DE60132208T2

DE60132208T2 - Regulation der genexpression unter verwendung von einkettigen, monomeren, liganden-abhängigen polypeptidschaltern

Info

Publication number: DE60132208T2
Application number: DE60132208T
Authority: DE
Inventors: Roger Beerli; Ulrich Schopfer; Carlos F. Solana Beach BARBAS
Original assignee: Novartis AG; Scripps Research Institute
Current assignee: Novartis AG; Scripps Research Institute
Priority date: 2000-07-18
Filing date: 2001-07-16
Publication date: 2008-12-24
Anticipated expiration: 2021-07-17
Also published as: CA2415726A1; AU2001272544B2; ATE382691T1; EP1303606B1; EP1303606A2; NZ523649A; AU7254401A; ES2299494T3; WO2002006463A3; DE60132208D1; EP1908835A2; EP1908835A3; IL153833A0; WO2002006463A2; JP2004504029A

Description

Technisches Gebiet der Erfindung
Das Gebiet dieser Erfindung ist die Transkriptionsregulation. Insbesondere bezieht sich die vorliegende Erfindung auf Polypeptide, die die Transkription auf eine von kleinmolekularen Liganden abhängige Weise aktivieren oder unterdrücken können.
Hintergrund der Erfindung
Konstruierte Transkriptionsfaktoren mit definierter Zielspezifität und Regulationsfunktion liefern wertvolle Werkzeuge für die Grundlagen- und angewandte Forschung und für die Gentherapie. Dementsprechend ist der Entwurf von sequenzspezifischen DNA-Bindungsdomänen seit zwei Jahrzehnten von größtem Interesse. Von den vielen Klassen von DNA-bindenden Proteinen, die untersucht wurden, ist das modulare Cys2-His2-Zinkfinger-DNA-Bindungsmotiv am vielversprechendsten für die Herstellung von Proteinen mit maßgeschneiderter DNA-Bindungsspezifität. Die neuartige Architektur dieser Klasse von Proteinen ermöglicht die schnelle Konstruktion von genspezifischen Targeting-Vorrichtungen. Polydactyle Zinkfingerproteine werden am einfachsten durch die Assemblierung von modularen Zinkfingerdomänen hergestellt, die vordefinierte Dreinukleotidsequenzen erkennen (siehe z. B. Segal, D.J., Dreier, B., Beerli, R.R. und Barbas, C.F., III (1999) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96, 2758–2763; Beerli, R.R., Segal, D.J., Dreier, B. und Barbas, C.F., III (1998) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95, 14628–14633; und Beerli, R.R., Dreier, B. und Barbas, C.F., III (2000) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97, 1495–1500). Polydactyle Proteine können unter Verwendung von variablen Anzahlen von Zinkfingerdomänen unterschiedlicher Spezifität assembliert werden, wobei DNA-bindende Proteine geliefert werden, die nicht nur neuartige Sequenzen, sondern auch Sequenzen unterschiedlicher Länge erkennen. Durch das Kombinieren von sechs Zinkfingerdomänen werden Proteine erzeugt, die 18 zusammenhängende Basenpaare einer DNA-Sequenz erkennen, eine DNA-Adresse, die ausreichend komplex ist, um einen beliebigen Lokus in dem 4 Milliarden Basenpaare umfassenden menschlichen Genom (oder einem beliebigen anderen Genom) zu bestimmen. Die Fusion von polydactylen Zinkfingerproteinen dieses Typs zu Aktivierungs- oder Repressionsdomänen liefert Transkriptionsfaktoren, die die Expression sowohl von Transgenen als auch von endogenen Genen effizient und spezifisch modulieren (Beerli, R.R., Segal, D.J., Dreier, B. und Barbas, C.F., III (1998) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95, 14628–14633; und Beerli, R.R., Dreier, B. und Barbas, C.F., III (2000) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97, 1495–1500).
Während die Verfügbarkeit von konstruierten Transkriptionsfaktoren mit maßgeschneiderten DNA-Bindungsspezifitäten neuartige Möglichkeiten bei der Transkriptionsregulation liefert, wären zusätzliche Anwendungen für ligandenabhängige Transkriptionsfaktoren verfügbar. Konstruierte Zinkfingerproteine, die von kleinmolekularen Induktoren abhängig sind, hätten eine Anzahl von Anwendungen, sowohl für die Regulation von endogenen Genen als auch für die Entwicklung von induzierbaren Expressionssystemen für die Regulation von Transgenen. Natürliche Transkriptionsfaktoren werden durch eine Anzahl von unterschiedlichen Mechanismen reguliert, einschließlich Posttranslationsmodifizierung, wie z. B. Phosphorylierung (Janknecht, R. und Hunter, T. (1997) EMBO J 16, 1620–1627; Darnell, J.E., Jr. (1997) Science 277, 1630–1635), oder durch Ligandenbindung. Die prototypischen ligandenaktivierten Transkriptionsfaktoren gehören zur Familie der nukleären Hormonrezeptoren, die die Rezeptoren für Geschlechtssteroide oder Adrenokortikoide umfasst (Carson-Jurica, M.A., Schrader, W.T. und O'Malley, W. (1990) Endocrine Reviews 11, 201–220; Evans, R.M. (1988) Science 240, 889–895). Diese Rezeptoren werden in Abwesenheit von Hormonen durch die Zuordnung zu einer Anzahl von Inaktivierungsfaktoren, die hsp90 umfassen, inaktiv gehalten (Pratt, W.B. und Toft, D.O. (1997) Endocrine Rev. 18, 306–360). Auf eine Ligandenbindung hin trennen sich nukleäre Hormonrezeptoren von dem Inaktivierungskomplex, dimerisieren und werden dazu fähig, DNA zu binden und die Transkription zu aktivieren (Carson-Jurica, M.A., Schrader, W.T. und O'Malley, W. (1990) Endocrine Reviews 11, 201–220; Evans, R.M. (1988) Science 240, 889–89512–14; und Pratt, W.B. und Toft, D.O. (1997) Endocrine Rev. 18, 306–360). Wesentlich ist, dass nicht nur Hormon-bindende, sondern auch Inaktivierungs- und Dimerisierungsfunktionen innerhalb der Ligandenbindungsdomäne (LBD) dieser Proteine liegen (Beato, M. (1989) Cell 56, 335–344). Diese Tatsache wurde experimentell ausgenutzt, und Steroidhormonrezeptor-LBDs haben verbreitete Anwendung als Werkzeuge gefunden, um heterologe Proteine hormonabhängig zu machen.
Insbesondere wird die Estrogenrezeptor(ER)-LBD verwendet, um die Funktionen von c-Myc (Eilers, M., Picard, D., Yamamoto, K.R. und Bishop, J.M. (1989) Nature 340, 66–68), c-Fos (Superti-Furga, G., Bergers, G., Picard, D. und Busslinger, M. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88, 5114–5118) und sogar der zytoplasmatischen Kinase c-Raf (Samuels, M.L., Weber, M.J., Bishop, J.M. und McMahon, M. (1993) Mol. Cell. Biol. 13, 6241–6252) hormonabhängig zu machen. Um ein induzierbares Expressionssystem zur Verwendung in der Grundlagenforschung und Gentherapie zu entwickeln, ist die Verfügbarkeit von ligandenabhängigen Transkriptionsregulatoren Voraussetzung. Vorzugsweise würden diese Regulatoren durch einen kleinmolekularen Induktor mit keiner anderen biologischen Aktivität aktiviert, würden spezifische Sequenzen binden, die nur in dem Zielpromotor vorhanden sind, und eine geringe Immunogenität aufweisen. Eine Anzahl von ligandregulierten artifiziellen Transkriptionsfaktoren wurde mit verschiedenen Mitteln unter Verwendung von funktionellen Domänen hergestellt, die entweder von Prokaryoten (Gossen, M. und Bujard, H. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89, 5547–5551 20. Gossen, M., Freundlieb, S., Bender, G., Müller, G., Rillen, W. und Bujard, H. (1995) Science 268, 1766–1769 21. Laboes, M.A., Baim, S.B., Shenk, T. und Levine, A.J. (1990) Mol. Cell. Biol. 10, 3343–3356 22. Baim, S.B., Laboes, M.A., Levine, A.J. und Shenk, T. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88, 5072–5076) oder Eukaryoten (Christopherson, K.S., Mark, M.R., Bajaj, V. und Godowski, P.J. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89, 6314–6318 24. No, D., Yao, T.-P. und Evans, R.M. (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93, 3346–3351 25. Wang, Y., O'Malley, B.W., Jr., Tsai, S. und O'Malley, B.W. (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91, 8180–8184 Beerli et al. -35–26. Wang, Y., Xu, J., Pierson, T., O'Malley, B.W. und Tsai, S.Y. (1997) Gene Therapy 4, 432–441 27. Braselmann, S., Graninger, P. und Busslinger, M. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90, 1657–1661 28. Louvion, J.F., Havaux-Copf, B. und Picard, D. (1993) Gene 131, 129–134 29. Rivera, V.M., Clackson, T., Natesan, S., Pollock, R., Amara, J.F., Keenan, T., Magari, S.R., Phillips, T., Courage, N.L., Cerasoli, F., Jr., Holt, D.A. und Gilman, M. (1996) Nature. Med. 2, 1028–1032) stammen.
Von den funktionellen Domänen, die von eukaryotischen Proteinen stammen, werden nukleäre Hormonrezeptor-LBDs am meisten verwendet. Whitelaw M.L. et al., EMBO J. 12 (1993), 4169–4179 und Whitelaw M.L. et al., MCB 14. (1994), 8343–8355 offenbaren Chimären zwischen den nukleären Rezeptoren für Glukokortikoide und Dioxin.
Die WO-A-01/36447 , die gemäß Art. 54(3) EPÜ zum Stand der Technik gehört, offenbart chimäre Proteine, die zumindest zwei funktionelle Proteineinheiten aufweisen, wobei jede Einheit die Dimerisierungsdomäne eines Elements der Steroid/Thyroid-Hormonnukleärrezeptorüberfamilie aufweist. Jede Einheit kann eine Ligandenbindungsdomäne, eine DNA-Bindungsdomäne und eine Aktivierungsdomäne enthalten. Insbesondere wurden Regulatoren beschrieben, die auf der Gal4-DNA-Bindungsdomäne (DBD) basieren, die mit einer Human-ER-(Braselmann, S., Graninger, P. und Busslinger, M. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90, 1657–1661; Louvion, J.F., Havaux-Copf, B. und Picard, D. (1993) Gene 131, 129–134) oder Progesteronrezeptor(PR)-LBD fusioniert ist; (Wang, Y., O'Malley, B.W., Jr., Tsai, S. und O'Malley, B.W. (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91, 8180–8184; Wang, Y., Xu, J., Pierson, T., O'Malley, B.W. und Tsai, S.Y. (1997) Gene Therapy 4, 432–441), sowie das Ecdyson-induzierbare System, das auf dem Drosophila-Ecdyson-Rezeptor (EcR) und dem Saugetier-Retinoid-X-Rezeptor (RXR) basiert (Christopherson, K.S., Mark, M.R., Bajaj, V. und Godowski, P.J. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89, 6314–6318; No, D., Yao, T.- P. und Evans, R.M. (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93, 3346–3351). Verglichen mit dem heterodimeren EcR/RXR-System haben Regulatoren, die auf den ER- und PR-LBDs basieren, den wichtigen Vorteil, dass dieselben als Homodimere wirksam sind und die Lieferung nur einer cDNA benötigen. Während jedoch Ecdyson keine bekannte biologische Wirkung auf Säugetierzellen hat, rufen Estrogen und Progesteron eine biologische Reaktion bei Zellen oder Geweben hervor, die die endogenen Steroidrezeptoren exprimieren. Mit der Verfügbarkeit einer mutierten ER- und einer gekürzten PR-LBD, die nicht mehr auf ihre natürlichen Liganden ansprechen, aber durchaus auf synthetische Antagonisten, wie z. B. 4-Hydoxytamoxifen (4-OHT) (Littlewood, T.D., Hancock, D.C., Danielian, P.S., Parker, M.G. und Evan, G.I. (1995) Nucl. Acids Res. 23, 1686–1690) bzw. RU486 (Vegeto, E., Allan, G.F., Schrader, W.T., Tsai, M.-J., McDonnell, D.P. und O'Malley, B.W. (1992) Cell 69, 703–713), ist dies kaum noch relevant. Somit können auf Steroidhormonrezeptor-LBDs basierende induzierbare Expressionssysteme entwickelt werden, die unabhängig von den endogenen Steroidrezeptoren wirksam sind. Bislang wurde dies für die PR-LBD durch die Entwicklung eines RU486-induzierbaren Expressionssystems gezeigt, das auf der Gal4-DBD basiert (Wang, Y., O'Malley, B.W., Jr., Tsai, S. und O'Malley, B.W. (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91, 8180–8184; Wang, Y., Xu, J., Pierson, T., O'Malley, B.W. und Tsai, S.Y. (1997) Gene Therapy 4, 432–441). Ein induzierbares Expressionssystem, das auf einer punktmutierten (G525R) ER-LBD basiert (Littlewood, T.D., Hancock, D.C., Danielian, P.S., Parker, M.G. und Evan, G.I. (1995) Nucl. Acids Res. 23, 1686–1690), die nicht mehr auf Estrogen anspricht, jedoch durchaus auf den Antagonisten 4-OHT, wurde bislang nicht beschrieben. Konstruierte Zinkfingerproteine weisen eine Anzahl von Vorteilen verglichen mit anderen DBDs, einschließlich der von Gal4 abgeleiteten, auf, da die Fähigkeit, DNA-Bindungsspezifitäten zu konstruieren, ermöglicht, dass ligandenabhängige Regulatoren auf einen beliebigen gewünschten artifiziellen oder natürlichen Promotor gerichtet werden. Hier wird der Nutzen von Fusionsproteinen zwischen konstruierten Zinkfingerproteinen und Nukleärhormonrezeptor-LBDs für die induzierbare Steuerung der Genexpression untersucht.
Kurze Zusammenfassung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung liefert ein nicht natürlich vorkommendes Polypeptid, das zwei Ligandenbindungsdomänen, die funktionsfähig miteinander verknüpft sind, eine erste funktionelle Domäne, bei der es sich um eine DNA-Bindungsdomäne handelt, die funktionsfähig mit einer der Ligandenbindungsdomänen verknüpft ist, und eine zweite funktionelle Domäne enthält, bei der es sich um eine Transkriptionsregulationsdomäne handelt. Die Ligandenbindungsdomänen sind bevorzugt kovalent miteinander verknüpft. Bevorzugter sind die beiden Bindungsdomänen mittels eines Peptidlinkers kovalent verknüpft, der etwa 10 bis etwa 40 Aminosäurereste, bevorzugt etwa 15 bis etwa 35 Aminosäurereste und bevorzugter etwa 18 bis etwa 30 Aminosäurereste enthält.
Die Ligandenbindungsdomänen stammen von nukleären Hormonrezeptoren. Die Ligandenbindungsdomänen können von dem gleichen oder von unterschiedlichen nukleären Hormonrezeptoren stammen. Exemplarische und bevorzugte nukleäre Hormonrezeptoren sind Steroidhormonrezeptoren, wie z. B. ein Estrogenrezeptor, ein Progesteronrezeptor, ein Ecdysonrezeptor und ein Retinoid-X-Rezeptor.
Die erste funktionelle Domäne ändert die Funktion oder die Aktivität eines Zielnukleotids und ist eine DNA-Bindungsdomäne. Die DNA-Bindungsdomäne enthält bevorzugt zumindest ein manipuliertes Zinkfinger-DNA-Bindungsmotiv, bevorzugter zwei bis zwölf Zinkfinger-DNA-Bindungsmotive und noch bevorzugter drei bis sechs Zinkfinger-DNA-Bindungsmotive. Bei einem Ausführungsbeispiel binden die Zinkfinger-DNA-Bindungsmotive spezifisch an eine Nuldeotidsequenz der Formel (GNN)_1-6, wobei G Guanidin und N ein beliebiges Nuldeotid ist. Die zweite funktionelle Domäne ist eine Transkriptionsregulationsdomäne, wie z. B. eine Transkriptionsaktivierungsdomäne oder eine Transkriptionsrepressionsdomäne.
Bei einem Ausführungsbeispiel umfasst ein Polypeptid dieser Erfindung (a) eine DNA-Bindungsdomäne mit drei bis sechs Zinkfinger-DNA-Bindungsmotiven; (b) eine erste von einem Retinoid-X-Rezeptor stammende Ligandenbindungsdomäne, die funktionsfähig mit der DNA-Bindungsdomäne verknüpft ist, eine zweite von einem Ecdysonrezeptor stammende Ligandenbindungsdomäne, die mit einem Peptidspacer aus 18 bis 36 Aminosäureresten mit der ersten Ligandenbindungsdomäne verknüpft ist; und (c) eine Transkriptionsregulationsdomäne, die funktionsfähig mit der zweiten Bindungsdomäne verknüpft ist.
Bei einem weiteren Ausführungsbeispiel umfasst ein Polypeptidgenschalter (a) eine DNA-Bindungsdomäne mit drei bis sechs Zinkfinger-DNA-Bindungsmotiven; (b) eine erste von einem Progesteronrezeptor stammende Ligandenbindungsdomäne, die funktionsfähig mit der DNA-Bindungsdomäne verknüpft ist, eine zweite von einem Progesteronrezeptor stammende Ligandenbindungsdomäne, die mit einem Peptidspacer aus 18 bis 36 Aminosäureresten mit der ersten Ligandenbindungsdomäne verknüpft ist; und (c) eine Transkriptionsregulationsdomäne, die funktionsfähig mit der zweiten Ligandenbindungsdomäne verknüpft ist.
In einem weiteren Aspekt liefert die vorliegende Erfindung Polynukleotide, die für einen Polypeptidgenschalter der Erfindung codieren, Expressionsvektoren, die derartige Polynukleotide enthalten, und Zellen, die derartige Nukleotide enthalten.
Ein weiterer Aspekt dieser Erfindung liefert ein Verfahren zum Regulieren der Funktion eines Zielnuldeotids, das eine definierte Sequenz enthält. Das Verfahren umfasst den Schritt einer in vitro- oder ex vivo-Exposition des Zielnukleotids mit einem Polypeptid dieser Erfindung in Gegenwart eines Liganden, der zumindest eine der Ligandenbindungsdomänen des Polypeptids bindet. In einem damit in Beziehung stehenden Aspekt liefert die vorliegende Erfindung ein Verfahren zum Regulieren der Transkription (z. B. Expression) eines Zielnukleotids (z. B. Gens). Gemäß diesem Verfahren wird ein Zielnuldeotid, das eine definierte Sequenz enthält, einem Polypeptid dieser Erfindung in Gegenwart eines Liganden ausgesetzt, der an zumindest eine der Ligandenbindimgsdomänen dieses Polypeptids bindet. Das Polypeptid enthält eine DNA-Bindungsdomäne, die spezifisch an die definierte Sequenz in dem Zielnukleotid bindet. Wenn der Polypeptidgenschalter eine Transkriptionsrepressionsdomäne enthält, handelt es sich bei der Regulation um Repression. Wenn der Polypeptidgenschalter eine Transkriptionsaktivierungsdomäne enthält, handelt es sich bei der Regulation um Aktivierung.
Kurze Beschreibung der Zeichnungen
Bei den Zeichnungen, die einen Teil der Beschreibung darstellen, zeigen:
1 die Erzeugung von konstruierten Zinkfingerproteinen mit einer neuartigen DNA-Bindungsspezifität. A, Aminosäuresequenz der Dreifingerproteine B3 und N1. DNA-Erkennungshelixpositionen -2 bis 6, fett gedruckt, wurden in die Rahmenstruktur des Dreifingerproteins Sp1C eingebracht. Die Position der antiparallelen β-Blätter und der α-Helices, strukturelle Kennzeichen von Zinkfingerdomänen, ist wie gezeigt. Die DNA-Bindungsspezifität jedes Fingers ist links gezeigt. F1-3, Finger 1–3. B. ELISA-Analyse der DNA-Bindungsspezifität. Zinkfingerproteine wurden in E. coli als MBP-Fusionen exprimiert und gereinigt. Die Spezifität der Bindung wurde durch Messung der Bindung an immobilisierte biotinylierte Haarnadel-Oligonukleotide analysiert, die die gezeigten 5'-(GNN)₃-3'-Sequenzen enthielten. Schwarze Banden, B3; graue Banden, N1. Die Maximalsignale wurden auf 1 normiert. Der K_D-Wert für die Bindung an die spezifische Zielsequenz wurde durch elektrophoretische Mobilitätsverschiebungsuntersuchung (EMSA) gemessen und ist über den entsprechenden Banden aufgetragen.
2 die Regulation der Genexpression durch hormonabhängige, einkettige ER-Fusionskonstrukte. A, Struktur von ER-Fusionsproteinen. E2C, Sechsfingerprotein; L, flexibler Peptidlinker. B, Fusionsproteine mit einer einzigen ER-LBD-Bindung als Dimere. HeLa-Zellen wurden mit einem C7-ER-VP64-Expressionsvektor und den gezeigten TATA-Luciferase-Reporterplasmiden, die entweder eine oder zwei C7-Bindungsstellen trugen, cotransfiziert. 24 Stunden nach der Transfektion wurden Zellen entweder unbehandelt gelassen (-), oder es wurden 100 nM 4-OHT hinzugegeben (+). Die Luciferase-Aktivität bei Gesamtzellextrakten wurde 48 Stunden nach der Transfektion gemessen. Jede Bande stellt den Mittelwert (+/- SD) von Doppelmessungen dar. C, Kontrollplasmid pcDNA3, das kein Fusionsprotein exprimiert. C, D, Regulation der Transkription durch eine einzige Bindungsstelle durch Fusionsproteine mit zwei ER-LBDs. HeLa-Zellen wurden mit den gezeigten Expressionsvektoren und dem E2C-TATA-Luciferase-Reporterplasmid cotransfiziert, das eine einzige E2C-Bindungsstelle einer TATA-Box vorgelagert trägt. 4-OHT-Induktion und Messung der Luciferase-Aktivität wurden ausgeführt wie bei B beschrieben.
3 die Regulation der Genexpression durch hormonabhängige, einkettige RXR/EcR-Fusionskonstrukte. A, Struktur von einkettigen RXR/EcR-Fusionsproteinen. B, Regulation der Transkription durch eine einzige Bindungsstelle. HeLa-Zellen wurden mit den gezeigten Expressionsvektoren und dem E2C-TATA-Luciferase-Reporterplasmid, das eine einzige E2C-Bindungsstelle trägt, cotransfiziert. 24 Stunden nach der Transfektion wurden Zellen entweder unbehandelt gelassen (-), oder es wurden 5 μM Ponasteron A hinzugegeben (+). Die Luciferase-Aktivität bei Gesamtzellextrakten wurde 48 Stunden nach der Transfektion gemessen. Jede Bande stellt den Mittelwert (+/- SD) von Doppelmessungen dar. pcDNA3.1, Kontrollplasmid, der kein Fusionsprotein exprimiert.
4 die Nukleotid-(SEQ-ID-NR: 31) und Aminosäurerest-Sequenz (SEQ-ID-NR: 32) der Zinkfinger-Bindungsdomäne B3B.
5 die Nukleotid-(SEQ-ID-NR: 33) und Aminosäurerest-Sequenz (SEQ-ID-NR: 34) der Zinkfinger-Bindungsdomäne 2C7.
6 die Nukleotid-(SEQ-ID-NR: 35) und Aminosäurerest-Sequenz (SEQ-ID-NR: 36) der Zinkfinger-Bindungsdomäne B3C2.
7 die Nukleotid-(SEQ-ID-NR: 37) Sequenz der Repressionsdomäne (KRAB-A)₂.
8 die Nukleotid-(SEQ-ID-NR: 38) Sequenz der Repressionsdomäne (SID)₂.
9 die Nukleotid-(SEQ-ID-NR: 39) und Aminosäurerest-Sequenz (SEQ-ID-NR: 40) des Polypeptids E2C-ER-L-ER-VP64.
10 die Nukleotid-(SEQ-ID-NR: 41) und Aminosäurerest-Sequenz (SEQ-ID-NR: 42) des Polypeptids E2C-ER-LL-ER-VP64.
Detaillierte Beschreibung der Erfindung
I. Die Erfindung
Die vorliegende Erfindung liefert Polypeptidgenschalter, Polynukleotide, die für derartige Polypeptide codieren, Expressionsvektoren, die derartige Polynuldeotide enthalten, Zellen, die derartige Expressionsvektoren oder Polynukleotide enthalten, und Verfahren zum Regulieren einer Zielnuldeotidfunktion unter Verwendung derartiger Polypeptide, Polynukleotide und Expressionsvektoren. Anders als bestehende Genschalter, die eine einzige Ligandenbindungsdomäne zusammen mit einer DNA-Bindungsdomäne und/oder einer Transkriptionsregulationsdomäne enthalten, enthalten Polypeptidgenschalter der vorliegenden Erfindung zwei Ligandenbindungsdomänen. Auf die Bindung des Liganden hin erfolgt eine intramolekulare Konfigurationsänderung, die eine Ausrichtung der funktionellen Domänen bezüglich des interessierenden Zielgens ermöglicht. Ein Vorteil der vorliegenden Genschalter gegenüber bestehenden Genschaltern besteht deshalb darin, dass nur ein einziger molekularer Schalter und ein einziger Expressionsvektor für die Herstellung dieses Schalters benötigt werden.
II. Polypeptide
Ein Polypeptidgenschalter der vorliegenden Erfindung umfasst zwei Ligandenbindungsdomänen (LBDs) und eine erste funktionelle Domäne (FD-1). Die Ligandenbindungsdomänen sind funktionsfähig mit der ersten funktionellen Domäne verknüpft, sodass das Polypeptid in Gegenwart eines definierten Liganden, der an zumindest eine der Ligandenbindungsdomänen bindet, die Nukleotidfunktion ändern kann. Die Domänen können in einer beliebigen Reihenfolge angeordnet sein. Wie es im Folgenden gezeigt ist, können sich die Ligandenbindungsdomänen entweder in der amino- oder carboxylterminalen Richtung von der ersten funktionellen Domäne aus befinden.

