EA031322B1 - Клетка или клеточная линия для экспрессии экзогенных нуклеотидных последовательностей и применение клетки или клеточной линии - Google Patents

Клетка или клеточная линия для экспрессии экзогенных нуклеотидных последовательностей и применение клетки или клеточной линии Download PDF

Info

Publication number
EA031322B1
EA031322B1 EA201201036A EA201201036A EA031322B1 EA 031322 B1 EA031322 B1 EA 031322B1 EA 201201036 A EA201201036 A EA 201201036A EA 201201036 A EA201201036 A EA 201201036A EA 031322 B1 EA031322 B1 EA 031322B1
Authority
EA
Eurasian Patent Office
Prior art keywords
cell
dna
sequence
site
sequences
Prior art date
Application number
EA201201036A
Other languages
English (en)
Other versions
EA201201036A1 (ru
Inventor
Уилльям М. Эйнли
Майкл Г. Мюррей
Федор Урнов
Брайан Цайтлер
Original Assignee
Дау Агросайенсиз Ллс
Сангамо Терапьютикс, Инк.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Дау Агросайенсиз Ллс, Сангамо Терапьютикс, Инк. filed Critical Дау Агросайенсиз Ллс
Publication of EA201201036A1 publication Critical patent/EA201201036A1/ru
Publication of EA031322B1 publication Critical patent/EA031322B1/ru

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01H—NEW PLANTS OR NON-TRANSGENIC PROCESSES FOR OBTAINING THEM; PLANT REPRODUCTION BY TISSUE CULTURE TECHNIQUES
    • A01H1/00—Processes for modifying genotypes ; Plants characterised by associated natural traits
    • A01H1/06—Processes for producing mutations, e.g. treatment with chemicals or with radiation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8201—Methods for introducing genetic material into plant cells, e.g. DNA, RNA, stable or transient incorporation, tissue culture methods adapted for transformation
    • C12N15/8213—Targeted insertion of genes into the plant genome by homologous recombination
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/87—Introduction of foreign genetic material using processes not otherwise provided for, e.g. co-transformation
    • C12N15/90—Stable introduction of foreign DNA into chromosome
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/16—Hydrolases (3) acting on ester bonds (3.1)
    • C12N9/22—Ribonucleases RNAses, DNAses
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/80—Fusion polypeptide containing a DNA binding domain, e.g. Lacl or Tet-repressor
    • C07K2319/81—Fusion polypeptide containing a DNA binding domain, e.g. Lacl or Tet-repressor containing a Zn-finger domain for DNA binding
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2800/00—Nucleic acids vectors
    • C12N2800/80—Vectors containing sites for inducing double-stranded breaks, e.g. meganuclease restriction sites

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Environmental Sciences (AREA)
  • Developmental Biology & Embryology (AREA)
  • Botany (AREA)
  • Crystallography & Structural Chemistry (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Breeding Of Plants And Reproduction By Means Of Culturing (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)

Abstract

Изобретение относится к способам целевой интеграции одной или более экзогенных нуклеотидных последовательностей в клетку, например, для экспрессии одного или более полипептидов, представляющих интерес, а также к способам целевого удаления из генома интегрированных в эндогенный геном клетки экзогенных нуклеотидных последовательностей.

