KR20150012572A - ｐ53 단백질 및 ｐ18 단백질이 결합된 융합 단백질을 포함하는 암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물 및 이의 용도 - Google Patents

Abstract

p53 단백질 및 p18 단백질, p53 단백질 및 p18 변이체 단백질, 또는 이 결합된 융합 단백질을 포함하는 암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물 및 이의 용도에 관한 것이다. 일 구체예에 따른 약학적 조성물, 및 이를 사용한 암의 치료 또는 예방 방법에 따르면, 효과적으로 암의 치료 또는 예방이 가능하다.

Description

ｐ53 단백질 및 ｐ18 단백질이 결합된 융합 단백질을 포함하는 암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물 및 이의 용도{Pharmaceutical composition comprising p53-p18 fusion protein for preventing or treating cancer and using the same}

p53 단백질 및 p18 단백질이 결합된 융합 단백질을 포함하는 암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물, 및 암의 치료 또는 예방 방법에 관한 것이다.

세포가 증식하기 위해서는 G1기(G1 phase), DNA 복제기(S phase), G2기(G2 phase) 및 세포분열기(M phase)를 거치는 일련의 단계를 순환하는데, 이를 세포주기(cell cycle)라 한다. 세포분열기는 유사분열과 세포질분열을 거쳐 세포가 증식하는 실질적인 단계이고, DNA 복제기에서는 DNA가 복제되고 세포수는 변하지 않는다. 따라서, 세포주기에서 세포분열기를 제외한 DNA 복제기, G1기, 및 G2기를 간기(interphase)라고 한다. G1기와 G2기는 세포주기를 조절하는 체크포인트(checkpoint)를 포함하는데, 이는 세포가 비정상적으로 증식하지 않도록 하는 중요한 역할을 한다. 체크포인트에서 세포주기의 다음 단계로 넘어가기 위한 조건이 충족되었는지를 확인한 후, 모든 조건이 만족되면 DNA 복제기 또는 세포분열기가 진행된다. 이러한 체크포인트에서의 세포 증식 조절이 제대로 이루어지지 않으면 암과 같은 비정상적인 세포 증식을 유발한다.

G1 체크포인트를 지나고, DNA 복제기, G2 체크포인트를 지나서 유사분열을 하기 위해서는 CDK(cyclin-dependent kinase) 단백질의 활성이 필요하다. CDK는 단독으로 활성을 가질 수 없으며 Cyclin 단백질과 결합되어야 키나아제 활성을 갖게 된다. Cyclin-CDK 복합체는 세포증식에 관련된 단백질들을 인산화시켜 세포 분열을 유도한다. DNA 복제기를 유도하는 단백질들은 주로 Cyclin D/E, CDK 4/6이고, CDK 4/6은 Rb(Retinoblastoma) 단백질을 인산화시켜서 전사 인자인 E2F의 전사 활성을 갖게 한다. 세포분열기를 유도하는 단백질들은 주로 Cyclin A/B, CDK 2/1이며, 이들의 Cyclin-CDK 복합체는 MPF(M-phase promoting factor)라고 일컫는다. 유사분열이 완료되거나 DNA 복제가 완료되면 더 이상의 키나아제 활성이 필요하지 않으므로 Cyclin-CDK 복합체의 Cyclin이 분해되어 CDK의 활성이 사라진다.

세포 주기 조절을 위해 Cyclin-CDK 복합체의 활성을 조절하는 많은 인자들이 존재한다. 대표적인 것으로는 G1 체크포인트에서 DNA가 손상되었을 때 작용하는 p21 단백질이 있다. DNA가 손상되었을 시에 활성되는 종양 억제인자 유전자(tumor suppressor gene)인 p53에 의해 p21 유전자가 발현된다. p21은 DNA 복제기를 유도하는 Cyclin-CDK 복합체에 결합하여 CDK4/6/2의 키나아제 활성을 저해함으로써, Rb 단백질의 인산화를 막는다. 그 결과, 세포는 G1기에 머물면서 손상된 DNA를 수리할 시간을 얻게 된다. 만일 DNA 손상이 세포가 수용하지 못할 정도로 심하면 p53은 아폽토시스 유도 유전자(apoptosis-inducing gene)인 Bax 단백질의 유전자를 발현시킨다. 즉, 세포증식의 조절에 있어서 p53의 작용은 p21 유전자를 발현시켜 세포증식을 일시적으로 정지시키는 것(growth arrest), 또는 p53-결합 단백질인 ASPP 단백질과 결합한 p53 단백질이 Bax 유전자를 발현시켜 아폽토시스를 유발하는 것(apoptosis inducing)의 두 가지로 나누어 볼 수 있다. 아폽토시스는 예정된 세포 죽음(programmed cell death)이라고도 하며 세포가 조직내에서 더 이상 필요 없을 때, 바이러스의 침입을 받았거나 암세포로 변환되었을 때 등, 개체수준에서 세포의 죽음이 오히려 도움이 되면 세포 스스로 자살하는 기작이다.

세포 증식을 조절하기 위해서는 종양 억제인자 유전자와 전암 유전자(proto-oncogene)와의 균형이 유지되어야 한다. 종양 억제인자 유전자인 p53 단백질의 유전자가 돌연변이(mutation)되면, 비정상적인 세포의 아폽토시스를 유도할 수 없으므로 비정상적 세포 증식을 유발한다. 또한 정상적인 세포 증식 인자인 전암유전자가 변이(바이러스에 의한 유전자 치환 등)되거나 과발현 되어 암유전자가 되어도 암세포와 같은 비정상적인 세포 증식을 유도한다. 암유전자는 비정상적인 활성을 갖는 성장인자, 세포내 신호전달 단백질을 만들어 잘못된 신호 전달을 유발하기 때문에 외부의 증식 신호가 없어도 세포증식이 일어날 수 있다. 또한, p18 단백질은 CDK4/6의 활성을 저해하는 역할을 한다.

이러한 사실로 볼 때, p53 단백질과 p18 단백질은 암을 치료하는데 중요한 역할을 할 것으로 예상된다. 따라서, p53 단백질 또는 그의 단편, 및 p18 단백질 또는 그의 변이체를 포함하는 항암제의 개발이 요구되고 있는 실정이다.

암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물이 제공된다.

암의 치료 또는 예방 방법이 제공된다.

일 양상은 인 비트로 안정화 단백질; 및 상기 인 비트로 안정화 단백질의 C- 말단에 연결되어 있는 융합 단백질을 포함하는 것으로서, 상기 융합 단백질은 막 투과 서열 도메인, p53 단백질 및 p18 단백질이 결합된 융합 단백질 및 인 비트로 안정화 단백질을 포함하는 단백질 복합체의 약학적 유효량; 및 약학적으로 허용되는 담체, 희석제 또는 부형제를 포함하는 암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

용어 "인 비트로 안정화 단백질(in vitro stabilization protein)"은 상기 단백질 복합체의 생체 외부에서, 예를 들면, 상기 단백질 복합체를 실험적으로 정제를 하는 경우, 상기 단백질 복합체의 용해도 및 안정성을 증진시키기 위한 단백질을 말한다. 상기 인 비트로 안정화 단백질은 상기 단백질 복합체의 일부로써, 생체 내에서 면역원성이지 않아야 한다.

