KR20100039676A

KR20100039676A - ＡＲＨ1 단백질 또는 이를 코딩하는 유전자를 포함하는 ＮＦ―κＢ 억제제

Info

Publication number: KR20100039676A
Application number: KR1020080098737A
Authority: KR
Inventors: 노승배; 박상윤
Original assignee: 국립암센터
Priority date: 2008-10-08
Filing date: 2008-10-08
Publication date: 2010-04-16
Also published as: WO2010041827A2; WO2010041827A3; KR101071305B1

Abstract

본 발명은 ARH1 단백질 또는 이를 코딩하는 유전자의 신규한 용도에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 ARH1 단백질 또는 이를 코딩하는 유전자를 유효성분으로 포함하는 NF-κB 억제제, 상기 억제제를 함유하는 혈관신생관련 질환, 염증성 질환, 자가면역질환 또는 바이러스성 질환 치료용 조성물에 관한 것이다.

ARH1, TRADD, NF-κB 억제제, 혈관신생

Description

ＡＲＨ1 단백질 또는 이를 코딩하는 유전자를 포함하는 ＮＦ―κＢ 억제제{NF-κB Inhibitor containing ARH1 protein or gene encoding the same}

NF-κB(nuclear factor kappa B)는 1986년 B 세포에서 면역글로블린 카파 경쇄(immunoglobulin κ light chain)에 결합하는 인자로서 발견된 이래 가장 연구가 활발히 진행된 전사인자 중의 하나이다 (Baeuerle and Baltimore, Cell, 87: 13-20, 1996).

NF-κB는 면역과 염증반응의 활성화, 세포사멸의 억제에 관여하는 유전자의 발현을 조절하는 전사인자로서(Beg and Baltimore, Science, 274: 782-784, 1996), p52/p100(NF-κB2), c-Rel, RelB 및 p65(RelA)의 다섯 종류의 하위 그룹으로 분류 된다. 이러한 NF-κB는 세포내에서 p50 서브유닛군(p50, p52)과 p65 서브유닛군(p65, c-Rel, RelB)의 동형중합체(homodimer) 또는 이형중합체(heterodimer)를 형성하는데, 가장 풍부하고 활성인 형태의 NF-κB는 p50/p65(p50/relA)의 이형중합체이다. 이들은 정상상태에서는 그 억제제(inhibitor)인 IκB 단백질(IκBα, IκBβ, IκBγ, IκBε, Bcl3)들과 결합하여 불활성화된 상태로 세포질에 존재한다. 그러나 사이토카인(TNF-α, IL-1 등), 박테리아/바이러스 감염(LPS, dsRNA 등), 스트레스(ROI, UV, adriamycin, 방사선 등) 등의 다양한 외부 자극에 의해 IκB 단백질이 인산화되어 분해됨으로써 유리된 NF-κB는 활성화되어 핵으로 이동한 다음 표적 유전자의 NF-κB 결합 사이트에 결합하여 유전자의 발현을 유도하게 된다.(Rothwarf et al.,Nature, 395:297-300, 1998; Yamaoka et al., Cell, 93:1231-1240, 1998).

전사인자 NF-κB는 발생, 면역반응 등의 정상생리 기능에도 중요하지만 비정상적인 NF-κB 활성화는 여러 질병의 병리기전과도 밀접한 관계가 있는 것으로 알려져 있으므로 비정상적인 NF-κB의 활성화를 조절하여 퇴행성·난치성 질환의 발병이나 진행을 억제할 수 있어 의약품 개발의 표적 물질로서 주목을 받고 있다.

종양억제인자 (TNF)는 TNFR1에 반응하여 전사조절 인자인 NF-κB와 AP-1을 활성화시켜 염증반응과 면역기능을 변화시킬 수 있는 유전자 발현을 유도할 수 있다. TNF는 TNFR1에 결합하는 과정에서 삼중체 (trimer) 를 형성하고 수용체의 다중 체화를 유도한다. TNFR1은 자신의 세포질쪽 부위에 존재하는 죽음 도메인 (death domain)을 통하여 TRADD (TNFR-associated death domain) 라는 세포질 단백질의 죽음 도메인과 결합한다. TRADD는 활성화된 TNFR1에 여러 신호 전달 인자들이 결합할 수 있도록 하는 중간 매개체 역할을 한다. TRADD를 통해 TNFR1과 반응할 수 있는 단백질에는 TRAF2, RIP, FADD 등이 있다. TRAF2 (TNF-associated factor-2) 와 RIP (receptor-interacting protein)은 NF-κB와 JNK/AP-1을 활성화 시키는 반면에 FADD는 세포억제를 유도한다.　TRAF2 는 NIK (NF-κB-inducing kinase) 를 활성화시키며, NIK는 IKK (I-κB 키이나제 복합체)를 활성화시킨다. IKK는 I-κB (inhibitor of κB) 를 인산화시켜 I-κB의 분해를 촉진시킴으로써, NF-κB가 핵내로 이동하여 여러 유전자들의 전사를 유도 시킬 수 있도록 한다 (Hsu, H. et al., Cell, 81, 495-504, 1995; Van Antwerp, DJ. et al., Science, 274, 787-789, 1996; Hsu, H. et al., Cell, 84, 299-308, 1996b; Locksley, RM. et al., Cell, 104, 487-501, 2001). 따라서 세포 내 단백질 간의 결합 형태가 세포사멸, 분해 억제 및 단백질의 핵내 이동의 유,무에 서로 밀접하게 연관되어 있다는 것을 알 수 있으며, 이러한 TNF 신호전달 경로 상의 특정 단백질 간의 결합 형태에 영향을 줌으로써 NF-κB 활성화를 조절할 수 있을 것으로 기대할 수 있다.

한편, ARH1 단백질은 약26 kDa의 GTP 결합 도메인을 포함하는 유전자로 다양한 종 유래의 진핵세포에 존재하는 것으로 알려져 있으며, 유방 및 난소암에서 발현이 저하되어 있고 세포성장 억제를 유도할 수 있음이 알려져 있다(Yu, Y. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 96, 214-219, 1999; Luo, RZ. et al., Oncogene, 22, 2897-2909, 2003).

본 발명자는 TNF 신호전달 경로 상에 있는 단백질간 결합을 조절함으로써 NF-κB 활성을 저해시킬 수 있는 유전자를 탐색하던 중, ARH1 단백질이 TNF 신호전달체계에서 필수적인 기능 수행을 하는 TRADD와 상호작용하여 TRADD와 TRAF2와의 결합을 경쟁적으로 차단함으로써 NF-κB의 핵 내로의 이동을 저해함으로써 NF-κB 활성을 억제할 수 있다는 것을 확인한바, 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 ARH1 단백질 또는 이를 코딩하는 유전자를 유효성분으로 포함하는 NF-κB 억제제를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 NF-κB 억제제를 함유하는 NF-κB 비정상적 활성화와 관련된 질환 치료용 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 ARH1 단백질 또는 이를 코딩하는 유전자를 이용하여 세포 내의 NF-κB 활성을 억제하는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 NF-κB 억제제를 이용하여 NF-κB 비정상적 활성화와 관련된 질환을 치료하는 방법을 제공하는 것이다.

하나의 양태로서, 본 발명은 ARH1 단백질 또는 이를 코딩하는 유전자를 유효성분으로 포함하는 NF-κB 억제제에 관한 것이다.

본 발명에서 용어 "NF-κB 억제제"는 세포 내에서 NF-κB의 발현 또는 활성을 감소시키는 제제를 의미하는 것으로서, 구체적으로는 NF-κB에 직접적으로 작용하거나 또는 NF-κB의 신호전달경로 상에서 상위 조절자에 간접적으로 작용하여 NF-κB의 발현을 전사 수준에서 감소시키거나, 발현된 NF-κB의 분해를 증가시키거나, 그 활성을 방해함으로써, NF-κB의 발현 수준 또는 그 활성을 감소시키는 제제를 뜻한다. 세포 내에서 NF-κB가 활성화되면 이들이 핵 내부로 이동하여 표적 사 이트에 결합하여 다른 유전자의 발현을 유도시키게 되는데, 본원에서 NF-κB 활성이란 이러한 실질적인 유전자 발현을 의미하는 것으로, 상기 NF-κB 활성 억제는 이들의 핵 내부로의 이동이 저해되어 유전자 발현이 억제되는 것을 포함하는 개념이다.

