JPH07501456A

JPH07501456A - 二つの誘導性配列を含む合成真核細胞プロモーター

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Publication number: JPH07501456A
Application number: JP5516926A
Authority: JP
Inventors: フィルマス、ジョージ; クレイン、マイケル
Original assignee: コノート　ラボラトリーズ　リミテッド
Priority date: 1992-03-30
Filing date: 1993-03-30
Publication date: 1995-02-16
Anticipated expiration: 2013-01-21
Also published as: CA2128602A1; CA2128602C; ATE217649T1; EP0633941B1; RU94042389A; BR9306167A; KR950700420A; NO316451B1; ES2176202T3; DE69331931D1; GB9206874D0; AU3883393A; FI944451A0; JP2701983B2; DE69331931T2; WO1993020218A1; US5559027A; NO943610L; AU667532B2; FI944451A

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】二つの誘導性配列を含む合成真核細胞プロモーター技術分野本発明は、改良誘導性哺乳動物発現系の作出に関する。

発明の背景哺乳動物発現系は、翻訳後に広範囲に修飾されるタンパク質の、組み替え技術による生産において広く用いられている。これらの系は構成性か誘導性のｌ、１ずれかである。誘導性系は可能性として細胞毒性のタン）＜り質の発現に用いることが適切である。

発現系が構成性か誘導性かを決定する鍵となるのが、プロモーターである。実験系において誘導され得るいくつかの哺乳動物プロモーターが特徴づけされており、メタロチオネイン（ＭＴ）遺伝子およびマウス乳癌ウィルス／末端反復配列（ＭＭＴＶ−ＬＴＲ）に存在するプロモーターが広く用いられている。

ＭＴプロモーターの最良の誘導物質は、カドミウム（Ｃｄ）および亜鉛（Ｚｎ）などの重金属である。プロモーターの誘導は、金属による活性化の後にＭＴプロモーター中に存在する誘導性金属感受性配列（ＭＲＥ）に結合する転写因子によって媒介される。このプロモーターにはまた、活性化の必要がない転写因子に結合し、遺伝子発現の基底レベルに関わるいくつかの構成性（非誘導性）配列が含まれる。これらの構成性配列の存在の結果、ＭＴプロモーターの発現の非誘導性レベルは有意であり、誘導比（誘導性発現と基底レベル発現との比）は通常５〜１０倍を超えない。ＭＴプロモーターの構成性配列のいくつかを除去することによって基底レベルの発現を減らす試みがなされてきた。しかし、これら配列の除去はまた、発現の誘導性レベルをも低減させる。

天然ヒトＭＴ−ＩＩＡプロモーターは、ＭＲＥおよび構成性配列の他に、単一の誘導性グルココルチコイド感受性配列（ＧＲＥ）を含み、デキサメタシン（ｄｅｘ）のようなグルココルチコイドはＭＴ−ＩＩＡプロモーターからそのままで低レベル発現を誘導する。

天然ＭＭＴＶ−ＬＴＲプロモーターは、四つの誘導性ＧＲＥを含み、グルココルチコイドによって強く誘導され得る。発現の基底レベルはヒ）ＭＴ−ＩＩＡプロモーターを用いて得られるものに較べると低いが、誘導性発現の絶対的レベルは基底レベルはどには高くない。

遺伝子発現調節に関わる誘導性配列などの核酸配列は、調節される遺伝子の５′ 側または３′側または調節される遺伝子内に位置することができる。

発明の概要本発明によれば、少なくとも二つの異なるクラスの誘導性配列からなる遺伝子転写調節のための合成誘導性真核細胞プロモーターが提供される。本発明に係る誘導性配列のクラスには、ホルモン感受性配列（ＧＲＥを含む）、金属感受性配列（ＭＲＥ）、熱シヨツク感受性配列、インターフェロン感受性配列およびサイトカイン感受性配列が含まれる。

一つの実施態様において、提供される合成プロモーターは天然プロモーターに由来し、異なるクラスの誘導性配列の一つは天然誘導性配列であるが、もう一つの異なるクラスの誘導性配列は例えば天然プロモーターへの挿入によってまたは天然プロモーター中の通常は不活性な配列の活性化などによってもたらされる。

一般に二つの異なるクラスの誘導性配列が本発明の新規の合成プロモーター中には存在するが、適宜、三つまたはそれ以上の組み合わせが存在していてもよい。

合成プロモーター中の異なるクラスの誘導性配列を利用することによって、遺伝子産物の真核生物発現系、とくに哺乳動物発現系における発現の共働的誘導が可能になる。すなわち、複数のクラスの誘導性配列の誘導によって得られる遺伝子発現のレベルは、個々のクラスの誘導性配列の別々の誘導によって達成される個々の遺伝子発現の総和よりも大きい。加えて、遺伝子発現の総合的レベルが高まると考えられる。