용어 "막 투과(membrane transfer 또는 membrane translocation)"는 인 비트로(in vitro) 및/또는 인 비보(in vivo) 상에서 운반 대상인 p53 단백질 및 p18 단백질이 결합된 융합 단백질을 세포 또는 핵의 내부 또는 외부로 운반할 수 있는 능력을 말한다. 또한, "막 투과 서열(membrane transfer sequence domain: MTS)" 도메인은 그 자체로 인지질 이중막의 세포막을 통과할 수 있는 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드를 말한다. 상기 막 투과 서열 도메인은 N-말단에 단일 소수성 영역(single hydrophobic region)을 가지고, 헬릭스 구조(helix structure)를 형성하며, 유연성을 나타내고, 상대적으로 짧은 길이의 아미노산(7개 내지 17개 아미노산)을 가질 수 있다. 따라서, 상기 막 투과 서열 도메인의 물성은 대개 소수성을 나타낼 수 있다. 일 구체예에 따르면, 상기 막 투과 서열 도메인은 그 자체로 인지질 이중막의 세포막을 통과할 수 있는 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드이면 모두 가능할 수 있다. 서열번호 6 내지 서열번호 20으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것일 수 있다.

용어 "인 비보 안정화 단백질(in vivo stabilization protein)"은 상기 단백질 복합체가 실질적으로 작용하는 생체 내부에서, 상기 단백질 복합체의 안정성을 증진시키기 위한 단백질을 말한다. 인 비보 안정화 단백질은 상기 단백질 복합체의 일부로써, 생체 내에서 면역원성이지 않고, 단백질의 종류에 한정되지 않는다. 일 구체예에 따르면, 상기 인 비보 안정화 단백질은 혈청 알부민 결합 펩티드(serum albumin binding peptide), Fc 및 PEG(polyethyleneglycol)로 이루어진 군으로부터 선택되는 것일 수 있으나, 이에 한정되지는 않는다.

일 구체예에 따르면, 상기 인 비트로 안정화 단백질의 C-말단에 연결되어 있는 융합 단백질은 핵-세포질 신호 도메인을 더 포함할 수 있다.

일 구체예에 따르면, 상기 p53 단백질은 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 p53 단백질의 전사활성 도메인일 수 있다. 상기 p18 단백질은 p18 야생형 단백질일 수 있다. p18 야생형 단백질은 서열번호 2의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드일 수 있다. 상기 p53 단백질 및 p18 단백질이 결합된 융합 단백질은 서열번호 3의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드일 수 있다.

서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드는 p53 단백질 중 Mdm2에 결합하는 부위인 인간 p53 단백질의 18 내지 26번째 아미노산 서열을 포함하는 전사활성 도메인을 말한다. p18 야생형 단백질은 서열번호 2의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드일 수 있다. 인간 p53 단백질의 18 내지 26번째 아미노산 서열을 포함하는 전사활성 도메인과 인간 p18 단백질이 결합된 폴리펩티드는 서열번호 3의 아미노산 서열일 수 있다. 상기 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드는 p53 단백질의 분해를 촉진시키는 Mdm2/Mdm4의 활성을 저해함으로써 p53 단백질의 안정성을 증가시킬 수 있다. p53 단백질의 작용으로 p21 유전자를 발현시켜 세포 증식을 일시적으로 정지시키고, p53-결합 단백질인 ASPP와 결합한 p53 단백질이 Bax 유전자를 발현시켜 아폽토시스를 유발하게 할 수 있다. 또한, p18 단백질은 CDK4/6의 활성을 저해하는 역할을 하게 되므로, 상기 서열번호 3의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드를 포함하는 상기 약학적 조성물은 새로운 항암제로서 유용하게 사용될 수 있다.

상기 p18 단백질은 p18 단백질의 변이체일 수 있다. p18 단백질은 서열번호 4의 폴리펩티드일 수 있다. p18 단백질은 서열번호 5의 폴리뉴클레오티드 서열에 의하여 암호화되는 폴리펩티드일 수 있다. p18 단백질 변이체는 p18 단백질을 포함하는 융합 단백질과 비교하여 p18 단백질 변이체를 포함하는 융합 단백질의 용해도 또는 안정성을 증가시킬 수 있고, 항암 효과가 향상될 수 있다.

용어 "핵-세포질 신호 도메인(nucleus-cytoplasm signal domain)"은 그와 융합된 물질을 핵의 내부 또는 외부로 전달할 수 있는 폴리펩티드를 포함한다. 핵-세포질 신호 도메인은 NLS(nucleus location sequence) 도메인 또는 NES(nucleus export sequence) 도메인일 수 있다. 예를 들면, p53 단백질 및 p18 단백질이 결합된 융합 단백질을 핵의 내부로 전달하기 위해 NLS를 포함하는 단백질 복합체를 제조할 수 있다. 예를 들면, p53 단백질 및 p18 단백질이 결합된 융합 단백질을 세포질에 존재하도록 하기 위해 NES를 포함하는 단백질 복합체를 제조할 수 있다.

NLS 도메인은 세포질에서 핵으로 수송되는 단백질들이, NES 도메인은 핵에서 세포질로 수송되는 단백질들에 포함된 폴리펩티드일 수 있다. NLS 도메인 또는 NES 도메인을 포함하는 폴리펩티드는 핵막을 통과할 수 있다. 예를 들면, NLS 도메인으로 사용될 수 있는 폴리펩티드는 KKKRK(서열번호 21), PKKKRKV(서열번호 22), KRPAATKKAGQAKKKK(서열번호 23) 등일 수 있다. 핵-세포질 신호 도메인은 예를 들면, 단백질 복합체에서 p53 단백질 및 p18 단백질이 결합된 융합 단백질 및 인 비보 안정화 단백질의 사이에 위치할 수 있다.

핵-세포질 신호 도메인은 단백질의 용해도를 증가시킬 수 있다. 예를 들면, 핵-세포질 신호 도메인이 단백질 복합체에서 C-말단에 가깝게 위치하는 경우, 단백질의 용해도가 증가될 수 있다. 예를 들면, 인 비보 안정화 단백질(예를 들어, 혈청 알부민 등)이 존재하는 경우, C-말단 펩티다아제의 공격을 막아 핵-세포질 위치 도메인이 그의 기능을 수행할 수 있다.

