WO1995025169A1 - Gen quimerico que utiliza el gen o cdna de la insulina, en especial para terapia genica de la diabetes - Google Patents

Gen quimerico que utiliza el gen o cdna de la insulina, en especial para terapia genica de la diabetes Download PDF

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Alfons Valera Abril
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Definitions

  • the present invention relates firstly to a chimeric gene that uses the insulin gene or cDNA (complementary DNA) directed by a promoter or promoter fusion.
  • a chimeric gene formed by the fusion of the promoter of P-enolpiruvato carboxykinase to the structural gene of human insulin, which allows the production of human insulin, in a physiologically regulated manner, in a tissue other than the pancreas.
  • the invention also relates to other objects described below.
  • IDDM insulin-dependent diabetes mellitus
  • Gene therapy involves the transfer of genetic material into a patient's cells in order to treat a disease.
  • Different gene therapy approaches are currently being developed, based on the introduction of genes directly into animals or into cells - which are subsequently transplanted.
  • the most important goal is not to successfully transplant cells that express the gene into an animal, but to get the gene to be expressed in a regulated and physiological manner.
  • the choice of a good promoter that directs the expression of the appropriate gene is crucial in order to obtain adequate plasma levels of the corresponding protein.
  • the subject of the invention is a chimeric gene that uses the insulin gene or cDNA (complementary DNA) directed by a promoter or fusion of promoters, preferably adjustable and activated by the diabetic process.
  • the object of the invention is a chimeric gene that is obtained by the fusion of the human insulin gene to the P-enolpyruvate carboxy kinase (PEPCK) promoter.
  • PPCK P-enolpyruvate carboxy kinase
  • P-enolpiruvato carboxykinase is a key enzyme in the control of the gluconeogenic pathway, and is found mainly in the liver, kidney, jejunum and adipose tissue.
  • the activity of this enzyme is regulated at the level of its gene expression (Hanson, RW, et al. (1976) Glycogenesis: I ts Regulation in mammalian Species. John Wiley & Sons, Inc., New York).
  • PEPCK gene expression It is finely regulated by hormones. In the fragment of the PEPCK promoter used (-550 bp to +73 bp) sequences that respond to cAMP, glucocorticoids and insulin have been described (ynshaw-Boris, A.
  • This fragment of the PEPCK promoter is capable of directing the expression of the bovine growth hormone gene in a regulated and tissue-specific manner in transgenic animals (McGrane, MM, et al (1988) J. Biol. Chem. 263 , 11443-11451; Short, MK, et al. (1992) Mol. Cell. Biol. 12, 1007-1020; Eisenberger, CL (1992) Mol. Cell. Biol. 12, 1396-1403).
  • the chimeric gene will be transcribed, but, when enough has been synthesized, the insulin itself will inhibit the PEPCK promoter that directs its expression.
  • the invention is therefore aimed at creating a chimeric PEPCK / insulin gene.
  • the fragment corresponding to the insulin gene conserves 170 bp of the 5 'flanking zone goes.
  • the chimeric PEPCK / insulin gene contains two initiations of transcription, one corresponding to the insulin promoter, and the other to the PEPCK promoter. It is actually a chimeric promoter, to which the part of the PEPCK promoter confers tissue specificity (mainly liver, kidney, jejunum and adipose).
  • This chimeric gene has been introduced into hepato a cells in culture and hepatocytes in primary culture by transient transfection, observing that insulin-specific mRNA cells in liver and immunoreactive insulin appeared in these culture media.
  • a subject of the invention is also a method of fusion of promoters or gene regulatory elements that allow insulin to be expressed in cell types other than pancreatic ⁇ cells.
  • the part of the PEPCK promoter confers tissue specificity (mainly liver, kidney, jejunum and adipose).
  • a subject of this invention is also an expression vector that allows insulin to be expressed in cells other than pancreatic ⁇ cells, more particularly, a pPCK / Ins plasmid vector and a vPCK / Ins retroviral vector. These vectors allow the expression of the chimeric gene in cells.
  • Other viral expression vectors adenovirus, herpes virus, papillonavirus, etc.
  • non-viral can also be used.
