DE69432422T2

DE69432422T2 - Methoden zum aufspüren von anti-östrogenverbindungen

Info

Publication number: DE69432422T2
Application number: DE69432422T
Authority: DE
Inventors: Peter Kushner; Paul Webb
Original assignee: University of California
Current assignee: University of California
Priority date: 1993-09-01
Filing date: 1994-09-01
Publication date: 2004-03-04
Anticipated expiration: 2014-09-02
Also published as: NO960715L; EP0724648B1; KR100355647B1; ATE236247T1; AU682398B2; WO1995006754A1; AU7719094A; JP3503945B2; CA2169466A1; NO960715D0; JPH09502345A; EP0724648A1; DE69432422D1; EP0724648A4

Description

HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Viele Brust-Tumore benötigen Östrogen für das Tumorwachstum. So kann die Behandlung mit Anti-Östrogen-Verbindungen das Ausbreiten des Tumors verlangsamen oder verhindern. Viele Anti-Östrogene zeigen jedoch sowohl antagonistische als auch agonistische Aktivität gegenüber Östrogen. Z. B. zeigt das nicht-steroide anti-östrogene Tamoxifen, das als das Mittel der Wahl zur endokrinen Therapie von fortgeschrittenem Brustkrebs eingeführt ist, sowohl agonistische als auch antagonistische Aktivität. Sutherland, S. & Jackson, M., Cancer Treat. Revs. 15 183–194 (1987).
Die agonistische Aktivität von Tamoxifen und anderen Anti-Östrogenen kann grundlegende Wirkungen auf Patienten ausüben. Z. B. kann die agonistische Aktivität günstige Wirkungen haben, wie die Verhütung von Osteoporose und Verringerung des Serumcholesterins. Love et al., New Eng. J. Med. 326: 852–85E (1992); Love et al., J. Natl. Cancer Inst. 82: 1327–1332 (1990). Umgekehrt kann die agonistische Aktivität auch schädlich sein. Z. B. erhöht Tamoxifen manchmal das Auftreten von endometrialen Tumoren Lino et al., Cancer Treat. & Res. 53: 228–237 (1991). oder scheltet von einer Hemmung zu einer Stimulierung des Östogen-abhängigen Wachstums bei der Progression von Brustkrebs um Parker, M. G. (Hrsg.) Cancer Surveys 14: Growth Regulation by Nuclear Hormone Receptors, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1952).
Es ist erwünscht, reine Östrogene zu identifizieren, da angenommen wird, daß sie zu schnelleren, vollständigeren oder länger anhaltenden Tumorantworten führen. Wakeling, A. E., Breast Cancer Res & Treat 25: 1–9 (1993). Z. B. blockierte ICI 164,384, von dem angenommen wurde, daß es ein reines Anti-Östrogen ist, die MCF-7-Zellinvasions-Aktivität einer rekonstituierten Grundmembran, während Östradiol und 4'-Hydroxy-tamoxifen diese Aktivität stimulierten, was nahelegt, daß eine frühe Behandlung von Brustkrebs mit einem reinen Anti-Östrogen besonders günstig sein könnte zur Begrenzung der Tumorausbreitung Braacke et al., Br. J. Cancer 63: 867–872 (1991).
Im Gegensatz dazu können, während reine Anti-Östrogene für die Behandlung von Krebs bevorzugt zu sein scheinen, gemischte Agonisten/Antagonisten-Verbindungun zur Prävention bevorzugt sein. Derartige Verbindungen sollten ausrei chende antagonistische Aktivität auf das Wachstum von Östrogen-stimulierten Brusttumoren mit der gleichzeitigen Aufrechterhaltung einer agonistischen Aktivität auf die Knochendichte und die Lipidgehalte im Serum kombinieren.
Derzeit werden Anti-Östrogen-Verbindungen mit Hilfe von Tiermodellen, wie dem Ratten-Uterus-Test, abgesucht. Diese Tests sind mühsam, langsam, teuer und nicht sicher auf Menschen übertragbar, aufgrund der Unterschiede zwischen menschlichen Östrogen-Rezeptoren und denen von Nagetieren.
Alternativ haben Forscher menschliche Brustkrebs-Zellinien angewandt und ihr durch Östrogene stimuliertes Wachstum untersucht oder alternativ die Antwort von nativen oder transfizierten Reportergenen als Assay für die Östrogen-Antwort angewandt. Diese Zellininien nutzen Reportergene, die die Aktivität von Anti-Östrogen-Verbindungen anzeigen, die durch das klassische Östrogen-Antwort- Element vermittelt wird.
Der Stand der Technik liefert keine Methoden zur schnellen und leichten Untersuchung von potentiellen Anti-Östrogen-Verbindungen auf ihre agonistischen sowie antagonistischen Eigenschaften, die über andere Pfade als der klassischen Pfad der Östrogen-Antwort vermittelt werden, das kann ihre Verwendung für verschiedene therapeutische Anwendungen nachteilig oder vorteilhaft beeinflussen. Die vorliegende Erfindung ist auf diese und andere Probleme des Standes der Technik gerichtet.
