ES2263290T3

ES2263290T3 - Dominios de union d dedo de cinc para gnn.

Info

Publication number: ES2263290T3
Application number: ES99953825T
Authority: ES
Inventors: Carlos F. Barbas
Original assignee: Novartis AG; Scripps Research Institute
Current assignee: Novartis AG; Scripps Research Institute
Priority date: 1998-10-16
Filing date: 1999-10-14
Publication date: 2006-12-01
Anticipated expiration: 2019-10-14
Also published as: ZA200102908B; IL142440A; EP1715040A3; US6610512B1; US6140081A; CA2347025C; CN1269958C; NZ511523A; AU1037600A; JP2010143936A; ATE323720T1; US20100041028A1; EP1121381A2; DE69930950T2; ATE509101T1; NZ529583A; NZ529584A; EP1715040B1; CN1330713A; BR9914599A

Abstract

Un polipéptido de unión a nucleótido de dedo de cinc aislado y purificado que contiene al menos una región de unión a nucleótido en el que la secuencia de la región de unión es cualquiera de SEQ ID Nº 1, SEQ ID Nº 13, SEQ ID Nº 17, SEQ ID Nº 18, SEQ ID Nº 25, SEQ ID Nº 59, SEQ ID Nº 60 o SEQ ID Nº 77.

Description

Dominios de unión de dedo de cinc para GNN.

Campo técnico de la invención

El campo de esta invención es la proteína dedo de cinc que se une a nucleótidos diana. Más particularmente, la presente invención pertenece a secuencias de restos de aminoácidos dentro del dominio de hélice \alpha de dedos de cinc que se une específicamente a nucleótidos diana de la fórmula 5'-(GNN)-3'.

Antecedentes de la invención

El paradigma que el mecanismo primario para gobernar la expresión de genes implica que los interruptores de las proteínas que se unen a ADN de una manera específica de la secuencia se estableció en 1967 (Ptashne, M, (1967) Nature (Londres) 214, 323, 4).Se han descrito diversas familias estructurales de proteínas de unión a ADN. A pesar de una abundancia de diversidad estructural, el motivo de dedo de cinc Cys_{2}-His_{2} constituye el motivo de unión de ácido nucleico más frecuentemente utilizado en eucariotas. Esta observación es tanto verdad para levaduras como para el hombre. El motivo de dedo de cinc Cys_{2}-His_{2}, identificado primero en el ADN y ARN que se unen al factor de transcripción TFIIIA (Miller, J., McLachlan, A. D. y Klug, A. (1985) Embo J 4, 1609-14), es quizás la estructura ideal sobre la que se puede construir una proteína específica de la secuencia. Un solo dominio de dedo de cinc consta se aproximadamente 30 aminoácidos con un pliegue \beta\beta\alpha sencillo estabilizado por interacciones hidrófobas y la quelación de un solo in de cinc (Miller, J., McLachlan, A. D. y Klug, A. (1985) Embo J 4, 1609-14, Lee, M. S., Gippert, G. P., Soman, K. V., Case, D. A. y Wright, P. E. (1989) Science 245, 635-7). La presentación de la hélice \alpha de este dominio en el surco mayor de ADN permite los contactos de base específicos de la secuencia. Cada dominio de dedo de cinc reconoce tres pares de bases de ADN (Pavletich, N. P. y Pabo, C. O. (1991) Science (Washington, D. C., 1883-) 252, 809-17, Elrod-Erickson, M., Rould, M. A., Nekludova, L. y Pabo, C. O. (1996) Structure (Londres) 4, 1171-1180, Elrod-Erickson, M., Benson, T. E. y Pabo, C. O. (1998) Structure (Londres) 6, 451-464, Kim, C. A. y Berg, J. M. (1996) Nature Structural Biology 3, 940-945), aunque la variación en la presentación de hélice puede permitir el reconocimiento de más de un sitio extendido (Pavletich, N. P. y Pabo, C. O. (1993) Science (Washington, D. C., 1883-) 261, 1701-7, Houbaviy, H. B., Usheva, A., Shenk, T. y Burley, S. K. (1996) Proc Natl Acad Sci Estados Unidos 93, 13577-82, Fairfall, L.., Schwabe, J. W. R., Chapman, L., Finch, J. T. y Rhodes, D. (1993) Nature (Londres) 366, 483-7, Wuttke, D. S., Foster, M. P.; Case, D. A., Gottesfeld, J. M. y Wright, P. E. (1997) J. Mol. Biol. 273, 183-206). En contraste a la mayoría de los factores de transcripción que dependen de la dimerización de dominios de proteína para extender los contactos de proteína - ADN a secuencias o direcciones más largas de ADN, las repeticiones de tándem covalentes sencillas del dominio de dedo de cinc permiten el reconocimiento de secuencias asimétricas más largas de ADN por este motivo.

Los inventores recientemente han descrito proteínas de dedo de cinc polidáctilos que contienen 6 dominios de dedo de cinc y se unen a 18 pares de bases de secuencia de ADN contigua (Liu, Q., Segal, D. J., Ghiara, J. B. y Barbas III, C. F. (1997) PNAS 94, 5525-5530). El reconocimiento de 18 pares de bases de ADN es suficiente para describir una única dirección de ADN dentro de todos los genomas conocidos, un requerimiento para usar proteínas polidáctilos como interruptores de genes altamente específicos. Por supuesto, el control de tanto la activación como la represión de genes se ha mostrado que usan estas proteínas polidáctilas en un sistema de modelo (Liu, Q., Segal, D. J., Ghiara, J. B. y Barbas III, C. F. (1997) PNAS 94, 5525-5530).

Ya que cada dominio de dedo de cinc se une típicamente a tres pares de bases de secuencia, un alfabeto de reconocimiento completo requiere la caracterización de 64 dominios. La información existente que podría guiar la construcción de estos dominios ha venido de tres tipos de estudios: determinación de estructura (Pavletich, N. P. y Pabo, C. O. (1991) Science (Washington, D. C., 1883-) 252, 809-17, Elrod-Erickson, M., Rould, M. A., Nekludova, L y Pabo, C. O. (1996) Structure (Londres) 4, 1171-1180, , Elrod-Erickson, M., Benson, T. E. y Pabo, C. O. (1998) Structure (Londres) 6, 451-464, Kim, C. A. y Berg, J. M. (1996) Nature Strctural Biology 3, 940-945, Pavletich, N. P. y Pabo, C. O. (1993) Science (Washington, D. C., 1883-) 261, 1701-7, Houbaviy, H. B., Usheva, A., Shenk, T. y Burley, S. K. (1996) Proc Natl Acad Sci Estados Unidos 93, 13577-82, Faifall, L., Schwabe, J. W. R., Chapman, L., Finch, J. T. y Rhodes, D. (1993) Nature (Londres) 366, 483-7, 11, Wuttke, D. S., Foster, M. P.; Case, D. A., Gottesfeld, J. M. y Wright, P. E. (1997) J. Mol. Biol. 273, 183-206., Nolte, R. T., Conlin, R. M., Harrison, S. C. y Brown, R. S. (1998) Proc. Natl. Acad. Estados Unidos, 95, 2938-2943, Narayan, V. A., Kriwacki, R. W. y Caradonna, J. P. (1997) J. Biol. Chem. 272, 7801-7809, mutagénesis dirigida al sitio (Isalan, M., Choo, Y. y Klug, A. (1997) Proc. Natl. Acad. Sci. Estados Unidos 94, 5617-5621, Nardelli, J. Gibson, T. J., Vesque, C. y Charnay, P. (1991) Nature 349, 175-178, Nardelli, J., Gibson, T. y Charnay, P. (1992) Nucleic acids Res. 20, 4137-44, Taylor, W. E., Suruki, H. K., Lin, A. H. T., Naraghi-Arani, P., Igarashi, R. Y., Younessian, M., Katkus, P. y Vo, N. V. (1995) Biochemistry 34, 3222-3230, Desjarlais, J. R. y Berg, J. M. (1992) Proteins: Struct., Funct., Genet. 12, 101-4, Desjarlais, J. R. y Berg, J. M. (1992) Proc Natl Acad Sci Estados Unidos 89, 7345-9), y selecciones de representación visual de fago (Choo, Y. y Klug, A. (1994) Proc Natl Acad Sci Estados Unidos 91, 11163-7, Greisman, H. A. y Pabo, C. O. (1997) Science (Washington, D. C.) 275, 657-661.23, Rebar, E. J. y Pabo, C. O. (1994) Science (Washington, D. C., 1883-) 263, 671-3, Jamieson, A. C. Kim, S. -H. y Wells, J. A. (1994) Biochemistry 33, 5689-5695, Jamieson, A. C., Wang, H. y Kim, S. -H. (1996) PNAS 93, 12834-12839, Isalan, M., Klug, A. y Choo, Y. (1998) Biochemistry 37, 12026-33, Wu, H., Yang, W. -P. y Barbas III, C. F. (1995) PNAS 92, 344-348). Todos han contribuido significativamente al mejor entendimiento de los inventores del reconocimiento de dedo de cinc/ADN, pero cada uno tiene sus limitaciones. Los estudios estructurales han identificado un espectro diverso de interacciones proteína /ADN pero no explican si las interacciones alternativas podrían ser más óptimas. Además, aunque se observan las interacciones que permiten que el reconocimiento específico de de secuencia, se proporciona poca información sobre cómo secuencias alternativas se excluyen de la unión. Estas cuestiones han estado parcialmente dirigidas parcialmente por mutagénesis de proteínas existentes, pero los datos están siempre limitados por el número de mutantes que pueden estar caracterizados. La representación visual de fago y selección de genotecas aleatorias supera ciertas limitaciones numéricas, pero que proporcionan la presión selectiva apropiada para asegurar que tanto la especificidad como la afinidad dirigen la selección es difícil. Los estudios experimentales de varios laboratorios (Choo, Y. y Klug, A. (1994) Proc Natl Acad Sci Estados Unidos 91, 11163-7, Greisman, H. A. y Pabo, C. O. (1997) Science (Washington, D. C.) 275, 657-661, Rebar, E. J. y Pabo, C. O. (1994) Science (Washington, D. C., 1883-) 263, 671-3, Jamieson, A. C., Kim, S. -H y Wells, J. A. (1994) Biochemistry 33, 5689-5695.25, Jamieson, A. C., Wang, H. y Kim, S. -H (1996) PNAS 93, 12834-12839, Isalan, M., Klug, A. y Choo, Y. (1998) Biochemistry 37, 12026-33), que incluye la propia de los inventores (Wu, H., Yang, W. -P. y Barbas III, C. F. (1995) PNAS 92, 344-348), han demostrado que es posible diseñar o seleccionar unos pocos miembros de este alfabeto de reconocimiento, la especificidad y afinidad de estos dominios para su ADN diana se investigó de manera excepcional de uña manera rigurosa y sistemática en estos estudios tempranos.

Desde que Jacob y Monod cuestionaron la naturaleza química del represor y propusieron un esquema mediante el que la síntesis de proteínas individuales dentro de una célula podría estar provocada o reprimida, el control experimental específico de expresión génica ha sido una expectativa tentadora (Jacob, F. y Monod, J. (1961) J. Mol. Biol. 3, 318-356). Ahora está bien establecido que los genomas están regulados al nivel de transcripción principalmente a través de la acción de las proteínas conocidas como factores de transcripción que se unen a ADN de una manera específica de la secuencia. A menudo estos factores de proteínas actúan de una manera combinatoria compleja que permiten el control de la expresión génica temporal, espacial, y sensible al ambiente (Ptashne, M. (1997) Nature Medicine 3, 1069-1072). Los factores de transcripción frecuentemente actúan tanto a través de un dominio de unión a ADN que localiza la proteína a un sitio específico con el genoma, como a través de los dominios efectores accesorios que actúan para provocar (activar) o reprimir la transcripción en o cerca de ese sitio (Cowell, I. G. (1994) Trends Biochem. Sci. 19, 38-42). Los dominios efectoers, tal como el dominio de activación VP 16 (Sadowski, I. Ma, J., Triezenberg, S. y Ptashe, M. (1988) Nature 335, 563-564) y el dominio de represión KRAB (Margolin, J. F., Friedman, J. R. Meyer, W., K. -H., Vissing, H., Thiesen, H. -J. y Rauscher III, F. J. (1994) Proc. Natl.Acad. Sci. Estados Unidos 91, 4509-4513), son típicamente modulares y retienen su actividad cuando están condensados a otras proteínas de unión a ADN. Mientras que los genes podrían estar fácilmente controlados mediante la dirección de factores de transcripción a sitios particulares dentro de un genoma, el diseño de las proteínas de unión a ADN que se podrían adaptar para unirse a cualquier secuencia dada ha sido un desafío desalentador.

La presente descripción está basada en el reconocimiento de las características estructurales únicas para la clase Cys_{2}-His_{2} de proteínas de dedo de cinc, de unión a ácido nucleico. El dominio de dedo de cinc de Cys_{2}-His_{2} consta de un pliegue \beta\beta\alpha sencillo de aproximadamente 30 aminoácidos de longitud. la estabilidad estructural de este pliegue se logra por interacciones hidrófobas y mediante quelación de un ion de cinc sencillo por los restos Cys_{2}-His_{2} conservados (Lee, M. S., Gippert, G. P., Soman, K. V., Case, D. A. y Wright, P. E. (1989) Science 245, 635-637). El reconocimiento de ácido nucleico se logra mediante contactos de cadena lateral de aminoácidos específicos que se originan a partir de la hélice \alpha del dominio, que típicamente se une a tres pares de bases de la secuencia de ADN (Pavletich, N. P. y Pabo, C. O. (1991) Science 252, 809-17, Elrod-Erickson, M., Rould, M. A., Nekludova, L. y Pabo, C. O. (1996) Structure 4, 1171-1180). Otros motives de reconocimiento de ácido nucleico diferente, enlace covalente sencillo de múltiples dominios de dedo de cinc permite el reconocimiento de secuencias asimétricas extendidas de ADN. Los estudios de proteínas de dedo de cinc naturales han mostrado que tres dominios de dedo de cinc se pueden unir a 9 pares de bases de secuencia de ADN contiguas (Pavletich, N. P. y Pabo, C. O. (1991) Science 252, 809-17, Swimoff, A. H. y Milbrandt, (1995) Mol. Cell. Biol. 15, 2275-87). Aunque el reconocimiento de los 9 pares de bases de secuencia es insuficiente para especificar un único sitio dentro de incluso el pequeño genoma de E. coli, las proteínas polidáctilas que contienen seis dominios de dedo de cinc pueden especificar 18 pares de bases de reconocimiento (Liu, Q., Segal, D. J., Ghiara, J. B. y Barbas III, C. F. (1997) Proc. Natl. Acad. Sci Estados Unidos 94, 5525-5530). Con respecto al desarrollo de un sistema universal para el control de genes, una dirección de 18 pares de bases puede ser suficiente para especificar un sitio sencillo dentro de todos los genomas conocidos. Sin embargo, aunque las proteínas polidáctilas de este tipo son desconocidas en la naturaleza, se ha mostrado recientemente su eficacia en la activación y represión de genes dentro de las células humanas vivas (Liu, Q., Segal, D. J., Ghiara, J. B. y Barbas I, 11, C. F. (1997) Proc. Natl. Acad. Sci Estados Unidos 94, 5525-5530).

Breve sumario de la invención

En un aspecto, la presente invención proporciona un polipéptido de unión a nucleótido de dedo de cinc aislado y purificado que contiene al menos una región de unión a nucleótido en al que la secuencia de la región de unión está en cualquiera de las SEQ ID Nº 1, SEQ ID Nº 13, SEQ ID Nº 17, SEQ ID Nº 18, SEQ ID Nº 25, SEQ ID Nº 59, SEQ ID Nº 60 o SEQ ID Nº 77. En un aspecto relacionado, esta invención además proporciona composiciones que comprenden entre 2 y 12 de tales polipéptidos de unión de nucleótidos de dedo de cinc que tienen la secuencia de cualquiera de la SEQ ID Nº 1-110, en la que al menos uno de los polipéptidos es cualquiera de la SEQ ID Nº 1, SEQ ID Nº 13, SEQ ID Nº 17, SEQ ID Nº 18, SEQ ID Nº 25, SEQ ID Nº 59, SEQ ID Nº 60 o SEQ ID Nº 77. La composición preferiblemente contiene entre 2 y 6 polipéptidos. En una realización preferida, el polipéptido de unión a nucleótido de dedo de cinc está unido de manera operativa, preferiblemente mediante un engarce de resto de aminoácido que tiene la secuencia de la SEQ ID Nº 111. Una composición de esta invención se une específicamente a una diana de nucleótido que contiene la secuencia 5'-(GNN) n-3', en la que cada N es A, C, G, o T con la condición de que todas las N no pueden ser C y donde n es preferiblemente 2 a 6. Un polipéptido o composición puede estar además ligado de manera operativa a uno o más factores de modulación de transcripción tales como activadores de transcripción o supresores o represores de transcripción. La presente invención también proporciona un polinucleótido aislado y purificado que codifica un polipéptido o composición de esta invención y un vector de expresión que contiene tal polinucleótido.