LBDs FD-1

FD-1 LBDs
Ein Polypeptid dieser Erfindung kommt nicht natürlich vor. Wie derselbe hier verwendet wird, bedeutet der Begriff „nicht natürlich vorkommend" z. B. eines oder mehr der Folgenden: (a) ein Peptid, das aus einer nicht natürlich vorkommenden Aminosäuresequenz gebildet ist; (b) ein Peptid, das eine nicht natürlich vorkommende Sekundärstruktur aufweist, die nicht dem Peptid zugeordnet ist, wie es in der Natur vorkommt; (c) ein Peptid, das eine oder mehr Aminosäuren umfasst, die normalerweise nicht der Art von Organismus zugeordnet sind, bei der dieses Peptid in der Natur vorkommt; (d) ein Peptid, das ein Stereoisomer aus einer oder mehr der Aminosäuren umfasst, die das Peptid bilden, wobei das Stereoisomer nicht dem Peptid zugeordnet ist, wie es in der Natur vorkommt; (e) ein Peptid, das einen oder mehr andere chemische Anteile als eine der natürlichen Aminosäuren umfasst; oder (f) ein isolierter Abschnitt einer natürlich vorkommenden Aminosäuresequenz (z. B. eine gekürzte Sequenz). Ein Polypeptid dieser Erfindung existiert in einer isolierten Form und gereinigt, um im Wesentlichen frei von verunreinigenden Substanzen zu sein. Ein Polypeptid ist von synthetischer Beschaffenheit. Das heißt, das Polypeptid wird von natürlichen Quellen isoliert und gereinigt oder de novo unter Verwendung von Techniken, die in der Technik bekannt sind, hergestellt.
A. Ligandenbindungsdomäne (LBD)
Jede LBD ist eine Aminosäurerestsequenz, die in der Lage ist, einen bestimmten Liganden zu binden und dies auch tut. Die Bindung des Liganden an die LBD verändert die Konformation/Funktion des Polypeptids und ermöglicht ein Regulieren einer Funktion eines Zielnukleotids. In Abwesenheit des Liganden funktioniert der Genschalter nicht, um die Nukleotidfunktion zu verändern. Zumindest eine der LBDs ist in der Lage, einen bestimmten Liganden zu binden und bindet diesen auch. Beide LBDs können einen bestimmten Liganden binden. Somit können die LBDs gleich oder unterschiedlich sein. Bevorzugte LBDs stammen von nukleären Hormonrezeptoren, wie z. B. Steroidhormonrezeptoren.
Exemplarische und bevorzugte Steroidrezeptoren, die als die Quelle von Ligandenbindungsdomänen dienen können, umfassen den Estrogenrezeptor (ER), den Progesteronrezeptor (PR), den Glukokortikoid-α-Rezeptor, den Glukokortikoid-β-Rezeptor, den Mineralokortikoid-Rezeptor, den Androgen-Rezeptor, den Thyroidhormonrezeptor, den Retinsäurerezeptor (RAR), den Retinoid-X-Rezeptor (RXR), den Vitamin-D-Rezeptor, den COUP-TF-Rezeptor, den Ecdyson-Rezeptor (EcR), den Nurr-1-Rezeptor und Orphan-Rezeptoren. Ein bevorzugter EcR stammt entweder von Drosophila melanogaster (DE) oder Bombyx (BE).
Wie es in der Technik bekannt ist, werden Steroidhormone aus einer DNA-Bindungsdomäne und einer Ligandenbindungsdomäne gebildet. Die DNA-Bindungsdomäne enthält die Rezeptorregulationssequenz und bindet DNA, und die Ligandenbindungsdomäne bindet die spezifische biologische Verbindung (Ligand), um den Rezeptor zu aktivieren. Der Begriff „Ligand" bezieht sich auf eine beliebige Verbindung, die den Rezeptor aktiviert, normalerweise durch Wechselwirkung (Bindung) mit der Ligandenbindimgsdomäne des Rezeptors. Liganden umfassen jedoch auch Verbindungen, die den Rezeptor ohne Bindung aktivieren. Wenn dieselbe bei einem Polypeptidgenschalter der vorliegenden Erfindung verwendet wird, wird es bevorzugt, dass die Ligandenrezeptordomäne ausgehend von ihrem natürlich vorkommenden Liganden modifiziert wird, ein anderer Ligand als der natürlich vorkommende Ligand (z. B. Steroidhormon). Mittel zum Verändern oder Derivatisieren von natürlich vorkommenden Nukleärhormonrezeptorligandenbindungsdomänen, um die Bindungsspezifität zu verändern, sind in der Technik bekannt (siehe z. B. US-Patente Nr. 5,874,534 und 5,599,904 ). Ebenso wurden Mittel zum Verändern des Estrogenrezeptors, um seine Bindungsaffinität zu verändern, berichtet [siehe z. B. Littlewood et al., Nucleic Acids Res., 3(10):1686–1690, 1995].
Der Begriff „natürlich vorkommender Ligand" bezieht sich auf Verbindungen, die normalerweise nicht bei Tieren oder Menschen vorkommen und die an die Ligandenbindungsdomäne eines Rezeptors binden. Der Ligand kann auch ein „nicht-nativer Ligand" sein, ein Ligand, der in der Natur nicht bei dem spezifischen Organismus (Mensch oder Tier) vorkommt, bei dem eine Gentherapie in Betracht gezogen wird. Z. B. kommen bestimmte Insektenhormone, wie z. B. Ecdyson, nicht bei Menschen vor. Dies ist ein Beispiel für ein nicht-natives Hormon für Tier oder Mensch.
Beispiele für nicht natürliche Liganden, Anti-Hormone und nicht-native Liganden umfassen die Folgenden: 11β-(4-Dimethylaminophenyl)-17β-hydroxy-17α-propinyl-4,9-estradien-3-on (Ru38486 oder Mifepeston); 11β-(4-Dimethylaminophenyl)-17α-hydroxy-17β-(3-hydroxypropyl)-13α-methyl-4,9-gonadien-3-on (ZK98299 oder Onapriston); 11β-(4-Acetylphenyl)-17β-hydroxy-17α-(1-propinyl)-4,9-estradien-3-on (ZK112993); 11[3-(4-Dimethylaminophenyl)-17β-hydroxy-17α-(3-hydroxy-1(Z)-propenyl-estra-4,9-dien-3-on (ZK98734); (7β11β17β)-11-(4-Dimethylaminophenyl)-7-methyl-4',5'-dihydrospiroy'ester-4,9-dien-17,2'(3'H)-furan!-3-on (Org31806); (11β,14β,17α)-4',5'-Dihydro-11-(4- dimethylaminophenyl)y'spirostra-4,9-dien-17,2'(3'H)-furan!-3-on (Org31376); 5-alpha-Pregnan-3,2-dion. Zusätzliche nicht-natürliche Liganden umfassen im Allgemeinen synthetische nicht-steroidale Estrogen- oder Anti-Estrogen-Verbindungen, die im weiten Sinne als selektive Estrogenrezeptor-Modulatoren (SERMS) definiert sind. Exemplarische Verbindungen umfassen Tamoxifen und Raloxifen, sind jedoch nicht darauf beschränkt.
Exemplarische und bevorzugte Liganden zur Verwendung mit verschiedenen Ligandenbindungsdomänen sind (1) EcR: Ponasteron a, Muristeron A, GS-E (Invitrogen), Tebufenozid; (2) ER: Estrogenantagonisten, wie z. B. 4-Hydroxy-Tamoxifen, ICI 164384, RU 54876, Raloxifen; und (3) PR: Progesteronantagonisten, wie z. B. RU 486, RU 38486 und Onapriston.
Eine besonders bevorzugte LBD, die von einem Progesteronrezeptor stammt, weist Aminosäurereste 645–914 von dem Humanprogesteronrezeptor auf. Eine exemplarische LBD, die von einem Estrogenrezeptor stammt, weist Aminosäurereste 282–599 von der Mausmutante G225R auf.
Die beiden LBDs werden durch einen Aminosäurerestsequenzlinker getrennt, der etwa 10 bis etwa 50 Aminosäurereste enthält. Bevorzugt enthält der Spacer etwa 15 bis etwa 40 Aminosäurereste und bevorzugter etwa 18 bis etwa 35 Aminosäurereste. Exemplarische und bevorzugte Spacer enthalten 18 (L), 30 (LL) oder 36 (LLL) Aminosäurereste.
B. Funktionelle Domänen
Eine zweite Komponente eines vorliegenden Polypeptids ist eine funktionelle Domäne. Wie dieselben hier verwendet werden, bedeuten der Begriff „funktionelle Domäne" und seine grammatischen Äquivalente eine Aminosäurerestsequenz, die an ein Nukleotid bindet, dessen Struktur verändert und/oder die Funktion desselben verändert. Exemplarische derartige funktionelle Domänen umfassen Nukleotidbindungsdomänen, Transkriptionsregulationsdomänen (z. B. Transkriptionsaktivierungsdomänen und Transkriptionsrepressionsdomänen) und Domänen mit Nuldeaseaktivität. Derartige Domänen sind in der Technik bekannt.
1. Nukleotidbindungsdomänen
Eine funktionelle Domäne eines Polypeptids kann eine DNA-Bindungsdomäne sein, eine Sequenz von Aminosäureresten, die eine definierte DNA-Sequenz erkennen und an dieselbe binden. Aminosäurerestsequenzen, die definierte DNA-Sequenzen erkennen und an dieselben binden, sind in der Technik bekannt (z. B. GAL4). Die DNA-Bindungsdomäne eines Polypeptidgenschalters dieser Erfindung weist ein oder mehr manipulierte DNA-Bindungszinkfingermotive auf. Derartige Zinkfinger-DNA-Bindungsmotive sind in der Technik bekannt (siehe z. B. PCT-Patentanmeldungen Nr. WO95/19421 und WO 98/54311 ). Eine DNA-Bindungsdomäne eines Polypeptidgenschalters dieser Erfindung umfasst somit bevorzugt ein mehrfingriges, polydactyles, Zinkfingerpeptid, das konzipiert ist, um spezifische Nukleotidzielsequenzen zu binden.
Die vorliegende Offenbarung basiert auf der Erkennung der strukturellen Merkmale, die für die Cys₂-His₂-Zinkfingerdomäne eindeutig sind, bestehend aus einer einfachen ββα-Faltung einer Länge von etwa 30 Aminosäuren. Strukturelle Stabilität dieser Faltung wird erreicht durch hydrophobe Wechselwirkungen und durch Chelatisierung eines einzelnen Zinkions durch die konservierten Cys₂-His₂-Reste (Lee, M.S., Giepert, G.P., Soman, K.V., Case, D.A. & Wright, P.E. (1989) Science 245, 635–637). Nukleinsäureerkennung wird durch spezifische Aminosäureseitenkettenkontakte erreicht, die von der α-Helix der Domäne ausgehen, die normalerweise drei Basenpaare der DNA-Sequenz bindet (Pavletich, N.P. & Pabo, C.O. (1991) Science 252, 809–17, Elrod-Erickson, M., Rould, M.A., Nekludova, L. & Pabo, C.O. (1996) Structure 4, 1171–1180). Anders als bei anderen Nuldeinsäureerkennungsmotiven ermöglicht eine einfache kovalente Verknüpfung von mehreren Zinkfingerdomänen die Erkennung von ausgedehnten asymmetrischen DNA-Sequenzen.
Untersuchungen von natürlichen Zinkfingerproteinen haben gezeigt, dass drei Zinkfingerdomänen 9 bp einer zusammenhängenden DNA-Sequenz binden können (Pavletich, N.P. & Pabo, C.O. (1991) Science 252, 809–17., Swirnoff, A.H. & Milbrandt, J. (1995) Mol. Cell. Biol. 15, 2275–87). Während die Erkennung von 9 bp einer Sequenz nicht ausreichend ist, um eine eindeutige Stelle sogar nur innerhalb des kleinen Genoms von E. coli zu bestimmen, können polydactyle Proteine, die sechs Zinkfingerdomänen enthalten, eine 18-bp-Erkennung bestimmen (Liu, Q., Segal, D.J., Ghiara, J.B. & Barbas III, C.F. (1997) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94, 5525–5530). Bezüglich der Entwicklung eines universellen Systems zur Gensteuerung kann eine 18-bp-Adresse ausreichend sein, um eine einzige Stelle in allen bekannten Genomen zu bestimmen. Und ihre Wirksamkeit bei der Genaktivierung und -repression in lebenden menschlichen Zellen wurde kürzlich gezeigt (Liu, Q., Segal, D.J., Ghiara, J.B. & Barbas III, C.F. (1997) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94, 5525–5530).
Die manipulierte Zinkfingernukleotidbindungspeptiddomäne kann von einem Wildtyp-Zinkfingerprotein durch Kürzung oder Erweiterung abgeleitet oder hergestellt werden, oder als eine Variante des vom Wildtyp abgeleiteten Polypeptids durch einen Prozess gezielter Mutagenese oder durch eine Kombination der Prozeduren. Der Begriff „gekürzt" bezieht sich auf ein Zinkfingernukleotidbindungspolypeptid, das weniger als die volle Anzahl von Zinkfingern enthält, die in dem nativen Zinkfingerbindungsprotein vorkommen, oder aus dem nicht gewünschte Sequenzen entfernt wurden. Z. B. kann es sich bei der Kürzung des Zinkfingernukleotidbindungsproteins TFIIIA, das in der Natur neun Zinkfinger enthält, um ein Polypeptid nur mit den Zinkfingern eins bis drei handeln. Erweiterung bezieht sich auf ein Zinkfingerpolypeptid, zu dem zusätzliche Zinkfingermodule hinzugefügt wurden. Z. B. kann TFIIIA auf 12 Finger erweitert werden, indem 3 Zinkfingermodule von mehr als einem Wildtyppolypeptid hinzugefügt werden, was ein „Hybrid"-Zinkfingernukleotidbindungspolypeptid ergibt.
Der Begriff „mutagenisiert" bezieht sich auf ein zinkfingerabgeleitetes Nukleotidbindungspolypeptid, das durch Durchführen eines beliebigen der bekannten Verfahren zum Erzielen einer zufälligen oder gezielten Mutagenese der DNA-Codierungsproteine erhalten wurde. Z. B. kann bei TFIIIA eine Mutagenese durchgeführt werden, um nicht-konservierte Reste bei einer oder mehr der Wiederholungen der Konsensussequenz zu ersetzen. Gekürzte Zinkfingernukleotidbindungsproteine können auch mutagenisiert werden. Beispiele für bekannte Zinkfingernukleotidbindungsproteine können ebenfalls mutagenisiert werden. Beispiele für bekannte Zinkfingernuldeotidbindungspolypeptide, die gemäß der vorliegenden Erfindung gekürzt, erweitert und/oder mutagenisiert werden können, um die Funktion einer Nuldeotidsequenz, die ein Zinkfinger-Nuldeotidbindungsmotiv enthält, zu hemmen, umfassen TFIIIA und zif268. Andere Zinkfingenukleotidbindungsproteine sind Fachleuten bekannt.
Eine Zinkfinger-DNA-Bindungsdomäne kann unter Verwendung einer Vielzahl von Standardtechniken, die in der Technik bekannt sind, hergestellt werden. Phagenanzeigebibliotheken von Zinkfingerproteinen wurden eingerichtet und unter Bedingungen ausgewählt, die eine Anreicherung von sequenzspezifischen Proteinen begünstigten. Zinkfingerdomänen, die eine Anzahl von Sequenzen erkannten, erforderten eine Verfeinerung durch gezielte Mutagenese, die sowohl durch Phagenauswahldaten als auch durch strukturelle Informationen geleitet wurde.
Eine DNA-Bindungsdomäne, die bei einem Polypeptid dieser Erfindung verwendet wird, ist bevorzugt ein Zinkfingernukleotidbindungspeptid, das an eine (GNN)_1-6- Nukleotidsequenz bindet. Zinkfinger, die spezifisch an (GNN)_1-6 binden, sind in der US-Patentanmeldung Seriennr. 09/173,941, eingereicht am 16. Oktober 1998, beschrieben.
Exemplarische und bevorzugte Zinkfinger-DNA-Bindungsdomänen werden hier als E2C, C7, B3B, 2C7, B3C2 und N1 bezeichnet. Eine detaillierte Beschreibung der Herstellung von Polypeptidgenschaltern, die Zinkfinger-DNA-Bindungsdomänen enthalten, ist im Folgenden den Beispielen zu entnehmen. Die Aminosäurerest- und Codierungsnuldeotidsequenzen für B3B, 2C7 und B3C2 sind jeweils in den 4–6 gezeigt.
2. Transkriptionsregulationsdomänen
Eine Transkriptionsregulationsdomäne bezieht sich auf ein Peptid, das wirksam ist, um die Transkription eines Zielnukleotids (z. B. Gens) zu aktivieren oder zu unterdrücken. Transkriptionsaktivierungsdomänen sind in der Technik bekannt (siehe z. B. Seipel et al., (1992) EMBO J., 11:4961–4968). Exemplarische und bevorzugte Transkriptionsaktivierungsdomänen umfassen VP16, TA2, VP64, STAT6, relA, TAF-1, TAF-2, TAU-1 und TAU-2. Besonders bevorzugte Aktivierungsdomänen zur Verwendung bei der vorliegenden Erfindung sind VP16 und VP64. Mittel zum Verknüpfen von VP16 und VP64 mit Ligandenbindungsdomänen werden im Folgenden in den Beispielen vorgestellt.
Transkriptionsrepressordomänen sind ebenfalls in der Technik bekannt. Exemplarische und bevorzugte derartige Transkriptionsrepressoren sind ERD, KRAB, SID, Histondeacetylase, DNA, Methylase und Derivate, Multimere und Kombinationen derselben, wie z. B. KRAB-ERD, SID-ERD, (KRAB)₂, (KRAB)₃, KRAB-A, (KRAB-A)₂, (SID)₂, (KRAB-A)-SID und SID-(KRAB-A). Eine erste Repressordomäne kann unter Verwendung der KRAB (Krüppel-associated box – Krüppel-zugeordnete Box)-Domäne hergestellt werden (Margolin et al., 1994). Diese Repressordomäne befindet sich gewöhnlich am N-Terminus von Zinkfingerproteinen, und es wird angenommen, dass dieselbe ihre repressive Aktivität auf die TATA-abhängige Transkription auf eine von der Entfernung und Ausrichtung unabhängige Weise durch eine Wechselwirkung mit dem RING-Finger-Protein KAP-1 ausübt. Es kann die KRAB-Domäne verwendet werden, die zwischen den Aminosäuren 1 und 97 des Zinkfingerproteins KOXI zu finden ist. Schließlich können, um den Nutzen einer Histondeacetylierung für die Repression zu untersuchen, die Aminosäuren 1 bis 36 der Mad-mSIN2-Wechselwirkungsdomäne (mSIN2 interaction domain – SID) zu einer anderen Domäne fusioniert werden (Ayer et al., 1996). Diese kleine Domäne befindet sich am N-Terminus des Transkriptionsfaktors Mad und ist zuständig für das Vermitteln seiner Transkriptionsrepression durch Wechselwirkung mit mSIN3, das wiederum mit dem Co-Repressor N-CoR und mit der Histondeacetylase mRPD1 in Wechselwirkung tritt.
Die Aminosäurerest- und Nukleotidcodierungssequenzen von bevorzugten Transkriptionsrepressionsdomänen (KRAB-A)₂ und (SID)₂ sind in den 7 bzw. 8 gezeigt. Mittel zum Verknüpfen von Repressionsdomänen mit Ligandenbindungsdomänen sowie exemplarische Polypeptidgenschalter, die Repressionsdomänen enthalten, werden im Folgenden in den Beispielen vorgestellt.
3. Polypeptidgenschalter
Ein Polypeptid dieser Erfindung weist zwei Ligandenbindungsdomänen, eine erste funktionelle Domäne und eine zweite funktionelle Domäne auf. Diese Domänen können in beliebiger Reihenfolge vorliegen, wie es im Folgenden gezeigt ist.
Bei einem bevorzugten Ausführungsbeispiel sind die beiden Ligandenbindungsdomänen (LBDs) direkt benachbart zueinander angeordnet, d. h. dieselben sind in dem monomeren Polypeptidgenschalter der Erfindung „in Reihe geschaltet" und sind nicht durch eine funktionelle Domäne der Erfindung getrennt. Die in Reihe geschalteten LBDs können voneinander durch ein Linkermolekül, wie z. B. ein Polypeptidlinkermolekül, getrennt sein.
Bei einem bevorzugten Ausführungsbeispiel sind die beiden LBDs zwischen zwei funktionellen Domänen (FDs) der Erfindung angeordnet, wobei eine funktionelle Domäne eine Transkriptionsregulationsdomäne (TRD) ist und die andere funktionelle Domäne eine Nukleotidbindungsdomäne (NBD) ist.
Bei einem besonders bevorzugten Ausführungsbeispiel besteht der monomere Polypeptidgenschalter der Erfindung aus zwei FDs und zwei LBDs in der sequentiellen Reihenfolge FD-1/LBD-1/LBD-2/FD-2. Bei diesem Ausführungsbeispiel ist eine funktionelle Domäne eine TRD, und die andere funktionelle Domäne ist eine NBD.
Bevorzugt umfasst die NBD, die bei dem monomeren Polypeptidgenschalter der Erfindung eingesetzt wird, 6 Zinkfinger-Bindungsmotive. Wie es ferner in den Beispielen im Folgenden beschrieben ist, ermöglicht eine 6-Zinkfinger-NBD, die bei einem monomeren Polypeptidgenschalter eingesetzt wird, die Erkennung einer eindeutigen 18bp-Nukleinsäuresequenz, die symmetrisch oder asymmetrisch sein kann.