ARH1 단백질은 약 26 kDa의 GTP 결합 도메인을 포함하는 유전자로 다양한 종 유래의 진핵세포에 존재하는 것으로 알려져 있는데, 본 발명의 ARH1 단백질 또는 이를 코딩하는 유전자는 NF-κB 억제 활성을 갖고 있는 한 인간을 포함한 다양한 포유류 유래의 ARH1 단백질, 이를 코딩하는 유전자 또는 이와 기능적으로 동등한 변이체를 포함하는 개념이다. 여기서 "기능적으로 동등한 변이체"란 특정 종 유래의 야생형 단백질 또는 이의 유전자 서열과 비교하여 변이가 있지만 NF-κB 활성을 억제할 수 있는 기능을 갖는 것을 말한다.

본 발명에서 이용할 수 있는 ARH1 단백질 또는 이를 코딩하는 유전자는 인간을 포함한 동물, 예를 들어 원숭이 (monkeys), 돼지 (pigs), 말 (horses), 소 (cows), 양 (sheeps), 개 (dogs), 고양이 (cats), 생쥐 (mice), 토끼 (rabbits) 등으로부터 유래할 수 있으며, 바람직하게는 인간 유래의 ARH1, 더욱 바람직하게는 서열번호 1로 기재되는 ARH1 단백질 (미국국립보건원 유전자은행(NIH GenBank)의 허가번호 AAG35625) 또는 서열번호 2로 기재되는 ARH1 단백질을 코딩하는 유전자(미국국립보건원 유전자은행의 허가번호 AF202543)이지만, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 ARH1 단백질은 이의 천연형 아미노산 서열을 갖는 단백질뿐만 아니라 이의 아미노산 서열 변이체가 또한 본 발명의 범위에 포함된다. ARH1 단백질의 변이체란 ARH1 천연 아미노산 서열과 하나 이상의 아미노산 잔기가 결실, 삽입, 비보전적 또는 보전적 치환 또는 이들의 조합에 의하여 상이한 서열을 가지는 단백질을 의미한다. 분자의 활성을 전체적으로 변경시키지 않는 단백질 및 펩티드에서의 아미노산 교환은 당해 분야에 공지되어 있다(H.Neurath, R.L.Hill, The Proteins, Academic Press, New York, 1979). 가장 통상적으로 일어나는 교환은 아미노산 잔기 Ala/Ser, Val/Ile, Asp/Glu, Thr/Ser, Ala/Gly, Ala/Thr, Ser/Asn, Ala/Val, Ser/Gly, Thy/Phe, Ala/Pro, Lys/Arg, Asp/Asn, Leu/Ile, Leu/Val, Ala/Glu, Asp/Gly 간의 교환이다. 경우에 따라서는 인산화(phosphorylation), 황화(sulfation), 아세틸화(acetylation), 당화(glycosylation), 메틸화(methylation), 파렌실화(farnesylation) 등으로 수식(modification)될 수도 있다.

상기 ARH1 단백질 또는 이의 변이체는 천연에서 추출하거나 합성(Merrifleld, J. Amer. chem. Soc..85:2149-2156, 1963) 또는 DNA 서열을 기본으로 하는 유전자 재조합 방법에 의해 제조될 수 있다(Sambrook et al, Molecular Cloning, Cold Spring Harbour Laboratory Press, New York, USA, 2판, 1989).

또한, 본 발명에서 ARH1 단백질을 코딩하는 유전자는 ARH1 단백질을 코딩하 는 핵산분자를 의미하며, 이들은 자연에서 분리되거나 인위적으로 합성 변형된 것일 수 있다.

본 발명의 ARH1 단백질을 코딩하는 유전자로서 사용될 수 있는 ARH1 핵산분자는 이를 구성하는 핵산 분자의 작용성 등가물, 예를 들어, ARH1 핵산 분자의 일부 염기서열이 결실(deletion), 치환(substitution) 또는 삽입(insertion)에 의해 변형되었지만, ARH1 핵산 분자와 기능적으로 동일한 작용을 할 수 있는 변이체(variants)를 포함하는 개념이다.

또한, 본 발명의 ARH1 단백질을 암호화하는 핵산분자는 게놈 DNA, cDNA 및 화학합성 DNA를 포함할 수 있으며, 게놈 DNA 및 cDNA는 당업계의 공지된 방법에 따라 제조할 수 있다.

게놈 DNA는 예를 들어, ARH1 유전자를 가지는 세포로부터 게놈 DNA를 추출하고 게놈 라이브러리(벡터는 예를 들면 플라스미드, 파지, 코스미드, BAC, PAC 등이 이용될 수 있다)를 제작하고 상기 라이브러리를 본 발명의 단백질을 암호화하는 DNA(예를들어, 서열번호 2) 를 기초로 제작한 프로브를 이용하여 콜로니 또는 플라그 혼성화를 수행하거나, 본 발명의 단백질을 암호화하는 DNA (예를들어, 서열번호 2) 에 특이적인 프라이머를 작성하고, 이를 이용한 폴리머라제 연쇄반응 (Polymerase Chain Reaction, PCR)을 수행함으로써 제조할 수도 있다.

cDNA 는 예를 들어, ARH1 유전자를 가지는 세포에서 추출한 mRNA를 기초로 cDNA를 합성하고, 상기 합성된 cDNA 를 λZAP 등의 벡터로 삽입하여 cDNA 라이브러리를 제작하고, 상기 cDNA 라이브러리를 전개하여, 상기와 동일하게 콜로니 또는 플라그 혼성화를 수행하거나 또는 PCR을 수행하여 제조할 수 있다.

이렇게 분리된 유전자는 이들이 코딩하는 아미노산 수준에 있어서, ARH1 단백질의 아미노산 서열(서열번호 1)과 높은 상동성을 가지는 것이 바람직하며, 높은 상동성이란 아미노산 서열 전체에서, 적어도 50% 이상, 더 바람직하게는 70% 이상, 더 바람직하게는 90% 이상의 서열 동일성을 가리킨다. 아미노산 서열이나 염기서열의 상동성은 BLAST (Karlin, S and Altschul, SF. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90, 5873-5877, 1993) 에 기초하여 개발된 BLASTN 이나 BLASTX 라 불리는 프로그램 (Altschul, SF. et al., J. Mol. Biol., 215, 403-410, 1990) 을 사용하여 분석될 수 있으며 구체적인 방법은 다음의 웹사이트에 공지되어 있다 (http://www.ncbi.nlm.nih.gov.).

한편, 본 발명의 ARH1 단백질을 코딩하는 유전자는 세포 내 전달을 위한 발현 벡터에 포함되어 제공될 수 있다.

본 발명의 ARH1 단백질을 코딩하는 유전자는 DNA 및 DEAE-덱스트란의 복합체, DNA 및 핵 단백질의 복합체, DNA 및 지질의 복합체 등의 다양한 형질전환 기술을 이용하여 세포 내로 도입시킬 수 있는데, 이를 위해 상기 ARH1 유전자는 세포 내로의 효율적인 도입을 가능하게 하는 전달체 내에 포함된 형태일 수 있다. 상기 전달체는 바람직하게는 벡터이며, 바이러스 벡터 및 비바이러스 벡터 모두 사용 가능한데, 예를 들어 플라스미드, 파아지, 코스미드, 바이러스 벡터 등이 포함될 수 있으며, 이러한 벡터는 자가 복제하거나 숙주 DNA에 통합될 수 있다.

