JPH0488980A - ペプチドｃ末端アミド化に関与する酵素の製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は、ペプチドＣ末端アミド化に関与する２種の酵
素を同時にまたは別個に製造するための方法に関し、よ
り詳しくは、これらの酵素をコードするｃＤＮＡを使用
する前記各酵素の製造方法に関する。

〔従来の技術〕

従来、生体内酵素反応によるペプチドＣ末端グリシン付
加体のＣ末端アミド化（本明細書では「ペプチドＣ末端
アミド化Ｊと略称する）に関与する酵素は、ペプチジル
グリシン−α−アミデーティングモノオキシゲナーゼ（
ペプチドＣ末端アミド化酵素）　（ＥＣ，１，１４，１
７，３＞と呼ばれており（Ｂｒａｄｂｕｒｙら、Ｎａｔ
ｕｒｅ、　２９８．６８６．１９８２　：　ＧＩｅ＋＋
＋ｂｏｔｓｋｉら、Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、、２５９
．６３８５．１９８４）　、次のような反応を触媒して
いると考えられてきた。

生体内でのアミド化機構の解明、ならびに組換えＤＮＡ
技術によって生産されるペプチドをＣ末端がアミド化さ
れて初めて生理活性を示すペプチド類、例えばカルシト
ニン、ガストリンなどへ生体外で転化する方法に利用す
べく、本酵素を精製する試みがなされてきた。このよう
な酵素の例としては、ウシ脳下垂体中葉（Ｍｕｒｔｈｙ
ら、Ｊ、Ｂｉｏｌ　。

Ｃｈｅｅ＆、、２６１．１８１５．１９８６）　　ブタ
脳下垂体（Ｋｉｚｅｒら、Ｅｎｃ（ｏｃｒｉｎｏｌｏＦ
ｌｙ、Ｌ１８．２２８２．１９８８　：　Ｂｒａｄｂｕ
ｒｙら、Ｅｕｒ、Ｊ、Ｂｉｏｃｈｅｍ、、１６旦、　５
７９．１９８７）、ブタ心房（Ｋｏｊｉｍａら、Ｊ、Ｂ
ｉｏｃｈｅｍ、、１０５．４４０．１９８９）、アフリ
カッメガエル体皮（Ｍｉｚｕｎｏら、Ｂｉｏｃｈｅｍ、
Ｂｉｏｐｈｙｓ。

Ｒｅｓ、Ｃｏｍｍｕｎ、、１３７．９８４．１９８６）
　、ラット甲状腺腫瘍（Ｍｅｈｔａら、＾ｒｃｈ、Ｂｉ
ｏｃｈｅ＋＋＋、Ｂｉｏｐｈｙｓ、、２６１．　”４４
゜１９８８）由来のものが報告されている。なお、これ
らの蛋白質は、分子量がウシでは３８　、４２または５
４ＫＤａ　、カエルでは３９ＫＤａ　、ラットでは４１
　、５０または７５ＫＤａ　、ブタでは６４または９２
ＫＤａと報告されており、それぞれ採取方法などにより
かなり異なっている。

また、これらの精製酵素を多量に入手することが困難で
あることから、近年、一般に行われるようになった組換
えＤＮＡ技術を用い、これらの酵素の発現に必要な対応
するｃＤＮＡの単離およびそれらを利用した該酵素の製
造が試みられている。例えば、Ｅｉｐｐｅｒ　Ｂ、＾、
らは、Ｍｃｙｌ、Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ　１．７７７〜
７９０．１９８７で、０ｈｓｕｙｅ、　Ｋらは、Ｂｉｏ
ｃｈｅｍ、Ｂｉｏｐｈｙｓ。

