CN109517047B - 一种抗结核分枝杆菌的靶点及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种抗结核分枝杆菌的靶点及其应用，属于细胞生物学领域。本发明发现了一种PknG的类红素氧还蛋白结果域，它可以通过与宿主泛素相互作用促进结核分枝杆菌的胞内存活过程同时促进肿瘤细胞的增殖。本发明可指导针对该结构域的抗结核分枝杆菌抗体开发以及现有结核疫苗改造。例如以该结构域为靶点的抑制剂或药物可以部分抑制结核分枝杆菌的胞内存活。此外，还可以将现有结核疫苗(如卡介苗)中的PknG基因中该结构域剔除掉，从而避免促癌风险，同时改造后的疫苗应用于临床肿瘤治疗时也会避免肿瘤发生等副作用。

Description

一种抗结核分枝杆菌的靶点及其应用
技术领域
本发明涉及一种抗结核分枝杆菌的靶点及其应用。属于细胞生物学领域。
背景技术
近年来，慢性炎症在癌症发生发展中的关键作用得到普遍认可，其促癌作用的机制已成为当前生命科学研究热点之一。研究表明，病毒或细菌感染引起的慢性炎症是导致肝癌、结肠癌或胃癌的最大危险因素之一。结核病(Tuberculosis,TB)是由结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis，Mtb)引起的一种古老疾病，它至今仍是严重威胁全球人类健康的传染病之一。然而，结核分枝杆菌感染与肺癌发生或发展之间的相关性一直未有报道。
发明内容
本发明通过生物信息学分析预测发现Mtb分泌蛋白PknG中存在一个类红素氧还蛋白结构域，经研究，类红素氧还蛋白结构域与宿主的泛素蛋白相互作用激活PknG的自剪切功能，剪切后的PknG进入细胞核调控细胞增殖等细胞进程，并且在促进结核分枝杆菌胞内存活过程中发挥部分功能。类红素氧还蛋白结构域缺失的PknG丧失自剪切及调控细胞增殖等细胞进程的功能。因此PknG中的类红素氧还蛋白结构域可作为潜在的抗结核药物新靶点。以该结构域为靶点研究的抑制剂或药物可以有效的抑制结核分枝杆菌与宿主的相互作用，从而部分抑制结核分枝杆菌的胞内存活及结核分枝感染引起的肺癌的发生和发展。
为解决现有技术存在的缺陷，本发明的第一个目的是提供一种类红素氧还蛋白结构域，其序列为(a)或(b)或(c)，其中，
(a)SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列；
(b)在(a)中的氨基酸序列经过取代、缺失或添加一个氨基酸或几个氨基酸由(a)衍生的多肽或其类似物；
(c)与(a)、(b)中氨基酸序列整体相似度在85％以上的由(a)衍生的多肽或其类似物。
本发明的第二个目的是提供所述类红素氧还蛋白结构域在制备致病菌抑制剂方面的应用。
在本发明的一种实施方式中，所述类红素氧还蛋白结构域位于PknG蛋白上。
在本发明的一种实施方式中，所述类红素氧还蛋白结构域来源于结核分枝杆菌。
在本发明的一种实施方式中，所述致病菌包括但不限于结核分枝杆菌、诺卡氏菌、假诺卡氏菌。
本发明的第三个目的是提供所述类红素氧还蛋白结构域在制备抗结核病药物方面的应用。
在本发明的一种实施方式中，所述应用是指，将SEQ ID NO.1所示的类红素氧还蛋白结构域作为药物作用靶点，制备可与之靶向结合的药物。
本发明的第四个目的是提供一种疫苗，所述疫苗含有敲除所述类红素氧还蛋白结构域的PknG蛋白。
本发明还要求保护所述类红素氧还蛋白结构域在制备肿瘤细胞抑制剂方面的应用。
有益效果：本发明提供了一种可作为潜在的抗结核药物的新靶点。以该结构域为靶点研究的抑制剂或药物可以有效的抑制结核分枝杆菌与宿主的相互作用，从而部分抑制结核分枝杆菌的胞内存活及结核分枝感染引起的肺癌的发生和发展。
附图说明
图1为PknG通过类红素氧还蛋白结构域与泛素互作的验证；其中，HA-Ub，带有HA标签的Ub；HA-Ub(I44A)，带有HA标签的第44位异亮氨酸突变为丙氨酸的泛素；PknG-GFP，带有GFP标签的野生型PknG；PknG(97-139)-GFP，带有GFP标签的类氧还红素蛋白结构域；PknG(140-234)-GFP，带有GFP的PknG类泛素结构域；
图2为PknG通过与Ub互作激活自剪切功能的验证；其中；GFP，在293T细胞中转染了表达GFP的pEGFP-N1空载体；PknG-GFP，表达PknG的pEGFP-N1-PknG；PknG△97-139-GFP，为表达类泛素结构域缺失的PknG蛋白的pEGFP-N1-PknG△97-139；
图3为PknG自剪切后进入细胞核方式验证；其中；PknG，PknG蛋白；PknG K181M，激酶活性缺失PknG蛋白；PknG△97-139，类泛素结构域缺失的PknG蛋白；
