JP2001057888A - 大腸癌抑制遺伝子関連蛋白質 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】大腸癌抑制遺伝子ＡＰＣに関与する新規物質を
見いだし、ＡＰＣの制御を可能にし、大腸癌を制御する
こと。 【解決手段】ＡＰＣ遺伝子産物、特に該遺伝子産物のア
ルマジロリピート（Ａｒｍ）部位との結合能をもつ新規
蛋白質Ｍ１、すなわち配列表の配列番号１に示すアミノ
酸配列からなるポリペプチド、及び該ポリペプチドの一
部を有するポリペプチド、該ポリペプチドをコードする
ポリヌクレオチドまたはその相補鎖、該ポリヌクレオチ
ドまたはその相補鎖を含むベクター、該ベクターを有す
る形質転換体、当該ポリペプチドに対する抗体、当該ポ
リペプチドの製造法、上記のものを利用したＭ１の機能
および発現の阻害剤・拮抗剤・賦活剤のスクリーニング
方法、該方法で同定された化合物を提供し、更にこれら
を利用し、大腸腫瘍に用いる医薬組成物・診断手段を提
供する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、大腸癌に関与する癌抑
制遺伝子（Ａｄｅｎｏｍａｔｏｕｓ Ｐｏｌｙｐｏｓｉ
ｓ Ｃｏｌｉ：ＡＰＣ）がコードするポリペプチドに対
する結合能、特にＡＰＣ遺伝子産物のアルマジロリピー
ト部位に対する結合能を有する新規な蛋白質（以下、Ｍ
１と呼称する）およびポリペプチドに関するものであ
る。さらに詳しくは、新規蛋白質Ｍ１のアミノ酸配列の
全部または一部を有するポリペプチド、該ポリペプチド
をコードするポリヌクレオチド、該ポリヌクレオチドを
含有する組換えベクター、該組換えベクターで形質転換
された形質転換体、該形質転換体を使ったペプチドまた
はポリペプチドの製造方法、該ペプチドまたはポリペプ
チドに対する抗体、これらを利用した化合物のスクリー
ニング方法、該スクリーニングされた化合物、該ポリペ
プチド若しくは該ポリヌクレオチドに作用する活性阻害
化合物または活性賦活化合物、これらに関係する医薬組
成物、およびこれらに関係する疾病診断手段に関係す
る。

【０００２】

【従来の技術】癌抑制遺伝子ＡＰＣは、家族性腺腫性ポ
リポーシス（ｆａｍｉｌｉａｌ ａｄｅｎｏｍａｔｏｕ
ｓ ｐｏｌｙｐｏｓｉｓ：ＦＡＰ）の原因遺伝子として
単離され、散発性の大腸癌の７０〜８０％では、該ＡＰ
Ｃの異常が報告されている。ＡＰＣ遺伝子産物は、２，
８４３個のアミノ酸からなる３００ｋＤａの巨大な蛋白
質である（Ｃｅｌｌ，８７：１５９−１７０，１９９
６）。ＡＰＣ遺伝子産物は、種々の蛋白質との相互作用
が知られており、その１つにβ−カテニンがある。β−
カテニンは、カドヘリンの細胞質側ドメインに結合して
細胞接着に役割を果たすと同時に、発生過程や腫瘍形成
において重要な役割を担うＷｎｔ／Ｗｉｎｇｌｅｓｓシ
グナル伝達経路の重要な構成要素の１つとしても機能し
ている（Ｃｅｌｌ，８６：３９１−３９９，１９９６）
（Ｎａｔｕｒｅ，３８２：６３８−６４２，１９９
６）。β−カテニンは、一種の癌遺伝子産物で、ＡＰＣ
遺伝子産物は、β−カテニンの機能を抑制することによ
り癌抑制機能を発揮していると考えられている（Ｓｃｉ
ｅｎｃｅ，２７５：１７８４−１７８７，１９９７）
（Ｓｃｉｅｎｃｅ，２７５：１７８７−１７９０，１９
９７）（Ｓｃｉｅｎｃｅ，２７５：１７９０−１７９
２，１９９７）。その他、ＡＰＣ遺伝子産物は、ＧＳＫ
−３ｂ、Ａｘｉｎもしくはコンダクチン／Ａｘｉｌとの
相互作用が知られている（Ｓｃｉｅｎｃｅ，２８０：５
９６−５９９，１９９８）（Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｂｉｏｌ
ｏｇｙ，８：５７３−５８１，１９９８）（Ｊ．Ｂｉｏ
ｌ．Ｃｈｅｍ．，２７３：１０８２３−１０８２６，１
９９８）（Ｇｅｎｅｓ Ｃｅｌｌｓ，６：３９５−４０
３，１９９８）。また、ＡＰＣ遺伝子産物は、ＥＢ１と
ｈＤＬＧとの、そのＣ末端を介した相互作用も報告され
ている（Ｓｃｉｅｎｃｅ，２７２：１０２０−１０２
３，１９９６）。さらに、ＡＰＣ遺伝子産物には、蛋白
質間の相互作用の役割を担うアルマジロリピートドメイ
ンが存在することも知られている。

【０００３】

【発明が解決しようとする課題】本発明が解決しようと
する課題は、上記のように多様な物質との相互作用を担
う大腸癌の癌抑制遺伝子であるＡＰＣ遺伝子に関与する
新規物質を見いだすことであり、該新規物質を癌の制御
を目的とする手段として使用することである。より具体
的には、本発明の課題はＡＰＣ遺伝子産物との結合能、
特にＡＰＣ遺伝子産物由来のアルマジロリピートドメイ
ンとの結合能、をもつ新規な物質（Ｍ１）を提供するこ
とであり、それに伴い有用性ある新規物質（Ｍ１）由来
のポリペプチドを提供することである。また本発明の別
の課題は、Ｍ１由来のポリペプチドをコードするポリヌ
クレオチドを提供し、遺伝子工学手法による、Ｍ１由来
のポリペプチドの製造法を提供することである。さらに
本発明の別の課題は、Ｍ１由来のポリペプチドに対する
抗体を提供することである。その他の本発明の課題は、
上記のものを利用してＭ１の有する作用の阻害剤・拮抗
剤・賦活剤のスクリーニングをおこなうことであり、ス
クリーニングされた化合物を提供することであり、また
これらを利用した大腸腫瘍に用いる医薬組成物・診断手
段を提供することである。

【０００４】

【解決するための手段】課題解決のため、本発明者は、
ヒト胎児脳ｃＤＮＡライブラリーからＡＰＣ遺伝子産物
のアルマジロリピートドメイン（以下、ａｒｍと呼称す
ることもある）に結合する新規蛋白質Ｍ１のｃＤＮＡを
２ハイブリッドスクリーニング法を用いて同定し、その
塩基配列および該新規蛋白質Ｍ１のｃＤＮＡがコードす
るアミノ酸配列を決定し、本発明を完成した。

【０００５】すなわち、本発明は下記の群より選ばれる
ポリペプチド；配列表の配列番号１に記載のアミノ酸
配列で示されるポリペプチド、前記のポリペプチド
のアミノ酸配列を含有するポリペプチド、前記のポ
リペプチドと少なくとも約７０％のアミノ酸配列上の相
同性を有しかつ大腸癌の癌抑制遺伝子（Ａｄｅｎｏｍａ
ｔｏｕｓ Ｐｏｌｙｐｏｓｉｓ Ｃｏｌｉ：ＡＰＣ）の
遺伝子産物のアルマジロリピート部位をコードするポリ
ペプチドに対する結合能を有するポリペプチド、および
前記からのポリペプチドのアミノ酸配列において
１ないし数個のアミノ酸の欠失、置換、付加などの変異
あるいは誘発変異を有し、かつＡＰＣ遺伝子産物のアル
マジロリピート部位に対する結合能を有するポリペプチ
ド；配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列の少なく
とも５個のアミノ酸配列を有し、かつＡＰＣ遺伝子産物
のアルマジロリピート部位に対する結合能を有するポリ
ペプチド；本発明のポリペプチドをコードするポリヌク
レオチドまたはその相補鎖；本発明のポリヌクレオチド
またはその相補鎖とストリンジェントな条件下でハイブ
リダイゼーションするポリヌクレオチド；本発明のポリ
ヌクレオチドまたはその相補鎖の塩基配列のうち少なく
とも１５個の連続した塩基配列で示されるポリヌクレオ
チドであって、該ポリヌクレオチドの転写によって発現
されるポリペプチドがＡＰＣ遺伝子産物のアルマジロリ
ピート部位に対する結合能を有する、ポリヌクレオチ
ド；本発明のポリヌクレオチドを含有する組換えベクタ
ー；本発明の組換えベクターで形質転換された形質転換
体；本発明の形質転換体を培養する工程を含む、本発明
のポリペプチドの製造方法；本発明のポリペプチドのＡ
ＰＣ遺伝子産物のアルマジロリピート部位に対する結合
性を阻害もしくは増強する化合物のスクリーニング方法
であって、本発明のポリペプチド、本発明の抗体のうち
少なくともいずれか１つを用いることを特徴とするスク
リーニング方法；本発明のポリヌクレオチドと相互作用
して該ポリヌクレオチドの発現を阻害もしくは増強する
化合物のスクリーニング方法であって、本発明のポリヌ
クレオチド、本発明のベクター、本発明の形質転換体、
本発明の抗体のうち少なくともいずれか１つを用いるこ
とを特徴とするスクリーニング方法；本発明のポリペプ
チドのＧＥＦ（グアニンヌクレオチド交換因子：Ｇｕａ
ｎｉｎｅ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｅｘｃｈａｎｇｅ
Ｆａｃｔｏｒ）活性を阻害もしくは増強する化合物のス
クリーニング方法であって、本発明のポリペプチド、本
発明の抗体のうち少なくともいずれか１つを用いること
を特徴とするスクリーニング方法；本発明のスクリーニ
ング方法でスクリーニングされる化合物；本発明のポリ
ペプチドのＡＰＣ遺伝子産物のアルマジロリピート部位
に対する結合性を阻害もしくは増強する化合物；本発明
のポリヌクレオチドと相互作用して該ポリヌクレオチド
の発現を阻害もしくは増強する化合物；本発明のポリペ
プチドのＧＥＦ活性を阻害もしくは増強する化合物；本
発明のポリペプチド、本発明のポリヌクレオチド、本発
明のベクター、本発明の形質転換体、本発明の抗体、ま
たは本発明の化合物のうち少なくともいずれか１つを含
有することを特徴とする大腸腫瘍の治療に用いる医薬組
成物；本発明のポリペプチドの発現または活性に関連し
た疾病の診断手段であって、試料中の（ａ）該ポリペプ
チドをコードしているポリヌクレオチド、および／また
は（ｂ）該ポリペプチド、をマーカーとして分析するこ
とを含む診断手段、を提供する。

