JPH03500482A - ホスホエノールピルベート カルボキシキナーゼに係る遺伝子のプロモーターの制御下における、遺伝子導入動物の外来遺伝子の発現の食餌およびホルモンによる調節 - Google Patents
ホスホエノールピルベート カルボキシキナーゼに係る遺伝子のプロモーターの制御下における、遺伝子導入動物の外来遺伝子の発現の食餌およびホルモンによる調節Info
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。
Description
に係る遺伝子のプロモーターの制御下における、遺伝子導入動物の外来遺伝子の
発現の食餌およびホルモンによる調節
関連出願
本出願は現在、審査中であり、ここに引用して組入れる、1987年6月16日
付出願のSer、 No、07/62.654の一部継続出願である。
優先権が35 U、S、C,120に基づき主張される。
発明の背景
発明の分野
本発明は遺伝子導入動物および組織培養細胞における外来遺伝子の発現の制御に
関する。
清報開示
農業において動物が特定の特質[trait]を有することが、しばしば望まれ
る。伝統的にこれは、この特質の交配によって達成されていた。しかし交配には
多くの欠点がある。すなわち動物ラインで所望の特質を定着させるためには、何
世代もが必要とされる。交配された動物が最終的にその特質を獲得した時には、
これらの動物はまた、別の望ましからざる特質をも取得してしまう。特定の各動
物が所望の特質を獲得することにつき保障はない。
そこで動物の表現型操作に関する、よりよく制御された手段が探求されてきた。
組換えDNA技術の発展は、このゴールを達成するのに有用な道を提供した。理
論的には、ある特質が動物に欠落している特定の遺伝子と組合わされている場合
には、この遺伝子を動物に導入することができ、これによってその特質を持つよ
うに、その表現型を改質することが可能である。勿論、克服されなければならな
い多くの障害がある。特定の特質と組合わされている遺伝子を同定しなければな
らず、また単離しなければならない。適当な調節配列をこれらの遺伝子に機能的
に結合させ、特質を適度に発現させなければならない。生じるユニットは受容動
物の細胞中に安定に導入されなければならない。その時、寅にその時にだけ「導
入遺伝子J (trangene)は意図したとおりに機能することができる。
導入遺伝子は、遺伝子導入動物において、選ばれたプロモーター/調節ドメイン
の制御の下に発現させることができる。このプロモーター/調節ドメインはその
遺伝子が構造として(一定の比率および一定のレベルで)、発現されるか否か、
あるいは遺伝子が異なる環境刺激によって、沈黙しているか、または誘導される
か、を決定する。シトゾールホスホエノールビルベート カルボキシキナーゼ(
P E P CK XE C4,1,1−32)プロモーターは、後者のタイプ
のプロモーター/調節ドメインの例である。
外来遺伝子が本質的に発現される場合には、この遺伝子の相当するタンパク質生
成物の一定の発現が宿主動物に対して望ましくない作用を有することがある。こ
れは、遺伝子のプログラムされI;発現が通常の発育に必要である場合に、胚形
成期間中に特に有害である。従って、誘導性まI;は抑制性のプロモーターによ
って、遺伝子の発現を制御することが望まれる。さらにまた、これらの変更は容
易に行われることから、食餌の変更に対して、制御可能な様相で応答できるプロ
モーターを使用することが望ましい。
かなりの誘導しうるプロモーターが知られている。このようなプロモーターの一
つは、UtterおよびKurahashiにより1954年に発見されt;糎
新生酵素であるPEPCKのシトゾール型(cytosolic form)の
遺伝子の発現を調節する。この酵素は肝臓、腎臓皮質および白色脂肪組織で高い
特異活性を有し、さらに低いレベルでは肺および空腸で特異活性を有する。Ha
nsonおよびGarberによるAm、 J、 Cl1n、 Nutriti
on、 25 : 1010(1972) ; UtterおよびKuraha
sh iによるJ、 Biol、 Chem、 207 : 287(1954
)。PEPCKのシトゾール型およびミトコンドリア型は、両方ともに、異なる
核遺伝子によってコードされる。両型のPEPCKの発現はともに、種特異的変
異である。ラットおよび鶏における、この酵素のシトゾール型の遺伝子は単離さ
れ、特徴付けられている。Yoo−Warren等によるPNAS 80 :
3656−60(1983Xラツト)およびRod、 Yoo−Warrenお
よびHansonによる、J、 Biol、 Chem、。
259 : 15609〜15614(1984X鶏)。
糖新生は全ての背椎動物において、グルコース恒常性を支持するために、非ヘキ
ソース前駆体をグルコースに変換するプロセスである。これは、肝臓および腎臓
皮質だけで生起する。うクテートからの糖新生(Coriサイクル)は13の酵
素を包含し、そしてまた、クエン酸サイクルにおいて、または解糖においても役
割を演じる数種の反応と、このプロセスに特異的である他の反応とを包含する。
グルコース合成の主要前駆体は、乳酸に加えて、ピルビン酸、アミノ酸(たとえ
ば、アラニンまたはグルタミン)およびグリセロールである。この経路は、飢餓
期間中または糖尿病中に、刺激され、そして食餌炭水化物によって弱められる。
糖新生の主要ホルモン制御体は糖新生を刺激するグルカゴン(これはcAMPを
介して作用する)およびグルコースの合成を抑制する、インシュリンである。解
糖からのグルコースの新規合成(糖新生)を、肝臓および筋肉にグリコーゲンと
して貯蔵されている、予め形成されているグルコースの分解と区別することは重
要である。PEPCKは糖新生経路において最初に行われるプロセスであり、こ
のプロセスにおけるベース設定酵素(pace−setting)である。この
酵素のための遺伝子の格別の誘発可能性は、PEPCKがグルコース恒常性を維
持する際に演じる重要な調節位置に反映する。
肝臓において、PEPCKはグルカゴン、エビ不フィリン、ノルエピネフィリン
、グルココルチコイド類およびチロキシンによって誘発され、そしてインシュリ
ンによって脱誘発される。
腎臓においては、アシド−シスまたはグルココルチコイド類はPEPCK発現を
高め、他方、アルカロシスはPEPCK合成を阻害する。さらに、脂肪組織にお
いては、ノルエピネフィリンおよびエビ不フィリンはPEPCKレベルを押し上
げ、他方、インシュリンおよびグルココルチコイド類はこの酵素のレベルを減少
させるo Tilghman等によるGluconeogenesis: It
s Regulation in Mammalian 5pecies、 H
ansonおよびMeh1mang@(1976)の第2章として発表されたr
Hor+nonal Regulation or Phosph。
enolpyruvate Carboxykinase (G T P )
in Mammalian I”1ssuesJの表1参照。
PEPCK遺伝子発現のホルモンによる調部は組織特異性である。(i(ans
onおよびMehlmanによる前記文献参照)。しかしながら、この遺伝子の
組織特異性に対し、あるいは肝臓および脂肪組織のような組織中の不ルモンに対
する応答の差違に対し、応答できる配列に関しては僅かな情報しかない。
PEPCKの活性に対する食餌効果は知られている。24時間の飢餓は酵素活性
の3倍の増加をもたらし、これは炭水化物含有量の高い食餌(たとえば、グルコ
ース、7ラクトースおよびグリセロール)によって逆行され、あるいは高タンパ
ク質食餌の再供給によって悪化される。ShragO等によるJ、 Biol、
Chem、、 238 : 3188(1963)。PeretおよびCha
nezによるJ、 Nutrition。
106 : 103(1976)−二よれば、高タンパク質食餌は哺乳動物(ラ
ット)に3いて、肝PEPCKの活性を誘発させ、食餌中のタンパク質含有量が
増加するほど、この活性は増大した。もう一つの糖新生酵素である、ピルベート
カルボキシラーゼは、この方法では影響されなかった。
哺乳動物において、母親からの血液供給は出生時点で止められ、過渡低血糖が生
じる。これは、血漿インシュリンの濃度を降下させ、そしてグルカゴンのレベル
を高める。この結果として、PEPCKの初期発現を誘発する、肝cAMPの濃
度は増加する。この酵素の出現によって、糖新生経路は完成し、これによって、
肝糖新生が開始される。
シトゾール型PEPCKをコードする遺伝子の発現を天然で調節するプロモータ
ーの配列はWynshav−Bor is等によるJ、 Biol。
Cbem、、 259 : 12161(1984)の第1図に示されており、
これをここに引用記載する。ホルモンによって誘発された動物の肝臓からの核内
のPEPCK遺伝子の転写率は高いことが知られており、これは熱−シオック遺
伝子に関して報告されている転写率に匹敵する。Meissner等による前記
文献(1983)の第I表参照。
rPEPcKプロモーター」のある調節ドメインは同定されている。Wynsh
av−Boris等によるJ、 Biol、 Chem、、 261 : 97
14(1986年7月25日) ; 5hort等によるJ、 Biol、 C
hem、 261:9721(1986年7月25日)。このPEPCKプロモ
ーターはヘルペスウイJレスチミジンキナーゼ(TK)遺伝子およびトランスフ
ェクションされたヘパトーマ(FTO−2B)細胞中のアミノ−3′−グリセリ
ンホスホトランスフェラーゼ(A G P Tもしくはネオレジスタンス)の両
方の発現の制御に使用されている。TKおよびAGPTの合成は両方ともに、e
AMPおよびデキサメタソンに対して応答性である。Id、; Wynshav
−Boris等によるBiotechniques、 4(2) : 104(
1986)。
酵素(ヘキソキナーゼ1および2、ホスホグルコースイソメラーゼ、ホスホグリ
セレート キナーゼ、チロ−スホスフェートイソメラーゼ、ホスホグリセレート
ムターゼ、ピルベートキナーゼ、ホスホ7ラクトキナーゼ、エノラーゼ、7ラ
クトーズ1.6−ジホス7エートアラドラーゼ、グリセルアルデヒド3−ホスフ
ェート デヒドロゲナーゼ、および解糖調節タンパク質)をコードする遺伝子を
制御する酵母プロモーターの使用を唱道した。これらのプロモーターは異種遺伝
子を結合し、形質転換した酵母細胞中の相当する遺伝子の発現の制御に使用され
る。
Kawasakiは、一般的方法として、適当な栄養培地を選択することにより
、その発現を調節することを引用している。しかしながら、彼はいずれかの組換
え遺伝子の発現および定められた遺伝子産物の産生については、酵母プロモータ
ーおよび酵母細胞に制限されると述べている。この遺伝子産物はまた、これらが
酵母細胞から放出されるものであることによって、不都合にも、グリコジル化さ
れてしまう。
さらにまた、この解糖できる酵母プロモーターは、完全動物では使用できず、ま
た酵母以外の有機体では発現することができない。
Kingsmanは、米国特許4,615.974において、イースト由りアル
ファ インターフェロン発現の制御に解糖経路プロモーターである酵母ホスホグ
リセレート キナーゼ(PGK)プロモーターを特定的に使用している。この生
成はグルコースを培養培地中に導入することによって誘発されている。
しかしながら、Kawasaki またはK11g5+nanのどちらにも、完
全動物の細胞における導入遺伝子の発現に対する食餌の使用、あるいは出生後に
だけ実質的に活性である遺伝子系の選択に関しては検討されていない。
Konradは、米国特許4,499.188において、TRPプ0−E−一タ
ーの制御下における形質転換細菌細胞中の異種(heterologous)遺
伝子の発現に関して述べている。この培地は初期に、トリプトファンに冨むもの
であり、これによって、その遺伝子を抑制している。細菌の生育はトリプトファ
