明細 大腸癌転移抑制剤 技術分野
本発明は、 A s e f (A P C— s t i m u l a t e d g u a n l n e n u c l e o t i d e e x c h a n g e f a c t o r ) の機能阻害およびノまたは A s e f の発現阻害を特徴とする、 大腸癌転移抑制剤および大腸癌転移抑制方法に関する。 さ らに詳し く は、 A s e f の発現阻害、 A s e f と A P C (A d e n o m a t o u s P o l y p o s i s C o l i )遺伝子産物との結合阻害 または A s e f のグァニンヌク レオチ ド交換因子(G u a n i n e n u c l e o t i d e E x c h a n g e F a c t o r ; 以下、 G E F と略称する) 活性の阻害を特徴とする、 大腸癌転移抑制剤、 A s e f 阻害剤、 医薬組成物、 大腸癌の防止剤および/または治療 剤、 大腸癌転移抑制方法、 並びに大腸癌の防止方法および/または 治療方法に関する。 背景技術
A s e f は、本発明者らによ り大腸癌抑制遺伝子関連蛋白質 M 1 と して見出され、 既に特許出願されて公開された蛋白質である (特 許文献 1 および非特許文献 1 )。 当該蛋白質は 6 1 9アミ ノ酸残基 からなる蛋白質であり 、 D b 1 相同 (D H) ドメイン、 プレ ッ ク ス ト リ ン ( P r e c k s t r i n ) 相同 ( P H) ドメ イ ン、 S r c相 同 3 ( S H 3 ) ドメインをそのアミ ノ酸配列中に保有する。
A s e f の作用の 1つと して、低分子量 G T P結合蛋白質フア ミ リ ーの 1 つである R h o フア ミ リ ーに属する R a c に対する特異
的な G E F活性をもつことが知られている。すなわち、 A s e f は、 R a c に結合し G D P / G T P交換反応を促進して R a c を活性 ィ匕し、 R a c が関与する細胞内情報伝達の下流に位置する N F κ B c - j u n 、 S R E等に作用する。 R h o フ ァ ミ リーに属する蛋白 質はァクチンネッ トワークの再構成に重要な役割を果たし、 それに よ り細胞運動および細胞間接着を調節している。 したがって、 A s e f は、 細胞のラメ リ ポディア (葉状仮足) や細胞膜のラ ッ フ リ ン グを誘導し、 細胞運動および細胞間接着に関与する可能性がある。
A s e f は、 癌抑制遺伝子 A P Cの遺伝子産物と、 該遺伝子産物 のアルマジロ リ ピー ト ドメイ ンを介して結合するこ とが明らかに なっている。 A s e f は A P C遺伝子産物によ り G E F活性が正に 調節される。 そのため、 A P C遺伝子産物による A s e f を介した 細胞膜のラッ フ リ ングゃラメ リ ポディア形成の誘導が、ィ ヌ腎臓由 来上皮様細胞である M D C K細胞で認められている。 また A s e f は、 細胞内において A P C遺伝子産物と同様に、 移動する細胞の微 小管先端部位に集積している。 このこ とから、 細胞が大腸の絨突起 先端 ( v i 1 l u s t i p ) へタ リ プ ト ( c r y p t ) から移動 する際の移動制御の鍵を A s e f が握っている可能性がある。
一方、 癌抑制遺伝子 A P C (非特許文献 2 ) は、 家族性腺腫性ポ リ ポーシス 、 i a m i l i a l a d e n o m a t o u s p o l y P o s i s : F A P ) の原因遺伝子と して単離され、 散発性大腸 癌の約 7 0 %〜約 8 0 %でその変異が認められている。 A P C遺伝 子産物 (以下、 A P C と称する) は、 2 , 8 4 3アミ ノ酸残基から なる約 3 0 0 k D a の巨大な蛋白質であり 、そのアミ ノ酸配列中に は、蛋白質間相互作用の役割を担うアルマジロ リ ピー ト ドメインが 存在する。 大腸癌細胞で認められる多く の体細胞 A P C変異は、 変 異ク ラス ター領域 (M C R ) と呼ばれるその中央領域内で生じ、 例
えば、 マイ ク ロチュブール、 E B 1 、 h D L Gへの結合部位、 並び に ]3 —力テニンおよびアキシンに対する少なく と も幾つかの部位 が切断された切断 A P C ( t r u n e a t e d A P C ) を生じる (非特許文献 4、 5、 6、 7および 8 )。 しカゝしながら、 A s e f への結合に対応する A P Cの領域は、 アルマジロ リ ピー ト ドメ イ ン であり、 ほとんどの変異 A P C中でその配列が維持されている (非 特許文献 6、 7および 8 )。 A P Cは、 一種の癌遺伝子産物である i3 —力テニンに結合して分解を誘導する作用を有する (非特許文献 2、 3、 4、 5および 6 )。 一力テニンは、 W n t ZW i n g l e s s シグナル伝達因子の 1つであり 、力 ドヘリ ンの細胞質側 ドメ イ ンに結合して細胞接着に役割を果たすと同時に、発生過程や腫瘍 形成において重要な役割を担っている (非特許文献 9および 1 0 )。
A s e f のアミ ノ酸配列おょぴその遺伝子の塩基配列は、 G e n B a n k にァクセ ッ シ ョ ン番号 A B 0 4 2 1 9 9 と して登録され ている。 また、 A P Cのアミ ノ酸配列およびその遺伝子の塩基配列 は、 G e 11 B a n kにァクセ ッ シ ョ ン番号 NM O 0 0 0 3 8 と して 登録されている。
以下、 本明細書において引用した文献を列記する。
特許文献 1 : 特開 2 0 0 1 — 0 5 7 8 8 8号公報。
非特許文献 1 : カ ワサキ ( K a w a s a k i , Y . ) ら、 「サイェン ス ( S c i e n c e )」、 2 0 0 0年、 第 2 8 9卷、 p . 1 1 9 4 — 1 1 9 7。
非特許文献 2 : キンッラー ( K i n z 1 e r , K . W. ) ら、 「セル ( C e l l )」、 1 9 9 6年、 第 8 7卷、 p . 1 5 9 — 1 7 0。
非特許文献 3 : フ ァーンヘッ ド ( F e a r n h e a d ) ら、 「ヒ ュ 一マン モ レキュ ラー ジエネテイ ク ス (H u m a n M o l e c u 1 a r G e n e t i c s )」、 2 0 0 1年、 第 1 0卷、 p . 7 2
1 — 7 3 3。
Ife,特許文献 4 : ビーンズ( B i e n z , M . )ら、 「セル( C e 1 1 )」、 2 0 0 0年、 第 1 0 3卷、 p . 3 1 1 — 3 2 0。
非特許文献 5 : ぺリ フ ァー ( P e r i f e r , M. ) ら、 「サイェン ス ( S c i e n c e )」、 2 0 0 0年、 第 2 8 7卷、 p . 1 6 0 6 — 1 6 0 9。
非特許文献 6 : ァキヤマ (A k i y a m a , T .)、 「サイ ト力イ ン アン ド グロースフ ァ ク ター レビューズ ( C y t o k i n e a n d G r o w t h F a c t o r R e v i e w s )」、 2 0 0 0 年、 第 1 1巻、 p . 2 7 3 — 2 8 2。