Description

Изобретение относится к способам целевой интеграции одной или более экзогенных нуклеотидных последовательностей в клетку, например, для экспрессии одного или более полипептидов, представляющих интерес, а также к способам целевого удаления из генома интегрированных в эндогенный геном клетки экзогенных нуклеотидных последовательностей.
031322 Bl
Перекрестная ссылка на родственные заявки
Заявка на данное изобретение претендует на приоритет предварительной заявки на патент США № 61/336457, поданной 22 января 2010 г., раскрытие которой включено в настоящий документ посредством ссылки во всей ее полноте.
Заявление в отношении прав на изобретения, сделанное в рамках федерально финансируемого исследования и развития разработки
Не применимо.
Область техники
Настоящее раскрытие информации относится к области геномной инженерии, в частности к целевой интеграции и/или целевой эксцизии одной или более экзогенных последовательностей в геноме клетки.
Уровень техники
Биотехнология стала важным инструментом в усилиях для решения проблемы увеличения мирового спроса на производство продуктов питания. Традиционные подходы к повышению производительности в сельском хозяйстве, например увеличение урожая или разработанная резистентность к вредителям, основываются либо на мутационной селекции, либо на введении новых генов в геномы видов сельскохозяйственных культур путем трансформации. Оба процесса являются по своей сути неспецифическими и относительно неэффективными. Например, традиционные способы трансформации растений доставляют экзогенную ДНК, которая интегрируется в геном в случайных местах. Таким образом, в целях выявления и изоляции трансгенных линий с заданными характерными свойствами необходимо создать тысячи уникальных случайных интеграционных событий, а затем - экран для заданных индивидуумов. В результате инженерия обычных признаков растений является трудоемким, длительным и непредсказуемым делом. Кроме того, случайный характер этих интеграций делает затруднительным предсказание того, произойдут ли плейотропные эффекты, связанные с непреднамеренным нарушением генома. В результате размножение, изоляция и характеристика линий растений с инженерными генами или признаками были чрезвычайно трудоемкими и дорогостоящими процессами с низкой вероятностью успеха. Целевая генная модификация преодолевает материально-технические проблемы обычной практики в растительных системах и как таковую давно существующую, но недостижимую цель как в фундаментальных исследованиях биологии растений, так и в сельскохозяйственной биотехнологии. Тем не менее, за исключением генной ориентации через позитивно-негативный выбор препарата в рисе или использование предварительно-инженерных сайтов рестрикции, целевая геномная модификация всех видов растений, как модели, так и сельскохозяйственной культуры, до недавнего времени оказывалась очень трудной. Terada et al. (2002), Nat. Biotechnol. 20(10):1030; Terada et al. (2007), Plant. Physiol. 144(2):846; D'Halluin et al. (2008), Plant. Biotechnology. J. 6(1):93.
В клетках млекопитающих стабильный трансгеноз и целевая инсерция генов имеют много потенциальных применений как в генной терапии, так и в клеточной инженерии. Однако современные стратегии зачастую являются неэффективными и вставляют трансген в геномную ДНК неспецифическим образом. Неспособность контролировать расположение геномной инсерции может привести к очень разным уровням экспрессии трансгена среди популяции из-за эффектов положения в пределах генома. Кроме того, современные способы стабильного трансгеноза и амплификации трансгенов часто приводят к физической потере трансгена, сайленсингу трансгена с течением времени, инсерционному мутагенезу за счет интеграции гена и автономного промотора внутри или рядом с эндогенным геном, создания хромосомных аномалий и экспрессии перестроенных генных продуктов (состоящих из эндогенных генов, вставленных трансгенов или того и другого) и/или создания связанных с векторами видами токсичности и иммуногенности in vivo от полученных из вектора генов, которые экспрессируются постоянно в связи с необходимостью долгосрочной персистенции вектора, чтобы обеспечить стабильную экспрессию трансгена.
Недавно были описаны способы и композиции для целевого расщепления геномной ДНК. Такие события целевого расщепления могут быть использованы, например, для того, чтобы индуцировать целевой мутагенез, индуцировать целевые делеции последовательностей клеточной ДНК, а также содействовать целевой рекомбинации в предетерминированном хромосомном локусе. См., например, патентные публикации США № 20030232410, 20050208489, 20050026157, 20050064474 и 20060188987 и международную публикацию WO 2007/014275, раскрытие которых включено в настоящий документ посредством ссылки во всей их полноте для любых целей. Патентная публикация США № 20080182332 описывает использование неканонических нуклеаз цинкового пальца (нуклеазы цинкового пальца (ZFN)) для целевой модификации геномов растений, а патентная публикация США № 20090205083 описывает ZFN-опосредованную целевую модификацию EPSPS локуса растения. Кроме того, работы Moehle et al. (2007), Proc. Natl. Acad, Sci. USA, 104(9):3055-3060) описывают использование ZFN, предназначенных для добавления целевого гена в определенном локусе.
Тем не менее, остается потребность в композициях и способах целевой интеграции, в том числе для целевой интеграции в растения, для создания стабильных, передаваемых по наследству генетических модификаций в растении и его потомстве и для целевой интеграции в клетках млекопитающих для ген
- 1 031322 ной терапии и для целей развития клеточных линий.
Сущность изобретения
Настоящее раскрытие относится к способам для экспрессирования одного или более продуктов экзогенной последовательности нуклеиновых кислот (т.е. белка или молекулы РНК), которая была интегрирована в сайт множественной инсерции, интегрированный в геном клетки. Клетка может представлять собой эукариотическую клетку, например клетку растения, дрожжей или млекопитающих.
Интеграция экзогенных последовательностей нуклеиновых кислот облегчается при помощи геномной интеграции полинуклеотидной последовательности, содержащей несколько целевых сайтов для одной или более нуклеаз, например нуклеазы цинкового пальца (ZFN), в геном клетки. Полинуклеотиды (также называемые здесь сайтом множественной инсерции) предоставляют возможность специфического целевого двухцепочечного расщепления в геноме клетки, где двухцепочечное расщепление, в свою очередь, приводит к интеграции экзогенной последовательности (последовательностей) как через гомологически зависимые механизмы, так и через гомологически независимые механизмы.
Одним из аспектов настоящего изобретения является выделенная клетка или клеточная линия для экспрессии одной или более экзогенных нуклеотидных последовательностей, содержащие полинуклеотидную последовательность, интегрированную в эндогенный геном клетки, где указанная последовательность включает сайт множественной инсерции для указанной экзогенной последовательности, содержащий три или более различных парных целевых сайта для одной или более нуклеаз цинкового пальца, где каждый парный целевой сайт содержит первый и второй целевые сайты, образующие парный целевой сайт, причем близлежащие края целевых сайтов каждого парного целевого сайта отделены друг от друга 2-50 и более нуклеотидами, парные целевые сайты отделены друг от друга нуклеотидными линкерами, и по меньшей мере один из указанных парных целевых сайтов не присутствует в эндогенном геноме. В частности, последовательности первого целевого сайта из каждого парного целевого сайта являются одинаковыми. В предпочтительном варианте осуществления клетка является эукариотической клеткой, такой как растительная клетка или клетка млекопитающего, а клеточная линия является линией клеток млекопитающего.
Так, в одном аспекте здесь раскрыты молекулы нуклеиновой кислоты, также известные как сайты множественной инсерции, включающие один или более целевых сайтов для нуклеаз, таких как нуклеазы цинкового пальца (ZFN). В некоторых вариантах воплощения целевые сайты не присутствуют в эндогенном геноме, в который интегрирован сайт множественной инсерции. Сайт множественной инсерции может включать один, два, три, четыре, пять, шесть, семь или более целевых сайтов для нуклеаз. В некоторых вариантах воплощения димеризация полудоменов расщепления двух связывающих ДНКсвязывающих белков, которые связываются с соседними целевыми сайтами (спаренные целевые сайты), является необходимой для расщепления (например, для расщепления необходима пара нуклеаз, одна, связывающаяся с каждым сайтом). В любом из сайтов множественной инсерции, описанных здесь, один целевой сайт из каждой пары целевых сайтов может содержать ту же последовательность. См., например, фиг. 1. В некоторых вариантах воплощения целевые сайты по меньшей мере одной пары являются одинаковыми. В других вариантах воплощения по меньшей мере одна пара целевых сайтов содержит индивидуальные целевые последовательности из различных целей (например, из различных генов и/или генов из различных организмов). В некоторых вариантах воплощения по меньшей мере один из парных целевых сайтов содержит последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 1-20. В некоторых вариантах воплощения сайт множественной инсерции может включать в себя еще одну кодирующую последовательность, например единицу транскрипции растения (ЕТР), включающую последовательность, кодирующую фосфинотрицин ацетилтрансферазу (ФАТ), или скрининг маркер для использования в клетках млекопитающих. Сайты множественной инсерции интегрируются в геном клетки (например, клетки растения или млекопитающего), чтобы обеспечить геномные мишени для нуклеаз (например, ZFN). В некоторых вариантах воплощения целевые сайты расположены так, что одна или более пар нуклеаз цинкового пальца связывают и расщепляют, как гомодимеры. В других вариантах воплощения целевые сайты расположены так, что одна или более пар нуклеаз цинкового пальца связывают и расщепляют, как гетеродимеры.
В другом аспекте здесь предоставлен способ интегрирования одной или более экзогенных последовательностей в сайт множественной инсерции, интегрированный в геном клетки (например, клетки растения или млекопитающего) или клеточной линии; включающий введение одной или более нуклеаз цинкового пальца и одной или более экзогенных нуклеотидных последовательностей в указанные клетку или клеточную линию, где нуклеазы цинкового пальца связываются с сайтом множественной инсерции в эндогенном геноме клетки или клеточной линии и расщепляют геном клетки; что приводит к интеграции экзогенной последовательности в указанные клетку или клеточную линию. В частном варианте осуществления одна или более экзогенных последовательностей содержат последовательность, кодирующую функциональный полипептид. Также предоставляется способ удаления одной или более интегрированных в эндогенный геном клетки экзогенных нуклеотидных последовательностей согласно способу по любому из пп.4, 5 и введение одной или более нуклеаз цинкового пальца в клетку, причем нуклеазы нацеливаются на парные целевые сайты в эндогенном геноме клетки, вследствие чего одна или более ин
- 2 031322 тегрированных экзогенных последовательностей удаляются из генома, а затем расщепляются соответствующими нуклеазами. В частности, в данном способе клетка дополнительно включает модификации ее генома за пределами области, включающей интегрированную молекулу нуклеиновой кислоты. В предпочтительном варианте изобретения клетка представляет собой растительную клетку. В любом из способов, описанных здесь, способы могут быть использованы в комбинации с другими способами изменения генома, включая целевую интеграцию и/или целевую инактивацию в одном или в более эндогенных локусов. Более того, в любом из способов, описанных здесь, нуклеаза может содержать один или более гибридных белков, содержащих связывающий домен типа цинкового пальца и полудомен расщепления, где связывающий домен типа цинкового пальца был разработан для связывания с целевым сайтом в сайте множественной инсерции. Более того, в любом из этих способов экзогенная последовательность нуклеиновой кислоты содержит одну или более последовательностей, которая(ые) является(ются) гомологичной(ыми) последовательностям в сайте множественной инсерции и/или эндогенными последовательностями в регионе, в который интегрирован сайт множественной инсерции.
В любом из способов, описанных здесь, один или более сайтов множественной инсерции могут быть интегрированы в геном при помощи любого подходящего способа, например, при помощи целевой интеграции при помощи нуклеазы (например, ZFN) с использованием ZFN, которые нацеливаются на эндогенный ген, в котором желательна инсерция. Кроме того, один или более сайтов множественной инсерции могут быть случайным образом интегрированы в геном клетки с помощью стандартных способов.
Экзогенная последовательность нуклеиновой кислоты может содержать последовательность, кодирующую один или более функциональных полипептидов (например, кДНК), с одним или более промоторами или без них и/или может производить одну или более РНК последовательностей (например, при помощи одной или более кассет экспрессии мшРНК, которые придают организму желательные признаки. Такие признаки у растений включают, не ограничиваясь этим, резистентность или толерантность к гербицидам, резистентность или толерантность к насекомым-вредителям, резистентность или толерантность к заболеваниям (вирусным, бактериальным, грибковым, нематодам), стрессоустойчивость и/или сопротивление стрессу, о чем свидетельствует сопротивление или резистентность к засухе, жаре, заморозкам, повышенной влажности, солевому стрессу, окислительному стрессу; повышенная урожайность, содержание пищевых продуктов и состав, внешний вид, мужское бесплодие, высушивание, выносливость, плодовитость, количество и качество крахмала; количество и качество масла, качество и количество белка; аминокислотный состав и тому подобное. Конечно, любые две или более экзогенные нуклеиновые кислоты любого вида, например, те, которые предоставляют резистентность к гербицидам, насекомым, заболеваниям (вирусным, бактериальным, грибковым, нематодам) или засухоустойчивости, мужское бесплодие, высушивание, выносливость, плодовитость, свойства крахмала, количество и качество масла или повышающие урожайность и питательную ценность, могут быть использованы по желанию. В некоторых вариантах воплощения экзогенная последовательность нуклеиновой кислоты содержит последовательность, кодирующую белок, устойчивый к гербицидам (например, ген ААД (арилоксиалканоат диоксигеназа)), и/или ее функциональные фрагменты. Экспрессия интегрированной последовательности может быть обусловлена промотором, функционально связанным с интегрированной последовательностью. Альтернативно, интегрированная последовательность является безпромоторной, а транскрипция обусловлена эндогенным промотором в регионе инсерции сайта множественной инсерции полинуклеотида. В других вариантах воплощения расщепление и неточное восстановление сайта связывания может инактивировать или активировать гены, представляющие интерес. В некоторых вариантах воплощения полинуклеотид является плазмидой. В других вариантах воплощения полинуклеотид является линейной ДНК молекулой. В клетках млекопитающих способы и композиции изобретения могут быть использованы для конструкции клеточных линий, например для конструкции клеточных линий, экспрессирующих мультимерные полипептиды, такие как антитела. В некоторых вариантах воплощения клеточные линии могут быть использованы для исследовательских целей, например для конструкции клеточных линий, экспрессирующих элементы пути метаболизма, представляющие интерес. В некоторых вариантах воплощения первичные клетки или стволовые клетки могут быть использованы, чтобы экспрессировать мультимерные белки, представляющие интерес для целей клеточной терапии. В другом аспекте здесь предоставлены способы измерения активности нуклеазы цинкового пальца. В некоторых вариантах воплощения способ включает (а) предоставление по меньшей мере одной нуклеазы цинкового пальца и молекулы нуклеиновой кислоты, как описано здесь, где каждый из парных целевых сайтов включает две нуклеазы цинкового пальца половины целевых сайтов, с которыми нуклеаза цинкового пальца связана, и вырезанный сайт, который вырезается связанной нуклеазой цинкового пальца, где вырезанный сайт расположен между половинами целевых сайтов; (б) объединение нуклеазы цинкового пальца с нуклеиновой кислотой таким образом, что нуклеаза цинкового пальца расщепляет парные целевые сайты, по меньшей мере, в пределах вырезанного сайта; (в) секвенирование, по меньшей мере, вырезанного сайта для генерирования данных о последовательности; и (г) сравнение в данных о последовательности количества и длины делеций пар оснований в вырезанном сайте с количеством и длиной делеций пар оснований в вырезанном сайте в отсутствие нуклеазы цинкового пальца, чтобы, таким образом, измерить активность нуклеа
- 3 031322 зы цинкового пальца в парных целевых сайтах. В некоторых вариантах воплощения делеция более чем одной пары оснований указывает на повышенную активность нуклеазы (нуклеаз) цинкового пальца.
В еще других вариантах воплощения здесь предоставлены способы оптимизации активности нуклеазы цинкового пальца в парных целевых сайтах. В некоторых вариантах воплощения способы включают (а) предоставление по меньшей мере одной нуклеазы цинкового пальца и молекулы нуклеиновой кислоты, как описано здесь, где каждый из парных целевых сайтов включает две нуклеазы цинкового пальца половины целевых сайтов, с которыми нуклеаза цинкового пальца связана, и вырезанный сайт, который вырезается связанной нуклеазой цинкового пальца, где вырезанный сайт расположен между половинами целевых сайтов; (б) комбинирование одной или более нуклеаз цинкового пальца с нуклеиновой кислотой таким образом, что нуклеаза цинкового пальца расщепляет парные целевые сайты, по меньшей мере, в пределах вырезанного сайта; (в) определение уровня активности нуклеазы цинкового пальца на вырезанном сайте; (г) изменения количества пар оснований в вырезанном сайте; (д) повторение шагов (б)-(г) множество раз и (е) выбор для включения в нуклеиновую кислоту вырезанного сайта, который содержит количество пар оснований, обеспечивающее наивысший уровень активности нуклеазы цинкового пальца, тем самым оптимизируя активность нуклеазы цинкового пальца на парном целевом сайте.
В любом из способов, описанных здесь, вовлекающих нуклеазы цинкового пальца, первый и второй полудомены расщепления происходят из типа IIS рестрикции эндонуклеазы, например FokI или StsI. Более того, в любом из способов, описанных здесь, по меньшей мере один из гибридных белков может содержать изменения в аминокислотной последовательности интерфейса димеризации полудомена расщепления, например, такие, что образуются облигатные гетеродимеры полудоменов расщепления. В любом из способов, описанных здесь, растительная клетка может включать однодольную или двудольную растительную клетку. В некоторых вариантах воплощения растительная клетка представляет собой культурное растение, например кукурузу. В некоторых вариантах воплощения клетка может включать клетку млекопитающих, такую как первичная клетка, линия клеток или стволовая клетка. В некоторых вариантах воплощения клеточная линия млекопитающих может использоваться для производства полипептидов, представляющих интерес.
Краткое описание чертежей
Фиг. 1 является схематическим изображением типичного сайта множественной инсерции, как описано здесь. Фиг. 1 демонстрирует сайт множественной инсерции, составленный из 7 ZFN целевых сайтов. ZFN пары, которые связываются с целевыми сайтами, отображаются в виде геометрических фигур. Блок 1 представляет собой экзогенную последовательность, которая интегрирована в сайт множественной инсерции в присутствии соответствующей пары ZFN, сохраняя при этом целевые сайты ZFN (затененные и клетчатые треугольники). Фиг. 1 демонстрирует интеграцию блока 1 в сайт множественной инсерции в присутствии соответствующей пары ZFN вместо целевых сайтов ZFN.
Фиг. 2 является схематическим изображением типичного сайта множественной инсерции, как показано на фиг. 1, на которой Блок 2 представляет собой экзогенную последовательность, которая интегрирована в сайт множественной инсерции в присутствии соответствующей пары ZFN.
Фиг. 3 является схемой внутриаллельной рекомбинации, усиленной посредством ZFN. Две вставки на идентичных месторасположениях генома, но смещенные относительно друг друга могут подвергаться гомологичной рекомбинации или обмену цепочек после двухцепочечного расщепления при помощи ZFN. Пара ZFN (с обоими мономерами ZFN, экспрессируемыми вместе) может быть предоставлена путем скрещивания растений, экспрессирующих пару ZFN, с растениями, содержащими обе аллели вместе, или путем введения двух мономеров ZFN от двух сторон гибрида в растения, содержащие одну аллель.
Фиг. 4 является схематическим изображением использования гетеродимерных ZFN левого и правого целевых доменов. Верхняя линия отображает геном с левым и правым целевыми ZFN доменами (затененный треугольник и шахматный треугольник). Когда соответствующая пара ZFN добавлена в присутствии экзогенных молекул, включающих ген в окружении различных гетеродимерных пар, ген и окружающие нуклеазные сайты вводятся в геном так, как показано.
Фиг. 5 является схематическим изображением интеграции и эксцизии экзогенных последовательностей (изображаются как гены) на любой стороне геномно интегрированной последовательности. Добавленные гены окружены областями гомологии, чтобы направить кассеты генов в соответствующий сайт. Две половины ZFN целевого сайта, используемые для инсерции, рекомбинируют при помощи создания двух новых комбинаций во вставочной ДНК. Эксцизия кассеты гена осуществляется путем связывания соответствующих пар ZFN для того, чтобы расщеплять на фланкирующих ZFN целевых сайтах. Эксцизия может требовать шаблон, содержащий гомологичные плечи, чтобы предотвратить делеции желаемой последовательности ДНК. Каждый ген может включать одну или более последовательностей, например, одну или более кодирующих последовательностей.
Фиг. 6 является схематическим изображением эксцизии и повторного использования вставочных маркерных генов с использованием ZFN гетеродимеров (изображаются как треугольники с разными оттенками)
Фиг. 7 представляет собой карту плазмиды pDAB105900.
- 4 031322
Фиг. 8 представляет собой карту плазмиды pDAB105908.
Фиг. 9 представляет собой диаграмму кассеты экспрессии гомодимера нуклеазы цинкового пальца.
Фиг. 10 представляет собой диаграмму кассеты экспрессии гетеродимера нуклеазы цинкового пальца.
Фиг. 11 демонстрирует eZFN активность расщепления в кукурузе, как определено по частоте делеций в результате соединения негомологичных концов после расщепления.
Фиг. 12 демонстрирует eZFN активность расщепления в табаке, как определено по частоте делеций в результате соединения негомологичных концов после расщепления.
Фиг. 13 представляет собой схему двух трансгенных вставок в тот же генетический локус. Верхняя линия показывает случайную последовательность, маркированную СМИ для сайта множественной инсерции (также называемую здесь посадочной площадкой), содержащую eZFN сайты связывания, необходимые для гомологичной рекомбинации в локусе и блоке 1, содержащую селективный маркерный ген канамицина и оцениваемый маркерный ген ГУО. Средняя линия изображает тот же сайт множественной инсерции (СМИ), что и в верхней ДНК вместе с блоком 2, содержащим селективный маркерный ген устойчивости к гигромицину и селективный маркерный ген желтой флуоресценции белка. (ГФТ/ЖФБ). В нижней линии показан локус после рекомбинации.
Фиг. 14 демонстрирует гомологичную рекомбинацию в аллельных позициях посредством ZFN и генерацию двух различных вставок ДНК в том же генетическом локусе, который описан в фиг. 13. Конструкция включает блок 1 (содержащий канамициновый и ГУО маркеры, ГУО/НФТ), сайт множественной инсерции (СМИ или посадочная площадка) и блок 2 (содержащий гигромициновый маркер и маркер желтой флуоресценции, ГФТ/ЖФБ), трансформированный в Арабидопсис. Для создания отдельно каждого блока вместе с сайтом множественной инсерции в отдельных растениях блок 2 вырезают из интегрированного сайта для получения конфигурации только блока 1 или блок 1 вырезают из интегрированного сайта для получения конфигурации только блока 2. Удаление генных блоков осуществляется путем скрещивания растений, содержащих оригинальное трансгенное событие, с растениями, экспрессирующими ZFN, которые расщепляют на сайтах связывания eZFN, расположенных сбоку от каждого генного блока. Восстановленные растения с одним блоком скрещивают, чтобы производить две конфигурации вместе в одном растении, и это растение скрещивают с растением, экспрессирующим мейозспецифический промотор, чтобы оказывать воздействие на обмен ДНК между двумя аллелями блока 1 и блока 2.
Фиг. 15 представляет собой структурную схему, отображающую шаги получения рекомбинации между двумя последовательностями ДНК, расположенными в одном и том же генетическом локусе, при помощи ZFN расщепления на промежуточном сайте между двумя последовательностями. Конструкция, описанная на фиг. 16, трансформируется в Арабидопсис. Один из двух генных блоков (описанных на фиг. 14) удаляют путем скрещивания с растениями, экспрессирующими eZFN, связывающие сайты которых окружают блоки по бокам, что приводит в результате к растениям, содержащим либо блок 1, либо блок 2.
Фиг. 16 представляет собой схему плазмиды, используемой для введения обменного локуса в Арабидопсис. Она содержит блоки 1 и 2, как описано на фиг. 14, и последовательность сайта множественной инсерции. Указаны сайты связывания eZFN и боковые блоки 1 и 2 (блок 1: eZFN 1 и 8; блок 2: eZFN 3 и 6) или расположенные центрально в сайте множественной инсерции (eZFN 4 и 7), чтобы облегчить гомологичную рекомбинацию.
Подробное описание изобретения
Настоящее раскрытие относится к способам и композициям для целевой интеграции (ЦИ) в геном, например, культурного растения, такого как кукуруза, или в клетки млекопитающего. Сайт множественной инсерции, содержащий несколько целевых сайтов для одной или более нуклеаз (например, ZFN) интегрируется в геном. После интеграции сайта множественной инсерции в геном соответствующие нуклеазы вводятся в клетку вместе с экзогенной последовательностью, которая должна быть вставлена. В некоторых вариантах воплощения нуклеаза(ы) содержит(ат) одну или более ZFN. ZFN обычно содержат домен расщепления (или полудомен расщепления) и связывающий домен типа цинкового пальца и могут быть представлены как белки, как полинуклеотиды, кодирующие эти белки, или как комбинации полипептидов и полинуклеотидов, кодирующих полипептиды. Нуклеазы цинкового пальца типично функционируют как димерные белки после димеризации полудоменов расщепления. Облигатные гетеродимерные ZFN, в которых ZFN мономеры связываются с левыми и правыми доменами распознавания, могут соединяться, чтобы сформировать активную нуклеазу, которая была описана. См., например, патентную публикацию США № 2008/0131962. Таким образом, при данных соответствующих целевых сайтах левый мономер может образовывать активные ZF нуклеазы с любым правым мономером. Это значительно увеличивает количество подходящих сайтов нуклеаз на основе испытанных левых и правых доменов, которые могут быть использованы в различных сочетаниях. Например, рекомбинация сайтов связывания 4 гомодимерных ZF нуклеаз дает дополнительные 12 гетеродимерных ZF нуклеаз. Более существенно, она делает возможным системный подход к трансгенному дизайну таким образом, что каждая новая введенная последовательность становится окруженной сбоку уникальным сайтом ZFN, кото
- 5 031322 рый может быть использован для уклонения от удаления гена или для нацеливания на дополнительные гены рядом с ним. Кроме того, этот способ может упрощать стратегии укладки в один локус, который управляется ZFN-зависимыми двухцепочечными разрывами.
Связывающий домен типа цинкового пальца может быть каноническим (С2Н2) цинковым пальцем или неканоническим (например, C3H) цинковым пальцем. Более того, связывающий домен типа цинкового пальца может содержать один или более цинковых пальцев (например, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или более цинковых пальцев) и может быть разработан, чтобы связываться с любой последовательностью в пределах сайта множественной инсерции. Присутствие такого гибридного белка (или белков) в клетках приводит к связыванию гибридного белка (гибридных белков) с его (их) сайтом(ами) связывания и расщепления в пределах сайта множественной инсерции, что приводит в результате к интеграции экзогенной последовательности(ей).
Общие положения.
Осуществление на практике способов, а также подготовка и использование композиций, описанных здесь, использует, если не указано иное, обычные способы в молекулярной биологии, биохимии, структуре и анализе хроматина, вычислительной химии, культивировании клеток, рекомбинантных ДНК и смежных областях, которые входят в сферу специальных знаний в данной области техники. Эти способы полностью описаны в литературе. См., например, Sambrook et al. MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, Second edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989 and Third edition, 2001; Ausubel et al., CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, John Wiley & Sons, New York, 1987 и периодические корректировки; серии METHODS IN ENZYMOLOGY, Academic Press, San Diego; Wolffe, CHROMATIN STRUCTURE AND FUNCTION, Third edition, Academic Press, San Diego, 1998; METHODS IN ENZYMOLOGY, Vol. 304, Chromatin (P.M. Wassarman and A.P. Wolffe, eds.), Academic Press, San Diego, 1999; и METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY, Vol. 119, Chromatin Protocols (P.B. Becker, ed.) Humana Press, Totowa, 1999.
Определения.
Термины нуклеиновая кислота, полинуклеотид и олигонуклеотид являются взаимозаменяемыми и относятся к дезоксирибонуклеотидному или рибонуклеотидному полимеру в линейной или круговой конформации и в одно- или двухцепочечной форме. Для целей настоящего раскрытия эти термины не должны истолковываться как ограничивающие в отношении длины полимера. Термины могут охватывать известные аналоги природных нуклеотидов, а также нуклеотиды, которые являются модифицированными во фрагментах оснований, сахаров и/или фосфатов (например, фосфоротиоатные каркасы). В общем аналог специфического нуклеотида имеет ту же специфику спаривания оснований, т.е. аналог А будет спариваться с Т.
Термины полипептид, пептид и белок используются как синонимы для обозначения полимера аминокислотных остатков. Этот термин также относится к аминокислотным полимерам, в которых одна или более аминокислот представляют собой химические аналоги или модифицированные производные соответствующих природных аминокислот.
Связывание относится к последовательность-специфическому нековалентному взаимодействию между макромолекулами (например, между белком и нуклеиновой кислотой). Не все компоненты связывающего взаимодействия должны быть последовательность-специфическими (например, контакты с фосфатными остатками в остове ДНК) до тех пор, пока взаимодействие в целом является последовательность-специфическим. Такое взаимодействие, как правило, характеризуется константой диссоциации (Kd), равной 10-6 M-1 или ниже. Сродство относится к силе связывания: повышенное сродство связывания коррелирует с более низкой Kd.
Связывающий белок представляет собой белок, который способен связываться с другой молекулой. Связывающий белок может связываться, например, с молекулой ДНК (ДНК-связывающий белок), молекулой РНК (РНК-связывающий белок) и/или молекулой белка (белок-связывающий белок). В случае белок-связывающего белка он может связываться с самим собой (для образования гомодимеров, гомотримеров и т.д.) и/или он может связываться с одной или более молекул другого белка или белков. Связывающий белок может иметь более чем один тип связывающей активности. Например, белки типа цинкового пальца имеют ДНК-связывающую, РНК-связывающую и белок-связывающую активность.
ДНК-связывающий белок типа цинковый палец (или связывающий домен) представляет собой белок или домен в пределах более крупного белка, который связывает ДНК последовательностьспецифическим образом через один или более цинковых пальцев, которые являются областями аминокислотной последовательности в связывающем домене, структура которого стабилизирована путем координации иона цинка. Термин ДНК-связывающий белок типа цинковый палец часто сокращают как белок цинковый палец или ZFP.
Связывающие домены типа цинковый палец могут быть разработаны для связывания с предетерминированной нуклеотидной последовательностью. Неограничивающие примеры способов разработки белков типа цинковый палец представляют собой конструирование и селекцию. Сконструированный белок цинковый палец представляет собой белок, не встречающийся в природе, чья конструкция/композиция является результатом, главным образом, рациональных критериев. Рациональные крите
- 6 031322 рии конструирования включают применение правил замещения и компьютеризированных алгоритмов обработки информации в базе данных, хранения информации о существующих данных, о ZFP конструкциях и о связывании. См., например, патенты США № 6140081, 6453242 и 6534261, см. также патенты WO 98/53058, WO 98/53059, WO 98/53060, WO 02/016536 и WO 03/016496. Избранный белок типа цинковый палец представляет собой белок, не встречающийся в природе, производство которого в первую очередь следует из результатов эмпирического процесса, такого как фаговый дисплей, фильтр взаимодействия или гибридная селекция. См., например, патенты США № 5789538, 5925523, 6007988, 6013453, 6200759, WO 95/19431, WO 96/06166, WO 98/53057, WO 98/54311, WO 00/27878, WO 01/60970, WO 01/88197 и WO 02/099084.
Термин последовательность относится к нуклеотидной последовательности любой длины, которая может представлять собой ДНК или РНК, может быть линейной, круговой или разветвленной и может быть одноцепочечной или двухцепочечной. Термин донорная последовательность относится к нуклеотидной последовательности, которая вставлена в геном. Донорная последовательность может быть любой длины, например, между 2 и 10000 нуклеотидами в длину (или любым целым числом между ними или выше их), предпочтительно от 100 до 1000 нуклеотидов в длину (или любое целое число между ними), более предпочтительно примерно от 200 до 500 нуклеотидов в длину.
Термин гомологичная неидентичная последовательность относится к первой последовательности, которая разделяет степень идентичности последовательности со второй последовательностью, но чья последовательность не идентична таковой во второй последовательности. Например, полинуклеотид, содержащий последовательность дикого типа мутантного гена, является гомологичным и неидентичным последовательности мутантного гена. В некоторых вариантах воплощения степень гомологии между двумя последовательностями является достаточной для предоставления возможности гомологичной рекомбинации между ними, используя нормальные клеточные механизмы. Две гомологичные неидентичные последовательности могут быть любой длины, и степень их негомологичности может быть настолько маленькой, как единственный нуклеотид (например, для коррекции геномных точечных мутаций при помощи целевой гомологичной рекомбинации), или настолько большой, как 10 тыс. или более пар нуклеотидов (например, для инсерции гена в предетерминированный эктопический сайт в хромосоме). Два полинуклеотида, содержащие гомологичные неидентичные последовательности не должны быть одинаковой длины. Например, может быть использован экзогенный полинуклеотид (например, донорный полинуклеотид), равный от 20 до 10000 нуклеотидов или нуклеотидных пар.
Способы определения идентичности последовательности нуклеиновых кислот и аминокислот являются известными в данной области техники. Как правило, такие способы включают определение нуклеотидной последовательности мРНК гена и/или определение аминокислотной последовательности, закодированной таким образом, и сравнение этих последовательностей со второй нуклеотидной или аминокислотной последовательностью. Геномные последовательности также можно определить и сравнить таким образом. В общем идентичность относится к точному соответствию нуклеотида нуклеотиду или аминокислоты аминокислоте двух полинуклеотидных или полипептидных последовательностей соответственно. Две или более последовательности (полинуклеотидные или аминокислотные) можно сравнить с определением процента их идентичности. Процент идентичности двух последовательностей, будь то последовательности нуклеиновых кислот или аминокислот, представляет собой количество точных совпадений между двумя выровненными последовательностями, разделенное на длину более короткой последовательности и умноженное на 100. Приблизительное выравнивание последовательностей нуклеиновых кислот обеспечивается алгоритмом локальной гомологии в соответствии с работой Smith and Waterman, Advances in Applied Mathematics, 2:482-489 (1981). Этот алгоритм может быть применен к аминокислотным последовательностям при помощи использования оценочной матрицы, разработанной Dayhoff, Atlas of Protein Sequences and Structure, M.O. Dayhoff ed., 5 suppl. 3:353-358, National Biomedical Research Foundation, Washington, D.C., USA, и нормализованной Gribskov, Nucl. Acids Res. 14(6):6745-6763 (1986). Типичное осуществление этого алгоритма, для того чтобы определить процент идентичности последовательности, обеспечивается Genetics Computer Group (Madison, WI) в обслуживающей программе BestFit. Подходящие программы для расчета процента идентичности или сходства между последовательностями, как правило, являются известными в данной области техники, например, другой программой выравнивания является программа BLAST, использующая значение параметров по умолчанию. Например, программы BLASTN и BLASTP могут быть применены с использованием следующих параметров по умолчанию: genetic code = standard, filter = none, strand = both, cutoff = 60, expect = 10, Matrix = BLOSUM62, Descriptions = 50 sequences, sort by = HIGH SCORE, Databases = non-redundant, GenBank+EMBL+DDBJ+PDB+GenBank CDS translations+Swiss protein+Spupdate+PIR. Подробную информацию об этих программах можно найти в Интернете. Что касается последовательностей, описанных здесь, диапазон желаемой степени идентичности последовательности составляет приблизительно от 80 до 100% и любое целое значение между ними. Как правило, процент идентичности между последовательностями составляет по меньшей мере 70-75%, предпочтительно 80-82%, более предпочтительно 8590%, еще более предпочтительно 92%, еще более предпочтительно 95% и наиболее предпочтительно 98% идентичности последовательности.
- 7 031322