ンを消費し、その結果として、遺伝子にスイッチが入る。しかし、このtrpプ
ロモーターの使用は原核細胞に制限されている。
Pa1m1terは、米国特許4,579.821において、組換えr D N
Aベクターを微量注入した胚から成長した成熟マウスにおけるヘルペス ウィ
ルスチミジンキナーゼ(TK)遺伝子発現を開示している。このベクターは、マ
ウスメタロチオネイン−I(MT−■)プロモーターに作動できるような状態で
結合しているTK遺伝子を含有する。このプロモーターはカルシウムのような重
金属またはデキサメタシンのようなステロイドホルモンの投与により調節可能で
ある。遺伝子導入動物に重金属を供給することによって、このプロモーターまた
はマウスMT−nプロモーターを誘発させる方法は格別の急性および慢性の毒性
および奇形原性によって、本質的な制限を受ける。さらにまた、MT−Iプロモ
ーターは、PEPCKプロモーターとは異なり、胎児発育中に活性であるので、
結合した外来遺伝子の胎内発現は遺伝子導入胎児に対して有害な作用を及ぼす。
PEPCKプロモーターはデキサメタシンを使用して誘発させることができるが
[Wynshaw−boris等(1966)参照]、グルココルチコイドに対
するよりも肝cAMPに対して実質的により応答性である。確かに、肝PEPC
K活性は副腎摘出動物において、飢餓により誘発させることができるが、栄養充
分の食餌を食べている。副腎摘出動物にデキサメタシンを注入しても、PEPC
K活性は誘発されない。Re5hef等によるJ、 Biol、 Chem、
244 : 5577−81(1969)。
PEPCKプロモーターは、MTiTiブロモ−ターキサメタシンによる誘発に
比較して、さらに強力にかつまた容易に、c A M Pにより誘発される。さ
らに、遺伝子導入動物では、PEPCKプロモーターの発現は動物食餌のタンパ
ク質含有量および炭本化物含有量の調節によって容易に変更される。
牛成長ホルモンまたは関連種の発現に、組換えD N A技術を使用することが
格別に重要であったことは、下記の参考刊行物によって証明されている:
MillerによるEP出! 47.600;RottmanによるEP出願6
7.026;De BoerによるEP出! 75.444;De Geete
rによるEP出願85.036;BuellによるEP出願103.395;R
oLtmanによるEP出願112.012;AvivによるEP出! 131
.843;HsiungによるEP出! 153.123:Kopchickに
よるEPH[161,640;Kr1viによるEP出願193.515;Av
ivによるGB 2.073.245:およびFraserによるUS 4,4
43,539゜RoLtmanによるEP出願67.026は特に注目され、こ
の出願にはbGH遺伝子のcDNA複製を有する寄託されているプラスミド(P
LG23)が記載されており、モしてEP出願112.012には、ゲノムBG
Hのヌクレオチド配列が記載されている。しかしながら、これらの刊行物には、
bGH発現の制御にPEPCKプロモーターを使用することは示唆されていない
。
本発明の要旨
我々は、PEPCKプロモーターが、遺伝子導入動物の選ばれ!二組織田で、P
EPCK以外の遺伝子の発現の調節に、特−別の有用1生を有することを見い出
した。
第一に、動物の食餌を変えることによって、外来的に制御することができる。動
物に、高タンパク質で低炭水化物の食餌を与えると、グルカゴンおよび(または
)エビネフイリンの分泌が生じる。これら2種のホルモンは、目漂組織のcAM
Pのレベルを高め、これによって、PEPCKグロモーター活性が次いで刺激さ
れる。食餌中炭水化物が増加するほど、インシュリンレベルは高められ、PEP
CK選伝子の発現は押えられる。
食餌操作はホルモン処置に比較して、より簡単で、経済的で、そして宿主動物に
対する潜在的有害性が少ない。
第二に、PEPCKプロモーターは、出生の互後まで有意には誘発されない。す
なわち、発育甲の胎児はPEPCKプロモーターに結合している異種構造遺伝子
の発達期間中、発現と戦う必要がない。1!l:寅として、PEPCK遺伝子の
発現は母親からのグルコースの供給が、ヘソの賭の切断によって止められた後に
だけ關始される。従って、本発明のPEPCK制御遺伝子発現系は、発達甲の胚
および胎児が結合した構造遺伝子の不適当な発現から防護されるという利点を有
する。
第三に、PEPCKプロモーターに結合した遺伝子は、正常では高レベルのPE
PCKを発現する細胞、すなわち肝臓および腎臓の細胞甲でだけ発現が認められ
た。我々は、この組織特異性がこのプロモーターの近接460bpにより付与さ
れるものと考える。
第四に、PEPCKプロモーターは、誘発された時に、非常に高レベルの発現に
よって特徴付けられる。Meisner等によれば(1983年)、餓死したラ
ットの肝臓中のPEPCK mRNAの転写工は3 、500ppmであった。
これに対してドロソフイラ(Drosoph i la)の熱シH”/り遺伝子
では3 、000ppmであり、中下垂体前葉のと成長享ルモンmRNAでは2
70ppmであり、そしてステロイド処置したラットの肝臓のメタロチオネイン
mRNAでは260ppmである。PEPCKに係るmRNAは約30分の半減
期を有し、従って、m RN Aレベルは、転写レベルにほとんど依存する。
PEPCKプロモーターは遺伝子は遺伝子導入動物における外米遺伝子の発現の
制御に特に有用であるが、このプロモーターはまた、細胞培養における真核生物
遺伝子による遺伝子の発現の制御に有用である。この場合には、その容易な誘発
性および高い脱誘発性、ならびに高いブロモ−ター強さがその根本的な利点であ
る。
外来遺伝子のインビトロ発現の場合には、PEPCKプロモーターは好ましくは
、c A M Pによって誘発させ、そしてインシュリンによって脱誘発される
。すなわち、c A M Pとインシュリンとは、遺伝子発現を最終的に制御す
るための1組の誘発体−抑制体系である。
本発明のその他の利点は、不明細書の記載、図面および特許請求の範囲を考察す
ることによって明白になるであろう。特許請求の範囲は一連の好適態様を表わす
ものとして、明細wrcpに例月することによって、ここに組入れられる。
図面の簡単な説明
第19は、シトゾール型(1)およびミトコンドリア型(2)のPEPCK酵素
の位置を示す、糖新生経路の図表である。
第2図は、PEPCK/bGH遺伝子を有する遺伝子導入マウスおよび同腹の仔
(白色動物)を示すものである。左側の大きい黒色の動物は、そのゲノム守に安
定して組込まれているキノラPEPCK/bGH遺伝子を含有する。
第3刃は、PEPCK/bGH導入遺伝子を含有するマウスの成長速度を示すも
のである。第2図に示されている動物TG:0PCKbGHコ 9F1は0.7
5mg/血清mQで中成長ホルモンを示し、その同腹の仔のサイズの2倍に成長
した。
第4又は、遺伝子導入マウスにおける血清中のbGHレベルに対する、高炭水化
物食餌効果、高タンパク質食餌効果およびBt、−cAMP投与の効果を示して
いる。パネルAでは、低レベルの血清bGHを示す、代表的遺伝子導入マウスを
高炭水化物食餌状態に1週間、維持する。この動物に、次いで、炭水化物を含ま
ない高タンパク質食餌を1週間与えた。指示間隔で、血液を尾静脈から採取し、
血清:bcuのレベルを測定した。
パネルBでは高レベルの血清bGHを示す代表的な遺伝子導入マウスを24時間
、飢餓状態におき、次いで高炭水化物食餌を1週間与えた。この動物に、次いで
炭水化物を含有しない高タンパク質食餌を、パネルAに記載のように与えた。パ
ネルCでは、2−4ny/mQ−1、Aug/mQの範囲の血清濃度でbGHを
示す、4匹の遺伝子導入マウスに、30分の間隔で3回連続して、Bt。
c A M Pおよびテオフィリン(両方ともに、30+ng/kg)を注射し
た。90分後に、マウスの尾静脈から採血し、血清中のbGH濃度を測定した。
血清中のbGHレベルの変化は「ホールドインクリーズJ (fold 1nc
rease)で表わす。パネルDでは、遺伝子導入マウスをパネルCに記載のと
おりに処置し、血清0bGH濃度の変化を測定した。
第5図には、PEPCK/bGH遺伝子を含有する遺伝子導入マウスにおける中
成長ホルモンm RN Aの組織特異的発現が示されている。bGHmRNAは
第6図に示されているbGH構造遺伝子およびPEPCKプロモーターを含有す
るDNA区分を、プローブとして使用するノーザン ブロッティング法により分
析した。各列は、それぞれ、遺伝子導入マウスから採取した、種々の組織から抽
出した総RN A 30ugを含有する。キメラPEPCK/bGH遺伝子によ
って産生されたm RN A let PEPCK mRNA 73bpおよび
bGHをコードするRNA 1.Obpを含有する。これら両種のmRNAの位
置は分子サイズマーカーとともに、図にl接に示されている。パネルAには、高
レベルのb G H(750ng/血清mQ)を示す遺伝子導入マウスの結果が
列1〜7で示されている;1−肝臓;2−肺臓;3−腎臓;4−心臓;5−肺臓
;6−脳;7−腸。パネルBには、低レベルのb G H(10ng/血清mQ
)を示す遺伝子導入マウスの結果が示されており、列1〜7はパネルAと貝−の
意味を有する。
第6図には、p P CG H溝築が示されている。PEPCKプロモーター/
選伝子のA−548〜+737ラグメントをpcH=でクローン化し、pPCb
GHを得る。
第7図には、AGPTまたはneoの構造遺伝子に結合したPEPCKプロモー
ターを含有するキメラ遺伝子の発現が示されている。第8図に示されている感染
性レトロウィルスから生じたmRNA(pLJPcKneo)の定量的S1ヌク
レアーゼマツピング;このレトロウィルスを、ITo−2B肝腫瘍細胞の感染に
使用した、すなわち妊娠19日のラットの腹腔内に注入した。pLJPCKne
o (第8図)からのB g I U / E CoRIフラグメント(860
pb)およびpBR322の630bpを含有する、I460pbのPvu 1
78g ] U7ラグメントを、Bg117部位で「p32」で末端・標識し、
細胞または肝臓から抽出した全RNAをハイブリッド形成させた。720bp−
yラグメントはレトロウィルスの5 ’ L T Riらの転写物であり(ウィ
ルスLTRRNA)そしテ375bp7ラグメントはPEPCKプt7モーター
からのRNA転写により保護される(PCK−ne oRNA)。
各列は下記のとおりであった: CON:非ホルモン;cAMP;INS;イン
シュリン;cAMP/rNs;−緒に添加されたホルモン; INS/cAMP
、cAMPの前の2時間の時点で添加されたインシュリン; cAMP+ IN
S、cAMP後の2時間の時点で添加されたインシュリン。胎児注入二側I〜5
.19ヨ今胎児として、子宮内でpLJPcKneoを注入され、そして20分
の間隔でc A M P (25ng/体重kg)を3回、rJ腔内注入により
投与された、1ケ月令のラットの肝臓がらのRNA。
このRNAをl離し、S1ヌクレア一ゼマンピング操作した。
右側の列1〜3は左側の列よりも長くさらした(48時間)。
全列はそれぞれ、前記のとおりの動物の肝臓がら、または細胞から嵐離した総R
N A 40ugを含有する。
第8図には、AGPTまたはneo構造遺伝子にM結されたPEPCKプロモー
ターを含有するレトロウィルスベクターが示されている。PEPCKプロモータ
ーの位置は、指示されている種々の調節エレメントとともに、BamHI/Bg
1m−7ラグメントとして示されている。レトロウィルスベクターpLJは図の
右側にサークルとして示されている。下方の図は、neo構造遺伝子に連結し、
レトロウィルスベクターのLTRの内部に含有されているF’EPCKプロモー
ター含有レトロウィしスベクターpLJPCKneoを示している。このプラス
ミドpLJPCKneoは第7図に記載の寅験に使用されたものである。
