CN112209991B - APC/Asef相互作用的三肽抑制剂及其应用 - Google Patents

APC/Asef相互作用的三肽抑制剂及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种APC/Asef相互作用的三肽抑制剂，所述三肽抑制剂包含如式(1)所示的氨基酸序列及其盐：式(1)：P1‑X1‑X2‑X3‑P2。本发明提供的新型三肽通过抑制癌细胞中APC/Asef蛋白相互作用起到抗肿瘤作用。多肽的N端与C端封端，能够与APC蛋白形成强烈的疏水作用，并且多肽中所含的带有羧基的氨基酸能够与APC蛋白中的碱性氨基酸形成强烈的静电作用，3肽的立体构型能够与APC蛋白口袋契合，因此能够强烈的抑APC/Asef相互作用，从而起到抗肿瘤治疗效果。本发明抗肿瘤肽具有广谱性，对多种癌细胞具有抑制和杀伤作用，肽链长度短，抗肿瘤活性高，而且稳定不易失活。

Description

APC/Asef相互作用的三肽抑制剂及其应用
技术领域
本发明属于多肽领域，更具体地讲，涉及一类抗肿瘤三肽化合物及其应用。
背景技术
细胞内特异性的蛋白质之间相互作用构成了细胞内多种多样的信号转导通路，对正常细胞及癌细胞的生存都至关重要，是一类重要的药物靶标源。研究发现，癌细胞中存在一种特异的蛋白蛋白相互作用―截短型APC(腺瘤性息肉蛋白Adenomatous PolyposisColi)/Asef(鸟苷酸交换因子APC-stimulated guanine nucleotide exchange factor)蛋白相互作用，它肿瘤的发生发展中发挥着重要作用，可成为癌症治疗的新药物靶标。
APC在生理状态下参与调节细胞粘附和细胞迁移等过程。临床研究证实在结肠癌、乳腺癌、肺癌等病人中，APC基因都发生移码突变或缺失突变，表达截短型的APC蛋白。截短型APC蛋白N端的ARM结构域彻底暴露，不再发挥正常的生理功能，却能够有效的结合鸟苷酸交换因子Asef。正常生理状态下Asef处于自身抑制状态，被截短型的APC结合后，Asef蛋白构象发生变化，自身抑制被释放造成鸟苷酸交换因子活性被激活，从而激活Rho家族的GTPase-Cdc42将GTP换为GDP，使信号向下游因子传导，引发异常的细胞扁化、细胞膜皱褶化、假足产生，细胞间黏附力降低，促进细胞迁移和血管生成，形成息肉从而导致癌细胞的增殖和侵袭。进一步研究表明，Asef基因敲除后能够有效的抑制癌细胞的迁移。
近年来，通过阻断APC/Asef相互作用进行结肠癌治疗取得了一定进展，主要工作集中在恢复APC的全长功能以避免与Asef发生相互作用。Macnab等将外源野生型APC基因导入体内，使其在体内表达，替代已突变的截短型APC来破坏其与Asef的结合，但外源基因在体内的表达能否控制在适度水平等还存在一系列问题。Floquet等利用基因诱导的方法来恢复全长APC，但由于APC全长较长，不易转染，极大的限制了这种方法的应用。
基于此，人们尝试寻找特异性的活性多肽能够阻断APC/Asef相互作用，并且使这些多肽作为癌症治疗药物，以解决当前耐药性及有效治疗药物不足的现状。然而，没有文献公开本发明的三肽化合物。
发明内容
本发明的第一个目的在于提供一种APC/Asef相互作用的三肽抑制剂。
本发明的第二个目的在于提供供APC/Asef相互作用的三肽抑制剂在制备APC/Asef蛋白相互作用抑制剂中的应用。
本发明的第三个目的在于提供APC/Asef相互作用的三肽抑制剂在制备抗肿瘤药物中的应用。
本发明的第四个目的在于提供一种预防或治疗肿瘤的药物组合物。
为了实现上述目的，本发明提供了一种APC/Asef相互作用的三肽抑制剂，所述三肽抑制剂包含如式(1)所示的氨基酸序列及其盐：
式(1)：P1-X1-X2-X3-P2
其中P1是下式代表的基团
-CORA1，-SO2RA1，-CO-RA1RA2；
X1是Glu、Gly、His、Pro、Phe(P3)或Ala(P4)；
