CN103249428B - 钙调磷酸酶抑制因子1在制备治疗与NF-κB活性升高相关的疾病的药物中的用途 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了包含SEQ ID NO：3的氨基酸序列的肽、或其编码核酸在制备用于治疗与NF-кB活性升高相关的疾病的药物中的应用。该肽可与IKB相互作用，并影响IKB在42位酪氨酸的磷酸化，从而抑制NF-кB信号通路。

Description

钙调磷酸酶抑制因子1在制备治疗与NF-κB活性升高相关的疾病的药物中的用途
发明领域
本发明涉及人类肿瘤和炎症的治疗领域，特别涉及钙调磷酸酶抑制因子1(RCAN1)蛋白对核因子-kappaB(NF-κB)的抑制及其在治疗与NF-κB相关的疾病例如肿瘤中的应用。
发明背景
在发达国家癌症是死亡的首要原因，最新数据显示在中国每四到五例死亡中就有一位死于癌症。而且大多数癌症仍缺乏有效地治疗方法，癌症给全世界都带来了严重的社会和经济问题。
核因子-kappaB(NF-κB)在正常生理情况下作为转录调节因子主要参与免疫应答、细胞增殖、细胞死亡及炎症反应(Baud and Karin，2009)。NF-κB是体内主要的细胞抗凋亡因子，NF-κB信号传导通路的异常与很多肿瘤包括血液以及实体肿瘤的发生发展及其对化疗和放疗的耐受性有关，已发现存在NF-κB活性异常持续增高的血液肿瘤包括：多发性骨髓瘤、急性淋巴细胞白血病、急性髓细胞白血病、慢性淋巴细胞白血病、慢性髓细胞白血病、套细胞淋巴瘤、粘膜相关淋巴组织淋巴瘤、弥漫性大细胞淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤、骨髓增生异常综合征、成人T-细胞白血病，而存在NF-κB活性异常持续增高的实体肿瘤包括：乳腺癌、卵巢癌、肺癌、宫颈癌、前列腺癌、肝癌、胰腺癌、食管癌、胃癌、咽喉癌、胆管癌、甲状腺癌、副甲状腺癌，以及皮肤和头颈的鳞状细胞癌(Basseres and Baldwin，2006)。对于人类急性T-细胞白血病小鼠模型的研究也发现NF-κB的缺陷可以延缓白血病的发生(dos Santos et al.，2008)。研究发现很多类固醇激素，自然存在或合成的化合物都是通过对NF-κB的抑制而起到肿瘤抑制作用的。
NF-κB主要通过细胞增殖，血管新生，肿瘤转移，炎症反应以及凋亡抑制等过程促进肿瘤的发生发展。最近的研究发现大约1／5的多发性骨髓瘤患者存在NF-κB信号通路的基因突变，2008年美国FDA批准硼替佐米(Bortezomib)用于治疗多发性骨髓瘤。作为蛋白酶体抑制剂，硼替佐米被认为主要是通过抑制NF-κB信号传导通路而起到肿瘤治疗作用，但是作为广谱的蛋白酶体抑制剂，硼替佐米有很普遍且严重的副作用，大大限制了它在肿瘤治疗中的广泛应用(Delforge et al.，2010)。用于急性早幼粒细胞白血病的三氧化二砷(又名砒霜)，它的主要作用也是抑制NF-κB活性，但三氧化二砷的毒性也限制了它在肿瘤治疗中的应用。
NF-κB不仅在肿瘤中有重要功能，NF-κB也是非常重要的炎症因子，例如白介素、肿瘤坏死因子等的调节因子，因此在炎症反应中也有重要功能。还有，作为影响细胞存活的重要分子，NF-κB在神经退行性变包括老年痴呆症和脑中风中也有重要功能。
因此，NF-κB信号通路是一个非常重要的肿瘤药物靶点，也是国内外药物开发的热点，现在急需可以特异抑制NF-κB活性，而且副作用较小的药物，以用于肿瘤治疗。
钙调磷酸酶抑制因子1(RCAN1)最早发现是钙调磷酸酶(calcineurin)的内源性抑制因子，已发现RCAN1的C-末端具有抑制钙调磷酸酶的活性(Arron et al.，2006；Chan et al.，2005；Fuentes et al.，2000)。由于剪切子的不同，RCAN1有4个剪切异构体，其中剪切异构体1即RCAN1.1(SEQ ID NO：1)和剪切异构体4即RCAN1.4(SEQ ID NO：2)在体内的表达较高，RCAN1.1和RCAN1.4仅在N末端28个氨基酸有区别，RCAN1.1在神经组织内表达较高，RCAN1.4在外周组织例如肌肉中的表达较高。虽然二者在各个组织里的表达不同，但二者在功能上类似。
发明概述
在一个方面，本发明提供了一种肽或其编码核酸在制备用于治疗与NF-κB活性升高相关的疾病的药物中的应用，其中所述肽包含(a)包含SEQ ID NO：3的氨基酸序列；或者包含(b)SEQ ID NO：3的氨基酸序列经过修饰例如经过取代、缺失或添加一或多个氨基酸而获得的氨基酸序列，其中所述肽具有抑制NF-κB信号通路的作用。
在一个方面，本发明提供了一种药物组合物，其包含一种肽或编码其的核酸以及任选存在的药物可接受的载体或赋形剂，其中所述肽(a)包含SEQ ID NO：3的氨基酸序列；或者包含(b)SEQ ID NO：3的氨基酸序列经过修饰例如经过取代、缺失或添加一或多个氨基酸而获得的氨基酸序列，其中所述肽具有抑制NF-κB信号通路的作用。
在一个方面，本发明提供了治疗与NF-κB活性升高相关的疾病的方法，包括患有所述疾病的患者施用一种肽或编码其的核酸，其中所述肽(a)包含SEQ ID NO：3的氨基酸序列；或者(b)包含SEQ ID NO：3的氨基酸序列经过修饰例如经过取代、缺失或添加一或多个氨基酸而获得的氨基酸序列，其中所述肽具有抑制NF-κB信号通路的作用。
在一个实施方案中，所述肽(a)由SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列组成，或者(b)由SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列组成，或者(c)由SEQ ID NO：3的氨基酸序列组成，或者(d)由(a)-(c)中的氨基酸序列经过修饰例如经过取代、缺失或添加一或多个氨基酸而获得的氨基酸序列组成，其中所述肽具有抑制NF-κB信号通路的作用，或者(e)由与(a)-(c)中的氨基酸序列具有至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的序列相同性的氨基酸序列组成，其中所述肽具有抑制NF-κB信号通路的作用。
