JP2004504029A

JP2004504029A - 単鎖、一量体、リガンド依存性ポリペプチドスイッチを用いる遺伝子発現の調節

Info

Publication number: JP2004504029A
Application number: JP2002512356A
Authority: JP
Inventors: ロジェ・ベールリ; ウルリッヒ・ショップファー; カルロス・エフ・バーバス
Original assignee: Novartis AG; Scripps Research Institute
Current assignee: Novartis AG; Scripps Research Institute
Priority date: 2000-07-18
Filing date: 2001-07-16
Publication date: 2004-02-12
Also published as: WO2002006463A2; IL153833A0; ATE382691T1; WO2002006463A3; AU7254401A; AU2001272544B2; EP1908835A3; NZ523649A; EP1908835A2; ES2299494T3; DE60132208D1; EP1303606B1; DE60132208T2; CA2415726A1; EP1303606A2

Abstract

単鎖、一量体ポリペプチド遺伝子スイッチを提供する。この遺伝子スイッチはリガンド結合ドメインおよび少なくとも一つの機能性ドメインを含む。好ましい機能性ドメインはＤＮＡ結合ドメインおよび転写調節ドメインである。このスイッチを使用して遺伝子機能を調節する方法もまた提供する。

Description

【０００１】
（技術分野）
この発明の分野は転写の調節である。さらに特に、本発明は小分子リガンド−依存性様式で転写を活性化するか抑制することができるポリペプチドに関係する。
【０００２】
（背景技術）
規定した標的特異性および調節機能を持つデザインした転写因子は、基礎および応用研究ならびに遺伝子治療に貴重なツールを提供する。したがって、配列−特異的ＤＮＡ結合ドメインのデザインは、過去２０年の間強い興味の主題となっている。研究された多くのクラスのＤＮＡ結合タンパク質のうち、モジュラーＣｙ_ｓ２−Ｈｉ_ｓ２亜鉛フィンガーＤＮＡ結合モチーフは、あつらえのＤＮＡ結合特異性を持つタンパク質の生成について最も有望であると示されている。このクラスのタンパク質の新規な構成は遺伝子−特異的標的装置の迅速な構築を提供する。多指の亜鉛フィンガータンパク質は、予め規定した三ヌクレオチド配列を認識するモジュラー亜鉛フィンガードメインの集合により最も容易に作製される（例えば、Ｓｅｇａｌ，Ｄ．Ｊ．，Ｄｒｅｉｅｒ，Ｂ．，Ｂｅｅｒｌｉ，Ｒ．Ｒ．，ａｎｄＢａｒｂａｓ，Ｃ．Ｆ．，ＩＩＩ（１９９９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．ＳｃｉＵＳＡ９６，２７５８−２７６３；Ｂｅｅｒｌｉ，Ｒ．Ｒ．，Ｓｅｇａｌ，Ｄ．Ｊ．，Ｄｒｅｉｅｒ，Ｂ．，ａｎｄＢａｒｂａｓ，Ｃ．Ｆ．，ＩＩＩ（１９９８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９５，１４６２８−１４６３３；ａｎｄＢｅｅｒｌｉ，Ｒ．Ｒ．，Ｄｒｅｉｅｒ，Ｂ．，ａｎｄＢａｒｂａｓ，Ｃ．Ｆ．，ＩＩＩ（２０００）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９７，１４９５−１５００を参照）。
【０００３】
不定数の多様な特異性の亜鉛フィンガードメインを用いて多指のタンパク質を集合させて、新規配列だけでなく多様な長さの配列を認識するＤＮＡ結合タンパク質を提供することができる。６個の亜鉛フィンガードメインを結合することにより、１８個の隣接する塩基対のＤＮＡ配列、４０億個の塩基対ヒトゲノム（もしくはいかなる他のゲノム）中のいかなる遺伝子座も十分特定するＤＮＡアドレス複合体、を認識するタンパク質を生成してきている。このタイプの多指の亜鉛フィンガータンパク質の活性化もしくは抑制ドメインへの融合は、導入遺伝子および内因性遺伝子の両方の発現を効率良くかつ特異的に調整する、転写因子を提供する（Ｂｅｅｒｌｉ，Ｒ．Ｒ．，Ｓｅｇａｌ，Ｄ．Ｊ．，Ｄｒｅｉｅｒ，Ｂ．，ａｎｄＢａｒｂａｓ，Ｃ．Ｆ．，ＩＩＩ（１９９８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９５，１４６２８−１４６３３；ａｎｄＢｅｅｒｌｉ，Ｒ．Ｒ．，Ｄｒｅｉｅｒ，Ｂ．，ａｎｄＢａｒｂａｓ，Ｃ．Ｆ．，Ｉｌｌ（２０００）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９７，１４９５−１５００）。
【０００４】
あつらえのＤＮＡ結合特異性を持つデザインした転写因子の利用可能性は転写調節に新規機会を提供する一方で、さらに別の応用がリガンド−依存性転写因子に利用可能になるであろう。小分子誘導物質に依存するデザイナー亜鉛フィンガータンパク質は、内因性遺伝子の調節のためおよび導入遺伝子の調節について誘導発現システムの開発のための両方に数多くの応用を有するであろう。天然の転写因子は、リン酸化のような翻訳後修飾を含む、数多くの異なる機構により（Ｊａｎｋｎｅｃｈｔ，Ｒ．，ａｎｄＨｕｎｔｅｒ，Ｔ．（１９９７）ＥＭＢＯＪ１６，１６２０−１６２７；Ｄａｒｎｅｌｌ，Ｊ．Ｅ．，ＪＲ−（１９９７）Ｓｃｉｅｎｃｅ２７７，１６３０−１６３５）もしくはリガンド結合により調節される。始原型リガンド−活性化転写因子は、６個のステロイドもしくは副腎皮質ステロイドに対する受容体を含む、核ホルモン受容体ファミリーのメンバーである（ＣａｒｓｏｎＪｕｒｉｃａ，Ｍ．Ａ．，Ｓｃｈｒａｄｅｒ，Ｗ．Ｔ．，ａｎｄＯ’Ｍａｌｌｅｙ，Ｗ．（１９９０）ＥｎｄｏｃｒｉｎｅＲｅｖｉｅｗｓ１１，２０１−２２０；Ｅｖａｎｓ，Ｒ．Ｍ．（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ２４０，８８９−８９５）。
【０００５】
これらの受容体は、ｈｓｐ９０を含む数多くの不活性化因子との会合により、ホルモンの不存在下では不活性に保たれる（Ｐｒａｔｔ，Ｗ．Ｂ．，ａｎｄＴｏｆｔ，Ｄ．Ｏ．（１９９７）ＥｎｄｏｃｒｉｎｅＲｅｖ．１８，３０６−３６０）。リガンド結合に際して、核ホルモン受容体は、不活性化複合体から解離し、二量体化し、ならびにＤＮＡに結合しそして転写を活性化できるようになる（Ｃａｒｓｏｎ−Ｊｕｒｉｃａ，Ｍ．Ａ．，Ｓｃｈｒａｄｅｒ，Ｗ．Ｔ．，ａｎｄＯａＭａｌｌｅｙ，Ｗ．（１９９０）ＥｎｄｏｃｒｉｎｅＲｅｖｉｅｗｓ１１，２０１−２２０；Ｅｖａｎｓ，Ｒ．Ｍ．（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ２４０，８８９−８９５１２−１４；ａｎｄＰｒａｔｔ，Ｗ．Ｂ．，ａｎｄＴｏｆｔ，Ｄ．Ｏ．（１９９７）ＥｎｄｏｃｒｉｎｅＲｅｖ．１８，３０６−３６０）。意義深いことに、ホルモン結合だけでなく不活性化および二量化機能もまた、これらのタンパク質のリガンド結合ドメイン（ＬＢＤ）内に存在する（Ｂｅａｔｏ，Ｍ．（１９８９）Ｃｅｌｌ５６，３３５−３４４）。この事実は実験的に利用され、そしてステロイドホルモン受容体ＬＢＤは異種のタンパク質をホルモン依存性にさせるツールとして幅広く使用されている。