【０００６】

【発明の実施の形態】（新規Ｍ１）本発明において提供
される新規蛋白質Ｍ１をコードするポリヌクレオチド
は、ヒトの胎児脳ｃＤＮＡライブラリーから、ＡＰＣ遺
伝子産物のアルマジロリピートドメインを使い、２ハイ
ブリッドスクリーニング法により、新規なアミノ酸配列
を有する物質として、そのｃＤＮＡが取得されたもので
ある。本発明の新規蛋白質Ｍ１のｃＤＮＡは、６１９個
のアミノ酸からなる蛋白質をコードし、既知のＤｂｌフ
ァミリー（低分子量Ｇ蛋白質Ｒｈｏファミリーに作用す
るＧＤＰ解離促進蛋白質の１つである）（Ｃｕｒｒｅｎ
ｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ ＣｅｌｌＢｉｏｌｏｇｙ，
８：２１６−２２２，１９９６）に類似のドメイン構造
を有していた。遺伝子データベース（Ｔｈｅ Ｎａｔｉ
ｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏ
ｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）を検索したとこ
ろ、本発明の新規蛋白質Ｍ１のｃＤＮＡは、Ｄｂｌファ
ミリーの１つである既知物質ＫＩＡＡ０４２４と約７３
％の相同性を有することが判明した。ＫＩＡＡ０４２４
は、本発明の新規蛋白質Ｍ１とは、該Ｍ１のＮ末端領域
を欠如する点に最も大きな差異を有する。両者は、Ｄｂ
ｌ相同（ＤＨ）ドメイン、プレックストリン（Ｐｒｅｃ
ｋｓｔｒｉｎ）相同（ＰＨ）ドメイン、Ｓｒｃ相同３
（ＳＨ３）ドメインを担持する点において同一である。
また、マウスを用いた新規蛋白質Ｍ１の組織分布研究に
おいて、該Ｍ１のｍＲＮＡが脳に高レベルで発現してお
り、他の臓器でも低レベルで発現していることを確認し
た。

【０００７】新規蛋白質Ｍ１のペプチド断片（配列表、
配列番号１のアミノ酸７３〜１２６）を使用して作製し
た抗体は、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（Ｇ
ＳＴ）との融合蛋白として得た新規蛋白質Ｍ１に対し強
い反応性を示した。また、該作製した抗体を用い、脳に
存在する新規物質Ｍ１が、約８５ｋＤａの蛋白質である
ことを抗原抗体反応を利用した測定系で確認した。

【０００８】また、新規蛋白質Ｍ１とＡＰＣ遺伝子産物
との直接的な相互作用を確認するための実験において、
グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）との
融合蛋白として得たＡＰＣ遺伝子産物のアルマジロリピ
ートドメイン（ＡＰＣ−ａｒｍ）は、ＧＳＴ融合Ｍ１断
片（ＧＳＴ−Ｍ１−Ｍ）と相互作用したが、ＧＳＴ単独
とは反応せず、同様に、Ｍ１−Ｍは、ＧＳＴ−ＡＰＣ−
ａｒｍとは反応したが、ＧＳＴ融合β−カテニンのアル
マジロリピートドメイン又はＧＳＴ単独とは反応しない
ことを確認した。すなわち、新規蛋白質Ｍ１はＡＰＣ遺
伝子産物と、該ＡＰＣ遺伝子産物のアルマジロリピート
ドメインを介して結合していると推定される。また、ラ
ット胎児脳の溶解物（ｌｙｓａｔｅ）を抗ＡＰＣ抗体で
免疫沈降し、ついで抗Ｍ１抗体でイムノブロットするこ
とにより、ＡＰＣ遺伝子産物と本発明のＭ１が共沈殿す
ることが判明した。この反応において、抗Ｍ１抗体を、
抗原性を保持するＭ１断片で前処理すると、Ｍ１とＡＰ
Ｃ遺伝子産物の共沈殿が阻害された。すなわち、Ｍ１と
ＡＰＣ遺伝子産物とは生体内で結合していると考えられ
る。また、Ｍ１とＡＰＣ遺伝子産物の結合部位を２ハイ
ブリッド法を用いて確認したところ、少なくともＭ１の
アミノ酸７３〜１２６で示される領域に結合部位が存在
することが推定された。このことは、Ｍ１のＳＨ３ドメ
インの上流域に、ＡＰＣ遺伝子産物のアルマジロリピー
トドメインとの結合部位が存在することを意味する。Ｋ
ＩＡＡ０４２４は、このような領域をもたないので、Ａ
ＰＣ遺伝子産物との反応性がない。

【０００９】さらに、新規蛋白質Ｍ１はその作用とし
て、Ｒｈｏファミリーの１つであるＲａｃに特異的なＧ
ＥＦ活性をもつことを確認した。つまり、新規蛋白質Ｍ
１は、Ｒａｃに結合しＧＤＰ／ＧＴＰ交換反応を促進し
てＲａｃを活性化し、Ｒａｃの関与する細胞情報伝達の
下流に位置するＮＦκＢ、ｃ−ｊｕｎ、ＳＲＥ等に作用
する。また、Ｒａｃの生理機能である、細胞のラメリポ
ディア（葉状仮足）や細胞膜のラッフリングを誘導する
可能性もあり、細胞接着への関与が推定される。

【００１０】ＡＰＣ遺伝子産物の細胞内局在について
は、細胞が大腸絨突起先端へクリプトから移動する際
に、移動する細胞の微小管先端部位に集積していること
が報告されている（Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．，１３
４：１６５−１７９，１９９６）が、本発明の新規蛋白
Ｍ１も同様の部位に集積していることを見出した。この
ことから、本発明の新規蛋白質Ｍ１が、大腸絨突起にお
ける細胞移動制御の鍵を握っている可能性がある。

【００１１】（ポリペプチド）本発明の新規蛋白質Ｍ１
は、配列表の配列番号１に示すアミノ酸配列からなるポ
リペプチドである。さらに本発明のポリペプチドは、こ
の配列表の配列番号１に示すポリペプチドの部分配列を
有するポリペプチドから選択される。その選択されるポ
リペプチドは、配列表の配列番号１に示すポリペプチド
と、好ましくは約７０％以上、より好ましくは約８０％
以上、さらに好ましくは約９０％をこえる相同性を有す
る。この相同性をもつポリペプチドの選択は、例えばＡ
ＰＣ遺伝子産物のアルマジロリピートドメインとの結合
性を指標にして行うことができる。

【００１２】アミノ酸配列の相同性を決定する技術は、
自体公知であり、例えばアミノ酸配列を直接決定する方
法、推定されるポリヌクレオチドの塩基配列を決定後こ
れにコードされるアミノ酸配列を推定する方法等を使用
することができる。

【００１３】本発明のポリペプチドは、配列表の配列番
号１に示すアミノ酸配列からなるポリペプチドの、部分
配列を有するポリペプチドから選択されるアミノ酸配列
を試薬・標準物質・免疫原として利用できる。その最小
単位としては、少なくとも約５個以上、好ましくは少な
くとも約８〜１０個以上、さらに好ましくは少なくとも
約１１〜１５個以上のアミノ酸で構成されるアミノ酸配
列からなり、免疫学的にスクリーニングしうるポリペプ
チドを本発明の対象とする。

【００１４】さらに、このように特定されたポリペプチ
ドをもとにして、ＡＰＣ遺伝子産物のアルマジロリピー
トドメインとの結合性を指標とすることにより、１ない
し数個のアミノ酸の欠失・置換・付加などの変異あるい
は誘発変異を有するアミノ酸配列からなるポリペプチド
も提供することができる。欠失・置換・付加あるいは挿
入の手段は自体公知であり、例えばＵｌｍｅｒの技術
（Ｓｃｉｅｎｃｅ，２１９：６６６，１９８３）を利用
することが出来る。さらに、これら利用できるペプチド
は、その構成アミノ基もしくはカルボキシル基などを修
飾するなど、機能の著しい変更を伴わない程度に改変が
可能である。

【００１５】本発明のポリペプチドは、それら自体で、
新規蛋白質Ｍ１の機能を調節するための医薬組成物に使
用できる。また、本発明のポリペプチドは、新規蛋白質
Ｍ１の機能を調節しうる化合物、例えば、阻害剤、拮抗
剤、賦活剤等を得るためのスクリーニングや、新規蛋白
質Ｍ１に対する抗体の取得に用いることができる。さら
に、本発明のポリペプチドは、試薬・標準品としても使
用可能である。

【００１６】（ポリヌクレオチド）本発明のポリヌクレ
オチドおよびその相補鎖は、配列表の配列番号１に記載
のアミノ酸配列をコードする、配列表の配列番号２のポ
リヌクレオチドおよび該ポリヌクレオチドに対する相補
鎖、これらのポリヌクレオチドとストリンジェントな条
件下でハイブリダイゼーションするポリヌクレオチド、
およびこれらのポリヌクレオチドのうち少なくとも１５
個の連続した塩基配列を有しかつコードするペプチドが
ＡＰＣ遺伝子産物のａｒｍドメインとの結合能を有する
ポリヌクレオチド、を意味する。ポリヌクレオチドとし
てＤＮＡを代表例にとると、「ＤＮＡにストリンジェン
トな条件下でハイブリダイズするＤＮＡ」は、例えば前
述のＭｏｌｅｃｕｌｅｒ Ｃｌｏｎｉｎｇに記載の方法
によって得ることができる。ここで、「ストリンジェン
トな条件下でハイブリタイズする」とは、例えば、６×
ＳＳＣ、０．５％ＳＤＳおよび５０％ホルムアミドの溶
液中で４２℃にて加温した後、０．１×ＳＳＣ、０．５
％ＳＤＳの溶液中で ６８℃にて洗浄する条件でも依然
として陽性のハイブリタイズのシグナルが観察されるこ
とを表す。