LBDs FD-1 FD-2

FD-1 FD-2 LBDs

FD-1 LBDs FD-2

FD-2 LBDs FD-1

FD-2 FD-1 LBDs
Eine große Vielzahl von Polypeptidgenschaltern wurde hergestellt. Exemplarische derartige Genschalter umfassen (Begriffsdefinitionen siehe oben):
Genschalter, die RXR-, E2C- und Aktivierungsdomänen verwenden

E2C-RXR-L-DE-VP64, E2C-RXR-LL-DE-VP64, E2C-RXR-LLL-DE-VP64, E2C-RXR-L-BE-VP64, E2C-RXR-LL-BE-VP64, E2C-RXR-LLL-BE-VP64, E2C-RXR-L-DE-VP16, E2C-RXR-LL-DE-VP16, E2C-RXR-LLL-DE-VP16, E2C-RXR-L-BE-VP16, E2C-RXR-LL-BE-VP16, E2C-RXR-LLL-BE-VP16;

Genschalter, die RXR-, 2C7- und Aktivierungsdomänen verwenden

2C7-RXR-L-DE-VP64, 2C7-RXR-LL-DE-VP64, 2C7-RXR-LLL-DE-VP64, 2C7-RXR-L-BE-VP64, 2C7-RXR-LL-BE-VP64, 2C7-RXR-LLL-BE-VP64, 2C7-RXR-L-DE-VP16, 2C7-RXR-LL-DE-VP16, 2C7-RXR-LLL-DE-VP16, 2C7-RXR-L-BE-VP16, 2C7-RXR-LL-BE-VP16, E2C-RXR-LLL-BE-VP16;

Genschalter, die RXR-, B3B- und Aktivierungsdomänen verwenden

B3B-RXR-L-DE-VP64, B3B-RXR-LL-DE-VP64, B3B-RXR-LLL-DE-VP64, B3B 7-RXR-L-BE-VP64, B3B 7-RXR-LL-BE-VP64, B3B-RXR-LLL-BE-VP64, B3B-RXR-L-DE-VP16, B3B-RXR-LL-DE-VP16, B3B-RXR-LLL-DE-VP16, B3B-RXR-L-BE-VP16, B3B-RXR-LL-BE-VP16, B3B-RXR-LLL-BE-VP16;

Genschalter, die RXR-, B3C2- und Aktivierungsdomänen verwenden

B3C2-RXR-L-DE-VP64, B3C2-RXR-LL-DE-VP64, B3C2-RXR-LLL-DE-VP64, B3C2-RXR-L-BE-VP64, B3C2-RXR-LL-BE-VP64, B3C2-RXR-LLL-BE-VP64, B3C2-RXR-L-DE-VP16, B3C2-RXR-LL-DE-VP16, B3C2-RXR-LLL-DE-VP16, B3C2-RXR-L-BE-VP16, B3C2 B-RXR-LL-BE-VP16, B3C2-RXR-LLL-BE-VP16;

Genschalter, die RXR-, E2C- und Repressionsdomänen verwenden

E2C-RXR-L-DE-(KRAB-A)2, E2C-RXR-LL-DE-(KRAB-A)2, E2C-RXR-LLL-DE-(KRAB-A)2, E2C-RXR-L-BE-(KRAB-A)2, E2C-RXR-LL-BE(KRAB-A)2, E2C-RXR-LLL-BE-(KRAB-A)2, E2C-RXR-L-DE-(KRAB-A)2, E2C-RXR-LL-DE-(KRAB-A)2, E2C-RXR-LLL-DE-(KRAB-A)2, E2C-RXR-LBE-(KRAB-A)2, E2C-RXR-LL-BE-(KRAB-A)2, E2C-RXR-LLL-BE-(KRABA)2, E2C-RXR-L-DE-(SID)2, E2C-RXR-LL-DE-(SID)2, E2C-RXR-LLL-D(SID)2, E2C-RXR-L-BE-(SID)2, E2C-RXR-LL-BE-(SID)2, E2C-RXR-LLL-B(SID)2, E2C-RXR-L-DE-(SID)2, E2C-RXR-LL-DE-(SID)2, E2C-RXR-LLL-D(SID)2, E2C-RXR-L-BE-(SID)2, E2C-RXR-LL-BE-(SID)2, E2C-RXR-LLL-B(SID)2;

Genschalter, die RXR-, 2C7- und Repressionsdomänen verwenden

2C7-RXR-L-DE-(KRAB-A)2, 2C7-RXR-LL-DE-(KRAB-A)2, 2C7-RXR-LLL-DE-(KRAB-A)2, 2C7-RXR-L-BE-(KRAB-A)2, 2C7-RXR-LL-BE-(KRABA)2, 2C7-RXR-LLL-BE- (KRAB-A)2, 2C7-RXR-L-DE-(KRAB-A)2, 2C7-RXLL-DE-(KRAB-A)2, 2C7-RXR-LLL-DE-(KRAB-A)2, 2C7-RXR-L-BE-(KRAB-A)2, 2C7-RXR-LL-BE-(KRAB-A)2, E2C-RXR-LLL-BE-(KRAB-A)2, 2CRXR-L-DE-(SID)2, 2C7-RXR-LL-DE-(SID)2, 2C7-RXR-LLL-DE-(SID)2, 2CRXR-L-BE-(SID)2, 2C7-RXR-LL-BE-(SID)2, 2C7-RXR-LLL-BE-(SID)2, 2CRXR-L-DE-(SID)2, 2C7-RXR-LL-DE-(SID)2, 2C7-RXR-LLL-DE-(SID)2, 2CRXR-L-BE-(SID)2, 2C7-RXR-LL-BE-(SID)2, E2C-RXR-LLL-BE-(SID)2,n;

Genschalter, die RXR-, B3B- und Repressionsdomänen verwenden

B3B-RXR-L-DE-(KRAB-A)2, B3B-RXR-LL-DE-(KRAB-A)2, B3B-RXR-LLL-DE-(KRAB-A)2, B3B 7-RXR-L-BE-(KRAB-A)2, B3B 7-RXR-LL-BE-(KRAB-A)2, B3B-RXR-LLL-BE-(KRAB-A) 2, B3B-RXR-L-DE-(KRAB-A)2, B3B-RXR-LL-DE-(KRAB-A)2, B3B-RXR-LLL-DE-(KRAB-A)2, B3B-RXR-L-BE-(KRAB-A)2, B3B-RXR-LL-BE-(KRAB-A)2, B3B-RXR-LLL-BE(KRAB-A)2, B3B-RXR-L-DE-(SID)2, B3B-RXR-LL-DE-(SID)2, B3B-RXLLL-DE-(SID)2, B3B7-RXR-L-BE-(SID)2, B3B7-RXR-LL-BE-(SID)2, B3RXR-LLL-BE-(SID)2, B3B-RXR-L-DE-(SID)2, B3B-RXR-LL-DE-(SID)2, B3B-RXR-LLL-DE-(SID)2, B3B-RXR-L-BE-(SID)2, B3B-RXR-LL-BE-(SID)2, B3B-RXR-LLL-BE-(SID)2;

Genschalter, die RXR-, B3C2- und Repressionsdomänen verwenden

B3C2-RXR-L-DE-(KRAB-A)2, B3C2-RXR-LL-DE-(KRAB-A) 2, B3C2-RXR-LLL-DE-(KRAB-A)2, B3C2-RXR-L-BE-(KRAB-A)2, B3C2-RXR-LL-BE-(KRAB-A)2, B3C2-RXR-LLL-BE-(KRAB-A)2, B3C2-RXR-L-DE-(KRABA)2, B3C2-RXR-LL-DE-(KRAB-A)2, B3C2-RXR-LLL-DE-(KRAB-A)2, B3C2-RXR-L-BE-(KRAB-A)2, B3C2 B-RXR-LL-BE-(KRAB-A)2, B3C2-RXR-LLL-BE-(KRAB-A)2, B3C2-RXR-L-DE- (SID)2, B3C2-RXR-LL-DE-(SID)2, B3C2-RXR-LLL-DE-(SID)2, B3C2-RXR-L-BE-(SID)2, B3C2-RXR-LL-BE-(SID)2, B3C2-RXR-LLL-BE-(SID)2, B3C2-RXR-L-DE-(SID)2, B3C2-RXR-LL-DE-(SID)2, B3C2-RXR-LLL-DE-(SID)2, B3C2-RXR-L-BE-(SID)2, B3C2 B-RXLL-BE-(SID)2, B3C2-RXR-LLL-BE-(SID)2;

Genschalter, die PR-, E2C- und Aktivierungsdomänen verwenden

E2C-PR-L-PR-VP64, E2C-PR-LL-PR-VP64, E2C-PR-LLL-PR-VP64, E2C-PR-L-PR-VP64, E2C-PR-LL-PR-VP64, E2C-PR-LLL-PR-VP64, E2C-PR-L-PR-VP16, E2C-PR-LL-PR-VP16, E2C-PR-LLL-PR-VP16, E2C-PR-L-PR-VP16, E2C-PR-LL-PR-VP16, E2C-PR-LLL-PR-VP16;

Genschalter, die PR-, 2C7- und Aktivierungsdomänen verwenden

2C7-PR-L-PR-VP64, 2C7-PR-LL-PR-VP64, 2C7-PR-LLL-PR-VP64, 2C7-PR-L-PR-VP64, 2C7-PR-LL-PR-VP64, 2C7-PR-LLL-PR-VP64, 2C7-PR-L-PR-VP16, 2C7-PR-LL-PR-VP16, 2C7-PR-LLL-PR-VP16, 2C7-PR-L-PR-VP16, 2C7-PR-LL-PR-VP16, E2C-PR-LLL-PR-VP16;

Genschalter, die PR-, B3B- und Aktivierungsdomänen verwenden

B3B-PR-L-PR-VP64, B3B-PR-LL-PR-VP64, B3B-PR-LLL-PR-VP64, B3B 7-PR-L-PR-VP64, B3B 7-PR-LL-PR-VP64, B3B-PR-LLL-PR-VP64, B3B-PR-L-PR-VP16, B3B-PR-LL-PR-VP16, B3B-PR-LLL-PR-VP16, B3B-PR-L-PR-VP16, B3B-PR-LL-PR-VP 16, B3B-PR-LLL-PR-VP16;

Genschalter, die PR-, B3C2- und Aktivierungsdomänen verwenden

B3C2-PR-L-PR-VP64, B3C2-PR-LL-PR-VP64, B3C2-PR-LLL-PR VP64, B3C2-PR-L-PR-VP64, B3C2-PR-LL-PR-VP64, B3C2-PR-LLL-PR-VP64, B3C2-PR-L-PR-VP16, B3C2-PR-LL-PR-VP16, B3C2-PR-LLL-PR-VP16, B3C2-PR-L-PR-VP16, B3C2 B-PR-LL-PR-VP16, B3C2-PR-LLL-PR-VP16;

Genschalter, die PR-, E2C- und Repressionsdomänen verwenden

E2C-PR-L-PR-(KRAB-A)2, E2C-PR-LL-PR(KRAB-A)2, E2C-PR-LLL-PR-(KRAB-A)2, E2C-PR-L-PR-(KRAB-A)2, E2C-PR-LL-PR-(KRAB-A)2, E2C-PR-LLL-PR-(KRAB-A)2, E2C-PR-L-PR-(KRAB-A)2, E2C-PR-LL-PR(KRAB-A)2, E2C-PR-LLL-PR-(KRAB-A)2, E2C-PR-L-PR-(KRAB-A)2, E2C-PR-LL-PR- (KRAB-A)2, E2C-PR-LLL-PR-(KRAB-A)2, E2C-PR-L-PR-(SID)2, E2C-PR-LL-PR-(SID)2, E2C-PR-LLL-PR-(SID)2, E2C-PR-L-PR-(SID)2, E2PR-LL-PR-(SID)2, E2C-PR-LLL-PR-(SID)2, E2C-PR-L-PR-(SID)2, E2C-PLL-PR-(SID)2, E2C-PR-LLL-PR-(SID)2, E2C-PR-L-PR-(SID)2, E2C-PR-LPR-(SID)2, E2C-PR-LLL-PR-(SID)2;

Genschalter, die PR-, 2C7- und Repressionsdomänen verwenden

2C7-PR-L-PR-(KRAB-A)2, 2C7-PR-LL-PR-(KRAB-A)2, 2C7-PR-LLPR-(KRAB-A)2, 2C7-PR-L-PR-(KRAB-A)2, 2C7-PR-LL-PR-(KRAB-A)2, 2C7-PR-LLL-PR-(KRAB-A)2, 2C7-PR-L-PR-(KRAB-A)2, 2C7-PR-LL-PR-(KRAB-A)2, 2C7-PR-LLL-PR-(KRAB-A)2, 2C7-PR-L-PR-(KRAB-A)2, 2C7-PR-LL-PR-(KRAB-A) 2, E2C-PR-LLL-PR-(KRAB-A)2, 2C7-PR-L-PR-(SID)2, 2CPR-LL-PR-(SID)2, 2C7-PR-LLL-PR-(SID)2, 2C7-PR-L-PR-(SID)2, 2C7-PR-LPR-(SBD)2, 2C7-PR-LLL-PR-(SBD)2, 2C7-PR-L-PR-(SID)2, 2C7-PR-LL-PR (SID)2, 2C7-PR-LLL-PR-(SID)2, 2C7-PR-L-PR-(SID)2, 2C7-PR-LL-PR-(SID)2, E2C-PR-LLL-PR- (SID)2,n;

Genschalter, die PR-, B3B- und Repressionsdomänen verwenden

B3B-PR-L-PR-(KRAB-A)2, B3B-PR-LL-PR-(KRAB-A)2, B3B-PR-LLL-PR-(KRAB-A)2, B3B 7-PR-L-PR-(KRAB-A)2, B3B 7-PR-LL-PR-(KRAB-A)2, B3B-PR-LLL-PR-(KRAB-A)2,B3B-PR-L-PR-(KRAB-A)2, B3B-PR-LL-PR (KRAB-A)2, B3B-PR-LLL-PR-(KRAB-A)2, B3B-PR-L-PR-(KRAB-A)2, B3PR-LL-PR-(KRAB-A)2, B3B-PR-LLL-PR-(KRAB-A)2, B3B-PR-L-PR-(SID)2, B3B-PR-LL-PR-(SID)2, B3B-PR-LLL-PR-(SID)2, B3B-7-PR-L-PR-(SID)2, B3B-7-PR-LL-PR-(SID)2, B3B-PR-LLL-PR-(SID)2, B3B-PR-L-PR-(SID)2, B3B-PLL-PR-(SID)2, B3B-PR-LLL-PR-(SID)2, B3B-PR-L-PR-(SH))2, B3B-PR-LPR-(SID)2, B3B-PR-LLL-PR-(SID)2;

Genschalter, die PR-, B3C2- und Repressionsdomänen verwenden

B3C2-PR-L-PR-(KRAB-A)2, B3C2-PR-LL-PR-(KRAB-A)2, B3C2-PR-LLL-PR-(KRAB-A)2, B3C2-PR-L-PR-(KRAB-A)2, B3C2-PR-LL-PR-(KRAB-A)2, B3C2-PR-LLL-PR-(KRAB-A)2, B3C2-PR-L-PR-(KRAB-A)2, B3C2-PR-LL-PR-(KRAB-A)2, B3C2-PR-LLL-PR-(KRAB-A)2, B3C2-PR-L-PR-(KRAB-A)2, B3C2-PR-LL-PR-(KRAB-A)2, B3C2-PR-LLL-PR-(KRAB-A)2, B3C2-PR-L-PR-(SID)2, B3C2-PR-LL-PR-(SID)2, B3C2-PR-LLL-PR-(SID)2, B3C2-PR-L-PR-(SID)2, B3C2-PR-LL-PR-(SID)2, B3C2-PR-LLL-PR-(SID)2, B3C2-PR-L-PR- (SID)2, B3C2-PR-LL-PR-(SID)2, B3C2-PR-LLL-PR-(SID)2, B3C2-PR-L-PR-(SID)2, B3C2-PR-LL-PR-(SID)2, B3C2-PR-LLL-PR-(SID)2,

Genschalter, die ER-, E2C- und Aktivierungsdomänen verwenden

E2C-ER-L-ER-VP64, E2C-ER-LL-ER-VP64, E2C-ER-LLL-ER-VP64, E2C-ER-L-ER-VP64, E2C-ER-LL-ER-VP64, E2T,-ER-LLL-ER-VP64, E2C-ER-L-ER-VP16, E2C-ER- LL-ER-VP16, E2C-ER-LLL-ER-VP16, E2C-ER-L-ER-VP16, E2C-ER-LL-ER-VP16, E2C-ER-LLL-ER-VP 16;

Genschalter, die ER-, 2C7- und Aktivierungsdomänen verwenden

2C7-ER-L-ER-VP64, 2C7-ER-LL-ER-VP64, 2C7-ER-LLL-ER-VP64, 2C7-ER-L-ER-VP64, 2C7-ER-LL-ER-VP64, 2C7-ER-LLL-ER-VP64, 2C7-ER-L-ER-VP16, 2C7-ER-LL-ER-VP16, 2C7-ER-LLL-ER-VP16, 2C7-ER-L-ER-VP16, 2C7-ER-LL-ER-VP16, E2C-ER-LLL-ER-VP16;

Genschalter, die ER-, B3B- und Aktivierungsdomänen verwenden

B3B-ER-L-ER-VP64, B3B-ER-LL-ER-VP64, B3B-ER-LLL-ER-VP64, B3B 7-ER-L-ER-VP64, B3B 7-ER-LL-ER-VP64, B3B-ER-LLL-ER-VP64, B3B-ER-L-ER-VP16, B3B-ER-LL-ER-VP16, B3B-ER-LLL-ER-VP16, B3B-ER-L-ER-VP16, B3B-ER-LL-ER-VP 16, B3B-ER-LLL-ER-VP 16;

Genschalter, die ER-, B3C2- und Aktivierungsdomänen verwenden

B3C2-ER-L-ER-VP64, B3C2-ER-LL-ER-VP64, B3C2-ER-LLL-ER VP64, B3C2-ER-L-ER-VP64, B3C2-ER-LL-ER-VP64, B3C2-ER-LLL-ER-VP64, B3C2-ER-L-ER-VP16, B3C2-ER-LL-ER-VP16, B3C2-ER-LLL-ER-VP16, B3C2-ER-L-ER-VP16, B3C2 B-ER-LL-ER-VP16, B3C2-ER-LLL-ER-VP16;

