KR100659922B1 - Ｇｎｎ에 대한 아연 핑거 결합 도메인 - Google Patents

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Abstract

한 개 이상의 GNN 삼중자를 함유하는 표적 뉴클레오타이드에 대해 결합 특이성을 갖는 아연 핑거-뉴클레오타이드 결합 폴리펩타이드가 제공된다. 또한, 상기 폴리펩타이드를 함유한 폴리펩타이드, 및 뉴클레오타이드 기능을 조절하기 위한 상기 아연 핑거-뉴클레오타이드 결합 폴리펩타이드 및 이를 하나 이상 함유하는 폴리펩타이드의 용도가 제공된다.
아연 핑거 도메인, 뉴클레오타이드 결합 폴리펩타이드, 전사 활성화인자, 전사 억제자, 리프레서

Description

ＧＮＮ에 대한 아연 핑거 결합 도메인{Zinc finger binding domains for GNN}
본 발명은 표적 뉴클레오타이드에 결합하는 아연 핑거 단백질에 관한 것이다. 보다 자세하게는, 본 발명은 식 5'-(GNN)-3'의 표적 뉴클레오타이드에 특이적으로 결합하는 아연 핑거의 α-나선 도메인내의 아미노산 잔기 서열에 관한 것이다.
유전자의 발현을 제어하는 주요 메카니즘이 서열 특이적 방식으로 DNA와 결합하는 단백질 스위치와 연루되어 있다는 패러다임은 1967년에 확립되었다(참조: Ptashne, M. (1967) Nature (London) 214, 323-4). 다양한 구조의 DNA 결합 단백질 계열은 공개되어 있다. 폭넓은 구조적 다양성에도 불구하고 Cys2-His2 아연 핑거 모티프는 진핵생물에서 가장 흔히 사용되는 핵산 결합 모티프를 구성한다. 이와 같은 관찰 결과는 사람의 경우와 마찬가지로 효모의 경우에서도 그러하다. 처음에 DNA 및 RNA 결합 전사 인자 TFIIIA(참조: Miller, J., McLachlan, A. D. & Klug, A. (1985) Embo J 4, 1609-14)에서 동정된 Cys2-His2 아연 핑거 모티프는 아마도, 이를 이용하여 서열 특이적 단백질을 구축할 수 있는 이상적인 구조적 골격이다. 단일 아연 핑거 도메인은 약 30개의 아미노산으로 구성되어 있으며 단순한 ββα 폴딩이 소수성 상호작용 및 한 개 아연 이온의 킬레이트화에 의해 안정화되어 있다(참조: Miller, J., McLachlan, A. D. & Klug, A. (1985) Embo J 4, 1609-14, Lee, M. S., Gippert, G. P., Soman, K. V., Case, D. A. & Wright, P. E. (1989) Science 245, 635-7). 이 도메인의 α-나선이 DNA의 메이저 그루브(major groove)에 표출됨으로써 서열 특이적 염기의 접촉이 가능하다. 나선의 표출이 다양함으로 인해 보다 확장된 부위의 인식이 가능할 지라도(참조: Pavletich, N. P. & Pabo, C. O. (1993) Science (Washington, D. C., 1883-) 261, 1701-7, Houbaviy, H. B., Usheva, A., Shenk, T. & Burley, S. K. (1996) Proc Natl Acad Sci USA 93, 13577-82, Fairall, L., Schwabe, J. W. R., Chapman, L., Finch, J. T. & Rhodes, D. (1993) Nature (London) 366, 483-7, Wuttke, D. S., Foster, M. P., Case, D. A., Gottesfeld, J. M. & Wright, P. E. (1997) J. Mol. Biol. 273, 183-206), 각 아연 핑거 도메인은 전형적으로 세 개의 DNA 염기 쌍을 인식한다(참조: Pavletich, N. P. & Pabo, C. O. (1991) Science (Washington, D. C., 1883-) 252, 809-17, Elrod-Erickson, M., Rould, M. A., Nekludova, L. & Pabo, C. O. (1996) Structure (London) 4, 1171-1180, Elrod-Erickson, M., Benson, T. E. & Pabo, C. O. (1998) Structure (London) 6, 451-464, Kim, C. A. & Berg, J. M. (1996) Nature Structural Biology 3, 940-945). 보다 긴 DNA 서열 또는 어드레스(address)로 단백질-DNA 접촉을 연장하기 위해 대부분의 전사 인자가 단백질 도메인의 이량체화에 의존하는 것과는 대조적으로, 아연 핑거 도메인의 단순한 공유결합 탠덤 반복체는 상기 모티프에 의해 보다 긴 비대칭 DNA 서열을 인식할 수 있다.
본 발명자들은 최근에 6개의 아연 핑거 도메인을 함유하고 18개 염기 쌍의 연속적인 DNA 서열에 결합하는 폴리닥틸 아연 핑거 단백질을 공개한 바 있다(참조: Liu, Q., Segal, D. J., Ghiara, J. B. & Barbas III, C. F. (1997) PNAS 94, 5525-5530). 18개 염기 쌍 DNA의 인식은 공지된 모든 게놈내의 독특한 DNA 어드레스, 즉 고도의 특이적 유전자 스위치로서 폴리닥틸 단백질을 사용하기 위한 요건을 기술하기에 충분하다. 사실, 유전자 활성화 및 억제 둘 다의 조절은 모델 시스템에서 상기 폴리닥틸 단백질을 사용하는 것으로 제시되어 왔다(참조: Liu, Q., Segal, D. J., Ghiara, J. B. & Barbas III, C. F. (1997) PNAS 94, 5525-5530).
각 아연 핑거 도메인은 전형적으로 3개의 염기 쌍 서열과 결합하기 때문에, 완전한 인식 알파벳은 64개 도메인의 특징을 요건으로 한다. 이들 도메인의 작제를 지시할 수 있는 현 정보는 세 가지 유형의 연구로부터 수득되었다: 구조 결정(참조: Pavletich, N. P. & Pabo, C. O. (1991) Science (Washington, D. C., 1883-) 252, 809-17, Elrod-Erickson, M., Rould, M. A., Nekludova, L. & Pabo, C. O. (1996) Structure (London) 4, 1171-1180, Elrod-Erickson, M., Benson, T. E. & Pabo, C. O. (1998) Structure (London) 6, 451-464, Kim, C. A. & Berg, J. M. (1996) Nature Structural Biology 3, 940-945, Pavletich, N. P. & Pabo, C. O. (1993) Science (Washington, D. C., 1883-) 261, 1701-7, Houbaviy, H. B., Usheva, A., Shenk, T. & Burley, S. K. (1996) Proc Natl Acad Sci USA 93, 13577-82, Fairall, L., Schwabe, J. W. R., Chapman, L., Finch, J. T. & Rhodes, D. (1993) Nature (London) 366, 483-7, 11, Wuttke, D. S., Foster, M. P., Case, D. A., Gottesfeld, J. M. & Wright, P. E. (1997) J. Mol. Biol. 273, 183-206, Nolte, R. T., Conlin, R. M., Harrison, S. C. & Brown, R. S. (1998) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 95, 2938-2943, Narayan, V. A., Kriwacki, R. W. & Caradonna, J. P. (1997) J. Biol. Chem. 272, 7801-7809), 부위 지시된 돌연변이유발(참조: Isalan, M., Choo, Y. & Klug, A. (1997) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 94, 5617-5621, Nardelli, J., Gibson, T. J., Vesque, C. & Charnay, P. (1991) Nature 349, 175-178, Nardelli, J., Gibson, T. & Charnay, P. (1992) Nucleic Acids Res. 20, 4137-44, Taylor, W. E. Suruki, H. K., Lin, A. H. T., Naraghi-Arani, P., Igarashi, R. Y., Younessian, M., Katkus, P. & Vo, N. V. (1995) Biochemistry 34, 3222-3230, Desjarlais, J. R. & Berg, J. M. (1992) Proteins: Struct., Funct., Genet. 12, 101-4, Desjarlais, J. R. & Berg, J. M. (1992) Proc Natl Acad Sci USA 89, 7345-9) 및 파아지-디스플레이 선별(참조: Choo, Y. & Klug, A. (1994) Proc Natl Acad Sci USA 91, 11163-7, Greisman, H. A. & Pabo, C. O. (1997) Science (Washington, D. C.) 275, 657-661. 23, Rebar, E. J. & Pabo, C. O. (1994) Science (Washington, D. C., 1883-) 263, 671-3, Jamieson, A. C., Kim, S.-H. & Wells, J. A. (1994) Biochemistry 33, 5689-5695, Jamieson, A. C., Wang, H. & Kim, S.-H. (1996) PNAS 93, 12834-12839, Isalan, M., Klug, A. & Choo, Y. (1998) Biochemistry 37, 12026-33, Wu, H., Yang, W.-P. & Barbas III, C.F. (1995) PNAS 92, 344-348). 세 가지 모두는 본 발명자가 아연 핑거/DNA 인식에 대해 이해하는데 상당히 기여하였으나 각각은 그 자체로 한계가 있다. 구조 연구는 다양한 단백질/DNA 상호작용을 확인시켜 주지만 어느 상호작용이 보다 최적인지는 설명하지 못한다. 서열 특이적 인식을 가능케 하는 상호작용이 관찰되고 있으나 어느 서열이 어떻게 결합으로부터 배제되는 지에 관한 정보는 거의 없다. 이들 의문은 현존 단백질의 돌연변이유발에 의해 부분적으로 해결되어 왔으나 그 데이터는 특징이 확인될 수 있는 돌연변이의 수로는 항상 한계가 있다. 파아지-디스플레이 및 무작위 라이브러리의 선별이 특정한 수치의 한계를 극복하지만 특이성 및 친화성 둘 다가 선별에 기여함을 보장하기 위해 적절한 선택 압력을 제공하는 것은 어렵다. 본 출원인의 연구(참조: Wu, H., Yang, W.-P. & Barbas III, C. F. (1995) PNAS 92, 344-348)를 포함하여 몇몇 연구소의 실험 연구(참조: Choo, Y. & Klug, A. (1994) Proc Natl Acad Sci USA 91, 11163-7, Greisman, H. A. & Pabo, C. O. (1997) Science (Washington, D. C.) 275, 657-661, Rebar, E. J. & Pabo, C. O. (1994) Science (Washington, D. C., 1883-) 263, 671-3, Jamieson, A. C., Kim, S.-H. & Wells, J. A. (1994) Biochemistry 33, 5689-5695. 25, Jamieson, A. C., Wang, H. & Kim, S.-H. (1996) PNAS 93, 12834-12839, Isalan, M., Klug, A. & Choo, Y. (1998) Biochemistry 37, 12026-33)로부터 상기 인식 알파벳의 소수 일원을 설계하거나 선택할 수 있음이 입증되었다. 그러나, 이들 도메인의 표적 DNA에 대한 특이성 및 친화성은 상기 초기 연구에서 활발하고 체계적인 양상으로는 거의 연구되지 않았다.
쟈콥 및 모노드는 리프레서의 화학적 성질에 의문을 갖고 세포내의 개개 단백질의 합성을 유도하거나 억제할 수 있는 방안을 제시하였기 때문에 유전자 발현의 구체적인 실험상의 조절은 현실로 다가왔다(참조: Jacob, F. & Monod, J. (1961) J. Mol. Biol. 3, 318-356). 현재, 주로 서열 특이적 양상으로 DNA에 결합하는 전사 인자로서 알려진 단백질의 작용을 통해서 게놈을 전사의 수준에서 조절하는 것은 잘 정립되어 있다. 흔히 이들 단백질 인자는 유전자 발현의 시간적-, 공간적- 및 환경적-반응성 조절을 가능케 하는 복합적인 조합 방식으로 작용한다(참조: Ptashne, M. (1997) Nature Medicine 3, 1069-1072). 전사 인자는 흔히 단백질을 게놈내의 특정 부위로 위치시키는 DNA-결합 도메인을 통해서 작용하고, 상기 특정 부위에서 또는 근처에서 전사를 유발(활성화)하거나 억제하는 보조 이펙터 도메인을 통해서 작용한다(참조: Cowell, I. G. (1994) Trends Biochem, Sci. 19, 38-42). 활성화 도메인 VP16(참조: Sadowski, I., Ma, J., Triezenberg, S. & Ptashne, M. (1988) Nature 335, 563-564) 및 억제 도메인 KRAB(참조: Margolin, J. F., Friedman, J. R., Meyer, W., K.-H., Vissing, H., Thiesen, H.-J. & Rauscher III, F. J. (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91, 4509-4513)과 같은 이펙터 도메인은 전형적으로 모듈적이고 이들이 다른 DNA-결합 단백질에 융합될 때 자신의 활성을 유지한다. 유전자는 전사 인자를 게놈내의 특정 부위로 지시함으로써 쉽게 조절될 수 있는 반면, 어떠한 주어진 서열과 결합하도록 구성될 수 있는 DNA 결합 단백질의 설계는 어려운 과제로 남아 있다.
본 발명은 핵산-결합 아연 핑거 단백질의 Cys2-His2 부류에 대해 독특한 구조적 특징의 인식을 기초로 하고 있다. Cys2-His2 아연 핑거 도메인은 약 30개 아미노산 길이의 단순한 ββα 폴딩으로 이루어져 있다. 이러한 폴딩의 구조적 안정성은 소수성 상호작용 및 보존된 Cys2-His2 잔기에 의한 한 개의 아연 이온의 킬레이트화에 의해 달성된다(참조: Lee, M. S., Gippert, G. P., Soman, K. V., Casse, D. A. & Wrignt, P. E. (1989) Science 245, 635-637). 핵산 인식은 DNA 서열의 세 개 염기 쌍과 전형적으로 결합하는 도메인의 α-나선으로부터 기원하는 특이적 아미노산 쇄 접촉을 통해 달성된다(참조: Pavletich, N. P. & Pabo, C. O. (1991) Science 252, 809-17, Elrod-Erickson, M., Rould, M. A., Nekludova, L. & Pabo, C. O. (1996) Structure 4, 1171-1180). 다른 핵산 인식 모티프와는 달리, 다수의 아연 핑거 도메인의 단순한 공유결합 연결이 DNA의 연장된 비대칭 서열의 인식을 가능케 한다. 천연 아연 핑거 단백질의 연구 결과, 세 개의 아연 핑거 도메인이 9개 염기 쌍의 연속적인 DNA 서열과 결합할 수 있는 것으로 제시되었다(참조: Pavletich, N. P. & Pabo, C. O. (1991) Science 252, 809-17., Swirnoff, A. H. & Milbrandt, J. (1995) Mol. Cell. Biol. 15, 2275-87). 9개 염기 쌍 서열의 인식이 이. 콜라이의 작은 게놈내에서 조차 특정 부위를 지정하기에 충분하지 않지만, 6개의 아연 핑거 도메인을 함유하는 폴리닥틸 단백질은 18-bp 인식을 특정할 수 있다(참조: Liu, Q., Segal, D. J., Ghiara, J. B. & Barbas III, C. F. (1997) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94, 5525-5530). 유전자 조절에 대한 보편적인 시스템의 개발에 있어서, 18-bp 어드레스는 모든 공지된 게놈내의 단일 부위를 특정하기에 충분할 수 있다. 그러나, 이러한 유형의 폴리닥틸 단백질이 자연계에서 알려져 있지 않지만, 생존하는 사람 세포내에서의 유전자 활성화 및 억제에 있어서 그들의 효능이 최근에 밝혀진 바 있다(참조: Liu, Q., Segal, D. J., Ghiara, J. B. & Barbas III, C. F. (1997) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94, 5525-5530).
발명의 간단한 요약
한 가지 양태로서, 본 발명은 서열 1 내지 110중 어느 하나의 아미노산 잔기서열을 함유하는, 분리되고 정제된 아연 핑거-뉴클레오타이드 결합 폴리펩타이드를 제공한다. 연관된 양태에서, 본 발명은 또한 2개 내지 약 12개의 상기 아연 핑거-뉴클레오타이드 결합 폴리펩타이드들을 포함하는 폴리펩타이드를 제공한다. 당해 폴리펩타이드는 바람직하게는 2개 내지 약 6개의 아연 핑거-뉴클레오타이드 결합 폴리펩타이드들을 함유한다. 바람직한 양태로서, 아연 핑거-뉴클레오타이드 결합 폴리펩타이드는 바람직하게는 서열 111의 서열을 갖는 아미노산 잔기 링커에 의해 작동가능하게 연결된다. 본 발명의 폴리펩타이드는 서열 5'-(GNN)n-3'(여기서, 각각의 N은 A, C, G 또는 T이며 단 모든 N이 C일 수 없고, n은 바람직하게는 2 내지 6이다)을 함유하는 뉴클레오타이드 표적과 특이적으로 결합한다. 아연 핑거-뉴클레오타이드 결합 폴리펩타이드 또는 이를 하나 이상 함유하는 폴리펩타이드는 추가로 전사 활성화인자(activator) 또는 전사 서프레서(suppressor) 또는 리프레서(repressor)와 같은 한 개 이상의 전사 조절 인자에 작동가능하게 연결될 수 있다. 또한, 본 발명은 본 발명의 아연 핑거-뉴클레오타이드 결합 폴리펩타이드 또는 이를 하나 이상 함유하는 폴리펩타이드를 암호화하는, 분리되고 정제된 폴리뉴클레오타이드 및 이러한 폴리뉴클레오타이드를 함유한 발현 벡터를 제공한다.
추가 양태로서, 본 발명은 서열 5'-(GNN)n-3'(여기서, n은 1 내지 6의 정수이다)을 함유하는 뉴클레오타이드 서열을 한 개 이상의 전사 조절 인자에 작동가능하게 연결된 본 발명의 폴리펩타이드의 유효량에 노출시킴을 포함하여, 상기 뉴클레오타이드 서열의 작용을 조절하는 방법을 제공한다. 5'-(GNN)n-3' 서열은 뉴클레오타이드의 전사된 영역 또는 프로모터 영역에서 또는 발현된 서열 태그 내에서 발견할 수 있다.
