KR100208311B1 - 두개의 유발요소들을 함유한 합성 진핵 세포의 프로모터 - Google Patents

두개의 유발요소들을 함유한 합성 진핵 세포의 프로모터 Download PDF

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Abstract

이 명세서의 요약으로, 본 발명은 신규의 개선된 유발가능한 포유동물의 발현 시스템의 제조와 사용, 특별히, 기본적인 유전자 발현의 낮은 수준을 유지하면서 글루코코르티코이드들과 금속 이온들에 의해 상승적으로 유발될 수 있는 하나의 또는 몇개의 부가적인 글루코코르티코이드-반응적 요소들을 함유한 변형된 사람의 MT-IIA 프로모터들의 제조와 사용을 제공한다. 유발 비율은 본질적인 요소들을 삭제함으로써 더욱 증가시킬 수 있다. 유사한 전략이 부가적인 금속-반응적인 요소들을 삽입함으로써 개선된 쥐의 유방암 바이러스(MMTV) 프로모터를 생성하는데 사용될 수 있다. 변형들은 본 발명의 범주안에서 가능하다.

Description

[발명의 명칭]
두개의 유발 요소들을 함유한 합성 진핵 세포의 프로모터
[도면의 간단한 설명]
제1도는 hMT-IIA 프로모터와 본 발명의 한 실시예에 따라 hMT-IIA 프로모터에 영향을 주는 여러가지 수정으로 변형된 프로모터의 유전자 지도이다.
[발명의 상세한 설명]
[발명의 기술 분야]
본 발명은 개선된 유발 포유 동물의 발현 시스템의 생성에 관한 것이다.
[본 발명의 배경]
포유 동물의 발현 시스템은 재조합 기술들에 의해, 해독후에 광범위하게 변형되는 단백질들의 제조하는데 널리 사용되고 있다. 이러한 시스템은 본질적이거나 또는 유발 가능한 것일 수 있다. 잠재적으로 세포독성의 단백질들의 발현을 위해서는 유발 시스템들을 사용하는 것이 바람직하다.
발현 시스템이 본질적이냐 유발 가능한 것이냐를 결정하는 중요한 요소는 프로모터이다. 발현 시스템들내에서 유발될 수 있는 몇몇 포유동물의 프로모터들은 그 특성이 파악되었으며 금속타이오닌(metallothionein,MT) 유전자들내에 그리고 쥐의 유방암 바이러스/긴 종결 반복(MMTV-LTR)내에 존재하는 프로모터들이 광범위하게 사용된다.
MT 프로모터를 위한 가장 좋은 유발자들은 카드ABA(Cd)과 아연(Zn)과 같은 중금속 이온들이다. 이 프로모터의 유발은, 금속들에 의해 활성화된 후에, MT 프로모터에 존재하는 유발 금속 반응 요소들(Metal Responsive Elements, 이하 MREs라 함)에 결합하는 전사 요소들에 의해 중재된다. 이 프로모터는 또한 활성화될 필요가 없는 전사 요소들에 결합하는, 그리고 유전자 발현의 기본적인 수준을 책임지는 몇개의 본질적인(비유발적인)요소들을 함유한다. 이러한 본질적인 요소들의 존재 결과, MT프로모터 발현의 비유발적 수준이 중요하게되고 유발비율(유발적 발현과 발현의 기본 수준과의 비율)이 통상 5배 내지 10배를 넘지 못한다. MT프로모터의 본질적인 요소들을 제거함으로써 발현의 기본 수준을 낮추려는 시도들이 행해져왔다.
그러나, 이러한 요소들의 제거는 또한 발현의 유발 수준을 또한 낮춘다.
자연적인 사람의 MT-IIA 프로모터는 MREs와 본질적인 요소들 이외에도 단일의 유발가능한 글루코코르티코이드 반응 요소(Glucocorticoid Responsive Element, 이하 GRE라 함)와 덱사메타손(Dexamethasone,Dex)과 같은 글루코코르티코이드들을 포함하며, 자연적 상황에서 MT-IIA 프로모터로부터 낮은 수준의 발현을 유도한다.
