FR2772786A1 - Sequences nucleotidiques chevauchantes, et leur utilisation dans le cadre de la detection de xenohormones ainsi que dans des compositions pharmaceutiques - Google Patents

Sequences nucleotidiques chevauchantes, et leur utilisation dans le cadre de la detection de xenohormones ainsi que dans des compositions pharmaceutiques Download PDF

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Robert Barouki
Vincent Michele Garlatti
Charbel Massaad
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    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
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    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
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Abstract

La présente invention a pour objet l'utilisation de séquences nucléotidiques comprenant une ou plusieurs unités de réponse aux glucocorticoïdes, minéralocorticoïdes, androgènes et progestatifs (encore désignées GRU), et/ ou une ou plusieurs unités de réponse aux oestrogènes (encore désignées ERU), lesdites unités de réponse étant caractérisées en ce que leurs deux éléments de réponse se chevauchent de telle façon que le centre de l'un de ces deux éléments est décalé d'une distance de 5 paires de bases par rapport au centre de l'autre de ces deux éléments, pour la mise en oeuvre d'une méthode de détection in vitro de xénohormones, ou pour la préparation de médicaments destinés au traitement de pathologies associées à l'activité des récepteurs aux glucocorticoïdes, minéralocorticoïdes, androgènes et progestatifs, et/ ou des récepteurs aux oestrogènes.

Description

SEQUENCES NUCLEOTIDIQUES CHEVAUCHANTES, ET LEUR
UTILISATION DANS LE CADRE DE LA DETECTION DE
XENOHORMONES AINSI QUE DANS DES COMPOSITIONS
PHARMACEUTIQUES
La présente invention a pour objet l'utilisation de séquences nucléotidiques dérivées des éléments de réponse aux glucocorticoïdes et/ou aux oestrogènes, pour la mise en oeuvre de méthodes de détection in vitro de xénohormones.
L'invention a également pour objet des compositions pharmaceutiques contenant de telles séquences nucléotidiques.
La toxicité de nombreux composés retrouvés dans l'environnement ainsi que d'un certain nombre de médicaments est due à leur interaction avec des récepteurs hormonaux. De tels composés sont encore désignés xénohormones.
L'activation illégitime de ces récepteurs hormonaux peut avoir diverses conséquences sur le métabolisme, la différenciation et/ou la prolifération cellulaires.
Un exemple typique est celui de pesticides et de certains polluants atmosphériques qui, en activant le récepteur à l'oestradiol, vont déclencher une réponse de type oestrogénique.
Ces xénoestrogènes ont été suspectés d'être à l'origine de la diminution de la fertilité masculine et de l'augmentation de la fréquence de certains cancers ces dernières années comme le cancer du testicule et le cancer du sein (Auger et al.;
Jensen et al., 1995).
D'autres composés semblent avoir des effets de type glucocorticoïdes, et pourraient ainsi entraîner des perturbations du système immunitaire (Tanaka et al., 1996).
Les xénohormones ayant des structures très diverses, il est difficile de proposer un dosage structural direct. Un dosage fonctionnel peut être envisagé chez l'animal en utilisant les propriétés physiologiques des récepteurs activés, mais cette approche serait trop lourde et trop coûteuse si elle devait être utilisée en routine.
On peut donc s'orienter vers les systèmes de cellules en culture, en particulier en utilisant les transfections cellulaires (les différentes approches sont discutées dans Sonnenschein et al., 1995).
Le principe consiste à cloner un promoteur régulé par un récepteur nucléaire donné en amont d'un gène rapporteur codant pour une enzyme dont le dosage est simple et sensible.
Si la cellule possède le récepteur en question, l'addition de la xénohormone entraînera une activation du promoteur qui serait révélée par le gène rapporteur.
Il existe plusieurs variantes de cette approche utilisant soit des cellules de mammifère, soit des levures.
Les promoteurs utilisés sont des promoteurs naturels, par exemple celui du gène de la vitellogénine pour les oestrogènes et celui du virus MMTV (Mouse Mamrnary & Tumor Virus) pour les glucocorticoïdes.
Malgré leur intérêt, ces promoteurs présentent un certain nombre d'inconvénients
i) ils ne sont pas nécessairement les plus sensibles au récepteur étudié,
ii) ils peuvent être régulés par d'autres effecteurs ; en effet, les gènes sont souvent soumis à des régulations multiples et il est fréquent que ces régulations soient colocalisées dans le promoteur dans une unité de régulation (ou domaine de régulation) (Lucas et Granner, 1992).
L'utilisation de ces promoteurs peut donc poser un problème de spécificité de l'effet observé.
Les récepteurs nucléaires sont les intermédiaires au niveau cellulaire de action de plusieurs hormones et effecteurs comme les hormones stéroïdes, la triodothyronine, I'acide rétinoïque, et la 1-25 (OH)2 vitamine D3 (Evans, 1988).
Ces récepteurs hormonaux prennent une configuration telle, lorsqu'ils sont liés aux hormones, qu'ils reconnaissent alors des séquences d'ADN désignées éléments de réponse auxdits récepteurs, et qu'ils activent ainsi les différents promoteurs comprenant desdits éléments de réponse.
Il existe deux grandes familles de récepteurs nucléaires activés par un ligand (Beato et al., 1995; Mangelsdorf et al., 1995) :
- la famille des récepteurs aux glucocorticoïdes, minéralocorticoïdes, androgènes et progestatifs (encore désignés récepteurs aux glucocorticoïdes),
- la famille des récepteurs aux oestrogènes et à la triodothyronine.
La plupart des récepteurs de cette dernière famille lient l'ADN sous la forme d'hétérodimères avec le récepteur à l'acide cis-rétinoïque, RXR. Leurs éléments de réponse se composent généralement de répétitions directes du demisite AGGTCA (Mangelsdorf and Evans, 1995). L'élément de réponse aux oestrogènes est, de manière intéressante, différent en ce sens qu'il est habituellement palindromique et formé de deux demi-sites inversés séparés par trois paires de bases (Klein-HitpaB et al., 1988a). Cette structure est également celle des éléments de réponse de la famille du récepteur aux glucocorticoides (Martinez et al., 1987), mais dans ce cas, la séquence des demi-sites est différente.
Les récepteurs nucléaires ont une structure en domaine commune avec deux régions hautement conservées : le domaine central de liaison à l'ADN et le domaine C-terminal de liaison de l'hormone (Kumar et al., 1987; Fawell et al., 1990; Kumar et al., 1986; Tora et al., 1989; Tasset et al., 1990; Webster et al., 1988; Lees et al., 1989). Après stimulation hormonale, le récepteur aux oestrogènes (ER), lie un élément de réponse aux oestrogènes, ERE, sous la forme d'un homodimère modulant ainsi l'expression génétique (Brandt et al., 1997; Kumar et al., 1988; Beato, 1989; Dean et al., 1996).
L'efficacité et la spécificité de la régulation d'un gène par une hormone dépend de la séquence, de l'orientation et de l'espacement des demi-sites mais aussi du nombre et de la localisation des éléments de réponse (Kraus et al., 1994 ; Anolik et al., 1995; Discroll et al., 1996). En effet, un caractère commun à un grand nombre de promoteurs régulés par les hormones est la présence de plusieurs éléments de réponse adjacents. Dans de nombreux cas, ces éléments ont un effet synergique sur la transcription du gène (Klein-HitpaB et al., 1988b;
Martinez et al., 1989). Il est aussi connu que dans le cas de certains récepteurs nucléaires et de facteurs de transcription, une liaison coopérative est observée sur des éléments adjacents (Martinez et al., 1989; Tsai et al., 1989). La distance entre ces éléments est critique. Elle devient optimale quand elle correspond à un multiple de tours d'hélice ce qui permet alors la liaison des récepteurs sur le même côté de la double hélice d'ADN. Cependant, cette distance peut aussi être très longue. Dans ce cas, la boucle formé par I' ADN permettrait l'interaction entre récepteurs et la stabilisation du complexe (Ptashne, 1986). La flexibilité de la protéine serait critique pour que de telles interactions puissent se produire.
Une unité de réponse aux glucocorticoïdes, encore désignée ci-après GRE
A, contenant deux éléments de réponse aux glucocorticoïdes agencés de manière chevauchante a été mise en évidence dans le cadre de travaux sur la régulation du promoteur du gène de l'aspartate aminotransférase cytosolique (AspATc) (Garlatti et al., 1994). Cette séquence est reconnue par un tétramère du récepteur, qui se forme de manière fortement coopérative. Des travaux de modification de cette séquence GRE A, ont été effectués afin d'augmenter son affinité pour le tétramère, et ont abouti à la séquence désignée ci-après GRE A up (Garlatti et al., 1994).
Toutefois, aucune corrélation entre, d'une part, la mise en évidence de ces unités de réponse GRE A et GRE A up susmentionnées, et, d'autre part, la possibilité d'utiliser de tels éléments de réponse chevauchants dans le cadre de la mise en oeuvre d'une méthode de détection de xénohormones, n'a été faite, ni même suggérée dans l'article de Garlatti et al susmentionné.
En effet, le but de cet article était celui de l'étude, sur le plan fondamental, d'un promoteur, à savoir le promoteur du gène AspATc, et de l'élément de réponse aux glucocorticoïdes activant ce promoteur, lorsque ledit élément de réponse est reconnu par les récepteurs aux glucocorticoïdes.
Le glucocorticoïde utilisé dans les expériences d'activation du promoteur du gène AspATc décrites dans l'article Garlatti et al. susmentionné, est la dexaméthasone, à savoir un analogue de synthèse de la cortisone. A la différence des xénohormones susceptibles d'être retrouvées dans l'environnement, la dexaméthasone est un agoniste très puissant des récepteurs aux glucocorticoïdes, et à ce titre représente l'analogue de synthèse le plus efficace de la cortisone.
Par conséquent, aucune corrélation n'a été faite ni suggérée dans cet article, entre, d'une part, les unités de réponse GRE A et GRE A up susmentionnées, et, d'autre part, I'utilisation de ces unités pour la détection de xénohormones dans des échantillons, tels que de l'eau ou des extraits de plantes ou de sol, car rien ne pouvait laisser supposer que les quantités de xénohormones présentes dans de tels échantillons étaient susceptibles d'être suffisantes pour activer des promoteurs par les unités de réponse susmentionnées.