非特許文献 7 : ミ ヨ シ (M i y o s h i , Y . ) ら、 「ヒ ューマン モ レキユ ラ一 ジエネテ イ ク ス (H u m a n M o l e c u l a r G e n e t i c s )」、 1 9 9 2年、 第 1卷、 p . 2 2 9 — 2 3 3。 非特許文献 8 : ナガワ (N a g a w a , H . ) ら、 「ヒ ューマン ミ ユーテーシ ヨ ン (H u m a n M u t a t i o n )」、 1 9 9 3年、 第 2巻、 p . 4 2 5 — 4 3 4。
非特許文献 9 : 「セル ( C e l l )」、 1 9 9 6年、 第 8 6卷、 p . 3 9 1 — 3 9 9。
非特許文献 1 0 : 「ネイチヤー (N a t u r e )」、 1 9 9 6年、 第 3 8 2卷、 p . 6 3 8 — 6 4 2。
非特許文献 1 1 : ウォン (W o n g , M. H . ) ら、 「プロシーディ ング ォブ ナショ ナル アカデ ミ ー ォブ サイ エンス ( P r o c e e d i n g o r n a t i o n a l a c a d e m y o f s c i e n c e U S A)」、 1 9 9 6年、 第 9 3卷、 p . 9 5 8 8 — 9 5 9 3。
非特許文献 1 2 : オーシマ (O s h i m a , H . ) ら、 「キャ ンサー リ サーチ ( C a n c e r R e s e a r c h )」、 1 9 9 7年、 第 5
7卷、 p . 1 6 4 4 — 1 6 4 9。
非特許文献 1 3 : パディ ソン ( P a d d i s o n , P . J . ) ら、 「ジーンズ アン ド ディべロプメ ン ト (G e n e s a n d D e v e l o p m e n t )」、 2 0 0 2年、 第 1 6卷、 p . 9 4 8 — 9
5 80 発明の開示
A s e f については、上記のよ う に腫瘍形成や発生過程において 重要な役割を担う癌抑制遺伝子 A P Cの遺伝子産物と結合するこ とが知られているが、細胞におけるその作用および疾患との関連は 未だ明ら力 こされていない。 A s e f の作用を明らかにして、 その 機能を調節することによ り 、 A s e f に起因する疾患の防止および 治療が可能になる。
本発明者らは、 A s e f の G E F活性およびその細胞内局在から 細胞運動および細胞間接着への A s e f の関与可能性を推察し、 A s e f が大腸癌、 特に A P C変異が認められる大腸癌において、 大 腸癌細胞の運動性を高め、 その転移に関与するこ とを見出した。 そ して、 この知見を利用し、 A s e f の機能阻害および Zまたは A s e f 遺伝子の発現阻害によ り大腸癌転移が抑制されるこ と を見出 して、 本発明を完成した。
すなわち、本発明の一態様は A s e f の機能阻害および/または A s e f 遺伝子の発現阻害を特徴とする大腸癌転移抑制剤に関す る。
また本発明の一態様は、 A s e f 遺伝子の発現阻害を特徴とする 大腸癌転移抑制剤に関する。
さ らに本発明の一態様は、 A s e f の A P C遺伝子産物との結合 阻害を特徴とする大腸癌転移抑制剤に関する。
さ らにまた本発明の一態様は、 A s e f の G E F活性の阻害を特 徴とする大腸癌転移抑制剤に関する。
また本発明の一態様は、 A s e f の機能阻害および/または A s e f 遺伝子の発現阻害を特徴とする大腸癌転移抑制方法に関する。 さ らに本発明の一態様は、 A s e f 遺伝子の発現阻害を特徴とす る大腸癌転移抑制方法に関する。
さ らにまた本発明の一態様は、 A s e f の A P C遺伝子産物との 結合阻害を特徴とする大腸癌転移抑制方法に関する。
また本発明の一態様は、 A s e f の G E F活性の阻害を特徴とす る大腸癌転移抑制方法に関する。
さ らに本発明の一態様は、 A s e f 遺伝子の発現に対する R N A 干渉を利用するこ とを特徴とする A s e f 阻害剤に関する。
さ らにまた本発明の一態様は、 A s e f 遺伝子の発現に対する R N A干渉効果を示すオリ ゴヌ ク レオチ ドを含んでなる A s e f 阻 害剤に関する。
また本発明の一態様は、配列表の配列番号 1 に記載の塩基配列か らなるオリ ゴヌ ク レオチ ドに関する。
さ らに本発明の一態様は、配列表の配列番号 2に記載の塩基配列 からなるオリ ゴヌク レオチ ドに関する。
さ らにまた本発明の一態様は、配列表の配列番号 3 に記載の塩基 配列からなるオリ ゴヌク レオチ ドに関する。
また本発明の一態様は、配列表の配列番号 4に記載の塩基配列か らなるオリ ゴヌ ク レオチ ドに関する。
さ らに本発明の一態様は、配列表の配列番号 1 または配列番号 3 に記載の塩基配列からなるオリ ゴヌ ク レオチ ドを含んでなる前記 A s e f 阻害剤に関する。
さ らにまた本発明の一態様は、 A s e f 遺伝子の発現に対する R
N A干渉を利用するこ とを特徴とする A s e f 阻害方法に関する。 また本発明の一態様は、 A s e f 遺伝子の発現に対する R N A干 渉効果を示すオリ ゴヌク レオチ ドを利用するこ と を特徴とする A s e f 阻害方法に関する。
さ らに本発明の一態様は、配列表の配列番号 1 または 3に記載の 塩基配列からなるオリ ゴヌ ク レオチ ドを利用するこ と を特徴とす る前記 A s e f 阻害方法に関する。
さ らにまた本発明の一態様は、前記いずれかの A s e f 阻害剤を 含んでなる大腸癌転移抑制剤に関する。
また本発明の一態様は、配列表の配列番号 1 から 4のいずれか 1 に記載の塩基配列からなるオリ ゴヌク レオチ ドを含んでなる大腸 癌転移抑制剤に関する。
さ らに本発明の一態様は、前記いずれかの A s e f 阻害剤を用い ることを特徴とする大腸癌転移抑制方法に関する。
さ らにまた本発明の一態様は、配列表の配列番号 1 から 4のいず れか 1 に記載の塩基配列からなるオリ ゴヌク レオチ ドを用いるこ とを特徴とする大腸癌転移抑制方法に関する。
また本発明の一態様は、 前記いずれかの大腸癌転移抑制剤、 また は、前記いずれかの A s e f 阻害剤を含んでなる医薬組成物に関す る。
さ らに本発明の一態様は、 前記いずれかの大腸癌転移抑制剤、 ま たは、前記いずれかの A s e f 阻害剤を含んでなる大腸癌の防止剤 および/または治療剤に関する。
さ らにまた本発明の一態様は、前記いずれかの大腸癌転移抑制剤 . または、前記いずれかの A s e f 阻害剤を用いるこ とを特徴とする 大腸癌の防止方法おょぴ Zまたは治療方法に関する。
図面の簡単な説明
第 1 図は A s e f をコー ドする D N Aを含むアデノ ウイルスを 感染させた M D C K細胞の細胞間接着が低減したことを説明する。 細胞間接着は、 縦軸に示したよ う に、 凝集塊 (N p ) 数を総細胞 (N c ) 数で割った数値で示した。 図中、 A s e f - f u 1 1 は全長 A s e f 遺伝子; A P C— a r mは A P C遺伝子のアルマジロ リ ビー ト ドメイ ン; A s e f 一 A A P Cは A P C結合部位を欠失させた A s e f 変異体遺伝子; A s e f 一 Δ D Hは D H ドメイ ンを欠失させ た A s e f 変異体遺伝子を含むアデノ ウイルスで細胞を感染させ たことを示す。 結果は 3回の実験の平均値士標準偏差 ( S D ) であ る。