자연적인 MMTV-LTR 프로모터는 네개의 유발가능한 GRE들을 가지며 글루코코르티코이드에 의해 강하게 유발될 수 있다. 발현의 기본적인 수준은 사람의 MMT-IIA 프로모터로 얻어지는 것보다 낮지만 유발 발현의 절대적인 수준은 그렇게 높지않다.
유발 요소들과 같은 핵산 서열들은 유전자 발현의 조절에 관여하고, 5'이나 3 위치, 또는 조절되는 유전자 사이에 위치될 수 있다.
[발명의 요약]
본 발명에 따라, 유전자의 전사를 조절하기 위한, 최소한 두개의 다른 부류의 유발 요소들을 포함하는, 합성 유발 진핵 세포의 프로모터가 제공된다. 본 발명이 관계된 유발 요소들의 부류들은 호르몬-반응적인 요소들(GRE들을 포함하여), 금속-반응적인 요소들(MREs), 열 충격-반응적인 요소들, 인테페론-반응적인 요소들과 시토킨 반응적인 요소들을 포함한다.
한 실시예로, 여기에서 제공된 합성 프로모터는 자연적인 프로모터로 부터 얻을 수 있고 유발 요소들의 다른 부류들중 하나는 자연적인 유발 요소인 반면 유발 요소들의 또 다른 부류들이, 자연적인 프로모터내에 삽입 또는 자연적인 프로모터내의 보통의-비활성 요소의 활성에 의해 제공된다.
일반적으로 두개의 다른 부류의 유발 요소들이 본 발명의 신규의 합성 프로모터내에 존재하지만, 원한다면, 셋이나 그이상의 조합도 존재할 수 있다.
합성 프로모터들내에서 다른 부류들의 유발 요소들의 사용은 진핵세포의 발현 시스템, 특히 포유동물의 발현 시스템에서 유전자 생성물의 발현을 유발하는데 상승 작용을 하게한다. 다시 말해서, 다중 부류의 유발요소에 의해 유발된 유전자 발현의 수준이 유발 요소들의 각 부류의 분리된 유도에 의한 각 유전자 발현의 합보다 더 크다는 것이다. 뿐만 아니라, 유전자 발현의 전체적인 수준들이 증대될 수 있다.
여기에 제공된 합성 프로모터들은, 그러한 프로모터들은 합성적으로도 또한 얻어질 수도 있지만, 일반적으로, 여기에서 더 상세하게 설명될 바와 같이, 자연적인 프로모터들을 변형함에 의해 얻어진다.
위에서 언급한 바와 같이, 유발 프로모터들은 유발이 없을 때 유전자 발현의 기본적 수준을 제공하는, 적어도 하나의 본질적인 요소를 가질 수 있다. 본 발명의 한 실시예에서, 적어도 하나의 본질적인 요소가 기능적으로 무력화되고, 이는 일반적으로 기본적인 유전자 발현의 수준을 감소시키며 변형되지 않은 프로모터와 비교되었을때, 기본적인 유전자 발현에 대한 유발된 유전자 발현의 비율을 증가시키는 결과가 된다. 그러한 적어도 하나의 본질적인 요소의 무력화는 자연적인 프로모터로부터의 삭제 및/또는 예를 들어, 그안에 유발 요소의 삽입에 의해 영향을 받는다.
그러므로 본 발명은, 바람직한 실시예에서, 자연적인 GREs 및/또는 MREs 뿐만 아니라, 부가적인 GREs 및/또는 MREs를 함유하는 개선된 유발 진핵세포의 프로모터들을 제공한다. 자연적인 프로모터들의 본질적인 요소들은 개선된 프로로터들에서 삭제되거나 삭제되지 않을 수 있다. 개선된 프로모터들은 중금속 이온과 글루코코르티코이드(덱사메타손과 같은)가 동시에 사용되고 적어도 하나의 MRE와 적어도 하나의 GRE가 동시에 존재할 때 상승적으로 유발될 수 있다. 상승적인 유발은, 사람의 MT-IIA 나 MMTV-LTR 프로모터들과 같은, 변형되지 않은 프로모터들에서 관찰되는 것보다 훨씬 높은 수준의 유전자 발현의 결과로 나타난다. 새로운 프로모터들은 또한 변형되지 않은 프로모터들보다 더 작은 본질적 요소들을 가지고 그것은 더 낮은 유전자 발현의 기본 수준을 설명한다.