ZUSAMMENFASUNG DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung liefert Methoden zum Absuchen von Testverbindungen auf ihre Fähigkeit, die Transcription durch eine indirekte Östrogen-Antwort oder eine klassische Östrogen-Antwort zu aktivieren oder zu hemmen. Die indirekte Östrogen-Antwort wird durch Promotoren vermittelt, die eine AP1-Stelle umfassen. und die klassische Östrogen-Antwort wird durch Promotoren vermittelt, die ein klassisches Östrogen-Antwort-Element umfassen. Bevorzugte AP1-Stellen können von Mettallaprotease-Genen isoliert werden. Bevorzugte klassisches Östrogen-Antwort-Elemente können von dem Xenopus vitellogenin A2-Gen isoliert werden.
Die Methoden wenden üblicherweise Zellen an, umfassend einen Östrogen-Rezeptor und einen Promotor, umfassend eine AP1-Stelle, die die Expression eines Reportergens steuert. Die Zellen werden dann mit der Testverbindung zusammengebracht die Expression des Reportergens wird nachgewiesen.
Bei diesem Assay angewandte Zellen können irgendeine Zelle sein, die Östrogen-Rezeptoren natürliche exprimiert oder als Ergebnis eines transgenen Kodierens des Rezeptors. Bevorzugte Zellen umfassen MCF-7, ERC1, ERC2 oder ERC3. Die zum Nachweis e ner Östrogen-Antwort angewandten Reportergene umfassen Gene, die β-Galactosidase und bakterielle Chloramphenicol-acetyl-transferase kodieren. Die angewandten Promotoren können solche sein, die natürlicher Weise AP1- oder Östrogen-Rezeptor-Elemente enthalten, oder die Promotoren können gentechniisch manipuliert sein, um solche Elemente zu enthalten.
Die Assays können mit Zellen angewandt werden, die Promotoren mit einer AP1-Stelle umfassen, oder alternativ kann eine zweite Reihe von Zellen angewandt werden mit einem Promotor, umfassend ein klassisches Östrogen-Antwort-Element, das die Expression eines zweiten Reportergens steuert. Alternativ können die beiden Promotoren und Reportergene in den gleichen Zellen vorliegen. Bei diesen Assays kann die Fähigkeit der Testverbindung, sowohl die indirekten als auch die klassischen Pfade zu induzieren oder zu hemmen, bestimmt werden.
Wenn die Methoden angewandt werden, um Östrogen-Antagonisten zu identifizieren, werden die Testverbindungen mit den Zellen und einer Verbindung zusammengebracht, von der bekannt ist, daß sie eine indirekte Östrogen-Antwort vermittelt. Die Fähigkeit. d e Antwort zu hemmen, wird bestimmt durch Nachweis der Expression des Reportergens. Verbindungen, von denen bekannt ist, daß sie eine indirekte Östrogen-Antwort vermitteln, umfassen Tamoxifen und Östrogen bei halb-maximalen Konzentrationen. Die Verbindungen können auch auf ihre Fähigkeit untersucht werden, den klassischen Östrogenpfad zu induzieren oder zu blockieren.
Die Erfindung liefert ferner Verbindungen, die nach den beanspruchten Methoden identifiziert werden. Ebenfalls erwähnt werden Zellen, die einen Östrogen-Rezeptor überexprimieren und einen Promotor umfassen, umfassend eine AP1-Stelle, die die Expression eines Reportergens reguliert. Beispielhafte Zellen umfassen ERCs.
KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
1 zeigt die durch eine AP1-Stelle vermittelte Östrogen-Stimulation. (A) Eine Consensus-AP1-Stelle hat ERE-artige Aktivität. Reportergene, Δcoll73 und Δcoll60 wurden in ERC1-Zellen transfiziert (Kushner et al., Mol. Endocronol. 4: 1465–1473 (1990). Δcoll73 besteht aus menschlichem Collagenase-Promotor (–73 bis +63) der stromaufwärts des CAT-Gens geklont ist. Angel et al., Mol. Cell. Biol. 7: 2256–2266 (1987). Die Stellung der Consensus AP1-Stelle ist angegeben. Δcoll60 enthält die AP1-Stelle (–73 bis –60) nicht. EREΔcol160 enthält ein Oligonucleotid entsprechend dem frog vitellogenin A1 Consensus ERE (Parker, M. G. (Hrsg.) Cancer Surveys 14: Growth Regulation by Nuclear Hormone Receptors, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1992) unmittelbar stromaufwärts der Collagenase-Sequenzen n Δcoll60. Typische Ergebnisse von CAT-Assays, normalisiert für die Transfketions-Effienz nach einer einzigen Transfektion sind gegenüber angegeben. Jeder Punkt ist dir Mittelwert von drei Assays mit Standardfehlern. CAT-Aktivitäten von Zellen, die in Abwesenheit von Hormon gehalten worden sind, sind als weiße Balken angegeben, diejenigen in Gegenwart einer Sättigungskonzentration (100 nM) an Östradiol als schwarze Balken. (B) Östrogen-Induktion an der AP1-Stelle erfordert AP1-Proteine. Ergebnisse von CAT-Assays hergestellt aus F9-Zellen, die mit Δcoll73 transfiziert sind.
2 zeigt die Aktivität von AP1-Stellen in MCF-7-Zellen. Die Östrogen-Induktion von AP1-abhängigen Reportergenen Δcoll73 und Δcoll60 ist oben beschrieben.
AP1ΔTK-CAT besteht aus der Collagenase-AP1-Stelle, die stromaufwärts eines Herpes simplex Virus-TK-Promotors (–32 bis +45) geklont ist. TK-TATA besitzt stromaufwärts keine bekannten Transcriptionsfaktor-Bindungsstellen. CAT-Aktivitäten in Gegenwart (schwarz) und in Abwesenheit (weiß) von Östrogen sind gegenüber jedem Reporter angegeben.