Genschalter, die ER-, E2C- und Repressionsdomänen verwenden

E2C-ER-L-ER-(KRAB-A)2, E2C-ER-LL-ER-(KRAB-A)2, E2C-ER-LLL-ER-(KRAB-A)2, E2C-ER-L-ER-(KRAB-A)2, E2C-ER-LL-ER-(KRAB-A)2, E2C-ER-LLL-ER-(KRAB-A)2, E2C-ER-L-ER-(KRAB-A)2, E2C-ER-LL-ER(KRAB-A)2, E2C-ER-LLL-ER-(KRAB-A)2, E2C-ER-L-ER-(KRAB-A)2, E2C-ER-LL-ER-(KRAB-A)2, E2C-ER-LLL-ER-(KRAB-A)2, E2C-ER-L-ER-(SID)2, E2C-ER-LL-ER-(SID)2, E2C-ER-LLL-ER-(SID)2, E2C-ER-L-ER-(SID)2, E2ER-LL-ER-(SID)2, E2C-ER-LLL-ER-(SID)2, E2C-ER-L-ER-(SID)2, E2C-ER-LL-ER-(SID)2, E2C-ER-LLL-ER-(SID)2, E2C-ER-L- ER-(SID)2, E2C-ER-LER-(SID)2, E2C-ER-LLL-ER-(SID)2;

Genschalter, die ER-, 2C7- und Repressionsdomänen verwenden

2C7-ER-L-ER-(KRAB-A)2, 2C7-ER-LL-ER-(KRAB-A)2, 2C7-ER-LLER-(KRAB-A)2, 2C7-ER-L-ER-(KRAB-A)2, 2C7-ER-LL-ER-(KRAB-A)2, 2C7-ER-LLL-ER-(KRAB- A)2, 2C7-ER-L-ER-(KRAB-A)2, 2C7-ER-LL-ER-(KRAB-A) 2, 2C7-ER-LLL-ER(KRAB-A)2, 2C7-ER-L-ER-(KRAB-A) 2, 2C7-ER-LL-ER-(KRAB-A)2, E2C-ER-LLL-ER-(KRAB-A)2, 2C7-ER-L-ER-(SID)2, 2CER-LL-ER-(SID)2, 2C7-ER-LLL-ER-(SID)2, 2C7-ER-L-ER-(SID)2, 2C7-ER-L-ER-(SBD)2, 2C7-ER-LLL-ER-(SBD)2, 2C7- ER-L-ER-(SID)2, 2C7-ER-LL-ER (SID)2, 2C7-ER-LLL-ER-(SID)2, 2C7-ER-L-ER-(SID)2, 2C7-ER-LL-ER-(SID)2, E2C-ER-LLL-ER- (SID)2,n;

Genschalter, die ER-, B3B- und Repressionsdomänen verwenden

B3B-ER-L-ER-(KRAB-A)2, B3B-ER-LL-ER-(KRAB-A)2, B3B-ER-LLL-ER-(KRAB-A)2, B3B 7-ER-L-ER-(KRAB-A)2, B3B 7-ER-LL-ER-(KRAB-A)2, B3B-ER-LLL-ER-(KRAB-A)2, B3B-ER-L-ER-(KRAB-A)2, B3B-ER-LL-ER(KRAB-A)2, B3B-ER-LLL-ER-(KRAB-A)2, B3B-ER-L-ER-(KRAB-A)2, B3ER-LL-ER-(KRAB-A)2, B3B-ER-LLL-ER-(KRAB-A)2, B3B-ER-L-ER-(SID)2, B3B-ER-LL-ER-(SID)2, B3B-ER-LLL-ER-(SID)2, B3B-7-ER-L-ER-(SID)2, B3B-7-ER-LL-ER-(SID)2, B3B-ER-LLL-ER-(SID)2, B3B-ER-L-ER-(SID)2, B3B-PLL-ER-(SID)2, B3B-ER-LLL-ER-(SID)2, B3B-ER-L-ER-(SH))2, B3B-ER-L-ER-(SID)2, B3B-ER-LLL-ER-(SID)2;

Genschalter, die ER-, B3C2- und Repressionsdomänen verwenden

B3C2-ER-L-ER-(KRAB-A)2, B3C2-ER-LL-ER-(KRAB-A)2, B3C2-ER-LLL-ER-(KRAB-A)2, B3C2-ER-L-ER-(KRAB-A)2, B3C2-ER-LL-ER-(KRAB-A)2, B3C2-ER-LLL-ER-(KRAB-A)2, B3C2-ER-L-ER-(KRAB-A)2, B3C2-ER-LL-ER-(KRAB-A)2, B3C2-ER-LLL-ER-(KRAB-A)2, B3C2-ER-L-ER-(KRAB-A)2, B3C2-ER-LL-ER-(KRAB-A)2, B3C2-ER-LLL-ER-(KRAB-A)2, B3C2-ER-L-ER-(SID)2, B3C2-ER-LL-ER-(SID)2, B3C2-ER-LLL-ER-(SID)2, B3C2-ER-L-ER-(SID)2, B3C2-ER-LL-ER-(SID)2, B3C2-ER-LLL-ER-(SID)2, B3C2-ER-L-ER-(SID)2, B3C2-ER-LL-ER-(SID)2, B3C2-ER-LLL-ER-(SID)2, B3C2-ER-L-ER- (SID)2, B3C2-ER-LL-ER-(SID)2, B3C2-ER-LLL-ER-(SID)2,