在一个实施方案中，所述与NF-κB活性升高相关的疾病选自：多发性骨髓瘤、白血病、套细胞淋巴瘤、粘膜相关淋巴组织淋巴瘤、弥漫性大细胞淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤、骨髓增生异常综合征、乳腺癌、卵巢癌、肺癌、宫颈癌、前列腺癌、肝癌、胰腺癌、食管癌、胃癌、咽喉癌、胆管癌、甲状腺癌、副甲状腺癌以及皮肤和头颈的鳞状细胞癌。在一个实施方案中，所述疾病优选是白血病，例如选自急性淋巴细胞白血病、急性髓细胞白血病、慢性淋巴细胞白血病、慢性髓细胞白血病、成人T-细胞白血病。
附图简述
图1：RCAN1可以降低NF-κB的核转移和NF-κB的转录活性。(A)使用RCAN1的表达载体pcDNA3.1(-)RCAN1.1-myc和pcDNA3.1(-)RCAN1.4-myc，以及基因敲除载体si-RCAN1转染HEK293细胞，48小时后收集细胞，分离细胞核并裂解，进行SDS-PAGE，使用抗-NF-κB抗体进行western blot，抗-TBP抗体检测的TBP(TATA结合蛋白)作为核蛋白的内参。(B)使用RCAN1的表达载体pcDNA3.1(-)RCAN1.1-myc和pcDNA3.1(-)RCAN1.4-myc，以及基因敲除载体si-RCAN1与NF-κB的转录活性指示载体pNF-κBluc共同转染HEK293细胞，24小时后使用荧光素酶试剂盒测定荧光素酶活性，用于指示细胞内NF-κB的转录活性。*：表示统计学显著性，p<0.05。对照：空载体。
图2：免疫共沉淀显示RCAN1与IKB蛋白存在蛋白-蛋白相互作用。使用RCAN1的表达载体pcDNA3.1(-)RCAN1.1-myc转染HEK293细胞，48小时后收集细胞并裂解，(A)使用抗-myc抗体(9E10)进行免疫沉淀，使用抗-IKBα抗体进行western blot；(B)使用抗-IKBα抗体进行免疫沉淀，使用抗-myc抗体(9E10)进行western blot。输入为免疫沉淀之前的细胞裂解液。
图3：RCAN1低表达使得IKB在42位的酪氨酸磷酸化明显增加。使用基因敲除载体si-RCAN1转染HEK293细胞，48小时后收集细胞并裂解，(A)使用抗-IKBα抗体进行免疫沉淀，使用IKB42位酪氨酸磷酸化抗体进行western blot；(B)使用IKB42位酪氨酸磷酸化抗体进行免疫沉淀，使用抗-IKBα进行western blot。*：表示统计学显著性，p<0.05。对照：空载体。
图4：RCAN1高表达导致了急性白血病细胞系以及原代急性白血病细胞的死亡。使用RCAN1的腺病毒感染急性淋巴细胞白血病细胞系(A)和急性髓性淋巴细胞白血病细胞系(B)，48小时后使用细胞存活率试剂盒检测细胞存活率。(C)从白血病患者及缓解患者和对照正常人群的外周血中分离单个核细胞，并使用RCAN1的腺病毒感染原代培养的白血病细胞，48小时后使用细胞存活率试剂盒检测细胞存活率。Av-GFP为表达绿色荧光蛋白的腺病毒，Av-RCAN1.1为表达RCAN1.1蛋白的腺病毒(实施例1.2.2所述Ad-RCAN1.1载体)，Av-RCAN1.4为表达RCAN1.4蛋白的腺病毒(实施例1.2.2所述Ad-RCAN1.4载体)。
图5：RCAN1的N-端103个氨基酸可以与IKB结合并抑制NF-κB的转录活性，并且杀伤急性白血病细胞。(A)使用RCAN1N-端103个氨基酸的表达载体pcDNA3.1RCAN1-103mychis或者(B)表达103-197氨基酸的pcDNA3.1RCAN103-197myc载体转染HEK293细胞，48小时后收集细胞并裂解，使用抗-myc抗体(9E10)进行免疫沉淀，使用抗-IKBα抗体进行western blot。(C)使用RCAN1N-端103个氨基酸的表达载体pcDNA3.1RCAN1-103mychis或者表达103-197氨基酸的pcDNA3.1RCAN103-197myc载体，与NF-κB的转录活性指示载体pNF-κBluc共同转染HEK293细胞，24小时后使用荧光素酶试剂盒测定荧光素酶活性，用于指示细胞内NF-κB的转录活性。(D)使用RCAN1N-端103个氨基酸的表达载体pcDNA3.1RCAN1-103mychis或者表达103-197氨基酸的pcDNA3.1RCAN103-197myc质粒转染Jurkat白血病细胞系，48小时后使用细胞存活率试剂盒检测细胞存活率。*：表示统计学显著性，p<0.05。对照：空载体。
图6：纯化的TAT-RCAN1-103多肽可以导致白血病细胞死亡。(A)SDS-PAGE显示提纯的TAT-RCAN1-103多肽为单一条带。(B)在Jurkat细胞中加入TAT-RCAN1-103多肽，48小时后使用使用细胞存活率试剂盒检测细胞存活率。*：表示统计学显著性，p<0.05。对照：空载体。
发明详细描述
除非特别指出，本文使用的科学和技术术语应具有本领域技术人员通常已知的含义。另外除非特别需要，则单数术语应包括复数，复数术语应包括单数。前述技术和方法通常根据本领域熟知的及在本说明书引用的参考文献所述的常规方法进行。见例如并入作参考的Sambrook et al.Molecular Cloning：A Laboratory Manual(3rd ed.，Cold Spring HarborLaboratory Press，Cold Spring Harbor,N.Y.(2001))所述。
