WO2004047867A1 - 大腸癌転移抑制剤 - Google Patents

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WO2004047867A1
WO2004047867A1 PCT/JP2003/010449 JP0310449W WO2004047867A1 WO 2004047867 A1 WO2004047867 A1 WO 2004047867A1 JP 0310449 W JP0310449 W JP 0310449W WO 2004047867 A1 WO2004047867 A1 WO 2004047867A1
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apc
sef
asef
gene
colorectal cancer
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PCT/JP2003/010449
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Tetsu Akiyama
Yoshihiro Kawasaki
Rina Sato
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Daiichi Pharmaceutical Co.,Ltd.
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Definitions

  • the present invention relates to a colorectal cancer metastasis inhibitor and a method for suppressing metastasis of colorectal cancer, which are characterized by inhibition of the function of Asef (APC—stimuulatedgeuanllneenucleotiideexchanagangefactor) and the inhibition of expression of Asef.
  • APC timinguulatedgeuanllneenucleotiideexchanagangefactor
  • a sef expression inhibition of A sef expression, inhibition of the binding of A sef to the APC (A denomatous Polyposis Coli) gene product, or guanine nucleotide exchange factor of A sef (Guaninenucleotide Exchange Factor; Abbreviated as GEF)
  • GEF Greeninenucleotide Exchange Factor
  • Asef is a protein that has been discovered by the present inventors as a colorectal cancer suppressor gene-related protein M1, and has already been filed for patent and published (Patent Document 1 and Non-Patent Document 1).
  • the protein is a protein consisting of 619 amino acid residues and has a Db1 homology (DH) domain, a plextrin (Preckstrin) homology (PH) domain, and a Src homology.
  • the (SH3) domain carries in its amino acid sequence.
  • Rho family which is one of the small GTP-binding protein families. It is known to have typical GEF activity. That is, A sef binds to R ac and promotes the GDP / GTP exchange reaction to activate R ac, and NF ⁇ B c -jun, SRE located downstream of intracellular signaling involved in R ac Act on etc. Proteins belonging to the Rho family play important roles in reconstituting the actin network, thereby regulating cell motility and cell-cell adhesion. Thus, A sef induces cell lamellar podia (lamellipodia) and cell membrane ruffling, and may be involved in cell motility and cell-cell adhesion.
  • lamellipodia lamellipodia
  • Asef binds to the gene product of the tumor suppressor gene APC via the armadillo repeat domain of the gene product. Asef is positively regulated in GEF activity by the APC gene product. Therefore, induction of cell membrane ruffling lamellipodia formation through A sef by the APC gene product has been observed in MDCK cells, which are epithelioid cells derived from canine kidney. In addition, Asef is accumulated at the tip of the microtubule of the migrating cell in the same manner as the APC gene product in the cell. From this, it is possible that A sef holds the key to the migration control when cells move from the script (crypt) to the villus tip (vi1lustip) of the large intestine.
  • the tumor suppressor gene APC (Non-Patent Document 2) is isolated as a causative gene of familial adenomatous polyposis, iamilialadenomatous polyposis (FAP), and accounts for about 70% to about 70% of sporadic colorectal cancers. The mutation is observed in 80%.
  • the APC gene product (hereinafter referred to as APC) is a giant protein of about 300 kDa consisting of 2,843 amino acid residues, and the amino acid sequence contains no protein. There is an armadillo repeat domain responsible for the interaction. Many somatic APC mutations found in colorectal cancer cells occur in their central region, called the mutation cluster region (MCR).
  • binding sites for microcroines, EB1, hDLG, and] 3 generate truncated APC (truneated APC) in which at least some sites are cleaved for force tenin and axin (Non-patent Document 4). , 5, 6, 7, and 8).
  • APC has an action of inducing degradation by binding to a kind of oncogene product, i3-forcenine (Non-Patent Documents 2, 3, 4, 5, and 6).
  • One strength tenin is one of the Wnt ZWingless signal transduction factors.It binds to the cytoplasmic domain of force helix and plays a role in cell adhesion, and at the same time plays an important role in developmental processes and tumorigenesis. (Non Patent Literatures 9 and 10).
  • amino acid sequence of Asef and the nucleotide sequence of its gene have been registered in GenBank under the accession number AB042199.
  • amino acid sequence of APC and the nucleotide sequence of its gene are registered in Ge11Bank under the accession number NMO000038.
  • Patent Document 1 Japanese Patent Application Laid-Open No. 2001-0578888.
  • Non-Patent Document 1 Kawasaki (Kawasaki, Y.) et al., "Science (Science)", 2000, Vol. 289, pp. 1194-111.
  • Non-Patent Document 2 Kinller (Kinz 1 er, K. W.) et al., Cell (Cel), 1996, Vol. 87, p. 159—170.
  • Non-Patent Document 3 F Earnhead et al., "Human Molecu 1 ar Genetics", 2001, Vol. 10, Vol. 7 2 1 — 7 3 3.
  • Patent Document 4 Beans, Bi., M., et al., "Cell (Ce11)", 2000, Vol. 103, p.
  • Non-Patent Document 5 Perifer, M. et al., “Science”, 2000, Vol. 287, p. 9.
  • Non-Patent Document 6 Akiyama (T.), “Cytokine and Growth Factor Reviews”, 2000, Vol. 11 , P. 2 7 3 — 2 8 2.
  • Non-Patent Document 7 Miyoshi, Y., et al., "Human Molecular Genetics", 1990, Vol. 1, p. 2 2 9 — 2 3 3.
  • Non-Patent Document 8 Nagawa, H. et al., “Human Mutation,” 1993, Vol. 2, p. 425—434.
  • Non-Patent Document 9 “Cell (Cell)”, 1996, Vol. 86, p.
  • Non-Patent Document 10 “Natura”, 1991, Vol. 382, p. 638—642.
  • Non-Patent Document 11 Wong, M. H., et al., "Proceeding of National Academy of Sciences (Proceeding or national acadamyofscience USA)", 1993, Vol. 93. , P. 9 5 8 8 — 9 5 9 3.
  • Non-Patent Document 12 Oshima, H., et al., “Cancer Research”, 1995, 5th. 7 rolls, p. 1 6 4 4 — 1 6 4 9.
  • Non-patent Document 13 Paddison, P.J. et al., "Jeans and Development", 2002, Vol. 16, Vol. 4 8 — 9
  • a sef is known to bind to the gene product of the tumor suppressor gene APC, which plays an important role in tumorigenesis and developmental processes as described above, but its effect on cells and its association with diseases are known. It has not been evident yet. By clarifying the action of A sef and regulating its function, it is possible to prevent and treat diseases caused by A sef.
  • the present inventors inferred from the GEF activity of A sef and its subcellular localization that A sef might be involved in cell motility and cell-cell adhesion. In this study, they found that the motility of colorectal cancer cells was enhanced and involved in their metastasis. Utilizing this finding, they have found that colorectal cancer metastasis is suppressed by inhibiting the function of Asef and inhibiting the expression of Z or Asef gene, and completed the present invention.
  • one embodiment of the present invention relates to a colorectal cancer metastasis inhibitor characterized by inhibition of A sef function and / or inhibition of A sef gene expression.
  • Another embodiment of the present invention relates to a colorectal cancer metastasis inhibitor characterized by inhibiting the expression of the Asef gene.
  • one embodiment of the present invention relates to a colorectal cancer metastasis inhibitor characterized by inhibiting the binding of Asef to an APC gene product. Furthermore, one embodiment of the present invention relates to an agent for suppressing metastasis of colorectal cancer, which is characterized by inhibition of GEF activity of Asef.
  • One embodiment of the present invention also relates to a method for inhibiting metastasis of colorectal cancer, which comprises inhibiting the function of Asef and / or inhibiting the expression of Asef gene. Further, one embodiment of the present invention relates to a method for suppressing metastasis of colorectal cancer, which is characterized by inhibiting the expression of the Asef gene.
  • one embodiment of the present invention relates to a method for suppressing metastasis of colorectal cancer, which comprises inhibiting the binding of Asef to the APC gene product.
  • one embodiment of the present invention relates to a method for suppressing metastasis of colorectal cancer, which is characterized by inhibition of GEF activity of Asef.
  • one embodiment of the present invention relates to an Asef inhibitor characterized by utilizing RNA interference on the expression of the Asef gene.
  • one embodiment of the present invention relates to an Asef inhibitor comprising an oligonucleotide that exhibits an RNA interference effect on the expression of the Asef gene.
  • one embodiment of the present invention relates to an oligonucleotide consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 in the sequence listing.
  • one embodiment of the present invention relates to an oligonucleotide having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 2 in the sequence listing.
  • one embodiment of the present invention relates to an oligonucleotide having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 3 in the sequence listing.
  • one embodiment of the present invention relates to an oligonucleotide comprising the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 4 in the sequence listing.
  • one embodiment of the present invention relates to the Asef inhibitor comprising the oligonucleotide having the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 3 in the Sequence Listing.
  • one aspect of the present invention relates to the expression of R sef
  • the present invention relates to an A sef inhibition method characterized by utilizing NA interference.
  • Another aspect of the present invention relates to a method for inhibiting A sef, which comprises using an oligonucleotide that exhibits an RNA interference effect on the expression of an A sef gene.
  • one embodiment of the present invention relates to the above-mentioned Asef inhibition method, which comprises using an oligonucleotide having the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 1 or 3 in the sequence listing.
  • one embodiment of the present invention relates to a colorectal cancer metastasis inhibitor comprising any one of the above-mentioned Asef inhibitors.
  • Another embodiment of the present invention relates to a colorectal cancer metastasis inhibitor comprising an oligonucleotide having the nucleotide sequence of any one of SEQ ID NOS: 1 to 4 in the sequence listing.
  • one embodiment of the present invention relates to a method for suppressing metastasis of colorectal cancer, which comprises using any one of the above-mentioned ASEAN inhibitors.
  • one embodiment of the present invention relates to a method for suppressing metastasis of colorectal cancer, which comprises using an oligonucleotide having the nucleotide sequence of any one of SEQ ID NOS: 1 to 4 in the sequence listing. .
  • one embodiment of the present invention relates to a pharmaceutical composition
  • a pharmaceutical composition comprising any one of the above-mentioned colorectal cancer metastasis inhibitors or any one of the above-mentioned Asef inhibitors.
  • one embodiment of the present invention relates to an agent for preventing and / or treating colorectal cancer, comprising any of the above-mentioned agents for inhibiting metastasis of colorectal cancer, or any of the above-mentioned Asef inhibitors.
  • one embodiment of the present invention provides a method for preventing colorectal cancer, comprising using any one of the above-mentioned colorectal cancer metastasis inhibitors or any one of the above-mentioned A sef inhibitors.
  • a method for preventing colorectal cancer comprising using any one of the above-mentioned colorectal cancer metastasis inhibitors or any one of the above-mentioned A sef inhibitors.
  • FIG. 1 illustrates the reduced intercellular adhesion of MDCK cells infected with an adenovirus containing DNA encoding Asef.
  • the intercellular adhesion was represented by a value obtained by dividing the number of aggregates (N p) by the total number of cells (N c).
  • a sef-fu 11 is the full-length A sef gene
  • APC-arm is the armadillo beat domain of the APC gene
  • a sef-A APC is the A sef mutant gene in which the APC binding site has been deleted
  • One ⁇ DH indicates that the cells were infected with an adenovirus containing the A sef mutant gene in which the DH domain was deleted.
  • Results are the mean standard deviation (SD) of three experiments.
  • Fig. 2 shows that the enhanced cell motility of MDCK cells due to the expression of the A sef gene indicates that APC mutants containing the armadillo repeat domain ( ⁇ C-arm, APC-876 and APC-13) 09)
  • the co-expression of the gene was further enhanced, and the motility and the intrinsic motility of the cell, which were enhanced by the expression of the A sef gene, were increased by the A sef- ⁇ DH gene or A sef-ABR ( Explain that it was reduced by expression of the gene (APC binding region of Asef).
  • the results were expressed as relativistic migration (re1atvimemigrattion), which is related to the migration of the parent cell.
  • M o ck means cells into which an empty vector has been introduced.
  • FIG. 3a illustrates the binding of Acef and the APC truncation mutant in SW480 cells.
  • the binding analysis was performed by immunoprecipitation using an anti-Asef antibody (Anti-Asef).
  • Anti-Asef an anti-Asef antibody
  • + indicates that the antibody pre-incubated with the antigen before immunoprecipitation was used.
  • Figure 3b shows that A sef _ ABR (APC binding region of A sef) shows that IVT-APC-arm and GST-A sef-f Explain that the u11 interaction was inhibited in a dose-dependent manner.
  • MW indicates a molecular weight marker.
  • Figure 4 shows that expression of the A sef gene or the A sef gene (A sef- ⁇ APC) deleted of the APC binding site increased the motility of colon cancer cell SW480, but lacked the GEF region. Movement of various colorectal cancer cells (SW480, DLD-1, HCT15, WiDR and HCT116) despite expression of the lost A sef gene (A sef - ⁇ DH) Explain that gender did not change or decreased. The results were expressed as relative migration relative to the migration of each cell expressing the control LacZ gene (relativiemigration).
  • Fig. 5 shows that the short hairpin RNAs, shRNA-Asef and shRNA-APC, which inhibit the expression of the A sef gene and the APC gene, respectively, are in colorectal cancer cells (SW) Explain that motility of 480 and WiDR) was reduced, but did not affect the motility of colon cancer cells with normal APC (HCT116 and LS180).
  • SW colorectal cancer cells
  • short hairpin RNA that does not inhibit the expression of the Asef gene or APC gene mut—shRNA—Asef and mut-shRNA—APC were used.
  • the results were expressed as relative migration (re1atvimemigrataoint) of each cell into which mut-shRNA-Asef was introduced.
  • Non-Patent Document 12 In APC knockout mice, the growth rate of primary adenoma cells is the same as that of normal script epithelial cells, but adenoma cells undergo directed migration along the klipto villus axis. It is known that this is not the case (Non-Patent Document 12).
  • the abnormal migration mode based on the activation of A sef by the APC truncation mutant is considered to be important for the deterioration of the tumor to an invasive malignant tumor as well as the formation of adenoma.
