CN112409447A - 一种靶向识别膜联蛋白a2的亲和短肽及其制备方法与用途 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种靶向识别膜联蛋白A2的亲和短肽及其制备方法与用途，其可以特异性靶定膜联蛋白A2(Annexin A2)，尤其是基于Annexin A2在大多数肿瘤中高表达的特点，进而为高效，靶向识别肿瘤组织，预测和提高肿瘤靶向治疗提供新的可能性；本发明还涉及了该多肽作为多肽分子探针或肿瘤导向多肽能与抗肿瘤的药物偶联，作为靶头增加药物或载有药物的载体如纳米材料、脂质体等在过表达Annexin A2的细胞中的含量，再添加药学上可接受的辅料或佐剂制成新型的更有效的靶向抗癌药物。本发明的多肽还可制成显像剂,用于多种高表达Annexin A2肿瘤的靶向治疗和成像,另外,还可制成多肽抑制剂,阻断Annexin A2与相关的蛋白相互作用。本发明所述多肽能对膜联蛋白A2具有特异性靶向作用，选择性强，且本发明涉及的肽可以采用化学合成的方法制备得到，其纯度高、分子量小、特异性强、无免疫原性及安全可靠。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，特别是一种与膜联蛋白A2有高亲和力的多肽，具有良好的结合特异性和敏感性的应用。
背景技术
癌症是全球第二大死因，仅次于心血管疾病。目前临床上治疗恶性肿瘤主要以手术、化疗和放疗为主，都很难达到满意的疗效，其中化疗是近年来在肿瘤治疗中发展最快的方法。但是化疗药物在杀伤肿瘤细胞的同时，也杀伤了人体正常细胞，毒副作用大。药物治疗是恶性肿瘤全身治疗的重要方法之一。传统的抗肿瘤化疗药物靶向性差，无法区分正常组织和肿瘤组织。药物迅速从血液中消除，并且只有少量药物分布到靶部位，肿瘤内的积聚能力差，有很大的毒性和不良反应。这些药物抗肿瘤治疗效果很低，并且效果不令人满意。随着研究的进一步深入，从传统细胞毒性化疗转向分子靶向药物和免疫治疗药物，其中分子靶向治疗特异性、针对性和有效性较强，患者耐受性较好，而毒副反应相对于细胞毒药物较低，相较于传统化疗药物有着显著的优势。
靶向治疗从90年代后期开始在治疗某些类型癌症上得到明显的效果，与化疗一样可以有效治疗癌症，但是副作用与化疗相较之下减少许多。靶向治疗在目前也是一个非常活跃的研究领域。靶向治疗是在细胞分子水平上，针对已经明确的致癌位点（该位点可以是肿瘤细胞内部的一个蛋白分子，也可以是一个基因片段），来设计相应的治疗药物，药物进入体内会特异地选择致癌位点来相结合发生作用，使肿瘤细胞特异性死亡，而不会波及肿瘤周围的正常组织细胞，所以分子靶向治疗又被称为“生物导弹”。这项治疗的原理是使用具有特异性对抗癌细胞的不正常或失调蛋白质的小分子，例如，酪氨酸磷酸酶抑制剂，治疗EGFR（表皮生长因子受体）敏感突变的非小细胞肺癌，疗效显著，但耐药基因的出现是目前阻碍进一步提高疗效的主要障碍。因此，靶向抗肿瘤药物及分子探针研究势在必行。癌症靶向治疗成功的前提是找准治疗的靶点。
膜联蛋白A2（Annexin A2）是一种钙离子介导的磷脂结合特性的蛋白质，属于膜联蛋白家族成员，广泛分布于各种真核细胞膜、细胞质和细胞外液，主要表达在血管内皮细胞、单核细胞、巨噬细胞、树突状细胞、滋养层细胞、上皮细胞、肿瘤细胞等细胞中。其功能主要是参与膜转运及膜表面一系列依赖于钙调蛋白的活动，包括胞吐作用中的膜融合、囊泡运输、细胞黏附、细胞增殖、凋亡、复制、信号传导以及离子通道的形成，许多疾病及体内调控都与膜联蛋白A2有关。Annexin A2又称为AnnexinⅡ、Calpactin I重链、Lipocortin 1I、P36。最早在Rous肉瘤病毒转化的鸡胚胎成纤维细胞中发现。它们参与一系列细胞活动，比如胞吐、胞吞、细胞增殖、分化和凋亡。最早在急性早幼粒细胞白血病中发现Annexin A2高表达，而其家族的另一成员AnnexinV与抗磷脂综合征相关，因此提出Annexinopathy的概念。研究发现Annexin A2与其他Annexins不同，具有RNA结合的特性，与DNA合成、复制相关，在肿瘤的发生、浸润和转移中起作用。它在各种类型肿瘤中起正向调节作用，在调节细胞功能上亦扮演多个角色，包括血管生成、增殖、凋亡、细胞迁移、入侵和粘附。近年来，人们发现Annexin A2在胃癌、结肠癌、前列腺腺癌、肝细胞肝癌、胰腺导管腺癌等肿瘤中异常表达，与肿瘤浸润、转移或预后相关。Annexin A2已经成为治疗癌症的重要靶标。
