DE69738072T2 - Modifizierte steroid-hormon rezeptoren - Google Patents

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Description

  • Diese Erfindung betrifft Gentherapie, bei der modifizierte Steroidrezeptoren die Expression von Genen in Gewebe regulieren. Insbesondere enthalten die modifizierten Steroidrezeptoren eine DNA-Bindungsdomäne, eine oder mehrere Transregulationsdomänen und eine Ligandenbindungsdomäne und können einen nicht natürlichen Liganden binden.
  • Allgemeiner Stand der Technik
  • Die folgende Beschreibung des Hintergrunds der Erfindung wird bereitgestellt, um beim Verständnis der Erfindung zu helfen, es wird jedoch nicht eingeräumt, dass er den Stand der Technik im Hinblick auf die Erfindung beschreibt oder diesen darstellt.
  • Intrazelluläre Rezeptoren sind eine Superfamilie verwandter Proteine, die die nuklearen Effekte von Steroidhormonen, Schilddrüsenhormon und Vitaminen A und D vermitteln (Evans, Science 240:889-895 (1988)). Das Vorliegen eines spezifischen intrazellulären Rezeptors in der Zelle definiert diese Zelle als ein Ziel für das zugehörige Hormon. Die Mechanismen der Aktion der intrazellulären Rezeptoren sind insofern verwandt, das sie in dem Zytoplasma oder den Kernen von Zielzellen latent bleiben, bis sie einem spezifischen Liganden ausgesetzt werden (Beato, Cell 56:335-344 (1989); O'Malley et al., Biol. Reprod. 46:163-167 (1992)). Eine Interaktion mit Hormon induziert dann eine Kaskade molekularer Ereignisse, was schließlich zu der spezifischen Assoziation des aktivierten Rezeptors mit anderen Proteinen oder regulatorischen Elementen von Zielgenen führt. Die resultierenden positiven oder negativen Auswirkungen auf die Regulation der Gentranskription werden von dem Zelltyp und dem Promotorkontext des Zielgens bestimmt.
  • Im Fall von Steroidhormonen und Steroidrezeptoren zeichnen solche Komplexe für die Regulation komplexer zellulärer Ereignisse verantwortlich, einschließlich der Aktivierung oder Repression der Gentranskription. Zum Beispiel zeichnen die Eierstockhormone Östrogen und Progesteron zum Teil für die Regulation komplexer zellulärer Ereignisse verantwortlich, die mit der Differenzierung, dem Wachstum und dem Funktionieren weiblicher Fortpflanzungsgewebe assoziiert werden. Ebenso zeichnet Testosteron für die Regulation komplexer zellulärer Ereignisse verantwortlich, die mit der Differenzierung, dem Wachstum und der Funktion männlicher Fortpflanzungsgewebe assoziiert werden.
  • Darüber hinaus spielen diese Hormone wichtige Rollen in der Entwicklung und Progression von Malignitäten des reproduktiven endokrinen Systems. Die Reprodukionssteroide Östrogen, Testosteron und Progesteron werden bei einer Vielfalt hormonabhängiger Krebsarten der Brust (Sunderland et al., J. Clin. Oncol. 9:1283-1297 (1991)), des Eierstocks (Rao et al., Endocr. Rev. 12:14-26 (1991)), des Endometriums (Dreicer et al., Cancer Investigation 10:27-41 (1992)) und möglicherweise der Prostata (Daneshgari et al, Cancer 71:1089-1087 (1993)) impliziert. Darüber hinaus hängt das Einsetzen postmenopausaler Osteoporose mit einem Rückgang der Produktion von Östrogen zusammen (Barzel, Am. J. Med. 85:847-850 (1988)).
  • Darüber hinaus sind Kortikosteroide potente und wohl dokumentierte Mediatoren von Entzündung und Immunität. Sie üben tief greifende Auswirkungen auf die Produktion und Freisetzung zahlreicher humoraler Faktoren und die Verteilung und Vermehrung verschiedener Zellbestandteile, die mit den Immunantworten und Entzündungsreaktionen assoziiert werden, aus. Zum Beispiel können Steroide die Produktion und Freisetzung von Cytokinen (IL-1, IL-2, IL-3, IL-6, IL-8, TNF-α, IFN-γ), chemischen Mediatoren (Eicosanoide, Histamin) und Enzymen (MMPS) in Gewebe inhibieren und die Aktivierung von Makrophagen und Endothelzellen direkt verhindern. Aufgrund der umfassenden Herunterregulation dieser physiologischen Ereignisse weisen Kortikosteroide einen Nettoeffekt des Supprimierens der Entzündungsreaktion auf und sind daher weitgehend dazu verwendet worden, eine Vielfalt immunologischer und Entzündungserkrankungen (rheumatoide Arthritis, Psoriasis, Asthma, allergische Rhinitis usw.) zu behandeln.
  • Außer den therapeutischen Nutzen gibt es jedoch einige schwerwiegende toxische Nebenwirkungen, die mit der Steroidtherapie assoziiert werden. Zu diesen zählen Magen- und Zwölffingerdarmgeschwüre, Muskelatrophie, Hypertonie, Osteoporose, Kopfschmerzen usw. Solche Nebenwirkungen haben die Nutzung von Steroiden als Therapeutika behindert.
  • Im Allgemeinen wird die biologische Aktivität von Steroidhormonen direkt von einem hormon- und gewebespezifischen intrazellulären Rezeptor vermittelt. Liganden werden von dem Hämolymphsystem durch den Körper verteilt. Das Hormon verbreitet sich ungehindert über alle Membranen, offenbart seine biologische Aktivität jedoch nur in jenen Zellen, die den gewebespezifischen intrazellulären Rezeptor enthalten.
  • Bei Fehlen des Liganden werden die inaktiven Steroidhormonrezeptoren, wie die Glukokortikoid-(„GR"-), Mineralokortikoid-(„MR"-), Androgen-(„AR"-), Progesteron-(„PR"-) und Östrogenrezeptoren („ER"), in einem großen Komplex abgesondert, der aus dem Rezeptor, den Hitzeschockproteinen („hsp") 90, hsp70 und hsp56 und auch anderen Proteinen besteht (Smith et al., Mol. Endo. 7:4-11 (1993)). Von der zellulären Lokalisierung der physiologisch inaktiven Form des oligomeren Komplexes wurde gezeigt, dass sie entweder zytoplasmatisch oder nukleär ist (Picard et al., Cell Regul. 1:291-299 (1992); Simmons et al., I Biol. Chem. 265:20123-20130 (1990)).
  • Beim Binden seines Agonisten- oder Antagonistenliganden ändert der Rezeptor seine Konformation und dissoziiert von dem inhibitorischen heteromeren Komplex (Allan et al., J. Biol. Chem. 267:19513-19520 (1992); Allan et al., P.N.A.S. 89:11750-11754 (1992)). Im Fall von GR und anderen verwandten Systemen wie AR, MR und PR löst die Hormonbindung eine Dissoziation von Hitzeschock- und anderen Proteinen und die Freisetzung eines monomeren Rezeptors von dem Komplex aus (O'Malley et al., Biol. Reprod. 46:163-167 (1992)). Studien von Genanalyse- und In-vitro-Proteaseverdau-Versuchen zeigen, dass Konformationsänderungen der Rezeptorstruktur, die von Agonisten induziert werden, den von Antagonisten induzierten ähnlich sind, sich jedoch von diesen unterscheiden (Allan et al., J. Biol. Chem. 267:19513-19520 (1992); Allan et al., P.N.A.S. 89:11750-11754 (1992); Vegeto et al., Cell 69:703-713 (1992)). Beide Konformationen sind jedoch mit hsp-Bindung inkompatibel.
  • Nach den Konformationsänderungen der Rezeptorstruktur können die Rezeptoren mit DNA interagieren. Studien legen nahe, dass die DNA-Bindungsform des Rezeptors ein Dimer ist. Im Fall von GR-Homodimeren (Tsai et al., Cell 55:361-369 (1988)) ermöglicht dies dem Rezeptor, an spezifische DNA-Stellen in der Regulationsregion von Zielgenpromotoren zu binden (Beato, Cell 56:335-344 (1989)). Diese kurzen Nukleotidabschnitte sind als palindromartige, invertierte oder wiederholte Wiederholungen (id.) angeordnet. Die Spezifität wird mittels der Sequenz und des Abstands der wiederholten Sequenzen ermittelt (Tsai und O'Malley, Ann. Rev. Biocliem. 63:451-486 (1994)). Nach Bindung des Rezeptors an DNA zeichnet das Hormon für das Vermitteln einer zweiten Funktion verantwortlich, die dem Rezeptor ermöglicht, spezifisch mit dem Transkriptionsapparat zu interagieren. Eine solche Interaktion könnte für entweder eine positive oder eine negative Regulation der Genexpression sorgen, d. h. Steroidrezeptoren sind ligandenbindende Transkriptionsfaktoren, die nicht nur die Expression spezifischer Gene aktivieren, sondern diese auch reprimieren können. Studien haben jedoch gezeigt, dass Repression keine DNA-Bindung erfordert.
  • Zum Beispiel können Kortikosteroide, wenn sie an ihre intrazellulären Rezeptoren gebunden sind, sich auf die Transkription einer Vielfalt von Genen auswirken, deren Produkte Schlüsselrollen in der Etablierung und Progression einer Entzündungssituation spielen. Zu solchen Genen zählen jene, die für Cytokine, chemische Mediatoren und Enzyme kodieren. Die Transkription dieser Gene kann in Abhängigkeit von den Transkriptionsfaktoren und/oder Regulationssequenzen, die die Expression des Gens steuern, reprimiert oder aktiviert werden. Gegenwärtig gibt es zahlreiche Berichte, die die Auswirkung von Glukokortikoid auf die Expression verschiedener Gene auf Transkriptionsebene dokumentieren.
  • Insbesondere ist der Glukokortikoidrezeptor ein Mitglied einer Familie ligandenabhängiger Transkriptionsfaktoren, die zu sowohl einer positiven als auch einer negativen Regulation der Genexpression im Stande sind (Beato, FASER J. 5:2044-2051 (1991); Pfahl, Endocr. Rev. 14:651-658 (1993); Schule et al., Trends Genet. 7:377-381 (1991)). In seiner inaktivierten Form ist der GR Teil eines großen heteromeren Komplexes, der hsp90 sowie andere Proteine (Denis et al., J. Biol. Chem. 262:11803-11806 (1987); Howard et al., J. Biol. Chem. 263:3474-3481 (1988); Mendel et al., J. Biol. Chem. 261:3758-3763 (1986); Rexin et al., J. Biol. Chem. 267:9619-9621 (1992); Sanchez et al., J. Biol. Chem. 260:12398-12401 (1985)) und hsp56 (Lebea et al., J. Biol. Chem. 267:4281-4284 (1992); Pratt, J. Steroid Biochem. Mol. Biol. 46:269-279 (1993); Sanchez, J. Biol. Chem. 265:22067-22070 (1990); Yem, J. Biol Chem. 267:2868-2871 (1992)) enthält. Die Bindung von Agonist stimuliert die Aktivierung, Dissoziation von hsp90 und den anderen Proteinen (Denis et al., Nature 333:686-688 (1988); Sanchez et al., J. Biol. Chem. 262:6986-6991 (1987)) und nukleäre Translokation des Rezeptors, Voraussetzungen für sowohl Transaktivierung als auch Transrepression.
  • Die Klonierung mehrerer Mitglieder der Steroidrezeptor-Superfamilie hat die Rekonstitution hormonabhängiger Transkription in heterologen Zellsystemen erleichtert und die Abgrenzung der GR-Aktivierungs- und -Repressionsmechanismen erleichtert. Anschließend haben in-vivo- und In-vitro-Studien mit mutierten und chimären Rezeptoren demonstriert, dass Steroidhormonrezeptoren modulare Proteine sind, die in strukturell und funktionell definierten Domänen organisiert sind. Deletionsmutanten des GR haben ermittelt, dass die Transaktivierungsdomäne sich an der N-terminalen Aminosäuresequenz befindet, die zwischen den Aminosäuren 272 und 400 positioniert ist (Jonat et al., Cell 62:1189-1204 (1990)). Eine wohl definierte DNA-Bindungsdomäne („DBD") mit 66 Aminosäuren wurde identifiziert und im Detail studiert, wobei sowohl genetische als auch biochemische Ansätze angewendet wurden (Lucibello et al., EMBO J. 9:2827-2834 (1990)). Die Liganden- oder Hormonbindungsdomäne („LBD"), die sich in dem carboxyterminalen Abschnitt des Rezeptors befindet, besteht aus etwa 300 Aminosäuren (Kerppola et al., Mol. Cell. Biol. 13:3782-3791 (1993)). Die LBD war mr eine detaillierte ortsgerichtete Mutagenese nicht zugänglich, da diese Domäne sich zu einer komplexen tertiären Struktur zu falten scheint, wobei eine spezifische hydrophobe Tasche erzeugt wird, die bei Bindung den Effektorliganden umgibt. Dieses Merkmal verursacht Schwierigkeiten beim Unterscheiden zwischen Aminosäureresten, die sich auf die Gesamtstruktur der LBD-Domäne auswirken, von jenen, die an einem direkten Kontakt mit dem Liganden beteiligt sind. Die LBD enthält auch Sequenzen, die für die Rezeptordimerisation, nukleare Lokalisierung, hsp-Interaktionen und Transaktivierungssequenzen des Rezeptors verantwortlich zeichnen (Fuller et al., FASEB J. 5:3092-3099 (1991)).
  • Der Mechanismus der Genaktivierung wird im Allgemeinen besser als der der Repression verstanden. Zur Transaktivierung ist eine ligandeninduzierte Konformationsänderung, die mit der vergleichbar ist, von der gefolgert wird, dass sie zur Aktivierung der Progesteron-(Allan et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:11750-11754 (1992)) und Östrogenrezeptoren (Beekman et al., Mol. Endocrinol. 7:1266-1274 (1993) erforderlich ist, zur effizienten Aktivierung der Transkriptionsaktivierungsfunktion des Rezeptors erforderlich (Rollenberg und Evans, Cell 55:899-906 (1988); Webster et al., Cell 54:199-207 (1988)). Des Weiteren ist die Konformationsänderung zur Interaktion des Rezeptors mit anderen Komponenten des Transkriptionsapparats erforderlich. Die Transaktivierung wird von einem Rezeptordimer vermittelt, das an ein Glukokortikoid-Response-Element („GRE") gebunden ist. Eine solche Transaktivierung findet ausschließlich mittels Homodimerisation statt. Dies wird hauptsächlich durch eine Region im zweiten Zinkfinger des Rezeptors erzielt, die als die D-Loop bekannt ist (Umesono et al., Cell 57:1139-1146 (1989); Dahlman-Wright et al., J. Biol. Chem. 266:3107-3112 (1991)). Die resultierenden Homodimere binden dann an das palindromartige GRE, um den Transkriptionsaktivierungsvorgang zu initiieren (Evans, Science 240:889-895 (1988); Cato et al., J. Steroid Biochem. Mol. Biol. 43:63-68 (1992)).
  • Transrepression andererseits scheint von der monomeren Form des Rezeptors durch Interaktionen mit anderen Transkriptionsfaktoren vermittelt zu werden, einschließlich AP-1 und NFK-B, was sie daran hindert, ihre Funktion als Transkriptionsaktivatoren auszuführen (Hoeck et al., EMBO J. 13:4087-4095 (1994)). Studien zeigen auch eine Transrepression durch die dimere Form des Rezeptors. Im Fall des monomeren Wegs legen Studien nahe, dass AP-1 eine hormonabhängige Aktivierung GR-regulierter Promotoren durch einen gegenseitig inaktiven Komplex verhindert, der entweder durch eine direkte Protein-Protein-Interaktion des Rezeptors und AP-1 oder durch einen dritten Partner gebildet wird (Miner et al., Cell Growth Differ. 2:525-530 (1991); Pfahl, Endocrine Rev. 14:651-658 (1993)). Eine solche Transrepression von AP-1 und NFK-B, die von der monomeren Form des Rezeptors vermittelt wird, hängt von dem Vorliegen der DNA-Bindungsdomäne ab. Sie hängt nicht von der Fähigkeit des Rezeptors ab, DNA zu binden. Im Fall der dimeren Form des Rezeptors legen mehrere Studien nahe, dass Mechanismen für eine solche GR-vermittelte Transrepression GR-Bindung an eine Sequenz beinhalten, die ein cis-agierendes Element für einen anderen trans-agierenden Faktor überlappen, wodurch dieses von seinem zugehörigen Element verschoben wird oder seine Bindung an sein zugehöriges Element verhindert wird (Akerblom et al., Science 241:350-353 (1988); Drouin et al., Mol. Cell. Biol. 9:5305-5314 (1989); Oro et al., Cell 55:1109-1114 (1988); Stromstedt et al., Mol. Cell. Biol. 11:3379-3383 (1991)).
  • Wie oben angemerkt, resultierte die GR-vermittelte Transrepression, die auf direkte oder indirekte Interaktion des GR mit anderen trans-agierenden Faktoren zurückzuführen war, in der Inhibition ihrer Aktivität und/oder Fähigkeit, DNA zu binden (Celada et al., J. Exp. Med. 177:691-698 (1993); Diamond et al., Science 249:1266-1272 (1990); Gauthier et al., Embo J. 12:5089-5096 (1993); Jonat et al., Cell 62:1189-1204 (1990); Kutoh et al., Mol. Cell. Biol. 12:4955-4969 (1992); Lucibello et al., Embo J. 9:2827-2834 (1990); Ray et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:752-756 (1994); Schule et al., Cell 62:1217-1226 (1990); Teerberg et al., J. Biol. Chem. 267:17567-17573 (1992); Yang-Yen et al., Cell 62:1205-1215 (1990); Lucibello et al., EMBO J. 9:2827-2834 (1990)). Diese Modelle erfordern eine Ligandenbindung, um die Aktivierung, Dissoziation von hsp90 und nukleare Translokation des Rezeptors zu stimulieren. Es ist nicht klar, ob diese Mechanismen von derselben ligandeninduzierten Konformationsänderung abhangen, die für die Transaktivierung erforderlich ist. Eine nicht zur Transaktivierung fähige Mutante reprimiert jedoch den AP-1-abhängigen Promotor, was nahe legt, dass die Transaktivierungsfunktion des Rezeptors für die Repression der AP-1-Aktivität nicht erforderlich ist (Yang-Yen et al., Cell 62:1205-1215 (1990)). Des Weiteren legen ähnliche Studien außerdem nahe, dass die Transaktivierungsfunktion des Rezeptors für die Repression der NFK-B-Aktivität nicht erforderlich ist.
  • In Versuchen, den Transrepressionsmechanismus zu entschlüsseln, haben Studien die Rolle des gebundenen Liganden an der GR-vermittelten Repression von auf AP-1 reagierenden Genen, die ein Tetradecanoylphorbolacetat-Response-Element („TPA"-Response-Element) enthielten, untersucht. Von der Repression dieser Gene wurde vorgeschlagen, dass sie das Ergebnis der direkten Interaktion des GR mit c-Jun (Diamond et al., Science 249:1266-1272 (1990); Lucibello et al., EMBO J. 9:2827-2834 (1990); Schule et al., Cell 62:1217-1226 (1990); Touray et al., Oncogene 6:1227-1234 (1991); Yang-Yen et al., Cell 62:1205-1215 (1990)) oder c-Fos (Kerppola et al., Mol. Cell. Biol. 12:3782-3791 (1992)), bei denen es sich um Bestandteile des AP-1-Transkriptionskomplexes handelt. Die GR-DNA-Bindungsdomäne ist für diese Interaktion erforderlich, da die meisten Mutationen in dieser Domäne im Verlust der Repressoraktivität in vivo resultierten (Diamond et al., Science 249:1266-1272 (1990); Jonat et al., Cell 62:1189-1204 (1990); Lucibello et al., EMBO J. 9:2827-2834 (1990); Schule et al., Cell 62:1217-1226 (1990); Yang-Yen et al., Cell 62:1205-1215 (1990)).
  • Die DNA-Bindungsdomäne ist ebenfalls zur Inhibition von In-vitro-Transkription aus dem Kollagenasepromotor und Inhibition von Jun-Fos-Heterodimer-Bindung an das Kollagenase-TPA-Response-Element erforderlich (Mordacq et al., Genes Dev. 3:760-769 (1989)). Die Deletion oder Verkürzung der Ligandenbindungsdomäne resultiert ebenfalls in einem erheblichen Verlust der Repressoraktivität (Jonat et al., Cell 62:1189-1204 (1990); Schule et al., Cell 62:1217-1226 (1990); Yang-Yen et al., Cell 62:1205-1215 (1990)), was nahe legt, dass die Ligandenbindungsdomäne zur Inhibition der AP-1-Aktivität beitragen oder diese modulieren kann.
  • Weitere Studien, die die Rolle des Liganden bei der GR-vermittelten Transrepression des Kollagenasepromotors untersuchten, stellten eine effiziente rezeptorvermittelte Transrepression mit einem ligandenfreien mutierten GR fest, bei der der erste Cysteinrest des proximalen Zinkfingers durch Tyrosin ersetzt wurde (Liu et al., Mol. Cell. Bio. 15:1005-1013 (1995)). Solche Studien legen nahe, dass weder die Zurückhaltung des Liganden noch die direkte Bindung des Rezeptors an DNA erforderlich ist, d. h. diese Transrepression der AP-1-Aktivität durch GR ist vom Liganden unabhängig.
  • Die Expression der meisten Säugergene wird in vivo als Reaktion auf eine große Auswahl von Stimuli, einschließlich physikalischer (Druck, Temperatur, Licht), elektrischer (z. B. Übertragung von Motoneuronsignalen und sensiblen Neuronsignalen) sowie biochemischer (Ionen, Nukleotide, Neurotransmitter, Steroide und Peptide) Beschaffenheit, umständlich reguliert. Während der Mechanismus der Transkriptionsregulation der Genexpression umfassend studiert wurde (McKnight, Genes Dev. 10:367-381 (1996)), war der Fortschritt beim Erzielen einer Zielgenregulation in Säugerzellen, ohne die endogene Genexpression zu beeinträchtigen, begrenzt. Gegenwärtig werden die meisten Strategien zur Zielgenaktivierung oder -repression in einer konstitutiven Art und Weise vorgenommen. Eine solche ungeregelte Regulation der Genexpression ist nicht im Idealfall physiologisch und kann für das Zellwachstum und die Zelldifferenzierung sogar schädlich sein. Im Gegensatz dazu beeinträchtigt die Verwendung der Hefe-GAL4-DNA-Bindungsdomäne in dieser Erfindung endogene Gene nicht, da dieser chimäre Regulator nur Zielgenkonstrukte erkennen wird, die die GAL4-Bindungssequenz enthalten.
  • Mehrere induzierbare Systeme wurden zum Steuern der Zielgenexpression eingesetzt. Zu diesen induzierbaren Agentien zählen Schwermetallionen (Mayo et al., Cell 29:99-108 (1982)), Hitzeschock (Nover et al., CRC Press 167-220 (1991)), Isopropyl-β-D-thiogalactosid (β-gal) (Baim et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 88:5072-5076 (1981)) und Steroidhormone wie Östrogen (Braselmann et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 90:1657-1661 (1993)) und Glukokortikoide (Lee et al., Nature 294:228-232 (1981)). Viele dieser Induktoren sind jedoch entweder für Säugerzellen toxisch oder beeinträchtigen die endogene Genexpression (Figge et al., Cell 52:713-722 (1988)).
  • Unter Nutzung eines bakteriellen, auf Tetracyclin reagierenden Operonelements entwickelten Gossen et al. ein Modell zum Steuern der Genexpression mit einem tetracyclingesteuerten Transaktivator (tTA und rtTA) (Gossen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 89:5547-5551 (1992); Gossen et al., Science 268:1766-1769 (1995)). No et al. berichteten vor kurzem von einem Dreikomponentensystem, das aus einem chimären GAL4-VP16-Ecdyson-Rezeptor, dessen Partner Retinoid-X-Rezeptor (RXR) und einem Zielgen besteht. Sie demonstrierten dessen Anwendung beim Aktivieren der Reportergenexpression in einer ecdysonabhängigen Art und Weise (No et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 93:3346-3351 (1996)). Die hierin beschriebene Erfindung weist gegenüber den Modellen von No und Gossen Vorteile auf, da der chimäre Regulator nur die Zielgenkonstrukte und nicht endogene Gene erkennt und das System nur bei Vorliegen einer exogenen Verbindung, jedoch nicht bei Vorliegen beliebiger endogener Moleküle aktiviert wird.
  • WO 93/23431 (Baylor College of Medicine) beschreibt mutierte Proteine von Steroidhormonrezeptoren, einschließlich Progesteronrezeptor. Die modifizierten Rezeptoren können zwischen einem Antagonisten und einem Agonisten unterscheiden. Von solchen modifizierten Rezeptoren wird vorgeschlagen, dass sie als ein molekularer Schalter zum Regulieren der Expression in der Gentherapie verwendet werden.
  • Lipkin et al. (1996), J. Virol. 70:7182-1789, beschreiben Fusionsproteine zwischen einem Retinsäurerezeptor (retinoic acid receptor, RAR) oder einem aktivierten Retinoid-X-Rezeptor (RXR) und einer VP16-Transaktivierungsdomäne.
  • Y. Wang et al. (1994), P.N.A.S. 91: 8180-8184, beschreiben ein chimäres Protein mit einer von VP16 abgeleiteten Transaktivierungsdomäne, einer Gal-4-DNA-Bindungsdomäne und einer mutierten Progesteronrezeptor-Ligandenbindungsdomäne, die auf RU486 reagiert. Die Transregulationsdomäne stammt vom N-Terminus.
  • Zusammenfassung der Erfindung
  • Demgemäß stellt die vorliegende Erfindung ein modifiziertes Steroidhormonrezeptorprotein bereit, wobei das Rezeptorprotein auf einen herkömmlichen Antagonisten eines Wildtyp-Progesteronrezeptorprotein-Gegenstücks mit einer agonistischen Reaktion reagiert und wobei das modifizierte Rezeptorprotein eine DNA-Bindungsdomäne, eine Transregulationsdomäne und eine mutierte Progesteronrezeptor-Ligandenbindungsregion umfasst, dadurch gekennzeichnet, dass die Transregulationsdomäne zu der Ligandenbindungsregion heterolog ist und sich in einer C-terminalen Position in dem modifizierten Steroidhormonrezeptorprotein befindet.
  • Die Progesteronrezeptor-Ligandenbindungsregion kann durch eine Veränderung einer primären Sequenz in etwa 13 bis 42 carboxyterminalen Aminosäuren einer Wildtyp- Progesteronrezeptor-Ligandenbindungsdomäne mutiert sein. Mehr bevorzugt kann die Progesteronrezeptor-Ligandenbindungsregion im Wesentlichen aus Aminosäuren bestehen, die aus der Gruppe bestehend aus 640 bis 914, 640 bis 917 oder 640 bis 920 einer Progesteronrezeptor-Ligandenbindungsdomäne ausgewählt sind.
  • Die Transregulationsdomäne kann vorzugsweise die Genexpression transaktivieren oder transreprimieren.
  • In bestimmten Ausführungsformen kann die DNA-Bindungsdomäne durch eine DNA-Bindungsdomäne ersetzt werden, die normalerweise nicht mit der Progesteronrezeptor-Ligandenbindungsdomäne assoziiert wird. Vorzugsweise handelt es sich bei der DNA-Bindungsdomäne um eine GAL-4-DNA-Bindungsdomäne.
  • Bei der Transregulationsdomäne kann es sich um eine Transaktivierungsdomäne handeln, die sich von einer Transaktivierungsdomäne unterscheidet, die naturgemäß mit der mutierten Steroidhormonrezeptorprotein-Ligandenbindungsdomäne assoziiert wird.
  • Bei einer bevorzugten Transregulationsdomäne handelt es sich um eine Transrepressionsdomäne.
