JPH09502345A - 抗エストロゲン化合物をスクリーニングする方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は、エストロゲン作動及び拮抗特性の双方を有することができる化合物を同定する新規なアッセイ方法を提供する。特に、このアッセイは、レポーター遺伝子と結合するＡＰ１部位を有するプロモーターを含有する細胞を用いる。レポーター遺伝子の発現を誘発するか又はブロックすることが可能な化合物を同定することができる。さらに、化合物の標準エストロゲン応答を調節する能力も試験することができる。

Description

【発明の詳細な説明】 抗エストロゲン化合物をスクリーニングする方法 発明の背景 多くの胸部腫瘍は、腫瘍成長にエストロゲン類を必要とする。よって、抗エス トロゲン化合物で処理することにより、腫瘍転移を遅くするか又は予防すること ができる。しかし、多くの抗エストロゲン類は、エストロゲン拮抗活性及び作動 活性の双方を示す。例えば、進展した胸部ガンの内分泌治療のための選択の処置 として確立している非ステロイド性抗エストロゲン・タモキシフェンは、拮抗活 性及び作動活性の双方を示す。サザーランド（Sutherland，S） 及びジャクソン （Jackson，M）、Cancer Treat．Revs．15巻:183-194頁（1987年）。 タモキシフェン及びその他の抗エストロゲン類の作動活性は、患者に大きな効 果を有するであろう。例えば、作動活性は、骨粗鬆症を予防したり、血清コレス テロールを低下させるような利益をもたらす効果を有する。ラブ（Love）ら、Ne wEng．J．Med．326巻:852-856頁（1992年）。ラブ（Love）ら、J．Natl．Cancer Inst．82巻:1327-1332頁（1990年）。逆に、作動活性は有害にもなるであろう 。例えば、タモキシフェンは、時々子宮内腫瘍発生率を増加させるか（イイノ（ Iino）ら、Cancer Treat．& Res.53巻:228-237頁（1991年））又は胸部腫瘍進行 においてエストロゲン依存成長を阻害する方から刺激する方へとスイッチする。 パーカー（Parker，M.G.）（編）、Cancer Surveys 14巻:“Growth Regulation by Nuclear Hormone Receptors”、コールド・スプリング・ハーバー・ラボラト リー出版（Cold Spring Harbor Laboratory Press）（1992年）。 純抗エストロゲン類（pure antiestrogens）は、迅速、完全、又は長期間の腫 瘍応答をもたらすことが予想されるので、純抗エストロゲン類を同定することが 望まれている。ウェクリング（Wakeling，A．E.）、Breast Cancer Res．& Trea t.25巻:1-9頁（1993年）。例えば、純抗エストロゲンであると考えられているＩ ＣＩ 164,384は、再構成基底膜のＭＣＦ−７細胞侵入活性をブロックした一方、 エストラジオール及び4'−ヒドロキシタモキシフェンは、純抗エストロゲンでの 胸部 ガンの初期的処置が腫瘍の転移を制限するのに特に有益であると示唆しているこ の活性を剌激した。ブラーケ （Braacke）ら、Br．J．Cancer 63巻:867-872頁（ 1991年）。 逆に、純抗エストロゲンはガン処置に好適であるようである一方、混合した作 動薬−拮抗薬化合物は予防処置に好ましいようである。このような化合物は、骨 密度及び血清脂質（serum lipid）レベルにおいて同時に起きる作動活性を維持 しながら、エストロゲン剌激を受けた胸部腫瘍成長に十分な拮抗活性を与える。 現在、抗エストロゲン化合物は、ラット子宮試験のような動物モデルでスクリ ーンされている。この試験は煩わしく、反応が遅く、高価で、かつヒトと齧歯類 とのエストロゲン受容体の差のため、ヒトに適用されるかが不明確である。 また、研究者は、ヒト胸部ガン細胞系を用いて、エストロゲン類による剌激を 受けるそれらの成長をアッセイしていたか、又はエストロゲン応答（response） のアッセイとして天然若しくはトランスフェクションされたレポーター遺伝子（ reporter gene）を用いた。これらの細胞系は、古典エストロゲン応答要素（cla ssical estrogen response element）を通して媒介される抗エストロゲン化合物 の活性を示すレポーター遺伝子を利用する。 先行技術は、古典エストロゲン応答経路以外の経路を通して媒介される拮抗及 び作動特性の潜在的な抗エストロゲン化合物を迅速かつ容易に試験する方法を提 供していない。この経路は、さまざまな治療施用にそれらを用いることに、逆方 向又は有効に影響を及ぼすことができる。本発明は、先行技術のこれら及び他の 問題に関する。 発明の概要 本発明は、間接エストロゲン応答又は古典エストロゲン応答を通して転写を活 性化するか又は阻害する試験化合物の能力をスクリーニングする方法を提供する 。