DE69331931T2

DE69331931T2 - Synthetische eukaryotische Promotoren welche zwei induzierbare Elemente enthalten

Info

Publication number: DE69331931T2
Application number: DE69331931T
Authority: DE
Inventors: Jorge Filmus; Michel Klein
Original assignee: Aventis Pasteur Ltd
Current assignee: Sanofi Pasteur Ltd
Priority date: 1992-03-30
Filing date: 1993-03-30
Publication date: 2002-09-12
Anticipated expiration: 2013-03-31
Also published as: KR100208311B1; JP2701983B2; NO943610D0; DK0633941T3; WO1993020218A1; KR950700420A; EP0633941B1; FI944451A0; US5559027A; NO316451B1; CA2128602A1; CA2128602C; FI944451A; EP0633941A1; FI113548B; ATE217649T1; BR9306167A; RU94042389A; RU2128225C1; AU3883393A

Description

GEBIET DER ERFINDUNG

Die vorliegende Erfindung betrifft die Erzeugung verbesserter induzierbarer Säugetierexpressionssysteme.

HINTERGRUND DER ERFINDUNG

Säugetierexpressionssysteme werden bei der Herstellung von Proteinen, die nach der Translation stark modifiziert werden, durch rekombinante Techniken weithin verwendet. Diese Systeme können entweder konstitutiv oder induzierbar sein. Es ist ratsam, induzierbare Systeme für die Expression von potentiell cytotoxischen Proteinen zu verwenden.
Ein Schlüsselelement bei der Festlegung, ob ein Expressionssystem konstitutiv oder induzierbar ist, ist der Promotor. Mehrere Säugetierpromotoren, die in experimentellen Systemen induziert werden können, sind charakterisiert worden, und die Promotoren, die in den Metallothionein (MT)-Genen und dem Maus Mammary- Tumor-Virus/long terminal repeat (MMTV-LTR) vorliegen, wurden intensiv angewendet.
Die besten Induktoren für den MT-Promotor sind Schwermetallionen wie z. B. Cadmium (Cd) und Zink (Zn). Die Induktion des Promotors wird durch Transkriptionsfaktoren vermittelt, welche nach der Aktivierung durch Metalle an die induzierbaren auf Metalle ansprechenden Elemente (MREs) binden, die in dem MT-Promotor vorliegen. Dieser Promotor enthält ebenfalls mehrere konstitutive (nicht induzierbare) Elemente, welche Transkriptionsfaktoren binden, die nicht aktiviert werden müssen und die für ein Grundniveau der Genexpression verantwortlich sind. Als eine Folge des Vorliegens dieser konstitutiven Elemente ist das nicht induzierte Niveau der Expression des MT-Promotors signifikant, und das Induktionsverhältnis (das Verhältnis zwischen der induzierbaren Expression und dem Grundniveau der Expression) ist gewöhnlich nicht größer als 5- bis 10-fach. Versuche wurden unternommen, um das Grundniveau der Expression zu verringern, indem einige der konstitutiven Elemente des MT-Promotors entfernt wurden. Die Entfernung dieser Elemente verringert jedoch ebenfalls das induzierbare Expressionsniveau.
Der native menschliche MT-IIA-Promotor enthält neben den MREs und den konstitutiven Elementen ein einzelnes induzierbares auf Glucocorticoide ansprechendes Element (GRE), und Glucocorticoide wie z. B. Dexamethason (dex) induzieren ausgehend von dem MT- IIA-Promotor in seinem nativen Umfeld niedrige Niveaus der Expression.
Der native MMTV-LTR-Promotor enthält vier induzierbare GREs und kann durch Glucocorticoide stark induziert werden. Das Grundniveau der Expression ist niedriger als das, das mit dem menschlichen MT-IIA-Promotor erhalten wird, aber das absolute Niveau der induzierbaren Expression ist nicht so hoch.
Nukleinsäuresequenzen wie z. B. induzierbare Elemente, die an der Regulation der Genexpression beteiligt sind, können 5' von, 3' von oder innerhalb des regulierten Gens lokalisiert sein.
J. Filmas et al., Nucleic Acids Research, Band 20, Nr. 11, Seiten 2755-2760, 1992, offenbaren einen MT-Promotor, in welchen synthetische auf Metalle ansprechende Elemente (MRE-Sequenzen) eingefügt wurden.
Schüle et al., Nature, Band 332, Seiten 87-90, 1988, offenbaren, dass der Glucocorticoidrezeptor und der CACCC-Box-Bindungsfaktor in dem Ratten-Tryptophanoxygenasepromotor kooperativ zusammenarbeiten.
Lin et al., Nature, Band 345, Seiten 359-361, 1990, zeigen, dass unterschiedliche eukaryotische Transkriptionsaktivatoren (GAL4- Derivat und ATF) die Transkription von Säugetiergenen auf eine synergistische Weise induzieren.

ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG

Gemäß der vorliegenden Erfindung wird ein synthetischer induzierbarer eukaryotischer Promotor zur Regulation der Transkription eines Gens bereitgestellt, welcher wenigstens zwei unterschiedliche Klassen induzierbarer Elemente umfasst, die so ausgewählt wurden, dass diese ein synergistisches Expressionsniveau eines Genprodukts in einem eukaryotischen Expressionssystem erzeugen, welche auf Hormone ansprechende Elemente (einschließlich GREs), auf Metall ansprechende Elemente (MREs), auf Wärmeschock ansprechende Elemente, auf Interferon ansprechende Elemente und auf Cytokin ansprechende Elemente sind.
In einer Ausführungsform ist der synthetische Promotor, welcher hierin bereitgestellt wird, von einem nativen Promotor abgeleitet, und eine der unterschiedlichen Klassen induzierbarer Elemente ist ein natives induzierbares Element, während eine andere der unterschiedlichen Klassen an induzierbaren Elementen beispielsweise durch Insertion in den nativen Promotor oder durch Aktivierung eines normalerweise inaktiven Elements in dem nativen Promotor bereitgestellt wird. Während im allgemeinen zwei unterschiedliche Klassen induzierbarer Elemente in dem neuen synthetischen Promotor der Erfindung vorliegen, können nach Wunsch Kombinationen aus drei oder mehreren vorliegen.
Die Verwendung unterschiedlicher Klassen induzierbarer Elemente in den synthetischen Promotoren ermöglicht die synergistische Induktion einer Expression eines Genprodukts in einem eukaryotischen Expressionssystem, insbesondere einem Säugetierexpressionssystem. Das heißt, das Niveau der Genexpression, welche durch Induktion mehrerer Klassen an induzierbaren Elementen erhalten wird, ist höher als die Summe der einzelnen Genexpressionen, die durch getrennte Induktion der einzelnen Klassen induzierbarer Elemente erzielt wird. Zusätzlich können die Gesamtniveaus der Genexpression erhöht werden.
Die synthetischen Promotoren, welche hierin bereitgestellt werden, sind im allgemeinen von natürlichen Promotoren durch Modifikation abgeleitet, wie hierin detaillierter beschrieben wird, auch wenn solche Promotoren ebenfalls synthetisch hergestellt werden können.
Wie oben erwähnt, können induzierbare Promotoren wenigstens ein konstitutives Element enthalten, welches ein Grundniveau der Genexpression in Abwesenheit einer Induktion bereitstellt. In einer Ausführungsform der Erfindung ist wenigstens ein konstitutives Element funktionsunfähig, was im allgemeinen zu einem verringerten Niveau der Grundgenexpression und zu einem erhöhten Verhältnis der induzierten Genexpression zu der Grundgenexpression führt, wenn diese mit dem unmodifizierten Promotor verglichen werden. Eine solche Funktionsunfähigkeit des wenigstens einen konstitutiven Elements kann durch Deletion aus dem nativen Promotor und/oder durch Insertion, beispielsweise eines induzierbaren Elements dort hinein, bewirkt werden.
Die vorliegende Erfindung stellt daher in bevorzugten Ausführungsformen verbesserte induzierbare eukaryotische Promotoren bereit, die nicht nur native GREs und/oder MREs sondern ebenfalls zusätzliche GREs und/oder MREs enthalten. Konstituvie Elemente der nativen Promotoren können in den verbesserten Promotoren deletiert sein oder nicht. Die verbesserten Promotoren können synergistisch induziert werden, wenn sowohl ein Schwermetallion als auch ein Glucocorticoid (wie z. B. Dexamethason) gleichzeitig verwendet werden und sowohl wenigstens ein MRE als auch ein GRE vorliegen. Die synergistische Induktion führt zu Genexpressionsniveaus, die viel höher sind als jene, die mit unmodifizierten Promotoren wie beispielsweise den menschlichen MT-IIA- oder den MMTV-LTR-Promotoren beobachtet werden. Die neuen Promotoren können ebenfalls weniger konstitutive Elemente enthalten als die unmodifizierten Promotoren, was ein niedrigeres Grundniveau der Genexpression ermöglicht.
Geeigneterweise kann der unmodifizierte Promotor der menschliche MT-IIA- oder der MMTV-LTR-Promotor sein. Die ansprechenden Elemente können geeignet die Konsensussequenz für solche Elemente enthalten; zum Beispiel enthält
5'-GATCTTGCGCCCGGCCCG-3' (SEQ ID Nr.: 2)
die MRE-Konsensussequenz, und
5'-GATCTGGTACAGGATGTTCTAGCTACG-3' (SEQ ID Nr.: 1)
enthält die GRE-Konsensussequenz, welche in den Ausführungsformen dieser Erfindung verwendet wird.
Vorteile der vorliegenden Erfindung umfassen:
a) hohe Gesamtniveaus der Genexpression,
b) verminderte Niveaus der Grundgenexpression,
c) synergistische Induktion der Expression eines Gens,
d) Promotoren, welche im Hinblick auf das Induktionsverhältnis und/oder das Ansprechverhalten auf geeignete Induktoren kundengerecht angefertigt wurden.

KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNG

Fig. 1 ist eine Genkarte des hMT-IIA-Promotors und eines modifizierten Promotors mit verschiedenen Modifikationen, welche mit dem hMT-IIA-Promotor gemäß einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung durchgeführt wurden.

ALLGEMEINE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG

Wie oben angegeben, kann der neue Promotor, welcher hierin bereitgestellt wird, von einem nativen Promotor abgeleitet sein. In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung enthält der Promotor wenigstens ein natives induzierbares Element, welches ein MRE ist, und wenigstens ein unterschiedliches induzierbares Element, welches ein auf Hormone ansprechendes Element, insbesondere ein auf Glucocorticoide ansprechendes Element (GRE) ist, das in dem nativen Promotor durch Insertion bereitgestellt wird.
Solch ein eingefügtes GRE kann ein synthetisches Molekül sein, welches ein Paar komplementärer Oligonukleotide umfasst, welche die GRE-Konsensussequenz enthalten. Eine Mehrzahl an GREs kann in den nativen Promotor in Form eines mit sich selbst ligierten Kopf-Schwanz-Elements eingefügt werden.
Eine besonders bevorzugte Ausführungsform der Erfindung stellt einen menschlichen Metallothioneingen (hMT-IIA)-Promotor bereit, welcher modifiziert ist, so dass er wenigstens ein induzierbares GRE enthält, um so eine Synergie der Genexpression bei der Induktion der induzierbaren MREs und GREs in einem eukaryotischen Expressionssystem, insbesondere einem Säugetierexpressionssystem, zu erhalten, und welcher vorzugsweise mit einem erhöhten Gesamtniveau der Genproduktexpression verbunden ist. In dieser besonders bevorzugten Ausführungsform können multimere Kopf- Schwanz-GREs in den nativen hMT-IIA-Promotor eingefügt sein.
Es ist ebenfalls bevorzugt, wenigstens ein konstitutives Element des nativen hMT-IIA-Promotors funktionsunfähig zu machen, beispielsweise durch Deletion eines solchen Elements und/oder durch Insertion wenigstens eines GREs dort hinein. In einem veranschaulichenden Beispiel werden sowohl die Deletion von konstitutiven Elementen als auch die Insertion einzelner oder multipler GREs eingesetzt, um konstitutive Elemente funktionsunfähig zu machen.
In einer anderen bevorzugten Ausführungsform der Erfindung enthält der Promotor wenigstens ein natives induzierbares Element, welches ein HRE, insbesondere ein auf Glucocorticoide ansprechendes Element (GRE) ist, und wenigstens ein unterschiedliches induzierbares Element, welches ein MRE ist, das durch Insertion bereitgestellt wurde.
Ein solches eingefügtes MRE kann ein synthetisches Molekül sein, welches ein Paar komplementärer Oligonukleotide, welche die MRE- Konsensussequenz enthalten, umfasst. Eine Mehrzahl an MREs kann in den nativen Promotor in Form eines multimeren mit sich selbst ligierten Kopf-Schwanz-Elements eingefügt werden.
Eine besonders bevorzugte Ausführungsform der Erfindung stellt einen Maus Mammary-Tumor-Virus/long terminal repeat (MMTV-LTR)- Promotor bereit, welcher so modifiziert wurde, dass er wenigstens ein induzierbares MRE enthält, um eine Synergie der Genexpression bei Induktion der induzierbaren GREs und MREs in einem eukaryotischen Expressionssystem zu erhalten, und welcher vorzugsweise mit einem erhöhten Gesamtniveau der Genexpression verbunden ist. In dieser besonders bevorzugten Ausführungsform können multimere Kopf-Schwanz-MREs in den nativen MMTV-LTR-Promotor eingefügt sein.
Der neue synthetische induzierbare eukaryotische Promotor, welcher hierin bereitgestellt wird, kann in einen Vektor zur eukaryotischen Expression eines Genprodukts eingebaut werden, insbesondere wenn er funktionsfähig mit einem Gen verknüpft ist, das durch das Expressionssystem exprimiert werden soll. Ein solches Expressionssystem kann eukaryotische Zellen, welche den Vektor enthalten, insbesondere Säugetierzellen wie z. B. Vero-, CHO-, HeLa-, Ratten-II-Fibroblasten und Darmepithelzellen umfassen.