不希望受任何理论所局限，在体内NF-κB信号通路的调节主要依赖于κB抑制因子IKB，IKB在32和36位的丝氨酸磷酸化促进了IKB在蛋白酶体的降解，IKB降解后暴露NF-κB分子的核定位序列，NF-κB分子随后转入细胞核内，与其靶基因上的κB反应元件结合调节靶基因的转录(Alkalayet al.，1995)。此外，研究证实IKB在42位酪氨酸的磷酸化也可以影响IKB的稳定性，从而影响NF-κB信号通路的活性(Imbert et al.，1996；Sethi et al.，2007；Waris et al.，2003)。
本发明发现了RCAN1蛋白的剪切异构体RCAN1.1(SEQ ID NO：1)和RCAN1.4(SEQ ID NO：2)抑制NF-κB信号通路，降低了癌症细胞的存活；进一步地，本发明人发现具有RCAN1.1的N-端103个氨基酸的肽(SEQ ID NO：3)可以与IKB相互作用并抑制NF-κB活性，降低癌症细胞的存活。因此，本发明人首次揭示了RCAN1蛋白是NF-κB的内源性调节蛋白，其可以影响NF-κB信号通路，其与NF-κB抑制因子IKB相互作用并影响它在第42位酪氨酸的磷酸化。
在一个方面，本发明提供了一种肽或其编码核酸在制备用于治疗与NF-κB活性升高相关的疾病的药物中的应用，其中所述肽(a)包含SEQ IDNO：3的氨基酸序列；或者(b)包含SEQ ID NO：3的氨基酸序列经过修饰例如经过取代、缺失或添加一或多个氨基酸而获得的氨基酸序列，其中所述肽具有抑制NF-κB信号通路的作用。
在一个实施方案中，所述肽(a)由SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列组成，或者(b)由SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列组成，或者(c)由SEQ ID NO：3的氨基酸序列组成，或者(d)由(a)-(c)中的氨基酸序列经过修饰例如经过取代、缺失或添加一或多个氨基酸而获得的氨基酸序列组成，其中所述肽具有抑制NF-κB信号通路的作用，或者(e)由与(a)-(c)中的氨基酸序列具有至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的序列相同性的氨基酸序列组成，其中所述肽具有抑制NF-κB信号通路的作用。
当术语“包含”被用于本发明说明书和权利要求书中时，其不排除其它元件或步骤。为本发明目的，术语“由...组成”被认为是术语“包含”的优选实施方案。
本文所用术语“肽”，“多肽”和“蛋白质”可互换使用，指氨基酸残基的聚合物，其包含经肽键结合的两个或更多个氨基酸。聚合物可以是线性的，分枝的或环状的，可包含天然存在的和／或氨基酸类似物，它可被非氨基酸间断。通常，若氨基酸聚合物是长的(例如超过50个氨基酸残基)，其优选称为多肽或蛋白质，但是若其是50个氨基酸长或更短，优选称为“肽”。
本文中所述肽可以由任何合适的现有技术方法制备，例如化学合成、重组表达等等。对此可以参见例如Sambrook et al.Molecular Cloning：ALaboratory Manual(3rd ed.，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold SpringHarbor，N.Y.(2001))以及Blackwell Scientific Publications出版、Nicholson编辑的“Peptide Synthesis”中Atherton和Sheppard的第9章“PeptideSynthesis”所述。
在本文中，所述“修饰”优选是本领域所熟知的保守序列修饰，包括氨基酸取代、添加或缺失。氨基酸修饰可以通过本领域已知的标准技术导入，例如在编码蛋白的核酸中进行定点诱变、分子克隆、寡核苷酸指导的诱变和随机PCR介导的诱变。保守氨基酸取代包括其中氨基酸残基由具有相似结构或化学性质的氨基酸残基取代的那些。本领域已经确定了具有相似侧链的氨基酸残基家族。这些家族包括具有碱性侧链的氨基酸(例如赖氨酸、精氨酸、组氨酸)，酸性侧链的氨基酸(例如天冬氨酸、谷氨酸)，无电荷的极性侧链氨基酸(例如天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、色氨酸)，非极性侧链氨基酸(例如甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸)，分支的侧链氨基酸(例如苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)以及芳族侧链氨基酸(例如酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸)。本领域技术人员已知也可以使用除了上述之外的其他类别氨基酸家族。相似的较小变化也包括氨基酸缺失或插入，或者这二者。使用本领域熟知的计算机程序可以找到关于确定哪些氨基酸残基可以被取代、插入或缺失而不消除其免疫学活性的指导。本领域技术人员已知的计算机算法例如Gap或者Bestfit可用于优化对比氨基酸序列以对比及限定相似或相同的氨基酸残基。
例如，本文上述取代一或多个氨基酸可以是将SEQ ID NO：1、2或3中氨基酸残基取代为具有相似结构或化学性质的氨基酸残基，例如精氨酸和赖氨酸，谷氨酸和天冬氨酸，丝氨酸和苏氨酸，谷氨酰胺和天冬酰胺，缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸之间的相互取代。
例如，本文上述缺失一或多个氨基酸可以是缺失SEQ ID NO：1中第1位的氨基酸残基，SEQ ID NO：2中第1位的氨基酸残基，或者SEQ ID NO：3中第9位的氨基酸残基。
