JPH02500248A - ヘモグロビン遺伝子クローンの発現による細胞成長の増強 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ５３、以下のステップからなり、酸素存在下で成長する宿主培養細胞であって、 微生物と、動物、植物及び昆虫からなる群から選ばれた蛋白質細胞生物から得ら れた細胞とからなる一群の培養細胞から選ばれ由来する前記宿主培養細胞の、一 般に作られる蛋白質及び遺伝子工学の結果として発現される蛋白質の両方の蛋白 質、バイオポリマー及び他の代謝産物の生産を増加させる方法。

（ａ）宿主培養細胞に酸素結合活性を有する蛋白質を生産させることができるポ ータプルＤＮＡ配列の調製、 （ｂ）前記ポータプルＤＮＡ配列の、少くとも多少の酸素結合蛋白質を発（Ｃ） 蛋白質の発現に適当な条件下での宿主細胞の培養、そして（ｄ）蛋白質に少くと も多少の酸素結合活性を有する活性構造をとらせること。

５４、以下のステップからなり、酸素を必要とするプロセス及び操作に酸素を輸 送及び供給する方法。

（ａ）宿主培養細胞に酸素結合活性を有する蛋白質を生産させることができるボ ークプルＤＮＡ配列の調製、 （ｂ）少くとも多少の酸素結合蛋白質を発現することができる宿主培養細胞への 、前記ボークプルＤＮＡ配列の導入、（ｃ）蛋白質の発現に適当な条件下での宿 主細胞の培養、（ｄ）蛋白質に少くとも多少の酸素結合活性を有する活性構造を とらせること、そして、 （ｅ）前記酸素を必要とするプロセスへ、前記宿主細胞または前記宿主細胞から の酸素結合蛋白質を含む調製品を効果的に配給すること。

５５、以下のステップからなり、環境から酸素を結合・除去する方法。

（ａ）宿主培養細胞に酸素結合活性を有する蛋白質を生産させることができるボ ークプルＤＮＡ配列の調製、 （ｂ）少くとも多少の酸素結合蛋白質を発現することができる宿主培養細胞への 、前記ボークプルＤＮＡ配列の導入、（ｃ）蛋白質の発現に適当な条件下での宿 主細胞の培養、（ｄ）蛋白質に少くとも多少の酸素結合活性を有する活性構造を とらせること、そして、 （ｅ）前記酸素を含有する環境へ、前記宿主細胞または前記宿主細胞からの酸素 結合蛋白質を含む調製品を効果的に配給すること。

５６、以下のステップからなり、少くとも多少の酸素結合活性を有する蛋白質を 産生できる細胞であって、微生物と、動物、植物及び昆虫からなる群から選ばれ た蛋白質細胞生物から得られた細胞とからなる一群の培養細胞から選ばれ由来す る前記宿主培養細胞の、コントロールされた環境下での成長量、成長速度及び到 達細胞密度を含む培養細胞の成長特性を増加させる方法。

（ａ）前記蛋白質の発現に適当な条件下での宿主細胞の培養、そして、（ｂ）前 記蛋白質に少くとも多少の酸素結合活性を有する活性構造をとらせること。

５７、以下のステップからなり、少くとも多少の酸素結合活性を有する蛋白質を 産生できる細胞であって、微生物と、動物、植物及び昆虫からなる群から選ばれ た蛋白質細胞生物から得られた細胞とからなる一群の培養細胞から選ばれ由来す る前記宿主培養細胞であって、酸素存在下で成長する宿主培養細胞の一般に作ら れる蛋白質及び遺伝子工学の結果として発現される蛋白質の両方の蛋白質、バイ オポリマー及び蛋白質の代謝産物の生産を増加させる方法。

（ａ）前記蛋白質の発現に適当な条件下での宿主細胞の培養、そして、（ｂ）前 記蛋白質に少くとも多少の酸素結合活性を有する活性構造をとらせること。

５８、少くとも多少の酸素結合活性を有する蛋白質を産生できる宿主培養細胞を 、酸素を含有する環境に導入することよりなる環境から酸素を結合及び除去する 方法。

明細書 ヘモグロビン遺伝子クローンの発現による細胞成長の増強合衆国政府は本発明に つき一定の権利を保有している。

技術分野 本発明は酸素結合蛋白質、特にヘモグロビンの生産に関し、また減圧或いは低圧 酸素レベルの環境下のみならず十分な酸素レベルの環境下における好気性生物の 成長及び物質合成能力の増強に関するものである。

茸量技術 ヘモグロビンやミオグロビンなどのグロビン類はヘムを含有する酸素担体である 。可逆的な、高濃度酸素の存在下における酸素との結合及び低濃度領域における 酸素の放出により、これらの蛋白質は多細胞生物の酸素吸収率（ｕｐｔａｋｅ　 ｒａｔｅ）を単なる受動的な拡散の場合よりも増加させると考えられている。単 細胞生物では、その酸素吸収率は、本質的に、その成育環境または成育培地の溶 存酸素の細胞外膜への輸送率により制限されると一般に考えられている。しかし 、細胞構造を詳細に検討することにより、環境酸素と、酸素が最終的に反応を受 けるチトクロームの間には、幾つかの潜在的な拡散障壁があることが解ってきた ０例えば、グラム陰性細菌では、チトクロームが原形質膜内側に付着している場 合には、拡散酸素は、代謝反応から電子を受け取るまでに、細胞壁、外膜、細胞 周辺腔（ｐｅｒｉｐｌａｓｍｉｃ　５ｐａｃｅ　）及び内膜などの移動障壁を横 切る必要がある。真核単細胞では、酸化的リン酸化がミトコンドリアで起きると 、さらに拡散の抵抗が生じる。酸素のような小さな中性分子は受動的拡散により これらの障壁を通過すると推測される。しかし、これらの障壁は、実際の反応部 位への物質移動に対する全抵抗の少なからぬ一因となっており、これらは酸素が 限られている条件下では重大なものとなりつる。

溶存酸素レベルを消耗することによって成長にどのような生理的効果があるのか については、ニジエリシア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ、大腸菌 ）、サツカロミセス・セレビシアエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｖｃｅｓ　ｃｅｒｅｖ ｉｓｉａｅ、　ｐ母）、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　）属、アル カリゲネス・オイトロファス（Ｍ旦キ詔工旦し些に亜ｈｕｓ　）を含む幾つかの 生物の場合で説明されてきている。例えば、大腸菌では、これは非常に親和性の 高いチトクロームを有するのであるが、溶存酸素分圧の変化はターミナルオキシ ゲナーゼに異なる制御を与えることになり、その結果、好気的呼吸の間に酸化さ れたＮＡＤＨ分子当り放出されるプロトン数が減少する。このため、化学量論的 ＡＴＰ生合成は逆変化する（Ｋｒａｎｚ　ｅｔ　ａｌ、　。

Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ　１５８：１１９１−１１９ ４．１９８４：　Ｉｎｇｒａｈａｍ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｇｒ盾翌狽■@ｏｆ ｔｈｅ　ｂａｃｅｔｅｒｉａｌ　ｃｅｌｌ、　５ｉｎａｕｅｒ　Ａｓ５ｏｃｉａ ｔｉｏｎ、　Ｉｎｃ、　１９８３．　ｐ１４７．両文献とも{明 細書の内容として包含する）。

また好気性生物が呼吸に酸素を必要とするということに加え、酸素結合蛋白質は 他の潜在的な利用のされ方もある。例えば、ステロイド変換、酢の産生、生物学 的廃棄物処理または酵素反応による分解のような酸化的物質変換の増強に利用さ れたり、醗酵や蒸留による醗酵食品や醗酵飲料の生産段「皆での利用される。

繊維状細菌、ベギアトア（Ｂｅｇｇｉａｔｏａ　）目の一つであるヴイトレオシ ラ（Ｖｉｔｒｅｏｓｃｉｌｌａ）は水溜りゃ腐りかけた植物質などの貧酸素環境 下で見つけられた完全な好気性生物である。低酸素条件下で細菌が成長すると、 等価サブユニットの２量体からなる可溶性ヘム蛋白質（サブユニットＭＷ　１５ ，７７５）の合成は幾倍かに誘導される（Ｂｏｅｒｍａｎ　ｅｔ　ａｌ、　、　 Ｃｏｎｔｒｏｌ　ｏｆ　ｈｅｍｅ　ｃｏｎｔｅｎｔ　１ｎＶｉｔｒｅｏｓｃｉｌ ｌａ　ｂｖ　ｏｘｙ　ｅｎ、　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｇｅｎｅｒａｌ　Ａｐｐ ｌｉｅｄ　Ｍｉｃｒｏｋｉｉｏｌｏｇ凵@２８：３５−４２ 、１９８２）　、この可溪性ヘム蛋白質は、注目すべきスペクトル（Ｗｅｂｓｔ ｅｒ、　ｅｔ　ａｌ、　。

ｏｇｉｃａｌ　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　２４９：４２５７−４２６０．１９７４） 　、構造（Ｗａｋａｂａｙａｓｈｉ、　ｅｔ　ａｌ、。

Ｐｒｉｍａｒ　ｓｅ　ｕｅｎｃｅｓ　ｏｆ　ａ　ｄｉｍｅｒｉｃ　ｂａｃｔｅｒ ｉａｌ　ｈｅｍｏ　１ｏｂｉｎ　ｆｒｏｍ　Ｖｉｔｒｅｏｓモ奄撃撃＝B Ｎａｔｕｒｅ　３２２：４８１−４８３．１９８６）　、そしてキネチック（Ｏ ｒｉｉ、　ｅｔ　ａｌ、、　Ｐｈｏｔｏｄｉｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｏｘ 　Ｔｅｎａｔｅｄ　ｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅ　ｏｆｓ）　（Ｖｉｔｒｅｏｓｃｉｌ ｌａ）　ａｎｄ　ｋｉｎｅｔｉｃ　Tｔｕｄｉｅｓ ｏｆ　ｒｅａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ、　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｂｉｏｌｏｇｉ ｃａｌ　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　２６１：２９７８−２９８６D１９８６　） が本当の細菌ヘモグロビンである。

この蛋白質は、以前チトクローム０と考えられており、酸素貯蔵に機能するもの と推測されていた。しかしながら、生化学的な矛盾（Ｗｅｂｓｔｅｒ、　ｅｔ　 ａｌ、。

Ｏｘｙ　ｅｎａｔｅｄ　ｃ　ｔｏｃｈｒｏｍｅ　ｏ、　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　 Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　２５２：１８R４−１８３６゜ １９７７）およびこれに続いてなされた本当の膜結合チトクローム。及びｄの発 見Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　２５８：１３７６８−１３３７７１．１９８３；　Ｗｅ ｂｓｔｅｒ、　ｅｔ　ａｌ、、　Ｆｅｄｅｒａｔｉｏｎ　ｐｒ盾モ■■р奄獅■ ４４：６７８．１９８５）にを契機として、さらに詳細なスペクトルの研究（Ｃ ｈｏｃ　ｅｔ　ａｌ、。

Ｏｘｖ　ｅｎａｔｅｄ　ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａｔｅ　ａｎｄ　ｃａｒｂｏｎ５° ｉｓ　ｅｃｉｅｓ　ｏｆ　ｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅ　ｏ　ｆＶ奄狽窒■盾唐モ奄撃 ■ ａｌ、Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　２ ５７：８６５−８６９．１９８２；　０ｒｉｉ　ｅｔ　ａｌA、前記文 献参照）やその推定アミノ酸配列の終局的決定及び、既知のヘモグロビン配列と の部分共通性に関する研究（２３）がなされるに至った。

これらの論文は真核生物のヘモグロビンに特有の多くの特徴と変わらない点を明 らかにし、またある程度は、酸素の使用においておそらく演じている役割又はそ の可能性について論じているが、これら研究者の誰も、この細菌ヘモグロビンの 細胞内産生を働かせるポータプルＤＮＡ配列を分離することはできなかったし、 またその産生のための組換ＤＮＡ法を創出した者もいなかった。加うるに、ヴイ トレオシラ（Ｖｉｔｒｅｏｓｃｉｌｌａ）内でのこの蛋白質による酸素の輸送や 酵素反応論的機能について裏付けとなる文献はなく、また細菌ヘモグロビンを異 種生物に導入することによってどのような利益があるかを示唆した文献もなかっ た。さらに、このような酸素結合蛋白質が非常に広範囲に応用できるだろうとい うことについて示唆はなされていなかった。

驚くべきことに、本発明者は細菌ヘモグロビンの組換ＤＮＡ合成を働かせること ができるボークプルＤＮＡ配列の発見した。本発明のヘモグロビンは、ここで述 べる組換ＤＮＡ法により作られたものであり、酸素欠乏環境下における生物の成 長についての研究を増加させよう、また、本発明の酸素結合蛋白質は細胞に供給 する酸素を増加させるのにも、また他の酸素を使用するプロセスにも有用であり 、さらに他の液体または気体から酸素を結合したり分離するのにも有用である。

さらにまた本発明の酸素結合蛋白質は、細胞の生産、すなわち細胞により通常作 られる蛋白質や代謝産物の生産、あるいは遺伝子操作により細胞内で発現させる 天然又は非天然の代謝産物や蛋白質の産生を増加させることができる。本発明の 蛋白質は、また、組換ＤＮＡの仕事の選択マーカーとしても有用であり、醗酵、 酵素反応による分解、毒性化学廃棄物の処理、醸造、そして特に酸化反応や変換 反応などの酸素を必要とする段階を増強するなどの様々な応用ができる。

本発明はまた、ＤＮＡポリマー内で遺伝子に通常先行する位置にあって、この遺 伝子のｍＲＮＡへの転写開始点を供給する成るＤＮＡ配列に関するものでもある 。これらは“ブロモ−クー”配列と呼ばれている。構造遺伝子の上流には通常必 要ではないが、転写及び／又は翻訳の開始頻度及び速度を決定する蛋白質と結合 する他のＤＮＡ又はＲＮＡ配列がある。これら他の配列は、アテニュエイクー、 エンハンサ−、オペレーターなどを含み、　“レギュレーター”配列と呼ばれて いる。このように、遺伝子の転写及び最終的な発現が起こるがどうかを決定する のに働く配列は、正確には、°゛プロモーター／レギユレーター配列と呼ばれて いる。

遺伝子のプロモーター／レギュレーター配列は非常に大きな構造的及び機能的多 様性を許容したもので、一般には、化学物質や、時には細胞内或いは細胞周囲の 生理的環境に反応して遺伝子転写の制御を果たす。遺伝子転写におけるプロモー ター／レギュレーターの作用機構については、幾つかの総括的なモデルが提唱さ れている。一つのモデルは、リプレッサー遺伝子と他の遺伝子のプロモーター近 傍のレギュレーター配列又はオペレーター配列とを用いたものである。このモデ ルによれば、リプレッサー配列の転写によりリプレッサー蛋白が発現し、これが オペレーター配列と選択的に結合して目的遺伝子の転写を効果的に抑制する。環 境からの信号、例えば、当該遺伝子の蛋白産物により作用を受ける化学物質の濃 度増加などにより、リプレッサー蛋白は効果的に不活性化され、オペレーター配 列への結合能が阻害される。こうして遺伝子の転写は中断されることになる。基 質濃度の増加は基質分解を力虫媒する蛋白質の合成を誘導する操作としてみるこ とができよう。

遺伝子転写の制御におけるプロモーター／レギュレーター配列の作用機構の総括 的モデルのもう一つは、リプレッサーＤＮＡ配列により不活性型リプレッサー蛋 白が最初に形成されると提案している。この不活性型蛋白はオペレーターＤＮＡ 配列に結合することができず、なにが他の細胞内物質１選ばれた遺伝子によりコ ードされた蛋白によって触媒された反応産物である化合物のようなものと結合す るまでは、目的遺伝子の転写はできなくなる。このような細胞内での反応産物濃 度の増加は、産物合成の原因である蛋白質の過剰生産の可能性を抑制するように 働（であろう、これらの例では、レギュレーター蛋白は転写を抑制するように機 能する。他のレギュレーター蛋白は、特定のＤＮＡ配列の転写を強化あるいは活 性化するものとして記述されている。このように、ポジティブ及びネガティブな 制御蛋白質と、これに対応するレギュレーターＤＮＡ配列との双方があり得ろ。

遺伝子発現の制御はまた、翻訳の段β皆でも起きる。例えば、制御分子はメツセ ンジャーＲＮＡの特定部位に結合し、転写を抑制または阻止する。

今日の遺伝子工学の活動の多くは、細胞に外来遺伝子を安定して取込ませ、目的 遺伝子の多数の複製源とするだけでなく、経済的に重要な遺伝子産物の大規模な 転写及び発現を可能にすることを目指してきた。

ラクトース（”ｌａｃ”）プロモーター／オペレーク−系は、オペレーターの作 用モードを通じて大変制御しやすいので、一般に広く使われている９オペレータ ーが抑制されると、ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼは全く結合できなくなり転 写を開始できなくなる。このようにブロモ−クーの働きを効果的に阻害する。

この系に、さらにイソプロピル−Ｂ−Ｄ−チオガラクトシド（ＩＰＴＧ）のよう な既知のインデューサーを加えて誘導すれば、抑制を解除することができる。イ ンデューサーはリプレッサー蛋白を除去し、この結果ＲＮＡポリメラーゼが機能 できるようになる。