間接エストロゲン応答は、ＡＰ１部位を含有するプロモーター（promoter）に よって媒介され、古典エストロゲン応答は、古典エストロゲン応答要素を含有す るプロモーターによって媒介される。好ましいＡＰ１部位は、メタロプロテアー ゼ遺伝子（metalloprotease gene）から単離することができる。好ましい古典エ ストロゲン応答要素は、アフリカツメガエル・ビテロゲニンＡ２遺伝子（Xenopu s vitellognin A2 gene）から単離することができる。 本方法は典型的には、エストロゲン受容体、及びレポーター遺伝子の発現を調 節するＡＰ１部位を含有するプロモーターを含有する細胞を用いる。この細胞を その後、試験化合物と接触させ、レポーター遺伝子の発現を検知する。 アッセイに用いる細胞は、エストロゲン受容体を天然に発現する、いかなる細 胞であっても、又は受容体をコードする導入遺伝子（transgene）の結果として のいかなる細胞であってもよい。好ましい細胞として、ＭＣＦ−７、ＥＲＣ１、 ＥＲＣ２又はＥＲＣ３が挙げられる。エストロゲン応答を検知するのに用いられ るレポーター遺伝子として、ベータ−ガラクトシダーゼ（beta-galactosidase） 及びバクテリアル・クロラムフェニコール・アセチル・トランスフェラーゼ（ba cterial chloramphenicol acetyl transferase）をコードする遺伝子が挙げられ る。用いられるプロモーターは、ＡＰ１又はエストロゲン受容体要素を天然に含 有するものであるか、又はそのプロモーターがそれらの要素を含有するように遺 伝子工学操作されたものである。 アッセイは、ＡＰ１部位を有するプロモーターを含有する細胞で行われる。ま たは、第２のレポーター遺伝子の発現を調節する古典エストロゲン応答要素を含 有するプロモーターを有する第２の細胞のセットを用いることができる。これら のアッセイで、試験化合物の間接及び古典経路の双方を誘導するか又は阻害する 能力を測定することができる。 本方法を用いてエストロゲン拮抗薬を同定するとき、試験化合物を細胞及び間 接エストロゲン応答を媒介すると知られている化合物と接触させる。応答を阻害 する能力は、レポーター遺伝子の発現を検知することによって測定される。間接 エストロゲン応答を媒介すると知られている化合物として、タモキシフェン及び 最大濃度の半分の濃度のエストロゲンが挙げられる。化合物は、古典エストロゲ ン経路を誘導するか又はブロックする能力も試験することができる。 本発明は、請求の範囲に記載する方法により同定される化合物をさらに提供す る。エストロゲン受容体を過発現し（overexpress）、かつレポーター遺伝子の 発現を調節するＡＰ１部位を含有するプロモーターを含有する細胞も請求の範囲 に記載する。この細胞の例として、ＥＲＣ１が挙げられる。 図面の簡単な説明 図１は、ＡＰ１部位によって媒介されるエストロゲン刺激を示す。（Ａ）共通 ＡＰ１部位はＥＲＥ様活性を有する。レポーター遺伝子、Δcoll73及びΔcoll60 は、ＥＲＣ１細胞に移入される（transfect）（クッシュナー（Kushner）ら、Mo l.Endocrinol．4巻:1465-1473頁（1990年）。Δcoll73は、ＣＡＴ遺伝子のヒト ・コラゲナーゼ（collagenase）・プロモーター（-73から+63）クローン上流か らなる。エンジェル（Angel）ら、Mol．Cell．Biol．7巻:2256-2266頁（1987年 ）。共通ＡＰ１部位の位置が示される。Δcoll60は、ＡＰ１部位（-73から+63） を欠損していた。ＥＲＥΔcoll60は、Δcoll60中のコラゲナーゼ配列のすぐ上流 に、カエル・ビテロゲニンＡ２共通ＥＲＥに対応するオリゴヌクレオチドを含ん でいる（パーカー（編）、Cancer Surveys 14 Growth Regulation by Nuclear H ormone Receptors、コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー出版（1992 年））。１回のトランスフェクションに続く、トランスフェクション効率で標準 化したＣＡＴアッセイの典型的な結果を、反対側に示す。各々の点は、標準誤差 を有する３度のアッセイの平均値である。ホルモンがない場合に維持される細胞 からのＣＡＴ活性は、白の棒グラフで示す。エストラジオールの飽和濃度（１０ ０ｎＭ）の存在下のＣＡＴ活性は、黒の棒グラフで示す。（Ｂ）ＡＰ１部位での エストロゲン誘導は、ＡＰ１タンパク質を必要とする。ＣＡＴアッセイの結果は 、Δcoll73で移入されるＦ９細胞から調製した。 図２は、ＭＣＦ−７細胞内のＡＰ１部位の活性を示す。ＡＰ１依存レポーター 遺伝子Δcoll73及びΔcoll60のエストロゲン誘導は上述した。ＡＰ１ΔＴＫ−Ｃ ＡＴは、ヘルペス・シンプレックス・ウィルス（herpes simplex virus）ＴＫプ ロモーター（-32から+45）のコラゲナーゼＡＰ１部位クローン上流からなる。