JP2002238579A - ヒト腫瘍関連遺伝子とタンパク質 - Google Patents
ヒト腫瘍関連遺伝子とタンパク質Info
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Abstract
子と、その発現タンパク質及びタンパク質に対する抗体
の提供。 【解決手段】 ヒト8番染色体q24.-2領域に存在し、特
定のアミノ酸配列を有するタンパク質をコードするヒト
腫瘍関連遺伝子hMLZEと、この遺伝子の発現タンパク質h
Mlze、およびタンパク質hMlzeを認識する抗体。
Description
関連遺伝子とその発現タンパク質に関するものである。
さらに詳しくは、この出願の発明は、ヒト悪性腫瘍の診
断法や治療法の開発に有用な新規ヒト遺伝子hMLZEと、
その発現産物であるタンパク質hMlzeに関するものであ
る。
速度で上昇している(文献1)。大部分の薄い腫瘍は外
科切除によって治癒できるが、黒色腫が一旦浸潤転移し
てしまうと、他の類似症状療法はほとんど無力化してし
まう。腫瘍悪性化(腫瘍浸潤)の基本的な変化を理解す
るために、悪性黒色腫の腫瘍転移モデル系が開発され
(文献2)、種々の転移挙動を再現する細胞系、例えば
マウス黒色腫細胞株B16(文献3)やK1735(文献4)が確
立されている。これら細胞株間の発現分子の差異を比較
することによって、腫瘍浸潤(転移)に関与する遺伝子
が同定された(文献5-8)が、その臨床的な関連性は限
定されている。
関与する遺伝子を探索するため、1組のB16マウス黒色
腫細胞(B16−F10とB16−BL6)を選択した。B16−F10細
胞は、元々新生黒色腫から確立された親B16黒色腫細胞
のin vivo選択(尾静脈注射後の肺への転移増殖)を10
回行って得られ、一方B16−BL6細胞はB16−F10細胞のin
vitro選択(マウス膀胱膜への浸透)を6回行って得ら
れた(文献9)。これらの細胞は遺伝子的にほぼ同一で
あり、そして尾静脈に注射したとき肺に転移増殖する高
い能力を有している。しかしながら、足底に注射したと
きは、B16−F10と比較してB16−BL6が高い転移頻度を示
す。この出願の発明者らは、これら細胞間の遺伝子発現
の差異を調べることによって腫瘍浸潤、特に真皮浸潤の
メカニズムへの洞察が得られるものと推測し、差引きcD
NAライブラリーを構築した(文献10の方法)。そして、
B16−F10細胞と比較してB16−BL6細胞で発現が増加して
いる一連の遺伝子を単離し、そしてこれら遺伝子のなか
には腫瘍転移において極めて重要な役割を果たしている
ものが存在することを報告している(文献11-14)。
願の発明者らによって、黒色腫瘍の転移亢進に関連する
マウス遺伝子の存在が明らかにされてきた。しかしなが
ら、実際の腫瘍転移に決定的な役割を果たすマウス腫瘍
関連遺伝子は特定されておらず、また当然のことながら
ヒト腫瘍関連遺伝子も特定されていなかった。
鑑みてなされたものであって、ヒト悪性黒色腫等の腫瘍
診断や治療に有用なヒト腫瘍関連遺伝子と、その発現蛋
白質を提供することを課題としている。
子の発現蛋白質に対する抗体を提供することを課題とし
てもいる。
を解決するものとして、以下の(1)〜(10)の発明を提供
する。 (1) ヒト8番染色体q24.-2領域に存在し、配列番号2
のアミノ酸配列を有するタンパク質をコードするヒト腫
瘍関連遺伝子hMLZE。 (2) cDNAが配列番号1の塩基配列を有する前記発明(1)
のヒト遺伝子hMLZE。 (3) 前記発明(1)のヒト遺伝子hMLZEのゲノムDNA、mRN
A、cDNAまたはそれらの相補配列から精製されたポリヌ
クレオチド。 (4) 前記発明(1)のヒト遺伝子hMLZEまたは前記発明(3)
のポリヌクレオチドにハイブリダイズする、10塩基対以
上の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド。 (5) 前記発明(3)のポリヌクレオチドを保有する組換え
ベクター。 (6) 前記発明(5)の組換えベクターによる形質転換体細