편의적으로 변형되지 않은 프로모터는 사람의 MT-IIA 또는 MMTV-LTR 프로모터들이 될 수 있다. 반응적인 요소들은 편리하게도 그러한 요소들을 위한 일치서열(consensus sequence)을 가진다. 예를 들면, 5'-GATCTTGCGCCCGGCCCG-3'(서열번호 2)는 MRE 일치서열을 함유하고 5'-GATCTGGTACAGGATGTTCTAGCTACG-3'(서열번호 1)는 본 발명의 실시예들에서 사용되는 GRE일치서열을 함유한다.
본 발명의 잇점은:
a) 높은 유전자 발현의 전체적 수준,
b) 기본적 유전자 발현의 감소된 수준,
c) 유전자 발현의 상승적인 유발,
d) 유발 비율 및/또는 편리한 유발자들에 대한 민감성에 관하여 맞추어진 프로모터들을 포함한다.
[발명의 일반적인 설명]
위에서 언급한 바와 같이, 여기에서 제공된 신규의 프로모터는 자연적인 프로모터로부터 파생될 수 있다. 본 발명의 한 바람직한 실시예에서,프로모터는 적어도 하나의 자연적인 유발 요소(MRE)와 적어도 하나의 다른 유발 요소(호르몬 반응적인 요소), 특별히 자연적인 프로모터내 삽입에 의해 제공되는 글루코코르티코이드 반응적인 요소(GRE)를 함유한다.
그러한 삽입되는 GRE는 GRE 일치서열을 함유하는 상보적인 올리고 뉴플레오타이드들의 쌍을 포함하는 합성 분자일 수 있다. 복수의 GRE들이 자연적인 프로모터안에 다합적 머리-에서-꼬리 자가-연결된(self-ligated)요소의 형태로 삽입될 수 있다.
본 발명의 특별히 바람직한 실시예는 진핵 세포의 발현 시스템, 특별히 포유 동물의 발현 시스템에서 유발 가능한 MRE들과 GRE들의 유발에 대한 상승적 유전자 발현을 가지기 위하여 적어도 하나의 유발가능한 GRE를 함유하도록 변형되고 유전자 생성물 발현의 증대된 전체적 수준과 바람직하게 결합된, 사람의 금속타이오닌 유전자(hMT-IIA) 프로모터를 제공한다. 이 특별히 바람직한 실시예에서, 다합적 머리-에서-꼬리 GRE들이 자연적인 hMT-IIA 프로모터내에 삽입될 수 있다.
요소의 삭제 및/또는 적어도 하나의 GRE를 삽입함등에 의하여 자연적인 hMT-IIA 프로모터의 적어도 하나의 본질적인 요소의 무력화가 또한 바람직하다. 한 실시예에서, 본질적인 요소들의 삭제와 단일의 또는 다중의 GRE들의 삽입들 둘다 본질적인 요소들을 무력화 하는데 이용된다.
또 다른 본 발명의 바람직한 실시예에서, 프로모터는 적어도 하나의 자연적인 유발가능한 요소(GRE), 특별히 글루코코르티코이드 반응적인 요소(GRE)와 삽입에 의해 제공되는 적어도 하나의 다른 유발가능한 요소(MRE)을 함유한다.
그러한 삽입되는 MRE는 MRE 일치서열을 합유하는 상보적인 올리고 뉴클레오타이드의 쌍을 포함하는 합성 분자일 수 있다. 복수의 MRE들이 다합적 머리-에서-꼬리 자가-연결된 요소의 형태로 자연적인 프로모터 내에 삽입될 수 있다.
본 발명의 특별히 바람직한 실시예는 진핵 세포의 발현 시스템에서 유발 가능한 MRE들과 GRE들의 유발에 대한 상승적 유전자 발현을 가지기 위하여 적어도 하나의 유발가능한 MRE를 함유하도록 변형되고 유전자 발현의 증대된 전체적 수준과 바람직하게 결합된, 쥐의 유방암 바이러스/긴 종결 반복(MMTV-LTR)프로모터를 제공한다. 이 특별히 바람직한 실시예에서, 다합적 머리-에서-꼬리 MRE들이 자연적인 MMTV-LTR 프로모터내에 삽입될 수 있다.
