WO2015069044A1 - ｐ53 단백질 및 ｐ15 단백질이 결합된 융합 단백질 및 이를 포함하는 암의 예방 또는 치료용 조성물 - Google Patents

ｐ53 단백질 및 ｐ15 단백질이 결합된 융합 단백질 및 이를 포함하는 암의 예방 또는 치료용 조성물 Download PDF

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WO2015069044A1
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fusion
cancer
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이재일
김정민
심선희
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삼성전자 주식회사
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Definitions

  • Fusion protein conjugated with p53 protein and pl5 protein and composition for preventing or treating cancer comprising the same
  • the present invention relates to a fusion protein in which a P 53 protein and a pl5 protein are combined, and a pharmaceutical composition for preventing or treating cancer.
  • cells circulate through a series of stages, including the G1 phase, DNA replication (S phase), G2 phase (G2 phase), and cell division (M phase). This is called the cell cycle.
  • Cell division is a substantial step in which cells proliferate through mitosis and cytoplasmic division.
  • DNA replication groups ⁇ G1 and G2, excluding cell division are called interphase.
  • Groups G1 and G2 contain checkpoints that regulate the cell cycle, which plays an important role in preventing cells from proliferating abnormally. After checking at the checkpoint whether the conditions for passing to the next stage of the cell cycle have been met, the DNA replicator or cell divider will proceed if all conditions are met. Inadequate control of cell proliferation at these checkpoints leads to abnormal cell proliferation such as cancer.
  • CDK eye 1 in-dependent kinase
  • Cyclin-CDK complexes induce cell division by phosphorylating proteins involved in cell proliferation.
  • Inducing proteins are mainly Cyclin D / E, CDK 4/6, and CDK 4/6
  • Phosphorylation of b (Retinoblastoma) protein enables the transcriptional activity of the transcription factor E2F.
  • the proteins that induce cell division are mainly CyclinA / B, CDK 2/1, These Cycl in-CDK complexes are referred to as M-phase promoting factor (MPF).
  • M-phase promoting factor MPF
  • p21 protein which acts when DNA is damaged at the G1 checkpoint.
  • the p21 gene is expressed by p53, a tumor suppressor gene that is activated when DNA is damaged.
  • p21 inhibits the phosphorylation of Rb protein by binding to the Cyc l in—CDK complex that induces DNA replicators and inhibiting the kinase activity of CDK4 / 6/2.
  • the cells stay in G1 phase and have time to repair damaged DNA. If the DNA damage is so severe that the cell cannot accept it, p53 expresses the gene of Bax protein, an apoptosi s-inducing gene.
  • the action of p53 in the regulation of cell proliferation is to express p21 gene to temporarily arrest cell growth (growth arrest), or p53 protein combined with p53-binding ASPP protein to express Bax gene
  • p21 gene to temporarily arrest cell growth (growth arrest)
  • p53 protein combined with p53-binding ASPP protein to express Bax gene
  • Apoptosis also known as progra ed cel l death, allows for cell death at the individual level, such as when cells are no longer needed within a tissue, when they have been invaded by a virus or converted into cancer cells. This is the mechanism by which cells commit themselves.
  • CDK inhibitors that regulate the cell cycle can be classified into two categories, CIPCCDK inhibitor protein (FPC) and family inhibitor of INK4 (Inhibitors of Eye 1).
  • CIP has p21 and p27.
  • INK4 mainly inhibits the activity of CDK 4, 6 and there are pl5, pl6, pl8, pl9.
  • One embodiment provides a fusion protein comprising a p53 protein and a pl5 protein.
  • Another embodiment provides pulleynucleotides that co-occupy the fusion protein well.
  • Another embodiment provides a recombinant vector comprising the polynucleotide.
  • Another embodiment provides a cell transformed with the recombinant vector.
  • Another embodiment provides a method of preparing a fusion protein comprising culturing the transformed cells.
  • Another embodiment provides a pharmaceutical composition for preventing and / or treating cancer comprising the fusion protein as an active ingredient.
  • Another embodiment provides a method of treating cancer comprising administering to a subject a therapeutically effective amount of said fusion protein.
  • the fusion protein and the pharmaceutical composition comprising the same as an active ingredient according to one embodiment can be effectively used for the prevention or treatment of cancer. Also the fusion Since the protein has no immunogenicity, it is useful as a safe anti-cancer protein, has a specific effect on cancer cells, has fewer side effects, and is applicable to the prevention and / or prevention of almost all kinds of cancers. Excellent effects can be expected for solid cancers that do not work.
  • FIG. 1 schematically shows an example of a fusion protein according to one embodiment.
  • FIG. 2 is a graph showing the change in cancer tissue size (mm 3 ) according to the number of administrations indicated by the fusion protein according to one embodiment in the HCT-116 xenograft mouse model.
  • One embodiment of the present invention is a p53 protein or fragments thereof and pl5 protein
  • the fusion protein may be an in vitro stabi li zat ion protein, a membrane transfer sequence (MTS) domain, a nucleus-cytoplasm s ignal domain, and an in vivo stabilization protein.
  • Protein in vivo stabi li zat ion protein
  • MTS membrane transfer sequence
  • Protein in vivo stabi li zat ion protein
  • Another example is to pore a polynucleotide encoding said fusion protein.
  • Another example provides a recombinant vector comprising the polynucleotide.
  • Another example provides a cell transformed with the recombinant vector.
  • Another example provides a method for producing a fusion protein comprising culturing the transformed cells.
  • compositions for preventing and / or treating cancer comprising the fusion protein as an active ingredient.
  • the pharmaceutical composition may further comprise a pharmaceutically acceptable carrier, diluent and / or excipient in an amount normally used as necessary.
  • CDK Cycl in-dependent kinase
  • INK4 INK4
  • the fusion protein according to one embodiment of the present invention is linked to the p53 protein that regulates the expression of the CIP family protein and the pl5 protein belonging to the INK4 family protein, and simultaneously exerts CIP family protein activity and INK4 protein activity to prevent cancer and And / or a therapeutic effect may be obtained.
  • the p53 protein has an amino acid sequence provided by NCBI access ion number NP_000537 (SEQ ID NO: 1)
  • P53 protein may be a polypeptide or a fragment thereof.
  • P53 protein is used herein to mean both full-length protein and fragments thereof unless otherwise stated.
  • the p53 protein may be a transcriptional activation domain of p53 protein having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 (Glu Thr Phe Ser Asp Leu Trp Lys Leu Leu Pro Glu Asn).
  • the p53 protein fragment having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 means a transcriptional active domain comprising the 18th to 26th amino acid sequence of the human p53 protein, which is a site that binds to Mdm2 in the p53 protein. Of p53.
  • the transcriptional activation domain greatly increases the stability of p53 in vivo by binding to Mdm2, which is responsible for p53 degradation, and expresses the p21 gene encoding the CDK inhibitor protein by the action of p53 to temporarily stop cell proliferation and p53-binding.
  • P53 combined with the protein aptosi s-st imul at ing protein of p53, expresses the Bax gene and plays a role in inducing cell death.
  • the tumor suppressor pl5 protein plays a role in inhibiting the activity of CDK 4,6. Therefore, the fusion protein in which the transcriptional activation domain of p53 and the pl5 protein are combined and the pharmaceutical composition containing the same as an active ingredient can be very useful as a new anticancer agent.
  • the pl5 protein has an amino acid sequence provided by NCBI accession number NPJ304927 (SEQ ID NO: 3)
  • pl5 protein It may be a polypeptide or a fragment thereof.
  • the pl5 protein may be a polypeptide or a fragment thereof.
  • the pl5 protein may be a polypeptide or a fragment thereof.
  • solubility To improve the solubility (solubi li ty), it affects the overall protein activity Some amino acid residues may be modified (substituted, deleted, added, deleted, etc.) as long as they do not reach.
  • sequence of linking the p53 protein and the pl5 protein in the fusion protein is not limited, and includes both N-terminal p53 protein-pl5 protein-C terminus or N-terminal-pl5 protein-p53 protein-C terminus forms.
  • the fusion protein to which the p53 protein fragment of SEQ ID NO: 2 and the pl5 protein of SEQ ID NO: 3 is bound may have an amino acid sequence of SEQ ID NO: 4.
  • the fusion protein is an in vitro stabilization protein, a membrane transfer sequence (MTS) domain, a nuclear cytoplasmic signal domain, and an in vivo stabilization protein. It may further comprise one or more polypeptides selected from the group consisting of proteins (in vivo stabilization protein).
  • MTS membrane transfer sequence
  • the position of the added polypeptide in the fusion protein is not limited, and the one or more additional polytide may be independently included between the N-terminal, C-terminal, or p53 protein and pl5 protein of the fusion protein. .
  • the fusion protein in addition to the p53 protein and pl5 protein, in vitro stabilization protein, membrane transmission sequence (MTS) domain, nuclear_cytoplasmic signal
  • the fusion protein to which the p53 protein and the pl5 protein included are " fusion fragment of p53 protein and pl5 protein. "
  • the fusion protein is p53 protein and pl5 protein
  • the fusion protein comprising N-terminus to C-terminus, at least one selected from the group consisting of an in vitro stabilizing protein, a membrane permeation sequence domain, and a nuclear cytoplasmic signal domain in the N′-terminus direction of the p53 protein Further, or may further comprise at least one member selected from the group consisting of a membrane permeation sequence domain, a nuclear-cytoplasmic signal domain, and an in vivo stabilizing protein in the C-terminal direction of the pl5 protein.
  • the fusion protein is a fusion protein comprising a pl5 protein and a p53 protein in an N-terminus to a C-terminus order.
  • At least one member selected from the group consisting of cytoplasmic signal domains or at least one member selected from the group consisting of a membrane permeation sequence domain, a nuclear-cytoplasmic signal domain, and an in vivo stabilizing protein in the C-terminal direction of the p53 protein. It may be to include the above.
  • in vitro stabilizing protein in vitro stabilization protein (in vitro stabi li zat ion protein)
  • in vitro stabilization protein in vitro stabi li zat ion protein
  • the ex vivo stabilizing protein is part of the fusion protein and should not induce immunogenicity in vivo.
  • the ex vivo stabilizing protein when introduced into the fusion protein, it is preferably located in the N-terminal direction of the fusion protein, but is not limited thereto. Also preferably, the stabilizing protein in vivo may additionally be located between pl5 and p53 in addition to both ends of the fusion protein. According to one embodiment, the ex vivo stabilizing protein may be, but is not limited to, ubiquitin or ubiquitin-like protein.
  • Ubiquitin (ubiquit in, Ub) is the most conserved protein found in nature and consists of 76 amino acid sequences and is a water soluble protein that shows perfect homology between evolutionarily diverse species such as insects, trout and humans. Ubiquitin is also known as a protein that is stable to changes in pH, is not easily denatured even at high temperatures, and is stable to proteases.
  • ubiquitin can improve the insolubility of the fusion protein.
  • the ubiquitin or ubiquitin-like protein (ubiquit in-l ike protein,
  • Ubl may be selected from the group consisting of wild type ubiquitin, wild type ubiquitin-like protein, mutant ubiquitin and mutant ubiquitin-like protein.
  • the mutant ubiquitin means that the amino acid sequence of the wild type ubiquitin is changed to another amino acid sequence, for example, ubiquitin in which Lys of wild type ubiquitin is replaced with Arg, and / or wild type ubiquitin C—terminal RGG.
  • Ubiquitin modified to RGA ie, Gly present at 76th of the ubiquitin wild type polypeptide is substituted with Ala).
  • the substitution is at least one selected from Lys present at 6, 11, 27, 29, 33, 48, and 63 of the wild type ubiquitin.
  • the substitution may be made at the position of Lys, independently or in combination.
  • the wild type ubiquitin may be composed of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 13 and mutant ubiquitin may be composed of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 14 or SEQ ID NO: 15.
  • the ubiquitin-like protein is a protein having similar characteristics to ubiquitin, for example, Nedd8 (NP_006147.1, ⁇ J306156.1), SUM0-1 (NP_001005781.1, ⁇ _001005781), SUM0 -2 (NP_008868.3, ⁇ _006937.3), NUBKNP— 001230280.1, NM_001243351.1), ubi quit in-homology domain protein PIC1 (AAB40388), UBL3 (NP_009037.1, NM_007106.3), UBL5 (NP_001041706. 1, # 001048241.2), ISG15 (NP_005092.1, NM—005101.3), etc., but is not limited thereto.