Todavía en un aspecto adicional, la presente invención proporciona el uso de una composición de esta invención en la fabricación de un medicamento para regular la función de una secuencia de nucleótidos que contiene la secuencia 5'-(GNN) n-3', en la que n es un número entero entre 1 y 6. La composición puede estar ligada de manera operativa a uno o más factores de modulación de la transcripción. La secuencia 5'-(GNN) n-3', se puede encontrar en la región transcrita o región promotora del nucleótido o dentro de una etiqueta de secuencia expresada.

La presente descripción demuestra la simplicidad y eficacia de una estrategia general para la producción rápida de interruptores de genes. Con una familia de dominios de dedo de cinc que reconoce las secuencias del subconjunto de 5'-GNN-3', de un alfabeto de dedo de cinc de 64 miembros, proteínas polidáctilas que reconocen de manera específica secuencias de 9 ó 18 pares de bases novedosas para la primera vez se construyeron y caracterizaron. Los potentes factores de transcripción se generaron y se mostró que controlan tanto la activación como la represión de genes. La activación de genes se logró usando el dominio de activación VP 16 del virus herpes simplex (Sadowski, I., Ma, J., Triezenberg, S. y Ptashne, M. (1988) Nature 335, 563-564) y una repetición tetrámera de su dominio de mínima activación. La represión o silenciamiento de genes se logró usando tres dominios efectores de origen humano, la casilla asociada krüppel (KRAB) (Margolin, J. F., Friedman, J. R., Meyer, W., K. -H., Vissing, H., Thiesen, H. -J. y Rauscher III, F. J. (1994) Proc. Natl.Acad. Sci. Estados Unidos 91, 4509-4513), el dominio represor ERF (ERD) (sgoura, D. N., Athanasiou, M. A., Beal, G. J., Jr., Fisher, R. J., Blair, D. G. y Mavrothalassitis, G. J. (1995) EMBO J. 14, 4781-4793), y el dominio de interacción mSIN3 (SID) (Ayer, D. E., Laherty, C. D., Lawrence, Q. A., Armstrong, A. P. y Eisenman, R. N. (1996) Mol. Cell. Biol. 16, 5772-5781). Usando ensayos de gen indicador de la luciferasa en células epiteliales humanas, los datos muestran que los reguladores transcripcionales artificiales, diseñados para dirigir el promotor del proto-oncogen erb-2/HER-2, puede eliminar o activar la expresión de genes de una manera específica. Para la primera vez, la activación o represión de genes se logró dirigiendo dentro de la transcripción de genes, sugiriendo que la información obtenida a partir de las etiquetas de secuencias expresadas (EST) pueden ser suficientes para la construcción de los interruptores de genes. La metodología y materiales novedosos descritos en esta memoria descriptiva prometen diversas aplicaciones en la terapia génica, organismos transgénicos, genómicos funcionales, y otras áreas de la biología celular y molecular.

Breve descripción del dibujo

En el dibujo, que forma una parte de la memoria descriptiva.

La Fig. 1 (mostrada en seis paneles) muestra la especificidad de unión de las regiones de polipéptidos de unión a nucleótidos de dedo de cinc de la invención.

Descripción detallada de la invención I. La invención

La presente invención proporciona polipéptidos de unión de nucleótidos de dedo de cinc, conteniendo las composiciones uno o más de tales polipéptidos y el uso de los polipéptidos y composiciones para modular la expresión génica.

II. Compuestos

Un compuesto de esta invención es un polipéptido de unión a nucleótido de dedo de cinc aislado que se une a una secuencia de nucleótidos GNN y modula la función de la secuencia de nucleótidos. El polipéptido puede potenciar o suprimir la transcripción de un gen, y se puede unir a ADN o ARN. un polipéptido de unión a nucleótido de dedo de cinc se refiere a un polipéptido que es una forma derivatizada de una proteína de dedo de cinc de tipo salvaje o una producida mediante recombinación. Un polipéptido puede ser un híbrido que contiene dominio (s) de dedo de cinc de una proteína ligada a dominio (s) de dedo de cinc de una segunda proteína, por ejemplo. Los dominios pueden ser de tipo salvaje o mutagenizada. Un polipéptido incluye una forma truncada de una proteína de dedo de cinc de tipo salvaje. Los
ejemplos de proteínas de dedo de cinc a partir de las que se pueden producir un polipéptido incluyen TFIII y zif268.

Un polipéptido de unión a nucleótido de dedo de cinc de esta invención comprende un único heptámero (la secuencia contigua de 7 residuos de aminoácidos) dentro del dominio de hélice \alpha del polipéptido, dicha secuencia heptámera determina la especificidad de unión a un nucleótido diana. La secuencia heptámera se puede localizar en cualquier parte dentro del dominio de la hélice \alpha pero se prefiere que el heptámero se extienda desde la posición -1 a la posición 6 como los restos se numeran de manera convencional en la técnica. Un polipéptido de esta invención puede incluir cualesquiera secuencias de hoja \beta y marco conservado conocidas en la técnica para funcionar como parte de una proteína de dedo de cinc. Se prepararon un gran número de polipéptidos de unión de nucleótidos de dedo de cinc y se ensayaron para evaluar la especificidad de unión contra nucleótidos diana que contienen un triplete GNN. Los resultados de aquellos estudios se resumen en la Fig. 1. En la Fig. 1, la especificidad de unión de triplete GNN para cada péptido se muestra en la columna de la derecha, con la más alta especificidad mostrada primero y en negrita. En la Fig. 1, las SEQ números: se muestran entre paréntesis. Para cada diana de GNN particular (por ejemplo, GAA, mostrada en la columna de la derecha de la Fig. 1), las secuencias se enumeran en orden de especificidad decreciente para ese triplete.

Como se muestra en la Fig. 1, los datos muestran una conservación sorprendente de las tres posiciones de contacto de ADN (-1, 3, y 6) se observaron para prácticamente todos los clones de una diana dada. Aunque muchos de estos restos se observaron previamente en estas posiciones después de las selecciones con genotecas mucho menos completas, el grado de conservación observado en esta memoria descriptiva representa una mejora notable sobre los estudios anteriores (Choo, Y. y Klug, A. (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. Estados Unidos 91, 11163-7, Greisman, H. A. y Pabo, C. O. (1997) Science (Washington, D. C.) 275, 657-661, Rebar, E. J. & Pabo C.O. (1994) Science (Washington, D. C., 1883-) 263, 671-3, Jamieson, A. C. Kim, S. -H. y Wells, J. A. (1994) Biochemistry 33, 5689-5695, Jamieson, A. C., Wang, H. y Kim, S. -H. (1996) PNAS 93, 12834-12839, Wu, H., Yang, W. -P. y Barbas III, C. F. (1995) PNAS 92, 344-348). La presente invención describe las enseñanzas de la técnica anterior que las tres posiciones helicoidales -1, 3, y 6 de un dominio de dedo de cinc son suficientes para permitir la descripción detallada de al especificidad de unión a ADN del dominio son incorrectos.

Típicamente, las selecciones de fagos han mostrado una selección de consenso en solamente una o dos de estas posiciones. La variación de secuencia mayor se producía en los residuos en las posiciones 1 y 5, que no hace que las bases se pongan en contacto en la estructura Zif268/ADN y se esperaron que no contribuyan de manera significativa al reconocimiento (Pavletich, N. P. y Pabo, C. O. (1991) Science (Washington, D. C., 1883-) 252, 809-17, Elrod-Erickson, M., Rould, M. A., Nekludova, L. y Pabo, C. O. (1996) Structure (Londres) 4, 1171-1180). La variación en las posiciones 1 y 5 también implican que la conservación en las otras posiciones se debía a su interacción con el ADN y no simplemente la amplificación fortuita de un solo clon debido a otras razones. También se observó la conservación de la identidad de residuo en la posición 2. La conservación de la posición 2 es algo artificial, la genoteca NNK tenía este residuo fijado como serina. Ese resto hace contactos con la estructura central de ADN en al estructura Zif268. Ambas genotecas contenían una leucina invariable en la posición 4, un resto crítico en el núcleo hidrófobo que estabiliza el plegamiento de este dominio.

La impresionante conservación de aminoácidos se observó para el reconocimiento del mismo nucleótido en dianas diferentes. Por ejemplo, Asn en la posición 3 (Asn 3) se seleccionó prácticamente siempre para reconocer adeninaen la posición media, si en el contexto de GAG, GAA, GAT, o GAC. Gln-1 y Arg-1 se seleccionaban siempre para reconocer adenina o guanina, respectivamente, en la posición 3' independientemente del contexto. El reconocimiento basado en la cadena lateral de amida de adenina por Gln o Asn está bien documentado en estudios estructurales como es la cadena lateral de guanidinio de Arg al contacto de guanina con una guanina en 3' ó 5' (Elrod-Erickson, M, Benson, T. E. y Pabo, C. O. (1998) Structure (Londres) 6, 451-464, Kim, C. A. y Berg, J. M. (1996) Nature Structural Biology 3, 940-945, Fairall, L., Schwabe, J. W. R., Chapman, L., Finch, J. T. y Rhodes, D. (1993) Nature (Londres) 366, 483-7). Sin embargo, más a menudo, se seleccionaron dos o tres aminoácidos para el reconocimiento de nucleótidos. His3 o Lys3 (y hasta un grado menor, Gly3) se seleccionaron para el reconocimiento de una guanina central. Ser3 y Ala3 se seleccionaron para reconocer una timina intermedia. Thr3, Asp3, y Glu3 se seleccionaron para reconocer uan citosina intermedia. Asp y Glu también se seleccionaron en la posición -1 para reconocer una citosina 3', mientras que Thr-1 y Ser-1 se seleccionaron para reconocer una timina 3'.

Las variantes de Zif268 seleccionadas se subclonaron en un vector de expresión bacteriano, y las proteínas se sobre expresaron (proteínas de dedo-2, de aquí en adelante hechas referencia por el subsitio para el que estaban encuadradas). Es importante estudiar proteínas solubles mejor que fusiones de fagos ya que se sabe que los dos pueden diferir significativamente en sus características de unión (Crameri, A., Cwirla, S y Stemmer, W. P. (1996) Nat. Med. 2, 100-102). Las proteínas se ensayaron para evaluar su capacidad de reconocer cada uno de los 16 subsitios de dedo -2 de 5'-GNN-3' usando un ensayo ELISA multidiana. Este ensayo proporcionó un ensayo extremadamente riguroso para especificidad ya que eran siempre seis sitios "no específicos" que difiere del sitio "específico "en solamente un sólo nucleótido fuera de una diana de nueve nucleótidos. Muchas de las proteínas de dedo-2 seleccionadas de fagos mostraron una especificidad exquisita, mientras otras demostraban grados variables de reactividad cruzada. Realmente algunos polipéptidos se unen mejor a otros subsitios que aquellos para los que se seleccionaron.

Se realizaron intentos para mejorar la especificidad de unión modificando la hélice de reconocimiento usando la mutagénesis dirigida al sitio. Los datos de las selecciones de los inventores e información estructural guiaban al diseño de mutantes. Como el estudio más exhaustivo realizado hasta la fecha, se caracterizaron más de 100 proteínas mutantes en un esfuerzo para expandir nuestro entendimiento de las reglas de reconocimiento. Aunque las posiciones de hélice 1 y 5 no se espera que jueguen un papel directo en el reconocimiento de ADN, las mejores mejoras en al especificidad siempre implicaban modificaciones en estas posiciones. Estos residuos se han observado que hacen contactos de estructura central del fosfato, que contribuyen a la afinidad de una manera no específica de la secuencia. La retirada de los contactos no específicos incruenta la importancia de los contactos específicos a la estabilidad global del complejo, potenciando por lo tanto la especificidad. Por ejemplo, la especificidad de los polipéptidos para los tripletes diana GAC, GAA, y GAG se mejoraron simplemente reemplazando los restos atípicos, cargados en las posiciones 1 y 5 con restos más pequeños, no cargados.

Otra clase de modificaciones implicaba cambios en los restos tanto de unión como de no unión. La reactividad cruzada de los polipéptidos para GGG y el subsitio de dedo -2 GAG estaba suprimido por las modificaciones HiseLys y Thr5Val. Es interesante notar que His3 se seleccionaba por unanimidad durante el "panning" para reconocer la guanina intermedia, aunque Lys3 proporcionaba mejor discriminación de A y G. Esto sugiere que las condiciones de "panning" para esta proteína puede tener una selección favorecida por un parámetro tal como afinidad sobre la de especificidad. en la estructura Zif268, His3 proporciona un enlace de hidrógeno al N7 de la guanina intermedia (Pavletich, N. P. y Pabo, C. O. (1991) Science (Washington, D. C., 1883-) 252, 809-17, Elrod-Erickson, M., Rould, M. A., Nekludova, L. y Pabo, C. O. (1996) Structure (Londres) 4, 1171-1180. este enlace también se podría hacer con N7 de adenina, y de hecho Zif268 no discrimina entre G y A en esta posición (Swirnoff, A. H. y Milbrandt, J. (1995) Mol. Cell. Biol. 15, 2275-87). His3 se encontró que esepcifica solamente uan guanina intermedia en polipéptidos dirigidos a GGA, GGC, y GGT, incluso aunque Lys3 se seleccionó durante el "panning" para GGC y GGT. De manera similar, las múltiples reactividades cruzadas de polipéptidos dirigidos a GTG se atenuaron por las modificaciones Lys1Ser y Ser3Glu, dando como resultado una pérdida de afinidad de 5 veces. Glu3 se ha mostrado que es muy específica para citosina en los estudios de selección de sitio de unión de Zif268 (Swimoff, A. H. y Milbrandt, (1995) Mol. Cell. Biol. 15, 2275-87). Ningún de los estudios estructurales muestran una interacción de Glu3 con la timina intermedia, y Glu3 nunca se seleccionó para reconocer una timina intermedia en el estudio de los inventores o cualesquiera otros (Choo, Y. y Klug, A. (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. Estados Unidos 91, 11163-7, Greisman, H. A. y Pabo, C. O. (1997) Science (Washington, D. C.) 275, 657-661.23, Rebar, E. J. y Pabo, C. O. (1994) Science (Washington, D. C., 1883-) 263, 671-3, Jamieson, A. C. Kim, S. -H. y Wells, J. A. (1994) Biochemistry 33, 5689-5695, Jamieson, A. C., Wang, H. y Kim, S. -H. (1996) PNAS 93, 12834-12839, Isalan, M., Klug, A. y Choo, Y. (1998) Biochemistry 37, 12026-33, Wu, H., Yang, W. -P. y Barbas III, C. F. (1995) PNAS 92, 344-348). A pesar de esto, la modificación Ser3Glu favorecía el reconocimiento de una tiamina intermedia sobre citosina. Estos ejemplos ilustran las limitaciones de dependencia de de las estructuras previas y datos de selección para entender los elementos estructurales que son la razón fundamental de la especificidad. También se debe enfatizar que las mejoras mediante modificaciones que implican las posiciones 1 y 5 no han estado predichas por existir "códigos de reconocimiento" (Desjarlais, J. R y Berg, J. M. (1992) Proc Natl Acad Sci Estados Unidos 89, 7345-9. Suzuki, M., Gerstein, M. y Yagi, N. (19949 Nucleic Acids Res. 22, 3397-405, Choo, Y. y Klug, A. (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. Estados Unidos 91, 11168-72, Choo, Y. y Klug, A. (1997) Curr. Opin. Struct. Biol. 7, 117-125), que típicamente solamente consideran las posiciones -1, 2, 3, y 6. Solamente mediante la combinación de selección y mutagénesis dirigida al sitio los inventores pueden comenzar a comprender completamente las problemáticas del reconocimiento dedo de cinc/ADN.

A partir de los datos de la selección combinada y mutagénesis parecía que el reconocimiento específico de muchos nucleótidos se podrían llevar a cabo usando motivos, en lugar de y aminoácido sencillo. Por ejemplo, la mejor especificación de una guanina en 3' se logró usando la combinación de Arg-1, Ser1, y Asp2 (el motivo RSD). Usando Val5 y Arg6 para especificar una guanina en 5', reconocimiento de los subsidios GGG, GAG, GTG, y GCG se podría llevar a cabo usando una estructura de hélice común (SRSD-X-LVR) que difiere solamente en el resto de la posición 3 (Lys3 para GGG, Asn3 para GAG, Glu3 para GTG, y Asp3 para GCG). De manera similar, la timina en 3' se especificó usando Thr-1, Ser1, y Gly2 en los clones finales (el motivo TSG). Además, una citosina en 3' se puede especificar usando Asp-1, Pro1, y Gly2 (el motivo DPG) excepto cuando el subsitio era GCC; Pro1 no estaba tolerado por este subsitio. La especificación de una adenina en 3' era con Gln-1, Ser1, Ser2 en dos clones (motivo QSS). Los residuos de las posiciones 1 y 2 de los motivos se estudiaron para cada una de las bases en 3' y se encontró que proporcionaban especificidad óptimo para una base en 3' dada se describen en esta memoria descriptiva.