X2是Ser、Trp、Lys、Ala、Arg、Ile、Phe、4-噻唑丙氨酸、环丙基丙氨酸、
4-三氟甲基苯丙氨酸、3-(3-苯并噻吩基)丙氨酸、苯甲酰基苯丙氨酸或4,4-
联苯丙氨酸、Phe(P3)或Gly(P5)；
X3是Leu、Pro、Lys、Gly(P5)、Ala(P4)、Leu、N-Me-Leu、371770-32-0；
P2是下式代表的基团：
-H、-NH2或-NRA1RA2；
其中，RA1、RA2表示氢原子、任意取代的烃基团、任选取代的杂环基团或任选取代的苯环；
Phe(P3)表示苯丙氨酸以及苯丙氨酸中的苯环被杂环、任意取代的烃基团、任意取代的苯环、联苯或任意取代的萘环所取代；
Ala(P4)表示丙氨酸或者丙氨酸的甲基被任意取代的苯环或者环戊基所取代；
Gly(P5)表示甘氨酸或者甘氨酸的亚甲基被环戊基、环己基。
作为一个优选方案，P1是4-嘧啶甲酰基，2-氯-4-嘧啶甲酰基，2-溴-4-嘧啶甲酰基或2-硫甲基-4-嘧啶甲酰基。
作为一个优选方案，X1是Glu或Gly。
作为一个优选方案，X2是Ser、Phe、4-噻唑丙氨酸、环丙基丙氨酸、4-三氟甲基苯丙氨酸、3-(3-苯并噻吩基)丙氨酸、苯甲酰基苯丙氨酸或4,4-联苯丙氨酸。
作为一个优选方案，X3是Leu，371770-32-0或Pro。
作为一个优选方案，P2是磺胺二甲氧嘧啶，反式-2-苯基环丙氨基、磺胺嘧啶、或环丙胺。
作为一个优选方案，所述三肽抑制剂由式(1)所代表的序列或其盐组成。
作为一个优选方案，所述三肽或其盐的长度不多于三个氨基酸。
作为一个优选方案，当P1为化合物31462-59-6时，所述三肽抑制剂的序列为31462-59-6-E-S-L-P2，31462-59-6-E-A-L-P2。
作为一个优选方案，当P2为化合物1986-47-6，122-11-2时，所述三肽抑制剂的序列为P1-E-S-L-P2，P1-E-A-L-P2。
作为一个优选方案，当X1为Glu时，所述三肽抑制剂的序列为P1-E-A-L-P2，P1-E-A-L-P2。
作为一个优选方案，当X3为Leu，371770-32-0或Pro时，所述三肽抑制剂的序列为P1-E-S-X3-P2，P1-E-A-X3-P2。
在优选的技术方案中，所述三肽的序列为：
多肽1(39901-94-5)-ESL-(1003-03-8)；多肽2(39901-94-5)-ESL-(51-67-2)；多肽3(31462-59-6)-ESL-(122-11-2)；多肽4(31462-59-6)-ESL-(1700004-46-1)；多肽5(31462-59-6)-ESL-(72-14-0)；多肽6(31462-59-6)-ESL-(127-69-5)；多肽7(31462-59-6)-ESL-(144-83-2)；多肽8(31462-59-6)-ESL-(2447-57-6)；多肽9(31462-59-6)-ESL-(80-35-3)；多肽10(31462-59-6)-ESL-(53981-38-7)；多肽11(31462-59-6)-ESL-(4998-76-9)；多肽12(31462-59-6)-ESL-(41100-52-1)；多肽13(31462-59-6)-ESL-(2439-56-7)；多肽14(31462-59-6)-ESL-(1156491-10-9)；多肽15(31462-59-6)-ESL-(1807938-62-0)；多肽16(31462-59-6)-ESL-(1570-99-6)；多肽17(31462-59-6)-ESL-(64-04-0)；多肽18(31462-59-6)-ESL-(104777-77-7)；多肽19(31462-59-6)-ESL-(3721-28-6)；多肽20(31462-59-6)-ESL-(90874-41-2)；多肽21(31462-59-6)-ESL-(59592-32-4)；多肽22(31462-59-6)-ESL-(21404-88