Ｔ Ｋ−ＴＡＴＡは、ある既知の上流転写因子結合部位を欠損している。エストロゲ ン存在下（黒）及び不存在下（白）でのＣＡＴ活性は、各々のレポーターの反対 側に示す。 図３は、ＡＰ１部位での抗エストロゲンによる作動作用を示す。（Ａ）Δcoll 73、Δcoll60又はＥＲＥΔcoll60で移入され、かつエストロゲン（黒）の飽和濃 度（100nM）（黒）、タモキシフェン（斜線）及びＩＣＩ（縦縞）又はホルモン なし （白）でインキュベートされたＥＲＣ１細胞のＣＡＴアッセイ。活性を、３つの 分離点の平均である単一の実験で示す。（Ｂ）抗ホルモン作動作用の投与依存性 。Δcoll73で移入したＥＲＣ１をプレート上に置き、ある範囲のホルモン濃度に さらした。各々の点は、ＣＡＴ反応の３回のアッセイの平均である。（Ｃ）エス トロゲン応答性細胞系における抗エストロゲン活性。Δcoll73及びΔcoll60のＭ ＣＦ−７細胞及びΔcoll73へのトランスフェクション、並びにΔcoll60及びEＲ ＥΔcoll60のイシカワ（Ishikawa）細胞へのトランスフェクションに続く代表的 なＣＡＴアッセイの結果を示す。活性は３つの分離点の平均である単一の実験を 示す。 図４は、過渡的トランスフェクション（transient transfection）での抗エス トロゲン活性を示す。（Ａ）Δcoll73を、ＥＲ発現ベクターＨＥＯの量を変化さ せて、ＣＨＯ細胞に導入し（ホリンカ（Holinka，C．F.）ら、J．Steroid Bioch em.25巻:781-786頁（1986年）、本明細書に参考として組み込まれる）、親発現 ベクターＳＧ５で10μｇに標準化される。ホルモン存在下のＣＡＴ活性が測定さ れ、図３Ａに示す。（Ｂ）ホルモン活性のためのＥＲ領域の要求。ヒトＥＲｃＤ ＮＡの４つの誘導体の構造を図に示す。ＤＮＡ結合領域を、縞のボックスで示し 、リガンド結合領域をＥ２で表す。トランス活性機能TＡＦ−１及びTＡＦ−２を マークする。右側のパネルは、各々の突然変異体の存在下、Δcoll73でのホルモ ンの効果を示す。トランスフェクションは、クッシュナー （Kushner）ら、Mol ．Endocrinol．4巻:1465-1473頁（1990年）（本明細書に参考として組み込まれ る）によって記載されるように、各々のＥＲ発現ベクター300ngを含むＣＨＯ細 胞内で行われた。 好ましい態様の説明 本発明は、エストロゲンにより媒介されるさまざまなガン（例えば、胸部ガン 、卵巣ガン、子宮ガン）及び他の疾病（例えば、子宮内膜症）の処置又は予防の いずれかに所望の特性を有する大量の試験化合物をスクリーンする有効な方法を 提供する。本発明は、試験化合物の作動及び拮抗活性をスクリーニングすること ができる。さらに、本発明は、間接エストロゲン応答のみをブロックするが、古 典エストロゲン応答要素でのエストロゲン活性をブロックしない新規なタイプの 抗 エストロゲン化合物をスクリーニングする方法を提供する。 動物及びヒトにおいて、タモキシフェンのような抗エストロゲン類の剌激及び 阻害活性のバランスは、発情性活性（estrogenic activity）の指標として測定 される器官、細胞又は特定のタンパク質に依存して大きく変化する。この効果の 多様性のため、古典エストロゲン受容体要素（ＥＲＥ類）でのエストロゲン受容 体（ＥＲ）の拮抗活性のモデルと一致させるのは困難である。この点が、ビアト （Beato，M.）、Cell 56巻:335-344頁（1989年）及びクライン−ヒットパス（ Klein-Hitpass）ら、Nucleic Acids Res.16巻:647-663頁（1988年）に記載され 、これらは本明細書中に参考として含まれる。 本発明は、ＥＲがＥＲＥと結合する代わりに他の応答要素、即ちＡＰ１結合部 位と相互作用することにより転写を活性化できるということを見出したことに、 一部依存している。このＡＰ１媒介経路（本明細書で間接エストロゲン応答とい う）は、タモキシフェン及び他の推定される抗エストロゲンの作動特性の多くを 説明できる。ＡＰ１部位の総括的な記載は、エンジェル（Angel）及びカーン（K ann）、Biochem．Biophys．Acta．1072巻:129-157頁（1991年）、並びにエンジ ェル（Angel）ら、Cell 49巻:729-739頁（1987年）にあり、これらは本明細書 に参考として含まれる。 本発明の方法において、古典エストロゲン応答要素及び間接エストロゲン応答 の双方を用いて、エストロゲン拮抗及び作動活性の双方を検知するスクリーニン グ・システムを提供することができる。本方法は典型的には、ヒト・エストロゲ ン受容体を高レベルで製造する培養細胞を含有する。好ましい細胞として、クッ シュナー （Kushner）ら、Mol．Endocrinol．4巻:1465-1473頁（1990年）（本明 細書中に参考として含まれる）に記載されるＭＣＦ−７細胞又はＥＲＣ１細胞、 及びウェッブ（Webb）ら、Mol．