第 2図は A s e f 遺伝子発現による M D C K細胞の細胞運動性 の亢進が、 アルマジロ リ ピー ト ドメ イ ンを含む A P C変異体 (Α Ρ C一 a r m、 A P C— 8 7 6およぴ A P C— 1 3 0 9 ) 遺伝子の共 発現によ り さ らに促進されたこと、並びに A s e f 遺伝子発現によ り亢進された運動性および細胞本来の運動性が A s e f 一 Δ D H 遺伝子または A s e f 一 A B R (A s e f の A P C結合領域) 遺伝 子の発現によ り低減したこ とを説明する。 結果は、 親細胞の遊走に 河する相对的遊走 、 r e 1 a t i v e m i g r a t i o n ) で表 した。 図中 M o c k とは、 空ベクターを導入した細胞を意味する。 第 3図 a は S W 4 8 0細胞中で A s e f と A P C切断変異体が 結合したこ とを説明する。 結合の解析は、 抗 A s e f 抗体 (A n t i - A s e f ) を用いて免疫沈降によ り行った。 図中、 +は免疫沈 降前に抗原でプレインキュベーショ ンした抗体を用いたこ と を示 す。
第 3図 b は A s e f _ A B R (A s e f の A P C結合領域) が、 イ ンビ ト ロでの I V T— A P C— a r mと G S T— A s e f - f
u 1 1 の相互作用を、用量依存的に阻害したこ とを説明する。図中、 MW . は分子量マーカーを示す。
第 4図は A s e f 遺伝子または A P C結合部位を欠失させた A s e f 遺伝子 (A s e f - Δ A P C ) の発現によ り大腸癌細胞 S W 4 8 0 の運動性が亢進したが、 G E F領域を欠失させた A s e f 遺 伝子 (A s e f - Δ D H ) を発現させても各種大腸癌細胞 ( S W 4 8 0、 D L D— 1、 H C T 1 5、 W i D rおよび H C T 1 1 6 ) の 運動性は変化しないか、あるいは低減したこ とを説明する。結果は、 対照である L a c Z遺伝子を発現させた各細胞の遊走に対する相 対的遊走 ( r e l a t i v e m i g r a t i o n ) で表した。
第 5図は A s e f 遺伝子および A P C遺伝子の発現をそれぞれ 阻害するシ ョ ー トヘア ピン R N Aである s h R N A— A s e f お ょぴ s h R N A - A P Cが、いずれも A P C変異を有する大腸癌細 胞 ( S W 4 8 0および W i D r ) の運動性を低減させたが、 正常 A P Cを有する大腸癌細胞 (H C T 1 1 6および L S 1 8 0 ) の運動 性には影響しなかったこ とを説明する。 比較対照と して、 A s e f 遺伝子または A P C遺伝子の発現を阻害しないショ一トヘアピン R N Aである m u t — s h R N A— A s e f および m u t - s h R N A— A P Cを用いた。 結果は、 m u t - s h R N A— A s e f を遺伝子導入した各細胞の遊走に対する相対的遊走( r e 1 a t i v e m i g r a t i o n ) で表した。 発明を実施するための最良の形態
本発明は、 参照によ り ここに援用されると ころの、 日本国特許出 願番号第 2 0 0 2 - 3 8 2 0 8 3号からの優先権を請求する もの である。
本明細書中で使用されている技術的および科学的用語は、別途定
義されていない限り 、 当業者によ り普通に理解される意味を持つ。 本明細書中では当業者に既知の種々の方法が参照されている。 その よ う な引用されている公知の方法を開示する刊行物等の資料は、 引 用によ り 、本明細書中にそれらの全体が完全に記載されている もの と見なす。
以下、 本発明について、 発明の実施の態様をさ らに詳しく 説明す る。 以下の詳細な説明は例示であ り 、 説明のためのものに過ぎず、 本発明を何ら限定するものではない。
本発明においては、 A s e f が上皮由来細胞の細胞間接着を低減 させる と共にその運動性を顕著に促進する こ と を見出した。 さ らに これらの作用が、 A P Cによ り調節されており 、 特に大多数の大腸 癌細胞で同定されている断片化した変異 A P Cが A s e f を効率 よ く 活性化する こ と を見出した。 これらから、 変異 A P C と A s e f との複合体形成が、 大腸癌細胞の異常な運動性の原因の 1 つと考 えた。 つま り 、 腸管上皮細胞の上方への遊走、 すなわちク リ プ トか ら絨突起先端への遊走に当該複合体が関与している と推定した。 実 際、 A P C遺伝子の強制発現が腸管上皮において細胞遊走の異常を 引き起こすこ とが知られている (非特許文献 1 1 )。 A P C ノ ック ァゥ トマウスにおいて、初期腺腫細胞の増殖速度は正常ク リ プ ト上 皮細胞のものと 同 じであるが、腺腫細胞はク リ プ トー絨突起軸に沿 う有向遊走を しないこ とが知られている (非特許文献 1 2 )。
このよ う に、 A P C切断変異体による A s e f の活性化に基づい た異常な遊走態様は、腺腫形成と同様に腫瘍の侵襲性悪性腫瘍への 悪化に重要である と考えられる。 また、 A s e f の G E F領域を欠 失させた変異体は、細胞間接着を低減させた り細胞運動性を促進し た り しないこ と力 ら、 G E F活性が A s e f のかかる機能に重要で ある と推定した。
本発明においては、 A s e f と変異 A P Cの結合を阻害する ドミ ナン トネガティブ変異体、例えば A s e f のアミゾ酸配列中の A P C結合領域 (第 7 3番目から第 1 2 6番目までのァミ ノ酸配列) か らなる変異体または A s e f の G E F領域を欠失させた変異体を 用いて、変異 A P Cを発現する大腸癌細胞の運動性を阻害できるこ とを明らかにした。 また、 A s e f 遺伝子または A P C遺伝子の発 現阻害によ り 、 同様に、 変異 A P Cを発現する大腸癌細胞の運動性 を阻害できることを明らかにした。 さ らに、 上記 ドミナン トネガテ ィブ変異体を発現させたヒ ト大腸癌細胞の造腫瘍性、 増殖性、 さ ら に転移が、かかる変異体を発現させなかった細胞と比較して阻害さ れることを、 重度複合免疫不全マウス ( S C I Dマウス) を用いた イ ンビボ ( i n v i v o ) の検討において見出した。 このよ う な 阻害は、 ドミナン トネガティブ変異体を発現させたヒ ト大腸癌細胞 と して、変異体発現後にク ローン化して得た細胞を用いた検討にお いても、 また標識化した変異体を発現させた後に該標識を指標にし て変異体が発現された細胞をセルソーターによ り 9 0 %以上に濃 縮して得たミ ックスポピユ レーショ ンを用いた検討( m i x p o p u 1 a t i o n法) においても、 同様に認められた。
このよ う に、 A s e f の機能阻害によ り 、 細胞の運動性を阻害で き、 さ らには細胞の増腫瘍性並びに腫瘍細胞の増殖性および Zまた は転移を抑制できる。細胞の運動性の阻害は A s e f 遺伝子または A P C遺伝子の発現阻害によっても達成できるため、 これら各遺伝 子の発現阻害によ り細胞の増腫瘍性並びに腫瘍細胞の増殖性およ び Zまたは転移の抑制が可能である。
上記知見に基づいて、 本発明は、 A s e f の阻害を特徴とする大 腸癌転移抑制剤および大腸癌転移抑制方法を提供する。 当該大腸癌 転移抑制剤および大腸癌転移抑制方法は、 A s e f の機能阻害およ
び/または A s e f 遺伝子の発現阻害を特徴とする。 .