-6)；多肽23(31462-59-6)-ESL-(19992-45-1)；多肽24(31462-59-6)-ESL-(765-30-0)；多肽25(31462-59-6)-ESL-(5452-35-7)；多肽26(31462-59-6)-ESL-(91469-55-5)；多肽27(31462-59-6)-ESL-(100-60-7)；多肽28(31462-59-6)-ESL-(1986-47-6)；多肽29(1126-44-9)-ESL-(1986-47-6)；多肽30(149849-92-3)-ESL-(1986-47-6)；多肽31(31462-59-6)-EAL-(1986-47-6)；多肽32(31462-59-6)-E(112883-43-9)L-(1986-47-6)；多肽33(31462-59-6)-ES(371770-32-0)-(1986-47-6)；多肽34(31462-59-6)-EQL-(1986-47-6)；多肽35(31462-59-6)-ENL-(1986-47-6)；多肽36(31462-59-6)-ESL-(2038-57-5)；多肽37(31462-59-6)-EFL-(1986-47-6)；多肽38(31462-59-6)-E-(205526-38-1)-L-(1986-47-6)；多肽39(31462-59-6)-E-(205528-32-1)-L-(1986-47-6)；多肽40(31462-59-6)-E-(214750-76-2)-L-(1986-47-6)；多肽41(31462-59-6)-E-(213383-02-9)-L-(1986-47-6)；多肽42(31462-59-6)-E-(177966-60-8)-L-(1986-47-6)；多肽43(31462-59-6)-E-(117666-96-3)-L-(1986-47-6)；多肽44(31462-59-6)-E-(238742-88-6)-L-(1986-47-6)。注：括号内为化合物的CAS号。
为了实现本发明第二个目的，本发明提供了APC/Asef相互作用的三肽抑制剂在制备APC/Asef相互作用抑制剂中的应用。
为了实现本发明第三个目的，本发明提供了APC/Asef相互作用的三肽抑制剂在制备抗肿瘤药物中的应用。
作为一个优选方案，所述肿瘤是指结肠癌、宫颈癌、乳腺癌、前列腺癌、甲状腺癌、肝癌、胃癌、肺癌、肾癌、膀胱癌、鼻咽癌、喉癌、食道癌、腺样囊性癌、白血病、黑色素瘤、视网膜母细胞瘤。
为了实现本发明第四个目的，本发明提供了一种预防或治疗肿瘤的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物含有上述多肽抑制剂或其盐，或上述多肽抑制剂或其盐的混合物，和药学上可接受的载体。
本发明的药物组合物可以制成本领域公知的各种常规剂型，包括但不限于，适于口服的片剂(包括各种包衣片剂、缓释或控释片剂)、锭剂、胶囊剂(包括软胶囊和硬胶囊)、颗粒剂、可分散粉末、水性或油性混悬剂、乳剂、酏剂或糖浆剂等等；适于局部使用的霜剂、软膏剂、凝胶、水性或油性溶液或混悬剂等等；适于吸入使用的粉末或液体气雾剂、适于经胃肠外给药的无菌水性或油性的静脉内、皮下或肌内注射剂、栓剂等等。
本领域技术人员知晓在本发明的药物组合物中，作为活性成分的抗肿瘤肽和药学上可接受的载体的合适用量，能够根据本领域的常规方法确定。本领域技术人员同样知晓如何制备含有本发明的抗肿瘤肽的药物组合物。
本发明的抗肿瘤肽可以采用本领域技术人员已知的方法合成，例如固相合成，并采用本领域技术人员已知的方法进行纯化，例如高效液相色谱法。
本发明的优点在于：本发明提供了一种新型三肽，通过抑制癌细胞中APC/Asef蛋白相互作用起到抗肿瘤作用。它来源于Asef蛋白，我们选择性地缩短了该蛋白的肽链长度并进一步优化了序列，最终得到了本发明的抗肿瘤肽。多肽的N端与C端封端，能够与APC蛋白形成强烈的疏水作用，并且多肽中所含的带有羧基的氨基酸能够与APC蛋白中的碱性氨基酸形成强烈的静电作用，3肽的立体构型能够与APC蛋白口袋契合，因此能够强烈的抑APC/Asef相互作用，从而起到抗肿瘤治疗效果。本发明抗肿瘤肽具有广谱性，对多种癌细胞具有抑制和杀伤作用，肽链长度短，抗肿瘤活性高，而且稳定不易失活。