Ｒｅｓ、Ｃｏｍ＋ｓｕｎ、１５０．　１２７５〜１２８
１．　１９８８で、　５ｔｏｆｆｅｒｓ。

Ｄ、＾、らは、Ｐｒｏｃ　、Ｎａｔ　ｌ　、＾ｃａｄ、
ｓｃｉ、ＩＪｓ＾、８６，７３５〜７３９、１９８９で
、そしてに１ａｕｄｅｒ、　Ｊ、らはＢｉｏｃｈｅｅｅ
。

Ｂｉｏｐｈｙｓ、Ｒｅｓ、Ｃｏｗｍｕｎ、　　１８９．
　５５１〜５５８　１９９０、　で、それぞれウシの下
垂体、カエルの皮膚、ラットの心房およびヒトの甲状腺
細胞由来のペプチドＣ末端アミド化酵素ｃＤＮＡを公表
しており、また、必ずしもその生産性において満足でき
るものでないが、カエル由来およびウシ由来のｃＤＮＡ
を利用した組換えＤＮＡ技術を用いたペプチドＣ末端ア
ミド化酵素の生産例も知られている（例えば、それぞれ
特開平１−１０４１６８号オヨび国ｔｌ公開ＷＯ８９／
　０２４６０号公報、ならびにＰｅｒｋｉｎｓら、Ｍｏ
１．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ　。

４．１３２〜１３９．１９９０参照）。

一方、本発明者らは従来報告されているペプチドＣ末端
アミド化酵素の触媒反応は、一種の酵素で次式〇） （上式中、Ａは、天然のα−アミノ酸に由来するα−ア
ミノ基もしくはイミノ基およびα−カルボキシル基以外
の残基を表しており、Ｘは、水素原子またはカルボニル
基を介してＮ原子と結合するアミノ酸誘導体の残基を表
す）で示されるＣ末端グリシン付加体がら、次式（Ｉ［
［） （上式中、ＡおよびＸは前記のような意味を表す）で示
されるＣ末端アミド化物への転化を行うのでなく、中間
に、次式（ｎ） （上式中、ＡおよびＸは前記のような意味を表す）で示
されるＣ末端α−ヒドロキシルグリシン付加体を介し、
この式（ｎ）の化合物は酵素の助けをかりることなくア
ルカリ性条件下で式（ＩＩ［）の化合物に転化されるこ
とを示した（Ｔａｊｉｍａら、Ｊ、Ｂｉｏｌ。

Ｃｈｅａ＋、、２６５．９６０２〜９６０５．１９９０
）。さらに、本発明者らは式（ｎ）の化合物を基質とし
て式（ＩＩＩ）の化合物への転化を触媒する酵素がウマ
血清中に存在することを見い出し、先に提案した（特願
平１−２８１９３３号明細書参照）。この酵素は前述の
式（１）の化合物から式（ｎ）の化合物への転化を触媒
する酵素と併用すると、式（Ｉｆ）の化合物から式（Ｉ
ＩＩ）の化合物への転化をアルカリ条件下で行うよりも
効率よく式（１）の化合物から式（Ｉ［Ｉ）の化合物へ
の転化が図れることを見い出した。

〔発明が解決しようとする課題〕

前記２種の酵素を式（Ｉ）の化合物から式（ＩＩ［）の
化合物への転化の目的で工業的に利用するには、これら
をより安価に多量に入手する必要があることは他の各種
酵素と何等変るものでない。

そこで、本発明の目的は前記２種の酵素を対応するｃＤ
ＮＡを利用して効率よく製造するための方法を提供する
ことにある。

〔課題を解決するための手段〕

本発明者ら、主としてラットおよびウマ由来のペプチド
Ｃ末端アミド化酵素の単離ならびにそれらのｃＤＮＡの
調製を行ってきたが、驚くべきことに、これらは前記２
種の酵素を相互に隣接してコードしており、そしてこれ
らに由来する各酵素は細胞における分泌過程のプロセッ
シングにより別個に放出されることを見い出し、さらに
これら２種の酵素に対応するｃＤＮＡをそれぞれ独立し
て調製し、それらを適当なベクター−宿主系で発現する
ことに成功し本発明を完成した。従って、本発明によれ
ば、ペプチドＣ末端アミド化に関与する酵素の製造方法
であって、前記式（Ｉ）の化合物から式（ＩＩ）の化合
物への転化を触媒する酵素および／または式（Ｉ［）の
化合物から式（Ｉ［［）の化合物への転化を触媒する酵
素をコードするｃＤＮＡを含み、かつこれらを発現する
ことができるプラスミドで形質転換された宿主細胞を培
養することによって前記両酵素またはいずれか一方の酵
素を生産蓄積させた培養物から対応する酵素を採取する
ことを特徴とする方法が提供される。なお、式（Ｉ）で
示されるＣ末端グリシン付加体の具体例は、特願平２−
７６３３１号明細書に詳しい。

