JP2003047469A - ヒト表皮自己抗原蛋白質及びその遺伝子 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 ヒト表皮自己抗原に関する蛋白質及び該蛋白
質をコードする遺伝子に関し、特に皮膚等の自己免疫疾
患の診断や免疫療法に応用することができ、ヒトの皮膚
や消化管の粘膜に存在する抗原蛋白質やかかる抗原蛋白
質のエピトープ、それらをコードするＤＮＡ、及びかか
る蛋白質等を用いた、エピプラキン活性促進物質又は抑
制物質等のスクリーニング方法や、自己免疫疾患治療薬
や、自己免疫疾患診断キット等を提供すること。 【解決手段】 自己免疫性水疱症患者の血清が認識する
ヒト４５０ｋＤａのヒト表皮自己抗原であるエピプラキ
ンのｃＤＮＡを単離し、全塩基配列及びアミノ酸配列を
決定し、さらに患者血清が特異的に認識する抗原エピト
ープを同定した。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、エピプラキン活性
を有する蛋白質若しくはペプチド及びそれをコードする
エピプラキン遺伝子、並びにかかる蛋白質・ペプチドを
用いた、エピプラキン活性促進物質又は抑制物質等のス
クリーニング方法、自己免疫疾患治療薬、及び自己免疫
疾患診断キット等に関する。

【０００２】

【従来の技術】プラキンは多くの自己免疫水疱性疾患に
おいて、表皮に存在する標的抗原蛋白質と考えられてお
り、デスモプラキンは、表皮細胞において細胞内で中間
径線維と結合して、細胞構造を維持する役割を果たして
いると考えられている。デスモプラキンの基本構造の解
明に引き続き、ＢＰＡＧ１、プレクチン、エンボプラキ
ン、ペリプラキン等の多くの関連蛋白質が同定されてき
た（J. Biol. Chem. 265, 2603-2612, 1990、J. Biol.
Chem. 266, 12555-12559, 1991、J. Biol. Chem.266, 1
7784-17790, 1991、J. Cell Biol. 114, 83-99, 1991、
Genes Dev.10, 1724-1735, 1996、J. Cell Biol. 134,
715-729, 1996、J. Cell Biol. 139, 1835-1849, 199
7）。これらの蛋白質は、「プラキンファミリー」とい
うファミリーとして知られている（Exp. Dermatol. 5,
237-246, 1996）。このファミリーのほぼすべてのメン
バーは、共通の構造を有しており、セントラルロッドド
メインにより分断された、球状のアミノ末端領域及びカ
ルボキシ末端領域をもつと考えられている。多くのプラ
キンがもつ上記２つの球状領域において、いくつかの相
同領域構造が同定されているのに対し、セントラルドメ
インには７連子のリピート配列が豊富にみられ、二量体
を形成する相手とともに平行なαヘリカル−コイルドコ
イル構造を形成すると考えられている（Int. J. Biol.
Macromol. 14, 145-153, 1992）。このモデル構造か
ら、デスモプラキンＩは細胞内でホモ二量体を形成する
ことが知られている（J. Biol. Chem. 264, 8310-8318,
1989）。初期の調査により、プラキンのカルボキシ末
端領域が、中間径フィラメントへの結合に関与している
ことが明らかになっている（J. Cell Biol. 123, 691-7
05, 1993、J. Cell Biol. 121, 607-619, 1993、J. Cel
l Biol. 134, 1455-1467, 1996）。デスモプラキン及び
ＢＰＡＧ１のアミノ末端領域は、デスモソーム又はヘミ
デスモソームに結合すると考えられている。さらに、プ
レクチンとＢＰＡＧ１におけるいくつかのスプライス・
フォームには、アミノ末端にアクチン結合領域や微小管
結合領域を有するものがあり、こうした領域は、マイク
ロフィラメント及び／又は微小管と、中間径フィラメン
トとの間の結合を媒介するという報告もなされている
（Cell 86, 655-665, 1996、Cell 98, 229-238, 1998、
Hum. Mol. Genet. 8, 2461-2472, 1999）。プレクチン
又はデスモプラキンが関与するいくつかの遺伝病の研
究、及びＢＰＡＧ１ヌルマウスの研究により、特定の組
織において、各種のプラキンが正常な組織において重要
な役割を果たすことが知られている（Genes Dev.10, 17
24-1735, 1996、J. Clin. Invest. 97, 2289-2298, 199
6、Hum. Mol. Genet. 8, 143-148, 1999、Cell 81, 233
-243, 1995）。また、表皮に存在するプラキンが多くの
自己免疫性水疱症疾患の標的抗原であると考えられてお
り、これらのプラキンが特定の疾患のマーカーとして使
用できると考えられている（J. Biol. Chem. 266, 1255
5-12559, 1991、J. Clin. Invest. 89, 1775-1782, 199
2、J. Invest. Dermatol. 109, 365-369, 1997、J. Inv
est. Dermatol. 112, 153-156, 1999）。しかし、それ
らの病理学的役割は未だ明らかにはされていない。

【０００３】本発明者らは、数年前に、臨床的及び病理
学的面から水疱性類天疱瘡に似た表皮下水疱性疾患患者
について報告している（J. Dermatol. 19, 610-613, 19
92）。イムノブロット分析により、かかる患者の血清
は、２３０ｋＤａ蛋白質（ＢＰＡＧ１）や１８０ｋＤａ
の水疱性天疱瘡抗原には反応しなかったものの、４５０
ｋＤａの表皮ポリペプチドと反応することが明らかとな
った。かかるポリペプチドは、ヒトケラチノサイト、並
びにＨｅＬａ細胞、ＫＢ細胞及びＡ４３１細胞を含む形
質転換細胞株において発現していた（Dermatology 189,
120-122, 1994）。上記ポリペプチドの分子構造を決定
するため、かかる患者血清を用いてヒトケラチノサイト
ｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングしたところ、二
種類のｃＤＮＡを単離することができた。一方は、ラッ
トプレクチンに対して相同性が高い蛋白質をコードする
ｃＤＮＡが得られ、もう一方は、プレクチンに対して部
分的に相同性を示し、これまで同定されていない新規蛋
白質をコードするｃＤＮＡであった（J. Invest. Derma
tol. 106, 1025-1030, 1996）。

【０００４】

【発明が解決しようとする課題】本発明の課題は、ヒト
表皮自己抗原に関する蛋白質及び該蛋白質をコードする
遺伝子に関し、特に皮膚等の自己免疫疾患の診断や免疫
療法に応用することができ、ヒトの皮膚や消化管の粘膜
に存在する抗原蛋白質やかかる抗原蛋白質のエピトー
プ、それらをコードするＤＮＡ、及びかかる蛋白質等を
用いた、エピプラキン活性促進物質又は抑制物質等のス
クリーニング方法や、自己免疫疾患治療薬や、自己免疫
疾患診断キット等を提供することにある。

【０００５】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、上記の課
題を解決するために鋭意研究し、自己免疫性水疱症患者
の血清が認識するヒト４５０ｋＤａのヒト表皮自己抗原
であるエピプラキンのｃＤＮＡを単離し、全塩基配列及
びアミノ酸配列を決定し、さらに患者血清が特異的に認
識する抗原エピトープを同定した。かかる配列情報から
エピプラキンの構造を調べたところ、プラキンファミリ
ーに属するが分子のほぼ全体にわたりデスモプラキンの
カルボキシ末端のＢドメイン類似構造が１３個分布し、
棒状ドメイン、アミノ末端ドメインが認められず、構造
上他のプラキン分子と大きく異なっていることがわかっ
た。また、エピプラキンは肝臓、小腸、大腸、唾液腺、
胃、虫垂に発現しており、その他、全表皮、特に基底細
胞層より上層部や、エクリン汗腺及び毛包の細胞や、食
道における基底層を含むすべての重層扁平上皮や、耳下
腺の腺細胞、並びに、胃及び大腸の粘膜上皮細胞等に発
現することがわかった。本発明は、以上のような知見に
基づき完成するに至ったものである。

【０００６】すなわち本発明は、以下の(ａ)又は(ｂ)の
蛋白質をコードする遺伝子(ａ)配列番号２に示されるア
ミノ酸配列からなる蛋白質(ｂ)配列番号２に示されるア
ミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠
失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、か
つエピプラキン活性を有する蛋白質（請求項１）や、配
列番号１に示される塩基配列若しくはその相補的配列又
はこれらの配列の一部若しくは全部を含む配列からなる
ＤＮＡ（請求項２）や、請求項２記載の遺伝子を構成す
るＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズ
し、かつエピプラキン活性を有する蛋白質をコードする
ＤＮＡ（請求項３）や、配列番号２に示されるアミノ酸
配列からなる蛋白質（請求項４）や、配列番号２に示さ
れるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸
が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からな
り、かつエピプラキン活性を有する蛋白質（請求項５）
や、請求項４又は５記載の蛋白質の一部からなり、自己
免疫性水疱症患者血清に結合することを特徴とするペプ
チド（請求項６）や、ペプチドが請求項４又は５記載の
抗原エピトープであることを特徴とする請求項６記載の
ペプチド（請求項７）や、ペプチドが配列番号３に示さ
れるアミノ酸配列からなることを特徴とする請求項６又
は７記載のペプチド（請求項８）に関する。

【０００７】また本発明は、請求項４若しくは５記載の
蛋白質又は請求項６〜８のいずれか記載のペプチドと、
マーカー蛋白質及び／又はペプチドタグとを結合させた
融合蛋白質又は融合ペプチド（請求項９）や、請求項４
若しくは５記載の蛋白質又は請求項６〜８のいずれか記
載のペプチドに特異的に結合する抗体（請求項１０）
や、抗体がモノクローナル抗体であることを特徴とする
請求項１０記載の抗体（）や、（請求項１１）や、抗体
がポリクローナル抗体であることを特徴とする請求項１
０記載の抗体（請求項１２）や、請求項１０〜１２のい
ずれか記載の抗体が特異的に結合する組換え蛋白質又は
ペプチド（請求項１３）や、請求項４若しくは５記載の
蛋白質又は請求項６〜８のいずれか記載のペプチドを発
現することができる発現系を含んでなる宿主細胞（請求
項１４）や、請求項４若しくは５記載の蛋白質又は請求
項６〜８のいずれか記載のペプチドをコードする遺伝子
機能が染色体上で欠損した非ヒト動物（請求項１５）
や、請求項４若しくは５記載の蛋白質又は請求項６〜８
のいずれか記載のペプチドを過剰発現する非ヒト動物
（請求項１６）や、非ヒト動物が、マウス又はラットで
ある請求項１５又は１６記載の非ヒト動物（請求項１
７）に関する。

【０００８】さらに本発明は、請求項４若しくは５記載
の蛋白質、請求項６〜８のいずれか記載のペプチド、又
は請求項４若しくは５記載の蛋白質又は請求項６〜８の
いずれか記載のペプチドを発現している細胞膜と、被検
物質とを用いることを特徴とするエピプラキン活性促進
又は抑制物質のスクリーニング方法（請求項１８）や、
請求項４若しくは５記載の蛋白質又は請求項６〜８のい
ずれか記載のペプチドを発現している細胞と、被検物質
とを用いることを特徴とするエピプラキン活性促進若し
くは抑制物質又は該蛋白質若しくはペプチドの発現促進
若しくは抑制物質のスクリーニング方法（請求項１９）
や、請求項４若しくは５記載の蛋白質又は請求項６〜８
のいずれか記載のペプチドを発現している細胞が、請求
項１４記載の宿主細胞であることを特徴とする請求項１
９記載のエピプラキン活性促進若しくは抑制物質又は該
蛋白質若しくはペプチドの発現促進若しくは抑制物質の
スクリーニング方法（請求項２０）や、請求項１５〜１
７のいずれか記載の非ヒト動物と、被検物質とを用いる
ことを特徴とするエピプラキン活性促進若しくは抑制物
質、又は請求項４若しくは５記載の蛋白質又は請求項６
〜８のいずれか記載のペプチドの発現促進若しくは抑制
物質のスクリーニング方法（請求項２１）に関する。

【０００９】また本発明は、請求項１８〜２１のいずれ
か記載のスクリーニング方法により得られるエピプラキ
ン活性促進物質（請求項２２）や、請求項１８〜２１の
いずれか記載のスクリーニング方法により得られるエピ
プラキン活性抑制物質（請求項２３）や、請求項１９〜
２１のいずれか記載のスクリーニング方法により得られ
る請求項４若しくは５記載の蛋白質又は請求項６〜８の
いずれか記載のペプチドの発現促進物質（請求項２４）
や、請求項１９〜２１のいずれか記載のスクリーニング
方法により得られる請求項４若しくは５記載の蛋白質又
は請求項６〜８のいずれか記載のペプチドの発現抑制物
質（請求項２５）や、請求項４若しくは５記載の蛋白
質、請求項６〜８のいずれか記載のペプチド、請求項１
３記載の組換え蛋白質若しくはペプチド、又は請求項１
０〜１２のいずれか記載の抗体を有効成分として含有す
る自己免疫疾患治療薬（請求項２６）や、自己免疫疾患
が、自己免疫性水疱症であることを特徴とする請求項２
６記載の自己免疫疾患治療薬（請求項２７）や、請求項
４又は５記載の蛋白質をコードするＤＮＡ又はＲＮＡの
アンチセンス鎖の全部又は一部からなる自己免疫疾患の
診断用プローブ（請求項２８）や、自己免疫疾患が、自
己免疫性水疱症であることを特徴とする請求項２８記載
の診断用プローブ（請求項２９）や、請求項２８又は２
９記載の診断用プローブ及び／又は請求項１０〜１２の
いずれか記載の抗体を含有することを特徴とする自己免
疫疾患診断薬（請求項３０）や、自己免疫疾患が、自己
免疫性水疱症であることを特徴とする請求項３０記載の
自己免疫疾患診断薬（請求項３１）や、請求項２８若し
くは２９記載の診断用プローブ、及び／又は請求項３０
若しくは３１記載の自己免疫疾患診断薬を含有すること
を特徴とする自己免疫疾患診断キット（請求項３２）
や、自己免疫疾患が、自己免疫性水疱症であることを特
徴とする請求項３２記載の自己免疫疾患診断キット（請
求項３３）に関する。

