DE69930950T2

DE69930950T2 - Zinkfinger-bindungsdomänen für gnn

Info

Publication number: DE69930950T2
Application number: DE69930950T
Authority: DE
Inventors: F. Carlos Solana Beach BARBAS
Original assignee: Novartis AG; Scripps Research Institute
Current assignee: Novartis AG; Scripps Research Institute
Priority date: 1998-10-16
Filing date: 1999-10-14
Publication date: 2006-12-14
Anticipated expiration: 2019-10-15
Also published as: WO2000023464A3; US6140081A; US20050148075A1; BR9914599A; CN1896099A; ES2263290T3; ZA200102908B; AU765630B2; CA2347025C; NZ511523A; MXPA01003755A; JP2010143936A; US20060223757A1; EP1121381B1; AU1037600A; EP1121381A2; CN1330713A; US20100041028A1; WO2000023464A2; ATE509101T1

Description

Fachgebiet der Erfindung
Das Fachgebiet der vorliegenden Erfindung betrifft Zinkfinger-Proteine, die an Ziel-Nucleotide binden. Insbesondere betrifft die vorliegende Erfindung Aminosäuresequenzen innerhalb der α-helikalen Domäne von Zinkfingern, die spezifisch an Ziel-Nucleotide der Formel 5'-(GNN)-3' binden.
Stand der Technik
Im Jahr 1967 wurde das Modell entworfen, dass der primäre Mechanismus zum Steuern der Genexpression Protein-Schalter umfasst, welche in einer sequenzspezifischen Weise an die DNA binden (Ptashne, M., (1967), Nature (London) 214: 323-324). Familien von DNA-bindenden Proteinen mit vielfältigen Strukturen wurden beschreiben. Trotz der großen Vielfältigkeit in der Struktur stellt das Cys₂-His₂-Zinkfinger-Motiv das am häufigsten genutzte Nucleinsäure-bindende Motiv in Eukaryoten dar. Diese Beobachtung gilt sowohl für Hefen als auch für Menschen. Das Cys₂-His₂-Zinkfinger-Motiv, das erstmals in dem DNA- und RNA-bindenden Transkriptionsfaktor TFIIIA identifiziert wurde (Miller, J., McLachlan, A. D., und Klug, A., (1985), EMBO J. 4: 1609-1614), ist vielleicht das ideale Strukturgerüst, auf dem ein sequenzspezifisches Protein konstruiert werden könnte. Eine einzelne Zinkfinger-Domäne besteht aus etwa 30 Aminosäuren mit einer einfachen ββα-Faltung, die durch hydrophobe Wechselwirkungen und die Chelatbildung eines einzelnen Zinkions stabilisiert wird (Miller, J., McLachlan, A. D., und Klug, A., (1985), Embo J. 4: 1609-1614; Lee, M. S., Gippert, G. P., Sornan, K. V., Case, D. A., und Wright, P. E., (1989), Science 245: 635-637). Wenn die α-Helix dieser Domäne der großen Furche der DNA präsentiert wird, werden sequenzspezifische Basenkontakte möglich. Jede Zinkfinger-Domäne erkennt typischerweise drei Basenpaare einer DNA (Pavletich, N. P., und Pabo, C. O., (1991), Science (Washington, D. C., 1883-) 252: 809-817; Elrod-Erickson, M., Rould, M. A., Nekludova, L., und Pabo, C. O., (1996), Structure (London) 4: 1171-1180; Elrod-Erickson, M., Benson, T. E., und Pabo, C. O., (1998), Structure (London) 6: 451-464; Kim, C. A., und Berg, J. M., (1996), Nature Structural Biology 3: 940-945), wobei jedoch durch eine Variation in der Präsentation der Helix möglicherweise ein längerer Bereich erkannt werden kann (Pavletich, N. P., und Pabo, C. O., (1993), Science (Washington, D. C., 1883-) 261: 1701-1707; Houbaviy, H. B., Usheva, A., Shenk, T., und Burley, S. K., (1996), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93: 13577-13582; Fairall, L., Schwabe, J. W. R., Chapman, L., Finch, J. T., und Rhodes, D., (1993), Nature (London) 366: 483-487; Wuttke, D. S., Foster, M. P., Case, D. A., Gottesfeld, J. M., und Wright, P. E., (1997), J. Mol. Biol. 273: 183-206). Im Gegensatz zu den meisten Transkriptionsfaktoren, welche auf eine Dimerisierung von Proteindomänen angewiesen sind, um Protein-DNA-Kontakte auf längere DNA-Sequenzen oder Adressen auszudehnen, machen es die einfachen kovalenten Tandem-Sequenzwiederholungen der Zinkfinger-Domäne möglich, dass durch dieses Motiv längere asymmetrische DNA-Sequenzen erkannt werden können.
Wir haben kürzlich Polydactyl-Zinkfinger-Proteine beschrieben, die sechs Zinkfinger-Domänen enthalten und an 18 Basenpaare einer aneinandergrenzenden DNA-Sequenz binden (Liu, Q., Segal, D. J., Ghiara, J. B., und Barbas III, C. F., (1997), PNAS 94: 5525-5530). Die Erkennung von 18 Basenpaaren einer DNA ist ausreichen, um eine einmalige DNA-Adresse innerhalb aller bekannten Genome zu beschreiben, wobei dies eine Voraussetzung für die Verwendung von Polydactyl-Proteinen als hochspezifische Gen-Schalter ist. Tatsächlich wurde in einem Modellsystem die Kontrolle von sowohl Genaktivierung als auch Genrepression unter Verwendung dieser Polydactyl-Proteine gezeigt (Liu, Q., Segal, D. J., Ghiara, J. B., und Barbas III, C. F., (1997), PNAS 94: 5525-5530).
Da jede Zinkfinger-Domäne typischerweise an drei Basenpaare einer Sequenz bindet, ist es für ein vollständiges Erkennungsalphabet erforderlich, dass 64 Domänen charakterisiert werden. Vorliegende Informationen, welche als Anleitung zum Konstruieren dieser Domänen dienen konnten, stammten aus drei Arten von Studien: Bestimmen der Struktur (Pavletich, N. P., und Pabo, C. O., (1991), Science (Washington, D. C., 1883-) 252: 809-817; Elrod-Erickson, M., Rould, M. A., Nekludova, L., und Pabo, C. O., (1996), Structure (London) 4: 1171-1180; Elrod-Erickson, M., Benson, T. E., und Pabo, C. O., (1998), Structure (London) 6: 451-464; Kim, C. A., und Berg, J. M., (1996), Nature Structural Biology 3: 940-945; Pavletich, N. P., und Pabo, C. O., (1993), Science (Washington, D. C., 1883-) 261: 1701-1707; Houbaviy, H. B., Usheva, A., Shenk, T., und Burley, S. K., (1996), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93: 13577-13582; Fairall, L., Schwabe, J. W. R., Chapman, L., Finch, J. T., und Rhodes, D., (1993), Nature (London) 366: 483-487.11; Wuttke, D. S., Foster, M. P., Case, D. A., Gottesfeld, J. M., und Wright, P. E., (1997), J. Mol. Biol. 273: 183-206; Nolte, R. T., Conlin, R. M., Harrison, S. C., und Brown, R. S.,(1998), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95: 2938-2943; Narayan, V. A., Kriwacki, R. W., und Caradonna, J. P., (1997), J. Biol. Chem. 272: 7801-7809); positionsgerichtete Mutagenese (Isalan, M., Choo, Y., und Klug, A., (1997), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94: 5617-5621; Nardelli, J., Gibson, T. J., Vesque, C., und Charnay, P., (1991), Nature 349: 175-178; Nardelli, J., Gibson, T., und Chamay, P., (1992), Nucleic Acids Res. 20: 4137-4144; Taylor, W. E., Suruki, H. K., und Lin, A. H. T., Naraghi-Arani, P., Igarashi, R. Y., Younessian, M., Katkus, P., und Vo, N. V., (1995), Biochemistry 34: 3222-3230; Desjarlais, J. R., und Berg, J. M., (1992), Proteins: Struct., Funct., Genet. 12: 101-104; Desjarlais, J. R., und Berg, J. M., (1992), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 7345-7349); und Phagendisplay-Selektionen (Choo, Y., und Klug, A., (1994), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91: 11163-11167; Greisman, H. A., und Pabo, C. O., (1997), Science (Washington, D. C.) 275: 657-661.23; Rebar, E. J., und Pabo, C. O., (1994), Science (Washington, D. C., 1883-) 263: 671-673; Jamieson, A. C., Kim, S.-H., und Wells, J. A., (1994), Biochemistry 33: 5689-5695; Jamieson, A. C., Wang, H., und Kim, S.-H., (1996), PNAS 93: 12834-12839; Isalan, M., Klug, A., und Choo, Y., (1998), Biochemistry 37: 12026-12033; Wu, H., Yang, W.-P., und Barbas III, C. F., (1995), PNAS 92: 344-348). Alle haben entscheidend zur Aufklärung der Zinkfinger/DNA-Erkennung beigetragen, jedoch hat jedes Verfahren seine Grenzen. Anhand solcher Studien bzgl. der Struktur wurde ein vielfältiges Spektrum von Protein/DNA-Wechselwirkungen identifiziert, es konnte jedoch nicht geklärt werden, ob andere Wechselwirkungen möglicherweise optimaler sind. Weiterhin werden zwar Wechselwirkungen festgestellt, die eine sequenzspezifische Erkennung möglich machen, jedoch werden nur wenige Informationen darüber bereitgestellt, wie verhindert wird, dass andere Sequenzen gebunden werden. Diese Fragen wurden teilweise durch die Mutagenese von existierenden Proteinen untersucht, wobei jedoch die Ergebnisse immer durch die Zahl von Mutanten eingeschränkt sind, die charakterisiert werden können. Durch Phagendisplay und Selektion von randomisierten Banken können bestimmte zahlenmäßige Einschränkungen überwunden werden, es ist jedoch schwierig, den geeigneten selektiven Druck bereitzustellen, der sicherstellt, dass die Selektion sowohl durch die Spezifität als auch durch die Affinität gesteuert wird. Experimentelle Studien aus verschiedenen Laboratorien (Choo, Y., und Klug, A., (1994), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91: 11163-11167; Greisman, H. A., und Pabo, C. O., (1997), Science (Washington, D. C.) 275: 657-661; Rebar, E. J., und Pabo, C. O., (1994), Science (Washington, D. C., 1883-) 263: 671-673; Jamieson, A. C., Kim, S.-H., und Wells, J. A., (1994), Biochemistry 33: 5689-5695.25; Jamieson, A. C., Wang, H., und Kim, S.-H., (1996), PNAS 93: 12834-12839; Isalan, M., Klug, A., und Choo, Y., (1998), Biochemistry 37: 12026-12033), umfassend unsere eigenen Untersuchungen (Wu, H., Yang, W.-P., und Barbas III, C. F., (1995), PNAS 92: 344-348), haben gezeigt, dass es möglich ist, einige wenige Mitglieder dieses Erkennungsalphabets zu entwerfen oder zu selektieren. Jedoch wurden Spezifität und Affinität dieser Domänen für ihre Ziel-DNA in diesen früheren Studien selten in einer exakten und systematischen Art und Weise untersucht.
Seit Jacob und Monod die chemische Natur des Repressors hinterfragt und ein Schema vorgeschlagen haben, durch welches die Synthese von einzelnen Proteinen innerhalb einer Zelle hervorgerufen oder unterdrückt werden könnte, war es eine große Herausforderung, die Genexpression experimentell spezifisch kontrollieren zu können (Jacob, F., und Monod, J., (1961), J. Mol. Biol. 3: 318-356). Nun ist allgemein anerkannt, dass Genome auf der Transkriptionsebene hauptsächlich durch die Wirkung von Proteinen reguliert werden, die als Transkriptionsfaktoren bekannt sind, welche an die DNA in einer sequenzspezifischen Weise binden. Diese Proteinfaktoren wirken häufig in einer komplexen kombinatorischen Art und Weise, wodurch eine zeitliche, räumliche und auf die Umgebung reagierende Kontrolle der Genexpression möglich wird (Ptashne, M., (1997), Nature Medicine 3: 1069-1072). Häufig wirken Transkriptionsfaktoren sowohl durch eine DNA-bindende Domäne, welche das Protein auf eine spezifische Stelle innerhalb des Genoms lokalisiert, als auch durch zusätzliche Effektordomänen, die wirken, indem sie die Transkription an dieser Stelle oder in der Nähe davon hervorrufen (aktivieren) oder unterdrücken (Cowell, I. G., (1994), Trends Biochem. Sci. 19: 38-42). Effektordomänen, z.B. die Aktivierungsdomäne VP16 (Sadowski, I., Ma., J., Triezenberg, S., und Ptashne, M., (1988), Nature 335: 563-564) und die Repressionsdomäne KRAB (Margolin, J. F., Friedman, J. R., Meyer, W., K.-H., Vissing, H., Thiesen, H.-J., und Rauscher III, F. J., (1994), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91: 4509-4513), liegen typischerweise bausteinartig vor und behalten ihre Aktivität bei, wenn sie an andere DNA-bindende Proteine fusioniert werden. Während Gene einfach kontrolliert werden könnten, indem Transkriptionsfaktoren zu bestimmten Stellen innerhalb eines Genoms gesteuert werden, war es eine enorme Herausforderung, DNA-bindende Proteine zu entwerfen, die möglicherweise so maßgeschneidert werden könnten, dass sie an jede beliebige bestimmte Sequenz binden.
Die vorliegende Offenbarung beruht auf der Aufklärung der strukturellen Merkmale, die ausschließlich bei der Cys₂-His₂-Klasse von Nucleinsäure-bindenden Zinkfinger-Proteinen vorliegen. Die Cys₂-His₂-Zinkfinger-Domäne besteht aus einer einfachen ββα-Faltung mit einer Länge von etwa 30 Aminosäuren. Die strukturelle Stabilität dieser Faltung wird durch hydrophobe Wechselwirkungen und durch Chelatbildung eines einzelnen Zinkions durch die konservierten Cys₂-His₂-Reste erreicht (Lee, M. S., Gippert, G. P., Soman, K. V., Case, D. A., und Wright, P. E., (1989), Science 245: 635-637). Die Nucleinsäure-Erkennung erfolgt durch spezifische Aminosäuren-Seitenketten-Kontakte, die durch die α-Helix der Domäne zustande kommen, die typischerweise an drei Basenpaare einer DNA-Sequenz bindet (Pavletich, N. P., und Pabo, C. O., (1991), Science 252: 809-817; Elrod-Erickson, M., Rould, M. A., Nekludova, L., und Pabo, C. O., (1996), Structure 4: 1171-1180). Anders als bei anderen Nucleinsäure-Erkennungsmotiven macht eine einfache kovalente Bindung von mehreren Zinkfinger- Domänen die Erkennung von längeren asymmetrischen DNA-Sequenzen möglich. Untersuchungen von natürlichen Zinkfinger-Proteinen haben gezeigt, dass drei Zinkfinger-Domänen an 9 bp einer aneinandergrenzenden DNA-Sequenz binden können (Pavletich, N. P., und Pabo, C. O., (1991), Science 252: 809-817; Swirnoff, A. H., und Milbrandt, J., (1995), Mol. Cell. Biol. 15: 2275-2287). Während die Erkennung von 9 bp einer Sequenz nicht einmal ausreichend ist, um eine einmalige Stelle innerhalb des kleinen Genoms von E. coli zu spezifizieren, können Polydactyl-Proteine, die sechs Zinkfinger-Domänen enthalten, spezifisch 18 bp erkennen (Liu, Q., Segal, D. J., Ghiara, J. B., und Barbas III, C. F., (1997), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94: 5525-5530). Im Hinblick auf die Entwicklung eines universellen Systems für die Kontrolle von Genen kann eine 18-bp-Adresse ausreichend sein, um eine einzelne Stelle innerhalb aller bekannten Genome zu spezifizieren. Obwohl Polydactyl-Proteine dieses Typs in der Natur unbekannt sind, wurde kürzlich ihre Wirksamkeit in der Aktivierung und Repression von Genen innerhalb von lebenden menschlichen Zellen gezeigt (Liu, Q., Segal, D. J., Ghiara, J. B., und Barbas III, C. F., (1997), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94: 5525-5530).
Kurze Zusammenfassung der Erfindung
In einem Aspekt stellt die vorliegende Erfindung ein isoliertes und gereinigtes Nucleotid-bindendes Zinkfinger-Polypeptid bereit, das mindestens eine Nucleotid-bindende Region enthält, wobei die Sequenz der bindenden Region eine von SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 59, SEQ ID NO: 60 oder SEQ ID NO: 77 ist. In einem damit zusammenhängenden Aspekt stellt die Erfindung weiterhin Zusammensetzungen bereit, die zwei bis zwölf solche Nucleotid-bindende Zinkfinger-Polypeptide mit einer Sequenz von SEQ ID NO: 1 bis 110 umfassen, wobei mindestens eines der Polypeptide eines von SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 59, SEQ ID NO: 60 oder SEQ ID NO: 77 ist. Die Zusammensetzung enthält vorzugsweise zwei bis sechs Polypeptide. In einer bevorzugten Ausführungsform sind die Nucleotid-bindenden Zinkfinger-Polypeptide funktionell verbunden, vorzugsweise durch einen Aminosäure-Linker der SEQ ID NO: 111. Eine Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung bindet spezifisch an ein Nucleotid-Ziel, welches die Sequenzen 5'-(GNN)_n-3' enthält, wobei jedes N ein A, C, G oder T darstellt, mit der Maßgabe, dass nicht alle Ns ein C sein können, und wobei n vorzugsweise 2 bis 6 ist. Ein Polypeptid oder eine Zusammensetzung kann weiterhin mit einem oder mehreren Transkriptions-Modulationsfaktoren funktionell verbunden sein, z.B. Transkriptions-Aktivatoren oder Transkriptions-Suppressoren oder Repressoren. Außerdem stellt die vorliegende Erfindung ein isoliertes und gereinigtes Polynucleotid, das ein Polypeptid oder eine Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung codiert, und einen Expressionsvektor bereit, der ein solches Polynucleotid enthält.