多肽是由多个氨基酸通过肽键连接而形成的一类化合物，通常由10-100个氨基酸分子组成，其连接方式与蛋白质相同，相对分子质量低于10000。多肽普遍存在于生物体内，迄今在生物体内发现的多肽已达数万种，其广泛参与和调节机体内各系统、器官、组织和细胞的功能活动，在生命活动中发挥重要作用。多肽作为一类重要生物活性物质，具有活性高、低免疫原性、毒性低、易于装载等特点广泛应用于癌症治疗中。靶向给药系统可将药物选择性浓集定位于靶器官，靶组织，靶细胞中，将小分子多肽修饰于靶向给药系统表面，能在降低传统化疗药物毒副作用的同时提高治疗指数。肿瘤靶向肽(tumor targetingpeptide)指一类能够靶向肿瘤或肿瘤微环境的肽类。由于噬菌体展示技术的进步，已经有大量的肽被发现，这类肿瘤靶向肽对存在于肿瘤和肿瘤血管上特定的受体/标记物有很强的亲和力。肿瘤靶向肽对存在于肿瘤或肿瘤血管上特定的受体或标记物有很强的亲和力，因此能够靶向肿瘤或肿瘤微环境， 它们通常也被称为肿瘤归巢肽。近年来，利用现代生物技术合成的多肽药物已成为药物研发的热点之一，其因适应症广、安全性高且疗效显著，目前已广泛应用于肿瘤、肝炎、糖尿病、艾滋病等疾病的预防、诊断和治疗，具有广阔的开发前景。
有鉴于此，特提出本发明。
发明内容
本发明的目的在于提供一种靶向识别膜联蛋白A2的亲和短肽及其制备方法与用途，其氨基酸序列为：YWRGVYN，特别是该肽在制备抗癌药物中的用途。
本发明提供的一种靶向识别膜联蛋白A2的亲和短肽的制备方法，包括以下步骤：
（1）多肽YW7的制备
采用Fmoc固相合成多肽策略，以Fmoc-Asn（pbf）-OH为原料与Wang树脂进行键合。然后脱去Fmoc基团后，再与Fmoc-Typ（tBu）-OH在缩合剂DIC和HOBt的存在下进行缩合反应，完成了第二个氨基酸的连接；然后后再脱去Fmoc，与第三个氨基酸Fmoc-Val（Boc）-OH进行缩合反应；按照这个程序依次从C端合成到N端，（使用的氨基酸包括Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Arg-OH和Fmoc-Trp-OH）直至合成完毕，得到脱去Fmoc基团的侧链保护的树脂；
在上述得到的肽树脂中，加入切割试剂，20℃避光下反应2小时，过滤；收集滤液，旋转蒸发仪浓缩，再加入10倍左右体积的预冷无水乙醚，-20℃沉淀3小时，析出白色粉末物，收集沉淀，再用无水乙醚洗涤沉淀，真空干燥，得到多肽，其中切割试剂由TFA、水和TIS（三异丙基氯硅烷）按照质量比96:1.5:2.5混合而成；
采用C18反相制备柱进行纯化，收集主峰，冷冻干燥，得到白色固体即为产物；
产物经质谱鉴定，质谱图中显示的分子量与理论分子量基本一致。
（2）FITC-阳性多肽片段FITC-YW7的制备
采用Fmoc固相合成多肽策略，以Fmoc-YW7-Wang树脂为原料，脱去Fmoc基团后，再与Fmoc-Acp-OH在缩合剂DIC和HOBt的存在下进行缩合反应；然后后再脱去Fmoc，与FITC-Cl进行缩合反应；
在上述得到的肽树脂中，加入切割试剂，20℃避光下反应2小时，过滤；收集滤液，旋转蒸发仪浓缩，再加入10倍左右体积的预冷无水乙醚，-20℃沉淀3小时，析出白色粉末物，收集沉淀，再用无水乙醚洗涤沉淀，真空干燥，得到多肽，其中切割试剂由TFA、水和TIS(三异丙基氯硅烷)按照质量比96:1.5:2.5混合而成；
采用C18反相制备柱进行纯化，收集主峰，冷冻干燥，得到白色固体即为产物；
产物经质谱鉴定，质谱图中显示的分子量与理论分子量基本一致。
本发明提供了一种多肽分子探针，包括本发明提供的多肽，其氨基酸序列为YWRGVYN。