胞。 (7) 前記発明(1)のヒト遺伝子hMLZEの発現産物であっ
て、配列番号2のアミノ酸配列を有するヒトタンパク質
hMlze。 (8) 前記発明(6)の形質転換体細胞によって産生される
前記発明(7)のヒトタンパク質hMlze。 (9) 配列番号2の連続5アミノ酸残基以上のアミノ配
列からなるペプチド。 (10) 前記発明(7)のヒトタンパク質hMLZEを認識する抗
体。
悪性黒色腫細胞株B16-BL6 cDNAライブラリーからB16-F1
0 cDNAを差し引き(subtraction)、新規のマウス遺伝
子MLZE(mMLZE)を単離した。この遺伝子mMLZEは、ノー
ザンブロット解析の結果、悪性黒色腫B16-BL6株で高頻
度に発現しているが、正常な皮膚細胞(メラノサイト)
では発現が検出されなかったことから、悪性黒色腫の浸
潤転移に重要な役割を果たす新規マウス遺伝子であるこ
とが確認された。このマウス遺伝子mMLZEは、1570bpの
翻訳領域(open reading frame:ORF)(GenBank Access
ion No. AB042406)を有しており、468アミノ酸残基から
なる推定分子量53kDaのタンパク質をコードしていた。
そして、発明者らは、このmMLZE塩基配列についてヒトE
STクローンのホモロジー検索を来ない、相同性の高いヒ
トESTクローンを特定し、このESTクローンをプローブと
してヒトcDNAライブラリーをスクリーニングすることに
よって、悪性黒色腫の転移亢進に関与する新規ヒト遺伝
子hMLZE cDNAを単離した。この新規遺伝子hMLZEは、そ
の全長cDNAが2758bp(配列番号1)であり、1527bpから
なるPRFには508アミノ酸配列(配列番号2)からなるタ
ンパク質hMlze(推定分子量約57kDa)をコードしてい
る。
記のとおり、この遺伝子hMLZEが悪性黒色腫だけでな
く、多くのヒト悪性腫瘍に関与することも見出した。
ト遺伝子およびその発現タンパク質を基礎とするもので
ある。なお、前記の発明において、「ポリヌクレオチ
ド」および「オリゴヌクレオチド」は特定塩基数の断片
を意味するものでなく、一応の目安として100bp以上の
断片をポリヌクレオチド、100bp未満の断片をオリゴヌ
クレオチドとするが、例外も存在する。同様に、オリゴ
ペプチドについても特定範囲のアミノ酸残基数に限定さ
れるものではない。
を詳しく説明する。
ZEは、前記のとおり、ヒト8番染色体q24.-2領域に存在
し、配列番号2のアミン酸配列を有するヒト腫瘍関連タ
ンパク質hMlzeタンパク質をコードするゲノム遺伝子で
ある。さらに詳しくは、このhMLZE遺伝子は、発明(2)に
示したように、そのcDNAが配列番号1の塩基配列を有す
ることを特徴としている。
明(4)のポリヌクレオチド作製のために有用であり、さ
らには悪性黒色腫をはじめてとす各種のヒト悪性腫瘍の
診断や、治療薬開発の対象遺伝子等としても有用であ
る。
れがコードするタンパク質の発現に対する制御領域(プ
ロモーター/エンハンサー、サプレッサー等)も含まれ
る。これらの発現制御領域は、タンパク質hMlzeの機能
や、あるいは遺伝子hMLZEの発現制御因子の探索に有用
である。
列番号1の塩基配列またはその一部配列からなるポリヌ
クレオチドまたはオリゴヌクレオチドをプローブとして
ヒトゲノムDNAライブラリーをスクリーニングすること
によって単離するすることができる。
ゲノムDNA、mRNA、cDNAまたはこれらの相補配列から精
製されたポリヌクレオチドである。このようなポリヌク
レオチドは、発明(4)のオリゴヌクレオチドの調製や、
タンパク質hMlzeの遺伝子工学的生産のための材料とし
て有用である。
ら単離したゲノムDNAやmRNAから公知の方法により精製
することによってDNA断片やRNA断片として得ることがで
きる。また、cDNAはヒト細胞から抽出したポリ(A)+RNA
Nを鋳型として合成することができる。ヒト細胞として
は、人体から手術などによって摘出されたものでも培養
細胞でも良い。cDNAは、公知の方法(Mol. Cell Biol.