본 발명은 유전자 스위치의 신속한 생성을 위한 일반적인 전략의 단순성 및 효율성을 입증한다. 64개 일원 아연 핑거 알파벳의 5'-GNN-3' 서브세트의 서열을 인식하는 규명된 아연 핑거 도메인의 한 계열을 사용하여, 신규한 9- 또는 최초로 18-bp 서열을 특이적으로 인식하는 폴리닥틸 단백질이 작제되고 이의 특징이 확인되었다. 효능적인 전사 인자가 생성되었는데 이는 유전자 활성화 및 억제 둘 다를 제어할 수 있는 것으로 밝혀졌다. 유전자 활성화는 헤르페스 심플렉스 바이러스 VP16 활성화 도메인(참조: Sadowski, I., Ma, J., Triezenberg, S. & Ptashne, M. (1988) Nature 335, 563-564) 및 이의 최소 활성화 도메인의 재조합 4량체 반복체를 사용하여 달성되었다. 유전자 억제 또는 침묵(silencing)은 사람 기원의 3개 이펙터 도메인, 즉 kruppel 연관된 박스(kruppel associated box; KRAB)(참조: Margolin, J. F., Friedman, J. R., Meyer, W., K.-H., Vissing, H., Thiesen, H.-J. & Rauscher III, F. J. (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91, 4509-4513), ERF 리프레서 도메인(ERF repressor domain; ERD)(참조: Sgouras, D. N., Athanasiou, M. A., Beal, G. J., Jr., Fisher, R. J., Blair, D. G. & Mavrothalassitis, G. J. (1995) EMBO J. 14, 4781-4793) 및 mSIN3 상호작용 도메인(mSIN3 interaction domain; SID)(참조: Ayer, D. E., Laherty, C. D., Lawrence, Q. A., Armstrong, A. P. & Eisenman, R. N. (1996) Mol. Cell. Biol. 16, 5772-5781)을 사용하여 달성되었다. 사람 상피 세포를 대상으로 루시퍼라제 리포터 유전자 검정을 사용한 결과, 수득한 데이터는 원-종양유전자 erbB-2/HER-2의 프로모터를 표적으로 하도록 설계된 인공 전사 조절인자가 특정한 방식으로 유전자 발현을 억제하거나 활성화할 수 있음을 보여준다. 최초로 유전자 활성화 또는 억제가 유전자 전사물 내의 표적화에 의해 달성되었으며, 이는 발현된 서열 태그(EST)로부터 수득한 정보가 유전자 스위치의 작제에 충분할 수 있음을 시사한다. 본원에 기술된 신규한 방법 및 재료는 유전자 요법, 유전자전이된(transgenic)된 유기체, 기능적 게놈학, 및 세포 및 분자 생물학의 다른 영역에서의 다양한 응용성을 제시한다.
명세서의 일부를 구성하는 도면에서 도 1(6개의 패널로 나타냄)은 본 발명의 아연 핑거-뉴클레오타이드 결합 폴리펩타이드의 영역의 결합 특이성을 보여준다.
I. 발명
본 발명은 아연 핑거-뉴클레오타이드 결합 폴리펩타이드, 한 개 이상의 이러한 폴리펩타이드를 함유하는 폴리펩타이드, 및 유전자 발현을 조절하기 위한 상기 아연 핑거-뉴클레오타이드 결합 폴리펩타이드 및 이를 하나 이상 함유하는 폴리펩타이드의 용도를 제공한다.
II. 화합물
본 발명의 화합물은 GNN 뉴클레오타이드 서열과 결합하여 GNN 뉴클레오타이드 서열의 기능을 조절하는, 분리된 아연 핑거-뉴클레오타이드 결합 폴리펩타이드이다. 폴리펩타이드는 유전자의 전사를 증가 또는 억제시킬 수 있으며 DNA 또는 RNA와 결합할 수 있다. 아연 핑거-뉴클레오타이드 결합 폴리펩타이드는 야생형 아연 핑거 단백질의 유도체화된 형태, 또는 재조합을 통해 생성된 것인 폴리펩타이드를 가리킨다. 폴리펩타이드는 예를 들면 한 단백질로부터의 아연 핑거 도메인이 다른 제2 단백질의 아연 핑거 도메인에 연결된 하이브리드일 수 있다. 도메인은 야생형이거나 돌연변이화된 것일 수 있다. 폴리펩타이드는 야생형 아연 핑거 단백질의 절두된(truncated) 형태를 포함한다. 폴리펩타이드를 생성할 수 있는 아연 핑거 단백질의 예로는 TFIIIA 및 zif268을 들 수 있다.
본 발명의 아연 핑거-뉴클레오타이드 결합 폴리펩타이드는 이의 α-나선 도메인내의 독특한 7량체(7개 아미노산 잔기의 연속 서열)를 포함하는데, 그 7량체 서열은 표적 뉴클레오타이드에 대한 결합 특이성을 결정한다. 이 7량체 서열은 α-나선 도메인내 어느 곳이든 위치할 수 있으나 7량체가 잔기의 번호를 본 분야에서 통상적으로 지정하는 바와 같이 위치 -1에서 위치 6까지 확장되어 있는 것이 바람직하다. 본 발명의 폴리펩타이드는 본 분야에서 아연 핑거 단백질의 일부로서 작용하는 것으로 알려진 어떠한 β-시트 및 골격 서열을 포함할 수 있다. 많은 아연 핑거-뉴클레오타이드 결합 폴리펩타이드가 제조되어 GNN 삼중자(triplet)를 함유한 표적 뉴클레오타이드에 대한 결합 특이성에 대해 시험되었다. 이들 연구의 결과는 도 1에 요약되어 있다. 도 1에서, 각 펩타이드에 대한 GNN 삼중자 결합 특이성은 우측 컬럼에 기록되어 있고 최고의 특이성은 우선적으로 진하게 나타내었다. 도 1에서, 서열 번호는 괄호안에 표기되어 있다. 각각의 특정 GNN(예: 도 1의 우측 컬럼에 기재된 GAA) 표적의 경우, 서열은 그 삼중자에 대한 특이성이 감소하는 순서로 수록되어 있다.
도 1에 도시된 데이터는 주요 DNA 접촉 위치중 모두 세 개(-1, 3 및 6)의 두드러진 보존이 주어진 표적의 실질적인 모든 클론에 대해 관찰되었음을 보여준다. 비록 이들 잔기중 다수가 훨씬 덜 완전한 라이브러리로 선별 후 상기 위치에서 이전에 관찰되었지만, 여기에서 관찰된 보존의 정도는 초기 연구에 비해 현저한 향상을 나타낸다(참조: Choo, Y. & Klug, A. (1994) Proc Natl Acad Sci USA 91, 11163-7, Greisman, H. A. & Pabo, C. O. (1997) Science (Washington, D. C.) 275, 657-661, Rebar, E. J. & Pabo, C. O. (1994) Science (Washington, D. C., 1883-) 263, 671-3, Jamieson, A. C., Kim, S.-H. & Wells, J. A. (1994) Biochemistry 33, 5689-5695, Jamieson, A. C., Wang, H. & Kim, S.-H. (1996) PNAS 93, 12834-12839., Wu, H., Yang, W.-P. & Barbas III, C. F. (1995) PNAS 92, 344-348). 본 발명은 아연 핑거 도메인의 세 개 나선 위치 -1, 3 및 6이 그 도메인의 DNA 결합 특이성에 대한 상세한 설명을 인정하기에 충분하다는 선행 기술의 교시가 옳지 않음을 제시한다.
전형적으로, 파아지 선별은 상기 위치중 단지 하나 또는 두 개 위치에서만 보존성 선별(consensus selection)을 보여주었다. Zif268/DNA 구조에서 염기 접촉이 이루어지지 않는 위치 1 및 5의 잔기에서 가장 큰 서열 변이가 발생했는데, 이는 인식에 유의적으로 기여하지 않는 것으로 예측되었다(참조: Pavietich, N. P. & Pabo, C. O. (1991) Science (Washington, D. C., 1883-) 252, 809-17, Elrod-Erickson, M., Rould, M. A., Nekludova, L. & Pabo, C. O. (1996) Structure (London) 4, 1171-1180). 위치 1 및 5에서의 변이는 또한 다른 위치에서의 보존이 이들과 DNA와의 상호작용에서 기인한 것이며 단순히 다른 이유로 인한 단일 클론의 우연한 증폭에서 기인한 것이 아님을 내포한다. 위치 2에서 잔기 동일성의 보존이 또한 관찰되었다. 위치 -2의 보존은 어느 정도 인위적이다. NNK 라이브러리는 이 잔기를 세린으로 고정해 놓았다. 이 잔기는 Zif268 구조에서 DNA 골격과 접촉한다. 양 라이브러리는 이 도메인의 폴딩을 안정화하는 소수성 코어에서 중요한 잔기로서 위치 4에 불변 류신을 함유한다.
인상적인 아미노산 보존이 상이한 표적에서 동일한 뉴클레오타이드의 인식에 대해 관찰되었다. 예를 들면, 위치 3의 Asn(Asn3)은 GAG, GAA, GAT 또는 GAC에 상관없이 실질적으로 항상 중간 위치의 아데닌을 인식하도록 선택된다. Gln-1 및 Arg-1은 정황에 상관없이 3' 위치에서 각각 아데닌 또는 구아닌을 인식하도록 선택된다. Gln 또는 Asn에 의한 아데닌의 아미드 측쇄에 의거한 인식은 3' 또는 5' 구아닌과의 구아닌 접촉에 대한 Arg 구아니디늄 측쇄와 마찬가지로 구조 연구에서 익히 증명되었다(참조: Elrod-Erickson, M., Benson, T. E. & Pabo, C. O. (1998) Structure (London) 6, 451-464, Kim, c. A. & Berg, J. M. (1996) Nature Structural Biology 3, 940-945., Fairall, L., Schwabe, J. W. R., Chapman, L., Finch, J. T. & Rhodes, D. (1993) Nature (London) 366, 483-7). 그러나, 보다 빈번히 두 개 또는 세 개 아미노산이 뉴클레오타이드를 인식하도록 선택된다. His3 또는 Lys3 (그리고 보다 적은 정도로 Gly3)은 중간 구아닌을 인식하도록 선택된다. Ser3 및 Ala3은 중간 티민을 인식하도록 선택된다. Thr3, Asp3 및 Glu3은 중간 시토신을 인식하도록 선택된다. Asp 및 Glu는 또한 위치 -1번에서 3' 시토신을 인식하도록 선택되는 반면, Thr-1 및 Ser-1은 3' 티민을 인식하도록 선택된다.
선별된 Zif268 변이체들은 세균 발현 벡터내로 서브클로닝되어 단백질을 과발현시킨다(핑거-2 단백질, 이하 이들 단백질이 작동하는 아부위라 한다). 파아지-융합 보다 가용성 단백질을 연구하는 것이 중요한데 그 이유는 양자가 그들의 결합 특징이 상당히 다를 수 있는 것으로 알려져 있기 때문이다(참조: Crameri, A., Cwirla, S. & Stemmer, W. P. (1996) Nat. Med. 2, 100-102). 단백질들은 다수-표적 ELISA 검정을 사용하여 16개 5'-GNN-3' 핑거-2 아부위 각각을 인식하는 능력에 대해 시험되었다. 9개 뉴클레오타이드 표적중 단지 한 개의 뉴클레오타이드만이 "특이적" 부위와 상이한 6개의 "비-특이적" 부위가 항상 존재하기 때문에, 이 검정은 특이성에 대해 아주 활발한 시험을 제공한다. 파아지-선별된 핑거-2 단백질중 다수가 예민한 특이성을 나타낸 한편, 다른 것들은 다양한 정도의 교차반응성을 나타낸다. 일부 폴리펩타이드는 이들을 선택하기 위한 아부위보다 다른 아부위에 실제로 보다 양호하게 결합한다.
부위 지시된 돌연변이유발을 이용하여 인식 나선을 변형시킴으로써 결합 특이성을 향상시키려는 시도가 있었다. 본 발명자들의 선별 및 구조 정보로부터의 데이터가 돌연변이 설계의 지표가 되었다. 지금까지 실시된 가장 소모적인 연구로서, 인식의 규칙에 대한 본 발명자들의 이해를 넓히고자 하는 노력으로 100개 이상의 돌연변이 단백질의 특징을 확인하였다. 비록 나선 위치 1 및 5가 DNA 인식에 직접적인 역할을 하는 것으로 예상되지 않지만, 특이성에 있어서의 가장 양호한 개선에는 항상 그들 위치에서의 변형이 연루된다. 이들 잔기는 비-서열 특이적 방식으로 친화성에 기여하는 포스페이트 골격 접촉이 이루어지는 것으로 관찰되어왔다. 비-특이적 접촉의 제거는 복합체의 전체 안정성에 대한 특정 접촉의 중요성을 높여주며 이에 의해 특이성을 증대시킨다. 예를 들면, 표적 삼중자 GAC, GAA 및 GAG에 대한 폴리펩타이드의 특이성은 위치 1 및 5의 비전형적인 하전 잔기를 보다 작은 비하전 잔기로 단순히 치환시킴으로써 향상되었다.
또 다른 부류의 변형은 결합 및 비-결합 잔기 모두에 있어서의 변화를 포함한다. GGG 및 핑거-2 아부위 GAG에 대한 폴리펩타이드의 교차반응성은 변형 His3Lys 및 Thr5Val에 의해 제거되었다. 비록 Lys3이 보다 양호한 A 및 G의 식별력을 제공할 지라도 His3이 작동 동안에 중간 구아닌을 인식하도록 예외 없이 선별되었다는 것은 흥미로운 일이다. 이것은 이 단백질에 대한 작동 조건이 특이성에 비해 친화성과 같은 변수에 의한 선별에 호의적임을 시사한다. Zif268 구조에서 His3은 중간 구아닌의 N7에 수소 결합을 제공한다(참조: Pavletich, N. P. & Pabo, C. O. (1991) Science (Washington, D. C., 1883-) 252, 809-17, Elrod-Erickson, M., Rould, M. A., Nekludova, L. & Pabo, C. O. (1996) Structure (London) 4, 1171-1180). 이 결합은 또한 아데닌의 N7과 이루어질 수 있으며 사실 Zif268은 이 위치에서 G와 A를 식별하지 못한다(참조: Swirnoff, A. H. & Milbrandt, J. (1995) Mol. Cell. Biol. 15, 2275-87). 비록 Lys3이 GGC 및 GGT에 대해 작동하는 동안에 선별되었을 지라도 His3은 GGA, GGC 및 GGT를 표적으로 하는 폴리펩타이드에서 단지 중간의 구아닌만을 특정하는 것으로 밝혀졌다. 유사하게, GTG를 표적으로 하는 폴리펩타이드의 다수 교차반응성은 변형 Lys1Ser 및 Ser3Glu에 의해 약독화되어 결과적으로 친화성이 5배 상실되었다. Glu3은 Zif268의 결합 부위 선별 연구에서 시토신에 대해 아주 특이적인 것으로 밝혀졌다(참조: Swirnoff, A. H. & Milbrandt, J. (1995) Mol. Cell. Biol. 15, 2275-87). 어떠한 구조 연구도 Glu3과 중간 티민의 상호작용을 제시한 바 없으며 Glu3은 본 발명자의 연구나 기타 다른 어떠한 연구에서도 중간 티민을 인식하도록 결코 선택되지 않았다(참조: Choo, Y. & Klug, A. (1994) Proc Natl Acad Sci USA 91, 11163-7, Greisman, H. A. & Pabo, C. O. (1997) Science (Washington, D.C.) 275, 657-661, Rebar, E. J. & Pabo, C. O. (1994) Science (Washington, D.C., 1883-) 263, 671-3, Jamieson, A. C., Kim, S.-H. & Wells, J. A. (1994) Biochemistry 33, 5689-5695, Jamieson, A. C., Wang, H. & Kim, S.-H. (1996) PNAS 93, 12834-12839, Isalan, M., Klug, A. & Choo, Y. (1998) Biochemistry 37, 12026-33, Wu, H., Yang, W.-P. & Barbas III, C. F. (1995) PNAS 92, 344-348). 이러한 상황에도 불구하고 Ser3Glu 변형은 시토신보다 중간 티민의 인식을 선호한다. 이들 예는 특이성의 기초가 되는 구조 요소를 이해하기 위해 이전의 구조 및 선별 데이터에 의존하는 데에는 한계가 있음을 입증한다. 또한, 위치 1 및 5에서의 변형에 의한 개선은 전형적으로 단지 위치 -1, 2, 3 및 6만을 고려하는 현 "인식 코드" (참조: Desjarlais, J. R. & Berg, J. M. (1992) Proc Natl Acad Sci USA 89, 7345-9. Suzuki, M., Gerstein, M. & Yagi, N. (1994) Nucleic Acids Res. 22, 3397-405, Choo, Y. & Klug, A. (1997) Curr. Opin. Struct. Biol. 7, 117-125)에 의해 예견될 수 없었다는 점이 강조되어야 한다. 단지 선별 및 부위 지시된 돌연변이유발의 조합에 의해서만이 본 발명자는 복잡한 아연 핑거/DNA 인식을 충분히 이해할 수 있다.