  • Andere bevorzugte der Transregulationsdomänen umfassen eine Krüppel-assoziierte Box-A-Transrepressionsdomäne (KRAB-Transrepressionsdomäne), wobei es sich z. B. bei der KRAB-Transrepressionsdomäne um eine Kid-1- oder eine Kox1-KRAB-Transrepressionsdomäne handelt.
  • Die mutierte Progesteronrezeptor-Ligandenbindungsdomäne kann einen synthetischen Antagonisten binden, der ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus: RU486, Org31806 und Org31376.
  • In bevorzugten Ausführungsformen kann die genannte mutierte Progesteronrezeptor-Ligandenbindungsregion auf RU486 in einer Konzentration von nur 0,01 nM reagieren.
  • Das modifizierte Steroidhormonrezeptorprotein umfasst vorzugsweise in folgender Reihenfolge vom N-Terminus zum C-Terminus die DNA-Bindungsdomäne, die mutierte Progesteronrezeptor-Ligandenbindungsregion und die Transregulationsdomäne.
  • Die Erfindung stellt eine Nukleinsäuresequenz bereit, die ein wie hierin beschriebenes modifiziertes Steroidhormonrezeptorprotein kodiert. Die Nukleinsäuresequenz kann weiterhin einen gewebespezifischen Promotor umfassen.
  • Die Erfindung beinhaltet einen Vektor, der eine wie hierin beschriebene Nukleinsäuresequenz enthält.
  • Die Erfindung beinhaltet außerdem eine Zelle, die mit einem wie hierin beschriebenen Vektor transfiziert oder transformiert wurde.
  • Die Erfindung stellt außerdem ein Verfahren zum Herstellen einer transformierten Zelle in situ bereit, das den Schritt des Inkontaktbringens der Zelle mit einem wie hierin beschriebenen Vektor für einen Zeitraum, der dazu ausreicht, die Zelle zu transformieren, umfasst, wobei die transformierte Zelle ein modifiziertes Steroidhormonrezeptorprotein exprimiert, das von dem Vektor kodiert wird.
  • In einem anderen Gesichtspunkt stellt die Erfindung die Verwendung eines wie hierin beschriebenen Vektors bei der Herstellung eines Arzneimittels zum Abgeben der Nukleinsäuresequenz, die das modifizierte Steroidhormonrezeptorprotein kodiert, an einen Säuger in vivo bereit.
  • In einem weiteren Gesichtspunkt stellt die Erfindung die Verwendung eines wie hierin beschriebenen Vektors bei der Herstellung eines Arzneimittels zum Abgeben der Nukleinsäuresequenz, die das modifizierte Steroidhormonrezeptorprotein kodiert, an einen Säuger in vivo zum Regulieren der Expression von Neuritwachstumsfaktor bereit.
  • Die Erfindung beinhaltet außerdem ein transgenes, nicht menschliches Tier, dessen Zellen die wie hierin beschriebene Nukleinsäure oder den wie hierin beschriebenen Vektor enthalten.
  • Die Konstruktion neuartiger modifizierter Steroidhormonrezeptoren, die die Expression von Nukleinsäuresequenzen regulieren, ist hierin beschrieben und überraschenderweise ermöglichen diese Modifikationen die Steuerung der Transaktivierungs- und Transrepressionsfunktionen des modifizierten Steroidhormonrezeptors. Solche Modifikationen ermöglichen auf unerwartete Weise, dass die Rezeptoren an verschiedene Liganden binden, deren Strukturen sich drastisch von den natürlich vorkommenden Liganden (beispielsweise nicht natürliche Liganden, Antihormone und nicht native Liganden) unterscheiden und dadurch für eine wesentliche Verbesserung gegenüber früheren Versuchen, die Zielgenexpression zu steuern oder zu regulieren, sorgen.
  • Diese Modifikationen werden in der Ligandenbindungsdomäne des GR erzeugt und eliminieren die Fähigkeit des GR, seinen natürlichen Liganden zu binden. Diese modifizierten Steroidrezeptoren zeigen eine normale Transaktivierungs- und Transrepressionsaktivität; die Stimulation einer solchen Aktivität erfolgt jedoch über eine Aktivierung durch einen nicht natürlichen und exogen oder endogen angewendeten Liganden. Modifikationen werden ebenso in der Ligandenbindungsdomäne des PR erzeugt und eliminieren die Fähigkeit des PR, seinen natürlichen Liganden zu binden. Der Austausch der GR-Bindungsdomäne durch die modifizierte PR-Bindungsdomäne ermöglicht die Stimulation der auf GR reagierenden Genexpression über nicht natürliche Liganden.
  • Andere Modifikationen der GR-Ligandenbindungsdomäne in Verbindung mit Modifikationen der DNA-Bindungsdomäne des GR eliminieren die Fähigkeit von Steroidhormonen, die Transaktivierung durch ihren natürlichen Liganden zu initiieren. Stattdessen ermöglichen solche Modifikationen, dass der modifizierte Rezeptor nicht natürliche Liganden bindet und die Transrepression der Genexpression, jedoch nicht die Transaktivierung stimuliert. In ähnlicher Weise ermöglicht die Verwendung derselben Modifikation der Ligandenbindungsdomäne in Verbindung mit Modifikationen der Transregulationsdomäne, dass der modifizierte Rezeptor nicht natürliche Liganden bindet und die Transaktivierung, jedoch nicht die Transrepression der Genexpression stimuliert.
  • Andere Modifikationen entfernen die Ligandenbindungsdomäne komplett, um einen konstitutiv aktiven Steroidrezeptor zu erzeugen. Solche Modifikationen bewirken fortwährende Transaktivierungs- und Transrepressionsauswirkungen auf die Regulation der Gentranskription. Darüber hinaus werden Modifikationen, die entweder Transaktivierungs- oder Transrepressionsfunktionen selektiv eliminieren, in den konstitutiv aktiven Steroidrezeptor integriert, wodurch die Genexpression konstitutiv transreprimiert oder transaktiviert wird. Des Weiteren verwenden andere Modifikationen eine Ligandenbindungsdomäne, die ihren natürlichen Liganden erkennt oder bei Modifikation einen nicht natürlichen Liganden erkennt, jedoch mit einer DNA-Bindungsdomäne und Transregulationsdomänen fusioniert ist, die normalerweise nicht mit der Ligandenbindungsdomäne assoziiert werden. Ein solches Konstrukt kann die Expression eines Gens, das normalerweise nicht mit der Ligandenbindungsdomäne in einem Wildtyp-Rezeptorprotein assoziiert wird, regulieren.
  • Diese modifizierten Rezeptoren können exprimiert werden, indem DNA-Expressionsvektoren speziell entwickelt werden, um das Niveau der Expression rekombinanter Genprodukte zu steuern. Die Steroidrezeptorfamilie von Genregulatorproteinen ist ein idealer Satz solcher Moleküle. Diese Proteine sind von Liganden aktivierte Transkriptionsfaktoren, deren Liganden von Steroiden zu Retinoiden, Fettsäuren, Vitaminen, Schilddrüsenhormonen und anderen gegenwärtig unidentifizierten kleinen Molekülen reichen. Diese Verbindungen binden an Rezeptoren und aktivieren oder reprimieren die Transkription.
  • Diese Rezeptoren werden modifiziert, um zu ermöglichen, dass sie verschiedene Liganden binden, deren Struktur entweder natürlich vorkommt oder sich von natürlich vorkommenden Liganden unterscheidet. Durch Screenen von Rezeptormutanten können Rezeptoren ausgewählt werden, die auf Liganden reagieren, die den endogenen Rezeptor der Wirtszelle nicht aktivieren. Folglich kann eine Regulation eines gewünschten Transgens unter Verwendung eines Liganden erzielt werden, der an einen maßgeschneiderten Rezeptor bindet oder diesen reguliert. Dies erfolgt nur mit Zellen, die den modifizierten Rezeptor integriert haben und diesen exprimieren.
  • Unter Nutzung der Fähigkeiten des modifizierten Steroidhormonrezeptors, um die Regulation der Genexpression zu bewirken, können diese Genkonstrukte als therapeutische Genmedikamente, zum Genaustausch und in der Gentherapie verwendet werden. Diese modifizierten Rezeptoren sind in der Gentherapie von Nutzen, in der ein Steuern des Niveaus der Expression eines Gens, ob nun Transaktivierung oder Repression, erforderlich ist. Die Anzahl der Erkrankungen, die mit einer unangemessenen Produktion von hormonellen Stimuli oder unangemessenen Antworten auf diese assoziiert werden, hebt die medizinische und biologische Bedeutung dieser Konstrukte hervor.
  • Die Eigenschaften der modifizierten Steroidhormonrezeptoren ermöglichen, dass die meisten oder alle der schädlichen Auswirkungen von Steroiden vermieden werden, während im Allgemeinen ihre therapeutischen Nutzen aufrechterhalten werden. Insbesondere verursacht die Verabreichung von Steroiden in der Regel Toxizitätsprobleme. Die schädlichen Auswirkungen von Steroiden können der In-vivo-Transaktivierung oder -Transrepression bestimmter Gene zugeschrieben werden. Diese toxischen Effekte können wohl das Resultat von sowohl Transaktivierung als auch Transrepression sein oder können vorwiegend einem dieser zugeschrieben werden. Die vorliegende Erfindung beinhaltet die Verwendung modifizierter GR-Moleküle als Genmedikamente zum Ersatz für die Steroidtherapie. Diese synthetischen Rezeptoren bewahren Funktionen, die jenen der endogenen Rezeptoren ähnlich sind, können jedoch durch Reagieren auf alternative Liganden einige der toxischen Nebenwirkungen eliminieren, die der gegenwärtig eingesetzten Steroidtherapie zugeschrieben werden können.
  • Diese Fähigkeit der GR-Konstrukte, Steroidtoxizität zu vermeiden, aber noch immer therapeutische Wirkungen zu zeigen, ermöglicht, dass die Konstrukte zum Behandeln zahlreicher Erkrankungen verwendet werden, einschließlich Arthritis, Asthma, seniler Demenz oder Parkinson-Krankheit. Des Weiteren können die Konstrukte zum Verhindern oder Behandeln von Erkrankungen verwendet werden, bei denen eine unangemessene Produktion von hormonellen Stimuli oder unangemessene Antworten auf diese vorliegt bzw. vorliegen, z. B. hormonabhängige Krebsarten der Brust, des Eierstocks, des Endometriums, der Prostata, und postmenopausale Osteoporose. Die Konstrukte können auch in Verbindung mit kotransfizierten Expressionsvektoren verwendet werden, um als ein Genschalter zu funktionieren. Zwecks einer ausführlichen Beschreibung eines Genschalters, siehe US-Patentschrift Nr. 5,364,791 , Vegeto et al.
  • Die hierin beschriebenen Konstrukte können zur Genaustauschtherapie in Menschen und zum Erstellen von transgenen Tiermodellen, die zum Studieren von Erkrankungen des Menschen verwendet werden, eingesetzt werden. Die transgenen Modelle können ebenso zum Einschätzen und Erforschen neuartiger Therapiewege zum Behandeln von Wirkungen chemischer und physikalischer Karzinogene und Tumorpromotor verwendet werden. Die obigen Konstrukte können auch zum Unterscheiden von Steroidhormonrezeptorantagonisten und Steroidhormonrezeptoragonisten eingesetzt werden. Eine solche Erkennung von Antagonisten- oder Agonistenaktivität kann unter Verwendung von Zellen durchgeführt werden, die mit den obigen Konstrukten transformiert wurden. Daher werden nun im Hinblick auf das Obige verschiedene Gesichtspunkte der Erfindung beschrieben.
  • Hierin wird ein modifiziertes Glukokortikoidrezeptor-Fusionsprotein beschrieben. Der Fusionsproteinrezeptor enthält einen GR, wobei seine Ligandenbindungsdomäne durch eine mutierte PR-Ligandenbindungsdomäne ersetzt wurde. Dieses Fusionsprotein kann durch die Bindung eines nicht natürlichen Liganden, nicht jedoch durch natürliches oder synthetisches Glukokortikoid oder andere natürliche oder synthetische Steroide aktiviert werden. Das Fusionsprotein beinhaltet eine Glukokortikoidrezeptorregion, die eine DNA-Bindungsdomäne und eine oder mehrere Transregulationsdomänen umfasst. Die Transregulationsdomänen können die auf Glukokortikoid reagierende Genexpression transaktivieren oder transreprimieren.
  • Außer der Glukokortikoidrezeptorregion beinhaltet das Fusionsprotein außerdem eine mutierte Progesteron-Ligandenbindungsregion, die einen nicht natürlichen Liganden binden kann. Die mutierte Ligandenbindungsregion ist vorzugsweise durch Deletion von etwa 16 bis 42 carboxyterminalen Aminosäuren einer Progesteronrezeptor-Ligandenbindungsdomäne mutiert. Die mutierte Progesteronrezeptor-Ligandenbindungsregion umfasst, besteht im Wesentlichen aus oder besteht aus vorzugsweise etwa den Aminosäuren 640 bis 891 eines Progesteronrezeptors. Andere bevorzugte Ausführungsformen umfassen, bestehen im Wesentlichen aus oder bestehen aus den Aminosäuren 640-917, den Aminosäuren 640-920 oder den Aminosäuren 640-914. Ein Fachmann wird erkennen, dass verschiedene Mutationen zum Erzielen der gewünschten Funktion erzeugt werden können.
  • Der Ausdruck „Fusionsprotein", wie hierin verwendet, bezieht sich auf ein Protein, das sich auch zwei oder mehr Proteinen (oder Fragmenten davon) zusammensetzt, wobei jedes Protein naturgemäß separat auftritt. Die Kombination kann zwischen kompletten Aminosäuresequenzen des Proteins, wie in der Natur vorgefunden, oder Fragmenten davon vorliegen. Im Fall eines Glukokortikoid-Progesteron-Fusionsproteinrezeptors setzt sich das Fusionsprotein vorzugsweise aus Abschnitten des Glukokortikoidrezeptors und des Progesteronrezeptors zusammen. Diese Kombination kann die komplette Aminosäuresequenz jedes Proteins oder Fragmente davon beinhalten. Zum Beispiel kann das Glukokortikoid-Progesteron-Fusionsprotein die Ligandenbindungsdomäne von Progesteron und die DNA-Bindungsdomäne und Transregulationsdomänen des Glukokortikoidrezeptors beinhalten. Dies ist nur ein Beispiel und es soll nicht einschränkend sein.
  • Der Ausdruck „nicht natürlicher Ligand", wie hierin verwendet, bezieht sich auf Verbindungen, die normalerweise an die Ligandenbindungsdomäne eines Rezeptors, jedoch nicht den endogenen Liganden binden können. „Endogen", wie hierin verwendet, bezieht sich auf eine Verbindung, die vom Inneren von Säugerzellen stammt. Der Rezeptor wird nicht dem Liganden ausgesetzt, außer er wird exogen zugeführt. „Exogen", wie hierin verwendet, bezieht sich auf eine Verbindung, die aus externen Quellen stammt und nicht normalerweise in Säugerzellen vorliegt. Dies beinhaltet auch Liganden oder Verbindungen, die normalerweise nicht in Tieren oder Menschen vorgefunden werden. Nicht natürlich beinhaltet auch Liganden, die nicht naturgemäß in dem spezifischen Organismus (Mensch oder Tier), bei dem eine Gentherapie in Betracht gezogen wird, vorgefunden werden. Diese Liganden aktivieren Rezeptoren durch Bindung an die modifizierte Ligandenbindungsdomäne. Die Aktivierung kann durch eine spezifische Ligand-Rezeptor-Interaktion erfolgen, ob nun durch direkte Bindung oder durch Assoziation in einer beliebigen Form mit dem Rezeptor.
  • „Natürlicher Ligand", wie hier verwendet, bezieht sich auf Verbindungen, die normalerweise an die Ligandenbindungsdomäne eines Rezeptors binden und endogen sind. Der Rezeptor wird in diesem Fall dem Liganden endogen ausgesetzt. Zu natürlichen Liganden zählen Steroide, Retinoide, Fettsäuren, Vitamine, Schilddrüsenhormone sowie synthetische Varianten der obigen. Dies soll nur ein Beispiel und nicht einschränkend sein.
  • Der Ausdruck „Ligand", wie hierin erwähnt, bedeutet eine beliebige Verbindung, die den Rezeptor aktiviert, für gewöhnlich durch Interaktion mit der Ligandenbindungsdomäne des Rezeptors. Ligand beinhaltet ein Molekül oder eine Menge von Molekülen, das bzw. die spezifisch an einen modifizierten Rezeptor binden kann bzw. können. Der Ausdruck „spezifisch binden" bedeutet, dass ein markierter Ligand, der an den Rezeptor gebunden ist" durch Addition von unmarkiertem Ligand vollständig von dem Rezeptor verdrängt werden kann, wie in der Technik bekannt ist.
  • Beispiele nicht natürlicher Liganden und nicht nativer Liganden lassen sich in der PCT-Veröffentlichung WO 96/40911 finden.
  • Der Ausdruck „binden" oder „gebunden", wie hierin verwendet, bezieht sich auf die Assoziation, Anlagerung, Verbindung oder Verknüpfung eines Liganden, ob nun nicht natürlich oder natürlich, durch kovalente oder nichtkovalente Mittel mit einem entsprechenden Rezeptor. Der Ligand und der Rezeptor interagieren komplementär und spezifisch in Stellen an einer gegebenen Struktur. Die Bindung beinhaltet, ist jedoch nicht darauf beschränkt, Bestandteile, die durch elektrostatische Bindung, hydrophobe Bindung, Wasserstoffbrückenbindung, Interkalation oder das Bilden von Helixstrukturen mit spezifischen Stellen an Nukleinsäuremolekülen assoziieren.
  • Der Ausdruck „Glukokortikoidrezeptor" bezieht sich auf einen Steroidhormonrezeptor, der auf einen Glukokortikoidliganden reagiert. Der Glukokortikoidrezeptor ist Teil der Steroidhormonrezeptor-Superfamilie, bei denen es sich um bekannte Steroidrezeptoren handelt, deren primäre Sequenz nahe legt, dass sie miteinander verwandt sind. Zu repräsentativen Beispielen solcher Rezeptoren zählen die Östrogen-, Progesteron-, Vitamin-D-, Hühnerovalbumin-Upstream-Promotor-Transfaktor-, Ecdyson-, Nurr-1- und Orphan-Rezeptoren, Glukokortikoid-α, Glukokortikoid-β, Mineralokortikoid, Androgen, Schilddrüsenhormon, Retinsäure und Retinoid X. Diese Rezeptoren setzen sich aus DNA-Bindungsdomänen, Ligandenbindungsdomänen sowie Transregulationsdomänen zusammen.
  • Der Glukokortikoidrezeptor ist ein ligandenabhängiger Transkriptionsfaktor, der sowohl zu einer positiven als auch einer negativen Regulation der Genexpression im Stande ist. Eine Interaktion des Rezeptors mit einem Liganden induziert eine Kaskade molekularer Ereignisse, die schließlich zu der spezifischen Assoziation des aktivierten Rezeptors mit regulatorischen Elementen von Zielgenen führen. In einer inaktiven Form bilden solche Rezeptoren einen großen Komplex, der den Rezeptor, Hitzeschockproteine und andere Proteine umfasst.
  • Der Ausdruck „Glukokortikoidrezeptorregion" bezieht sich auf ein Fragment oder einen Teil des kompletten Glukokortikoidrezeptors, wie oben definiert. Eine Glukokortikoidrezeptorregion kann die vollständige oder einen Teil der Aktivität des natürlichen Rezeptorproteins bewahren. Zum Beispiel könnte eine Glukokortikoidrezeptorregion nur die DNA-Bindungsdomäne und die Transregulationsdomänen und nicht die Ligandenbindungsdomäne oder umgekehrt enthalten. Dies ist nur ein Beispiel und es soll nicht einschränkend sein.
  • Der Ausdruck „Ligandenbindungsdomäne" oder „Ligandenbindungsregion", wie hierin verwendet, bezieht sich auf jenen Abschnitt eines Steroidhormonrezeptorproteins, der das adäquate Hormon oder den adäquaten Liganden bindet und eine Kaskade molekularer Ereignisse induziert, die schließlich zu der spezifischen Assoziation des aktivierten Rezeptors mit regulatorischen Elementen von Zielgenen führen. Dies beinhaltet, ist jedoch nicht darauf beschränkt, die positiven oder negativen Auswirkungen auf die Regulation der Gentranskription. Die Bindung des Liganden an die Ligandenbindungsdomäne induziert eine Konformationsänderung der Rezeptorstruktur. Die Konformationsänderung beinhaltet die Dissoziation von Hitzeschockproteinen und die Freisetzung eines monomeren Rezeptors aus dem Rezeptorkomplex sowie eine andere tertiäre oder dreidimensionale Struktur. Die Konformationsänderung, die stattfindet, ist für den Steroidrezeptor und den Liganden, der an die Ligandenbindungsdomäne bindet, spezifisch.
  • Zum Beispiel ermöglicht die Konformationsänderung, die stattfindet, wenn Glukokortikoidhormon bindet, bei Glukokortikoidrezeptoren eine Homodimerisation, d. h. Dimerisation zwischen zwei identischen GR-Molekülen. Eine Heterodimerisation kann jedoch mit anderen Steroidrezeptoren erfolgen, d. h. Dimerisation mit zwei Molekülen wie GR und ER. Eine solche Dimerisation ermöglicht, dass der Rezeptor mit DNA bindet oder die regulatorische Wirkung durch Binden anderer Transkriptionsfaktoren induziert.
  • Der Ausdruck „DNA-Bindungsdomäne", wie hierin verwendet, bezieht sich auf jenen Teil des Steroidhormonrezeptorproteins, der eine spezifische DNA-Sequenz in den Regulationsregionen von Zielgenen bindet. Diese Domäne kann kurze Nukleotidabschnitte binden, die als palindromartige, invertierte oder wiederholte Wiederholungen angeordnet sind. Eine solche Bindung wird die Genexpression in Abhängigkeit von dem spezifischen Liganden und den Konformationsänderungen aufgrund einer solchen Ligandenbindung aktivieren. Für die Repression ist DNA-Bindung nicht erforderlich.
  • Der Ausdruck „Transregulationsdomäne", wie hierin verwendet, bezieht sich auf jene Abschnitte des Steroidhormonrezeptorproteins, die die Genexpression transaktivieren oder transreprimieren können. Dies würde unterschiedliche Regionen des Rezeptors, die für entweder Repression oder Aktivierung verantwortlich zeichnen, oder die Regionen des Rezeptors, die für sowohl Repression als auch Aktivierung verantwortlich zeichnen, beinhalten. Solche Regionen sind räumlich verschieden. Das Obige ist nur ein Beispiel und es soll nicht einschränkend sein. Bei der Transrepression ist diese Domäne unter einem Mechanismus mit Dimerisation verbunden, die wiederum eine Protein-Protein-Interaktion bewirkt, um die Genexpression zu verhindern oder zu reprimieren. Eine solche Regulation findet statt, wenn der Rezeptor durch die Ligandenbindung an die Ligandenbindungsdomäne aktiviert wird. Die Konformationsänderung des Rezeptors kann ein Dinier mit einem diskreten Abschnitt der Transregulationsdomäne bilden, um die Genexpression zu reprimieren. Darüber hinaus kann die Repression durch eine monomere Form des Rezeptors erfolgen, DNA-Bindung ist jedoch nicht erforderlich (siehe unten).
  • Die Ausdrücke „Transaktivierung", „transaktivieren" oder „transaktivierend" beziehen sich auf eine positive Auswirkung auf die Regulation der Gentranskription aufgrund der Interaktion eines Hormons oder Liganden mit einem Rezeptor, die die Kaskade molekularer Ereignisse verursacht, die schließlich zu der spezifischen Assoziation des aktivierten Rezeptors mit den regulatorischen Elementen der Zielgene führen. Die Transaktivierung kann aus der Interaktion nicht natürlicher sowie natürlicher Liganden entstehen. Agonistenverbindungen, die mit Steroidhormonrezeptoren interagieren, um eine Transkriptionsreaktion zu fördern, können die Transaktivierung bewirken. Zu solchen positiven Auswirkungen auf die Transkription zählt die Bindung eines aktivierten Rezeptors an spezifische Erkennungssequenzen in dem Promotor von Zielgenen, um die Transkription zu aktivieren. Die aktivierten Rezeptoren können spezifisch mit DNA interagieren. Die durch Hormon oder Ligand aktivierten Rezeptoren assoziieren in den Regulationsregionen von Zielgenen mit spezifischen DNA-Sequenzen oder Hormon-Response-Elementen. Die Transaktivierung verändert die Rate der Transkription oder induziert die Transkription eines bestimmten Gens bzw. bestimmter Gene. Dies bezieht sich auf einen Anstieg der Rate und/oder des Umfangs der Transkription, die stattfindet.
  • Die Ausdrücke „transreprimieren", „Transrepression" oder „transreprimierend", wie hierin verwendet, beziehen sich auf die negativen Auswirkungen auf die Regulation der Gentranskription aufgrund der Interaktion eines Hormons oder Liganden mit einem Rezeptor, die eine Kaskade molekularer Ereignisse induziert, die schließlich zu der spezifischen Assoziation des aktivierten Rezeptors mit anderen Transkriptionsfaktoren wie NFK-B oder AP-1 führen. Die Transrepression kann aus der Interaktion nicht natürlicher sowie natürlicher Liganden entstehen. Antagonisten- und Agonistenverbindungen, die mit Steroidhormonrezeptoren interagieren, können die Transrepression bewirken. Sobald der Ligand an den Rezeptor bindet, findet eine Konformationsänderung statt. Die Transrepression kann mittels zweier unterschiedlicher Mechanismen erfolgen, d. h. durch die dimere und monomere Form des Rezeptors. Die Verwendung der monomeren Form des Rezeptors zur Transrepression hängt von dem Vorliegen der DNA-Bindungsdomäne, jedoch nicht von der Fähigkeit des Rezeptors, DNA zu binden, ab. Die Verwendung der dimeren Form des Rezeptors zur Transrepression hängt von den Rezeptorbindung-Response-Elementen, die ein cis-Element bzw. cis-Elemente überlappen, ab. Die Transrepression verändert die Rate der Transkription oder inhibiert die Transkription eines bestimmten Gens. Die Transrepression verringert die Rate und/oder den Umfang der Transkription, die stattfindet.
  • Der Ausdruck „Progesteronrezeptor", wie hierin verwendet, bezieht sich auch auf einen Steroidhormonrezeptor, der auf das Hormon Progesteron reagiert oder von diesem aktiviert wird. Progesteron ist Teil der Steroidhormonrezeptor-Superfamilie, wie oben beschrieben. Der Progesteronrezeptor kann als zwei unterschiedliche, aber verwandte Formen existieren, die von demselben Gen abgeleitet sind. Der Vorgang zur Erzeugung der Produkte kann eine abwechselnde Initiierung der Transkription, Spleißunterschiede oder Transkriptionstermination sein. Diese Rezeptoren setzen sich aus DNA-Eindungs-, Ligandenbindungs- sowie Transregulationsdomänen zusammen. Der Progesteronrezeptor ist auch ein ligandenabhängiger Transkriptionsfaktor, der die Genexpression regulieren kann. Die Interaktion des Progesteronrezeptors mit einem Liganden induziert eine Kaskade molekularer Ereignisse, die schließlich zu der spezifischen Assoziation des aktivierten Rezeptors mit regulatorischen Elementen von Zielgenen führen.