여기에서 제공된 신규의 합성 유발 가능한 진핵 세포의 프로모터는, 특별히 발현 시스템에 의해 발현되어지는 유전자에 효과적으로 결합되었을 때, 유전자 생성물의 진핵 세포적 발현을 위한 벡터내에 받아들여질 수 있다. 그러한 발현 시스템은 벡터를 함유하는 진핵세포들 특별히, Vero, CHO, HeLa, RatII 섬유아세포들과 장의 상피 세포들과 같은 포유동물 세포들을 포함할 수 있다.
[바람직한 실시예의 설명]
제1도에서, 본 발명의 실시예에 따른 여러가지 수정들을 받아들인 새로운 프로모터의 다른 변형들을 보여주고 있다. 프로모터들의 새로운 시리즈들은 다음의 계통적 분류법을 이용하여 생성된다. 사람의 MT-IIA 유전자(-740 에서 +60 염기들)의 5'프로모터 영역의 800bp을 함유하는 KspI DNA 조각이 사람의 MT-IIA 유전자를 함유하는 플라스미드로부터 분리된다(참고 Karin el at,(1982) Nature, 299, 797-802). 뭉툭한 끝들을 생성한 후에, HindIII 연결자들이 첨가되고 그 조각이 리포터 유전자로 사용된 클로람페니콜 아세틸 전이효소(CAT) 유전자를 가진 플라스미드인, pSVOATCAT 내의 CAT 유전자 5'HindIII 부위에 삽입되었다. 원래의 MT-IIA프로모터의 두개의 본질적인 요소들(API과 AP2-제1도의 위쪽 지도 참조)이 XmaIII 조각(-79 에서 -129 염기들)을 제거함으로써 삭제되었다.
GRE 일치서열을 함유하는 상보적인 올리고뉴클레오타이드들의 쌍, 5' BamHI 부위와 3'BglII 부위가 합성되었다. 정(正) 사슬 올리고뉴클레오타이드 서열은 5'-GATCTGGTACAGGATGTTCTAGCTACG-3'(서열번호 1) 이었다. 다합적 머리-에서-꼬리 GRE들은 BamHI과 BglII의 존재하에 합성 GRE 올리고뉴클레오타이드를 자가-연결 시킴에 의해 제공되었다. 단일의 그리고 다합적 GRE들이 프로모터의 SacII 부위(-175 염기)나 프로모터의 XmaIII 부위(-129 염기)내에 삽입되었다(제1도의 아래쪽 지도를 참조). SacII 요소에의 삽입은 두번째 AP2 부위를 파괴한다.
MRE 일치서열을 함유한 상보적인 올리고뉴클레오타이드들의 쌍, 5' BamHI 부위와 3'BglII 부위가 합성되었다. 정(正) 사슬 올리고뉴클레오타이드는: 5'-GATCTTGCGCCCGGCCCG-3'(서열번호 2)이었다. 그러한 올리고뉴클레오타이드들은 다합적 머리-에서-꼬리 요소들을 합성하는데 사용되고 단일의 또는 다중의 MRE들은 GRE들에서와 유사한 방법으로 hMT-IIA 프로모터내에 삽입 될 수 있다.
MMTV-LTR 프로모터로의 비슷한 GRE 및/또는 MRE 삽입들과 MMTV-LTR프로모터로부터의 본질적인 요소들의 선택적 삭제들에 영향을 미치는 MMTV-CAT 벡터가 플라스미드 p201(Majors et al, 1981), Nature, 283, 253-258)로부터 PstI을 사용하여 분리되고, 뭉툭한 끝들의 생성후에,PSVOATCAT의 HindIII 부위에 삽입되었다.
이 신규의 프로모터들은 글루코코르티코이드 수용체를 발현하는, RATII 섬유아세포들, CH0(중국 햄스터 난소 세포들), VERO(원숭이 섬유아세포) 및 Hela(사람의 자궁경부 암세포들)세포들을 사용한 일시적인 CAT 발현 검정들에서 시험되었다. 아래의 실시예에서 재생되는 결과들은, 이러한 신규의 프로모터들은 통상적으로 글루코코르티코이드 수용체를 발현하거나 글루코코르티코이드 수용체 유전자에 의해 전이된 세포들이 중금속 이온들과 덱사메타손에 의해 유발될 때 매우 높은 수준의 발현을 생성한다는 것을 보여준다. 이러한 프로모터들에 의해 얻어지는 발현의 유발된 수준들은 와일드-타입 사람의 MT-IIA나 MMTV-LTR 프로모터들에 의해 관찰되는 것들보다 상당히 높다. 동시에 발현의 기본적인 수준은 와이드-타입 사람의 MT-IIA 프로모터로 관측되는 것보다 상당히 낮다.