조합된 선별 및 돌연변이유발 데이터로부터, 많은 뉴클레오타이드의 특이적 인식이 단일 아미노산 보다는 모티프를 사용하여 최상으로 달성될 수 있는 것으로 드러났다. 예를 들면, 3' 구아닌의 최상의 특정화는 Arg-1, Ser1 및 Asp2(RSD 모티프)의 조합을 사용하여 달성되었다. 5' 구아닌을 특정하기 위해 Val5 및 Arg6을 사용함으로써 아부위 GGG, GAG, GTG 및 GCG의 인식은 단지 위치 3 잔기(GGG의 경우 Lys3, GAG의 경우 Asn3, GTG의 경우 Glu3 및 GCG의 경우 Asp3)만이 상이한 공통된 나선 구조(SRSD-X-LVR)를 사용하여 달성될 수 있었다. 유사하게, 3' 티민은 최종 클론(TSG 모티프)에서 Thr1, Ser1 및 Gly2를 사용하여 특정되었다. 게다가, 3' 시토신은 아부위가 GCC일 때를 제외하고(이 아부위에 의해 Pro1은 허용되지 않았다) Asp-1, Pro1 및 Gly2(DPG 모티프)를 사용하여 특정될 수 있었다. 3' 아데닌의 특정화는 두 개 클론(QSS 모티프)에서 Gln-1, Ser1, Ser2로 달성되었다. 모티프의 위치 1 및 2의 잔기가 3' 염기의 각각에 대해 연구되었고 본원에 기술된 바와 같이 주어진 3' 염기에 대해 최적의 특이성을 제공하는 것으로 밝혀졌다.
다수-표적 ELISA 검정은 모든 단백질이 Arg6을 함유하고 이 잔기는 구조 연구로부터 이 위치에서 구아닌과 접촉하는 것으로 알려져 있기 때문에 5' 위치에서 구아닌을 선호한 것으로 가정하였다(참조: Pavletich, N. P. & Pabo, C. O. (1991) Science (Washington, D. C., 1883-) 252, 809-17, Elrod-Erickson, M., Rould, M. A., Nekludova, L. & Pabo, C. O. (1996) Structure (London) 4, 1171-1180, Elrod-Erickson, M., Benson, T. E. & Pabo, C. O. (1998) Structure (London) 6, 451-464, Kim, C. A. & Berg, J. M. (1996) Nature Structural Biology 3, 940-945), Pavletich, N. P. & Pabo, C. O. (1993) Science (Washington, D. C., 1883-) 261, 1701-7, Houbaviy, H. B., Usheva, A., Shenk, T. & Burley, S. K. (1996) Proc Natl Acad Sci USA 93, 13577-82, Fairall, L., Schwabe, J. W. R., Chapman, L., Finch, J. T. & Rhodes, D. (1993) Nature (London) 366, 483-7, Wuttke, D. S., Foster, M. P., Case, D. A., Gottesfeld, J. M. & Wright, P. E. (1997) J. Mol. Biol. 273, 183-206, Nolte, R. T., Conlin, R. M., Harrison, S. C. & Brown, R. S. (1998) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 95, 2938-2943). 이 상호작용은 5' 결합 부위 시그니처 검정(참조: Choo, Y. & Klug, A. (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 91, 11168-72); 도 2, 백색 막대)을 사용하여 입증되었다. 각 단백질은 핑거-2 아부위의 5' 뉴클레오타이드가 G, A, T 또는 C로서 고정되고 중간 및 3' 뉴클레오타이드는 무작위로된 16개 올리고뉴클레오타이드 표적의 풀에 적용 되었다. 모든 단백질은 거의 교차반응성이 없는 GNN 풀을 선호한다.
다수-표적 ELISA 검정의 결과는 정제된 단백질의 친화성 연구에 의해 검증되었다. 교차반응성이 ELISA 검정에서 최소인 경우에, 단일 뉴클레오타이드 미스매치는 전형적으로 100배 이상의 친화성 손실을 초래한다. 이러한 특이성 정도는 아연 핑거 단백질을 사용해서는 아직 입증되지 않았다. 일반적으로, 중간 및 3' 위치에서 G 또는 A를 갖는 아부위와 결합하도록 선택 또는 설계된 단백질은 최고의 친화성을 나타냈으며 그 다음으로는 중간 또는 3' 위치에서 단지 하나의 G 또는 A만을 가진 것, 그 다음으로는 단지 T 또는 C만을 가진 것이 높은 친화성을 나타내었다. 전자 그룹은 전형적으로 Zif268(10 nM)보다 높은 친화성으로 그들의 표적에 결합하였고 후자 그룹은 어느 정도 낮은 친화성을 나타냈으며, 거의 모든 단백질은 모 C7 단백질 보다 낮은 친화성을 나타냈다. 결합 친화성과 결합 특이성 사이에는 상호관련이 없는데, 이는 특이성이 특이적 단백질-DNA 접촉뿐만 아니라 거의 정확한 뉴클레오타이드를 배제하는 상호작용에서 기인할 수 있음을 시사한다.
Asp2는 표적 아부위가 GNG인 모든 단백질에서 Arg-1과 동시-선별되었다. 현재는 이에 대해 두 가지 이유가 있는 것으로 이해되고 있다. Zif268의 구조 연구(참조: Pavietich, N. P. & Pabo, C. O. (1991) Science (Washington, D. C., 1883-) 252, 809-17, Elrod-Erickson, M., Rould, M. A., Nekludova, L. & Pabo, C. O. (1996) Structure (London) 4, 1171-1180)로부터, 핑거 2의 Asp2는 Arg-1과 한 쌍의 보강 수소 결합을 이루어 Arg-1/3' 구아닌 상호작용뿐만 아니라 물-매개된 접촉을 안정화시킨다. 그러나, Asp2의 카복실레이트는 또한 핑거-1 아부위의 5' 구아닌과 염기 쌍을 이루고 있는 시토신의 N4로부터 수소 결합을 허용한다. 이 위치에서 T와 염기 쌍을 이룬 아데닌은 시토신과 마찬가지로 유사한 접촉을 이룰 수 있다. 이 상호작용은 특히 중요한데 그 이유는 이 상호작용이 핑거 2의 인식 아부위를 3개 뉴클레오타이드(GNG)에서 4개 뉴클레오타이드(GNG(G/T))로 확장시키기 때문이다(참조: Isalan, M., Choo, Y. & Klug, A. (1997) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 94, 5617-5621., Jamieson, A. C., Wang, H. & Kim, S.-H. (1996) PNAS 93, 12834-12839, Isalan, M., Klug, A. & Choo, Y. (1998) Biochemistry 37, 12026-33). 이 현상을 "표적 부위 중복"이라고 하며 이는 세 가지 중요한 의미를 갖는다. 첫째, Asp2는 본 발명자들의 핑거-1 아부위가 5' 구아닌을 함유하기 때문에 핑거-2 아부위가 GNG일 때 본 발명자들의 라이브러리에 의한 선별에 선호된다. 둘째, Asp2는 GNN 또는 TNN 핑거-2 아부위에 대한 선택을 연구하는데 사용되는 상기 라이브러리의 용도를 제한할 수 있는데, 그 이유는 이들 라이브러리의 핑거 3이 핑거-2 아부위의 5' 뉴클레오타이드가 G 또는 T로 특정되도록 보조할 수 있는 Asp2를 함유하기 때문이다. 핑거 2에서 Thr6을 갖는 Zif268 및 C7에서, 핑거 3의 Asp2는 5' 위치 (T/G)GG에서 G 또는 T 인식을 강화시켜 준다. 이 상호작용은 또한 한결같이 Zif268 계 라이브러리를 사용한 종래의 파아지 디스플레이 연구가 주로 GNN 인식에 한정된 선별을 발견한 이유를 설명할 수 있다(참조: Choo, Y. & Klug, A. (1994) Proc Natl Acad Sci USA 91, 11163-7, Rebar, E. J. & Pabo, C. O. (1994) Science (Washington, D. C., 1883-) 263, 671-3, Jamieson, A. C., Kim, S.-H. & Wells, J. A. (1994) Biochemistry 33, 5689-5695, Jamieson, A. C., Wang, H. & Kim, S.-H. (1996) PNAS 93, 12834-12839, Isalan, M., Klug, A. & Choo, Y. (1998) Biochemistry 37, 12026-33, Wu, H., Yang, W.-P. & Barbas III, C.F. (1995) PNAS 92, 344-348).
마지막으로, 표적 부위 중복은 잠재적으로 모듈적인 빌딩 블록으로서 그들 아연 핑거의 사용을 제한한다. 구조 데이터로부터 GL1 및 YY1에서와 같이 표적 부위 중복이 아주 광범위한 아연 핑거와, 이와는 다르게 Zif268과 유사하고 단지 약간의 중복만을 나타내는 아연 핑거가 있는 것으로 알려져 있다. 본 발명자들의 최종 단백질 세트의 경우, Asp2는 GGG, GAG, GTG 및 GCG와 결합하는 폴리펩타이드에서 발견된다. 위치 2에서 발견된 다른 잔기에 대해 잠재적인 중복은 대체로 알려지지 않고 있으나 구조 연구에 따르면 이 위치에서 발견된 많은 다른 잔기가 교차-아부위 접촉에 참여할 수 있는 것으로 나타난다. Asp2를 함유한 핑거는 이들이 각 GNG 아부위에 이어서 T 또는 G를 요구하기 때문에 모듈 방식을 제한할 수 있다.
하기 표 1은 GNN 표적 삼중자의 16가지 양태에 대한 최고의 선택성을 나타내는 서열(서열 1 내지 16)을 요약한 것이다.
Figure 112001008576405-pct00001
상기 데이터는 모든 가능한 GNN 삼중자 서열이 아연 핑거 도메인에 의해 정교한 특이성으로 인식될 수 있음을 보여준다. 최적화된 아연 핑거 도메인은 단일 염기 차이를 100배 이상의 친화성 감소로 식별할 수 있다. 주요 접촉 위치 -1, 3 및 6번에서 최적화된 단백질에서 발견된 아미노산중 다수가 간단한 인식 코드와 일치하지만, 최적의 특이적 인식이 그들 잔기가 제공되는 환경에 민감한 것으로 밝혀졌다. 위치 1, 2 및 5번의 잔기는 특이적 인식에 중요한 것으로 밝혀졌다. 게다가, 상기 데이터는 위치 1번 잔기의 단순한 동일성 보다는 위치 -1, 1 및 2에서의 서열 모티프가 3' 염기의 고도의 특이적 인식에 필요하다는 것을 최초로 입증한다. 이들 잔기는 특이적 염기의 인식 및 다른 염기의 배제 측면 모두에서 나선의 상호작용에 대한 적절한 입체화학 환경을 제공하는 듯 하지만, 최종 결과는 고도의 특이적인 상호작용이다. 이들 도메인의 광범위한 이용은 이들이 DNA 및 다른 아연 핑거 도메인과의 상호작용을 조절하는 경우에 실현될 것이다. 이것은 표적 부위 중복에 의해 부과될 수 있는 한계내에서 조작함으로써 달성될 수 있는데, 다시 말하면 5'-(GNN)n-3' 유형의 서열이 표적되어야 한다. 그런 다음 공개된 도메인의 신속한 재조합은 단백질의 형성에 파아지 디스플레이 라이브러리의 개발 필요성을 배제하면서 규명된 특이성의 폴리닥틸 단백질의 형성을 가능케 한다. 이들 폴리닥틸 단백질은 생존 세포에서 사람 erbB-2 프로모터에 의해 유도된 전사를 활성화하고 억제하는데 사용되어 왔다. 본원에 기술된 아연 핑거 도메인의 계열은 DNA 서열의 5'-(GNN)6-3' 계열과 결합하는 166개 또는 1.7×107개의 새로운 단백질을 작제하는데 충분할 것이다.
아연 핑거-뉴클레오타이드 결합 폴리펩타이드 유도체는 절단 또는 확장에 의해 야생형 아연 핑거 단백질로부터 유도 또는 생성될 수 있거나, 부위 지시된 돌연변이유발의 방법 또는 이들 방법의 조합에 의해 야생형-유래된 폴리펩타이드의 변이체로서 유도 또는 생성될 수 있다. 용어 "절두된"은 천연 아연 핑거 결합 단백질에서 발견된 아연 핑거의 전체 수보다 이를 적게 함유하거나 불필요한 서열이 제거된 아연 핑거-뉴클레오타이드 결합 폴리펩타이드를 가리킨다. 예를 들면, 천연적으로 9개의 아연 핑거를 함유하는 아연 핑거-뉴클레오타이드 결합 단백질 TFIIIA의 절단은 단지 아연 핑거 1 내지 3만을 가진 폴리펩타이드일 수 있다. 확장은 추가의 아연 핑거 모듈이 부가된 아연 핑거 폴리펩타이드를 가리킨다. 예를 들면, TFIIIA는 3개의 아연 핑거 도메인을 부가함으로써 12개의 핑거로 확장될 수 있다. 또한, 절두된 아연 핑거-뉴클레오타이드 결합 폴리펩타이드는 1개 이상의 야생형 폴리펩타이드로부터의 아연 핑거 모듈을 포함할 수 있으며 이에 따라 "하이브리드" 아연 핑거-뉴클레오타이드 결합 폴리펩타이드가 생성된다.
용어 "돌연변이유발된"은 단백질을 암호화하는 DNA의 무작위 또는 부위 지시된 돌연변이유발을 달성하는 모든 공지 방법을 실시함으로써 수득된 아연 핑거 유도된-뉴클레오타이드 결합 폴리펩타이드를 가리킨다. 예를 들면, TFIIIA에서 돌연변이유발을 실시하여 컨센서스 서열의 반복체 하나 이상중 비보존된 잔기를 치환시킬 수 있다. 절두된 아연 핑거-뉴클레오타이드 결합 단백질을 또한 돌연변이유발시킬 수 있다.
아연 핑거-뉴클레오타이드 결합 모티프를 함유한 뉴클레오타이드 서열의 기능을 억제하기 위해 본 발명에 따라 절두, 확장 및/또는 돌연변이유발될 수 있는 공지된 아연 핑거-뉴클레오타이드 결합 폴리펩타이드의 예로는 TFIIIA 및 zif268이 포함된다. 다른 아연 핑거-뉴클레오타이드 결합 단백질이 당업자에게 공지되어 있다.
본 발명의 폴리펩타이드는 본 분야에 잘 알려진 여러 표준 기술을 이용하여 제조할 수 있다(참조: 1995년 1월 18일 출원된 미국 특허원 제08/676,318호, 이의 전체 내용은 본원에 참고로 인용된다). 아연 핑거 단백질의 파아지 디스플레이 라이브러리는 서열 특이적 단백질의 집적을 유리하게 하는 조건하에서 형성되고 선별되었다. 많은 서열을 인식하는 아연 핑거 도메인은 파아지 선별 데이터 및 구조 정보 둘 다에 의해 유도된 부위 지시된 돌연변이유발에 의해 세밀한 구별을 필요로 한다.
쥐 Cys2-His2 아연 핑거 단백질 Zif268은 파아지 디스플레이 라이브러리의 작제에 사용된다(참조: Wu, H., Yang, W.-P. & Barbas III, C. F. (1995) PNAS 92, 344-348). Zif268은 아연-핑거 단백질중 구조적으로 가장 잘 특징이 확인되어 있다(참조: Pavletich, N. P. & Pabo, C. O. (1991) Science (Washington, D. C., 1883-) 252, 809-17, Elrod-Erickson, M., Rould, M. A., Nekludova, L. & Pabo, C. O. (1996) Structure (London) 4, 1171-1180, Swirnoff, A. H. & Milbrandt, J. (1995) Mol. Cell. Biol. 15, 2275-87). 이 단백질의 3개 아연 핑거 도메인 각각에서 DNA 인식은 DNA의 일본쇄상에서 주요 3개 뉴클레오타이드와 접촉하는 α-나선의 N-말단에 존재하는 잔기에 의해 매개된다. 이러한 3개 핑거 단백질에 대한 오퍼레이터 결합 부위는 5'-GCGTGGGCG-3'이다(핑거-2 아부위는 밑줄로 표시되어 있다). Zif268 및 다른 연관된 아연 핑거-DNA 복합체의 구조 연구(참조: Elrod-Erickson, M., Benson, T. E. & Pabo, C. O. (1998) Structure (London) 6, 451-464, Kim, C. A. & Berg, J. M. (1996) Nature Structural Biology 3, 940-945, Pavletich, N. P. & Pabo, C. O. (1993) Science (Washington, D. C., 1883-) 261, 1701-7, Houbaviy, H. B., Usheva, A., Shenk, T. & Burley, S. K. (1996) Proc Natl Acad Sci USA 93, 13577-82, Fairall, L., Schwabe, J. W. R., Chapman, L., Finch, J. T. & Rhodes, D. (1993) Nature (London) 366, 483-7, Wuttke, D. S., Foster, M. P., Case, D. A., Gottesfeld, J. M. & Wright, P. E. (1997) J. Mol. Biol. 273, 183-206., Nolte, R. T., Conlin, R. M., Harrison, S. C. & Brown, R. S. (1998) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 95, 2938-2943, Narayan, V. A., Kriwacki, R. W. & Caradonna, J. P. (1997) J. Biol. Chem. 272, 7801-7809)는 α-나선상의 주요 3개 위치 -1, 3 및 6번의 잔기가 특이적 염기 접촉에 연루되어 있음을 보여준다. 전형적으로, α-나선의 위치 -1번 잔기는 핑거 아부위의 3' 염기와 접촉하는 한편 위치 3 및 6번은 각각 중간 염기 및 5' 염기와 접촉한다.