  • Nedd8 NP_006147.1, ⁇ J306156.1
  • SUM0-1 NP_001005781.1, ⁇ _001005781
  • SUM0 -2 NP_008868.3, ⁇
  • the ubiquitin or ubiquitin-like protein may comprise an amino acid sequence cleavable by a protease or an amino acid sequence not cleaved by the protease at the C-terminus.
  • Amino acid sequences cleavable by the protease can be identified through a search database known in the art. E.g,
  • the fusion protein to which the ⁇ 53 protein and the ⁇ 15 protein are bound may contain a membrane permeation sequence domain and / or a stabilizing protein in vivo.
  • the polypeptide since the polypeptide has a very short length, the ⁇ 53 protein and the ⁇ 15 protein bind to each other. Done It does not affect the function of the fusion protein. Also, within the cell
  • ubiquitin or ubiquitin-like proteins Cleavage of ubiquitin or ubiquitin-like proteins by proteases . Even if ubiquitin or ubiquitin-like protein is not immunogenic, it is not only safe in vivo, but also does not fold because it does not contain cysteine, so that the fusion protein combined with p53 protein and pl5 protein does not cause fusion protein structure change. It does not affect its function within.
  • membrane transfer refers to the ability to deliver a fusion protein to be delivered intracellularly or into the nucleus on in vitro and / or in vivo.
  • -Also membrane transfer sequence (MTS) domain
  • MTS membrane transfer sequence domain
  • the membrane permeation sequence domain is the N-terminal Has a single hydrophobic region, forms a helix structure, exhibits flexibility, and has relatively short amino acids (7 to 17 amino acids).
  • the membrane permeable sequence domain may be any polypeptide having an amino acid sequence that can pass through the cell membrane of the phospholipid bilayer per se, but is not particularly limited. , It may be composed of the amino acid sequence of SEQ ID NO.
  • the membrane permeation sequence domain when introduced into the fusion protein, it may be linked to the C terminus of the ex vivo stabilizing protein or the N terminus of the p53-pl5 fragment, but is not limited thereto.
  • nucleus-cytoplasm signal domain is interpreted to mean a polypeptide sequence that serves to transport fusion proteins into or out of the nucleus.
  • the nuclear cell cytoplasmic signal domain is NLS (nucleus location sequence) domain or
  • NES nucleus export sequence
  • the NLS domain is characterized by proteins that are transported from the cytoplasm to the nucleus
  • the NES domain is characterized by proteins that are transported from the nucleus to the cytoplasm, all of which refer to polypeptides having an amino acid sequence that can pass through the nuclear membrane. This is not particularly limited.
  • a polypeptide that can be used as the NLS domain can be, for example, a polypeptide represented by the following general formula:
  • the present invention may be KKKRK (SEQ ID NO: 17), PKKKRKV (SEQ ID NO: 18), or PMKRVKLD (SEQ ID NO: 19), but is not limited thereto.
  • polypeptide that can be used as the NLS domain may be a polypeptide represented by the following general formula:
  • ' ⁇ ' is lysine
  • R ' is arginine
  • K / R is lysine or arginine
  • (K / R) 3/5" is selected from the group consisting of lysine and arginine.
  • X10-12 refers to ten to twelve arbitrary amino acids, each identical or different.
  • KRPMTKKAGQAKKKK SEQ ID NO: 20
  • it may be KRPMTKKAGQAKKKK (SEQ ID NO: 20) and the like, but is not limited thereto.
  • Polypeptides that can be used as the NES domain can be, for example, polypeptides represented by the following general formula:
  • L is leucine
  • ⁇ is isoleucine
  • V is valine
  • phenylalanine is methionine
  • X is any amino acid
  • LX (2, 3) is leucine And any amino acid that is the same or different at each of the second and third positions following it
  • [LIVFM] -X (2, 3)” is LI M and Refers to any amino acid, identical or different, each present at the second and third positions following it.
  • the nuclear-cytoplasmic signal domain in the fusion protein plays an important role in increasing the solubility of the protein in addition to the important task of moving the fusion protein into and out of the nucleus. When located close to the C-terminus of the fusion protein, the solubility is increased. It is even more helpful.
  • nuclear-cytoplasmic signal domain is basic and is susceptible to attack by C-terminal peptidase, which is stabilized in vivo as described above.
  • proteins eg., serum albumin, etc.
  • proteins eg. serum albumin, etc.
  • they prevent the attack of C-terminal peptidase to allow the nuclear-cytoplasmic signaling domain to function.
  • in vivo stabi l zat ion protein refers to a protein that provides stability so that the fusion protein can be stably present in the living body in which the fusion protein substantially functions.
  • the in vivo stabilizing protein is part of the fusion protein,
  • the in vivo stabilizing protein is MT (alpha 1 ant i trypsin; SEQ ID NO: 21), serum albumin, serum albumin binding peptide (serum albumin binding peptide; SABP; SEQ ID NO: 22), Fc and PEG polyethyleneglyco l) may be one or more selected from the group consisting of, but is not limited thereto.
  • the fusion protein may further comprise at least one selected from the group consisting of an in vitro stabilizing protein, a membrane permeation sequence domain, a nuclear ⁇ cytoplasmic signal domain, and an in vivo stabilizing protein, the details of which are described above. same.
  • the fusion protein is composed of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9 or SEQ ID NO: 10.
  • the fusion protein of SEQ ID NO: 4 is a fusion protein in which a p53 protein fragment of SEQ ID NO: 2 and a pl5 protein of SEQ ID NO: 3 are combined.
  • the fusion protein of SEQ ID NO: 6 is a fusion protein bound in the sequence of mutant ubiquitin [Ub7KR (G76A)]-p53 fragment -pl5-NLS, wherein amino acid sequences 1-29 of the sequence are purified tags (e.g., Hi s-tag ) And cleavage sequences.
  • the fusion protein of SEQ ID NO: 7 is the 1-29 amino acid sequence is removed from the fusion protein of SEQ ID NO: 6.
  • the fusion protein of SEQ ID NO: 9 is mutant
  • Ubiquitin [Ub7KR (G76A)] -p53 fragment -pl5-NLS-SABP The fusion protein bound in sequence, wherein the amino acid sequence of the 1 to 29 amino acid sequence of the purified tag (eg Hi s-tag) and cleavage sequence (cleavage site ).
  • the fusion protein of SEQ ID NO: 10 is the 1-29 amino acid sequence is removed from the fusion protein of SEQ ID NO: 9.
  • the present invention also provides a pharmaceutical composition for preventing or treating cancer, comprising a fusion protein comprising a p53 protein or a fragment thereof, and a pl5 protein as an active ingredient.
  • the fusion protein may further include at least one selected from the group consisting of an in vitro stabilizing protein, a membrane permeation sequence domain, a nuclear-cytoplasmic signaling domain, and an in vivo stabilizing protein, and the details thereof are as described above. same.
  • the fusion protein is N-(2-aminoethyl)-2-aminoethyl-N-(2-aminoethyl)-2-aminoethyl-N-(2-aminoethyl)-2-aminoethyl-N-(2-aminoethyl)-2-aminoethyl-N-(2-aminoethyl)-2-aminoethyl-N-(2-aminoethyl)-2-aminoethyl-N-(2-aminoethyl)-2-aminoethyl-N-(2-aminoethyl)-2-aminoethyl-N-(2-aminoethyl)-2-aminoethyl-N-(2-aminoethyl)-2-aminoethyl-N-(2-aminoethyl)-2-aminoethyl-N
  • a fusion protein with a pl5 protein linked to the C terminus of the p53 protein a fusion protein with a pl5 protein linked to the C terminus of the p53 protein
  • a fusion protein with a p53 protein linked to the C terminus of the pl5 protein a fusion protein with a p53 protein linked to the C terminus of the pl5 protein
  • a fusion protein comprising a nuclear-cytoplasmic signal domain, a membrane permeation sequence (MTS) linked to the C terminus of the nuclear-cytoplasmic signal domain, and a fusion fragment of a p53 protein and a pl5 protein linked to the C terminus of the membrane permeable sequence;
  • MTS membrane permeation sequence
  • a fusion protein comprising a membrane permeation sequence (MTS) and a fusion fragment of a p53 protein and a pl5 protein linked to the C terminus of the membrane permeation sequence;
  • MTS membrane permeation sequence
  • An in vitro stabilizing protein a nuclear-cytoplasmic signal domain linked to the C terminus of the in vitro stabilizing protein, a membrane permeation sequence linked to the C terminus of the nuclear-cytoplasmic signal domain, and a p53 protein linked to the C terminus of the membrane permeable sequence pl5 Fusion proteins, including fusion fragments of proteins;
  • a fusion protein comprising an in vitro stabilizing protein, a membrane permeation sequence linked to the C terminus of the ex vivo stabilizing protein, and a fusion fragment of a p53 protein and a pl5 protein linked to the C terminus of the membrane permeation sequence;
  • An in vitro stabilizing protein a membrane permeation sequence linked to the C terminus of the ex vivo stabilizing protein, a nuclear-cytoplasmic signal domain linked to the C terminus of the membrane permeable sequence, and a p53 protein and a pl5 protein linked to the C terminus of the nuclear cytoplasmic signal domain Fusion proteins comprising fusion fragments of;
  • fusion protein comprising a nuclear-cytoplasmic coral domain linked to;
  • An in vitro stabilizing protein a membrane permeation sequence linked to the C terminus of the ex vivo stabilizing protein, a fusion fragment of p53 protein and a ⁇ 15 protein linked to the C terminus of the membrane permeation sequence, and a C terminal of the fusion fragment of the ⁇ 53 protein and a ⁇ 15 protein
  • a fusion protein comprising a linked nuclear-cytoplasmic signal domain and an in vivo stabilizing protein linked to the C terminus of the nuclear-cytoplasmic signal domain;
  • a fusion protein comprising an in vitro stabilizing protein, a fusion fragment of a ⁇ 53 protein and a ⁇ 15 protein linked to a C terminus of the in vitro stabilizing protein, and a nuclear-cytoplasmic signal domain connected to a C terminus of a fusion fragment of the ⁇ 53 protein and a ⁇ 15 protein;
  • a fusion protein comprising an in vitro stabilizing protein and a fusion fragment of a ⁇ 53 protein and a ⁇ 15 protein linked to the C terminus of the in vitro stabilizing protein;
  • Fusion protein comprising an in vitro stabilizing protein, a fusion fragment of p53 protein and pl5 protein linked to the C terminus of the in vitro stabilizing protein, an in vivo stabilizing protein linked to the C terminus of the fusion fragment of the p53 protein and pl5 protein
  • the present invention also provides a polynucleotide encoding the fusion protein, a recombinant vector comprising the polynucleotide, and a cell transformed with the recombinant vector.
  • the present invention provides a method for producing a fusion protein comprising the step of culturing the transformed cells.
  • polynuc leot ide 1 refers to deoxyribonucleotides present in single- or double-stranded form or
  • polynucleotides encompass RNA genomic sequences, cDNAs and RNA sequences transcribed therefrom, and include analogs of natural polynucleotides, unless specifically noted otherwise.
  • the polynucleotide encoding the protein complex of the present invention may include a nucleic acid sequence of SEQ ID NO: 5 or SEQ ID NO: 8.
  • the polynucleotide is not only a nucleotide sequence encoding an amino acid sequence of the fusion protein, but also a sequence of
  • complementary sequences include not only perfectly complementary sequences, but also substantially complementary sequences, which, for example, under the stringent conditions known in the art, may, for example, alter the amino acid sequence of the fusion protein.
  • substantially complementary sequences which, for example, under the stringent conditions known in the art, may, for example, alter the amino acid sequence of the fusion protein.
  • nucleotide sequence By a nucleotide sequence it is meant a sequence that can be hybridized.
  • the recombinant vector may be an expression vector, which can stably express the fusion protein in a host cell.
  • the expression vector may be a conventional one used in the art to express foreign proteins in plants, animals or microorganisms.
