CN110785430A - 用于治疗纤维化和dna损伤介导的疾病的rage蛋白 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种拟磷酸化RAGE蛋白质，其包含与天然哺乳动物RAGE同工型或其片段具有至少90％同一性的氨基酸序列，其中存在于哺乳动物RAGE同工型的胞质尾区中的至少一个丝氨酸被拟磷酸化结构替换。本发明进一步涉及编码拟磷酸化RAGE蛋白质的多核苷酸和包含该多核苷酸的载体。最后，本发明涉及包含运载体和选自RAGE蛋白质、载体的活性药物成分的组合物，该组合物用于治疗或预防患者的疾病，其中所述疾病优选选自由DNA修复受损引起的疾病、由DNA损伤增加引起的疾病或由衰老加剧引起的疾病。

Description

用于治疗纤维化和DNA损伤介导的疾病的RAGE蛋白

技术领域

本发明涉及RAGE蛋白(例如拟磷酸化RAGE蛋白)及其在治疗DNA损伤介导的疾病，特别是纤维化中的用途。

背景技术

整个说明书中对背景技术的任何讨论绝不应被认为是承认该技术是本领域众所周知的或形成本领域公知常识的一部分。

人体的每个细胞每天都会遭受数十至上千的DNA损伤(Jackson and Bartek,2009；Ciccia and Elledge,2010)，其中DNA双链断裂(DSB)是DNA损伤的最具细胞毒性的形式。如果不进行修复，这些损伤会导致各种病症，例如癌症、神经退行性疾病、纤维化和免疫缺陷(Jackson and Bartek,2009；Aparicio et al.,2014；O’Driscoll,2012)。

通常，细胞通过一系列复杂的事件来应对这些断裂，通常称为DNA损伤应答(CDDR)，CDDR通过无错误的同源重组修复(HRR)途径或易出错的非同源的末端连接修复途径(NHEJ)来检测、信号传导和修复DSB(Branzei and Foiani,2008)。DSB导致DSB感应ATM激酶活化，然后磷酸化多个下游靶标，包括组蛋白变体H2AX和效应激酶CHK2(Matsuoka etal.,2007)。

因此，根据需要在时空上的修复信号传导的编排在保存遗传完整性方面起着重要作用。导致DNA DSB积累的DNA修复受损可能导致西方社会一些最具有破坏性的疾病，包括神经退行性疾病、肺纤维化和癌症。

已知RAGE是晚期糖基化终末产物(AGE)的受体(Schmidt et al.,1992)。AGE是糖部分非酶促添加到蛋白质的产物。在健康的组织中，RAGE以低基础水平表达。然而，RAGE的上调已与从动脉粥样硬化到阿尔茨海默氏病的各种病理事件有关(Bierhaus et al.,2005；Bierhaus and Nawroth,2009)，其中RAGE的有害作用已被视为配体-依赖性的。肺组织表达RAGE的最高基础水平，特别是在1型肺泡上皮细胞内，这表明RAGE在肺中可能起关键作用，这与其他表达RAGE的组织不同(Demling et al.,2006；Fehrenbach et al.,1998)。然而，RAGE在肺中的确切生理功能尚未完全了解。与传统上认为RAGE是纤维化的配体依赖性的促炎介质一致，He等人报道，纯合的RAGE缺陷小鼠(RAGE-/-)对博来霉素诱导的肺损伤具有抵抗力，具有提高的存活率和较低的纤维化评分。其表明了在用博来霉素处理后的RAGE-/-中，支气管肺泡灌洗液中促纤维化细胞因子TGFβ1和PDGF的蛋白质水平没有增加(He et al.,2007)。

已经针对RAGE提出了解决RAGE的促炎功能的不同治疗方法。在这些方法中，使用了RAGE的同工型，其称为可溶性RAGE。该同工型仅包含RAGE的细胞外区域。以这种形式，可溶性RAGE能够在RAGE配体与全长RAGE相互作用之前与该配体结合。由于这种能力，已经提出并销售了可溶性RAGE，其用作诱饵受体可以防止由于全长RAGE活化而产生的有害作用(Bierhaus et al.,2005；Bierhaus and Nawroth,2009)。

在最近发表的文件(Kumar et al,2015)中，发明人可以证明RAGE以组成型或诱导型定位于细胞核。核-RAGE经由ATM信号级联反应被募集到DNA损伤的位点。此外，RAGE与MRN复合物相互作用以参与DNA末端的溶核加工，同时它通过促进在其上装载单链DNA结合蛋白来保护ssDNA。小鼠体内的基因消融或体外RAGE的敲除导致同源性定向修复失败，导致DNA双链断裂(DSB)积累并增强了促炎性细胞因子环境。未修复的DNA加上炎症促使组织纤维化、肿瘤形成，从而扰乱器官生理。

在Kumar et al.2015中，表明RAGE可以转移到细胞核，特别是肺内的细胞核，其在DSB区域聚集，并通过DNA-DSB感应激酶“ATM”在丝氨酸376和389处被磷酸化。

发明内容

本发明尤其基于令人惊讶的发现，即用拟磷酸化(phosphomimetic)结构，特别是拟磷酸化氨基酸替换鼠RAGE和人RAGE的胞质尾区(cytoplasmatic tail，CT)中的至少一个丝氨酸残基导致RAGE介导的DNA修复效率显著提高。而且，向患有肺纤维化的糖尿病小鼠施用这样的拟磷酸化RAGE不仅促进了导致纤维化的过程的停止，而且还诱导了纤维化的缓解和肺功能的几乎正常化。更重要的是，这种纤维化的缓解也被其他受疾病影响的组织(例如神经和肾细胞)证实。

因此，根据第一方面，本发明提供一种拟磷酸化RAGE蛋白，其包含与天然哺乳动物RAGE同工型或其片段具有至少90％同一性的氨基酸序列，其中存在于所述哺乳动物RAGE同工型的胞质尾区(CT)中的至少一个丝氨酸被拟磷酸化结构替换。

被拟磷酸化结构替换的相关丝氨酸残基特别是通过ATM信号级联反应的RAGE磷酸化靶标。相对于野生型RAGE，拟磷酸化RAGE在DNA修复中的改善效果至少部分是由于增加的拟磷酸化RAGE的细胞核输入。因此，根据第二方面，本发明提供RAGE蛋白的融合蛋白，其包含融合到至少一个细胞核靶向结构的、与天然哺乳动物RAGE同工型或其片段具有至少90％同一性的氨基酸序列。

根据第三方面，本发明提供了分离的多核苷酸，其具有对根据第一方面的拟磷酸化RAGE或根据第二方面的融合蛋白进行编码的核酸序列。该分离的多核苷酸特别适用于根据第一方面的RAGE蛋白或根据第二方面的RAGE融合蛋白的体外表达。或者，分离的多核苷酸可用于RAGE蛋白的体内表达，即基因治疗。

对于基因治疗，分离的多核苷酸特别地被引入载体中，用于在患者细胞中的蛋白质的瞬时转染和表达，或用于稳定整合到患者细胞的基因组中。因此，根据第四方面，本发明提供了包含根据第三方面的多核苷酸和启动子的载体。

为了治疗患有以下疾病的患者，例如由DNA修复受损引起的疾病、由DNA损伤增加引起的疾病或由衰老加剧引起的疾病，拟磷酸化RAGE蛋白本身或包含编码拟磷酸化RAGE蛋白的多核苷酸的载体可以被用作活性药物成分(API)。在这两种情况下，API必须转运到要治疗的细胞中。为了运输，通常需要运载体。

因此，根据第五方面，本发明提供一种包含运载体和活性药物成分的组合物，该活性药物成分选自根据第一方面的拟磷酸化RAGE蛋白的和根据第四方面的载体，该组合物用于治疗或预防患者的疾病。该疾病优选地选自由DNA修复受损引起的疾病、由DNA损伤增加引起的疾病或由衰老加剧引起的疾病。

根据第六方面，本发明提供一种利用聚组氨酸标签的RAGE蛋白的纯化方法，包括以下步骤：

-提供包含带有聚组氨酸标签的RAGE蛋白和污染物蛋白的第一溶液；

-使所述第一溶液经历Ni-NTA色谱法，并洗脱含有所述RAGE蛋白的第二溶液；和

-使所述第二溶液经历肝素色谱法，并洗脱含有所述RAGE蛋白的第三溶液。

附图说明

现在将参考附图仅以举例的方式描述本发明的实施方式，其中：

图1显示，全长mRAGE的重构使糖尿病小鼠的肺功能正常化。用盐水对照、AAV2/8-RAGE^WT、AAV2/8-RAGE^S376E-S389E或AAV2/8-RAGE^S376A-S389A病毒粒子转导WT非糖尿病和糖尿病小鼠。转导后四周，通过使用FlexiVent系统测定压力-容积曲线来评估小鼠的肺功能。数据代表至少三个独立测量值的组平均值(每组8至10只小鼠)。

图2显示，mRAGE的拟磷酸化突变体提高了肾脏再灌注损伤的存活率。与损伤后5至7天用盐水或空病毒粒子对照预处理的糖尿病小鼠相比，用AAV2/8-RAGE^S376E-S389E病毒粒子预处理四周的糖尿病小鼠显示出更高的存活率。数据代表对照和糖尿病小鼠在再灌注损伤后的相对致死率。STZ：链脲佐菌素；N＝8。

图3显示，ATM介导的RAGE磷酸化对于RAGE的核累积起重要作用。(A)在博来霉素和CPT诱导DNA DBS后，人RAGE充当激活的ATM信号级联反应的下游靶标。用λ-磷酸酶处理逆转RAGE磷酸化。ATM的特异性抑制防止RAGE磷酸化，而一般的激酶抑制剂Nu7026不能抑制RAGE磷酸化。此外，如在hRAGE^S389A突变体中磷酸化丧失所表明的，人RAGE的S391在DNB DSB修复信号传导中充当磷酸受体。磷酸化hRAGE经由ATM-磷酸特异性抗体α-S/TQ来检测。α-FLAG用作hRAGE-FLAG的负载对照。CPT：喜树碱，N＝3。(B)预敏的肺腺癌细胞用仅DMSO或喜树碱处理(1μM，持续60分钟)通过γH2AX来标记所诱导的hRAGE磷酸化以及其与DNA DSB修复簇集点(foci)的共定位。如图所示，使用针对各个靶标的DAPIAn抗体对细胞核染色。

图4显示，在糖尿病中ATM介导的RAGE磷酸化降低。RAGE用作激活的ATM信号级联反应的下游靶标。与经辐照的小鼠相比，糖尿病小鼠表现出降低的RAGE磷酸化。如关于λH2AX在糖尿病和辐照样本中获得的增加的信号所表明的，诱发了DNA DBS修复机制。尽管RAGE蛋白水平相同，但是与辐照样本相比，糖尿病样本中的RAGE磷酸化程度较低。

图5显示，RAGE的拟磷酸化突变体改善了神经再生。用AAV2/8-RAGE^S376E-S389E病毒粒子转导的糖尿病小鼠的神经病变分析显著改善了神经功能。误差棒：±SEM，N＝6-8；p值在未配对的双侧学生t检验中计算得出。

图6显示，RAGE的拟磷酸化突变体减少了STZ诱导的糖尿病的肾纤维化和DNA损伤。(A)用AAV2/8-RAGE^S376E-S389E病毒粒子转导小鼠。用Masson三色染色法(Trichrome)染色的肾脏组织显示，用拟磷酸化RAGE处理可以使累积的ECM消退，从而改善整体肾脏功能。(B)STZ诱导的糖尿病组织的免疫荧光显微镜检查显示DNA DSB修复标记物γH2AX的核定位。在用拟磷酸化RAGE突变体转导的组织中不存在γH2AX的核定位。比例尺，50μm(上图)和10μm(下图)，阴性对照：仅第二抗体。

图7显示了鼠RAGE的比较表达和纯化。左：上图：重组RAGE蛋白的表达和纯化的示意图。将各自的载体构建体转化到大肠杆菌(E.coli)细胞中。转化的细胞在TB中培养。蛋白纯化在Ni-NTA上进行。将获得的纯化级分进行透析并储存。在用CBB染色的SDS-PAGE凝胶上对纯化的蛋白级分进行Bottom分析。显示了WT RAGE(泳道1)、RAGE^S376A(泳道2)、RAGE^S389A(泳道3)和RAGE^S376A-S389A(泳道4)的纯度。在所有测试级分中可见对应于重组RAGE的55kDa的突出条带。在所有分析的级分中都可以看到具有更高或更低分子量的附加条带，它们代表与重组蛋白一起纯化的污染物。

图8显示了超纯RAGE的表达和纯化。左：重组RAGE蛋白的表达和纯化的示意图。将各自的载体构建体转化到大肠杆菌细胞中。转化的细胞在TB中培养。蛋白纯化在Ni-NTA上进行。将获得的纯化级分施加在肝素琼脂糖柱上以进一步纯化。将所得的超纯级分应用于使用Sephacryl S200色谱柱的进一步纯化步骤。将获得的超纯蛋白级分透析并储存。右：在用CBB染色的SDS-PAGE凝胶上分析纯化的蛋白级分。显示了WT RAGE(泳道1)、RAGE^S376A(泳道2)、RAGE^S389A(泳道3)和RAGE^S376A-S389A(泳道4)和RAGE^S376E-S389E(泳道5)的纯度。在所有测试级分中可见对应于重组RAGE的55kDa突出带。在所有测试样本中均未见到具有更高或更低分子量的附加条带，表明蛋白级分的纯度很高。

图9显示了来自糖尿病个体和年龄匹配的对照组的人肺切片的代表性图像，这些切片如实施例7一样被Masson三色染色法，P21、P16或IL-6染色，并通过明视场和偏振光(刻度为40μm)可视化。

图10显示未经处理的野生型小鼠(盐水对照)、未经处理的糖尿病小鼠(盐水对照)以及用含有高磷酸化RAGE(S376E-S389E)或未磷酸化RAGE(S376A-S389A)的病毒粒子转导的糖尿病小鼠经Masson三色染色法染色的肺切片的代表性图像，该图像通过明视场和偏振光可视化，其中累积的ECM或衰老区域通过其蓝色染色(刻度为40μm)识别。虚线表示各自的缩放窗口。结果证实，如通过Masson三色染色法染色观察到的，拟磷酸化RAGE的引入导致细胞外基质组分减少。

图11显示了在STZ诱导的糖尿病、RAGE处理和非糖尿病对照小鼠的肺切片和肾切片中Masson三色染色法染色的定量结果。这些柱代表被Masso三色染色法染色覆盖的正方形像素区域。A)表示图10所示图像的量化。B)表示图6A)中所示图像的量化。

图12的A)显示代表IL-6阳性细胞的平均百分比的图，IL-6阳性细胞是持续性DNA损伤的标记。通过免疫荧光分析显示年龄相匹配的对照组和3个月或6个月STZ诱导糖尿病小鼠的肺中的IL-6阳性细胞(表示出平均百分比值(平均±SD**：P<0.01：***P≤0.001；N＝6)。图12的B)显示，用如实施例1和表1所述的各个RAGE病毒粒子转导的来自6个月STZ诱导糖尿病小鼠肺中的持续性DNA损伤标记物IL-6阳性细胞的平均百分比。通过免疫荧光分析测定IL-6染色(平均±SD，*：P<0.05，***：P≤0.001，(N＝8)。

图13显示了以图例所示的各个RAGE病毒粒子转导的6个月STZ诱导糖尿病小鼠的肺中γH2AX阳性细胞核的定量分析结果。在病毒转导后6周收获肺。空载体用作对照。

图14的A)中描绘了代表性的免疫印迹的图像，其显示了利用特异性抗体(抗AsRed2；抗γH2AX)的经转导的糖尿病小鼠肺中突变体RAGE、仅空载体(仅RFP)和γH2AX的表达。图14的B)中显示了采用如表1所示的各个RAGE病毒粒子的6个月STZ诱导糖尿病小鼠的肺中pATM阳性细胞核的定量分析的结果(平均±SD；**：P<0.01，(N＝8)。

图15的A)中显示了对来自非糖尿病对照小鼠或用含有RAGE S376E-S389E、RAGES376A-S389A的AAV2/8或空载体(仅RFP)转导的6个月STZ诱导糖尿病小鼠的肺中的静态顺应性的定量分析结果(平均±SD，

P<0.05，N＝8)。图15的B)中，描绘了代表性的免疫印迹，其显示了RAGE突变体(AA：S376A-S389A或EE：S376E-S389E)以及γH2AX和组蛋白H3在非糖尿病小鼠的肾脏中的表达。