以下、本発明をより具体的に説明する。

本発明で用いることができるＣ末端アミド化酵素ｃＤＮ
Ａは、ヒト、ウシ、ウマ、ブタ、ヒツジ、ウサギ、ヤギ
、ラット、マウス等の哺乳類、ニワトリ、シチメンチョ
ウ等の鳥類、カエル等の両生類、ヘビ等のハ虫類、イワ
シ、サバ、ウナギ、サケ等の魚類などに存在するペプチ
ドＣ末端アミド化酵素のアミノ酸配列をコードするＤＮ
Ａに由来し、そのｃＤＮＡのほぼ中央付近にＬｙｓ−Ｌ
ｙｓの配列が存在するものであればその起源は問わない
が、好ましいものとしては哺乳類由来のものが挙げられ
る。

より具体的には、現在知られているペプチドＣ末端アミ
ド化酵素のアミノ酸配列をアミノ酸の１文字表示で、し
かも種間での相同性を高くするように欠落部分く−で示
す）を任意に挿入して第１図に示されるようなアミノ酸
配列をコードするＤＮＡ断片であって、それらのＣ末端
近傍の疎水性アミノ酸領域に相当する部分を除いたｃＤ
ＮＡが有利に使用できる。なお、各ｃＤＮＡは、ヒト、
ウマ、ウシ、ラット、カエル■およびカエル■について
、それぞれＢｉｏｃｈｅ（Ｂｉｏｐｈｙｓ、Ｒｅｓ、Ｃ
ｏｍｍｕｎ、１８９．　５５１〜５５８゜１９９０　、
特願平２−７６３３１号明細書；　Ｍｏｌ　、Ｅｎｄｏ
ｃｒｉｎａｌ　。

１、７７７〜７９０ページ、１９８７　；　Ｐｒｏｃ、
Ｎａｔｌ　、＾ｃａｄ、ｓｃｉ。

ＵＳＡ、　８６．７３５〜７３９ページ、１９８９　；
　Ｂｉｏｃｈｅｅｅ、Ｂｉｏｐｈｙｓ。

Ｒｅｓ、Ｃｏｍｍｕｍ、、１４８．５４６〜５５２ペー
ジ、１９８７　、およびＢｉｏｃｈｅｍ、Ｂｉｏｐｈｙ
ｓ、Ｒｅｓ、Ｃｏｓｍｕ＋ｍ、、１５０．１２７５〜１
２８１ページ、１９８８に記載されている。これらのう
ち例えば、第１図のウマの配列によれば、４４１と４４
２番目のＫ（リジン）、Ｋ（リジン）配列に該当する。

この配列は、ヒト、ウマ、ウシ、ラットのｃＤＮＡで良
く保存されている。この配列より、前半部分く５′側）
のｃＤＮＡは、式（Ｉ）で示されるペプチドＣ末端グリ
シン付加体に作用して、式＜ＩＩ）で示されるペプチド
Ｃ末端α−ヒドロキシルグリシン付加体を生産する活性
を持つ蛋白質をコードしており、また、このＫＫ配列よ
り後半（３′側）の部分のｃＤＮＡは、Ｃ末端グリシン
付加体に作用して式（Ｉ［）で示されるＣ末端アミド化
物とグリオキシル酸を生成する活性を持つ蛋白質をコー
ドしている。このＫＫ配列近傍の部位でそれ自体公知の
制限酵素を用い、ｃＤＮＡを前半部と後半部に分離する
ことができる。