附图说明
图1多肽28的体外结合亲和力实验，IC50＝4.746μM。
图2等温量热滴定法测定多肽28与APC的亲和力结果。
图3等温量热滴定法测定多肽44与APC的亲和力结果。
图4等温量热滴定法测定多肽29与APC的亲和力结果。
图5等温量热滴定法测定多肽33与APC的亲和力结果。
图6等温量热滴定法测定多肽38与APC的亲和力结果。
图7免疫印迹法测定多肽44，28对APC/Asef相互作用的抑制作用。
图8免疫印迹法测定多肽29、33、38对APC/Asef相互作用的抑制作用。
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。
实施例1多肽1的固相合成、切割、纯化以及鉴定
1.1多肽1的固相合成
本发明利用多肽合成仪采用固相合成法合成多肽1(39901-94-5)-ESL-(1003-03-8)：以DMF为溶剂，各种α-氨基被Fmoc保护的氨基酸溶液的浓度0.25mol/L，HBTU溶液、HOBt溶液的浓度为0.33mol/L，哌啶溶液的浓度为200ml/L，DIEA溶液的浓度为174.2ml/L。
1.1.1活化树脂
取1g Fmoc(芴苄氧羰基)保护的丁苯酰胺树脂放入反应釜并加入适量二氯甲烷膨胀树脂，抽滤除去反应釜中多余二氯甲烷并将膨胀树脂重新置入反应釜。加入6.00mL含20％哌啶的N,N-二甲基甲酰胺溶液振荡5min，继续抽滤除去溶剂，再加入6.00mL含20％哌啶的N,N-二甲基甲酰胺溶液振荡15min，再次抽滤除去溶剂，甲醇洗涤3次后再用二氯甲烷洗涤三次，再次抽滤除去溶剂，取15颗树脂用茚三酮检测，如检测结果显蓝色则停止活化步骤，若不变色则重复以上步骤。
1.1.2多肽的缩合
称取N-芴甲氧羰基-L-亮氨酸(Fmoc-Leu-OH)1.12g与1-羟基苯并三唑(HOBT)0.14g加入上述反应釜中。加入含有0.33mL2,4,6-三甲基吡啶和0.16mL N,N-二异丙基碳二亚胺的6.00mL N,N-二甲基甲酰胺溶液，密封后35℃振荡反应1h。反应结束后洗涤，将反应液抽滤干净，依次用N,N-二甲基甲酰胺、甲醇以及二氯甲烷洗涤，完毕后取15颗树脂用茚三酮检测，若呈蓝色则重复上述过程直到检测结果显无色。接着加入6.00mL含20％哌啶的N,N-二甲基酰胺溶液振荡5+15min，抽滤完后用N,N-二甲基甲酰胺、甲醇、二氯甲烷分别3次清洗树脂，抽滤除去滤液后，取15颗树脂用茚三酮检测，若为蓝色结束上述步骤，若无色则重复以上脱Fmoc基步骤。按照上述方法逐一缩合Fmoc-Ser-OH和Fmoc-Glu(OTBU)-OH。待合成完毕后，分别用乙酰基封端。再将树脂分别用N，N-二甲基甲酰胺和二氯甲烷先后洗涤，并置于真空干燥箱内50℃干燥48h备用。
1.2多余基团及树脂的切割
将干燥后的树脂用刮刀切开连接处，并将其投放于25mL茄形瓶中，冰水浴下缓慢滴入15mL树脂切割液(含92.5％三氟乙酸，2.5％水，2.5％对甲酚和2.5％1,2-乙二硫醇)，升温至室温下振荡60min，紫外检测反应是否完成，待反应完成后将反应液连同树脂一同转移至抽滤装置中抽滤掉树脂，并将收集到的滤液置于茄形瓶内，冰乙醚沉降并在4℃、7 000×g冷冻离心15min，弃上清液，重复操作3次，最后真空干燥烘箱内50℃干燥48h即得肽粗品0.2g。
1.3 APC/Asef多肽抑制剂的纯化及鉴定
