ES2299494T3 - Regulacion de la expresion genica usando conmutadores polipeptidicos monomericos monocatenarios dependientes de ligandos. - Google Patents

Abstract

Un polipéptido no natural que comprende dos dominios fijadores de ligando derivados de receptores de hormonas nucleares ligado operativamente a un dominio fijador de ADN y un dominio de regulación de la transcripción, en el cual el dominio fijador de ADN comprende al menos un motivo fijador de dedo de zinc obtenido por ingeniería.

Description

Regulación de la expresión génica usando conmutadores polipeptídicos monoméricos monocatenarios dependientes de ligandos.

Campo técnico de la invención

El campo de la presente invención es la regulación de la transcripción. Más particularmente, la presente invención se refiere a polipéptidos capaces de activar o reprimir la transcripción en una forma dependiente de ligando de molécula pequeña.

Antecedentes de la invención

Los factores de transcripción diseñados con especificidad de blanco y función reguladora definidas proveen herramientas invaluables para la investigación básica y aplicada, y para la terapia génica. En consecuencia, el diseño de dominios de fijación de ADN específicos de secuencia ha sido objeto de intenso interés en las últimas dos décadas. De las muchas clases de proteínas fijadoras de ADN estudiadas, el motivo de fijación de ADN modular de dedo de zinc Cis2-His2 ha demostrado ser el más promisorio para la producción de con especificidad de unión a ADN personalizada. La nueva arquitectura de esta clase de proteínas provee la rápida construcción de dispositivos dirigidos a genes específicos. Las proteínas polidáctiles de dedo de zinc se preparan con mayor facilidad a través del ensamblado de dominios de modulares de dedos de zinc que reconocen secuencias predefinidas de tres nucleótidos (ver, por ejemplo, Segal, D. J., Dreier, B., Beerli, R. R., y Barbas, C. F., III (1999) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96, 2758-2763; Beerli, R. R., Segal, D. J., Dreier, B., y Barbas, C. F., III (1998) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95, 14628-14633; y Beerli, R. R., Dreier, B., y Barbas, C. F., III (2000) Proc. Natl. Acad Sci. USA 97, 1495-1500). Las proteínas polidáctiles se pueden ensamblar mediante el uso de cantidades variables de dominios de dedos de zinc de diversa especificidad que proveen proteínas fijadoras de ADN que no sólo reconocen secuencias nuevas sino también secuencias de longitud variada. Mediante la combinación de seis dominios de dedos de zinc, se han producido proteínas que reconocen 18 pares de bases contiguos de secuencia de ADN, una dirección de ADN suficientemente compleja para especificar cualquier sitio del genoma humano de 4 mil millones de pares de bases (o cualquier otro genoma). La fusión de las proteínas polidáctiles de dedo de zinc de este tipo a dominios de activación o represión proporciona factores de transcripción que modulan de manera eficiente y específica la expresión de transgenes y genes endógenos (Beerli, R. R., Segal, D. J., Dreier, B., y Barbas, C. F., III (1998) Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 95, 14628-14633; y Beerli, R. R., Dreier, B., y Barbas, C. F., III (2000) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97, 1495-1500).

Si bien la disponibilidad de los factores de transcripción diseñados con especificidades de unión a ADN personalizadas proporciona nuevas oportunidades para la regulación de la transcripción, otras aplicaciones estarían disponibles para los factores de transcripción dependientes de ligandos. El diseño de proteínas de dedos de zinc dependientes de moléculas pequeñas inductoras tendría numerosas aplicaciones, tanto para la regulación de genes endógenos como para el desarrollo de sistemas de expresión inducibles para la regulación de transgenes. Los factores de transcripción naturales son regulados por numerosos mecanismos diferentes, incluso la modificación posterior a la postranslación tales como la fosforilación (Janknecht, R., y Hunter, T. (1997) EMBO J 16,1620-1627; Darnell, J. E., Jr. (1997) Science 277, 1630-1635), o por unión de ligandos. Los prototipos de factores de transcripción activados por ligandos son miembros de la familia de receptores de hormonas nucleares, incluso los receptores de esteroides sexuales o adrenocorticoides (Carson-Jurica, M. A., Schrader, W. T., y O'Malley, W. (1990) Endocrine Reviews 11, 201-220; Evans, R. M. (1988) Science 240, 889-895). Estos receptores se mantienen inactivos en ausencia de la hormona, por asociación con diversos factores inactivadotes que incluyen hsp90 (Pratt, W. B., y Toft, D. O. (1997) Endocrine Rev. 18, 306-360). Ante la unión con el ligando, los receptores de hormonas nucleares se disocian del complejo inactivador, se dimerizan y adquieren capacidad para fijar el ADN y activar la transcripción (Carson-Jurica, M. A., Schrader, W. T., y O'Malley, W. (1990) Endocrine Reviews 11, 201-220; Evans, R. M. (1988) Science 240, 889-89512-14; y Pratt, W. B., y Toft, D. O. (1997) Endocrine Rev. 18, 306-360). Significativamente, no solo la fijación de la hormona, sino también la las funciones de inactivación y de dimerización residen dentro del dominio de fijación del ligando (LBD) de estas proteínas (Beato, M. (1989) Cell 56, 335-344). Este hecho ha sido explotado experimentalmente y los LBD receptores de hormonas
esteroides han hallado amplio uso como herramientas para obtener proteínas heterólogas dependientes de hormona.

En particular, se ha usado LBD de receptor de estrógeno (ER) para obtener las funciones de c-Myc (Eilers, M., Picard, D., Yamamoto, K. R., y Bishop, J. M. (1989) Nature 340, 66-68), c-Fos (Superti-Furga, G., Bergers, G., Picard, D., y Busslinger, M. (1991) Proc. NatL Acad Sci. USA 88, 5114-5118) e incluso la quinasa citoplasmática c-Raf (Samuels, M. L., Weber, M. J., Bishop, J. M., y McMahon, M. (1993) Mol. Cell. Biol. 13, 6241-6252) dependiente de hormona. A fin de desarrollar un sistema de expresión inducible para el uso en investigación básica y terapia génica, un requisito previo es la disponibilidad de reguladores de la transcripción dependientes de ligando. De preferencia, estos reguladores deberían ser activados por una molécula pequeña inductora sin otra actividad biológica, fijar secuencias específicas sólo presentes en el promotor blanco y tener baja inmunogenicidad. Varios factores de transcripción artificiales regulados por ligando han sido generados por diversos medios, mediante el uso de dominios funcionales derivados de procariontes (Gossen, M. y Bujard, H. (1992) Proc. Natl. Acad Sci. USA 89, 5547-5551 20. Gossen, M., Freundlieb, S., Bender, G., Müller, G., Hillen, W., y Bujard. H. (1995) Science 268, 1766-1769 21. Labow, M. A., Baim, S. B., Shenk, T., y Levine, A. J. (1990) Mol. Cell. Biol. 10, 3343-3356 22. Baim, S. B., Labow, M. A., Levine, A. J., y Shenk, T. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88, 5072-5076) o eucariontes (Christopherson, K. S., Mark, M. R., Bajaj, V., y Godowski, P. J. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89, 6314-6318 24. No, D., Yao, T.-P., y Evans, R. M. (1996) Proc. Natl. Acad Sci. USA 93, 3346-3351 25. Wang, Y., O'Malley, B. W., Jr., Tsai, S., y O'Malley, B. W. (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91, 8180-8184 Beerli et al. -35-26. Wang, Y., Xu, J., Pierson, T., O'Mallei, B. W., y Tsai, S. Y. (1997) Gene Therapy 4, 432-441 27. Braselmann, S., Graninger, P., y Busslinger, M. (1993) Proc. Natl. Acad Sci. USA 90, 1657-1661 28. Louvion, J. F., Havaux-Copf, B., y Picard, D. (1993) Gene 131, 129-134.29. Rivera. V. M., Clackson, T. Natesan. S., Pollock, R., Amara, J. F., Keenan, T., Magari, S. R., Phillips, T., Courage, N. L., Cerasoli, F., Jr., Holt, D. A., y Gilman, M. (1996) Nature. Med 2, 1028-1032).

De los dominios funcionales derivados de proteínas eucariontes, los LBD de receptores de hormonas nucleares han sido los más ampliamente usados. Whitelaw M. L et al., EMBO J. 12 (1993), 4169-4179 y Whitelaw M. L. et al., MCB 14, (1994), 8343-8355 describen quimeras entre los receptores nucleares para glucocorticoides y dioxina.

El documento WO-A-O1/36447, que representa técnica previa según el artículo Art. 54(3) EPC, describe proteínas quiméricas que tienen al menos dos unidades de proteína funcionales, en donde cada unidad comprende el dominio de dimerización de un miembro de la superfamilia de receptores nucleares de hormonas esteroides/tiroides. Cada unidad puede contener un dominio fijador de ligando, un dominio fijador de ADN y un dominio de activación. En particular, se han descrito reguladores basados en el dominio fijador de ADN Gal4 (DBD) fusionado a un ER humano (Braselmann, S., Graninger, P., y Busslinger, M. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90,1657-1661; Louvion, J. F., Havaux-Copf, B., y Picard, D. (1993) Gene 131,129-134) o LBD de receptor de progesterona (PR); (Wang, Y., O'Malley, B. W., Jr., Tsai, S., y O'Malley, B. W. (1994) Proc. Natl. Acad Sci. USA 91, 8180-8184; Wang, Y., Xu, J., Pierson, T., O'Malley, B. W., y Tsai, S. Y. (1997) Gene Therapy 4, 432-441), además del sistema inducible por ecdisona basado en el receptor de ecdisona de Drosophila (EcR) y el receptor X de retinoide de mamífero (RXR) (Christopherson, K. S., Mark, M. R, Bajaj, V., y Godowski, P. J. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89, 6314-6318; No, D., Yao, T.-P., y Evans, R. M. (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93, 3346-3351). Comparados con el sistema heterodimérico EcR/RXR, los reguladores basados en los LBD de ER y PR tienen la importante ventaja de que actúan como homodímeros y requieren la provisión de sólo un cADN. Sin embargo, si bien la ecdisona no tiene ningún efecto biológico conocido sobre las células de mamíferos, el estrógeno y la progesterona desencadenan una respuesta biológica en células o tejidos que expresan los receptores de esteroides endógenos. Con la disponibilidad de LBD de ER mutado y PR truncado que han perdido su capacidad de respuesta a sus ligandos naturales pero no a los antagonistas sintéticos tales como 4-hidroxitamoxifeno (4-OHT) (Littlewood, T. D., Hancock, D. C., Danielian, P. S., Parker, M. G., y Evan, G. L (1995) Nucl. Acids Res. 23, 1686-1690) o RU486 (Vegeto, E., Allan, G. F., Schrader, W. T., Tsai, M.-J., McDonnell, D. P., y O'Malley, B. W. (1992) Cell 69, 703-713), respectivamente, esto ya no representa un gran problema. En consecuencia, se pueden desarrollar sistemas de expresión inducible en base de LBD de receptores de hormonas que actúan de manera independiente de los receptores de esteroides endógenos. Hasta la fecha, se ha demostrado esto para PR LBD a través del desarrollo de un sistema de expresión inducible por RU486 basado en Gal4 DBD (Wang, Y., O'Malley, B. W., Jr., Tsai, S., y O'Malley, B. W. (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91, 8180-8184; Wang, Y., Xu, J., Pierson, T., O'Malley, B. W., y Tsai, S. Y. (1997) Gene Therapy 4, 432-441). Hasta el momento no se ha descrito un sistema de expresión inducible basado en un LBD (G525R) ER con mutación puntual (Littlewood, T. D., Hancock, D. C., Danielian, P. S., Parker, M. G., y Evan, G. L (1995) Nucl. Acids Res. 23, 1686-1690) que ha perdido la capacidad de respuesta a estrógeno pero no al antagonista 4-OHT. Las proteínas de dedo de zinc diseñadas tienen varias ventajas, comparadas con otras DBD, incluso la derivada de Gal4, dado que la capacidad de obtener especificidades de fijación de ADN por ingeniería permite dirigir los reguladores dependientes de ligando hacia cualquier promotor artificial o natural deseado. Aquí se explora la utilidad de las proteínas de fusión entre las proteínas de dedo de zinc diseñadas y los LBD de receptores de hormonas nucleares para el control inducible de la expresión génica.

Breve sumario de la invención

La presente invención provee un polipéptido no natural que contiene dos dominios fijadores de ligando ligados operativamente entre sí, un primer dominio funcional que es un dominio de fijación de ADN ligado operativamente a uno de los dominios fijadores de ligando, y un segundo dominio funcional que es un dominio de regulación de la transcripción. Los dominios fijadores de ligando de preferencia están ligados covalentemente entre sí. Con mayor preferencia, los dos dominios fijadores están ligados covalentemente mediante un péptido ligador que contiene de aproximadamente 10 a aproximadamente 40 residuos de aminoácidos, preferiblemente de aproximadamente 15 a aproximadamente 35 residuos de aminoácidos y con mayor preferencia de aproximadamente 18 a aproximadamente 30 residuos de aminoácidos.

Los dominios fijadores de ligando derivan de receptores de hormonas nucleares. Los dominios fijadores de ligando se pueden derivar de receptores de hormonas nucleares iguales o diferentes. Los ejemplos preferidos de receptores de hormonas nucleares son receptores de hormonas esteroides tales como un receptor de estrógeno, un receptor de progesterona, un receptor de ecdisona y un receptor de retinoide X.

El primer dominio funcional altera la función o la actividad de un nucleótido blanco y es un dominio fijador de ADN. El dominio fijador de ADN de preferencia contiene al menos un motivo fijador de ADN de dedo de zinc obtenido por ingeniería, con mayor preferencia entre dos y doce motivos fijadores de ADN de dedo de zinc y, con aún mayor preferencia, entre tres y seis motivos fijadores de ADN de dedo de zinc. En una forma de realización, los motivos fijadores de ADN de dedo de zinc se unen específicamente a una secuencia de nucleótidos de la fórmula (GNN)_{1-6}, en donde G es guanidina y N es cualquier nucleótido. En otra forma de realización, el primer dominio, el segundo dominio funcional es un dominio regulador de la transcripción tal como un dominio de activación de la transcripción o un dominio de represión de la transcripción.

En una forma de realización, un polipéptido de la presente invención incluye (a) un dominio fijador de ADN que tiene de tres a seis motivos fijadores de ADN de dedo de zinc; (b) un primer dominio fijador de ligando derivado de un receptor de retinoide X ligado operativamente al dominio fijador de ADN, un segundo dominio fijador de ligando derivado de un receptor de ecdizona ligado al primer dominio fijador de ligando con un espaciador de péptidos de 18 a 36 residuos de aminoácidos; y (c) un dominio regulador de la transcripción ligado operativamente al segundo dominio de fijación.

En aún otra forma de realización, un conmutador génico de polipéptido incluye (a) un dominio fijador de ADN que tiene entre tres y seis motivos fijadores de ADN de dedo de zinc; (b) un primer dominio fijador de ligando derivado de un receptor de progesterona ligado operativamente al dominio fijador de ADN, un segundo dominio fijador de ligando derivado de un receptor de progesterona ligado al primer dominio fijador de ligando con un espaciador de péptidos de entre 18 y 36 residuos de aminoácidos; y (c) un dominio regulador de la transcripción ligado operativamente al segundo dominio fijador de ligando.

En otro aspecto, la presente invención provee polinucleótidos que codifican un conmutador génico de polipéptido de la invención, vectores de expresión que contienen dichos polinucleótidos y células que contienen dichos nucleótidos.

Otro aspecto de la presente invención provee un procedimiento para regular la función de un nucleótido blanco que contiene una secuencia definida. El proceso incluye la etapa de exponer in vitro o ex vivo el nucleótido blanco a un polipéptido de la presente invención en presencia de un ligando que se fija al menos a uno de los dominios fijadores de ligando del polipéptido. En un aspecto relacionado, la presente invención provee un proceso para regular la transcripción (por ejemplo, la expresión) de un nucleótido blanco (por ejemplo, un gen). De conformidad con dicho proceso, un nucleótido blanco que contiene una secuencia definida se expone a un polipéptido de la presente invención en presencia de un ligando que se fija al menos a uno de los dominios fijadores de ligando de dicho polipéptido. El polipéptido contiene un dominio fijador de ADN que se fija específicamente a la secuencia definida en el nucleótido blanco. Cuando el conmutador génico de polipéptido contiene un dominio de represión de la transcripción, la regulación es una represión. Cuando el conmutador génico de polipéptido contiene un a dominio de activación de la transcripción, la regulación es activación.