本発明で利用されるｃＤＮＡのクローニングは、それ自
体公知の方法により、前述した各種動物の諸組織を用い
て実施することができる。具体的には、＋、−法、ハイ
ブリダイゼーション法、ＰＣＲ法など一般に用いられて
いる方法（例えば、Ｍｅｔｈｏｄｓｉｎ　　Ｅｎｚｙｍ
ｏｌｏｇｙ、　　ｖｏｌ、１５２　；　　Ｇｕｉｄｅ　
　ｔｏ　　ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ　Ｔｅｃ
ｈｎｉｑｕｅｓ、　Ｓ、Ｌ、Ｂｅｒｇｅｒおよび＾、Ｒ
，Ｋｉｍｍｅ１編、１９８７．＾ｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒ
ｅｓｓ、　ＩＮＣ，；　Ｎｅｔｈｃｄｓ　ｉｎＭｏｌｅ
ｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ、　ｖｏｌ　、４　；　Ｎ
ｅｗ　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ
、　Ｊ、ＭＪａｌｋｅｒ編、１９８８．　Ｔｈｅ　Ｈｕ
ｍａｎａＰｒｅｓｓ　Ｉｎｃ、　；　Ｍｏ１ｅｃｕｌａ
ｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　Ａ　ＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎ
ｕａｌ　２ｎｄ　Ｅｄ、Ｊ、Ｓａｍｂｒｏｏｋ、Ｅ、Ｆ
、Ｆｒ１ｔｓｃｈ、　Ｔ。

Ｎａｎ１ａｔｉｓ編、１９８９．　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉ
ｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｐｒｅｓ
ｓ参照）に従って行い、得られなｃＤＮＡクローンの塩
基配列を決定することにより蛋白質をコードするｃＤＮ
Ａ領域を決定し、前述の中央部のＫＫ配列付近でｃＤＮ
Ａを分割することで目的のｃＤＮＡは得られる。

ラットを例に説明すると、ペプチドＣ末端アミド化酵素
を多く生産する組織、例えば、ラットの下垂体をグアニ
ジルチオシアネートと共にホモジナイズすることにより
細胞を破砕し、塩化セシウム平衡密度勾配超遠心分離に
よりＲＮＡ分画を得る。続いてオリゴｄＴセルロースを
担持したアフィニティータロマドグラフィーにより、前
記ＲＮＡ分画からポリＡをもつＲＮＡ　（ポリ＾＋ＲＮ
＾）を単離する。

このポリ＾＋ＲＮ＾を鋳型として使用し、公知の方法、
好ましくは岡山−Ｂｅｒｇの方法（Ｍｏ１．Ｃｅ１１．
Ｂｉｏｌ。

２、１６１．１９８２＞によって、ｃＤＮＡライブラリ
ーを得る。これらのライブラリーから適当なプローブを
使用してポジティブなりローンをスクリーニングし、増
幅したｃＤＮＡライブラリーから適当なプローブを使用
して再スクリーニングして得たポジティブなｃＤＮＡク
ローンを単離し、これらの制限酵素マツピングおよびシ
ーフェンシングなどによって目的のｃＤＮＡを構造決定
することができる。また、前記ｃＤＮＡを発現ベクター
に組込み、このもので形質転換した宿主のペプチドＣ末
端アミド化酵素の生産性を評価することにより目的のｃ
ＤＮＡを含むプラスミドを選択することもできる。

このｃＤＮＡを発現させる宿主は、大腸菌、枯草菌、酵
母などの微生物、昆虫、動物などに由来する培養細胞系
など通常用いられる細胞でよい。発現プラスミドは、こ
れらの細胞中でｃＤＮＡを効率良く発現できるプラスミ
ドであれば、何でも良い。例えば、次に示す数置に記載
のものなどから適当に選ぶことができる。

続生化学実験講座１、遺伝子研究法■、−組換えＤＮＡ
技術−第７章組換え体の発現、（１９８６）、日本生化
学会編、東京化学同人；　Ｒｅｃｏ…ｂｉｎａｎｔＤＮ
Ａ、　Ｐａｒｔ　Ｄ、　５ｅｃｔｉｏｎ［、、Ｖｅｃｔ
ｏｒｓ　ｆｏｒ　Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆ　Ｃ１ｏｎ
ｅｃｌ　Ｇｅｎｅｓ、　（１９８７）　ＲａｙＷｕおよ
びＬａｗｒｅｎｃｅＣｒｏｓｓｍａｎ　　ｉｉ、　＾ｃ
ａｄｅｍｉｃ　　Ｐｒｅｓｓ、　　ＩＮＣ，；　　Ｍｏ
ｌｅｃｕｌａｒ（ｌｏｎｉｎｇ、＾Ｌａｂｏｒａｔｏｒ
ｙ　Ｍａｎｕａｌ　２ｎｄ　Ｅｄ、Ｂｏｏｋ　３゜（１
９８９）　Ｊ、Ｓａ蒙ｂｒｏｏｋ、　Ｅ、Ｆ、Ｆｒ１ｔ
ｓｃｈおよびＴ。