优选地，所述多肽探针选择性强，纯度高，分子量小，穿透性强，无免疫原性，安全可靠。
更优选地，可成为具有高灵敏度和特异性的分子探针引入体内，后与细胞内特定的靶蛋白Annexin A2发生特异性结合并产生某种信号，实现高度特异性的诊断或靶向治疗作用。
本发明提供了一种肿瘤导向多肽，包含结合肽的氨基酸序列如序列表所示，与抗肿瘤的药物偶联，作为靶头增加药物或载有药物的载体如纳米材料、脂质体等在过表达Annexin A2的细胞中的含量，再添加药学上可接受的辅料或佐剂制成新型的更有效的靶向抗癌药物。
本发明提供了一种显像剂，包含结合肽的氨基酸序列如序列表所示，用于多种过表达Annexin A2肿瘤的靶向治疗和成像。
本发明提供了一种多肽抑制剂，包含所述结合肽的氨基酸序列如序列表所示，可阻断Annexin A2与相关的蛋白相互作用 。
本发明的有益效果是：（1）本发明提出的多肽具有Annexin A2特异靶向的特性，因此在实际应用中，可广泛用于过表达Annexin A2的肿瘤中。因此，该肿瘤靶向多肽及其衍生物在过表达Annexin A2肿瘤分子诊断，筛查和靶向治疗中具有重要应用价值。
（2）该多肽对过表达Annexin A2肿瘤细胞的特异性结合作用，为进一步寻找新的Annexin A2的配体，研究大分子间相互作用的结合位点、寻找亲和力高且具有生物活性的配体分子以及药物的筛选、疫苗和新型诊断试剂的研发等领域带来了更多希望。
（3）与传统药物相比，短肽具有相对分子质量较小、免疫原性弱、活性高等优点，更容易简便规模化生产短肽类药物，选出的多肽有望成为效果好、效益高的新时代药物。
作为优选技术方案，本发明所述癌症为Annexin A2过表达的癌症，优选为胰腺癌。
附图说明
图1为Annexin A2的重组与纯化结果图；其中图1（A）为构建的Annexin A2表达质粒全图谱，图1（B）为Annexin A2蛋白纯化结果图。
图2为Annexin A2特异性结合阳性多肽的筛选结果；其中图2（A）为利用噬菌体展示技术对Annexin A2特异性结合阳性多肽的三轮靶向筛选滴度实验结果图，A、B、C分别为第一、二、三轮筛选滴度实验蓝白斑平板图。图2（B）为重复率最高阳性噬菌体的DNA测序结果图。
图3为固相合成的多肽YW7和FITC-阳性多肽片段FITC-YW7的质谱鉴定图；其中图3（A）为固相合成的多肽YW7的质谱图，图3（B）为固相合成的FITC-阳性多肽片段FITC-YW7的质谱图。
图4为阳性多肽YW7与Annexin A2亲和力的验证结果，其中图4（A）为MOE对接多肽YW7与Annexin A2鉴定亲和力结果图。图4（B）为MST实验鉴定多肽YW7与Annexin A2亲和力结果图。
图5为多肽FITC-YW7与过表达Annexin A2的胰腺癌细胞特异性靶向结合能力的体外鉴定结果图；其中图5（A）为免疫荧光验证多肽FITC-YW7与胰腺癌Panc-1细胞特异性靶向结合能力的荧光结果图和柱形图。图5（B）为流式细胞术鉴定多肽FITC-YW7与胰腺癌Panc-1细胞特异性靶向结合能力的实验结果图和柱形图。图5（C）为免疫荧光鉴定多肽FITC-YW7与Annexin A2在胰腺癌Panc-1细胞表面共定位的荧光结果图和柱形图。
具体实施方式
以下通过具体实施例进一步说明本发明的技术方案。
实施例1 Annexin A2的重组与纯化
1.1转化构建的Annexin A2表达质粒
将感受态细胞，冰上解冻。感受态细胞加质粒，轻柔混匀，冰上5min静置。42度热激90秒。快速转移到冰上，冷却3min。加入无抗性LB培养基，37度。将混合液用玻璃棒蘸取并均匀铺到AMP平板培养基上。将平板放在37度孵箱中过夜。次日，检查菌落生长情况，4度冰箱保存。
1.2大量扩增Annexin A2
摇过夜菌Annexin A2，在锥形瓶加入AMP和LB（1:1000）。37度，200rpm摇菌过夜。次日，存过夜菌Annexin A2，-20度冻存。在锥形瓶中加入LB、菌液和AMP，37度180rpm摇菌4小时。在菌液中加IPTG诱导，22度180rpm摇菌5小时。取无菌离心管，分装菌液。4度12000g离心10min，弃上清，-20冻存。