본원에서 "도입"은 형질전환 또는 형질도입에 의해 외래 DNA를 세포로 유입시키는 것을 의미한다. 형질전환은 칼슘 포스페이트-DNA 공침전법, DEAE-덱스트란-매개 형질전환법, 폴리브렌-매개 형질전환법, 전기충격법, 미세주사법, 리포좀 융합법, 리포펙타민 및 원형질체 융합법 등의 당업계에 공지된 여러 방법에 의해 수행될 수 있다. 형질도입은 감염(infection)을 수단으로 하여 바이러스 또는 바이러스 벡터 입자를 사용하여 세포 내로 유전자를 전달시키는 것을 의미한다.

또한, ARH1 유전자는 발현 벡터 내에서 프로모터/인핸서 서열과 같은 발현 조절 서열 및 기타 전사, 해독 또는 프로세싱에 필요한 서열들과 함께 결합될 수 있다. 조절 서열은 뉴클레오타이드의 구성적 발현(constitutive expression)을 지시하는 것뿐만이 아니라 조직-특이적 조절 및/또는 유도성 서열을 포함할 수 있으며, 발현 벡터의 설계는 형질전환시킬 숙주 세포, 목적하는 발현 수준 등과 같은 요소에 의해 결정될 수 있다.

또한, 본 발명의 ARH1 유전자는 벡터에 포함된 상태로 세포배양 시스템에서 적절한 진핵세포에 도입시켜 ARH1을 직접적으로 발현시키거나, 원핵세포에 형질전환시켜 ARH1 단백질을 발현시킨 후, 이들 단백질을 정제하여 사용할 수 있다. 이러한 본 발명의 ARH1 단백질은 예를 들면 정제된 단백질, 수용성 단백질, 또는 표적 세포로의 전달 또는 투여를 위한 담체에 결합된 형태의 단백질이나 아미노산 잔기와 융합된 형태를 포함할 수 있다.

한편, 본 발명의 ARH1 단백질은 NF-κB 억제활성을 나타내는데, 이러한 NF- κB 억제활성은 ARH1 단백질이 NF-κB의 p50 또는 p65 서브유닛의 핵내로의 이동을 저해시킴으로써 이루어지는 것이 바람직하다.

또한, 상기와 같은 NF-κB 활성 억제는 ARH1 단백질과 TRADD(TNF receptor-associated death domain) 단백질과의 상호작용에 의해 달성되는 것이 바람직하다. 이러한 상호작용은 NF-κB를 불활성화시키거나 NF-κB의 핵 내부로의 이동 저해를 초래할 수 있다.

구체적으로 본 발명의 ARH1 단백질은 TRADD 단백질과 결합할 수 있으며, 바람직하게는 TRADD 단백질의 N-도메인과 결합할 수 있다. 이를 통해 TRADD와 TRAF2(TNF receptor-associated factor 2)의 결합을 경쟁적으로 차단시킴으로써 TRAF2에 의해 전달되는 NF-κB 활성화를 저해시킬 수 있게 된다.

TRADD 단백질은 활성화된 TNFR1에 여러 신호 전달 인자들이 결합할 수 있도록 하는 중간 매개체 역할을 하는 단백질로서 TRADD 단백질을 통해 TNFR1 과 반응할 수 있는 단백질에는 TRAF2, RIP, FADD 등이 있다. 특히 TRAF2 (TNF-associated factor-2) 와 RIP (receptor-interacting protein) 은 NF-κB 와 JNK/AP-1을 활성화 시킨다. TRAF2 와 RIP 은 NIK (NF-κB-inducing kinase)를 활성화시키며, NIK는 IKK(I-κB kinase complex)를 활성화시키며, 활성화된 IKK는 I-κB(inhibitor of κB)를 인산화시켜 I-κB의 분해를 촉진시킴으로써, NF-κB가 핵 내로 이동하여 여러 유전자들의 전사를 유도 시킬 수 있도록 하는 것이다.

본 발명의 ARH1 단백질은 이러한 TRADD 단백질에 결합하여 TRADD와 TRAF2의 결합을 경쟁적으로 차단함으로써, TRAF2에 의해 전달되는 NF-κB 활성화를 저해하 게 되는데, 이는 결국 NF-κB의 서브유닛인 p50 또는 p65가 핵 내로 이동되는 것을 저해시켜 여러 유전자들의 전사를 억제시킬 수 있게 된다.

본 발명의 구체적 실시예에서, 본 발명자는 ARH1 단백질이 NF-κB 활성을 억제시킴을 확인하였고, 이러한 억제기전이 세포 내에서 ARH1 단백질이 TRADD 단백질과 결합하여 TRAF2과 TRADD의 결합을 차단함으로써, TRAF2 신호전달 경로상에 있는 NF-κB 전사활성을 억제시키고, 유전자로 알려진 p65/p50유전자를 핵내로의 이동을 방해함으로써 이루어진다는 것을 확인하였다.

또한, ARH1 단백질이 NF-κB의 활성화에 의해 유도될 수 있는 혈관신생에 영향을 주는지를 실험한 결과, ARH1 단백질은 혈관신생을 억제시킬 수 있고, 혈관신생을 촉진하는 것으로 알려진 인자 VEGF 의 발현도 저해시키는 것을 확인하였다.

또 다른 양태로서, 본 발명은 상기 ARH1 단백질 또는 이를 코딩하는 유전자를 유효성분으로 포함하는 NF-κB 억제제를 함유하는 NF-κB 비정상적 활성화와 관련된 질환 치료용 조성물에 관한 것이다.

본 발명의 ARH1 단백질 또는 이를 코딩하는 유전자는 세포 내에서 TRADD 단백질과 상호작용하여 NF-κB의 서브유닛인 p50 또는 p65가 핵 내로 이동되는 것을 저해시킴으로써 NF-κB 억제 활성을 나타내므로, NF-κB 비정상적 활성화와 관련된 질환 치료 및 예방용 조성물로서 제공될 수 있다.

본 발명의 NF-κB 억제제를 적용할 수 있는 질환으로는 NF-κB 비정상적 활 성화에 의해 발병되는 질환이라면 특별히 제한되지 않으나, 예를 들면, 대표적으로 혈관신생관련 질환, 염증성 질환, 자기면역질환 또는 바이러스성 질환 등이 있으며, 더욱 구체적인 질환의 예로는 천식, 알러지성 비염, 아토피성 피부염, 담마진, 결막염, 건선, 궤양성 대장염, 전신성 염증반증후군, 패혈증, 다발성근염, 피부근염, 결절성 다발관절염, 혼합결합 조직증, 쉐그렌증후군, 통풍, 알쯔하이머형 치매증, 파킨슨병, 근위축성측색경화증, 만성 관절류머티즘, I형 당뇨병, II형 당뇨병, 당뇨성 망막증, 다발성경화증, 크론병, 만성 갑상선염(하시모토병), 세리아크병, 중증근무력증, 심상성 천포창, 전신성 에리테마토데스, 바이러스질환(HIV, 헤르페스, 센다이 로타바이러스, 인플루엔자바이러스, 광견병바이러스, 수포성 구내염바이러스, 라이노바이러스, A형간염바이러스, B형간염바이러스, 풍진바이러스 등), 세균성질환, 방사선에 의한 장해, 동맥경화, 혈관종, 혈관섬유종, 재관류장해 및 심장비대증이 등이 있다.

본원에 있어서, "예방"이란 조성물의 투여로 질환의 형성을 억제시키거나 발병을 지연시키는 모든 행위를 의미하는 것이며, "치료"란 조성물의 투여로 상기 질환의 증세가 호전되거나 이롭게 변경되는 모든 행위를 의미하는 것이다.