【００１０】

【発明の実施の形態】本発明の蛋白質としては、配列番
号２で示されるエピプラキンや、配列番号２で示される
アミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠
失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、か
つエピプラキン活性を有する蛋白質等を挙げることがで
きる。上記エピプラキン活性とは、自己免疫性水疱症患
者血清と結合するか、細胞内で中間径フィラメントを束
ねる機能をいう。なお、本件蛋白質はそのＤＮＡ配列情
報等に基づき公知の方法で調製することができ、その由
来は特に制限されるものではない。また、本発明の対象
となるペプチドとしては、本発明の蛋白質の一部からな
り、自己免疫性水疱症患者血清に結合するものであれば
どのようなものでもよく、好ましくはIYQAMWK（配列番
号３）等のアミノ酸配列からなる抗原エピトープを具体
的に例示することができる。上記本発明の対象となる蛋
白質及びペプチド、並びにこれら蛋白質及びペプチドに
特異的に結合する抗体が特異的に結合する組換え蛋白質
及びペプチドを総称して、以下「本件蛋白質・ペプチ
ド」ということがある。なお、本件蛋白質・ペプチドは
そのＤＮＡ配列情報等に基づき公知の方法で調製するこ
とができ、かかる抗原の由来はヒトに限定されるもので
はない。

【００１１】本発明の対象となるＤＮＡとしては、上記
本件蛋白質をコードするものであればどのようなもので
もよく、例えば、配列番号２に示されるエピプラキンを
コードするＤＮＡや、配列番号２で示されるアミノ酸配
列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若
しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつエピプラ
キン活性を有する蛋白質等をコードするＤＮＡや、配列
番号１に示される塩基配列又はその相補的配列並びにこ
れらの配列の一部又は全部を含む配列からなるＤＮＡを
具体的に挙げることができる。これらはそのＤＮＡ配列
情報等に基づき、例えばヒト、マウス、ラット等の遺伝
子ライブラリーやｃＤＮＡライブラリーなどから公知の
方法により調製することができる。

【００１２】また、配列番号１に示される塩基配列又は
その相補的配列並びにこれらの配列の一部又は全部を含
む配列からなるＤＮＡをプローブとして、各種ＤＮＡラ
イブラリーに対してストリンジェントな条件下でハイブ
リダイゼーションを行ない、該プローブにハイブリダイ
ズするＤＮＡを単離することにより、新規のエピプラキ
ン活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡを得ることも
できる。こうして得られるＤＮＡも本発明の範囲であ
る。かかる本発明のＤＮＡを取得するためのハイブリダ
イゼーションの条件としては、例えば、４２℃でのハイ
ブリダイゼーション、及び１×ＳＳＣ、０．１％のＳＤ
Ｓを含む緩衝液による４２℃での洗浄処理を挙げること
ができ、６５℃でのハイブリダイゼーション、及び０．
１×ＳＳＣ，０．１％のＳＤＳを含む緩衝液による６５
℃での洗浄処理をより好ましく挙げることができる。な
お、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーに影
響を与える要素としては、上記温度条件以外に種々の要
素があり、当業者であれば、種々の要素を適宜組み合わ
せて、上記例示したハイブリダイゼーションのストリン
ジェンシーと同等のストリンジェンシーを実現すること
が可能である。

【００１３】本発明の融合蛋白質や融合ペプチドとして
は、本件蛋白質・ペプチドとマーカー蛋白質及び／又は
ペプチドタグとが結合しているものであればどのような
ものでもよく、マーカー蛋白質としては、従来知られて
いるマーカー蛋白質であれば特に制限されるものではな
く、例えば、アルカリフォスファターゼ、抗体のＦｃ領
域、ＨＲＰ、ＧＦＰなどを具体的に挙げることができ、
また本発明におけるペプチドタグとしては、Ｍｙｃタ
グ、Ｈｉｓタグ、ＦＬＡＧタグ、ＧＳＴタグなどの従来
知られているペプチドタグを具体的に例示することがで
きる。かかる融合蛋白質は、常法により作製することが
でき、Ｎｉ−ＮＴＡとＨｉｓタグの親和性を利用したエ
ピプラキン活性を有する蛋白質等の精製や、Ｔ細胞誘導
活性を有する蛋白質の検出や、エピプラキン活性を有す
る蛋白質等に対する抗体の定量、天疱瘡及び類天疱瘡等
の自己免疫水疱症疾患、重層扁平上皮あるいは粘膜上皮
由来の腫瘍などの診断用マーカーなどとして、また当該
分野の研究用試薬としても有用である。

【００１４】本発明の前記蛋白質やペプチドに特異的に
結合する抗体としては、モノクローナル抗体、ポリクロ
ーナル抗体、キメラ抗体、一本鎖抗体、ヒト化抗体等の
免疫特異的な抗体を具体的に挙げることができ、これら
は上記本件蛋白質・ペプチド、融合蛋白質や融合ペプチ
ド等の全部又は一部を抗原として用いて常法により作製
することができるが、その中でもモノクローナル抗体が
その特異性の点でより好ましい。かかるモノクローナル
抗体等の抗体は、例えば、天疱瘡及び類天疱瘡等の自己
免疫水疱症疾患、重層扁平上皮あるいは粘膜上皮由来の
腫瘍などの診断、ミサイル療法等の治療ばかりでなく、
天疱瘡及び類天疱瘡等の自己免疫水疱症疾患、重層扁平
上皮あるいは粘膜上皮由来の腫瘍の発症機構を明らかに
する上で有用である。

【００１５】上記の本発明の抗体は、慣用のプロトコー
ルを用いて、動物（好ましくはヒト以外）に本件蛋白質
・ペプチド若しくはエピトープを含むその断片、又は該
蛋白質を膜表面に発現した細胞を投与することにより産
生され、例えばモノクローナル抗体の調製には、連続細
胞系の培養物により産生される抗体をもたらす、ハイブ
リドーマ法（Nature 256, 495-497, 1975）、トリオー
マ法、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ法（Immunology Today
4, 72, 1983）及びＥＢＶ−ハイブリドーマ法（MONOCL
ONAL ANTIBODIES AND CANCER THERAPY, pp.77-96, Alan
R.Liss, Inc.,1985）など任意の方法を用いることがで
きる。

【００１６】本発明の上記本件蛋白質・ペプチドに対す
る一本鎖抗体をつくるために、一本鎖抗体の調製法（米
国特許第4,946,778号）を適用することができる。ま
た、ヒト化抗体を発現させるために、トランスジェニッ
クマウス又は他の哺乳動物等を利用したり、上記抗体を
用いて、本件蛋白質・ペプチドを発現するクローンを単
離・同定したり、アフィニティークロマトグラフィーで
そのポリペプチドを精製することもできる。本件蛋白質
・ペプチドやその抗原エピトープを含むペプチドに対す
る抗体は、前記のように各種癌の診断や治療に使用でき
る可能性がある。そして、これら抗体が特異的に結合す
る組換え蛋白質又はペプチドも、前記のように本発明の
本件蛋白質・ペプチドに包含される。

【００１７】また前記モノクローナル抗体等の抗体に、
例えば、ＦＩＴＣ（フルオレセインイソシアネート）又
はテトラメチルローダミンイソシアネート等の蛍光物質
や、 ¹²⁵Ｉ、³²Ｐ、¹⁴Ｃ、³⁵Ｓ又は³Ｈ等のラジオアイソ
トープや、アルカリホスファターゼ、ペルオキシダー
ゼ、β−ガラクトシダーゼ又はフィコエリトリン等の酵
素で標識したものや、グリーン蛍光蛋白質（ＧＦＰ）等
の蛍光発光蛋白質などを融合させた融合蛋白質を用いる
ことによって、本件蛋白質・ペプチドの機能解析を行う
ことができる。また本件発明の抗体を用いる免疫学的測
定方法としては、ＲＩＡ法、ＥＬＩＳＡ法、蛍光抗体
法、プラーク法、スポット法、血球凝集反応法、オクタ
ロニー法等の方法を挙げることができる。

【００１８】本発明はまた、上記本件蛋白質・ペプチド
を発現することができる発現系を含んでなる宿主細胞に
関する。かかる本件蛋白質・ペプチドをコードする遺伝
子の宿主細胞への導入は、Davisら（BASIC METHODS IN
MOLECULAR BIOLOGY, 1986）及びSambrookら（MOLECULAR
CLONING: A LABORATORY MANUAL, 2nd Ed., Cold Sprin
g Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.
Y., 1989）などの多くの標準的な実験室マニュアルに記
載される方法、例えば、リン酸カルシウムトランスフェ
クション、ＤＥＡＥ−デキストラン媒介トランスフェク
ション、トランスベクション(transvection)、マイクロ
インジェクション、カチオン性脂質媒介トランスフェク
ション、エレクトロポレーション、形質導入、スクレー
プローディング (scrape loading)、弾丸導入(ballisti
c introduction)、感染等により行うことができる。そ
して、宿主細胞としては、大腸菌、ストレプトミセス、
枯草菌、ストレプトコッカス、スタフィロコッカス等の
細菌原核細胞や、酵母、アスペルギルス等の真菌細胞
や、ドロソフィラＳ２、スポドプテラＳｆ９等の昆虫細
胞や、Ｌ細胞、ＣＨＯ細胞、ＣＯＳ細胞、ＨｅＬａ細
胞、Ｃ１２７細胞、ＢＡＬＢ／ｃ３Ｔ３細胞（ジヒドロ
葉酸レダクターゼやチミジンキナーゼなどを欠損した変
異株を含む）、ＢＨＫ２１細胞、ＨＥＫ２９３細胞、Ｂ
ｏｗｅｓ悪性黒色腫細胞等の動物細胞や、植物細胞等を
挙げることができる。

【００１９】また、発現系としては、上記本件蛋白質・
ペプチドを宿主細胞内で発現させることができる発現系
であればどのようなものでもよく、染色体、エピソーム
及びウイルスに由来する発現系、例えば、細菌プラスミ
ド由来、酵母プラスミド由来、ＳＶ４０のようなパポバ
ウイルス、ワクシニアウイルス、アデノウイルス、鶏痘
ウイルス、仮性狂犬病ウイルス、レトロウイルス由来の
ベクター、バクテリオファージ由来、トランスポゾン由
来及びこれらの組合せに由来するベクター、例えば、コ
スミドやファージミドのようなプラスミドとバクテリオ
ファージの遺伝的要素に由来するものを挙げることがで
きる。この発現系は発現を起こさせるだけでなく発現を
調節する制御配列を含んでいてもよい。

【００２０】上記発現系を含んでなる宿主細胞やかかる
細胞の細胞膜、またかかる細胞を培養して得られる本件
蛋白質・ペプチドは、後述するように本発明のスクリー
ニング方法に用いることができる。例えば、細胞膜を得
る方法としては、F. Pietri-Rouxel（Eur. J. Bioche
m., 247, 1174-1179, 1997）らの方法などを用いること
ができる。また、かかる本件蛋白質・ペプチドを細胞培
養物から回収し精製するには、硫酸アンモニウムまたは
エタノール沈殿、酸抽出、アニオンまたはカチオン交換
クロマトグラフィー、ホスホセルロースクロマトグラフ
ィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、アフィニテ
ィークロマトグラフィー、ハイドロキシアパタイトクロ
マトグラフィーおよびレクチンクロマトグラフィーを含
めた公知の方法、好ましくは、高速液体クロマトグラフ
ィーが用いられる。特に、アフィニティークロマトグラ
フィーに用いるカラムとしては、例えば、本件蛋白質・
ペプチドに対する抗体を結合させたカラムや、上記本件
蛋白質・ペプチドに通常のペプチドタグを付加した場合
は、このペプチドタグに親和性のある物質を結合したカ
ラムを用いることにより、本件蛋白質・ペプチドを得る
ことができる。上記本件蛋白質・ペプチドの精製方法
は、ペプチド合成の際にも適用することができる。

【００２１】本発明において、上記本件蛋白質・ペプチ
ドをコードする遺伝子機能が染色体上で欠損した非ヒト
動物とは、染色体上の本件蛋白質・ペプチドをコードす
る遺伝子の一部若しくは全部が破壊・欠損・置換等の遺
伝子変異により不活性化され、本件蛋白質・ペプチドを
発現する機能を失なった非ヒト動物をいい、また、本件
蛋白質・ペプチドを過剰発現する非ヒト動物としては、
野生型非ヒト動物に比べてかかる本件蛋白質・ペプチド
を大量に産生する非ヒト動物を具体的に提示することが
できる。そして、本発明における非ヒト動物としては、
マウス、ラット等の齧歯目動物などの非ヒト動物を具体
的に挙げることができるが、これらに限定されるもので
はない。

【００２２】ところで、メンデルの法則に従い出生して
くるホモ接合体非ヒト動物には、本件蛋白質・ペプチド
欠損型又は過剰発現型とその同腹の野生型とが含まれ、
これらホモ接合体非ヒト動物における欠損型又は過剰発
現型とその同腹の野生型を同時に用いることによって個
体レベルで正確な比較実験をすることができることか
ら、野生型の非ヒト動物、すなわち本件蛋白質・ペプチ
ドをコードする遺伝子機能が染色体上で欠損又は過剰発
現する非ヒト動物と同種の動物、さらには同腹の動物
を、例えば下記に記載する本発明のスクリーニングに際
して併用することが好ましい。かかる本件蛋白質・ペプ
チドをコードする遺伝子機能が染色体上で欠損又は過剰
発現する非ヒト動物の作製方法を、エピプラキンノック
アウトマウスやエピプラキントランスジェニックマウス
を例にとって以下説明する。

【００２３】例えば、エピプラキン蛋白質をコードする
遺伝子機能が染色体上で欠損したマウス、すなわちエピ
プラキンノックアウトマウスは、マウス遺伝子ライブラ
リーからＰＣＲ等の方法により得られた遺伝子断片を用
いて、ヒトエピプラキンと相同性を有するマウスエピプ
ラキンをコードする遺伝子をスクリーニングし、スクリ
ーニングされたマウスエピプラキンをコードする遺伝子
をウイルスベクター等を用いてサブクローンし、ＤＮＡ
シーケンシングにより特定する。このクローンのマウス
エピプラキンをコードする遺伝子の全部又は一部をｐＭ
Ｃ１ネオ遺伝子カセット等に置換し、３′末端側にジフ
テリアトキシンＡフラグメント（ＤＴ−Ａ）遺伝子や単
純ヘルペスウイルスのチミジンキナーゼ（ＨＳＶ−ｔ
ｋ）遺伝子等の遺伝子を導入することによって、ターゲ
ッティングベクターを作製する。