Breve descripción de los dibujos

En los dibujos que conforman una porción de la memoria descriptiva:

La Figura 1 muestra la generación de proteínas de dedo de zinc diseñadas con nueva especificidad de fijación de. A, secuencia de aminoácidos de las proteínas de tres dedos B3 y N1. Las posiciones de hélice de reconocimiento de ADN -2 a 6, mostradas en letras en negrita imprenta, se injertaron en el armazón de la proteína de tres dedos Sp1C. La ubicación de las láminas \beta antiparalelas y las hélices \alpha, referencias estructurales de los dominios de dedos de zinc, son tal como se indica. La especificidad de fijación de ADN de cada dedo se muestra a la izquierda. F1-3, dedo 1-3. B, análisis por ELISA de la especificidad de unión de ADN. Las proteínas de dedo de zinc se expresaron en E. coli como fusiones de MBP y se purificaron. La especificidad de unión se analizó por medición de la unión a oligonucleótidos de horquilla biotinilados inmovilizados que contienen las secuencias 5'-(GNN)3-3' indicadas. Barras negras, B3; barras grises, N1. Las señales máximas se normalizaron respecto de 1. El valor K_{D} para la unión con la secuencia blanco específica se midió por ensayo de cambio de movilidad electroforética y se rotuló en la parte superior de las barras correspondientes.

La Figura 2 muestra la regulación de la expresión génica de construcciones de fusión ER de monocatenarias dependientes de hormona. A, estructura de proteínas de fusión ER. E2C, proteínas de seis dedos; L, péptido ligador flexible. B, las proteínas de fusión con LBD ER único se unen como dímeros. Las células HeLa se cotransfectaron con un vector de expresión C7-ER-VP64 y los plásmidos informadores de luciferasa TATA indicado portan uno o dos sitios fijadores de C7. 24 h después de la transfección, en la que las células se dejaron sin tratar (-), o se añadió 100 nM de 4-OHT (+). Se midió la actividad de luciferasa en extractos de células totales 48 h después de la transfección. Cada barra representa el valor medio (+/- DE) de las mediciones por duplicado. C, plásmido control pcADN3 que no expresa una proteína de fusión. C, D, regulación de la transcripción a través de un único sitio de unión mediante proteínas de fusión con dos ER-LBD. Las células HeLa se cotransfectaron con los vectores de expresión indicados y el plásmido informador de luciferasa E2C-TATA, portador de un único sitio de fijación corriente arriba de una caja TATA.
La inducción de 4-OHT y la medición de la actividad de luciferasa se llevaron a cabo tal como se describe en B.

La Figura 3 muestra la regulación de la expresión génica mediante construcciones de fusión RXR/EcR monocatenarias dependientes de hormona. A, estructura de proteínas de fusión RXR/EcR monocatenarias. B, regulación de la transcripción a través de un único sitio de fijación. Las células HeLa se cotransfectaron con los vectores de expresión indicados y el plásmido informador de luciferasa E2C-TATA, portador de un único sitio de unión E2C. 24 h después de la transfección, las células se dejaron sin tratar (-), o se añadió 5 \muM de ponasterona A (+). Se midió la actividad de luciferasa en extractos celulares totales 48 h después de la transfección. Cada barra representa el valor medio (+/- DE) de mediciones por duplicado. pcADN3.1, plásmido control que no expresa una proteína de fusión.

La Figura 4 muestra el nucleótido (SEQ ID NO: 31) y la secuencia de residuos de aminoácidos (SEQ ID NO: 32) del dominio de fijación de dedo de zinc B3B.

La Figura 5 muestra el nucleótido (SEQ ID NO: 33) y la secuencia de residuos de aminoácidos (SEQ ID NO: 34) del dominio de fijación de dedo de zinc 2C7.

La Figura 6 muestra el nucleótido (SEQ ID NO: 35) y la secuencia de residuos de aminoácidos (SEQ ID NO: 36) del dominio de fijación de dedo de zinc B3C2.

La Figura 7 muestra el nucleótido (SEQ ID NO: 37) y la secuencia de dominio de represión (KRAB-_A)2.

La Figura 8 muestra el nucleótido (SEQ ID NO: 38) y la secuencia de dominio de represión (SID)2.

La Figura 9 muestra el nucleótido (SEQ ID NO: 39) y la secuencia de residuos de aminoácidos (SEQ ID NO: 40) del polipéptido E2C-ER-L-ER-VP64.

La Figura 10 muestra el nucleótido (SEQ ID NO: 41) y la secuencia de residuos de aminoácidos (SEQ ID NO: 42) del polipéptido E2C-ER-LL-ER-VP64.

Descripción detallada de la invención I. La invención

La presente invención provee un conmutador génico de polipéptidos, los polinucleótidos que codifican dichos polipéptidos, los vectores de expresión que contienen dichos polinucleótidos, las células que contienen dichos vectores de expresión o polinucleótidos y los procesos para regular la función de los nucleótido blanco mediante el uso de dichos polipéptidos, polinucleótidos y vectores de expresión. A diferencia de los conmutadores génicos existentes que contienen un único dominio fijador de ligando junto con un dominio fijador de ADN y/o un dominio regulador de la transcripción, el conmutador génico de polipéptidos de la presente invención contiene dos dominios fijadores de ligando. Tras la fijación del ligando, ocurre un cambio intramolecular de la configuración que permite el alineamiento de los dominios funcionales del gen blanco de interés. En consecuencia, una ventaja de los presentes conmutadores génicos respecto de los conmutadores génicos existentes es la necesidad de sólo un único conmutador molecular y un único vector de expresión para la producción de dicho conmutador.

II. Polipéptidos

Un conmutador génico de polipéptido de la presente invención incluye dos dominios fijadores de ligando (LBD) y un primer dominio funcional (FD-1). Los dominios fijadores de ligando están ligados operativamente al primer dominio funcional de manera tal que el polipéptido, en presencia de un ligando definido que se fija al menos a uno de los dominios fijadores de ligando, puede alterar la función del nucleótido. Los dominios se pueden disponer en cualquier orden. Tal como se muestra más adelante, los dominios fijadores de ligando se pueden situar en dirección amino o carboxilo terminal respecto del primer dominio funcional.

1

Un polipéptido de la presente invención no es natural. Tal como se usa en la presente, el término "no es natural" significa, por ejemplo, uno o más de los siguientes: (a) un péptido que comprende una secuencia de aminoácidos no natural; (b) un péptido que tiene una estructura secundaria no natural no asociada con el péptido tal como se encuentra en la naturaleza; (c) un péptido que incluye uno o más aminoácidos no asociados normalmente con las especies de organismo en las cuales el péptido aparece en la naturaleza; (d) un péptido que incluye un estereoisómero de uno o más de los aminoácidos que comprenden el péptido, en el que el estereoisómero no está asociado con el péptido tal como se encuentra en la naturaleza; (e) un péptido que incluye uno o más restos químicos distintos de uno de los aminoácidos naturales; o (f) una porción aislada de una secuencia de aminoácidos natural (por ejemplo, una secuencia truncada). Un polipéptido de la presente invención existe en forma aislada y purificada para estar sustancialmente libre de sustancias contaminantes. Un polipéptido es sintético por naturaleza. Es decir, el polipéptido se aísla y se purifica de fuentes naturales o se fabrica de novo que utiliza técnicas bien conocidas en la técnica.

A. Dominio fijador de ligando (LBD)

Cada LBD es una secuencia de residuos de aminoácidos capaz de fijarse y se fija a un ligando particular. La fijación del ligando al LBD altera la conformación/función del polipéptido y permite regular una función de un nucleótido blanco. En ausencia de ligando, el conmutador génico no actúa alterando la función del nucleótido. Al menos uno de los LBD es capaz de fijar y se fija a un ligando particular. Ambos LBD se pueden fijar a un ligando particular. En consecuencia, los LBD pueden ser iguales o diferentes. Los LBD preferidos derivan de receptores de hormonas nucleares tales como los receptores de hormonas esteroides.

Los ejemplos preferidos de receptores de esteroides que pueden actuar como fuente de dominios fijadores de ligando incluyen el receptor de estrógeno (ER), el receptor de progesterona (PR), el receptor de \alpha-glucocorticoides, el receptor de \beta-glucocorticoides, el receptor de mineralocorticoides, el receptor de andrógenos, el receptor de hormona tiroidea, el receptor de ácido retinoico (RAR), el receptor de retinoide X (RXR), el receptor de vitamina D, el receptor COUP-TF, el receptor de ecdisona (EcR), el receptor Nurr-1 y receptores huérfanos. Un EcR de preferencia deriva de Drosophila melanogaster (DE) o Bombyx (BE).

Tal como es bien conocido en la técnica, las hormonas esteroides se componen de un dominio fijador de ADN y un dominio fijador de ligando. El dominio fijador de ADN contiene el receptor que regula la secuencia y fija el ADN y el dominio fijador de ligando fija el compuesto biológico específico (ligando) a fin de activar el receptor. El término "ligando" se refiere a cualquier compuesto que activa el receptor, usualmente por interacción con (fijación) el dominio fijador de ligando del receptor. Sin embargo, los ligandos también incluyen compuestos que activan el receptor sin fijación. Cuando se una en un conmutador génico de polipéptido de la presente invención, se prefiere que el dominio receptor de ligando esté modificado respecto del ligando natural, como ligando distinto del ligando natural (por ejemplo de hormona esteroide). Las formas de alterar o derivar los dominios fijadores de ligando naturales de receptor de hormona nuclear para alterar la especificad de unión son bien conocidos en la técnica (ver, por ejemplo las patentes de los Estados Unidos N.º 5.874.534 y 5.599.904). De modo similar, se han informado medios para alterar el receptor de estrógeno a fin de modificar su afinidad de unión [ver, por ejemplo Littlewood et al., Nucleic Acids Res., 3(10):1686-1690,1995].

El término "ligando natural" se refiere a compuestos que normalmente no se encuentran en animales o humanos y que se fijan al dominio fijador de ligando de un receptor. El ligando también puede ser un "ligando no nativo", un ligando que no se encuentra naturalmente en el organismo específico (humano o animal) en el cual se contempla la terapia génica. Por ejemplo, ciertas hormonas de insectos tales como ecdisona no se encuentran en humanos. Este es un ejemplo de una hormona no nativa del animal o humano.

Los ejemplos de ligandos no naturales, antihormonas y ligandos no nativos incluyen los siguientes: 11\beta-(4-dimetilaminofenil)-17\beta-hidroxi-17\alpha-propinil-4,9-estradieno-3-ona (Ru38486 o Mifepestone); 11\beta-(4-dimetilaminofenil)-17\alpha-hidroxi-17\beta-(3-hidroxipropil)-13\alpha-metil-4,9-gonadieno-3-ona (ZK98299 u Onapristone); 11\beta-(4-acetilfenil)-17\beta-hidroxi-17\alpha(1-propinil)-4,9-estradieno-3-ona (ZK112993); 11\beta-(4-dimetilaminofenil)-17\beta-hidroxi-17\alpha-(3-hidroxi-1(Z)-propenil-estra-4,9-dieno-3-ona (ZK98734); (7\beta11\beta17\beta)-11-(4-dimetilaminofenil)-7-metil-4',5'-dihi-
drospiroil ester-4,9-dieno-17,2'(3'H)-furan-3-ona (Org31806): (11\beta,14\beta,17\alpha)-4',5'-dihidro-11-(4-dimetilaminofenil)
i'spirostra-4,9-dieno-17,2'(3,H)-furan-3-ona (Org31376); 5-alfa-pregnano-3,2-diona. Otros ligandos no naturales incluyen, en general, compuestos sintéticos no esteroides estrogénicos o antiestrogénicos, definidos ampliamente como moduladores selectivos de receptores de estrógenos (SERMS). Los ejemplos de compuestos incluyen, sin limitaciones, tamoxifeno y raloxifeno.

Los ejemplos de ligandos preferidos para el uso con diversos dominios fijadores de ligando son (1) EcR: Ponasterona a, Muristerona A, GS-E (Invitrogen), Tebufenocida; (2) ER: antagonistas de estrógeno tales como 4-hidroxi-tamoxifeno, ICI 164384, RU 54876, Raloxifeno; y (3) PR: antagonistas de progesterona tales como RU 486, RU 38486 y Onapristona.

Un LBD especialmente preferidos derivado de un receptor de progesterona comprende los residuos de aminoácidos 645-914 del receptor humano de progesterona. Un ejemplo de LBD derivado de un receptor de estrógeno comprende los residuos de aminoácidos 282-599 del mutante murino G225R.

Los dos LBD están separados por un ligador de secuencia de residuos de aminoácidos que contiene de aproximadamente 10 a aproximadamente 50 residuos de aminoácidos. De preferencia, el espaciador contiene de aproximadamente 15 a aproximadamente 40 residuos de aminoácidos y, con mayor preferencia, de aproximadamente 18 a aproximadamente 35 residuos de aminoácidos. Los ejemplos preferidos de espaciadores contienen 18 (L), 30 (LL), o 36 (LLL) residuos de aminoácidos.

\vskip1.000000\baselineskip

B. Dominios funcionales

Un segundo componente de uno de los presentes polipéptidos es un dominio funcional. Tal como se usa en la presente, el término "dominio funcional" y sus equivalentes gramaticales significan una secuencia de residuos de aminoácidos que se fina, altera la estructura y/o altera la función de un nucleótido. Los ejemplos de dichos dominios funcionales incluyen dominios de fijación de nucleótidos, dominios reguladores de la transcripción (por ejemplo los dominios de activación de la transcripción y los dominios de represión de la transcripción) y dominios que tienen actividad de nucleasa. Dichos dominios son bien conocidos en la técnica.

\vskip1.000000\baselineskip

1. Dominios de fijación de nucleótidos

Un dominio funcional de un polipéptido puede ser un dominio fijador de ADN, una secuencia de residuos de aminoácidos que reconoce y se fija a una secuencia de ADN definida. Las secuencias de residuos de aminoácidos que reconocen y se fijan a secuencias de ADN definidas son bien conocidas en la técnica (por ejemplo, GAL4). El dominio fijador de ADN de un conmutador génico de polipéptido de la presente invención comprende uno o más motivos de dedos de zinc fijadores de ADN obtenidos por ingeniería. Dichos motivos fijadores de ADN de dedo de zinc son bien conocidas en la técnica (ver, por ejemplo, solicitudes de patente PCT N.º WO95/19421 y WO 98/54311).

Un dominio fijador de ADN de un conmutador génico de polipéptido de la presente invención, en consecuencia, de preferencia incluye un dedo múltiple, polidáctil, péptido de dedo de zinc que está diseñado para fijar secuencias específicas de nucleótidos blanco.

La presente descripción se basa en el reconocimiento de las características estructurales singulares del dominio de dedo de zinc Cis2-His2 que consiste en un simple plegamiento \beta\beta\alpha de aproximadamente 30 aminoácidos de longitud. La estabilidad estructural de este plegamiento se logra mediante interacciones hidrofóbicas y por quelación de un único ión zinc mediante los residuos conservados Cis2-His2 (Lee, M. S., Gippert, G. P., Soman, K. V., Case, D. A. & Wright, P. E. (1989) Science 245, 635-637). El reconocimiento de los ácidos nucleicos se logra mediante contactos específicos de las cadenas laterales de los aminoácidos que se originan en las hélices \alpha del dominio, los cuales generalmente fijan tres pares de bases de la secuencia de ADN (Pavletich, N. P. & Pabo, C.O. (1991) Science 252, 809-17, Elrod-Erickson, M., Rould, M. A., Nekludova, L. & Pabo, C. O. (1996) Structure 4, 1171-1180). A diferencia de otros motivos de reconocimiento de ácidos nucleicos, la unión covalente simple de múltiples dominios de dedo de zinc permite reconocer extensas secuencias asimétricas de ADN.