Endocrinol．6巻:157-167頁（1993年）（本明細 書中に参考として含まれる）に記載されるＥＲＣ２及びＥＲＣ３細胞が挙げられ る。 例えば、イシカワ（Ishikawa）細胞を含む他の適当な細胞、及び当業者に知ら れているさまざまな胸部ガン細胞。本発明は、哺乳類の細胞における実施に限ら れず、例えばイースト及び昆虫細胞でも実施することができる。 細胞は変形されて、ベリー（Berry）ら、E.M.B.O．J．９巻:2811-2818頁（199 0 年）（本明細書中に参考として含まれる）に記載されるような切形（truncated ）又はキメラ・エストロゲン受容体を提供することができる。これらの変形によ り、向上したエストロゲン親和力及び向上したアッセイ感受性を結果として生じ ることができる。 さらに、これらの細胞は、応答要素（ＡＰ１部位又はＥＲＥのいずれか）がレ ポーター遺伝子の発現を調節するレポーター遺伝子で移入される（transfect） 。典型的には、２つの異なるレポーター遺伝子が用いられる。一方の遺伝子は、 古典エストロゲン応答系によって誘導される転写をレポート（report）する一方 、他方の遺伝子は、間接エストロゲン応答により誘導される転写をレポートする 。この２つのレポーター遺伝子及び応答要素は典型的には、分離した細胞内に置 かれるが、本方法は、同じ細胞内の双方の構成で用いることできる。 古典エストロゲン応答系のレポーター遺伝子は、ターゲット・プロモーターの エストロゲン応答要素（ＥＲＥ）上流を含んでおり、そのプロモーターを調節す ることができる。好ましい態様として、ＥＲＥは、アフリカツメガエル・ビテロ ゲニンＡ２遺伝子からの共通エストロゲン応答要素ＡＧＧＴＣＡＣＡＧＴＧＡＣ ＣＴであることができる。 細胞内に用いられる特定のＥＲＥは、本発明の重要な面ではなく、本発明はこ のＥＲＥの使用に限定されない。当業者に既知の他のＥＲＥ類も用いることがで きる。例えば、天然に発生するＥＲＥ類の他の供給源には、Ｂ２遺伝子、ニワト リ・オバルブミン遺伝子、及びＰＳ２遺伝子が挙げられる。また、非天然発生Ｅ ＲＥ類を、特定のプロモーターに挿入することができる。アフリカツメガエル・ ビテロゲニンＡ２遺伝子からの共通ＥＲＥは、この目的のために広く用いられる が、他のＥＲＥ類もまた用いることができる。 間接エストロゲン応答経路のためのレポーター遺伝子は、ターゲット・プロモ ーターのＡＰ１部位上流を含んでおり、そのプロモーターを調節することができ る。ＡＰ１部位は、ＡＰ１（ジュン （Jun）及びフォス（Fos）タンパク質）又 はそのタンパク質の科（family）のあるメンバーにより結合される部位である。 好ましい態様として、共通ＡＰ１部位は、ＴＧＡ（Ｃ／Ｇ）ＴＣＡである。 ある当業者は、用いられる特定のＡＰ１部位が本発明の重要な面ではないと認 識するであろう。ＡＰ１又はその科のメンバーによって結合することができ、か つプロモーターを調節することができる、いかなる配列も好適である。これは、 天然発生ＡＰ１部位を含むプロモーターを含むであろう。典型的なプロモーター として、ストロメリシン（stromelysin）、ゲラチナーゼ（gelatinase）、マト リリシン（matrilysin）、及びヒト・コラゲナーゼ遺伝子のようなメタロプロテ アーゼ遺伝子が挙げられるが、これに限定されるものではない。 また、非天然発生ＡＰ１又は関連結合部位を含むプロモーターを、構成するこ とができる。これは、ＡＰ１の制御下では典型的に見出せないレポーター遺伝子 系の発生を助長する。さらに、ＡＰ１部位の多重複製を含み、それによって感受 性を向上させるか、又はレポーター遺伝子系の応答をたぶん調節できるプロモー ターを構成することができる。 本発明は、特定のレポーター遺伝子に限定されない。容易にアッセイできる生 成物を発現するいかなる遺伝子も、本アッセイの好適な指標を提供するであろう 。好適なレポーター遺伝子は、当業者に既知である。これには、例えばバクテリ アル・クロラムフェニコール・アセチル・トランスフェラーゼ（ＣＡＴ）、ベー タ−ガラクトシダーゼ、又はルシフェラーゼ（luciferase）が挙げられる。 抗エストロゲン活性の多くの化合物をスクリーニングするために、ヒト・エス トロゲン受容体の高レベルの発現を有し、かつ応答要素及びレポーター遺伝子の いずれをも宿る細胞を、最大の半分又はそれ以下の誘導を与えるエストロゲンの 投与にさらす。各々の場合において、これは、エストロゲン受容体のレベル及び レポーター構成の特定の詳細に依存する数倍から数百倍の誘導を生じるであろう 。これは、酵素的アッセイによって定量することができるＣＡＴ遺伝子生成物の ような、レポーター遺伝子生成物の増加に反映するであろう。細胞は、マルチ− ウェル培養皿の分離したウェルで成長するか又は半固体栄養マトリクス内での比 色分析（colorometic assay）のためのエストロゲンにさらすことができる。