具体实施方式

为了提供对说明书和权利要求书以及此类术语所赋予范围的清楚一致的理解，提供了以下定义。

定义

如本文所用，“肽”涉及通过肽键连接的氨基酸链。肽可由任何类型的任意数目的氨基酸组成，优选天然存在的氨基酸，其优选通过肽键连接。特别地，肽包含至少3个氨基酸，优选至少5个、至少7个、至少9个、至少12个或至少15个氨基酸。此外，肽的长度没有上限。然而，优选地，根据本发明的肽的长度不超过500个氨基酸，更优选地，其长度不超过300个氨基酸；甚至更优选不超过250个氨基酸。因此，术语“肽”包括通常是指具有2至20个氨基酸的长度的肽的“寡肽”，以及具有至少60个、至少80个、优选至少100个氨基酸的“多肽”。

如本文所用，术语“多肽”是指肽。术语“多肽”和“蛋白质”可互换使用。本文所用的多肽和蛋白质包括化学合成的蛋白质以及由基因编码的天然合成的蛋白质。多肽或蛋白质可以得自天然来源(例如人血)，或在细胞培养物中产生比如重组蛋白质。

如本文所用，术语“蛋白质”涉及可以包含一个或更多个多肽链。具有一个和多于一个多肽链的蛋白质通常被表达在来自一个基因的一个多肽链上，并且仅在翻译后被切割。因此，术语“蛋白质”和“多肽”通常可互换使用。

如本文所用，术语“蛋白质结构域”或“结构域”是指这样的蛋白质的区域，其可以独立于蛋白质的其余部分而折叠成稳定的三维结构。该结构可以维持完整蛋白质内的与结构域的功能相关的特定功能，包括酶促活性、创建另一种分子的识别基序或提供蛋白质存在于特定环境中所必需的结构成分。在蛋白质家族和其他需要类似功能的蛋白质超家族中，蛋白质结构域通常是蛋白质的进化保守区域。

根据本发明的术语“融合蛋白”涉及通过将最初针对不同的蛋白质/肽所编码的两个或更多个基因、cDNA或序列连接而产生的蛋白质。这些基因可以天然存在于同一生物体或不同生物体中，也可以是合成的多核苷酸。

如本文所用，术语“患者”表示待治疗的哺乳动物，特别是患有脑癌的人。

如本文所用，术语“哺乳动物”是指任何哺乳动物，包括但不限于啮齿目哺乳动物，诸如小鼠和仓鼠；以及兔形目(order Logomorpha)哺乳动物诸如兔子；食肉目哺乳动物，包括猫科动物(猫)和犬科动物(狗)；偶蹄目哺乳动物，包括牛科动物(牛)和猪(猪)；或奇蹄目哺乳动物，包括马科动物(马)；灵长目动物；Ceboids或Simoids(猴子)或类人目动物(人和猿)。

两个氨基酸序列之间或两个核苷酸序列之间的相关性由参数“同一性”描述。为了本发明的目的，使用如在EMBOSS软件包(EMBOSS:The European Molecular Biology OpenSoftware Suite,Rice et a/.,2000,Trends Genet.16:276-277)(优选版本3.0.0或更新版本)的尼德尔(Needle)程序中实施的Needleman-Wunsch算法(Needleman and Wunsch,1970,J.Mol.Biol.48:443-453)来确定两个氨基酸序列之间的序列同一性程度。使用的可选参数是空位开放罚分10，空位延伸罚分0.5和EBLOSUM62(BLOSUM62的EMBOSS版本)替换矩阵。尼德尔标记的“最长同一性”的输出(使用非简化选项获得)用作同一性百分比，其计算方式如下：

(相同残基x 100)/(比对长度-比对中的空位总数)。

为了本发明的目的，使用如在EMBOSS软件包(EMBOSS:The European MolecularBiology Open Software Suite,Rice et a/.,2000，同上)(优选版本3.0.0或更新版本)的尼德尔程序中实施的Needleman-Wunsch算法(Needleman and Wunsch,1970，同上)来确定两个核苷酸序列之间的序列同一性程度。使用的可选参数是空位开放罚分10，空位延伸罚分0.5和EDNAFULL(NCBI NUC4.4的EMBOSS版本)替换矩阵。尼德尔标记的“最长同一性”的输出(使用-非简化选项获得)用作同一性百分比，其计算方式如下：

(相同的脱氧核糖核苷酸x 100)/(比对长度-比对中的空位总数)

例如，至少90％的同一性包括与受试序列具有90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或甚至99％的同一性。通常，尽管可以包括任何数量的保守氨基酸替代，然而，相似的序列将在与肽或多核苷酸的功能相关的位置上包括相同的残基，例如活性位点残基或糖基化的氨基酸。

根据本发明的术语“运载体(carrier)”涉及可用于将货物递送到患者细胞中的分子，货物特别是活性药物成分，例如多核苷酸或蛋白质。运载体可以与货物共价或非共价结合，也可以封装货物。

当涉及细胞、核酸、蛋白质或载体(vector)时使用的术语“重组”表示该细胞、核酸、蛋白质或载体已通过异源核酸或蛋白质的引入或者对天然核酸或蛋白质的改变而被修饰，或者该细胞源自如此修饰的细胞。因此，例如，重组细胞表达在细胞的天然(非重组)形式内找不到的基因，或以与自然界不同的水平或在不同条件下来表达天然基因。

根据本发明的“分离的”多核苷酸(例如，RNA、DNA或混合的聚合物)或肽是与自然伴随天然人序列或蛋白质的其他细胞组分基本上分离的那些，所述其他细胞组分例如核糖体、聚合酶、染色体、其他RNA分子和蛋白质。该术语包括已经从其天然存在的环境中去除的核酸序列或蛋白质，并且包括重组或克隆的DNA分离物和化学合成的类似物或通过异源系统生物合成的类似物。

与“包括”、“含有”或“特征在于”同义的过渡术语“包含”是包含性或开放性的，并且不排除其他未叙述的要素或方法步骤。过渡短语“由……组成”排除权利要求中未指定的任何要素、步骤或成分，但是不排除通常与其相关联的杂质。当短语“由……组成”出现在权利要求的主体的从句中而不是紧跟在前序之后时，它仅限制了该从句中列出的要素；该权利要求整体上也不排除其他要素。过渡短语“基本上由……组成”将权利要求的范围限制为指定的材料或步骤“以及实质上不影响要求保护的发明的基本和新颖特征的那些”。““基本上由……组成”的权利要求在以“由……组成”格式写成的封闭式权利要求与以“包括”格式起草的完全开放式权利要求之间占据中间立场。”

拟磷酸化(Phosphomimetic)RAGE

根据第一方面，本发明提供了一种拟磷酸化RAGE蛋白，其包含与天然哺乳动物RAGE同工型或其片段具有至少90％同一性的氨基酸序列，其中存在于哺乳动物RAGE同工型的CD中的至少一个丝氨酸被替换为拟磷酸化结构。

在从小鼠到人类的高级多细胞生物体中，RAGE是高度保守的蛋白质。编码RAGE的基因由11个不同的外显子组成，位于人类的6号染色体上和小鼠的17号染色体上，并且在两个物种中都靠近主要组织相容性复合物(MHC)III(Sugaya et al.,1994)。

在结构上，RAGE属于免疫球蛋白超家族，该蛋白由N-末端信号肽(人RAGE中的氨基酸1-22)、V-型免疫球蛋白样结构域(人RAGE中的氨基酸23-116)、两个串联的C-型免疫球蛋白样结构域(在人RAGE中分别为氨基酸124-221和227-317)、单个跨膜结构域(人RAGE中的氨基酸343-363)和一个短的C-末端胞内胞质尾区(人RAGE中的氨基酸364-404)组成。

组合的可变结构域和C1(VC1)结构域主要参与配体结合，而C2结构域主要参与配体结合的精细调节和配体识别的特异性。可变结构域由于其固有的三维结构(例如β-折叠和原纤维)而识别配体(Bierhaus,Humpert,Morcos,et al.,2005；Moser,Herold,&Schmidt,2006；Schmidt,Yan,Yan,&Stern,2000；S.F.Yan et al.,2007)。

跨膜结构域允许受体锚定并跨越细胞膜。小胞质尾区主要参与将受体连接到细胞内信号传导通路(Kislinger et al.,1999；Neeper et al.,1992；Schmidt et al.,1992)。RAGE经历各种翻译后修饰，诸如糖基化、泛素化(ubiquititnation)和磷酸化(Bannister&Kouzarides,2011)(177，)。根据这些修饰的程度，其分子量可以为48KDa至64KDa或更大。

与配体结合的V、C1和C2结构域也参与DNA结合。因此，不希望受理论的束缚，暗示这些结构域对于RAGE在DNA修复中的功能至关重要。因此，根据本发明的拟磷酸化RAGE蛋白优选至少包含VC1结构域。在这方面，应当指出，哺乳动物RAGE的最高度保守的片段由SEQID NO:1的氨基酸40至241形成，其包括一部分V结构域和完整的C1结构域。根据第一方面的一个实施方案，天然哺乳动物RAGE同工型或其片段含有氨基酸序列即SEQ ID NO:1的氨基酸40至241。

根据另一个实施方案，拟磷酸化RAGE蛋白包含VC1和C2结构域。此外，在胞质尾区(CT)中发生了拟磷酸化替换，即至少一个丝氨酸被拟磷酸化结构替换。因此，拟磷酸化RAGE蛋白至少包含CT的一部分。根据一个优选的实施方案，拟磷酸化RAGE蛋白包含完整的CT。

根据一个实施方案，拟磷酸化RAGE含有V结构域、C1结构域、C2结构域、跨膜结构域和CT。

根据一个实施方案，拟磷酸化RAGE蛋白包含与天然哺乳动物RAGE同工型或其片段具有至少95％同一性的氨基酸序列。优选地，氨基酸序列与天然哺乳动物RAGE同工型或其片段具有至少98％同一性。

根据本发明的拟磷酸化结构涉及看起来化学上类似于磷酸化氨基酸的任何部分(moiety)。通常，磷酸基团被添加到丝氨酸、酪氨酸和苏氨酸中。因此，由于结构和化学性质上的相似性，拟磷酸化结构能够或可以被认为是恒定磷酸化的丝氨酸、酪氨酸或苏氨酸，并且能够或可以具有与恒定磷酸化的丝氨酸、酪氨酸或苏氨酸相同的作用。

用于替换RAGE的细胞质结构域中的一个或更多个丝氨酸的拟磷酸化结构可以是相同或不同的部分。拟磷酸化结构可以是与磷酸化丝氨酸类似的天然或合成的氨基酸或者任何其他分子。在拟磷酸化RAGE中，至少一个丝氨酸优选被拟磷酸化氨基酸替换。拟磷酸化氨基酸可以是谷氨酸或天冬氨酸。根据一个实施方案，拟磷酸化结构是谷氨酸。

拟磷酸化RAGE特别是在通过ATM信号级联反应而被磷酸化的丝氨酸的位置上含有拟磷酸化结构。如Kumar et al.2015所示，通过博来霉素或喜树碱诱导DNA双链断裂(DSB)、激活ATM信号级联反应，导致鼠RAGE在丝氨酸376和389处的磷酸化(以SEQ ID NO:1为参考)，并导致在细胞核中鼠RAGE的核积累。此外，如实施例1所示，用谷氨酸替换这些丝氨酸而得的拟磷酸化RAGE具有增强的减少肺纤维化的作用。在人RAGE中，发现了鼠Ser389的等同物在位置391处(以SEQ ID NO:3作为参考)。Ser376在人类中不是保守的。发明人现在可以证明，博来霉素或喜树碱对DNA DSB的诱导导致人RAGE在丝氨酸Ser391处磷酸化，并且还导致在细胞核中人RAGE的核积累(参见实施例4，特别是图3)。因此，这提供了这样的证据，即对于所有哺乳动物RAGE，通过ATM信号级联反应的Ser389以及任选的Ser376的核定位和磷酸化的影响是保守的。因此，对于缓解纤维化的增强的药理作用可以合理地概括为是由于拟磷酸化的人RAGE和其他哺乳动物RAGE蛋白。

参考实施例，拟磷酸化RAGE可以例如源自鼠RAGE。在这种情况下，所述氨基酸序列与SEQ ID NO:1或其片段具有至少95％同一性。优选地，拟磷酸化RAGE与由SEQ ID NO:1鉴定的鼠RAGE或其片段具有至少98％同一性，更优选至少99％同一性。鼠RAGE的片段可以例如含有SEQ ID NO:1的氨基酸40至214和364至404。根据一个实施方案，鼠RAGE的片段含有SEQ ID NO:1的氨基酸23至221和364至404。根据一个实施方案中，鼠RAGE的片段含有SEQID NO:1的氨基酸23至317和364至404。根据一个实施方案，鼠RAGE的片段含有SEQ ID NO:1的氨基酸23至404。

源自鼠RAGE的拟磷酸化RAGE蛋白可以含有替换Ser376或Ser389的拟磷酸化结构。不希望受理论的束缚，假设替换两个丝氨酸之一就已导致活性增强和/或核定位增强。然而，如实施例中所示，优选地，Ser376和Ser389均被拟磷酸化结构替换。优选地，Ser376和Ser389独立地被一个或多个拟磷酸化氨基酸替换，所述拟磷酸化氨基酸例如天冬氨酸和谷氨酸。更优选地，Ser376和Ser389均被谷氨酸替换。因此，根据一个实施方案，拟磷酸化RAGE包含与SEQ ID NO:2具有至少95％同一性，优选至少98％同一性，更优选至少99％同一性的氨基酸序列。

可选择地，拟磷酸化RAGE可以源自人RAGE。在这种情况下，氨基酸序列与SEQ IDNO:3或其片段具有至少95％同一性。优选地，拟磷酸化RAGE与由SEQ ID NO:3鉴定的人RAGE或其片段具有至少98％同一性，更优选至少99％同一性。人RAGE的片段可以例如含有SEQID NO:3的氨基酸40至214和364至404。根据一个实施方案，鼠RAGE的片段含有SEQ ID NO:3的氨基酸23至221和364至404。根据一个实施方案，人RAGE的片段含有SEQ ID NO:3的氨基酸23至317和364至404。根据一个实施方案，人RAGE的片段含有SEQ ID NO:3的氨基酸23至404。因此，根据一个实施方案，拟磷酸化RAGE包含与SEQ ID NO:4具有至少95％同一性的氨基酸序列。优选地，序列同一性为至少98％。更优选地，与SEQ ID NO:4的序列同一性为至少99％。然而，根据一个实施方案，与SEQ ID NO:4的序列同一性低于100％。属于该定义的拟磷酸化RAGE蛋白的实例是SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:24和SEQ ID NO:25的蛋白。SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:24和SEQ ID NO:25的拟磷酸化RAGE蛋白的一个氨基酸不同于SEQ ID NO:4。在SEQ ID NO:23中，位置362的亮氨酸被赖氨酸替换。在SEQ ID NO:24中，位置32的谷氨酸酯(盐)被赖氨酸替换。在SEQ ID NO:25中，位置367的谷氨酰胺被赖氨酸替换。

根据一个实施方案，拟磷酸化RAGE具有SEQ ID NO:4或其片段的氨基酸序列。根据一个实施方案，拟磷酸化RAGE具有SEQ ID NO:23或其片段的氨基酸序列。根据一个实施方案，拟磷酸化RAGE具有SEQ ID NO:24或其片段的氨基酸序列。根据一个实施方案，拟磷酸化RAGE具有SEQ ID NO:25或其片段的氨基酸序列。根据一个实施方案，所述拟磷酸化RAGE不具有SEQ ID NO:4的氨基酸序列。

拟磷酸化RAGE蛋白也可以与其他肽融合，诸如亲和标签(affinity tags)、延长半衰期的肽或靶向肽。

根据第一方面的拟磷酸化RAGE蛋白可以特别用于治疗由DNA修复受损引起的疾病、由DNA损伤增加引起的疾病或由衰老加剧引起的疾病。因此，根据一个实施方案，根据第一方面的拟磷酸化RAGE蛋白用于医学治疗，特别是用于治疗由DNA修复受损引起的疾病、由DNA损伤增加引起的疾病或由衰老加剧引起的疾病。疾病和给药方法在以下第五方面中进一步定义。

融合蛋白

特别地，被拟磷酸化结构替换的相关丝氨酸残基是通过ATM信号级联反应RAGE被磷酸化的靶标。相对于野生型RAGE，拟磷酸化RAGE在DNA修复并因此在例如肺纤维化的降低中的改善效果，似乎至少部分是由于拟磷酸化RAGE的核输入增加所致。因此，不希望被理论所束缚，将野生型RAGE靶向细胞核的其他手段也将导致DNA修复增强，从而改善纤维化缓解。

因此，根据第二方面，本发明提供了RAGE蛋白的融合蛋白，其包含与至少一个细胞核靶向结构融合的、与天然哺乳动物RAGE同工型或其片段具有至少90％同一性的氨基酸序列。