A s e f 遺伝子の発現阻害は、 例えば A s e f 遺伝子の発現に対 する R N A干渉 (R N A i n t e r f e r e n c e ) 効果を利用 する こ とによって実現可能である。 R N A干渉は、 R N Aを利用 し て遺伝子の発現を抑制する方法と して、近年報告された方法である (非特許文献 1 3 )。 具体的には、 A s e f 遺伝子の発現に対する R N A干渉効果を示すオリ ゴヌク レオチ ドを使用 して、 A s e f 遺 伝子の発現阻害が可能である。 かかるオリ ゴヌ ク レオチ ドと して、 配列表の配列番号 1 に記載の塩基配列からなる c D N Aが例示で きる。 また、 当該 c D N Aの相補的 R N A (配列表の配列番号 3 ) も同様に使用できる。 かかる c D NAを含むベクターまたはその相 補的 R N Aを細胞に導入するこ と によ り 、 A s e f 遺伝子の発現阻 害を実現できる。 ベク ターまたは R N Aの細胞への導入は、 自体公 知の方法、 例えばリ ポフエク ショ ン等を利用 して実施可能である。 したがって、 上記オリ ゴヌ ク レオチ ドを含む A s e f 阻害剤も、 本 発明の範囲に包含される。 かかる A s e f 阻害剤に含まれるオリ ゴ ヌク レオチ ドは、 1種であってよ く 、 また 2種以上が含まれていて もよい。 また、 A s e f 遺伝子の発現阻害は、 A s e f 遺伝子のァ ンチセンスオリ ゴヌ ク レオチ ドの使用によっても、 実現可能である c 上記 R N A干渉効果を示すオリ ゴヌ ク レオチ ドまたは上記アンチ センスオリ ゴヌ ク レオチ ドは、 A s e f 遺伝子の塩基配列を基に設 計したオリ ゴヌク レオチ ドから、 A s e f 遺伝子の発現系を用いて. その発現を特異的に阻害する ものを選択する こ と によ り 得る こ と ができ る。
A s e f の機能阻害は、 例えば A s e f と A P C との結合阻害、 または A s e f の G E F活性の阻害によ り実現可能である。 阻害の 対象と なる A s e f と A P C との結合は、好ま しく は A s e f と正
常な A P C との結合、 よ り好ま しく は A s e f と A P C変異体との 結合、 さ らに好ま しく は A s e f と A P J 切断変異体との結合、 さ らによ り 好ま しく は A s e f と アルマジロ リ ピー ト ドメ イ ンを含 む A P C切断変異体との結合である。 アルマジロ リ ピー ト ドメ イ ン を含む A P C切断変異体と しては、 A P Cのア ミ ノ酸配列の N末端 第 1 番目 から第 8 7 6番目 の連続するア ミ ノ酸残基からなるポリ ペプチ ド、 または A P Cのア ミ ノ酸配列の N末端第 1番目から第 1 3 0 9番目 の連続するア ミ ノ酸残基からなるポ リ ペプチ ドを例示 でき る。 これらポリ ペプチ ドは、 A P C切断変異体と して、 多く の 大腸癌および家族性腺腫性ポリ ポーシス ( F A P ) で同定されたも のである。
A s e f と A P C との結合阻害は、該結合に対する A s e f の ド ミナン トネガティブ変異体を使用 して実現できる。 例えば、 A P C と結合できるが、 G E F活性を示さない A s e f 変異体は、 A s e f と A P C との結合阻害剤と して使用可能である。 かかる A s e f 変異体は、 A s e f のア ミ ノ酸配列に基づいて設計し、 A P C との 結合活性を常法によ り試験する こ と によ り得られる。 具体的には、 A s e f の G E F領域を欠失させた変異体が例示でき る。 あるいは A s e f のアミ ノ酸配列中の A P C結合領域(第 7 3番目から第 1 2 6番目までのアミ ノ酸配列) からなるポリペプチ ドが好ま しく 用 いられる。 こ のポリ ぺプチ ドのア ミ ノ酸配列に基づいて設計したポ リ ペプチ ドから、 A s e f と A P C の結合を阻害するものを選択し て用いるこ と も可能である。 また、 A P C遺伝子の発現阻害によつ ても、 A s e f と A P C との結合阻害は達成できる。 A P C遺伝子 の発現阻害は、 A P C遺伝子の発現に対する R N A干渉効果を示す オリ ゴヌク レオチ ドを用いて実現可能である。 かかるオリ ゴヌ ク レ ォチ ドと して、 配列表の配列番号 2 に記載の塩基配列からなる c D
N Aが例示できる。 また、 当該 c D N Aの相補的 R N A (配列表の 配列番号 4 ) も同様に使用できる。 あるいは、 A P C遺伝子のアン チセンスオリ ゴヌク レオチ ドの使用によっても、 A P C遺伝子の発 現阻害は実現可能である。上記 R N A干渉効果を示すオリ ゴヌク レ ォチ ドまたは上記アンチセンスオリ ゴヌク レオチ ドは、 A P C遺伝 子の塩基配列を基に設計したオリ ゴヌ ク レオチ ドカゝら、 A P C遺伝 子の発現系を用いて、その発現を特異的に阻害するものを選択する こ とによ り得ることができる。
A s e f の G E F活性の阻害は、 例えば G E F活性の阻害剤を、 A s e f を用いて同定し使用することによ り実現できる。 また、 A s e f 遺伝子の発現を阻害する化合物や A s e f と A P C との結 合を阻害する化合物を、 A s e f 遺伝子を用いて、 または A s e f および A P Cを用いて同定して使用してもよい。化合物を同定する ためのアツセィ系は、 自体公知のスク リーニング系を利用して構築 可能である。
A s e f の機能および Zまたは発現を阻害する上記物質を有効 成分と して含む A s e f 阻害剤を用いるこ とによ り 、大腸癌の転移 を抑制することが可能である。 すなわち、 A s e f 阻害剤を含んで なる大腸癌転移抑制剤および上記 A s e f 阻害剤を用いるこ とを 特徴とする大腸癌転移抑制方法も、 本発明の範囲に包含される。 具 体的には、 例えば、 配列表の配列番号 1 から配列番号 4に記載のい ずれか 1 つの塩基配列からなるオリ ゴヌク レオチ ドを含んでなる 大腸癌転移抑制剤、並びにこれらオリ ゴヌ ク レオチ ドの少なく と も 1 つを用いるこ と を特徴とする大腸癌転移抑制方法を挙げる こ と ができる。
本発明に係る大腸癌転移抑制剤または A s e f 阻害剤を適用す るこ とによ り、大腸癌の造腫瘍性および転移を抑制するこ とができ
る。 すなわち、 上記大腸癌転移抑制剤または A s e f 阻害剤は、 大 腸癌および大腸癌転移の防止および/または治療に使用するこ と ができる。 この観点から、 上記大腸癌転移抑制剤または A s e f 阻 害剤を有効成分と してその有効量含んでなる大腸癌の防止剤およ び Zまたは治療剤も本発明の範囲に包含される。 また、 上記大腸癌 転移抑制剤または A s e f 阻害剤を使用するこ とを特徴とする、大 腸癌の防止方法および Zまたは治療方法を提供可能である。
このよ う に、 本発明においては、 上記大腸癌転移抑制剤または A s e f 阻害剤を含む医薬組成物を提供することが可能である。
本発明に係る医薬組成物の必要な用量範囲は、含有される成分の 有効性、 投与経路、 処方の性質、 対象の症状の性質、 および担当医 師の判断等に応じて適宜選択.される。 一般的には適当な用量は、 例 えば対象の体重 1 k g あたり約 0 . 0 1 μ g乃至 1 0 O m g程度、 好ま しく は約 0 . 1 μ g ~ l m g程度の範囲であるこ とが好ま しい t しかしなが ら、 当該分野においてよく知られた最適化のための一般 的な常套的実験を用いてこれらの用量の変更を行う こ とができる。 上記投与量は 1 日 1 回〜数回に分けて投与することができ、数日ま たは数週間に 1 回の割合で間欠的に投与してもよい。
A s e f 遺伝子または A P C遺伝子の発現を阻害し得るオリ ゴ ヌク レオチ ドを用いる ときは、 遺伝子治療を利用して、 当該オリ ゴ ヌク レオチ ドを対象中の細胞内で生成させてもよい。遺伝子治療は 公知の方法が利用でき、 例えば、 オリ ゴヌク レオチ ドを注射によ り 直接投与する非ウィルス性の トランスフエクショ ン法、 あるいはゥ ィルスベクターを利用 した ト ラ ンスフエク ショ ン法のいずれも適 用するこ とができ る。 非ウィルス性の ト ランスフエク ショ ン法にお いては、オリ ゴヌク レオチ ドを注射によ り直接投与する方法のほか- オリ ゴヌク レオチ ドをリ ポソーム等のリ ン脂質小胞に封入し、その