La présente invention découle de la mise en évidence par les Inventeurs
- d'une part, du fait que les éléments de réponse aux oestrogènes peuvent également être disposés de façon artificielle de manière à se chevaucher dans le cadre d'une unité de réponse aux oestrogènes, comme cela avait été mis en évidence ci-dessus dans le cas d'un élément naturel de réponse aux glucocorticoïdes, à savoir l'élément GRE A, et ce malgré les différences, tant au niveau de leurs séquences en acides aminés, que dans leur structure tridimensionnelle, existant entre les éléments de réponse aux oestrogènes, et ceux aux glucocorticoides,
- et, d'autre part, du fait que les unités de réponse aux glucocorticoïdes et celles aux oestrogènes, comprenant des éléments de réponse chevauchants, permettent de détecter des xénohormones à des doses jusqu'à environ 10 à 100 fois plus faibles que ne le permettent les éléments de réponse non chevauchants correspondants.
Un des buts de la présente invention est de fournir de nouvelles méthodes de détection de xénohormones présentes dans l'environnement ou dans le corps humain ou animal, simples de mise en oeuvre et plus spécifiques desdites xénohormones que les méthodes existantes de l'état de la technique.
La présente invention a également pour but de fournir de nouvelles compositions pharmaceutiques utilisables dans le cadre du traitement de pathologies en tout ou partie associées à la présence de telles xénohormones dans l'environnement, et donc à l'activité des récepteurs aux glucocorticoïdes, minéralocorticoïdes, androgènes et progestatifs, et/ou des récepteurs aux oestrogènes.
Un autre but de la présente invention est de fournir de nouvelles unités de réponse susceptibles d'être utilisées dans une méthode de détection telle que décrite ci-dessus, ou dans les compositions pharmaceutiques susmentionnées.
La présente invention a pour objet l'utilisation de séquences nucléotidiques comprenant une ou plusieurs unités de réponse aux glucocorticoïdes, minéralocorticoïdes, androgènes et progestatifs (encore désignées unités de réponse aux glucocorticoïdes, ou GRU), et/ou une ou plusieurs unités de réponse aux oestrogènes (encore désignées ERU), lesdites unités étant telles qu'elles comprennent
- pour l'unité GRU : deux séquences nucléotidiques capables d'activer les promoteurs par les glucocorticoïdes, lorsqu'elles sont reconnues par les récepteurs associés à ces derniers, ces deux séquences, encore désignées éléments de réponse aux glucocorticoïdes (ou éléments GRE), étant des séquences dérivées par modification d'un ou plusieurs nucléotides de l'élément de réponse GRE correspondant à la séquence d'ADN de formule suivante
5 GGTACA X1X2X3 TGTTCT 3'
3, CCATGT X4X5X6 ACAAGA 5,
dans laquelle X1, X2, et X3, indépendamment les uns des autres, représentent un nucléotide quelconque, tandis que X4, Xg, et X6, représentent un nucléotide capable de s'apparier avec X1, X2, et X3, respectivement,
- pour l'unité ERU : deux séquences nucléotidiques capables d'activer les promoteurs par les oestrogènes, lorsqu'elles sont reconnues par les récepteurs associés à ces derniers, ces deux séquences, encore désignées éléments de réponse aux oestrogènes (ou éléments ERE), étant des séquences dérivées par modification d'un ou plusieurs nucléotides de l'élément de réponse GRE correspondant à la séquence d'ADN de formule suivante
AGGTCA X1X2X3 TGACCT 3'
3, TCCACT X4X5X6 ACTGGA 51
dans laquelle X1, X2, et X3, indépendamment les uns des autres, représentent un nucléotide quelconque, tandis que X4, Xg, et X6, représentent un nucléotide capable de s'apparier avec X1, X2, et X3, respectivement,
lesdites unités de réponse GRU et ERU étant caractérisées en ce que leurs deux éléments de réponse respectifs, GRE et ERE, se chevauchent de telle façon que le centre de l'un des éléments GRE ou ERE, est respectivement décalé d'une distance de 5 paires de bases par rapport au centre de l'autre élément
GRE ou ERE,
pour la mise en oeuvre d'une méthode de détection in vitro de xénohormones, ou pour la préparation de médicaments destinés au traitement de pathologies associées à l'activité des récepteurs aux glucocorticoïdes et/ou aux oestrogènes.
Par l'expression "élément de réponse aux glucocorticoïdes", on entend toute séquence nucléotidique capable d'activer les promoteurs par les glucocorticoïdes, lorsqu'elles sont reconnues par les récepteurs associés à ces derniers.
Par l'expression "élément de réponse aux oestrogènes", on entend toute séquence nucléotidique capable d'activer les promoteurs par les oestrogènes, lorsqu'elles sont reconnues par les récepteurs associés à ces derniers.
Avantageusement, les modifications apportées aux éléments de réponse
GRE ou ERE, dont les formules sont indiquées ci-dessus, sont essentiellement telles qu'elles permettent auxdites unités de réponse d'activer les promoteurs les comprenant, lorsque ces unités sont reconnues par les récepteurs associés aux glucocorticoïdes, minéralocorticoïdes, androgènes et progestatifs, ou par les récepteurs aux oestrogènes.
L'invention concerne plus particulièrement l'utilisation susmentionnée de séquences nucléotidiques comprenant à titre d'unité GRU
- la séquence nucléotidique de formule (I) suivante 5 3
XalGT ACXbl GXclA XdlGXel CCXfl GTT CXgl 3, Xa2 CA TGXb2 CXC2T Xd2CXe2 GGXf2 CAA GXg2 5,
dans laquelle
les éléments de réponse GRE sont indiqués, sur l'un des brins d'ADN, en caractères gras et italiques,
Xaî à Xgî, indépendamment les uns des autres, représentent un nucléotide quelconque ou dérivé, tandis que Xa2 à Xg2, représentent un nucléotide ou dérivé capable de s'apparier avec Xa1 à Xgî respectivement,
- ou une succession d'au moins deux séquences nucléotidiques de formule
(I) susmentionnée, chacune des séquences nucléotidiques de formule (I) étant
espacées d'une distance comprise entre 10n et 11n paires de bases, centre à
centre, n étant un nombre entier supérieur ou égal à 2.
Avantageusement, les séquences nucléotidiques comprenant, à titre d'unité
GRU, la séquence nucléotidique de formule (I), ou une succession d'au moins
deux séquences nucléotidiques de formule (I), susmentionnées, sont
caractérisées en ce que
- Xa1, Xb1, Xf1, et Xg1, indépendamment les uns des autres, représentent
un nucléotide quelconque ou dérivé, tandis que Xa2, Xb2, Xf2, et Xg2,
représentent un nucléotide ou dérivé capable de s'apparier avec Xa1, Xb1, Xf1,
et Xg1, respectivement,
Xci représente A ou T, tandis que Xc2 représente T ou A
respectivement,
- Xd1 représente A ou C, tandis que Xd2 représente T ou G
respectivement,
- Xe1 représente A ou T, tandis que Xe2 représente T ou A
respectivement.
L'invention a plus particulièrement pour objet l'utilisation susmentionnée
de séquences nucléotidiques comprenant à titre d'unité GRU
- la séquence nucléotidique désignée "GRE A" suivante:
5 GGT ACA GAA AGA CCT GTT CT 3'
3 CCA TGT CTT TCT GGA CAA GA 5,
dans laquelle les éléments de réponse GRE sont indiqués, sur l'un des brins
d'ADN, en caractères gras, italiques, et soulignés,
- ou une succession d'au moins deux séquences nucléotidiques GRE A,
espacées d'une distance comprise entre 10n et 11n paires de bases, centre à
centre, n étant un nombre entier supérieur ou égal à 2, notamment
la séquence (GRE A)2 suivante 5 CGT ACA GAA AGA CCT GTT CTXa GGT ACA GAA ACA CCT GTT CT 3' 3' CCA TGT CTT TCT GGA CAA GAXb CCA TGT CTT TCT GGA CAA GA 5
dans laquelle Xa représente un nucléotide quelconque ou dérivé, et Xb
représente un nucléotide ou dérivé capable de s'apparier avec Xa, notamment
Xa représente C et Xb représente G,
la séquence (GRE A)4 suivante 5' GGT ACA OAA AGA CCT GTT CTXa GGT ACA GAA AGA CCT GTT CT 3' 3' CCA TGT CTT TCT GGA CAA GAXb CCA TGT CTT TCT GGA CAA GA 5' 5 XCGGT ACA GAA AGA CCT GTT CTXe GGT ACA GAA AGA CCT GTT CT 3 3' XdCCA TGT CTT TCT GGA CAA GAXf CCA TGT CTT TCT GGA CAA GA 5'
dans laquelle Xa, Xc, et Xe, indépendamment les uns des autres, représentent
un nucléotide quelconque ou dérivé, tandis que Xb, Xd, et Xf, représentent un
nucléotide ou dérivé capable de s'apparier avec Xa, Xc, et Xe, respectivement,
notamment Xa, Xc, et Xe représentent C et Xa, Xc, et Xe représentent G.
L'invention a plus particulièrement encore pour objet l'utilisation
susmentionnée de séquences nucléotidiques comprenant à titre d'unité GRU :
- la séquence nucléotidique désignée "GRE A up" suivante:
5' GGT ACA GTA CGT CCT GTT CT 3'
3' CCA TGT CAT GCA GGA CAA GA 5'
dans laquelle les éléments de réponse GRE sont indiqués, sur l'un des brins
d'ADN, en caractères gras, italiques, et soulignés,
- ou une succession d'au moins deux séquences nucléotidiques GRE A up,
espacées d'une distance comprise entre 10n et lin paires de bases, centre à
centre, n étant un nombre entier supérieur ou égal à 2, notamment
la séquence (GRE A up)2 suivante 5 GGT ACA GTA CGT CCT GTT CTXa GGT ACA GTA CGT CCT GTT CT 3' 3' CCA TGT CAT GCA GGA CAA GAXb CCA TGT CAT GCA GGA CAA GA 5'
dans laquelle Xa représente un nucléotide quelconque ou dérivé, et Xb
représente un nucléotide ou dérivé capable de s'apparier avec Xa, notamment
Xa représente C et Xb représente G,
la séquence (GRE A up)4 suivante 5 GGT ACA GTA CGT CCT GTT CTXa GGT ACA GTA CGT CCT GTT CT 3' 3' CCA TGT CAT GCA GGA CAA GAXb CCA TGT CAT GCA GGA CAA GA 5' 5' XcGGT ACA GTA CGT CCT GTT CTXe GGT ACA GTA CGT CCT GTT CT 3' 3' XdCCA TGT CAT GCA GGA CAA GAXf CCA TGT CAT GCA GGA CAA GA 5'
dans laquelle Xa, Xc, et Xe, indépendamment les uns des autres, représentent
un nucléotide quelconque ou dérivé, tandis que Xb, Xd, et Xf, représentent un
nucléotide ou dérivé capable de s'apparier avec Xa, Xc, et Xe, respectivement,
notamment Xa, Xc, et Xe représentent C et Xa, Xc, et Xe représentent G.