일 구체예에 따르면, 인 비트로 안정화 단백질의 C-말단에 연결되어 있는 융합 단백질은 막 투과 서열 도메인; 상기 막 투과 서열 도메인의 C-말단에 연결되어 있는 p53 단백질 및 p18 단백질이 결합된 융합 단백질; 및 상기 p53 단백질 및 p18 단백질이 결합된 융합 단백질에 연결되어 있는 인 비보 안정화 단백질을 포함하는 것인 약학적 조성물을 포함할 수 있다.

일 구체예에 따르면, 인 비트로 안정화 단백질의 C-말단에 연결되어 있는 융합 단백질은 p53 단백질 및 p18 단백질이 결합된 융합 단백질 및 인 비보 안정화 단백질 사이에 연결되어 있는 핵-세포질 신호 도메인을 더 포함할 수 있다.

일 구체예에 따르면, 인 비트로 안정화 단백질의 C-말단에 연결되어 있는 융합 단백질은 상기 인 비트로 안정화 단백질의 C-말단에 연결되어 있는 막 투과 서열; 상기 막 투과 서열의 C-말단에 연결되어 있는 p53 단백질 및 p18 단백질이 결합된 융합 단백질; 상기 p53 단백질 및 p18 단백질이 결합된 융합 단백질의 C-말단에 연결되어 있는 핵-세포질 신호 도메인; 및 상기 핵-세포질 신호 도메인의 C-말단에 연결되어 있는 인 비보 안정화 단백질로 이루어진 것일 수 있다.

일 구체예에 따르면, 인 비트로 안정화 단백질은 유비퀴틴 또는 유비퀴틴-유사 단백질일 수 있으나, 이에 한정되지는 않는다.

유비퀴틴(ubiquitin: Ub)은 자연계에서 발견되는 보존적인 단백질로 76개의 아미노산 서열로 이루어져 있으며, 곤충, 송어 및 인간처럼 다양한 종들간에 높은 상동성을 보이는 수용성 단백질이다. 또한, 유비퀴틴은 pH의 변화에 대해 안정하고, 고온에서도 쉽게 변성되지 않으며, 프로테아제에 대해서도 안정성이 있는 단백질로 알려져 있다. 따라서, 유비퀴틴은 상기 단백질 복합체의 불용성을 개선할 수 있다.

상기 유비퀴틴 또는 유비퀴틴-유사 단백질(ubiquitin-like protein, Ubl)은 야생형 유비퀴틴, 야생형 유비퀴틴-유사 단백질, 돌연변이 유비퀴틴 및 돌연변이 유비퀴틴-유사 단백질로 이루어진 군으로부터 선택되는 것일 수 있다. 일 구체예에 따르면, 상기 야생형 유비퀴틴은 서열번호 24의 아미노산 서열로 이루어진 것일 수 있다. 돌연변이 유비퀴틴은 야생형 유비퀴틴의 아미노산 서열을 다른 아미노산 서열로 바꾼 것을 말한다. 예를 들면, 야생형 유비퀴틴의 Lys을 Arg으로 치환한 유비퀴틴, 및 야생형 유비퀴틴 C-말단 RGG를 RGA로 변경시킨 유비퀴틴(서열번호 25)을 포함한다. 상기 야생형 유비퀴틴 단백질의 Lys을 Arg으로 치환한 돌연변이형 유비퀴틴에서, 야생형 유비퀴틴의 6번째, 11번째, 27 번째, 29 번째, 33 번째, 48 번째, 63번째, 또는 이들의 조합에 존재하는 Lys이 치환될 수 있다. 예를 들면, 유비퀴틴 돌연변이형은 야생형 유비퀴틴 단백질의 76번째에 존재하는 Gly이 Ala으로 치환된 폴리펩티드일 수 있다. 유비퀴틴-유사 단백질은 유비퀴틴과 그 특성이 유사한 단백질을 말한다. 예를 들면, 유비퀴틴-유사 단백질은 Nedd8, SUMO-1, SUMO-2, NUB1, PIC1, UBL3, UBL5, ISG15, 또는 이들의 조합일 수 있다.

일 구체예에 따르면, 상기 유비퀴틴 또는 유비퀴틴-유사 단백질은 C-말단에 프로테아제에 의해 절단 가능한 아미노산 서열 또는 프로테아제에 의해 절단되지 않는 아미노산 서열을 포함한다. 상기 프로테아제에 의해 절단 가능한 아미노산 서열은 당업계에 공지된 검색 데이터베이스(예를 들면, ExPASy의 PeptideCutter)를 통해 확인할 수 있다. 절단 가능한 아미노산 서열을 포함하는 단백질 복합체는 프로테아제에 의해 절단될 수 있고, 절단된 단백질 또는 폴리펩티드는 그의 기능을 수행할 수 있다. 예를 들면, N 말단으로부터 유비퀴틴 또는 유비퀴틴 유사 단백질, 절단 가능한 아미노산 서열, 및 p53 단백질 및 p18 단백질이 결합된 융합 단백질이 결합된 단백질 복합체는 프로테아제의 절단에 의해 p53 단백질 및 p18 단백질이 유리될 수 있다. 유리된 p53 단백질 및 p18 단백질은 그의 기능을 수행할 수 있다. 막 투과 서열을 포함하는 p53 단백질 및 p18 단백질의 융합 단백질은 막 투과 서열 도메인의 폴리펩티드의 길이가 짧으므로, p53 단백질 및 p18 단백질의 융합 단백질의 기능에 영향을 미치지 않을 수 있다. 세포 내의 프로테아제에 의해 유비퀴틴 또는 유비퀴틴-유사 단백질이 절단되지 않더라도 p53 단백질 및 p18 단백질이 결합된 융합 단백질이 세포 내에서 그 기능을 할 수 있다.

상기 조성물이 암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물로 제조되는 경우, 상기 조성물은 약학적으로 허용되는 담체를 포함할 수 있다. 상기 조성물에 포함되는 약학적으로 허용되는 담체는 제제시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 예를 들면, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산 칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산 칼슘, 미세결정성 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로스, 물, 시럽, 메틸 셀룰로스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘, 미네랄 오일, 또는 이들의 조합을 포함할 수 있다. 상기 약학적 조성물은 예를 들면 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제, 또는 이들의 조합을 더 포함할 수 있다.

상기 암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물은 경구 또는 비경구로 투여할 수 있다. 비경구 투여는 정맥내 주입, 피하 주입, 근육 주입, 복강 주입, 내피 투여, 국소 투여, 비내 투여, 폐내 투여, 직장내 투여, 또는 이들의 조합일 수 있다. 단백질 또는 펩티드는 소화가 되기 때문에 경구용 조성물은 활성 약제를 코팅하거나 위에서의 분해로부터 보호되도록 제형화될 수 있다. 또한, 상기 조성물은 상기 조성물이 표적 세포로 이동할 수 있는 임의의 장치에 의해 투여될 수 있다.