第9ヌには、PEPCK/bGH導入遺伝子を含有するマウスの5outher
nプロット分析が示されている。尾生検試料から抽出したマウスDNAをPvu
IfまたはKpnIのどちらかで消化した(ズ示されている)。マウスDNA
は親動物#34および子孫34−2.34−4.34−63よび34−7からの
ものであった。プラスミドpPCGHは、対照としてKpnIおよびPvulr
で消化しj;。制限酵素切断D N A 20ugを電気泳動により取り出し、
ニトロセルロース フィルターに移した。このフィルターを、ニック トランス
レーションにより標識したEcoRI−EcoRIPEPCK/bGH7ラグメ
ントとハイブリッド形成させた。
第10図は、高レベルのbGHを示すF1雄動物からのキメラPEPCK/bG
Hの系統を示すディファレンシャル トランスミッション(different
ial transmission)を示す血統図である。この図において、0
印は雄を表わし、Q印は雌を表わし、ダイアモンド印◇は導入遺伝子の組込みの
t;めの検定の前に死亡した動物を表わす。N印および■印はドツトプロット分
析法によって測定して、PEPCK/bGH遺伝子に対しへテロ接合体である動
物を表わす。遺伝子導入した雄の動物は、示されているように、C57BL6X
SJL雌と交配させるか、またはへテロ接合体遺伝子導入雌を交配させた。血清
bGHレベルはbGHng/血清rnQで表わす。表1に合わせて、Fl同腹仔
およびF2寛腹仔の番号を付ける。500ng b G H/血清mQを示す司
腹仔#2からのへテロ接合体F1雄をヘテロF1雄と雌との間の交配を示してい
る。
第11図は、PEPCK/bGH遺伝子導入豚とそ遺伝子導入層仔との間の比較
を示すものである。遺伝子導入豚#11(0印)と対照豚#12(4P印)に係
る、経過時間に対する背口の脂肪(backfat)の変化が示されている。背
田の脂肪の深さは、第−肋骨、最終肋骨および最終腰椎の部位で超音波により測
定し、得られた数値は平均した。
不発明の詳細な説明
水防E!AIFで使用されている「動物」の用語は、人間を含む、全ての背椎動
物を包含するものとする。この用語にはまた、胚および胎児状態を包含する全て
の発生段階にある各動物を包含する。
添付されている特許請求の範囲の目的に対して、「遺伝子導入動物J (tra
nsgenic anima+)は、組換えウィルスを微量注入するか、または
組換えウィルスを感染させることによるなどの単細胞レベルにおける遺伝子操作
によって、直接あるいは間接的に受け取った遺伝情報を有する細胞の1個または
2個以上を含有する動物のいずれかを意味する。この用語は、古典的な交配また
はインビトロ繁殖を包含することを意図するものではなく、むしろ、その1個ま
たは2個以上の細胞が組換えDNA分子を有する動物を包含するものである。こ
の分子は染色体内に組込まれていることができ、あるいは染色体外的複製DNA
であることができる。「生殖細胞ライン遺伝子導入動物」の用語は、遺伝1報が
生殖細胞ライン中に導入され、それによって、その情報を子孫に伝える能力が付
与されている遺伝子導入動物を意味する。このような子孫が寅際に、その情報の
一部または全部を有する場合には、これらの動物はまた、遺伝子導入動物である
。
情報は、受は入れ動物が属する動物種とは異種でることができ、たとえばラット
細胞中のと成長ホルモン遺伝子であることができる。情報は、その酵素を合成す
る能力が先天的に欠けている個体甲に導入された、酵素をコードする遺伝子のよ
うに、特定の各受容動物に対してだけ異種であることができる。あるいはぼた、
情報は、受容動物がすでに持っている遺伝情報であることができる。最後にあげ
I;場合においては、導入された遺伝子は、作動の結果として、先天的遺伝子と
は異なる条件の下で発現するか、またはさらに効果的に発現することができる。
さらにまた% rpEpcKプロモーター」の用語は、制限なしで使用する場合
には、いずれかの動物のゲノムのPEPCK遺伝子に係るプロモーターあるいは
それらの人工的等個物、ならびにc A M Pおよびインシュリンに応答する
その修飾物を包含する。従って、この用語は、PEPCKのミトコンドリア型ア
イソザイムをコードする遺伝子のプロモーターは包含しない。
PEPCKプロモーターは、その食餌制御シグナルに対する応答性を有すること
から、好適であるが、分娩後(出生後)にだけ有意に発現される他の遺伝子のプ
ロモーターもまた、動物甲に導入された遺伝子の発現の制御に価値があることが
ある。このようなプロモーターの一つはチロシンアミノトランスフェラーゼをコ
ードする遺伝子のプロモーターである。プロモーターは、遺伝子導入動物が出生
前にその遺伝子を実質的に発現させ現は許容されうるものと理解する。遺伝子の
種類は、その出生前における特定レベルでの発現が受け入れられるか、または受
け入れられないかを指図する。先天的PEPCKプロモーターの場合には、2種
の成熟した動物が2440および3432ミリ単位(IIIU) /肝臓ダラム
を発現することが見い巳されているが、胎児は40〜50mtl/肝臓gを発現
するだけである。すなわち、酵素活性の成熟対胎児発現の比率は約60=1であ
る。好ましくは、本発明のプロモーターは、少なくともlO:1の、結合遺伝子
の成熟対胎児発現比率を有する。好ましくは、本発明のプロモーターは少なくと
もlooOppmのシグナル強度、すなわちbGHプロモーターまたはMTプロ
モーターの約4倍のシグナル強度を有する。
さらにまた、食餌信号に対して応答性の他のプロモーターを使用できることも考
えられる。このようなプロモーターは、NADP−マレニート デヒドロゲナー
ゼおよび脂肪酸シンセターゼをコードする遺伝子に係るプロモーターを包含しう
る。これらは食餌グルコースにより刺激され(これはインシュリンを介して作用
する)、そしてグルカゴンにより阻害される。
PEPCKズコモーターは、対象の構造遺伝子のいずれもの、たとえば中成長ホ
ルモン、アデノシンデアミナーゼ、チロトロピン−放=性ホルモン、ベーターグ
ロブリン(オンコゲンを含む)をコードする遺伝子およびヘルペス ウィルスの
チミジンキナーゼ遺伝子および細菌トランスポゾンAGPT遺伝子のような標識
遺伝子の発現を制御するために使用することができる。
本明細書に記載の実験例において、PEPCKプロモーターは中成長ホルモン遺
伝子と結合させたが、本発明はPEPCK/bGH発現系に制限されるものでは
ないと理解する。
PEPCK/bGHの使用の合理性は散型に存在する。第一に、bGHの発現は
遺伝子導入動物の血清中で、ラジオイムノアッセイによって容易に検知される。
第二に、bGHの発現は遺伝子導入動物を表現型に変え、かくして、この動物は
PEPCK/bGH導入遺伝子を含有していない対照動物よりも大きいサイズに
成長する。第一に、牧畜用動物に適用すると、PEPCKのような活性プロモー
ターの制御の下に3けるbGHの発現は、遺伝子導入動物のサイズを増加しなが
ら、まI;これらの動物のタンパク質対脂肪の比率を増加し、従って、その身体
組成が変えられる。家畜における身体組成の変更に対するGHの有用性は証明さ
れている。しかしながら、現在、GH投与に関する唯一の方法は、動物へのW、
液注入である。それらのゲノムに組込まれたGH遺伝子を含有する遺伝子導入動
物を得ることができることは、商業的に格別に重要である。
遺伝子により改良された動物において結合導入遺伝子を誘導するために、PEP
CKプロモーターを使用するもう一つの例には、チロイド放!:2世ホルモン(
T RH)遺伝子に連結しI;PEPCKプロモーターを含有するキメラ遺伝子
を鶏の生殖ライン甲に導入するために、レトロウィルスベクターを使用すること
がある。TRHは成長因子である。このタンパク質を鶏に、それぞれ注入する方
法は労力を要し、かつまた高価である。
PEPCK/bGH系を使用する我々の実験的研究を下記に詳細に説明するが、
これは本発明を説明しようとするものであり、本発明を制限しようとするもので
はない。
中成長ホルモンゲノム配列は知られている。bGHゲノム挿入配列は牛脂盤ライ
ブラリィのラムダcharon28クローンがら分離した。Eco RI制限消
化は完全構造遺伝子を含有する4、3kb配列、5′−7ランキング配列1.7
kbおよび3′−7ランキング配列の400bpを取り出した。これを市販のプ
ラスミドpBR322のユニークEco R1側守にクローン化した。生成する
bGH)ランスファーベクターは公的に入手することができる。Woychtk
等によるNucl、 Ac1ds Res、、 10 : 7197(1982
年)参照。
bGH遺伝子、または他の対象遺伝子はゲノム白米のものである必要はない。こ
れはcDNA転写物であることができ、あるいは部分的に、または全体的に合成
されたものであることができる。「背景」の箇所で引用した、bGHクローニン
グに関する技術を参照することができる。
天然のラット肝臓(シトゾールW)PEPCKグロモーターの官能性部分の配列
(−548〜−1)およびPEPCK構造遺伝子の一部の配列(+1〜+73)
を第6図に示す。これはWynshav−Bor i s等(1984年)にも
とづいている。この文献に記載されているように、この621bp Bam H
I−Bglllフラグメントはチミジンキナーゼ構造遺伝子(pPCTK−6A
)に操作可能に結合されているプラスミドpopp中にクローン化されている。
グラスミドpOPFはまた、SV40エンハンサ−を含有しているが、この因子
はPEPCKプロモーターのホルモン応答を減少させない。
我々は、ラットからのシトゾール型PEPCKの遺伝子月のプロモーターを使用
したが、他のシトゾール型PEPCKプロモーターも、対象遺伝子の発現の制御
に有利に使用することができることは明白である。ミドフンドリア型のPEPC
K酵素は異なるプロモーターの制御の下で、構造として発現され、異なる遺伝子
によりコードされる。天然のミトコンドリア型PEPCKをコードする遺伝子と
組合されたプロモーターは本発明ではあまり価値がない。これは、このプロモー
ターがシトゾール型の遺伝子と貝−の短時間の調節を受けられないからである。
我々は、シトゾールをのPEPCKに係る天然プロモーターの官能性7ラグメン
トを使用したが、天然プロモーターの欠失変異種または置換変異種も特定の場合
に有利であることができる。一連の5′−欠失変異種は、5hort等により開
示されている(1986年)、この文献および背景の記載箇所で引用されt;他
の文献はPEPCKプロモーターの種々の調節ドメインの特徴を記載しており、
従って、これらの文献は配列の変化の場所に関する若干の指針を炎供している。
−例として、cAMP調面因子は−91〜−80にあるものと信じられる。−6
1〜−416x分はホルモン的に活性なエンハンサ−として働くことができる。
Wynshaw−Boris等(1986年)。
さらに、その他のグルココルチコイド(メタロチオネイン)およびcAMP(プ
レグロソマトスタチン、グラスミノーゲンアクチベーター、バンアクティブイン
テスティナルボリペズチド)応答因子の配列に関する考察はまた。PEPCKグ
σモーターの望ましい非天然型の発達あるいはPEPCK遺伝子の制御発現と組
合わされたD N Aの付加的調節領域を導く。
実験例に戻り、BamHI−BamHI7ラグメントはbGH−担荷プラスミド
から分離し、前記のδ21bpPEPCKグロモーター担持ユニットにより置き
換えた。置き換えられたDNAは、第6又に示されているbGH配列上の標識に
よって示されているように、bGH遺伝子の完全5′−フランキング配列を包含
していた。生成した融合遺伝子は、そのBgIM部位で、bGHの第一エキフン
の開始部位に結合しているPEPCK構造道伝予の第一エキフンの73bpを含
有している。しかしながら、PEPCKの翻訳開始部位は+73よりもさらに下
流にあるので、bGHJ伝子誘導子誘導mRNAbGHへの正常な翻訳は干渉さ
れない。