【００２４】この作製されたターゲティングベクターを
線状化し、エレクトロポレーション（電気穿孔）法等に
よってＥＳ細胞に導入し、相同的組換えを行い、その相
同的組換え体の中から、Ｇ４１８やガンシクロビア（Ｇ
ＡＮＣ）等の抗生物質により相同的組換えを起こしたＥ
Ｓ細胞を選択する。また、この選択されたＥＳ細胞が目
的とする組換え体かどうかをサザンブロット法等により
確認することが好ましい。その確認されたＥＳ細胞のク
ローンをマウスの胚盤胞中にマイクロインジェクション
し、かかる胚盤胞を仮親のマウスに戻し、キメラマウス
を作製する。このキメラマウスを野生型のマウスとイン
タークロスさせると、ヘテロ接合体マウスを得ることが
でき、また、このヘテロ接合体マウスをインタークロス
させることによって、本発明のエピプラキンノックアウ
トマウスを作製することができる。また、エピプラキン
ノックアウトマウスにおいてエピプラキンの発現能が欠
失しているかどうかを確認する方法としては、例えば、
上記の方法により得られたマウスからＲＮＡを単離して
ノーザンブロット法等により調べたり、またこのマウス
におけるエピプラキンの発現をウエスタンブロット法等
により直接調べる方法がある。

【００２５】エピプラキンのトランスジェニックマウス
は、ヒト、マウス、ラット、ウサギ等に由来するエピプ
ラキンをコードするｃＤＮＡに、チキンβ−アクチン、
マウスニューロフィラメント、ＳＶ４０等のプロモータ
ー、及びラビットβ−グロビン、ＳＶ４０等のポリＡ又
はイントロンを融合させて導入遺伝子を構築し、該導入
遺伝子をマウス受精卵の前核にマイクロインジェクショ
ンし、得られた卵細胞を培養した後、仮親のマウスの輸
卵管に移植し、その後被移植動物を飼育し、産まれた仔
マウスから前記ｃＤＮＡを有する仔マウスを選択するこ
とにより、トランスジェニックマウスを創製することが
できる。また、ｃＤＮＡを有する仔マウスの選択は、マ
ウスの尻尾等より粗ＤＮＡを抽出し、導入したエピプラ
キンをコードする遺伝子をプローブとするドットハイブ
リダイゼーション法や、特異的プライマーを用いたＰＣ
Ｒ法等により行うことができる。

【００２６】また、上記本件蛋白質・ペプチドをコード
する遺伝子若しくはＤＮＡ、本件蛋白質・ペプチド、本
件蛋白質・ペプチドとマーカー蛋白質及び／又はペプチ
ドタグとを結合させた融合蛋白質、本件蛋白質・ペプチ
ドに対する抗体、本件蛋白質・ペプチドを発現すること
ができる発現系を含んでなる宿主細胞等は、以下に具体
的に説明するように、天疱瘡及び類天疱瘡等の自己免疫
水疱症疾患、重層扁平上皮あるいは粘膜上皮由来の腫瘍
などの治療や診断に有用であり、エピプラキン活性の促
進又は抑制物質のスクリーニングや本件蛋白質・ペプチ
ドの発現の促進又は抑制物質のスクリーニングに用いる
ことができるばかりでなく、天疱瘡及び類天疱瘡等の自
己免疫水疱症疾患、重層扁平上皮あるいは粘膜上皮由来
の腫瘍などの発症のメカニズムの解明にも使用すること
ができる。

【００２７】本発明の免疫誘導活性促進又は抑制物質の
スクリーニング方法としては、前記本発明の本件蛋白質
・ペプチド又は本件蛋白質・ペプチドを発現している細
胞膜と、被検物質とを用いる方法や、前記本件蛋白質・
ペプチドを発現している細胞と、被検物質とを用いる方
法や、本件蛋白質・ペプチドのノックアウトマウスやト
ランスジェニックマウス等の非ヒト動物と、被検物質と
を用いる方法等を挙げることができる。また、前記本件
蛋白質・ペプチドを発現している細胞と、被検物質とを
用いる方法や、本件蛋白質・ペプチドのノックアウトマ
ウスやトランスジェニックマウス等の非ヒト動物と、被
検物質とを用いる方法等は本件蛋白質・ペプチドの発現
促進若しくは抑制物質のスクリーニング方法に用いるこ
とができる。

【００２８】上記本件蛋白質・ペプチド又は本件蛋白質
・ペプチドを発現している細胞膜と被検物質とを用いる
スクリーニング方法としては、本件蛋白質・ペプチド又
は細胞膜表面に発現している本件蛋白質・ペプチドと、
被検物質とを接触せしめ、該本件蛋白質・ペプチドのエ
ピプラキン活性を測定・評価する方法を具体的に挙げる
ことができる。また、本件蛋白質・ペプチドを発現して
いる細胞と、被検物質とを用いるスクリーニング方法と
しては、本件蛋白質・ペプチドを発現している細胞と被
検物質とを接触せしめ、該本件蛋白質・ペプチドのエピ
プラキン活性や本件蛋白質・ペプチドの発現量の変化を
測定・評価する方法を具体的に挙げることができる。

【００２９】前記本件蛋白質・ペプチドをコードする遺
伝子機能が染色体上で欠損した非ヒト動物又は本件蛋白
質・ペプチドを過剰発現する非ヒト動物と、被検物質と
を用いたスクリーニング方法としては、これら非ヒト動
物から得られる細胞又は組織と、被検物質とをインビト
ロで接触せしめ、該本件蛋白質・ペプチドのエピプラキ
ン活性や本件蛋白質・ペプチドの発現量の変化を測定・
評価する方法や、前記本件蛋白質・ペプチドをコードす
る遺伝子機能が染色体上で欠損した非ヒト動物又は本件
蛋白質・ペプチドを過剰発現する非ヒト動物にあらかじ
め被検物質を投与した後、該非ヒト動物から得られる細
胞又は組織における該本件蛋白質・ペプチドのエピプラ
キン活性や本件蛋白質・ペプチドの発現量の変化を測定
・評価する方法や、前記本件蛋白質・ペプチドをコード
する遺伝子機能が染色体上で欠損した非ヒト動物又は本
件蛋白質・ペプチドを過剰発現する非ヒト動物にあらか
じめ被検物質を投与した後、該非ヒト動物における該本
件蛋白質・ペプチドのエピプラキン活性や本件蛋白質・
ペプチドの発現量の変化を測定・評価する方法などを具
体的に挙げることができる。

【００３０】また上記スクリーニング方法により得られ
る本発明のエピプラキン活性促進物質や発現促進物質
は、エピプラキン活性の促進や本件蛋白質・ペプチドの
発現の促進を必要としている患者の治療等に用いること
ができる。また、上記スクリーニング方法により得られ
る本発明のエピプラキン活性抑制物質や発現抑制物質
は、エピプラキン活性の抑制や本件蛋白質・ペプチドの
発現の抑制を必要としている患者の治療等に用いること
ができる。本発明の本件蛋白質・ペプチド又はこれに対
する抗体は、天疱瘡及び類天疱瘡等の自己免疫水疱症疾
患、重層扁平上皮あるいは粘膜上皮由来の腫瘍などに対
する治療薬の有効成分として用いることができ、また、
ミサイル療法に用いることもできる。これらの治療薬
は、経口的あるいは非経口的に投与することができる。
経口投与剤としては散剤、顆粒剤、カプセル剤、錠剤な
どの固形製剤あるいはシロップ剤、エリキシル剤などの
液状製剤とすることができる。また、非経口投与剤とし
て注射剤、経皮製剤あるいは座薬等とすることができ
る。これらの製剤は活性成分に薬理学的、製剤学的に認
容される助剤を加えることにより常法に従って製造する
ことができる。助剤としては、例えば、経口剤および粘
膜投与剤にあっては、軽質無水ケイ酸、澱粉、乳糖、結
晶セルロース、乳糖カルシウム等の賦形剤、カルボキシ
メチルセルロ−ス等の崩壊剤、ステアリン酸マグネシム
等の滑沢剤などの製剤用成分が、また注射剤にあって
は、生理食塩水、マンニトール、プロピレングリコ−ル
等の溶解剤ないし溶解補助剤、界面活性剤などの懸濁化
剤などの製剤用成分が、さらに外用剤にあっては、水性
ないし油性の溶解剤ないし溶解補助剤、粘着剤などの製
剤用成分が使用される。また、投与量は、対象疾患の種
類、患者の年齢、性別、体重、症状、投与形態に応じて
適宜決定することができる。

【００３１】さらに本発明の本件蛋白質・ペプチドをコ
ードするＤＮＡ又はＲＮＡのアンチセンス鎖の全部又は
一部を天疱瘡及び類天疱瘡等の自己免疫水疱症疾患、重
層扁平上皮あるいは粘膜上皮由来の腫瘍などの診断用プ
ローブとすることができ、また、かかる診断用プローブ
や本件蛋白質・ペプチドに特異的に結合する抗体を含有
する本発明の診断薬、診断キット等を用いると、天疱瘡
及び類天疱瘡等の自己免疫水疱症疾患、重層扁平上皮あ
るいは粘膜上皮由来の腫瘍などを診断することができ
る。上記診断用プローブとしては、本件蛋白質・ペプチ
ドをコードするＤＮＡ（ｃＤＮＡ）又はＲＮＡ（ｃＲＮ
Ａ）のアンチセンス鎖の全部又は一部であり、プローブ
として成立する程度の長さ（少なくとも２０ベース以
上）を有するものが好ましい。かかる検出に用いられる
検体としては、被験者の細胞、例えば血液、尿、唾液、
組織等の生検から得ることができるゲノムＤＮＡや、Ｒ
ＮＡ又はｃＤＮＡを具体的に挙げることができるがこれ
らに限定されるものではなく、かかる検体を使用する場
合、ＰＣＲ等により増幅したものを用いてもよい。

【００３２】

【実施例】以下に、実施例を揚げてこの発明を更に具体
的に説明するが、この発明の範囲はこれらの例示に限定
されるものではない。 実施例１（ヒト表皮自己抗原をコードするオーバーラッ
プｃＤＮＡクローンの単離） 文献（J. Invest. Dermatol. 106, 1025-1030, 1996）
記載の方法でイムノスクリーニングを行い、ＨｅＬａ細
胞由来λｇｔｌｌライブラリー（Clontech Laboratorie
s社製）を用いてエクステンションクロ−ニングにより
単離されたクローンpE450-Dの５′末端をプローブとし
て用い、ランダムプライム（random-primed）ｃＤＮＡ
でＨｅＬａ細胞由来λｇｔｌｌライブラリー（Clontech
Laboratories社製）をスクリーニングした。（図
１）。クローンＥｐ２４の最長クローンを単離し、５個
のオーバーラップクローン（クローンＥｐ２８、Ｅｐ１
１、Ｅｐ２、Ｅｐ７９、及びＥｐ２１）を同定した。な
お、これらのクローンの同定はＥｐ２４の５′末端由来
のプローブを用いて５′ＲＡＣＥにより行った。また、
上記ＨｅＬａ細胞ｃＤＮＡライブラリーのスクリーニン
グを再び行い、クローンＥｐ１及び Ｅｐ５を得た。ク
ローンＥｐ５では、推定開始コドンのＡＴＧはインフレ
ーム終止コドンの後に存在していた。

【００３３】下流のクローニングは、クローンpE450-C
の３′末端をプローブとして用い、上記と同様にＨｅＬ
ａ細胞ｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングすること
により行った（図１）。かかるスクリーニングにより、
ほとんど同一の数個のクローンと、ＴＧＡを含む１個の
クローン（クローンＥｐ１２）を単離した。これらの結
果、かかるクローンは３′末端側に１６０２ｂｐの高い
相同性を示すリピート配列を有することがわかった。ク
ローンpE450-C及びpE450-Dはともに、かかるリピート配
列領域において一部重複していたが、この領域は５個の
相同性の強いリピート配列を有するため、この領域にお
いて相当する位置の同定はできなかった。次に、クロー
ンＥｐ１２の３′末端領域由来の特異的プライマーを使
ってｃＤＮＡライブラリーを作製した。６．３ｋｂの長
さがある最長のクローンＥｐ１１５を、いくつかの長さ
が短いクローン（Ｅｐ１５０及び Ｅｐ１０４）と共に
単離した。１．６ｋｂｐのリピート配列領域由来の特異
的プライマーを使ってｃＤＮＡライブラリーを作製し、
１個のクローン（Ｅｐ４）を単離した。

【００３４】３′末端のリピート配列領域を単離するた
め、ＨｅＬａ細胞のポリ(Ａ)⁺ＲＮＡからｃＤＮＡライ
ブラリーを作製した。ｃＤＮＡ合成キット（Life Techn
ologies社製）を用いてｃＤＮＡを合成した。トレハロ
ースを添加してかかるキットの規定の手順を変更し、第
一鎖合成反応（Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95, 520-5
24, 1998）を行った。第一鎖合成に用いた特異的プライ
マーとしては、クローンＥｐ１１５には5'-CCAGACACAAC
AAGTATGCC-3'（Ｐ１；配列番号４）を、クローンＥｐ４
には5'-TAGCGCTTGACCGAGTCCATC-3'（Ｐ２；配列番号
５）を使用した。得られた第一鎖ｃＤＮＡにEcoRIアダ
プターを結合させた後、pUC18（Amersham Pharmacia Bi
otech社製）のEcoRIサイトに挿入し、プラスミドライブ
ラリーを作製した。各ライブラリーのスクリーニング
は、特異的プローブを用いて行った。３′末端のリピー
ト配列領域及びそのギャップ配列の大きさを確認する
為、5'-TCGAGAAGCAGGAAACCA-3'（Ｐ３；配列番号６）と
5'-CCATATGACACATAGACGAC-3'（Ｐ４；配列番号７）との
プライマーを用いてヒトゲノムからＰＣＲ法により増幅
した。その結果、イントロンを含まないおよそ９ｋｂｐ
のクローンを得た。上記ｃＤＮＡの配列における７６０
塩基のギャップは、この遺伝子配列より補填された。

【００３５】５′末端の上流のｃＤＮＡ配列を得るた
め、RACE System（Life Technologies社製）とＨｅＬａ
細胞由来の全ＲＮＡとを、又はＨｅＬａ細胞（Clontech
Laboratories社製）由来の［ポリ(Ａ)⁺ＲＮＡから調製
したアダプターが結合した二重鎖ｃＤＮＡからなる］Ma
rathon-Ready cDNA Systemを使用して、５′−ＲＡＣＥ
（rapid amplification of cDNA ends）法を行った。そ
の後、５′−ＲＡＣＥ法により得られた産物をpGEM-T E
asyベクター（Promega）にクローニングした。なお、上
記得られたｃＤＮＡクローン及びゲノムクローンの配列
決定は、自動ＤＮＡシーケンサー（Applied Biosystems
社製）を用いてdouble-strand strategyにより行い、さ
らに、内部プライマーを作製して内部配列を決定した。