ｌａｃプロモーター／オペレーター系を持つプラスミドで形質転換された細胞は 、培地からＩＰＴＧのようなインデューサーが除かれていて抑制状態にある間は 、最大密度まで成長することが許容される。細胞密度が最高レベルに達したとき 、インデューサーの添加により系の抑制は解除される。プロモーターはこのとき から自由になり転写を開始し、こうしてプロモーターの強さに対応した収率で遺 伝子産物の発現を得る。しかしながら、これら誘導可能なプロモーター系には比 較的弱いものもあり、このような系を用いた商業的又は研究的生産では細胞に最 大出力を出させられない。

より高収率で目的生成物を産生させることが可能な微生物の発現媒体が必要似な るに従って、トリプトファン（”Ｔｒｐ”〕プロモーター／オペレーター系が広 く使われるようになってきた。この系はｌａｃプロモーターより少くとも３倍の 強さを持つ幾つかの既知の系のうちの一つである。しかしながら、これにはブロ モ−クーの制御がしにくいという欠点がある。ｔｒｐプロモーターはｌａｃプロ モーターのように誘導可能ではない。すなわち、結合リプレッサーが誘導によっ て除去されない。それどころか、系は上述のような一種のフィードバックループ として作動する。系はｔｒｐブロモ−クー／オペレーター系のアテニュエイクー 領域を除去して、形質転換細胞が冨トリプトファン培地で成長できるように工夫 されている。これは、オペレーク−を実質的に完全に抑制するのに十分なトリプ トファンを供給して、細胞成長がどのような外来蛋白質の未成熟な発現によって も阻害されることがないようにしたものである。培養が妥当な成長レベルに達し たら、トリプトファンの追加供給を止めることにより、トリプトファン濃度を低 く制限して、それによりプロモーターの抑制を解除し、その結果、挿入されてい る目的蛋白質遺伝子を発現させる。使ってみると、この系は幾つかの欠点がある 。例えば、ブロモ−クーを完全に抑制するためには成長培地のトリプトファンを 高レベルに維持する必要があり、さらに、培養を完全に成長させるためには培地 からトリプトファンを完全に使い果たさせるようにする必要がある。

トリプトファンとラクトースのプロモーターからハイブリッド系が開発されてい る。どちらのプロモーターもｌａｃリプレッサーにより抑制され、またＩＰＴＧ により抑制が解除される。　Ｄｅ　Ｂｏｅｒ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｔｈｅ　ｔａｃ 　ｒｏｍｏｔｅｒ：　Ａ　ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｈｙｂｒｉｄ　ｄｅｒｉｖｅｄ 　ｆｒｏｍ　ｔｈｅ　ｔｒ　ａｎｄ　ｌａｃ　Ｐｒｏｍｏｔｅｒｓ、　Ｐｒｏｃ 、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、@Ｓｃｉ。

ＬＩＳＡ、　８０：　２１−２５．１９８３．を参照のこと。この系には、上記 ２つの議論で示した欠点がある。すなわち、通常の成長培地になんらかの試薬を 添加・導入する必要がある。

大腸菌においてクローン化蛋白質の発現に一穀に使用されているもう１つのリプ レッサー／プロモーター系は、ラムダ・ファージのＰＬプロモーター系に基づい ている。　Ｂｅｒｎａｒｄ　ａｎｄ　Ｈｅ１ｓｉｎｋｉ、　Ｍｅｔｈｏｄ　ｉｎ 　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、　６８：４８２−４９２．１９V９： Ｕｓｅ　ｏｆ　Ｌａｍｂｄａ　Ｐｈａ　ｅ　Ｐｒｏｍｏｔｏｒ　ＰＬ　ｔｏ　Ｐ ｒｏｍｏｔｅ　Ｇｅｎｅ　Ｅｘ　ｒｅｓｓｉｏｎ　Ｉｎ　ｈ凾ｂ窒奄■ Ｐｌａｓｍｉｄ　Ｃ１ｏｎｉｎ　Ｖｅｈｉｃｌｅｓ　を参照のこと。このプロモ ーターの誘導には培養温度を３０℃から４２℃に上げることが必要である。この 系では、誘導前に３０’Ｃにするので成長速度が最適値なものより低下し、また 温度変更によって細胞代謝を損なうという欠点がある。温度の変更は代謝に影響 を与えるのである。この点については、例えば、Ｎｅ１ｄｈａｒｔ、　ｅｔ　ａ ｌ、、　Ｔｈｅ　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ　Ａｎｄ　Ｒｅ　ｕｌａｔｉｏｎ　０ｆＨｅ ａｔ−３ｈｏｃｋ　Ｐｒｏｔｅｉｎｓ、　Ａｎｎｕａｌ　Ｒｅｖｉｅｗｓ　ｏｆ 　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、　１８：２９５−３２９．１９８Sにより 論じられている。

商業的で、簡潔で、制御性が高くかつ効率的な、一定温度下で外部からのコント ロールによりＤＮＡ配列の転写を選択的に制御するように支配できるブロモ−ク ー／レギュレーター系が技術上必要とされてきたのである６本発明者らはこのよ うな発現系を発見した。これは培地中の溶存酸素濃度を低くすることにより発現 能力を低いところから非常に高いところまで転じることができる。この溶存酸素 レベルの低下は、成長培地にどのような化学物質も添加する必要性がなく、高い 細胞密度のもとて容易に実行され、遺伝子発現を誘導することができる。

茜更Ω皿示 本発明は酸素結合蛋白質、特にヘモグロビン、それを生産する組換ＤＮＡ法に関 し、又、これら酸素結合蛋白質の細胞内生産の遂行を可能にするボークプルＤＮ Ａ配列に関するものである０本発明は又、これらボークプルＤＮＡ配列を含むベ クターに関するものである。

本発明の目的のひとつは、十分な量と純度で生産することができる細菌のヘモグ ロビン蛋白質を提供することにあり、これにより、商業的、薬学的、実験室的又 は工業的な酸素結合能を有する組成物を提供する。

本発明のもう一つの目的は、これら酸素結合蛋白質の生産のための組換ＤＮＡ方 法を提供することにある。これら酸素結合蛋白質の組換ＤＮＡによる生成を容易 にするため、酸素結合蛋白質の細胞内生産の遂行を可能にするポータプルＤＮＡ 配列を提供することも本発明のもう一つの目的である。本発明は又、これらボー クプル配列を含むクローニングベクターを提供することも目的とする。これらの ベクターは組換系に使用することができ、生物の成長特性を増強させ、さらに酸 素結合蛋白質を実用に必要な量で生産する。酸素結合蛋白質の細胞内合成により 、物質生産もまた増加させることができる。

本発明はまた、生きた微生物のＤＮＡ配列を外部からの制御、これは環境下で使 用可能な酸素に依存するのであるが、その支配下におくための新規方法及び新規 物質を提供することを特徴とする特に、プロモーター／リプレッサー、それを生 産する組換ＤＮＡ方法に関する。また転写及び翻訳を開始させ、目的遺伝子産物 の発現をコントロールすることができるボータプルＤＮＡ配列に関する。

このように、本発明のもうひとつ他の目的は、環境の酸素濃度変化に機能的に反 応するプロモーター／レギュレーターＤＮＡ配列を取りこませることにより、目 的の染色体又は外部染色体遺伝子或いはＤＮＡ配列の発現をコントロールするこ とを提供する。本発明は、このように、遺伝子操作をコントロールするための種 々の好気的又は僅かに好気的な操作手順に広く応用でき、原核細胞及び真核細胞 の内在遺伝子に存在している制御を変化させることから、宿主細胞に安定に取り こませた目的外部又は外来遺伝子を選択的かつ部分的に発現を確実に制御するこ とまでにわたって広く応用できる。

本発明のさらにもうひとつの目的は、商業的、薬学的、実験室的又は工業的な使 用に供給するのに十分な量と純度で生産することができる前述のブロモ−クー／ レギュレーターを提供することにある。

本発明の他の目的は、これらブロモ−クー／レギュレーター生産のための組換Ｄ ＮＡ法を提供することにある。これらプロモーター／レギュレーターの組換ＤＮ Ａ合成を容易にするため、遺伝子産物の発現をコントロールできるポータプルＤ ＮＡ配列を提供することも、本発明の目的である。

また、これらポータプルＤＮＡ配列を含むベクターを提供することも本発明の目 的である。これらのベクターは組換系に使用されることができ、広範囲の種々の 受入細胞の形質転換の有用な道具を提供する。

本発明のその他の目的と利点は以下の説明部分の中に述べられるよう。そしであ る程度は説明の記載から明らかとなるであろうし、または本発明の実施から学び とれよう、目的及び利点は、添付の請求の範囲において特に指摘された手段と組 合せによって理解され達成されよう。

目的を達成するため、そして本発明の意図するところに従って、酸素と化学量論 的反応が可能な酸素結合蛋白質酸素が説明される。さらに目的を達成するため、 そして本発明の意図するところに従って、実施例としてまた本明細書中に広範に 記載されているように、ヘモグロビン蛋白質をコードするポータプルＤＮＡ配列 を提供する。特に、繊維状細菌Ｖｉｔｒｅｏｓｃｉｌｌａのヘモグロビンをコー ドするポータプルＤＮＡ配列を提供する。これらの配列は酸素結合蛋白質の細胞 内生産を遂行できるヌクレオド配列から成る。ポータプル配列は合成配列でもよ いし、制限酵素処理断片（°゛天然ＤＮＡの配列）でもよい。

目的を達成するため、そして本発明の意図するところに従って、プロモーター／ レギュレーターが説明される。さらに目的を達成するため、そして本発明の意図 するところに従って、実施例として及び本明細書中に広範に記載されているよう に、これらプロモーター／レギュレーターのためのポータプルＤＮＡ［ｌｃ列が 提供される。本発明の実施に使用するのに特に好ましいプロキークー／レギュレ ーターＤＮＡ配列は繊維状細菌Ｖｉｔｒｅｏｓｃｉｌｌａより得られるものであ る。ポータプルＤＮＡ配列は、これらプロモーター／レギュレーターのために提 供される。

ポータプル配列は合成配列でもよいし、制限酵素処理フラグメント（“天然”Ｄ ＮＡの配列）でもよい。

本発明に使用する天然ＤＮＡ配列の同定及び単離を容易にするため、発明者らは Ｖｉｔｒｅｏｓｃｉｌｌａゲノムのライブラリーを開発した。このライブラリー は細胞に本発明のヘモグロビンを生成させることができる遺伝子的情報を含んで いる。ここで述べられる組換ＤＮＡ法で使われかもしれない他の天然ＤＮＡ配列 は他のゲノムのライブラリーから単離することができよう。

さらに本発明のプロセスに有用なポータプルＤＮＡ配列は合成により作ることも できよう。これら合成りＮＡ配列は、当業者に公知のポリヌクレオチド合成及び 配列技術によって作ることができる。

さらに目的を達成するため、そして本発明の意図するところに従って１組換ＤＮ Ａ法が開示される。これにより上述のボークプルＤＮＡ配列を使用してすぐに酸 素結合蛋白質を宿主細胞又は細菌に製造させることができる。この組換ＤＮＡ法 は、 （ａ）宿主細胞にヘモグロビン活性を含めた酸素結合活性を有する蛋白質を製造 させることができるポータプルＤＮＡ配列の調製、（ｂ）宿主細胞又は宿主細胞 に移入してその中で複製できボークプルＤＮＡ配列を操作するエレメントを含有 するベクターへの、ポータプルＤＮＡ配列のクローニング、宿主細胞内での複製 、（Ｃ）ベクターを使うのであれば、酸素結合蛋白質を発現できる宿主細胞への 、ボークプルＤＮＡ配列及び操作エレメントを含有するベクターの移入、 （ｄ）ベクターの複製と伝帳及び蛋白質の発現に適当な条件の下での宿主細胞の 培養、そして （ｅ）以下の何れか （ｉ）蛋白質の採取、 （ｉｉｌ蛋白質の酸素結合活性の有する活性構造をとらせること、から成る。

また、目的を達成するため、そして本発明の意図するところに従って、宿主細胞 又は微生物により遺伝子産物の翻訳及び転写を上述のポータプルＤＮＡ配列を使 って外部からコントロールする組換ＤＮＡ法が開示される。

本発明のプロセスは、生細胞又はウィルスの内での目的ＤＮＡ配列の発現を、酸 素レベルに応答するブロモ−クー／レギュレーターＤＮＡ配列をサイト特異的な 挿入をすることにより酸素レベルによる制御に支配させる。またＤＮＡ配列が宿 主の染色体成分又は染色体外成分として安定して取りこまれている宿主微生物内 での目的“外来”または外因性配列を宿主細胞内で確実に発現させる従来方法の 改良を開示する６、このような改良法は、目的ＤＮＡ配列と、酸素の環境濃度変 化により目的ＤＮＡの発現を選択的に促進または阻害することができるプロモー ター／レギュレーターＤＮＡ配列とを融合することより構成される。

さらに、目的を成就するため、そして本発明の目的するところに従って、少くと も１つのポータプルＤＮＡ配列を含むクローニングベクターを提供する。とくに 、プラスミドｐＵｃ１９／ｐＲＥＤ２を開示する。

ここまでの全般的記述と以下に続く詳細な記述との両方とも典型例及び説明に過 ぎず、請求の範囲にクレームされているように本発明はこれに限定されない。

添付図面は、本明細書に取りこまれその一部を構成するもので、本発明の一実施 態様を図説し、明細書の記述と共に本発明の詳細な説明するものである。

区ｌ第υ擦…朋 第１図はプラスミドｐＵｃ１９／ｐＲＥＤ２の部分制限地図である。

Ｒ咀Ω実旅Ｑ屋温黙措 これより発明の現時点で好ましい実施態様について詳細に言及する。この実施態 様は図面と以下の具体例と共に、本発明の原理を提供する。

本発明者らが組換ＤＮＡ法により酸素結合蛋白質及びその天然プロモーター／レ ギュレーターを作成したということが理解されなければならない。いくつかの生 産方法並びにこれら組換産物の使用について以下に記述されているが、これら生 産物のみの最終的な使用も本発明の動噴に含まれる。

上記で触れたように、本発明は、一つには、種々の宿主細胞及び宿主微生物内で 酸素結合蛋白質を細胞内生産させることができるポータプルＤＮＡ配列に関する ０本文における°°ポータプルＤＮＡ配列”とは合成ヌクレオチド配列或いは天 然に存在するＤＮＡ配列の制限フラグメントのいずれかを意味する０本明細書の 趣旨から、゛酸素結合蛋白質“とは、アミノ酸配列の細胞内生産をさせるデオキ シリポ核酸に存在するコドンによって決定される一次構造を有する蛋白質を意味 し、番羽訳後に蛋白修飾されたものを含む（或いは含まない）、このような翻訳 後の蛋白修飾には、例えば、ヘム補欠分子族との結合がある。さらに“酸素結合 蛋白質”という語は、細胞から分泌され得るような蛋白質形態、或いは分泌され ずに細胞内に存在する蛋白質形態の何れをも意味するつもりである。

好適実施態様では、ポータプルＤＮＡ配列はヘモグロビンを細胞内で生産させる ことができる。特に好ましい実施態様では、ポータプルＤＮＡ配列は繊維状細菌 、Ｖｉｔｒｅｏｓｃｉｌｌａ、から既に単離されているものと生物学的に等価な ヘモグロビンを細胞内で生産させることができる。ここで云う°°生物学的に等 価−とは、本発明のポータプルＤＮＡ配列を使って生産された蛋白質が、Ｖｉｔ ｒｅｏｓｃｉｌｌａから単離されている等価二量体可溶性ヘム蛋白質（サブユニ ットＭＷ　１５，７７５）と同じ様式で（但し同じ程度である必要はないが）酸 素と結合することができることを意味する。

上記で触れたように、本発明は、一つには、種々の宿主細胞又は宿主微生物内で 、内因性又は外因性遺伝子産物の細胞内生産を指向することができるプロモータ ー／レギュレーターを含んだボークプルＤＮＡ配列に関する。本文における“ポ ータプルＤＮＡ配列−及び゛プロモーター／レギュレーター”とは、合成によっ て作られたヌクレオチド配列或いは天然に存在するＤＮＡ配列の制限フラグメン トのいずれかを意味する。

本発明のボークプルＤＮＡ配列はまた、プロモーター／レギュレーター下流域に あって、少くとも一つの外来蛋白質をコードするＤＮＡ配列を含むことができる 。本明細書の趣旨から、“外来蛋白質”とは、対応アミノ酸配列の細胞内生産を させるデオキシリポ核酸に存在するコドンによって法定される一次構造を有する 蛋白質を意味し、翻訳後に蛋白修飾されたものを含む（或いは含まない）。さら に°゛外来蛋白質”という８吾は、細胞から分泌され得るような蛋白質形態、或 いは分泌されずに細胞内に存在する蛋白質形態の何れをも意味する。

正確な制御機構ははっきりしないが、ブロモ−クー／レギュレーターは宿主細胞 にとって使用可能な酸素を減少させることによってヘモグロビン及び／又はその 他の効果的に融合した遺伝子産物を、細胞内で生産させることができる。

特に好ましい実施態様では、プロモーター／レギュレーターは、転写及び翻訳を 開始しコントロールする配列であって、繊維状細菌、Ｖｉｔｒｅｏｓｃｉ］　ｌ ａ、から既に単離されているものと生物学的に等価なヘモグロビン蛋白質を細胞 内で生産させることができるものと実質的に等価な配列を含む。ここで云う゛実 質的に等価”とは、宿主細胞にとって使用可能な酸素レベルをある限界値以下に 減少させることにより、プロモーター／レギュレーターが下流域の遺伝子産物を 効果的に発現させることを意味する。

