KR100375890B1

KR100375890B1 - 유도성 징크핑거 발현 벡터 및 이를 이용한 표적 유전자발현의 인위적 조절 방법

Info

Publication number: KR100375890B1
Application number: KR10-2000-0055147A
Authority: KR
Inventors: 김진수; 강종석
Original assignee: 주식회사 툴젠
Priority date: 2000-09-20
Filing date: 2000-09-20
Publication date: 2003-03-15
Also published as: KR20020022379A

Abstract

본 발명은 표적 유전자의 전사 개시점 부근의 임의의 표적 염기서열을 인식하는 징크핑거 단백질을 암호화하는 유전자를 소분자에 의해 발현이 조절될 수 있는 유도성 발현 벡터(inducible expression vector)내에 작동가능하게 연결시켜 이루어지는 유도성 징크핑거 단백질 발현 벡터 및 이를 이용한 표적 유전자 발현의 인위적 조절 방법에 관계된다.

Description

유도성 징크핑거 발현 벡터 및 이를 이용한 표적 유전자 발현의 인위적 조절 방법{Method of Artificial Regulation of Target Gene Expression Using Inducible Zinc Finger Expression System}

본 발명은 인위적으로 표적 유전자의 발현을 조절하는 방법 및 이에 사용되는 벡터에 관한 것이다. 구체적으로, 본 발명은 표적 유전자의 전사 개시점 부근의 염기서열을 인식하여 결합하는 징크핑거 단백질에 관한 것이다. 더욱 구체적으로는, 상기 징크핑거 단백질을 암호화하는 유전자를 소분자 유도성 발현 벡터내에 작동가능하게 삽입하여 이루어지는 소분자 유도성 징크핑거 발현 벡터 및 이를 이용한 표적 유전자 발현의 인위적 조절 방법에 관한 것이다.

포스트게놈 시대(post-genomic era)가 전개되면서 유전자의 발현을 인위적으로 조절할 수 있는 시스템의 필요성이 강조되고 있다. 각종 게놈 프로젝트의 결과 인간을 포함한 여러 생명체에서 수많은 유전자의 서열이 밝혀지고 있으나, 이들 대부분의 유전자의 기능은 아직 밝혀지지 않고 있다. 만일 생물체내 또는 배양 세포내에서 어떤 유전자의 발현을 업(상승적) 또는 다운(하향적) 조절할 수 있다면, 이 방법은 유전자의 기능을 밝히는 데 있어서 유용할 것이고, 이러한 방법은 포스트게놈 시대에 광범위하게 활용될 수 있을 것이다. 즉, 이렇게 유전자의 업 또는 다운조절된 발현으로 야기되는 생물학적 결과를 모니터함으로써 관심있는 유전자의 기능을 연구하거나 그 유전자의 생물학적 역할을 밝힐 수 있다. 나아가 표적 유전자의 발현 조절은 유전자치료의 수단으로서도 매우 중요한 가치가 있다. 즉 질병과 관련된 유전자를 적절히 조절할 수 있다면 매우 효과적인 치료수단으로 활용될 수 있을 것이다.

종래에 표적 유전자의 발현을 인위적으로 조절하기 위하여 주로 사용되어 왔던 방법으로 안티센스 방법, 리보자임 방법이 있었다. 안티센스 방법은 표적 유전자의 전사물인 mRNA와 상보적인 핵산을 투여하여 이 상보적인 핵산이 표적 유전자 mRNA와 융합하여 표적 유전자 mRNA의 번역을 방해함으로써 표적 유전자의 단백질 발현을 억제한다. 리보자임법은 RNA효소가 표적 유전자의 mRNA 서열을 인식하여 절단시킴으로써 역시 표적 유전자의 단백질 형성을 억제한다.

이러한 종래의 안티센스나 리보자임 방법에서는 mRNA 서열내에서 상보적인 핵산 또는 리보자임이 결합할 결합 부위를 여러번의 시행착오(trial and error)를 거쳐 결정해야 하는 번거로움이 있고, 안티센스나 리보자임 분자들이 결합하는 부위가 표적 유전자의 전사물인 mRNA이어서 전사물의 번역단계를 제어하기 때문에 그 제어 효율이 낮다는 단점이 있을 뿐만 아니라, 표적 유전자의 억제에는 사용될 수 있으나 활성에는 사용될 수 없다는 한계가 있었다.

한편, 최근에, 징크핑거 단백질을 이용하여 표적 유전자의 발현을 조절할 수 있을 것이라는 가능성이 대두되고 있고 이에 대해 긍정적인 연구들이 있었다.

징크핑거는 진핵생물에서 가장 흔하게 발견되는 DNA 결합 단백질의 DNA 결합 모티프로서 알려져 있다. 징크핑거 단백질은 서열특이적으로 특정 표적 서열을 인식하는 능력을 가지고 있으므로, 이 징크핑거 단백질을 전사 활성화(또는 억제) 도메인과 연결하면 표적 유전자를 조절하는데 사용할 수 있다.

종래의 안티센스나 리보자임법에 비해, 징크핑거 단백질을 이용한 표적 유전자 조절에서는, 징크핑거 단백질이 전사물이 아니라 유전자 서열에 결합하여 전사 자체를 조절하므로 매우 효과적이고 강력한 제어가 가능하다. 또한, 둘 이상의 독립적인 결합 부위를 인식하는 징크핑거 단백질을 동시에 사용하여 조절할 수 있어서, 점 돌연변이등 자연적으로 발생하는 결합부위내 서열의 돌연변이로 인한 내생 클론의 발생을 최대한 줄일 수 있다. 또한 이러한 징크핑거 단백질을 전사 활성자 또는 억제자에 연결하느냐에 따라 유전자 발현의 억제는 물론 활성화에도 이용될 수 있다는 장점이 있다.

최근에 서열 특이적 징크핑거 DNA-결합 도메인을 여러가지 종류의 적당한 효과 도메인(활성화 도메인 또는 억제 도메인)과 융합한 전사인자(Transcription Factor: TF)의 형태(전사인자 발현 시스템)로 세포에서 발현시키면 표적 유전자의 발현을 업 또는 다운 조절시킬 수 있다는 연구가 발표되었다 [Liu, Q., Segal, D. J., Ghiara, J. B., and Barbas, C. F., III (1997)Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 94, 5525-5530; Beerli, R. R., Segal, D. J., Dreier, B., and Barbas C.F., III (1988)Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 95, 14628-14633; Beerli R.R., Dreier B. Barbas C.F.3rd, Positive and negative regulation of endogeneous genes by designed transcription factor, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 2000 Feb. 15:97(4) 1495-500].