BESCHREIBUNG DER BEVORZUGTEN AUSFÜHRUNGSFORM

In Fig. 1 werden unterschiedliche Versionen eines neuen Promotors gezeigt, welcher verschiedene Modifikationen gemäß Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung aufweist. Die neue Serie an Promotoren wird erzeugt, indem die folgende Methodik verwendet wird. Ein KspI-DNA-Fragment, welches 800 bp des 5'-Promotorbereichs des menschlichen MT-IIA-Gens (Basen -740 bis +60) enthält, wurde aus einem Plasmid isoliert, das das menschliche MT-IIA-Gen enthielt (siehe Karin et al., (1982), Nature, 299, 797-802). Nach dem Erzeugen glatter Enden wurden HindIII-Linker zugegeben, und das Fragment wurde in pSVOATCAT, ein Plasmid, welches das Chloramphenicolacetyltransferase (CAT)-Gen, welches als ein Reportergen verwendet wird, enthält, an der HindIII- Stelle 5' zu dem CAT-Gen eingefügt. Zwei konstitutive Elemente (AP1 und AP2 - siehe obere Karte, Fig. 1) des ursprünglichen MT-IIA-Promotors wurden deletiert, indem ein XmaIII-Fragment (Basen -79 bis -129) entfernt wurde.
Ein Paar komplementärer Oligonukleotide, welche die GRE-Konsensussequenz, eine 5'-BamHI-Stelle und eine 3'-BglII-Stelle enthielten, wurde synthetisiert. Der positive Strang der Oligonukleotidsequenz war:
5'-GATCTGGTACAGGATGTTCTAGCTACG-3' (SEQ ID Nr.: 1)
Multimere Kopf-Schwanz-GREs wurden hergestellt, indem das synthetische GRE-Oligonukleotid in Gegenwart von BamHI und BglII mit sich selbst ligiert wurde. Einzelne und multimere GREs wurden in die SacII-Stelle des Promotors (bei Base -175) oder die XmaIII-Stelle des Promotors (bei Base -129) eingefügt (siehe untere Karte in Fig. 1). Die Insertion an dem SacII-Element zerstört eine zweite AP2-Stelle.
Ein Paar komplementärer Oligonukleotide, welche die MRE-Konsensussequenz, eine 5'-BamHI-Stelle und eine 3'-BglII-Stelle enthielten, wurde synthetisiert. Der positive Strang der Nukleotidsequenz war:
5'-GATCTTGCGCCCGGCCCG-3' (SEQ ID Nr.: 2)
Solche Oligonukleotide können verwendet werden, um multimere Kopf-Schwanz-Elemente zu synthetisieren, und einzelne oder multiple MREs können in den hMT-IIA-Promotor auf eine analoge Weise wie bei den GREs eingefügt werden.
Der MMTV-CAT-Vektor zum Bewirken ähnlicher GRE- und/oder MRE- Insertionen in und gegebenenfalls Deletionen konstitutiver Elemente aus dem MMTV-LTR-Promotor wurde aus dem Plasmid p201 (Majors et al., (1981), Nature, 283, 253-258) unter Verwendung von PstI entfernt und, nach Erzeugung von glatten Enden, in die HindIII-Stelle von pSVOATCAT eingefügt.
Die neuen Promotoren wurden in vorübergehenden CAT-Expressionstests unter Verwendung von Ratten-II-Fibroblasten, CHO- (Ovarium-Zellen des chinesischen Hamsters), VERO- (Affen-Fibroblasten) und Hela- (menschlichen Cervicaltumorzellen) Zellen, welche den Glucocorticoidrezeptor exprimieren, getestet. Die Ergebnisse, welche in den nachfolgenden Beispielen angegeben sind, zeigten, dass diese neuen Promotoren sehr hohe Expressionsniveaus erzeugen, wenn Zellen, welche normalerweise den Glucocorticoidrezeptor exprimieren oder mit dem Glucocorticoidrezeptorgen transfiziert sind, gleichzeitig mit Schwermetallionen und Dexamethason induziert werden. Die induzierten Expressionsniveaus, welche mit diesen Promotoren erhalten werden, sind signifikant höher als jene, die mit dem menschlichen MT-IIA- oder dem MMTV-LTR-Wildtyppromotor beobachtet werden. Gleichzeitig war das Grundniveau der Expression signifikant niedriger als das, welches mit dem menschlichen MT-IIA-Wildtyppromotor beobachtet wurde.

BEISPIELE

Die obige Offenbarung beschreibt die vorliegende Erfindung allgemein. Ein vollständigeres Verständnis kann durch Bezug auf die folgenden spezifischen Beispiele erhalten werden. Diese Beispiele werden lediglich zu Zwecken der Veranschaulichung beschrieben und sollen den Umfang der Erfindung nicht beschränken. Änderungen der Form und Ersatz durch Äquivalente sind umfasst, wie es die Umstände nahe legen oder angebracht erscheinen lassen. Obwohl hierin spezielle Begriffe eingesetzt wurden, sind solche Begriffe in einem beschreibenden Sinn und nicht zu Zwecken der Beschränkung gedacht.