El ensayo ELISA multidiana asumían que las proteínas preferían guanina en la posición 5' ya que todas las proteínas contenían Arg6 y este residuo se conoce a partir de estudios estructurales que ponen en contacto guanina en esta posición (Pavletich, N. P. y Pabo, C. O. (1991) Science (Washington, D. C., 1883-) 252, 809-17, Elrod-Erickson, M., Rould, M. A., Nekludova, L. y Pabo, C. O. (1996) Structure (Londres) 4, 1171-1180, Elrod-Erickson, M., Benson, T. E. y Pabo, C. O. (1998) Structure (Londres) 6, 451-464, Kim, C. A. y Berg, J. M. (1996) Nature Structural Biology 3, 940-945, Pavletich, N. P. y Pabo, C. O. (1993) Science (Washington, D. C., 1883-) 261, 1701-7, Houbaviy, H. B., Usheva, A., Shenk, T. y Burley, S. K. (1996) Proc Natl Acad Sci Estados Unidos 93, 13577-82, Fairfall, L.., Schwabe, J. W. R., Chapman, L., Finch, J. T. y Rhodes, D. (1993) Nature (Londres) 366, 483-7, Wuttke, D. S., Foster, M. P.; Case, D. A., Gottesfeld, J. M. y Wright, P. E. (1997) J. Mol. Biol. 273, 183-206, Nolte, R. T., Conlin, R. M., Harrison, S. C. y Brown, R. S. (1998) Proc. Natl. Acad. Sci. Estados Unidos 95, 2938-2943). Esta interacción se demostró en esta memoria descriptive usando el ensayo de firma de sitio de unión 5' ((Choo, Y. y Klug, A. (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. Estados Unidos 91, 11168-72); Fig. 2, barras blancas). Cada proteína se aplicó a conjuntos de dinas de 16 oligonucleótidos en los que el nucleótido 5' del subsitio de dedo -2 se fijó como G, A, T, o C y los nucleótidos intermedios y en 3' se hicieron aleatorios. Todas las proteínas preferían el conjunto GNN sin reactividad cruzada esencialmente.

Los resultados del ensayo ELISA multidiana se confirmaron mediante estudios de afinidad de proteínas purificadas. En los casos en los que la reactividad cruzada era mínima en el ensayo ELISA, una falta de coincidencia de nucleótido individual típicamente dio como resultado una pérdida de afinidad mayor que 100 veces. Este grado de especificidad se tenía todavía que demostrar con proteínas de dedo de cinc. En general, las proteínas seleccionadas o diseñadas para unirse a subsidios con G o A en la posición central y 3' tenían la mayor afinidad, seguido de las que solamente tenían una G o A en la posición central o 3', seguido de aquellos que contenían solamente T o C. El grupo anterior típicamente se unían a sus dianas con una mayor afinidad que Zif268 (10 nM), el último con algo de menor afinidad, y casi todas las proteínas tenían una menor afinidad que la proteína parental C7. No existía ninguna correlación entre la afinidad de unión y especificidad de unión que sugiere que la especificidad se puede producir no solamente a partir de los contactos específicos de proteína - ADN, sino también a partir de interacciones que excluyen todos excepto el nucleótido correcto.

Asp2 se co-seleccionaba siempre con Arg-1 en todas las proteínas para las que el subsitio diana era GNG. Ahora se entendía que existen dos razones para esto. Para los estudios estructurales de Zif268 (Pavletich, N. P. y Pabo, C. O. (1991) Science (Washington, D. C., 1883-) 252, 809-17, Elrod-Erickson, M., Rould, M. A., Nekludova, L. y Pabo, C. O. (1996) Structure (Londres) 4, 1171-1180, se sabe ahora que Asp2 de dedo 2 hace un par de enlaces de hidrógeno de refuerzo con Arg-1 que estabiliza la interacción Arg-1/guanina en 3', así como algunos contactos mediados por agua. Sin embargo, el carboxilato de Asp2 acepta un enlace de hidrógeno del N4 de una citosina que es una base apareada a una guanina en 5' del subsitio dedo-1. La base adenina apareada a T en esta posición puede hacer un contacto análogo al vista con citosina. Esta interacción es particularmente importante debido a que extiende el subsitio de reconocimiento de dedo 2 de tres nucleótidos (GNG) a cuatro (GNG (G/T)) (Isalan, M., Choo, Y. y Klug, A. (1997) Proc. Natl. Acad. Sci. Estados Unidos 94, 5617-5621, Jamieson, A. C., Wang, H. y Kim, S. -H. (1996) PNAS 93, 12834-12839, Isalan, M., Klug, A. y Choo, Y. (1998) Biochemistry 37, 12026-33). Este fenómeno se denomina "superposición de sitio diana", y tiene tres importantes ramificaciones. Primero, Asp2 estaba favorecida por la selección por cuatro librerías cuando el subsitio dedo-2 era GSN debido a que el subsitio dedo-1 de los inventores contenía una guanina en 5'. Segundo, puede limitar la utilidad de las genotecas usadas en este estudio para seleccionar sobre subsidios de sedo-2 GNN o TNN debido a que dedo 3 de estas genotecas contienen un Asp2, que puede ayudar a especificar que el nucleótido en 5' del subsitio de dedo -2 sea G o T. En Zif268 y C7, que tienen Thr6 en dedo 2, Asp2 de dedo 3 refuerza el reconocimiento de G o T en la posición 5' (T/G) GG. Esta interacción también puede explicar por qué los estudios de representación visual de fago previo, que usaban todos genotecas basados en Zif268, han encontrado una selección limitada principalmente al reconocimiento de GNN (Choo, Y. y Klug, A. (1994) Proc Natl Acad Sci Estados Unidos 91, 11163-7, Rebar, E. J. y Pabo, C. O. (1994) Science (Washington, D. C., 1883-) 263, 671-3, Jamieson, A. C. Kim, S. -H. y Wells, J. A. (1994) Biochemistry 33, 5689-5695, Jamieson, A. C., Wang, H. y Kim, S. -H. (1996) PNAS 93, 12834-12839, Isalan, M., Klug, A. y Choo, Y. (1998) Biochemistry 37, 12026-33, Wu, H., Yang, W. -P. y Barbas III, C. F. (1995) PNAS 92, 344-348).

Finalmente, la superposición del sitio diana limita potencialmente el uso de estos dedos de cinc como bloques de construcción modular. A partir de los datos estructurales se sabe que existen algunos dedos de cinc en los que la superposición del sitio diana es completamente amplia, tales como aquellos en GLI e YY1, y otros que son similares a Zif268 y muestran solamente una superposición modesta. En el conjunto final de proteínas de los inventores, Asp2 se encuentra en polipéptidos que se unen a GGG, GAG, GTG, y GCG. La superposición potencial de otros residuos encontrados en la posición 2 se desconoce en gran parte, sin embargo los estudios estructurales revelan que otros muchos residuos encontrados en esta posición pueden participar en tales contactos de subsitio cruzado. Los dedos que contie-
nen Asp2 pueden limitar la capacidad de modulación, ya que requerirían que a cada subsitio GNG siga una T o G.

La tabla 1, a continuación, muestra las secuencias (SEQ ID números 1-16) que muestra la selectividad mayor para las 16 realizaciones de tripletes diana GNN.

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TABLA 1

Especificidad diana	posiciones de aminoácidos	SEQ ID NO:
	-1123456
GAA	QSSNLVR	1
GAC	DPGNLVR	2
GAG	RSDNLVR	3
GAT	TSGNLVR	4
GCA	QSGDLRR	5
GCC	DCRDLAR	6
GCG	RSDDLVK	7
GCT	TSGELVR	8
GGA	ORAHLER	9
GGC	DPGNLVR	10
GGG	RSDKLVR	11
GGT	TSGHLVR	12

TABLA 1 (continuación)

Especificidad diana	posiciones de aminoácidos	SEQ ID NO:
	-1123456
GTA	OSSSLVR	13
GTC	DPGALVR	14
GTG	RSDELVR	15
GtT	TSGSLVR	16

Los datos muestran que todas las secuencias posibles del triplete GNN se pueden reconocer con una especificidad exquisita por dominios de dedo de cinc. Los dominios de dedo de cinc optimizados pueden discriminar diferencias de bases individuales en más de 100 veces de pérdida de afinidad. Aunque muchos de los aminoácidos encontrados en las proteínas optimizadas en las posiciones de contacto claves -1, 3, y 6 son aquellas que son consistentes con un código sencillo de reconocimiento, se ha descubierto que el reconocimiento específico óptimo es sensible al contexto en el que estos residuos se presentan. Los residuos en las posiciones 1, 2, y 5 se han encontrado que son críticos para el reconocimiento específico. Además los datos demuestran que para la primera vez que los motivos de secuencia en las posiciones -1, 1, y 2 mejor que la simple identidad del residuo de la posición 1 se requieren para el reconocimiento altamente específico de la base 3'. Estos residuos probablemente proporcionan el contexto estereoquímico propio para las interacciones de la hélice tanto en términos de reconocimiento de bases específicas como en la exclusión de otras bases, siendo el resultado neto interacciones altamente específicas. La amplia utilidad de estos dominios se realizaría si eran modulares tanto en sus interacciones con ADN como en los otros dominios de dedo de cinc. Esto se podría lograr trabajando dentro de las probables limitaciones impuestas por la superposición del sitio diana, a saber, se deben dirigir las secuencias del tipo 5'-(GNN)_{n}-3'. La recombinación preparada de los dominios descritos después permite la creación de proteínas polidáctilas de especificidad definida que imposibilitan la necesidad de desarrollar genotecas de representación visual de fago en su generación. Estas proteínas polidáctilas se han usado para activar y reprimir la transcripción conducida por el promotor humano erbB-2 en células vivas. La familia de los dominios de dedo de cinc descritos en esta memoria descriptiva es probablemente suficiente para la construcción de 10^{6} ó 17 millones de proteínas novedosas que se unen a la familia 5'-(GNN)_{n}-3' de secuencias de ADN.

El derivado de polipéptidos de unión a nucleótidos de dedo de cinc se puede derivar o producir a partir de una proteína de dedo de cinc de tipo salvaje mediante truncamiento o expansión, o como una variante del polipéptido derivado de tipo salvaje mediante un procedimiento de mutagénesis dirigida al sitio, o mediante una combinación de los procedimientos. El término "truncado" se refiere a un polipéptido de unión a nucleótido de dedo de cinc que contiene menos que el número completo de dedos de cinc encontrados en la proteína de unión de dedo de cinc nativa o que se ha suprimido de las secuencias no deseadas. Por ejemplo, el truncamiento de la proteína de unión a nucleótido de dedo de cinc TFIIIA, que consiste naturalmente nueve dedos de cinc, podría ser un polipéptido con solamente uno a tres dedos de cinc. La expansión se refiere a un polipéptido de dedo de cinc al que se han añadido módulos de dedo de cinc adicionales. Por ejemplo, TFIIIA se puede extender a 12 dedos añadiendo 3 dominios de dedo de cinc. Además, un polipéptido de unión a nucleótido de dedo de cinc truncado puede incluir módulos de dedo de cinc de más de polipéptido de tipo salvaje, de este modo dando como resultado un polipéptido de unión a nucleótido de dedo de cinc "híbrido".

El término "mutagenizado" se refiere a un n polipéptido de unión a nucleótido derivado de dedo de cinc que se ha obtenido realizando cualquiera de los procedimientos conocidos para llevar a cabo la mutagénesis aleatoria o dirigida al sitio del ADN que codifica la proteína. Por ejemplo, en TFIIIA, la mutagénesis se puede realizar para reemplazar los residuos no conservados en una o más de las repeticiones de la secuencia de consenso. Las proteínas de unión de nucleótidos de dedo de cinc truncadas también se pueden mutagenizar.

Los ejemplos de polipéptidos de unión a nucleótido de dedo de cinc conocidos que se pueden truncar, expandir, y/o mutagenizar de acuerdo con la presente invención con el fin de inhibir la función de una secuencia de nucleótidos que contiene un motivo de unión a nucleótido de dedo de cinc incluye TFIIIA y Zif268. Otras proteínas de unión de nucleótido de dedo de cinc serán bien conocidos por los expertos en la técnica.

Un polipéptido de esta invención se puede preparar usando una diversidad de técnicas convencionales bien conocidas en la técnica (Véase, por ejemplo, la solicitud de patente de Estados Unidos Nº 8/676.318, presentada el 18 de enero de 1995, cuya descripción completa se incorpora en esta memoria descriptiva como referencia). Las genotecas de representación visual de fago de proteínas de dedo de cinc se crearon y se seleccionaron en condiciones que favorecían el enriquecimiento de proteínas específicas de secuencia. Los dominios de dedo de cinc que reconocen un número de secuencias de refinamiento requerido mediante mutagénesis dirigida al sitio que fue guiada tanto por datos de selección de fago como información estructural.

La proteína Zif268 de dedo de cinc Cis_{2}-His_{2} murina se usa para la construcción de genotecas de representación visual de fagos (Wu, Yang, W. -P. y Barbas III, C. F. (1995) PNAS 92, 344-348). Zif268 es estructuralmente la mejor caracterizada de las proteínas de dedo de cinc (Pavletich, N. P. y Pabo, C. O. (1991) Science (Washington, D. C., 1883-) 252, 809-17, Elrod-Erickson, M., Rould, M. A., Nekludova, L. y Pabo, C. O. (1996) Structure (Londres) 4, 1171-1180, Swirnoff, A. H. y Milbrandt, J. (1995) Mol. Cell. Biol. 15, 2275-87). El reconocimiento de ADN en cada uno de los tres dominios de dedo de cinc de esta proteína está mediado por los restos en el extremo N de la hélice \alpha que pone en contacto principalmente tres nucleótidos sobre una sola cadena del ADN. El sitio de unión a operador para esta proteína de tres dedos es 5'-GCGTGGGCG-3' (subsitio de dedo-2 está subrayado). Los estudios estructurales de Zif268 y otros complejos de dedo de cinc - ADN relacionados (Elrod-Erickson, M., Benson, T. E. y Pabo, C. O. (1998) Structure (Londres) 6, 451-464, Kim, C. A. y Berg, J. M. (1996) Nature Structural Biology 3, 940-945), Pavletich, N. P. y Pabo, C. O. (1993) Science (Washington, D. C., 1883-) 261, 1701-7, Houbaviy, H. B., Usheva, A., Shenk, T. y Burley, S. K. (1996) Proc Natl Acad Sci Estados Unidos 93, 13577-82, Fairfall, L.., Schwabe, J. W. R., Chapman, L., Finch, J. T. y Rhodes, D. (1993) Nature (Londres) 366, 483-7, Wuttke, D. S., Foster, M. P.; Case, D. A., Gottesfeld, J. M. y Wright, P. E. (1997) J. Mol. Biol. 273, 183-206., Nolte, R. T., Conlin, R. M., Harrison, S. C. y Brown, R. S. (1998) Proc. Natl. Acad. Estados Unidos, 95, 2938-2943, Narayan, V. A., Kriwacki, R. W. y Caradonna, J. P. (1997) J. Biol. Chem. 272, 7801-7809) han mostrado que los residuos de principalmente tres posiciones en la hélice \alpha, -1, 3, y 6, están implicados en contactos de base específicos. Típicamente, el residuo en la posición -1 de los contactos de la hélice \alpha y la base en 3'
del subsitio de dedo mientras que las posiciones 3 y 6 ponen en contacto la base central y la base 5', respectivamente.