그러나, 이렇게 징크핑거 단백질과 효과 도메인을 융합한 전사인자(TF) 발현 시스템을 이용하는 기존의 방법은 효과 도메인의 특성에 따라 조절하고자 하는 표적 유전자 이외의 인접한 다른 유전자의 발현에도 영향을 줄 수 있다는 문제점이 있다. 예를 들어, 효과도메인 중 하나인 KRAB 도메인은 DNA-결합 도메인과 융합시 리포터 유전자의 발현을 억제하는 것으로 알려져 있다. 그런데, KRAB의 효과는 유전자의 프로모터로부터 수킬로베이스 떨어진 결합 부위에서도 그 유전자를 억제할 수 있는 강력한 성능을 가진다. 때에 따라서는 이러한 강력한 억제가 유용한 특성이 될 수도 있지만, 특이성에 있어서 문제점이 있을 수 있다. 예를 들어 이 징크핑거-KRAB 융합 단백질을 생체내 유전자의 조절에 사용하고자 하는 경우, KRAB 도메인이 그 결합부위에서 멀리 떨어진 유전자에도 영향을 주는 특성을 가지기 때문에 표적으로 삼은 유전자 이외에 다른 인접 유전자의 발현에도 영향을 줄 수 있다. 따라서 이 융합 전사인자(TF) 시스템은 트랜스제닉 동·식물 또는 유전자 치료에 사용될 경우 표적 유전자 이외의 유전자 발현에 영향을 줌으로써 부작용을 초래할 가능성이 크다.

한편, 최근에 징크핑거 단백질을 강력한 프로모터인 CMV 프로모터를 이용해 세포내에서 발현시키면 세포내 표적 유전자의 발현을 효과적으로 억제한다는 것이알려졌다[김진수 및 파보(Kim, J. S. and Pabo, C. O.) (1997)J. Biol. Chem. 272, 29795-29800]. 그러나, 상기 문헌에서는 징크핑거 단백질을 강력한 프로모터를 이용하여 대량으로 발현시켰기 때문에 징크핑거 단백질의 농도는 세포내에서항상고농도로 일정하게 유지되고 표적 유전자도 일정하게 억제되고 있는 것을 보여주고 있을 뿐, 징크핑거 단백질을 소량으로 발현시키거나 징크핑거 단백질의 발현이 중단되면 표적 유전자가 다시 활성화될 수 있는지에 대해서는 어떠한 암시나 개시도 하고 있지 않다. 즉, 상기 논문에서는 징크핑거 단백질이 표적 유전자의 발현을 가역적으로 억제할 수 있는지 또는 표적 유전자의 발현이 징크핑거 단백질의 양에 의존적인지에 대해서는 어떠한 언급도 없다.

그러나, 어떤 표적 유전자 조절 시스템이 표적 유전자의 기능을 밝히기 위한 연구용으로 또는 유전자치료와 같은 치료용으로 활용되기 위해서는 표적 유전자의 발현을 가역적으로 조절할 수 있어야 한다. 더욱 바람직하게는, 표적 유전자가 조절되는 정도를 인위적으로 제어할 수 있어야 한다. 즉, 필요할 때만 표적 유전자를 조절할 수 있고 필요하지 않을 때는 표적 유전자의 발현이 원래 상태로 복귀될 수 있으며, 바람직하게는 표적 유전자를 너무 강력하게 억제하거나 활성화시키는 극단적인 조절이 아니라 조절 수위를 적절히 조절할 수 있을 것이 요망된다.

즉, 수백억개 이상의 염기로 이루어진 생체내 유전자 중에서도 표적으로 삼은 유전자만을 특이적으로 인식할 수 있고(서열 특이성), 그 조절 방법이 소분자에 의해 외부에서 손쉽게 조절 가능할 뿐만 아니라(조절 용이성), 가역적으로 온-오프 조절할 수 있으면서(조절 가역성), 그 조절 정도를 소분자의 농도를 변화시킴으로서 손쉽게 제어할 수 있으며(단계적 조절 가능성), 표적 유전자가 아닌 다른 유전자에 대해서는 영향을 미치지 않는(무해성) 일반적이고 보편적인 표적 유전자의 인위적 조절 방법에 대한 요구가 당업계에 지속되어 왔다.

본 발명자들은 징크핑거 단백질이 서열특이적으로 표적 유전자의 발현을 가역적으로 조절하며, 그 조절정도는 징크핑거 단백질의 발현양에 의존적임을 처음으로 발견하고, 이 징크핑거 단백질의 발현이 외부에서 투여되는 소분자에 의존적이 되도록 구성함으로써 본 발명을 완성하기에 이르렀다.

본 발명은 상기한 종래 기술의 문제점을 극복하기 위한 것으로, 표적 유전자의 발현을 소분자를 이용하여 가역적으로 온-오프 조절할 수 있으면서 그 조절 정도를 소분자의 농도를 변화시킴으로서 손쉽게 제어할 수 있으며 표적 유전자가 아닌 다른 유전자에 대해서는 영향을 미치지 않는 일반적이고 보편적인 방법 및 시스템을 제공하는 것을 목적으로 한다.

구체적으로 본 발명은 표적 유전자의 발현이 외부에서 투여되는 소분자(small molecule)의 투여량에 의존하는 방식(dose-dependent manner)으로 조절되는 방법 및 이에 사용되는 벡터를 제공하는 것을 목적으로 한다.

또한, 본 발명은 표적 유전자의 발현을 가역적으로 조절(reversible regulation)하는 방법 및 이에 사용되는 벡터를 제공하는 것을 또다른 목적으로 한다.

도1은 본 발명의 실시예에서 사용된 징크핑거 단백질 및 그 결합 부위의 염기서열을 도식적으로 나타낸다. 각 징크핑거 도메인을 원으로 나타내었다. 하나의 징크핑거 도메인이 인식하는 염기 서열을 원 밑에 나타내었다.

도2의 상단은 본 발명의 실시예에서 사용된 루시퍼라제 리포터 유전자의 프로모터 부위를 도식적으로 나타낸다. 하단에는 징크핑거 단백질이 결합하는 결합부위의 염기 서열을 루시퍼라제 리포터 유전자의 전사개시점(+1)을 기준으로 상대적인 위치에 정렬하여 도시한다. 점은 동일한 뉴클레오티드를 나타내고, 밑줄은 돌연변이된 염기 서열을 나타낸다.

도3은 다양한 프로모터 조절하에 발현시킨 6-징크핑거 268//NRE 단백질의 전사 억제를 보여주는 도표이다. 각각 CMV 프로모터(A 칼럼), SV40 프로모터(B 칼럼), HSV-TK 프로모터(C 칼럼)의 조절하에 놓인 징크핑거 단백질의 발현은 GAL4-VP16 활성자에 의한 루시퍼라제 리포터 유전자의 발현을 억제한다. 그림에 나타낸 억제률은 징크핑거 단백질을 암호화하지 않는 콘트롤 플라즈미드가 도입된 보통 세포에서 루시퍼라제 활성을 구하고 이를 징크핑거 단백질을 암호화하는 플라즈미드가 도입된 세포에서의 루시퍼라제 활성으로 나눈 값이다.

도4A는 본 발명에 따른 엑디손 유도형 징크핑거 단백질에 의한 표적 유전자의 발현 억제가 엑디손 유도체인 포나스테론 A의 투여량에 비례함을 보여주는 도표이다. 포나스테론 A를 첨가한 48시간 후 루시퍼라제의 활성을 측정한 결과이다. c268 세포주 및 c268//NRE 세포주 모두 포나스테론 A의 양이 증가할수록 리포터 유전자의 발현이 점진적으로 억제된다.

도4B는 엑디손 유도형 징크핑거 단백질에 의한 리포터 유전자의 서열 특이적 발현 억제를 보여주는 도표이다. 리포터 플라즈미드의 결합 부위의 염기서열은 도2에 도시한 것과 같다.