【０００６】
特に、エストロゲン受容体（ＥＲ）ＬＢＤを使って、ｃ−Ｍｙｃ（Ｅｉｌｅｒｓ，Ｍ．，Ｐｉｃａｒｄ，Ｄ．，Ｙａｍａｍｏｔｏ，Ｋ．Ｒ．，ａｎｄＢｉｓｈｏｐ，Ｊ．Ｍ．（１９８９）Ｎａｔｕｒｅ３４０，６６−６８），ｃ−Ｆｏｓ（Ｓｕｐｅｒｔｉ−Ｆｕｒｇａ，Ｇ．，Ｂｅｒｇｅｒｓ，Ｇ．，Ｐｉｃａｒｄ，Ｄ．，ａｎｄＢｕｓｓｌｉｎｇｅｒ，Ｍ．（１９９１）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８８，５１１４−５１１８）および細胞質キナーゼｃ−Ｒａｆさえ（Ｓａｍｕｅｌｓ，Ｍ．Ｌ．，Ｗｅｂｅｒ，Ｍ．Ｊ．，Ｂｉｓｈｏｐ，Ｊ．Ｍ．，ａｎｄＭｃＭａｈｏｎ，Ｍ．（１９９３）ＭｏＬＣｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１３，６２４１−６２５２）の機能もホルモン依存性にさせている。基礎研究および遺伝子治療の使用のための誘導発現システムを開発するために、リガンド−依存性転写調節体の利用可能性は必要条件である。優先的に、これらの調節体は、他の生物学的活性の無い小分子誘導物質により活性化され、標的プロモーター中のみに存在する特異的配列に結合し、そして低い免疫原性を有するであろう。
【０００７】
原核生物（Ｇｏｓｓｅｎ，Ｍ．，ａｎｄＢｕｊａｒｄ，Ｈ．（１９９２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８９，５５４７−５５５１２０．Ｇｏｓｓｅｎ，Ｍ．，Ｆｒｅｕｎｄｌｉｅｂ，Ｓ．，Ｂｅｎｄｅｒ，Ｇ．，Ｍｉｉｌｌｅｒ，Ｇ．，Ｈｉｌｌｅｎ，Ｗ．，ａｎｄＢｕｊａｒｄ，Ｈ．（１９９５）Ｓｃｉｅｎｃｅ２６８，１７６６−１７６９２１．Ｌａｂｏｗ，Ｍ．Ａ．，Ｂａｉｍ，Ｓ．Ｂ．，Ｓｈｅｎｋ，Ｔ．，ａｎｄＬｅｖｉｎｅ，Ａ．Ｊ．（１９９０）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１０，３３４３−３３５６２２．Ｂａｉｍ，Ｓ．Ｂ．，Ｌａｂｏｗ，Ｍ．Ａ．，Ｌｅｖｉｎｅ，Ａ．Ｊ．，ａｎｄＳｈｅｎｋ，Ｔ．（１９９１）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８８，５０７２−５０７６）もしくは真核生物（Ｃｈｒｉｓｔｏｐｈｅｒｓｏｎ，Ｋ．Ｓ．，Ｍａｒｋ，Ｍ．Ｒ．，Ｂａｊａｊ，Ｖ．，ａｎｄＧｏｄｏｗｓｋｉ，Ｐ．Ｊ．（１９９２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８９，６３１４−６３１８２４．Ｎｏ，Ｄ．，Ｙａｏ，Ｔ．−Ｐ．，ａｎｄＥｖａｎｓ，Ｒ．Ｍ．（１９９６）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９３，３３４６−３３５１２５．Ｗａｎｇ，Ｙ．，Ｏ’Ｍａｌｌｅｙ，Ｂ．Ｗ．，Ｊｒ．，Ｔｓａｉ，Ｓ．，ａｎｄＯ’Ｍａｌｌｅｙ，Ｂ．Ｗ．（１９９４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９１，８１８０−８１８４．Ｂｅｅｒｌｉｅｔａｌ．−３５−２６．Ｗａｎｇ，Ｙ．，Ｘｕ，Ｊ．，Ｐｉｅｒｓｏｎ，Ｔ．，Ｏ’Ｍａｌｌｅｙ，Ｂ．Ｗ．，ａｎｄＴｓａｉ，Ｓ．Ｙ．（１９９７）ＧｅｎｅＴｈｅｒａｐｙ４，４３２−４４１２７．Ｂｒａｓｅｈｎａｎｎ，Ｓ．，Ｇｒａｎｉｎｇｅｒ，Ｐ．，ａｎｄＢｕｓｓｌｉｎｇｅｒ，Ｍ．（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９０，１６５７−１６６１２８．Ｌｏｕｖｉｏｎ，Ｊ．Ｆ．，Ｈａｖａｕｘ−Ｃｏｐｆ，Ｂ．，ａｎｄＰｉｃａｒｄ，Ｄ．（１９９３）Ｇｅｎｅ１３１，１２９−１３４２９．Ｒｉｖｅｒａ，Ｖ．Ｍ．，Ｃｌａｃｋｓｏｎ，Ｔ．，Ｎａｔｅｓａｎ，Ｓ．，Ｐｏｌｌｏｃｋ，Ｒ．，Ａｍａｒａ，Ｊ．Ｆ．，Ｋｅｅｎａｎ，Ｔ．，Ｍａｇａｒｉ，Ｓ．Ｒ．，Ｐｈｉｌｌｉｐｓ，Ｔ．，Ｃｏｕｒａｇｅ，Ｎ．Ｌ．，Ｃｅｒａｓｏｌｉ，Ｆ．，Ｊｒ．，Ｈｏｌｔ，Ｄ．Ａ．，ａｎｄＧｉｌｍａｎ，Ｍ．（１９９６）Ｎａｔｕｒｅ．Ｍｅｄ．２，１０２８−１０３２）のどちらかから誘導化される機能性ドメインを用いて、数多くのリガンド−調節人工的転写因子が種々の手段により生成されている。
【０００８】
真核タンパク質から誘導化される機能的ドメインのうち、核ホルモン受容体ＬＢＤは最も広く使用されている。特に記述されているのは、ヒトＥＲ（Ｂｒａｓｅｌｍａｎｎ，Ｓ．，Ｇｒａｎｉｎｇｅｒ，Ｐ．，ａｎｄＢｕｓｓｌｉｎｇｅｒ，Ｍ．（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．９０，１６５７−１６６１；Ｌｏｕｖｉｏｎ，Ｊ．Ｆ．，Ｈａｖａｕｘ−Ｃｏｐｆ，Ｂ．，ａｎｄＰｉｃａｒｄ，Ｄ．（１９９３）Ｇｅｎｅ１３１，１２９−１３４）もしくはプロゲステロン受容体（ＰＲ）ＬＢＤ（Ｗａｎｇ，Ｙ．，Ｏ’Ｍａｌｌｅｙ，Ｂ．Ｗ．，Ｊｒ．，Ｔｓａｉ，Ｓ．，ａｎｄＯ’Ｍａｌｌｅｙ，Ｂ．Ｗ．（１９９４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９１，８１８０−８１８４；Ｗａｎｇ，Ｙ．，Ｘｕ，Ｊ．，Ｐｉｅｒｓｏｎ，Ｔ．，Ｏ’Ｍａｌｌｅｙ，Ｂ．Ｗ．，ａｎｄＴｓａｉ，Ｓ．Ｙ．（１９９７）ＧｅｎｅＴｈｅｒａｐｙ４，４３２−４４１）に融合したＧａ１４　ＤＮＡ結合ドメイン（ＤＢＤ）に基づく調節体、ならびにショウジョウバエのエクジソン受容体（ＥｃＲ）および哺乳動物レチノイドＸ受容体（ＰＸＲ）（Ｃｈｒｉｓｔｏｐｈｅｒｓｏｎ，Ｋ．Ｓ．，Ｍａｒｋ，Ｍ．Ｒ．，Ｂａｊａｊ，Ｖ．，ａｎｄＧｏｄｏｗｓｋｉ，Ｐ．Ｊ．（１９９２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８９，６３１４−６３１８；Ｎｏ，Ｄ．，Ｙａｏ，Ｔ．−Ｐ．，ａｎｄＥｖａｎｓ，Ｒ．Ｍ．（１９９６）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９３，３３４６−３３５１）に基づくエクジソン−誘導システムである。
【０００９】
ヘテロ二量体ＥｃＲ／ＲＸＲシステムに比較して、ＥＲおよびＰＲ　ＬＢＤに基づく調節体は、それらはホモ二量体として機能しかつ一つのｃＤＮＡのみの送達を必要とするという重要な有利性を有する。しかしながら、エクジソンは哺乳動物の細胞に既知の生物学的影響を何も持たないが一方、エストロゲンおよびプロゲステロンは、内因性ステロイド受容体を発現するところの細胞もしくは組織の中で生物学的レスポンスを引き出すであろう。突然変異したＥＲおよび、それらの天然リガンドへの応答性を喪失しているが４−ヒドロキシタモキシフェン（４−ＯＨＴ）（Ｌｉｔｔｌｅｗｏｏｄ，Ｔ．Ｄ．，Ｈａｎｃｏｃｋ，Ｄ．Ｃ．，Ｄａｎｉｅｌｉａｎ，Ｐ．Ｓ．，Ｐａｒｋｅｒ，Ｍ．Ｇ．，ａｎｄＥｖａｎ，Ｇ．Ｉ．（１９９５）Ｎｕｃｌ．ＡｃｉｄｓＲｅｓ．２３，１６８６−１６９０）もしくはＲＵ４８６（Ｖｅｇｅｔｏ，Ｅ．，Ａｌｌａｎ，Ｇ．Ｆ．，Ｓｃｈｒａｄｅｒ，Ｗ．Ｔ．，Ｔｓａｉ，Ｍ．−Ｊ．，ＭｃＤｏｎｎｅｌｌ，Ｄ．Ｐ．，ａｎｄＯ’Ｍａｌｌｅｙ，Ｂ．Ｗ．（１９９２）Ｃｅｌｌ６９，７０３−７１３）のような合成アンタゴニストへはそうでないところの先端を切ったＰＲ　ＬＢＤそれぞれの利用可能性を持っては、このことはもはや大きい関心事ではない。かくして、内因性ステロイド受容体と独立して機能する、ステロイドホルモン受容体ＬＢＤ−ベースの誘導発現システムを開発することができる。