Con el fin de seleccionar una familia de dominios de dedo de cinc que reconoce el subconjunto 5'-GNN-3' de secuencias, dos genotecas de dedo de cinc altamente diversas se construyeron en el vector de representación visual de fago pComb3H (Barbas III, C. F., Kang, A. S., Lerner, R. A. y Benkovic, S. J. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. Estados Unidos 88, 7978-7982., Arder, C. y Barbas III, C. F. (1997) Curr. Opin. Biotechnol. 8, 503-508). Ambas genotecas implicadas en la distribución al azar de los restos dentro de la hélice \alpha de dedo 2 de C7, una variante de Zif268 (Wu, H., Yang, W. -P. y Barbas III, C. F. (1995) PNAS 92, 344-348). La genoteca 1 se construyó mediante distribución al azar de las posiciones -1, 1, 2, 3, 5, 6 usando una estrategia de estimulación de VNS con distribución al azar de las posiciones -2, -1, 1, 2, 3, 5, 6. La estrategia de estimulación de NNK permite que todas las combinaciones de aminoácidos dentro de 32 codones mientras que VNS evita Tyr, Phr, Cys y todos los codones de parada en su conjunto de 24 codones. Las genotecas constaban de 4,4 x 10^{9} y 3,5 x 10^{9} miembros, respectivamente, cada uno capaz de reconocer secuencias del tipo 5'-GCGNNNGCG-3'. El tamaño de la genoteca NNK aseguraba que podría estar reconocida con un 99% de confianza mientras que la genoteca VNS era en gran parte diversa pero algo incompleta. Estas librerías son, sin embargo, significativamente mayor que las genotecas de dedo de cinc reseñador previamente (Choo, Y. y Klug, A. (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. Estados Unidos 91, 11163-7, Greisman, H. A. y Pabo, C. O. (1997) Science (Washington, D. C.) 275, 657-661, Rebar, E. J. y Pabo, C. O. (1994) Science (Washington, D. C., 1883-) 263, 671-3, Jamieson, A. C. Kim, S. -H. y Wells, J. A. (1994) Biochemistry 33, 5689-5695, Jamieson, A. C., Wang, H. y Kim, S. -H. (1996) PNAS 93, 12834-12839, Isalan, M., Klug, A. y Choo, Y. (1998) Biochemistry 37, 12026-33). Se realizaron siete rondas de selección sobre el fago que muestra dedo de cinc con cada una de las 16 dianas de los ADN de horquilla biotiniladas 5'-GCGGNNGCG-3' usando un protocolo de unión en solución. La rigurosidad se incrementó en cada ronda mediante la adición de ADN competidor. Se proporcionó ADN de esperma de esperma de arenque fragmentado para selección contra el gafo que está unido no específicamente a ADN. La presión selectiva rigurosa para la especificidad de secuencia se obtuvo proporcionando ADN de los tipos 5'-GCGNNNGCG-3' como competidores específicos. El exceso de ADN del tipo 5'-GCGGNNGCG-3' se añadió para proporcionar incluso una selección más rigurosa contra la unión a los ADN con cambios de bases único o dobles cuando se compara con la diana biotinilada. El fago que se une al ADN biotinilado único se recubrieron usando perlas revestidas de estreptavidina. En algunos casos el procedimiento de selección se repitió. Los datos presentes muestran que estos dominios son funcionalmente modulares y se pueden recombinar con otro para crear proteínas polidáctilas capaces de unirse a secuencias de 18 pares de bases con afinidad subnanomolar. La familia de los dominios de dedo de cinc descritos en esta memoria descriptiva es suficiente
para la construcción de 17 millones de proteínas que se unen a la familia 5'-(GNN)_{6}-3' de las secuencias de ADN.

La invención incluye una secuencia de nucleótidos que codifican un polipéptido de unión a nucleótido de dedo de cinc. Las secuencias de ADN que codifican polipéptidos de unión a nucleótidos de dedo de cinc de la invención, que incluye polipéptidos nativos, truncados y expandidos, se pueden obtener mediante varios procedimientos. Por ejemplo, el ADN se puede aislar usando procedimientos de hibridación que se conocen bien en la técnica. Éstos incluyen, pero no se limitan a: (1) hibridación de sondas a librerías genómicas o ADNc para detectar secuencias de nucleótidos compartidas; (2) selección de anticuerpo de genotecas de expresión para detectar características estructurales compartidas; y (3) síntesis por la reacción en cadena de la polimerasa (PCR). Las secuencias de ARN de la invención se pueden obtener mediante procedimientos conocidos en la técnica (véase, por ejemplo, Current Protocols in Molecular Biology Ausubel, y col., Eds., 1989).

El desarrollo de las secuencias de ADN específicas que codifican polipéptidos de unión a nucleótidos de dedo de cinc de la invención se pueden obtener mediante: (1) aislamiento de una secuencia de ADN de doble cadena a partir del ADN genómico; (2) fabricación química de una secuencia de ADN para proporcionar los codones necesarios para el polipéptido de interés; y (3) síntesis in vitro de una secuencia de ADN de doble cadena mediante la transcripción inversa de ARNm aislado a partir de una célula donante eucariótica. En este último caso, un ADN de doble cadena de ARNm se forma eventualmente que se refiere en general a ADNc. De estos tres procedimientos para desarrollar las secuencias de ADN específicas para uso en los procedimientos recombinantes, el aislamiento de ADN genómico es el menos común. Esto es especialmente verdad cuando es deseable obtener la expresión microbiana de polipéptidos de mamíferos debido a la presencia de intrones.

Para obtener polipéptidos de unión a ADN derivado de dedo de cinc, se conoce la síntesis de secuencias de ADN es frecuentemente el procedimiento de elección cuando la secuencia entera de restos de aminoácidos del producto de polipéptido deseado. Cuando la secuencia entera de los restos de aminoácidos del polipéptido deseado no se conoce, la síntesis directa de secuencias de ADN no es posible y el procedimiento de elección es la formación de las secuencias de ADNc. Entre los procedimientos convencionales para aislar las secuencias de ADNc de interés es la formación de genotecas de ADNc que llevan plásmido que se derivan de transcripción de fase inversa de ARNm que es abundante en células donantes que tienen un alto nivel de expresión genética. Cuando se usa en combinación con la tecnología de reacción en cadena de polimerasa, incluso los productos raros de expresión pueden ser clones. En aquellos casos en los que se conocen las partes significativas de la secuencia de aminoácido del polipéptido, se puede emplear la producción de secuencias de sonda de ADN o ARN de cadena sencilla o doble que duplican una secuencia supuestamente presente en el ADNc diana se puede emplear en los procedimientos de hibridación ADN/ADN que se llevan a cabo sobre copias clonadas del ADNc que se han desnaturalizado en una forma de cadena sencilla. (Jay, y col., Nucleic Acid, Research 11: 2325, 1983).

En otro aspecto, la presente invención proporciona una composición farmacéutica que comprende una cantidad terapéuticamente eficaz de un polipéptido de unión a nucleótido de dedo de cinc o una cantidad terapéuticamente eficaz de una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido de unión a nucleótido de dedo de cinc en combinación con un vehículo farmacéuticamente aceptable.

Como se usa en esta memoria descriptiva, los términos "farmacéuticamente aceptable", "fisiológicamente tolerable" y las variaciones gramaticales de los mismos, como se refieren a composiciones, vehículos, diluyentes y reactivos, se unas de manera indistinta y representan que los materiales son capaces de administración a o sobre un ser humano sin la producción de efectos fisiológicos indeseables tales como nauseas, vértigo, perturbación gástrica y similares que estarían hasta un grado que prohibiría la administración de la composición.

La preparación de una composición farmacológica que contiene ingredientes activos disueltos o dispersados en ella se entiende bien en la técnica. Típicamente tales composiciones se preparan como inyectables estériles como soluciones o suspensiones líquidas, acuosas o no acuosas, sin embargo, también se pueden preparar las formas sólidas para solución, o suspensión, en líquido antes de usar. La preparación también puede estar emulsionada.

El ingrediente activo se puede mezclar con excipientes que son farmacéuticamente aceptables y compatibles con el ingrediente activo en cantidades adecuadas para uso en los procedimientos terapéuticos descritos en esta memoria descriptiva. Los excipientes adecuados son, por ejemplo, agua, solución salina, dextrosa, glicerol, etanol o similares y las combinaciones de los mismos. Además, si se desea, la composición puede contener cantidades menores de sustancias auxiliares tales como agentes humectantes o emulsionantes, así como agentes de tamponación de pH y similares que potencian la eficacia del ingrediente activo.

La composición farmacéutica terapéutica de la presente invención pueden incluir sales farmacéuticamente aceptables de los componentes en esta memoria descriptiva. Las sales farmacéuticamente aceptables incluyen las sales de adición de ácido (formadas con los grupos amino libres del polipéptido) que se forman con ácidos inorgánicos tales como, por ejemplo, ácidos clorhídrico o fosfórico, o ácidos orgánicos tales como acético, tartárico, mandélico y similares. Las sales formadas con los grupos carboxilo libre también se pueden derivar de bases inorgánicas tales como, por ejemplo, hidróxido de sodio, potasio, calcio o férrico, y bases orgánicas tales como isopropilamina, trimetilamina, 2-etilamino etanol, histidina, procaína y similares.

Los vehículos fisiológicamente tolerables se conocen bien en la técnica. Los ejemplos de vehículos líquidos son soluciones acuosas estériles que no contienen materiales además de los ingredientes activos y agua, o contienen un tampón tal como fosfato de sodio a un valor de pH fisiológico, solución salina fisiológica o ambos, tal como solución salina tamponada con fosfato. Todavía adicionalmente, los vehículos acuosos pueden contener más de una sal tampón, así como sales tales como cloruros de sodio y potasio, dextrosa, propilenglicol, polietilenglicol y otros solutos. Las composiciones líquidas también pueden contener fases líquidas además de y la exclusión de agua. Los ejemplos de tales fases líquidas adicionales son glicerina, aceites vegetales tales como aceite de semilla de algodón, ésteres orgánicos tales como electo de etilo, y emulsiones de agua-aceite.

III. Composiciones

En otro aspecto, la presente invención proporciona una pluralidad de polipéptidos de unión a nucleótidos de dedo de cinc unidos de manera operativa de tal manera que se una específicamente a un motivo de diana de nucleótido definido como 5'-(GNN)n-3', en la que n es un número entero mayor que 1. Preferiblemente, n es un número entero entre 2 y aproximadamente 6.

Los medios para enlazar el polipéptido de unión de nucleótido de dedo de cinc se describen en esta memoria descriptiva en los ejemplos así como en la solicitud de patente de Estados Unidos Nº 08/676.318, presentada el 18 de enero de 1995). Los polipéptidos individuales están unidos preferiblemente con engarces de oligopéptidos. Tales engarces preferiblemente se parecen al engarce que se encuentra en las proteínas de dedo de cinc de origen natural. Un engarce preferido para uso en la presente invención es la secuencia del resto aminoácido TGEKP (SEQ ID Nº 111).

Para examinar la eficacia de preparación de tales composiciones y su uso en el control génico, el gen humano erbB-2 se eligió como un modelo. Una proteína polidáctila que reconoce específicamente una secuencia de 18 pares de bases en la región no traducida en 5' de este gen se convirtió en un represor transcripcional por la fusión con dominios de represores KRAB, ERD, o SID. Los activadores transcripcionales se generaron mediante la fusión con el dominio de activación VP16 del virus herpes simplex o con una repetición tetrámera del dominio de activación mínimo de VP16, denominado VP64. Los datos muestran durante la primera vez que tanto la represión como la activación génica como se puede lograr dirigiendo las proteínas diseñadas a un solo sitio dentro de la región transcrita de un gen.

El gen humano erbB-2 se eligió como una diana modelo para el desarrollo de interruptores transcripcionales basados en dedo de cinc. Los miembros de la familia del receptor de ErbB juegan papeles importantes en el desarrollo de malignidades humanas. En particular, erbB-2 se sobreexpresa como resultado de una amplificación de genes y/o desregulación transcripcional en un alto porcentaje de adenocarcinomas humanos que surgen en numerosos sitios, incluyendo mama, ovario, pulmón, estómago, y glándula salivar (Hynes, N. E. y Stern, D. F. (1994) Biochim. Biophys. Acta 1198, 165-184). El aumento de expresión de erbB-2 conduce a la activación constitutiva de su tirosina quinasa intrínseca, y se ha mostrado que provoca la transformación de células cultivadas. Numerosos estudios clínicos han mostrado que los pacientes que llevan tumores con elevados niveles de expresión de ErbB-2 tienen una prognosis más pobre (Hynes, N. E. y Stern, D. F. (1994) Biochim. Biophys. Acta 1198, 165-184). Además de su implicación en cáncer humano, erbB-2 juega papales biológicos importantes, tanto en el adulto como durante el desarrollo embrionario de mamíferos (Hynes, N. E. y Stern, D. F. (1994) Biochim. Biophys. Acta 1198, 165-184, Altiok, N., Bessereau, J-L. y Changeux, J. -P. (1995) EMBO J. 14, 4258-4266, Lee, K. -F., Simón, H., Chen, H., Bates, B., Hung, M. -C y Hausser, C. (1995) Nature 378, 394-398).

El promotor de erbB-2 por lo tanto representa un caso de ensayo interesante para el desarrollo de reguladores transcripcionales artificiales. este promotor se ha caracterizado en detalle y se ha mostrado que es relativamente complejo, conteniendo tanto un sitio de inicio transcripcional dependiente de TATA como independiente de TATA (Ishii, S., Imamoto, F., Yamanashi, Y., Toyoshima, K. y Yamamoto, T. (1987) Proc. natl. Acad. Sci Estados Unidos 84, 4374-4378). Mientras que los estudios tempranos mostraron que las proteínas polidáctilas podrían actuar como reguladores transcripcionales que activan específicamente o reprimen la transcripción, estas proteínas se unen cadena arriba de un promotor artificial a repeticiones de seis tándems del sitio de unión a proteínas (Liu, Q., Segal, D. J., Ghiara, J. B. y Barbas III, C. F. (1997) Proc. Natl. Acad. Sci Estados Unidos 94, 5525-5530). Además, este estudio, utilizaba proteínas polidáctilas ensambladas a partir de bloques de construcción predefinidas para unirse a un solo sitio en el promotor de erbB-2 nativo. Se ha descrito anteriormente la generación y caracterización de una familia de dominios de dedo de cinc que se unen a cada uno de los 16 tripletes de ADN 5'-GNN-3'. Una razón que los inventores fijan sobre la producción de esta familia de dominios de reconocimiento es que las regiones promotoras de la mayoría de los organismos son relativamente ricas en GC en su contenido en base. De este modo, si las proteínas que reconocen los sitios 5'-(GNN)_{x}-3' se pueden fácilmente ensamblar desde este sitio de dominios de dedo de cinc definidos, muchos genes podrían dirigir rápidamente y específicamente para regulación. Una proteína que contiene seis dominios de dedo de cinc y que reconocen 18 pares de base de ADN deben ser suficientes para definir una sola dirección dentro de todos los genomas conocidos. El examen de la región promotora de erbB-2 reveló dos sitios 5'-(GNN)_{n}-3' y un sitio 5'-(GNN)_{n}-3'. Uno de estos sitios, identificados en esta memoria descriptiva como e2c, cae dentro de la región no traducida en 5' del gen erbB-2 y se eligió como el sitio diana para la generación de un interruptor transcripcional específico de gen. Una investigación similar de secuencia BLAST de la base de datos del GenBank confirmó que esta secuencia es única para erbB-2. La posición de al secuencia diana e2c, cadena abajo y en la vecindad de los dos sitios de inicio de transcripción principal, permitía el examen de represión a través de la inhibición de o bien el inicio o elongación de transcripción. Una característica interesante del sitio de diana de e2c es que se encuentra dentro de un tramo corto de secuencia que se conserva entre genes de erbB-2 humanos, de rata, y de ratón (White, M. R. -A y Hung, M. -C (1992) Oncogene 7, 677-683). De este modo, la dirección de este sitio permitiría el estudio de esta estrategia en modelos animales antes de su aplicación a una enfermedad humana.

Para generar proteínas polidáctilas con especificidad de unión de ADN deseada, los estudios presentes se han centrado en el conjunto de dominios de dedo de cinc predefinidos, que contrasta la estrategia de selección secuencial propuesta por Greiman y pabo (Greisman, H. A. y Pabo, C. O. (1997) Science 275, 657-661). Tal estrategia requeriría la generación y selección secuencial de seis genotecs de dedo de cinc para cada proteína requerida, haciendo este planteamiento experimental inaccesible a la mayoría de laboratorios y extremadamente durando mucho tiempo para todo. Además, ya que es difícil aplicar una selección negativa específica contra la unión de secuencias alternativas en esta estrategia, las proteínas pueden resultar que son relativamente inespecíficas como se ha reseñado recientemente (Kim, J. -S y Pabo, C. O. (1997) J. Biol. Chem. 272, 29795-29800).

Se investigó la utilidad general de dos estrategias diferentes para generar tres proteínas de dedo que reconocen 9 pares de bases de secuencia de ADN. Cada estrategia se basó en la naturaleza modular del dominio de dedo de cinc, y tiene la ventaja de una familia de dominios de dedo de cinc que reconoce tripletes de la 5'-GNN-3'. Dos proteínas de tres dedos que reconocen los medios sitios (HS) 1 y 2 de sitio e2c diana de 5'-(GNN)_{6}-3' erbB-2 se generaron en la primera estrategia condensando las variantes de dominio de dedo 2 (F2) predefinidas juntas usando una estrategia de ensamblaje de PCR. Para examinar la generalidad de este planteamiento, se prepararon usando el mismo planteamiento tres proteínas de res dedos que reconocen secuencias del tipo 5'-(GNN)3-3'. Las proteínas de dedo de cinc purificadas se prepararon como fusiones con la proteína de unión a maltosa (MBP). El análisis de ELISA reveló que las proteínas F2 conectadas en serie eran capaces de actuar en concierto para reconocer específicamente las secuencias diana de ADN de 9 pares de bases deseadas. Cada una de las cinco proteínas mostradas era capaz de discriminar entre secuencia de 5'-(GNN)_{3}-3' diana y no diana.