3 zeigt den Agonismus durch Anti-Östrogene an der AP1-Stelle. (A) CAT-Assay von ERC1-Zellen, die mit Δcoll73, Δcoll60 oder EREΔcol 60 transfiziert und mit Sättigungskonzentrationen (100 nM) an Östrogen (schwarz) Tamoxifen (schraffiert) und ICI (gestreift) oder keinem Hormon (weiß) inkubiert worden sind. Es ist ein einziger Versuch gezeigt, wobei die Aktivitäten das Mittel von drei einzelnen Punkten sind. (B) Dosisabhängigkeit von Anti-Hormon-Agonismus. Mit Δcoll73 transfizierte ERC1 wurden auf Platten aufgebracht und einem Bereich von Hormonkonzentrationen ausgesetzt. Jeder Punkt ist das Mittel aus drei Assays der CAT-Reaktivität. (C) Anti-Östrogen-Aktivität in auf Östrogen ansprechenden Zellinien. Es sind Ergebnisse von repräsentativen CAT-Assays nach Transfektion von col173 und Δcoll60 in MCF-7-Zellen und col173, Δcoll60 und EREΔcol160 in Ishikawa-Zellen gezeigt. Es ist ein einziger Versuch gezeigt, wobei die Aktivitäten das Mittel von drei einzelnen Punkten sind.
4 zeigt die Anti-Östrogen-Wirkung bei vorübergehenden Transfektionen. (A) Δcoll73 wurde in CHO-Zellen eingeführt, mit unterschiedlichen Mengen an ER-Expressionsvektor HEO (Holinka, C. F. et al., J. Steroid. Biochem. 25: 781–786 (1986)), normalisiert auf 10 μg mit dem Eltern-Expressionsvektor SG5. CAT-Aktivitäten wurden in Gegenwart von Hormnen bestimmt, wie in 3A gezeigt. (B) Anforderungen von ER-Domänen für die Hormonwirkung. Die Struktur von vier Derivaten der Human-ER-cDNA ist schematisch angegeben. Die DNA-Bindungs-Domäne ist durch den gestreiften Ka sten angegeben, die Liganden-Bindungs-Domäne ist als E2 bezeichnet. Transaktivierungsfunktionen TAF-1 und TAF-2 sind markiert. Die rechte Abbildung zeigt die Wirkung von Hormon auf Δcoll73. in Gegenwart jeder Mutante. Transfektionen wurden wie von Kushner et al. 4: 1465–1473 (1990) beschrieben in CHO-Zellen umfassend 300 ng jedes ER-Expressionsvektors, durchgeführt.
BESCHREIBUNG DER BEVORZUGTEN AUSFÜHRUNGSFORMEN
Die vorliegende Erfindung liefert eine wirksame Möglichkeit, eine große Anzahl an Testverbindungen auf solche abzusuchen, die die gewünschten Eigenschaften entweder zur Behandlung oder zur Verhütung von verschiedenen Krebsarten (z. B. Brustkrebs, Eierstockkrebs oder Gebärmutterkrebns) und andere Krankheiten (z. B. Endometriosis), die durch Östrogen vermittelt werden, aufweisen. Die Erfindung ermöglicht das Absuchen von Testverbindungen auf agonistische sowie antagonistische Aktivität. Außerdem liefert die Erfindung Verfahren zum Absuchen auf neue Arten van Anti-Östrogen-Verbindungen, die nur die indirekte Östrogen-Antwort blockieren und die Östrogen-Wirkung bei klassischen Östrogen-Antwort-Elementen nicht blockieren.
Bei Tieren und bei Menschen variiert das Gleichgewicht zwischen stimulierenden und hemmenden Aktivitäten von Anti-Östrogenen wie Tamoxifen in weiten Grenzen, abhängig von dem Organ, Zell- oder spezifischen Protein, das als Indikator für die Östrogen-Aktivität gemessen wird. Diese Vielfalt von Wirkungen ist mit dem Modell des Antagonismus der Östrogen-Rezeptor (ER)-Aktivität von klassischen Östrogen-Rezeptor-Elementn (EREs) schwer zu erklären, wie von Beato, M., Cell, 56: 335–344 (1989) und Klein-Hitpass et al., Nucleic Acids Res., 16: 647–663 (1988) beschrieben Die vorliegende Erfindung beruht zum Teil auf der Feststellung, deß ERs die Transcription durch Wechselwirkung mit einem anderen Antwortelement, der AP1-Bindungsstelle aktivieren können, anstatt an EREs zu binden. Dieser durch AP1 vermittelte Pfad, der hier als die indirekte Östrogen-Antwort erwähnt wird, kann stark zu den agonistischen Eigenschaften von Tamoxifen und anderen vermuteten Anti-Östrogenen beitragen. Eine allgemeine Beschreibung der AP1-Stelle findet sich in Angel & Kann, Biochem. Biophys. Acta., 1072: 129–157 (1991) und Angel et al., Cell, 49: 729–739 (1987).