상기 암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물의 적합한 투여량은 제제화 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성, 병적 상태, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하게 처방될 수 있다. 상기 조성물의 바람직한 투여량은 성인 기준으로 0.001 내지 100 ㎎/kg일 수 있다. 용어 "약학적 유효량"은 암을 예방 또는 치료하는 데, 또는 혈관신생으로 인한 질환의 예방 또는 치료하는 데 충분한 양을 말한다.

상기 조성물은 당해 당업자가 용이하게 실시할 수 있는 방법에 따라, 약학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제를 이용하여 제제화함으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 다용량 용기 내에 내입시켜 제조될 수 있다. 이때 제형은 오일 또는 수성 매질중의 용액, 현탁액, 시럽제 또는 유화액 형태이거나 엑스제, 산제, 분말제, 과립제, 정제 또는 캅셀제 형태일 수도 있다. 조성물은 분산제 또는 안정화제를 더 포함할 수 있다. 또한, 상기 조성물은 개별 치료제로 투여하거나 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있고, 종래의 치료제와는 순차적으로 또는 동시에 투여될 수 있다.

일 구체예에 따르면, 상기 약학적 조성물이 예방 또는 치료 대상으로 하는 암은 예를 들어, 편평상피세포암, 소세포폐암, 비소세포폐암, 폐의 선암, 폐의 편평상피암, 복막암, 피부암, 피부 또는 안구내 흑색종, 직장암, 항문부근암, 식도암, 소장암, 내분비선암, 부갑상선암, 부신암, 연조직 육종, 요도암, 만성 또는 급성 백혈병, 림프구 림프종, 간세포암, 위장암, 췌장암, 교아종, 경부암, 난소암, 간암, 방광암, 간종양, 유방암, 결장암, 대장암, 자궁내막 또는 자궁암, 침샘암, 신장암, 간암, 전립선암, 음문암, 갑상선암, 간암, 두경부암, 또는 이들의 조합일 수 있다.

일 양상은 비트로 안정화 단백질; 및 상기 인 비트로 안정화 단백질의 C-말단에 연결되어 있는 융합 단백질을 포함하는 것으로서, 상기 융합 단백질은 막 투과 서열 도메인, p53 단백질 및 p18 단백질이 결합된 융합 단백질 및 인 비트로 안정화 단백질을 포함하는 단백질 복합체를 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 암의 치료 또는 예방 방법을 제공한다.

비트로 안정화 단백질, 막 투과 서열 도메인, p53 단백질, p18 단백질, 인 비트로 안정화 단백질, 융합 단백질, 단백질 복합체는 전술한 바와 같다.

상기 개체는 인간을 포함한 포유동물일 수 있다.

상기 투여는 경구 또는 비경구 투여일 수 있다. 비경구 투여는 정맥내 주입, 피하 주입, 근육 주입, 복강 주입, 내피 투여, 국소 투여, 비내 투여, 폐내 투여, 직장내 투여, 또는 이들의 조합일 수 있다.

상기 암의 치료는 암이 낫거나 또는 완화되는 것일 수 있다. 암의 예방은 암이 발생을 막는 것일 수 있다.

일 구체예에 따른 약학적 조성물 또는 암의 치료 또는 예방 방법에 따르면, 효과적으로 암의 예방 또는 치료가 가능할 수 있다.

도 1은 일 구체예에 따른 단백질 복합체의 모식도를 나타낸다.
도 2는 일 구체예에 따른 단백질 복합체를 정제하여 SDS-PAGE를 수행한 겔의 사진이다.
도 3은 일 구체예에 따른 단백질 복합체를 정제하여 SDS-PAGE를 수행한 겔의 사진이다.
도 4a 내지 도 4e는 일 구체예에 따른 암세포에 대한 단백질 복합체의 항암 효과를 나타내는 그래프이다.
도 5는 일 구체예에 따른 이종이식(xenograft) 마우스 모델에 대한 단백질 복합체의 항암 효과를 나타내는 그래프이다.

이하 하나 이상의 구체예를 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 하나 이상의 구체예를 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1. 단백질 복합체를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 발현 벡터의 제조

N-말단으로부터 야생형 유비퀴틴 단백질 또는 돌연변이형 유비퀴틴 단백질; 막 투과 서열(membrane transfer sequence: MTS) 도메인; p53 또는 p53의 변이체, 및 p18 또는 p18의 변이체를 포함하는 융합 단백질; 핵 위치 신호(nucleus localization signal: NLS) 도메인; 및 혈청 알부민 결합 펩티드(Serum Albumin Binding Peptide: SABP)의 순서로 연결된 세포 내 전달용 단백질 복합체를 생산하기 위한 상기 단백질 복합체의 발현 벡터를 제조하였다. 또한, 상기 단백질 복합체와의 비교 실험을 위해, 단백질 복합체에서 하나 이상의 구성 요소를 제외한 단백질 복합체를 생산하기 위한 발현 벡터를 제조하였다. 이하, 야생형 유비퀴틴 단백질은(서열번호 24)은 Ub7KR로, 야생형 유비퀴틴 단백질의 C-말단의 RGG를 RGA로 변경시킨 돌연변이형 유비퀴틴(서열번호 25)은 Ub7KR(G76A)로 명명하였다. Ub7KR은 유비퀴틴의 7개의 리신(Lys)이 모두 아르기닌(Arg)으로 치환된 것이다.

총 12가지 종류의 발현 벡터를 ㈜ 제노텍에 의뢰하여 제조하였으며, 단백질 과발현을 위한 벡터는 pET-21b(+)(EMD Biosciences)를 사용하였다. 상기 단백질 복합체를 발현시키기 위해 상기 벡터에 포함된 총 12 종류의 인서트(insert) DNA 절편은 다음과 같다:

#1: N 말단-Ub7KR(G76A)-MTS-p53-p18-NLS-C 말단의 순서로 결합된 단백질 복합체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드(서열번호 26);

#2: N 말단-Ub7KR(G76A)-MTS-p53-p18-NLS-SABP-C 말단의 순서로 결합된 단백질 복합체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드(서열번호 27);

#3: N 말단-Ub7KR-MTS-p53-p18-NLS-SABP-C 말단의 순서로 결합된 단백질 복합체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드(서열번호 28);

#4: N 말단-Ub7KR(G76A)-p53-p18-NLS-C 말단의 순서로 결합된 단백질 복합체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드(서열번호 29);

#5: N 말단-Ub7KR(G76A)-p53-p18-NLS-SABP-C 말단의 순서로 결합된 단백질 복합체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드(서열번호 30);

#6: N 말단-Ub7KR-p53-p18-NLS-C 말단의 순서로 결합된 단백질 복합체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드(서열번호 31);