서열의 5'-GNN-3' 서브세트를 인식하는 아연 핑거 도메인의 계열을 선별하기 위해, 고도로 다양한 2개의 아연 핑거 라이브러리가 파아지 디스플레이 벡터 pComb3H에서 작제되었다(참조: Barbas III, C. F., Kang, A. S., Lerner, R. A. & Benkovic, S. J. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88, 7978-1982., Rader, C. & Barbas III, C. F. (1997) Curr. Opin. Biotechnol. 8, 503-508). 양 라이브러리는 Zif268의 변이체인 C7의 핑거 2의 α-나선내의 잔기의 무작위화를 수반한다(참조: Wu, H., Yang, W.-P & Barbas III, C. F. (1995) PNAS 92, 344-348). 라이브러리 1은 NNK 도핑(doping) 전략을 이용한 위치 -1, 1, 2, 3, 5 및 6번의 무작위화에 의해 작제되지만, 라이브러리 2는 VNS 도핑 전략을 이용한 위치 -2, -1, 1, 2, 3, 5 및 6번의 무작위화에 의해 작제된다. NNK 도핑 전략은 32개 코돈내에서 모든 아미노산 조합을 가능케 하는 한편, VNS는 이의 24개 코돈 세트에서 Tyr, Phe, Cys 및 모든 정지 코돈을 배제한다. 라이브러리는 각각 4.4 x 109 및 3.5 x 109으로 구성되었으며, 각각은 5'-GCGNNNGCG-3' 유형의 서열을 인식할 수 있다. NNK 라이브러리가 99% 신뢰도로 조사될 수 있어 NNK 라이브러리의 크기가 확인되었지만, VNS 라이브러리는 고도로 다양하여 어느 정도 불완전하다. 그러나, 이들 라이브러리는 이전에 보고된 아연 핑거 라이브러리(참조: Choo, Y. & Klug, A. (1994) Proc Natl Acad Sci USA 91, 11163-7, Greisman, H. A. & Pabo, C. O. (1997) Science (Washington, D. C.) 275, 657-661. 23, Rebar, E. J. & Pabo, C. O. (1994) Science (Washington, D. C., 1883-) 263, 671-3, Jamieson, A. C., Kim, S.-H. & Wells, J. A. (1994) Biochemistry 33, 5689-5695, Jamieson, A. C., Wang, H. & Kim, S.-H. (1996) PNAS 93, 12834-12839, Isalan, M., Klug, A. & Choo, Y. (1998) Biochemistry 37, 12026-33)보다 상당히 크다. 용액 결합 프로토콜을 이용하여 16 5'-GCGGNNGCG-3' 바이오티닐화 헤어핀 DNA 표적 각각으로 아연 핑거 디스플레이-파아지에 대해 7회의 선별을 실시한다. 각 회에서 경쟁자 DNA를 첨가하여 엄중성(stringency)을 증가시킨다. DNA에 비특이적으로 결합된 파아지에 대한 선별을 위해 전단된 청어 정자 DNA가 준비되었다. 특이적 경쟁자로서 5'-GCGNNNGCG-3' 유형의 DNA를 제공함으로써 서열 특이성에 대한 엄중 선별 압력이 수득되었다. 바이오티닐화 표적에 비하여 단일 또는 이중 염기 변화를 갖는 DNA와의 결합에 대해 훨씬 더 엄중 선별을 제공하기 위해 5'-GCGGNNGCG-3' 유형의 과량 DNA를 부가한다. 단일 바이오티닐화 DNA 표적 서열에 결합한 파아지는 스트렙타비딘 피복된 비드를 사용하여 회수한다. 일부 경우에는 선별 과정을 반복한다. 현 데이터는 이들 도메인이 기능적으로 모듈이 되며 서로 조합되어 나노몰 이하의 친화성으로 18-bp 서열과 결합할 수 있는 폴리닥틸 단백질을 형성할 수 있음을 보여준다. 본원에 기술된 아연 핑거 도메인의 계열은 DNA 서열의 5'-(GNN)6-3' 계열과 결합하는 17×107개의 새로운 단백질을 작제하기에 충분하다.
본 발명은 아연 핑거-뉴클레오타이드 결합 폴리펩타이드를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 천연, 절두된 및 확장된 폴리펩타이드를 포함하여 본 발명의 아연 핑거-뉴클레오타이드 결합 폴리펩타이드를 암호화하는 DNA 서열은 여러가지 방법에 의해 수득될 수 있다. 예를 들면, DNA는 본 분야에 잘 알려진 하이브리드화 절차를 이용하여 분리할 수 있다. 이들 절차는 이로써 한정되는 것은 아니지만 (1) 게놈 또는 cDNA 라이브러리에 프로브를 하이브리드화하여 공유된 뉴클레오타이드 서열을 검출하고, (2) 발현 라이브러리의 항체 스크리닝을 실시하여 공유된 구조 특징을 검출하며, (3) 폴리머라제 연쇄 반응(PCR)에 의해 합성하는 것을 포함한다. 본 발명의 RNA 서열은 본 분야에 공지된 방법에 의해 수득될 수 있다(참조예: Current Protocols in Molecular Biology Ausubel, et al. eds., 1989).
본 발명의 아연 핑거-뉴클레오타이드 결합 폴리펩타이드를 암호화하는 특이적 DNA 서열의 개발은 (1) 게놈 DNA로부터 이본쇄 DNA 서열의 분리, (2) 해당 폴리펩타이드를 위해 필요한 코돈을 제공하기 위한 DNA 서열의 화학적 제조 및 (3) 진핵 공여 세포로부터 분리된 mRNA의 역전사에 의한 이본쇄 DNA 서열의 생체내 합성에 의해 수득될 수 있다. 후자의 경우에, mRNA의 이본쇄 DNA 상보 서열이 궁극적으로 형성되며 이는 일반적으로 cDNA라고 한다. 재조합 절차에 사용하기 위한 특이적 DNA 서열을 개발하는 상기 세가지 방법 가운데 게놈 DNA의 분리가 적어도 공통적이다. 이것은 특히 인트론의 존재로 인해 포유류 폴리펩타이드의 미생물 발현을 수득할 필요가 있을 때 명백하다.
아연 핑거 유도된-DNA 결합 폴리펩타이드를 수득하기 위해, DNA 서열의 합성은 목적하는 폴리펩타이드 산물의 아미노산 잔기의 전체 서열이 알려져 있을 때 흔히 선택할 수 있는 방법이다. 목적하는 폴리펩타이드의 아미노산 잔기의 전체 서열이 알려져 있지 않을 때 DNA 서열의 직접적인 합성은 가능하지 않으며 선택할 수 있는 방법은 cDNA 서열의 형성이다. 해당 cDNA 서열을 분리하기 위한 표준 절차 가운데는 고수준의 유전자 발현을 나타내는 공여 세포에 풍부한 mRNA의 역전사로부터 유도된 플라스미드-보유 cDNA 라이브러리의 형성이 포함된다. 폴리머라제 연쇄 반응 기술과 병용될 때, 희귀 발현 산물도 클로닝될 수 있다. 폴리펩타이드의 아미노산 서열의 상당 부분이 알려져 있는 경우에, 표적 cDNA에 추정적으로 존재하는 서열을 복사하는 표지된 일본쇄 또는 이본쇄 DNA 또는 RNA 프로브 서열의 제조물이, 일본쇄 형태로 변성된 cDNA의 클로닝된 복사물에 대해 실시되는 DNA/DNA 하이브리드화 공정에 사용될 수 있다(참조: Jay, et al., Nucleic Acid Research 11:2325, 1983).
다른 양태로서, 본 발명은 치료학적으로 유효한 양의 아연 핑거-뉴클레오타이드 결합 폴리펩타이드 또는 이를 암호화하는 치료학적으로 유효한 양의 뉴클레오타이드 서열이 약제학적으로 허용되는 담체와 배합된 약제학적 조성물을 제공한다.
조성물, 담체, 희석제 및 시약과 관련하여 본원에 사용된 용어 "약제학적으로 허용되는", "생리학적으로 허용되는" 및 이의 문법적 어미변화체는 상호교환적으로 사용될 수 있으며, 그 물질들은 조성물의 투여를 방해하는 정도로 구토, 현기증, 위장 전도(gastric upset) 등과 같은 바람직하지 않은 생리학적 현상을 일으키지 않고서 사람에게 투여할 수 있음을 나타낸다.
활성 성분이 용해 또는 분산되어 있는 약제학적 조성물의 제조는 본 분야에 잘 알려져 있다. 전형적으로 이와 같은 조성물은 수성 또는 비수성의 액체 용액 또는 현탁액과 같은 멸균 주사제로 제조되거나, 사용하기 전에 액체중의 용액 또는 현탁액에 적합한 고체 형태로도 제조될 수 있다. 또한, 제제는 유화될 수 있다.
활성 성분은 약제학적으로 허용되고 활성 성분과 혼화성인 부형제와 본원에 기술된 치료 방법에 사용하기에 적합한 양으로 혼합할 수 있다. 적합한 부형제의 예로는 물, 염수, 덱스트로즈, 글리세롤, 에탄올, 이들의 혼합물 등이 포함된다. 또한, 필요한 경우, 조성물은 활성 성분의 효능을 증가시키는 소량의 보조 물질, 예를 들면 습윤제, 유화제, pH 조절제 등을 함유할 수 있다.
본 발명의 치료학적 약제 조성물은 본원에 기술된 성분의 약제학적으로 허용되는 염을 포함할 수 있다. 약제학적으로 허용되는 염은 염산 또는 인산과 같은 무기산, 또는 아세트산, 주석산, 만델산 등과 같은 유기산으로 형성되는 산 부가 염(폴리펩타이드의 유리 아미노 그룹과 형성됨)을 포함한다. 유리 카복실 그룹으로 형성된 염은 또한 수산화나트륨, 수산화칼륨, 수산화암모늄, 수산화칼슘 또는 수산화철과 같은 무기 염기, 및 이소프로필아민, 트리메틸아민, 2-에틸아미노 에탄올, 히스티딘, 프로카인 등과 같은 유기 염기로부터 유도될 수 있다.
생리학적으로 허용되는 담체는 본 분야에 잘 알려져 있다. 액체 담체의 예로는 활성 성분 및 물 이외에 어떠한 물질도 함유하지 않는 멸균 수용액 또는 생리학적 pH 값의 완충액(인산나트륨), 생리학적 염수 또는 둘 다(예: 인산염-완충된 염수)를 함유하는 멸균 수용액을 들 수 있다. 또 다른 수성 담체는 완충염뿐만 아니라 염화나트륨 및 염화칼륨, 덱스트로즈, 프로필렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜 및 기타 용질과 같은 염을 하나 이상 함유할 수 있다. 액체 조성물은 또한 물과 함께 또는 물이 없는 액상을 함유할 수 있다. 이와 같은 추가적인 액상의 예로는 글리세린, 식물유(예: 면실유), 유기 에스테르(예: 에틸 올레이트) 및 수-유 에멀젼이 포함된다.
III. 하나 이상의 아연 핑거-뉴클레오타이드 결합 폴리펩타이드를 함유하는 폴리펩타이드
또 다른 양태로서, 본 발명은 5'-(GNN)n-3'(여기서, n은 1 이상의 정수이다)으로 정의된 뉴클레오타이드 표적 모티프에 특이적으로 결합하는 방식으로 작동가능하게 연결된, 다수의 아연 핑거-뉴클레오타이드 결합 폴리펩타이드를 제공한다. 바람직하게는 n은 2 내지 약 6의 정수이다.
아연 핑거-뉴클레오타이드 결합 폴리펩타이드를 연결하는 수단은 하기 실시예뿐만 아니라 1995년 1월 18일에 출원된 미국 특허원 제08/676,318호에 기술되어 있다. 개개의 폴리펩타이드는 바람직하게는 올리고펩타이드 링커와 연결된다. 이 러한 링커는 바람직하게는 천연 아연 핑거 단백질에서 발견되는 링커와 유사하다. 본 발명에 사용하기에 바람직한 링커는 아미노산 잔기 서열 TGEKP(서열 111)이다.
하나 이상의 아연 핑거-뉴클레오타이드 결합 폴리펩타이드를 함유하는 상기 폴리펩타이드 제조의 효능 및 유전자 조절에 있어서의 그들의 용도를 조사하기 위해, 사람 erbB-2 유전자가 모델로서 선택되었다. 이 유전자의 5'-비해독 영역중 18bp 서열을 특이적으로 인식하는 폴리닥틸 단백질은 KRAB, ERD 또는 SID 리프레서 도메인과의 융합에 의해 전사 리프레서로 전환된다. 헤르페스 심플렉스 VP16 활성화 도메인 또는 VP64라고 하는 VP16의 최소 활성화 도메인의 4량체 반복체와의 융합에 의해 전사 활성화인자가 형성된다. 데이터는 유전자 억제 및 활성화 둘 다가 유전자의 전사 영역내의 단일 부위로 설계된 단백질을 표적화시킴으로써 달성될 수 있음을 최초로 보여주었다.
아연 핑거-계 전사 스위치의 개발을 위한 모델 표적으로서 사람 erbB-2 유전자가 선택되었다. ErbB 수용체 계열의 일원은 사람 악성종양의 발달에 중요한 역할을 한다. 특히, erbB-2는 유방, 난소, 폐, 위 및 타액선을 포함한 많은 부위에서 발생하는 고 비율의 사람 선암에서 유전자 증폭 및/또는 전사 탈조절의 결과로서 과발현된다(참조: Hynes, N. E. & Stem, D. F. (1994) Biochim. Biophys. Acta 1198, 165-184). ErbB-2의 증가된 발현은 이의 내인성 티로신 키나제의 구조적 활성화를 유도하며 배양 세포의 형질전환을 일으키는 것으로 제시되어 왔다. 많은 임상 연구는 ErbB-2 발현 수준이 증가된 종양을 갖는 환자가 보다 좋지 않은 징후를 나타낸다는 것을 제시한다(참조: Hynes, N. E. & Stern, D. F. (1994) Biochim. Biophys. Acta 1198, 165-184). erbB-2는 사람 암과 관련되어 있다는 점 이외에, 성인 및 포유류의 배 발생 동안에 생물학적으로 중요한 역할을 한다(참조: Hynes, N. E. & Stern, D. F. (1994) Biochim. Biophys. Acta 1198, 165-184, Altiok, N., Bessereau, J.-L. & Changeux, J.-P (1995) EMBO J. 14, 4258-4266, Lee, K.-F., Simon, H., Chen, H., Bates, B., Hung, M.-C. & Hauser, C. (1995) Nature 378, 394-398).
그러므로, erbB-2 프로모터는 인공 전사 조절인자의 개발에 흥미로운 시험 대상으로 나타난다. 이 프로모터는 상세하게 특징이 확인되었으며 비교적 복합적이고 TATA-의존적 및 TATA-독립적 전사 개시 부위를 함유하는 것으로 제시되었다(참조: Ishii, S., Imamoto, F., Yamanashi, Y., Toyoshima, K. & Yamamoto, T. (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84, 4374-4378). 초기 연구는 폴리닥틸 단백질이 전사를 특이적으로 활성화하거나 억제하는 전사 조절인자로서 작용할 수 있음을 보여주지만, 이들 단백질은 인공 프로모터의 상부스트림에서 단백질 결합 부위의 6개 탠덤 반복체에 결합한다(참조: Liu, Q., Segal, D. J., Ghiara, J. B. & Barbas III, C. F. (1997) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94, 5525-5530). 게다가, 이 연구는 결합 특이성이 변형되지 않은 폴리닥틸 단백질을 이용한다. 여기서, 본 발명자들은 예정된 빌딩 블록으로부터 조립된 폴리닥틸 단백질이 천연 erbB-2 프로모터내의 단일 부위와 결합하는 효능을 시험하였다. 16개 5'-GNN-3' DNA 삼중자 각각과 결합하는 아연 핑거 도메인 계열의 생성 및 특징확인은 상기되어 있다. 본 발명자들이 이 계열의 인식 도메인의 생성에 중점을 둔 이유는 대부분 유기체의 프로모터 영역이 이들의 염기 함량에서 비교적 GC가 풍부하다는데 있다. 따라서, 만일 5'-(GNN)x-3' 부위를 인식하는 단백질이 이 세트의 규정된 아연 핑거 도메인으로부터 쉽게 조립될 수 있다면, 많은 유전자는 신속하고 특이적으로 조절을 위해 표적화될 수 있다. 6개의 아연 핑거 도메인을 함유하고 18bp의 DNA를 인식하는 단백질은 알려진 모든 게놈내에서 단일 어드레스를 규정하기에 충분해야 한다. erbB-2 프로모터 영역의 조사 결과 두 개의 5'-(GNN)6-3' 부위 및 한 개의 5'-(GNN)9-3' 부위가 밝혀졌다. 이들 부위중 하나(본원에서 e2c로 명명)는 erbB-2 유전자의 미해독 영역내에 속하며 유전자-특이적 전사 스위치의 생성을 위한 표적 부위로서 선택되었다. 진뱅크 데이터 염기의 BLAST 서열 유사성 조사로부터 이 서열은 erbB-2에 유일한 것으로 검증되었다. 두 개의 주요 전사 개시 부위의 하부스트림 및 이 근처에 e2c 표적 서열이 위치함으로써 전사 개시 또는 연장의 억제를 통한 억제 시험이 가능하다. e2c 표적 부위의 흥미로운 특징은 사람, 랫트 및 마우스 erbB-2 유전자사이에 보존성이 짧은 신장 서열내에서 발견되었다는 점이다(참조: White, M. R.-A. & Hung, M.-C. (1992) Oncogene 7, 677-683). 따라서, 이 부위의 표적화로 인해 사람의 질병에 적용하기 이전에 동물 모델에서의 전략 연구가 가능할 것이다.
목적하는 DNA-결합 특이성을 갖는 폴리닥틸 단백질을 생성하기 위해 본 연구는 예정된 아연 핑거 도메인의 조립에 초점을 두었으며 이는 그리스만과 파보에 의해 제안된 연속 선별 전략과 대조적이다(참조: Greisman, H. A. & Pabo, C. O. (1997) Science 275, 657-661). 이와 같은 전략은 필요한 각 단백질에 대한 6개 아연 핑거 라이브러리의 연속적인 생성 및 선별을 필요로 하는데, 대부분의 실험실에 이러한 실험 방법의 수용이 불가능하고 많은 시간이 소모될 것이다. 게다가, 이 전략에서 다른 결합 서열에 대한 특이적 음성 선택을 적용하는 것이 어렵기 때문에, 최근에 보고된 바와 같이 비교적 비특이적인 단백질이 생성될 수 있다(참조: Kim, J.-S. & Pabo, C. O. (1997) J. Biol. Chem. 272, 29795-29800).