In einem weiteren Aspekt stellt die vorliegende Erfindung die Verwendung einer Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung zum Herstellen eines Medikaments zum Regulieren der Funktion einer Nucleotidsequenz bereit, welche die Sequenz 5'-(GNN)_n-3' enthält, wobei n eine Zahl von 1 bis 6 ist. Die Zusammensetzung kann mit einem oder mehreren Transkriptions-Modulationsfaktoren funktionell verbunden sein. Die Sequenz 5'-(GNN)_n-3' kann in der transkribierten Region oder Promotorregion der Nucleotidsequenz oder innerhalb eines exprimierten Sequenzabschnitts (EST) liegen.
Die vorliegende Offenbarung zeigt die Einfachheit und Wirksamkeit einer allgemeinen Strategie für eine schnelle Produktion von Gen-Schaltern. Anhand einer Familie von definierten Zinkfinger-Domänen, welche Sequenzen der 5'-GNN-3'-Untergruppe eines aus 64 Mitgliedern bestehenden Zinkfinger-Alphabets erkennen, wurden Polydactyl-Proteine konstruiert und charakterisiert, die spezifisch neue 9- oder erstmalig 18-bp-Sequenzen erkennen. Wirksame Transkriptionsfaktoren wurden erzeugt, und es wurde gezeigt, dass sie sowohl eine Genaktivierung als auch eine Genrepression steuern. Die Genaktivierung wurde unter Verwendung der Aktivierungsdomäne VP16 des Herpes-simplex-Virus (Sadowski, I., Ma., J., Triezenberg, S., und Ptashne, M., (1988), Nature 335: 563-564) und einer rekombinanten tetrameren Sequenzwiederholung der minimalen Aktivierungsdomäne davon erreicht. Die Repression oder das Abschalten von Genen wurde unter Verwendung von drei Effektordomänen menschlichen Ursprungs erreicht, der Krüppel-assoziierten Box (KRAB) (Margolin, J. F., Friedman, J. R., Meyer, W., K.-H., Vissing, H., Thiesen, H.-J., und Rauscher III, F. J., (1994). Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91: 4509-4513), der ERF-Repressor-Domäne (ERD) (Sgouras, D. N., Athanasiou, M. A., Beal, G. J., Jr., Fisher, R. J., Blair, D. G., und Mavrothalassitis, G. J., (1995), EMBO J. 14: 4781-4793) und der mSIN3-Interaktions-Domäne (SID) (Ayer, D. E., Laherty, C. D., Lawrence, Q. A., Armstrong, A. P., und Eisenman, R. N., (1996), Mol. Cell. Biol. 16: 5772-5781). Unter Verwendung von Luciferase-Reportergen-Tests an menschlichen Epithelzellen wurde gezeigt, dass künstliche Transkriptions-Regulatoren, die so entworfen sind, dass sie zielgerichtet auf den Promotor des Proto-Onkogens erbB-2/HER-2 hinsteuern, die Genexpression in einer spezifischen Weise verhindern oder aktivieren können. Erstmalig wurde eine Genaktivierung oder Genrepression erreicht, indem eine Stelle innerhalb des Gentranskripts zielgerichtet angesteuert wird, dies legt nahe, dass die aus exprimierten Sequenzabschnitten (ESTs) erhalten Informationen möglicherweise für die Konstruktion von Gen-Schaltern ausreichend sein können. Die hier beschriebenen neuen Verfahren und Stoffe bieten vielversprechende Perspektiven für vielfältige Anwendungen in der Gentherapie, bei transgenen Organismen, in der funktionellen Genomanalyse und anderen Fachgebieten der Zell- und Molekularbiologie.
Kurze Beschreibung der Zeichnung
In der Zeichnung, welche einen Teil der Beschreibung darstellt, zeigt 1 (dargestellt in sechs Abbildungen) die Bindungsspezifität von Regionen von Nucleotid-bindenden Zinkfinger-Polypeptiden der Erfindung.
Genaue Beschreibung der Erfindung
I. Die Erfindung
Die vorliegende Erfindung stellt Nucleotid-bindende Zinkfinger-Polypeptide, Zusammensetzungen, die ein solches oder mehrere solche Polypeptide enthalten, und die Verwendung der Polypeptide und Zusammensetzungen zum Modulieren der Genexpression bereit.
II. Verbindungen
Eine Verbindung der vorliegenden Erfindung ist ein isoliertes Nucleotid-bindendes Zinkfinger-Polypeptid, das an eine GNN-Nucleotidsequenz bindet und die Funktion dieser Nucleotidsequenz moduliert. Das Polypeptid kann die Transkription eines Gens steigern oder unterdrücken und kann an DNA oder RNA binden. Ein Nucleotid-bindendes Zinkfinger-Polypeptid bezieht sich auf ein Polypeptid, das eine derivatisierte Form eines Wildtyp-Zinkfinger-Proteins ist oder das ein durch Rekombination hergestelltes Protein ist. Ein Polypeptid kann ein Hybrid sein, das z.B. Zinkfinger-Domäne(n) aus dem einen Protein enthält, die an Zinkfinger-Domäne(n) eines zweiten Proteins gebunden ist (sind). Die Domänen können in Wildtyp-Form oder in mutagenisierter Form vorliegen. Ein Polypeptid umfasst eine verkürzte Form eines Wildtyp-Zinkfinger-Proteins. Beispiele von Zinkfinger-Proteinen, aus denen ein Polypeptid hergestellt werden kann, umfassen TFIIIA und Zif268.
Ein Nucleotid-bindendes Zinkfinger-Polypeptid der vorliegenden Erfindung umfasst ein einmaliges Heptamer (aneinandergrenzende Sequenz von sieben Aminosäureresten) innerhalb der α-helikalen Domäne des Polypeptids, wobei die heptamere Struktur die Bindungsspezifität für ein Ziel-Nucleotid bestimmt. Diese heptamere Sequenz kann irgendwo innerhalb der α-helikalen Domäne liegen, jedoch erstreckt sich das Heptamer vorzugsweise von Position –1 bis zu Position 6, wobei die Reste in der nach dem Stand der Technik üblichen Weise numeriert sind. Ein Polypeptid der vorliegenden Erfindung kann beliebige β-Faltblatt- und Gerüstsequenzen umfassen, von denen auf dem Fachgebiet bekannt ist, dass sie als Teil eines Zinkfinger-Proteins fungieren. Eine große Zahl von Nucleotid-bindenden Zinkfinger-Polypeptiden wurde hergestellt und auf Bindungsspezifität gegenüber Ziel-Nucleotiden, die ein GNN-Triplett enthielten, getestet. Die Ergebnisse dieser Studien sind in 1 zusammengefasst. In 1 ist die GNN-Triplett-Bindungsspezifität für jedes Peptid in der rechten Spalte angegeben, wobei die höchste Spezifität zuerst dargestellt und in fetter Schrift geschrieben ist. In 1 sind die SEQ ID NOs: in Klammern angegeben. Für jedes bestimmte GNN- Ziel (z.B. GAA, angegeben in der rechten Spalte von 1) sind die Sequenzen in der Reihenfolge der abnehmenden Spezifität für dieses Triplett aufgelistet.
Wie in 1 dargestellt zeigen die Ergebnisse eine deutliche Konservierung aller drei primären DNA-Kontaktpositionen (–1, 3 und 6), dies wurde praktisch für alle Clone eines bestimmten Ziels festgestellt. Zwar wurden viele dieser Reste schon früher nach den Selektionen mit sehr viel weniger vollständigen Banken an diesen Positionen gefunden, jedoch zeigt das Ausmaß der hier festgestellten Konservierung eine dramatische Verbesserung gegenüber früheren Studien (Choo, Y., und Klug, A., (1994), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91: 11163-11167; Greisman, H. A., und Pabo, C. O., (1997), Science (Washington, D. C.) 275: 657-661; Rebar, E. J., und Pabo, C. O., (1994), Science (Washington, D. C., 1883-) 263: 671-673; Jamieson, A. C., Kim, S.-H., und Wells, J. A., (1994), Biochemistry 33: 5689-5695; Jamieson, A. C., Wang, H., und Kim, S.-H., (1996), PNAS 93: 12834-12839; Wu, H., Yang, W.-P., und Barbas III, C. F., (1995), PNAS 92: 344-348). Die vorliegende Erfindung macht deutlich, dass die Angaben nach dem bisherigen Stand der Technik, dass die drei helikalen Positionen –1, 3 und 6 einer Zinkfinger-Domäne ausreichend sind, um eine genaue Beschreibung der DNA-bindenden Spezifität möglich zu machen, nicht korrekt sind.
Typischerweise haben Phagenselektionen lediglich in einer oder zwei dieser Positionen eine Consensus-Selektion gezeigt. Die größte Sequenzvariation trat an den Resten in den Positionen 1 und 5 auf, die in der Zif268/DNA-Struktur keine Basenkontakte machen und von denen man erwartete, dass sie nicht signifikant zur Erkennung beitragen (Pavletich, N. P., und Pabo, C. O., (1991), Science (Washington, D. C., 1883-) 252: 809-817; Elrod-Erickson, M., Rould, M. A., Nekludova, L., und Pabo, C. O., (1996), Structure (London) 4: 1171-1180). Außerdem wies die Variation in den Positionen 1 und 5 drauf hin, dass die Konservierung in den anderen Positionen auf ihrer Wechselwirkung mit der DNA beruhte und nicht einfach die zufällige Amplifikation eines einzelnen Clons infolge anderer Gründe war. Außerdem wurde eine Konservierung der Identität des Rests an Position 2 festgestellt. Die Konservierung von Position –2 ist in gewisser Weise ein Artefakt; die NNK-Bank enthielt diesen Rest gleichbleibend als Serin. Dieser Rest macht in der Zif268-Struktur die Kontakte mit dem DNA-Grundgerüst. Beide Banken enthielten ein unveränderliches Leucin an Position 4, wobei es sich um einen kritischen Rest im hydrophoben Kern handelt, welcher die Faltung dieser Domäne stabilisiert.
Eine eindrucksvolle Aminosäurekonservierung wurde für die Erkennung des gleichen Nucleotids in unterschiedlichen Zielen festgestellt. Z.B. wurde Asn in Position 3 (Asn3) praktisch immer selektiert, um Adenin in der mittleren Position zu erkennen, ob im Zusammenhang mit GAG, GAA, GAT oder GAC. Gln-1 und Arg-1 wurden immer selektiert, um Adenin bzw. Guanin in der 3'-Position zu erkennen, und zwar unabhängig vom Zusammenhang. Eine Amidseitenkette-basierte Erkennung von Adenin durch Gln oder Asn ist in Strukturstudien gut dokumentiert, wie dies auch bei dem Arg-Guanidinium-Seitenkette-zu-Guanin-Kontakt mit einem 3'- oder 5'-Guanin der Fall ist (Elrod-Erickson, M., Benson, T. E., und Pabo, C. O., (1998), Structure (London) 6: 451-464; Kim, C. A., und Berg, J. M., (1996), Nature Structural Biology 3: 940-945; Fairall, L., Schwabe, J. W. R., Chapman, L., Finch, J. T., und Rhodes, D., (1993), Nature (London) 366: 483-487). Häufiger jedoch wurden zwei oder drei Aminosäuren für die Nucleotiderkennung selektiert. His3 oder Lys3 (und in einem geringeren Ausmaß Gly3) wurden für die Erkennung eines mittleren Guanins selektiert. Ser3 und Ala3 wurden selektiert, um ein mittleres Thymin zu erkennen. Thr3, Asp3 und Glu3 wurden selektiert, um ein mittleres Cytosin zu erkennen. Asp und Glu wurden auch in Position –1 selektiert, um ein 3'-Cytosin zu erkennen, während Thr-1 und Ser-1 selektiert wurden, um ein 3'-Thymin zu erkennen.
Selektierte Zif268-Varianten wurden in einen bakteriellen Expressionsvektor subcloniert und die Proteine überexprimiert (Finger-2-Proteine, nachstehend durch die Untereinheit („subsite") bezeichnet, für die sie isoliert („panned") worden waren). Man sollte eher lösliche Proteine untersuchen als Fusionen mit Phagen, da bekannt ist, dass die beiden sich in ihren Bindungseigenschaften möglicherweise signifikant unterscheiden (Crameri, A., Cwiria, S., und Stemmer, W. P., (1996), Nat. Med. 2: 100-102). Die Proteine wurden auf ihre Fähigkeit getestet, jede der 16 5'-GNN-3'-Finger-2-Untereinheiten zu erkennen, wobei ein Mehr-Ziel-ELISA-Test verwendet wurde. Dieser Test stellte einen extrem rigorosen Test auf Spezifität bereit, da immer sechs „unspezifische" Stellen vorlagen, die sich von der „spezifischen" Stelle nur durch ein einzelnes Nucleotid aus einem Neun-Nucleotid-Ziel unterschieden. Zahlreiche der Phagen-selektierten Finger-2-Proteine zeigten eine außerordentlich gute Spezifität, während andere ein variierendes Ausmaß an Kreuzreaktivität aufwiesen. Einige Polypeptide banden besser an Untereinheiten, die sich von denjenigen unterschieden, für die sie selektiert worden waren.
Versuche zum Verbessern der Bindungsspezifität wurden unternommen, indem die Erkennungshelix anhand von positionsgerichteter Mutagenese modifiziert wurde. Die Ergebnisse aus unseren Selektionen und die Strukturinformationen dienten als Anleitung zum Entwerfen von Mutanten. In der umfassendsten Studie, die bisher durchgeführt wurde, wurden über 100 mutierte Proteine charakterisiert, wobei versucht wurde, die Regeln der Erkennung noch weiter aufzuklären. Obwohl man nicht erwartet hat, dass die Helixpositionen 1 und 5 eine direkte Rolle in der DNA-Erkennung spielen, waren bei den besten Verbesserungen der Spezifität immer Modifikationen in diesen Positionen enthalten. Für diese Reste wurde festgestellt, dass sie Kontakte mit dem Phosphat-Grundgerüst herstellen, welche zur Affinität in einer nicht-sequenzspezifischen Weise beitragen. Wenn man unspezifische Kontakte entfernt, wird dadurch die Wichtig keit der spezifischen Kontakte für die gesamte Stabilität des Komplexes gesteigert, wodurch die Spezifität erhöht wird. Z.B. wurden die Spezifität von Polypeptiden für die Ziel-Tripletts GAC, GAA und GAG verbessert, indem einfach atypische, geladene Reste in den Positionen 1 und 5 durch kleinere, ungeladene Reste ersetzt wurden.
Eine weitere Klasse von Modifikationen umfasste Änderungen bei sowohl bindenden als auch nicht-bindenden Resten. Die Kreuzreaktivität von Polypeptiden für GGG und die Finger-2-Untereinheit GAG wurde durch die Modifikationen His3Lys und Thr5Val aufgehoben. Es ist interessant anzumerken, dass His3 während des „Panning"-Isolierverfahrens zum Erkennen des mittleren Guanin eindeutig selektiert wurde, obwohl Lys3 eine bessere Unterscheidung von A und G bereitstellte. Dies legt nahe, dass die Panning-Bedingungen für dieses Protein möglicherweise die Selektion durch einen Parameter, z.B. die Affinität, gegenüber der Spezifität begünstigt haben. In der Zif268-Struktur bildet His3 eine Wasserstoffbindung mit dem N7 des mittleren Guanin (Pavletich, N. P., und Pabo, C. O., (1991), Science (Washington, D. C., 1883-) 252: 809-817; Elrod-Erickson, M., Rould, M. A., Nekludova, L., und Pabo, C. O., (1996), Structure (London) 4: 1171-1180). Diese Bindung könnte auch mit dem N7 von Adenin erfolgen, und tatsächlich unterscheidet Zif268 nicht zwischen G und A in dieser Position (Swirnoff, A. H., und Milbrandt, J., (1995), Mol. Cell. Biol. 15: 2275-2287). Es wurde gefunden, dass His3 nur in solchen Polypeptiden für ein mittleres Guanin spezifisch war, die auf GGA, GGC und GGT zielten, auch wenn Lys3 während des Panning für GGC und GGT selektiert wurde. Genauso wurden die mehrfachen Kreuzreaktivitäten von Polypeptiden, die auf GTG zielten, durch die Modifikationen Lys1Ser und Ser3Glu abgeschwächt, was zu einem fünffachen Verlust an Affinität führte. Für Glu3 wurde in Bindungsstellen-Selektionsstudien von Zif268 gezeigt, dass es sehr spezifisch für Cytosin ist (Swirnoff, A. H., und Milbrandt, J., (1995), Mol. Cell. Biol. 15: 2275-2287). In keinen Strukturstudien wurde eine Wechselwirkung von Glu3 mit dem mittleren Thymin gezeigt, und Glu 3 wurde in unseren Studien und in anderen Untersuchungen nie zum Erkennen eines mittleren Thymin selektiert (Choo, Y., und Klug, A., (1994), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91: 11163-11167; Greisman, H. A., und Pabo, C. O., (1997), Science (Washington, D. C.) 275: 657-661; Rebar, E. J., und Pabo, C. O., (1994), Science (Washington, D. C., 1883-) 263: 671-673; Jamieson, A. C., Kim, S.-H., und Wells, J. A., (1994), Biochemistry 33: 5689-5695; Jamieson, A. C., Wang, H., und Kim, S.-H., (1996), PNAS 93: 12834-12839; Isalan, M., Klug, A., und Choo, Y., (1998), Biochemistry 37: 12026-12033; Wu, H., Yang, W.-P., und Barbas III, C. F., (1995), PNAS 92: 344-348). Trotzdem begünstigt die Modifikation Ser3Glu die Erkennung eines mittleren Thymin gegenüber Cytosin. Diese Beispiele sollen auf die Einschränkungen hinweisen, die vorliegen, wenn man sich auf früheren Strukturen und Selektionsdaten bezieht, um die Strukturelemente aufzuklären, die der Spezifität zugrunde liegen. Außerdem sollte betont werden, dass Verbesserungen durch Modifikationen, welche die Positionen 1 und 5 umfassen, durch bereits vorliegende „Erkennungscodes" nicht hätten vorausgesagt werden können (Desjarlais, J. R., und Berg, J. M., (1992), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 7345-7349; Suzuki, M., Gerstein, M., und Yagi, M., (1994), Nucleic Acids Res. 22: 3397-3405; Choo, Y., und Klug, A., (1994), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91: 11168-11172; Choo, Y., und Klug, A., (1997), Curr. Opin. Struct. Biol.7: 117-125), die typischerweise lediglich die Positionen –1, 2, 3 und 6 betrachten. Nur durch die Kombination von Selektion und positionsgerichteter Mutagenese können wir damit beginnen, die Kompliziertheit der Zinkfinger/DNA-Erkennung vollständig zu verstehen.
