JPS58502180A - Ｄｎａ配列の転写の調節 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ＤＮＡ配列の転写の調節 これは、　１９８１年１１月２３日に提出された同時係属アメリカ合衆国特許出 願番号３２４，１１１の一部継続出願である。 宜量 本発明は、一般に遺伝物質の操作に、そして、より具体的には。 特定のＤＮＡ配列の転写を外的な制御によって選択的に調整するのに有効な方法 及び材料に関する。 「遺伝物質Ｊは、細胞の（及びウィルスの）組成の製造、及び細胞及びウィルス 粒子の環境の変化に対する応答をプログラムし且つ誘導する物質として広く定義 することが出来る。　総ての生きている細胞とウィルス（いわゆるｒ　ＲＮＡ　 ウィルス」は除いて）の遺伝物質は、長い鎖状の、デオキシリポ核酸（ｒＤＮ＾ 」）として知られるポリマー物質から構成される。ＤＮＡポリマーの反復単位は ヌクレオチドとして知られる。　各ヌクレオチドは、４つの核酸（アデニン、グ アニン、シトシン及びチミン）の内の１つが糖質（デオキシリボース）に結合し たものから成り、糖質には燐酸塩グループが付いている。　リボ核酸（’ＲＮＡ 　Ｊ　）は、ポリマーのヌクレオチドで、核酸、アデニン、グアニン、シトシン 、及びウラシルとから成り、これらは１つのリポース分子に結合され。 リポース分子には１つの燐酸塩グループが付いている。 最も簡単に表すと、遺伝物質のプログラム機能は一般に、　ＤＮＡヌクレオチド 配列（遺伝子）が比較的に不安定なメソセンジャーＲＮＡ　（ｒｍＲＮＡ」）ポ リマーに転写され、それが、今度は、アミノ酸から構造性、調整性及び触媒性蛋 白質を形成する為の鋳型として働くようなプロセスを通して発揮される。　蛋白 質の合成はこのように、遺伝子のＤＮＡ配列によってもたられたプログラムされ た遺伝情報の「発現」の最終形態である。 １つのＤＮＡポリマーにおいて通常に１つの遺伝子の「先に来るＪある種のＤＮ Ａ配列は、　ｍＲＮＡへの転写の開始の部位を定める。 これらは「プロモーター」配列と呼ばれる。　その他のＤＮＡ配列も、１つのＤ ＮＡポリマーにおいては１遺伝子の「上流」において。 転写の開始の頻度（或いは割合）を決定する蛋白質を結合する。 これらのその他の配列は、「レギュレーターＪ配列と呼ばれる。 このように、１つの機能ＤＮＡポリマーにおいて１つの選択された遺伝子（或い は遺伝子の配列系）の先に来て、１つの遺伝子の転写（そしてその後の発現）が 行われるか否かを決定する配列は。 「プロモーター／レギュレーターＪ　ＤＮＡ配列と総称される。 遺伝子のプロモーター／レギュレーター配列はあきらかに非常に多くの構造的及 び機能的な変化を示し、実際のところ、より簡単な遺伝システムの僅かな配列が 完全に、構造的且つ機能的に特性を確認されたに過ぎない。　プロモーター／レ ギュレーターは。 一般に、細胞の内部及び周囲の化学的（そしてときには物理的）環境条件に対応 して遺伝子の転写を調節する働きをする。　単純な原核系内の遺伝子の転写にお ける。そしてその後の発現におけるプロモーター／レギュレーター作用の働きの 一般的な「モデル」がこれまでに多く提案されている。　このようなモデルの１ つは、１つの「リプレッサー」遺伝子と１つのレギュレーター配列或いは「オペ レーター」配列を別の遺伝子のプロモーターの近くに措定する。　このモデルに よれば、リプレッサー配列の転写は。 １つのリプレッサー蛋白質の発現となり、この蛋白質は選択的にオペレーター配 列に結合して９選択された遺伝子の遺伝子転写を完全に不可能にする。　１つの 環境「信号」　（例えば１問題゛の遺伝子の蛋白生成物によって作用される１化 学物質の濃度の増加）は操作的にリプレッサー蛋白質を不活性化し、遺伝子の転 写を中断させるような仕方でオペレーター配列に結合するその能力を阻止する場 合がある。　１基質の濃度の増加は、その分解の触媒として働く蛋白質の合成を 「促すＪように作用すると見ることも出来る。 遺伝子の転写の調整に於けるプロモーター／レギュレーター配列の作用の別の一 般的なモデルは、リプレッサーＤＮＡ配列による１つの最初は不活性な形のりプ レソサー蛋白質の形成を措定する。 このような不活性な形態は、それが細胞内に存在する別の物質と結合するまでは 、オペレーターＤＮＡ配列に結合しくそして選択された遺伝子の転写を妨害する ）ことは出来ない。　その他の物質としては２例えば９選択された遺伝子によっ てコード化された蛋白質が触媒の働きをする反応の生成物である化合物が挙げら れる。　細胞内のこのような反応生成物の濃度の上昇は、この生成物の合成の原 因となる蛋白質の潜在的な過剰生産を抑制するように作用する。　これらの例に おいては、レギュレーター蛋白質は。 転写を抑制するように機能する。　特定のＤＮＡ配列の転写を生しるその他の調 整蛋白質も述べられている。このように、負の？［ｉｌ＋御性蛋白質と正の制御 性蛋白質との双方及びそれらに対応する調整ＤＮＡ配列の例が存在する。 真核細胞内のプロモーター／レギュレーターＤＮＡ配列の作用の同様な「モデル 」がこれまでに提案されている。　例えば、　Ｂｒｏｗｎ、「真核細胞内の遺伝 子の発現Ｊ　、　５ｃｉｅｎｃｅ、　２１１　、　ｐｐ、　６６７−６７４　（ １９８１）を参照されたい。 遺伝子工学の基本的な問題のなかに、関心のある選択された遺伝子配列の分離と 、その多数のコピーをそれらが分離された細胞内でそれらの転写に通常影響を及 ぼすプロモーター／レギュレーターＤＮＡ配列とともに調製する問題がある。　 遺伝子工堂の別の基本問題は、細胞へのＤＮＡ配列の挿入と安定した組み込みを 、遺伝子配列の転写とそれらの発現を外部からの調節を可能とする仕方で行うこ とである。 選択されたＤＮＡ配列の分離と複写とにおける素晴らしい進歩は。 制限エンドヌクレアーゼ酵素（これらは特定の部位におけるＤ　Ｎ　Ａポリマー の切断を行うことが可能である）と接合酵素（これらはＤＮＡ配列を融合する働 きをする）との使用によって初めて可能となった。　関心のあるＤＮＡ配列は通 常は、プラスミド或いはウィルス性のｒヘクターＪに取り込まれ、前述のヘクタ ーは適当な宿主細胞（例えば、細菌、酵母、或いは補乳類細胞Ｊ内での選択的な 複製が可能である。　これらのヘクターが、興味あるＤＮＡ配列とともに高等動 物或いは植物の細胞の内部に導入されると、それらは染色体外要素として保持さ れるか、或いは染色体に取り入れられる。 現在までの殆どの遺伝子工学活動は、細菌等の原核細胞内での。 及び、酵母、黴及び藻類等の真核生物内での外来性ＤＮＡの安定した組み込みに 向けられて来た。　これら実験がねらった結果は。 選択された遺伝子の多数のコピーの供給源のみならず、蛋白性製品の形で商業的 に意味のある遺伝子を大量に転写し発現することであった。　例えば、　Ｃｏｈ ｅｎ等１合衆国特許番号４，２３７，２２４　；　Ｍａｎｉｓ、合衆国特許４， ２７３，８７５　、及びＣｏｈｅｎ　、合衆国特許４　、２９３　、６５２を参 照されたい。　植物及び動物等の高等生物の真核細胞に関する研究は、培養下で 連続的に成長する能力のある細胞に一般に関連している。 本発明の背景に重大なかかわりを持つものに、共同発明者及び彼等の共同者によ る先行研究の多数の論文があり、それらは、（１）哺乳類の遺伝子の発現の調節 ；（２）純化された遺伝子の真核細胞への導入に、関連する。 本発明の詳細な説明し先行技術の状態を示すために参照によって特にここに併合 されたものは、共同発明者Ｐａ１ｍ１ｔｅｒ及び彼の共同研究者による下記の論 文である。　即ち、　Ｄｕｒｎａｍ等、「マウスのｍｅｔａｌｌｏｔｈｉｏｎｅ ｉｎ−Ｉ遺伝子の分離と特性付けＪ　、　、Ｐ、Ｎ、Ａ、Ｓ、。 ７７、　ｐｐ、６５１１−６５１５　（１９８０）　；　Ｄｕｒｎａｍ等、「マ ウスのｍｅｔａｌｌｏｔｈｉｏｎｅｉｎ−Ｉ遺伝子の転写の重金属による調節Ｊ 　ｌ　、ｒ、　ＢＩＯｌ、　Ｃｈｅｍ、、　２５６　、ｐｐ、　５７１２−５７ １６　（１９８１）　ｉ　Ｍａｙｏ等、「培養されたマウス細胞内のｍｅｔａｌ ｌｏｔｈｉｏｎｅｉｎ−１ｍＲＮＡ合成のグルココルチコイド調節」。 