【００３６】実施例２（プラキンファミリーのメンバー
であるヒト表皮自己抗原の特異構造） オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）は、インフレ
ームＴＧＡトリプレット後の２つ目のＡＴＧトリプレッ
トから開始される。これは、最初のＡＴＧトリプレット
の前に、翻訳を開始するコンセンサス配列がないからで
ある（NucleicAcids Res. 15, 8125-8148, 1987）。Ｏ
ＲＦの全長は１５，１９５ｂｐであり、その予想される
アミノ酸配列（５，０６５アミノ酸）を図２及び３に示
す。かかるアミノ酸配列から分子量は５５２，４６７Ｄ
ａであることがわかったが、これは以前ＳＤＳ−ＰＡＧ
Ｅで測定した４５０ｋＤａという分子量と一致している
といえる。

【００３７】上記得られたアミノ酸配列をもとに、Nati
onal Center for Biotechnology Informationから入手
したＢＬＡＳＴルーチンを使用して、Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒ
ｏｔ及びＰＩＲを含むさまざまな蛋白質のデータベース
を調査した。さらに、University of Wisconsin Geneti
cs Computer Group (ＵＷＧＣＧ)から入手したＣＯＭＰ
ＡＲＥ及びＤＯＴＰＬＯＴプログラムを使用して比較し
た。その結果、かかる蛋白質は、デスモプラキンのカル
ボキシ末端ドメインで最初に同定されたＢドメインが１
３個存在するという重要な特徴を有していた（J. Biol.
Chem. 265, 2603-2612, 1990）。このことから、上記
蛋白質エピプラキンは、デスモプラキン、水疱性類天疱
瘡抗原１（ＢＰＡＧ１）及びプレクチン等のプラキンフ
ァミリーのメンバーであるといえる。しかし、エピプラ
キンは以下のような異なる特徴も有している。エピプラ
キンのＢドメインは２つのグループに分けることができ
る。１つのグループはデスモプラキンのＢドメイン（ド
メイン３、６、８、９、１０、１１、１２及び１３；図
１中のＢ）に対しておよそ７０％の相同性を示し、もう
１つのグループは、デスモプラキンのＢドメイン（ドメ
イン１、２、４、５及び７；図１中のＢ＊）に対してお
よそ４５〜５０％の相同性を示す。しかし、１３個のリ
ピート配列はすべて、デスモプラキンのカルボキシ末端
領域におけるＡドメインやＣドメインよりも、Ｂドメイ
ンとの類似性が強い（表１及び参照１）。

【００３８】

【表１】

【００３９】また、ＭＡＴＣＨルーチンを使用して、蛋
白質間で相同的な配列の部位を同定し、いくつかの予測
技術を使用して二次構造を決定した。７連子を含む短い
領域は手作業によって判定にした。2d'-1g、1g'-2e、2
a'-1g、1g'-2a、1e'-1d及び1d'-1eの位置の極性アミノ
酸残基間の鎖間イオン性相互作用は、相対的な鎖のずれ
や鎖極性に反映するものと考えられている（J. Mol. Bi
ol. 98, 293-304, 1975、J. Mol. Biol. 113, 449-454,
1977）。なお、上記2d'-1gは、ｎ′鎖の第２の７連子
のｄ位置にある残基が、ｎ鎖の第１の７連子のｇ位置に
ある残基と相互作用するという意味を表す。５個のＢド
メイン（ドメイン９、１０、１１、１２及び１３）の後
ろに位置するリンカー領域（長さにして３５８残基）
が、ほとんど完全に一致していたが（図４Ａ）、その保
存性の高い５個のリンカー領域内において、３個の相同
部分が存在することが明らかになった（図４Ｂ）。例え
ば、リンカー領域（残基２３９１〜２７４８）におい
て、２つの部分（残基２３９１〜２４７２及び２４７３
〜２５５４）で３０％の相同性があり、最後の６３残基
は特に高い相同性を示しており、グリシン−プロリンに
富む部分をはさんで存在する、上記２つの領域よりも短
い第３の相同領域（残基２６１３〜２６７５）は、２つ
の領域と類似していることがわかった。こうしたリピー
ト配列では、２つか３つの７連子含有セグメントがβタ
ーン及び／又は短いβストランドで分断されていると予
測された。

【００４０】各リンカー内には上記７連子含有セグメン
トは全部で９つ存在しており、多くの球状蛋白質構造に
見られるモチーフである逆平行のα−らせんを構成する
と予測した。エピプラキンのコイルド−コイルロッドド
メインとアミノ末端ドメインの同定はできなかったが、
他のプラキンファミリーの既知のメンバーにおけるこれ
らのドメインは、特徴的な性質を有していることが知ら
れている。さらに、配列において二量体モチーフが認め
られないことから、おそらくエピプラキンはインビボに
おいて単鎖で存在していると考えられる。その他の機能
的蛋白質モチーフの調査では、膜貫通型配列やビメンチ
ン又はアクチン結合領域は発見できなかった（J. Cell
Biol. 134, 1455-1467, 1996、Hum. Mol. Genet. 8, 24
61-2472,1999）。

【００４１】実施例３（エピプラキン抗原エピトープ） エピプラキンの線状エピトープを正確にマッピングする
ために、エピプラキンのアミノ酸残基２８０７〜３３３
７の間の領域において、連続する１０個のアミノ酸から
なる線状ペプチド（デカペプチド）を８個ずつ重複させ
てセルロースに結合させて合成し、計２６４個のペプチ
ドに対する反応性を、患者血清を用いた免疫染色で検討
した。なお、上記デカペプチドは以下のように合成し
た。９−フルオレニルメトキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）
アミノ酸を用いて、システム（Autospot robot ASP222;
ABIMED Analysen-Technik GmbH社製）を製造者のプロ
トコルに従い、セルロース膜上で部分的に重複したペプ
チドを合成した（Methods Mol. Biol. 66, 49-169, 199
6、J. Immunol. 144, 976-83, 1990）。かかるＡＳＰ２
２２ソフトウエアプログラムを使用して、アミノ酸添加
の各サイクルのスポッティング時期を決定し、デカペプ
チドを作製した。この結果を図２及び３に示す。この領
域は５個の保存性の高いカルボキシル末端のリピート配
列を１つ包含しており、患者血清により認識される配列
を含んでいた（J. Invest. Dermatol. 106, 1025-1030,
1996）。かかる患者血清は、アミノ酸配列MSIYQAMWKGV
L（配列番号８）には強い反応性を示したが、アミノ酸
配列TKGFFDPNTH（配列番号９）においては反応性は弱か
った。前者の配列はエピプラキンに独特のもので、後者
の配列はプレクチンにも見られた。後者の配列は、最後
の残基がヒスチジンのかわりにグルタミン酸であれば、
デスモプラキンのペプチド（TKGFFDPNTE）と高い相同性
を有していた。

【００４２】マイクロプレートと以下のように作製した
ＢＳＡ結合ペプチドＡ、Ｂ及びＣを用いて、酵素結合免
疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）を行った。ペプチドＡ（MS
IYQAMWKGVLC；配列番号１０）、ペプチドＢ（TKGFFDPNT
HENC；配列番号１１）及びペプチドＣ（VKRYLEGTSCIAGV
LVP；配列番号１２）は文献（J. Org. Chem. 53, 617-6
24, 1988）記載の固相法により合成した。標準プログラ
ムに従い、自動ペプチド合成機（Model 9050; Millipor
e/Biosearch社製）でペプチドを合成し、Multisolvent
Delivery System（600E; Waters社製）と逆相カラム（D
elta PakC18; Waters社製）とを用いた高速液体クロマ
トグラフィーでペプチドを精製した。水と０．１％のト
リフルオロ酢酸を含むアセトニトリルとのグラジエント
でペプチドを溶出した。精製した各ペプチドの分子量及
びアミノ酸配列をthe matrix-assisted laser desorpti
on ionization time of flight mass spectrometer（KO
MPACT MALDI II; Kratos-Shimadzu）及びprotein seque
ncer（491CLC; Applied Biosystems）を用いて確認し
た。得られた上記の各合成ペプチド（２ｍｇ）に製造者
のプロトコルに従い、Ｎ−（４−マレイミドブチリルオ
キシ）−コハク酸イミド（ＧＭＢＳ；２ｍｇ；Ｄｏｊｉ
ｎ社製）を用いてウシ血清アルブミン（ＢＳＡ；１０ｍ
ｇ；Sigma社製）を結合させた。

【００４３】上記作製した５０ｎｇの各ＢＳＡ結合合成
ペプチド（ＰＢＳに溶解；０.５μｇ／ｍｌ）を４℃で
一晩インキュベーションすることにより、マイクロタイ
タープレート（Nunc A/S社製）のウェルをコーティング
した。０.０５％のＴｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳ（ＰＢ
Ｓ−Ｔ）で室温にて１時間インキュベーションし、非特
異的な結合を阻害した後、血清試料（希釈率１：２００
又は１％のＢＳＡを含むＰＢＳ−Ｔで２倍に希釈）を上
記ウェルに添加した。室温で振盪しながら１時間インキ
ュベーションした後、ウェルをＰＢＳ−Ｔにて３回洗浄
し、ＰＢＳ−Ｔで１０００倍に希釈した１００μｌのア
ルカリホスファターゼ結合ヒトＩｇＧ抗体（Bio-Rad La
boratories社製）溶液を添加した。室温で振盪しながら
１時間インキュベーションした後、ウェルをＰＢＳ−Ｔ
にて３回、ＰＢＳにて２回洗浄した。基質溶液を用いて
室温で１時間インキュベーションした後、吸光度（４５
０ｎｍ）をSOFTMAX System（Molecular Devices Co., L
td.社製）で測定し、各合成ペプチドにより得られた吸
光度を、ＢＳＡと抗体に対する反応の値を差し引いて求
めた。その結果を図５Ａに示す。このことから、かかる
患者の血清が前者のペプチドMSIYQAMWKGVL（配列番号
８）のみに反応することがわかった。

【００４４】さらに、LVPAKDQPGRQEKMSIYQAMWKGVLRPGT
配列内のエピトープをさらに限定するため、エピプラキ
ンの部分配列LVPAKDQPGRQEKMSIYQAMWKGVLRPGT（残基２
７３９〜２７６７）において、９個のアミノ酸を部分的
に重複するように合成した一連のデカペプチドをセルロ
ース膜上で合成した。セルロース膜上のかかるペプチド
に対して、患者血清、ヒトＩｇＧのアルカリホスファタ
ーゼ結合抗体（Bio-Rad Laboratories社製）、及び５−
ブロモ−４−クロロ−３−リン酸インドイル（Bio-Rad
Laboratories社製）又はニトロブルーテトラゾリウム
（Bio-Rad Laboratories社製）を用いて酵素免疫測定を
行った。その結果、強陽性を示す４つのペプチドを検出
した（図５Ｂ）。かかる配列はKMSIYQAMWKからIYQAMWKG
VLの配列に相当していた。これらのことから、かかる患
者血清により認識された主要なエピトープは、IYQAMWK
（配列番号３）であることがわかった（図５Ｃ）。

【００４５】患者血清と４５０ｋＤａ表皮自己抗原との
反応に対する合成ペプチドの影響を調べるためにウエス
タンブロット分析を行った。文献（J. Dermatol. 19, 6
10-613, 1992）記載の方法で表皮の抽出物を作製し、最
終濃度０.０１Ｍになるようにジチオスレイトールを添
加した後、蛋白質をＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル
（５％のポリアクリルアミド）電気泳動で分離し、分離
した蛋白質をImmunobilon^TM PVDF（polyvinylidene dif
luoride membrane）膜（Millipore社製）に移し、合成
ペプチドと、共にインキュベーションする前又はインキ
ュベーションした後の患者血清とを反応させた。その結
果を図６に示す。このことから、患者血清は合成ペプチ
ドMSIYQAMWKGVLC（配列番号１０）と反応した後では４
５０ｋＤａ表皮自己抗原と反応しないことがわかった
（図６、レーン１及び２）。以上のことは、患者血清中
の抗体がエピプラキンのエピトープを認識していること
を示唆している。

【００４６】実施例４（エピプラキンの発現部位） リンカー領域をコードする特異的なｃＤＮＡをプローブ
として用い、ＲＮＡマスターブロット（RNA Master Blo
t）に対するノーザンハイブリダイゼーションを製造者
のプロトコルに従いRNA Master Blot（ＰＴ３００４−
１；Clontech社製）を用いて行った。なお上記プローブ
としては以下のように作製した３つのプローブを用い
た。エピプラキンｍＲＮＡの特異的プローブは、Ｅｐ１
２をテンプレートとしてプライマー5'-GGCGCCAGGACCTGC
TGA-3'（Ｐ５；配列番号１３）及び5'-CACCTTGCTGAGCCG
CTCCT-3'（Ｐ６；配列番号１４） を用いてＰＣＲを行
い、得られたＰＣＲ産物を³²Ｐで標識することにより作
製した。また、プレクチンｍＲＮＡの特異的プローブ
は、pE450-Bをテンプレートとしてプライマー5'-CCACAC
CACGGTGGACGA-3'（Ｐ７；配列番号１５）及び5'-ACTCAG
CAGCTGCCTCTG-3' （Ｐ８；配列番号１６）を用いてＰＣ
Ｒを行い、得られたＰＣＲ産物を³²Ｐで標識することに
より作製した（J. Invest. Dermatol. 106, 1025-1030,
1996）。なお、コントロールプローブは、³²Ｐで標識
したユビキチンｃＤＮＡを用いた。これらの結果を図７
に示す。このことから、プレクチン（図７Ｂ）と同様に
エピプラキン（図７Ａ）は広範囲にわたってさまざまな
組織に発現していたが、発現量の多い組織は両者で異な
っていた。プレクチン転写によるシグナルは、筋肉、心
臓、胎盤及び脊髄において強く発現していたが、エピプ
ラキンのプローブは、肝臓、小腸、大腸、唾液腺、胃、
虫垂由来のＲＮＡと強く反応しており、胎盤、肺、脳及
び骨髄由来のＲＮＡに対する反応は、前記のものより弱
かった。