Ｍａｎｉａｔｉｓ編、Ｃｏ１ｄ　ＳｐｒｉｎｇＨａｒｂ
ｏｒ　ＬａｂｏｒａｔｏｒｙＰｒｅｓｓなど。

例えば、動物培養細胞として常用されているＣ■−１が
宿主として使用される場合は、ｐＳＶ　、　ｐＬ２ｎ　
。

ｐＣｏ　ｌ型のプロモーターおよび必要により選択マー
カーを配したものが使用できる。また、大腸菌について
はｐＧＨ、ｐＫＹＰ　、　ｐＨＵＢ型のベクターが、酵
母についてはＹＲｐ　、　ＹＥｐ型のものが使用できる
。これらのベクターのｃＤＮ八による組換え、および組
換えプラスミドによる宿主細胞の形質転換、形質導入は
それぞれ前述の文献等に記載されるそれ自体公知の手順
によって行うことができる。こうして得られる形質転換
された細胞は、由来する細胞を増殖するのに通常使用さ
れる培地および培養条件下で培養することができる。

このような培養物から産生蓄積せしめたペプチドＣ末端
アミド化酵素の採取は、例えば、動物培養細胞を用いる
場合には産生酵素が細胞外に分泌されるので、細胞を除
去した後の培養液から容易に採取できるが、必要により
細胞溶解物から採取してもよい。この採取・精製は通常
の酵素精製法、例えば沈殿による分画、ヘパリン親和性
クロマトグラフィーおよび透析等を組み合わせて実施す
ることができ、さらに本発明者らによって開発されたＣ
末端グリシン付加体をリガンドとする基質親和性クロマ
トグラフィーを組み合わせて使用することが好ましいく
国際公開Ｎｏ　８９／１２０９６号公報、特願平１−２
８１９３３号明細書参照）。このクロマトグラフィーの
リガンドとしては、グリシンを含め２〜６個のアミノ酸
残基からなるペプチド類、特にＤ−Ｔｙｒ−Ｔｒｐ　　
Ｇｌｙ、Ｐｈｅ−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−に１３１およびＧｌ
ｙ　　Ｐｈｅ−Ｇｌｙを使用するものが好ましい。精製
手順の具体例は、前記公報の記載に従って行うことがで
きる。

〔実施例〕

以下の例で、ラット下垂体由来のペプチドＣ末端アミド
化酵素ｃＤＮへを利用する該酵素の生産について説明す
るが、本発明はこれによって限定されるものでない。

匠Ｌ　　　プラスミドの造１ ラット下垂体由来のポリ＾＋ＲＮ＾を用いてｃＤＮＡク
ローニングをおこなったところ、分子量の異なる５本の
ｃＤＮ八が得られたく第２図、第３図、生化学、６１、
８４２　（１９８９）参照）このｃＤＮＡより、特願平
２−１０６４１２号明細書に示した手法に従って、シグ
ナルペプチド領域のｃＤＮＡを含む発現プラスミド５Ｖ
−２０３を速製した。このプラスミドは動物培養細胞系
発現ベクターｐｓＶ２ベクターＣＳ、Ｓｕｂｒａｍａｎ
ｉら、Ｍｏｌ。

Ｃｅ１１．Ｂｉｏｌ、１．８５４　（１９８１））の旧
ｎｄｌＩ［−ＩＩ［部位に合成リンカ−を介して第２図
のｃＤＮΔの一１番目から２７４２番目までの塩基を含
むＥｃｏＲＩ　　Ｘｍａ　ｉ断片を挿入したものである
。