본 발명의 ARH1 단백질 또는 이를 코딩하는 유전자를 유효성분으로 포함하는 NF-κB 억제제를 함유하는 NF-κB 비정상적 활성화와 관련된 질환 치료용 조성물은 약학적으로 허용가능한 담체를 추가로 포함할 수 있으며, 담체와 함께 제제화될 수 있다. 본 발명에서 용어, "약학적으로 허용가능한 담체"란 생물체를 자극하지 않고 투여 화합물의 생물학적 활성 및 특성을 저해하지 않는 담체 또는 희석제를 말한다. 액상 용액으로 제제화되는 조성물에 있어서 허용되는 약제학적 담체로는, 멸균 및 생체에 적합한 것으로서, 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 알부민 주사용액, 덱스트로즈 용액, 말토 덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올 및 이들 성분 중 1 성분 이상을 혼합하여 사용할 수 있으며, 필요에 따라 항산화제, 완충액, 정균제 등 다른 통상의 첨가제를 첨가할 수 있다. 또한 희석제, 분산제, 계면활성제, 결합제 및 윤활제를 부가적으로 첨가하여 수용액, 현탁액, 유탁액 등과 같은 주사용 제형, 환약, 캡슐, 과립 또는 정제로 제제화할 수 있다.

본 발명의 상기 NF-κB 비정상적 활성화와 관련된 질환 치료용 조성물은 이를 유효성분으로 포함하는 어떠한 제형으로도 적용가능하며, 경구용 또는 비경구용 제형으로 제조할 수 있다. 본 발명의 약학적 제형은 구강(oral), 직장(rectal), 비강(nasal), 국소(topical; 볼 및 혀 밑을 포함), 피하, 질(vaginal) 또는 비경구(parenteral; 근육내, 피하 및 정맥내를 포함) 투여에 적당한 것 또는 흡입(inhalation) 또는 주입(insufflation)에 의한 투여에 적당한 형태를 포함한다.

본 발명의 조성물을 유효성분으로 포함하는 경구 투여용 제형으로는, 예를 들어 정제, 트로키제, 로렌지, 수용성 또는 유성현탁액, 조제분말 또는 과립, 에멀젼, 하드 또는 소프트 캡슐, 시럽 또는 엘릭시르제로 제제화할 수 있다. 정제 및 캡슐 등의 제형으로 제제화하기 위해, 락토오스, 사카로오스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아밀로펙틴, 셀룰로오스 또는 젤라틴과 같은 결합제, 디칼슘 포스페이트와 같은 부형제, 옥수수 전분 또는 고구마 전분과 같은 붕괴제, 스테아르산 마스네슘, 스테아르산 칼슘, 스테아릴푸마르산 나트륨 또는 폴리에틸렌글리콜 왁스와 같은 윤활유를 포함할 수 있으며, 캡슐제형의 경우 상기 언급한 물질 외에도 지방유와 같은 액체 담체를 더 함유할 수 있다.

본 발명의 조성물을 유효성분으로 포함하는 비경구 투여용 제형으로는, 피하주사, 정맥주사 또는 근육내 주사 등의 주사용 형태, 좌제 주입방식 또는 호흡기를 통하여 흡입이 가능하도록 하는 에어로졸제 등 스프레이용으로 제제화할 수 있다. 주사용 제형으로 제제화하기 위해서는 본 발명의 조성물을 안정제 또는 완충제와 함께 물에서 혼합하여 용액 또는 현탁액으로 제조하고, 이를 앰플 또는 바이알의 단위 투여용으로 제제화할 수 있다. 좌제로 주입하기 위해서는, 코코아버터 또는 다른 글리세라이드 등 통상의 좌약 베이스를 포함하는 좌약 또는 체료 관장제와 같은 직장투여용 조성물로 제제화할 수 있다. 에어로졸제 등의 스프레이용으로 제형화하는 경우, 수분산된 농축물 또는 습윤 분말이 분산되도록 추진제 등이 첨가제와 함께 배합될 수 있다.

또 다른 양태로서, 본 발명은 상기 NF-κB 억제제를 이용하여 NF-κB 비정상적 활성화와 관련된 질환을 치료하는 방법에 관한 것이다.

본 발명에서 상기 질환의 치료는 NF-κB 억제제를 함유하는 NF-κB 비정상적 활성화와 관련된 질환 치료용 약학적 조성물을 투여하는 단계를 포함할 수 있다. 본 발명에서 용어, "투여"는 어떠한 적절한 방법으로 환자에게 본 발명의 약학적 조성물을 도입하는 것을 의미하며, ARH1 유전자의 바이러스성 또는 비바이러스성 기술에 의한 운반 또는 ARH1 유전자를 발현하는 세포의 이식을 포함한다.

본 발명의 조성물의 투여 경로는 목적 조직에 도달할 수 있는 한 경구 또는 비경구의 다양한 경로를 통하여 투여될 수 있으며, 구체적으로, 구강, 직장, 국소, 정맥내, 복강내, 근육내, 동맥내, 경피, 비측내, 흡입, 안구 내 또는 피내경로를 통해 통상적인 방식으로 투여될 수 있다. 바람직하게는 질환 병소를 나타내는 조직에 국소 투여한다.

본 발명의 치료방법은 본 발명의 조성물을 약학적 유효량으로 투여하는 것을 포함한다. 적합한 총 1일 사용량은 올바른 의학적 판단범위 내에서 처치의에 의해 결정될 수 있다는 것은 당업자에게 자명한 일이다. 특정 환자에 대한 구체적인 치료적 유효량은 달성하고자 하는 반응의 종류와 정도, 경우에 따라 다른 제제가 사용되는지의 여부를 비롯한 구체적 조성물, 환자의 연령, 체중, 일반 건강 상태, 성별 및 식이, 투여 시간, 투여 경로 및 조성물의 분비율, 치료기간, 구체적 조성물과 함께 사용되거나 동시 사용되는 약물을 비롯한 다양한 인자와 의약 분야에 잘 알려진 유사 인자에 따라 다르게 적용하는 것이 바람직하다. 따라서 본 발명의 목적에 적합한 약학적 조성물의 유효량은 전술한 사항을 고려하여 결정하는 것이 바람직하다.

또한, 본 발명의 치료 방법은 NF-κB 비정상적 활성화에 의한 질환이 발생할 수 있는 임의의 동물에 적용가능하며, 동물은 인간 및 영장류뿐만 아니라, 소, 돼지, 양, 말, 개 및 고양이 등의 가축을 포함한다.

또다른 양태로서, 본 발명은 ARH1 단백질 또는 이를 코딩하는 유전자를 이용하여 세포 내의 NF-κB 활성을 억제하는 방법에 관한 것이다.

본 발명의 ARH1 단백질을 세포에 직접 처리하거나, ARH1 단백질을 코딩하는 유전자를 세포에 처리하여 이들 단백질을 발현시키면, NF-κB의 핵 내부로의 이동을 저해함으로써 NF-κB 활성을 억제시킬 수 있다. 구체적으로, ARH1 단백질은 TRADD(TNF receptor-associated death domain) 단백질과 상호작용하여 TRADD와 TRAF2(TNF receptor-associated factor 2)의 결합을 경쟁적으로 차단시켜 NF-κB의 p50 또는 p65 서브유닛의 핵내로의 이동을 저해시킬 수 있으므로, 세포 내 비정상적 NF-κB 활성을 효과적으로 억제시킬 수 있는 것이다.

이때, 본 발명의 ARH1 유전자를 세포에 처리하는 방법으로는 대개 유전자를 구성하고 있는 핵산 분자를 세포에 도입시킬 수 있는 바이러스성 또는 비바이러스성 운반 기술을 이용할 수 있다. 바이러스 운반 메카니즘은 렌티바이러스(lentivirus), 레트로바이러스(retrovirus), 아데노바이러스(adenovirus), 허피스바이러스(herpes virus) 및 아비폭스바이러스(avipox virus) 등을 포함하나, 이에만 제한되는 것은 아니다. 비바이러스성 운반 메카니즘은 지질 매개 트랜스펙션, 리포좀, 면역리포좀, 리포펙틴, 양이온성 표면 양친매물질 및 이의 조합물을 포함할 수 있다. 이러한 결과, ARH1 유전자가 도입되어 ARH1 단백질을 발현하는 진핵세포는 NF-κB의 비정상적 활성화와 관련된 질환에 대한 세포치료제로서 이용될 수 있다.