用反相高效液相色谱法对多肽进行纯化。固定相为C18半制备柱，流动相由水相和有机相组成，水相：去离子水(含质量浓度0.1％三氟乙酸)；有机相：含80％乙腈水溶液(含质量浓度0.1％的三氟乙酸)；流速：6.00mL/min；洗脱梯度：水相(55％→10％，1％/min)，有机相(45％→90％，1％/min)。采集高效液相色谱图中最高峰的洗脱液，50℃旋转蒸发仪除去洗脱液中的乙腈，并将剩余的水溶液迅速冷冻后用冷冻干燥机除去水分，得到5mg白色蓬松粉末状固体，HPLC-MS(高效液相色谱-质谱联用)验证固体纯度大于98％，ESI:518.53[M-H]-。
实施例2按照实施例1相同的方法制备多肽2(39901-94-5)-ESL-(51-67-2)，固体纯度大于98％，ESI:570.57[M-H]-；
实施例3按照实施例1相同的方法制备多肽3(31462-59-6)-ESL-(122-11-2)，固体纯度大于98％，ESI:744.8[M-H]-；
实施例4按照实施例1相同的方法制备多肽4(31462-59-6)-ESL-(1700004-46-1)，固体纯度大于98％，ESI:709.56[M-H]-；
实施例5按照实施例1相同的方法制备多肽5(31462-59-6)-ESL-(72-14-0)，固体纯度大于98％，ESI:689.75[M-H]-；
实施例6按照实施例1相同的方法制备多肽6(31462-59-6)-ESL-(127-69-5)，固体纯度大于98％，ESI:701.74[M-H]-；
实施例7按照实施例1相同的方法制备多肽7(31462-59-6)-ESL-(144-83-2)，固体纯度大于98％，ESI:683.23[M-H]-；
实施例8按照实施例1相同的方法制备多肽8(31462-59-6)-ESL-(2447-57-6)，固体纯度大于98％，ESI:744.25[M-H]-；
实施例9按照实施例1相同的方法制备多肽9(31462-59-6)-ESL-(80-35-3)，固体纯度大于98％，ESI:714.24[M-H]-；
实施例10按照实施例1相同的方法制备多肽10(31462-59-6)-ESL-(53981-38-7)，固体纯度大于98％，ESI:583.26[M-H]-；
实施例11按照实施例1相同的方法制备多肽11(31462-59-6)-ESL-(4998-76-9)，固体纯度大于98％，ESI:533.28[M-H]-；
实施例12按照实施例1相同的方法制备多肽12(31462-59-6)-ESL-(41100-52-1)，固体纯度大于98％，ESI:613.34[M-H]-；
实施例13按照实施例1相同的方法制备多肽13(31462-59-6)-ESL-(2439-56-7)，固体纯度大于98％，ESI:533.28[M-H]-
实施例14按照实施例1相同的方法制备多肽14(31462-59-6)-ESL-(1156491-10-9)，固体纯度大于98％，ESI:639.71[M-H]-
实施例15按照实施例1相同的方法制备多肽15(31462-59-6)-ESL-(1807938-62-0)，固体纯度大于98％，ESI:656.11[M-H]-
实施例16按照实施例1相同的方法制备多肽16(31462-59-6)-ESL-(1570-99-6)，固体纯度大于98％，ESI:581.31[M-H]-
实施例17按照实施例1相同的方法制备多肽17(31462-59-6)-ESL-(64-04-0)，固体纯度大于98％，ESI:555.31[M-H]-
实施例18按照实施例1相同的方法制备多肽18(31462-59-6)-ESL-(104777-77-7)，固体纯度大于98％，ESI:583.31[M-H]-
实施例19按照实施例1相同的方法制备多肽19(31462-59-6)-ESL-(3721-28-6)，固体纯度大于98％，ESI:567.3[M-H]-
实施例20按照实施例1相同的方法制备多肽20(31462-59-6)-ESL-(90874-41-2)，固体纯度大于98％，ESI:581.33[M-H]-
实施例21按照实施例1相同的方法制备多肽21(31462-59-6)-ESL-(59592-32-4)，固体纯度大于98％，ESI:687.41[M-H]-