Ｊ、　Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、２５６．　ｐｐ、２６２１−２６２４　（１９８１ ）　；　Ｈａｇｅｒ等、「グルココルチコイドによるマウス肝臓ｍｅｔａｌｌｏ ｔｈｉｏｎｅｉｎ−Ｔ遺伝子の転写調節Ｊ　、　Ｎａｔｕｒｅ、　２９１　、　 ｐｐ、３４０−３４２　（１９８１）　：　Ｇｌａｎｖｉｌｌｅ等。 「マウス＋ｌ１ｅｔａｌｌｏｔｈｉｏｎｅｉｎ−Ｉ遺伝子の構造とそのｍＲＮＡ 　Ｊ　、　Ｎａ　ｔｕｒｅ。 ２９２　、　ｐｐ、２６７−２６９　（１９８１）　；及びＢｅａｃｈ等、「カ ドミウム耐性マウス細胞内のｍｅｔａｌｌｏｔｈｉｏｎｅｉｎ−Ｉ遺伝子の増幅 Ｊ　、　Ｐ、Ｎ、Ａ、Ｓ、、　７８゜ｐｐ、２２１０−２２１４　（１９８１） 。　以上は総て、殆どのを椎動物組織内に１つ或いはそれ以上の形態で見られる 低分子量の金属結合蛋白質の生成の仕様を定めるＤＮＡ配列を取り扱っている。 　より具体的には、これら論文はマウスのｍｅｔａｌｌｏｔｈｉｏｎｅｉｎ遺伝 子、そしてそれらのプロモーター／レギュレーターＤＮＡ配列、及びプロモータ ー／レギュレーター配列の金属及びステロイド・ホルモンに対する応答度を取り 扱っている。 参照によってここに併合する共同発明者Ｐａ１ｍ１ｔｅｒ及び彼の共同研究者に よる追加論文は：　ＭｃＫｎｉｇｈｔ等、「トランスフェリン遺伝子発現、ステ ロイド・ホルモン及び鉄分の欠乏による鶏の雛の肝臓内におけるｍＲＮ＾転写の 調節Ｊ　、　Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、、　２５５　、　ｐｐ。 １４８−１５３　（１９８０）　；及びＰａ１ｍ１ｔｅｒ等、ｒオバルブミン及 びコナルブミン遺伝子の転写のステロイド・ホルモンによる調節、多数の調節部 位及び中間蛋白質に基づくモデル」、Ｌ」ｎ且Ｃｈｗ、、　−公述、　ｐｐ、７ ９１０−７９１６　（１９８１）である。 参照によって更にここに併合するものには、共同発明者Ｂｒ１ｎｓｔｅｒ及び彼 の共同研究者による。マウス卵細胞の胚胞内への或いは授精したマウス卵子への プラスミドの微量注入に関する論文。 即ち＋　Ｂｒ１ｎｓｔｅｒ等、ｒマウス卵母細胞は注射されたクセノプス５Ａ　 ＲＮＡ遺伝子を転写するＪ　、　５ｃｉｅｎｃｅ　＋　２１し、　ｐｐ、３９６ −３９８　（１９８１）がある。 更に本発明の背景に関連し、ここに参照によって併合するものに、　Ｉｌｌｍｅ ｎｓｅｅ等、釦旦、　２３．　ｐｐ、９−１８　（１９８１）及びＧｏｒｄｏｎ 等１Ｐ、Ｎ、Ａ、Ｓ、、７７、　ｐｐ、　７３８０−７３８４　（１９８１）の 論文があり、それぞれ。 除核マウス卵への核の注入、及びヘルペス・チミジンキナーゼ遺伝子及びＳＶ４ ０　（シミアン・ウィルス４０）配列のマウスへの導入を取り扱っている。　最 後に、　Ｗａｇｎｅｒ等の、　Ｐ、Ｎ、Ａ、Ｓ　、　７８．　ｐｐ、　５０１６ −５０２０　（１９８１）に掲載された最近の論文は、ヒトβ−グロビン遺伝子 及び１つの機能的ウィルス・チミジンキナーゼ遺伝子との発生中のマウスへの取 込みを取り扱っており９本発明の背景に関連する。 木光凱久厘豹 本発明は、生きた細胞及びウィルスのＤＮＡ配列を、金属とステロイド化合物と を用いることによって外部から調節する新規の方法及び材料を提供する。　その −面において１本発明は１選択されたどんな染色体内或いは染色体外遺伝子或い はＤＮＡ配列の転写の制御をも可能にし、それを金属及び／或いはステロイド・ ホルモン化合物の濃度の環境的変化に機能的に応答するブロモ−クー／レギュレ ーターＤＮＡ配列の組み込みによって行う。 本発明はこのように、遺伝プロセスを制御する数多くの手順に広く通用すること が可能であり、その範囲は、原核細胞及び真核細胞内に内在する遺伝子の現在の 調節を変更することから、高等動物及び植物を含む「宿主」細胞に安定的に取り 入れられた選択された外来性遺伝子の発現の選択的、差別的な調節の実行にまで 及ぶ。 本発明の実施の際に現在好まれているプロモーター／レギュレーターＤＮＡ配列 は、鳥類及び哺乳類の細胞から得られたもので：もともとチキンのトランスフェ リン（コナルブミン）遺伝子に関連する鉄及びステロイド・ホルモン応答性プロ モーター／レギュレーター配列；チキンのオバルブミン遺伝子に関連するステロ イド・ホルモン応答性プロモーター／レギュレーター配列；及びマウスｍｅｔａ ｌｌｏｔｈｉｏｎｅｉｎ４或いはｍｅｔａｌｌｏｔｈｉｏｎｅｉｎ　Ｕ遺伝子の 金属及びステロイド・ホルモン応答性プロモーター／レギュレーター配列を含む 。 本発明の新規の融合遺伝子生成物は８選択されたＤＮＡ配列を含み、それらに金 属及び／或いはステロイド・ホルモン応答性プロモーター／レギュレーターＤＮ Ａ配列が上述したように結合される。 これらの生成物はＤＪＪＡプラスミド及びウィルス性ヘクターに取り込まれて、 広汎な受容細胞の形質転換の道具となるものである。 本発明のプロセスは、生きた細胞或いはウィルス内の選択されたＤＮＡ配列の転 写を金属及び／或いはステロイドにより、特定の部位にその働きをするプロモー ター／レギュレーターＤＮＡ配列を挿入することで、調節する方法を含む。　宿 主細胞において選択された外来性のＤＮＡ配列の転写を確実に行う為の先行技術 方法の改良も包含されており５そこではＤＮＡ配列は宿主の染色体内の或いは染 色体外の物質として安定して取り込まれる。　前述の改良は９選択されたＤＮＡ 配列に１グルココルチコイド及びデキサメサゾン等のステロイド・ホルモン化合 物及び／或いは鉄、コバルト。 ニッケル、銅、銀、金、亜鉛、カドミウム、水銀及びビスマス等の金属のイオン の環境濃度の変動に応答して９選択されたＤＮＡ配列の転写を選択的に促進する か或いは抑制することの出来るプロモーター／レギュレーターＤＮＡ配列をくっ つけることから成る。 本発明のその他の面及び利点は２本発明の下記の詳細な説明及び図面を考慮すれ ばおのずと明らかになり、第１図は、’ＤＮＡプラスミドｐＭＫの制限エンドヌ クレアーゼ切断地図を示し、前述のＯＮ八へラスミドｐＭＫは本発明の融合遺伝 子生成物を取り入れており；第２図は２本発明の融合遺伝子生成物を取り入れた ＤＮＡプラスミドｐＭＧＨの構造を示し；第３図は１本発明の融合遺伝子生成物 を微量注入された卵から発生したマウスの成長特性を簡略に示す。 詳寝左皮所 下記の実例は＝　（ａ）プラスミドｐＭＫを一例とする融合遺伝子の調整；　（ ｂ）プラスミドｐＭＫの授精した単細胞マウス卵への注入とそれから成マウスの 成長を可能にする注射された卵の操作；（Ｃ）成マウス内の外来性（ウィルス性 チミジンキナーゼ）遺伝子の安定した組み込み、転写、及び発現の範囲の確定； （ｄ）ｐＭＫプラスミドを用いた哺乳類細胞培養の形質転換及び形質転換された 細胞内での外来性遺伝子の発現に及ぼす金属の影響；　（ｅ）ｐＭＫプラスミド を注射されたマウス胚内の外来性遺伝子の転写及び発現の研究；　（ｆ）プラス ミドｐＭＧＨにしめされた融合遺伝子の作成；　（ｇ）授精した単細胞マウス卵 へのプラスミドｐＭＧＨの注入とそれから成マウスの成長を可能にする注入され た卵の操作；及び（ｈ）成マウス内における外来性（成長ホルモン）遺伝子の安 定した組み込み、転写及び発現の範囲の決定を、それぞれ目指している。 劃」− この例は９本発明の融合遺伝子の作成の手順に関する。　１つのＤＮＡプラスミ ド、　ｐＭＫが、単純性庖疹ウィルス（）ＩｓＶ　）チミジンキナーゼ（ＴＫ） の為の１つのＤＮＡ配列コードを持つことが示され、　１には作用的にマウスｍ ｅｔａｌｌｏｔｈｉｏｎｅｉｎ−Ｉ　（ＭＴ−１）遺伝子のプロモーター／レギ ュレーターＤＮＡ配列と関連する。 Ｄｕｒｎａｍ等、　Ｐ、Ｎ、Ａ、Ｓ、、　７７、　ｐｐ、６５１１−６５１５　 （１９８０）は、　［ｌＮＡプラスミドｍ１ｐＥＥ　３　、　ｓ　の構造を開示 し、それは３．８キロヘース・ジェノミックＥｃｏ旧断片を含む細菌性のプラス ミドｐＢＲ３２２がら成り。 