[실시예]
상기의 명세서는 본 발명을 일반적으로 설명하였다. 다음의 구체적인 실시예를 참고하면 더욱 완벽한 이해를 할 수 있을 것이다. 이러한 실시예는 설명을 위한 것이지 본 발명의 범위를 제한하기 위한 것은 아니다. 형태의 변화와 균등물의 치환은 상황상 제시될 수 있는 것으로 생각되어진다. 여기에 특정 용어가 사용되더라도 그것은 설명을 위한 것이지 제한하기 위한 것은 아니다.
[실시예 1]
이 실시예는 부가적인 GRE들을 함유한 변형된 hMT-IIA 프로모터들의 제조에 관한 것이다.
모든 MT 발현 벡터들은 어떠한 규칙적인 서열들을 가지지 않는 클로람페니콜 아세틸·전이효소(CAT) 유전자를 함유하는 플라스미드인 pSVOATCAT(Gorman et al., Mol.Cell,Biol., 2, 1044,[1982]).로부터 파생된다. 그 안의 CAT 유전자자 와일드-타입 사람의 MT-IIA 프로모터(hMT-IIA)의 조절하에 있는 대조 플라스미드, MT-CAT가 아래에서 설명되는 바와같이 생성되었다. hMT-IIA의 프로모터 부위의 800 bp KspI 조각(-740 에서 +60 염기들)이 분리되었다. 뭉툭한 끝들이 생성된 후에, HindIII 연결자들이 첨가되고 그 조각은 pSVOATCAT의 CAT 유전자로부터 5'인, HindIII 부위내에 삽입되었다. 플라스미드 MMT-CAT-△X가 본질적인 AP1-AP2 요소들을 함유한 MT-CAT의 MT 프로모터로부터 XmaIII 조각(-79 에서 -129 염기들)을 제거함으로써 생성되었다. 부가적인 GRE 들을 삽입하기 위하여, GRE 일치서열, 5'BamHI 부위와 3'BglIII 부위를 함유한 상보적인 올리고뉴클레오타이드들의 쌍들이 합성되었고 다합적 머리-에서-꼬리 요소들이 BamHI 과 BglII의 존재하에 이러한 합성 서열들을 자가-연결시킴에 의해 생성되었다. 정(正) 사슬 뉴클레오타이드 서열은 상기의 서열번호 1이다. 단합적 또는 다합적 GRE들이 뭉툭한 끝들의 생성후에 MT-CAT-△X 벡터의 SacII 이나 XmaIII 부위에 삽입되었다(제1도). 삽입된 GRE들의 수는 DNA 시퀸싱(sequencing)에 의해 확인되었다.
[실시예 2]
이 실시예는 부가적인 GRE들을 함유하는 발현 벡터의 사용에 관한 것이다.
이 실시예에서 사용된 발현벡터는 SG2이다. 이 SG2는 두개의 부가적인 GRE들이 MT-CAT-△X의 SacII 부위에 삽입된 변형된 MT-IIA 프로모터를 함유한 pSVOATCAT-파생 CAT 발현 벡터이다(제1도). 15 ㎍의 플라스미드 DNA가 칼슘 포스페이트 과정(Graham et al.(1973) Virology, 52, 456-467)을 사용하여 CHO 세포들에 전이되었다. 37℃에서 5시간동안 배양후에, 세포들은 PBS내의 15% 글리세롤로 3분동안 충격을 받았다. 그런 다음 단일층들은 다른 유발자들로(CdC12및/또는 덱사메타손) 16시간동안 배양되고 세포 추출물들이 준비되었다. CAT 활성도가14C-플로람페닐을 기질로 사용하여 측정되고 방사성 아세틸레이티드 생성물은 크실렌으로 추출되었다. 방사성 카운트는 섬광 카운터에서 결정되었다.