  • the recombinant vector may be constructed through various methods known in the art.
  • the recombinant vector can be constructed using prokaryotic or eukaryotic cells as hosts.
  • the vector is an expression vector and the prokaryotic cell is a host.
  • powerful promoters e.g.
  • replication origins that operate in eukaryotic cells included in the vector include fl replication origin, SV40 replication origin, pMBl replication origin, adeno replication origin, MV replication origin and BBV replication origin, etc. It is not limited to this.
  • promoters derived from the genome of mammalian cells eg, metallothionine promoters
  • mammals eg, metallothionine promoters
  • Promoters derived from viruses can be used, and polyadenylation sequences are generally used as transcription termination sequences. Can be included.
  • the transformed cell may be any host cell known in the art as the host cell capable of continuously cloning or expressing the recombinant vector, and as a prokaryotic cell, for example, E. coli Bacillus genus strains such as JM109, E. coli BL21, E. coli RRl, E. coli LE392, E. coli B, E. coli X 1776, E.
  • E. coli Bacillus genus strains such as JM109, E. coli BL21, E. coli RRl, E. coli LE392, E. coli B, E. coli X 1776, E.
  • coli W3110 Bacillus subtilis, Bacillus thuringiensis, and ' Enterococci and strains such as Salmonella typhimurium, Serratia marsonsons, and various Pseudomonas species
  • eukaryotic cells as host cells — Saccharomyce cerevisiae, insect cells, plant cells and animal cells, e.g.
  • CH0 cell lines Choinese hamster ovary
  • W138 ⁇
  • COS—7 293, HepG2, 3 ⁇ 3, RIN and MDCK cell lines and the like
  • CH0 cell lines Choinese hamster ovary
  • COS COS—7, 293, HepG2, 3 ⁇ 3, RIN and MDCK cell lines and the like
  • the delivery of the polynucleotide or recombinant vector comprising the same into a host cell may employ a delivery method well known in the art.
  • a delivery method well known in the art.
  • the host cell is a prokaryotic cell
  • a CaCl 2 method or an electroporation method may be used.
  • the host cell is a eukaryotic cell
  • a micro-injection method, a calcium phosphate precipitation method, an electroporation method, Liposomal-mediated transfection methods and gene bombardments may be used, but are not limited thereto.
  • the method for selecting the transformed host cell by the selection marker Using the expressed phenotype, it can be easily carried out according to methods well known in the art.
  • the selection marker is a specific antibiotic resistance gene
  • the transformant can be easily selected by culturing the transformant in a medium containing the antibiotic.
  • Cultivation of the transformed cells can be carried out through various methods known in the art.
  • the transformed cells were inoculated in YT liquid medium to incubate the culture, and when the cell density reached a certain level, IPTG was added to the medium to induce protein expression by the lacl promoter.
  • Proteins secreted into cells or into the medium can be obtained in purified form according to various purification methods known in the art. Purification methods, for example, by solubility fractionation with ammonium sulphate, size fractional filtration and various chromatography (made for separation according to size, charge, hydrophobicity or affinity). Through the purified protein can be obtained. For example, when the fusion protein is fused to GST, the desired protein can be easily obtained by using a resin column bound to glutathione or a Ni 2+ -NTA Hi s-binding resin column when fused to 6x Hi s. .
  • the fusion of p53 and pl5 included in the fusion protein significantly increases the stability of p53, temporarily expresses the p21 gene to stop cell proliferation, expresses the Bax gene, induces cell death, and CDK. Because it plays a role of inhibiting the activity of 4, 6, it is effective as an active ingredient in the prevention and / or treatment of cancer.
  • a pharmaceutical composition for the prevention and / or treatment of cancer comprising the fusion protein as an active ingredient.
  • the pharmaceutical composition may further comprise a pharmaceutically acceptable carrier, diluent and / or excipient in an amount conventionally used as necessary.
  • the pharmaceutically acceptable carrier is commonly used in the formulation, lactose, textose, sucrose, sorbbi, manny, starch, acacia rubber, calcium phosphate, alginate, gelatin, silicate, microcrystalline Cellulose, polyvinylpyridone, cellulose, water, syrup, methyl cellulose, Methylhydroxybenzoate, propylhydroxybenzoate, talc, stearic acid magnesium, mineral oil and the like, but are not limited thereto.
  • the pharmaceutical composition may further include lubricants, wetting agents, sweeteners, flavoring agents, emulsifiers, suspending agents, preservatives, and the like in addition to the above components.
  • a method of preventing and / or treating cancer comprising administering a therapeutically effective amount of the fusion protein to a patient in need thereof.
  • the method of preventing and / or treating cancer may further comprise identifying a patient in need of prevention and / or treatment of cancer prior to the administering step.
  • use is provided for use in the prophylaxis and / or treatment of cancer of the fusion protein, or for use in the manufacture of a medicament for the prevention and / or treatment of cancer of the fusion protein.
  • the fusion protein or a pharmaceutical composition comprising the same as an active ingredient may be prepared in unit dose form or formulated using a pharmaceutically acceptable carrier and / or excipient according to a method which can be easily carried out by those skilled in the art, or in a multi-dose container. It can be prepared by incorporation.
  • the formulation may be in the form of solutions, suspensions, syrups or emulsions in oils or aqueous media, or may be in the form of axes, powders, powders, granules, tablets or capsules, and may further comprise dispersants or stabilizers.
  • the composition may be administered as a separate therapeutic agent or in combination with other therapeutic agents, and may be administered sequentially or simultaneously with conventional therapeutic agents.
  • the fusion protein or a pharmaceutical composition for preventing or treating cancer containing the same as an active ingredient may be administered orally or parenterally.
  • parenteral administration it can be administered by intravenous injection, subcutaneous injection, intramuscular injection, intraperitoneal injection, endothelial administration, topical administration, nasal administration, pulmonary administration and rectal administration.
  • oral administration because proteins or peptides are digested, oral compositions should be formulated to coat the active agent or protect it from degradation in the stomach.
  • the composition may be administered by any device that can move the composition to target cells.
  • compositions may be prescribed in various ways depending on factors such as formulation method, mode of administration, age of patient, body weight, sex, morbidity, food, time of administration, route of administration, rate of excretion and response sensitivity. Can be. Preferred dosages of the compositions are in the range of 0.001 to 100 nig / kg on an adult basis.
  • pharmaceutically effective amount or “therapeutically effective amount” has an effect on the prevention or treatment of cancer.
  • the patient to be administered the pharmaceutical composition for preventing or treating the fusion protein or cancer comprising the same as an active ingredient may be a mammal, for example, a rodent including a primate, a rat, a mouse, etc.
  • the cancer to be prevented or treated by the fusion protein or pharmaceutical composition may be solid or hematologic cancer, for example, squamous cell carcinoma, small cell lung cancer, non-small cell lung cancer, lung adenocarcinoma, squamous cell carcinoma of the lung , Peritoneal cancer, skin cancer, skin or intraocular melanomas, rectal cancer, anal muscle cancer, esophageal cancer, small intestine cancer, endocrine cancer, parathyroid cancer, adrenal cancer, soft tissue sarcoma, urethral cancer, chronic or acute leukemia, lymphoma, gastrointestinal cancer, pancreatic cancer , Glioblastoma, cervical cancer, ovarian cancer, liver cancer, bladder cancer, breast cancer, colon cancer, colon cancer, endometrium or uterine cancer, salivary gland cancer, kidney cancer, prostate cancer, vulva cancer, thyroid cancer and head and neck cancer It is not so limited.
  • squamous cell carcinoma small cell lung cancer, non-small cell lung cancer,
  • Example 1 Preparation of expression vector of fusion protein comprising ubiquitin, transmembrane sequence domain, transcriptional activation domain of P53 protein and fusion protein of Pl5 (p53-pl5) and human serum albumin binding protein
  • ubiquitin is a kind of hydrophilic polypeptide.
  • Mutant proteins, membrane transfer sequence (MTS) domains, p53, pl5, nucleus local i zat ion signal domain (NLS), and An expression vector of the fusion protein was prepared to produce a fusion protein for intracellular delivery linked in the order of Serum Albumin Binding Peptide (SABP).
  • SABP Serum Albumin Binding Peptide
  • an expression vector for producing a fusion protein excluding one or more components from the fusion protein was prepared for a comparative experiment with the fusion protein.
  • a total of three types of expression vectors were prepared by Genotech Co., Ltd., and a vector for protein overexpression was pET-21b (+) (EMD Biosciences).
  • a total of three insert DNA fragments contained in the vector for expressing the fusion protein are as follows:
  • Ub7KR (G76A) -p53 a polynucleotide encoding a fusion protein bound in the order pl5-NLS (represented by SEQ ID NO: 5 and the nucleic acid sequence, if present in the Expressed in amino acid sequence, if not including purified tag and cleavage sequence, expressed as amino acid sequence of SEQ ID NO: 7);
  • protein complex # 72 polynucleotide encoding the fusion protein bound in the sequence Ub7KR (G76A) -MTS-p53-pl5-NLS_SABP (experimental group; Expressed in amino acid sequence of SEQ ID NO: 9. Expressed in amino acid sequence of SEQ ID NO: 10 when not including a purified tag and a cleavage sequence); And
  • protein complex # 52 polynucleotide encoding the fusion protein bound in the sequence Ub7KR (G76A) -MTS-p53-pl8-NLS-SABP (positive control; SEQ ID NO:
  • each insert DNA fragment is a nucleotide sequence that can be cleaved with Ndel at the 5 'end, Xh can be cleaved at the 3' end
  • Ndel-Xhol cleavage of the pET21b (+) vector by including a nucleotide sequence Can be inserted into the sequence.
  • FIG. 1 A schematic diagram showing possible primary structures of the fusion protein according to one embodiment is shown in FIG. 1.
  • Example 2 Expression and Purification of Fusion Proteins
  • E. co // BL2KDE3 transformed with the vector was expressed.
  • YT medium was used as a culture medium, and when the OD value was 0.5 at an absorbance of 600 nm, 0.5 mM IPTG was added thereto and further incubated at 18 ° C. for 16 hours.
  • the cultured cells were pulverized ultrasonically under 50 mM Tris-HCl complete solution (pH 8.0) containing 5% glycerol, 5 mM ⁇ -mercaptoethanol, 0.2% Triton C-100 and 0.2 M NaCl, The supernatant was obtained using a centrifuge (10,000 g).
  • the supernatant was applied to a Ni 2+ -NTA super flow column (Qiagen) equilibrated with the buffer solution, and washed complete layer solution (50 mM Tris-HCl, pH 8.0, 5% glycerol, 5 mM) corresponding to 5 times the column volume. washed with ⁇ -mercaptoethanol, 0.2% Triton X-100 and lMNaCl, followed by elution complete solution (50 mM Tris-HCl, pH 8.0, 5% glycerol, 5 mM ⁇ -mercaptoethanol, 0. Triton X). -100 and 0.2 M NaCl) eluted the fusion protein.
  • Example 2 In order to confirm the anticancer effect of the fusion proteins produced in, is injected into the subcutaneous colon cancer cell line (HCT116) in 6-week-old BALB / c nude mice with 1.0 x 10 6 cel 1 / mouse was created for the cancer tissue. Twice a week, the fusion proteins # 76, # 72, and # 52 were injected into the mouse cancer at 300 ug / 100 ul, followed by changes in the size of the cancer tissue (mm 3 ).

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Abstract

p53 단백질 및 p15 단백질이 결합된 융합 단백질 및 이를 포함하는 암의 예방 또는 치료용 약학 조성물에 관한 것이다. 일 구체예에 따른 약학 조성물에 따르면, 효과적으로 암의 예방 또는 치료가 가능하다.