例如，本文上述添加一或多个氨基酸可以是在SEQ ID NO：1中第1位添加氨基酸残基Ala，在SEQ ID NO：2中第1位添加氨基酸残基Ala，或者在SEQ ID NO：3中第9位添加氨基酸残基Ala。
本文所用术语“抑制NF-κB信号通路”是指抑制NF-κB作为转录因子调节其下游靶基因的活性。
本文所用术语“相同性”是指对应于两个蛋白质链中位于相同或类似位置的相同氨基酸的百分比。用BLAST算法利用BLOSUM62阵列计算同源性百分比，该算法可在NCBI网站(http：／／www.ncbi.nlm.nih.gov／)获得。优选所述具有序列相同性的肽是功能性同源物，即其显示显著的相同性(例如在氨基酸水平大约50％序列相同性)并且如其相应蛋白质一样执行相同功能。至少大约60％，至少大约70％，至少大约80％、至少大约90％、至少大约95％、至少大约96％、至少大约97％、至少大约98％、至少大约99％或更高的序列相同性的功能性同源物是优选的功能性同源物。
在本文中，术语“核酸”，“核酸分子”，“多核苷酸”和“核苷酸序列”可互换使用，定义任何长度的多聚物，如聚脱氧核糖核苷酸(DNA)(例如cDNA，基因组DNA，质粒，载体，分离的DNA和其任何混合物)或聚核糖核苷酸(RNA)分子(例如mRNA)或混合的聚核糖-聚脱氧核糖核苷酸。它们包含单链或双链，线性或圆形，天然或合成的多核苷酸。
对于指定的核酸而言，“编码”或者“被编码的”是指包含用于翻译为指定蛋白的信息。编码蛋白质的核酸在核酸的翻译区内可包含非翻译序列(例如内含子)，或者可以缺少这种插入的非翻译序列(例如在cDNA中)。编码蛋白的信息由使用密码子而指定。
在一个实施方案中，本发明的核酸还可以含在载体例如表达载体、质粒、病毒，噬菌粒、噬菌体、粘粒或人工染色体中。如本文所用，“表达载体”是重组或者合成产生的核酸构建体，其具有一系列指定核酸元件，所述核酸元件允许特定核酸在宿主细胞中转录，例如表达载体除了编码要表达的核酸序列以外还可包括衍生自与用于表达的宿主相容的复制和控制序列以及赋予转染的细胞可选择表型的选择标记。本发明的核酸可以被掺入质粒、染色体、线粒体DNA、质体DNA、病毒或者核酸片段中。本领域已知且可商购许多合适的表达载体，例如原核表达载体、酵母表达载体、哺乳动物表达载体、昆虫细胞表达载体、植物细胞表达载体。在一个实施方案中，本发明的核酸序列(SEQ ID NO：1、2或3)在表达载体如pcDNA3.1(-)mychis(c)(Invitrogen)、pSuper(Oligoengine)或者Adeno-X(Clontech)中表达。
“宿主细胞”是指含有载体且支持该载体复制和／或表达的细胞。宿主细胞可以是原核细胞如大肠杆菌细胞，或者真核细胞如酵母细胞、昆虫细胞、两栖动物细胞或者哺乳动物细胞。表达本文所述蛋白的宿主细胞可以是本领域使用的任何真核细胞或原核细胞，例如HEK293，HEK293T，大肠杆菌细胞等。本领域技术人员已知各种细胞培养以及表达、收集、纯化以及检测被表达的蛋白的技术。对此可参见例如J.Perbal，A Practical Guide toMolecular Cloning，John Wiley and S ons(1984)，J.S ambrook et al.，MolecularCloning：A Laboratory Manual，Cold Spring Harbour Laboratory Press(1989)和F.M.Ausubel et al.(editors)，Current Protocols in Molecular Biology,GreenePub.Associates and Wiley-Interscience(1988)，Ed Harlow and David Lane(editors)。
在另一个方面，本发明还提供了一种肽或其编码核酸作为治疗与NF-κB活性升高相关的疾病的药物的应用，其中所述肽(a)包含SEQ IDNO：3的氨基酸序列；或者(b)包含SEQ ID NO：3的氨基酸序列经过修饰例如经过取代、缺失或添加一或多个氨基酸而获得的氨基酸序列，其中所述肽具有抑制NF-κB信号通路的作用。
在另一个方面，本发明还提供了一种用于治疗与NF-κB活性升高相关的疾病的药物组合物，其包含一种肽或编码其的核酸以及任选存在的药物可接受的载体或赋形剂，其中所述肽(a)包含SEQ ID NO：3的氨基酸序列；或者(b)包含SEQ ID NO：3的氨基酸序列经过修饰例如经过取代、缺失或添加一或多个氨基酸而获得的氨基酸序列，其中所述肽具有抑制NF-κB信号通路的作用。
在一个实施方案中，所述肽(a)由SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列组成，或者(b)由SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列组成，或者(c)由SEQ ID NO：3的氨基酸序列组成，或者(d)由(a)-(c)中的氨基酸序列经过修饰例如经过取代、缺失或添加一或多个氨基酸而获得的氨基酸序列组成，其中所述肽具有抑制NF-κB信号通路的作用，或者(e)由与(a)-(c)中的氨基酸序列具有至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的序列相同性的氨基酸序列组成，其中所述肽具有抑制NF-κB信号通路的作用。将肽或核酸分子配制为药物组合物可参见Gennaro，A.L.andGennaro，A.R.(2000)Remington：The Science and Practice of Pharmacy，20thEd.，Lippincott Williams&Wilkins，Philadelphia，PA；Crowder,T.M.et al.(2003)A Guide to Pharmaceutical Particulate Science.Interpharm／CRC，BocaRaton，FL；和Niazi，S.K.(2004)HandbookofPharmaceutical ManufacturingFormulations，CRC Press，Boca Raton，FL。