9bp의 DNA 서열을 인식하는 3개-핑거 단백질을 생성하는데 상이한 두 전략의 일반적인 이용이 연구되었다. 각 전략은 아연 핑거 도메인의 모듈 특성에 기초를 두었고 5'-GNN-3'의 삼중자를 인식하는 아연 핑거 도메인의 계열을 이용한다. 5'-(GNN)6-3' erbB-2 표적 부위 e2c의 반부위(HS) 1 및 2를 인식하는 3개-핑거 단백질 두 가지가 첫 번째 전략에서 PCR 조립 전략을 사용하여 예정된 핑거 2(F2) 도메인 변이체를 함께 융합시킴으로써 형성되었다. 이 방법의 일반성을 조사하기 위해 동일한 방법을 사용하여 5'-(GNN)3-3' 유형의 서열을 인식하는 3개-핑거 단백질을 추가로 3개 더 제조한다. 정제된 아연 핑거 단백질은 말토즈 결합 단백질(MBP)과의 융합물로서 제조되었다. ELISA 분석 결과 연속적으로 연결된 F2 단백질은 일제히 작용하여 목적하는 9-bp DNA 표적 서열을 특이적으로 인식할 수 있는 것으로 드러났다. 제시된 5개 단백질 각각은 표적과 비표적 5'-(GNN)3-3' 서열을 식별할 수 있다.
각 단백질의 표적에 대한 친화성은 전기영동 이동 검정에 의해 결정되었다. 이들 연구로부터 아연 핑거 펩타이드는 Kd 값이 3 내지 70 nM의 범위인 Zif268 및 다른 천연 전사 인자와 비슷한 친화성을 갖고 있는 것으로 입증되었다. 여기서, Zif268의 오퍼레이터에 대한 Kd는 10nM이다. 해명될 이유가 있기 때문에, 한 그룹이 천연 Zif268 단백질의 Kd 값이 6nM 내지 10pM(600배 변이)라고 보고된 바 있음을 주지해야 한다(참조: Pavletich, N. P. & Pabo, C. O. (1991) Science 252, 809-17, Greisman, H. A. & Pabo, C. O. (1997) Science 275, 657-661). 대부분의 연구는 Zif268-DNA 상호작용의 Kd가 3 내지 10nM이라고 보고하였다(참조: Choo, Y. & Klug, A. (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91, 11163-11167, Hamilton, T. B., Borel, F. & Romaniuk, P. J. (1998) Biochemistry 37, 2051-2058). 따라서, 여기에 보고된 결과를 기타 다른 경우에서 보고된 결과와 비교하기 위해, 상대적인 Kd를 비교하여야 한다(돌연변이 Kd)/(Zif268 Kd)(여기서 양 값은 동일한 보고서로부터 유래한 것이다). 현 데이터는 파아지 디스플레이를 이용하여 제조된 새로운 3-핑거 단백질의 다른 연구(여기서는 Zif268 보다 10배 내지 200배 약한 친화성이 보고되었다)에 필적한다(참조: Greisman, H. A. & Pabo, C. O. (1997) Science 275, 657-661, Choo, Y., Sanchez-Garcia, I. & Klug, A. (1994) Nature 372, 642-5).
F2 도메인 변이체의 연속 연결에 대한 대안인 두 번째 전략으로서, 두 개의 e2c 5'-(GNN)3-3' 반부위에 특이적인 3개-핑거 단백질이 "나선 이식(helix grafting)"에 의해 제조되었다. 인식 나선의 표출을 지지하는 잔기인 아연 핑거 도메인의 골격 잔기는 단백질마다 다양하다. 본 발명자들은 골격 잔기가 친화성 및 특이성에 작용을 할 수 있을 것으로 예견한다. 나선 이식의 경우, DNA 인식 나선의 아미노산 위치 -2 내지 6이 Zif268(참조: Pavletich, N. P. & Pabo, C. O. (1991) Science 252, 809-17) 또는 Sp1C 골격(참조: Desjarlais, J. R. & Berg, J. M. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90, 2256-60)내로 이식되었다. Sp1C 단백질은 킬레이트화제에 대해 증가된 안정성을 나타내는 것으로 나타난 설계된 컨센서스 단백질이다. 단백질은 신속한 PCR에 의거한 유전자 조립 전략에 의해 제조된 DNA 주형으로부터 발현되었다. 각 경우에 있어서, MBP 융합 단백질의 ELISA 분석은 F2 골격 작제물로 관찰된 DNA 결합 특이성 및 친화성이 보유되었음을 보여주었다.
상기 논의된 바와 같이, 9bp의 DNA 서열의 인식은 복잡한 게놈내의 고유 부위를 특정하기에 충분하지 않다. 대조적으로, 18bp의 연속 DNA 서열을 인식하는 6개-핑거 단백질은 사람 게놈에서의 단일 부위를 규명할 수 있었으며 이에 따라 유전자-특이적 전사 스위치의 생성에 중요한 전제조건을 충족한다. erbB-2 표적 서열 e2c에 결합하는 6개-핑거 단백질은 간단한 제한효소 분해, 및 F2, Zif268 및 Sp1C 골격 주형 DNA를 이용한 클로닝에 의해 3개-핑거 작제물로부터 생성된다. 정제된 MBP 융합 단백질의 ELISA 분석은 6개-핑거 단백질 각각이 특이적 표적 서열을 인식할 수 있으며 비-표적 5'-(GNN)6-3' 부위 또는 Zif268 표적 부위의 탠덤 반복체와 교차반응성이 거의 없음을 보여주었다.
e2c DNA 표적 부위에 대한 각 단백질의 친화성은 겔-이동 분석에 의해 결정되었다. 25nM의 적당한 Kd 값이 F2 골격으로부터 작제된 E2C(F2) 6개-핑거 단백질로 관찰되었으며 이 값은 그의 구성성분인 3개-핑거 단백질보다 단지 2배 내지 3배 더 우수한 값이다. 6개-핑거 단백질에 대한 이전 연구에서 본 발명자들은 3개-핑거 구성성분에 비하여 6개-핑거 단백질의 DNA 리간드에 대한 친화성이 약 70배 증가되었음을 관찰하였다(참조: Liu, Q., Segal, D. J., Ghiara, J. B. & Barbas III, C. F. (1997) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94, 5525-5530). E2C(F2) 펩타이드의 친화성의 실질적인 증가의 부재는 F2 도메인의 일련의 연결이 최적이 아님을 시사한다. 6개-핑거 단백질의 F2 도메인의 주기성이 이 연장된 서열에 걸친 DNA의 주기성과 일치하지 않을 수 있고 이 단백질의 결합 에너지중 상당 부분이 DNA를 푸는데 소비될 수 있다(참조: Shi, Y. & Berg, J. M. (1996) Biochemistry 35, 3845-8). F2 도메인 단백질과 대조적으로, E2C(Zif) 및 E2C(Sp1) 6개-핑거 단백질은 이의 본래 3개-핑거 단백질 구성성분과 비교하여 40배 내지 70배 증가된 친화성을 나타냈으며, 각각의 Kd 값은 1.6nM 및 0.5nM이다. 중요한 점은, 이들 단백질의 3개-핑거 성분 모두가 결합에 연루되었는데 그 이유는 반-부위의 돌연변이가 거의 100배의 친화성 감소를 유도하였기 때문이라는 점이다. 우세한 공지된 전사 인자는 나노몰의 친화성으로 그들의 특이적 DNA 리간드에 결합하는데, 이는 유전자 발현의 조절이 보통의 수명의 단백질/DNA 복합체에 의해 지배된다는 것을 제시한다. 따라서, 증가된 친화성의 아연 핑거 단백질이 요구되어서는 안되고, 특히 비-특이적 DNA와의 결합이 또한 증가되는 경우에는 이롭지 않을 수 있다.
아연 핑거 도메인은 일반적으로 천연 상태에서 모듈인 것으로 간주되며 각 핑거는 3-bp 아부위를 인식한다(참조: Pavletich, N. P. & Pabo, C. O. (1991) Science 252, 809-17). 이것은 아연 핑거 도메인이 목적하는 서열 어떤 것과도 재조합되어 구조 5'-(GNN)x-3'의 연장된 서열을 인식하는 폴리닥틸 단백질을 형성할 수 있는 능력에 의해 지지된다. 그러나, 적어도 일부 경우에 있어서, 아연 핑거 도메인은 개개의 3bp 부위 보다 중복된 4bp 부위를 특정하는 것으로 나타남을 주지해야 한다. Zif268에 있어서, 나선 위치 -1, 3 및 6번에서 발견된 것 이외의 잔기가 DNA와의 접촉에 연루된다(참조: Elrod-Erickson, M., Rould, M. A., Nekludova, L. & Pabo, C. O. (1996) Structure 4, 1171-1180). 특이적으로, F2의 나선 위치 2에 존재하는 아스파르테이트는 인식에서 몇 가지 역할을 하며 다양한 접촉을 이룬다. 아스파르테이트 측쇄의 카복실레이트는 위치 -1번의 아르기닌과 수소 결합하여 표적 부위의 3'-구아닌과의 상호작용을 안정화한다. 이 아스파르테이트는 또한 구아닌의 상보적인 시토신과의 물-매개된 접촉에 참여한다. 또한, 이 카복실레이트는 핑거 1 결합 부위의 5'-구아닌 염기의 반대 가닥에 있는 시토신 염기의 N4와 직접 접촉하는 것으로 관찰된다. 바로 이 상호작용이 표적 부위 중복에 대한 화학적 기초가 된다. 사실, Zif268 F2 라이브러리가 4개의 5'-GCG GNG GCG-3' 서열에 대해 선별되었을 때, 천연 Zif268내의 잔기와 유사하게 위치 -1번의 아르기닌과 위치 2번의 아스파르테이트 둘 다가 수득되었다. e2c 표적 서열(5'-GGG GCC GGA GCC GCA GTG-3')(서열 112)은 이후로 G 보다는 A가 위치하기 때문에, 잠재적인 표적 부위 중복 문제가 e2c-특이적 6개-핑거 단백질의 핑거 1에서 예상되었다. 그러나, Zif- 및 Sp1C-골격 6개-핑거 단백질 모두에 있어서, 위치 2번에 아스파르테이트를 함유하는 GTG-특이적 핑거 1은 표적 부위 e2c-a 및 e2c-g에 대한 이들의 아주 유사한 친화성에 의해 표시되는 바와 같이 서열 5'-GTGA-3' 및 5'-GTGG-3'의 서열을 동등하게 잘 인식하는 것으로 나타난다.
상기된 본 발명의 폴리뉴클레오타이드 또는 폴리펩타이드는 하나 이상의 전사 조절 인자에 작동가능하게 연결될 수 있다. 전사 활성화인자 또는 전사 서프레서 또는 리프레서와 같은 조절 인자는 본 분야에 잘 알려져 있다. 이와 같은 인자에 폴리펩타이드를 작동가능하게 연결시키기 위한 수단 또한 본 분야에 잘 알려져 있다. 대표적으로 바람직한 조절 인자 및 이들을 유전자 발현의 조절에 사용하는 것은 이하에 상세히 기술될 것이다.
II. 용도
한가지 양태로서, 본 발명의 방법은 아연 핑거-뉴클레오타이드 결합 모티프를 이 모티프와 결합하는 유효량의 아연 핑거-뉴클레오타이드 결합 폴리펩타이드와 접촉시킴을 포함하여, 아연 핑거-뉴클레오타이드 결합 모티프를 함유하는 뉴클레오타이드 서열의 기능을 조절(억제)하는 방법을 포함한다. 뉴클레오타이드 서열이 프로모터인 경우, 본 발명의 방법은 아연 핑거-DNA 결합 모티프를 함유한 프로모터의 전사 트랜스활성화인자(transactivator)를 억제하는 것을 포함한다. 용어 "억제하는"은 예를 들면 아연 핑거-뉴클레오타이드 결합 모티프를 함유하는 프로모터에 작동가능하게 연결된 구조 유전자의 전사에 대한 활성화 수준을 억제하는 것을 가리킨다. 또한, 아연 핑거-뉴클레오타이드 결합 폴리펩타이드 유도체는 구조 유전자내 또는 RNA 서열내 모티프와 결합할 수 있다.
용어 "유효량"은 이전에 활성화된 프로모터를 탈활성화시키는 양, 아연 핑거-뉴클레오타이드 결합 모티프를 함유한 프로모터를 불활성화시키는 양 또는 구조 유전자의 전사 또는 RNA의 해독을 차단하는 양을 포함한다. 아연 핑거 유도된-뉴클레오타이드 결합 폴리펩타이드의 필요량은 기존 단백질/프로모터 복합체에서 천연 아연 핑거-뉴클레오타이드 결합 단백질을 대체시키는데 필요한 양 또는 천연 아연 핑거-뉴클레오타이드 결합 단백질과 경쟁하여 프로모터 자체와 함께 복합체를 형성하는데 필요한 양이다. 유사하게, 구조 유전자 또는 RNA를 차단하는데 필요한 양은 각각 RNA 폴리머라제에 결합하여 유전자의 판독을 차단하는 양 또는 해독을 억제하는 양이다. 바람직하게는, 본 발명의 방법은 세포내에서 실행된다. 프로모터 또는 구조 유전자를 기능적으로 불활성화시킴으로써 전사 또는 해독이 억제된다. 아연 핑거-뉴클레오타이드 결합 단백질 모티프를 함유한 세포내 뉴클레오타이드 서열과 결합하거나 "접촉하기" 위한 유효량의 억제 단백질의 전달은 레트로바이러스 벡터 또는 리포좀에 의한 것과 같은 본원에 기술된 메카니즘중 하나나 본 분야에 잘 알려진 다른 방법에 의해 달성될 수 있다.
용어 "조절"은 기능의 억제, 향상 또는 유도를 가리킨다. 예를 들면, 본 발명의 아연 핑거-뉴클레오타이드 결합 폴리펩타이드는 프로모터내의 모티프에 결합함으로써 프로모터 서열을 조절할 수 있으며 이에 따라 프로모터 뉴클레오타이드 서열에 작동가능하게 연결된 유전자의 전사를 증가시키거나 억제할 수 있다. 다른 방도로서, 조절은 아연 핑거-뉴클레오타이드 결합 폴리펩타이드가 구조 유전자에 결합하여 DNA 의존적인 RNA 폴리머라제가 유전자를 판독하는 것을 차단하여 유전자 의 전사를 억제하는 것을 포함할 수 있다. 구조 유전자는 예를 들면 정상적인 세포 유전자 또는 종양유전자일 수 있다. 다른 방도로서, 조절은 전사물의 해독을 억제하는 것을 포함할 수 있다.
유전자의 프로모터 영역은 전형적으로 구조 유전자의 5'에 위치하는 조절 요소를 포함한다. 유전자가 활성화되는 경우, 전사 인자로 알려진 단백질이 유전자의 프로모터 영역에 부착한다. 이러한 부착은 효소가 제2 유전자 단편을 DNA에서 RNA로 전사시킴에 의한 "스위치 작동"과 유사하다. 대부분의 경우, 생성된 RNA 분자는 특정 단백질의 합성을 위한 주형으로서 작용한다. 때때로 RNA 자체가 최종 산물이 된다.
프로모터 영역은 정상적인 세포성 프로모터이거나 예를 들면 종양유전자 프로모터일 수 있다. 종양유전자 프로모터는 일반적으로 바이러스-유래된 프로모터이다. 예를 들면, 레트로바이러스의 긴 말단 반복체(LTR)는 본 발명의 아연 핑거 결합 폴리펩타이드에 대한 표적일 수 있는 프로모터 영역이다. 사람 T-세포 림프 편향성 바이러스(HTLV) 1 및 2 또는 사람 면역결핍 바이러스(HIV) 1 또는 2와 같은 병원체를 포함한 렌티바이러스 그룹의 일원으로부터의 프로모터가 본 발명의 아연 핑거 결합 폴리펩타이드에 의한 전사 조절을 표적으로 할 수 있는 바이러스 프로모터 영역의 예가 된다.