Aus den kombinierten Selektions- und Mutagenese-Daten ging hervor, dass die spezifische Erkennung zahlreicher Nucleotide am besten unter Verwendung von Motiven und nicht einer einzelnen Aminosäure erreicht werden kann. Z.B. wurde die beste Spezifikation eines 3'-Guanin unter Verwendung der Kombination von Arg-1, Ser1 und Asp2 (des RSD-Motivs) erreicht. Unter Verwendung von Val5 und Arg6, um ein 5'-Guanin zu spezifizieren, konnte die Erkennung der Untereinheiten GGG, GAG, GTG und GCG erreicht werden, indem eine herkömmliche Helixstruktur verwendet wurde (SRSD-X-LVR), die sich nur im Rest der Position 3 unterschied (Lys3 für GGG, Asn3 für GAG, Glu3 für GTG und Asp3 für GCG). Genauso wurde 3'-Thymin spezifiziert, wobei Thr-1, Ser1 und Gly2 (das TSG-Motiv) in den endgültigen Clonen verwendet wurden. Weiterhin konnte ein 3'-Cytosin spezifiziert werden, indem Asp-1, Pro1 und Gly2 (das DPG-Motiv) verwendet wurden, außer wenn die Untereinheit GCC war; Pro1 wurde von dieser Untereinheit nicht toleriert. Die Spezifikation eines 3'-Adenin erfolgte in zwei Clonen mit Gln-1, Ser1 und Ser2 (QSS-Motiv). Die Reste der Positionen 1 und 2 der Motive wurden für jede der 3'-Basen analysiert, wobei gefunden wurde, dass eine optimale Spezifität für eine bestimmte 3'-Base wie hier beschrieben bereitgestellt wurde.
Der Mehr-Ziel-ELISA-Test legte nahe, dass alle Proteine Guanin in der 5'-Position bevorzugten, da alle Proteine Arg6 enthielten und dieser Rest aus Strukturstudien dafür bekannt ist, dass er mit einem in dieser Position stehenden Guanin in Kontakt tritt (Pavletich, N. P., und Pabo, C. O., (1991), Science (Washington, D. C., 1883-) 252: 809-817; Elrod-Erickson, M., Rould, M. A., Nekludova, L., und Pabo, C. O., (1996), Structure (London) 4: 1171-1180; Elrod-Erickson, M., Benson, T. E., und Pabo, C. O., (1998), Structure (London) 6: 451-464; Kim, C. A., und Berg, J. M., (1996), Nature Structural Biology 3: 940-945; Pavletich, N. P., und Pabo, C. O., (1993), Science (Washington, D. C., 1883-) 261: 1701-1707; Houbaviy, H. B., Usheva, A., Shenk, T., und Burley, S. K., (1996), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93: 13577-13582; Fairall, L., Schwabe, J. W. R., Chapman, L., Finch, J. T., und Rhodes, D., (1993), Nature (London) 366: 483-487; Wuttke, D. S., Foster, M. P., Case, D. A., Gottesfeld, J. M., und Wright, P. E., (1997), J. Mol. Biol. 273: 183-206; Nolte, R. T., Conlin, R. M., Harrison, S. C., und Brown, R. S.,(1998), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95: 2938-2943). Diese Wechselwirkung wurde hier gezeigt, indem der 5'-Bindungsstellen-Signatur-Test verwendet wurde ((Choo, Y., und Klug, A., (1994), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91: 11168-11172); 2 weiße Balken). Jedes Protein wurde an Pools von 16 Oligonucleotid-Zielen getestet, in denen das 5'-Nucleotid der Finger-2-Untereinheit als G, A, T oder C feststehend vorlag und das mittlere und das 3'-Nucleotid randomisiert waren. Alle Proteine bevorzugten den GNN-Pool, wobei im Wesentlichen keine Kreuzreaktivität vorlag.
Die Ergebnisse des Mehr-Ziel-ELISA-Tests wurden durch Affinitätsstudien von gereinigten Proteinen bestätigt. In den Fällen, in denen die Kreuzreaktivität im ELISA-Test minimal war, führte ein einzelnes, nicht passendes Nucleotid typischerweise zu einem mehr als 100-fachen Verlust an Affinität. Dieses Ausmaß an Spezifität musste mit Zinkfinger-Proteinen erst noch gezeigt werden. Im Allgemeinen hatten diejenigen Proteine die höchste Affinität, die ausgewählt oder entworfen worden waren, um an Untereinheiten mit G oder A in der mittleren und in der 3'-Position zu binden, gefolgt von denjenigen, die nur ein einziges G oder A in der mittleren oder in der 3'-Position aufwiesen, gefolgt von denjenigen, die nur T oder C enthielten. Die erstere Gruppe band typischerweise an ihre Ziele mit einer höheren Affinität als Zif268 (10 nM), die letztere mit einer etwas niedrigeren Affinität, und fast alle Proteine hatten eine Affinität, die niedriger war als diejenige des parentalen C7-Proteins. Es gab keine Korrelation zwischen der Bindungsaffinität und der Bindungsspezifität, dies legt nahe, dass die Spezifität nicht nur aus spezifischen Protein-DNA-Kontakten, sondern auch aus Wechselwirkungen resultieren kann, welche alle Nucleotide mit Ausnahme des korrekten Nucleotids ausschließen.
Asp2 wurde immer gemeinsam mit Arg-1 in allen Proteinen selektiert, für welche die Ziel-Untereinheit GNG war. Jetzt hat man verstanden, dass es hierfür zwei Gründe gibt. Aus Strukturuntersuchungen von Zif268 (Pavletich, N. P., und Pabo, C. O., (1991), Science (Washington, D. C., 1883-) 252: 809-817; Elrod-Erickson, M., Rould, M. A., Nekludova, L., und Pabo, C. O., (1996), Structure (London) 4: 1171-1180) ist bekannt, dass Asp2 von Finger 2 mit Arg-1 ein Paar von unterstützenden Wasserstoffbindungen herstellt, welche die Arg-1/3'-Guanin-Wechselwirkung stabilisieren, und außerdem noch einige Wasser-vermittelte Kontakte. Jedoch nimmt das Carboxylat von Asp2 auch eine Wasserstoffbindung von dem N4 eines Cytosinrestes an, der mit einer 5'-Guaninbase der Finger-1-Untereinheit gepaart vorliegt. Eine Adeninbase, die mit T in dieser Position gepaart ist, kann einen analogen Kontakt zu demjenigen herstellen, der mit Cytosin zu sehen ist. Diese Wechselwirkung ist besonders wichtig, da sie die Erkennungs-Untereinheit von Finger 2 von drei (GNG) auf vier Nucleotide (GNG(G/T)) erweitert (Isalan, M., Choo, Y., und Klug, A., (1997), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94: 5617-5621; Jamieson, A. C., Wang, H., und Kim, S.-H., (1996), PNAS 93: 12834-12839; Isalan, M., Klug, A., und Choo, Y., (1998), Biochemistry 37: 12026-12033). Dieses Phänomen wurde als „Zielstellen-Überlappung" bezeichnet und hat drei wichtige indirekte Folgen. Erstens wurde Asp2 für die Selektion durch unsere Bank begünstigt, wenn die Finger-2-Untereinheit GNG war, da unsere Finger-1-Untereinheit ein 5'-Guanin enthielt. Zweitens kann es möglicherweise den Nutzen der in dieser Studie zum Selektieren auf GNN- oder TNN-Finger-2-Untereinheiten verwendeten Banken begrenzen, da Finger 3 dieser Banken ein Asp2 enthält, welches möglicherweise dazu beitragen kann, das 5'-Nucleotid der Finger-2-Untereinheit als G oder T zu spezifizieren. In Zif268 und C7, die Thr6 in Finger 2 aufweisen, bewirkt Asp2 von Finger 3 eine G- oder T-Erkennung in der 5'-Position (T/G)GG. Diese Wechselwirkung könnte auch eine Erklärung dafür sein, warum in früheren Phagendisplay-Studien, bei denen immer Zif268-basierte Banken verwendet wurden, eine Selektion gefunden wurde, die hauptsächlich auf die GNN-Erkennung beschränkt war (Choo, Y., und Klug, A., (1994), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91: 11163-11167; Rebar, E. J., und Pabo, C. O., (1994), Science (Washington, D. C., 1883-) 263: 671-673; Jamieson, A. C., Kim, S.-H., und Wells, J. A., (1994), Biochemistry 33: 5689-5695; Jamieson, A. C., Wang, H., und Kim, S.-H., (1996), PNAS 93: 12834-12839; Isalan, M., Klug, A., und Choo, Y., (1998), Biochemistry 37: 12026-12033; Wu, H., Yang, W.-P., und Barbas III, C. F., (1995), PNAS 92: 344-348).
Schließlich schränkt die Zielstellen-Überlappung möglicherweise die Verwendung dieser Zinkfinger als bausteinartige Baueinheiten ein. Aus Strukturdaten ist bekannt, dass es einige Zinkfinger gibt, in denen die Zielstellen-Überlappung ziemlich ausgeprägt ist, z.B. bei GLI und YY1, und dass es andere gibt, die dem Zif268 ähnlich sind und eine nur bescheidene Überlappung aufweisen. In unserem endgültigen Satz von Proteinen wird Asp2 in Polypeptiden gefunden, die GGG, GAG, GTG und GCG binden. Das Überlapp-Potential von anderen Resten, die in Position 2 gefunden werden, ist größtenteils unbekannt, wobei jedoch Strukturuntersuchungen zeigen, dass zahlreiche andere Reste, die an dieser Position gefunden werden, möglicherweise an solchen Untereinheit-Kreuzkontakten beteiligt sind. Finger, die Asp2 enthalten, schränken möglicherweise das Bausteinsystem ein, da es bei ihnen erforderlich wäre, dass auf jede GNG-Untereinheit ein T oder G folgt.
In der nachstehenden Tabelle 1 sind die Sequenzen (SEQ ID NOs: 1 bis 16) zusammengefasst, welche die höchste Selektivität für die 16 Ausführungsformen von GNN-Zieltripletts zeigen. Tabelle 1
Die Ergebnisse zeigen, dass alle möglichen GNN-Triplettsequenzen durch Zinkfinger-Domänen mit einer außerordentlich guten Spezifität erkannt werden können. Optimierte Zinkfinger-Domänen können einzelne Basenunterschiede durch einen mehr als 100-fachen Verlust an Affinität unterscheiden. Während viele der Aminosäuren, die in den optimierten Proteinen an den Schlüssel-Kontaktpositionen –1, 3 und 6 gefunden werden, diejenigen sind, die für einen einfachen Erkennungscode sprechen, wurde entdeckt, dass eine optimale spezifische Erkennung für den Zusammenhang, in dem diese Reste präsentiert werden, empfindlich ist. Dabei wurde gefunden, dass die Reste an den Positionen 1, 2 und 5 für eine spezifische Erkennung kritisch sind. Weiterhin machen die Ergebnisse erstmalig deutlich, dass Sequenzmotive an den Positionen –1, 1 und 2, und nicht die einfache Identität des Restes an Position 1, für eine hochspezifische Erkennung der 3'-Base erforderlich sind. Diese Reste stellen wahrscheinlich den richtigen stereochemischen Zusammenhang für Wechselwirkungen der Helix bereit, und zwar sowohl hinsichtlich einer Erkennung von spezifischen Basen als auch beim Ausschluss anderer Basen, wobei als Nettoergebnis hochspezifische Wechselwirkungen erhalten werden. Eine vielseitige Nutzung dieser Domänen könnte realisiert werden, wenn sie sich in ihren Wechselwirkungen mit der DNA und anderen Zinkfinger-Domänen bausteinartig verhalten würden. Dies konnte erreicht werden, indem innerhalb der wahrscheinlichen Einschränkungen gearbeitet wird, die durch Zielstellen-Überlappung gestellt werden, nämlich dass zielgerichtet auf Sequenzen des Typs 5'-(GNN)_n-3' hingesteuert werden sollte. Eine einfache Rekombination der beschriebenen Domänen macht dann die Herstellung von Polydactyl-Proteinen einer definierten Spezifität möglich, so dass es nicht mehr erforderlich ist, Phagendisplay-Banken zu entwickeln, um sie zu erzeugen. Diese Polydactyl-Proteine wurden eingesetzt, um die Transkription, die durch den menschlichen erbB-2-Promotor gesteuert wird, in lebenden Zellen zu aktivieren oder zu unterdrücken. Die hier beschriebene Familie von Zinkfinger-Domänen ist wahrscheinlich ausreichend für die Konstruktion von 16⁶ oder 17 Millionen neuen Proteinen, die an die 5'-(GNN)₆-3'-Familie von DNA-Sequenzen binden.
Das Nucleotid-bindende Zinkfinger-Polypeptid-Derivat kann von einem Wildtyp-Zinkfinger-Protein durch Verkürzung oder Verlängerung oder als eine Variante des vom Wildtyp-stammenden Polypeptids durch ein Verfahren der positionsgerichteten Mutagenese oder durch eine Kombination der Verfahren hergeleitet oder produziert werden. Der Begriff „verkürzt" bezieht sich auf ein Nucleotid-bindendes Zinkfinger-Polypeptid, welches weniger als die vollständige Anzahl von Zinkfingern aufweist, die im nativen Zinkfinger-Bindungsprotein gefunden werden, oder bei dem nicht-erwünschte Sequenzen entfernt wurden. Z.B. könnte eine verkürzte Form des Nucleotid-bindenden Zinkfinger-Proteins TFIIIA, das in der Natur neun Zinkfinger enthält, ein Polypeptid mit lediglich den Zinkfingern eins bis drei sein. Eine verlängerte Form bezieht sich auf ein Zinkfinger-Polypeptid, an das weitere Zinkfinger-Baueinheiten angefügt wurden. Z.B. kann TFIIIA auf 12 Finger verlängert werden, indem drei Zinkfinger-Domänen angefügt werden. Außerdem kann ein verkürztes Nucleotid-bindendes Zinkfinger-Polypeptid Zinkfinger-Baueinheiten aus mehr als einem Wildtyp-Polypeptid umfassen, wodurch ein „hybrides" Nucleotid-bindendes Zinkfinger-Polypeptid zustande kommt.
Der Begriff „mutagenisiert" bezieht sich auf ein Zinkfinger-hergeleitetes Nucleotid-bindendes Polypeptid, das erhalten wurde, indem ein beliebiges bekanntes Verfahren zum Erreichen einer zufälligen oder positionsgerichteten Mutagenese der das Protein codierenden DNA durchgeführt wurde. Z.B. kann in TFIIIA eine Mutagenese durchgeführt werden, um nicht-konservierte Reste in einer oder mehreren der Sequenzwiederholungen der Consensus-Sequenz zu ersetzen. Verkürzte Nucleotid-bindende Zinkfinger-Proteine können auch mutagenisiert werden.
Beispiele von bekannten Nucleotid-bindenden Zinkfinger-Polypeptiden, die gemäß der vorliegenden Erfindung verkürzt, verlängert und/oder mutagenisiert werden können, um die Funktion einer Nucleotidsequenz zu hemmen, welche ein Zinkfinger-Nucleotid-Bindungsmotiv enthält, umfassen TFIIIA und Zif268. Dem Fachmann sind noch andere Nucleotid-bindende Zinkfinger-Proteine bekannt.
Ein Polypeptid der vorliegenden Erfindung kann hergestellt werden, indem verschiedene herkömmliche Techniken eingesetzt werden, die auf dem Fachgebiet bekannt sind (vgl. z.B. US Patentanmeldung Nr. 08/676 318, eingereicht am 18.01.1995, deren gesamte Offenbarung hier durch Bezugnahme eingeschlossen ist). Phagendisplay-Banken von Zinkfinger-Proteinen wurden hergestellt und unter Bedingungen selektiert, welche die Anreicherung von sequenzspezifischen Proteinen begünstigten. Zinkfinger-Domänen, welche mehrere Sequenzen erkennen, machten eine Feinbearbeitung durch positionsgerichtete Mutagenese erforderlich, wobei als Anleitung hierfür sowohl die Ergebnisse der Phagenselektion als auch die Strukturinformationen dienten.