  • mutants lacking the GEF region of A sef do not reduce cell-cell adhesion or promote cell motility, so GEF activity is important for such functions of A sef It was estimated.
  • a dominant-negative mutant that inhibits the binding of A sef to a mutant APC for example, the APC binding region (amino acids from the 73rd position to the 126th position) in the amisoic acid sequence of A sef Acid sequence) or a mutant lacking the GEF region of Asef can be used to inhibit the motility of colorectal cancer cells expressing the mutant APC. Also, it was demonstrated that inhibition of the expression of the Asef gene or the APC gene can similarly inhibit the motility of colorectal cancer cells expressing the mutant APC. Furthermore, the tumorigenicity, proliferation, and metastasis of human colon cancer cells expressing the dominant negative mutant are inhibited as compared to cells not expressing such mutant.
  • the inhibition of the function of A sef can inhibit the motility of the cells, and can further suppress the tumorigenicity of the cells and the proliferation and Z or metastasis of the tumor cells.
  • Inhibition of cell motility can also be achieved by inhibiting the expression of the A sef gene or APC gene. Suppression is possible.
  • the present invention provides a colorectal cancer metastasis inhibitor and a method for suppressing colorectal cancer metastasis, which are characterized by the inhibition of A sef.
  • the colorectal cancer metastasis inhibitor and the method for suppressing colorectal cancer metastasis include inhibiting the function of A sef and And / or A sef gene expression inhibition. .
  • RNA interference is a method recently reported as a method of suppressing gene expression using RNA (Non-Patent Document 13). Specifically, it is possible to inhibit the expression of the A sef gene by using an oligonucleotide that exhibits an RNA interference effect on the expression of the A sef gene.
  • An example of such an oligonucleotide is a cDNA comprising the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 in the sequence listing.
  • a complementary RNA of the cDNA SEQ ID NO: 3 in the sequence listing
  • a sef inhibitors containing the above-mentioned oligonucleotides are also included in the scope of the present invention.
  • the oligonucleotide contained in such an A sef inhibitor may be one kind, or two or more kinds.
  • a expression inhibition of sef genes A sef gene by the use of ⁇ Nchisensuori Gore nucleocapsid click Reochi de of oligo nucleocapsid click Reochi de or the anti Sensuori Gore j click indicating the c the RNA interference effect can be achieved
  • Leotide can be obtained by selecting an oligonucleotide designed from the nucleotide sequence of the A sef gene using an A sef gene expression system and specifically inhibiting the expression. be able to.
  • Inhibition of the function of A sef can be achieved, for example, by inhibiting the binding of A sef to APC or inhibiting the GEF activity of A sef.
  • the binding between A sef to be inhibited and APC is preferably positive for A sef Constant binding to APC, more preferably binding of Asef to an APC mutant, more preferably binding of A sef to an APJ truncation mutant, and more preferably binding to A sef Binding to truncated APC mutants containing the armadillo repeat domain.
  • APC truncated mutants containing the armadillo repeat domain include polypeptides consisting of the amino acid sequence of the N-terminal 1st to 876th consecutive amino acids of the APC amino acid sequence.
  • polypeptide consisting of the amino acid sequence of the amino acid sequence of APC from the 1st to 1309th N-terminal consecutive amino acid residues.
  • FAP familial adenomatous polyposis
  • Inhibition of binding between A sef and APC can be achieved using a dominant negative mutant of A sef for the binding.
  • an A sef mutant that can bind to APC but does not show GEF activity can be used as a binding inhibitor between A sef and APC.
  • Such an A sef mutant can be obtained by designing based on the amino acid sequence of A sef and testing the binding activity to APC by a conventional method. Specifically, a mutant in which the GEF region of Asef is deleted can be exemplified.
  • a polypeptide comprising an APC binding region (amino acid sequence from the 73rd position to the 126th position) in the amino acid sequence of Asef is preferably used.
  • polypeptides designed based on the amino acid sequence of this polypeptide it is also possible to select and use those that inhibit the binding between Asef and APC. Also, by inhibiting the expression of the APC gene, the inhibition of binding between Asef and APC can be achieved. Inhibition of APC gene expression can be achieved using oligonucleotides that exhibit RNA interference effects on APC gene expression. As such an oligonucleotide, cD consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 2 in the sequence listing is used. NA can be exemplified. In addition, the complementary RNA of the cDNA (SEQ ID NO: 4 in the sequence listing) can be used in the same manner.
  • antisense oligonucleotides of the APC gene can also inhibit the expression of the APC gene.
  • Oligonucleotides or the above antisense oligonucleotides exhibiting the RNA interference effect can be obtained by using the APC gene expression system designed based on the nucleotide sequence of the APC gene. Thus, it can be obtained by selecting a substance that specifically inhibits its expression.
  • the inhibition of GEF activity of Asef can be realized, for example, by identifying and using an inhibitor of GEF activity using Asef.
  • a compound that inhibits the expression of the Asef gene or a compound that inhibits the binding between Asef and APC may be identified and used by using the Asef gene or by using Asef and APC.
  • An Atsey system for identifying a compound can be constructed using a screening system known per se.
  • the present invention also includes a colon cancer metastasis inhibitor comprising an Asef inhibitor and a method for inhibiting colon cancer metastasis, which comprises using the above-mentioned Asef inhibitor.
  • a colorectal cancer metastasis inhibitor comprising an oligonucleotide consisting of any one of the nucleotide sequences set forth in SEQ ID NO: 1 to SEQ ID NO: 4 in the sequence listing;
  • a method for inhibiting metastasis of colorectal cancer characterized by using at least one of the leotides.
  • the present invention By applying the colorectal cancer metastasis inhibitor or A sef inhibitor according to the present invention, the tumorigenicity and metastasis of colorectal cancer can be suppressed.
  • the above colorectal cancer metastasis inhibitor or A sef inhibitor can be used for prevention and / or treatment of colorectal cancer and colorectal cancer metastasis.
  • the present invention also includes a colorectal cancer-preventing agent and / or a Z or therapeutic agent comprising the above-mentioned colorectal cancer metastasis inhibitor or A sef inhibitor as an active ingredient in an effective amount.
  • the present invention can provide a method for preventing colorectal cancer and a method for treating or treating colon cancer, characterized by using the above-mentioned colorectal cancer metastasis inhibitor or A sef inhibitor.
  • the necessary dose range of the pharmaceutical composition according to the present invention is appropriately selected depending on the efficacy of the contained components, the administration route, the nature of the prescription, the nature of the target condition, the judgment of the attending physician, and the like. .
  • a suitable dose will be, for example, in the range of about 0.01 ⁇ g to 100 mg / kg body weight of the subject, preferably in the range of about 0.1 ⁇ g to lmg. Shii t However, it is a child that is responsible for changes in these dosage levels using conventional experiments for optimization, as is well understood in the art.
  • the above dose can be administered once a day to several times a day, and may be administered intermittently at a rate of once every few days or weeks.
  • the oligonucleotide When using an oligonucleotide capable of inhibiting the expression of the A sef gene or APC gene, the oligonucleotide may be produced in cells of the subject using gene therapy.
  • Known methods can be used for gene therapy.
  • any of non-viral transfection methods in which an oligonucleotide is directly administered by injection, and a transfection method using a virus vector can be used. Can be applied.
  • the non-viral transfection method besides the method of directly administering the oligonucleotide by injection-the oligonucleotide is encapsulated in a phospholipid such as a liposome, The method of administering liposomes is recommended.
  • the use of a vasoactive liposome is more preferable.
  • the vector used for transfection by incorporating an oligonucleotide in the transfection method using a viral vector is a retrovirus.
  • DNA virus vectors such as vector, adenovirus vector, adeno-associated vector vector, and vaccine vector, or RNA virus vector. Efficient administration is possible by using these virus vectors.
  • a method of encapsulating the vector in a liposome and administering the ribosome is also recommended.
  • the medicament according to the present invention may be a medicament containing only an active ingredient of a colorectal cancer metastasis inhibitor or an A sef inhibitor, but is usually a pharmaceutical composition using one or more pharmaceutical carriers. It is preferable to manufacture
  • the amount of the active ingredient contained in the pharmaceutical preparation according to the present invention is appropriately selected from a wide range, but is usually about 0.0001 to 70% by weight, preferably 0.00001 to 5% by weight. It is appropriate to set it in the range of about% by weight.
  • Pharmaceutical carriers include diluents and excipients, such as fillers, extenders, binders, humectants, disintegrants, surfactants, and lubricants, which are usually used depending on the use form of the preparation. Excipients and the like can be exemplified, and these are appropriately selected and used depending on the administration form of the obtained preparation.
  • Such carriers include saline, buffered saline, dextrose, water, glycerol, ethanol, and mixtures thereof.
  • the carrier is not limited to these, and any substance may be used as desired, as long as it is a substance used in general pharmaceutical production.
  • the pharmaceutical composition according to the present invention can be used as a solution preparation, It can be used after freeze-drying it to make it storable, dissolving it in a buffer solution containing water or saline, and adjusting to an appropriate concentration before use.
  • the pharmaceutical composition When administering the pharmaceutical composition of the present invention, the pharmaceutical composition may be used alone, or may be used together with other compounds or medicaments necessary for the treatment.
  • the administration route can be selected from either systemic administration or local administration.
  • an appropriate administration route is selected according to the disease, symptoms, and the like.
  • parenteral routes include subcutaneous, intradermal, intramuscular, and the like, in addition to normal intravenous and intraarterial administration. Oral administration is also possible.
  • transmucosal or transdermal administration is possible. Alternatively, it can be directly administered to a tumor by injection or the like.
  • the administration form can be appropriately selected from those well known to those skilled in the art, and typical examples include tablets, pills, powders, powders, fine granules, granules, capsules and the like. Includes solid dosage forms, aqueous dosage forms, ethanolic solution preparations, suspensions, fat emulsions, liposome preparations, clathrates such as cyclodextrin, and liquid dosage forms such as syrup and elixir It is. Depending on the route of administration, these may be orally, parenterally (drops, injections), nasal, inhalants, vaginal, suppositories, sublinguals, eye drops, ear drops, ointments, tablets, etc. It is classified into reaming agents, transdermal absorbing agents, transmucosal absorbing agents, etc., and can be prepared, molded, and prepared according to the usual methods.
  • the pharmaceutical composition according to the present invention When used for gene therapy, it is generally preferable to prepare it as an injection, a drip, or a ribosome preparation. It can also be prepared in a form that can be administered together with a substance that enhances gene transfer efficiency, such as protamine.
  • Powders, pills, capsules and tablets contain ratato, glucose, Binding of excipients such as sucrose and mannitol, disintegrants such as starch and sodium alginate, lubricants such as magnesium stearate and talc, polyvinyl alcohol, hydroxypropyl cellulose and gelatin And surfactants such as fatty acid esters, and plasticizers such as dalyceline.
  • a solid pharmaceutical carrier is used to produce the capsules.
  • Suspensions can be produced using water, saccharides such as sucrose, sorbitol and flatatose, glycols such as polyethylene daricol (PEG), and oils.
  • saccharides such as sucrose, sorbitol and flatatose
  • glycols such as polyethylene daricol (PEG)
  • oils such as polyethylene daricol (PEG)
  • Injectable solutions can be prepared using carriers that consist of a salt solution, a glucose solution, or a mixture of saline and sucrose solution.
  • Libosome formation is performed, for example, by adding a solution in which the substance is dissolved in a solvent (such as ethanol) to a solution in which phospholipids are dissolved in an organic solvent (such as black form), and then distilling off the solvent. This is performed by adding a phosphate buffer to the mixture, shaking, sonicating and centrifuging, and then collecting the supernatant by filtration.
  • a solvent such as ethanol
  • Fat emulsification is necessary after, for example, mixing the substance, oil components (vegetable oils such as soybean oil, sesame oil and olive oil, MCTs, etc.), emulsifiers (phospholipids, etc.), and heating to form a solution.
  • oil components vegetable oils such as soybean oil, sesame oil and olive oil, MCTs, etc.
  • emulsifiers phospholipids, etc.
  • a quantity of water can be added and emulsification and homogenization can be carried out using an emulsifier (homogenizer, for example, a high-pressure injection type or ultrasonic type). It can also be lyophilized.
  • an emulsifying aid may be added. Examples of the emulsifying aid include glycerin and sugars (such as glucose, sorbitol and fructose). Is exemplified.
  • cyclodextrin inclusion for example, a solution prepared by dissolving cyclodextrin in water or the like is added to a solution in which the substance is dissolved in a solvent (such as ethanol), and then cooled. The deposited precipitate is filtered and sterilized and dried. This can be done. At this time, as the cyclodextrin to be used, cyclodextrin (a, ⁇ , ⁇ type) having a different pore diameter may be appropriately selected according to the size of the substance.
  • a solvent such as ethanol
  • a sef or APC used in the following examples, or a mutant thereof will be described.
  • the protein and the mutant are abbreviated.
  • Asef-fu11 is a wild-type protein consisting of full-length Asef force.
  • a fusion protein (HA_taggedwi 1 d — type A sef) to which a hemagnoretinin (HAemagg 1 utinin; HA) tag is added, or with glutathione S _ transferase (Glutathione S — transferase; GST) It was expressed as a fusion protein (GST-A sef-ful 1).
  • a sef-A APC is a mutant in which the N-terminal APC binding region of A sef is deleted. This mutant has stronger GEF activity than wild-type A sef.
  • ADH is a mutant in which the DH region (GEF region) of Asef is deleted. The mutant does not show GEF activity.
  • a sef-ABR is a polypeptide consisting of the APC binding region (amino acid sequence from the 73rd to the 126th amino acid) in the amino acid sequence of Asef. It was expressed as a fusion protein with the maltose binding protein (MBP) (MBP-Asafe-ABR).
  • MBP maltose binding protein
  • APC — arm is a polypeptide that functions as the armadillo repeat domain of APC and is a Myc-tagged fusion protein (Myc -tagged APC_arm) '.
  • APC-876 is a polypeptide consisting of consecutive amino acid residues from the N-terminal 1st to the 876th N-terminal of the amino acid sequence of APC, and is an armadillo repeat. Includes domain.