实施例22按照实施例1相同的方法制备多肽22(31462-59-6)-ESL-(21404-88-6)，固体纯度大于98％，ESI:583.34[M-H]-
实施例23按照实施例1相同的方法制备多肽23(31462-59-6)-ESL-(19992-45-1)，固体纯度大于98％，ESI:609.38[M-H]-
实施例24按照实施例1相同的方法制备多肽24(31462-59-6)-ESL-(765-30-0)，固体纯度大于98％，ESI:491.2[M-H]-
实施例25按照实施例1相同的方法制备多肽25(31462-59-6)-ESL-(5452-35-7)，固体纯度大于98％，ESI:547.32[M-H]-
实施例26按照实施例1相同的方法制备多肽26(31462-59-6)-ESL-(91469-55-5)，固体纯度大于98％，ESI:517.2[M-H]-
实施例27按照实施例1相同的方法制备多肽27(31462-59-6)-ESL-(100-60-7)，固体纯度大于98％，ESI:547.31[M-H]-
实施例28按照实施例1相同的方法制备多肽28(31462-59-6)-ESL-(1986-47-6)，固体纯度大于98％，ESI:603.76[M-H]-
实施例29按照实施例1相同的方法制备多肽29(1126-44-9)-ESL-(1986-47-6)，固体纯度大于98％，ESI:649.84[M-H]-
实施例30按照实施例1相同的方法制备多肽30(149849-92-3)-ESL-(1986-47-6)，固体纯度大于98％，ESI:637.84[M-H]-
实施例31按照实施例1相同的方法制备多肽31(31462-59-6)-EAL-(1986-47-6)，固体纯度大于98％，ESI:587.76[M-H]-
实施例32按照实施例1相同的方法制备多肽32(31462-59-6)-E-(112883-43-9)-L-(1986-47-6)，固体纯度大于98％，ESI:715.94[M-H]-
实施例33按照实施例1相同的方法制备多肽33(31462-59-6)-ES-(371770-32-0)-(1986-47-6)，固体纯度大于98％，ESI:757.94[M-H]-
实施例34按照实施例1相同的方法制备多肽34(31462-59-6)-EQL-(1986-47-6)，固体纯度大于98％，ESI:644.82[M-H]-
实施例35按照实施例1相同的方法制备多肽35(31462-59-6)-ENL-(1986-47-6)，固体纯度大于98％，ESI:630.82[M-H]-
实施例36按照实施例1相同的方法制备多肽36(31462-59-6)-ESL-(2038-57-5)，固体纯度大于98％，ESI:569.31[M-H]-
实施例37按照实施例1相同的方法制备多肽37(31462-59-6)-EFL-(1986-47-6)，固体纯度大于98％，ESI:628.73[M-H]-
实施例38按照实施例1相同的方法制备多肽38(31462-59-6)-E-(205526-38-1)-L-(1986-47-6)，固体纯度大于98％，ESI:704.83[M-H]-
实施例39按照实施例1相同的方法制备多肽39(31462-59-6)-E-(205528-32-1)-L-(1986-47-6)，固体纯度大于98％，ESI:635.74[M-H]-
实施例40按照实施例1相同的方法制备多肽40(31462-59-6)-E-(214750-76-2)-L-(1986-47-6)，固体纯度大于98％，ESI:592.70[M-H]-
实施例41按照实施例1相同的方法制备多肽41(31462-59-6)-E-(213383-02-9)-L-(1986-47-6)，固体纯度大于98％，ESI:684.84[M-H]-