Description

【명세서】
【발명의 명칭】
p53 단백질 및 pl5 단백질이 결합된 융합 단백질 및 이를 포함하는 암의 예방 또는 치료용 조성물
【기술분야】
P53 단백질 및 pl5 단백질이 결합된 융합 단백질, 및 이를 포함하는 암의 예방 또는 치료용 약학 조성물에 관한 것이다. 【배경 기술】
세포가 증식하기 위해서는 G1기 (Gl phase), DNA 복제기 (S phase), G2기 (G2phase)및 세포분열기 (M phase)를 거치는 일련의 단계를 순환하는데 , 이를 세포주기 (cell cycle)라 한다. 세포분열기는 유사분열과 세포질분열을 거쳐 세포가 증식하는 실질적인 단계이고， DNA복제기에서는 DNA가 복제되고 세포수는 변하지 않는다. 따라서, 세포주기에서 세포분열기를 제외한 DNA 복제기ᅳ G1기， G2기를 간기 (interphase)라고 한다. G1기와 G2기는 세포주기를 조절하는 체크포인트 (checkpoint)를 포함하는데, 이는 세포가 비정상적으로 증식하지 않도록 하는 중요한 역할을 한다. 체크포인트에서 세포주기의 다음 단계로 넘어가기 위한 조건이 층족되었는지를 확인한 후， 모든 조건이 만족되면 DNA복제기 또는 세포분열기가 진행된다. 이러한 체크포인트에서의 세포 증식 조절이 제대로 이루어지지 않으면 암과 같은 비정상적인 세포 증식을 유발한다.
G1 체크포인트를 지나고， DNA 복제기， G2 체크포인트를 지나서 유사분열을 하기 위해서는 CDK( eye 1 in-dependent kinase) 단백질의 활성이 필요하다. CDK는 단독으로 활성을 가질 수 없으며 Cyclin 단백질과
결합되어야 키나아제 활성을 갖게 된다. Cyclin-CDK 복합체는 세포증식에 관련된 단백질들을 인산화시켜 세포 분열을 유도한다. DNA 복제기를
유도하는 단백질들은 주로 Cyclin D/E, CDK 4/6이고， CDK 4/6은
b(Retinoblastoma) 단백질을 인산화시켜서 전사 인자인 E2F의 전사 활성을 갖게 한다. 세포분열기를 유도하는 단백질들은 주로 CyclinA/B, CDK 2/1이며， 이들의 Cyc l in-CDK복합체는 MPF(M-phase promot ing factor )라고 일컫는다. 유사분열이 완료되거나 DNA 복제가 완료되면 더 이상의 키나아제 활성이 필요하지 않으므로 Cyc l in-CDK 복합체의 Cycl in이 분해되어 CDK의 활성이 사라진다.
세포 주기 조절을 위해 Cyc l in-CDK 복합체의 활성을 조절하는 많은 인자들이 존재한다. 대표적인 것으로는 G1 체크포인트에서 DNA가 손상되었을 때 작용하는 p21 단백질이 있다. DNA가 손상되었을 시에 활성되는 종양 억제인자 유전자 (tumor suppressor gene)인 p53에 의해 p21 유전자가 발현된다. p21은 DNA 복제기를 유도하는 Cyc l in— CDK 복합체에 결합하여 CDK4/6/2의 키나아제 활성을 저해함으로써， Rb단백질의 인산화를 막는다. 그 결과， 세포는 G1기에 머물면서 손상된 DNA를 수리할 시간을 얻게 된다. 만일 DNA손상이 세포가 수용하지 못할 정도로 심하면 p53은 아톱토시스 유도 유전자 (apoptosi s-inducing gene)인 Bax 단백질의 유전자를 발현시킨다. 즉, 세포증식의 조절에 있어서 p53의 작용은 p21 유전자를 발현시켜 세포증식을 일시적으로 정지시키는 것 (growth arrest ) , 또는 p53-결합 단백질인 ASPP 단백질과 결합한 p53 단백질이 Bax 유전자를 발현시켜 아폼토시스를 유발하는 것 (apoptosi s inducing)의 두 가지로 나누어 볼 수 있다.
아픕토시스는 예정된 세포 죽음 (progra隱 ed cel l death)이라고도 하며 세포가 조직 내에서 더 이상 필요 없을 때， 바이러스의 침입을 받았거나 암세포로 변환되었을 때 등， 개체수준에서 세포의 죽음이 오히려 도움이 되면 세포 스스로 자살하는 기작이다.
세포주기를 조절하는 CDK 억제제는 크게 CIPCCDK inhibi tor protein) fami ly와 INK4( Inhibi tors of eye 1 in-dependent kinase 4) 두 가지로 분류할 수 있다. CIP 에는 p21과 p27이 있다. INK4는 주로 CDK 4 , 6의 활성을 저해하며 pl5 , pl6 , pl8 , pl9가 있다.
세포 증식을 조절하기 위해서는 종양 억제인자 유전자와 전암 유전자 (proto-oncogene)와의 균형이 유지되어야 한다. 종양 억제인자 유전자인 p53 단백질의 유전자가 변이 (mutat i on)되면， 비정상적인 세포의 아픕토시스를 유도할 수 없으므로 비정상적 세포 증식을 유발한다. 또한 정상적인 세포 증식 인자인 전암유전자가 변이 (바이러스에 의한 유전자 치환 등)되거나 과발현 되어 암유전자가 되어도 암세포와 같은 비정상적인 세포 증식을 유도한다. 암유전자는 비정상적인 활성을 갖는 성장인자， 세포내 신호전달 단백질을 만들어 잘못된 신호 전달을 유발하기 때문에 외부의 증식 신호가 없어도 세포증식이 일어난다. 또한， pl5 단백질은
CDK4/6의 활성을 저해하는 역할을 한다.
【발명의 상세한 설명】
【기술적 과제】
이러한 사실로 볼 때， 비정상적인 세포 증식으로 인한 암을 저해하기 위해 세포 주기를 조절하는 각종 인자들을 활용한 항암제의 개발이 요구되고 있는 실정이다.
【기술적 해결방법】
일 구체예는 p53 단백질 및 pl5 단백질을 포함하는 융합 단백질을 제공한다.
다른 구체예는 상기 융합 단백잘을 코당하는 풀리뉴클레오티드를 제공한다.
다른 구체예는 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 백터를 제공한다.
다른 구체예는 상기 재조합 백터로 형질전환된 세포를 제공한다. 다른 구체예는 상기 형질전환된 세포를 배양시키는 단계를 포함하는 융합 단백질의 제조방법을 제공한다.
다른 구체예는 상기 융합 단백질을 유효성분으로 포함하는 암의 예방 및 /또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.
다른 구체예는 상기 융합 단백질의 치료적 유효량을 개체에 투여하는 단계를 포함하는 암 치료방법을 제공한다.
【유리한 효과】
일 구체예에 따른 융합 단백질 및 이를 유효성분으로 포함하는 약학 조성물은 암의 예방 또는 치료에 효과적으로 사용 가능하다. 또한 상기 융합 단백질은 면역원성이 없기 때문에, 안전한 항암 치료용 단백질로서 유용하고， 암세포에 특이적으로 작용하여 부작용이 적을 뿐 아니라， 거의 모든 종류의 암의 예방 및 /또는 예방에 적용 가능하고， 기존의 항암제가 효과를 발휘하지 못하는 고형암에도 우수한 효과를 기대할 수 있다.
【도면의 간단한 설명】
도 1은 일 구체예에 따른 융합 단백질의 일 예를 모식적으로 나타낸 것이다.
도 2는 HCT-116 이종이식 (xenograft ) 마우스 모델에서 일 구체예에 따른 융합 단백질이 나타내는 투여 회수에 따른 암 조직 크기 (mm3) 변화를 보여주는 그래프이다.
【발명의 실시를 위한 최선의 형태】 ■
본 발명의 일 예는 p53 단백질 또는 그 단편 및 pl5 단백질을
포함하는 융합 단백질을 제공한다. 상기 융합 단백질은 생체외 안정화 단백질 ( in vi tro stabi l i zat ion protein) , 막 투과 서열 (membrane transfer sequence， MTS) 도메인， 핵-세포질 신호 도메인 (nuc lens-cytoplasm s ignal domain) , 및 생체내 안정화 단백질 ( in vivo stabi l i zat ion protein)로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 추가로 포함할 수 있다.
또 다른 예는 상기 융합 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 계공한다.
또 다른 예는 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 백터를 제공한다.
또 다른 예는 상기 재조합 백터로 형질전환된 세포를 제공한다.
또 다른 예는 상기 형질전환된 세포를 배양시키는 단계를 포함하는 융합 단백질의 제조방법을 제공한다.
또 다른 예는 상기 융합 단백질을 유효성분으로 포함하는 암의 예방 및 /또는 치료용 약학 조성물을 제공한다. 상기 약학 조성물은 필요에 따라서 약학적으로 허용되는 담체， 희석제 및 /또는 부형제를 통상적으로 사용되는 양으로 추가로 포함할 수 있다. 앞서 설명한 바와 같이， CDK (Cycl in-dependent kinase) 단백질은 암 발생에 주요한 역할을 하고, 이의 억제제로서 CIP CDK inhibi tor protein) 계통 단백질과 INK4( Inhibi tors of cyc l in-dependent kinase 4) 계통 단백질들이 있다. 본 발명의 일 구체예에 따른 융합 단백질은 CIP 계통 단백질 발현을 조절하는 p53 단백질과 INK4 계통 단백질에 속하는 pl5 단백질이 연결된 것으로， CIP계통 단백질 활성과 INK4단백질 활성을 동시에 발휘하여 보다 우수한 암의 예방 및 /또는 치료 효과를 얻을 수 있다.
일 구체예에 따르면, 상기 p53 단백질은 NCBI access ion number NP_000537에 의하여 제공되는 아미노산 서열 (서열번호 1)을 갖는
폴리펩타이드 또는 그 단편일 수 있다. 본 명세서에서 p53 단백질은 별도의 언급이 없는 한 전장 단백질과 그 단편을 모두 의미하는 것으로 사용된다. 또한， 상기 p53단백질은 서열번호 2(Glu Thr Phe Ser Asp Leu Trp Lys Leu Leu Pro Glu Asn)의 아미노산 서열을 갖는 p53 단백질의 전사활성 도메인일 수 있다.
상기 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 p53 단백질 단편은 p53 단백질 중 Mdm2에 결합하는 부위인 인간 p53 단백질의 18 내지 26번째 아미노산 서열을 포함하는 전사활성 도메인을 의미한다. 상기 p53의 .
전사활성 도메인은 p53 분해 작용을 하는 Mdm2와 결합함으로써 생체 내에서의 p53의 안정성을 크게 증가시키며, p53의 작용으로 CDK 억제제 단백질을 암호화하는 p21 유전자를 발현시켜 세포증식을 일시적으로 정지시키고 p53-결합 단백질인 ASPP(apoptosi s-st imul at ing protein of p53)와 결합한 p53이 Bax 유전자를 발현시켜 세포 죽음을 유발하는 역할을 한다. 또한, 종양 억제제인 pl5단백질은 CDK 4 , 6의 활성을 저해하는 역할을 한다. 따라서 p53 의 전사활성 도메인과 pl5 단백질이 결합된 융합 단백질과 이를 유효성분으로 함유하는 약학 조성물은 새로운 항암제로 매우 유용하게 사용될 수 있다.
일 구체예에 따르면， 상기 pl5 단백질은 NCBI accession number NPJ304927에 의하여 제공되는 아미노산 서열 (서열번호 3)을 갖는
폴리펩타이드 또는 그 단편일 수 있다. 또한， pl5 단백질은
용해도 (solubi l i ty)를 개선하기 위한 목적으로， 전체 단백질 활성에 영향을 미치지 않는 한 일부 아미노산 잔기를 변형 (치환， 삭제， 부가, 결실 등)하여 사용할 수 있다.
상기 융합 단백질에서 p53 단백질과 pl5 단백질의 연결되는 순서는 제한이 없으며， N 말단ᅳ p53 단백질 -pl5 단백질 -C 말단 또는 N 말단 -pl5 단백질 -p53단백질 -C말단 형태 모두 포함된다. 일 구체예에서， 서열번호 2의 p53 단백질 단편과 서열번호 3의 pl5 단백질이 결합된 융합 단백질은 서열번호 4의 아미노산 서열을 갖는 것일 수 있다.
일 구체예에서， 상기 융합 단백질은 생체외 안정화 단백질 (in vitro stabilization protein) , 막 투과 서열 (membrane transfer sequence , MTS) 도메인， 핵-세포질 신호 도메인 (皿 cleus-cytoplasm signal domain), 및 생체내 안정화 단백질 (in vivo stabilization protein)으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 폴리펩타이드를 추가로 포함할 수 있다.