プラスミドのＥｃｏ　ＲＩ部位に挿入されたマウスＭＴ−Ｉ遺伝子を含む。 ＭＴ−１遺伝子は約１．１　ｋｂ対の長さがあり、少なくとも２つのイントロン を含む。 第１図、バートＡに示すとおり、プラスミドｐＭＴ−ＴＫは、チミジンキナーゼ 遺伝子を含む（ＭｃＫｎｉｇｈｔ、　Ｎｕｃ、　Ａｃ１ｄ、　Ｒｅｓ、＋　８＋ 　ｐｐ、５９４９−５９６４　（１９８０）を参照のこと〕単純性庖疹ウィルス ・タイプＩの３．５　ｋｂ　Ｂａｍ旧断片をＢａｍ旧部位に挿入することによっ てプラスミドｍ１ｐＥＥ３　、　ｓから作られた。　矢印で示すように、２つの 遺伝子が同一の転写オリエンテーション（向き）にある。　第１図。 パートＢに示すように、融合プラスミドｐＭＫは、ｌｎ　制限エンドヌクレアー ゼによりプラスミドｐＭＫＴ−ＴＫを消化し、そしてＴイＤＮＡリガーゼによる 結合によって直接にＭＴ−Ｉ遺伝子の５゛領域（ＭＴ−■のプロモーター／レギ ュレーター配列）をＴＫ構造遺伝子に接合することによって生成された。　ｐＢ １１３２２配列は単線で示され、　ＴＫ遺伝子配列は細い帯によって、ＭＴ−Ｉ 遺伝子配列は幅の広い帯によって示される。　ｍＲＮＡコード部は塗りつぶした 帯によって、非転写及びイントロン部は空白の帯によって示される。　輪の中の 斜線を入れた帯は、ハイブリダイゼーション探針として使用される遺伝子の領域 を示す、ＭＴ−１特異性探針、「酊−ＸＨＪは、　Ｘｂａ　ＩがらＨｉｎｄｎＩ に、そしてＴＫ特異性探針ｒＴＫ−ＢＰ　ＪはハＬ■がらＰｓｔ　１に延びる。 　融合プラスミド探針’　ｐＭＫ　（−ＥＫ　）　Ｊは、全プラスミドを含むが 、　Ｅｃｏ　ＲＩから紅ＬＩ領域は例外で、それは、　５ｏｕｔｈｅｒｎ　プロ ットが、これがマウス・ゲノムに多く存在する配列であることを示したからであ る。　プラスミドの作成及び遺伝子特異性探針に関連する制限部位は第１図のパ ー）Ａに示す。　ｐＭＫの組み込まれたコピーの地図作成の際に使用される総て の制限部位は、第１図のパー）Ｂに示す。　ｐＭＫは、…皿１［［、Ｘｂａ　Ｉ 　、或いはＸｈｏ　Ｉによって切断されない。　２つの遺伝子用のＴＡＴＡＡ　 ｒプロモーター」配列及びＡＴＧ翻訳開始コドンの位置も示されている。 珂工 この例は、融合遺伝子運搬プラスミド、　ｐＭＫの、授精したマウス卵細胞の前 核への微量注入用のベクターとしての使用に、そして、卵細胞の成マウスへの成 長に関連し、このマウスは体細胞及び生殖細胞に取り入れられたｐＭＫ　ＤＮＡ 配列を持つ。　例■のｐＭＫＤＮＡは、細菌細胞の清浄にされた溶出物から、　 ＳＤＳプロティナーゼに処理によって分離され、その後、フェノール・クロロホ ルム抽出及びエタノール沈降がそれに続く。　核酸はＲＮａｓｅ　Ａによって消 化すり、　０．１Ｘ　ＳＥＴ　（ＩＸ　ＳＥＴ　＝　１％ＳＤＳ／Ｊ　５　ｍＭ 　ＥＤＴＡ、　１０　ｍＭ　Ｔｒｉｓ、　ｐＨ７，５）の中でＢｌｏ−Ｇｅ１　 Ａ３０ｍコラムを通されて、　ＤＮＡがＲＮＡ断片から分離された。　これらの 実験において使用された標本は、アガロースゲル電気泳動及び臭化エチジウム染 色によって明らかになったが、約１／３の高次コイル・プラスミド、１／３の切 断（ニック）された輪、及び約１／３のプラスミドの大きなオリゴマーを含む。 Ｃ５７Ｘ　Ｓ几ハイブリッドの授精単細胞卵子が、輸卵管がらＢｒ１ｎｓ　ｔｅ ｒ媒質（Ｂｒｉｎｓｔｅｒ、ｐｐ、２．５１−２８６．　’培養細胞の成長、栄 養及び代謝Ｊ　、　Ｖｏｌ、２．　Ｒｏｔｈｂｌａｔ及びＣｒ１ｓｔｏｆａｌａ ＋　ｅｄｓ、＋　Ｎ、ｙ、、　Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ　（１９７２）を 参照のこと〕を用いて、妊娠第１日の朝にフラッシュによって採取された。　重 なった細胞は卵子からヒアルロニダーゼ（３００Ｕ　／ｍ＋）を用いて取り除か れ、操作の前に卵子のデブリス及び酵素を洗い流した。　注入を行う為に、卵子 は５μｇ／ｍｌサイトカラシンＢを含むＢｒ１ｎｓｔｅｒ媒質の中に保ってディ プレッション・スライドに移され、先の丸いピペットで保定して、そのあいだに 、インジェクター・ピペットの先が透明帯及び卵黄を通って雄性前核に挿入され た（Ｂｒｉｎｓｔｅｒ等、　５ｃｉｅｎｃｅ　＋肚、　ｐｐ、　３９６−３９８ 　（１９８１）　）。　インジェクター・ピペット内のＤＮＡ溶液は、マイクロ メ−゛ターに接続された注射器を用いてゆっくりと核の中に放出された。　授精 卵のより大きな前核（雄性）は、全部で約２００コピーのｐＭｋプラスミドを含 む約２ｐ＋のプラスミド溶液を注入された。　注入の後、卵子はサイトカラシン を洗い流して、採取の際に用いたと同じ媒質中に戻された。　注入が完了した後 に、卵子は偽妊娠のランダム・ブレンド・スイス・マウスの卵管に移された。 １５匹の偽妊娠マウスの卵管に、それぞれ平均１６個の卵子が移された。　これ らのマウスのうちの６匹が同腹子を持ち、１２匹の雄と７匹の雌を生んだ。　４ 週令で、雄は正常な雌と交尾させられた。　遺伝子発現を検定する前に、マウス はＣｄ５０　（２ｍｇ／ｋｇ）を注射された。　これはＨ３Ｖ　ＴＫ活性を引き 起こす意図をもってなされたが、それはこの投与が肝臓及び腎臓においてＭＴ− Ｉ　ｍＲＮＡを生じさせることが示されたからである（Ｄｕｒｎａｍ等、　Ｐ、 Ｎ、Ａ、Ｓ、７７゜ｐｐ　、６５１１−６５１５　（１９８０）　）。　１８時 間後ニマウスは殺され、肝臓のサンプルが↑に検定の為に採取され、各動物の残 り部分は、後に核酸分析を行う為に冷凍された。 何■ この例は、前例の成マウスの組織に対して行われた検定に関連する。 最初のＴＫ検定においては、５μＩの２０％肝臓ホモジェネートが試験された。 　あるマウス（Ｂ２３−２　）は、その他のマウスの約４０倍の活性を示した。 　しかしながら、この活性は高すぎて、検定の非線形領域内にあった。　約２０ ０倍の適切な希釈の後に、このマウスのＴＫ活性は同腹のマウス及び同様な齢の 他のマウスと比較して高いことが分かった。　ＴＫ活性がＩ（ＳＶ　ＴＫ遺伝子 によるものか或いは内性マウス遺伝子によるものかを確かめる為に、　Ｈ５Ｖ　 ＴＫに特異性のある抗体が酵素検定に先立って肝臓抽出物に混合された。　マウ ス２３−２のＴＫ活性はこの抗血清によって９７％抑制されたが、その他のマウ スのＴＫ活性は影響を受けなかった。 追加の検定によって、マウス２３−２のＴＫ活性の大部分はＥＳＶ遺伝子生成物 によるものであることが確認された。　内在性マウスＴＫ酵素は１ｏｄｏｄｅｏ ｘｙｃｙｔｉｄｉｎｅ　（ＩｄＣ）を燐酸化することは出来ないが、　Ｈ３Ｖ酵 素は出来る。　このように、　ＩｄＣは酵素がウィルス性のものの場合は、（３ Ｈ）チミジンの〔３Ｈ〕チミジル酸への変換を抑止する。　これは、マウス２３ −２の酵素標本については観察されたが、その同腹のマウスのものについては観 察されなかった。 マウスとＨ５Ｖ　ＴＫ酵素の基質特異性も、１２５工ｄＣ及び、シチジン・デア ミナーゼの抑止剤であるｔｅｔｒａｈｙｄｒｏｕｒｉｄｉｎｅを用いて実証する こと力咄来る。　正常なマウスの粗肝臓抽出物中では、１２５工ｄ。 は、燐酸化誘導体に変換されるが、それはデアミナーゼの作用によるもので、デ アミナーゼは１２５■ｄＣを１ｏｄｏｄｅｏｘｙｕｒｉｄｉｎｅに変換し、　１ ｏｄｏｄｅｏｘｙｕｒｉｄｉｎｅはＴＫによって燐酸化出来る。　しかしながら 、デアミナーゼのインヒビター（ｔｅｔｒａｈｙｄｒｏｕｒｉｄｉｎｅ、　ＴＨ Ｕ）が検定に加えられると、内在性ＴＫ酵素用のラベルを付けた基質は形成され ず、見掛けの活性は３０倍はど抑制される。　これとは対照的に、マウス２３− ２のＴＫ活性は、１２５工ｄＣを直接に使用出来るウィルス酵素を用いた場合に 予測されるものの２０％はど抑制されただけである。 マウス内のＭＫ融合遺伝子の存在を定量する為に、腎１１ＯＮＡが制限酵素」■ 　」旦により消化され、アガロース・スラブ・ゲルの上で電気泳動を行った後に 、　５ｏｕｔｈｅｒｎの方法によってブロッティングされた（Ｊ、　Ｍｏ１．　 