リ ポソームを投与する方法が推奨される。 リ ポソームと しては、 力 チオン性リ ポソームの使用がよ り好ま しい。 ウィルスベクターを使 用する ト ラ ンスフエ ク ショ ン法においてオリ ゴヌ ク レオチ ドを組 込んで ト ラ ンス フエ ク シ ョ ンに使用するベク ター と しては、好ま し く はレ ト ロ ウイルスベク ター、 アデノ ウイノレスベタ ター、 アデノ 関 連ゥイ ノレスベク ター、 ワク シニ アゥイ ノレス べク タ一等の D N Aウイ ルスベクター、 あるいは R N A ウィルスベク ターが挙げられる。 こ れら ウィ ルスベク ターを用いる こ と によ り 効率良い投与が可能で ある。 さ らに、 ウィルスベクターを用レヽる ト ランスフエクシヨ ン法 においても、 該ベク ターを リ ポソームに封入して、 その リ ボソーム を投与する方法が推奨される。
本発明に係る医薬は、 大腸癌転移抑制剤または A s e f 阻害剤の 有効成分のみを含む医薬と なしてもよいが、 通常は、 1種または 2 種以上の医薬用担体を用いて医薬組成物を製造する こ とが好ま し レヽ。
本発明に係る医薬製剤中に含まれる有効成分の量は、 広範囲から 適宜選択されるが、 通常約 0 . 0 0 0 0 1 〜 7 0重量%、 好ま しく は 0 . 0 0 0 1 〜 5重量%程度の範囲とするのが適当である。
医薬用担体と しては、 製剤の使用形態に応じて通常使用 される、 充填剤、 増量剤、 結合剤、 付湿剤、 崩壌剤、 表面活性剤、 滑沢剤等 の希釈剤や賦形剤等を例示でき、 これらは得られる製剤の投与形態 に応じて適宜選択使用される。 かかる担体と しては、 生理食塩水、 緩衝化生理食塩水、 デキス ト ロース 、 水、 グリ セロール、 エタノ ー ル、 およびそれらの混合物が挙げられる。 担体はこれらに限らず、 一般的な医薬の製造に用いられる物質であれば、所望に応じていず れを用いる こ と もできる。
本発明に係る医薬組成物は、 溶液製剤と して使用できる他に、 こ
れを凍結乾燥化し保存し得る状態にした後、 用時、 水や生埋的食塩 水等を含む緩衝液等で溶解して適当な濃度に調製した後に使用す る こ と も可能である。
本発明の医薬組成物を投与する と きには、該医薬組成物を単独で 使用 しても よ く 、 あるいは治療に必要な他の化合物または医薬と共 に使用 してもよい。
投与経路は、全身投与または局所投与のいずれも選択する こ とが できる。 この場合、 疾患、 症状等に応じた適当な投与経路を選択す る。 例えば、 非経口経路と して、 通常の静脈内投与、 動脈内投与の ほか、 皮下、 皮内、 筋肉内等への投与を挙げるこ とができる。 ある いは経口による投与も可能である。 さ らに、 経粘膜投与または経皮 投与も可能である。 あるいは、 腫瘍に注射等によ り直接投与する こ とができる。
投与形態は、 当業者によ く 知られている形態から適宜選択でき、 その代表的なもの と しては、 錠剤、 丸剤、 散剤、 粉末剤、 細粒剤、 顆粒剤、 カプセル剤等の固体投与形態や、 水溶液製剤、 エタ ノ ール 溶液製剤、 懸濁剤、 脂肪乳剤、 リ ボソーム製剤、 シク ロデキス ト リ ン等の包接体、シロ ップ、エリ キシル等の液剤投与形態が含まれる。 これらは更に投与経路に応じて経口剤、非経口剤(点滴剤、注射剤)、 経鼻剤、 吸入剤、 経膣剤、 坐剤、 舌下剤、 点眼剤、 点耳剤、 軟膏剤、 ク リ ーム剤、 経皮吸収剤、 経粘膜吸収剤等に分類され、 それぞれ通 常の方法に従い、 調合、 成形、 調製する こ とができる。
本発明に係る医薬組成物を遺伝子治療に使用する場合、一般的に は、 注射剤、 点滴剤、 あるいはリ ボソーム製剤と して調製する こ と が好ま しい。 また、 プロ タ ミ ン等の遺伝子導入効率を高める物質と 共に投与される よ う な形態に調製する こ と もできる。
散剤、丸剤、 力プセル剤および錠剤は、 ラタ トース、 グルコース、
シユーク ロースおよびマンニ トール等の賦形剤、澱粉およびアルギ ン酸ソーダ等の崩壌剤、 マグネシウムステアレー トおよびタルク等 の滑沢剤、 ポ リ ビュルアルコール、 ヒ ドロ キシプロ ピルセルロース およびゼラチン等の結合剤、 脂肪酸エステル等の界面活性剤、 ダリ セ リ ン等の可塑剤等を用いて製造できる。 锭剤ゃカプセルを製造す るには、 固体の製薬担体が用いられる。
懸濁剤は、 水、 シユーク ロース、 ソルビ トールおょぴフラタ トー ス等の糖類、ポ リ エチレンダリ コール( P E G )等のグリ コール類、 油類を使用 して製造でき る。
注射用の溶液は、 塩溶液、 グルコース溶液、 または塩水と ダルコ ース溶液の混合物からなる担体を用いて調製可能である。
リ ボソーム化は、 例えばリ ン脂質を有機溶媒 (ク ロ 口ホルム等) に溶解した溶液に、 当該物質を溶媒 (エタノール等) に溶解した溶 液を加えた後、溶媒を留去し、これにリ ン酸緩衝液を加え、振と う 、 超音波処理および遠心処理した後、 上清をろ過処理して回収するこ と によ り行い得る。
脂肪乳剤化は、 例えば当該物質、 油成分 (大豆油、 ゴマ油および ォリ ーブ油等の植物油並びに M C T等)、 乳化剤 ( リ ン脂質等) 等 を混合、 加熱して溶液と した後に、 必要量の水を加え、 乳化機 (ホ モジナイザー、 例えば高圧噴射型や超音波型等) を用いて、 乳化 · 均質化処理して行い得る。 また、 これを凍結乾燥化する こ と も可能 である。 なお、 脂肪乳剤化する と き、 乳化助剤を添加しても よ く 、 乳化助剤と しては、 例えばグリ セリ ンや糖類 (例えばブ ドウ糖、 ソ ルビ トールおょぴ果糖等) が例示される。
シク ロデキス ト リ ン包接化は、 例えば当該物質を溶媒 (エタ ノー ル等) に溶解した溶液に、 シク ロデキス ト リ ンを水等に加温溶解し た溶液を加えた後、 冷却して析出した沈殿をろ過し、 滅菌乾燥する
こ とによ り行い得る。 こ の際、 使用されるシク ロデキス ト リ ンは、 当該物質の大き さに応じて、空隙直径の異なるシク ロデキス ト リ ン ( a , β 、 γ型) を適宜選択すればよい。 実施例
以下、 本発明を実施例に基づき具体的に説明するが、 本発明は下 記の実施例に限定されない。
まず、 以下の実施例で用いた A s e f または A P C、 あるいはそ れらの変異体について説明する。 当該蛋白質および当該変異体は、 略称で記載する。
A s e f - f u 1 1 は、 野生型の全長 A s e f 力 らなる蛋白質で ある。 へマグノレチニン ( H a e m a g g 1 u t i n i n ; H A ) タ グを付加した融合蛋白質(H A _ t a g g e d w i 1 d — t y p e A s e f )、 またはグルタ チオン S _ ト ラ ンス フェ ラーゼ ( G l u t a t h i o n e S — t r a n s f e r a s e ; G S T ) と の融合蛋白質 ( G S T — A s e f — f u l 1 ) と して発現させた。
A s e f 一 A A P Cは、 A s e f の N末端側 A P C結合領域を欠 失させた変異体である。 こ の変異体は野生型 A s e f よ り 強い G E F活性を有する。
A s e f — A D Hは、 A s e f の D H領域 ( G E F領域) を欠失 させた変異体である。 該変異体は G E F活性を示さない。
A s e f 一 A B Rは、 A s e f のア ミ ノ酸配列中の A P C結合領 域 (第 7 3番目から第 1 2 6番目までのア ミ ノ酸配列) からなるポ リペプチ ドである。 マル トース結合たんぱく 質 (M B P ) との融合 蛋白質 (M B P — A s e f - A B R ) と して発現させた。
A P C — a r mは、 A P Cのアルマジロ リ ピー ト ドメ イ ン力、らな るポリペプチ ドであ り 、 M y c タグを付加した融合蛋白質 (M y c
- t a g g e d A P C _ a r m) 'と して発現させた。
A P C— 8 7 6 は、 A P Cのア ミ ノ酸配列の N末端第 1番目 から 第 8 7 6番目 までの連続するア ミ ノ酸残基からなるポ リ ペプチ ド であ り 、 アルマジロ リ ピー ト ドメイ ンを含んでいる。
A P C— 1 3 0 9 は、 A P Cのア ミ ノ酸配列の N末端第 1番目か ら第 1 3 0 9番目 までの連続するア ミ ノ酸残基からなるポ リ ぺプ チ ドであ り 、 アルマジロ リ ピー ト ドメイ ンを含んでいる。
A P C— 8 7 6 および A P C— 1 3 0 9 は、 大腸癌および家族性 腺腫性ポリ ポーシス ( F A P ) で同定された A P C切断変異体であ る。