Die Nukleotid-(SEQ-ID-NR: 39) und Aminosäurerest-Sequenz (SEQ-ID-NR: 40) von Polypeptid E2C-ER-L-ER-VP64 sind in 9 gezeigt. Die Nukleotid-(SEQ-ID-NR: 41) und Aminosäurerest-Sequenz (SEQ-ID-NR: 42) von Polypeptid E2C-ER-LL-ER-VP64 sind in 10 gezeigt.
III. Polynukleotide, Expressionsvektoren und Wirtszellen
In einem damit in Beziehung stehenden Aspekt liefert die vorliegende Erfindung Polynukleotide, die für einen Polypeptidgenschalter dieser Erfindung codieren, Expressionsvektoren, die diese Polynukleotide enthalten, Zellen, die diese Polynukleotide enthalten, und transformierte Zellen, die diese Expressionsvektoren enthalten. Vektoren von primärem Nutzen für die Gentherapie umfassen, sind jedoch nicht beschränkt auf Humanadenovirus-Vektoren, adenzugeordnete Vektoren, von murinen oder Lentiviren abgeleitete retrovirale Vektoren oder eine Vielzahl von nicht-viralen Zusammensetzungen, die Liposomen, Polymere und andere DNA-enthaltende Konjugate umfassen. Derartige Vektorsysteme können verwendet werden, um die Genschalter entweder in vitro oder in vivo zu liefern, abhängig vom Vektorsystem. Mit Adenvirus können z. B. Vektoren intravenös verabreicht werden, um die Leber und andere Organe zu transduzieren, direkt in die Lunge oder in vaskuläre Kompartimente eingeführt werden, die durch Ligation oder andere Verfahren vorübergehend lokalisiert werden. Verfahren zum Konstruieren derartiger Vektoren und Verfahren und Verwendungen für die beschriebene Erfindung sind Fachleuten auf dem Gebiet der Gentherapie bekannt.
IV. Verfahren zum Regulieren einer Nukleotidfunktion
Die vorliegende Erfindung liefert ferner ein Verfahren zum Regulieren der Expression einer gewünschten Nuldeotidsequenz, wie z. B. eines Gens. Gemäß dem Verfahren wird die Zielnukleotidsequenz einer wirksamen Menge eines Genschalters und eines Liganden ausgesetzt, wobei die Nukleotidbindungsdomäne des Genschalters an einen Abschnitt des Zielnukleotids bindet, und wobei der Ligand an zumindest eine der Ligandenbindungsdomänen des Genschalters bindet. Die Exposition kann in vitro oder ex vivo erfolgen. Der Begriff „wirksame Menge" bedeutet die Menge, die die Transkription eines Nukleotids (z. B. strukturelles Gen oder Translation von RNA) reguliert.
Der Begriff „Regulieren" bezieht sich auf die Unterdrückung, Verstärkung oder Induktion einer Funktion. Z. B. kann ein Polypeptid der Erfindung eine Promotorsequenz durch Bindung an ein Motiv innerhalb des Promotors modulieren, wodurch die Transkription eines Gens, das wirksam mit der Promotornuldeotidsequenz verknüpft ist, verstärkt oder unterdrückt wird. Alternativ dazu kann die Modulation die Inhibition eines Gens umfassen, wenn das Polypeptid an das strukturelle Gen bindet und die DNA-abhängige RNA-Polymerase daran hindert, das Gen zu lesen, wodurch die Transkription des Gens verhindert wird. Alternativ dazu kann eine Modulation die Inhibition der Translation eines Transkripts umfassen.
Die Promotorregion eines Gens umfasst die regulatorischen Elemente, die normalerweise bezüglich eines strukturellen Gens 5' liegen. Wenn ein Gen aktiviert werden soll, lagern sich Proteine, die als Transkriptionsfaktoren bekannt sind, an die Promotorregion des Gens an. Diese Anordnung ähnelt einem „Anschalter", indem ein Enzym in die Lage versetzt wird, ein zweites Gensegment von DNA zu RNA zu transkribieren. In den meisten Fällen dient das entstehende RNA-Molekül als eine Schablone für die Synthese eines spezifischen Proteins; manchmal ist die RNA selbst das Endprodukt.
Die Regulation der Genexpression oder Transkription kann sowohl durch Exposition des Zielgens mit einem Polypeptidschalter dieser Erfindung als auch bevorzugt durch Transformation einer Zelle, die das Zielgen enthält, in vitro oder ex vivo mit einem Expressionsvektor, der eine Polynukleotidsequenz enthält, die für einen Genschalter codiert, erreicht werden.
Die folgenden Beispiele veranschaulichen spezielle Ausführungsbeispiele der vorliegenden Erfindung und beschränken die Beschreibung oder die Ansprüche auf keine Weise.
BEISPIEL 1: Allgemeine Verfahren
Herstellung von Zinkfingerproteinen.
Für die Herstellung der B3- und N1-Zinkfingerproteine wurden DNA-Erkennungshelices von den Zif268-Finger-2-Varianten pmGAA, pmGAC, pmGGA, pmGGG und pGTA verwendet [Segal, D.J., Dreier, B., Beerli, R.R. und Barbas, C.F., III (1999) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96, 2758–2763]. Dreifingerproteine, die die jeweiligen 9bp-Zielstellen binden, wurden durch Einbringung der geeigneten DNA-Erkennungshelices in die Rahmenstruktur des Dreifingerproteins Sp1C konstruiert [Desjarlais, J.R. und Berg, J.M. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90, 2256–2260]; DNA-Fragmente, die für die zwei 3-Finger-Proteine codierten, wurden aus 6 überlappenden Oligonukleotiden assembliert, wie es beschrieben ist [Beerli, R.R, Segal, D.J., Dreier, B. und Barbas, C.F., III (1998) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95, 14628–14633]. Die Dreifingerproteincodierungsregionen wurden dann über Sfi1-Digestion in den bakteriellen Expressionsvektor pMal-CSS kloniert.
Proteinreinigung.
Maltosebindungsprotein(MBP)-Fusionsproteine wurden unter Verwendung des Proteinfusions- und Reinigungssystems (New England Biolabs), außer dass Zinkpuffer A (ZBA; 10 mM Tris, pH7,5/90 mM KCL, 1 mM MgCl₂, 90 μM ZnCl₂)/1% BSA/5 mM DTT) als der Säulenpuffer verwendet wurde, auf >90% Homogenität gereinigt. Proteinreinheit und -konzentration wurden aus Coomassie-Blaugefärbten 15% SDS-PAGE-Gelen durch Vergleich mit BSA-Standards bestimmt.
ELISA-Analyse.
Bei 96-Well-ELISA-Platten wurden 0,2 μg Streptavidin (Pierce) in jedes Well 1 Stunde lang bei 37°C eingebracht, dann zweimal mit Wasser gespült. Biotinyliertes Zieloligonukleotid (0,025 μg) wurde auf die gleiche Weise angewandt. ZBA/3% BSA wurde zum Blockieren angewandt, aber die Wells wurden nach der Inkubation nicht gespült. Alle folgenden Inkubationen erfolgten bei Raumtemperatur. Beginnend mit 2 μg gereinigtem MBP-Fusionsprotein in den obersten Wells wurden 2-fache serielle Verdünnungen in 1x Bindungspuffer (ZBA/1% BSA/5 mM DTT/0,12 μg/μl gescherte Heringsperma-DNA) angewandt. Die Proben wurden 1 Stunde lang bei Raumtemperatur inkubiert, gefolgt von 10 Spülungen mit Wasser. Maus-Anti-Maltose-BindungsproteinmAb (Sigma) in ZBA/1% BSA wurde 30 Minuten lang in die Wells eingebracht, gefolgt von 10 Spülungen mit Wasser. Ziegen-Anti-Maus-IgG-mAb, konjugiert mit alkalischer Phosphatase (Sigma), wurde 30 Minuten lang in die Wells eingebracht, gefolgt von 10 Spülungen mit Wasser. Alkalisches Phosphatasesubstrat (Sigma) wurde angewandt, und die OD405 wurde mit SOFTmax 2.35 (Molecular Devices) quantitativ bestimmt.
Gelmobilitätverschiebungsuntersuchungen.
Zieloligonukleotide wurden an ihren 3'-Enden mit [³²P] markiert und gelgereinigt. Elf 3-fache serielle Protein-Verdünnungen wurden in 20 μl Bindungsreaktionen (1x Bindungspuffer/10% Glycerol/≈1 pM Zieloligonukleotid) drei Stunden lang bei Raumtemperatur inkubiert, dann auf einem 5%igen Polyacrylamid-Gel in 0,5x TBE-Puffer aufgelöst. Die quantitative Bestimmung von getrockneten Gelen wurde unter Verwendung von PhosphorImager und ImageQuantSoftware (Molecular Dynamics) durchgeführt, und KD wurde durch Scatchard-Analyse bestimmt.
Reporterkonstrukte zum Bestimmen der optimalen Beabstandung und Ausrichtung der beiden Halbstellen.
C7-Dimer-TATA-Fragmente wurden durch PCR-Amplifikation mit C7-Dimer-TATA-Primern (5'-GAG GGT ACC GCG TGG GCG A_0-5 GCG TGG GCG AGT CGA CTC TAG AGG GTA TAT AAT GG-3' (SEQ-ID-NR: 1) für direkte Wiederholungen; 5'-GAG GGT ACC GCG TGG GCG A_0-5 CGC CCA CGC AGT CGA CTC TAG AGG GTA TAT AAT GG-3' (SEQ-ID-NR: 2) für invertierte Wiederholungen; 5'-GAG GGT ACC CGC CCA CGC A_0-5 GCG TGG GCG AGT CGA CTC TAG AGG GTA TAT AAT GG-3' (SEQ-ID-NR: 3) für evertierte Wiederholungen) und GLprimer2 (5'-CTT TAT GTT TTT GGC GTC TTC C-3' (SEQ-ID-NR: 4); Promega) unter Verwendung von p17x4TATA-luc (überlassen von S.Y. Tsai) als eine Schablone erzeugt. PCR-Produkte wurden über Digestion mit den Restriktionsendonuldeasen Kpn1 und Nco1 in pGL3-Basic (Promega) kloniert.
RU486- und Tamoxifen-induzierbare Promotorkonstrukte.
10xC7-TATA-, 10×B3-TATA- und 10xN1-TATA-Fragmente wurden aus jeweils zwei Paaren von komplementären Oligonukleotiden assembliert und der Firefly-Luciferase-Codierungsregion vorgelagert in Sac1-Xmal linearisiertes pGL3-Basic (Promega) kloniert, unter Erzeugung der Plasmide 10xC7-TATA-luc, 10xB3-TATA-luc und 10xN1-TATA-luc. Um das 10xN1-TATA-lacZ-Reporterkonstrukt zu erzeugen, wurde die lacZ-Codierungsregion aus pβgal-Basic (Clontech) herausgeschnitten und verwendet, um die Luciferasecodierungsregion von 10xN1-TATA-luc über Hind3-BamHl-Digestion zu ersetzen.
Luciferase- und β-gal-Reporteruntersuchungen.
Für alle Transfektionen wurden HeLa-Zellen in 24-Well-Schalen plattiert und bei einer Konfluenz von 40–60% verwendet. Für Luciferasereporteruntersuchungen wurden 175 ng Reporterplasmid (Promotorkonstrukte bei pGL3 oder als Negativkontrolle pGL3-Basic) und 25 ng Effektorplasmid (Zinkfinger-Steroidrezeptorfusionen bei pcDNA3 oder als Negativkontrolle leerem pcDNA3) unter Verwendung des Lipofectamin-Reagens (Gibco BRL) transfiziert. Nach etwa 24 Stunden wurde eine Expression durch das Hinzufügen von 10 nM RU486 (Biomol), 100 nM 4-OHT (Sigma) oder 5 mM Ponasteron A (Invitrogen) induziert. Zellextrakte wurden etwa 48 Stunden nach der Transfektion hergestellt und unter Verwendung des Promega-Luciferaseuntersuchungsreagens in einem MicroLumat LB96P-Luminometer (EG&G Berthold, Gaithersburg, MD) auf Luciferaseaktivität untersucht. Für Doppelreporteruntersuchungen wurden 85 ng Luciferasereporterplasmid, 85 ng b-gal-Reporterplasmid und 15 ng von jedem der beiden Effektorplasmide transfiziert. b-gal-Aktivität wurde unter Verwendung des Lumineszenz-b-Galaktosidase-Erfassungsausrüstungssatzes II (Clontech) gemessen.
Zinkfinger-Steroidrezeptor-Fusionskonstrukte mit N-terminalen Effektordomänen.
Die VP16-Codierungsregion wurde PCR-amplifiziert aus pcDNA3/C7-VP16 unter Verwendung der Primer VPNhe-F (5'-GAG GAG GAG GAG GCT AGC GCC ACC ATG GGG CGC GCC GGC GCT CCC CCG ACC GAT GTC AGC CTG-3') (SEQ-ID-NR: 5) und VPHind-B (5'-GAG GAG GAG GAG AAG CTT GTT AAT TAA ACC GTA CTC GTC AAT TCC AAG GGC ATC G-3') (SEQ-ID-NR: 6) oder VPNLSHind-B (5'-GAG GAG GAG GAG AAG CTT AAC TTT GCG TTT CTT TTT CGG GTT AAT TAA ACC GTA CTC GTC AAT TCC AAG GGC ATC G-3') (SEQ-ID-NR: 7). Die C7-Codierungsregion wurde aus dem gleichen Plasmid amplifiziert unter Verwendung der Primer C7Hind-F (5'-GAG GAG GAG GAG AAG CTT GGG GCC ACG GCG GCC CTC GAG CCC TAT GC-3') (SEQ-ID-NR: 8) und C7Bam-B (5'-GAG GAG GGA TCC CCC TGG CCG GCC TGG CCA CTA GTT CTA GAG TC-3') (SEQ-ID-NR: 9) oder C7NLSBam-B (5'-GAG GAG GGA TCC CCA ACT TTG CGT TTC TTT TTC GGC TGG CCG GCC TGG CCA CTA GTT CTA GAG TC-3') (SEQ-ID-NR: 10). Die gekürzte Human-PR-LBD (aa645-914) wurde amplifiziert aus PAPCMVGL914VPc'-SV [Wang, Y., Xu, J., Pierson, T., O'Malley, B.W. und Tsai, S.Y. (1997) Gene Therapy 4, 432–441] unter Verwendung der Primer PRBam-F (5'-GAG GAG GAG GAG GGA TCC AGT CAG AGT TGT GAG AGC ACT GGA TGC TG-3') (SEQ-ID-NR: 11) und PREco-B (5'-GAG GAG GAA TTC TCA AGC AAT AAC TTC AGA CAT CAT TTC TGG AAA TTC-3') (SEQ-ID-NR: 12). Die VP16-C7-PR-, VP16-NLS-C7-PR- und VP16-C7-NLS-PR-Codierungsregionen wurden dann in pcDNA3.1(+)Zeo (Invitrogen) unter Verwendung der Nhe1-, Hind3-, BamH1- und EcoR1-Restriktionsstellen, die in den PCR-Primern enthalten sind, assembliert. In den sich ergebenden Konstrukten wurden die C7-Codierungsregionen von zwei Sfi-Stellen flankiert, und die VP16-Codierungsregionen von Asc1- und Pac1-Stellen. Diese Restriktionsstellen wurden eingeführt, um den Austausch von DBDs bzw. Effektordomänen zu erleichtern.
Um die VP16-C7-ER-, VP16-NLS-C7-ER- und VP16-C7-NLS-ER-Konstrukte zu erzeugen, wurde die punktmutierte Maus-ER-LBD-Codierungsregion (aa281-599, G525R) aus pBabe/Myc-ER herausgeschnitten [Littlewood, T.D., Hancock, D.C., Danielian, P.S., Parker, M.G. und Evan, G.I. (1995) Nucl. Acids Res. 23, 1686–1690] und verwendet, um die PR-LBD-Codierungsregion über BamH1-EcoR1-Restriktionsdigestion zu ersetzen.
Um Fusionskonstrukte mit B3- oder N1-DBDs zu erzeugen, wurde C7 über Sfil-Digestion durch die B3- oder N1-Codierungsregionen ersetzt. Fusionskonstrukte, die eine VP64-Effektordomäne enthielten, wurden durch Ersetzen von VP16 durch die VP64-Codierungsregion über Asc1-Pac1-Digestion erzeugt.
Zinkfinger-Steroidrezeptor-Fusionskonstrukte mit C-terminalen Effektordomänen.
Die gekürzte Human-PR-LBD wurde amplifiziert aus PAPCMVGL914VPc'-SV [Wang, Y., Xu, J., Pierson, T., O'Malley, B.W. und Tsai, S.Y. (1997) Gene Therapy 4, 432–441] unter Verwendung der Primer PRFse-F (5'-GAG GAG GAG GAG GAG GGC CGG CCG CGT CGA CCA GGT CAG AGT TGT GAG AGC ACT GGA TGC-3') (SEQ-ID-NR: 13) und PRAsc-B (5'-GAG GAG GAG GAG GAG GGC GCG CCC CGT CGA CCC AGC AAT AAC TTC AGA CAT CAT TTC TGG-3') (SEQ-ID-NR: 14). Die punktmutierte Maus-ER-LBD wurde amplifiziert aus pBabe/Myc-ER [Littlewood, T.D., Hancock, D.C., Danielian, P.S., Parker, M.G. und Evan, G.I. (1995) Nucl, Acids Res. 23, 1686–1690] unter Verwendung der Primer ERFse-F (5'-GAG GAG GAG GAG GAG GGC CGG CCG CCG AAA TGA AAT GGG TGC TTC AGG AGA C-3') (SEQ-ID-NR: 15) und ERAsc-B (5'-GAG GAG GAG GAG GAG GGC GCG CCC GAT CGT GTT GGG GAA GCC CTC TGC TTC-3') (SEQ-ID-NR: 16). Die resultierenden PCR-Produkte wurden dann über Digestion mit den Restriktionsendonukleasen Fse1 und Asc1 zwischen den E2C- und VP16-Codierungsregionen eingefügt in pcDNA3/E2C-VP16 [Beerli, R.R., Segal, D.J., Dreier, B. und Barbas, C.F., III (1998) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95, 14628–14633].
Um Fusionskonstrukte mit B3- oder N1-DBDs zu erzeugen, wurde E2C über Sfil-Digestion durch die B3- oder N1-Codierungsregionen ersetzt. Fusionskonstrukte, die eine VP64-Effektordomäne enthielten, wurden durch Ersetzen von VP16 durch die VP64-Codierungsregion über Asc1-Pac1-Digestion erzeugt.
Heterodimere Schaltkonstrukte.
Zur Herstellung der E2C-ER-Fusion wurde die punktmutierte Maus-ER-LBD amplifiziert aus pBabe/Myc-ER [Littlewood, T.D., Hancock, D.C., Danielian, P.S., Parker, M.G. und Evan, G.I. (1995) Nucl. Acids Res. 23, 1686–1690] unter Verwendung der Primer ERFse-F und ERPac-B (5'-GAG GAG GAG GAG GAG TTA ATT AAG ATC GTG TTG GGG AAG CCC TCT GCT TC-3') (SEQ-ID-NR: 17). Das PCR-Produkt wurde dann über Fsel-Pacl-Digestion in das Konstrukt pcDNA3/E2C-VP64 eingesetzt, wobei die VP64-Codierungsregion ersetzt wurde. Um die ER-VP64-Fusion zu erzeugen, wurde die ER-LBD unter Verwendung der Primer ERATGBam-F (5'-GAG GAG GAG GAG GGA TCC GCC ACC ATG CGA AAT GAA ATG GGT GCT TCA GGA GAC-3') (SEQ-ID-NR: 18) und ERAsc-B amplifiziert. Das PCR-Produkt wurde dann über BamH1-Asc1-Digestion eingesetzt in pcDNA3/E2C-VP64 [Beerli, R.R., Segal, D.J., Dreier, B. und Barbas, C.F., III (1998) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95, 14628–14633], wobei die E2C-Codierungsregion ersetzt wurde.