뿐만 아니라, SG2 벡터가 와일드-타입 MT-IIA 프로모터와 MMTV-LTR 프로모터를PSVOATCAT 플라스미드의 HindIII 부위에 삽입함에 의해 제조된 두개의 다른 벡터들과 비교되었다. CH0 세포들은 글루코코르티코이드 수용체를 가지고 있지 않으므로, 이 세포들은 10 ㎍의 글루코코트티코이드 수용체 발현 벡터(Giguere et al,(1986) Cell, 46, 645-652)와 함께 전이되었다. CAT 발현 검정들은 사중으로 행해졌고 표준편차는 10%를 넘지 아니한다. 단백질 농도가 각 세포 용해물내에서 측정되었고 CAT활성도가 같은 양의 단백질에 대해 계산되었다. 이러한 실험으로부터의 결과들이 아래의 표 1에 요약되어있다.
표 1에 나타난 결과들은 금속들과 덱사메타손에 의한 SG2 프로모팅의 상승적 유발이 와일드-타입 MT-IIA와 MMTV-LTR 프로모터들 보다 더 높은 수준의 CAT 유전자 발현을 생성한다는 것을 보여준다. 동시에, 유발비율이 또한 상당히 개선되었다.
[실시예 3]
이 실시예는 부가적인 GRE들을 함유하는 벡터의 사용을 더 설명하는 것이다.
실시예 1의 과정과 유사한 과정을 사용하여, SG2 프로모터의 활성도가 글루코코르티코이드 수용체(Giguere et al,(1986) Cell, 46, 645-652)를 발현하도록 제작된 VERO 세포들내의 자연적인 MT-IIA 프로모터의 활성도와 비교되었다. 이 실시예에서, 세포들은 또한, 프로모터에 의해 유도된, 활성이 중금속들이나 글루코코르티코이드들에 의한 실험 조건에 영향을 받지 않는 β-갈락토시다아제 유전자가 존재하는 발현 벡터와 함께 전이되었다. 전이와 유발 후에, 세포 추출물의 부분이 β-갈락토시다아제(β-Gal) 활성을 측정하기 위해서 사용되었다. 이 활성도는 전이 효율을 고려하여 CAT 활성을 표준화하는데 사용되었다.
얻어진 결과들은 아래의 표 2에 있고, 그들은 CHO 세포들로 얻어진 것들과 비슷하다는 것을 알 수 있고 덱사메타손이 변형된 MT-IIA(SG2) 프로모터에서 금속 이온들과 상승적으로 작용한다는 것을 보여주고 있다.
[실시예 4]
이 실시예는 발현 벡터로의 한층 더한 변형과 얻어진 결과들을 설명하는 것이다.
부가적인 변형들은 제1도에서 상세하게 보이는 바와 같이, hMT-IIA 프로모터가 SacII 부위에 부가된 수의 GRE들과 다수의 MRE들을 도입하고 XmaIII 부위에 많은 수의 GRE들을 도입하도록 영향을 받았다.
결과적인 변형된 플라스미드 DNA는 실시예 3에서 설명된 바와 같이, VERO세포에 도입되고 CAT유전자 발현은 위에서 설명한 바와 같이 결전된다. 얻어진 결과들은 아래의 표 3에 표시되어 있다.
[실시예 5]
이 실시예는 부가적인 GRE들을 함유하는 변형된 MMTV-LTR 프로모터의 제조와 사용을 설명하는 것이다.
앞의 실시예에서와 유사한 과정을 사용하여 두개의 MRE들이 네개의 GRE들을 함유하나 MRE는 함유하지 않은 MMTV-LTR 프로모터의 BfrI 부위에 삽입되었다(Majors and Varmus, Nature 283: 253-258). 표 4는 변형되지 않은 MMTV-LTR 프로모터가 아연(Zn) 더하기 카드뮴(Cd)에 의해 유발되지 않음에 반하여, 변형된 프로모터(BM2-MMTV)는 10배의 유발을 발휘하는 것을 보여준다.
BM2-MMTV가 덱사메타손 더하기 Zn 더하기 Cd에 의해 유발되었을때, CAT 발현에 있어서 두배의 상승이 관찰되었다.