そのようなプロモーターはまた合成によって得てもよいが、一般にここで提供される合成プロモーターはここに詳述するように天然のプロモーターに由来する修飾によって得られるものである。

上記したように、誘導性プロモーターは少なくとも一つの構成性配列を含むことができるが、これは誘導の存在なしで基底遺伝子発現レベルをもたらすことができる。本発明の実施例において、少なくとも一つの構成性配列を機能的に無能にして、その結果、非修飾プロモーターと比較して一般に遺伝子発現の基底レベルが低下し、誘導された遺伝子発現対基底遺伝子発現の比が高まる。少なくとも一つの構成性配列のそのような機能的無能は、天然プロモーターから除去することによっておよび／または誘導性配列などをそこに挿入することによって達成することができる。

したがって、本発明は好ましい実施態様において、天然ＧＲＥおよび／またはＭＲＥだけではなく追加のＧＲＥおよび／またはＭＲＥを含む改良誘導性真核生物プロモーターを提供する。天然プロモーターの構成性配列は改良プロモーター中で除去されていてもいなくてもよい。改良プロモーターは、重金属イオンおよびグルココルチコイド（デキサメタシンなど）の両者が同時に用いられて少なくとも一つのＭＲＥおよび少なくとも一つのＧＲＥの両者が存在する場合には、共働的に誘導され得る。共働的誘導の結果、と）ＭＴ−Ｉ　Ｉ　ＡｔたｉｉＭＭＴＶ −ＬＴＲプＯ（−−９−すどの非修飾プロモーターで観察されるよりもはるかに高い遺伝子発現レベルが認められる。新規のプロモーターはまた非修飾プロモーターよりも少ない構成性配列を含んでいてもよく、これはより低い基底レベルの遺伝子発現をもたらす。

適宜、非修飾プロモーターはヒトＭＴ−ＩＩＡまたはＭＭＴＶ−ＬＴＲプロモーターが用いられる。感受性配列は適宜、そのような配列のための共通配列を含んでいてもよく、例えば５′　−ＧＡＴＣＴＴＧＣＧＣＣＣＧＧＣＣＣＧ−３′（配列番号２）はＭＲＥ共通配列を含み、そして５・−ＧＡＴＣＴＧＧＴＡＣＡＧＧＡＴＧＴＴＣＴＡＧＣＴＡＣＧ−３′　（配列番号１）は本発明の実施例において用いられるＧＲＥ共通配列を含む。

本発明の効果には次のようなものがあげられる。

ａ）高い総合的レベルの遺伝子発現ｂ）基底遺伝子発現レベルの低減Ｃ）遺伝子発現の共働的誘導ｄ）誘導比および／または適切な誘導物質に対する感受性に関して修飾されたプロモーター図面の簡単な説明第１図は、ｈＭＴ−ＩＩＡプロモーターおよび本発明の一つの実施態様に従ってｈＭＴ−ＩＩＡプロモーターに施した種々の修飾を有する修飾されたプロモーターの遺伝子地図である。

発明の詳細な説明上記したように、ここに提供される新規のプロモーターは天然プロモーターに由来するものが用い得る。

本発明の一つの好ましい実施態様において、プロモーターは少なくとも一つの天然誘導性配列および少なくとも一つの異なる誘導性配列を含み、前者はＭＲＥであり、後者はホルモン感受性配列、とくに天然プロモーター中に挿入によって導入されたグルココルチコイド感受性配列（ＧＲＥ）であるそのような挿入ＧＲＥは、ＧＲＥ共通配列を含む一対の相補的オリゴヌクレオチドからなる合成分子でもよい。複数のＧＲＥを天然プロモーター中に多量体直列自己連結配列物のかたちで挿入してもよい。

本発明のとくに好ましい実施態様は、真核生物発現系、とくに噴孔動物発現系において誘導性ＭＲＥおよびＧＲＥの誘導時に遺伝子発現の共働作用が達成されるように、少なくとも一つの誘導性ＧＲＥを含むように修飾した、そして好ましくは増強された総合レベルの遺伝子産物発現を伴う、ヒトメタロチオネイン遺伝子（ｈＭＴ−Ｉ　ＩＡ）プロモーターを提供する。このとくに好ましい実施態様においては、多量体直列ＧＲＥを天然ｈＭＴ−ＩＩＡプロモーターに挿入することができる。

天然ｈＭＴ−Ｉ　ＩＡプロモーターの少なくとも一つの構成性配列を、例えばそのような配列を除去することによっておよび／または少なくとも一つのＧＲＥをそこに挿入することによって、無能にすることもまた好ましい。一つの具体的な実施例において、構成性配列の除去および単一または複数のＧＲＥの挿入の両方を適用して構成性配列を無能にする。

本発明の他の好ましい実施態様において、プロモーターは、少なくとも一つの天然誘導性配列すなわちＨＲＥ、とくにグルココルチコイド感受性配列（ＧＲＥ）、および少なくとも一つの異なる誘導性配列すなわち挿入によって導入されたＭＲＥを含む。