Das murine Cys₂-His₂-Zinkfinger-Protein Zif268 wird zum Konstruieren von Pagendisplay-Banken eingesetzt (Wu, H., Yang, W.-P., und Barbas III, C. F., (1995), PNAS 92: 344-348). Zif268 ist das strukturell am besten charakterisierte Zinkfinger-Protein (Pavletich, N. P., und Pabo, C. O., (1991), Science (Washington, D. C., 1883-) 252: 809-817; Elrod-Erickson, M., Rould, M. A., Nekludova, L., und Pabo, C. O., (1996), Structure (London) 4: 1171-1180; Swirnoff, A. H, und Milbrandt, J., (1995), Mol. Cell. Biol. 15: 2275-2287). Die DNA-Erkennung wird in jedem der drei Zinkfinger-Domänen dieses Proteins durch Reste im N-Terminus der α-Helix vermittelt, die hauptsächlich mit drei Nucleotiden auf einem Einzelstrang der DNA in Kontakt treten. Die Operator-Bindungsstelle für diese Drei-Finger-Protein ist 5'-GCGTGGGCG-3' (wobei die Finger-2-Untereinheit unterstrichen ist). Strukturuntersuchungen von Zif268 und anderen verwandten Zinkfinger-DNA-Komplexen (Elrod-Erickson, M., Benson, T. E., und Pabo, C. O., (1998), Structure (London) 6: 451-464; Kim, C. A., und Berg, J. M., (1996), Nature Structural Biology 3: 940-945; Pavletich, N. P., und Pabo, C. O., (1993), Science (Washington, D. C., 1883-) 261: 1701-1707; Houbaviy, H. B., Usheva, A., Shenk, T., und Burley, S. K., (1996), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93: 13577-13582; Fairall, L., Schwabe, J. W. R., Chapman, L., Finch, J. T., und Rhodes, D., (1993), Nature (London) 366: 483-487; Wuttke, D. S., Foster, M. P., Case, D. A., Gottesfeld, J. M., und Wright, P. E., (1997), J. Mol. Biol. 273: 183-206); Nolte, R. T., Conlin, R. M., Harrison, S. C., und Brown, R. S., (1998), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95: 2938-2943; Narayan, V. A., Kriwacki, R. W., und Caradonna, J. P., (1997), J. Biol. Chem. 272: 7801-7809) haben gezeigt, dass Reste aus hauptsächlich drei Positionen auf der α-Helix, –1, 3 und 6, an spezifischen Basenkontakten beteiligt sind. Typischerweise tritt der Rest an Position –1 der α-Helix mit der 3'-Base der Untereinheit dieses Fingers in Kontakt, währen die Positionen 3 und 6 mit der mittleren Base bzw. der 5'-Base in Kontakt treten.
Um eine Familie von Zinkfinger-Domänen zu selektieren, welche die 5'-GNN-3'-Untereinheit von Sequenzen erkennen, wurden zwei sich stark unterscheidende Zinkfinger-Banken in dem Phagendisplay-Vektor pComb3H konstruiert (Barbas III, C. F., Kang, A. S., Lerner, R. A., und Benkovic, S. J., (1991), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 7978.7982; Rader, C., und Barbas III, C. F., (1997), Curr. Opin. Biotechnol. 8: 503-508)). Beide Banken umfassten ein Randomisieren von Resten innerhalb der α-Helix von Finger 2 von C7, einer Variante von Zif268 (Wu, H., Yang, W.-P., und Barbas III, C. F., (1995), PNAS 92: 344-348). Die Bank 1 wurde durch Randomisieren der Positionen –1, 1, 2, 3, 5, 6 unter Verwendung einer NKK-Doping-Strategie konstruiert, während die Bank 2 unter Verwendung einer VNS-Doping-Strategie unter Randomisieren der Positionen –2, –1, 1, 2, 3, 5, 6 konstruiert wurde. Die NNK-Doping-Strategie macht alle Aminosäurekombinationen innerhalb von 32 Codons möglich, während die VNS-Strategie Tyr, Phe, Cys und alle Stopp-Codons in ihrem 24-Codon-Satz ausschließt. Die Banken bestanden aus 4,4 × 10⁹ bzw. 3,5 × 10⁹ Mitgliedern, von denen jedes in der Lage war, Sequenzen vom Typ 5'-GCGNNNGCG-3' zu erkennen. Die Größe der NNK-Bank stellte sicher, dass die Abschätzung mit 99% Vertrauen erfolgen konnte, während die VNS-Bank sehr vielfältig, jedoch irgendwie unvollständig war. Diese Banken sind jedoch signifikant größer als früher beschriebene Zinkfinger-Banken (Choo, Y., und Klug, A., (1994), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91: 11163-11167; Greisman, H. A., und Pabo, C. O., (1997), Science (Washington, D. C.) 275: 657-661; Rebar, E. J., und Pabo, C. O., (1994), Science (Washington, D. C., 1883-) 263: 671-673; Jamieson, A. C., Kim, S.-H., und Wells, J. A., (1994), Biochemistry 33: 5689-5695; Jamieson, A. C., Wang, H., und Kim, S.-H., (1996), PNAS 93: 12834-12839; Isalan, M., Klug, A., und Choo, Y., (1998), Biochemistry 37: 12026-12033). Sieben Selektionsrunden wurden an Zinkfingerpräsentierenden Phagen mit jedem der 16 biotinylierten 5'-GCGGNNGCG-3'-Haarnadel-DNA-Zielen durchgeführt, wobei ein in Lösung durchgeführtes Bindungsprotokoll verwendet wurde. Die Stringenz wurde in jeder Runde durch Zugabe von Kompetitor-DNA erhöht. Gescherte Heringsperma-DNA diente für die Selektion gegenüber Phagen, die unspezifisch an DNA banden. Ein stringenter Selektionsdruck für die Sequenzspezifität wurde erhalten, indem DNAs der Typen 5'-GCGNNNGCG-3' als spezifische Kompetitoren bereitgestellt wurden. Überschüssige DNA des Typs 5'-GCGNNNGCG-3' wurde zugegeben, um eine noch stringentere Selektion gegenüber der Bindung an DNAs zu erreichen, die im Vergleich zu dem biotinylierten Ziel einzelne oder doppelte Basenänderungen aufwiesen. Phagen, die an die einzelne biotinylierte DNA-Zielsequenz banden, wurden unter Verwendung von Streptavidin-beschichteten Perlen gewonnen. In einigen Fällen wurde der Selektionsprozess wiederholt. Die vorlie genden Ergebnisse zeigen, dass diese Domänen funktionell bausteinartig sind und mit einer anderen kombiniert werden können, so dass Polydactyl-Proteine erzeugt werden, die in der Lage sind, an 18-bp-Sequenzen mit einer subnanomolaren Affinität zu binden. Die hier beschriebene Familie von Zinkfinger-Domänen ist ausreichend, um 17 Millionen neue Proteine zu konstruieren, die an die 5'-(GNN)₆-3'-Familie von DNA-Sequenzen binden.
Die Erfindung umfasst eine Nucleotidsequenz, die ein Nucleotid-bindendes Zinkfinger-Polypeptid codiert. DNA-Sequenzen, die Nucleotid-bindende Zinkfinger-Polypeptide der Erfindung codieren, umfassend native, verkürzte und verlängerte Polypeptide, können durch verschiedene Verfahren erhalten werden. Z.B. kann die DNA unter Verwendung von Hybridisierungsverfahren isoliert werden, die auf dem Fachgebiet bekannt sind. Diese umfassen, sind jedoch nicht beschränkt auf: (1) Hybridisieren von Sonden an genomische oder cDNA-Banken zum Nachweisen gemeinsamer Nucleotidsequenzen; (2) Antikörper-Screening von Expressionsbanken zum Nachweisen gemeinsamer Strukturmerkmale; und (3) Synthetisieren durch die Polymerasekettenreaktion (PCR). RNA-Sequenzen der Erfindung können durch Verfahren erhalten werden, die auf dem Fachgebiet bekannt sind (vgl. z.B. Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel et al., Hrsg., 1989).
Spezifische DNA-Sequenzen, welche Nucleotid-bindende Zinkfinger-Polypeptide der Erfindung codieren, können entwickelt werden durch: (1) Isolieren einer doppelstränigen DNA-Sequenz aus der genomischen DNA; (2) chemisches Herstellen einer DNA-Sequenz, um die erforderlichen Codons für das Polypeptid von Interesse bereitzustellen; und (3) in vitro-Synthese einer doppelsträngigen DNA-Sequenz durch reverse Transkription von mRNA, die aus einer eukaryotischen Spenderzelle isoliert wurde. Im letzteren Fall wird schließlich ein doppelsträngiges DNA-Komplement von mRNA gebildet, das im allgemeinen als cDNA bezeichnet wird. Von diesen drei Methoden zum Entwickeln spezifischer DNA-Sequenzen zur Verwendung in Rekombinations-Verfahren wird das Isolieren von genomischer DNA am seltensten verwendet. Dies trifft insbesondere zu, wenn Säuger-Polypeptide in Mikroorganismen exprimiert werden sollen, und zwar aufgrund des Vorliegens von Introns.
Zum Herstellen von Zinkfinger-hergeleiteten DNA-bindenden Polypeptiden ist das Synthetisieren von DNA-Sequenzen häufig die Methode der Wahl, wenn die gesamte Sequenz von Aminosäureresten des gewünschten Polypeptidprodukts bekannt ist. Wenn die gesamte Sequenz von Aminosäureresten des gewünschten Polypeptidprodukts nicht bekannt ist, ist die direkte Synthese von DNA-Sequenzen nicht möglich, so dass es das Verfahren der Wahl ist, cDNA-Sequenzen herzustellen. Zu den Standardverfahren zum Isolieren von cDNA-Sequenzen von Interesse zählt das Herstellen von cDNA-Plasmid-Banken, die durch eine reverse Transkription von mRNA hergeleitet werden, welche in Spenderzellen mit einer hohen genetischen Expressionsrate reichlich vorliegt. Wenn dies in Kombination mit der Polymerasekettenreaktion-Technologie eingesetzt wird, können sogar seltene Expressionsprodukte cloniert werden. In Fällen, in denen signifikante Teile der Aminosäuresequenz des Polypeptids bekannt sind, kann möglicherweise die Produktion von markierten einzel- oder doppelsträngigen DNA- oder RNA-Sondensequenzen, die eine Sequenz duplizieren, welche vermutlich in der Ziel-cDNA vorliegt, in DNA/DNA-Hybridisierungsverfahren eingesetzt werden, die an clonierten Kopien der cDNA durchgeführt werden, die zu einer einzelsträngigen Form denaturiert worden waren (Jay et al., Nucleic Acid Research, (1983), 11: 2325).
In einem anderen Aspekt stellt die vorliegende Erfindung eine pharmazeutische Zusammensetzung bereit, die eine therapeutisch wirksame Menge eines Nucleotid-bindenden Zinkfinger-Polypeptids oder eine therapeutisch wirksame Menge einer Nucleotidsequenz, welche ein Nucleotid-bindendes Zinkfinger-Polypeptid codiert, in Kombination mit einem pharmazeutisch verträglichen Träger umfasst.
Die hier verwendeten Begriffe „pharmazeutisch verträglich", „physiologisch tolerierbar" und andere grammatikalische Formen davon, die sich auf Zusammensetzungen, Träger, Verdünnungsmittel und Reagenzien beziehen, werden austauschbar verwendet und bedeuten, dass die Stoffe an einen oder bei einem Menschen verabreicht werden können, ohne dass unerwünschte physiologische Effekte, z.B: Übelkeit, Schwindel, Magenbeschwerden und dergleichen, in einem Ausmaß auftreten würden, welches die Verabreichung der Zusammensetzung verbieten würde.
Die Herstellung einer pharmakologischen Zusammensetzung, welche Wirkstoffe enthält, die darin gelöst oder dispergiert sind, ist auf dem Fachgebiet bekannt. Typischerweise werden solche Zusammensetzungen als sterile Injektionspräparate, entweder als flüssige Lösungen oder als Suspensionen, die wässrig oder nicht-wässrig sein können, hergestellt, wobei jedoch auch feste Formen zubereitet werden können, die dafür geeignet sind, vor der Verwendung als Lösung oder Suspension hergestellt zu werden. Das Präparat kann auch emulgiert werden.
Der Wirkstoff kann mit Excipienten gemischt werden, die pharmazeutisch verträglich und mit dem Wirkstoff kompatibel sind, wobei Mengen verwendet werden, die für die Verwendung in den hier beschriebenen therapeutischen Verfahren geeignet sind. Geeignete Excipienten sind z.B. Wasser, Kochsalzlösung, Dextrose, Glycerin, Ethanol oder dergleichen und Kombinationen davon. Außerdem kann die Zusammensetzung, sofern dies gewünscht wird, gegebenenfalls kleinere Mengen von Hilfsstoffen enthalten, z.B. Feuchthaltemittel oder Emulgatoren, außerdem pH-Puffer und dergleichen, welche die Wirksamkeit des Wirkstoffs steigern.
Die therapeutische pharmazeutische Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung kann pharmazeutisch verträgliche Salze der darin enthaltenden Komponenten umfassen. Pharmazeutisch verträgliche Salze umfassen die Säureadditionssalze (gebildet mit den freien Aminogruppen des Polypeptids), die mit anorganischen Säuren, z.B. Salzsäure oder Phosphorsäure, oder organischen Säuren, z.B. Essigsäure, Weinsäure, Mandelsäure und dergleichen, gebildet werden. Außerdem können Salze, die mit den freien Carboxylgruppen gebildet werden, von anorganischen Basen, z.B. Natrium-, Kalium-, Ammonium-, Calcium- oder Eisen(III)-hydroxiden, und von organischen Basen, z.B. Isopropylamin, Trimethylamin, 2-(Ethylamino)ethanol, Histidin, Procain und dergleichen, hergeleitet werden.
Physiologisch verträgliche Träger sind auf dem Fachgebiet bekannt. Beispiele von flüssigen Trägern sind sterile wässrige Lösungen, die zusätzlich zu den Wirkstoffen und Wasser keine Stoffe enthalten oder die einen Puffer enthalten, z.B. Natriumphosphat bei einem physiologischen pH-Wert, physiologische Kochsalzlösung oder beides, z.B. als Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung. Weiterhin können wässrige Träger mehr als ein Puffersalz enthalten, außerdem Salze, z.B. Natrium- und Kaliumchlorid, Dextrose, Propylenglykol, Polyethylenglykol und andere gelöste Stoffe. Flüssige Zusammensetzungen können auch flüssige Phasen zusätzlich zu Wasser oder unter Ausschluss von Wasser enthalten. Beispiele von solchen zusätzlichen flüssigen Phasen sind Glycerin, pflanzliche Öle, z.B. Baumwollsamenöl, organische Ester, z.B. Ethyloleat, und Wasser-Öl-Emulsionen.
III. Zusammensetzungen
In einem anderen Aspekt stellt die vorliegende Erfindung eine Vielzahl von Nucleotid-bindenden Zinkfinger-Polypeptiden bereit, die in einer Weise funktionell verbunden sind, dass sie spezifisch an ein Nucleotid-Zielmotiv binden, das als 5'-(GNN)_n-3' definiert ist, wobei n eine Zahl größer als 1 ist. Vorzugsweise ist n eine Zahl von 2 bis etwa 6.
Mittel zum Verbinden von Nucleotid-bindenden Zinkfinger-Polypeptiden sind nachstehend in den Beispielen und in der US Patentanmeldung Nr. 08/676 318, eingereicht am 18.01.1995, beschrieben. Die einzelnen Polypeptide werden vorzugsweise mit Oligopeptid-Linkern verbunden. Solche Linker ähneln vorzugsweise den Linkern, die in natürlich vorkommenden Zinkfinger-Proteinen gefunden werden. Ein bevorzugter Linker zur Verwendung in der vorliegenden Erfindung ist die Aminosäuresequenz TGEKP (SEQ ID NO: 111).
Die Wirksamkeit beim Herstellen solcher Zusammensetzung und ihre Verwendung in der Genkontrolle wurde untersucht, indem das menschliche erbB-2-Gen als Modell gewählt wurde. Ein Polydactyl-Protein, das spezifisch eine 18-bp-Sequenz in der 5'-untranslatierten Region dieses Gens erkennt, wurde durch Fusion mit KRAB-, ERD- oder SID-Repressordomänen zu einem Transkriptions-Repressor umgewandelt. Transkriptions-Aktivatoren wurden durch Fusion mit der Aktivierungsdomäne VP16 von Herpes simplex oder mit einer tetrameren Sequenzwiederholung der minimalen Aktivierungsdomäne von VP16, bezeichnet als VP64, erzeugt. Die Ergebnisse zeigen erstmalig, dass sowohl eine Genrepression als auch eine Genaktivierung erreicht werden kann, indem entworfene Proteine zielgerichtet zu einer einzelnen Stelle innerhalb der transkribierten Region eines Gens hingesteuert werden.
Das menschliche erbB-2-Gen wurde als Modellziel die Entwicklung von Zinkfinger-basierten Transkriptions-Schaltern gewählt. Mitglieder der ErbR-Rezeptorfamilie spielen in der Entwicklung von menschlichen Krebserkrankungen wichtige Rollen. Insbesondere erbB-2 wird in Folge einer Genamplifikation und/oder Transkriptions-Deregulation bei einem hohen Prozentsatz von menschlichen Adenokarzinomen überexprimiert, die an zahlreichen Stellen entstehen können, umfassend Brust, Ovar, Lunge, Magen und Speicheldrüse (Hynes, N. E., und Stem, D. F., (1994), Biochim. Biophys. Acta 1198: 165-184). Eine gesteigerte Expression von ErbB-2 führt zur konstitutiven Aktivierung der intrinsischen Tyrosinkinase, und es wurde gezeigt, dass hierdurch die Transformation von gezüchteten Zellen bewirkt wird. Zahlreiche klinische Studien haben gezeigt, dass Patienten, die an Tumoren mit erhöhten ErbB-2-Expressionsraten leiden, eine schlechtere Prognose haben (Hynes, N. E., und Stern, D. F., (1994), Biochim. Biophys. Acta 1198: 165-184). ErbB-2 spielt Zusätzlich zu seiner Beteiligung an Krebs beim Menschen sowohl bei erwachsenen Säugern als auch während ihrer Embryonalentwicklung eine wichtige biologische Rolle (Hynes, N. E., und Stem, D. F., (1994), Biochim. Biophys. Acta 1198: 165-184; Altiok, N., Bessereau, J.-L., Changeux, J.-P., (1995), EMBO J. 14: 4258-4266; Lee, K.-F., Simon, H., Chen, H., Bates, B., Hung, M.-C., und Hauser, C., (1995), Nature 378: 394-398).