실시예 1에서 5 그리고 표 1에서 4에 나타난 실험들의 결과들은 GRE들 형태의 부가적인 유발 요소들을 삽입한 변형된 hMT-IIA 프로모터와 관련하여 그리고 MRE들 형태의 부가적인 유발 요소들을 삽입한 변형된 MMTV 프로모터와 관련하여 전사(transcription)의 상승적인 활성화가 가능하다는 것을 보여주고 있다. GRE들을 hMT-IIA 프로모터에 삽입하는 것과 MRE들을 MMTV 프로모터에 삽입하는 것은 리포터 유전자 발현의 기본적 수준을 증가시키지않았고, 변형된 프로모터들의 유발성과 전사능력이 그들의 와일드-타입 상대방들의 그것들에 대해 상당히 개선되었다. 네개의 여분의 MRE들(벡터 SM4)의 배타적인 삽입이 MT 프로모터 전사 능력에 단지 온건한 개선의 결과로 나타남에 반하여, 이러한 개선은 기본적인 발현에 있어서 상당한 증가를 수반한다.
MT-CAT 벡터내의 변형되지 않은 hMT-IIA 프로모터는 글루코코르티코이드 수용체 유전자를 사용하여 전이된 Vero 세포들에서 덱사메타손에 의해 유발될 수 없었다. 그러나, 적어도 하나의 부가적인 GRE을 그 프로모터에 삽입하는 것이 글루코코르티코이드 반응성과 유전자 발현을 부여하는데 충분했다.
삽입되는 부가적인 GRE들의 수와 삽입 위치의 영향을 분석하기 위해서, 변형된 프로모터의 두 시리즈가 하나 또는 그이상의 GRE들을 MT-CAT-△X의 SacII 부위(SG 시리즈)나 XmaIII 부위(XG 시리즈)에 첨가함으로써 실시예들에서 생성되었다. 모든 벡터들은 CdCl2와 글루코코르티코이드에 의해 유발가능하였다 그러나. 삽입 부위와 관계없이, 최소 두개의 인접한 GRE들이 전이된 Vero 세포들을 CdCl2와 덱사메타손에 의한 동시처리에 의해 상승적 유발을 생성하기 위해서 필요하였다.
변형된 hMT-IIA 프로모터들에 대해 계산된 유발 비율이 와일드-타입 프로모터에 비교되었을때 6배까지 증가되었다. 부가적인 GRE들의 삽입이 예를 들어, SG3에서 유전자 발현의 기본적 수준을 증가시키지 않는다는 사실은 이러한 비율의 개선에 있어서 중요한 요인이다. 이 관찰은 본 발명에 따라, 본질적인 요소들 대신에 다른 부류의 유발 요소들을 첨가함에 의한 상승적 전사 활성화 생성의 잇점중 하나를 강조한다.

Claims (22)

  1. 천연프로모터에서 유래하고, 적어도 두 개의 다른 분류의 유도성요소들을 포함하고 있는 유전자의 전사조절을 위한 합성유도성 진핵생물 프로모터로서, 다음: (a) 상기 다른 분류의 유도성요소들 중 하나가, 금속-반응적인 요소(MRE) 또는 글루코코르티코이드-반응적인 요소(GRE)인 천연유도성 요소이며, (b) 또 다른 상기 다른 분류의 유도성요소는, 상기 일방의 유도성요소가 MRE인 경우에는 글루코코르티코이드-반응적인 요소(GRE)이며, 또는 상기 일방의 유도성요소가 GRE이고 다중 유도성요소들의 삽입에 의해 상기 천연프로모터 중에 제공되는 경우에는 MRE이며, (c) 상기 다른 분류의 유도성요소들이, 진핵생물발현계에 있어서 상승적 레벨의 유전자산물의 발현을 제공하도록 선택되는 것을 특징으로 하는 프로모터.
  2. 제1항에 있어서, 상기 적어도 하나의 천연적인 유발 가능한 요소가 MRE인 것을 특징으로 하는 프로모터.
  3. 제2항에 있어서, 다중 연결된 GREs가 BamHI 및 BglII의 존재하에서 자가-연결된 다합적 머리-에서-꼬리 요소의 형태로 상기 천연적인 프로모터 내에 삽입되는 것을 특징으로 하는 프로모터.
  4. 제2항 또는 제3항에 있어서, 상기 각각의 삼입된 GRE가 GRE 일치서열을 함유하며, 뉴클레오타이드 서열: 5'-GATCTGGTACAGGATGTTCTAGCTACG-3'(서열번호 1)로 표시되는 정(正)사슬을 가진 합성분자인 것을 특징으로 하는 프로모터.