そのような挿入ＭＲＥは、ＭＲＥ共通配列を含む一対の相補的オリゴヌクレオチドからなる合成分子でもよい。複数のＭＲＥを天然プロモーター中に多量体直列自己連結配列物のかたちで挿入してもよい。

本発明のとくに好ましい実施態様は、真核生物発現系において誘導性ＧＲＥおよびＭＲＥの誘導時に遺伝子発現の共働作用が達成されるように少なくとも一つの誘導性ＧＲＥを含むように修飾して、そして好ましくは増強された総合レベルの遺伝子発現を伴う、マウス乳ガンウィルス／末端反復（ＭＭＴＶ−ＬＴＲ）プロモーターを提供する。このとくに好ましい実施態様においては、多量体直列ＭＲＥを天然ＭＭＴＶ−ＬＴＲプロモーター中に挿入することができる。

新規の合成誘導性真核生物プロモーターは、とくに発現系によって発現されるべき遺伝子に作動的に連結されている場合は、遺伝子産物の真核生物発現のためのベクター中に組み込んでもよい。そのような発現系には、ベクターを含む真核細胞、とくに哺乳動物細胞、例えばＶｅ　ｒ　ａ、ＣＨＯ，Ｈｅ　Ｌａ、Ｒａ　ｔ　Ｉ　Ｉ繊維芽細胞および消化管上皮細胞などがある。

好ましい実施態様の説明第１図には、本発明の実施態様による多様な修飾を組み入れた新規のプロモーターの種々の型が示されている。新規の一連のプロモーターは、次のような方法で作出される。ヒトＭＴ−ＩＩＡ遺伝子の５ｏｏｂｐの５゛　プロモーター領域を含むＫｓＰＩ−ＤＮＡフラグメント（塩基−７４０〜＋６０）を、ヒトＭＴ−ＩＩＡ遺伝子を含むプラスミド（Ｋａｒｉｎら、１９８２、Ｎａｔｕｒｅ、２９９．７９７−８０２を参照されたい）から単離した。平滑末端を作出した後、ＨｉｎｄＩＩＩリンカ−を加えて、フラグメントをレポーター遺伝子として用いられるクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）遺伝子を含むプラスミドであるｐｓＶＯＡＴｃＡＴ中にＨＩｎｄＩ　Ｉ　Ｉ部位でＣＡＴ遺伝子の５′側に挿入した。オリジナルＭＴ−ＩＩＡプロモーターの二つの構成性配列（ＡＰＩおよびＡｒ１、第１図上部地図参照）をＸｍａ　Ｉ　Ｉ　Ｉフラグメント（塩基−７９〜−１２９）を除去することによって欠失させた。

ＧＲＥ共通配列、５’　ＢａｍＨＩ部位および３′ＢｇｌＩＩ部位を含む一対の相補的オリゴヌクレオチドを合成した。玉鎖オリゴヌクレオチド配列は下記のようであった。

５′　−ＧＡＴＣＴＧＧＴＡＣＡＧＧＡＴＧＴＴＣＴＡＧＣＴＡＣＧ−３’　（配列番号１）多量体直列ＧＲＥを、Ｂ　ａ　ｍ　ＨＩおよびＢｇｌＩＩの存在下で合成ＧＲＥオリゴヌクレオチドを自己結合させることによって調製した。単一および多量体のＧＲＥをプロモーターの５ａｃＩＩ部位（塩基−１７５で）またはプロモーターのＸｍａ　Ｉ　Ｉ　Ｉ部位（塩基−１２９）中に挿入した（第１図下部地図参照）。５ａｃＩＩ配列での挿入は二つ目のＡＰ２部位を破壊する。

ＭＲＥ共通配列、５’　ＢａｍＨＩ部位および３″ＢｇｌＩＩ部位を含む一対の相補的オリゴヌクレオチドを合成した。玉鎖オリゴヌクレオチド配列は下記のようであった。

５′　−ＧＡＴＣＴＴＧＣＧＣＣＣＧＧＣＣＣＧ−３′（配列番号２）そのようなオリゴヌクレオチドを多量体直列配列の合成に用いてもよく、単一または複数のＭＲＥをＧＲＥの場合と同様にしてｈＭＴ−ＩＩＡプロモーター中に挿入してもよい。

同様のＧＲＥおよび／またはＭＲＥのＭＭＴＶ−ＬＴＲプロモーターへの挿入および同プロモーターからの任意の構成性配列除去を達成するためのＭＭＴＶ−ＣＡＴベクターを、プラスミドｐ２０１（ＭａｊｏｒＳ　ら　、１９８１　、Ｎａｔｕｒｅ、　２８３　、　２５３−２５８）からＰｓｔＩを用いて除去し、平滑末端を作出した後、ｐ　５ＶＯＡＴＣＡＴのＨｉｎｄＩＩＩ部位に挿入した。