試 験する化合物を、培養皿ウェル又は半固体マトリクスでできた小さなウェルに加 え、エストロゲン誘導における効果をアッセイする。抗エストロゲン化合物は、 レポーター遺伝子活性においてエストロゲン誘導した増加を減ずるか又は破壊す るであろう。仮定的純抗エストロゲンは、レポーター遺伝子の双方のタイプでエ スト ロゲン活性をブロックするであろうし、エストロゲン不存在下でレポーター遺伝 子を誘導する能力を有しないであろう。混合したエストロゲン拮抗薬−作動薬は 、レポーター遺伝子、特にＡＰ１部位に結合したレポーター遺伝子を誘導する能 力を示すであろう。 他の態様として、間接経路をブロックする化合物を用いて、エストロゲンによ って媒介される胸部ガン及び他の疾病の処置又は予防における、タモキシフェン 又は他の抗エストロゲンを補うことができる。これらの化合物は、抗エストロゲ ン類のエストロゲン作動活性を排除するように機能する。第２に、それらは単独 に用いることができた。特に、直接経路活性をそのままにして、間接エストロゲ ン応答要素でのあるエストロゲン媒介病理効果をブロックするのによい。間接経 路をブロックする化合物は、エストロゲン及びプロゲスチン（progestin）を含 む混合経口避妊薬（combined oral contraceptive（ＣＯＣ））として有用であ る。エストロゲン、プロゲスチン、及び遮断化合物を含む三重ＣＯＣは、配合物 又は内因性のいずれであっても、古典応答要素で活性化できるが、間接応答要素 で活性をブロックするであろう。よって、三重ＣＯＣは、妊娠を予防する最新の ＣＯＣとして機能するが、胸部ガンに対して防護効果を提供することもできる。 典型的には、ＡＰ１部位に結合したレポーター遺伝子は、エストロゲンではな く、過剰の（Kdの10倍）タモキシフェン、4-ヒドロキシタモキシフェン、又は抗 エストロゲンによって、活性化される。抗エストロゲンによりレポーター遺伝子 活性をブロックするか又は減少させる候補のために、化合物のライブラリーが調 査されている。候補はその後、古典経路のためのレポーター遺伝子を含む細胞で 試験され、ＥＲＥでのエストロゲン活性で妨げられないことを確認する。 本発明のアッセイで同定される化合物を、経口避妊薬としてガンの処置の標準 医薬組成物に用いるか、又はエストロゲン活性の転形（modulation）が必要とさ れる他の応用に用いることができる。医薬組成物は、先行技術で既知の方法を用 いて調製かつ投与することができる。医薬組成物は一般に、予防的治療法及び／ 又は治療法のための非経口、経口、又は局所（topical or local）投与を意図し ている。医薬組成物は、投与法に依存するさまざまな単位投薬形態で投与するこ とができる。例えば、経口投与に好適な単位投薬形態として、粉末、錠剤、丸剤 、 及びカプセルが挙げられる。 本発明で用いるのに好適な医薬配合物は、レミントンの薬剤学（Remington's Pharmaceutical Sciences）（マック出版社（Mack Publishing Company）、フィ ラデルフィア、PA、第17版（1985年））に見出され、これは本明細書内に参考と して含まれる。本発明の化合物及び医薬として有効な担体を含有する、さまざま な医薬組成物を調製することができる。 次の実施例は、例として提供するものであって、これに限定されない。 実施例 他のマトリクス・メタロプロテアーゼと同様に、ヒト・コラゲナーゼ遺伝子は ＡＰ１に応答する。エンジェルら、Mol．Cell．Biol．7巻:2256-2266頁（1987年 ）。ＡＰ１部位がエストロゲン応答を与えるか否かを試験するために、コラゲナ ーゼ・プロモーターをバクテリアルＣＡＴ遺伝子（Δcoll73）に融合させ、ＥＲ （ＥＲＣ１）を過発現するチャイニーズ・ハムスター卵巣細胞に移入した（クシ ュナーら、Mol．Endocrinol．4巻:1465-1473頁（1990年））。 エンジェルら、Mol．Cell．Biol．7巻:2256-2266頁（1987年）（本明細書内に 参考として含まれる）で先述されているCo1173及びCo1160は、Eco0109 及びNdel を有する消化（digestion）で変形して、ｐＵＣの直鎖におけるＡＰ１部位を除 去し、結局Δに設計した。ＥＲＥΔcoll60は、共通ＥＲＥ、ＡＧＧＴＣＡＣＡＧ ＴＧＡＣＣＴの結さつ（ligation）によりΔcoll60のＨｉｎｄIII部位上流に調 製される。ＥＲＣトランスフェクション及び電気穿孔法（electroporation）は 、クシュナーら、Mol．Endocrinol．4巻:1465-1473頁（1990年）（本明細書内に 参考として含まれる）に記載されるように行った。Ｆ９細胞トランスフェクショ ンは、カルシウム・ホスフェート共同沈降反応による。細胞を1.5cmn皿上で30％ 合流（confluence）でシードし、レポーター遺伝子５mg、アクチンＢ−ＨＣＧ１ mgで一晩移入した。 