PEPCK遺伝子グ遺伝子タロモーター伝子への結合は、多分、別の制限酵素お
よび(または)リンカ−あるいはアダプタ−分子の使用を包含する、買様の手段
により達成することができる。PEPCKプロモーターが官能性のままであり、
対象の完全構造遺伝子を発現し、そしてPEPCKffi伝子の一部が所望のポ
リペプチドを包含する融合タンパク質の一部として発現しないことが基本的な考
え方である。
この点で、我々はキメラPEPCKプロモーター/bGH遺伝子担持プラスミド
を有する。所望の発現系を有する遺伝子導入動物を調製するするためには、多く
の従来から認められている技法を使用することができる。我々の寅験例では、所
望の宿主動物の胚細胞を微量注射により形質転換し、発達および成長を完了させ
た。
微量注射用のキメラ遺伝子を調製するために、細菌配列をEcoRI消化により
取り呂した。これにより、また、PEPCKの5′−7ランキング配列の87p
bが分離されI;が、このプロモーターは高タンパク質食餌により、およびcA
MPにより、誘発性のままであつI;。
好適態様では、1個の細胞の胚を、多卵性にされたC57BL6/S J Lマ
ウスの卵管からフラッシュにより採取する。この卵子をヒアルロニダーゼで洗浄
し、汚染矧胞を除去し、ラクテートおよびピルベートを含有する塩媒質中の、微
量注射用スライドに移す。LeiLz方向反転顕微鏡(divert 1nve
rted m1croscope)の下で、約1pQのDNA溶液(200コビ
イのPEPCK/bGH遺伝子)を含有する注射ピペットを、受精させた卵子の
雄生殖咳中に挿入し、このDNAを注入する[この技術に関しては、ヨogan
、 B、 Con5tanLini、 FおよびLacy、 E、によるrMa
nipulating the !Jouse EmbryoJ 、Co1d
Spring Harbor Laboratory。
1986年を参照できる1゜この卵子は16時間、インキュベートする。このイ
ンキュベーション時間の後に、生きている胚を偽擬妊娠マウスの卵管に再移植す
る。wagner等によるP、N、A、S、 (X1’) 78 : 6376
〜80(1981年)。これらのマウスを次いで、生産させ、6〜10匹の正常
のサイズの同腹子を得る。
遺伝子導入動物を調整するもう一つの方法は、対象の、または治療価値のある、
遺伝子を含有するレトロウィルスで予め移植した胚を感染させることによる方法
である。組換えD N A技術を使用することにより、レトロウィルスゲノムを
操作し、外来遺伝子および外来プロモーターを含有させることができる。
この組換えレトロウィルスゲノムはそのウィルスキャプシド内に包む事ができ、
生きている感染性ウィルスとして使用することができる。1個の細胞段階または
発生の最終段階の胚を、この組換えレトロウィルスで感染させることができ、こ
の外来遺伝子を含有するプロウィルスは宿主ゲノム中に、1個のコビイをして組
込むことができるようになる。従って、組換えレトロウィルスによる感染は胚ゲ
ノム内のそれ自体のプロモーターまたはへテロブロモ−ターの制御の下に、外来
遺伝子の組込みを可能にする。感染された胚は次いで、微量注射された胚の移転
と同様の方法で、偽擬妊娠雌マウスに移すことができ、生じた子供を次いで、外
来遺伝子の存在に関して検定する。
我々は、AGPT遺伝子に結合しているPEPCKプロモーターを含有するネズ
ミおよび家禽のレトロウィルスベクターの両方を構築しI;;これらは培地中に
おける繊維芽細胞の感染により発現に関して試験した。このPEPCKプロモー
ターはプロウィルス内で活性であり、感染細胞において、高レベルのPEPCK
/AGPT mRNAが検出された。転写は適当な出発部位で開始され、転写の
正確なホルモン調節が見られる。従って、このPEPCKプロモーター/調節ド
メインは遺伝子導入動物を生産するための、この別方法に非常に有用である。
初期圧段階において、外米DNAを動物に導入する必要はない。相通する構造遺
伝子に結合され、レトロウィルスベクターに組込まれた、PEPCKプロモータ
ーは、発達期間甲の胎児動物の細胞の感染に使用することができる。我々は、1
9日日令光の動物(発達の最終第三期)の腹腔口にレトロウィルスを注入すると
、肝臓の染色体中に、キメラPEPCK−AGPTまたは1見!遺伝子が組込ま
れることを証朗した。全部の肝臓細胞が感染されるのではないが、我々は肝臓で
m RN Aを検出できる。この遺伝子の転写はc A M Pにより刺激され
る。この方法は、肝臓がこの発生段階期間甲において、造血組織から肝組織まで
、多分、分化性であることから効果的である。この分化はDNA複製を包含し、
感染性レトロウィルスは次いで、肝細胞ゲノム田に組込まれる。レトロウィルス
は複製欠失ウィルスであるので、動物は引続くウィルス感染段階は生じない。こ
の技術は、比較的に非侵略的技術によって、遅い発生段階で、動物組織に遺伝子
を効果的に導入するための能力を有する。
さらにまI;、細胞増殖に好ましい条件の下に、ベクターを細胞口に導入するこ
とができ、また形質転換細胞を動物に導入することができる。
導入遺伝子はまた、出生後の動物に導入することもできる。
5匹のマウス(3週間令)の尾静脈に、PEPCK/bGH転写ユニットを担持
する複製能力のないネズミ レトロウィルスの107粒子を含有する組織培養培
地1m12量を注入した。4週間後に、血清試料は20〜50ng/mQのbG
H濃度を示した。
本発明は動物に導入遺伝子を導入するいずれか特定の方法に制限されるものでは
ない。
ホモ接合体(homozyous)遺伝子導入マウスラインを陽性の親動物(f
ounder) (微量注入された胚から竺じた陽性の仔)を河−ハイブリッド
ラインの正常なマウスと交配することによって確立される。生産される21世代
は、導入遺伝子が親動物の遺伝子細胞の全部を含有している場合には、導入遺伝
子の50%へテロ接合体であるべきである。ヘテロ接合体F1動物を異種交配さ
せると、生じたF2世代は導入遺伝子に関して25%ホモ接合体と50%へテロ
接合体と25%野性型であらねばならない。
従って、F2世代動物によって、導入遺伝子に対してホモ接合体動物を生産する
ことができる;これらの動物を別のホモ接合体マウスと交配させると、次の世代
は導入遺伝予圧で、100%ホモ接合体であり、ホモ接合体ラインが確立された
。
親マウスはまず、外米PEPCK/bGHDNAの存在に賀して、ドツト プロ
ット分析およびサザン(5outhern)分析法によりスクリーニングした。
これらの要件の両方でi=であった(すなわち、異種遺伝子の存在を示し、かつ
また予想された長さの制限フラグメントを生成した)マウスをEL I SA検
定法によって、bGHの発現に関して試験した。
DNAは、Davis等の方法[!Jeth、 Enzymol、、 65 :
404−411(1980年)]の改良方法に従い、尾の部分(約1cm)か
ら抽出した。
潜在的、遺伝子導入マウスからの尾の一部分を液体窒素甲で粉砕し、粉末を生成
した。この乾燥した粉末を、プロテイナーゼ1100u、n+Q%S D S
0.5%、N a c 1 0.IM、 Tris(pH7,5)50o+Mお
よびEDTAlmMを含有する抽出緩衝液に加え、次いで55℃で一夜にわたり
インキュベートした。RNアーゼT1を1(Hl/m+2の最終濃度で加え、こ
の試料を37℃で1時間インキュベートした。RNアーゼ処理後に、DNAを、
等量のフェノールとクロロホルムとを含有する混合物で抽出し、次いで等量のク
ロロホルムで抽出し、次いでエタノールで沈澱させた。
陽性の遺伝子導入動物の第一次スクリーニングをドツトプロット分析法によって
行った。マウスの尾から抽出されたDNAをOjN N a OH/2.ON
a c l中で変性させ、次いで5chleicherおよび5chuleの複
製装置上のニトロセルロース フィルターに適用した。導入遺伝子のコピー数を
決定するための標準としては、既知量のpPCbGHプラスミドDNAを使用し
た。変性DNA試料を3種の濃度で加えた後に、ニトロセルロースフィルターを
2時間焼き、1100u/m(!の変性したサケ精巣D N Aを含有する50
%ホルムアミド、20+nM P I P E S、 0.5%SDS溶液田で
予備ハイブリッド形成した。ハイブリッド形成に使用したプローブを第6文に示
す(IIJPCGH(7)ECORI−BamHI PEPCK/l:+GHセ
グメント)。このDNAフラグメントを對gby等の方法[J、 Mol、 B
iol、、 113 : 237−251(1977)コによるニック翻訳によ
って、 :a−”PE −dCTPで標識した。
陽性の遺伝子導入動物−の遺伝子のと数体ゲノム当りのコピーの数はドツトプロ
ット分析法によって決定した。ドツトはハイブリッド形成およびオートラジオグ
ラフィ後に、ニトロセルロースから切り取り、ハイブリッド形成した放射能を液
体シンチレーションカウンターにより測定した。標準DNA試料にハイブリッド
形成した放射能はスポットの数に従い直線的に増加した。手数ケマウスゲノム当
りで3XlO@KbのDNAおよびpPcbGHの6.2にりのDNA数値を陽
性の動物の導入遺伝子のコピー数の測定に使用した。組込まれた導入遺伝子の制
限フラグメントの大きさはサテンブロッティング法1southern。
E、 LによるJ、 Mat、 Biol、、 98 : 503〜5171に
よって分析した。ハイブリッド形成プローブ(第6図)には、ニック翻訳:Ri
gby、 P、W、J、等によるJ、 Mo1. Biol、、 113 :
237−251(1977)]により、あるいは無無作為プライマー法jFei
nberg、 A、P、等によるAnal、 Biochem、、 132:
6−13(1983)]jこより、標識した。
キメラPEPCK/bGH遺伝子の組込みおよび発現の両方に対して陽性であっ
たマウスを各導入遺伝子ラインの発展のための装動物として使用した。
導入遺伝子の存在に関して、始めにスクリーニングした44匹のマウスの中で、
2匹は組込みに関して陽性であった(#9および#34)。これらの遺伝子導入
マウスからのDNAの分析は、PEPCK/bGH遺伝子が装動物の両方のうち
の1個だけの染色体厚で、縦並びで、頭−尾の反復状態で組込まれていることを
示した。ゲノムDNAをKpnI(この酵素は遺伝子内の1ケ所を切断する)で
消化させると、第2図に示されているように、装動物#34および子孫に関して
、約2700bpの予想された長さの7ラグメントが得られた。遺伝子は縦並び
に、頭−尾配列として存在するので、Kpnrで消化すると、DNAグローブに
ハイブリッド形成されている完全PEPCK/gGH遺伝子と同一長さのf’J
Ii!フラグメントの多数のコビイが得られる(第9図)。ゲノムDNAをpv
ul[(この酵素は4つの部位でPEPCK/bGH遺伝子を切断する)で、制
限酵素消化すると、1.300bp、635bpおよび355bpの予想された
サイズの多数のコビイが得られた(最少フラグメントは第9図では識別されない
)。導入遺伝子の縦並びの、頭−尾配列の接合によって作り出されたpvuII
フラグメントは635bp7ラグメントと同一サイズであった。このKpnIお
よびpvulrによる同一パターンはサザンプロット法により分析されI;全部
の遺伝子導入マウスで検出され、このことは、装動物およびそれらの子孫におい
て、導入遺伝子内部では、転位、欠失または挿入がなかったことを示している。
陽性のマウスにおける導入遺伝子のコビイ数は、ドツトプロット分析法により測
定した。装動物#9の第一世代子孫は異なるドツトプロットパターンを示した;
これらは1〜5コビイ/細胞〜25〜50コビイ/B胞の範囲であった。異なる
コピイ数の遺伝子を含有する装動物#9の第一世代子孫は各ラインの装動物にし
た。装動物#9(そのゲノムは25コピイ/細胞を含有していた)の子孫である
2匹のへテロ接合体動物間の交配は、出生後の数ヨ閣内に有意の数の子孫の死亡
をもたらした(第10図)。