新規のプロモーターをＲＡＴＩ工繊維芽細胞、ＣＨＯ（チャイニーズハムスター卵巣、ｌ１ｌｌ胞）　、Ｖｅ　ｒ　ｏ　（サル繊維芽細胞）およびＨｅ１ａ（ヒト子宮頚管腫瘍細胞）を用いる暫時ＣＡＴ発現アッセイにおいてグルココルチコイド受容体を発現させて試験した。以下の実施例で再現した結果は、これら新規のプロモーターによって、グルココルチコイド受容体を通常発現しているかグルココルチコイド受容体遺伝子でトランスフ、エクトされた細胞が同時に重金属イオンおよびデキサメタシンで誘導された場合に極めて高いレベルの発現がもたらされることを示した。これらのプロモーターを用いて得られる発現の誘導レベルは、野生型ヒトＭＴ−ＩＩＡまたはＭＭＴＶ−ＬＴＲプロモーターを用いて得られるものよりも有意に高い。同時に、発現の基底レベルは、野生型ヒトＭＴ−ＩＩＡプロモーターで観察されるものよりも有意に低かった。

［実施例コ上記の開示は本発明の一般的記述である。以下の詳細な実施例を参照することによってより完全な理解が得られる。これらの実施例はもっばら説明を目的どするものであって、発明の範囲の限定を意図するものではない。状況の示唆または提示から形状の変更および相当物との代替は当然予想されるものである。特定の用語をここで適用するが、そのような用語は説明を意図するものであって、限定を目的どするものではない。

［実施例１コ本実施例は、追加のＧＲＥを含む修飾された１１　Ｍ　Ｔ−ＩＩＡプロモーターの構築を説明するものである。

ＭＴ発現ベクターはすべて、いかなる調節配列をも有しないクロラムフェニコールアセチルＩ・ランスフェラーゼ（ＣＡＴ）遺伝子を含むプラスミドｐ　Ｓ　ＶＯＡＴＣＡＴ（Ｇｏｒｍａｎら、Ｍｏ１．Ｃｅ１１．Ｂｉｏｌ、２．１０４４．１９８２）に由来した。ＣＡＴ遺伝子が野生型ヒトＭＴ−ＩＩＡプロモーター（ｈＭＴ−ＩＩＡ）の制御下にある調節プラスミドであるＭＴ−ＣＡＴを、下記のようにして作出した。ｈＭＴ−ＩＩＡのプロモーター領域の８００ｂｐのＫｓｐＩフラグメント（（塩基−７４０〜＋６０．第１図）を単離した。平滑末端を作出した後、ＨｉｎｄＩＩＩリンカ−を加えて、フラグメントをｐＳＶＯＡＴＣＡＴのＣＡＴ遺伝子５′側のＨｉｎｄＩＩＩ部位に挿入した。

プラスミドＭＴ−ＣＡＴ−ΔＸを、構成性ＡＰＩ−ＡＰ２を含むＭ　Ｔ　−ＣＡ、　ＴのＭＴプロモーターからＸｍａＩＩＩ７ラグメント（塩基−７９〜−１２９）を除去することによって作出した。追加のＧＲＥを挿入するために、ＧＲＥ共通配列、５′　ＢａｍＨＩ部位および３′　ＢｇｌＩＩ部位を含む一対の相補的オリゴヌクレオチドを合成して、これら合成配列物をＢ　ａ　ｍ　ＨＩおよびＢｇｌＩＩの存在下で自己連結することによって多量体直列配列を作出した。玉鎖ヌクレオチド配列は、上記のような配列番号１であった。次いで単量体または多量体のＧＲＥを、平滑末端を作出した後にＭＴ−ＣＡＴ−ΔＸベクターの５ａｃＩＩ部位またはＸｍ　ａ　Ｉ　Ｉ　Ｉ部位のいずれかに挿入した（第１図）。

挿入されたＧＲＥの数を、ＤＮＡ配列決定によって確認した。

［実施例２］本実施例は追加のＧＲＥを含む発現ベクターの使用を説明するものである。

本実施例に用いられる発現ベクターはＳＧ２であって、これは二つの追加のＧＲＥをＭＴ−ＣＡＴ−ΔＸの５ａｃＩＩ部位に挿入した修飾ＭＴ−ＩＩＡプロモーターを含むｐ　５ＶＯＡＴＣＡＴ由来ＣＡＴ発現ベクターである（第１図）。１５μｇのプラスミドＤＮＡをＣＨＯ細胞に燐酸カルシウム工程（Ｇｒａｈａｍら、１９７３、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、５２．４５６−４６７）を用いてトランスフェクトさせた。３７℃で５時間インキュベートシた後、細胞をＰＢＳ中で１５％グリセロールを用いて３分間衝撃処理した。次いで単層細胞を異なる誘導物質（ＣｄＣ１２および／またはデキサメタシン）とともに１６時間インキュベートして、細胞抽出物を調製した。次いでＣＡＴ活性を１４Ｃ−クロラムフェニコールを基質として用いて測定し、放射性アセチル化産生物をキシレンを用いて抽出した。放射性カウントをシンチレーションカウンター中で測定した。