勿論、本発明のプロモーター／レギュレーターは極めて多数の内因性及び／又は 外因性外来蛋白質の転写と翻訳をコントロールし開始させることが出来る。

本発明のブロモ−クー／レギュレーターのために好ましい最初のボークプルＤＮ Ａ配列は、少くとも以下のヌクレオチド配列部分を含む。これは、５′から３゛ へと読まれ、転写開始配列へ工旦（下線部）とＶｉｔｒｅｏｓｃｉｌｌａ構造遺 伝子のヌクレオド配列の幾つか（これも下線部）を含んでいる。

ＡＡＧＣＴｒＡ、ＡＣＧ　ＧＡＣＧＣＴＧＧＧＧ　ＴｒＡ、ＡＡＡＧＴＡＴ　Ｔ ＴＧＡＧＴｒＴＴＧ　ＡＴＧＴＧＧＡＴｒＡ　ＡＧｍＴＡ、`ＧＡ　６０ ＧＧＣＡＡＴＡＡＡＧ　Ａ丁ＴＡＴＡＡＴＡＡ　ＧＴＧＣＴＧＣＴＡＣＡＣＣＡ ＴＡＣＴＧＡ　丁ＧＴＡＴＧＧＣＡＡ　ＡＡＣＣＡＴＡＡＴ`　１２０ ＧＧＡＣＡＴＡＡＡ、Ａ　ＡＡＣＧＣＡＣＣ，ＡＴ　ＡＡＧＧ丁ＧＧＴＣＴ　ｍ ＴＡＣＧＴＣＴ　ＧＡＴＡｍ、ＡＣＡ　ＣＡＧＣＡＧＣＡＧs　６６０ ＴＴＧＧＣＴＧＴＴＧ　ＧＣＣＡＡＡＡＣＴｒ　ＧＧＧＡＣＡＡＡＴＡ　ＴｒＧ ＣＣＣＴＧＴＧ　ＴＡＡＧＡＧＣＣＣＧ　ＣＣＧ訂ＧＣＴＧb７２０ ＧＡＣＧＴＣＴＴＣＡ　ＧＧＴＧＴＧＣＣＴｒ　ＧＧＣＡＴ　７４５上記略号に より表現されたヌクレオチド塩基は以下の通りである。すなわちＡ：アデニン、 Ｃニゲアニン、Ｃ：シトシン、Ｔ：チミンである。

上記配列はさまざまなプロモーター／レギュレーターにおいて高度に維持されて いる成る配列と相同性を有する０通常の番号性によれば、また上記配列での共通 配列に対する相同性を下線で示す、上流−１０塩基の共通配列すなわちブリブノ ウ・ボックス（Ｐｒｉｂｎｏｗ　ｂｏｘ　）はＴＡＴＡＡＴＡ　（Ａ／Ｇ）であ る。−３５塩基の共通配列はエエＧＡＣΔであり、共通シャイン・グルガノ（Ｓ ｈｉｎｅ−Ｄａｌｇａｎｏ）配列４１ＡＧＧＡＧＧＴＸＸＸ　（ＸＸ）ＡＴＧ” Ｃ’ある。

好ましい実施態様では、上記配列は、少くとも下記アミノ酸配列部分を含む部の 下流域ヌクレオチド配列と操作可能に融合される。

Ｍｅｔ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ｇｉｎ−Ｇｌｎ−計−１１ｅ−Ａｓｎ−１１ｅ−１１ ｅ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ｔｈｒ−１１ｅ−Ｔｈｒ−計一計−Ｐｈｅ−Ｔ３ｒ−Ｌｙ ｓ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｇｌｎ−Ａｓｎ−Ｉ　１ｅ−Ｇ ｌｕ−Ａｓｎ−示されている。現在では、本発明の実施により純化され作成され た蛋白質はこの配列と８０％以上の相同性を持つことになるだろうと信じられて いる。本発明の蛋白質は低酸素環境下の細胞の機能を増加させることが観測され ている（　Ｋｈｏｓｌａ　ａｎｄ　Ｂａ１ｌｅｙ、未発表の結果）。

前述の略号で表記されたアミノ酸は以下の通りである。

ロイシン　Ｌｅｕ イソロイシン　Ｉｌｅ グルタミン酸　Ｇｌｕ アスパラギン酸　Ａｓｐ グルタミン　Ｇｌｎ アスパラギン　Ａｓｎ メチオニン　Ｍｅｔ フェニルアラニン　Ｐｈｅ ヒスチジンン　Ｈｉｓ 蛋白質の配列において、幾つかのアミノ酸の変更はこの蛋白質の基本的性質には なんの影響もあたえないということを、本発明の実施の際にＳれてはならない。

それ故また、他のポータプルＤＮＡ配列、同じアミノ酸配列を細胞内産生させる ことができるものも、酸素結合能力を有する類縁アミノ酸配列を細胞内産生させ ることができるものの両者とも、本発明の領域に含まれることが意図される。ま た、ＤＮＡ配列において、幾つかのヌクレオチド塩基の変更はこのコードした配 列の基本的性質にはなんの影響もあたえないということを、本発明の実施の際に 忘れてはならない、それ故また、酸素レベルの変化を通じて操作可能な他の類縁 ポータプルＤＮＡプロモーター／レギュレーター配列も本発明の領域に含まれる ことが意図される。

これら類縁アミノ酸配列の中には天然Ｖｉｔｒｅｏｓｃｉｌｌａヘモグロビンと 実質的に相同なものがあるだろうし、酸素結合蛋白質として機能可能でも天然Ｖ ｉｔｒｅｏｓｃｉｌｌａヘモグロビンと実質的な相同性がない他のアミノ酸配列 もあるだろうということが考慮される。ここで云う゛実質的な相同性”とは、天 然Ｖｉｔｒｅｏｓｃｉｌｌａヘモグロビンとの相同性（共通性）の程度が５０％ 以上、好ましくは８０％以上であることを意味する。

同じように、これら類似ＤＮＡ配列の中には、前記配列と実質的に相同なものも あるだろうし、前に述べたプロモーター／レギュレーターとして機能できるが前 に大要を述べた配列と実質的な相同性がない他のＤＮＡ配列もあるだろうという ことが考慮される。

前述で触れたように、本発明のポータプルＤＮＡ配列は、手で或いは自動装置に より合成的に作りだすことができる。これらポリヌクレオチド配列の合成的製造 手段は当業者に広く知られている。特に本明細書に包含される指導的教材により 広く知られている。例えばポリヌクレオチド合成に関する技術の現況の例として 、Ｍａｎｉａｔｉｓ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃ１ｏｎｉｎ　− Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒ　Ｍａｎｕａｌ、　Ｃｏ１ｄ　Ｓ垂窒奄■ ｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　（１９８４）　、及びＨｏｒｖａｔ ｈ　ｅｔ　ａｌ、　、　Ａｎ　Ａｕｔｏｍａｔｅｄ　ＤＮＡ@Ｓ　−ｎｔｈｅ ｓｉｚｅｒ　Ｅｍ　ｌｏ　ｉｎ　Ｄｅｏｘｉｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ　３°−Ｐｈ ｏｓｏ　ｈｏｒａｍｉｄｉｔｅｓ、　Ｍｅｔｈｏｄ　ｉｎ　dｎｚｙｍｏｌ。

ｇｙ　１５４：３１３−３２６．１９８７．が挙げられる。これらは引用例とし て本明細書に包含する。

また、ポータプルＤＮＡ配列は天然配列の断片、即ち天然に存在しまた本発明者 らにより初めてクローン化され発現されたポリヌクレオチドの断片であってもよ い、一実施態様では、ポータプルＤＮＡ配列はゲノムライブラリーから単離され た制限酵素断片である。この好適実施態様では、ゲノムライブラリーは細菌Ｖｉ ｔｒｅｏｓｃｉｌｌａから作られる。他の残された実施態様では、ポータプルＤ ＮＡ配列は他のゲノム及びｃＤＮＡライブラリーから分離される。

本発明のボークプルＤＮＡ配列は、好ましくは、宿主染色体に直接挿入されると 想像できるが、本発明はまた、そのそれぞれがここで述べる少くとも一つのボー クプルＤＮＡ配列を含む一連のベクターを提供する。ポータプルＤＮＡ配列の追 加コピーをベクターに含有させて、目的酸素結合蛋白質を大量生産するように宿 主細胞の能力を増加させてもよいことが考慮される。また他の目的ＤＮＡ配列を 本発明のベクターに含有させることも想像できよう。さらに、少くとも一つの本 発明のポータプルＤＮＡ配列と多分化の目的ＤＮＡ配列の追加コピーと共に、複 合ベクターを使うことにより本発明が実施されるかもしれなし）。

加えて、本発明に範囲のクローニングベクターは、ポータプルＤＮＡ配列及び／ 又はＤＮＡ配列に先行又は続（補充ヌクレオチド配列を含んでもよい。これらの 補充配列はポータプルプロモーター／レギュレーター及び／又はどのような融合 ＤＮＡ配列の転写も敵対的に邪魔することがないもので、場合によっては、転写 、翻訳、翻訳後の処理、あるいは活性型と推測される最終的な遺伝子産物の１次 アミノ酸構造の能力を高めるものであろう。

本発明の好ましいベクターは第１図に示されている。このベクター、ｐＬＪＣ１ ９／ｐＲＥＤ２は前記アミノ酸をコードする好ましいヌクレオチド配列を含有す る。ベクターｐｔｌｃ１９／ｐＲＥＤ２細胞は、メリーランド州ロックビルのア メリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（Ａｍｅｒｉｋａｎ　ｔｙｐｅ　 ｃｕｌｔｕｒｅＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎ；　”ＡＴＣＣ”　）に受託番号６７５３ ６で寄託されている。

前述の、Ｖｉｔｒｅｏｓｃｉｌｌａヘモグロビン蛋白質をコードする好ましいヌ クレオド配列及びこれに隣接するＶｉｔｒｅｏｓｃｉｌｌａ配列は第１図におい て領域Ａとして示しである。上記ヌクレオチド配列は、第１図の領域Ａにおいて 半時針目りに読む、プラスミドｐｔＪｃ１９／ｐＲＥＤ２はまた好ましいＤＮＡ 配列の先行又は後続する、ターミネークー、エンハンサ−、アテニュエイター等 のような補充ヌクレオチド配列を含んでもよい、細胞内空間から輸送される蛋白 質のために、少くとも一つのり−グー配列や、ベクターＤＮＡの適当な転写及び それに続ぐ翻訳に必要な又は好ましいなにか他のＤＮＡ配列を、本発明の範囲内 で含有させてもよい。

好ましい実施態様では、本発明のポータプルＤＮＡ配列を含有し、発現可能なり ローニング・ベクターはここに開示され請求の範囲でクレームされたプロモータ ー／レギュレーターに加え（或いはその代りに）種々の操作可能なエレメントを 含有する。これら“操作可能なエレメント”は少くとも一つのブロモ−クー、少 くとも一つの発現レギュレーターとして働く配列、そして少くとも一つの終了コ ドン、少くとも一つのリーダー配列、そしてベクターＤＮＡの適当な転写及びそ れに続く翻訳に必要な又は好ましいなにか他のＤＮＡ配列を含有する。

本発明の別の実施態様では、ここに記載されたポータプルＤＮＡ配列を１以上含 有する他の公知ベクター、或いは最近まで未発見のベクターを使用するものとし て予想される。特に、ベクターは以下の性格、　（１）最低限の宿主生物の配列 を保持すること、　（２）適当と思われる宿主内で安定であること、　（３）適 当と思われる宿主内で高いコピー数で存在可能であること、（４）制御可能なプ ロモーターを保有すること、そして（５）ポータプルＤＮＡ配列が挿入される部 位から離れたプラスミドの部分に存在する選択可能な特徴をコードする少くとも 一つのＤＮＡ配列を持つこと、の幾つか或いは全てを有することが望ましい、上 記基準に合せるためにベクターを変更することは、本明細書に記載された利用可 能な文献及び教材により当業者によって容易に達成できる。上記性格を有しそれ 故本発明に適合する別のクローニングベクターは現在も存在しているであろうし 、また発見されるかもしれないが、これらのベクターも又本発明の範囲にあるも のとして考慮されるということを理解するべきである。

実験例１に述べられるように、大腸菌ベクターは好ましい実施態様である０種々 のクローニング・ベクターが、以下説明するように、本発明のボークブルＤＮＡ 配列の挿入に適した広範囲の宿主細胞又は生物には必要である。もし必要ならこ のようなりローニング担体は、利用可能な文献のもとで、当該技術分野の　。

通常の技能の範囲内である。

一般の枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ 　）　、アルカリギネス（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ　）　、ストレプトコッカス （Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　）　、ラクトバシルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌ ｌｕｓ　）　、メチロフィルス（Ｍｅｔｈｙｌｏｐｈｉｌｕｓ　）　、ザントモ ナス（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ　）　＋　コリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂ ａｃｔｅｒｉｕｍ　）　、プレヴイバクトリウム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕ ｍ）　、アセトバクター（Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ　）そしてストレプトミセス （Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）などの細菌を含むその他の細菌宿主も、制限なぐ 適用できる。

適合可能な真核宿主微生物の例には、真菌や、サツカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒ ｏｍｙｃｅｓ）及びカンディグ（Ｃａｎｄｉｄａ　）のような酵母、そしてアス ペルギルス（、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　）　、ベニシリム（Ｐｅｎｉｎｉｃｉ ｌｌｉｍ）及びセファロツボリムｌｃｅｐｈａｌｏｓｐｏｒｉｕｍ）などのカビ が含められよう。

本発明の範囲は、真核微生物、及び動物や昆虫及び植物を含む酸素存在下で生長 する他細胞生物由来の宿主培養細胞における発現系をカバーするものである。

本発明のプロモーター／レギュレーターは、培地の溶存酸素濃度の減少によって 発現活性を低いところから非常に暑いところへ転換する宿主において特に有用で ある。このような発現系はＶｉｔｒｅｏｓｅｉｌｌａ由来のものである必要はな い。

種々のベクター系が、プラスミド、ウィルス及びバクテリオファージを含むこれ ら又は目的にかなった他の宿主として適用されるであろう。以下の、但しこれに は限定されないが、クローニング・ベクターのリストが、上記規準に適合するよ うに改変することができ又それゆえ本発明に使用するのに好ましいベクターとし て列挙できてよいと思われる。このような改変は本明細書に記載された利用可能 な文献及び教材により当業者により容易に達成される。

例えば、ｐＵｃ９．ｐＢＲ３２２，ｐＧＷ７．ｐｌａｃＩ’及びｐＤＰ８を含む 多くの選択可能なりローニング・ベクターが大ＦＡｒ＝て使用するためのものと して特徴づけられている。前述のＭａｎｉａｔｉｓ　ｅｔ　ａｌ、　、を参照。

大腸菌内で複製し、又ストレプトミセス（兆匹匹笠匹朋）内で使用できる二つの 機能を持つベクターにはｐＫＣ４６２ａがある。枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）で 使用するための好ましいベクターには、ｐＵＢｌｌｏ、ｐｓＡＯ５０１，ｐｓＡ ２１００．ｐＢＤ６．ｐＢＤ８゜そしてｐＴ１２７が含まれる。　Ｇａｎｅｓａ ｎ　ａｎｄ　Ｈｏｃｋｍ、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ　ａｎｄ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ。

ぴ」Ｌｌ狙迂ｕ、アカデミツク・プレス（１９８４）を参照。シュードモナス（ Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　）では、ＰＳＦＩＯＩＯ，Ｐｍ５１４９．ｐＫＴ２０ ９、そしてＲＫ２が適合する（これらのベクターの幾つかはアグロバクテリウム （Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　）及びザントモナス（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ 　）を含む広範囲のグラム陰性薗に有用である）、サツカロミセス（Ｓａｅｃｈ ａｒｏｍｖｃｅｓ　）では、ＹＥｐ２４．ＹＩｐ５．そしてＹＲｐ１７を使用す ることができる。Ｂｏｓｔｅｉｎ　ａｎｄ　Ｄａｖｉｓ、　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ 　Ｂｉｏｌ。

鉦ｏｆ　ｔｈｅ　Ｙｅａｓｔ　Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　（Ｓｔｒａｔｈｅ ｒｎ　ｅｔ　ａｌ、　、ｍ）　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈ≠窒ｂ盾■ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、　１９８２年、を参照。Ｃ甫乳動物の系では、ＳＶ４０ 由来のもののようなレトロウィルスベクターが代表的に使用される。クローニン グ・ベクターの必要かつ目的とする構成成分を合成及び／又は単乱し、さらにそ れらを組合せることは、当業者の果たすべき義務と職務の範囲内であり、必要以 上の実験をしなくても達成されることが可能であろう。

本発明のクローニング・ベクターの構築において、いかなる融合遺伝子配列及び ／又は酸素結合蛋白質をコードするポータプルＤＮＡ配列のブロモ−クー／レギ ュレーターの多数のコピーと、必要に応じて附随的な操作エレメントとが各ベク ターに挿入されることが、さらに留意される。このような実施態様では、宿主生 物はベクター当り多くの目的酸素結合蛋白質を生産するであろう。ベクターに挿 入されたＤＮＡ配列のコピー数は、そのベクターのサイズに起因するのだが、適 当な宿主に移入し、その中で複製、発現する最終的ベクターに能力によってのみ 制限される。

また、クローニング・ベクターは薬剤耐性マーカーや、宿主に選別可能な特徴を 発現させるその他のマーカーなどような選択マーカーを含有することが望ましい ０本発明の特に好ましい実施態様では、アンピシリン耐性遺伝子がベクターｐＴ Ｊｃ１９／ｐＲＥＤ２に含まれている。このような薬剤耐性や他の選択マーカー は、一つには、形質転換細胞の選別を容易にするためのものである。また、この ような選別可能なマーカーがクローニング・ベクターに存在すれば、培養培地中 に混入微生物を増殖させたままでもこれを使用でき有用である。この実施態様で は、生存するための発現系（フエノクイブ）を誘導するのに必要な条件下で生物 を培養することによりこのような形質転換宿主生物の純粋培養が、得られる。