【００１７】本発明のポリヌクレオチドは、配列表の配
列番号１に記載のアミノ酸配列をコードする、配列表の
配列番号２のポリヌクレオチドの情報から選択される相
同鎖および相補鎖を意味し、指定されたヌクレオチド配
列の領域に対応する少なくとも約１５〜２０個以上の配
列からなるポリヌクレオチド配列及び該相補鎖を意味す
る。この有用なポリヌクレオチド配列の決定は、公知の
蛋白質発現系、例えば無細胞蛋白質発現系を利用して簡
易に発現蛋白質の確認を行い、その生理活性特にＡＰＣ
遺伝子産物のアルマジロリピートドメインとの結合性を
指標にして選別することにより行うことができる。無細
胞蛋白質発現系としては、例えば胚芽、家兎網状赤血球
等由来のリボソーム系の技術を利用できる（Ｎａｔｕｒ
ｅ、１７９、１６０〜１６１、１９５７）。

【００１８】これらのポリヌクレオチドは、いずれも本
発明の新規蛋白質Ｍ１および本発明のポリペプチドの製
造に有用な遺伝子情報を提供するものであり、これらを
コードする遺伝子等の核酸、またはｍＲＮＡ検出のため
のプローブもしくはプライマーとして、あるいは遺伝子
発現を調節するためのアンチセンスオリゴマーとして使
用することができる。例えば、本発明のポリヌクレオチ
ドをアンチセンスとして使用する場合、他の既知蛋白
質、例えばＤｂｌファミリーの１つであるＫＩＡＡ０４
２４等、とのコンセンサス配列領域以外の新規蛋白質Ｍ
１に固有な領域のヌクレオチド配列を用いることによ
り、Ｍ１の発現が特異的に阻害される。さらに、本発明
のポリヌクレオチドは、核酸に関する試薬・標準品とし
ても利用できる。

【００１９】（形質転換体）上記のような無細胞蛋白質
発現系以外にも、大腸菌、酵母、枯草菌、昆虫細胞、動
物細胞等の自体公知の宿主を利用した遺伝子組換え技術
によって、本発明からなる新規蛋白質Ｍ１およびその由
来物からなるポリペプチドを提供可能である。本発明の
具体例においては、ＣＯＳ−７細胞を利用したが、無論
これに限定されるものではない。

【００２０】形質転換は、自体公知の手段を応用するこ
とができ、例えばレプリコンとして、プラスミド、染色
体、ウイルス等を利用して宿主の形質転換を行う。より
好ましい系としては、遺伝子の安定性を考慮するなら
ば、染色体内へのインテグレート法があげられるが、簡
便には核外遺伝子を用いた自律複製系を利用する。ベク
ターは、宿主の種類により選択され、発現目的の遺伝子
配列と複製そして制御に関する情報を担持した遺伝子配
列とを構成要素とする。構成要素は宿主が原核細胞か真
核細胞かによって選択し、プロモーター、リボソーム結
合部位、ターミネーター、シグナル配列、エンハンサー
等を自体公知の方法によって組合せて使用する。

【００２１】形質転換体は、自体公知の各々の宿主の培
養条件に最適な条件を選択して培養することにより、本
発明のポリペプチドの製造に用いることができる。培養
は、発現産生される新規蛋白質Ｍ１およびその由来物か
らなるポリペプチドの生理活性、特にＡＰＣ遺伝子産物
のアルマジロリピートドメインとの結合性を指標にして
行ってもよいが、培地中の形質転換体量を指標にして継
代培養またはバッチによって行う。

【００２２】（新規蛋白質Ｍ１およびその由来物の回
収）培地からの新規蛋白質Ｍ１およびその由来物からな
るポリペプチドの回収は、ＡＰＣ遺伝子産物のアルマジ
ロリピートドメインとの結合性を指標にして、分子篩、
イオンカラムクロマトグラフィー、アフィニティクロマ
トグラフィー等を組合せるか、溶解度差にもとづく硫
安、アルコール等の分画手段によっても精製回収でき
る。より好ましくは、アミノ酸配列の情報に基づき、該
アミノ酸配列に対する抗体を作成し、ポリクローナル抗
体またはモノクロ−ナル抗体によって、特異的に吸着回
収する方法を用いる。

【００２３】（抗体）抗体は、本発明の新規蛋白質Ｍ１
およびその由来物からなるポリペプチドの抗原決定基を
選別し、作成する。抗原決定基は、少なくとも５個、よ
り好ましくは少なくとも８〜１０個のアミノ酸で構成さ
れる。このアミノ酸配列は、必ずしも配列表の配列番号
１と相同である必要はなく、蛋白質の立体構造上の外部
への露出部位であればよく、露出部位が不連続部位であ
れば、該露出部位について連続的なアミノ酸配列である
ことも有効である。実施例では、アミノ酸配列の７３位
〜１２６位の断片を免疫原として利用した。抗体は、免
疫学的に新規蛋白質Ｍ１およびその由来物からなるポリ
ペプチドを認識する限り特に限定されない。この認識の
有無は、公知の抗原抗体結合反応によって決定する。

【００２４】抗体を産生するためには、本発明の新規蛋
白質Ｍ１およびその由来物からなるポリペプチドを、ア
ジュバントの存在または非存在下で、単独または担体に
結合して、動物に対して体液性応答および／または細胞
性応答等の免疫誘導を行う。担体は、自身が宿主に対し
て有害作用をおこさなければ特に限定されず、例えばセ
ルロース、重合アミノ酸、アルブミン等が例示される。
免疫する動物としては、マウス、ラット、兎、やぎ、馬
等が好適に用いられる。ポリクローナル抗体は、自体公
知の血清からの抗体回収法によって取得する。好ましい
手段としては、免疫アフィニティークロマトグラフィー
法である。実施例においては、ＧＳＴ−Ｍ１を結合させ
たアフィニティークロマトグラフィーにより、抗Ｍ１抗
体を精製した。

【００２５】モノクロ−ナル抗体を生産するためには、
上記の免疫手段が施された動物から抗体産生細胞を回収
し、自体公知の永久増殖性細胞への形質転換手段を導入
することによって行われる。

【００２６】ポリクローナル抗体またはモノクローナル
抗体は、直接本発明からなる新規蛋白質Ｍ１と結合し、
その活性を制御可能であり、ＡＰＣ遺伝子産物と新規蛋
白質Ｍ１との相互作用系の制御を容易に行うことができ
る。そのため、ＡＰＣ遺伝子産物と新規蛋白質Ｍ１が関
連する疾患の治療・予防のために有用である。

【００２７】（スクリーニング）かくして調製された新
規蛋白質Ｍ１およびその由来物からなるポリペプチド、
これらをコードするポリヌクレオチドおよびその相補
鎖、これらのアミノ酸配列および塩基配列の情報に基づ
き形質転換させた細胞、並びに新規蛋白質Ｍ１およびそ
の由来物からなるポリペプチドを免疫学的に認識する抗
体は、単独または複数手段を組合せることによって、新
規蛋白質Ｍ１およびその由来物からなるポリペプチドと
ＡＰＣ遺伝子産物との結合性、新規蛋白質Ｍ１のＧＥＦ
活性等の機能、または新規蛋白質Ｍ１の発現に対する阻
害剤もしくは賦活剤のスクリーニングに有効な手段を提
供する。すなわち、本発明のポリペプチド、本発明の抗
体の少なくともいずれか１つを用いることで、本発明の
ポリペプチドとＡＰＣ遺伝子産物との結合性を阻害もし
くは増強する化合物を得るためのスクリーニング方法
が、本発明のポリヌクレオチド、本発明のベクター、本
発明の形質転換体、本発明の抗体の少なくともいずれか
１つを用いることで本発明のポリヌクレオチドと相互作
用し該ポリヌクレオチドの発現を阻害もしくは増強する
化合物のスクリーニング方法が、本発明のポリペプチ
ド、本発明の抗体の少なくともいずれか１つを用いるこ
とで本発明のポリペプチドのＧＥＦ活性等の機能を阻害
もしくは増強する化合物のスクリーニング方法が提供可
能である。例えば、ポリペプチドの立体構造に基づくド
ラッグデザインによる拮抗剤の選別、蛋白質発現系を利
用した遺伝子レベルでの発現調整剤の選別、抗体を利用
した抗体認識物質の選別等が、自体公知の医薬品スクリ
ーニングシステムにおいて利用可能である。

【００２８】（化合物、医薬組成物）上記のスクリーニ
ング方法で得られた化合物は、新規蛋白質Ｍ１およびそ
の由来物からなるポリペプチドとＡＰＣ遺伝子産物との
相互作用、または新規蛋白質Ｍ１のＧＥＦ活性等の機能
を調節する阻害剤、拮抗剤、賦活剤等の候補化合物とし
て利用可能である。また、遺伝子レベルでの新規蛋白質
Ｍ１およびその由来物からなるポリペプチドの発現に対
する阻害剤、拮抗剤、賦活剤等の候補化合物としても利
用可能である。上記の阻害剤、拮抗剤、賦活剤等の候補
化合物としては、蛋白質、ポリペプチド、抗原性を有さ
ないポリペプチド、低分子化合物等が挙げられ、好まし
くは低分子化合物である。

【００２９】かくして選別された候補化合物は、生物学
的有用性と毒性のバランスを考慮して選別することによ
って、大腸腫瘍の治療に用いる医薬組成物として調製可
能である。また、本発明からなる新規蛋白質Ｍ１および
その由来物からなるポリペプチド、これらをコードする
ポリヌクレオチドおよびその相補鎖、これらの塩基配列
を含むベクター並びに、新規蛋白質Ｍ１およびその由来
物からなるポリペプチドを免疫学的に認識する抗体は、
それら自体が、新規蛋白質Ｍ１とＡＰＣ遺伝子産物との
相互作用に対する阻害・拮抗・賦活等の機能を有する、
大腸腫瘍の治療に用いる医薬手段として使用できる。こ
こで、大腸腫瘍とは、良性腫瘍ならびに悪性腫瘍を含
み、具体的には、家族性腺腫性ポリポーシス（ＦＡＰ）
および大腸癌が挙げられる。なお、製剤化にあたって
は、自体公知のポリペプチド、蛋白質、ポリヌクレオチ
ド、抗体等、各対象に応じた製剤化手段を導入すればよ
い。