これは発生に重要である遺伝子座における、ホモ接合体動物における挿入度異誘
導を示す。装動物#34ラインのコビイ数は均一であり、装動物およびF1世代
マウスにおいて、25フビイ/細胞であっI;。
血清口のbGH濃度の測定に我々が使用したELISA(酵素結合イムノソルベ
ント検定)は、ビオチニル化された山羊抗ヒトIgGに結合するアルカリ性ホス
7アターゼストレプトアビジンの使用を包含する。結合したアルカリ性ホスファ
ターゼの活性は比色検定法により測定することができ、従って放射性標識リガン
ドを使用する必要はない。微量滴定板に、初めに、モルモット抗−bGHを、検
定する試料に加えられるbGHの全部が結合するように、過剰に塗布する。この
塗布された微量滴定板に、血清試料および精製bGHを加える。次いで、第二の
抗体としてサル抗bGHを加え、第一の抗体に結合したbGHO量に正比例して
定量的に結合させる。第三の抗体として、山羊抗ヒトIgG(これはサルIgG
を認識する)をビオチンに化学的に結合させる。このストレプトアビジン−酵素
結合物は検=試薬として使用することができる。この場合に、この結合物はアル
カリ性ホスファターゼース)・レプトアビジンである。
結合したアルカリ性ホスファターゼ結合物(これはビオチニル化山羊抗ヒトrg
Gに結合し、次いでサル抗bGHに結合する)を基質に供給し、呈色生成物が生
成する。この生成物は、次いでスペクトル光度測定により測定することができる
。この酵素反応は長期インキュベーション時間にわたり線状である。この長期イ
ンキュベーションはこの検定法の感度を増大させる。
@量適定板に、Na、COs/NaHCOs (pH9−6)で1:100に稀
釈したモルモット抗bGHを塗布し、37°Cで1時間、次いで4℃で一夜にわ
たりインキュベートした。この板をリン酸塩緩衝塩類溶液(PBS)中の0.1
%牛血清アルブミンで洗浄し、次いでPBS中の10%牛血清アルブミンにより
、37℃で1時間、「ブロック」した。PBS9の1%牛血清アルブミンで稀釈
しI;真正bGHを既知量で含有する標準試料および血清試料を加え、37℃で
14間インキユベートシ、次いで前記のとおりに洗浄した。PBSc4:Iの1
%牛血清アルブミンで1 : 10.000に稀釈したサル抗bGHを加え、3
7℃で1時間、インキュベートした。PBS中の1%牛血清アルブミンでl :
2.000に稀釈した、ビオチニル化山羊抗ヒトbGHを加え、37℃で1時
間インキュベートし、次いで前記のとおりに洗浄した。PBS中の1%牛血清ア
ルブミンで1 : 2.5000に稀釈した、アルカリ性ホス7アターゼースト
レプトアビジン結合物を加え、37℃で1時間、インキュベートし、次いで前記
のとおりに洗浄した。PBS田の1%牛血清アルブミンで1 : 2.500に
稀釈した、アルカリ性ホスファターゼ−ストレプトアビジン結合物を加え、37
℃で1時間インキュベートし、次いで前記のとおりに洗浄した。アルカリ住不ス
7アターゼ基質としてPBSヲの1%牛血清アルブミンで1 mg/mQに稀釈
したp−ニトロフェニルホスフェートを加え、37℃で45分貨インキュベート
し、色の発現を加速しj;。この板をPerkin−E1merスペクトル光度
計で1時間および5時間読み取った。
我々は、肝臓および腎臓における内在PEPCKの特異的発現の根拠となるPE
PCK遺伝子のfZ作用因子が、これらの遺伝子導入マウスのゲノム内に組込ま
れたキメラ遺伝子のプロモーター/調節ドメインを形成している、5′〜フラン
キング配列の460bp内に存在することが判った。これらの動物に8けるPE
PCK/bGHの発現の組織特異性を測定するために、種々の組織甲のRNAレ
ベルを分析した(第5′5)。
RNAはC?+irgvin、 J、M、等によるBiochemistry、
24 : 5294−5299(!979)に記載の方法に基本的に従い、L
amers、 W、J、によるProc、 Natl、 Acad、 Sci、
X国、79 : 5137−5141(1982)によって少し修正して、マウ
ス組織から抽出した。総RNA (20ug)は1%寒天、18%ホルムアルデ
ヒドゲル上で20m1J MOPS、5mM酢酸N a −I M!J E D
T Aを用いる電気泳動によって分離した。
RNA試料は上記MOPS、5mM酢aNa、1mM EDTA中で80℃にお
いて5分間、変性させた。このRNA試料を上記MOPS、5mM酢酸Na、1
mM EDTA中で80℃において5分間、変性させた。このRNA試料は、上
記MOPS緩衝液、3%ホルムアルデヒドおよび0.1%SDS中で80℃にお
いて5分間、変性させた。電気泳動緩衝液は20mM MOPS、 5mM酢!
!Na、1mM EDTA、8.1%ホルムアルデヒドであった。
電気泳動の後に、RNAを20XSSC中のrGene 5creen Plu
sJにl接に移した。移転が完了した後に、3分間の紫外部光露光により、この
RNAをrGene 5creen PlusJ膜に架橋させ、次いで80℃で
2時間焼いた。このRN Aを、第6図に示されているように、pPCbGI(
キメラ遺伝子のニック翻訳(IXIO’cpm/mQ) E c o RI 7
ラグメントにハイブリッド形成させた。
予備ハイブリッド形成溶液およびハイブリッド形成溶液は両方ともに、50%ホ
ルムアルデヒド、0.2M N a c 1 s 50mM Tris(pH7
,5)、10%デキストランスルフェート、0.1ビロリン酸ナトリウム、1%
SDS、0.2%牛血清アルブミン、0.2%フィコル(Ficoll) (分
子量400.000) 、0.2%PVP (分子量40.000)およびQ、
1mg/m12サケ精巣DNAよりなるものであった。36時間のハイブリッド
形成の後に、濾液を2XSSC,0,1%SDSで2回、室温において5分間、
洗浄し、次いで2xssc、o。
1%SDSで2亘1.42℃で30分間、洗浄した。
PEPCK/bGH遺伝子の成熟RN A転写産物は約IKbであり、他方、内
在=pEpcKのmRNAは約2 、8 Wbである。
Cimbala、 M、A、J、等によるBiol、 Chem、 257 :
7629−7636(1982)。
ノーザン分析用に使用したプローブはキメラPEPCK/bGH8よび内在性P
EPCKの両方とハイブリッド形成する。
第5叉に示されているように、血清bGHを含有する遺伝子導入動物をこの発現
の組織特異性に関して試験すると、これらはと臓において高レベルの発現を示し
た。第5ヌのパネルAむよびパネルB(列1)に示されているように、pPCb
GHプローブにハイブリッド形成したi、OKbに強いバンドが存在する。
この導入遺伝子はパネルAでマウスの腎臓でも発現された;腎臓は外5−e?E
PcKが発現するもう一つの組織である。パネルBでは、動物の腎臓においては
、検出できるPEPCK/bGHmRNAは見い出されなかった。ここでは、低
レベルのbGHが発現されたが、これはノーザン分析法の感度における限界によ
るものと考えられる。しかしながら、低発現性動物の腎臓における導入遺伝子の
発現は、ランダムプライミングにより標識された午成長示ルモンcDNAプロー
ブを使用して検ヒされている。
これらの発見にもとづき、我々は肝臓および腎臓における発現に必要な配列が4
60bpPEPCK7ラグメントに存在し、そしてこの各へテロ接合体マウスラ
インにおけるキメラPEPCK/bGH遺伝子が組込まれる染色体部位がこの導
入遺伝子の組li&峙異世発現を千渉しないものと結論した。この遺伝子を含有
するが、測定できる血清bGHレベルを示さない、別の血統のマウスをbGH峙
異的rnRNAに関して検定した場合には、検査した組織のいずれにも、b G
Hm RN Aは存在しなかった。高レベルでbGE(を発現する遺伝子導入
マウスは同性のそれらの貝腹仔のサイズの約1.5〜2倍であった(第3ズおよ
び表1)。このこと;=、これらの動物によって産生される成長だルモンが竺物
学的に活亡であり、そして異所部位である肝臓8;び腎臓で正しく作用し、この
ホルモンをここで産生したことを示してしる。
表二: PE?CK/’:+GH遺伝子含有道云子導入マウスの雪質。
と数体ゲノム肖りの?E?CK/bGHのフピイ数をドツトプロ77に;り測定
した。コビイ数標準として、1.5.10.15.25.508よび100のコ
ピー数等価で、プラスミドpPCGHを使用しl;。定量のために、ドツトはハ
イブリッド形成および万一トラン2グラフイの後に、ニトロセルロースフィルタ
ーから切り取り、ハイブリッド形成しているプローブの量を液体シンチレーショ
ンカウンターにより測定した。血清9のbGH濃度は巧料および方法に関して後
記されているとおりに測定した。成長率は遺伝子導入マウスの体重を、同室の寛
腹仔の品々体重で割算することによって計算した。
表1
PE?CK/bGHbGH
マウス 生別 コピー数/細胞 ng/血清ll1rl 成長比率2−IM 5
0 ’:、0
2−2 M 5 0 !、0
2−6 7 23 500 L7
2−7 7 5 ioo 2.0
001−2 M 25 0 i、0
0〇ニー3 M 50 2.300 ユ、5002−: M 、 25 500
1.60i−I M 25 400 i、3
014 M 250 1.0
01−5 M 25 0 1.0
0’、−7F 25 0 !、0
02−2 M 25 300 1.4
02−2 M 25 8 1.0
02−4 ” 25 0 1.0
02−5 F 25 0 1.0
03−IM 25 43 i、0
03−2 M 25 38 1.0
03−4 M 25 0 1.0
03−5 M 25 350 1−4
03−6 M 25 300 1.5
03−7 F 25 0 !、0
bGHRNAに笑する別のスズライジングメカニズムが午下垂体@織で竺じるこ
とが知られている[Hampson、 F、に、等による?roc、 Natl
、 Acad、 sci、、 ”A”A、 84 : 2673−2677G9
87年)]。
bGHmRNAのうちの低%(0,:%)はbGH遺伝子のイントロンDを含有
下る。エクソン5の最初の50個のヌクレオチットを通してのオープン リーデ
ィングフレームとして統〈イントロンD0′)内包。この変化した遺伝子産物の
生理学的意味は知られていない。遺伝子導入マウスの数種の異なる組織からの全
RNAをbGHイントロンD配列だけよりなるプローブとハイブリッド形成した
場合には、1.3kbRN Aのバンドが肝臓でだけ検=された。すなわち、こ
のbGHスプライシングの別のプロセスはまた、遺伝子導入マウスで生起するが
、これはこれらの遺伝子導入マウスの?F臓でも生起することから、下垂体に特
異的ではない。
これらの動物におけるキメラPEPCK/bGH遺伝子の発現のレベルに係る格
別の変化は食餌の変更によって竺じl;。この研究で使用された2種の合成食W
l:Nutritional Biochemica2 Corporatio
nから入手した。高次本化物食餌はショ猾81 、5%、カゼイン12.2%、
DL−メチアニン0.3%、綿寅油4%、醸造酵母2%、8よびミネラル ミッ
クスニビタミンΔ%を含有した。
高タンパク質食餌はカゼイン64%、σ−15胞栄養繊維22%、植物油11%
、醸造酵母2%およびミネラルミックス士ビタミン1%を含有した。マウスにこ
れらの食餌を与え、バは適時に飲ませた。−
遺伝子導入マウスを24時¥iWt食させ、次いで高次本化物(81゜5%)、
低タンパク質(!2.5%)食餌を与えた。各動物の血済宇のbGHレベルは3
20ng b GH/血清mαから14ngbGH/血清m0に低下した。高次
本化物食餌を高タンパク質(61%)で炭本化物を含まない食餌ととり替えた場
合には、血清bGHレベルは1週間後に、14ng b G H/rnQから4
30ng/maに高められた(第43)、低レベルでbGHを発現した遺伝子導
入マウスは食餌における二〇らの変更と関連した、側−のパターンの発現を示し
t二。
高次7”−イ’+物食餌は、血清中のインシュリンのレベルを増加さぜ、PE?