  • Der Ausdruck „modifiziert", „Modifikation", „Mutante" oder „mutiert" bezieht sich auf eine Veränderung des Rezeptors von seiner natürlich vorkommenden Wildtyp-Form. Dies beinhaltet eine Veränderung der primären Sequenz eines Rezeptors, so dass sie sich von der Wildtyp- oder natürlich vorkommenden Sequenz unterscheidet. Das mutierte Steroidhormonrezeptorprotein, wie in der vorliegenden Erfindung verwendet, kann eine Mutante eines beliebigen Mitglieds der Steroidhormonrezeptor-Superfamilie sein. Zum Beispiel kann ein Steroidrezeptor durch Deletion von Aminosäuren am carboxyterminalen Ende des Proteins mutiert werden. Im Allgemeinen liefert eine Deletion von etwa 1 bis etwa 120 Aminosäuren vom carboxyterminalen Ende des Proteins einen mutierten Steroidhormonrezeptor, der in der vorliegenden Erfindung von Nutzen ist. Ein Durchschnittsfachmann dieser Technik wird jedoch erkennen, dass eine kürzere Deletion von carboxyterminalen Aminosäuren erforderlich sein wird, um nützliche Mutanten bestimmter Steroidhormonrezeptorproteine zu erzeugen. Andere Mutationen oder Deletionen können in anderen Domänen des Steroidrezeptors von Interesse vorgenommen werden, wie der DNA-Bindungsdomäne oder der Transregulationsdomäne.
  • Zum Beispiel wird eine Mutante des Progesteronrezeptorproteins eine Deletion carboxyterminaler Aminosäuren von ungefähr 1 bis 60 Aminosäuren enthalten. In einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung werden 42 carboxyterminale Aminosäuren aus dem Progesteronrezeptorprotein deletiert. In ähnlicher Weise kann eine Mutation einer oder mehrerer Aminosäuren in der DNA-Bindungsdomäne oder den Transregulationsdomänen die Regulation der Genexpression ändern.
  • Ein Fachmann wird erkennen, dass eine Kombination von Mutationen und/oder Deletionen möglich ist, um die gewünschte Reaktion zu gewinnen. Dies würde doppelte Punktmutationen an derselben Domäne oder unterschiedlichen Domänen beinhalten. Darüber hinaus beinhaltet Mutation außerdem „Nullmutationen", bei denen es sich um genetische Läsionen an einem Genort handelt, die das Genprodukt völlig inaktivieren.
  • Beispiele von Mutationen sind in der PCT-Veröffentlichung WO 96/40911 beschrieben.
  • Der Ausdruck „Mutation" beinhaltet außerdem beliebige andere Derivate. Der Ausdruck „Derivat", wie hierin verwendet, bezieht sich auf ein Peptid oder eine Verbindung, das bzw. die aus einem anderen Peptid bzw. einer anderen Verbindung mit einer ähnlichen Struktur produziert oder modifiziert wurde. Ein solches Derivat kann ein „chemisches Derivat", ein „Fragment", eine „Variante", eine „Chimäre" oder ein „Hybrid" des Komplexes sein. Ein Derivat bewahrt mindestens einen Teil der Funktion des Proteins (beispielsweise Reaktionsfähigkeit mit einem Antikörper, der für den Komplex spezifisch ist, enzymatische Aktivität oder Bindungsaktivität, die durch nicht katalytische Domänen vermittelt wird), was seine Nutzung gemäß der vorliegenden Erfindung ermöglicht.
  • Ein Derivat kann ein Komplex sein, der mindestens eine Polypeptid-„Variante” umfasst, der entweder eine oder mehrere Aminosäuren fehlen oder die hinsichtlich des nativen Polypeptids zusätzliche oder substituierte Aminosäuren enthält. Die Variante kann von einem natürlich vorkommenden Komplexbestandteil abgeleitet sein, indem die Protein-DNA kodierende Sequenz adäquat modifiziert wird, um Codons für eine oder mehrere Aminosäuren an einer oder mehreren Stellen des C-Terminus, N-Terminus und/oder in der nativen Sequenz hinzuzufügen, zu entfernen und/oder zu modifizieren. Es versteht sich, dass solche Varianten mit hinzugefügten, substituierten und/oder zusätzlichen Aminosäuren eine oder mehrere charakterisierende Abschnitte des nativen Komplexes beibehalten. Ein funktionelles Derivat von Komplexen, das Proteine mit deletierten, inserierten und/oder substituierten Aminosäureresten umfasst, kann unter Anwendung von Standardtechniken hergestellt werden, die Durchschnittsfachmännern wohl bekannt sind.
  • Ein „chemisches Derivat" des Komplexes enthält zusätzliche chemische Einheiten, die normalerweise nicht Teil des Proteins sind. Solche Einheiten können die Löslichkeit, Absorption, biologische Halbwertzeit und dergleichen des Moleküls verbessern.
  • Der Ausdruck „modifiziert" oder „Modifikation", wie hierin verwendet, bezieht sich auf eine Änderung der Zusammensetzung oder Struktur der Verbindung oder des Moleküls. Die Aktivität des Derivats, der modifizierten Verbindung oder des Moleküls wird jedoch hinsichtlich der Aktivität der Mutterverbindung oder des Muttermoleküls bewahrt, verstärkt oder erhöht. Dies würde die Änderung einer Aminosäure in der Sequenz des Peptids oder die Einführung einer oder mehrerer natürlich vorkommender Aminosäuren oder anderer Verbindungen beinhalten. Diese beinhaltet eine Änderung eines chemischen Körpers, eine Änderung einer Wasserstoffanordnung oder eine beliebige Art chemischer Variation. Darüber hinaus bezieht sich „Analogon", wie hierin verwendet, auf eine Verbindung, die einer anderen Struktur ähnelt. Analogon ist nicht notwendigerweise ein Isomer. Die obigen sind nur Beispiele und sind nicht einschränkend.
  • Der Ausdruck „Nukleinsäuresequenz", „Gen", „Nukleinsäure" oder „Nukleinsäurekassette", wie hierin verwendet, bezieht sich auf das genetische Material von Interesse, das ein Protein oder ein Peptid oder RNA exprimieren kann, nachdem es bzw. sie transient, permanent oder episomal in eine Zelle integriert wurde. Die Nukleinsäure kann positional und sequentiell in einem Vektor mit anderen erforderlichen Elementen ausgerichtet sein, so dass die Nukleinsäure transkribiert und, falls erforderlich, in Protein in den Zellen translatiert werden kann.
  • Der Ausdruck „genetisches Material", wie hierin verwendet, bezieht sich auf angrenzende DNA- oder RNA-Fragmente. Das genetische Material, das in targetierte Zellen eingeführt wird, kann eine beliebige DNA oder RNA sein. Zum Beispiel kann die Nukleinsäure: (1) normalerweise in den targetierten Zellen gefunden werden, (2) normalerweise in targetierten Zellen gefunden, jedoch nicht in physiologisch adäquaten Niveaus in targetierten Zellen exprimiert werden, (3) normalerweise in targetierten Zellen gefunden werden, jedoch nicht in optimalen Niveaus in bestimmten pathologischen Zuständen exprimiert werden, (4) nicht normalerweise in den targetierten Zellen gefunden werden, (5) neuartige Fragmente von Genen sein, die normalerweise in targetierten Zellen exprimiert oder nicht exprimiert werden, (6) synthetische Modifikationen von Genen sein, die in targetierten Zellen exprimiert oder nicht exprimiert werden, (7) eine beliebige andere DNA sein, die zur Expression in targetierten Zellen modifiziert sein kann, und (8) eine beliebige Kombination der obigen sein.
  • Der Ausdruck „Genexpression" oder „Nukleinsäureexpression", wie hierin verwendet, bezieht sich auf das Genprodukt des genetischen Materials aus dem Transkriptions- und Translationsvorgang. Die Expression beinhaltet die Polypeptidkette, die aus einem mRNA-Molekül translatiert wurde, das von einem Gen transkribiert wurde. Wenn das RNA-Transkript nicht translatiert wird, z. B. rRNA, tRNA, stellt das RNA-Molekül das Genprodukt dar.
  • Ein Glukokortikoid-Progesteron-Fusionsproteinrezeptor kann als ein Zelloberflächen-, zytoplasmatisches oder nukleares Protein exprimiert werden. Mit „Zelloberflächenprotein" ist gemeint, dass ein Protein die Zellmembran bei Expression vollständig oder zum Teil umspannt und das zudem auf der Oberfläche der Zelle freiliegt. Mit zytoplasmatischem Protein ist gemeint, dass ein Protein komplett in dem Zytoplasma enthalten ist und nicht den Zellkern oder die Zelloberflächen umspannt. Hinsichtlich „nuklearem Protein" ist gemeint, dass das Protein die Zellkernmembran bei Expression vollständig oder zum Teil umspannt und dem Zellzytoplasma ausgesetzt ist oder komplett in dem Zellkern enthalten, nicht an der Zellkernmembran angelagert und nicht dem Zellzytoplasma ausgesetzt ist.
  • Ein modifiziertes Rezeptorprotein, wie hierin beschrieben, kann eine mutierte Progesteron-Ligandenbindungsregion der Aminosäuren 640 bis 914 einer Progesteronrezeptor-Ligandenbindungsdomäne beinhalten. Ein anderes modifiziertes Rezeptorprotein, wie hierin beschrieben, kann eine Transregulationsdomäne sein, die sich in der N-terminalen Region der mutierten Progesteron-Ligandenbindungsdomäne befindet. In noch einem anderen modifizierten Rezeptorprotein, wie hierin beschrieben, kann eine Transregulationsdomäne vorliegen, die sich in der C-terminalen Region der mutierten Progesteron-Ligandenbindungsdomäne befindet. Folglich kann sich die Transregulationsdomäne entweder in der C-terminalen oder der N-terminalen Richtung der Ligandenbindungsdomäne befinden.
  • Ein modifiziertes Rezeptorprotein, wie hierin beschrieben, kann eine GAL4-DNA-Bindungsdomäne beinhalten. In einem anderen modifizierten Rezeptorprotein, wie hierin beschrieben, kann eine Krüppel-assoziierte Box-A-Transrepressionsdomäne (KRAB-Transrepressionsdomäne) vorliegen. Die Ausdrücke „GAL4-DNA-Bindungsdomäne" und „KRAB-Transrepressionsdomäne" werden als in der Technik für gewöhnlich verstanden verwendet und umfassen funktionelle Äquivalente solcher Sequenzen, die die Fähigkeit, DNA zu binden, bewahren oder die Transrepressionsaktivität bewahren.
  • In einem anderen modifizierten Rezeptor, wie hierin beschrieben, kann eine mutierte Progesteronrezeptor-Ligandenbindungsregion vorliegen, die RU486 in einer Konzentration von nur 0,01 nM binden kann. In noch einer anderen Ausführungsform reagiert ein modifiziertes Steroidhormonrezeptorprotein auf einen herkömmlichen Antagonisten des Wildtyp-Steroidhormonrezeptorprotein-Gegenstücks mit einer agonistischen Reaktion. Fachmänner werden verstehen, dass „Bindung" mittels mehrerer herkömmlicher Verfahren in der Technik gemessen werden kann, wie Bindungskonstanten, und dass eine Protein-„Reaktion” ebenfalls unter Anwendung herkömmlicher Techniken im Fachgebiet gemessen werden kann, wie eine Messung induzierter Transkriptionsniveaus.
  • Wie hierin verwendet, bezieht sich der Ausdruck „konstitutiv" auf die Fähigkeit, die Genexpression ohne Erfordernis eines Liganden ständig zu aktivieren oder zu reprimieren.
  • Beispiele mutierter Transregulationsdomänen sind in der PCT-Veröffentlichung WO 96/40911 beschrieben.
  • Beispiele einer mutierten DNA-Bindungsdomäne sind in der PCT-Veröffentlichung WO 96/40911 beschrieben.
  • Die Nukleinsäure ist das genetische Material, das ein Protein oder ein Peptid oder RNA exprimieren kann, nachdem es bzw. sie transient, permanent oder episomal in eine Zelle integriert wurde.
  • Vektoren können die Nukleinsäure transient, permanent oder episomal in eine Zelle oder Gewebe exprimieren.
  • Der Ausdruck „Vektor", wie hierin beschrieben, bezieht sich auf eine Konstruktion, die sich aus genetischem Material zusammensetzt, das zum Steuern der Transformation einer targetierten Zelle entworfen ist. Ein Vektor enthält mehrere genetische Elemente, die positional und sequentiell mit anderen erforderlichen Elementen ausgerichtet sind, so dass die Nukleinsäure in einer Nukleinsäurekassette transkribiert und, falls erforderlich, in den transfizierten Zellen translatiert werden kann. Der Ausdruck Vektor, wie hierin verwendet, kann sich auf Nukleinsäure beziehen, z. B. DNA, die von einem Plasmid, Cosmid, Phagemid oder Bakteriophagen abgeleitet ist, in die eine oder mehrere Fragmente der Nukleinsäure inseriert oder kloniert sein können, die für bestimmte Proteine kodieren. Der Ausdruck „Plasmid", wie hierin verwendet, bezieht sich auf eine Konstruktion, die sich aus extrachromosomalem genetischem Material zusammensetzt, für gewöhnlich eines kreisförmigen DNA-Doppelstrangs, die unabhängig von chromosomaler DNA replizieren kann. Das Plasmid repliziert nicht unbedingt.
  • Der Vektor kann eine oder mehrere einzigartige Restriktionsstellen enthalten und kann zur autonomen Replikation in einem definierten Wirt oder Organismus im Stande sein, so dass die klonierte Sequenz reproduziert wird. Das Vektormolekül kann einen gewissen wohl definierten Phänotyp an den Wirtsorganismus verleihen, der entweder selektierbar ist oder einfach nachgewiesen wird. Der Vektor kann eine lineare oder kreisförmige Konfiguration aufweisen. Die Bestandteile eines Vektors kann ein DNA-Molekül enthalten, das Folgendes integriert: (1) DNA; (2) eine Sequenz, die ein therapeutisches oder gewünschtes Produkt kodiert; und (3) regulatorische Elemente zur Transkription, Translation, RNA-Verarbeitung, RNA-Stabilität und Replikation, ist jedoch nicht darauf beschränkt.
  • Der Zweck des Vektors besteht darin, eine Expression einer Nukleinsäuresequenz in Zellen oder Gewebe bereitzustellen. Die Expression beinhaltet die effiziente Transkription eines inserierten Gens oder einer inserierten Nukleinsäuresequenz. Expressionsprodukte können Proteine, Polypeptide oder RNA sein. Die Nukleinsäuresequenz kann in einer Nukleinsäurekassette enthalten sein. die Expression der Nukleinsäure kann kontinuierlich, konstitutiv oder reguliert sein. Der Vektor kann auch als ein prokaryontisches Element zur Replikation von Plasmid in Bakterien und Selektion zur Erhaltung von Plasmid in Bakterien verwendet werden.
  • In der vorliegenden Erfindung umfasst der bevorzugte Vektor die folgenden Elemente, die sequentiell in einer adäquaten Distanz verknüpft sind, um eine funktionelle Expression zu ermöglichen: ein Promotor, eine 5'-mRNA-Leader-Sequenz, eine Translationsinitiationsstelle, eine Nukleinsäurekassette, die die zu exprimierende Sequenz enthält, eine untranslatierte 3'-mRNA-Region und eine Polyadenylierungssignalsequenz. Wie hierin verwendet, bezieht sich der Ausdruck „Expressionsvektor" auf einen DNA-Vektor, der alle Informationen enthält, die zum Produzieren eines rekombinanten Proteins in einer heterologen Zelle erforderlich sind.
  • Darüber hinaus kann der Ausdruck „Vektor", wie hierin verwendet", kann auch virale Vektoren beinhalten. Ein „viraler Vektor" ist in diesem Sinne ein Vektor, der durch Einbindung eines Abschnitts eines viralen Genoms in dem Vektor physikalisch in ein Viruspartikel integriert ist, z. B. ein Verpackungssignal, und ist nicht lediglich DNA oder ein lokalisiertes Gen, das aus einem Abschnitt einer viralen Nukleinsäure genommen wurde. Obwohl ein Abschnitt eines viralen Genoms in einem Vektor der vorliegenden Erfindung vorliegen kann, verursacht dieser Abschnitt folglich keine Integration des Vektors in ein Viruspartikel und ist folglich nicht dazu im Stande, ein infektiöses Viruspartikel zu produzieren.
  • Ein Vektor, wie hierin verwendet, kann auch DNA-Sequenzelemente beinhalten, die eine extrachromosomale (episomale) Replikation der DNA ermöglichen. Vektoren, die zu einer episomalen Replikation im Stande sind, werden als extrachromosomale Moleküle erhalten und können replizieren. Diese Vektoren werden nicht durch einfachen Abbau eliminiert, sondern werden weiterhin kopiert. Diese Elemente können von einem viralen oder Säugergenom abgeleitet sein. Diese stellen eine anhaltende oder „beständige" Expression bereit, wie im Folgenden beschrieben.
  • Der Ausdruck „beständige Expression", wie hierin beschrieben, bezieht sich auf die Einführung von Genen in die Zelle zusammen mit genetischen Elementen, die eine episomale (d. h. extrachromosomale) Replikation ermöglichen. Dies kann zu einer scheinbar stabilen Transformation der Zelle ohne die Integration des neuartigen genetischen Materials in das Chromosom der Wirtszelle führen.
  • „Stabile Expression", wie hierin verwendet, bezieht sich auf die Integration von genetischem Material in Chromosomen der targetierten Zelle, wobei es zu einem permanenten Bestandteil des genetischen Materials in dieser Zelle wird. Die Genexpression nach stabiler Integration kann die Eigenschaften der Zelle und deren Nachkommenschaft, die durch Replikation entsteht, permanent verändern, was zu einer stabilen Transformation führt.
  • Ein verwandter Gesichtspunkt der vorliegenden Erfindung zeichnet sich durch eine transfizierte Zelle aus, die einen Vektor enthält, der eine Nukleinsäuresequenz für einen modifizierten Rezeptor, wie hierin beschrieben, enthält. Wie hierin verwendet, bezieht sich der Ausdruck „transfiziert" oder „Transfektion" auf die Integration von Fremd-DNA in beliebige Zellen, indem diese einer derartigen DNA ausgesetzt werden. Dies würde die Einführung von DNA mittels verschiedener Abgabeverfahren, z. B. über Vektoren oder Plasmide, beinhalten.
  • Zu Verfahren zur Transfektion können Mikroinjektion, CaPO4-Präzipitation, Liposomfusion (z. B. Lipofektion), Elektroporation oder Verwendung einer Genkanone zählen. Dies sind nur Beispiele und diese sind nicht einschränkend gemeint. Der Ausdruck „Transfektion", wie hierin verwendet, bezieht sich auf das Verfahren des Einführens von DNA (z. B. DNA-Expressionsvektor) in eine Zelle. Nach Eintritt in die Zelle kann die transfizierte DNA: (1) sich mit dem Genom des Wirts rekombinieren; (2) unabhängig als ein Episom replizieren oder (3) als ein Episom ohne Replikation vor der Elimination erhalten werden. Zellen können naturgemäß dazu im Stande sein, DNA aufzunehmen. Bestimmte Zellen, die nicht naturgemäß dazu im Stande sind, DNA aufzunehmen, erfordern verschiedene Behandlungen, wie oben beschrieben, um den Transfer von DNA über die Zellmembran zu induzieren.
  • Ein verwandter Gesichtspunkt der vorliegenden Erfindung zeichnet sich durch eine transformierte Zelle mit einem Vektor aus, der eine Nukleinsäuresequenz für einen modifizierten Rezeptor, wie hierin beschrieben, enthält. Wie hierin verwendet, bezieht sich der Ausdruck „transformiert" oder „Transformation" auf transiente, stabile oder permanente Veränderungen der Eigenschaften (exprimierter Phänotyp) einer Zelle durch den Mechanismus des Gentransfers. Genetisches Material wird in einer Form in eine Zelle eingeführt, in der es ein spezifisches Genprodukt exprimiert oder die Expression oder Auswirkungen endogener Genprodukte verändert.
  • Der Ausdruck „stabil", wie hierin verwendet, bezieht sich auf die Einführung eines Gens bzw. von Genen in das Chromosom der targetierten Zelle, wo es sich integriert bzw. sie sich integrieren und zu einem permanenten Bestandteil des genetischen Materials in dieser Zelle wird bzw. werden. Die Genexpression nach stabiler Transformation kann die Eigenschaften der Zelle permanent verändern, was zu einer stabilen Transformation führt. Eine episomale Transformation ist eine Variante der stabilen Transformation, in der das eingeführte Gen nicht in die Wirtszellenchromosome integriert wird, sondern stattdessen als ein extrachromosomales Element repliziert wird. Dies kann zu einer scheinbar stabilen Transformation der Eigenschaften einer Zelle führen. „Transient", wie hierin verwendet, bezieht sich auf die Einführung eines Gens in eine Zelle, um die Nukleinsäure zu exprimieren, z. B. exprimiert die Zelle spezifische Proteine, Peptide oder RNA, usw. Das eingeführte Gen wird nicht in das Wirtzellengenom integriert und wird dementsprechend über einen Zeitraum aus der Zelle eliminiert. Transiente Expression bezieht sich auf die Expression eines Genprodukts während einer Periode transienter Transfektion. Transiente Expression bezieht sich auch auf transfizierte Zellen mit einer begrenzten Lebensdauer.
  • Die Transformation kann mittels In-vivo-Techniken oder Ex-vivo-Techniken vorgenommen werden, wie in der PCT-Veröffentlichung WO 96/40911 beschrieben. Die Transformation kann gewebespezifisch sein, um die Expression der Nukleinsäure vorwiegend in dem Gewebe oder der Zelle nach Wahl zu regulieren.
  • Die Transformation der Zelle kann mit der Produktion einer Vielfalt von Genprodukten assoziiert sein, einschließlich Protein und RNA. Solche Produkte sind in der PCT-Veröffentlichung WO 96/40911 beschrieben. Das von der transformierten Zelle exprimierte Produkt hängt von der Nukleinsäure der Nukleinsäurekassette ab. In der vorliegenden Erfindung ist die zu exprimierende Nukleinsäure ein Fusionsprotein, wie oben angegeben, oder Variationen davon oder ein beliebiges der hierin offenbarten anderen Rezeptorproteine.
  • In einer Ausführungsform ist die transformierte Zelle eine Muskelzelle. Der Ausdruck „Muskel" bezieht sich auf myogene Zellen, einschließlich Myoblasten, Skelett-, Herz- und glatte Muskelzellen. Die Muskelzellen oder das Gewebe können bzw. kann in vivo, in vitro oder in Gewebekultur sein und zum Differenzieren in Muskelgewebe im Stande sein. In einer anderen Ausführungsform ist die transformierte Zelle eine Lungenzelle. Der Ausdruck „Lungenzelle", wie hierin verwendet, bezieht sich auf Zellen, die mit dem Lungensystem assoziiert sind. Die Lungenzelle kann ebenfalls in vivo, in vitro oder in Gewebekultur sein.
  • In noch einer anderen Ausführungsform ist die transformierte Zelle eine Zelle, die mit den Gelenken assoziiert ist. Der Ausdruck „Zellen, die mit den Gelenken assoziiert sind" bezieht sich auf alle zellulären und nicht zellulären Materialien, die das Gelenk (z. B. Knie oder Ellbogen) ausmachen und an der normalen Funktion des Gelenks beteiligt sind oder aufgrund von pathologischen Zuständen in dem Gelenk vorliegen. Zu diesen zählen Materialien, die mit Folgendem assoziiert sind: der Gelenkkapsel wie Synovialis, Synovia, Synovialzellen (einschließlich Typ-A-Zellen und Typ-B-Synovialzellen); die Knorpelbestandteile des Gelenks wie Chondrozyt, extrazelluläre Matrix von Knorpel; die Knochenstrukturen wie Knochen, Periost, Periostzellen, Osteoblast, Osteoklast; die immunologischen Bestandteile wie Entzündungszellen, Lymphozyten, Mastzellen, Monozyten, eosinophile Zelle; andere Zellen wie Fibroblasten und Kombinationen der obigen. Nach der Transformation exprimieren diese Zellen das Fusionsprotein. Ein Fachmann wird schnell begreifen, dass eine beliebige Zelle eine Transformation erfahren kann und innerhalb des Schutzumfangs dieser Erfindung liegt.
  • Ein Gesichtspunkt der vorliegenden Erfindung zeichnet sich durch Verfahren zum Transformieren einer Zelle mit einer einen Vektor enthaltenden Nukleinsäure, die für einen modifizierten Rezeptor kodiert, aus. Dieses Verfahren beinhaltet die Schritte des Transformierens einer Zelle in situ durch Inkontaktbringen der Zelle mit dem Vektor für einen Zeitraum, der dazu ausreicht, die Zelle zu transformieren. Wie oben erörtert, kann die Transformation in vivo oder ex vivo sein. Nach der Transformation exprimiert die Zelle den mutierten Glukokortikoidrezeptor. Dieses Verfahren beinhaltet Verfahren zum Einführen und Verfahren zum Integrieren des Vektors. „Integrieren" und „Einführen", wie hierin verwendet, beziehen sich auf die Aufnahme oder den Transfer des Vektors in einer Zelle bzw. in eine Zelle, so dass der Vektor das therapeutische Genprodukt in einer Zelle exprimieren kann, wie oben mit Transformation erörtert.
  • Die hierin beschriebenen modifizierten Rezeptoren können in einem Verfahren verwendet werden, das die Schritte des Transformierens einer Zelle mit einem Vektor, der eine Nukleinsäure enthält, die für den modifizierten Rezeptor von Interesse kodiert, umfasst. Die transformierten Zellen können den mutierten Rezeptor exprimieren. Der Rezeptor kann durch einen nicht natürlichen Liganden die Expression von auf Glukokortikoid reagierenden Genen regulieren, ob eine solche Regulation nun eine Transaktivierung oder Transrepression ist. Der Ausdruck „auf Glukokortikoid reagierende Gene", wie hierin verwendet, bezieht sich auf Gene, deren Expression von der Aktivierung des Glukokortikoidrezeptors reguliert wird. Eine solche Regulation beinhaltet sowohl eine positive als auch eine negative Regulation der Genexpression. Dies beinhaltet auch von GRE-gesteuerte (GRE = Glukokortikoid-Response-Element) Gene.
  • Dieses Verwendungsverfahren beinhaltet Verfahren des Genaustauschs unter Verwendung des Fusionsproteins, Verfahren der Gentherapie unter Verwendung des Fusionsproteins und Verfahren zum Verabreichen des Fusionsproteins, in denen dieselben Schritte angewendet werden. „Genaustausch", wie hierin verwendet, steht für Zuführen einer Nukleinsäuresequenz, die in vivo in einem Tier exprimiert werden kann und folglich die Funktion eines endogenen Gens, das in dem Tier fehlt oder defekt ist, bereitstellen oder verstärken kann.
  • Hierin werden Verfahren zur Verabreichung beschrieben, wie oben erörtert. Solche Verfahren beinhalten Verfahren zum Verabreichen eines Bestands an Polypeptid, Protein oder RNA an einen Menschen, ein Tier oder an Gewebekultur oder Zellen. Diese Verwendungsverfahren der oben angeführten Vektoren umfassen die Schritte des Verabreichens einer wirksamen Menge der Vektoren an einen Menschen, ein Tier oder Gewebekultur. Der Ausdruck „verabreichen" oder „Verabreichung", wie hierin verwendet, bezieht sich auf den Weg der Einführung eines Vektors oder Trägers von DNA in den Körper. Die Vektoren der obigen Verfahren und die unten erörterten Verfahren können mittels verschiedener Wege verabreicht werden. Die Verabreichung kann intravenös, Injektion zwischen Gewebe, topisch, oral oder mittels einer Genkanone oder Hyposprayinstrumenten erfolgen. Die Verabreichung kann direkt in ein Zielgewebe, z. B. Direktinjektion in den Synovialraum oder Zellen, oder mittels systemischer Abgabe erfolgen. Dies sind nur Beispiele und sie sind nicht einschränkend.
  • Die Verabreichung wird eine Vielfalt von Verfahren beinhalten, wie in der PCT-Veröffentlichung WO 96/40911 beschreiben. Siehe auch WO 93/18759 . Die bevorzugte Ausführungsform ist mittels Direktinjektion. Zu Verabreichungswegen zählen intramuskulär, Aerosol, oral, topisch, systemisch, Okular, intraperitoneal, intrathekal und/oder Fluidräume.