【００１０】
このことは今まで、Ｇａ１４　ＤＢＤに基づくＲＵ４８６−誘導発現システムの開発を通じてＰＲ　ＬＢＤについて示されている（Ｗａｎｇ，Ｙ．，Ｏ’Ｍａｌｌｅｙ，Ｂ．Ｗ．，Ｊｒ．，Ｔｓａｉ，Ｓ．，ａｎｄＯ’Ｍａｌｌｅｙ，Ｂ．Ｗ．（１９９４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９１，８１８０−８１８４；Ｗａｎｇ，Ｙ．，Ｘｕ，Ｊ．，Ｐｉｅｒｓｏｎ，Ｔ．，Ｏ’Ｍａｌｌｅｙ，Ｂ．Ｗ．，ａｎｄＴｓａｉ，Ｓ．Ｙ．（１９９７）ＧｅｎｅＴｈｅｒａｐｙ４，４３２−４４１）。エストロゲンへの応答性を喪失しているがアンタゴニスト４−ＯＨＴへはそうでない、点突然変異（Ｇ５２５Ｒ）ＥＲ　ＬＢＤに基づく誘導発現システム（Ｌｉｔｔｌｅｗｏｏｄ，Ｔ．Ｄ．，Ｈａｎｃｏｃｋ，Ｄ．Ｃ．，Ｄａｎｉｅｌｉａｎ，Ｐ．Ｓ．，Ｐａｒｋｅｒ，Ｍ．Ｇ．，ａｎｄＥｖａｎ，Ｇ．Ｉ．（１９９５）Ｎｕｃｌ．ＡｃｉｄｓＲｅｓ．２３，１６８６−１６９０）は今まで記載されていない。デザインした亜鉛フィンガータンパク質は、Ｇａ１４から誘導化されるものを含む他のＤＢＤに比較して、数多くの利点を有するが、これは、ＤＮＡ結合特異性を工学する能力が、リガンド−依存性調節体をいかなる望ましい人工的もしくは天然的プロモーターに向けることを可能にするからである。ここで我々は、デザインした亜鉛フィンガータンパク質と核ホルモン受容体ＬＢＤとの間の融合タンパク質を遺伝子発現の誘導制御のために利用することを探求する。
【００１１】
（発明の簡単な概要）
一つの実施態様において、本発明は、お互いに機能するように結合した二つのリガンド結合ドメインおよびリガンド結合ドメインの一つに機能するように結合した第一機能的リガンド結合ドメインを含むところの非天然由来のポリペプチドを提供する。好ましくは、リガンド結合ドメインはお互いに共有結合している。さらに好ましくは、二つの結合ドメインは、約１０〜約４０個のアミノ酸残基、好ましくは、約１５〜約３５個のアミノ酸残基、そしてさらに好ましくは、約１８〜約３０個のアミノ酸残基を含むペプチドリンカーにより共有結合している。
【００１２】
一つの実施態様において、リガンド結合ドメインは核ホルモン受容体から誘導化される。リガンド結合ドメインは同一のもしくは異なる核ホルモン受容体から誘導化され得る。例示的でかつ好ましい核ホルモン受容体は、エストロゲン受容体、プロゲステロン受容体、エクジソン受容体およびレチノイドＸ受容体のようなステロイドホルモン受容体である。
【００１３】
第一機能的ドメインは、標的ヌクレオチドの機能もしくは活性を変えるいかなるドメインでもあり得る。一つの実施態様において、第一機能的ドメインはヌクレオチド結合ドメインである。好ましくは、ヌクレオチド結合ドメインはＤＮＡ結合ドメインである。ＤＮＡ結合ドメインは、好ましくは、少なくとも一つの亜鉛フィンガーＤＮＡ結合モチーフ、さらに好ましくは２〜１２個の亜鉛フィンガーＤＮＡ結合モチーフ、なおさらに好ましくは３〜６個の亜鉛フィンガーＤＮＡ結合モチーフを含む。一つの実施態様において、亜鉛フィンガーＤＮＡ結合モチーフは、式中ＧはグアニヂンでありそしてＮはいかなるヌクレオチドである、式（ＧＮＮ）_１〜６のヌクレオチド配列に特異的に結合する。もう一つの実施態様において、第一機能的ドメインは、転写活性化ドメインもしくは転写抑制ドメインのような転写調節ドメインである。
【００１４】
なおもう一つの実施態様において、ポリペプチド遺伝子スイッチは第二機能的ドメインを含む。この実施態様に従って、好ましい第一機能的ドメインはヌクレオチド結合ドメインであり、そして第二機能的ドメインは転写調節ドメインである。
【００１５】
一つの実施態様において、この発明のポリペプチドは、（ａ）３〜６個の亜鉛フィンガーＤＮＡ結合モチーフを有するＤＮＡ結合ドメイン；（ｂ）ＤＮＡ結合ドメインに機能するように結合したレチノイドＸ受容体から誘導化された第一リガンド結合ドメイン、１８〜３６個のアミノ酸残基のペプチドスペーサーを持つ第一リガンド結合ドメインに結合したエクジソン受容体から誘導化された第二リガンド結合ドメイン；および（ｃ）第二結合ドメインに機能するように結合した転写調節ドメイン、を含む。
【００１６】
なおもう一つの実施態様において、ポリペプチド遺伝子スイッチは、（ａ）３〜６個の亜鉛フィンガーＤＮＡ結合モチーフを有するＤＮＡ結合ドメイン；（ｂ）ＤＮＡ結合ドメインに機能するように結合したプロゲステロン受容体から誘導化された第一リガンド結合ドメイン、１８〜３６個のアミノ酸残基のペプチドスペーサーを持つ第一リガンド結合ドメインに結合したプロゲステロン受容体から誘導化された第二リガンド結合ドメイン；および（ｃ）第二リガンド結合ドメインに機能するように結合した転写調節ドメイン、を含む。
【００１７】
もう一つの態様において、この発明は、この発明のポリペプチド遺伝子スイッチをコード化するポリヌクレオチド、そんなポリヌクレオチドを含む発現ベクターおよびそんなヌクレオチドを含む細胞を提供する。
この発明のもう一つの態様は、規定した配列を含む標的ヌクレオチドの機能を調節するプロセスを提供する。このプロセスは、ポリペプチドの少なくとも一つのリガンド結合ドメインに結合するリガンドの存在下に、標的ヌクレオチドをこの発明のポリペプチドに露出させるステップを含む。関係する態様において、本発明は、標的ヌクレオチド（例えば遺伝子）の転写（例えば発現）を調節するプロセスを提供する。そのプロセスに従って、規定した配列を含む標的ヌクレオチドを、ポリペプチドの少なくとも一つのリガンド結合ドメインに結合するリガンドの存在下に、この発明のポリペプチドに露出させる。ポリペプチドは、標的ヌクレオチド中で規定した配列に特異的に結合するヌクレオチド結合ドメインを含む。ポリペプチド遺伝子スイッチが転写抑制ドメインを含む場合には、調節は抑制である。ポリペプチド遺伝子スイッチが転写活性化ドメインを含む場合には、調節は活性化である。
【００１８】
（図面の簡単な説明）
明細書の一部分を形成する図面において、図１は、新規なＤＮＡ結合特異性を持つデザインした亜鉛フィンガータンパク質の生成を示す。図１Ａは三フィンガータンパク質Ｂ３およびＮ１のアミノ酸配列である。肉太の字体で示す、ＤＮＡ認識へリックス位置の−２〜６が、三フィンガータンパク質Ｓｐ１Ｃのフレームワークの中に移植された。逆並行βシートおよびαへリックスの位置、亜鉛フィンガードメインのホールマークは示すごとくである。それぞれのフィンガーのＤＮＡ結合特異性は左に示されている。Ｆ１〜３はフィンガー１〜３である。図１ＢはＤＮＡ結合特異性のＥＬＩＳＡ分析である。亜鉛フィンガータンパク質は、ＭＢＰ融合体として大腸菌中で発現され、精製されたものである。結合特異性は、示した５’−（ＧＮＮ）_３−３’ 配列を含む固定化、ビオチン化ヘアピンオリゴヌクレオチドへの結合を測定することにより分析された。黒色の棒線はＢ３であり；灰色の棒線はＮ１である。最大のシグナルは１に正規化された。特異的標的配列への結合についてのＫ_Ｄ値は、電気泳動移動度シフトアッセイにより測定されたもので、相当する棒線の上にラベルされている。