이 때， 추가되는 폴리펩타이드의 융합 단백질 내 위치는 제한이 없으며， 상기 추가되는 1종 이상의 폴리템타이드는 각각 독립적으로 융합 단백질의 N 말단， C 말단， 또는 p53 단백질과 pl5 단백질 사이에 포함될 수 있다.
본 명세서에서， 상기 융합 단백질이 p53 단백질과 pl5 단백질 이외에 생체외 안정화 단백질 (in vitro stabilization protein), 막 투과 서열 (membrane transfer sequence , MTS) 도메인， 핵_세포질 신호
도메인 (nucleus-cytoplasm signal domain), 및 생체내 안정화 단백질 (in vivo stabilization protein)으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 추가로 포함하는 경우， 여기에 포함된 p53 단백질과 pl5 단백질이 연결된 융합 단백질은 "p53 단백질과 pl5 단백질의 융합 단편"으로 칭하기로 한다. 바람직하게， 상기 융합 단백질은 p53 단백질 및 pl5 단백질을
N-말단에서 C-말단의 순서로 포함하는 융합 단백질에 있어서, p53 단백질의 Nᅳ말단 방향에 생체외 안정화 단백질, 막 투과 서열 도메인 및 핵ᅳ세포질 신호 도메인으로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상을 추가로 포함하거나， pl5 단백질의 C-말단 방향에 막 투과 서열 도메인， 핵-세포질 신호 도메인 및 생체내 안정화 단백질로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상을 추가로 포함하는 것일 수 있다. 또한 바람직하게， 상기 융합 단백질은 pl5 단백질 및 p53 단백질을 N-말단에서 C—말단의 순서로 포함하는 융합 단백질에 있어서， pl5 단백질의 N-말단 방향에 생체외 안정화 단백질， 막 투과 서열 도메인 및 핵-세포질 신호 도메인으로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상을 추가로 포함하거나， p53 단백질의 C-말단 방향에 막 투과 서열 도메인， 핵-세포질 신호 도메인 및 생체내 안정화 단백질로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상을 추가로 포함하는 것일 수 있다.
용어， "생체외'안정화 단백질 ( in vi tro stabi l i zat ion protein) "은 상기 융합 단백질의 생체 외부에서， 즉， 상기 융합 단백질을 실험적으로 정제를 하는 경우， 상기 융합 단백질의 용해도 및 안정성을 증진시키기 위한 단백질을 의미한다. 상기 생체외 안정화 단백질은 상기 융합 단백질의 일부로써， 생체 내에서 면역원성을 유발하지 않아야 한다.
일 구체예에서， 생체외 안정화 단백질이 융합 단백질 내에 도입돠는 경우， 융합 단백질의 N 말단 방향에 위치하는 것이 바람직하나， 이에 제한되는 것은 아니다. 또한 바람직하게， 생체내 안정화 단백질은 융합 단백질의 양 말단 외에 추가적으로 pl5 와 p53 사이에 위치할 수 있다. 일 구체예에 따르면， 상기 생체외 안정화 단백질은 유비퀴틴 또는 유비퀴틴-유사 단백질일 수 있으나， 이에 한정되지는 않는다.
유비퀴틴 (ubiqui t in , Ub)은 자연계에서 발견되는 가장 보존적인 단백질로 76개의 아미노산 서열로 이루어져 있으며 , 곤충， 송어 및 인간처럼 진화적으로 다양한 종들간의 완벽한 상동성을 보이는 수용성 단백질이다. 또한, 유비퀴틴은 pH의 변화에 대해 안정하고, 고온에서도 쉽게 변성되지 않으며， 프로테아제에 대해서도 안정성이 있는 단백질로 알려져 있다.
따라서， 유비퀴틴은 상기 융합 단백질의 불용성을 개선할 수 있다.
상기 유비퀴틴 또는 유비퀴틴 -유사 단백질 (ubiqui t in-l ike protein,
Ubl )은 야생형 유비퀴틴, 야생형 유비퀴틴 -유사 단백질， 돌연변이 유비퀴틴 및 돌연변이 유비퀴틴—유사단백질로 이루어진 군으로부터 선택되는 것일 수 있다. 상기 돌연변이 유비퀴틴은 야생형 유비퀴틴의 아미노산 서열을 다른 아미노산 서열로 바꾼 것을 의미하며， 예를 들면， 야생형 유비퀴틴의 Lys을 Arg으로 치환한 유비퀴틴， 및 /또는 야생형 유비퀴틴 C—말단 RGG를 RGA로 변경시킨 (즉 유비퀴틴 야생형 폴리펩타이드의 76번째에 존재하는 Gly이 Ala으로 치환된) 유비퀴틴을 포함한다. 일 구체예에 따르면， 상기 야생형 유비퀴틴의 Lys을 Arg으로 치환한 돌연변이형 유비퀴틴에서， 상기 치환은 야생형 유비퀴틴의 6， 11， 27， 29 , 33 , 48 및 63번째에 존재하는 Lys 중에서 선택된 1종 이상에서 이루어질 수 있으며， 치환은 상기 Lys의 위치에서 독립적으로 또는 조합하여 이루어질 수 있다. 일 구체예에 따르면， 상기 야생형 유비퀴틴은 서열번호 13의 아미노산 서열로 이루어진 것일 수 있고 돌연변이형 유비퀴틴은 서열번호 14 또는 서열번호 15의 아미노산 서열로 이루어진 것일 수 있다.
일 구체예에 따르면， 상기 유비퀴틴 -유사 단백질은 유비퀴틴과 그 특성이 유사한 단백질로， 예를 들어， Nedd8(NP_006147.1 , 匪 J306156.1) , SUM0-1(NP_001005781.1 , 丽 _001005781)， SUM0-2(NP_008868.3 , 匪 _006937.3)， NUBKNP— 001230280.1 , NM_001243351.1) , ubi quit in-homo logy domain protein PIC1 (AAB40388) , UBL3(NP_009037.1 , NM_007106.3)， UBL5(NP_001041706.1 , 匿ᅳ 001048241.2) , ISG15(NP_005092.1 , NM— 005101.3) 등으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있으나， 이에 한정하지는 않는다.
일 구체예에 따르면， 상기 유비퀴틴 또는 유비퀴틴 -유사 단백질은 C-말단에 프로테아제에 의해 절단 가능한 아미노산 서열 또는 프로테아제에 의해 절단되지 않는 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 상기 프로테아제에 의해 절단 가능한 아미노산 서열은 당업계에 공지된 검색 데이터베이스를 통해 확인할 수 있다. 예를 들어，
http : //www . expasy . org/ t oo 1 s/pept i decut t er/pept i decut t er— enzymes . html에 서 검색되는 프로테아제 및 그의 절단 가능한 아미노산 서열을 이용할 수 있다. 상기 절단 가능한 아미노산 서열이 포함되는 경우, 상기 융합 단백질이 세포 내로 투과된 다음， 세포 내의 프로테아제에 의해 유비퀴틴 또는 유비퀴틴 -유사 단백질은 절단이 되어， p53 단백질 및 pl5 단백질0 j 결합된 융합 단백질이 세포 내에서 그 기능을 할 수 있게 된다. 상기 절단 후， ρ53 단백질 및 ρ15 단백질이 결합된 융합 단백질에는 막 투과 서열 도메인 및 /또는 생체내 안정화 단백질이 포함되어 있을 수 있지만， 이들은 폴리펩타이드의 길이가 매우 짧으므로， ρ53 단백질 및 ρ15 단백질이 결합된 융합 단백질의 기능에는 영향을 미치지 않는다. 또한， 세포 내의
프로테아제에 의해 유비퀴틴 또는 유비퀴틴 -유사 단백질이 절단.되지 않더라도 유비퀴틴 또는 유비퀴틴 -유사 단백질은 면역원성이 없으므로 생체내에서 안전할 뿐 아니라， 시스테인을 포함하지 않아서 폴딩이 되지 않으므로 융합 단백질 구조 변화를 유발하지 않고 p53 단백질 및 pl5 단백질이 결합된 융합 단백질이 세포 내에서 그 기능을 발휘하는데 영향을 미치지 않는다.
용어, "막 투과 (membrane transfer)"는 인 비트로 vitro) 및 /또는 인 비보 (/ vivo) 상에서 운반 대상인 융합 단백질을 세포 내 또는 핵 내로 운반할 수 있는 능력을 의미한다. - 또한， "막 투과 서열 (membrane transfer sequence , MTS)도메인' '은 그 자체로 인지질 이중막의 세포막을 통과할 수 있는 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드를 의미한다. 상기 막 투과 서열 도메인은 그 N-말단에 단일 소수성 영역 (single hydrophobic region)을 가지고， 헬릭스 구조 (helix structure)를 형성하며， 유연성을 나타내고， 상대적으로 짧은 길이의 아미노산 (7개 내지 17개 아미노산)을 갖는 것을 특징으로 한다. 따라서， 상기 막 투과 서열 도메인의 물성은 대개 소수성을 나타낸다. 일 구체예에 따르면， 상기 막 투과 서열 도메인은 그 자체로 인지질 이중막의 세포막을 통과할 수 있는 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드이면 모두 가능하고 특별히 한정되지 않으나， 서열번호 16의 아미노산 서열로 이루어진 것일 수 있다.
일 구체예에서， 상기 막 투과 서열 도메인이 융합 단백질에 도입되는 경우에， 생체외 안정화 단백질의 C 말단 또는 p53-pl5 단편의 N 말단에 연결될 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.
용어， "핵-세포질 신호 (nucleus-cytoplasm signal) 도메인 "은 융합 단백질을 핵의 내부로 수송하거나， 핵의 외부로 수송하기 위는 역할을 하는 폴리펩타이드 서열을 의미하는 것으로 해석된다. 일 구체예에 따르면， 상기 핵ᅳ세포질 신호 도메인은 NLS(nucleus location sequence) 도메인 또는
NES(nucleus export sequence) 도메인일 수 있다. 즉， 융합 단백질을 핵 내로 이송시키기 위해서는 상기 융합 단백질에 NLS를 포함시키고， 상기 융합 단백질을 세포질에 남아 있도록 하기 위해서는 상기 융합 단백질에 NES를 포함시킬 수 있다.
NLS 도메인은 세포질에서 핵으로 수송되는 단백질들이, NES 도메인은 핵에서 세포질로 수송되는 단백질들이 특징적으로 가지고 있는데， 상기 도메인 모두 핵막을 통과할 수 있는 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드를 의미하며， 상기 아미노산 서열이 특별히 한정되지는 않는다. 상기 NLS 도메인으로 사용될 수 있는 폴리펩타이드는 예를 들어, 다음의 일반식으로 표현되는 폴리펩타이드일 수 있다:
K(K/ )X(K/R)
위 식에서， 는 리신이고， 은 아르기닌이고， "K/R' '은 리신 또는 아르기닌이고， "X" 는 임의의 아미노산을 말한다.
구체적으로는 KKKRK (서열번호 17)， PKKKRKV (서열번호 18) 또는 PMKRVKLD (서열번호 19) 등일 수 있으나， 이에 한정되지는 않는다.
다른 예로， 상기 NLS 도메인으로 사용될 수 있는 폴리펩타이드는 다음의 일반식으로 표현되는 폴리펩타이드일 수 있다:
(K/R) (K/R)X10-12(K/R)3/5
위 식에서， 'Τ'는 리신이고， "R' '은 아르기닌이고， "K/R"은 리신 또는 아르기닌이고, " (K/R)3/5" 는 리신 및 아르기닌으로 이루어진 군에서 선택되는 3개 내지 5개의 아미노산을 말하고, 'Τ'는 임의의 아미노산이고， "X10-12" 는 각각 동일하거나 상이한 10개 내지 12개의 임의의 아미노산을 말한다.
구체적으로는 KRPMTKKAGQAKKKK (서열번호 20) 등일 수 있으나， 이에 한정되지는 않는다.