Somit stellt der erbB-2-Promotor einen interessanten Testfall für die Entwicklung von künstlichen Transkriptions-Regulatoren dar. Dieser Promotor wurde genau charakterisiert, wobei gezeigt wurde, dass er relativ komplex ist und sowohl eine TATA-abhängige als auch eine TATA-unabhängige Transkriptions-Initiationsstelle enthält (Ishii, S., Imamoto, F., Yamanashi, Y., Toyoshima, K., und Yamamoto, T., (1987), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84: 4374-4378). Frühe Studien haben gezeigt, dass Polydactyl-Proteine als Transkriptions-Regulatoren wirken könnten, die spezifisch die Transkription aktivieren oder unterdrücken, wobei diese Proteine stromaufwärts eines künstlichen Promotors an sechs Tandem-Sequenzwiederholungen der Protein-Bindungsstelle banden (Liu, Q., Segal, D. J., Ghiara, J. B., und Barbas III, C. F., (1997), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94: 5525-5530). Weiterhin wurden in dieser Studie Polydactyl-Proteine verwendet, die in ihrer Bindungsspezifität nicht modifiziert waren. Hier testeten wir die Effizienz von Polydactyl-Proteinen, die aus vorher definierten Baueinheiten zusammenge setzt waren, mit der sie an eine einzelne Stelle in dem nativen erbB-2-Promotor banden. Vorstehend ist die Herstellung und Charakterisierung einer Familie von Zinkfinger-Domänen beschrieben, welche an jedes der 16 5'-GNN-3'-DNA-Tripletts binden. Ein Grund, warum wir uns darauf konzentrierten, diese Familie von Erkennungsdomänen zu produzieren, besteht darin, dass die Promotorregionen der meisten Organismen in ihrem Basengehalt relativ GC-reich sind. Wenn also Proteine, die 5'-(GNN)_x-3'-Stellen erkennen, einfach aus diesem Satz von definierten Zinkfinger-Domänen zusammengesetzt werden könnten, könnten zahlreiche Gene rasch und spezifisch zielgerichtet für die Regulation angesteuert werden. Ein Protein, das sechs Zinkfinger-Domänen enthält und 18 bp einer DNA erkennt, sollte ausreichend sein, um eine einzelne Adresse innerhalb aller bekannten Genome zu definieren. Durch Untersuchen der erbB-2-Promotorregion wurden zwei 5'-(GNN)₆-3'-Stellen und eine 5'-(GNN)₉-3'-Stelle aufgedeckt. Eine dieser Stellen, die hier als e2c identifiziert wurde, fällt in die 5'-untranslatierte Region des erbB-2-Gens und wurde als Zielstelle für die Erzeugung eines genspezifischen Transkriptions-Schalters ausgewählt. Eine BLAST-Suche nach Sequenzähnlichkeit bei der Datenbank GenBank bestätigte, dass diese Sequenz einmalig nur bei erbB-2 vorkommt. Aufgrund der Position der e2c-Zielsequenz, stromabwärts und in der Nähe der zwei Haupt-Transkriptions-Initiationsstellen, war es möglich, dass man untersuchen konnte, ob die Repression durch Hemmung entweder der Transkriptions-Initiation oder der Verlängerung erfolgt. Ein interessantes Merkmal der e2c-Zielstelle besteht darin, dass sie innerhalb eines kurzen Sequenzabschnitts vorliegt, der zwischen den erbB-2-Genen von Mensch, Ratte und Maus konserviert ist (White, M. R.-A., und Hung, M.-C., (1992), Oncogene 7: 677-683). Somit könnte man diese Strategie mittels eines zielgerichteten Ansteuern dieser Stelle zuerst in Tiermodellen testen, bevor man sie bei einer Krankheit des Menschen anwendet.
Zur Herstellung von Polydactyl-Proteinen mit einer gewünschten DNA-Bindungsspezifität hat man sich in den vorliegenden Studien auf das Zusammenfügen von vorher definierten Zinkfinger-Domänen konzentriert, dies steht im Gegensatz zu der sequentiellen Selektionsstrategie, die von Greisman und Pabo vorgeschlagen wurde (Greisman, H. A., und Pabo, C. O., (1997), Science 275: 657-661). Für eine solche Strategie wäre die aufeinander folgende Herstellung und Selektion von sechs Zinkfinger-Banken für jedes erforderliche Protein nötig, wodurch diese experimentelle Vorgehensweise für die meisten Laboratorien nicht durchführbar und für alle Laboratorien extrem zeitaufwändig wäre. Da es in dieser Strategie weiterhin sehr schwierig ist, eine spezifische negative Selektion gegenüber der Bindung von alternativen Sequenzen anzuwenden, kann sie möglicherweise Proteine zur Folge haben, die relativ unspezifisch sind, wie früher berichtet wurde (Kim, J.-S., und Pabo, C. O., (1997), J. Biol. Chem. 272: 29795-29800).
Der allgemeine Nutzen von zwei verschiedenen Strategien zur Herstellung von Drei-Finger-Proteinen, welche 9 bp einer DNA-Sequenz erkennen, wurde untersucht. Jede Strategie basierte auf der bausteinartigen Natur der Zinkfinger-Domäne und nutzt eine Familie von Zinkfinger-Domänen, welche Tripletts des Typs 5'-(GNN)-3' erkennen. In der ersten Strategie wurden zwei Drei-Finger-Proteine, welche die Halbseiten (HS) 1 und 2 der 5'-(GNN)₆-3'-erbB-2-Zielstelle e2c erkennen, hergestellt, indem die vorher definierten Finger-2- (F2-) Domäne-Varianten unter Verwendung einer PCR-Zusammenbau-Strategie aneinander fusioniert wurden. Um die Allgemeingültigkeit dieser Vorgehensweise zu untersuchen, wurden drei weitere Drei-Finger-Proteine, welche Sequenzen des Typs 5'-(GNN)₃-3' erkennen, anhand der gleichen Vorgehensweise hergestellt. Gereinigte Zinkfinger-Proteine wurden als Fusionen mit dem Maltosebindenden Protein (MBP) hergestellt. Die ELISA-Analyse zeigte, dass seriell verbundene F2-Proteine in der Lage waren, gemeinsam so zu wirken, dass sie spezifisch die gewünschten 9-bp-DNA-Zielsequenzen erkennen. Jedes der fünf gezeigten Proteine war in der Lage, zwischen einer Ziel- und einer Nicht-Ziel-5'-(GNN)₃-3'-Sequenz zu unterscheiden.
Die Affinität von jedem der Proteine für sein Ziel wurde durch Tests der Verschiebung der elektrophoretischen Mobilität („electrophoretic mobility-shift assays") bestimmt. Diese Studien machten deutlich, dass die Zinkfinger-Peptide Affinitäten besitzen, die mit Zif268 und anderen natürlichen Transkriptionsfaktoren vergleichbar sind, wobei die K_d-Werte im Bereich von 3 bis 70 nM lagen. Hier beträgt der K_d-Wert von Zif268 für seinen Operator 10 nM. Es muss jedoch angemerkt werden, dass aus Gründen, die noch geklärt werden müssen, eine Gruppe K_d-Werte für das natürliche Zif268-Protein berichtete, die im Bereich von 6 nM bis 10 pM lagen, wobei es sich um eine 600-fache Variation handelte (Pavletich, N. P., und Pabo, C. O., (1991), Science 252: 809-817; Greisman, H. A., und Pabo, C. O., (1997), Science 275: 657-661). In den meisten Studien wurde berichtet, dass der K_d-Wert der Zif268-DNA-Wechselwirkung zwischen 3 und 10 nM lag (Choo, Y., und Klug, A., (1994), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91: 11163-11167; Hamilton, T. B., Borel, F., und Romaniuk, P. J., (1998), Biochemistry 37: 2051-2058). Wenn also die hier beschriebenen Ergebnisse mit denjenigen, die an anderer Stelle beschrieben sind, verglichen werden, sollten die relativen K_d-Werte miteinander verglichen werden, (Mutante-K_d)/(Zif268-K_d), wobei beide Werte aus dem gleichen Bericht stammen. Die vorliegenden Daten zeigen günstige Ergebnisse, wenn man sie mit anderen Studien von neuen Drei-Finger-Proteinen vergleicht, die unter Verwendung von Pagendisplay hergestellt wurden, wobei Affinitäten beschrieben wurden, die 10- bis 200-fach schwächer waren als die beim Zif268 (Greisman, H. A., und Pabo, C. O., (1997), Science 275: 657-661; Choo, Y., Sanchez-Garcia, I., und Klug, A., (1994), Nature 372: 642-645).
Als Alternative zu der seriellen Verknüpfung von Varianten der F2-Domäne wurden in der zweiten Strategie Drei-Finger-Proteine, die für die zwei e2c-5'-(GNN)₃-3'-Halbseiten spezifisch sind, durch „Helix-Transplantation" („helix grafting") hergestellt. Die Gerüstreste der Zinkfinger-Domänen, diejenigen Reste, welche die Präsentation der Erkennungshelix unterstützen, variieren bei den verschiedenen Proteinen. Wir gehen davon aus, dass die Gerüstreste möglicherweise bei der Affinität und Spezifität ein Rolle spielen. Für eine Helix-Transplantation wurden die Aminosäurepositionen –2 bis 6 der DNA-Erkennungshelices entweder in ein Zif268- (Pavletich, N. P., und Pabo, C. O., (1991), Science 252: 809-817) oder in ein Sp1C-Gerüst transplantiert (Desjarlais, J. R., und Berg, J. M., (1993), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 2256-2260). Das Sp1C-Protein ist ein entworfenes Consensus-Protein, für das gezeigt wurde, dass es eine erhöhte Stabilität gegenüber chelatbildenden Mitteln aufweist. Die Proteine wurden aus DNA-Matrizen exprimiert, welche durch eine schnelle PCR-basierte Gen-Zusammenbau-Strategie hergestellt wurden. In jedem Fall zeigte die ELISA-Analyse von MBP-Fusionsproteinen, dass die DNA-Bindungsspezifitäten und Affinitäten, die bei den F2-Gerüstkonstrukten festgestellt wurden, erhalten blieben.
Wie vorstehend angegeben reicht die Erkennung einer 9-bp-DNA-Sequenz nicht aus, um eine einmalige Stelle innerhalb eines komplexen Genoms zu spezifizieren. Im Gegensatz dazu könnte ein Sechs-Finger-Protein, das 18 bp einer aneinandergrenzenden DNA-Sequenz erkennt, eine einzelne Stelle im menschlichen Genom definieren, wodurch eine wichtige Voraussetzung für die Erzeugung eines Gen-spezifischen Transkriptions-Schalters erfüllt wäre. Sechs-Finger-Proteine, welche an die erbB-2-Zielsequenz e2c binden, wurden aus Drei-Finger-Konstrukten durch einfaches Spalten mit Restriktionsenzymen und Clonieren mit F2-, Zif268- und Sp1C-Gerüstmatrizen-DNAs erzeugt. ELISA-Analysen von gereinigten MBP-Fusionsproteinen zeigten, dass jedes der Sechs-Finger-Proteine in der Lage war, die spezifische Zielsequenz zu erkennen, wobei nur eine geringe Kreuzreaktivität zu Nicht-Ziel-5'-(GNN)₆-3'-Stellen oder einer Tandem-Sequenzwiederholung der Zif268-Zielstelle vorlag.
Die Affinität jedes Proteins für die e2c-DNA-Zielstelle wurde durch Gel-Verschiebungs-Analyse bestimmt. Ein mittlerer K_d-Wert von 25 nM wurde bei dem E2C(F2)-Sechs-Finger-Protein festgestellt, konstruiert aus dem F2-Gerüst, dies ist ein Wert, der nur 2- bis 3-mal besser ist als bei den darin enthaltenen Drei-Finger-Proteinen. In unseren vorherigen Studien von Sechs-Finger-Proteinen stellten wir eine etwa 70-fach gesteigerte Affinität der Sechs-Finger-Proteine für ihren DNA-Liganden im Vergleich zu ihren Drei-Finger-Komponenten fest (Liu, Q., Segal, D. J., Ghiara, J. B., und Barbas III, C. F., (1997), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94: 5525-5530). Das Fehlen eines wesentlichen Anstiegs der Affinität des E2C(F2)-Peptids legt nahe, dass die serielle Verknüpfung von F2-Domänen nicht optimal ist. Es ist möglich, dass die Periodizität der F2-Domänen des Sechs-Finger-Proteins in dieser verlängerten Sequenz nicht zu derjenigen der DNA passt und dass ein signifikanter Anteil der Bindungsenergie dieses Proteins dazu verwendet wird, die DNA zu entwinden (Shi, Y., und Berg, J. M., (1996), Biochemistry 35: 3845-3848). Im Gegensatz zu dem F2-Domäne-Protein zeigten die Sechs-Finger-Proteine E2C(Zif) und E2C(Sp1) eine 40- bis 70-fach erhöhte Affinität im Vergleich zu ihren ursprünglichen Drei-Finger-Protein-Bestandteilen, mit K_d-Werten von 1,6 nM bzw. 0,5 nM. Beide Drei-Finger-Komponenten dieser Proteine waren signifikant an der Bindung beteiligt, da eine Mutation jeder der Halbseiten zu einer etwa 100-fachen Abnahme der Affinität führte. Die Überlegenheit bekannter Transkriptionsfaktoren, welche an ihre spezifischen DNA-Liganden mit einer nanomolaren Affinität binden, legt nahe, dass die Kontrolle der Genexpression durch Protein/DNA-Komplexe mit einer nicht außergewöhnlichen Lebensdauer bestimmt wird. Somit sollten keine Zinkfinger-Proteine mit einer erhöhten Affinität erforderlich sein, und sie könnten sogar nachteilig sein, insbesondere wenn auch die Bindung an unspezifische DNA erhöht ist.
Die Zinkfinger-Domäne wird allgemein als bausteinartig angesehen, wobei jeder Finger eine 3-bp-Untereinheit erkennt (Pavletich, N. P., und Pabo, C. O., (1991), Science 252: 809-817). Hierfür spricht auch die Tatsache, dass wir in der Lage sind, Zinkfinger-Domänen in einer beliebigen gewünschten Sequenz zu rekombinieren, wodurch Polydactyl-Proteine erhalten werden, die verlängerte Sequenzen der Struktur 5'-(GNN)_x-3' erkennen. Jedoch sollte angemerkt werden, dass es mindestens in einigen Fällen den Eindruck macht, dass Zinkfinger-Domänen eher überlappende 4-bp-Stellen spezifizieren als einzelne 3-bp-Stellen. In Zif268 sind beim Kontaktieren der DNA zusätzlich zu den in den Helixpositionen –1, 3 und 6 vorliegenden Resten noch Reste beteiligt (Elrod-Erickson, M., Rould, M. A., Nekludova, L., und Pabo, C. O., (1996), Structure 4: 1171-1180). Insbesondere ein Aspartat in Helixposition 2 von F2 spielt in der Erkennung verschiedene Rollen und stellt eine Vielfalt von Kontakten her. Das Carboxylat der Aspartat-Seitenkette bildet Wasserstoffbindungen mit Arginin an der Position –1, wodurch seine Wechselwirkung mit dem 3'-Guanin seiner Zielstelle stabilisiert wird. Dieses Aspartat ist außerdem an Wasser-vermittelten Kontakten mit dem zum Guanin komplementären Cytosin beteiligt. Außerdem wurde festgestellt, dass dieses Carboxylat einen direkten Kontakt zu dem N4 der Cytosinbase am gegenüberliegenden Strang der 5'-Guaninbase der Finger-1-Bindungsstelle herstellt. Diese Wechselwirkung ist es, welche die chemische Basis für eine Zielstellen-Überlappung darstellt. Tatsächlich wurden, wenn die Zif268-F2-Banken auf die vier 5'-GCG GNG GCG-3'-Sequenzen selektiert wurden, sowohl ein Arginin an Position –1 als auch ein Aspartat an Position 2 erhalten, analog zu den Resten im nativen Zif268. Da auf die e2c-Zielsequenz (5'-GGG GCC GGA GCC GCA GTG-3') (SEQ ID NO: 112) eher ein A als ein G folgt, wurde mit einem möglichen Zielstellen-Überlappungs-Problem bei Finger 1 eines e2c-spezifischen Sechs-Finger-Proteins gerechnet. Jedoch scheint in beiden Zif- und Sp1C-Gerüst-Sechs-Finger-Proteinen der GTG-spezifische Finger 1, welcher ein Aspartat an Position 2 enthält, die Sequenzen 5'-GTGA-3' und 5'-GTGG-3' gleich gut zu erkennen, wie durch ihre sehr ähnlichen Affinitäten zu den Zielstellen e2c-a und e2c-g gezeigt wird.
Ein Polynucleotid oder eine Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung wie vorstehend angegeben kann mit einem oder mehreren Transkriptions-Modulationsfaktoren funktionell verbunden sein. Modulationsfaktoren, z.B. Transkriptions-Aktivatoren oder Transkriptions-Suppressoren oder Repressoren sind auf dem Fachgebiet bekannt. Außerdem sind auf dem Fachgebiet Verfahren bekannt, mit denen Polypeptide an solche Faktoren funktionell gebunden werden können. Nachstehend werden solche beispielhafte und bevorzugte Faktoren und ihre Verwendung zum Modulieren der Genexpression ausführlich beschrieben.