  • Der Ausdruck „wirksame Menge", wie hierin verwendet, bezieht sich auf ausreichenden Vektor, der an Menschen, Tiere oder in Gewebekulturzellen verabreicht wird, um die adäquaten Polypeptid-, Protein- oder RNA-Spiegel zu produzieren. Ein Fachmann erkennt, dass der adäquate Protein-, Polypeptid- oder RNA-Spiegel von der beabsichtigten Verwendung des bestimmten Vektors abhängen wird. Diese Spiegel werden je nach der Art der Verabreichung, Behandlung oder Vakzination sowie der beabsichtigten Verwendung unterschiedlich sein.
  • Ein Verfahren zum Verwenden der hierin beschriebenen mutierten Rezeptoren setzt RU486 als den nicht natürlichen Liganden ein, um die Genexpression zu regulieren. Dieser Ligand kann die mutierte Progesteron-Ligandenbindungsdomäne binden und die Transregulationsdomänen des Rezeptors aktivieren. RU486 kann die ädaquaten, auf Progesteron reagierenden Gene aktivieren oder reprimieren. Dies ist nur ein Beispiel und es soll nicht einschränkend sein. Fachmänner werden erkennen, dass andere nicht natürliche Liganden verwendet werden können.
  • Ein Verfahren zum Behandeln von Asthma wird beschrieben. Dieses Verfahren beinhaltet die Transformation von Zellen, die mit den Lungen oder dem Lungensystem assoziiert sind, mit den oben angeführten Vektoren. Die Vektoren enthalten Nukleinsäure, die das Fusionsprotein kodiert. Nach Expression in den Lungenzellen kann der mutierte Rezeptor die Expression der adäquaten auf Glukokortikoid reagierenden Gene und/oder GRE-gesteuerten Transgene durch einen nicht natürlichen Liganden transaktivieren oder transreprimieren.
  • Die obigen Verfahren zur Behandlung berufen sich auf die Verwendung von RU486 als dem nicht natürlichen Liganden. Die Transaktivierung und Transrepression kann erfolgen, wenn der mutierte Progesteronrezeptor von RU486 aktiviert wird. Die Gene, die als Reaktion auf die Ligandenbindung an das Fusionsprotein transreprimiert oder transaktiviert werden, werden oben beschrieben.
  • Ein Gesichtspunkt der vorliegenden Erfindung zeichnet sich durch ein transgenes, nicht menschliches Tier aus, dessen Zellen die Vektoren der vorliegenden Erfindung enthalten. Diese Zellen beinhalten Keim- oder somatische Zellen. Nicht menschliche, transgene Tiermodelle können zum Verständnis molekularer Karzinogenese und Erkrankung, Einschätzen und Erforschen neuartiger therapeutischer Wege für Auswirkungen durch potentielle chemische und physikalische Karzinogene und Tumorpromotoren verwendet werden.
  • Mit „transgenem Tier" ist ein Tier gemeint, dessen Genom eine zusätzliche Kopie oder Kopien des Gens von derselben Spezies enthält oder es enthält das Gen oder die Gene einer anderen Spezies, wie ein Gen, das für einen mutierten Glukokortikoidrezeptor kodiert und mittels Genmanipulations- oder Klonierungstechniken eingeführt wurde, wie hierin beschrieben und wie in der Technik bekannt. Das transgene Tier kann das resultierende Tier, in dem der Vektor in den Embryo inseriert wurde, aus dem das Tier sich entwickelte, oder eine beliebige Nachkommenschaft dieses Tiers beinhalten. Der Ausdruck „Nachkommenschaft", wie hierin beschrieben, beinhaltet direkte Nachkommenschaft des transgenen Tiers sowie beliebige Nachkommenschaft folgender Nachkommenschaft. Folglich wird ein Fachmann leicht erkennen, dass, wenn zwei unterschiedliche transgene Tiere erzeugt werden, wobei jeweils ein anderes Gen oder andere Gene verwendet wird bzw. werden, und sie gepaart werden, besteht die Möglichkeit, dass ein Teil der resultierenden Nachkommenschaft zwei oder mehr eingeführte Gene enthält. Ein Fachmann wird leicht erkennen, dass durch Steuern der Paarungen transgene Tiere, die mehrere eingeführte Gene enthalten, erzeugt werden können.
  • Weitere Merkmale und Vorteile der Erfindung werden aus der folgenden Beschreibung der bevorzugten Ausführungsformen dieser und aus den Ansprüchen offenbar werden.
  • Kurzbeschreibung der Zeichnungen
  • 1 zeigt die Mutagenese und Screening-Strategie, die in den vorliegenden Versuchen angewendet wird.
  • 2 stellt die funktionelle und strukturelle Charakterisierung der UP-1-Mutante dar.
  • 3 zeigt eine Western-Analyse des mutierten humanen Progesteronrezeptors.
  • 4 zeigt die Transkriptionsaktivitäts- und Hormonbindungsanalyse von Wildtyp- und mutierten humanen Progesteronrezeptorkonstrukten.
  • 5 zeigt die Spezifität der Transkriptionsaktivität des mutierten humanen Progesteronrezeptors.
  • 6 stellt die transinte Transfektion eines mutierten humanen Progesteronrezeptors in Säugerzellen bildlich dar.
  • 7 stellt die GR-PR-Fusionskonstrukte bildlich dar.
  • 8 stellt die Konstrukte mit doppelter Punktmutation von Ratten- und humanem GR bildlich dar.
  • 9 stellt die Nukleinsäuresequenz dar, die ein Plasmid pGR0403R kodiert, das ein konstitutiv aktives mutiertes GR-Protein exprimiert.
  • 10 stellt das Plasmid pGR0403R, das ein konstitutiv aktives mutiertes GR-Protein exprimiert, bildlich dar.
  • 11 stellt die Menge von CAT-Protein dar, die als Reaktion auf die Ligandenbindung an mutierten humanen und Ratten-GR und die jeweiligen Wildtyp-Rezeptoren produziert wird.
  • 12 ist eine schematische Darstellung des Fusionsproteins mit einer Aktivierungstransregulationsdomäne.
  • 13 ist eine schematische Darstellung des Genschalters.
  • 14 ist eine schematische Darstellung von GLVP und dessen Derivaten, die eine zusätzliche Transaktivierungsdomäne enthalten.
  • 15 ist eine schematische Darstellung der Auswirkung verschiedener Längen einer Poly-Q-Insertion auf das GLVP-Transaktivierungspotential.
  • 16 ist eine schematische Darstellung, dass eine zusätzliche Kopie der VP16-Aktivierungsdomäne in GLVP dessen Transaktivierungspotential nicht weiter steigert.
  • 17 ist ein Diagramm des chimären Original-GLVP und von dessen C-terminal verlängerten Derivaten.
  • 18 ist ein Diagramm der Transkriptionsaktivität von GLVP im Vergleich zu dessen C-terminal positionierter VP16-Aktivierungsdomäne und verschiedener Verlängerungen der hPR-LBD.
  • 19 ist ein Diagramm der Konstrukte von induzierbaren Repressoren und Reporter.
  • Die Zeichnungen sind nicht notwendigerweise maßstabsgetreu. Bestimmte Merkmale der Erfindung sind möglicherweise der Deutlichkeit und Kürze im Hinblick auf den Maßstab übertrieben dargestellt oder in schematischer Form gezeigt.
  • Ausführliche Beschreibung der Erfindung
  • Hierin werden modifizierte Proteine von Steroidhormonrezeptoren beschrieben. Zu Steroidhormonrezeptoren, die modifiziert sein können, zählen beliebige jener Rezeptoren, die die Steroidhormonrezeptor-Superfamilie ausmachen. Zu repräsentativen Beispielen solcher Rezeptoren zählen die Östrogen-, Progesteron-, Glukokortikoid-, Mineralokortikoid-, Androgen-, Schilddrüsenhormon-, Retinsäure-, Retinoid-X- und Vitamin-D3-Rezeptoren.
  • Die modifizierten Steroidhormonrezeptorproteine der vorliegenden Erfindung beinhalten eine Steroidrezeptorregion, die sich aus einer DNA-Bindungsdomäne, einen oder mehreren Transregulationsdomänen und einer mutierten Steroidrezeptor-Ligandenbindungsregion, die einen nicht natürlichen Liganden binden kann, zusammensetzt.
  • Die DNA-Bindungsdomäne enthält die Rezeptorregulationssequenz und bindet DNA. Eine solche Domäne kann eine Hefe-GAL4-DNA-Bindungsdomäne sein. Die Ligandenbindungsdomäne bindet die spezifische Verbindung, die den Rezeptor aktivieren wird, beispielsweise RU486.
  • Mehrere unterschiedliche funktionelle Domänen wurden in Transkriptionsfaktoren charakterisiert; sie können entweder sauer (VP16, GAL4), an Glutamin reich (SP1, Oct- 1, Oct2A), an Prolin reich (Oct3/4) oder an Serin oder Threonin reich (Pit1) sein (Wegner et al., Curr. Opin. in Cell Biol. 5:488-498 (1993)). Es ist bekannt, dass unterschiedliche Arten von Transkriptionsaktivierungsdomänen mit unterschiedlichen Koaktivatoren des allgemeinen Transkriptionsapparats interagieren. Wenn unterschiedliche Aktivierungsdomänen in einem Transaktivator zusammenfusioniert sind, können sie miteinander synergisieren, um dessen Transkriptionspotential zu steigern. Vor kurzem demonstrierten Gerber et al., dass eine Insertion von entweder einem Polyglutamin-(Poly-Q-) oder Polyprolinabschnitt (Poly-P-Abschnitt) in das GAL4-VP16 die Aktivierung von GAL4-VP16 fördert (Gerber et al., Science 263:808-811 (1994)).
  • Um die Potenz des GLVP-Regulators zu steigern, wurden unterschiedliche Längen von Poly-Q-Abschnitten, die von den Triplett-Wiederholungen (CAG)n kodiert werden, in den N-Terminus des GLVP-Regulators inseriert (14). Eine Transaktivierungsanalyse der verschiedenen Größen von Poly-Q-Insertionen in das GLVP zeigen, dass die Addition von 10-34Q die Transkriptionsaktivität des Regulators an dem Reportergen (17x4-TATA-hGH) steigert, während eine weitere Verlängerung von Poly-Q von einem 66Q-Oligomer in ein 132Q-Oligomer in einer reduzierten Aktivierung des Zielgens resultiert (15). Diese Versuche demonstrierten, dass eine Kombination unterschiedlicher Arten von funktionellen Domänen mit adäquater Stärke das Aktivierungspotential des chimären GLVP-Regulators weiter verbessert.
  • Um zu verstehen, ob zusätzliche Aktivierungsdomänen derselben Art ebenfalls das Aktivierungspotential des chimären Regulators steigern würden, wurde GLVPx2 mit 2 Kopien der VP16-Aktivierungsdomäne am N-Terminus konstruiert (14). Wie in 16 gezeigt ist, steigerte eine weitere Addition derselben Art von Transaktivierungsdomäne (VP16) das Aktivierungspotential des Regulators nicht.
  • Das Original-GLVP kann die Zielgenexpression effizient aktivieren, da es stärkere Promotoren enthält, wie den Thymidinkinasepromotor (tk-Promotor). Um die Transkriptionsaktivität von GLVP weiter zu fördern, wurde ein potenterer, von RU486 induzierbarer Genregulator erzeugt. Dieser neue Genregulator reagierte auf RU486 in einer Konzentration, die sogar noch niedriger war, als die von dem Original-GLVP verwendet wurde. In dieser Konzentration weist RU486 keinerlei Anti-Progesteron- oder Anti-Glukokortikoidaktivität auf. Das induzierbare System wurde erfolgreich dazu verwendet, sekretiertes NGF aus einem Reportergen in einer von RU486 abhängigen Art und Weise zu produzieren, um den Neuritauswuchs in kokultivierten PC 12-Zellen (von adrenalem Phäochromozytom der Ratte) zu induzieren. Diese von RU486 steuerbare Ligandenbindungsdomäne kann auch in einen induzierbaren Repressor zum Beenden der Zielgenexpression umgewandelt werden. Von individuellen Domänen in einem chimären Fusionsprotein wurde gezeigt, dass sie die Funktion des jeweils anderen in einem von der Position abhängigen Kontext beeinflussen.
  • Die Transkriptionsregulation der Genexpression wurde im letzten Jahrzehnt intensiv studiert (McKnight, Genes Dev. 10:367-381; Goodrich et al., Curr. Opin. in Cell Biol. 6:403-409; Pugh, Curr. Opin. in Cell Biol. 8:303-311). Es wird im Allgemeinen angenommen, dass Transkriptionsfaktoren selektiv an ihre Erkennungssequenzen an DNA (Promotoren und Enhancer) binden und direkt mit den TBP-assoziierten Faktoren (TAFs), Koaktivatoren oder Korepressoren interagieren, um die Transkriptionsaktivität zu aktivieren oder zu reprimieren. Kernhormonrezeptoren, wie Steroid-, Schilddrüsen-, Retinoid- und Orphan-Rezeptoren, sind eine einzigartige Klasse induzierbarer Transkriptionsfaktoren, die ihre jeweiligen Zielgene als Reaktion auf ihre zugehörigen Liganden modulieren können. Vor kurzem wurden mehrere Koaktivatoren (SRC-1) (Onate et al., Science 270:1354-1357 (1995)), CBP (Kamei et al., Cell 85:403-414 (1996)) und Korepressoren (N-CoR, SMART) (Hörlein et al., Nature 377:397-404 (1995); Chen et al., Nature 377:454-457 (1995)), die die Kernhormonrezeptoraktivierung von Zielgenen modifizieren, identifiziert. Diese Studien legen nahe, dass mehrere Proteinfaktoren am komplexen Vorgang der Transkriptionsregulation der Genexpression beteiligt sind.
  • Mutagenesestudien der hPR-Ligandenbindungsdomäne haben demonstriert, dass eine Erweiterung der LBD-Deletion von Aminosäureposition 891 auf 914 das Aktivierungspotential des chimären Regulators steigert. Eine Addition dieses kurzen Abschnitts von 23 Aminosäuren steigert das Dimerisationspotential der PR-LBD und die anschließende Bindung an deren Response-Element. Eine weitere Verlängerung der hPR-LBD von Rest 917 auf 928 resultiert in einer Abnahme der Transaktivierung, was nahe legt, dass diese Region als eine Repressorinteraktionsdomäne dienen kann. Tatsächlich, wenn dieser Abschnitt von 12 Aminosäuren an die GAL4-DNA-Bindungsdomäne ligiert wird, reicht dies aus, um die Transkriptionsrepression eines Zielgens zu verleihen, was nahe legt, dass diese 12 Aminosäuren mit einem noch unidentifizierten zellulären Korepressor interagieren könnten.
  • Viele chimäre Proteine wurden in den letzten Jahren konstruiert, um unterschiedliche funktionelle Domänen verschiedener Proteine zu einer vielseitigen Chimäre zu vereinen. Obgleich offensichtlich ist, dass jede Proteindomäne unabhängig funktionieren kann, ist verhältnismäßig wenig darüber bekannt, wie individuelle Domänen die Funktion des jeweils anderen in einem chimären Protein modulieren. Das Aktivierungspotential von VP16 wird von seiner relativen Position in dem chimären Regulator beeinflusst. Der C-terminal positionierte chimäre VP16-Regulator GL914VPC' aktiviert die Zielgenexpression effektiv, da er einen minimalen Promotor in einer RU486-Konzentration enthält, die um das 10-fache niedriger ist als sein N-terminal positioniertes VP16-Gegenstück, GL914VP. In dieser Konzentration wird von RU486 erwartet, dass es die endogene Genexpression nicht beeinträchtigt.
  • Dieses neue induzierbare System wird einen verbesserten Sicherheitsspielraum liefern und weiter zu seiner Anwendung zur Genregulation in vivo beitragen. Mutationsstudien offenbarten, dass der chimäre Regulator GL914VPC' etwa 8- bis 10-mal potenter ist als unser ursprünglich beschriebener Regulator GLVP und bei einer niedrigeren Ligandenkonzentration reagiert. Des Weiteren können in einem chimären Protein individuelle funktionelle Domänen, wie die an der Transaktivierung, DNA-Bindung und Ligandenbindung beteiligten, die Funktion des jeweils anderen modulieren, je nach ihren relativen Positionen.
  • Protein-Protein-Interaktionsstudien legen nahe, dass unterschiedliche Arten von Transaktivierungs- oder Transrepressionsdomänen mit ihren jeweiligen TAFs oder Koaktivator-, Korepressormolekülen in dem RNA-Polymerase-Il-Präinitiationskomplex interagieren, um die Gentranskription zu verändern (Pugh, Curr. Opin. in Cell Biol. 8:303-311; Goodrich et al., Cell 75:519-530 (1993)). An Glutamin reiche Abschnitte wurden in verschiedenen Transkriptionsfaktoren (SP1, Oct-1 und Androgenrezeptor) identifiziert, obwohl ihre präzise Funktion unbekannt ist (Wegner et al., Curr. Opin. in Cell Biol. 5:488-498 (1993); Gerber et al., Science 263:808-811 (1994)). Erweiterte Regionen von Triplett-CAG-Wiederholungen wurden in mehreren neurodegenerativen Erkrankungen impliziert, wie Chores Huntington, Kennedy-Syndrom, dentatorubrale Pallidoluysian-Atrophie (DRPLA) und hereditäre spinozerebelläre Ataxien (SCHI) (Kuhl et al., Curr. Opin. in Genet. Dev. 3:404-407 (1993); Ross et al., Trends in Neurosci. 16:254-260 (1993); Ashley et al., Annu. Rev. Genet. 29:703-728 (1995)).
  • Vor kurzem haben mehrere Gruppen Proteine isoliert, die für die oben erwähnten neurodegenerativen Erkrankungen verantwortlich zeichnen, und bestätigt, dass sie in der Tat lange Polyglutaminabschnitte (Poly-Q-Abschnitte) enthalten, die von den erweiterten CAG-Wiederholungen kodiert werden (Servadio et al., Nature Genet. 10:94-98 (1995); Yazawa et al., Nature Genet. 10:99-103 (1995); Trottier et al, Nature Genet. 10:104-110 (1995)). Um die Rolle von Poly-Q-Abschnitten in der Transkriptionsregulation weiter zu verstehen, wurden verschiedene Längen von Poly-! in den N-Terminus von GLVP inseriert.
  • Die Addition eines 10-34-Oligomers von Poly-Q resultiert in einer synergistischen Transkriptionsaktivierung, während erweiterte CAG-Triplett-Wiederholungen über 66 oligomere Glutamine hinaus das Transaktivierungspotential des chimären Regulators GLVP nicht weiter steigern. Diese Beobachtungen legen nahe, dass Struktur- und Konformationsänderungen an Proteinen, die von der erweiterten CAG-Triplett-Wiederholung kodiert werden, beteiligt sein könnten, im Vergleich zu dem Poly-Q mit regulärer Länge, das von 10-30 Wiederholungen von CAG in normalem Protein kodiert wird. Diese Ergebnisse legen nahe, dass eine neurologische Erkrankung mit erweiterten CAG-Wiederholungen (> 40 mer) möglicherweise nicht in einem abweichend hohem Transkriptionspotential begründet ist, sondern stattdessen in einem Einfluss auf andere Gesichtspunkte der Zellfunktion begründet ist (Burke et al., Nature Medicine 2:347-350 (1996)).
  • Ein Transkriptionsfaktor kann in Abhängigkeit von dem Promotor/Enhancer-Kontext seiner bestimmten Ziel-DNA und den Koregulatorproteinen, mit dem er interagiert, entweder die Genexpression aktiveren oder reprimieren, (Kingston et al., Genes Dev. 10:905-920 (1996)). Zum Beispiel bindet der Schilddrüsenhormonrezeptor (TR) bei Fehlen von Schilddrüsenhormon (T3) normalerweise an seine Erkennungssequenz an DNA und reprimiert die Zielgenaktivierung durch Interaktionen mit Korepressoren (Baniahmad et al., Mol. Cell. Biol. 15:76-86 (1995); Shibata et al. (unveröffentlicht) (1996); Chen et al., Nature 377:454-457 (1995)). Bei Vorliegen von T3 wird der Korepressor aus dem Rezeptor freigesetzt und Koaktivatoren werden rekrutiert, um die Genexpression zu fördern. Viele Transkriptionsfaktoren, wie p53, WT-1, YY1, Rel, können ebenfalls in Abhängigkeit von der DNA-Matrize und Proteinkofaktoren, mit denen sie interagieren, als Dual-Aktivatoren und -Repressoren fungieren.
  • Der Drosophila-Zinkfinger-Transkriptionsfaktor, Krüppel, wird von einem Gap-Gen kodiert und ist für die Organogenese während der späteren Entwicklungsstadien unabdingbar. Durch In-vitro-Protein-Protein-Interaktionsstudien haben Sauer et al. demonstriert, dass das Krüppel-Protein in niedriger Proteinkonzentration (monomere Form) als ein Transkriptionsaktivator fungiert, indem es mit TFIIB interagiert. In einer höheren Proteinkonzentration bildet Krüppel jedoch ein Dimer und interagiert direkt mit TFIIEβ, was in einer Transkriptionsrepression resultiert. Mehrere mit Krüppel verwandte Proteine wurden vor kurzem in Säugerzellen identifiziert (Witzgall et al., Mol. Cell. Biol. 13:1933-1942 (1993); Witzgall et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 91:4514-4518 (1994); Margolin et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 91:4509-4513 (1994)). Eines von diesen, Kid-1, wurde aus Rattenniere isoliert und enthält eine stark konservierte Region von –75 Aminosäuren am N-Terminus, die als Krüppel-assoziierte Box (KRAB) bezeichnet wird.
  • Es wurde gezeigt, dass die KRAB-Domäne als ein potenter Repressor fungieren kann, wenn sie mit einer Hefe-GAL4-DNA-Bindungsdomäne oder TetR fusioniert wird (Deutschle et al., Mol. Cell. Biol. 15:1907-1914 (1995)). Ein Ersetzen der VP16-Transkriptionsaktivierungsdomäne durch die Kid-1-KRAB-Repressionsdomäne wandelt einen regulierbaren Transaktivator in einen regulierbaren Repressor. Durch Austauschen der GAL4-DNA-Bindungsdomäne durch die DNA-Bindungsdomäne eines anderen Proteins kann die Repression eines Zielgens (z. B. Tumorproliferationsgen) als Reaktion auf den Liganden RU486 erzielt werden. Vor kurzem berichteten Deutschle et al., dass die KRAB-Domäne, die aus Koxl-Zinkfingerprotein isoliert wurde, das mit dem von Kid-i eine umfassende Homologie teilt, mit einem Adaptorprotein von 110 kDa interagiert, das als SMP1 (silencing-mediating Protein 1, inaktivierendes/-vermittelndes Protein 1) bezeichnet wird. Die Eigenschaften und der Mechanismus dieses Adaptorproteins müssen noch ermittelt werden. Vor kurzem wurde ein KRAB-assoziiertes Protein-1 (KAP-1) identifiziert, das an die KRAB-Domäne bindet und als ein Transkriptionskorepressor funktioniert (Friedman et al., Gene and Dev. 10:2067 (1996)).
  • Unter Verwendung des neu modifizierten GL914VPC' wurde die Regulation des Neuritauswuchses in PC12-Zellen über eine von RU486 steuerbare Expression von NGF erzielt. Dieses neuartige induzierbare System kann eingesetzt werden, um die biologische Funktion auf eine zeitliche Art und Weise zu analysieren. Zum Beispiel könnte die Rolle eines Wachstumsfaktors in einem bestimmten Entwicklungsstadium beurteilt werden und die sequentielle Beziehung von In-vivo-Zelltod und Proliferation könnte auf eine Art und Weise abgegrenzt werden, die mit konstitutiver Expression des Testgens nicht möglich sind.
  • Es wurde eine gewebespezifische Regulation der Genexpression in transgenen Mäusen unter Nutzung dieses induzierbaren Systems demonstriert. Ein von RU486 induzierbarer Regulator kann dazu verwendet werden, ein induzierbares Gen-Knockout (zeitlich und/oder räumlich) in transgenen Mäusen zu erzeugen, was eine embryonale Letalität umgehen könnte, die aus der Verwendung gegenwärtiger Gen-Knockout-Techniken resultiert. Eine kombinatorische Einbindung anderer induzierbarer Systeme, wie des Tetracyclin- oder Ecdyson-Systems, mit dem von RU486 induzierbaren System kann Biologen eines Tages ermöglichen, komplexe biologische Vorgänge zu modulieren, die mehrere Steuerungsniveaus einschließen.
  • Die folgenden sind Beispiele der vorliegenden Erfindung unter Verwendung der mutierten Steroidrezeptoren zur Gentherapie. Einem Fachmann wird leicht offensichtlich werden, dass verschiedene Substitutionen und Modifikationen an der hierin offenbarten Erfindung vorgenommen werden können, ohne vom Schutzumfang und Geist der Erfindung abzuweichen. Folglich werden diese Beispiele zur Veranschaulichung dargeboten und sollen die Erfindung in keinerlei Weise einschränken.
  • Die folgenden sind spezifische Beispiele bevorzugter Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung. Diese Beispiele demonstrieren, wie die molekularen Schaltmechanismen der vorliegenden Erfindung bei der Konstruktion verschiedener Zell- oder Tiermodelle verwendet werden können und wie solche molekularen Schaltmechanismen zum Transaktivieren oder Transreprimieren der Regulation der Genexpression verwendet werden können.
  • Verwendungsverfahren
  • Zelltransformation
  • Eine Ausführungsform der vorliegenden Erfindung beinhaltet Zellen, die mit Nukleinsäure transformiert wurden, die für den mutierten Rezeptor kodiert. Nachdem die Zellen transformiert wurden, werden die Zellen das Protein, das Polypeptid oder die RNA exprimieren, das bzw. die von der Nukleinsäure kodiert wird. Zellen beinhalten, sind jedoch nicht darauf beschränkt, Gelenke, Lungen, Muskel und Haut. Dies soll in keinerlei Weise einschränkend sein.
  • Die Nukleinsäure, die das genetische Material von Interesse enthält, ist positional und sequentiell in dem Wirt oder Vektoren ausgerichtet, so dass die Nukleinsäure in RNA transkribiert und, falls erforderlich, in Proteine oder Polypeptide in den transformierten Zellen translatiert werden kann. Eine Vielfalt mutierter Glukokortikoidproteine und -polypeptide kann von der Sequenz in der Nukleinsäurekassette in den transformierten Zellen exprimiert werden.
  • Die Transformation kann entweder mittels In-vivo- oder Ex-vivo-Techniken vorgenommen werden. Ein Fachmann wird mit solchen Techniken zur Transformation vertraut sein. Die Transformation mittels Ex-vivo-Techniken beinhaltet das Kotransfizieren der Zellen mit DNA, die einen selektierbaren Marker enthält. Dieser selektierbare Marker wird zum Auswählen jener Zellen, die transformiert wurden, verwendet. Selektierbare Marker sind Fachmännern wohl bekannt.
  • Zum Beispiel besteht ein Ansatz zur Gentherapie für Muskelerkrankungen darin, Myoblasten von einer betroffenen Einzelperson zu entfernen, sie in vitro gentechnisch zu verändern und sie in einen Aufnahmelocus zu reimplantieren. Der Ex-vivo-Ansatz beinhaltet die Schritte des Erntens von Myoblasten, Kultivieren der Myoblasten, Transduzieren oder Transfizieren der Myoblasten und Einführen der transfizierten Myoblasten in die betroffene Einzelperson.
  • Die Myoblasten können mittels einer Vielfalt von Methoden erhalten werden. Sie können von der Einzelperson entnommen werden, die zu einem späteren Zeitpunkt mit den Myoblasten, die transformiert wurden, zu injizieren ist, oder sie können aus anderen Quellen gesammelt, transformiert und dann in die Einzelperson von Interesse injiziert werden.