2, 161-170, 1982; J. Gene 25, 263-269, 1983; Gen
e, 150, 243-250, 1994)を用いて合成することができ
る。あるいは、オリゴヌクレオチドをプライマ−とし
て、ヒト細胞から単離したmRNAを鋳型とするRT-PCR法を
用いて、目的cDNAを合成することもできる。このように
して調製されるcDNAは、具体的には配列番号1の塩基配
列を有している。なお、一般にヒト遺伝子は個体差によ
る多型が頻繁に認められる。従って配列番号1の塩基配
列において、1または複数個(10以下)のヌクレオチド
の付加、欠失および/または他のヌクレオチドによる置
換がなされているポリヌクレオチドもこの発明のポリヌ
クレオチド(cDNA)の範囲に含まれる。また、同様に、
これらの変更によって生じる、1または複数個のアミノ
酸の付加、欠失および/または他のアミノ酸による置換
がなされているタンパク質も、タンパク質hMlzeの活性
を有する限り、後記発明(7)のタンパク質の範囲に含ま
れる。
たは前記発明(3)のポリヌクレオチドにハイブリダイズ
する、10塩基対以上の塩基配列からなるオリゴヌクレオ
チドである。これらのオリゴヌクレオチド(DNA断片ま
たはRNA断片、若しくはそれらのアンチセンス鎖)は、
例えば、遺伝子hMLZEやその変異を検出するためのプロ
ーブ、あるいはポリヌクレオチドを合成するためのPCR
プライマーとして有用である。また、悪性黒色腫やその
他の悪性腫瘍診断用のマイクロアレイ等のためのDNA断
片やRNA断片として使用することもできる。このような
オリゴヌクレオチドは、常法により合成して調製するこ
ともでき、あるいは場合によっては発明(3)のポリヌク
レオチドを適当な制限酵素で切断することによってもで
きる。
ドを保有する組換えベクターである。ベクターはクロー
ニングベクターまたは発現ベクターであり、インサート
としてのポリヌクレオチドの種類や、その使用目的等に
応じて適宜のものを使用する。例えば、cDNAまたはその
ORF領域をインサートとしてタンパク質hMlzeを生産する
場合には、in vitro転写用の発現ベクターや、大腸菌、
枯草菌等の原核細胞や、酵母、昆虫細胞、哺乳動物細胞
等の真核細胞のそれぞれに適した発現ベクターを使用す
ることができる。また、遺伝子hMLZEのゲノムDNAをイン
サートとする場合には、BAC(Bacterial Artificial Ch
romosome)ベクターやコスミドベクター等を使用するこ
ともでき、こられらの組換えベクターは、例えば蛍光in
situハイブリダイゼーション(FISH)による染色体異
常を診断するためのプローブとして有用である。さらに
は、遺伝子hMLZE由来のポリヌクレオチドをウイルスベ
クター等に組換え、これを遺伝子治療に用いることもで
きる。
による形質転換体細胞である。これらの細胞は、例え
ば、タンパク質hMlzeを製造する場合には、大腸菌、枯
草菌等の原核細胞や、酵母、昆虫細胞、哺乳動物細胞等
の真核細胞等を使用することができる。また、遺伝子hM
LZE由来のポリヌクレオチドを組み換えたウイルスベク
ターによって形質転換したメラノサイト等の細胞は、遺
伝子治療に用いることもできる。これらの形質転換体細
胞は、電気穿孔法、リン酸カルシウム法、リポソーム
法、DEAEデキストラン法など公知の方法によって組換え
ベクターを細胞に導入することによって調製することが
できる。
発現産物であって、配列番号2のアミノ酸配列を有する
ことを特徴とするタンパク質hMlzeである。このタンパ
ク質は、抗体作製のための免疫原として、あるいは悪性
黒色腫やその他の悪性腫瘍の治療薬を開発するための標
的分子等として有用である。このタンパク質は、ヒト細
胞から単離する方法、配列番号2のアミノ酸配列に基づ
き化学合成によってペプチドを調製する方法等によって
得ることができるが、好ましくは、発明(6)の形質転換
細胞から単離・精製する方法によって大量に生産せるこ
とができる(発明(8))。すなわち、形質転換体細胞を
培養し、その培養物から、例えば、尿素などの変性剤や
界面活性剤による処理、超音波処理、酵素消化、塩析や
溶媒沈殿法、透析、遠心分離、限外濾過、ゲル濾過、SD
S-PAGE、等電点電気泳動、イオン交換クロマトグラフィ
ー、疎水性クロマトグラフィー、アフィニティークロマ
トグラフィー、逆相クロマトグラフィー等によって単
離、精製することによってタンパク質hMlzeを大量に得
ることができる。なお、発明(7)のタンパク質には、他
の任意の蛋白質との融合蛋白質も含まれる。例えば、グ
ルタチン−S−トランスフェラ−ゼ(GST)や緑色蛍光
蛋白質(GFP)との融合蛋白質などが例示できる。さら
に、細胞で発現したタンパク質は、翻訳された後、細胞
内で各種修飾を受ける場合がある。したがって、修飾さ
れたタンパク質も発明(7)のタンパク質の範囲に含まれ
る。このような翻訳後修飾としては、N末端メチオニン
の脱離、N末端アセチル化、糖鎖付加、細胞内プロテア
−ゼによる限定分解、ミリストイル化、イソプレニル
化、リン酸化などである。
残基以上のアミノ酸配列からなるオリゴペプチドであ
る。このオリゴペプチドは、例えば抗体作製のための抗
