JP5898304B2 - NF−κB活性上昇に関連する疾患を治療するための医薬を製造するためのカルシニューリン調節因子1の使用 - Google Patents
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Description
(a) 配列番号3に示すアミノ酸配列を含み、あるいは、
(b) 配列番号3に示すアミノ酸配列における1個又は複数のアミノ酸の修飾、例えば欠失、置換、挿入もしくは付加を介して得られたアミノ酸配列を含み、且つ前記ペプチドがNF-кBシグナル経路を抑制する作用を有する、
使用を提供する。
(a) 配列番号3に示すアミノ酸配列を含み、あるいは、
(b) 配列番号3に示すアミノ酸配列における1個又は複数のアミノ酸の修飾、例えば欠失、置換、挿入もしくは付加を介して得られたアミノ酸配列を含み、前記ペプチドがNF-кBシグナル経路を抑制する作用を有する、
医薬組成物を提供する。
前記ペプチドが、
(a) 配列番号3に示すアミノ酸配列を含み、あるいは、
(b) 配列番号3に示すアミノ酸配列における1個又は複数のアミノ酸のが修飾、例えば欠失、置換、挿入もしくは付加を介して得られたアミノ酸配列を含み、前記ペプチドがNF-кBシグナル経路を抑制する作用を有する、
方法を提供する。
(a) 配列番号1に示すアミノ酸配列からなり、あるいは、
(b) 配列番号2に示すアミノ酸配列からなり、あるいは、
(c) 配列番号3に示すアミノ酸配列からなり、あるいは
(d) (a)−(c)のアミノ酸配列のいずれかにおける1個又は複数のアミノ酸の修飾、例えば欠失、置換、挿入もしくは付加を介して得られたアミノ酸配列からなり、且つNF-кBシグナル経路を抑制する作用を有し、あるいは、
(e) (a)−(c)のアミノ酸配列のいずれかと少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%または少なくとも99%の同一性を有するアミノ酸配列からなり、且つNF-кBシグナル経路を抑制する作用を有する。
(a) 配列番号3に示すアミノ酸配列を含み、あるいは 、
(b) 配列番号3に示すアミノ酸配列における1個または複数のアミノ酸の修飾、例えば欠失、置換、挿入もしくは付加を介して得られたアミノ酸配列を含み、且つ前記ペプチドがNF-кBシグナル経路を抑制する作用を有する、
使用を提供する。
(a) 配列番号1に示すアミノ酸配列からなり、あるいは、
(b) 配列番号2に示すアミノ酸配列からなり、あるいは、
(c) 配列番号3に示すアミノ酸配列からなり、あるいは、
(d) (a)−(c)のアミノ酸配列のいずれかにおける1個または複数のアミノ酸の修飾、例えば欠失、置換、挿入もしくは付加を介して得られたアミノ酸配列からなり、且つNF-кBシグナル経路を抑制する作用を有し、あるいは、
(e) (a)−(c)のアミノ酸配列のいずれかと少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%または少なくとも99%の同一性を有するアミノ酸配列からなり、且つNF-кBシグナル経路を抑制する作用を有する。
(a) 配列番号3に示すアミノ酸配列を含み、あるいは
(b) 配列番号3に示すアミノ酸配列における1個または複数のアミノ酸の修飾、例えば欠失、置換、挿入もしくは付加を介して得られたアミノ酸配列を含み、且つ前記のペプチドがNF-кBシグナル経路を抑制する作用を有する、
使用を提供する。
(a) 配列番号3に示すアミノ酸配列を含み、あるいは、
(b) 配列番号3に示すアミノ酸配列における1個または複数のアミノ酸の修飾、例えば欠失、置換、挿入もしくは付加を介して得られたアミノ酸配列を含み、且つNF-кBシグナル経路を抑制する作用を有する、
医薬組成物を提供する。
(a) 配列番号1に示すアミノ酸配列からなり、あるいは
(b) 配列番号2に示すアミノ酸配列からなり、あるいは
(c) 配列番号3に示すアミノ酸配列からなり、あるいは
(d) (a)−(c)のアミノ酸配列における1個または複数のアミノ酸の修飾、例えば欠失、置換、挿入もしくは付加を介して得られたアミノ酸配列からなり、且つNF-кBシグナル経路を抑制する作用を有し、あるいは