#7: N 말단-Ub7KR(G76A)-MTS-p53-p18 변이체-NLS-C 말단의 순서로 결합된 단백질 복합체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드(서열번호 32);

#8: N 말단-Ub7KR(G76A)-MTS-p53-p18 변이체-NLS-SABP-C 말단의 순서로 결합된 단백질 복합체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드(서열번호 33);

#9: N 말단-Ub7KR-MTS-p53-p18 변이체-NLS-SABP-C 말단의 순서로 결합된 단백질 복합체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드(서열번호 34);

#10: N 말단-Ub7KR(G76A)-p53-p18 변이체-NLS-C 말단의 순서로 결합된 단백질 복합체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드(서열번호 35);

#11: N 말단-Ub7KR(G76A)-p53-p18 변이체-NLS-SABP-C 말단의 순서로 결합된 단백질 복합체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드(서열번호 36);

#12: N 말단-Ub7KR-p53-p18 변이체-NLS-C 말단의 순서로 결합된 단백질 복합체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드(서열번호 37);

#13: N 말단-Ub7KR(G76A)-p53-p18-NLS-C 말단의 순서로 결합된 단백질 복합체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드(서열번호 38);

#14: N 말단-Ub7KR(G76A)-p53-p18-NLS-C 말단의 순서로 결합된 단백질 복합체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드(서열번호 39); 및

#15: N 말단-Ub7KR-p53-p18-NLS-C 말단의 순서로 결합된 단백질 복합체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드(서열번호 40).

한편, 상기 각각의 인서트 DNA 절편은 5' 말단에 NdeI으로 절단될 수 있는 뉴클레오티드 서열을, 3' 말단에 XhoI으로 절단될 수 있는 뉴클레오티드 서열을 포함함으로써, 상기 pET21b(+) 벡터의 NdeI-XhoI 절단 서열에 삽입될 수 있다.

일 구체예에 따른 단백질 복합체의 가능한 1차 구조를 나타내는 모식도를 도 1에 나타내었다. 도 1에서, "6XHis"는 6개의 히스티딘 아미노산으로 이루어지는 아미노산 서열이고, "TEV site"는 담배 엣치 바이러스(Tobacco Etch Virus: TEV) 프로테아제의 인식 부위이고, "Ub"는 유비퀴틴이고, "Ub7KR"은 야생형 유비퀴틴 단백질이고, "Ub7KR(G76A)"은 야생형 유비퀴틴 단백질의 C-말단의 RGG를 RGA로 변경시킨 돌연변이형 유비퀴틴이고, "MTS"는 MTS 도메인이고, "NLS"는 NLS 도메인이고, "p53p18"은 p53과 p18의 융합 단백질이고, "SABP"는 혈청 알부민 결합 펩티드를 말한다.

실시예 2. 단백질 복합체의 발현 및 정제

실시예 1에서 제조한 벡터 6종류를 E. coli BL21(DE3)에 각각 형질전환시키고 배양하여 상기 단백질 복합체를 생산하였다. 이때, 배양액으로 YT 배지를 사용하였으며, 흡광도 600 nm에서 O.D.값이 0.5일 때 0.5 mM의 IPTG를 넣고 18 ℃에서 16시간 동안 더 배양하였다. 상기 배양하여 얻은 세포를, 5% 글리세롤, 5 mM β-머캅토에탄올, 0.2%(v/v) 트리톤 X-100 및 0.2 M NaCl을 포함하는 50 mM Tris-HCl 완충액(pH 8.0) 하에서 초음파로 분쇄한 후, 원심분리기(10,000 g)를 이용하여 상층액을 얻었다. 상기 상층액을 상기 완충액으로 평형화된 Ni^{2 +}-NTA superflow 컬럼(Qiagen)에 적용하고, 컬럼 부피의 5배에 해당하는 세척 완충액(50 mM Tris-HCl, pH 8.0, 5%(v/v) 글리세롤, 5 mM β-머캅토에탄올, 0.2%(v/v) 트리톤 X-100 및 1 M NaCl)로 세척한 다음, 용출 완충액(50 mM Tris-HCl, pH 8.0, 5%(v/v) 글리세롤, 5 mM β-머캅토에탄올, 0.2%(v/v) 트리톤 X-100, 0.2 M NaCl)으로 상기 단백질 복합체를 용출하였다. 단백질 복합체가 포함된 분획들을 모아 Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter(Milipore)를 이용하여 분획 중에 포함된 염을 제거하고 농축하였다. 정제된 단백질 농도는 BSA를 표준 물질로 사용하여 측정하였다.

도 2는 실시예 1에서 제작한 벡터로부터 발현된 단백질 복합체들을 상기 방법에 의해 정제한 결과를 SDS-PAGE한 겔의 사진이다. 도 2에서, 레인 1은 #1: N 말단-Ub7KR(G76A)-MTS-p53-p18-NLS-C 말단의 순서로 결합된 단백질 복합체이고, 레인 2는 #2: N 말단-Ub7KR(G76A)-MTS-p53-p18-NLS-SABP-C 말단의 순서로 결합된 단백질 복합체이며, 레인 3은 #3: N 말단-Ub7KR-MTS-p53-p18-NLS-SABP-C 말단의 순서로 결합된 단백질 복합체이고, 레인 4는 #4: N 말단-Ub7KR(G76A)-p53-p18-NLS-C 말단의 순서로 결합된 단백질 복합체이며, 레인 5는 #5: N 말단-Ub7KR(G76A)-p53-p18-NLS-SABP-C 말단의 순서로 결합된 단백질 복합체이고, 레인 6은 #6: N 말단-Ub7KR-p53-p18-NLS-C 말단의 순서로 결합된 단백질 복합체이다. M은 사이즈 마커이다.

실시예 3. 인 비보 안정화 단백질을 포함하는 단백질 복합체의 인 비보 안정성 확인

실시예 2에서 제조한 단백질 복합체가 인 비보에서 안정적으로 존재할 것인지 여부를 유추하기 위해, 상기 단백질 복합체들과 생체 내에 존재하는 단백질인 혈청 알부민과의 결합 여부를 확인하였다.

먼저, 500 ㎍의 실시예 2에서 정제한 단백질 복합체 중 SABP를 포함하는 단백질 복합체 #5 또는 SABP를 포함하지 않는 단백질 복합체 #4와, 1500 ㎍의 우혈청 알부민(BSA)을 1000 ㎕의 PBS 완충액(1x PBS, 0.2%(v/v) 트윈 20, 100 mM 아르기닌, 0.2% 환원된 글루타티온) 에 18℃에서 120분 동안 방치하여 결합 시간을 충분히 제공한 다음, 이를 HiLoad Superdex S-75 16/60 컬럼(GE healthcare)에 로딩하여 용출하였다. 이 때 용출 조건은 흐름 속도(flow rate) 1 ㎖/분, PBS 완충액 (1x PBS, 0.2%(v/v) 트윈 20, 100 mM 아르기닌, 및 0.2%(w/v) 환원된 글루타티온)이며, 2 ㎖ 분획으로 120 분 동안 수득하였다. 이후, 상기 용출액을 50 mM Tris 완충액(50 mM Tris-HCl, pH 8.0, 5%(v/v) 글리세롤, 5 mM β- 머캅토에탄올, 0.2%(v/v) 트리톤 X-100, 및 1 M NaCl)로 평형화된 Ni^{2 +}-NTA superflow 컬럼(Qiagen)에 적용하여, 실시예 2와 동일한 방법으로 단백질 복합체를 용출하였다.