Los estudios de proteínas natural de dedo de zinc han demostrado que tres dominios de dedo de zinc pueden fijar 9 bp de secuencias de ADN contiguas (Pavletich, N. P. & Pabo, C.O. (1991) Science 252, 809-17., Swimoff, A. H. & Milbrandt, J. (1995) Mol. Cell. Biol. 15, 2275-87). Mientras que el reconocimiento de 9 bp de secuencia es insuficiente para especificar un sitio singular dentro de incluso el menor genoma de E. coli, las proteínas polidáctiles que contienen dominios de seis dedos de zinc pueden especificar el reconocimiento de 18 bp (Liu, Q., Segal, DJ., Ghiara, J.B. & Barbas III, C. F. (1997) Proc. Natl. Acad Sci. USA 94, 5525-5530). Respecto del desarrollo de un sistema universal para el control génico, el control de 18 bp puede ser suficiente para especificar un sitio único dentro de todos los genomas conocidos. Y recientemente se demostró su eficacia en la activación y la represión génica dentro de células humanas vivas (Liu, Q., Segal, D. J., Ghiara, J. B. & Barbas III, C. F. (1997) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94, 5525-5530).

El dominio peptídico fijador de nucleótido de dedo de zinc obtenido por ingeniería se puede derivar o producir a partir de una proteína de tipo salvaje por truncación o expansión, o como variante del polipéptido derivado del tipo salvaje mediante un proceso de mutagénesis dirigida a sitio, o por una combinación de los procedimientos. El término "truncado" se refiere a un polipéptido fijador de nucleótido de dedo de zinc que contiene menos que la cantidad total de dedos de zinc hallados en la proteína fijadora de dedo de zinc nativa o que ha sido eliminada de las secuencias no deseadas. Por ejemplo, la truncación de la proteína fijadora de nucleótido de dedo de zinc TFIIIA, que naturalmente contiene nueve dedos de zinc, puede ser un polipéptido con sólo uno a tres dedos de zinc. La expansión se refiere a un polipéptido de dedo de zinc al cual se han añadido módulos de dedo de zinc adicionales. Por ejemplo, TFIIIA se puede extender a 12 dedos por añadido de 3 módulos de dedos de zinc a partir de más de un polipéptido de tipo salvaje, lo cual da por resultado un polipéptido fijador de nucleótido de dedo de zinc "híbrido".

El término "mutagenizado" se refiere a un polipéptido fijador de nucleótido de dedo de zinc derivado que se ha obtenido al realizar cualquiera de los procedimientos conocidos para obtener mutagénesis aleatoria o dirigida a sitio de las proteínas codificadoras de ADN. Por ejemplo, en TFIIIA, la mutagénesis se puede preformar a fin de reemplazar residuos no conservados en una o más de las repeticiones de la secuencia de consenso. Las proteínas fijadoras de nucleótido de dedo de zinc truncadas también se pueden mutagenizar. Los ejemplos de proteínas fijadoras de nucleótido de dedo de zinc también se pueden mutagenizar. Los ejemplos polipéptidos fijadores de nucleótido de dedo de zinc conocidos que se pueden truncar, expandir y/o mutagenizar de acuerdo con la presente invención a fin de inhibir la función de una secuencia de nucleótidos que contienen un motivo fijador de nucleótido de dedo de zinc incluyen TFIIIA y zif268. Otras proteínas fijadoras de nucleótido de dedo de zinc serán conocidas por los expertos en la técnica.

En el dominio fijador de ADN de dedo de zinc, se puede preparar usando diversas técnicas estándar bien conocidas en la técnica. Las bibliotecas de presentación de fagos de proteínas de dedos de zinc han sido creadas y seleccionadas en condiciones que favorecen el enriquecimiento de proteínas específicas de secuencia. Los dominios de dedo de zinc reconocen una cantidad de secuencias que requieren refinamiento mediante mutagénesis dirigida a sitio guiada por datos de selección de fagos e información estructural.

Un dominio fijador de ADN usado en un polipéptido de la presente invención de preferencia es un péptido fijador de nucleótido de dedo de zinc que se fija a una secuencia de nucleótidos (GNN)_{1-6}. Los dedos de zinc que se fijan específicamente a (GNN)_{1-6} han sido descritos en la solicitud de patente de los Estados Unidos Serie Número 09/173.941, presentada el 16 de octubre de 1998.

Los ejemplos preferidos de dominios fijadores de ADN de dedos de zinc se designan en la presente E2C, C7, B3B, 2C7, B3C2 y N1. Una descripción detallada de la preparación de los conmutadores génicos de polipéptidos que contienen dominios fijadores de ADN de dedo de zinc se encuentran en adelante en los Ejemplos. Los residuos de aminoácidos y las secuencias de nucleótidos codificadoras para B3B, 2C7 y B3C2 se muestran en las Fig. 4-6, respectivamente.

2. Dominios reguladores de la transcripción

Un dominio regulador de la transcripción se refiere a un péptido que actúa para activar o reprimir la transcripción de un nucleótido blanco (por ejemplo, un gen). Los dominios de activación de la transcripción son bien conocidos en la técnica (ver. por ejemplo, Seipel et al., (1992) EMBO J., 11.4961-4969). Los ejemplos preferidos de dominios de activación de la transcripción incluyen VP16, TA2, VP64, STAT6, relA, TAF-1, TAF-2, TAU-1 y TAU-2. Los dominios de activación especialmente preferidos para el uso en la presente invención son VP16 y VP64. Los medios para fijar VP16 y VP64 a los dominios fijadores de ligando se establecen en adelante en los Ejemplos.

Los dominios represores de la transcripción también son bien conocidos en la técnica. Los ejemplos preferidos de dichos represores de la transcripción son ERD, KRAB, SID, histonadesacetilasa, ADN, metilasa y sus derivados, multímeros y sus combinaciones tales como KRAB-ERD, SID-ERD, (ERAB)2, (KRAB)3, KRAB-A, (KRAB-A)2, (SID)2, (KRAB-A)-SID y SID-(KRABA). Un primer dominio represor se puede preparar usando el dominio de caja asociada a Kr\etappel- (KRAB) (Margolin et al., 1994). Este dominio represor generalmente se encuentra en el N terminal de las proteínas de dedo de zinc y presuntamente ejerce su actividad represora sobre la transcripción dependiente de TATA en forma independiente de la distancia y la orientación, al interactuar con la proteína de dedos RING KAP-1. Se puede utilizar el dominio KRAB hallado entre los aminoácidos 1 y 97 de la proteína de dedo de zinc KOX1. Por último, a fin de explorar la utilidad de la histonadesacetilación para la represión, se pueden fusionar los aminoácidos 1 a 36 del dominio de interacción Mad mSIN2 (SID) con otro dominio (Ayer et al., 1996). Este pequeño dominio se encuentra en el N terminal del factor de transcripción Mad y es responsable de mediar la represión de la transcripción al interactuar con mSIN3, el cual a su vez interactúa con el correpresor N-CoR y con la histonadesacetilasa mRPD1.

Los residuos de aminoácidos y nucleótidos que codifican las secuencias de los dominios preferidos de represión de la transcripción (KRAB-A)2 y (SID)2 se muestran en las Fig. 7 y 8, respectivamente. Las formas para ligar los dominios de represión a los dominios fijadores de ligando además de los ejemplos de conmutadores génicos de polipéptidos que contienen dominios de represión se establecen en adelante en los Ejemplos.

3. Conmutador génico de polipéptidos

Un polipéptido de la presente invención comprende dos dominios fijadores de ligando, un primer dominio funcional y un segundo dominio funcional. Estos dominios pueden existir en cualquier orden, tal como se muestra más adelante.

En una forma de realización preferida, los dos dominios fijadores de ligando (LBD) se ubican directamente adyacentes entre sí, es decir están "conectados en serie" dentro del conmutador génico monomérico del polipéptido de la invención y no están separados por un dominio funcional de la invención. Los LBD conectados en serie pueden estar separados entre sí por una molécula ligadora, tal como por ejemplo una molécula de polipéptido ligador.

En una forma de realización preferida, los dos LBD se ubican entre dos dominios funcionales (FD) de la invención, en los cuales un dominio funcional es un dominio regulador de la transcripción (TRD) y el otro dominio funcional es un dominio de fijación de nucleótido (NBD).

En una forma de realización particularmente preferida, el conmutador génico de polipéptido monomérico de la invención consiste en dos FD y dos LBD en el orden de secuencia FD-1/LBD-1/LBD-2/FD-2. En esta forma de realización, un dominio funcional es un TRD y el otro dominio funcional es un NBD.

De preferencia, el NBD empleado en el conmutador génico de polipéptido monomérico de la invención incluye 6 motivos fijadores de dedo de zinc. Tal como también se describe en los siguientes ejemplos, un NBD de 6 dedos de zinc empleado en un conmutador génico de polipéptido monomérico permite reconocer una singular secuencia de ácido nucleico de 18 bp, la cual puede ser simétrica o asimétrica.

2

Se ha preparado una amplia variedad de conmutadores génicos de polipéptidos. Los ejemplos de dichos conmutadores génicos incluyen (ver con anterioridad la definición de los términos):

\vskip1.000000\baselineskip

Conmutadores génicos que utilizan RXR, E2C y dominios de activación

E2C-RXR-L-DE-VP64, E2C-RXR-LL-DE-VP64, EZC-RXR-LLL-DE-VP64, E2C-RXR-L-BE-VP64, E2C-RXRLL-BE-VP64, E2C-RXR-LLL-BE-VP64, E2C-RXR-L-DE-VP16, E2C-RXR-LL-DE-VP16, E2C-RXR-LLL-DE-
VP16, E2CRXR-L-BE-VP16, E2C-RXR-LL-BE-VP16, E2C-RXR-LLL-BE-VP16.

\vskip1.000000\baselineskip

Conmutadores génicos que utilizan RXR, 2C7 y dominios de activación

2C7-RXR-L-DE-VP64, 2C7-RXR-LL-DE-VP64, 2C7-RXR-LLL-DE-VP64, 2C7-RXR-L-BE-VP64, 2C7-RXR-LLBE-VP64, 2C7-RXR-LLL-BE-VP64, 2C7-RXR-L-DE-VP16, 2C7-RXR-LL-DE-VP16, 2C7-RXR-LLL-DE-
VP16, 2C7-RXRL-BE-VP16, 2C7-RXR-LL-BE-VP16, E2C-RXR-LLL-BE-VP16.

\vskip1.000000\baselineskip

Conmutadores génicos que utilizan RXR, B3B y dominios de activación

B3B-RXR-L-DE-VP64, B3B-RXR-LL-DE-VP64, B3B-RXR-LLL-DE-VP64, B3B 7-RXR-L-BE-VP64, B3B 7-RXR-LL-BE-VP64, B3B-RXR-LLL-BE-VP64, B3B-RXR-L-DE-VP16, B3B-RXR-LL-DE-VP16, B3B-RXR-LLL-DE-VP16, B3B-RXR-L-BE-VP16, B3B-RXR-LL-BE-VP16, B3B-RXR-LLL-BE-VP16; LBD FD-1 FD-2 FD-1 FD-2 I LBD FD-1 LBD FD-2 FD-2 LBD FD-1 FD-2 FD-1 LBD.

\vskip1.000000\baselineskip

Conmutadores génicos que utilizan RXR, B3C2 y dominios de activación

B3C2-RXR-L-DE-VP64, B3C2-RXR-LL-DE-VP64, B3C2-RXR-LLL-DE-VP64, B3C2-RXR-L-BE-VP64,
B3C2-RXR-LL-BE-VP64, B3C2-RXR-LLL-BE-VP64, B3C2-RXR-L-DE-VP16, B3C2-RXR-LL-DE-VP16, B3C2-RXR-LLL-DEVP16, B3C2-RXR-L-BE-VP16, B3C2 B-RXR-LL-BE-VP16, B3C2-RXR-LLL-BE-VP16.

\vskip1.000000\baselineskip

Conmutadores génicos que utilizan RXR, E2C y dominios de represión

E2C-RXR-L-DE-(KRAB-A)2, E2C-RXR-LL-DE-(KRAB-A)2, E2C-RXR-LLL-DE-(KRAB-A)2, E2C-RXR-
LBE-(KRAB-A)2, E2C-RXR-LL-BE-(KRAB-A)2, E2C-RXR-LLL-BE-(KRAB-A)2, E2C-RXR-L-DE-(KRAB-A)2, E2C-RXRLL-DE-(KRAB-A)2, E2C-RXR-LLL-DE-(KRAB-A)2, E2C-RXR-L-BE-(KRAB-A)2, E2C-RXR-LL-BE-(KRAB-A)2, E2CRXR-LLL-BE-(KRAB-A)2, E2C-RXR-L-DE-(SID)2, E2C-RXR-LL-DE-(SID)2, E2C-RXR-LLL-DE-(SID)2, E2C-RXR-LBE-(SID)2, E2C-RXR-LL-BE-(SID)2, E2C-RXR-LLL-BE-(SID)2, E2C-RXR-L-DE-(SID)2, E2C-RXR-LL-DE-(SID)2, E2CRXR-LLL-DE-(SID)2, E2C-RXR-L-BE-(SID)2, E2C-RXR-LL-BE-(SID)2, E2C-RXR-LLL-BE-(SID)2;

\vskip1.000000\baselineskip

Conmutadores génicos que utilizan RXR, 2C7 y dominios de represión

2C7-RXR-L-DE-(KRAB-A)2, 2C7-RXR-LL-DE-(KRAB-A)2, 2C7-RXR-LLL-DE-(KRAB-A)2, 2C7-RXR-
LBE-(KRAB-A)2, 2C7-RXR-LL-BE-(KRAB-A)2, 2C7-RXR-LLL-BE-(KRAB-A)2, 2C7-RXR-L-DE-(KRAB-A)2, 2C7-RXRLL-DE-(KRAB-A)2, 2C7-RXR-LLL-DE-(KRAB-A)2, 2C7-RXR-L-BE-(KRAB-A)2, 2C7-RXR-LL-BE-(KRAB-A)2, E2CRXR-LLL-BE-(KRAB-A)2, 2C7-RXR-L-DE-(SID)2, 2C7-RXR-LL-DE-(SID)2, 2C7-RXR-LLL-DE-(SID)2, 2C7-RXR-LBE-(SID)2, 2C7-RXR-LL-BE-(SID)2, 2C7-RXR-LLL-BE-(SID)2, 2C7-RXR-L-DE-(SID)2, 2C7-RXR-LL-DE-(SID)2, 2C7-RXR-LLL-DE-(SID)2, 2C7-RXR-L-BE-(SID)2, 2C7-RXR-IL-BE-(SID)2, EZC-RXR-LLL-BE-(SID)2,n;

\vskip1.000000\baselineskip

Conmutadores génicos que utilizan RXR, B3B y dominios de represión

B3B-RXR-L-DE-(KRAB-A)2, B3B-RXR-LL-DE-(KRAB-A)2, B3B-RXR-LLL-DE-(IGtAB-A)2, B3B 7-RXR-LBE-(KRAB-A)2, B3B 7-RXR-LL-BE-(KRAB-A)2, B3B-RXR-LLL-BE-(KRAB-A)2, B3B-RXR-L-DE-(KRAB-A)2, B3B-RXRLL-DE-(KRAB-A)2, B3B-RXR-LLL-DE-(KRAB-A)2, B3B-RXR-L-BE-(KRAB-A)2, B3B-RXR-LL-BE-(KRAB-A)2, B3BRXR-LLL-BE-(KRAB-A)2, B3B-RXR-L-DE-(SID)2, B3B-RXR-LL-DE-(SID)2, B3B-
RXR-LLL-DE-(SID)2, B3B 7-RXR-LBE-(SID)2, B3B 7-RXR-LL-BE-(SID)2, B3B-RXR-LLL-BE-(SID)2, B3B-RXR-L-DE-(SID)2, B3B-RXR-LL-DE-(SID)2, B3B-RXR-LLL-DE-(SID)2, B3B-RXR-L-BE-(SID)2, B3B-RXR-LL-BE-(SID)2, B3B-RXR-LLL-BE-(SID)2.