  • Nachdem die Ex-vivo-Myoblasten gesammelt wurden, können sie durch Inkontaktbringen der Myoblasten mit Medien, die den Nukleinsäuretransporter enthalten, und Aufbewahren der kultivierten Myoblasten in den Medien für einen ausreichenden Zeitraum und unter Bedingungen, die zur Aufnahme und Transformation der Myoblasten geeignet sind, transformiert werden. Die Myoblasten können dann mittels Injektion von Zellsuspensionen in Gewebe in eine adäquate Stelle eingeführt werden. Ein Fachmann wird erkennen, dass die Zellsuspension Folgendes enthalten kann: Salze, Puffer oder Nährsubstanzen, um die Lebensfähigkeit der Zellen zu erhalten; Proteine, um die Zellstabilität sicherzustellen; und Faktoren, um die Angiogenese und das Wachstum der implantierten Zellen zu fördern.
  • In einem alternativen Verfahren können geerntete Myoblasten ex vivo auf einer Matrix gezüchtet werden, die aus Kunststoffen, Fasern oder gelatineartigen Materialien besteht und die nach der Transduktion chirurgisch in eine adäquate Stelle implantiert werden kann. Diese Matrix kann mit Faktoren imprägniert werden, um die Angiogenese und das Wachstum der implantierten Zellen zu fördern. Die Zellen können dann reimplantiert werden.
  • Verabreichung
  • Verabreichung, wie hierin verwendet, bezieht sich auf den Weg der Einführung eines Vektors oder Trägers von DNA in den Körper. Die Verabreichung kann intravenöse, intramuskuläre, topische oder orale Abgabeverfahren beinhalten. Die Verabreichung kann direkt an ein Zielgewebe oder mittels systemischer Abgabe erfolgen.
  • Insbesondere kann die vorliegende Erfindung zum Behandeln einer Erkrankung oder zum Verabreichen der formulierten DNA-Expressionsvektoren, die eine beliebige spezifische Nukleinsäuresequenz exprimieren können, verwendet werden. Die Verabreichung kann auch das Verabreichen eines oben erörterten regulierbaren Vektors beinhalten. Eine solche Verabreichung eines Vektors kann zum Behandeln einer Erkrankung angewendet werden. Die bevorzugte Ausführungsform ist mittels Direktinjektion an das Zielgewebe oder systemischer Verabreichung.
  • Ein zweiter wichtiger Schritt ist die Abgabe des DNA-Vektors an den Nukleus der Zielzelle, wo er ein Genprodukt exprimieren kann. In der vorliegenden Erfindung wird dies mittels Formulierung erzielt. Die Formulierung kann aus gereinigten DNA-Vektoren oder DNA-Vektoren, die mit anderen Formulierungselementen, wie Lipiden, Proteinen, Kohlenhydraten, synthetischen organischen oder anorganischen Verbindungen, assoziiert sind, bestehen. Beispiele solcher Formulierungselemente beinhalten, sind jedoch nicht darauf beschränkt, Lipide, die Liposome bilden können, kationische Lipide, hydrophile Polymere, Polykationen (z. B. Protamin, Polybren, Spermidin, Polylysin), Peptid- oder synthetische Liganden, die Rezeptoren auf der Oberfläche der Zielzellen erkennen, Peptid- oder synthetische Liganden, die eine endosomale Lyse induzieren, Peptid- oder synthetische Liganden, die Materialien auf den Nukleus richten können, Gele, Matrizen mit langsamer Freisetzung, lösliche oder unlösliche Teilchen sowie andere Formulierungselemente, die nicht aufgeführt sind. Dies beinhaltet Formulierungselemente zum Fördern der Abgabe, Aufnahme, Stabilität und/oder Expression von genetischem Material in Zellen.
  • Die Abgabe und Formulierung eines beliebigen gewählten Vektorkonstrukts wird von der bestimmten Anwendung der Expressionsvektoren abhängen. Im Allgemeinen wird sich eine spezifische Formulierung für jedes verwendete Vektorkonstrukt auf die Vektoraufnahme im Hinblick auf das bestimmte targetierte Gewebe, gefolgt von einer Demonstration der Wirksamkeit richten. Aufnahmestudien werden Aufnahmeassays beinhalten, um die zelluläre Aufnahme der Vektoren und die Expression der gewebespezifischen DNA nach Wahl zu bewerten. Solche Assays werden auch die Lokalisierung der Ziel-DNA nach der Aufnahme ermitteln und die Erfordernisse zur Aufrechterhaltung von Steady-State-Konzentrationen von exprimiertem Protein festlegen. Dann können die Wirksamkeit und die Zytotoxizität geprüft werden. Die Toxizität wird nicht nur die Zellenlebensfähigkeit, sondern auch die Zellfunktion beinhalten.
  • Die DNA-Aufnahme durch Zellen, die mit Fluidräumen assoziiert sind, hat die einzigartige Fähigkeit, nach einfacher Injektion gereinigter DNA-Präparate in die Fluidräume DNA aus dem extrazellulären Raum aufzunehmen. Die Expression von DNA mittels dieses Verfahrens kann mehrere Monate aufrechterhalten werden.
  • Das Integrieren von DNA mittels Formulierung in teilchenförmige Komplexe von Nanometergröße, die eine Endozytose durchmachen, erhöht den Bereich von Zelltypen, die Fremdgene aus dem extrazellulären Raum aufnehmen werden.
  • Die Formulierung kann auch DNA-Transporter einschließen, die einen nichtkovalenten Komplex mit DNA bilden und den Transport der DNA durch die Zellmembran steuern können. Dies kann die Sequenz von Schritten einschließen, die Endozytose und verstärkte endosomale Freisetzung beinhaltet. Es ist bevorzugt, dass der Transporter auch die DNA durch die Zellkernmembran transportiert. Siehe z. B. Woo et al., WO 93/18759 mit dem Titel „A DNA Transporter System and Method of Use".
  • Darüber hinaus kann die Abgabe zellspezifisch oder gewebespezifisch sein, indem zell- oder gewebespezifische Promotoren eingebunden werden. Des Weiteren können mRNA-stabilisierende Sequenzen (3'-UTRs) zum Bereitstellen von stabilisierten modifizierten Rezeptormolekülen verwendet werden. Solche stabilisierenden Sequenzen erhöhen die Halbwertzeit von mRNAs und können zell- oder gewebespezifisch sein. Das Obige wird in der US-Patentschrift 5,298,422 (Schwartz et al.) detaillierter erörtert.
  • In einem bevorzugten Verabreichungsverfahren, das ein DNA-Transportersystem einschließt, weist das DNA-Transportersystem einen DNA-Bindungskomplex mit einem Bindungsmolekül auf, das nichtkovalent an DNA binden kann, die kovalent mit einem Oberflächenliganden verknüpft ist. Der Oberflächenligand kann an einen Zelloberflächenrezeptor binden und den Eintritt in die Zelle durch Endozytose, Pinozytose oder Potozytose stimulieren. Darüber hinaus kann ein zweiter DNA-Bindungskomplex nichtkovalent an DNA binden und ist kovalent mit einem Zellkemliganden verknüpft. Der Zellkernligand kann ein Transportersystem erkennen und durch eine Zellkernmembran transportieren. Darüber hinaus kann ein dritter DNA-Bindungskomplex verwendet werden, der ebenfalls nichtkovalent an DNA binden kann. Das dritte Bindungsmolekül ist kovalent mit einem Element verknüpft, das eine endosomale Lyse oder verstärkte Freisetzung des Komplexes aus dem Endosom nach einer Endozytose induziert. Die Bindungsmoleküle können Spermin, Sperminderivate, Histone, kationische Peptide und/oder Polylysin sein. Siehe auch C.F. Szoka Jr. et al., Bioconjug. Chem. 4:85-93 (1993); F.C. Szoka Jr. et al., P.N.A.S., 90:893-897 (1993).
  • Der direkte Transfer von Genen ist sehr effektiv gewesen. Versuche zeigen, dass die Verabreichung mittels Direktinjektion von DNA in Gelenkgewebe in der Expression des Gens im Bereich der Injektion resultiert. Die Injektion von Plasmiden, die die mutierten Rezeptoren enthalten, in die Räume der Gelenke resultiert in der Expression des Gens für längere Zeiträume. Die injizierte DNA scheint in einem unintegrierten extrachromosomalen Zustand bestehen zu bleiben. Dies bedeutet, dass ein Transfer die bevorzugte Ausführungsform ist.
  • Die zur Abgabe verwendete Formulierung kann auch durch Liposome oder kationische Lipide erfolgen. Liposome sind hohle sphärische Vesikel, die sich aus Lipiden zusammensetzen, die in einer ähnlichen Art und Weise angeordnet sind wie jene Lipide, die die Zellmembran ausmachen. Sie haben einen inneren wässrigen Raum zum Einschließen wasserlöslicher Verbindungen und reichen in Bezug auf die Größe einen Durchmesser von 0,05 bis zu mehreren Mikrometern. Mehrere Studien haben gezeigt, dass Liposome Nukleinsäuren an Zellen abgeben können und dass die Nukleinsäure biologisch aktiv bleibt. Von kationischen Lipidformulierungen, wie Formulierungen, die DOTMA einbinden, wurde gezeigt, dass sie DNA-Expressionsvektoren an Zellen abgeben, was eine Produktion des entsprechenden Proteins ergibt. Lipidformulierungen können in Bezug auf die Zusammensetzung nichttoxisch und biologisch abbaubar sein. Sie zeigen Halbwertzeiten mit langer Zirkulierung und Erkennungsmoleküle können leicht an ihre Oberfläche zum Richten auf Gewebe angelagert werden. Schließlich hat eine kosteneffiziente Herstellung liposombasierter Pharmazeutika, entweder in einer flüssigen Suspension oder einem lyophilisierten Produkt, die Durchführbarkeit dieser Technologie als ein annehmbares Arzneimittelabgabesystem bewiesen. Siehe C.F. Szoka Jr. et al., Pharm. Res. 7:824-834 (1990); F.C. Szoka Jr. et al., Pharm. Res. 9:1235-1242 (1992).
  • Das gewählte Abgabeverfahren sollte in einer nuklearen oder zytoplasmatischen Akkumulation und einer optimalen Dosierung resultieren. Die Dosierung wird von der Erkrankung und dem Verabreichungsweg abhängen, sollte jedoch zwischen 1-1000 μg/kg Körpergewicht liegen. Diese Konzentration ist mittels Standardverfahren leicht ermittelbar. Sie könnte mehr oder weniger von der optimalen Dosierung abhängen. Die Behandlungsdauer wird sich über den Verlauf der Krankheitssymptome erstrecken, möglicherweise kontinuierlich. Die Anzahl der Dosen wird von der Erkrankung, der Formulierung und der Wirksamkeitsdaten aus klinischen Versuchen abhängen.
  • Im Hinblick auf Vektoren beinhalten die pharmakologische Dosis eines Vektors und das Niveau der Genexpression in dem entsprechenden Zelltyp ausreichendes Protein oder ausreichende RNA, sind jedoch nicht darauf beschrankt, um entweder: (1) das Niveau der Proteinproduktion zu erhöhen; (2) die Produktion eines Proteins zu reduzieren oder anzuhalten; (3) die Aktion eines Proteins zu inhibieren; (4) die Proliferation oder Akkumulation spezifischer Zelltypen zu inhibieren und (5) die Proliferation oder Akkumulation spezifischer Zelltypen zu induzieren. Als ein Beispiel, wenn ein Protein produziert wird, das die Akkumulation von Entzündungszellen in dem Gelenk bewirkt, kann die Expression dieses Proteins inhibiert werden oder die Aktion dieses Proteins kann beeinträchtigt, verändert oder geändert werden.
  • Beständige Expression unter Verwendung episomaler Vektoren
  • In jedem der vorstehenden Beispiele induziert die transiente Expression rekombinanter Gene die gewünschte biologische Reaktion. In einigen Erkrankungen ist eine beständigere Expression rekombinanter Gene wünschenswert. Dies wird erzielt, indem Elemente hinzugefügt werden, die eine extrachromosomale (episomale) Replikation von DNA in die Struktur des Vektors ermöglichen. Vektoren, die zur episomalen Replikation im Stande sind, werden als extrachromosomale Moleküle erhalten und können replizieren. Diese Sequenzen werden nicht durch einfachen Abbau eliminiert, werden jedoch weiterhin kopiert. Episomale Vektoren stellen eine längere oder beständige, wenn auch nicht notwendigerweise stabile oder permanente Expression rekombinanter Gene in dem Gelenk bereit. Beständige im Gegensatz zu stabiler Expression ist wünschenswert, um Anpassungen der pharmakologischen Dosis des rekombinanten Genprodukts zu ermöglichen, während die Erkrankung sich im Zeitablauf entwickelt.
  • Formulierungen zur Genabgabe in Zellen des Gelenks
  • Anfängliche Versuche setzten DNA in Formulierungen zum Gentransfer in Zellen des Gelenks ein. Diese DNA wird von Synovialzellen während des Prozesses dieser Zellen, die Synovia durch Sekretion und Pinozytose kontinuierlich zu resorbieren und umzumodellieren, aufgenommen. Die Genabgabe wird unter Verwendung kationischer Lipide, hydrophiler (kationischer) Polymere oder DNA-Vektoren, die mit Polykationen kondensiert sind, die den Eintritt von DNA-Vektoren in kontaktierte Zellen fördern, durch Verpacken von DNA in Teilchen verstärkt. Formulierungen können den Eintritt von DNA-Vektoren in den Körper der Zelle fördern, indem Elemente integriert werden, die die endosomale Freisetzung fördern können, wie bestimmte Oberflächenproteine aus Adenovirus, Influenzavirus-Hämagglutinin, synthetischem GALA-Peptid oder Bakterientoxin. Formulierungen können den Eintritt von DNA-Vektoren in die Zelle weiter fördern, indem Elemente integriert werden, die an Rezeptoren auf der Oberfläche von Zellen in dem Gelenk binden und die Aufnahme und Expression verstärken können. Alternativ kann teilchenförmige DNA, die mit Polykationen komplexiert wurde, effektive Substrate für die Phagozytose durch Monozyten oder andere Entzündungszellen sein. Darüber hinaus können Teilchen, die DNA-Vektoren enthalten, zum Gentransfer in die Zellen des Gelenks verwendet werden. Ein Fachmann wird erkennen, dass die obigen Formulierungen außerdem auch mit anderen Geweben verwendet werden können.
  • Induktion von „Steroidreaktion" durch Gentransfer von Steroidrezeptoren in Zellen des Gelenks Die gegenwärtige Therapie für schwere Arthritis schließt die Verabreichung pharmakologischer Agentien, einschließlich Steroiden, ein, um die Entzündungsreaktion zu mindern. Steroide können systemisch oder lokal mittels Direktinjektion in die Gelenkhöhle verabreicht werden.
  • Steroide funktionieren normalerweise durch Binden an Rezeptoren im Zytoplasma von Zellen. Die Bildung des Steroidrezeptorkomplexes ändert die Struktur des Rezeptors, so dass er dazu in die Lage versetzt wird, zu dem Nukleus zu translozieren und an spezifische Sequenzen in dem Genom der Zelle zu binden und die Expression spezifischer Gene zu verändern. Genetische Modifikationen des Steroidrezeptors können vorgenommen werden, die diesem Rezeptor ermöglichen, nicht natürliche Steroide zu binden. Andere Modifikationen können vorgenommen werden, um einen mutierten Steroidrezeptor zu erzeugen, der „konstitutiv aktiv" ist, was heißt, dass er an DNA binden und die Genexpression bei Fehlen von Steroid auf dieselbe Art und Weise regulieren kann, in der der natürliche Steroidrezeptor die Genexpression nach Behandlung mit natürlichen oder synthetischen Steroiden reguliert.
  • Von besonderer Bedeutung ist die Wirkung von Glukokortikoidsteroiden, wie Cortison, Hydrocortison, Prednison oder Dexamethason, bei denen es sich um wirksame Arzneimittel handelt, die zur Behandlung von Arthritis zur Verfügung stehen. Ein Ansatz zum Behandeln von Arthritis besteht darin, einen Vektor einzuführen, in dem die Nukleinsäurekassette einen gentechnisch veränderten Steroidrezeptor in Zellen des Gelenks exprimiert, z. B. ein gentechnisch veränderter Steroidrezeptor, der die Wirkung von Glukokortikoid nachahmt, zur Wirkung jedoch nicht das Vorliegen von Glukokortikoid erfordert. Dies wird durch Expression eines oben erörterten Fusionsrezeptorproteins oder anderer mutierter Glukokortikoidrezeptoren wie jenen, die in Zellen des Gelenks konstitutiv aktiv sind, erzielt. Dies induziert die therapeutischen Wirkungen von Steroiden ohne die systemische Toxizität dieser Arzneimittel.
  • Alternativ ermöglicht die Konstruktion eines Steroidrezeptors, der von einem neuartigen, normalerweise inerten Steroid aktiviert wird, die Verwendung von Arzneimitteln, die sich nur auf Zellen auswirken würden, die diesen Rezeptor aufnehmen. Diese Strategien erzielen eine therapeutische Wirkung von Steroiden auf Arthritis ohne die tief greifenden systemischen Komplikationen, die mit diesen Arzneimitteln assoziiert sind. Von besonderer Bedeutung ist die Fähigkeit, diese Gene differentiell zu spezifischen Zelltypen (beispielsweise Synovialzellen im Vergleich zu Lymphozyten) zu targetieren, um sich auf die Aktivität dieser Zellen auszuwirken.
  • Die Steroidrezeptorfamilie von Genregulationsproteinen ist ein idealer Satz solcher Moleküle. Diese Proteine sind von einem Ligand aktivierte Transkriptionsfaktoren, deren Liganden von Steroiden zu Retinsäure, Fettsäuren, Vitaminen, Schilddrüsenhormonen und anderen gegenwärtig unidentifizierten kleinen Molekülen reichen. Diese Verbindungen binden an Rezeptoren und aktivieren oder reprimieren die Transkription.
  • Progesteronrezeptorfusionsproteine können modifiziert werden, um zu ermöglichen, dass sie an verschiedene Liganden binden, deren Struktur sich von natürlich vorkommenden Liganden unterscheidet. Zum Beispiel resultieren kleine C-terminale Veränderungen der Aminosäuresequenz, einschließlich Kürzung, in einer veränderten Affinität der Ligandenbindung an den Progesteronrezeptor. Durch Screenen von Rezeptormutanten können Rezeptoren individuell angepasst werden, um auf Liganden zu reagieren, die die endogenen Rezeptoren einer Wirtszelle nicht aktivieren.
  • Ein Durchschnittsfachmann wird jedoch erkennen, dass verschiedene Mutationen, beispielsweise eine kürzere Deletion carboxyterminaler Aminosäuren, erforderlich sein werden, um geeignete Mutanten bestimmter Steroidhormonrezeptorproteine zu erzeugen. Steroidhormonrezeptoren, die möglicherweise mutiert sind, sind beliebige jener Rezeptoren, die die Steroidhormonrezeptor-Superfamilie umfassen, wie Rezeptoren, einschließlich der Östrogen-, Progesteron-, Glukokortikoid-α-, Glukokortikoid-β-, Mineralokortikoid-, Androgen-, Schilddrilsenhormon-, Retinsäure- und Vitamin-D3-Rezeptoren.
  • Direkte DNA-Abgabe an Muskel
  • Erkrankungen, die aufgrund vieler verschiedener Gründe in einer anomalen Muskelentwicklung resultieren, können unter Verwendung der obigen modifizierten Progesteronrezeptoren behandelt werden. Diese Erkrankungen können durch Verwendung der direkten Abgabe von Genen, die für den mutierten Progesteronrezeptor kodieren, was in der Produktion von mutiertem Rezeptorgenprodukt resultiert, behandelt werden. Gene, die reprimiert oder aktiviert werden können, wurden oben detailliert dargestellt.
  • Direkte DNA-Abgabe an die Lungen
  • Die gegenwärtige Therapie für schweres Asthma schließt die Verabreichung pharmakologischer Agentien, einschließlich Steroiden, ein, um die Asthmareaktion zu inhibieren. Steroide können systemisch oder lokal mittels Direktinstillation oder Abgabe in die Lungen verabreicht werden.
  • Von besonderer Bedeutung ist die Wirkung von Glukokortikoidsteroiden, wie Cortison, Hydrocortison, Prednison oder Dexamethason, bei denen es sich um die wichtigsten wirksamen Arzneimittel handelt, die zur Behandlung von Asthma zur Verfügung stehen. Ein Ansatz zum Behandeln von Asthma besteht darin, einen Vektor einzuführen, in dem die Nukleinsäurekassette einen gentechnisch veränderten Steroidrezeptor in Zellen der Lungen exprimiert, z. B. ein gentechnisch veränderter Steroidrezeptor, der die Wirkung von Glukokortikoid nachahmt, zur Wirkung jedoch nicht das Vorliegen von Glukokortikoid erfordert. Dies wird durch Expression der oben erörterten Fusionsproteine oder anderer mutierter Glukokortikoidrezeptoren wie jenen, die in Zellen der Lungen konstitutiv aktiv sind, erzielt. Dies induziert die therapeutischen Wirkungen von Steroiden ohne die systemische Toxizität dieser Arzneimittel.
  • Alternativ ermöglicht die Konstruktion eines Steroidrezeptors, der von einem neuartigen, normalerweise inerten Steroid aktiviert wird, die Verwendung von Arzneimitteln, die sich nur auf Zellen auswirken würden, die diesen Rezeptor aufnehmen. Diese Strategien erzielen eine therapeutische Wirkung von Steroiden auf Asthma ohne die tief greifenden systemischen Komplikationen, die mit diesen Arzneimitteln assoziiert sind. Von besonderer Bedeutung ist die Fähigkeit, diese Gene differentiell zu spezifischen Zelltypen (beispielsweise Alveoli der Lungen) zu targetieren, um sich auf die Aktivität dieser Zellen auszuwirken.
  • Die Steroidrezeptorfamilie von Genregulationsproteinen ist ein idealer Satz solcher Moleküle. Diese Proteine sind von einem Ligand aktivierte Transkriptionsfaktoren, deren Liganden von Steroiden zu Retinoiden, Fettsäuren, Vitaminen, Schilddrüsenhormonen und anderen gegenwärtig unidentifizierten kleinen Molekülen reichen. Diese Verbindungen binden an Rezeptoren und regulieren die Transkription entweder hoch oder herunter.
  • Der bevorzugte Rezeptor der vorliegenden Erfindung ist der modifizierte Progesteronrezeptor. Diese Rezeptoren können modifiziert werden, um zu ermöglichen, dass sie an verschiedene Liganden binden, deren Struktur sich von natürlich vorkommenden Liganden unterscheidet. Zum Beispiel resultieren kleine C-terminale Veränderungen der Aminosäuresequenz, einschließlich Kürzung, in einer veränderten Affinität des Loganden und einer veränderten Funktion. Durch Screenen von Rezeptormutanten können Rezeptoren individuell angepasst werden, um auf Liganden zu reagieren, die die eigenen Rezeptoren von Wirtszellen nicht aktivieren.
  • Ein Durchschnittsfachmann wird jedoch erkennen, dass verschiedene Mutationen, beispielsweise eine kürzere Deletion carboxyterminaler Aminosäuren, erforderlich sein werden, um geeignete Mutanten bestimmter Steroidhormonrezeptorproteine zu erzeugen. Steroidhormonrezeptoren, die möglicherweise mutiert sind, sind beliebige jener Rezeptoren, die die Steroidhormonrezeptor-Superfamilie umfassen, wie Rezeptoren, einschließlich der Östrogen-, Progesteron-, Glukokortikoid-α-, Glukokortikoid-β-, Mineralokortikoid-, Androgen-, Schilddrüsenhormon-, Retinsäure- und Vitamin-D3-Rezeptoren.
  • Beispiele
  • Obwohl die vorliegende Erfindung unter Bezugnahme auf die Einzelheiten der folgenden Beispiele offenbart wird, versteht sich, dass diese Offenbarung in einem veranschaulichenden und nicht in einem einschränkenden Sinne gedacht ist, wie in Erwägung gezogen wird, dass Modifikationen Fachmännern leicht in den Sinn kommen werden.
  • Mutagenese und Charakterisierung der Ligandenbindungsdomäne von humanem Progesteronrezeptor
  • Beispiel 1
  • Hefestamm
  • Der Saccharomyces-cerevisiae-Starnm BJ3505 (MATα, pep4:HIS3, prb1-Δ1.6R, his3Δ200, lys2-801, trpl-Δ101, ura3-52, gal2, (CUP1)) wurde verwendet (Yeast Genetic Stock Center, Berkeley, CA, USA). Alle Hefetransformationen wurden unter Befolgung des Lithiumacetattransformationsprotokolls (Ito et al., J. Bacteriol. 153:163-168, 1983) durchgeführt.
  • Die PCR-Reaktionen wurden unter Verwendung einer YEphPR-B-DNA-Matrize (ein von YEp52AGSA abgeleitetes Hefe-Expressionsplasmid, das die cDNA von hPR, Form B (Misrahi et al., Biochem. Bioph. Res. Comm. 143:740-748, 1987) enthielt, die stromabwärts des Hefe-Metallothionein-CUP 1-Promotors inseriert wurde) und unter Verwendung von drei verschiedenen Sätzen von Primern durchgeführt. Um die Fidelität der zweiten Strangpolymerisationsreaktion zu verringern, wurden Pufferbedingungen von 1,5 mM MgCl2, 0,1 mM dNTPs und pH 8,2 angewendet. Etwa 2000 primäre Transformanten wurden aus jeder regionsspezifischen Bibliothek bezogen.
  • Beispiel 2
  • Hefemutanten-Screening
  • Kolonien jeder Bibliothek von hPR-Molekülen, die in spezifischen Unterregionen mutiert wurden, wurden gepoolt, große DNA-Mengen wurden hergestellt und dazu verwendet, Hefezellen zu transformieren, die das Reporterplasmid YRpPC3GS+ tragen, das zwei GRE/PRE-Elemente stromaufwärts des CYC1-Promotors enthalten, der mit dem Lac-Z-Gen von E. coli verknüpft ist (Mak et al., J. Biol. Chem. 265:20085-20086, 1989). Die transformierten Zellen wurden auf Platten mit 1,5%-igem Agar-Agar plattiert, die 2 % Glukose, 0,5 % Caseinhydrolysate (eine 5%-ige Stammlösung von Caseinhydrolysaten wird stetig autoklaviert, bevor sie zum Zerstören von Tryptophan verwendet wird), 6,7 g/1 Hefestickstoffbase (ohne Aminosäuren) und 100 μM CuSO4 enthielten (CAA/Cu-Platten), und 2 Tage bei 30 °C gezüchtet. Diese Kolonien wurden dann auf CAA/Cu-Platten, die 0,16 g/l 5-Brom-4-chlor-3-indolyl-β-D-galactosid (X-Gal, ein Indikator von β-Galactosidase-Aktivität) enthielten, mit oder ohne die Hormone, wie in 1 angegeben, replikaplattiert und einen Tag bei 30 °C, dann zwei Tage bei Raumtemperatur in Dunkelheit wachsen gelassen.
  • Beispiel 3
  • Wachstum von Hefekultur für In-vitro-Assay
  • Saccharomyces-cerevisiae-Ze Hen, die YEphPRB und das Reporterplasmid enthielten, wurden über Nacht bei 30 °C in Minimalmedien, die 2 % Glukose enthielten, gezüchtet. Die Zellen wurden in frischem Medium subkultiviert und bis zur frühen mid-log-Phase (OD600 nm = 1,0) wachsen gelassen. Die Induktion des Rezeptors wurde durch Zugabe von 100 μM Kupfersulfat zu der Kultur initiiert. Die Zellen wurden mittels Zentrifugation bei 1500 × g für 10 Minuten geerntet und in dem adäquaten Puffer resuspendiert. Dieser und alle folgenden Schritte der Analyse der Hefeextrakte wurden bei 4 °C vorgenommen.