Beispiel 1

Dieses Beispiel veranschaulicht die Konstruktion modifizierter hMT-IIA-Promotoren, welche zusätzliche GREs enthalten.
Alle MT-Expressionsvektoren waren von pSVOATCAT abgeleitet, einem Plasmid, welches das Chloramphenicolacetyltransferase (CAT)- Gen ohne irgendwelche regulatorischen Sequenzen enthält (Gorman et al., Mol. Cell. Biol., 2, 1044, [1982]). MT-CAT, ein Kontrollplasmid, bei welchem sich das CAT-Gen unter der Regulation des menschlichen MT-IIA-Wildtyppromotors (hMT-IIA) befindet, wurde wie nachstehend beschrieben erzeugt. Ein 800 bp-KspI- Fragment des Promotorbereichs von hMT-IIA (Basen -740 bis +60) (Fig. 1) wurde isoliert. Nach der Erzeugung glatter Enden wurden HindIII-Linker zugegeben, und das Fragment wurde in die HindIII-Stelle von pSVOATCAT, 5' zu dem CAT-Gen, eingefügt. Das Plasmid MT-CAT-ΔX wurde erzeugt, indem das XmaIII-Fragment (Base -79 bis -129) aus dem MT-Promotor von MT-CAT, welcher die konstitutiven AP1-AP2-Elemente enthält, entfernt wurde. Um zusätzliche GREs einzufügen, wurde ein Paar komplementärer Oligonukleotide, welche die GRE-Konsensussequenz, eine 5'-BamHI-Stelle und 3'-BglII-Stelle enthielten, synthetisiert, und multimere Kopf- Schwanz-Elemente wurden durch Ligieren dieser synthetischen Sequenzen mit sich selbst in Gegenwart von BamHI und BglII erzeugt. Der positive Strang der Nukleotidsequenz war SEQ ID Nr. 1, wie sie oben angegeben ist. Monomere oder multimere GREs wurden dann entweder an der SacII- oder der XmaIII-Stelle des MT- CAT-ΔX-Vektors nach Erzeugung glatter Enden eingefügt (Fig. 1). Die Anzahl an eingefügten GREs wurde durch DNA-Sequenzierung bestätigt.

Beispiel 2

Dieses Beispiel veranschaulicht die Verwendung eines Expressionsvektors, welcher zusätzliche GREs enthält.
Der Expressionsvektor, welcher in diesem Beispiel verwendet wurde, war SG2, welcher ein von pSVOATCAT abgeleiteter CAT-Expressionsvektor ist, der einen modifizierten MT-IIA-Promotor enthält, in welchen zwei zusätzliche GREs an der SacII-Stelle von MT-CAT-ΔX eingefügt wurden (Fig. 1). 15 ug der Plasmid-DNA wurden in CHO-Zellen transfiziert, indem das Calciumphosphatverfahren (Graham et al. (1973) Virology, 52, 456-467) verwendet wurde. Nach Inkubation für 5 Stunden bei 37ºC wurden die Zellen 3 Minuten lang mit 15% Glycerol in PBS abgeschreckt. Die Monolayer wurden dann mit den unterschiedlichen Induktoren (CdCl&sub2; und/oder Dexamethason) für 16 Stunden inkubiert, und Zellextrakte wurden hergestellt. Die CAT-Aktivität wurde dann unter Verwendung von ¹&sup4;C-Chloramphenicol als Substrat gemessen, und das radioaktive acetylierte Produkt wurde mit Xylol extrahiert. Radioaktive Zählimpulse wurden in einem Szintillationszähler bestimmt.
Zusätzlich wurde der SG2-Vektor mit zwei anderen Vektoren verglichen, welche durch Einfügen eines Wildtyp-MT-IIA-Promotors und des MMTV-LTR-Promotors in die HindIII-Stelle des pSVOATCAT- Plasmids konstruiert wurden. Da CHO-Zellen keine Glucocorticoidrezeptoren aufweisen, wurden die Zellen mit 10 ug eines Glucocorticoidrezeptorexpressensionsvektors (Giguere et al., (1986) Cell, 46, 645-652) kotransfiziert. CAT-Expressionstests wurden 4-fach durchgeführt, und die Standardabweichung überschritt nicht 10%. Die Proteinkonzentration wurde in jedem Zelllysat gemessen, und die CAT-Aktivität wurde für äquivalente Proteinmengen berechnet. Die Ergebnisse aus diesen Versuchen sind in Tabelle I unten zusammengefasst. (Die Tabellen erscheinen am Ende des beschreibenden Textes.)
Die Ergebnisse, welche in Tabelle I erscheinen, zeigen, dass die synergistische Induktion des SG2-Promotors mit Metallen und Dexamethason ein höheres Niveau der CAT-Genexpression erzeugte als die Wildtyp-MT-IIA- und MMTV-LTR-Promotoren. Gleichzeitig war das Induktionsverhältnis ebenfalls signifikant verbessert.