(e) (a)−(c)のアミノ酸配列と少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%または少なくとも99%の同一性を有するアミノ酸配列からなり、且つNF-кBシグナル経路を抑制する作用を有する。ペプチドあるいは核酸分子を医薬組成物へと調合することについては、Gennaro, A.L. and Gennaro, A.R. (2000) Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 20th Ed., Lippincott Williams & Wilkins, Philadelphia, PA; Crowder, T.M. et al. (2003) A Guide to Pharmaceutical Particulate Science. Interpharm/CRC, Boca Raton, FL;およびNiazi, S.K. (2004) Handbook of Pharmaceutical Manufacturing Formulations, CRC Press, Boca Raton, FLを参考すること。
(a) 配列番号3に示すアミノ酸配列を含み、あるいは
(b) 配列番号3に示すアミノ酸配列における1個または複数のアミノ酸の修飾、例えば欠失、置換、挿入もしくは付加を介して得られたアミノ酸配列を含み、且つ前記のペプチドはNF-кBシグナル経路を抑制する作用を有することを含む、
方法を提供する。
(a) 配列番号1に示すアミノ酸配列からなり、あるいは
(b) 配列番号2に示すアミノ酸配列からなり、あるいは
(c) 配列番号3に示すアミノ酸配列からなり、あるいは
(d)(a)−(c)のアミノ酸配列おける1個または複数のアミノ酸の修飾、例えば欠失、置換、挿入もしくは付加を介して得られたアミノ酸配列からなり、且つNF-кBシグナル経路を抑制する作用を有し、あるいは
(e)(a)−(c)のアミノ酸配列と少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%または少なくとも99%の同一性を有するアミノ酸配列からなり、且つNF-кBシグナル経路を抑制する作用を有する。
本発明を下記の実施例によりさらに説明するが、実施例あるいはそれらの組み合わせは、本発明の範囲あるいは実施形態を制限すると解釈すべきではない。本発明の範囲は添付した特許請求の範囲において定義され、本発明書または本分野の一般的な常識に基づいて、本分野の当業者は、特許請求の範囲に定義される範囲を明瞭に理解する。本発明の主旨または範囲を外れない限り、当業者は、本発明に任意に変形あるいは変更してもよく、この変形また変更も本発明の範囲内に含まれる。
1.1 材料
PCR増幅用の酵素およびdNTP:Takarra社から購入;
PCR増幅プライマー:上海生工社で合成;
Takarra制限酵素(EcoR I、Kpn I、Hind III、Bgl II):New England Biolab社から購入;
Takara T4リガーゼ:大連宝生物社から購入;
真核発現ベクターpcDNA3.1(-)mychis(c):Invitrogen社から購入;
遺伝子ノックアウトベクターpSuper:Oligoengine社から購入;
アデノウイルス発現ベクターAdeno-X:Clontech社から購入;
大腸菌DH5をInvitrogen社から購入。
特別に説明される以外、ほかの慣用の化学試薬はすべて中国国内の分析試薬である。
細胞系:HEK293細胞系をATCC社から購入した。HEK293細胞をウシ胎児血清を10%含むDMEM培地に培養し、培養条件は、37℃の定温とし、CO2を5%含む細胞インキュベーターとした。細胞培養に関する用品をすべてInvitrogenから購入した。
1.2.1 プラスミドの構築
(1)RCAN1の高発現ベクターを構築するために、pcDNA3.1(-)RCAN1.1-myc組換えプラスミドを構築し、以下のプライマーを用いてPCRによりヒトcDNAライブラリーを増幅させ、EcoR 1ならびにKpn Iにより酵素切断し、同じ酵素で切断されたpcDNA3.1(-)mychis(c)ベクターとライゲーションした。
上流プライマー:ccgCTCGAGgccaccATGGAGGAGG TGGACCTGCA (配列番号4)
下流プライマー:atggtacc CCTCTTCTTCCTCCTTC (配列番号5)
上流プライマー:ccgCTCGAGgccaccATGCATTTTA GAAACTTTAA (配列番号6)
下流プライマー:atggtacc CCTCTTCTTCCTCCTTC (配列番号7)
DS-511super sense:
GatccccGAGGAAATGGAAAGAATGAGGttcaagagaCCTCATTCTTTCCATTTCCTCttttta (配列番号8)
DS-511super
AS:AgcttaaaaaGAGGAAATGGAAAGAATGAGGTCTCTTGAACCTCATTCTTTCCATTTCCTC ggg (配列番号9)
まず、pRCAN1.1-EGFPおよびpRCAN1.4-EGFPベクターを構築した。EcoR IまたはKpn I酵素でpcDNA 3.1(-)RCAN1.1-mycあるいはpcDNA3.1(-)RCAN1.4-mycプラスミドを切断し、挿入物とする0.7kbのDNA断片を回収し、同じ酵素で切断されたpEGFP-N3(clonetech社から購入)ベクターに挿入し、pRCAN1.1- EGFPおよびpRCAN1.4-EGFPベクターを得た。