La afinidad de cada una de las proteínas para su diana se determinó mediante ensayos de desplazamiento de movilidad electroforética. Estos estudios demostraron que los péptidos de dedo de cinc tienen afinidades comparables a Zif268 y otros factores de transcripción naturales con los valores de K_{d} que varían entre 3 y 70 nM. En esta memoria descriptiva la K_{d} de Zig268 para este operador era 10 nM. Se debe indicar que, por razones que quedan por explicarse, un grupo tiene valores de K_{d} reseñados para la proteína Zif268 natural que varía entre 6 nM y 10 pM, una variación de 600 veces (Pavletich, N. P. y Pabo, C. O. (1991) Science 252, 809-17, Greisman, H. A. y Pabo, C. O. (1997) Science 275, 657-661). La mayoría de los estudios han reseñado que la K_{d} de la interacción Zif268-ADN estaba entre 3 y 10 nM, Choo, Y. y Klug, A. (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. Estados Unidos 91, 11163-11167, Hamilton, T. B., Borel, F. y Romaniuk, P. J. (1998) (Biochemistry 37, 2051-2058). De este modo con el fin de comparar los resultados reseñados en esta memoria descriptiva con los reportados en otra parte, las k_{d} relativas se comparan, (Mutant K_{d})/Zif268 K_{d})y donde ambos valores se derivan del mismo informe. Los datos presentes se comparan favorablemente a otros estudios de las proteínas de tres dedos novedosos preparados usando la representación visual de fago donde las afinidades 10 a 200 veces más débiles que Zif268 se reseñaron (Greisman, H. A. y Pabo, C. O. (1997) Science 275, 657-661, Choo, Y., Sánchez-García, I. y Klug, A. (1994) Nature 372, 642-5).

Como una alternativa a la conexión en serie de las variantes del dominio F2, en la segunda estrategia, las proteínas de tres dedos específicas para los dos medios sitios de e2c 5'-(GNN)_{3}-3' se produjeron por "injerto de hélice". Los residuos de marco conservado de los dominios de dedo de cinc, aquellos residuos que soportan la presentación de la hélice de reconocimiento, varían entre las proteínas. Los inventores anticiparon que los residuos de marco conservado pueden jugar un papel en afinidad y especificidad. Para el injerto de hélice, las posiciones de aminoácidoso -2 a 6 de las hélices de reconocimiento de ADN estaban o bien injertados en Zif268 (Pavletich, N. P. y Pabo, C. O. (1991) Science 252, 809-17) o un marco conservado SpC1 (Desjarlais, J. R. y Berg, J. M. (1993) Proc.Natl. Acad. Sci. Estados Unidos 90, 2256-60). La proteína SpC1 es una proteína de consenso diseñada que muestra que tiene estabilidad potenciada hacia los agentes quelantes. Las proteínas se expresaron a partir de moldes de ADN preparados mediante una estrategia rápida de conjunto de genes basada en PCR. En cada caso, el análisis de ELISA de las proteínas de fusión MBP mostraron que se retenían las especificidades y afinidades de unión a ADN observadas con las construcciones de marco conservado F2.

Como se ha descrito anteriormente, el reconocimiento de 9 pares de bases de la secuencia de ADN no es suficiente para especificar un sitio único dentro de un genoma complejo. Por el contrario, una proteína de seis dedos que reconoce 18 pares de bases de la secuencia de ADN contigua podría definir un solo sitio en el genoma humano, se este modo cumpliendo un importante prerrequisito para la generación de un interruptor transcripcional específico de gen. Las proteínas de seis dedos que se unen a la secuencia ec2 diana de erbB-2 se generaron a partir de las construcciones de tres dedos mediante la digestión con enzima de restricción sencilla y clonando con los ADN de molde de los marco conservados F2, Zif268, y Sp1C. El análisis de ELISA de las proteínas de fusión MBP purificadas mostraron que cada una de las proteínas de seis dedos era capaz de reconocer la secuencia diana específica, con poca reactividad cruzada a sitios 5'-(GNN)_{6}-3' no dianas o una repetición tándem del sitio diana Zif268.

La afinidad de cada proteína para el sitio diana de ADN e2c se determinó mediante análisis de desplazamiento de gel. Un valor modesto de k_{d} de 25 nM se observó con la proteína de seis dedos E2C(F2) construida a partir del marco conservado F2, un valor que es solamente 2 a 3 veces mejor que sus proteínas constituyentes de tres dedos. En los estudios previos de los inventores de proteínas de seis dedos, los inventores observaron una afinidad potenciada de aproximadamente 70 veces de las proteínas de seis dedos para su ligando de ADN cuando se compara con sus constituyentes de tres dedos (Liu, Q., Segal, D. J., Ghiara, J. B. y Barbas III, C. F. (1997) Proc. Natl. Acad. Sci. Estados Unidos 94, 5525-5530). La ausencia de un incremento sustancial en al afinidad del ppéptido E2C(F2) sugirió que la conexión en serie de los dominios F2 no es óptima. Es posible que la periodicidad de los dominios F2 de la proteína de seis dedos no coincide con la del ADN sobre esta secuencia extendida, y la de una fracción significativa de la energía de unión de esta proteína se gasta en el desenrollado de ADN (Shi, Y y Berg, J. M. (1996) Biochemistry 35, 3845-8). En contraste con la proteína del dominio F2, las proteínas de seis dedos E2C(Zif) y E2C(Sp1) mostraban un incremento de afinidad de 40 a 70 veces comparada con sus constituyentes de proteínas de tres dedos originales, con valores de K_{d} de 1,6 nM y 0,5 nM, respectivamente. De manera significativa, ambos componentes de tres dedos de estas proteínas estaban implicados en la unión, ya que la mutación de cualquier medio sitio conducía a un descenso aproximado de 100 veces en la afinidad. La preponderancia de los factores de transcripción conocidos se unen a sus ligandos de ADN específicos con afinidad nanomolar, sugiriendo que el control de la expresión génica está gobernada por los complejos proteína/ADN de vidas no excepcionales. De este modo, las proteínas de dedo de cinc de afinidad incrementada no se deben requerir y podrían ser desventajosas, especialmente si la unión a ADN no específico también aumenta.

El dominio de dedo de cinc está generalmente considerado que es de naturaleza modular, reconociendo con cada dedo un subsitio de tres pares de bases (Pavletich, N. P. y Pabo, C. O. (1991) Science 252, 809-17). Esto está reforzado por la capacidad de los inventores de recombinar dominios de dedo de cinc en cualquier secuencia deseada, produciendo proteínas polidáctilas que reconocen secuencias extendidas de la estructura 5'-(GNN)_{x}-3'. Sin embargo, se debe indicar que al menos en algunos casos, los dominios de dedo de cinc parece que especifican la superposición de sitios de 4 pares de bases mejor que sitios de 3 pares de bases individuales. En Zif268, los residuos además de aquellos encontrados en las posiciones de hélice -1, 3, y 6 están implicadas en poner en contacto ADN (Elrod-Erickson, M., Rould, M. A., Nekludova, L. y Pabo, C. O. (1996) Structure 4, 1171-1180). Específicamente, un aspartato en la posición de hélice 2 de F2 juega varios papeles en reconocimiento y hace una variedad de contactos. El carboxilato del hidrógeno de la cadena lateral de aspartato se une con arginina en la posición -1, estabilizando su interacción con la guanina en 3' de su sitio diana. Este aspartato también participa en los contactos mediados por agua con la citosina complementaria de guanina. Además, este carboxilato se observa que hace un contacto directo con el N4 de la base citosina en la hebra opuesta de la base guanina en 5' del sitio de unión de dedo 1. Es esta interacción que es la base química para la superposición del sitio diana. De hecho, cuando las genotecas Zif268 se seleccionaron contra las cuatro secuencias 5'-GCG GNG GCG-3', se obtuvieron tanto una arginina en la posición -1 como un aspartato en la posición 2, análogo a los residuos en Zif268. Ya que la secuencia diana e2c 5'-GGG GCC GGA GCC GCA GTG-3' (SEQ ID Nº 112) está seguida de una A mejor que una G, se anticipó un problema potencial de superposición en el sitio diana con el dedo 1 de una proteína de seis dedos específica de e2c. Sin embargo, tanto en las proteínas de seis dedos de marco conservado Zif como Sp1C, el dedo 1 específico de GTG que contenía un aspartato en la posición 2 parece que reconoce las secuencias 5'-GTGA-3' y 5'-GTGG-3' igual de bien, como se indica por sus afinidades muy similares a los sitios diana e2c-a y e2c-g.

Un polinucleótido o composición de esta invención como se ha establecido anteriormente, se puede ligar de manera operativa a uno o más factores de modulación de la transcripción. Los factores de modulación tales como activadores de transcripción o supresores o represores de transcripción se conocen bien en la técnica. Los medios para unir de manera operativa polipéptidos a tales factores se conocen bien en la técnica. Los factores dichos ejemplares y preferidos y su uso para modular la expresión génica se describen en detalle den esta memoria descriptiva más adelante.

II Usos

En una realización, un procedimiento de la invención incluye un procedimiento para modular (inhibir o suprimir) la función de una secuencia de nucleótidos que comprende un motivo de unión de nucleótidos de dedo de cinc que comprende poner en contacto el motivo de unión de nucleótido de dedo de cinc con una cantidad eficaz de un polipéptido de unión da nucleótido de dedo de cinc que se une al motivo. En el caso en que la secuencia de nucleótidos sea un promotor, el procedimiento incluye la inhibición de un promotor que contiene un motivo de unión de ADN a dedo de cinc. El término "inhibición" se refiere a la supresión del nivel de activación de transcripción de un gen estructural ligado a un promotor, que contienen, por ejemplo, un motivo de unión a nucleótido de dedo de cinc. Además, el derivado polipeptídico de unión a nucleótido de dedo de cinc se puede unir a un motivo dentro de un gen estructural o dentro de una secuencia de ARN.

El término "cantidad eficaz" incluye la cantidad que da como resultado la desactivación de un promotor activado previamente o la cantidad que da como resultado la inactivación de un promotor que contiene un motivo de unión a nucleótido de dedo de cinc, o la cantidad que bloquea la transcripción de un gen estructural o traducción de ARN. La cantidad de polipéptido de unión a nucleótido derivado de dedo de cinc requerida es la cantidad necesaria para que o bien desplace una proteína de unión a nucleótido de dedo de cinc nativo en un complejo existente de proteína promotor, o la cantidad necesaria para competir con la proteína nativa de unión a nucleótido de dedo de cinc para formar un complejo con el propio promotor. De manera similar, la cantidad requerida para bloquear un gen o ARN estructural es la cantidad que se une a y bloquea la ARN polimerasa de lectura mediante el gen o la cantidad que inhibe la traducción, respectivamente. Preferiblemente, el procedimiento se realiza de manera intracelular. Mediante la inactivación de manera funcional de un promotor o gen estructural, se suprime la transcripción o traducción. La distribución de una cantidad eficaz de la proteína inhibidora para unirse a o "poner en contacto" la secuencia de nucleótidos celular que contiene el motivo de proteína de unión a nucleótido de dedo de cinc, se puede realizar mediante uno de los mecanismos descritos en esta memoria descriptiva, tal como mediante vectores retrovirales o liposomas, u otros procedimientos bien conocidos en la técnica.

El término "modulando" se refiere a la supresión, potenciación o inducción de una función. Por ejemplo, el polipéptido de unión a nucleótido de dedo de cinc de la invención puede modular una secuencia de promotor mediante la unión a un motivo dentro del promotor, por lo tanto potenciando o suprimiendo la transcripción de un gen ligado de manera operativa a la secuencia de nucleótidos del promotor. Como alternativa, la modulación puede incluir la inhibición de la transcripción de un gen en el que el polipéptido de unión a nucleótido de dedo de cinc se une al gen estructural y bloquea la ARN polimerasa dependiente de ADN a partir de la lectura a través del gen, de este modo, inhibiendo la transcripción del gen. Por ejemplo, el gen estructural puede ser un gen celular normal o un encogen. Como alternativa, la modulación puede incluir la inhibición de la traducción de una transcripción.

La región promotora de un gen incluye los elementos reguladores que típicamente ubican 5' a un gen estructural. Si un gen se va a activar, las proteínas conocidas como factores de transcripción se unen a la región promotora del gen. este ensamblaje se parece a un "interruptor" permitiendo que una enzima transcriba un segundo segmento genético de ADN a ARN. En la mayoría de los casos la molécula de ARN resultante sirve como un molde para la síntesis de una proteína específica; algunas veces el propio ARN es el producto final.

La región promotora puede ser un promotor celular normal o, por ejemplo, un oncopromotor. Un oncopromotor es generalmente un promotor derivado de virus. Por ejemplo, la repetición terminal larga (LTR) de retrovirus es una región promotora que puede ser una diana para una variante de polipéptido de unión de de dedo de cinc de la invención. Los promotores de los miembros del grupo Lentivirus, que incluyen tales patógenos como virus linfotrófico de células T de tipo humano (HTLV) 1 y 2, o virus de inmunodeficiencia humana (VIH) 1 ó 2, son ejemplos de regiones promotoras virales que pueden estar dirigidas para la modulación transcipcional por un polipéptido de unión a dedo de cinc de la invención.

Con el fin de ensayar el concepto de usar proteínas de dedo de cinc como reguladores transcripcionales específicos de gen, la proteína de seis dedos E2X(Sp1) se condensó a un número de dominios efectores. Los represores transcripcionales se generaron uniendo cualquiera de los tres dominios represores derivados de seres humanos a la proteína de dedo de cinc. la primera proteína represora se preparó usando el dominio represor de ERF (ERD) (Sgouras, D. N., Athanasiou, M. A., Beal, G. J., Jr., Fisher, R. J., Blair, D. G. y Mavrothalassitis, G. J. (1995) EMBO J. 14, 4781-4793), definido por los aminoácidos 473 a 530 del factor represor de ets2 (ERF). Este dominio media el efecto antagonista de ERF sobre la actividad de los factores de transcripción de la familia ets. Un represor sintético se construyó mediante la fusión de este dominio al extremo C de la proteína de dedo de cinc. La segunda proteína represora se preparó usando el dominio de caja asociada Krüppel (KRAB) (Margolin, J. F., Friedman, J. R., Meyer, W., K. -H., Vissing, H., Thiesen, H. -J. y Rauscher III, F. J. (1994) Proc. Natl.Acad. Sci. Estados Unidos 91, 4509-4513). Este dominio represor se encuentra comúnmente en el extremo N de las proteínas de dedo de cinc y presumiblemente ejerce su actividad represora sobre la transcripción dependiente de TATA de una manera independiente de la distancia y orientación (Penhue, G. y Lania, L., (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. Estados Unidos 93, 1015-1020), mediante la interacción con la proteína de dedo de ANILLO KAP-1 (Friedman, J. R., Fredericks, W. J., Jensen, D. E., Speicher, D. W., Huang, X. -P., Neilson, E. G. y Rauscher III, F. J. (1996) Genes & Dev. 10, 2067-2078). Los autores utilizaron el dominio KRAB encontrado entre los aminoácidos 1 y 97 de la proteían de dedo de cinc KOX1 (Margolin, J. F., Friedman, J. R., Meyer, W., K. -H., Vissing, H., Thiesen, H. -J. y Rauscher III, F. J. (1994) Proc. Natl.Acad. Sci. Estados Unidos 91, 4509-4513). En este caso se construyó una fusión N-terminal con la proteína de seis dedos. Finalmente, para explorar la utilidad de la desacetilación de la histona para represión, los aminoácidos 1 a 36 del dominio de interacción mSIN3 (SID) se condensaron al extremo N de la proteína de dedo de cinc (Ayer, D. E., Latherty, C. D., Lawrence, Q. A., Armstrong, A. P. y Eisenman, R. N. (1996) Mol. Cel. Biol. 16, 5772-5781). Este pequeño dominio se encuentra en el extremo N del factor de transcripción Mad y es responsable de la mediación de su represión transcripcional interactuando con mSIN3, que a su vez interactúa el co-represor N-CoR y con al histona desacetilasa mRPD1 (Heinzel, T., Lavinsky, R. M., Mullen, T. -M., Sšderstršm, M., Laherty, C. D., Torchia, J., Yang, W. -M., Brard, G., Ngo, S. D. y col., e. (1997) Nature 387, 43-46). Para examinar la activación específica de gen, los activadores transcripcionales se generaron condensando la proteína de dedo de cinc a los aminoácidos 413 a 489 de la proteína VP16 del virus herpes simplex (Sadowski, I., Ma, J., Triezenberg, S. y Ptashne, M. (1988) Nature 335, 563-564), o a una repetición tetrámera artificial del dominio de activación mínima de VP16, DALDDFDLDML (SEQ ID Nº 113) (Seipel, K., Georgiev, O. y Schaffner, W. (1992) EMBO J. 11, 4961-4968), denominado VP64.