５Ｖ−２０３１ラスミドＤＮＡより、本発明に係るＣ末
端グリシン付加体に作用して、Ｃ末端α−ヒドロキシル
グリシン付加体へ変換する酵素を発現する発現プラスミ
ドＳｖ−＾を構築した。中央付近のＫＫ配列部分をコー
ドするｃＤＮＡ領域近傍に存在するＢａｗｌ　（部位〔
第３図Ｂ　（１３８６）　）以降のＤＮＡ部分を、Ｂａ
ｍＨＩ　、　Ｘｍａ　Ｉ　Ｃ第３図Ｘ　（２９４Ｂ）　
）消化により欠除させ、切断部位に合成りＮＡリンカ−
（５’−””：”ＴＡｇ咎礼ｃｃ品−５・）を挿入し、
ライゲーションし、次いでＳｖ−＾プラスミドを完成し
た。合成りＮＡは、ＡＢＩ社製ＤＮＡ合成機を用いる常
法により合成しそして精製した。この合成りＮＡは、Ｂ
ａｗｌ　Ｉ切断部位−ストップゴドンーＸｓａ　Ｉ切断
部位で構成されている。

次に、Ｃ末端α−ヒドロキシルグリシン付加体を、Ｃ末
端アミド化体とグリオキシル酸に変換する酵素を発現す
る本発明に係る発現プラスミド５Ｖ−Ｂを構築した。シ
グナルペプチドをコードする領域のすぐ下流に存在する
Ｋｐｎ　ｉ部位〔第３図Ｎ（１７５）　）及び、中央の
ＫＫ部位近傍に相当する位置に存在するＢａｍＨＩ部位
で５Ｖ−２０３Ｄ　Ｎ　Ａを切断し、その間を合成りＮ
Ａ（３，−ｏＡｑａｃ殻ｃｃｌｘｃ−３′　　により連
結して発現プラスミド５Ｖ−Ｂとした。この結果、シグ
ナルペプチド領域とｃＤＮＡ後半部位のフレームが合っ
て連結された。

匠こ　　稗　　　　での 培養細胞ＣＯ５−７は、１０％牛脂児血清を含む合成培
地（ＤＭＥＭ）中で生育させ、公知の方法により例１の
発現プラスミドを用い形質転換した（Ｃ，Ｃｈｅｎ　ａ
ｎｃｌＨ，Ｏｋａｙａｍａ、　Ｍｏ１．Ｃｅ１１．Ｂｉ
ｏｌ、７．２７４５　（１９８７）参照）。

このとき、細胞５Ｘ１０５個に対し、２０μｇの発現プ
ラスミドを使用した。３％二酸化炭素、３５℃の条件下
で２４時間培養した後、ウシ血清アルブミン（ＢＳ＾）
０．２％含むＤＮＥＭ培地１０社で２回細胞を洗浄した
後、０．２％ＢＳ＾を含むＤＭＥＭ培地１０ｍ１中、５
％ニ酸化炭素、３７℃の条件下で４８時間さらに培養し
た。

例２で発現させた細胞培養液を遠心分離により細胞と上
滑（培地）に分けた。

上清について酵素活性を測定した。活性測定は基本的に
は文献（Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅ＋ｗ、　２６５．９６０
２−９６０５゜１９９０）に示したＨＰＬＣを用いた方
法に従っておこなった。つ饋り、Ｃ末端グリシン付加体
のα−ヒドロキシルグリシン付加体への変換活性は、次
のような反応液組成（Ａ）で反応を進め、一定時間反応
後にＨＰＬＣにより、基質（ＰｈｅＧｌｙＰｈｅＧ！ｙ
）及び生産物（ＰｈｅＧＩｙＰｈｅｈｙｄｒｏｘｙＧＩ
ｙ）を定量し求めた。

叉区籐粧炙（Ａ） １５μＮ　　ＰｈｅＧＩｙＰｈｅＧＩｙ５　ｍＭ　　Ｃ
ｕＳＯ４ ５μｌ／反応液１ＩｌＩｌ　　カタラーゼ（シグマ）１
００＋＊Ｍ　　ＭＥＳ緩衝液（ｐＨ５，６）１　ｅａＭ
　　アスコｌレビン酸 ＋　培養上清（培地） また、α−ヒドロキシルグリシン付加体のアミド化物お
よびグリオキシル酸への変換活性は、次の反応組成（Ｂ
）を用いて、同様に測定した。