  5. 제2항 또는 제3항에 있어서, 상기 천연적인 프로모터가 hMT-IIA프로모터인 것을 특징으로 하는 프로모터.
  6. 제1항에 있어서, 상기 적어도 하나의 천연적인 유발가능한 요소가 GRE인 것을 특징으로 하는 프로모터.
  7. 제6항에 있어서, 다중-연결된 MRE가, BamHI 및 BglII의 존재 하에서 자가-연결된 다합적 머리-에서-꼬리 요소의 형태로 천연적인 프로모터 내에 삽입되는 것을 특징으로 하는 프로모터.
  8. 제6항 또는 7항에 있어서, 상기 삽입된 MRE가, MRE일치서열을 포함하고, 뉴클레오타이드 서열: 5'-GATCTTGCGCCCGGCCCG-3'(서열번호 2)로 표시되는 정(正)사슬을 가지는 합성 분자인 것임을 특징으로 하는 프로모터.
  9. 제6항 또는 제7항에 있어서, 상기 천연적인 프로모터가 MMTV-LTR프로모터 인 것을 특징으로 하는 프로모터.
  10. 제1항 내지 제3항 또는 제6항 또는 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 하나의 구성적인 요소를 포함하는 천연적인 프로모터에서 유래하고, 상기 적어도 하나의 구성적인 요소를 기능적으로 무능력화 한 것을 특징으로 하는 프로모터.
  11. 제10항에 있어서, 상기 적어도 하나의 구성적인 요소가, 천연적인 프로모터와 비교해서, 기저 유전자발현의 감소된 수준과 기저 유전자발현에 대한 유도된 유전자발현의 증가된 비율을 제공하도록 충분히 기능적으로 무능력화된 것임을 특징으로 하는 프로모터.
  12. 제11항에 있어서, 상기 적어도 하나의 구성적인 요소가 유도성 요소의 천연적인 프로모터로부터의 제거 및/또는 그 안으로의 삽입에 의해 무능력화된 것을 특징으로 하는 프로모터.
  13. 제12항에 있어서, 상기 구성적인 요소가, 적어도 하나의 GRE의 삭제 및/또는 그 안으로의 삽입에 의해 무능력화 되는 것을 특징으로 하는 프로모터.
  14. 제12항에 있어서, 천연적인 hMT-IIA프로모터의 염기-79~ -129 사이에 위치한 천연구성요소 AP1 및 AP2가 제거되는 것을 특징으로 하는 프로모터.
  15. 제11항에 있어서, 적어도 하나의 GRE서열이, 천연 hMT-IIA프로모터 의 SacII부위(염기-175)에 삽입되는 것에 의해, 그 위치에서의 AP2구성요소를 무능력화 하는 것을 특징으로 하는 프로모터.
  16. 제11항에 있어서, 상기 적어도 하나의 GRE가, 천연 hMT-IIA프로모터 의 SacII부위(염기-175)와 XmaIII부위(염기-129) 중 적어도 하나에 삽입되는 것을 특징으로 하는 프로모터.
  17. 제15항 또는 제16항에 있어서, 2개가 연결한 GRE서열들이 XmaIII부위에 삽입되는 것을 특징으로 하는 프로모터.
  18. 제15항 또는 제16항에 있어서, 3개가 연결한 GRE서열들이 SacII부위에 삽입되는 것을 특징으로 하는 프로모터.
  19. 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에서 청구된 합성 유발 가능한 진핵생물의 프로모터에 의해 특징지어지는 유전자생성물의 진핵생물적 발현을 위한 벡터.
  20. 제19항에 있어서, 상기 프로모터가 작동가능하도록 유전자에 연결된 것을 특징으로 하는 벡터.
  21. 유발된 유전자발현을 구성하기 위해 제19항 또는 제20항에서 청구된 벡터를 포함하는 진핵세포에 의해 특징지워지는 진핵생물발현시스템.
  22. 제21항에 있어서, 상기 진핵세포들이 Vero, CHO. HeLa, RatII 및, 상피 세포들로부터 선택되어진 포유동물의 세포인 것을 특징으로 하는 진핵생물발현시스템.
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