1.3纯化Annexin A2
在细菌沉淀中加裂解缓冲液4ml/g，重悬。加溶菌酶终浓度1mg/ml，冰上30min。200w超声6次，每次10秒，间隔10秒。4度离心10000g 20min，留上清于冰上，各留100ul上样。取0.3ml BeyoGold™ GST-tag Purification Resin，4度1000g离心10秒，弃上清，加0.5ml裂解缓冲液，平衡重复3次，4度1000g离心10秒。在上清中加入BeyoGold™ GST-tagPurification Resin，4度结合1小时。将混合物加入亲和层析柱，流出液留100ul上样。用裂解缓冲液洗柱4次，每次0.2ml，留第4次100ul上样。分别用0.5ml洗脱液洗脱，每管留样，各留100ul上样，剩下-80冻存。
结果如图1所示，图1为Annexin A2的重组与纯化结果图，其中图1（A）为构建的Annexin A2表达质粒全图谱。图1（B）为Annexin A2蛋白纯化结果图，结果显示在62kd处有明显纯化的Annexin A2蛋白。
实施例2 Annexin A2蛋白特异性结合阳性多肽的靶向筛选
2.1宿主菌E.coli ER2738的复苏、培养
制备大肠杆菌平板，取LB-TET培养平板于37度孵箱预热1小时，待E.coli ER2738菌液融化后，用接种环蘸取少量菌液均匀铺在培养平板，然后倒置于37℃的恒温培养箱中过夜培养。制备宿主菌液，从生长良好的培养板中挑取单一菌落，置于含有四环素的LB细菌培养液中，37℃、180rpm振荡过夜培养，使细菌处于对数生长期。制备好的含大肠杆菌LB-Tet平板放到4℃冰箱保存备用，宿主菌液放到-80℃冰箱保存备用。
2.2噬菌体展示七肽库靶向筛选
以Annexin A2作为靶蛋白，利用噬菌体展示技术靶向筛选方法，参照噬菌体展示七肽库试剂盒的操作说明，通过三轮靶向筛选，并尽量保证每一轮噬菌体的投入总量相同，每轮递增筛选压力，最终获得高度富集的噬菌体。具体筛选步骤如下：
2.2.1准备Annexin A2
准备Annexin A2，终浓度5ug/ml，溶于0.1M NAHCO3（PH 8.6），铺于96孔板上，振摇30min，4度过夜。
2.2.2准备菌液
筛选当天将过夜培养的宿主菌液加到LB培养液中。37℃、180rpm振荡约3小时。以上为筛选滴度测定及扩增使用菌液。
2.2.3蛋白固定
用吸管吸净96孔板中的液体，并在无菌滤纸上将96孔板中液体拍甩干净。用0.5%BSA封闭，37℃放置1小时。
2.2.4肽库结合
弃掉96孔板里的封闭液。加入用TBST稀释100倍的Ph.D.TM-7原始噬菌体展示七肽库，室温下120rpm微摇作用1小时。
2.2.5洗涤
吸掉第一轮未结合的噬菌体液，把96孔板放到无菌滤纸上用力拍干。用0.1%TBST洗涤96孔板10次，每次约30秒左右，并冲洗96孔板底部及其边缘，倒掉洗涤液，在无菌滤纸上拍干。
2.2.6洗脱
96孔板里加入洗脱液（0.2M Glycine-HCl，PH2.2），常温下、80rpm、微摇15min。洗脱作用结束后，轻轻吹打洗脱液后吸出，加入到含有中和缓冲液的EP管里，混匀。
2.3测定噬菌体滴度
提前摇菌，加TET到LB中，37度180rpm，3小时后，达到对数生长期（OD值达到0.6左右为佳）。测定滴度前先将LB/IPTG/Xgal平板在37℃孵箱预热1小时以上。准备琼脂糖凝胶，微波加热至融化。取吸附后中和洗脱液（或扩增后噬菌体上清液），用LB培养基倍数稀释噬菌体。稀释范围为：吸附后中和洗脱液稀释102-105；扩增后噬菌体上清液稀释109-1012。每个EP管加入备好的菌液，并在每管里加入10μl不同稀释倍数的噬菌体液。在振荡仪上振荡5min混匀。把感染后噬菌体液加到室温融化的琼脂中，立即将混悬液加至已预热的LB/ IPTG/Xgal平板里，用冷却的涂布玻璃棒均匀涂开（每个稀释倍数一个平板，并做好标记）。 将涂好的平板倒置于37℃的孵箱过夜培养。第二天检查平板上的噬菌体蓝斑生长情况并计数（即数每个平板上的噬菌体斑个数）。