これら蛋白質またはポリ ぺプチ ドのいずれかをコー ドする D N Aを含むアデノ ウィルスの作製は、 アデノ ー Χ ΤΜ クスプレツシ ョ ンシステム (ク ロ ンテック社) を用いて、 各蛋白質をコー ドする ボリ ヌ ク レオチ ドを、 アデノ ウィルスベク タ一 p A d e n o — Xに ク ローン化するこ とによ り行った。 以下、 A d A s e f 一 f u 1 1 と は、 A s e f - f u 1 1 をコー ドする D N Aを含むアデノ ウィル スを意味する。 上記その他の蛋白質またはポリ ペプチ ドをコー ドす る D N Aを含むアデノ ウィルスも同様に、各 D NAの呼称に A d を 付して表わす。
上記蛋白質またはポリ ペプチ ドのいずれかをコー ドする D N A を含むプラス ミ ドの作製は、 常法にしたがって行った。
細胞の培養おょぴ上記プラス ミ ドの ト ランスフエク ショ ンは、 以 下のよ う に行った。 M D C K細胞 (正常なィヌの腎から樹立された 上皮様細胞株) および W i D r 細胞はダルべッコ改変ィ一ダル培地 に 1 0 %牛胎児血清 ( F C S ) を加えて培養した。 S W 4 8 0細胞 はレイボビッツ L一 1 5培地に 1 0 % F C S を加えて培養した。 D L D _ 1細胞および H C T 1 5細胞は、 R P M I 1 6 4 0培地に 1
0 %' F C S を加えて培養した。 H C T 1 1 6細胞はマッコイ 5 A培 地に 1 0 % F C S を加えて培養した。 これら細胞に、 リ ボフヱク ト ァ ミ ン 2 0 0 0 (ライ フテク ノ ロ ジ一社) を用いて、 上記プラス ミ ドを ト ラ ンス フ エ ク シ ョ ン した。
蛋白質の発現および作製は、 次のよ う に行った。 G S T と の融合 蛋白質または M B P との融合蛋白質は、 大腸菌で合成し、 ダルタチ オンーセフ ァ ロ ース (G S H— S e p h a r o s e ; フ ァノレマシア 社) またはア ミ ロース レジン ( a m y l o s e r e s i n ; ニュ 一イ ングラン ドバイオラボズ社) への吸着によ り 単離した。
R N A干渉試験に用いるシ ョ ー トヘアピン R N A (以下、 s h R N Aと略称する) である、 s h R N A - A s e f および s h R N A 一 A P Cは、 それぞれ A s e f 遺伝子おょぴ A P C遺伝子の発現を 抑制するよ う に設計した。 s h R N A— A s e f および s h R NA - A P Cの塩基配列は配列表の配列番号 1 および配列番号 2 にそ れぞれ記載した。 また、 s h R N A - A s e f および s h R N A - A P Cにそれぞれ変異を加え、 A s e f 遺伝子および A P C遺伝子 の発現を抑制しない s h R N Aである、 m u t — s h R N A— A s e f および m u t — s h R N A— A P Cを作成し、配列表の配列番 号 5および配列番号 6 にそれぞれ記載した。 実施例 1
細胞間接着および細胞形態に対する A s e f の効果を検討する ため、 M D C K細胞に上記アデノ ウイルスを感染させた。 使用 した アデノ ウイルスは、 A d A s e f - f u 1 1、 A d A s e f 一 Δ Α P C、 A d A s e f — A D Hおよび A d A P C— a r mである。 対 照と して、 A d L a c Z を用いた。 M D C K細胞へのアデノ ウィル スの感染効率は、 免疫蛍光染色での検討によ り 、 9 0 %以上である
こ と を確認した。 また、 これらアデノ ウイルスはそれぞれ、 MD C K細胞に感染させる と予想通 り の大き さの蛋白質を生産する こ と を、 ィムノブロ ッテイ ングによ り確認した。
細胞形態は Λ感染させた細胞を 1 2 ゥエルの組織培養プレー ト の 各ゥエルに細胞数 3 . 0 X 1 ◦ 4 と なる よ う に播種し、 3 7 °Cで 3 時間イ ンキュベーショ ンした後、 アデノ ウイルスで感染させ 〔感染 多直度 : m u l t i p l i c i t y o f i n f e c t i o n (m. o . i ) = 2 0 0〕、 さ らに 3 6 時間培養後、 位相差顕微鏡 で観察した。 A d A s e f 一 Δ A P Cで感染させた細胞は基底上で 平面状にな り 、 膜のラ ッフ リ ングおよびラメ リ ポディ アを示した。 一方、 A d A s e f 一 Δ D Hで感染させた細胞は、 形態変化を示さ ず、 未感染の細胞と変わ り なかった。
細胞間接着は、 感染させた細胞を 0 . 0 2 %エチ レンジアミ ン四 酢酸 ( E D T A) を含むリ ン酸緩衝化生理食塩水 ( P B S ) 中でプ レー トから剥が し、 2 0回ピペッティ ングした後に、 細胞ク ラスタ 一 (粒子) の数を計数した。 細胞ク ラスターを総細胞数で割つた値 ( N p Z N c ) で、 細胞間接着を評価した。 ピペッティ ングによ り 分散させる と、 A d A s e f — A A P Cで感染させた細胞は効率よ く 分離したが、未感染細胞おょぴ A d A s e f 一 Δ D Hまたは A d L a c Z で感染させた細胞は凝集塊のままであった (第 1 図)。 こ れらの結果から、 A s e f が細胞間接着を低減させる機能を持つこ と、 またその G E F活性がこ の機能に必須である こ とが明 らかにな つた。
さ らに、 A d A s e f 一 f u 1 1 または A d A s e f - Δ A P C を過剰発現させる と、細胞間接触部位に局在する E—力 ドヘリ ン量 が減少し、 細胞質に局在する E—力 ドヘリ ン量が増加するこ と を、 抗 E—力 ドヘリ ン抗体を使用 した免疫組織化学分析によ り 明 らか
にした。 免疫組織化学分析は、 アデノ ウイルス感染 3 6時間後に、 M D C K細胞を P B S中 3 . 7 %のホルムアルデヒ ドで固定して行 つた。 固定した細胞は E—力 ドヘリ ンに対するラ ッ トモノ ク ローナ ル抗体 ( E C C D - 2 ; 力ルビオケム社) および ト リ メ チルローダ ミ ンイ ソチオシァネー ト結合フ ァ ロィ ジン (T R I T C— c o n j u g a t e d p h a l l o i d i n ; モ レキュ ラープロ ーブス 社)、 または E—力 ドヘリ ンに対する ラ ッ トモノ ク ローナル抗体お よび /3 一力テニンに対する ゥサギポリ ク ローナル抗体 (サンタクル スバイオテク ノ ロジー社) で室温にて 6 0分間二重染色した。 抗 E 一力 ドヘリ ン抗体および抗 —カテニン抗体によ り 得られた染色 パターンは、 フルォ レセイ ンィ ソチオシァネー ト標識抗ラ ッ ト I g G抗体おょぴ T R I T C標識抗ラ ビッ ト I g G抗体を用いて可視 ィ匕した。 細胞はカールツ ァイ ス L S M 5 1 0 レーザースキヤニン グマイ ク ロ ス コープを用いて撮影した。抗 ^ 一力テユン抗体で染色 する と、細胞間接触部位に局在する 一力テニン量が減少したこ と が明 らかになつたが、 この減少は E—力 ドヘリ ンほど顕著ではなか つた。 一方、 A d A s e f 一 A D Hまたは A d L a c Zで感染させ た細胞は、 E—力 ドヘリ ンまたは jS —力テニンの局在について変化 を示さなかった。 これらから、 A s e f の G E F活性がこれら分子 の局在の変化に重要である と考えられた。 MD C K細胞の溶解物の ィ ムノブロ ッ ト解析によれば、 E—力 ドヘ リ ンまたは j3 —力テニン の総量は A d A s e f - f u 1 1 または A d A s e f - Δ A P C での感染で著しい変化はなかった。 これらから、 A s e f 遺伝子の 発現の結果生じる細胞間接着の低減は、細胞間接触部位での E—力 ドヘリ ンおよび ]3 —力テニンの減少によるこ とが判明 した。 実施例 2
細胞の運動性に対する A s e f の効果を、 上記プラス ミ ドを用い て A s e f 遺伝子または A P C遺伝子、 あるいはそれらの変異体遺 伝子を発現させた M D C K細胞を用いて検討した。 細胞の運動性は ト ラ ンス ウェルマィ グレーショ ンチャ ンバ一を用いた細胞遊走試 験によ り行った。 該チャ ンバ一は、 M D C K細胞には直径 1 2 mm でポアサイ ズ 1 2 / mの ものを用いた (コス ター社)。 ト ラ ンス フ ェ ク シ ヨ ン 1 8 時間後に、 細胞数 3 . 0 X 1 0 4の M D C K細胞を チャンバ一の上室に加え、 1 8 時間で上室の下側へ遊走させた。 細 胞遊走は、 ポリ カーボネー トフ ィ ルターの低層側に遊走した細胞を 計数して測定した。