【００１９】
図２は、ホルモン依存性、単鎖ＥＲ融合構築体の遺伝子発現の調節を示す。図２ＡはＥＲ融合タンパク質の構造である。Ｅ２Ｃは六フィンガータンパク質であり；Ｌは柔軟なペプチドリンカーである。図２Ｂは、二量体として単一のＥＲ−ＬＢＤ結合を持つ融合タンパク質である。ヒーラ細胞は、Ｃ７−ＥＲ−ＶＰ６４発現ベクターおよび、一つもしくは二つのどちらかのＣ７結合部位を保持する、示したＴＡＴＡルシフェラーゼのレポータープラスミドで共トランスフェクトされた。トランスフェクションの２４時間後に、細胞を未処理で放置するか（−）もしくは１００ｎＭの４−ＯＨＴを加える（＋）かをした。全細胞抽出物中のルシフェラーゼ活性はトランスフェクションの４８時間後に測定された。それぞれの棒線は二回測定の平均値（±ＳＤ）を提示する。図２Ｃは融合タンパク質を発現しない制御プラスミドｐｃＤＮＡ３である。図２Ｃ、Ｄは、二つのＥＲ−ＬＢＤを持つ融合タンパク質により単一の結合部位を通じる転写の調節である。ヒーラ細胞は、示した発現ベクターおよびＴＡＴＡボックスの上流に単一のＥｃ２結合部位を保持する、Ｅ２Ｃ−ＴＡＴＡ−ルシフェラーゼのレポータープラスミドで共トランスフェクトされ、そして４−ＯＨＴ誘導およびルシフェラーゼ活性の測定は図２Ｂでの説明のように行われた。
【００２０】
図３は、ホルモン依存性、単鎖ＲＸＲ／ＥｃＲ融合構築体の遺伝子発現の調節を示す。図３ＡはＲＸＲ／ＥｃＲ融合タンパク質の構造である。図３Ｂは、単一の結合部位を通じる転写の調節である。ヒーラ細胞は、示した発現ベクターおよび、単一のＥｃ２結合部位を保持する、ＴＡＴＡルシフェラーゼのレポータープラスミドで共トランスフェクトされた。トランスフェクションの２４時間後に、細胞を未処理で放置するか（−）もしくは５ｎＭのポナステロンＡを加える（＋）かをした。全細胞抽出物中のルシフェラーゼ活性はトランスフェクションの４８時間後に測定された。それぞれの棒線は二回測定の平均値（±ＳＤ）を提示する。ｐｃＤＮＡ３．１は融合タンパク質を発現しない制御プラスミドである。
【００２１】
図４は、亜鉛フィンガー結合ドメインＢ３Ｂのヌクレオチド（配列番号３１）およびアミノ酸残基配列（配列番号３２）を示す。
図５は、亜鉛フィンガー結合ドメイン２Ｃ７のヌクレオチド（配列番号３３）およびアミノ酸残基配列（配列番号３４）を示す。
図６は、亜鉛フィンガー結合ドメインＢ３Ｃ２のヌクレオチド（配列番号３５）およびアミノ酸残基配列（配列番号３６）を示す。
図７は、抑制ドメイン（ＫＲＡＢ−Ａ）２のヌクレオチド（配列番号３７）を示す。
図８は、抑制ドメイン（ＳＩＤ）２のヌクレオチド（配列番号３８）を示す。
図９は、ポリペプチドＥ２Ｃ−ＥＲ−Ｌ−ＥＲ−ＶＰ６４のヌクレオチド（配列番号３９）およびアミノ酸残基配列（配列番号４０）を示す。
図１０は、ポリペプチドＥ２Ｃ−ＥＲ−ＬＬ−ＥＲ−ＶＰ６４のヌクレオチド（配列番号４１）およびアミノ酸残基配列（配列番号４２）を示す。
【００２２】
（発明の詳細な説明）
Ｉ．本発明
本発明は、ポリペプチド遺伝子スイッチ、そんなポリペプチドをコード化するポリヌクレオチド、そんなポリヌクレオチドを含む発現ベクター、そんな発現ベクターもしくはポリヌクレオチドを含む細胞ならびにそんなポリペプチド、ポリヌクレオチドおよび発現ベクターを用いて標的ヌクレオチド機能を調節するプロセスを提供する。ＤＮＡ結合ドメインおよび／もしくは転写調節ドメインと一緒に単一のリガンド結合ドメインを含むところの現存する遺伝子スイッチと異なり、本発明のポリペプチド遺伝子スイッチは二つのリガンド結合ドメインを含む。リガンドの結合に際して、分子内配置の変化が起り、機能性ドメインの興味のある標的遺伝子へのアラインメントを容認する。それ故に、現存の遺伝子スイッチに比較して本遺伝子スイッチの利点は、単一の分子スイッチおよびそのスイッチの生成のための単一の発現ベクターのみについての必要性である。
【００２３】
ＩＩ．ポリペプチド
本発明のポリペプチド遺伝子スイッチは少なくとも三つの成分を含む：二つのリガンド結合ドメイン（ＬＢＤ）および第一機能ドメイン（ＦＤ−１）である。これらのリガンド結合ドメインは、ポリペプチドが、少なくとも一つのリガンド結合ドメインに結合する規定したリガンドの存在下で、ヌクレオチドの機能を変更できるように、第一機能性ドメインに機能するように結合する。ドメインはいかなる順番でも並べ得る。下に示すように、このリガンド結合ドメインは、第一機能性ドメインからアミノ末端もしくはカルボキシル末端のどちらかの方向に位置することができる。
【表１】

【００２４】
この発明のポリペプチドは非−天然由来である。ここで用いる限りでは、用語“非−天然由来”とは、例えば、以下に示す一つもしくはそれ以上のものを意味する：（ａ）非−天然由来のアミノ酸配列からなるペプチド；（ｂ）天然に由来するようなペプチドと関連しない非−天然由来の二次構造を有するペプチド；（ｃ）ペプチドが天然に由来する生物と通常は関連しない非−天然由来の一つもしくはそれ以上のアミノ酸を含むペプチド；（ｄ）立体異性体が天然に由来するように関連しないペプチドを含む、一つもしくはそれ以上のアミノ酸の立体異性体を含むペプチド；（ｅ）天然アミノ酸の一つ以外の化学的部分を一つもしくはそれ以上含むペプチド；または（ｆ）天然由来のアミノ酸配列の離れた一部分（例えば、先端を切った配列）。この発明のポリペプチドは単離体で存在し、そして汚染物質が実質的に無いように精製される。ポリペプチドは現実には合成品である。即ち、ポリペプチドは天然資源から単離されかつ精製されるか、もしくは技術上周知の技法を用いて新規に作製される。
【００２５】
Ａ．リガンド結合ドメイン（ＬＢＤ）
それぞれのＬＢＤは、特定のリガンドを受け入れて結合するアミノ酸残基配列である。ＬＢＤへのリガンドの結合はポリペプチドの配位／機能を変えて、そして標的ヌクレオチドの機能を調整することを容認する。リガンドの不存在下では、遺伝子スイッチはヌクレオチドの機能を変えるようには作用しない。少なくとも一つのＬＢＤは結合する能力があり、かつ特定のリガンドと結合する。両方のＬＢＤは特定のリガンドと結合することができる。かくして、ＬＢＤは同一でも異なっていてもよい。好ましいＬＢＤはステロイドホルモン受容体のような核ホルモン受容体から誘導化される。
【００２６】
リガンド結合ドメインの供給源として役立ち得る、例示的でかつ好ましいステロイドホルモン受容体には、エストロゲン受容体（ＥＲ）、プロゲステロン受容体（ＰＲ）、グルココルチコイド−α受容体、グルココルチコイド−β受容体、鉱質コルチコイド受容体、アンドロゲン受容体、甲状腺ホルモン受容体、レチノイン酸受容体（ＲＡＲ）、レチノイドＸ受容体（ＲＸＲ）、ビタミンＤ受容体，ＣＯＵＰ−ＴＦ受容体、エクジソン受容体（ＥｃＲ）、Ｎｕｒｒ−１受容体およびオーファン受容体が挙げられる。好ましいＥｃＲは、ショウジョウバエのメラノガステル（ＤＥ）もしくはカイコガ（ＢＥ）のどちらかから誘導化される。
【００２７】