L'invention concerne également l'utilisation susmentionnée de séquences
nucléotidiques comprenant à titre d'unité ERU
- la séquence nucléotidique de formule (II) suivante
5' 3'
Xa1 GG TCXb1 GGT CGA CCXc1 GAC CXd1
Xa2CC AGXb2 CCA GCT GGXc2 CTG GXd2 3' 5'
dans laquelle
les éléments de réponse ERE sont indiqués, sur l'un des brins
d'ADN, en caractères gras et italiques,
Xa1 à Xd1, indépendamment les uns des autres, représentent
un nucléotide quelconque ou dérivé, tandis que Xa2 à Xd2, représentent un
nucléotide ou dérivé capable de s'apparier avec Xa1 à Xd1 respectivement,
- ou une succession d'au moins deux séquences nucléotidiques de formule
(II) susmentionnée, espacées d'une distance comprise entre 10n et 11n paires de
bases, centre à centre, n étant un nombre entier supérieur ou égal à 2.
L'invention a plus particulièrement pour objet l'utilisation susmentionnée
de séquences nucléotidiques comprenant à titre d'unité ERU
- la séquence nucléotidique désignée "over ERE" suivante
5 AGG TCA GGT CGA CCT GAC CT 3'
3' TCC AGT CCA GCT GGA CTG GA 5'
dans laquelle les éléments de réponse ERE sont indiqués, sur l'un des brins
d'ADN, en caractères gras, italiques et soulignés,
- ou une succession d'au moins deux séquences nucléotidiques over ERE,
espacées d'une distance comprise entre 10n et 1 in paires de bases, centre à
centre, n étant un nombre entier supérieur ou égal à 2, notamment
la séquence (over ERE)2 suivante 5 AGG TCA GGT CCA CCT GAC CTXa AGG TCA GGT CGA CCT GAC CT 3' 3' TCC AGT CCA GCT GGA CTG GAXb TCC AGT CCA GCT GGA CTG GA 5'
dans laquelle Xa représente un nucléotide quelconque ou dérivé, et Xb
représente un nucléotide ou dérivé capable de s'apparier avec Xa, notamment
Xa représente C et Xb représente G,
la séquence (over ERE)4 suivante 5 AGG TCA GGT CCA CCT GAC CTXa AGG TCA GGT CGA CCT GAC CT 3' 3' TCC AGT CCA GCT GGA CTG GAXb TCC AGT CCA GCT GGA CTG GA 5' 5' XcAGG TCA GGT CGA CCT GAC CTXe AGG TCA GGT CCA CCT GAC CT 3' 3' XdTCC AGT CCA GCT GGA CTG GAXf TCC AGT CCA GCT GGA CTG GA 5'
dans laquelle Xa, Xc, et Xe, indépendamment les uns des autres, représentent
un nucléotide quelconque ou dérivé, tandis que Xb, Xd, et Xf, représentent un
nucléotide ou dérivé capable de s'apparier avec Xa, Xc, et Xe, respectivement,
notamment Xa, Xc, et Xe représentent C et Xa, Xc, et Xe représentent G.
L'invention a également pour objet toute séquence nucléotidique
caractérisée en ce qu'elle comprend une succession d'au moins deux séquences
nucléotidiques GRE A, et /ou une succession d'au moins deux séquences
nucléotidiques GRE A up, telles que définies ci-dessus.
L'invention concerne également toute séquence nucléotidique caractérisée
en ce qu'elle comprend à titre d'unité ERU
- la séquence nucléotidique de formule (II) suivante
5' 3'
Xa1GG TCXb1 GGT CGA CCXc1 GAC CXd1
Xa2CC AGXb2 CCA GCT GGXc2 CTG GXd2 3' 5'
dans laquelle
les éléments de réponse ERE sont indiqués, sur l'un des brins
d'ADN, en caractères gras et italiques,
Xaî à Xd1, indépendamment les uns des autres, représentent
un nucléotide quelconque ou dérivé, tandis que Xa2 à Xd2, représentent un
nucléotide ou dérivé capable de s'apparier avec Xa1 à Xd1 respectivement,
- ou une succession d'au moins deux séquences nucléotidiques de formule
(II) susmentionnée, espacées d'une distance comprise entre 10n et 11n paires de
bases, centre à centre, n étant un nombre entier supérieur ou égal à 2.
L'invention a plus particulièrement pour objet toute séquence
nucléotidique telle que décrite ci-dessus, et caractérisée en ce qu'elle comprend
à titre d'unité ERU:
- la séquence nucléotidique over ERE suivante:
5' AGG TCA GGT CCA CCT GAC CT 3'
3' TCC AGT CCA CCT GGA CTG GA 51
dans laquelle les éléments de réponse ERE sont indiqués, sur l'un des brins
d'ADN, en caractères gras, italiques et soulignés,
- ou une succession d'au moins deux séquences nucléotidiques over ERE,
espacées d'une distance comprise entre 10n et 11n paires de bases, centre à
centre, n étant un nombre entier supérieur ou égal à 2, notamment
la séquence (over ERE)2 suivante
5 AGG TCA GGT CGA CCT GAC CTXa AGG TCA GGT CGA CCT GAC CT 3'
3' TCC AGT CCA GCT GGA CTG GAXb TCC AGT CCA GCT GGA CTG GA 5'
dans laquelle Xa représente un nucléotide quelconque ou dérivé, et Xb
représente un nucléotide ou dérivé capable de s'apparier avec Xa, notamment
Xa représente C et Xb représente G,
la séquence (over ERE)4 suivante 5 AGG TCA GGT CGA CCT GAC CTXa AGG TCA GGT CGA CCT GAC CT 3' 3' TCC AGT CCA GCT GGA CTG GAXb TCC AGT CCA GCT GGA CTG GA 5' 5' XcAGG TCA GGT CGA CCT GAC CTXe AGG TCA GGT CGA CCT GAC CT 3' 3' XdTCC AGT CCA GCT GGA CTG GAXf TCC AGT CCA GCT GGA CTG GA 5'
dans laquelle Xa, Xc, et Xe, indépendamment les uns des autres, représentent
un nucléotide quelconque ou dérivé, tandis que Xb, Xd, et Xf, représentent un
nucléotide ou dérivé capable de s'apparier avec Xa, Xc, et Xe, respectivement,
notamment Xa, Xc, et Xe représentent C et Xa, Xc, et Xe représentent G.
L'invention a également pour objet toute séquence nucléotidique
comprenant une ou plusieurs unités ERU, telle que définie ci-dessus, et
comprenant également une ou plusieurs unités GRU définies ci-dessus.
L'invention concerne également les séquences nucléotidiques définies ci
dessus, dans lesquelles la ou les unités ERU, et, le cas échéant la ou les unités
GRU, sont situées en amont d'un promoteur basal contrôlant la transcription
d'un gène rapporteur.
Avantageusement, le promoteur basal est choisi parmi les suivants
- le promoteur AMTV correspondant au promoteur du virus MMTV délété, décrit dans Umesono et al., 1988, Nature, 336, 262-265,
- le promoteur TK correspondant au promoteur de la thymidine kinase virale,
- le promoteur réduit à la boîte TATA, correspondant à un fragment du promoteur de la thymidine kinase virale.
Avantageusement encore, le gène rapporteur est choisi parmi les gènes suivants
- le gène codant pour la luciferase,
- le gène codant pour la ss-galactosidase,
- le gène codant pour la chloramphénicol acétyl transférase,
le gène codant pour le cytochrome P450 lA1 métabolisant l'éthoxycoumarine en hydroxycoumarine fluorescente, susceptible d'être détectée directement dans le milieu de culture,
- le gène codant pour le cytochrome P450 2A6 métabolisant la coumarine en hydroxycoumarine fluorescente, susceptible d'être détectée directement dans le milieu de culture.
L' invention a également pour objet tout vecteur, notamment tout plasmide, caractérisé en ce qu'il comprend au moins une séquence nucléotidique telle que décrite ci-dessus selon l'invention.
L'invention a plus particulièrement pour objet tout vecteur, notamment tout plasmide, caractérisé en ce qu'il comprend au moins une séquence nucléotidique comprenant une unité ERU, telle que décrite ci-dessus selon l'invention.
Un vecteur particulièrement préféré dans le cadre de la présente invention est celui contenant, à titre d'unité ERU, la séquence over ERE décrite ci-dessus, ou une succession d'au moins deux séquences over ERE.
L'invention concerne également toute cellule humaine ou animale transformée par un vecteur tel que défini ci-dessus.
De préférence, les cellules susmentionnées sont choisies parmi les cellules suivantes (référencées dans le catalogue ATCC American Type Culture
Collection)
- les cellules Hep G2, Hep 3B, TONG/HCC, hépatomateuses humaines,
- les fibroblastes CVÎ de rein de singe,
- les hépatocytes humains,
- les cellules MCF7 du carcinome mammaire,
- les cellules LNCaP du carcinome prostatique.
L'invention concerne également toute méthode de détection in vitro de xénohormones susceptibles d'interagir avec des récepteurs aux glucocorticoïdes, et/ou des récepteurs aux oestrogènes dans l'organisme humain ou animal, caractérisée en ce qu'elle comprend
- la mise en culture de cellules humaines ou animales telles que décrites cidessus, dans un milieu de culture en présence d'un échantillon biologique susceptible de contenir lesdites xénohormones,
- la détection de la présence du polypeptide codé par ledit gène rapporteur dans lesdites cellules ou le milieu de culture de ces dernières, notamment par colorimétrie dans le cas où le polypeptide codé par le gène rapporteur réagit avec son substrat dans le cadre d'une réaction colorée, ou par fluorimétrie dans le cas où le polypeptide codé par le gène rapporteur est fluorescent, ou susceptible d'être reconnu par une molécule fluorescente, ou par chimioluminescence, ou encore par une méthode radioactive.