加えて、ＳＧ２ベクターを、野生型ＭＴ−ＩＩＡプロモーターおよびＭＭＴＶ− ＬＴＲＴＲ上−９−をｐＳＶＯＡＴＣＡＴプラスミドのＨｉｎｄＩＩＩ部位に挿入することによって構築した二つの他のベクターと比較した。ＣＨＯ細胞がグルココルチコイド受容体を有しないことから、細胞を１０μｇのグルココルチコイド受容体発現ベクター（Ｇｉｇｕｅｒｅら、１９８６、Ｃｅ１ｌ、土」、６４５ −６５２）で共トランスフェクトさせた。ＣＡＴ発現アッセイを各四重に行ったが、標準偏差は１０％を超えなかった。タンパク質濃度を各細胞溶解物について測定し、ＣＡＴ活性を等量のタンパク質について算出した。これらの実験の結果を下記の表１に要約する。（諸表は明細書の最後尾に付す。）表１の結果は、金属とデキサメタシンによるＳＧ２プロモーターの共働的誘導が野生型ＭＴ−ＩＩＡおよびＭＭＴＶ−ＬＴＲプロモーターの場合よりも高レベルのＣＡＴ遺伝子発現をもたらしたことを示している。

同時に、誘導比もまた有意に改良された。

［実施例３］本実施例はさらに、追加のＧＲＥを含むベクターの使用を説明するものである。

実施例１と同様の方法を用いて、ＳＧ２プロモーターの活性を、グルココルチコイド受容体を発現するように作出しなＶｅｒｏ細胞中の天然ＭＴ−ＩＩＡプロモーター（Ｇｉｇｕｅｒｅら、１９８６、Ｃｅ　ｌ　ｌ。

±副、６４５−６５２）の活性と比較した。本実施例においては、細胞をまた、 β−ガラクトシダーゼ遺伝子がプロモーターによって制御されていてその活性が本実験条件下で重金属またはグルココルチコイド感受性を受けないような発現ベクターを用いて共トランスフェクトさせた。トランスフェクションおよび誘導の後、細胞抽出物の一部をβ−ガラクトシダーゼ（β−Ｇａｌ）活性の測定に用いた。この活性を、トランスフェクションの効率を考慮してＣＡＴ活性測定値を標準化するために用いた。

得られた結果を下記の表２に示すが、これらはＣＨＯ細胞で得られたもの（表１）と非常に相似しており、修飾されたＭＴ−Ｉ　ＩＡ　（ＳＧ２）プロモーター上でデキサメタシンが金属イオンと共働的に作用することを示している。

［実施例４］本実施例は、発現ベクターへのさらなる修飾およびそれによって得られる結果を説明するものである。

第１図に示すように、追加の修飾は、ｈＭＴ−ＩＩＡプロモーターの５ａｃＩＩ部位に追加数のＧＲＥおよび複数のＭＲＥを導入し、またＸｍａＩＩＩ部位に複数のＧＲＥを導入することによって行った。

得られた修飾プラスミドＤＮＡを、Ｖｅｒｏ細胞に実施例３と同様にして導入して、ＣＡＴ遺伝子発現を上記のようにして決定した。得られる結果を下記の表３に示す。

［実施例５］本実施例は追加のＧＲＥを含む修飾ＭＭＴＶ−ＬＴＲプロモーターの構築および使用を説明するものである。

上記の実施例と同様の工程を用いて、四つのＧＲＥを含むがＭＲＥを全く有しないＭＭＴＶ−ＬＴＲプロモーター（ＭａｊｏｒｓおよびＶａｒｍｕｓｌＮａｔｕｒｅ、２８３．２５３−２５８）のＢｆｒＩ部位に二つのＭＲＥを挿入した。表４は、非修飾ＭＭＴＶ−ＬＴＲプロモーターはＺｎ＋Ｃｄによって誘導できなかったのに対して、修飾プロモーター（８Ｍ２−ＭＭＴＶ）は１０倍の誘導をもたらしたことを示している。

８Ｍ２−ＭＭＴＶがデキサメタシン＋Ｚｎ＋Ｃｄによって誘導された場合には、ＣＡＴ発現において２倍の共働作用が認められた。

実施例１〜５および表１〜４に示された実験結果は、転写の共働的活性化が、修飾ｈＭＴ−ＩＩＡプロモーターにおいては追加の誘導性配列をＧＲＥのかたちで挿入することによって、修飾ＭＭＴＶプロモーターにおいては追加の誘導性配列をＭＲＥのがたちで挿入することによって、それぞれ達成され得ることを示す。