도 3은 상기 과정에 의해 용출된 단백질 복합체를 SDS-PAGE한 겔의 사진이다. 도 3에서 보는 바와 같이, 혈청 알부민 결합 단백질을 포함하는 단백질인 단백질 복합체 #5에서만, BSA와 결합하였음을 확인할 수 있었다. 단백질 복합체는 크기가 작을 경우 생체 내에서 신장 클리어런스(renal clearance)가 일어나거나, 프로테아제에 의해 분해될 수 있는데, 혈청 알부민은 혈액 내에서 안정한 단백질이고, 신장 클리어런스가 일어나지 않으므로, 혈청 알부민 결합 단백질이 포함된 단백질 복합체는 체내에서 안정할 수 있다. 또한, p18 변이체를 포함하는 단백질 복합체는 야생형 p18 단백질을 포함하는 단백질 복합체에 비하여 용해도 및 안정성이 향상되었다.

실시예 4. 여러 종류의 암 세포주를 이용한 단백질 복합체의 항암효과 확인

실시예 2에서 제조한 단백질 복합체의 세포 내 투과 및 암세포의 치료 효능을 확인하기 위하여, 대장암 세포주(HCT116, SW48, LoVo 및 LS174T, 한국 세포주 은행) 및 피부 상피암 세포주(A431, 한국 세포주 은행)를 대상으로 상기 단백질 복합체의 투여에 의한 p53-p18 단백질의 항암 효과를 확인하였다.

상기 세포들을 각각 웰당 1×10⁴개가 포함되도록 10%의 FBS가 포함된 RPMI 배지(Gibco BL)에 넣고, 단백질 복합체 #1, #2 및 #3을 각각 0, 0.032, 0.16, 0.8, 4, 20 또는 100 ㎍/㎖의 농도로 처리한 다음, 96시간 동안 CO₂ 배양기에서 온도 37℃, 습도 85%, CO₂ 5%의 조건으로 배양하였다. 비교 실험으로는 상기 단백질 복합체 대신 항암 치료 항체 얼비툭스(Erbitux: Erbi)를 동일 양으로 처리하고 상기와 동일한 조건에서 배양하였다. 또한, 상기 단백질 복합체 또는 얼비툭스를 처리하지 않은 세포주를 대조군으로 하였다.

세포주 HCT116, SW48, LoVo, LS174T 및 A431에 대한 단백질 복합체의 항암 효과를 각각 도 4a 내지 도 e에 나타내었다(X 축: 단백질 복합체의 농도, Y축: 세포 생존율(%), ◆; Erbi, ▲; p56, x; p52, *; p44). 도 4a 내지 도 4e에서 나타낸 바와 같이, 핵 위치 신호 도메인(NLS) 및 인 비보 안정화 단백질(SABP)을 모두 포함하는 단백질 복합체는 20 ㎍/㎖의 농도에서 상기 모든 세포주의 세포 성장을 현저하게 억제함을 확인할 수 있었으며, 100 ㎍/㎖의 농도에서는 모든 세포주의 세포 성장을 완전히 억제함을 확인할 수 있었다. 또한, p18 변이체를 포함하는 단백질 복합체 투여군은 야생형 p18 단백질을 포함하는 단백질 복합체 투여군에 비하여 세포 정장 억제 효과가 더 향상되었다.

실시예 5. HCT 116 이종이식( xenograft ) 마우스 모델을 이용한 단백질 복합체의 항암효과 확인

실시예 2에서 제조한 단백질 복합체의 항암효과를 확인하기 위하여, 대장암 세포주(HCT116)를 6주령 BALB/c 누드 마우스에 주입하여 암 조직을 생성시켰다. 단백질 복합체를 생성된 암 조직에 일주일에 2회 투여한 후, 암 조직 크기의 변화를 관찰하였다.

도 5는 이종이식(xenograft) 마우스 모델에 대한 단백질 복합체의 항암 효과를 나타내는 그래프이다(X 축: 단백질 복합체의 투여 횟수, Y축: 암 조직의 크기(㎣), ◇; 대조군, □; Ub-MTS-p53p18-SABP 투여군). 도 5에서 나타낸 바와 같이, 대조군인 Ub-p53p18(단백질 복합체 #4)에 비해 단백질 복합체 Ub-MTS-p53p18-SABP(단백질 복합체 #2) 투여군은 42% 암 조직의 크기가 감소하였다. 또한, p18 변이체를 포함하는 단백질 복합체 투여군은 야생형 p18 단백질을 포함하는 단백질 복합체 투여군에 비하여 항암 효과가 향상되었다.