  • APC-1309 is a polypeptide consisting of consecutive amino acid residues from N-terminal 1st to 1309th of the amino acid sequence of APC. , Including Armadillo repeat domains.
  • APC-876 and APC-1309 are APC truncation mutants identified in colorectal cancer and familial adenomatous polyposis (FAP).
  • adenoviruses containing DNA encoding either of these proteins or polypeptides is performed by using an adenoexpression system (Clontech) to generate adenoviruses that encode each protein. Leotide was performed by cloning the adenovirus vector pA deno-X.
  • AdA sef-fu 11 means an adenovirus containing DNA encoding Ad sef-fu 11.
  • adenoviruses containing DNAs encoding the above-mentioned other proteins or polypeptides are represented by adding the name of each DNA with Ad.
  • Plasmids containing DNA encoding any of the above proteins or polypeptides were prepared according to conventional methods.
  • the culture of the cells was performed, and the above-described plasmid transfection was performed as follows.
  • MDCK cells epidermal-like cell lines established from normal canine kidney
  • WiDr cells were cultured in Dulbecco's modified Dudal medium supplemented with 10% fetal calf serum (FCS).
  • SW480 cells were cultured by adding 10% FCS to Leibovitz L-15 medium.
  • DLD 1 cells and HCT 15 cells were placed in RPMI 1640 medium. The cells were cultured with 0% 'FCS.
  • HCT116 cells were cultured by adding 10% FCS to McCoy's 5A medium. These cells were transfected with the above plasmid using Libofectamine 2000 (Life Technology Co., Ltd.).
  • a fusion protein with GST or a fusion protein with MBP is synthesized in Escherichia coli and sent to daltathione-sepharose (GSH—Sepharose; Phanoremasia) or amyloseresin (Amyloseresin; New England Biolabs).
  • GSH daltathione-sepharose
  • Amyloseresin Amyloseresin; New England Biolabs
  • shRNA-A sef and shRNA-APC short hairpin RNAs (hereinafter abbreviated as shRNAs) used in RNA interference tests, suppress the expression of the A sef gene and the APC gene, respectively.
  • shRNAs short hairpin RNAs
  • the nucleotide sequences of shRNA-Asef and shRNA-APC are described in SEQ ID NO: 1 and SEQ ID NO: 2 in the sequence listing, respectively. Mutations were also made to sh RNA-A sef and sh RNA-APC to create mut—sh RNA—A sef and mut—sh RNA—APC, which are sh RNAs that do not suppress the expression of A sef gene and APC gene. And described in SEQ ID NO: 5 and SEQ ID NO: 6 in the sequence listing, respectively.
  • SEQ ID NO: 5 and SEQ ID NO: 6 short hairpin RNAs
  • MDCK cells were infected with the adenovirus.
  • Adenoviruses used were AdAsef-fu11, AdAsef- ⁇ PC, AdAsef—ADH and AdAPC—arm.
  • AdLacZ was used as a control.
  • the efficiency of adenovirus infection of MDCK cells is more than 90%, as determined by immunofluorescence staining. It was confirmed. In addition, it was confirmed by immunoblotting that each of these adenoviruses produced proteins of the expected size to infect MDCK cells.
  • the infected cells were detached from the plate in phosphate-buffered saline (PBS) containing 0.02% ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) and pipetted 20 times. After that, the number of cell clusters (particles) was counted. Cell-cell adhesion was evaluated by dividing the cell cluster by the total cell number (NpZNc). When dispersed by pipetting, cells infected with AdA sef — AAPC were efficiently separated, but uninfected cells were infected with AdA sef-1 ⁇ DH or Ad LacZ. The remaining cells remained clumps (Fig. 1). From these results, it became clear that Asef has a function of reducing cell-cell adhesion and that its GEF activity is essential for this function.
  • PBS phosphate-buffered saline
  • EDTA ethylenediaminetetraacetic acid
  • AdA sef-fu 11 or AdA sef- ⁇ APC reduces the amount of E-force localized at the cell-cell contact site and reduces the amount of E localized at the cytoplasm.
  • the increase in the amount of force-drain is evident by immunohistochemical analysis using anti-E-force-drain antibody. I made it. Immunohistochemical analysis was performed 36 hours after adenovirus infection, by fixing MDCK cells with 3.7% formaldehyde in PBS.
  • the fixed cells consisted of a rat monoclonal antibody against E-forced helicen (ECCD-2; Rybiochem) and Trimethyl-rhodaminisothiocyanate-conjugated phlo- rosin (TRITC-conjugated phalloidin; Molecular Probes).
  • E-forced helicen E-forced helicen
  • TRITC-conjugated phalloidin Trimethyl-rhodaminisothiocyanate-conjugated phlo- rosin
  • TRITC-conjugated phalloidin Trimethyl-rhodaminisothiocyanate-conjugated phlo- rosin
  • TRITC-conjugated phalloidin Trimethyl-rhodaminisothiocyanate-conjugated phlo- rosin
  • the staining patterns obtained with the anti-E one-strand antibody and the anti-catenin antibody were the same as those of the anti-rat IgG antibody labeled with fluorescein-sothiosinate and the anti-rabbit IgG antibody labeled with TRITC. It was used to make it visible.
  • the cells were photographed using a Carl Zeiss LSM510 laser scanning microscope. Staining with anti- ⁇ -forced Taeyun antibody clearly revealed a decrease in the amount of force-localized tenin at the cell-cell contact site, but this decrease was not as pronounced as E-forced helin. .
  • Example 2 The effect of A sef on cell motility was examined using MDCK cells that expressed the A sef gene or APC gene or their mutant genes using the above plasmid.
  • the motility of the cells was determined by a cell migration test using a trans-well migration chamber.
  • the chamber used was MDCK cells having a diameter of 12 mm and a pore size of 12 / m (Costar). 18 hours after the transfection, MDCK cells having a cell count of 3.0 ⁇ 10 4 were added to the upper chamber of the chamber 1 and allowed to migrate to the lower side of the upper chamber for 18 hours. Cell migration was measured by counting cells that migrated to the lower side of the polycarbonate filter.
  • a sef — cells transfected with plasmid containing DNA encoding fu11 can be parental cells (MDCK) or cells transfected with vector (Mock). ) Compared to) (Fig. 2). Cells that co-expressed one of the APC-arm gene, the APC-876 gene and the APC-139 gene together with the A sef-fu 11 gene were expressed in the A sef-fu 11 gene. Motility was enhanced over transduction of the gene alone. The effect of APC on the cell motility-promoting ability of A sef was stronger for APC-arm, APC_876 and APC-1309 than for APC-fu11. On the other hand, APC_arm alone did not stimulate migration.
  • the immune complex was adsorbed to Protein G_Sepharose 6B at 4 ° C for 2 hours. After multiple washes with Buffer A containing 0.1% Triton X—100, the samples were separated by SDS-PAGE and then separated by a polyvinylidene difluoride membrane filter (Immobilon). P; Millipore). The blot was subjected to immunoblotting analysis using a mouse anti-Peacock IgG antibody (Promega) conjugated to alkaline phosphatase as a secondary antibody.
  • the used egret anti-A sef polyclonal antibody was prepared by a conventional method (Non-patent Document 1).
  • a sef was co-immunoprecipitated with an APC-cleaved mutant (FIG. 3a).
  • co-precipitation of Asef and the APC mutant was inhibited by pre-incubation of the antibody with an excess of its antigen at 4 ° C for 2 hours.
  • APC-Arm was prepared by in vitro translation (IVT-APC-Arm), and in the presence of GST-Asef-1fu11 and MBP-Asef-1ABR bound to Sepharose. Incubated at The ratio of APC-Arm to MBP-Asef-ABR was varied as shown in Fig. 3b.
  • Various colon cancer cell lines were infected with adenovirus containing DNA encoding Asef-fu11, Asef-AAPC, or Asef-ADH, and a cell migration test was performed in the same manner as in Example 2. .
  • the colorectal cancer cell lines used are SW480, DLD-1, HCT15, WiDR and HCT116.
  • SW480 cells, DLD-1 cells, HCT15 cells, and WiDR cells contain APC truncation mutants.
  • HCT116 cells contain normal APC but have mutations in jS-force tenin.
  • FIG. 4 shows the results.
  • SW480 cells were infected with AdA sef-fu 11 or Ad A sef-1 ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇
  • their motility was promoted.
  • SW480 cells, DLD-1 cells, HCT15 cells, and WiDr cells were infected with AdA sef- ⁇
  • their motility was partially inhibited.
  • HC ⁇ 116 cells were not inhibited by AdA sef-ADH. From this fact, HCT The full-length APC in 116 could not activate Asef.
  • Asef was activated in colon cancer cells containing APC-cleaved mutants, but was not activated or hardly activated in cells containing normal APC. Further, it was revealed that the activation was inhibited by Asef- ⁇ DH.
  • RNA interference test The interaction between Asef and the APC mutant in the migration of colorectal cancer cells was examined by an RNA interference test.
  • the test was performed using a pSHAG_1 vector system (Non-Patent Document 13).
  • the colon cancer cell lines used were SW480 cells, WiDR cells, LS180 cells and HCT116 cells.
  • SW480 cells and WiDR cells contain APC truncation mutants.
  • LS180 cells and HCT116 cells contain normal APC but have mutations in 3-force tenin.
  • a cell migration test was carried out in the same manner as in Example 2 for various colorectal cancer cells transfected with an expression vector containing either shRNA-Asef or shRNA-APC.
  • SW480 cells and WiDr cells transfected with either shRNA-A sef or shRNA-APC were mut-shRNA-A sef or mut_sh.
  • Mobility was reduced compared to cells transfected with RNA-APC (Fig. 5). ( This was observed in LS180 cells and HCT116 cells.) I could't.
  • Example 3 Immunobutting analysis of the contacted cells was carried out in the same manner as described above. At this time, as a control, conversion of ⁇ -tupurin was measured. As a result, sh RNA-A sef and sh RNA-APC almost completely inhibited the expression of A sef gene and APC gene, respectively.
  • a sef — ABR clone prepared from a human HT29 colorectal cancer cell line was implanted into SCID mice and observed for changes in tumorigenicity and proliferation.
  • a sef - ABR plus Mi de 1 5 ⁇ g is, in HT 2 9 cell of cell number 5 XI 0 6, was introduced Ri by the re-Pofuekushiyo down.
  • Each of the five clones obtained was cultured in vitro using a DMEM medium containing lmg / ml (final concentration) of G418, and 4 SCID mice per group (8 weeks) was transplanted into the spleen at the age of 1 ⁇ 10 6 /0.05 ml / mouse.
  • ink was injected into the tail vein, and the animals were sacrificed by exsanguination under ether anesthesia, and the spleen and liver were removed and weighed.
  • a sef promotes cell motility and further reduces intercellular adhesion, and this function of A sef is activated by the gene product of the tumor suppressor gene APC.
  • a sef increases the motility of colon cancer cells in colorectal cancer, particularly colon cancer in which an APC mutation is observed, and is involved in its tumorigenicity and metastasis.
  • the present invention provides a colorectal cancer metastasis inhibitor and a method for suppressing colorectal cancer metastasis characterized by inhibition of A sef function and Z or A sef gene expression, which are provided in the present invention. It has a great effect on prevention and treatment of Z or treatment.
  • SEQ ID NO: 1 Oligonucleotide designed based on the nucleotide sequence of human Asef to suppress the expression of Asef gene.
  • SEQ ID NO: 2 An oligonucleotide designed based on the nucleotide sequence of human APC to suppress the expression of the APC gene.
  • SEQ ID NO: 3 Oligonucleotide designed based on the nucleotide sequence of human Asef to suppress the expression of Asef gene.
  • SEQ ID NO: 4 Oligonucleotide designed to suppress APC gene expression based on the nucleotide sequence of human APC.
  • SEQ ID NO: 5 an oligonucleotide designed based on the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1.
  • SEQ ID NO: 6 an oligonucleotide designed based on the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 2.