Кроме того, степень сходства последовательности между полинуклеотидами может быть определена путем гибридизации полинуклеотидов в условиях, позволяющих формирование стабильных дуплексов между гомологичными областями, с последующим перевариванием одноцепочечной специфической нуклеазой (нуклеазами) и определением размера переваренных фрагментов. Две нуклеиновые кислоты или две полипептидные последовательности являются существенно гомологичными друг другу, когда последовательности демонстрируют по меньшей мере приблизительно70-75%, предпочтительно 80-82%, более предпочтительно 85-90%, еще более предпочтительно 92%, еще более предпочтительно 95% и наиболее предпочтительно 98% идентичности последовательности по определенной длине молекул, как определяется использованием вышеуказанных способов. Как используется здесь, обозначение по существу гомологичные также относится к последовательностям, демонстрирующим полную идентичность с указанной ДНК или полипептидной последовательностью. Последовательности ДНК, которые являются по существу гомологичными, могут быть идентифицированы в эксперименте гибридизации по Саузерну, например, в строгих условиях, как они определены для данной конкретной системы. Определение необходимых условий гибридизации находится в пределах квалификации в данной области техники. См., например, работу Sambrook et al., ранее; Nucleic Acid Hybridization: A Practical Approach, editors B.D. Hames and S.J. Higgins, (1985), Oxford; Washington, DC; IRL Press). Селективная гибридизация двух фрагментов нуклеиновой кислоты может быть определена следующим образом. Степень идентичности последовательности между двумя молекулами нуклеиновой кислоты влияет на эффективность и силу событий гибридизации между этими молекулами. Частично идентичная последовательность нуклеиновой кислоты будет, по меньшей мере частично, ингибировать гибридизацию полностью идентичной последовательности с молекулой-мишенью. Ингибирование гибридизации полностью идентичной последовательности можно оценить с помощью анализов гибридизации, которые хорошо известны в данной области техники (например, саузерн (ДНК) блоттинг, норзерн (РНК) блоттинг, гибридизация в растворе и т.п., см. работу Sambrook, et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition (1989), Cold Spring Harbor, N.Y.). Такие анализы могут проводиться с использованием различных степеней селективности, например, с использованием условий, изменяющихся от низкого до высокого уровня строгости. Если используются условия низкой строгости, отсутствие неспецифического связывания может быть оценено с использованием вторичного зонда, который не имеет даже частичной степени идентичности последовательности (например, зонд, имеющий менее 30% идентичности последовательности с молекулой-мишенью), так, что в отсутствие событий неспецифического связывания вторичный зонд не будет гибридизироваться к цели.
При использовании системы обнаружения на основе гибридизации выбирают такой зонд нуклеиновой кислоты, который является комплементарным к эталонной последовательности нуклеиновых кислот, а затем, путем подбора соответствующих условий, зонд и эталонную последовательность селективно гибридизуют или связывают друг с другом, чтобы образовать дуплексную молекулу. Молекула нуклеиновой кислоты, которая способна к избирательной гибридизации с эталонной последовательностью в умеренно строгих условиях гибридизации, обычно гибридизуется в условиях, которые позволяют выявлять целевую последовательность нуклеиновых кислот, равную по длине по меньшей мере приблизительно 10-14 нуклеотидам, имеющим по меньшей мере около 70% идентичности с последовательностью выбранного зонда нуклеиновых кислот. Строгие условия гибридизации обычно предоставляют возможность выявления целевой последовательности нуклеиновых кислот, равных по длине по меньшей мере приблизительно 10-14 нуклеотидам, имеющим более чем приблизительно 90-95% идентичности с последовательностью выбранного зонда нуклеиновых кислот. Условия гибридизации, подходящие для гибридизации зонд/эталонная последовательность, где зонд и эталонная последовательность имеют определенную степень идентичности последовательности, могут быть определены известными в данной области техники способами (см., например, работу Nucleic Acid Hybridization: A Practical Approach, редакторы EI.D. Hames and S.J. Higgins, (1985), Oxford; Washington, DC; IRL Press). Условия гибридизации хорошо известны специалистам в данной области техники. Строгость гибридизации относится к степени, в которой условия гибридизации не способствуют образованию гибридов, содержащих ошибочное спаривание нуклеотидов, с более высокой строгостью, связанной с более низкой толерантностью к ошибочно спаренным гибридам. Факторы, влияющие на строгость гибридизации, хорошо известны специалистам в данной области техники и включают, не ограничиваясь этим, температуру, уровень рН, ионную силу и концентрацию органических растворителей, таких как, например, формамид и диметилсульфоксид. Как известно специалистам в данной области техники, строгость гибридизация увеличивается посредством более высоких температур, более низкой ионной силы и более низких концентраций растворителя. Что касается строгости условий гибридизации, в данной области техники хорошо известно, что для создания определенной строгости могут быть использованы многочисленные равные условия изменением, например, следующих факторов: продолжительности и сущности последовательностей, композиции оснований различных последовательностей, концентрации солей и других компонентов растворов гибридизации, наличия или отсутствия блокирующих веществ в растворах для гибридизации (например, декстрана сульфата и полиэтиленгликоля), температуры реакции гибридизации и временных параметров, а также изменением условий промывания. Выбор конкретного набора условий гибридизации осуществляют в
- 8 031322 соответствии со стандартными способами в данной области техники (см., например, работу Sambrook, et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition, (1989) Cold Spring Harbor, N.Y.).
Термин рекомбинация относится к процессу обмена генетической информацией между двумя полинуклеотидами. Для целей настоящего раскрытия термин гомологичная рекомбинация (ГР) относится к специализированной форме такого обмена, который происходит, например, во время восстановления двухцепочечных разрывов в клетках. Этот процесс, требующий гомологии нуклеотидной последовательности, использует донорную молекулу для восстановления шаблона целевой молекулы (например, той, которая испытала двухцепочечный разрыв) и известен как некроссоверная конверсия генов или конверсия генов короткого тракта, потому что он приводит к передаче генетической информации от донора к цели, без привязки к какой-либо конкретной теории, такая передача может вовлекать коррекцию ошибочного спаривания гетеродуплексной ДНК, которая образуется между разорванной мишенью и донором, и/или синтез-зависимый отжиг цепочки, в котором донор используется для ресинтеза генетической информации, которая станет частью цели, и/или связанных процессов. Такая специализированная ГР часто приводит в результате к изменению последовательности целевой молекулы, так, что часть или все последовательности донорного полинуклеотида являются включенными в целевой полинуклеотид.
Термин расщепление относится к разрыву ковалентного остова ДНК молекулы. Расщепление может быть инициировано с помощью различных способов, включая, но не ограничиваясь этим, ферментативный или химический гидролиз фосфодиэфирной связи. Являются возможными как одноцепочечное расщепление, так и двухцепочечное расщепление, и двухцепочечное расщепление может произойти в результате двух различных событий одноцепочечного расщепления. Расщепление ДНК может привести к производству либо затупленных концов, либо ступенчатых концов. В некоторых вариантах воплощения гибридные полипептиды используются для целевого двухцепочечного расщепления ДНК.
Домен расщепления содержит одну или более полипептидных последовательностей, которые обладают каталитической активностью для расщепления ДНК. Домен расщепления может содержаться в одной полипептидной цепи, или расщепляющая активность может возникнуть в результате объединения двух (или более) полипептидов.
Полудомен расщепления представляет собой полипептидную последовательность, которая в сочетании со вторым полипептидом (либо идентичным, либо отличающимся) образует комплекс, обладающий расщепляющей активностью (желательно, двухцепочечной расщепляющей активностью).
Хроматин является нуклеопротеидной структурой, содержащей клеточный геном. Клеточный хроматин содержит нуклеиновую кислоту, основную ДНК и белок, включая гистоны и негистоновые хромосомные белки. Большая часть эукариотического клеточного хроматина существует в виде нуклеосом, в которых ядро нуклеосомы содержит приблизительно 150 пар оснований ДНК, связанных с октамером, содержащим по два каждого из гистонов Н2А, Н2В, H3 и Н4; и ДНК-линкер (переменной длины в зависимости от организма), расположенный между ядрами нуклеосом. Молекула гистона H1, как правило, связана с ДНК-линкером. Для целей настоящего раскрытия термин хроматин предназначен для охвата всех типов клеточных нуклеопротеидов, как прокариотических, так и эукариотических. Клеточный хроматин включает в себя как хромосомный, так и эписомный хроматин.
Хромосома представляет собой хроматиновый комплекс, содержащий весь геном клетки или его часть. Геном клетки часто характеризуется его кариотипом, который является совокупностью всех хромосом, заключающих в себе геном клетки. Геном клетки может содержать одну или более хромосом.
Эписома представляет собой воспроизводимую нуклеиновою кислоту, комплекс нуклеопротеидов или другие структуры, включающие нуклеиновую кислоту, которая не является частью хромосомного кариотипа клетки. Примеры эписом включают плазмиды и некоторые вирусные геномы.
Доступная область представляет собой сайт в клеточном хроматине, в котором целевой сайт, присутствующий в нуклеиновой кислоте, может быть связан экзогенной молекулой, распознающей целевой сайт. Не привязываясь к какой-либо конкретной теорией, предполагается, что доступная область является одной из тех, которые не упакованы в нуклеосомную структуру. Отдельную структуру доступной области часто можно обнаружить по ее чувствительности к химическим и ферментативным зондам, например, нуклеазам.
Целевой сайт или целевая последовательность представляет собой последовательность нуклеиновых кислот, которая определяет часть нуклеиновой кислоты, с которой будет связываться связующая молекула, в том случае, если существуют достаточные для связывания условия. Например, последовательность 5'-GAATTC-3' является целевым сайтом для EcoRI рестрикции эндонуклеазы.
Экзогенная молекула представляет собой молекулу, которая обычно не присутствует в клетке, но может быть введена в клетку при помощи одного или более генетических, биохимических или других способов. Нормальное присутствие в клетке определяется в отношении конкретной стадии развития и окружающей среды клетки. Так, например, молекула, которая присутствует только во время эмбрионального развития мышц, является экзогенной молекулой по отношению ко взрослой мышечной клетке. Кроме того, молекула, индуцированная посредством теплового шока, является экзогенной молекулой по отношению к клеткам, не подвергшимся тепловому шоку. Экзогенная молекула может содержать, например, кодирующую последовательность для любого полипептида или его фрагмента, функционирую
- 9 031322 щую версию работающей неправильно эндогенной молекулы или работающую неправильно версию нормально функционирующей эндогенной молекулы. Кроме того, экзогенная молекула может содержать кодирующую последовательность из другого вида, которая является ортологом эндогенного гена в клетке-хозяине.
Экзогенная молекула может быть, среди прочего, малой молекулой, такой как созданная при помощи процесса комбинаторной химии, или макромолекулой, такой как белок, нуклеиновая кислота, углевод, липид, гликопротеин, липопротеин, полисахарид, любым модифицированным производным вышеупомянутых молекул или комплексом, включающим в себя одну или более из вышеупомянутых молекул. Нуклеиновые кислоты включают ДНК и РНК, могут быть одно- или двухцепочечными, могут быть линейными, разветвленными или круговыми и могут быть любой длины. Нуклеиновые кислоты включают те, которые способны образовывать дуплексы, а также триплексобразующие нуклеиновые кислоты. См., например, патенты США № 5176996 и 5422251.
Белки включают, не ограничиваясь этим, ДНК-связывающие белки, транскрипционные факторы, факторы реконструкции хроматина, метилированные ДНК-связывающие белки, полимеразы, метилазы, деметилазы, ацетилазы, деацетилазы, киназы, фосфатазы, интегразы, рекомбиназы, лигазы, топоизомеразы, гиразы и геликазы.
Экзогенная молекула может быть молекулой того же типа, что и эндогенная молекула, например экзогенный белок или нуклеиновая кислота. Например, экзогенная нуклеиновая кислота может содержать инфицирующий вирусный геном, плазмиду или эписому, введенные в клетку, или хромосому, которая в нормальных условиях не присутствует в клетке. Способы введения экзогенных молекул в клетки являются известными специалистам в данной области техники и включают, не ограничиваясь этим, липидопосредованную передачу (например, липосомы, включающей нейтральные и катионные липиды), электропорацию, прямую инъекцию, слияние клеток, бомбардировку частицами, совместное осаждение с фосфатом кальция, ДЭАЭ-декстранопосредованную передачу и опосредованную вирусным вектором передачу.
В противоположность этому эндогенная молекула представляет собой ту, которая обычно присутствует в определенной клетке на определенном этапе развития в конкретных условиях окружающей среды. Например, эндогенная нуклеиновая кислота может содержать хромосому, геном митохондрий, хлоропласт и другие органеллы или природную эписомную нуклеиновую кислоту. Дополнительные эндогенные молекулы могут включать белки, например, факторы транскрипции и ферменты. Как используется здесь, термин продукт экзогенной нуклеиновой кислоты включает в себя как полинуклеотидные, так и полипептидные продукты, например продукты транскрипции (полинуклеотиды, такие как РНК) и продукты трансляции (полипептиды).
Молекула слияния представляет собой молекулу, в которой две или более субъединичные молекулы связаны между собой, предпочтительно ковалентно. Субъединичные молекулы могут быть молекулами того же химического типа или могут быть молекулами различных химических типов. Примеры первого типа молекулы слияния включают, не ограничиваясь этим, гибридные белки (например, слияние между ZFP ДНК-связывающего домена и доменом расщепления) и нуклеиновые кислоты слияния (например, нуклеиновая кислота, кодирующая гибридный белок, описанный выше). Примеры второго типа молекулы слияния включают, не ограничиваясь этим, слияние между триплексобразующей нуклеиновой кислотой и полипептидом и слияние между связующим малой бороздки и нуклеиновой кислотой.
Экспрессия гибридного белка в клетке может возникнуть в результате доставки гибридного белка в клетку или в результате доставки полинуклеотида, кодирующего гибридный белок, в клетку, где полинуклеотид транскрибируется, а транскрипт транслируется, для генерирования гибридного белка. Транссплайсинг, расщепление полипептида и лигирование полипептида может также принимать участие в экспресии белка в клетке. Способы доставки полинуклеотида и полипептида в клетки представлены в другом месте настоящего раскрытия.
Ген для целей настоящего раскрытия включает ДНК-область, кодирующую генный продукт (см. ниже), а также все области ДНК, которые регулируют производство генного продукта, независимо от того, являются ли такие регуляторные последовательности расположенными рядом с кодирующими и/или транскрибирующими последовательностями. Соответственно, ген включает, но необязательно ограничивается этим, промоторные последовательности, терминаторы, трансляционные регуляторные последовательности, такие как сайты связывания рибосомы и внутренние сайты посадки рибосомы, энхансеры, сайленсеры, изоляторы, граничные элементы, источники репликации, сайты прикрепления матрицы и области контроля локуса. Экспрессия генов относится к конверсии информации, содержащейся в гене, в генный продукт. Генный продукт может быть прямым транскрипционным продуктом гена (например, мРНК, тРНК, рРНК, антисмысловым РНК, рибозимом, структурной РНК или любым другим типом РНК) или белком, произведенным при помощи трансляции мРНК. Генные продукты также включают РНК, которые были модифицированы при помощи таких процессов, как кэппирование, полиаденилирование, метилирование, редактирование, и белки, модифицированные при помощи, например, метилирования, ацетилирования, фосфорилирования, убиквитинирования, ADP-рибозилирования, миристилирования и гликозилирования.
- 10 031322
Модуляция экспрессии генов относится к изменению активности гена.
Модуляция экспрессии может включать, не ограничиваясь этим, активацию гена и подавление гена.
Растительные клетки включают, не ограничиваясь этим, клетки односемядольных (однодольных) или двусемядольных (двудольных) растений. Неограничивающие примеры однодольных растений включают зерновые растения, такие как кукуруза, рис, ячмень, овес, пшеница, сорго, рожь, сахарный тростник, ананас, лук, бананы и кокос. Неограничивающие примеры двудольных растений включают табак, помидоры, подсолнечник, хлопчатник, сахарную свеклу, картофель, салат-латук, дыню, сою, канолу (рапс) и люцерну. Растительные клетки могут происходить из любой части растения и/или из любой стадии развития растений.
Область интереса представляет собой любую область клеточного хроматина, такую как, например, ген или некодирующая последовательность внутри или рядом с геном, в котором желательно связать экзогенную молекулу. Связывание может быть с намерением расщепления целевой ДНК и/или с намерением целевой рекомбинации. Область интереса может присутствовать в хромосоме, эписоме, органеллярном геноме (например, митохондриальном, хлоропластном) или, например, в инфицирующем вирусном геноме. Область интереса может быть в кодирующей области гена, в пределах транскрибирующихся некодирующих областей, таких как, например, лидерные последовательности, трейлерные последовательности или интроны, или в пределах нетранскрибирующихся областей, или выше или ниже от кодирующей области. Область интереса может быть настолько мала, как единственная нуклеотидная пара, или составлять до 2000 пар нуклеотидов в длину, или составлять любое целое значение нуклеотидных пар.
Термины оперативная связь и оперативно связан (или функционально связан) являются взаимозаменяемыми со ссылкой на сопоставление двух или более компонентов (таких как, например, элементы последовательности), где компоненты расположены таким образом, что оба компонента нормально функционируют и допускают возможность того, что по меньшей мере один из указанных компонентов может стать посредником функции, которая приводится в действие по меньшей мере одним из других компонентов. В качестве иллюстрации транскрипционная регуляторная последовательность, такая как, например, промотор, является оперативно связанной с кодирующей последовательностью, если транскрипционная регуляторная последовательность контролирует уровень транскрипции кодирующей последовательности в ответ на наличие или отсутствие одного или более транскрипционных регуляторных факторов. Транскрипционная регуляторная последовательность, как правило, оперативно связана в cis с кодирующей последовательностью, но не обязательно должна находиться в непосредственной близости к ней. Например, энхансер является транскрипционной регуляторной последовательностью, которая оперативно связана с кодирующей последовательностью, хотя они и не являются смежными.
В отношении гибридных полипептидов термин оперативно связан может относиться к факту, что каждый из компонентов выполняет ту же функцию в связи с другим компонентом, которую выполнял бы, если бы не был связан таким образом. Например, в отношении гибридного полипептида, в котором ДНК-связывающий домен ZFP сливается с доменом расщепления, ДНК-связывающий домен ZFP и домен расщепления находятся в оперативной связи, если в гибридном полипептиде часть ДНКсвязывающего домена ZFP способна связывать его целевой сайт и/или его сайт связывания, в то время как домен расщепления способен расщеплять ДНК вблизи от целевого сайта.
Функциональный фрагмент белка, полипептида или нуклеиновой кислоты представляет собой белок, полипептид или нуклеиновую кислоту, последовательность которых не является идентичной белку, полипептиду или нуклеиновой кислоте полной длины, но сохраняет ту же функцию, что и белок, полипептид или нуклеиновая кислота полной длины. Функциональный фрагмент может иметь больше, меньше или столько же остатков, сколько и соответствующая природная молекула, и/или может содержать одну или более аминокислотных или нуклеотидных замещений. Способы определения функции нуклеиновых кислот (например, кодирующая функция, способность гибридизироваться с другой нуклеиновой кислотой) являются хорошо известными в данной области техники. Кроме того, хорошо известными являются способы определения функции белка. Например, ДНК-связывающая функция полипептида может быть определена, например, при помощи фильтр-связывания, электрофоретической подвижности сдвига или анализов иммунопреципитации. ДНК-расщепление может быть проанализировано с помощью гель-электрофореза. См. работу Ausubel et al., выше. Способность белка взаимодействовать с другим белком может быть определена, например, при помощи одновременной иммунопреципитации, двугибридных анализов или комплементации, как генетических, так и биохимических. См., например, работу Fields et al. (1989), Nature 340:245-246; патент США № 5585245 и РСТ WO 98/44350.
Сайты множественной инсерции.
Здесь раскрыты сайты множественной инсерции, а именно полинуклеотиды, содержащие множество сайтов связывания нуклеаз цинкового пальца (ZFN), такие, что, при связывании соответствующей пары ZFN, сайт множественной инсерции расщепляется между целевыми сайтами пары ZFN.
Целевые сайты, включенные в сайт множественной инсерции, предпочтительно не обнаруживаются в геноме клетки, в которую они интегрированы. Таким образом, возникновение нежелательного расщепления в геноме уменьшается или устраняется. Любое количество целевых сайтов может быть включено в
- 11 031322 сайт множественной инсерции полинуклеотида, например 1-50 (или любое число между ними), предпочтительно от 2 до 30 (или любое число между ними) и даже более предпочтительно от 5 до 20 (или любое число между ними). Для нуклеаз цинкового пальца целевые сайты, как правило, находятся в парах, так что нуклеазы цинкового пальца образуют гомо- и гетеродимеры, чтобы расщеплять соответствующий сайт.
Более того, как продемонстрировано на фиг. 1, один целевой сайт из каждой пары целевого сайта (затененный треугольник фиг. 1) может быть одинаковым по всему сайту множественной инсерции. Кроме того, гетеродимерные пары могут быть разными между сайтами.
Сайт множественной инсерции может включать в себя целевые сайты, связанные только гомодимерами, целевые сайты, связанные только гетеродимерами, или сочетание целевых сайтов, связанных гомои гетеродимерами. Целевые сайты, связанные гомодимерами, могут быть предпочтительнее в некоторых случаях по одной или нескольким из следующих причин: доставка одной ZFN может быть более эффективной, чем двух; гомодимеризация уменьшает проблемы неравной стехиометрии из-за неодинаковой экспрессии ZFN; токсичность от расщепления внецелевых сайтов может быть уменьшена; гомодимер имеет в два раза больше шансов быть разрушенным при использовании ССНС (неканонических) доменов цинкового пальца; и/или общее количество уникальных сайтов нацеливания может быть увеличено. Кроме того, гетеродимерам предпочтение может быть отдано и в других случаях, так как они предоставляют возможность для смешивания и приведения в соответствие различных целевых сайтов и, следовательно, для потенциального увеличения нацеливаемых сайтов для ZFN пар. Кроме того, гетеродимеры могут предоставить возможность последовательного добавления доноров, по мере необходимости, практикующим специалистом. Гетеродимерные комбинации также могут предоставить возможность для специфической делеции любых заданных секций доноров за счет использования новых пар ZFN.
Будет очевидно, что для целевого сайта не является необходимым состоять из трех нуклеотидов для нуклеаз цинкового пальца. Например, в случаях, когда происходят взаимодействия с перекрещиванием цепей (см., например, патент США № 6453242 и WO 02/077227), один или более отдельных цинковых пальцев мультипальцевого связывающего домена могут связываться с перекрывающимися квадруплетными субсайтами. В результате трехпальцевый белок может связывать 10-нуклеотидную последовательность, в которой десятый нуклеотид является частью квадруплета, связанного заключительным пальцем, четырехпальцевый белок может связывать 13-нуклеотидную последовательность, в которой тринадцатый нуклеотид является частью квадруплета, связанного заключительным пальцем, и т.д.
Длина и природа аминокислотной линкерной последовательности между отдельными цинковыми пальцами в мультипальцевом связывающем домене также влияет на связывание с целевой последовательностью. Например, наличие так называемого неканонического линкера, длинного линкера или структурированного линкера между соседними цинковыми пальцами в мультипальцевом связывающем домене может предоставить возможность этим пальцам связывать субсайты, которые не находятся в непосредственной близости. Неограничивающие примеры таких линкеров описаны, например, в патенте США № 6479626 и WO 01/53480. Таким образом, один или более субсайтов в целевом сайте для связывающего домена цинкового пальца могут быть отделены друг от друга при помощи 1, 2, 3, 4, 5 или более нуклеотидов. Для предоставления всего лишь одного примера четырехпальцевый связывающий домен может связываться с 13-нуклеотидным целевым сайтом, включающим в себя один за другим два смежных 3-нуклеотидных субсайта, промежуточный нуклеотид и два смежных триплетных субсайта. Расстояние между последовательностями (например, целевых сайтов) относится к числу нуклеотидов или нуклеотидных пар, промежуточных между двумя последовательностями, измеряемому от границ последовательностей, ближайших друг к другу.
В некоторых вариантах воплощения, в которых расщепление зависит от связывания двух доменов цинкового пальца/молекул слияния полудомена расщепления, для того, чтобы отделить целевые сайты, два целевых сайта могут находиться на противоположных цепях ДНК. В других вариантах воплощения оба целевых сайта находятся на одной и той же цепи ДНК.
Сайт множественной инсерции может быть интегрирован в любую точку генома растения. В некоторых вариантах воплощения сайт множественной инсерции интегрирован в Zp15 в геном кукурузы, который, как описано в заявке на патент США № 12/653735, является желательным сайтом для целевой интеграции экзогенных последовательностей.
ДНК-связывающие домены.
Любой ДНК-связывающий домен может быть использован в способах, описанных здесь. В некоторых вариантах воплощения ДНК-связывающий домен включает в себя белок типа цинковый палец. Связывающий домен цинкового пальца включает один или более цинковых пальцев. Miller et al. (1985), EMBO J. 4:1609-1614; Rhodes (1993), Scientific American Feb.:56-65; патент США № 6453242. Связывающие домены цинкового пальца, описанные здесь, обычно включают 2, 3, 4, 5, 6 или даже больше цинковых пальцев.
Как правило, один домен цинкового пальца составляет приблизительно 30 аминокислот в длину. Структурные исследования продемонстрировали, что каждый домен (мотив) цинкового пальца содержит два бета-листа (удерживаемых в бета-очереди, которая содержит два неизменных остатка цистеина) и
- 12 031322 альфа-спираль (содержащую два неизменных остатка гистидина), которые удерживаются в той или иной конформации путем координирования атома цинка при помощи двух цистеиновых остатков и двух гистидиновых остатков.
Цинковые пальцы включают в себя как канонические С2Н2 цинковые пальцы (т.е. те, в которых ион цинка координируется двумя остатками цистеина и двумя остатками гистидина), так и неканонические цинковые пальцы, такие как, например, С3Н цинковые пальцы (те, в которых ион цинка координируется тремя остатками цистеина и одним остатком гистидина), а также С4 цинковые пальцы (те, в которых ион цинка координируется четырьмя остатками цистеина). См. также WO 02/057293, а также патентную публикацию США № 20080182332 в отношении неканонических ZFP для использования в растениях. Инженерный связывающий домен цинкового пальца может иметь новую специфичность связывания по сравнению с природным белком типа цинковый палец. Инженерные способы включают, не ограничиваясь этим, рациональное конструирование и различные типы селекции. Рациональное конструирование включает в себя, например, использование баз данных, содержащих триплетные (или квадруплетные) нуклеотидные последовательности и отдельные аминокислотные последовательности цинкового пальца, в которых каждая триплетная или квадруплетная нуклеотидная последовательность связана с одной или несколькими аминокислотными последовательностями типа цинковые пальцы, которые связывают конкретную триплетную или квадруплетную последовательность Типичные способы селекции, включая фаговый дисплей и двугибридные системы, описаны в патентах США № 5789538, 5925523, 6007988, 6013453, 6410248, 6140466, 6200759 и 6242568, а также в патентах WO 98/37186, WO 98/53057, WO 00/27878, WO 01/88197 и GB 2338237.
Повышение специфичности связывания для связывающих доменов цинкового пальца было описано, например, в патенте, находящемся в совместном обладании, WO 02/077227.
Так как отдельный цинковый палец связывается с трехнуклеотидной (например, триплетной) последовательностью (или четырехнуклеотидной последовательностью, которые могут частично перекрываться одним нуклеотидом с четырехнуклеотидным сайтом связывания соседнего цинкового пальца), длина последовательности, к которой связывающий домен цинкового пальца разработан для связывания (например, целевая последовательность), будет определять количество цинковых пальцев в разработанном связывающем домене цинкового пальца. Например, для ZFP, в котором мотивы пальца не связываются с перекрывающимися субсайтами, шестинуклеотидная целевая последовательность связана двупальцевым связывающим доменом; девятинуклеотидная целевая последовательность связана трехпальцевым связывающим доменом и т.д. Как отмечается здесь, сайты связывания для отдельных цинковых пальцев (например, субсайты) в целевом сайте не должны быть прилегающими, но могут быть отделены при помощи одного или более нуклеотидов, в зависимости от длины и природы аминокислотных последовательностей между цинковыми пальцами (например, межпальцевыми линкерами) в мультипальцевом связывающем домене. В мультипальцевом связывающем домене цинкового пальца расположенные рядом цинковые пальцы могут быть разделены при помощи аминокислотных линкерных последовательностей, состоящих приблизительно из 5 аминокислот (так называемых канонических межпальцевых линкеров), или, альтернативно, при помощи одного или более неканонических линкеров. См., например, находящиеся в совместном обладании патенты США № 6453242 и 6534261. Для разработанных связывающих доменов цинкового пальца, состоящих более чем из трех пальцев, инсерция более длинных (неканонических) межпальцевых линкеров между определенными цинковыми пальцами может быть желательной в некоторых случаях, так как это может увеличить сродство и/или специфичность связывания связывающего домена. См., например, патент США № 6479626 и WO 01/53480. Таким образом, мультипальцевые связывающие домены цинкового пальца также могут быть охарактеризованы в отношении наличия и месторасположения неканонических межпальцевых линкеров. Например, шестипальцевый связывающий домен цинкового пальца, содержащий три пальца (присоединенные при помощи двух канонических межпальцевых линкеров), длинный линкер и три дополнительных пальца (присоединенные при помощи двух канонических межпальцевых линкеров) обозначаются как конфигурация 2x3. Подобным образом связывающий домен, содержащий два пальца (с каноническим линкером между ними), длинный линкер и два дополнительных пальца (присоединенные при помощи канонического линкера) обозначаются как конфигурация 2x2. Белок, содержащий три двупальцевых единицы (в каждой из которых два пальца соединены при помощи канонического линкера) и в котором каждая из двупальцевых единиц соединяется с соседними двупальцевыми единицами при помощи длинного линкера, называется конфигурацией 3x2.
Наличие длинного или неканонического межпальцевого линкера между двумя соседними цинковыми пальцами в мультипальцевом связывающем домене часто предоставляет двум пальцам возможность связываться с субсайтами, которые не являются непосредственно смежными в целевой последовательности. Соответственно, может существовать пробел из одного или более нуклеотидов между субсайтами в целевом сайте, т.е. целевой сайт может содержать один или более нуклеотидов, которые не связаны цинковым пальцем. Например, 2x2 связывающий домен цинкового пальца может связываться с двумя шестинуклеотидными последовательностями, разделенными одним нуклеотидом, т. е. он связывается с
- 13 031322
13-нуклеотидным целевым сайтом. См. также работы Moore et al. (2001a), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 98:1432-1436; Moore et al. (2001b), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 98:1437-1441 и WO 01/53480.
Как упоминалось ранее, целевой субсайт представляет собой трех- или четырехнуклеотидную последовательность, которая связана одним цинковым пальцем. Для определенных целей двупальцевая единица обозначается как связывающий модуль. Связывающий модуль может быть получен при помощи, например, селекции для двух соседних пальцев в контексте мультипальцевого белка (как правило, трехпальцевого), который связывает определенную шестинуклеотидную целевую последовательность. Кроме того, модули могут быть сконструированы при помощи сборки отдельных цинковых пальцев. См. также заявки WO 98/53057 и WO 01/53480.
Альтернативно, ДНК-связывающий домен может быть получен из нуклеазы.
Например, известны распознающие последовательности хоминг-эндонуклеаз и мегануклеаз, такие как I-SceI, I-CeuI, PI-PspI, PI-Sce, I-SceIV, I-CsmI, I-PanI, I-SceII, I-PpoI, I-SceIII,I-CreI, I-TevI, I-TevII и I-TevIII. См. также патенты США № 5420032, 6833252, работы Belfort et al. (1997), Nucleic Acids Res. 25:3379-3388; Dujon et al. (1989), Gene 82:115-118; Perler et al. (1994), Nucleic Acids Res. 22, 1125-1127; Jasin (1996), Trends Genet. 12:224-228; Gimble et al. (1996), J. Mol. Biol. 263:163-180; Argast et al. (1998), J. Mol. Biol. 280:345-353 и New England Biolabs catalogue. Кроме того, ДНК-связывающая специфичность хоминг-эндонуклеаз и мегануклеаз может быть разработана, чтобы связывать ненатуральные целевые сайты. См., например, работы Chevalier et al. (2002), Molec. Cell 10:895-905; Epinat et al. (2003), Nucleic Acids Res. 31:2952-2962; Ashworth et al. (2006), Nature 441:656-659; Paques et al. (2007), Current Gene Therapy 7:49-66; патентную публикацию США № 20070117128.
В качестве еще одной альтернативы ДНК-связывающий домен может быть получен из белков с лейциновой молнией. Лейциновые молнии представляют собой класс белков, которые участвуют в белок-белковых взаимодействиях во многих эукариотических регуляторных белках, которые являются важными транскрипционными факторами, связанными с генной экспрессией. Лейциновая молния относится к общим структурным мотивам, совместно используемым в этих транскрипционных факторах в нескольких царствах, включая животных, растения, дрожжи и т.д. Лейциновая молния образуется двумя полипептидами (гомодимером или гетеродимером), которые связываются со специфическими последовательностями ДНК таким образом, что остатки лейцина равномерно распределены по α-спирали, так, что лейциновые остатки двух полипептидов оканчиваются на той же поверхности спирали. Специфичность ДНК-связывания лейциновых молний может быть использована в ДНК-связывающих доменах, описанных здесь.
В некоторых вариантах воплощения ДНК-связывающий домен представляет собой инженерный домен из TAL-эффектора, полученного из растительного патогенного микроорганизма Xanthomonas (см. работы Miller et al. (2010), Nature Biotechnology, Dec 22 [Epub ahead of print]; Boch et al., (2009), Science 29 Oct 2009 (10.1126/science.117881) и Moscou и Bogdanove, (2009), Science, 29 Oct. 2009 (10.1126/science.1178817).
Домены расщепления.
Как отмечалось выше, ДНК-связывающий домен может быть связан с доменом расщепления (нуклеазным). Например, хоминг-эндонуклеазы могут быть модифицированы в их ДНК-связывающей специфичности, сохраняя при этом функции нуклеазы. Кроме того, белки типа цинковый палец могут также быть сплавлены с доменом расщепления, чтобы сформировать нуклеазу цинкового пальца (ZFN). Часть домена расщепления гибридных белков, описанных здесь, может быть получена из любой эндонуклеазы или экзонуклеазы. Типичные эндонуклеазы, из которых может быть получен домен расщепления, включают, не ограничиваясь этим, эндонуклеазы рестрикции и хоминг-эндонуклеазы. См., например, 2002-2003 Catalogue, New England Biolabs, Beverly, M.A. и работу Belfort et al. (1997), Nucleic Acids Res. 25:3379-3388. Известны дополнительные ферменты, которые расщепляют ДНК (например, S1 нуклеаза, маш (фасоль золотистая) нуклеаза, панкреатическая ДНаза I; микрококковая нуклеаза, НО эндонуклеаза дрожжей; см. также работу Linn et al. (eds.) Nucleases, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1993). Известные неограничивающие примеры хоминг-эндонуклеаз и мегануклеаз включают I-SceI, I-Ceul, PI-PspI, PI-Sce, I-SceIV, I-CsmI, I-PanI, I-SceII, I-PpoI, I-SceIII, I-CreI, I-TevI, I-TevII и I-TevIII. См. также патент США № 5420032; патент США № 6833252; работы Belfort et al. (1997) Nucleic Acids Res. 25:33793388; Dujon et al. (1989) Gene 82:115-118; Perler et al. (1994) Nucleic Acids Res. 22, 1125-1127; Jasin (1996) Trends Genet. 12:224-228; Gimble et al. (1996) J. Mol. Biol. 263:163-180; Argast et al. (1998) J. Mol. Biol. 280:345-353 и New England Biolabs catalogue. Один или более из этих ферментов (или их функциональных фрагментов) могут быть использованы в качестве источника доменов расщепления и полудоменов расщепления.
Эндонуклеазы рестрикции (ферменты рестрикции) присутствуют во многих видах и способны к связыванию с ДНК последовательность-специфическим образом (на сайте распознавания), а также к расщеплению ДНК на месте связывания или рядом с ним. Некоторые ферменты рестрикции (например, Тип IIS) расщепляют ДНК в сайтах, удаленных от сайта распознавания, и имеют раздельные домены связывания и расщепления. Например, Тип IIS фермент FokI катализирует двухцепочечное расщепление ДНК через 9 нуклеотидов от сайта распознавания на одной цепи и через 13 нуклеотидов от сайта распо
- 14 031322 знавания на другой цепи. См., например, патенты США № 5356802, 5436150 и 5487994, а также работы Li et al. (1992), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:4275-4279; Li et al. (1993), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:27642768; Kim et al. (1994a), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:883-887; Kim et al. (1994b), J. Biol. Chem. 269:3197831982. Таким образом, в одном варианте воплощения гибридные белки содержат домен расщепления (или полудомен расщепления) по меньшей мере из одного фермента рестрикции Типа IIS и одного или более связывающих доменов цинкового пальца, которые могут быть или могут не быть инженерными.
Типичным ферментом рестрикции Tuna IIS, чей домен расщепления является раздельным со связывающим доменом, является FokI. Данный специфический фермент активен в виде димера. Bitinaite et al. (1998), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95:10570-10575. Таким образом, для целей настоящего раскрытия часть фермента FokI, используемая в раскрытых гибридных белках, считается полудоменом расщепления. Таким образом, целевое двухцепочечное расщепление и/или целевое замещение клеточных последовательностей с помощью слияний цинковый палец-FokI, два гибридных белка, каждый из которых содержит полудомен расщепления FokI, могут быть использованы для восстановления каталитически активного домена расщепления. Кроме того, также может быть использована одна полипептидная молекула, содержащая связывающий домен цинкового пальца и два полудомена расщепления FokI. Параметры целевого расщепления и целевого изменения последовательности с использованием слияния цинковый палец-FokI предоставлены в другом месте настоящего раскрытия.