2.4噬菌体扩增纯化
把剩余的吸附后洗脱液进行扩增纯化，以备接下来的筛选。取无菌离心管，把备好的过夜宿主菌接种到LB培养基中，形成对数前宿主菌液。把所有的吸附后洗脱液加入到对数前宿主菌液里，于37℃、200rpm快速振荡5小时进行扩增。把扩增噬菌体液于4℃、12000rpm离心10min，把上清转到另一新的离心管里再次同等条件下离心。小心取离心管上部80%的上清液到一新的离心管里，再往离心管里加入六分之一体积的PEG/NaCl，放4℃冰箱过夜沉淀。次日，将前日沉淀50ml管于4℃、12000rpm条件下离心15min，弃上清，再次同等条件离心2min，弃掉剩余上清液。把沉淀物用1ml的TBS重悬后转移到无菌EP管里，于4℃、14000rpm条件下离心5min。上清转移到新的EP管里，再次加入六分之一体积的PEG/ NaCl，冰上沉淀1小时。于4℃、14000rpm条件下离心10min，弃掉上清液，保留沉淀。用200ul的TBS重悬沉淀物，于4℃、1000rpm离心1min，保留上清于新的EP管（此为扩增后噬菌体液），-20℃冰箱储存。
2.5第二到三轮筛选
筛选的基本步骤同第一轮。每下一轮筛选均选用前一轮扩增后的噬菌体液作为次级肽库，每轮尽量保持同第一轮基本一致的噬菌体投入量，总共进行三轮靶向筛选。每轮筛选后的洗脱液均要测定噬菌体滴度，并计算噬菌体的回收率。
2.6阳性单克隆噬菌体挑选与单链DNA提取及测序
2.6.1阳性单克隆噬菌体挑选
把第三轮筛选后所得的噬菌体液，进行滴度测定铺制LB平板，在生长的斑数不足100个的平板上，随机挑取40个间隔5mm生长良好的蓝斑。把随机挑取的40个蓝斑分别加入到1ml对数前宿主菌液（同噬菌体扩增），于37℃、 200rpm快速振荡4.5小时进行扩增。
2.6.2阳性单克隆噬菌体单链DNA提取
将扩增的单克隆噬菌体液分别于4℃、14000rpm离心30秒，取上清液转到新管中，4℃、1000rpm离心30秒，取上清的80% 转到新的无核酸酶离心管里，取300ul菌液按1:1比例加300ul甘油，-20度冰箱冻存，取此即为扩增的单克隆噬菌体液。剩下500ul菌液加200ulPEG，混匀室温静置20min，4度离心14000rpm，10min，弃上清，4度14000rpm离心3min，弃上清，加100ulNaI，混合均匀，加250ul无水乙醇，静置10min，4度10000rpm离心10min，弃上清，用预冷的70%乙醇轻微洗3次，晾干30min，10000rpm离心5min，弃上清，加60ul TE。
2.6.3DNA纯化
取上一步60ulTE管，加40ulTE补足至100ul。向离心管里加入500ul Buffer B3，充分混匀。将混合液全部移入吸附柱，室温下，8000g，离心30秒，将滤出液再次加入吸附柱中再次过柱。倒掉收集管里的液体，将吸附柱放回收集管里。向吸附柱里加入500μl WashSolution，9000g、离心30秒。倒掉收集管里的液体，吸附柱重新放到收集管中。重复上一步骤，将空吸附柱和收集管放入离心机，9000g，离心1min。在吸附膜中央加入40μl的ElutionBuffer，室温静置2min。9000g离心1min，将所得到的DNA溶液进行测序。
结果如图2所示，图2为Annexin A2特异性结合阳性多肽的靶向筛选结果，其中图2（A）为利用噬菌体展示技术对Annexin A2特异性结合阳性多肽的三轮靶向筛选滴度实验结果图，A、B、C分别为第一、二、三轮筛选滴度实验蓝白斑平板图。表1为三轮靶向筛选的噬菌体投入量，回收噬菌体滴度和噬菌体回收率，结果显示在第三轮阳性单克隆噬菌体显著富集。图2（B）为重复率最高阳性噬菌体的DNA测序结果图，其氨基酸序列为YWRGVYN（YW7）。将该序列与已知蛋白多肽序列对比同源性和相似性分析结果为与已知蛋白多肽序列没有同源性，与核苷酸序列没有相似性。
表1 三轮减性筛选的噬菌体投入量、回收噬菌体滴度和回收率
实施例3 阳性多肽YW7和FITC-YW7的固相合成与鉴定