在另一个方面，本发明还提供了一种治疗与NF-κB活性升高相关的疾病的方法，包括给患有所述疾病的患者施用一种肽或编码其的核酸或者包含其的药物组合物，其中所述肽(a)包含SEQ ID NO：3的氨基酸序列；或者(b)包含SEQ ID NO：3的氨基酸序列经过修饰例如经过取代、缺失或添加一或多个氨基酸而获得的氨基酸序列，其中所述肽具有抑制NF-κB信号通路的作用。
本发明使用的术语“施用”表示通过合适的方法将预定量的物质导入病人。本发明的分离的肽、分离的核酸分子、表达载体、重组细胞、药物组合物或疫苗可以通过任何通常途径施用，只要其能到达所希望的组织。可以考虑多种施用方式，包括腹膜内、静脉内、肌内、皮下、透皮、口服、局部、鼻内、肺内和直肠内，但是本发明不限于这些举例说明的施用方式。
在一个实施方案中，所述肽(a)由SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列组成，或者(b)由SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列组成，或者(c)由SEQ ID NO：3的氨基酸序列组成，或者(d)由(a)-(c)中的氨基酸序列经过修饰例如经过取代、缺失或添加一或多个氨基酸而获得的氨基酸序列组成，其中所述肽具有抑制NF-κB信号通路的作用，或者(e)由与(a)-(c)中的氨基酸序列具有至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的序列相同性的氨基酸序列组成，其中所述肽具有抑制NF-κB信号通路的作用。
本文中，本发明所述肽还可以与另外的肽融合，从而修饰肽的生理学或药学性质，例如增加稳定性或增加膜穿透性。在一个实施方案中，本发明的肽(例如SEQ ID NO：3)可以与人类免疫缺陷病毒HIV的Tat蛋白(例如第47-57个氨基酸RKKRRQRRRG(SEQ ID NO：14))融合以促进多肽穿透细胞膜。
本文中，所述与NF-κB活性升高相关的疾病是指疾病的发生、发展、持续或者复发与NF-κB活性升高相关的任何疾病(Basseres and Baldwin，2006)。例如所述疾病可以选自多发性骨髓瘤、白血病、套细胞淋巴瘤、粘膜相关淋巴组织淋巴瘤、弥漫性大细胞淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤、骨髓增生异常综合征、乳腺癌、卵巢癌、肺癌、宫颈癌、前列腺癌、肝癌、胰腺癌、食管癌、胃癌、咽喉癌、胆管癌、甲状腺癌、副甲状腺癌以及皮肤和头颈的鳞状细胞癌。在一个实施方案中，所述疾病优选是白血病，例如选自急性淋巴细胞白血病、急性髓细胞白血病、慢性淋巴细胞白血病、慢性髓细胞白血病、成人T-细胞白血病。
在本文中，治疗是指：减轻、缓解、消除、阻碍、阻止所述疾病的症状和／或者延缓所述疾病的发生和／或发展。对于疾病症状的监测和／或测量可以通过临床医师可以使用任何手段或方法进行。
一种肽或编码其的核酸是否能够抑制NF-κB的活性可以通过测定细胞核内NF-κB蛋白的量来确定。本领域已知许多测定NF-κB蛋白的测定方法，例如细胞核蛋白免疫印迹，使用分离的核蛋白的电泳迁移率实验，以及使用报告基因系统测定NF-κB蛋白作为转录因子的活性(Imbert et al.，1996)。在本发明的一个实施方案中，通过Western印迹测定细胞核内NF-κB蛋白的量以研究RCAN1对于NF-κB活性的抑制作用。
本领域中，已知很多体内例如动物实验或者体外实验例如细胞学测定可以用来研究一种肽或编码其的核酸是否能够用于治疗与NF-κB活性升高相关的疾病(Kordes et al.，2000)。例如，白血病已知是一种与NF-κB活性升高相关的疾病。白血病为血液类肿瘤，白血病细胞系例如JURKAT等是良好的白血病细胞模型，尤其是短期培养的原代白血病细胞，直接从患者外周血中分离后立即用于药物测试，基于细胞存活率的细胞学测定方法能够反映药物的效果及机制。在本发明中，使用了白血病细胞系和原代培养的白血病细胞作为模型研究了RCAN1治疗白血病的效果，该模型能够证明RCAN1是治疗白血病的良好候选药物。
本发明所述RCAN1蛋白或者其N端103个氨基酸片段具备作为新型NF-κB抑制剂的如下优势：RCAN1是人体自然存在的内源性蛋白，因此在人体中的免疫原性很低，不会被人体的免疫系统快速清除；多肽类药物比之于小分子化合物还具有生物活性高，作用特异性强等特点，因此多肽类药物的副作用较小而且治疗效果明显。
实施例
本发明通过下述实施例进一步阐明，但任何实施例或其组合不应当理解为对本发明的范围或实施方式的限制。本发明的范围由所附权利要求书限定，结合本说明书和本领域一般常识，本领域普通技术人员可以清楚地明白权利要求书所限定的范围。在不偏离本发明的精神和范围的前提下，本领域技术人员可以对本发明的技术方案进行任何修改或改变，这种修改和改变也包含在本发明的范围内。
实施例1、RCAN1表达载体的制备
1.1材料
PCR扩增的酶及dNTP：购自Takarra公司；
PCR扩增引物：由上海生工公司合成；
Takara限制性内切酶(EcoR I、Kpn I、Hind III、Bgl II)：购自New EnglandBiolab公司；
Takara T4连接酶：购自大连宝生物公司；
真核表达载体pcDNA3.1(-)mychis(c)：购自Invitrogen公司；
基因敲除载体pSuper：购自Oligoengine；
腺病毒表达载体Adeno-X：购自Clontech；