도5A는 엑디손 유도형 징크핑거 단백질을 이용한 표적 유전자 발현의 가역적 조절을 보여주는 도표이다. 도표 하단에는 포나스테론 처리 시간 및 일시적 형질전환 후 포나스테론 제거시간과 루시퍼라제 활성 측정시간을 도식적으로 나타내었다. 상단 좌측은 c268 세포주에서 Z 결합 부위를 갖는 리포터 유전자의 상대적 활성을 시간에 따라 나타낸 것이다. 상단 우측은 c268//NRE 세포주에 대한 것이다.

도5B는 겔 이동 실험 결과이다. c268 및 c268//NRE 세포주에 24시간 동안 포나스테론 A를 처리한 후 배양액에서 포나스테론 A를 제거한 후 도표 상단에 표시한 시간대에서 핵 추출물을 얻어서 각각 Z 및 N/Z 서열의 DNA를 프로브로 하여 겔 이동 실험(gel shift assay)을 수행한 결과의 겔 사진이다.

도6은 다양한 결합 부위를 함유하는 리포터 유전자가 염색체내에 삽입된 안정적 형질전환된 세포주에서 각각의 징크핑거 단백질에 의한 리포터 유전자의 전사억제를 보여주는 도표이다.

도7은 염색체내에 삽입된(안정적으로 형질전환된) 다양한 결합 부위를 함유하는 리포터 유전자의 복제수 및 삽입 위치를 보여주는 서던 블롯 분석 사진이다. 상단의 세포주는 다양한 결합 부위 염기서열을 함유하는 리포터 유전자로 안정적으로 형질전환된 세포주를 나타낸다. H 레인은HindIII 제한효소로 절단한 결과를, N 레인은NdeI 제한효소로 절단한 결과를, N+H 레인은 이 둘의 제한효소로 동시에 절단한 결과를 나타낸다. 좌측은 분자 크기 마커(kb)를 나타낸다.

상기 목적을 달성하기 위하여 본 발명에서는,

표적 유전자의 전사 개시점 부근의 임의의 표적 염기 서열을 인식하는 징크핑거 단백질을 암호화하는 유전자를 소분자 유도성 발현 벡터(small molecule inducible expression vector)내에 소분자에 의해 징크핑거 단백질 발현이 조절될 수 있도록 작동가능하게 연결시켜 이루어지는 유도성 징크핑거 단백질 발현 벡터로서, 발현된 징크핑거 단백질이 표적 유전자의 발현을 가역적으로 조절하는 시스템을 제공한다.

또한, 본 발명에서는,

(1) 표적 유전자의 전사 개시점 부근의 임의의 표적 염기 서열을 인식하는 징크핑거 단백질을 암호화하는 유전자를 소분자 유도성 발현 벡터내에 소분자에 의해 징크핑거 단백질 발현이 조절될 수 있도록 작동가능하게 연결시켜 이루어지는 소분자 유도성 징크핑거 단백질 발현 벡터를 세포내에 도입하는 단계, 및

(2) 상기 소분자를 세포내로 투입하여 세포내 상기 징크핑거 단백질의 발현양을 조절하고 이 징크핑거 단백질의 조절된 양에 의존적으로 표적 유전자의 발현이 조절되는 단계를 포함하는, 표적 유전자의 발현을 가역적으로 조절하는 방법을 제공한다.

본 발명에 따른 유도성 징크핑거 단백질 발현 벡터내에는 징크핑거 단백질을 암호화하는 유전자가 소분자와 결합된 수용체 전사인자가 인식할 수 있는 부위를 함유하는 프로모터 부위와 작동가능하게 연결되어 있다. 따라서, 외부에서 소분자가 투여되면, 세포 내에서 소분자는 수용체 전사인자와 결합하고 소분자와 결합한 수용체 전사인자는 프로모터 내의 인식부위에 결합할 수 있게 된다. 그 결과 수용체 전사인자의 작용으로 징크핑거 단백질이 발현된다. 소분자와 결합하지 않은 수용체 전사인자는 프로모터 내의 인식부위에 결합할 수 없기 때문에 소분자를 투여하지 않은 상태에서는 징크핑거의 발현이 억제된다. 발현된 징크핑거 단백질은 표적 유전자의 전사 개시점 근처에 위치하는 표적 결합 부위를 인식하고 결합하여 표적 유전자 발현을 억제하게 된다. 징크핑거 단백질의 발현양은 외부에서 투여되는 소분자의 양에 의존적이어서, 투여를 중단하면, 징크핑거 단백질의 자연적 소멸로 징크핑거 단백질의 농도가 떨어지게 되고, 결과적으로 징크핑거 단백질에 의한 표적 유전자의 억제가 감소되어 표적 유전자의 발현이 진행된다. 결국, 소분자의 농도에 의존적으로 표적 유전자 발현의 가역적 조절이 가능하게 된다.

징크핑거 단백질

징크핑거 단백질은 진핵생물에서 가장 흔하게 발견되는 DNA 결합 단백질의 DNA 결합 모티프이고, 이 징크핑거 DNA 결합 단백질을 전사 활성자 또는 전사 억제자와 융합하면, 이 융합 단백질은 새로운 전사인자로서 징크핑거가 인식하는 표적 유전자의 발현을 활성 또는 억제시킬 수 있다고 알려져 있다. 상기 김진수 등의 논문에서는 징크핑거 단백질이 표적 유전자의 전사 개시점 부근에 결합하게 되면, 전사 억제자 또는 활성자와 융합되지 않아도 단독으로 표적 유전자의 전사를 억제한다는 것을 알려주고 있다. 본 발명자들은 여기에서 진일보하여 징크핑거 단백질이 표적 유전자의 발현을 가역적으로 조절할 수 있으며, 징크핑거 농도에 의존적으로 단계적으로도 조절될 수 있음을 처음으로 발견하였다. 따라서, 본 발명자들은 이러한 징크핑거 단백질을 세포내 표적 유전자의 인위적 조절을 위한 도구로서 사용하게 되었다.

Cys₂-His₂타입의 징크 핑거 도메인이 보통 3개 이상 나란히 배열되어 징크핑거 단백질을 구성한다. 하나의 도메인은 3개 내지 4개의 염기로 구성된 표적서열을 인식할 수 있는데, 이러한 단위 징크핑거 도메인의 적절한 재배열 및 연결로 9-10 염기의 표적 서열을 선택적으로 인식할 수 있는 서열특이적 징크핑거를 만들 수 있다. 본 발명에서는 징크핑거 단백질로서 3 개의 징크핑거 도메인이 나란히 배열되어 구성된 3-핑거 단백질을 사용할 수 있다. 1 개의 징크핑거 도메인이 대략 3 개의 염기서열(3 bp)을 인식하기 때문에 이러한 3-핑거 단백질은 9 개의 염기서열(9 bp)을 인식하게 된다. 바람직하게는, 본 발명에서 표적 염기 서열을 인식하는 징크핑거 단백질이 6 개 이상의 징크핑거 도메인의 조합으로 이루어지는 것이다. 즉, 2 개의 3-핑거 단백질을 적당한 링커로 연결한 2×3 핑거의 융합 단백질이 바람직하다. 6-핑거 단백질은 3-핑거 단백질에 비해 더 강력하면서 보다 특이적으로 작용하는 것으로 알려져 있다[Kim J. S. and Pabo, C. O.(1998)Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 95, 2812-2817].