NES 도메인으로 사용될 수 있는 폴리펩타이드는 예를 들어， 다음의 일반식으로 표현되는 폴리펩타이드일 수 있다:
L-X(2 , 3)-[LIVFM]-X(2 ,3)-L-X-[LI ]
위 식에서， "L"은 류신이고， " Γ는 이소류신이고， "V"는 발린이고， 는 페닐알라닌이고， 은 메티오닌이고， "X"는 임의의 아미노산이고， "L-X(2 , 3) " 은 류신 및 그 뒤인 두번째 및 세번째 위치에 존재하는 각각 동일하거나 상이한 임의의 아미노산을 말하고， " [LIVFM]-X(2 , 3) "는 LI M및 그 뒤인 두번째 및 세번째 위치에 존재하는 각각 동일하거나 상이한 임의의 아미노산을 말한다 .
상기 융합 단백질에서 핵-세포질 신호 도메인은 상기 융합 단백질을 핵 내외로 이동시키는 중요한 일을 하는 이외에도, 단백질의 용해도를 증가시키는데 중요한 역할을 하는데 융합 단백질에서 C-말단에 가깝게 위치해 있는 경우， 용해도의 증가에 더욱 도움이 된다.
이 경우 핵-세포질 신호 도메인은 염기성 (basi c)을 띄고 있어 C-말단 펩티다아제의 공격을 받기 쉬운데, 상기한 바와 같은 생체내 안정화
단백질 (예를 들어， 혈청 알부민 등)이 존재하는 경우， C-말단 펩티다아제의 공격을 막아 핵-세포질 신호 도메인이 제 기능을 할 수 있도록 한다.
용어, "생체내 안정화 단백질 ( in vivo stabi l i zat ion protein) "은 상기 융합 단백질이 실질적으로 작용하는 생체 내부에서， 상기 융합 단백질이 안정적으로 존재할 수 있도록 안정성을 부여하는 단백질을 의미한다. 상기 생체내 안정화 단백질은 상기 융합 단백질의 일부로써， 생체 내에서
면역원성을 유발하지 않아야 하며, 특히， 대상에 투여된 경우， 대상의 혈액 내에서 안정성을 획득할 수 있는 단백질이면 어떠한 단백질이라도 가능하다. 일 구체예에 따르면，상기 생체내 안정화 단백질은 MT(alpha 1 ant i trypsin ; 서열번호 21)， 혈청 알부민， 혈청 알부민 결합 펩타이드 (serum albumin binding pept ide ; SABP; 서열번호 22) , Fc 및 PEG polyethyleneglyco l )로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상일 수 있으나， 이에 한정되지는 않는다.
일 구체예에서， 상기 생체내 안정화 단백질이 융합 단백질에
도입되는 경우， 융합 단백질의 N말단， C말단， 또는 p53단백질과 pl5단백질 사이에 포함될 수 있다. ■ 상기 융합 단백질은 생체외 안정화 단백질， 막 투과 서열 도메인， 핵ᅳ세포질 신호 도메인， 및 생체내 안정화 단백질로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 추가로 포함하는 것일 수 있으며， 그 구체적 내용은 앞서 설명한 바와 같다. 예를 들어， 서열번호 4， 서열번호 6，서열번호 7， 서열번호 9또는 서열번호 10의 아미노산 서열로 이루어진 융합 단백질을 포함한다. 서열번호 4의 융합 단백질은 서열번호 2의 p53 단백질 단편과 서열번호 3의 pl5 단백질이 결합된 융합 단백질이다. 서열번호 6의 융합 단백질은 돌연변이형 유비퀴틴 [Ub7KR(G76A) ]-p53단편 -pl5-NLS순서로 결합된 융합단백질로， 상기 서열 중 1~29번째 아미노산 서열은 정제 태그 (예， Hi s-tag) 및 절단 서열 (cleavage si te)를 포함한다. 서열번호 7의 융합 단백질은 상기 서열번호 6의 융합단백질에서 1~29번째 아미노산 서열이 제거된 것이다. 서열번호 9의 융합 단백질은 돌연변이형
유비퀴틴 [Ub7KR(G76A) ]-p53단편 -pl5-NLS-SABP순서로 결합된 융합 단백질로， 상기 서열 중 1~29번째 아미노산 서열은 정제 태그 (예， Hi s-tag) 및 절단 서열 (cleavage site)를 포함한다. 서열번호 10의 융합 단백질은 상기 서열번호 9의 융합단백질에서 1~29번째 아미노산 서열이 제거된 것이다. 또한， 본 발명은 p53 단백질 또는 이의 단편, 및 pl5 단백질을 포함하는 융합 단백질을 유효성분으로 포함하는 암의 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다. - 상기 융합 단백질은 생체외 안정화 단백질， 막 투과 서열 도메인， 핵-세포질 신호 도메인， 및 생체내 안정화 단백질로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 추가로 포함하는 것일 수 있으며， 그 구체적 내용은 앞서 설명한 바와 같다.
일 구체예에 따르면, 상기 융합 단백질은
p53 단백질의 C 말단에 pl5 단백질이 연결된 융합 단백질;
pl5 단백질의 C 말단에 p53 단백질이 연결된 융합 단백질;
핵-세포질 신호 도메인， 상기 핵-세포질 신호 도메인의 C 말단에 연결된 막 투과 서열 (MTS) , 및 상기 막 투과 서열의 C 말단에 연결된 p53 단백질과 pl5 단백질의 융합 단편을 포함하는 융합 단백질;
막 투과 서열 (MTS) , 및 상기 막 투과 서열의 C 말단에 연결된 p53 단백질과 pl5 단백질의 융합 단편을 포함하는 융합 단백질;
생체외 안정화 단백질，상기 생체외 안정화 단백질의 C말단에 연결된 핵-세포질 신호 도메인， 상기 핵-세포질 신호 도메인의 C 말단에 연결된 막 투과 서열， 및 상기 막 투과 서열의 C 말단에 연결된 p53 단백질과 pl5 단백질의 융합 단편을 포함하는 융합 단백질; 생체외 안정화 단백질,상기 생체외 안정화 단백질의 C말단에 연결된 막 투과 서열， 및 상기 막 투과 서열의 C 말단에 연결된 p53 단백질과 pl5 단백질의 융합 단편을 포함하는 융합 단백질;
생체외 안정화 단백질,상기 생체외 안정화 단백질의 C말단에 연결된 막 투과 서열， 상기 막 투과 서열의 C 말단에 연결된 핵-세포질 신호 도메인 및 상기 핵ᅳ세포질 신호 도메인의 C 말단에 연결된 p53 단백질과 pl5 단백질의 융합 단편을 포함하는 융합 단백질;
생체외 안정화 단백질，상기 생체외 안정화 단백질의 C말단에 연결된 막 투과 서열, 상기 막 투과 서열의 C 말단에 연결된 p53 단백질과 pl5 단백질의 융합 단편， 및 상기 p53 단백질과 pl5 단백질의 융합 단편의 C 말단에 연결된 핵-세포질 산호 도메인을 포함하는 융합 단백질;
생체외 안정화 단백질，상기 생체외 안정화 단백질의 C말단에 연결된 막 투과 서열， 상기 막 투과 서열의 C 말단에 연결된 p53 단백질과 ρ15 단백질의 융합 단편， 상기 ρ53 단백질과 ρ15 단백질의 융합 단편의 C 말단에 연결된 핵-세포질 신호 도메인， 및 상기 핵-세포질 신호 도메인의 C 말단에 연결된 생체내 안정화 단백질을 포함하는 융합 단백질;
생체외 안정화 단백질，상기 생체외 안정화 단백질의 C말단에 연결된 막 투과 서열， 상기 막 투과 서열의 C 말단에 연결된 ρ53 단백질과 ρ15 단백질의 융합 단편， 상기 ρ53 단백질과 ρ15 단백질의 융합 단편의 C 말단에 연결된 생체내 안정화 단백질을 포함하는 융합 단백질;
생체외 안정화 단백질，상기 생체외 안정화 단백질의 C말단에 연결된 ρ53 단백질과 ρ15 단백질의 융합 단편， 및 상기 ρ53 단백질과 ρ15 단백질의 융합 단편의 C 말단에 연결된 핵-세포질 신호 도메인을 포함하는 융합 단백질;
생체외 안정화 단백질， 및 상기 생체외 안정화 단백질의 C 말단에 연결된 ρ53 단백질과 ρ15 단백질의 융합 단편을 포함하는 융합 단백질; 생체외 안정화 단백질，상기 생체외 안정화 단백질의 C말단에 연결된 ρ53단백질과 ρ15단백질의 융합 단편， 상기 ρ53단백질과 ρ15단백질의 융합 단편의 C 말단에 연결된 핵-세포질 신호 도메인， 및 상기 핵-세포질 신호 도메인의 C 말단에 연결된 생체내 안정화 단백질을 포함하는 융합 단백질; 생체외 안정화 단백질，상기 생체외 안정화 단백질의 C말단에 연결된 p53단백질과 pl5단백질의 융합 단편， 상기 p53단백질과 pl5단백질의 융합 단편의 C 말단에 연결된 생체내 안정화 단백질을 포함하는 융합 단백질
로 이루어진 군에서 선택된 것일 수 있다.
또한， 본 발명은 상기 융합 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드， 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 백터， 상기 재조합 백터로 형질전환된 세포를 제공한다. 또한， 본 발명은 상기 형질전환된 세포를 배양시키는 단계를 포함하는 융합 단백질의 제조방법을 제공한다.
용어 "폴리뉴클레오티드 (polynuc leot ide) 1' 는 단일가닥 또는 이중가닥 형태로 존재하는 디옥시리보뉴클레오티드 또는
리보뉴클레오티드의 중합체를 말한다. 상기 폴리뉴클레오티드는 RNA 게놈 서열， cDNA 및 이로부터 전사되는 RNA 서열을 포괄하며， 특별하게 다른 언급이 없는 한 천연의 폴리뉴클레오티드의 유사체를 포함한다. 일예로， 본 발명의 단백질 복합체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 서열번호 5 또는 서열번호 8의 핵산 서열을 포함하는 것일 수 있다.
상기 폴리뉴클레오티드는 상기 융합 단백질의 아미노산 서열을 코딩하는 뉴클레오티드 서열뿐만 아니라， 그 서열에
상보적인 (complementary) 서열도 포함한다. 상기 상보적인 서열은 완벽하게 상보적인 서열뿐만 아니라， 실질적으로 상보적인 서열도 포함하며， 이는 당업계에 공지된 엄격 조건 (str ingent condi t ions) 하에서， 예를 들어， 상기 융합 단백질의 아미노산 서열을 코딩하는 뉴클레오티드 서열의
뉴클레오티드 서열과 흔성화될 수 있는 서열을 의미한다.
상기 재조합 백터는， 숙주 세포 내에서 안정적으로 상기 융합 단백질을 발현시킬 수 있는， 발현용 백터일 수 있다. 상기 발현용 백터는 당업계에서 식물， 동물 또는 미생물에서 외래의 단백질을 발현하는 데 사용되는 통상의 것을 사용할 수 있다. 상기 재조합、백터는 당업계에 공지된 다양한 방법을 통해 구축될 수 있다.
상기 재조합 백터는 원핵 세포 또는 진핵 세포를 숙주로 하여 구축될 수 있다. 예를 들어， 백터가 발현 백터이고， 원핵 세포를 숙주로 하는 경우에는， 전사를 진행시킬 수 있는 강력한 프로모터 (예를 들어，
pL 프로모터， trp프로모터 , l ac프로모터， t ac프로모터， T7프로모터 등)， 해독의 개시를 위한 리보좀 결합 자리 및 전사 /해독 종결 서열을 포함하는 것이 일반적이다. 진핵 세포를 숙주로 하는 경우에는， 백터에 i함되는 진핵 세포에서 작동하는 복제원점은 f l 복제원점， SV40 복제원점， pMBl 복제원점, 아데노 복제원점， MV 복제원점 및 BBV 복제원점 등을 포함하나， 이에 한정되는 것은 아니다. 또한， 포유동물 세포의 게놈으로부터 유래된 프로모터 (예를 들어， 메탈로티오닌 프로모터) 또는 포유동물
바이러스로부터 유래된 프로모터 (예를 들어, 아데노바이러스 후기 프로모터 백시니아 바이러스 7.5K프로모터， SV40 프로모터， 사이토메갈로바이러스 프로모터 및 HSV의 tk프로모터)가 이용될 수 있으며， 전사 종결 서열로서 폴리아데닐화 서열을 일반적으로 포함할수 있다.