根据测得的氨基酸序列，通过对其氨基酸序列进行同源性比对分析及对其核酸序列的生物信息学分析。用固相合成法合成多肽YW7（序列为YWRGVYN）和FITC-阳性多肽片段FITC-YW7（序列为YWRGVYN），并对合成的多肽进行鉴定。同时也在生工生物工程（上海）股份有限公司合成了以上多肽YW7及FITC-阳性多肽片段FITC-YW7。
3.1多肽YW7的制备
3.1.1采用Fmoc固相合成多肽策略，以Fmoc-Asn（pbf）-OH为原料与Wang树脂进行键合。然后脱去Fmoc基团后，再与Fmoc-Tyr（tBu）-OH在缩合剂DIC和HOBt的存在下进行缩合反应，完成了第二个氨基酸的连接；然后后再脱去Fmoc，与第三个氨基酸Fmoc-Val（Boc）-OH进行缩合反应；按照这个程序依次从C端合成到N端，（使用的氨基酸包括Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Arg-OH和Fmoc-Trp-OH）直至合成完毕，得到脱去Fmoc基团的侧链保护的树脂。
3.1.2在上述得到的肽树脂中，加入切割试剂，20℃避光下反应2小时，过滤；收集滤液，旋转蒸发仪浓缩，再加入10倍左右体积的预冷无水乙醚，-20℃沉淀3小时，析出白色粉末物，收集沉淀，再用无水乙醚洗涤沉淀，真空干燥，得到多肽，其中切割试剂由TFA、水和TIS（三异丙基氯硅烷）按照质量比96:1.5:2.5混合而成。
3.1.3采用C18反相制备柱进行纯化，收集主峰，冷冻干燥，得到白色固体即为产物；产物经质谱鉴定，质谱图中显示的分子量与理论分子量基本一致。
3.2FITC-阳性多肽片段FITC-YW7的制备
3.2.1采用Fmoc固相合成多肽策略，以Fmoc-YW7-Wang树脂为原料，脱去Fmoc基团后，再与Fmoc-Acp-OH在缩合剂DIC和HOBt的存在下进行缩合反应；然后后再脱去Fmoc，与FITC-Cl进行缩合反应。
3.2.2在上述得到的肽树脂中，加入切割试剂，20℃避光下反应2小时，过滤；收集滤液，旋转蒸发仪浓缩，再加入10倍左右体积的预冷无水乙醚，-20℃沉淀3小时，析出白色粉末物，收集沉淀，再用无水乙醚洗涤沉淀，真空干燥，得到多肽，其中切割试剂由TFA、水和TIS(三异丙基氯硅烷)按照质量比96:1.5:2.5混合而成。
3.2.3采用C18反相制备柱进行纯化，收集主峰，冷冻干燥，得到白色固体即为产物；产物经质谱鉴定，质谱图中显示的分子量与理论分子量基本一致。
结果如图3所示，图3为固相合成的多肽YW7和FITC-阳性多肽片段FITC-YW7的质谱鉴定图；其中图3（A）为固相合成的多肽YW7的质谱图，图3（B）为固相合成的FITC-阳性多肽片段FITC-YW7的质谱图。质谱结果显示固相合成的多肽YW7和FITC-阳性多肽片段FITC-YW7分别与其理论值一致，且与生工生物工程（上海）股份有限公司合成多肽及FITC-阳性多肽片段的分子量及其他结果一致。表明固相合成合成的多肽符合质量要求，可用于后续的效应评价。
实施例4 阳性多肽YW7与Annexin A2蛋白亲和力的验证
4.1 MOE对接多肽YW7与Annexin A2蛋白鉴定亲和力
基于蛋白-配体相互作用过程中存在的诱导契合效应，将PDB数据库中的Annexin A2逐一放在靶标分子的活性位点处，通过不断优化多肽YW7的位置和构象，寻找Annexin A2和多肽YW7作用的最佳构象，并预测其结合模式、亲和力和通过打分函数挑选出接近天然构象的与受体亲和力最佳的配体。
4.2 MST（微量热涌动仪）鉴定多肽YW7与Annexin A2的亲和力
在MST检测中，保持多肽YW7浓度不变，同时对非标记的Annexin A2蛋白进行梯度稀释，反应溶液为MST Buffer(contain 0.05% Tween-20)。短时间的结合反应后，将样品装载到NT.115标准毛细管中，通过Monolith NT.115进行测量。