白血病細胞系は、一般的なトランスフェクション方法でトランスフェクションできないので、アデノウイルスを使用し、RCAN1タンパク質を発現させた。トランスフェクションの一日前、約106個のHEK293細胞を60mmのシャーレに接種し、リボソームLF2000(invitrogenから購入)または5μgのPac 1(NEB社から購入)酵素切断されたアデノウイルスベクターAdeno-X、あるいはAd-RCAN1.1およびAd-RCAN1.4を利用し、細胞をトランスフェクションした(具体的な方法についてInvitrogenのLF2000トランスフェクションキットの説明書参照)。7日後、細胞を収集し、3回の凍結融解により細胞を溶解し、ウイルスを含んでいる溶解液を集め、0.5mlの細胞溶解液で60mmのシャーレに接種したHEK293細胞をトランスフェクトし、48時間後細胞を凍結融解してウイルスを集め、さらに同じ方法によりHEK293を二回トランスフェクトし、ウイルスを集めて実験に供した。ウイルス力価が約4 × 108 /mlであった。本発明において、特別な説明がある場合以外、細胞系および初代細胞に使われるトランスフェクト回数(MOI)は30であった。
2.1 NF-кB核移植の実験手順
HEK293細胞へRCAN1発現ベクターpcDNA3.1(-)RCAN1.1-mycをトランスフェクションする:リボソームLF2000(invitrogenから購入)でHEK293細胞をトランスフェクションし、4μlのLF2000を100μlのopti-MEM(invitrogen社から購入)に加え、5分間後2μgのRCAN1発現ベクターpcDNA3.1(-)RCAN1.1-mycが添加された100μlのopti-MEMと混合し、室温で15分間静置し、培養したHEK293を含む35mmシャーレに加えた。
RCAN1の高レベル発現を示した細胞の細胞核内におけるNF-кB活性は顕著に低くなり(図1に示す)、NF-кBの核転移がRCAN1によって顕著に抑制されることが示された。RCAN1ノックアウトによりNF-кBの核転移が顕著に高められることが示された(図1A)。
RCAN1発現ベクターならびにpNF-кB-luc(Clontech社から購入)、pRL-TK(Promega社から購入)でHEK293細胞を同時にトランスフェクションし(プラスミドの使用比例が1:1:0.02であり、具体的な方法についてInvitrogenのLF2000トランスフェクションキット参照)、24時間後細胞を溶解し、Dual-Luciferase(登録商標) Reporter Assay(Promega社から購入)で蛍光を測定した。
その結果は、RCAN1高レベル発現がNF-кB活性を抑制し、RCAN1ノックアウトがNF-кB活性を顕著に高めることを示す(図1B)。
3.1方法手順
(実施例2の2.1に示すように)HEK293細胞によってRCAN1発現ベクターをトランスフェクションした;
48時間後細胞を収集し、溶解した;
20μlの免疫共沈試薬Protein A/G agarose(Santa Cruz社から購入)および2μlの抗-IKBα抗体(Cell Signaling社から購入)を加え、4℃において一晩振とうした。
2000g遠心で上澄みを除去し、PBSで沈殿を二回洗い、ローディングバッファを加えた;
12%グリシンSDS-PAGEでタンパク質を単離し、タンパク質をPVDF膜に転移した。
Western Blot:anti-myc抗体(Abcam社から購入)によりタンパク質を検出した(具体的な方法についてAbcamの操作説明書参照)。
反対に、anti-myc抗体を使用してタンパク質を沈殿させ、更にIKB抗体を使用し、Western Blotを行った。SDS-PAGE及びWestern Blot法は、具体的には実施例2の2.1を参照。
図に示すように、RCAN1タンパク質はIKBタンパク質と相互作用があった(図2)。
4.1 実験手順
HEK293によってRCAN1ノックアウトベクターsi-RCAN1をトランスフェクションした(実施例2の2.1に示す方法を用いた、ベクターsi-RCAN1の使用量も2μgであった)。
48時間後細胞を収集し、溶解し、IKB抗体(Cell Signaling社から購入)を使って免疫沈殿をした(具体な方法についてCell Signalingの操作説明書を参照する)。
免疫沈殿においては、タンパク質を12%SDS-PAGEゲルで分離し、PVDF膜に移した。