Beispiel 3

Dieses Beispiel veranschaulicht weiterhin die Verwendung eines Vektors, welcher zusätzliche GREs enthält.
Unter Verwendung eines ähnlichen Verfahrens wie dem aus Beispiel 1 wurde die Aktivität des SG2-Promotors mit der des nativen MT-IIA-Promotors in VERO-Zellen verglichen, die gentechnisch so verändert wurden, dass sie Glucocorticoidrezeptoren exprimierten (Giguere et al., (1986) Cell, 46, 645-652). In diesem Beispiel wurden die Zellen ebenfalls mit einem Expressionsvektor kotransfiziert, in welchem das β-Galactosidasegen von einem Promotor angetrieben wurde, dessen Aktivität unter den Versuchsbedingungen durch Schwermetalle oder Glucocorticoide nicht beeinflusst wurde. Nach Transfektion und Induktion wurde ein Aliquot des Zellextrakts verwendet, um die β-Galactosidase (β-Gal)-Aktivität zu messen. Diese Aktivität wurde verwendet, um CAT-Aktivitätsmessungen zu standardisieren, indem die Transfektionseffizienz berücksichtigt wurde.
Die erhaltenen Ergebnisse sind in Tabelle II unten gezeigt, und man kann sehen, dass diese sehr ähnlich zu denen sind, die mit CHO-Zellen (Tabelle I) erhalten wurden, und sie zeigen, dass Dexamethason synergistisch mit Metallionen auf den modifizierten MT-IIA (SG2)-Promotor einwirkt.

Beispiel 4

Dieses Beispiel veranschaulicht eine weitere Modifikation des Expressionsvektors und die erhaltenen Ergebnisse.
Zusätzliche Modifikationen wurden an dem hMT-IIA-Promotor vorgenommen, um eine zusätzliche Anzahl an GREs und multiplen MREs an der SacII-Stelle einzuführen, und um eine Anzahl an GREs an der XmaIII-Stelle einzuführen, wie detailliert in Fig. 1 gezeigt ist.
Die resultierende modifizierte Plasmid-DNA wurde wie in Beispiel 3 beschrieben in VERO-Zellen eingeführt, und die CAT-Genexpression wurde wie oben beschrieben bestimmt. Die erhaltenen Ergebnisse sind in Tabelle III unten angegeben.

Beispiel 5

Dieses Beispiel veranschaulicht die Konstruktion und Verwendung eines modifizierten MMTV-LTR-Promotors, welcher zusätzliche MREs enthält.
Zwei MREs wurden unter Verwendung eines ähnlichen Verfahrens wie in den vorhergehenden Beispielen an der BfrI-Stelle des MMTV- LTR-Promotors, welcher 4 GREs enthält, aber keine MREs aufweist, eingefügt (Majors und Varmus, Nature 283: 253-258). Tabelle IV zeigt, dass während der unmodifizierte MMTR-LTR-Promotor nicht durch Zn plus Cd induzierbar war, der modifizierte Promotor (BM2-MMTV) eine 10-fache Induktion zeigte. Wenn BM2-MMTV durch Dexamethason plus Zn plus Cd induziert wurde, wurde eine zweifache Synergie bei der CAT-Expression beobachtet.
Die Ergebnisse der Experimente, welche in den Beispielen 1 bis 5 und in den Tabellen I bis IV dargestellt sind, zeigen, dass es möglich ist, eine synergistische Aktivierung der Transkription im Zusammenhang mit einem modifizierten hMT-IIA-Promotor durch Einfügen zusätzlicher induzierbarer Elemente in Form von GREs und im Zusammenhang mit einem modifizierten MMTV-Promotor durch Einfügen zusätzlicher induzierbarer Elemente in Form von MREs zu erzielen. Die Zufügung der GREs zu dem hMT-IIA-Promotor und von MREs zu dem MMTV-Promotor erhöhte nicht das Grundniveau der Reportergenexpression, und die Induzierbarkeit und Transkriptionsstärke der modifizierten Promotoren waren gegenüber jenen ihrer Wildtypgegenstücke signifikant verbessert. Im Gegensatz dazu führte die ausschließliche Insertion von vier zusätzlichen MREs (Vektor SM4) in den hMT-IIA-Promotor nur zu einer leichten Verbesserung bei der Transkriptionsstärke des MT-Promotors, und diese Verbesserung wurde von einer signifikanten Zunahme der Grundexpression begleitet.
Der unmodifizierte hMT-IIA-Promotor in dem MT-CAT-Vektor konnte durch Dexamethason in Verozellen, die mit dem Glucocorticoidrezeptorgen transfiziert waren, nicht induziert werden. Jedoch war die Insertion wenigstens eines zusätzlichen GRE in den Promotor ausreichend, um ein Ansprechen auf Glucocorticoide und eine Genexpression zu vermitteln.
Um den Einfluss der Anzahl an zusätzlichen GREs, die eingefügt wurden, und der Insertionsstelle zu analysieren, wurden zwei Serien modifizierter Promotoren in den Beispielen erzeugt, indem ein oder mehrere GREs entweder an der SacII-Stelle (SG-Serie) oder der XmaIII-Stelle (XG-Serie) von MT-CAT-ΔX angefügt wurden. Alle Vektoren waren durch CdCl&sub2; und Glucocorticoide induzierbar. Jedoch war ein Minimum von zwei benachbarten GREs notwendig, um eine synergistische Induzierbarkeit durch gleichzeitige Behandlung von transfizierten Verozellen mit CdCl&sub2; und Dexamethason, unabhängig von der Stelle der Insertion, zu erzeugen.
Das Induktionsverhältnis, welches für die modifizierten hMT-IIA- Promotoren berechnet wurde, war verglichen mit dem Wildtyp-Promotor bis zu 6-fach erhöht. Die Tatsache, dass die Insertion zusätzlicher GREs das Grundniveau der Genexpression beispielsweise in SG3 nicht erhöhte, ist ein wichtiger Faktor bei der Verbesserung dieses Verhältnisses. Diese Beobachtung betont einen der Vorteile der Erzeugung einer synergistischen Transkriptionsaktivierung durch ein Zufügen unterschiedlicher Klassen induzierbarer Elemente an Stelle von konstitutiven, gemäß der vorliegenden Erfindung.