유전자-특이적 전사 조절인자로서 아연 핑거 단백질을 이용하는 개념을 시험하기 위해 E2C(Sp1) 6개-핑거 단백질을 많은 이펙터 도메인에 융합시킨다. 전사 리프레서는 3개의 사람-유래된 리프레서 도메인중 어느 하나를 아연 핑거 단백질에 부착시켜 생성시킨다. 첫 번째 리프레서 단백질은 ets2 리프레서 인자(ERF)의 아미노산 473 내지 530번으로 규정되는 ERF 리프레서 도메인(ERD)(참조: Sgouras, D. N., Athanasiou, M. A., Beal, G. J., Jr., Fisher, R. J., Blair, D. G. & Mavrothalassitis, G. J. (1995) EMBO J. 14, 4781-4793)을 사용하여 제조한다. 이 도메인은 ets 계열의 전사 인자의 활성에 대한 ERF의 길항 효과를 매개한다. 이 도메인을 아연 핑거 단백질의 C-말단에 융합시켜 합성 리프레서를 작제한다. 두 번째 리프레서 단백질은 크루펠-연관된 박스(KRAB) 도메인(참조: Margolin, J. F., Friedman, J. R., Meyer, W., K.-H., Vissing, H., Thiesen, H.-J. & Rauscher III, F. J. (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91, 4509-4513)을 사용하여 제조한다. 이 리프레서 도메인은 아연 핑거 단백질의 N-말단에서 공통적으로 발견되며 아마도 RING 핑거 단백질 KAP-1(참조: Frieman, J. R., Fredericks, W. J., Jensen, D. E., Speicher, D. W., Huang, X.-P., Neilson, E. G. & Rauscher III, F. J. (1996) Genes & Dev. 10, 2067-2078)과 상호작용함으로써 거리- 및 배향-독립적인 방식으로 TATA-의존적인 전사에 대해 억제 활성을 발휘하는 것 같다(참조: Pengue, G. & Lania, L. (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93, 1015-1020). 본 발명자들은 아연 핑거 단백질 KOX1의 아미노산 1 내지 97번 사이에서 발견된 KRAB 도메인을 사용하였다(참조: Margolin, J. F., Friedman, J. R., Meyer, W., K.-H., Vissing, H., Thiesen, H.-J. & Rauscher III, F. J. (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91, 4509-4513). 이 경우에, 6개-핑거 단백질과의 N-말단 융합물을 작제한다. 마지막으로, 억제를 위한 히스톤 탈아세틸화의 용도를 연구하기 위해 Mad mSIN3 상호작용 도메인(SID)의 아미노산 1 내지 36번을 아연 핑거 단백질의 N-말단에 융합시킨다(참조: Ayer, D. E., Laherty, C. D., Lawrence, Q. A., Armstrong, A. P. & Eisenman, R. N. (1996) Mol. Cell. Biol. 16, 5772-5781). 이 작은 도메인은 전사 인자 Mad의 N-말단에서 발견되며 mSIN3에 이어 보조-리프레서 N-CoR과 상호작용하고 또한 히스톤 데아세틸라제 mRPD1(참조: Heinzel, T., Lavinsky, R. M., Mullen, T.-M., Ssderstrsm, M., Laherty, C. D., Torchia, J., Yang, W.-M., Brard, G., N해, S. D. & al., e. (1997) Nature 387, 43-46)과 상호작용함으로써 전사 억제를 매개하는 역할을 한다. 유전자-특이적 활성화를 조사하기 위해, 아연 핑거 단백질을 헤르페스 심플렉스 바이러스 VP16 단백질(참조: Sadowski, I., Ma, J., Triezenberg, S. & Ptashne, M. (1988) Nature 335, 563-564)의 아미노산 413 내지 489 또는 VP16 최소 활성화 도메인의 인공 4량체 반복서열인 DALDDFDLDML(서열 113)(VP64라고 한다)(참조: Seipel, K., Georgiev, O. & Schaffner, W. (1992) EMBO J. 11, 4961-4968)에 융합시킴으로써 전사 활성화인자를 생성한다.
본 발명자들이 설계한 전사 조절인자의 특이적 활성을 시험하기 위해 루시퍼라제 리포터 유전자에 커플링된 erbB-2 프로모터의 단편을 함유한 리포터 작제물을 생성시킨다. 표적 리포터 플라스미드는 ATG 개시 코돈에 대해 뉴클레오타이드 -758 내지 -1번을 함유한 반면, 조절 리포터 플라스미드는 뉴클레오타이드 -1571 내지 -24번을 함유하며 이에 따라 위치 -24 내지 -7번에 포함된 E2C 결합 부위의 한 개 뉴클레오타이드를 제외한 모든 것이 결실되어 있다. 양 프로모터 단편은 이전의 관찰과 일치하여 헬라(HeLa) 세포내로 일시적으로 형질감염되었을 때 유사한 활성을 나타냈다(참조: Hudson, L. G., Ertl, A. P. & Gill, G. N. (1990) J. Biol. Chem. 265, 4389-4393). 아연 핑거-리프레서 도메인 융합 작제물의 erbB-2 프로모터 활성에 대한 효과를 시험하기 위해, 헬라 세포를 아연 핑거 발현 벡터 각각 및 루시퍼라제 리포터 작제물로 일시적으로 동시 형질감염시킨다(도 5A). 각 작제물에서 유의적인 억제가 관찰되었다. ERD 및 SID 융합 단백질은 각각 약 50% 및 80% 억제를 생성한다. 가장 효능적인 리프레서는 KRAB 융합 단백질이다. 이 단백질은 erbB-2 프로모터 활성을 완전히 억제시킨다. 관찰된 잔여 활성은 프로모터 없는 pGL3 리포터의 배경 수준이었다. 대조적으로, 단백질중 어떤 것도 E2C 표적 부위가 없는 대조 erbB-2 리포터 작제물의 유의적인 억제를 일으키지 않았으며 이는 억제가 실질적으로 표적 부위에 대한 E2C(Sp1) 단백질의 특이적 결합에 의해 매개된다는 것을 입증한다. 어떠한 이펙터 도메인이 결여된 아연 핑거 단백질의 발현은 약한 억제(약 30%)를 유도하였으며 이는 SID 및 KRAB 작제물에서 관찰된 억제의 대부분이 DNA-결합 단독이 아닌 이펙터 도메인에 의해 유발됨을 가리킨다. 이 관찰은 억제의 메카니즘이 전사 연장이 아닌 전사 개시의 활성적인 억제임을 강력히 시사한다. 일단 RNA 폴리머라제 II에 의한 전사가 개시되는 경우, 아연 핑거 단백질은 폴리머라제의 작용에 의해 DNA로부터 쉽게 대체되는 것으로 나타난다.
전사의 활성화를 매개하는 유전자-특이적 폴리닥틸 단백질의 용도는 동일한 두 개의 리포터 작제물을 사용하여 조사되었다. VP16 융합 단백질은 전사를 약 5배 자극하는 것으로 밝혀진 반면 VP64 융합 단백질은 27배의 활성화를 유도한다. 단일 VP16에 의거한 전사 활성화인자에 의해 유발된 프로모터 활성의 상당한 자극은 아연 핑거 단백질이 유전자의 전사 영역에서 결합한다는 사실의 측면에서 이례적이다. 이것은 RNA 폴리머라제 II의 경로에서 심지어 나노몰 이하의 친화성을 가지면서 아연 핑거 단백질의 단순한 결합이 유전자 발현에 반드시 부정적인 영향을 미칠 필요가 없음을 입증한다.
본원의 데이터는 신규한 9- 및 18-bp DNA 표적 부위와 결합할 수 있는 아연 핑거 단백질이 5'-GNN-3' 부위를 인식하는 예정된 도메인을 사용하여 신속히 제조될 수 있음을 보여준다. 이 정보는 각각이 18bp의 DNA 서열과 결합할 수 있는 166 또는 1.7×107개의 새로운 6개-핑거 단백질을 제조하는데 충분하다. 신규한 아연 핑거 단백질의 작제를 위한 이와 같은 신속한 방법은 이전에 제안된 아연 핑거 도메인의 연속적인 생성 및 선별(참조: Greisman, H. A. & Pabo, C. O. (1997) Science 275, 657-661)에 비해 유리하며, 상기 규정된 표적 중복 문제의 잠재성이 5'-GNN-3' 부위를 표적으로 하는 단백질에서 회피될 수 있음을 시사하는 구조 정보를 이용한다. 복잡하고 잘 연구된 erbB-2 프로모터 및 생존 사람 세포를 이용한 데이터는 이들 단백질이 적절한 이펙터 도메인을 제공하는 한 발현을 유도하거나 활성화시키고 이들 실험에서 억제 수준을 배경 수준으로 강하시키기데 사용될 수 있음을 입증한다. 이들 연구는 KRAB 도메인이 전사 리프레서로서 ERD 또는 SID 도메인보다 훨씬 더 효능적이고 그 프로모터의 TATA-의존적 및 TATA-독립적 전사 개시 모두를 억제할 수 있음을 시사한다. 이들 리프레서 도메인은 이전에 직접적으로 비교된 바 없다. 예정된 아연 핑거 도메인을 사용하여 이펙터 도메인에 연결된 폴리닥틸 단백질을 작제하는 현 방법은 전사 복합체에 연루된 단백질과 경쟁하거나 이 단백질을 방해함으로써 전사를 단지 억제하고자 시도한 방법에 비해 상당히 유리하다(참조: Kim, J.-S & Pabo, C. O. (1997) J. Biol. Chem. 272, 29795-29800, Kim, J.-S., Kim, J., Cepek, K. L., Sharp, P. A. & Pabo, C. O. (1997) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94, 3616-3620). 거리를 두고 작용하는 잠재성을 가진 이펙터 도메인의 유용성은 이들 유전자-스위치를 확인되지 않은 유전자 및 프로모터의 조절에 적용가능하게 할 것이다. 이들 전사 조절인자는 고도의 공정처리 방식으로 PCR 조립 방법을 이용하여 제조할 수 있기 때문에 본 발명자들은 그들의 잠재적이고 실질적인 응용에 관한 평가가 적절할 것으로 믿는다. 이러한 방식으로 제조된 신규한 DNA 결합 단백질은 DNA에 의거한 진단 응용에서 잠재적으로 유용성이 있어야 한다. 유전자 기능의 연구에 있어서, 본 발명자들은 필요한 경우 정해진 수준으로 유전자의 전사를 활성화하고 억제하는 능력이 유전자 기능을 밝히는데 조력할 수 있을 것으로 믿는다. 이들 단백질은 트랜스로 작용함으로써 조절 능력을 발휘하기 때문에 기능성 유전자의 녹아웃(knockout) 또는 활성화가 이형접합 유전자전이된 동물에서 생성될 수 있다. 이것은 온전한 동물에서 유전자 녹아웃을 생성하는데 필요한 시간을 상당히 감소시킬 것이며 녹아웃 기술이 적용될 수 있는 유기체의 범위를 확장시켜 준다. 이들 단백질은 또한 바이러스 유전자 산물의 생성을 억제하기나 질병과 싸우는데 연루된 유전자를 활성화하는 유전자 요법에 사용할 수 있다. 중요한 것은 이들 단백질의 제조의 용이함으로 과학자들이 상기 아이디어를 용이하게 시험할 수 있으리라는 점이다.
이하의 실시예는 본 발명의 바람직한 양태를 예시하며 어떠한 방식으로든 명세서 또는 청구범위를 한정하는 것이 아니다.
실시예 1: 파아지 디스플레이에 의한 선별
PCR 중복 연장에 의한 아연-핑거 라이브러리의 작제는 이전에 공개된 바와 거의 같다(참조: Shi, Y. & Berg, J. M. (1996) Biochemistry 35, 3845-8). 파아지의 성장 및 침전은 이전에 공개된 바와 같으며(참조: Pengue, G. & Lania, L. (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93, 1015-1020, Friedman, J. R., Fredericks, W. J., Jensen, D. E., Speicher, D. W., Huang, X.-P., Neilson, E. G. & Rauscher III, F. J. (1996) Genes & Dev. 10, 2067-2078), 단 파아지 증식을 위해 ER2537 세포(New England Biolabs)를 사용하고 성장 배지에 90μM ZnCl2를 첨가한다. 침전된 파아지를 아연 완충액 A(ZBA; 10mM 트리스, pH 7.5/90mM KCl, 1mM MgCl2, 90μM ZnCl2)/1% BSA/5mM DTT중에 재현탁시킨다. 결합 반응물(500μl: ZBA/5mM DTT/1% Blotto(BioRad)/경쟁자 올리고뉴클레오타이드/4μg 전단된 청어 정자 DNA(시그마)/100μl 여과된 파아지(약 1013 콜로니 형성 단위))을 실온에서 30분 동안 배양한 후, 72nM 바이오티닐화 헤어핀 표적 올리고뉴클레오타이드를 첨가한다. 일정하게 서서히 혼합하면서 3.5시간 동안 계속 배양한다. 스트렙트아비딘-피복된 자석 비드(50μl; Dynal)를 500μl ZBA/1% BSA로 2회 세척한 다음, 500μl ZBA/5% Blotto/항체-표시(무관한) 파아지(약 1012 콜로니 형성 단위)로 실온에서 약 4시간 동안 차단시킨다. 결합 기간의 말기에, 차단 용액을 결합 반응물로 대체하고 실온에서 1시간 동안 배양한다. 비드를 500μl ZBA/5mM DTT/2% 트윈 20으로 1시간에 걸쳐 10회 세척하고 트윈 20 없이 1회 세척한다. 결합된 파아지를 10μg/μl 트립신으로 30분 동안 용출시킨다.
헤어핀 표적 올리고뉴클레오타이드는 서열 5'-바이오틴-GGACGCN'N'N'CGCGGGTTTTCCCGCGNNNGCGTCC-3' (서열 114)(여기서, NNN은 3-뉴클레오타이드 핑거 2-표적 서열이고 N'N'N'은 그의 상보서열이다)을 갖는다. 오염된 모(母) 파아지에 대해 선별하기 위해 매회 마다 7.2nM로 표적 서열이 TGG(compTGG)인 유사한 비-바이오티닐화 올리고뉴클레오타이드를 첨가한다. 비-바이오티닐화 올리고뉴클레오타이드의 두 개 풀을 또한 경쟁자로서 사용한다. 한 개의 풀은 모두 64개의 가능한 3-뉴클레오타이드 표적 서열(compNNN)를 함유하고 다른 한 개의 풀은 현재의 선별 표적을 제외한 모든 GNN 표적 서열(compGNN)을 함유한다. 이들 풀은 전형적으로 다음과 같이 사용된다: 1회, compNNN 부재 또는 compGNN 존재; 2회, 7.2nM compGNN; 3회, 10.8 nM compGNN; 4회, 1.8μM compNNN, 25nM compGNN; 5회, 2.7μM compNNN, 90nM compGNN; 6회, 2.7μM compNNN, 250nM compGNN; 7회, 3.6μM compNNN, 250nM compGNN.
실시예 2: 다수-표적 특이성 검정
아연-핑거 암호화 서열을 함유한 파아지미드 RF DNA인 pComb3H(참조: Pengue, G. & Lania, L. (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93, 1015-1020, Heinzel, T., Lavinsky, R. M., Mullen, T.-M., Ssderstrsm, M., Laherty, C. D., Torchia, J., Yang, W.-M., Brard, G., Ngo, S. D. & al., e. (1997) Nature 387, 43-46)의 단편을 변형된 pMAL-c2(New England Biolabs) 세균 발현 벡터내로 서브클로닝시키고 XL1-블루(Stratagene)를 형질전환시킨다. 과발현된 말토즈 결합 단백질-아연 핑거 융합 단백질을 함유한 동결/해동 추출물을 단백질 융합 및 정제 시스템(New England Biolabs)을 사용하여 IPTG-유도된 배양물로부터 제조한다. 96-웰 ELISA 평판에서, 각 웰에 0.2μg의 스트렙트아비딘(Pierce)을 37℃에서 1시간 동안 적용한 다음 물로 2회 세척한다. 바이오티닐화 표적 올리고뉴클레오타이드(0.025μg)를 유사하게 적용한다. ZBA/3% BSA를 차단을 위해 적용하지만 웰을 배양 후 세척하지 않는다. 모든 후속 배양은 실온에서 실시한다. 추출물의 8개 2배 연속 희석물을 1 x 결합 완충액(ZBA/1% BSA/5mM DTT/0.12μg/μl 전단된 청어 정자 DNA)중에 적용한다. 샘플을 1시간 배양하고 물로 10회 세척한다. ZBA/1% BSA중의 마우스 항-말토즈 결합 단백질 mAb(Sigma)를 웰에 30분 동안 적용한 후, 물로 10회 세척한다. 알카리성 포스파타제(Sigma)에 결합된 염소 항-마우스 IgG mAb를 웰에 30분 동안 적용한 후, 물로 10회 세척한다. 알카리성 포스파타제 기질(Sigma)을 적용하고 SOFTmax 2.35(Molecular Devices)로 OD405를 정량한다.
실시예 3: 겔 이동성 변환 검정
융합 단백질은 단백질 융합 및 정제 시스템(New England Biolabs)을 사용하여 90%를 초과하는 균질성으로 정제하며, 단 ZBA/5mM DTT를 컬럼 완충액으로 사용한다. 단백질 순도 및 농도는 쿠마시 블루-염색된 15% SDS-PAGE 겔로부터 BSA 표준물과 비교하여 결정한다. 표적 올리고뉴클레오타이드를 5' 또는 3' 말단에서 [32P]로 표지하고 겔 정제한다. 단백질의 11개 3배 연속 희석물을 실온하에 20μl 결합 반응액(1 x 결합 완충액/10% 글리세롤/약 1pM 표적 올리고뉴클레오타이드)중에서 3시간 동안 배양한 다음, 0.5 x TBE 완충액중의 5% 폴리아크릴아미드 겔상에서 해리시킨다. 포스포이미저(PhosphorImager) 및 이미지퀀트(ImageQuant) 소프트웨어(Molecular Dynamics)를 사용하여 건조된 겔을 정량하고 스캐차드 분석으로 KD를 결정한다.