原として使用することができ、例えば、配列番号2のア
ミノ酸配列に基づき、公知のペプチド合成法等により作
成することができる。
認識するポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体
である。この抗体は、細胞でのタンパク質hMlzeまたは
その変異体タンパク質の発現を調べることによって悪性
黒色腫やその他の悪性腫瘍の診断を行うための材料等と
して有用である。この抗体には、タンパク質hMlzeのエ
ピトープに結合することができる全体分子、およびFa
b、F(ab')2、Fv断片等が全て含まれる。このような抗体
は、例えばポリクローナル抗体の場合には、前記のタン
パク質hMlzeやそのペプチドを抗原として用いて動物を
免役した後、血清から得ることが出きる。あるいは、上
記の真核細胞用発現ベクターを注射や遺伝子銃によっ
て、動物の筋肉や皮膚に導入した後、血清を採取するこ
とによって作製することができる。動物としては、マウ
ス、ラット、ウサギ、ヤギ、ニワトリなどが用いられ
る。免疫した動物の脾臓から採取したB細胞をミエロ−
マと融合させてハイブリド−マを作製すれば、モノクロ
−ナル抗体を産生することができる。
いてさらに詳細かつ具体的に説明するが、この出願の発
明は以下の例によって限定されるものではない。
グ 差引きcDNAライブラリーの調製は文献11-12の記載に従
って行った。目的クローンを得るため、λZAP-cDNA合成
キット(Stratagene社)を使用してHeLa細胞からヒトcD
NAライブラリー調製した。PCRで得られた放射標識ESTク
ローンAW276035を使用して、総計1×106個のクローン
をスクリーニングし、陽性クローンから得られたインサ
ートcDNAをin vivoで切断してpBluescript II SK(-)ベ
クター内に挿入した。また、放射標識hMLZE翻訳領域を
使用して、ヒト胎盤ゲノムDNAライブラリー(TaKaRa
社)の総計1×106個のクローンをスクリーニングし
た。 1.2 ノーザンブロット分析 トータルRNAは、グアニジンチオシアネート/CsTFA法を
使用して調製した。ノーザンブロット分析用に、変性ゲ
ル電気泳動でトータルRNA 20〜30μgを分離し、Biodyne
A(PALL社)に移した。ヒト多組織ノーザンブロットは
Clontech社製を使用した。ハイブリダーゼーションプロ
ーブは、Random Primer DNA LabelingKit(Takara社)
を使用し、hMLZE翻訳領域を[α−32P]dCTPで放射標識
して調製した。 1.3 GFP融合タンパク質のin vivo分析 GFP融合遺伝子を作成するため、KODポリメラーゼ(TOYO
BO社)を使用してhMLZEライブラリークローンの翻訳領
域をを増幅した。プライマーは停止コドンと制限酵素As
cIおよびNotIサイトを含んでおり、これらの制限酵素サ
イトを利用してPCR産物をpEGFP3Bベクター(文献15)に
連結した。
7は、LipofectAMINEトランスフェクション試薬(Gibco-
BRL社)を使用して一過性にトランスフェクションし
た。細胞は、35mmのガラス底培養皿中でトランスフェク
ション後24時間培養し、その後逆方向レーザー走査型顕
微鏡(Zeiss LSM410)によってin vivoで観察した。 1.4 蛍光in situハイブリダイゼーション ヒト胎盤ゲノムDNAライブラリーをスクリーニングする
ことによってhMLZEの翻訳領域を得た。陽性クローンをE
coRIで消化し、hMLZE配列を含む7kbフラグメントを得
た。このフラグメントがhMLZE cDNA(配列番号1)の位
置1614から1726までの配列を含有していることをPCRで
確認した。Rバンド化ヒト染色体の蛍光in situハイブリ
ダイゼーション(FISH)分析は、文献(16)の記載に従
って実施した。すなわち、ビオチン標識ゲノムDNAプロ
ーブ150ngを中期染色体スプレッドとハイブリッド形成
させた。蛍光色素検出用に、上記スライドをフルオレセ
インイソチオシアネート(FITC)抱合アビジン(Vector
Laboratorie社)と共にインキュベートし、洗浄した。
FITCシグナルは、ビオチン標識ヤギ抗アビジン抗体(Ve
ctor Laboratories社)とのインキュベーション、続い
てFITC抱合アビジンとのインキュベーションによって増
幅させた。調製物はプロピジウムヨージドで対比染色
し、レーザー走査型顕微鏡(Zeiss LSM410)で観察し
た。 1.5 抗体 pET28aのマルチクローニングサイトをpET32a(Novagen
社)のマルチクローニングサイトとDraIおよびTthl11サ
イトに置換して改変pET28aベクター(Novagen社)に、h
MLZE翻訳領域を挿入結合した。このプラスミドをBL21-C
odonPlus(Stratagene社)に形質転換し、0.2mMイソプ
ロピルチオガラクトシドを使用して6Hisタグ付きhMlze
の発現を誘導した。超音波処理で溶菌し、8M尿素、0.5
M NaCl、5mMイミダゾールおよび20mMトリス−HCl[pH
8.0]を使用して不溶性ペレットから6Hisタグ付きhMlz