표적으로 삼은 유전자를 특이적으로 인식, 결합하여 그 유전자의 발현을 조절할 수 있는 징크핑거 단백질은 다음과 같이 선택 및 조합하여 제조한다. 먼저,표적 유전자의 전사개시점 부근의 임의의 서열(약 9개 또는 18개 염기)을 선택한다. 선택된 서열중 3개의 염기서열을 인식할 수 있는 단위 징크핑거 도메인들을 선택한다. 이들 선택된 도메인을 연결하여 표적 유전자의 9개 또는 18개 염기 서열을 인식할 수 있는 3개 또는 6개의 징크핑거로 이루어진 징크핑거 단백질을 조합한다.

표적 유전자의 결합 부위의 3개의 염기서열을 특이하게 인식하는 개개의 징크핑거 모티프는 2000년 2월 18일자 대한민국 특허출원(출원번호 2000-7730호)에 기재된 바와 같이 효모에서의 선택 시스템을 이용하여 얻을 수 있다.

유도성 유전자 발현 시스템

상기한 바와 같이 선택된 징크핑거 단백질을 암호화하는 유전자를 소분자에 의해 징크핑거 단백질의 발현이 조절될 수 있도록 유도성 유전자 발현 시스템내에 삽입한다.

당업계에 알려진 소분자 유도성 유전자 발현 시스템으로는 엑디손, 테트라싸이클린, 라파마이신 또는 RU486 응답성인 유도성 유전자 발현 시스템 등이 있다[No, D., Yao, T.P., and Evans, R. M.(1996)Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 93, 3346-3351, Gossen, M., and Bujard, H. (1992)Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 89,5547-5551, Rivera, V. M., Clackson, T., Natesan, S., Pollock, R., Amara, J.F., Keenan, T., Magari, S.R., Phillips, T., Courage, N. L., Cerasoli, F. Jr., Holt, D.A. and Gilman, M. (1996)Nat. Med. 2, 1028-1032, Wang, U., O'Malley, B.W.,Jr., Tsai, S. Y., and O'Malley, B.W. (1994)Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 91, 8180-8184]. 예를 들어, 엑디손 응답성 유도성 유전자 발현 시스템에서는 엑디손 수용체 전사인자가 결합하는 프로모터 부위를 포함하는 벡터내에 외부 유전자를 작동가능하게 연결하면, 이 외부 유전자는 세포 밖에서 투여되는 소분자인 엑디손에 의존적으로 벡터내에 삽입된 외부 유전자를 발현시키게 된다.

이러한 종래의 유도성 유전자 발현 시스템들은 외부의 유전자의 발현을 소분자에 의해 조절하고자 할 때 사용되나 배양세포 또는 생체 내에 존재하는 내부의(endogenous) 유전자, 즉 염색체 상에 존재하는 유전자의 발현을 조절하는 데에는 사용될 수 없다. 그 이유는 소분자에 의한 유도성 유전자 발현 시스템이 작동하기 위해서는 발현하고자 하는 유전자의 프로모터 부위에 소분자의 수용체로 작용하는 전사인자가 결합하는 염기 서열이 존재해야 하기 때문이다. 외부 유전자의 경우에는 소분자 수용체 전사인자가 결합하는 염기 서열이 배치되어 있는 벡터에 발현하고자 하는 유전자를 삽입하여 사용할 수 있으나 생체내에 천연적으로 존재하는 내부 유전자의 경우에는 이처럼 염기 서열을 염색체 내에 임의로 배치하여 조작하는 것이 불가능하거나 용이하지 않다.

본 발명에서는 이러한 유도성 유전자 발현 벡터 내에 징크핑거 단백질을 암호화하는 유전자를 삽입함으로써 상기 문제점을 해결하였다. 즉, 본 발명에 따르면, 표적 유전자의 전사 개시점 부근에서 선택된 임의의 염기서열 9-18 bp를 인식하는 3개 또는 6개의 징크핑거 도메인으로 구성된 징크핑거 단백질을 선택, 조합하여 그 단백질을 암호화하는 유전자를 상기 유도성 유전자 발현 시스템내에 소분자에 의존적으로 발현되도록 삽입한다. 이렇게 함으로써, 이 징크핑거 단백질은 생체내에 천연적으로 존재하는 표적 유전자의 전사 개시점 부근에 위치하는 결합 부위를 아무런 조작없이도 인식할 수 있게 된다. 결과적으로, 소분자에 의해 징크핑거 단백질의 발현이 조절되고 다시 징크핑거 단백질에 의해 생체내의 표적 유전자의 발현이 조절되게 된다. 따라서, 본원 발명에 따라 기존의 소분자 유도성 유전자 발현 시스템에 징크핑거를 삽입하게 되면, 생체내의 어떠한 유전자라도 그 염기서열이 알려져 있기만 하면 그 발현을 자유자재로 손쉽게 조절할 수 있게 된다.

이하 적합한 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 자세히 설명할 것이다. 그러나 본 발명의 범위는 후술하는 실시예에 의해 제한되지 않음에 유의해야 할 것이다.

<실시예>

실험 방법:

플라즈미드의 제조:

일시적 형질전환에 사용된 플라즈미드의 제조과정은 선행문헌[Kim J. S. and Pabo, C. O. (1997)J. Biol. Chem. 272, 29795-29800; Kim J. S. and Pabo, C. O.(1998)Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 95, 2812-2817]에 상세히 기술되었다. 리포터 플라즈미드로는 루시퍼라제 유전자를 포함하는 pGL3-Basic(Promega에서 구입)을 변형하여 사용하였다. 즉 TATA 박스와 전사개시점을 포함하는 DNA 단편을 pGL3-Basic의NheI과BglII 인지장소 사이에 삽입하여 pGL3-TATA/Inr을 만들었고 이를 기반으로해서 징크핑거 단백질들이 결합하는 염기서열을 전사개시점 부근에 배치한 리포터 플라즈미드를 만들었다. pGL3-TATA/Inr의 프로모터 부위의 염기서열은 선행문헌[Kim J. S. and Pabo, C. O. (1997)J. Biol. Chem. 272, 29795-29800]의 그림1에 상세히 기술하였고 본 발명에서 사용한 리포터 플라즈미드의 프로모터 부위의 염기서열은 도 2에 제시하였다.

징크핑거 단백질 Zif268, NRE, 268//NRE를 각각 발현하는 플라즈미드들의 제조과정은 선행문헌에 상세히 기술되었다[Kim J. S. and Pabo, C. O.(1998)Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 95, 2812-2817]. 이들 플라즈미드들은 각각의 징크핑거 단백질을 지정하는 DNA 단편들을 pcDNA3(Invitrogen에서 구입)에 삽입한 것으로 이들 플라즈미드로부터 발현되는 징크핑거 단백질들은 아미노 말단에 핵배치신호 서열(Nuclear localization signal)과 S-Tag을 포함하게 된다.