Bei den erfindungsgemäßen Methoden können sowohl die klassischen Östrogen-Antwort-Elemente als auch die indirekte Östrogen-Antwort angewandt werden, um ein Absuchsystem zu liefern, das sowohl antagonistische als auch agonistische Aktivität gegenüber Östrogen nachweist. Die Verfahren umfassen typischerweise kultivierte Zellen, die hohe Gehalte an Human-Östrogen-Rezeptor bilden. Bevorzugte Zellen um fassen MCF-7-Zellen oder ERC1-Zellen, die von Kushner et al. Mol. Endocrinol. 4 1465–1473 (1990) beschrieben worden sind. ERC2- und ERC3-Zellen sind beschrieben worden von Webb et al., Mol. Endocrinol 6: 157–167 (1993).
Andere geeignete Zellen umfassen z. B. Ishikawa-Zellen und verschiedene Brustkrebs-Zellen, die dem Fachmann bekannt sind. Die Erfindung ist nicht auf die Durchführung in Säugetierzellen beschränkt und sie kann z. B. in Hefe- oder Insekten-Zellen durchgeführt werden.
Die Zellen können modifiziert sein, um Auslese- oder chimäre Östrogen-Rezeptoren zu ergeben, wie von Berry et al., E.M.B.O J. 9: 2811–2818 (1990) beschrieben. Diese Modifikationen können zu einer erhöhten Östrogen-Affintät und erhöhten Empfindlichkeit des Assays führen.
Außerdem werden diese Zellen mit Reportergenen transfiziert, in denen ein Antwortelement (entweder die AP1-Stelle oder ERE) die Expression eines Reportergens steuert. Typischerweise werden zwei unterschiedliche Reportergene angewandt. Ein Gen zeigt die durch das klassische Östrogen-Antwort-System induzierte Transcription an, während das andere Gen die durch die indirekte Östrogen-Antwort induzierte Transcription anzeigt. Die beiden Reportergene und Antwortelemente befinden sich typischerweise in getrennten Zellen, aber die Verfahren können auch angewandt werden mit beiden Konstrukten in der selben Zelle.
Das Reportergen für das klassische Östroyen-Antwort-System enthält ein Östrogen-Antwort-Element (ERE) stromaufwärts von dem Ziel-Promotor und das in der Lage ist, diessen Promotor zu steuern. Bei einer bevorzugten Ausführungsform kann das ERE das Consensus-Östrogen-Antwort-Element AGGTCACAGTGACCT von dem Xenopus vitellogenin A2-Gen sein.
Das spezielle in den Zellen angewandte ERE ist kein kritischer Aspekt der Erfindung und die vorliegende Erfindung ist nicht auf die Verwendung dieses ERE beschränkt. Es können auch andere dem Fachmann bekannte EREs verwundet werden. Z. B. umfassen andere Quellen für natürlich vorkommende EREs das B2-Gen, das Hühner-Ovalbumin-Gen und das PS2-Gen. Wahlweise können nicht-natürlich vorkommende EREs in spezielle Promotoren insertiert werden. Das Consensus-ERE von dem Xenopus vitellogenin A2-Gen wird verbreitet für diesen Zweck angewandt, aber andere EREs können ebenfalls verwendet werden.
Das Reportergen für den Pfad der indirekten Östrogen-Antwort enthält eine AP1-Stelle stromaufwärts von dem Ziel-Promotor und die in der Lage ist, diesen Promotor zu steuern. Die AP1-Stelle ist eine Stelle, die über AP1 (die Jun und Fos Proteine) oder andere Mitglieder dieser Proteinfamilie gebunden ist. Bei einer bevorzugten Ausführungsform ist die Consensus-AP1-Stelle TGA(C/G)TCA.
Der Fachmann würde erkennen, daß die spezielle angewandte AP1-Stelle kein kritischer Aspekt der Erfindung ist. Irgendeine Sequenz, in der Lage ist, durch AP1 oder Mitglieder dieser Familie gebunden zu werden und einen Promotor zu steuern, ist geeignet. Dies würde Promotoren umfassen, die eine natürlich vorkommende AP1-Stelle enthalten. Typische Promotoren umfassen, sind aber nicht beschränkt auf Metalloprotease-Gene, wie Stromelysin, Gelatinase, Matrilysin und das Human-Collagenase-Gen.
Wahlweise können Promotoren aufgebaut werden, die eine nicht natürlich vorkommende AP1- oder verwandte Bindungsstelle enthalten. Die erleichtert die Bildung von Reportergen-Systemen, die sich nicht typischerweise unter der Kontrolle von AP1 finden. Außerdem können Promotoren aufgebaut werden, die multiple Kopien der AP1-Stelle enthalten, wodurch die Empfindlichkeit oder die Möglichkeit, die Antwort des Reportegen-Systems zu modulieren, zunimmt.
Die vorliegende Erfindung ist nicht auf ein spezielles Reportergen beschränkt. Irgendein Gen, das ein leicht zu bestimmendes Produkt exprimiert, liefert einen geeigneten Indikator für das erfindungsgemäße Assay. Geeignete Reportergene sind dem Fachmann bekannt. Sie umfassen z. B. bakterielle Chloramphenicol-acetyl-transferase (CAT), β-Galactosidase oder Luciferase.