细胞核靶向结构的添加还防止了膜结合型RAGE的增加，因此避免或至少减少了与RAGE上调相关的病理事件。

融合蛋白的RAGE蛋白可以例如源自鼠RAGE。在这种情况下，氨基酸序列与SEQ IDNO:1或其片段具有至少95％同一性。优选地，RAGE与由SEQ ID NO:1鉴定的鼠RAGE或其片段具有至少98％同一性，更优选至少99％同一性。鼠RAGE的片段可以例如含有SEQ ID NO:1的氨基酸40至214。根据一个实施方案，鼠RAGE的片段含有SEQ ID NO:1的氨基酸23至221。根据一个实施方案，鼠RAGE的片段含有SEQ ID NO:1的氨基酸23至317。根据一个实施方案，鼠RAGE的片段含有SEQ ID NO:1的氨基酸23至404。

根据第二方面的融合蛋白中的RAGE蛋白可以是根据第一方面的拟磷酸化RAGE蛋白。即使已显示拟磷酸化RAGE蛋白定位于核内，但是附加的NLS仍可以提高拟磷酸化RAGE蛋白的核定位效率，从而增强DNA修复并减少膜结合型RAGE蛋白的炎性副作用。

根据本发明的细胞核靶向结构可以是具有将RAGE蛋白递送至细胞核的潜在功能的任何部分或序列。特别地，细胞核靶向结构是核定位序列(NLS)。通常，NLS由暴露于蛋白质表面的带正电荷的赖氨酸或精氨酸的一个或更多个短序列组成，但其他类型的NLS也是已知的。NLS的非限制性实例包括源自以下的NLS序列：SV40病毒大T抗原的NLS，具有氨基酸序列PKKKRKV(SEQ ID NO:7)；来自核质蛋白的NLS(例如核质蛋白双分型(bipartite)NLS，具有序列KRPAATKKAGQAKKKK(SEQ ID NO:8))；c-myc NLS，具有氨基酸序列PAAKRVKLD(SEQID NO:9)或RQRRNELKRSP(SEQ ID NO:10)；hRNPA1 M9 NLS，具有序列NQSSNFGPMKGGNFGGRSSGPYGGGGQYFAKPRNQGGY(SEQ ID NO:11)；来自输入蛋白-α的IBB结构域的序列RMRIZFKNKGKDTAELRRRRVEVSVELRKAKKDEQILKRRNV(SEQ ID NO:12)；肌瘤T蛋白的序列VSRKRPRP(SEQ IDNO:13)和PPKKARED(SEQ ID NO:14)；人p53的序列PQPKKKPL(SEQ ID NO:15)；小鼠c-abl IV的序列SALIKKKKKMAP(SEQ ID NO:16)；流感病毒NS1的序列DRLRR(SEQ ID NO:17)和PKQKKRK(SEQ ID NO:18)；肝炎病毒δ抗原的序列RKLKKKIKKL(SEQ ID NO:19)；小鼠Mx1蛋白的序列REKKKFLKRR(SEQ ID NO:20)；人聚(ADP-核糖)聚合酶的序列KRKGDEVDGVDEVAKKKSKK(SEQ ID NO:21)；和类固醇激素受体(人)糖皮质激素的序列RKCLQAGMNLEARKTKK(SEQ IDNO:22)。

当存在多于一个的NLS时，可以选择每一个而不依赖于其它，使得单个NLS可以以多于一个的拷贝存在和/或与一个或更多个其他的NLS组合在一起以一个或多个拷贝存在。细胞核靶向结构可以与RAGE蛋白的C-末端或N-末端融合。优选地，NLS连接至N-末端。

融合蛋白可以与一个或更多个亲和标签连接。亲和标签的实例是聚组氨酸、蛋白A、谷胱甘肽S转移酶、P物质、FLAG、链霉亲和素和免疫球蛋白重链恒定区。

多核苷酸

根据第三方面，本发明提供了分离的多核苷酸，其具有对根据第一方面的拟磷酸化RAGE或根据第二方面的融合蛋白进行编码的核酸序列。

用于分离或克隆编码肽的多核苷酸的技术是本领域已知的，并且包括从基因组DNA分离、从cDNA制备或其组合。可以例如通过使用众所周知的聚合酶链反应(PCR)或表达文库的抗体筛选以检测具有共同结构特征的克隆的DNA片段，可以实现从这种基因组DNA克隆多核苷酸。参见，例如，Innis et al.,1990，PCR:A Guide to Methods and Application(PCR：方法与应用指南)，学术出版社，纽约。可以使用其他核酸扩增程序，例如连接酶链反应(LCR)、连接活化转录(LAT)和基于多核苷酸的扩增(NASBA)。

根据一个实施方案，分离的多核苷酸包含编码鼠拟磷酸化RAGE的、与SEQ ID NO:5具有至少95％同一性、优选至少98％同一性、更优选至少99％同一性的核酸序列。

根据另一个实施方案，分离的多核苷酸包含编码人拟磷酸化RAGE的、与SEQ IDNO:6具有至少95％同一性、优选至少98％同一性、更优选至少99％同一性、最优选100％同一性的核酸序列。

该分离的多核苷酸特别地可用于插入表达载体以体外表达根据第一方面的RAGE蛋白或根据第二方面的RAGE融合蛋白。或者，分离的多核苷酸可以用于体内RAGE蛋白的表达，即基因治疗。

因此，根据一个实施方案，根据第二方面的分离的多核苷酸用于医学治疗，特别是用于治疗由DNA修复受损引起的疾病、由DNA损伤增加引起的疾病或由衰老加剧引起的疾病。疾病和给药方法在以下第五方面中进一步定义。

用于基因转移或体外表达的载体

在第四方面，本发明还涉及包含根据第三方面的多核苷酸的表达载体。对于基因治疗，分离的多核苷酸特别地被引入载体中，以在患者细胞中进行蛋白质的瞬时转染和表达，或稳定整合到被引入的患者细胞的基因组中。载体可以是要用于基因治疗的转基因表达载体，特别是根据第一方面的拟磷酸化RAGE蛋白或根据第二方面的融合蛋白的体内表达。

转基因表达载体可以是例如源自病毒的载体，诸如慢病毒载体、腺病毒载体或腺相关病毒(AAV)载体。特别地，转基因表达载体可以是重组腺相关病毒(rAAV)载体。

腺相关病毒AAV属于依赖(Dependo)病毒属，依赖病毒属又属于细小病毒科(Parvovirinae)的亚科，也称为细小病毒(parvoviruses)，能够感染脊椎动物。细小病毒科属于小型DNA动物病毒科，即细小病毒科。从属名可以推论，依赖病毒的成员的独特性在于它们通常需要与辅助病毒(诸如腺病毒或疱疹病毒)共感染以在细胞培养中进行产毒性感染。依赖病毒属包括通常会感染人类的AAV和感染其他温血动物的相关病毒(例如，牛、犬、马和绵羊腺相关病毒)。有关细小病毒和细小病毒科的其他成员的更多信息描述于KennethI.Berns,"Parvoviridae:The Viruses and Their Replication(细小病毒科：病毒及其复制),"第69章，病毒学领域(第3版，1996年)。

通过使用分子方法，从野生型腺相关病毒(wtAAV)得到rAAV。rAAV载体不同于wtAAV载体，因为其病毒基因组的全部或一部分已被转基因替换，所述转基因是相对于本文进一步定义的AAV核酸序列而言的非天然核酸。

转基因表达载体还优选包含控制元件(例如启动子)，以及转录和翻译终止信号。为了能够在患病细胞或组织中提供拟磷酸化RAGE的表达，启动子可以是组织特异性启动子。优选地，启动子选自角质形成细胞特异性启动子、肝特异性启动子、成纤维细胞特异性启动子或巨噬细胞特异性启动子。

如实施例1所述，可以产生这样的rAAV病毒，其携带有编码拟磷酸化RAGE或包含RAGE的融合蛋白的基因。

可选择地，表达载体可以用于根据第一方面的拟磷酸化RAGE蛋白或根据第二方面的融合蛋白的体外表达。

表达载体还优选包含控制元件(诸如启动子)，以及转录和翻译终止信号。根据第三方面的多核苷酸和控制元件可以连接在一起以产生重组表达载体，该重组表达载体可以包括一个或更多个限制位点，以允许编码所述多肽的多核苷酸在这样的位点插入或替代。所述多核苷酸可以插入合适的表达载体中进行表达。在创建表达载体时，编码序列位于表达载体中，从而使编码序列与适当控制序列可操作地连接以进行表达。

体外表达载体可以是能方便地经历重组DNA程序并能引起本发明第四方面的多核苷酸表达的任何载体(例如，质粒或病毒)。体外表达载体的选择通常将取决于表达载体与该表达载体要被引入其中的宿主细胞的相容性。表达载体可以是线性的或闭合环状的质粒。

体外表达载体可以适用于基于细胞的表达或无细胞的表达。表达载体可以是自主复制载体，即作为染色体外实体存在的载体，其复制不依赖于染色体复制，例如质粒、染色体外元件、微型染色体或人工染色体。

对于自主复制，载体还可以包括复制起点，其使载体能够在所讨论的宿主细胞中自主复制。复制起点可以是在细胞中起作用的、介导自主复制的任何质粒复制子。术语“复制起点”或“质粒复制子”是指使质粒或载体能够在体内复制的多核苷酸。

可选择地，载体可以是这样一种载体，即当被引入到宿主细胞时，该载体被整合到基因组中并与其中整合了该载体的染色体一起复制。为了整合到宿主细胞基因组中，表达载体可以依靠表达载体的任何其他元件以通过同源或非同源重组整合到基因组中。可选择地，载体可以含有另外的多核苷酸，以通过同源重组而在染色体中的精确位置处定向整合到宿主细胞的基因组中。

本发明的体外表达载体优选含有一种或更多种(例如几种)可选择的标记物，其允许容易地选择转化的、转染的、转导的细胞等等。可选择的标记物是这样一种基因，即其产物提供杀生物剂(biocide)或病毒的抗性、对重金属的抗性、相对于营养缺陷型的原养型(prototrophy to auxotrophs)等。

用于连接上述元件以构建本发明的重组表达载体的方法是本领域技术人员众所周知的(参见，例如，Sambrook et al,1989，同上)。

治疗方法/供使用的组合物

根据第五方面，本发明提供包含运载体和活性药物成分的组合物，所述活性药物成选自根据第一方面的拟磷酸化RAGE蛋白、根据第二方面的融合蛋白和根据第四方面的载体，所述组合物用于治疗或预防患者的疾病。第五方面的主题还可以被定义为用于治疗或预防患者的疾病的方法，包括向患者施用包含运载体和活性药物成分的组合物，所述活性药物成分选自根据第一方面的拟磷酸化RAGE蛋白、根据第二方面的融合蛋白和根据第四方面的载体。更一般地，本发明还涉及一种用于治疗或预防患者的疾病的方法，包括向所述患者施用根据第一方面的拟磷酸化RAGE。可选择地，用于治疗或预防患者疾病的方法包括向患者施用根据第二方面的融合蛋白。此外，根据本发明的用于治疗或预防患者疾病的方法可以包括向患者施用根据第三方面的分离的多核苷酸，尤其是根据第四方面的载体。

根据第五方面的一个实施方案，提供用于治疗或预防患者疾病的组合物，其中所述组合物包含运载体和根据第四方面的载体。代替施用载体形式的基因，也可以转染或转导分离的多核苷酸。因此，根据第五方面的替代实施方案，提供用于治疗或预防患者疾病的组合物，其中所述组合物包含运载体和根据第三方面的分离的多核苷酸。根据第五方面的替代实施方案，提供用于治疗或预防患者疾病的组合物，其中所述组合物包含运载体和根据第一方面的拟磷酸化RAGE蛋白。根据第五方面的替代实施方案，提供用于治疗或预防患者疾病的组合物，其中所述组合物包含运载体和根据第二方面的融合蛋白。

如实施例中所示，向患有肺纤维化的糖尿病小鼠施用载体形式的拟磷酸化RAGE导致纤维化的缓解和肺功能恢复至健康个体的水平。相应地，体内表达的拟磷酸化RAGE成功地增强了DNA修复，使得肺纤维化不仅停止而且减少了。然而，拟磷酸化RAGE的作用不限于肺组织。发明人能够证明拟磷酸化RAGE减少了患有诱导糖尿病的小鼠中的肾纤维化和DNA损伤(参见实施例7和图6)。此外，AAV2/8-RAGE^S376E-S389E病毒粒子的转导提高了糖尿病小鼠肾脏再灌注损伤的存活率。最后，RAGE的拟磷酸化突变体改善了神经再生(参见实施例6和图5)。

基于该证据，可以合理地预期，拟磷酸化RAGE对涉及DNA损伤的任何疾病(诸如由DNA修复受损引起的疾病、由DNA损伤增加引起的疾病或由衰老加剧引起的疾病)都有作用。

根据一个实施方案，该疾病是肺、神经、肾脏、血管或淋巴管的疾病。优选地，该疾病是肺、神经或肾脏的疾病。

根据一个实施方案，该疾病选自与年龄相关的疾病、肝纤维化、糖尿病并发症、神经退行性疾病、辐射损伤、局部缺血再灌注、中风、心肌梗塞、与肾衰竭和替代疗法相关的组织损伤、败血病、诸如创伤愈合受损和牛皮癣的皮肤病、肺纤维化，其中肺纤维化尤其是由吸烟、污染、糖尿病、辐射或化学疗法引起。

用于引入载体或拟磷酸化RAGE的合适运载体包括病毒运载体和非病毒运载体。病毒运载体的实例是腺病毒衣壳、腺相关病毒衣壳、慢病毒衣壳和病毒样颗粒(VLP)，例如细小病毒科的VLP。

诸如腺病毒、AAV或慢病毒的病毒系统可以提供(表达)载体和作为运载体的衣壳两者。

非病毒运载体是例如PEI纳米颗粒、脂质体或明胶纳米颗粒、脂质体、免疫球蛋白或其片段。PEI纳米颗粒由聚醚酰亚胺(PEI)聚合物形成，直径为50nm至100nm，被认为是长期安全和生物相容的。明胶是一种源自胶原蛋白的蛋白质。阳离子明胶纳米颗粒的直径为100nm至300nm，通过将阳离子，例如乙二胺、腐胺、亚精胺或精胺化学引入明胶的羧基制得。脂质体是由一个或多个磷脂双分子层构成的球形囊泡。免疫球蛋白或其片段包括完整抗体、Fab片段，F(ab′)₂片段、Fd片段、Fv片段、dAb片段、分离的互补决定区(CDR)和单链Fv(scFv)。

根据优选的实施方案，API是rAAV载体，其包含编码拟磷酸化RAGE蛋白的多核苷酸，并且运载体是AAV衣壳。优选地，衣壳对患病的组织或细胞具有特异性。根据一个实施方案，AAV系统(rAAV载体/衣壳)是AAV2/8。不同的AAV衣壳对不同的组织具有特异性。因此，应根据要治疗的疾病选择AAV衣壳。

为了增加特异性，该组合物还可以包含特异性靶向患者的患病细胞的细胞靶向部分。细胞靶向部分可以是例如被组织特异性细胞受体特异性结合的肽。

实施方案的组合物可以通过药学领域中众所周知的任何方法来制备并给药到受试者。参见，例如Goodman&Gilman's The Pharmacological Basis of Therapeutics(Goodman和Gilman：治疗学的药理学基础),Hardman等人编，McGraw—Hill Professional(第10版，2001)；Remington:The Science and Practice of Pharmacy(雷明顿：药学科学与实践),Gennaro编，Lippincott Williams&Wilkins(第20版，2003年)；和PharmaceuticalDosage Forms and Drug Delivery Systems(药物剂型和药物递送系统)，Ansel等人编，Lippincott Williams&Wilkins(第7版，1999年)。另外，实施方案的药物组合物也可以配制为包括其他医学上有用的药物或生物制剂。

组合物可以通过任何常规的给药途径施用于患者，例如，口服、胃肠外或通过吸入或通过局部应用。胃肠外给药包括静脉注射、皮下注射、腹膜内注射、肌内注射、液体剂、混悬剂、乳剂和滴剂。对于胃肠外给药，药物组合物应为可注射剂，例如液体剂或混悬剂。为此，组合物优选以诸如无菌无热原水和无菌无热原盐溶液的液体运载体进行配制。配方的其他潜在成分粘合剂、崩解剂、表面活性剂、吸收促进剂、水分保持剂、吸收剂、润滑剂、填充剂、增量剂、增湿剂、防腐剂、稳定剂、乳化剂、增溶剂、控制渗透压的盐、稀释剂诸如缓冲剂和赋形剂，通常根据配方的使用形式来使用。根据所得配方的单位剂量而任选地选择和使用这些。根据一个实施方案，所述用途包括将所述组合物通过静脉(IV)、腹膜内(IP)、通过吸入或通过局部应用给药到患者。