Einkettige Schaltkonstrukte.
Für die Herstellung von einkettigen Fusionen mit zwei ER-LBDs wurde die punktmutierte Maus-ER-LBD amplifiziert aus pBabe/Myc-ER [Littlewood, T.D., Hancock, D.C., Danielian, P.S., Parker, M.G. und Evan, G.I. (1995) Nucl. Acids Res. 23, 1686–1690], entweder unter Verwendung der Primer ERFse-F und ERSpel-B (5'-GAG GAG GAG GAG GAG GAG ACT AGT GGA ACC ACC CCC ACC ACC GCC CGA GCC ACC GCC ACC AGA GGA GAT CGT GTT GGG GAA GCC CTC TGC-3') (SEQ-ID-NR: 19) oder unter Verwendung der Primer ERNhe1-F1 (für 18aa-Linkerkonstrukt; 5'-GAG GAG GAG GAG GAG GAG GCT AGC GGC GGT GGC GGT GGC TCC TCT GGT GGC GGT GGC GGT TCT TCC AAT GAA ATG GGT GCT TCA GGA GAC-3') (SEQ-ID-NR: 20) oder ERNhe1-F2 (für 30aa-Linkerkonstrukt; 5'-GAG GAG GAG GAG GAG GAG GCT AGC TCT TCC AAT GAA ATG GGT GCT TCA GGA GAC-3') (SEQ-ID-NR: 21) und ERAsc-B. Bei den PCR-Produkten erfolgte dann eine Digestion mit Fse1 und Spe1 bzw. Nhe1 und Asc1, und dieselben wurden in Fse1-Asc1 linearisiertes pcDNA3/E2C-VP64 eingesetzt [Beerli, R.R., Segal, D.J., Dreier, B. und Barbas, C.F., III (1998) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95, 14628–14633].
Zur Herstellung von einkettigen RXR-EcR-Fusionen wurde die Ligandenbindungsdomäne des Human-Retinoid-X-Rezeptors (hRXRα, aa373-654) PCR-amplifiziert aus pVgRXR (Invitrogen) unter Verwendung der Primer RXRFse-F (5'-GAG GAG GAG GGC CGG CCG GGA AGC CGT GCA GGA GGA GCG GC-3') (SEQ-ID-NR: 22) und RXRSpe-B (5'-GAG GAG GAG GAG GAG ACT AGT GGA ACC ACC CCC ACC ACC GCC CGA GCC ACC GCC ACC AGA GGA AGT CAT TTG GTG CGG CGC CTC CAG C-3') (SEQ-ID-NR: 23). Die Ligandenbindungsdomäne des Ecdysonrezeptors (EcR, aa202-462, Drosophila melanogaster) wurde PCR-amplifiziert aus pVgRXR unter Verwendung der Primer EcRNhe-F1 (für 18aa-Linkerkonstrukt; 5'-GAG GAG GAG GAG GCT AGC TCT TCC GGT GGC GGC CAA GAC TTT GTT AAG AAG G-3') (SEQ-ID-NR: 24) oder EcRNhe-F2 (für 30aa-Linkerkonstrukt; 5'-GAG GAG GAG GAG GCT AGC GGC GGT GGC GGT GGC TCC TCT GGT GGC GGT GGC GGT TCT TCC GGT GGC GGC CAA GAC TTT GTT AAG AAG G-3') (SEQ-ID-NR: 25) und EcRAsc-B (5'-GAG GAG GAG GGC GCG CCC GGC ATG AAC GTC CCA GAT CTC CTC GAG-3') (SEQ-ID-NR: 26). Bei den PCR-Produkten erfolgte dann eine Digestion mit Fse1 und Spe1 bzw. Nhe1 und Asc1, und dieselben wurden in Fse1-Asc1 linearisiertes pcDNA3/E2C-VP64 eingesetzt [Beerli, R.R., Segal, D.J., Dreier, B. und Barbas, C.F., III (1998) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95, 14628–14633]. DNA-Bindungsdomänen wurden über SM-Digestion, Effektordomänen über Asc1-Pac1-Digestion ausgetauscht.
Um das 36aa-Linker-E2C-RLLE-VP64-Fusionskonstrukt zu erzeugen, wurde die RXR-LBD PCR-amplifiziert aus pcDNA3/E2C-RE-VP64 unter Verwendung der Primer RXRFse-F und RXRSpeLL-B (5'-GAG GAG GAG GAG GAG ACT AGT AGA GCC ACC GCC CCC TTC AGA ACC GCC CGA GCC ACC GCC ACC AGA GG-3') (SEQ-ID-NR: 27). Die EcR-LBD wurde amplifiziert aus dem gleichen Plasmid unter Verwendung der Primer EcRNheLL-F (5'-GAG GAG GAG GAG GCT AGC GGG GGT TCG GAG GGT GGC GGG TCT GAG GGT GGG GGT GGT TCC ACT AGC TCT TCC-3') (SEQ-ID-NR: 28) und EcRAsc-B. Die PCR-Produkte wurden in pcDNA3/E2C-VP64 eingesetzt, wie es im Vorhergehenden beschrieben ist.
BEISPIEL 2: Genschalter
Herstellung von hormonregulierten Zinkfinger-Steroidrezeptor-Fusionsproteinen.
Frühere Studien haben das Potential von manipulierten C2-H2-Zinkfingerproteinen für die Regulation der Zielgenexpression gezeigt [Liu, Q., Segal, D.J., Ghiara, J.B. und Barbas, C.F., III (1997) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94, 5525–5530; Kim, J.S. und Pabo, C.O. (1997) J Biol Chem 272, 29795–29800; Beerli, R.R., Segal, D.J., Dreier, B. und Barbas, C.F., III (1998) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95, 14628–14633; Beerli, R.R., Dreier, B. und Barbas, C.F., III (2000) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97, 1495–1500]. Um jedoch das Potential von manipulierten Zinkfingerproteinen voll zu verwirklichen, ist es erwünscht, dass ihre ansonsten konstitutive DNA-Bindungsaktivität ligandenabhängig gemacht wird. Die Ligandenbindungsdomänen (LBDs) des Humanprogesteronrezeptors (hPR) und des Mausestrogenrezeptors (mER) wurden bislang für die Regulation von heterologen Proteinen verwendet, nachdem dieselben modifiziert worden waren, um keine Bindung an die natürlichen Hormone aufzuweisen, während sie die Bindung an synthetische Antagonisten behielten [Littlewood, T.D., Hancock, D.C., Danielian, P.S., Parker, M.G. und Evan, G.I. (1995) Nucl. Acids Res. 23, 1686–1690; Wang, Y., Xu, J., Pierson, T., O'Malley, B.W. und Tsai, S.Y. (1997) Gene Therapy 4, 432–441]. Somit wurde die Zif268-Variante C7 [Wu, H., Yang, W.-P. und Barbas, C.F., III (1995) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92, 344–348] zu einer Transkriptionsaktivierungsdomäne plus die LBD von einem der beiden nukleären Hormonrezeptoren fusioniert. Das VP64-C7-PR-Fusionsprotein enthält eine N-terminale VP64-Aktivierungsdomäne [Beerli, R.R., Segal, D.J., Dreier, B. und Barbas, C.F., III (1998) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95, 14628–14633] und eine C-terminale hPR-LBD (aa645-914) ohne die Aminosäuren 915–933, die auf den Progesteronantagonisten RU486/Mifepriston, aber nicht auf Progesteron anspricht [Wang, Y., Xu, J., Pierson, T., O'Malley, B.W. und Tsai, S.Y. (1997) Gene Therapy 4, 432–441]. Das VP64-C7-ER-Fusionsprotein enthält eine C-terminale mER-LBD (aa982-599) mit einer einzigen Aminosäuresubstitution (G525R) und spricht auf den Estrogenantagonisten 4-Hydroxy-Tamoxifen (4-OHT), aber nicht auf Estrogen an [Littlewood, T.D., Hancock, D.C., Danielian, P.S., Parker, M.G. und Evan, G.I. (1995) Nucl. Acids Res. 23, 1686–1690].
Bestimmung des optimalen Ansprechelements für Zinkfinger-Steroidrezeptor-Fusionsproteine.
Natürlich vorkommende Steroidrezeptoren binden DNA als Dimere und erkennen normalerweise Ansprechelemente, die aus Palindromsequenzen bestehen [Evans, R.M. (1988) Science 240, 889–895; Carson-Jurica, M.A., Schrader, W.T. und O'Malley, W. (1990) Endocrine Reviews 11, 201–220]. Außerdem wurde gezeigt, dass in einigen Fällen auch direkte Wiederholungen als Bindungsstellen für Rezeptordimere dienen können [Aumais, J.P., Lee, H.S., DeGannes, C., Horsford, J. und White, J.H. (1996) J. Biol. Chem. 271, 12568–12577]. Bei dieser offensichtlichen Flexibilität bei der DNA-Erkennung durch natürlich vorkommende Rezeptordimere war die optimale Struktur eines Ansprechelements für einen artifiziellen, Zinkfinger-basierten Transkriptionsschalter nicht bekannt. Um jedoch ein effizientes, hormoninduzierbares System für die Regulation der Zielgenexpression zu entwickeln, ist eine detaillierte Kenntnis der Bindungsstellenarchitektur erforderlich.
Um die optimale Ausrichtung und Beabstandung der beiden Halbstellen eines Ansprechelements für ein Zinkfinger-LBD-Fusionsprotein zu bestimmen, wurde eine Reihe von Reporterplasmiden konstruiert. Jedes enthält zwei C7-Bindungsstellen, die einer TATA-Box und einer Firefly-Luciferase-Codierungsregion vorgelagert sind. Die beiden C7-Bindungsstellen wurden in unterschiedlichen Ausrichtungen (direkte, invertierte oder evertierte Wiederholung) und mit verschiedenen Beabstandungen (keine Beabstandung oder Beabstandung von 1 bis 5 bp) eingeführt. Plasmide, die die Expression von VP64-C-PR- oder VP64-C7-ER-Fusionskonstrukten lenken, wurden dann mit den verschiedenen Reporterplasmiden cotransfiziert und auf eine hormoninduzierte Luciferaseexpression hin untersucht. Es ist wesentlich, dass jede der C7-Dimerbindungsstellen in der Lage war, als ein Ansprechelement sowohl für PR- als auch für ER-basierte Proteine wirksam zu sein, wenn auch mit variierendem Wirkungsgrad. Im Gegensatz dazu wurde ein Reporterplasmid mit einer einzigen C7-Bindungsstelle nicht aktiviert, was anzeigte, dass die hormoninduzierte Aktivierung der Transkription durch Dimere vermittelt wurde.
Die optimale Beabstandung hing von der Ausrichtung der beiden Halbstellen ab. Im Fall des PR-Fusionsproteins schien die optimale Beabstandung bei 2–3 bp für invertierte Wiederholungen und 3 bp für evertierte Wiederholungen zu liegen. Ansprechelemente, die aus direkten Wiederholungen bestanden, wiesen keine alleinige optimale Beabstandung auf; das beste Ansprechverhalten wurde mit 4–5 bp oder gar keiner Beabstandung erhalten. Für das ER-Fusionsprotein lag die optimale Beabstandung bei 3–4 bp für direkte Wiederholungen, 1–2 bp für invertierte Wiederholungen und 3 bp für evertierte Wiederholungen. Es sei darauf hingewiesen, dass es erhebliche Schwankungen bei der basalen, d h. ligandenunabhängigen Aktivität von PR- und ER-Fusionsproteinen gab, abhängig von dem getesteten Ansprechelement. Am bemerkenswertesten ist, dass eine Zunahme der Beabstandung von direkten Wiederholungen von 3 auf 4 bp zu einer 1,9-fach höheren Basalaktivität von VP64-C7-PR und sogar zu einer 3,7-fachen Steigerung im Fall von VP64-C7-ER führte. Eine hohe Basalaktivität ist bei einem induzierbaren Promotorsystem, bei dem oft eine strenge Kontrolle der Expressionspegel eines bestimmten interessierenden Gens erforderlich ist, besonders wenn das Genprodukt toxisch ist, äußerst unerwünscht. Somit muss beim Auswählen geeigneter Ansprechelemente besonderes Augenmerk nicht nur auf die Hormoninduzierbarkeit, sondern auch auf die Basalaktivität in Gegenwart des Regulatorproteins gerichtet werden. Das Ansprechelement, das aus direkten Wiederholungen mit einer Beabstandung von drei Nuldeotiden besteht, wurde als eine gute Wahl zur Verwendung bei einem hormoninduzierbaren artifiziellen Promotor betrachtet, da es sowohl mit PR- als auch mit ER-Fusionsproteinen kompatibel war. Es ist wesentlich, dass seine Basalaktivität in Gegenwart von entweder PR- oder ER-Fusionsproteinen zu den niedrigsten aller getesteten Ansprechelemente gehörte. Außerdem wurde eine gute hormoninduzierte Aktivierung der Transkription sowohl mit VP64-C7-PR (3,9-fach) als auch mit VP64-C7-ER (9,5-fach) beobachtet.
Herstellung von neuartigen DNA-Bindungsdomänen.
Während die Verwendung der C7-DNA-Bindungsdomäne gut für die im Vorhergehenden beschriebenen Vorstudien geeignet war, kann es sein, dass es sich nicht um eine gute Wahl für die Eingliederung in einen induzierbaren Transkriptionsregulator handelt. Das C7-Protein ist eine Variante des Maustranskriptionsfaktors Zif268 [Pavletich, N.P. und Pabo, C.O. (1991), Science 252, 809–817] mit erhöhter Affinität, aber unveränderter Spezifität [Wu, H., Yang, W.-P. und Barbas, C.F., III (1995) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92, 344–348]. Es wurde gefolgert, dass die Verwendung von abwechselnden DNA-Bindungsdomänen potentielle pleiotrope Effekte der Chimärenregulatoren minimieren würde. Bislang wurde eine Strategie für die schnelle Assemblierung von Zinkfingerproteinen aus einer Familie von vordefinierten Zinkfingerdomänen, die für jedes der 16 5'-GNN-3'-DNA-Tripletts spezifisch sind, beschrieben [Beerli, R.R., Segal, D.J., Dreier, B. und Barbas, C.F., III (1998) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95, 14628–14633; Segal, D.J., Dreier, B., Beerli, R.R. und Barbas, C.F., III (1999) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96, 2758–2763]. Dreifingerproteine, die jede beliebige gewünschte 5'-(GNN)₃-3'-Sequenz binden, können schnell durch Einbringen der Aminosäurereste, die an der busenspezifischen DNA-Erkennung beteiligt sind, in die Rahmenstruktur des Konsensus-Dreifingerproteins Sp1C hergestellt werden [Desjarlais, J.R. und Berg, J.M. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90, 2256–2260]. Bislang wurden weit über 100 Dreifingerproteine im Labor hergestellt. Zwei davon, B3 und N1, wurden ausgewählt, um bei induzierbaren Transkriptionsregulatoren verwendet zu werden ( 1A). Die Proteine B3 und N1 sind konzipiert, um die Sequenzen 5'-GGA GGG GAC-3' bzw. 5'-GGG GTA GAA-3' zu binden. Um ihre DNA-Bindungsspezifität zu verifizieren, wurden diese Proteine als MBP-Fusionen gereinigt und durch ELISA-Analyse unter Verwendung einer willkürlichen Auswahl von Oligonuldeotiden, die 5'-(GNN)3-3'-Sequenzen enthielten, getestet (1B). Es ist wesentlich, dass beide Proteine ihre Zielsequenz erkannten und keine Kreuzreaktivität mit irgendeiner der anderen getesteten 5'-(GNN)₃-3'-Sequenzen zeigten. Wie es durch ELISA beurteilt wurde, war jedoch die Bindung von N1 viel schwächer als die Bindung von B3. Deshalb wurden Affinitäten durch elektrophoretische Mobilitätverschiebungsanalyse (EMSA) bestimmt. Das B3-Protein band seine Zielsequenz mit einem K_D-Wert von 15 nM, ähnlich den KD-Werten, die vorher für andere Dreifingerproteine berichtet wurden [Beerli, R.R., Segal, D.J., Dreier, B. und Barbus, C.F., III (1998) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95, 14628–14633]. Im Gegensatz dazu war die N1-Affinität für sein Ziel erheblich geringer, und sein K_D-Wert wird auf in dem Bereich von 5–10 μM liegend geschätzt. Dass die beiden Proteine sehr unterschiedliche Affinitäten für ihre jeweiligen Zielsequenzen aufwiesen, wurde als positiv erachtet, da dies ermöglicht, den Einfluss der Affinität auf die Funktionalität eines induzierbaren Expressionssystems zu untersuchen.
RU486- und 4-OHT-induzierbare Systeme für die Steuerung der Genexpression.
Um eine Vergleichsanalyse zu ermöglichen, wurde eine Reihe von RU486- oder 4-OHT-induzierbaren Transkriptionsregulatoren konstruiert, die entweder die B3- oder die N1-DNA-Bindungsdomäne enthielten. Die Rolle der Platzierung der Aktivierungsdomäne wurde untersucht, indem dieselbe entweder mit dem N- oder dem C-Terminus des Proteins fusioniert wurde. Zwei unterschiedliche Aktivierungsdomänen wurden verglichen: die Herpes-Simplex-Virus-VP16-Transaktivierungsdomäne [Sadowski, I., Ma, J., Triezenberg, S. und Ptashne, M. (1988) Nature 335, 563–564] und die synthetische VP64-Aktivierungsdomäne, die aus 4 Tandemwiederholungen der Minimalaktivierungsdomäne von VP16 besteht [Beerli, R.R., Segal, D.J., Dreier, B. und Barbas, C.F., III (1998) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95, 14628–14633].