Доменом расщепления или полудоменом расщепления может быть любая часть белка, которая сохраняет расщепляющую активность или которая сохраняет возможность мультимеризации (например, димеризации), чтобы сформировать функциональный домен расщепления.
Типичные ферменты рестрикции Type IIS описаны в находящейся в совместном обладании международной публикации WO 2007/014275, включенной в настоящий документ в качестве ссылки в полном объеме.
Для улучшения специфичности расщепления домены расщепления также могут быть модифицированы. В некоторых вариантах воплощения варианты полудомена расщепления, использующие эти варианты, минимизируют или предотвращают гомодимеризацию полудоменов расщепления. Неограничивающие примеры таких модифицированных полудоменов расщепления описаны детально в патенте WO 2007/014275, включенном в настоящий документ в качестве ссылки в полном объеме. См. также раздел Примеры. В некоторых вариантах воплощения домен расщепления, содержащий инженерный полудомен расщепления (также называемый мутантом домена димеризации), который минимизирует или предотвращает гомодимеризацию, известен специалистам в данной области техники и описан, например, в патентных публикациях США № 20050064474 и 20060188987, включенных в настоящий документ в качестве ссылки в полном объеме. Аминокислотные остатки в позициях 446, 447, 479, 483, 484, 486, 487, 490, 491, 496, 498, 499, 500, 531, 534, 537 и 538 FokI, - все представляют собой мишени для воздействия на димеризацию полудоменов расщепления FokI. См., например, патентные публикации США № 20050064474 и 20060188987, международную патентную публикацию WO 07/139898, работы Miller et al. (2007), Nat. Biotechnol. 25(7):778-785 и Doyon et al. (2011), Nature Methods, 8(1):74-79.
Дополнительные инженерные полудомены расщепления FokI, которые формируют облигатные гетеродимеры, также могут быть использованы в ZFN, описанных здесь. В одном варианте воплощения первый полудомен расщепления включает мутации в аминокислотных остатках в позициях 490 и 538 FokI, а второй полудомен расщепления включает мутации в аминокислотных остатках 486 и 499.
В некоторых вариантах воплощения домен расщепления содержит два полудомена расщепления, оба из которых являются частью одного полипептида, содержащего связывающий домен, первый полудомен расщепления и второй полудомен расщепления. Полудомены расщепления могут иметь такую же аминокислотную последовательность или различные аминокислотные последовательности, до тех пор, пока они функционируют, чтобы расщеплять ДНК.
В общем для расщепления необходимы два гибридных белка, если гибридные белки содержат полудомены расщепления. Альтернативно может быть использован один белок, содержащий два полудомена расщепления. Два полудомена расщепления могут быть получены из одной и той же эндонуклеазы (или ее функциональных фрагментов) или каждый полудомен расщепления может быть получен из различных эндонуклеаз (или их функциональных фрагментов). Кроме того, целевые сайты для двух гибридных белков предпочтительно расположены относительно друг друга так, что связывание двух гибридных белков с их соответствующими целевыми сайтами помещает полудомены расщепления в такую пространственную ориентацию по отношению друг к другу, которая позволяет полудоменам расщепления сформировать функциональный домен расщепления, например, при помощи димеризации. Таким образом, в некоторых вариантах воплощения близлежащие края целевых сайтов разделены при помощи 5-8 нуклеотидов или при помощи 15-18 нуклеотидов. Однако любое целое число нуклеотидов или нуклеотидных пар может находиться между двумя целевыми сайтами (например, от 2 до 50 нуклеотидов и более). В общем точка расщепления лежит между целевыми сайтами.
Гибридные белки.
Способы дизайна и конструирования гибридных белков (и полинуклеотидов, кодирующих их же) являются известными специалистам в данной области техники. Например, способы дизайна и конструи
- 15 031322 рования гибридных белков, содержащих ДНК-связывающие домены (например, домены цинкового пальца) и регуляторные домены или домены расщепления (или полудомены расщепления) и полинуклеотиды, кодирующие такие гибридные белки, описаны в находящихся в совместном обладании патентах США № 6453242 и 6534261 и публикациях заявок на патент США № 2007/0134796 и 2005/0064474, которые включены в настоящий документ в качестве ссылки во всей их полноте. В некоторых вариантах воплощения полинуклеотиды, кодирующие гибридные белки, являются искусственно сконструированными. Эти полинуклеотиды могут быть вставлены в вектор, а вектор может быть введен в клетку (см. ниже дополнительные раскрытия относительно векторов и способов введения полинуклеотидов в клетки).
В некоторых вариантах воплощения способов, описанных здесь, нуклеаза цинкового пальца включает гибридный белок, содержащий связывающий домен цинкового пальца и полудомен расщепления из фермента рестрикции FokI, и два таких гибридных белка экспрессируются в клетке. Экспрессия двух гибридных белков в клетке может возникнуть в результате доставки двух белков в клетку; доставки одного белка и одной нуклеиновой кислоты, кодирующей один из белков, в клетку; доставки двух нуклеиновых кислот, каждая из которых кодирует один из белков, в клетку, или в результате доставки одной нуклеиновой кислоты, кодирующей оба белка, в клетку. В дополнительных вариантах воплощения гибридный белок содержит одну полипептидную цепочку, содержащую два полудомена расщепления, и связывающий домен цинкового пальца. В этом случае один гибридный белок экспрессируется в клетке и, не желая быть связанными теорией, как полагают, расщепляет ДНК в результате формирования внутримолекулярного димера полудоменов расщепления.
В некоторых вариантах воплощения компоненты гибридных белков (например, ZFP-FokI слияния) организованны так, что домен цинкового пальца является ближайшим к аминоконцу гибридного белка, а полудомен расщепления является ближайшим к карбоксиконцу. Это отражает относительную ориентацию домена расщепления в природных димеризованных доменах расщепления, таких как производные от фермента FokI, в котором ДНК-связывающий домен является ближайшим к аминоконцу, а полудомен расщепления является ближайшим к карбоксиконцу. В этих вариантах воплощения димеризация полудоменов расщепления для того, чтобы сформировать функциональную нуклеазу, вызвана связыванием гибридных белков с сайтами на противоположных цепях ДНК с 5'-концами сайтов связывания, находящимися проксимально относительно друг друга.
В дополнительных вариантах воплощения компоненты гибридных белков (например, ZFP-FokI слияния) организованны так, что полудомен расщепления является ближайшим к аминоконцу гибридного белка, а домен цинкового пальца является ближайшим к карбоксиконцу. В этих вариантах воплощения димеризация полудоменов расщепления для того, чтобы сформировать функциональную нуклеазу, вызвана связыванием гибридных белков с сайтами на противоположных цепях ДНК с 3'-концами сайтов связывания, находящимися проксимально относительно друг друга. В еще дополнительных вариантах воплощения первый гибридный белок включает полудомен расщепления, ближайший к аминоконцу гибридного белка, и домен цинкового пальца, ближайший к карбоксиконцу, а второй гибридный белок организован так, что домен цинкового пальца является ближайшим к аминоконцу гибридного белка, а полудомен расщепления является ближайшим к карбоксиконцу. В этих вариантах воплощения оба гибридных белка связываются с одной и той же цепью ДНК, с сайтом связывания первого гибридного белка, содержащего домен цинкового пальца, ближайший к карбоксиконцу, расположенному на 5'-стороне сайта связывания второго гибридного белка, содержащего домен цинкового пальца, ближайший к аминоконцу. В некоторых вариантах воплощения раскрытых гибридных белков аминокислотная последовательность между доменом цинкового пальца и доменом расщепления (или полудоменом расщепления) обозначается ZC линкер. ZC линкер будет отличаться от межпальцевых линкеров, о которых говорилось выше. См., например, патентные публикации США № 20050064474А1 и 20030232410 и международную патентную публикацию WO 05/084190 для подробных сведений о получении ZC линкеров, которые оптимизируют расщепление.
В одном из вариантов воплощения изобретение предоставляет ZFN-содержащий белок по типу цинковый палец, имеющий одну или более аминокислотных последовательностей спирали распознавания, продемонстрированных в табл. 1. В другом варианте воплощения здесь предоставлен вектор экспрессии ZFP, содержащий нуклеотидную последовательность, кодирующую ZFP, имеющий одну или более спиралей распознавания, продемонстрированных в табл. 1.
Целевая интеграция.
Раскрытые способы и композиции могут быть использованы для расщепления ДНК в геноме любой клетки, в которую сайт множественной инсерции был интегрирован, что способствует стабильной целевой интеграции экзогенной последовательности в сайт множественной инсерции и/или эксцизии экзогенной последовательности в присутствии соответствующих пар ZFN. См. фиг. 1 и 2. Кроме того, здесь описаны способы, в которых сайты ZFN-инсерции, как часть экзогенной последовательности, вводятся в геном клетки сериями. См. фиг. 4 и 5. Например, экзогенная последовательность, окруженная с боков различными комбинациями сайтов гетеродимерной нуклеазы, вставляется в геном. Впоследствии ZFNпара, которая расщепляет в одном из соответствующих фланговых сайтов ZFN, вводится в клетку в при- 16 031322 сутствии другой экзогенной последовательности, которая снова включает в себя различные комбинации сайтов гетеродимерной нуклеазы. Этот процесс может быть повторен при желании вставить экзогенные последовательности. Кроме того, при наличии соответствующих пар ZFN, одна или более экзогенных последовательностей могут быть удалены из генома.
Фиг. 6 демонстрирует другой вариант воплощения, в котором экзогенная последовательность включает маркерный ген и ген, представляющий интерес. И маркерный ген, и ген интереса находятся в окружении различных ZFN-сайтов связывания (изображены в виде треугольников с разными оттенками), так, что маркерный ген может быть удален в случае необходимости, например, при вставке дополнительных генов. В организмах, таких как растения, где существует ограниченное число эффективных селективных маркеров, это позволяет использовать всего лишь один селективный маркерный ген, значительно облегчая потенциал накапливания генов, представляющих интерес. В некоторых вариантах воплощения, например, в зависимости от эффективности направленного на гомологию восстановления ДНК, может быть использован расщепленный селективный маркер. Правильная интеграция донорной ДНК-последовательности, использующая расщепленный селективный маркер, создает экспрессируемый селективный маркерный ген. Селективные маркеры могут быть исключены из интегрированной последовательности ДНК и поэтому могут быть использованы повторно. В другом варианте воплощения экзогенная последовательность для удаления является окруженной в геноме неполными последовательностями расщепленного маркерного гена. После эксцизии маркерный ген вновь конструируется, что приводит в результате к созданию функционального маркерного гена. Использование эксцизии селективного маркера ограничивает количество необходимых селективных маркеров до двух или, возможно, только до одного. Для целевой интеграции в интегрированный сайт множественной инсерции, как описано здесь, разработаны один или более ДНК-связывающих доменов (например, ZFP) для связывания целевого сайта у предетерминированного сайта расщепления или вблизи него, а гибридный белок, содержащий разработанные ДНК-связывающий домен и домен расщепления, экспрессируется в клетке. После связывания ДНК-связывающей части (например, цинкового пальца) гибридного белка с целевым сайтом ДНК расщепляется, предпочтительно через двухцепочечный разрыв, рядом с целевым сайтом при помощи домена расщепления.
Присутствие двухцепочечного разрыва в сайте множественной инсерции облегчает интеграцию экзогенных последовательностей с помощью гомологичной рекомбинации. В некоторых вариантах воплощения полинуклеотид, содержащий экзогенную последовательность, чтобы быть вставленным в сайт множественной инсерции, будет включать в себя один или более областей гомологии с полинуклеотидом сайта множественной инсерции и/или окружающего генома для облегчения гомологичной рекомбинации. Приблизительно 25, 50, 100, 200, 500, 750, 1000, 1500, 2000 или более нуклеотидов гомологии последовательности между донорной и геномной последовательностью (или любые целые значения от 10 до 2000 нуклеотидов, или больше) будут поддерживать гомологичную рекомбинацию между ними. В некоторых вариантах воплощения гомологичные плечи содержат менее чем 1000 пар оснований в длину. В других вариантах воплощения гомологичные плечи содержат менее чем 750 пар оснований в длину. См. также предварительную заявку на патент США № 61/124047, которая включена в настоящий документ в качестве ссылки. Молекулы донора (экзогенная последовательность) могут содержать несколько прерывающихся областей гомологии с клеточным хроматином. Например, для целевой инсерции последовательностей, которые обычно не присутствуют в области интереса, вышеупомянутые последовательности могут быть представлены в донорной молекуле нуклеиновой кислоты и окружены областями гомологии с последовательностью гена в области интереса.
Любая последовательность интереса (экзогенная последовательность) может быть введена в сайт множественной инсерции или удалена из него, как описано здесь. Типичные экзогенные последовательности включают, не ограничиваясь этим, любую полипептидную кодирующую последовательность (например, кДНК), промотор, энхансер и другие регуляторные последовательности (например, интерферирующие РНК-последовательности, мшРНК-кассеты экспрессии, эпитопные метки, маркерные гены, сайты распознавания ферментов расщепления и различные виды конструкций экспрессии. Такие последовательности могут быть легко получены с помощью стандартных молекулярно-биологических способов (клонирование, синтез и т.д.) и/или являются коммерчески доступными. Экзогенная последовательность может быть введена в клетку перед экспрессией гибридного белка (гибридных белков), одновременно с ней или после. Донорный полинуклеотид может быть ДНК или РНК, одноцепочечным или двухцепочечным и может быть введен в клетку в линейной или круговой форме. Если он введен в линейной форме, концы донорной последовательности могут быть защищены (например, от экзонуклеолитической деградации) при помощи способов, известных специалистам в данной области техники. Например, один или более остатков дидезоксинуклеотида добавляют к концу 3' линейной молекулы и/или самокомплементарные олигонуклеотиды лигируют с одним или с обоими концами. См., например, работы Chang et al. (1987), Proc. Natl. Acad. Sci. uSA 84:4959-4963; Nehls et al. (1996), Science 272:886-889. Дополнительные способы защиты экзогенных полинуклеотидов от деградации включают, не ограничиваясь этим, добавление концевой группы (групп) и использование модифицированных межнуклеотидных связей, таких как, например, фосфоротиоаты, фосфороамидаты и остатки О-метил-рибозы или дезоксирибозы Поли
- 17 031322 нуклеотид может быть введен в клетку как часть векторной молекулы, имеющей дополнительные последовательности, такие как, например, источники репликации, промоторы и гены, кодирующие резистентность к антибиотикам. Кроме того, донорные полинуклеотиды могут быть введены как голая нуклеиновая кислота, как нуклеиновая кислота в комплексе с веществом, таким как наночастица, липосома или полоксамер, или могут быть доставлены в растительные клетки посредством бактерий или вирусов (например, Agrobacterium, Rhizobium sp. NGR234, Sinorhizoboium meliloti, Mesorhizobium loti, вируса табачной мозаики, картофельного вируса X, вируса мозаики цветной капусты и вируса мозаики листа маниоки. См., например, работу Chung et al. (2006), Trends Plant Sci. 11(1):1-4.
Как подробно указано выше, сайты связывания на сайте множественной инсерции для двух гибридных белков (гомодимеров или гетеродимеров), каждый из которых содержит связывающий домен цинкового пальца и полудомен расщепления, могут быть расположены через 5-8 или 15-18 нуклеотидов друг от друга, как измерено от границы каждого сайта связывания, ближайшей к другому сайту связывания, а расщепление происходит между сайтами связывания. Не имеет значения, происходит ли расщепление в одном сайте или в нескольких сайтах между сайтами связывания, так как расщепленные геномные последовательности заменяются донорными последовательностями. Таким образом, для эффективного изменения последовательности одиночных нуклеотидных пар при помощи целевой рекомбинации центральная точка области между сайтами связывания находится в пределах 10000 нуклеотидов этой нуклеотидной пары, предпочтительно в пределах 1000 нуклеотидов или 500 нуклеотидов, или 200 нуклеотидов, или 100 нуклеотидов, или 50 нуклеотидов, или 20 нуклеотидов, или 10 нуклеотидов, или 5 нуклеотидов, или 2 нуклеотидов, или одного нуклеотида, или в нуклеотидной паре, представляющей интерес.
Также предоставлены способы и композиции, которые могут повысить уровни целевых рекомбинаций, включая, но не ограничиваясь этим, использование дополнительных слияний ZFP-функциональный домен, чтобы активировать экспрессию генов, участвующих в гомологичной рекомбинации, таких как, например, растительные гены RAD54 группы эпистаза (например, AtRad54, AtRad51) и гены, продукты которых взаимодействуют с вышеупомянутыми генными продуктами. См., например, работу Klutstein et al. Genetics. 2008 Apr; 178(4):2389-97.
Аналогично слияния ZFP-функциональный домен могут быть использованы в комбинации со способами и композициями, описанными здесь, для подавления экспрессии генов, участвующих в негомологичном соединении концов (например, Ku70/80, XRCC4, поли(АБР рибоза) полимераза, ДНК-лигаза 4). См., например, работы Riha et al. (2002), EMBO 21:2819-2826; Freisner et al. (2003), Plant J. 34:427-440; Chen et al. (1994), European Journal of Biochemistry 224:135-142. Способы активации и подавления экспрессии гена с помощью слияния между связывающим доменом цинкового пальца и функциональным доменом раскрыты, например, в находящихся в совместном обладании патентах США № 6534261, 6824978 и 6933113. Дополнительные способы подавления включают использование антисмысловых олигонуклеотидов и/или малых интерферирующих РНК (миРНК или РНК-и) или мшРНК, нацеленных на последовательность гена, который должны быть подавлен.
Дальнейшее повышение эффективности целевой рекомбинации в клетках, содержащих молекулу слияния цинковый палец/нуклеаза и донорную ДНК-молекулу, достигается путем блокирования клеток в G2-фазе клеточного цикла, когда задаваемые гомологией процессы восстановления максимально активны. Такая задержка может быть достигнута различными способами. Например, клетки могут быть обработаны с помощью, например, лекарственных средств, соединений и/или малых молекул, которые влияют на прогрессию клеточного цикла таким образом, чтобы задержать клетки в G2-фазе. Типичные молекулы этого типа включают, не ограничиваясь этим, соединения, которые оказывают воздействие на полимеризацию микротрубочек (например, винбластин, нокодазолом, таксол), соединения, которые взаимодействуют с ДНК (например, цис-платина(П) дихлорид диамина, цисплатин, доксорубицин), и/или соединения, которые влияют на синтез ДНК (например, тимидин, гидроксимочевина, L-мимозин, этопозид, 5-фторурацил). Дополнительное увеличение эффективности рекомбинации достигается за счет использования ингибиторов гистондеацетилазы (ГДАЦ) (например, бутирата натрия, трихостатина А), которые изменяют структуру хроматина, чтобы сделать геномную ДНК более доступной для клеточных механизмов рекомбинации.
Дополнительные способы задержки клеточного цикла включают чрезмерную экспрессию белков, которые ингибируют активность ЦЗК (циклинзависимых киназ) клеточного цикла, например, путем введения кДНК, кодирующей белок в клетку, либо путем введения в клетку инженерного ZFP, который активирует экспрессию гена, кодирующего белок. Задержка клеточного цикла также достигается за счет ингибирования активности циклинов и ЦЗК, например, с помощью РНК-и способов (например, патент США № 6506559) или путем введения в клетки инженерного ZFP, который подавляет экспрессию одного или более генов, вовлеченных в прогрессию клеточного цикла, таких как, например, циклин и/или ЦЗК гены. См., например, находящийся в совместном обладании патент США № 6534261 для способов синтеза инженерных белков типа цинковый палец для регуляции экспрессии генов.
Альтернативно в определенных случаях целевое расщепление проводится в отсутствие донорного полинуклеотида (предпочтительно в фазе S и G2), а рекомбинация происходит между гомологичными хромосомами.
- 18 031322
Векторы экспрессии.
Нуклеиновая кислота, кодирующая один или более гибридных белков (например, ZFN), как описано здесь, может быть клонирована в вектор для трансформации в прокариотические или эукариотические клетки для репликации и/или экспрессии.
Векторы могут представлять собой прокариотические векторы, например, плазмиды, или челночные векторы, векторы насекомых или эукариотические векторы. Нуклеиновая кислота, кодирующая гибридный белок, может также быть клонирована в вектор экспрессии для введения в клетку.
Чтобы экспрессировать гибридные белки (например, ZFN), последовательности, кодирующие гибридные белки, как правило, субклонируют в вектор экспрессии, содержащий промотор прямой транскрипции. Подходящие бактериальные и эукариотические промоторы хорошо известны в данной области техники и описаны, например, в работах Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual (2nd ed. 1989; 3rd ed., 2001); Kriegler, Gene Transfer and Expression: A Laboratory Manual (1990); и Current Protocols in Molecular Biology Ausubel et al., supra). Системы бактериальной экспрессии для экспрессии ZFP являются доступными, например, в Е. coli, Bacillus sp. и Salmonella (Palva et al., Gene 22:229-235 (1983)). Наборы для таких систем экспрессии являются коммерчески доступными. Системы эукариотической экспрессии для клеток млекопитающих, дрожжей и клеток насекомых хорошо известны специалистам в данной области техники и также являются коммерчески доступными.
Промотор, используемый для прямой экспрессии, кодирующей гибридный белок нуклеиновой кислоты, зависит от конкретного применения. Например, сильный конститутивный промотор, подходящий клетке-хозяину, как правило, используется для экспрессии и очистки гибридных белков.
В отличие от этого, когда гибридный белок вводится in vivo для регулирования генов растений (см. раздел Доставка нуклеиновых кислот в растительные клетки, ниже), используется либо конститутивный, регулируемый (например, во время развития, посредством типа тканей или клеток или посредством окружающей среды), либо индуцибельный промотор, в зависимости от конкретного использования гибридного белка. Неограничивающие примеры растительных промоторов включают промоторные последовательности, полученные от A. thaliana убиквитина-3 (уби-3) ((Callis, et al., 1990, J. Biol. Chem. 26512486-12493), A. tumifaciens маннопин синтазы (Amas) (Petolino et al., патент США № 6730824) и/или вируса мозаики листа маниоки (CsVMV) (Verdaguer et al., 1996, Plant Molecular Biology 31:1129-1139). См. также раздел Примеры. В дополнение к промотору вектор экспрессии обычно содержит единицу транскрипции или кассету экспрессии, которая содержит все дополнительные элементы, необходимые для экспрессии нуклеиновой кислоты в клетках-хозяевах, прокариотических или эукариотических. Типичная кассета экспрессии, таким образом, содержит промотор, функционально связанный, например, с последовательностями нуклеиновых кислот, кодирующих гибридный белок, и сигналы, необходимые, например, для эффективного полиаденилирования транскрипта, окончания транскрипции, сайтов связывания рибосом или окончания трансляции. Дополнительные элементы кассеты могут включать, например, энхансеры, гетерологичные сигналы сплайсинга и/или сигнал ядерной локализации (СЯЛ) Конкретный вектор экспрессии, используемый для транспортировки генетической информации в клетку, выбирают в связи с предполагаемым использованием гибридных белков, например, экспрессия в растениях, животных, бактериях, грибах, простейших и т. д. (см. векторы экспрессии, описанные ниже). Стандартные бактериальные и животные векторы экспрессии известны в данной области техники и подробно описаны, например, в патентной публикации США 20050064474А1 и в международных патентных публикациях № WO 05/084190, WO 05/014791 и WO 03/080809. Стандартные способы трансфекции могут быть использованы для производства бактериальных, млекопитающих, дрожжевых или насекомых клеточных линий, которые экспрессируют большое количество белка, который может быть очищен с помощью стандартных способов (см., например, работы Colley et al., J. Biol. Chem. 264:17619-17622 (1989); Guide to Protein Purification, in Methods in Enzymology, vol. 182 (Deutscher, ed., 1990)). Трансформация эукариотических и прокариотических клеток производится согласно стандартным способам (см., например, Morrison, J. Bact. 132:349-351 (1977); Clark-Curtiss & Curtiss, Methods in Enzymology 101:347-362 (Wu et al., eds., 1983). Для введения чужеродных нуклеотидных последовательностей в такие клеткихозяева может быть использована любая из хорошо известных процедур. Такие процедуры включают использование трансфекции кальция фосфата, полибрена, слияния протопластов, электропорации, ультразвуковых способов (например, сонопорации), липосом, микроинъекций, голых ДНК, плазмидных векторов, вирусных векторов, как эписомных, так и интегративных, и любых других хорошо известных способов для введения клонированной геномной ДНК, кДНК, синтетической ДНК или другого чужеродного генетического материала в клетку-хозяина (см., например, работу Sambrook et al., выше). Необходимо только, чтобы конкретные используемые генно-инженерные процедуры были способны успешно внедрять по меньшей мере один ген в клетку-хозяина, способную экспрессировать белок выбора.
Доставка нуклеиновых кислот в растительные клетки.
Как отмечалось выше, ДНК-конструктмогут быть введены в (например, в геном) желаемое растение-хозяина с помощью различных традиционных способов. Для рассмотрения таких способов см., например, работы Weissbach & Weissbach Methods for Plant Molecular Biology (1988, Academic Press, N.Y.) Section VIII, p. 421-463 и Grierson & Corey, Plant Molecular Biology (1988, 2nd Ed.), Blackie, London, Ch. 7
- 19 031322
9. Например, ДНК-конструкция может быть введена непосредственно в геномную ДНК растительной клетки с использованием таких способов, как электропорация и микроинъекция протопластов растительной клетки, или ДНК-конструкции могут быть введены непосредственно в ткани растения с использованием баллистических способов, таких как бомбардировка ДНК-частицами (см., например, работу Klein et al. (1987) Nature 327:70-73). Альтернативно ДНК-конструкция может быть введена в растительную клетку с помощью трансформации наночастиц (см., например, заявку на патент США № 12/245685, которая включена в настоящий документ в качестве ссылки во всей своей полноте). Альтернативно ДНКконструкции могут быть объединены с соответствующими Т-ДНК граничными/фланговыми областями и введены в обычный Agrobacterium tumefaciens вектор хозяина. Способы Agrobacterium tumefaciensопосредованной трансформации, включающие нейтрализацию и использование бинарных векторов, хорошо описаны в научной литературе. См., например, работы Horsch et al. (1984), Science 233:496-498 и Fraley et al. (1983), Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 80:4803.
Кроме того, трансфер генов может осуществляться с использованием вирусов или бактерий неAgrobacterium, таких как Rhizobium sp. NGR234, Sinorhizoboium meliloti, Mesorhizobium loti, картофельный вирус Х, вирус мозаики цветной капусты и вирус мозаики листа маниоки и/или вирус табачной мозаики, См., например, работу Chung et al. (2006), Trends Plant Sci. 11(): 1 -4.
Функции вирулентности Agrobacterium tumefaciens хозяина будут направлять инсерцию Т-цепочки, содержащей конструкт, и смежный маркер в ДНК растительной клетки, когда клетка инфицирована бактериями, с помощью бинарного Т ДНК вектора (Bevan (1984), Nuc. Acid Res. 12:8711-8721) или процедуры совместного культивирования (Horsch et al. (1985,) Science 227:1229-1231). Как правило, система трансформации Agrobacterium используется для разработки двудольных растений (Bevan et al. (1982), Ann. Rev. Genet 16:357-384; Rogers et al. (1986), Methods Enzymol. 118:627-641). Система трансформации Agrobacterium также может использоваться для трансформации, а также для переноса ДНК в однодольные растения и растительные клетки. См. патент США № 5591616, работы Hernalsteen et al. (1984), EMBO J. 3:3039-3041; Hooykass-Van Slogteren et al. (1984), Nature 311:763-764; Grimsley et al. (1987), Nature 325:1677-179; Boulton et al. (1989), Plant Mol. Biol. 12:31-40 и Gould et al. (1991), Plant Physiol. 95:426-434. Альтернативные способы переноса и трансформации генов включают, не ограничиваясь этим, трансформацию протопласта через кальций-, полиэтиленгликоль (ПЭГ)- или электропорацияопосредованное поглощение голой ДНК (см. работы Paszkowski et al. (1984), EMBO J. 3:2717-2722, Potrykus et al. (1985), Molec. Gen. Genet. 199:169-177; Fromm et al. (1985), Proc. Nat. Acad. Sci. USA 82:5824-5828 и Shimamoto (1989), Nature 338:274-276), а также электропорацию растительных тканей (D'Halluin et al. (1992), Plant Cell 4:1495-1505). Дополнительные способы трансформации растительной клетки включают микроинъекции, опосредованное карбидом кремния ДНК-поглощение (Kaeppler et al. (1990), Plant Cell Reporter 9:415-418) и бомбардировку микрочастицами (см. Klein et al. (1988), Proc. Nat. Acad. Sci. USA 85:4305-4309; и Gordon-Kamm et al. (1990), Plant Cell 2:603-618).
Раскрытые способы и композиции могут быть использованы для вставки экзогенных последовательностей в сайт множественной инсерции, который был вставлен в геном растительной клетки. Это подходит, так как экспрессия введенного трансгена в геном растения сильно зависит от его сайта интеграции. Таким образом, гены, кодирующие, например, устойчивость к гербицидам, резистентность к насекомым, питательные вещества, молекулы антибиотиков или терапевтические молекулы, могут быть вставлены при помощи целевой рекомбинации в области генома растений, благоприятные для их экспрессии.
Трансформированные клетки растений, которые производятся при помощи любого из вышеперечисленных способов трансформации, могут быть культивированы, чтобы восстанавливать целое растение, которое обладает трансформированным генотипом и, таким образом, желаемым фенотипом. Такие способы восстановления полагаются на манипуляции с определенными фитогормонами в питательной среде культуры тканей, как правило, полагаясь на биоцидный и/или гербицидный маркер, который был введен вместе с заданной нуклеотидной последовательностью. Регенерация растений из культуры протопластов описана в работах Evans, et al., Protoplasts Isolation and Culture in Handbook of Plant Cell Culture, p. 124-176, Macmillian Publishing Company, New York, 1983; and Binding, Regeneration of Plants, Plant Protoplasts, pp. 21-73, CRC Press, Boca Raton, 1985. Регенерация также может быть получена из растительного каллюса, эксплантов, органов, пыльцы, эмбрионов или их частей. Такие способы регенерации описаны в целом в работах Klee et al. (1987), Ann. Rev. of Plant Phys. 38:467-486.
Нуклеиновые кислоты, которые вводятся в клетки растения, могут быть использованы для придания желаемых признаков, по сути, любому растению. Широкий спектр растений и систем растительной клетки могут быть разработаны для заданных физиологических и агрономических характеристик, описанных здесь, используя конструкции нуклеиновых кислот настоящего раскрытия и различные способы трансформации, упомянутые выше. В предпочтительных вариантах воплощения целевые растения и растительные клетки для генной инженерии включают, не ограничиваясь этим, однодольные и двудольные растения, такие как зерновые культуры, в том числе злаковые зерновые культуры (например, пшеница, кукуруза, рис, просо, ячмень), плодовые культуры (например, помидор, яблоко, груша, клубника, апельсин), кормовые культуры (например, люцерна), культуры овощных корнеплодов (например, морковь,
- 20 031322 картофель, сахарная свекла, батат), листовые овощные культуры (например, салат-латук, шпинат); цветущие растения (например, петуния, роза, хризантема), хвойные деревья и сосны (например, сосна пихта, ель); растения, используемые в фиторемедиации (например, растения, накапливающие тяжелые металлы); масличные культуры (например, подсолнечник, семена рапса), а также растения, используемые в экспериментальных целях (например, Арабидопсис). Таким образом, раскрытые способы и композиции могут использоваться для более широкого круга растений, в том числе, но не ограничиваясь этим, для видов из родов Asparagus, Avena, Brassica, Citrus, Citrullus, Capsicum, Cucurbita, Daucus, Erigeron, Glycine, Gossypium, Hordeum, Lactuca, Lolium, Lycopersicon, Malus, Manihot, Nicotiana, Orychophragmus, Oryza, Persea, Phaseolus, Pisum, Pyrus, Prunus, Raphanus, Secale, Solarium, Sorghum, Triticum, Vitis, Vigna и Zea.
Специалисту в данной области техники будет понятно, что, после того как экзогенная последовательность стабильно включена в трансгенные растения и подтверждена ее функциональность, она может быть введена в другие растения при помощи полового скрещивания. Любой из ряда стандартных способов размножения может быть использован в зависимости от видов, которые подлежат скрещиванию. Трансформированная растительная клетка, каллюс, ткань или растение могут быть идентифицированы и изолированы при помощи селекции или скрининга генно-инженерного растительного материала для признаков, которые кодируются маркерными генами, присутствующими в трансформирующей ДНК. Например, селекция может быть выполнена путем выращивания инженерного растительного материала на средах, содержащих ингибирующее количество антибиотиков или гербицидов, которым трансформирующая генная конструкция придает резистентность. Кроме того, трансформированные растения и растительные клетки также могут быть идентифицированы путем скрининга на виды активности любых видимых маркерных генов (например, β-глюкуронидазы, люциферазы, В или С1 генов), которые могут присутствовать на рекомбинантных конструкциях нуклеиновых кислот. Такие методологии селекции и скрининга являются хорошо известными специалистам в данной области техники.
Физические и биохимические способы также могут быть использованы для идентификации трансформантов растения или растительной клетки, содержащих вставленные конструкции гена. Эти способы включают, но не ограничиваются этим, 1) саузерн-анализ или ПЦР-амплификацию для обнаружения и определения структуры вставки рекомбинантной ДНК; 2) норзерн-блоттинг, защита S1 РНазы, удлинение праймера или обратную транскриптаза-ПЦР-амплификацию для обнаружения и изучения РНКтранскриптов генных конструкций; 3) ферментативные анализы для обнаружения ферментной или рибозимной активности, если такие генные продукты кодируются генной конструкцией; 4) электрофорез белков в геле, способы вестерн-блоттинга, иммунопреципитацию или ферментсвязанные иммуноферментные анализы (ИФА), где продуктами генной конструкции являются белки. Дополнительные способы, такие как гибридизация in situ, ферментное окрашивание и иммуноокрашивание, также могут быть использованы для обнаружения наличия или экспрессии рекомбинантной конструкции в определенных органах и тканях растений. Способы для проведения всех этих анализов хорошо известны специалистам в данной области техники.
Эффекты генной манипуляции с использованием способов, описанных здесь, можно наблюдать, например, при помощи норзерн-блоттинга РНК (например, мРНК), выделенной из тканей, представляющих интерес. Как правило, если присутствует мРНК или количество мРНК увеличилось, можно предположить, что в настоящее время экспрессируются соответствующие трансгены. Могут быть использованы и другие способы измерения активности генов и/или закодированных полипептидов. Различные типы ферментативных анализов могут быть использованы в зависимости от используемого субстрата и способа обнаружения увеличения или уменьшения продукта реакции или побочного продукта. Кроме того, уровни экспрессированного полипептида могут быть измерены иммунохимическим способом, т. е. при помощи ELISA, RIA, EIA и других анализов на основе антител, хорошо известных специалистам в этой области техники, например, путем анализов электрофоретического обнаружения (или с окрашиванием, или с помощью вестерн-блоттинга). В качестве неограничивающего примера обнаружение ААД-1 и ФАТ белков с использованием анализа ИФА описано в заявке на патент США № 11/587893, который включен в настоящий документ в качестве ссылки в полном объеме. Трансген может быть селективно экспрессирован в некоторых тканях растения или на некоторых стадиях развития или трансген может быть экспрессирован практически во всех тканях растения в значительной степени в течении всего его жизненного цикла. Тем не менее, любой режим комбинаторной экспрессии также применим.
Настоящее раскрытие также включает в себя семена трансгенных растений, описанных выше, где семя имеет трансгенную или генную конструкцию. Настоящее раскрытие дополнительно охватывает потомство, клоны, клеточные линии или клетки трансгенных растений, описанных выше, где указанное потомство, клон, клеточная линия или клетка имеют трансгенную или генную конструкцию.
Гибридные белки (например, ZFN) и векторы экспрессии, кодирующие гибридные белки, могут быть введены непосредственно в растение для генной регуляции, целевого расщепления и/или рекомбинации. В некоторых вариантах воплощения растение содержит множество паралогичных генов-мишеней. Таким образом, один или более различных гибридных белков или векторов экспрессии, кодирующих гибридные белки, могут быть введены в растения с целью выявления одного или более из этих паралогичных генов (например, Zp15, см. РСТ патентную публикацию WO 2010/077319) генов в растении. Вве
- 21 031322 дение эффективных количеств осуществляется при помощи любого из путей введения, обычно используемых для введения гибридных белков в окончательный контакт с растительной клеткой, подлежащей обработке. ZFP вводят любым подходящим способом, предпочтительно с приемлемыми носителями. Подходящие способы введения таких модуляторов доступны и хорошо известны специалистам в этой области техники и, несмотря на то, что для введения определенной композиции может быть использован более чем один путь, конкретный путь может часто обеспечить более быструю и более эффективную реакцию, чем другой путь введения.
Носители могут быть также использованы и частично определяются конкретной композицией, которая вводится, а также конкретным способом, который используется для введения композиции. Таким образом, существует широкое разнообразие подходящих форм носителей, которые являются коммерчески доступными.
Доставка в клетки млекопитающих ZFN, описанные здесь, могут быть доставлены в целевые клетки млекопитающего с помощью любого подходящего средства, в том числе, например, путем инъекции ZFN мРНК. См. работу Hammerschmidt et al. (1999), Methods Cell Biol. 59:87-115.
Способы доставки белков, содержащих цинковые пальцы, описаны, например, в патентах США № 6453242, 6503717, 6534261, 6599692, 6607882, 6689558, 6824978, 6933113, 6979539, 7013219 и 7163824, раскрытия всех из которых включены в настоящий документ в качестве ссылки во всей их полноте.