\newpage

Conmutadores génicos que utilizan RXR, B3C2 y dominios de represión

B3C2-RXR-L-DE-(KRAB-A)2, B3C2-RXR-LL-DE-(KRAB-A)2, B3C2-RXR-LLL-DE-(KRAB-A)2, B3C2-
RXR-LBE-(KRAB-A)2, B3C2-RXR-LL-BE-(KRAB-A)2, B3C2-RXR-LLL-BE-(KRAB-A)2, B3C2-RXR-L-DE-
(KRAB-A)2, B3C2-RXR-LL-DE-(KRAB-A)2, B3C2-RXR-LLL-DE-(KRAB-A)2, B3C2-RXR-L-BE-(KRAB-A)2, B3C2 B-RXR-LL-BE-(KRABA) 2, B3C2-RXR-LLL-BE-(KRAB-A)2, B3C2-RXR-L-DE-(SID)2, B3C2-RXR-LL-DE-(SID)2, B3C2-RXR-LLL-DE-(SID)2, B3C2-RXR-L-BE-(SID)2, B3C2-RXR-LL-BE-(SID)2, B3C2-RXR-LLL-BE-(SID)2, B3C2-RXR-L-DE-(SID)2, B3C2-RXRLL-DE-(SID)2, B3C2-RXR-LLL-DE-(SID)2, B3C2-RXR-L-BE-(SID)2, B3C2 B-RXR-LL-BE-(SID)2, B3C2-RXR-LLLBE-(SID)2.

\vskip1.000000\baselineskip

Conmutadores génicos que utilizan PR, E2C y dominios de activación

E2C-PR-L-PR-VP64, E2C-PR-LL-PR-VP64, E2C-PR-LLL-PR-VP64, E2C-PR-L-PR-VP64, E2C-PR-LL-
PRVP64, E2C-PR-LLL-PR-VP64, E2C-PR-L-PR-VP16, E2C-PR-LL-PR-VP16, E2C-PR-LLL-PR-VP16, E2C-PR-L-PRVP16, E2C-PR-LL-PR-VP16, E2C-PR-LLL-PR-VP16.

\vskip1.000000\baselineskip

Conmutadores génicos que utilizan PR, 2C7 y dominios de activación

2C7-PR-L-PR-VP64, 2C7-PR-LL-PR-VP64, 2C7-PR-LLL-PR-VP64, 2C7-PR-L-PR-VP64, 2C7-PR-LL-
PRVP64, 2C7-PR-LLL-PR-VP64, 2C7-PR-L-PR-VP16, 2C7-PR-LL-PR-VP16, 2C7-PR-LLL-PR-VP16, 2C7-PR-L-PRVP16, 2C7-PR-LL-PR-VP16, E2C-PR-LLL-PR-VP16.

\vskip1.000000\baselineskip

Conmutadores génicos que utilizan PR, B3B y dominios de activación

B3B-PR-L-PR-VP64, B3B-PR-LL-PR-VP64, B3B-PR-LLL-PR-VP64, B3B 7-PR-L-PR-VP64, B3B 7-PR-LL-PR VP64, B3B-PR-LLL-PR-VP64, B3B-PR-L-PR-VP16, B3B-PR-LL-PR-VP16, B3B-PR-LLL-PR-VP16, B3B-PR-L-PRVP16, B3B-PR-LL-PR-VP16, B3B-PR-LLL-PR-VP16.

\vskip1.000000\baselineskip

Conmutadores génicos que utilizan PR, B3C2 y dominios de activación

B3C2-PR-L-PR-VP64, B3C2-PR-LL-PR-VP64, B3C2-PR-LLL-PR-VP64, B3C2-PR-L-PR-VP64, B3C2-PR-LLPR-VP64, B3C2-PR-LLL-PR-VP64, B3C2-PR-L-PR-VP16, B3C2-PR-LL-PR-VP16, B3C2-PR-LLL-PR-VP16,
B3C2-PR-L-PR-VP16, B3C2 B-PR-LL-PR-VP16, B3C2-PR-LLL-PR-VP16.

\vskip1.000000\baselineskip

Conmutadores génicos que utilizan PR, E2C y dominios de represión

E2C-PR-L-PR-(KRAB-A)2, E2C-PR-LL-PR-(KRAB-A)2, E2C-PR-LLL-PR-(KRAB-A)2, E2C-PR-L-PR-
(KRABA) 2, E2C-PR-LL-PR-(KRAB-A)2, E2C-PR-LLL-PR-(KRAB-A)2, E2C-PR-L-PR-(KRAB-A)2, E2C-PR-LL-PR-(KRAB-A) 2, E2C-PR-LLL-PR-(KRAB-A)2, E2C-PR-L-PR-(KRAB-A)2, E2C-PR-LL-PR-(KRAB-A)2,
E2C-PR-LLL-PR-(KRAB-A)2, E2C-PR-L-PR-(SID)2, E2C-PR-LL-PR-(SID)2, E2C-PR-LLL-PR-(SID)2, E2C-PR-L-PR-(SID)2, E2C-PR-LL-PR-(SID)2, E2C-PR-LLL-PR-(SID)2, E2C-PR-L-PR-(SID)2, E2C-PR-LL-PR-(SID)2,
E2C-PR-LLL-PR-(SID)2, E2C-PR-L-PR-(SID) 2, E2C-PR-LL-PR-(SID)2, E2C-PR-LLL-PR-(SID)2;

\vskip1.000000\baselineskip

Conmutadores génicos que utilizan PR 2C7 y dominios de represión

2C7-PR-L-PR-(KRAB-A)2, 2C7-PR-LL-PR-(KRAB-A)2, 2C7-PR-LLL-PR-(KRAB-A)2, 2C7-PR-L-PR-
(KRAB-A)2, 2C7-PR-LL-PR-(KRAB-A)2, 2C7-PR-LLL PR-(KRAB-A)2, 2C7-PR-L-PR-(KRAB-A)2, 2C7-PR-LL-PR-(KRAB-A)2, 2C7-PR-LLL-PR-(KRAB-A)2, 2C7-PR-L-PR-(KRAB-A)2, 2C7-PR-LL-PR-(KRAB-A)2, E2C-PR-LLL-PR-(KRAB-A)2, 2C7-PR-L-PR-(SID)2, 2C7-PR-LL-PR-(SID)2, 2C7-PR-LLL-PR-(SID)2, 2C7-PR-L-PR-(SID)2, 2C7-PR-LL-PR-(SID)2, 2C7-PR-LLL-PR-(SID)2, 2C7-PR-L-PR-(SID)2, 2C7-PR-LL-PR-(SID)2, 2C7-PR-LLL-PR-(SID)2, 2C7-PR-L-PR-(SID)2, 2C7-PR-LL-PR-(SID)2, E2C-PR-LLL-PR-(SID)2,n;

\vskip1.000000\baselineskip

Conmutadores génicos que utilizan PR, B3B y dominios de represión

B3B-PR-L-PR-(KRAB-A)2, B3B-PR-LL-PR-(KRAB-A)2, B3B-PR-LLL-PR-(KRAB-A)2, B3B 7-PR-LPR-
(KRAB-A)2, B3B 7-PR-LL-PR-(KRAB-A)2, B3B-PR-LLL-PR-(KRAB-A)2, B3B-PR-L-PR-(KRAB-A)2, B3B-PR-LLPR-(KRAB-A)2, B3B-PR-LLL-PR-(KRAB-A)2, B3B-PR-L-PR-(KRAB-A)2, B3B-PR-LL-PR-(KRAB-A)2,
B3B-PR-LLLPR-(KRAB-A)2, B3B-PR-L-PR-(SID)2, B3B-PR-LL-PR-(SID)2, B3B-PR-LLL-PR-(SID)2, B3B 7-PR-L-PR-(SID)2, B3B 7-PR-LL-PR-(SID)2, B3B-PR-LLL-PR-(SID)2, B3B-PR-L-PR-(SID)2, B3B-PR-LL-PR-
(SID)2, B3B-PR-LLL-PR-(SID)2, B3B-PR-L-PR-(SID)2, B3B-PR-LL-PR-(SID)2, B3B-PR-LLL-PR-(SID)2.

\vskip1.000000\baselineskip

Conmutadores génicos que utilizan PR. B3C2 y dominios de represión

B3C2-PR-L-PR-(KRAB-A)2, B3C2-PR-LL-PR-(KRAB-A)2, B3C2-PR-LLL-PR-(KRAB-A)2, B3C2-PR-LPR-(KRAB-A)2, B3C2-PR-LL-PR-(KRAB-A)2, B3C2-PR-LLL-PR-(KRAB-A)2, B3C2-PR-L-PR-(KRAB-A)2, B3C2-PRLL-PR-(KRAB-A)2, B3C2-PR-LLL-PR-(KRAB-A)2, B3C2-PR-L-PR-(KRAB-A)2, B3C2 B-PR-LL-PR-(KRAB-A)2, B3C2-PR-LLL-PR-(KRAB-A)2, B3C2-PR-L-PR-(SID)2, B3C2-PR-LL-PR-(SID)2, B3C2-PR-LLL-PR-(SID)2, B3C2-PR-LPR-(SID)2, B3C2-PR-LL-PR-(SID)2, B3C2-PR-LLL-PR-(SID)2, B3C2-PR-L-PR-(SID)2, B3C2-PR-LL-PR-(Sm)2, B3C2-PR-LLL-PR-(SID)2, B3C2-PR-L-PR-(SID)2, B3C2 B-PR-LL-PR-(SID)2, B3C2-PR-LLL-PR-(SID)2.

\vskip1.000000\baselineskip

Conmutadores génicos que utilizan ER, E2C y dominios de activación

E2C-ER-L-ER-VP64, E2C-ER-LL-ER-VP64, E2C-ER-LLL-ER-VP64, E2C-ER-L-ER-VP64, E2C-ER-LL-
ERVP64, E2C-ER-LLL-ER-VP64, E2C-ER-L-ER-VP16, EZC-ER-LL-ER-VP16, E2C-ER-LLL-ER-VP16, E2C-ER-L-ERVP16, E2C-ER-LL-ER-VP16, E2C-ER-LLL-ER-VP16.

\vskip1.000000\baselineskip

Conmutadores génicos que utilizan ER, 2C7 y dominios de activación

2C7-ER-L-ER-VP64, 2C7-ER-LL-ER-VP64, 2C7-ER-LLL-ER-VP64, 2C7-ER-L-ER-VP64, 2C7-ER-LL-
ERVP64, 2C7-ER-LLL-ER-VP64, 2C7-ER-L-ER-VP16, 2C7-ER-LL-ER-VP16, 2C7-ER-LLL-ER-VP16, 2C7-ER-L-ERVP16, 2C7-ER-LL-ER-VP16, E2C-ER-LLL-ER-VP16.

\vskip1.000000\baselineskip

Conmutadores génicos que utilizan ER, B3B y dominios de activación

B3B-ER-L-ER-VP64, B3B-ER-LL-ER-VP64, B3B-ER-LLL-ER-VP64, B3B 7-ER-L-ER-VP64, B3B 7-ER-LL-ERVP64, B3B-ER-LLL-ER-VP64, B3B-ER-L-ER-VP16, B3B-ER-LL-ER-VP16, B3B-ER-LLL-ER-VP16, B3B-ER-L-ERVP16, B3B-ER-LL-ER-VP16, B3B-ER-LLL-ER-VP16.

\vskip1.000000\baselineskip

Conmutadores génicos que utilizan ER, B3C2 y dominios de activación

B3C2-ER-L-ER-VP64, B3C2-ER-LL-ER-VP64, B3C2-ER-LLL-ER-VP64, B3C2-ER-L-ER-VP64, B3C2-ER-LLER-VP64, B3C2-ER-LLL-ER-VP64, B3C2-ER-L-ER-VP16, B3C2-ER-LL-ER-VP16, B3C2-ER-LLL-ER-VP16, B3C2-ER-L-ER-VP16, B3C2 B-ER-LL-ER-VP16, B3C2-ER-LLL-ER-VP16.

\vskip1.000000\baselineskip

Conmutadores génicos que utilizan ER, E2C y dominios de represión

E2C-ER-L-ER-(KRAB-A)2, E2C-ER-LL-ER-(KRAB-A)2, E2C-ER-LLL-ER-(KRAB-A)2, E2C-ER-L-ER-
(KRABA) 2, E2C-ER-LL-ER-(KRAB-A)2, E2C-ER-LLL-ER-(KRAB-A)2, E2C-ER-L-ER-(KRAB-A)2, E2C-ER-LL-ER-(KRAB-A) 2, E2C-ER-LLL-ER-(KRAB-A)2, E2C-ER-L-ER-(KRAB-A)2, E2C-ER-LL-ER-(KRAB-A)2, E2C-ER-LLL-ER-(KRAB-A)2, E2C-ER-L-ER-(SID)2, E2C-ER-LL-ER-(SID)2, E2C-ER-LLL-ER-(SID)2, E2C-ER-L-ER-(SID)2, E2C-ER-LL-ER-(SID)2, E2C-ER-LLL-ER-(SID)2, E2C-ER-L-ER-(SID)2, E2C-ER-LL-ER-(SID)2, E2C-ER-LLL-ER-(SID)2, E2C-ER-L-ER-(SID) 2, E2C-ER-LL-ER-(SID)2, E2C-ER-LLL-ER-(SID)2.

\vskip1.000000\baselineskip

Conmutadores génicos que utilizan ER, 2C7 y dominios de represión

2C7-ER-L-ER-(KRAB-A)2, 2C7-ER-LL-ER-(KRAB-A)2, 2C7-ER-LLL-ER-(KRAB-A)2, 2C7-ER-L-ER-
(KRABA) 2, 2C7-ER-LL-ER-(KRAB-A)2, 2C7-ER-LLL-ER-(KRAB-A)2, 2C7-ER-L-ER-(KRAB-A)2, 2C7-ER-LL-ER-(KRAB-A)2, 2C7-ER-LLL-ER-(KRAB-A)2, 2C7-ER-L-ER-(KRAB-A)2, 2C7-ER-LL-ER-(KRAB-A)2,
E2C-ER-LLL-ER-(KRAB-A)2, 2C7-ER-L-ER-(SID)2, 2C7-ER-LL-ER-(SID)2, 2C7-ER-LLL-ER-(SID)2, 2C7-ER-L-ER-(SID)2, 2C7-ER-LL-ER-(SID) 2, 2C7-ER-LLL-ER-(SID)2, 2C7-ER-L-ER-(SID)2, 2C7-ER-LL-ER-(SID)2, 2C7-ER-LLL-ER-(SID)2, 2C7-ER-L-ER-(SID) 2, 2C7-ER-LL-ER-(SID)2, E2C-ER-LLL-ER-(SID)2,n.

\vskip1.000000\baselineskip

Conmutadores génicos que utilizan ER. B3B y dominios de represión

B3B-ER-L-ER-(KRAB-A)2, B3B-ER-LL-ER-(KRAB-A)2, B3B-ER-LLL-ER-(KRAB-A)2, B3B 7-ER-LER-
(KRAB-A)2, B3B 7-ER-LL-ER-(KRAB-A)2, B3B-ER LLL-ER-(IGtAB-A)2, B3B-ER-L-ER-(KRAB-A)2, B3B ER-LLER-(KRAB-A)2, B3B-ER-LLL-ER-(KRAB-A)2, B3B-ER-L-ER-(IGtAB-A)2, B3B-ER-LL-ER-(KRAB-A)2,
B3B-ER-LLLER-(KRAB-A)2, B3B-ER-L-ER-(SID)2, B3B-ER-LL-ER-(SID)2, B3B-ER-LLL-ER-(SID)2, B3B 7-ER-L-ER-(SID)2, B3B 7-ER-LL-ER-(SID)2, B3B-ER-LLL-ER-(SID)2, B3B-ER-L-ER-(SID)2, B3B-ER-LL-ER-(SID)2, B3B-ER-LLL-ER-(SID)2, B3B-ER-L-ER-(SID)2, B3B-ER-LL-ER-(SID)2, B3B-ER-LLL-ER-(SID)2.