Um eine Anzahl von Verbindungen auf ihre Anti-Östrogen-Wirkung abzusuchen, werden Zellen mit einer starken Expression von Human-Östrogen-Rezeptoren und die ein Antwort-Element und Reportergene enthalten, Dosen von Östrogen ausgesetzt, die eine halb-maximale Induktion oder weniger ergeben. In jedem Falle führt dies zu einer mehrere hundert-fachen Induktion, abhängig von dem Gehalt an Östrogen-Rezeptor und den speziellen Details des Reporteraufbaus. Die zeigt sich in einer Zunahme des Reportergen-Produktes, wie des CAT-Gen-Produktes, das durch ein ein ezymatisches Assay quantitativ bestimmt werden kann. Die Zellen können Östrogenen ausgesetzt werden, die entweder in getrennten Vertiefungen einer Kulturschale mit mehreren Vertiefungen wachsen, oder für das colorimetrische Assay in einer halbfesten Nährstoffmatrix. Die zu untersuchenden Verbindungen werden in die Vertiefungen der Kulturschale oder in kleine Vertiefungen, die in der halbfesten Matrix erzeugt worden sind, gegeben und die Wirkung der Östrogen-Induktion wird bestimmt. Eine anti-östrogene Verbindung verringert die durch Östrogen induzierte Zunahme der Reportergen-Aktivität oder hebt sie auf. Ein hypothetisch reines Anti-Östrogen blockiert die Östrogen-Wirkung bei beiden Arten von Reportergenen und besitzt nicht die Fähigkeit, die Reportergene in Abwesenheit von Östrogen zu induzieren. Ein gemischter Östrogen-Antagonist/Agonist zeigt eine gewisse Fähigkeit, die Reportergene zu induzieren, besonders die Reportergene, die an die AP1-Stelle gebunden sind.
Bei einer anderen Ausführungsform können Verbindungen, die den indirekten Pfad blockieren, angewandt werden, um Tamoxifen oder anders Anti-Östrogene bei der Behandlung oder Verhütung von Brustkrebs und anderen durch Östrogen vermittelten Krankheiten zu ergänzen. Diese Verbindungen wirken so, daß sie die östrogenagonistische Aktivität von Anti-Östrogenen eliminieren. Zweitens können sie allein Anwendung finden. Insbesondere kann es vorteilhaft sein, einige durch Östrogen vermittelte pathologische Wirkungen an indirekten Östrogen-Antwort-Elementen zu blockieren während der direkte Pfad aktiv bleibt. Verbindungen, die den indirekten Pfad blockieren, sind geeignet als Komponenten von kombinierten oralen Kontrazeptiva (COC), die Östrogene und Progestine enthalten. Ein dreifaches COC, das Östrogene, Progestine und eine blockierende Verbindung enthält, würde es ermöglichen, daß Östrogen entweder in der Zubereitung oder endogen als klassisches Antwort-Element wirkt, aber die Wirkung von indirekten Antwort-Elementen blockiert. So wirkt ein dreifaches COC wie gängige COCs zur Verhütung einer Schwangerschaft, kann aber auch zu einer Schutzwirkung gegen Brustkrebs führen.
Typischerweise wird das an die AP1-Stelle gebundene Reportergen nicht mit Östrogen, sondern mit einem Überschuß (10-faches des Kd) von Tamoxifen, 4-Hydroxy-tamoxifen oder einem anderen Anti-Östrogen aktiviert. Eine Bibliothek von Verbindungen wird auf Kandidaten untersucht, die die Reporterger-Aktivität durch das, Anti-Östrogen blockieren oder verringern. Die Kandidaten werden dann mit Zellen untersucht, die das Reportergen für den klassischen Pfad enthalten, um zu bestätigen, daß sie die Östrogen-Aktivierung an ERE nicht stören.
Verbindungen, die in dem erfindungsgemäßen Assay identifiziert worden sind, können in pharmazeutischen Standardzusammensetzungen zur Behandlung von Krebs als Komponenten von oralen Kontrazeptiva oder für irgendeine andere Anwendung, bei der eine Modulation der Östrogen-Aktivtät erwünscht ist, verwendet werden. Die pharmazeutischen Zusammensetzungen können nach bekannten Verfahren hergestellt und verabreicht werden. Die pharmazeutischen Zusammensetzungen sind im allgemeinen zur parenteralen, topischen oder lokalen Verabreichung zur prophylaktischen und/oder therapeutischen Behandlung vorgesehen. Die pharmazeutischen Zusammensetzungen können in e ner Vielfalt von Einheitsdosisformen verabreicht werden, abhängig von der Art der Verabreichung. Z. B. umfassen Einheitsdosisformen, die zur oralen Verabreichung geeignet sind, Pulver, Tabletten, Pillen und Kapseln.
Geeignete pharmazeutische Zubereitungen zur Anwendung im Rahmen der vorliegenden Erfindung finden sich in Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Company, Philadelphia, PA, 17. Aufl. (1985). Es kann eine Vielfalt von pharmazeutischen Zusammensetzungen hergestellt werden, die die erfindungsgemäßen Verbindungen und wirksame Träger enthalten.
Das folgend Beispiel ist zur Erläuterung und nicht zur Beschränkung angegeben. BEISPIEL Das Human Collagenase-Gen spricht, wie anderer Matrix-Metalloproteasen, auf AP1 an. Angel et al., Mol. Cell. Biol. 7: 2256–2266 (1987). Um zu untersuchen, ob eine AP1-Stelle eine Östrogen-Antwort übertragen kann, wurde der Collagenase-Promotor mit dem bakaeriellen CAT-Gen (Δcoll73) verschmolzen und in Eizellen von Chinesischem Hamster, die ER (ERC1) überexprimierten, transfiziert Kushner et al., Mol. Endocrinol. 4 1465–1473 (1990).