본 발명에 따른 ARH1 단백질은 TRADD 단백질과 상호작용하여 NF-κB의 핵내로의 이동을 차단함으로써 세포 내의 NF-κB 활성을 억제시킬 수 있으므로, NF-κB의 억제제로서 작용할 수 있으며, 본 발명의 NF-κB 억제제는 NF-κB의 비정상적 활성화와 관련된 병변의 일종인 혈관신생을 세포 및 조직 수준에서 실질적으로 억제하는 효과를 보였다.

이하, 본 발명을 실시예에 의하여 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1. 세포 배양

인간 자궁경부암 유래의 HeLa 세포, 난소암 세포주 2774, SKOV-3, OVCA-3 및 유방암 세포주 MCF-7 (American Type Culture Collection, USA) 는 열로 불활성화 된 10%의 소태아혈청 및 페니실린/스트렙토마이신 (100 unit/ml)으로 보충된 DMEM 및 RPMI 배지 (Life Technologies, USA) 에서 5% CO₂의 37에서 배양하였다. HUVEC 세포주 (human umbilical vein endothelial cells, Clonetics, San Diego, USA) 는 2% FBS (Fetal Bovine Serum) 를 포함하는 EGM 배지 (Clonetics, San Diego, USA) 에서 5% CO₂의 37에서 배양하였다.

실시예 2: ARH1 , TRADD , TRAF2 발현 벡터 제조

인간 ARH1 유전자 외 모든 유전자를 포함하는 벡터를 제조하였다. 원핵세포 발현벡터로서 pGEX4T-1-ARH1 (도 2c), pGEX4T-1-TRAF2 (도 2c) 및 pET28-TRADD(N) (도 2c), 또한, 진핵세포 발현벡터로서, pcDNA3.1/ARH1 (도 1b, 3c, 3d, 4a), pcDNA4/HisMax-ARH1 (도 2b), pEGFPN3-ARH1 (도 2d, 3c), pEGFPC1-TRADD(N) (도 2b 및 2d) 및 pcDNA4/HisMax-TRADD(도 2b)를 각각의 발현 벡터에 하기와 같은 방법으로 클로닝 함으로써 제작하였다.

요약하면 ARH1 유전자 단편을 PCR를 통하여 얻은 후 pcDNA3.1 (Invitrogen, USA), pcDNA4/HisMax-ARH1 (Invtrogen), pGEX4T-1 (Amersham Biosciences, Sweden) 및 pEGFPN3 (Clonetech, USA) 발현 벡터에는 EcoRI 과 XhoI 위치로, pEGFPC1 및 pEGFPN3 벡터에는 BglII 과 EcoRI 위치로 삽입하였다. TRAF2를 코딩하는 유전자는 pGEX4T-1의 발현 벡터에 BamHI 과 SalI 부위에 삽입한 후 재조합 단백질을 분리, 정제하였다. TRADD를 코딩하는 유전자의 절편은 pET28 (Novagen, USA) 및 pcDNA4/HisMax (Invitrogen) 발현 벡터에 각각 EcoRI 과 XhoI 위치로 삽입하여 제작하였으며 모든 절편을 포함하는 상기 각 플라스미드는 제조자의 권고대로 DNA 염기서열 분석 (Applied Biosystems, USA) 을 수행하여 확인하였다.

상기 벡터들은 원핵세포인 경우 각각 형질전환시킨 대장균 세포주 (E.coli BL21DE3) 는 100μg/ml 엠피실린 (ampicillin) 및 75μg/ml 카나마이신 (kanamycin)을 포함한 37℃ LB 배양액에서, 595 nm 흡광도가 0.5~0.6까지 배양하 고, 0.5 mM IPTG (isopropyl-b-D-thiogalactopyranoside)로 37℃에서 유전자에 따라 각각 3~4 시간 동안 재조합 단백질의 발현을 유도하여, 용해 완충용액 (50 mM Tris-HCl (pH8.0), 100 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1% Triton X-100, 1 mM PMSF, 0.5 mM DTT)에 재부유시키고 초음파로 분쇄하였다. 변성된 단백질들은 각각 GST 및 Ni⁺ column 을 이용하여 순수 분리, 정제하였다.

실시예 3: ARH1 단백질에 의한 NF-κB 의 전사 활성 억제 기능 검증

NF-κB의 전사 활성 억제 기능을 조사하기 위하여 HEK 293 정상세포주 배양용기 (24 well, Costar Co.)에 성장시킨 후 스트라타진 (Stratagen)에서 구입한 NF-κB의 루시퍼레이즈 리포터 컨스트럭트 pNFB-Luc 250 ng, Renililla 루시퍼레이즈 벡터 pRL-TK (Promega) 25 ng과 농도에 따른 각각 ARH1 0.1과 0.5 ㎍, 또는 대조군으로 ARH1의 존재 없이 전기충격방법을 이용하여 형질전환 시켰다. 24 시간 지난 다음 세포들은 적어도 2 시간동안 일시적으로 항생제(antibiotic)가 결여된 배지에서 배양하고 그 다음 10 ng/ml 인간 TNF-α를 첨가하여 자극시켰다. 세포들을 수활하고 dual-luciferase assay manual (Promega)에 따라 lysis buffer를 이용하여 세포에 처리한 후 루시퍼레이즈(luciferase) 활성을 luminometer를 이용하여 측정하였다. 그 결과 ARH1 유전자가 형질전환된 세포의 NF-κB 전사활성이 억제되는 것을 확인할 수 있었다(도 1a, 1b).

한편, ARH1에 의한 NF-κB의 세포내 이동 및 핵내 위치화를 관찰하기 위하여, SKOV-3 난소암 세포주를 ARH1 단백질을 포함하는 발현 벡터로 트렌스펙션한 후 세포내 단백질 발현 수준을 조사하였다. 요약하면, 전장 ARH1 발현 벡터 또는 ARH1 유전자를 포함하지 않는 대조군 벡터로 트렌스펙션 된 SKOV-3 세포를 융해 (lysis) 완충액 [50 mmol/L Tris-HCl (pH 8.0), 150 mmol/L NaCl, 1% NP40, 0.1% SDS, 10 mmol/L sodium deoxylate]으로 융해하였다. 20 ug의 총 세포 용출액을 SDS-10% 폴리아크릴아마이드 겔에서 분리하여 나일론 막에 전달하고 항-p65 항체 (Santa Cruz, USA)과 배양한 후 ECL Chemiluminescent Kit (Amersham, UK)을 제조사의 지시에 따라 사용하여 화학발광으로 시각화하였다. 전체 단백질의 양을 정량화하기 위한 목적으로 세포질 마커로는 HSP 90 (Santa Cruz, USA) 단백질을 사용하였고, 핵 속의 마커로는 Histone H1 (Santa Cruz, USA) 항체를 이용하여 웨스턴 블롯을 실시하였다.

그 결과, ARH1단백질을 발현하는 세포는 대조군에 비해 세포질의 p65 단백질 발현 수준이 높고, 핵내의 p65 단백질 발현 수준이 낮은 것으로 나타났다(도 1c). 이는 ARH1의 과발현이 NF-κB의 세포질에서 핵 내로의 이동을 막음으로 세포질에서 ARH1이 NF-κB (p65)의 단백질 분해를 촉진하여 이를 불안정화함과 동시에 이의 불활성화 및 NF-κB (p65) 단백질을 핵 내로의 이동을 차단시키는 새로운 기능을 가지고 있음을 제시하는 것이다.