含有根据第三方面的多核苷酸和作为运载体的AAV衣壳的rAAV的组合物可以在首发感染中按体重以10¹²至10¹⁶个病毒粒子/kg范围的剂量转导给患者。优选地，以一级速率(primary rate)计的剂量范围为10¹³至10¹⁵个病毒粒子/kg体重，更优选为8 10¹³至10¹⁴个病毒粒子/kg体重。

初次应用后，可以应用进一步的加强感染(booster infection)。加强感染的剂量的范围可以为在首发感染中10¹¹至10¹⁵个病毒粒子/kg体重。优选地，以一级速率计的剂量范围为10¹²至10¹⁴个病毒粒子/kg体重，更优选6 10¹²至10¹³个病毒粒子/kg体重。

该组合物也可以用于细胞疗法。因此，根据第五方面的一个实施方案，活性药物成分是根据第四方面的载体，并且所述治疗是细胞疗法，包括以下步骤：

-从患者的患病组织获得细胞；

-培养所述细胞；

-用该组合物转染患者的细胞，以及

-施用来自患者的转染细胞。

生产方法

根据第六方面，本发明提供制备根据本发明第一方面的拟磷酸化RAGE蛋白或根据本发明第二方面的融合蛋白的方法。该方法至少包括蛋白质的蛋白表达纯化的步骤。

为了表达融合蛋白，可以使用基于细胞的或无细胞的(体外)表达系统。常见的基于细胞的系统是细菌例如大肠杆菌、枯草杆菌(B.subtilis)，酵母(yeast)例如酿酒酵母(S.cerevisiae)，或真核细胞系诸如杆状病毒感染的Sf9细胞，哺乳动物细胞(例如CHO细胞、HEK293细胞或HeLa细胞)。

因此，根据本发明第六方面的一个实施方案，制备根据本发明的第一方面和第二方面的拟磷酸化RAGE或融合蛋白的方法至少包括以下步骤：

a)将根据第三方面的多核苷酸引入宿主细胞；

b)在导致以所述多核苷酸为模板的蛋白质表达的条件下在培养基中培养转化的宿主细胞；

c)分离表达产物。

根据第四方面的表达载体被引入宿主细胞中，使得所述表达载体被保留为染色体组成部分或如前所述的自复制的染色体外载体。

术语“宿主细胞”涵盖由于复制期间发生的突变而与亲本细胞不同的、亲本细胞的任何后代。宿主细胞的选择在很大程度上取决于编码多肽的基因及其来源。宿主细胞可以是可用于重组制备本发明的多肽的任何细胞，例如原核生物或真核生物。

原核宿主细胞可以是任何革兰氏阳性细菌或革兰氏阴性细菌。革兰氏阳性细菌包括但不限于芽孢杆菌、链球菌、链霉菌、葡萄球菌、肠球菌、乳杆菌、乳球菌、梭状芽孢杆菌(Clostridium)、地芽孢杆菌(Geobacillus)和大洋芽孢杆菌(Oceanobacillus)。革兰氏阴性细菌包括但不限于大肠杆菌、假单胞菌、沙门氏菌、弯曲杆菌、幽门螺杆菌、黄杆菌、梭杆菌、棒状杆菌(llyobacter)、奈瑟氏菌和脲原体。宿主细胞也可以是真核生物，例如哺乳动物、昆虫、植物或真菌细胞。优选地，宿主细胞是大肠杆菌。

适用于融合蛋白生产在营养培养基中的宿主细胞培养方法是本领域众所周知的。例如，宿主细胞可以通过摇瓶培养、在实验室或工业发酵罐中小规模或大规模发酵(包括连续、分批、分批补料或固态发酵)在合适的培养基中和在使融合蛋白得以表达的条件下培养。使用本领域已知的方法，在包含碳源和氮源以及无机盐的合适的营养培养基中进行培养。合适的培养基可以从商业供应商处获得，或者可以根据公开的组合物(例如，在美国典型培养物保藏中心的目录中)进行制备。

取决于所用宿主/载体系统，融合蛋白可能会或可能不会被分泌到营养培养基中。在被分泌的情况下，则多肽可以直接从培养基中回收。否则，将细胞与培养基分离并进行裂解。

细胞裂解的方法是本领域已知的。细胞裂解方法的非限制性实例是机械破坏、液体均质化、超声处理、冻融程序或研钵和研杵。

可以使用本领域已知的方法回收拟磷酸化RAGE蛋白或融合蛋白。例如，可以通过常规方法从营养培养基中回收拟磷酸化RAGE蛋白或融合蛋白，所述常规方法包括但不限于离心、过滤、萃取、喷雾干燥、蒸发或沉淀。

可以通过本领域中已知的多种程序来纯化拟磷酸化RAGE蛋白或融合蛋白，所述程序包括但不限于色谱法(例如，离子交换、亲和、疏水、聚焦层析和尺寸排阻)、电泳程序(例如，制备性等电聚焦)、差别溶解度(例如硫酸铵沉淀)、SDS-PAGE或萃取(例如参见ProteinPurification,J.-C.Janson和Lars Ryden编辑,VCH出版社,纽约,1989)以获得基本上纯的多肽。

高纯度纯化RAGE的方法

根据目前的技术水平，全长RAGE通常使用聚组氨酸标签亲和色谱法，特别是聚组氨酸Ni-NTA纯化系统、由Qiagen商业化的

方法纯化。

聚组氨酸标签是蛋白质中的氨基酸基序，其由至少六个组氨酸(His)残基组成，通常在蛋白质的N-或C-末端。它也被称为六组氨酸标签、6xHis标签、His6标签以及商标名称His-tag(由EMD Biosciences注册)。

聚组氨酸标签以微摩尔的亲和力结合到螯合剂，诸如镍的亚氨基二乙酸(Ni-IDA)和镍的次氮基三乙酸(Ni-NTA)和钴的羧甲基天冬氨酸盐(Co-CMA)。用于纯化的适合树脂是用螯合剂官能化的琼脂糖凝胶/琼脂糖。

然而，如实施例8所示，尽管该纯化方法实现了RAGE蛋白的一定程度的纯度，但是该纯度不足以用于全长RAGE蛋白的医学用途。所有测试的RAGE蛋白的最终纯化样品，尤其是RAGE突变蛋白，还包含除了纯化的RAGE外的几种蛋白。在这方面，参考图7，其示出了SDS-PAGE分析的结果。在凝胶中，除了55 kDA处的RAGE蛋白条带外，更高分子量和更低分子量的蛋白条带均不可见。

本发明人基于第一纯化步骤(特别是聚组氨酸Ni-NTA色谱法)结合肝素色谱法，定义了一种新颖的纯化方法。该纯化方法提供了高度纯化的RAGE蛋白，包括野生型和突变型RAGE。

固定化的肝素与蛋白质具有两种主要的相互作用的方式。已知其对多种生物分子具有亲和力，包括凝结因子和其他血浆蛋白、脂蛋白、蛋白质合成因子、作用于核酸的酶和类固醇受体。肝素由于其具有硫酸根阴离子基团，因此还用作高容量阳离子交换剂。然而，到目前为止，RAGE与肝素的结合还未见描述。

因此，根据第七方面，本发明提供了一种利用聚组氨酸标签的RAGE蛋白的纯化方法，包括以下步骤：

-提供包含带有多组氨酸标签的RAGE蛋白和污染物蛋白的第一溶液；

-使第一溶液经历Ni-NTA色谱法并洗脱出含有RAGE蛋白的第二溶液；和

-使第二溶液经历肝素色谱法，并洗脱出含有RAGE蛋白的第三溶液。

根据第七方面的一个实施方案，该方法还包括使含有RAGE蛋白的第三溶液经历凝胶过滤色谱法，特别是Sephacryl色谱法。

可以使第一溶液、第二溶液和第三溶液进行过滤和/或缓冲液更换。第一溶液优选是通过裂解其中产生RAGE蛋白的宿主细胞并随后离心获得的上清液。可以用上面列出的任何方法进行细胞裂解。裂解优选由超声处理引起。裂解缓冲液优选含有Tris-HCl缓冲液、NaCl、甘油、咪唑和β-巯基乙醇。

裂解缓冲液中Tris-HCl的浓度范围可以为5 mM至100 mM。优选地，Tris-HCl的浓度范围为10 mM至50 mM。更优选地，Tris-HCl的浓度范围为15 mM至35 mM。最优选地，Tris-HCl的浓度范围为20 mM至30mM，特别地，Tris-HCl的浓度为约25mM。

裂解缓冲液中NaCl的浓度范围可以为50 mM至2000 mM。优选地，NaCl的浓度范围为100 mM至1000 mM。更优选地，NaCl的浓度范围为300 mM至800mM。最优选地，NaCl的浓度范围为400 mM至500mM，特别地NaCl的浓度为约450mM。

裂解缓冲液中甘油的浓度范围可以为1 wt％至50 wt％。优选地，甘油的浓度范围为2 wt％至40 wt％。更优选地，甘油的浓度范围为5 wt％至20 wt％。最优选地，甘油的浓度范围为8 wt％至12 wt％，特别地，甘油的浓度为约10 wt％。

裂解缓冲液中咪唑的浓度范围可以为10 mM至100 mM。优选地，咪唑的浓度范围为15 mM至90mM。更优选地，咪唑的浓度范围为20 mM至80mM。最优选地，咪唑的浓度范围为40mM至60mM，特别地，咪唑的浓度为约50mM。

裂解缓冲液中β-巯基乙醇的浓度范围可以为0.1 mM至10 mM。优选地，β-巯基乙醇的浓度范围为0.5 mM至8mM。更优选地，β-巯基乙醇的浓度范围为1 mM至5 mM。最优选地，β-巯基乙醇的浓度范围为1.5 mM至2.5 mM，特别地，β-巯基乙醇的浓度为约2mM。

裂解缓冲液的pH范围特别地为7至8。优选地，裂解缓冲液的pH范围为7.2至7.8。更优选地，裂解缓冲液的pH范围为7.4至7.6，特别地，pH为约7.5。

对于多组氨酸纯化，可以使用本领域已知的任何Ni-NTA树脂。优选地，树脂是来自Qiagen的

系统的Ni-NTA琼脂糖。结合优选地以分批模式进行。结合时间的范围可以为20分钟至10小时。优选地，结合时间的范围为1小时至5小时。更优选地，结合时间的范围为2.5至3.5小时。

在第一溶液结合到Ni-NTA柱上之后，去除流出物，并优选用裂解缓冲液洗涤柱。然后用Ni-NTA洗脱缓冲液洗脱结合的RAGE蛋白。Ni-NTA洗脱缓冲液优选含有与裂解缓冲液相同的组分，但是含有增大的咪唑浓度。

裂解缓冲液中咪唑的浓度范围可以为100 mM至1000 mM。优选地，咪唑的浓度范围为200 mM至800mM。更优选地，咪唑的浓度范围为400 mM至600 mM。最优选地，咪唑的浓度范围为450 mM至550 mM，特别地，咪唑的浓度为约500 mM。

可以使用咪唑的增加浓度的梯度进行洗脱。从Ni-NTA柱洗脱出第二溶液后，可以更换缓冲液，优选通过透析来更换。经缓冲液更换的第二溶液可以特别地含有Tris-Cl、KCl和β-巯基乙醇。

经缓冲液更换的第二溶液中Tris-HCl的浓度范围可以为5 mM至100mM。优选地，Tris-HCl的浓度范围为10 mM至50mM。更优选地，Tris-HCl的浓度范围为15 mM至35 mM。最优选地，Tris-HCl的浓度范围为20 mM至30mM，特别地Tris-HCl的浓度为约25 mM。

经缓冲液更换的第二溶液中KCl的浓度范围可以为10 mM至500 mM。优选地，KCl的浓度范围为20 mM至200 mM。更优选地，KCl的浓度范围为50 mM至150 mM。最优选地，KCl的浓度范围为80 mM至120 mM，特别地KCl的浓度为约100 mM。

经缓冲液更换的第二溶液中的pH范围可以为7至8。优选地，裂解缓冲液的pH范围为7.2至7.8。更优选地，pH范围为7.4至7.6，特别地，pH为约7.5。

对于肝素色谱法，树脂可以是本领域已知的任何肝素树脂。肝素树脂优选为Heparin Sepharose 6 Fast

(GE Healthcare Life Sciences)。结合优选地以分批模式进行。结合时间的范围可以为20分钟至100分钟。优选地，结合时间的范围为40分钟至80分钟。更优选地，结合时间的范围为在50至70分钟。

使用肝素洗脱缓冲液从肝素树脂洗脱第三溶液。肝素洗脱缓冲液可以特别地含有Tris-Cl、NaCl和β-巯基乙醇。

经缓冲液更换的第二溶液中Tris-HCl的浓度范围可以为5 mM至100 mM。优选地，Tris-HCl的浓度范围为10 mM至50mM。更优选地，Tris-HCl的浓度范围为15 mM至35 mM。最优选地，Tris-HCl的浓度范围为20 mM至30mM，特别地Tris-HCl的浓度为约25 mM。

肝素洗脱缓冲液中NaCl的浓度范围可以为50 mM至2000 mM。优选地，NaCl的浓度范围为100 mM至1000mM。更优选地，NaCl的浓度范围为300 mM至800mM。最优选地，NaCl的浓度范围为400 mM至600mM，特别地NaCl的浓度为约500 mM。

肝素洗脱缓冲液中的pH范围可以例如为7至8。优选地，裂解缓冲液的pH范围为7.2至7.8。更优选地，pH的范围为7.4至7.6，特别地，pH为约7.5。

通过以下说明性实施例进一步解释本发明。

实施例

实施例1：病毒制备

如O’Driscoll(2012)所述进行HEK293细胞中重组AAV病毒粒子的制备。对于每种载体类型，以5×10⁶个细胞/烧瓶接种细胞。一旦细胞达到80％融合度，就用表1所示的相应质粒进行转染。HEK 293T细胞的三重转染(triple-transfection)设置如下：对于每个融合的T150烧瓶，将12.5μg的AAV骨架质粒(用RAGE-RFP表达盒通过替换GFP克隆到pAM CBAWPRE bGH骨架质粒中；表1)、25μg DP2rs辅助质粒和12μg pXr8质粒加入到15mL反应管中的2.4mL无菌水中，然后向混合物中加入330μL的2.5M CaCl₂。将转染混合物通过0.2μm注射器过滤器过滤到另一个15mL反应管中，并在剧烈混合溶液的同时，加入2.5mL的2x HeBs缓冲液(280mM NaCl、1.5mM Na₂HPO₄、50mM HEPES，pH 7.5)。将混合物在室温下孵育5分钟，并将5mL施加至相应的T150烧瓶。

将转染的细胞在37℃/5％CO₂下孵育。转染后16小时，去除培养基并用新鲜的完全DMDM替换。转染后96小时，细胞通过剧烈混合在裂解缓冲液(50mM Tris、150mM NaCl，pH8.4)中裂解以释放AAV病毒粒子。将裂解液和培养基样品在37℃水浴中孵育30分钟。通过在4℃下3000g离心15分钟去除细胞碎片。使用碘克沙醇梯度和Vivaspin离心浓缩器(截止值为50KDa)来纯化并浓缩病毒粒子。

表1：用于AAV制备的质粒的详细信息。

实施例2：糖尿病患者的肺部肺功能和静态顺应性的测量可以通过AAV2/8- RAGE^S376E-S389E病毒粒子得到改善。

为了测试拟磷酸化RAGE恢复糖尿病患者的肺功能和静态顺应性的能力，用AAV2/8-RAGE^S376E-S389E病毒粒子转导链脲佐菌素诱导的糖尿病小鼠(糖尿病龄六个月)。

使用的小鼠

在这项研究中使用了两种不同的小鼠品系。野生型(WT)和RAGE基因敲除(RAGE^-/-)小鼠为相同的C57BL6背景。如Constein,R.,et al.(2001)所述创建RAGE^-/-小鼠。WT小鼠获自美国波士顿的Charles River。将小鼠分成四组饲养，进行12h/12h光照/黑暗周期，随意进食和饮水。在接下来的6天中通过i.p.施用新鲜溶解在无菌柠檬酸钠(0.05M，pH 4.5)中的STZ(60mg/kg)来诱导糖尿病。仅对用作对照的小鼠施用柠檬酸钠。给药后16至25天通过测量尾静脉样品中的血糖水平来验证糖尿病。诱导糖尿病后的头两周，每天测量血糖。如果葡萄糖水平偶尔恢复，则在第25至27天再次注射STZ。在头四个星期内，超过90％的小鼠患有糖尿病。血糖一增加到300mg/dl以上，就开始单独补充1U至2U甘精胰岛素(Glargine)(40U/ml)。一旦血糖水平稳定在400mg/dl至450mg/dl之间，则在头两个月每周至少测定血糖一次，此后每两周测定一次。严格的血糖控制使整个实验过程中的个体血糖水平保持稳定(健康对照组：136.2±3.06mg/dl，糖尿病小鼠：408.3±15.3mg/dl；p<0.0001)。在实验结束时进行功能测定，然后动物用CO₂处死并根据相应的测定来处理器官。