Coll73 und Coll60, die früher von Angel et al., Mol. Cell. Biol. 7: 2256–2266 (1987) beschrieben worden waren, wurden durch Abbau mit EcoO109 und Ndel modifiziert, um eine AP1-Stelle in dem Grundgerüst von pUC zu entfernen, und wurden konsequent als Δ bezeichnet. EREΔcoll60 wurde hergestellt durch Ligatisierung von Consensus-ERE, AGGTCACAGTGACCT, in die HindIII-Stelle stromaufwärts von dem Δcll60-Promotor. ERC-Transfektionen und Elektoporation wurden durchgeführt, wie von Kushner et al., Mol. Endocrinol. 4 1465–1473 (1990) beschrieben. F9-Zell-Transfektionen erfolgten durch gemeinsame Ausfällung mit Calciumphosphat. Die Zellen wurden mit 30% Konfluenz auf 1,5 cmn Schalen ausgesät und über Nacht mit 5 mg Reportergen, 1 mg Actin B-HCG transfiziert.
In einigen Transfektionen, wie angegeben, waren 100 ng AP1-Expressionsvektoren und 1 μg ER-Expressionsvektor HEO enthalten Kumar et al., Cell, 51: 941–951 (1987). Der menschliche cfos-Expressionsvektor war BK28. Sassone-Corsi et al., Cell, 54: 553–560 (1988). Der menschliche c-jin-Expressionsvektor war RSVc-Jun. Turner & Tjian, Science 243: 1689–1694 (1998). Die Zellen wurden mit Glycerin geschockt, wieder zugegeben (re-fed) und mit Hormon behandelt. Alle CAT-Assays wurden auf die Produktion von HCG normalisiert, wie von Kushner et al., Mol. Endocrinol. 4 1465–1473 (1990) beschrieben. Daten sind als Zählungen pro Minute von Tritium enthaltendem umgewandelten Acetyl-GoA pro Einheit HCG (CAT-Einheiten) angegeben.
Östradiol stimulierte Δcoll73 zehnfach (1A) während ein ähnlicher Reporter, bei dem die AP1-Stelle entfernt worden war, (Δcoll60) eine verringerte Grundaktivität und keine Östrogen-Antwort ergab. Der Ersatz der AP1-Stelle (EREΔcoll60) durch einen klassischen ERE (Klein-Hitpass et al., Nucleic Acids Res., 16: 647–663 (1988)) stellte die Östrogen-Antwort, aber nicht die erhöhte Grundaktivität, wieder her.
In F9-Zellen, die keine endogene AP1-Aktivität aufweisen, (Chiu et al., Cell, 54: 541–551 (1988) sprach Δcoll73 in Gegenwart von vorübergehend transfiziertem ER nicht auf Östrogen an (1B). Die Östrogen-Aktivierung konnte wieder hergestellt werden durch Cotransfizieren von Expressionsvektoren für AP1-Proteine c-Jun und c-fos. Sassone-Corsi et al., Cell, 54: 553–560 (1988), Turner & Tjian, Science 243: 1689– 1694 (1998). Parallel sprach EREΔcoll60 auf Östrogen an, selbst in Abwesenheit von AP1 und Δcoll60 und blieb von Östrogen unbeeinflußt (Daten nicht gezeigt). Die Östrogen-Induktion des Collagenase-Promotors erforderte daher sowohl die AP1-Stelle als auch AP1-Proteine.
Um zu bestätigen, daß ER die Transcription durch AP1-Stellen unter physiologischen Bedingungen aktiviert, wurde die Untersuchung in MCF-7 (2) einer menschlichen Brusttumor-Zelle, in der die Aktivität der Collagenase-Gen-Familie auf Östrogen anspricht und die mit der Invasivität des Tumors zusammenhängt, untersucht. Thompson et al.. Cancer Res. 48: 6764–6768 (1988).
AP1ΔTK-CAT besteht aus der Collagenase-AP1-Stelle, die stromaufwärts von einem Herpes-simplex-Virus-TK-Promotor (–32 bis +45) geklont ist. TK-TATA besitzt stromaufwärts keine bekannte Transcriptionsfaktor-Bindungsstellen. AP1ΔTK-CAT wurde aufgebaut durch. Ligatisierung einer Oligonucleotid überspannenden Collagenase-Sequenz –73 bis –52 in die HindIII-Stelle stromaufwärts von einem TK-CAT-Derivat, das modifiziert worden war. um die PUC-AP1-Stelle zu entfernen. AP1-TK-TATA wurde aufgebaut durch Ligatisierung des gleichen Oligonucleotids in die HindIII-Stelle eines CAT-Vektors, der TK-Sequenzen –32 bis +45 enthielt und bereits keine PUC19-AP1-Stelle. Leitmann, D. C. et al., Mol. Cell. Biol. 12: 1352–1356 (1992). Bei MCF-7-Transfektionen wurde die gleiche Arbeitsweise wie bei ERC-Zellen angewandt, wie beschrieben von Kushner et al., Mol. Endocrinol. 4 1465–1473 (1990).
Östrogen stimulierte die Δcoll73-Aktivität vierfach und die Entfernung der AP1-Stelle hob das Ansprechen auf Östrogen auf. Die Collagenase-AP1-Stelle übertrug die Östrogen-Antwort ebenfalls auf den Herpes-simplex-Virus-TK-Promotor und die isolierte TK-TATA-Box , von denen keines allein auf Östrogen ansprach. So war die AP1-Stelle alles, was für die Östrogen-Antwort auf heterologe Promotoren erforderlich war. Diese Art der Östrogen-Induktion kann einen weit üblicheren Pfad darstellen, als bisher angenommen. Dieser Pfad wird als die indirekte Östrogen-Antwort bezeichnet.