실시예 4: ARH1 단백질과 TRADD 단백질의 상호작용

ARH1 단백질의 NF-κB 억제 기전을 분자적 수준에서 이해하기 위하여 Gyuris등에 의해 개발된 이스트 투-하이브리드 분석을 종전에 기술된 대로 수행하여 (Gyuris et al., Cell, 75: 791-803, 1993; Park et al., Cancer Res., 65: 749-757, 2005) ARH1 단백질과 상호작용하는 단백질을 스크리닝 하였다. 요약하면, ARH1 단편은 단백질의 발현을 위하여 효모, 대장균 공통 벡터인 LexA 조절유전자를 포함하는 pGilda 벡터 (Clontech)에 EcoRI 과 XhoI 위치에 삽입하였다. 그 다음 컨스트럭트를 실험 효모 균주인 EGY 48 (Clontech)에 도입하고, 1차 아미노산 선택적인 마커인 히스티딘이 결여된 배양 배지로부터 발현 된 콜로니를 얻은 후, 이를 이용하여 HeLa 세포 유래의 cDNA 라이브러리 (Clontech)를 통해 2차로 결합하는 콜로니를 선택하였다. 그 후 결합하는 단백질을 검증을 하기 위하여 다양한 확인 방법 (2% 갈락토스를 포함하는 류신-결핍 배지에서 세포가 자라는 능력, 2% 갈락토스 및 2% 라피노스를 포함하는 합성 배지에서 파란색 콜로니 형성 여부)을 통하여 결합된 유전자를 선별한 후 NCBI가 제공하는 BLAST 프로그램을 이용하여 염기서열로 얻은 유전자를 판별한다. 그 결과 ARH1이 TRADD와 상호결합 한다는 사실을 알아냈으며 (도 2a, 2b), 재확인을 위하여 TRADD을 코딩하는 DNA 단편을 PCR을 이용하여 얻은 후 pJG4-5 (Clontech)의 EcoRI 및 XhoI 위치로 클로닝하고, 효모 균주인 EGY 48 에 형질전환 시킨 후 각종 시험 방법을 통해 확인했다. TRADD와 ARH1 단백질간의 직접적인 상호결합을 동시 침전방법 (co-immunoprecipitation)을 통하여 endogenous TRADD와 외부에서 주입한 GFP-tagged ARH1 (GFP-ARH1) 단백질이 상호결합함을 확인하였다. 상기 결과들로 ARH1이 TRADD에 직접 결합함을 확인하였다 (도 2c). 또한, 세포 내에서 핵, ARH1 및 TRADD의 세포내 위치를 형광현미경으로 확인하였다 (도 2d).

이러한 결과는 ARH1과 TRADD의 상호작용에서 TRADD N-도메인의 중요성을 보여주는 것이며, N-도메인이 ARH1과의 상호작용에 필수충분조건임을 나타내는 것이다. 아울러, 종전의 TRAF2 결합 도메인의 모티브로써의 N-도메인이 아닌 단백질-단백질 상호작용을 통한 전사조절에 관여하는 새로운 기능을 제시하는 것이다.

또한, 실시예 3과 4를 종합해보면, ARH1이 과발현 된 경우 TRAF2와의 상호결합이 차단되고 (도 2a, 2b), NF-κB의 유전자로 알려진 p65/p50 유전자의 핵 내로의 이동이 저해되어 p65/p50 단백질이 세포질 내에 축척됨으로써 NF-κB 활성이 저해되는 것을 확인할 수 있다 (도 1c). 상기 결과는 ARH1이 TRADD-TRAF2 상호결합을 세포내에서 경쟁적으로 차단함으로서 전사조절 메커니즘을 억제하고 NF-κB의 유전자로 알려진 p65/p50 유전자를 핵 내로의 이동을 방해함으로써 NF-κB 활성을 억제시키는 새로운 기능을 가지고 있음을 제시하는 것을 알 수 있다.

실시예 5: ARH1 의 인간 난소암세포에서 혈관신생 형성능 및 전이 억제 활성 검증

NF-κB의 활성억제를 통해 혈관신생 형성을 억제시킬 수 있다는 연구결과가 보고되고 있다. 내피세포에서의 혈관신생형성과 NF-κB의 활성과 많은 연관이 있다는 예로서는 인테그린과 관계되어져 있는 키나아제 (integrin-linked kinase, ILK)에 의해 밝혀졌는데 (Lee, SP. et al., Circulation, 114, 150-159, 2006), ILK는 인테그린의 세포내 말단에 결합되어 있는 세포내 단백질로서 세포의 구조, 생존, 증식에 중요한 역할을 한다. 조직이 허혈에 처하게 되면 이에 대하여 조직에 있는 세포는 이를 극복하기 위해 반응을 하게 되는데 본 논문에 의하면 저산소증 하에서 혈관내피세포는 세포내 ILK의 양과 그 키나아제 기능을 증강시키는 것으로 나타났다. 이같이 증강된 ILK는 저산소증 하에서 Akt, Erk, IB를 통하여 전사인자인 HIF-1 그리고 NF-κB의 핵내 이동을 조절하는 것으로 나타났다. 이같이 핵내로 이동한 HIF-1 그리고 NF-κB는 공히 ICAM-1 (intercellular adhesion molecule-1) 그리고 SDF-1 (stromal cell-derived factor-1)의 발현을 조절하고 이는 최종적으로 혈관내피 전구세포가 허혈성 조직으로 회귀하는데 중요한 역할을 할 것으로 밝혀졌다. 향후 ILK를 유전적으로 증강 또는 억제하는 것은 궁극적으로 혈관신생을 조절하는 중요한 방법이 될 수 있다는 것을 시사하는 것이다. 이외에도 최근에 보고된 바에 의하면 암 혈관신생에 있어 중요한 역할을 하는 안지오포이에틴-1 (Ang-1)의 세포내에서 과 발현은 전사인자인 NF-κB의 활성을 중개하고 (Mitola, S. et al., Blood, 112, 1154-1157, 2008), 새로 발견된 암과 혈관형성단백질 안지오시딘 (angiocidim)은 NF-κB가 핵내로 이동할 때 인산화가 이루어져야 하는데 이때 IB, p50, 및 p65의 인산화를 유발하는 유전자로 보고되고 있다 (Gaurnier-Hausser, A. et al., Cancer Res., 68, 5905-5914, 2008).

이에, 본 발명자는 ARH1 단백질이 혈관신생 형성을 억제시킬 수 있는지를 조사하였다. 내피세포의 성장과 이동 그리고 증식을 포함하여 튜브 형성등 다양한 과 정이 모두 정상적으로 이루어져야 혈관신생이 일어난다. 즉 다시 말하면, 혈관신생 형성능은 내피세포의 증식, 이동과 침투, 튜브 형성에 의하여 이루어진다. 먼저 시험관내에서의 ARH1단백질의 혈관신생 형성능 억제 활성을 조사하기 위하여 내피세포에 ARH1 단백질을 발현시켜 그 억제능을 조사하였다. 구체적인 실험방법은 다음과 같다.

먼저, 내피세포에서의 실험을 정확히 수행하기 위하여 ARH1 유전자를 과발현시킨 후 RT-PCR를 통해 ARH1의 mRNA에서의 수준을 결정하였고, 동시에 단백질 수준에서도 웨스턴 블롯을 통해 정상적으로 발현이 된다는 사실을 확인하였다. 또한, 이의 대조군으로 siARH1(ARH1 유전자의 발현을 저해하는 siRNA)를 제작하여 이들에 의한 ARH1 mRNA 및 단백질의 발현 억제효과를 동일한 방법으로 확인하였다(도 3a). ARH1 단백질이 내피세포의 증식정도에 영향을 미치는지를 조사하기 위해, [ ³ H] 사이미딘 결합 분석 방법으로 DNA 합성량을 다음과 같은 실험을 실시하였다. 젤라틴 (gelatin)이 고정된 뱌양용기 (96 well, Nunc)에 내피세포 (4.5 x 10³ cells/well)를 넣고 37℃에서 하루동안 배양한 다음, 세포성장배지 [(Medium 199/10% FBS/10mM HEPES (pH 7.4)]에서 이 내피세포와 ARH1 단백질, ARH1 단백질이 포함되지 않은 대조군, 및 ARH1를 발현 시키지 못하게 하는 siRNA 펩티드를 전처리한 후, VEGF (10 ng/ml)을 첨가하였다. 48 시간 후 [ ³ H] 사이미딘 (0.5 μCi/well, 76 Ci/mmol, AP Biotech)으로 24 시간동안 내피세포를 처리하고, 0.1%의 알부민이 든 인산염 완충액으로 씻은 후 0.4 N NaOH로 상온에서 20분간 세포를 용해시킨 후 2N HCl로 중화시킨 다음 DNA 합성에 이용된 방사능의 양을 liguid scintillation counter로 측정하였다. 그 결과 ARH1 단백질이 내피세포의 증식을 저해하는 것을 확인하였다(도 3b)