<110> Samsung Electronics Co. Ltd <120> Pharmaceutical composition comprising p53-p18 fusion protein for preventing or treating cancer <130> PN095359 <160> 40 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> P53 fragment <400> 1 Glu Thr Phe Ser Asp Leu Trp Lys Leu Leu Pro Glu Asn 1 5 10 <210> 2 <211> 168 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> P18 <400> 2 Met Ala Glu Pro Trp Gly Asn Glu Leu Ala Ser Ala Ala Ala Arg Gly 1 5 10 15 Asp Leu Glu Gln Leu Thr Ser Leu Leu Gln Asn Asn Val Asn Val Asn 20 25 30 Ala Gln Asn Gly Phe Gly Arg Thr Ala Leu Gln Val Met Lys Leu Gly 35 40 45 Asn Pro Glu Ile Ala Arg Arg Leu Leu Leu Arg Gly Ala Asn Pro Asp 50 55 60 Leu Lys Asp Arg Thr Gly Asn Ala Val Ile His Asp Ala Ala Arg Ala 65 70 75 80 Gly Phe Leu Asp Thr Leu Gln Thr Leu Leu Glu Phe Gln Ala Asp Val 85 90 95 Asn Ile Glu Asp Asn Glu Gly Asn Leu Pro Leu His Leu Ala Ala Lys 100 105 110 Glu Gly His Leu Arg Val Val Glu Phe Leu Val Lys His Thr Ala Ser 115 120 125 Asn Val Gly His Arg Asn His Lys Gly Asp Thr Ala Cys Asp Leu Ala 130 135 140 Arg Leu Tyr Gly Arg Asn Glu Val Val Ser Leu Met Gln Ala Asn Gly 145 150 155 160 Ala Gly Gly Ala Thr Asn Leu Gln 165 <210> 3 <211> 183 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Fusion protein of p53 fragment and p18 <400> 3 Glu Thr Phe Ser Asp Leu Trp Lys Leu Leu Pro Glu Asn Lys Leu Met 1 5 10 15 Ala Glu Pro Trp Gly Asn Glu Leu Ala Ser Ala Ala Ala Arg Gly Asp 20 25 30 Leu Glu Gln Leu Thr Ser Leu Leu Gln Asn Asn Val Asn Val Asn Ala 35 40 45 Gln Asn Gly Phe Gly Arg Thr Ala Leu Gln Val Met Lys Leu Gly Asn 50 55 60 Pro Glu Ile Ala Arg Arg Leu Leu Leu Arg Gly Ala Asn Pro Asp Leu 65 70 75 80 Lys Asp Arg Thr Gly Asn Ala Val Ile His Asp Ala Ala Arg Ala Gly 85 90 95 Phe Leu Asp Thr Leu Gln Thr Leu Leu Glu Phe Gln Ala Asp Val Asn 100 105 110 Ile Glu Asp Asn Glu Gly Asn Leu Pro Leu His Leu Ala Ala Lys Glu 115 120 125 Gly His Leu Arg Val Val Glu Phe Leu Val Lys His Thr Ala Ser Asn 130 135 140 Val Gly His Arg Asn His Lys Gly Asp Thr Ala Cys Asp Leu Ala Arg 145 150 155 160 Leu Tyr Gly Arg Asn Glu Val Val Ser Leu Met Gln Ala Asn Gly Ala 165 170 175 Gly Gly Ala Thr Asn Leu Gln 180 <210> 4 <211> 168 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> p18 varient <400> 4 Met Ala Glu Pro Trp Gly Asn Lys Leu Ser Ser Ala Ala Ala Arg Gly 1 5 10 15 Asp Leu Glu Gln Leu Arg Arg Leu Leu Gln Asn Asn Val Asn Val Asn 20 25 30 Ala Gln Asn Arg Phe Gly Arg Thr Ala Leu Gln Val Met Lys Leu Gly 35 40 45 Asn Pro Glu Ile Ala Arg Arg Leu Leu Lys Arg Gly Ala Asn Pro Asp 50 55 60 Leu Lys Asp Arg Thr Gly Phe Ala Val Ile His Asp Ala Ala Arg Glu 65 70 75 80 Gly Phe Leu Asp Thr Leu Gln Thr Leu Leu Glu Phe Gln Ala Asp Val 85 90 95 Asn Ala Glu Asp Asn Glu Gly Asn Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Lys 100 105 110 Glu Gly His Leu Arg Val Val Glu Phe Leu Val Lys His Thr Ala Ser 115 120 125 Asn Val His Arg Arg Asn His Lys Gly Asp Thr Ala Cys Asp Leu Ala 130 135 140 Arg Leu Tyr Gly Arg Asn Glu Val Val Ser Leu Met Gln Ala Asn Gly 145 150 155 160 Ala Gly Gly Ala Thr Asn Leu Gln 165 <210> 5 <211> 504 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Polynucleotide encoding p18 varients <400> 5 atggccgagc cttgggggaa caagttgagc tccgcagctg ccagggggga cctagagcaa 60 cttaggaggt tgttgcaaaa taatgtaaac gtcaatgcac aaaataggtt tggaaggact 120 gcgctgcagg ttatgaaact tggaaatccc gagattgcca ggagactgct aaaaagaggt 180 gctaatcccg atttgaaaga ccgaactggt aatgctgtca ttcatgatgc ggccagagca 240 ggtttcctgg acactttaca gactttgctg gagtttcaag ctgatgttaa cgcagaggat 300 aatgaaggga acactccctt gcacttggct gccaaagaag gccacctccg ggtggtggag 360 ttcctggtga agcacacggc cagcaatgtg caccggcgga accataaggg ggacaccgcc 420 tgtgatttgg ccaggctcta tgggaggaat gaggttgtta gcctgatgca ggcaaacggg 480 gctgggggag ccacaaatct tcaa 504 <210> 6 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> membrane translocation sequence domain <400> 6 Ala Ala Val Ala Leu Leu Pro Ala Val Leu Leu Ala Leu Leu Ala Pro 1 5 10 15 <210> 7 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> membrane translocation sequence domain <400> 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sequence domain <400> 13 Leu Leu Leu Pro Ile Leu Ser Ser Ala 1 5 <210> 14 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> membrane translocation sequence domain <400> 14 Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu Pro Leu Leu Gly 1 5 10 <210> 15 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> membrane translocation sequence domain <400> 15 Leu Gly Ala Ala Leu Leu Leu Leu Pro Leu Leu Ala Ala 1 5 10 <210> 16 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> membrane translocation sequence domain <400> 16 Leu Leu Ser Val Leu Leu Leu Pro Leu Leu Gly 1 5 10 <210> 17 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> membrane translocation sequence domain <400> 17 Leu Leu Leu Leu Pro Leu Leu Leu Leu Pro Ala 1 5 10 <210> 18 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> membrane translocation sequence domain <400> 18 Leu Leu Leu Ala Gly Leu Ala Ser Leu Leu Leu Pro Gly Ser Ala Ala 1 5 10 15 <210> 19 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> membrane translocation sequence domain <400> 19 Gly Ala Ala Ala Ala Pro Leu Leu Val Ala Val Ala Ala Leu Leu Leu 1 5 10 15 Gly Ala Ala Gly 20 <210> 20 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> membrane translocation sequence domain <400> 20 Gly Gly Gln Leu Pro Leu Leu Val Val 1 5 <210> 21 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> nucleus localization signal domain <400> 21 Lys Lys Lys Arg Lys 1 5 <210> 22 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> nucleus localization signal domain <400> 22 Pro Lys Lys Lys Arg Lys Val 1 5 <210> 23 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> nucleus localization signal domain <400> 23 Lys Arg Pro Ala Ala Thr Lys Lys Ala Gly Gln Ala Lys Lys Lys Lys 1 5 10 15 <210> 24 <211> 76 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Ubiquitin wild type protein (Homo sapiens) <400> 24 Met Gln Ile Phe Val Lys Thr Leu Thr Gly Lys Thr Ile Thr Leu Glu 1 5 10 15 Val Glu Pro Ser Asp Thr Ile Glu Asn Val Lys Ala Lys Ile Gln Asp 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300 ttgagacttc gtggtgccga attcgaaaca ttttcagacc tatggaaact acttcctgaa 360 aacaagctta tggccgagcc ttgggggaac gagttggcgt ccgcagctgc caggggggac 420 ctagagcaac ttactagttt gttgcaaaat aatgtaaacg tcaatgcaca aaatggattt 480 ggaaggactg cgctgcaggt tatgaaactt ggaaatcccg agattgccag gagactgcta 540 cttagaggtg ctaatcccga tttgaaagac cgaactggta atgctgtcat tcatgatgcg 600 gccagagcag gtttcctgga cactttacag actttgctgg agtttcaagc tgatgttaac 660 atcgaggata atgaagggaa cctgcccttg cacttggctg ccaaagaagg ccacctccgg 720 gtggtggagt tcctggtgaa gcacacggcc agcaatgtgg ggcatcggaa ccataagggg 780 gacaccgcct gtgatttggc caggctctat gggaggaatg aggttgttag cctgatgcag 840 gcaaacgggg ctgggggagc cacaaatctt caaggaagca aaaagaagag aaagggtgga 900 ggtagtgata tctgtctgcc tcgttggggt tgtctgtggg aagattaata actcgagcac 960 caccaccacc accactg 977 <210> 40 <211> 926 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Polnucleotide encoding a protein complex of 6xHis-TEV site-Ub7KR-p53-p18-NLS <400> 40 catatgagag gatcgcatca ccatcaccat cacgattacg 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900 ctcgagcacc accaccacca ccactg 926