Ｂｉｏｌ、　、　９８．　ｐｐ、　５０３−５１７　（１９７５）　）。 内在性ＭＴ−１遺伝子及びその他の融合遺伝子を検出するニック・トランスレー トされた探針が使用された。　内在性ＭＴ−１遺伝子は。 ６　ｋｂ　Ｂｓｔ　ＥＩＩ断片の中にはいるが、　ＭＫ融合遺伝子は伜の酵素に よって２．３　ｋｂ断片に切断されると考えられる（第１図、バートＢを参照の こと）。　マウス２３−２及び更に追加の３匹のマウス（Ｎｏ、　１９−２．　 Ｎｏ、　２１−３．　Ｎｏ、　２３−１）のＤＮＡは、　ＭＫ遺伝子からのもの と考えられる２、３　ｋｂバンドを持つことが判明した。　■遺伝子ハンドは、 密度計測によって測定すると、マウス１９−２を除く総てのマウスのＭＴ４遺伝 子ハンドの約半分の強度を持ち、マウス１９−２ではＭＫハンドは約６倍程強か った。　細胞１つ当たりのＭＫ遺伝子の数を推定する為に、対照実験が行われ１ そこでは同じ組合せの探針が、同モル量のＭＴ−Ｉ及びＭＫ遺伝子にハイブリダ イズされた。 これはｐＭＴ−ＴＫ　（第１図、バートＡ）を」並ＲＩ或いはム■によって消化 し、更にアガロース・ゲル電気泳動法によってＭＴ−Ｉ遺伝子とＭＫ遺伝子を含 む断片を分離することによってなされた。 異なる量のダイジェスト（４０から１６０　ｐｇのプラスミドＤＮＡ　）が定量 を容易にするように電気泳動に付された。　ＭＴ−１遺伝子を表すオートラジオ グラフ・バンドは、　ＭＫ遺伝子を表すバンドよりも常に４倍はど強かった。　 先の実験で、ＭＴ４遺伝子ハンドはＭＫ遺伝子バンドよりも２倍強いだけであっ たので、細胞当たりでは。 ＭＴ−１遺伝子の２倍の数のＭＫ遺伝子があると結論することが出来る。 このように、細胞当たりに２ＭＴ−１遺伝子があることが分かれば。 これらのマウスの細胞１つ当たりには４ＭＫ遺伝子があると考えることができる 。　同じ計算によって、マウス１９−２は１細胞当たり約４８コピーのＭＫ遺伝 子を持つと推定された。 マウス１９−２．２１−３．２３−１においては、完全なＭＫ遺伝子は存在した が、　ＨＳＶ　ＴＫ酵素活性は検出されながったので、これらマウスが実際にＣ ｄによって誘導されたか否かの検査が、ｐ　のラベルを付けたＭＴ−Ｉ　ｃＤＮ Ａ　ｒを用いた溶液ハイブリダイゼーションによりＭＴ−Ｉ　ｍＲＮＡ０量を測 定することによって実施された。　マウスは総て、１肝細胞当たり６００から２ ７００分子のＭＴ−１ｍＲＮＡを持つことが分かった。　マウスの肝臓内のＭＴ ４　ｍＲＮＡの基本レベルは変動するが、平均は１細胞当たり約１５０分子であ った。　これに対して、最適な誘導の後には、１細胞当たり約２３００分子のレ ベルが一般に得られた（Ｄｕｒｎａｍ等、前掲）。　この対照は、マウスが殺さ れた時点では、　ＭＴ−１遺伝子はまだ誘導されている状態にあったことを示し 、チミジンキナーゼ活性の欠乏は１組織へのＣｄの移送が出来なかったことによ るのではないことを示唆している。 ＨＳＶ　ＴＫ　ｍＲＮＡ　レベルも、Ｐ（７）ラベルを付けたＨＳＶ　ＴＫ　ｃ Ｄ’ＮＡを用いた溶液ハイブリダイゼーションによって測定された。　ＴＫ　ｍ ＲＮＡはマウス２３−２の肝臓で検出されたが、そのレベルは１細胞当たり僅か に２８分子であった。　少量のＨＳＶ　ＴＫ　ｍＲＮＡがマウス１９−２におい ても検出されたが、このマウスはＭＫ遺伝子の５０にも近いコピーを持っていた 。　その他のマウスは総て、１細胞当たり２分子に満たないＴＫ　ｍＲＮＡを持 っていた。 肚遺伝子は、マウス２３−２の幾つかの異なる組織、即ち、肝臓。 腎臓、脳１筋肉、精巣等に存在することが分かったが、ハイブリダイジング・ハ ンドの強さは、各組織において似通っており、遺伝子コピー数は各組織において 一定であることを示唆している。 ＨＳＶ　ＴＫ活性及びｍＲＮＡレベルは、腎臓においては肝臓においてよりも低 く、脳においては検出出来なかった。　このように、ＭＫ遺伝子の発現はこれら の組織におけるＭＴ４遺伝子の発現と緊密に類似していた。 ｐＭＫプラスミドがマウス・ゲノムに組み込まれたが否かを確認する為に、　Ｍ Ｋ遺伝子について陽性であった４匹の各マウスのＤＮＡが、　ｐＭＫプラスミド の内部で２度、１度、或いは全く切断を行わない幾つかの酵素によって消化され た。　電気泳動とプロッティングを行った後に、ニトロセルロースは、ニック・ トランスレートされた探針とハイブリクイズされたが２　この探針はＥｃｏ　Ｒ １と」肛、■との間の１１５０　ｂｐを除く総てのプラスミドを含む：この領域 が除外されたのはそれが反復配列を含むからである。　どんなサイズ・ハンドが 生成されるかの予測は、　ｐＭＫプラスミドがマウス・ゲノムに組み込まれるか 否かによって非常に異なる。　例えば。 単一の組み込まれたプラスミドの中で１度だけ切断を行う酵素の場合は、ジャン クション断片、即ち、プラスミド及びゲノムの配列の双方を結合する断片のみを 生み出すことになり、プラスミドから予測されるサイズとは異なるであろう。 １）ＭＫ内で１度だけ切断を行う酵素、　Ｂａｍ旧、　ｌ’ｎ　、或いは」、ｐ ｇｌを持つＭＫ遺伝子が陽性の各マウスの肝ＤＮＡの制限は、１つの顕著な８． ４　ｋｂ　断片を示したが１　この断片は組み込まれないプラスミドから予測さ れるものと同じサイズであった。　同様に、　ｐＭＫ内で２度切断する酵素１例 えばＢｓｔ　ＥＩＩ、　Ｅｃｏ　Ｒ１及びＲｖｕ　ＩＩは。 ２つの顕著なバンドを示し、それらは加えると８．４　ｋｂ、即ち、　ｐＭＫの サイズとなる。　しかしながら、　ｐＭＫ内で切断を行わない酵素、　Ｈ４ｎｄ ｌ［Ｉ、　Ｘｂａ　Ｉ等が使用されると、ハイブリダイジングＤＮＡは切断され ないゲノムＤＮＡはどの大きさであり；組み込まれない単一プラスミドに対応す るハンドは現れなかった。　このハラドックスの１つの解決は、　ｐＭＫの幾つ かのコピーが何度か縦列重複され単一の部位において組み込まれたとすることで ある。　この構成を持つＤＮＡの制限は１元のプラスミドに２つのジャンクショ ン断片を合わせたものに相当する断片を生み出すことになり、それは１　／　ｎ を下回る強さとなる。　まさに１強いハンドに加えて。 典型的な幾つかの追加のより弱いハンドが存在する。　これらの弱いハンドの１ つはＭＴ−１遺伝子に対応したが、それは探針の約６５ｏ　ｂｐがＭＴ−１遺伝 子の５“配列と同種であることから予測できた。 その他の弱いバンドは、予測されたジャンクション断片に該当すると考えられる 。　マウス２３−２のジャンクション断片の平均強さは、主ハンドと比較して約 １１５であり、完全なｐＭＫプラスミドがこのマウスにおいて５度反復されたこ とを示唆している。 この縦列重複という考えを試験するために、マウス２３−２の高分子量ＤＮＡが 分離され、　ｐＭＫ反復ユニットを最小サイズに切断する意図から、プラスミド ｐＭＫの中では切断を行わない−揃いの酵素を用いて切断された。　ハイブリダ イジング・ハンドのサイズは。 切断されないＤＮＡにおいては４５ｋｂ　（最大のマーカー）よりも大きく、肛 Ｉ　■、■ａ１．　及び■虹Ｉによる制限の後には、２３がら４５ｋｂの間にあ ったが、臭化エチジウム・ストレイニングが示すように、全マウスＤＮＡは平均 ２ｋｂの重量に切断された。　」堕肛が他の酵素とともに加えられると、　８． ４　ｋｂ　Ｂａｍ　Ｈ１線形断片が幾つかのより弱い断片とともに得られたが、 これらのより弱い断片は予測されたジャンクション断片を表すもの゛と考えられ た。 このように、マウス２３−２においてはｐＭＫプラスミドの４つ或いは５つの直 接の反復があったと結論され、この結果は８．４　ｋｂバンド及びジャンクショ ン断片の相対的な強さ、及び遺伝子の投与量と合致するものであった。 上記の実験におけるプラスミドの組み込みと発現の達成効率は非常に良かった。 　最初の実験の１９匹の子（雄１２匹、雌７匹）は。 ＴＫ全発現検定され、マウス２３−２は明らかに陽性であった。　１２匹の雄の ＤＮＡが調べられたが、４匹が陽性であった。　第２の実験においては、　ｐＭ Ｋプラスミドは、　Ｍｕｌｌｉｇａｎ等、　Ｎａｔｕｒｅ、　２２７．　ｐｐ。 １０８−１１４　（１９８０）のベクターからのＢａｍ旧断片、即ち、　ＳＶ４ ０オリジン及びＴ−抗原遺伝子を含むｐＳＶ３−ｇｐｔを挿入することによって 補強された。　１２匹の子についてＴＫ全発現びｐＭＫ　ＤＩＪＡの分析がなさ れ、総てが陰性であった。　第３の実験においては１元のプラスミドは、注入に 先立って線状にされマウスＤＮＡに結合された。 この実験においては、５匹の子がこれまでに分析され、２匹がＩｓＶ　ＴＫを発 現し、ＭＫ遺伝子を持つことが分かった。　第４の実験においてｂｒ、　ＭＫ遺 伝子を含む線形の２．３　ｋｂ　Ｂｓｔ　Ｅ２断片が注入され。 ５匹のマウスの内の１匹がＨ３Ｖ　ＴＫ全発現関して陽性である。 堅実な統計的な研究には子の数が少なすぎ、従って、プロトコルの変化の影響が あるか否かは分からないが８分析された総計４１匹の子の内から、全部で４匹の Ｈ５Ｖ　ＴＫを発現したマウスが得られ。 更に、完全なＴＫ遺伝子を持つがＴＫを発現しない３匹の子がいた。 拠丘 この例は、プラスミド・ベクターに組み込まれた本発明の融合遺伝子生成物を用 いた。培養哺乳類細胞のトランスフェクションに関する。　より具体的には、こ の例は、　ｐＭＫプラスミドによるマウスＬＴＫ−細胞のトランスフェクション を例示する。 総ての細胞は、１０％新生子牛血清（Ｇｒａｎｄ　ｌ５ｌａｎｄ　Ｂｉｏｌｏｇ ｉｃａｌＣｏ、　）を加えたＨａｍのＦ１２の中で培養され、　ＬＴＫ−細胞は Ｇ、　Ｍｅｒｒｉｌｌ　（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　ｏｆ　Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ ）から入手された。　トランスフェクションの方法は、匈１ｇ１ｅｒ等、釦旦、 　１４．　ｐｐ、　７２５−７３１　（１９７８）に記述されている。　簡潔に 云うと、２μｇの適切なベクターＤＮＡ力＜、３７５μｌ　ＴＥ　（Ｌ　ｍＡ　 Ｔｒｉｓ、　ｐＨ７，９，０，１，ｍＭ　ＥＤＴＡ）中の１８匹ｇの担体練精子 ＤＮＡと混合され、　１２５　、ｃｒｌのｌｌ’１ｃａｃ１２が加えられ、そし て、全混合物はゆっくりと、攪拌しながら。 ５００μｌの２Ｘ　Ｈｅｐｅｓ緩衝塩水（２８０ｍＭ　ＮａＣｌ、’　５０　ｍ Ｍ　Ｈｅｐｅｓ、　１．５ｍＭ　Ｎａ２ＰＨ０４，ｐＨ７，１）に加えられる。 　室温で３０分のあいだ沈降物が形成されるのを待ち、　１０　ｍｌの培地の中 の１００　ｍｍ　Ｍの細胞に加えられる。　細胞は、トランスフェクションの１ 日前に、１皿当たりに８×１０５　の割合で盛られ、トランスフェクションの４ 時間前に新鮮な培地が与えられた。　トランスフェクションの１日後に、細胞は 選択ＨＡＴ培地（１５μｇ／ｍｌのヒポキチンチン。 ０．２μｇ／ｍｌのアミノプテリン、及び５μｇ／ｍｌのチミジン）に１０μＭ 　Ｃｄを加えたもの或いは加えないものの中に置かれた。　選択培地は３日毎に 交換された。　選択にＣｄが使用された場合は。 細胞の収穫の２週間前に取り除かれた。　個々のコロニーは、ガラス試験管を用 いてクローニングされ１選択培地の中で拡張された。 ｐＭＫを用いたマウス”ＴＫ−細胞のトランスフェクションは、チミジンキナー ゼ活動がカドミウムによって誘導出来るがデキサメサゾンによっては誘導出来な いクローンを生した。 孤ｙ 本例は、プラスミドｐＭＫを注入されたマウス卵子内の１（ＳＶチミジンキナー ゼ活性の転写調節の研究を例示するものである。 微量注入の手順は例２のように実施された。　３Ｈ−チミジンキナーゼの検定は 下記の仕方で成された。　プラスミドの注入の後に、卵子はランダムに２つのグ ループに分けられ、　Ｂｒ１ｎｓｔｅｒの培地の中で２２時間のあいだ培養され 、その後、２００μｍの低張性緩衝液（１０ｍｌのＫＣＩ、　２　ｍＭのＭｇＣ ｌ、２．１０　ｍＭ　ｔｒｉｓ　ＨＣｌ−、ｐＨ７，４，１ｍＭ　ａｔｐ＋　ｉ ｏ　ｍＭ　のβ−メルカプトエタノール、　５０　ｍＭのε−アミノカプロン酸 、及び１　ｍｇ　／ｍｌのウシ血清アルブミン）２１に移された。　１つのグル ープは、培地中に５０μｉの力゛ドミウムを含み、もう１つのグループは含まな かった。　細胞は３度凍結され溶解されて、２０ｍ１の反応混合物（１５０ｍＭ 　Ｔｒｉｓ　ＨＣＩ、　ｐＨ７，５，１０ｍＭ　ＡＴＰ、　１０　ｍＭ　ＭｇＣ ｌ２．２５　ｍＭ　ＮａＦ、　１０　ｍＭβ−メルカプトエターノル）が加えら れ、続いて、　５　ｐｃｉＨ−チミジン（８０Ｃｉ　／ｍｍｏｆ　；　Ｎｅｗ　 Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｎｕｃｌｅａｒ　）を含む５μｍの水が加えられた。 混合物は３７度で２時間のあいだインキュベートされ、生成された３Ｈ−ＴＭＰ はＤＥ−８１へ吸着させてシンチレーション・カウンティングにより測定された 。 下記の表１は、各界なる数のプラスミドを注入した場合の、カドミウムの誘導を 伴う場合及び伴わない場合のそれぞれの、チミジンキナーゼ活性の分析の結果を 示す。　形成された３Ｈ−ＴＭＰの値は、２つの別々の実験の２５卵子の平均値 である。 、表」− 融合ｐＭＫ遺伝子により生成されたチミジンキナーゼ活性のカドミウムによる調 節 注入されたｐＭＫ　’Ｈ−ＴＭＰ　（ｃｐｍ　Ｘ　１Ｏ−３）ｂ　の生成プラス ミドの数 Ｃｄ無しで培養　５０μＭ　Ｃｄの中でされた卵子　培養された卵子 ２．０００　１９０．０　２，３６４．３２００　２５．３　２６８．４ ２０　８．３　１２．２ ０　８．５　８．８ デキ号メサヅン処理に応答したＴＫ活性の増加は測定出来なかったが、その理由 は恐らく細胞内にグルココルチコイド・レセプターが欠乏していたからであろう 。 ｐＭＫから得られた制限断片による処理を受けた卵子内のチミジンキナーゼ活性 の研究は、Ｉｎによる制限の結果化じた断片に対して強いカドミウム制限がある ことを明らかにした（ＤＮＡポリマラーゼを用いて末端を平坦にする場合もしな い場合も）。　）ＩｓＶ　ＴＫ構造遺伝子及びＭＴ−Ｉプロモーター／レギュレ ーター配列が別々に注入されるか、或いは試験管内で再結合されてから一緒に単 −ＤＮＡ線状断片として注入された場合にも、同様な結果が得られたが、その程 度は大幅に低かった。 桝■ この例は１本発明による別の融合遺伝子の調製の手順に関する。 この例においては、１つのＤＮＡプラスミド、即ち、　ｐＭＧＨが、１つのラッ ト成長ホルモン（ＧＨ）構造遺伝子の為の１つのＤＮＡ配列コーディングを含む ことが示され、前述の構造遺伝子は作用的にマウスｍｅｔａｌｌｏｔｈｉｏｎｅ ｉｎ−Ｉ　（ＭＴ−Ｉ）遺伝子のプロモーター／レギュレーターＤＮＡ配列に関 連する。　上記の例■の場合がそうであったように、融合遺伝子は、　Ｄｕｒｎ ａｍ等、　Ｐ、Ｎ、Ａ、Ｓ、、　７７、ｐｐ、６５１１−６５１５　（１９８０ ）により開示されたプラスミドｍ’ｘｐＥ’Ｅ　３　、　ｓ　を用いて作成され た。 第２図のパートＡに図示するように、クローニングされたゲノム・マウス成長ホ ルモン遺伝子の断片が、それからは５゛調節領域が除去されているが、１つのＭ Ｔ４プロモーター／レギュレーター領域に融合されてプラスミドｐＭＧＨを形成 した。　より具体的には、　ＭＴ−Ｉ　ゲノム・クローンｍ１ｐＥＥ３．８ノ特 異ｔ、Ｋ　ｈＬＩＩ　ｆａ　位置。 まず」れ■による消化、そして、　ＡＴＰ、　ＧＴＰ、　ＣＴＰ及びＴＴＰの存 在下で接着末端にＤＮＡポリメラーゼの旧ｅｎｏｗ断片を詰めることにより、… 虹■部位に変換された。　亘虹■リンカ−（５’　−ＣＣＴＣＧＡＧＧ−３゛） はそれから平坦末端に結合され、　Ｅ、　ｃｏｌｉ細菌株ＲＲ工はこのＤＮＡに よって形質転換された。ｐＢＲ３２２の一ハ＋ｕ１１部位は、ＭＴ４プロモータ ーを含む珈旧断片に変換され、　ｐＢＲ３２２ＤＮＡは、ラットＧＨ構造遺伝子 （Ｂａｒｔａ等、　Ｐ、Ｎ、八、５．、７９　、　ｐｐ、　４８６７−４８７１ 　（１９８１）　；　Ｄｏｅｈｍｅｒ等、Ｐ、Ｎ、八、Ｓ、、７ン９　、ｐｐ、 ２２６８−２２７２　（１９８２）　；及びＧｌａｎｖｉｌｌｅ等、　Ｎａｔｕ ｒｅ、２９２．　