본 발명에서 형질전환된 세포는 상기 재조합 백터를 안정되면서 연속적으로 클로닝 또는 발현시킬 수 있는 숙주 세포는 당업계에 공지된 어떠한 숙주 세포도 이용할 수 있으며， 원핵 세포로는， 예를 들어， E. coli JM109 , E. coli BL21 , E. coli RRl , E. coli LE392 , E. coli B , E. coli X 1776 , E. coli W3110 , 바실러스 서브틸리스, 바실러스 츄린겐시스와 같은 바실러스 속 균주， 그리고 '살모넬라 티피무리움， 세라티아 마르세슨스 및 다양한 슈도모나스 종과 같은 장내균과 균주 등이 있으며， 진핵 세포에 형질 전환시키는 경우에는 숙주 세포로서， — Saccharomyce cerevisiae) , 곤충 세포， 식물 세포 및 동물 세포， 예를 들어， CH0 세포주 (Chinese hamster ovary) , W138 , ΒΗΚ , COS— 7， 293， HepG2 , 3Τ3 , RIN및 MDCK세포주 등이 이용될 수 있다.
상기 폴리뉴클레오티드 또는 이를 포함하는 재조합 백터의 숙주 세포 내로의 운반은， 당업계에 널리 알려진 운반 방법을 사용할 수 있다. 상기 운반 방법은 예를 들어， 숙주 세포가 원핵 세포인 경우， CaCl2 방법 또는 전기 천공 방법 등을 사용할 수 밌고， 숙주 세포가 진핵 세포인 경우에는, 미세 주입법， 칼슴 포스페이트 침전법， 전기 천공법， 리포좀 -매개 형질감염법 및 유전자 밤바드먼트 등을 사용할 수 있으나， 이에 한정하지는 않는다. 상기 형질 전환된 숙주 세포를 선별하는 방법은 선택 표지에 의해 발현되는 표현형을 이용하여， 당업계에 널리 알려진 방법에 따라 용이하게 실시할 수 있다. 예를 들어, 상기 선택 표지가 특정 항생제 내성 유전자인 경우에는， 상기 항생제가 함유된 배지에서 형질전환체를 배양함으로써 형질전환체를 용이하게 선별할 수 있다.
형질 전환된 세포의 배양은 당업계에 공지된 다양한 방법을 통하여 실시할 수 있다. 예를 들어， 형질 전환된 세포를 YT 액상 배지에 접종하여 배양을 실사한 다음， 세포 밀도가 일정 수준에 도달한 시점에서 IPTG를 배지에 첨가하여 lacl 프로모터에 의한 단백질 발현을 유도하고
배양함으로써, '세포 내 또는 배지로 분비된 단백질을 얻을 수 있다.
세포 내 또는 배지로 분비된 단백질은 당업계에 공지된 다양한 정제 방법에 따라 정제된 형태로 얻을 수 있다. 예를 들어, 암모늄 설페이트에 의한 용해도 분획화 (solubi l i ty fract i onat i on) , 크기 분별 여과 및 다양한 크로마토그래피 (크기， 전하， 소수성 또는 친화성에 따른 분리를 위해 제작된 것)에 의한 정제 방법을 통하여 정제된 형태로 단백질을 얻을 수 있다. 예를 들어， 융합 단백질이 GST에 융합된 경우에는 글루타티온이 결합돤 레진 칼럼， 6x Hi s에 융합된 경우에는 Ni2+-NTA Hi s-결합 레진 칼럼을 이용하여 원하는 단백질을 용이하게 얻을 수 있다.
앞서 설명한 바와 같이， 상기 융합 단백질에 포함된 p53 및 pl5의 융합체는 p53의 안정성을 크게 증가시키고， p21 유전자를 발현시켜 세포증식을 일시적으로 정지시키며， Bax 유전자를 발현시켜 세포 죽음을 유발하고 , CDK 4， 6의 활성을 저해하는 역할을 하므로， 암의 예방 및 /또는 치료에 있어서 유효성분으로 효과적이다.
따라서, 다른 예에서， 상기 융합 단백질을 유효성분으로 포함하는 암의 예방 및 /또는 치료용 약학 조성물이 제공된다. 상기 약학 조성물은 필요에 따라서 약학적으로 허용되는 담체， 회석제 및 /또는 부형제를 통상적으로 사용되는 양으로 추가로 포함할 수 있다.
상기 약학적으로 허용되는 담체는 계제시에 통상적으로 이용되는 것으로서， 락토스， 텍스트로스， 수크로스， 솔비를， 만니를， 전분， 아카시아 고무， 인산 칼슘， 알기네이트， 젤라틴， 규산 칼슴， 미세결정성 샐를로스， 폴리비닐피를리돈， 셀를로스， 물， 시럽， 메틸 셀를로스， 메틸히드록시벤조에이트， 프로필히드록시벤조에이트， 활석， 스테아르산 마그네슴 및 미네랄 오일 등을 포함하나， 이에 한정되는 것은 아니다. 상기 약학 조성물은 상기 성분들 이외에 윤활제， 습윤제， 감미제， 향미제， 유화제， 현탁제, 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다.
또 다른 예에서， 상기 융합 단백질의 치료적 유효량을 암의 예방 및 /또는 치료를 필요로 하는 환자에게 투여하는 단계를 포함하는， 암의 예방 및 /또는 치료 방법이 제공된다. 상기 암의 예방 및 /또는 치료 방법은 상기 투여 단계 이전에 암의 예방 및 /또는 치료를 필요로 하는 환자를 확인하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
또 다른 예에서, 상기 융합 단백질의 암의 예방 및 /또는 치료에 사용하기 위한 용도, 또는 상기 융합 단백질의 암의 예방 ,및 /또는 치료를 위한 약물 제조에 사용하기 위한 용도가 제공된다.
상기 융합 단백질 또는 이를 유효성분으로 포함하는 약학 조성물은 당업자가 용이하게 실시할 수 있는 방법에 따라， 약학적으로 허용되는 담체 및 /또는 부형제를 이용하여 제제화함으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 다용량 용기 내에 내입시켜 제조될 수 있다. 이때 제형은 오일 또는 수성 매질중의 용액, 현탁액， 시럽제 또는 유화액 형태이거나 액스제， 산제， 분말제， 과립제， 정제 또는 캅셀제 형태일 수도 있으며, 분산제 또는 안정화제를 추가적으로 포함할 수 있다. 또한， 상기 조성물은 개별 치료제로 투여하거나 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있고， 종래의 치료제와는 순차적 또는 동시에 투여될 수 있다.
상기 융합 단백질 또는 이를 유효성분으로 포함하는 암의 예방 또는 치료용 약학 조성물은 경구 또는 비경구로 투여할 수 있다. 비경구 투여인 경우에는 정맥내 주입, 피하 주입， 근육 주입， 복강 주입, 내피 투여， 국소 투여， 비내 투여， 폐내 투여 및 직장내 투여 등으로 투여할 수 있다. 경구 투여시， 단백질 또는 펩타이드는 소화가 되기 때문에 경구용 조성물은 활성 약제를 코팅하거나 위에서의 분해로부터 보호되도록 제형화 되어야 한다. 또한， 상기 조성물은 상기 조성물이 표적 세포로 이동할 수 있는 임의의 장치에 의해 투여될 수 있다.
상기 융합 단백질 또는 이를 유효성분으로 포함하는 암의 예방 또는 치료용 약학 조성물의 적합한 투여량은 제제화 방법， 투여 방식， 환자의 연령， 체중， 성， 병적 상태, 음식， 투여 시간, 투여 경로， 배설 속도 및 반응 감웅성과 같은 요인들에 의해 다양하게 처방될 수 있다. 상기 조성물의 바람직한 투여량은 성인 기준으로 0.001 내지 100 nig/kg 범위 내이다. 용어 "약학적 유효량" 또는 "치료적 유효량' '은 암의 예방 또는 치료에 효과를 .
' 나타낼 수 있는 양을 의미한다.
상기 융합 단백질 또는 이를 유효성분으로 포함하는 암의 예방 또는 치료용 약학 조성물의 투여 대상 환자는 포유류， 예컨대 인간， 원승이 등을 포함하는 영장류， 래트， 마우스 등을 포함하는 설치류 등일 수 있다.
일 구체예에 따르면， 상기 융합 단백질 또는 약학 조성물이 예방 또는 치료 대상으로 하는 암은 고형암 또는 혈액암일 수 있으며， 예컨대， 편평상피세포암， 소세포폐암， 비소세포폐암, 폐와선암， 폐의 편평상피암， 복막암， 피부암， 피부 또는 안구내 혹색종， 직장암， 항문부근암， 식도암， 소장암， 내분비선암， 부갑상선암， 부신암， 연조직 육종， 요도암， 만성 또는 급성 백혈병， 림프종， 위장암, 췌장암，교아종, 경부암， 난소암， 간암， 방광암， 유방암， 결장암， 대장암， 자궁내막 또는 자궁암， 침샘암， 신장암， 전립선암， 음문암, 갑상선암 및 두경부암 등으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것일 수 있으니， 이에 한정하지는 않는다. 【발명의 실시를 위한 형태】
이하 하나 이상의 구체예를 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나， 이들 실시예는 하나 이상의 구체예를 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다. 실시예 1 : 유비퀴틴, 막투과서열 도메인, P53단백질의 전사활성 도메인 및 Pl5의 융합단백질 (p53-pl5) 및 인간혈청 알부민 결합단백질을 포함하는융합단백질의 발현 백터의 제조
본 실시예에서는 친수성 폴리펩타이드의 한 종류인 유비퀴틴
돌연변이형 단백질， 막 투과 서열 (MTS : membrane transfer sequence)도메인, p53 , pl5 , 핵 위치 신호 도메인 (NLS : nucleus local i zat ion signal domain) 및 혈청 알부민 결합 펩타이드 (SABP : Serum Albumin Binding Pept ide)의 순서로 연결된 세포 내 전달용 융합 단백질을 생산하기 위한 상기 융합 단백질의 발현 백터를 제조하였다. 또한， 상기 융합 단백질과의 비교 실험을 위해 상기 융합 단백질에서 하나 이상의 구성 요소를 제외한 융합 단백질을 생산하기 위한 발현 백터를 제조하였다. 이하， "Ub7KR"^ 야생형 유비퀴틴의 ' 아미노산 서열 (서열번호 13)의 6， 11 , 27 , 29 , 33 , 48 및 63번째에 존재하는 Lys 이 모두 Arg으로 치환된 것을 말하고 (서열번호 14)， "Ub7KR(G76A) " 는 야생형 유비퀴틴의 아미노산 서열의 6， 11， 27， 29， 33 , 48 및 63번째에 존재하는 Lys 이 모두 Arg으로 치환되고 76번째에 존재하는 Gly이 Ala으로 치환된 것을 말한다 (서열번호 15) .
총 3가지 종류의 발현 백터를 (주) 제노텍에 의뢰하여 제조하였으며， 단백질 과발현을 위한 백터는 pET-21b(+) (EMD Biosci ences)를 사용하였다. 상기 융합 단백질을 발현시키기 위해 상기 백터에 포함된 총 3 종류의 인서트 ( insert ) DNA 절편은 다음과 같다:
protein complex #76 : Ub7KR(G76A)-p53— pl5-NLS의 순서로 결합된 융합 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 (정제태그 (및 절단서열을 포함한 경우 서열번호 5와 핵산 서열로 표시되며 서열번호 6의 아미노산 서열로 발현됨. 정제태그 및 절단서열을 포함하지 않은 경우 서열번호 7의 아미노산 서열로 발현됨) ;
protein complex #72 : Ub7KR(G76A)-MTS-p53-pl5-NLS_SABP의 순서로 결합된 융합 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 (실험군; 정제태그 및 절단서열을 포함한 경우 서열번호 8의 핵산 서열로 표시되며 서열번호 9의 아미노산 서열로 발현됨. 정제태그 및 절단서열을 포함하지 않은 경우 서열번호 10의 아미노산 서열로 발현됨) ; 및
protein complex #52： Ub7KR(G76A)-MTS-p53-pl8-NLS-SABP의 순서로 결합된 융합 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 (양성 대조군; 서열번호
12의 아미노산 서열로 발현됨) .