A s e f — f u 1 1 をコー ドする D N Aを含むプラス ミ ドを ト ラ ンス フエ ク シ ヨ ン した細胞は、 親細胞 ( M D C K ) またはべク タ 一を ト ラ ンスフエク シヨ ンした細胞 (M o c k ) と比較して運動性 が促進した (第 2図)。 A s e f - f u 1 1 遺伝子と共に、 A P C - a r m遺伝子、 A P C— 8 7 6遺伝子および A P C— 1 3 0 9遺 伝子のいずれか 1つを共発現させた細胞は、 A s e f - f u 1 1 遺 伝子のみを ト ラ ンスフエ ク ショ ンしたものよ り も運動性が促進し た。 A s e f の細胞運動性促進能に対する A P Cの効果は、 A P C - a r m、 A P C _ 8 7 6 および A P C— 1 3 0 9 の方が A P C— f u 1 1 よ り強かった。 一方、 A P C _ a r mのみでは遊走を刺激 しなかった。 また、 A s e f — A A P C遺伝子を ト ラ ンス フエ ク シ ヨ ンした細胞は、 A s e f - f u 1 1 遺伝子および A P C— a r m 遺伝子をコ ト ラ ンスフエク ショ ンしたものよ り も さ らに亢進した 遊走反応を示した。 これらから、 A s e f は MD C K細胞の遊走を 促進する能力を保有する こ とが明らかになった。 A s e f のこ のよ う な能力は、 A P C、 特にアルマジロ リ ピー ト ドメ イ ンを含む A P C切断変異体 (A s e f - A r m) によ り さ らに促進される こ とが
判明 した。 さ らに、 A s e f 一 Δ D Hが M D C K細胞の遊走を促進 しなかったこ とから、 A s e f の G E F活性がこのよ う な遊走刺激 活性に必要である と考えられた。
一方、 A s e f 一 A B R遺伝子を A P C— 1 3 0 9遺伝子と共に 発現させたとき、 細胞遊走の促進はほぼ完全に阻害された。 A s e f — A D Hも A P C— 1 3 0 9 が介する細胞遊走の促進を阻害し た。 これらから、 大腸癌または F A Pで同定された A P C変異体で ある A P C— 8 7 9および A P C— 1 3 0 9 は、 A s e f と相互作 用 してその活性を促進し、 それによ り 細胞遊走を促進する と考えら れた。 しかし、 全長 A P C遺伝子を MD C K細胞に ト ランスフエク シヨ ンしても、 A s e f が誘導する遊走の促進はみられなかった (第 2 図)。 このこ とから、 大腸癌細胞において A P Cが変異によ る切断によって活性化されないと、 A P Cは A s e f の有効な活性 剤にはならないと考えられた。
次に、 A s e f および A P C切断変異体を含むこ とが知られてい る S W 4 8 0細胞の運動性について検討した。 A s e f 一 A B Rを コー ドする D N Aを含むプラス ミ ドを S W 4 8 0細胞に ト ランス フエク シヨ ンしたと ころ、 当該細胞の遊走は、 親株または M o c k よ り約 5 0 %低減した (第 2 図)。 同様に、 A s e f — A D Hプラ ス ミ ドを ト ランスフエク 'シヨ ンした S W 4 8 0細胞の遊走は約 4 0 %低減した。 このこ とから、 細胞で発現された A s e f — A B R または A s e f — A D Hが、 A s e f と A P C切断変異体の結合に 対して ドミナン トネガティ ブに作用 し、 A s e f — A B Rまたは A s e f 一 Δ D Hによる細胞遊走を阻害するこ とが判明 した。 実施例 3
大腸癌細胞において、 A P C切断変異体と A s e f との結合につ
いて検討した。 まず、 細胞数 5 . 0 X 1 0 6の S W 4 8 0細胞を、 1 % ト リ トン X— 1 0 0 を含むバッファー A 〔 5 0 mM T r i s 一 H C 1 ( p H 7. 5 )、 1 5 0 mM N a C l 、 5 m M E D T A、 2 mM パナジン酸ナ ト リ ウム (N a 3 V〇 4)、 1 0 mM フ ッ化ナ ト リ ウム〕 5 0 0 μ 1 中で溶解した。 溶解物を の抗 A s e f 抗体で 4 °Cにて 1 時間イ ンキュベーシ ョ ン した後、 4 °Cで 2 時間かけて免疫複合体をプロティ ン G _セファ ロース 6 Bに吸着 させた。 0. 1 % ト リ ト ン X— 1 0 0 を含むバッ フ ァー Aで何度も 洗浄した後、 試料を S D S — P A G Eによ り分離し、 ポリ ビニリデ ン ジフルオリ ド膜フィルター ( I mm o b i l o n P ; ミ リ ポ ァ社) に転写した。 ブロ ッ トは、 アルカ リ ホス フ ァ ターゼを結合さ せたマ ウス抗ゥサギ I g G抗体 (プロメガ社) を二次抗体と して使 用して、 ィムノブロ ッテイ ング分析に付した。 用いたゥサギ抗 A s e f ポリ ク ローナル抗体は、従前の方法で作製した(非特許文献 1 ), その結果、 A s e f は A P C切断変異体と共免疫沈降した (第 3 図 a )。 また、 A s e f と A P C変異体との共沈は、 抗体をその抗 原の過剰量と と もに 4 °Cで 2時間プレイ ンキュベーショ ンするこ とによ り 阻害された。 これら力 ら、 A s e f は S W 4 8 0細胞中で A P C変異体と協働するこ とが判明した。
次に、 インビ トロにおいて、 G S T _ A s e f — f u 1 1 と A P C一 a r mとを共免疫沈降させ、 A s e f 一 A B R添加の影響を検 討した。 まず、 A P C— A r mをイ ンビ ト ロ翻訳によ り作製し ( I V T— A P C— A r m)、 セフ ァロース に結合させた G S T— A s e f 一 f u 1 1 と M B P — A s e f 一 A B Rの存在下でイ ンキュ ベーシヨ ンした。 MB P— A s e f 一 A B Rに対する A P C— A r m量の比は、 第 3図 b に示したよ う に変化させた。 G S T— A s e f _ f u 1 1 一 S e p h a r o s e に結合した A P C— a r mは、
S D S 一 P A G Eに次いでォー ト ラ ジオグラ フィーを行って可視 ィ匕した (第 3 図 b の上パネル)。 また、 反応混合物に添加した M B P — A s e f 一 A B Rはゲルをクマシ一ブルー染色する こ と によ り 可視化した (第 3 図 b の下パネル)。 その結果、 A s e f 一 A B Rを加える とその量の増加に伴って、 G S T— A s e f 一 f u 1 1 と A P C - a r mとの共免疫沈降物が用量依存的に減少した。 すな わち、 イ ンビ ト ロにおいて、 A s e f 一 A B Rが A s e f と A P C 変異体との結合を阻害するこ とが明 らかになった。
このよ う に、 A s e f と A P C変異体との結合を ドミナン トネガ ティ ブな形で阻害する A s e f 一 A B Rを用いて、 S W 4 8 0細胞 の遊走を阻害するこ とができた。 実施例 4
各種大腸癌細胞株に、 A s e f - f u 1 l、A s e f 一 A A P C、 または A s e f — A D Hをコー ドする D N Aを含むアデノ ウィル スを感染させ、 実施例 2 と同様に細胞遊走試験を行った。 用いた大 腸癌細胞株は、 S W 4 8 0、 D L D— 1、 H C T 1 5、 W i D r お よび H C T 1 1 6 である。 S W 4 8 0細胞、 D L D— 1細胞、 H C T 1 5細胞、 および W i D r 細胞は、 A P C切断変異体を含む。 H C T 1 1 6細胞は、 正常 A P Cを含むが、 jS —力テニンに変異が認 められる。
結果を第 4 図に示す。 S W 4 8 0細胞は、 A d A s e f 一 f u 1 1 または A d A s e f 一 Δ Α Ρ Οを感染させる と、 その運動性が促 進した。 また、 S W 4 8 0細胞、 D L D— 1 細胞、 H C T 1 5細胞 および W i D r 細胞は、 A d A s e f 一 Δ ϋ Ηで感染させる と、 そ の運動性が部分的に阻害された。 一方、 H C Τ 1 1 6細胞は、 A d A s e f 一 A D Hによ り 阻害されなかった。 このこ と力 ら、 H C T