Die Wirkung von Anti-Östrogenen auf die indirekte Östrogen-Antwort wurden anschließend untersucht. Alle Zellen wurden transfiziert, wie von Kushner et al., Mol. Endocrinol. 4 1465–1473 (1990) beschrieben. Ishikawa-Zellen, von Holinka et al., J. Steroid. Biochem. 25: 781–786 (1986) beschrieben, wurden mit 10 nM PMA und 10 μM Forskolin induziert vor der Östrogen- und Anti-Östrogen-Induktion.
Tamoxifen hemmt die Östrogen-Wirkung bei klassischen EREs durch Interferenz mit der östrogen-abhängigen Transcriptions-Aktivierungsfunktion in der ER-Liganden-Bindungs-Domäne. Berry et al., E.M.B.O J. 9: 2811–2818 (1990). Es zeigt manchmal partiellen Agonismus bei klassischen EREs, was der Aktivität einer zelltyp-spezifischen konstitutiven Transaktivierungsfunktion in dem Amino-Terminus zuzuschreiben ist. Id. ICI hemmt eine Dimerisierungsfunktion (Fawelll et al., Proc. Nad. Acad. Sci. USA, 87: 6883–6887 (1990)), was eine Wechselwirkung hoher Affinität m t EREs in Zielpromotoren verhindert, und zeigt bei den meisten Assays keinen Agonismus Wakeling, A . J. Steroid. Biochem. Molec. Bio. 37: 771–775 (1990).
Deutlich stimulierten Tamoxifen und ICI die Δcoll73-Expression fünffach in ERC1-Zellen (3A). Keines beeinflußte Δcoll60. Im Gegensatz dazu zeigte EREΔcoll60 Östrogen- aber keine Anti-Östrogen-Antwort. was darauf hinweist, daß der Anti-Östrogen-Agonismus spezifisch für die AP1-Stelle ist. Die Dosis-Antwort (3B) jedes Agonisten stimmte mit seiner Affinität gegenüber ER überein (Tora et al., E.M.B.O J. 8: 1981–1986(1989) (1 nM für Östradiol, 10 nM für ICI und Tamoxifen). Es wurde auch die Anti-Östrogen-Antwort in Zellen mit endogenem ER untersucht. In MCF7 stimulierte Tamoxifen die Δcoll73-Expression schwach und ICI zeigte geringe Wirkung (3C). Eine menschliche Endometrium-Zellinie (Holinka, C. F. et al., J. Steroid. Biochem. 25: 781–786, worauf hier verwiesen wird), Östrogen, Tamoxifen und ICI waren gleich wirksam eine AP1-ortsspezifische zweifache Antwort hervorzurufen, beeinflußten das klassische ERE aber nicht.
Die Wirkung von vorübergehend exprimierten ER-Mutanten (Kumar et al., Cell, 51: 941–951 (1987), Kumar & Chambon, Cell, 55: 145–155 (1988), worauf hier verwiesen wird) auf Δcoll73 in CHO-Zellen wurde untersucht, um zu bestimmen, welche ER- Domäne eine indirekte Antwort vermittelt. Östrogen und Tamoxifen aktivierten den Collagenase-Promotor (4A), obwohl beide bei größeren Mengen an vorübergehend transfiziertem ER weniger wirksam waren. Die ICI-Induktion wurde bei höheren ER-Gehalten deutlicher. Dies stimmt überein mit Beobachtungen, daß ICI ER-Gehalte verringert, indem es die Halbwertzeit von ER-Protein verringert. Dauvois et al., Proc. Natl. Acad. Sci. LISA, 89: 4037–44041 (1992).
Das ER enthält zwei Transcriptions-Aktivierungs-Funktionen (4B), Amino-Terminus konstitutiv (TAF-1) und Carboxyl-Terminus östrogen-abhängig (TAF-2). Isoliertes TAF-1 (HE15) scheint eine hormon-unabhängige Aktivierung der Transcription zu ergeben und die Deletion von TAF-1 (HE19) verringerte die Östrogen-Antwort und hob die Anti-Östrogen-Aktivität auf. Anti-Östrogen-Aktivität gegenüber Δcoll73 in CHO-Zellen reflektiert daher die TAF-1-Aktivität. Dies stimmt mit Überlegungen überein, daß Tamoxifen TAF-2 nicht aktivieren kann (Berry et al. (1990)) und beinhaltet ferner, daß ICI diese Funktion nicht aktivieren kann. ICI-Agonismus kann auch implizieren, daß monomeres ER in diesem Komplex wirkt. Fawelll et al., (1990). Deletion der DNA-Bindungsdomäne (HE11) verringerte die Hormoninduktion nicht, was nahelegt, daß die Antwort unabhängig von der DNA-Bindung ist, und vielmehr indirekt durch AP1-Proteine induziert wird.