Avantageusement, I'échantillon biologique susceptible de contenir les xénohormones est l'eau, des extraits de plantes, des extraits de prélèvements de sol, dans le cas de la mise en oeuvre d'une méthode de détection de ces xénohormones dans l'environnement, ou un prélèvement sanguin dans le cas de la mise en oeuvre d'une méthode de détection in vitro de ces xénohormones dans le corps humain ou animal.
Une méthode de détection in v
ERE, dans un milieu de culture en présence d'un échantillon biologique susceptible de contenir lesdites xénohormones
la détection de la présence du polypeptide codé par ledit gène rapporteur dans lesdites cellules ou le milieu de culture de ces dernières, notamment de la manière indiquée ci-dessus.
L'invention a également pour objet toute composition pharmaceutique caractérisée en ce qu elle comprend, en association avec un véhicule physiologiquement acceptable, au moins une unité GRU et/ou ERU telles que définies ci-dessus.
Des compositions pharmaceutiques préférées dans le cadre de la présente invention, sont celles comprenant à titre d'unité GRU, la séquence GRE A up décrite ci-dessus, ou une succession d'au moins deux séquences GRE A up.
D'autres compositions pharmaceutiques préférées dans le cadre de la présente invention, sont celles comprenant à titre d'unité ERU, la séquence over ERE décrite ci-dessus, ou une succession d'au moins deux séquences over ERE.
Avantageusement, les compositions pharmaceutiques susmentionnées de l'invention, sont caractérisées en ce que la ou les unités GRU, et/ou la ou les unités ERU, sont précédées et suivies par une succession d'au moins environ 5 nucléotides ou dérivés.
De préférence, les compositions pharmaceutiques susmentionnées de l'invention, se présentent sous une forme administrable par voie parentérale, notamment par voie intraveineuse, ou par voie orale ou locale., notamment à raison d'environ 0,1 mg/kg à environ 10 mg/kg par jour de traitement.
L'invention a également pour objet tout vecteur pour la thérapie génique caractérisé en ce qu'il comprend au moins une unité GRU et/ou ERU, telles que définies ci-dessus.
Des vecteurs pour la thérapie génique particulièrement préférés dans le cadre de la présente invention sont ceux comprenant à titre d'unité GRU, la séquence GRE A up décrite ci-dessus, ou une succession d'au moins deux séquences GRE A up, ou à titre d'unité ERU, la séquence over ERE décrite cidessus, ou une succession d'au moins deux séquences over ERE.
L'invention concerne également toute composition pharmaceutique comprenant un vecteur pour la thérapie génique tel que défini ci-dessus, en association avec un véhicule physiologiquement acceptable.
L'invention a également pour objet l'utilisation des compositions pharmaceutiques comprenant au moins une unité GRU, telles que décrites cidessus, dans le cadre du traitement des pathologies associées à la fonction d'un récepteur aux stéroïdes, notamment du cancer de la prostate ou du syndrome de
Cushing.
L'invention a également pour objet l'utilisation des compositions pharmaceutiques comprenant au moins une unité ERU, telles que décrites cidessus, dans le cadre du traitement des pathologies associées à l'activité la fonction d'un récepteur aux oestrogènes, notamment les cancers du sein, du col de l'utérus et de l'ovaire.
L'invention a également pour objet les trousses ou kits pour la mise en oeuvre d'une méthode de détection in vitro de xénohormones, telle que décrite ci-dessus, comprenant
- des cellules, telles que définies ci-dessus, transformées par un vecteur contenant une ou plusieurs unités GRU et/ou ERU, lesdites cellules étant avantageusement cultivées à 37"C, et conservées à -80"C,
- le cas échéant, un milieu de culture desdites cellules,
- le cas échéant, les réactifs nécessaires à la détection du polypeptide codé par le gène rapporteur.
L'invention sera davantage illustrée à l'aide de la description détaillée qui suit de la construction de la séquence over ERE, et de son utilisation dans le cadre de la détection de xénohormones.
I) MATERIELS ET METHODES
1) Culture cellulaire
Les cellules HepG2 (Knowles et al., 1980), les cellules MCF-7 (cellules de tumeur mammaires) et les cellules CMT sont maintenues dans le milieu
DMEM (Dulbecco's minimal essential medium) sans rouge de phénol, et contenant 10% de sérum de veau foetal (Gibco), de la pénicilline (100 U/ml), de la streptomycine (100 ul/ml) (Diamant) et de la fungizone (0.5 ug/ml) (Squibb).
2) Plasmides
Les vecteurs d'expression du récepteur à l'oestradiol humain (ER) ainsi que les fragments tronqués du récepteur (HE13, HE15, HE19, HE21, HE38,
HE70, et HE72) ont été décrits par Green et al., 1987, et T. Ylicomi et al., 1992. Le plasmide AMTV-CAT dérive du plasmide MMTV-CAT, cependant les séquences régulatrices sensibles aux glucocorticoïdes ont été délétées (Umesono et al., 1988). Un site Hind III a été créé à cette position. Il servira comme site de clonage des oligonucléotides. Les oligonucléotides ont été sous-clonés aussi dans le site HindIII du plasmide Tk-CAT. Les oligomères (ERE, (ERE)2, over
ERE, and (over ERE)2) possèdent des extrémités 5' compatibles avec le site HindIII. Cependant le site de restriction est perdu après le sous-clonage. La séquence (ERE)2 a été obtenue par la ligation de deux oligonucléotides ERE.
Séquence du ERE: brin A : 5 AGCTGCTCAGCT AGGTCA CTG CGACCT
CTACT3, brin B: 5 AGCTAGTAG AGGGCT GAG TGACCT AGCTGAGC3 Séquence du over ERE: brin A 5 AGCTGCTCAGCT
AGGTCAGGTCGACCTGACCT CTACT3', brin B: 5 AGCTAGTAG
AGGTCAGGTCGACCT GACCT AGCTGAGC3. Séquence du (over ERE)2: brin A 5 AGCTGCTCAGCT AGGTCAGGTCGACCTGACCT C
AGGTCAGGTCGACCTGACCT CTACT3', brin B: 5 AGCTAGTAG
AGGTCAGGTCGACCTGACCT G AGGTCAGGTCGACCTGACCT AGCTGAGC3. (les sites ERE sont soulignés). La séquence GRE utilisée dérive du promoteur du gène de I'aspartate aminotransférase cytosolique (Garlatti et al., 1994). Cette séquence possède une efficacité transcriptionnelle comparable au GRE consensus. Le plasmide exprimant la luciferase (RSV-Luc) a été acheté chez Promega.
3) Transfection transitoire
Les expériences de transfections ont été décrites par Massaad et al., 1997.
Un jour avant la transfection les cellules HepG2 sont ensemencées à 106 cellules dans une boîte de culture de 10 cm de diamètre. Le milieu de culture est remplacé par du milieu ne contenant pas de stéroïdes 2 à 3 heures avant la transfection. Pour éliminer les stéroïdes, le sérum est chauffé à deux reprises pendant 20 minutes à 65"C sur du charbon actif piégeant les stéroïdes.
Dans un tube stérile, 5 yg du plasmide à étudier (ERE-CAT, over ERE
CAT...), différentes quantités du plasmide d'expression du ER (récepteur aux oestrogènes) et 1 g du plasmide codant pour la luciferase sont mélangés dans un volume final de 500y1 contenant 62,5 yI de CaC12 (2M). Ce mélange est ajouté goutte à goutte et avec bullage à 500 ul de HBS 2X (Nacl 280 mM,
Hepes 50 mM, Na2HPO4 1,5 mM pH 7,1). Ce pH est primordial pour la formation d'un précipité stable ADN-phosphate de calcium. Trente minutes sont nécessaires pour le déroulement de la réaction de complexation. Ce mélange est ensuite ajouté goutte à goutte aux cellules qui sont incubées pendant 3h 30 min.
Cette incubation favorise la précipitation de l'ADN et son adhérence aux cellules. Par la suite, le traitement par du PBS 1X contenant 20% en volume de glycérol permet l'internalîsation des grains d'ADN-calcium. Deux minutes plus tard, 5 ml de PBS 1X, pH 7,5, sont ajoutés afin de diluer le glycérol. Un second lavage au PBS est nécessaire pour éliminer toute trace de glycérol. Dix ml de milieu complet sont ajoutés aux cellules et les boîtes sont incubées durant 24 heures afin que les plasmides transfectés soient exprimés.
Un protocole similaire est utilisé pour les cellules MCF-7. Les cellules sont ensemencées à 106 cellules par boîte de 6 cm de diamètre, et transfectées selon la technique au phosphate de calcium (Jiang et al., 1992).
Seize heures plus tard, le milieu est remplacé par un milieu 5% SVF sans stéroïdes; puis les boîtes sont traitées par les hormones à tester: l'oestradiol (10-7 M de concentration finale) I'antihormone (ICI164386) ou les xénohormones. Une incubation de 24 heures permet l'induction hormonale.
4) Dosage de l'activité CAT:
La chloramphénicol acétyltransférase assure le transfert d'un groupement acétyl vers l'hydroxyle en position 3 du chloramphénicol (antibiotique). La quantification du produit acétylé permet la mesure directe de l'activité régulatrice d'un promoteur.
La technique classique consiste à extraire le produit et le substrat, à les séparer par une chromatographie (TLC) et d'une autoradiographie. La méthode que nous avons utilisée, plus rapide, consiste en un transfert de la radioactivité de L'ACéTYL CoA (3H ou 14C) vers le chloramphénicol aisément détectable grâce à un compteur à scintillation. Le liquide scintillant utilisé est ltéconofluorX qui est hydrophobe. Or le chloramphénicol acétylé diffuse dans l'éconofluor alors que l'acétyl CoA demeure dans la phase aqueuse. Ainsi, seul le produit de la réaction est dans un environnement permettant sa détection par le compteur à scintillation.