  • Beispiel 4
  • Transkriptionsassay
  • Hefezellen, die die Reporter- und Expressionsplasmide enthielten, wurden wie oben in Beispiel 3 beschrieben über Nacht in Gegenwart von 100 μM Kupfersulfat gezüchtet. Wenn die Zelldichte OD600 nm = 1,0 erreichte, wurden den Kulturen Hormone zugegeben. Nach einer Inkubation für 4 Stunden wurden Hefeextrakte hergestellt und auf β-Galactosidase-Aktivität geprüft, wie zuvor beschrieben (Miller, Hrsg. J. M. Miller, 352-355 (1972)).
  • Im Allgemeinen sind Reporter, die in der vorliegenden Erfindung von Nutzen sind, beliebige, die eine adäquate Messung der Transkriptionsniveaus ermöglichen. Zu bevorzugten Reportersystemen zählen Reportervektoren, die sich aus dem C-proximalen Hefe-Iso-1-cytochrom-Promotorelement zusammensetzen, das mit einem Strukturgen fusioniert ist, wobei das Strukturgen aus der Gruppe bestehend aus β-Galactosidase, Galactokinase und URA3 ausgewählt ist. Mehr bevorzugt setzt sich der Vektor aus einer Insertionsstelle für ein Reporter-Response-Element zusammen. Die Vektoren, die β-Galactokinase als einen Indikator für Transkriptionsaktivität enthalten, sind von dem Muttervektor PC2 abgeleitet sind, während die Vektoren, die Galactokinase enthalten, sind vom YCpR1-Vektor abgeleitet. Vorzugsweise stammen die Strukturgene von E. coli.
  • Beispiel 5
  • Western-Immunblotting
  • Hefezellen wurden wie oben fur den Transkriptionsassay gezüchtet. Hefeextrakte zur Western-Blot-Analyse wurden hergestellt, indem das Zellpellet in TEDG + Salze resuspendiert wurde. Die Zellsuspension wurde mit einem gleichen Volumen an Glasperlen gemischt und durch Vortexen in einem Mikrozentrifugenbecher gespalten. Das Homogenisat wurde 10 Minuten bei 12.000 × g zentrifugiert. Der Überstand wurde gesammelt und die Proteinkonzentration wurde unter Verwendung von Rinderserumalbumin als Standard geschätzt. Hefeextrakte wurden auf einem 0,1%-igem Natriumdodecylsulfat/7%-igem Polyacrylamidgel gelöst und auf eine Immobilon-Membran überführt, wie zuvor beschrieben (McDonnell et al., Mol. Cell. Biol. 9:3517-3523, 1989). Es wurde unter Verwendung eines monoklonalen Antikörpers (JZB39), der gegen die N-terminale Domäne der A- und B-Formen von hPR gerichtet war, ein Festphasenradioimmunoassay durchgeführt.
  • Beispiel 6
  • Hormonbindungskompetitionsassay
  • Die Induktion von PR-Synthese wurde durch Zugabe von 100 μM CuSO4 zu der Kultur initiiert und die Inkubation wurde für 6 Stunden fortgeführt. Das Zellpellet wurde in TESH-Puffer, der 1 μg/ml Leupeptin, 10 μg/ml PMSF und 10 μg/ml Pepstatin enthielt, resuspendiert. Die Zellsuspension wurde mit einem gleichen Volumen an Glasperlen (0,5 mm; B. Braun Instruments) gemischt und durch Vortexen in einem Mikrozentrifugenbecher gespalten. Das Homogenisat wurde 10 Minuten bei 12.000 × g zentrifugiert und der Überstand wurde 30 Minuten bei 100.000 × g weiter zentrifugiert, um eine Zytosolfraktion zu erhalten. Verdünnte Hefeextrakte (200 μl), die 100 μg Gesamtprotein enthielten, wurden über Nacht bei 4 °C mit [3H]-Ligand in Abwesenheit (Gesamtbindung) oder Gegenwart (unspezifische Bindung) eines 100-fachen Überschusses von unmarkiertem Liganden inkubiert. Gebundene und freie Steroide wurden durch Zugabe von 500 μl mit Dextran überzogener Aktivkohlensuspension (0,5 % Norit A, 0,05 % Dextran, 10 mM Tris-HCl, pH 7,4, und 1 mM EDTA) getrennt. Die spezifische Bindung wurde durch Subtrahieren der unspezifischen Bindung von der Gesamtbindung ermittelt. Es wurde eine Scatchard-Analyse durchgeführt, wie zuvor von Mak et al., J. Biol. Chem. 264:21613-21618 (1989), beschrieben.
  • Beispiel 7
  • Ortsgerichtete Mutagenese
  • Die Mutanten YEphPR-B879 und YEphPR-B891 wurden unter Befolgung der von Dobson et al., J. Biol. Chem. 264:4207-4211 (1989), beschriebenen Vorgehensweise hergestellt. CJ236-Zellen wurden mit mpPR90 (einem M13-Plasmid, das hPR-cDNA enthält) infiziert. Die resultierende, Uridin enthaltende einzelsträngige DNA wurde an 20-mer-Oligonukleotide reassoziieren gelassen, die ein TGA-Stoppcodon enthielten, das der Aminosäure 880 bzw. 892 entsprach.
  • Beispiel 8
  • Konstruktion von Säuger-Expressionsvektoren
  • Der Säuger-Expressionsvektor phPR-B enthält die SV40-Enhancer-Sequenz stromaufwärts des humanen Wachstumshormonpromotors, der mit der hPR-B-cDNA verknüpft ist. Dieser Vektor wurde mit Sal1 und EcoR1 verdaut. Das 6,1 kb lange Fragment (das die Vektorsequenzen und die 1,5 kb am 5'-Ende des hPR enthielt) wurde auf Gel gereinigt und an das 2,1 kb lange Fragment von YEphPR-B891 (das das 3'-Ende des Rezeptors enthielt) ligiert, das zuvor mit Sal1 und EcoR1 abgeschnitten wurde. Das resultierende Plasmid, phPR-B891, kodiert eine verkürzte Version von hPR, Form B, von 42 Aminosäuren.
  • Beispiel 9
  • Transiente Transfektionen und CAT-Assays von Säugerzellen
  • Fünf Mikrogramm Chloramphenicolacetyltransferase-Reporterplasmid (CAT-Reporterplasmid), das zwei Kopien eines PRE/GRE aus dem Tyrosinaminotransferasegen enthielt, das mit dem Thymidinkinasepromotor verknüpft war (PRETKCAT), wurden zusammen mit 5 μg Wildtyp- oder mutierten Rezeptor-DNAs bei Versuchen einer transienten Kotransfektion verwendet. Die transienten Kotransfektionen und CAT-Assays wurden wie von Tsai et al., Cell 57:443-448 (1989), beschrieben durchgeführt.
  • Beispiel 10
  • Mutagenese der Hormonbindungsdomäne von hPR-B
  • Um Aminosäuren in der hPR-HBD zu charakterisieren, die für die Ligandenbindung und die hormonabhängige Transaktivierung wichtig sind, wurden Bibliotheken mutierter hPR-Moleküle erzeugt und die Mutanten in ein wiederhergestelltes, auf Progesteron reagierendes Transkriptionssystem in Hefe eingeführt. Dieses System ermöglichte das Screenen großer Anzahlen von Mutantenklonen und die direkte, visuelle Identifizierung von Phänotypen.
  • Einzigartige Restriktionsstellen für NaeI, AvrII und EcoNI wurden in der cDNA von hPR erzeugt, wobei drei Kassetten von 396, 209 und 400 Nukleotiden (Region 1, 2 bzw. 3) erhalten wurden. Für die PCR-Mutagenese wurden drei Sätze von Primern (16 + 7 für Region 1, 5 + 4 für Region 2 und 6 + 13 für Region 3) in der Polymerisationsreaktion unter Verwendung von YEphPR-B als DNA-Matrize eingesetzt. Die nach der PCR erhaltenen Fragmente wurden mit den adäquaten Enzymen verdaut, auf Gel gereinigt und in das Mutterplasmid YEphPR-B ligiert. Ligationsgemische wurden zum Transformieren von Bakterienzellen und zum Erhalten von Bibliotheken von hPR-Molekülen, die willkürlich in der HBP punktmutiert wurden, verwendet. 5 μg DNA wurden aus jeder Bibliothek verwendet, um Hefezellen zu transformieren, die das Reporterplasmid YRpPC3GS+ trugen, und Transformanten wurden zur Tryptophan- und Uracil-Auxotrophie auf CAA-Platten, die 100 μM CuSO4 enthielten, gewählt. Diese wurden dann auf CAA-Platten, die die Hormone enthielten, repliziert. Das Screenen auf „up-Mutationen" ermbglichte die Identifizierung von Rezeptormutanten mit hormonunabhängiger Transkriptionsaktivität oder erhöhter Affinität für den Liganden (diese Klone sollten blau bleiben, wenn sie mit 100-fach weniger Hormon gezüchtet wurden) oder mit einer veränderten Reaktion auf RU486 oder ein Glukokortikoid-Analogon. Im „down-Mutationen"-Screening wurden Rezeptormutanten, die bei Vorliegen des Liganden transkriptional inaktiv waren, nachgewiesen.
  • Aufgrund der Beschaffenheit des Verfahrens, das zum Erzeugen der mutierten DNA-Matrizen verwendet wurde, war es erforderlich, zunächst die Qualität der erhaltenen Bibliotheken zu ermittein. Diese wurde beurteilt, indem die Anzahl von Nullmutationen geschätzt wird, die durch Mutagenese erzeugt wurden. Wir schätzten die Häufigkeit des Auftretens transkriptional inaktiver Rezeptoren (weiße Kolonien) im Vergleich zu der Gesamtzahl von Kolonien. Diese Häufigkeit betrug etwa 7 %.
  • Die primären Transformanten wurden auf Platten, die das Antiprogestin RU486 enthielten, replikaplattiert. Der Wildtyp-Rezeptor wird von diesem Hormon nicht aktiviert (1). Unter Anwendung dieser Screening-Strategie wurde eine einzige Kolonie identifiziert, die eine beträchtliche Transkriptionsaktivität als Reaktion auf das Antihormon zeigte. Interessanterweise zeigte dieselbe Kolonie keine Transkriptionsaktivität, wenn sie bei Gegenwart von Progesteron replikaplattiert wurde. Die Kolonie wurde gereinigt und der Phänotyp wurde bestätigt. Eine Vertreibung des Expressionsvektors aus dem Klon, auf die eine Wiedereinführung des nicht mutierten Vektors folgte, demonstrierte, dass der Phänotyp in der Tat mit dem Expressionsvektor in Zusammenhang stand und nicht das Resultat einer sekundären Mutation war. Darüber hinaus wurde das mutierte Plasmid, das als UP-1 bezeichnet wurde, aus Hefe durch Leiten durch E. coli isoliert (wie in Ward, Nucl. Acids Res. 18:5319 (1990)) und gereinigt. Diese DNA wurde dann wieder in Hefe eingeführt, die nur das Reporterplasmid enthielt. Wie erwartet, war der Mutantenphänotyp stabil und stand direkt mit dem Rezeptorexpressionsplasmid im Zusammenhang.
  • Beispiel 11
  • Charakterisierung der UP-1-Mutante
  • Die Platten-Assays, die zum Identifizieren der Rezeptormutanten verwendet wurden, sind von qualitativer Beschaffenheit. Um die Eigenschaften von UP-1 weiter zu charakterisieren, wurde in einem Transkriptionsassay die Aktivität der Rezeptormutanten mit der des Wildtyp-Rezeptors verglichen. In diesem Verfahren wurden Hefezellen, die mit entweder dem Wildtyp- oder dem mutierten Rezeptor und einem auf Progesteron reagierenden Reporter transformiert worden waren, über Nacht in Gegenwart von 100 μM CuSO4 gezüchtet. Wenn die Zellen einen OD600 nm von 1,0 erreicht hatten, wurden sie mit Progesteron oder RU486 supplementiert und nach vier Stunden mittels Zentrifugation geerntet. Dann wurde die β-Galactosidase-Aktivität in dem Zellzytosol gemessen.
  • Unter Bezugnahme auf 2, Feld (A), ist 1 μM RU486 bei Prüfung mit dem Wildtyp-Rezeptor ein schwacher Transkriptionsinduktor, wohingegen Progesteron eine mehr als 60-fache Induktion der Transkription bei 1 μM bewirkte. Diese Situation wurde jedoch umgekehrt, wenn die Mutante analysiert wurde. In diesem Fall war RU486 ein äußerst potenter Aktivator, wohingegen Progesteron unwirksam war. Interessanterweise war die Aktivität, die mit der Mutante in Gegenwart von RU486 erzielt wurde, von derselben Größenordnung wie die des Wildtyps, der in Gegenwart von Progesteron geprüft wurde. Diese Umkehr der Spezifität deutet klar daraufhin, dass der Mechanismus, durch den diese Liganden mit dem Rezeptor interagieren, grundlegend anders ist.
  • 2 zeigt die DNA- und Aminosäuresequenzen der Wildtyp- und mutierten DNAs. Das Cytosin an Position 2636 fehlte in der mutierten DNA, daher wurde ein verschobenes Leseraster erstellt und ein Stoppcodon wurde 36 Nukleotiden stromabwärts der C-2636-Deletion erzeugt. Eine schematische Struktur der Wildtyp- und UP-1-Rezeptoren ist ebenfalls mit einer Darstellung der 12 C-terminalen Aminosäuren, die dem mutierten Rezeptor eigen sind, gezeigt. Konservierte und strukturell ähnliche Aminosäuren sind durch ein Apostroph bzw. ein Sternchen gekennzeichnet.
  • Eine DNA-Sequenz-Analyse von UP-1 identifizierte eine Deletion von einem einzigen Nukleotid bei Base 2636 (2B). Diese Mutation resultiert in einer Verschiebung des Leserasters, die ein Stoppcodon 36 Nukleotide stromabwärts erzeugt. Infolgedessen wird der Wildtyp-Rezeptor um 54 authentische Aminosäuren gekürzt und 12 neue Aminosäuren werden am C-Terminus hinzugefügt.
  • Beispiel 12
  • Western-Analyse des mutierten humanen Progesteronrezeptors
  • 3 zeigt eine Western-Analyse von mutiertem hPR. Hefezellen, die das Reporterplasmid und Wildtyp- (yhPR-B) oder mutierten (UP-1) hPR trugen, wurden über Nacht in CAA-Medium mit (Bahnen 3 bis 5 und 7 bis 9) oder ohne (Bahnen 2 und 6) 100 μM CuSO4 gezüchtet. 1 μM Progesteron oder 1 μM RU486 wurde wie angeführt zugegeben und die Zellen wurden weitere 4 Stunden wachsen gelassen. Hefeextrakte wurden wie oben beschrieben hergestellt. 50 μg Proteinextrakt wurden auf einem 0,1%-igen SDS/7%-igem Polyacrylamidgel laufen gelassen. 50 μg eines T47D-Zellkernextrakts, der die A- und B-Formen von hPR enthielt, wurden ebenfalls als eine Positivkontrolle geladen (Bahn 1). Die Positionen von Molekulargewichtsmarkern sind angegeben.
  • Es wurde eine Western-Immunoblot-Analyse von UP-1- und Wildtyp-Rezeptoren vorgenommen, um zu verifizieren, dass der mutierte Rezeptor wie aus seiner DNA-Sequenz vorhergesagt synthetisiert wurde, und um die Möglichkeit zu eliminieren, dass einige Hauptabbauprodukte für den Mutantenphänotyp verantwortlich zeichnen. Wie in 3 gezeigt, wanderte der mutierte Rezeptor schneller in dem Gel, wodurch das mittels DNA-Sequenzierung vorhergesagte Molekulargewicht bestätigt wird. Der Wildtyp-Rezeptor (yhPR-B) lief als ein 114-kDa-Protein, während der mutierte Rezeptor 5 kDa kleiner war (vgl. Bahnen 2 und 3 mit 6 und 7). Die Zugabe von 100 μM CuSO4 zu den Zellkulturen steigerte die Synthese sowohl des Wildtyp- als auch des mutierten hPR im gleichen Ausmaß. Es wurden keine Hauptabbauprodukte nachgewiesen. In Gegenwart von Progesteron und RU486 wurden yhPR-B-Banden aufgrund von hormoninduzierter Phosphorylierung des Rezeptors nach oben verschoben. lm Gegensatz dazu induzierte RU486 eine Verschiebung des Wildtyp-PR nach oben zu einem geringeren Ausmaß (Bahnen 4 und 5). Bei der UP-1-Mutante wurde diese hormonabhängige Verschiebung nach oben bei Behandlung mit RU486 erkannt (Bahnen 8 und 9). Folglich kann der C-Terminus von PR für die Inaktivität von RU486 verantwortlich zeichnen. Demzufolge würde ein Entfernen dieser Sequenz RU486 ermöglichen, zu einem Agonisten zu werden.
  • Beispiel 13
  • Hormonbindungsanalyse
  • 4 zeigt die Transkriptionsaktivität und die Hormonbindungsanalyse von Wildtyp- und mutierten hPR-Konstrukten. Die hPR-Konstrukte sind zusammen mit einer schematischen Darstellung der Rezeptormolektile auf der linken Seite dargestellt. Hefezellen wurden in Gegenwart von 100 μM CuSO4 gezüchtet. Eine Transkriptionsanalyse wurde wie oben beschrieben vorgenommen. Versuche wurden in dreifacher Ausführung durchgeführt und die Transkriptionsaktivitäten wurden im Hinblick auf Protein standardisiert. Hormonbindungsassays wurden in Gegenwart von 20 nM [3H]-Progesteron oder 20 nM [3H]-RU486 durchgeführt.
  • Es wurde eine Sättigungsbindungsanalyse des mutierten UP-1-Rezeptors durchgeführt, um zu ermitteln, ob seine Affinität für RU486 und Progesteron verändert wurde. Eine Scatchard-Analyse der Bindungsdaten demonstrierte, dass sowohl der Wildtyp- als auch der mutierte Rezeptor eine ähnliche Affinität für RU486 von 4 bzw. 3 nM aufwiesen. Wie in 4 zu erkennen ist, hatte das mutierte Rezeptormolekül die Fähigkeit, Progesteron zu binden, verloren. Somit sind die Aminosäurenkontakte für Progesteron und RU486 mit hPR unterschiedlich.
  • Beispiel 14
  • Erzeugung von Deletionsmutanten von hPR-B
  • Wie in 2B gezeigt, offenbarte eine DNA-Sequenzierung, dass die Rasterverschiebungsmutation in dem UP-1-Klon eine doppelte Mutation in dem Rezeptorprotein erzeugte. Das heißt, eine modifizierte C-terminale Aminosäuresequenz und eine Kürzung von 42 Aminosäuren. Um zu identifizieren, welche Mutation schließlich für den beobachteten Phänotyp verantwortlich zeichnete, wurden zwei neue Rezeptormutanten in vitro konstruiert: YEphPR-B879, die ein Stoppcodon enthielt, das Aminosäure 880 entsprach, und YEphPR-B891, die ein Stoppcodon bei Aminosäure 892 enthielt. Hormonbindungsdaten (siehe 4) demonstrierten, dass beide dieser gekürzten Rezeptoren RU486 binden konnten, jedoch nicht Progesteron. Wenn sie in vivo untersucht wurden, aktivierten beide Mutantenrezeptoren die Transkription in Gegenwart von RU486 auf Niveaus, die mit denen der Mutante UP-1 vergleichbar sind, die in Hefe erzeugt wurde. Wie erwartet, waren beide Mutanten in Gegenwart von Progesteron inaktiv. Folglich lag der beobachtete Phänotyp nicht in Mutationen an einer zweiten Stelle in dem UP-1-Molekül begründet. Zudem zeichneten 12 zusätzliche Aminosäuren, von 880 bis 891, nicht für die Mutantenaktivität verantwortlich. Darüber hinaus ist klar, dass die 42 C-terminalen Aminosäuren erforderlich sind, damit Progesteron an den Rezeptor binden kann, während die letzten 54 Aminosäuren für die RU486-Bindung nicht notwendig sind. Folglich steht der Antagonist mit anderen Aminosäuren in dem nativen Rezeptormolekül in Kontakt und kann im Vergleich zu Agonisten eine andere Rezeptorkonformation induzieren.
  • Neben den obigen Deletionsmutationen haben andere Deletionen in der C-terminalen Aminosäuresequenz Bindungsaktivität mit RU486 und nicht mit Progesteron bereitgestellt. Zu solchen Deletionen zählen: (1) eine Deletion von 16 Aminosäuren, die die Aminosäuren 1-917 des Progesteronrezeptors belässt; und (2) eine Deletion von 13 Aminosäuren, die die Aminosäuren 1-920 des Progesteronrezeptors belässt. Die Verwendung der Rezeptorbindungsregion mit TATA-CAT-Expression in Assays mit transienter Transfektion zeigte eine CAT-Expression mit der Deletion von 16 Aminosäuren, d. h. Aminosäuren 640-917, und der Deletion von 13 Aminosäuren, d. h. Aminosäuren 640-920.
  • Beispiel 15
  • Steroidspezifität für Aktivierung der Transkription der UP-1-Mutante
  • 5 zeigt die Spezifität der Transkriptionsaktivität des mutierten hPR. In Feld (A) wurden die Transkriptionsaktivitäten des Wildtyp- und des UP-1-Mutantenrezeptors in Gegenwart unterschiedlicher Konzentrationen von Progesteron, RU486, Org31806 und Org31376, wie angegeben, geprüft.
  • Ein Transkriptionsassay wurde unter Verwendung von zwei synthetischen Antagonisten, Org31806 und Org31376, durchgeführt, bei denen es sich um potente Antiprogestine handelt. Wie in 5A gezeigt, wurde der mutierte Rezeptor von beiden dieser Verbindungen aktiviert. Die Kurve der von der Konzentration abhängigen Aktivität war der mit RU486 erhaltenen ähnlich, was nahe legt, dass die Affinität dieser zwei Antagonisten für den mutierten Rezeptor der von RU486 ähnlich ist. Wenn sie mit dem Wildtyp-Rezeptor geprüft wurden, wiesen diese Verbindungen eine minimale Transkriptionsaktivität auf und verhielten sich nur bei Konzentrationen von 1 μM wie partielle Agonisten (3-10 % der Progesteronaktivität), wie dies RU486 tut. Folglich erstreckt sich die Inhibitionswirkung des C-Terminus von hPR auf andere Rezeptorantagonisten.
  • In Feld (B) wurden die Transkriptionsaktivitäten von Wildtyp- und mutierten UP-1-Rezeptoren in Gegenwart von 1 μM Progesteron (P), RU486 (RU), R5020 (R), Dexamethason (D), Cortisol (C), Östradiol (E), Tamoxifen (TX) oder Nafoxidin (N) geprüft (siehe 5B). Der synthetische Antagonist R5020 hatte keine Auswirkung auf die UP-1-Mutante, was nahe legt, dass Agonisten, wie Progesteron und R5020, den C-Terminus des nativen Rezeptors zur Bindung erfordern und dementsprechend dabei versagen, den gekürzten UP-1-Rezeptor zu erkennen. Andere Steroide, von denen bekannt ist, dass sie in Hefezellen eintreten, wie Östradiol, die Antiöstrogene Tamoxifen und Nafoxidin, Dexamethason und Cortisol, können möglicherweise den mutierten Rezeptor aktivieren. Von allen getesteten Steroiden wurde befunden, dass sie mit entweder dem Wildtyp- oder dem mutierten Rezeptor inaktiv sind. Folglich ist die Aktivierung des mutierten Rezeptors für Antiprogestine spezifisch.
  • Beispiel 16
  • Transkriptionsaktivität mutierter Rezeptoren in Säugerzellen
  • 6 zeigt die transiente Transfektion von mutiertem hPR in Säugerzellen. In Feld (A) wurden HeLa-Zellen transient mit phPR-B und phPR-B891-Rezeptoren zusammen mit PRETKCAT-Rezeptorplasmid unter Anwendung des Polybren-Transfektionsverfahrens, wie beschrieben (Tsai et al., 1989) transfiziert. Zellen wurden mit oder ohne 100 nM Progesteron oder RU486 für 48 Stunden vor dem Ernten gezüchtet. CAT-Assays wurden wie oben beschrieben durchgeführt. In Feld (B) wurden CV-1-Zellen wie in (A) transient transfiziert.
  • Unter Bezugnahme auf 6 wurde die Aktivität von mutiertem Rezeptor in sowohl humanen HeLa-Endometriumzellen als auch Affennieren-CV-1-Fibroblasten geprüft. Eine Mutante, phPR-891, wurde konstruiert, indem das vollständige PR-Insert von phPR-B-Vektor durch die gekürzte PR-cDNA von YEphPR-B891 konstruiert. Die resultierende Rezeptormutante, phPR-B891, ist eine Kürzung von 42 Aminosäuren der hPR-B-Form. Die mutierten 891- und Wildtyp-Rezeptoren wurden zusammen mit dem PRETKCAT-Reporterplasmid, das zwei Kopien eines GRE/PRE-Elements enthält, in HeLa-Zellen transfiziert.
  • Wie erwartet, aktivierte Wildtyp-PR die Transkription des CAT-Gen-Reporters in Gegenwart von 10-7 M Progesteron (6A). Obwohl das Basaltranskriptionsniveau hoch war, wurde eine 3- bis 4-fache Induktion der Transkription nachgewiesen, wenn den Medien Progesteron zugegeben wurde. Im Gegensatz dazu erfolgte in Gegenwart von RU486 keine Induktion. Das in diesen Versuchen nachgewiesene hohe Basalniveau der Transkription kann eine RU486-Auswirkung auf Wildtyp-hPR maskieren oder verändern.
  • Andererseits wurde eine Induktion der CAT-Aktivität beobachtet, wenn die 891-Mutante in Gegenwart von 10-7 M RU486 inkubiert wurde (6A). Dieselbe Konzentration von Progesteron wies keine Aktivität auf.
  • Zelltypspezifische Faktoren können die Aktivität der Transaktivierungsdomänen von Steroidrezeptoren beeinflussen. Um diese Möglichkeit zu beurteilen, wurden Wildtyp- und mutierte Rezeptoren in CV-1-Zellen transfiziert. Ähnliche Ergebnisse wurden erhalten, d. h. Progesteron aktivierte den Wildtyp-Rezeptor, während RU486 den mutierten 891-Rezeptor aktivierte (6B).
  • Das Protein, das aus phPR-B891-Plasmid synthetisiert wurde, wies in Säugerzellen das korrekte Molekulargewicht auf. Der mutierte Rezeptor wurde in COSM6-Zellen transfiziert. Eine Western-Analyse an Zellextrakten zeigte, dass die 891-Mutante wie erwartet als ein Protein von 109 kDa synthetisiert wurde, das einem Protein entspricht, das 42 Aminosäuren kürzer ist als der Wildtyp-hPR. Folglich fungiert RU486 als ein Agonist des gekürzten B-Rezeptors in einem wiederhergestellten Hefesystem und auch in Säugerzellen. Der Transaktivierungsmechanismus erfordert den C-terminalen Schwanz des mutierten Rezeptors nicht und ist zwischen den drei getesteten Spezies konserviert.
  • Beispiel 17 (nicht erfindungsgemäß)
  • Konstruktion von Polyglutaminabschnitt-Insertion in die LBD
  • Der Polyglutaminabschnitt, der mehrere Wiederholungen von CAG enthält, wurde mittels eines Verfahrens konstruiert, das von S. Rusconi (Seipel et al., Nucl. Acid. Res. 21:5609-5615) entwickelt wurde, wobei eine Multimerisation von DNA-Fragment (verdautes BsaI und BbsI) kodierenden Glutamin-Wiederholungen genutzt wird, was zu Poly-Qn führt. Das Plasmid pBluescript-KS(II) wurde mit Acc65I und SacI verdaut, der linearisierte Vektor wurde auf Gel gereinigt und mit dem reassoziierten Oligonukleotidpaar R3/R4 ligiert, um das Plasmid pPAP zu erzeugen. Die Oligonukleotidsequenz für R3 (oberer Strang) ist: 5'-GTACGTTTAAACGCGGCGCGCCGTCGACCTGCAGAAGCTTACTAGTGGTAC CCCATGGAGATCTGGATCCGAATTCACGCGTTCTAGATTAATTAAGC-3' (Seq. ID Nr. 2) und die Sequenz für R4 (unterer Strang) ist: 5'-GGCCGCTTAATTAATCTAGAACGCGTGAATTCGGATCCAGATCTCCATGGGGTACCACTAGTAAGCTTCTGCAGGTCGACGGCGCGCCGCGTTTAAAC-3' (Seq. ID Nr. 3).