本発明のボークプルＤＮＡ配列は、それ自体選択マーカーとして使用できるもの であり、これにより低酸素環境下で成長するという特性を与え、さらに宿主細胞 の中に容易に目視できる赤い色調を生じさせる。

本発明のブロモ−クー／レギュレーターは蛋白質の発現をコントロールできるも のであり、これによって、細胞により通常作られる代謝産物や、遺伝子操作によ り細胞内で発現する天然又は非天然の代謝産物や蛋白質の生成をコントロールす ることができる。これには異種蛋白質（細胞内、細胞外を問わない）が含まれ、 ポリサッカライド、アミノ酸、ヌクレオチドなどの単純代謝産物、抗生物質及び 生細胞又は細胞性生物触媒（酵素）により作られる他の化学物質などのバイオポ リマーばかりではない。

ここに記述される組換ＤＮＡ法により作成された本発明の酸素結合蛋白質は、低 酸素環境下での生物の成育に関する研究を伸長させることになろう、加えて、本 発明の酸素結合蛋白質は細胞や酸素を使用するその他のプロセスへの酸素供給を 増加させるものとして（Ａｄｌｅｒｃｒｅｕｔｚ　ｅｔ　ａｌ、　、　Ｂｉｏｅ ａｔａｌｖｓｔ　ｉｎ　Ｏｒ　ａｎｉｃ　５ｙｎｔｈｅｓｉｓ、　Ｓｙｍｐｏｓ ｉｕｍ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ｗｏｒｋｉｎｇ　Ｐａｒｔｙ　ｏｎ　Ｉｍｍｏｂｉｌｉ ｚｅｄ　Ｂｉｏｃａｔａｌｙｓ狽刀@ｏｆ　ｔｈｅ Ｅｕｒｏｐｅａｎ　Ｆｅｄｅｒａｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｐ、　 Ａｂｓｔｒａｃｔｓ、　ｐ、１８．１９８５　）　、文化のt ａｎｄ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ９：　６５−８０．１９８４）のに有用で ある。さらにまた１本発明の酸素結合蛋白質は、細胞生産すなわち、細胞により 普通に作られる蛋白質や代謝産物の生産、遺伝子操作により細胞内で発現する天 然又は非天然の代謝産物及び蛋白質の生産を増加させることが可能である。これ には、上記で述べたように、異種蛋白質、バイオポリマー、簡単な代謝産物、抗 生物質及び生細胞又は細胞性生物触媒（Ｕ素）により作られる他の化学物質が含 まれる。

本発明による蛋白質生成物は又、ｒｓｎ、ｕ素分解、有毒化学物質の廃棄物処理 、酩造や、特にステロイド変換のような酸化反応や物質変化などの特定の酸素要 求段階を増加させるといった種々の応用ができる。

この発明はまた、酸素結合蛋白質生産のための組換ＤＮＡ法に関するものでもあ る。一般に、この方法は、 （ａ）宿主細胞又は微生物に酸素結合能を有する蛋白質を生産させることができ るボークプルＤＮＡ配列の調製、 （ｂ）このポータプルＤＮＡ配列の宿主内への直接移入、或いはこのボークプル ＤＮＡ配列を宿主細胞または微生物へ移入できその中で複製可能なベクター（こ のようなベクターはポータプルＤＮＡ配列を操作するエレメントを含有している ）へのクローニング、［ｃ）酸素結合蛋白質を発現できる宿主へのポータプルＤ ＮＡ配列と操作エレメントとを含有するベクターの移入、 （ｄ）ベクターの複製及び伝帳に適当な条件下における、そして／又は蛋白質発 現に適当な条件下における宿主細胞の培養、（ｅ）以下の何れか、 ｆｉ）蛋白質の採取、 （ｉｉ）蛋白質に酸素結合能を有する活性構造をとらせること、から成る。

この方法におけるポータプルＤＮＡ配列は、上記で説明したように、合成された もの又は天然に存在するポリヌクレオチドである。好ましい実施態様では、ポー タプルＤＮＡ配列は少くとも上記Ｖｉｔｒｅｏｓｃｉｌｌａヘモグロビン蛋白質 部分をコードする。

この発明はまた、これらプロモーター／レギュレーターを使用するための組換Ｄ ＮＡ法に関するものである。一般に、この方法は、定められた環境条件下で目的 ＤＮＡ配列の発現を外部制御の支配下におくための方法（プロセス）を提供する もので、以下のステップにより構成される。

（ａ）定められた環境条件下でＶｉｔｒｅｏｓｃｉｌｌａヘモグロビンのプロモ ーター／レギュレーターＤＮＡ配列に対応して転写、及び／又は駐訳される目的 単離構造遺伝子を少くとも一つ用意すること、（ｂ）目的構造遺伝子を前記プロ モーター／レギュレーターＤＮＡ配列と操作可能に融合すること。

ポータプルＤＮＡ配列が宿主染色体に直接挿入できる、或いは、ベクター・クロ ーニング系に使用できるということは想像できよう。本方法に使用できると思わ れるベクターは上記で説明したものである。好ましい実施態様では、クローニン グ・ベクターｐＵｃ１９／ｐＲＥＤ２が開示方法の中で使用されている。

このようにして得られたベクターは、次に適当な宿主細胞又は生物に移入するこ とができる。外因性ＤＮＡを取込んで、これらの遺伝子と附随的操作エレメント とを発現する能力を有する微生物ならどれでも選ぶことができると思われる。

特に本発明の使用に好ましい宿主は、上記説明したものを含むものである。ベク ターを宿主に移入する方法は当業界の通常の技術の範囲内のものである。酵母の ような特定の微生物で最終的に発現させるためには、クローニング・ベクターを 大腸菌などの他の微生物に先ず最初に移入し、そこでベクターを複製させて増殖 後そこからベクターを取出し純化して、それから酸素結合蛋白質を最終的に発現 する酵母に移入するのが好ましいかもしれない。

宿主細胞又は微生物は酸素結合蛋白質発現に適当な条件下で培養される。この条 件は、一般に宿主生物に特異的であり、このような生物の成長条件に関する刊行 文献を参考にして当業者により容易に決定される。

一つの実施態様では、ＤＮＡ配列発現の制御に必要な条件は、ベクターに挿入さ れた或いは初めから存在する操作可能なエレメントに依存し、形質転換及び培養 の段階で影響を受けることになる。細胞はＤＮＡ配列発現を抑制する適当な制御 条件の存在下において高密度まで成長する。最適な細胞密度に近づいたら、環境 条件をポータプルＤＮＡ配列発現に適当な条件へと変える。こうして最適密度近 傍まで宿主細胞が成長するまで続く時間の間クローン蛋白質が生産され、もし望 むなら、発現に必要な制御条件が誘導された後のある時期に、結果として生じた クローン蛋白質産物を採集できると考えられる。

使用する操作エレメントが本発明のプロモーター／レギュレーター配列内にある 場合、その条件は以下の通りである。細胞はＤＮＡ配列の発現を阻害する適当な 酸素レベル下で高密度まで成長する。最適な細胞密度に近づいたら、環境酸素レ ベルをポータプルＤＮＡ配列発現に適当な低い値に変える。酸素飽和溶液で１％ 以下から飽和までの各レベルが本発明の範囲内である。こうして、最適密度近傍 まで宿主細胞が成長するまで続く時間の間、遺伝子に融合された目的産物が生産 され、もし望むなら、発現に必要な制御条件が誘導された後のある時期に、結果 として生じた生産物を採集できよう。

本発明の生産物である酸素結合蛋白質を採取するのであれば、精製の前またはそ れに続いて、また活性構造をとる前に又はその後に採取することができる。

本発明の酸素結合蛋白質の何％かは、宿主細胞また生物での発現により、その適 当な活性構造をとると広く信じられている。望むなら、酸素結合蛋白質は細胞膜 を通過して輸送されることもできる。これは、適当なリーダー配列をコードする ＤＮＡを組換蛋白質をコードするＤＮＡと連結すれば、一般に行なうことができ よう、多くのシグナルペプチドの構造が公表されている。少くとも一つの必要な ポータプルＤＮＡを含む又はこれに付は加えられたリーダー配列は融合蛋白質を 細胞内で生産させ、この蛋白質は細胞膜を通過輸送され細胞から離れたらリーダ ー配列を切断すると想像される。

本発明の酸素結合蛋白質の別の使い方も予想される０本発明の純粋蛋白質及び／ 又は細胞全体及び／又は細胞抽出物は、それ自体で酸素への結合に使用でき、そ しである程度は赤血球のように機能できよう。

本発明はまた、必要なら酸素結合蛋白質（これは細胞破砕液や粗細胞標品から単 離され、抽出物から純化され、合成配列から或いはこの蛋白質を含む全細胞から 作られる）を引き渡すことにより、細胞に又は他の酸素を使用するプロセスに供 給酸素を送り、増加させる方法として使用することができる１本発明の蛋白質製 品は培養細胞の培地に効果的に加えることができ、これによって酸素輸送を増加 させるものと想像できる。

また、本発明の蛋白質は酸素を結合したり、海水などの液体や他の気体から酸素 を分離するのに使用できると想像できる。

特異的問題または環境に対して本発明が教える利用は、ここに含まれる教示に従 い当業者の可能性の範囲内にあることが理解される０本発明の生産物及びその単 離、使用及び大量生産の為の代表的プロセスの例を以下に示す。

産業状の利用性 本発明の生産物及びプロセスは薬学的、実験室的、及び工業的利用の範囲で有用 性を見出す、この発明は、種々の蛋白質または代謝産物の生産を増加させるため の増強された成長特性を有する代謝操作がされた細胞を提供する。発明はさらに 、特定ＤＮＡ配列の発現を定められた環境条件下で外部制御の支配下におく方法 を提供する。また本発明の実施のため、組換ＤＮＡ融合遺伝子産物、発現ベクタ ー、及びヌクレオチド塩基配列を提供する。本発明の生産物及びプロセスは、ク ローン蛋白質の大量生産や代謝産物の合成、醗酵による化成品生産、酵素処理に よる分解、廃棄物処理、構造及び広範囲の酸化反応などのような広範囲の好気的 プロセスでの利用を見出す。

（以下余白） 実−と−例 兄姿例１−　Ｖｉｔｒｅ　５ｃｉｌｌａヘモグロビンの太陽菌テノ２三二三２２ 及び発現 且見及〃方法 Ｖｉｔｒｅｏｓｃｉｌｌａ　ｓ　、（マレ−１１ｕｒｒａｙ）　８株番号：３８ ９）は）〜ｅｂｓｔｅｒ博士（米国、６０６１６．イリノイ州、シカゴ、イリノ イ工科大学生物学部）より入手し、１．５％１Ｊｅ抽出物、１．５％ペプトンお よび０．０２％酢酸ナトリウム（ＮａＯ）１によりｐＨ８，０に調節）を含む培 地で成長させた。

大腸菌ＪＭ１０１はＳｉｍｏｎ博士（米国、９１１２５、カリフォルニア州、パ サデナ、カリフォルニア工科大学、生物学部）の実験室より入手し、１％バクト ドリプトン、０．５％酵母エキス、１％塩化ナトリウムを含むＬブイヨンで成長 させた。

プラスミドｐＵｃ　１９　（Ｙａｎｉｓｃｈ−Ｐｅｒｒｏｎ　ｅｔ　ａｌ、、　 Ｉｎ　ｒｏｖｅｄ　Ｌ１１３　ｈａ　ｅｃｌｏｎｉｎ　ｖｅｃｔｏｒｓ　ａｎｄ 　ｈｏｓｔ　５ｔｒａｉｎｓ：　ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ　５ｅｑｕｅｎｃｅｓ　 ｏｆ　ｍ１３ｍｐ１W　ａｎｄ ｐＵｃ１９　ｖｅｃｔｏｒｓ、　Ｇｅｎｅ　３３：１０３−１０９．１９８５　 ］のパッケージ・キットはファルマシア社より購入した。全ての制限酵素、■４ ポリヌクレオチドキナーゼ及びＴ４リガーゼはニューイングランド・バイオラボ 又はベセグ・リサーチ・ラボラトリーズより入手した。子牛小腸アルカリ性フォ スファクーゼはファルマシア社からのものである。混合オリゴヌクレオチド・プ ローブはアプライド・バイオシステムズ・シンセサイザーにより合成した。コダ ック・ＸＡＲ５・Ｘ線フィルムをオートラジオグラフィーに使用した。シーンク リーン（Ｇｅｎｅｃｌｅａｎ　）キットはバイオ１０１　（Ｂｉｏｌｏｌ）より 購入した。他の化学薬品は全て分析グレードである。

ＶｉｔｒｅｏｓｃｉｌｌａゲノムのＤＮＡは５ｉｌｈａｖｙ　ｅｔ　ａｌ、、　 １ｍｅｎｔｓ　ｗｉｔ、ｈ　ｅｎｅｆｕｓｉｏｎｓ、　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ 　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　（１９８４）　（その内容を本明細書 に包含する）のプロトコルに従い単離した。）（ｉｎｄ　Ｉｌｉ＞’Ａ化したＶ ｉｔｒｅｏｓｃｉｌｌａ　Ｄ　Ｎ　ＡはｐＵｃ１９のフォスファクーゼ処理した １−ｆｉｎｄ　Ｔ１１部位にサイトに連結し１．．７　Ｍ　１０１に形質移入し た。組換コロニー及びプラーク（オ、！、！ａｎｉａｔｉｓ、　ｅｔ、　ａｌ、 。

ｋｌｏｌｅｃｕｌａｒ　ｃｌｏｎｉｎｇ−−ａ　ｉａｂ　ｒａｔｏｒｙ　ｍａｎ ｕａｌ、　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂ盾窒≠狽盾窒■ （１９８２）　（その内容を本明細書に包含する）に記載されているように、ニ トロセルロース・フィルターに転写した。前述の５ｉｌｈａＸ−＼・ｅｔ、　ａ ｌ、に従い、組換コロニーからプラスミドを素早く単離した。プラスミドＤＮＡ の消化断片及びゲノムＤＮＡの断片はシーンクリーン（Ｇｅｎｅｅｌｅａｎ　） キットを使ってアガロース・ゲルから単離した。大腸菌細胞は前述の５ｉｌｈａ ｖｙ　ｅｔ　ａｌ、のＣａＣｌ２方法により形質転換した。プラスミド吸収は、 氷冷適格細胞を３７°Ｃで５分間熱シヨツクをかしすることにより誘導した。

サザーヘーン・ハイブリダイゼーションするため、デュポン（Ｄｕｐｏｎ　）社 のカタログ、Ｎｏ、ＮＥＦ−９７６、ｒＰｒｏｔｏｃｏｌｓ　ｆｏｒ　ｅｌｅｃ ｔｒｏｐｈｏｒｅｔｉｃ　ａｎｄ　ｃａｐｉｌｌａｒｙｔ、ｒａｎｓｆｅｒ　ｏ ｆ　ＤＮＡ　ａｎｄ　ＲＮＡ　、　ＤＮＡ　ａｎｄ　ＲＮＡ　ｈｙｂｒｉｄｉｚ ａｔｉｏｎ、　ａｎｄ　ＤＮＡ　ａ獅п@ＲＮ、Ａ ｒｅｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ」（１９８５）　（その内容な本明５Ｍに包含 する）に提案された試薬を用いた。コロニー及びプラークのハイブリダイゼーシ ョンには、前述の１１ａｎｉａｔｉｓ、　ｅｔ　ａｌ、に記載された試薬を用し ）だ。フィルターは予め４５〜５０°Ｃで２４時間プレハイブリダイズし、３０ °Ｃて２０＝２４時間ハイブリダイズした。

２００＋ＬＣｉの（”Ｐ）ＡＴＰでリン酸化した２００ピコモルのオリゴヌクレ オチド（放射比活性；　７０００Ｃｉ　／ｍｍｏｌ）をプローブとして使用した 。フィルターはオートラジオグラフィーの前に、２ＸＳＳＣ，０，！％５ＤＳＴ 室温で洗浄しく５分間、３回）、さらに（Ｃ末端プローブ用には）４６℃で洗浄 し、　（Ｎ末端プローブ用には）５０℃で洗浄した。

ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動は、標準プロトコルであるＬａｅｍｍｌ ｉ。

Ｃ１ｅａｖａｅ　ｏｆ　５ｔｒｕｃｔｕｒａｌ　ｒｏｔｅｉｎｓ　、沖ハ復■ｔ 　ｅ　ａｓｓｅｍｌｙ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｈｅａｄ　ｏｆｂａｃｔｅｒｉｏ　ｈａ 　ｅ工、　、　Ｎａｔｕｒｅ　２２７：６８０−６８５．、１９７０　（その内 容を本明細書に包含する）に従い、１２．５％ゲル濃度で行なった。ゲル内の蛋 白質はＭｅｒｒｉｌｅｔ　ａｌ、、　Ｕｌｔｒａｓｅｎｓｉｔｉｖｅｓｔａｉｎ 　ｆｏｒ　ｒｏｔｅｉｎｓ　ｉｎ　ｏｌｙａｃｒｖｌａｍｉｄｅ　−駅仄１四胚 ｒｅ　１ｏｎａｌ　ｖａｒｉａｔｉｏｎ　ｉｎ　ｃｅｒｅｂｒｏｓ　１ｎａｌ　 ｆｌｕｉｄ　ｒｏｔｅｉｎｓ、　５ｃｉｅｎｃｅ　２１１：P４３７− １４３８、１９８３の銀染色法により肉眼で見えるようにした。