小鼠的转导

在盐水中制备用于转导的病毒接种物。然后异氟烷(isofluorene)麻醉的小鼠挂在成角度的木制平台上(通过其切牙挂在手术线上)，并用一条丝带将其轻轻地固定在适当的位置，然后轻轻打开嘴，用镊子将其舌头拉出并缓慢沿气管壁的侧面将病毒负载直接递送到气管内，而不会阻塞空气的进入。轻柔地进行该程序，以免发生组织损伤。将小鼠保持直立几秒钟，以使接种物被吸入肺部。

随后小鼠在如上所述的正常生长条件下休息4周，并定期进行监测。

肺功能测量

为了评估肺力学，如Wielputz等人(2011)所述进行侵入性肺功能分析。为此，小鼠用戊巴比妥钠(80mg/kg)麻醉，气管切开，然后放在小型动物呼吸机上(FlexiVent系统，SCIREQ，Montreal，QC，加拿大)。为防止自发呼吸，然后将小鼠用泮库溴铵(0.5mg/kg)使其瘫痪，并在(150次呼吸/分钟)的频率和3cm H₂O的呼气终末正压下用10mL/kg的潮气量通气以防止肺泡塌陷。连续测量在压力逐步增大情况下的压力-容积曲线(PVs-P)。进行所有扰动，直到获得三个可接受的测量值。

如图1所示，与盐水处理的阴性对照相比，用拟磷酸化RAGE突变体转导的糖尿病小鼠表现出增强的肺功能和改善的静态顺应性。与非糖尿病小鼠相比，仅用盐水处理的糖尿病小鼠表现出严重的肺功能降低。这与糖尿病导致肺组织内出现纤维化的事实相符。结果，肺损失是导致功能降低的动力。与盐水处理的对照相比，用AAV2/8-RAGE^S376A-S389A病毒粒子转导的小鼠表现出略微改善的肺功能。在用鼠RAGE^WT转导的小鼠中观察到甚至更好的肺功能。然而，当用拟磷酸化RAGE突变体(AAV2/8-RAGE^S376E-S389E)转导小鼠时，获得了肺功能和静态顺应性的显著改善，大体上与非糖尿病小鼠处于相同的水平。

实施例3：AAV2/8-RAGE^S376E-S389E病毒粒子的转导适时提高了糖尿病小鼠肾脏中再 灌注损伤的存活率(efficiency of survival)。

由于拟磷酸化RAGE可以改善糖尿病小鼠的肺功能，因此在遭受肾脏损伤的小鼠中测试了RAGE突变体的可能功能。WT小鼠用链脲佐菌素处理以诱导糖尿病(每组8至10只小鼠)。接下来，糖尿病龄6个月的小鼠用AAV2/8-RAGE^S376E-S389E病毒粒子预处理4周。如Dessing等人(2012)所述诱导再灌注损伤。数据代表组平均值(每组8至10只小鼠)。为了诱导肾脏损伤，在WT非糖尿病小鼠(C57BL/6；9至10周)对照或经STZ处理的小鼠中，利用异氟烷(Baxter，Deerfield，USA)吸入麻醉在全麻下夹闭两条肾动脉30分钟。小鼠皮下注射0.01mg/100g丁丙诺啡(Temgesic，RB Pharmaceuticals，Berkshire，UK)。监测小鼠存活率数天。作为参考，小鼠接受了不夹闭肾动脉情况下的类似预处理。

结果如图2所示。因此，用RAGE的拟磷酸化突变体进行预处理明显提高患有肾脏再灌注损伤小鼠的存活比率，而在相同条件下用盐水或空病毒粒子预处理的小鼠展现出降低的存活率(25％致死率)。

实施例4：活化的ATM介导的RAGE的磷酸化对于细胞核转位及其DNA修复功能是必 不可少的。

评估RAGE磷酸化

Kumar(2016)已经表明，鼠RAGE被ATM磷酸化。为了评估人RAGE是否也是ATM的靶标，通过转染人肺腺癌细胞(A549)，在体外分析了DNADSB后RAGE磷酸化的状态。为此，在用喜树碱(CPT；1μM)或博来霉素(BL；30ug/ml)处理1小时后，通过将细胞重悬于补充蛋白酶和磷酸酶抑制剂的20mM Tris-Cl pH 7.5、40mM NaCl、2mM MgCl₂、0.5％NP40、50U/ml核酸酶(Benzonase)中来制备细胞提取物。在冰上孵育15分钟后，将NaCl浓度调节至150/450mM，然后再孵育15分钟。然后将裂解物在4℃下于14K离心15分钟。上清液收集在标记的管中。然后通过3FLAG标签捕获珠(M2-琼脂糖)拉下hRAGE，并使用抗pS/TQ抗体通过免疫蛋白印迹(western blotting)来分析磷酸化，pS/TQ抗体对DNA-PK或ATM底物的保守基序具有特异性(#9607，细胞信号传导)。

已发现，在博来霉素和CPT诱导DSB之后，RAGE被磷酸化(参见图3A)。为了确定这种磷酸化的来源，在已知的DNA-PK抑制剂Nu7026或ATM的特异性抑制剂Ku55933的存在下重复实验。发现，响应于DNA损伤，RAGE的磷酸化被Ku55933而非Nu7026抑制，这表明RAGE充当ATM感应激酶的下游靶标(见图3A)。

荧光显微镜检查

A549细胞在聚L-赖氨酸包被的盖玻片(Thermo)或玻璃底培养皿(Ibidi)上生长，用BrdU(10μM，在不含酚红的DMEM培养基中24小时)预先致敏，然后用1μM喜树碱处理60分钟。孵育后，细胞在4℃下用4％多聚甲醛固定15分钟，并在室温下用在PBS中的0.3％TritonX-100透性化5分钟。然后样品以5％牛血清白蛋白阻断，并使用所示的第一抗体和第二抗体进行免疫染色。物种吸附的AlexaFluor 488/555/647第二抗体购自Abcam。用连接到倒置荧光显微镜(Cell Observer，Carl Zeiss,GmbH，

Germany)的CCD相机捕获感染细胞和对照细胞的荧光图像。使用x63油物镜扫描样品。使用ImageJ(Fiji)和Photoshop CS5(Adobe)进一步处理图像。

观察到，在诱导DNA DSB时，RAGE转位至细胞核，如图3B所示。通过与DNA DSB修复标记物γH2AX的共染色说明了DNA修复的起始。考虑到在诱导DNA DSB时RGAE就被磷酸化的事实，可以假设RAGE磷酸化先于其转位到细胞核。

实施例5：糖尿病介导的RAGE S376和S389磷酸化降低影响DNA修复功能

为了测试糖尿病小鼠中RAGE的磷酸化状态，对肺组织提取物进行免疫蛋白印迹实验。为此，收获并裂解来自糖尿病小鼠的肺组织。将暴露于辐射以产生DNA损伤的小鼠与糖尿病小鼠进行比较。利用BioBeam 8000(Gamma Service Medical GmbH，Germany)中的¹³⁷Cs以12Gy剂量率的γ辐射对小鼠进行全身辐射(TBI)。麻醉小鼠，并将其保持在通风的放射室中进行TBI。辐射后已诱发DNA损伤的小鼠再被饲养4个小时，然后处死并收集器官。对照小鼠以相同方式处理，但未暴露于辐射。

通过将细胞或组织重悬于补充蛋白酶和磷酸酶抑制剂的20mM Tris-Cl pH 7.5、40mM NaCl、2mM MgCl₂、0.5％NP40、50U/ml核酸酶中获得全细胞提取物或组织提取物(各自组织的液态N2研磨粉)。在冰上孵育15分钟后，将NaCl浓度调节至150/450mM，然后将其进一步孵育15分钟。然后将裂解物在4℃下于14K离心15分钟。上清液收集在标记的试管中，并使用Bradford试剂对总蛋白质进行定量。用约10μg至20μg的总蛋白以Laemmli缓冲液(0.8％SDS、4％甘油、100mM二硫苏糖醇、25mM Tris-HCl pH6.8、0.005％溴酚蓝)上样。蛋白质通过SDS-PAGE解析(转移到硝酸纤维素(Protran)上)，并使用与辣根过氧化物酶偶联的合适的第一抗体和第二抗体(Cell Signaling或Santa Cruz)进行探测，蛋白质检测通过ECL试剂(GE Healthcare)完成。

来自糖尿病小鼠的组织样品显示出与暴露于辐射的小鼠相当的、表明DNA DSB修复机制开始的升高的γH2AX水平。然而，如果与经辐照的组织样品相比，则糖尿病样品中磷酸化的RAGE的量显著减少。这可能是由于ATM活性随着糖尿病龄的增长而降低，导致DNADSB修复受损。结果显示在图4中。相应地，与经辐照的小鼠相比，糖尿病小鼠表现出降低的RAGE磷酸化。如由在糖尿病样品和辐照样品中获得的γH2AX信号增强所表明的，已诱发DNADBS修复机制。与辐照样品相比，尽管RAGE蛋白水平相同，但糖尿病样品中的RAGE磷酸化程度较低。

实施例6：AAV2/8-RAGE^S376E-S389E病毒粒子的转导适时改善了神经功能的恶化。

肺和肾功能的显著改善促使人们考察RAGE^S376E-S389E突变体对糖尿病小鼠神经功能恶化的益处。为此，用AAV病毒粒子转导小鼠，并在8至10周后分析神经功能。为此，将WT对照小鼠与用相应的病毒粒子转导的小鼠进行比较。简而言之，根据Hargreaves测定法的一般程序，使用Hargreaves仪器(Ugo Basile，Comerio，Italy)测量小鼠的缩足潜伏期(footwithdrawal latency)。仪器的截止时间预设为33s，强度为60。简单地说，将每只小鼠放入测试箱中，并在进行测量之前给予时间(30分钟)适应。利用交替后爪对每只动物进行三次缩足潜伏期测量。每个试验间隔5分钟，以减少皮肤损伤的可能性和皮肤伤害性感受器敏感性的改变。对于热板试验，记录直到小鼠表现出第一不适迹象的潜伏期，并确定对照动物和经处理动物之间的潜伏期差异。结果以柱状图形式显示在图5中。明显地，在用AAV2/8-RAGE^S376E-S389E转导的动物中，δ反应时间显著减少至约50％。相应地，RAGE的磷酸化突变体改善了神经再生。用AAV2/8-RAGE^S376E-S389E病毒粒子转导的糖尿病小鼠的神经病变分析显著改善了神经功能。

实施例7：AAV2/8-RAGE^S376E-S389E病毒粒子的转导适时改善了糖尿病小鼠的肾功能

由于拟磷酸化RAGE突变体提高了糖尿病小鼠肾脏再灌注损伤中的存活率，因此对RAGE突变体在肾纤维化中的功能进行了分析。因此，对用AAV2/8-RAGE^S376E-S389E病毒粒子转导的经STZ处理的肾脏组织进行了Masson三色染色法染色。通过以下对组织切片进行染色：用二甲苯将其脱蜡，通过一系列100％乙醇、95％乙醇、70％乙醇使其再水合，然后用水充分洗涤，然后用Weigert铁苏木素溶液孵育10分钟，然后用蒸馏水充分洗涤并用Biebrich猩红酸性品红溶液(scarlet-acid fuchsin solution)孵育10至15分钟。温育后，将载玻片充分洗涤并在磷钼酸-磷钨酸溶液中分化10至15分钟，并将其转移至苯胺蓝溶液中并染色5至10分钟。以蒸馏水简单冲洗，然后在1％的乙酸溶液中分化2至5分钟。在该步骤之后，再次用蒸馏水洗涤载玻片，并立即用95％乙醇、无水乙醇和正二甲苯脱水。然后安装载玻片并进行显微镜分析。在图6A中可以看到，在用Masson三色染色法染色的、AAV2/8-RAGE^S376E-S389E病毒粒子转导的小鼠的肾脏组织中，在小鼠用STZ处理时形成的累积的ECM消退了。ECM的消退与整体肾脏功能改善相关。

另外，为了量化结果，针对图6A)的每个图像，计算了被Masson三色染色法染色覆盖的正方形像素的面积。定量结果以柱状图形式显示在图11B)中。在图11B)中，明显的是，与未经处理的(盐水)STZ诱导糖尿病小鼠相比，在经RAGE^S376E-S389E处理的STZ诱导糖尿病小鼠中ECM的量显著减少。经RAGE^S376E-S389E处理的STZ诱导糖尿病小鼠中的ECM水平与非糖尿病小鼠中的ECM水平几乎相同。

为了进一步评估拟磷酸化RAGE对于STZ诱导的糖尿病的DNA损伤修复功能，对肾脏切片进行荧光显微镜检查。如在图6B中可见，STZ处理导致DNA DSB修复标记物γH2AX在细胞核中累积。相反，在用AAV2/8-RAGE^S376E-S389E病毒粒子转导的经STZ处理的细胞中不存在γH2AX的累积，与非糖尿病组织的细胞相当，表明RAGE突变体在减少DNA损伤中有作用。这通过图15b)中的免疫蛋白印迹进一步证实，图15b)显示在非糖尿病小鼠中没有γH2AX，在糖尿病小鼠中γH2AX水平高。引人注目的是，在RAGE^S376E-S389E转导的小鼠中而不是在RAGE^{S376A -S389A}转导的小鼠中，该水平显著降低。

实施例8：表达和纯化RAGE的方法

为了蛋白质表达，pET28a-RAGE构建体被转化到大肠杆菌BL21(DE3)Codon Plus(Novagen)感受态细胞中。将细菌在TB培养基中于37℃剧烈振荡(200rpm)下培养至密度为OD₆₀₀＝0.8，然后转移至25℃。用IPTG(水中0.4mM)诱导蛋白质表达。将培养物在恒定条件下进一步孵育8小时。然后将细胞培养物在4℃下以6000rpm离心15分钟。去除上清液，并在-80℃下储存细胞沉淀。

将冷冻的细胞沉淀重悬于裂解缓冲液(50mM NaHPO₄(pH＝8.0)，300mM NaCl，10mM咪唑)中以纯化蛋白质。在冰浴上用40W脉冲的超声处理促进细胞溶解，而2s持续脉冲的长度各为5min。根据QIAexpressionist方法，使用Ni NTA珠从裂解物中纯化重组蛋白。然后将纯化的级分在SDS PAGE上分析。

如图7所示，重组RAGE(55KDa)以足以使用考马斯亮蓝(CBB)染色来检测的量进行表达和纯化。CBB染色的凝胶中存在的其他条带表示使用上述纯化方法与重组RAGE一起纯化的污染物。为了进一步分析，将最纯的级分合并，并于4℃下在1X PBS或所示的反应缓冲液中透析过夜。

实施例9：表达和纯化超纯RAGE的改进方法

为了蛋白质表达，pET28a-RAGE构建体被转化到大肠杆菌BL21(DE3)Codon Plus(Novagen)感受态细胞中。将细菌在TB培养基中于37℃剧烈振荡(200rpm)下培养至密度为OD₆₀₀＝0.6，然后转移至25℃。用IPTG(水中0.3mM)诱导蛋白质表达。将培养物在恒定条件下进一步孵育12小时。接下来，将细胞培养物在4℃下以6000rpm离心15分钟。去除上清液，并在-80℃下储存细胞沉淀。

然后将沉淀重悬于裂解缓冲液(25mM Tris–Cl(pH＝7.5)，450mM NaCl，10％甘油，50mM咪唑，2mMβ-巯基乙醇)中，并在冰浴上以40W的脉冲进行超声处理，2s的持续脉冲的长度各为5分钟。然后通过在4℃下于12K离心45分钟来澄清裂解物。上清液用于在4℃下通过Ni-NTA珠以分批模式纯化重组蛋白3小时。结合后，将珠用裂解缓冲液充分洗涤，并以线性或逐步梯度(100mM至500mM)处于裂解缓冲液中的咪唑来洗脱蛋白质。在SDS PAGE上分析纯化的蛋白质，然后将合并的级分在25mM Tris-Cl(pH＝7.5)、100mM KCl、1mMβ-巯基乙醇中充分透析。经透析的蛋白质进行进一步的纯化步骤。首先将蛋白质施加到肝素-琼脂糖柱上1小时。然后，用透析缓冲液充分洗涤该柱。然后使用洗脱缓冲液(25mM Tris–Cl(pH＝7.5)，500mM NaCl，2mMβ-巯基乙醇)从肝素柱上洗脱蛋白质。为了进一步纯化，将超纯蛋白质级分施加至Sephacryl柱。该柱在透析缓冲液中平衡，然后加入2ml蛋白质浓缩液。收集峰级分，并通过SDS PAGE分析。然后将超纯级分在透析缓冲液中透析，并在4℃下储存以进一步分析。不同重组RAGE蛋白的纯化结果通过图8中的SDS-PAGE凝胶图像可视化。对应于重组RAGE，在所有测试级分中可见55kDa的明显条带。在所有测试样品中均未见到分子量更高或更低的附加条带，表明蛋白质级分的纯度很高。