技術上周知のように、ステロイドホルモンはＤＮＡ結合ドメインおよびリガンド結合ドメインから構成されている。ＤＮＡ結合ドメインは、配列を調節する受容体を含みかつＤＮＡに結合し、そしてリガンド結合ドメインは特異的生物学的化合物（リガンド）と結合して、受容体を活性化する。用語“リガンド”は、普通は受容体のリガンド結合ドメインとの相互作用（の結合）により、受容体を活性化するいかなる化合物も指す。しかしながら、リガンドはまた、結合無しで受容体を活性化する化合物も含む。本発明のポリペプチド遺伝子スイッチを使用する場合には、リガンド結合ドメインは、天然由来のリガンドから修飾したもの、天然由来のリガンド（例えばステロイドホルモン）以外のリガンド、であることが望ましい。天然由来の核ホルモン受容体リガンド結合ドメインを変えて、結合特異性を変える手段は、技術上周知である（例えば、その開示は出典明示により本明細書の一部とする、米国特許第５，８７４，５３４号および第５，５９９，９０４号、を参照）。同様に、エストロゲン受容体を変えて、その結合親和性を変更する手段が報告されている［例えば、Ｌｉｔｔｌｅｗｏｏｄｅｔａｌ．，ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ．，３（１０）：１６８６−１６９０，１９９５、を参照］。
【００２８】
用語“天然由来のリガンド”は、通常は動物もしくはヒトの中に見出されないで、そして受容体のリガンド結合ドメインに結合するところの化合物をいう。リガンドはまた、“非−天然リガンド”、即ち遺伝子治療が意図されている特異的な生物（ヒトもしくは動物）の中に通常は見出されないリガンド、でもあり得る。例えば、エクジソンのような或る昆虫ホルモンはヒト中に見出されない。これは、動物もしくはヒトについての非−天然ホルモンの例である。
【００２９】
非−天然リガンド、抗−ホルモンおよび非−自生リガンドの例としては以下のものが挙げられる：１１β−（４−ジメチルアミノフェニル）−１７β−ヒドロキシ−１７α−プロピニル−４，９−エストラジエン−３−オン（Ｒｕ３８４８６もしくはミフェペストン）；１１β−（４−ジメチルアミノフェニル）−１７α−ヒドロキシ−１７β−（３−ヒドロキシプロピル）−１３α−メチル−４，９−ゴナジエン−３−オン（ＺＫ９８２９９もしくはオナプリストン）；１１β−（４−アセチルフェニル）−１７β−ヒドロキシ−１７α−（１−プロピニル）−４，９−エストラジエン−３−オン（ＺＫ１１２９３３）；１１β−（４−ジメチルアミノフェニル）−１７β−ヒドロキシ−１７α−（３−ヒドロキシ−１（Ｚ）−プロペニルエストラ−４，９−ジエン−３−オン（ＺＫ９８７３４）；（７β，１１β，１７β）−１１−（４−ジメチルアミノフェニル）−７−メチル−４’，５’−ジヒドロスピロイ’エステル−４，９−ジエン−１７，２’（３’Ｈ）−フラン！−３−オン（Ｏｒｇ３１８０６）；（１１β，１４β，１７α）−４’，５’−ジヒドロ−１１−（４−ジメチルアミノフェニル）イ’スピロスタ−４，９−ジエン−１７，２’（３’Ｈ）−フラン！−３−オン（Ｏｒｇ３１３７６）；５−アルファ−プレグナン−３，２−ジオン。さらに別の非−天然リガンドとしては、選択的エストロゲン受容体モジュレーター（ＳＥＲＭＳ）として広く規定されている、合成的非−ステロイドエストロゲンもしくは抗−エストロゲン化合物が一般的に、挙げられる。例示的な化合物としては、タモキシフェンおよびラロキシフェンが、非限定的に、挙げられる。
【００３０】
種々のリガンド結合ドメインと共に使用される、例示的でかつ好ましいリガンドは（１）ＥｃＲ：ポナステロン、ムリステロンＡ、ＧＳ−Ｅ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、テブフェノシド；（２）ＥＲ：４−ヒドロキシ−タモキシフェン、ＩＣＩ１６４３８４、ＲＵ５４８７６、ラロキシフェンのようなエストロゲンアンタゴニスト；ならびに（３）ＰＲ：ＲＵ４８６、ＲＵ３８４８６およびオナプリストンのようなプロゲステロンアンタゴニスト、である。
【００３１】
プロゲステロン受容体から誘導化される、特に好ましいＬＢＤはヒトプロゲステロン受容体からのアミノ酸残基６４５〜９１４を含む。エストロゲン受容体から誘導化される、例示的なＬＢＤはマウスＧ２２５Ｒからのアミノ酸残基２８２〜５９９を含む。
二つのＬＢＤは、約１０〜約５０個のアミノ酸残基を含むアミノ酸残基配列リンカーにより隔てられている。好ましくは、スペーサーは約１５〜約４０個のアミノ酸残基をそして、さらに好ましくは、約１８〜約３５個のアミノ酸残基を含む。例示的でかつ好ましいスペーサーは、１８（Ｌ）、３０（ＬＬ）もしくは３６（ＬＬＬ）個のアミノ酸残基を含む。
【００３２】
Ｂ．機能性ドメイン
本ポリペプチドの第二の成分は機能性ドメインである。ここで用いる限りでは、用語“機能性ドメイン”およびその文法的同意語は、ヌクレオチドに結合し、その構造を変え、および／もしくはその機能を変えるところのアミノ酸残基配列を意味する。例示的のそのような機能性ドメインとしては、ヌクレオチド結合ドメイン、転写調節ドメイン（例えば、転写活性化ドメインおよび転写抑制ドメイン）ならびにヌクレアーゼ活性を有するドメイン、が挙げられる。そのようなドメインは技術上周知である。
【００３３】
１．ヌクレオチド結合ドメイン
ポリペプチドの機能性ドメインはヌクレオチド結合ドメインであり得る：規定したヌクレオチド配列を認識しそしてに結合する、アミノ酸残基の配列である。標的ヌクレオチド配列はＲＮＡ配列もしくは、好ましくは、ＤＮＡ配列であり得る。規定したＤＮＡ配列を認識しそしてに結合する、アミノ酸残基配列は技術上周知である（例えばＧＡＬ４）。いかなるそのようなＤＮＡ結合ドメインは、この発明のポリペプチド遺伝子スイッチのＤＮＡ結合ドメインとして使用され得る。しかしながら、本遺伝子スイッチのＤＮＡ結合ドメインは一つもしくはそれ以上のＤＮＡ結合亜鉛フィンガーモチーフであることが好ましい。そのようなＤＮＡ結合亜鉛フィンガーモチーフは技術上周知である（例えば、その開示は出典明示により本明細書の一部とする、ＰＣＴ特許出願第ＷＯ　９５／１９４２１号および第ＷＯ　９８／５４３１１号を参照）。かくして、この発明のポリペプチド遺伝子スイッチのＤＮＡ結合ドメインは、好ましくは、特異的なヌクレオチド標的配列に結合するようにデザインされるところの多重フィンガーで、多指の、亜鉛フィンガーペプチドを含む。
【００３４】
本開示は、長さで大よそ３０個のアミノ酸の単一ββαひだからなる、Ｃｙｓ_２−Ｈｉｓ_２亜鉛フィンガードメインにユニークな構造的特徴の認識に基づいている。このひだの構造的安定性は、疎水性相互作用により、および保存Ｃｙｓ_２−Ｈｉｓ_２残基による単一の亜鉛イオンのキレート化によって達成される（Ｌｅｅ，Ｍ．Ｓ．，Ｇｉｐｐｅｒｔ，Ｇ．Ｐ．，Ｓｏｍａｎ，Ｋ．Ｖ．，Ｃａｓｅ，Ｄ．Ａ．＆Ｗｒｉｇｈｔ，Ｐ．Ｅ．（１９８９）Ｓｃｉｅｎｃｅ２４５，６３５−６３７）。核酸の認識は、ＤＮＡ配列の３個の塩基対に典型的に結合するところのドメインのα−へリックスから由来する、特異的なアミノ酸側鎖端子を通じて達成される（Ｐａｖｌｅｔｉｃｈ，Ｎ．Ｐ．＆Ｐａｂｏ，Ｃ．Ｏ．（１９９１）Ｓｃｉｅｎｃｅ２５２，８０９−１７，Ｅｌｒｏｄ−Ｅｒｉｃｋｓｏｎ，Ｍ．，Ｒｏｕｌｄ，Ｍ．Ａ．，Ｎｅｋｌｕｄｏｖａ，Ｌ．＆Ｐａｂｏ，Ｃ．Ｏ．（１９９６）Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ４，１１７１−１１８０）。他の核酸認識モチーフと異なり、多重亜鉛フィンガードメインの単一な共有連鎖はＤＮＡの拡張非対称的配列の認識を可能にする。