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Abstract

腫瘍形成や発生過程において重要な役割を担う癌抑制遺伝子ＡＰＣの遺伝子産物と結合する蛋白質Ａｓｅｆの機能（ＡＰＣ遺伝子産物との結合またはグアニンヌクレオチド交換因子活性）阻害および／またはＡｓｅｆ遺伝子の発現阻害を特徴とする大腸癌転移抑制剤並びに大腸癌転移抑制方法を提供した。

Description

明細 大腸癌転移抑制剤 技術分野
本発明は、 A s e f (A P C— s t i m u l a t e d g u a n l n e n u c l e o t i d e e x c h a n g e f a c t o r ) の機能阻害およびノまたは A s e f の発現阻害を特徴とする、 大腸癌転移抑制剤および大腸癌転移抑制方法に関する。 さ らに詳し く は、 A s e f の発現阻害、 A s e f と A P C (A d e n o m a t o u s P o l y p o s i s C o l i )遺伝子産物との結合阻害 または A s e f のグァニンヌク レオチ ド交換因子（G u a n i n e n u c l e o t i d e E x c h a n g e F a c t o r ; 以下、 G E F と略称する） 活性の阻害を特徴とする、 大腸癌転移抑制剤、 A s e f 阻害剤、 医薬組成物、 大腸癌の防止剤および/または治療 剤、 大腸癌転移抑制方法、 並びに大腸癌の防止方法および/または 治療方法に関する。 背景技術
A s e f は、本発明者らによ り大腸癌抑制遺伝子関連蛋白質 M 1 と して見出され、 既に特許出願されて公開された蛋白質である （特 許文献 1 および非特許文献 1 )。 当該蛋白質は 6 1 9アミ ノ酸残基 からなる蛋白質であり 、 D b 1 相同 （D H) ドメイン、 プレ ッ ク ス ト リ ン （ P r e c k s t r i n ) 相同 （ P H) ドメ イ ン、 S r c相 同 3 ( S H 3 ) ドメインをそのアミ ノ酸配列中に保有する。
A s e f の作用の 1つと して、低分子量 G T P結合蛋白質フア ミ リ ーの 1 つである R h o フア ミ リ ーに属する R a c に対する特異 的な G E F活性をもつことが知られている。すなわち、 A s e f は、 R a c に結合し G D P / G T P交換反応を促進して R a c を活性 ィ匕し、 R a c が関与する細胞内情報伝達の下流に位置する N F κ B c - j u n 、 S R E等に作用する。 R h o フ ァ ミ リーに属する蛋白 質はァクチンネッ トワークの再構成に重要な役割を果たし、 それに よ り細胞運動および細胞間接着を調節している。 したがって、 A s e f は、 細胞のラメ リ ポディア （葉状仮足） や細胞膜のラ ッ フ リ ン グを誘導し、 細胞運動および細胞間接着に関与する可能性がある。
A s e f は、 癌抑制遺伝子 A P Cの遺伝子産物と、 該遺伝子産物 のアルマジロ リ ピー ト ドメイ ンを介して結合するこ とが明らかに なっている。 A s e f は A P C遺伝子産物によ り G E F活性が正に 調節される。 そのため、 A P C遺伝子産物による A s e f を介した 細胞膜のラッ フ リ ングゃラメ リ ポディア形成の誘導が、ィ ヌ腎臓由 来上皮様細胞である M D C K細胞で認められている。 また A s e f は、 細胞内において A P C遺伝子産物と同様に、 移動する細胞の微 小管先端部位に集積している。 このこ とから、 細胞が大腸の絨突起 先端 （ v i 1 l u s t i p ) へタ リ プ ト （ c r y p t ) から移動 する際の移動制御の鍵を A s e f が握っている可能性がある。
一方、 癌抑制遺伝子 A P C (非特許文献 2 ) は、 家族性腺腫性ポ リ ポーシス 、 i a m i l i a l a d e n o m a t o u s p o l y P o s i s ： F A P ) の原因遺伝子と して単離され、 散発性大腸 癌の約 7 0 %〜約 8 0 %でその変異が認められている。 A P C遺伝 子産物 （以下、 A P C と称する） は、 2 , 8 4 3アミ ノ酸残基から なる約 3 0 0 k D a の巨大な蛋白質であり 、そのアミ ノ酸配列中に は、蛋白質間相互作用の役割を担うアルマジロ リ ピー ト ドメインが 存在する。 大腸癌細胞で認められる多く の体細胞 A P C変異は、 変 異ク ラス ター領域 （M C R ) と呼ばれるその中央領域内で生じ、 例 えば、 マイ ク ロチュブール、 E B 1 、 h D L Gへの結合部位、 並び に ]3 —力テニンおよびアキシンに対する少なく と も幾つかの部位 が切断された切断 A P C ( t r u n e a t e d A P C ) を生じる (非特許文献 4、 5、 6、 7および 8 )。 しカゝしながら、 A s e f への結合に対応する A P Cの領域は、 アルマジロ リ ピー ト ドメ イ ン であり、 ほとんどの変異 A P C中でその配列が維持されている （非 特許文献 6、 7および 8 )。 A P Cは、 一種の癌遺伝子産物である i3 —力テニンに結合して分解を誘導する作用を有する （非特許文献 2、 3、 4、 5および 6 )。 一力テニンは、 W n t ZW i n g l e s s シグナル伝達因子の 1つであり 、力 ドヘリ ンの細胞質側 ドメ イ ンに結合して細胞接着に役割を果たすと同時に、発生過程や腫瘍 形成において重要な役割を担っている （非特許文献 9および 1 0 )。
A s e f のアミ ノ酸配列おょぴその遺伝子の塩基配列は、 G e n B a n k にァクセ ッ シ ョ ン番号 A B 0 4 2 1 9 9 と して登録され ている。 また、 A P Cのアミ ノ酸配列およびその遺伝子の塩基配列 は、 G e 11 B a n kにァクセ ッ シ ョ ン番号 NM O 0 0 0 3 8 と して 登録されている。
以下、 本明細書において引用した文献を列記する。
特許文献 1 ： 特開 2 0 0 1 — 0 5 7 8 8 8号公報。
非特許文献 1 ： カ ワサキ （ K a w a s a k i , Y . ) ら、 「サイェン ス （ S c i e n c e )」、 2 0 0 0年、 第 2 8 9卷、 p . 1 1 9 4 — 1 1 9 7。
非特許文献 2 ： キンッラー （ K i n z 1 e r ， K . W. ) ら、 「セル ( C e l l )」、 1 9 9 6年、 第 8 7卷、 p . 1 5 9 — 1 7 0。
非特許文献 3 ： フ ァーンヘッ ド （ F e a r n h e a d ) ら、 「ヒ ュ 一マン モ レキュ ラー ジエネテイ ク ス （H u m a n M o l e c u 1 a r G e n e t i c s )」、 2 0 0 1年、 第 1 0卷、 p . 7 2 1 — 7 3 3。
Ife,特許文献 4 ： ビーンズ（ B i e n z , M . )ら、 「セル（ C e 1 1 )」、 2 0 0 0年、 第 1 0 3卷、 p . 3 1 1 — 3 2 0。
非特許文献 5 ： ぺリ フ ァー （ P e r i f e r ， M. ) ら、 「サイェン ス （ S c i e n c e )」、 2 0 0 0年、 第 2 8 7卷、 p . 1 6 0 6 — 1 6 0 9。
非特許文献 6 ： ァキヤマ （A k i y a m a , T .)、 「サイ ト力イ ン アン ド グロースフ ァ ク ター レビューズ （ C y t o k i n e a n d G r o w t h F a c t o r R e v i e w s )」、 2 0 0 0 年、 第 1 1巻、 p . 2 7 3 — 2 8 2。
非特許文献 7 : ミ ヨ シ （M i y o s h i ， Y . ) ら、 「ヒ ューマン モ レキユ ラ一 ジエネテ イ ク ス (H u m a n M o l e c u l a r G e n e t i c s )」、 1 9 9 2年、 第 1卷、 p . 2 2 9 — 2 3 3。 非特許文献 8 ： ナガワ （N a g a w a , H . ) ら、 「ヒ ューマン ミ ユーテーシ ヨ ン （H u m a n M u t a t i o n )」、 1 9 9 3年、 第 2巻、 p . 4 2 5 — 4 3 4。
非特許文献 9 : 「セル （ C e l l )」、 1 9 9 6年、 第 8 6卷、 p . 3 9 1 — 3 9 9。
非特許文献 1 0 ： 「ネイチヤー （N a t u r e )」、 1 9 9 6年、 第 3 8 2卷、 p . 6 3 8 — 6 4 2。
非特許文献 1 1 ： ウォン （W o n g , M. H . ) ら、 「プロシーディ ング ォブ ナショ ナル アカデ ミ ー ォブ サイ エンス （ P r o c e e d i n g o r n a t i o n a l a c a d e m y o f s c i e n c e U S A)」、 1 9 9 6年、 第 9 3卷、 p . 9 5 8 8 — 9 5 9 3。
非特許文献 1 2 ： オーシマ （O s h i m a , H . ) ら、 「キャ ンサー リ サーチ （ C a n c e r R e s e a r c h )」、 1 9 9 7年、 第 5 7卷、 p . 1 6 4 4 — 1 6 4 9。
非特許文献 1 3 : パディ ソン （ P a d d i s o n , P . J . ) ら、 「ジーンズ アン ド ディべロプメ ン ト （G e n e s a n d D e v e l o p m e n t )」、 2 0 0 2年、 第 1 6卷、 p . 9 4 8 — 9
5 80 発明の開示
A s e f については、上記のよ う に腫瘍形成や発生過程において 重要な役割を担う癌抑制遺伝子 A P Cの遺伝子産物と結合するこ とが知られているが、細胞におけるその作用および疾患との関連は 未だ明ら力 こされていない。 A s e f の作用を明らかにして、 その 機能を調節することによ り 、 A s e f に起因する疾患の防止および 治療が可能になる。
本発明者らは、 A s e f の G E F活性およびその細胞内局在から 細胞運動および細胞間接着への A s e f の関与可能性を推察し、 A s e f が大腸癌、 特に A P C変異が認められる大腸癌において、 大 腸癌細胞の運動性を高め、 その転移に関与するこ とを見出した。 そ して、 この知見を利用し、 A s e f の機能阻害および Zまたは A s e f 遺伝子の発現阻害によ り大腸癌転移が抑制されるこ と を見出 して、 本発明を完成した。
すなわち、本発明の一態様は A s e f の機能阻害および/または A s e f 遺伝子の発現阻害を特徴とする大腸癌転移抑制剤に関す る。
また本発明の一態様は、 A s e f 遺伝子の発現阻害を特徴とする 大腸癌転移抑制剤に関する。
さ らに本発明の一態様は、 A s e f の A P C遺伝子産物との結合 阻害を特徴とする大腸癌転移抑制剤に関する。 さ らにまた本発明の一態様は、 A s e f の G E F活性の阻害を特 徴とする大腸癌転移抑制剤に関する。
また本発明の一態様は、 A s e f の機能阻害および/または A s e f 遺伝子の発現阻害を特徴とする大腸癌転移抑制方法に関する。 さ らに本発明の一態様は、 A s e f 遺伝子の発現阻害を特徴とす る大腸癌転移抑制方法に関する。
さ らにまた本発明の一態様は、 A s e f の A P C遺伝子産物との 結合阻害を特徴とする大腸癌転移抑制方法に関する。
また本発明の一態様は、 A s e f の G E F活性の阻害を特徴とす る大腸癌転移抑制方法に関する。
さ らに本発明の一態様は、 A s e f 遺伝子の発現に対する R N A 干渉を利用するこ とを特徴とする A s e f 阻害剤に関する。
さ らにまた本発明の一態様は、 A s e f 遺伝子の発現に対する R N A干渉効果を示すオリ ゴヌ ク レオチ ドを含んでなる A s e f 阻 害剤に関する。
また本発明の一態様は、配列表の配列番号 1 に記載の塩基配列か らなるオリ ゴヌ ク レオチ ドに関する。
さ らに本発明の一態様は、配列表の配列番号 2に記載の塩基配列 からなるオリ ゴヌク レオチ ドに関する。
さ らにまた本発明の一態様は、配列表の配列番号 3 に記載の塩基 配列からなるオリ ゴヌク レオチ ドに関する。
また本発明の一態様は、配列表の配列番号 4に記載の塩基配列か らなるオリ ゴヌ ク レオチ ドに関する。
さ らに本発明の一態様は、配列表の配列番号 1 または配列番号 3 に記載の塩基配列からなるオリ ゴヌ ク レオチ ドを含んでなる前記 A s e f 阻害剤に関する。
さ らにまた本発明の一態様は、 A s e f 遺伝子の発現に対する R N A干渉を利用するこ とを特徴とする A s e f 阻害方法に関する。 また本発明の一態様は、 A s e f 遺伝子の発現に対する R N A干 渉効果を示すオリ ゴヌク レオチ ドを利用するこ と を特徴とする A s e f 阻害方法に関する。
さ らに本発明の一態様は、配列表の配列番号 1 または 3に記載の 塩基配列からなるオリ ゴヌ ク レオチ ドを利用するこ と を特徴とす る前記 A s e f 阻害方法に関する。
さ らにまた本発明の一態様は、前記いずれかの A s e f 阻害剤を 含んでなる大腸癌転移抑制剤に関する。
また本発明の一態様は、配列表の配列番号 1 から 4のいずれか 1 に記載の塩基配列からなるオリ ゴヌク レオチ ドを含んでなる大腸 癌転移抑制剤に関する。
さ らに本発明の一態様は、前記いずれかの A s e f 阻害剤を用い ることを特徴とする大腸癌転移抑制方法に関する。
さ らにまた本発明の一態様は、配列表の配列番号 1 から 4のいず れか 1 に記載の塩基配列からなるオリ ゴヌク レオチ ドを用いるこ とを特徴とする大腸癌転移抑制方法に関する。
また本発明の一態様は、 前記いずれかの大腸癌転移抑制剤、 また は、前記いずれかの A s e f 阻害剤を含んでなる医薬組成物に関す る。
さ らに本発明の一態様は、 前記いずれかの大腸癌転移抑制剤、 ま たは、前記いずれかの A s e f 阻害剤を含んでなる大腸癌の防止剤 および/または治療剤に関する。
さ らにまた本発明の一態様は、前記いずれかの大腸癌転移抑制剤 . または、前記いずれかの A s e f 阻害剤を用いるこ とを特徴とする 大腸癌の防止方法おょぴ Zまたは治療方法に関する。 図面の簡単な説明