\vskip1.000000\baselineskip

Conmutadores génicos que utilizan ER, B3C2 y dominios de represión

B3C2-ER-L-ER-(KRAB-A)2, B3C2-ER-LL-ER-(KRAB-A)2, B3C2-ER-LLL-ER-(KRAB-A)2, B3C2-ER-LER-(KRAB-A)2, B3C2-ER-LL-ER-(KRAB-A)2, B3C2-ER-LLL-ER-(KRAB-A)2, B3C2-ER-L-ER-(KRAB-A)2, B3C2-ERLL-ER-(KRAB-A)2, B3C2-ER-LLL-ER-(KRAB-A)2, B3C2-ER-L-ER-(KRAB-A)2, B3C2 B-ER-LL-ER-
(KRAB-A)2, B3C2-ER-LLL-ER-(KRAB-A)2, B3C2-ER-L-ER-(SID)2, B3C2-ER-LL-ER-(SID)2, B3C2-ER-LLL-ER-(SID)2, B3C2-ER-LER-(SID)2, B3C2-ER-LL-ER-(SID)2, B3C2-ER-LLL-ER-(SID)2, B3C2-ER-L-ER-(SID)2, B3C2-ER-LL-ER-(SID)2, B3C2-ER-LLL-ER-(SID)2, B3C2-ER-L-ER-(SID)2, B3C2 B-ER-LL-ER-(SID)2, B3C2-ER-LLL-ER-(SID)2.

\vskip1.000000\baselineskip

El nucleótido (SEQ ID NO: 39) y la secuencia de residuos de aminoácidos (SEQ ID NO: 40) del polipéptido E2C-ERL-ER-VP64 se muestran en la Fig. 9. El nucleótido (SEQ ID NO: 41) y secuencia de residuos de aminoácidos (SEQ ID NO: 42) del polipéptido E2C-ER-LL-ER-VP64 se muestran en la Fig. 10.

III. Polinucleótidos, vectores de expresión y células huésped

En un aspecto relacionado, la presente invención provee polinucleótidos que codifican un conmutador génico de polipéptido de la presente invención, vectores de expresión que contienen dichos polinucleótidos, células que contienen dichos polinucleótidos y células transformadas que contienen dichos vectores de expresión. Los vectores de principal utilidad para la terapia génica incluyen , pero sin limitaciones vectores adenovirus humanos, vectores adenoasociados, vectores murinos o retrovirales derivados de lentivirus, o una variedad de composiciones no virales que incluyen liposomas, polímeros y otros conjugados que contienen ADN. Dichos sistemas de vectores se pueden usar o proveen los conmutadores génicos in vitro o in vivo, según el sistema de vector. Con adenovirus, por ejemplo, los vectores se pueden administrar por vía intravenosa a fin de translucir el hígado y otros órganos, introducir directamente en el pulmón o en los compartimientos vasculares con localización temporaria por ligación u otros procedimientos. Los procedimientos para construir dichos vectores, y los procedimientos y usos para la invención descrita son conocidos por los expertos en el campo de la terapia génica.

IV. Procedimientos para regular la función de los nucleótidos

La presente invención también provee un proceso para regular la expresión de una secuencia de nucleótidos deseada tal como un gen. De conformidad con el proceso, la secuencia de nucleótido blanco se expone a una cantidad efectiva de un conmutador génico y un ligando, en los cuales el dominio de fijación de nucleótido del conmutador génico se fija a una porción del nucleótido blanco y en el cual el ligando se fija al menos a uno de los dominios fijadores de ligando del conmutador génico. La exposición puede ser in vitro o ex vivo. El término "cantidad efectiva" significa que la cantidad que regula la transcripción de un nucleótido (por ejemplo un gen estructural o traducción de ARN).

El término "regular" se refiere a la supresión, aumento o inducción de una función. Por ejemplo, un polipéptido de la invención puede modular una secuencia promotora por fijación a un motivo dentro del promotor, por lo que aumenta o suprime la transcripción de un gen ligado operativamente a la secuencia de nucleótidos promotora. Alternativamente, la modulación puede incluir la inhibición de un gen en el cual el polipéptido se fija al gen estructural y bloquea la lectura del gen por parte de la ARN polimerasa dependiente de ADN, por lo que se inhibe la transcripción del gen. Alternativamente, la modulación puede incluir la inhibición de la traducción de una transcripción.

La región promotora de un gen incluye los elementos reguladores que generalmente se encuentra 5' respecto de un gen estructural. Si se debe activar un gen, las proteínas denominadas factores de transcripción se adosan a la región promotora del gen. Este ensamblado se asemeja a un "interruptor encendido" al permitir que una enzima transcriba un segundo segmento génico de ADN a ARN. En la mayoría de los casos, la molécula de ARN obtenida sirve como modelo para la síntesis de una proteína específica; en ocasiones, el propio ARN es el producto final.

La regulación de la expresión o la transcripción de un gen se puede lograr al exponer el gen blanco a un conmutados polipeptídico de la presente invención o, de preferencia al transformar in vitro o ex vivo una célula que contiene el gen blanco con un vector de expresión que contiene una secuencia de polinucleótidos que codifica un conmutador génico.

Los Ejemplos siguientes ilustran formas de realización particulares de la presente invención y de ninguna manera limitan la memoria descriptiva o las reivindicaciones.

Ejemplo 1 Procedimientos generales

Construcción de proteínas de dedo de zinc. Para la construcción de las proteínas de dedo de zinc B3 y N1, se utilizaron hélices de reconocimiento de ADN provenientes de las variantes de 2 dedos Zif268 pmGAA, pmGAC, pmGGA, pmGGG, y pGTA were utilized [Segal, D. J., Dreier, B., Beerli, R. R., y Barbas, C. F., III (1999) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96, 2758-2763]. Se construyeron tres proteínas de dedo fijadoras de los respectivos sitios de 9-bp por injerto de las adecuadas hélices de reconocimiento de ADN en el armazón de la proteína de tres dedos Sp1C [Desjarlais, J. R., y Berg, J. M. (1993) Proc. Natl Acad. Sci. USA 90, 2256-2260]; se ensamblaron fragmentos de ADN codificadores de las dos proteínas de tres dedos a partir de 6 oligonucleótidos superpuestos tal como está descrito [Beerli, R. R., Segal, D. J., Dreier, B., y Barbas, C. F., III (1998) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95, 14628-14633]. Luego se clonaron las regiones codificadoras de la proteína de tres dedos en el vector de expresión bacteriano pMal-CSS por digestión de Sfi1.

Purificación de proteínas. Las proteínas de fusión de la proteína fijadora (MBP) se purificaron hasta >90% de homogeneidad mediante el sistema de fusión y purificación de proteínas (New England Biolabs), excepto que se usó Zinc Buffer A (ZBA; 10 mM Tris, pH7,5/90 mM KCI, 1 mM MgCl2, 90 PM ZnCl2)/1% BSA/5 mM DTT) como buffer de columna. Se determinó la proteína y la concentración de la proteína mediante geles 15% SDS-PAGE teñidos con Coomassie blue, por comparación con estándares de BSA.

Análisis por ELISA. En placas de ELISA de 96 cavidades, se aplicó 0,2 \mug de estreptavidina (Pierce) a cada cavidad durante 1 hora a 37ºC, luego se lavaron dos veces con agua. Se aplicó oligonucleótido blanco biotinilado (0,025 \mug) de la misma manera. Se aplicó ZBA/3% BSA para el bloqueo, pero las cavidades no se lavaron después de la incubación. Todas las incubaciones posteriores fueron a temperatura ambiente. A partir de 2 \mug de proteína de fusión MBP purificada en las cavidades superiores, se aplicaron diluciones seriadas al medio en 1x buffer de unión (ZBA/1% BSA/5 mM DIT/0,12 \mug/\mul de ADN de salmón desagregado). Las muestras se incubaron durante 1 hora a temperatura ambiente, seguido de 10 lavados con agua. Se aplicó proteína fijadora antimaltosa murina mAb (Sigma) en ZBA/1% BSA a las cavidades durante 30 minutos, seguido de 10 lavados con agua. Se aplicó IgG mAb antimurino de cabra conjugado con fosfatasa alcalina (Sigma) a las cavidades durante 30 minutos, seguido de 10 lavados con agua. Se aplicó sustrato de fosfatasa alcalina (Sigma), y se cuantificó la DO405 con SOFTmax 235 (Molecular Devices).

Ensayos de variación de movilidad en gel. Los oligonucleótidos blanco se rotularon en sus extremos 3' con [32P] y se purificaron en gel. Se incubaron once diluciones seriadas al tercio de proteína en reacciones de fijación de 20 \mul (1x Buffer de unión/10% glicerol/\approx1 pM oligonucleótido blanco) durante tres horas a temperatura ambiente, luego se resolvieron en 5% poliacrilamida en 0,5x de buffer TBE. Se efectuó la cuantificación de los geles secos mediante PhosphorImager y software ImageQuant (Molecular Dynamics), y se determinó K_{D} por análisis de Scatchard.

Construcciones informadoras para determinar el espaciado óptimo y la orientación de los dos sitios medios. Se generaron fragmentos diméricos C7 TATA por amplificación por PCR con cebadores de dímero C7 TATA (5'-GAG GGT ACC GCG TGG GCG A_{0-5} GCG TGG GCG AGT CGA CTC TAG AGG GTA TAT AAT GG-3' (SEQ ID NO: 1) para repeticiones directas; 5'-GAG GGT ACC GCG TGG GCG A_{0-5} CGC CCA CGC AGT CGA CTC TAG AGG GTA TAT AAT GG-3' (SEQ ID NO: 2) para repeticiones invertidas; 5'-GAG GGT ACC CGC CCA CGC A_{0-5} GCG TGG GCG AGT CGA CTC TAG AGG GTA TAT AAT GG-3' (SEQ ID NO: 3) para repeticiones evertidas y cebador GL2 (5'-CTT TAT GTT TTT GGC GTC TTC C-3' (SEQ ID NO: 4); Promega), mediante el uso de p17x4TATA-luc (obsequio de S. Y. Tsai) como molde. Los productos de PCR se clonaron en pGL3-Basic (Promega) por digesción las endonucleasas de restricción Kpnl y Nco1.

Construcciones promotoras inducibles por RU486 y tamoxifeno.

Los fragmentos 10xC7-TATA, 10xB3-TATA, y 10xN1-TATA se ensamblaron a partir de dos pares de oligonucleótidos complementarios cada uno y se clonaron en Sacl-Xmal linealizado pGL3-Basic (Promega), corriente arriba respecto de la región codificadora de luciferasa de luciérnaga, a fin de crear los plásmidos 10xC7-TATA-luc, 10xB3-TATA-luc, y 10xN1-TATA-luc. Para generar la construcción informadora 10xN1-TATA-lacZ, se extrajo la región codificadora de lacZ de p\betagal-Basic (Clontech) y se usó para reemplazar la región codificadora de luciferasa de 10xN1-TATA-luc por digestión con Hind3-BamH1.

Ensayos de informador de luciferase y \beta-gal. Para todas las transfecciones, se plaquearon células HeLa en placas de 24 cavidades y se usaron con una confluencia del 40-60%. Para los ensayos de informador de luciferasa, se transfectaron 175 ng de plásmido informador (construcciones promotoras en pGL3 o, como control negativo, pGL3-Basic) y 25 ng de plásmido efector (fusiones de receptor de esteroides de dedos de zinc en pcADN3 o, como control negativo, pcADN3 vacío) mediante el reactivo de lipofectamina (Gibco BRL). Después de aproximadamente 24 h, se indujo la expresión por la adición de 10nM de RU486 (Biomol), 100 nM de 4-OHT (Sigma), o 5 mM de ponasterona A (Invitrogen). Se prepararon los extractos celulares aproximadamente 48 horas después de la transfección y se analizaron en la actividad de luciferasa mediante el reactivo de ensayo de luciferasa de Promega en un luminómetro MicroLumat LB96P (EG&G Berthold, Gaithersburg, MD). Para los ensayos de informador dual, se transfectaron 85 ng de plásmido informador de luciferasa, 85 ng de plásmido informador de b-gal, y 15ng de cada uno de los dos plásmidos efectores. Se midió la actividad de b-gal mediante el kit de detección de b-galactosidasa luminescente II (Clontech).

Construcciones de fusión de receptor de esteroides con dedo de zinc con dominios efectores N terminales. La región codificadora VP16 se amplificó por PCR a partir de pcADN3/C7-VP16 mediante los cebadores VPNhe-F (5'-GAG GAG GAG GAG GCT AGC GCC ACC ATG GGG CGC GCC GGC GCT CCC CCG ACC GAT GTC AGC CTG-3') (SEQ ID NO: 5), y VPHind-B (5'-GAG GAG GAG GAG AAG CTT GTT AAT TAA ACC GTA CTC GTC AAT TCC AAG GGC ATC G-3') (SEQ ID NO: 6) o VPNLSHind-B (5'-GAG GAG GAG GAG AAG CTT AAC TTT GCG TTT CTT TTT CGG GTT AAT TAA ACC GTA CTC GTC AAT TCC AAG GGC ATC G-3') (SEQ ID NO: 7). La región codificadora C7 se amplificó a partir del mismo plásmido, mediante los cebadores C7Hind-F (5'-GAG GAG GAG GAG AAG CTT GGG GCC ACG GCG GCC CTC GAG CCC TAT GC-3') (SEQ ID NO: 8), y C7Bam-B (5'-GAG GAG GGA TCC CCC TGG CCG GCC TGG CCA CTA GTT CTA GAG TC-3') (SEQ ID NO: 9) o C7NLSBam-B (5'-GAG GAG GGA TCC CCA ACT TTG CGT TTC TTT TTC GGC TGG CCG GCC TGG CCA CTA GTT CTA GAG TC-3') (SEQ ID NO: 10). Se amplificó el LBD truncado humano PR (aa645-914) a partir de PAPCMVGL914VPc'-SV [Wang, Y., Xu, J., Pierson, T., O'Malley, B. W., y Tsai, S. Y. (1997) Gene Therapy 4, 432-441] mediante los cebadores PRBam-F (5'-GAG GAG GAG GAG GGA TCC AGT CAG AGT TGT GAG AGC ACT GGA TGC TG-3') (SEQ ID NO: 11) y PREco-B (5'-GAG GAG GAA TTC TCA AGC AAT AAC TTC AGA CAT CAT TTC TGG AAA TTC-3') (SEQ ID NO: 12). Las regiones codificadoras VP16-C7-PR, VP16-NLS-C7-PR, y VP16-C7-NLS-PR luego se ensamblaron en pcADN3.1(+)Zeo (Invitrogen) mediante los sitios de restricción Nhe1, Hind3, BamH1 y EcoR1 incorporados en los cebadores de PCR. En las construcciones obtenidas, las regiones codificadoras C7 estaban flanqueadas por dos sitios Sfi1, y las regiones codificadoras VP16 por sitios Asc1 y Pac1. Estos sitios de restricción se introdujeron para facilitar el intercambio de DBD y los dominios efectores, respectivamente.

A fin de generar las construcciones VP16-C7-ER, VP16-NLS-C7-ER, y VP16-C7-NLS-ER, se extrajo la región codificadora ER LBD murina con mutación puntual (aa281-599, G525R) de pBabe/Mic-ER [Littlewood, T. D., Hancock, D. C., Danielian, P. S., Parker, M. G., y Evan, G. L (1995) Nucl. Acids Res. 23, 1686-1690], y se usó para reemplazar la región codificadora PR LBD mediante digestión por restricción de BamHI-EcoRI.

A fin de generar las construcciones de fusión con B3 o N1 DBD, se reemplazó C7 por las regiones codificadoras B3 o N1 por digestión de Sfi1. Se obtuvieron construcciones por fusión que contienen un dominio efector VP64 por reemplazo de VP16 por la región codificadora VP64 mediante digestión de Asc1-Pac1.

Construcciones de fusión de receptor de esteroides de dedo de zinc con dominios efectores C terminales. El PR LBD truncado humano se amplificó a partir de PAPCMVGL914VPc'-SV [Wang, Y., Xu, J., Pierson, T., O'Malley, B. W., y Tsai, S. Y. (1997) Gene Therapy 4, 432-441] mediante los cebadores PRFse-F (5'-GAG GAG GAG GAG GAG GGC CGG CCG CGT CGA CCA GGT CAG AGT TGT GAG AGC ACT GGA TGC-3) (SEQ ID NO: 13) y PRAsc-B (5'-GAG GAG GAG GAG GAG GGC GCG CCC CGT CGA CCC AGC AAT AAC TTC AGA CAT CAT TTC TGG-3') (SEQ ID NO: 14). Se amplificó el ER LBD murino con mutación puntual a partir de pBabe/Mic-ER [Littlewood, T. D., Hancock, D. C., Danielian, P. S., Parker, M. G., y Evan, G. I. (1995) Nucl. Acids Res. 23, 1686-1690] mediante el uso de los cebadores ERFse-F (5'-GAG GAG GAG GAG GAG GGC CGG CCG CCG AAA TGA AAT GGG TGC TTC AGG AGA C-3') (SEQ ID NO: 15) y ERAsc-B (5'-GAG GAG GAG GAG GAG GGC GCG CCC GAT CGT GTT GGG GAA GCC CTC TGC TTC-3') (SEQ ID NO: 16). Los productos obtenidos por PCR luego se insertaron en pcADN3/E2C-VP16 [Beerli, R. R., Segal, D. J., Dreier, B., y Barbas, C. F., III (1998) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95, 14628-14633], entre las regiones codificadoras E2C y VP16, por digestión con las endonucleasas de restricción Fse1 y Asc1.