【００３５】
天然の亜鉛フィンガータンパク質の研究は、三亜鉛フィンガードメインが隣接するＤＡＮ配列の９ｂｐに結合し得ることを示している（Ｐａｖｌｅｔｉｃｈ，Ｎ．Ｐ．＆Ｐａｂｏ，Ｃ．Ｏ．（１９９１）Ｓｃｉｅｎｃｅ２５２，８０９−１７．，Ｓｗｉｒｎｏｆｆ，Ａ．Ｈ．＆Ｍｉｌｂｒａｎｄｔ，Ｊ．（１９９５）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１５，２２７５−８７）。９ｂｐの配列の認識は大腸菌の小さいゲノム内でさえユニークな部位を特定するには不十分である一方で、六亜鉛フィンガードメインを含む多指のタンパク質は１８−ｂｐ認識を特定する（Ｌｉｕ，Ｑ．，Ｓｅｇａｌ，Ｄ．Ｊ．，Ｇｈｉａｒａ，Ｊ．Ｂ．＆ＢａｒｂａｓＩＩＩ，Ｃ．Ｆ．（１９９７）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９４，５５２５−５５３０）。遺伝制御のための万能システムの開発に関して、８−ｂｐアドレスは十分に、全ての既知ゲノム内で単一の部位を特定することができる。そして、生きているヒト細胞内で遺伝子の活性化および抑制におけるそれらの有効性が最近示されている（Ｌｉｕ，Ｑ．，Ｓｅｇａｌ，Ｄ．Ｊ．，Ｇｈｉａｒａ，Ｊ．Ｂ．＆ＢａｒｂａｓＩＩＩ，Ｃ．Ｆ．（１９９７）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９４，５５２５−５５３０）。
【００３６】
亜鉛フィンガー−ヌクレオチド結合ペプチドドメインは、野生型亜鉛フィンガータンパク質から、先端切断もしくは拡張により、または部位指向性突然変異誘発による野生型−誘導ポリペプチドの変異体として、またはこれらの手順の組合せにより、誘導化もしくは生成され得る。用語“先端を切った”は、天然の亜鉛フィンガー結合タンパク質中に見出される亜鉛フィンガーを全数以下に含むかもしくは望ましくない配列を欠失したところの亜鉛フィンガーヌクレオチド結合ポリペプチドを指す。例えば、９個の亜鉛フィンガーを天然に含む、亜鉛フィンガー−ヌクレオチド結合タンパク質ＴＦＩＩＩＡの先端切断は、１〜３個の亜鉛フィンガーのみを持つポリペプチドであるかもしれない。拡張とは、さらに別の亜鉛フィンガーモジュールが加えられているところの亜鉛フィンガーポリペプチドをいう。例えば、一つ以上の野生型ポリペプチドからの３個の亜鉛フィンガーモジュール加えることにより、ＴＦＩＩＩＡを１２個のフィンガーまで拡張し得るが、そのために“ハイブリッド”亜鉛フィンガー−ヌクレオチド結合ポリペプチドが結果的に得られる。
【００３７】
用語“突然変異を誘発させる”は、ＤＮＡコード化タンパク質のランダムもしくは部位−指向性の突然変異誘発を達成する既知方法のいずれかを実施することにより得られているところの亜鉛フィンガー誘導−ヌクレオチド結合ポリペプチドを指す。例えば、ＴＦＩＩＩＡにおいて、突然変異誘発を実施して、コンセンサス配列の一つもしくはそれ以上の繰返し体中で非−保存残基を置換することができる。先端を切った亜鉛フィンガー−ヌクレオチド結合タンパク質はまた突然変異を誘発させ得る。多例の既知亜鉛フィンガー−ヌクレオチド結合タンパク質もまた、突然変異を誘発させ得る。亜鉛フィンガー−ヌクレオチド結合モチーフを含むヌクレオチド配列の機能を阻害するために、本発明に従って先端を切り、拡張し、そして／もしくは突然変異を誘発させ得るところの亜鉛フィンガー−ヌクレオチド結合ポリペプチドの例としては、ＴＦＩＩＡおよびｚｉｆ２６８が挙げられる。他の亜鉛フィンガー−ヌクレオチド結合タンパク質は当業者に公知であるであろう。
【００３８】
亜鉛フィンガーＤＮＡ結合ドメインは、種々の技術上周知の標準技法を用いて作成され得る。亜鉛フィンガータンパク質のファージ表示ライブラリーを、配列特異的タンパク質の富化を有利にする条件下で、創生しかつ選択した。数多くの配列を認識する亜鉛フィンガードメインは、ファージ選択データおよび構造的情報の両方により導かれた部位−指向性突然変異誘発による改善を必要とした。
【００３９】
この発明のポリペプチド中で用いるＤＮＡ結合ドメインは、好ましくは、（ＧＮＮ）_１〜６ヌクレオチド配列に結合する亜鉛フィンガー−ヌクレオチド結合ペプチドである。（ＧＮＮ）_１〜６に特異的に結合する亜鉛フィンガーは、１９９８年１０月１６日に出願された、米国特許出願番号０９／１７３，９４１（その開示は出典明示により本明細書の一部とする）に記載されている。
【００４０】
例示的かつ好ましい亜鉛フィンガーＤＮＡ結合ドメインは、Ｅ２Ｃ、Ｃ７、Ｂ３Ｂ、２Ｃ７、Ｂ３Ｃ２およびＮ１とここでは呼ばれている。亜鉛フィンガーＤＮＡ結合ドメインを含むポリペプチド遺伝子スイッチの作製の詳細な説明は、以後の実施例で見ることができる。図４〜６は、Ｂ３Ｂ、２Ｃ７およびＢ３Ｃ２についてのアミノ酸残基およびコード化ヌクレオチド配列をそれぞれ示す。
【００４１】
２．転写調節ドメイン
転写調節ドメインとは、標的ヌクレオチド（例えば遺伝子）の転写を活性化するか抑制するように作用する，ペプチドをいう。転写活性化ドメインは技術上周知である（例えば、Ｓｅｉｐｅｌｅｔａｌ．，（１９９２）ＥＭＢＯＪ．，１１：４９６１−４９６８、を参照）。例示的かつ好ましい転写活性化ドメインとしては、ＶＰ１６、ＴＡ２、ＶＰ６４、ＳＴＡＴ６、ｒｅｌＡ、ＴＡＦ−１、ＴＡＦ−２、ＴＡＵ−１およびＴＡＵ−２、が挙げられる。本発明で使用するために特に好ましい活性化ドメインはＶＰ１６およびＶＰ６４である。ＶＰ１６およびＶＰ６４をリガンド結合ドメインに結合させる手段は以後の実施例に示されている。
【００４２】
転写抑制ドメインはまた技術上周知である。例示的かつ好ましいそのような転写抑制体としては，ＥＲＤ、ＫＲＡＢ、ＳＩＤ、ヒストンデアセチラーゼ、ＤＮＡ、メチラーゼ、ならびにそれらの誘導体、多量体および組合せ、例えば、ＫＲＡＢ−ＥＲＤ、ＳＩＤ−ＥＲＤ、（ＫＲＡＢ）_２、（ＫＲＡＢ）_３、ＫＲＡＢ−Ａ、（ＫＲＡＢ−Ａ）_２、（ＳＩＤ）_２、（ＫＲＡＢ−Ａ）−ＳＩＤおよびＳＩＤ−（ＫＲＡＢ−Ａ）、が挙げられる。第一抑制ドメインをＫｒηｐｐｌ−関連ボックス（ＫＲＡＢ）ドメインを用いて作製することができる（Ｍａｒｇｏｌｉｎｅｔａｌ．，１９９４）。この抑制ドメインは亜鉛フィンガータンパク質のＮ−末端に普通に見出され、そしておそらく、ＲＩＮＧフィンガータンパク質ＫＡＰ−１と相互作用することにより、その抑制活性をＴＡＴＡ−依存性転写に距離−および配向−非依存性様式で及ぼすであろう。亜鉛フィンガータンパク質ＫＯＸ１のアミノ酸１および９７の間に見出されるＫＲＡＢドメインを利用することができる。最後に、抑制のためのヒストン脱アセチル化の利用を探求するために、Ｍａｄ　ｍＳＩＮ２相互作用ドメイン（ＳＩＤ）のアミノ酸１〜３６をもう一つのドメインに融合させることができる（Ａｙｅｒｅｔａｌ．，１９９６）。この小さいドメインは転写因子ＭａｄのＮ−末端に見出され、そしてその転写抑制をｍＳＩＮ３と相互作用することにより調整する役割を果たしているが、それは今度は共−抑制体Ｎ−ＣｏＲおよびヒストンデアセチラーゼｍＲＰＤ１と相互作用する。
【００４３】
図７および８は、好ましい転写抑制ドメイン（ＫＲＡＢ−Ａ）_２および（ＳＩＤ）_２のアミノ酸残基およびヌクレオチドコード化配列をそれぞれ示す。抑制ドメインをリガンド結合ドメインに結合させる手段ならびに抑制ドメインを含む例示的ポリペプチド遺伝子スイッチは以後の実施例に示されている。