ｐｐ、　２６７−２６９　（１９８１）を参照のこと〕を含む ４．８　ｋｂ　Ｘｈｏ　Ｉ　−Ｂａｍ　ＨＩ断片に接合されてｐＭＧＨ（８，９ ｋｂ）を形成した。　第２図、パー）Ｂはそれに続く注入研究に使用された断片 、即ち、　Ｃｈｅｎ等、八ｎａ１．　Ｂｉｏｃｈｅｍ、、　１０し。 ｐｐ、　３３９−３４１　（１９８０）のＮａＣｌＯ４法によりアガロースゲル カラ分離された５、０　ｋｂＪｌｇｌ　Ｉ　−１旧断片を示している。　ゲノム のＳｏｕ　ｔｈｅｒｎプロットの為に、エクソン４及び５にまたがる１、０　ｋ ｂＰｓｔ　Ｉ断片が分離され５ニツク・トランスレートされ（Ｐａｌｍｉｔｔｅ ｒ等、釦旦、ユ９　、　ｐｐ、　７０１−７１０　（１９８０）を参照のこと〕 、それからハイブリダイゼーション探針として使用された。　第２図。 バー）Ｃにおいては、融合遺伝子のエクソン１の予測された構造が示されている 。　線及び空白の帯は、　ＭＴ−Ｉの翻訳されない配列を示し５点を打った帯は ＧＨの翻訳されない配列を示し、塗りつぶした帯はＧ）ｌコーディング領域の始 まりを示している。 融合遺伝子は１つのｍＲＮＡの転写を指揮するものと予測されるが。 このｍＲＮＡは、ＭＴ−Ｉから得られた６８塩基を含み、それに１つ＋７）Ｘｈ 。 ■リンカーから得られた１塩基が続き、更に、ヌクレオチド７で始まるラノ）Ｇ ＨｍＲＮＡ配列が続く。　この構造は、　Ｇ１合成用の位置１２４−−１２６　 （第２図、パートＣ）に位置する（ｍＲＮＡ）　ＡＵＧ開始コドン、４つの介在 配列及びラットＧＨ遺伝子のポリ　（Ａ　）部位（第２図、パートＢ）及び３　 ｋｂの下流染色体配列を保つ。 桝Ｗ この例は、融合遺伝子を担うプラスミド、　ｐｌ’１Ｇｌ（の断片を、前述の例 ■のものと類イ以した微量注入研究用のベクターとして使用することに関する。 　ＭＴ−Ｉ　（−１８５）のＢＢＬ１部位からハｍＨＩ　へ延びる５、Ｏｋｂ断 片（第２図、パートＢを参照のこと）は、　ｐＭＧＨから制限を受け、アガロー ス・ゲル上でその他の断片から分離され。 卵への注入に使用される。　異種の末端を持つこの線状の断片が選択されたのは 、経験によって前述の断片が高次コイルのプラスミドよりもより効率的に宿主Ｄ ＮＡ　と一体化することが示唆されたからである。　授精卵の雄性前核には、こ の断片の約６００コピーを含む２ピコリツトルが微量注入され、　１７０　（！ ｆｉｌの卵が例■のように養母の生殖管に挿入された。　これらの卵から２１匹 の動物が発生した。 ■ この例は、伊ハゴに従って発生したマウスの組織に実施された検定に関する。　 マウスが離乳した時点で、全核酸が尾から抽出され、どのマウスがＭＧＨ配列を 持つかを確認する為のＤＮＡ　ドツト・ハイブリダイゼーションに使用された。 　第２図、パートＢのＰｓｔ　Ｉ　探針を用いて、７匹のマウス（ＭＧＨ２，３ ，１０，１４，１６，１９及び２１）がハックグラウンドを上回るハイブリダイ ゼーション信号を与え、これらのマウスのＤＮＡは更に５ｓｔｌによる制限と５ ｏｕｔｈｅｒｎブロツテイングにより分析された。　この分析は、７匹のマウス が総て、第２図に示された制限地図から予測された完全な１．７　ｋｂ　Ｓｓｔ 　１断片を持つことを示した。　顕著な１．７　ｋｂハイブリダイジング・ハン ドを持つマウスは総て、　３．３　ｋｂハンドをも示した。　このハンドは、　 ５−Ｏｋｂ」訂１　−　Ｒａｍ　）ＩＩ断片の環状体から予測されるものである 。多くのコピーを持つマウスの２匹（ＭＧＨ４０及び１９）は、　Ｈｉｎｄｌｌ ｒで消化されると、　５．０　ｋｂのハイブリダイジング断片を示したが、この …ｎｄｌＩ＋断片は注入された断片内で一度だけ切断を行う。　驚いたことには 、　Ｂａｍ　ＨＩは１分析された総てのＤＮＡ　（ＭＣ１１−１０，１４，１６ 及び１９）の中に１つの５．Ｏｋｂのハイブリダイジング断片を生成し、これば この制限部位は環状化の際には回復されているが、ＢＥＬ■及びＥｃｏＲＴ（こ の断片内では切断を行わない）はより大きな断片を生成したことを示唆している 。 このことから、総てのＭＧＨ陽性マウスは、少なくとも１つの完全な＋７１　ｒ 　−Ｂａｍ　ＩＩ挿入部を持ち、４匹のマウスは、この５゜Ｑｋｂ断片の先端か ら終端までの反復を持つこと力ｌ告諭出来るが。 しかしながら、この断片が何時どのようにして環状化され組み込まれるのかを識 別することは不可能である。 分娩から３３日目に総てのマウスは離乳され、　５０００　ｐｐｍのＺｎ５Ｏ４ （７６ｍＭ　）を含む水を足した固形餌料を与えられ、成長率が定期的に記録さ れた。　Ｚｎの投与量は、　５０００　ｐｐｍが、多くの月に渡ってこの餌料で 飼育されたマウスの繁殖能力を損なうことなく。 肝臓内のＭＴ−１ｍＲＮＡを殆ど最大レベルに誘導することを示した実験に基づ き選択された。 第３図は、　ＭＧＨ配列を含む７匹のマウスの成長を示す。　ＭＣＩ（配列を持 たない同腹子が便利な対照となっている；各性別ごとに体重は平均されている。 　雄の体重は中を塗りつぶした記号で示され、３匹の兄弟の平均標準偏差値が示 されている。ＭＧＨ−２１は第７２日に死亡した。 ＭＣＩ＋配列を持つ６匹のマウスが、対照を大幅に上回る体重増加（最大１．８ 倍まで）を示した。　ＭＣＩ＋−１６を例外として５体重増加とＭＧＨ遺伝子投 与量との間には相関がある。　ＭＧＨ配列のコピーを最も多く持つマウスＭＧＨ −２１は、急速な成長を続けた７週間後に死亡したが、他のマウスは更に成長を 続けた。 例■のような、　ｍｅｔａｌｌｏｔｈｉｏｎｅｉｎチミジンキナーゼ融合遺伝子 を持つマウスの研究に基づき、　ＭＧＨの最大の発現は、肝臓、腸及び腎臓に見 られると予測された。　）ＩＧＨ遺伝子発現の組織特異性の評価が、肝臓におけ るその活性の分析によって開始された。。 第５６日に実施した部分肝切除により、　ＭＧ）ｌ特異性配列の分離とＲＮＮス スロットハイブリダイゼーションによる定量を行うことが出来た。　肝臓内のＭ ＧＨｍＲＮＡの発現のレベルは、遺伝子組替え（トランスジェニック）マウスの 成長と相関関係を示した。　最大のマウス、　ＭＣＩ＋−２，１９及び２１は肝 臓に多量のＭＧＨｍＲＮＡを含んでいたが、より成長率の低いＭＧＨ−１０，１ ４及び１６は約５０倍はど低いレベルのＭＧＨｍＲＮＡを含んでいた。　核酸を ニトロセルロースにスポットする前に、即ち、ハイブリダイゼーションの後のＲ Ｎａｓｅ　ＡにＴ１を加えたものによる処理の前に塩基の加水分解を行ったサン プルの分析は、潜在的な汚染の可能性を持つＤＮＡではな（ＲＮＡが探針にハイ ブリダイズしていることを立証した。　これらのデータから、　ＭＧＨ−２，１ ９及び２１の肝ＲＮＡの３０μｇは、それぞれ、ポリ　（Ａ）＋ラット下垂体Ｒ ＮＡ　１３，２５．及び５０ｎｇと同量のＧＨｍＲＮＡを含むものと推定された 。　使用されたＲＮＡ標準は、　Ｒｏｔ分析に基づき約１０％ＧＨｍＲＮＡを含 み、従って、これら遺伝子組替えマウスの肝細胞１つは約８００から３０００　 ＭＣＩ（ｍＲＮＡ分子が存在するものと推定された。 融合遺伝子内の総てのプロセス信号が正しく判別されているとすると、１つの融 合ｍＲＮＡ　（真正なＧｔ（ｍＲＮＡより６３ヌクレオチド′はど大きい）が生 み出されることになる。　ＭＧＨ−２１の肝ＲＮＡの変性ゲル電気泳動法及びＲ ＮＡ　Ｎｏｒｔｈｅｒｎプロット分析は、そのサイズが真正のマウス及びラット 下垂体ＧＨｍＲＮＡと区別出来ないことを示した。　対照マウスの肝ＲＮΔはＧ Ｈ反応配列を示さない。　ＲＮＡプロット分析のために使用されたＧＨＤＮＡ探 針がラット及びマウスＧＨｍＲＮＡを共に識別するので、肝臓内のハイブリダイ ゼーション種は実際に融合遺伝子の生成物であり、内在性のマウスＧＨ遺伝子の 予期しない活動開始によるものではないことを証明する必要がある。　融合遺伝 子の構成にＸｈｏ　Ｉリンカ−を使用すると、　ＭＧＨｍＲＮＡ内にのみ存在す るある配列を生み出す。　それゆえ、ｐＭＧＨのＸｈｏ　１部位は、Ｔ３２　Ｐ −ＡＴＰ及びポリヌクレオチドキナーゼを用いて標識をつけられ、　Ｓｓｔ　Ｉ によって切断される。　