  • a subject of the invention is also a transgenic animal that expresses the chimeric gene described above, as well as a cell type originating from this transgenic animal.
  • Transgenic mice have been obtained in the laboratory by the technique of microinjection of the chimeric gene to fertilized mouse ovules before the fusion of the two female and male pronuclei. The animals obtained were found to be healthy and normoglycemic, indicating that there is good control in the regulation of the chimeric gene.
  • Another object of the invention is the chromosome of the transgenic animal that contains the chimeric gene "" described above.
  • the invention aims at a chimeric gene of the type described above, for use in the gene therapy of diabetes, more specifically, for the use in the gene therapy of diabetes in tissues other than the pancreas in mammals, particularly in the human species.
  • transgenic animal of the type described for use in the development of gene therapy protocols.
  • Figure 1 depicts the construction of the PEPCK / Insulin chimeric gene from plasmid pB7.0 and the human insulin gene
  • Figure 2 represents the structure of the chimeric PEPCK / insulin gene na
  • Figure 3 represents the process of obtaining the retroviral vector vPCK / Ins from plasmid pPCK / - Ins.
  • the plasmid pB7.0 containing the entire PEPCK gene was started.
  • the 5 * flanking zone of this gene was obtained by digestion with the enzymes Xbal and BglII (fragment -460 bp at +73 bp).
  • This fragment was then subcloned into the polylinker of plasmid pTZ18.
  • this plasmid was digested with Xbal and BglII and the promoter fragment was subsequently ligated to these targets.
  • the PEPCK promoter had been subcloned in pTZ18 and there were still other targets in the polylinker that could be used later.
  • the human insulin gene was introduced.
  • Plasmid pTZ18 which contained the PEPCK promoter, was digested with BglII, target located at the end of the promoter ( 3 'end), and with Sphl, target located in the polylinker. This linearized plasmid was ligated with the BglII / -Sphl fragment of the insulin gene, and the chimeric PEPCK / insulin gene was obtained, subcloned into pTZ18 (Fig. 1). This plasmid was named pPCK / Ins.
  • Fig. 2 the structure of the chimeric PEPCK / insulin gene is presented in detail.
  • the PEPCK promoter fragment -460 bp at +73 bp
  • This insulin promoter fragment contains the elements recognized by the general machinery of transcription and an element of response to cAMP (which induces gene expression).
  • the human insulin gene contains three exons (two encoders, El and E2) and two introns (A and B). In position 5 'with respect to intron A is the "cap site" and in 3' of the last exon is the polyadenylation zone (Fig. 2).
  • This chimeric gene has been introduced into hepatoma cells in culture and hepatocytes in primary culture by transient transfection of the plasmid pPCK / I-ns, being observed that it appeared in these specific insulin mRNA cells, and immunoreactive insulin in the medium. of cultivation
  • the Clal fragment of pl2NPCK / I-ns, containing the chimeric gene was obtained and introduced into the Cia I target of the retroviral vector pLJ (-SV40) (derived from the parental vector pLJ (Korman, AJ, et al. (1987 ) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 84. 2150-2154)).
  • This vector was introduced into psi-2 cells (Mann, R., (1983) Cell 33, 153-159) by precipitation with calcium phosphate.
  • the cells were exposed to the G418 selection antibiotic 48 hours after the transfer, and those that were positive for vector integration survived the toxic. These cells were kept in culture for a month, and when they reached confluence the culture medium, which contained the defective virions, was collected.
  • the process of obtaining a transgenic animal that expresses the chimeric gene PEPCK / Insulin is briefly explained below. Once it was verified that the chimeric gene was functional by transfection of cells in culture, the chimeric gene (Xbal-Sphl fragment) was microinjected into fertilized mouse ovules before the fusion of the two female and male pronuclei according to the method described by Wagner, et al. (1981) Proc. Nati Acad. Sci. USA 78, 5016). These embryos were subsequently transferred to a recipient mother.
  • transgenic animals From the animals obtained, DNA was isolated from a tail fragment and then the presence of the transgene was analyzed by Southern blotting and subsequent hybridization with a specific probe containing a fragment of the micro-injected chimeric gene. With transgenic animals colonies have been established, in which the expression of the chimeric gene has been analyzed. Thus the obtained transgenic animals express the transgene in the tissues where the PEPCK is normally expressed. The animals obtained turned out to be healthy and norraoglycemic, indicating therefore that there is good control in the regulation of the chimeric gene.