实施例10：对照和糖尿病患者的肺组织分析

对人对照和糖尿病患者的肺的分析显示纤维化组织进行性累积(如Masson三色染色法染色所证明)(图9，竖直像板1、2)和P16-和P21染色所证明的衰老性病变(图9，竖直像板3、4)。如实施例7所述进行肺切片的制备和染色。在糖尿病患者中，衰老相关的分泌表型也显著增强，如IL-6的增加所证明(图9，竖直像板5)。这表明糖尿病个体中正在进行持续性DNA损伤信号传导。此外，重要的是，该结果与在未处理的糖尿病小鼠中的发现相符。因此，可以预期，小鼠中纤维化组织和衰老损伤的成功减少可以转化到人类患者。

实施例11-小鼠中RAGE的细胞核表达和纤维化的缓解

对于支持糖尿病小鼠中细胞核RAGE表达和功能会恢复DNA修复甚至增强纤维化缓解的假说进行了测试。用携带拟磷酸化RAGE突变体(RAGES376E-S389E)的AAV2/8病毒粒子处理小鼠，导致仅细胞核RAGE表达(图14A)，因此避免了跨膜或线粒体RAGE信号传导。单独的载体用作阴性对照。为了了解ATM信号传导的作用，使用了RAGE的不可磷酸化突变体(RAGES376A-S389A)。当在STZ小鼠(糖尿病龄6个月)中转导拟磷酸化突变体时，观察到DNA损伤相关簇集点的急剧减少，如yH2AX(图13)和ATM阳性簇集点(图14B)所示。这伴随着β-Gal染色和IL-6(图12B)的阳性率显著降低。如图12A所示，在健康小鼠和糖尿病小鼠中，IL-6含量均随时间增加，然而，在糖尿病小鼠中IL-6含量明显更强。使用RAGES376E-S389E，IL-6的水平可以降低到与相同年龄的健康个体相当的水平。

因此，如Masson三色染色法染色所观察到的，通过引入拟磷酸化RAGE改善DNA修复并降低衰老，导致细胞外基质成分减少(图10)。更重要的是，DNA损伤簇集点和衰老的减少也伴随着肺功能的改善，如图15A所示。然而，不可磷酸化的RAGE突变体(RAGES376A-S389A)或单独的载体只有很小的或没有效果(图15A)。

此外，为了量化糖尿病小鼠肺的Masson三色染色法染色所观察到的细胞外基质成分的减少(图10)，对于图10的每个图像均计算Masson三色染色法染色所覆盖的正方形像素的面积。定量的结果以柱状图形式显示在图11A中。在图11A的图中，明显地，与未处理的(盐水)STZ诱导糖尿病小鼠相比，在经RAGE^S376E-S389E处理的STZ诱导糖尿病小鼠中，指示纤维化组织重塑的ECM的量显著减少。经RAGE^S376E-S389E处理的STZ诱导糖尿病小鼠中的ECM水平与非糖尿病小鼠中的ECM水平几乎相同。

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序列

SEQ ID NO:1UniprotKB的鼠RAGE Q62151(序列版本2(2016年2月17日))

SEQ ID NO:2拟磷酸化mRAGE

MPAGTAARAWVLVLALWGAVAGGQNITARIGEPLVLSCKGAPKKPPQQLEWKLNTGRTEAWKVLSPQGGPWDSVARILPNGSLLLPATGIVDEGTFRCRATNRRGKEVKSNYRVRVYQIPGKPEIVDPASELTASVPNKVGTCVSEGSYPAGTLSWHLDGKLLIPDGKETLVKEETRRHPETGLFTLRSELTVIPTQGGTHPTFSCSFSLGLPRRRPLNTAPIQLRVREPGPPEGIQLLVEPEGGIVAPGGTVTLTCAISAQPPPQVHWIKDGAPLPLAPSPVLLLPEVGHEDEGTYSCVATHPSHGPQESPPVSIRVTETGDEGPAEGSVGESGLGTLALALGILGGLGVVALLVGAILWRKRQPRREERKAPEEQEDEEERAELNQEEEAEMPENGAGGP

SEQ ID NO:3UniprotKB的人RAGE Q15109(序列版本1(1997年11月01日))

SEQ ID NO:4拟磷酸化hRAGE(蛋白)

MAAGTAVGAWVLVLSLWGAVVGAQNITARIGEPLVLKCKGAPKKPPQRLEWKLNTGRTEAWKVLSPQGGGPWDSVARVLPNGSLFLPAVGIQDEGIFRCQAMNRNGKETKSNYRVRVYQIPGKPEIVDSASELTAGVPNKVGTCVSEGSYPAGTLSWHLDGKPLVPNEKGVSVKEQTRRHPETGLFTLQSELMVTPARGGDPRPTFSCSFSPGLPRHRALRTAPIQPRVWEPVPLEEVQLVVEPEGGAVAPGGTVTLTCEVPAQPSPQIHWMKDGVPLPLPPSPVLILPEIGPQDQGTYSCVATHSSHGPQESRAVSISIIEPGEEGPTAGSVGGSGLGTLALALGILGGLGTAALLIGVILWQRRQRRGEERKAPENQEEEEERAELNQEEEPEAGESSTGGP

SEQ ID NO:5拟磷酸化mRAGE(核苷酸)

ATGCCAGCGGGGACAGCAGCTAGAGCCTGGGTGCTGGTTCTTGCTCTATGGGGAGCTGTAGCTGGTGGTCAGAACATCACAGCCCGGATTGGAGAGCCACTTGTGCTAAGCTGTAAGGGGGCCCCTAAGAAGCCGCCCCAGCAGCTAGAATGGAAACTGAACACAGGAAGAACTGAAGCTTGGAAGGTCCTCTCTCCCCAGGGAGGCCCCTGGGACAGCGTGGCTCGAATCCTCCCCAATGGTTCCCTCCTCCTTCCAGCCACTGGAATTGTCGATGAGGGGACTTTCCGGTGTCGGGCAACTAACAGGCGAGGGAAGGAGGTCAAGTCCAACTACCGAGTCCGAGTCTACCAGATTCCTGGGAAGCCAGAAATTGTGGATCCTGCCTCTGAACTCACAGCCAGTGTCCCTAATAAGGTGGGGACATGTGTGTCTGAGGGAAGCTACCCTGCAGGGACCCTTAGCTGGCACTTAGATGGGAAACTTCTGATTCCCGATGGCAAAGAAACACTCGTGAAGGAAGAGACCAGGAGACACCCTGAGACGGGACTCTTTACACTGCGGTCAGAGCTGACAGTGATCCCCACCCAAGGAGGAACCCATCCTACCTTCTCCTGCAGTTTCAGCCTGGGCCTTCCCCGGCGCAGACCCCTGAACACAGCCCCCATCCAACTCCGAGTCAGGGAGCCTGGGCCTCCAGAGGGCATTCAGCTGTTGGTTGAGCCTGAAGGTGGAATAGTCGCTCCTGGTGGGACTGTGACCTTGACCTGTGCCATCTCTGCCCAGCCCCCTCCTCAGGTCCACTGGATAAAGGATGGTGCACCCTTGCCCCTGGCTCCCAGCCCTGTGCTGCTCCTCCCTGAGGTGGGGCACGAGGATGAGGGCACCTATAGCTGCGTGGCCACCCACCCTAGCCACGGACCTCAGGAAAGCCCTCCTGTCAGCATCAGGGTCACAGAAACCGGCGATGAGGGGCCAGCTGAAGGCTCTGTGGGTGAGTCTGGGCTGGGTACGCTAGCCCTGGCCTTGGGGATCCTGGGAGGCCTGGGAGTAGTAGCCCTGCTCGTCGGGGCTATCCTGTGGCGAAAACGACAACCCAGGCGTGAGGAGAGGAAGGCCCCGGAAgaaCAGGAGGATGAGGAGGAACGTGCAGAGCTGAATCAGGAAGAGGAAGCGGAGATGCCAGAGAATGGTGCCGGGGGACCGTAA

SEQ ID NO:6拟磷酸化hRAGE(核苷酸)

ATGGCAGCCGGAACAGCAGTTGGAGCCTGGGTGCTGGTCCTCAGTCTGTGGGGGGCAGTAGTAGGTGCTCAAAACATCACAGCCCGGATTGGCGAGCCACTGGTGCTGAAGTGTAAGGGGGCCCCCAAGAAACCACCCCAGCGGCTGGAATGGAAACTGAACACAGGCCGGACAGAAGCTTGGAAGGTCCTGTCTCCCCAGGGAGGAGGCCCCTGGGACAGTGTGGCTCGTGTCCTTCCCAACGGCTCCCTCTTCCTTCCGGCTGTCGGGATCCAGGATGAGGGGATTTTCCGGTGCCAGGCAATGAACAGGAATGGAAAGGAGACCAAGTCCAACTACCGAGTCCGTGTCTACCAGATTCCTGGGAAGCCAGAAATTGTAGATTCTGCCTCTGAACTCACGGCTGGTGTTCCCAATAAGGTGGGGACATGTGTGTCAGAGGGAAGCTACCCTGCAGGGACTCTTAGCTGGCACTTGGATGGGAAGCCCCTGGTGCCTAATGAGAAGGGAGTATCTGTGAAGGAACAGACCAGGAGACACCCTGAGACAGGGCTCTTCACACTGCAGTCGGAGCTAATGGTGACCCCAGCCCGGGGAGGAGATCCCCGTCCCACCTTCTCCTGTAGCTTCAGCCCAGGCCTTCCCCGACACCGGGCCTTGCGCACAGCCCCCATCCAGCCCCGTGTCTGGGAGCCTGTGCCTCTGGAGGAGGTCCAATTGGTGGTGGAGCCAGAAGGTGGAGCAGTAGCTCCTGGTGGAACCGTAACCCTGACCTGTGAAGTCCCTGCCCAGCCCTCTCCTCAAATCCACTGGATGAAGGATGGTGTGCCCTTGCCCCTTCCCCCCAGCCCTGTGCTGATCCTCCCTGAGATAGGGCCTCAGGACCAGGGAACCTACAGCTGTGTGGCCACCCATTCCAGCCACGGGCCCCAGGAAAGCCGTGCTGTCAGCATCAGCATCATCGAACCAGGCGAGGAGGGGCCAACTGCAGGCTCTGTGGGAGGATCAGGGCTGGGAACTCTAGCCCTGGCCCTGGGGATCCTGGGAGGCCTGGGGACAGCCGCCCTGCTCATTGGGGTCATCTTGTGGCAAAGGCGGCAACGCCGAGGAGAGGAGAGGAAGGCCCCAGAAAACCAGGAGGAAGAGGAGGAGCGTGCAGAACTGAATCAGgaGGAGGAACCTGAGGCAGGCGAGAGTAGTACTGGAGGGCCTCCGCGGATA

SEQ ID NO:23拟磷酸化hRAGE，突变L362至K362

MAAGTAVGAWVLVLSLWGAVVGAQNITARIGEPLVLKCKGAPKKPPQRLEWKLNTGRTEAWKVLSPQGGGPWDSVARVLPNGSLFLPAVGIQDEGIFRCQAMNRNGKETKSNYRVRVYQIPGKPEIVDSASELTAGVPNKVGTCVSEGSYPAGTLSWHLDGKPLVPNEKGVSVKEQTRRHPETGLFTLQSELMVTPARGGDPRPTFSCSFSPGLPRHRALRTAPIQPRVWEPVPLEEVQLVVEPEGGAVAPGGTVTLTCEVPAQPSPQIHWMKDGVPLPLPPSPVLILPEIGPQDQGTYSCVATHSSHGPQESRAVSISIIEPGEEGPTAGSVGGSGLGTLALALGILGGLGTAALLIGVIKWQRRQRRGEERKAPENQEEEEERAELNQEEEPEAGESSTGGP

SEQ ID NO:24拟磷酸化hRAGE，突变E32至K32

MAAGTAVGAWVLVLSLWGAVVGAQNITARIGEPLVLKCKGAPKKPPQRLEWKLNTGRTEAWKVLSPQGGGPWDSVARVLPNGSLFLPAVGIQDEGIFRCQAMNRNGKETKSNYRVRVYQIPGKPEIVDSASELTAGVPNKVGTCVSEGSYPAGTLSWHLDGKPLVPNEKGVSVKEQTRRHPETGLFTLQSELMVTPARGGDPRPTFSCSFSPGLPRHRALRTAPIQPRVWEPVPLEEVQLVVEPEGGAVAPGGTVTLTCEVPAQPSPQIHWMKDGVPLPLPPSPVLILPEIGPQDQGTYSCVATHSSHGPQESRAVSISIIEPGEEGPTAGSVGGSGLGTLALALGILGGLGTAALLIGVILWQRRQRRGEERKAPENQEEEEERAELNQEEEPEAGESSTGGP

SEQ ID NO:25拟磷酸化hRAGE，突变Q367至K367

MAAGTAVGAWVLVLSLWGAVVGAQNITARIGEPLVLKCKGAPKKPPQRLEWKLNTGRTEAWKVLSPQGGGPWDSVARVLPNGSLFLPAVGIQDEGIFRCQAMNRNGKETKSNYRVRVYQIPGKPEIVDSASELTAGVPNKVGTCVSEGSYPAGTLSWHLDGKPLVPNEKGVSVKEQTRRHPETGLFTLQSELMVTPARGGDPRPTFSCSFSPGLPRHRALRTAPIQPRVWEPVPLEEVQLVVEPEGGAVAPGGTVTLTCEVPAQPSPQIHWMKDGVPLPLPPSPVLILPEIGPQDQGTYSCVATHSSHGPQESRAVSISIIEPGEEGPTAGSVGGSGLGTLALALGILGGLGTAALLIGVILWQRRKRRGEERKAPENQEEEEERAELNQEEEPEAGESSTGGP