实施例42按照实施例1相同的方法制备多肽42(31462-59-6)-E-(177966-60-8)-L-(1986-47-6)，固体纯度大于98％，ESI:684.81[M-H]-
实施例43按照实施例1相同的方法制备多肽43(31462-59-6)-E-(117666-96-3)-L-(1986-47-6)，固体纯度大于98％，ESI:732.84[M-H]-
实施例44按照实施例1相同的方法制备多肽44(31462-59-6)-E-(238742-88-6)-L-(1986-47-6)，固体纯度大于98％，ESI:696.73[M-H]-
实施例45多肽分子水平抑制APC/Asef相互作用实验。
1.1利用荧光偏振实验(FP)建立APC/Asef相互作用抑制剂体外筛选体系，评价多肽分子水平抑制APC/Asef相互作用的能力。
(1)表达纯化APC(303-739)和Asef(170-271)。构建原核表达载体pET28a-APC和pET28a-Asef并在菌株BL-21中大量表达APC和Asef，然后应用亲和离子交换，凝胶过滤等层析方法得到重组质粒表达的纯化蛋白APC和Asef；
(2)母液配置：对合成的多肽进行逐一编号，如多肽1，多肽2，…；多肽44。然后各称取1mg并用DMSO溶解至100mM初始浓度。配制荧光肽母液浓度为100μM。
(3)反应条件：用反应缓冲液(50mM Hepes 7.5,300mM NaCl,1mM EDTA，1mM DTT)稀释APC(303-739)和荧光肽(Tracer)至各自相应浓度。反应在室温，96孔板中进行。每个实验组做3个复孔。
(4)梯度稀释：在A行各孔加入8μL多肽，B-H各行加入4μLDMSO。从A行各取4μL多肽加入B行稀释后再取出4μL加入C行，以此类推直到G行，G行稀释之后取出4μL多肽丢掉。
(5)加入91μLAPC蛋白稀释液，室温条件孵育1.5h。加入5μL荧光肽稀释液，室温条件下继续孵育1.5h。
(6)信号值检测：用多功能酶标仪(Synergy H4Hybrid Reader)来检测荧光偏振值。激发光为485nm，发射光为525nm，G因子为1，灵敏度设置为65。
(7)数据处理：1)计算样本的平均荧光值，包含作为阳性对照的“蛋白+荧光肽”和作为阴性对照的“Tracer”；2)然后按照以下公式进行计算Inhibition(％)＝100*(阳性对照-sample)/(阳性对照-阴性对照)。以小分子终浓度的log值为横坐标，抑制率(％)为纵坐标，用Graphpad Prism 7软件拟合出抑制曲线并求出IC50值，结果如下表1所示。以多肽28为代表绘制相应的亲和力曲线，结果如图1所示。
表1多肽抑制APC/Asef相互作用的IC50(单位：μM)
Figure BDA0002127871840000111
Figure BDA0002127871840000121
实施例46利用等温滴定微量热实验(ITC)测定活性多肽的亲和力常数
使用Bio-Rad的实时PCR检测系统进行了等温滴定微量热实验。相同批次的蛋白质和多肽被用于热转移实验。通过对蛋白的荧光检测，检测APC蛋白在温度从20℃提高到85℃过程中蛋白的量热曲线。将APC(407-751)解冻后，以12,000r.p.m.离心5min，在4℃储存。然后APC是与多肽分别单独和混合在冰上孵化2h。接下来，多肽与小分子的混合物在12000r.p.m.离心5分钟。所有的样品都准备一式三份,包含25μM APC,250μM肽(2％最终DMSO浓度)，pH＝8.0。将多肽缓慢滴入到蛋白中，记录480nm激发后的荧光。获得生物分子相互作用的完整热力学参数包括结合常数，摩尔结合晗、摩尔结合熵，如图2—图6所示。如图2—图6所示，多肽28，44，29，33和38均能有效的结合APC蛋白，通过高亲和力抑制APC/Asef相互作用。
实施例47多肽分子细胞水平抑制APC/Asef相互作用活性检测