结果如图4所示，图4为阳性多肽YW7与Annexin A2亲和力的验证结果，其中图4（A）为MOE对接多肽YW7与Annexin A2鉴定亲和力结果图，MOE分子对接结果表明多肽YW7可以与蛋白Annexin A2很好地结合，S打分为-66.078。多肽YW7的Tyr1-Trp2-Arg3形成了一个类似于环肽的构象处于活性口袋的内侧 ，且Tyr1的苯环与Leu300形成疏水作用；Gly4-Val5-Tyr6则呈现出舒展的线性构象，位于活性口袋的外侧 ，其中Val5的酰胺NH与Asn61的末端羰基形成氢键。图4（B）为MST鉴定多肽YW7与Annexin A2亲和力结果图，结果显示多肽YW7与Annexin A2具有亲和力，Kd值为12μM。
实施例5 多肽FITC-YW7与过表达Annexin A2胰腺癌细胞特异性靶向结合能力的体外鉴定
5.1免疫荧光鉴定多肽FITC-YW7与胰腺癌Panc-1细胞的结合能力
将HPDE6-C7和PANC-1细胞铺于带有载玻片的24孔板中，放细胞孵箱培养细胞贴壁并铺单层。24小时后，弃去培养基用PBS洗3次，摇床微摇每次5min。4%多聚甲醛固定10min。PBS洗3次，摇床微摇每次5min。用含0.5% TritonX-100的PBS透化10min。PBS洗3次，摇床微摇每次5min。加3%BSA封闭，室温静置15min。分别加入0μM，0.75μM，3μM的多肽FITC-YW7，37度静置5min。PBS洗3次，摇床微摇每次5min。加入DAPI染液，37度静置15min。将24孔板中的载玻片取出，倒扣在加有抗荧光淬灭封片剂的载玻片上，避光4度湿盒保存。共聚焦显微镜定位FITC-YW7在细胞的位置，并鉴定多肽FITC-YW7与过表达Annexin A2胰腺癌细胞的特异性靶向作用。
5.2流式细胞术鉴定多肽FITC-YW7与胰腺癌Panc-1细胞的结合能力
将HPDE6-C7和 PANC-1细胞铺于带有载玻片的6孔板中，放细胞孵箱培养细胞贴壁并铺满单层。24小时后，弃去培养基，加胰酶消化1min，离心1000rpm 5min，用含有10%的血清停止消化，弃去上清液，PBS洗1次，离心1000rpm 5min，弃上清。加入0.75μM的多肽FITC-YW7，混合均匀，37度孵育5min。离心1000rpm 5min，弃上清。加PBS洗一遍，室温1000rpm离心5min，弃上清。加300ulPBS混合均匀。流式细胞仪检测。
5.3免疫荧光鉴定多肽FITC-YW7与Annexin A2在胰腺癌Panc-1细胞表面的共定位
将PANC-1细胞铺于带有载玻片的24孔板中，放细胞孵箱培养细胞贴壁并铺单层。24小时后，弃去培养基用PBS洗3次，摇床微摇每次5min。4%多聚甲醛固定10min。PBS洗3次，摇床微摇每次5min。用含0.5% TritonX-100的PBS透化10min。PBS洗3次，摇床微摇每次5min。加3%BSA封闭，室温静置15min。按比例稀释加入Annexin A2抗体，4度静置过夜孵育。PBS洗3次，摇床微摇每次5min。按比例稀释加入山羊抗兔IgG 荧光二抗（TRITC），37度静置孵育1.5小时。加入0.75μM的多肽FITC-YW7，37度静置孵育5min。PBS洗3次，摇床微摇每次5min。加入DAPI染液，37度静置15min。将24孔板中的载玻片取出，倒扣在加有抗荧光淬灭封片剂的载玻片上，避光4度湿盒保存。共聚焦显微镜检测绿色荧光和红色荧光在细胞的位置，并鉴定多肽FITC-YW7和Annexin A2蛋白是否在细胞表面共定位。
结果如图5所示，图5为多肽FITC-YW7与胰腺癌Panc-1细胞特异性靶向结合能力的体外鉴定结果图。其中图5（A）为免疫荧光验证多肽FITC-YW7与胰腺癌Panc-1细胞特异性靶向结合能力的荧光结果图和柱形图，荧光结果图和柱形图显示胰腺癌细胞PANC-1和HPDE6-C7分别与0μM，0.75μM，3μM FITC-YW7孵育5min时，多肽FITC-YW7与过表达Annexin A2胰腺癌细胞结合的荧光强度随着FITC-YW7浓度的增加而升高，且在0.75μM时即可显示较高的荧光强度和差异性（P<0.05）。*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001。