【００４７】実施例５（重層扁平上皮及び単層上皮にお
ける、エピプラキンの局在性） また、合成ペプチドに対する抗体と４５０ｋＤａ表皮自
己抗原との反応に対する合成ペプチドの影響を調べるた
めに実施例３記載のウエスタンブロット分析を行い、合
成ペプチドに対するポリクローナル抗体が４５０ｋＤａ
表皮自己抗原と反応した。なお、かかるポリクローナル
抗体は以下のようにして調製した。Ｎ−（４−マレイミ
ドブチリルオキシ）−コハク酸イミドを用いて、精製し
たペプチドＡ（MSIYQAMWKGVLC；配列番号１０）をスカ
シガイ科カサガイのヘモシアニン（ＫＬＨ）に結合さ
せ、かかる結合物とフロイント完全アジュバンドとでウ
サギを免疫し、かかる免疫により産生された抗体（ペプ
チドＡ特異的抗体）を、ペプチド固定化カラムを用いた
イムノアフィニティーゲルクロマトグラフィーにより、
吸着物を１ＭのＮａＣｌ（ｐＨ７.５）と０.１７ＭのＧ
ｌｙ−ＨＣｌ（ｐＨ２.３）との溶出液を用いて室温で
精製した。その結果を図６に示す。合成ペプチドＭＳＩ
ＹＱＡＭＷＫＧＶＬＣに対するポリクローナル抗体は、
かかる合成ペプチドと結合する前は４５０ｋＤａ表皮抗
原に反応するが、結合後は反応しない（図６、レーン３
及び４）。そこで、ヒトプレクチンと相同性を有しない
５個の保存されたリンカー領域の１つに含まれているエ
ピプラキン領域（残基２４４３〜２６８２；図２及び３
参照）とＧＳＴ（グルタチオンＳ−トランスフェラー
ゼ）とから成る組換え蛋白質に対するポリクローナル抗
体やモノクローナル抗体も４５０ｋＤａ表皮抗原と同様
の結果が得られるかどうかを確認してみた。

【００４８】上記エピプラキン（残基２４４３〜２６８
２）とＧＳＴ（グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ）
とから成る組換え蛋白質は以下の方法で作製した。エピ
プラキンの特定領域をコードするｃＤＮＡを、特異的プ
ライマーを用いてＰＣＲ法により増幅し、EcoR I断片を
pGEX 4T-1（Pharmacia社製）にサブクローンした。大腸
菌ＪＭ１０９でＧＳＴ組換え体を発現させるために、５
０μｇ／ｍｌのアンピシリンを添加したＬＢ培地を用い
て３２℃で培養し、１ｍＭのイソプロピル−１−チオ−
β−Ｄ−ガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）により誘導し
た。ＩＰＴＧを添加して３時間培養した後大腸菌を回収
し、ＰＢＳ中で超音波により溶菌し、続いて１５，００
０ｇで１０分間遠心分離にかけた。上清を４０μｌ／ｍ
ｌのグルタチオン−セファロース（Amersham Pharmacia
Biotech社製）といっしょに２０℃で３０分間インキュ
ベーションした。グルタチオン−セファロースビーズ
を、１５ｍＭのグルタチオンを含む溶出緩衝液［１５ｍ
Ｍの還元グルタチオン、５０ｍＭのトリス塩酸緩衝液
（ｐＨ８．０）］で洗浄し、ＧＳＴ組換え蛋白質を溶出
した。Immunobilon^TM膜を用いてかかるＧＳＴ組換え蛋
白質のウエスタンブロットを行い、得られた蛋白質のア
ミノ酸配列を自動分析機により確認した。

【００４９】また、組換え蛋白質に対するポリクローナ
ル抗体は以下のようにラットの体内で作製した。精製し
たＧＳＴ組換え蛋白質を同量のフロイント完全アジュバ
ンドと混合し、ラット１匹あたり１００μｇの組換え蛋
白質（フロイント完全アジュバンドを含む）を皮下注射
し１次免疫を行った。また、追加抗原刺激として、１次
免疫から１週間後と２週間後に２回、同量の組換え蛋白
質とフロイント不完全アジュバンドと混合して皮下注射
した。２回目の追加抗原刺激注射から３週間後に上記ラ
ットから血液を採取した。なお、組換え蛋白質に対する
モノクローナル抗体は鼠径部のリンパ節を採取し、メッ
シュでリンパ球を培養液に圧出し、ラットのミエローマ
細胞（653 cells）と、ポリエチレングリコールを用い
て融合させた。ＨＡＴ（Hypoxanthine、Aminopterin、t
hymidine）培地を用いて融合した細胞のみを選択し、そ
の上清をＥＬＩＳＡ法により、抗ＧＳＴ抗体を用いて、
抗エピプラキン融合蛋白質抗体を生産しているか否かを
検討した。その結果３種の抗体（６Ｆ８、１Ｂ１、４Ｃ
１１）を得た。なお、本実験においては、６Ｆ８の抗体
を用いて行った。この結果、エピプラキン（残基２４４
３〜２６８２）とＧＳＴとから成る組換え蛋白質に対す
るポリクローナル抗体及びモノクローナル抗体はともに
４５０ｋＤａ表皮抗原と反応するが（図６、レーン５及
び７）、ＧＳＴに対するポリクローナル抗体及びモノク
ローナル抗体はともに４５０ｋＤａ表皮抗原と反応しな
いことがわかった（図６、レーン６及び８）。

【００５０】上記組換え蛋白質に対するモノクローナル
抗体を使用して、ヒトの皮膚に対して間接免疫蛍光染色
法を行った。生検あるいは検屍で得られたヒト組織をＯ
ＣＴコンパウンド（Sakura Finetechnical Co., Ltd.社
製）に包埋し、液体窒素で凍結した。凍結切片（５μ
ｍ）を空気乾燥した後、ＰＢＳ中で５分間、その後、特
異的抗血清（ラットＩｇＧ）又はＧＳＴに対する抗血清
（ヤギＩｇＧ）を１００倍に希釈したＰＢＳ溶液中で１
時間、室温でインキュベーションした。かかる切片をＰ
ＢＳで３回洗浄し、上記抗血清とフルオレセインイソシ
アネートで標識した（ＦＩＴＣ標識化）ヤギ抗体とを室
温で１時間インキュベーションし、その後ＰＢＳで３回
洗浄した。切片を浸漬オイルに浸し、蛍光顕微鏡（UFX-
DX;Nikon社製）にて観察した。その結果を図８（参考写
真１参照）に示す。これらの結果、かかる抗体は全表皮
と反応し、特に基底細胞層より上層で強い蛍光染色が確
認された（図８Ａ）。患者血清により認識されたエピト
ープに対するポリクローナル抗体を使用した場合におい
ても、同様の結果が得られた（図８Ｃ）。エピプラキン
の組換え蛋白質に対するポリクローナル抗体を使用した
ところ、エクリン汗腺及び毛包の細胞において陽性が示
された（図８Ｅ、Ｇ）。また、食道においてもエピプラ
キンの組換え蛋白質に対するポリクローナル抗体が、基
底層を含むすべての重層扁平上皮と反応することがわか
った（図８Ｉ）。免疫蛍光は、耳下腺の腺細胞、並び
に、胃及び大腸の粘膜上皮細胞においても認められた
（図８Ｋ、Ｍ、Ｏ）。

【００５１】

【発明の効果】本発明によると、皮膚等の自己免疫疾患
の診断や免疫療法に応用することができ、ヒトの皮膚や
消化管の粘膜に存在する抗原蛋白質エピプラキンやかか
る抗原蛋白質のエピトープ、それらをコードするＤＮＡ
を提供することができる。また、かかる抗原蛋白質や抗
原エピトープ、遺伝子ＤＮＡ等を用いることにより、エ
ピプラキン活性促進物質又は抑制物質等のスクリーニン
グをするだけでなく、天疱瘡及び類天疱瘡等の自己免疫
水疱症疾患や、重層扁平上皮、粘膜上皮由来の腫瘍など
に対する診断法や治療法に応用することができる。ま
た、かかる抗原タンパク質等を用いることにより、天疱
瘡及び類天疱瘡等の自己免疫水疱症疾患や、重層扁平上
皮、粘膜上皮由来の腫瘍などの発症のメカニズムを明ら
かにすることができる。