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Abstract

El gen quimérico está dirigido por un promotor o fusión de promotores, los cuales preferentemente son regulables y están activados por el proceso diabético. Preferentemente, se obtiene por fusión del gen de la insulina humana al promotor de la PEPCK (p-enolpiruvato carboxiquinasa). Dicho promotor (fragmento-460 pb a + 73 pb) está fusionado a la zona 5' flanqueante del gen de la insulina humana (-170 pb a + 1). El gen de la insulina humana contiene dos exones codificantes E1 y E2 y dos intrones A y B. También se refiere a un vector de expresión que permite expresar insulina en células diferentes de las celulas B del páncreas y a un animal transgénico que expresa el citado gen quimérico. Se utiliza especialmente para la terapia génica de la diabetes.

Description

GEN QUIMÉRICO QUE UTILIZA EL GEN O CDNA DE LA INSULINA, EN ESPECIAL PARA TERAPIA GENICA DE LA DIABETES.
La presente invención se refiere en primer lugar a un gen quimérico que utiliza el gen o cDNA (ADN comple¬ mentario) de la insulina dirigido por un promotor o fusión de promotores.
Más concretamente se refiere al diseño de un gen quimérico formado por la fusión del promotor de la P- enolpiruvato carboxiquinasa al gen estructural de la insulina humana, que permite la producción de insulina humana, de manera fisiológicamente regulada, en un tejido diferente del páncreas.
La invención se refiere también a otros objetos que se describen más adelante.
ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN
Los pacientes afectados de diabetes mellitus dependiente de insulina (IDDM) (tipo I) dependen dramáti¬ camente de la administración de la hormona. La interrup¬ ción de la administración de insulina provoca primero hiperglucemia y cetoacidosis , posteriormente coma y final¬ mente muerte si la hormona no es inyectada. Por tanto, la vida y la calidad de vida de estos pacientes depende completamente de las fluctuaciones de sus niveles de insulina en sangre.
La terapia géπica consiste en la transferencia de material genético en células de un paciente a fin de tratar una enfermeda. Actualmente se están desarrollando diferentes aproximaciones de terapia génica, basadas en la introducción de genes directamente en animales o en célu¬ las -que posteriormente son trasplantadas. Sin embargo, la meta más importante no es conse¬ guir trasplantar con éxito células que expresen el gen en un animal, sino conseguir que el gen se exprese de manera regulada y fisiológica. La elección de un buen promotor que dirija la expresión del gen adecuado es crucial a fin de obtener niveles plasmáticos adecuados de la correspon¬ diente proteína.
En el caso de la diabetes se trata de elegir el promotor que dirija la expresión del gen para obtener niveles plasmáticos de insulina adecuados a cada circuns¬ tancia en que se encuentre el individuo. La sobreexpresión del gen de la insulina provocaría hipoglucemia y una expresión baja de dicho gen no modificaría los niveles de glucosa elevados en el proceso diabético.
DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN
La invención tiene por objeto un gen quimérico que utiliza el gen o cDNA (ADN complementario) de la insulina dirigido por un promotor o fusión de promotores, preferentemente regulables y activados por el proceso diabético.
Preferentemente, la invención tiene por objeto un gen quimérico que se obtiene por la fusión del gen de la insulina humana al promotor de la P-enolpiruvato carboxi- quinasa (PEPCK) .