大肠杆菌DH5购自Invitrogen。
其余常规化学试剂均为国产分析纯，除非另外指明。
细胞系：HEK293细胞系购自ATCC。HEK293细胞培养于含10％胎牛血清的DMEM培养基中，培养环境为37℃恒温，含5％CO2的细胞培养箱。细胞培养产品均购自Invitrogen公司。
1.2实验步骤
1.2.1质粒构建
(1)为构建RCAN1高表达载体，构建了pcDNA3.1(-)RCAN1.1-myc重组质粒，使用如下引物PCR扩增人类cDNA文库，并经EcoR1和Kpn I酶切后连接入用相同酶切的pcDNA3.1(-)mychis(c)载体后获得。
用于克隆RCAN1.1的PCR引物为：
上游引物：ccgCTCGAGgccaccATGGAGGAGG TGGACCTGCA(SEQ IDNO：4)
下游引物：atggtacc CCTCTTCTTCCTCCTTC(SEQ ID NO：5)
使用人类cDNA文库(购自Clontech公司)为模板，分别以上述引物通过常规PCR(PCR条件：94℃10min，30个循环94℃、30s，55℃、30s，72℃、30s，最后72℃5min)扩增基因片段，然后通过琼脂糖凝胶电泳分离并回收PCR扩增片段，所述片段的上游带有EcoR1酶切位点，下游带有Kpn I酶切位点。PCR得到的DNA片段通过EcoR1+Kpn I双酶切，然后连接到同样利用EcoR1+Kpn I双酶切的pcDNA3.1(-)mychis(c)载体，获得pcDNA3.1(-)RCAN1.1-myc重组表达质粒。
(2)使用与(1)同样的方法，构建了RCAN1同源异构体4的真核表达载体pcDNA3.1(-)RCAN1.4-myc。
用于克隆RCAN1.4的PCR引物为：
上游引物：ccgCTCGAGgccaccATGCATTTTA GAAACTTTAA(SEQ IDNO：6)
下游引物：atggtacc CCTCTTCTTCCTCCTTC(SEQ ID NO：7)
(3)为获得RCAN1基因敲除载体，两条核苷酸经过退火，即95℃、5分钟，然后自然冷却，变为双链后插入被Hind III和Bgl II酶切的pSuper载体，获得Si-RCAN1。两条核苷酸的序列为：
DS-511super sense：
GatccccGAGGAAATGGAAAGAATGAGGttcaagagaCCTCATTCTTTCCATTTCCTCttttta(SEQ ID NO：8)
DS-511superAS：
AgcttaaaaaGAGGAAATGGAAAGAATGAGGTCTCTTGAACCTCATTCTTTCCATTTCCTC ggg(SEQ ID NO：9)
1.2.2腺病毒载体的构建
首先构建pRCAN1.1-EGFP和pRCAN1.4-EGFP载体：使用EcoRI和KpnI酶切pcDNA3.1(-)RCAN1.1-myc或者pcDNA3.1(-)RCAN1.4-myc质粒，回收0.7kb的DNA片段作为插入物，插入到使用相同酶切的pEGFP-N3(购自clonetech公司)载体，获得pRCAN1.1-EGFP和pRCAN1.4-EGFP载体。
构建Ad-RCAN1.1和Ad-RCAN1.4载体：使用Nhe I和Not I酶切pRCAN1.1-EGFP和pRCAN1.4-EGFP载体，回收约1.4kb的片段作为插入物，插入到相同酶切的pShuttle2(购自Clontech公司)得到pShuttle2-RCAN1.1-EGFP和pShuttle2-RCAN1.4-EGFP，然后使用I-ceuI和PI-SceI酶切pShuttle2-RCAN1.1-EGFP和pShuttle2-RCAN1.4-EGFP回收约1.4kb的片段作为插入物，插入到相同酶切的Adeno-X腺病毒载体(购自Clontech公司)得到Ad-RCAN1.1和Ad-RCAN1.4载体。
1.2.3腺病毒的生产
由于白血病细胞系使用一般的转染方法都无法转染，在此我们使用了腺病毒来表达RCAN1蛋白。约106个HEK293细胞在转染之前一天接种到60mm培养皿，细胞转染使用脂质体LF2000(购自invitrogen)和5μg的Pac1(购自NEB公司)酶切的病毒载体Adeno-X或者Ad-RCAN1.1和Ad-RCAN1.4(具体方法参见Invitrogen的LF2000转染试剂盒的说明书)。7天后，收取细胞并使用3次冻融裂解细胞收取含病毒的裂解液，使用细胞裂解液0.5ml感染60mm培养皿接种的HEK293细胞，48小时后冻融裂解细胞收取病毒，同样的方法再连续感染两次HEK293后收取的病毒用于实验。病毒的滴度大约为4X108／ml。在本发明中，除非特别指明，细胞系及原代细胞使用的感染复数(MOI)为30。
实施例2：RCAN1高表达抑制NF-κB活性，低表达可以增高NF-κB活性
2.1NF-κB核转移实验步骤
HEK293细胞转染RCAN1表达载体pcDNA3.1(-)RCAN1.1-myc：使用脂质体LF2000(购自invitrogen)转染HEK293细胞，4μl的LF2000加入至100μl的opti-MEM(购自Invitrogen公司)，5分钟后与加入2μg的RCAN1表达载体pcDNA3.1(-)RCAN1.1-myc的100μl的opti-MEM混合后，室温静置15分钟，加入至养有HEK293的35mm直径的培养皿中。
48小时后分离细胞核并裂解：细胞核使用细胞核蛋白提取试剂盒(购自Millipore公司)分离并裂解。
细胞核裂解液使用12％甘氨酸SDS-PAGE分离蛋白(购自Biorad公司)：跑胶及转膜装置为Biorad公司的mini-protean3垂直电泳装置。