A fin de generar construcciones de fusión con B3 o N1 DBD, se reemplazó E2C por las regiones codificadoras B3 o N1 mediante digestión de Sfi1. Se obtuvieron construcciones por fusión que contienen un dominio efector VP64 por reemplazo de VP16 por la región codificadora VP64 mediante digestión de Asc1-Pac1.

Construcciones conmutadoras heterodiméricas. Para la construcción de la fusión E2C-ER, se amplificó el ER LBD murino con mutación puntual de pBabe/Mic-ER [Littlewood, T. D., Hancock, D. C., Danielian, P. S., Parker, M. G., y Evan, G. I. (1995) Nucl. Acids Res. 23, 1686-1690] mediante los cebadores ERFse-F y ERPac-B (5'-GAG GAG GAG GAG GAG TTA ATT AAG ATC GTG TTG GGG AAG CCC TCT GCT TC-3') (SEQ ID NO: 17). Luego se insertó el producto de PCR en la construcción pcADN3/E2C-VP64, por reemplazo de la región codificadora VP64, por digestión de Fse1-Pac1. A fin de generar la fusión ERVP64, se amplificó ER LBD mediante los cebadores ERATGBam-F (5'-GAG GAG GAG GAG GGA TCC GCC ACC ATG CGA AAT GAA ATG GGT GCT TCA GGA GAC-3') (SEQ ID NO: 18) y ERAsc-B. Luego se insertó el producto de PCR en la construcción pcADN3/E2C-VP64, [Beerli, R. R., Segal, D. J., Dreier, B., y Barbas, C. F., III (1998). Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95, 14628-14633] por reemplazo de la región codificadora E2C por digestión de BamH1-Asc1.

Construcciones conmutadoras monocatenarias. Para la construcción de fusiones monocatenarias con dos ER LBD, se amplificó el ER LBD murino con mutación puntual de pBabe/Mic-ER [Littlewood, T. D., Hancock, D. C., Danielian, P. S., Parker, M. G., y Evan, G. I. (1995) Nucl. Acids Res. 23, 1686-1690] mediante el uso de los cebadores ERFse-F y ERSpe1-B (5'-GAG GAG GAG GAG GAG GAG ACT AGT GGA ACC ACC CCC ACC ACC GCC CGA GCC ACC GCC ACC AGA GGA GAT CGT GTT GGG GAA GCC CTC TGC-3') (SEQ ID NO: 19), o mediante el uso de los cebadores ERNhe1-F1 (para la construcción ligadora de 18aa; 5'-GAG GAG GAG GAG GAG GAG GCT AGC GGC GGT GGC GGT GGC TCC TCT GGT GGC GGT GGC GGT TCT TCC AAT GAA ATG GGT GCT TCA GGA GAC-3') (SEQ ID NO: 20) o ERNhel-F2 (para la construcción ligadora de 30aa; 5'-GAG GAG GAG GAG GAG GAG GCT AGC TCT TCC AAT GAA ATG GGT GCT TCA GGA GAC-3') (SEQ ID NO: 21), y ERAsc-B. Los productos de PCR luego se digirieron con, respectivamente, Fse1 y Spe1, o Nhe1 y Asc1, y se insertaron en Fse1-Asc1 linealizado pcADN3/E2C-VP64 [Beerli, R. R., Segal, D. J., Dreier, B., y Barbas, C. F., III (1998) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95, 14628-14633].

Para la construcción de fusiones monocatenarias RXR-EcR, se amplificó por PCR el dominio fijador de ligando del receptor de retinoide X humano (hRXR\alpha, aa373-654) a partir de pVgRXR (Invitrogen) mediante el uso de los cebadores RXRFse-F (5'-GAG GAG GAG GGC CGG CCG GGA AGC CGT GCA GGA GGA GCG GC-3') (SEQ ID NO: 22) y RXRSpe-B (5'-GAG GAG GAG GAG GAG ACT AGT GGA ACC ACC CCC ACC ACC GCC CGA GCC ACC GCC ACC AGA GGA AGT CAT TTG GTG CGG CGC CTC CAG C-3') (SEQ ID NO: 23). Se amplificó por PCR el dominio fijador de ligando del receptor de ecdisona (EcR, aa202-462, de Drosophila melanogaster) a partir de pVgRXR mediante los cebadores EcRNhe-F1 (para la construcción ligadora de 18aa; 5'-GAG GAG GAG GAG GCT AGC TCT TCC GGT GGC GGC CAA GAC TTT GTT AAG AAG G-3') (SEQ ID NO: 24), o EcRNhe-F2 (para la construcción ligadora de 30aa; 5'-GAG GAG GAG GAG GCT AGC GGC GGT GGC GGT GGC TCC TCT GGT GGC GGT GGC GGT TCT TCC GGT GGC GGC CAA GAC TTT GTT AAG AAG G-3') (SEQ ID NO: 25), y EcRAsc-B (5'-GAG GAG GAG GGC GCG CCC GGC ATG AAC GTC CCA GAT CTC CTC GAG-3') (SEQ ID NO: 26). Los productos de PCR luego se digirieron con, respectivamente, Fse1 y Spe1, o Nhe1 y Asc1, y se insertaron en Fse1-Asc1 linealizado pcADN3/E2C-VP64 [Beerli, R. R., Segal, D. J., Dreier, B., y Barbas, C. F., III (1998) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95, 14628-14633]. El dominio fijador de ADN se intercambió por digestión de Sfi1, los dominios efectores por digestión de Asc1-Pac1.

A fin de generar el ligador de 36aa, la construcción de fusión E2C-RLLE-VP64, se amplificó por PCR el RXR LBD a partir de pcADN3/E2C-RE-VP64 mediante el uso de los cebadores RXRFsa-F y RXRSpeLL-B (5'-GAG GAG GAG GAG GAG ACT AGT AGA GCC ACC GCC CCC TTC AGA ACC GCC CGA GCC ACC GCC ACC AGA GG-3') (SEQ ID NO: 27). El EcR LBD se amplificó con el mismo plásmido, mediante el uso de los cebadores EcRNheLL-F (5'-GAG GAG GAG GAG GCT AGC GGG GGT TCG GAG GGT GGC GGG TCT GAG GGT GGG GGT GGT TCC ACT AGC TCT TCC-3') (SEQ ID NO: 28) y EcRAsc-B. Los productos de PCR se insertaron en pcADN3/E2C-VP64 tal como se describió con anterioridad.

\vskip1.000000\baselineskip

Ejemplo 2 Conmutadores génicos

Generación de proteínas de fusión de receptores esteroides de dedo de zinc regulados por hormonas. Los estudios previos demostraron el potencial de las proteínas de dedo de zinc C2-H2 obtenidas por ingeniería para la regulación de la expresión génica blanco [Liu, Q., Segal, D. J., Ghiara, J. B., y Barbas, C. F., III (1997) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94, 5525-5530; Kim, J. S., y Pabo, C. O. (1997) J Biol Chem 272,29795-29800; Beerli, R. R, Segal, D. J., Dreier, B., y Barbas, C. F., III (1998) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95, 14628-14633; Beerli, R. R., Dreier, B., y Barbas, C. F., III (2000) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97, 1495-1500]. Sin embargo, para comprender en su totalidad el potencial de las proteínas de dedo de zinc obtenidas por ingeniería, es deseable lograr que su actividad constitutiva de fijación de ADN sea dependiente de ligando. Los dominios fijadores de ligando (LBD) del receptor de progesterona humano (hPR) y el receptor de estrógeno murino (mER) se han usado previamente para la regulación de proteínas heterólogas, después de ser modificadas para carecer de la fijación de las hormonas naturales mientras retienen la fijación a antagonistas sintéticos [Littlewood, T. D., Hancock, D. C., Danielian, P. S., Parker, M. G., y Evan, G. I. (1995) Nucl. Acids Res. 23,1686-1690; Wang, Y., Xu, J., Pierson, T., O'Malley, B. W., y Tsai, S. Y. (1997) Gene Therapi 4, 432-441]. En consecuencia, se fusionó el variante Zif268 C7 [Wu, H., Yang, W.-P., y Barbas, C. F., III (1995) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92, 344-348] a un dominio de activación de transcripción más el LBD de alguno de los dos receptores de hormonas nucleares. La proteína de fusión VP64-C7-PR contiene un dominio de activación N terminal VP64 [Beerli, R. R., Segal, D. J., Dreier, B., y Barbas, C. F., III (1998) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95, 14628-14633], y un LBD hPR C terminal (aa645-914) que carece de los aminoácidos 915-933, que responde al antagonista de progesterona RU486/Mifepristona pero no de progesterona [Wang, Y., Xu, J., Pierson, T., O'Mallei, B. W., y Tsai, S. Y. (1997) Gene Therapy 4, 432-441]. La proteína de fusión VP64-C7-ER contiene un LBD mER C terminal (aa282-599) con una única sustitución de aminoácidos (G525R), y responde al antagonista de estrógeno 4-hidroxi-tamoxifeno (4-OHT) pero no a estrógeno [Littlewood, T. D., Hancock, D. C., Danielian, P. S., Parker, M. G., y Evan, G. I. (1995) Nucl. Acids Res. 23, 1686-1690].

Determinación del elemento de respuesta óptima para las proteínas de fusión de receptor de esteroides de dedo de zinc. Los receptores de esteroides naturales fijan el ADN como dímeros y generalmente reconocen los elementos de respuesta que consisten en secuencias palindrómicas [Evans, R. M. (1988) Science 240, 889-895; Carson-Jurica, M. A., Schrader, W. T., y O'Malley, W. (1990) Endocrine Reviews 11, 201-220]. Además, se ha demostrado que en algunos casos también pueden servir las repeticiones directas como sitios de unión para los dímeros de receptor [Aumais, J. P., Lee, H. S., DeGannes, C., Horsford, J., y White, J. H. (1996) J. Biol. Chem. 271, 12568-12577]. Debido a esta flexibilidad obvia del reconocimiento de ADN por los dímeros de receptores naturales, no se conocía la estructura óptima de un elemento de respuesta para un conmutador de transcripción artificial basado en el dedo de zinc. Sin embargo, a fin de desarrollar un sistema eficiente inducible por hormonas para la regulación de la expresión del gen blanco, se requiere el conocimiento detallado de la arquitectura del sitio de fijación.

A fin de determinar la orientación óptima y el espaciado de los dos sitios medios de un elemento de respuesta para una proteína de fusión de LBD de dedo de zinc, se construyó un conjunto de plásmidos informadores. Cada uno contiene dos sitios de fijación C7 corriente arriba respecto de una caja TATA y una región codificadora de luciferasa de luciérnaga. Los dos sitios fijadores de C7 se introdujeron en diferentes orientaciones (repeticiones directas, invertidas, o evertidas) y con diversos espaciados (sin espaciado o 1 a 5 bp de espaciado). Luego se cotransfectaron los plásmidos directores de la expresión de las construcciones de fusión VP64-C-PR o VP64-C7-ER con los diversos plásmidos informadores y se analizó la expresión de luciferasa inducida por hormonas. De manera significativa, cada uno de los sitios de fijación diméricos de C7 era capaz de actuar como elementos de respuesta para almas proteínas con base PR y ER, aunque don diferente eficiencia. En contraste, no se activó un plásmido informador con un único sitio de fijación C7, lo cual indica que la activación de la transcripción inducida por hormonas era mediada por dímeros.

El espaciado óptimo dependió de la orientación de los dos sitios medios. En el caso de la proteína de fusión PR, el espaciado óptimo pareció ser de 2-3 bp para las repeticiones invertidas y 3 bp para las repeticiones evertidas. Los elementos de respuesta que consistieron en repeticiones directas no tenían espaciado óptimo único; la mejor respuesta se obtuvo con 4-5 bp, o sin espaciado. Para la proteína de fusión ER, el espaciado óptimo era de 3-4 bp para las repeticiones directas, 1-2 bp para las repeticiones invertidas, y 3 bp para las repeticiones evertidas. Cabe destacar que hubo significativas variaciones en la actividad basal, es decir la actividad independiente de ligando de las proteínas de fusión PR y ER, según los elementos de respuesta estudiados. Más notablemente, el aumento del espaciado de las repeticiones directas de 3 a 4 bp condujo a una actividad basal 1,9 veces mayor de VP64-C7-PR, e incluso un incremento de 3,7 veces en el caso de VP64-C7-ER. La actividad basal elevada es extremadamente indeseable para un sistema de promotor inducible, en el cual a menudo se requiere un estrecho control sobre los noveles de expresión de un gen particular de interés, especialmente si el producto génico es tóxico. En consecuencia, al elegir los elementos de respuesta adecuados, se debe prestar particular atención no solo a la inductibilidad por hormonas sino también a su actividad basal en presencia de la proteína reguladora. El elemento de respuesta que consiste en repeticiones directas con un espaciado de tres nucleótidos se consideró una buena elección para el uso de un promotor artificial inducible por hormonas, dado que era compatible con ambas proteínas de fusión PR y ER. Significativamente, su actividad basal en presencia de cualquiera de las proteínas de fusión PR o ER estaba entre los más bajos de todos los elementos de respuesta estudiados. Además, se observó buena activación de la transcripción inducida por hormonas con VP64-C7-PR (3,9 veces) y VP64-C7-ER (9,5 veces).

Generación de nuevos dominios fijadores de ADN. Si bien el uso del dominio fijador de ADN C7 era adecuado para los estudios preliminares antes descritos, puede no ser una buena elección para la incorporación en un regulador de transcripción inducible. Las proteína C7 es una variante del factor de transcripción murino Zif268 [Pavletich, N. P., y Pabo, C. O. (1991) Science 252, 809-817], con mayor afinidad, pero especificidad no alterada [Wu, H., Yang, W.-P., y Barbas, C. F., III (1995) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92, 344-348]. Los inventores consideraron que el uso de dominios fijadores de ADN alternativos podría minimizar los posibles efectos pleiotróficos de los reguladores quiméricos. Previamente, los inventores describieron una estrategia para el ensamblado rápido de proteínas de dedo de zinc a partir de una familia de dominios de dedos de zinc específicos para cada uno de los 16 tripletes de ADN 5'-GNN-3' [Beerli, R. R., Segal, D. J., Dreier, B., y Barbas, C. F., III (1998) Proc. Natl Acad. Sci. USA 95,14628-14633; Segal, D. J., Dreier, B., Beerli, R. R., y Barbas, C. F., III (1999) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96, 2758-2763]. Se pueden preparar rápidamente tres proteínas de dedos fijadores de cualquier secuencia 5'-(GNN)3-3' deseada, mediante el injerto de residuos de aminoácidos que intervienen en el reconocimiento de ADN específico de base en el marco de la proteína de tres dedos Sp1C [Desjarlais, J. R., y Berg, J. M. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90, 2256-2260]. Hasta la fecha, se han producido más de 100 proteínas de tres dedos en el laboratorio de los autores. Dos de ellas, B3 y N1, se eligieron para ser usadas en los reguladores de transcripción inducibles (Figura 1A). Las proteínas B3 y N1 están diseñadas para fijar las secuencias 5'-GGA GGG GAC-3' o 5'-GGG GTA GAA-3', respectivamente. A fin de verificar su especificidad de fijación de ADN, estas proteínas se purificaron como fusiones MBP y se analizaron por análisis de ELISA mediante una selección arbitraria de oligonucleótidos que contienen secuencias 5'-(GNN)3-3' (Fig. 1B). Significativamente, ambas proteínas reconocieron sus secuencias blanco y no mostraron reactividad cruzada con ninguna de las demás secuencias 5'-(GNN)3-3'secuencias estudiadas. Sin embargo, a juicio de la prueba por ELISA, la fijación de N1 era mucho más débil que la fijación de B3. En consecuencia, se determinaron las afinidades por análisis de variación de la movilidad electroforética. La proteína B3 se fijó a su secuencia blanco con un valor de K_{D} de 15 nM, similar a los valores de K_{D} informador previamente para otras proteínas de tres dedos [Beerli, R. R., Segal, D. J., Dreier, B., y Barbas, C. F., III (1998) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95, 14628-14633]. En contraste, la afinidad de N1 por su blanco fue notablemente más baja y se estimó su valor de K_{D} en el rango de 5-10 \muM. El hecho de que las dos proteínas tenían afinidades muy diferentes para sus respectivas secuencias blanco se consideró positivo, dado que permite investigar la influencia de la afinidad sobre la funcionalidad de un sistema de expresión inducible.