La P-enolpiruvato carboxiquinasa es un enzima clave en el control de la vía gluconeogénica, y se encuen¬ tra principalmente en el hígado, riñon, yeyuno y tejido adiposo. La actividad de este enzima se regula a nivel de la expresión de su gen (Hanson, R.W., et al. (1976) Gluco- neogenesis : I ts Regulation in mammalian Species. John Wiley & Sons, Inc., New York). La expresión del gen de la PEPCK se encuentra finamente regulada por hormonas. En el frag¬ mento del promotor de la PEPCK utilizado (-550 pb a +73 pb) se han descrito secuencias que responden a AMPc, a glucocorticoides y a insulina ( ynshaw-Boris, A. et al (1984) J. Biol. Chem. 259, 12161-12169; Wynshaw-Boris, A. et al. (1986) J. Biol. Chem. 261, 9714-9720; Short, J.M. et al. (1986) J. Biol. Chem. 261, 9721-9726; O'Brien R.M., et al. (1990) Science 249, 533-537). El glucagón actuando vía AMPc, y los glucocorticoides activan la expresión del gen, mientras que la insulina inhibe dicha expresión. En animales diabéticos, la expresión del gen de la PEPCK está incrementada debido al aumento de los nive¬ les plasmáticos de glucagón y al descenso en los niveles de insulina (Tilghman, S.M., et al. (1974) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 71, 1304-1308; Hopgood, M.F., et al (1973) Biochem. J. 134, 445-453; Kioussis, D., et al. (1978) J. Biol. Chem. 253, 4327-4332). Este fragmento del promotor de la PEPCK es capaz de dirigir la expresión del gen de la hormona de crecimiento bovino de manera regulada y especí- fica de tejido en animales transgénicos (McGrane, M.M., et al (1988) J. Biol. Chem. 263, 11443-11451; Short, M.K., et al. (1992) Mol. Cell. Biol. 12, 1007-1020; Eisenberger, C.L. (1992) Mol. Cell. Biol. 12, 1396-1403).
Por tanto, al fusionar este promotor de la PEPCK al gen de la insulina humana se producirá insulina en los tejidos donde se expresa el promotor de la PEPCK. En un animal diabético, se transcribirá el gen quimérico, pero, cuando ya se haya sintetizado suficiente, la propia insu¬ lina inhibirá el promotor de la PEPCK que dirige su expre- sión.
La invención tiene, pues, por objeto la creación de un gen quimérico PEPCK/insulina. En este gen quimérico, el fragmento correspondiente al gen de la insulina conser- va 170 pb de la zona flanqueante 5' . El gen quimérico PEPCK/insulina contiene dos inicios de transcripción, uno correspondiente al promotor de la insulina, y el otro al promotor de la PEPCK. Se trata en realidad de un promotor quimérico, al que la parte del promotor de la PEPCK le confiere especi¬ ficidad de tejido (principalmente hígado, riñon, yeyuno y adiposo). Este gen quimérico se ha introducido en células de hepato a en cultivo y en hepatocitos en cultivo prima- rio mediante transfección transitoria, observándose que aparecía en estas células mRNA específico de insulina en hígado e insulina inmunoreactiva en el medio de cultivo.
La invención tiene también por objeto un procedi¬ miento de fusión de promotores o elementos reguladores de genes que permitan expresar la insulina en tipos celulares distintos de las células β del páncreas. En el gen quimé¬ rico, la parte del promotor de la PEPCK le confiere espe¬ cificidad de tejido (principalmente hígado, riñ-ón, yeyuno y adiposo) . Esta invención también tiene por objeto un vector de expresión que permite expresar insulina en células diferentes de las células β del páncreas, más particular¬ mente, un vector plasmídico pPCK/Ins y un vector retroví- rico vPCK/Ins. Estos vectores permiten la expresión del gen quimérico en células. También pueden utilizarse otros vectores de expresión virales (adenovirus, herpes virus, papilonavirus , etc.) o no virales.
Se han utilizado para infectar diferentes tipos de células en cultivo primario y líneas celulares estable- cidas (hepatoma, fibroblastos, mioblastos, preadipocitos ) . Las líneas celulares infectadas expresan insulina humana de manera predecible. La invención tiene por objeto, además, un animal transgénico que expresa el gen quimérico descrito ante¬ riormente, así como un tipo celular originado a partir de este animal transgénico. En el laboratorio se han obtenido ratones trans- génicos mediante la técnica de microinyección del gen quimérico a óvulos fecundados de ratón antes de la fusión de los dos pronúcleos femenino y masculino. Los animales obtenidos resultaron estar sanos y normoglucémicos , indi- cando que existe un buen control en la regulación del gen quimérico.