图4为促进结核分枝杆菌胞内存活的结构域验证；其中；△PknG，敲除PknG的Mtb；△PknG:PknG，敲除PknG后再回补PknG序列的Mtb(PknG表达类似于野生株Mtb)；△PknG:PknG K181M，表达无激酶活性PknG的Mtb菌株；△PknG:PknG△97-139，表达类氧还红素蛋白结构域缺失PknG的Mtb菌株；△PknG:PknG△140-234，表达类泛素结构域缺失PknG的Mtb菌株；△PknG:PknG△TPR，表达TPR结构域缺失PknG的Mtb；
图5为促进肿瘤细胞增殖及迁移的结构域验证；其中；WT-BCG，感染表达野生型PknG的Mtb；△PknG，感染PknG敲除的Mtb；△PknG：PknG，感染敲除PknG后回补PknG的Mtb；△PknG:PknG△97-139，表达类氧还红素蛋白结构域缺失PknG的Mtb菌株；
图6为促进肿瘤细胞在裸鼠体内成瘤结构的验证；其中；WT-BCG，感染表达野生型PknG的Mtb；△PknG，感染PknG敲除的Mtb；△PknG：PknG，感染敲除PknG后回补PknG的Mtb；△PknG:PknG△97-139，表达类氧还红素蛋白结构域缺失PknG的Mtb菌株。
具体实施方式
实施例1结核分枝杆菌分泌蛋白PknG的类红素氧还蛋白结构域
通过生物信息学分析，发现结核分枝杆菌存在一段与真核细胞中红素氧还蛋白结构域类似的一段结构域，我们命名为类红素氧还蛋白结构域。该结构域存在于结核分枝杆菌效应蛋白PknG氨基酸位点97-139位，可以与宿主泛素蛋白相互作用，促进肿瘤细胞的增殖迁移及结核分枝杆菌的胞内存活等过程，其氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。pknG基因的序列如Gene ID:886397所示。
实施例2 PknG通过类红素氧还蛋白结构域与泛素互作
将PknG全长基因、编码类红素氧还蛋白结构域(PknG蛋白氨基酸第97-139位)的基因及编码类泛素结构域(PknG蛋白氨基酸第140-234位)的基因分别构建到pEGFP-N1质粒上；将泛素(Ub，GI number：6647297)及其突变体Ub(I44A)(Ub的I44位是Ub与其他蛋白进行非共价疏水相互作用的关键位点)分别构建到PCS2质粒上；用Lipofectamine 2000(Invitrogen)将重组质粒转染到HEK293T细胞中；转染6小时后更换新鲜培养基；转染24小时后弃掉培养基，PBS洗涤细胞两遍，然后用含有蛋白酶抑制剂的细胞裂解液裂解细胞；收取细胞裂解液至1.5ml离心管13000rpm离心5分钟；将上清转移到新的1.5ml离心管，分别加入20微升GFP-Nanoab-Agarose(唯纳抗)；4度旋转4小时后离心收集Beads，细胞裂解液洗涤3次；加入SDS-PAGE上样缓冲液；沸水加热10分钟后上样并Western Blotting检测。
通过上述免疫共沉淀实验发现，PknG类红素氧还蛋白结构域与Ub相互作用，而与Ub(I44A)无相互作用。说明PknG通过类红素氧还蛋白结构域(氨基酸位点：97-139)与泛素间形成疏水相互作用而互作(图1)。
实施例3 PknG通过与Ub互作激活自剪切功能
将编码PknG全长基因、类红素氧还蛋白结构域缺失基因(PknG△97～139)分别构建到pEGFP-N1质粒上；用Lipofectamine 2000(Invitrogen)将重组质粒按照图2所示转染到HEK293T细胞中；转染6小时后更换新鲜培养基；转染24小时后弃掉培养基，PBS洗涤细胞两遍，然后用含有蛋白酶抑制剂的细胞裂解液裂解细胞；收取细胞裂解液至1.5ml离心管13000rpm离心5分钟；将上清转移到新的1.5ml离心管，分别加入20微升GFP-Nanoab-Agarose(唯纳抗)；4度旋转4小时后离心收集Beads，细胞裂解液洗涤3次；加入SDS-PAGE上样缓冲液；沸水加热10分钟后上样并Western Blotting检测。
结果如图2所示，转染了野生型PknG的细胞样本中除了含有全长的PknG外(约105KD)，还有一个分子量70KD的剪切条带出现。转染了类红素氧还蛋白结构域缺失PknG的细胞样本中只有全长的PknG出现(约100KD)，没有剪切条带出现。该结果说明PknG在宿主细胞内的自剪切功能是依赖类红素氧还蛋白结构域与泛素互作的。
实施例4 PknG自剪切后C端进入细胞核