SV40 초기 프로모터 및 허피스 심플렉스 바이러스 티미딘 키나제(HSV-TK) 프로모터의 조절하에 놓인 268//NRE 펩티드를 암호화하는 발현 플라즈미드는 다음과 같이 제조하였다. 268//NRE 펩티드를 암호화하는 DNA 단편은 pCS-268//NRE[Kim J. S. and Pabo, C. O.(1998)Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 95, 2812-2817]를 주형으로 하는 중합화 효소 연쇄 반응 증폭에 의해 얻었고, 이를 pRL-SV40 및 pRL-TK (Promega사 제품)의 각각NdeI 및XbaI 부위에 서브클로닝하였다.

안정적 형질전환 실험에 사용된 징크핑거 발현 플라즈미드는 하기와 같이 제조하였다. Zif268 펩티드 및 268//NRE 펩티드를 암호화하는 DNA 단편은 pCS-Zif268 및 pCS-268//NRE에서 중합화 연쇄 반응 증폭으로 얻고, 이들 DNA 단편을 pIND (Invitrogen사 제품)의BamHI 및KpnI 부위에 삽입하여 pIND-Zif268 및 pIND-268//NRE을 제조하였다.

안정적 형질전환 실험에 사용된 리포터 플라즈미드는 하기와 같이 제조하였다. 플라즈미드 pGL3-TATA/Inr, pGL3-TATA/Inr:N, pGL3-TATA/Inr:Z, pGL3-TATA/Inr:N/Z [Kim J. S. and Pabo, C. O.(1988)Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 95, 2812-2817에 제시됨]를 제한효소MluI 및XbaI으로 절단하고 그 절편을 pcDNA3(Invitrogen사 제품)의MluI 및XbaI 부위에 삽입하여 pc-TATA/Inr, pc-TATA/Inr:N, pc-TATA/Inr:Z, pc-TATA/Inr:N/Z를 제조함으로써, 다양한 합성 프로모터의 조절하에 놓인 루시퍼라제 리포터 유전자를 포함하는 DNA 단편을 제조하였다.

본 발명에서 사용한 플라즈미드들은 Invitrogen, Promega사 등으로부터 구입한 플라즈미드를 모체로 하여 만들었고 이들 플라즈미드에 삽입한 징크핑거 단백질을 지정하는 DNA 단편이나 리포터 유전자의 프로모터 DNA 단편의 염기서열들은 선행문헌에 기술되어 있어 손쉽게 제조할 수 있다.

안정적 형질전환 실험

엑디손 응답성 프로모터의 조절하에 징크핑거 단백질을 발현시키는 세포주를 제조하기 위하여, pIND-Zif268 또는 pIND-268//NRE를 엑디손 수용체가 항상 발현되도록 개조한 인간 세포주 EcR-293 (Invitrogen사 제품)에 형질전환시켰다. 0.80 mg/ml의 G418을 포함하는 배지에서 배양하여 G418 내성 클론을 선택하고 S-Tag 순간검정키트(Rapid Assay Kit; Novagen사 제품)를 이용하여 징크핑거 단백질의 발현을 확인하였다.

리포터 유전자가 세포내 게놈상에 삽입되어 있는 세포주를 제조하기 위하여, EcR-293 세포를 pc-TATA/Inr, pc-TATA/Inr:N, pc-TATA/Inr:Z, 또는 pc-TATA/Inr:N/Z 플라즈미드로 안정적으로 형질전환시키고, G418 내성 클론을 선택하였다.

일시적 형질전환 실험

인간 세포주 EcR-293 세포를 문헌[Cepec, K. L., Chasman, D. I., and Sharp, P. A. (1996)Genes Dev. 10, 2079-2088]에 기재된 바와 같이 인산칼슘 침전으로 일시적 형질전환시켰다. 즉, 60 mm 직경 플레이트에 단층 세포로서 10-30% 조밀도로 자란 세포층에, 다음과 같은 플라즈미드를 첨가하였다.

(i) 징크핑거 단백질을 암호화하는 DNA 단편이 들어 있지 않은 발현 플라즈미드 (pCS) 또는 징크핑거 단백질을 암호화하는 발현 플라즈미드 0.5 μg,

(ii) 개똥벌레 루시퍼라제를 암호화하는 리포터 플라즈미드 0.5 μg,

(iii) GAL4-VP16 융합 단백질을 암호화하는 활성자 플라즈미드 2.5 μg,

(iv)Renilla루시퍼라제(pRL-SV40, Promega사 제품)를 암호화하는 내부 조절 플라즈미드 0.25 μg, 및

(v) 수송(carrier) 플라즈미드(pUC19 또는 pBluescript II KS+) 11.25 μg.

징크핑거 단백질이 엑디손 응답성 프로모터의 조절하에 발현되는 안정적으로 형질전환된 세포주를 6-웰 플레이트에서 하기 플라즈미드로 일시적으로 형질전환시켰다.

(i) 개똥벌레 루시퍼라제를 암호화하는 리포터 플라즈미드 0.25 μg,

(ii) GAL4-VP16 융합 단백질을 암호화하는 활성자 플라즈미드 1.25 μg,

(iii)Renilla루시퍼라제(pRL-CMV)를 암호화하는 내부 조절 플라즈미드 0.125 μg, 및

(iv) 수송(carrier) 플라즈미드(pUC19 또는 pBluescript II KS+) 5.625 μg.

포나스테론A를 배양 배지에 5 μM로 첨가하여 징크핑거 단백질의 발현을 유도한다. 형질전환된 세포내 루시퍼라제 활성은 듀얼-루시퍼라제 리포터 아세이 키트(Dual-Luciferase Reporter Assay System; Promega사 제품)으로 측정하였다.

겔 이동 분석

문헌[Dignam, J. D., Lebovitz, R. M., and Roeder, R. G. (1983)Nucleic Acid Res.11, 1475-1489]에 기재된 바와 같이, 안정적으로 형질전환된 세포주로부터 핵 추출물을 얻었다. 결합 반응액은 20 μl의 결합 버퍼(20 mM Tris-HCl(pH 7.7), 120 mM NaCl, 5 mM MgCl₂, 20 μM ZnSO₄, 10%(v/v) 글리세롤, 5 mM 디티오쓰레이톨 및 poly(dI-dC) 0.1 mg/ml)중에 방사능표지된 DNA 프로브(약 1 nM) 및 핵 추출물(총 단백질 5 μg)을 함유하였다. 결합 반응액을 실온에서 30분 동안 인큐베이트한 후 5% 폴리아크릴아미드 겔상에서 전기영동시켰다.

서던 블롯 분석

안정적으로 형질전환된 세포주로부터 게놈DNA(10 μg)을 단리하여 이를 제한 효소로 절단하고 0.8% 아가로스 겔상에서 전기영동시켜, 니트로셀룰로스 멤브레인상에 블롯팅하였다. pGL3-TATA/Inr로부터 루시퍼라제 DNA 단편을 단리하여 방사능표지하여 이를 프로브로 사용하였다. 혼성화 반응은 반응 버퍼(6×SSC, 5×덴하트 용액, 0.1% SDS, 100 μg/ml 연어 정자 DNA, 0.5% 덱스트란 설페이트 및 50% 포름아미드) 중에서 42℃로 밤새 수행한 후, 멤브레인을 0.2×SSC 및 0.1% SDS에서 65℃에서 세척하였다.