Otro objeto de la invención es el cromosoma del animal transgenico que contiene el gen quiméri "' anterior¬ mente descrito. Finalmente la invención tiene por objeto un gen quimérico del tipo descrito anteriormente, para la utili¬ zación en la terapia génica de la diabetes, más concreta¬ mente, para la utilización en la terapia génica de la diabetes en tejidos diferentes del páncreas en mamíferos , particularmente, en la especie humana.
También se refiere a un animal transgénico del tipo descrito para su utilización en el desarrollo de protocolos de terapia génica.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS
Para mejor comprensión de cuanto se ha expuesto se acompañan unos dibujos referidos a ejemplos de realiza¬ ción. En dichos dibujos, la figura 1 representa la construcción del gen quimérico PEPCK/Insulina a partir del plásmido pB7.0 y del gen de la insulina humana; la figura 2 representa la estructura del gen quimérico PEPCK/insuli- na; y la figura 3 representa el proceso de obtención del vector retrovírico vPCK/Ins a partir del plásmido pPCK/- Ins .
EJEMPLOS DE REALIZACIÓN
Para la construcción del gen quimérico PEPCK/in- sulina (Fig. 1) se partió del plásmido pB7.0 que contiene el gen completo de la PEPCK. La zona 5* flanqueante de este gen se obtuvo mediante digestión con los enzimas Xbal y BglII (fragmento -460 pb a +73 pb). A continuación, se subclonó este fragmento en el polylinker del plásmido pTZ18. Para ello se digirió este plásmido con Xbal y BglII y se ligó posteriormente el fragmento del promotor, a estas dianas. De esta manera se había subclonado el promo¬ tor de la PEPCK en pTZ18 y aún quedaban otras dianas en el polylinker que podían ser utilizadas posteriormente. A continuación se procedió a introducir el gen de la insuli¬ na humana. En este caso, se cortó el gen completo de la insulina con BglII y Sphl y se obtuvo el fragmento -170 pb a +1561 pb (Bell, I.B., et al (1980) Nature 284, 26-32). El plásmido pTZ18, que contenía el promotor de la PEPCK, se digirió con BglII, diana situada al final del promotor (extremo 3'), y con Sphl, diana situada en el polylinker. Este plásmido linearizado se ligó con el fragmento BglII/- Sphl del gen de las insulina, y se obtuvo el gen quimérico PEPCK/insulina , subclonado en pTZ18 (Fig. 1). Este plásmi¬ do se nombró pPCK/Ins.
En la Fig. 2 se presenta, con detalle, la estruc- tura del gen quimérico PEPCK/insulina. El promotor de la PEPCK (fragmento -460 pb a +73 pb) está fusionado a la zona 5* flanqueante del gen de la insulina humana (-170 pb a +1). Este fragmento del promotor de la insulina contiene los elementos que reconoce la maquinaria general de trans¬ cripción y un elemento de respuesta a AMPc (que induce la expresión del gen). Por tanto, en la región 5* flanqueante del gen quimérico se encontraban dos TATA box y dos ini- cios de la transcripción, uno al final del promotor de la PEPCK y otro al final del promotor de la insulina. El gen de la insulina humana contiene tres exones (dos codifican¬ tes, El y E2) y dos intrones (A y B). En posición 5' respecto al intrón A se encuentra el "cap site" y en 3' del último exón se encuentra la zona de polyadenilación (Fig. 2).
Este gen quimérico se ha introducido en células de hepatoma en cultivo y en hepatocitos en cultivo prima¬ rio mediante transfección transitoria del plásmido pPCK/I- ns , observándose que aparecía en estas células mRNA espe¬ cífico de insulina, e insulina inmunoreactiva en el medio de cultivo.
Una vez comprobado que el gen quimérico PEPCK/In- sulina se expresaba de manera predecible procedimos a la obtención de un vector retrovírico que contuviera el gen quimérico, y que, a su vez, se expresara de manera regula¬ da y controlable por el propio producto de expresión, la insulina. Este es un requisito imprescindible para la elaboración de un vector de utilidad en terapia génica. Tal como se esquematiza en la figura 3, para la construcción del vector retrovírico se subclonó el frag¬ mento EcoRI-HindI11 del plásmido pPCK/Ins, que contiene el gen quimérico PEPCK/insulina completo, al plásmido pl2N. Posteriormente se obtuvo el fragmento Clal del pl2NPCK/I- ns , conteniendo el gen quimérico, y se introdujo en la diana Cía I del vector retrovírico pLJ(-SV40) (derivado del vector parental pLJ (Korman, A.J., et al. (1987) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 84. 2150-2154)). El vector resultan- te, vPCK/Ins, contiene el gen quimérico PEPCK/insulina en orientación contraria al LTR 5' (promotor del retrovirus).