eタンパク質を抽出した。抽出されたタンパク質をTALON
樹脂に写し、イミダゾールで溶出した。この精製タンパ
ク質でウサギを免疫し、ポリクローナル抗体を産生させ
た。 1.6 ウエスタンブロット分析 全細胞溶解物は、106個の細胞ペレットに10倍量の溶解
緩衝液(50mMトリスHCl[pH 8.0]、250mM NaCl、0.1%
NP-40、1mM PMSF)を添加して調製した。この溶解物
(タンパク質50μg)を5分間沸騰させ、10%SDSポリア
クリルアミドゲル電気泳動(PAGE)で分離し、Immobilo
n膜(Millipore社)に移した。この膜を、1:200希釈
のウサギ抗hMlzeポリクローナル抗体または1:1000希
釈のウサギ抗GFPポリクローナル抗体(MBL社)と共に1
時間インキュベートし、次いで1:1000希釈のホースラ
ディッシュペルオキシダーゼ標識抗ウサギIgG抗体(MBL
社)と共にインキュベートした。免疫複合体を検出する
ために、Renaissance化学発光試薬(Dupont/NEN社)を
使用した。 1.7 ヒト黒色腫細胞および母斑試料 黒色腫細胞は、大阪大学病院での診断時に外科手術を受
けた26人のメラノーマ患者から得た。母斑試料は、同病
院で切除手術を受けた5人の患者から得た。外科試料は
ホルマリンで固定し、パラフィン包埋した。 1.8 免疫組織化学分析 ホルマリンで固定しそしてパラフィンに埋め込んだ標本
からパラフィンを除去し、そして一連の傾斜アルコール
中で水和化した。内在性ペルオキシダーゼは0.3%過酸
化物を有するリン酸緩衝生理食塩液中で失活させた。こ
れらの試料は1:200希釈の抗hTib23ポリクローナル抗
体又は1:100希釈の抗c−Mycモノクローナル抗体(Ab
-1、Oncogene Science)と共に室温で2時間インキュベ
ートし、続いてホースラディッシュペルオキシダーゼ抱
合抗ウサギIgG抗体又は抗マウスIgG1抗体(MBL、名古屋
市)と共に室温で1時間インキュベートした。その後、
最終産生物は、ペルオキシダーゼの基質としてジアミノ
ベンジジン(DAB)又はアミノエチルカルバゾール(AE
C)を使用して視覚化した。陰性対照は、一次抗体の代
わりに非免疫化ウサギIgGを使用して実施した。これら
のスライドは、必要な場合、マイヤーのヘマトキシリン
で対比染色した。 1.9 統計 統計的有意差は、χ2およびフィッシャー検定で分析し
た。 2. 結果と考察 2.1 hMLZE cDNAの単離 B16−F10 cDNAを差し引いたマウスメラノーマB16−BL6
cDNAライブラリーのスクリーニング(文献11)により、
マウスの新規遺伝子mMLZEを単離した。B16−F10細胞お
よびびB16−BL6細胞のノーザンブロット分析によって、
この遺伝子mMLZEの約2.4kb転写産物がB16−BL6細胞内で
は高度に発現され、B16−F10細胞内では中程度に発現さ
れることが明らかになった(図1)。また、マウスメラ
ノサイト細胞株melan−a、マウスメラノーマ細胞株B16
−F1(B16−F10の親株)においてもノーザンブロット分
析を行った結果、これらの細胞ではmMLZE転写産物は全
く検出されなかった。このマウス遺伝子mMLZEは1570bp
のORFを含んでおり(GenBank Accession No. AB04240
6)、推定分子量約53kDaの468アミノ酸残基からなるタ
ンパク質をコードしていた。
として、ヒトESTクローンAW276035.1およびAI05243.1を
特定した。このAW276035.1のDNAフラグメントをPCR増幅
し、さらに放射標識プローブとして、ヒト子宮頸癌細胞
HeLa cDNAライブラリーをコロニーハイブリダイゼーシ
ョンでスクリーニングし、hMLZE cDNAを単離した。この
ヒトcDNAクローンは2758bp長であり(配列番号1)、そ
ノーザンブロット分析によって、HeLa細胞におけるその
転写産物サイズが約2.8kbであることが確認された(デ
ータは示さず)。このことから、このcDNAクローンが遺
伝子hMLZE由来の全長cDNAであると判断された。このク
ローンは、1527bpからなるORFを有しており、このORFに
は推定分子量57kDaの508アミノ酸配列(配列番号2)か
らなるタンパク質hMlzeがコードされていた。
始部位のコンセンサス(文献17)と一部合致していた。
また、ウサギ網状赤血球を用いたin vitro翻訳によっ
て、約60kDaのタンパク質が産生されたことから、この
予測された開始コドンがin vitroで機能的であることが
確認された。さらに、国立バイオテクノロジー情報セン
ター(NCBI)(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/)
での相同性検索によって、配列番号2のアミノ酸配列か
らなるタンパク質は、これまでに同定されたタンパク質
と明白な相同性を全く示さないことが明らかになった。
基性アミノ酸に富んでおり、特に配列番号1の位置133
〜151(KRKLLDPEPSFLKECRR)および位置201〜218(KKAL
TLQKGMVMAYKRK)は2極性核シグナルモチーフ(文献1