Protocole expérimental:
Après l'aspiration du milieu de culture, deux lavages au PBS 1X sans calcium ni magnésium sont réalisés. Cinq cents ul de tampon de lyse 1X (Promega's Reporter Lysis Buffer ) sont ajoutés aux boîtes de culture après deux rinçages au PBS 1X sans Ca2+ ni Mg2 +. Quinze minutes plus tard, les cellules sont détachées par grattage puis centrifugées à 8000 g. L'échantillon est séparé en 3 fractions: 100 l serviront pour le dosage CAT, 20 yI serviront pour le dosage de la luciferase et 80 ul seront utilisés pour le dosage des protéines.
Cent il de surnageant sont chauffés à 65 C durant 5 minutes afin de dénaturer les acétylases endogènes, puis centrifugés pendant 20 minutes à 15000 tours/min. Vingt ILI de Premix (EDTA 5mM, Tris-HCI 250 mM pH 7,5, acétyl
CoA froid 30 ltM, 3H acétyl CoA 0,5 1Ci, chloramphénicol lmM) et 20 l de chloramphénicol (5 mM) sont ajoutés à 60 ul d'échantillons. Les échantillons sont ensuite incubés durant 30 minutes à 37 C. Quatre-vingt il de ce mélange réactionnel sont ajoutés à 4 ml d'Econofluor. Un mélange vigoureux permet la diffusion du chloramphénicol vers la phase hydrophobe; puis les échantillons sont incubés durant 30 minutes à température ambiante; ceci permet la séparation des deux phases et la diffusion de la radioactivité vers l'EconofluorX où le comptage est réalisé. La radioactivité est mesurée grâce au compteur à scintillation Beckman (modèle: LS 5000 CE). Il est à noter que la diffusion de la radioactivité est une fonction linéaire du temps (Neumann et al., 1987).
5) Dosage de la luciférase:
Le dosage de la luciférase est extrêmement sensible, rapide et simple. La luciférase est une protéine monomérique de poids moléculaire de 62 KDa. Elle catalyse l'oxydation de la luciférine (peroxyde) accompagnée de la production de photons.
Le test conventionnel de la luciférase génère un bref éclair lumineux qui apparaît dès le contact de l'enzyme avec le substrat. Mais le système que nous avons utilisé (Promega's luciferase assay system) possède un "turnover" enzymatique plus lent permettant de visualiser une intensité lumineuse constante durant plusieurs minutes; on s'affranchit ainsi d'un luminomètre à injection automatique. La sensibilité de détection de cette méthode est de l'ordre de 10-20 moles de luciférase. Ce test est donc environ 100 fois plus sensible que le dosage CAT.
Protocole expérimental:
Le dosage de la luciférase est réalisé sur un luminomètre calibré (modèle:
BIOORBIT 1250). Cent ul de réactif (Luciferase assay reagent- Promega ) sont mélangés vigoureusement aux 20 ul de l'échantillon à doser. Le comptage est réalisé 10 secondes puis 20 secondes après. Les résultats sont exprimés en mVolts (De Wet et al., 1987).
6) Préparation des extraits cellulaires
Les cellules CMT sont transfectées selon la technique au DEAE décrit par
Ishikawa et al., 1992. Brièvement, les cellules sont ensemencées à 2 106 cellules/boîte de 10 cm de diamètre. Vingt-quatre heures plus tard, les cellules sont lavées deux fois avec le PBS, puis 500 ul de trypsine sont ajoutées. Les cellules sont incubées durant 10 min à température ambiante, ensuite 4 ml de milieu de culture, contenant 20 g du vecteur d'expression du ER, 400 ug de
DEAE dextran et 0.1 mM de chloroquine, est ajouté. Les cellules sont incubées durant 4 heures à 37"C suivi d'un choc de 2 min au DMSO (diméthylsulfoxyde). Une heure avant la récolte des cellules, l'oestradiol (10-7M) est rajoutée. Les cellules sont lavées à deux reprises au PBS froid, puis récoltées dans le tampon de liaison (Tris-HC1 20 mM(pH 7.5), DTT 2mM, glycérol 20% (v/v) et KCl 0,4 M). Des extraits cellulaires totaux sont préparés en congelant les cellules à -80"C puis en les réchauffant sur la glace. Ceci est suivi par une centrifugation à 10000g pendant 15 min à 0 C dans une centrifugeuse Sigma. Le surnageant est conservé à -800C.
Le ER a été aussi exprimé dans les cellules SF9 en utilisant le kit pBlueBac-liis baculovirus expression system" acheté chez Invitrogen.
Le ER a été préparé grâce au kit de transcription et de traduction in vitro dans un système de réticulocytes (TNT -Promega). Brièvement, 4 ug de vecteur d'expression du ER est incubé avec le lysat TNT, la RNA polymérase T7, le mélange d'acides aminés (1 mM), et la RNAsine (40 UI). La réaction est incubée durant deux heures à 30"C.
7) Expériences de retardement sur gel (EMSA)
Les oligonucléotides sont hybridés puis radiomarqués en utilisant le fragment Klenow de l'ADN polymérase I. Les tests sont réalisés comme décrit par Cao et al., 1993. Les réactions de liaison ont été réalisées dans un tampon de liaison (Tris-HCI 20 mM (pH 7.8), dithiothreitol 1 mM, EDTA1 mM, glycérol 10 % (vol/vol), albumine bovine 3 ug/, ul, NaCI 100 mM), 0,3 ng d'ADN radiomarqué et 1 g de dIdC. Dans le cas des extraits de baculovirus enrichis en ER, le Nonidet P40 (Sigma) 0.1 % est ajouté à la réaction dans le but de minimiser la liaison de protéines accessoires au ER. Finalement, le ER est ajouté aux concentrations indiquées dans les figures des légendes. Trente minutes après l'incubation à température ambiante, le mélange réactionnel est déposé sur un gel d'électrophorèse constitué de polyacrylamide 6% (acrylamide/bisacrylamide, 29:1) et de TBE 0,25 X, préchauffé (100 V/12 cm, 30 min); la migration se poursuit durant 90 min (200 V/12 cm). Le gel est ensuite séché puis mis à exposer avec un film. L'anticorps monoclonal, H222, est incubé avec le récepteur durant la réaction de liaison. L'étude densitométrique est réalisée grâce au logiciel NIH Image.
8) Expérience d'interférence par méthylation:
L'expérience est réalisée comme décrit par Truss et al., 1991. Brièvement, les oligonucléotides marqués à la T4 polynucléotide kinase sont traités au diméthyl sulfate (DMS). L'ADN méthylé est ensuite ajouté à 15 l de ER recombinant purifié (acheté chez PanVera). Le mélange réactionnel est ensuite déposé sur un gel d'électrophorèse composé d'acrylamide 6%. Après l'autoradiographie, les bandes intéressantes sont excisées puis mises à éluer
durant la nuit à 370C dans 500 yI de tampon (Tris-EDTA, NaCl 1 ,5M). Après
lavage au phénol et au chloroforme et précipitation à l'éthanol, l'ADN est clivé
par la pipéridine puis déposé sur un gel dénaturant de polyacrylamide 10%-urée
8M. Le gel est ensuite séché puis autoradiographié.
9) Calcul du rapport de coopérativité:
Les équations décrites par Martinez et al (22) ont été adaptées pour la
séquence over ERE. Le modèle suivant pour l'interaction du ER avec la
séquence over ERE est proposé
Figure img00200001
les complexes II et complexes IV sont formés respectivement par le dimère et le tétramère de ER liés à la séquence ovERE
(ovERE) (ER2) (ovERE) (ER2) 2 (ovERE) (ER2)
KdII = = =
(IIA) (IIB) (II)
comme la séquence ovERE est formée de deux ERE identiques:
(IIA)=(IIB)=1/2 (II)
(11) (ER2)
KdIV =
2 (IV)
KdII 4 (ovERE) (IV)
Rapport de coopérativité=
KdIV 2
La radioactivité contenue dans les complexes IV et II est déterminée en coupant les bandes correspondantes et en les comptant grâce à un compteur à scintillation.
11) RESULTATS
1) Liaison du ER à la séquence over ERE
Une nouvelle séquence d'ADN, appelée over ERE, formée de deux ERE chevauchants, a été mise au point . Ce chevauchement a été possible car le ERE est formé de deux demi-sites séparés par 3 pb. Ces trois nucléotides ont été transformés de manière à créer deux ERE chevauchants identiques.
Dans le but de déterminer si cette séquence lie le ER, des expériences de retardement sur gel ont été effectuées en utilisant les séquences ERE et over
ERE. Dans ces expériences, des extraits de cellules infectées par baculovirus enrichis en ER et purifiés sur une colonne de DEAE-dextran, ont été utilisées.
Dans le cas de la séquence ERE, deux bandes sont observées; ces bandes correspondent probablement à des états de protéolyse différents de la forme dimérique du ER. Dans le cas de la séquence over ERE, trois bandes sont observées : les bandes 1 et 2 sont identiques à celles observées pour le ERE.
Cependant une troisième bande majoritaire, migrant plus lentement, est observée uniquement pour la séquence over ERE. Ce complexe pourrait contenir des molécules additionnelles de ER. L'addition de l'anticorps H222, dirigé contre l'extrémité C terminale du ER, a causé un retardement supplémentaire des 3 bandes. Ces résultats montrent, donc, que la séquence over ERE lie le ER. La compétition avec un excès de 1000 fois de la séquence GRE n'a pas altérée la liaison du ER sur la séquence over ERE. Par contre, un excès de 1000 fois de la séquence ERE non radiomarquée a aboli la formation du complexe over ERE
ER. Ces résultats montrent que la liaison entre le ER et la séquence over ERE est spécifique. Des résultats similaires sont obtenus en utilisant des extraits ER purifiés.
Comme la séquence over ERE est composée de deux ERE, il est possible que le complexe migrant lentement, observé dans le cas du over ERE, serait formé de deux dimères de ER. Dans le but de savoir si les quatre demi-sites de la séquence over ERE sont occupés par le ER, des expériences d'interférence par méthylation ont été réalisées. L'ADN radiomarqué est partiellement méthylé suite à un traitement par le DMS; une liaison entre l'ADN et le ER est ensuite réalisée. Après retardement sur gel, le complexe migrant lentement est excisé du gel, puis l'ADN est clivé par la pipéridine. Finalement, 1'ADN résultant de la digestion est déposé sur un gel de séquence. Le G en position 2 de la séquence (AGGTC (A/G) ou le G sur le brin opposé du C en position 5 sont importants pour la formation du complexe ADN-ER. A l'opposé, les G situés à l'extérieur du demi-site ERE ne sont pas essentiels pour la liaison. Le G en position 3 a interféré partiellement. En conclusion, ces résultats montrent que chacun des 4 demi-sites de la séquence over ERE lient un monomère de ER; ceci traduit la liaison d'un tétramère de ER à la séquence over ERE.