Las construcciones indicadoras que contienen fragmentos del promotor erbB-2 acoplado a un gen indicador de la luciferasa se generaron para ensayar las actividades específicas de los reguladores transcripcionales de los inventores. El plásmido indicador diana que contenía nucleótidos -758 a -1 con respecto al codón de inicio ATG, mientras que el plásmido indicador control contenía los nucleótidos -1571 a -24, de este modo careciendo todos excepto un nucleótido del sitio de unión a E2C abarcado en las posiciones -24 a -7. Ambos fragmentos promotores mostraron actividades similares cuando se transfectan de manera transitoria en células HeLa, de acuerdo con las observaciones previas (Hudson, L. G., Ertl, A. P. y Gill, G. N. (1990) J. Biol. Chem. 265, 4389-4393). Para ensayar el efecto de las construcciones de fusión de dominio del represor de dedo de cinc sobre la actividad del promotor de erbB-2, se co-transfectaron de manera transitoria células HeLa con cada uno de los vectores de expresión de dedo de cinc y las construcciones del indicador de la luciferasa (Fig. 5 A). Se observó represión significativa con cada construcción. Las proteínas de fusión de ERD y SID produjeron aproximadamente 50% y 80% de represión, respectivamente. El represor más potente era la proteína de fusión KRAB. Esta proteína provocaba la represión completa de la actividad del promotor erbB-2. La actividad residual observada estaba al nivel del fondo del indicador pGL3 menos promotor. Por el contrario, ninguna de las proteínas provocaba una represión significativa del control de la construcción del indicador erbB-2 que carece del sitio diana de E2C, demostrando que al represión esta de hecho mediada por la unión específica de la proteína E2C(Sp1) a su sitio diana. La expresión de una proteína de dedo de cinc que carece de cualquier dominio efector daba como resultado una represión débil, aproximadamente 30%, que indica que la mayoría de la represión observada con las construcciones SID y KRAB está provocada por sus dominios efectores, en lugar de por la unión a ADN solo. Esta observación sugiere en gran medida que el mecanismo de represión es una inhibición activa del inicio de la transcripción en lugar de la elongación. Una vez que el inicio de la transcripción por la ARN polimerasa II se haya producido, la proteína de dedo de cinc parece que se desplaza fácilmente a partir del ADN mediante la acción de la polimerasa.

La utilidad de las proteínas polidáctilas específicas de gen para mediar la activación de la transcripción se investigó usando las mismas dos construcciones del indicador. La proteína de fusión VP16 se encontró que estimula la transcripción aproximadamente 5 veces, mientras que la proteína de fusión VP64 producía una activación de 27 veces. Esa dramática estimulación de la actividad del promotor provocada por un solo activador transcripcional basado en VP16 es excepcional en vista del hecho de que la proteína de dedo de cinc se une en la región transcrita del gen. Esto de nuevo demuestra que el mero de unión de una proteína de dedo de cinc, incluso con una con afinidad subnanomolares, en la ruta de la ARN polimerasa necesitan no necesariamente afectar de manera negativa a la expresión génica.

Los datos en esta memoria descriptiva muestran que las proteínas de dedo de cinc capaces de unirse a sitios diana de ADN de 9 y 18 pares de bases de pueden preparar rápidamente usando dominios predefinidos que reconocen sitios 5'-GNN-3'. Esta información es suficiente para la preparación de 10^{6} ó 17 millones de proteínas novedosas de seis dedos cada una capaz de unirse a la secuencia de ADN de 18 pares de bases. Esta rápida metodología para la construcción de proteínas novedosas de dedo de cinc tiene ventajas sobre la generación y selección secuencial de los dominios de dedo de cinc propuestos por otros (Greisman, H. A. y Pabo, C. O. (1997) Science 275, 657-661) y toma ventaja de información estructural que sugiere que el potencial para el problema de solapamiento diana como se ha definido anteriormente se podría evitar en las proteínas que dirigen los sitios 5'-GNN-3'. Usando el complejo y bien estudiado promotor erbB-2 y células humanas vivas, los datos demuestran que estas proteínas, cuando se proporcionan con el dominio efector apropiado, se pueden usar para provocar o activar la expresión y producir niveles graduados de represión por debajo del nivel de fondo en estos experimentos. Estos estudios sugieren que el dominio KRAB es significativamente más potente que un represor transcripcional que los dominios ERD o SID, y que es capaz de inhibir el inicio transcripcional tanto dependiente de TATA como el independiente de TATA de este promotor. Estos dominios represores no se han comparado directamente previamente. La presente estrategia de usar dominios de dedo de cinc predefinidos para construir las proteínas polidáctilas acopladas a los dominios efectores tiene ventajas significativas sobre las estrategias que intentan solamente reprimirla transcripción compitiendo o interfiriendo con las proteínas implicadas en el complejo de transcripción (Kim, J. -S y Pabo, C. O. (1997) J. Biol. Chem. 272, 29795-29800, Kim, J. -S., Kim, J., Cepek, K. L., Sharp, P. A. y Pabo, C. O. (1997) Proc. Natl. Acad. Sci. Estados Unidos 94, 3616-3620). La utilización de dominios efectores que tienen el potencial de actuar sobre una distancia debe permitir la aplicación de estos interruptores de genes para la regulación de genes no caracterizados u promotores. Ya que estos reguladores transcripcionales se podrían preparar usando la estrategia de ensamblaje de la PCR de los inventores de una manera de alto rendimiento, los inventores creen que es apropiado comentar sus aplicaciones prácticas potenciales. Las proteínas novedosas de unión a ADN generadas de esta manera deben tener utilidad potencial en las aplicaciones diagnósticas basadas en ADN. Para el estudio de la función génica, los inventores creen que al capacidad de tanto activar como reprimir la transcripción de genes, niveles graduados si es necesario, pueden asistir en al asignación de la función génica. Ya que estas proteínas ejercen su control actuando en trans, la inactivación génica o activación se podría producir en animales heterocigóticos transgénicos. Esto reduciría de manera notable el tiempo requerido para producir una inactivación génica en un animal entero y extendería el intervalo de de organismos al que la tecnología de inactivación se podría aplicar. Estas proteínas también se podrían usar en las aplicaciones de terapia génica que inhiben la producción de productos génicos virales o que activan los genes implicados en la lucha contra enfermedades. De manera significativa, la facilidad con la que estas proteínas se pueden preparar facilitará el ensayo de estas ideas por la comunidad científica.

Los ejemplos que siguen ilustran realizaciones preferidas de la presente invención y no son limitantes de la memoria descriptiva o reivindicaciones de ninguna manera.

Ejemplo 1

Selección por representación visual de fago

La construcción de genotecas de dedo de cinc mediante la extensión de superposición de PCR era esencialmente como se ha descrito previamente (Shi, Y. y Berg, J. M. (1996) Biochemistry 35, 3845-8). El crecimiento y precipitación del fago eran como se ha descrito previamente (Pengue, G. y Lania, L. (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. Estados Unidos 93, 1015-1020, Friedman, J. R., Fredericks, W. J., Jensen, D. E., Speicher, D. W., Huang, X. -P., Neilson, E. G. y Rauscher III, F. J. (1996) Genes y Dev. 10, 2067-2078), excepto que las células ER2537 (New England Biolabs) se usaron para propagar el fago y se añadieron 90 \muM de ZnCl_{2} al medio de crecimiento. Los fagos precipitados se resuspendieron en tampón de cinc A (ZBA; Tris 10 mM, pH 7,5/KCl 90 mM, MgCl_{2}, ZnCl_{2} 90 \muM) BSA al 1% / DTT 5 mM. Las reacciones de unión (500 \mul: ZBA/DTT 5 mM/Blotto al 1% (BioRad)/oligonucleótidos de competidor/ 4 \mug de ADN de esperma de arenque fragmentado (Sigma)/100 \mul de fago filtrado (\approx 10^{13} unidades formadoras de colonias)) se incubaron durante 30 minutos a temperatura ambiente, antes de la adición de oigonucleótido diana de horquilla biotinilado 72 nM. La incubación continuó durante 3,5 horas con mezcla constante suave. Se lavaron dos veces perlas magnéticas revestidas con estreptavidina (50 \mul; Dynal) con 500 \mul de ZBA/BSA al 1%, después se bloqueó con 500 \mul de ZBA/Blotto al 5%/ anticuerpo/que representa visualmente (irrelevante) fago (\approx 10^{12} unidades formadoras de colonias) durante aproximadamente \approx 4 horas a temperatura ambiente. Al final de período de unión, la solución de bloqueo se reemplazó mediante la reacción de unión y se incubó 1 hora a temperatura ambiente. Las perlas se lavaron 10 veces durante un período de 1 hora con 500 \mul de ZBA/DTT 5 mM/Tween 20 al 2% después una vez con Tween 20. El fago unido se eluyó 30 minutos con 10 \mug/\mul de tripsina.

Los oligonucleótidos diana de horquilla tenían la secuencia 5'-Biotin-GGACGCN'N'N'CGCGGGTTTTCCCGCG
NNNGCGTCC-3' (SEQ ID Nº 114), donde NNN era la secuencia diana de dedo-2 del nucleótido 3 y N'N'N' su complemento. Un oligonucleótido no biotinilado similar, en el que la secuencia diana era TGG (comp TGG), se incluyó a 7,2 nM en cada ronda de selección para seleccionar contra fago parenteral contaminante. También se usaron dos combinaciones de oligonucleótidos no biotinilados como competidores: uno que contenía las 64 posibles secuencias dianas de 3-nucleótido (comp NNN), conteniendo el otro todas las secuencias diana de GNN excepto para la actual diana de selección (comp GNN). Estas combinaciones se usaron típicamente comosigue: ronda 1, sin compNNN o compGNN; ronda 2, compGNN 7,2 nM; ronda 3, compGNN 10,8 nM; ronda 4, compNNN 1,8 \muM, compGNN 25 nM; ronda 5, compNNN 2,7 \muM, compGNN 90 nM; ronda 6, compNNN 2,7 \muM, compGNN 250 nM; ronda 7, compNNN 3,6 \muM, compGNN 250 nM.

Ejemplo 2

Ensayos de especificidad multi-diana

El fragmento de pComb3H (Pengue, G. y Lania, L. (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. Estados Unidos 93, 1015-1020, Heinzel, T., Lavinsky, R. M., Mullen, T. -M., Sšderstršm, M., Laherty, C. D., Torchia, J., Yang, W. -M., Brard, G., Ngo, S. D. y col., e. (1997) Nature 387, 43-46).ADN de fagémido RF que contiene la secuencia codificadora de dedo de cinc se subclonó en un vector de expresión bacteriana pMAL-c2 modificado (New England BioLabs) y se transformó en XL1-Blue (Stratagene). Los extractos congelados/descrongelados que contenían las proteínas de fusión de dedo de cinc de unión a maltosa sobreexpresadas se prepararon a partir de cultivos inducidos por IPTG usando la proteína de fusión y sistema de purificación (New England BioLabs). En placas de 96 pocillos de ELISA, se aplicaron 0,2 \mug de estreptavidina (Pierce) a cada pocillo durante una hora a 37ºC, después se lavaron dos veces con agua. Se aplicó oligonucleótido biotinilado diana (0,025 \mug) de manera similar. ZBA/BSA al 3% se aplicó para bloqueo, pero los pocillos s no se lavaron después de la incubación. Todas las incubaciones posteriores eran a temperatura ambiente. Se aplicaron ocho diluciones en serie dos veces de los extractos en tampón de unión 1 x (ZBA/BSA al 1%/DTT 5 mM/0,12 \mug/\mul de ADN de esperma de arenque fragmentado). Las muestras se incubaron 1 hora, seguido de 10 lavados con agua. Se aplicó proteína de unión a anti-maltosa de ratón mAb (Sigma) en ZBA/BSA al 1% a los pocillos durante 30 minutos, seguido de 10 lavados con agua. Se aplicó anti-ratón IgG mAb de cabra conjugado a fosfatasa alcalina (Sigma) a los pocillos durante 30 minutos, seguido de 10 lavados con agua. Se aplicó sustrato de fosfatasa alcalina (Sigma), y la DO_{405} se cuantificó con SOFTmáx 2,35 (Molecular Devices).

Ejemplo 3

Ensayos de desplazamiento de movilidad de gel

Las proteínas de fusión se purificaron hasta > 90% de homogeneidad usando Proteína de Fusión y sistema de purificación (New England BioLabs), excepto que se usó ZBA/DTT 5 mM como el tampón de columna. Se determinaron la pureza y concentración de proteína a partir de geles SDS al 15% - PAGE teñidos con azul de Coomassie mediante comparación a BSA convencionales. Los oligonucleótidos diana se marcaron en sus extremos 5' ó 3' con [^{32}P] y se purificaron en gel. Once diluciones en serie 3 veces de proteína se incubaron en 20 \mul de reacciones de unión (1 x de tampón de unión/glicerol al 10%/ oligonucleótido diana \approx 1 pM) durante tres horas a temperatura ambiente, después se resolvieron sobre un gel de poliacrilamida al 5% en 0,5 x de tampón TBE. La cuantificación de ges secos se realizó usando un PhosphorImager y software ImageQuant (Molecular Dynamics), y se determinó la K_{D} mediante análisis de Scatchard.

Ejemplo 4

Generación de proteínas polidáctilas con especificidad de unión a ADN

Los estudios reseñados en esta memoria descriptiva usan las variantes de dedo 2 (F'') pmGAC, pmGAG, pGCA, pGCC, pmGGA, pmGGC, pmGGG, y pGTG definidas en el manuscrito acompañante (Hudson, L. G., Ertl, A. P. y Gill, G. N. (1990) J. Biol. Chem. 265, 4389-4393). Para generar los ADN que codifican proteínas de tres dedos. se amplificaron mediante la PCR regiones codificadoras a partir de variantes F2 seleccionadas o diseñadas y se ensamblaron mediante extensión de superposición de PCR. Como alternativa, los ADN que codifican proteínas de tres dedos con un marco conservado de Zif268 o Sp1C se sintetizaron a partir de 8 ó 10 oligonucleótidos de superposición, respectivamente. Las construcciones de marco conservado Sp1C, usadas para todos los ensayos de indicador descritos en esta reseña, se generaron como sigue. En el caso de E2C-HS1 (Sp1), 0,4 pmoles de cada uno de los oligonucleótidos SPE2-3 (5'-GCG AGC AAG GTC GCG GCA GTC ACT AAA AGA TTT GCC GCA CTC TGG GCA TTT ATA CGG TTT TTC ACC-3') (SEQ ID Nº 115) y SPE2-4 (5'-GTG ACT GCC GCG ACC TTG CTG GCC ATC AAC GCA CTC ATA CTG GCG AGA AGC CAT ACA AAT GTC CAG AAT GTG CG-3')SEQ ID Nº 116) se mezclaron con 40 pmoles de cada uno de los oligonucleótidos SPE2-2 (5'-GGT AAG TCCTTC TCT CAG AGC TCT CAC CTG GTG CGC CAC CAG CGT ACC CAC AGC GGT GAA AAA CCG TAT AAA TGC CCA GAG-3'(SEQ ID Nº 117) y SPE2-5' (5'-ACG CAC CAG CTT GTC AGA GCG GCT GAA AGA CTT GCC ACA TTC TGG ACA TTT GTA TGG C-3') (SEQ ID Nº 118( en una mezcla convencional de PCR y se cicló 25 veces (30 segundos a 94ºC, 30 segundos a 60ºC, 30 segundos a 72ºC). Una alícuota de esta reacción de pre-ensamblaje se amplificó después con 40 pmols de cada uno de los cebadores SPE2-1 (5'-GAG GAG GAG GAG GTG GCC CAG GCG GCC CTC GAG CCC GGG GAG AAG CCC TAT GCT TGT CCG GAA TGT CCT AAG TCC TTC TCT CAG AGC-3') (SEQ ID Nº 119) y SPE2-6 (5'-GAG GAG GAG GAG CTGGCC GGC CTG GCC ACT AGT TTT TTT ACC GGT GTG AGT ACG TTG GTG ACG CAC CAG CTT GTC AGA GCG-3') (SEQ ID Nº 120) usando las mismas condiciones de ciclación. El ADN de A2C-HS2(Sp1) se generó de la misma manera, usando un conjunto análogo de oligonucleótidos que se diferencian solamente en las regiones codificadoras de hélice de reconocimiento. Todas las regiones codificadoras de ters dedos ensambladas se digirieron con la endonucleasa Sfi1 de restricción y se clonaron en pMal-CSS, un derivado del vector de expresión bacteriano pMal-C2 (New England BioLabs). Los ADN que codifican proteínas de seis dedos con cada uno de los marcos conservados diferentes se ensamblaron en pMal-CSS usando sitios de restricción Xma1 y BsrF1 incluidos en las secuencias que flanquean las regiones codificadoras de tres dedos. Cada una de las proteínas de dedo de cinc se expresó en la cepa de E. coli XL1-blue y se investigaron las propiedades de unión mediante ELISA y análisis de desplazamiento de gel como se describe en el manuscrito acompañante (Hudson, L. G., Ertl, A. P. y Gill, G. N. (1990) J. Biol. Chem. 265, 4389-4393).