【００４４】
３．ポリペプチド遺伝子スイッチ
この発明のポリペプチドは、一つの実施態様において、二つのリガンド結合ドメインおよび第一機能性ドメインを含む。もう一つの実施態様において、ポリペプチド遺伝子スイッチは二つのリガンド結合ドメイン、第一機能性ドメインおよび第二機能性ドメイン、を含む。これらのドメインは、下に示すように、いかなる順序でも存在し得る。
【００４５】
好ましい実施態様において、二つのリガンド結合ドメイン（ＬＢＤ）はお互いに直接隣接して位置している；即ち、それらはこの発明の一量体ポリペプチド遺伝子スイッチ内で“順次に連結”していて、そしてこの発明の機能性ドメインにより隔てられていない。この順次に連結しているＬＢＤは、例えばポリペプチドリンカー分子のような、リンカー分子によりお互いから隔てられ得る。
【００４６】
好ましい実施態様において、二つのＬＢＤはこの発明の二つの機能性ドメイン（ＦＤ）の間に位置しているが、ここで一つの機能性ドメインは転写調節ドメイン（ＴＲＤ）であり、そして他の機能性ドメインはヌクレオチド結合ドメイン（ＮＢＤ）である。
【００４７】
特に好ましい実施態様において、この発明の単量体ポリペプチド遺伝子スイッチは、ＦＤ−１／ＬＢＤ−１／ＬＢＤ−２／ＦＤ−２の連続した順番で、二つのＦＤおよび二つのＬＢＤからなる。好ましくは、この実施態様において、一つの機能性ドメインはＴＲＤであり、そして他の機能性ドメインはＮＢＤである。
好ましくは、この発明の単量体ポリペプチド遺伝子スイッチで使用されるＮＢＤは、６個の亜鉛フィンガー結合モチーフを含む。以後の実施例でさらに説明するように、単量体ポリペプチド遺伝子スイッチに使用される六亜鉛フィンガーＮＢＤは、対称的もしくは非対称的であってもよいところのユニークな１８ｂｐ核酸配列の認識を容認する。
【表２】

【００４８】
多種類のポリペプチド遺伝子スイッチが作成されている。例示的なそんな遺伝子スイッチとしては、以下に示すものが挙げられる（用語の規定については上を参照）：
ＲＸＲ、Ｅ２Ｃおよび活性化ドメインを用いる遺伝子スイッチ
Ｅ２Ｃ−ＲＸＲ−Ｌ−ＤＥ−ＶＰ６４，Ｅ２Ｃ−ＲＸＲ−ＬＬ−ＤＥ−ＶＰ６４，Ｅ２Ｃ−ＲＸＲ−ＬＬＬ−ＤＥ−ＶＰ６４，Ｅ２Ｃ−ＲＸＲ−Ｌ−ＢＥ−ＶＰ６４，Ｅ２Ｃ−ＲＸＲ−ＬＬ−ＢＥ−ＶＰ６４，Ｅ２Ｃ−ＲＸＲ−ＬＬＬ−ＢＥ−ＶＰ６４，Ｅ２Ｃ−ＲＸＲ−Ｌ−ＤＥ−ＶＰ１６，Ｅ２Ｃ−ＲＸＲ−ＬＬ−ＤＥ−ＶＰ１６，Ｅ２Ｃ−ＲＸＲ−ＬＬＬ−ＤＥ−ＶＰ１６，Ｅ２Ｃ−ＲＸＲ−Ｌ−ＢＥ−ＶＰ１６，Ｅ２Ｃ−ＲＸＲ−ＬＬ−ＢＥ−ＶＰ１６，Ｅ２Ｃ−ＲＸＲ−ＬＬＬ−ＢＥ−ＶＰ１６；
【００４９】
ＲＸＲ、２Ｃ７および活性化ドメインを用いる遺伝子スイッチ
２Ｃ７−ＲＸＲ−Ｌ−ＤＥ−ＶＰ６４，２Ｃ７−ＲＸＲ−ＬＬ−ＤＥ−ＶＰ６４，２Ｃ７−ＲＸＲ−ＬＬＬ−ＤＥ−ＶＰ６４，２Ｃ７−ＲＸＲ−Ｌ−ＢＥ−ＶＰ６４，２Ｃ７−ＲＸＲ−ＬＬ−ＢＥ−ＶＰ６４，２Ｃ７−ＲＸＲ−ＬＬＬ−ＢＥ−ＶＰ６４，２Ｃ７−ＲＸＲ−Ｌ−ＤＥ−ＶＰ１６，２Ｃ７−ＲＸＲ−ＬＬ−ＤＥ−ＶＰ１６，２Ｃ７−ＲＸＲ−ＬＬＬ−ＤＥ−ＶＰ１６，２Ｃ７−ＲＸＲ−Ｌ−ＢＥ−ＶＰ１６，２Ｃ７−ＲＸＲ−ＬＬ−ＢＥ−ＶＰ１６，Ｅ２Ｃ−ＲＸＲ−ＬＬＬ−ＢＥ−ＶＰ１６；
【００５０】
ＲＸＲ、Ｂ３Ｂおよび活性化ドメインを用いる遺伝子スイッチ
Ｂ３Ｂ−ＲＸＲ−Ｌ−ＤＥ−ＶＰ６４，Ｂ３Ｂ−ＲＸＲ−ＬＬ−ＤＥ−ＶＰ６４，Ｂ３Ｂ−ＲＸＲ−ＬＬＬ−ＤＥ−ＶＰ６４，Ｂ３Ｂ７−ＲＸＲ−Ｌ−ＢＥ−ＶＰ６４，Ｂ３Ｂ７−ＲＸＲ−ＬＬ−ＢＥ−ＶＰ６４，Ｂ３Ｂ−ＲＸＲ−ＬＬＬ−ＢＥ−ＶＰ６４，Ｂ３Ｂ−ＲＸＲ−Ｌ−ＤＥ−ＶＰ１６，Ｂ３Ｂ−ＲＸＲ−ＬＬ−ＤＥ−ＶＰ１６，Ｂ３Ｂ−ＲＸＲ−ＬＬＬ−ＤＥ−ＶＰ１６，Ｂ３Ｂ−ＲＸＲ−Ｌ−ＢＥ−ＶＰ１６，Ｂ３Ｂ−ＲＸＲ−ＬＬ−ＢＥ−ＶＰ１６，Ｂ３Ｂ−ＲＸＲ−ＬＬＬ−ＢＥ−ＶＰ１６；
【００５１】
ＲＸＲ、Ｂ３Ｃ２および活性化ドメインを用いる遺伝子スイッチ
Ｂ３Ｃ２−ＲＸＲ−Ｌ−ＤＥ−ＶＰ６４，Ｂ３Ｃ２−ＲＸＲ−ＬＬ−ＤＥ−ＶＰ６４，Ｂ３Ｃ２−ＲＸＲ−ＬＬＬ−ＤＥ−ＶＰ６４，Ｂ３Ｃ２−ＲＸＲ−Ｌ−ＢＥ−ＶＰ６４，Ｂ３Ｃ２−ＲＸＲ−ＬＬ−ＢＥ−ＶＰ６４，Ｂ３Ｃ２−ＲＸＲ−ＬＬＬ−ＢＥ−ＶＰ６４，Ｂ３Ｃ２−ＲＸＲ−Ｌ−ＤＥ−ＶＰ１６，Ｂ３Ｃ２−ＲＸＲ−ＬＬ−ＤＥ−ＶＰ１６，Ｂ３Ｃ２−ＲＸＲ−ＬＬＬ−ＤＥ−ＶＰ１６，Ｂ３Ｃ２−ＲＸＲ−Ｌ−ＢＥ−ＶＰ１６，Ｂ３Ｃ２Ｂ−ＲＸＲ−ＬＬ−ＢＥ−ＶＰ１６，Ｂ３Ｃ２−ＲＸＲ−ＬＬＬ−ＢＥ−ＶＰ１６；
【００５２】
ＲＸＲ、Ｅ２Ｃおよび抑制ドメインを用いる遺伝子スイッチ
Ｅ２Ｃ−ＲＸＲ−Ｌ−ＤＥ−（ＫＲＡＢ−Ａ）２，Ｅ２Ｃ−ＲＸＲ−ＬＬ−ＤＥ−（ＫＲＡＢ−Ａ）２，Ｅ２Ｃ−ＲＸＲ−ＬＬＬ−ＤＥ−（ＫＲＡＢ−Ａ）２，Ｅ２Ｃ−ＲＸＲ−Ｌ−ＢＥ−（ＫＲＡＢ−Ａ）２，Ｅ２Ｃ−ＲＸＲ−ＬＬ−ＢＥ（ＫＲＡＢ−Ａ）２，Ｅ２Ｃ−ＲＸＲ−ＬＬＬ−ＢＥ−（ＫＲＡＢ−Ａ）２，Ｅ２Ｃ−ＲＸＲ−Ｌ−ＤＥ−（ＫＲＡＢ−Ａ）２，Ｅ２Ｃ−ＲＸＲ−ＬＬ−ＤＥ−（ＫＲＡＢ−Ａ）２，Ｅ２Ｃ−ＲＸＲ−ＬＬＬ−ＤＥ− （ＫＲＡＢ−Ａ）２，Ｅ２Ｃ−ＲＸＲ−Ｌ−ＢＥ−（ＫＲＡＢ−Ａ）２，Ｅ２Ｃ−ＲＸＲ−ＬＬ−ＢＥ−（ＫＲＡＢ−Ａ）２，Ｅ２Ｃ−ＲＸＲ−ＬＬＬ−ＢＥ−（ＫＲＡＢ−Ａ）２，Ｅ２Ｃ−ＲＸＲ−Ｌ−ＤＥ−ＳＩＤ）２，Ｅ２Ｃ−ＲＸＲ−ＬＬ−ＤＥ−（ＳＩＤ）２，Ｅ２Ｃ−ＲＸＲ−ＬＬＬ−ＤＥ（ＳＩＤ）２，Ｅ２Ｃ−ＲＸＲ−Ｌ−ＢＥ−（ＳＩＤ）２，Ｅ２Ｃ−ＲＸＲ−ＬＬ−ＢＥ−（ＳＩＤ）２，Ｅ２Ｃ−ＲＸＲ−ＬＬＬ−ＢＥ（ＳＩＤ）２，Ｅ２Ｃ−ＲＸＲ−Ｌ−ＤＥ−（ＳＩＤ）２，Ｅ２Ｃ−ＲＸＲ−ＬＬ−ＤＥ−（ＳＩＤ）２，Ｅ２Ｃ−ＲＸＲ−ＬＬＬ−ＤＥ（ＳＩＤ）２，Ｅ２Ｃ−ＲＸＲ−Ｌ−ＢＥ−（ＳＩＤ２，Ｅ２Ｃ−ＲＸＲ−ＬＬ−ＢＥ−（ＳＩＤ）２，Ｅ２Ｃ−ＲＸＲ−ＬＬＬ−ＢＥ（ＳＩＤ）２；
【００５３】
ＲＸＲ、２Ｃ７および抑制ドメインを用いる遺伝子スイッチ
２Ｃ７−ＲＸＲ−Ｌ−ＤＥ−（ＫＲＡＢ−Ａ）２，２Ｃ７−ＲＸＲ−ＬＬ−ＤＥ−（ＫＲＡＢ−Ａ）２，２Ｃ７−ＲＸＲ−ＬＬＬ−ＤＥ−（ＫＲＡＢ−Ａ）２，２Ｃ７−ＲＸＲ−Ｌ−ＢＥ−（ＫＲＡＢ−Ａ）２，２Ｃ７−ＲＸＲ−ＬＬ−ＢＥ−（ＫＲＡＢ−Ａ）２，２Ｃ７−ＲＸＲ−ＬＬＬ−ＢＥ−（ＫＲＡＢ−Ａ）２，２Ｃ７−ＲＸＲ−Ｌ−ＤＥ−（ＫＲＡＢ−Ａ）２，２Ｃ７−ＲＸＲＬＬ−ＤＥ−（ＫＲＡＢ−Ａ）２，２Ｃ７−ＲＸＲ−ＬＬＬ−ＤＥ−（ＫＲＡＢ−Ａ）２，２Ｃ７−ＲＸＲ−Ｌ−ＢＥ−（ＫＲＡＢ−Ａ）２，２Ｃ７−ＲＸＲ−ＬＬ−ＢＥ−（ＫＲＡＢ−Ａ）２，Ｅ２Ｃ−ＲＸＲ−ＬＬＬ−ＢＥ−（ＫＲＡＢ−Ａ）２，２Ｃ７ＲＸＲ−Ｌ−ＤＥ−（ＳＩＤ）２，２Ｃ７−ＲＸＲ−ＬＬ−ＤＥ−（ＳＩＤ）２，２Ｃ７−ＲＸＲ−ＬＬＬ−ＤＥ−（ＳＩＤ）２，２Ｃ７ＲＸＲ−Ｌ−ＢＥ−（ＳＩＤ）２，２Ｃ７−ＲＸＲ−ＬＬ−ＢＥ−（ＳＩＤ）２，２Ｃ７−ＲＸＲ−ＬＬＬ−ＢＥ−（ＳＩＤ）２，２Ｃ７ＲＸＲ−Ｌ−ＤＥ−（ＳＩＤ）２，２Ｃ７−ＲＸＲ−ＬＬ−ＤＥ−（ＳＩＤ）２，２Ｃ７−ＲＸＲ−ＬＬＬ−ＤＥ−（ＳＩＤ）２，２Ｃ７ＲＸＲ−Ｌ−ＢＥ−（ＳＩＤ）２，２Ｃ７−ＲＸＲ−ＬＬ−ＢＥ−（ＳＩＤ）２，Ｅ２Ｃ−ＲＸＲ−ＬＬＬ−ＢＥ−（ＳＩＤ）２，ｎ；
【００５４】
ＲＸＲ、Ｂ３Ｂおよび抑制ドメインを用いる遺伝子スイッチ