Western Blot方法：使用anti-NF-κB抗体(购自Sigma公司)检测细胞核内的NF-κB水平(具体方法参见Sigma公司的使用说明书)。Anti-TBP抗体(购自Sigma公司)检测的TBP蛋白作为内参。SDS-PAGE胶及westernblot的具体方法参见Molecular Cloning：A Laboratory Manual，Cold SpringHarbour Laboratory Press(1989)
2.2NF-κB核转移实验结果
显示RCAN1高表达的细胞的细胞核内的NF-κB明显降低(见图1)，说明RCAN1可以明显抑制NF-κB的核转移，RCAN1敲除可以明显升高NF-κB的核转移(图1A)。
2.3NF-κB活性荧光指示系统的实验步骤
RCAN1表达载体与pNF-κB-luc(购自Clontech公司)，pRL-TK(购自Promega公司)共同转染HEK293细胞(质粒使用比例为1∶1∶0.02，具体方法参见Invitrogen的LF2000转染试剂盒的说明书)，24小时后裂解细胞采用双荧光报告系统(购自Promega公司)测试荧光。
2.4NF-κB活性荧光指示系统的实验结果
结果显示RCAN1高表达可以显著抑制NF-κB活性，RCAN1敲除可以明显升高NF-κB活性(图1B)。
实施例3：RCAN1与IKB结合
3.1方法步骤
HEK293细胞转染RCAN1表达载体(如实施例22.1所述)；
48小时后收取细胞并裂解；
加入20μl免疫共沉淀试剂ProteinA／G agarose(购自Santa Cruz公司)和2μl抗-IKBα抗体(购自Cell Signaling公司)，4℃摇动过夜。
2000g离心去上清，并使用PBS洗沉淀两次，加入上样缓冲液；
12％甘氨酸SDS-PAGE分离蛋白并将蛋白转至PVDF膜；
Western blot使用anti-myc抗体(购自ABcam公司)检测RCAN1蛋白(具体方法参见ABcam的抗体说明书)。
反之，可以使用anti-myc抗体沉淀蛋白，再使用IKB抗体做westernblot。SDS-PAGE和western blot的方法具体参见实施例22.1。
3.2结果
如图所示，RCAN1蛋白与IKB蛋白存在相互作用(图2)。
实施例4：RCAN1影响IKB在42位的酪氨酸磷酸化
4.1实验步骤
HEK293细胞转染RCAN1敲除载体si-RCAN1(如实施例22.1所述，载体Si-RCAN1用量也是2ug)；
48小时后收取细胞并裂解，使用IKB抗体(购自Cell Signaling公司)做免疫沉淀(具体方法参见Cell signaling的说明书)；
免疫沉淀用12％SDS-PAGE胶分离并转至PVDF膜；
Western blot使用抗IKB-Y42磷酸化抗体(购自ABcam公司)检测。SDS-PAGE和western blot的方法具体参见实施例22.1。
4.2结果
结果显示RCAN1的敲除可以明显增加IKB在Y42的磷酸化(图3)。
实施例5：RCAN1腺病毒感染导致白血病细胞死亡
5.1材料
白血病细胞株Jurkat，NALM-6，CEM，MOLT-4，Kasumi，HL-60，THP-1，HEL均购自ATCC。白血病原代细胞以及细胞株均培养在含10％胎牛血清的RPMI1640培养基中，细胞培养产品均购自Invitrogen公司。培养环境为37℃恒温，含5％CO2的细胞培养箱。
单个核细胞分离液Histopaque-1077：购自Sigma公司。
细胞存活率试剂盒Celltiter-Glo发光试剂盒：购自Promega公司。
5.2实验步骤
白血病原代细胞的分离采用的是Histopaque试剂，在15ml的离心管内加入3ml的Histopaque-1077试剂，上层为3ml白血病患者的新鲜外周血，在300g离心30分钟，吸取第二层的单个核细胞并使用10ml的PBS缓冲液洗涤一次，接种至培养皿。
白血病细胞株或者原代白血病细胞使用表达RCAN1.1和RCAN1.4的腺病毒感染48小时后，使用细胞存活率试剂盒检测细胞存活率。
5.3结果
结果显示RCAN1.1或者RCAN1.4的高表达可以引起急性淋巴白血病细胞系Jurkat，NALM-6，CEM，MOLT-4死亡，存活率大约为30-60％(图4A)。RCAN1.1或者RCAN1.4高表达可以引起急性髓细胞白血病细胞系Kasumi，HL-60，THP-1，HEL的死亡，存活率大约为40-80％(图4B)。RCAN1.1在急性白血病原代细胞中的高表达可以引起明显的细胞死亡，存活率大约为55％，而对于正常的血细胞及缓解白血病患者的血细胞没有明显的杀伤作用，说明RCAN1可以特异的引起白血病细胞的死亡(图4C)。
实施例6：确定抑制NF-κB的RCAN1结构域
6.1材料
构建pcDNA3.1RCAN1-103mychis质粒：使用引物T7(TAATACGACTCACTATAGGG(SEQ ID NO：10))和逆向引物DS103KpnR：AtggtaccGCTTGTCTGGATTTGGCGGA(SEQ ID NO：11)，以pcDNA3.1(-)RCAN1.1-myc为底物扩增1-103片段，使用酶切位点EcoR1和Kpn1插入到pcDNA3.1(-)mychis(c)获得pcDNA3.1RCAN1-103mychis重组质粒。
构建pcDNA3.1RCAN103-197myc质粒：使用引物DSCR1-103F：ccgCTCGAGgccaccatg C AGTTTCTGAT CTCCCCT(SEQ ID NO：12)和逆向引物BGH(TAGAAGGCACAGTCGAGG(SEQ ID NO：13))，以pcDNA3.1(-)RCAN1.1-myc为底物扩增103-197片段，使用酶切位点EcoR1和Kpn1插入到pcDNA3.1(-)mychis(c)获得pcDNA3.1RCAN103-197myc重组质粒。
核转染试剂盒VCA-1003：购自Lonza公司。
6.2实验步骤