将PknG全长及截短体基因分别构建到pEGFP-N1质粒上；用Lipofectamine 2000(Invitrogen)将重组质粒按照图3所示转染到细胞中；转染6小时后更换新鲜培养基；转染24小时后弃掉培养基，PBS洗涤细胞两遍，然后用含有蛋白酶抑制剂的细胞裂解液裂解细胞；收取细胞裂解液至1.5ml离心管13000rpm离心5分钟；将上清转移到新的1.5ml离心管，加入SDS-PAGE上样缓冲液；沸水加热10分钟后上样并Western Blotting检测。
结果如图3所示，PknG主要自剪切成两条带(N端和C端)，其中N端主要位于细胞质内，而带有GFP标签的C端主要进入细胞核中，可见，该功能依赖PknG的类红素氧还蛋白结构域(图3)。
实施例5 PknG促进结核分枝杆菌胞内存活部分依赖类红素氧还蛋白结构域
分别构建敲除PknG的Mtb(△PknG),回补野生型PknG的Mtb(△PknG:PknG)以及回补类红素氧还蛋白结构域缺失(△PknG:△PknG 97-139)或类泛素结构域缺失(△PknG:PknG△140-234)或TPR结构域缺失PknG(△PknG:PknG△TPR)的Mtb菌株，连同野生Mtb菌株分别感染小鼠；分别感染10天和20天时解剖小鼠；取小鼠肺组织研磨并梯度稀释涂布平板；分别计算小鼠肺中Mtb的细菌数。
结果如图4所示，与PknG敲除(△PknG)的Mtb相比，类泛素(△PknG:PknG△140-234)和TPR结构域缺失的菌株(△PknG:PknG△TPR)在宿主细胞内的CFU数下降了50％，而类红素氧还蛋白结构域缺失的菌株(△PknG:△PknG 97-139)在宿主细胞内的CFU数下降了20％。该结果说明类泛素和TPR结构域在PknG促进Mtb胞内存活过程中都发挥了重要作用。类红素氧还蛋白结构域只发挥了部分作用，其在促进Mtb胞内存活方面的作用强度要比类泛素和TPR结构域低50％左右(图4)。
实施例6 PknG促进肿瘤细胞增殖及迁移依赖类红素氧还蛋白结构域
分别构建敲除PknG的Mtb(△PknG),回补野生型PknG的Mtb(△PknG:PknG)以及回补类红素氧还蛋白结构域缺失(△PknG:△PknG 97-139)或类泛素结构域缺失(△PknG:PknG△140-234)或TPR结构域缺失PknG(△PknG:PknG△TPR)的Mtb菌株，连同野生Mtb菌株分别感染肺上皮癌细胞株A549；通过CCK-8实验和肿瘤细胞迁移实验分别检测PknG及其截短体对肿瘤细胞增殖及迁移能力的影响。同时我们将Mtb菌株感染后的A549细胞接种到裸鼠腋下位置，观察肿瘤细胞在裸鼠体内的成瘤能力。
结果如图5所示，CCK8实验结果说明表达野生型PknG的Mtb可以使肿瘤细胞的增殖能力提高1倍(图5A)。进一步，肿瘤细胞侵袭实验(图5B)及对侵袭结果的统计(图5C)显示，表达野生型PknG的Mtb可以使肿瘤细胞的侵袭能力提高约2.2倍(图5B,C)，而PknG敲除(△PknG)及PknG类红素氧还蛋白结构域缺失的Mtb(△PknG:PknG△97-139)丧失促进肿瘤细胞增殖和迁移的能力(图5A-C)。该结果说明PknG的类红素氧还蛋白结构域在促进肿瘤细胞增殖及迁移过程中发挥重要作用。
裸鼠成瘤实验结果如图6所示，与感染过Mtb(△PknG:△PknG 97-139)的肿瘤细胞相比较，感染过野生型Mtb及Mtb(△PknG:PknG)的肿瘤细胞的成瘤能力要提高1倍。因此，在实验动物体内PknG的类红素氧还蛋白结构域同样促进肿瘤细胞增殖及迁移过程中发挥重要作用。
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。
SEQUENCE LISTING
<110> 中国科学院微生物研究所
<120> 一种抗结核分枝杆菌的靶点及其应用
<160> 1
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 43
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 1
Pro Val Val Pro Glu Ser Lys Arg Phe Cys Trp Asn Cys Gly Arg Pro
1 5 10 15
Val Gly Arg Ser Asp Ser Glu Thr Lys Gly Ala Ser Glu Gly Trp Cys
20 25 30
Pro Tyr Cys Gly Ser Pro Tyr Ser Phe Leu Pro
35 40

Claims (1)

1.如SEQ ID NO.1所示的类红素氧还蛋白结构域在筛选致病菌抑制剂方面的应用，其特征在于，将SEQ ID NO.1所示的结构域作为致病菌抑制剂结合的靶点；所述致病菌为结核分枝杆菌。
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