塾愚 ヘモグロビン遺伝子の２つのド、メイン（一つはＮ−末端で、一つばＣ−末端） と相同性を予想できる３組の混合オリゴヌクレオチドプローブを合成した。

■ｔｒｅｏｓｃｉｌｌａ　Ｄ　Ｎ　ＡのｐＵｃ　１９−Ｈｉｎｄ　ｎｌライブラ リーをアンピシリン。

Ｘ−ｇａｌ及びＩＰＴＧを豊富に含むプレート（寒天培地）に予備播種し、た、 肉眼観察によると、７０％以上のコロニーが多分組換体であった。それから約１ ０．０００コロニーをスクリーニングした。３つの陽性コロニーが確認された。

プレート上のコロニーが高密度なので、これら陽性コロニーを各群の隣接クロー ンと一緒に素早く分離しＨｉｎｄｅｌ消化してアッセイした。これらの内の一つ 、ｐＲＥＤｌは２．２ｋｂを含む３つの挿入断片を持っていた。続いて、このプ ラスミドを種々の工〕／ドヌクレアーゼで消化した。その消化したＤＮＡバ：ノ ドはサザーン・ハイブリダイズした。Ｈｉｒ＋ｒｌ　ｎ１部位はオリゴメリック プローブにより架橋された頌域の上流にも下流にも存在し、ないと予想されるの で、２．２ｋｌ）バンドが実際に完全ヘモグロビン遺伝子を含んでいることを確 認【、また。

ヘモグロビン構造遺伝子を含んだｐＲＥＤｌのＨ箱ｄ　Ｔｉｌ断片を純化１．Ｉ Ｊ、桶漠プロトコルによりｐＵｃ１９に両方向に再挿入した（ｐＲＥＤ２及びＩ ｌｌ　ＲＥ　Ｄ３）、プラスミドｐＲＥＤ１．ｐＲＥＤ２、ｐＲＥＤ３及びｐＵ ｃｉ９を含有する大腸菌細胞とＶｉｔｒ朋匹１１１ａ細胞を定常フェーズまで成 長させ、ヘモグロビンポリペプチドの存在を確かめるため細胞抽出物を５ＤＳ− ポリアクリルアミドゲルでアッセイした。ヘモグロビンは全ての組換細胞で主要 な細月包性蛋白質とじて発現していた。プラスミドｐＲＥＤ２及びｐ　ＲＥ　Ｄ 　３の両方ともこのポリペプチドをほぼ等量発現していたので、覗時点ては、遺 伝子は多分、大腸菌の天然プロモーターから発現されるものと思われる。

プラスミドｐ　ＲＥ　Ｄ　２の制限地図を第１図に示す。

″″：験ｆ９Ｉ２−中金ヌクレオ天旦配烈Ｖｉｔｒｅｏｓｃｉｌｌａゲノム・ラ イブラリーから分離された断片の関連領域の配列決定を以下のように行なった。

構造遺伝子及び隣接配列を含有するプラスミドｐＲＥＤ２のＨｉｎｄ　ｌｌｌ− ３ｐｈＩ断片をｐＵｃ１９（ベセダ・リサーチ・ラボラトリーズより購入）でサ ブクローンし、プラスミドｐＲＥＤ４を得た。得られたプラスミドを制限酵素マ ツピングして、Ｈｉｎｄｎド５ｐｈＩ挿入部分を２つの断片に分けるＭｌｕＩ部 位の存在を確認した。これは−船に広く行なわれているプロトコル（λ！ａｘｓ ａｍ　ａｎｄ　Ｇ１１ｂｅｒｔ。

ｙｅｃｉｆｉｅ　ＤＮＡ　ｃｈｅｍｉｃａｌ　ｓｅ　ｕｅｎｉ　ｒｅａｅｔｉｏ ｎ、　Ｎ＋＋ｃｌｅａｒ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　P５ニ ア８２３−７８３０．１９８７　）を使ってそれぞれ侶別りこ配列決定した。

Ｉ−１ｉｎｄ　ＩＩＩ　−Ｓ　ｐｈ　Ｉ断片の重要部分のヌクＬ、　Ｚ（チド配 列を下記に示すやこれは推定上の大腸菌プロモー外−、リポソーム結合部位、完 全ＶＨｂ構造遺伝子（開始及び純了のコドンに：′：、下線が付１．である）及 び推定上の大腸菌転写ターミネー・クー（Ｋｈｏｓｌａ　ａｎｄ　Ｂａ１ｌｅｙ 、　Ｔｈｅ　Ｖｉｔ夏塁租貝、堕、１卵卯…曵ｉｎ　ｐｎｅ：　ｍｏｌｅｃｕｌ ａｒ虹卯功■（＾火」四μ即聾ゴ可Ｊ肌轄にμ匹９讐坤り国、堕辿肛抽強、９１ ムＭｏ１．＆　Ｇｅｎ、　Ｇｅｎｅｔ、、　ｉｎ　ｐｒｅｓｓ　）を含有する。

Ａ、ＡＧＣＴｒＡＡＣＧ　ＧＡＣＧＣＴＧＧＧＧ　ＴｒＡＡＡ、ＡＧＴＡＴ　ｎ ’ＧＡＧＴＴｒＴＧ　ＡＴＧＴＧＧＡＴｒＡ　ＡＧπＴｒＡ`ＧＡ　６０ −５例３−　ＲＥＤ２による　腸−の成長声加：振遣２之区三接黛 この実験例では、活性Ｖｉｔｒｅｏｓｃｉｌｌａヘモグロビンを生産する大腸菌 の成長の挙動を、同一条件下で成長させた対照株の挙動と比較した。以下の株を 調べた。

（１）ＪＭＩｏｌ　：　ｐＲＥＤ２　；（２）ＪＭＩ　Ｏ１：　ｐＵＣ９：　及 び（３）ＪＭＩＯＩ プラスミドｐＵｃ９とｐＵｃ１９は、挿入物とは無関係な即ちプラスミドの機能 的性質の何れとも無関係な１ケ所の制限サイトの違いを除き、本質的に同じであ る。

寒胆土順− 細胞は１％（Ｗ／Ｖ）バクトドリブトン、０．５％（Ｗへ１）酵母エキス、０． ５９６ｆ＊／Ｖ）ＮａＣ１，０，３％ｆＷ／ＶＩ　Ｋ＊　ＨＰＯ，及び０．１％ （Ｗ／Ｖ）　ＫＨ’２　ＰＯ，’を含む複合培地（ｐＨ７，０）で３７℃で成長 させた。プラスミド含有細胞はｌｏｏｍｇ／εのアンピシリン存在下で成長させ た。いずれの場合も、振盪フラスコは４３０ｇ／１２グルコース、５　ｇ／１２ 酵母エキス、１１０ｇ／ｌ２（ＮＨ４１２Ｓｏ、、８ｇ／１２Ｍｇ５○−’７Ｈ ｚＯ１０，２７ｇ／ｊ２Ｆｅｃ１ｓ　・６Ｈ＊　Ｏｌｏ、０２ｇ／ｌ２Ｚｎｃ１ ａ　・４Ｈ，Ｏｌｏ、０２ｇ＃２ＣａＣ１ｚ　−２Ｈｚ　Ｏｌｏ、０２ｇ／ｆｆ ＮａＭｏ０−　・２Ｈ２０，０，０１ｇ／Ｉ２ＣｕＳＯ４・５Ｈ２０，０，００ ５ｇ／ｌ２（７）Ｈ，ＢＯ，，０，１９６（Ｖ／Ｖｌ濃塩酸、４．２ｍｇ／Ｉ２ ’Ｊポ：７ラビン、５４ｍｇ／Ｉ２パントテン酸、６０ｍｇ／１葉酸を含む濃縮 栄養ブイヨンを１％（Ｖ／Ｖ）の分量（ドーズ）で接種した。この組成は、流加 培養法（ｆｅｄ−ｂａｔｃｈ　ｍｏｄｅ）において定常状態の細胞を高密度に成 長させるために以前より成功裏に使用されてきたものである。細胞はそれからさ らに定常状態に再び達するまで成長させた。光学密度はボシュロム・スペクトロ ニック２トスベクト口フォトメーターにより６００ｎｍにて測定した。乾燥重量 は、１０ｍ１の試料を４℃下で遠心し、蒸留水で一度洗い、続けて再懸濁した試 料を１００℃で一夜乾燥することにより測定した。細胞のヘム含有量は、Ｌａｍ ｂａ　＆　Ｗｅｂｓｔｅｒ　（Ｌａｍｂａ　＆Ｗｅｂｓｔｅｒ、　Ｅｆｆｅｃｔ 　ｏｆ　ｒｏｗｔｈ　ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ　ｏｎ　１ｅｌｄ　ａｎｄ　ｈｅｍ ｅ　ｃｏｎｔｅｎｔ　ｏｆＶｉｔｒｅｏｓｃｉｌｌａ、　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ 　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ　１４２：１６９−１７３．１９８０　）の方法に 従いアッセイした。ヘモグロビン活性は、Ｗｅｂｓｔｅｒ　＆　Ｌｉｕ　（Ｗｅ ｂｓｔｅｒ　＆　Ｌｉｕ、　Ｒｅｄｕｃｅｄｎｉｃｏｔｉｎａｍｉｄｅ　ａｄｅ ｎｉｎｅ　ｄｉｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ　ｃ　ｔｏｃｈｒｏｍｅ　ｏ　ｒｅｄｕｃ ｔａｓｅ　ａｓｓｏｃｉ≠狽■п@ｗｉｔｈ Ｃｈ　ｔｏｃｈｒｏｍｅ　ｏ　ｕｒｉｆｉｅｄ　ｆｒｏｍ　Ｖｉｔｒｅｏｓｃｉ ｌｌａ、　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　ＢｉｏｌｏｇｉｃａｌＣｈｅｍｉｓｔｒｙ　 ２４９：４２５７−４２６０．１９７４　）の方法によって測定した。

３つの株の成長特性、ヘム含有量及びヘモグロビン活性を下記の表に提供する。

１、ＯＤａ。。　０．９３７　０．７３７　０．９４５（栄養培地補給前） ２、　００．。。　１．２３０　０．８８０　０．９８５３、最大獲得乾燥重量 　１．５ｇＡ　０．８５ｇ／Ｌ　Ｉｇ／Ｌ４、相対ヘム含量　５．５　１　＊＊ ５、相対ヘモグロビン活性　５　１　＊＊６、比成長速度＊　０．０４／ｈ０． ０１／ｈ　０．００９／ｈ＊　上記振盪フラスコへの追加培地供給速度の平均値 斡　未計測 例４−　ＲＥＤ２による　の　−〇＝ 典型的な高細胞密度醗酵は流加培養タイプである。最適な栄養添加速度、及びそ の結果としての生産性は、究極的には、酢酸や乳酸のような成長を阻害する代謝 物を産生することなく細胞が炭素源を好気的に分解代謝できる速度により制限さ れる（　Ｚａｂｒｉｓｋｉｅ　ａｎｄ　Ａｒｃｕｒｉ、　Ｆａｃｔｏｒｓ　１ｎ ｆｌｕｅｎｃｉｎ　ｒｏｄｕｔｉｖｉｔ　ｏｆｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎｓ　ｅ ｍ　ｌｏ　ｉｎ　ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ　ｍ１ｃｒｏｏｒ　ａｎｉｓｍｓ、　 Ｅｎｚｙｍｅ　ａｎｄ　Ｍ奄モ窒盾ｂ奄≠■ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　８ニア０６−７１７．１９８６：　Ｔｓａｉ　ｅｔ　ａ ｌ、、　Ｔｈｅ　ｅｆｆｅｃｔ　ｏｆ　ｏｒ　ａｎｉｃ　ｎPｔｒｏ　ｅｎ ａｎｄ　１ｕｃｏｓｅ　ｏｎ　ｔｈｅ　ｒｏｄｕｃｔｉｖｉｔ　ｏｆ　ｒｅｃｏ ｍｂｉｎａｎｔ　１ｎｓｕｌｉｎ−１ｉｋｅ　ｒｏｗｔｈのヘモグロビンを発現 する組換株（ＪＭＩｏｌ　：　ｐＲＥＤ２）の成長特性と、同じようなプラスミ ドを含有する株（ＪＭＩＯｌ　：　ｐｔＪｃ９）及びプラスミドを含有しない株 （ＪＭＩＯＩ）との比較を典型的な流加培養醗酵条件下で行なった。

材赳及シ方法 細胞は、二ニー・ブランズウィック・マイクロファーム・ファーメンクー（Ｎｅ ｗ　Ｂｒａｎｓｗｉｃｋ　Ｍｉｃｒｏｆｅｒｍ　ｆｅｒｍｅｎｔａｏｒ）内で３ ７±０．５℃、ｐＨ７±０．０５、開始作業容量２．５１２にて成長させた。４ ．５Ｉ２／分の一定の空気流入速度と３００ｒｐｍの撹拌を各運転時に維持した 。シリコン消泡剤ＡＦ６０を泡立ちを制御するために使用した。前述のＴｓａｉ 　ｅｔ　ａｌ、　、の第２表に挙げられたバッチの培地と流加培地１を用いた。

接種後の成長はバッチモードである。バッチが定常状態に達した後、流下培地ｌ を使用して１０ｍ１／時間の流速で連続供給を開始した。プラスミド含有細胞に は１００ｍｇ／Ｉ２のアンピシリンを使用した。全ての場合で、溶存酸素（ｄｉ ｓｓｏｌｖｅｄ　ｏｘｙｇｅｎ；　Ｄ　Ｏ）レベルは、初期のＬｏｇフェーズの 間とバッチ定常状態に向う時期を除いて殆んどの運転期間中、飽和空気の５％近 辺で正しく一定に維持された。

超星 ３つの株について計測された成長パラメーターを下記にまとめる。バッチ定常フ ェーズは連続供給を始める前の条件に関係している。

バッチ・ｌｏｇフェーズ　０．９５　０．７３　０．９５成長速度（ｈ−’） バッチ・定富フェーズ　２．６　１．６　２．６乾燥細胞量（ｇ／Ｌ） フィードバッチ・ｌｏｇフェーズ　０．０５６　０．０３３　０．０６６成長速 度Ｆｈ−’） 最終乾燥細胞量（ｇ／Ｌｌ　５．８　２．８　５．９また、ＪＭＩＯｌ　：　ｐ ＲＥＤ２の呼吸の挙動は、ギルソン・レスピロメーター（Ｇｉｌｓｏｎ　ｒｅｓ ｐｉｒｏｍｅｔｏｒ　）での観察すると、低Ｄｏレベルで対暇ノ株に比ヘテ改善 されていた。

結論 Ｖｉｔｒｅｏｓｃｉｌｌａのヘモグロビンを含有する細胞は比較プラスミドを含 有する対照よりもより速くより高密度に成長する。

＃馬（！１１５−他のプロモーターの制御下に′：８しるの　腸テ　でのＶｉｔ ｒｅｏｓｃｉｌｌａ−ｓ−９’　ｔ：ｌ　ｅ　＞　（Ｖ　Ｈｂ　）　０’）”Ｊ ！！上記実験例１．３及び４では、ヘモグロビンの発現はその菌本来の酸素制御 プロモーターの制御の下にある。それゆえ、溶存酸素濃度（Ｄｏ）と細胞内ＶＨ ｂレベルを独立に変えることは不可能である。これを克服するため、発明者らは この蛋白質を、ｔ　ｒ　ｐ　（Ｒｕ５ｓｅｌｌ　ａｎｄ　Ｂｅｎｎｅｔｔ、　Ｃ ｏｎ５ｔｒｕｃｔｉｏｎ　ａｎｄ　ａｎａｌｖｓｉｓ　ｏｆｉｎ　ｖｉｔｒｏ　 ａｃｔｉｖｉｔｖ　ｏｆ　Ｅ、　ｃｏｌｉ　ｒｏｍｏｔｅｒ　ｈｙｂｒｉｄｓ　 ａｎｄ　ｒｏｍｏｔｅｒ　ｍｕｔａｎｔ刀@ｔｈａｔ ａｌｔｅｒ　ｔｈｅ　−３５ｔｏ　−１０ｓ　ｃｉｎ　、　Ｇｅｎｅ　２０：２ ３１−１４３．１９８２　）やｔ　ａ　ｃ　（ｄｅＢｏｅｒｅｔ　ａｌ、　Ｔｈ ｅ　ｔａｃ　ｒｏｍｏｔｅｒ：　ａ　ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ　ｈｖｂｒｉｄ　ｄ ｅｒｉｖｅｄ　ｆｒヨ卯ｋＬＩ＝！にシ、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｅａｄ 、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ　８０：２１−２５．１９８３）のような大腸園内で機能 するた他の制御可能なプロモーターのコントロール下で発現させることプラスミ ドｐＲＥＤ４　（実験例２を参照）をＨｉｎｄ　ｉｌｌで直線上にし、ニキソヌ クレアーゼＢａ１３１で処理してＨｉｎｄ　ｌＴｌ−３ｐｈＩ　ＶＨｂ断片の５ °末端欠損部を作った。５ｐｈｘで消化した後、生じたＶＨｂ断片をＨｉｎｄ　 ｌｌｌ−３ｐｈｌ消化し５１．：ｐＵＣ１９ヘクローン化した。欠損端部の位置 は配列決定（実験例２のそれと似たようなプロトコル）により確認した。