8)と一致した。またC末端はロイシンに富む領域を含
有しており、配列番号2の位置392〜413にロイシンジッ
パー構造を含んでいる。 2.2 正常ヒト組織におけるhMLZEの発現 hMLZE mRNAの組織分布を調べるため、放射標識hTIB23翻
訳領域をプローブとして、多数のヒト組織についてノー
ザンブロット分析を行った。結果は図4に示したとおり
であり、約2.8kbの転写産物が気管および脾臓で発現す
ることが確認された。 2.3 hMLZEの細胞内局在性 GFP融合コンストラクトを使用してhMLZEの細胞内局在性
を調べた。hMLZEのN末端領域は塩基性アミノ酸残基に
富んでおり、2個の2極性核シグナルモチーフを含んで
いるので、hMLZEは核に局在している可能性が想定され
る。ヒト胚性腎細胞293Tおよびサル腎細胞COS-7をGFP融
合コンストラクトで一過性にトランスフェクションし、
in vivo局在性をレーザー走査型顕微鏡によって観察し
た。結果は図5に示したとおりであり、予期に反してGF
P融合hMlze(pEGFP−hMLZE)は細胞質に局在していた。
調べるため、タンパク質hMlzeを2つに分け、それぞれ
のGFP融合タンパク質の細胞内局在性を検査した。GFP-
融合ΔC(pEGFP3B−hMLZE−ΔC;アミノ酸位置247〜
508)は細胞質と核に均等に分布していたが、2個の2
極性核シグナルモチーフを含有するGFP-融合ΔN(pEG
FP3B−hMLZE−ΔN;アミノ酸位置1〜246)は細胞質に
局在していた(図3)。 2.4 hMLZE遺伝子の染色体局在性 hMLZE遺伝子の染色体位置をFISH分析で決定した。図5
に示したように、ビオチン結合hMLZEゲノムDNAフラグメ
ントからの特定FISHシグナルはヒト8番染色体(遺伝子
名称:MELE)の長腕テロメア領域で観察された。他の再
現可能なシグナルは中期染色体では観察されなかった。
従って、hMLZE遺伝子は8q24.1-2領域に局在する遺伝子
であることが確認された。この領域のコピー数は、メラ
ノーマでは約30%の割合で増加することが報告されてい
る(文献19)。 2.5 ヒト悪性黒色腫におけるhMlze発現と亢進したClar
kレベルとの相関関係 6Hisタグ標識hMlze組換えタンパク質でウサギを免疫化
し、ポリクローナル抗体を得た。pEGFP3Bベクターまた
はpEGFP3B−hMLZEで一過性にトランスフェクションした
293T細胞の抽出物をウエスタンブロット分析した。抗GF
P抗体と抗hMlze抗体は共に、GFP(27kDa)タグ付きhMlz
e(57kDa)タンパク質の予想分子量と良好に一致する84
kDaのタンパク質を認識した(図6A)。この認識され
たバンドは、過剰量の抗原性組換えタンパク質と競合し
たとき消失することから(データは示さず)、この抗体
がhMlzeを特異的に認識することが確認された。また、B
16-BL6転移性コロニーを抗hMlze抗体で染色した場合に
は、B16-BL6細胞に細胞質染色が観察された(図6
B)。培養B16-BL6細胞にも同様の細胞質染色が観察さ
れた(図6B)。BL6細胞における染色は抗原性組換えh
Mlzeタンパク質の過剰添加によって消失した(データは
示さず)。以上の結果からも、hMlzeのN末端側には2
個の2極性核シグナルモチーフを含有するが、hMlzeは
細胞質に局在することが確認された。
皮膚、母斑およびメラノーマで免疫組織化学的に評価し
た。パラフィンに包埋した組織試料を抗Mlze抗体で染色
し、ヘマトキシリン染色した。各セクションから得られ
た対照試料は、一次抗体の代わりに非免疫化ウサギIgG
を使用し、同様にヘマトキシリン染色した。結果は図7
に示したとおりであり、正常皮膚内部では、抗hMlze抗
体はメラノサイトを染色しなかった。このことは、マウ
スメラノサイトmelan−aのノーザンブロット分析と一
致した(図1参照)。また、5つの良性母斑内のメラノ
サイトは抗hMlze抗体に陰性であった(図7)。
メラノーマ試料についてタンパク質hMlzeの発現を調べ
た。3つの症例は主として紡錘細胞形態を、2つの症例
は紡錘化した類上皮細胞形態を、そして残りは主として
類上皮細胞形態を有していた。8個の試料(30%)でメ
ラノーマ細胞の細胞質染色が観察された(図7)。細胞
内染色パターンは、GFP-融合コンストラクトを使用した
細胞内局在性の試験結果(図3)と一致した。また、こ
の染色パターンは過剰の抗原性組換えタンパク質で消失
した(データは示さず)。
つのカテゴリー(文献17)に分類し、タンパク質hMlze
の発現と腫瘍進行の相関関係を評価した。結果は表1に
示したとおりであり、進行したClark浸潤レベルIII、IV
およびV(55%)(図8B、表I)は、Clark浸潤レベルI
およびII(13%)(図8A、表I)と比較したとき、hMlz
e発現と有意な相関関係が観られた(p=0.038)。進行
したClark浸潤レベルを有する6つのhMlze陽性症例中、
1例(症例番号24)では免疫反応の頻度および強度が増
加し、真皮にまで進行的に降下していることが示された
(図8C)。以上の結果から、腫瘍が浸潤および転移能