2) Le ER se lie de manière coopérative à la séquence over ERE
La liaison coopérative du ER à la séquence over ERE a été démontrée grâce aux expériences de liaison entre la séquence over ERE radiomarquée et des quantités croissantes de ER. Le complexe migrant rapidement, correspondant au dimère de ER, apparaît dès les faibles concentrations de ER ajoutées (complexe II). Dès que la quantité de ER devient plus importante, le complexe migrant lentement (complexe IV) apparaît, puis devient progressivement le complexe majoritaire. Les quantités de complexes II et IV et d'ADN libre ont été déterminées grâce à la radioactivité présente dans chaque bande. La quantité d'ADN présente dans le complexe II augmente en premier, mais ne devient jamais supérieure à 20% de la radioactivité totale de l'ADN. A contrario, le complexe IV, présent à des concentrations supérieures, devient rapidement la forme prédominante de radioactivité. En utilisant ces résultats et les équations présentées dans les matériels et méthodes, les constantes de dissociation (Kd) des complexes II et IV, ont été déterminées. KdII est approximativement 15 fois plus élevé que KdIV. Ainsi, le second dimère se lie avec une meilleure affinité, si la séquence avoisinante est occupée par le premier dimère. Ces caractéristiques de liaison montrent que le ER se lie d'une manière coopérative à la séquence over ERE.
Dans le but de comparer les affinités apparentes de liaison du ER aux séquences ERE ou over ERE, des expériences de liaison par retardement sur gel entre la séquence over ERE radiomarquée et le ER ont été réalisées, lorsque des quantités croissantes de ERE ou de over ERE froids sont rajoutées. L'addition d'un excès d'oligonucléotide over ERE froid a empêché la formation du complexe avec une efficacité 3 fois supérieure à celle de l'oligonucléotide ERE.
3) Fonctionnalité de la séquence over ERE:
Il a ensuite été examiné si la séquence over ERE est fonctionnelle dans le contexte du promoteur AMTV. Ce promoteur dérive du promoteur MMTV mais il est délété du fragment -190/-88 sensible à l'induction par les glucocorticoïdes (Umesono et al., 1988). L'activité CAT des cellules transfectées par ce plasmide n'est pas régulée par l'oestradiol.
Les cellules HepG2 ont été cotransfectées avec des concentrations croissantes de vecteur d'expression du ER (0 ng à 100 ng), et soit par le plasmide AMTV-ERE-CAT, soit par le plasmide AMTV-(ERE)2-CAT contenant deux ERE en tandem, ou finalement par le plasmide AMTV-over ERE-CAT.
L'hormone, 17-ss Estradiol (10-7M), est ajoutée au milieu de culture 24 heures plus tard. L'activité transcriptionnelle du plasmide AMTV-ERE-CAT augmente puis atteint un plateau à 30 ng de ER transfecté. Dans le cas du plasmide AMTV-(ERE) 2-CAT, I'allure de la courbe est similaire au premier, cependant l'activité transcriptionnelle est deux fois supérieure au plasmide AMTV-ERE
CAT. Pour le plasmide AMTV-over ERE-CAT, I'activité transcriptionnelle est 3 à 4 fois supérieure à celle obtenue pour le plasmide AMTV-ERE-CAT. Ces résultats montrent que deux ERE liés en tandem ont une activité transcriptionnelle additive, alors que deux ERE chevauchants ont une activité transcriptionnelle synergique.
La possibilité que les éléments du promoteur AMTV-CAT contribuent aux propriétés du over ERE a été testée. Les séquences ERE et over ERE ont été sous-clonées en amont du promoteur différent, celui de la thymidine kinase (Tk). L'activité transcriptionnelle de la séquence over ERE est 4 à 5 fois supérieure à celle de la séquence ERE. Une fois de plus, ces résultats montrent une synergie fonctionnelle entre deux ERE chevauchants et ceci indépendamment du contexte du promoteur. Des résultats similaires ont été obtenus dans les cellules MCF-7.
Comme deux ERE chevauchants ont une activité transcriptionnelle synergique et deux ERE adjacents ont une activité additive, une nouvelle séquence a été construite, (over ERE)2, formée de deux over ERE adjacents, séparés par 21 pb (centre à centre). Les expériences de transfection transitoires ont montré que l'activité transcriptionnelle de la séquence (over ERE)2 est similaire à celle de la séquence over ERE. Ces résultats montrent qu'un tétramère de ER lié à la séquence over ERE est suffisant pour induire la transcription de manière optimale, au moins dans ces conditions.
4) Effet des xénoestrogènes
Le ER est activé par les oestrogènes ainsi que par de nombreux composés naturels ou chimiques ayant une activité oestrogéno-mimétique. Ces composés sont appelés xénoestrogènes. La réponse des promoteurs contenant les séquences
ERE et over ERE a été comparée à diverses classes de xénoestrogènes.
Le rouge de phénol, un colorant connu mimant l'effet des oestrogènes, a été ajouté, à différentes concentrations, aux cellules HepG2 transfectées soit par le plasmide ERE soit par le plasmide over ERE. L'activité transcriptionnelle de la séquence over ERE est 4 à 5 fois plus élevée que celle de la séquence over
ERE, et ceci pour les mêmes concentrations de rouge de phénol ajoutée. En conséquence, en utilisant la séquence ERE, on peut détecter l'effet du rouge de phénol à une concentration de 10-4 M, alors que la séquence over ERE nous permet de détecter l'activité oestrogénique de ce composé à une concentration plus faible (10-6M).
L'activité oestrogénique d'un composé formé de deux noyaux phénoliques polychlorinés (Chlordane) a été testée en utilisant le même test que celui décrit pour le rouge de phénol. Le chlordane a activé la transcription du plasmide
ERE-CAT à une concentration de 10-5 M. A l'opposé, on peut détecter l'activité oestrogénique de cette molécule à une concentration de 10-7 M grâce au plasmide over ERE-CAT. Dans ce cas aussi l'activité transcriptionnelle de la séquence over ERE est très synergique.
Donc, I'activation synergique de la transcription de la séquence over ERE est observée dans le cas de l'hormone naturelle et des composés chimiques ayant une activité oestrogénique.
5) Effet des antioestrogènes
L'activité basale du plasmide AMTV-over ERE-CAT est plus élevée que celles des plasmides AMTV-(ERE)2-CAT et AMTV-ERE-CAT. Ces différences d'activités basales pourraient être dues soit aux propriétés intrinsèques de ces promoteurs, soit à une stimulation endogène du ER par des composés ayant une activité cestrogénomimétique. Dans le but de tester la deuxième hypothèse, les cellules HepG2 ont été transfectées par l'un de ces trois plasmides sus-cités puis incubées soit avec l'oestradiol soit avec un antagoniste du ER le ICI168134 soit avec les deux. Comme prévu, le ICI168134 a fortement inhibé l'induction par l'oesradiol, mais ce composé a aussi bien inhibé l'activité basale de ces trois constructions. Ces résultats montrent que l'activité basale élevée du over ERE serait due à une stimulation endogène du ER.
6) Les domaines A/B et E sont responsables de la liaison coopérative du ER à la séquence over ERE:
La liaison coopérative du ER à la séquence over ERE serait due soit à une propriété intrinsèque à la séquence over ERE, soit à des domaines spécifique du
ER. Dans le but de tester la deuxième hypothèse, des récepteurs à l'oestradiol tronqués ont été utilisés. Des extraits cellulaires de cellules CMT transfectées soit par l'un des vecteurs d'expression du ER tronqués soit par le ER sauvage sont incubés avec les séquences ERE ou over ERE radiomarquées. La migration du complexe contenant le dimère ERE a été déterminée grâce à la sonde ERE.
En utilisant la sonde over ERE, le ER sauvage (HE0) a formé un transactivation effectuée par la séquence over ERE est approximativement 5 fois plus élevée que celle effectuée par la séquence ERE. Dans le cas de HE19, l'activation de la transcription effectuée par la séquence over ERE est 2 à 3 fois supérieure à celle effectuée par le ERE. Donc le HE19 a perdu la faculté d'effectuer une activation transcriptionnelle synergique. HE15 et HE21 ont une activité transcriptionnelle très faible et ceci pour les deux séquences ERE ou over ERE. Ces résultats sont en accord avec les expériences de retardement sur gel, dans lesquelles HE0 et HE13 se lient d'une manière coopérative à la séquence over ERE. En conclusion, la liaison coopérative du récepteur à 'oestradiol à la séquence over ERE in vitro corrèle avec l'activation de la transcription synergique in vivo.
III) CONCLUSION
La capacité du récepteur à l'oestradîol de se lier à deux éléments de réponse à l'oestradiol chevauchants (over ERE), a été évaluée. La liaison et les propriétés fonctionnelles de la séquence over ERE, ont été étudiées. En plus du complexe dimérique, cette séquence lie spécifiquement un complexe de haut poids moléculaire reconnu par un anticorps dirigé contre le ER. La structure de la séquence over ERE (4 demi-sites) et la mobilité du complexe montrent que c'est un complexe formé d'un tétramère de ER lié à la séquence over ERE. Ceci est renforcé par plusieurs arguments. (i) Il est improbable que le complexe migrant lentement soit formé par des contaminations de protéines qui retarderaient le migration du complexe over ERE-ER, ceci car un profil identique de migration est observé pour différentes préparations de ER : ER préparé dans des cellules infectées par baculovirus, ER purifié trouvé sur le commerce, ER préparé par un système de transcription / traduction in vitro, et finalement des extraits cellulaires de cellules CMT transfectées par le ER. (ii)
Les expériences d'interférence par méthylation ont montré que les résidus G localisés dans les quatre demi-sites ERE sont totalement ou partiellement protégés. Cependant, les résidus G se situant à l'extérieur des demi-sites ERE n'ont pas été protégés par la liaison. Comme chaque demi-site ERE est occupé par un monomère de ER, la séquence over ERE lie un tétramère de ER.