<실시예 1> 결합 특이성 분석

본 발명자들은 먼저 6개의 핑거로 이루어진 징크핑거 단백질의 결합 부위의 염기서열 특이성에 대해 조사하였다. 이 6개의 징크핑거 단백질은 Zif268 펩티드를 구성하는 3개의 핑거 및 NRE 펩티드를 구성하는 3개의 핑거를 링커로 연결하여 제조하였다(NRE는 선행문헌[Greisman, H. A., and Pabo, C. O. (1997)Science 275, 657-661]에서 파지 전시에 의해 선택된 Zif268 펩티드의 변형체이다). 6개의 징크핑거 단백질 및 그 결합 부위 서열을 도1에 도식적으로 나타내었다.

도2에서는 본 실험에서 사용된 리포터 플라즈미드를 개략적으로 도시하였다. 리포터 플라즈미드는 리포터 유전자(루시퍼라제 유전자)의 프로모터의 상류쪽에 GAL4 결합 부위를 5개 갖고, 전사 개시점 부근에 다양한 징크핑거 단백질의 결합 부위를 갖는다. 상기 리포터 플라즈미드내의 전사 개시점 부근 징크핑거 단백질의 결합 부위의 염기서열을 하부에 함께 나타내었다.

상기 리포터 플라즈미드 각각을 268//NRE 펩티드를 발현시키는 플라즈미드 및 GAL4-VP16을 발현시키는 플라즈미드와 함께 숙주 세포에 형질전환시키고, 2일간의 배양 후 세포 추출물로부터 리포터 유전자(루시퍼라제 효소)의 발현을 측정하였다.

본 발명자들은 상기 실험에서, 268//NRE 펩티드가 그의 본래 결합 염기서열과 아주 유사한 염기서열들을 효과적으로 구별하여 결합하는 것을 발견할 수 있었다(그 결과를 도3에 도시하였다). 시토메갈로바이러스(CMV) 프로모터의 조절하에 발현되는 268//NRE 펩티드는 GAL4-VP16의 융합 단백질이 리포터 유전자의 프로모터내 GAL4 결합 부위에 결합하여 활성화시키는 리포터 유전자의 발현을 효과적으로억제하였다(이하 실험 결과는 도3A 참조). 즉, GAL4-VP16에 의한 리포터 유전자의 발현은 리포터 유전자의 전사개시점 근처에 19 bp의 N/Z 결합 부위(결합 염기 서열은 도1에 나타냄)가 포함되면, 137배(즉, 99.3%)가 억제되었다. 대조적으로 그 결합부위가 9 bp의 N 또는 Z로서 N/Z의 일부인 경우 발현 억제는 각 1.4배 및 16배로 현저히 줄어 들었다. N/Z 결합 부위의 서열에 돌연변이를 일으킨 경우, 즉, N/Z 부위의 3' 말단 G염기 하나가 C로 치환된 N/mZ1 (도2의 결합 부위의 서열 참조)의 경우에는 268//NRE 펩티드가 여전히 123배의 억제를 보였다. 그러나, 3' 말단에 두 개의 염기를 치환할 경우(N/mZ2)에는 겨우 7배의 억제만을 보였다. 이와 유사하게, 5' 말단의 3개의 염기를 돌연변이시킬 경우(mN/Z)에는 단 8.3배의 억제만이 관찰되었다. 도1에서 개략적으로 도시한 바와 같이, N/Z 결합 부위의 5' 말단(AAG)는 핑거6(C 말단의 징크핑거 도메인)이 인식하고, 3' 말단(GCG)는 핑거1(N 말단의 징크핑거 도메인)이 인식한다. 본 발명자들의 상기 실험 결과는 6 핑거 도메인의 각 핑거가 19 bp의 인식 부위의 친화도 및 특이성에 중대한 기여를 하고 있음을 의미하고, 이는 6개의 징크핑거 단백질에 의한 DNA 인식이 생체내에서 매우 특이적이라는 사실을 뒷받침한다.

<실시예 2> 다양한 프로모터의 조절하에서 징크핑거 단백질의 발현

징크핑거 단백질의 세포 내 농도와 전사 억제와의 관계를 알아보는 실험을 하였다. 이를 위해 268//NRE 펩티드를 다양한 프로모터에 연결시켜 발현시키고 이를 실시예 1에서와 같은 형질전환 실험을 하였다. 본 연구에서 사용된 프로모터는CMV 조기 프로모터, SV40 조기 프로모터, HSV-TK 프로모터이다. 콘트롤 실험 결과293 세포주에 형질전환시켰을 때 CMV 프로모터는 SV40 프로모터보다 약 30배 더 강력하고, HSV-TK 프로모터보다는 약 1000배 더 강력하게 작용하는 것을 알 수 있었다. 즉, 루시퍼라제 유전자를 각각의 프로모터에 연결하여 플라즈미드를 만든 후 이들을 이용하여 293 세포주를 형질전환시킨 후 일정 시간후에 세포 추출물에서 루시퍼라제 역가를 조사한 결과 CMV 프로모터를 사용한 경우가 SV40 프로모터, HSV-TK 프로모터를 사용한 경우보다 각각 30배, 1,000배 더 높은 역가를 보였다. 예상한 바와 같이, SV40와 HSV-TK 프로모터의 조절하에 발현된 268//NRE 펩티드는 CMV 프로모터를 사용한 경우보다 리포터 유전자의 전사 억제 효율이 훨씬 약하게 나타났다(도 3B 및 도3C 참조). 이러한 결과는 표적 유전자 발현의 억제 정도는 징크핑거 단백질의 세포내 농도에 대단히 민감하게 의존적이라는 것을 나타낸다. 즉 세포내 징크핑거 단백질의 농도가 높을수록 표적 유전자의 발현 억제 정도가 높게 나타났다.

<실시예3> 소분자를 이용한 징크핑거 단백질 발현의 유도

생체내 징크핑거 단백질의 농도를 소분자의 투여량 의존적인 방식으로 조절함으로써 리포터 유전자의 발현이 조절될 수 있는지를 실험하였다. 이를 위해 본 발명자들은 엑디손 유도성 발현 시스템을 이용하였다. 엑디손 유도성 발현 시스템은 임의의 유전자를 엑디손 응답성 프로모터의 조절하에서 발현되도록 하여 그 유전자의 발현 여부를 곤충 엑디손 호르몬(또는 그 유사체인 포나스테론 A)의 투여량에 의해 제어하는 시스템을 말한다. 본 발명자들은 Zif268 펩티드 또는 268//NRE 펩티드의 발현이 엑디손 응답성 프로모터의 조절하에 놓여진 효과 플라즈미드를 만들었다. 이들 플라즈미드를 엑디손 수용체가 항상 발현되도록 개조된 인간 세포주 EcR-293에 안정적으로 형질전환시켰다. 징크핑거 단백질들은 아미노말단에 S-Tag이 융합된 형태로 발현되기 때문에 S-Tag 분석을 통하여 포나스테론 A가 존재하는 경우에만 Zif268 펩티드 또는 268//NRE 펩티드를 생산하는 세포주 클론을 확인하였다.