ｈＭＴ−Ｉ工ＡプロモーターへのＧＲＥの追加およびＭＭＴＶプロモーターへのＭＲＥの追加はレポーター遺伝子発現の基底レベルを上げず、修飾プロモーターの誘導性および転写力はそれらの野生型対応物と比較して有意に改良された。これに対して、ｈＭＴ−ＩＩＡプロモーターに四つのＭＲＥのみを付加（ベクター５Ｍ４）ｌ、た結果は中位のＭＴプロモーター転写力改良をもたらしただけであり、この改良は基底発現の有意の増加を伴った。

ＭＴ−ＣＡＴベクター中の非修飾ｈＭＴ−ＩＩＡプロモーターはグルココルチコイド受容体遺伝子でトランスフェクトされたＶｅｒｏ細胞においてデキサメタシンによって誘導されなかった。しかし、プロモーターへの少なくとも一つの追加ＧＲＥの挿入がグルココルチコイド感受性および遺伝子発現をもたらすに十分であった。

挿入された追加ＧＲＥの数および挿入部位の影響を分析するために、実施例において一つまたはそれ以上のＧＲＥをＭＴ−ＣＡＴ−ΔＸの５ａｃＩＩ部位（ＳＧ系列）またはＸｍａＩＩＩ部位（ＸＧ系列）に付加することによって二基列の修飾プロモーターを作出した。全てのベクターはＣｄＣｌ２およびグルココルチコイドによって誘導された。しかし、挿入部位に関係なく、トランスフェクトされたＶｅｒｏ細胞のＣｄＣｌ２およびデキサメタシンによる同時処理によって共働的誘導性を得るには最少二つの隣接したＧＲＥが必要であった。

修飾ｈＭＴ−ＩＩＡプロモーターについて算出した誘導比は、野生型プロモーターに比較して６倍まで増加した。追加ＧＲＥの挿入によって遺伝子発現の基底レベルが例えばＳＧ３において増加しなかったという事実はこの比の改良において重要である。これは、本発明によって、共働的転写活性化を異なるクラスの構成性ではなく誘導性の配列を付加することによって起こさせる利点の一つを強調するものである。

開示の概要本開示の概要において、発明者は新規のそして改良された誘導性哺乳動物発現系の工学的作出および使用、とくに、低レベルの基底遺伝子発現を維持しながらグルココルチコイドおよび金属イオンによって共働的に誘導される一つまたは数個の追加のグルココルチコイド感受性配列を含む修飾されたヒトＭＴ−Ｉ　Ｉ　Ａプロモーターの調製および使用を提示する。誘導比はさらに構成性配列を除去することによって増加させることができる。同様の方法を、追加の金属感受性配列の挿入による改良マウス乳ガンウィルス（ＭＭＴＶ）プロモーターの作出に用いてもよい。諸修飾が本発明の範囲内で可能である。

表１＊＝誘導比表２＊＝誘導比表３プロモーター　誘導物質　相対的ＣＡ　′ｒ活性（％、　ＭＴ−ＩＩＡ文４月０ＭＴ−ＩＩＡ　対照　１．００閘Ｔ（ＩＡ　５μＭＣｄＣ１２１０６４ＭＴ−ＩＩＡ　１μＭデキサメタシン　１０３ＭＴ−ＩＩＡ　５μＭＣｄＣ＋２＋１μ間デキサメタシン　］０７４ＳＧＩ　対照　３２ＳＧＩ　’５μＭＣｄＣ１２３２８ＳＧ１　１μ間デキサメタシン　９５７ＳＧＩ　５μＭＣｄＣ１２＋１μＭデキサメタシン　１３６４ＳＧ２　対照　３６ＳＧ２　５μＭＣｄＣ１２３６４ＳＧ２　１μ閘デキサメタシン　１１６４ＳＧ２　５μＭＣｄＣ１２＋１μＭデキサメタシン　２３２４ＳＧ３　対照　５０ＳＧ３　５μＭＣｄＣ１２５９６ＳＧ３　１　ｐ　Ｍデキサメタシン　１８２１ＳＧ３　５μＭＣｄＣ１２＋１μＭデキサメタシン　３１５６ＳＧ４　対照　２９ＳＧ４　５μＭＣｄＣ１２，２１０ＳＧ４　１μ間デキサメタシン　３８６ＳＧ４　５μＭＣｄＣ１２＋１μ閘デキサメタシン　１３１７ＳＧ５　対照　２１ＳＧ５　５／／Ｍ　ＣｄＣ１２２００ＳＧ５　１μ開デキサメタシン　１３６ＳＧ５　５μＭＣｄＣ１２＋１μＮデキサメタシン　１１１７１μ輌デキサメタシン　１５７４ＸＧ２　５μＭＣｄＣ１２＋１μ閾デキサメタシン　１９５７ＸＧ３　５ｐＭＣｄＣ１２＋１μ間デキサメタシン　２２９Ｘ−３Ｇ２　５μＭＣｄＣ１２＋１μにデキサメタシン　２５６２１μ翼デキサメタシン　３３８３１μ楓デキサメタシン　１５２４表４プロモーター　誘導物質　標準化ＣＡＴ活性ＭＭＴＶ−ＬＴＲＤ　ｅ　ｘ　１３５４０５ＭＭＴＶ−ＬＴＲＺ　ｎ　＋　Ｃｄ　２２５ＭＭＴＶ−ＬＴＲＺｎ＋Ｃｄ＋Ｄｅｘ１４５４１６（１０２Ｘ）＊ＢＭ２−ＭＭＴＶ　対照　１０７８ＢＭ２１０７８Ｂ　Ｄ　ｅ　ｘ　９２８９９ＢＭ２−ＭＭＴＶ　Ｚ　ｎ　＋　Ｃｄ　１０８２７ＢＭ１０８２７Ｂ　Ｚ　ｎ　＋　Ｃｄ　＋Ｄ　ｅ　ｘ　１９６６１４（１８２Ｘ）＊＊＝誘導比手続ネ甫正書印発）平成６年９月２８日