Sistemas inducibles por RU486- y 4-OHT para el control de la expresión génica. A fin de permitir un análisis comparativo, se construyó un conjunto de reguladores de transcripción inducibles por RU486- o 4-OHT que contienen el dominio fijador de ADN B3 o N1. Se investigó el papel de la ubicación del dominio de activación, al fusionarlo con los N o C terminales de la proteína. Se compararon dos dominios de activación diferentes: el dominio de transactivación de herpes simplex virus VP16 [Sadowski, I., Ma, J., Triezenberg, S., y Ptashne, M. (1988) Nature 335, 563-564], y el dominio de activación sintético VP64, que consiste en 4 repeticiones en tándem del dominio de activación mínimo de VP16 [Beerli, R. R., Segal, D. J., Dreier, B., y Barbas, C. F., III (1998) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95, 14628-14633].

Se construyeron promotores sintéticos sobre la base de las secuencias de ADN blanco de B3 y N1, y la estructura de elemento de respuesta óptima definida con anterioridad. Cada uno de los plásmidos 10xB3-TATA-luc y 10xN1-TATA-luc contenía cinco elementos de respuesta, que consisten en repeticiones directas espaciadas por tres nucleótidos, corriente arriba respecto de una caja TATA y una región codificadora de luciferasa de luciérnaga. Los elementos de respuesta se separaron entre sí mediante otros seis nucleótidos, los cuales debían permitir la fijación concomitante de cinco dímeros y así maximizar la actividad del promotor. Se evaluó la actividad de las diversas construcciones de fusión mediante estudios de cotransfección transitoria con los plásmidos informadores similares TATA de células HeLa (Tabla 1).

TABLA 1

3

En general, las proteínas de fusión ER resultaron ser los transactivadores más fuertes, y la actividad de luciferasa inducida por 4-OHT usualmente era 3 a 6 veces mayor que la actividad de luciferasa inducida por RU486 mediada por las proteínas de fusión PR. Sin embargo, dado que la actividad basal, es decir, independiente de ligando, de las quimeras ER a menudo era algo mayor, su estimulación inducida por hormonas generalmente no era mejor. Por lo común se observaba una activación génica dependiente de hormonas superior a dos órdenes de magnitud con ambas proteínas de fusión PR y ER, valores que eran significativamente mejores que los previamente informados para la proteína de fusión Gal4-PR GLVPc' [Wang, Y., Xu, J., Pierson, T., O'Malley, B. W., y Tsai, S. Y. (1997) Gene Therapy 4, 432-441].

La ubicación del dominio de activación tenía significativa influencia sobre la actividad de los reguladores quiméricos. Sin embargo, la ubicación preferida dependía de la naturaleza del dominio de activación. Mientras que el dominio VP16 generaba activadores más potentes cuando se ubicaba en el C terminal, VP64 era más activo en el N terminal. En consecuencia, las comparaciones directas demostraron que un dominio VP64 N terminal era más potente que un dominio VP16 N terminal, y un dominio VP16 C terminal era más potente que un dominio VP64 C terminal. También se halló que la naturaleza y la ubicación del dominio de activación tenían influencia sobre la actividad basal de los reguladores quiméricos. En particular, se observó una actividad basal relativamente elevada en el caso de los reguladores con dominio VP64 N terminal.

La naturaleza del dominio fijador de ADN tenía gran influencia sobre la extensión de la dependencia de ligando de las quimeras. El uso de la proteína N1 como dominio fijador de ADN condujo a construcciones de fusión más estrechamente reguladas con estimulación significativamente mejor de las actividades de promotor que el uso de B3, probablemente debido a las notables diferencias de afinidad entre N1 y B3. En particular, el regulador de N1-ER-VP64 no tenía actividad basal significativa y era capaz de mediar una activación inducida por 4-OHT de 464 1319 veces mayor del promotor mínimo lOxNI-TATA (Tabla 1). La extensión de la activación inducida por ligando de la expresión génica en un rango de 3 órdenes de magnitud es particularmente notable, dado que hasta el momento sólo se han informado para el sistema de regulación génica controlado por tetraciclinas [Gossen, M., y Bujard, H. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89, 5547-5551; Gossen, M., Freundlieb, S., Bender, G., Müller, G., Hillen, W., y Bujard, H._(1995) Science 268,1766-1769].

Regulación concomitante de múltiples promotores. La tecnología de dedos de zinc ha puesto a disposición un amplio repertorio de especificidades de fijación de ADN para el uso en la ingeniería de proteínas [Beerli, R. R., Segal, D. J., Dreier, B., y Barbas, C. F., III (1998) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95, 14628-1463; Segal, D. J., Dreier, B., Beerli, R. R., y Barbas, C. F., III (1999) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96,2758-2763; Beerli, R. R., Dreier, B., y Barbas, C. F., III (2000) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97, 1495-1500]. La disponibilidad de diferentes dominios reguladores de receptores derivados de hormonas esteroides [Littlewood, T. D., Hancock, D. C., Danielian, P. S., Parker, M. G., y Evan, G. I. (1995) Nucl. Acids Res. 23,1686-1690; Wang, Y., Xu, J., Pierson, T., O'Malley, B. W., y Tsai, S. Y. (1997) Gene Therapy 4,432-441], y la capacidad de redirigir los reguladores quiméricos hacia virtualmente cualquier secuencia blanco deseada debería permitir la regulación independiente de la expresión de múltiples genes al mismo tiempo. A fin de examinar esta posibilidad, se construyó un plásmido informador para dirigir la expresión de \beta-galactosidasa (\beta-gal) bajo el control de promotor mínimo 10xN1-TATA. Luego se expresaron transitoriamente los reguladores quiméricos B3-PR-VP16 y N1-ER-VP64 en células HeLa junto con loas plásmidos informadores 10xB3-TATA-luc y 10xN1-TATA-\beta-gal. Las células transfectadas se trataron con RU486 o 4-OHT y se monitorearon las actividades de luciferasa y \beta-gal. Significativamente, RU486 indujo la expresión de luciferasa mientras que no tuvo ningún efecto sobre la actividad génica del informador \beta-gal. Por su parte, 4-OHT no afectó la expresión de luciferasa pero activó de manera eficiente la expresión de \beta-gal. Estos resultados demostraron que las dos combinaciones de reguladores/promotores actúan de manera independiente entre sí, y que múltiples genes se pueden regular de manera eficiente e independiente mediante la adición selectiva de la hormona deseada.

Desarrollo de un conmutador génico monomérico dependiente de hormona. La capacidad para obtener por ingeniería proteínas fijadoras de ADN con especificidades deseadas permite generar factores de transcripción artificiales capaces de imponer efectos reguladores dominantes sobre los genes endógenos [Beerli, R R., Dreier, B., y Barbas, C. F., III (2000) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97, 1495-1500]. Para muchas de las aplicaciones de esta tecnología puede ser deseable que el efecto sobre la expresión de los genes endógenos sea reversible. El uso de LBD de receptores de hormona esteroide tiene el potencial de lograr que la regulación de la expresión de los genes endógenos sea reversible. Sin embargo, uno de los principales inconvenientes es el hecho de que los receptores de hormonas esteroides, así como los reguladores quiméricos descritos en la presente, se fijan al ADN como dímeros. En consecuencia, cuando la proteína de fusión C7-ER-VP64 se expresó transitoriamente en células HeLa fue incapaz de regular una construcción informadora portadora de un único sitio de fijación de C7, mientras que reguló con facilidad un informador que tenía dos sitios de fijación de C7 y en con secuencia efectuaba la fijación de un dímero (Fig. 2B). Se presentó un problema adicional cuando se reemplazó C7 DBD por E2C, que contiene seis dominios de dedo de zinc y reconoce la secuencia de 18-bp 5'-GGG GCC GGA GCC GCA GTG-3' (SEQ ID NO; 29) en el 5'-UTR del protooncogén cerbB-2 [Yamamoto, T., Ikawa, S., Akiyama, T., Semba, K., Nomura, N., Miyajima, N., Saito, T., y Toyoshima, K. (1986) Nature 319, 230-234; Beerli, R. R., Segal, D. J., Dreier, B., y Barbas, C. F., III (1998) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95, 14628-14633]. La proteína de fusión E2C-ER-VP64 era constitutivamente activa sobre un informador portador de un único sitio de unión E2C, casi tan activa como la proteína de fusión E2C-VP64 sin un ER LBD, y no respondí bien ante la hormona. En apariencia, el uso de un gran dominio fijador de ADN que reconoce una extensión larga de ADN con alta afinidad hace que la quimera sea independiente de hormonas y de la dimerización.

A fin de superar estos problemas, los autores produjeron dos tipos de reguladores quiméricos de base ER, diseñados para ser capaces de regular la expresión génica a través de un único sitio de fijación en forma dependiente de hormona. En la primera estrategia, se generó un regulador heterodimérico que consistía en una proteína de dedo de zinc E2C obtenida por ingeniería fusionada con un ER LBD, además de un ER LBD fusionado con un dominio de activación VP64 (Fig. 2A). Cuando este regulador heterodimérico se expresó en células HeLa, no tenía actividad significativa sobre el plásmido informador E2C-TATA-luc en ausencia de 4-OHT. La adición de hormona condujo a una estimulación de 3 a 5 veces de la expresión de luciferasa, lo cual indica la formación de heterodímeros funcionales. Sin embargo, la activación génica del informador inducida por hormona era significativamente inferior a la inducida por una proteína de fusión E2C-VP64, presuntamente debido al menos en parte a la formación de homodímeros E2C-ER y ER-VP64. Los homodímeros eran inactivos, dado que ni E2C-ER ni ER-VP64 solos indujeron la expresión de la luciferasa. En la segunda estrategia, se generaron proteínas de fusión por combinación de las parejas de dimerización E2C-ER y ER-VP64 en un único polipéptido, a través de un ligador de polipéptido flexible. Se estudiaron dos ligadores, de 18 y 30 aminoácidos de longitud, y se crearon las proteínas E2C-scER/18-VP64 y E2C-scER/30-VP64 (Fig. 2A). Se esperaba que estas proteínas se activaran por, dimerización intramolecular, en lugar de intermolecular y en consecuencia fueran funcionales como monómeros. La combinación de dos ER LBD en una única construcción de cadena fusionada debería permitir una dimerización inducida por hormona más eficiente y en consecuencia producir activadores más eficientes. De hecho, cuando se expresaron transitoriamente E2C-scER/18-VP64 y E2C-scER/30-VP64 en células HeLa, activaron eficientemente el informador E2C-TATA-luc en una forma especialmente dependiente de hormona (Fig. 2B, 2C y 2D). En consecuencia, los reguladores diméricos que requerían elementos de respuesta similares a los de los receptores de hormonas esteroides naturales se convirtieron exitosamente en factores de transcripción monoméricos dependientes de ligando.

Conmutadores génicos monoméricos basados en LBD EcR y RXR. A fin de demostrar que la producción de un conmutador génico monomérico dependiente de ligando por fusión con dos LBD es una estrategia de aplicación general, se estudió la utilidad de otros receptores de hormonas nucleares. En particular, se investigó la utilidad de los LBD del receptor de ecdisona de Drosophila (EcR). En Drosophila, este receptor actúa como heterodímero entre EcR y el producto del gen de ultraespiraclo (USP) [Yao, T.-P., Forman, B. M., Jiang, Z., Cherbas, L., Chen, J.-D., McKeown, M., Cherbas, P., y Evans, R. M. (1993) Nature 366, 476-479]. Sin embargo, se ha demostrado que EcR también se heterodimeriza eficazmente con el receptor de retinoide X homólogo de USP de vertebrados (RXR) en respuesta al agonista de ecdisona Muristerona A o ponasterona A (PonA) [Nakanishi, K. (1992) Steroids 57, 649-657; Yao, T.-P., Forman, B. M., Jiang, Z., Cherbas, L., Chen, J.-D., McKeown, M., Cherbas, P., y Evans, R M. (1993) Nature 366, 476-479; No, D., Yao, T.-P., y Evans, R. M. (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93,3346-3351]. En consecuencia se usaron los LBD EcR y RXR para preparar un conmutador génico monomérico análogo a las quimeras scER descritas con anterioridad (Fig. 3A). En consecuencia, se insertaron el LBD humano RXR\alpha (aa373-654) y el LBD de Drosophila EcR (aa202-462) entre el E2C DBD y el dominio de activación de VP64, por lo que se creó E2C-RE-VP64. En esta construcción de fusión, los dos LBD están conectados a través de un ligador flexible de 18 aminoácidos, el mismo que se usó en E2C-scER/18-VP64. Cuando este regulador quimérico se expresó transitoriamente en células HeLa junto con el plásmido informador E2C-TATA-luc, se observó significativa actividad basal. No obstante, se pudo incrementar dicha actividad 3 veces mediante PonA, lo cual demuestra que dicha construcción artificial respondía a la hormona. A fin de mejorar la dependencia de ligando, se incrementó la longitud del ligando que conectaba los LBD de RXR y EcR, una medida que pareció ser beneficiosa en el caso de las construcciones monoméricas de ER. Un ligador más largo debería permitir que los LBD optimizaran sus contactos y contribuyeran al trastorno de conformación del estado no ligado. De hecho, cuando se alargó el ligador a 30 aa (en E2C-RLE-VP64) o 36 aa (en E2C-RLLE-VP64), la actividad basal se redujo significativamente y la adición de PonA llevó a una activación de 9 a 10 veces mayor, un grado de respuesta comparable al de las construcciones de fusión monocatenarias de ER (Fig. 3B). En consecuencia, la conexión en serie de pares de LBD de receptores de hormona nuclear parece ser una estrategia de aplicación general para obtener proteínas fijadoras de ADN monoméricas dependientes de ligando.

Los LBD hPR y mER usados para las proteínas de fusión no abarcaron sus señales naturales de localización nuclear símil SV40 (NLS), ubicadas entre los aminoácidos 637 y 644 en hPR, y entre los aminoácidos 260 y 267 en mER [Carson-Jurica, M. A., Schrader, W. T., y O'Malley, W. (1990) Endocrine Reviews 11, 201-220]. Si bien se ha demostrado que este NLS no se requiere para la localización nuclear dependiente de hormona de hPR, la regulación de la localización subcelular de los receptores esteroides parece ser compleja, y a priori no quedaba claro si se requería la presencia de NLS símil SV40 para la adecuada función de las proteínas quiméricas. En consecuencia, se prepararon construcciones adicionales que incorporaban un NLS SV40 (PKKKRKV) (SEQ ID NO: 30) en el código de aminoácidos de letra única), entre VP16 y C7, o entre C7 y LBD.

Luego se estudiaron los reguladores quiméricos de transcripción en su capacidad para regular el plásmido informador 10xC7-TATA-luc en forma dependiente de hormona. 10xC7-TATA-luc contiene diez sities de fijación de C7 [5'-GCG TGG GCG-3] espaciados por 5 nucleótidos, y una caja TATA, corriente arriba respecto de la región codificadora de la luciferasa de luciérnaga. Cada una de las proteínas de fusión reguló hacia arriba la expresión de luciferasa en forma virtualmente dependiente de hormona. RU486 estimuló la actividad de VP16-C7 PR 26 veces, mientras que 4-OHT condujo a una activación 43 veces mayor de VP16-C7-ER. No se detectó reactividad cruzada entre RU486 y ER, o entre 4-OHT y PR. No sólo no se requirió la presencia de una NLS en cualquiera de las posiciones sino que era indeseable, dado que condujo a un incremento de la actividad basal (es decir independiente de hormona) de las construcciones de fusión, presumiblemente debido a aumento de la localización nuclear. En consecuencia, los LBD de hPR (aa645-914) y mER (aa281-599, G525R) son capaces de conferir dependencia de hormona a la proteína de dedo de zinc C7.