Как описано здесь, ZFN могут быть доставлены с использованием векторов, содержащих последовательности, кодирующие один или более из ZFN. Любые векторные системы могут быть использованы, в том числе, но не ограничиваясь этим, плазмидные векторы, ретровирусные векторы, лентивирусные векторы, аденовирусные векторы, поксвирусные векторы, вируса герпеса векторы и адено-связанного вируса векторы, и т.д. См. также патенты США № 6534261, 6607882, 6824978, 6933113, 6979539, 7013219 и 7163824, включенные в настоящий документ в качестве ссылки во всей их полноте. Более того, будет очевидно, что любой из этих векторов может включать один или более ZFN-кодирующих последовательностей. Таким образом, когда одна или более пар ZFN вводятся в клетку, ZFN может переноситься на одном и том же векторе или на разных векторах. Когда используется множество векторов, то каждый вектор может содержать последовательность, кодирующую одну или множество ZFN.
Обычные способы на основе вирусного и невирусного переноса генов могут быть использованы для введения нуклеиновых кислот, кодирующих генно-инженерные ZFP в клетки млекопитающих. Такие способы могут быть использованы для введения нуклеиновых кислот, кодирующих ZFP в клетки млекопитающих in vitro. В некоторых вариантах воплощения нуклеиновые кислоты, кодирующие ZFP, вводят для использования in vivo или ex vivo.
Невирусные системы доставки вектора включают электропорацию, липофекцию, микроинъекцию, баллистики, виросомы, липосомы, иммунолипосомы, поликатион или конъюгаты липид:нуклеиновая кислота, голую ДНК, искусственные вирионы и агент, увеличивающий использование ДНК. Использование сонопорации, например, системы Sonitron 2000 (Rich-Map), также может применяться для доставки нуклеиновых кислот. Вирусные системы доставки вектора включают ДНК и РНК вирусы, которые имеют либо эписомные, либо интегрированные геномы после доставки в клетку. Дополнительные типичные системы доставки нуклеиновых кислот включают те, которые предоставлены компанией Amaxa Biosystems (Cologne, Germany, Maxcyte, Inc. (Rockville, Maryland), BTX Molecular Delivery Systems (Holliston, MA) и Copernicus Therapeutics Inc, (см., например, патент США № 6008336). Липофекция описана, например, в патентах США № 5049386, 4946787 и 4897355), а реагенты липофекции доступны на коммерческой основе (например, Transfectam™ и Lipofectin™). Катионные и нейтральные липиды, которые являются подходящими для эффективного рецептор-распознавания липофекции полинуклеотидов, включают таковые из Feigner, WO 91/17424, WO 91/16024. Доставка может осуществляться в клетки (введение ex vivo) или ткани-мишени (введение in vivo). Подготовка комплексов липид:нуклеиновая кислота, включая целевые липосомы, такие как иммунолипидные комплексы, хорошо известны специалистам в данной области техники (см., например, Crystal, Science 270:404-410 (1995); Blaese et al., Cancer Gene Ther. 2:291-297 (1995); Behr et al., Bioconjugate Chem. 5:382-389 (1994); Remy et al., Bioconjugate Chem. 5:647-654 (1994); Gao et al., Gene Therapy 2:710-722 (1995); Ahmad et al., Cancer Res. 52:4817-4820 (1992); патенты США № 4186183, 4217344, 4235871, 4261975, 4485054, 4501728, 4774085, 4837028 и 4946787).
Как отмечалось выше, раскрытые способы и композиции могут быть использованы в любом типе клетки млекопитающего. Белки (например, ZFP), полинуклеотиды, кодирующие их, и композиции, содержащие белки и/или полинуклеотиды, описанные здесь, могут быть доставлены в клетки-мишени с помощью любого подходящего средства. Подходящие клетки включают, не ограничиваясь этим, эукариотические и прокариотические клетки, и/или клеточные линии. Неограничивающие примеры таких клеток или клеточных линий, полученных от таких клеток, включают COS, СНО (например, CHO-S, CHO-K1, CHO-DG44, CHO-DUXB11, CHO-DUKX, CHOK1SV), VERO, MDCK, WI38, V79, B14AF28-G3, BHK, HaK, NS0, SP2/0-Ag14, HeLa, HEK293 (например, HEK293-F, HEK293-4, HEK293-P) и perC6 клетки, а также клетки насекомых, такие как Spodoptera fugiperda (Sf), или грибковые клетки, такие как
- 22 031322
Saccharomyces, Pichia и Schizosaccharomyces. В некоторых вариантах воплощения клеточная линия представляет собой СНО-Ki, MDCK или HEK293 клеточную линию. Подходящие первичные клетки включают мононуклеарные клетки периферической крови (МКПК) и другие подмножества клеток крови, такие как, но не ограничиваясь этим, CD4+ Т-клетки и CD8+ Т-клетки. Подходящие клетки также включают стволовые клетки, такие как, например, эмбриональные стволовые клетки, индуцированные плюрипотентные стволовые клетки, гемопоэтические стволовые клетки, нервные стволовые клетки и мезенхимальные стволовые клетки.
Примеры
Пример 1. Конструирование плазмид.
Пример 1.1. eZFN сайты связывания.
Восемь разработанных сайтов связывания нуклеазы цинкового пальца (eZFN) (CL:AR SEQ ID NO: 1, RL:PR - SEQ ID NO: 2, AL:PR - SEQ ID NO: 3, PL:AR - SEQ ID NO: 4, CL:RR SEQ ID NO: 5, RL:CR - SEQ ID NO: 6, CL:PR - SEQ ID NO: 7, RL:AR - SEQ ID NO: 8) были объединены в единый фрагмент ДНК (мульти-eZFN сайт связывания) с расположенными по бокам сайтами ПЦРпраймера, уникальными для каждого из сайта связывания eZFN. Кроме того, другие eZFN сайты связывания были сконструированы и продемонстрировали расщепление на высоком уровне в дрожжах (см., например, патентную публикацию США № 2009/0111119), включая PL:RR - SEQ ID NO: 9, AL:RR SEQ ID NO: 10, AL:CR - SEQ ID NO: 11, PL:CR - SEQ ID NO: 12 и гомодимер eZFN RR:RR SEQ ID NO: 13, RL:RL - SEQ ID NO: 14, PR:PR - SEQ ID NO: 15, PL:PL - SEQ ID NO: 16, CL:CL SEQ ID NO: 17, CR:CR - SEQ ID NO: 18, AR:AR - SEQ ID NO: 19 и AL:AL - SEQ ID NO: 20. Обозначения CL и CR относятся соответственно к левой и правой сторонам конструкций цинкового пальца для рецептора CCR5, обозначенных как 8266 и 8196, которые имеют последовательности и связываются с целевыми сайтами, показанными в патентной публикации США № 2008/0159996. Обозначения AL и AR относятся соответственно к левой и правой сторонам конструкций цинкового пальца для локуса AAVS1, обозначенных как 15556 и 15590, и имеют последовательности спирали распознавания и связываются с целевыми сайтами, показанными в патентной публикации США № 2008/0299580. Последовательности спирали распознавания и целевые сайты для PL и PR конструкций, а также для RL и RR конструкций перечислены в табл. 1 и 2. PL и PR оба относятся к левой и правой сторонам конструкций цинкового пальца для ZFN, специфичных для гена человека PRMT1, в то время как RL и RR относятся к левой и правой сторонам конструкций цинкового пальца для ZFN, специфичных для мышиного локуса Rosa26.
Ни один из этих целевых сайтов не присутствует в геноме кукурузы, как измерено при помощи биоинформатического анализа. Сайты ПЦР-праймера были включены для оценки NHEJ, полученного в результате двухцепочечного расщепления хромосомно-локализованного ДНК-фрагмента посредством eZFN.
Таблица 1
Конструкции ZFN
ZFN название (ген) Fl F2 F3 F4 F5 F6
ZFN 19353 (PRMT) «PL» DRSNLS R (SEQ ID N0:27) RSDALT Q (SEQ ID N0:28) TSGNLT R (SEQ ID N0:29) TSGSLT R (SEQ ID N0:30) TSGHLS R (SEQ ID N0:31) не доступно
ZFN 19354 (PRMT) «PR» RSANLS V (SEQ ID N0:32) DRANLS R (SEQ ID N0:33) RSDNLR E (SEQ ID N0:34) ERGTLA R (SEQ ID N0:35) TSSNRK T (SEQ ID N0:36) не доступно
ZFN 18473 DRSART QSGHLS RSDDLS RNDHR не не
- 23 031322
(mRosa26) «RL» R (SEQ ID N0:37) R (SEQ ID N0:38) К (SEQ ID N0:39) KN (SEQ ID N0:40) доступно доступно
ZFN 18477 (mRosa26) «RR» QSGDLT TSGSLT QSGHLA QSSDLT RSDNLS QNAHR
R R R R E KT
(SEQ ID (SEQ ID (SEQ ID (SEQ ID (SEQ ID (SEQ ID
N0:41) N0:42) N0:43) N0:44) N0:45) N0:46)
Таблица 2
Целевые сайты связывания ZFN
ZFN название (ген) Целевой сайт связывания
ZFN 19353 (PRMT) «PL» acGGTGTTGAGcATGGACtcgtagaaga (SEQ ID N0:47)
ZFN 19354 (PRMT) «PR» tcTATGCCCGGGACAAGtggctggtgag (SEQ ID N0:48)
ZFN 18473 (mRosa26) «RL» gaT GGGCGGG AGT Cttctgggcaggctt (SEQ ID N0:49)
ZFN 18477 (mRosa26) «RR» ctAGAAAGACTGGAGTTGCAgatcacga (SEQ ID N0:50)
Все сайты были включены в синтезированный фрагмент ДНК и фрагмент клонировали в плазмиду с использованием ТОРО-клонирования (Invitrogen, Carlsbad, CA). Реакция Gateway LR CLONASE™ (Invitrogen) была использована для переноса этого фрагмента в векторы pDAB101834 и pDAB101849. Эти векторы содержат селективные маркеры, подходящие для табака и кукурузы соответственно. pDAB101834 состоит из промотора вируса мозаики листа маниоки (CsVMV; промотор и 5' нетранслируемая область, полученные из вируса мозаики листа маниоки; Verdaguer et al., (1996), Plant Molecular Biology, 31(6):1129-1139), гена фосфинотрицин ацетил трансферазы (ФАТ, Wohlleben et al., (1988), Gene 70(1):25-37) и AtuORF1 3' UTR (3' нетранслируемой области (UTR, HTP), содержащей терминатор транскрипции и сайт полиаденилирования открытой рамки считывания 1 (ORF1) из Agrobacterium tumefaciens pTi15955; Barker et al., (1983), Plant Molecular Biology, 2(6):335-50). Вектор pDAB101849 кукурузы содержит кассету селективного маркера, включающую промотор гена актин 1 риса (OsAct1, промотор, 5' нетранслируемая область (UTR) и интрон, полученные из гена актин 1 риса Oryza sativa (Act1), McElroy et al., (1990) Plant Cell 2(2): 163-71) и ZmLip 3' UTR (3' нетранслируемая область (UTR), содержащая терминатор транскрипции и сайт полиаденилирования LIP гена кукурузы Zea mays, GenBank номер доступа L35913).
Результирующий вектор табака, pDAB105900 (фиг. 7), был перенесен в Agrobacterium tumefaciens, используя электропорацию. После валидации фермента рестрикции, Agrobacterium хранился как глицериновое сырье до использования. Кукурузный вектор, pDAB105908 (фиг. 8), складывали и очищали, используя набор Qiagen QIAfilter Plasmid Giga (Qiagen, Valencia, CA) в соответствии с протоколом производителя.
Пример 1.2. Векторы для экспрессирования eZFN.
ZFN-векторы, экспрессирующие соответствующие спирали распознавания либо в каноническом (С2Н2), либо в неканоническом (C3H) остове были изготовлены, по сути, так, как описано в патентных публикациях США № 2008/0182332 и 2008/0159996.
Функция ZFN была протестирована на eZFN сайте множественной инсерции, как описано в примере 1.1, вставленном в скрининговую систему ZFN дрожжей (см. патентную публикацию США № 2009/0111119). Все протестированные ZFN-пары были активными в дрожжевой системе.
Восемь eZFN клонированы в векторы, которые содержат регуляторные последовательности, необходимые для экспрессии в клетках растений. Стратегии клонирования, развернутые для конструкций, являются, по сути, такими, как описанные в патентных публикациях США № 2009/0111188А1 и 20100199389. Фиг. 9 и 10 демонстрируют схематически обобщенные кассеты экспрессии eZFN.
Пример 2. Оценивание eZFN в кукурузе.
Пример 2.1. WHISKERS™-опосредованная ДНК-доставка.
Эмбриогенные клеточные культуры кукурузы Hi-II были произведены и использованы в качестве источника живых растительных клеток, на которых была продемонстрирована интеграция. Специалист в данной области техники может предвидеть использование культур клеток, полученных из различных видов растений, или дифференцированных тканей растительного происхождения из различных видов растений в качестве источника живых растительных клеток, в которых была продемонстрирована инте
- 24 031322 грация.
В этом примере плазмида (pDAB105908), содержащая кассету ФАТ растительного селективного маркера и мульти-eZFN инсерционную последовательность сайта связывания, используется для генерирования трансгенных событий. Трансгенные изоляты были трансформированы с eZFN для того, чтобы оценить расщепление двойной цепи.
В частности, 12 мл объёма глобулярной массы (ОГМ) из ранее криосохраненной клеточной линии плюс 28 мл кондиционированной среды субкультивируют в 80 мл GN6 жидкой среды (N6 среда (Chu et al. (1975), Scientia Sin 18:659-668), 2,0 мг/л, 2,4-D, 30 г/л сахарозы, рН 5,8) в колбе Эрленмейера объемом 500 мл и помещают на шейкер при скорости 125 об/мин при температуре 28°C. Этот шаг повторяют 2 раза, используя те же клеточные линии, так, что в общей сложности 36 мл ОГМ распределяют в 3 колбах. Через 24 ч жидкую среду GN6 удаляют и заменяют на 72 мл GN6 S/M осмотической среды (N6 среда, 2,0 мг/л 2,4-D, 30 г/л сахарозы, 45,5 г/л сорбита, 45,5 г/л маннита, 100 мг/л миоинозита, уровень рН 6,0). Колбу инкубируют в темноте в течение 30-35 мин при температуре 28°C с умеренной скоростью перемешивания (125 об/мин). Во время инкубации 50 мг/мл суспензии нитевидных кристаллов карбида кремния (Advanced Composite Materials, LLC, Greer, SC) получают путем добавления 8,1 мл GN6 S/M жидкой среды к 405 мг стерильных нитевидных кристаллов карбида кремния.
После инкубирования в GN6 S/M осмотической среде содержимое каждой колбы собирают в центрифужный сосуд объемом 250 мл. После того как все клетки в колбе оседают на дно избыточное объемное содержание, приблизительно равное 14 мл GN6 S/M жидкости, отбирают и собирают в стерильную колбу объемом 1 л для дальнейшего использования. Предварительно увлажненную суспензию нитевидных кристаллов смешивают на максимальной скорости на вихревой мешалке в течение 60 с, а затем добавляют в центрифужный сосуд.
В этом примере 170 мкг очищенного фрагмента из ДНК плазмиды pDAB105908 добавляют в каждый сосуд. После того как была добавлена ДНК, сосуд немедленно помещают в модифицированный коммерческий смеситель для красок Red Devil 5400 (Red Devil Equipment Co., Plymouth, MN) и перемешивают в течение 10 с. После перемешивания коктейль клеток, среду, нитевидные кристаллы и ДНК добавляют к содержимому колбы объемом 1 л вместе со 125 мл свежей жидкой среды GN6 для снижения осмотичности. Клеткам предоставляют возможность восстановления на шейкере при скорости 125 об/мин в течение 2 ч. 6 мл диспергированной суспензии фильтруют на фильтровальной бумаге Whatman № 4 (5,5 см), используя стеклянное устройство, собирающее клетки, связанное с собственной вакуумной линией, так, что получают 60 фильтров на сосуд. Фильтры размещают на планшетах 60x20 мм с твердой средой GN6 (такой же, как жидкая среда GN6, за исключением 2,5 г/л гелеобразователя Gelrite) и культивируют при температуре 28°C в темноте в течение 1 недели.
Пример 2.2. Идентификация и изоляция предполагаемых трансгенных событий.
Через одну неделю после доставки ДНК фильтровальную бумагу переносят на планшеты 60x20 мм с селективной средой GN6 (1H) (N6 среда, 2,0 мг/л 2,4-D, 30 г/л сахарозы, 100 мг/л миоинозита, 2,5 г/л Gelrite, уровень рН 5,8), содержащий селективное вещество. Эти селективные планшеты инкубируют при температуре 28°C в течение одной недели в темноте. После одной недели селекции в темноте ткань вкладывают в свежую среду при помощи соскоба половины клеток из каждого планшета в пробирку, содержащую 3,0 мл агарозной среды GN6, которая сохраняется при температуре 37-38°C (N6 среда, 2,0 мг/л 2,4 -D, 30 г/л сахарозы, 100 мг/л миоинозита, 7 г/л SeaPlaque агарозы, уровень рН 5,8, автоклавированная всего лишь на протяжении 10 мин при температуре 121°C). Смесь агароза/ткань разбивают с помощью шпателя, а затем 3 мл смеси агароза/ткань равномерно выливают на поверхность 100x15 мм чашки Петри, содержащей среду GN6 (1H). Этот процесс повторяется для обеих половин каждого планшета. После того как все ткани залиты планшеты индивидуально запечатывают с NESCOFILM® или PARAFILM М® и культивируют при температуре 28°C в темных условиях в течение периода времени до 10 недель.
Предположительно трансформированные изоляты, которые растут в этих селекционных условиях, удаляют из залитых планшетов и переносят в свежую селективную среду на планшеты 60x20 мм. Если устойчивый рост становится очевидным после приблизительно 2 недель, событие считается устойчивым к применяемым гербицидам (селективный агент), и аликвоту клеток впоследствии собирают для анализа генотипа.
Пример 2.3. Экстракция геномной ДНК.
Геномную ДНК (гДНК) извлекают из изолированных клеток кукурузы, как описано в примере 2.2, и используют в качестве шаблона для экспериментов ПЦР-генотипирования. гДНК извлекают приблизительно из 100-300 мкл объёма глобулярной массы (ОГМ) Hi-II каллюса, который был изолирован, как описано выше, в соответствии с протоколами производителей, которые подробно описаны в наборе DNeasy 96 Plant Kit (QIAGEN Inc., Valencia, CA). Геномную ДНК элюируют в 100 мкл поставляемого в наборе элюирующего буфера, что дает окончательную концентрацию 20-200 нг/мкл, а затем анализируют с помощью способов генотипирования на основе ПЦР, описанных ниже.
- 25 031322
Пример 2.4. Молекулярный анализ числа копий.
Анализы TAQMAN® проводят для скрининга образцов устойчивого к гербицидам каллюса для выявления тех, которые содержат единственную копию интеграции pDAB 105908 трансгена. Детальный анализ проводят с использованием праймеров и зондов, специфичных для кассет экспрессии генов. События одной копии идентифицируют для дополнительного анализа.
Пользовательские анализы TAQMAN® были разработаны для анализа ФАТ гена в Hi-II каллюсе при помощи Third Wave Technologies (Madison, WI). Образцы геномной ДНК вначале денатурируют в формате 96-луночного планшета путем инкубации при температуре 95°C, а затем охлаждают до комнатной температуры. Далее эталонную смесь (содержащую зондовую смесь для ФАТ и внутренний эталонный ген в дополнение к буферу) добавляют в каждую лунку и образцы покрывают минеральным маслом. Планшеты опечатывают и инкубируют в термоциклере BioRad TETRAD®. Планшеты охлаждают до комнатной температуры, прежде чем считывать на флуоресцентном планшетном ридере. Все планшеты содержали 1 копию, 2 копии и 4 копии стандартов, а также контрольные образцы дикого типа и контрольные лунки, не содержащие образцы. Результаты считывания собирали и сравнивали, во сколько раз они отличались от нуля (т.е. от исходных данных) для каждого канала определяли для каждого образца при помощи деления показателя образца исходного сигнала на показатель отсутствия шаблонного исходного сигнала.
Из этих данных строят стандартную кривую, которая наилучшим образом соответствует определенной при помощи анализа линейной регрессии. Используя параметры, определенные из этого соответствия, очевидное число копий ФАТ затем рассчитывается для каждого образца.
Пример 2.5. Дизайн праймера для ПЦР-генотипирования.
В этом примере ПЦР-генотипирование понимают как включающее, не ограничиваясь этим, полимеразную цепную реакцию (ПЦР) амплификации геномной ДНК, полученной из изолированных тканей каллюса кукурузы, прогнозировано содержащих донорную ДНК, встроенную в геном, с последующим стандартным клонированием и секвенированием продуктов ПЦР-амплификации. Способы ПЦРгенотипирования были хорошо описаны (например, в работе Rios, G. et al. (2002), Plant J. 32:243-253) и могут быть применены к геномной ДНК, полученной от любых видов растений или из любых типов ткани, включая клеточные культуры.
Специалист в данной области техники может разработать стратегии для ПЦР-генотипирования, которые включают (но не ограничиваются) амплификацию специфических последовательностей в геноме растения, амплификацию множественных специфических последовательностей в геноме растения, амплификацию неспецифических последовательностей в геноме растения или их комбинацию. За амплификацией может следовать клонирование и секвенирование, как описано в этом примере, или прямое секвенирование продуктов амплификации. Специалист в данной области техники может предвидеть альтернативные способы для анализа продуктов амплификации, сгенерированных здесь. В одном из вариантов воплощения, описанном здесь, в ПЦР-амплификации используются олигонуклеотидные праймеры, специфичные для гена-мишени.
В примерах, представленных здесь, синтезируют олигонуклеотидные праймеры, например, при помощи Integrated DNA Technologies, Inc. (Coralville, IA), в условиях стандартного обессоливания и разбавления водой до концентрации 100 мкМ. Олигонуклеотидные праймеры конструируют для отжига на фланговых областях ДНК-вставки. Праймеры тестируют с помощью разведения плазмиды ДНК в присутствии ДНК, изолированной из нетрансгенных растений. pDAB105908 трансгена амплифицируют ПНР из геномной ДНК предполагаемых событий с помощью праймеров. Полученный в результате фрагмент клонируют в плазмиду вектора и секвенируют, чтобы подтвердить, что мульти-eZFN последовательность сайта связывания была полностью интегрирована в геном растения в процессе трансформации.
Пример 2.6: Селекция трансгенных событий с целевой ДНК.
Проводят скрининг событий низких копий (1-2) при помощи ПНР для интактной мульти-eZFN последовательности сайта связывания и ФАТ гена. Количество копий подтверждают саузерн анализом с использованием стандартных способов с зондом ФАТ гена. Каллюс из выбранных трансгенных событий, скрывающий единственную копию, интактные вставки сохраняют для последующей оценки с временно экспрессированными eZFN.
Пример 3. eZFN ДНК-доставка в клетки растений.
Для того чтобы предоставить возможность eZFN-опосредованного двухцепочечного расщепления, понятно, что требуется доставка eZFN-кодирующей ДНК с последующей экспрессией функционального eZFN белка в растительную клетку. Специалист в данной области техники может предвидеть, что экспрессия функционального белка ZFN может быть достигнута несколькими способами, включая, но не ограничиваясь этим, трансгеноз ZFN-кодирующей конструкции или временную экспрессию ZFNкодирующей конструкции.
В примерах, приведенных здесь, описываются способы доставки eZFN-кодирующей ДНК в клетки растений. Специалист в данной области техники может использовать любой из различных способов доставки ДНК, подходящий для растительных клеток, в том числе, но не ограничиваясь этим,
- 26 031322
Agrobacterium-опосредованную трансформацию, доставку ДНК на основе баллистических способов или WHISKERS™-опосредованную ДНК-доставку. В одном из вариантов воплощения, описанных здесь, эксперименты баллистически-опосредованной ДНК-доставки проводились с использованием различных eZFN-кодирующих ДНК-конструкций.
Пример 3.1. Баллистически-опосредованная доставка ДНК.
Как описано выше, были произведены эмбриогенные Hi-II клеточные культуры кукурузы и они были использованы в качестве источника живых растений для оценивания eZFN функции. Специалист в данной области техники может предвидеть использование клеточных культур, полученных из различных видов растений или дифференцированных тканей растительного происхождения из различных видов растений, в качестве источника живых растительных клеток, в которых демонстрируется целевая интеграция.
Плазмиды, экспрессирующие одну из восьми eZFN, которая связывается со специфической целевой последовательностью на мульти-eZFN сайте связывания, вместе с внутренним контролем (IPK-1), подвергают бомбардировке в каллюсном пуле из 5-10 трансгенных изолятов.
События трансгенного Hi-II каллюса кукурузы субкультивируют еженедельно в среде GN6 (1Н). Через семь дней после культивирования приблизительно 400 мг клеток тонко распределяют в круге диаметром 2,5 см над центром чашки Петри 100x15 мм, содержащей среду GN6 S/M, отвержденную при помощи 2,5 г/л Gelrite. Клетки культивируют в темноте в течение 4 ч. Чтобы покрыть баллистические частицы ДНК, 3 мг золотых частиц диаметром 0,6 мкм промывают один раз 100% этанолом, дважды стерильной дистиллированной водой и ресуспендируют в 50 мкл воды в силиконовой пробирке типа Эппендорф. В общей сложности 5 мкг плазмидной ДНК, 20 мкл спермидина (0,1 М) и 50 мкл хлорида кальция (2,5 М) добавляют отдельно к суспензии золота и осторожно перемешивают на вихревой мешалке. Смесь инкубируют при комнатной температуре в течение 10 мин, осаждают при скорости 10000 об/мин в настольной микроцентрифуге в течение 10 с, ресуспендируют в 60 мкл холодного 100% этанола и 8-9 мкл распределяют на каждый макроноситель.
Бомбардировку выполняют с использованием системы Biolistic PDS-1000/НЕ™ (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA). Планшеты, содержащие клетки, помещают на среднюю полку в условиях Hg вакуума 1100 фунтов/кв.дюйм и 27 дюймов и подвергают бомбардировке в соответствии с оперативным руководством. Через 24 часа после бомбардировки ткани переносят небольшими группами в твердую среду GN6.
Пример 4. Секвенирование и анализ Solexa.
Пример 4.1. Подготовка образцов.
Через 72 ч после бомбардировки eZFN и контрольным IPK1-ZFN (Shukla et al. (1990), Nature 459, 437-441) ткани собирают в микроцентрифужные пробирки объемом 2 мл и лиофилизируют по меньшей мере в течение 48 ч. Геномную ДНК извлекают из лиофилизированной ткани с помощью набора для извлечения гДНК QIAGEN® в соответствии со спецификацией производителя. Наконец, ДНК ресуспендируют в 200 мкл воды и определяют концентрацию с помощью спектрофотометра Nanodrop (Thermo Scientific, Wilmington, DE). Целостность ДНК оценивают при помощи потока всех образцов через 0,8% агарозные Е-гели (Invitrogen, Carlsbad, CA). Все образцы нормализуют (25 нг/мкл) для ПЦРамплификации, чтобы генерировать ампликоны для Solexa секвенирования.
ПЦР-праймеры для амплификации областей, окружающих каждый из сайтов eZFN расщепления, а также IPK1-ZFN целевой сайт из целевых (ZFN-обработанных) и контрольных образцов были приобретены в компании IDT (Integrated DNA Technologies, San Jose, CA). Оптимальные условия для амплификации этих праймеров были идентифицированы при помощи градиентной ПЦР с использованием 0,2 мкМ соответствующих праймеров, Accuprime Pfx Supermix (1.1X, Invitrogen, Carlsbad, CA) и 100 нг шаблона геномной ДНК в 23,5 мкл реакции. Циклические параметры включают начальную денатурацию при температуре 95°C (5 мин) с последующими 35 циклами денатурации (95°C, 15 с), отжигом [55-72°C, 30 с], экстенсией (68°C, 1 мин) и окончательной экстенсией (72°C, 7 мин). Продукты амплификации анализируют на 3,5% ТАЕ агарозных гелях. После определения оптимальной температуры отжига проводят препаративные ПЦР-реакции для валидации каждого набора ПЦР-праймеров и для генерирования ампликона Solexa. Олигонуклеотиды, используемые для амплификации целевых областей eZFN кукурузы и табака приведены в табл. 3. IPK1 области нацеливания амплифицируют с использованием праймеров (SEQ ID NO: 27 GCAGTGCATGTTATGAGC (прямой праймер) и SEQ ID NO: 28 CAGGACATAAATGAACTGAATC (обратный праймер)).
- 27 031322
Таблица 3
Праймерные последовательности, используемые для амплификации сайтов расщепления eZFN
Название праймер а Seq ID NO: Последовательн ость Название праймера Seq ID NO: Последовательн ость
SP/AL:P R SEQ ID N0:29 GGCACAGAGT AAGAGGAAAA ASP/AL:P R SEQ ID N0:38 GCAGTGCTCT GTGGGGTC
SP/CL:A R SEQ ID N0:30 AGGGACCCAG GTATACATTT ASP/CL:A R SEQ ID N0:39 CCTGGACAGT TGTCAAAATT
SP/CL:P R SEQ ID N0:31 CATTCCGCCCT TGCCAGC ASP/CL:P R SEQ ID N0:40 GTGAACTTATT ATCCATCTGTC C
SP/CL:R R SEQ ID N0:33 GACAATGCCT GACTCCCG ASP/CL:R R SEQ ID N0:41 CACTCAGACA CCAGGGTTT
SP/PL:A R SEQ ID N0:34 CAAGGAATGA ATGAAACCG ASP/PL:A R SEQ ID N0:42 AGCCGGGAGA TGAGGAAG
SP/RL:A R SEQ ID NO: 35 CTGCAGGAGA CAGGTGCC ASP/RL:A R SEQ ID N0:43 CCTGGGCTGC TTCACAAC
SP/RL:C R SEQ ID N0:36 CAATCCCCAC CCAACACT ASP/RL:C R SEQ ID N0:44 AGGAGGGTGA TGGTGAGG
SP/RL:P R SEQ ID N0:37 CCTGGGGAG TAGCAGTGTT ASP/RL:P R SEQ ID N0:45 TGTGATTACTA CCCTGCCC
Для препаративной ПЦР 8 отдельных мелкомасштабных ПЦР-реакций выполняют для каждого шаблона с использованием условий, описанных выше, а продукты объединяют вместе и очищают гелем на 3,5% агарозном геле, используя набор для очистки гелем Qiagen MinElute™. Концентрации очищенных гелем ампликонов определяют с помощью спектрофотометра Nanodrop, а образцы Solexa готовят путем объединения приблизительно 100 нг ампликонов из eZFN целевых и соответствующих дикого типа контролен, а также нормализованных IPK-1 целевых и дикого типа контролен. Из eZFN+IPK-1 целевых образцов, IPK-1 целевого образца и дикого типа контролей получают и секвенируют четыре окончательных образца Solexa, содержащих ампликоны. Ампликоны клонируют в PCR-Blunt II-TOPO (Invitrogen) и предоставляют для секвенирования для валидации праймеров перед Solexa секвенированием.
Пример 4.2. Секвенирование и анализ Solexa.
Solexa секвенирование приводит к производству тысяч последовательностей.
Последовательности анализируют с использованием сценариев анализа DAS Next Generation Sequence (NGS). Последовательности низкого качества (последовательности с показателем качества отсечения <5) отфильтровывают. Затем последовательности выравнивают в соответствии с эталонной последовательностью и оценивают на инсерции/делеции (индели) на сайте расщепления ZFN, вызванные ZFN-опосредованным расщеплением и NHEJ-опосредованным восстановлением, которые часто вызывает индели, свидетельствующие об активности ZFN. Корректированную активность определяют по количеству делеций больше одной пары оснований в разрыве последовательности между сайтами связывания белков ZFN после вычитания фоновой активности. Активность для каждого eZFN в исследовании рассчитывают в сравнении с контролем и нормализованной с IPK-1 ZFN активностью. Нормализованную активность для каждого eZFN затем сравнивают с рядом eZFN, которые используются в исследовании. Активность также оценивают на уровне выравнивания последовательности (эталон по сравнению с продуктом Solexa) по наличию инделей на сайте расщепления eZFN.
Как продемонстрированно на фиг. 11, семь из восьми eZFN демонстрируют корректирующую активность в кукурузе.
Пример 5. Оценивание eZFN в табаке.
Пример 5.1. Стабильная интеграция последовательности сайта связывания мульти-eZFN.
Для того чтобы создать трансгенные растительные события с интегрированной копией последовательности сайта связывания мульти-eZFN, описанной выше, диски листьев (1 см2), вырезанные из растений табака сорта Petit Havana (например, событие 1585-10, содержащее ранее интегрированный ZFN-IL1 сайт связывания), стерильно выращенные на MS среде (Phytotechnology Labs, Shawnee Mission, KS) с 30 г/л сахарозой в PhytaTrays (Sigma, St. Louis, МО), флоатировали в течение ночи на культуре Agrobacterium LBA4404, содержащей плазмиду pDAB105900, выращенную до OD600~1,2, блоттировали сухой на
- 28 031322 стерильную фильтровальную бумагу и поместили на ту же среду с добавлением 1 мг/л индолилуксусной кислоты и 1 мг/л бензаминопуринов на чашки 60x20 мм (5 дисков на чашку). После 72 ч совместного культивирования диски листьев перенесли в ту же среду с 250 мг/л цефотаксима и 5 мг/л BASTA®. Через 3-4 недели всходы перенесли в среду MS с 250 мг/л цефотаксима и 10 мг/л BASTA® в PhytaTrays для дополнительных 2-3 недель до сбора листьев и молекулярного анализа.
Пример 5.2. Число копий и анализ ЕТР последовательности сайта связывания мульти-eZFN трансгенных событий.
ДНК-изоляция. Трансгенные ткани растения табак собирают из BASTA®-устойчивых всходов и лиофилизируют на протяжении по меньшей мере 2 дней в 96-луночных собирающих планшетах. Затем ДНК изолируют с использованием 96-луночного набора для экстракции DNEASY™ (Qiagen, Valencia, CA) в соответствии с инструкциями производителя. Для разрушения тканей используют измельчитель ткани модели 2-96 А Kleco (Garcia Manufacturing, Visalia CA).
Количественный анализ ДНК. Полученную в результате геномную ДНК подвергают количественному анализу с использованием набора для ДНК-анализа QUANT-IT® Pico Green (Molecular Probes, Invitrogen, Carlsbad, CA). Пять предварительно квалифицированных ДНК-стандартов в диапазоне от 20 до 1,25 нг/мкл (серийно разведенных) используют для генерирования стандартной кривой. Неизвестные образцы сначала разводят до разведений 1:10 или 1:20, чтобы они находились в пределах линейного диапазона анализа. Смешивают 5 мкл разведенных образцов и стандартов со 100 мкл разведенного субстрата Pico Green (1:200) и инкубируют в течение 10 мин в темноте. Флуоресценцию регистрируют с помощью ридера-планшетов Synergy2 (Biotek, Winooski, VT). Концентрацию геномной ДНК оценивают по расчетам из стандартной кривой после коррекций фоновой флуоресценции. Затем ДНК разбавляют с использованием ТЕ или воды до общей концентрации, равной 10 нг/мкл, с использованием автоматизированного жидкостного манипулятора Biorobot3000 (Qiagen).
Оценивание числа копий. Предполагаемые трансгенные события анализируют на предмет сложности интеграции с использованием мультиплексных анализов гидролиза ДНК-зонда, аналогичных анализам TAQMAN®. Количество копий мультисайтовой конструкции оценивают с помощью последовательность-специфических праймеров и зондов как для трансгенной ФАТ, так и для эндогенного эталонного гена табака, PAL. Анализы для обоих генов разрабатывают с использованием программного обеспечения LightCycler® Probe Design Software 2.0. ПЦР в реальном времени для обоих генов оценивают с помощью системы LightCycler®480 (Roche Applied Science, Indianapolis, IN). Для амплификации готовят эталонную смесь зондов LightCycler®480 Probes Master в 1X конечной концентрации в 10 мкл объема мультиплексной реакции, содержащей 0,4 мкМ каждого праймера и 0,2 мкМ каждого зонда (табл. 4). Два этапа реакции амплификации осуществляются с экстенсией при температуре 58°C в течение 38 с и приобретением флуоресценции. Все образцы проводят в трех экземплярах и для анализа каждого образца используют усредненные значения Ct. Анализ данных ПЦР в реальном времени проводят с использованием программного обеспечения LIGHTCYCLER® с использованием относительного квантового модуля и на основе ЛЛО-снособа. Для этого включают образец гДНК из калибратора одной копии с целью нормализации результата. Событие калибратора одной копии идентифицируют при помощи саузерн анализа и подтверждают наличием одной вставки ФАТ гена.
Таблица 4 Праймеры и зонды, используемые в анализах гидролиза зонда ФАТ и PAL
Название Последовательность (5'—3') Тип Зонд
TQPATS (SEQ ID N0:9) ACAAGAGTGGATTGATGATCTAGAGAGGT Праймер NA
TQPATA (SEQ ID N0:10) CTTTGATGCCTATGTGACACGTAAACAGT Праймер NA
TQPATFQ (SEQ ID NO: И) CY5-GGTGTTGTGGCTGGTATTGCTTACGCTGGBHQ2 Зонд Су5
TQPALS (SEQ ID NO: 12) TACTATGACTTGATGTTGTGTGGTGACTGA Праймер NA
TQPALA (SEQ ID N0:13) GAGCGGTCTAAATTCCGACCCTTATTTC Праймер NA
TQPALFQ (SEQ ID NO: 14) 6FAMAAACGATGGCAGGAGTGCCCTTTTTCTATCAATBHQ1 Зонд 6FAM
ПЦР. Впоследствии проводят скрининг событий низких копий (1-2) при помощи ПЦР для интактной единицы транскрипции растения (ЕТР) для ФАТ гена и интактного мульти-eZFN сайта связывания.
- 29 031322
Пример 6. Тестирование eZFN-расщепления на последовательности сайта связывания мульти-eZFN.
Для тестирования способности eZFN облегчать целевое расщепление в интегрированной последовательности сайта связывания мульти-eZFN используют анализ переходных процессов на основе переходной экспрессии eZFN-конструкций с помощью совместного культивирования Agrobacterium и дисков табачного листа. Диски листьев (1 см2), вырезанные из трансгенных событий, содержащие одну копию полной длины последовательности сайта связывания мульти-eZFN-содержащей конструкции (а также одну копию полной длины ZFN-IL1 -конструкции), флоатируют в течение ночи на культуре Agrobacterium, выращенной до OD600~1,2, блоттируют сухой на стерильную фильтровальную бумагу и затем помещают на ту же среду с добавлением 1 мг/л индолилуксусной кислоты и 1 мг/л бензаминопуринов. Для каждого тестируемого eZFN используют три вида обработки - pDAB1601 (отрицательный контроль только ФАТ), только pDAB4346 (положительный контроль - ZFN-IL1 только) и pDAB4346+pDABeZFNX (ZFN-IL1+eZFN, подлежащий тестированию) - с двадцатью дисками листьев для обработки.
Пример 6.1. Секвенирование.
Геномную ДНК изолируют из обработанных Agrobacterium трансгенных дисков из листьев табака, используя набор для экстракции ДНК Qiagen. Все процедуры обработки выполняют в двух экземплярах, а геномную ДНК из всех образцов ресуспендируют в 100 мкл воды и определяют концентрацию с помощью спектрофотометра Nanodrop. Равные количества геномной ДНК из каждого повтора для индивидуальной обработки объединяют вместе и используют в качестве исходного шаблона для генерации Solexa ампликона.
ПЦР-праймеры для амплификации областей, охватывающие последовательности сайта связывания мульти-eZFN и сайт расщепления целевых (eZFN-обработанных) и контрольных образцов, были приобретены в компании Integrated DNA Technologies (Coralville, IA) и очищены при помощи высокоэффективной жидкостной хроматографии ВЭЖХ. Оптимальные условия амплификации определяют при помощи градиентной ПНР с использованием 0,2 мкМ соответствующих праймеров, Accuprime Pfx Supermix (1.1x, Invitrogen, Carlsbad, CA) и 100 нг шаблонной геномной ДНК в 23,5 мкл реакции. Циклические параметры включают начальную денатурацию при температуре 95°C (5 мин) с последующими 35 циклами денатурации (95°C, 15 с), отжигом [55-72°C, 30 с], экстенсией (68°C, 1 мин) и окончательной экстенсией (72°C, 7 мин). Продукты амплификации анализируют на 3,5% ТАЕ агарозных гелях. После определения оптимальной температуры отжига (56,1°C) проводят препаративные ПЦР-реакции для валидации каждого набора ПЦР-праймеров и для генерирования ампликона Solexa. Для препаративной ПЦР 8 отдельных мелкомасштабных ПЦР-реакций выполняют для каждого шаблона с использованием условий, описанных выше, и продукты объединяют вместе и очищают гелем на 3,5% агарозном геле, используя набор для очистки гелем Qiagen MinElute™. Концентрации очищенных гелем ампликонов определяют с помощью спектрофотометра Nanodrop, а для получения конечного образца секвенирования Solexa (800 нг общего образца) объединяют приблизительно 200 нг каждого ампликона. Ампликоны также клонируют в PCR-Blunt II-TOPO и предоставляют для нормального секвенирования для валидации праймеров перед Solexa секвенированием. Проводят анализ Solexa (Shendure et al. (2008), Nat. Biotechnology, 26:1135-1145) и анализируют последовательности.
Пример 6.2. Секвенирование и анализ Solexa.
Проведение Solexa секвенирования приводит к производству тысяч последовательностей. Последовательности анализируют с использованием сценариев анализа DAS NGS. Последовательности низкого качества (последовательности с показателем качества отсечения <5) отфильтровывают. Затем последовательности выравнивают в соответствии с эталонной последовательностью (pDAB105900, содержащей мульти-eZFN сайт связывания) и оценивают на инсерции/делеции (индели) на сайте расщепления. Рассчитывают корректируемую активность (% NHEJ) для каждого eZFN и необработанных контролей (количество последовательностей высокого качества с инделями/общее число последовательностей высокого качества x 100), что продемонстрированно на фиг. 12 ниже. Активность 8-eZFN в двух трансгенных табачных событиях (105900/№ 33 и 105900/№ 45) продемонстрирована (фиг. 12). Три из восьми eZFN являются активными в двух протестированных трансгенных табачных событиях. Активность также оценивают на уровне выравнивания последовательности (эталонная в сравнении с продуктом solexa) по наличию инделей на сайте расщепления eZFN в eZFN-обработанных образцах.
Все комбинации ZFN мономеров (правые и левые) половины были активны в анализе дрожжей. Данные, описанные для экспериментов с кукурузой и табаком, демонстрируют, что некоторые или большинство из комбинаций являются активными у растений, подтверждая возможность использования значительного числа перестановок двух ZFN мономеров из четырех оригинальных ZFN, отобранных для исследования.
Пример 7. Внутриаллельная рекомбинация.
Внутриаллельная рекомбинация позволяет развитие и оптимизацию из двух независимых блоков трансгенов, которые затем могут быть сложены вместе в одном локусе при помощи рекомбинации. Для повышения уровня рекомбинации между двумя блоками двухцепочечное расщепление инициирует ДНКобмен при помощи генной конверсии или хроматидного обмена.
- 30 031322