【００５２】

【配列表】 SEQUENCE LISTING <110> JAPAN SCIENCE AND TECHNOLOGY CORPORATION <120> Human Epidermal autoantigen and its gene <130> 13-195 <140> <141> <160> 16 <170> PatentIn Ver. 2.1 <210> 1 <211> 15534 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (89)..(15283) <400> 1 ccagccgtgt gtgatgagtg gccacacctt gcctcctctt cccgtcccag gcaccaacag 60 cacagagcag gccagtgtac ccagagcc atg gca gcc acg ctg gga gcc ggc 112 Met Ala Ala Thr Leu Gly Ala Gly 1 5 acg ccc ccc agg ccc cag gcc agg agc ata gct ggg gtg tat gtg gag 160 Thr Pro Pro Arg Pro Gln Ala Arg Ser Ile Ala Gly Val Tyr Val Glu 10 15 20 gcc tcg ggc cag gcc cag agt gtc tac gcc gcc atg gag cag ggc ctc 208 Ala Ser Gly Gln Ala Gln Ser Val Tyr Ala Ala Met Glu Gln Gly Leu 25 30 35 40 ctg cct gct ggg ctc ggg cag gct ctg cta gag gcc cag gca gcc act 256 Leu Pro Ala Gly Leu Gly Gln Ala Leu Leu Glu Ala Gln Ala Ala Thr 45 50 55 ggg ggc ctg gtg gac ctc gcc cgg ggc cag ctg ctc cct gtg tcc aag 304 Gly Gly Leu Val Asp Leu Ala Arg Gly Gln Leu Leu Pro Val Ser Lys 60 65 70 gcc ctg cag cag ggt ctg gtg ggg ctg gag ctg aag gag aag ctg ctg 352 Ala Leu Gln Gln Gly Leu Val Gly Leu Glu Leu Lys Glu Lys Leu Leu 75 80 85 gcc gct gag cgt gcc act acg ggc tat cct gac ccc tac ggc ggt gag 400 Ala Ala Glu Arg Ala Thr Thr Gly Tyr Pro Asp Pro Tyr Gly Gly Glu 90 95 100 aag ctg gcc ctc ttt cag gcc atc ggg aag gag gtt gtg gac agg gcc 448 Lys Leu Ala Leu Phe Gln Ala Ile Gly Lys Glu Val Val Asp Arg Ala 105 110 115 120 ctg ggg cag agc tgg ctg gag gtc caa ctg gcc act ggg ggc ctg gtg 496 Leu Gly Gln Ser Trp Leu Glu Val Gln Leu Ala Thr Gly Gly Leu Val 125 130 135 gac ccc gcc cag gga gtg ctc gtg gcc cct gag cca gcc tgc cac cag 544 Asp Pro Ala Gln Gly Val Leu Val Ala Pro Glu Pro Ala Cys His Gln 140 145 150 ggc ctc ctg gac cgg gag aca tgg cac aag ctg tca gag ctt gag cct 592 Gly Leu Leu Asp Arg Glu Thr Trp His Lys Leu Ser Glu Leu Glu Pro 155 160 165 ggc aca ggt gac ctg cgc ttc ctc aac ccc aac acg ctg gag cgg ctg 640 Gly Thr Gly Asp Leu Arg Phe Leu Asn Pro Asn Thr Leu Glu Arg Leu 170 175 180 aca tac cac cag ctg ctg gaa agg tgt gtg cgt gcc ccc ggg tcg ggg 688 Thr Tyr His Gln Leu Leu Glu Arg Cys Val Arg Ala Pro Gly Ser Gly 185 190 195 200 cta gcc ttg ctg ccc ctc aag atc acc ttc cgc tcc atg ggc ggg gcg 736 Leu Ala Leu Leu Pro Leu Lys Ile Thr Phe Arg Ser Met Gly Gly Ala 205 210 215 gtg agt gca gct gag ctg ctg gag gtg ggc atc ctg gac gag cag gct 784 Val Ser Ala Ala Glu Leu Leu Glu Val Gly Ile Leu Asp Glu Gln Ala 220 225 230 gtg cag ggt ctg cgg gag ggc agg ctg gcc gca gtg gac gtg agt gca 832 Val Gln Gly Leu Arg Glu Gly Arg Leu Ala Ala Val Asp Val Ser Ala 235 240 245 cgt gcc gag gtg cgg cgc tac ctg gag ggt acc ggc agc gtg gcc ggg 880 Arg Ala Glu Val Arg Arg Tyr Leu Glu Gly Thr Gly Ser Val Ala Gly 250 255 260 gtt gtc ctg ctg ccc gaa ggc cac aag aag agc ttt ttc cag gct gcc 928 Val Val Leu Leu Pro Glu Gly His Lys Lys Ser Phe Phe Gln Ala Ala 265 270 275 280 acc gag cac ctg ctc cca atg ggc acc gcg ctg cca ctc cta gag gcc 976 Thr Glu His Leu Leu Pro Met Gly Thr Ala Leu Pro Leu Leu Glu Ala 285 290 295 cag gct gcc acc cac acc ctg gtg gac ccc atc aca ggc cag cgg ctg 1024 Gln Ala Ala Thr His Thr Leu Val Asp Pro Ile Thr Gly Gln Arg Leu 300 305 310 tgg gta gac gag gca gtc agg gcg ggc ctg gtc agc cca gag ctc cat 1072 Trp Val Asp Glu Ala Val Arg Ala Gly Leu Val Ser Pro Glu Leu His 315 320 325 gag cag ctc ctg gtg gct gag cag gcc gtg aca ggg cac cac gac ccc 1120 Glu Gln Leu Leu Val Ala Glu Gln Ala Val Thr Gly His His Asp Pro 330 335 340 ttc agt ggc tcc caa atc ccc ctt ttc cag gcc atg aag aag ggg cta 1168 Phe Ser Gly Ser Gln Ile Pro Leu Phe Gln Ala Met Lys Lys Gly Leu 345 350 355 360 gtg gac agg cca cta gca ctg cgg ctc ttg gat gcc cag ctg gcc aca 1216 Val Asp Arg Pro Leu Ala Leu Arg Leu Leu Asp Ala Gln Leu Ala Thr 365 370 375 ggc ggg ctg gtc tgt cca gca cgc agg ctc cgg ctg ccc ctg gag gcc 1264 Gly Gly Leu Val Cys Pro Ala Arg Arg Leu Arg Leu Pro Leu Glu Ala 380 385 390 gcc ctg cgc tgc ggc tgc ctg gat gaa gac act cag cgg cag ctc tcg 1312 Ala Leu Arg Cys Gly Cys Leu Asp Glu Asp Thr Gln Arg Gln Leu Ser 395 400 405 cag gct ggc agc ttc tca gac ggc acg cac ggc ggc ctg cgc tat gaa 1360 Gln Ala Gly Ser Phe Ser Asp Gly Thr His Gly Gly Leu Arg Tyr Glu 410 415 420 cag ctg ctg gcc ctc tgt gtc acc gac cca gag acc ggg ctt gcc ttc 1408 Gln Leu Leu Ala Leu Cys Val Thr Asp Pro Glu Thr Gly Leu Ala Phe 425 430 435 440 ctg cca ctc tca ggg gga ccc cgg gga ggg gag ccc cag gga ccc cca 1456 Leu Pro Leu Ser Gly Gly Pro Arg Gly Gly Glu Pro Gln Gly Pro Pro 445 450 455 ttc atc aag tac agc act cgg cag gcc ctg agc acg gcc aca gcc acc 1504 Phe Ile Lys Tyr Ser Thr Arg Gln Ala Leu Ser Thr Ala Thr Ala Thr 460 465 470 gtc tct gtg ggg aag ttc cgg ggc cgg ccc gtg tcc ctc tgg gag ctg 1552 Val Ser Val Gly Lys Phe Arg Gly Arg Pro Val Ser Leu Trp Glu Leu 475 480 485 ctc ttc tct gag gcc atc tcc tca gag cag agg gcg atg ctg gcc cag 1600 Leu Phe Ser Glu Ala Ile Ser Ser Glu Gln Arg Ala Met Leu Ala Gln 490 495 500 cag tac cag gaa ggg acc ctc tcc gtg gag aag ctg gcc gct gag ctg 1648 Gln Tyr Gln Glu Gly Thr Leu Ser Val Glu Lys Leu Ala Ala Glu Leu 505 510 515 520 agc gcc acc ctt gag cag gct gca gcc act gcc agg gtc acc ttt tct 1696 Ser Ala Thr Leu Glu Gln Ala Ala Ala Thr Ala Arg Val Thr Phe Ser 525 530 535 ggg ctg agg gac acc gtg aca cca gga gag ctg ctg aaa gcc gag atc 1744 Gly Leu Arg Asp Thr Val Thr Pro Gly Glu Leu Leu Lys Ala Glu Ile 540 545 550 atc gac cag gac ctg tac gag cgg ttg gag cat gga cag gcc aca gcc 1792 Ile Asp Gln Asp Leu Tyr Glu Arg Leu Glu His Gly Gln Ala Thr Ala 555 560 565 aag gat gtg ggc agc ctg gcc tcg gcg cag agg tac ctg cag ggt acg 1840 Lys Asp Val Gly Ser Leu Ala Ser Ala Gln Arg Tyr Leu Gln Gly Thr 570 575 580 ggc tgc att gct ggc ctg ctg ctc cct ggc tcc cag gaa cgc ctg agc 1888 Gly Cys Ile Ala Gly Leu Leu Leu Pro Gly Ser Gln Glu Arg Leu Ser 585 590 595 600 atc tat gag gcc cga tgc aag ggg ctc ctc cgg ccc ggc act gcc ctc 1936 Ile Tyr Glu Ala Arg Cys Lys Gly Leu Leu Arg Pro Gly Thr Ala Leu 605 610 615 atc ctt ctg gag gca caa gct gcc aca ggc ttc atc atc gac cca aaa 1984 Ile Leu Leu Glu Ala Gln Ala Ala Thr Gly Phe Ile Ile Asp Pro Lys 620 625 630 gca aac aag ggg cac tcc gtt gag gag gca ctg agg gct gct gtc att 2032 Ala Asn Lys Gly His Ser Val Glu Glu Ala Leu Arg Ala Ala Val Ile 635 640 645 ggg cct gat gtg ttc gcg aag ctg ctg tcg gct gag cgc gct gtc act 2080 Gly Pro Asp Val Phe Ala Lys Leu Leu Ser Ala Glu Arg Ala Val Thr 650 655 660 ggc tac act gac ccc tac acc ggg cag cag atc tcc ctc ttc cag gcc 2128 Gly Tyr Thr Asp Pro Tyr Thr Gly Gln Gln Ile Ser Leu Phe Gln Ala 665 670 675 680 atg cag aag ggc ctc atc gtc cgg gag cac ggc atc cgc ctg ctg gag 2176 Met Gln Lys Gly Leu Ile Val Arg Glu His Gly Ile Arg Leu Leu Glu 685 690 695 gcc cag atc gcc acg ggc ggc gtc atc gac ccc gtg cac agc cac cgc 2224 Ala Gln Ile Ala Thr Gly Gly Val Ile Asp Pro Val His Ser His Arg 700 705 710 gtg ccc gtg gac gtg gcc tac cgg cgc ggc tac ttc gat cag atg ctg 2272 Val Pro Val Asp Val Ala Tyr Arg Arg Gly Tyr Phe Asp Gln Met Leu 715 720 725 aac ttg atc ctg ttg gac cct tct gac gac acc aag ggc ttc ttc gac 2320 Asn Leu Ile Leu Leu Asp Pro Ser Asp Asp Thr Lys Gly Phe Phe Asp 730 735 740 ccc aac acg cac gag aac ctc acg tac ctg cag ctt ctg gag cgc tgt 2368 Pro Asn Thr His Glu Asn Leu Thr Tyr Leu Gln Leu Leu Glu Arg Cys 745 750 755 760 gtg cgt gac ccc gag acg ggc ctg tac ctc ctg cca ctc agc agc acg 2416 Val Arg Asp Pro Glu Thr Gly Leu Tyr Leu Leu Pro Leu Ser Ser Thr 765 770 775 cag tcc ccg ctg gtg gac agt gcc acc cag cag gcc ttc cag aac ctg 2464 Gln Ser Pro Leu Val Asp Ser Ala Thr Gln Gln Ala Phe Gln Asn Leu 780 785 790 ctg ctc tcc gtg aag tat gga cgg ttt cag ggg cag agg gtc tcc gcg 2512 Leu Leu Ser Val Lys Tyr Gly Arg Phe Gln Gly Gln Arg Val Ser Ala 795 800 805 tgg gag ctg atc aac tct gag tac ttc agc gag ggc cgc agg agg cag 2560 Trp Glu Leu Ile Asn Ser Glu Tyr Phe Ser Glu Gly Arg Arg Arg Gln 810 815 820 ctg ctg cgt cgc tac cgg cag cgc gag gtc acg ctg ggg cag gtg gca 2608 Leu Leu Arg Arg Tyr Arg Gln Arg Glu Val Thr Leu Gly Gln Val Ala 825 830 835 840 aag ctg ctg gag gcg gag acg cag aga cag gcg gac atc atg ctg ccc 2656 Lys Leu Leu Glu Ala Glu Thr Gln Arg Gln Ala Asp Ile Met Leu Pro 845 850 855 gca ctg cgg agc cgg gtc acc gtc cac cag ctc ctg gag gcc ggt atc 2704 Ala Leu Arg Ser Arg Val Thr Val His Gln Leu Leu Glu Ala Gly Ile 860 865 870 att gac cag cag ctg ttg gac caa gtg ctg gcc ggg aca atc agc ccg 2752 Ile Asp Gln Gln Leu Leu Asp Gln Val Leu Ala Gly Thr Ile Ser Pro 875 880 885 gag gcc ctc cta ctc atg gac ggc gtc cgc agg tac ctg tgc ggc ctg 2800 Glu Ala Leu Leu Leu Met Asp Gly Val Arg Arg Tyr Leu Cys Gly Leu 890 895 900 gga gct gtg ggc ggt gtg cgg ctg ctg ccc tct ggc cag cgg ctc agc 2848 Gly Ala Val Gly Gly Val Arg Leu Leu Pro Ser Gly Gln Arg Leu Ser 905 910 915 920 ctc tac cag gcc atg agg cag aag ctg ctg ggg ccc agg gtg gcc ctg 2896 Leu Tyr Gln Ala Met Arg Gln Lys Leu Leu Gly Pro Arg Val Ala Leu 925 930 935 gcc ctg ctg gag gcc cag gcg gcc acc gga acc atc atg gac cct cac 2944 Ala Leu Leu Glu Ala Gln Ala Ala Thr Gly Thr Ile Met Asp Pro His 940 945 950 agc cca gag agc ctc tcg gtg gat gag gcc gtg cgc agg ggt gtg gtg 2992 Ser Pro Glu Ser Leu Ser Val Asp Glu Ala Val Arg Arg Gly Val Val 955 960 965 ggg ccg gag ctg tat ggc agg ctg aag cgg gct gag ggt gcc att gct 3040 Gly Pro Glu Leu Tyr Gly Arg Leu Lys Arg Ala Glu Gly Ala Ile Ala 970 975 980 ggc ttc aga gac ccc ttc tct ggg aag cag gtg tct gtg ttc cag gcc 3088 Gly Phe Arg Asp Pro Phe Ser Gly Lys Gln Val Ser Val Phe Gln Ala 985 990 995 1000 atg aag aaa ggt ctc atc cct tgg gag caa gct gcc cgc ctc ctg gag 3136 Met Lys Lys Gly Leu Ile Pro Trp Glu Gln Ala Ala Arg Leu Leu Glu 1005 1010 1015 gct caa gtg gcc aca gga ggg atc att gac ccc acc agc cac cac cac 3184 Ala Gln Val Ala Thr Gly Gly Ile Ile Asp Pro Thr Ser His His His 1020 1025 1030 ctc ccc atg cca gtg gcc att cag cgt ggc tat gtt gac cag gag atg 3232 Leu Pro Met Pro Val Ala Ile Gln Arg Gly Tyr Val Asp Gln Glu Met 1035 1040 1045 gag aca gcc ttg tcc agc tcc tcc gag acc ttc ccc aca ccg gac ggc 3280 Glu Thr Ala Leu Ser Ser Ser Ser Glu Thr Phe Pro Thr Pro Asp Gly 1050 1055 1060 cag ggg cgc acg agc tat gcc cag ctc ctg gag gag tgc ccc agg gat 3328 Gln Gly Arg Thr Ser Tyr Ala Gln Leu Leu Glu Glu Cys Pro Arg Asp 1065 1070 1075 1080 gag act tct ggc ctt cac ctc ctg ccc ctg cca gaa agt gct cct gcc 3376 Glu Thr Ser Gly Leu His Leu Leu Pro Leu Pro Glu Ser Ala Pro Ala 1085 1090 1095 ctc ccc acc gag gag cag gtc cag agg agc ctg cag gcc gtg ccg ggg 3424 Leu Pro Thr Glu Glu Gln Val Gln Arg Ser Leu Gln Ala Val Pro Gly 1100 1105 1110 gcc aag gat ggc aca tcc ctc tgg gac ctg ctc agc tcc tgc cac ttc 3472 Ala Lys Asp Gly Thr Ser Leu Trp Asp Leu Leu Ser Ser Cys His Phe 1115 1120 1125 acc gag gag caa cgg agg ggc ctg ctg gag gac gtg cag gag ggg agg 3520 Thr Glu Glu Gln Arg Arg Gly Leu Leu Glu Asp Val Gln Glu Gly Arg 1130 1135 1140 acc act gtg cca cag ctg cta gcc tct gtg cag agg tgg gta cag gag 3568 Thr Thr Val Pro Gln Leu Leu Ala Ser Val Gln Arg Trp Val Gln Glu 1145 1150 1155 1160 acc aag ctt ctg gcc cag gcc cgc gtc atg gtg ccc ggc cca cgg ggt 3616 Thr Lys Leu Leu Ala Gln Ala Arg Val Met Val Pro Gly Pro Arg Gly 1165 1170 1175 gag gta ccc gct gtc tgg ctg ctg gat gct ggc atc atc acc cag gag 3664 Glu Val Pro Ala Val Trp Leu Leu Asp Ala Gly Ile Ile Thr Gln Glu 1180 1185 1190 acc ctt gag gcc ctg gct cag ggc acg cag tcg ccc gcc cag gtc gcc 3712 Thr Leu Glu Ala Leu Ala Gln Gly Thr Gln Ser Pro Ala Gln Val Ala 1195 1200 1205 gag cag ccg gcg gtg aag gcc tgc ctg tgg ggc aca ggc tgc gtg gcc 3760 Glu Gln Pro Ala Val Lys Ala Cys Leu Trp Gly Thr Gly Cys Val Ala 1210 1215 1220 ggt gtg ctg cta cag ccc tct ggg gcc aag gcc agc atc gcc cag gcc 3808 Gly Val Leu Leu Gln Pro Ser Gly Ala Lys Ala Ser Ile Ala Gln Ala 1225 1230 1235 1240 gtg agg gat ggc ctc ctg ccc aca ggc ctg ggc cag agg ctg ctg gaa 3856 Val Arg Asp Gly Leu Leu Pro Thr Gly Leu Gly Gln Arg Leu Leu Glu 1245 1250 1255 gcc cag gtg gca tct ggc ttc ctt gtt gac ccc ctg aac aac cag aga 3904 Ala Gln Val Ala Ser Gly Phe Leu Val Asp Pro Leu Asn Asn Gln Arg 1260 1265 1270 ctg tca gtg gag gac 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Asn Arg Val Leu Ala Asp Pro Ser Asp Asp Thr Lys Gly Phe Phe 2885 2890 2895 Asp Pro Asn Thr His Glu Asn Leu Thr Tyr Val Gln Leu Leu Arg Arg 2900 2905 2910 Cys Val Pro Asp Pro Asp Thr Gly Leu Tyr Met Leu Gln Leu