この２１７ヌクレオチド断片はゲルによって純化され、 変性され、一本鎖特異性ヌクレアーゼ保護検定におけるハイブリダイゼーション 探２６　特表昭５８−５（１２１８０（８）針として使用される。ＭＧＨｍＲＮ Ａへのハイブリダイゼーションは８７４塩基ヌクレア一ゼ耐性断片を生み出すと 考えられるが、マウスＧ）Ｉ　ｍＲＮＡ或いはｍｅｔａｌｌｏｔｈｉｏｎｅｉｎ 　ｍＲＮＡはキナーゼ末端を保護することが出来ず、従って陰性である。　この 分析の結果は、予測された７４塩基断片がマウスＭＧＨ−２１の肝ＲＮＡに存在 することを示したが、正常なマウスの下垂体ＲＮＡ　、対照マウスの肝ＲＮＡ　 、或いは。 成長に関して陰性であったマウスＭＧＨ−３の肝ＲＮＡ内には存在しないことを 示した。　このように、転写は、　ＧＨ遺伝子のＭＴ−１１西モーターにおいて 正しく開始し推定上の末端部位まで続いているように、４つのＧＨ介在配列は正 しくスプライスされているように。 そして、　ＭＧＨｍＲＮＡはポリアデニル化されるように思われる。 ＭＧＨｍＲＮＡレベルとマウスの成長の相関関係は、　ＭＧＨ遺伝子の発現は観 察された生物学的な結果を説明していることを示唆している。　この予測は、上 記の３つの独立したＲＮＡ分析によって支持され、　Ｇｌ（の循環レベルは上昇 していることを予測している。　遺伝子組替えマウス及び同腹子から血液が採取 され、　Ｄｏｅｈｍｅｒ等。 Ｐ、Ｎ、八、Ｓ、５皿、　ｐｐ、　２２６８−２２７２　（１９８２）の手順に よって標識免疫検定法によりＧＨを検定された。　その結果は下記の累積表２に 示表１ マウス　性　ＭＣＩ（遺（ゴｉａｌ　ＭＧＨｍＲＮＡ（ｂｌ　成長ホルモンｔｅ ｌ　成長数／細胞　分子／細胞　μｇ／ｍｌ　ダラム　率ＭＧＨ−２雌　２０　 ８００　５７　４１．２　１．８７ＭＣｌ＋−３雌　１　＜５０　０．８７　２ ２．５　１．０２ＭＧＨ−１０雄　８　＜５０　０．２８　３４．４　１．３２ ＭＧ）ｌ−１４雄　２　＜５０　０．３１　３０．６　１．１７ＭＧＨ−１６雄 　２　＜５０　１７．９　３６．４　１．４０ＭＧＨ−１９雄　１０　１５００ 　３２．０　４４．０　１．６９ＭＧＨ−２１雌　３５　３０００　１１２．０ 　３９．３　１．７８雌同復子　０　０　０．１６±０．１　２２．０±０．８ （ｎ　＝　３） 雄同腹子　０　０　０．１５±０．０８　２６．０±２（ｎ　＝１１） ｆａｌ　ＤＮＡ　ドツト・ハイブリダイゼーション及びシンチレーション・カウ ンティングによって推定された。 （１））　ＲＮＡスロット・ハイブリダイゼーションによって推定された。 ｔｅｌ　Ｄ　ｏ　ｅ　ｈ　ｍ　ｅ　ｒ等が記述した標識免疫検定法（１？ＩＡ　 ’）によって測定された。 （ｄｌ　第６４日の実験動物の体重。　同性の同腹子と比較した体重比を示す（ 第３図をも参照のこと）。 ４匹の遺伝子組替えマウスの値は、対照同腹子のレベルの１００倍から８００倍 大きかった；１匹のマウスはその血清に１１２μｇ／ｍ１のＧＨを示した。　そ れより遅くはなるが充分に高い成長率を示した２匹の遺伝子組替えマウスは１通 常範囲の上限付近のＧＨレベルを血清に示した。　これらの動物内のＧＨの生理 学的な調節の欠如と異所性の生産が、それらの成長の促進を恐らく説明するもの と思われる。　Ｚｎが成長率に与えた正確な影響は、これまでのところ完全には 検討されてはいない。　第３図に示されるように。 殆どの動物は、　Ｚｎ食餌が開始される前から正常なものよりも大きかったこと は明白である。　更に、動物の１匹（ＭＧＩ（−１９）は、第５６日以降ばＺｎ 食餌を中止されたが、加速された成長率で成長を続けた。　ＭＧＨ遺伝子の多く のコピーを持つマウスは１重金属の誘導を必要とすることなしに、過剰なＧＨを 体質的に作り出すとも考えられる。　それゆえ、　Ｚｎに依存する成長という問 題は、マウスの子の分析によって最も容易に解答かえられるであろう。　１匹の マウスＭＧＨ−１０がＭＧＨ遺伝子をその子の半分（１９匹のうちの１０匹）に 伝え、これらの遺伝子がその染色体の１つに安定的に組み込まれていることを示 唆していることが、暫定的に指摘出来るように思われる。　ＭＧＨ遺伝子を持つ １０匹の子は５匹づつの２つのグループにわけられた。　離乳の後に、１つのグ ループは、その食餌に５０００　ｐｐｍ　ＺｎＳＯ４を加えられたが、もう１つ のグループには加えられなかった。　亜鉛が投与されたちのは、「対照区の約１ ０倍の循環Ｇ）ｌレベル（ＲＩＡにょゲご測定）を示した。 これらのデータは、これらマウスの変更された表現型はｍｅｔａ１１ｏｔｈｉｏ ｎｅｉｎ成長ホルモン融合遺伝子の組み込みと発現の直接の結果であることを強 力に示唆している。　これらマウスの幾匹かに見られたＧＨの異常に高いレー・ ルは、肝臓内の高レベルの罰ＨｍＲＮＡ　（１細胞当たり最大３０００分子）に 対応する。　肝臓内のＭＣＩＩ　ｍＲＮへの蓄積量は、　’ＭＴ−１ｍＲＮＡの 内在性レベルとがわらないものであるが、先に研究されたｍｅｔａｌｌｏｔｂｉ ｏｎｅｉｎチミジンキナーゼ融合遺伝子から得られたもののレベルの約１００倍 はど高い。　コノ差は、　ＴＫ　ｍＲＮＡと比較してのＧｌｌ　ｍＲＮＡの生来 の安定性の結果であるように思われるが、しかしながら、融合遺伝子の構造の相 違によるプロセス効率の転写率の違いによる可能性もある。　遺伝子組替えマウ ス内の高レベルのＭＧＨ遺伝子の発現は、異なる組織内でのＭＧＨ（！：ＭＴ− １ｍＲＮＡ生成の直接の比較に多いに役立ち、染色体内での位置がＭＴ−１プロ モーターの組織特異性発現に重要な影響を持つか否かの問題番取り扱うことを可 能にする。 遺伝子組み替えマウスの幾匹かの成長ホルモン・レベルは、正常なマウスのレベ ルの８００倍にも達し、影響を受けない同腹子の体重の２倍近くの動物を生み出 した。　この超生理学的なＧＨの蓄積は、疑うことなく、正常なフィードバック 機構の欠如と、肝臓。 腎臓、及び腸を含む多くの大きな器官内でのこの遺伝子の発現とを反映するもの である。　高レベルのＧＨに長期に渡ってさらされる影響は、入念に研究されて おり〔Ｒｉｃｈｍｏｎｄ等７ム７、。 ４９、ｐｐ、　１６３−１６７　（１９７８）を参照のこと〕、巨大症と呼ばれ る病的な状態をもたらす。　ヒトにおけるこの状態は１通常は下垂体腺腫に関連 するが、肺癌によるＧＨの異所性発現に関連することも稀にはある。 Ｇ）Ｉの法尻な影響のうちのあるものは、ホルモンによって直接媒介される。　 しかしながら、　ＧＨの主要な影響は肝臓内でのソマトメジンの生成を刺激する ことであると一般には考えられている。 ソマトメジンは、インシュリンに似た成長要素であり、筋肉１軟骨、及び骨のよ うな中胚葉組織の増殖を促進するものである。 ＧＨ反応へのソマトメジンの関与は、正常なものよりも循環ＧＨレベルが僅かに 高いだけの動物、ＭＧＨ−１０，１４，１６等の成長に対する１つの説明を与え る。　これらの動物においては、肝臓内で生成されたＧＨは１局所的なＧＨ濃度 が比較的に高いので、ソマトメジンの生成を刺激するにば充分であるのかも知れ ない。　このように。 これらの動物においては、　ＧＨはある種のホルモンの局所的なｐａｒａｃｒｉ ｎｅ機能を擬似する可能性がある。 上記の例は、マウスｍｅｔａｌｌｏｔｈｉｏｎｅｉｎ−１遺伝子プロモ一ター／ レギユレーターＤＮＡ配列のカドミウム及び亜鉛に対する応答という一般的なコ ンチクストの中で本発明の実際を例示するものであるが、それに対して特定の配 列が応答を示すので融合遺伝子発現を調節するのに使用出来る可能性のあるその 他の物質が数多く存在することは明白である。　本発明の実施において有用なそ の他の金属には、鉄、コハルトニソケル、銅、銀、金、水銀、及びビスマスがあ る。　マウスにおける？ｌＴ−’Ｉプロモーター／レギュレーター配列の研究に よると、この配列が応答を示す可能性があるステロイドとしては１発情ホルモン 物質、プロゲスチン、アンドロゲン及び、特に、デキサメサゾンのようなグルコ コルチコイドがある。