Synthetische Promotoren wurden basierend auf den B3- und N1-DNA-Zielsequenzen und der im Vorhergehenden definierten optimalen Ansprechelementstruktur konstruiert. Die Plasmide 10xB3-TATA-luc und 10xN1-TATA-luc enthalten jedes fünf Ansprechelemente, die aus direkten Wiederholungen bestehen, die durch drei Nukleotide voneinander beabstandet sind, und die einer TATA-Box und einer Firefly-Luciferase-Codierungsregion vorgelagert sind. Die Ansprechelemente sind voneinander durch sechs Nukleotide getrennt, was die gleichzeitige Bindung von fünf Dimeren ermöglichen und somit die Promotoraktivität maximieren sollte. Die Aktivität der verschiedenen Fusionskonstrukte wurde durch Studien einer vorübergehenden Cotransfektion mit den verwandten TATA-Reporterplasmiden in HeLa-Zellen beurteilt (Tabelle 1). Tabelle 1

	LBD	=PR	LBD	=ER
	Exp. I	Exp. 2	Exp. 1	Exp. 2
VP16-B3-LBD	34x	36x	37x	26x
VP64-B3-LBD	37x	24x	26x	27x
B3-LBD-VP16	115x	116x	47x	58x
B3-LBD-VP64	110x	85x	62x	99x
VP16-N1-LBD	188x	159x	101x	39x
VP64-N1-LBD	206x	390x	49x	58x
N1-LBD-VP16	282x	203x	24x	30x
N1-LBD-VP64	151x	129x	1319x	464x