Для того чтобы продемонстрировать эту концепцию у растений, трансгенные вставки, продемонстрированные на фиг. 13, сделаны в Arabidopsis thaliana. Конструкции включают блоки генов, которые содержат селективный маркер (неомицин фосфотрансфераза (НФТ II) или гигромицин фосфотрансфераза (ГФТ) и поддающийся оценке маркер (β-глюкуронидаза (ГУО) или белок с желтой флуоресценцией (ЖФБ)). Эти блоки генов находятся в идентичных месторасположениях генома, но смещены относительно друг друга приблизительно на 2 кб. Рекомбинация между двумя блоками осуществляется путем комбинации хромосом, несущих каждый из двух блоков в одном растении путем скрещивания, а затем - повторного скрещивания потомства растений, экспрессирующих ZFN, которые расщепляют в центральном месторасположении между двумя блоками (черная планка над СМИ на фиг. 13). ZFN экспрессируются с помощью мейоза специфического/предпочтительного промотора. Последовательности посадочной площадки, которые используются, включают те, которые описаны в заявке на патент США № 61/297641, которая включена в настоящий документ в качестве ссылки. Для создания независимых блоков на одинаковом месте генома была сделана конструкция, включающая оба блока в смежном расположении (фиг. 14). Чтобы создать растения, которые несут только независимые блоки, каждый блок вырезают в отдельных гибридах с использованием ZFN, предназначенных для вырезания ДНК на обеих сторонах от соответствующего блока в соответствующем ZFN сайте связывания (красные и синие полосы). Фиг. 15 демонстрирует, что блоки вырезают, создавая вставки единого блока, после скрещивания с соответствующими линиями (Арабидопсис, экспрессирующий ZFN). Эти линии несут ген ФАТ как селективный маркер. Восстановление растений с ожидаемыми фенотипами (ГигР+, КанР-, ФАТ+, ЖФБ+ или КанР+, ГигР-, ФАТ+, ГУО+) подтверждено через скрининг фенотипа (резистентность к гербицидам для ГигР, КанР и ФАТ генов или подлежащая оценке экспрессия маркерного гена ГУО и ЖФБ) или при помощи молекулярного анализа, такого как ПНР и Саузерн. Растения, несущие один из двух различных блоков, скрещивают для генерирования потомства ГигР+, КанР+, ФАТ-, ГУО+, ЖФБ+.
После молекулярной характеристики полученных в результате растений растения с подтвержденным вставками скрещивают с линиями, которые экспрессируют ZFN, сайт связывания которого находится между двумя блоками, с помощью мейоз-специфического промотора для осуществления обмена ДНК. Это приводит к укладыванию двух блоков вместе в одном месте ДНК. Окончательно сложенные гены растений несут ГигР+, КанР+, ГУО+, ЖФБ+ конфигурацию в качестве единого разделяющего локуса. Кроме того, растения, содержащие один из блоков, скрещивают с одним из двух мономеров, содержащих мейозный промотор/ZFN конструкции, получают гомозиготные растения для двух вставок, а затем скрещивают вместе.
Пример 7.1. ДНК-конструкция.
Стратегии клонирования, развернутые для строительства ZFN-конструкций, были, по сути, описаны в патентных публикациях США № 2009/0111188А1 и 2010/0199389. Фиг. 9 изображает типичную кассету экспрессии eZFN. ZFN-кодирующие последовательности экспрессируются с помощью ZmUbi1 промотора (промотор, 5' нетранслируемая область (UTR) и интрон, полученный из гена убиквитин 1 (уби-1) Zea mays; Christensen et al. (1992), Plant Molec. Biol. 18(4), 675-89). Впоследствии их клонировали в бинарный вектор назначения GATEWAY™, содержащий промотор риса актин 1, стимулирующий экспрессию ФАТ гена. Полученные в результате плазмиды pDAB105951 (ZFN1, CL:AR), 105954 (ZFN8, RL:AR), 105952 (ZFN3, AL:PR), 105953 (ZFN6, CL:RR), обозначенные как конструкции эксцизор блока 1 (eZFN1, 8) или эксцизор блока 2 (eZFN3, 6), соответственно, переносят в штамм Agrobacterium DA2552recA. Штамм Agrobacterium DA2552 был сделан компетентным для электропорации при помощи изготовления стартовой культуры путем посева штамма DA2552 из исходного раствора глицерина в 10 мл среды YEP, содержащей спектиномицин (спек) (100 мкг/мл) и эритромицин (эри) (150 мкг/мл). Инкубируют 10 мл культуры в течение ночи при температуре 28°C при 200 об/мин. 5 мл стартовой культуры используют для инокуляции 500 мл YEP с соответствующими антибиотиками в соответствующим образом промаркированную колбу Эрленмейера объемом 1,5 л. Культуру инкубируют в течение ночи при температуре 28°C при скорости 200 об/мин. После инкубации в течение ночи культуру охлаждают, поместив ее на влажную ледяную баню и нежно вращая. Клетки хранят при температуре 4°C в течение всех последующих шагов. Клетки осаждают центрифугированием при 4000xg в течение 10 мин при температуре 4°C в стерильных промаркированных центрифужных сосудах в предварительно охлажденном роторе. Супернатант сливают и удаляют, затем добавляют от 5 до 10 мл ледяной стерильной бидистиллированной воды, а клетки набирают и мягко пипетируют вверх и вниз до тех пор, пока не исчезнут скопления. Объем суспензии доводят приблизительно до 500 мл ледяной стерильной бидистиллированной водой. Клетки осаждают центрифугированием при 4000xg в течение 10 мин при температуре 4°C в предварительно охлажденном роторе. Супернатант удаляют и добавляют от 5 до 10 мл ледяной стерильной бидистиллированной воды, затем используют стерильную пипетку с широким отверстием для мягкого пипетирования клеток вверх и вниз, до тех пор, пока не исчезнут скопления. Объем суспензии доводят приблизительно до 250 мл ледяной стерильной бидистиллированной водой, а клетки снова осаждают центрифугированием при 4000χγ в течение 10 мин при температуре 4°C в предварительно охлажденном роторе. Супернатант удаляют и добавляют от 5 до 10 мл ледяной стерильной бидистиллированной воды, осадок осто
- 31 031322 рожно ресуспендируют и конечный объем доводят до 50 мл ледяной стерильной бидистиллированной водой. Клетки осаждают центрифугированием при 4000xg в течение 10 мин. при температуре 4°C в предварительно охлажденном роторе. Клетки вновь ресуспендируют в конечном объеме 5 мл 10% (об./об.) ледяного стерильного глицерина. Клетки распределяют в аликвотах 50 мкл в стерильные микроцентрифужные пробирки объемом 0,5 мл и замораживают в жидком азоте.
мкл компетентных клеток DA2552 подвергают электропорации с 50 нг плазмидной ДНК с использованием системы электропорации GENE PULSER® XCELL® (BioRad Hercules, CA) в соответствии с заданными производителями настройками и протоколами для электропорации Agrobacterium. Клетки восстанавливают в течение 2 ч в SOC при температуре 28°C, а затем покрывают YEP спек/эри агарные планшеты и выращивают в течение 48 ч при температуре 28°C.
Пример 7.2. Конструкция локуса обмена.
ДНК-конструкцию локуса обмена готовят из GATEWAY™ векторов, включающих вектор 1: AtAct2 промотор (AtAct2 промотор v2 (промотор, 5' нетранслируемая область и интрон из гена актина Arabidopsis thaliana (ACT2)); An et al. (1996), Plant J. 10, 107-121))/GUS (Jefferson, (1987), EMBO J. 6, 3901-3907)/AtuORF23 3'UTR (3' нетранслируемая область (UTR), содержащая терминатор транскрипции и сайт полиаденилирования открытой рамки считывания 23 (ORF23) Agrobacterium tumefaciens pTi15955; Barker et al., (1983), Plant Molec. Biol. 2(6):335-50):: AtAct2 промотор/НФТП (Bevan et al. (1983), Nature 304, 184-187)/AtuORF23 3' UTR, окруженный eZFN 1 и 8; вектор 2: синтетическая 2 кб область с eZFN 4 и 7 в центре последовательности и вектор 3: CsVMV промотор/ГФТ (Kaster et al. (1983), Nucleic Acids Res. 11(19), 6895-6911 (1983))/AtuORF23 3' UTR::AtUbi10 промотор (промотор, 5' нетранслируемая область и интрон из гена полиубиквитин 10 (UBQ10) Arabidopsis thaliana); Norris et al. (1993), Plant Molecular Biology 21(5):895-906)/PhiYFP (Shagin et al., (2004), Molecular Biol. Evol. 21:841-850)/AtuORF23 3' UTR, окруженный eZFN 3 и 6. Вектор назначения готовят при помощи вставки двух 1 кб рандомизированных синтетических последовательностей ДНК в остов бинарного вектора Agrobacterium, с сайтами рестрикции, включенными между ними для того, чтобы клонировать GATEWAY™ ccdB кассету негативного селективного маркера. Векторы входа клонируют в вектор назначения при помощи реакции LR Clonase. Полученный в результате вектор pDAB100646 (фиг. 16) переносят в Agrobacterium, как описано выше.
Пример 7.3. Трансформация Арабидопсиса.
Все трансформации в Арабидопсисе были выполнены согласно способам, описанным в работе Clough & Bent (1998, Plant J., 16, 735-743).
Эксцизорные линии.
Конструкции эксцизорной линии обладают геном фосфинотрицин ацетилтрансфераза (ФАТ), который передает резистентность к глюфосинату. Через семь, десять и тринадцать дней после посадки растения T1 опрыскивают раствором гербицида Liberty в концентрации 284 мг/л (200 г активного ингредиента на 1 л (г аи/л) глюфосината, Bayer Crop Sciences, Kansas City, МО) в объеме распылителя, равном 10 мл/лоток (703 л/га) с помощью наконечника-распылителя со сжатым воздухом DeVilbiss, чтобы доставить эффективный уровень 200 г аи/га глюфосината на аппликацию. Выжившие (активно растущие растения) определяют через 4-7 дней после окончательного распыления и пересаживают в индивидуальные 3-дюймовые горшки, подготовленные с грунтовой средой (Metro Mix 360).
Экспрессию eZFN в эксцизорных событиях определяют при помощи обратной транскриптазы ПЦР (ОТ ПЦР), а число копий определяют при помощи кПЦР, как описано здесь для ФАТ гена, и подтверждают саузерн анализом. Три события низких копий экспрессии ZFN на высоком уровне перекрещиваются с событиями локуса обмена.
Линии локуса обмена.
Линии локуса обмена производят в Арабидопсисе следующими способами, описанными в работе Clough & Bent (1998, Plant J., 16, 735-743), включая селекцию на среде, содержащей гигромицин или канамицин.
Пример 7.4. Скрещивание Арабидопсиса и восстановление потомства.
Скрещивание событий локуса обмена с двумя наборами эксцизорных линий блока 1 и блока 2 выполняют с использованием стандартных способов. Семена от гибридов выращивают на гигромицине (делеция блока 1) и канамицине (делеция блока 2) и резистентные растения анализируют на экспрессию ГУО (делеция блока 1) или экспрессию ЖФБ (делеция блока 2). Активность ГУО определяют с помощью гистохимического анализа (Jefferson et al. (1987), Plant Mol. Biol. Rep 5, 387-405), а активность ЖФБ - с помощью флуоресцентной микроскопии. Растения с заданными фенотипами (блок 1 положительные: ГУО+, НФТ+, ГФТ-, ЖФБ-, блок 2 положительные: ГУО-, НФТ-, ГФТ+, ЖФБ+) анализируют способом ПЦР и саузерн, чтобы подтвердить желаемую конфигурацию генов. Листья от выбранных растений окрашивают биалафос-растворами для оценки, какие из них являются ФАТ+.
Растения, содержащие кассеты генов блок 1 и блок 2, скрещивают и выбирают потомство на гигромициновых/канамициновых планшетах. ГигР/КанР растения анализируют на наличие всех генов с помощью ПЦР и скрининга фенотипа. F1 растения с желаемым фенотипом выращивают и скрещивают с
- 32 031322 растениями с промотором мейоза/ZFN для достижения рекомбинации между блоком 1 и блоком 2. Полученное в результате потомство выращивают на гигромициновых/канамициновых планшетах. Растения, выжившие во время селекции, проверяются на ГУО и ЖФБ. Подтверждение и характеристика рекомбинантов выполняют с помощью ПЦР, саузерн анализов, секвенирования и анализов сегрегации.
Пример 8. Укладывание гена в eZFN сайтах.
Стратегии, продемонстрированные на фиг. 1, 2, 4- 6, могут быть выполнены с применением следующих способов.
Дизайн конструкций.
Различные комбинации сайтов гетеродимерных eZFN могут быть собраны как конкатемер в плазмидный вектор, подходящий для трансформации растения. Фиг. 1, 2 и 4 иллюстрируют различные варианты гетеродимерных eZFN сайтов, которые могут быть включены в вектор и трансформированы в хромосомы растения.
WHISKERS™ трансформация.
Эмбриогенные клеточные культуры кукурузы Hi-II, произведенные, как описано в патенте США № 7179902, используются в качестве источника живых растительных клеток, на которых продемонстрирована целевая интеграция. ДНК-фрагменты, содержащие сайты гетеродимерной eZFN, связанные с кассетой растительного селективного маркера, используются для генерирования трансгенных событий. Трансгенные события являются изолированными и охарактеризованными. 12 мл объёма глобулярной массы (ОГМ) из ранее криосохраненной клеточной линии плюс 28 мл кондиционированной среды субкультивируют в 80 мл жидкой среды GN6 (N6 среда (Chu et al. (1975) Sci Sin 18:659-668), 2,0 мг/л, 2,4-D, 30 г/л сахарозы, уровень рН 5,8) в колбе Эрленмейера объемом 500 мл и помещают на шейкер при скорости 125 об/мин и при температуре 28°C. Этот шаг повторяют дважды, используя ту же клеточную линию, так, что в общей сложности 36 мл ОГМ распределяют в 3 колбах.
Через 24 ч жидкую среду GN6 удаляют и заменяют на 72 мл осмотической среды GN6 S/M (N6 среда, 2,0 мг/л 2,4-D, 30 г/л сахарозы, 45,5 г/л сорбита, 45,5 г/л маннита, 100 мг/л миоинозита, рН 6,0). Колбу инкубируют в темноте в течение 30-35 мин при температуре 28°C с умеренной скоростью перемешивания (125 об/мин). Во время инкубации 50 мг/мл суспензии нитевидных кристаллов карбида кремния (Advanced Composite Materials, LLC, Greer, SC) получают путем добавления 8,1 мл жидкой среды GN6 S/M к 405 мг стерильных нитевидных кристаллов карбида кремния. После инкубирования в осмотической среде GN6 S/M содержимое каждой колбы собирают в центрифужный сосуд объемом 250 мл. После того как все клетки в колбе оседают на дно избыточное объемное содержание, приблизительно равное 14 мл GN6 S/M жидкости, отбирают и собирают в стерильную колбу объемом 1 л для дальнейшего использования. Предварительно увлажненную суспензию нитевидных кристаллов смешивают на максимальной скорости на вихревой мешалке в течение 60 с, а затем добавляют в центрифужный сосуд.
Аликвоту 85 мкг очищенного ДНК-фрагмента добавляют в каждый сосуд.
После того как была добавлена ДНК, сосуд немедленно помещают в модифицированный коммерческий смеситель для красок Red Devil 5400 (Red Devil Equipment Co., Plymouth, MN) и перемешивают в течение 10 с. После перемешивания коктейль клеток, среду, нитевидные кристаллы и ДНК добавляют к содержимому колбы объемом 1 л вместе со 125 мл свежей жидкой среды GN6 для снижения осмотичности. Клеткам предоставляют возможность восстановления на шейкере при скорости 125 об/мин в течение 2 ч. Фильтруют 6 мл диспергированной суспензии на фильтровальной бумаге Whatman № 4 (5,5 см), используя стеклянное устройство, собирающее клетки, связанное с собственной вакуумной линией, так, что получают 60 фильтров на сосуд. Фильтры размещают на планшетах 60x20 мм твердой среды GN6 (такая же, как GN6 жидкая среда, за исключением 2,5 г/л гелеобразователя Gelrite) и культивируют при температуре 28°C в темноте в течение 1 недели.
Идентификация и изоляция предполагаемых целевых интеграционных трансгенных событий.
Через одну неделю после доставки ДНК фильтровальную бумагу переносят на планшеты 60x20 мм с селективной средой GN6 (1H) (N6 среда, 2,0 мг/л 2,4-D, 30 г/л сахарозы, 100 мг/л миоинозита, 2,5 г/л Gelrite, pH 5,8), содержащие селективное вещество. Эти селективные планшеты инкубируют при температуре 28°C в течение одной недели в темноте. После 1 недели селекции в темноте ткань вкладывают в свежую среду при помощи соскоба '/2 клеток из каждого планшета в пробирку, содержащую 3,0 мл GN6 агарозной среды, которая сохраняется при температуре 37-38°C (N6 среда, 2,0 мг/л 2,4-D, 30 г/л сахарозы, 100 мг/л миоинозита, 7 г/л SeaPlaque® агарозы, рН 5,8, автоклавированная на протяжении 10 мин при температуре 121°C).
Смесь агароза/ткань разбивают с помощью шпателя, а затем 3 мл смеси агароза/ткань равномерно выливают на поверхность 100x25 мм чашки, содержащей GN6 (1H) среду. Этот процесс повторяется для обеих половин каждого планшета. После того как все ткани залиты планшеты культивируют при температуре 28°C в темных условиях в течение периода времени до 10 недель. Предположительно трансформированные изоляты, которые растут в этих селекционных условиях, удаляют из залитых планшетов и переносят на свежую селективную среду на планшеты 60x20 мм. Если устойчивый рост становится очевидным после приблизительно 2 недель, событие считается резистентным к применяемым гербицидам
- 33 031322 (селективный агент), и аликвоту клеток впоследствии собирают для анализа генотипа. Стабильная растительная трансформация производит единственный экземпляр интегрантов, которые используются для экспериментов стекинга.
Молекулярная характеристика событий.
Геномную ДНК (гДНК) извлекают из изолированных клеток кукурузы, описывают и используют в качестве шаблона для экспериментов ПЦР-генотипирования. Извлекают гДНК приблизительно из 100300 мкл объёма глобулярной массы (ОГМ) Hi-II каллюса, который изолирован в соответствии с протоколами производителей, подробно описанными в наборе DNEASY® 96 Plant Kit (QIAGEN Inc., Valencia, СА). Геномную ДНК элюируют в 100 мкл элюирующего буфера, поставляемого с набором, что дает окончательную концентрацию 20-200 нг/мкл, а затем анализируют с помощью основанных на ПЦР способах генотипирования.
Молекулярный анализ числа копий.
INVADER® или анализы гидролиза зонда выполняются для скрининга образцов резистентного к гербицидам каллюса для выявления тех образцов, которые содержат одну копию интеграции Т-цепочки ДНК. Детальный анализ проводят с использованием праймеров и зондов, специфических для кассет экспрессии генов. Идентифицируют события одной копии для дополнительных анализов. Пользовательские анализы INVADER® были разработаны для анализа селективного маркерного гена в Hi-II каллюсе при помощи Third Wave Technologies (Madison, WI). Геномные образцы амплифицируют с помощью набора для анализа INVADER®, результаты считывания собирают. Из этих считываний определяют, во сколько раз они отличаются от нуля (т. е. от исходных данных) для каждого канала определяют для каждого образца при помощи деления показателя образца исходного сигнала на показатель отсутствия шаблонного исходного сигнала. Из этих данных строят стандартную кривую, которая наилучшим образом соответствует определенной при помощи анализа линейной регрессии. Используя параметры, определенные из этого соответствия, затем рассчитывается очевидное число копий селективного маркера для каждого образца.
Селекция трансгенных событий с целевой ДНК.
Проводят скрининг событий низких копий (1-2 копий трансгена) при помощи ПЦР, как описано выше, для интактной единицы транскрипции растения (ЕТР), содержащей кассету селективного маркерного гена и интактный сайт eZFN. Число копий подтверждается саузерн анализом с использованием стандартных способов с селективным маркерным геном. Каллюс из выбранных трансгенных событий, скрывающий единственную копию, интактные вставки сохраняют.
Баллистически-опосредованная доставка ДНК в растительные клетки, содержащие eZFN.
Как описано выше, эмбриогенные Hi-II клеточные культуры кукурузы производят и используют в качестве источника живых растительных клеток, в которых продемонстрированы целевые интеграции. Эмбриогенные суспензии кукурузы субкультивируют в жидкой среде GN6 приблизительно на протяжении 24 ч до эксперимента, как описано выше. Избыток жидкой среды удаляют и приблизительно 0,4 мл
ОГМ клеток тонко распределяют в круге диаметром 2,5 см над центром чашки Петри 100x15 мм, содержащей среду GN6 S/M, отвержденную при помощи 2,5 г/л Gelrite. Клетки культивируют в темноте в течение 4 ч. Чтобы покрыть баллистические частицы ДНК, содержащей фрагменты донорной ДНК (блок 1 на фиг. 1, блок 2 на фиг. 2 или ген 1 на фиг. 4), 3 мг золотых частиц диаметром 1,0 мкм промывают один раз 100% этанолом, дважды стерильной дистиллированной водой и ресуспендируют в 50 мкл воды в силиконовой пробирке типа Эппендорф. В общей сложности 5 мкг плазмидной ДНК (содержащейся в одном векторе или в отдельных векторах молекул нуклеиновых кислот, кодирующих eZFN и фрагмент донорной ДНК), 20 мкл спермидина (0,1 М) и 50 мкл хлорида кальция (2,5 М) добавляют отдельно к суспензии золота и перемешивают на вихревой мешалке. Смесь инкубируют при комнатной температуре в течение 10 мин., осаждают при скорости 10000 об/мин в настольной микроцентрифуге в течение 10 с, ресуспендируют в 60 мкл холодного 100% этанола и 8-9 мкл распределяют на каждый макроноситель.
Бомбардировку выполняют с использованием системы Biolistic PDS-1000/НЕ™ (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA). Планшеты, содержащие клетки, помещают на среднюю полку в условиях Hg вакуума 1100 фунтов/кв. дюйм и 27 дюймов и подвергают бомбардировке в соответствии с оперативным руководством. Через 16 ч после бомбардировки ткани переносят небольшими группами в GN6 (1Н) среду и культивируют на протяжении 2-3 недель при температуре 28°C в темных условиях. Переносы продолжают каждые 2-4 недели до тех пор, пока не начинают появляться предполагаемые трансгенные изоляты в результате интеграции донорной ДНК. Биалафос-резистентные колонии, как правило, анализируют с помощью ПЦР и Саузерн-блоттинга с использованием способов, подробно описанных выше, для получения изолятов, содержащих целевые последовательности.
Скрининг для целевых интеграционных событий с помощью ПЦР-генотипирования ПЦР-реакции проводятся для исследования наличия интактной копии донорной ДНК. Дополнительные реакции фокусируют на 5'-границе между мишенью и донором и 3'-границе между донором и мишенью. Амплифицированные фрагменты вырезают из геля и очищают в соответствии со стандартными протоколами. Очи
- 34 031322 щенные фрагменты впоследствии клонируют в плазмиду pCR2.1 с использованием набора ТОРО ТА CLONING® (с вектором pCR2.1) и химически компетентных клеток Е. coli ONE SHOT® ТОР10 (Invitrogen Life Technologies, Carlsbad, СА) в соответствии с протоколом производителя.
Выбирают отдельные колонии и подтверждают, что они содержат амплифицированный ПЦРфрагмент. Реакции двухцепочечного секвенирования плазмидных клонов выполняют, чтобы подтвердить, что амплифицированная ПЦР геномная последовательность содержит интегрированный донор. Идентифицируют события, содержащие донорный фрагмент, представляющие мишень, в которой нацеливают управляемое гомологией восстановление ZFN-опосредованного двухцепочечного разрыва и целевую интеграцию донорной ДНК в специфических генах.
Специфическое применение генной укладки (стекинга) с использованием eZFN-сайтов.
Фиг. 1 демонстрирует вариации сайтов множественной инсерции из семи eZFN целевых сайтов, стабильно трансформированных в хромосому растения. Пары eZFN, которые связываются с целевыми сайтами, изображаются в виде геометрических фигур. Блок 1 представляет собой экзогенную полинуклеотидную последовательность, которая может быть интегрирована в сайт множественной инсерции соответствующей пары eZFN при трансформировании eZFN, предназначенной для расщепления специфического сайта eZFN. Совместная трансформация eZFN и блок 1 донорной ДНК-последовательности может быть достигнута с помощью способа баллистической трансформации, ранее описанного выше. Привязанность различных других сайтов eZFN поддерживают, когда eZFN, трансформированная в растигельную клетку, не расщепляет на этих других сайтах. Блок 1, который интегрируется в хромосомы растений с помощью гомологичной рекомбинации, приводит в результате к клеткам растений, которые содержат последовательность блока 1. Полученные в результате растительные клетки можно выращивать в зрелых растениях и проводить скрининг на наличие блока 1 с использованием способов аналитической молекулярной биологии, известных в данной области техники, таких как саузерн-блоттинг, Taqman анализ или Invader анализ. Фиг. 2 иллюстрирует другой вариант фиг. 1, в котором другой eZFN сайт связывания является мишенью полинуклеотидной донорной последовательности блок 2. В результате интеграция фрагмента ДНК производит стабильное растение, содержащее в хромосоме блок 2.
Фиг. 4 иллюстрирует использование левого и правого доменов eZFN. Верхняя линия отображает геном растения с трансформированными левым и правым eZFN доменами (заштрихованный треугольник и шахматный треугольник). Когда соответствующий eZFN добавлен в присутствии экзогенной молекулы, включающей ген 1 в окружении новых и различных гетеродимерных eZFN сайтов, ген 1 и окружающие eZFN сайты вводятся в геном. Результирующие прогены, которые содержат ген 1 и окружающие eZFN сайты, идентифицируют, и такие растения могут быть впоследствии перенацелены с использованием новых гетеродимерных eZFN сайтов, которые не были представлены в рамках родительского растения (например, eZFN сайты, содержащие заштрихованный треугольник и шахматный треугольник). Фиг. 5 и 6 иллюстрируют, как eZFN сайты могут быть использованы для укладки новых трансгенов в хромосомное местоположение. Кроме того, эта стратегия предоставляет возможность эксцизии других кассет экспрессии генов. В некоторых случаях кассета экспрессии генов может быть полностью удалена (фиг. 5), в других сценариях кассета экспрессии генов может быть удалена в определенном поколении растений и в конечном счете быть вновь введенной в потомство этих растений, что предоставляет возможность переработки кассеты экспрессии генов. Удаленная маркерная последовательность (фиг. 6) может быть повторно вставлена с помощью опосредованной гомологичной рекомбинации нацеливания гена, используя протокол, описанный выше. Нацеливание гена в гетеродимерных eZFN сайтах завершают с использованием протокола, описанного выше. В этом примере eZFN сайты связывания используются, чтобы предоставить возможность in planta удаление любых трансгенов, в том числе селективных маркерных генов, из трансформированного растения. См. предварительную заявку на патент США № 61/297628, поданную 22 января 2010 г., включенную в настоящий документ в качестве ссылки.
Все патенты, заявки на патенты и публикации, упомянутые здесь, включены, таким образом, в качестве ссылки во всей их полноте для всех целей.
Несмотря на то что раскрытие было предоставлено в некоторых деталях в качестве иллюстрации и примера для ясности понимания, для специалистов в данной области техники будет очевидно, что различные изменения и модификации могут быть осуществлены без отхода от сущности и объема настоящего изобретения. Соответственно, вышеприведенные описания и примеры не должны быть истолкованы как ограничивающие.
- 35 031322
ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ <110> DOW AGROSCIENCES LLC <120> КЛЕТКА ИЛИ КЛЕТОЧНАЯ ЛИНИЯ ДЛЯ ЭКСПРЕССИИ ЭКЗОГЕННЫХ НУКЛЕОТИДНЫХ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ И ПРИМЕНЕНИЕ КЛЕТКИ ИЛИ КЛЕТОЧНОЙ ЛИНИИ
<130> 8325-4007.40
<140> <141> PCT/US2011/000125 2011-01-24
<150> <151> 61/336,457 2010-01-22
<160> 75
<170> патентная версия 3.5
<210> <211> <212> <213> 1 34 ДНК Искусственная последовательность
<220> <223> описание искусственной последовательности: синтетический олигонуклеотид
<400> 1
gccttttgca gtttatccac tagggacagg attg 34
<210> <211> <212> <213> 2 37 ДНК Искусственная последовательность
<220> <223> описание искусственной последовательности: синтетический олигонуклеотид
<400> 2
aagactcccg cccatctctc tatgcccggg acaagtg 37 <210> 3 <211> 37 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> описание искусственной последовательности: синтетический олигонуклеотид <400> 3 ccaccccaca gtggggcctc tatgcccggg acaagtg 37 <210> 4 <211> 38 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность
- 36 031322 <220>
<223> описание искусственной последовательности: синтетический олигонуклеотид <400> 4 gagtccatgc tcaacaccgt gcactaggga caggattg <210> 5 <211> 40 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> описание искусственной последовательности:
синтетический олигонуклеотид <400> 5 gccttttgca gtttatctct agaaagactg gagttgcaga <210> 6 <211> 33 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> описание искусственной последовательности:
синтетический олигонуклеотид <400> 6 aagactcccg cccatccagg atgaggatga cca <210> 7 <211> 36 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> описание искусственной последовательности:
синтетический олигонуклеотид <400> 7 gccttttgca gtttatctct atgcccggga caagtg <210> 8 <211> 34 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> описание искусственной последовательности: синтетический олигонуклеотид <400> 8 aagactcccg cccatctcac tagggacagg attg 34 <210> 9 <211> 43 <212> ДНК
- 37 031322 <213> Искусственная последовательность <220>
<223> описание искусственной последовательности: синтетический олигонуклеотид <400> 9 gagtccatgc tcaacaccgt gctagaaaga ctggagttgc aga <210> 10 <211> 39 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> описание искусственной последовательности: синтетический олигонуклеотид <400> 10 ccaccccaca gtggggccta gaaagactgg agttgcaga <210> 11 <211> 33 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> описание искусственной последовательности: синтетический олигонуклеотид <400> 11 ccaccccaca gtggggcagg atgaggatga cca <210> 12 <211> 38 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> описание искусственной последовательности: синтетический олигонуклеотид <400> 12 gagtccatgc tcaacaccgt gcaggatgag gatgacca <210> 13 <211> 46 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> описание искусственной последовательности: синтетический олигонуклеотид <400> 13 tctgcaactc cagtctttct agatctagaa agactggagt tgcaga 46 <210> 14
- 38 031322 <211> 34 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> описание искусственной последовательности: синтетический олигонуклеотид <400> 14 aagactcccg cccatctaga tgggcgggag tctt <210> 15 <211> 40 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> описание искусственной последовательности: синтетический олигонуклеотид <400> 15 cacttgtccc gggcatagag ctctatgccc gggacaagtg <210> 16 <211> 42 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> описание искусственной последовательности: синтетический олигонуклеотид <400> 16 gagtccatgc tcaacaccgt gcacggtgtt gagcatggac tc <210> 17 <211> 33 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> описание искусственной последовательности: синтетический олигонуклеотид <400> 17 tggtcatcct catcctcagg atgaggatga cca <210> 18 <211> 33 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> описание искусственной последовательности: синтетический олигонуклеотид <400> 18 gccttttgca gtttatgata aactgcaaaa ggc 33
- 39 031322 <210> 19 <211> 34 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> описание искусственной последовательности: синтетический олигонуклеотид <400> 19 caatcctgtc cctagtgcac tagggacagg attg <210> 20 <211> 34 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> описание искусственной последовательности: синтетический олигонуклеотид <400> 20 ccaccccaca gtggggcgcc ccactgtggg gtgg <210> 21 <211> 29 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> описание искусственной последовательности: синтетический праймер <400> 21 acaagagtgg attgatgatc tagagaggt <210> 22 <211> 29 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> описание искусственной последовательности: синтетический праймер <400> 22 ctttgatgcc tatgtgacac gtaaacagt <210> 23 <211> 29 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> описание искусственной последовательности: синтетический зонд <400> 23
- 40 031322 ggtgttgtgg ctggtattgc ttacgctgg <210> 24 <211> 30 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> описание искусственной последовательности: синтетический праймер <400> 24 tactatgact tgatgttgtg tggtgactga <210> 25 <211> 28 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> описание искусственной последовательности: синтетический праймер <400> 25 gagcggtcta aattccgacc cttatttc <210> 26 <211> 33 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> описание искусственной последовательности: синтетический зонд <400> 26 aaacgatggc aggagtgccc tttttctatc aat <210> 27 <211> 18 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> описание искусственной последовательности: синтетический праймер <400> 27 gcagtgcatg ttatgagc <210> 28 <211> 22 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> описание искусственной последовательности: синтетический праймер
- 41 031322 <400> 28 caggacataa atgaactgaa tc <210> 29 <211> 20 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> описание искусственной последовательности: синтетический праймер <400> 29 ggcacagagt aagaggaaaa <210> 30 <211> 20 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> описание искусственной последовательности: синтетический праймер <400> 30 agggacccag gtatacattt <210> 31 <211> 18 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> описание искусственной последовательности: синтетический праймер <400> 31 cattccgccc ttgccagc <210> 32 <400> 32
000 <210> 33 <211> 18 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> описание искусственной последовательности: синтетический праймер <400> 33 gacaatgcct gactcccg 18
- 42 031322 <210> 34 <211> 19 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> описание искусственной праймер последовательности: синтетический
<400> 34
caaggaatga atgaaaccg 19
<210> 35
<211> 18
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> описание искусственной последовательности: синтетический
праймер
<400> 35
ctgcaggaga caggtgcc 18
<210> 36 <211> 18 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> описание искусственной последовательности: синтетический праймер <400> 36 caatccccac ccaacact <210> 37 <211> 19 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> описание искусственной последовательности: синтетический праймер <400> 37 cctggggagt agcagtgtt <210> 38 <211> 18 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> описание искусственной последовательности: синтетический праймер <400> 38 gcagtgctct gtggggtc 18
- 43 031322 <210> 39 <211> 20 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> описание искусственной последовательности: синтетический праймер <400> 39 cctggacagt tgtcaaaatt <210> 40 <211> 23 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> описание искусственной последовательности: синтетический праймер <400> 40 gtgaacttat tatccatctg tcc <210> 41 <211> 19 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> описание искусственной последовательности: синтетический праймер <400> 41 cactcagaca ccagggttt <210> 42 <211> 18 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> описание искусственной последовательности: синтетический праймер <400> 42 agccgggaga tgaggaag <210> 43 <211> 18 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> описание искусственной последовательности: синтетический праймер
- 44 031322 <400> 43 cctgggctgc ttcacaac <210> 44 <211> 18 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> описание искусственной последовательности: синтетический праймер <400> 44 aggagggtga tggtgagg <210> 45 <211> 19 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> описание искусственной последовательности: синтетический праймер <400> 45 tgtgattact accctgccc <210> 46 <211> 7 <212> белок <213> Искусственная последовательность <220>
<223> описание искусственной последовательности: синтетический пептид <400> 46
Asp Arg Ser Asn Leu Ser Arg
5 <210> 47 <211> 7 <212> белок <213> Искусственная последовательность <220>
<223> описание искусственной последовательности: синтетический пептид <400> 47
Arg Ser Asp Ala Leu Thr Gln
5 <210> 48 <211> 7 <212> белок <213> Искусственная последовательность
- 45 031322 <220>
<223> описание искусственной последовательности: пептид <400> 48
Thr Ser Gly Asn Leu Thr Arg
5 синтетический <210> 49 <211> 7 <212> белок <213> Искусственная последовательность <220>
<223> описание искусственной последовательности: пептид <400> 49
Thr Ser Gly Ser Leu Thr Arg
5 синтетический <210> 50 <211> 7 <212> белок <213> Искусственная последовательность <220>
<223> описание искусственной последовательности: пептид <400> 50
Thr Ser Gly His Leu Ser Arg
5 синтетический <210> 51 <211> 7 <212> белок <213> Искусственная последовательность <220>
<223> описание искусственной последовательности: пептид <400> 51
Arg Ser Ala Asn Leu Ser Val
5 синтетический <210> 52 <211> 7 <212> белок <213> Искусственная последовательность <220>
<223> описание искусственной последовательности: пептид <400> 52
Asp Arg Ala Asn Leu Ser Arg
5 синтетический
- 46 031322 синтетический <210> 53 <211> 7 <212> белок <213> Искусственная последовательность <220>
<223> описание искусственной последовательности: пептид <400> 53
Arg Ser Asp Asn Leu Arg Glu
5 <210> 54 <211> 7 <212> белок <213> Искусственная последовательность <220>
<223> описание искусственной последовательности: пептид <400> 54
Glu Arg Gly Thr Leu Ala Arg
5 синтетический <210> 55 <211> 7 <212> белок <213> Искусственная последовательность <220>
<223> описание искусственной последовательности: пептид <400> 55
Thr Ser Ser Asn Arg Lys Thr
5 синтетический <210> 56 <211> 7 <212> белок <213> Искусственная последовательность <220>
<223> описание искусственной последовательности: пептид <400> 56
Asp Arg Ser Ala Arg Thr Arg
5 синтетический <210> 57 <211> 7 <212> белок <213> Искусственная последовательность
- 47 031322 <220>
<223> описание искусственной последовательности: пептид <400> 57
Gln Ser Gly His Leu Ser Arg
5 синтетический <210> 58 <211> 7 <212> белок <213> Искусственная последовательность <220>
<223> описание искусственной последовательности: пептид <400> 58
Arg Ser Asp Asp Leu Ser Lys
5 синтетический <210> 59 <211> 7 <212> белок <213> Искусственная последовательность <220>
<223> описание искусственной последовательности: пептид <400> 59
Arg Asn Asp His Arg Lys Asn
5 синтетический <210> 60 <211> 7 <212> белок <213> Искусственная последовательность <220>
<223> описание искусственной последовательности: пептид <400> 60
Gln Ser Gly Asp Leu Thr Arg
5 синтетический <210> 61 <211> 7 <212> белок <213> Искусственная последовательность <220>
<223> описание искусственной последовательности: пептид <400> 61
Thr Ser Gly Ser Leu Thr Arg
5 синтетический
- 48 031322 синтетический <210> 62 <211> 7 <212> белок <213> Искусственная последовательность <220>
<223> описание искусственной последовательности: пептид <400> 62
Gln Ser Gly His Leu Ala Arg
5 <210> 63 <211> 7 <212> белок <213> Искусственная последовательность <220>
<223> описание искусственной последовательности: пептид <400> 63
Gln Ser Ser Asp Leu Thr Arg
5 синтетический <210> 64 <211> 7 <212> белок <213> Искусственная последовательность <220>
<223> описание искусственной последовательности: пептид <400> 64
Arg Ser Asp Asn Leu Ser Glu
5 синтетический <210> 65 <211> 7 <212> белок <213> Искусственная последовательность <220>
<223> описание искусственной последовательности: пептид <400> 65
Gln Asn Ala His Arg Lys Thr
5 синтетический <210> 66 <211> 28 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность
- 49 031322 <220>
<223> описание искусственной последовательности: олигонуклеотид синтетический
<400> 66
acggtgttga gcatggactc gtagaaga 28
<210> 67
<211> 28
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> описание искусственной последовательности: синтетический
олигонуклеотид
<400> 67
tctatgcccg ggacaagtgg ctggtgag 28
<210> 68
<211> 28
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> описание искусственной последовательности: синтетический
олигонуклеотид
<400> 68
gatgggcggg agtcttctgg gcaggctt 28
<210> 69 <211> 28 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> описание искусственной последовательности: синтетический олигонуклеотид <400> 69 ctagaaagac tggagttgca gatcacga <210> 70 <211> 6 <212> белок <213> Искусственная последовательность <220>
<223> описание искусственной последовательности: синтетический пептид <400> 70
Thr Gln Pro Ala Thr Ser
5 <210> 71 <211> 6
- 50 031322 синтетический <212> белок <213> Искусственная последовательность <220>
<223> описание искусственной последовательности: пептид <400> 71
Thr Gln Pro Ala Thr Ala
5 <210> 72 <211> 7 <212> белок <213> Искусственная последовательность <220>
<223> описание искусственной последовательности: пептид <400> 72
Thr Gln Pro Ala Thr Phe Gln
5 синтетический <210> 73 <211> 6 <212> белок <213> Искусственная последовательность <220>
<223> описание искусственной последовательности: пептид <400> 73
Thr Gln Pro Ala Leu Ser
5 синтетический <210> 74 <211> 6 <212> белок <213> Искусственная последовательность <220>
<223> описание искусственной последовательности: пептид <400> 74
Thr Gln Pro Ala Leu Ala
5 синтетический <210> 75 <211> 7 <212> белок <213> Искусственная последовательность <220>
<223> описание искусственной последовательности:
пептид синтетический
- 51 031322 <400> 75
Thr Gln Pro Ala Leu Phe Gln
5