  • Die folgenden Restriktionsstellen werden in pPAP als die mehreren Klonierungstellen (von T3 bis T7) integriert: PmeI, AscI, SalI, PstI, HindIII, SpeI, Acc65I, NcoI, BglII, BamHI, EcoRI, MluI, XbaI, PacI, NotI, SacI. Oligonukleotide, die für 10 Glutamine kodieren, wurden reassoziieren gelassen und in die BglII- und BamHI-Stelle des Plasmids pPAP subkloniert. Die Sequenz für den oberen und den unteren Strang des Oligonukleotids war 10QU 5'-GATCTCGGTCTCCAACAGCAACAGCAACAGCAACAGCAACAGGGTCTTCTG-3' (Seq ID Nr. 4) bzw. 10QL: 5'-GATCCAGAAGACCCTGTTGCTGTTGCTGTTGCTGTTGCTGTTGGAGACCGA-3' (Seq ID Nr. 5). Das Insert wurde mittels Restriktionsverdau und Sequenzierung bestätigt.
  • Das Plasmid mit dem 10Q-Insert (pPAP-10Q) wurde über Nacht mit BsaI und BbsI (New England Biolab) verdaut und präzipitiert. Ein Zehntel der präzipitierten DNA (die sowohl Vektor als auch Fragment enthält) wurde religiert, um das Plasmid pPAP-18Q zu erzeugen. Jeder Ligationsschritt resultiert in pPAP-2(n-1)Q aus dem vorherigen Vektor pPAP-nQ. Auf diese Art und Weise wurden verschiedene Erweiterungen von Poly-Q erzielt und die resultierenden Plasmide pPAP-34Q, pPAP-66Q und pPAP132Q wurden erzeugt und mittels Sequenzierung bestätigt. Die BglII- und BamHI-Fragmente (die für den Poly-Q-Abschnitt kodieren) aus diesen Plasmiden wurden gereinigt und in die BglII-Stelle von pRSV-GLVP kloniert, um GLVP mit verschiedenen Poly-Q-Inserts am N-Terminus zu erzeugen. Diese GLVP-nQ wurden wieder in den pCEP4-Vektor inseriert, wodurch pCEP4-GLVP-nQ erzeugt wurde.
  • Ein Verlängern der C-terminalen Ligandenbindungsdomäne von 879 auf 914 (17) steigerte allmählich die von RU486 induzierte Aktivierung der Zielgenexpression.
  • Wichtig ist dabei, dass diese Mutanten spezifisch auf RU486, jedoch nicht auf den Progesteron-Agonisten R5020 reagierten. Eine weitere Erweiterung der C-terminalen LBD über Aminosäure 914 hinaus resultierte in einer Verringerung der GLVP-Reaktion auf RU486.
  • Konstruktion, Charakterisierung und Analyse von mutierten humanen GR/PR-Fusionsproteinrezeptoren
  • Beispiel 18 (nicht erfindungsgemäß)
  • Plasmidkonstruktion
  • Ein mutierter humaner Progesteronrezeptor wurde wie oben erörtert konstruiert und charakterisiert. Eine Mutagenese der Ligandenbindungsdomäne des humanen PR wurde mit denselben, oben umrissenen Vorgehensweisen ausgeführt. Die Charakterisierung des mutierten Progesteronrezeptors identifizierte eine Deletion von einem einzigen Nukleotid an Base 2636. Diese Mutation resultierte in einer Verschiebung des Leserasters, die ein Stoppcodon 36 Nukleotide stromabwärts erzeugt. Infolgedessen wird der Wildtyp-Rezeptor um 54 authentische Aminosäuren gekürzt und 12 neue Aminosäuren werden am C-Terminus hinzugefügt. Die Kürzung von 42 Aminosäuren am C-Terminus könnte RU486 binden und wurde wie oben erörtert charakterisiert.
  • Plasmid-DNA, die den GR/PR-Fusionsproteinrezeptor und den Wildtyp-GR kodiert, wurde wie folgt konstruiert. Jede Insertionsmutante wurde mit den Restriktionsenzymen BamHI und Xhol verdaut, die die 3'-Seite des SV40-Polyadenylierungssignals flankierten. Die resultierenden Fragmente wurden aus einem Agarosegel isoliert. Das große Fragment der Insertionsmutante, die den aminoterminalen kodierenden Teil des GR enthielt, d. h. die Transregulations- und DNA-Bindungsregion, und der Großteil des Plasmids wurden mit dem kleinen Fragment einer anderen Insertionsmutante, die die carboxyterminale kodierende Sequenz der oben hergestellten hPR-Deletionsmutante enthielt, ligiert. Die resultierenden Plasmide, die die Deletion in der hPR-Ligandenbindungsdomäne trugen, wurden sequenziert, um die Integrität der GR/PR-Mutantenkonstrukte sicherzustellen.
  • Darüber hinaus wurde außerdem Plasmid-DNA, die einen mutierten Ratten- oder humanen GR und den Ratten-Wildtyp-GR oder humanen Wildtyp-GR kodiert, konstruiert. Die Plasmide für pGR0385 (oder prCS1.C) der Ratte und dessen Wildtyp pGR0384 wurden unter Anwendung der obigen Verfahren konstruiert. Einzelheiten bezüglich der Konstruktion, Mutation und Charakterisierung des obigen Plasmids lassen sich in Lanz und Rusconi, Endocrinology 135:2183-2195 (1994), finden, dessen Gesamtheit hiermit durch Bezugnahme, einschließlich der Zeichnungen, hierin aufgenommen ist. Die Charakterisierung des mutierten Ratten- und humanen GR identifizierte eine doppelte Punktmutation in der Ligandenbindungsdomäne. In dem Rattenkonstrukt wurden die Aminosäuren 770, 771, Methionin und Leucin, durch Alanin und Alanin ersetzt. Die Aminosäuren 780 und 781 wurden deletiert. In den humanen Konstrukten wurden die Aminosäuren 762 und 763 deletiert. Die Aminosäuren 752 und 753 wurden durch Alanine substituiert. Sowohl die Substitutions- und Deletionsänderungen waren am Carboxyterminusteil der Ratten- oder humanen GR-Ligandenbindungsdomäne. Die Insertionsmutante wurde mit den Restriktionsenzymen BamHI und Xhol verdaut, die die 3'-Seite des SV40-Polyadenylierungssignal flankieren, und das resultierende Fragment wurde aus Agarosegel isoliert. Das große Fragment einer Insertionsmutante, die den aminoterminalen kodierenden Teil des Ratten- oder humanen GR enthielt, und der Großteil des Plasmids wurden mit dem kleinen Fragment einer anderen Insertionsmutante, die die carboxyterminalen kodierenden Sequenzen der mutierten Ligandenbindungsdomäne enthielt, ligiert. Die resultierenden Plasmide, die die Deletion in der Ligandenbindungsdomäne trugen, wurden sequenziert, um die Integrität der Ratten- oder humanen GR-Mutanten sicherzustellen.
  • Darüber hinaus wurden die obigen Vorgehensweisen auch dazu angewendet, Plasmid-DNA zu konstruieren, die eine GR-Mutante mit einem konstitutiv aktiven Rezeptor, d. h. pGR0403R, kodierte (9 und 10). Die Insertionsmutante wurde mit dem adäquaten Restriktionsenzym verdaut. Die resultierenden Fragmente wurden aus Agarosegel isoliert. Das große Fragment der Insertionsmutante, die den aminoterminalen kodierenden Teil des GR, d. h. die Transregulationsdomänen und DNA-Bindungsdomänen, enthielt, und der Großteil des Plasmids wurden mit dem kleinen Fragment einer anderen Insertionsmutante, die die mutierte GR-Ligandenbindungsdomäne enthielt, ligiert. Das resultierende Plasmid wurde sequenziert (9), um die Integrität des Mutantenkonstrukts sicherzustellen.
  • Beispiel 19
  • Zellkultur, Transfektion und Assay auf CAT- und Luciferase-Aktivitäten
  • CV-1-Zellen wurden bei 37 °C in Dulbeccos modifiziertem Eagle-Medium, das 10 % fötales Rinderserum (fetal bovine serum, „FBS") enthielt, in einer feuchten Atmosphäre, die 5 % CO2 enthielt, gehalten. Die Zellen wurden unter Verwendung des im Handel erhältlichen kationischen Agens Lipofectamin transfiziert. Kurz gesagt, DNA wurde mit dem Lipofectamin-Reagens gemischt und den Zellen zugesetzt. Nach 5 Stunden wurde der DNA-Mix entfernt und durch Wachstumsmedium, das 10 % FBS enthielt, ersetzt und die Zellen wurden wieder in eine Atmosphäre, die 5 % CO2 enthielt, gegeben. Achtzehn Stunden später wurden die Zellen ungefähr 24 Stunden mit Steroiden in verschiedenen Konzentrationen behandelt, dann geerntet.
  • In diesem Verfahren werden die CV-1-Zellen mit entweder dem Wildtyp-Rezeptor oder dem mutierten Rezeptor und einem auf Glukokortikoid reagierenden Reporterkonstrukt transformiert. Um die Transkriptionsaktivität zu messen, wurde ein CAT-Reporter, der zwei synthetische GREs und eine TATA-Box enthielt, verwendet. Um die Transkriptionsrepression zu messen, wurden zwei Konstrukte verwendet. Das erste enthält zwei Kopien der Bindungsstelle für den durch Entzündung induzierbaren Transkriptionsfaktor AP-1, worauf der Thymidinkinase-Promotor (tk-Promotor) folgt, der mit CAT verknüpft ist. Das zweite enthält zwei Kopien der Bindungsstelle für den durch Entzündung induzierbaren Transkriptionsfaktor NFK-B, worauf eine TATA-Box folgt, die mit dem Luciferase-Gen verknüpft ist. Die CAT-Expression wurde unter Verwendung eines ELISA-Assays gemäß der vom Hersteller empfohlenen Vorgehensweise quantifiziert. Die Luciferase-Aktivität wurde unter Verwendung eines im Handel erhältlichen Luciferase-Assays gemäß der vom Hersteller empfohlenen Vorgehensweise gemessen.
  • Beispiel 20 (nicht erfindungsgemäß)
  • In-vitro-Transfektionen unter Verwendung von CV-1-Zellen
  • Der GR/PR-Fusionsproteinrezeptor und der mutierte Ratten-GR wurden über eine In-vitro-Transfektion in CV-1-Zellen auf biologische Aktivität getestet. Als Kontrollen wurden Vektoren, die den humanen Wildtyp-GR und den Ratten-Wildtyp-GR exprimieren, verwendet. Ergebnisse dieser Versuche demonstrieren, dass der humane Wildtyp-GR und der Ratten-Wildtyp-GR als Reaktion auf Dexamethason und minimal durch RU486 transkriptional aktiviert werden. Im Gegensatz dazu wird der mutierte Ratten-GR (CS1.CD) von RU486 und nicht von Dexamethason transkriptional aktiviert. In ähnlicher Weise wird auch der GR/PR-Fusionsproteinrezeptor von RU486 und nicht von Dexamethason aktiviert. 11 stellt die Menge an CAT-Protein dar, das als Reaktion auf den bestimmten Liganden produziert wird.
  • Beispiel 21 (nicht erfindungsgemäß)
  • In-vitro-Transkriptionsrepressionsstudien
  • Die von dem mutiertem Ratten-GR und dem humanen GR/PR-Konstrukt vermittelte Transkriptionsrepression wurde untersucht. Die Menge an CAT-Protein, das unter der Transkriptionskontrolle synthetischer Aktivierungselemente produziert wird, wurde ermittelt.
  • Insbesondere wurden zwei Reporter untersucht, TRE2tkCAT, das AP-1 enthält, das mit dem Thymidinkinasepromotor fusioniert ist, der mit CAT verknüpft ist. Der zweite verwendete Reporter war NFK-B-luc-Plasmid, das 2 NFK-B-Bindungsstellen enthält, die mit Luciferase fusioniert sind. Diese Promotoren enthalten durch Entzündung induzierbare Promotoren und wurden dazu verwendet, die Fähigkeit der Wildtyp- und mutierten GR-Konstrukte, die Transkription zu reprimieren, zu beurteilen.
  • Zellen wurden zusammen mit entweder dem Ratten-Wildtyp-GR oder dem humanen Wildtyp-GR oder dem mutierten Ratten-GR (CS1.CD) oder dem mutierten humanen GR in CV-1-Zellen transfiziert. Zellen, die zuvor mit Dex oder RU486 behandelt wurden, um eine Bindung an den Steroidrezeptor zu ermöglichen, wurden dann mit Phorbolester TPA stimuliert, um AP-1 und NFK-B zu aktivieren. Geleitzellen wurden nicht mit TPA stimuliert und Kontrollzellen erhielten ebenfalls weder Dex noch RU486.
  • Die Ergebnisse demonstrieren, dass eine RU486-Behandlung in einem Rückgang des CAT-Protein-Niveaus und der Luciferase-Aktivität in mit CS1.CD transfizierten Zellen resultierte. Eine Dex-Behandlung hatte keine Auswirkung auf die CAD-Niveaus oder die Luciferase. Diese Ergebnisse wurden nicht erwartet, da Dex nicht an die Ligandenbindungsdomäne des mutierten Ratten-GR, CS1.CD, oder des mutierten humanen GR bindet. In Zellen, die mit dem Wildtyp-GR transfiziert wurden, bewirkten sowohl Dex und RU486 einen Rückgang des CAT-Protein-Niveaus und der Luciferase-Aktivität. Solche Ergebnisse sind nicht unerwartet, da der Wildtyp-GR sowohl Dex als auch RU486 bindet.
  • Beispiel 22 (nicht erfindungsgemäß)
  • Expression und Nachweis von mutiertem GR
  • Drei Antikörper wurden erhalten und dazu verwendet, um rekombinanten, zum Teil gereinigten GR in einer Western-Blot-Analyse zu erkennen. Studien wurden durchgeführt, um Protein von Wildtyp-GR oder mutiertem GR aus transfizierten Zellen oder GR aus Ratten-Synovialgewebe unter Verwendung der obigen Antikörper nachzuweisen.
  • Die Antikörper waren auch dazu im Stande, humanen GR nachzuweisen, der aus HeLa-Zellextrakten erhalten wurde. Beträchtliche GR-Niveaus wurden mit nur 200 μg Vollzellextrakt nachgewiesen. Die Immunreaktivität wurde ebenfalls mit Synovialgewebe nachgewiesen und Antikörper werden hergestellt, um zwischen Proteinen von Wildtyp-Gr und mutiertem GR zu unterscheiden.
  • Beispiel 23 (nicht erfindungsgemäß)
  • Transaktivierungs- und Transrepressionsstudien
  • Neben den obigen Versuchen wurde der Vektor mit NFK-B-Bindungsstellen, die mit dem Luciferase-Gen fusioniert waren, in echte Gelenke in Ratten injiziert und mit oder TNF-α behandelt. TNF-α ist ein Cytokin, das eine Entzündung induziert und eine NFK-B-Bindung an seine adäquaten DNA-Sequenzen fördert. Mit dem DNA-Konstrukt resultiert eine TNF-α-Behandlung in einem Anstieg der Transkription von TNF-α und exogen eingeführtem Luciferase-Gen. In Synovialgewebe wird ohne Plasmidtransfektion keine Luciferase-Aktivität nachgewiesen. Auch in Synovialgewebe, das mit Plasmid in Abwesenheit von TNF injiziert wurde, liegt keine Luciferase-Aktivität vor. Ein sechsfacher Anstieg des Luciferaseniveaus trat auf, wenn Gewebe 0,1 oder 1 nM TNF ausgesetzt wurde. Dies dient als ein leicht nachweisbarer In-vivo-Marker für die Funktion von Wildtyp-GR oder mutiertem GR.
  • Konstruktion, Charakterisierung und Analyse von doppelten Punktmutationen in der Ligandenbindungsdomäne von GR
  • Beispiel 24 (nicht erfindungsgemäß)
  • Mutagenese der Ligandenbindungsdomäne von humanem GR
  • Ein Plasmid wurde konstruiert, das die cDNA von humanem GR enthielt, wobei die Aminosäuren 752 und 753 durch Alanine ersetzt und die Aminosäuren 762 und 763 deletiert waren. Dieses Plasmid, pSTC-hGR-CS1/CD, wurde wie folgt konstruiert. Das Wildtyp-Glukokortikoidhormonzeptorplasmid wurde mit den Restriktionsenzymen Nsil und Xbal verdaut, die die zu mutierende Region flankieren. Die resultierenden Fragmente wurden aus Agarosegel isoliert. Das kleinere Fragment wurde mit den Restriktionsenzymen EcoRI und SspI verdaut, wobei drei Fragmente erzeugt wurden. Die resultierenden Fragmente wurden aus Agarosegel isoliert.
  • Ein synthetisches Fragment wurde synthetisiert: 5'-AAT TCC CCG AGG CGG CAG CTG AAA TCA TCA CCA ATC AGA TCT-3' (Seq. ID Nr. 6), um das EcoRI/SspI- Fragment zu ersetzen. Das größere Plasmidfragment, das NsiI/EcoRI-Fragment, das SspI/XbaI-Fragment und das synthetische EcoRI/SspI-Fragment wurden zusammenligiert. Das resultierende Plasmid trägt die wie oben beschriebene Substitution und Deletion.
  • Beispiel 25 (nicht erfindungsgemäß)
  • Charakterisierung von GR-Mutanten in der Ligandenbindungsdomäne
  • Um die Integrität der Mutation sicherzustellen, wurde das Plasmid, das das mutierte humane GR enthielt, sequenziert. Weitere Versuche, wie oben erörtert, wurden durchgeführt, um den mutierten humanen GR zu charakterisieren. Es wurden eine Western-Analyse und eine Hormonbindung, wie oben erörtert, durchgeführt, um den Charakter der Konstrukte sicherzustellen, z. B. Zellexpression des Proteins und Steroidspezifität für die Aktivierung oder Repression der Transkription.
  • Beispiel 26 (nicht erfindungsgemäß)
  • Transkriptionsaktivität der mutierten Rezeptoren in Säugerzellen
  • LMTK--Zellen wurden bei 37 °C in Dulbeccos modifiziertem Eagle-Medium, das 10 % fötales Rinderserum (fetal bovine serum, „FBS") enthielt, in einer feuchten Atmosphäre, die 5 % CO2 enthielt, gehalten. Die Zellen wurden mit dem in Kawai et al., Mol. Cell. Bio. 4:91-1172 (1984), beschriebenen Polybren-Verfahren, das hiermit durch Bezugnahme hierin aufgenommen ist, einschließlich der Zeichnungen, transfiziert. Nach einem Schock mit 25%-igem Glycerin in Hanks gepufferter Kochsalzlösung (Hank's buffered saline solution, „HBSS") wurden die Zellen zweimal mit HBSS gewaschen und Medium, das Hormone oder Lösemittel enthielt, wurde zugegeben. Die Zellen wurden 48 Stunden kultiviert. Extrakte wurden mittels eines Frost/Tau-Wechsels hergestellt. Die CAT-Aktivität wurde mit 25 μg Protein und einer Inkubationszeit von 16 Stunden geprüft. Geprüfte CAT-Aktivität, wie von Seed et al., Gene 67:271 (1988) hiermit durch Bezugnahme hierin aufgenommen, einschließlich der Zeichnungen.
  • Konstruktion, Charakterisierung und Analyse von konstitutiv aktivem mutiertem GR
  • Beispiel 27 (nicht erfindungsgemäß)
  • Mutagenese der Ligandenbindungsdomäne von humanem GR
  • Die Deletion der Steroid-Ligandenbindungsdomäne wurde wie folgt hergestellt. Diese Deletion entfernte einen großen Teil des carboxyterminalen Teils des Proteins, wodurch alle Steroidbindungseigenschaften eliminiert werden. Unter Anwendung der oben erörterten Vorgänge wurde das pGR0403R-Plasmid (9 und 10) konstruiert. Diese Mutation führt zu einem konstitutiv aktiven Rezeptor. Diese Mutante konnte die Transkription des CAT-Reportergens in Gegenwart oder Abwesenheit von Glukokortikoidhormon aktivieren. Darüber hinaus kann diese Mutante auch die Transkription des NFK-B-Luciferase-Konstrukts reprimieren.
  • Beispiel 28 (nicht erfindungsgemäß)
  • Charakterisierung von GR-Mutanten in der Ligandenbindungsdomäne
  • Um die Integrität der Mutation sicherzustellen, wurde das Plasmid, das das mutierte humane GR enthielt, pGR0403R (10), sequenziert (9). Weitere Versuche, wie oben erörtert, wurden durchgeführt, um den mutierten humanen GR zu charakterisieren. Es wurden eine Western-Analyse und eine Hormonbindung, wie oben erörtert, durchgeführt, um den Charakter der Konstrukte sicherzustellen, z. B. Zellexpression des Proteins, Fehlen von Steroidspezifität für die Aktivierung oder Repression der Transkription und Grundniveau der Genexpression im Vergleich zur konstitutiven Expression.
  • Beispiel 29 (nicht erfindungsgemäß)
  • Transkriptionsaktivität der mutierten Rezeptoren in Säugerzellen
  • Das konstitutiv aktive mutierte GR-Konstrukt wurde wie oben erörtert hergestellt. Der Rezeptor weist keine Ligandenbindungsdomäne auf und reprimiert, wenn er in Zellen exprimiert wird, die Transkription von AP-1-angetriebenen Genen in Abwesenheit von Dex oder RU486. In-vitro-Tests zeigen, dass die konstitutiv aktive GR-Mutante bei Transfektion Promotoren mit Glukokortikoid-Response-Elementen aktiviert und AP-1 enthaltende Promotoren reprimiert.
  • Konstruktion. Charakterisierung und Analyse von Mutationen in den DNA-Bindungs- oder Transregulationsdomänen von GR
  • Beispiel 30 (nicht erfmdungsgemäß)
  • Mutagenese der DNA-Bindungs- oder Transregulationsdomänen von GR
  • Zum Erhalten der Transaktivierungsaktivität ohne Transrepressionsaktivität wurde das folgende Konstrukt hergestellt. Die mutierte Ligandenbindungsdomäne wird wie oben beschrieben mutiert. Verfahrensdetails von Lanz et al., Endocrinology 135:2183-2195 (1994) sind hiermit durch Bezugnahme hierin aufgenommen, einschließlich der Zeichnungen. Die mutierte DNA-Bindungsdomäne wird mutiert, indem das Serin an Position 425 durch Glycin, das Leucin an Position 436 durch Valin und das Tyrosin und das Asparagin an den Positionen 478 und 479 durch Leucin und Glycin ersetzt werden.
  • Zum Erhalten der Transaktivierungsaktivität ohne Transrepressionsaktivität wurde das folgende Konstrukt hergestellt. Die mutierte Ligandenbindungsdomäne wird wie oben beschrieben mutiert. Die mutierte Transregulationsdomäne wird mutiert, indem das Alanin an Position 458 durch Threonin, das Asparagin und das Alanin an den Positionen 454 und 458 durch Asparaginsäure bzw. Threonin und das Arginin und die Asparaginsäure an den Positionen 460 und 562 durch Asparagin bzw. Cystein ersetzt werden.
  • Beispiel 31 (nicht erfindungsgemäß)
  • Charakterisierung von GR-Mutanten in den DNA-Bindungs- und Transregulationsdomänen
  • Um die Integrität der Mutation sicherzustellen, wurde das Plasmid, das das mutierte GR enthielt, sequenziert. Weitere Versuche, wie oben erörtert, wurden durchgeführt, um die mutierten GR-Konstrukte zu charakterisieren. Es wurden eine Western-Analyse und eine Hormonbindung, wie oben erörtert, durchgeführt, um den Charakter der Konstrukte sicherzustellen, z. B. Proteinexpression in Zellen und Steroidspezifität für die Aktivierung oder Repression der Transkription.
  • Beispiel 32 (nicht erfindungsgemäß)
  • Transkriptionsaktivität der mutierten Rezeptoren in Säugerzellen
  • Die obigen mutierten GR-Konstrukte wurden hergestellt. Die zwei verschiedenen Rezeptorkonstrukte weisen entweder eine mutierte DNA-Bindungsdomäne oder eine mutierte Transregulationsdomäne auf. Bei Expression in Zellen reprimiert das Nur-Transrepressionskonstrukt mit einer DNA-Bindungsdomänen-Mutation die Transkription von AP-1- und NFK-B-angetriebenen Genen in Gegenwart von Dex und RU486. Es wurde keine Aktivierung der Transkription beobachtet. In-vitro-Tests zeigen, dass die GR-Mutante bei Transfektion AP-1 und NFK-B enthaltende Promotoren reprimiert und die auf Glukokortikoid reagierenden Gene nicht aktiviert.
  • Bei dem Nur-Transaktivierungskonstrukt mit einer mutierten Transregulationsdomäne wurde die Aktivierung der Transkription in Gegenwart verschiedener Steroide beobachtet. In Gegenwart von Dex oder RU486 wurde keine Transrepression von AP-1-oder NFK-B-angetriebenen Genen nachgewiesen. In-vitro-Tests zeigen, dass die GR-Mutante bei Transfektion auf Glukokortikoid reagierende Gene als Reaktion auf Ligandenstimulation aktiviert, es wurde jedoch keine Repression von AP-1- und NFK-B-Genen beobachtet.
  • Beispiel 33
  • Huhn-, Ratten- und Säuger-Progesteronrezeptoren
  • Huhn-, Ratten- und Säuger-Progesteronrezeptoren sind leicht zu erhalten und funktionieren durch Bindung an dieselbe DNA-Regulationssequenz. Huhn- und Ratten-Progesteronrezeptoren binden jedoch ein anderes Spektrum von Liganden, die Affinitäten besitzen, die sich von denen unterscheiden, die mit humanem Progesteronrezeptor interagieren. Folglich können der Huhn- und der Ratten- Progesteronrezeptor als ein transgener Regulator in Menschen verwendet werden. Des Weiteren kann er zum Screenen auf spezifische Liganden verwendet werden, die Huhn- oder Ratten-Progesteronrezeptor, jedoch nicht endogenen humanen Progesteronrezeptor aktivieren. Ein Beispiel eines Liganden ist 5α-Pregnan-3,20-dion (Dihydroprogesteron), das äußerst gut an Huhn- und Ratten-Progesteronrezeptor bindet, jedoch nicht an humanen Progesteronrezeptor bindet oder sehr schlecht an diesen bindet.