【００３０】本発明からなる新規蛋白質Ｍ１およびその
由来物からなるポリペプチド、これらをコードするポリ
ヌクレオチドおよびその相補鎖、これらの塩基配列を含
むベクター並びに、新規蛋白質Ｍ１およびその由来物か
らなるポリペプチドを免疫学的に認識する抗体は、本発
明のポリペプチドの発現またはその活性が関連する疾
患、例えば、本発明の新規蛋白質Ｍ１の発現またはＡＰ
Ｃ遺伝子産物との相互作用に関連した疾患等の診断手段
として使用することができる。特に、大腸腫瘍の診断マ
ーカーおよび／または試薬等の診断手段として有用であ
る。診断は、新規蛋白質Ｍ１をコードしている核酸配列
との相互作用・反応性を利用して、相応する核酸配列の
存在量を決定すること、および／または新規蛋白質Ｍ１
について生体内分布を決定すること、および／または新
規蛋白質Ｍ１の試料中での存在量を決定することによっ
て行う。詳しくは、新規蛋白質Ｍ１を診断マーカーとし
て検定する。その測定法は、自体公知の抗原抗体反応
系、酵素反応系、ＰＣＲ反応系等を利用すればよい。な
お、ここで言う手段とは、目的達成のために使用する方
法および／または媒体を意味する。すなわち、例えば、
診断手段には、診断するための方法、診断に用いる試薬
キットなどが含まれる。

【００３１】

【実施例】以下、本発明を実施例に基づき具体的に説明
するが、本発明は下記の実施例に限定されない。 （ｃＤＮＡのクローニング ）ＡＰＣ遺伝子産物のアル
マジロリピートドメイン（以下、ＡＰＣ−ａｒｍと略称
することもある）に対する結合能を有する蛋白質を得る
ことを目的として、２ハイブリッドスクリーニング（ｔ
ｗｏ ｈｙｂｒｉｄ ｓｃｒｅｅｎｓ）（ＣＬＯＮＴＥ
ＣＨ ＭＡＴＣＨＭＡＫＥＲ^ＴＭ Ｔｗｏ−Ｈｙｂｒｉ
ｄ Ｓｙｓｔｅｍ）を行った。すなわち、ベイト（ｂａ
ｉｔ）として、ヒトＡＰＣ遺伝子産物アルマジロリピー
トドメイン（アミノ酸残基４４６−８８０）を融合させ
たＧＡＬ４ ＤＮＡ結合ドメインを含有するプラスミド
ＧＢＴ９−ＡＰＣを用い、ヒト胎児脳（ｈｕｍａｎ ｆ
ｅｔａｌ ｂｒａｉｎ）ｃＤＮＡライブラリー（Ｃｌｏ
ｎｔｅｃｈ）を対象としてスクリーニングした。該ｃＤ
ＮＡライブラリーとベイトとを、レポーター遺伝子とし
てｈｉｓ３とｌａｃＺとを導入した酵母にトランスフェ
クションし、β−ｇａｌアッセイおよびＨＩＳ栄養要求
性を指標として、陽性クローンを検出した。

【００３２】形質転換体１．１×１０^７個から、１つの
陽性クローンを得た。この得られたクローンから、該ク
ローンで発現されているＡＰＣ−ａｒｍに結合するポリ
ペプチドをコードするｃＤＮＡ断片の塩基配列をＤＮＡ
シークエンスにより決定したところ、新規な配列であっ
た。得られたｃＤＮＡ断片の下流領域の配列は’Ｍａｒ
ａｔｈｏｎ’−ｒｅａｄｙ ヒト脳ｃＤＮＡ（Ｃｌｏｎ
ｔｅｃｈ）を用いて３’ＲＡＣＥシステム（Ｃｌｏｎｔ
ｅｃｈ）により取得した。プライマーは５’−ＣＧＡＣ
ＡＴＣＴＧＣＧＡＧＧＧＣＴＡＣＧＴＣＣＧＧ−３’を
用いた。また上記で得られたｃＤＮＡ断片の配列の一部
（配列表、配列番号２の塩基番号９７−２６９）をプロ
ーブとして、ヒトゲノムライブラリー（Ｃｌｏｎｔｅｃ
ｈ）について、ジゴキシゲニン（ｄｉｇｏｘｉｇｅｎｉ
ｎ；ＤＩＧ）標識プローブを用いたハイブリダイゼーシ
ョンによりスクリーニングした。その結果、配列表、配
列番号２の塩基番号１−８１を含む２つのオーバーラッ
プするクローンを得、目的とするＡＰＣ−ａｒｍに結合
する蛋白質の完全長ｃＤＮＡの配列を決定した。

【００３３】（アミノ酸配列）上記方法で得られた、配
列表の配列番号２に示すｃＤＮＡは新規な塩基配列を有
していた。該ｃＤＮＡをもとに、その塩基配列の翻訳に
よって、新規蛋白質Ｍ１の推定アミノ酸配列、すなわち
配列表の配列番号１に示すアミノ酸残基６１９の配列が
得られた（図１Ａ）。

【００３４】（既存蛋白質との相同性）該新規蛋白質Ｍ
１の推定アミノ酸配列を用いて、既存のｄａｔａｂａｓ
ｅ（Ｇｅｎｂａｎｋ）に対してＢＬＡＳＴ（Ｔｈｅ Ｎ
ａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈ
ｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）を用いた相同
性検索を行ったところＤｂｌファミリーのサブファミリ
ーメンバーの１つであるＫＩＡＡ０４２４と７３％の相
同性を認めた（図２Ｂ、Ｃ）。両者は、Ｄｂｌ相同（Ｄ
ｂｌ ｈｏｍｏｌｏｇｙ；ＤＨ）ドメイン、プレックス
トリン相同（Ｐｒｅｃｋｓｔｒｉｎ ｈｏｍｏｌｏｇ
ｙ；ＰＨ）ドメイン、Ｓｒｃ相同３（ＳＨ３）ドメイン
を保持する点において同一であるが、ＫＩＡＡ０４２４
には、新規蛋白質Ｍ１のＮ末端領域は存在しないことが
判明した。この結果、配列表の配列番号１に示すアミノ
酸配列を有する本発明の蛋白質Ｍ１は新規蛋白質である
ことが確認された。

【００３５】（発現組織の確認）次に配列表の配列番号
１の推定アミノ酸配列で示される新規蛋白質Ｍ１の、ヒ
ト組織における発現を、ノザンブロット解析により確認
した。多種のヒト組織から得たｐｏｌｙ（Ａ）^＋ＲＮＡ
をブロットしたフィルターをＣｌｏｎｔｅｃｈ社より入
手し、ＤＩＧ標識したＭ１のｃＤＮＡプローブ、５’−
ＧＡＣＣＡＣＡＣＴＧＣＣＡＴＣＧＣＴＧ−３’および
５’−ＴＧＴＡＧＴＴＴＡＣＣＡＡＧＧＡＣＣＧ−３’
でハイブリダイゼーションした。その結果、脳に高レベ
ルで発現していることを確認した。また、ｔｉｓｓｕｅ
ｂｌｏｔｓによる解析では、脳以外に、睾丸でも存在
を確認した。さらに、腎由来の細胞でも発現を確認し
た。

【００３６】（抗体の産生）Ｍ１に対する抗体は、ＮＺ
ＷウサギをＭ１のアミノ酸７３−１２６を含むペプチド
を用いて公知の方法で免疫し調製した。ＡＰＣに対する
抗体は、ＮＺＷウサギをＡＰＣ遺伝子産物（以下ＡＰＣ
と略称することもある）のアミノ酸１１２２−１７２９
を含むペプチドを用いて公知の方法で免疫して調製し
た。ＡＰＣのＮ末端領域に対するマウスモノクローナル
抗体は公知の方法で調製した（Ｍｉｙａｓｈｉｒｏ ｅ
ｔ ａｌ．１９９５）。抗体は、それぞれ免疫に用いた
抗原を結合させたアフィニティーカラムを使用してアフ
ィニティークロマトグラフィーを行うことにより精製し
た。精製したウサギポリクローナル抗Ｍ１抗体とＧＳＴ
融合Ｍ１（ＧＳＴ−Ｍ１）との結合反応性を調べたとこ
ろ、得られた抗体は、ＧＳＴ−Ｍ１に強い反応性を示し
た。

【００３７】（Ｍ１の発現）本発明の新規蛋白質Ｍ１を
発現させるために、発現プラスミドｐｃＤＮＡ３．１
（＋）のＥｃｏＲＩ／ＮｏｔＩ部位にＭ１のｃＤＮＡを
組み込み、ＣＯＳ−７細胞にトランスフェクションし
た。新規蛋白質Ｍ１の発現確認のため、Ｍ１ｃＤＮＡを
組み込んだベクター、コントロールベクター、ＨＡ−タ
グで標識したＭ１ｃＤＮＡを組み込んだベクター、ＨＡ
−タグを組み込んだベクターを、ＣＯＳ−７細胞にトラ
ンスフェクションした。培養した各形質転換体の溶解
物、およびＭ１の存在が確認されているラット胎児脳の
溶解物について、上記の様に取得した抗Ｍ１抗体、およ
び抗ＨＡ抗体を用いて免疫沈降し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥに
より分画し、次いで抗Ｍ１抗体および抗ＨＡ抗体を用い
てイムノブロットを行った。Ｍ１ｃＤＮＡを組み込んだ
ベクター（レーン３）、ＨＡ−タグで標識したＭ１ｃＤ
ＮＡを組み込んだベクター（レーン６、８）で形質転換
したＣＯＳ−７細胞およびラット胎児脳（レーン１）で
は明らかに新規蛋白質の発現が認められ、その分子量は
約８５ｋＤａであることが判明した（図２）。また、用
いた抗Ｍ１抗体を抗原で事前処理しておく（図２中、ｐ
ｅｐ．±で表示）と、新規蛋白質は検出されなかった。
すなわち、抗Ｍ１抗体で認識される新規蛋白質Ｍ１が発
現されたことが確認された。

【００３８】（Ｍ１とＡＰＣとのｉｎ ｖｉｖｏにおけ
る結合の解析）ラット胎児脳溶解物について、上記で作
製した新規蛋白質Ｍ１、およびＡＰＣに対するウサギポ
リクローナル抗体、ならびにβ−カテニンに対するマウ
スモノクローナル抗体（Ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ Ｌ
ａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を用いて免疫沈降し、ＳＤＳ
−ＰＡＧＥにより各沈降物を分離後、各抗体を用いてイ
ムノブロットを行った（図３）。レーン１および２はラ
ット胎児脳の溶解物を抗Ｍ１抗体で、レーン３および４
は抗ＡＰＣ抗体で、レーン５および６は抗β−カテニン
抗体で免疫沈降した結果を、レーン１、３、５は、予め
各抗体を対応する抗原で吸収して用いた結果（図３中、
ｐｅｐ．±で表示）を示す。抗Ｍ１抗体で免疫沈降した
Ｍ１が抗ＡＰＣ抗体もしくは抗β−カテニン抗体で検出
され、抗ＡＰＣ抗体で免疫沈降したＡＰＣ遺伝子産物が
抗Ｍ１抗体で検出され、抗β−カテニン抗体で免疫沈降
したβ−カテニンが抗Ｍ１抗体で検出されることから、
新規蛋白質Ｍ１はｉｎ ｖｉｖｏにおいてもＡＰＣおよ
びβ−カテニンと結合していることが明らかとなった。