(1)构建Flag-APC(303-876)和HA-Asef(170-632)质粒，瞬时转染293T细胞，(组1)转染HA-Asef+vector；(组2)转染HA-Asef和Flag-APC；(组3)转染HA-Asef和Flag-APC。转染48h后，加入不同浓度的小分子抑制剂孵育6h。细胞裂解后，加入Anti-Flag M2 AffinityGel孵育过夜。之后做Westerning blot用相应的抗体检测被APC拉下来的Asef量的变化情况。如图7所示，多肽44，28可在10μM明显抑制细胞内APC/Asef相互作用。如图8所示，多肽33可在50μM抑制细胞内APC/Asef相互作用，多肽29，38可在20μM非常明显抑制细胞内APC/Asef相互作用，多肽38可在25μM非常明显抑制细胞内APC/Asef相互作用。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (2)

1.一种APC/Asef相互作用的三肽抑制剂，其特征在于，所述三肽抑制剂的序列选自如下所示的序列的任意一种：
多肽1：(39901-94-5)-ESL-(1003-03-8)；
多肽2：(39901-94-5)-ESL-(51-67-2)；
多肽3：(31462-59-6)-ESL-(122-11-2)；
多肽4：(31462-59-6)-ESL-(1700004-46-1)；
多肽5：(31462-59-6)-ESL-(72-14-0)；
多肽6：(31462-59-6)-ESL-(127-69-5)；
多肽7：(31462-59-6)-ESL-(144-83-2)；
多肽8：(31462-59-6)-ESL-(2447-57-6)；
多肽9：(31462-59-6)-ESL-(80-35-3)；
多肽10：(31462-59-6)-ESL-(53981-38-7)；
多肽11：(31462-59-6)-ESL-(4998-76-9)；
多肽12：(31462-59-6)-ESL-(41100-52-1)；
多肽13：(31462-59-6)-ESL-(2439-56-7)；
多肽14：(31462-59-6)-ESL-(1156491-10-9)；
多肽15：(31462-59-6)-ESL-(1807938-62-0)；
多肽16：(31462-59-6)-ESL-(1570-99-6)；
多肽17：(31462-59-6)-ESL-(64-04-0)；
多肽18：(31462-59-6)-ESL-(104777-77-7)；
多肽19：(31462-59-6)-ESL-(3721-28-6)；
多肽20：(31462-59-6)-ESL-(90874-41-2)；
多肽21：(31462-59-6)-ESL-(59592-32-4)；
多肽22：(31462-59-6)-ESL-(21404-88-6)；
多肽23：(31462-59-6)-ESL-(19992-45-1)；
多肽24：(31462-59-6)-ESL-(765-30-0)；
多肽25：(31462-59-6)-ESL-(5452-35-7)；
多肽26：(31462-59-6)-ESL-(91469-55-5)；
多肽27：(31462-59-6)-ESL-(100-60-7)；
多肽28：(31462-59-6)-ESL-(1986-47-6)；
多肽29：(1126-44-9)-ESL-(1986-47-6)；
多肽30：(149849-92-3)-ESL-(1986-47-6)；
多肽36：(31462-59-6)-ESL-(2038-57-5)；
括号内为化合物的CAS号。
2.一种药物组合物，其特征在于，所述药物组合物含有权利要求1所述的三肽抑制剂或其盐，或权利要求1所述的三肽抑制剂及其盐的混合物，和药学上可接受的载体。
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