第 1 図は A s e f をコー ドする D N Aを含むアデノ ウイルスを 感染させた M D C K細胞の細胞間接着が低減したことを説明する。 細胞間接着は、 縦軸に示したよ う に、 凝集塊 （N p ) 数を総細胞 （N c ) 数で割った数値で示した。 図中、 A s e f - f u 1 1 は全長 A s e f 遺伝子； A P C— a r mは A P C遺伝子のアルマジロ リ ビー ト ドメイ ン； A s e f 一 A A P Cは A P C結合部位を欠失させた A s e f 変異体遺伝子； A s e f 一 Δ D Hは D H ドメイ ンを欠失させ た A s e f 変異体遺伝子を含むアデノ ウイルスで細胞を感染させ たことを示す。 結果は 3回の実験の平均値士標準偏差 （ S D ) であ る。
第 2図は A s e f 遺伝子発現による M D C K細胞の細胞運動性 の亢進が、 アルマジロ リ ピー ト ドメ イ ンを含む A P C変異体 （Α Ρ C一 a r m、 A P C— 8 7 6およぴ A P C— 1 3 0 9 ) 遺伝子の共 発現によ り さ らに促進されたこと、並びに A s e f 遺伝子発現によ り亢進された運動性および細胞本来の運動性が A s e f 一 Δ D H 遺伝子または A s e f 一 A B R (A s e f の A P C結合領域） 遺伝 子の発現によ り低減したこ とを説明する。 結果は、 親細胞の遊走に 河する相对的遊走 、 r e 1 a t i v e m i g r a t i o n ) で表 した。 図中 M o c k とは、 空ベクターを導入した細胞を意味する。 第 3図 a は S W 4 8 0細胞中で A s e f と A P C切断変異体が 結合したこ とを説明する。 結合の解析は、 抗 A s e f 抗体 （A n t i - A s e f ) を用いて免疫沈降によ り行った。 図中、 +は免疫沈 降前に抗原でプレインキュベーショ ンした抗体を用いたこ と を示 す。
第 3図 b は A s e f _ A B R (A s e f の A P C結合領域） が、 イ ンビ ト ロでの I V T— A P C— a r mと G S T— A s e f - f u 1 1 の相互作用を、用量依存的に阻害したこ とを説明する。図中、 MW . は分子量マーカーを示す。
第 4図は A s e f 遺伝子または A P C結合部位を欠失させた A s e f 遺伝子 （A s e f - Δ A P C ) の発現によ り大腸癌細胞 S W 4 8 0 の運動性が亢進したが、 G E F領域を欠失させた A s e f 遺 伝子 （A s e f - Δ D H ) を発現させても各種大腸癌細胞 （ S W 4 8 0、 D L D— 1、 H C T 1 5、 W i D rおよび H C T 1 1 6 ) の 運動性は変化しないか、あるいは低減したこ とを説明する。結果は、 対照である L a c Z遺伝子を発現させた各細胞の遊走に対する相 対的遊走 （ r e l a t i v e m i g r a t i o n ) で表した。
第 5図は A s e f 遺伝子および A P C遺伝子の発現をそれぞれ 阻害するシ ョ ー トヘア ピン R N Aである s h R N A— A s e f お ょぴ s h R N A - A P Cが、いずれも A P C変異を有する大腸癌細 胞 （ S W 4 8 0および W i D r ) の運動性を低減させたが、 正常 A P Cを有する大腸癌細胞 （H C T 1 1 6および L S 1 8 0 ) の運動 性には影響しなかったこ とを説明する。 比較対照と して、 A s e f 遺伝子または A P C遺伝子の発現を阻害しないショ一トヘアピン R N Aである m u t — s h R N A— A s e f および m u t - s h R N A— A P Cを用いた。 結果は、 m u t - s h R N A— A s e f を遺伝子導入した各細胞の遊走に対する相対的遊走（ r e 1 a t i v e m i g r a t i o n ) で表した。 発明を実施するための最良の形態
本発明は、 参照によ り ここに援用されると ころの、 日本国特許出 願番号第 2 0 0 2 - 3 8 2 0 8 3号からの優先権を請求する もの である。
本明細書中で使用されている技術的および科学的用語は、別途定 義されていない限り 、 当業者によ り普通に理解される意味を持つ。 本明細書中では当業者に既知の種々の方法が参照されている。 その よ う な引用されている公知の方法を開示する刊行物等の資料は、 引 用によ り 、本明細書中にそれらの全体が完全に記載されている もの と見なす。
以下、 本発明について、 発明の実施の態様をさ らに詳しく 説明す る。 以下の詳細な説明は例示であ り 、 説明のためのものに過ぎず、 本発明を何ら限定するものではない。
本発明においては、 A s e f が上皮由来細胞の細胞間接着を低減 させる と共にその運動性を顕著に促進する こ と を見出した。 さ らに これらの作用が、 A P Cによ り調節されており 、 特に大多数の大腸 癌細胞で同定されている断片化した変異 A P Cが A s e f を効率 よ く 活性化する こ と を見出した。 これらから、 変異 A P C と A s e f との複合体形成が、 大腸癌細胞の異常な運動性の原因の 1 つと考 えた。 つま り 、 腸管上皮細胞の上方への遊走、 すなわちク リ プ トか ら絨突起先端への遊走に当該複合体が関与している と推定した。 実 際、 A P C遺伝子の強制発現が腸管上皮において細胞遊走の異常を 引き起こすこ とが知られている （非特許文献 1 1 )。 A P C ノ ック ァゥ トマウスにおいて、初期腺腫細胞の増殖速度は正常ク リ プ ト上 皮細胞のものと 同 じであるが、腺腫細胞はク リ プ トー絨突起軸に沿 う有向遊走を しないこ とが知られている （非特許文献 1 2 )。
このよ う に、 A P C切断変異体による A s e f の活性化に基づい た異常な遊走態様は、腺腫形成と同様に腫瘍の侵襲性悪性腫瘍への 悪化に重要である と考えられる。 また、 A s e f の G E F領域を欠 失させた変異体は、細胞間接着を低減させた り細胞運動性を促進し た り しないこ と力 ら、 G E F活性が A s e f のかかる機能に重要で ある と推定した。 本発明においては、 A s e f と変異 A P Cの結合を阻害する ドミ ナン トネガティブ変異体、例えば A s e f のアミゾ酸配列中の A P C結合領域 （第 7 3番目から第 1 2 6番目までのァミ ノ酸配列） か らなる変異体または A s e f の G E F領域を欠失させた変異体を 用いて、変異 A P Cを発現する大腸癌細胞の運動性を阻害できるこ とを明らかにした。 また、 A s e f 遺伝子または A P C遺伝子の発 現阻害によ り 、 同様に、 変異 A P Cを発現する大腸癌細胞の運動性 を阻害できることを明らかにした。 さ らに、 上記 ドミナン トネガテ ィブ変異体を発現させたヒ ト大腸癌細胞の造腫瘍性、 増殖性、 さ ら に転移が、かかる変異体を発現させなかった細胞と比較して阻害さ れることを、 重度複合免疫不全マウス （ S C I Dマウス） を用いた イ ンビボ （ i n v i v o ) の検討において見出した。 このよ う な 阻害は、 ドミナン トネガティブ変異体を発現させたヒ ト大腸癌細胞 と して、変異体発現後にク ローン化して得た細胞を用いた検討にお いても、 また標識化した変異体を発現させた後に該標識を指標にし て変異体が発現された細胞をセルソーターによ り 9 0 %以上に濃 縮して得たミ ックスポピユ レーショ ンを用いた検討（ m i x p o p u 1 a t i o n法） においても、 同様に認められた。
このよ う に、 A s e f の機能阻害によ り 、 細胞の運動性を阻害で き、 さ らには細胞の増腫瘍性並びに腫瘍細胞の増殖性および Zまた は転移を抑制できる。細胞の運動性の阻害は A s e f 遺伝子または A P C遺伝子の発現阻害によっても達成できるため、 これら各遺伝 子の発現阻害によ り細胞の増腫瘍性並びに腫瘍細胞の増殖性およ び Zまたは転移の抑制が可能である。
上記知見に基づいて、 本発明は、 A s e f の阻害を特徴とする大 腸癌転移抑制剤および大腸癌転移抑制方法を提供する。 当該大腸癌 転移抑制剤および大腸癌転移抑制方法は、 A s e f の機能阻害およ び/または A s e f 遺伝子の発現阻害を特徴とする。 .
A s e f 遺伝子の発現阻害は、 例えば A s e f 遺伝子の発現に対 する R N A干渉 （R N A i n t e r f e r e n c e ) 効果を利用 する こ とによって実現可能である。 R N A干渉は、 R N Aを利用 し て遺伝子の発現を抑制する方法と して、近年報告された方法である (非特許文献 1 3 )。 具体的には、 A s e f 遺伝子の発現に対する R N A干渉効果を示すオリ ゴヌク レオチ ドを使用 して、 A s e f 遺 伝子の発現阻害が可能である。 かかるオリ ゴヌ ク レオチ ドと して、 配列表の配列番号 1 に記載の塩基配列からなる c D N Aが例示で きる。 また、 当該 c D N Aの相補的 R N A (配列表の配列番号 3 ) も同様に使用できる。 かかる c D NAを含むベクターまたはその相 補的 R N Aを細胞に導入するこ と によ り 、 A s e f 遺伝子の発現阻 害を実現できる。 ベク ターまたは R N Aの細胞への導入は、 自体公 知の方法、 例えばリ ポフエク ショ ン等を利用 して実施可能である。 したがって、 上記オリ ゴヌ ク レオチ ドを含む A s e f 阻害剤も、 本 発明の範囲に包含される。 かかる A s e f 阻害剤に含まれるオリ ゴ ヌク レオチ ドは、 1種であってよ く 、 また 2種以上が含まれていて もよい。 また、 A s e f 遺伝子の発現阻害は、 A s e f 遺伝子のァ ンチセンスオリ ゴヌ ク レオチ ドの使用によっても、 実現可能である c 上記 R N A干渉効果を示すオリ ゴヌ ク レオチ ドまたは上記アンチ センスオリ ゴヌ ク レオチ ドは、 A s e f 遺伝子の塩基配列を基に設 計したオリ ゴヌク レオチ ドから、 A s e f 遺伝子の発現系を用いて. その発現を特異的に阻害する ものを選択する こ と によ り 得る こ と ができ る。
A s e f の機能阻害は、 例えば A s e f と A P C との結合阻害、 または A s e f の G E F活性の阻害によ り実現可能である。 阻害の 対象と なる A s e f と A P C との結合は、好ま しく は A s e f と正 常な A P C との結合、 よ り好ま しく は A s e f と A P C変異体との 結合、 さ らに好ま しく は A s e f と A P J 切断変異体との結合、 さ らによ り 好ま しく は A s e f と アルマジロ リ ピー ト ドメ イ ンを含 む A P C切断変異体との結合である。 アルマジロ リ ピー ト ドメ イ ン を含む A P C切断変異体と しては、 A P Cのア ミ ノ酸配列の N末端 第 1 番目 から第 8 7 6番目 の連続するア ミ ノ酸残基からなるポリ ペプチ ド、 または A P Cのア ミ ノ酸配列の N末端第 1番目から第 1 3 0 9番目 の連続するア ミ ノ酸残基からなるポ リ ペプチ ドを例示 でき る。 これらポリ ペプチ ドは、 A P C切断変異体と して、 多く の 大腸癌および家族性腺腫性ポリ ポーシス （ F A P ) で同定されたも のである。
A s e f と A P C との結合阻害は、該結合に対する A s e f の ド ミナン トネガティブ変異体を使用 して実現できる。 例えば、 A P C と結合できるが、 G E F活性を示さない A s e f 変異体は、 A s e f と A P C との結合阻害剤と して使用可能である。 かかる A s e f 変異体は、 A s e f のア ミ ノ酸配列に基づいて設計し、 A P C との 結合活性を常法によ り試験する こ と によ り得られる。 具体的には、 A s e f の G E F領域を欠失させた変異体が例示でき る。 あるいは A s e f のアミ ノ酸配列中の A P C結合領域（第 7 3番目から第 1 2 6番目までのアミ ノ酸配列） からなるポリペプチ ドが好ま しく 用 いられる。 こ のポリ ぺプチ ドのア ミ ノ酸配列に基づいて設計したポ リ ペプチ ドから、 A s e f と A P C の結合を阻害するものを選択し て用いるこ と も可能である。 また、 A P C遺伝子の発現阻害によつ ても、 A s e f と A P C との結合阻害は達成できる。 A P C遺伝子 の発現阻害は、 A P C遺伝子の発現に対する R N A干渉効果を示す オリ ゴヌク レオチ ドを用いて実現可能である。 かかるオリ ゴヌ ク レ ォチ ドと して、 配列表の配列番号 2 に記載の塩基配列からなる c D N Aが例示できる。 また、 当該 c D N Aの相補的 R N A (配列表の 配列番号 4 ) も同様に使用できる。 あるいは、 A P C遺伝子のアン チセンスオリ ゴヌク レオチ ドの使用によっても、 A P C遺伝子の発 現阻害は実現可能である。上記 R N A干渉効果を示すオリ ゴヌク レ ォチ ドまたは上記アンチセンスオリ ゴヌク レオチ ドは、 A P C遺伝 子の塩基配列を基に設計したオリ ゴヌ ク レオチ ドカゝら、 A P C遺伝 子の発現系を用いて、その発現を特異的に阻害するものを選択する こ とによ り得ることができる。
A s e f の G E F活性の阻害は、 例えば G E F活性の阻害剤を、 A s e f を用いて同定し使用することによ り実現できる。 また、 A s e f 遺伝子の発現を阻害する化合物や A s e f と A P C との結 合を阻害する化合物を、 A s e f 遺伝子を用いて、 または A s e f および A P Cを用いて同定して使用してもよい。化合物を同定する ためのアツセィ系は、 自体公知のスク リーニング系を利用して構築 可能である。
A s e f の機能および Zまたは発現を阻害する上記物質を有効 成分と して含む A s e f 阻害剤を用いるこ とによ り 、大腸癌の転移 を抑制することが可能である。 すなわち、 A s e f 阻害剤を含んで なる大腸癌転移抑制剤および上記 A s e f 阻害剤を用いるこ とを 特徴とする大腸癌転移抑制方法も、 本発明の範囲に包含される。 具 体的には、 例えば、 配列表の配列番号 1 から配列番号 4に記載のい ずれか 1 つの塩基配列からなるオリ ゴヌク レオチ ドを含んでなる 大腸癌転移抑制剤、並びにこれらオリ ゴヌ ク レオチ ドの少なく と も 1 つを用いるこ と を特徴とする大腸癌転移抑制方法を挙げる こ と ができる。