실시예 4: 목적하는 DNA 결합 특이성을 갖는 폴리닥틸 단백질의 생성
여기에 수록된 연구는 첨부된 원고에 정의된 핑거 2(F2) 변이체 pmGAC, pmGAG, pGCA, pGCC, pmGGA, pmGGC, pmGGG 및 pGTG를 이용한다(참조: Hudson, L. G., Ertl, A. P. & Gill, G. N. (1990) J. Biol. Chem. 265, 4389-4393). 3개-핑거 단백질을 암호화하는 DNA를 생성하기 위해, F2 암호화 영역을 선별 또는 설계된 F2 변이체로부터 PCR 증폭하고 PCR 중복 연장에 의해 조립한다. 다른 방도로서, Zif268 또는 Sp1C 골격을 갖는 3개-핑거 단백질을 암호화하는 DNA를 각각 8개 또는 6개 중복 올리고뉴클레오타이드로부터 합성한다. 당해 보고서에 기술된 모든 리포터 검정에서 사용된 Sp1C 골격 작제물은 다음과 같이 생성되었다. E2C-HS1(Sp1)의 경우, 각각 0.4pmole의 올리고뉴클레오타이드 SPE2-3(5'-GCG AGC AAG GTC GCG GCA GTC ACT AAA AGA TTT GCC GCA CTC TGG GCA TTT ATA CGG TTT TTC ACC-3')(서열 115) 및 SPE2-4(5'-GTG ACT GCC GCG ACC TTG CTC GCC ATC AAC GCA CTC ATA CTG GCG AGA AGC CAT ACA AAT GTC CAG AAT GTG GC-3')(서열 116)을 각각 40 pmole의 올리고뉴클레오타이드 SPE2-2(5'-GGT AAG TCC TTC TCT CAG AGC TCT CAC CTG GTG CGC CAC CAG CGT ACC CAC ACG GGT GAA AAA CCG TAT AAA TGC CCA GAG-3')(서열 117) 및 SPE2-5(5'-ACG CAC CAG CTT GTC AGA GCG GCT GAA AGA CTT GCC ACA TTC TGG ACA TTT GTA TGG C-3')(서열 118)와 표준 PCR 혼합물중에서 혼합하고 25회 사이클을 반복한다(1회: 94℃에서 30초, 60℃에서 30초, 72℃에서 30초). 그런 다음 이 예비 조립 반응물의 분취량을 각각 40pmole의 프라이머 SPE2-1(5'-GAG GAG GAG GAG GTG GCC CAG GCG GCC CTC GAG CCC GGG GAG AAG CCC TAT GCT TGT CCG GAA TGT GGT AAG TCC TTC TCT CAG AGC-3')(서열 119) 및 SPE2-6(5'-GAG GAG GAG GAG CTG GCC GGC CTG GCC ACT AGT TTT TTT ACC GGT GTG AGT ACG TTG GTG ACG CAC CAG CTT GTC AGA GCG-3')(서열 120)과 함께 동일한 주기 조건을 사용하여 증폭시킨다. 인식 나선 암호화 영역만이 다른 유사한 세트의 올리고뉴클레오타이드를 사용하고 동일한 방식으로 E2C-HS2(Sp1) DNA를 생성한다. 모든 조립된 3개-핑거 암호화 영역을 제한 엔도뉴클레아제 Sfi1로 분해시키고 세균 발현 벡터 pMal-C2(New England Biolabs)의 유도체인 pMal-CSS내로 클로닝시킨다. 상이한 골격 각각을 갖는 6개-핑거 단백질을 암호화하는 DNA를 3개-핑거 암호화 영역이 플랭킹된 서열내에 포함된 Xma1 및 BsrF1 제한 부위를 사용하여 pMal-CSS와 조립한다. 각각의 아연 핑거 단백질을 이. 콜라이 균주 XL1-블루에서 발현시키고 상기한 바와 같이 ELISA 및 겔 이동 분석으로 결합 특성을 조사한다(참조: Hudson, L. G., Ertl, A. P. & Gill, G. N. (1990) J. Biol. Chem. 265, 4389-4393).
실시예 5: 아연 핑거-이펙터 도메인 융합 단백질의 작제
아연 핑거-이펙터 도메인 융합 단백질의 작제를 위해, ets 리프레서 인자(ERF) 리프레서 도메인(ERD)의 아미노산 473 내지 530번을 암호화하는 DNA(참조: Sgouras, D. N., Athanasiou, M. A., Beal, G. J., Jr., Fisher, R. J., Blair, D. G. & Mavrothalassitis, G. J. (1995) EMBO J. 14, 4781-4793), KOX1의 KRAB 도메인의 아미노산 1 내지 97번을 암호화하는 DNA(참조: Margolin, J. F., Friedman, J. R., Meyer, W., K.-H., Vissing, H., Thiesen, H.-J. & Rauscher III, F. J. (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91, 4509-4513) 또는 Mad mSIN3 상호작용 도메인(SID)의 아미노산 1 내지 36번을 암호화하는 DNA(참조: Ayer, D. E., Laherty, C. D., Lawrence, Q. A., Armstrong, A. P. & Eisenman, R. N. (1996) Mol. Cell. Biol. 16, 5772-5781)를 Taq DNA 폴리머라제를 사용하여 중복 올리고뉴클레오타이드로부터 조립한다. VP16 전사 활성화 도메인의 아미노산 413 내지 489번(참조: Sadowski, I., Ma, J., Triezenberg, S. & Ptashne, M. (1988) Nature 335, 563-564)를 암호화하는 영역을 pcDNA3/C7-C7-VP16(10)으로부터 PCR 증폭시킨다. 아미노산 437 내지 447번을 포함하는 VP16의 최소 활성화 도메인의 4량체 반복체를 암호화하는 VP64 DNA(참조: Seipel, K., Georgiev, O. & Schaffner, W. (1992) EMBO J. 11, 4961-4968)가 두 쌍의 상보적인 올리고뉴클레오타이드로부터 생성되었다. 생성된 단편을 표준 클로닝 공정에 의해 아연 핑거 암호화 영역에 융합시킨다. 이에 따라 생성된 각 작제물은 내부 SV40 핵 국소화 시그날뿐만 아니라 C-말단 HA 데카펩타이드 태그를 함유한다. 융합 작제물을 진핵 발현 벡터 pcDNA3(Invitrogen)내로 클로닝한다.
실시예 6: 루시퍼라제 리포터 플라스미드의 작제
ATG 개시 코돈에 대해 뉴클레오타이드 -758 내지 -1을 포함하는 erbB-2 프로모터 단편을 TaqExpand DNA 폴리머라제 믹스(Boehringer Mannheim)를 사용하여 사람 골수 게놈 DNA로부터 PCR 증폭시키고, 개똥벌레 루시퍼라제 유전자의 상부스트림의 pGL3basic(Promega)내로 클로닝한다. Hind3으로 분해시켜 pSVOAL△5'/erbB-2(N-N)(참조: Hudson, L. G., Ertl, A. P. & Gill, G. N. (1990) J. Biol. Chem. 265, 4389-4393)으로부터 뉴클레오타이드 -1571 내지 -24번을 포함하는 사람 erbB-2 프로모터 단편을 절단하고 개똥벌레 루시퍼라제 유전자의 상부스트림의 pGL3basic내로 서브클로닝한다.
실시예 7: 루시퍼라제 검정
모든 형질감염에서, 헬라 세포를 40 내지 60%의 컨플루언시(confluency)로 사용한다. 전형적으로, 세포를 400ng 리포터 플라스미드(pGL3-프로모터 작제물 또는 음성 대조군으로서 pGL3basic), 50ng 이펙터 플라스미드(pcDNA3중의 아연 핑거 작제물 또는 음성 대조군으로서 공 pcDNA3) 및 200ng 내부 표준 플라스미드(phrAct-βGal)로 리포펙타민 시약(Gibco BRL)을 사용하여 6개 웰 디쉬의 웰에서 형질감염시킨다. 형질감염 후 약 48시간 경과하여 세포 추출물을 준비한다. 루시퍼라제 활성은 루시퍼라제 검정 시약(Promega)으로 측정하고, βGal 활성은 갈락토-광(Tropix)로 MicroLumat LB96P 발광측정기(EG&G Berthold)에서 측정한다. 루시퍼라제 활성은 βGal 활성을 표준으로 한다.
실시예 8: 헬라 세포에서의 erbB-2 유전자의 조절
erbB-2 유전자는 강제된 조절을 표적으로 한다. erbB-2 유전자는 흔히 사람 암, 특히 유방암 및 난소암에서 과다하게 발현되며 상승된 ErbB-2 수준은 빈약한 징후와 상호연관이 있다(참조: N. E. Hynes and D. F. Stern, Biochim. Biophys. Acta 1198, 165 (1994). 천연 erbB-2 유전자를 조절하기 위해, E2C-KRAB라고 하는 합성 리프레서 단백질 및 E2C-VP64라고 명명된 트랜스활성화인자 단백질을 사용한다(참조: R. R. Beerli, D. J. Segal, B Dreier, C. F. Barbas, III, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95, 14628 (1998)). 양 단백질은 원-종양유전자 erbB-2의 5'-비해독 영역에 18-bp DNA 서열인 5'-GGG GCC GGA GCC GCA GTG-3' (서열 121)을 인식하는, 동일한 설계된 아연 핑거 단백질 E2C를 함유한다. 이 DNA-결합 단백질은 6개의 예정되고 모듈적인 아연 핑거 도메인으로부터 작제한다(참조: D. J. Segal, B. Dreier, R. R. Beerli, C. F. Barbas, III, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96, 2758 (1999)). 리프레서 단백질은 Kox-1 KRAB 도메인을 함유하는 반면(참조: J. F. Margolin et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91, 4509 (1994)) 트랜스활성화인자 VP64는 헤르페스 심플렉스 바이러스 단백질 VP16으로부터 유도된 최소 활성화 도메인의 4량체 반복체를 함유한다(참조: K. Seipel, O. Georgiev, W. Schaffner, EMBO J. 11. 4961 (1992)).
사람 경부 암 세포주 헬라의 유도체인 헬라/테트-오프(HeLa/tet-off)가 사용되었다(참조: M. Gossen and H. Bujard, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89, 5547 (1992)). 헬라 세포는 상피 세포 기원이기 때문에 ErbB-2를 발현하며 erbB-2 유전자 표적의 연구에 아주 적합하다. 헬라/테트-오프 세포는 테트라사이클린-조절된 트랜스활성화인자를 생성하여, 성장 배지로부터 테트라사이클린 또는 이의 유도체 데옥시사이클린(Dox)를 제거함으로써 테트라사이클린 반응 요소(TRE)의 조절하에서 해당 유전자의 유도를 가능하게 한다. 본 발명자들은 화학적 조절하에 전사 인자의 위치를 찾아내는데 이 시스템을 사용하였다. 이로써, pRevTRE/E2C-SKD 및 pRevTRE/E2C-VP64 플라스미드를 작제하고(pcDNA3-계 발현 플라스미드(참조: R.R. Beerli, D. J. Segal, B. Dreier, C. F. Barbas, III, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95, 14628 (1998))로부터 E2C(Sp1)-KRAB 및 E2C(Sp1)-VP64 암호화 영역을 PCR 증폭시킨다), BamH1 및 Cla1 제한 부위를 사용하여 pRevTRE(Clontech)내로 서브클로닝하고 BamH1 및 Not1 제한 부위를 사용하여 pMX-IRES-GFP[참조: X. Liu et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94, 10669 (1997)]내로 서브클로닝한다. PCR 증폭의 충실도를 서열분석에 의해 검증하고, 헬라/테트-오프 세포내로 형질감염시키고 20개의 안정한 클론을 분리한 다음, 리포펙타민 플러스 시약(Gibco BRL)을 사용하여 Dox-의존적인 표적 유전자 조절에 대해 분석한다(pRevTRE/E2C-SKD 및 pRevTRE/E2C-VP64 작제물로 헬라/테트-오프 세포주(참조: M. Gossen and H. Bujard, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89, 5547 (1992))를 형질감염시킨다). 하이그로마이신-함유 배지에서 선별한지 2주 후, 2μg/ml Dox의 존재하에 안정한 클론을 분리하고 ErbB-2 발현의 Dox-의존적인 조절에 대해 분석한다. 웨스턴 블롯, 면역침전, 노던 블롯 및 유동 세포 계수 분석을 문헌[참조: D. Graus-Porta, R. R. Beerli, N. E. Hynes, Mol. Cell. Biol. 15, 1182 (1995)]에 기술된 바와 같이 실시한다. erbB-2 프로모터 활성의 판독으로서, ErbB-2 단백질 수준을 웨스턴 블롯에 의해 먼저 분석한다. 이들 클론의 상당 부분이 4일 동안 Dox를 제거했을 때 ErbB-2 발현의 조절, 즉 E2C-KRAB 클론에서 ErbB-2의 하향조절 및 E2C-VP64 클론에서 상향조절을 나타내었다. ErbB-2 단백질 수준은 이들의 특이적 mRNA의 변형된 수준과 상호 연관이 있었으며, 이는 ErbB-2 발현의 조절이 전사의 억제 또는 활성화의 결과임을 가리킨다. E2C-VP64 클론에서 발현된 추가의 ErbB-2 단백질은 천연적으로 발현된 단백질과 구분할 수 없으며 생물학적으로 활성을 나타냈는데, 그 이유는 상피 성장 인자(EGF)는 티로신 인산화가 쉽게 유도되기 때문이다. Dox의 부재하에 E2C-KRAB 클론 #27중의 ErbB-2 수준은 EGF-유도된 티로신 인산화에서의 검출 수준 이하였다. 따라서, ErbB-2 발현은 또한 유동 세포측정에 의해 분석되었으며, E2C-VP64 클론 #18에서의 ErbB-2의 현저한 상향조절(5.6배)와는 완저히 대조적으로 E2C-KRAB 클론 #27에서 ErbB-2 발현이 전혀 검출되지 않은 것으로 나타났다. 따라서, erbB-2 유전자 조절의 정도는 완전한 억제(E2C-KRAB 클론 #27)에서 약 6배의 활성화(E2C-VP64 클론 #18)에 이른다. 연관된 ErbB-1 단백질의 발현에 대한 어떠한 유의적인 효과도 관찰되지 않았으며 이는 ErbB-2 발현의 조절이 전사의 일반적인 하향조절 또는 상향조절의 결과가 아님을 가리킨다. 6개 아연 핑거 도메인을 사용하여 18bp의 DNA 서열을 표적으로 하는 상기 전사 인자의 효능과 대조적으로, E2C 표적 서열의 9-bp 반-부위중 어느 한 쪽에 결합하는 3개의 아연 핑거 도메인으로 제조된 전사 활성화인자는 erbB-2-루시퍼라제 리포터의 전사를 활성화시킬 수 없었다. 이 결과는 6개 핑거 단백질의 증가된 특이성 및 친화성이 유전자 조절에 대한 우성 효과를 제공하기 위해 필요할 수 있음을 시사한다.
실시예 9: 레트로바이러스 벡터 pMX-IRES-GFP내로 E2C-KRAB 및 E2C-VP64 단백질의 암호화 영역의 도입
몇 가지의 다른 세포주에서 E2C-KRAB 및 E2C-VP64 단백질을 발현하기 위해 이들 단백질의 암호화 영역을 레트로바이러스 벡터 pMX-IRES-GFP내로 도입한다. E2C(Sp1)-KRAB 및 E2C(Sp1)-VP64 암호화 영역을 pcDNA3-계 발현 플라스미드(참조: R. R. Beerli, D. J. Segal, B Dreier, C. F. Barbas, III, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95, 14628 (1998))로부터 PCR 증폭시키고, BamH1 및 Cla1 제한 부위를 사용하여 pRevTRE(Clontech)내로 서브클로닝하고 BamH1 및 Not1 제한 부위를 사용하여 pMX-IRES-GFP[참조: X. Liu et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94, 10669 (1997)]내로 서브클로닝한다. PCR 증폭의 충실도를 서열분석에 의해 검증한다. 이 벡터는 아연 핑거 단백질의 해독을 위한 단일 바이시트트로닉 메시지 및 내부 리보좀-유입 부위(IRES)로부터 녹색 형광 단백질(GFP)을 발현한다. 양 암호화 영역은 동일한 mRNA를 공유하고 있기 때문에 이들의 발현은 물리적으로 서로 연결되어 있으며, GFP 발현은 아연 핑거 발현의 지표이다. 그런 다음 이들 플라스미드로부터 제조된 바이러스를 사용하여 사람 암종 세포주 A431을 감염시킨다(pMX-IRES-GFP/E2C-KRAB 및 pMX-IRES-GFP/E2C-VP64 플라스미드로 리포펙타민 플러스(Gibco BRL)을 사용하여 양쪽성 패키징 세포 피닉스 암포(Phoenix Ampho)내로 일시적으로 형질감염시키고 이틀 후에 배양 상층액을 사용하여 8μg/ml 폴리브렌의 존재하에 표적 세포를 감염시킨다. 감염 3일 후 세포를 분석을 위해 수거한다). 감염 후 3일 경과하면, 유동 세포측정기에 의해 ErbB-2 발현을 측정한다. 중요한 것은 E2C-KRAB 바이러스 처리된 세포의 약 59%가 반드시 ErbB-2 음성적인 한편, E2C-VP64 바이러스 처리된 세포의 약 27%에서 ErbB-2 수준이 증가한다는 점이다. GFP 형광 대 ErbB-2 형광의 플롯팅 결과, GFP 음성을 나타내고 정상적인 ErbB-2 수준을 가진 일군과 GFP 양성을 나타내고 변형된 ErbB-2 수준을 가진 다른 일군이 존재하는 것으로 드러났다. 관련된 ErbB-1 및 ErbB-3 단백질의 발현 수준을 측정함으로써 유전자 표적의 특이성을 조사한다. 이들 단백질 수준의 어떠한 유의적인 변형도 검출되지 않았는데, 이는 erbB-2 유전 표적이 특이적이고 유전자 발현 및 이펙터 도메인의 과발현에서의 일반적인 변형의 비-특이적 결과가 아님을 가리킨다. erbB-3의 감지할만한 조절의 결여는 특히 놀랄만한데, 그 이유는 5'-UTR이 E2C 설계된 표적 서열과 3개만이 미스매치인 18bp 서열 5'-GGa GCC GGA GCC GgA GTc-3'(서열 122)(15bp 동일-소문자는 상이함을 나타낸다)를 함유하고 있기 때문이다(참조: M. H. Kraus, W. Issing, T. Miki, N. c. Popescu, S. A. Aaronson, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86, 9193 (1989)).