한편， 상기 각각의 인서트 DNA 절편은 5 ' 말단에 Ndel으로 절단될 수 있는 뉴클레오티드 서열을, 3 ' 말단에 Xh이으로 절단될 수 있는
뉴클레오티드 서열을 포함함으로써， 상기 pET21b(+) 백터의 Ndel-Xhol 절단 서열에 삽입될 수 있다.
일 구체예에 따른 융합 단백질의 가능한 1차 구조를 나타내는 모식도를 도 1에 나타내었다. 실시예 2: 융합단백질의 발현 및 정제
상기 실시예 1에서 제조한 백터 3 종류를 이용하여 융합 단백질을 과발현시키기 위해， 상기 백터로 형질 전환된 E. co// BL2KDE3)에서 발현시켰다. 이때， 배양액으로 YT 배지를 사용하였으며， 흡광도 600 nm에서 O.D.값이 0.5일 때 0.5 mM의 IPTG를 넣고 18 °C에서 16시간 동안 더 배양하였다. 상기 배양하여 얻은 세포를， 5%글리세를， 5mM β-머캅토에탄올， 0.2% Triton Χ-100및 0.2 M NaCl을 포함하는 50 mM Tris-HCl 완층액 (pH 8.0) 하에서 초음파로 분쇄한 후， 원심분리기 (10,000 g)를 이용하여 상층액을 · 얻었다. 상기 상층액을 상기 완충액으로 평형화된 Ni2+-NTA super flow 칼럼 (Qiagen)에 적용하고， 컬럼 부피의 5배에 해당하는 세척 완층액 (50 mM Tris-HCl, pH 8.0, 5%글리세롤， 5mM β-머캅토에탄올， 0.2% Triton X-100및 lMNaCl)로 세척한 다음， 용출 완층액 (50 mM Tris-HCl, pH 8.0， 5%글리세를， 5 mM β-머캅토에탄올， 0. Triton X-100 및 0.2 M NaCl)으로 상기 융합 단백질을 용출하였다. 융합 단백질이 포함된 분획들을 모아 Amicon Ultra— 15 Centrifugal Fi lter(Mi 1 ipore)를ᅵ이용하여 분획 중에 포함된 염을 제거하고 농축하였다. 정제된 단백질 농도는 BSA를 표준 물질로 사용하여 측정하였다. 실시예 3: HCT 116 이종이식 (xenograft) 마우스모델을 이용한융합 단백질의 항암효과확인
실시예 2에서 제조한 융합 단백질의 항암효과를 확인하기 위하여， 6주령 BALB/c누드 마우스에 대장암 세포주 (HCT116)를 1.0 x 106cel 1 /mouse로 피하에 주입하여 암 조직을 생성시켰다. 생성된 암 조직에 일주일에 2회씩， 융합 단백질 #76， #72및 #52를 각각 300ug/100ul로 마우스 꼬리 정짹주사한 후， 암 조직 크기의 변화 (mm3)를 관찰하였다.
그 결과， 도 2에서 나타낸 바와 같이， 융합 단백질 #76
[Ub7KR(G76A)-p53-pl5-NLS; 서열번호 6] 및 융합 단백질 #72투여군 [ Ub7KR ( G76A ) -MTS-p53-p 15-NLS-SABP； 서열번호 9] 이 모두 항암 효과를 나타내었고，특히 융합 단백질 #76에 비해 융합 단백질 #72투여군 이 28.5% 향상된 항암 효과를 보였다. 융합 단백질 #72 투여군은 양성 대조군
[Ub7KR(G76A)-MTS-p53-pl8-NLS-SABP, #52； 서열번호 12]과 유사한 효과를 나타내었다.

Claims

【청구의 범위】
【청구항 1】
p53 단백질 또는 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 p53 단백질 단편， 및 pl5 단백질을 포함하는， 융합 단백질.
【청구항 2】
거 U항에 있어서， 상기 융합 단백질은
생체외 안정화 단백질 (in vitro stabilization protein),
막 투과 서열 (membrane transfer sequence, MTS) 도메인，
핵-세포질 신호 (nucleus-cytoplasm signal) 도메인, 및
생체내 안정화 단백질 (in vivo stabilization protein)
로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 폴리펩타이드를 추가로 ' 포함하는 것인， 융합 단백질.
【청구항 3】
게 2항에 있어서， 상기 생체외 안정화 단백질은 야생형 유비퀴틴, 들연변이 유비퀴틴， 및 유비퀴틴 -유사 단백질로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상이고，
상기 야생형 유비퀴틴은 서열번호 13의 아미노산 서열로 이루어진 것이고，
상기 돌연변이 유비퀴틴은 상기 야생형 유비퀴틴의 아미노산 서열의 6, 11, 27， 29， 33, 48 및 63번째에 존재하는 Lys 중 하나 이상이 Arg으로 치환된 것， 상기 야생형 유비퀴틴의 76번째에 존재하는 Gly이 Ala으로 치환된 것，또는 상기 야생형 유비퀴틴의 아미노산 서열의 6， 11， 27， 29, 33， 48 및 63번째에 존재하는 Lys 중 하나 이상이 Arg으로 치환되고 76번째에 존재하는 Gly이 Ala으로 치환된 것이고，
상기 유비퀴틴ᅳ유사 단백질은 Nedd8, SUM0-1, SUMO-2, NUBl, PICl, UBL3, UBL5 및 ISG15로 구성된 군으로부터 선택된 것인,
융합 단백질.
【청구항 4】
제 2항에 있어서, 상기 막 투과 서열 도메인은 서열번호 16의 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩타이드인， 융합 단백질.
【청구항 5】 .
제 2항에 있어서， 상기 생체내 안정화 단백질은 MT(alpha 1 ant i t rypsin) , 혈청 알부민， 혈청 알부민 결합 펩타이드 (serum albumin binding pept ide ; SABP) , Fc 및 PEG(polyethyleneglycol )로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상인， 융합 단백질.
【청구항 6】
게 2항에 있어서，상기 핵—세포질 신호 도메인은 NLS(nuc leus locat ion sequence)도메인 또는 NES(nuc leus export sequence)도메인인,융합 단백질 .
[청구항 7】
제 6항에 있어서， 상기 NLS 도메인은 서열번호 17， 서열번호 18， 서열번호 19 및 서열번호 20으로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩타이드인， 융합 단백질.
【청구항 8】
제 1항에 있어서， 상기 융합 단백질은
p53 단백질의 C 말단에 pl5 단백질이 연결된 융합 단백질;
pl5 단백질의 C 말단에 p53 단백질이 연결된 융합 단백질;
핵-세포질 신호 도메인， 상기 핵—세포질 신호 도메인의 C 말단에 연결된 막 투과 서열 (MTS) , 및 상기 막 투과 서열의 C 말단에 연결된 p53 단백질과 pl5 단백질의 융합 단편을 포함하는 융합 단백질;
막투과 서열 (MTS) , 및 상기 막 투과 서열의 C 말단에 연결된 p53 단백질과 pl5 단백질의 융합 단편을 포함하는 융합 단백질;
생체외 안정화 단백질，상기 생체외 안정화 단백질의 C말단에 연결된 핵-세포질 신호 도메인， 상기 핵—세포질 신호 도메인의 C 말단에 연결된 막 투과 서열， 및 상기 막 투과 서열의 C 말단에 연결된 p53 단백질과 pl5 단백질의 융합 단편을 포함하는 융합 단백질;
생체외 안정화 단백질，상기 생체외 안정화 단백질의 C말단에 연결된 막 투과 서열， 및 상기 막 투과 서열의 C 말단에 연결된 p53 단백질과 pl5 단백질의 융합 단편을 포함하는 융합 단백질;
생체외 안정화 단백질，상기 생체외 안정화 단백질의 C말단에 연결된 막 투과 서열， 상기 막 투과 서열의 C 말단에 연결된 핵-세포질 신호 도메인， 및 상기 핵-세포질 신호 도메인의 C 말단에 연결된 p53 단백질과 pl5
단백질의 융합 단편을 포함하는 융합 단백질;
생체외 안정화 단백질, 상기 생체외 안정화 단백질의 C말단에 연결된 막 투과 서열， 상기 막 투과 서열의 C 말단에 연결된 p53 단백질과 pl5 단백질의 융합 단편， 및 상기 p53 단백질과 pl5 단백질의 융합 단편의 C 말단에 연결된 핵-세포질 신호 도메인을 포함하는 융합 단백질;
생체외 안정화 단백질，상기 생체외 안정화 단백질의 C말단에 연결된 막 투과 서열， 상기 막 투과 서열의 C 말단에 연결된 p53 단백질과 pl5 단백질의 융합 단편， 상기 p53 단백질과 pl5 단백질의 융합 단편의 C 말단에 연결된 핵-세포질 신호 도메인， 및 상기 핵-세포질 신호 도메인의 C 말단에 연결된 생체내 안정화 단백질을 포함하는 융합 단백질;
생체외 안정화 단백질，상기 생체외 안정화 단백질의 C말단에 연결된 막 투과 서열, 상기 막 투과 서열의 C 말단에 연결된 p53 단백질과 pl5 단백질의 융합 단편， 상기 p53 단백질과 pl5 단백질의 융합 단편의 C 말단에 연결된 생체내 안정화 단백질을 포함하는 융합 단백질;
생체외 안정화 단백질，상기 생체외 안정화 단백질의 C말단에 연결된 p53 단백질과 pl5 단백질의 융합 단편， 및 상기 p53 단백질과 pl5 단백질의 융합 단편의 C 말단에 연결된 핵-세포질 신호 도메인을 포함하는 융합 단백질;
생체외 안정화 단백질, 및 상기 생체외 안정화 단백질의 C 말단에 연결된 p53 단백질과 pl5 단백질의 융합 단편을 포함하는 융합 단백질;
생체외 안정화 단백질，상기 생체외 안정화 단백질의 C말단에 연결된 p53단백질과 pl5단백질의 융합 단편， 상기 p53단백질과 pl5단백질의 융합 단편의 C 말단에 연결된 핵-세포질 신호 도메인， 및 상기 핵-세포질 신호 도메인의 C 말단에 연결된 생체내 안정화 단백질을 포함하는 융합 단백질; 및
생체외 안정화 단백질，상기 생체외 안정화 단백질의 C말단에 연결된 p53단백질과 pl5단백질의 융합 단편, 상기 p53단백질과 pl5단백질의 융합 단편의 C 말단에 연결된 생체내 안정화 단백질을 포함하는 융합 단백질
로 이루어진 군에서 선택된 것인， 융합 단백질.
【청구항 9】
제 1항에 있어서， 상기 융합 단백질은 서열번호 4， 서열번호 6 , 서열번호 7, 서열번호 9 또는 서열번호 10으로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열로 어루어진 폴리펩타이드인, 융합 단백질.
【청구항 10】
제 1항 내지 게 9항 중 어느 한 항의 융합 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드.
【청구항 11】
제 10항의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 백터.
【청구항 12】
제 11항의 재조합 백터로 형질전환된 세포.
【청구항 13】
제 12항의 세포를 배양시키는 단계를 포함하는, 제 1항의 융합 단백질을 제조하는 방법.
【청구항 14】
제 1항 내지 제 9항 중 어느 한 항의 융합 단백질을 유효성분으로 포함하는 암의 예방 또는 치료용 약학 조성물. 【청구항 15】
제 14항에 있어서, 상기 암은 편평상피세포암， 소세포폐암,
비소세포폐암， 폐의 선암， 폐의 편평상피암， 복막암， 피부암， 피부 또는 안구내 혹색종, 직장암， 항문부근암， 식도암， 소장암， 내분비선암，부갑상선암， 부신암， 연조직 육종， 요도암， 만성 또는 급성 백혈병， 림프종, 위장암， 췌장암， 교아종， 경부암， 난소암， 간암， 방광암， 유방암， 결장암， 대장암， 자궁내막 또는 자궁암， 침샘암， 신장암, 전립선암， 음문암， 갑상선암， 또는 두경부암인 , 암의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
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