1 1 6 中の全長 A P Cは A s e f を活性化できないと考えられた。 これらの結果から、 A s e f は A P C切断変異体を含む大腸癌細胞 で活性化されるが、正常 A P Cを含む細胞では活性化されないまた は活性化されにく いこ とが判明 した。 また、 当該活性化は、 A s e f — Δ D Hによ り 阻害されるこ とが明 らかになった。
実施例 5
大腸癌細胞の遊走における A s e f と A P C変異体と の相互作 用を、 R N A干渉試験によ り検討した。 当該試験は、 p S H A G _ 1 ベク ターシステムを用いて行った (非特許文献 1 3 )。 用いた大 腸癌細胞株は、 S W 4 8 0細胞、 W i D r 細胞、 L S 1 8 0細胞お よび H C T 1 1 6細胞である。 S W 4 8 0細胞および W i D r 細胞 は、 A P C切断変異体を含む。 L S 1 8 0細胞および H C T 1 1 6 細胞は、 正常 A P Cを含むが、 3 —力テニンに変異が認め られる。
s h R N A - A s e f または s h R N A— A P Cのいずれかを 含む発現ベク ターを ト ラ ンス フ エ ク ショ ンした各種大腸癌細胞に ついて、 実施例 2 と同様に細胞遊走試験を行った。 その結果、 s h R N A— A s e f または s h R N A— A P Cのいずれかを ト ラ ン ス フエタ シ ョ ンした S W 4 8 0細胞および W i D r 細胞は、 m u t 一 s h R N A - A s e f または m u t _ s h R N A— A P C を ト ラ ンスフエク シヨ ンした細胞に比べて、運動性が低減した(第 5 図) ( —方、 L S 1 8 0細胞および H C T 1 1 6細胞では、 このよ う な現 象は認められなかった。
次に、 s h R N A— A s e f 、 s h R N A— A P C、 m u t _ s h R N A— A s e f および m u t — s h R N A— A P Cのいずれ か 1 つのオリ ゴヌ ク レオチ ドを含む発現べク ターを ト ラ ンスフエ ク ショ ンした細胞について、 ィ ムノ ブ口 ッティ ング分析を実施例 3
と同様に実施した。 このとき、 対照と して、 α —チュープリ ンの変 ィ匕を測定した。 その結果、 s h R N A - A s e f および s h R N A 一 A P Cは、それぞれ A s e f 遺伝子および A P C遺伝子の発現を ほぼ完全に阻害した。
これらから、 A s e f 遺伝子または A P C遺伝子の発現阻害によ り、 A P C切断変異を有する大腸癌細胞の運動性が低減されること が判明した。 すなわち、 大腸癌細胞の遊走に、 A P C変異体と A s e f との相互作用が重要な役割を果たすと考えられた。 実施例 6
ヒ ト S W 4 8 0大腸癌細胞に、 A s e f ド ミ ナン トネガティブ変 異体である A s e f — A B Rを発現させて作成した細胞を、 それぞ れ S C I Dマウスに移植し、 造腫瘍性や増殖の変化を観察した。 A s e f _ A B Rプラス ミ ドは、 S W 4 8 0大腸癌細胞に、 リ ポフエ クショ ンによ り導入した。 得られた 3つのクローンをそれぞれ、 G 4 1 8 を l m g Zm l (終濃度) 含有する L一 1 5培地を使用して インビ トロで培養し、 一群当たり 2〜 4匹の S C I Dマウス ( 8週 齢) の側腹部皮下に、 細胞数 1 X 1 0 7 Z 0 . 1 m 1 Zマ ウス移植 した。 腫瘍移植後 2 0 日 目に腫瘍塊を摘出して重量を測定した。 ま た、 各ク ローンを移植したマ ウスの腫瘍塊の重量 (T ) を対照群の 値 ( C ) で割り、 阻害比 ( I Rと略称する) と して百分率で表した [ I R ( % ) = T Z C X 1 0 0〕。 移植した細胞で A s e f — A B Rが発現されていることは、 常法によ り確認した。
A s e f 一 A B Rのみを安定的に発現する 3 ク ローンのう ち、 2 ク ローンで造腫瘍性の低下や増殖の遅延が見られた (表 1 )。 これ らから、 A s e f が造腫瘍性や腫瘍細胞増殖に関与する と考えられ た。
表 1
重量土 SD (g) IR(%) 腫瘍生着/移植数
SW480 0.496 ±0.080 0 4/4
ABR-2 0.609 ±0.069 -22.7 3/3
ABR-8 0.000 ±0.000 100 0/3
ABR-17 0.203 ±0.056 59.1 4/4
実施例 7
ヒ ト H T 2 9大腸癌細胞株で作製した A s e f — A B Rク ロー ン (実施例 6参照) を S C I Dマウスに移植し、 造腫瘍性や増殖の 変化を観察した。 A s e f — A B Rプラス ミ ド 1 5 μ g は、 細胞数 5 X I 0 6の H T 2 9細胞に、 リ ポフエクシヨ ンによ り 導入した。 得られた 5 つのク ローンをそれぞれ、 G 4 1 8 を l m g /m l (終 濃度) 含有する D M E M培地を使用 してイ ンビ ト ロで培養し、 一群 あた り 4 匹の S C I Dマウス ( 8週齢) の脾臓内に、 細胞数 1 X 1 0 6 / 0 . 0 5 m l /マ ウス移植した。 腫瘍細胞移植後 1 8 日 目 に 尾静脈内にイ ンク を注入後、 エーテル麻酔下で放血屠殺し、 脾臓お よび肝臓を摘出して重量を測定した。
H T 2 9 細胞で作製した A s e f — A B R ドミ ナン トネガティ ブ変異体安定発現株 5 ク ローン中 4 ク ローンにおいて、 脾臓や肝臓 での腫瘍形成が認め られなかった (表 2 )。 実施例 6 で S W 4 8 0 大腸癌細胞を用いて作製した 3 ク ローンについても同様な現象が 得られた。 すなわち、 A s e f は造腫瘍性や腫瘍細胞増殖に関与す る こ とが判明 した。 また A s e f _ A B R ドミナン トネガティ ブ変 異体安定発現株で、 肝臓の腫瘍形成が認め られなかったこ とから、 A s e f 一 A B R ドミナン トネガティブ変異体が、腫瘍の転移を抑 制するこ とが判明 した。
表 2
正常 1.340 ±0.176 30.8 + 7.1
親株 (ΗΤ29) 2.236 ±0.153 124.5 20.4
Asef-ABR-A7 1.584 ±0.093 38.0 士 3.9
Asef-ABR-B5 2.627 ±0.392 129.3 ± 13.5
Asef-ABR-C3 1.579 ±0.124 44.3 11.0
Asef-ABR-C12 1.526 ±0.070 37.8 5.1
Asef-ABR-Dl l 1.359 ±0.173 37.3 土 4.6 産業上の利用可能性
本発明においては、 A s e f が細胞の運動性を促進し、 さ らに細 胞間接着を低減するこ と 、 A s e f の この機能が癌抑制遺伝子 A P Cの遺伝子産物によ り活性化されることを見出した。また、大腸癌、 特に A P C変異が認められる大腸癌において、 A s e f が大腸癌細 胞の運動性を高め、 その造腫瘍性および転移に関与するこ とを見出 した。 これらに基づいて本発明において提供する、 A s e f の機能 阻害および Zまたは A s e f 遺伝子の発現阻害を特徴とする大腸 癌転移抑制剤並びに大腸癌転移抑制方法は、大腸癌およぴ大腸癌の 転移の防止および Zまたは治療に多大な効果を有するものである。 配列表フリ一テキス ト
配列番号 1 : A s e f 遺伝子の発現を抑制するために、 ヒ ト A s e f の塩基配列に基づいて設計したオリ ゴヌ ク レオチ ド。
配列番号 2 : A P C遺伝子の発現を抑制するために、 ヒ ト A P C の塩基配列に基づいて設計したオリ ゴヌク レオチ ド。
配列番号 3 : A s e f 遺伝子の発現を抑制するために、 ヒ ト A s e f の塩基配列に基づいて設計したオリ ゴヌク レオチ ド。
配列番号 4 : A P C遺伝子の発現を抑制するために、 ヒ ト A P C の塩基配列に基づいて設計したオリ ゴヌク レオチ ド。
配列番号 5 :配列番号 1 に記載の塩基配列に基づいて設計したォ リ ゴヌ ク レオチ ド。
配列番号 6 :配列番号 2 に記載の塩基配列に基づいて設計したォ リ ゴヌ ク レオチ ド。