실시예 10: 비-사람 영장류 세포에서의 erbB-2 유전자의 조절
erbB-2'의 5'-UTR내 아연 핑거 표적 서열은 많은 종에서 보존되고 있는 28-bp 서열내에 자리잡고 있다. 비-사람 영장류 세포에서의 erbB-2 유전자 발현의 조절을 조사하기 위해, COS-7 섬유아세포를 바이시스트로닉 E2C-KRAB 레트로바이러스로 감염시키고 유동 세포측정기에 의해 분석한다. 사람 세포와 마찬가지로, GFP 마커에 의해 표기된 바와 같은 리프레서 단백질의 발현은 ErbB-2 단백질의 손실과 상호관련이 있다. 유사하게, NIH/3T3 세포를 E2C-KRAB 및 E2C-VP64 암호화 레트로바이러스로 감염시킴으로써 쥐 세포에서의 유전자 표적화를 평가한다. 그런 다음 mAb와 쥐 ErbB-2 세포외 도메인과의 반응성 결여로 인해 유동 세포측정기보다 웨스턴 블롯에 의해 ErbB-2 발현 수준을 모니터링한다. 다시, E2C-KRAB로 감염된 세포를 보정했을 때 완전한 전사 녹아웃이 관찰된다. 그러나, 사람 세포주와는 달리 E2C-VP64 유도된 ErbB-2 상향조절은 감염 효율에 대해 보정한 후 약 1.8배로서 NIH/3T3 세포에서 약간 적었다. 이러한 불일치에 대한 적절한 설명은 사람과 마우스의 프로모터가 구조적으로 상이하다는데서 찾을 수 있다. 사람과는 달리 마우스의 erbB-2 프로모터는 TATA 박스를 함유하지 않는다(참조: M. R. White and M. C. Hung, Oncogene 7, 677 (1992)). VP16에 의한 전사 활성화는 TATA-결합 단백질을 함유하는 다단백질 복합체인 TFIID와의 상호작용에 의해 적어도 일부가 매개된다(참조: C. J. Ingles, M. Shales, W. D. Cress, S. J. Triezenberg, J. Greenblatt, Nature 351, 588 (1991)). 따라서, E2C-VP64 단백질은 TATA 박스의 부재하에서 전사를 덜 효과적으로 활성화하는 듯 하다. 이들 데이터는 DNA 결합 부위가 표적 세포내의 서열 및 상대적 위치의 관점에서 보존될 수 있는 한편, 이펙터 도메인은 최대 효능을 위해 최적화될 필요가 있음을 시사한다. 그럼에도 불구하고, 이들의 효능이 다를 수 있지만, 본원에 기술된 인공 전사 인자는 상이한 종으로부터 유래된 세포에서 erbB-2 유전자 전사의 조절을 유도할 수 있으며, 따라서 여러 유기체에서 유전자 기능의 연구를 위한 방안을 제공한다.
실시예 11: ErbB-2 과발현 종양 세포의 G1 축적의 특이적 유도
ErbB-2의 과발현은 이의 내인성 티로신 키나제 활성의 구조적 활성화를 유도하며(참조: P. P. Di Fiore et al., Science 237, 178 (1987)) 수용체를 과발현하는 종양 세포에서의 ErbB-2의 하향조절은 성장 억제를 유도하는 것으로 나타난다(참조: R. M. Hudziak et al., Mol. Cell. Biol. 9, 1165 (1989); J. Deshane et al., Gene Ther. 1, 332 (1994); J. M. Daly et al., Cancer Res. 57, 3804 (1997)). 성장 억제의 메카니즘은 세포가 세포 주기 G1 단계에서 S 단계로 진행하는 것이 억제되는 것으로 나타난다(참조: R. M. Neve, H. Sutterluty, N. Pullen, H. A. Lane, J. M. Daly, W. Krek, N. E. Hynes). 따라서, 본 발명자들은 erbB-2 과발현 종양 세포에서의 본 발명자들이 설계한 전사 리프레서의 발현이 G1 차단을 유도하는 지를 조사하였다. 따라서, E2C-KRAB 레트로바이러스로 SKBR3 유방암 세포를 감염시키고 세포 주기 분포를 유동 세포측정기에 의해 ErbB-2 발현 수준과 관련하여 분석한다(22). 두 세포 군이 관찰되었다: 세포 약 40%는 감염되지 않았고 정상적인 ErbB-2 수준을 나타낸 한편, 약 60%의 감염 세포는 3일 후에 약 7배 감소된 수용체 수준을 나타냈다. 정상적인 수용체 수준을 갖는 세포와 비교하여, 감소된 ErbB-2 발현 수준을 갖는 세포의 상당 부분이 세포 주기의 G1 단계에 있었다. SKBR3 세포에서 관찰된 G1 축적이 ErbB-2 과발현 종양 세포에 대해 특이적임을 확신하기 위해, ErbB-2의 증가된 수준을 나타내지 않는 T47D 유방암 세포주로 유사한 분석을 실시한다(도 4B). 실재로, T47D 세포를 E2C-KRAB 레트로바이러스로 감염시키고 유동 세포측정 분석에 적용하였을 때, 정상적이고 감소된 ErbB-2 수준을 갖는 세포 군은 구별할 수 없는 DNA 함량을 나타내는 것으로 밝혀졌다. 따라서, 본 발명자들이 설계한 리프레서 단백질은 ErbB-2 과발현 종양 세포의 G1 축적을 특이적으로 유도할 수 있다. 세포-주기 진행을 억제하고 그럼으로써 ErbB-2 과발현 종양 세포의 성장을 억제하는 능력은 설계된 전사 인자를 암 유전 요법에 사용할 수 있는 잠재성을 제시한다.
<110> Novartis AG The Scripps Research Institute <120> Zinc finger binding domains for GNN <130> 30746/A <150> US 09/173,941 <151> 1998-10-16 <160> 122 <170> KOPATIN 1.71 <210> 1 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:nucleotide binding polypeptides <400> 1 Gln Ser Ser Asn Leu Val Arg 1 5 <210> 2 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:nucleotide binding polypeptides <400> 2 Asp Pro Gly Asn Leu Val Arg 1 5 <210> 3 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:nucleotide binding polypeptides <400> 3 Arg Ser Asp Asn Leu Val Arg 1 5 <210> 4 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:nucleotide binding polypeptides <400> 4 Thr Ser Gly Asn Leu Val Arg 1 5 <210> 5 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:nucleotide binding polypeptides <400> 5 Gln 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Asp Ser Leu Val Arg 1 5 <210> 81 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:nucleotide binding polypeptides <400> 81 Arg Ser Asp Val Leu Val Arg 1 5 <210> 82 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:nucleotide binding polypeptides <400> 82 Arg His Asp Ser Leu Leu Arg 1 5 <210> 83 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:nucleotide binding polypeptides <400> 83 Arg Ser Asp Ala Leu Val Arg 1 5 <210> 84 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:nucleotide binding polypeptides <400> 84 Arg Ser Ser Ser Leu Val Arg 1 5 <210> 85 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:nucleotide binding polypeptides <400> 85 Arg Ser Ser Ser His Val Arg 1 5 <210> 86 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:nucleotide binding polypeptides <400> 86 Arg Ser Asp Glu Leu Val Lys 1 5 <210> 87 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:nucleotide binding polypeptides <400> 87 Arg Ser Asp Ala Leu Val Lys 1 5 <210> 88 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:nucleotide binding polypeptides <400> 88 Arg Ser Asp Val Leu Val Lys 1 5 <210> 89 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:nucleotide binding polypeptides <400> 89 Arg Ser Ser Ala Leu Val Arg 1 5 <210> 90 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:nucleotide binding polypeptides <400> 90 Arg Lys Asp Ser Leu Val Lys 1 5 <210> 91 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:nucleotide binding polypeptides <400> 91 Arg Ser Ala Ser Leu Val Arg 1 5 <210> 92 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 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Ser Leu Val Arg 1 5 <210> 104 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:nucleotide binding polypeptides <400> 104 Thr Ser Gly Ala Leu Val Arg 1 5 <210> 105 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:nucleotide binding polypeptides <400> 105 Thr Pro Gly Ala Leu Val Arg 1 5 <210> 106 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:nucleotide binding polypeptides <400> 106 Thr Gly Gly Ser Leu Val Arg 1 5 <210> 107 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:nucleotide binding polypeptides <400> 107 Thr Ser Gly Glu Leu Val Arg 1 5 <210> 108 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:nucleotide binding polypeptides <400> 108 Thr Ser Gly Glu Leu Thr Arg 1 5 <210> 109 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:nucleotide binding polypeptides <400> 109 Thr Ser Ser Ala Leu Val Lys 1 5 <210> 110 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:nucleotide binding polypeptides <400> 110 Thr Ser Ser Ala Leu Val Arg 1 5 <210> 111 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:peptide linker <400> 111 Thr Gly Glu Lys Pro 1 5 <210> 112 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:e2c target sequence <400> 112 ggggccggag ccgcagtg 18 <210> 113 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:VP16's minimal activation domain <400> 113 Asp Ala Leu Asp Asp Phe Asp Leu Asp Met Leu 1 5 10 <210> 114 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Hairpin target oligonucleotide <400> 114 ggacgcnnnc gcgggttttc ccgcgnnngc gtcc 34 <210> 115 <211> 66 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Oligonucleotide SPE2-3 <400> 115 gcgagcaagg tcgcggcagt cactaaaaga tttgccgcac tctgggcatt tatacggttt 60 ttcacc 66 <210> 116 <211> 74 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Oligonucleotide SPE2-4 <400> 116 gtgactgccg cgaccttgct cgccatcaac gcactcatac tggcgagaag ccatacaaat 60 gtccagaatg tggc 74 <210> 117 <211> 81 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Oligonucleotide SPE2-2 <400> 117 ggtaagtcct tctctcagag ctctcacctg gtgcgccacc agcgtaccca cacgggtgaa 60 aaaccgtata aatgcccaga g 81 <210> 118 <211> 58 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Oligonucleotide SPE2-5 <400> 118 acgcaccagc ttgtcagagc ggctgaaaga cttgccacat tctggacatt tgtatggc 58 <210> 119 <211> 87 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Oligonucleotide SPE2-1 <400> 119 gaggaggagg aggtggccca ggcggccctc gagcccgggg agaagcccta tgcttgtccg 60 gaatgtggta agtccttctc tcagagc 87 <210> 120 <211> 81 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Oligonucleotide SPE2-6 <400> 120 gaggaggagg agctggccgg cctggccact agttttttta ccggtgtgag tacgttggtg 60 acgcaccagc ttgtcagagc g 81 <210> 121 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:part of erbB-2 5'UTR <400> 121 ggggccggag ccgcagtg 18 <210> 122 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:part of erbB-3 5'UTR <400> 122 ggagccggag ccggagtc 18

Claims (43)

  1. 서열 1 내지 110중 어느 한 서열로 이루어진, 분리되고 정제된 아연 핑거-뉴클레오타이드 결합 폴리펩타이드.
  2. 서열 1 내지 110의 아미노산 서열로 이루어진 그룹으로부터 선택된 2 내지 12개의 정제된 아연 핑거-뉴클레오타이드 결합 폴리펩타이드들로 이루어진 폴리펩타이드.
  3. 제2항에 있어서, 서열 1 내지 110의 아미노산 서열로 이루어진 그룹으로부터 선택된 2 내지 6개의 정제된 아연 핑거-뉴클레오타이드 결합 폴리펩타이드들로 이루어진 폴리펩타이드.
  4. 제2항 또는 제3항에 있어서, 아연 핑거-뉴클레오타이드 결합 폴리펩타이드들이 작동가능하게 연결되어 있는 폴리펩타이드.
  5. 제2항 또는 제3항에 있어서, 아연 핑거-뉴클레오타이드 결합 폴리펩타이드들이 서열 111의 서열을 갖는 링커에 의해 연결되어 있는 폴리펩타이드.
  6. 제2항 또는 제3항에 있어서, 각각의 아연 핑거-뉴클레오타이드 결합 폴리펩타이드들이 상이한 뉴클레오타이드 서열과 결합하는 폴리펩타이드.
  7. 제2항 또는 제3항에 있어서, 서열 5'-(GNN)n-3'(여기서, 각각의 N은 A, C, G 또는 T이고 단, 모든 N이 C일 수 없으며, n은 2 내지 6이다)을 함유하는 뉴클레오타이드에 결합하는 폴리펩타이드.
  8. 제1항에 있어서, 한 개 이상의 전사 조절 인자에 추가로 작동가능하게 연결되어 있는 폴리펩타이드.
  9. 제2항 또는 제3항에 있어서, 추가로 한 개 이상의 전사 조절 인자에 작동가능하게 연결되어 있는 폴리펩타이드.
  10. 제1항에 따른 폴리펩타이드를 암호화하는, 분리되고 정제된 폴리뉴클레오타이드.
  11. 제2항 또는 제3항에 따른 폴리펩타이드를 암호화하는, 분리되고 정제된 폴리뉴클레오타이드.
  12. 제10항에 따른 폴리뉴클레오타이드를 함유하는 발현 벡터.
  13. 제11항의 폴리뉴클레오타이드를 함유하는 발현 벡터.
  14. 서열 5'-(GNN)n-3'(여기서, n은 1 내지 6의 정수이다)을 함유하는 뉴클레오타이드 서열을 제2항 또는 제3항에 따른 폴리펩타이드의 유효량에 노출시킴을 포함하여, 상기 뉴클레오타이드 서열을 조절하는 방법.
  15. 제14항에 있어서, 서열 5'-(GNN)n-3'이 뉴클레오타이드 서열의 전사 영역에 위치하고 있는 방법.
  16. 제14항에 있어서, 서열 5'-(GNN)n-3'이 뉴클레오타이드 서열의 프로모터 영역에 위치하고 있는 방법.
  17. 제14항에 있어서, 서열 5'-(GNN)n-3'이 발현 서열 태그내에 위치하고 있는 방법.
  18. 제14항에 있어서, 폴리펩타이드가 한 개 이상의 전사 조절 인자에 작동가능하게 연결되어 있는 방법.
  19. 제2항 또는 제3항에 따른 폴리펩타이드를 함유하는, 암 치료용 약제.
  20. 삭제
  21. 삭제
  22. 제4항에 있어서, 아연 핑거-뉴클레오타이드 결합 폴리펩타이드들이 서열 111의 서열을 갖는 링커에 의해 연결되어 있는 폴리펩타이드.
  23. 제4항에 있어서, 각각의 아연 핑거-뉴클레오타이드 결합 폴리펩타이드들이 상이한 뉴클레오타이드 서열과 결합하는 폴리펩타이드.
  24. 제5항에 있어서, 각각의 아연 핑거-뉴클레오타이드 결합 폴리펩타이드들이 상이한 뉴클레오타이드 서열과 결합하는 폴리펩타이드.
  25. 제4항에 있어서, 서열 5'-(GNN)n-3'(여기서, 각각의 N은 A, C, G 또는 T이고 단, 모든 N이 C일 수 없으며, n은 2 내지 6이다)을 함유하는 뉴클레오타이드에 결합하는 폴리펩타이드.
  26. 제5항에 있어서, 서열 5'-(GNN)n-3'(여기서, 각각의 N은 A, C, G 또는 T이고 단, 모든 N이 C일 수 없으며, n은 2 내지 6이다)을 함유하는 뉴클레오타이드에 결합하는 폴리펩타이드.
  27. 제6항에 있어서, 서열 5'-(GNN)n-3'(여기서, 각각의 N은 A, C, G 또는 T이고 단, 모든 N이 C일 수 없으며, n은 2 내지 6이다)을 함유하는 뉴클레오타이드에 결합하는 폴리펩타이드.
  28. 제4항에 있어서, 추가로 한 개 이상의 전사 조절 인자에 작동가능하게 연결되어 있는 폴리펩타이드.
  29. 제5항에 있어서, 추가로 한 개 이상의 전사 조절 인자에 작동가능하게 연결되어 있는 폴리펩타이드.
  30. 제6항에 있어서, 추가로 한 개 이상의 전사 조절 인자에 작동가능하게 연결되어 있는 폴리펩타이드.
  31. 제7항에 있어서, 추가로 한 개 이상의 전사 조절 인자에 작동가능하게 연결되어 있는 폴리펩타이드.
  32. 제4항에 따른 폴리펩타이드를 암호화하는, 분리되고 정제된 폴리뉴클레오타이드.
  33. 제5항에 따른 폴리펩타이드를 암호화하는, 분리되고 정제된 폴리뉴클레오타이드.
  34. 제6항에 따른 폴리펩타이드를 암호화하는, 분리되고 정제된 폴리뉴클레오타이드.
  35. 제7항에 따른 폴리펩타이드를 암호화하는, 분리되고 정제된 폴리뉴클레오타이드.
  36. 서열 5'-(GNN)n-3'(여기서, n은 1 내지 6의 정수이다)을 함유하는 뉴클레오타이드 서열을 제4항에 따른 폴리펩타이드의 유효량에 노출시킴을 포함하여, 상기 뉴클레오타이드 서열을 조절하는 방법.
  37. 서열 5'-(GNN)n-3'(여기서, n은 1 내지 6의 정수이다)을 함유하는 뉴클레오타이드 서열을 제5항에 따른 폴리펩타이드의 유효량에 노출시킴을 포함하여, 상기 뉴클레오타이드 서열을 조절하는 방법.
  38. 서열 5'-(GNN)n-3'(여기서, n은 1 내지 6의 정수이다)을 함유하는 뉴클레오타이드 서열을 제6항에 따른 폴리펩타이드의 유효량에 노출시킴을 포함하여, 상기 뉴클레오타이드 서열을 조절하는 방법.
  39. 서열 5'-(GNN)n-3'(여기서, n은 1 내지 6의 정수이다)을 함유하는 뉴클레오타이드 서열을 제7항에 따른 폴리펩타이드의 유효량에 노출시킴을 포함하여, 상기 뉴클레오타이드 서열을 조절하는 방법.
  40. 제4항에 따른 폴리펩타이드를 함유하는, 암 치료용 약제.
  41. 제5항에 따른 폴리펩타이드를 함유하는, 암 치료용 약제.
  42. 제6항에 따른 폴리펩타이드를 함유하는, 암 치료용 약제.
  43. 제7항에 따른 폴리펩타이드를 함유하는, 암 치료용 약제.
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