ｔｒｐとｔａｃプロモーター及びクロラムフェニコール・アセチルトランスフェ ラーゼ遺伝子（ＣＡＴ）はファルマシア社より購入した。オリゴヌクレオチドは カリフォルニア工科大学でアプライド・バイオシステムズ・ＤＮＡシンセサイザ ーを使用して合成した。全てのＤＮＡ酵素は商人より得た。

ｖｏｂ遺伝子産物の機能アッセイは前述の）〜ｅｂｓｔｅｒ　ａｎｄ　Ｌｉｕに 記載されたものである。

細胞は４°Ｃでベレットにし、１００ｍＭＴｒｉｓ　（ｐＨ７，５）、５０ｍＭ ＮａＣ１で再懸濁した。この細胞！！！：濁液を水冷下、３分間、７５Ｗで高周 波破砕（ソニケート）シた。１２，０００ｇで１０分間遠心後、上清を集めＶ） Ｉｂのアッセイをした。総蛋白含量はバイオラド社（Ｂｉｏｒａｄ　Ｉｎｃ、） のブラッドフォード（Ｂｒａｄｆｏｒｄ）アッセイキットを使用して計算した。

ＶＨｂ活性は△Ａ４１９−４３６／ｍｇ総蛋白として報告する。

結果 欠損株の一つ、ｐＲＥＤ３０２はＶＨｂ構造遺伝子のＡＴＧ開始コドンの２塩基 対上流をマツプしていた。この欠損株が次の仕事に使用された。ｔｒｐプロモー ターのＥｃｏＲＩ　／　ＢａｍＨ１部分を、切断されたＶ）ｌｂ断片の上流にク ローンした。以下のリポソーム結合部位を合成し。

５°　ＧΔＴＣＣＣＧＧＧＴＣＴＡＧＡＧＧＡ　３゜ＧＧＣＣＣＡＧＡＴＣＴＣ ＣＴ そしてＢａｍＨＩとヌクレアーゼで平滑末端にしたＸｂａＩ部位の間に挿入し、 ｔｒｐプロモーターでコントロールされるＶＨｂ発現系を生み出した。ＣＡＴ遺 伝子（Ａｌｔｏｎ　ａｎｄ　Ｖａｐｎｅｋ、　Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ　ｓｅ　ｕ ｅｎｃｅ　ａｎａｌｙｓｉｓｉ　ｏｆ　ｔｂｅｃｂｌｏｒａｍ　ｂｅｎｉｃｏｌ 　ｒｅｓｉＳＬａｎｃｅ　ｔ、に二月、　Ｎａｔｕｒｅ　２８２：８６４−８６ ９．１９７９　）をこのｐＵＣ１９を基本とするプラスミドに利用可能なｌａｃ プロモーターの下流にその制御を受けるように挿入した。最後に、この１）ＵＣ ｌ３を基本とするプラスミド上のβ−ラクタマーゼ遺伝子なＰｖｕＩ処理及び再 連結により除去した。こ　１の段階の目的はプラスミドにコードされた周辺蛋白 質の存在を取り除くことにある。このようにして得られたプラスミドをｐＨｂＣ ＡＴと呼んで、ＪＭＩＯＩを形質転換した。対照に見られるように、ＣＡＴ遺伝 子はｐＬＩｃ１９のｌａｃプロモーターの下流にその制御を受けるようにクロー ン化された。β−ラクタマーゼ遺伝子は除かれていることが確認できた。これら ２つのプラスミドの関連領域の制限地図及び予想配列を下に示す。

２几旦ＣＡ　’Ｔ−工支ｊ山ｌ ＥｅｏＲＩ ５’　ＧＡＡＴＴ　ＣＣＣＣＴ　ＧＴｒＧＡ　ＣＡＡＴｒ　ＡＡＴＣＡ　ＴＣＧ ＡＡ　ＣＴＡＧＴ　ＴＡＡＣＴ　ＡＧＴＡＣＶＨｂの開始コドン ＣＡＴＧＴ　ＴＡＧＭ：　・−・−・−（ＳｐｈＩ部位まで実験例３と同じ）Ｅ ｅｏＲＩとＶＨｂ構造遺伝子の開始点との間に広がる領域の配列は上に示す。

これはエニニプロモーター・と合成リポソーム結合サイトとを含有する。

ＣＡＴ　（２，５ｋｂ ＪＭＩＯ１／ｐＨｂｃＡＴｏ）ＶＨｂレベルに対するトリプトファン（リプレッ サー）及びインド−＝ルアクリル酸（非代謝性インデューサー−）の影響を下記 の表に示す。これらの実験では、細胞は３ｇ／ｆｆグリセロール、３ｇ／２カザ ミノ酸及び適当量のインドール−アクリル酢酸又はトリプトファンを含む最少眼 培地でｌｏｇフェーズの中間（ｍｉｄ−１ｏｇ）まで成長した。

宿主：　トリプトファン　インドール−アクリル酸　比Ｈｂ活寸生プラスミド　 ［ｍｇ／Ｌｌ　（ｍｇ／Ｌ）　＊ＪＭＩＯＩ：ｐＣＡＴ　３．４　Ｘ　１０−” ＪＭＩＯＩ：ｐＨｂＣＡＴ　２０　６．２　Ｘ　１０−”１／　４　１８．３　 Ｘ　１０” ｔｔ　３１．５　Ｘ　１０−” １）　１　２９．５　Ｘ　１０” ／／　２．５　３６．５　Ｘ　１０−”ｔｔ　５　４７．ＯＸ　１０−” ／／　１０　３６．６Ｘ１０−３ 記：　△Ａ４ｒｅ−ａｓｓ／ｍｇ全可溶性蛋白質ｔａｃプロモーターのコントロ ール下でＶＨｂ遺伝子を発現させるため、ｔａｃプロモーターのＨｊｎｄ　ＩＩ Ｉ−ＢａｍＨＩ領域、ｐＨｂＣＡＴのＢａｍＨＩ／５ｐｈＩ断片及びベクターｐ ＢＲ３２２のＨｉｎｄ　Ｔｌｌ−３ｐｈＩ消化断片（Ｂｏｌｉｖａｒ　ｅｔ　ａ ｌ。

Ｃｏｎ５ｔｒｕｃｔｉｏｎ　ａｎｄ　ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ　ｏｆ 　ｎｅｗ　ｃｌｏｎｉｎ　ｖｅｈｉｃｌｅｓ、　Ｉｌ、　Ａ@ｍｕｌｔｉ− ｕｒ　ｏｓｅ　ｃｌｏｎｉｎ　ｓ　ｓｔｅｍ、　Ｇｅｎｅ　２：９５−１１３． １９７７　）を使って発現プラスミドを作った。

この構築体（ｐｌＮＴｌ）を使うと、細胞の赤さのレベルは非代謝性インデュー サーＩＰＴＧの種々の量と良い相関があり、遺伝子産物の生成はｔａｃのコント ロールに支配されていることを示していた。この発現系の利点は次の通りである 。

ａ、ＶＨｂの高い発現 す、成長用混合培地を使えること ｉ＃″路、（７ｉ１６−３腸−の成長−疋白”のプロモーターの？！ｉｌ（下に お【るＶ）３ｂの発王この実験の目的は大腸菌に対するＶＨｂの成長効果を示す ことにある。これらのケースでは、ＶＨｂは本来のＶＨｂ酸素制御プロモーター とは異なるプロモーターを便って発現させる。使用した菌株ニブラスミドは１、 ＨＢＩＯＩ　：ｐＢＲ３２２（ＢＲＬからのｐＢＲ３２２）２、ＪＭＩＯＩ　： ｐＩＮＴｌ　（実験例５で述べたｐＩＮＴｌ）である。この２つの宿主はほとん ど同じ遺伝子型（ｇｅｎｏｔｙｐｅｓ　）を有し、主な違いはＪＭＩＯＩでは１ ａｃＩｑ遺伝子を含んだＦ°因子が存在することにある。

この遺伝子はｔａｃのような強力なブロモ−クーをコントロールさせる必要があ る。

次のような培地処方を適当な注釈の形でここに述べる。

１ｘＬＢ　：　Ｌｏｇ／Ｉｔクトトリブトン、５ｇ／Ｉ２酵母エキス、５　ｇ　 ／　４２　Ｎ　ａ　Ｃｌ　、３　ｇ　／　Ａ　Ｋ　２　ＨＰＯ２，１ｇ／’ｊ２ ＫＨ２Ｐ○４．１００ｍｇ／ｆ２アンピシリン２ＸＬＢ　：　２０ｇ／Ｉ２バタ トトリプトン、１０ｇ／４２酵母エキス、５ｇ／Ｊ２ＮａＣ１，３ｇ／１２Ｋｚ 　ＨＰＯ４，１ｇ／ｊ２ＫＨ２ＰＯ４，１００ｍｇ／Ｉ２アンピシリン３ｘＬＢ 　：　５０ｇ／Ｊ２バクトドリプトン、２５ｇ／Ｉ２酵母エキス、５　ｇ　／　 ４２　Ｎ　ａ　Ｃｌ　、　３　ｇ　／　Ａ　Ｋ　ｚ　ＨＰ　０−１１ｇ／ｆ２Ｋ Ｈｚ　ＰＯ２，１００ｍｇ／Ｉ２アンピシリン実験は以下のように行なった。上 記２種類の菌株のシングルコロニーを培養チューブに入れた５ｍｌのＩＸＬＢに 接種し、３７℃で一夜成長させた。

適当な接種物を０．５ｍｌとって、以下の培地を５０ｍ１入れた２５０ｍ１培養 フラスコに移す。

１）　ＨＢＩＯＩ：ｐＢＲ３２２：　２Ｘ　ＬＢ２）　ＨＢＩＯＩ：ｐＢＲ３２ ２：　５Ｘ　ＬＢ３）　ＪＭＩＯＩ：ｐＩｈＴｌ　：　２Ｘ　ＬＢ４）　ＪＭＩ ＯＩ：ｐＩｈＴｌ　：　２Ｘ　ＬＢ　＋０．１　ｍＭ　ＩＰＴＧ５）　ＪＭＩＯ Ｉ：ｐＩｈＴｌ　：　２Ｘ　ＬＢ　＋　０．５　ｍＭ　ＩＰＴＧ６）　ＪＭＩＯ Ｉ：ｐＩｈＴｌ　：　５Ｘ　ＬＢ力ＪＭＩＯＩ：ｐＩｔｆｆｌ　：　５Ｘ　ＬＢ 　＋　Ｏｌｌ　ｍＭ　ＩＴＰＧ８）　ＪＭＩＯＩ：ｐＩｈＴｌ　：　５Ｘ　ＬＢ 　＋　０．５　ｍＭ　ＩπＧ細胞はそれから二二−ブランズウィックＧ２４エン バイロメンタル・インキュベーター８シエーカー（Ｎｅｗ　Ｂｒｕｎｓｗｉｃｋ 　Ｇ２４　Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ　Ｉｎｃｕｂａｔｏｒ　５ｈａｋｅｒ） で振盪速度を中間にセットして３７℃で２４時間成長させる。実験の終りには、 培養液を１％ＮａＣ１で１０倍に希釈してＯＤ、。０をスベクトロニクス２１ス ペクトロフォトメーター（ｓｐｅｃｔｒｏｎｉｃｓ　２１　ｓｐｅｃｔｒｏｐｈ ｏｔｏｍｅｔｅｒ）にて測定する。

ＨＢＩＯＩ：ｐＢＲ３２２２Ｘ　０　３．００ＪＭＩＯＩ　：ｐＩｈＴｌ　２Ｘ 　０　３．０３ＪＭＩＯＩ　：ｐＩｈＴｌ　２Ｘ　Ｏ，１２，９１ＪＭＩＯＩ： ｐＩｈＴｌ　２Ｘ　Ｏ，５３，００ＨＢＩＯＩ　：ｐＢＲ３２２５Ｘ　０　２． ７３ＪＭＩＯＩ　：　ｐＴｈＴｌ　５Ｘ　Ｏ３，２６ＪＭＩＯＩ　：ｐＩｈＴｌ 　ｓｘ　ｏ、　１　３．４０ＪＭＩＯＩ：ｐＩｈＴｌ　５Ｘ　Ｏ，５３，１５こ のデータから以下の結論が導きだせる。

（１）２ＸＬＢを含む全てのケースで細胞は適当な同じ密度まで成長した。この 密度は同一成長条件下でＩＸＬＢにおいていつも得られる密度のおおざっばに２ 倍であり、利用可能な栄養を消費していることを示している。換言すれば、細胞 は栄養制限によって定常フェーズの成長に入っている。

（２）過剰の栄養状態で成長した細胞は最終的に酸素が限定された条件に達し、 それのよって酢酸のような阻害性の代謝物を生じることが示された（前述のＴｓ ａｉ　ｅｔ　ａｌ、、）　、最終的には、例え栄養をさらに供給しても成長は停 止することになる。５×での全ての実験の結果はこのようなことが起こることを 示している。換言すれば、最終的に酸素の制限が起こり、培養は定常相にさせら れてしまう。

（３）従って、０２制限成長下ではヘモグロビン遺伝子の存在が大腸菌の成長性 を増加させる。ここではＶ）ｌｂの発現がＤｏレベルで制御されないという違い はあるものの、この結果は実験例３及び４と似ている。

（４）決められた成長条件下では成長増加効果を最高にするＶＨｂ発現の最適レ ベルが存在するのが明らかである。このような最適条件は成長の環境条件ばかり てなく各セル・ライン及び／又はプラスミド構築体に特有の成長特性とも置係す る。それゆえ最適条件はこの技術の種々の応用に当ってケース・パイ・ケースに 基いて決定されなければならないだろう。但し、このような決定をするのに過度 の実験は必要ではない。

（以下余白〕 医稔立Ｊ士＝μ町引二≧見ｊ白質のり一二Ｚ区巳二虫成星且＝り己旦３琴二影１ この実験の目的はクローン化遺伝子度物の一モデルに対するＶＨｂ遺伝子の影響 を明らかにすることにある。広く種々の遺伝子産物が組換ＤＮＡ技＜＋ｔｊによ り商業的に生産されるから、これ：＝木技術の重要な応用面である。この種類の 典型的なプロセスには高細胞亨度流加培養醒醒がある。このようなプロセスの生 産性は最終的に、不十分な酸素をどれだけ利用できるかということにより制限さ れる。

以下の宿主／プラスミドを本実験に使用した。

１、ＪＭＩＯＩ＋ｐＣＡＴ ２、ＪＭＩＯＩ　：ｐＨｂＣＡＴ これらのプラスミドの構築は実験例５に記載されている。

以下の培地組成を使用した。

ＬＢ　：　Ｌｏｇ／ｆｆバクトドリブトン、５ｇ／！酵母エキス、５ｇ／ｆ２Ｎ ａＣ１，３ｇ／ｆｆＫ２ＨＰ○４．１ｇ／　ｌ２ＫＨ２ＰＯ−，３０ｍｇ／　Ｉ ２タロラムフェニコール１０×フイード：　１００ｇ／ｆｆバタトトリブトン、 １００ｇ／ρ酵母エキス、１５０ｍｇ／ｆｆクロラムフェニコール実験は以下の ように行なった。

２種類の菌株のシングルコロニーを培養チューブに入れた５ｍ１ＬＢに接種し一 夜成長させた。接種物１ｍｌを新鮮Ｌ８１００ｍｌに移し、成長曲線を続けさせ た。細胞がｌｏｇフェーズの終りの近づいたら、１０×フイード培地を１ｍｌ加 え、成長のバーストを続けさせた。同様に二回目の添加パルスを行なった。この 成長フェーズの終りに、１００ｍＭＩＰＴＧを含んだ１０×フイード培地を１ｍ ｌパルス添加し、ＣＡＴ遺伝子を発現を誘導した。一時間後試料を抜きだしＣＡ Ｔアッセイをモニターした。実験の結果を以下に示す。

１）　ＩＰＴＧ添加前のクレット値　６７０　７００２）全可溶性蛋白質　０． ３１　０．４３５（ｍｇ／ｍ１　培養液） ３）　ＣＡＴ活性　１．３９ｘｌＯ’　２．６７ｘｌＯ’（ｚフト／ｍｇ　可溶 性蛋白質） ４）　ＣＡＴ活性　４．３　ｘｌＯ”　１１．６　ｘｌＯ”（ユニット／ｍｌ　 培養液） 上のデータから次のような結論が導きだせるだろう。

（１）ＶＨｂの存在は、例えＶＨｂが低レベルでも、クローン遺伝子産物の生成 を増強する。

（２）培養液の単位容積当りのクローン遺伝子産物の量を増加させるほかにさら に、ＶＨｂの存在は又クローン遺伝子産物の比活性（総可溶性蛋白質の単位重量 当りの活性）を増加させる。