Ala Gly 2915 2920 2925 Arg Gly Ser Ala Val His Gln Leu Ser Glu Glu Leu Arg Cys Ala Leu 2930 2935 2940 Arg Asp Ala Arg Val Thr Pro Gly Ser Gly Ala Leu Gln Gly Gln Ser 2945 2950 2955 2960 Val Ser Val Trp Glu Leu Leu Phe Tyr Arg Glu Val Ser Glu Asp Arg 2965 2970 2975 Arg Gln Asp Leu Leu Ser Arg Tyr Arg Ala Gly Thr Leu Thr Val Glu 2980 2985 2990 Glu Leu Gly Ala Thr Leu Thr Ser Leu Leu Ala Gln Ala Gln Ala Gln 2995 3000 3005 Ala Arg Ala Glu Ala Glu Ala Gly Ser Pro Arg Pro Asp Pro Arg Glu 3010 3015 3020 Ala Leu Arg Ala Ala Thr Met Glu Val Lys Val Gly Arg Leu Arg Gly 3025 3030 3035 3040 Arg Ala Val Pro Val Trp Asp Val Leu Ala Ser Gly Tyr Val Ser Gly 3045 3050 3055 Ala Ala Arg Glu Glu Leu Leu Ala Glu Phe Gly Ser Gly Thr Leu Asp 3060 3065 3070 Leu Pro Ala Leu Thr Arg Arg Leu Thr Ala Ile Ile Glu Glu Ala Glu 3075 3080 3085 Glu Ala Pro Gly Ala Arg Pro Gln Leu Gln Asp Ala Trp Arg Gly Pro 3090 3095 3100 Arg Glu Pro Gly Pro Ala Gly Arg Gly Asp Gly Asp Ser Gly Arg Ser 3105 3110 3115 3120 Gln Arg Glu Gly Gln Gly Glu Gly Glu Thr Gln Glu Ala Ala Ala Ala 3125 3130 3135 Ala Ala Ala Ala Arg Arg Gln Glu Gln Thr Leu Arg Asp Ala Thr Met 3140 3145 3150 Glu Val Gln Arg Gly Gln Phe Gln Gly Arg Pro Val Ser Val Trp Asp 3155 3160 3165 Val Leu Phe Ser Ser Tyr Leu Ser Glu Ala Arg Arg Asp Glu Leu Leu 3170 3175 3180 Ala Gln His Ala Ala Gly Ala Leu Gly Leu Pro Asp Leu Val Ala Val 3185 3190 3195 3200 Leu Thr Arg Val Ile Glu Glu Thr Glu Glu Arg Leu Ser Lys Val Ser 3205 3210 3215 Phe Arg Gly Leu Arg Arg Gln Val Ser Ala Ser Glu Leu His Thr Ser 3220 3225 3230 Gly Ile Leu Gly Pro Glu Thr Leu Arg Asp Leu Ala Gln Gly Thr Lys 3235 3240 3245 Thr Leu Gln Glu Val Thr Glu Met Asp Ser Val Lys Arg Tyr Leu Glu 3250 3255 3260 Gly Thr Ser Cys Ile Ala Gly Val Leu Val Pro Ala Lys Asp Gln Pro 3265 3270 3275 3280 Gly Arg Gln Glu Lys Met Ser Ile Tyr Gln Ala Met Trp Lys Gly Val 3285 3290 3295 Leu Arg Pro Gly Thr Ala Leu Val Leu Leu Glu Ala Gln Ala Ala Thr 3300 3305 3310 Gly Phe Val Ile Asp Pro Val Arg Asn Leu Arg Leu Ser Val Glu Glu 3315 3320 3325 Ala Val Ala Ala Gly Val Val Gly Gly Glu Ile Gln Glu Lys Leu Leu 3330 3335 3340 Ser Ala Glu Arg Ala Val Thr Gly Tyr Thr Asp Pro Tyr Thr Gly Gln 3345 3350 3355 3360 Gln Ile Ser Leu Phe Gln Ala Met Gln Lys Asp Leu Ile Val Arg Glu 3365 3370 3375 His Gly Ile Arg Leu Leu Glu Ala Gln Ile Ala Thr Gly Gly Val Ile 3380 3385 3390 Asp Pro Val His Ser His Arg Val Pro Val Asp Val Ala Tyr Arg Arg 3395 3400 3405 Gly Tyr Phe Asp Glu Glu Met Asn Arg Val Leu Ala Asp Pro Ser Asp 3410 3415 3420 Asp Thr Lys Gly Phe Phe Asp Pro Asn Thr His Glu Asn Leu Thr Tyr 3425 3430 3435 3440 Val Gln Leu Leu Arg Arg Cys Val Pro Asp Pro Asp Thr Gly Leu Tyr 3445 3450 3455 Met Leu Gln Leu Ala Gly Arg Gly Ser Ala Val His Gln Leu Ser Glu 3460 3465 3470 Glu Leu Arg Cys Ala Leu Arg Asp Ala Arg Val Thr Pro Gly Ser Gly 3475 3480 3485 Ala Leu Gln Gly Gln Ser Val Ser Val Trp Glu Leu Leu Phe Tyr Arg 3490 3495 3500 Glu Val Ser Glu Asp Arg Arg Gln Asp Leu Leu Ser Arg Tyr Arg Ala 3505 3510 3515 3520 Gly Thr Leu Thr Val Glu Glu Leu Gly Ala Thr Leu Thr Ser Leu Leu 3525 3530 3535 Ala Gln Ala Gln Ala Gln Ala Arg Ala Glu Ala Glu Ala Gly Ser Pro 3540 3545 3550 Arg Pro Asp Pro Arg Glu Ala Leu Arg Ala Ala Thr Met Glu Val Lys 3555 3560 3565 Val Gly Arg Leu Arg Gly Arg Ala Val Pro Val Trp Asp Val Leu Ala 3570 3575 3580 Ser Gly Tyr Val Ser Gly Ala Ala Arg Glu Glu Leu Leu Ala Glu Phe 3585 3590 3595 3600 Gly Ser Gly Thr Leu Asp Leu Pro Ala Leu Thr Arg Arg Leu Thr Ala 3605 3610 3615 Ile Ile Glu Glu Ala Glu Glu Ala Pro Gly Ala Arg Pro Gln Leu Gln 3620 3625 3630 Asp Ala Trp Arg Gly Pro Arg Glu Pro Gly Pro Ala Gly Arg Gly Asp 3635 3640 3645 Gly Asp Ser Gly Arg Ser Gln Arg Glu Gly Gln Gly Glu Gly Glu Thr 3650 3655 3660 Gln Glu Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Arg Arg Gln Glu Gln Thr 3665 3670 3675 3680 Leu Arg Asp Ala Thr Met Glu Val Gln Arg Gly Gln Phe Gln Gly Arg 3685 3690 3695 Pro Val Ser Val Trp Asp Val Leu Phe Ser Ser Tyr Leu Ser Glu Ala 3700 3705 3710 Arg Arg Asp Glu Leu Leu Ala Gln His Ala Ala Gly Ala Leu Gly Leu 3715 3720 3725 Pro Asp Leu Val Ala Val Leu Thr Arg Val Ile Glu Glu Thr Glu Glu 3730 3735 3740 Arg Leu Ser Lys Val Ser Phe Arg Gly Leu Arg Arg Gln Val Ser Ala 3745 3750 3755 3760 Ser Glu Leu His Thr Ser Gly Ile Leu Gly Pro Glu Thr Leu Arg Asp 3765 3770 3775 Leu Ala Gln Gly Thr Lys Thr Leu Gln Glu Val Thr Glu Met Asp Ser 3780 3785 3790 Val Lys Arg Tyr Leu Glu Gly Thr Ser Cys Ile Ala Gly Val Leu Val 3795 3800 3805 Pro Ala Lys Asp Gln Pro Gly Arg Gln Glu Lys Met Ser Ile Tyr Gln 3810 3815 3820 Ala Met Trp Lys Gly Val Leu Arg Pro Gly Thr Ala Leu Val Leu Leu 3825 3830 3835 3840 Glu Ala Gln Ala Ala Thr Gly Phe Val Ile Asp Pro Val Arg Asn Leu 3845 3850 3855 Arg Leu Ser Val Glu Glu Ala Val Ala Ala Gly Val Val Gly Gly Glu 3860 3865 3870 Ile Gln Glu Lys Leu Leu Ser Ala Glu Arg Ala Val Thr Gly Tyr Thr 3875 3880 3885 Asp Pro Tyr Thr Gly Gln Gln Ile Ser Leu Phe Gln Ala Met Gln Lys 3890 3895 3900 Asp Leu Ile Val Arg Glu His Gly Ile Arg Leu Leu Glu Ala Gln Ile 3905 3910 3915 3920 Ala Thr Gly Gly Val Ile Asp Pro Val His Ser His Arg Val Pro Val 3925 3930 3935 Asp Val Ala Tyr Arg Arg Gly Tyr Phe Asp Glu Glu Met Asn Arg Val 3940 3945 3950 Leu Ala Asp Pro Ser Asp Asp Thr Lys Gly Phe Phe Asp Pro Asn Thr 3955 3960 3965 His Glu Asn Leu Thr Tyr Val Gln Leu Leu Arg Arg Cys Val Pro Asp 3970 3975 3980 Pro Asp Thr Gly Leu Tyr Met Leu Gln Leu Ala Gly Arg Gly Ser Ala 3985 3990 3995 4000 Val His Gln Leu Ser Glu Glu Leu Arg Cys Ala Leu Arg Asp Ala Arg 4005 4010 4015 Val Thr Pro Gly Ser Gly Ala Leu Gln Gly Gln Ser Val Ser Val Trp 4020 4025 4030 Glu Leu Leu Phe Tyr Arg Glu Val Ser Glu Asp Arg Arg Gln Asp Leu 4035 4040 4045 Leu Ser Arg Tyr Arg Ala Ser Thr Leu Thr Val Glu Glu Leu Gly Ala 4050 4055 4060 Thr Leu Thr Ser Leu Leu Ala Gln Ala Gln Ala Gln Ala Arg Ala Glu 4065 4070 4075 4080 Ala Glu Ala Gly Ser Pro Arg Pro Asp Pro Arg Glu Ala Leu Arg Ala 4085 4090 4095 Ala Thr Met Glu Val Lys Val Gly Arg Leu Arg Gly Arg Ala Val Pro 4100 4105 4110 Val Trp Asp Val Leu Ala Ser Gly Tyr Val Ser Arg Ala Ala Arg Glu 4115 4120 4125 Glu Leu Leu Ala Glu Phe Gly Ser Gly Thr Leu Asp Leu Pro Ala Leu 4130 4135 4140 Thr Arg Arg Leu Thr Ala Ile Ile Glu Glu Ala Glu Glu Ala Pro Gly 4145 4150 4155 4160 Ala Arg Pro Gln Leu Gln Asp Ala Trp Arg Gly Pro Arg Glu Pro Gly 4165 4170 4175 Pro Ala Gly Arg Gly Asp Gly Asp Ser Gly Arg Ser Gln Arg Glu Gly 4180 4185 4190 Gln Gly Glu Gly Glu Thr Gln Glu Ala Ala Ala Ala Thr Ala Ala Ala 4195 4200 4205 Arg Arg Gln Glu Gln Thr Leu Arg Asp Ala Thr Met Glu Val Gln Arg 4210 4215 4220 Gly Gln Phe Gln Gly Arg Pro Val Ser Val Trp Asp Val Leu Phe Ser 4225 4230 4235 4240 Ser Tyr Leu Ser Glu Ala Arg Arg Asp Glu Leu Leu Ala Gln His Ala 4245 4250 4255 Ala Gly Ala Leu Gly Leu Pro Asp Leu Val Ala Val Leu Thr Arg Val 4260 4265 4270 Ile Glu Glu Thr Glu Glu Arg Leu Ser Lys Val Ser Phe Arg Gly Leu 4275 4280 4285 Arg Arg Gln Val Ser Ala Ser Glu Leu His Thr Ser Gly Ile Leu Gly 4290 4295 4300 Pro Glu Thr Leu Arg Asp Leu Ala Gln Gly Thr Lys Thr Leu Gln Glu 4305 4310 4315 4320 Val Thr Glu Met Asp Ser Val Lys Arg Tyr Leu Glu Gly Thr Ser Cys 4325 4330 4335 Ile Ala Gly Val Leu Val Pro Ala Lys Asp Gln Pro Gly Arg Gln Glu 4340 4345 4350 Lys Met Ser Ile Tyr Gln Ala Met Trp Lys Gly Val Leu Arg Pro Gly 4355 4360 4365 Thr Ala Leu Val Leu Leu Glu Ala Gln Ala Ala Thr Gly Phe Val Ile 4370 4375 4380 Asp Pro Val Arg Asn Leu Arg Leu Ser Val Glu Glu Ala Val Ala Ala 4385 4390 4395 4400 Gly Val Val Gly Gly Glu Ile Gln Glu Lys Leu Leu Ser Ala Glu Arg 4405 4410 4415 Ala Val Thr Gly Tyr Thr Asp Pro Tyr Thr Gly Gln Gln Ile Ser Leu 4420 4425 4430 Phe Gln Ala Met Gln Lys Asp Leu Ile Val Arg Glu His Gly Ile Arg 4435 4440 4445 Leu Leu Glu Ala Gln Ile Ala Thr Gly Gly Val Ile Asp Pro Val His 4450 4455 4460 Ser His Arg Val Pro Val Asp Val Ala Tyr Arg Arg Gly Tyr Phe Asp 4465 4470 4475 4480 Glu Glu Met Asn Arg Val Leu Ala Asp Pro Ser Asp Asp Thr Lys Gly 4485 4490 4495 Phe Phe Asp Pro Asn Thr His Glu Asn Leu Thr Tyr Val Gln Leu Leu 4500 4505 4510 Arg Arg Cys Val Pro Asp Pro Asp Thr Gly Leu Tyr Met Leu Gln Leu 4515 4520 4525 Ala Gly Arg Gly Ser Ala Val His Gln Leu Ser Glu Glu Leu Arg Cys 4530 4535 4540 Ala Leu Arg Asp Ala Arg Val Thr Pro Gly Ser Gly Ala Leu Gln Gly 4545 4550 4555 4560 Gln Ser Val Ser Val Trp Glu Leu Leu Phe Tyr Arg Glu Val Ser Glu 4565 4570 4575 Asp Arg Arg Gln Asp Leu Leu Ser Arg Tyr Arg Ala Gly Thr Leu Thr 4580 4585 4590 Val Glu Glu Leu Gly Ala Thr Leu Thr Ser Leu Leu Ala Gln Ala Gln 4595 4600 4605 Ala Gln Ala Arg Ala Glu Ala Glu Ala Gly Ser Pro Arg Pro Asp Pro 4610 4615 4620 Arg Glu Ala Leu Arg Ala Ala Thr Met Glu Val Lys Val Gly Arg Leu 4625 4630 4635 4640 Arg Gly Arg Ala Val Pro Val Trp Asp Val Leu Ala Ser Gly Tyr Val 4645 4650 4655 Ser Gly Ala Ala Arg Glu Glu Leu Leu Ala Glu Phe Gly Ser Gly Thr 4660 4665 4670 Leu Asp Leu Pro Ala Leu Thr Arg Arg Leu Thr Ala Ile Ile Glu Glu 4675 4680 4685 Ala Glu Glu Ala Pro Gly Ala Arg Pro Gln Leu Gln Asp Ala Trp Arg 4690 4695 4700 Gly Pro Arg Glu Pro Gly Pro Ala Gly Arg Gly Asp Gly Asp Ser Gly 4705 4710 4715 4720 Arg Ser Gln Arg Glu Gly Gln Gly Glu Gly Glu Thr Gln Glu Ala Ala 4725 4730 4735 Ala Ala Ala Ala Ala Ala Arg Arg Gln Glu Gln Thr Leu Arg Asp Ala 4740 4745 4750 Thr Met Glu Val Gln Arg Gly Gln Phe Gln Gly Arg Pro Val Ser Val 4755 4760 4765 Trp Asp Val Leu Phe Ser Ser Tyr Leu Ser Glu Ala Arg Arg Asp Glu 4770 4775 4780 Leu Leu Ala Gln His Ala Ala Gly Ala Leu Gly Leu Pro Asp Leu Val 4785 4790 4795 4800 Ala Val Leu Thr Arg Val Ile Glu Glu Thr Glu Glu Arg Leu Ser Lys 4805 4810 4815 Val Ser Phe Arg Gly Leu Arg Arg Gln Val Ser Ala Ser Glu Leu His 4820 4825 4830 Thr Ser Gly Ile Leu Gly Pro Glu Thr Leu Arg Asp Leu Ala Gln Gly 4835 4840 4845 Thr Lys Thr Leu Gln Glu Val Thr Glu Met Asp Ser Val Lys Arg Tyr 4850 4855 4860 Leu Glu Gly Thr Ser Cys Ile Ala Gly Val Leu Val Pro Ala Lys Asp 4865 4870 4875 4880 Gln Pro Gly Arg Gln Glu Lys Met Ser Ile Tyr Gln Ala Met Trp Lys 4885 4890 4895 Gly Val Leu Arg Pro Gly Thr Ala Leu Val Leu Leu Glu Ala Gln Ala 4900 4905 4910 Ala Thr Gly Phe Val Ile Asp Pro Val Arg Asn Leu Arg Leu Ser Val 4915 4920 4925 Glu Glu Ala Val Ala Ala Gly Val Val Gly Gly Glu Ile Gln Glu Lys 4930 4935 4940 Leu Leu Ser Ala Glu Arg Ala Val Thr Gly Tyr Thr Asp Pro Tyr Thr 4945 4950 4955 4960 Gly Gln Gln Ile Ser Leu Phe Gln Ala Met Gln Lys Asp Leu Ile Val 4965 4970 4975 Arg Glu His Gly Ile Arg Leu Leu Glu Ala Gln Ile Ala Thr Gly Gly 4980 4985 4990 Val Ile Asp Pro Val His Ser His Arg Val Pro Val Asp Val Ala Tyr 4995 5000 5005 Arg Arg Gly Tyr Phe Asp Glu Glu Met Asn Arg Val Leu Ala Asp Pro 5010 5015 5020 Ser Asp Asp Thr Lys Gly Phe Phe Asp Pro Asn Thr His Glu Asn Leu 5025 5030 5035 5040 Thr Tyr Leu Gln Leu Leu Gln Arg Ala Thr Leu Asp Pro Glu Thr Gly 5045 5050 5055 Leu Leu Phe Leu Ser Leu Ser Leu Gln 5060 5065 <210> 3 <211> 7 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 3 Ile Tyr Gln Ala Met Trp Lys 1 5 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:P1 <400> 4 ccagacacaa caagtatgcc 20 <210> 5 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:P2 <400> 5 tagcgcttga ccgagtccat c 21 <210> 6 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:P3 <400> 6 tcgagaagca ggaaacca 18 <210> 7 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:P4 <400> 7 ccatatgaca catagacgac 20 <210> 8 <211> 12 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 8 Met Ser Ile Tyr Gln Ala Met Trp Lys Gly Val Leu 1 5 10 <210> 9 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 9 Thr Lys Gly Phe Phe Asp Pro Asn Thr His 1 5 10 <210> 10 <211> 13 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 10 Met Ser Ile Tyr Gln Ala Met Trp Lys Gly Val Leu Cys 1 5 10 <210> 11 <211> 13 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 11 Thr Lys Gly Phe Phe Asp Pro Asn Thr His Glu Asn Cys 1 5 10 <210> 12 <211> 17 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 12 Val Lys Arg Tyr Leu Glu Gly Thr Ser Cys Ile Ala Gly Val Leu Val 1 5 10 15 Pro <210> 13 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:P5 <400> 13 ggcgccagga cctgctga 18 <210> 14 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:P6 <400> 14 caccttgctg agccgctcct 20 <210> 15 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:P7 <400> 15 ccacaccacg gtggacga 18 <210> 16 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:P8 <400> 16 actcagcagc tgcctctg 18