Im Allgemeinen stellte sich heraus, dass die ER-Fusionsproteine die stärkeren Transaktivatoren waren, und die 4-OHT-induzierte Luciferaseaktivität war normalerweise 3 bis 6 mal höher als die RU486-induzierte Luciferaseaktivität, die durch PR-Fusionsproteine vermittelt wurde. Da jedoch die basale, d. h. ligandenunabhängige Aktivität von ER-Chimären oft etwas höher war, war ihre hormoninduzierte x-fache Stimulation allgemein nicht besser. Eine hormonabhängige Genaktivierung über 2 Größenordnungen hinausgehend wurde gewöhnlich sowohl bei PR- als auch ER-Fusionsproteinen beobachtet, Werte, die erheblich besser sind als was bislang für das Gal4-PR-Fusionsprotein GLVPc' berichtet wurde [Wang, Y., Xu, J., Pierson, T., O'Malley, B.W. und Tsai, S.Y. (1997) Gene Therapy 4, 432–441].
Die Platzierung der Aktivierungsdomäne hatte einen erheblichen Einfluss auf die Aktivität der Chimärenregulatoren. Eine begünstigte Platzierung war jedoch abhängig von der Beschaffenheit der Aktivierungsdomäne. Während die VP16-Domäne die potenteren Aktivatoren lieferte, wenn dieselbe am C-Terminus platziert war, war die VP64 am N-Terminus aktiver. Dementsprechend zeigten direkte Vergleiche, dass eine N-terminale VP64 potenter war als eine N-terminale VP16-Domäne, und eine C-terminale VP16 potenter war als eine C-terminale VP64-Domäne. Es wurde auch festgestellt, dass die Beschaffenheit und Platzierung der Aktivierungsdomäne einen Einfluss auf die Basalaktivität der Chimärenregulatoren haben. Insbesondere wurde im Fall von Regulatoren mit N-terminaler VP64-Domäne eine relativ hohe Basalaktivität beobachtet.
Die Beschaffenheit der DNA-Bindungsdomäne hatte großen Einfluss auf das Ausmaß der Ligandenabhängigkeit der Chimären. Die Verwendung des N1-Proteins als DNA-Bindungsdomäne führte zu strenger regulierten Fusionskonstrukten mit erheblich besserer x-facher Stimulation von Promotoraktivitäten als die Verwendung von B3, wahrscheinlich aufgrund der erheblichen Affinitätsunterschiede zwischen N1 und B3. Insbesondere hatte der N1-ER-VP64-Regulator keine signifikante Basalaktivität und war in der Lage, eine 464- bis 1319-fache 4-ORT-induzierte Aktivierung des 10xN1-TATA-Minimalpromotors zu vermitteln (Tabelle 1). Das Ausmaß der ligandeninduzierten Aktivierung der Genexpression in einem Bereich von 3 Größenordnungen ist besonders bemerkenswert, weil es bislang nur für das Tetracyclin-gesteuerte System der Genregulation berichtet wurde [Gossen, M. und Bujard, H. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89, 5547–5551; Gossen, M., Freundlieb, S., Bender, G., Müller, G., Rillen, W. und Bujard, H. (1995) Science 268, 1766–1769].
Gleichzeitige Regulation von mehreren Promotoren.
Die Zinkfingertechnologie hat ein großes Repertoire von DNA-Bindungsspezifitäten zur Verwendung bei der Proteinmanipulation verfügbar gemacht [Beerli, R.R., Segal, D.J., Dreier, B. und Barbas, C.F., III (1998) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95, 14628–14633; Segal, D.J., Dreier, B., Beerli, R.R. und Barbas, C.F., III (1999) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96, 2758–2763; Beerli, R.R., Dreier, B. und Barbas, C.F., III (2000) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97, 1495–1500]. Die Verfügbarkeit von unterschiedlichen von Steroidhormonrezeptoren abgeleiteten Regulatordomänen [Littlewood, T.D., Hancock, D.C., Danielian, P.S., Parker, M.G. und Evan, G.I. (1995) Nucl. Acids Res. 23, 1686–1690; Wang, Y., Xu, J., Pierson, T., O'Malley, B.W. und Tsai, S.Y. (1997) Gene Therapy 4, 432–441] und die Fähigkeit, Chimärenregulatoren zu praktisch jeder beliebigen gewünschten Zielsequenz umzuschalten, sollte es möglich machen, die Expression von mehreren Genen gleichzeitig unabhängig voneinander zu regulieren. Um diese Möglichkeit zu untersuchen, wurde ein Reporterplasmid konstruiert, das die Expression von β-Galaktosidase (β-gal) unter der Steuerung des 10xN1-TATA-Minimalpromotors lenkt. Die Chimärenregulatoren B3-PR-VP16 und N1-ER-VP64 wurden dann vorübergehend in HeLa-Zellen zusammen mit den 10xB3-TATA-luc- und 10xN1-PAPA-β-gal-ReporterpIasmiden exprimiert. Die transfizierten Zellen wurden entweder mit RU486 oder mit 4-OHT behandelt, und die Luciferase- und β-gal-Aktivitäten wurden beobachtet. Es ist wesentlich, dass RU486 die Expression von Luciferase induzierte, während es keine Wirkung auf die β-gal-Reportergenaktivität hatte. 4-OHT beeinflusste andererseits nicht die Luciferase-Expression, aktivierte aber wirksam die β-gal-Expression. Diese Ergebnisse zeigen, dass die beiden Regulator/Promotor-Kombinationen unabhängig voneinander wirksam sind, und dass mehrere Gene wirksam und unabhängig voneinander durch die selektive Zugabe des gewünschten Hormons reguliert werden können.
Entwicklung eines monomeren hormonabhängigen Genschalters.
Die Fähigkeit, DNA-bindende Proteine mit gewünschten Spezifitäten zu konstruieren, ermöglicht es, artifizielle Transkriptionsfaktoren zu erzeugen, die in der Lage sind, endogene Gene mit dominanten regulatorischen Effekten zu belegen [Beerli, R.R., Dreier, B. und Barbas, C.F., III (2000) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97, 1495–1500]. Bei vielen Anwendungen dieser Technologie kann es erwünscht sein, dass die Wirkung auf die endogene Genexpression reversibel ist. Die Verwendung von Steroidhormonrezeptor-LBDs besitzt das Potential, die Regulation der endogenen Genexpression reversibel zu machen. Ein großer Nachteil besteht jedoch darin, dass Steroidhormonrezeptoren sowie die hier beschriebenen Chimärenregulatoren DNA als Dimere binden. Somit war, als das Fusionsprotein C7-ER-VP64 vorübergehend in HeLa-Zellen exprimiert wurde, dasselbe nicht in der Lage, ein Reporterkonstrukt zu regulieren, das eine einzige C7-Bindungsstelle trug, während dasselbe ohne Weiteres einen Reporter regulierte, der zwei C7-Bindungsstellen aufwies und daher die Bindung eines Dimers gestattete (2B). Ein zusätzliches Problem ergab sich, als die C7-DBD durch E2C ersetzt wurde, das sechs Zinkfingerdomänen enthält und die 18 bp-Sequenz 5'-GGG GCC GGA GCC GCA GTG-3' (SEQ-ID-NR: 29) in der 5'-UTR des Protoonkogens c erbB-2 erkennt [Yamamoto, T., Ikawa, S., Akiyama, T., Semba, K., Nomura, N., Miyajima, N., Saito, T. und Toyoshima, K. (1986) Nature 319, 230–234; Beerli, R.R., Segal, D.J., Dreier, B. und Barbas, C.F., III (1998) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95, 14628–14633]. Das E2C-ER-VP64-Fusionsprotein war auf einem Reporter konstitutiv aktiv, der eine einzige E2C-Bindungsstelle trug, fast so aktiv wie eine E2C-VP64-Fusion ohne eine ER-LBD, und sprach nicht gut auf das Hormon an. Offensichtlich macht die Verwendung einer großen DNA-Bindungsdomäne, die einen ausgedehnten Abschnitt von DNA mit hoher Affinität erkennt, die Chimäre hormon- und dimerisierungsunabhängig.
Um diese Probleme zu lösen, wurden zwei Arten von ER-basierten Chimärenregulatoren erzeugt, die konzipiert waren, um in der Lage zu sein, die Genexpression durch eine einzige Bindungsstelle auf eine hormonabhängige Weise zu regulieren. Bei der ersten Strategie wurde ein Heterodimerregulator erzeugt, der aus dem manipulierten Zinkfingerprotein E2C, fusioniert mit einer ER-LBD, sowie einer ER-LBD, fusioniert mit einer VP64-Aktivierungsdomäne, bestand (2A). Als dieser Heterodimerregulator in HeLa-Zellen exprimiert wurde, wies derselbe in Abwesenheit von 4-OHT keine wesentliche Aktivität an dem E2C-TATA-Iuc-Reporterplasmid auf. Die Zugabe von Hormon führte zu einer 3- bis 5-fachen Stimulation der Luciferase-Expression, was die Bildung von funktionellen Heterodimeren anzeigt. Die hormoninduzierte Reportergenaktivierung war jedoch erheblich geringer als diejenige, die durch ein E2C-VP64-Fusionsprotein induziert wird, vermutlich zumindest teilweise wegen der Bildung von E2C-ER- und ER-VP64-Homodimeren. Homodimere waren inaktiv, da weder E2C-ER noch ER-VP64 allein die Luciferase-Expression induzierten. Bei der zweiten Strategie wurden Fusionsproteine durch Kombinieren der Dimerisierungspartner E2C-ER und ER-VP64 in einem einzigen Polypeptid durch einen flexiblen Polypeptidlinker erzeugt. Zwei Linker wurden getestet, mit einer Länge von 18 und 30 Aminosäuren, wobei die Proteine E2C-scER/18-VP64 und E2C-scER/30-VP64 gebildet wurden (2A). Es wurde erwartet, dass diese Proteine über intramolekulare anstatt intermolekulare Dimerisierung aktiviert werden und deshalb als Monomere wirksam sind. Die Kombination von zwei ER-LBDs zu einem einkettigen Fusionskonstrukt sollte eine effizientere hormoninduzierte Dimerisierung ermöglichen und daher effizientere Aktivatoren liefern. Tatsächlich aktivierten, als E2C-scER/18-VP64 und E2C-scER/30-VP64 vorübergehend in HeLa-Zellen exprimiert wurden, dieselben wirksam den E2C-TATA-luc-Reporter auf eine weitgehend hormonabhängige Weise (2B, 2C und 2D). Somit wurden dimere Regulatoren, die Ansprechelemente benötigen, die denen von natürlichen Steroidhormonrezeptoren ähnlich sind, erfolgreich in monomere, ligandenabhängige Transkriptionsfaktoren umgewandelt.
Monomerer Genschalter, der auf EcR- und RXR-LBDs basiert.
Um zu zeigen, dass die Herstellung eines ligandenabhängigen monomeren Genschalters durch Fusion mit zwei LBDs eine allgemein anwendbare Strategie ist, wurde die Brauchbarkeit anderer nukleärer Hormonrezeptoren getestet. Insbesondere wurde die Brauchbarkeit der LBDs des Drosophila-Ecdysonrezeptors (EcR) untersucht. Bei Drosophila ist dieser Rezeptor als ein Heterodimer zwischen EcR und dem Produkt des Ultraspiracle-(USP)Gens wirksam [Yao, T.-P., Forman, B.M., Jiang, Z., Cherbas, L., Chen, J.-D., McKeown, M., Cherbas, P. und Evans, R.M. (1993) Nature 366, 476–479]. Es hat sich jedoch gezeigt, dass EcR ansprechend auf die Ecdyson-Agonisten Muristeron A oder Ponasteron A (PonA) auch wirksam mit USPs Wirbeltierhomolog Retinoid-X-Rezeptor (RXR) heterodimerisiert [Nakanishi, K. (1992) Steroids 57, 649–657; Yao, T.-P., Forman, B.M., Jiang, Z., Cherbas, L., Chen, J.-D., McKeown, M., Cherbas, P. und Evans, R.M.(1993) Nature 366, 476–479; No, D., Yao, T.-P. und Evans, R.M. (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93, 3346–3351]. Die EcR- und RXR-LBDs wurden deshalb verwendet, um einen monomeren Genschalter herzustellen, der zu den im Vorhergehenden beschriebenen scER-Chimären analog ist ( 3A). Somit wurden die Human-RXRa-LBD (aa373-654) und die Drosophila-EcR-LBD (aa202-462) zwischen der E2C-DBD und der VP64-Aktivierungsdomäne eingefügt, wobei E2C-RE-VP64 gebildet wurde. Bei diesem Fusionskonstrukt sind die beiden LBDs durch einen flexiblen 18-Aminosäuren-Linker verbunden, denselben, der bei E2C-scER/18-VP64 verwendet wurde. Als dieser Chimärenregulator vorübergehend in HeLa-Zellen zusammen mit dem E2C-TATA-Iuc-Reporterplasmid exprimiert wurde, wurde eine erhebliche Basalaktivität beobachtet. Die Aktivität konnte jedoch durch PonA um das Dreifache gesteigert werden, was zeigt, dass dieses artifizielle Konstrukt auf Hormone ansprach. Um die Ligandenabhängigkeit zu verbessern, wurde die Länge des Linkers, der die RXR- und EcR-LBDs verband, gesteigert, eine Maßnahme, die in dem Fall der einkettigen ER-Konstrukte günstig erschien. Ein längerer Linker sollte es ermöglichen, dass die LBDs ihren Kontakt optimieren, und zu der Konformationsstörung in dem nicht mit Liganden versehenen Zustand beitragen. Tatsächlich verringerte sich, als der Linker auf 30 an (bei E2C-RLE-VP64) oder 36 an (bei E2C-RLLE-VP64) verlängert wurde, die Basalaktivität erheblich, und PonA führte zu einer 9- bis 10-fachen Aktivierung, ein Ausmaß an Ansprechvermögen, das mit demjenigen der einkettigen ER-Fusionskonstrukte vergleichbar ist (3B). Somit erscheint die Reihenschaltung von Paaren von nukleären Hormonrezeptor-LBDs eine allgemein anwendbare Strategie zu sein, um monomere DNA-Bindungsproteine ligandenabhängig zu machen.
Die hPR- und mER-LBDs, die für die Fusionsproteine verwendet wurden, umfassten nicht ihre natürlichen SV40-artigen Kernlokalisationssignale (NLS), die zwischen den Aminosäuren 637 und 644 bei hPR und zwischen den Aminosäuren 260 und 267 bei mER angeordnet sind [Carson-Jurica, M.A., Schrader, W.T. und O'Malley, W. (1990) Endocrine Reviews 11, 201–220]. Obwohl gezeigt wurde, dass dieses NLS zur hormonabhängigen nukleären Lokalisation von hPR nicht erforderlich ist, scheint die Regulation der subzellulären Lokalisation von Steroidrezeptoren komplex zu sein, und es war a priori nicht klar, ob die Anwesenheit des SV40-artigen NLS für die ordnungsgemäße Funktion der Chimärenproteine erforderlich war. Somit wurden zusätzliche Konstrukte hergestellt, die ein SV40-NLS (PKKKRKV) (SEQ-ID-NR: 30) in Einbuchstabenaminosäurecode entweder zwischen VP16 und C7 oder zwischen C7 und LBD umfassten.
Die Chimärentranskriptionsregulatoren wurden dann auf ihre Fähigkeit getestet, das 10xC7-TATA-Iuc-Reporterplasmid auf eine hormonabhängige Weise zu regulieren. 10xC7-TATA-luc enthält zehn C7-Bindungsstellen [5'-GCG TGG GCG-3'], die durch 5 Nukleotide beabstandet sind, und eine TATA-Box der Firefly-Luciferase-Codierungsregion vorgelagert. Jedes der Fusionsproteine regulierte die Expression der Luciferase auf eine weitgehend hormonabhängige Weise nach oben. RU486 stimulierte die Aktivität von VP16-C7-PR um das 26-fache, während 4-OHT zu einer 43-fachen Aktivierung von VP16-C7-ER führte. Es gab keine nachweisbare Kreuzreaktivität zwischen RU486 und ER oder zwischen 4-OHT und PR. Die Gegenwart eines NLS in einer der beiden Positionen war nicht nur nicht erforderlich, sondern sogar unerwünscht, da sie zu einer gesteigerten Basal- (d. h. hormonunabhängigen) Aktivität der Fusionskonstrukte führte, vermutlich durch eine gesteigerte nukleäre Lokalisation. Somit sind die hPR- (aa645-914) und mER- (aa281-599, G525R) LBDs in der Lage, Hormonabhängigkeit auf das Zinkfingerprotein C7 zu übertragen.
Die Fähigkeit, die Expression von mehreren Genen oder Allelen eines Gens reversibel zu steuern, könnte sich als sehr nützlich für viele Grundlagenforschungsanwendungen erweisen. Insbesondere würde eine selektive und unabhängige Expression eines Gens, aber nicht eines anderen (und umgekehrt) durch kleine und nicht-toxische Liganden eine Vergleichsanalyse der Genfunktion sowohl in vitro als auch in vivo ermöglichen. Es wurde gezeigt, dass das Modulsystem zum Steuern der Zielgenexpression tatsächlich in der Lage ist, die Expression von zwei Genen in der gleichen transfizierten Zelle unabhängig voneinander zu steuern, wie es durch die RU486-abhängige Luciferase-Induktion und die 4-OHT-induzierte β-gal-Expression bewiesen wurde. Das Fehlen einer β-gal-Induktion durch RU486 und Luciferase-Induktion durch 4-OHT zeigt überzeugend die hier beschriebene Spezifität der Chimärenregulatoren. Nicht nur wird die hervorragende Spezifität der verwendeten DNA-Bindungsdomänen erhalten, sondern es besteht auch keine nachweisbare Kreuzreaktion zwischen RU486 und der ER-LBD oder zwischen 4-OHT und der PR-LBD. Sequenzliste

Claims

Nicht natürlich vorkommendes Polypeptid, umfassend zwei von nukleären Hormonrezeptoren stammende Ligandenbindungsdomänen, die funktionsfähig mit einer DNA-Bindungsdomäne verknüpft sind, und eine Transkriptionsregulationsdomäne, wobei die DNA-Bindungsdomäne wenigstens ein manipuliertes Zinkfinger-Bindungsmotiv aufweist.
Polypeptid nach Anspruch 1, wobei die zwei Ligandenbindungsdomänen mittels eines Peptidlinkers kovalent miteinander verknüpft sind.
Polypeptid nach Anspruch 2, wobei der Linker etwa 10 bis etwa 40 Aminosäurereste enthält.
Polypeptid nach Anspruch 2, wobei der Linker etwa 15 bis etwa 35 Aminosäurereste enthält.
Polypeptid nach Anspruch 2, wobei der Linker etwa 18 bis etwa 30 Aminosäurereste enthält.
Polypeptid nach Anspruch 1, wobei die erste und zweite Ligandenbindungsdomäne von unterschiedlichen nukleären Hormonrezeptoren stammen.
Polypeptid nach Anspruch 1, wobei die erste und zweite Ligandenbindungsdomäne vom gleichen nukleären Hormonrezeptor stammen.
Polypeptid nach Anspruch 1, wobei der nukläre Hormonrezeptor ein Estrogenrezeptor, ein Progesteronrezeptor, ein Retinsäurerezeptor oder ein Retinoid-X-Rezeptor ist.
Polypeptid nach Anspruch 6, wobei wenigstens eine der Ligandenbindungsdomänen von einem Retinoid-X-Rezeptor stammt.
Polypeptid nach Anspruch 1, das zwei bis zwölf manipulierte Zinkfinger-DNA-Bindungsmotive umfasst.
Polypeptid nach Anspruch 1, das zwei bis sechs manipulierte Zinkfinger-Bindungsmotive aufweist.
Polypeptid nach Anspruch 10, wobei die manipulierten Zinkfinger-DNA-Bindungsmotive spezifisch an eine Nukleotidsequenz der Formel (GNN)_1-6 binden, wobei G Guanin ist und N ein beliebiges Nukleotid ist.
Polypeptid nach Anspruch 1, wobei die Transkriptionsregulationsdomäne eine Aktivierungsdomäne ist.
Polypeptid nach Anspruch 1, wobei die Transkriptionsregulationsdomäne eine Repressionsdomäne.
Nicht natülich vorkommendes Polypeptid umfassend: (a) eine DNA-Bindungsdomäne mit zwei bis sechs manipulierten Zinkfinger-DNA-Bindungsmotiven; (b) eine erste von einem Retinoid-X-Rezeptor stammende Ligandenbindungsdomäne, die funktionsfähig mit der DNA-Bindungsdomäne verknüpft ist, eine zweite von einem Ecdysonrezeptor stammende Ligandenbindungsdomäne, die mit einem Peptidspacer aus 18 bis 36 Aminosäureresten funktionsfähig mit der ersten Ligandenbindungsdomäne verknüpft ist; und (c) eine Transkriptionsregulationsdomäne, die funktionsfähig mit der zweiten Ligandenbindungsdomäne verknüpft ist.
Nicht natürlich vorkommendes Polypeptid, umfassen: (a) eine DNA-Bindungsdomäne mit zwei bis sechs manipulierten Zinkfinger-DNA-Bindungsmotiven; (b) eine erste von einem Progesteronrezeptor stammende Ligandenbindungsdomäne, die funktionsfähig mit der DNA-Bindungsdomäne verknüpft ist, eine zweite von einem Progesteronrezeptor stammende Ligandenbindungsdomäne, die mit einem Peptidspacer aus 18 bis 36 Aminosäureresten mit der ersten Ligandenbindungsdomäne verknüpft ist; und (c) eine Transkriptionsregulationsdomäne, die funktionsfähig mit der zweiten Ligandenbindungsdomäne verknüpft ist.
Polynukleotid, das für das Polypeptid nach Anspruch 1 codiert.
Polynukleotid, das für das Polypeptid nach irgendeinem der Ansprüche 15 oder 16 codiert.
Expressionsvektor, umfassend das Polynukleotid nach Anspruch 17.
Expressionsvektor, umfassen das Polynukleotid nach Anspruch 18.
Wirtszelle, umfassend das Polynukleotid nach irgendeinem der Ansprüche 17 oder 18.
Wirtszelle, umfassend den Expressionsvektor nach irgendeinem der Ansprüche 19 oder 20.
Verfahren zum Regulieren der Funktion eines Zielnukleotids, das eine definierte Sequenz enthält, wobei das Verfahren die in vitro- oder ex vivo-Exposition des Zielnukleotids mit dem Polypeptid nach Anspruch 1 in Gegenwart eines Liganden umfasst, der eine der Ligandenbindungsdomänen des Polypeptids bindet, wobei die DNA-Bindungsdomäne des Polypeptids die definierte Sequenz bindet.
Verfahren gemäß Anspruch 23, wobei der Ligand ein nicht-nativer Ligand ist.
Expressionsvektor, der für ein nicht natürlich vorkommendes Polypeptid gemäß irgendeinem der Ansprüche 1 bis 16 codiert, zur Gentherapie.