本発明に係る大腸癌転移抑制剤または A s e f 阻害剤を適用す るこ とによ り、大腸癌の造腫瘍性および転移を抑制するこ とができ る。 すなわち、 上記大腸癌転移抑制剤または A s e f 阻害剤は、 大 腸癌および大腸癌転移の防止および/または治療に使用するこ と ができる。 この観点から、 上記大腸癌転移抑制剤または A s e f 阻 害剤を有効成分と してその有効量含んでなる大腸癌の防止剤およ び Zまたは治療剤も本発明の範囲に包含される。 また、 上記大腸癌 転移抑制剤または A s e f 阻害剤を使用するこ とを特徴とする、大 腸癌の防止方法および Zまたは治療方法を提供可能である。
このよ う に、 本発明においては、 上記大腸癌転移抑制剤または A s e f 阻害剤を含む医薬組成物を提供することが可能である。
本発明に係る医薬組成物の必要な用量範囲は、含有される成分の 有効性、 投与経路、 処方の性質、 対象の症状の性質、 および担当医 師の判断等に応じて適宜選択.される。 一般的には適当な用量は、 例 えば対象の体重 1 k g あたり約 0 . 0 1 μ g乃至 1 0 O m g程度、 好ま しく は約 0 . 1 μ g ~ l m g程度の範囲であるこ とが好ま しい t しかしなが ら、 当該分野においてよく知られた最適化のための一般 的な常套的実験を用いてこれらの用量の変更を行う こ とができる。 上記投与量は 1 日 1 回〜数回に分けて投与することができ、数日ま たは数週間に 1 回の割合で間欠的に投与してもよい。
A s e f 遺伝子または A P C遺伝子の発現を阻害し得るオリ ゴ ヌク レオチ ドを用いる ときは、 遺伝子治療を利用して、 当該オリ ゴ ヌク レオチ ドを対象中の細胞内で生成させてもよい。遺伝子治療は 公知の方法が利用でき、 例えば、 オリ ゴヌク レオチ ドを注射によ り 直接投与する非ウィルス性の トランスフエクショ ン法、 あるいはゥ ィルスベクターを利用 した ト ラ ンスフエク ショ ン法のいずれも適 用するこ とができ る。 非ウィルス性の ト ランスフエク ショ ン法にお いては、オリ ゴヌク レオチ ドを注射によ り直接投与する方法のほか- オリ ゴヌク レオチ ドをリ ポソーム等のリ ン脂質小胞に封入し、その リ ポソームを投与する方法が推奨される。 リ ポソームと しては、 力 チオン性リ ポソームの使用がよ り好ま しい。 ウィルスベクターを使 用する ト ラ ンスフエ ク ショ ン法においてオリ ゴヌ ク レオチ ドを組 込んで ト ラ ンス フエ ク シ ョ ンに使用するベク ター と しては、好ま し く はレ ト ロ ウイルスベク ター、 アデノ ウイノレスベタ ター、 アデノ 関 連ゥイ ノレスベク ター、 ワク シニ アゥイ ノレス べク タ一等の D N Aウイ ルスベクター、 あるいは R N A ウィルスベク ターが挙げられる。 こ れら ウィ ルスベク ターを用いる こ と によ り 効率良い投与が可能で ある。 さ らに、 ウィルスベクターを用レヽる ト ランスフエクシヨ ン法 においても、 該ベク ターを リ ポソームに封入して、 その リ ボソーム を投与する方法が推奨される。
本発明に係る医薬は、 大腸癌転移抑制剤または A s e f 阻害剤の 有効成分のみを含む医薬と なしてもよいが、 通常は、 1種または 2 種以上の医薬用担体を用いて医薬組成物を製造する こ とが好ま し レヽ。
本発明に係る医薬製剤中に含まれる有効成分の量は、 広範囲から 適宜選択されるが、 通常約 0 . 0 0 0 0 1 〜 7 0重量％、 好ま しく は 0 . 0 0 0 1 〜 5重量％程度の範囲とするのが適当である。
医薬用担体と しては、 製剤の使用形態に応じて通常使用 される、 充填剤、 増量剤、 結合剤、 付湿剤、 崩壌剤、 表面活性剤、 滑沢剤等 の希釈剤や賦形剤等を例示でき、 これらは得られる製剤の投与形態 に応じて適宜選択使用される。 かかる担体と しては、 生理食塩水、 緩衝化生理食塩水、 デキス ト ロース 、 水、 グリ セロール、 エタノ ー ル、 およびそれらの混合物が挙げられる。 担体はこれらに限らず、 一般的な医薬の製造に用いられる物質であれば、所望に応じていず れを用いる こ と もできる。
本発明に係る医薬組成物は、 溶液製剤と して使用できる他に、 こ れを凍結乾燥化し保存し得る状態にした後、 用時、 水や生埋的食塩 水等を含む緩衝液等で溶解して適当な濃度に調製した後に使用す る こ と も可能である。
本発明の医薬組成物を投与する と きには、該医薬組成物を単独で 使用 しても よ く 、 あるいは治療に必要な他の化合物または医薬と共 に使用 してもよい。
投与経路は、全身投与または局所投与のいずれも選択する こ とが できる。 この場合、 疾患、 症状等に応じた適当な投与経路を選択す る。 例えば、 非経口経路と して、 通常の静脈内投与、 動脈内投与の ほか、 皮下、 皮内、 筋肉内等への投与を挙げるこ とができる。 ある いは経口による投与も可能である。 さ らに、 経粘膜投与または経皮 投与も可能である。 あるいは、 腫瘍に注射等によ り直接投与する こ とができる。
投与形態は、 当業者によ く 知られている形態から適宜選択でき、 その代表的なもの と しては、 錠剤、 丸剤、 散剤、 粉末剤、 細粒剤、 顆粒剤、 カプセル剤等の固体投与形態や、 水溶液製剤、 エタ ノ ール 溶液製剤、 懸濁剤、 脂肪乳剤、 リ ボソーム製剤、 シク ロデキス ト リ ン等の包接体、シロ ップ、エリ キシル等の液剤投与形態が含まれる。 これらは更に投与経路に応じて経口剤、非経口剤（点滴剤、注射剤）、 経鼻剤、 吸入剤、 経膣剤、 坐剤、 舌下剤、 点眼剤、 点耳剤、 軟膏剤、 ク リ ーム剤、 経皮吸収剤、 経粘膜吸収剤等に分類され、 それぞれ通 常の方法に従い、 調合、 成形、 調製する こ とができる。
本発明に係る医薬組成物を遺伝子治療に使用する場合、一般的に は、 注射剤、 点滴剤、 あるいはリ ボソーム製剤と して調製する こ と が好ま しい。 また、 プロ タ ミ ン等の遺伝子導入効率を高める物質と 共に投与される よ う な形態に調製する こ と もできる。
散剤、丸剤、 力プセル剤および錠剤は、 ラタ トース、 グルコース、 シユーク ロースおよびマンニ トール等の賦形剤、澱粉およびアルギ ン酸ソーダ等の崩壌剤、 マグネシウムステアレー トおよびタルク等 の滑沢剤、 ポ リ ビュルアルコール、 ヒ ドロ キシプロ ピルセルロース およびゼラチン等の結合剤、 脂肪酸エステル等の界面活性剤、 ダリ セ リ ン等の可塑剤等を用いて製造できる。 锭剤ゃカプセルを製造す るには、 固体の製薬担体が用いられる。
懸濁剤は、 水、 シユーク ロース、 ソルビ トールおょぴフラタ トー ス等の糖類、ポ リ エチレンダリ コール（ P E G )等のグリ コール類、 油類を使用 して製造でき る。
注射用の溶液は、 塩溶液、 グルコース溶液、 または塩水と ダルコ ース溶液の混合物からなる担体を用いて調製可能である。
リ ボソーム化は、 例えばリ ン脂質を有機溶媒 (ク ロ 口ホルム等） に溶解した溶液に、 当該物質を溶媒 （エタノール等） に溶解した溶 液を加えた後、溶媒を留去し、これにリ ン酸緩衝液を加え、振と う 、 超音波処理および遠心処理した後、 上清をろ過処理して回収するこ と によ り行い得る。
脂肪乳剤化は、 例えば当該物質、 油成分 （大豆油、 ゴマ油および ォリ ーブ油等の植物油並びに M C T等）、 乳化剤 （ リ ン脂質等） 等 を混合、 加熱して溶液と した後に、 必要量の水を加え、 乳化機 （ホ モジナイザー、 例えば高圧噴射型や超音波型等） を用いて、 乳化 · 均質化処理して行い得る。 また、 これを凍結乾燥化する こ と も可能 である。 なお、 脂肪乳剤化する と き、 乳化助剤を添加しても よ く 、 乳化助剤と しては、 例えばグリ セリ ンや糖類 （例えばブ ドウ糖、 ソ ルビ トールおょぴ果糖等） が例示される。
シク ロデキス ト リ ン包接化は、 例えば当該物質を溶媒 （エタ ノー ル等） に溶解した溶液に、 シク ロデキス ト リ ンを水等に加温溶解し た溶液を加えた後、 冷却して析出した沈殿をろ過し、 滅菌乾燥する こ とによ り行い得る。 こ の際、 使用されるシク ロデキス ト リ ンは、 当該物質の大き さに応じて、空隙直径の異なるシク ロデキス ト リ ン ( a , β 、 γ型） を適宜選択すればよい。 実施例
以下、 本発明を実施例に基づき具体的に説明するが、 本発明は下 記の実施例に限定されない。
まず、 以下の実施例で用いた A s e f または A P C、 あるいはそ れらの変異体について説明する。 当該蛋白質および当該変異体は、 略称で記載する。
A s e f - f u 1 1 は、 野生型の全長 A s e f 力 らなる蛋白質で ある。 へマグノレチニン ( H a e m a g g 1 u t i n i n ； H A ) タ グを付加した融合蛋白質（H A _ t a g g e d w i 1 d — t y p e A s e f )、 またはグルタ チオン S _ ト ラ ンス フェ ラーゼ ( G l u t a t h i o n e S — t r a n s f e r a s e ; G S T ) と の融合蛋白質 （ G S T — A s e f — f u l 1 ) と して発現させた。
A s e f 一 A A P Cは、 A s e f の N末端側 A P C結合領域を欠 失させた変異体である。 こ の変異体は野生型 A s e f よ り 強い G E F活性を有する。
A s e f — A D Hは、 A s e f の D H領域 （ G E F領域） を欠失 させた変異体である。 該変異体は G E F活性を示さない。
A s e f 一 A B Rは、 A s e f のア ミ ノ酸配列中の A P C結合領 域 （第 7 3番目から第 1 2 6番目までのア ミ ノ酸配列） からなるポ リペプチ ドである。 マル トース結合たんぱく 質 （M B P ) との融合 蛋白質 （M B P — A s e f - A B R ) と して発現させた。
A P C — a r mは、 A P Cのアルマジロ リ ピー ト ドメ イ ン力、らな るポリペプチ ドであ り 、 M y c タグを付加した融合蛋白質 （M y c - t a g g e d A P C _ a r m) 'と して発現させた。
A P C— 8 7 6 は、 A P Cのア ミ ノ酸配列の N末端第 1番目 から 第 8 7 6番目 までの連続するア ミ ノ酸残基からなるポ リ ペプチ ド であ り 、 アルマジロ リ ピー ト ドメイ ンを含んでいる。
A P C— 1 3 0 9 は、 A P Cのア ミ ノ酸配列の N末端第 1番目か ら第 1 3 0 9番目 までの連続するア ミ ノ酸残基からなるポ リ ぺプ チ ドであ り 、 アルマジロ リ ピー ト ドメイ ンを含んでいる。
A P C— 8 7 6 および A P C— 1 3 0 9 は、 大腸癌および家族性 腺腫性ポリ ポーシス （ F A P ) で同定された A P C切断変異体であ る。
これら蛋白質またはポリ ぺプチ ドのいずれかをコー ドする D N Aを含むアデノ ウィルスの作製は、 アデノ ー Χ ΤΜ クスプレツシ ョ ンシステム (ク ロ ンテック社) を用いて、 各蛋白質をコー ドする ボリ ヌ ク レオチ ドを、 アデノ ウィルスベク タ一 p A d e n o — Xに ク ローン化するこ とによ り行った。 以下、 A d A s e f 一 f u 1 1 と は、 A s e f - f u 1 1 をコー ドする D N Aを含むアデノ ウィル スを意味する。 上記その他の蛋白質またはポリ ペプチ ドをコー ドす る D N Aを含むアデノ ウィルスも同様に、各 D NAの呼称に A d を 付して表わす。
上記蛋白質またはポリ ペプチ ドのいずれかをコー ドする D N A を含むプラス ミ ドの作製は、 常法にしたがって行った。
細胞の培養おょぴ上記プラス ミ ドの ト ランスフエク ショ ンは、 以 下のよ う に行った。 M D C K細胞 （正常なィヌの腎から樹立された 上皮様細胞株） および W i D r 細胞はダルべッコ改変ィ一ダル培地 に 1 0 %牛胎児血清 （ F C S ) を加えて培養した。 S W 4 8 0細胞 はレイボビッツ L一 1 5培地に 1 0 % F C S を加えて培養した。 D L D _ 1細胞および H C T 1 5細胞は、 R P M I 1 6 4 0培地に 1 0 %' F C S を加えて培養した。 H C T 1 1 6細胞はマッコイ 5 A培 地に 1 0 % F C S を加えて培養した。 これら細胞に、 リ ボフヱク ト ァ ミ ン 2 0 0 0 (ライ フテク ノ ロ ジ一社） を用いて、 上記プラス ミ ドを ト ラ ンス フ エ ク シ ョ ン した。
蛋白質の発現および作製は、 次のよ う に行った。 G S T と の融合 蛋白質または M B P との融合蛋白質は、 大腸菌で合成し、 ダルタチ オンーセフ ァ ロ ース （G S H— S e p h a r o s e ； フ ァノレマシア 社） またはア ミ ロース レジン （ a m y l o s e r e s i n ; ニュ 一イ ングラン ドバイオラボズ社） への吸着によ り 単離した。
R N A干渉試験に用いるシ ョ ー トヘアピン R N A (以下、 s h R N Aと略称する） である、 s h R N A - A s e f および s h R N A 一 A P Cは、 それぞれ A s e f 遺伝子おょぴ A P C遺伝子の発現を 抑制するよ う に設計した。 s h R N A— A s e f および s h R NA - A P Cの塩基配列は配列表の配列番号 1 および配列番号 2 にそ れぞれ記載した。 また、 s h R N A - A s e f および s h R N A - A P Cにそれぞれ変異を加え、 A s e f 遺伝子および A P C遺伝子 の発現を抑制しない s h R N Aである、 m u t — s h R N A— A s e f および m u t — s h R N A— A P Cを作成し、配列表の配列番 号 5および配列番号 6 にそれぞれ記載した。 実施例 1