CKの合成を抑制し、従って遺伝子転写を31害する二Granner、 D、
等によるNature 305 : 549−551(1983乞)E 、 P
コPCK mRNAの羊減期は30分(44,45)にすぎないので、高次本化
物食事の後の特異的mRNA合成レベルの減少は肝PEPCK合成の急速な低下
をもたらす。
高次本化物食餌を7ミ間与えj;後には、被験遺伝子導入マウスの血清甲のbG
Hレベルは、24時賀の飢餓の後の同一動物に見い巳されるレベルの5%より少
なくまで減少した。引続いて、タンパク質64%を含有する食餌を与えると、僅
かに7ヨ後に、血清’DGHの30倍の誘発が得られた。宿主動物の食餌内容に
おける変化に対するPEPCK/bGH導入還伝子の、この格別で比較的急速な
応答は、PE?CKプロモーター/調節域が肝臓における発現に対して、結合構
造遺伝子を巨標とする効果的な手段を提供する。すなわち、その発現は動物の食
餌を単純に変えることによって調節される。
PRPC:(/bGH遺伝子遺伝合口されているPEPCKプロモーターの46
0bpに存在するcAMF’調節ドメインが遺伝子導入マウスで機能するか否か
を確認するI;めに、動物に、30分の2 qで3互、:3t2 c AM P
8よびテオフィリンを腹疫内投与した。90分の時点で、動物の尾静脈から採
血し、その血清をbG:(に関して試験した。bGHの血清レベルは、第1互の
cAM?注射の後の90分以内に2〜3倍増加した(第4又)。導入遺伝子の組
込みに関して陽性であるが、その発現に関しては陰左である動物は、Bt4cA
MPの投与によってbGHの発現が誘発されなかった。すなわち、bGHを発現
するキメラPEPCK / ’D G H遺伝子を含有する遺伝子導入動物はc
AMP’によるその発現の調節に必要な乞Z作用世配列を含有する。
遺伝子導入動物におけるPEPCK/bGH遺伝子のBt、 cAMPの投与に
対する応答の迅速世はまた、この環状ヌクレオチアがラットの肝臓におけるPE
PCK遺伝子の転写を20分以内に8倍まで増加させるということを証明した、
我々の前述の研究から予想されることである:、Lamers、 W、J、等に
よるProc。
Natl、 Acad、 Sci、 %5.79 : 5i37−514!(1
982年):。キメラPEPCK/bGHキメラ遺伝子の構築に使用されたPE
PCKプロモーター/調節域の区分(−450/ + 73)は−107/−7
9賀の域にcAMPtl1節天子を含有する二5hort、 J、L等によるB
iol。
C:Iem、 26i : 9721−9726(1986年)3゜この因子は
、鶏のシトゾール型PEPCKに係る遺伝子のプロモーター/調節域にも存在す
るコア配列CTTACGTCAGAGGを含有する二Rod、 Y。
等に;るJ、 Biol、 CheI!1.259 : 15609−256i
4(1984年)]。この調調節子は、それ自体のプロモーターを含有する異種
遺伝子にc A M ? 5受左を付与し、レトロウィルスによるトランスフェ
クションにより :S:Iort、 LM、等によるBiol、 Chem、
26i : 972!〜9726(1986年):、または感染により、これが
導入される種々のタイプの細胞内で機能することが証明された。我々の発見は、
導入遺伝子が、次の様相で、すなわちその組li&特異士発現ばかりでなく、;
I;正常な染色体位置にある天然の遺伝子の発現を制御する司−ホルモンによっ
て調節される遺伝子の能力を保存する様相で、宿主LlNA口に組込まれること
を示している。
キメラ?E、’C:(/bGH遺伝子の組込みおよび発現の異なるパターンが遺
伝子導入マウスのラインで見い出された。約25ng/血清mQでbGEを発現
する親動物#34は、この親動物の遺伝子細胞の全部における導入遺伝子の存在
と一致して、予想のメンデルの二写で、遺伝子を子孫に伝えj;。しかしながら
この子孫は、親動物と均等なコピー数を有するけれども、検出できるレベルのb
GHを発現しなかった。このことはまた、遺伝子導入動物における他の遺伝子に
関しても報告されている〔?a 1 m1ter、 R,D、等によるCe1l
29 : 701=7!0(1982年)〕。PEPCK/b (、H遺伝子
の組込みおよび発現に関して陽性であった親動物#9はモザイクであった。この
親動物の子孫のうち、50%より充分に少ない動物は導入遺伝子を含有しており
、この遺伝子に対して場右の動物の口の若千はまた、それを発現するが、他は発
現しなかった。ペテロ接合体であるが、導入遺伝子を発現しない、2″!SのF
1動物(動物#9の子孫)を交配させると、bGHを発現するホモ接合体動物が
産生された(データは示されていない)。親動物#9からは、高レベル(300
〜2.300ng/血清mα)でbGHを発現するF1動物とロレベル(40〜
ioong/血清z+2)でbGHを発現するF1動物と低レベル(i〜10n
g/血清ml)でbGHを発現するF1動物とが産生された。この遺伝子の発現
レベルはコピー数とは厳密には関係しなかっ!;(表1)。
遺伝子導入ラインの一つのセグメントを第10!に基又として示した。ここに示
されているように、親動物T g [OP CGHE9 (#9)は遺伝子的に
モザイクであり、高レベルでbGHを発現した。高レベルの発現を示し、成長増
加が2倍である1四のF1雄動物を選び、高レベルの成長ホルモンを発現する動
物の遺伝子導入ラインを始めた。PEPCK/bGH遺伝子は高発現体F1雄か
らF2世代に伝えられた。しかしながら、導入遺伝子を含有する動物の全部がb
GHを発現するものではなく、コピー数は同一であっても、その発現レベルは異
なる。
F2世代では、雌にニーコピー数の遺伝子がそれらのゲノムに組込まれたにもか
かわらず、雌に比較して有意に多くの雄が高レベルで’DGHを発現下る(遺伝
子導入雄では25匹CF11匹であるのに対し、選云子導入雌では2!四口1匹
である)。
食頷およびTルモンにより誘発されるPEPCKプロモーター/調節域の急左応
答さおよび肝臓および腎臓におけるその組織特異的発現は、−この動物を、対象
の種々の構造遺伝子の巨標をこれらの組織にあてるための理想的道具にする。遺
伝子導入動物の食餌の原本化物含有量を変えることによって、構造遺伝子の発現
レベルを広範戸にわたり変えることもできる。PE?CK遺云子は正常には出生
まで発現しないので、発育田の胎児は結合しl;構造遺伝子からの高レベルのタ
ンパク質にさらされない。このことは、胎児の正常な発育を壬渉する潜在能力を
有するGHの;うな尽ルモンの場合に、明らかに有利である。我々は、このxj
J期の一連の英検から発生した動物の正常な繁殖能力に注=した。P三?CKレ
ギュロンロのこの組織特異!エレメントは、それ自体のプロモーターを含有する
異種遺伝子の発現を肝臓に向けるために使用することもできるべきである。
高レベル(0,5〜2.3ug/血清mff)のbGHを発現する遺伝子導入マ
ウスは、この導入遺伝子を発現しないそれらの司腹仔のサイズの2倍に成育した
(第3又の成長曲線参照)。この変更された成長パターンにもかかわらず、これ
らの動物は良好な健康を有し、かつまた繁殖釣に治世であった。しかしながら我
々は、高レベルおよび低レベルのbGH遺伝子発現レベルを有するマウスが両方
ともに、キメラPEPCK/bGH遺伝子を発現しないマウスに二較して、イン
シュリン投与に対してより敏感であることに気付いた。導入遺伝子を含有するが
、これを発現しないマウスは、正常な対照動物より以上には敏感ではない。遺伝
子導入動物に対する低濃度(0,05U/kg)のインシュリンの投与は、グル
コース栄養源の不存在の下では致死的であった。
成長ホルモンタンパク質を注射した豚の性能特質を模倣する表現型を有する遺伝
子導入豚を竺産するためにPEPCK−bGHi伝子を含有する2、8キロベー
ス(kb)線状フラグメントの約400コピーを豚の受精卵の竺殖核甲に注入し
た。千五十七個(1057)の卵に注射し、33四の!調養育豚に移し入れた:
これらの豚のうちの222!!はそれらの妊娠を保持し、112個の注入卵から
竺きて竺よれた新竺児を得た。
これらの動物に組込;れたPEPCK−oGH遺云子配列の大体の数はドツトハ
イブリッド形成法によって測定した。場左の動物は1〜200コピー/細胞の範
戸のコピー数を有する組込み配列を含有することが証明された。17匹の遺伝子
導入動物は、それらの循環血清内で、格別のレベルのと成長ホルモンタンパク質
を示し、その濃度は、ラジオイムノ検定法お;びELISAs定法により測定し
て、) ng/mQ〜200ng/mQの範囲であった。
これらの動物のうちの2匹(#ユ1および#44)におけるbGH遺伝子の組込
みおよび発現の詳細な分析を以下に示す。
豚の尾から8eしたゲノムDNAをEcoRl、Kpnl、PstIお;び?v
ulIで消化させた。消化したDNAを、ラッ;pEpcx遺伝子の−547−
+73のBamHI−BglI[フラグメント(これは「ランダムプライミング
」によって標識されている)とハイブリッド形成させj;。ゲノムDNAのEc
oR工消化によって、1記プローブとハイブリッド形成した2、8kbフラグメ
ントを得た。これはその導入遺伝子が豚#128よび#44の宿主ゲノム内に組
込まれI;縦並びの反復員位として存在することを示した。この尊入選伝子内に
は4つの内部Pvu11部位が存在する;これらの部位のうちの3つはB a
m−HニーB g1ゴグローブとハイブリッド形成する* 740kb〜520
kbの予想されt;内部7ラグメントが両動物からのゲノムDNA田に見い出さ
れた。縦並びの反復単位間の接合部に存在する第3の7ラグメン
【は740bり
内部フラグメントと周一サイズである。両方の動物において、導入遺伝子は縦並
びの反復巣位として存在し、これらの;で、遺伝子のコピーの若モは、KpmI
3よびpst!で消化した後に竺じる制限フラグメントにより示されるように、
進角きになる。導入遺伝子の頭−尾、尾−頭反復単位は消化後に、5.0スbフ
ラグメントを竺じ、導入遺伝子の頭反復単位C;、Kpnrで消化した後に、5
.0Kb−yラグメントを生じる。
これは、BamHI−BgllI DNAプローブと、2つの位置でハイブリッ
ド形成する。豚#11および豚#44の両方がらのゲノムDNAは、Kprri
で消化させると、 5.0Ftbフラグメントを生じたa P S t 1によ
る消化は、この導入遺伝子が逆向きにされt;場合に、グローブとその2つの位
置でハイブリッド形成する1、;ibの7ラグメンkを竺じるべきである。豚#
44がものDNAは?st工消化に;すi、2スb7ラグメントを竺じグニ。こ
れはX接する頭−頭反復嵐位の存在と一致する。1.7Kb7ラグメントは外3
%PEPCKフラグメントであり、これはBamHI−8g1Mグローブとハイ