II. Verwendung
In einer Ausführungsform umfasst ein Verfahren der Erfindung einen Prozess zum Modulieren (Hemmen oder Unterdrücken) der Funktion einer Nucleotidsequenz, die ein Zinkfinger-Nucleotid-Bindungsmotiv umfasst, umfassend das Inkontaktbringen des Zinkfinger-Nucleotid-Bindungsmotivs mit einer wirksamen Menge eines Nucleotid-bindenden Zinkfinger-Polypeptids, welches an das Motiv bindet. In dem Fall, wenn die Nucleotidsequenz ein Promotor ist, umfasst das Verfahren die Hemmung der Transkriptions-Transaktivierung eines Promotors, der ein Zinkfinger-DNA-Bindungsmotiv enthält. Der Begriff „Hemmung" bezieht sich auf die Suppression des Aktivierungsniveaus der Transkription eines Strukturgens, das mit einem Promotor funktionell verbunden ist, der z.B. ein Zinkfinger-Nucleotid-Bindungsmotiv enthält. Außerdem kann das Derivat des Nucleotid-bindende Zinkfinger-Polypeptids möglicherweise an ein Motiv innerhalb eines Strukturgens oder innerhalb einer RNA-Sequenz binden.
Der Begriff „wirksame Menge" umfasst diejenige Menge, die zur Deaktivierung eines vorher aktivierten Promotors führt, oder diejenige Menge, die zur Inaktivierung eines Promotors führt, der ein Zinkfinger-Nucleotid-Bindungsmotiv enthält, oder diejenige Menge, welche die Transkription eines Strukturgens oder die Translation von RNA blockiert. Die erforderliche Menge des Nucleotid-bindenden Zinkfinger-Polypeptids ist diejenige Menge, die erforderlich ist, um entweder ein natives Nucleotid-bindendes Zinkfinger-Protein in einem vorliegenden Protein/Promotor-Komplex zu ersetzen, oder diejenige Menge, die erforderlich ist, um mit dem nativen Nucleotid-bindenden Zinkfinger-Protein um die Bildung eines Komplexes mit dem Promotor selbst zu kompetieren. Genauso ist die Menge, die zum Blockieren eines Strukturgens oder einer RNA erforderlich ist, diejenige Menge, die an RNA-Polymerase bindet oder die sie so blockiert, dass sie das Gen nicht mehr weiter abliest, oder bzw. diejenige Menge, welche die Translation hemmt. Vorzugsweise wird das Verfahren intrazellulär durchgeführt. Durch ein funktionelles Inaktivieren eines Promotors oder Strukturgens wird die Transkription oder Translation unterdrückt. Die Verabreichung einer wirksamen Menge des Hemmproteins zum Binden an die zelluläre Nucleotidsequenz oder zum „Kontaktieren" dieser Sequenz, enthaltend das Zinkfinger-Nucleotidbindungs-Proteinmotiv, kann durch einen der hier beschriebenen Mechanismen erreicht werden, z.B. durch Retrovirus-Vektoren oder Liposomen, oder durch andere Verfahren, die auf dem Fachgebiet bekannt sind.
Der Begriff „Modulieren" bezieht sich auf das Unterdrücken, Verstärken oder Induzieren einer Funktion. Z.B. kann das Nucleotid-bindende Zinkfinger-Polypeptid der Erfindung eine Promotorsequenz modulieren, indem es an ein Motiv innerhalb des Promotors bindet, wodurch die Transkription eines Gens, das mit der Promotor-Nucleotisequenz funktionell verbunden ist, gesteigert oder gehemmt wird. Andererseits kann eine Modulation eine Hemmung der Transkription eines Gens umfassen, wobei das Nucleotid-bindende Zinkfinger-Polypeptid an das Strukturgen bindet und die DNA-abhängige RNA-Polymerase so blockiert, dass das Gen nicht mehr weiter abgelesen wird, wodurch die Transkription des Gens gehemmt wird. Das Strukturgen kann ein normales zelluläres Gen oder z.B. ein Onkogen sein. Andererseits kann eine Modulation eine Hemmung der Translation eines Transkripts umfassen.
Die Promotorregion eines Gens umfasst die regulatorischen Elemente, die typischerweise 5' zu einem Strukturgen liegen. Wenn ein Gen aktiviert werden soll, lagern sich Proteine, die als Transkriptionsfaktoren bekannt sind, an die Promotorregion des Gens an. Diese Zusammenlagerung entspricht einem „Anschalten", wodurch ein Enzym in die Lage versetzt wird, ein zweites genetisches Element von DNA zu RNA zu transkribieren. In den meisten Fällen dient das resultierende RNA-Molekül als eine Matrize zum Synthetisieren eines spezifischen Proteins; manchmal ist die RNA selbst das Endprodukt.
Die Promotorregion kann ein normaler zellulärer Promotor oder z.B. ein Onko-Promotor sein. Ein Onko-Promotor ist im Allgemeinen ein von einem Virus stammender Promotor. Z.B. ist die lange terminale Wiederholung („long terminal repeat", LTR) von Retroviren eine Promotorregion, die ein Ziel für eine Zinkfinger-Bindungspolypeptid-Variante der Erfindung darstellen kann. Promotoren aus Mitgliedern der Lentivirus-Gruppe, die Krankheitserreger wie humanes T-Zell-lymphotropes Virus- (HTLV-) 1 und 2 oder humanes Immundefizienz-Virus- (HIV-) 1 und 2 umfassen, sind Beispiele von viralen Promotorregionen, die als Ziel für eine Modulation der Transkription durch ein Zinkfinger-Bindungspolypeptid der Erfindung dienen können.
Um das Konzept der Verwendung von Zinkfinger-Proteinen als genspezifische Transkriptions-Regulatoren zu testen, wurde das Sechs-Finger-Protein E2C(Sp1) mit verschiedenen Effektordomänen fusioniert. Transkriptions-Repressoren wurden erzeugt, indem eine von drei vom Menschen stammenden Repressordomänen an das Zinkfinger-Protein angelagert wurde. Das erste Repressorprotein wurde hergestellt, indem die ERF-Repressor-Domäne (ERD) verwendet wurde (Sgouras, D. N., Athanasiou, M. A., Beal, G. J., Jr., Fisher, R. J., Blair, D. G., und Mavrothalassitis, G. J., (1995), EMBO J. 14: 4781-4793), die durch die Aminosäuren 473 bis 530 des ets2-Repressor-Faktors (ERF) definiert ist. Diese Domäne vermittelt die antagonistische Wirkung von ERF auf die Aktivität von Transkriptionsfaktoren der Familie ets. Ein synthetischer Repressor wurde konstruiert, indem diese Domäne mit dem C-Terminus des Zinkfinger-Proteins fusioniert wurde. Das zweite Repressorprotein wurde unter Verwendung der Krüppel-assoziierten Box- (KRAB-) Domäne hergestellt (Margolin, J. F., Friedman, J. R., Meyer, W., K.-H., Vissing, H., Thiesen, H.-J., und Rauscher III, F. J., (1994), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91: 4509-4513). Diese Repressordomäne ist normalerweise am N-Terminus von Zinkfinger-Proteinen zu finden und übt vermutlich ihre repressive Wirkung auf eine TATA-abhängige Transkription in einer Entfernungs- und Orientierungsunabhängigen Art und Weise aus (Pengue, G., und Lania, L., (1996), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93: 1015-1020), indem sie mit dem RING-Finger-Protein KAP-1 interagiert (Friedman, J. R., Fredericks, W. J., Jensen, D. E., Speicher, D. W., Huang, X.-P., Neilson, E. G., und Rauscher III, F. J., (1996), Genes & Dev. 10: 2067-2078). Wir verwendeten die KRAB-Domäne, die zwischen den Aminosäuren 1 und 97 des Zinkfinger-Proteins KOX1 gefunden wurde (Margolin, J. F., Friedman, J. R., Meyer, W., K.-H., Vissing, H., Thiesen, H.-J., und Rauscher III, F. J., (1994), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91: 4509-4513). In diesem Fall wurde eine N-terminale Fusion mit dem Sechs-Finger-Protein konstruiert. Um den Nutzen einer Histon-Deacetylierung für die Repression zu untersuchen, wurden schließlich die Aminosäuren 1 bis 36 der Mad mSIN3-Interaktions-Domäne (SID) mit dem N-Terminus des Zinkfinger-Proteins fusioniert (Ayer, D. E., Laherty, C. D., Lawrence, Q. A., Armstrong, A. P., und Eisenman, R. N., (1996), Mol. Cell. Biol. 16: 5772-5781). Diese kleine Domäne liegt am N-Terminus des Transkriptionsfaktors Mad vor und ist für die Vermittlung seiner Transkriptions-Repression durch Interagieren mit mSIN3 verantwortlich, das seinerseits mit dem Co-Repressor N-CoR und mit der Histon-Deacetylase mRPD1 interagiert (Heinzel, T., Lavinsky, R. M., Mullen, T.-M., Sšderstršm, M., Laherty, C. D., Torchia, J., Yang, W.-M., Brard, G., Ngo, S. D., et al. (1997), Nature 387: 43-46). Um die genspezifische Aktivierung zu untersuchen, wurden Transkriptions-Aktivatoren erzeugt, indem das Zinkfinger-Protein an die Aminosäuren 413 bis 489 des VP16-Proteins des Herpes-simplex-Virus (Sadowski, I., Ma., J., Triezenberg, S., und Ptashne, M., (1988), Nature 335: 563-564) oder an eine künstliche tetramere Sequenzwiederholung der minimalen Aktivierungsdomäne von VP16, DALDDFDLDML (SEQ ID NO: 113) (Seipel, K., Georgiev, O., und Schaffner, W., (1992), EMBO J. 11: 4961-4968), bezeichnet mit VP64, fusioniert wurde.
Reporterkonstrukte, die Fragmente des erbB-2-Promotors, gekoppelt an ein Luciferase-Reportergen, enthielten, wurden erzeugt, um die spezifischen Aktivitäten unserer entworfenen Transkriptions-Regulatoren zu testen. Das Ziel-Reporterplasmid enthielt die Nucleotide –758 bis –1, bezogen auf das Initiationscodon ATG, wohingegen das Kontroll-Reporterplasmid die Nucleotide –1571 bis –24 enthielt, in welchem somit alle Nucleotide der E2C-Bindungsstelle, die an den Positionen –24 bis –7 vorliegt, außer einem fehlten. Beide Promotorfragmente zeigten ähnliche Aktivitäten, wenn sie in HeLa-Zellen transient transfiziert wurden, dies stimmte mit früheren Beobachtungen überein (Hudson, L. G., Ertl., A. P., und Gill, G. N., (1990), J. Biol. Chem. 265: 4389-4393). Um die Wirkung von Zinkfinger-Repressordomäne-Fusionskonstrukten auf die Aktivität des erbB-2-Promotors zu testen, wurden HeLa-Zellen mit jedem der Zinkfinger-Expressionsvektoren und der Luciferase-Reporterkonstrukte transient co-transfiziert (5A). Eine signifikante Repression wurde bei jedem Konstrukt beobachtet. Die ERD- und SID-Fusionsproteine erzeugten eine Repression von etwa 50% bzw. 80%. Der wirksamste Repressor war das KRAB-Fusionsprotein. Dieses Protein bewirkte eine vollständige Repression der Aktivität des erbB-2-Promotors. Die festgestellte restliche Aktivität lag auf dem Niveau des Hintergrunds des Promotor-freien pGL3-Reporters. Im Gegensatz dazu bewirkte keines der Proteine eine signifikante Repression des Kontroll-erbB-2-Reporterkontrukts, dem die E2C-Zielstelle fehlte, dies macht deutlich, dass die Repression tatsächlich durch eine spezifische Bindung des Proteins E2C(Sp1) an seine Zielstelle vermittelt wird. Die Expression eines Zinkfinger-Proteins, das keine Effektordomäne aufweist, führte zu einer schwachen Repression von etwa 30%, dies macht deutlich, dass der Großteil der mit den SID- und KRAB-Konstrukten festgestellten Repression durch ihre Effektordomänen und nicht durch die DNA-Bindung alleine bewirkt wird. Diese Feststellung legt nahe, dass der Mechanismus der Repression eine aktive Hemmung der Transkriptions-Initiation und nicht der Verlängerung ist. Sobald die Hemmung der Transkription durch die RNA-Polymerase II stattgefunden hat, scheint das Zinkfinger-Protein durch die Wirkung der Polymerase sogleich von der DNA entfernt zu werden.
Der Nutzen von genspezifischen Polydactyl-Proteinen zum Vermitteln einer Aktivierung der Transkription wurde untersucht, indem die gleichen zwei Reporterkonstrukte eingesetzt wurden. Dabei wurde gefunden, dass das Fusionsprotein VP16 die Transkription etwa fünffach stimulierte, wohingegen das Fusionsprotein VP64 eine 27-fache Aktivierung bewirkte. Diese dramatische Stimulation der Promotoraktivität, ausgelöst durch einen einzelnen VP16-basierten Transkriptions-Aktivator, ist hinsichtlich der Tatsache außergewöhnlich, dass das Zinkfinger-Protein in der transkribierten Region des Gens bindet. Dies macht wiederum deutlich, dass das bloße Binden eines Zinkfinger- Proteins, sogar eines mit einer subnanomolaren Affinität, im Reaktionsablauf der RNA-Polymerase II nicht notwendigerweise die Genexpression negativ beeinflussen muss.
Die hier vorgelegten Ergebnisse zeigen, dass Zinkfinger-Proteine, die in der Lage sind, an neue 9- und 18-bp-DNA-Zielstellen zu binden, unter Verwendung von vorher definierten Domänen, die 5'-GNN-3'-Stellen erkennen, schnell hergestellt werden können. Diese Informationen reichen für die Herstellung von 16⁶ oder 17 Millionen neuen Zinkfinger-Proteinen aus, die jeweils in der Lage sind, an 18 bp einer DNA-Sequenz zu binden. Dieses schnelle Verfahren zum Konstruieren von neuen Zinkfinger-Proteinen hat Vorteile gegenüber der aufeinander folgenden Erzeugung und Selektion von Zinkfinger-Domänen, die von anderen Autoren empfohlen werden (Greisman, H. A., und Pabo., C. O., (1997), Science 275: 657-661), und nutzt die Struktuinformationen, welche nahelegen, dass die Möglichkeit für das vorstehend definierte Zielüberlappungs-Problem in Proteinen verhindert werden könnte, die 5'-GNN-3'-Stellen als Ziel ansteuern. Bei Verwendung des komplexen und gut untersuchten erbß-2-Promotors und lebender menschlicher Zellen machen die Ergebnisse deutlich, dass diese Proteine, wenn sie zusammen mit der geeigneten Effektordomäne bereitgestellt werden, verwendet werden können, um in diesen Experimenten die Expression hervorzurufen oder zu aktivieren und eine Repression mit abgestuften Niveaus bis hinunter zum Hintergrundniveau zu erzeugen. Diese Studien legen nahe, dass die KRAB-Domäne als ein Transkriptions-Repressor signifikant wirksamer ist als ERD- oder SID-Domänen und dass sie in der Lage ist, sowohl die TATA-abhängige als auch die TATA-unabhängige Transkriptions-Initiation dieses Promotors zu hemmen. Diese Repressordomänen wurden früher noch nicht direkt miteinander verglichen. Die vorliegende Strategie zur Verwendung von vorher definierten Zinkfinger-Domänen zum Konstruieren von Polydactyl-Proteinen, gekoppelt an Effektordomänen, hat signifikante Vorteile gegenüber Strategien, welche versuchen, die Transkription nur durch Kompetieren oder Stören mit Proteinen zu unterdrücken, die am Transkriptions-Komplex beteiligt sind (Kim, J.-S., und Pabo, C. O., (1997), J. Biol. Chem. 272: 29795-29800; Kim, J.-S., Kim. J., Cepek, K. L., Sharp, P. A., und Pabo, C. O., (1997), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94: 3616-3620). Die Verwendung von Effektordomänen, welche die Fähigkeit besitzen, über eine Distanz zu wirken, sollte es möglich machen, diese Gen-Schalter bei der Regulation von nichtcharakterisierten Genen und Promotoren anzuwenden. Da diese Transkriptions-Regulatoren unter Verwendung unserer PCR-Zusammenbau-Strategie möglicherweise mit einem hohen Durchsatz hergestellt werden könnten, halten wir es für angebracht, auf ihre mögliche praktische Anwendung hinzuweisen. Neue DNA-bindende Proteine, die auf diese Weise erzeugt werden, sollten einen möglichen Nutzen in DNA-basierten diagnostischen Anwendungen haben. Wir nehmen an, dass beim Analysieren der Genfunktion die Fähigkeit, die Transkription von Genen sowohl zu aktivieren als auch zu unterdrücken, und dies gegebenenfalls mit abgestuften Niveaus, dazu beitragen könnte, eine Genfunktion zuzuweisen. Da diese Proteine ihre Kontrolle ausüben, indem sie in trans wirken, könnte es dadurch bei heterozygoten transgenen Tieren zu einem Inaktivieren („Knockout") oder Aktivieren von funktionellen Genen kommen. Dies würde die Zeit drastisch reduzieren, die erforderlich wäre, um einen Gen-Knockout in einem ganzen Tier zu bewirken, und es würde das Spektrum von Organismen erweitern, bei denen die Knockout-Technologie angewendet werden könnte. Außerdem könnten diese Proteine in Gentherapie-Anwendungen eingesetzt werden, um die Produktion von viralen Genprodukten zu hemmen oder um Gene zu aktivieren, die an der Bekämpfung von Krankheiten beteiligt sind. Jedenfalls wird die Tatsache, dass diese Proteine so einfach hergestellt werden können, das Testen dieser Ideen durch die wissenschaftliche Gemeinschaft wesentlich erleichtern.