La liaison du ER à la séquence over ERE est coopérative. La constante de dissociation (Kd) du complexe tétramérique (ER4-over ERE) est 5 à 15 fois plus faible que celle du complexe dimérique (ER2-over ERE), ceci dépend de l'extrait utilisé. Ces résultats montrent que la liaison du premier dimère facilite la liaison du second dimère, et ceci de part et d'autre de la double hélice d'ADN.
Deux mécanismes éventuels peuvent conduire à la coopérativité de liaison du ER à la séquence over ERE : (i) Des interactions entre les récepteurs pourraient stabiliser la formation du tétramère en augmentant l'affinité du second dimère. (ii) La liaison du premier dimère pourrait modifier la structure de l'ADN de façon à augmenter l'affinité du second dimère. L'utilisation de fragments de récepteurs a permis de préciser le mécanisme mis en jeu. La délétion du domaine A/B n'a pas empêché la formation du tétramère ER-over
ERE, mais ceci a altéré les cinétiques de liaison. A contrario, la délétion du domaine E a donné des résultats plus frappants. Dans ce cas, la formation du tétramère a été sévèrement altérée. Quand les deux domaines sont délétés, le récepteur conserve donc uniquement le domaine de liaison à l'ADN, la liaison du ER aux séquences over ERE ou ERE est identique, et ceci même à des concentrations élevées en ER. A l'opposé du récepteur sauvage, la liaison du domaine de liaison à l'ADN du ER empêche la liaison d'un second diamètre, le domaine E est donc critique. Ce domaine aiderait donc le complexe ADNrécepteur à se mettre dans une conformation qui lui permet de lier un second dimère de récepteur; ceci constitue donc un rôle supplémentaire du domaine E.
La courbure de 1'ADN suite à l'interaction avec le récepteur pourrait expliquer les observations mentionnées ci-dessus. D'ailleurs, la liaison d'un dimère du domaine de liaison à l'ADN du ER suffit pour induire une courbure de l'ADN (Nardulli et al., 1993; Schwabe et al., 1993). Ceci pourrait empêcher la liaison d'un dimère de domaine de liaison à l'ADN sur le site chevauchant.
L'addition du domaine E permet de vaincre cette inhibition, et le récepteur entier se lie de manière coopérative. Comme le domaine E interagit avec diverses protéines, la liaison coopérative pourrait être due à une interaction du type récepteur-récepteur.
La capacité de former un tétramère n'est pas une propriété unique du ER.
Un autre membre de la famille des récepteurs nucléaires, le GR, est capable de former un tétramère en interagissant avec des GREs chevauchants localisés dans le promoteur du gène de l'aspartate aminotransférase (Garlatti et al., 1994). La liaison du tétramère de GR à des éléments de réponse chevauchants semble être plus coopérative que dans le cas du ER. Ceci pourrait être du au fait que le GR ne courbe pas l'ADN à la suite de sa liaison (Luisi et al., 1991).
Les deux sites ERE chevauchants du over ERE ont une activité transcriptionnelle synergique. Les expériences de liaison par retardement sur gel, ainsi que les expériences de transfections réalisées sur le ER sauvage et délété, suggèrent que la liaison coopérative pourrait expliquer la synergie fonctionnelle observée ex vivo (Ptashne, 1986).
En conclusion, il est démontré ci-dessus que deux éléments de réponse à l'oestradiol peuvent lier d'une manière coopérative un tétramère de ER, ce qui conduit à une forte induction hormonale. La formation d'interaction entre deux dimères de récepteur lors de la liaison sur des éléments chevauchants, révèle une bonne flexibilité de la molécule de récepteur. Il est possible que de telles interactions soient mises en jeu entre récepteurs se liant à des demi sites parfaits, ou même à des demi-sites imparfaits, ces interactions pourraient stabiliser ce genre de complexe ADN-ER. Ceci expliquerait l'efficacité de ces séquences dans la régulation hormonale.
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Claims (17)

REVENDICATIONS
1. Utilisation de séquences nucléotidiques comprenant une ou plusieurs unités de réponse aux glucocorticoïdes, minéralocorticoïdes, androgènes et progestatifs (encore désignées GRU), et/ou une ou plusieurs unités de réponse aux oestrogènes (encore désignées ERU), lesdites unités étant telles qu'elles comprennent
- pour l'unité GRU : deux séquences nucléotidiques, encore désignées éléments de réponse aux glucocorticoïdes (ou éléments GRE), ces deux séquences nucléotidiques étant dérivées par modification d'un ou plusieurs nucléotides de l'élément de réponse GRE correspondant à la séquence d'ADN de formule suivante
5 GGTACA X1X2X3 TGTTCT 3
3, CCATGT X4X5X6 ACAAGA 5,
dans laquelle X1, X2, et X3, indépendamment les uns des autres, représentent un nucléotide quelconque, tandis que X4, X5, et X6, représentent un nucléotide capable de s'apparier avec X1, X2, et X3, respectivement,
- pour l'unité ERU : deux séquences nucléotidiques, encore désignées éléments de réponse aux oestrogènes (ou éléments ERE), ces deux séquences nucléotidiques étant dérivées par modification d'un ou plusieurs nucléotides de l'élément de réponse ERE correspondant à la séquence d'ADN de formule suivante
5 AGGTCA X1X2X3 TGACCT 3'
3, TCCACT X4X5X6 ACTGGA 5,
dans laquelle X1 à X6 ont la signification indiquée ci-dessus
lesdites unités de réponse étant caractérisées en ce que leurs deux éléments de réponse se chevauchent de telle façon que le centre de l'un de ces deux éléments est décalé d'une distance de 5 paires de bases par rapport au centre de l'autre de ces deux éléments,
pour la mise en oeuvre d'une méthode de détection in vitro de xénohormones, ou pour la préparation de médicaments destinés au traitement de pathologies associées à 1'activité des récepteurs aux glucocorticoïdes, minéralocorticoïdes, androgènes et progestatifs, et/ou des récepteurs aux oestrogènes.
- ou une succession d'au moins deux séquences nucléotidiques de formule (I) susmentionnée, chacune des séquences nucléotidiques de formule (I) étant espacées d'une distance comprise entre 10n et 11n paires de bases, centre à centre, n étant un nombre entier supérieur ou égal à 2.
Xa1 à Xg11, indépendamment les uns des autres, représentent un nucléotide quelconque ou dérivé, tandis que Xa2 à Xg2, représentent un nucléotide ou dérivé capable de s'apparier avec Xai à Xg1 respectivement,
les éléments de réponse GRE sont indiqués, sur l'un des brins d'ADN, en caractères gras et italiques,
dans laquelle
Xa2CA TGXb2 CXc2T Xd2CXe2 GGXf2 CAA GXg2 3' 5'
Xa1GT ACXb1 GXc1A Xd1GXe1 CCXf1 GTT CXg1
- la séquence nucléotidique de formule (I) suivante 5' 3'
.2. Utilisation de séquences nucléotidiques selon la revendication 1, lesdites séquences nucléotidiques étant caractérisées en ce qu'elles comprennent à titre d'unité GRU
3. Utilisation de séquences nucléotidiques selon la revendication 2, lesdites séquences nucléotidiques étant caractérisées en ce que
- Xa1, Xb1, Xf1, et Xg1, indépendamment les uns des autres, représentent un nucléotide quelconque ou dérivé, tandis que Xa2, Xb2, Xf2, et Xg2, représentent un nucléotide ou dérivé capable de s'apparier avec Xa1, Xb1, Xf1, et Xg i respectivement,
Xcl représente A ou T, tandis que Xc2 représente T ou A respectivement,
- Xdi représente A ou C, tandis que Xd2 représente T ou G respectivement,
- Xe1 représente A ou T, tandis que Xe2 représente T ou A respectivement.
4. Utilisation de séquences nucléotidiques selon l'une des revendications 1 à 3, lesdites séquences nucléotidiques étant caractérisées en ce qu'elles comprennent à titre d'unité GRU
- la séquence nucléotidique désignée "GRE A" suivante:
5 GGT ACA GAA AGA CCT GTT CT 3'
3' CCA TGT CTT TCT GGA CAA GA 5s
dans laquelle les éléments de réponse GRE sont indiqués, sur l'un des brins
d'ADN, en caractères gras, italiques, et soulignés,
- ou une succession d'au moins deux séquences nucléotidiques GRE A,
espacées d'une distance comprise entre 10n et lin paires de bases, centre à
centre, n étant un nombre entier supérieur ou égal à 2, notamment
la séquence (GRE A)2 suivante
5 CGT ACA GAA AGA CCT GTT CTXa GGT ACA GAA AGA CCT GTT CT 3'
3' CCA TGT CTT TCT GGA CAA GAXb CCA TGT CTT TCT GGA CAA GA 5'
dans laquelle Xa représente un nucléotide quelconque ou dérivé, et Xb
représente un nucléotide ou dérivé capable de s'apparier avec Xa, notamment
Xa représente C et Xb représente G,
la séquence (GRE A)4 suivante 5' GT ACA GAA AGA CCT GTT CTXa GGT ACA GAA AGA CCT GTT CT 3' 3' CCA TGT CTT TCT GGA CAA GAXb CCA TGT CTT TCT GGA CAA GA 5' 5 Xc CGT ACA GAA AGA CCT GTT CTXe GGT ACA GAA AGA CCT GTT CT 3' 3' XdCCA TGT CTT TCT GGA CAA GAXf CCA TGT CTT TCT GGA CAA GA 5'
dans laquelle Xa, Xc, et Xe, indépendamment les uns des autres, représentent
un nucléotide quelconque ou dérivé, tandis que Xb, Xd, et Xf, représentent un
nucléotide ou dérivé capable de s'apparier avec Xa, Xc, et Xe, respectivement,
notamment Xa, Xc, et Xe représentent C et Xa, Xc, et Xe représentent G.