La capacidad para control reversiblemente la expresión de múltiples genes, o alelos de un gen podría demostrar ser muy útil para muchas aplicaciones de investigación básica. En particular, la expresión selectiva e independiente de un gen, pero no otro (y viceversa), mediante la acción de pequeños ligandos no tóxicos podría permitir el análisis comparativo de una función génica, tanto in vitro como in vivo. Los autores demostraron que su sistema modular para controlar la expresión génica blanco es sin duda capaz de controlar independientemente la expresión de dos genes dentro de la misma célula transfectada, tal como se evidencia mediante la inducción dependiente de luciferasa de RU486 y la expresión de \beta-gal inducida por 4-OHT. La falta de inducción de \beta-gal por parte de RU486, y la inducción de luciferasa por 4-OHT demuestra de manera convincente la especificidad de los reguladores quiméricos descritos en la presente. No sólo se retiene la exquisita especificidad del dominio fijador de ADN utilizado, sino también no hay reacciones cruzadas detectables entre RU486 y ER LBD, o entre 4-OHT y PR LBD.

<110> Novartis AG

\hskip1cm

Novartis Erfindungen Verwaltungsgesellschaft mbH

\hskip1cm

The Scripps Research Institute

\hskip1cm

Barbas, Carlos F.

\hskip1cm

Beerli, Roger

\hskip1cm

Schopfer, Ulrich

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<120> REGULACIÓN DE LA EXPRESIÓN GÉNICA USANDO CONMUTADORES POLIPEPTÍDICOS MONOMÉRICOS MONOCATENARIOS DEPENDIENTES DE LIGANDO

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<130> 4-31549A/SCR

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<160> 53

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<170> FastSEQ for windows version 4.0

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 1

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 58

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> desconocido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> sintetizado

\vskip0.400000\baselineskip

<221> misc-feature

\vskip0.400000\baselineskip

<222> 19-23

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Pueden faltar algunos o todos

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 1

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gagggtaccg cgtgggcgaa aaagcgtggg cgagtcgact ctagagggta tataatgg

\hfill

58

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 2

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 58

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> desconocido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> sintetizado

\vskip0.400000\baselineskip

<221> misc-feature

\vskip0.400000\baselineskip

<222> 19-23

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Pueden faltar algunos o todos

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 2

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gagggtaccg cgtgggcgaa aaacgcccac gcagtcgact ctagagggta tataatgg

\hfill

58

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 3

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 58

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> desconocido

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> sintetizado

\vskip0.400000\baselineskip

<221> misc-feature

\vskip0.400000\baselineskip

<222> 19-23

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Pueden faltar algunos o todos

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 3

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gagggtaccc gcccacgcaa aaagcgtggg cgagtcgact ctagagggta tataatgg

\hfill

58

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 4

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 22

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> desconocido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> sintetizado

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 4

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ctttatgttt ttggcgtctt cc

\hfill

22

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 5

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 63

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Desconocido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> sintetizado

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 5

\vskip1.000000\baselineskip

4

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 6

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 55

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Desconocido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> sintetizado

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 6

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gaggaggagg agaagcttgt taattaaacc gtactcgtca attccaaggg catcg

\hfill

55

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 7

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 76

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> desconocido

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> sintetizado

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 7

\vskip1.000000\baselineskip

5

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 8

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 47

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> desconocido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Sintetizado

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 8

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gaggaggagg agaagcttgg ggccacggcg gccctcgagc cctatgc

\hfill

47

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 44

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> desconocido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> sintetizado

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 9

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gaggagggat ccccctggcc ggcctggcca ctagttctag agtc

\hfill

44

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 10

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 65

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> desconocido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> sintetizado

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 10

\vskip1.000000\baselineskip

6

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 11

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 47

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> desconocido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> sintetizado

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 11

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gaggaggagg agggatccag tcagagttgt gagagcactg gatgctg

\hfill

47

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 12

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 48

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Desconocido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Sintetizado

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 12

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gaggaggaat tctcaagcaa taacttcaga catcatttct ggaaattc

\hfill

48

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 13

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 60

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> desconocido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> sintetizado

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 13

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gaggaggagg aggagggccg gccgcgtcga ccaggtcaga gttgtgagag cactggatgc

\hfill

60

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 14

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 60

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> desconocido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Sintetizado

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 14

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gaggaggagg aggagggcgc gccccgtcga cccagcaata acttcagaca tcatttctgg

\hfill

60

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 15

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 52

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Desconocido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Sintetizado

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 15

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gaggaggagg aggagggccg gccgccgaaa tgaaatgggt gcttcaggag ac

\hfill

52

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 16

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 51

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> desconocido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Sintetizado

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 16

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gaggaggagg aggagggcgc gcccgatcgt gttggggaag ccctctgctt c

\hfill

51

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 17

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 50

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Desconocido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> sintetizado

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 17

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gaggaggagg aggagttaat taagatcgtg ttggggaagc cctctgcttc

\hfill

50

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 18

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 54

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Desconocido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> sintetizado

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 18

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gaggaggagg agggatccgc caccatgcga aatgaaatgg gtgcttcagg agac

\hfill

54

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 19

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 90

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> desconocido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> sintetizado

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 19

\vskip1.000000\baselineskip

7

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 90

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Desconocido

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> sintetizado

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 20

\vskip1.000000\baselineskip

8

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 21

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 54

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> desconocido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> sintetizado

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 21

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gaggaggagg aggaggaggc tagctcttcc aatgaaatgg gtgcttcagg agac

\hfill

54

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 22

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 41

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> desconocido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> sintetizado

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 22

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gaggaggagg gccggccggg aagccgtgca ggaggagcgg c

\hfill

41

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 23

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 88

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Desconocido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Sintetizado

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 23

\vskip1.000000\baselineskip

9

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 24

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 52

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> desconocido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> sintetizado

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 24

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gaggaggagg aggctagctc ttccggtggc ggccaagact ttgttaagaa gg

\hfill

52

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 25

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 88

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> desconocido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> sintetizado

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 25

\vskip1.000000\baselineskip

10

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 26

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 45

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Desconocido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> sintetizado

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 26

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gaggaggagg gcgcgcccgg catgaacgtc ccagatctcc tcgag

\hfill

45

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 27

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 68

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Desconocido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> sintetizado

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 27

\vskip1.000000\baselineskip

11

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 28

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 72

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> desconocido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> sintetizado

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 28

\vskip1.000000\baselineskip

12

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 29

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 18

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Desconocido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> sintetizado

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 29

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ggggccggag ccgcagtg

\hfill

18

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 30

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 7

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> desconocido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> sintetizado

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 30

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Pro Lys Lys Lys Arg Lys Val}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 31

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 558

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> desconocido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> sintetizado; dominio de fijación de dedo de zinc B3B

\vskip0.400000\baselineskip

<221> misc-feature

\vskip0.400000\baselineskip

<222> 1, 2, 557, 558

\vskip0.400000\baselineskip

<223> n = A, T, C o G

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 31

\vskip1.000000\baselineskip

13

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 32

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 186

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> desconocido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> sintetizado; dominio de fijación de dedo de zinc B3B

\vskip0.400000\baselineskip

<221> VARIANTE

\vskip0.400000\baselineskip

<222> 1, 186

\vskip0.400000\baselineskip

<223> xaa = cualquier aminoácido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 32

\vskip1.000000\baselineskip

14

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 33

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 567

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Desconocido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> sintetizado; dominio de fijación de dedo de zinc 2c7

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<221> misc-feature

\vskip0.400000\baselineskip

<222> 1, 2, 566, 567

\vskip0.400000\baselineskip

<223> n = A,T,C o G

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 33

\vskip1.000000\baselineskip

15

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 34

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 189

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> desconocido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Sintetizado; dominio de fijación de dedo de zinc 2C7

\vskip0.400000\baselineskip

<221> VARIANTE

\vskip0.400000\baselineskip

<222> 1, 189

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa = Cualquier aminoácido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 34

\vskip1.000000\baselineskip

16

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 35

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 558

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> desconocido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Sintetizado; dominio de fijación de dedo de zinc B3C2

\vskip0.400000\baselineskip

<221> misc-feature

\vskip0.400000\baselineskip

<222> 1, 2, 557, 558

\vskip0.400000\baselineskip

<223> n = A,T,C o G

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 35

\vskip1.000000\baselineskip

17

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 36

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 186

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> desconocido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> sintetizado; dominio de fijación de dedo de zinc B3C2

\vskip0.400000\baselineskip

<221> VARIANTE

\vskip0.400000\baselineskip

<222> 1, 186

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa = Cualquier aminoácido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 36

\vskip1.000000\baselineskip

18

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 37

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 303

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> desconocido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> sintetizado; dominio de represión (KRAB-A)2

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 37

\vskip1.000000\baselineskip

19

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 38

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 240

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> desconocido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> sintetizado; dominio de represión (SID)2

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 38

\vskip1.000000\baselineskip

20

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 39

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 2739

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> desconocido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> sintetizado; polipéptido E2C-ER-L-ER-VP64

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 39

21

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 40

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 910

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> desconocido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> sintetizado; polipéptido E2C-ER-L-ER-VP64

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 40

\vskip1.000000\baselineskip

22

23

24

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 41

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 2775

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Desconocido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> sintetizado; polipéptido E2C-ER-LL-ER-VP64

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 41

25

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 42

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 922

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> desconocido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> sintetizado; polipéptido E2C-ER-LL-ER-VP64

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 42

\vskip1.000000\baselineskip

26

27

28

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 43

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 2775

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Desconocido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Sintetizado; secuencia complementaria de SEQ ID 41

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 43

29

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 44

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 2739

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Desconocido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Sintetizado; secuencia complementaria de SEQ ID 39

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 44

\vskip1.000000\baselineskip

30

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 45

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 558

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Desconocido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Sintetizado; secuencia complementaria de SEQ ID 35

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<221> misc-feature

\vskip0.400000\baselineskip

<222> 1, 2, 557, 558

\vskip0.400000\baselineskip

<223> n = A,T,C o G

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 45

\vskip1.000000\baselineskip

31

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 46

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 567

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> desconocido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Sintetizado; secuencia complementaria de SEQ ID 33

\vskip0.400000\baselineskip

<221> misc-feature

\vskip0.400000\baselineskip

<222> 1, 2, 566, 567

\vskip0.400000\baselineskip

<223> n = A,T,C o G

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 46

\vskip1.000000\baselineskip

32

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 47

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 558

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Desconocido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Sintetizado; secuencia complementaria de SEQ ID 31

\vskip0.400000\baselineskip

<221> misc-feature

\vskip0.400000\baselineskip

<222> 1, 2, 557, 558

\vskip0.400000\baselineskip

<223> n = A,T,C o G

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 47

33

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 48

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 38

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Desconocido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> sintetizado; péptido B3/F1

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 48

34

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 49

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 28

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Desconocido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> sintetizado; péptido B3/F2

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 49

35

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 50

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 34

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> desconocido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> sintetizado; péptido B3/F3

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 50

36

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 51

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 38

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> desconocido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> sintetizado; péptido N1/F1

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 51

\vskip1.000000\baselineskip

37

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 52

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 28

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Desconocido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Sintetizado; péptido N1/F2

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 52

\vskip1.000000\baselineskip

38

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 53

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 34

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Desconocido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> sintetizado; péptido N1/F3

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 53

\vskip1.000000\baselineskip

39

Claims (25)

1. Un polipéptido no natural que comprende dos dominios fijadores de ligando derivados de receptores de hormonas nucleares ligado operativamente a un dominio fijador de ADN y un dominio de regulación de la transcripción, en el cual el dominio fijador de ADN comprende al menos un motivo fijador de dedo de zinc obtenido por ingeniería.

2. El polipéptido de acuerdo con la reivindicación 1, en el cual los dos dominios fijadores de ligando están ligados covalentemente a través de un péptido ligador.

3. El polipéptido de acuerdo con la reivindicación 2, en el cual el ligador contiene de aproximadamente 10 a aproximadamente 40 residuos de aminoácidos.

4. El polipéptido de acuerdo con la reivindicación 2, en el cual el ligador contiene de aproximadamente 15 a aproximadamente 35 residuos de aminoácidos.

5. El polipéptido de acuerdo con la reivindicación 2, en el cual el ligador contiene de aproximadamente 18 a aproximadamente 30 residuos de aminoácidos.

6. El polipéptido de acuerdo con la reivindicación 1, en el cual el primero y el segundo dominio fijador de ligando derivan de diferentes receptores de hormonas nucleares.

7. El polipéptido de acuerdo con la reivindicación 1, en el cual el primero y el segundo dominio fijador de ligando derivan del mismo receptor de hormona nuclear.

8. El polipéptido de acuerdo con la reivindicación 1, en el cual el receptor de hormona nuclear es un receptor de estrógeno, un receptor de progesterona, un receptor de ácido retinoico o un receptor de retinoide X.

9. El polipéptido de acuerdo con la reivindicación 6, en el cual al menos uno de los dominios fijadores de ligando deriva de un receptor de retinoide X.

10. El polipéptido de acuerdo con la reivindicación 1, el cual comprende de dos a doce motivos fijadores de ADN de dedo de zinc obtenidos por ingeniería.

11. El polipéptido de acuerdo con la reivindicación 1, el cual comprende de dos a seis motivos fijadores de dedo de zinc obtenidos por ingeniería.

12. El polipéptido de acuerdo con la reivindicación 10, en el cual los motivos fijadores de ADN de dedo de zinc obtenidos por ingeniería se fija específicamente a una secuencia de nucleótidos de la fórmula (GNN)_{1-6}, en la cual G es guanina y N es cualquier nucleótido.

13. El polipéptido de acuerdo con la reivindicación 1, en el cual el dominio regulador de la transcripción es un dominio de activación.

14. El polipéptido de acuerdo con la reivindicación 1, en el cual el dominio regulador de la transcripción es un dominio de represión.

15. Un polipéptido no natural que comprende: (a) un dominio fijador de ADN que tiene de dos a seis motivos fijadores de ADN de dedo de zinc obtenidos por ingeniería; (b) un primer dominio fijador de ligando derivado de un receptor de retinoide X ligado operativamente al dominio fijador de ADN, un segundo dominio fijador de ligando derivado de un receptor de ecdisona ligado operativamente al primer dominio fijador de ligando mediante un espaciador de péptidos de 18 a 36 residuos de aminoácidos; y (c) un dominio regulador de transcripción ligado operativamente al segundo dominio fijador de ligando.

16. Un polipéptido no natural que comprende: (a) un dominio fijador de ADN que tiene de dos a seis motivos fijadores de ADN de dedo de zinc obtenidos por ingeniería; (b) un primer dominio fijador de ligando derivado de un receptor de progesterona ligado operativamente al dominio fijador de ADN, un segundo dominio fijador de ligando derivado de un receptor de progesterona ligado al primer dominio fijador de ligando mediante un espaciador de péptidos de 18 a 36 residuos de aminoácidos; y (c) un dominio regulador de transcripción ligado operativamente al segundo dominio fijador de ligando.

17. Un polinucleótido que codifica el polipéptido de acuerdo con la reivindicación 1.

18. Un polinucleótido que codifica el polipéptido de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 15 ó 16.

19. Un vector de expresión que comprende el polinucleótido de acuerdo con la reivindicación 17.

20. Un vector de expresión que comprende el polinucleótido de acuerdo con la reivindicación 18.

21. Una célula huésped que comprende el polinucleótido de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 17 ó 18.

22. Una célula huésped que comprende el vector de expresión de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 19 ó 20.

23. Un procedimiento para regular la función de un nucleótido blanco que contiene una secuencia definida, en donde el procedimiento comprende exponer in vitro o ex vivo el nucleótido blanco al polipéptido de acuerdo con la reivindicación 1 en presencia de un ligando que se fija a uno de los dominios fijadores de ligando del polipéptido, en el cual el dominio fijador de ADN del polipéptido se fija a la secuencia definida.

24. Un procedimiento de acuerdo con la reivindicación 23 en el cual dicho ligando es un ligando no nativo.

25. Un vector de expresión que codifica un polipéptido no natural de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 16 para su uso en terapia génica.