상기와 같이 징크핑거 단백질들을 발현하도록 안정적으로 형질전환된 세포주를 각각 c268, c268//NRE이라고 명명하였고 포나스테론 A의 농도 의존적으로 리포터 유전자의 발현이 조절될 수 있는지를 실험하였다. 상기 각 세포주들을 GAL4-VP16 플라즈미드 및 리포터 플라즈미드로 일시적으로 형질전환시켰다. 형질전환시킨 세포에 다양한 농도의 포나스테론 A를 첨가한 결과 포나스테론 A의 농도를 증가시킬수록 GAL4-VP16에 의한 리포터 유전자 발현 활성이 점진적으로 억제되었다(도4의 그래프 참조). 즉, c268 세포주에서 Zif268 단백질은 Zif268이 결합하는 9 bp 염기서열을 포함하는 리포터 플라즈미드를 사용했을 때, 포나스테론 A의 농도를 20μM까지 증가시키면 리포터 유전자의 발현을 8배까지 억제하였고, c268//NRE 세포주에서 268//NRE 단백질은 19 bp의 표적 염기서열을 포함하는 리포터 플라즈미드를 사용했을 때, 리포터 유전자의 발현을 24배까지 억제하였다. 반면 이들 세포주에서 징크핑거 단백질이 결합하는 표적 염기서열을 포함하지 않는 리포터 유전자를 사용했을 경우에는 전혀 그 발현에 영향을 주지 못했다.

다음으로는 이러한 유도성 징크핑거 발현 시스템이 표적 유전자의 발현을 가역적으로 조절할 수도 있는지를 시험하였다(도5). 먼저 c268, c268//NRE 세포주를 5μM의 포나스테론 A로 24시간 동안 처리하고, 이어서 이 세포주에 Z 부위 또는 N/Z 부위를 그 프로모터내에 함유하는 상기의 리포터 플라즈미드로 일시적 형질전환시킨 후 다양한 시간 간격으로 배양 배지로부터 포나스테론 A를 제거하였다. 루시퍼라제 활성은 일시적 형질전환 후 48시간이 지난 시점에서 측정하였다. 이와 병행해서 포나스테론A로 처리하지 않은 세포에서의 대조군 루시퍼라제 활성과 비교하였다. 초기 24시간 처리 후 포나스테론 A가 제거된 c268 세포주에서의 루시퍼라제 활성(도 5A 좌측, 0 h)은 포나스테론 A 처리를 하지 않은 세포(이를 100%로 한다)에서와 거의 동등하였고(87%) 포나스테론 A를 제거한 시점이 늦을수록 그 활성이 줄어들었다. 이는 포나스테론 A가 제거되면 징크핑거 단백질의 발현이 정지되고 세포내의 징크핑거 단백질 농도가 점차적으로 줄어들어 표적 유전자의 발현을 억제하지 못하게 되는 것을 의미한다.

c268//NRE 세포주의 경우에도 이와 유사한 결과를 관찰할 수 있었다. 그러나, 초기 24시간 처리 후 포나스테론 A가 제거된 c268//NRE 세포주에서의 루시퍼라제 활성(도 5A 우측, 0 h)은 포나스테론 A 처리를 하지 않은 세포에서의 것에 비해 17%에 불과하였다. c268 및 c268//NRE 세포로 부터 얻은 핵추출물로 겔 이동 실험을 한 결과 c268세포내 Zif268 펩티드는 배양 배지로부터 포나스테론 A를 제거한 후 48시간에서는 거의 검출되지 않았다(도5B 좌측). 대조적으로 c268//NRE 세포주에서는 포나스테론 A의 제거후 84시간이 지나도 268//NRE 펩티드의 상당량이 검출되었다(도5B 우측). 이는 Zif268 펩티드가 Zif268//NRE 펩티드 보다 세포내에서 반감기가 훨씬 짧다는 것을 암시한다(또는 6개의 핑거를 갖는 268//NRE 펩티드가 3개의 핑거를 갖는 Zif268 펩티드 보다 훨씬 강력한 DNA 결합하기 때문에 그 농도가 줄어들어도 DNA에 결합할 수 있다고 해석할 수도 있다). 선행 연구에서는 268//NRE 펩티드가 Zif268 펩티드 보다 6000배나 더 강하게 19-bp의 결합 서열에 결합한다는 것이 보고된 적이 있다 (Kim J. S. and Pabo, C. O.(1998)Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 95. 2812-2817). 상기 결과들은 징크핑거 단백질을 발현시키는 유도성 시스템을 채용하여 표적 유전자의 발현을 가역적으로 조절할 수 있음을 보여준다. 그러나, 어떤 징크핑거 단백질은 세포내에서 긴 반감기(또는 결합 부위에 대한 높은 친화도)를 가져서 표적 유전자 발현의 온-오프 조절이 느릴 수도 있음을 보여주고 있다.

<실시예 4> 게놈상에 삽입된 리포터 유전자의 억제

본 발명자들은 크로마틴 구조로 압축되어 있는 표적 부위에 징크핑거 단백질이 결합할 수 있는지를 연구하기 위하여 안정적 형질전환 실험을 수행하였다. 이러한 실험을 하게 된 이유는 일시적 형질전환시킨 DNA는 히스톤과 함께 긴밀한 크로마틴 구조를 형성하지 않을 수도 있기 때문이다[Smith, C. L. Hager, G. L. (1997)J. Biol. Chem.272, 27493-27496]. 비록 이전에 다양한 세포주에서 징크핑거 단백질을 전사인자로서 이용한 연구가 있었으나, 이들은 대부분 게놈내에 표적 유전자가 삽입되어 있지 않은 일시적 형질전환 실험에 관한 것들이다. 본 발명자들은 그 프로모터 부위에 다양한 징크핑거 결합 부위가 함유된 루시퍼라제 리포터 플라즈미드로 EcR-293 세포를 형질전환시키고, G-418 저항성 클론을 선택하였다. 이들 약물 내성의 클론중 GAL-VP16 융합 단백질을 암호화하는 활성자 플라즈미드로 일시적으로 형질전환될때에는 높은 루시퍼라제 활성을 보이나, 이러한 활성자 플라즈미드가 없으면 낮은 루시퍼자레 활성을 보이는 세포주를 단리하였다.

본 발명자들은 이들 세포주내에서 징크핑거 단백질에 의해 세포내 게놈에 삽입되어 있는 리포터 유전자의 발현이 서열 특이적으로 억제됨을 관찰할 수 있었다. 즉, Zif268 펩티드를 암호화하는 플라즈미드를, 게놈내에 삽입된 리포터 유전자의 프로모터내에 Zif268 부위(cTATA/Inr:Z로 나타냄) 또는 N/Z 부위(cTATA/Inr:N/Z-1,2,3으로 나타냄)중 하나를 함유시킨 세포주내로 일시적으로 도입시키면, VP16으로 활성화된 전사가 6.2배 내지 16배 억제되는 것이 관찰되었다(도6)(이들 세포주를 제조하는데 사용된 리포터 플라즈미드의 개략적 도시는 도2에 나타나 있다). 이와는 대조적으로 Zif268 펩티드는 삽입된 리포터 플라즈미드의 프로모터 부위내에 Zif268 결합 부위를 하나도 포함하고 있지 않은 cTATA/Inr 및 cTATA/Inr:N 세포주에서는 전혀 전사억제를 나타내지 않았다. 268//NRE 펩티드는 삽입된 리포터 유전자의 프로모터가 19-bp의 N/Z 부위를 포함하고 있는 cTATA/Inr:N/Z-1,2,3 세포주(이들 클론은 도1A에 나타낸 리포터 플라즈미드 pc-TATA/Inr:N/Z를 EcR-293 세포로 안정적으로 형질전환시켜 제조하였다)에서 77배 내지 92배의 억제를 나타내었다. 또한 268//NRE 펩티드는 cTATA/Inr:Z 세포주(프로모터 부위가 Zif268 부위를 포함함)에서 33배의 억제를 나타내었다. 반면 268//NRE 단백질은 cTATAInr 및cTATA/Inr:N 세포주에서는 거의 전사 억제를 나타내지 않았다.