Claims (8)

  1. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ
    1. Выделенная клетка или клеточная линия для экспрессии одной или более экзогенных нуклеотидных последовательностей, содержащие полинуклеотидную последовательность, интегрированную в эндогенный геном клетки, где указанная последовательность включает сайт множественной инсерции для указанной экзогенной последовательности, содержащий три или более различных парных целевых сайта для одной или более нуклеаз цинкового пальца, где каждый парный целевой сайт содержит первый и второй целевые сайты, образующие парный целевой сайт, причем близлежащие края целевых сайтов каждого парного целевого сайта отделены друг от друга 2-50 и более нуклеотидами, парные целевые сайты отделены друг от друга нуклеотидными линкерами и по меньшей мере один из указанных парных целевых сайтов не присутствует в эндогенном геноме.
  2. 2. Клетка или клеточная линия по п.1, где последовательности первого целевого сайта из каждого парного целевого сайта являются одинаковыми.
  3. 3. Клетка или клеточная линия по п.1, где клетка является эукариотической клеткой, такой как растительная клетка или клетка млекопитающего, а клеточная линия является линией клеток млекопитающего.
  4. 4. Способ интегрирования одной или более экзогенных нуклеотидных последовательностей в геном клетки или клеточной линии по любому из пп.1-3, включающий введение одной или более нуклеаз цинкового пальца и одной или более экзогенных нуклеотидных последовательностей в указанные клетку или клеточную линию, где нуклеазы цинкового пальца связываются с сайтом множественной инсерции в эндогенном геноме клетки или клеточной линии и расщепляют геном клетки, что приводит к интеграции экзогенной последовательности в указанные клетку или клеточную линию.
  5. 5. Способ по п.4, отличающийся тем, что одна или более экзогенных последовательностей содержат последовательность, кодирующую функциональный полипептид.
  6. 6. Способ удаления одной или более интегрированных в эндогенный геном клеток экзогенных нуклеотидных последовательностей согласно способу по любому из пп.4, 5, включающий введение одной или более нуклеаз цинкового пальца в клетку, причем нуклеазы нацеливаются на парные целевые сайты в эндогенном геноме клетки, вследствие чего одна или более интегрированных экзогенных последовательностей удаляются из генома, а затем расщепляются соответствующими нуклеазами.
  7. 7. Способ по любому из пп.4-6, отличающийся тем, что клетка дополнительно включает модификации ее генома за пределами области, содержащей интегрированную молекулу нуклеиновой кислоты.
  8. 8. Способ по любому из пп.4-6, отличающийся тем, что клетка представляет собой растительную клетку.
    н—и—-и—и—кьм—►
    Фиг. 1
    Фиг. 2
    - 52 031322
    Фиг. 3
    Фиг. 5
    - 53 031322
    ----------------HI Ген1 I Ml Μ3ρ№ρ1 ЦМ------------Удаление селективного маркера
    -----------Ml Γθ1 IM
    Повторное использование селективного маркера в следующей донорной конструкции
    ----------------И Ген1 IMI Ген2 НИ1 Мар»еР1 НИ-
    Удаление селективного маркера
    W] Ген1 ίΜ] Ген2 НМ
    Т-ДНК
    Фиг. 6
    -ДНК граница А pDAB10590u
    Т-ДНК граница А
    Т-ДНК граница А \
    9212 пара trfA
    Фиг. 7 ускорение spcR
    Т-ДНК граница А
    Т-ДНК граница А
    PDAB105908
    9708 pDAB101849-SQ-Rev
    OsActl промотору 2 DsAct Intron
    Фиг. 8
    - 54 031322 цинковый палец #1 Непроницаемый 2 NLS
    Кассета экспрессии ZFN гомодимера
    3234 пара оснований
    Фиг. 10 % NHEJ
    Фиг. 11
    Фиг. 12
    - 55 031322
    Фиг. 13
    Генная конверсия сестринских хроматид/кроссинговер в течение мейоза, облегченного посредством ZFN
    Фиг. 15
    - 56 031322 eZFN3связывающий сайт eZFN8 связывающий сайт eZFN1 связывающий сайт
    AtAct2 промотор v2
    Т-ДНК граница А
    Т-ДНК граница А' Т-ДНК граница А
    AtAct2 промотор v4 nptll
    AtuORF23 3' UTRv1 βΖΡΝ8εΒΑ3ΒΙΒΒΚ3111Μ* сайт eZFN1 связывающий сайт eZFN4связывающий сайт e7FN7 связывающий сайт
    AtuORF23 3’ UTR ν!
    PNYFPv3 eZFNS связывающий сайт
    CsVMV промотор v2
    3’UTRv1
    AtUbilO
    AtuORF23 3* UTRv1
    Фиг. 16
    PDAB100646
    23875 пара оснований инженерный синтетический регион S гомологии <>ZFN$ связывающий сайт инженерный синтетический регион 6 гомологии eZFN3 связывающий сайт
EA201201036A 2010-01-22 2011-01-24 Клетка или клеточная линия для экспрессии экзогенных нуклеотидных последовательностей и применение клетки или клеточной линии EA031322B1 (ru)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US33645710P 2010-01-22 2010-01-22
PCT/US2011/000125 WO2011090804A1 (en) 2010-01-22 2011-01-24 Targeted genomic alteration