叉夏五紅炎（Ｂ） ＩＪｔｚＭ　　ＰｈｅＧＩｙＰｈｅｈｙｄｒｏｘｙＧＩ
ｙ”１００ｍＨＭＥＳ緩衝液（ｐＨ５，６）＋　培養上
清（培地） ＊　反応液組成（Ａ）での反応を進め、ＨＰＬＣでα−
ヒドロキシルグリシン付加体を分取したものより調製し
た。

測定結果を第１表に示す。

５Ｖ−ａプラスミドによる形質転換株では、顕著に向上
しなα−ヒドロキシルグリシン付加体生産活性が認めら
れ、α−ヒドロキシルグリシン付加体を基質とした反応
には関与しなかった。これに対して、５ｖ−ｂプラスミ
ドにより形質転換された株では、Ｃ末端グリシン付加体
には全く反応せず、α−ヒドロキシルグリシン付加体を
アミド化物に変換する活性のみ認められた。ｃＤＮＡの
ほぼ全領域を持つプラスミド５Ｖ−２０３により形質転
換した株では、両酵素活性が認められたが、それぞれの
酵素活性は、５Ｖ−ａ　、　５Ｖ−ｂに比較して低いも
のであった。

次に、これらの形質転換株において発現している酵素が
単一なものかどうかをゲル沢過クロマトグラフィーによ
り確認した６セフアクリルＳ　−２００（ファルマシア
製）カラム（ＩＸ９５ｃｍ）を用い、溶出バッファ　　
１０ｍＭ　ＨＥＰＥＳ　　ＫＯＨ（ｐＨ７，０）、５０
ｍＭ　ＮａＣＮで平衡化した。溶出速度は６−１／時で
１＠１フラクシヨンを集めた。両酵素活性及び蛋白質量
を測定した結果を、第４図から第６図に示した。　５Ｖ
−ａ由来（第４図＞５ｖ−ｂ由来（第５図）の酵素活性
はそれぞれ単一のピークとなり、その測定された分子量
もそれぞれ３６ＫＤａ　、及び５４ＫＤａとそれぞれの
プラスミドが持つｃＤＮＡがコードする蛋白質の分子量
に相当した。しかし、５Ｖ−２０３プラスミド由来の蛋
白質は、第６図に示したように、Ｃ末端グリシンに作用
しα−ヒドロキシルグリシン付加体を生産する活性（ロ
ーロ）とα−ヒドロキシルグリシン付加体に作用し、ア
ミド化物とグリオキシル酸を生産する酵素活性（○−○
）の２つのピークに分離した。

しかも、これらの分子量は、第４図、第５図に示した゛
それぞれの酵素を単独に発現させたものと同一であった
。この結果は、培養細胞中でｃＤＮＡのコードする蛋白
質の中央部に位置するＫＫ配列がプロセッシングにより
切断されることを示していた。

従って、このような全ｃＤＮＡ領域を持つｃＤＮへの発
現によっても、本発明に係る２種の酵素を生産できるこ
とを示した。

次に、Ｃ末端アミド化反応において、本発明における２
種の酵素を併用することによる相乗効果を、第７図、第
８図を用いて示した。第７．８図はＰｈｅＧｌｙＰｈｅ
ＧＩｙを基質としたときのアミド化物への変換の経時変
化を示している。酵素試料は、５Ｖ−ａ　、　５Ｖ−ｂ
プラスミドと発現により得た培地上清を上述のゲルｒ過
により精製し、それぞれの活性画分を濃縮し調製した。

第７図には５Ｖ−ａ由来のものを示したが、α−ヒドロ
キシル付加体のみ生産され、アミド化物は生産されない
ことを示している。第８図には、５ｖ−ｂ由来のみを使
用した場合（☆）、と５Ｖ−ａ由来と５ｖ−ｂ由来を併
用した場合を示した。５ｖ−ｂ由来のみでは、α−ヒド
ロキシル付加体もアミド化物も全く生産されないが、両
酵素を併用する（酵素添加量は、同量）とα〜ヒドロキ
シル付加体も、アミド化物もともに順調に生産されるこ
とが示された。また、ここでさらに注目すべきことは、
反応４時間以降で併用した場合に、反応効率は上昇して
おり、９時間反応時には、第７図に示した５Ｖ−ａ由来
単独の場合に比較して１．５倍以上の変換率を示してい
ることである。このように両酵素の併用は、Ｃ末端アミ
ド化反応を効率的におこなうためには非常に有効な手段
であった。