또한, 내피세포 이동 및 침투에 관여하는지를 알아보기 위하여, 세포이동 실험을 수행하였다. 구체적으로, 세포이동 실험은 트랜스웰 (transwell) 프레이트 (포어 사이즈 8 um, Costar, USA) 를 사용하여 실시하였다. 트랜스웰의 밑 표면을 각각의 ARH1 용액 (10 ug/ml)으로 4℃에서 밤새도록 반응시키고, 그 후 1% FBS를 포함하는 M199 에 VEGF (25 ng/ml) 을 가지고 1시간 30동안 블록시켰다. 3 x 10⁵ 세포/ml의 농도로 HUVEC 세포를 배양 배지에서 부유시킨 후, 0.1 ml 의 세포 부유물을 ARH1 단백질과 siARH1 펩티드를 첨가하여 37℃에서 30분 동안 각각 전 배양시켰다. 다음으로 세포를 37℃에서 6~8 시간동안 이동하게 두었다. 코튼 면봉으로 필터의 윗부분에서 세포를 제거함으로서 세포이동을 종결하였고, 필터를 8% 글루타알데하이드(glutaraldehyde) 로 고정하고, 그리스탈 바이올릿 (crystal violet)으로 염색하였다. 세포이동은 광학현미경으로 관찰하였고, HPF (microscopic high power fields, x 200) 하에서 임의로 선택된 8군데에서 세포 수를 측정하였다.

그 결과, 상기 트렌스웰 시스템에서 내피세포 이동 및 침투는 VEGF 의 코팅에 의하여 촉진되고, 상기 효과는 ARH1 단백질에 의하여 저해된다는 사실을 확인하였다 (도 3c, 3d).

한편, ARH1 단백질이 세포 내에서 혈관형성을 유도하는 인자인 VEGF의 발현정도를 억제시킬 수 있는지를 실험한 결과, HUVEC 세포와 난소암 세포에 ARH1 단백질을 처리한 경우, VEGF의 발현이 모두 저해됨을 알 수 있었다(도 3e). 이러한 결과는 ARH1 단백질이 VEGF의 발현을 감소시킴으로써 혈관형성 억제를 막을 수 있음을 의미하는 것이다.

실시예 6: ARH1 의 인간 난소암세포에서 내피 튜브 형성 억제 활성 검증

본 발명자는 ARH1 단백질이 혈관신생 형성능을 저해하는지 알아보기 위하여, 내피 튜브 형성에 미치는 영향을 분석하였다. 구체적으로 마트리젤 (matrigel, Chemicon, USA) 을 96웰 프레이트의 각 웰에 100 ul 씩 첨가하여 중합시켰다. HUVEC 세포를 3 x 10⁵ 세포/ml 의 농도로 배양 배지에서 부유시킨 후, 0.1 ml 의 세포 부유물을 마트리젤이 코팅된 각 웰에 첨가하였다. 단백질 및 항-ARH1 를 첨가하여 37℃에서 16~18 시간 동안 배양한 후, 상기 세포의 사진을 찍고 튜브를 계수하여 평균값을 구하였다. 그 결과, ARH1 대한 단백질과 항체에 의하여 마트리젤에서 내피 튜브 형성을 선택적으로 저해하였지만, 대조군으로 사용한 siRNA를 처리한 경우에 있어서는 ARH1에 의하여 저해되었던 튜브 형성(tube formation)이 회복되었다(도 4a). 이상의 결과들을 토대로 종합해 볼 때 ARH1단백질이 강력한 혈관신생 형성능 저해제로 작용할 가능성을 제시할 수 있다. 이 가능성을 in vivo mouse model 에서 조사하기 전에 ex vivo system 을 이용하여 확인하였다. 이를 위하여 관 발아 분석 시험 (vessel sprouting assay) 를 실시한 결과에서도 혈관형성이 급격히 저해됨을 확인하였다 (도 4b).

실시예 7: ARH1 단백질에 의한 생체 내 혈관신생 억제능 검증

생체내서의 ARH1 억제능을 조사하기 위하여 2774 난소암 세포 주를 마우스의 피하에 주사하여 종양 마우스 모델(mouse model)을 제조하였다. 종양의 크기가 70-100 mm³에 도달하였을 때 ARH1 단백질을 직접 종양에 3일 간격으로 3회 주사하였다. 그 결과 대조군(PBS를 처리한 마우스)의 경우에는 평균 1500 mm³까지 종양의 크기가 증가한 반면 ARH1 단백질을 발현시킨 경우에는 종양의 크기 증가가 일어나지 않았다 (도 5). 또한 CD31에 대한 면역염색 방법으로 종양 절편의 혈관형성을 조사한 결과 대조군의 경우에는 대단히 많은 혈관의 형성이 이루어져 있는 반면 ARH1 단백질을 처리한 경우에는 종양 내의 혈관 형성이 극히 미진하였다 (도 5).

이러한 결과는 ARH1의 발현이 혈관신생 형성을 저해함으로써 암세포 살상을 유발함을 의미한다. 상기 결과는 ARH1 발현을 통해 NF-κB가 억제됨으로써 NF-κB의 비정상적 활성화에 기인할 수 있는 혈관신생 형성을 억제시킬 수 있음을 조직 수준에서 확인해주는 결과이다.

본 발명에 따른 ARH1 단백질은 세포 내에서 NF-κB 활성을 효과적으로 억제 할 수 있으므로, 이러한 ARH1 단백질 또는 이를 코딩하는 유전자를 포함하는 NF-κB 억제제는 NF-κB 비정상적 활성에 기인하는 다양한 질환, 예를 들면 혈관신생질환, 염증성 질환, 자기면역질환 및 바이러스성 질환의 치료제 개발에 효과적으로 이용될 수 있다.

도 1a는 농도에 따른ARH1 세포내 단백질의 발현이 NF-κB-리포터 유전자의 활성을 절감하는 그래프이다.

도 1b는 농도에 따른 ARH1 세포내 단백질의 발현이 NF-κB 로 중개 되는 전사활성을 억제하는 그래프이다.

도 1c는 ARH1 단백질 발현의 존재 유, 무에 따라 NF-κB 유전자로 알려진 p65 단백질이 핵내로의 이동을 하지 못하고 세포질에 단백질이 축적되는 현상을 나타낸 그림이다.

도 2a는 난소cDNA 라이브러리를 사용, 스크리닝 하여 얻어낸 TRADD 유전자를 세포내에서 ARH1단백질과 직접적으로 상호작용 하는지를 이스트 투-하이브리드 분석을 통하여 활성을 나타낸 사진 (왼쪽)과 그래프 (오른쪽)이다.

도 2b는 각각의 서로 다른 발현 벡터 시스템을 사용하여 유전자를 컨스트럭트 한 후, 세포주를 이용한 시험관내에서의 상호결합작용을 ARH1 항체 및 TRADD 항체를 이용하여 웨스턴블롯으로 재 확인한 사진이다.

도 2c는 서로 다른 발현 벡터 시스템을 사용하여 단백질들을 각각 정제한 후 시험관 안에서 동시에 일어날 수 있는 세포내 경쟁적 결합력을 알아본 사진이다.

도 2d는 인간 세포주에서 핵(DAPI), ARH1 및 TRADD의 세포내 위치를 형광현미경으로 관찰한 사진이다.

도 3a 는 ARH1를 정상적으로 발현하는 유전자와 RNA간섭을 통해 발현을 저지하는 유전자의 mRNA 수준을 RT-PCR과 형광물질을 가진 GFP 벡터를 이용하여 단백질의 발현 세포 형태를 형광현미경으로 관찰한 사진 (siARH1 처리시는 발현 억제)이다.