細胞間接着および細胞形態に対する A s e f の効果を検討する ため、 M D C K細胞に上記アデノ ウイルスを感染させた。 使用 した アデノ ウイルスは、 A d A s e f - f u 1 1、 A d A s e f 一 Δ Α P C、 A d A s e f — A D Hおよび A d A P C— a r mである。 対 照と して、 A d L a c Z を用いた。 M D C K細胞へのアデノ ウィル スの感染効率は、 免疫蛍光染色での検討によ り 、 9 0 %以上である こ と を確認した。 また、 これらアデノ ウイルスはそれぞれ、 MD C K細胞に感染させる と予想通 り の大き さの蛋白質を生産する こ と を、 ィムノブロ ッテイ ングによ り確認した。
細胞形態は Λ感染させた細胞を 1 2 ゥエルの組織培養プレー ト の 各ゥエルに細胞数 3 . 0 X 1 ◦ 4 と なる よ う に播種し、 3 7 °Cで 3 時間イ ンキュベーショ ンした後、 アデノ ウイルスで感染させ 〔感染 多直度 ： m u l t i p l i c i t y o f i n f e c t i o n (m. o . i ) = 2 0 0〕、 さ らに 3 6 時間培養後、 位相差顕微鏡 で観察した。 A d A s e f 一 Δ A P Cで感染させた細胞は基底上で 平面状にな り 、 膜のラ ッフ リ ングおよびラメ リ ポディ アを示した。 一方、 A d A s e f 一 Δ D Hで感染させた細胞は、 形態変化を示さ ず、 未感染の細胞と変わ り なかった。
細胞間接着は、 感染させた細胞を 0 . 0 2 %エチ レンジアミ ン四 酢酸 （ E D T A) を含むリ ン酸緩衝化生理食塩水 （ P B S ) 中でプ レー トから剥が し、 2 0回ピペッティ ングした後に、 細胞ク ラスタ 一 （粒子） の数を計数した。 細胞ク ラスターを総細胞数で割つた値 ( N p Z N c ) で、 細胞間接着を評価した。 ピペッティ ングによ り 分散させる と、 A d A s e f — A A P Cで感染させた細胞は効率よ く 分離したが、未感染細胞おょぴ A d A s e f 一 Δ D Hまたは A d L a c Z で感染させた細胞は凝集塊のままであった （第 1 図）。 こ れらの結果から、 A s e f が細胞間接着を低減させる機能を持つこ と、 またその G E F活性がこ の機能に必須である こ とが明 らかにな つた。
さ らに、 A d A s e f 一 f u 1 1 または A d A s e f - Δ A P C を過剰発現させる と、細胞間接触部位に局在する E—力 ドヘリ ン量 が減少し、 細胞質に局在する E—力 ドヘリ ン量が増加するこ と を、 抗 E—力 ドヘリ ン抗体を使用 した免疫組織化学分析によ り 明 らか にした。 免疫組織化学分析は、 アデノ ウイルス感染 3 6時間後に、 M D C K細胞を P B S中 3 . 7 %のホルムアルデヒ ドで固定して行 つた。 固定した細胞は E—力 ドヘリ ンに対するラ ッ トモノ ク ローナ ル抗体 ( E C C D - 2 ； 力ルビオケム社) および ト リ メ チルローダ ミ ンイ ソチオシァネー ト結合フ ァ ロィ ジン （T R I T C— c o n j u g a t e d p h a l l o i d i n ; モ レキュ ラープロ ーブス 社）、 または E—力 ドヘリ ンに対する ラ ッ トモノ ク ローナル抗体お よび /3 一力テニンに対する ゥサギポリ ク ローナル抗体 （サンタクル スバイオテク ノ ロジー社） で室温にて 6 0分間二重染色した。 抗 E 一力 ドヘリ ン抗体および抗 —カテニン抗体によ り 得られた染色 パターンは、 フルォ レセイ ンィ ソチオシァネー ト標識抗ラ ッ ト I g G抗体おょぴ T R I T C標識抗ラ ビッ ト I g G抗体を用いて可視 ィ匕した。 細胞はカールツ ァイ ス L S M 5 1 0 レーザースキヤニン グマイ ク ロ ス コープを用いて撮影した。抗 ^ 一力テユン抗体で染色 する と、細胞間接触部位に局在する 一力テニン量が減少したこ と が明 らかになつたが、 この減少は E—力 ドヘリ ンほど顕著ではなか つた。 一方、 A d A s e f 一 A D Hまたは A d L a c Zで感染させ た細胞は、 E—力 ドヘリ ンまたは jS —力テニンの局在について変化 を示さなかった。 これらから、 A s e f の G E F活性がこれら分子 の局在の変化に重要である と考えられた。 MD C K細胞の溶解物の ィ ムノブロ ッ ト解析によれば、 E—力 ドヘ リ ンまたは j3 —力テニン の総量は A d A s e f - f u 1 1 または A d A s e f - Δ A P C での感染で著しい変化はなかった。 これらから、 A s e f 遺伝子の 発現の結果生じる細胞間接着の低減は、細胞間接触部位での E—力 ドヘリ ンおよび ]3 —力テニンの減少によるこ とが判明 した。 実施例 2 細胞の運動性に対する A s e f の効果を、 上記プラス ミ ドを用い て A s e f 遺伝子または A P C遺伝子、 あるいはそれらの変異体遺 伝子を発現させた M D C K細胞を用いて検討した。 細胞の運動性は ト ラ ンス ウェルマィ グレーショ ンチャ ンバ一を用いた細胞遊走試 験によ り行った。 該チャ ンバ一は、 M D C K細胞には直径 1 2 mm でポアサイ ズ 1 2 / mの ものを用いた （コス ター社）。 ト ラ ンス フ ェ ク シ ヨ ン 1 8 時間後に、 細胞数 3 . 0 X 1 0 4の M D C K細胞を チャンバ一の上室に加え、 1 8 時間で上室の下側へ遊走させた。 細 胞遊走は、 ポリ カーボネー トフ ィ ルターの低層側に遊走した細胞を 計数して測定した。
A s e f — f u 1 1 をコー ドする D N Aを含むプラス ミ ドを ト ラ ンス フエ ク シ ヨ ン した細胞は、 親細胞 （ M D C K ) またはべク タ 一を ト ラ ンスフエク シヨ ンした細胞 （M o c k ) と比較して運動性 が促進した （第 2図）。 A s e f - f u 1 1 遺伝子と共に、 A P C - a r m遺伝子、 A P C— 8 7 6遺伝子および A P C— 1 3 0 9遺 伝子のいずれか 1つを共発現させた細胞は、 A s e f - f u 1 1 遺 伝子のみを ト ラ ンスフエ ク ショ ンしたものよ り も運動性が促進し た。 A s e f の細胞運動性促進能に対する A P Cの効果は、 A P C - a r m、 A P C _ 8 7 6 および A P C— 1 3 0 9 の方が A P C— f u 1 1 よ り強かった。 一方、 A P C _ a r mのみでは遊走を刺激 しなかった。 また、 A s e f — A A P C遺伝子を ト ラ ンス フエ ク シ ヨ ンした細胞は、 A s e f - f u 1 1 遺伝子および A P C— a r m 遺伝子をコ ト ラ ンスフエク ショ ンしたものよ り も さ らに亢進した 遊走反応を示した。 これらから、 A s e f は MD C K細胞の遊走を 促進する能力を保有する こ とが明らかになった。 A s e f のこ のよ う な能力は、 A P C、 特にアルマジロ リ ピー ト ドメ イ ンを含む A P C切断変異体 （A s e f - A r m) によ り さ らに促進される こ とが 判明 した。 さ らに、 A s e f 一 Δ D Hが M D C K細胞の遊走を促進 しなかったこ とから、 A s e f の G E F活性がこのよ う な遊走刺激 活性に必要である と考えられた。
一方、 A s e f 一 A B R遺伝子を A P C— 1 3 0 9遺伝子と共に 発現させたとき、 細胞遊走の促進はほぼ完全に阻害された。 A s e f — A D Hも A P C— 1 3 0 9 が介する細胞遊走の促進を阻害し た。 これらから、 大腸癌または F A Pで同定された A P C変異体で ある A P C— 8 7 9および A P C— 1 3 0 9 は、 A s e f と相互作 用 してその活性を促進し、 それによ り 細胞遊走を促進する と考えら れた。 しかし、 全長 A P C遺伝子を MD C K細胞に ト ランスフエク シヨ ンしても、 A s e f が誘導する遊走の促進はみられなかった (第 2 図）。 このこ とから、 大腸癌細胞において A P Cが変異によ る切断によって活性化されないと、 A P Cは A s e f の有効な活性 剤にはならないと考えられた。
次に、 A s e f および A P C切断変異体を含むこ とが知られてい る S W 4 8 0細胞の運動性について検討した。 A s e f 一 A B Rを コー ドする D N Aを含むプラス ミ ドを S W 4 8 0細胞に ト ランス フエク シヨ ンしたと ころ、 当該細胞の遊走は、 親株または M o c k よ り約 5 0 %低減した （第 2 図）。 同様に、 A s e f — A D Hプラ ス ミ ドを ト ランスフエク 'シヨ ンした S W 4 8 0細胞の遊走は約 4 0 %低減した。 このこ とから、 細胞で発現された A s e f — A B R または A s e f — A D Hが、 A s e f と A P C切断変異体の結合に 対して ドミナン トネガティ ブに作用 し、 A s e f — A B Rまたは A s e f 一 Δ D Hによる細胞遊走を阻害するこ とが判明 した。 実施例 3
大腸癌細胞において、 A P C切断変異体と A s e f との結合につ いて検討した。 まず、 細胞数 5 . 0 X 1 0 6の S W 4 8 0細胞を、 1 % ト リ トン X— 1 0 0 を含むバッファー A 〔 5 0 mM T r i s 一 H C 1 ( p H 7. 5 )、 1 5 0 mM N a C l 、 5 m M E D T A、 2 mM パナジン酸ナ ト リ ウム （N a 3 V〇 4)、 1 0 mM フ ッ化ナ ト リ ウム〕 5 0 0 μ 1 中で溶解した。 溶解物を の抗 A s e f 抗体で 4 °Cにて 1 時間イ ンキュベーシ ョ ン した後、 4 °Cで 2 時間かけて免疫複合体をプロティ ン G _セファ ロース 6 Bに吸着 させた。 0. 1 % ト リ ト ン X— 1 0 0 を含むバッ フ ァー Aで何度も 洗浄した後、 試料を S D S — P A G Eによ り分離し、 ポリ ビニリデ ン ジフルオリ ド膜フィルター （ I mm o b i l o n P ; ミ リ ポ ァ社） に転写した。 ブロ ッ トは、 アルカ リ ホス フ ァ ターゼを結合さ せたマ ウス抗ゥサギ I g G抗体 （プロメガ社） を二次抗体と して使 用して、 ィムノブロ ッテイ ング分析に付した。 用いたゥサギ抗 A s e f ポリ ク ローナル抗体は、従前の方法で作製した（非特許文献 1 ), その結果、 A s e f は A P C切断変異体と共免疫沈降した （第 3 図 a )。 また、 A s e f と A P C変異体との共沈は、 抗体をその抗 原の過剰量と と もに 4 °Cで 2時間プレイ ンキュベーショ ンするこ とによ り 阻害された。 これら力 ら、 A s e f は S W 4 8 0細胞中で A P C変異体と協働するこ とが判明した。
次に、 インビ トロにおいて、 G S T _ A s e f — f u 1 1 と A P C一 a r mとを共免疫沈降させ、 A s e f 一 A B R添加の影響を検 討した。 まず、 A P C— A r mをイ ンビ ト ロ翻訳によ り作製し （ I V T— A P C— A r m)、 セフ ァロース に結合させた G S T— A s e f 一 f u 1 1 と M B P — A s e f 一 A B Rの存在下でイ ンキュ ベーシヨ ンした。 MB P— A s e f 一 A B Rに対する A P C— A r m量の比は、 第 3図 b に示したよ う に変化させた。 G S T— A s e f _ f u 1 1 一 S e p h a r o s e に結合した A P C— a r mは、 S D S 一 P A G Eに次いでォー ト ラ ジオグラ フィーを行って可視 ィ匕した （第 3 図 b の上パネル）。 また、 反応混合物に添加した M B P — A s e f 一 A B Rはゲルをクマシ一ブルー染色する こ と によ り 可視化した （第 3 図 b の下パネル）。 その結果、 A s e f 一 A B Rを加える とその量の増加に伴って、 G S T— A s e f 一 f u 1 1 と A P C - a r mとの共免疫沈降物が用量依存的に減少した。 すな わち、 イ ンビ ト ロにおいて、 A s e f 一 A B Rが A s e f と A P C 変異体との結合を阻害するこ とが明 らかになった。
このよ う に、 A s e f と A P C変異体との結合を ドミナン トネガ ティ ブな形で阻害する A s e f 一 A B Rを用いて、 S W 4 8 0細胞 の遊走を阻害するこ とができた。 実施例 4
各種大腸癌細胞株に、 A s e f - f u 1 l、A s e f 一 A A P C、 または A s e f — A D Hをコー ドする D N Aを含むアデノ ウィル スを感染させ、 実施例 2 と同様に細胞遊走試験を行った。 用いた大 腸癌細胞株は、 S W 4 8 0、 D L D— 1、 H C T 1 5、 W i D r お よび H C T 1 1 6 である。 S W 4 8 0細胞、 D L D— 1細胞、 H C T 1 5細胞、 および W i D r 細胞は、 A P C切断変異体を含む。 H C T 1 1 6細胞は、 正常 A P Cを含むが、 jS —力テニンに変異が認 められる。
結果を第 4 図に示す。 S W 4 8 0細胞は、 A d A s e f 一 f u 1 1 または A d A s e f 一 Δ Α Ρ Οを感染させる と、 その運動性が促 進した。 また、 S W 4 8 0細胞、 D L D— 1 細胞、 H C T 1 5細胞 および W i D r 細胞は、 A d A s e f 一 Δ ϋ Ηで感染させる と、 そ の運動性が部分的に阻害された。 一方、 H C Τ 1 1 6細胞は、 A d A s e f 一 A D Hによ り 阻害されなかった。 このこ と力 ら、 H C T 1 1 6 中の全長 A P Cは A s e f を活性化できないと考えられた。 これらの結果から、 A s e f は A P C切断変異体を含む大腸癌細胞 で活性化されるが、正常 A P Cを含む細胞では活性化されないまた は活性化されにく いこ とが判明 した。 また、 当該活性化は、 A s e f — Δ D Hによ り 阻害されるこ とが明 らかになった。
実施例 5