〔発明の効果〕

本発明によれば、ペプチドＣ末端アミド化反応に関与す
る２種の酵素を、対応するｃＤＮＡの特定の組換えプラ
スミド−宿主系で極めて効率良く製造することができる
。

【図面の簡単な説明】

第１図はヒト、ウマ、ウシ、ラット、カエルよりクロー
ニングされたペプチドＣ末端アミド化酵素ｃＤＮＡより
推定されたアミノ酸配列を一文字表示で示したものであ
る。 第２図はラット下垂体ｍＲＮ＾よりクローニングしたＣ
末端アミド化酵素ｃＤＮＡの塩基配列およびそれにより
推定されたアミノ酸配列を示したものである。 第３図はラット下垂体ｍＲＮ＾よりクローニングされた
５つのＣ末端アミド化酵素ｃＤＮＡを模式的に示したも
のである。推定される酵素をコードされる領域をボック
スで示した。数字は翻訳開始点を１とした塩基数（ｂｐ
）を示す。ＴＭは膜貫通領域に対応する部分を示し、Ｋ
Ｋはリジン−リジン配列を示す。制限酵素はそれぞれ次
の略号で示した。 Ｂ（ＢａｍＨＩ）　、　Ｎ（Ｎｓｉ　Ｉ　）　、　ＲＩ
　（ＥｃｏＲＩ）　。 ＲＶ　（Ｅｃ祁Ｖ）、Ｓ（油Ｉ）、Ｘ（−ＡＩ）第４図
、第５図、第６図は、それぞれ、プラスミド５Ｖ−ａ　
、　５Ｖ−ｂ　、　５Ｖ−２０３により発現した酵素の
セファクリｌしＳ−２００カラムクロマトグラフイーパ
ターンを示した。 第７図、第８図は、ＰｈｅＧＩｙＰｈｅＧｌｙを基質と
したときの、α−ヒドロキシルグリシン体、Ｃ末端アミ
ド化体の産生の経時変化を示した。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、ペプチドＣ末端アミド化に関与する酵素の製造方法
   であって、前記酵素をコードするｃＤＮＡを含み、かつ
   これを発現することができるプラスミドで形質転換され
   た宿主細胞を培養することにより前記酵素を生産蓄積さ
   せた培養物から前記酵素の全部または一部を採取するこ
   とを特徴とする方法。 ２、前記酵素が、次式（ I ） ▲数式、化学式、表等があります▼（ I ） （上式中、Ａは、天然のα−アミノ酸に由来するα−ア
   ミノ基もしくはイミノ基およびα−カルボキシル基以外
   の残基を表しており、Ｘは、水素原子またはカルボニル
   基を介してＮ原子と結合するアミノ酸誘導体の残基を表
   す）で示されるＣ末端グリシン付加体に作用して、次式
   （II） ▲数式、化学式、表等があります▼（II） （上式中、ＡおよびＸは、前記の意味を表す）で示され
   るＣ末端α−ヒドロキシルグリシン付加体を生産する活
   性を有する酵素である請求項１記載の方法。 ３、前記酵素が、次式（II） ▲数式、化学式、表等があります▼（II） （上式中、ＡおよびＸは式（ I ）について定義した意
   味を表す）で示されるＣ末端α−ヒドロキシルグリシン
   付加体に作用して、次式（III） ▲数式、化学式、表等があります▼（III） （上式中、ＡおよびＸは、前記の意味を表す）で示され
   るＣ末端アミド化物とグリオキシル酸を生産する活性を
   有する酵素である請求項１記載の方法。 ４、前記ｃＤＮＡが哺乳動物由来のものである請求項１
   、２および３のいずれかに記載の方法。 ５、前記哺乳動物がラットである請求項４記載の方法。 ６、前記宿主細胞が動物培養細胞である請求項１から５
   のいずれかに記載の方法。