ブリッド形成する。豚#】1からのD”JAf?s t Iと消化させた場合に
は、豚#44に見い呂されf:1−2A’*7ラグメントではなく、1.7:(
bフラグメントを見い已した。さらに、この動物には、4.OKbの7ラグメン
トが存在した。
これ(=、この動物内の導入遺伝子のコピーにおけるPst−工部位の欠失を示
している。
詳細な:nRNAレベルでの組織特異性発現の分析は豚#11または他の遺云子
導入豚で行わなかったが、これは我々が世能研究8よび繁殖研究に対してそれら
の竺存可能士を保有することを望んだからであり、他方、豚#44はこの百的の
ために犠牲にしl;。
豚#440E臓、腎臓、肺臓、牌臓および腸がら単離しf;RNAを、BamH
4お;びPstIにょるPEPCK/bGH遺伝子の’?Jj ”!エンドヌク
レアーゼ消化により生成したDNAの5′−天端標識した7ラグメントとハイブ
リッド形成した後に、S1ヌクレアーゼ消化させた。さらに、司−のPEPCK
/bGHキメラ遺伝子を含有し、>500ng/血清レベルでbGHを発現する
遺伝子導入マウスからのRNAを分析した。B amHI−PstIプローブの
邦3っp7ラグメントは、検介した他の豚組織からのRNAにJってで!=なく
、豚評臓がらのRNAに;って、ヌクレアーゼ消化から保護しl;。従って、P
EPCK遺伝子からの5″−7ランキング配列の460bpを遺伝子導入動物の
結合bGH構造遺伝子の組織特異性発現にむけることができる。
PEPCKは2711期には、補色動物種の肝臓、腎臓の皮質で発現される;し
かしながら、PEPCK/bGHmR,NAは豚#44の肝臓にだけむけること
ができる。これに対して、計度および腎臓の両方にmRNAが存在する遺伝子導
入マウスにおいては、肝ffmRNA対腎臓mRNAの比工は外米PEPCK
mRNAに見い出される比厘よりも低いjMe 1sner 、 H等にょるB
iochemistry、 244 : 412−425(1985)Lこれは
、EcoRl−Bgl−II7ラグメント以外の別の配列が腎臓における導入遺
伝子の充分な発現に必要であることを示している。S1ヌクレア一ゼ分析はまた
、原註のPEPCK/bGHキメラ遺伝子が転写の正しい開始部位を使用するこ
とを示している。何故ならば、予想のサイズの7ラグメント(133bp)は保
護されているからである。
その血清口にb G H200ng/mQを含有することが、二重ラジオイムノ
検定およびEL I SA検定に;って証明された豚#11を、その遺伝子導入
されていない雄の司腹仔(#i2)と。同様の食餌計画の下においた。食餌:体
重増加比率および背口の脂肪の測定値を9咬した。食餌:体重増加比率は、遺伝
子導入されていない対照l:、:咬して、PEPCK/bGH遺伝子導入豚#1
1において格別に減りした(制限食餌供給条件−に30%の減少)。
豚#11および#12を、それぞれ約45日間の2回の連続期間にわたり二重し
た。動物には、同期間の間、16%粗タンパク質の石版の仕上げ胴料を与えた。
これらの豚は、適時の飼蜂供給期間(期間1)の場合には、50〜75眩の体重
を有し、125ヨ令であった。これらの動物の食餌を第二期覧口は、2.8kg
飼料/ヨに制限しt;。
表2
適時賃料供給 霊水供給811限
豚#11 豚#12 豚#11 豚#12品均−ヨ体重
増加(kg) 2.0 !、2 0.8 0.5食4fX:体重
増加 3.8 4.2 3゜55.3
最も顕著な発見は、豚#11の体脂肪が、対照に二重して劇的に減りしたことで
あった。第11cEのデータは、遺伝子導入豚(# : i )が、彼の貝腹仔
の対照に比較して、扁−食餌供給計蚤にわたり、2/2少ない背口の脂肪の蓄積
を示し!こことを示している。これらの結果は、外米成長ホルモンを投与した豚
に見い=される成長および骨格構造の変化に比較して、好;しいことである:C
hung、 C,S、等によるJ、 Ar+imal 5cience、 60
: 1i8〜二30(i985); ELherton、 T、D、等による
J、 Animal 5cience、 63: 1389−1399(i98
6); Machlin、 L、J、によるJ、 Animal 5cienc
e。
35 : 794〜799(i972):。重大なことに、成熟して出竺したP
E?CK/bGH遺伝子導入豚では、いずれにも異常あるいは病気は見い巳され
なかった。これらの動物はまた、正常な性欲を示し、繁殖的に健全であるように
見做された。
これらの英検は、適当に調節された場合に、牧畜動物の生殖紀胞うインロに導入
された遺伝子が動物の左能および牧畜業の経済士に対して、きわ立った、明白な
効果を有することができることを証明している。最近数年の間に、マウスにおけ
る研究によって、導入遺伝子の発現は時間および組織の選択の結果として調節で
きることが証明されている[Pa1m1ter、 R,D、等によるCe11.
41 : 343−345(1985)〕、これらの原則を適用すると、不発明
のPEPCKプロモーター/調節エレメントを使用することによって、赤身の内
生産物を生成する遺伝子導入した豚のラインを製造することができ、経済効率(
飼料二体重増加比率)が増大される。このことはjye亘National A
cademy of 5cienceが最近に、過度の動物士脂肪の摂取がx3
において食餌父連疾掴の最も重大な一天であると報告していることから、豚肉製
品を食する者の健康に対して朗確な効果をもたらすものと言うことができる:C
a11. D、L−等によるDesigning Foods : Anima
l?roc!uct 0ptions in the Marketplace
、 National Re5earci1C。
uncil、 18〜62(1988):。
!Ii乳動物肝臓における糖新生
」i
FJG、3
年令(日数)
7口
均bGH/ml 二m
μ3 bGH/ml 血清 ホールド インダクノジンA、 B。
FIG、5
FIG、7
FIG、 9
補正書の写しく翻訳文)提出書[特許法第184条の8コ平均背中の月旨月方(
mm〕
請求の範囲
’ 1.#t−PEPCKm!!e−71:6MT、!6ようl: M ! *
h ?、: P。
PCKプロモーターを担持する細胞の1個または2個以上を含ことを特徴とする
製造方法。
7.ベクターを1個または2個以上の胚細胞中に微量注入することによって導入
し、この胚を完全動物にまで発育させる、請求項6の方法。
8、上記ベクターがレトロライリスである、請求項6の方法。
9、上記ベクターを胎児腹腔中に注入し、これにより肝細胞に対する前駆体であ
る細胞の1個または2個以上をベクターによってトランスフェクションを行い、
その発生の後に、この遺伝子を肝細胞中に保有させる、請求項8の方法。
10、遺伝子欠失を有する動物の処置方法であって、その発現がこの欠失を補正
するのに必要である遺伝子を上記動物中に導入することを含み、この遺伝子がP
EPCKプロモーターに作動できるように結合されている、処置方法。
11、遺伝子導入動物から採った哺乳動物細胞で非−PEPCKポリペプチドを
産生する方法であって、上記細胞を、PEPCKプロモーターに作動できるよう
に結合されている非−PEPCK構造遺伝子で形質転換し、この細胞を適当な培
養培地中で培養し、次いで上記遺伝子による上記ポリペプチドの発現を、刺激に
よって誘発することを含む方法。
12、プロモーターを、c A M Pにより、あるいは細胞によ、り代謝され
た場合に、高い細胞内レベルでc A M Pを生じる物質により、刺激する、
請求項11の方法。
13、細胞が肝細胞である、請求項12の方法。
14、動物中に非−PEPCKポリペプチドを産生ずる方法であつて、非−PE
PCK構造遺伝子が作動できるようにPEPCKプロモーターが結合された1個
または2個以上の細胞の存在によって特徴付けられた動物を用意し、この遺伝子
を発現するようにこれらの細胞を誘発し、これによって上記ポリペプチドを産生
ずる方法。
16、発現を、タンパク質を増加するか、または炭水化物を減少させた食餌を動
物に与えることによって増加させる、請求項1請求項18の方法。
18、PEPCKプロモーターに作動出来るように結合されている非−PEPC
K遺伝子を担持する細胞の1個または2個以上を有する遺伝子導入動物における
、非−PEPCK遺伝子の発現を調節する方法であって、上記細胞中のPPPC
Kプロモーターが第一刺激への応答性と第二刺激への応答性とで異なるレベルの
活性を有し、第一および第二の環境的刺激に上記動物をおき、これによって結合
されている非−PEPCK遺伝子の発現を調節する方法。
!99発現を、タンパク質が増加しているか、または炭水化物が減少しているこ
とを特徴とする食餌を動物に与えることによって増加させる、請求項18の方法
。
20、発現を、炭水化物が増加しているか、またはタンパク質がて減少させる、
請求項18の方法。
21’、(a)発現の増加が望まれる場合には、タンIくり質対炭水化物の比率
の高い食餌を動物に与え、そして(b)発現の減少が望まれる場合には、タンパ
ク質対炭水化物の比率の低い食餌を動物に与える、ことをさらに包含する、請求
項18の方法。
22、発現を、炭水化物が実質的に欠けている食餌を動物に与えることによって
、増加させる、請求項18の方法。
23、食餌が少なくとも約50%のタンパク質を特徴する請求項22の方法。
24、食餌が少なくとも約70%の炭水化物を特徴する請求項21の方法。
25、出生後にだけ実質的に発現する遺伝子のプロモーターを担持する細胞の1
個または2個以上を有し、このプロモーターが天然では結合されていない遺伝子
に作動できるように結合されている、人間以外の遺伝子導入動物。
26、上記プロモーターが誘発性である、請求項25の動物。
27、上記プロモーターが高タンパク質および低炭水化物により誘発性である、
請求項26の動物。
28、上記プロモーターがPEPCKプロモーターである、請求項27の動物。
29、遺伝子導入動物において、実質的に出生後にだけポリペプチドを産生させ
る方法であって、このポリペプチドは上記動物中に出生前に存在する遺伝子によ
りコードされるものであり、この方法は、遺伝子導入動物中で上記ポリペプチド
の発現を刺激することを包含し、この動物は上記遺伝子が欠失している粗動物の
細胞の1個または2個以上を、ベクターにより、出生前に形質転換することによ
り、直接に、または間接的に上記遺伝子を受入れた動物であり、このベクターは
出生後にだけ本質的に正常に発現する第二の遺伝子のプロモーターに作動できる
ように結合された上記遺伝子を有するものであり、そしてこの遺伝子導入動物は
その遺伝子を保有する改質された粗動物またはその子孫の一種である、産生方法
。
30、プロモーターがPEPCKプロモーターである、請求項29の方法。
34、発現が組織特異性である、請求項21の方法。