Claims

【特許請求の範囲】

１．少なくとも二つ塩異なるクラスの誘導性配列を含んでなる遺伝子転写調節のための合成誘導性真核生物プロモーター。
２．該クラスの誘導性配列がホルモン感受性配列（ＨＲＥ）、金属感受性配列（ＭＲＥ）、熱ショック感受性配列（ＨＳＲＥ）およびインターフェロン感受性配列（ＩＲＥ）からなる群から選択されることを特徴とする請求項１に記載のプロモーター。
３．天然プロモーターに由来し、該異なるクラスの誘導性配列の一つが天然誘導性配列であり、他の該異なるクラスの誘導性配列が該天然プロモーター中に導入される異なる誘導性配列である請求項２に記載のプロモーター。
４．該異なるクラスの誘導性配列が真核生物発現系において共働的レベルの遺伝子産物の発現をもたらすするように選択されることを特徴とする請求項３に記載のプロモーター。
５．該異なるクラスの誘導性配列が真核生物発現系においてそこに作動的にカップリングされた遺伝子の共働的レベルの発現をもたらすように選択されることを特徴とする請求項１に記載のプロモーター。
６．該異なるクラスの誘導性配列が真核生物発現系においてそこに作動的にカップリングされた遺伝子の共働的レベルの発現をもたらすように選択されることを特徴とする請求項２に記載のプロモーター。
７．天然プロモーターに由来し、該異なるクラスの一つが天然誘導性配列であり、他の該異なるクラスが該天然プロモーター中に導入される異なる誘導性前列であって、該異なるクラスの誘導性配列が真核生物発現系において共働的レベルの遺伝子発現をもたらすように選択されることを特徴とする請求項１に記載のプロモーター。
８．少なくとも一つの構成性配列を含む天然プロモーターに由来し、該少なくとも一つの構成性配列が機能的に無能であることを特徴とする請求項１に記載のプロモーター。
９．天然プロモーターと比較して基底遺伝子発現レベルの低下および誘導遺伝子発現の基底遺伝子発現に対する比の増加をもたらすほどに十分に該少なくとも一つの構成性配列を機能的に無能にすることを特徴とする請求項８に記載のプロモーター。
１０．該少なくとも一つの構成性配列を天然プロモーターからの除去および／または誘導性配列のそこへの挿入によって無能にすることを特徴とする請求項８に記載のプロモーター。
１１．該少なくとも一つの天然誘導性配列が金属感受性配列（ＭＲＥ）であり、少なくとも一つの該異なる誘導性配列がホルモン感受性配列（ＨＲＥ）であることを特徴とする請求項３に記載のプロモーター。
１２．該少なくとも一つのホルモン感受性配列が少なくとも一つのグルココルチコイド感受性配列（ＧＲＥ）であり、該天然プロモーターに挿入によって導入されることを特徴とする請求項１１に記載のプロモーター。
１３．該挿入されたＧＲＥがＧＲＥ共通配列を含み、ヌクレオチド配列：【配列があります】（配列番号１）を有する正鎖を有する合成分子であることを特徴とする請求項１２に記載のプロモーター。
１４．複数のＧＲＥをＢａｍＨＩおよびＢｇｌＩＩの存在下で自己連結された多量体直列配列のかたちで該天然プロモーター中に挿入することを特徴とする請求項１３に記載のプロモーター。
１５．少なくとも一つの構成性配列を含む天然プロモーターに由来し、該少なくとも一つの構成性配列が機能的に無能であることを特徴とする請求項１２に記載のプロモーター。
１６．該少なくとも一つの構成性配列を天然プロモーターからの除去および／または誘導性プロモーターのそこへの挿入によって無能にすることを特徴とする請求項１５に記載のプロモーター。
１７．基底遺伝子発現レベルの低下および誘導遺伝子発現の比の増加をもたらすほどに十分に該少なくとも一つの構成性配列を機能的に無能にすることを特徴とする請求項１６に記載のプロモーター。
１８．該天然プロモーターがｈＭＴ−ＩＩＡプロモーターである請求項１７に記載のプロモーター。
１９．該天然プロモーターがｈＭＴ−ＩＩＡプロモーターである請求項１２に記載のプロモーター。