序列表

<110> 海德堡大学

<120> 用于治疗纤维化的RAGE蛋白质

<130> 6024W1008WO

<150> EP17177679.2

<151> 2017-06-23

<160> 25

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 402

<212> PRT

<213> 小家鼠

<400> 1

Met Pro Ala Gly Thr Ala Ala Arg Ala Trp Val Leu Val Leu Ala Leu

1 5 10 15

Trp Gly Ala Val Ala Gly Gly Gln Asn Ile Thr Ala Arg Ile Gly Glu

20 25 30

Pro Leu Val Leu Ser Cys Lys Gly Ala Pro Lys Lys Pro Pro Gln Gln

35 40 45

Leu Glu Trp Lys Leu Asn Thr Gly Arg Thr Glu Ala Trp Lys Val Leu

50 55 60

Ser Pro Gln Gly Gly Pro Trp Asp Ser Val Ala Arg Ile Leu Pro Asn

65 70 75 80

Gly Ser Leu Leu Leu Pro Ala Thr Gly Ile Val Asp Glu Gly Thr Phe

85 90 95

Arg Cys Arg Ala Thr Asn Arg Arg Gly Lys Glu Val Lys Ser Asn Tyr

100 105 110

Arg Val Arg Val Tyr Gln Ile Pro Gly Lys Pro Glu Ile Val Asp Pro

115 120 125

Ala Ser Glu Leu Thr Ala Ser Val Pro Asn Lys Val Gly Thr Cys Val

130 135 140

Ser Glu Gly Ser Tyr Pro Ala Gly Thr Leu Ser Trp His Leu Asp Gly

145 150 155 160

Lys Leu Leu Ile Pro Asp Gly Lys Glu Thr Leu Val Lys Glu Glu Thr

165 170 175

Arg Arg His Pro Glu Thr Gly Leu Phe Thr Leu Arg Ser Glu Leu Thr

180 185 190

Val Ile Pro Thr Gln Gly Gly Thr His Pro Thr Phe Ser Cys Ser Phe

195 200 205

Ser Leu Gly Leu Pro Arg Arg Arg Pro Leu Asn Thr Ala Pro Ile Gln

210 215 220

Leu Arg Val Arg Glu Pro Gly Pro Pro Glu Gly Ile Gln Leu Leu Val

225 230 235 240

Glu Pro Glu Gly Gly Ile Val Ala Pro Gly Gly Thr Val Thr Leu Thr

245 250 255

Cys Ala Ile Ser Ala Gln Pro Pro Pro Gln Val His Trp Ile Lys Asp

260 265 270

Gly Ala Pro Leu Pro Leu Ala Pro Ser Pro Val Leu Leu Leu Pro Glu

275 280 285

Val Gly His Glu Asp Glu Gly Thr Tyr Ser Cys Val Ala Thr His Pro

290 295 300

Ser His Gly Pro Gln Glu Ser Pro Pro Val Ser Ile Arg Val Thr Glu

305 310 315 320

Thr Gly Asp Glu Gly Pro Ala Glu Gly Ser Val Gly Glu Ser Gly Leu

325 330 335

Gly Thr Leu Ala Leu Ala Leu Gly Ile Leu Gly Gly Leu Gly Val Val

340 345 350

Ala Leu Leu Val Gly Ala Ile Leu Trp Arg Lys Arg Gln Pro Arg Arg

355 360 365

Glu Glu Arg Lys Ala Pro Glu Ser Gln Glu Asp Glu Glu Glu Arg Ala

370 375 380

Glu Leu Asn Gln Ser Glu Glu Ala Glu Met Pro Glu Asn Gly Ala Gly

385 390 395 400

Gly Pro

<210> 2

<211> 402

<212> PRT

<213> 小家鼠

<400> 2

Met Pro Ala Gly Thr Ala Ala Arg Ala Trp Val Leu Val Leu Ala Leu

1 5 10 15

Trp Gly Ala Val Ala Gly Gly Gln Asn Ile Thr Ala Arg Ile Gly Glu

20 25 30

Pro Leu Val Leu Ser Cys Lys Gly Ala Pro Lys Lys Pro Pro Gln Gln

35 40 45

Leu Glu Trp Lys Leu Asn Thr Gly Arg Thr Glu Ala Trp Lys Val Leu

50 55 60

Ser Pro Gln Gly Gly Pro Trp Asp Ser Val Ala Arg Ile Leu Pro Asn

65 70 75 80

Gly Ser Leu Leu Leu Pro Ala Thr Gly Ile Val Asp Glu Gly Thr Phe

85 90 95

Arg Cys Arg Ala Thr Asn Arg Arg Gly Lys Glu Val Lys Ser Asn Tyr

100 105 110

Arg Val Arg Val Tyr Gln Ile Pro Gly Lys Pro Glu Ile Val Asp Pro

115 120 125

Ala Ser Glu Leu Thr Ala Ser Val Pro Asn Lys Val Gly Thr Cys Val

130 135 140

Ser Glu Gly Ser Tyr Pro Ala Gly Thr Leu Ser Trp His Leu Asp Gly

145 150 155 160

Lys Leu Leu Ile Pro Asp Gly Lys Glu Thr Leu Val Lys Glu Glu Thr

165 170 175

Arg Arg His Pro Glu Thr Gly Leu Phe Thr Leu Arg Ser Glu Leu Thr

180 185 190

Val Ile Pro Thr Gln Gly Gly Thr His Pro Thr Phe Ser Cys Ser Phe

195 200 205

Ser Leu Gly Leu Pro Arg Arg Arg Pro Leu Asn Thr Ala Pro Ile Gln

210 215 220

Leu Arg Val Arg Glu Pro Gly Pro Pro Glu Gly Ile Gln Leu Leu Val

225 230 235 240

Glu Pro Glu Gly Gly Ile Val Ala Pro Gly Gly Thr Val Thr Leu Thr

245 250 255

Cys Ala Ile Ser Ala Gln Pro Pro Pro Gln Val His Trp Ile Lys Asp

260 265 270

Gly Ala Pro Leu Pro Leu Ala Pro Ser Pro Val Leu Leu Leu Pro Glu

275 280 285

Val Gly His Glu Asp Glu Gly Thr Tyr Ser Cys Val Ala Thr His Pro

290 295 300

Ser His Gly Pro Gln Glu Ser Pro Pro Val Ser Ile Arg Val Thr Glu

305 310 315 320

Thr Gly Asp Glu Gly Pro Ala Glu Gly Ser Val Gly Glu Ser Gly Leu

325 330 335

Gly Thr Leu Ala Leu Ala Leu Gly Ile Leu Gly Gly Leu Gly Val Val

340 345 350

Ala Leu Leu Val Gly Ala Ile Leu Trp Arg Lys Arg Gln Pro Arg Arg

355 360 365

Glu Glu Arg Lys Ala Pro Glu Glu Gln Glu Asp Glu Glu Glu Arg Ala

370 375 380

Glu Leu Asn Gln Glu Glu Glu Ala Glu Met Pro Glu Asn Gly Ala Gly

385 390 395 400

Gly Pro

<210> 3

<211> 404

<212> PRT

<213> 智人

<400> 3

Met Ala Ala Gly Thr Ala Val Gly Ala Trp Val Leu Val Leu Ser Leu

1 5 10 15

Trp Gly Ala Val Val Gly Ala Gln Asn Ile Thr Ala Arg Ile Gly Glu

20 25 30

Pro Leu Val Leu Lys Cys Lys Gly Ala Pro Lys Lys Pro Pro Gln Arg

35 40 45

Leu Glu Trp Lys Leu Asn Thr Gly Arg Thr Glu Ala Trp Lys Val Leu

50 55 60

Ser Pro Gln Gly Gly Gly Pro Trp Asp Ser Val Ala Arg Val Leu Pro

65 70 75 80

Asn Gly Ser Leu Phe Leu Pro Ala Val Gly Ile Gln Asp Glu Gly Ile

85 90 95

Phe Arg Cys Gln Ala Met Asn Arg Asn Gly Lys Glu Thr Lys Ser Asn

100 105 110

Tyr Arg Val Arg Val Tyr Gln Ile Pro Gly Lys Pro Glu Ile Val Asp

115 120 125

Ser Ala Ser Glu Leu Thr Ala Gly Val Pro Asn Lys Val Gly Thr Cys

130 135 140

Val Ser Glu Gly Ser Tyr Pro Ala Gly Thr Leu Ser Trp His Leu Asp

145 150 155 160

Gly Lys Pro Leu Val Pro Asn Glu Lys Gly Val Ser Val Lys Glu Gln

165 170 175

Thr Arg Arg His Pro Glu Thr Gly Leu Phe Thr Leu Gln Ser Glu Leu

180 185 190

Met Val Thr Pro Ala Arg Gly Gly Asp Pro Arg Pro Thr Phe Ser Cys

195 200 205

Ser Phe Ser Pro Gly Leu Pro Arg His Arg Ala Leu Arg Thr Ala Pro

210 215 220

Ile Gln Pro Arg Val Trp Glu Pro Val Pro Leu Glu Glu Val Gln Leu

225 230 235 240

Val Val Glu Pro Glu Gly Gly Ala Val Ala Pro Gly Gly Thr Val Thr

245 250 255

Leu Thr Cys Glu Val Pro Ala Gln Pro Ser Pro Gln Ile His Trp Met

260 265 270

Lys Asp Gly Val Pro Leu Pro Leu Pro Pro Ser Pro Val Leu Ile Leu

275 280 285

Pro Glu Ile Gly Pro Gln Asp Gln Gly Thr Tyr Ser Cys Val Ala Thr

290 295 300

His Ser Ser His Gly Pro Gln Glu Ser Arg Ala Val Ser Ile Ser Ile

305 310 315 320

Ile Glu Pro Gly Glu Glu Gly Pro Thr Ala Gly Ser Val Gly Gly Ser

325 330 335

Gly Leu Gly Thr Leu Ala Leu Ala Leu Gly Ile Leu Gly Gly Leu Gly

340 345 350

Thr Ala Ala Leu Leu Ile Gly Val Ile Leu Trp Gln Arg Arg Gln Arg

355 360 365

Arg Gly Glu Glu Arg Lys Ala Pro Glu Asn Gln Glu Glu Glu Glu Glu

370 375 380

Arg Ala Glu Leu Asn Gln Ser Glu Glu Pro Glu Ala Gly Glu Ser Ser

385 390 395 400

Thr Gly Gly Pro

<210> 4

<211> 404

<212> PRT

<213> 智人

<400> 4

Met Ala Ala Gly Thr Ala Val Gly Ala Trp Val Leu Val Leu Ser Leu

1 5 10 15

Trp Gly Ala Val Val Gly Ala Gln Asn Ile Thr Ala Arg Ile Gly Glu

20 25 30

Pro Leu Val Leu Lys Cys Lys Gly Ala Pro Lys Lys Pro Pro Gln Arg

35 40 45

Leu Glu Trp Lys Leu Asn Thr Gly Arg Thr Glu Ala Trp Lys Val Leu

50 55 60

Ser Pro Gln Gly Gly Gly Pro Trp Asp Ser Val Ala Arg Val Leu Pro

65 70 75 80

Asn Gly Ser Leu Phe Leu Pro Ala Val Gly Ile Gln Asp Glu Gly Ile

85 90 95

Phe Arg Cys Gln Ala Met Asn Arg Asn Gly Lys Glu Thr Lys Ser Asn

100 105 110

Tyr Arg Val Arg Val Tyr Gln Ile Pro Gly Lys Pro Glu Ile Val Asp

115 120 125

Ser Ala Ser Glu Leu Thr Ala Gly Val Pro Asn Lys Val Gly Thr Cys

130 135 140

Val Ser Glu Gly Ser Tyr Pro Ala Gly Thr Leu Ser Trp His Leu Asp

145 150 155 160

Gly Lys Pro Leu Val Pro Asn Glu Lys Gly Val Ser Val Lys Glu Gln

165 170 175

Thr Arg Arg His Pro Glu Thr Gly Leu Phe Thr Leu Gln Ser Glu Leu

180 185 190

Met Val Thr Pro Ala Arg Gly Gly Asp Pro Arg Pro Thr Phe Ser Cys

195 200 205

Ser Phe Ser Pro Gly Leu Pro Arg His Arg Ala Leu Arg Thr Ala Pro

210 215 220

Ile Gln Pro Arg Val Trp Glu Pro Val Pro Leu Glu Glu Val Gln Leu

225 230 235 240

Val Val Glu Pro Glu Gly Gly Ala Val Ala Pro Gly Gly Thr Val Thr

245 250 255

Leu Thr Cys Glu Val Pro Ala Gln Pro Ser Pro Gln Ile His Trp Met

260 265 270

Lys Asp Gly Val Pro Leu Pro Leu Pro Pro Ser Pro Val Leu Ile Leu

275 280 285

Pro Glu Ile Gly Pro Gln Asp Gln Gly Thr Tyr Ser Cys Val Ala Thr

290 295 300

His Ser Ser His Gly Pro Gln Glu Ser Arg Ala Val Ser Ile Ser Ile

305 310 315 320

Ile Glu Pro Gly Glu Glu Gly Pro Thr Ala Gly Ser Val Gly Gly Ser

325 330 335

Gly Leu Gly Thr Leu Ala Leu Ala Leu Gly Ile Leu Gly Gly Leu Gly

340 345 350

Thr Ala Ala Leu Leu Ile Gly Val Ile Leu Trp Gln Arg Arg Gln Arg

355 360 365

Arg Gly Glu Glu Arg Lys Ala Pro Glu Asn Gln Glu Glu Glu Glu Glu

370 375 380

Arg Ala Glu Leu Asn Gln Glu Glu Glu Pro Glu Ala Gly Glu Ser Ser

385 390 395 400

Thr Gly Gly Pro

<210> 5

<211> 1209

<212> DNA

<213> 小家鼠

<400> 5

atgccagcgg ggacagcagc tagagcctgg gtgctggttc ttgctctatg gggagctgta 60

gctggtggtc agaacatcac agcccggatt ggagagccac ttgtgctaag ctgtaagggg 120

gcccctaaga agccgcccca gcagctagaa tggaaactga acacaggaag aactgaagct 180

tggaaggtcc tctctcccca gggaggcccc tgggacagcg tggctcgaat cctccccaat 240

ggttccctcc tccttccagc cactggaatt gtcgatgagg ggactttccg gtgtcgggca 300

actaacaggc gagggaagga ggtcaagtcc aactaccgag tccgagtcta ccagattcct 360

gggaagccag aaattgtgga tcctgcctct gaactcacag ccagtgtccc taataaggtg 420

gggacatgtg tgtctgaggg aagctaccct gcagggaccc ttagctggca cttagatggg 480

aaacttctga ttcccgatgg caaagaaaca ctcgtgaagg aagagaccag gagacaccct 540

gagacgggac tctttacact gcggtcagag ctgacagtga tccccaccca aggaggaacc 600

catcctacct tctcctgcag tttcagcctg ggccttcccc ggcgcagacc cctgaacaca 660

gcccccatcc aactccgagt cagggagcct gggcctccag agggcattca gctgttggtt 720

gagcctgaag gtggaatagt cgctcctggt gggactgtga ccttgacctg tgccatctct 780

gcccagcccc ctcctcaggt ccactggata aaggatggtg cacccttgcc cctggctccc 840

agccctgtgc tgctcctccc tgaggtgggg cacgaggatg agggcaccta tagctgcgtg 900

gccacccacc ctagccacgg acctcaggaa agccctcctg tcagcatcag ggtcacagaa 960

accggcgatg aggggccagc tgaaggctct gtgggtgagt ctgggctggg tacgctagcc 1020

ctggccttgg ggatcctggg aggcctggga gtagtagccc tgctcgtcgg ggctatcctg 1080

tggcgaaaac gacaacccag gcgtgaggag aggaaggccc cggaagaaca ggaggatgag 1140

gaggaacgtg cagagctgaa tcaggaagag gaagcggaga tgccagagaa tggtgccggg 1200

ggaccgtaa 1209

<210> 6

<211> 1221

<212> DNA

<213> 智人

<400> 6

atggcagccg gaacagcagt tggagcctgg gtgctggtcc tcagtctgtg gggggcagta 60

gtaggtgctc aaaacatcac agcccggatt ggcgagccac tggtgctgaa gtgtaagggg 120

gcccccaaga aaccacccca gcggctggaa tggaaactga acacaggccg gacagaagct 180

tggaaggtcc tgtctcccca gggaggaggc ccctgggaca gtgtggctcg tgtccttccc 240

aacggctccc tcttccttcc ggctgtcggg atccaggatg aggggatttt ccggtgccag 300

gcaatgaaca ggaatggaaa ggagaccaag tccaactacc gagtccgtgt ctaccagatt 360

cctgggaagc cagaaattgt agattctgcc tctgaactca cggctggtgt tcccaataag 420

gtggggacat gtgtgtcaga gggaagctac cctgcaggga ctcttagctg gcacttggat 480

gggaagcccc tggtgcctaa tgagaaggga gtatctgtga aggaacagac caggagacac 540

cctgagacag ggctcttcac actgcagtcg gagctaatgg tgaccccagc ccggggagga 600

gatccccgtc ccaccttctc ctgtagcttc agcccaggcc ttccccgaca ccgggccttg 660