【００３９】（Ｍ１とＡＰＣの相互作用部位の解析）新
規蛋白質Ｍ１の、ＡＰＣ結合ドメインの解析を行うた
め、Ｍ１の様々な欠失変異体（ｄｅｌｅｔｉｏｎ ｍｕ
ｔａｎｔ）を公知の方法で作製し、ＡＰＣとの結合領域
を酵母（ｙｅａｓｔ）を用いた２ハイブリッドシステム
により調べた。具体的には、Ｍ１の欠失変異体を、下記
の特異的なプライマーを用いＰＣＲを行って、ｐＧＡＤ
４２４にクローニングし、ＧＡＬ４活性化ドメインとの
融合体を作成した。 ５’−ＡＴＴＴＡＴＴＧＴＡＧＴＴＴＡＣＣＡＡＧＧＡＣ−３’ ５’−ＴＧＣＧＣＴＧＡＡＧＣＡＣＴＣＴＧＧＧＡＣ−３’ ５’−ＧＡＣＣＡＣＡＣＴＧＣＣＡＴＣＧＣＴＧＡＴＧ−３’ ５’−ＣＣＴＣＡＧＣＣＧＡＡＣＧＡＡＧＣＴＧＧＣＴＧ−３’ ５’−ＣＴＴＧＣＴＧＣＴＣＴＧＣＧＣＣＴＣＣＧＣ−３’ ５’−ＧＴＧＡＡＴＣＡＧＧＡＣＧＡＧＣＣＣＧＣＧ−３’ ５’−ＧＡＴＧＴＴＣＣＣＧＡＡＧＡＴＧＧＴＡＣＧ−３’ ５’−ＡＴＧＣＣＴＧＡＴＧＧＡＧＣＴＣＴＧＧＡＣ−３’ ついで、該ＧＡＬ４活性化ドメインとの融合体を２ハイ
ブリッドシステムにおいてＨＩＳ３ ａｕｘｏｔｒｏｐ
ｈｙとβ−ｇａｌ リポーター活性を用いて、その相互
作用を試験した。その結果、図４に示すように、ＳＨ３
の上流の領域にＡＰＣ結合部位が存在することが判明し
た。

【００４０】（Ｍ１とＲｈｏファミリー低分子量Ｇ蛋白
質との結合解析）新規蛋白質Ｍ１は、Ｄｂｌファミリー
のサブファミリーの１つであるＫＩＡＡ０４２４と高い
相同性を有する。Ｄｂｌファミリーは低分子量Ｇ蛋白質
の１つであるＲｈｏファミリーに作用するＧＤＰ解離促
進蛋白質である。新規蛋白質Ｍ１と、ＫＩＡＡ０４２４
との相同性に着目し、新規蛋白質Ｍ１の機能解析のた
め、Ｒｈｏファミリー低分子量Ｇ蛋白質（ｓｍａｌｌ
Ｇ ｐｒｏｔｅｉｎ；ＲｈｏＡ、Ｒａｃ１、ＣＤＣ４
２）との結合を調べた。ニッケルビーズに吸着させた新
規蛋白質Ｍ１をＲｈｏＡ、Ｒａｃ１およびＧＳＴ−ＣＤ
Ｃ４２と、０．１％ＮＰ−４０を含むＥ１Ａ緩衝液〔５
０ｍＭ ＨＥＰＥＳ，ｐＨ７．０，１５０ｍＭＮａＣ
ｌ，５０ｍＭ ＮａＦ，５ｍＭ ＥＤＴＡ，１ｍＭＤＴ
Ｔ，５０μｇ／ｍＬ ｐｈｅｎｙｌｍｅｔｈｙｌｓｕｌ
ｐｈｏｎｙｌ ｆｌｕｏｒｉｄｅ（ＰＭＳＦ），１μｇ
／ｍｌ ロイペプチン，１μｇ／ｍｌアプロチニン〕中
で４℃にて１時間混合し、共沈殿物をイムノブロッティ
ングで検出した。図５に示すように、陽性コントロール
として使用したＤｂｌは用いた全てのＲｈｏファミリー
低分子量Ｇ蛋白質と結合するが、新規蛋白質Ｍ１はＲｈ
ｏＡおよびＲａｃ１とは結合したが、ＣＤＣ４２とは結
合しなかった。

【００４１】（Ｍ１のＧＥＦ活性）次に、新規蛋白質Ｍ
１のＧＥＦ活性について検討した。低分子量Ｇ蛋白質か
らのＧＤＰ解離を調べるために使用する［^３Ｈ］ＧＤＰ
結合型の低分子量Ｇ蛋白質を、２ｐｍｏｌの各低分子量
Ｇ蛋白質を０．２μＭ［^３Ｈ］ＧＤＰと３０℃で２０分
間、導入用緩衝液（ｌｏａｄｉｎｇ ｂｕｆｆｅｒ；２
０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．０、３ｍＭ Ｍｇ
Ｃｌ_２、１０ｍＭ ＥＤＴＡおよび１ｍＭジチオスレイ
トール）中でインキュベートすることにより得た。低分
子量Ｇ蛋白質からの［^３Ｈ］ＧＤＰの解離を防ぐため、
３７５ｍＭ ＭｇＣｌ_２を終濃度が１８ｍＭとなるよう
に加え、直ちに、該混合液を氷冷した。［^３Ｈ］ＧＤＰ
の解離は、反応溶液（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐ
Ｈ８．０、６ｍＭ ＭｇＣｌ _２、３．５ｍＭ ＥＤＴＡ
および１ｍＭ ジチオスレイトール）に２５０倍過剰の
非標識ＧＤＰ、ＧＴＰおよびＭ１を加えることにより２
５℃で行った（図６Ａ、Ｂ）。次に、低分子量Ｇ蛋白質
へのＧＴＰの結合を調べるために使用するＧＤＰ結合型
の低分子量Ｇ蛋白質を、２ｐｍｏｌの各低分子量Ｇ蛋白
質を０．２μＭ非標識ＧＤＰと３０℃で２０分間、導入
用緩衝液（ｌｏａｄｉｎｇ ｂｕｆｆｅｒ）中でインキ
ュベートし、３７５ｍＭ ＭｇＣｌ_２を終濃度が１８ｍ
Ｍとなるように加えることにより得た。［^３５Ｓ］ＧＴ
Ｐ_γＳの、ＧＤＰ結合型低分子量Ｇ蛋白質への結合は、
１０μＭの［^３５Ｓ］ＧＴＰ_γＳおよびＭ１を反応溶液
に加えることにより、２５℃で実施した（図７Ａ、
Ｂ）。解離試験、結合試験の両方において、反応は１ｍ
ｌの氷冷した停止用緩衝液（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣ
ｌ、ｐＨ８．０、２５ｍＭ ＭｇＣｌ_２および１００ｍ
Ｍ ＮａＣｌ）を加えて、停止した。希釈した混合溶液
をニトロセルロースろ紙で濾過し、フィルターを数回、
停止用緩衝液で洗浄した。ろ紙上に捕捉された放射活性
をカウントした。タンパク質濃度はウシ血清アルブミン
（ＢＳＡ）を標準蛋白質として用いて測定した。

【００４２】図６に示すように、新規蛋白質Ｍ１は、結
合しうる低分子量Ｇ蛋白質であるＲａｃ１に作用して、
Ｒａｃ１からのＧＤＰ解離を促進したが（図６Ａ）、Ｒ
ｈｏＡには結合しないのでＲｈｏＡからのＧＤＰ解離に
は作用しなかった（図６Ｂ）。また、図７に示すよう
に、新規蛋白質Ｍ１は、Ｒａｃ１へのＧＴＰ結合を促進
した（図７Ａ）が、ＲｈｏＡへのＧＴＰ結合には影響し
なかった（図７Ｂ）。すなわち、本発明の新規蛋白質Ｍ
１は、低分子量Ｇ蛋白質に作用し、ＧＥＦ活性を有す
る。

【００４３】（Ｍ１のＧＥＦ活性に対するＡＰＣの作
用）さらに、様々な濃度のＭ１について、ＡＰＣ−ａｒ
ｍの存在下または非存在下で、２０ｎＭの［^３Ｈ］ＧＤ
Ｐを結合させた結合型のＲａｃ１からの［^３Ｈ］ＧＤＰ
解離促進能を３０℃で１５分間インキュベーションして
測定した。ＡＰＣ−ａｒｍはＭ１より過剰量、モル比で
５倍となるように加えた。図８に示すように、Ｍ１のＧ
ＤＰ解離促進能は、ＡＰＣ−ａｒｍの添加により、増強
された。すなわち、Ｍ１は、ＡＰＣと結合することによ
り、ＧＤＰ解離促進能が増強されることが示唆された。

【００４４】（Ｍ１の細胞内局在）次に、本発明の新規
蛋白質Ｍ１の細胞内局在について検討した。まず、Ｍａ
ｄｉｎ−Ｄａｒｂｙ ｃａｎｉｎｅ ｋｉｄｎｅｙ（Ｍ
ＤＣＫ）上皮細胞株を１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）を
含むＤｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇ
ｌｅ’ｓ ｍｅｄｉｕｍ（ＤＭＥＭ）中で培養した。全
長のＭ１およびＭ１△ＮＢ（アミノ酸１２７−６１９）
ｃＤＮＡはＣＭＶプロモーターを有する哺乳動物発現ベ
クターｐｃＤＮＡ３．１（＋）中にサブクローン化し
た。プラスミドＤＮＡ、ｐＭＫＩＴＮｅｏ−Ｍｙｃタグ
で標識したＡＰＣ−ａｒｍは、ＡＰＣ（アミノ酸４４６
−８８０）の部分配列をコードしているＤＮＡ断片をＳ
Ｒαプロモーターを有するｐＭＫＩＴＮｅｏに挿入する
ことにより構築した。発現プラスミドは、リポフェクト
アミン（ＬｉｐｏｆｅｃｔＡＭＩＮＥ；Ｌｉｆｅ Ｔｅ
ｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）を用いて、使用者マニュアル
にしたがって、ＭＤＣＫ細胞にトランスフェクトした。