Western blotは、抗IKB-Y42リン酸化抗体(ABcam社から購入)を使って検出した。SDS-PAGE及びWestern Blot法は、具体的には実施例2の2.1を参照。
その結果は、IKBの42位におけるチロシンリン酸化はRCAN1ノックアウトにより顕著に増加された(図3)。
5.1 材料
白血病細胞株Jurkat、NALM-6、CEM、MOLT-4、Kasumi、HL-60、THP-1、HELを全てATCCから購入した。白血病初代細胞および細胞株はすべて10%ウシ胎児血清を含むRPMI 1640培地に培養され、細胞培養のための用品をすべてInvitrogenから購入した。培養条件は37℃の定温で、CO2を5%含む細胞インキュベーターとした。
単核細胞用の単離液体Histopaque-1077:Sigma社から購入。
細胞生存率キットCelltiter-Glo発光キット:Promega社から購入。
白血病初代細胞の単離は、Histopaque試薬を使い、15mlの遠心管に3mlのHistopaque-1077試薬を加えたところ、上層が3mlの白血病患者の新鮮な末梢血となった。300gで30分間遠心し、第二層の単核細胞を採取し、10mlのPBSバッファ液で一回洗浄し、シャーレに接種した。
その結果は、RCAN1.1あるいはRCAN1.4の高レベル発現が、急性リンパ性白血病細胞系Jurkat、NALM-6、CEM、MOLT-4を死滅させ、生存率が約30-60%であった(図4A)。RCAN1.1あるいはRCAN1.4の高レベル発現が、急性骨髄性白血病細胞系Kasumi、HL-60、THP-1、HELを死滅させ、生存率が約40-80%であった(図4B)。急性白血病初代細胞におけるRCAN1.1の高レベル発現は顕著な細胞死滅死亡を引き起こすことができ、生存率が約55%であったが、正常な血液細胞および病状の緩和した白血病患者の血液細胞に対し、殺傷作用はほとんどなかったことから、RCAN1が特異的に白血病細胞の死滅を引き起こすことが判明した(図4C)。
6.1 材料
pcDNA3.1RCAN1-103mychisプラスミドの構築:プライマーT7(TAATACGA CTCACTATAGGG(配列番号10))または逆方向プライマーDS103KpnR:AtggtaccG CTTGTCTGGATTTGGCGGA(配列番号11)、およびpcDNA3.1(-)RCAN1.1-mycを基質として、1-103断片を増幅し、酵素切断サイトEcoR 1ならびKpn1によりpcDNA3.1(-)mychis(c)に挿入し、pcDNA3.1RCAN1-103mychis組換プラスミドを得た。
核トランスフェクションキットVCA-1003:Lonza社から購入。
(1)免疫共沈:HEK293細胞にRCAN1のN-あるいはC-末端を発現するベクターpcDNA3.1RCAN1-103 mychisおよびpcDNA3.1RCAN103-197mycをそれぞれトランスフェクションし、実施例3に示す実験方法により免疫共沈実験を行った。
その結果、RCAN1のN末端にある103個のアミノ酸はIKBと互いに作用し、NF-кBの活性を抑制することができたのに対して、RCAN1のC末端はNF-кBの活性と関係がないことが判明した(図5A、B)。RCAN1のN末端にある103個のアミノ酸が白血病細胞株Jurkatの生存率を低減できた(図5C)。
7.1実験手順
pTAT-RCAN1N-103プラスミドの構築:TAT配列はヒト免疫不全ウイルスHIVにおけるTatタンパク質の第45-57個のアミノ酸(RKKRRQRRRG(配列番号14))であり、このTAT配列はRCAN1のN末端ポリペプチドと融合され、ポリペプチドの細胞膜浸透性を促進させた。TAT断片を含むコードオリゴヌクレオチドTatg agg aagaagcggagacagcgacgaaga ggatcc c(配列番号15)を、Nde IまたはXho I制限酵素(New England Biolabsから購入)で切断したpet-28b原核発現ベクター(Novagen社から購入)に挿入し、pet-28bTATベクターを得て、さらにBamh IまたはXho I酵素でpet-28bTATベクターを切断し、RCAN1 1-103のPCR断片を挿入した;当該PCRに関しては、
PCR上流プライマー:CGGGATCCATGGAGGAGGTGGACCTG(配列番号16)、
下流プライマー:CCGCTCGAGCTTGTCTGGATTTGGCGGA(配列番号17)
であった。
PCRのテンプレートはpcDNA3.1(-)RCAN1.1-myc発現ベクターであった。
Claims (15)
- ペプチド又はそれをコードする核酸の、NF-кB活性上昇に関連する疾患を治療するための医薬の製造における使用であって、
上記ペプチドが、
(c) 配列番号3に示すアミノ酸配列からなり、あるいは