！…引辷１五ニ韮竺竺唖旦孕詮迂叉甲ａ」盪肥椹謎座水腸凹工二ｙ旦亘　に対す る酸素依「性の制御この実験の目的は以下の通りである。

（１）大腸菌でのＶＨｂ遺伝子の発現が培地内酸素レベルの低下に応答して増加 することを示すこと。

（２）遺伝子発現の転写レベルの制御を立証すること。

（３）溶存酸素濃度の変化に応答する酸素依存性遺伝子スイッチの感受性を確認 すること。

ＶＨｂ遺伝子及びその側部配列を含んだＨｉｎｄ　ｎｌ−５ｐｈＩ断片をベクタ ーｐＢＲ３２２の対応部位にクローニングした。こねによりプラスミドｐＯＸ１ を創出した。これを次に大腸菌ホールド、ＨＢＩＯＩに形質移入した。醗酵は容 量２．５℃のニューブランズウィック・バイオフローＴＩファーメンクー（Ｎｅ ｗＢｒｕｎｓｗｉｃｋ　ＩＩ　Ｂｉｏｆｌｏ　ｆｅｒｍｅｎｔｏｒ）で培地とし てＬＢ（ｌｏｇ／ρバクトドリブトン、５ｇ／之酵母ニキス、５ｇ／ｆｆＮａｃ ｌ、３　ｇ／　、Ｑ　Ｋ２　ＨＰ　Ｏ４，１ｇ／１２に８２ＰＯ，）に８ｍｇ／ ｍｌのシリコン消泡剤を加えたものを培地として用いて３７℃、ｐＨ７，０で３ ０Ｏｒｐｍの一定の撹拌しながら行なった。他の方法は全て伝統的なプロトコル （前記のＭａｎｉａｔｉｓ、　ｅｔ　ａｌ、）による。

細胞は、毎回とも、５０％空気飽和よりも高いＤＯに相当する０Ｄａｏｏ　＝ｏ 。

２５まて成長した。この時点で空気の供給を徐々に減少させ、Ｄｏが４５分以上 （すなわち遺伝子誘導に十分長く、かつ大腸菌の一世代以内の時間範囲）かレプ てほぼリニアに約１％空気飽和まで下がるようにした。試料を断続的に取り出し ＶＨｂ−ｍＲＮＡと蛋白質レベルを分析した。後に、窒素を容器に散布して、強 制的な嫌気性条件下にお１づるＶＨｂプロモーターの誘導を調べた。

饋豊 （１）Ｄｏｔ／ベルを７０％から１％空気飽和まで下げるとＶＨｂ−ｍＲＮＡレ ベルは約１０倍に増加した。

（２）こね２に対応するＶＨｂ活性かの増加があ−った。　Ｖ　Ｈｂ　−ｍ　Ｒ Ｎ　Ａ　ｌノヘルの増大と活・ｉ牛ＶＨｂＯ量の増加どの間には時間的ずれがあ ることが認められた。こλ１．１才、活性ＶＨｂを生産するためＬこは宿主細胞 がヘムをさらに生合成することが必要とされるために起こるのかもしれない。

（３）ＶＨｂプロモーターは４０％空気飽和以下の場合のみ有意なしノベルにス イッチし、５％空気飽和以下では最大の誘導レベルに達した。

（４）プロモーターは強制的な嫌気的条件下ではスイッチ・オフしており、遺伝 子発現を最大にするためには環境の嫌気性基底レベルが重要であることを示して いた。

一験例９−他のクローン２白”の７素依　・Ａ。

ＶＨｂの酸素制御プロモーター要素（ｏｘｙｇｅｎ−ｒｅｇｕｒａｔｅｄ　ｐｒ ｏｍｏｔｅｒ　ｅｌｅｍｅｎｔ　；０ＲＥ）を他の遺伝子発現のために使用する ため、実験例１及び２で説明したクローンＶｉｔｒｅｏｓｃｉｌｌａ断片から欠 損株を作り、機能するプロモーター要素を分離した。酵素Ｂａ１３１をこの目的 のため使用した（前記のＭａｎｉａｔｉｓ、　ｅｔ　ａｌ、）。

分離した断片の一つは、６％ポリアクリルアミドゲルでサイズを調べると、実験 例２で示した配列の５°末端から約１２５ｂｐ下流までをカバーするものであっ た。この断片を使って、ＶＨｂとは異なる遺伝子を酸素依存性制御の下で発現さ せた。

この実験では、ここで説明した断片をプロモーターを持たないクロラムフェニコ ールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）遺伝子カートリッジ（ファルマシア 社より購入）と融合させた。この融合体をベクターｐＢＲ３２２のＨｉｎｄＴＩ Ｉ−３ｐｈＩ部位に挿入し、プラスミドｐｏｘｌを創製した。これを大腸菌宿主 ＨＥＩＯＩに形質移入した。

ＯＲＨの機能性をテストするため、実験例と同様な実験を行なった。ＣＡＴ遺伝 子産物アッセイは一般に広く行なわれている実験手順（前記のＭａｎｉａｔｉｓ 。

ｅｔａｌ、）を用いて行なった。

稙里 ＤＯ＝７０％空気飽和テハ、大腸菌ＨＢ１０１　：　ｐｏｘｌ（７）ＣＡＴ活性 ハロ。

Ｉ　Ｘ　１０’ユニット／ｍｇ可溶性蛋白質であった。Ｄ○を２から５％空気飽 和の間に４５分間維持した後では、大腸菌ＨＢＩＯＩ：ｐＯＸ１のＣＡＴ活性は ６゜３Ｘ１０’ユニット／ｍｇ可溶性蛋白質であった。これは培養の溶存酸素顔 料の外、例１Ｏ−ＩＥＦサツカロミセス・セレビシェ宿主　でｑＸ旦亘Ω黒種二 現 この実験では我々は真核細胞の一つモデル、サツカロミセス・セレビシェ（Ｓａ ｃｃｈａｒｏｍ　ｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ　）内でＶＨｂ遺伝子を発現さ せることを試みた。

ベクターはｐ　Ｂ　Ｍ　１５０　（Ｊｏｈｎｓｔｏｎ　ａｎｄ　Ｄａｖｉｓ、　 Ｓｅ　ｕｅｎｃｅｓ　ｔｈａｔ　ｒｅ　ｕｌａｔｅ　ｔｈｅｄｉｖｅｒ　ｅｎｔ 　ＧＡＬＩ−ＧＡＬＩＯｒｏｍｏｔｅｒ　ｉｎ　Ｓａｃｃｈａｒｏｍｖｃｅｓ　 ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、　Ｍｏ１ｅｃｕ撃≠秩@ａｎｄ Ｃｅｌｌａｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ　４：１４４０−１４４８．１９８４　） を用いた。宿主菌株は、　５ｒｉｅｎｃ　ｅｔ　ａｌ、、Ｅｆｆｅｃｔ　ｏｆ　 ＡＲＳＩ　ｍｕｔａｔｉｏｎｓ　ｏｎ　ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ　５ｔａｂｉｌｉ ｔ　ｉｎ　Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙモ■■ ｃｅｒｅｖｕｓｉａｅ、　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃｅ１ｌａｕｌａｒ　ａｎｄ　 Ｂｉｏｌｏｇｙ　５：１６７６−１６８４．１９８５．に記■■■ たＤ　６０３　（ａｄｅ−、ｕｒａ−、ｍｅｔ−、１ｙｓ−、ｒｅｇ　１　）で ある。実験例５で述べられた切断したＶＨｂ構造遺伝子をＧＡＬｌ、Ｏブロモ− クーの下流にクローニングしプラスミドｐＹＲＥＤ１を創出した。

塾是 組換菌株Ｄ６０３　：　ｐＹＲＥＤＩは、ガラクトース存在下（２％ペプトン、 １％酵母エキス、２％ガラクトース）で成長させると、対照のＤ６０３　：　ｐ ＢＭ１５０よりもきわめてより赤くなった。接種物（ｉ、ｎｏｃｕｌａ　）は最 低限のガラクトース培地で成長した。実験例３で言及した差スペクトルヘモグロ ビン分析によると、Ｄ６０３：ＰＹＲＥＤＩの超音波処理細胞破砕物［５ｏｎｉ ｃａｔｅｓ）ではＤ６０３：ｐＢＭ１５０と比較して著しいヘモグロビン活性が 確認された。

１１１−ＶＨｂを　するサッカミセス・セレビシェ捗胞Ω成長増加 この実験例では、酵母サツカロミセス・セレビシェ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｖｃｅ ｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）の成長に対するＶＮｂ発現の影響を調べた。酵母細胞 内に染色体外プラスミドとして安定して維持される酵母発現プラスミドＡＡＨ５ にＶＨｂ遺伝子をクローン化した。

材赳及〃方法 プラスミドｐＥＸ−２を以下のように構築した。実験例５記載のＢａｍＨＩ／５ ｐｈＩ断片を平滑末端に処理して酵母発現ベクター、ＡＡＨ５のＨｉｎｄ　ｍ部 位に連結することによりクローン化した（　Ａｍｍｅｒｅｒ、　Ｅｘ　ｒｅｓｓ ｉｏｎ　ｏｆ　ｅｎｅｓ　ｉｎ　ｅａｓｔ毀劫り旦ｒｅ　ＡＤＣＩ　ｒｏｍｏｔ ｅｒ、　Ｍｅｔｈｏｄ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ　１０１：１９２−２０１ ．１９８３　参照）。

ＡＡＨ５は、２μｍの環状複製オリジンである酵母の選択マーカーＬｅｕ２と、 酵母アルコールデヒドロゲナーゼ−１（ＡＤＨ−１）の転写のブロモ−クーとタ ーミネークー領域により切断された唯一のＨｉｎｄ　ＩＩＩサイトとを含有する 。

サツカロミセス・セレビシェ株４８８−０　（１ｅｕ２．ｕｒａ３．ｈｉｓｌ− ７）をラビッド・コロニー形質転換法（Ｋｅｓｚｅｎｍａｎ−Ｐｅｒｅｙｒａ　 ａｎｄ　Ｈｅ１ｄａ。

Ａ　ｃｏｌｏｎ　ｒｏｃｅｄｕｒｅ　ｆｏｒ　ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ　 ｏｆ　Ｓａｃｃａｒｏｍ　′ｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅA　Ｃｕｒｒ。

Ｇｅｎｅｔ、　１３：２１−２３．１９８８　）によりプラスミドＡＡ）１５及 びｐＥＸ−２で形質転換し、ロイシンを含まない合成デキストロース（ＳＤ）寒 天培地（Ｒｏｓｅ。

ｌ５ｏｌａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｅｎｅｓ　ｂ　ｃａｍ　ｌｅｍｅｎｔａｔｉｏｎ　 ｉｎ　ｅａｓｔ、　Ｍｅｔｈｏｄ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｇ凵B １５２：４８１−５０４．１９８７　）に播種した。形質転換したそれぞれから 、１次形質転換細胞のコロニー純化の後で、代表的なりローナル・セル・ライン を確立した。

成長を調べるため、一つの酵母コロニーを２ｍｌの５Ｄ−１ｅｕ　（４８８−０ には＋１ｅｕ）に接種し、ラボライン・モデル３２５８・オービット・エンビロ ーシェーカー（Ｌａｂｌｉｎｅ　Ｍｏｄｅｌ　３２５８０ｒｂｉｔ　Ｅｎｖｉｒ ｏ−ｓｈａｋｅｒ　）　で２４時間、３０℃、２６Ｏｒｐｍで培養した。細胞の 成長はパーキン・エルマー・ラムダ４Ａスペクトロフオトメーターを使用して濁 度（ＡＳ。。ｎｍ）で測定した。培養培地のグルコースレベルが２．０ｍＭ以下 まで下がった時に、培養に２０ＸＳＤ（４０％グルコース、１３．３％ディフコ （Ｄｉｆｃｏ　）酵母窒素ベース（アミノ酸無し）及び１．６ｍｇ／ｍｌのロイ シン以外の全アミノＷ、４８８−０には。

１．６ｍｇ／ｍｌロイシンなパルス培地に含ませた）を含む濃縮培地を１／４゜ 容積添加しパルスした。グルコース濃度はエームズ・グルコスチックス（ＡＩＴ ｌｅｓＧｌｕｃｏｓｔｉｘ　）の試験片を用いて測定した。

超！ 上記条件下で成長した株、４８８−０．４８８−０：ＡＡＨ５そして４８８−０ 　：　ｐＥＸ−２の成長曲線を比較すると以下のことが明らかとなった。

（１）成長の対数期では、３株とも全て同じ速度で成長した。

（２）ＶＨｂ含有株４８８−０：　ｐＥＸ−２は最終光学密度１３．０まで成長 した。一方１株４８８−０：ＡＡＨ５及び４８８−０！：！それぞれ光学密度１ ０．０と９．５までしか成長しなかった。このことは、プラスミド（４８８−０ ：ｐＥｘ−２）上にＶＨｂ遺伝子を持つ株と、ＶＨｂ遺伝子を持たない同じプラ スミド（４８８−０：ＡＡＨ５）を含む株と比較すると細胞密度が２６％増加し たことを表わしている。またこのことはＡＡ８５由来のプラスミド（４８８−０ ）を含む株よりも４８８−０：　ｐＥＸ−２の最終細胞密度が３２．６％増加し たことを表わしている。

μ、１２−　腸　での染　壮遺伝　の Ｖ）Ｉｂ　による　の土　口 この実験例では、実験例５で論じたｔａｃ−ＶＨｂ遺伝子融合体を大腸菌ＭＧＩ ６５５　（Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、　 ｈ”Ｙより入手）の染色体に縮装した。

材匣担より方法 Ｔｎ１０トランポゾン（Ｆｏｓｔｅｒ、　ｅｔ　ａｌ、、　Ｔｈｒｅｅ　Ｔｎｌ Ｏ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ　ｅｘｃｉｓｉｏｎｅｖｅｎｔｓ：　Ｒｅ１ａｔｉｏ ｎｓｈｉ　ｔｏ　ｔｒａｎｓ　ｏｓｉｔｉｏｎ　ａｎｄ　ｒｏｌｅ　ｏｆ　ｄｉ ｒｅｃｔ　ａｎｄ　１ｎｖ■窒狽■■ 匹正巨堕、　Ｃｅ１１．２３：２１５−２２７．１９８１　）の欠損株を以下の ように構築した。カナマイシン抵抗性遺伝子（ファルマシア社）をｐＩＮＴｌ　 （実験例５）の５ａｌＩサイトにクローン化した。出来だプラスミドからのＥｃ ｏＲＩ　／　Ｅａｇ　Ｉ断片（これは全長ｔａｃ−ＶＨｂ遺伝子融合体とＫａｎ Ｉ″遺伝子を含んでいる）をトランスポゼース遺伝子を欠落したＴｎｌＯ誘導体 （Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、　ｈ’ｆよ り入手）の逆位配列（ｉｎｃｅｒｔｅｄ　ｒｅｐｅａｔｓ：右側の１−６６塩基 及び左側の９２３４−９３００塩基）の間にクローン化した。出来たエレメント 、ＴｎｌＯｄＫａｎ−ｔａｃ−ＶＨｂをｔａｃ−ＴｎｌＯの右側のトランスポゼ ースを持つ複製プラスミド（Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏ ｒａｔｏｒｙ、　ＮＹより入手）にクローン化した。転移は０．５ｍＭで４時間 、誘導し、続いて細胞をラクトース・マツコンキー・Ｋａｎ寒天培地（ｌａｃｔ ｏｓｅ−ＭａｃＣｏｎｋｅｙ　−Ｋａｎ　ｐｌａｔｅｓ）に播種した。Ｌａｃ− ミュークントを選び、トランスポゾン誘導ミューチージョンをＰｉファージ（前 記の５ｉｌｈａｖｙ　ｅｔ　ａｌ、　）を使って大腸菌ＭＧ１６５５内で誘導し た。その結果生じたコロニーをさらに純化し、Ｌａｃ−、Ｋａｎ”　、Ａｍｐ’ 　、ＶＨｂ’″　（実験例３記載のアッセイにより確認したようにＩＰＴＧで誘 導可能）をチェックして、ＧＲＯ１３と命名した。１ｍＭＩＰＴＧを含み、続け て濃縮フィード培地（２５％バタトトリブトン、１２．５％酵母エキス）を添加 した２ＸＬＢ　（実験例６に記載）でのＭＧ１６５５株とＧＲＯ１３株との成長 させて比較すると、最終細胞密度の増加が見られた（最終細胞密度：ＭＧ１６５ ５では０Ｄｓｏｏ＝１６．８、ＧＲＯ１３では○Ｄ６゜。＝１８．１）。

ｏｔ 国際調査報告

Claims (58)