示されるように、ＡＰ１発現ベクター 100ng及びＥＲ発現ベクターＨＥ０ １ μｇが、トランスフェクション内に含まれる。クマー（Kumar）ら、Cell51巻:94 1-951頁（1987年）（本明細書内に参考として含まれる）。ヒトcfos発現ベクタ ーはＢＫ２８であった。サソネーコルシ（Sassone-Corsi）ら、Cell54巻:553-56 0頁 （1988年）（本明細書内に参考として含まれる）。ヒトc-jun 発現ベクターはRS Vc-Junであった。ターナー（Turner）及びチャン （Tjian）、Science243巻:168 9-1694頁（1989年）（本明細書内に参考として含まれる）。細胞を、グリセロー ル衝撃を与え（glycerol shocked）、再度培養し（re-fed）かつホルモン処理し た。すべてのＣＡＴアッセイは、クシュナーら、Mol．Endocrinol．4巻:1465-14 73頁（1990年）に記載されるように、ＨＣＧの製造に標準化された。データは、 ＨＣＧ単位（ＣＡＴ単位）毎に換算した、トリチウム標識アセチルＣｏＡの毎分 のカウント数で表される。 エストラジオールは、Δcoll73を10倍（図１Ａ）剌激し、一方ＡＰ１部位が除 去された同じレポーター（Δcoll60）は、減少した基礎活性を示し、かつエスト ロゲン応答がなかった。ＡＰ１部位（ＥＲＥΔcoll60）に替わる古典ＥＲＥの置 換（クライン−ヒットパス（Klein-Hitpass）ら、Nucl．Acids Res.16巻:647-66 3頁（1988年））は、エストロゲン応答を回復したが、上昇した基礎活性を回復 しなかった。 内因性ＡＰ１活性を欠くＦ９細胞（チュー（Chiu）ら、Cell54巻:541-551頁（ 1988年）（本明細書内に参考として含まれる））において、Δcoll73は、過渡的 に移入したＥＲの存在下、エストロゲンに応答しなかった（図１Ｂ）。エストロ ゲン活性は、ＡＰｌタンパク質c-Jun及びc-fosに発現ベクターを共移入する（co transfect）ことによって、回復することができる。サソネ−コルシら、Cell54 巻:553-560頁（1988年）。ターナー及びチャン、Science243 巻:1689-1694頁（1 989年）。同時に、ＥＲＥΔcoll60は、ＡＰｌ及びΔcoll60の不存在下でもエス トロゲン応答性であり、エストロゲンによって影響されずに残っていた（データ は示さず）。よって、コラゲナーゼ・プロモーターのエストロゲン誘導は、ＡＰ １部位及びＡＰ１タンパク質の双方を必要とした。 ＥＲが、生理的条件下、ＡＰ１部位を通して転写を活性化させることを確認す るために、我々は、コラゲナーゼ遺伝子の科の活性がエストロゲン応答性であり 、かつ腫瘍侵入性に関連する、ヒト胸部腫瘍細胞系、ＭＣＦ−７での研究を繰り 返した。トンプソン（Thompson）ら、Cancer Res．48巻:6764-6768頁（1988年） （本明細書に参考として含まれる）。 ＡＰ１ΔＴＫ−ＣＡＴは、ヘルペス・シンプレックス・ウィルスＴＫプロモー ター（-32〜＋45）のコラゲナーゼＡＰ１部位クローン上流からなる。ＴＫ−Ｔ ＡＴＡは、ある既知の上流転写因子結合部位を欠損している。ＡＰ１ΔＴＫ−Ｃ ＡＴは、オリゴヌクレオチド・スパニング・コラゲナーゼ配列（oligonucleotid e spanning collagenase sequence）-73〜 -52からＰＵＣ ＡＰ１部位を除去す るように変形されたＴＫ−ＣＡＴ誘導体のＨｉｎｄIII部位上流への結さつによ って、構成される。ＡＰ１ ＴＫ−ＴＡＴＡは、ＴＫ配列 -32〜 +45を含み、既 にＰＵＣ19 ＡＰ１部位を欠損したＣＡＴベクターのＨｉｎｄIII部位への同じ オリゴヌクレオチドの結さつによって、構成される。ライトマン（Leitmann，D. C.）ら、Mol．Cell．Biol.12巻:1352-1356頁（1992年）（本明細書に参考として 含まれる）。ＭＣＦ−７トランスフェクションは、クシュナーら、Mol．Endocri nol．4巻:1465-1473頁（1990年）に記載されるＥＲC細胞と同じプロトコールを 用いた。 エストロゲンは、Δcoll73活性を４倍剌激し、ＡＰ１部位の除去により、エス トロゲン応答性がなくなった。コラゲナーゼＡＰ１部位は、ヘルペス・シンプレ ックス・ウィルスＴＫプロモーター及び単離されたＴＫ ＴＡＴＡボックスにエ ストロゲン応答を与え、それらは共に、エストロゲン応答性のみであった。よっ て、ＡＰ１部位は、異種プロモーターのエストロゲン応答に必要とされるすべて であることがわかった。このタイプのエストロゲン誘導は、従来予想されていた ものよりも、より共通な経路で表すことができる。この経路は、間接エストロゲ ン応答とよばれる。 間接エストロゲン応答の抗エストロゲンの効果を、次に試験した。全ての細胞 をクシュナーら、Mol．Endocrinol．