  • Obwohl die unmodifizierten Huhn- oder Ratten-Progesteronrezeptoren bereits mit einem anderen Spektrum von Ligandenbindungsaffinitäten als der Mensch oder andere Säuger ausgestattet sind und in ihrer nativen Form verwendet werden können, ist es wichtig zu versuchen, zusätzlichen mutierten Progesteronrezeptor auszuwählen, um einen wirksameren Rezeptor zu erzeugen. Die Unterschiede zwischen Huhn-, Ratten- und humanen Progesteronrezeptoren liegen in einigen wenigen Aminosäurenunterschieden begründet. Folglich könnten andere Mutationen künstlich eingeführt werden. Diese Mutationen würden die Rezeptorunterschiede verstärken. Ein Screenen von Rezeptormutationen auf Ligandenwirksamkeit produziert eine Vielfalt von Rezeptoren, in denen Veränderungen der Affinitäten erfolgen. Das anfängliche Screenen von Progesteronmutanten wurde unter Verwendung von Zwischenniveaus von Liganden durchgeführt. Eine Mutante hatte die Progesteronaffinität vollkommen verloren, band jedoch einen synthetischen Liganden RU486 mit nahezu Wildtyp-Wirksamkeit. RU486 wird normalerweise als ein Antagonist der Progesteronfunktion betrachtet, war jedoch zu einem Agonisten geworden, wenn es unter Verwendung dieser spezifischen Mutante getestet wurde. Da der Ligand synthetisch ist, stellt er keine Verbindung dar, die wahrscheinlich in Menschen oder Tieren gefunden wird, die mit Gentherapie behandelt werden sollen. Obwohl RU486 in diesem Fall als ein Agonist arbeitet, ist es aufgrund seiner potentiellen Nebenwirkungen als ein Anti-Glukokortikoid nicht ideal. Des Weiteren bindet es auch an das humane Wildtyp-Progesteron. Folglich hat es die unerwünschte Nebenwirkung der Reproduktions- und Endokrindysfunktion.
  • Dieser Ansatz ist nicht auf den Progesteronrezeptor beschränkt, da angenommen wird, dass alle von Liganden aktivierten Transkriptionsfaktoren über ähnliche Mechanismen fungieren. Ein Fachmann erkennt, dass ein ähnliches Screenen anderer Mitglieder der Steroid-Superfamilie eine Vielfalt molekularer Schalter bereitstellen wird. Zum Beispiel aktiviert die Verbindung 1,25-Dihydroxy-Vitamin D3 den Vitamin-D-Rezeptor, die Verbindung 24,25-Dihydroxy-Vitamin D tut dies jedoch nicht. Mutanten des Vitamin-D-Rezeptors können produziert werden, die transkriptional aktiviert werden, wenn sie an 24,25-Dihydroxy-Vitamin D gebunden sind, jedoch nicht durch 1,25-Dihydroxy-Vitamin D3.
  • Ein Fachmann erkennt, dass die Liganden so entworfen werden, dass sie physiologisch toleriert werden, leicht geklärt werden, nicht toxisch sind und spezifische Auswirkungen auf das Transgensystem anstatt auf den gesamten Organismus haben.
  • Beispiel 34
  • Transgene Tiere
  • Bin modifizierter Glukokortikoidrezeptor kann bei der Produktion nichtmenschlicher transgener Tiere verwendet werden. Eine Vielfalt von Verfahren sind zum Herstellen transgener Tiere bekannt, einschließlich des in Leder und Stewart, US-Patentschrift Nr. 4,736,866 , erteilt am 12. April 1988, und Palmiter und Bannister, Annual Review of Genetics, 20:465-499, beschriebenen. Zum Beispiel können die oben beschriebenen mutierten Glukokortikoidrezeptoren mit der Nukleinsäurekassette vereint werden, die das zu exprimierende rekombinante Gen enthalten. Zum Beispiel kann Lactoferrin unter die Kontrolle eines Basalpromotors, wie Thymidinkinasepromotor mit angrenzenden Glukokortikoid-Response-Elementen, gestellt werden. Dieser Vektor wird in die Tierkeimbahn eingeführt, zusammen mit dem Vektor, der den mutierten Glukokortikoidrezeptor konstitutiv exprimiert. Die zwei Vektoren können ebenfalls zu einem Vektor vereint werden. Die Expression des rekombinanten Gens in das transgene Tier wird an- oder abgeschaltet, indem dem transgenen Tier eine pharmakologische Dosis von RU38486 verabreicht wird. Dieses Hormon dient dazu, die Transkription des Transgens spezifisch zu aktivieren. Die Dosis kann so eingestellt werden, dass sie das Expressionsniveau reguliert. Ein Fachmann wird leicht erkennen, dass dieses Protokoll für eine Vielfalt von Genen verwendet werden kann, und somit ist es bei der Regulation der zeitlichen Expression eines beliebigen gegebenen Genprodukts in transgenen Tieren von Nutzen.
  • Position von Transregulationsdomänen am C-Terminus
  • Beispiel 35
  • Chimäres Fusionsprotein mit verschiedenen C-Terminus-Deletionen
  • Um GLVP-Chimären mit verschiedenen C-terminalen Deletionen der humanen Progesteronrezeptor-Ligandenbindungsdomäne zu konstruieren, wurde das HindIII-zu-BamHI-Fragment, das diese verschiedenen Deletionen in pRSV-hPR-Plasmiden enthielt (Xu et al. (1996) (unveröffentlicht), wurde auf Gel mit dem QIAEX II-Gelextraktionskit (Qiagen) gereinigt. Die gereinigten Fragmente wurden in HindIII- und BamHI-Stellen von pRSV-GLVP subkloniert (Wang et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 91:8180-8184 (1994)), wodurch die Aminosäureregion 610 bis 891 des GLVP ersetzt wird.
  • Beispiel 36
  • GLVPC'-Chimären mit VP16-Aktivierung am C-Terminus
  • Klonierungen in zwei Schritten wurden angewendet, um eine VP16-Aktivierung zum C-Terminus des chimären Fusionsprotein zu bewegen. Zunächst wurde die hPR-LBD-Region (von Aminosäure 800 zu verschiedenen C-Termini) unter Verwendung von 5'-Primer (5'-TATGCCTTACCATGTGGC-3') mit einem anderen 3'-Primer als einem Paar amplifiziert und mit HindIII zu SalI verdaut, um das Fragment zur Ligation vorzubereiten. Für eine andere Position der Aminosäurenkürzung sind die 3'-Primer, die die SalI-Stelle integrieren: P3S-879: 5'-TTGGTCGACAAGATCATGCATTATC-3' (Seq. ID Nr. 9); P3S-891: 5'-TTGTCGACCCGCAGTACAGATGAAGTTG-3' (Seq. ID Nr. 10) und P3S-914: 5'-TTGGTCGACCCAGCAATAACTTCAGACATC-3'. Das DNA-Fragment, das die VP16-Aktivierungsdomäne (Aminosäuren 411-490) enthielt, wurde aus pMSV-VP16-Δ3'-β58N' mit SalI und BamHI isoliert.
  • Das verdaute PCR-Fragment und die VP16-Aktivierung wurden in die HindIII- und BamHI-Stellen des Expressionsvektors pCEP4 (Invitrogen) zusammenligiert. Der ligierte Vektor pCEP4-PV (LBD 810-879 und VP16), -C3 (LBD 810-891 und VP16) bzw. -C2 (LBD 810-914 und VP 16) enthalten nun C-terminale Fragmente von hPR-LBD aus der HindIII-Stelle (Amino 810) zu verschiedenen Kürzungen von LBD, die 3' an die VP16-Aktivierungsdomäne mit BamHI hinter dem Terminationscodon von VP16 fusioniert sind. Das HindIII/BamHI-Fragment aus pGL (in pAB-Vektor) wurde dann durch PV-, C3- bzw. C2-Fragment ersetzt, um pGL879VPC', pGL891VPC' und pGL914VPC' zu erhalten. Diese chimären Fusionsproteine wurden dann in Acc65I- und BamHI-Stellen von pCEP4-Expression subkloniert und wurden als pCEP4-pGL879VPC', pCEP4-pGL891VPC', pCEP4-pGL914VPC' bezeichnet (17).
  • Der Regulator mit einer C-terminal positionierten VP16 ist potenter als sein N-terminales Gegenstück (18). Darüber hinaus steigerte eine Erweiterung der C-terminalen LBD von Aminosäure 879 auf Aminosäure 914 die Transkriptionsaktivität des Regulators in dieser C-terminal positionierten VP16-Chimäre weiter. Folglich verstärkt eine Erweiterung der LBD zu Aminosäure 914 die RU486-abhängige Transaktivierung weiter, ungeachtet dessen, ob VP 16 in dem N- oder dem C-Terminus positioniert ist, was die Existenz einer schwachen Dimerisations- und Aktivierungsfunktion zwischen Aminosäure 879 und 914 der PR-LBD nahe legt. Durch Überführen der VP16-Aktivierungsdomäne vom N-Terminus zum C-Terminus wurde ein viel potenterer Transaktivator GL914VPC' erzeugt.
  • Der modifizierte GL914VPC' ist nicht nur potenter, sondern aktiviert außerdem das Reportergen bei einer im Vergleich zu GL914VP, in dem VP16 am N-Terminus positioniert ist, niedrigeren Ligandenkonzentration. Die GL914VP-Aktivität fand bei einer RU486-Konzentration von 0,1 nM statt und erreichte ein Höchstniveau von 1 nM. Im Gegensatz dazu steigerte GL914VPC' die Reportergenexpression bei der RU486-Konzentration, die 10-mal niedriger (0,01 nM) als die von GL914VP war. Dieser neu entdeckte Charakter von GL914VPC' ist für seine Verwendung in der induzierbaren Zielgenexpression wichtig, da er die Verwendung einer Konzentration ermöglichen würde, die keine Anti-Progesteron- oder Anti-Glukokortikoid-Aktivität aufweist. Dies stellt einen erheblichen Vorteil dar, wenn das induzierbare System in In-vivo-Situationen angewendet wird, wie durch transgene Mäuse und Gentherapie beispielhaft veranschaulicht.
  • Beispiel 37
  • Induzierbarer Repressor, der die Kid-1-KRAB-Domäne enthält
  • Das Kid-1-Gen, das die KRAB-Domäne (Aminosäuren 1-70) enthielt, wurde mit 2 Sätzen von Primern zur Insertion in den N- bzw. den C-Terminus von GL914 amplifiziert. Damit die KRAB-Domäne am N-Terminus des Fusionsproteins inseriert wird, wurde die Kid-1-cDNA mit dem Satz von Primern wie folgt amplifiziert: Kid3: 5'-CGACAGATCTGGCTCCTGAGCAAAGAGAA-3' (Seq. ID Nr. 11), Kid4: 5'-CCAGGGATCCTCTCCTTGCTGCAA-3' (Seq. ID Nr. 12). Die PCR-Produkte wurden mit BglII und BamHI verdaut und in pRSV-GL891 subkloniert, um pRSV-KRABGL891 zu erzeugen. Das KpnI/SalI-Fragment von KRABGL891 wurde dann gereinigt und in KpnI/SalI-Stellen in pRSV-GL914VP subkloniert, um pRSV-KRABGL914 zu erzeugen. Das gesamte KRABGL914-Fragment (KpnI/BamHI) wurde dann in das mit KpnI und BamHI verdaute pCEP4 inseriert, wodurch pCEP4-KRABGL914 erzeugt wurde (19).
  • Für eine C-terminal positionierte KRAB-Domäne wurde das Kid-1-Gen mit dem folgenden Satz von Primern amplifiziert: Kid1: 5'-TCTAGTCGACGATGGCTCCTGAGCAAAGAGAAG-3' (Seq. ID Nr. 13), Kid2: 5'-CCAGGGATCCTATCCTTGCTGCAACAG-3' (Seq. ID Nr. 14). Der Primer Kid2 enthält auch ein Terminationscodon (TAG) hinter Aminosäure 70. Die PCR-Produkte wurden mit SalI und BamHI verdaut und unter Verwendung des QIAEX II-Gelextraktionskit (Qiagen) gereinigt. Das Hindill- und SalI-Fragment (317 bp) aus pBS-GL914VPC' wurde wie das Vektorfragment von pCEP-GL914VPC', das mit HindIII und BamHI verdaut wurde, isoliert. Diese Drei-Stück-Fragmente wurden ligiert, um pCEP4-GL914KRAB zu erzeugen.
  • Der chimäre Regulator GL914KRAB, in dem die KRAB-Repressionsdomäne in den C-Terminus inseriert wurde, reprimierte die Expression beider Reporter in einer RU486-abhängigen Art und Weise stark (6- bis 8-fach). Die N-terminal positionierte KRAB-Repressionsdomäne (KRABGL914) reprimierte die Zielgenexpression in Gegenwart von RU486 jedoch nicht in dem Ausmaß, das mit in dem C-Terminus positionierten KRAB (GL914KRAB) erzielt wurde.
  • Beispiel 38
  • Transiente Transfektion, CAT-Assy, hGH-Assay und Western-Blot
  • HeLa- und CV-1-Zellen wurden mit der beschriebenen DNA-Menge unter Anwendung des Verfahrens polybrenvermittelter Ca2PO4-Präzipitation transfiziert und ein CAT-Assay wurde durchgeführt und quantifiziert, wie oben beschrieben (Wang et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 91:8180-8184 (1994)). HepG2-Zellen (106) wurden in DMEM mit 10 % fatalem Rinderserum und 1X Penicillin-Streptomycin-Glutamin (Gibco BRL) gezuchtet und mit dem Verfahren polybrenvermittelter Ca2PO4-Präzipitation transfiziert. Aliquots der Zellkulturmedien wurden in verschiedenen Zeitabständen entnommen und die hGH-Produktion wurde unter Verwendung des klinischen hGH-Assaykits (Nichols Institute) gemäß der Anweisung des Herstellers gemessen. Zur Western-Blot-Analyse wurden Proteinextrakte (20 μg) aus transient transfizierten HeLa-Zellen hergestellt, auf SDS-Polyacrylamidgel getrennt und auf Nylonmembran frans-blottiert, wie oben beschrieben. Der Blot wurde mit monoklonalem Anti-GAL4-DBD-Antikörper (Aminosäuren 1-147) (Clontech) sondiert und mit einem ECL-Kit (Amersham) entwickelt.
  • Diese Analysen bestätigten, dass die zwei Regulatorproteine in einem ähnlichen Niveau exprimiert werden. Zusammengenommen legen diese Ergebnisse nahe, dass wir durch Modifikation der PR-LBD in dem chimären Regulator dessen Reaktion auf einen Liganden um mindestens eine Zehnerpotenz weiter verbessern könnten.
  • Beispiel 39
  • Stabile Zelllinienerzeugung und Neuritauswuchs-Assay
  • Um die Verwendung des induzierbaren Systems in einer biologischen Situation zu demonstrieren, wurde ein regulierbares Expressionsmodell für Nervenwachstumsfaktor (nerve growth factor, NGF) entwickelt. Von NGF wurde gezeigt, dass er den Neuritauswuchs (Axon-Auswuchs) von PC 12-Zellen (von adrenalem Phäochromozytom der Rate) stimuliert, wenn er Zellkulturmedien zugesetzt wird (Greene et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 73:2424-2428 (1976)).
  • Ratten-FR-Zellen, die von fötalen Hautzellen der Rate (American Type Culture Collection, CRL 1213) stammen, wurden mittels des Ca2PO4-Verfahrens, wie zuvor beschrieben (Wang et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 91:8180-8184 (1994)), mit pCEP4-GLVP914VPC' transfiziert. Zellen wurden in DMEM mit 10 % fötales Rinderserum gezüchtet und mit 50 μg/ml Hygromycin-B (Boehringer Mannheim) selektiert. Nach 2-3 Wochen wurden Kolonien ausgesucht und anschließend expandiert. Jeder Klon wurde dann mit 2 μg des p17X4-TATA-CAT-Plasmids unter Einsatz von Lipofectin (GIBCO-BRL) transient transfiziert. Vierundzwanzig Stunden später wurden mit entweder RU486 (10-8 M) oder einem Vehikel aus 80%-igem Ethanol behandelt. Die Zellen wurden 48 Stunden später geerntet und die CAT-Aktivität wurde unter Verwendung von 50 μg Zellextrakten gemessen. Klone, die durch RU486 induzierbare CAT-Aktivität zeigen, wurden anschließend mit dem Vektor p17X4-TATA-rNGF(Neo) transfiziert.
  • Stabile Zellen, die beide Gene enthielten, wurden mit Hygromycin (50 μg/ml) und G418 (100 μg/ml) für 2-3 Wochen selektiert und anschließend expandiert. Jede Kolonie wurde dann in einer 10-cm-Petrischale angesetzt und mit 10-8 M RU486 oder Vehikelkontrolle (80%-igem Ethanol) behandelt. Nach 48 Stunden wurden die konditionierten Medien gesammelt und eingefroren. Anschließend wurden die konditionierten Medien aufgetaut und zweifach in DMEM mit 10 % Pferdeserum und 5 % fötalem Rinderserum verdünnt. Die verdünnten konditionierten Medien wurden dann auf PC 12-Zellen gegeben, wobei neue verdünnte konditionierte Medien alle zwei Tage zugegeben wurden. Nach 5-7 Tagen wurden PC12-Zellen auf Neuritauswuchs beobachtet.
  • Wenn konditionierte Medien (von mit RU486 behandelten C4FRNGF-Zellen) PC 12-Zellen zugesetzt wurden, wurde nach 48 h Inkubation ein starker Neuritauswuchs von PC12-Zellen beobachtet. Wenig, falls überhaupt, Neuritauswuchs wurde in PC12-Zellen beobachtet, die mit den konditionierten Medien inkubiert worden waren, die von stabilen Zellen gesammelt wurden, die mit Vehikel allein (85%-iges Ethanol) behandelt worden waren. Diese Ergebnisse demonstrieren, dass das induzierbare System zum Steuern verschiedener biologischer Phänomene verwendet werden kann.
  • Mutierte Glukokortikoidrezeptoren als Genschalter (nicht erfindungsgemäß) Neben den obigen Verfahren können die mutierten Glukokortikoidrezeptoren als Genschalter verwendet werden. Die obigen Konstrukte können zum Exprimieren eines kotransfizierten therapeutischen Zielgens unter Verwendung eines Glukokortikoid-Response-Elements („GRE"), das Promotor enthält, eingesetzt werden. Der GRE-Promotor wird die Expression des therapeutischen Gens bei Aktivierung der Ligandenbindungsdomäne der Konstrukte der vorliegenden Erfindung antreiben, aktivieren oder transaktivieren. Das therapeutische Protein kann ein sekretiertes Protein sein, z. B. ein Antientzündungscytokin. Solche Verfahren ermöglichen eine weiter umfassende Auswirkung auf das transfizierte Gewebe.
  • Ein Fachmann würde leicht zu schätzen wissen, dass die vorliegende Erfindung gut darauf adaptiert ist, die Aufgaben auszuführen und die erwähnten sowie die diesen innewohnenden Ziele und Vorteile zu erreichen. Die mutierten Steroidrezeptoren, zusammen mit den hierin beschriebenen Verfahren, Vorgehensweisen, Behandlungen, Molekülen, spezifischen Verbindungen, sind gegenwärtig repräsentativ für bevorzugte Ausführungsformen, die beispielhaft sind und nicht als Einschränkungen des Schutzumfangs der Erfindung gedacht sind. Änderungen daran und andere Verwendungen werden Fachmännern offenbar werden.
  • Einem Fachmann wird leicht offenbar werden, dass verschiedene Substitutionen und Modifikationen an der hierin offenbarten Erfindung vorgenommen werden können. SEQUENZPROTOKOLL
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Claims (22)

  1. Modifiziertes Steroidhormonrezeptorprotein, wobei das Rezeptorprotein auf einen herkömmlichen Antagonisten eines Wildtyp-Progesteronrezeptorprotein-Gegenstücks mit einer agonistischen Reaktion reagiert und wobei das modifizierte Rezeptorprotein eine DNA-Bindungsdomäne, eine Transregulationsdomäne und eine mutierte Progesteronrezeptor-Ligandenbindungsregion umfasst, dadurch gekennzeichnet, dass die Transregulationsdomäne zu der Ligandenbindungsregion heterolog ist und sich in einer C-terminalen Position in dem modifizierten Steroidhormonrezeptorprotein befindet.
  2. Modifiziertes Steroidhormonrezeptorprotein nach Anspruch 1, wobei die Progesteronrezeptor-Ligandenbindungsregion durch eine Veränderung einer primären Sequenz in etwa 13 bis 42 carboxyterminalen Aminosäuren einer Wildtyp-Progesteronrezeptor-Ligandenbindungsdomäne mutiert ist.
  3. Modifiziertes Steroidhormonrezeptorprotein nach Anspruch 2, wobei die Progesteronrezeptor-Ligandenbindungsregion im Wesentlichen aus Aminosäuren besteht, die aus der Gruppe bestehend aus 640 bis 914, 640 bis 917 oder 640 bis 920 einer Progesteronrezeptor-Ligandenbindungsdomäne ausgewählt sind.
  4. Modifiziertes Steroidhormonrezeptorprotein nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Transregulationsdomäne die Genexpression transaktivieren oder transreprimieren kann.
  5. Modifiziertes Steroidhormonrezeptorprotein nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die DNA-Bindungsdomäne durch eine DNA-Bindungsdomäne ersetzt wird, die normalerweise nicht mit der Progesteron-Ligandenbindungsdomäne assoziiert wird.
  6. Modifiziertes Steroidhormonrezeptorprotein nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei es sich bei der DNA-Bindungsdomäne um eine GAL-4-DNA- Bindungsdomäne handelt.
  7. Modifiziertes Steroidhormonrezeptorprotein nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei es sich bei der Transregulationsdomäne um eine Transaktivierungsdomäne handelt.
  8. Modifiziertes Steroidhormonrezeptorprotein nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei es sich bei der Transregulationsdomäne um eine Transrepressionsdomäne handelt.
  9. Modifiziertes Steroidhormonrezeptorprotein nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Transregulationsdomäne eine Krüppel-assoziierte Box-A-Transrepressionsdomäne (KRAB-Transrepressionsdomäne) umfasst.
  10. Modifiziertes Steroidhormonrezeptorprotein nach Anspruch 9, wobei es sich bei der KRAB-Transrepressionsdomäne um eine Kid-1- oder Kox1-KRAB-Transrepressionsdomäne handelt.
  11. Modifiziertes Steroidhormonrezeptorprotein nach Anspruch 10, wobei es sich bei der KRAB-Transrepressionsdomäne um eine Kid-1-KRAB-Transrepressionsdomäne handelt.
  12. Modifiziertes Steroidhormonrezeptorprotein nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die mutierte Progesteronrezeptor-Ligandenbindungsdomäne einen synthetischen Antagonisten bindet, der ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus: RU486, Org31806 und Org31376.
  13. Modifiziertes Steroidhormonrezeptorprotein nach Anspruch 12, wobei die mutierte Progesteronrezeptor-Ligandenbindungsregion auf RU486 in einer Konzentration von nur 0,01 nM reagieren kann.
  14. Modifiziertes Steroidhormonrezeptorprotein nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei das Rezeptorprotein in folgender Reihenfolge vom N-Terminus zum C-Terminus die DNA-Bindungsdomäne, die mutierte Progesteronrezeptor-Ligandenbindungsregion und die Transregulationsdomäne umfasst.
  15. Nukleinsäuresequenz, die ein modifiziertes Steroidhormonrezeptorprotein nach einem der vorhergehenden Ansprüche kodiert.
  16. Nukleinsäuresequenz nach Anspruch 15, die weiterhin einen gewebespezifischen Promotor umfasst.
  17. Vektor, der die Nukleinsäuresequenz nach Anspruch 15 oder 16 enthält.
  18. Zelle, die mit einem Vektor nach Anspruch 17 transfiziert oder transformiert wurde.
  19. In-vitro-Verfahren zum Herstellen einer transformierten Zelle, das den Schritt des Inkontaktbringens der Zelle mit einem Vektor nach Anspruch 17 für einen Zeitraum, der dazu ausreicht, die Zelle zu transformieren, umfasst, wobei die transformierte Zelle ein modifiziertes Steroidhormonrezeptorprotein exprimiert, das von dem Vektor kodiert wird.
  20. Verwendung des Vektors nach Anspruch 17 bei der Herstellung eines Arzneimittels zum Abgeben der Nukleinsäuresequenz, die das modifizierte Steroidhormonrezeptorprotein kodiert, an einen Säuger in vivo.
  21. Verwendung des Vektors nach Anspruch 17 bei der Herstellung eines Arzneimittels zum Abgeben der Nukleinsäuresequenz, die das modifizierte Steroidhormonrezeptorprotein kodiert, an einen Säuger in vivo zum Regulieren der Expression von Neuritwachstumsfaktor.
  22. Transgenes, nicht menschliches Tier, dessen Zellen die Nukleinsäure nach Anspruch 15 oder 16 oder den Vektor nach Anspruch 17 enthalten.
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Families Citing this family (15)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
AU1523900A (en) * 1998-11-20 2000-06-13 Valentis, Inc. Adenoviral vector-mediated delivery of modified steroid hormone receptors and related products and methods
DE19933075C2 (de) * 1999-07-19 2001-11-29 Deutsches Krebsforsch Nicht-menschliches Säugetier mit gewebespezifisch verändertem Glukokortikoidrezeptor
US7329728B1 (en) 1999-10-25 2008-02-12 The Scripps Research Institute Ligand activated transcriptional regulator proteins
AU7254401A (en) * 2000-07-18 2002-01-30 Novartis Ag Regulation of gene expression using single-chain, monomeric, ligand dependent polypeptide switches
US7011972B2 (en) 2000-07-18 2006-03-14 The Scripps Research Institute Fusion polypeptide comprising two ligand binding domains
EP1326969B1 (de) * 2000-09-25 2009-04-15 Genetronics, Inc. Verbessertes system zur regulation der transgenexpression
WO2002097050A2 (en) 2001-05-31 2002-12-05 Novartis Ag Novel estrogen receptor ligand binding domain variants and novel ligands and pharmaceutical compositions
AU2003301960A1 (en) * 2002-11-05 2004-06-03 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Methods of isolation of active compounds and activated targets
WO2005040212A2 (en) * 2003-10-24 2005-05-06 Istituto Di Ricerche Di Biologia Molecolare P Angeletti Spa Orthogonal gene switches
EP2179044A4 (de) * 2007-07-06 2012-06-06 Temasek Life Sciences Lab Ltd Mit einer chemikalie auf lexa-basis induzierbares genexpressionssystem zur verwendung in transgenen tieren
EP2207874B1 (de) * 2007-10-08 2014-12-03 Intrexon Corporation Technisch manipulierte dendritische zellen und verwendungen zur krebsbehandlung
BRPI0920679A2 (pt) 2008-10-08 2022-05-17 Intrexon Corp Células construídas expressando múltiplos imunomoduladores e usos das mesmas
JP5733705B2 (ja) * 2009-03-30 2015-06-10 国立大学法人 岡山大学 特異的プロモーターの活性を上昇させるシステム及び該システムを保持したベクター
TWI688395B (zh) * 2010-03-23 2020-03-21 英翠克頌公司 條件性表現治療性蛋白質之載體、包含該載體之宿主細胞及彼等之用途
US20230330227A1 (en) 2020-08-13 2023-10-19 A2 Biotherapeutics, Inc. Gene fusions for control of genetically modified cells

Family Cites Families (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4736866B1 (en) * 1984-06-22 1988-04-12 Transgenic non-human mammals
US5217867A (en) * 1988-11-30 1993-06-08 The Salk Institute For Biological Studies Receptors: their identification, characterization, preparation and use
AU639699B2 (en) * 1988-12-23 1993-08-05 Salk Institute For Biological Studies, The Dominant negative members of the steroid/thyroid superfamily of receptors
JPH04504654A (ja) * 1988-12-23 1992-08-20 ザ　ソーク　インスティテュート　フォア　バイオロジカル　スタディーズ レセプターの転写抑制活性組成物および方法
US5215916A (en) * 1991-06-19 1993-06-01 The United States Of America As Represented By The Department Of Health & Human Services Super glucocorticoid receptors: receptors with increased affinity and specificity for glucocorticoid steriods
US5298422A (en) * 1991-11-06 1994-03-29 Baylor College Of Medicine Myogenic vector systems
US5364791A (en) * 1992-05-14 1994-11-15 Elisabetta Vegeto Progesterone receptor having C. terminal hormone binding domain truncations
CA2135644C (en) * 1992-05-14 2009-01-27 Elisabetta Vegeto Mutated steroid hormone receptors, methods for their use and molecular switch for gene therapy
US6416998B1 (en) * 1992-09-02 2002-07-09 Baylor College Of Medicine Plasmid encoding a modified steroid hormone

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