35、発現が主として肝臓である、請求項34の方法。
36、上記遺伝子がホルモンを特徴とする請求項1の動物。
37、上記遺伝子が成長ホルモンを特徴とする請求項36の動物。
38、上記遺伝子がチロイド放出性ホルモンを特徴とする請求項36の動物。
39、上記遺伝子がPEPCK以外の酵素を特徴とする請求項1の動物。
40゜非−PBPCK構造遺伝子に作動できるように結合されているPEPCK
プロモーターを含有するキメラDNA分子。
41、肝c A M Pレベルに影響を及ぼす食餌を動物に与えることによって
発現を調節し、上記細胞が肝細胞である、請求項18の方法。
42.上記遺伝子によってコードされるポリペプチドの成熟動物発現対胎児発現
の比率が少なくとも10:lである、請求項1の動物。
43、当該プロモーターに対して外来である遺伝子に作動できるように結合され
ているプロモーターを担持する細胞の1個または2個以上を含有し、上記遺伝子
の下における成熟動物発現対胎児発現の比率が少なくともlO:1である、人間
以外の遺伝子導入動物。
44、転写の誘発に際して、上記遺伝子によってコードされるmRNAの転写比
率が、メタロチオネイン プロモーターに結合させた場合の、この遺伝子により
コードされるm RN Aの転写比率の少なくとも約4倍である、請求項43の
動物。
45、上記プロモーターの下における遺伝子の発現が動物の食餌の調節によって
制御される、請求項1Oの動物。
46、ベクターを、インビトロで細胞中に導入し、この細胞を次いで、この細胞
を増殖することができる動物中に導入する、請求項6の方法。
47、異種遺伝子を動物の肝細胞中に導入する方法であって、動物に対して異種
の遺伝子を担持するレトロライリス ベクターを用意し、このベクターを胎児段
階の動物の腹腔内に注入し、次いで動物をその胎児段階から発育させることを包
含する方法。
48、上記遺伝子がPEPCKプロモーターに作動できるように結合されている
、請求項47の方法。
49、レトロライリス ベクターが複数欠失性である、請求項47の方法。
50、第一および第二の環境的刺激間の差違が、食餌において動物に提供された
ホルモンレベルでの差違ではない、請求項18の方法。
51、上記非−PEPCKポリペプチドが動物の主として肝臓中で産生されるも
のである、請求項14の方法。
手続補正書動剣
平成2年11月7日
Claims (49)
- 1.非PEPCK構造遺伝子に作動できるように結合されたPEPCKプロモー ターを担持する細胞の1個または2個以上を含有する、人間以外の遺伝子導入動 物。
- 2.上記細胞が生殖ライン細胞を含む、請求項1の動物。
- 3.上記細胞が動物の選ばれた組織または臓器に属するものである、請求項1の 動物。
- 4.上記細胞が選ばれた条件の下で、遺伝子を発現するものである、請求項1の 動物。
- 5.上記動物が出生後に上記細胞で上記遺伝子を発現できるが、出生前には、こ のような発現を実質的にすることができないものである、請求項1の動物。
- 6.食餌タンパク質および炭水化物を制御することによって調節されている導入 非−PEPCK構造遺伝子を有する、人間以外の遺伝子導入動物の製造方法であ って、(a)非−PEPCK構造遺伝子に、作動できるように結合しているPE PCKプロモーターを用意し、キメラ発現ユニットを形成し、 (b)このキメラ発現ユニットを、上記動物種の細胞内で複製できるベクター中 に入れてクローン化し、次いで(c)このベクターを上記細胞中に導入し、上記 遺伝子導入動物内で、または上記遺伝子導入動物中に入れることにより、上記細 胞の増殖を促進させる; ことを特徴とする製造方法。
- 7.上記ベクターを1個または2個以上の胚細胞中に微量注入することによって 導入し、この胚を完全動物にまで発育させる、請求項6の方法。
- 8.上記ベクターがレトロウイルスである、請求項6の方法。
- 9.上記ベクターを胎児腹腔中に注入し、これにより、肝細胞に対する前駆体で ある細胞の1個または2個以上をベクターによってトランスフェクションを行な い、その発生の後に、この遺伝子を肝細胞中に保有させる、請求項8の方法。
- 10.遺伝子欠失を有する動物の処置方法であって、その発現がこの欠失を補正 するのに必要である遺伝子を上記動物中に導入することを含み、この遺伝子がP EPCKプロモーターに作動できるように結合されている、処置方法。
- 11.哺乳動物細胞で非−PEPCKポリペプチドを産生する方法であって、上 記細胞を、PEPCKプロモーターに作動できるように結合されている非−PE PCK構造遺伝子で形質転換し、この細胞を適当な培養培地中で培養し、次いで 上記遺伝子による上記ポリペプチドの発現を、上記プロモーターの刺激によって 誘発することを含む方法。
- 12.プロモーターを、cAMPにより、あるいは細胞により代謝された場合に 、高い細胞内レベルでcAMPを生じる物質により刺激する、請求項11の方法 。
- 13.細胞が肝細胞である、請求項12の方法。
- 14.細胞が遺伝子導入動物の細胞である、請求項11の方法。
- 15.発現を、タンパク質対炭水化物の比率が高い食餌を動物に与えることによ って増加させる、請求項14の方法。
- 16.発現を、タンパク質を増加するか、または炭水化物を減少させた食餌を動 物に与えることによって増加させる、請求項14の方法。
- 17.発現を、細胞をcAMPにさらすことによって増加させる、請求項12の 方法。
- 18.PEPCKプロモーターに作動出来るように結合されている非PEPCK 遺伝子を担持する細胞の1個または2個以上を有する遺伝子導入動物における、 非−PEPCK遺伝子の発現を調節する方法であって、PEPCKプロモーター が応答性にするような体験条件が上記細胞にもたらす環境的刺激に上記動物をお くことを包含する方法。
- 19.発現を、タンパク質が増加しているか、または炭水化物が減少しているこ とを特徴とする食餌を動物に与えることによって増加させる、請求項18の方法 。
- 20.発現を、炭水化物が増加しているか、またはタンパク質が減少しているこ とを特徴とする食餌を、動物に与えることによって減少させる、請求項18の方 法。
- 21.(a)発現の増加が望まれる場合には、タンパク質対炭水化物の比率の高 い食餌を動物に与え、そして(b)発現の減少が望まれる場合には、タンパク質 対炭水化物の比率の低い食餌を動物に与える、 ことをさらに包含する、請求項18の方法。
- 22.発現を、炭水化物が実質的に欠けている食餌を動物に与えることによって 、増加させる、請求項18の方法。
- 23.食餌が少なくとも約50%のタンパク質を含有する、請求項22の方法。
- 24.食餌が少なくとも約70%の炭水化物を含有する、請求項21の方法。
- 25.出生後にだけ実質的に発現する遺伝子のプロモーターを担持する細胞の1 個または2個以上を有し、このプロモーターが天然では結合されていない遺伝子 に作動できるように結合されている、人間以外の遺伝子導入動物。
- 26.上記プロモーターが誘発性である、請求項25の動物。
- 27.上記プロモーターが高タンパク質3よび低炭水化物により誘発性である、 請求項26の動物。
- 28.上記プロモーターがPEPCKプロモーターである、請求項27の動物。
- 29.遺伝子導入動物において、実質的に出生後にだけポリペプチドを産生させ る方法であって、このポリペプチドは上記動物中に出生前に存在する遺伝子によ りコードされるものであり、この方法は、遺伝子導入動物中で上記ポリペプチド の発現を刺激することを包含し、この動物は上記遺伝子が欠失している親動物の 細胞の1個または2個以上を、ベクターにより、出生前に形質転換することによ り、直接に、または間接的に上記遺伝子を受入れた動物であり、このベクターは 出生後にだけ本質的に正常に発現する第二の遺伝子のプロモーターに作動できる ように綜合された上記遺伝子を有するものであり、そしてこの遺伝子導入動物は その遺伝子を保有する改質された親動物またはその子孫の一種である、産生方法 。
- 30.プロモーターがPEPCKプロモーターである、請求項29の方法。
- 31.人間以外の遺伝子導入動物であって、第二の遺伝子のプロモーターに作動 できるように結合されている、第一の遺伝子を有する細胞の1個または2個以上 を含有し、上記細胞中のこの第一の遺伝子の発現が組織特異性である、遺伝子導 入動物。
- 32.組織が肝臓である、請求項31の動物。
- 33.プロモーターがPEPCKプロモーターである、請求項32の動物。
- 34.発現が組織特異性である、請求項21の方法。
- 35.発現が主として肝臓である、請求項34の方法。
- 36.上記遺伝子がホルモンをコードする、請求項1の動物。
- 37.上記遺伝子が成長ホルモンをコードする、請求項36の動物。
- 38.上記遺伝子がチロイド放出性ホルモンをコードする、請求項36の動物。
- 39.上記遺伝子がPEPCK以外の酵素をコードする、請求項1の動物。
- 40.非PEPCK構造遺伝子に作動できるように結合されているPEPCKブ ロモ−ターを含有するキメラDNA分子。
- 41.肝cAMPレベルに影響を及ぼす食餌を動物に与えることによって発現を 調節し、上記細胞が肝細胞である、請求項18の方法。
- 42.上記遺伝子によってコードされるポリペプチドの成熟動物発現対胎児発現 の比率が少なくとも10:1である、請求項1の動物。
- 43.当該プロモーターに対して外来である遺伝子に作動できるように結合され ているプロモーターを担持する細胞の1個または2個以上を含有し、上記遺伝子 の下における成熟動物発現対胎児発現の比率が少なくとも10:1である、人間 以外の遺伝子導入動物。
- 44.転写の誘発に際して、上記遺伝子によってコードされるmRNAの転写比 率が、メタロチオネインプロモーターに結合させた場合の、この遺伝子によりコ ードされるmRNAの転写比率の少なくとも約4倍である、請求項43の動物。
- 45.上記プロモーターの下における遺伝子の発現が動物の食餌の調節によって 制御される、請求項10の動物。
- 46.ベクターを、インビトロで細胞中に導入し、この細胞を次いで、この細胞 を増殖することができる動物中に導入する、請求項6の方法。
- 47.異種遺伝子を動物の肝細胞中に導入する方法であって、動物に対して異種 の遺伝子を担持するレトロウイルスベクターを用意し、このベクターを胎児段階 の動物の腹腔内に注入し、次いで動物をその胎児段階から発育させることを包含 する方法。
- 48.上記遺伝子がPEPCKプロモーターに作動できるように結合されている 、請求項47の方法。
- 49.レトロウイルスペクターが複製欠失性である、請求項47の方法。
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