【００４５】ＭＤＣＫ細胞は、リン酸緩衝生理食塩水
（Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ Ｂｕｆｆｅｒｅｄ Ｓａｌｉｎ
ｅ；ＰＢＳ）中で３．７％ホルムアルデヒドを用いて４
℃で１時間、固定した。固定した細胞は室温で１０分
間、０．２％トリトンＸ−１００を含むトリス緩衝生理
食塩水（Ｔｒｉｓ Ｂｕｆｆｅｒｅｄ Ｓａｌｉｎｅ；
ＴＢＳ）で処理し、ＴＢＳで３回洗浄した。細胞を透過
化した（ｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｚｅ）後、１％ＢＳＡ、
３％ＦＢＳ、０．２％トリトンＸ−１００を含むＴＢＳ
中で一次抗体と室温で１時間、インキュベートした。一
次抗体を除去し、細胞をＴＢＳで３回洗浄した。結合し
た一次抗体は、ＦＩＴＣ（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ ｉ
ｓｏｔｈｉｏｃｙａｎａｔｅ）またはローダミンを結合
したヤギ二次抗体（Ｃａｐｐｅｌ社）を用いて、検出し
た。染色したサンプルは、カールツ_アイスＬＳＭ５１０
レーザー走査顕微鏡（Ｃａｒｌ Ｚｅｉｓｓ ＬＳＭ５
１０Ｌａｓｅｒ ｓｃａｎｎｉｎｇ ｍｉｃｒｏｓｃｏ
ｐｅ）下で、観察した。

【００４６】結果は、図９に示す。図９中、ａ、ｂはＨ
Ａ−タグで標識したＭ１蛋白質を発現させた同一細胞、
ｃ、ｄはＨＡ−タグで標識したＭ１蛋白質とＭｙｃ−タ
グで標識したＡＰＣ−ａｒｍとを両方発現させた同一細
胞、ｅはＨＡ−タグで標識したＭ１△ＮＢ（アミノ酸１
２７−６１９）を発現させた細胞、ｆはＭｙｃ−タグで
標識したＡＰＣ−ａｒｍを発現させた細胞である。ま
た、ａ、ｂは抗ＨＡ抗体と抗ＡＰＣ抗体で二重染色し、
ｃ、ｄは抗ＨＡ抗体と抗Ｍｙｃ抗体で二重染色し、ｅは
抗ＨＡ抗体で、ｆは抗Ｍｙｃ抗体で処理した。ｂ中の矢
印頭で示すように、ＡＰＣ蛋白質のクラスターが伸長し
ている膜中に存在しており、また、ａ〜ｄ中の矢印で示
すように、Ｍ１とＡＰＣが上皮細胞中で細胞の辺縁の同
一部位に共存していることが判明した。

【００４７】（Ｍ１発現細胞株の形態解析）さらに、Ｍ
１△ＮＢを安定に発現するＭＤＣＫ細胞株を樹立し、Ｍ
１が細胞の形態、骨格に与える影響を調べたところ、Ｍ
１△ＮＢ発現細胞株５クローンはいずれも密に接着せず
ばらばらに増殖する傾向が見られた。新規蛋白質Ｍ１の
細胞接着への関与が推定された。

【００４８】

【発明の効果】以上説明したように本発明のＭ１は、新
規蛋白質であり、そのＡＰＣ遺伝子産物のアルマジロリ
ピート部位との結合性が特徴的で、ＧＥＦ（グアニンヌ
クレオチド交換因子：Ｇｕａｎｉｎｅ ｎｕｃｌｅｏｔ
ｉｄｅ Ｅｘｃｈａｎｇｅ Ｆａｃｔｏｒ）活性を有す
る。この特性を利用した新規医薬組成物、診療手段の提
供は、ＡＰＣ遺伝子産物関連の臨床・基礎の医用領域に
おいて大きな有用性を提供する。