Claims (20)

1. 인 비트로 안정화 단백질; 및 상기 인 비트로 안정화 단백질의 C-말단에 연결되어 있는 융합 단백질을 포함하는 것으로서, 상기 융합 단백질은 막 투과 서열 도메인, p53 단백질 및 p18 단백질이 결합된 융합 단백질 및 인 비트로 안정화 단백질을 포함하는 단백질 복합체의 약학적 유효량; 및 약학적으로 허용되는 담체, 희석제 또는 부형제를 포함하는 암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
2. 청구항 1에 있어서, 상기 인 비트로 안정화 단백질의 C-말단에 연결되어 있는 융합 단백질은 핵-세포질 신호 도메인을 더 포함하는 것인 약학적 조성물.
3. 청구항 1에 있어서, 상기 p53 단백질은 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 p53 단백질의 전사활성 도메인(transactivation domain)인 것인 약학적 조성물.
4. 청구항 1에 있어서, 상기 p18 단백질은 p18 단백질의 변이체인 것인 약학적 조성물.
5. 청구항 4에 있어서, 상기 p18 단백질의 변이체는 서열번호 4의 폴리펩티드인 것인 약학적 조성물.
6. 청구항 4에 있어서, 상기 p18 단백질의 변이체는 서열번호 5의 폴리뉴클레오티드 서열에 의하여 암호화되는 폴리펩티드인 약학적 조성물.
7. 청구항 1에 있어서, 상기 인 비트로 안정화 단백질의 C-말단에 연결되어 있는 융합 단백질은 막 투과 서열 도메인; 상기 막 투과 서열 도메인의 C-말단에 연결되어 있는 p53 단백질 및 p18 단백질이 결합된 융합 단백질; 및 상기 p53 단백질 및 p18 단백질이 결합된 융합 단백질에 연결되어 있는 인 비보 안정화 단백질을 포함하는 것인 약학적 조성물.
8. 청구항 7에 있어서, 상기 인 비트로 안정화 단백질의 C-말단에 연결되어 있는 융합 단백질은 p53 단백질 및 p18 단백질이 결합된 융합 단백질 및 인 비보 안정화 단백질 사이에 연결되어 있는 핵-세포질 신호 도메인을 더 포함하는 것인 약학적 조성물.
9. 청구항 1에 있어서, 상기 인 비트로 안정화 단백질의 C-말단에 연결되어 있는 융합 단백질은 상기 인 비트로 안정화 단백질의 C-말단에 연결되어 있는 막 투과 서열; 상기 막 투과 서열의 C-말단에 연결되어 있는 p53 단백질 및 p18 단백질이 결합된 융합 단백질; 상기 p53 단백질 및 p18 단백질이 결합된 융합 단백질의 C-말단에 연결되어 있는 핵-세포질 신호 도메인; 및 상기 핵-세포질 신호 도메인의 C-말단에 연결되어 있는 인 비보 안정화 단백질로 이루어진 것인 약학적 조성물.
10. 청구항 1에 있어서, 상기 인 비트로 안정화 단백질은 유비퀴틴 또는 유비퀴틴-유사 단백질인 것인 약학적 조성물.
11. 청구항 10에 있어서, 상기 유비퀴틴 또는 유비퀴틴-유사 단백질은 야생형 또는 돌연변이형인 것인 약학적 조성물.
12. 청구항 11에 있어서, 상기 유비퀴틴 돌연변이형은 유비퀴틴 야생형 폴리펩티드의 6, 11, 27, 29, 33, 48 및 63번째에 존재하는 Lys 중 하나 이상을 Arg으로 치환한 것인 약학적 조성물.
13. 청구항 11에 있어서, 상기 유비퀴틴 돌연변이형은 유비퀴틴 야생형 폴리펩티드의 76번째에 존재하는 Gly이 Ala으로 치환된 것인 약학적 조성물.
14. 청구항 제10항에 있어서, 상기 유비퀴틴 또는 유비퀴틴-유사 단백질은 C-말단에 프로테아제에 의해 절단 가능한 프로테아제 인식 아미노산 서열을 더 포함하는 것인 약학적 조성물.
15. 청구항 10에 있어서, 상기 유비퀴틴-유사 단백질은 Nedd8, SUMO-1, SUMO-2, NUB1, PIC1, UBL3, UBL5 및 ISG15로 구성된 군으로부터 선택되는 것인 약학적 조성물.
16. 청구항 1에 있어서, 상기 막 투과 서열 도메인은 서열번호 6 내지 서열번호 20의 폴리펩티드로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 약학적 조성물.
17. 청구항 1에 있어서, 상기 핵-세포질 신호 도메인은 NLS(nucleus location sequence) 도메인 또는 NES(nucleus export sequence) 도메인인 것인 약학적 조성물.
18. 청구항 1에 있어서, 상기 핵-세포질 신호 도메인은 서열번호 21 내지 서열번호 23의 폴리펩티드로 이루어진 군으로부터 선택되는 폴리펩티드인 것인 약학적 조성물.
19. 청구항 1에 있어서, 상기 인 비보 안정화 단백질은 혈청 알부민 결합 펩티드, Fc 및 PEG로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 약학적 조성물.
20. 인 비트로 안정화 단백질; 및 상기 인 비트로 안정화 단백질의 C-말단에 연결되어 있는 융합 단백질을 포함하는 것으로서, 상기 융합 단백질은 막 투과 서열 도메인, p53 단백질 및 p18 단백질이 결합된 융합 단백질 및 인 비트로 안정화 단백질을 포함하는 단백질 복합체를 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 암의 치료 또는 예방 방법.

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