4巻:1465-1473頁（1990年）に記載されるよ うに移入した。ホリンカ （Holinka）ら、J．Steroid Biochem．25巻:781-786頁 （1990年）（本明細書に参考として含まれる）に記載されるように、イシカワ細 胞は、エストロゲン及び抗エストロゲン誘導の前に、ＰＭＡ10nM及びフォルスコ リン（forskolin）10μＭで誘導した。 タモキシフェンは、ＥＲリガンド結合領域内のエストロゲン依存転写活性機能 を妨げることにより、古典ＥＲＥ類でのエストロゲン活性を阻害する。ベリー（ Berry）ら、E.M.B.O．J．9巻:2811-2818頁（1990年）。古典ＥＲＥで部分的作 動作用を示す。これは、アミノ末端での細胞タイプ特異的構成トランス活性機能 の活性に特徴を有する。同上。ＩＣＩは、二量体化機能を阻害する（フェアウェ ル（Fawell）ら、Proc．Natl．Acad．Sci．U.S.A．87巻:6883-6887頁（1990年） ）。これは、ターゲット・プロモーター中のＥＲＥとの高い親和相互作用を予防 し、たいていのアッセイにおいて作動活性を示さない。ウェークリング（Wakeli ng，A）、J．SteroidBiochem．Molec．Biol.37巻:771-775頁（1990年）。 驚くべきことに、タモキシフェン及びＩＣＩは、ＥＲＣＩ細胞中、Δcoll73発 現を５倍剌激した（図３Ａ）。Δcoll60には影響しなかった。比較して、ＥＲＥ Δcoll60は、エストロゲンを示したが、抗エストロゲン作動作用がＡＰ１部位に 特異的であることを示す抗エストロゲン応答を示していなかった。各作動薬の投 与応答（図３Ｂ）は、ＥＲの親和性と一致した（トラ（Tora）ら、E.M.B.O．J． 8巻:1981-1986頁（1989年）（エストラジオールには１nM,，ＩＣＩ及びタモキシ フェンには10nM）。我々は、内因性ＥＲで細胞内の抗エストロゲン応答をも試験 した。ＭＣＦ７において、タモキシフェンは、Δcoll73発現を弱く剌激し、ＩＣ Ｉはほとんど効果を示さなかった（図３Ｃ）。ヒト内因性細胞系（ホリンカ （H olinka）ら、J．Steroid Biochem．25巻:781-786頁（1990年）（本明細書に参考 として含まれる））、エストロゲン、タモキシフェン及びＩＣＩは、ＡＰ１部位 −特異性２倍応答を引き出すのに同じ潜在性（potent）であったが、古典ＥＲＥ には影響を与えなかった。 ＣＨＯ細胞内のΔcoll73で過渡的に発現したＥＲ突然変異体の効果（クマー（ Kumar）ら、Cell51巻:941-951頁（1987年）、クマー及びチャンボン（Chambon） 、Cell55巻:145-155頁（1988年）（本明細書に参考として含まれる））を調べて 、どのＥＲ領域が間接応答を媒介するのかを決定した。エストロゲン及びタモキ シフェンは、コラゲナーゼ・プロモーターを活性化した（図４Ａ）。但し、双方 共に過渡的に移入されたＥＲが多量であると、有効ではなかった。ＩＣＩ誘導は 、高ＥＲ含量でより重要であった。これは、ＥＲタンパク質の半減期を減少させ ることによって、ＩＣＩがＥＲレベルを減少させる観察と一致する。ダウボォア （Dauvois）ら、Proc．Natl．Acad．Sci．U.S．A.89巻:4037-44041頁（1992年） 。 ＥＲは、２つの転写活性化機能（図４Ｂ）、アミノ末端構成（ＴＡＦ−１）、 及びカルボキシル末端エストロゲン依存（ＴＡＦ−２）を含んでいる。単離され るＴＡＦ−１（ＨＥ１５）は、ＴＡＦ−１（ＨＥ１９）減少エストロゲン応答及 び消失抗エストロゲン活性の転写及び欠失のホルモン非依存性活性化を与えるよ うである。ゆえに、ＣＨＯ細胞中のΔcoll73の抗エストロゲン活性は、ＴＡＦ− １活性を反映する。これは、タモキシフェンがＴＡＦ−２を活性化できず、かつ ＩＣＩがこの機能を活性化できないことをさらに包含する示唆（ベリーら（1990 年））と一致する。ＩＣＩ作動作用は、単量体ＥＲがこの複合体で機能すること をも包含する。フェアウェルら（1990年）。ＤＮＡ結合領域（ＨＥ１１）の欠失 では、応答がＤＮＡ結合依存ではなく、むしろＡＰ１タンパク質を通して間接的 に媒介されることを示唆するホルモン誘導を低下させなかった。 要約すると、間接エストロゲン応答は、広く活性であり、抗エストロゲン類は この経路の作動薬である。タモキシフェンの十分に記載される作動薬効果は、間 接エストロゲン応答を反映することができる。抗エストロゲン類は、ＥＲ及びＡ Ｐ１タンパク質が相互作用できる細胞内で、重要なＡＰ１調節したターゲット遺 伝子上のエストロゲン性の活性、すなわち成長及び分化した応答を有するであろ う。腫瘍進行の際のＡＰ１での変化は、特に重要であり、胸部ガンでの抗エスト ロゲン耐性のモデルと考えられている。パーカー（Parker）ら、Cancer Surveys 、14巻：“Growth Regulation by Nuclear Hormone Receptors”。