力を獲得するにつれてMLZE遺伝子発現が増加することが
確認された。また、MLZE遺伝子が、特に真皮への浸潤能
力の獲得において、メラノーマの腫瘍進行に関与してい
ることが示唆された。
反応を試験した。このc−myc遺伝子は、hMLZE遺伝子に
近接した8番染色体q23領域にマッピングされ、周辺領
域の増幅が悪性メラノーマの30%で報告されている(文
献19)。hMlzeの発現は、対応する染色体領域の増幅に
よるc−Mycの過剰発現に起因する可能性があるからで
ある。試験の結果、8つのhMlze陽性症例のうち2例し
か抗c−Myc抗体に対する陽性反応(細胞質染色)を示
さなかった。図8にc−Myc陽性症例およびc−Myc陰性
症例の代表例を示す。1つの陽性症例(症例19)は主と
して腫瘍の上部皮膚構成成分で抗体陽性を示し、一方抗
hMlze抗体陽性は腫瘍全体で観察された(図8)。
6)、脳腫瘍(文献27)、乳癌(文献28)および肺癌
(文献29)で高頻度で発現することが報告されている。
また原発性皮膚黒色腫では、この領域のコピー数は約30
%の割合で増加することが報告されている(文献19)。
従って、hMLZE遺伝子が黒色腫だけでなく、これらの腫
瘍の発症や進行にも関与することが示唆された。しかし
ながら、上記の試験結果は、この発明のMLZE遺伝子が、
8q24領域に存在するc−mysとは異なる発現調節にある
ことを明確に示している。
よって、悪性黒色腫等のヒト悪性腫瘍に関連する遺伝子
とその発現タンパク質、およびタンパク質に対する抗体
が提供される。これらの遺伝子やタンパク質、抗体は悪
性腫瘍の診断法や治療法の開発のための材料として有用
である。
1年)。 2) Nature 242、148〜149(1973年)。 3) Am. J. Pathol. 97、587〜600(1979年)。 4) Clin Exp Metastasis 6、301〜318(1988年)。 5) Curr. Opin. Oncol. 7、162〜169(1995年)。 6) J. Natl. Cancer. Inst. 80、200〜204(1988年)。 7) Cancer Res. 56、875〜879(1996年)。 8) Cancer Res. 56、5266〜5271(1996年)。 9) Cancer Res.、40、1636〜1644(1980年)。 10) Genes Cells. 3、459〜475(1998年)。 11) EMBO J. 19、562〜571(2000年)。 12) J. Clic. Invt. 105、1189〜1197(2000年)。 13) Cancer Letter 147、139〜147(1999年)。 14) Jpn. J. Cancer Res. 91、75〜83(2000年) 15) Genomics 57、94〜101(1999年)。 16) Genomics 38、92〜95(1996年)。 17) Nuc. Acids Res. 12、857〜872(1984年)。 18) Trends. Biochem. Sci. 16、478〜481(1991年)。 19) Cancer Res. 58、2170〜2175(1998年)。 20) Cancer Res. 29、705〜726(1969年)。 21) Science 246、911〜916(1989年)。 22) Cell 82、463〜473(1995年)。 23) Cancer Res. 45、5670〜5676(1985年)。 24) J. Natl. Cancer Inst. 81、1406〜1412(1989
年)。 25) J. Invest. Dermatol. 100、342〜345(1993年)。 26) Genes Chromosomes Cancer 20、320〜328(1997
年)。 27) Genes Chromosomes Cancer 21、340〜346(1998
年)。 28) Genes Chromosomes Cancer 10、160〜170(1994
年)。 29) Cancer Gene Cytogenet 95、20〜32(1997年)。 30) Virchows. Arch. 426、461〜467(1995年)。 31) J. Invest. Dermatol. 112、332〜336(1999年)。
ヒトMLZEのノーザンブロット分析の結果である。マウス
メラノサイトmelan−aおよびマウスメラノーマ細胞株B
16−F1、B16−F10およびB16−BL6に由来するトータルRN
A20μgを含有するノーザンブロットを、32P標識mMLZE
cDNAとハイブリッド形成させた(上段)。ブロットは
マウスβ−アクチンプローブを使用して再度精査した
(下段)。約2.4kbの転写産物がB16−F10では中程度
に、B16−BL6では豊富に検出されたが、melan−aおよ
びB16−F1では転写産物は検出されなかった。
アミノ酸配列である。ボックス印は塩基性アミノ酸残
基、下線は2極性核局在化シグナルモチーフ、二重下線
はロイシンジッパーモチーフ、丸印はロイシンジッパー
モチーフを構成する4個の疎水性アミノ酸残基、星印は
停止コドンである。
ロット分析結果である。1レーン当たり約2μgのポリ