图5（B）为流式细胞术鉴定多肽FITC-YW7与胰腺癌Panc-1细胞特异性靶向结合能力的实验结果图和柱形图，实验结果图和柱形图显示多肽FITC-YW7与胰腺癌Panc-1细胞具有特异性靶向结合能力。PANC-1和HPDE6-C7分别用0.75μM FITC-YW7孵育5min，在PANC-1细胞上观察到强荧光信号，而在HPDE6-C7细胞上检测到较弱的荧光信号。*P <0.05，**P<0.01，***P<0.001。图5（C）为免疫荧光鉴定多肽FITC-YW7与Annexin A2在胰腺癌Panc-1细胞表面共定位的荧光结果图和柱形图，荧光结果图和柱形图显示使用Annexin A2抗体和多肽FITC-YW7与胰腺癌细胞共孵育，多肽FITC-YW7和Annexin A2在细胞表面共定位，交叉覆盖率在60%以上。*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001。
从实验例中可以得出，本发明的多肽具有靶向膜联蛋白A2的特性。既可以作为多肽分子探针以准确筛查过表达Annexin A2的肿瘤；也可以作为肿瘤导向多肽，与抗肿瘤的药物偶联，作为靶头增加药物或载有药物的载体如纳米材料、脂质体等在过表达AnnexinA2的细胞中的含量，再添加药学上可接受的辅料或佐剂制成新型的更有效的靶向抗癌药物。用于多种过表达Annexin A2肿瘤的靶向治疗和成像；还可以优化将多肽本身作为多肽抑制剂，阻断Annexin A2与相关的蛋白相互作用 。
<110> 辽宁医学诊疗科技研发中心有限公司
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<160> 1
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 7
<212> PRT
<213> Artificial sequence
<400> 1
Tyr Trp Arg Gly Val Tyr Asn
1 5
Claims (6)
1.一种靶向识别膜联蛋白A2的亲和短肽及其制备方法与用途，其特征在于，其氨基酸序列为：YWRGVYN。
2.根据权利要求1所述的Annexin A2特异结合肽，其特征在于，所述结合肽的氨基酸序列如序列表所示。
3.一种多肽分子探针，包括本发明提供的多肽，包含编码的核苷酸序列如序列表所示，以准确筛查过表达Annexin A2的肿瘤。
4.一种肿瘤导向多肽，其特征在于，所述结合肽的氨基酸序列如序列表所示，与抗肿瘤的药物偶联，作为靶头增加药物或载有药物的载体如纳米材料、脂质体等在过表达AnnexinA2的细胞中的含量，再添加药学上可接受的辅料或佐剂制成新型的更有效的靶向抗癌药物。
5.一种显像剂，其特征在于，所述结合肽的氨基酸序列如序列表所示，用于多种过表达Annexin A2肿瘤的靶向治疗和成像。
6.一种多肽抑制剂，其特征在于，所述结合肽的氨基酸序列如序列表所示，可阻断Annexin A2与相关的蛋白相互作用。
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| 易君等: "膜联蛋白A2在自身免疫性疾病中的作用", 免疫学杂志, no. 12, pages 1092 - 1096 * |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN113209315A (zh) * | 2021-05-10 | 2021-08-06 | 中国医科大学 | 靶向肿瘤的多肽探针及应用 |
| CN116375802A (zh) * | 2022-07-06 | 2023-07-04 | 浙江大学 | 一种小窝膜联蛋白AnnA1的亲和多肽及应用 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN112409447B (zh) | 2023-06-20 |
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