ZUSAMMENFASSUNG DER OFFENBARUNG

Als Zusammenfassung dieser Offenbarung stellen die Erfinder die Technologie und Anwendung für neue und verbesserte induzierbare Säugetierexpressionssysteme, insbesondere die Herstellung und Verwendung modifizierter menschlicher MT-IIA-Promotoren bereit, welche ein oder mehrere zusätzliche auf Glucocorticoide ansprechende Elemente enthalten, die synergistisch durch Glucocorticoide und Metallionen induziert werden können, während ein niedriges Niveau der Grundgenexpression beibehalten wird. Das Induktionsverhältnis kann weiter erhöht werden, indem konstitutive Elemente deletiert werden. Eine ähnliche Strategie kann verwendet werden, um einen verbesserten Maus Mammary-Tumor-Virus (MMTV)-Promotor durch ein Einfügen zusätzlicher auf Metalle ansprechender Elemente zu erzeugen. Modifikationen sind innerhalb des Umfangs dieser Erfindung möglich. TABELLE I
* = Induktionsverhältnis TABELLE II
* = Induktionsverhältnis TABELLE III TABELLE III (FORTSETZUNG) TABELLE IV
* Induktionsverhältnis

Claims

1. Ein synthetischer induzierbarer eukaryotischer Promotor zur Regulation der Transkription eines Gens, welcher wenigstens zwei unterschiedliche Klassen induzierbarer Elemente umfasst, wobei die unterschiedlichen Klassen induzierbarer Elemente so ausgewählt sind, dass diese ein synergistisches Expressionsniveau eines Genprodukts in einem eukaryotischen Expressionssystem bereitstellen, dadurch gekennzeichnet, dass die Klassen induzierbarer Elemente ausgewählt sind aus der Gruppe, bestehend aus auf Hormone ansprechenden Elementen (HREs), auf Metalle ansprechenden Elementen (MREs), auf Wärmeschock ansprechenden Elementen (HSREs) und auf Interferon ansprechenden Elementen (IREs).

2. Der Promotor, welcher in Anspruch 1 beansprucht wird, welcher von einem nativen Promotor abgeleitet ist und dadurch gekennzeichnet ist, dass eine der unterschiedlichen Klassen induzierbarer Elemente ein natives induzierbares Element ist und ein anderes der unterschiedlichen Klassen induzierbarer Elemente ein unterschiedliches induzierbares Element ist, das in den nativen Promotor eingefügt wurde oder in dem nativen Promotor durch Aktivierung eines normalerweise inaktiven Elements in dem nativen Promotor erzeugt wurde.

3. Der Promotor, der in Anspruch 2 beansprucht wird, dadurch gekennzeichnet, dass das wenigstens eine native induzierbare Element ein auf Metalle ansprechendes Element (MRE) ist und das wenigstens eine unterschiedliche induzierbare Element ein auf Hormone ansprechendes Element (HRE) ist.

4. Der Promotor, der in Anspruch 3 beansprucht wird, dadurch gekennzeichnet, dass das wenigstens eine auf Hormone ansprechende Element wenigstens ein auf Glucocorticoide ansprechendes Element (GRE) ist und in dem nativen Promotor durch Einfügung bereitgestellt wird.

5. Der Promotor, der in Anspruch 4 beansprucht wird, dadurch gekennzeichnet, dass mehrere verknüpfte GREs in den nativen Promotor eingefügt sind.

6. Der Promotor, der in Anspruch 5 beansprucht wird, dadurch gekennzeichnet, dass die mehreren verknüpften GREs in den nativen Promotor in Form eines multimeren Kopf-Schwanz-Elements eingefügt wurden, welches in Gegenwart von BamHI und BglII mit sich selbst ligiert wurde.

7. Der Promotor, der in irgendeinem der Ansprüche 4 bis 6 beansprucht wird, dadurch gekennzeichnet, dass das eingefügte GRE ein synthetisches Molekül ist, welches die GRE-Konsensussequenz enthält und einen positiven Strang mit der Nukleotidsequenz:

5'-GATCTGGTACAGGATGTTCTAGCTACG-3' (SEQ ID No: 1)

aufweist.