Ejemplo 5

Construcción de proteínas de fusión de dominio de efector de dedo de cinc

Para la construcción de proteínas de fusión de dominio de efector de dedo de cinc, los ADN que codifican los aminoácidos 473 a 530 del dominio represor del factor represor ets (ERF) (Sgouras, D. N., Athanasiou, M. A., Beal, G. J., Fisher, R. J., Blair, D. G. y Mavrothalassitis, G. J. (1995) EMBO J. 14, 4781-4793), aminoácidos 1 a 97 del dominio KRAB de KOX1 (Margolin, J. F., Friedman, J. R., Meyer, W., K. -H., Vissing, H., Thiesen, H. -J. y Rauscher III, F. J. (1994) Proc. Natl.Acad. Sci. Estados Unidos 91, 4509-45139, o los aminoácidos 1 a 36 del dominio de interacción Mad mSIN3 (SID) (Ayer, D. E., Laherty, C. D., Lawrence, Q. A., Armstrong, A. P. y Eisenman, R. N. (1996) Mol. Cell. Biol. 16, 5772-5781) se ensamblaron a partir de oligonucleótidos de superposición usando Taq ADN polimerasa. La región codificadora para los aminoácidos 413 a 489 del dominio de activación transcripcional VP16 (Sadowski, I. Ma, J., Triezenberg, S. y Ptashne, M. (1988) Nature 335, 563-564) se amplificó por PCR a partir de pcDNA3/C7-C7-VP16 (10). El ADN de VP16, que codifica una repetición tetrámera del dominio de activación mínima de VP16, que comprende los aminoácidos 437 a 447 (Seipel, K., Georgiev, O. y Schaffner, W. (1992) EMBO J. 11, 4961-4968), se generó a partir de dos pares de oligonucleótidos complementarios. Los fragmentos resultantes se condensaron a regiones codificadoras mediante procedimientos de clonación convencionales, de manera que cada construcción resultante contenía una señal de localización nuclear SV40 interna, así como una etiqueta decapéptídica HA C-terminal. Las construcciones de fusión se clonaron en el vector de expresión eucariótico pcDNA3 (Invitrogen).

Ejemplo 6

Construcción de plásmidos d reportero de luciferasa

Un fragmento promotor erbB-2 que comprende los nucleótidos -758 a -1, con relación al codón de inicio de ATG, se amplificó por PCR a partir de ADN genómico de médula ósea humana con la mezcal de TaqExpand ADN polimerasa (Boehringer Mannheim) y se clonó en pGL3basic (Promega), cadena arriba del gen de la luciferasa de luciérnaga. Un fragmento del promotor de erbB-2 humano que abarca los nucleótidos -1571 a -24, se escindió a partir de pSVOAL\Delta5'/erbB-2(N-N) (Hudson, L. G., Ertl, A. P. y Gill, G. N. (1990) J. Biol. Chem. 265, 4389-4393) por digestión con Hind3 y se subclonó en pGL3basic, cadena arriba del gen de la luciferasa de luciérnaga.

Ejemplo 7

Ensayos de luciferasa

Para todas las transfecciones, células Hela se usaron a una confluencia de 40-60%. Típicamente, las células se transfectaron con 400 ng de plásmido reportero (construcciones del promotor pGL3 o, como control negativo, pGL3basic), 50 ng de plásmido de efector (construcciones de dedo de cinc en pcDNA3 o, como control negativo, pcDNA3 vacío), y 200 ng de plásmido convencional interno (phrAct-\betaGal) en un pocillo de una placa de 6 pocillos usando el reactivo lipofectamina (Gibcol BRL). Los extractos de células se prepararon aproximadamente 48 horas después de la transfección. La actividad de la luciferasa se midió con reactivo de ensayo de luciferasa (Promega), actividad \betaGal con galacto-Light (tropix), en un luminómetro MicroLumat LB96P (EG&g Berthold). La actividad de la luciferasa se normalizó sobre la actividad de \betaGal.

Ejemplo 8

Regulación del gen erbB-2 en células Hela

El gen erbB-2-se dirigió para regulación impuesta. El gen erbB-2 se sobreexpresa frecuentemente en cánceres humanos, particularmente de mama y de ovario, y niveles elevados de ErbB-2 se correlacionan con escasa prognosis (N. E. Hynes y D. F. Stern, Biochim. Biophys. Acta 1198, 165 (1994)). Para regular el gen nativo erbB-2, se utilizaron una proteína represora sintética, designada E2C-KRAB, y una proteína transactivadora, designada E2C-VP64, (R. R. Beerli, D. J. Segal, B. Dreier, C. F. Barbas III, Proc. Natl. Acad. Sci. Estados Unidos 95, 14628 (1998)). Ambas proteínas contienen la misma proteína de dedo de cinc designada E2C que reconoce la secuencia de ADN de 18 pares de bases 5'-GGG GCC GGA GCC GCA GTG-3' (SEQ ID Nº 121= en la región no traducida en 5'del prto-oncogen erbB-2. Esta proteína de unión a ADN se construyó a partir de 6 dominios de dedo de cinc predefinidos y modulares (D. J. Segal, B. Dreier, R. R. Beerli, C. F. Barbas III, Proc. Natl. Acad. Sci. Estados Unidos 96, 2758 (1999)). La proteína represora contiene el dominio Kox-1 KRAB (J. F. Margolin y col., Proc. Natl. Acad. Sci. Estados Unidos 91, 4509 (1994)), mientras que VP64 transactivador contiene una repetición tetrámera del dominio de activación mínimo (K. Seipel, O. Georgiev, W. y Schaffner, EMBO J. 11, 4961 (1992)) derivado de la proteína de virus herpes simplex VP16.

Se utilizó un derivado de la línea celular HeLa de carcinoma cervical humano, HeLa/tet-off, (M. Gossen y H. Bujard,Proc. Natl. Acad. Sci. Estados Unidos 89, 5547 (1992)). Ya que las células HeLa son de origen epitelial expresan ErbB-2 y se adaptan bien a los estudios de dirección génica de erbB-2. Las células HeLa/tet-off producen el tranasactivador controlado por tetraciclina, permitiendo la inducción de un gen de interés bajo el control de un elemento de respuesta de tetraciclina (TRE) mediante la eliminación de tetraciclina o su derivado doxiciclina (Dox) del medio de crecimiento. Los inventores han usado este sistema para colocar los factores de transcripción de los inventores bajo control químico. de este modo, se construyeron los plásmidos pRevTRE/E2C-SKD y pRevTRE/E2C-VP64 (las regiones codificadoras de E2C(Sp1)-KRAB y E2C(Sp1)-VP64 se amplificaron por PCR a partir de plásmidos de expresión basados en pcDNA3 (R. R. Beerli, D. J. Segal, B. Dreier, C. F. Barbas III, Proc. Natl. Acad. Sci. Estados Unidos 95, 14628 (1998)) y se subclonó en pRevTRE (Clontech) usando los sitios de restricción BamH1 y Cla 1, y en pMX-IRES-GFP [X. Liu y col., Proc. Natl. Acad. Sci Estados Unidos 94, 10669 (1997)] usando los sitios de restricción BamH1 y Not1. La fidelidad de la amplificación de PCR se confirmó mediante secuenciación, se transfectó en células HeLa/tet-off, y 20 clones estables se aislaron cada uno y se analizaron para evaluar la regulación génica diana dependiente de Dox (las construcciones pRevTRE/E2C-KRAB y pRevTRE/E2C-VP64 se transfectaron en la línea celular HeLa/tet-off (M. Gossen y H. Bujard, Proc. Natl. Acad. Sci. Estados Unidos 89, 5547 (1992)) usando reactivo Lipofectamina Plus (Gibco BRL). Después de dos semanas de selección en medio que contenía higromicina, en presencia de 2 \mug/ml de Dox, se aislaron clones estables y se analizaron para evaluar la regulación dependiente de Dox de la expresión ErbB-2. Se llevaron a cabo transferencias Western, inmunoprecipitaciones, transferencias de Northern, y análisis de citometría de flujo esencialmente como se describe [D. Graus-Porta, R. R. Beerli, N. E. Hynes, Mol. Cell. Biol. 15, 1182 (1995)].). Como una lectura de la actividad del promotor de erbB-2, los niveles de proteína de ErbB-2 se analizaron inicialmente por transferencia de Western. Una fracción significativa de estos clones mostraron regulación de la expresión de erbB-2 tras la retirada de Dox durante 4 días, es decir, regulación hacia debajo de erbB-2 en clones de E2C-KRAB y regulación hacia arriba en clones de E2C-VP64. Los niveles de proteínas de ErbB-2 se correlacionaron con niveles alterados de su ARNm específico, indicando que la regulación de la expresión de ErbB-2 era un resultado de la represión o activación de la transcripción. La proteína adicional de ErbB-2 en los clones E2C-VP64 era indistinguible de la proteína expresada de manera natural y biológicamente activa, ya que el factor de crecimiento epidérmico (EGF) inducía fácilmente su fosforilación de tirosina. Los niveles de ErbB-2 en el clon nº 27 E2C-KRAB, en ausencia de Dox, se redujeron los niveles de detección a medida que lo era su fosforilación de tirosina inducida por EGF. Por lo tanto, la expresión de ErbB-2 también se analizó mediante citometría de flujo, no revelando expresión de ErbB-2 detectable en el clon nº 27 de E2C-KRAB, en un brusco contraste con la espectacular regulación hacia arriba (5,6 veces) de erbB-2 en el clon nº 18 de E2C-VP64. De este modo, el grado de regulación génica de erbB-2 variaba entre la represión total (clon nº 27 de E2C-KRAB) hasta casi 6 veces de activación (clon nº 18 de E2C-KRAB). No se observó ningún efecto significativo sobre la expresión de la proteína de ErbB-1, indicando que la regulación de la expresión de la ErbB-2 no era resultado de la regulación general hacia arriba o hacia debajo de la transcripción. En contraste a la eficacia de estos factores de transcripción que dirigen 18 pares de bases de la secuencia de ADN usando seis dominios de dedo de cinc, los activadores transcripcionales preparados con tres dominios de dedo de cinc que se unen a cualquiera de los medios sitios de 9 pares de bases de la secuencia diana de E2C eran incapaces de activarla transcripción de un indicador de la luciferasa de erbB-2. Estos resultados sugieren que el aumento de especificidad y afinidad de seis proteínas de dedo de se pueden requerir para proporcionar un efecto dominante sobre la regulación génica.

Ejemplo 9

Introducción de las regiones codificadoras de las proteínas de E2C-KRAB y E2C-VP64 en el vector retroviral pMX-IRES-GFP

Con el fin de expresar las proteínas de E2C-KRAB y E2C-VP64 en varias líneas celulares diferentes, sus regiones codificadoras se introdujeron en el vector retroviral pMX-IRES-GFP. Las regiones codificadoras de E2C(Sp1)-KRAB y E2C(Sp1)-VP64 se amplificaron por PCR a partir de plásmidos de expresión basados en pcDNA3 (R. R. Beerli, D. J. Segal, B. Dreir, C. F. Barbas III, Proc. Natl. Acad. Sci. Estados Unidos 95, 14628 (1998)9 y se subclonaron en pRevTRE (Clontech) usando los sitios de restricción BamH1 y Cla1, y en pMX-IRES-GFP [X. Liu y col., Proc. Natl. Acad. Sci. Estados Unidos 94, 10669 (1997)] usando los sitios de restricción BamH1 y Not1. La fidelidad de la amplificación de PCR se confirmó mediante secuenciación. Este vector expresa un solo mensaje biscistrónico para la traducción de la proteína de dedo de cinc, y a partir del sitio de entrada de ribosomas (IRES), la proteína fluorescente verde (GFP). Ya que ambas regiones codificadoras comparten el mismo ARNm, su expresión está ligada físicamente a otra y al expresión de GFP es un indicador de la expresión de dedo de cinc. Los virus preparados a partir de estos plásmidos se usaron después para infectar la línea celular A431 de carcinoma humano (plásmidos pMX-IRES-GFP/E2C-KRAB y pMX-IRES-GFP/E2C-VP64 se transfectaron transitoriamenteen la línea celular Phonix Ampho de empaquetamiento anfotrótrópico usando Lipofectamina Plus (Gibcol BRL) y, dos días después, se usaron sobrenadantes de cultivos para la infección de células diana en presencia de 8 \mug/ml de polibreno. Tres días después de la infección, las células se recogieron para análisis). Tres días después de la infección, la expresión de ErbB-2 se midió mediante citometría de flujo. De manera significativa, aproximadamente 59% de las células tratadas con virus E2C-KRAB eran esencialmente ErbB-2 negativas, mientras que en aproximadamente el 27% de los niveles de ErbB-2 de las células tratadas con el virus E2C-VP64 se incrementaron. La representación gráfica de la fluorescencia de GFP frente la fluorescencia de ErbB-2 reveló que existían dos poblaciones de células, una con niveles normales de ErbB-2 que era GFp negativa, y otra con niveles de ErbB-2 alterados que era GFP positiva. La especificidad de la dirección génica se investigó midiendo los niveles de expresión de las proteínas de ErbB-1 y ErbB-e relacionadas. No se detectaron alteraciones significativas de estos niveles de proteínas, indicando que la dirección génica de erbB-e es específica y no un resultado no específico de alteraciones generales en la expresión o sobreexpresión génica de los dominios efectores. La carencia de cualquier regulación apreciable de erbB-3 es particularmente notable ya que su 5'UTR contiene la secuencia de 18 pares de bases 5'-GGa GCC GGA GCC GgA GTc-3' (SEQ ID Nº 122), que presenta solamente 3 discordancias con la secuencia diana designada de E2C (15 pares de bases de identidad - la letras minúsculas indican diferencias) (M. H. Kraus, W. Issing, T. Miki, N. C. Popescu, S. A. Aaronson, Proc. Natl. Acad. Sci. Estados Unidos 86, 9193 (1989)).

Ejemplo 10

Regulación de gen erbB-2 en células de primate no humanas

La secuencia diana de dedo de cinc dentro de erbB-2's 5'-UTR cae dentro de un tramo de secuencia de 28 pares de bases que se conserva en muchas especies. Para investigar la regulación de la expresión génica de erbB-2 en células de primate no humanas, fibroblastos COS-7 se infectaron con el retrovirus E2C-KRAB y se analizaron por citometría de flujo. Como en las células humanas, la expresión de la proteína represora como se indica por el marcador de GFP se correlaciona bien con una pérdida de proteína de ErbB-2. De manera similar, la dirección génica en células murinas se evaluó mediante al infección de células NIH/3T3 con retrovirus que codifica E2C-KRAB y E2C-VP64. Los niveles de expresión de erbB-2 se controlaban después mediante transferencia de Western en lugar de citometría de flujo, debido a una falta de reactividad del mAb con el dominio extracelular de ErbB-2. De nuevo en esta memoria descriptiva, se observó con E2C-KRAB una inactivación transcipcional completa tras la corrección para células infectadas. Sin embargo, a diferencia de la líneas celulares humanas, la regulación de ErbB-2 inducida por E2C-VP64 era más bien modesta en las células NIH/3T3, aproximadamente 1,8 veces tras la corrección para eficacia de infección. Una explicación similar para esta discrepancia se ubica en las diferentes estructuras de los promotores humanos y de ratón. El promotor erbB-2 de ratón, a diferencia del humano, no contiene una casilla TATA (M. R. White y M. C. Hung, Oncogene 7, 677 (1992)). La activación transcripcional por VP16 está, al menos en parte, mediada por su interacción con TFIID, un complejo de multiproteínas que también contenía la proteína de unión a TATA (C. J. Ingles, M. Shales, W. D. Cress, S. J. Triezenberg, J. Greenblatt, Nature 351, 588 (1991)). Por lo tanto es plausible que la proteína E2C-VP64 active la transcripción menos eficazmente en ausencia de una casilla TATA. Estos datos sugieren que mientras un sitio de unión a ADN se puede conservar con respecto a la secuencia y posición relativa dentro de una célula diana, los dominios efectores pueden necesitar optimizarse para la eficacia máxima debida a los efectos del contexto. Independientemente, aunque sus potencias pueden diferir, los factores de transcripción artificial descritos en esta memoria descriptiva son capaces de imponer la regulación de la transcripción génica de erbB-2 en células derivadas de especies diferentes, proporcionando una estrategia para el estudio de la función génica en una diversidad de organismos.