【配列表】 Sequence Listing <110> Daiichi Pharmaceutical Co.,Ltd. <120> Colon carcinoma suppressor gene related protein <130> DP99-1045 <160> 2 <210> 1 <211> 619 <212> PRT <213> human <400> 1 Met Arg Pro Asp Gly Gln Gln Ala Leu Asp Ala Val Val Arg Ser Phe 1 5 10 15 Asp Cys His Ser Glu Ala Ala Leu Arg Gln Arg Asn Asp Val Ile Tyr 20 25 30 Cys Ser Leu Pro Arg Thr Ala Gln Gly Ile Val Gln Arg Glu Asp Gln 35 40 45 Leu Glu Val Leu Val Ser Leu Arg Glu Val Trp Gly Arg Arg Arg Gly 50 55 60 Arg Asp Gly Thr Cys Thr Gly Ala Met Pro Asp Gly Ala Leu Asp Thr 65 70 75 80 Ala Val Cys Ala Asp Glu Val Gly Ser Glu Glu Asp Leu Tyr Asp Asp 85 90 95 Leu His Ser Ser Ser His His Tyr Ser His Pro Gly Gly Gly Gly Glu 100 105 110 Gln Leu Ala Ile Asn Glu Leu Ile Ser Asp Gly Ser Val Val Cys Ala 115 120 125 Glu Ala Leu Trp Asp His Val Thr Met Asp Asp Gln Glu Leu Gly Phe 130 135 140 Lys Ala Gly Asp Val Ile Glu Val Met Asp Ala Thr Asn Arg Glu Trp 145 150 155 160 Trp Trp Gly Arg Val Ala Asp Gly Glu Gly Trp Phe Pro Ala Ser Phe 165 170 175 Val Arg Leu Arg Val Asn Gln Asp Glu Pro Ala Asp Asp Asp Ala Pro 180 185 190 Leu Ala Gly Asn Ser Gly Ala Glu Asp Gly Gly Ala Glu Ala Gln Ser 195 200 205 Ser Lys Asp Gln Met Arg Thr Asn Val Ile Asn Glu Ile Leu Ser Thr 210 215 220 Glu Arg Asp Tyr Ile Lys His Leu Arg Asp Ile Cys Glu Gly Tyr Val 225 230 235 240 Arg Gln Cys Arg Lys Arg Ala Asp Met Phe Ser Glu Glu Gln Leu Arg 245 250 255 Thr Ile Phe Gly Asn Ile Glu Asp Ile Tyr Arg Cys Gln Lys Ala Phe 260 265 270 Val Lys Ala Leu Glu Gln Arg Phe Asn Arg Glu Arg Pro His Leu Ser 275 280 285 Glu Leu Gly Ala Cys Phe Leu Glu His Gln Ala Asp Phe Gln Ile Tyr 290 295 300 Ser Glu Tyr Cys Asn Asn His Pro Asn Ala Cys Val Glu Leu Ser Arg 305 310 315 320 Leu Thr Lys Leu Ser Lys Tyr Val Tyr Phe Phe Glu Ala Cys Arg Leu 325 330 335 Leu Gln Lys Met Ile Asp Ile Ser Leu Asp Gly Phe Leu Leu Thr Pro 340 345 350 Val Gln Lys Ile Cys Lys Tyr Pro Leu Gln Leu Ala Glu Leu Leu Lys 355 360 365 Tyr Thr His Pro Gln His Arg Asp Phe Lys Asp Val Glu Ala Ala Leu 370 375 380 His Ala Met Lys Asn Val Ala Gln Leu Ile Asn Glu Arg Lys Arg Arg 385 390 395 400 Leu Glu Asn Ile Asp Lys Ile Ala Gln Trp Gln Ser Ser Ile Glu Asp 405 410 415 Trp Glu Gly Glu Asp Leu Leu Val Arg Ser Ser Glu Leu Ile Tyr Ser 420 425 430 Gly Glu Leu Thr Arg Val Thr Gln Pro Gln Ala Lys Ser Gln Gln Arg 435 440 445 Met Phe Phe Leu Phe Asp His Gln Leu Ile Tyr Cys Lys Lys Asp Leu 450 455 460 Leu Arg Arg Asp Val Leu Tyr Tyr Lys Gly Arg Leu Asp Met Asp Gly 465 470 475 480 Leu Glu Val Val Asp Leu Glu Asp Gly Lys Asp Arg Asp Leu His Val 485 490 495 Ser Ile Lys Asn Ala Phe Arg Leu His Arg Gly Ala Thr Gly Asp Ser 500 505 510 His Leu Leu Cys Thr Arg Lys Pro Glu Gln Lys Gln Arg Trp Leu Lys 515 520 525 Ala Phe Ala Arg Glu Arg Glu Gln Val Gln Leu Asp Gln Glu Thr Gly 530 535 540 Phe Ser Ile Thr Glu Leu Gln Arg Lys Gln Ala Met Leu Asn Ala Ser 545 550 555 560 Lys Gln Gln Val Thr Gly Lys Pro Lys Ala Val Gly Arg Pro Cys Tyr 565 570 575 Leu Thr Arg Gln Lys His Pro Ala Leu Pro Ser Asn Arg Pro Gln Gln 580 585 590 Gln Val Leu Val Leu Ala Glu Pro Arg Arg Lys Pro Ser Thr Phe Trp 595 600 605 His Ser Ile Ser Arg Leu Ala Pro Phe Arg Lys * 610 615 620 <210> 2 <211> 1860 <212> cDNA <213> human <400> 2 atg agg cca gat ggg cag caa gct ttg gat gct gtg gta agg agt ttt 48 Met Arg Pro Asp Gly Gln Gln Ala Leu Asp Ala Val Val Arg Ser Phe 1 5 10 15 gac tgt cac tct gaa gca gct ctc agg cag agg aat gat gtg att tat 96 Asp Cys His Ser Glu Ala Ala Leu Arg Gln Arg Asn Asp Val Ile Tyr 20 25 30 tgt agt tta cca agg acc gct cag ggt att gtg cag agg gaa gac cag 144 Cys Ser Leu Pro Arg Thr Ala Gln Gly Ile Val Gln Arg Glu Asp Gln 35 40 45 ctg gag gtt ctt gtg tca ctc cgt gaa gtg tgg ggg cgg cgg agg ggc 192 Leu Glu Val Leu Val Ser Leu Arg Glu Val Trp Gly Arg Arg Arg Gly 50 55 60 aga gat ggg acc tgc act gga gcc atg cct gat gga gct ctg gac aca 240 Arg Asp Gly Thr Cys Thr Gly Ala Met Pro Asp Gly Ala Leu Asp Thr 65 70 75 80 gct gtc tgc gct gac gaa gtg ggg agc gag gag gac ctg tat gat gac 288 Ala Val Cys Ala Asp Glu Val Gly Ser Glu Glu Asp Leu Tyr Asp Asp 85 90 95 ctg cac agc tcc agc cac cac tac agc cac cct gga ggg ggt ggg gag 336 Leu His Ser Ser Ser His His Tyr Ser His Pro Gly Gly Gly Gly Glu 100 105 110 cag ctg gct atc aat gag ctc atc agc gat ggc agt gtg gtc tgc gct 384 Gln Leu Ala Ile Asn Glu Leu Ile Ser Asp Gly Ser Val Val Cys Ala 115 120 125 gaa gca ctc tgg gac cat gtc acc atg gac gac cag gag ctg ggc ttc 432 Glu Ala Leu Trp Asp His Val Thr Met Asp Asp Gln Glu Leu Gly Phe 130 135 140 aaa gct ggg gac gtc atc gaa gtg atg gat gcc acc aac aga gag tgg 480 Lys Ala Gly Asp Val Ile Glu Val Met Asp Ala Thr Asn Arg Glu Trp 145 150 155 160 tgg tgg ggc cgg gtc gcc gat ggc gag ggc tgg ttt cca gcc agc ttc 528 Trp Trp Gly Arg Val Ala Asp Gly Glu Gly Trp Phe Pro Ala Ser Phe 165 170 175 gtt cgg ctg agg gtg aat cag gac gag ccc gcg gat gac gac gcc cct 576 Val Arg Leu Arg Val Asn Gln Asp Glu Pro Ala Asp Asp Asp Ala Pro 180 185 190 ctg gcc ggg aac agc gga gcg gag gac ggc ggg gcg gag gcg cag agc 624 Leu Ala Gly Asn Ser Gly Ala Glu Asp Gly Gly Ala Glu Ala Gln Ser 195 200 205 agc aag gac cag atg cgg acc aac gtc atc aac gag atc ctc agc act 672 Ser Lys Asp Gln Met Arg Thr Asn Val Ile Asn Glu Ile Leu Ser Thr 210 215 220 gag cgg gac tac atc aag cac ctg cgc gac atc tgc gag ggc tac gtc 720 Glu Arg Asp Tyr Ile Lys His Leu Arg Asp Ile Cys Glu Gly Tyr Val 225 230 235 240 cgg cag tgc cgc aag cgc gca gac atg ttc agc gag gag cag ctg cgt 768 Arg Gln Cys Arg Lys Arg Ala Asp Met Phe Ser Glu Glu Gln Leu Arg 245 250 255 acc atc ttc ggg aac atc gag gac atc tac cgc tgc cag aag gcc ttc 816 Thr Ile Phe Gly Asn Ile Glu Asp Ile Tyr Arg Cys Gln Lys Ala Phe 260 265 270 gtg aag gcc ctg gag cag agg ttc aac cgc gag cgc cca cac ctg agc 864 Val Lys Ala Leu Glu Gln Arg Phe Asn Arg Glu Arg Pro His Leu Ser 275 280 285 gag ctg ggt gcc tgc ttc ctg gag cat caa gcc gac ttc cag atc tac 912 Glu Leu Gly Ala Cys Phe Leu Glu His Gln Ala Asp Phe Gln Ile Tyr 290 295 300 tcg gag tac tgc aat aac cac ccc aac gcc tgc gtg gag ctc tcc cgg 960 Ser Glu Tyr Cys Asn Asn His Pro Asn Ala Cys Val Glu Leu Ser Arg 305 310 315 320 ctc acc aag ctc agc aag tac gtg tac ttc ttc gag gcc tgc cgg ctg 1008 Leu Thr Lys Leu Ser Lys Tyr Val Tyr Phe Phe Glu Ala Cys Arg Leu 325 330 335 ctg cag aag atg att gac atc tcc ctg gat ggc ttc ctg ctg act ccg 1056 Leu Gln Lys Met Ile Asp Ile Ser Leu Asp Gly Phe Leu Leu Thr Pro 340 345 350 gtg cag aag atc tgc aag tac cct ctg cag ctg gcc gag ctg ctc aaa 1104 Val Gln Lys Ile Cys Lys Tyr Pro Leu Gln Leu Ala Glu Leu Leu Lys 355 360 365 tac acg cac ccc cag cac agg gac ttc aag gat gtt gaa gcc gcc ttg 1152 Tyr Thr His Pro Gln His Arg Asp Phe Lys Asp Val Glu Ala Ala Leu 370 375 380 cat gcc atg aag aac gtg gcc cag ctc atc aac gag cgg aag cgg aga 1200 His Ala Met Lys Asn Val Ala Gln Leu Ile Asn Glu Arg Lys Arg Arg 385 390 395 400 ctt gag aac atc gac aag att gct cag tgg cag agc tcc ata gag gac 1248 Leu Glu Asn Ile Asp Lys Ile Ala Gln Trp Gln Ser Ser Ile Glu Asp 405 410 415 tgg gag gga gaa gat ctc ttg gtc agg agc tca gaa ctc atc tac tcg 1296 Trp Glu Gly Glu Asp Leu Leu Val Arg Ser Ser Glu Leu Ile Tyr Ser 420 425 430 ggg gag ctg act cga gtt aca cag cct caa gcc aaa agc cag cag cga 1344 Gly Glu Leu Thr Arg Val Thr Gln Pro Gln Ala Lys Ser Gln Gln Arg 435 440 445 atg ttc ttt ctc ttt gac cac cag ctc atc tac tgt aag aag gac ctg 1392 Met Phe Phe Leu Phe Asp His Gln Leu Ile Tyr Cys Lys Lys Asp Leu 450 455 460 ctc cgc cgc gac gtg ttg tac tac aag ggc cgg ctg gac atg gac ggc 1440 Leu Arg Arg Asp Val Leu Tyr Tyr Lys Gly Arg Leu Asp Met Asp Gly 465 470 475 480 ctg gag gtg gtg gac ctg gag gac ggg aag gac aga gac ctc cat gtg 1488 Leu Glu Val Val Asp Leu Glu Asp Gly Lys Asp Arg Asp Leu His Val 485 490 495 agc atc aag aac gcc ttc cgg ctg cac cgt ggc gcc aca ggg gac agc 1536 Ser Ile Lys Asn Ala Phe Arg Leu His Arg Gly Ala Thr Gly Asp Ser 500 505 510 cac ctg ctg tgc acc agg aag ccc gag cag aag cag cgc tgg ctc aag 1584 His Leu Leu Cys Thr Arg Lys Pro Glu Gln Lys Gln Arg Trp Leu Lys 515 520 525 gcc ttt gcc agg gag agg gag cag gtg cag ctg gac cag gag aca ggc 1632 Ala Phe Ala Arg Glu Arg Glu Gln Val Gln Leu Asp Gln Glu Thr Gly 530 535 540 ttc tcc atc act gaa ctg cag agg aag cag gcc atg ctg aat gcc agc 1680 Phe Ser Ile Thr Glu Leu Gln Arg Lys Gln Ala Met Leu Asn Ala Ser 545 550 555 560 aag cag cag gtc aca ggg aag ccc aaa gct gtt ggc cgg ccc tgc tac 1728 Lys Gln Gln Val Thr Gly Lys Pro Lys Ala Val Gly Arg Pro Cys Tyr 565 570 575 ctg acg cgc cag aag cac cca gcc ctg ccc agc aac cgg ccc cag cag 1776 Leu Thr Arg Gln Lys His Pro Ala Leu Pro Ser Asn Arg Pro Gln Gln 580 585 590 cag gtc ctg gtg ctg gcg gag ccc agg cgc aag cca tct acc ttc tgg 1824 Gln Val Leu Val Leu Ala Glu Pro Arg Arg Lys Pro Ser Thr Phe Trp 595 600 605 cac agc atc agc cgg ctg gca ccc ttc cgc aag tga 1860 His Ser Ile Ser Arg Leu Ala Pro Phe Arg Lys * 610 615 620

【図面の簡単な説明】

【図１】 新規蛋白質Ｍ１のアミノ酸配列の特徴および
相同ドメインの配列比較を説明する図である。（Ａ）ヒ
トＭ１の推定アミノ酸配列。ＳＨ３ドメインは太字、Ｄ
Ｈドメインは囲み太字、ＰＨドメインは太字かつ下線で
表示する。（Ｂ）Ｍ１と、Ｄｂｌファミリーのサブファ
ミリーメンバー；ＫＩＡＡ０４２４、Ｄｂｌ、Ｔｉａｍ
−１、Ｖａｖ、ｐ１１５−ＲｈｏＧＥＦ、ＣＤＣ２４お
よびＳｏｓ１との比較。ＤＨドメインの相同性はＭ１の
ＤＨドメインとほかのタンパクのＤＨドメインとの対応
比較における同一性／相同性の割合として計算した。
（Ｃ）ＤＨドメインのアミノ酸配列表。Ｍ１、ＫＩＡＡ
０４２４、Ｄｂｌ、Ｔｉａｍ−１、Ｖａｖ、ｐ１１５−
ＲｈｏＧＥＦ、ＣＤＣ２４およびＳｏｓ１のＤＨドメイ
ンを並列し、さらに最適化した。同一アミノ酸は白抜き
文字で示す。（Ｄ）ＰＨドメインのアミノ酸配列表。Ｍ
１と他のＧＥＦ蛋白質および基準となるヒトプレクスト
リン（ｐｌｅｃｋｓｔｒｉｎ）に存在するＰＨドメイン
を並列した。同一アミノ酸は白抜き文字で示す。

【図２】 新規蛋白質Ｍ１の発現を、ラット胎児脳、お
よびＭ１ｃＤＮＡを組み込んだ発現プラスミドｐｃＤＮ
Ａ３．１（＋）をトランスフェクトしたＣＯＳ−７細胞
で確認した図面である。図中、レーン１、２はラット胎
児脳、レーン３〜９は形質転換したＣＯＳ−７細胞での
Ｍ１発現を示し、形質転換のためのベクターとして、レ
ーン３と４はＭ１ｃＤＮＡを組み込んだベクター、レー
ン５はコントロールベクター、レーン６と８はＨＡ−タ
グで標識したＭ１ｃＤＮＡを組み込んだベクター、レー
ン７と９はＨＡ−タグを組み込んだコントロールベクタ
ーを使用した。また、レーン１、３、５は、予め抗Ｍ１
抗体を対応する抗原であるＭ１ペプチドで吸収して（ｐ
ｅｐ．＋）用いた結果である。