8. Der Promotor, der in irgendeinem der Ansprüche 2 bis 7 beansprucht wird, dadurch gekennzeichnet, dass der native Promotor der hMT-IIA-Promotor ist.

9. Der Promotor, der in Anspruch 2 beansprucht wird, dadurch gekennzeichnet, dass das wenigstens eine native induzierbare Element ein auf Hormone ansprechendes Element (HRE) ist und das wenigstens eine unterschiedliche induzierbare Element ein auf Metalle ansprechendes Element (MRE) ist.

10. Der Promotor, der in Anspruch 9 beansprucht wird, dadurch gekennzeichnet, dass das wenigstens eine auf Hormone ansprechende Element ein auf Glucocorticoide ansprechendes Element (GRE) ist und das MRE in dem nativen Promotor durch Einfügung bereitgestellt wird.

11. Der Promotor, der in Anspruch 10 beansprucht wird, dadurch gekennzeichnet, dass wenigstens zwei verknüpfte MREs in den nativen Promotor eingefügt sind.

12. Der Promotor, der in irgendeinem der Ansprüche 9 bis 11 beansprucht wird, dadurch gekennzeichnet, dass der native Promotor der MMTV-LTR-Promotor ist.

13. Der Promotor, der in irgendeinem der Ansprüche 1 bis 12 beansprucht wird, welcher von einem nativen Promotor abgeleitet ist, der wenigstens ein konstitutives Element enthält und dadurch gekennzeichnet ist, dass das wenigstens eine konstitutive Element funktionsunfähig ist.

14. Der Promotor, der in Anspruch 13 beansprucht wird, dadurch gekennzeichnet, dass das wenigstens eine konstitutive Element hinreichend funktionsunfähig ist, um ein verringertes Niveau der Grundgenexpression und ein erhöhtes Niveau der induzierten Genexpression gegenüber der Grundgenexpression, verglichen mit dem nativen Promotor, bereitzustellen.

15. Der Promotor, der in Anspruch 13 oder 14 beansprucht wird, dadurch gekennzeichnet, dass das wenigstens eine konstitutive Element durch Deletion aus dem nativen Promotor und/oder Einfügung eines induzierbaren Elements dorthinein untauglich gemacht wird.

16. Der Promotor, der in Anspruch 15 beansprucht wird, dadurch gekennzeichnet, dass das konstitutive Element durch Deletion und/oder Einfügung wenigstens eines GRE dorthinein unbrauchbar gemacht wird.

17. Der Promotor, der in Anspruch 15 beansprucht wird, dadurch gekennzeichnet, dass die nativen konstitutiven Elemente AP1 und AP2, die zwischen den Basen -79 bis -129 des nativen hMT-IIA- Promotors lokalisiert sind, deletiert sind.

18. Der Promotor, der in Anspruch 14 beansprucht wird, dadurch gekennzeichnet, dass wenigstens eine GRE-Sequenz an der SacII- Stelle (Base -175) des nativen hMT-IIA-Promotors eingefügt ist, wodurch das konstitutive AP2-Element an dieser Stelle unbrauchbar gemacht wird.

19. Der Promotor, der in Anspruch 14 beansprucht wird, dadurch gekennzeichnet, dass das wenigstens ein GRE in wenigstens eine von der SacII-Stelle (Base -175) und der XmaIII-Stelle (Base -129) des nativen hMT-IIA-Promotors eingefügt ist.

20. Der Promotor, der in Anspruch 18 oder 19 beansprucht wird, dadurch gekennzeichnet, dass zwei verknüpfte GRE-Sequenzen an der XmaIII-Stelle eingefügt sind.

21. Der Promotor, der in Anspruch 18 oder 19 beansprucht wird, dadurch gekennzeichnet, dass drei verknüpfte GRE-Sequenzen an der SacII-Stelle eingefügt sind.

22. Ein Vektor zur eukaryotischen Expression eines Genprodukts, der durch einen synthetischen induzierbaren eukaryotischen Promotor, wie er in irgendeinem der Ansprüche 1 bis 21 beansprucht wird, gekennzeichnet ist.

23. Der Vektor, der in Anspruch 22 beansprucht wird, dadurch gekennzeichnet, dass der Promotor funktionsfähig mit einem Gen verknüpft ist.

24. Ein eukaryotisches Expressionssystem, das durch eukaryotische Zellen, welche einen Vektor enthalten, wie er in Anspruch 22 oder 23 beansprucht wird, um eine induzierte Genexpression zu bewirken, gekennzeichnet ist.

25. Das Expressionssystem, das in Anspruch 24 beansprucht wird, dadurch gekennzeichnet, dass die eukaryotischen Zellen Säugetierzellen sind, die aus Vero-, CHO-, HeLa-, Ratten II- und Epithelzellen ausgewählt sind.