(d) (c)のアミノ酸配列における1個または数個のアミノ酸の欠失もしくは置換を介して得られたアミノ酸配列からなり、且つNF-кBシグナル経路を抑制する作用を有し、あるいは
(e) (c)のアミノ酸配列と少なくとも95%の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、且つNF-кBシグナル経路を抑制する作用を有し、
上記NF-кBの活性上昇に関連する疾患が、多発性骨髄腫、白血病、マントル細胞リンパ腫、粘膜関連リンパ組織リンパ腫、びまん性大細胞型性リンパ腫、ホジキンリンパ腫、骨髄異形成症候群、乳癌、卵巣腫、肺癌、子宮頸癌、前立腺癌、肝癌、膵臓癌、食道癌、胃癌、咽頭癌、胆管癌、甲状腺癌、副甲状腺腫および皮膚と頭頚の扁平上皮癌からなる群から選ばれる、
使用。 - 上記ペプチドが、(c)のアミノ酸配列と少なくとも96%の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、且つNF-кBシグナル経路を抑制する作用を有する、請求項1に記載の使用。
- 上記ペプチドが、(c)のアミノ酸配列と少なくとも97%の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、且つNF-кBシグナル経路を抑制する作用を有する、請求項1に記載の使用。
- 上記ペプチドが、(c)のアミノ酸配列と少なくとも98%の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、且つNF-кBシグナル経路を抑制する作用を有する、請求項1に記載の使用。
- 上記ペプチドが、(c)のアミノ酸配列と少なくとも99%の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、且つNF-кBシグナル経路を抑制する作用を有する、請求項1に記載の使用。
- 上記疾患が、白血病である、請求項1〜5のいずれか一項に記載の使用。
- 上記白血病が、急性リンパ性白血病、急性骨髄性白血病、慢性リンパ性白血病、慢性骨髄性白血病、成人型T細胞白血病からなる群から選ばれる、請求項6に記載の使用。
- ペプチド又はそれをコードする核酸及び任意に存在する薬学的に許容できる担体又は賦形剤を含む医薬組成物であって、
上記ペプチドが、
(c) 配列番号3に示すアミノ酸配列からなり、あるいは
(d) (c)のアミノ酸配列における1個または数個のアミノ酸の欠失もしくは置換を介して得られたアミノ酸配列からなり、且つNF-кBシグナル経路を抑制する作用を有し、あるいは
(e) (c)のアミノ酸配列と少なくとも95%の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、且つNF-кBシグナル経路を抑制する作用を有する、
医薬組成物。 - 上記ペプチドが、(c)のアミノ酸配列と少なくとも96%の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、且つNF-кBシグナル経路を抑制する作用を有する、請求項8に記載の医薬組成物。
- 上記ペプチドが、(c)のアミノ酸配列と少なくとも97%の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、且つNF-кBシグナル経路を抑制する作用を有する、請求項8に記載の医薬組成物。
- 上記ペプチドが、(c)のアミノ酸配列と少なくとも98%の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、且つNF-кBシグナル経路を抑制する作用を有する、請求項8に記載の医薬組成物。
- 上記ペプチドが、(c)のアミノ酸配列と少なくとも99%の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、且つNF-кBシグナル経路を抑制する作用を有する、請求項8に記載の医薬組成物。
- 多発性骨髄腫、白血病、マントル細胞リンパ腫、粘膜関連リンパ組織リンパ腫、びまん性大細胞型性リンパ腫、ホジキンリンパ腫、骨髄異形成症候群、乳癌、卵巣腫、肺癌、子宮頸癌、前立腺癌、肝癌、膵臓癌、食道癌、胃癌、咽頭癌、胆管癌、甲状腺癌、副甲状腺腫および皮膚と頭頚の扁平上皮癌からなる群から選ばれる疾患の治療における使用のためのものである、請求項8〜12のいずれか一項に記載の医薬組成物。
- 上記疾患が、白血病である、請求項13に記載の医薬組成物。
- 上記白血病が、急性リンパ性白血病、急性骨髄性白血病、慢性リンパ性白血病、慢性骨髄性白血病、成人型T細胞白血病からなる群から選ばれる、請求項14に記載の医薬組成物。
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