【図面の簡単な説明】

【図１】本発明のヒトエピプラキンの概略図及び関連す
るプラキンファミリーメンバーとの比較を示す図であ
る。

【図２】本発明のヒトエピプラキンのアミノ酸配列を示
す図である。

【図３】本発明のヒトエピプラキンのアミノ酸配列を示
す図であり、図２の続きである。

【図４】本発明のヒトエピプラキンのカルボキシ末端ド
メインに存在する保存性の高い５個の相同的なリピート
配列の比較と、５個の保存性の高いリンカー領域におけ
る１個のリピート配列中（残基２，３９１から２，７４
８）の３つの相同的セグメントの配列の比較を示す図で
ある。

【図５】本発明のヒトエピプラキンにおける各種ペプチ
ドを用いた酵素結合免疫吸着検定法の結果、ヒトエピプ
ラキンにおける各種ペプチドと患者血清との反応の結
果、及びヒトエピプラキンの抗原エピトープのアミノ酸
配列をそれぞれ示す図である。

【図６】本発明のヒトエピプラキンに対する各抗血清を
用いたウェスタンブロットの結果を示す図である。

【図７】本発明のエピプラキン、プレクチン、及びユビ
キチンの発現臓器をノーザンドットブロット法により調
べた結果を示す図である。

【図８】表皮におけるエピプラキンの局在部位を免疫蛍
光染色法により調べた結果を示す図である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｐ 37/00 Ｃ０７Ｋ 16/28 ４Ｃ０８４ Ｃ０７Ｋ 14/705 19/00 ４Ｃ０８５ 16/28 Ｃ１２Ｎ 1/15 ４Ｈ０４５ 19/00 1/19 Ｃ１２Ｎ 1/15 1/21 1/19 Ｃ１２Ｑ 1/02 1/21 1/68 Ａ 5/10 Ｇ０１Ｎ 33/15 Ｚ Ｃ１２Ｑ 1/02 33/50 Ｚ 1/68 33/53 Ｄ Ｇ０１Ｎ 33/15 Ｍ 33/50 33/564 Ｚ 33/53 33/566 33/577 Ｂ 33/564 Ｃ１２Ｐ 21/08 33/566 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ 33/577 5/00 Ａ // Ｃ１２Ｐ 21/08 Ａ６１Ｋ 37/02 Ｆターム(参考） 2G045 AA25 AA40 BA13 BB03 BB20 CA25 CB01 CB03 CB07 CB21 DA12 DA13 DA14 DA36 DA77 FB02 FB03 FB04 FB06 FB07 4B024 AA01 AA15 BA31 CA04 HA12 4B063 QA01 QA19 QQ43 QR55 QR80 QS32 4B064 AG27 DA01 4B065 AB01 CA46 4C084 AA02 BA22 BA23 ZB07 4C085 AA13 AA14 CC21 4H045 AA11 AA30 CA40 DA76 DA86 EA22 EA54

Claims (33)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 以下の(ａ)又は(ｂ)の蛋白質をコードす
   る遺伝子。 (ａ)配列番号２に示されるアミノ酸配列からなる蛋白質 (ｂ)配列番号２に示されるアミノ酸配列において、１若
   しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加された
   アミノ酸配列からなり、かつエピプラキン活性を有する
   蛋白質
2. 【請求項２】 配列番号１に示される塩基配列若しくは
   その相補的配列又はこれらの配列の一部若しくは全部を
   含む配列からなるＤＮＡ。
3. 【請求項３】 請求項２記載の遺伝子を構成するＤＮＡ
   とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ
   エピプラキン活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ。
4. 【請求項４】 配列番号２に示されるアミノ酸配列から
   なる蛋白質。
5. 【請求項５】 配列番号２に示されるアミノ酸配列にお
   いて、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは
   付加されたアミノ酸配列からなり、かつエピプラキン活
   性を有する蛋白質。
6. 【請求項６】 請求項４又は５記載の蛋白質の一部から
   なり、自己免疫性水疱症患者血清に結合することを特徴
   とするペプチド。
7. 【請求項７】 ペプチドが請求項４又は５記載の抗原エ
   ピトープであることを特徴とする請求項６記載のペプチ
   ド。
8. 【請求項８】 ペプチドが配列番号３に示されるアミノ
   酸配列からなることを特徴とする請求項６又は７記載の
   ペプチド。
9. 【請求項９】 請求項４若しくは５記載の蛋白質又は請
   求項６〜８のいずれか記載のペプチドと、マーカー蛋白
   質及び／又はペプチドタグとを結合させた融合蛋白質又
   は融合ペプチド。
10. 【請求項１０】 請求項４若しくは５記載の蛋白質又は
    請求項６〜８のいずれか記載のペプチドに特異的に結合
    する抗体。
11. 【請求項１１】 抗体がモノクローナル抗体であること
    を特徴とする請求項１０記載の抗体。
12. 【請求項１２】 抗体がポリクローナル抗体であること
    を特徴とする請求項１０記載の抗体。
13. 【請求項１３】 請求項１０〜１２のいずれか記載の抗
    体が特異的に結合する組換え蛋白質又はペプチド。
14. 【請求項１４】 請求項４若しくは５記載の蛋白質又は
    請求項６〜８のいずれか記載のペプチドを発現すること
    ができる発現系を含んでなる宿主細胞。
15. 【請求項１５】 請求項４若しくは５記載の蛋白質又は
    請求項６〜８のいずれか記載のペプチドをコードする遺
    伝子機能が染色体上で欠損した非ヒト動物。
16. 【請求項１６】 請求項４若しくは５記載の蛋白質又は
    請求項６〜８のいずれか記載のペプチドを過剰発現する
    非ヒト動物。
17. 【請求項１７】 非ヒト動物が、マウス又はラットであ
    る請求項１５又は１６記載の非ヒト動物。
18. 【請求項１８】 請求項４若しくは５記載の蛋白質、請
    求項６〜８のいずれか記載のペプチド、又は請求項４若
    しくは５記載の蛋白質又は請求項６〜８のいずれか記載
    のペプチドを発現している細胞膜と、被検物質とを用い
    ることを特徴とするエピプラキン活性促進又は抑制物質
    のスクリーニング方法。
19. 【請求項１９】 請求項４若しくは５記載の蛋白質又は
    請求項６〜８のいずれか記載のペプチドを発現している
    細胞と、被検物質とを用いることを特徴とするエピプラ
    キン活性促進若しくは抑制物質又は該蛋白質若しくはペ
    プチドの発現促進若しくは抑制物質のスクリーニング方
    法。
20. 【請求項２０】 請求項４若しくは５記載の蛋白質又は
    請求項６〜８のいずれか記載のペプチドを発現している
    細胞が、請求項１４記載の宿主細胞であることを特徴と
    する請求項１９記載のエピプラキン活性促進若しくは抑
    制物質又は該蛋白質若しくはペプチドの発現促進若しく
    は抑制物質のスクリーニング方法。
21. 【請求項２１】 請求項１５〜１７のいずれか記載の非
    ヒト動物と、被検物質とを用いることを特徴とするエピ
    プラキン活性促進若しくは抑制物質、又は請求項４若し
    くは５記載の蛋白質又は請求項６〜８のいずれか記載の
    ペプチドの発現促進若しくは抑制物質のスクリーニング
    方法。
22. 【請求項２２】 請求項１８〜２１のいずれか記載のス
    クリーニング方法により得られるエピプラキン活性促進
    物質。
23. 【請求項２３】 請求項１８〜２１のいずれか記載のス
    クリーニング方法により得られるエピプラキン活性抑制
    物質。
24. 【請求項２４】 請求項１９〜２１のいずれか記載のス
    クリーニング方法により得られる請求項４若しくは５記
    載の蛋白質又は請求項６〜８のいずれか記載のペプチド
    の発現促進物質。
25. 【請求項２５】 請求項１９〜２１のいずれか記載のス
    クリーニング方法により得られる請求項４若しくは５記
    載の蛋白質又は請求項６〜８のいずれか記載のペプチド
    の発現抑制物質。
26. 【請求項２６】 請求項４若しくは５記載の蛋白質、請
    求項６〜８のいずれか記載のペプチド、請求項１３記載
    の組換え蛋白質若しくはペプチド、又は請求項１０〜１
    ２のいずれか記載の抗体を有効成分として含有する自己
    免疫疾患治療薬。
27. 【請求項２７】 自己免疫疾患が、自己免疫性水疱症で
    あることを特徴とする請求項２６記載の自己免疫疾患治
    療薬。
28. 【請求項２８】 請求項４又は５記載の蛋白質をコード
    するＤＮＡ又はＲＮＡのアンチセンス鎖の全部又は一部
    からなる自己免疫疾患の診断用プローブ。
29. 【請求項２９】 自己免疫疾患が、自己免疫性水疱症で
    あることを特徴とする請求項２８記載の診断用プロー
    ブ。
30. 【請求項３０】 請求項２８又は２９記載の診断用プロ
    ーブ及び／又は請求項１０〜１２のいずれか記載の抗体
    を含有することを特徴とする自己免疫疾患診断薬。
31. 【請求項３１】 自己免疫疾患が、自己免疫性水疱症で
    あることを特徴とする請求項３０記載の自己免疫疾患診
    断薬。
32. 【請求項３２】 請求項２８若しくは２９記載の診断用
    プローブ、及び／又は請求項３０若しくは３１記載の自
    己免疫疾患診断薬を含有することを特徴とする自己免疫
    疾患診断キット。
33. 【請求項３３】 自己免疫疾患が、自己免疫性水疱症で
    あることを特徴とする請求項３２記載の自己免疫疾患診
    断キット。