도 3b는 ARH1에 대한 단백질을 이용하여 HUVEC 세포의 증식을 저해하는 것을 나타낸 그래프 (siARH1 처리시는 다시 회복)이다.

도 3c 와 3d 는 ARH1에 대한 단백질을 이용하여 HUVEC 세포의 이동 (C) 과 침투 (D) 가 저해하는 것을 나타낸 사진(상단) 및 그래프(하단) (siARH1 처리시는 다시 회복)이다.

도 3e는 혈관신생 유도물질의 하나인 내피세포 성장호르몬이 ARH1 단백질의 발현에 의해 억제되는 현상을 나타낸 사진이다.

도 4a는 ARH1에 대한 단백질을 이용하여 HUVEC 세포의 튜브 형성이 저해하는 것을 나타낸 사진(상단) 및 그래프(하단) (siARH1 처리시는 다시 회복)이다.

도 4b는 ARH1에 대한 단백질을 이용하여 마우스 근육을 사용한 ex vivo 에서도 혈관형성능을 저해하는 것을 나타낸 사진(상단) 및 그래프(하단) (siARH1 처리시는 다시 회복)이다.

도 5는 ARH1 단백질이 생체내에서 인간 난소암세포의 혈관신생 형성능을 효과적으로 저해하는 사진 및 그래프이다.

<110> National Cancer Center <120> NF-kB Inhibitor containing ARH1 protein or gene encoding the same <130> PA080390 <160> 2 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 229 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Met Gly Asn Ala Ser Phe Gly Ser Lys Glu Gln Lys Leu Leu Lys Arg 1 5 10 15 Leu Arg Leu Leu Pro Ala Leu Leu Ile Leu Arg Ala Phe Lys Pro His 20 25 30 Arg Lys Ile Arg Asp Tyr Arg Val Val Val Val Gly Thr Ala Gly Val 35 40 45 Gly Lys Ser Thr Leu Leu His Lys Trp Ala Ser Gly Asn Phe Arg His 50 55 60 Glu Tyr Leu Pro Thr Ile Glu Asn Thr Tyr Cys Gln Leu Leu Gly Cys 65 70 75 80 Ser His Gly Val Leu Ser Leu His Ile Thr Asp Ser Lys Ser Gly Asp 85 90 95 Gly Asn Arg Ala Leu Gln Arg His Val Ile Ala Arg Gly His Ala Phe 100 105 110 Val Leu Val Tyr Ser Val Thr Lys Lys Glu Thr Leu Glu Glu Leu Lys 115 120 125 Ala Phe Tyr Glu Leu Ile Cys Lys Ile Lys Gly Asn Asn Leu His Lys 130 135 140 Phe Pro Ile Val Leu Val Gly Asn Lys Ser Asp Asp Thr His Arg Glu 145 150 155 160 Val Ala Leu Asn Asp Gly Ala Thr Cys Ala Met Glu Trp Asn Cys Ala 165 170 175 Phe Met Glu Ile Ser Ala Lys Thr Asp Val Asn Val Gln Glu Leu Phe 180 185 190 His Met Leu Leu Asn Tyr Lys Lys Lys Pro Thr Thr Gly Leu Gln Glu 195 200 205 Pro Glu Lys Lys Ser Gln Met Pro Asn Thr Thr Glu Lys Leu Leu Asp 210 215 220 Lys Cys Ile Ile Met 225 <210> 2 <211> 690 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> gene <222> (1)..(690) <223> nucleotide sequence of ARH1 gene <400> 2 atgggtaacg ccagctttgg ctccaaggaa cagaagctgc tgaagcggtt gcggcttctg 60 cccgccctgc ttatcctccg cgccttcaag ccccacagga agatcagaga ttaccgcgtc 120 gtggtagtcg gcaccgctgg tgtggggaaa agtacgctgc tgcacaagtg ggcgagcggc 180 aacttccgtc atgagtacct gccgaccatt gaaaatacct actgccagtt gctgggctgc 240 agccacggtg tgctttccct gcacatcacc gacagcaaga gtggcgacgg caaccgcgct 300 ctgcagcgcc acgttatagc ccggggccac gccttcgtcc tggtctactc agtcaccaag 360 aaggaaaccc tggaagagct gaaggccttc tatgagctga tctgcaagat caaaggtaac 420 aacctgcata agttccccat cgtgctggtg ggcaataaaa gtgatgacac ccaccgggag 480 gtggccctga atgatggtgc cacctgtgcg atggagtgga attgcgcctt catggagatt 540 tcagccaaga ccgatgtgaa tgtgcaggag ctgttccaca tgctgctgaa ttacaagaaa 600 aagcccacca ccggcctcca ggagcccgag aagaaatccc agatgcccaa caccactgag 660 aagctgcttg acaagtgcat aatcatgtga 690

Claims

ARH1 단백질 또는 이를 코딩하는 유전자를 유효성분으로 포함하는 NF-κB 억제제.
제1항에 있어서, 상기 ARH1 단백질이 NF-κB의 p50 또는 p65 서브유닛의 핵내로의 이동을 저해하는 것을 특징으로 하는 NF-κB 억제제.
제1항에 있어서, 상기 NF-κB 억제가 ARH1 단백질과 TRADD(TNF receptor-associated death domain) 단백질과의 결합에 의해 달성되는 것을 특징으로 하는 NF-κB 억제제.
제3항에 있어서, 상기 ARH1 단백질이 TRADD과 결합하여 TRADD와 TRAF2(TNF receptor-associated factor 2)의 결합을 경쟁적으로 차단시키는 것을 특징으로 하는 NF-κB 억제제.
제1항에 있어서, 상기 ARH1 단백질 또는 이를 코딩하는 유전자는 인간 유래인 것을 특징으로 하는 NF-κB 억제제.
제1항에 있어서, 상기 ARH1 유전자는 세포 내 전달을 위한 발현 벡터에 포함 되는 것을 특징으로 하는 NF-κB 억제제.
제1항의 NF-κB 억제제를 함유하는 NF-κB 비정상적 활성화와 관련된 질환 치료용 조성물.
제7항에 있어서, 상기 질환은 혈관신생관련 질환, 염증성 질환, 자가면역질환 또는 바이러스성 질환인 것을 특징으로 하는 조성물.
제7항 또는 제8항에 있어서, 상기 질환은 천식, 알러지성 비염, 아토피성 피부염, 담마진, 결막염, 건선, 궤양성 대장염, 전신성 염증반증후군, 패혈증, 다발성근염, 피부근염, 결절성 다발관절염, 혼합결합 조직증, 쉐그렌증후군, 통풍, 알쯔하이머형 치매증, 파킨슨병, 근위축성측색경화증, 만성 관절류머티즘, I형 당뇨병, II형 당뇨병, 당뇨성 망막증, 다발성경화증, 크론병, 만성 갑상선염(하시모토병), 세리아크병, 중증근무력증, 심상성 천포창, 전신성 에리테마토데스, 바이러스질환(HIV, 헤르페스, 센다이 로타바이러스, 인플루엔자바이러스, 광견병바이러스, 수포성 구내염바이러스, 라이노바이러스, A형간염바이러스, B형간염바이러스, 풍진바이러스 등), 세균성질환, 방사선에 의한 장해, 동맥경화, 혈관종, 혈관섬유종, 재관류장해 및 심장비대증으로 구성되는 군으로부터 선택되는 질환인 것을 특징으로 하는 조성물.
제7항에 있어서, 약학적으로 허용되는 염을 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
ARH1 단백질 또는 이를 코딩하는 유전자를 이용하여 세포 내의 NF-κB 활성을 억제하는 방법.
제11항에 있어서, 상기 ARH1 단백질이 TRADD(TNF receptor-associated death domain) 단백질과 상호작용하여 TRADD와 TRAF2(TNF receptor-associated factor 2)의 결합을 경쟁적으로 차단시켜 NF-κB의 p50 또는 p65 서브유닛의 핵내로의 이동을 저해함으로써 NF-κB 활성을 억제하는 방법.