Ejemplo 11

Inducción específica de acumulación en G1 de células que sobreexpresan ErbB-2

Las sobreexpersión de ErbB-2 conduce a la activación constitutiva de suactividad intrínseca de la tirosina quinasa (P. P. Di Fiore y col., Science 237, 178 (1987)), y se ha mostrado que al regulación hacia debajo de ErbB-2 en células tumorales que sobreeexpresan el receptor conduce a la inhibición de crecimiento (R. M. Hudziak y col., Mol. Cell. Biol. 9, 1165 (1989); J. Deshane y col., Gene Ther. 1, 332 (1994); J. M. Daly y col., Cáncer Res. 57, 3804 (1997)). El mecanismo de inhibición de crecimiento parece que ser que previene la progresión de las células de la fase G1 a la S del ciclo celular (R. M. Neve, H. Sutterluty, N. Pullen, H. A. Lane, J. M. Daly, W. Krek, N. E. Hynes, remitido para publicación). De este modo, los inventores investigaron si al expresión del represor transcripcional designado de los inventores en células tumorales que sobreexpresan erbB-2 conducirían a a un bloque de G1. Por lo tanto, se infectaron células de cáncer de mama SKBR3 con retrovirus de E2C-KRAB y se analizó la distribución del ciclo celular en relación con los niveles de expresión de ErbB-2 mediante citometría de flujo (22). Se observaron dos poblaciones de células: aproximadamente el 40% de las células no estaban infectadas y tenían niveles normales de ErbB-2, mientras que las células infectadas, \sim60%, mostró aproximadamente una reducción de 7 veces después de 3 días. Comparado con las células con niveles de receptor normales, una fracción significativamente mayor de células con una disminución en los niveles de expresión de ErbB-2 estaba en la fase G1 del ciclo celular. Para determinar que la acumulación en G1 observada con las células SKBR3 era específica para las células tumorales que sobreexpresan ErbB-2, un análisis similar se llevó a cabo con la línea celular de cáncer de mama T47D, que no muestra niveles elevados de ErbB-2 (Fig. 4B). De hecho, cuando las células T47D se infectaron con el retrovirus de E2C-KRAB y se sometieron a análisis de citometría de flujo, se encontraron poblaciones celulares con niveles normales y reducidos de ErbB-2 que muestran un contenido de ADN indistinguible. De este modo, la proteína represora diseñada de los inventores es capaz de inducir específicamente la acumulación de G1 de células tumorales que sobre expresan ErbB-2. La capacidad de inhibir la progresión del ciclo celular, y que por lo tanto inhiben el crecimiento de células tumorales que sobreexpresan ErbB-2 sugiere el potencial de factores de transcripción designada para la terapia génica de cáncer.

<110> Novartis AG

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<120> Dominios de unión de dedo de cinc para GNN

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<130> 30746/A

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<140>

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<141>

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<160> 122

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<170> PatentIn Ver. 2.1

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<210> 1

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<211> 7

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<212> PRT

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<213> Secuencia artificial

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<220>

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<223> Descripción de la secuencia artificial: polipéptidos unión a nucleótidos

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<400> 1

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\sa{Gln Ser Ser Asn Leu Val Arg}

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<211> 7

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<212> PRT

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<213> Secuencia artificial

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<220>

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<400> 2

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<213> Secuencia artificial

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<220>

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<213> Secuencia artificial

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<213> Secuencia artificial

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<400> 6

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<213> Secuencia artificial

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<213> Secuencia artificial

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<213> Secuencia artificial

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<220>

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<213> Secuencia artificial

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<213> Secuencia artificial

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<213> Secuencia artificial

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<213> Secuencia artificial

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<213> Secuencia artificial

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<212> PRT

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<213> Secuencia artificial

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<213> Secuencia artificial

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<213> Secuencia artificial

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<220>

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<400> 20

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Asp Pro Gly Asn Leu Lys Arg}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 21

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 7

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 21

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Arg Ser Asp Asn Leu Arg Arg}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 22

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 7

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 22

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Lys Ser Ala Asn Leu Val Arg}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 23

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 7

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 23

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Arg Ser Asp Asn Leu Val Lys}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 24

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 7

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 24

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Lys Ser Ala Gln Leu Val Arg}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 25

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 7

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 25

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Gln Ser Ser Thr Leu Val Arg}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 26

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 7

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 26

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Gln Ser Gly Thr Leu Arg Arg}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 27

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 7

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<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 27

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Gln Pro Gly Asp Leu Val Arg}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 28

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 7

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 28

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Gln Gly Pro Asp Leu Val Arg}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 29

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<211> 7

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<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 29

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Gln Ala Gly Thr Leu Met Arg}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 30

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 7

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 30

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Gln Pro Gly Thr Leu Val Arg}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 31

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 7

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 31

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Gln Gly Pro Glu Leu Val Arg}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 32

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 7

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 32

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Gly Cys Arg Gly Leu Ser Arg}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 33

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 7

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 33

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Asp Pro Ser Thr Leu Lys Arg}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 34

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 7

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 34

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Asp Pro Ser Asp Leu Lys Arg}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 35

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 7

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 35

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Asp Ser Gly Asp Leu Val Arg}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 36

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 7

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 36

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Asp Ser Gly Gly Leu Val Arg}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 37

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 7

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 37

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Asp Ser Gly Glu Leu Lys Arg}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 38

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 7

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 38

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Arg Leu Asp Thr Leu Gly Arg}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 39

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 7

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 39

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Arg Pro Gly Asp Leu Val Arg}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 40

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 7

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 40

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Arg Ser Asp Thr Leu Val Arg}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 41

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 7

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 41

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Lys Ser Ala Asp Leu Lys Arg}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 42

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 7

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 42

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Arg Ser Asp Asp Leu Val Arg}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 43

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 7

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 43

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Arg Ser Asp Thr Leu Val Lys}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 44

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 7

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 44

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Lys Ser Ala Glu Leu Lys Arg}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 45

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 7

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 45

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Lys Ser ala Glu Leu Val Arg}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 46

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 7

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 46

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Arg Gly Pro Glu Leu Val Arg}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 47

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 7

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 47

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Lys Pro Gly Glu Leu Val Arg}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 48

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 7

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 48

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Ser Ser Gln Thr Leu Thr Arg}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 49

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 7

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 49

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Thr Pro Gly Glu Leu Val Arg}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 50

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 7

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 50

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Thr Ser Gly Asp Leu Val Arg}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 51

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 7

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 51

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Ser Ser Gln Thr Leu Val Arg}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 52

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 7

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 52

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Thr Ser Gln Thr Leu Thr Arg}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 53

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 7

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 53

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Thr Ser Gly Glu Leu Lys Arg}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 54

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 7

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 54

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Gln Ser Ser Asp Leu Val Arg}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 55

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 7

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 55

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Ser Ser Gly Thr Leu Val Arg}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 56

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 7

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 56

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Thr Pro Gly Thr Leu Val Arg}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 57

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 7

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 57

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Thr Ser Gln Asp Leu Lys Arg}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 58

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 7

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 58

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Thr Ser Gly Thr Leu Val Arg}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 59

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 7

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 59

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Gln Ser Ser His Leu Val Arg}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 60

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 7

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 60

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Gln Ser Gly His Leu Val Arg}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 61

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 7

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

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<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 61

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Gln Pro Gly His Leu Val Arg}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 62

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 7

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 62

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Glu Arg Ser Lys Leu Ala Arg}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 63

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 7

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 63

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Asp Pro Gly His Leu Ala Arg}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 64

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 7

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 64

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Gln Arg Ala Lys Leu Glu Arg}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 65

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 7

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 65

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Gln Ser Ser Lys Leu Val Arg}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 66

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 7

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 66

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Asp Arg Ser Lys Leu Ala Arg}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 67

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 7

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<212> PRT

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<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 67

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Asp Pro Ser Lys Leu Ala Arg}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 68

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 7

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 68

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Arg Ser Asp Lys Leu Thr Arg}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 69

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 7

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 69

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Arg Ser Asp His Leu Thr Arg}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 70

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 7

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 70

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Lys Ser Ala Lys Leu Glu Arg}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 71

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 7

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 71

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Thr Ala Asp His Leu Ser Arg}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 72

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 7

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 72

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\sa{Thr Ala Asp Lys Leu Ser Arg}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

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\vskip0.400000\baselineskip

<211> 7

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<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

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<220>

\vskip0.400000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 73

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\sa{Thr Pro Gly His Leu Val Arg}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 74

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 7

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

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<220>

\vskip0.400000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 74

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\sa{Thr Ser Ser His Leu Val Arg}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 75

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 7

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<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 75

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Thr Ser Gly Lys Leu Val Arg}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 76

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 7

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<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 76

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Gln Pro Gly Glu Leu val Arg}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 77

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 7

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 77

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Gln Ser Gly Glu Leu Val Arg}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 78

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 7

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<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 78

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\sa{Gln Ser Gly Glu Leu Arg Arg}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 79

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 7

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 79

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Asp Pro Gly Ser Leu Val Arg}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 80

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 7

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 80

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Arg Lys Asp Ser Leu Val Arg}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 81

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 7

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 81

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Arg Ser Asp Val Leu Val Arg}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 82

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 7

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 82

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Arg His Asp Ser Leu Leu Arg}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 83

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 7

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 83

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Arg Ser Asp Ala Leu Val Arg}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 84

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 7

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 84

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Arg Ser Ser Ser Leu Val Arg}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 85

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 7

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 85

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Arg Ser Ser Ser His Val Arg}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 86

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 7

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 86

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Arg Ser Asp Glu Leu Val Lys}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 87

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 7

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 87

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Arg Ser Asp Ala Leu Val Lys}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 88

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 7

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 88

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Arg Ser Asp Val Leu Val Lys}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 89

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 7

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

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<220>

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 89

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\sa{Arg Ser Ser Ala Leu Val Arg}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

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\vskip0.400000\baselineskip

<211> 7

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<212> PRT

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<213> Secuencia artificial

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<220>

\vskip0.400000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 90

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\sa{Arg Lys Asp Ser Leu Val Lys}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 91

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 7

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<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 91

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\sa{Arg Ser Ala Ser Leu Val Arg}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 92

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 7

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 92

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Arg Ser Asp Ser Leu Val Arg}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 93

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 7

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 93

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Arg Ile His Ser Leu Val Arg}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 94

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 7

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 94

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Arg Pro Gly Ser Leu Val Arg}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 95

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 7

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 95

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Arg Gly Pro Ser Leu Val Arg}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 96

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 7

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 96

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Arg Pro Gly Ala Leu Val Arg}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 97

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 7

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 97

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Lys Ser Ala Ser Leu Val Arg}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 98

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 7

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 98

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Lys Ser Ala Ala Leu Val Arg}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 99

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 7

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<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 99

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Lys Ser Ala Val Leu Val Arg}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 100

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 7

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 100

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Thr Ser Gly Ser Leu Thr Arg}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 101

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 7

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 101

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Thr Ser Gln Ser Leu Val Arg}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 102

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 7

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 102

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Thr Ser Ser Ser Leu Val Arg}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 103

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 7

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 103

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Thr Pro Gly Ser Leu Val Arg}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 104

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 7

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 104

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Thr Ser Gly Ala Leu Val Arg}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 105

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 7

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 105

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Thr Pro Gly Ala Leu Val Arg}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 106

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 7

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 106

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Thr Gly Gly Ser Leu Val Arg}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 107

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 7

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 107

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Thr Ser Gly Glu Leu Val Arg}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 108

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 7

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 108

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Thr Ser Gly Glu Leu Thr Arg}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 109

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 7

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 109

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Thr Ser Ser Ala Leu Val Lys}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 110

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 7

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 110

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Thr Ser Ser Ala Leu Val Arg}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 111

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 5

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: engarce de péptidos

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 111

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Thr Gly Glu Lys Pro}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 112

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 18

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: secuencia diana de e2c

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 112

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ggggccggag ccgcagtg

\hfill

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 113

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 11

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: dominio de activación mínimo de VP16

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 113

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Asp Ala Leu Asp Asp Phe Asp Leu Asp Met Leu}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 114

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 34

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: oligonucleótido diana de horquilla

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 114

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ggacgcnnnc gcgggttttc ccgcgnnngc gtcc

\hfill

34

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 115

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 66

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: oligonucleótido SPE2-3

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 115

\vskip1.000000\baselineskip

1

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 116

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 74

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: oligonucleótido SPE2-3

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 116

\vskip1.000000\baselineskip

2

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 117

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 81

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: oligonucleótido SPE2-4

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 117

\vskip1.000000\baselineskip

3

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 118

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 58

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: oligonucleótido SPE2-5

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 118

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

acgcaccagc ttgtcagagc ggctgaaaga cttgccacat tctggacatt tgtatggc

\hfill

58

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 119

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 87

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: oligonucleótido SPE2-1

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 119

\vskip1.000000\baselineskip

4

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 120

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 81

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: oligonucleótido SPE2-6

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 120

\vskip1.000000\baselineskip

5

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 121

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 18

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: parte de erbB-2 5'UTR

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 121

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ggggccggag ccgcagtg

\hfill

18

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 122

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 18

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: parte de erbB-32 5'UTR

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 122

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ggagccggag ccggagtc

\hfill

18

Claims

1. Un polipéptido de unión a nucleótido de dedo de cinc aislado y purificado que contiene al menos una región de unión a nucleótido en el que la secuencia de la región de unión es cualquiera de SEQ ID Nº 1, SEQ ID Nº 13, SEQ ID Nº 17, SEQ ID Nº 18, SEQ ID Nº 25, SEQ ID Nº 59, SEQ ID Nº 60 o SEQ ID Nº 77.

2. Una composición que comprende entre 2 y 12 polipéptidos de unión a nucleótido de dedo de cinc que tiene la secuencia de cualquiera de SEQ ID Nº 1-110, en la que al menos uno de los polipéptidos es un polipéptido se acuerdo con la reivindicación 1.

3. La composición de la reivindicación 2 que contiene entre 2 y 6 polipéptidos de unión de dedo de cinc.

4. La composición de la reivindicación 2 ó 3 en la que los polipéptidos están ligados de manera operativa.

5. La composición de cualquiera de las reivindicaciones 2 a 4 en la que los polipéptidos están ligados mediante un engarce que tiene la secuencia de SEQ ID Nº 111.

6. La composición de cualquiera de las reivindicaciones 2 a 5 en la que cada uno de los polipéptidos se une a una secuencia de nucleótidos diferentes.

7. La composición de cualquiera de las reivindicaciones 2 a 6 que se une a un nucleótido que contiene las secuencias 5'-(GNN)_{n}-3', en la que cada N es A, C, G, o T con la condición que todos los n no pueden ser C y donde n es 2 a 6.

8. El polipéptido de la reivindicación 1 ligado de manera operativa adicionalmente a uno o más factores de regulación de la transcripción.

9. La composición de cualquiera de las reivindicaciones 2 a 7 en la que los polipéptidos están ligados adicionalmente de manera operativa a uno o más factores de regulación de la transcripción.

10. Un polipéptido aislado y purificado que codifica el polipéptido de la reivindicación 1.

11. Un polipéptido aislado y purificado que codifica los polipéptidos de cualquiera de las reivindicaciones 2 a 7.

12. Un vector de expresión que contiene el polinucleótido de la reivindicación 10.

13. Un vector de expresión que contiene el polinucleótido de la reivindicación 11.

14. Uso de una composición de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 2 a 7 en la fabricación de un medicamento para regular la función de una secuencia de nucleótidos que contiene la secuencia 5'-(GNN)_{n}-3', donde n es un número entero entre 1 y 6.

15. El uso de la reivindicación 14 en el que la secuencia 5'-(GNN)_{n}-3' se localiza en la región transcrita de la secuencia de nucleótidos.

16. El uso de la reivindicación 14 en el que la secuencia 5'-(GNN)_{n}-3' se localiza en una región promotora de la secuencia de nucleótidos.

17. El uso de la reivindicación 14 en el que la secuencia 5'-(GNN)_{n}-3' se localiza dentro de una etiqueta de secuencia expresada.

18. El uso de la reivindicación 14 en el que la composición está ligada a uno o más factores de modulación de transcripción.

19. Una composición de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 2 a 7 para uso en medicina.

20. Uso de la composición de cualquiera de las reivindicaciones 2 a 7 para la fabricación de un medicamento para el tratamiento de cáncer.