Die folgenden Beispiele erläutern bevorzugte Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung und sollen die Beschreibung oder die Patentansprüche in keiner Weise einschränken.
Beispiel 1: Selektion durch Phagendisplay
Das Konstruieren von Zinkfinger-Banken durch PCR-Überlapp-Verlängerung erfolgte im Wesentlichen wie früher beschrieben (Shi, Y., und Bery, J. M., (1996), Biochemistry 35: 3845-3848). Das Züchten und Ausfällen der Phagen wurde wie früher beschrieben durchgeführt (Pengue, G., und Lania, L., (1996), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93: 1015-1020; Friedman, J. R., Fredericks, W. J., Jensen, D. E., Speicher, D. W., Huang, X.-P., Neilson, E. G., und Rauscher III, F, J., (1996), Genes & Dev. 10: 2067-2078), mit der Ausnahme, dass ER2537-Zellen (New England Biolabs) verwendet wurden, um die Phagen zu vermehren, und 90 μM ZnCl₂ zu den Wachstumsmedien zugegeben wurden. Die gefällten Phagen wurden in Zinkpuffer A (ZBA: 10 mM Tris, pH 7,5, 90 mM KCl, 1 mM MgCl₂, 90 μM ZnCl₂), 1% BSA, 5 mM DTT, resuspendiert. Bindungsreaktionsgemische (500 μl: ZBA, 5 mM DTT, 1% Blotto (BioRad), Kompetitor-Oligonucleotide, 4 μg gescherte Heringsperma-DNA (Sigma), 100 μl gefilterte Phagen (etwa 10¹³ koloniebildende Einheiten)) wurden 30 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert, anschließend wurden 72 nM biotinyliertes Haarnadel-Ziel-Oligonucleotid zugegeben. Die Inkubation wurde 3,5 Stunden unter konstantem sanftem Mischen fortgesetzt. Streptavidin-beschichtete magnetische Perlen (50 μl; Dynal) wurden zweimal mit 500 μl ZBA, 1% BSA, gewaschen, anschließend zusammen mit 500 μl ZBA, 5% Blotto, Antikörper-präsentierenden (irrelevanten) Phagen (etwa 10¹² koloniebildende Einheiten), für etwa vier Stunden bei Raumtemperatur gehalten. Am Ende des Bindungszeitraums wurde die Blockierungslösung durch die Bindungsreaktionslösung ersetzt und eine Stunde bei Raumtemperatur inkubiert. Die Perlen wurden zehnmal innerhalb eines Zeitraums von einer Stunde mit 500 μl ZBA, 5 mM DTT, 2% Tween 20, und anschließend ohne Tween 20 gewaschen. Die gebundenen Phagen wurden 30 Minuten mit 10 μg/μl Trypsin eluiert.
Haarnadel-Ziel-Oligonucleotide hatten die Sequenz 5'-Biotin-GGACGCN'N'N'CGCGGGTTTTCCCGCGNNNGCGTCC-3' (SEQ ID NO: 114), wobei NNN die Drei-Nucleotid-Zielsequenz von Finger 2 und N'N'N' ihr Komplement war. Ein ähnliches nicht-biotinyliertes Oligonucleotid, in dem die Zielsequenz TGG (compTGG) war, wurde mit 7,2 nM in jeder Selektionsrunde zugegeben, um gegenüber den kontaminierenden parentalen Phagen zu selektieren. Außerdem wurden zwei Pools von nicht-biotinylierten Oligonucleotiden als Kompetitoren verwendet: einer, der alle 64 möglichen Drei-Nucleotid-Zielsequenzen (compNNN) enthielt, und der andere, der alle GNN-Zielsequenzen enthielt, mit Ausnahme des aktuellen Selektionsziels (compGNN). Diese Pools wurden typischerweise wie folgt eingesetzt: Runde 1: kein compNNN oder compGNN; Runde 2: 7,2 nM compGNN; Runde 3: 10,8 nM compGNN; Runde 4: 1,8 μM compNNN, 25 nM compGNN; Runde 5: 2,7 μM compNNN, 90 nM compGNN; Runde 6: 2,7 μM compNNN, 250 nM compGNN; Runde 7: 3,6 μM compNNN, 250 nM compGNN.
Beispiel 2: Mehr-Ziel-Spezifitätstests
Das Fragment von pComb3H (Pengue, G., und Lania, L., (1996), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93: 1015-1020; Heinzel, T., Lavinsky, R. M., Mulien, T.-M., Sšderstršm, M., Laherty, C. D., Torchia, J., Yang, W.-M., Brard, G., Ngo, S. D., et al., (1997), Nature 387: 43-46) Phagemid RF-DNA, enthaltend die Zinkfinger-codierende Sequenz, wurde in den modifizierten bakteriellen Expressionsvektor pMAL-c2 (New England Biolabs) cloniert und in XL1-Blue (Stratagene) transformiert. Die gefrorenen/aufgetauten Extrakte, welche die überexprimierten Maltose-bindendes-Protein-Zinkfinger-Fusionsproteine überexprimierten, wurden aus IPTG-induzierten Kulturen hergestellt, wobei das „Protein Fusion and Purification System" (New England Biolabs) verwendet wurde. In ELISA-Platten mit 96 Vertiefungen wurden in jede Vertiefung 0,2 μg Streptavidin (Pierce) zugegeben und eine Stunde bei 37°C inkubiert, danach wurde zweimal mit Wasser gewaschen. Biotinyliertes Ziel-Oligonucleotid (0,025 μg) wurde genauso zugegeben. ZBA, 3% BSA, wurde zur Blockierung zugefügt, wobei jedoch die Vertiefungen nach der Inkubation nicht gewaschen wurden. Alle anschließenden Inkubationen erfolgten bei Raumtemperatur. Acht zweifache serielle Verdünnungen der Extrakte wurden in 1 × Bindungspuffer zubereitet (ZBA, 1% BSA, 5 mM DTT, 0,12 μg/μl gescherte Heringsperma-DNA). Die Proben wurden eine Stunde inkubiert, worauf zehn Waschgänge mit Wasser folgten. Ein gegen Maltose-bindendes Protein gerichteter mAb der Maus (Sigma) in ZBA, 1% BSA, wurde zu den Vertiefungen für 30 Minuten zugegeben, worauf zehn Waschgänge mit Wasser folgten. Ein Anti-Maus-IgG-mAb der Ziege, konjugiert an alkalische Phosphatase (Sigma), wurde zu den Vertiefungen für 30 Minuten zugegeben, hierauf folgten zehn Waschgänge mit Wasser. Ein Substrat der alkalischen Phosphatase (Sigma) wurde zugegeben und die OD₄₀₅ mit SOFTmax 2.35 (Molecular Devices) quantitativ bestimmt.
Beispiel 3: Gelmobilitäts-Verschiebungs-Tests
Fusionsproteine wurden auf eine Homogenität von > 90% gereinigt, indem das „Protein Fusion and Purification System" (New England Biolabs) verwendet wurde, mit der Ausnahme, dass ZBA, 5 mM DTT, als Säulenpuffer eingesetzt wurde. Die Reinheit und die Konzentration der Proteine wurden an Coomassie-Blau-gefärbten 15% SDS-PAGE-Gelen durch Vergleichen mit BSA-Standards bestimmt. Ziel-Oligonucleotide wurden an ihren 5'- oder 3'-Enden mit [³²P] markiert und Gel-gereinigt. Elf dreifache serielle Verdünnungen des Proteins wurden in 20 μl Bindungsreaktiongemischen (1 × Bindungspuffer, 10% Glycerin, etwa 1 pMol Ziel-Oligonucleotid) drei Stunden bei Raumtemperatur inkubiert und danach auf einem 5% Polyacrylamid-Gel in 0,5 × TBE-Puffer aufgetrennt. Die getrockneten Gele wurden unter Verwendung einer Phosphor-Imager- und ImageQuant-Software (Molecular Dynamics) quantitativ auswertet, und der K_D-Wert wurde durch Scatchard-Analyse bestimmt.
Beispiel 4: Herstellen von Polydactyl-Proteinen mit einer gewünschten DNA-Bindungsspezifität
In den hier beschriebenen Studien werden die Finger-2- (F2-) Varianten pmGAC, pmGAG, pGCA, pGCC, pmGGA, pmGGC, pmGGG und pGTG verwendet, die im beigefügten Manuskript definiert sind (Hudson, L. G., Ertl, A. P., und Gill, G. N., (1990), J. Biol. Chem. 265: 4389-4393). Um DNAs herzustellen, welche Drei-Finger-Proteine codieren, wurden F2-codierende Regionen aus ausgewählten oder entworfenen F2-Varianten PCR-amplifiziert und durch PCR-Überlapp-Verlängerung zusammengefügt. Alternativ wurden DNAs, die Drei-Finger-Proteine mit einem Zif268- oder Sp1C-Gerüst codieren, aus acht oder bzw. sechs überlappenden Oligonucleotiden synthetisiert. Sp1C-Gerüstkonstrukte, die für alle in dieser Beschreibung angegebenen Reportertests eingesetzt wurden, wurden wie folgt erzeugt. Im Fall von E2C-HS1(Sp1) wurden
in einem Standard-PCR-Gemisch gemischt und 25-mal einem Zyklus unterworfen (30 Sekunden bei 94°C, 30 Sekunden bei 60°C, 30 Sekunden bei 72°C). Ein Aliquot dieses Prä-Zusamenbau-Reaktionsgemisches wurde sodann
unter Verwendung der gleichen Bedingungen dem Zyklus unterworfen. Die E2C-HS2(Sp1)-DNA wurde genauso erzeugt, indem ein analoger Satz von Oligonucleotiden verwendet wurde, die sich nur in den Erkennungshelix-codierenden Regionen unterschieden. Alle zusammengefügten Drei-Finger-codierenden Regionen wurden mit der Restriktionsendonuclease Sfi1 gespalten und in pMal-CSS, ein Derivat des bakteriellen Expressionsvektors pMal-C2 (New England Biolabs), cloniert. DNAs, die Sechs-Finger-Proteine mit jedem der verschiedenen Gerüste codieren, wurden in pMal-CSS unter Verwendung der Restriktionsstellen Xma1 und BsrF1 zusammengefügt, die in den Sequenzen enthalten waren, welche die Drei-Finger-codierenden Regionen flankieren. Jedes der Zinkfinger-Proteine wurde in dem E. coli-Stamm XL1-Blue exprimiert, und die Bindungseigenschaften wurden durch ELISA und Gel-Verschiebungs-Analyse untersucht, wie im beigefügten Manuskript beschrieben (Hudson, L. G., Ertl, A. P., und Gill, G. N., (1990), J. Biol. Chem. 265: 4389-4393).
Beispiel 5: Konstruieren von Zinkfinger-Effektordomäne-Fusionsproteinen
Zum Konstruieren von Zinkfinger-Effektordomäne-Fusionsproteinen wurden DNAs, welche die Aminosäuren 473 bis 530 der ets-Repressor-Faktor- (ERF-) Repressor-Domäne (ERD) (Sgouras, D. N., Athanasiou, M. A., Beal, G. J., Jr., Fisher, R. J., Blair, D. G., und Mavrothalassitis, G. J., (1995), EMBO J. 14: 4781-4793), die Ami nosäuren 1 bis 97 der KRAB-Domäne von KOX1 (Margolin, J. F., Friedman, J. R., Meyer, W., K.-H., Vissing, H., Thiesen, H.-J., und Rauscher III, F. J., (1994), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91: 4509-4513) oder die Aminosäuren 1 bis 36 der Mad mSIN3-Interaktions-Domäne (SID) (Ayer, D. E., Laherty, C. D., Lawrence, Q. A., Armstrong, A. P., und Eisenman, R. N., (1996), Mol. Cell. Biol. 16: 5772-5781) codieren, aus überlappenden Oligonucleotiden unter Verwendung der Taq-DNA-Polymerase zusammengefügt. Die codierende Region für die Aminosäuren 413 bis 489 der Transkriptions-Aktivierungsdomäne VP16 (Sadowski, I., Ma., J., Triezenberg, S., und Ptashne, M., (1988), Nature 335: 563-564) wurde aus pcDNA3/C7-C7-V16 (10) PCR-amplifiziert. Die VP64-DNA, welche eine tetramere Sequenzwiederholung der minimalen Aktivierungsdomäne von VP16 codiert, umfassend die Aminosäuren 437 bis 447 (Seipel, K., Georgiev, O., und Schaffner, W., (1992), EMBO J. 11: 4961-4968), wurde aus zwei Paaren von komplementären Oligonucleotiden hergestellt. Die resultierenden Fragmente wurden durch Standardverfahren an Zinkfinger-codierende Regionen fusioniert, so dass jedes resultierende Konstrukt ein inneres SV40-Kern-Lokalisierungssignal und außerdem einen C-terminalen HA-Dekapeptid-Abschnitt („tag") enthielt. Fusionskonstrukte wurden in den eukaryotischen Expressionsvektor pcDNA3 (Invitrogen) cloniert.
Beispiel 6: Konstruieren von Luciferase-Reporterplasmiden
Ein erbB-2-Promotorfragment, umfassend die Nucleotide –758 bis –1, bezogen auf das Initiationscodon ATG, wurde aus menschlicher genomischer Knochenmark-DNA mit dem TagExpand DNA Polymerase Mix (Boehringer Mannheim) PCR-amplifiziert und in pGL3basic (Promega) cloniert, und zwar stromaufwärts des Luciferase-Gens des Leuchtkäfers. Ein menschliches erbB-2-Promotorfragment, umfassend die Nucleotide –1571 bis –24, wurde aus pSVOALΔ5'/erbB-2(N-N) (Hudson, L. G., Ertl, A. P., und Gill, G. N., (1990), J. Biol. Chem. 265: 4389-4393) durch Hind3-Spaltung ausgeschnitten und in pGL3basic stromaufwärts des Luciferase-Gens des Leuchtkäfers subcloniert.
Beispiel 7: Luciferase-Test
Für alle Transfektionen wurden HeLa-Zellen bei einer Konfluenz von 40 bis 60 verwendet. Typischerweise wurden die Zellen mit 400 ng Reporterplasmid (pGL3-Reporterkonstrukte oder, als negative Kontrolle, pGL3basic), 50 ng Effektorplasmid (Zinkfingerkonstrukte in pcDNA3 oder, als negative Kontrolle, leere pcDNA3) und 200 ng Innerer-Standard-Plasmid (phrAct-βGal) in einer Vertiefung einer Platte mit sechs Vertiefungen unter Verwendung des Lipofectamin-Reagens (Gibco BRL) transfiziert. Zellextrakte wurden etwa 46 Stunden nach der Transfektion hergestellt. Die Luciferase-Aktivität wurde mit dem Luciferase-Testreagens (Promega), die βGal-Aktivität mit dem Galacto-Light (Tropix) in einem MicroLumat LB96P Luminometer (EG & G Berthold) gemessen. Die Luciferase-Aktivität wurde auf βGal-Aktivität normalisiert.
Beispiel 8: Regulation des erbB-2-Gens in HeLa-Zellen
Das erbB-2-Gen wurde für eine erzwungene Regulation zielgerichtet angesteuert. Das erbB-2-Gen wird bei Krebserkrankungen des Menschen, insbesondere bei Brust- und Eierstockkrebs, häufig überexprimiert, und erhöhte ErbB-2-Spiegel korrelieren mit einer schlechten Prognose (N. E. Hynes und D. F. Stem, (1994), Biochim. Biophys. Acta 1198: 165). Um das native erbB-2-Gen zu regulieren, wurden ein synthetisches Repressorprotein, das mit E2C-KRAB bezeichnet wird, und ein Transaktivator-Protein, das mit E2C-VP64 bezeichnet wird, verwendet (R. R. Beerli, D. J. Segal, B. Dreier, C. F. Barbas III, (1998), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95: 14628). Die beiden Proteine enthalten das gleiche entworfene Zinkfinger-Protein E2C, welches die 18-bp-DNA-Sequenz 5'-GGG GCC GGA GCC GCA GTG-3' (SEQ ID NO: 121) in der 5'-untranslatierten Region des Proto-Onkogens erbB-2 erkennt. Dieses DNA-bindende Protein wurde aus sechs vorher definierten und bausteinartigen Zinkfingerdomänen konstruiert (D. J. Segal, B. Dreier, R. R. Beerli, C. F. Barbas III, (1999), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96: 2758). Das Repressorprotein enthält die Kox-1 KRAB-Domäne (J. F. Margolin et al., (1994), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91: 4509), wohingegen der Transaktivator VP64 eine tetramere Wiederholung der minimalen Aktivierungsdomäne enthält (K. Seipel, O. Georgiev, W. Schaffner, (1992), EMBO J. 11: 4961), die von dem Protein VP16 des Herpes-simplex-Virus stammt.