Zusammenfassend ist die indirekte Östrogen-Antwort verbreitet aktiv und Anti-Östrogene sind Agonisten bei diesem Pfad. Es ist möglich, daß irgend eine der gut beschriebenen Agonisten-Wirkungen von Tamoxifen die indirekte Östrogen-Antwort reflektiert. Anti-Östrogene werden Östrogen-Aktivität gegenüber kritischen AP1-gesteuerten Ziel-Genen haben und damit Wachstum und differenzierte Antwort in Zellen, in denen ER und AP1-Proteine in Wechselwirkung treten könnten. Veränderungen von AP1 während des Tumorwachstums könnten besonders signifikant sein und sollten in Modellen von Anti-Östrogen-Resistenz bei Brustkrebs berücksichtigt werden Parker, et al., Cancer Surveys 14: Growth Regulation by Nuclear Hormone Receptors, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1992).
Obwohl die Erfindung in gewissem Detail in der obigen Beschreibung und den Beispielen zur besseren Klarheit und Verständnis beschrieben worden ist, ist es offensichtlich, daß bestimmte Veränderungen und Modifikationen innerhalb des Rahmens der anliegenden Ansprüche durchgeführt werden können.

Claims

Verfahren zum Absuchen einer Verbindung, von der bekannt ist, daß sie anti-östrogene Aktivität besitzt auf agonistische östrogene Aktivität, die durch eine indirekte Östrogenantwort vermittelt wird, wobei das Verfahren umfaßt: a) Bereitstellen einer Zelle, umfassend einen Östrogen-Rezeptor und einen Promotor, umfassend eine AP-1-Stelle, die die Expression eines Reportergens steuert; b) Zusammenbringen der Zelle mit der Testverbindung und c) Nachweisen der Expression des Reportergens, wobei eine verstärkte Expression des Reportergens anzeigt, daß die Testverbindung agonistische östrogene Aktivität besitzt, die durch eine indirekte Östrogenantwort vermittelt wird
Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Zelle eine MCF-7-Zelle ist.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Zelle eine Ishikawa-Zelle ist.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Zelle eine ERC1-Zelle ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 3 oder 4, wobei die Zelle den Östrogen-Rezeptor überexprimiert.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei das Reportergen β-Galactosidase codiert.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei das Reportergen bakterielle Chloramphenicol-acetyl-Transferase codiert.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei der Promotor gentechnisch verändert ist, um eine AP-1-Stelle zu enthalten.
Verfahren nach Anspruch 1, umfassend ferner die folgenden Stufen: a) Bereitstellen einer zweiten Zelle, umfassend Östrogen-Rezeptor und einen Promotor, umfassend ein Standard-Östrogenantwort-Element, das die Expression eines zweiten Reportergens steuert; b) Zusammenbringen der zweiten Zelle mit der Testverbindung und c) Nachweisen der Expression des zweiten Reportergens.
Verfahren nach Anspruch 9, wobei das Antwortelement von dem Xenopus vitellogenin A2 Gen stammt.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Zelle ferner einen Promotor umfaßt, der ein Standard-Östrogenantwort-Element umfaßt, das die Expression des zweiten Reportergens steuert.
Verfahren nach Anspruch 11, wobei das Antwortelement von dem Xenopus vitellogenin A2 Gen stammt.
Verfahren zum Absuchen einer Verbindung, auf ihre Fähigkeit, die Transcription durch eine indirekte Östrogenantwort zu hemmen, wobei das Verfahren umfaßt: a) Bereitstellen einer Zelle, umfassend einen Östrogen-Rezeptor und einen Promotor, umfassend eine AP-1-Stelle, die die Expression eines Reportergens steuert; b) Zusammenbringen der Zelle mit der Testverbindung und einer Verbindung, von der bekannt ist, daß sie eine indirekte Östrogenantwort vermittelt, c) Nachweisen der Expression des Reportergens, wobei die Hemmung der verstärkten Expression des Reportergens, das durch die Verbindung gebildet worden ist, von der bekannt ist, daß sie durch eine indirekte Östrogenantwort vermittelte agonistische östrogene Aktivität besitzt, anzeigt, daß die Testverbindung agonistische östrogene Aktivität die durch eine indirekte Östrogenantwort vermittelt wird hemmt.
Verfahren nach Anspruch 13, wobei die Verbindung, von der bekannt ist, daß sie eine indirekte Östrogenantwort vermittelt, Tamoxifen ist.
Verfahren nach Anspruch 13, wobei die Verbindung, von der bekannt ist, daß sie eine indirekte Östrogenantwort vermittelt, Östrogen in halber maximaler Konzentration ist.
Verfahren nach Anspruch 13, wobei die Zelle eine MCF-7-Zelle ist.
Verfahren nach Anspruch 13, wobei die Zelle den Östrogen-Rezeptor überexprimiert.
Verfahren nach Anspruch 13, wobei die Zelle eine ERC1-Zelle ist.
Verfahren nach Anspruch 13, wobei der Promotor gentechnisch verändert ist, um eine AP-1-Stelle zu enthalten.
Verfahren nach Anspruch 13, umfassend ferner die folgenden Stufen: a) Bereitstellen einer Zelle, umfassend Östrogen-Rezeptor und einen Promotor, umfassend ein Standard-Östrogenantwort-Element, das die Expression eines zweiten Reportergens steuert; b) Zusammenbringen der zweiten Zeile mit der Testverbindung und c) Nachweisen der Expression des zweiten Reportergens.
Verfahren nach Anspruch 20, umfassend ferner die Stufe des Zusammenbringens der zweiten Zelle mit einer Verbindung, von der bekannt ist, daß sie eine Standard-Östrogenantwort vermittelt.