コールド・ス プリング・ハーバー・ラボラトリー出版（1992年）。 明瞭かつ理解のために、上記の説明及び実施例で本発明をある程度詳細に記述 したが、添付した請求の範囲の範囲内で、ある変化及び変形ができることは明ら かである。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，Ｍ Ｃ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ， ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＭＷ，ＳＤ)，ＡＭ，ＡＴ， ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，Ｃ Ｚ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＲ， ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＮ，ＭＷ，ＮＬ，Ｎ Ｏ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＩ ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＺ，ＶＮ (72)発明者 ウェッブ ポール アメリカ合衆国 カリフォルニア州 94122 サンフランシスコ アーヴィング ストリート 21‐1300

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．(a)エストロゲン受容体を含有する細胞及びレポーター遺伝子の発現を調節 するＡＰ１部位を有するプロモーターを提供し； (b)細胞を試験化合物に接触させ； (c)レポーター遺伝子の発現を検知する工程を有する、間接エストロゲン応答 を通して転写を活性化させる試験化合物の能力をスクリーニングする方法。 ２．細胞が、ＭＣＦ−７細胞である請求項１記載の方法。 ３．細胞が、エストロゲン受容体を過発現する請求項１記載の方法。 ４．細胞が、ＥＲＣ１細胞である請求項３記載の方法。 ５．レポーター遺伝子が、ベータ−ガラクトシダーゼをコードする請求項１記載 の方法。 ６．レポーター遺伝子が、バクテリアル・クロラムフェニコール・アセチル・ト ランスフェラーゼをコードする請求項１記載の方法。 ７．プロモーターが、遺伝子工学操作してＡＰ１部位を含有させる請求項１記載 の方法。 ８．さらに、(a)エストロゲン受容体及び第２のレポーター遺伝子の発現を調節 する標準エストロゲン応答要素を含有するプロモーターを含有する第２の細胞を 提供し； (b)第２の細胞を試験化合物に接触させ； (c)第２のレポーター遺伝子の発現を検知する工程を有する、請求項１記載の 方法。 ９．応答要素が、アフリカツメガエル・ビテロゲニンＡ２遺伝子由来である請求 項８記載の方法。 10．細胞が、第２のレポーター遺伝子の発現を調節する標準エストロゲン応答要 素を含有するプロモーターをさらに含有する請求項１記載の方法。 11．応答要素が、アフリカツメガエル・ビテロゲニンＡ２遺伝子由来である請求 項10記載の方法。 12．請求項１記載の方法によって同定されるエストロゲン作動薬。 13．(a)エストロゲン受容体及びレポーター遺伝子の発現を調節するＡＰ１部位 を含有するプロモーターを含有する細胞を提供し； (b)細胞を試験化合物及び間接エストロゲン応答を媒介することが知られてい る化合物に接触させて； (c)レポーター遺伝子の発現を検知する工程を有する、間接エストロゲン応答 を通して転写を阻害する試験化合物の能力をスクリーニングする方法。 14．間接エストロゲン応答を媒介することが知られている化合物が、タモキシフ ェンである請求項13記載の方法。 15．間接エストロゲン応答を媒介することが知られている化合物が、最大濃度の 半分のエストロゲンである請求項13記載の方法。 16．細胞が、ＭＣＦ−７細胞である請求項13記載の方法。 17．細胞が、エストロゲン受容体を過発現する請求項13記載の方法。 18．細胞が、ＥＲＣ１細胞である請求項17記載の方法。 19．プロモーターが、遺伝子工学操作してＡＰ１部位を含有させる請求項13記載 の方法。 20．(a)エストロゲン受容体及び第２のレポーター遺伝子の発現を調節する標準 エストロゲン応答要素を含有するプロモーターを含有する第２の細胞を提供し； (b)第２の細胞を試験化合物に接触させ； (c)第２のレポーター遺伝子の発現を検知する工程をさらに有する、請求項13 記載の方法。 21．第２の細胞を間接エストロゲン応答を媒介することが知られている化合物に 接触させる工程をさらに有する請求項20記載の方法。 22．請求項13記載の方法によって同定される化合物。 23．エストロゲン受容体を過発現し、レポーター遺伝子の発現を調節するＡＰ１ 部位を含有するプロモーターを含有する細胞を含有する組成物。 24．細胞が、ＥＲＣ１である請求項22及び請求項23記載の組成物。