리포터 플라즈미드로 안정적 형질전환시킨 세포주의 게놈상에 리포터 플라즈미드가 몇 카피가 들어가 있는지를 추정하기 위한 실험을 수행하였다. 만일 게놈상의 특정 부위에 여러 카피의 루시퍼라제 리포터 DNA가 삽입되었다면, 이 리포터 유전자는 긴밀한 크로마틴 복합체로 압축되지 않을 수 있고, 이러한 헐렁한 구조는 징크핑거 단백질이 그 결합 부위에 더 효율적으로 접근할 수 있게 했을 것이다. 이러한 가설을 배제하기 위하여, 본 발명자들은 삽입된 리포터 구성물의 특성을 서던 블롯 분석으로 규명하였다. 루시퍼라제 리포터 플라즈미드가 안정적으로 삽입된 세포주로부터 게놈 DNA를 단리하여HindIII (삽입된 플라즈미드내에 그 인식부위가 하나 있음) 또는NdeI (플라즈미드내에 인식부위가 없음) 또는 두 효소를 함께 사용하여 절단시키고, 이들 각각의 샘플을 아가로스 겔 상에서 전기영동시켰다. 서던 블롯된 밴드의 크기, 강도, 및 밴드 개수로부터 삽입된 플라즈미드의 카피 수를 추정하였다. 그 결과 대부분의 세포주에서 오직 하나 또는 두개의 카피의 리포터 플라즈미드만이 게놈내에 삽입되었음을 알 수 있었다. 예를 들어, cTATA/Inr:N/Z-3 세포주에서 단리된 게놈 DNA는HindIII 또는NdeI, 또는 둘 다로 절단시킨 경우 6-10 kb의 하나의 혼성화 단편을 보였다(삽입된 리포터 플라즈미드의 크기는 7.3 kb임)(도7의 19 내지 21 레인 참조). 이러한 결과는 cTATA/Inr:N/Z-3 세포주내 오직 한 부위의 게놈내에 오직 한 카피의 플라즈미드만이 삽입됨을 나타낸다. 이와는 달리, cTATA/Inr:N/Z-2 세포주로부터의 절단된 DNA에서 관찰되는 단편은NdeI으로 처리하였을 때 상당히 큰 크기의 밴드를 형성했고전반적으로HindIII로 처리하였을 때 매우 진한 밴드를 형성한 것으로 보아 많은 카피의 리포터 플라즈미드가 게놈상에 삽입되었음을 보여준다 (도7의 16 내지 18레인 참조). cTATA/Inr:N/Z-1,2,3 세포주로부터의 절단된 DNA에서 서로 상이한 밴드 패턴이 관찰되는데 이는 이들 세포주가 실질적으로 독립적인 클론들임을 보여준다. 게놈내 리포터 플라즈미드의 삽입 부위 및 삽입된 카피수가 상이함에도 불구하고 도7에 도시된 바와 같이 268//NRE 펩티드는 이들 세포주에서 활성화된 전사를 유사한 정도로 억제시켰다.

이들 실험들을 종합하면, 상기한 결과들은 조작된 징크핑거 단백질이 게놈상에 위치하는 결합부위에 접근할 수 있고, 표적 유전자의 전사를 가역적으로 조절할 수 있을 뿐만 아니라, 그 조절 정도가 징크핑거 단백질의 양에 의존적인 방식으로 작용함을 보여준다.

따라서, 본원 발명에 따르면, 게놈상에 존재하는 어떠한 임의의 유전자의 발현도, 그 유전자의 프로모터 부위의 염기서열을 인지하는 징크핑거 단백질이 소분자에 의해 발현되도록 조절하여 가역적이면서도 소분자의 양에 따라 미세하게 조절할 수 있다. 즉, 본원발명은 게놈상에 존재하는 표적 유전자 발현을 소분자를 이용하여 인위적으로 조절할 수 있는 새로운 일반적 원리를 제공하고 있다.

Claims

표적 유전자의 전사 개시점 부근의 임의의 표적 염기서열을 인식하는 징크핑거 단백질을 암호화하는 유전자를 소분자 유도성 발현 벡터(small molecule inducible expression vector)내에 소분자에 의해 징크핑거 단백질의 발현이 조절될 수 있도록 작동가능하게 연결시켜 이루어지는 징크핑거 단백질 발현 벡터로서, 발현된 징크핑거 단백질이 표적 유전자의 발현을 가역적으로 조절하는 유도성 징크핑거 단백질 발현 벡터.
(1) 표적 유전자의 전사 개시점 부근의 임의의 표적 염기서열을 인식하는 징크핑거 단백질을 암호화하는 유전자를 소분자 유도성 발현 벡터내에 소분자에 의해 징크핑거 단백질의 발현이 조절될 수 있도록 작동가능하게 연결시켜 이루어지는 소분자 유도성 징크핑거 단백질 발현 벡터를 세포내에 도입하는 단계,

(2) 상기 소분자를 세포내로 투입하여 세포내 상기 징크핑거 단백질의 발현양을 조절하고, 이 징크핑거 단백질의 조절된 양에 의존적으로 표적 유전자의 발현이 조절되는 단계를 포함하는, 표적 유전자의 발현을 가역적으로 조절하는 방법.
제1항에 있어서, 상기 표적 염기서열을 인식하는 징크핑거 단백질이 각각 2∼4 염기를 특이적으로 인식하는 징크핑거 도메인이 3개 이상이 연결되어 이루어지는 것인 벡터.
제1항에 있어서, 상기 표적 염기서열을 인식하는 징크핑거 단백질이 각각 2∼4 염기를 특이적으로 인식하는 징크핑거 도메인이 6개 이상이 연결되어 이루어지는 것인 벡터.
제1항에 있어서, 상기 유도성 징크핑거 단백질 발현 벡터가 엑디손 응답성인 벡터.
제2항에 있어서, 상기 표적 염기서열을 인식하는 징크핑거 단백질이 각각 2∼4 염기를 특이적으로 인식하는 징크핑거 도메인이 3개 이상이 연결되어 이루어지는 것인 방법.
제2항에 있어서, 상기 표적 염기서열을 인식하는 징크핑거 단백질이 각각 2∼4 염기를 특이적으로 인식하는 징크핑거 도메인이 6개 이상이 연결되어 이루어지는 것인 방법.
제2항에 있어서, 상기 유도성 징크핑거 단백질 발현 벡터가 엑디손 응답성인 방법.