【図３】 新規蛋白質Ｍ１とＡＰＣ遺伝子産物とのｉｎ
ｖｉｖｏでの結合をラット胎児脳溶解物について解析
した結果を示す図面である。図中、レーン１および２は
ラット胎児脳の溶解物を抗Ｍ１抗体で、レーン３および
４は抗ＡＰＣ抗体で、レーン５および６は抗β−カテニ
ン抗体で免疫沈降した結果、レーン１、３、５は、予め
各抗体を対応する抗原で吸収して（ｐｅｐ．＋）用いた
結果である。

【図４】 新規蛋白質Ｍ１とＡＰＣ遺伝子産物との結合
部位を説明する図である。＋はＡＰＣ遺伝子産物との結
合活性陽性、−は陰性を表す。＊はＡＰＣ遺伝子産物の
アルマジロ配列をベイトとした２ハイブリッドスクリー
ニングで得られたクローンを示す。

【図５】 新規蛋白質Ｍ１とＲｈｏファミリー低分子量
Ｇ蛋白質との結合を示す図面である。

【図６】 新規蛋白質Ｍ１の低分子量Ｇ蛋白質からのＧ
ＤＰ解離に対する促進作用を示す図であり、図Ａは低分
子量Ｇ蛋白質Ｒａｃ１に対する作用、図Ｂは低分子量Ｇ
蛋白質ＲｈｏＡに対する作用を示す。。

【図７】 新規蛋白質Ｍ１の低分子量Ｇ蛋白質へのＧＴ
Ｐ結合に対する促進作用を示す図であり、図Ａは低分子
量Ｇ蛋白質Ｒａｃ１に対する作用、図Ｂは低分子量Ｇ蛋
白質ＲｈｏＡに対する作用を示す

【図８】 新規蛋白質Ｍ１のＧＥＦ活性が、ＡＰＣ−ア
ルマジロドメインの添加により増強されることを示す図
である。

【図９】 新規蛋白質Ｍ１とＡＰＣ遺伝子産物とが、そ
れらを発現した上皮細胞株中の細胞の辺縁の同一部位に
存在することを示す図面である。図中、ａ、ｂはＨＡ−
タグで標識したＭ１蛋白質を発現させた同一細胞、ｃ、
ｄはＨＡ−タグで標識したＭ１蛋白質とＭｙｃ−タグで
標識したＡＰＣ−ａｒｍとを両方発現させた同一細胞、
ｅはＨＡ−タグで標識したＭ１△ＮＢ（アミノ酸１２７
−６１９）を発現させた細胞、ｆはＭｙｃ−タグで標識
したＡＰＣ−ａｒｍを発現させた細胞である。また、
ａ、ｂは抗ＨＡ抗体と抗ＡＰＣ抗体で二重染色し、ｃ、
ｄは抗ＨＡ抗体と抗Ｍｙｃ抗体で二重染色し、ｅは抗Ｈ
Ａ抗体で、ｆは抗Ｍｙｃ抗体で処理したものである。ｂ
中の矢印頭は、ＡＰＣ蛋白質のクラスターの存在を示し
ており、また、ａ〜ｄ中の矢印は、Ｍ１とＡＰＣの存在
を示す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｋ 45/00 Ａ６１Ｋ 48/00 ４Ｃ０８４ 48/00 Ａ６１Ｐ 35/00 ４Ｃ０８５ Ａ６１Ｐ 35/00 Ｃ０７Ｋ 14/47 ４Ｃ０８６ Ｃ０７Ｋ 14/47 16/18 ４Ｈ０４５ 16/18 Ｃ１２Ｎ 1/15 Ｃ１２Ｎ 1/15 1/19 1/19 1/21 1/21 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ 5/10 Ｃ１２Ｑ 1/68 Ａ Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｇ０１Ｎ 33/15 Ｚ Ｃ１２Ｑ 1/68 33/50 Ｔ Ｇ０１Ｎ 33/15 Ｚ 33/50 33/574 Ａ Ｃ１２Ｐ 21/08 33/574 Ａ６１Ｋ 37/02 // Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ａ Ｆターム(参考） 2G045 AA26 AA34 AA35 CB02 DA12 DA13 DA14 DA36 FB02 FB03 4B024 AA01 BA44 BA80 CA04 DA12 GA11 HA01 4B063 QA01 QA19 QQ02 QQ43 QQ46 QQ58 QR32 QR40 QR72 QS25 QS33 4B064 AG01 CA06 CA19 CA20 CC24 DA01 DA14 4B065 AA72X AA93Y AB01 BA02 CA24 CA25 CA44 CA46 4C084 AA02 AA06 AA07 AA13 AA24 BA01 BA08 BA22 CA27 CA53 DA39 DC50 MA01 NA14 ZB262 ZC782 4C085 AA13 AA14 AA17 AA19 BB01 BB11 CC22 EE01 4C086 AA01 AA02 EA16 MA04 NA14 ZB26 4H045 AA10 AA11 BA10 CA40 DA86 EA50 FA74

Claims (18)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 下記の群より選ばれるポリペプチド； 配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列で示される
   ポリペプチド、 前記のポリペプチドのアミノ酸配列を含有するポリ
   ペプチド、 前記のポリペプチドと少なくとも約７０％のアミノ
   酸配列上の相同性を有しかつ大腸癌の癌抑制遺伝子（Ａ
   ｄｅｎｏｍａｔｏｕｓ Ｐｏｌｙｐｏｓｉｓ Ｃｏｌ
   ｉ：ＡＰＣ）の遺伝子産物のアルマジロリピート部位を
   コードするポリペプチドに対する結合能を有するポリペ
   プチド、および 前記からのポリペプチドのアミノ酸配列において
   １ないし数個のアミノ酸の欠失、置換、付加などの変異
   あるいは誘発変異を有し、かつＡＰＣ遺伝子産物のアル
   マジロリピート部位に対する結合能を有するポリペプチ
   ド。
2. 【請求項２】 配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配
   列の少なくとも５個のアミノ酸配列を有し、かつＡＰＣ
   遺伝子産物のアルマジロリピート部位に対する結合能を
   有するポリペプチド。
3. 【請求項３】 請求項１または２に記載のポリペプチド
   をコードするポリヌクレオチドまたはその相補鎖。
4. 【請求項４】 請求項３に記載のポリヌクレオチドまた
   はその相補鎖とストリンジェントな条件下でハイブリダ
   イゼーションするポリヌクレオチド。
5. 【請求項５】 配列表の配列番号２に記載のポリヌクレ
   オチドまたはその相補鎖の塩基配列のうち少なくとも１
   ５個の連続した塩基配列で示されるポリヌクレオチドで
   あって、該ポリヌクレオチドの転写によって発現される
   ポリペプチドがＡＰＣ遺伝子産物のアルマジロリピート
   部位に対する結合能を有する、ポリヌクレオチド。
6. 【請求項６】 請求項３から５のいずれか１項に記載の
   ポリヌクレオチドを含有する組換えベクター。
7. 【請求項７】 請求項６の組換えベクターで形質転換さ
   れた形質転換体。
8. 【請求項８】 請求項７の形質転換体を培養する工程を
   含む、請求項１または２に記載のポリペプチドの製造方
   法。
9. 【請求項９】 請求項１または２に記載のポリペプチド
   を免疫学的に認識する抗体。
10. 【請求項１０】 請求項１に記載のポリペプチドの、Ａ
    ＰＣ遺伝子産物のアルマジロリピート部位に対する結合
    性を阻害もしくは増強する化合物のスクリーニング方法
    であって、請求項１または２に記載のポリペプチド、請
    求項９に記載の抗体のうち、少なくともいずれか１つを
    用いることを特徴とするスクリーニング方法。
11. 【請求項１１】 請求項３もしくは４に記載のポリヌク
    レオチドと相互作用して該ポリヌクレオチドの発現を阻
    害もしくは増強する化合物のスクリーニング方法であっ
    て、請求項３から５のいずれか１項に記載のポリヌクレ
    オチド、請求項６に記載のベクター、請求項７に記載の
    形質転換体、請求項９に記載の抗体のうち少なくともい
    ずれか１つを用いることを特徴とするスクリーニング方
    法。
12. 【請求項１２】 請求項１に記載のポリペプチドのＧＥ
    Ｆ（グアニンヌクレオチド交換因子：Ｇｕａｎｉｎｅ
    ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ＥｘｃｈａｎｇｅＦａｃｔｏ
    ｒ）活性を阻害もしくは増強する化合物のスクリーニン
    グ方法であって、請求項１または２に記載のポリペプチ
    ド、請求項９に記載の抗体のうち少なくともいずれか１
    つを用いることを特徴とするスクリーニング方法。
13. 【請求項１３】 請求項１０から１２のいずれか１項に
    記載のスクリーニング方法でスクリーニングされる化合
    物。
14. 【請求項１４】 請求項１に記載のポリペプチドの、Ａ
    ＰＣ遺伝子産物のアルマジロリピート部位に対する結合
    性を阻害もしくは増強する化合物。
15. 【請求項１５】 請求項３から５のいずれか１項に記載
    のポリヌクレオチドと相互作用して該ポリヌクレオチド
    の発現を阻害もしくは増強する化合物。
16. 【請求項１６】 請求項１に記載のポリペプチドのＧＥ
    Ｆ活性を阻害もしくは増強する化合物。
17. 【請求項１７】 請求項１または２に記載のポリペプチ
    ド、請求項３から５のいずれか１項に記載のポリヌクレ
    オチド、請求項６に記載のベクター、請求項７に記載の
    形質転換体、請求項９に記載の抗体、または請求項１３
    から１６のいずれか１項に記載の化合物のうち、少なく
    ともいずれか１つを含有することを特徴とする、大腸腫
    瘍の治療に用いる医薬組成物。
18. 【請求項１８】 請求項１のポリペプチドの発現または
    活性に関連した疾病の診断手段であって、試料中の
    （ａ）該ポリペプチドをコードしているポリヌクレオチ
    ド、および／または（ｂ）該ポリペプチド、をマーカー
    として分析することを含む診断手段。