cgcacagccc ccatccagcc ccgtgtctgg gagcctgtgc ctctggagga ggtccaattg 720

gtggtggagc cagaaggtgg agcagtagct cctggtggaa ccgtaaccct gacctgtgaa 780

gtccctgccc agccctctcc tcaaatccac tggatgaagg atggtgtgcc cttgcccctt 840

ccccccagcc ctgtgctgat cctccctgag atagggcctc aggaccaggg aacctacagc 900

tgtgtggcca cccattccag ccacgggccc caggaaagcc gtgctgtcag catcagcatc 960

atcgaaccag gcgaggaggg gccaactgca ggctctgtgg gaggatcagg gctgggaact 1020

ctagccctgg ccctggggat cctgggaggc ctggggacag ccgccctgct cattggggtc 1080

atcttgtggc aaaggcggca acgccgagga gaggagagga aggccccaga aaaccaggag 1140

gaagaggagg agcgtgcaga actgaatcag gaggaggaac ctgaggcagg cgagagtagt 1200

actggagggc ctccgcggat a 1221

<210> 7

<211> 7

<212> PRT

<213> 猴病毒40

<400> 7

Pro Lys Lys Lys Arg Lys Val

1 5

<210> 8

<211> 16

<212> PRT

<213> 智人

<400> 8

Lys Arg Pro Ala Ala Thr Lys Lys Ala Gly Gln Ala Lys Lys Lys Lys

1 5 10 15

<210> 9

<211> 9

<212> PRT

<213> 智人

<400> 9

Pro Ala Ala Lys Arg Val Lys Leu Asp

1 5

<210> 10

<211> 11

<212> PRT

<213> 智人

<400> 10

Arg Gln Arg Arg Asn Glu Leu Lys Arg Ser Pro

1 5 10

<210> 11

<211> 38

<212> PRT

<213> 智人

<400> 11

Asn Gln Ser Ser Asn Phe Gly Pro Met Lys Gly Gly Asn Phe Gly Gly

1 5 10 15

Arg Ser Ser Gly Pro Tyr Gly Gly Gly Gly Gln Tyr Phe Ala Lys Pro

20 25 30

Arg Asn Gln Gly Gly Tyr

35

<210> 12

<211> 42

<212> PRT

<213> 智人

<400> 12

Arg Met Arg Ile Glx Phe Lys Asn Lys Gly Lys Asp Thr Ala Glu Leu

1 5 10 15

Arg Arg Arg Arg Val Glu Val Ser Val Glu Leu Arg Lys Ala Lys Lys

20 25 30

Asp Glu Gln Ile Leu Lys Arg Arg Asn Val

35 40

<210> 13

<211> 8

<212> PRT

<213> 智人

<400> 13

Val Ser Arg Lys Arg Pro Arg Pro

1 5

<210> 14

<211> 8

<212> PRT

<213> 智人

<400> 14

Pro Pro Lys Lys Ala Arg Glu Asp

1 5

<210> 15

<211> 8

<212> PRT

<213> 智人

<400> 15

Pro Gln Pro Lys Lys Lys Pro Leu

1 5

<210> 16

<211> 12

<212> PRT

<213> 小家鼠

<400> 16

Ser Ala Leu Ile Lys Lys Lys Lys Lys Met Ala Pro

1 5 10

<210> 17

<211> 5

<212> PRT

<213> 流感病毒

<400> 17

Asp Arg Leu Arg Arg

1 5

<210> 18

<211> 7

<212> PRT

<213> 流感病毒

<400> 18

Pro Lys Gln Lys Lys Arg Lys

1 5

<210> 19

<211> 10

<212> PRT

<213> 丁型肝炎病毒

<400> 19

Arg Lys Leu Lys Lys Lys Ile Lys Lys Leu

1 5 10

<210> 20

<211> 10

<212> PRT

<213> 小家鼠

<400> 20

Arg Glu Lys Lys Lys Phe Leu Lys Arg Arg

1 5 10

<210> 21

<211> 20

<212> PRT

<213> 智人

<400> 21

Lys Arg Lys Gly Asp Glu Val Asp Gly Val Asp Glu Val Ala Lys Lys

1 5 10 15

Lys Ser Lys Lys

20

<210> 22

<211> 17

<212> PRT

<213> 智人

<400> 22

Arg Lys Cys Leu Gln Ala Gly Met Asn Leu Glu Ala Arg Lys Thr Lys

1 5 10 15

Lys

<210> 23

<211> 404

<212> PRT

<213> 智人

<400> 23

Met Ala Ala Gly Thr Ala Val Gly Ala Trp Val Leu Val Leu Ser Leu

1 5 10 15

Trp Gly Ala Val Val Gly Ala Gln Asn Ile Thr Ala Arg Ile Gly Glu

20 25 30

Pro Leu Val Leu Lys Cys Lys Gly Ala Pro Lys Lys Pro Pro Gln Arg

35 40 45

Leu Glu Trp Lys Leu Asn Thr Gly Arg Thr Glu Ala Trp Lys Val Leu

50 55 60

Ser Pro Gln Gly Gly Gly Pro Trp Asp Ser Val Ala Arg Val Leu Pro

65 70 75 80

Asn Gly Ser Leu Phe Leu Pro Ala Val Gly Ile Gln Asp Glu Gly Ile

85 90 95

Phe Arg Cys Gln Ala Met Asn Arg Asn Gly Lys Glu Thr Lys Ser Asn

100 105 110

Tyr Arg Val Arg Val Tyr Gln Ile Pro Gly Lys Pro Glu Ile Val Asp

115 120 125

Ser Ala Ser Glu Leu Thr Ala Gly Val Pro Asn Lys Val Gly Thr Cys

130 135 140

Val Ser Glu Gly Ser Tyr Pro Ala Gly Thr Leu Ser Trp His Leu Asp

145 150 155 160

Gly Lys Pro Leu Val Pro Asn Glu Lys Gly Val Ser Val Lys Glu Gln

165 170 175

Thr Arg Arg His Pro Glu Thr Gly Leu Phe Thr Leu Gln Ser Glu Leu

180 185 190

Met Val Thr Pro Ala Arg Gly Gly Asp Pro Arg Pro Thr Phe Ser Cys

195 200 205

Ser Phe Ser Pro Gly Leu Pro Arg His Arg Ala Leu Arg Thr Ala Pro

210 215 220

Ile Gln Pro Arg Val Trp Glu Pro Val Pro Leu Glu Glu Val Gln Leu

225 230 235 240

Val Val Glu Pro Glu Gly Gly Ala Val Ala Pro Gly Gly Thr Val Thr

245 250 255

Leu Thr Cys Glu Val Pro Ala Gln Pro Ser Pro Gln Ile His Trp Met

260 265 270

Lys Asp Gly Val Pro Leu Pro Leu Pro Pro Ser Pro Val Leu Ile Leu

275 280 285

Pro Glu Ile Gly Pro Gln Asp Gln Gly Thr Tyr Ser Cys Val Ala Thr

290 295 300

His Ser Ser His Gly Pro Gln Glu Ser Arg Ala Val Ser Ile Ser Ile

305 310 315 320

Ile Glu Pro Gly Glu Glu Gly Pro Thr Ala Gly Ser Val Gly Gly Ser

325 330 335

Gly Leu Gly Thr Leu Ala Leu Ala Leu Gly Ile Leu Gly Gly Leu Gly

340 345 350

Thr Ala Ala Leu Leu Ile Gly Val Ile Lys Trp Gln Arg Arg Gln Arg

355 360 365

Arg Gly Glu Glu Arg Lys Ala Pro Glu Asn Gln Glu Glu Glu Glu Glu

370 375 380

Arg Ala Glu Leu Asn Gln Glu Glu Glu Pro Glu Ala Gly Glu Ser Ser

385 390 395 400

Thr Gly Gly Pro

<210> 24

<211> 404

<212> PRT

<213> 智人

<400> 24

Met Ala Ala Gly Thr Ala Val Gly Ala Trp Val Leu Val Leu Ser Leu

1 5 10 15

Trp Gly Ala Val Val Gly Ala Gln Asn Ile Thr Ala Arg Ile Gly Lys

20 25 30

Pro Leu Val Leu Lys Cys Lys Gly Ala Pro Lys Lys Pro Pro Gln Arg

35 40 45

Leu Glu Trp Lys Leu Asn Thr Gly Arg Thr Glu Ala Trp Lys Val Leu

50 55 60

Ser Pro Gln Gly Gly Gly Pro Trp Asp Ser Val Ala Arg Val Leu Pro

65 70 75 80

Asn Gly Ser Leu Phe Leu Pro Ala Val Gly Ile Gln Asp Glu Gly Ile

85 90 95

Phe Arg Cys Gln Ala Met Asn Arg Asn Gly Lys Glu Thr Lys Ser Asn

100 105 110

Tyr Arg Val Arg Val Tyr Gln Ile Pro Gly Lys Pro Glu Ile Val Asp

115 120 125

Ser Ala Ser Glu Leu Thr Ala Gly Val Pro Asn Lys Val Gly Thr Cys

130 135 140

Val Ser Glu Gly Ser Tyr Pro Ala Gly Thr Leu Ser Trp His Leu Asp

145 150 155 160

Gly Lys Pro Leu Val Pro Asn Glu Lys Gly Val Ser Val Lys Glu Gln

165 170 175

Thr Arg Arg His Pro Glu Thr Gly Leu Phe Thr Leu Gln Ser Glu Leu

180 185 190

Met Val Thr Pro Ala Arg Gly Gly Asp Pro Arg Pro Thr Phe Ser Cys

195 200 205

Ser Phe Ser Pro Gly Leu Pro Arg His Arg Ala Leu Arg Thr Ala Pro

210 215 220

Ile Gln Pro Arg Val Trp Glu Pro Val Pro Leu Glu Glu Val Gln Leu

225 230 235 240

Val Val Glu Pro Glu Gly Gly Ala Val Ala Pro Gly Gly Thr Val Thr

245 250 255

Leu Thr Cys Glu Val Pro Ala Gln Pro Ser Pro Gln Ile His Trp Met

260 265 270

Lys Asp Gly Val Pro Leu Pro Leu Pro Pro Ser Pro Val Leu Ile Leu

275 280 285

Pro Glu Ile Gly Pro Gln Asp Gln Gly Thr Tyr Ser Cys Val Ala Thr

290 295 300

His Ser Ser His Gly Pro Gln Glu Ser Arg Ala Val Ser Ile Ser Ile

305 310 315 320

Ile Glu Pro Gly Glu Glu Gly Pro Thr Ala Gly Ser Val Gly Gly Ser

325 330 335

Gly Leu Gly Thr Leu Ala Leu Ala Leu Gly Ile Leu Gly Gly Leu Gly

340 345 350

Thr Ala Ala Leu Leu Ile Gly Val Ile Leu Trp Gln Arg Arg Gln Arg

355 360 365

Arg Gly Glu Glu Arg Lys Ala Pro Glu Asn Gln Glu Glu Glu Glu Glu

370 375 380

Arg Ala Glu Leu Asn Gln Glu Glu Glu Pro Glu Ala Gly Glu Ser Ser

385 390 395 400

Thr Gly Gly Pro

<210> 25

<211> 404

<212> PRT

<213> 智人

<400> 25

Met Ala Ala Gly Thr Ala Val Gly Ala Trp Val Leu Val Leu Ser Leu

1 5 10 15

Trp Gly Ala Val Val Gly Ala Gln Asn Ile Thr Ala Arg Ile Gly Glu

20 25 30

Pro Leu Val Leu Lys Cys Lys Gly Ala Pro Lys Lys Pro Pro Gln Arg

35 40 45

Leu Glu Trp Lys Leu Asn Thr Gly Arg Thr Glu Ala Trp Lys Val Leu

50 55 60

Ser Pro Gln Gly Gly Gly Pro Trp Asp Ser Val Ala Arg Val Leu Pro

65 70 75 80

Asn Gly Ser Leu Phe Leu Pro Ala Val Gly Ile Gln Asp Glu Gly Ile

85 90 95

Phe Arg Cys Gln Ala Met Asn Arg Asn Gly Lys Glu Thr Lys Ser Asn

100 105 110

Tyr Arg Val Arg Val Tyr Gln Ile Pro Gly Lys Pro Glu Ile Val Asp

115 120 125

Ser Ala Ser Glu Leu Thr Ala Gly Val Pro Asn Lys Val Gly Thr Cys

130 135 140

Val Ser Glu Gly Ser Tyr Pro Ala Gly Thr Leu Ser Trp His Leu Asp

145 150 155 160

Gly Lys Pro Leu Val Pro Asn Glu Lys Gly Val Ser Val Lys Glu Gln

165 170 175

Thr Arg Arg His Pro Glu Thr Gly Leu Phe Thr Leu Gln Ser Glu Leu

180 185 190

Met Val Thr Pro Ala Arg Gly Gly Asp Pro Arg Pro Thr Phe Ser Cys

195 200 205

Ser Phe Ser Pro Gly Leu Pro Arg His Arg Ala Leu Arg Thr Ala Pro

210 215 220

Ile Gln Pro Arg Val Trp Glu Pro Val Pro Leu Glu Glu Val Gln Leu

225 230 235 240

Val Val Glu Pro Glu Gly Gly Ala Val Ala Pro Gly Gly Thr Val Thr

245 250 255

Leu Thr Cys Glu Val Pro Ala Gln Pro Ser Pro Gln Ile His Trp Met

260 265 270

Lys Asp Gly Val Pro Leu Pro Leu Pro Pro Ser Pro Val Leu Ile Leu

275 280 285

Pro Glu Ile Gly Pro Gln Asp Gln Gly Thr Tyr Ser Cys Val Ala Thr

290 295 300

His Ser Ser His Gly Pro Gln Glu Ser Arg Ala Val Ser Ile Ser Ile

305 310 315 320

Ile Glu Pro Gly Glu Glu Gly Pro Thr Ala Gly Ser Val Gly Gly Ser

325 330 335

Gly Leu Gly Thr Leu Ala Leu Ala Leu Gly Ile Leu Gly Gly Leu Gly

340 345 350

Thr Ala Ala Leu Leu Ile Gly Val Ile Leu Trp Gln Arg Arg Lys Arg

355 360 365

Arg Gly Glu Glu Arg Lys Ala Pro Glu Asn Gln Glu Glu Glu Glu Glu

370 375 380

Arg Ala Glu Leu Asn Gln Glu Glu Glu Pro Glu Ala Gly Glu Ser Ser

385 390 395 400

Thr Gly Gly Pro

Claims (17)

1.一种拟磷酸化RAGE蛋白，其包含与天然哺乳动物RAGE同工型或其片段具有至少90％同一性的氨基酸序列，其中所述哺乳动物RAGE同工型的胞质尾区(CT)中存在的至少一个丝氨酸被拟磷酸化结构替换。

2.根据权利要求1所述的拟磷酸化RAGE蛋白，其中所述天然哺乳动物RAGE同工型或其片段含有SEQ ID NO:1的氨基酸40至241的氨基酸序列，并且其中所述拟磷酸化结构优选地选自谷氨酸、天冬氨酸。

3.根据权利要求1或2所述的拟磷酸化RAGE，其中所述氨基酸序列与由SEQ ID NO:1鉴定的鼠RAGE或其片段具有至少95％同一性，优选至少98％同一性，更优选至少99％同一性，其中如SEQ ID NO:1中所定义的Ser376和/或Ser389被一种或多种拟磷酸化氨基酸，特别是谷氨酸替换。

4.根据权利要求3所述的拟磷酸化RAGE，其包含与SEQ ID NO:2具有至少95％同一性，优选至少98％同一性，更优选至少99％同一性的氨基酸序列。

5.根据权利要求1或2所述的拟磷酸化RAGE，其中所述氨基酸序列与由SEQ ID NO:3鉴定的人RAGE或其片段具有至少95％同一性，优选至少98％同一性，更优选至少99％同一性，其中如SEQ ID NO:3中所定义的Ser391被拟磷酸化氨基酸，特别是谷氨酸替换。

6.根据权利要求5所述的拟磷酸化RAGE，其包含与SEQ ID NO:4具有至少95％同一性，优选至少98％同一性，更优选至少99％同一性的氨基酸序列。

7.根据权利要求6所述的拟磷酸化RAGE，其中所述氨基酸序列与SEQ ID NO:4的同一性小于100％。

8.根据权利要求1至7中任一项所述的拟磷酸化RAGE，用于治疗或预防患者的疾病，其中所述疾病优选地选自由DNA修复受损引起的疾病、由DNA损伤增加引起的疾病或由衰老加剧引起的疾病。

9.一种哺乳动物RAGE蛋白的融合蛋白，其包含与至少一个细胞核靶向结构融合的、与根据权利要求1或2中任一项所述的天然哺乳动物RAGE同工型或其片段具有至少90％同一性的氨基酸序列。

10.根据权利要求9所述的融合蛋白，其中所述哺乳动物RAGE的氨基酸序列与由SEQ IDNO:3鉴定的人RAGE或由SEQ ID NO:1鉴定的鼠RAGE或它们的片段具有至少95％同一性，优选至少98％同一性，更优选至少99％同一性，并且所述细胞核靶向结构是核定位序列(NLS)。

11.一种分离的多核苷酸，其具有编码根据权利要求1至7中任一项所述的拟磷酸化RAGE或编码根据权利要求9或10所述的融合蛋白的核酸序列。

12.根据权利要求11所述的分离的多核苷酸，其核酸序列与SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:6具有至少95％同一性，优选至少98％同一性，更优选至少99％同一性。

13.一种载体，其包含根据权利要求11或12所述的多核苷酸和启动子，其中所述启动子优选是组织特异性启动子，更优选地选自角质形成细胞特异性启动子、肝特异性启动子、成纤维细胞特异性启动子或巨噬细胞特异性启动子。

14.一种包含运载体和活性药物成分的组合物，所述活性药物成分选自根据权利要求1至7中任一项所述的拟磷酸化RAGE蛋白、根据权利要求9或10所述的融合蛋白和根据权利要求13所述的载体，所述组合物用于治疗或预防患者的疾病，其中所述疾病优选地选自由DNA修复受损引起的疾病、由DNA损伤增加引起的疾病或由衰老加剧引起的疾病。

15.根据权利要求13所述的用于使用的组合物，其中所述疾病是肺、神经、肾、血管或淋巴管的疾病，优选地所述疾病选自与年龄相关的疾病、肝纤维化、糖尿病并发症、神经退行性疾病、辐射损伤、局部缺血再灌注、中风、心肌梗塞、与肾衰竭和替代疗法相关的组织损伤、败血病、诸如创伤愈合受损和牛皮癣的皮肤病、肺纤维化，其中所述肺纤维化尤其是由吸烟、污染、糖尿病、辐射或化学疗法引起。

16.根据权利要求14或15所述的用于使用的组合物，其中所述运载体是腺伴随病毒(AAV)衣壳，优选是组织特异性AAV衣壳。

17.一种利用聚组氨酸标签的RAGE蛋白的纯化方法，包括以下步骤：

-提供包含带有聚组氨酸标签的RAGE蛋白和污染物蛋白的第一溶液；

-使所述第一溶液经历Ni-NTA色谱法并洗脱含有所述RAGE蛋白的第二溶液；以及

-使所述第二溶液经历肝素色谱法，并洗脱含有所述RAGE蛋白的第三溶液。

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