5. Utilisation de séquences nucléotidiques selon l'une des revendications 1
à 3, lesdites séquences nucléotidiques étant caractérisées en ce qu'elles
comprennent à titre d'unité GRU
- L séquence nucléotidique désignée "GRE A up" suivante:
5' GGT ACA GTA CGT CCT GTT CT 3'
3' CCA TGT CAT GCA GGA CAA GA 5'
dans laquelle les éléments de réponse GRE sont indiqués, sur l'un des brins
d'ADN, en caractères gras, italiques, et soulignés,
- ou une succession d'au moins deux séquences nucléotidiques GRE A up,
espacées d'une distance comprise entre 10n et lin paires de bases, centre à
centre, n étant un nombre entier supérieur ou égal à 2, notamment
la séquence (GRE A up)2 suivante 5' GGT ACA GTA CCT CCT GTT CTXa GGT ACA GTA CGT CCT GTT CT 3' 3' CCA TGT CAT GCA GGA CAA GAXb CCA TGT CAT GCA GGA CAA GA 5'
dans laquelle Xa représente un nucléotide quelconque ou dérivé, et Xb
représente un nucléotide ou dérivé capable de s'apparier avec Xa, notamment
Xa représente C et Xb représente G,
la séquence (GRE A up)4 suivante 5' GGT ACA GTA CGT CCT GTT CTXa GGT ACA GTA CGT CCT GTT CT 3' 3' CCA TGT CAT GCA GGA CAA GAXb CCA TGT CAT GCA GGA CAA GA 5' 5' XCGGT ACA GTA CGT CCT GTT CTXe GGT ACA GTA CGT CCT GTT CT 3 3' XdCCA TGT CAT GCA GGA CAA GAXf CCA TGT CAT GCA GGA CAA GA 5
dans laquelle Xa, Xc, et Xe, indépendamment les uns des autres, représentent
un nucléotide quelconque ou dérivé, tandis que Xb, Xd, et Xf, représentent un
nucléotide ou dérivé capable de s'apparier avec Xa, Xc, et Xe, respectivement,
notamment Xa, Xc, et Xe représentent C et Xa, Xc, et Xe représentent G.
6. Utilisation de séquences nucléotidiques selon la revendication 1, lesdites
séquences nucléotidiques étant caractérisées en ce qu'elles comprennent à titre
d'unité ERU:
- la séquence nucléotidique de formule (II) suivante
5' 3'
Xa1GG TCXb1 GGT CGA CCXc1 GAC CXd1
Xa2CC AGXb2 CCA GCT GGXc2 CTG GXd2 3' 5'
dans laquelle
les éléments de réponse ERE sont indiqués, sur l'un des brins
d'ADN, en caractères gras et italiques,
. Xa1 à Xd1, indépendamment les uns des autres, représentent
un nucléotide quelconque ou dérivé, tandis que Xa2 à Xd2, représentent un
nucléotide ou dérivé capable de s'apparier avec Xai à Xdl respectivement,
- ou une succession d'au moins deux séquences nucléotidiques de formule
(II) susmentionnée, espacées d'une distance comprise entre 10n et lin paires de
bases, centre à centre, n étant un nombre entier supérieur ou égal à 2.
7. Utilisation de séquences nucléotidiques selon la revendication 6, lesdites
séquences nucléotidiques étant caractérisées en ce qu'elles comprennent à titre
d'unité ERU
- la séquence nucléotidique désignée "over ERE" suivante
5 AGG TCA GGT CGA CCT GAC CT 3
3' TCC AGT CCA GCT GGA CTG GA 5'
dans laquelle les éléments de réponse ERE sont indiqués, sur l'un des brins
d'ADN, en caractères gras, italiques et soulignés,
- ou une succession d'au moins deux séquences nucléotidiques over ERE,
espacées d'une distance comprise entre 10n et lin paires de bases, centre à
centre, n étant un nombre entier supérieur ou égal à 2, notamment
la séquence (over ERE)2 suivante
5' AGG TCA GGT CGA CCT GAC CTXa AGG TCA GGT CGA CCT GAC CT 3'
3' TCC AGT CCA GCT GGA CTG GAXb TCC AGT CCA GCT GGA CTG GA 5'
dans laquelle Xa représente un nucléotide quelconque ou dérivé, et Xb
représente un nucléotide ou dérivé capable de s'apparier avec Xa, notamment
Xa représente C et Xb représente G,
ia séquence (over ERE)4 suivante 5' AGG TCA GGT CGA CCT GAC CTXa AGG TCA GGT CGA CCT GAC CT 3' 3' TC AGT CCA GCT GGA CTG GAXb TCC AGT CCA GCT GGA CTG GA 5' 5' XcAGG TCA GGT CGA CCT GAC CTXe AGG TCA GGT CGA CCT GAC CT 3' 3' XdTCC AGT CCA GCT GGA CTG GAXf TCC AGT CCA GCT GGA CTG GA 5'
dans laquelle Xa, Xc, et Xe, indépendamment les uns des autres, représentent
un nucléotide quelconque ou dérivé, tandis que Xb, Xd, et Xf, représentent un
nucléotide ou dérivé capable de s'apparier avec Xa, Xc, et Xe, respectivement,
notamment Xa, Xc, et Xe représentent C et Xa, Xc, et Xe représentent G.
8. Séquence nucléotidique caractérisée en ce qu'elle comprend une
succession d'au moins deux séquences nucléotidiques GRE A telle que définie
dans la revendication 4, et/ou une succession d'au moins deux séquences
nucléotidiques GRE A up telle que définie dans la revendication 5.
9. Séquence nucléotidique caractérisée en ce qu'elle comprend à titre
d'unité ERU
- la séquence nucléotidique de formule (II) suivante
5' 3'
Xa1GG TCXb1 GGT CGA CCXc1 GAC CXd1
Xa2CC AGXb2 CCA GCT GGXc2 CTG GXd2 3' 5'
dans laquelle
les éléments de réponse ERE sont indiqués, sur l'un des brins
d'ADN, en caractères gras et italiques,
. Xa1 à Xdl, indépendamment les uns des autres, représentent
un nucléotide quelconque ou dérivé, tandis que Xa2 à Xd2, représentent un
nucléotide ou dérivé capable de s'apparier avec Xai à Xdl respectivement,
- ou une succession d'au moins deux séquences nucléotidiques de formule
(II) susmentionnée, espacées d'une distance comprise entre lOn et lin paires de
bases, centre à centre, n étant un nombre entier supérieur ou égal à 2.
10. Séquence nucléotidique selon la revendication 9, caractérisée en ce
qu'elle comprend à titre d'unité ERU
- la séquence nucléotidique over ERE suivante:
5' AGG TCA GGT CGA CCT GAC CT 3'
3' TCC AGT CCA GCT GGA CTG GA 5,
dans laquelle les éléments de réponse ERE sont indiqués, sur l'un des brins
d'ADN, en caractères gras, italiques et soulignés,
- ou une succession d'au moins deux séquences nucléotidiques over ERE,
espacées d'une distance comprise entre lOn et lin paires de bases, centre à
centre, n étant un nombre entier supérieur ou égal à 2, notamment
la séquence (over ERE)2 suivante 5 AGG TCA GGT CGA CCT GAC CTXa AGG TCA GGT CGA CCT GAC CT 3' 3' TCC AGT CCA GCT GGA CTG GAXb TCC AGT CCA GCT GGA CTG GA 5'
dans laquelle Xa représente un nucléotide quelconque ou dérivé, et Xb
représente un nucléotide ou dérivé capable de s'apparier avec Xa, notamment
Xa représente C et Xb représente G,
la séquence (over ERE)4 suivante 5' AGG TCA GGT CGA CCT GAC CTXa AGG TCA GGT CGA CCT GAC CT 3' 3' TCC AGT CCA GCT GGA CTG GAXb TCC AGT CCA GCT GGA CTG GA 5' 5' XcAGG TCA GGT CGA CCT GAC CTXe AGG TCA GGT CGA CCT GAC CT 3' 3, XdTCC AGT CCA CCT GGA CTG GAXf TCC AGT CCA CCT GGA CTG GA gr
dans laquelle Xa, Xc, et Xe, indépendamment les uns des autres, représentent
un nucléotide quelconque ou dérivé, tandis que Xb, Xd, et Xf, représentent un
nucléotide ou dérivé capable de s'apparier avec Xa, Xc, et Xe, respectivement,
notamment Xa, Xc, et Xe représentent C et Xa, Xc, et Xe représentent G.
11. Séquence nucléotidique selon la revendication 9 ou 10, caractérisée en
ce qu'elle comprend une ou plusieurs unités GRU définies dans l'une des
revendications 1 à 5.
12. Séquence nucléotidique selon l'une des revendications 9 à 11,
caractérisée en ce que la ou les unités ERU, et, le cas échéant la ou les unités
GRU, sont situées en amont d'un promoteur contrôlant la transcription d'un
gène rapporteur.
13. Vecteur, notamment plasmide, caractérisé en ce qu'il comprend une
séquence nucléotidique selon l'une des revendications 9 à 12.
14. Cellule humaine ou animale transformée par un vecteur selon la
revendication 13.
15. Méthode de détection in vitro de xénohormones susceptibles
d'interagir avec des récepteurs aux glucocorticoïdes, des minéralocorticoïdes,
des androgènes et de la progestérone, et/ou des récepteurs aux oestrogènes dans
l'organisme humain, caractérisée en ce qu'elle comprend la mise en culture
respectivement de cellules humaines ou animales transformées par un vecteur
comprenant au moins une unité GRU définie dans l'une des revendications 1 à 5, et/ou de cellules humaines ou animales selon la revendication 14, dans un milieu de culture en présence d'un échantillon biologique susceptible de contenir lesdites xénohormones,
- la détection de la présence du polypeptide codé par ledit gène rapporteur dans lesdites cellules ou le milieu de culture de ces dernières, notamment par colorimétrie dans le cas où le polypeptide codé par le gène rapporteur réagit avec son substrat dans le cadre d'une réaction colorée, ou par fluorimétrie dans le cas où le polypeptide codé par le gène rapporteur est fluorescent, ou susceptible d'être reconnu par une molécule fluorescente, ou encore par une méthode radioactive.
16. Vecteur pour la thérapie génique caractérisé en ce qu'il comprend au moins une unité GRU définie dans l'une des revendications 1 à 5, et/ou au moins une unité ERU définie dans l'une des revendications 1, 6 et 7.
17. Composition pharmaceutique caractérisée en ce qu'elle comprend, en association avec un véhicule physiologiquement acceptable, au moins une unité
GRU définie dans l'une des revendications 1 à 5, et/ou au moins une unité ERU définie dans l'une des revendications 1, 6 et 7, lesdites unités étant le cas échéant précédées et suivies par une succession d'au moins environ 5 nucléotides ou dérivés, ou un vecteur selon la revendication 16.
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