Este vector fue introducido en células psi-2 (Mann, R. , (1983) Cell 33, 153-159) mediante precipitación con fosfato calcico. Las células fueron expuestas al antibiótico de selección G418 a las 48 horas de la trans- fección, y las que fueron positivas a la integración del vector sobrevivieron al tóxico. Se mantuvieron estas células en cultivo durante un mes, y cuando llegaron a confluencia se recolectó el medio de cultivo, que contenía los viriones defectivos.
A continuación se expone brevemente el proceso de obtención de un animal transgénico que expresa el gen quimérico PEPCK/Insulina. Una vez verificado que el gen quimérico era funcional mediante transfección de células en cultivo, se procedió a microinyectar el gen quimérico (fragmento Xbal-Sphl) a óvulos fecundados de ratón antes de la fusión de los dos pronúcleos femenino y masculino según el método descrito por Wagner, et al. (1981) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 78, 5016). Estos embriones eran posteriormente trans¬ feridos a una madre receptora. De los animales obtenidos se aisló DNA a partir de un fragmento de cola y a conti¬ nuación, se analizó la presencia del transgen mediante Southern blot y posterior hibridación con una sonda espe¬ cífica que contenía un fragmento del gen quimérico mi- croinyectado. Con los animales transgénicos se han esta¬ blecido colonias, en las que se ha analizado la expresión del gen quimérico. Así los animales transgénicos obtenidos expresan el transgen en los tejidos donde normalmente se expresa la PEPCK. Los animales obtenidos resultaron estar sanos y norraoglucémicos , indicando por tanto que existe un buen control en la regulación del gen quimérico.

Claims

R E I V I N D I C A C I O N E S
1. Gen quimérico que utiliza el gen o cDNA (ADN complementario) de la insulina dirigido por un promotor o fusión de promotores.
2. Gen quimérico según la reivindicación 1, caracterizado por el hecho de que los promotores son regulables y son activados por el proceso diabético.
3. Gen quimérico según la reivindicación 2, caracterizado por el hecho de que se obtiene por la fusión del gen de la insulina humana al promotor de la PEPCK (P- enolpiruvato carboxiquinasa) .
4. Procedimiento de fusión de promotores o ele¬ mentos reguladores de genes que permitan expresar la insulina en cualquier tipo celular distinto de las células β del páncreas.
5. Vector de expresión que permite expresar insulina en células diferentes de las células 3 del pán¬ creas .
6. Vector plasmídico pPCK/Ins según la reivindi¬ cación 5, que permite expresar insulina en células dife¬ rentes de las células 6 del páncreas.
7. Vector retrovírico vPCK/Ins según la reivindi¬ cación 5, que permite expresar insulina en células dife¬ rentes de las células β del páncreas.
8. Animal transgénico que expresa el gen quiméri¬ co según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3.
9. Tipo celular originado a partir del animal transgénico de la reivindicación 8.
10. Cromosoma del animal transgénico de la rei¬ vindicación 8, que contiene el gen quimérico según cual¬ quiera de las reivindicaciones 1 a 3.
11. Gen quimérico según cualquiera de las reivin- dicacioπes 1 a 3, para la utilización en la terapia génica de la diabetes.
12. Gen quimérico según cualquiera de las reivin¬ dicaciones 1 a 3, para la utilización en la terapia génica de la diabetes en tejidos diferentes del páncreas en mamíferos.
13. Gen quimérico según cualquiera de las reivin¬ dicaciones 1 a 3, para la utilización en la terapia génica de la diabetes en tejidos diferentes del páncreas en la especie humana.
14. Animal transgénico según la reivindicación 8, para su utilización en el desarrollo de protocolos de terapia génica.
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