上記のプラスミドｐＭＫに関連した形質転換においてＭＴ −■プロモーター／レギュレーター配列がデキサメサゾンにはっきりした応答を 示さなかったことは、（ｐＭＫに存在するものよりも）幾分か大きな５’　ＭＴ −１配列が、ステロイド応答性を保持するのに必要であるか１或いは８単に実験 操作手順になんらかの変更が必要であるかを示している可能性がある。　既に指 摘したように。 本発明の実施における使用に通したその他の金属及び／或いはステロイド・ホル モン応答性プロモーター／レギュレーター配列が意図される。　それらは哺乳類 及び鳥類の細胞超厚のもの〔例えばチキン・オハルブミン及びトランスフェリン （コナルブミン）遺伝子及びマウスｍｅｔａｌｌｏｔｈｉｏｎｅｉｎ−ＩＩ遺伝 子の転写と発現に関連する配列〕及びウィルス性配列（例えば、マウス乳房腫瘍 ウィルス配列）を含むことになろう。　これらのプロモーター／レギュレーター 配列は９種々のステロイド、例えばエストロゲン、プロゲスチン、アンドロゲン 、及びグルココルチコイドに応答する可能性がある。 ｐＭＫ及びｐＭＧＨに代表されるようなプラスミド・ヘクターは。 本発明に基づく多くの胚注入及び形質転換手順に適しているが。 選択されたＤＮＡ配列を、そしてそれには金属及び／或いはステロイド・ホルモ ン応答性プロモーター／レギュレーターＤＮＡ配列が融合されるが３運ぶために その他の多くのヘクターを構成することが出来ることは理解されるであろう。 外来性ＤＮＡ配列を宿主細胞に安定的に組み込む際に使用される融合遺伝子の生 成は、上記の例において特に例示された。　真核細胞の及びウィルスのゲノムを ５例えばＭｏｃａｒｓｋｉ等、並旦１例。 ｐｐ、　２４３−２４５　（１９８０）　；Ｐｏ５ｔ等、並旦、　２４．　ｐｐ 、　５５５−５６５　（１９８１）；及びＰｏｓ　を等、並置、　２５．２２７ −２３２　（１９８１）に示された手順によって８内在性或いは外来性金属及び ／或いはステロイド・ホルモン応答性プロモーター／レギュレーターＤＮＡ配列 の部位特異性挿入の対象とすることが出来ることは１本発明の考察内にある。 これまで説明し例示した本発明の多数の改良及び変更が本技術に熟達した方々に 着想されると予測される。　−例として２本発明は、高等動物、　（例えば畜生 ）及び植物のＤＮＡ配列の転写の調節を確実に行って、遺伝的欠陥を直し、病気 に対する耐性を与え。 或いは好ましい遺伝的特性を与えるのにもっとも有用であると予測される。 内包された可能性としては１例■、■及び■に例示されたように本発明を使用し て、商業的に価値のある動物５例えば畜生の早い成長を刺激することがある。　 利益はより短い生産期間と、？３らく上昇する食餌利用効率とからもたらされる ものと考えられる。 肉の品質も、ＧＨがアデュボサイトの生成を培養下で刺激することが最近明らか にされたように（Ｍｏｒｉｋａｗａ等、　Ｃｅ１ｌ、　２９．７８３−７８９　 （１９８２＞を参照のこと〕、生体内においても刺激するとすると。 改善されるであろう。　ＧＨがプロラクチンと同種であり、プロラクチン・リセ プクーに結合することを考慮すると、牛乳の生産も格段に増加される可能性があ る（Ｓｈｉｕ等、　Ｊ、Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、＋　２４９、ｐｐ、　７９０２ −７９１１　（１９７４）　、及びＰｅｅｌ等、　Ｊ、　Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎ、 　ＬＬＬＬｐｐ、　１６６２−１６７１　（１９８１）　）。　調節可能なプロ モーターを確保することは、　ＧＨの時機にかなった発現にも特に有利である。 　これらの技術の大動物への適用は、上述したマウスへの適用例よりも幾分かは 難しいように思われる。　にもかかわらず、望ましい形質をもたらす遺伝子が分 離される時が来れば、このアプローチは伝統的な繁殖法への貴重な追加となるで あろう。　マウスにおける外来性の遺伝子の組み込み及び調節された発現の条件 を最適化することは、これらの技術のその他の動物へ適用を促進するものと信す る。 その他の大きな可能性としては、この技術を成る種の遺伝病を直す或いは模擬す ることがある。　マウスには幾つかの生まれつきの短小形系統がある。　その１ つである１ｉｔｔｌｅは、ＧＨを欠き。 同型接合の場合は約半分のサイズであるＣＢｅａｍｅｒ等、　Ｊ、　Ｅｎｄｏｃ ｒｉシー、　７１．　ｐｐ、　３７−４５　（１９７６）を参照のこと〕。　こ こに記述した融合遺伝子を導入すれば、これらの動物の正常な成長を回復させる 可能性がある。　一方５これらの実験は巨大症を起こすことも可能であることを 示している。　これらのマウスが同型接合のストックを持って生まれると、過剰 ＧＨ生産の結果に関する生化学研究に有用なモデル・システムを提供するであろ う。 最後に、実験■から■までの幾匹かのマウスにおける成長ホルモンの生産の成功 は１本発明の手順を家畜のその他の重要なポリペプチドにまで拡張して適用する 可能性があることを示唆している。　ＭＧ！（−２１血清のＧｌｌ濃度は、　Ｇ Ｈの生産の為に遺伝子工学的操作を受けた細菌細胞或いは哺乳類細胞培養から収 穫されたと報告された濃度よりも１０倍から１００倍高かった［Ｇｏｅｄｅｌｌ 等、　Ｎａｔｕｒｅ。 ２Ｂ１．　ｐＩ＋、　５４４−５４８　（１９７９）　；　Ｐａｖｌａｋｉｓ等 、　Ｐ　Ｎ　Ａ　Ｓ　、　ｌ、ｐｐ、　７３９８−７４０２　（１９８１）　； 　Ｄｏｅｈｍｅｒ等、　Ｐ、Ｎ、Ａ、Ｓ、、　７９．　ｐｐ、　２２６８−２２ ７２（１９８２）　；及びＲｏｂｉｎｓ等、仮置、　２９．　ｐｐ、　６２３− ６３１　（１９８２）を参照のこと〕。　この「遺伝農業」概念は、動物内で貴 重な抗血清を生成することと似ているが、授精卵へ遺伝子を１度注入することが 、多数回の身体への注入と代わっている点が異なる。　そればかりか２選択され た遺伝子の発現が遺伝的なものになることは充分に考えられる。　このアプロー チは特に、関心のある蛋白質が、活性或いは安定性を得るために特別な共有変更 （例えば、蛋白質分解切断、グリコジル化５或いはＴ−カルボキシル化）を必要 とする場合に適用出来ると考えられる。 従って１本発明には請求の範囲に述べた限定のみが与えられるものである。 国際調査報告

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １６　選択されたＤＮＡ配列を外部の制御下に置く為のプロセスで。 前述の配列に金属及び／或いはステロイド・ホルモン反応性プロモーター／レギ ュレーターＤＮＡ配列を操作的に関連させることから成るもの。 ２、請求の範囲第１項のプロセスで、前述のプロモーター／レギュレーターＤＮ Ａ配列がマウスｍｅｔａｌｌｏｔｈｉｏｎｅｉｎ−Ｉプロモーター／レギュレー ター配列であるもの。 ３、選択された外来性ＤＮＡの転写と発現を宿主細胞内で確実に生しさせる為の 遺伝子工学的プロセスの、前述の細胞内では前述の選択されたＤＮＡ配列は宿主 の染色体内或いは染色体外物質として安定的に組み込まれるが１次のような改良 ：操作的にプロモーター／レギュレーターＤＮＡ配列を前述の選択されたＤＮＡ 配列に関連させることによって前述の選択されたＤＮＡ配列を外部の制御下に置 くことで、前述のプロモーター／レギュレーター配列は金属イオン及び／或いは ステロイド・ホルモンの濃度の環境的変化に反応する。 ４、請求の範囲第３項の改良であり、前述のプロモーター／レギュレーターＤＮ Ａ配列が、マウスｍｅｔａｌｌｏｔｈｉｏｎｅｉｎ−１と作用的に関連するプロ モーター／レギュレーター配列グループから選択されたものであるもの。 ５、宿主細胞或いはウィルスの遺伝子的形質転換への使用に適した融合遺伝子生 成物であり、前述の生成物が次のものからなるもの：金属及び／或いはステロイ ド・ホルモン反応性プロモーター／レギュレーターＤＮＡ配列と関連した前述の 宿主細胞に操作的に取りこまれるＤＮＡ配列う ６、請求の範囲第５項に従う融合遺伝子を含むＤＮＡプラスミドを含んだ遺伝子 的形質転換ヘクター。