(A)+RNAを含有するヒト多組織ノーザンブロットパネル
を 32P標識hMLZEとハイブリッド形成させた(上段)。
約2.8kbの転写産物が気管および脾臓で僅かに検出され
た。各レーンのRNA量は、ヒトβ−アクチンプローブ
(下段)を使用して標準化した。
の試験結果である。左端のイラストはヒト293Tおよびサ
ルCOS-7細胞内で発現させるためのGFP融合タンパク質の
模式図である。ボックスの下の数字はhMlzeタンパク質
中のアミノ酸残基位置を示している。楕円形はGFPタン
パク質、星印は核局在化シグナル、灰色ボックスはロイ
シンジッパー構造を示す。FLおよびPh欄はそれぞれ蛍光
および位相差画像である。FL画像は各GFP融合タンパク
質の細胞内局在性を示す。293TおよびCOS-7細胞を各融
合コンストラクトで一過性にトランスフェクションし、
24時間後に蛍光顕微鏡によってin vivoで分析した。目
盛り棒は10μmを示す。
る。ビオチン結合hTIB23ゲノムフラグメントをプローブ
としてRバンド化染色体のFISH分析を行った。中期全体
(A)および中期の一部分(B)の分析結果である。画
像分析ソフトウェアを使用して、FITCハイブリダイゼー
ションシグナルとプロピジウムヨージドで染色した染色
体の別々の画像を合わせ、レーザー走査型顕微鏡に取り
付けたカメラを使用してデジタル画像として撮影した。
矢印は8番染色体の長腕上の特異的なFITCシグナルを示
している。ヒト8番染色体の模式図およびhMLZE遺伝子
の局在性は右側に示した。
ある。Aは、293T細胞にpEGFP3BベクターまたはpEGFP
3B−hMLZEを一過性にトランスフェクションし、免疫ブ
ロット法で分析した結果である。抗GFP抗体および抗hMl
ze23抗体は共に、GFP(27kDa)融合hMlze(57kDa)タン
パク質(矢印)を認識した。Bは抗hNlze抗体を用いたh
Mlzeの免疫染色の結果である。B16-BL6転移性コロニー
を抗hMlze抗体により染色した(上段中央)。コントロ
ールとして非免疫性IgGを用いて染色した(上段左)。
免疫染色サンプルはまた、ヘマトキシリンによって共染
色した(上段右)。培養BL6細胞は抗hMlze抗体と免疫反
応させ、FITCで染色した(下段)。下段右(FL)は蛍光
像、下段左(Ph)は位相差像である。
織化学的染色の結果である。試料は抗hMlze抗体を使用
して(下段)、また対照の染色については非免疫化正常
IgGを使用して(上段)精査した。試料は全てヘマトキ
シリンで対比染色した。正常皮膚のメラノサイト(矢
印)および母斑細胞は染色に対して陰性であったが、メ
ラノーマは細胞質染色を示した(正常皮膚ではオリジナ
ル倍率10倍、母斑およびメラノーマでは40倍)。
ラノーマの免疫組織化学試験の結果である。試料は各抗
体で染色し、ヘマトキシリンで対比染色した。上段はhM
lze発現が陽性で、c−Myc発現が陰性のClark浸潤レベ
ルIIメラノーマの1例。hMlzeに対する細胞質染色が観
察される(LOW X:オリジナル倍率4倍、HIGH X:オリ
ジナル倍率20倍)が、c−myc染色は観察されない(オ
リジナル倍率20倍)。中断はhMlzeとc−mycの両方の発
現が陽性のClark浸潤レベルIIIメラノーマの1例。hMlz
e染色の全体像を低倍率で示した。また腫瘍の上部およ
び下部皮膚構成成分(ボックス)を高倍率で示した。上
部構成成分はhMlzeとc−Mycが共に陽性であり、一方下
部構成成分はhNlze陽性であるがc−Myc陰性である。下
段はhMlze陽性でc−Myc陰性のClark浸潤レベルIVメラ
ノーマの1例。hMlze染色は、腫瘍の上部構成成分と比
較したとき、主として下部構成成分で観察された。
Claims (10)
- 【請求項1】 ヒト8番染色体q24.-2領域に存在し、配
列番号2のアミノ酸配列を有するタンパク質をコードす
るヒト腫瘍関連遺伝子hMLZE。 - 【請求項2】 cDNAが配列番号1の塩基配列を有する請
求項1のヒト遺伝子hMLZE。 - 【請求項3】 請求項1のヒト遺伝子hMLZEのゲノムDN
A、mRNA、cDNAまたはそれらの相補配列から精製された
ポリヌクレオチド。 - 【請求項4】 請求項1のヒト遺伝子hMLZEまたは請求
項3のポリヌクレオチドにハイブリダイズする、10塩基
対以上の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド。 - 【請求項5】 請求項3のポリヌクレオチドを保有する
組換えベクター。 - 【請求項6】 請求項5の組換えベクターによる形質転
換体細胞。 - 【請求項7】 請求項1のヒト遺伝子hMLZEの発現産物
であって、配列番号2のアミノ酸配列を有するヒトタン
パク質hMlze。 - 【請求項8】 請求項6の形質転換体細胞によって産生
される請求項7のヒトタンパク質hMlze。 - 【請求項9】 配列番号2の連続5アミノ酸残基以上の
アミノ配列からなるペプチド。 - 【請求項10】 請求項7のヒトタンパク質hMlzeを認
識する抗体。
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