２０．該少なくとも一つのＧＲＥの天然プロモーターへの該挿入が該少なくとも一つの天然ＭＲＥおよび少なくとも一つの追加のＧＲＥの真核生物発現系における誘導時の遺伝子発現の共働作用を起こすことを特徴とする請求項１９に記載のプロモーター。
２１．該少なくとも一つのＧＲＥの天然プロモーターへの該挿入が該少なくとも一つのＧＲＥの真核生物発現系において増加レベルの遺伝子発現をもたらすことを特徴とする請求項２０に記載のプロモーター。
２２．複数の連結ＧＲＥを天然プロモーター中に挿入することを特徴とする請求項１９に記載のプロモータ。
２３．少なくとも一つの天然構成性配列を無能にすることを特徴とする請求項１９に記載のプロモーター。
２４．該構成性配列を除去および／または少なくとも一つのＧＲＥのそこへの挿入によって無能にすることを特徴とする請求項２３に記載のプロモーター。
２５．天然ｈＭＴ−ＩＩＡプロモーターの塩基−７９〜−１２９に位置する天然構成性配列ＡＰ１およびＡＰ２を除去することを特徴とする請求項２４に記載のプロモーター。
２６．少なくとも一つのＧＲＥ配列を天然ｈＭＴ−ＩＩＡプロモーターのＳａｃ１１部位（塩基一１７５）に挿入することによってその位置のＡＰ２構成性配列を無能にすることを特徴とする請求項Ｚ５に記載のプロモーター。
２７．該少なくとも一つのＧＲＥを天然ｈＭＴ−ＩＩＡプロモーターの少なくとも一つのＳａｃＩＩ部位（塩基−１７５）およびＸｍａＩＩＩ部位（塩基一１２９）に挿入することを特徴とする請求項１９に記載のプロモーター。
２８．二つの連結したＧＲＥ配列をＸｍａＩＩ１部位に挿入することを特徴とする請求項２７に記載のプロモーター。
２９．三つの連結したＧＲＥ配列をＳａｃ１Ｉ部位に挿入することを特徴とする請求項２７に記載のプロモーター。
３０．該少なくとも一つの天然誘導性配列がホルモン感受性配列（ＨＲＥ）であり、該少なくとも一つの異なる誘導性配列が金属感受性配列（ＭＲＥ）であることを特徴とする請求項３に記載のプロモーター。
３１．該少なくとも一つのホルモン感受性配列がグルココルチコイド感受性配列（ＧＲＥ）であり、該ＭＲＥを該天然プロモーターに挿入によって導入することを特徴とする請求項３０に記載のプロモーター。
３２．該挿入されたＭＲＥがＭＲＥ共通配列を含み、ヌクレオチド前列；【配列があります】（配列番号２）で表される正鎖を有する合成分子であることを特徴とする請求項３１に記載のプロモーター。
３３．複数のＭＲＥをＢａｍＨＩおよびＢｇＩＩ１の存在下で自己連結した多量体直列配列のかたちで天然プロモーター中に挿入することを特徴とする請求項３２に記載のプロモーター。
３４．該天然プロモーターがＭＭＴＶ−ＬＴＲプロモーターであることを特徴とする請求項３１に記載のプロモーター。
３５．少なくとも二つの連結したＭＲＥを天然プロモーターに挿入することを特徴とする請求項３４に記載のプロモーター。
３６．少なくとも二つの異なるクラスの誘導性配列からなる合成誘導性真核生物プロモーターを含んでなる遺伝子産物の真核生物発現のためのベクター。
３７．該プロモーターを作動できるように遺伝子に連結することを特徴とする請求項３６に記載のベクター。
３８．該プロモーターが請求項１９に記載の修飾された天然ｈＭＴ−ＩＩＡプロモーターであることを特徴とする請求項３７に記載のベクター。
３９．該プロモーターが請求項３４に記載の修飾された天然ＭＭＴＶ−ＬＴＲプロモーターであることを特徴とする請求項３７に記載のベクター。
４０．誘導された遺伝子発現を達成するための請求項３７に記載のベクターを含む真核細胞を含んでなる真核生物発現系。
４１．該真核細胞が哺乳動物細胞であることを特徴とする請求項４０に記載の発現系。
４２．該哺乳動物細胞がＶｅｒｏ、ＣＨＯ、ＨｅＬａ、ＲａｔＩＩおよび上皮細胞から選択されたものであることを特徴とする請求項４１に記載の発現系。