Ein Derivat der menschlichen Zervixkarzinom-Zelllinie HeLa, HeLa/tet-off, wurde verwendet (M. Gossen und H. Bujard, (1992), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 5547). Da HeLa-Zellen epithelialen Ursprungs sind, exprimieren sie ErbB-2 und sind für Studien der erbB-2-Gen-Zielsteuerung („targeting") gut geeignet. HeLa/tet-off-Zellen produzieren den Tetracyclin-kontrollierten Transaktivator, wodurch die Induktion eines Gens von Interesse unter der Kontrolle eines auf Tetracyclin ansprechenden Elements („Tetracyclin Response Element", TRE) ermöglicht wird, indem Tetracyclin oder sein Derivat Doxycyclin (Dox) aus dem Wachstumsmedium entfernt wird. Wir haben dieses System eingesetzt, um unsere Transkriptionsfaktoren unter eine chemisch Kontrolle zu stellen. Auf diese Weise wurden die Plasmide pRevTRE/E2C-SKD und pRevTRE/E2C-VP64 konstruiert (Die E2C(Sp1)-KRAB- und E2C(Sp1)-VP64-codierenden Regionen wurden aus pcDNA3-basierten Expressionsplasmiden PCR-amplifiziert (R. R. Beerli, D. J. Segal, B. Dreier, C. F. Barbas III, (1998), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95: 14628) und unter Verwendung der Restriktionsstellen BamH1 und Cla1 in pRevTRE (Clontech) und unter Verwendung der Restriktionsstellen BamH1 und Not1 in pMX-IRES-GFP (X. Liu et al., (1997), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94: 10669) subcloniert. Die Genauigkeit der PCR-Amplifikation wurde durch Sequenzierung bestätigt), in HeLa/tet-off-Zellen transfiziert und 20 stabile Clone jeweils isoliert und auf eine Dox-abhängige Zielgen-Regulation analysiert (Die Konstrukte pRevTRE/E2C-KRAB und pRevTRE/E2C-VP64 wurden unter Verwendung des Reagens Lipofectamin Plus (Gibco BRL) in die Zelllinie HeLa/tet-off transfiziert (M. Gossen und H. Bujard, (1992), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 5547). Nach zwei Wochen Selektion in einem Hygromycin-enthaltenden Medium in Gegenwart von 2 μg/ml Dox wurden stabile Clone isoliert und auf eine Dox-abhängige Regulation der ErbB-2-Expression analysiert. Western-Blots, Immunfällungen, Northern-Blots und durchflusscytometrische Analysen wurden im Wesentlichen wie beschrieben durchgeführt (D. Graus-Porta, R. R. Beerli, N. E. Hynes, (1995), Mol. Cell. Biol. 15: 1182)). Als eine Anzeige der Aktivität des erbB-2-Promotors wurden die ErbB-2-Proteinspiegel anfangs durch Western-Blotting analysiert. Ein signifikanter Anteil dieser Clone zeigte eine Regulation der Expression von ErbB-2, wenn man Dox für vier Tage entfernte, d.h. eine Nach-unten-Regulation von ErbB-2 in E2C-KRAB-Clonen und eine Nach-oben-Regulation in E2C-VP64-Clonen. Die ErbB-2-Proteinspiegel stimmten mit den veränderten Spiegeln ihrer spezifischen mRNA überein, dies zeigt, dass die Regulation der Expression von ErbB-2 ein Ergebnis der Repression oder Aktivierung der Transkription war. Das zusätzliche ErbB-2-Protein, das in E2C-VP64-Clonen exprimiert wurde, war von dem natürlich exprimierten Protein nicht zu unterscheiden und biologisch aktiv, da der epidermale Wachstumsfaktor (EGF) sogleich seine Tyrosin-Phosphorylierung induzierte. Die ErbB-2-Spiegel in dem E2C-KRAB-Clon Nr. 27 lagen in Abwesenheit von Dox unter der Nachweisgrenze, wie dies auch bei seiner EGF-induzierten Tyrosin-Phosphorylierung der Fall war. Deshalb wurde die ErbB-2-Expression auch durch Durchflusscytometrie analysiert, wodurch gezeigt wurde, dass keine nachweisbare ErbB-2-Expression in dem E2C-KRAB-Clon Nr. 27 vorlag, dies stand in einem starken Kontrast zu der dramatischen Nach-oben-Regulation (5,6-fach) von ErbB-2 im E2C-VP64-Clon Nr. 18. Somit reichte das Ausmaß der Regulation des erbB-2-Gens von einer totalen Repression (E2C-KRAB-Clon Nr. 27) bis zu einer fast sechsfachen Aktivierung (E2C-VP64-Clon Nr. 18). Keine signifikante Wirkung auf die Expression des verwandten ErbB-1-Proteins wurde festgestellt, dies zeigt, dass die Regulation der Expression von ErbB-2 nicht das Ergebnis einer allgemeinen Nach-unten- oder Nach-oben-Regulation der Transkription war. Im Gegensatz zur Wirksamkeit dieser Transkriptionsfaktoren, die zielgerichtet auf 18 bp einer DNA-Sequenz unter Verwendung von sechs Zinkfingerdomänen hinsteuern, waren Transkriptions-Aktivatoren, die mit drei Zinkfingerdomänen hergestellt wurden, welche an eine der 9-bp-Halbseiten der E2C-Zielsequenz binden, nicht in der Lage, die Transkription eines erbB-2-Luciferase-Reporters zu aktivieren. Diese Ergebnisse legen nahe, dass die erhöhte Spezifität und Affinität von Sechs-Finger-Proteinen möglicherweise erforderlich sind, um eine dominante Wirkung auf die Genregulation bereitzustellen.
Beispiel 9: Einführung der codierenden Regionen der Proteine E2C-KRAB und E2C-VP64 in den Retrovirus-Vektor pMX-IRES-GFP
Um die Proteine E2C-KRAB und E2C-VP64 in verschiedenen anderen Zelllinien zu exprimieren, wurden ihre codierenden Regionen in den Retrovirus-Vektor pMX-IRES-GFP eingeführt. Die E2C(Sp1)-KRAB- und E2C(Sp1)-VP64-codierenden Regionen wurden aus pcDNA3-basierten Expressionsplasmiden PCR-amplifiziert (R. R. Beerli, D. J. Segal, B. Dreier, C. F. Barbas III, (1998), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95: 14628) und unter Verwendung der Restriktionsstellen BamH1 und Cla1 in pRevTRE (Clontech) und unter Verwendung der Restriktionsstellen BamH1 und Not1 in pMX-IRES-GFP (X. Liu, et al., (1997), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94: 10669) subcloniert. Die Genauigkeit der PCR-Amplifikation wurde durch Sequenzierung bestätigt. Dieser Vektor exprimiert eine einzelne bicistronische Botschaft für die Translation des Zinkfinger-Proteins und, aus einer internen Ribosomen-Eintrittstelle („internal ribosome-entry site", IRES), des grünen fluoreszierenden Proteins (GFP). Da die beiden codierenden Regionen die gleiche mRNA gemeinsam haben, ist ihre Expression physikalisch miteinander verbunden und somit die GFP-Expression ein Indikator für die Expression des Zinkfingers. Anschließend wurde mit Viren, die aus diesen Plasmiden hergestellt worden waren, die menschliche Karzinom-Zelllinie A431 infiziert (pMX-IRES-GFP/E2C-KRAB- und pMX-IRES-GFP/E2C-VP64-Plasmide wurden in die amphotrope Verpackungs-Zelllinie Phoenix Ampho unter Verwendung von Lipfectamine Plus (Gibco BRL) transient transfiziert und zwei Tage später die Kulturüberstände für die Infektion von Zielzellen in Gegenwart von 8 μg/ml Polybrene verwendet. Drei Tage nach der Infektion wurden die Zellen für die Analyse geerntet). Drei Tage nach der Infektion wurde die Expression von ErbB-2 durch Durchflusscytometrie gemessen. Signifikant waren etwa 59% der mit E2C-KRAB-Virus behandelten Zellen im Wesentlichen ErbB-2-negativ, während in etwa 27% der mit E2C-VP64-Virus behandelten Zellen die ErbB-2-Spiegel erhöht waren. Durch Auftragen der GFP-Fluoreszenz gegen die ErbB-2-Fluoreszenz wurde gezeigt, dass es zwei Zellpopulationen gab, eine mit normalen ErbB-2-Spiegeln, die GFP-negativ war, und eine andere mit veränderten ErbB-2-Spiegeln, die GFP-positiv war. Die Spezifität der Gen-Zielsteuerung („gene targeting") wurde untersucht, indem die Expressionsraten der verwandten Proteine ErbB-1 und ErbB-3 gemessen wurden. Keine signifikanten Änderungen dieser Proteinspiegel wurden nachgewiesen, dies zeigt, dass die erbB-2-Gen-Zielsteuerung spezifisch ist und es sich nicht um ein unspezifisches Ergebnis von allgemeinen Änderungen in der Genexpression oder Überexpression der Effektordomänen handelt. Das Fehlen jeglicher nennenswerter Regulation von erbB-3 ist besonders bemerkenswert, da sein 5'-UTR die 18-bp-Sequenz 5'-GGa GCC GGA GCC GgA GTc-3' (SEQ ID NO: 122) enthält, die nur drei nicht passende Elemente zu der entworfenen E2C-Zielsequenz zeigt (Identität von 15 bp, wobei die Klein buchstaben die Unterschiede angeben) (M. H. Kraus, W. Issing, T. Miki, N. C. Popescu, S. A. Aaronson, (1989), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 9193).
Beispiel 10: Regulation des erbB-2-Gens in Nicht-Mensch-Primatenzellen
Die Zinkfinger-Zielsequenz innerhalb von 5'-UTR von erbB-2 liegt innerhalb eines 28-bp-Sequenzbereichs, der in zahlreichen Arten konserviert ist. Um die Regulation der Expression des erbB-2-Gens in Nicht-Mensch-Primatenzellen zu untersuchen, wurden COS-7-Fibroblasten mit dem bicistronischen E2C-KRAB-Retrovirus infiziert und durch Durchflusscytometrie analysiert. Wie in menschlichen Zellen stimmte die Expression des Repressorproteins, gezeigt durch den GFP-Marker, gut mit einem Verlust von ErbB-2-Protein überein. Genauso wurde die Gen-Zielsteuerung in murinen Zellen durch Infektion von NIH/3T3-Zellen mit E2C-KRAB- und E2C-VP64-codierenden Retroviren untersucht. Anschließend wurden die Expressionsraten von ErbB-2 durch Western-Blotting und nicht durch Durchflusscytometrie überwacht, und zwar aufgrund des Fehlens einer Reaktivität des mAb mit der murinen extrazellulären ErbB-2-Domäne. Wieder wurde hier mit E2C-KRAB, nach Korrektur bezogen auf die infizierten Zellen, ein vollständiges Ausschalten der Transkription festgestellt. Jedoch war, anders als bei menschlichen Zelllinien, eine durch E2C-VP64 induzierte Nach-oben-Regulation von ErbB-2 in NIH/3T3-Zellen eher mittelmäßig, etwa 1,8-fach, nach Korrektur auf die Infektionseffizienz. Eine wahrscheinliche Erklärung für diese Diskrepanz liegt in den unterschiedlichen Strukturen des menschlichen Promotors und des Maus-Promotors. Der erbB-2-Promotor der Maus enthält, anders als der des Menschen, keine TATA-Box (M. R. White und M. C. Hung, (1992), Oncogene 7: 677). Die Transkriptions-Aktivierung durch VP16 wird zumindest zum Teil durch seine Wechselwirkung mit TFIID vermittelt, einem Mehrproteinkomplex, der auch das TATA-bindende Protein enthält (C. J. Ingles, M. Shales, W. D. Cress, S. J. Triezenberg, J. Greenblatt, (1991), Nature 351: 588). Deshalb ist es plausibel, dass das Protein E2C-VP64 die Transkription in Abwesenheit einer TATA-Box weniger effektiv aktiviert. Diese Ergebnisse legen nahe, dass zwar eine DNA-Bindungsstelle möglicherweise hinsichtlich der Sequenz und der relativen Position innerhalb einer Zielzelle konserviert sein kann, dass jedoch Effektordomänen möglicherweise aufgrund von durch den Zusammenhang bewirkten Effekten auf eine maximale Effizienz optimiert werden müssen. Trotzdem sind die hier beschriebenen künstlichen Transkriptionsfaktoren, deren Stärken sich zwar voneinander unterscheiden können, in der Lage, die Regulation der Transkription des erbB-2-Gens in Zellen zu bewirken, die von verschiedenen Arten stammen, wodurch eine Strategie zum Untersuchen der Genfunktion in den verschiedensten Organismen bereitgestellt wird.
Beispiel 11: Spezifische Induktion der G1-Akkumulation von ErbB-2-überexprimierenden Tumorzellen
Die Überexpression von ErbB-2 führt zu einer konstitutiven Aktivierung der intrinsischen Tyrosinkinase-Aktivität (P. P. Di Fiore et al., (1987), Science 237: 178), wobei gezeigt wurde, dass die Nach-unten-Regulation von ErbB-2 in Tumorzellen, welche den Rezeptor überexprimieren, zu einer Wachstumshemmung führt (R. M. Hudziak et al., (1989), Mol. Cell. Biol. 9: 1165; J. Deshane et al., (1994), Gene Ther. 1: 332; J. M. Daly et al., (1997), Cancer Res. 57: 3804). Der Mechanismus der Wachstumshemmung scheint so zu sein, dass die Weiterentwicklung der Zellen von der G1- zur S-Phase des Zellzyklus verhindert wird (R. M. Neve, H. Sutterluty, N. Pullen, H. A. Lane, J. M. Daly, W. Krek, N. E. Hynes, vorgelegt für die Veröffentlichung). Somit untersuchten wir, ob die Expression unseres entworfenen Transkriptions-Repressors in erbB-2-überexprimierenden Tumorzellen zu einem G1-Block führen würde. Hierfür wurden die Brustkrebszellen SKBR3 mit E2C-KRAB-Retroviren infiziert und die Zellzyklus-Verteilung in Bezug auf die Expressionsraten von ErbB-2 durch Durchflusscytometrie analysiert (22). Zwei Zellpopulationen wurden festgestellt: Etwa 40% der Zellen waren nicht infiziert und hatten normale ErbB-2-Spiegel, während die infizierten Zellen, etwa 60%, nach drei Tagen etwa 7-fach reduzierte Rezeptorspiegel aufwiesen. Im Vergleich zu Zellen mit normalen Rezeptorspiegeln lag ein signifikant größerer Anteil von Zellen mit erniedrigten ErbB-2-Expressionsraten in der G1-Phase des Zellzyklus vor. Um sicherzustellen, dass die bei SKBR3-Zellen festgestellte G1-Akkumulation für ErbB-2-überexprimierende Tumorzellen spezifisch war, wurde eine ähnliche Analyse mit der Brustkrebs-Zelllinie T47D durchgeführt, welche keine erhöhten Werte von ErbB-2 zeigt (4B). Tatsächlich wurde gefunden, wenn T47D-Zellen mit dem E2C-KRAB-Retrovirus infiziert und einer Durchflusscytometrie unterworfen wurden, dass Zellpopulationen mit normalen und reduzierten ErbB-2-Spiegeln einen nicht zu unterscheidenden DNA-Gehalt aufwiesen. Somit ist unser entworfenes Repressorprotein in der Lage, die G1-Akkumulation von ErbB-2-überexprimierenden Tumorzellen spezifisch zu induzieren. Die Fähigkeit, den Ablauf des Zellzyklus zu hemmen und somit das Wachstum von ErbB-2-überexprimierenden Tumorzellen zu hemmen, legt das Potential der entworfenen Transkriptionsfaktoren für die Gentherapie von Krebserkrankungen nahe. SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Isoliertes und gereinigtes Nucleotid-bindendes Zinkfinger-Polypeptid, das mindestens eine Nucleotid-bindende Region enthält, wobei die Sequenz der bindenden Region eine von SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 59, SEQ ID NO: 60 oder SEQ ID NO: 77 ist.
Zusammensetzung, die zwei bis zwölf Nucleotid-bindende Zinkfinger-Polypeptide mit der Sequenz von einer von SEQ ID NO: 1 bis 110 umfasst, wobei mindestens eines der Polypeptide ein Polypeptid nach Anspruch 1 ist.
Zusammensetzung nach Anspruch 2, die zwei bis sechs Nucleotid-bindende Zinkfinger-Polypeptide enthält.
Zusammensetzung nach Anspruch 2 oder 3, wobei die Polypeptide funktionell verbunden sind.
Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 2 bis 4, wobei die Polypeptide durch einen Linker der Sequenz SEQ ID NO: 111 verbunden sind.
Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 2 bis 5, wobei jedes der Polypeptide an eine unterschiedliche Nucleotidsequenz bindet.
Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 2 bis 6, die an ein Nucleotid bindet, welches die Sequenzen 5'-(GNN)_n-3' enthält, wobei jedes N ein A, C, G oder T darstellt, mit der Maßgabe, dass nicht alle Ns ein C sein können, und wobei n 2 bis 6 ist.
Polypeptid nach Anspruch 1, das weiterhin mit einem oder mehreren Transkriptions-Regulationsfaktoren funktionell verbunden ist.
Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 2 bis 7, wobei die Polypeptide weiterhin mit einem oder mehreren Transkriptions-Regulationsfaktoren funktionell verbunden sind.
Isoliertes und gereinigtes Polynucleotid, welches das Polypeptid nach Anspruch 1 codiert.
Isoliertes und gereinigtes Polynucleotid, welches die Polypeptide nach einem der Ansprüche 2 bis 7 codiert.
Expressionsvekfor, der das Polynucleotid nach Anspruch 10 enthält.
Expressionsvektor, der das Polynucleotid nach Anspruch 11 enthält.
Verwendung einer Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 2 bis 7 zum Herstellen eines Medikaments zum Regulieren der Funktion einer Nucleotidsequenz, welche die Sequenz 5'-(GNN)_n-3' enthält. wobei n eine Zahl von 1 bis 6 ist.
Verwendung nach Anspruch 14, wobei die Sequenz 5'-(GNN)_n-3' in der transkribierten Region der Nucleotidsequenz liegt.
Verwendung nach Anspruch 14, wobei die Sequenz 5'-(GNN)_n-3' in einer Promotorregion der Nucleotidsequenz liegt.
Verwendung nach Anspruch 14, wobei die Sequenz 5'-(GNN)_n-3' innerhalb eines exprimierten Sequenzabschnitts (EST) liegt.
Verwendung nach Anspruch 14, wobei die Zusammensetzung mit einem oder mehreren Transkriptions-Modulationsfaktoren funktionell verbunden ist.
Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 2 bis 7 zur Verwendung in der Medizin.
Verwendung der Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 2 bis 7 zum Herstellen eines Medikaments zum Behandeln von Krebs.