【特許請求の範囲】
1. １．ヴィトレオシラ（Ｖｉｔｒｅｏｓｃｉｌｌａ）ヘモグロビン蛋白質の主要部 の細胞内生産をさせることができる一連のヌクレオチドを含むポータブルＤＮＡ 配列。
2. ２．前記一連のヌクレオチドがプロモーターを含んでいる請求項１のポータブル ＤＮＡ配列。
3. ３．前記一連のヌクレオチドが発現レギュレーターを含んでいる請求項１のＤＮ Ａ配列。
4. ４．前記一連のヌクレオチドがターミネーターを含んでいる請求項１のＤＮＡ配 列。
5. ５．前記一連のヌクレオチドがリーター配列を含んでいる請求項１のＤＮＡ配列 。
6. ６．真核生物において細胞内生産をさせることができる請求項１記載のＤＮＡ配 列。
7. ７．原核生物において細胞内生産をさせることができる請求項１記載のＤＮＡ配 列。
8. ８．細菌生物において細胞内生産をさせることができる請求項１記載のＤＮＡ配 列。
9. ９．大腸菌において細胞内生産をさせることができる請求項１記載のＤＮＡ配列 。
10. １０．前記一連のヌクレオチドが、転写及び翻訳の開始と、少くとも前記蛋白質 部分の発現のコントロールとをさせることができるプロモーター／レギュレータ ー配列を含んでいる請求項１のＤＮＡ配列。
11. １１．前記一連のヌクレオチドが、環境酸素の最初のレベルの中で成長する宿主 培養細胞内で、転写及び翻訳の開始と、その下流に存在する組換ＤＮＡ配列のコ ントロールとをさせることが可能なプロモーター／レギュレーター配列を含み、 環境酸素の最初のレベルの中で成長する宿主培養細胞内で、前記プロモーター／ レギュレーターが前記宿主以外の生物由来のものであって、環境酸素が前記最初 のレベル以下に減少した場合に前記下流配列の発現させることができる請求項１ のＤＮＡ配列。
12. １２．前記一連のヌクレオチドが、転写及び翻訳の開始と、ヴィトレオシラ（Ｖ ｉｔｒｅｏｓｃｉｌｌａ）のヘモグロビン蛋白質の発現のコントロールとをさせ ることができるヴィトレオシラ・プロモーター／レギュレーター由来のプロモー ター／レギュレーターを含んでいる請求項１のＤＮＡ配列。
13. １３．前記一連のヌクレオチドが、転写及び翻訳の開始と、クローン化蛋白質の 発現のコントロールとをさせることができるヴィトレオシラ・プロモーター／レ ギュレーター由来のプロモーター／レギュレーターを含んでいる請求項１のＤＮ Ａ配列。
14. １４．組換ＤＮＡ法により作成されたもので、少くともヴィトレオシラ（Ｖｉｔ ｒｅｏｓｃｉｌｌａ）のヘモグロビン蛋白質部分を有する蛋白質。
15. １５．少くともヴィトレオシラ（Ｖｉｔｒｅｏｓｃｉｌｌａ）のヘモグロビン蛋 白質部分をのためのコード配列を含み実質的に純化された遺伝子調製品。
16. １６．前記コード配列が前記純化された遺伝子と８０％以上相同である請求項１ ５記載の遺伝子調製品。
17. １７．前記コード配列が前記純化された遺伝子と５０％以上相同である請求項１ ５記載の遺伝子調製品。
18. １８．前記蛋白質が少くとも以下のアミノ酸配列部分を有する請求項１５の遺伝 子調製品。 【配列があります】
19. １９．前記コード配列が、転写及び翻訳の開始と、少くともヴィトレオシラ（Ｖ ｉｔｒｅｏｓｃｉｌｌａ）のヘモグロビン蛋白質部分の発現のコントロールとを させることができるプロモーター／レギュレーターＤＮＡ配列を含む請求項１５ の遺伝子調製品。
20. ２０．前記コード配列が、翻訳開始配列ＡＴＧ（下線部）とヴィトレオシラ（Ｖ ｉｔｒｅｏｓｃｉｌｌａ）構造遺伝子の多少のヌクレオチド配列（同じく下線部 ）と包含する以下のヌクレオチド配列部分（５′より３′へ読む）を少くとも有 するプロモーター／レギュレーター配列を備える請求項１５の遺伝子調製品。 Ｈｉｎ： 【配列があります】
21. ２１．少くともヴィトレオシラ（Ｖｉｔｒｅｏｓｃｉｌｌａ）ヘモグロビン蛋白 質部の細胞内生産をさせることができるヌクレオチド配列を備える組換ＤＮＡク ローニング・ベクター。
22. ２２．前記ベクターが酵母において細胞内生産をさせることができる請求項２１ のベクター。
23. ２３．前記ヌクレオチド配列が異種遺伝子挿入部を備え、その発現が請求項１７ のプロモーター／レギュレーターのコントロールの下にある請求項２１のベクタ ー。
24. ２４．前記ヌクレオチド配列が異種遺伝子挿入部を備え、その発現が請求項１１ のプロモーター／レギュレーターのコントロールの下にある請求項２１のペクタ ー。
25. ２５．前記ベクターが酸素存在下で成長する宿主培養細胞内で複製可能でありか つ宿主培養細胞内で前記ヴィトレオシラ（Ｖｉｔｒｅｏｓｃｉｌｌａ）ヘモグロ ビン蛋白質の発現を制御することが可能なヴィトレオシラ（Ｖｉｔｒｅｏｓｃｉ ｌｌａ）プロモーター／レギュレータ部分を少くとも含み、前記プロモーター／ レギュレーター下流には遺伝子が続き、前記プロモーター／レギュレーターの制 御下で、一般にこのようなプロモーター／レギュレーターで制御されるヘモグロ ビン蛋白質以外の蛋白質を発現する請求項２１のベクター。
26. ２６．少くともヴィトレオシラ（Ｖｉｔｒｅｏｓｃｉｌｌａ）ヘモグロビン蛋白 質部分を細胞内生産させるｔｒｐプロモーターを使った請求項２１のベクター。
27. ２７．少くともヴィトレオシラ（Ｖｉｔｒｅｏｓｃｉｌｌａ）ヘモグロビン蛋白 質部分の細胞内生産させるｔａｃプロモーターを使った請求項２１のベクター。
28. ２８．前記ベクターが、微生物と、動物、植物及び昆虫からなる群から選ばれた 蛋白質細胞生物から得られた細胞とからなる一群の培養細胞から選ばれ由来した 宿主培養細胞において複製可能である請求項２１のベクター。
29. ２９．ベクターｐＵＣ１９／ｐＲＤＥ２。
30. ３０．酸素存在下で成長する宿主培養細胞において少くともヴィトレオシラ（Ｖ ｉｔｒｅｏｓｃｉｌｌａ）ヘモグロビン蛋白質部分を生産するための組換ＤＮＡ 法であり、 前記宿主培養細胞が、微生物と、動物、植物及び昆虫からなる群から選ばれた蛋 白質細胞生物から得られた細胞とからなる一群の培養細胞から選ばれ由来したも のであり、 以下より構成される組換ＤＮＡ法。 （ａ）宿主培養細胞に少くとも多少のヴィトレオシラ（Ｖｉｔｒｅｏｓｃｉｌｌ ａ）ヘモクロビン活性を有する蛋白質を生産させることができるボータブルＤＮ Ａ配列の調製、 （ｂ）前記ポータプルＤＮＡ配列の、少くとも多少のヴィトレオシラ（Ｖｉｔｒ ｅｏｓｃｉｌｌａ）ヘモグロビン蛋白質を発現することができる宿主培養細胞へ の導入、 （ｃ）発現に適当な条件下での宿主細胞の培養、そして（ｄ）以下の何れか、 （ｉ）蛋白質の採取、 （ｉｉ）蛋白質にヘモグロビン活性を有する活性構造をとらせること。
31. ３１．前記ポータプルＤＮＡ配列は宿主培養細胞の染色体に直接導入され縮装さ れていることを特徴とする請求項３０の方法。
32. ３２．前記ポータプルＤＮＡ配列は前記宿主培養細胞に以下のステップで導入さ れている請求項３０の方法。 （ａ）宿主細胞内に移入できその中で複製可能であり、ポータプルＤＮＡ配列の 操作エレメントを含有するベクターへのポータプルＤＮＡ配列のクローニング、 （ｂ）少くとも多少のヴィトレオシラ（Ｖｉｔｒｅｏｓｃｉｌｌａ）ヘモグロビ ン蛋白質を発現することができる宿主培養細胞への、ポータプルＤＮＡ配列及び 操作エレメントを含有するベクターの移入、（ｃ）ベクターの複製及び伝幡と蛋 白質の発現とに適当条件下での宿主細胞の培養。
33. ３３．前記ポータプルＤＮＡ配列を含有する前記ベクターがｐＵＣ１９／ｐＲＥ Ｄ２である請求項３２の方法。
34. ３４．前記宿主微生物が細菌、菌類、かび及び酵母からなる群から選ばれたもの である請求項３０の方法。
35. ３５．前記宿主生物が酵母を含むことを特徴とする請求項３４の方法。
36. ３６．前記ベクターがｐＹＲＥＤ１からなることを特徴とする請求項３５の方法 。
37. ３７．前記活性構造になる前に前記蛋白質を採取することを特徴とする請求項３ ０の方法。
38. ３８．前記蛋白質が採取の前に前記活性構造になることができることを特徴とす る請求項３０の方法。
39. ３９．前記ベクターは、宿主細胞に移入する前に微生物宿主内で増殖されること を特徴とする請求項３０の方法。
40. ４０．ＡＴＣＣ受託番号Ｎｏ．６７５３６を有する微生物、大腸菌（Ｅｓｈｅｒ ｉｃｈｌａｃｏｌｉ）ＪＭ１０１　ｐＵＣ１９／−ｐＲＥＤ２。
41. ４１．以下のステップからなり，決められた環境条件下でポータプルＤＮＡ配列 の発現を外部コントロールの支配下におくプロセス。 （ａ）決められた環境条件下でヴィトレオシラ（Ｖｉｔｒｅｏｓｃｉｌｌａ）ヘ モグロビンプロモーター／レギュレーターＤＮＡ配列に応答する目的の分離構造 遺伝子を少くとも一つ用意し、 （ｂ）目的の構造遺伝子を前記プロモーター／レギュレーターＤＮＡ配列に操作 可能に融合する。
42. ４２．前記構造遺伝子が転写の際に応答するものであることを特徴とする請求項 ４１のプロセス。
43. ４３．前記構造遺伝子が翻訳の際に応答するものであることを特徴とする請求項 ４１のプロセス。
44. ４４．宿主培養細胞内で、宿主の染色体成分又は染色体外成分として安定に取り 込まれた少くとも一つの目的分離構造遺伝子配列を確実に発現させる遺伝子工学 のプロセスにおいて、 前記少くとも一つの目的分離構造遺伝子配列に、前記宿主内の酸素濃度の環境に よる変化に応答するヴィトレオシラ（Ｖｉｔｒｅｏｓｃｉｌｌａ）ヘモグロビン プロモーター／レギュレーターＤＮＡ配列を操作可能に融合するステップを含む ことを特徴とするステップ。
45. ４５．以下のステップを含み、外来蛋白質を宿主大腸菌培養細胞の中で発現させ る方法。 （ａ）前記宿主培養細胞への、請求項８によるＤＮＡ発現ベクターであって前記 外来蛋白質をコードする外来ＤＮＡ配列を含有するベクターの導入、 （ｂ）適当な培地と環境の中での前記培養宿主細胞の成長、及び前記外来ＤＮＡ により発現した蛋白質の分離。
46. ４６．前記ＤＮＡ発現ベクターがポータプルＤＮＡ配列であって、宿主培養細胞 の染色体に直接導入・縮装されていることを特徴とする請求項４５の方法。
47. ４７．以下のステップからなり、初期レベルの環境酸素の中で成長する宿主培養 細胞の中に外来蛋白質を作らせる方法。 （ａ）前記宿主培養細胞への、前記宿主培養細胞内で複製出来るＤＮＡ発現ベク ターの導入、 前記ベクターは転写及び翻訳の開始と、前記外来蛋白質をコードし、その下流に 存在する外来組換ＤＮＡ配列のコントロールとをさせすることができるプロモー ター／レギュレーター配列を有し、さらに前記プロモーター／レギュレーター配 列は前記初期レベル以下に環境酸素が低下した時に活性化されることが可能であ る。 （ｂ）前記外来蛋白質により発現する蛋白質を分離するのに適当な培地の中での 前記宿主培養細胞の成長、及び （ｃ）前記培地で利用される酸素のレベルを前記初期レベル以下の第２のレベル に下げること、 この第２のレベルは前記プロモーター／レギュレーターを活性化する酸素濃度を 提供する。
48. ４８．以下のステップからなり、初期レベルの環境酸素の中で成長する宿主培養 細胞の中に外来蛋白質を作らせる方法。 （ａ）前記宿主培養細胞への、請求項８によるＤＮＡ発現ベクターの導入、前記 ベクターは前記外来蛋白質をコードする外来ＤＮＡ配列を含有し、前記初期レベ ル以下に環境酸素が低下することにより活性化されることができるプロモーター ／レギュレーターを有する。 （ｂ）前記外来蛋白質により発現する蛋白質を分離するのに適当な培地の中での 前記宿主培養細胞の成長、及び （ｃ）前記培地で利用される酸素のレベルを前記初期レベル以下の第２のレベル に下げること、 この第２のレベルは前記プロモーター／レギュレーターを活性化する酸素濃度を 提供する。
49. ４９．前記ポータプルＤＮＡ配列が宿主培養細胞の染色体に直接導入され縮装さ れていることを特徴とする請求項４８の方法。
50. ５０．以下のステップからなり、酸素存在下で成長する宿主培養細胞であって、 微生物と、動物、植物及び昆虫からなる群から選ばれた蛋白質細胞生物から得ら れた細胞とからなる一群の培養細胞から選ばれ由来する前記宿主培養細胞の、コ ントロールされた環境下での成長量、成長速度及び到達細胞密度を含む成長特性 を増加させる方法。 （ａ）宿主培養細胞に少くとも多少の酸素結合活性を有する蛋白質を生産させる ことができるポータプルＤＮＡ配列の調製、（ｂ）少くとも多少の酸素結合蛋白 質を発現することができる宿主培養細胞への、前記ポータプルＤＮＡ配列の導入 、（ｃ）蛋白質の発現に適当な条件下での宿主細胞の培養、そして（ｄ）蛋白質 に少くとも多少の酸素結合活性を有する活性構造をとらせること。
51. ５１．前記ポータプルＤＮＡ配列は宿主培養細胞の染色体に直接導入・縮装され ていることを特徴とする請求項５０の方法。
52. ５２．前記ポータプルＤＮＡ配列は前記宿主培養細胞に以下のステップで導入さ れている請求項５０の方法。 （ａ）宿主細胞内に移入できその中で複製可能であり、ポータプルＤＮＡ配列の 操作エレメントを含有するベクターへのポータプルＤＮＡ配列のクローニング、 （ｂ）少くとも多少の酸素結合蛋白質を発現することができる宿主培養細胞への 、ポータプルＤＮＡ配列及び操作エレメントを含有するベクターの移入、 （ｃ）ベクターの複製及び伝幡と蛋白質の発現とに適当な条件の下での宿主細胞 の培養。
53. ５３．以下のステップからなり、酸素存在下で成長する宿主培養細胞であって、 微生物と、動物、植物及び昆虫からなる群から選ばれた蛋白質細胞生物から得ら れた細胞とからなる一群の培養細胞から選ばれ由来する前記宿主培養細胞の、一 般に作られる蛋白質及び遺伝子工学の結果として発現される蛋白質の両方の蛋白 質、バイオポリマー及び他の代謝産物の生産を増加させる方法。 （ａ）宿主培養細胞に酸素結合活性を有する蛋白質を生産させることができるポ ータプルＤＮＡ配列の調製、 （ｂ）前記ポータプルＤＮＡ配列の、少くとも多少の酸素結合蛋白質を発現する ことができる宿主培養細胞への導入、（ｃ）蛋白質の発現に適当な条件下での宿 主細胞の培養、そして（ｄ）蛋白質に少くとも多少の酸素結合活性を有する活性 構造をとらせること。
54. ５４．以下のステップからなり、酸素を必要とするプロセス及び操作に酸素を輸 送及び供給する方法。 （ａ）宿主培養細胞に酸素結合活性を有する蛋白質を生産させることができるポ ータプルＤＮＡ配列の調製、 （ｂ）少くとも多少の酸素結合蛋白質を発現することができる宿主培養細胞への 、前記ポータプルＤＮＡ配列の導入、（ｃ）蛋白質の発現に適当な条件下での宿 主細胞の培養、（ｄ）蛋白質に少くとも多少の酸素結合活性を有する活性構造を とらせること、そして、 （ｅ）前記酸素を必要とするプロセスヘ、前記宿主細胞または前記宿主細胞から の酸素結合蛋白質を含む調製品を効果的に配給すること。
55. ５５．以下のステップからなり、環境から酸素を結合・除去する方法。 （ａ）宿主培養細胞に酵素結合活性を有する蛋白質を出産させることができるポ ータプルＤＮＡ配列の調製、 （ｂ）少くとも多少の酸素結合蛋白質を発現することができる宿主培養細胞への 、前記ポータプルＤＮＡ配列の導入、（ｃ）蛋白質の発現に適当な条件下での宿 主細胞の培養、（ｄ）蛋白質に少くとも多少の酸素結合活性を有する活性構造を とらせること、そして、 （ｅ）前記酸素を含有する環境へ、前記宿主細胞または前記宿主細胞からの酸素 結合蛋白質を含む調製品を効果的に配給すること。
56. ５６．以下のステップからなり、少くとも多少の酸素結合活性を有する蛋白質を 産生できる細胞であって、微生物と、動物、植物及び昆虫からなる群から選ばれ た蛋白質細胞生物から得られた細胞とからなる一群の培養細胞から選ばれ由来す る前記宿主培養細胞の、コントロールされた環境下での成長量、成長速度及び到 達細胞密度を含む培養細胞の成長特性を増加させる方法。 （ａ）前記蛋白質の発現に適当な条件下での宿主細胞の培養、そして、（ｂ）前 記蛋白質に少くとも多少の酸素結合活性を有する活性構造をとらせること。
57. ５７．以下のステップからなり、少くとも多少の酸素結合活性を有する蛋白質を 産生できる細胞であって、微生物と、動物、植物及び昆虫からなる群から選ばれ た蛋白質細胞生物から得られた細胞とからなる一群の培養細胞から選ばれ由来す る前記宿主培養細胞であって、酸素存在下で成長する宿主培養細胞の一般に作ら れる蛋白質及び遺伝子工学の結果として発現される蛋白質の両方の蛋白質、バイ オポリマー及び蛋白質の代謝産物の生産を増加させる方法。 （ａ）前記蛋白質の発現に適当な条件下での宿主細胞の培養、そして、（ｂ）前 記蛋白質に少くとも多少の酸素結合活性を有する活性構造をとらせること。
58. ５８．少くとも多少の酸素結合活性を有する蛋白質を産生できる宿主培養細胞を 、酸素を含有する環境に導入することよりなる環境から酸素を結合及び除去する 方法。