Publications (2)

Publication Number Publication Date
EA201201036A1 EA201201036A1 (ru) 2013-01-30
EA031322B1 true EA031322B1 (ru) 2018-12-28

Family

ID=44307145

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
EA201201036A EA031322B1 (ru) 2010-01-22 2011-01-24 Клетка или клеточная линия для экспрессии экзогенных нуклеотидных последовательностей и применение клетки или клеточной линии

Country Status (18)

Country Link
US (1) US10260062B2 (ru)
EP (1) EP2526112B1 (ru)
JP (1) JP5902631B2 (ru)
KR (1) KR101866578B1 (ru)
CN (2) CN106086047B (ru)
AR (1) AR080009A1 (ru)
AU (1) AU2011207769B2 (ru)
BR (1) BR112012018249A2 (ru)
CA (1) CA2787494C (ru)
CL (1) CL2012002033A1 (ru)
CO (1) CO6561839A2 (ru)
EA (1) EA031322B1 (ru)
GE (1) GEP20176628B (ru)
IL (1) IL221029B (ru)
MX (1) MX336846B (ru)
NZ (1) NZ601247A (ru)
UA (1) UA118328C2 (ru)
WO (1) WO2011090804A1 (ru)

Families Citing this family (48)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
MX336846B (es) 2010-01-22 2016-02-03 Sangamo Biosciences Inc Alteracion genomica dirigida.
JP5952263B2 (ja) * 2010-04-26 2016-07-13 サンガモ バイオサイエンシーズ， インコーポレイテッド ジンクフィンガーヌクレアーゼを使ったｒｏｓａ遺伝子座のゲノム編集
CA2805263A1 (en) * 2010-07-29 2012-02-02 Dow Agrosciences Llc Strains of agrobacterium modified to increase plant transformation frequency
CN103842511A (zh) 2011-03-23 2014-06-04 先锋国际良种公司 产生复合转基因性状基因座的方法
CA2853829C (en) * 2011-07-22 2023-09-26 President And Fellows Of Harvard College Evaluation and improvement of nuclease cleavage specificity
WO2013166315A1 (en) 2012-05-02 2013-11-07 Dow Agrosciences Llc Targeted modification of malate dehydrogenase
WO2013169802A1 (en) * 2012-05-07 2013-11-14 Sangamo Biosciences, Inc. Methods and compositions for nuclease-mediated targeted integration of transgenes
SG10201701601WA (en) 2012-08-29 2017-04-27 Sangamo Biosciences Inc Methods and compositions for treatment of a genetic condition
EP3406715B1 (en) 2012-09-07 2023-12-13 Corteva Agriscience LLC Fad3 performance loci and corresponding target site specific binding proteins capable of inducing targeted breaks
UA118090C2 (uk) 2012-09-07 2018-11-26 ДАУ АГРОСАЙЄНСІЗ ЕлЕлСі Спосіб інтегрування послідовності нуклеїнової кислоти, що представляє інтерес, у ген fad2 у клітині сої та специфічний для локусу fad2 білок, що зв'язується, здатний індукувати спрямований розрив
UA119135C2 (uk) 2012-09-07 2019-05-10 ДАУ АГРОСАЙЄНСІЗ ЕлЕлСі Спосіб отримання трансгенної рослини
KR102192599B1 (ko) 2013-04-05 2020-12-18 다우 아그로사이언시즈 엘엘씨 식물의 게놈 내의 외인성 서열의 통합을 위한 방법 및 조성물
CA2910489A1 (en) 2013-05-15 2014-11-20 Sangamo Biosciences, Inc. Methods and compositions for treatment of a genetic condition
US9163284B2 (en) 2013-08-09 2015-10-20 President And Fellows Of Harvard College Methods for identifying a target site of a Cas9 nuclease
US9228207B2 (en) 2013-09-06 2016-01-05 President And Fellows Of Harvard College Switchable gRNAs comprising aptamers
TW201518504A (zh) 2013-11-04 2015-05-16 Dow Agrosciences Llc 最適玉米基因座（一）
UY35815A (es) 2013-11-04 2015-05-29 Dow Agrosciences Llc ?locus óptimos del maíz?
WO2015066634A2 (en) 2013-11-04 2015-05-07 Dow Agrosciences Llc Optimal soybean loci
TWI672378B (zh) 2013-11-04 2019-09-21 陶氏農業科學公司 最適大豆基因座（一）
US10774338B2 (en) 2014-01-16 2020-09-15 The Regents Of The University Of California Generation of heritable chimeric plant traits
EP4079847A1 (en) 2014-07-30 2022-10-26 President And Fellows Of Harvard College Cas9 proteins including ligand-dependent inteins
EP3191595B1 (en) 2014-09-12 2019-12-25 E. I. du Pont de Nemours and Company Generation of site-specific-integration sites for complex trait loci in corn and soybean, and methods of use
LT3194570T (lt) * 2014-09-16 2021-09-27 Sangamo Therapeutics, Inc. Būdai ir kompozicijos, skirti kraujodaros kamieninių ląstelių genomo inžinerijai ir korekcijai, kuriai tarpininkauja nukleazė
EP3220926A4 (en) 2014-11-17 2018-08-08 Adicet Bio Inc. Engineered gamma delta t-cells
US20160244784A1 (en) * 2015-02-15 2016-08-25 Massachusetts Institute Of Technology Population-Hastened Assembly Genetic Engineering
US12043835B2 (en) * 2015-03-16 2024-07-23 Institute Of Genetics And Developmental Biology, Chinese Academy Of Sciences Method for making site-directed modification to plant genomes by using non-inheritable materials
EP3095870A1 (en) 2015-05-19 2016-11-23 Kws Saat Se Methods for the in planta transformation of plants and manufacturing processes and products based and obtainable therefrom
IL258821B (en) 2015-10-23 2022-07-01 Harvard College Nucleobase editors and their uses
CA3023993A1 (en) 2016-05-12 2017-11-16 Adicet Bio Inc. Methods for selective expansion of .gamma..delta. t-cell populations and compositions thereof
KR102547316B1 (ko) 2016-08-03 2023-06-23 프레지던트 앤드 펠로우즈 오브 하바드 칼리지 아데노신 핵염기 편집제 및 그의 용도
AU2017308889B2 (en) 2016-08-09 2023-11-09 President And Fellows Of Harvard College Programmable Cas9-recombinase fusion proteins and uses thereof
US11542509B2 (en) 2016-08-24 2023-01-03 President And Fellows Of Harvard College Incorporation of unnatural amino acids into proteins using base editing
US20180142249A1 (en) * 2016-11-21 2018-05-24 Dow Agrosciences Llc Site specific integration of a transgne using intra-genomic recombination via a non-homologous end joining repair pathway
EP3555285A4 (en) * 2016-12-14 2020-07-08 Dow AgroSciences LLC RECONSTRUCTION OF JOB-SPECIFIC NUCLEASE BINDING POINTS
CN108220339A (zh) * 2016-12-14 2018-06-29 深圳华大生命科学研究院 细胞改造的方法
WO2018119359A1 (en) 2016-12-23 2018-06-28 President And Fellows Of Harvard College Editing of ccr5 receptor gene to protect against hiv infection
EP3592853A1 (en) 2017-03-09 2020-01-15 President and Fellows of Harvard College Suppression of pain by gene editing
US11542496B2 (en) 2017-03-10 2023-01-03 President And Fellows Of Harvard College Cytosine to guanine base editor
WO2018209320A1 (en) 2017-05-12 2018-11-15 President And Fellows Of Harvard College Aptazyme-embedded guide rnas for use with crispr-cas9 in genome editing and transcriptional activation
CN111801345A (zh) 2017-07-28 2020-10-20 哈佛大学的校长及成员们 使用噬菌体辅助连续进化(pace)的进化碱基编辑器的方法和组合物
US11319532B2 (en) 2017-08-30 2022-05-03 President And Fellows Of Harvard College High efficiency base editors comprising Gam
US11795443B2 (en) 2017-10-16 2023-10-24 The Broad Institute, Inc. Uses of adenosine base editors
CN107784199A (zh) * 2017-10-18 2018-03-09 中国科学院昆明植物研究所 一种基于总dna测序结果的细胞器基因组筛选方法
SG11202004506WA (en) 2017-11-15 2020-06-29 Adicet Bio Inc METHODS FOR SELECTIVE EXPANSION OF d3 ?d T-CELL POPULATIONS AND COMPOSITIONS THEREOF
AU2019394877A1 (en) 2018-12-03 2021-06-17 Adicet Therapeutics, Inc. Methods for selective in vivo expansion of gamma delta T-cell populations and compositions thereof
JP2022526908A (ja) 2019-03-19 2022-05-27 ザ ブロード インスティテュート，インコーポレーテッド 編集ヌクレオチド配列を編集するための方法および組成物
WO2021028359A1 (en) 2019-08-09 2021-02-18 Sangamo Therapeutics France Controlled expression of chimeric antigen receptors in t cells
AU2021267940A1 (en) 2020-05-08 2022-12-08 President And Fellows Of Harvard College Methods and compositions for simultaneous editing of both strands of a target double-stranded nucleotide sequence

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2008021207A2 (en) * 2006-08-11 2008-02-21 Dow Agrosciences Llc Zinc finger nuclease-mediated homologous recombination

Family Cites Families (71)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4217344A (en) 1976-06-23 1980-08-12 L'oreal Compositions containing aqueous dispersions of lipid spheres
US4235871A (en) 1978-02-24 1980-11-25 Papahadjopoulos Demetrios P Method of encapsulating biologically active materials in lipid vesicles
US4186183A (en) 1978-03-29 1980-01-29 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Army Liposome carriers in chemotherapy of leishmaniasis
US4261975A (en) 1979-09-19 1981-04-14 Merck & Co., Inc. Viral liposome particle
US4485054A (en) 1982-10-04 1984-11-27 Lipoderm Pharmaceuticals Limited Method of encapsulating biologically active materials in multilamellar lipid vesicles (MLV)
US4501728A (en) 1983-01-06 1985-02-26 Technology Unlimited, Inc. Masking of liposomes from RES recognition
US4897355A (en) 1985-01-07 1990-01-30 Syntex (U.S.A.) Inc. N[ω,(ω-1)-dialkyloxy]- and N-[ω,(ω-1)-dialkenyloxy]-alk-1-yl-N,N,N-tetrasubstituted ammonium lipids and uses therefor
US4946787A (en) 1985-01-07 1990-08-07 Syntex (U.S.A.) Inc. N-(ω,(ω-1)-dialkyloxy)- and N-(ω,(ω-1)-dialkenyloxy)-alk-1-yl-N,N,N-tetrasubstituted ammonium lipids and uses therefor
US5049386A (en) 1985-01-07 1991-09-17 Syntex (U.S.A.) Inc. N-ω,(ω-1)-dialkyloxy)- and N-(ω,(ω-1)-dialkenyloxy)Alk-1-YL-N,N,N-tetrasubstituted ammonium lipids and uses therefor
US4774085A (en) 1985-07-09 1988-09-27 501 Board of Regents, Univ. of Texas Pharmaceutical administration systems containing a mixture of immunomodulators
US4837028A (en) 1986-12-24 1989-06-06 Liposome Technology, Inc. Liposomes with enhanced circulation time
US5140081A (en) * 1989-03-21 1992-08-18 Ciba-Geigy Corporation Peroxide free radical initiators containing hindered amine moieties with low basicity
US5264618A (en) 1990-04-19 1993-11-23 Vical, Inc. Cationic lipids for intracellular delivery of biologically active molecules
WO1991017424A1 (en) 1990-05-03 1991-11-14 Vical, Inc. Intracellular delivery of biologically active substances by means of self-assembling lipid complexes
SE466987B (sv) * 1990-10-18 1992-05-11 Stiftelsen Ct Foer Dentaltekni Anordning foer djupselektiv icke-invasiv, lokal maetning av elektrisk impedans i organiska och biologiska material samt prob foer maetning av elektrisk impedans
US5436150A (en) 1992-04-03 1995-07-25 The Johns Hopkins University Functional domains in flavobacterium okeanokoities (foki) restriction endonuclease
US5356802A (en) 1992-04-03 1994-10-18 The Johns Hopkins University Functional domains in flavobacterium okeanokoites (FokI) restriction endonuclease
US5487994A (en) 1992-04-03 1996-01-30 The Johns Hopkins University Insertion and deletion mutants of FokI restriction endonuclease
US6242568B1 (en) 1994-01-18 2001-06-05 The Scripps Research Institute Zinc finger protein derivatives and methods therefor
CA2681922C (en) 1994-01-18 2012-05-15 The Scripps Research Institute Zinc finger protein derivatives and methods therefor
US6140466A (en) 1994-01-18 2000-10-31 The Scripps Research Institute Zinc finger protein derivatives and methods therefor
EP0752005B1 (en) 1994-03-23 2008-10-08 Ohio University Compacted nucleic acids and their delivery to cells
USRE45721E1 (en) 1994-08-20 2015-10-06 Gendaq, Ltd. Relating to binding proteins for recognition of DNA
GB9824544D0 (en) 1998-11-09 1999-01-06 Medical Res Council Screening system
US5789538A (en) 1995-02-03 1998-08-04 Massachusetts Institute Of Technology Zinc finger proteins with high affinity new DNA binding specificities
US5925523A (en) 1996-08-23 1999-07-20 President & Fellows Of Harvard College Intraction trap assay, reagents and uses thereof
GB9703369D0 (en) 1997-02-18 1997-04-09 Lindqvist Bjorn H Process
GB2338237B (en) 1997-02-18 2001-02-28 Actinova Ltd In vitro peptide or protein expression library
GB9710807D0 (en) 1997-05-23 1997-07-23 Medical Res Council Nucleic acid binding proteins
GB9710809D0 (en) 1997-05-23 1997-07-23 Medical Res Council Nucleic acid binding proteins
US7102055B1 (en) * 1997-11-18 2006-09-05 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Compositions and methods for the targeted insertion of a nucleotide sequence of interest into the genome of a plant
US6410248B1 (en) 1998-01-30 2002-06-25 Massachusetts Institute Of Technology General strategy for selecting high-affinity zinc finger proteins for diverse DNA target sites
WO1999045132A1 (en) 1998-03-02 1999-09-10 Massachusetts Institute Of Technology Poly zinc finger proteins with improved linkers
US6140081A (en) 1998-10-16 2000-10-31 The Scripps Research Institute Zinc finger binding domains for GNN
US7013219B2 (en) 1999-01-12 2006-03-14 Sangamo Biosciences, Inc. Regulation of endogenous gene expression in cells using zinc finger proteins
US6599692B1 (en) 1999-09-14 2003-07-29 Sangamo Bioscience, Inc. Functional genomics using zinc finger proteins
US6453242B1 (en) 1999-01-12 2002-09-17 Sangamo Biosciences, Inc. Selection of sites for targeting by zinc finger proteins and methods of designing zinc finger proteins to bind to preselected sites
US6534261B1 (en) 1999-01-12 2003-03-18 Sangamo Biosciences, Inc. Regulation of endogenous gene expression in cells using zinc finger proteins
US6794136B1 (en) 2000-11-20 2004-09-21 Sangamo Biosciences, Inc. Iterative optimization in the design of binding proteins
CA2394850C (en) 1999-12-06 2012-02-07 Sangamo Biosciences, Inc. Methods of using randomized libraries of zinc finger proteins for the identification of gene function
US6435261B1 (en) * 1999-12-30 2002-08-20 Wayne D. Ailiff Mechanism for inverting the cope of a molding flask
WO2001053480A1 (en) 2000-01-24 2001-07-26 Sangamo Biosciences, Inc. Nucleic acid binding polypeptides characterized by flexible linkers connected nucleic acid binding modules
JP5047437B2 (ja) 2000-02-08 2012-10-10 サンガモ バイオサイエンシーズ， インコーポレイテッド 薬物の発見のための細胞
US20020061512A1 (en) 2000-02-18 2002-05-23 Kim Jin-Soo Zinc finger domains and methods of identifying same
AU2001263155A1 (en) 2000-05-16 2001-11-26 Massachusetts Institute Of Technology Methods and compositions for interaction trap assays
JP2002060786A (ja) 2000-08-23 2002-02-26 Kao Corp 硬質表面用殺菌防汚剤
GB0108491D0 (en) 2001-04-04 2001-05-23 Gendaq Ltd Engineering zinc fingers
DE10131786A1 (de) 2001-07-04 2003-01-16 Sungene Gmbh & Co Kgaa Rekombinationssysteme und Verfahren zum Entfernen von Nukleinsäuresequenzen aus dem Genom eukaryotischer Organismen
WO2003016496A2 (en) 2001-08-20 2003-02-27 The Scripps Research Institute Zinc finger binding domains for cnn
AU2003251286B2 (en) 2002-01-23 2007-08-16 The University Of Utah Research Foundation Targeted chromosomal mutagenesis using zinc finger nucleases
US20030232410A1 (en) 2002-03-21 2003-12-18 Monika Liljedahl Methods and compositions for using zinc finger endonucleases to enhance homologous recombination
EP2806025B1 (en) 2002-09-05 2019-04-03 California Institute of Technology Use of zinc finger nucleases to stimulate gene targeting
US8409861B2 (en) * 2003-08-08 2013-04-02 Sangamo Biosciences, Inc. Targeted deletion of cellular DNA sequences
WO2005014791A2 (en) * 2003-08-08 2005-02-17 Sangamo Biosciences, Inc. Methods and compositions for targeted cleavage and recombination
US7888121B2 (en) 2003-08-08 2011-02-15 Sangamo Biosciences, Inc. Methods and compositions for targeted cleavage and recombination
US7838733B2 (en) 2004-04-30 2010-11-23 Dow Agrosciences Llc Herbicide resistance genes
US20100055793A1 (en) * 2005-07-25 2010-03-04 Johns Hopkins University Site-specific modification of the human genome using custom-designed zinc finger nucleases
EP1913149A4 (en) 2005-07-26 2009-08-05 Sangamo Biosciences Inc TARGETED INTEGRATION AND EXPRESSION OF EXOGENOUS NUCLEIC ACID SEQUENCES
US7951925B2 (en) 2006-05-25 2011-05-31 Sangamo Biosciences, Inc. Methods and compositions for gene inactivation
AU2007267887B2 (en) 2006-05-25 2013-05-30 Sangamo Therapeutics, Inc. Variant Foki Cleavage Half-Domains
EP2089427B1 (en) 2006-11-13 2014-07-30 Sangamo BioSciences, Inc. Zinc finger nuclease for targeting the human glucocorticoid receptor locus
SI2092068T1 (sl) * 2006-12-14 2015-06-30 Dow Agrosciences Llc Optimizirani nekanonični proteini s cinkovim prstom
WO2008133938A2 (en) 2007-04-26 2008-11-06 Sangamo Biosciences, Inc. Targeted integration into the ppp1r12c locus
PT2205749T (pt) 2007-09-27 2016-07-20 Dow Agrosciences Llc Proteínas de dedo de zinco modificadas por engenharia que visam genes de 5-enolpiruvil-chiquimato-3-fosfato-sintase
JP5763341B2 (ja) 2007-09-27 2015-08-12 サンガモ バイオサイエンシーズ， インコーポレイテッド 生物学的活性のあるヌクレアーゼの迅速なインビボ同定法
JP5507459B2 (ja) 2007-10-05 2014-05-28 ダウ アグロサイエンシィズ エルエルシー 植物細胞に分子性物質を移行させる方法
WO2009054985A1 (en) 2007-10-25 2009-04-30 Sangamo Biosciences, Inc. Methods and compositions for targeted integration
AU2009238629C1 (en) 2008-04-14 2015-04-30 Sangamo Therapeutics, Inc. Linear donor constructs for targeted integration
JP2012511926A (ja) 2008-12-17 2012-05-31 ダウ・アグロサイエンス・エル・エル・シー Ｚｐ１５遺伝子座内への標的組込み
MX336846B (es) 2010-01-22 2016-02-03 Sangamo Biosciences Inc Alteracion genomica dirigida.
BR112012017896A2 (pt) 2010-01-22 2015-09-01 Dow Agrosciences Llc Excisão de transgenes em organismos geneticamente modificados

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2008021207A2 (en) * 2006-08-11 2008-02-21 Dow Agrosciences Llc Zinc finger nuclease-mediated homologous recombination

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Durai et al. Zinc finder nucleases: custom-designed molecular scissors for genome engineering of plant and mammalian cells. NAR 2005, 33(18):5978-5990 *

Also Published As

Publication number Publication date
AU2011207769B2 (en) 2015-05-28
JP5902631B2 (ja) 2016-04-13
MX336846B (es) 2016-02-03
JP2013517770A (ja) 2013-05-20
CA2787494C (en) 2019-09-17
UA118328C2 (uk) 2019-01-10
BR112012018249A2 (pt) 2020-02-04
CN106086047A (zh) 2016-11-09
KR101866578B1 (ko) 2018-06-11
US10260062B2 (en) 2019-04-16
EP2526112A1 (en) 2012-11-28
CO6561839A2 (es) 2012-11-15
CN106086047B (zh) 2021-07-06
EP2526112B1 (en) 2018-10-17
AU2011207769A1 (en) 2012-08-02
NZ601247A (en) 2014-10-31
US20110189775A1 (en) 2011-08-04
KR20120117890A (ko) 2012-10-24
EA201201036A1 (ru) 2013-01-30
GEP20176628B (en) 2017-02-27
AR080009A1 (es) 2012-03-07
CA2787494A1 (en) 2011-07-28
CN102812034B (zh) 2016-08-03
EP2526112A4 (en) 2013-12-04
MX2012008490A (es) 2013-04-05
CN102812034A (zh) 2012-12-05
WO2011090804A1 (en) 2011-07-28
CL2012002033A1 (es) 2012-12-14
IL221029A0 (en) 2012-09-24
IL221029B (en) 2019-10-31

Similar Documents

Publication Publication Date Title
KR101866578B1 (ko) 표적화된 게놈 교체
US11085092B2 (en) Targeted modification of malate dehydrogenase
JP6127297B2 (ja) Ｚｐ１５遺伝子座内への標的組込み
EP2981166B1 (en) Methods and compositions for integration of an exogenous sequence within the genome of plants
AU2007284748B2 (en) Zinc finger nuclease-mediated homologous recombination
US20230374529A1 (en) Reconstruction of site specific nuclease binding sites

Legal Events

Date Code Title Description
MM4A Lapse of a eurasian patent due to non-payment of renewal fees within the time limit in the following designated state(s)

Designated state(s): AM AZ BY KZ KG MD TJ TM