(1)免疫共沉淀：HEK293细胞分别转染表达RCAN1的N-或者C-片段的载体pcDNA3.1RCAN1-103mychis和pcDNA3.1RCAN103-197myc，使用如实施例3所示实验方法进行免疫共沉淀实验。
(2)NF-κB活性荧光指示系统：HEK293细胞分别转染表达RCAN1的N-或者C-片段的载体pcDNA3.1RCAN1-103mychis和pcDNA3.1RCAN103-197myc，使用如实施例2的方法检测NF-κB活性。
(3)白血病细胞株Jurkat的存活率检测：表达RCAN1的N端103个氨基酸的质粒pcDNA3.1RCAN1-103mychis使用核转染法(方法参见AmaxaVCA-1003试剂盒说明书)转染Jurkat细胞，细胞存活率使用Celltiter-Glo发光试剂盒(Promega)检测。
6.3结果
结果显示RCAN1的N-端103个氨基酸可以与IKB相互作用并抑制NF-κB活性，RCAN1的C-端与NF-κB活性无关(图5A、B)。RCAN1的N-端103个氨基酸可以降低白血病细胞株Jurkat的存活率(图5C)。
实施例7：抑制NF-κB的RCAN1多肽的纯化及活性测试
7.1实验步骤
构建pTAT-RCAN1N-103质粒：TAT序列为人类免疫缺陷病毒HIV的Tat蛋白的第47-57个氨基酸(RKKRRQRRRG(SEQ ID NO：14))，此TAT序列与RCAN1的N端多肽融合，可以促进多肽穿透细胞膜。将含有TAT片段的编码寡核苷酸Tatg agg aagaagcggagacagcgacgaaga ggatcc c(SEQ IDNO：15)插入到使用Nde I和Xho I限制性内切酶(购自New EnglandBiolabs)酶切的pet-28b原核表达载体(购自Novagen公司)获得pet-28bTAT载体，然后使用Bamh I和Xho I酶切pet-28bTAT载体，插入RCAN11-103的PCR片段，PCR上游引物：CGGGATCCATGGAGGAGGTGGACCTG(SEQ ID NO：16)；下游引物：CCGCTCGAGCTTGTCTGGATTTGGCGGA(SEQ ID NO：17)。PCR模板为pcDNA3.1(-)RCAN1.1-myc表达载体。
RCAN1N-103多肽的纯化：50ng的pTAT-RCAN1N-103表达载体转化至100μl的BL21(DE3)pLysS细胞(购自Promega公司)，方法为冰浴30分钟，热休克40秒，冰浴5分钟。表达TAT-RCAN1N-103的克隆接种至200ml含100μg／ml的氨苄西林的LB培养基，37℃摇床225rpm摇16小时，再次接种至1升含100μg／ml的氨苄西林的LB培养基中，37℃摇床过夜。5000g离心10分钟收集细胞沉淀，使用PBS洗一次，将细胞沉淀溶于20ml细胞混悬液(含8M尿素，100mM氯化钠，20mM HEPES，PH8.0)，采用3次15秒的超声粉碎细胞，16000g，4℃离心15分钟，收集上清，过亲和层析柱子HisTrapTM(购自amersham pharmacia公司)。使用含500mM咪唑的细胞混悬液从柱子上解析蛋白，使用PD-10去盐化柱子(购自GE公司)去盐后在-80℃保存于含10％甘油的PBS(购自invitrogen公司)。SDS-PAGE凝胶电泳后使用考马斯亮蓝染色后显示分离纯化的蛋白条带(图6A)。
使用该纯化的TAT-RCAN1N-103多肽处理Jurkat细胞：使用10μM的TAT-RCAN1N-103多肽处理Jurkat细胞，24小时后使用MTT检测细胞存活率，实验结果显示TAT-RCAN1N-103处理组Jurkat细胞比正常对照组存活率明显减少(图6B)。
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Figure IDA00003252607700011
Figure IDA00003252607700021
Figure IDA00003252607700031
Figure IDA00003252607700041
Figure IDA00003252607700051

Claims (3)

1.一种肽或其编码核酸在制备用于治疗与NF-κB活性升高相关的疾病的药物中的应用，其中所述与NF-κB活性升高相关的疾病是白血病，其中所述肽
(a)由SEQIDNO：1所示的氨基酸序列组成，或者
(b)由SEQIDNO：2所示的氨基酸序列组成，或者
(c)由SEQIDNO：3的氨基酸序列组成，或者
(e)由与(a)-(c)中的氨基酸序列具有至少98％的序列相同性的氨基酸序列组成，且所述肽具有抑制NF-κB信号通路的作用。
2.权利要求1的应用，其中所述肽
(a)由SEQIDNO：1所示的氨基酸序列组成，或者
(b)由SEQIDNO：2所示的氨基酸序列组成，或者
(c)由SEQIDNO：3的氨基酸序列组成，或者
(e)由与(a)-(c)中的氨基酸序列具有至少99％的序列相同性的氨基酸序列组成，且所述肽具有抑制NF-κB信号通路的作用。
3.权利要求1的应用，其中所述疾病选自：急性淋巴细胞白血病、急性髓细胞白血病、慢性淋巴细胞白血病、慢性髓细胞白血病和成人T-细胞白血病。
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Rcan1 negatively regulates FceRI-mediatedsignaling and mast cell function;Yong Jun Yang等;《The Journal of Experimental Medicine》;20090131;第206卷(第1期);195-207 *
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