大腸癌細胞の遊走における A s e f と A P C変異体と の相互作 用を、 R N A干渉試験によ り検討した。 当該試験は、 p S H A G _ 1 ベク ターシステムを用いて行った （非特許文献 1 3 )。 用いた大 腸癌細胞株は、 S W 4 8 0細胞、 W i D r 細胞、 L S 1 8 0細胞お よび H C T 1 1 6細胞である。 S W 4 8 0細胞および W i D r 細胞 は、 A P C切断変異体を含む。 L S 1 8 0細胞および H C T 1 1 6 細胞は、 正常 A P Cを含むが、 3 —力テニンに変異が認め られる。
s h R N A - A s e f または s h R N A— A P Cのいずれかを 含む発現ベク ターを ト ラ ンス フ エ ク ショ ンした各種大腸癌細胞に ついて、 実施例 2 と同様に細胞遊走試験を行った。 その結果、 s h R N A— A s e f または s h R N A— A P Cのいずれかを ト ラ ン ス フエタ シ ョ ンした S W 4 8 0細胞および W i D r 細胞は、 m u t 一 s h R N A - A s e f または m u t _ s h R N A— A P C を ト ラ ンスフエク シヨ ンした細胞に比べて、運動性が低減した（第 5 図） ( —方、 L S 1 8 0細胞および H C T 1 1 6細胞では、 このよ う な現 象は認められなかった。
次に、 s h R N A— A s e f 、 s h R N A— A P C、 m u t _ s h R N A— A s e f および m u t — s h R N A— A P Cのいずれ か 1 つのオリ ゴヌ ク レオチ ドを含む発現べク ターを ト ラ ンスフエ ク ショ ンした細胞について、 ィ ムノ ブ口 ッティ ング分析を実施例 3 と同様に実施した。 このとき、 対照と して、 α —チュープリ ンの変 ィ匕を測定した。 その結果、 s h R N A - A s e f および s h R N A 一 A P Cは、それぞれ A s e f 遺伝子および A P C遺伝子の発現を ほぼ完全に阻害した。
これらから、 A s e f 遺伝子または A P C遺伝子の発現阻害によ り、 A P C切断変異を有する大腸癌細胞の運動性が低減されること が判明した。 すなわち、 大腸癌細胞の遊走に、 A P C変異体と A s e f との相互作用が重要な役割を果たすと考えられた。 実施例 6
ヒ ト S W 4 8 0大腸癌細胞に、 A s e f ド ミ ナン トネガティブ変 異体である A s e f — A B Rを発現させて作成した細胞を、 それぞ れ S C I Dマウスに移植し、 造腫瘍性や増殖の変化を観察した。 A s e f _ A B Rプラス ミ ドは、 S W 4 8 0大腸癌細胞に、 リ ポフエ クショ ンによ り導入した。 得られた 3つのクローンをそれぞれ、 G 4 1 8 を l m g Zm l (終濃度） 含有する L一 1 5培地を使用して インビ トロで培養し、 一群当たり 2〜 4匹の S C I Dマウス （ 8週 齢） の側腹部皮下に、 細胞数 1 X 1 0 7 Z 0 . 1 m 1 Zマ ウス移植 した。 腫瘍移植後 2 0 日 目に腫瘍塊を摘出して重量を測定した。 ま た、 各ク ローンを移植したマ ウスの腫瘍塊の重量 （T ) を対照群の 値 （ C ) で割り、 阻害比 （ I Rと略称する） と して百分率で表した [ I R ( % ) = T Z C X 1 0 0〕。 移植した細胞で A s e f — A B Rが発現されていることは、 常法によ り確認した。
A s e f 一 A B Rのみを安定的に発現する 3 ク ローンのう ち、 2 ク ローンで造腫瘍性の低下や増殖の遅延が見られた （表 1 )。 これ らから、 A s e f が造腫瘍性や腫瘍細胞増殖に関与する と考えられ た。 表 1
重量土 SD (g) IR(%) 腫瘍生着/移植数
SW480 0.496 ±0.080 0 4/4
ABR-2 0.609 ±0.069 -22.7 3/3
ABR-8 0.000 ±0.000 100 0/3
ABR-17 0.203 ±0.056 59.1 4/4
実施例 7
ヒ ト H T 2 9大腸癌細胞株で作製した A s e f — A B Rク ロー ン （実施例 6参照） を S C I Dマウスに移植し、 造腫瘍性や増殖の 変化を観察した。 A s e f — A B Rプラス ミ ド 1 5 μ g は、 細胞数 5 X I 0 6の H T 2 9細胞に、 リ ポフエクシヨ ンによ り 導入した。 得られた 5 つのク ローンをそれぞれ、 G 4 1 8 を l m g /m l (終 濃度） 含有する D M E M培地を使用 してイ ンビ ト ロで培養し、 一群 あた り 4 匹の S C I Dマウス （ 8週齢） の脾臓内に、 細胞数 1 X 1 0 6 / 0 . 0 5 m l /マ ウス移植した。 腫瘍細胞移植後 1 8 日 目 に 尾静脈内にイ ンク を注入後、 エーテル麻酔下で放血屠殺し、 脾臓お よび肝臓を摘出して重量を測定した。
H T 2 9 細胞で作製した A s e f — A B R ドミ ナン トネガティ ブ変異体安定発現株 5 ク ローン中 4 ク ローンにおいて、 脾臓や肝臓 での腫瘍形成が認め られなかった （表 2 )。 実施例 6 で S W 4 8 0 大腸癌細胞を用いて作製した 3 ク ローンについても同様な現象が 得られた。 すなわち、 A s e f は造腫瘍性や腫瘍細胞増殖に関与す る こ とが判明 した。 また A s e f _ A B R ドミナン トネガティ ブ変 異体安定発現株で、 肝臓の腫瘍形成が認め られなかったこ とから、 A s e f 一 A B R ドミナン トネガティブ変異体が、腫瘍の転移を抑 制するこ とが判明 した。 表 2
Figure imgf000032_0001
正常 1.340 ±0.176 30.8 + 7.1
親株 (ΗΤ29) 2.236 ±0.153 124.5 20.4
Asef-ABR-A7 1.584 ±0.093 38.0 士 3.9
Asef-ABR-B5 2.627 ±0.392 129.3 ± 13.5
Asef-ABR-C3 1.579 ±0.124 44.3 11.0
Asef-ABR-C12 1.526 ±0.070 37.8 5.1
Asef-ABR-Dl l 1.359 ±0.173 37.3 土 4.6 産業上の利用可能性
本発明においては、 A s e f が細胞の運動性を促進し、 さ らに細 胞間接着を低減するこ と 、 A s e f の この機能が癌抑制遺伝子 A P Cの遺伝子産物によ り活性化されることを見出した。また、大腸癌、 特に A P C変異が認められる大腸癌において、 A s e f が大腸癌細 胞の運動性を高め、 その造腫瘍性および転移に関与するこ とを見出 した。 これらに基づいて本発明において提供する、 A s e f の機能 阻害および Zまたは A s e f 遺伝子の発現阻害を特徴とする大腸 癌転移抑制剤並びに大腸癌転移抑制方法は、大腸癌およぴ大腸癌の 転移の防止および Zまたは治療に多大な効果を有するものである。 配列表フリ一テキス ト
配列番号 1 ： A s e f 遺伝子の発現を抑制するために、 ヒ ト A s e f の塩基配列に基づいて設計したオリ ゴヌ ク レオチ ド。
配列番号 2 ： A P C遺伝子の発現を抑制するために、 ヒ ト A P C の塩基配列に基づいて設計したオリ ゴヌク レオチ ド。
配列番号 3 ： A s e f 遺伝子の発現を抑制するために、 ヒ ト A s e f の塩基配列に基づいて設計したオリ ゴヌク レオチ ド。 配列番号 4 ： A P C遺伝子の発現を抑制するために、 ヒ ト A P C の塩基配列に基づいて設計したオリ ゴヌク レオチ ド。
配列番号 5 ：配列番号 1 に記載の塩基配列に基づいて設計したォ リ ゴヌ ク レオチ ド。
配列番号 6 ：配列番号 2 に記載の塩基配列に基づいて設計したォ リ ゴヌ ク レオチ ド。

Claims

請求の範囲
1 . A s e f (A P C— s t i m u l a t e d g u a n i n e n u c l e o t i d e e x c h a n g e l a c t o r ) の機能阻害および/または A s e f 遺伝子の発現阻害を特 徴とする大腸癌転移抑制剤。
2. A s e f (A P C— s t i m u l a t e d g u a n i n e n u c l e o t i d e e x c n a n g e f a c t o r ) 遺伝子の発現阻害を特徴とする大腸癌転移抑制剤。
3 . A s e f (A P C— s t i m u l a t e d g u a n i n e n u c l e o t i d e e x c n a n g e f a c t o r ) の A P C ( A d e n o m a t o u s P o l y p o s i s C o 1 i )遺伝子産.物との結合阻害を特徴とする大腸癌転移 抑制剤。
4 . A s e t 、A P C— s t i m u l a t e d g u a n i n e n u c l e o t i d e e x c h a n g e f a c t o r ) のグァニンヌ ク レオチ ド交換因子（ G u a n i n e n u c l e o t i d e E x c h a n g e F a c t o r )活性の 阻害を特徴とする大腸癌転移抑制剤。
5 . A s e f 、A P C— s t i m u l a t e d g u a n i n e n u c l e o t i d e e x c h a n g e ： f a c t o r ) の機能阻害および/または A s e f 遺伝子の発現阻害を特 徴とする大腸癌転移抑制方法。
6 . A s e i A P C—— s t i m u l a t e d g u a n i n e n u c l e o t i d e e x c h a n g e f a c t o r ) 遺伝子の発現阻害を特徴とする大腸癌転移抑制方法。
7 . A s e f (A P C— s t i m u l a t e d g u a n i n e n u c l e o t i d e e x c h a n g e f a c t o r ) の A P C (A d e n o m a t o u s P o l y p o s i s C o l i )遺伝子産物との結合阻害を特徴とする大腸癌転移 抑制方法。
8 . A s e f (A P C— s t i m u 1 a t e d g u a n i n e n u c l e o t i d e e x c h a n g e f a c t o r ) のグァニンヌ ク レオチ ド交換因子（ G u a n i n e n u c l e o t i d e E x c h a n g e F a c t o r リ活性の 阻害を特徴とする大腸癌転移抑制方法。
9 . A s e f (A P C— s t i m u l a t e d g u a n i n e n u c l e o t i d e e x c h a n g e r a c t o r ) 遺伝子の発現に対する R N A干渉を利用するこ と を特徴と する A s e f 阻害剤。
1 0 . A s e f A P C— s t i m u l a t e d g u a n i n e n u c l e o t i d e e x c h a n g e f a c t o r ) 遺伝子の発現に対する R N A干渉効果を示すオリ ゴヌク レ ォチ ドを含んでなる A s e f 阻害剤。
1 1 . 配列表の配列番号 1 に記載の塩基配列からなるオリ ゴヌ ク レオチ ド。
1 2. 配列表の配列番号 2に記載の塩基配列からなるオリ ゴヌク レオチ ド。
1 3. 配列表の配列番号 3 に記載の塩基配列からなるオリ ゴヌ ク レオチ ド。 1 4 配列表の配列番号 4 に記載の塩基配列からなるオリ ゴヌ ク レオチ ド。
1 5 配列表の配列番号 1 または 3 に記載の塩基配列からなるォ リ ゴヌ ク レオチ ドを含んでなる請求の範囲第 1 0項に記載 の A s e f 阻害剤。
6 A s e f (A P C— s t i m u l a t e d g u a i n e n u c l e o t i d e e x c h a n g e f a c t o r ) 遺伝子の発現に対する R N A干渉を利用するこ と を特徴と する A s e f 阻害方法。
1 7 A s e f ( A P C— s t l m u 1 a t e d g u a n i n e n u c l e o t i d e e x c h a n g e f a c t o r ) 遺伝子の発現に対する R N A干渉効果を示すオリ ゴヌ ク レ ォチ ドを利用することを特徴とする A s e f 阻害方法。
1 8 配列表の配列番号 1 または 3 に記載の塩基配列からなるォ リ ゴヌ ク レオチ ドを利用するこ とを特徴とする請求の範囲 第 1 7項に記載の A s e f 阻害方法。
9 請求の範囲第 9項、第 1 0項および第 1 5項のいずれか 1項 に記載の A s e f 阻害剤を含んでなる大腸癌転移抑制剤。
2 0 配列表の配列番号 1 から 4のいずれか 1 に記載の塩基配列 からなるオリ ゴヌ ク レオチ ドを含んでなる大腸癌転移抑制 剤。
2 請求の範囲第 9項、第 1 0項および第 1 5項のいずれか 1項 に記載の A s e f 阻害剤を用いるこ と を特徴とする大腸癌 転移抑制方法。
2 2 配列表の配列番号 1 から 4のいずれか 1 に記載の塩基配列 からなるオリ ゴヌク レオチ ドを用いるこ とを特徴とする大 腸癌転移抑制方法。
3 . 請求の範囲第 1項から第 4項、第 1 9項おょぴ第 2 0項のい ずれか 1項に記載の大腸癌転移抑制剤、 または、 請求の範囲 第 9項、第 1 0項および第 1 5項のいずれか 1項に記載の A s e f 阻害剤を含んでなる医薬組成物。
4 . 請求の範囲第 1項から第 4項、第 1 9項おょぴ第 2 0項のい ずれか 1項に記載の大腸癌転移抑制剤、 または、 請求の範囲 第 9項、第 1 0項おょぴ第 1 5項のいずれか 1項に記載の A s e f 阻害剤を含んでなる大腸癌の防止剤および/または 治療剤。
5 . 請求の範囲第 1項から第 4項、第 1 9項および第 2 0項のい ずれか 1項に記載の大腸癌転移抑制剤、 または、 請求の範囲 第 9項、第 1 0項および第 1 5項のいずれか 1項に記載の A s e f 阻害剤を用いるこ とを特徴とする大腸癌の防止方法 および Zまたは治療方法。
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