Ｂ３Ｂ−ＲＸＲ−Ｌ−ＤＥ−（ＫＲＡＢ−Ａ）２，Ｂ３Ｂ−ＲＸＲ−ＬＬ−ＤＥ−（ＫＲＡＢ−Ａ）２，Ｂ３Ｂ−ＲＸＲ−ＬＬＬ−ＤＥ−（ＫＲＡＢ−Ａ）２，Ｂ３Ｂ７−ＲＸＲ−Ｌ−ＢＥ−（ＫＲＡＢ−Ａ）２，Ｂ３Ｂ７−ＲＸＲ−ＬＬ−ＢＥ−（ＫＲＡＢ−Ａ）２，Ｂ３Ｂ−ＲＸＲ−ＬＬＬ−ＢＥ−（ＫＲＡＢ−Ａ）２，Ｂ３Ｂ−ＲＸＲ−Ｌ−ＤＥ−（ＫＲＡＢ−Ａ）２，Ｂ３Ｂ−ＲＸＲ−ＬＬ−ＤＥ−（ＫＲＡＢ−Ａ）２，Ｂ３Ｂ−ＲＸＲ−ＬＬＬ−ＤＥ−（ＫＲＡＢ−Ａ）２，Ｂ３Ｂ−ＲＸＲ−Ｌ−ＢＥ−（ＫＲＡＢ−Ａ）２，Ｂ３Ｂ−ＲＸＲ−ＬＬ−ＢＥ−（ＫＲＡＢ−Ａ）２，Ｂ３Ｂ−ＲＸＲ−ＬＬＬ−ＢＥ（ＫＲＡＢ−Ａ）２，Ｂ３Ｂ−ＲＸＲ−Ｌ−ＤＥ−（ＳＩＤ）２，Ｂ３Ｂ−ＲＸＲ−ＬＬ−ＤＥ−（ＳＩＤ）２，Ｂ３Ｂ−ＲＸＲＬＬＬ−ＤＥ−（ＳＩＤ）２，Ｂ３Ｂ７−ＲＸＲ−Ｌ−ＢＥ−（ＳＩＤ）２，Ｂ３Ｂ７−ＲＸＲ−ＬＬ−ＢＥ−（ＳＩＤ）２，Ｂ３ＢＲＸＲ−ＬＬＬ−ＢＥ−（ＳＩＤ）２，Ｂ３Ｂ−ＲＸＲ−Ｌ−ＤＥ−（ＳＩＤ）２，Ｂ３Ｂ−ＲＸＲ−ＬＬ−ＤＥ−（ＳＩＤ）２，Ｂ３Ｂ−ＲＸＲ−ＬＬＬ−ＤＥ−（ＳＩＤ）２，Ｂ３Ｂ−ＲＸＲ−Ｌ−ＢＥ−（ＳＩＤ）２，Ｂ３Ｂ−ＲＸＲ−ＬＬ−ＢＥ−（ＳＩＤ）２，Ｂ３Ｂ−ＲＸＲ−ＬＬＬ−ＢＥ−（ＳＩＤ）２；
【００５５】
ＲＸＲ、Ｂ３Ｃ２および抑制ドメインを用いる遺伝子スイッチ
Ｂ３Ｃ２−ＲＸＲ−Ｌ−ＤＥ−（ＫＲＡＢ−Ａ）２，Ｂ３Ｃ２−ＲＸＲ−ＬＬ−ＤＥ−（ＫＲＡＢ−Ａ）２，Ｂ３Ｃ２−ＲＸＲ−ＬＬＬ−ＤＥ−（ＫＲＡＢ−Ａ）２，Ｂ３Ｃ２−ＲＸＲ−Ｌ−ＢＥ−（ＫＲＡＢ−Ａ）２，Ｂ３Ｃ２−ＲＸＲ−ＬＬ−ＢＥ−（ＫＲＡＢ−Ａ）２，Ｂ３Ｃ２−ＲＸＲ−ＬＬＬ−ＢＥ−（ＫＲＡＢ−Ａ）２，Ｂ３Ｃ２−ＲＸＲ−Ｌ−ＤＥ−（ＫＲＡＢ−Ａ）２，Ｂ３Ｃ２−ＲＸＲ−ＬＬ−ＤＥ−（ＫＲＡＢ−Ａ）２，Ｂ３Ｃ２−ＲＸＲ−ＬＬＬ−ＤＥ−（ＫＲＡＢ−Ａ）２，Ｂ３Ｃ２−ＲＸＲ−Ｌ−ＢＥ−（ＫＲＡＢ−Ａ）２，Ｂ３Ｃ２Ｂ−ＲＸＲ−ＬＬ−ＢＥ−（ＫＲＡＢ−Ａ）２，Ｂ３Ｃ２−ＲＸＲ−ＬＬＬ−ＢＥ−（ＫＲＡＢ−Ａ）２，Ｂ３Ｃ２−ＲＸＲ−Ｌ−ＤＥ−（ＳＩＤ）２，Ｂ３Ｃ２−ＲＸＲ−ＬＬ−ＤＥ−（ＳＩＤ）２，Ｂ３Ｃ２−ＲＸＲ−ＬＬＬ−ＤＥ−（ＳＩＤ）２，Ｂ３Ｃ２−ＲＸＲ−Ｌ−ＢＥ−（ＳＩＤ）２，Ｂ３Ｃ２−ＲＸＲ−ＬＬ−ＢＥ−（ＳＩＤ）２，Ｂ３Ｃ２−ＲＸＲ−ＬＬＬ−ＢＥ−（ＳＩＤ）２，Ｂ３Ｃ２−ＲＸＲ−Ｌ−ＤＥ−（ＳＩＤ）２，Ｂ３Ｃ２−ＲＸＲ−ＬＬ−ＤＥ−（ＳＩＤ）２，Ｂ３Ｃ２−ＲＸＲ−ＬＬＬ−ＤＥ−（ＳＩＤ）２，Ｂ３Ｃ２−ＲＸＲ−Ｌ−ＢＥ−（ＳＩＤ）２，Ｂ３Ｃ２Ｂ−ＲＸＲＬＬ−ＢＥ−（ＳＩＤ）２，Ｂ３Ｃ２−ＲＸＲ−ＬＬＬ−ＢＥ−（ＳＩＤ）２
【００５６】
ＰＲ、Ｅ２Ｃおよび活性化ドメインを用いる遺伝子スイッチ
Ｅ２Ｃ−ＰＲ−Ｌ−ＰＲ−ＶＰ６４，Ｅ２Ｃ−ＰＲ−ＬＬ−ＰＲ−ＶＰ６４，Ｅ２Ｃ−ＰＲ−ＬＬＬ−ＰＲ−ＶＰ６４，Ｅ２Ｃ−ＰＲ−Ｌ−ＰＲ−ＶＰ６４，Ｅ２Ｃ−ＰＲ−ＬＬ−ＰＲ−ＶＰ６４，Ｅ２Ｃ−ＰＲ−ＬＬＬ−ＰＲ−ＶＰ６４，Ｅ２Ｃ−ＰＲ−Ｌ−ＰＲ−ＶＰ１６，Ｅ２Ｃ−ＰＲ−ＬＬ−ＰＲ−ＶＰ１６，Ｅ２Ｃ−ＰＲ−ＬＬＬ−ＰＲ−ＶＰ１６，Ｅ２Ｃ−ＰＲ−Ｌ−ＰＲ−ＶＰ１６，Ｅ２Ｃ−ＰＲ−ＬＬ−ＰＲ−ＶＰ１６，Ｅ２Ｃ−ＰＲ−ＬＬＬ−ＰＲ−ＶＰ１６；
【００５７】
ＰＲ、２Ｃ７および活性化ドメインを用いる遺伝子スイッチ
２Ｃ７−ＰＲ−Ｌ−ＰＲ−ＶＰ６４，２Ｃ７−ＰＲ−ＬＬ−ＰＲ−ＶＰ６４，２Ｃ７−ＰＲ−ＬＬＬ−ＰＲ−ＶＰ６４，２Ｃ７−ＰＲ−Ｌ−ＰＲ−ＶＰ６４，２Ｃ７−ＰＲ−ＬＬ−ＰＲ−ＶＰ６４，２Ｃ７−ＰＲ−ＬＬＬ−ＰＲ−ＶＰ６４，２Ｃ７−ＰＲ−Ｌ−ＰＲ−ＶＰ１６，２Ｃ７−ＰＲ−ＬＬ−ＰＲ−ＶＰ１６，２Ｃ７−ＰＲ−ＬＬＬ−ＰＲ−ＶＰ１６，２Ｃ７−ＰＲ−Ｌ−ＰＲ−ＶＰ１６，２Ｃ７−ＰＲ−ＬＬ−ＰＲ−ＶＰ１６，Ｅ２Ｃ−ＰＲ−ＬＬＬ−ＰＲ−ＶＰ１６；
【００５８】
ＰＲ、Ｂ３Ｂおよび活性化ドメインを用いる遺伝子スイッチ
Ｂ３Ｂ−ＰＲ−Ｌ−ＰＲ−ＶＰ６４，Ｂ３Ｂ−ＰＲ−ＬＬ−ＰＲ−ＶＰ６４，Ｂ３Ｂ−ＰＲ−ＬＬＬ−ＰＲ−ＶＰ６４，Ｂ３Ｂ７−ＰＲ−Ｌ−ＰＲ−ＶＰ６４，Ｂ３Ｂ７−ＰＲ−ＬＬ−ＰＲ−ＶＰ６４，Ｂ３Ｂ−ＰＲ−ＬＬＬ−ＰＲ−ＶＰ６４，Ｂ３Ｂ−ＰＲ−Ｌ−ＰＲ−ＶＰ１６，Ｂ３Ｂ−ＰＲ−ＬＬ−ＰＲ−ＶＰ１６，Ｂ３Ｂ−ＰＲ−ＬＬＬ−ＰＲ−ＶＰ１６，Ｂ３Ｂ−ＰＲ−Ｌ−ＰＲ−ＶＰ１６，Ｂ３Ｂ−ＰＲ−ＬＬ−ＰＲ−ＶＰ１６，Ｂ３Ｂ−ＰＲ−ＬＬＬ−ＰＲ−ＶＰ１６；
【００５９】
ＰＲ、Ｂ３Ｃ２および活性化ドメインを用いる遺伝子スイッチ
Ｂ３Ｃ２−ＰＲ−Ｌ−ＰＲ−ＶＰ６４，Ｂ３Ｃ２−ＰＲ−ＬＬ−ＰＲ−ＶＰ６４，Ｂ３Ｃ２−ＰＲ−ＬＬＬ−ＰＲ−ＶＰ６４，Ｂ３Ｃ２−ＰＲ−Ｌ−ＰＲ−ＶＰ６４，Ｂ３Ｃ２−ＰＲ−ＬＬ−ＰＲ−ＶＰ６４，Ｂ３Ｃ２−ＰＲ−ＬＬＬ−ＰＲ−ＶＰ６４，Ｂ３Ｃ２−ＰＲ−Ｌ−ＰＲ−ＶＰ１６，Ｂ３Ｃ２−ＰＲ−ＬＬ−ＰＲ−ＶＰ１６，Ｂ３Ｃ２−ＰＲ−ＬＬＬ−ＰＲ−ＶＰ１６，Ｂ３Ｃ２−ＰＲ−Ｌ−ＰＲ−ＶＰ１６，Ｂ３Ｃ２Ｂ−ＰＲ−ＬＬ−ＰＲ−ＶＰ１６，Ｂ３Ｃ２−ＰＲ−ＬＬＬ−ＰＲ−ＶＰ１６；
【００６０】
ＰＲ、Ｅ２Ｃおよび抑制ドメインを用いる遺伝子スイッチ
Ｅ２Ｃ−ＰＲ−Ｌ−ＰＲ−（ＫＲＡＢ−Ａ）２，Ｅ２Ｃ−ＰＲ−ＬＬ−ＰＲ−（ＫＲＡＢ−Ａ）２，Ｅ２Ｃ−ＰＲ−ＬＬＬ−ＰＲ−（ＫＲＡＢ−Ａ）２，Ｅ２Ｃ−ＰＲ−Ｌ−ＰＲ−（ＫＲＡＢ−Ａ）２，Ｅ２Ｃ−ＰＲ−ＬＬ−ＰＲ−（ＫＲＡＢ−Ａ）２，Ｅ２Ｃ−ＰＲ−ＬＬＬ−ＰＲ−（ＫＲＡＢ−Ａ）２，Ｅ２Ｃ−ＰＲ−Ｌ−ＰＲ−（ＫＲＡＢ−Ａ）２，Ｅ２Ｃ−ＰＲ−ＬＬ−ＰＲ（ＫＲＡＢ−Ａ）２，Ｅ２Ｃ−ＰＲ−ＬＬＬ−ＰＲ−（ＫＲＡＢ−Ａ）２，Ｅ２Ｃ−ＰＲ−Ｌ−ＰＲ−（ＫＲＡＢ−Ａ）２，Ｅ２Ｃ−ＰＲ−ＬＬ−ＰＲ−（ＫＲＡＢ−Ａ）２，Ｅ２Ｃ−ＰＲ−ＬＬＬ−ＰＲ−（ＫＲＡＢ−Ａ）２，Ｅ２Ｃ−ＰＲ−Ｌ−ＰＲ−（ＳＩＤ）２，Ｅ２Ｃ−ＰＲ−ＬＬ−ＰＲ−（ＳＩＤ）２，Ｅ２Ｃ−ＰＲ−ＬＬＬ−ＰＲ−（ＳＩＤ）２，Ｅ２Ｃ−ＰＲ−Ｌ−ＰＲ−（ＳＩＤ）２，Ｅ２ＣＰＲ−ＬＬ−ＰＲ−（ＳＩＤ）２，Ｅ２Ｃ−ＰＲ−ＬＬＬ−ＰＲ−（ＳＩＤ）２，Ｅ２Ｃ−ＰＲ−Ｌ−ＰＲ−（ＳＩＤ）２，Ｅ２Ｃ−ＰＲＬＬ−ＰＲ−（ＳＩＤ）２，Ｅ２Ｃ−ＰＲ−ＬＬＬ−ＰＲ−（ＳＩＤ）２，Ｅ２Ｃ−ＰＲ−Ｌ−ＰＲ−（ＳＩＤ）２，Ｅ２Ｃ−ＰＲ−ＬＬＰＲ−（ＳＩＤ）２，Ｅ２Ｃ−ＰＲ−ＬＬＬ−ＰＲ−（ＳＩＤ）２；
【００６１】
ＰＲ、２Ｃ７および抑制ドメインを用いる遺伝子スイッチ
２Ｃ７−ＰＲ−Ｌ−ＰＲ−（ＫＲＡＢ−Ａ）２，２Ｃ７−ＰＲ−ＬＬ−ＰＲ−（ＫＲＡＢ−Ａ）２，２Ｃ７−ＰＲ−ＬＬＬＰＲ−（ＫＲＡＢ−Ａ）２，２Ｃ７−ＰＲ−Ｌ−ＰＲ−（ＫＲＡＢ−Ａ）２，２Ｃ７−ＰＲ−ＬＬ−ＰＲ−（ＫＲＡＢ−Ａ）２，２Ｃ７−ＰＲ−ＬＬＬ−ＰＲ−（ＫＲＡＢ−Ａ）２，２Ｃ７−ＰＲ−Ｌ−ＰＲ−（ＫＲＡＢ−Ａ）２，２Ｃ７−ＰＲ−ＬＬ−ＰＲ−（ＫＲＡＢ−Ａ）２，２Ｃ７−ＰＲ−ＬＬＬ−ＰＲ−（ＫＲＡＢ−Ａ）２，２Ｃ７−ＰＲ−Ｌ−ＰＲ−（ＫＲＡＢ−Ａ）２，２Ｃ７−ＰＲ−ＬＬ−ＰＲ−（ＫＲＡＢ−Ａ）２，Ｅ２Ｃ−ＰＲ−ＬＬＬ−ＰＲ−（ＫＲＡＢ−Ａ）２，２Ｃ７−ＰＲ−Ｌ−ＰＲ−（ＳＩＤ）２，２Ｃ７ＰＲ−ＬＬ−ＰＲ−（ＳＩＤ）２，２Ｃ７−ＰＲ−ＬＬＬ−ＰＲ−（ＳＩＤ）２，２Ｃ７−ＰＲ−Ｌ−ＰＲ−（ＳＩＤ）２，２Ｃ７−ＰＲ−ＬＬＰＲ−（ＳＢＤ）２，２Ｃ７−ＰＲ−ＬＬＬ−ＰＲ−（ＳＢＤ）２，２Ｃ７−ＰＲ−Ｌ−ＰＲ−（ＳＩＤ）２，２Ｃ７−ＰＲ−ＬＬ−ＰＲ−（ＳＩＤ）２，２Ｃ７−ＰＲ−ＬＬＬ−ＰＲ−（ＳＩＤ）２，２Ｃ７−ＰＲ−Ｌ−ＰＲ−（ＳＩＤ）２，２Ｃ７−ＰＲ−ＬＬ−ＰＲ−（ＳＩＤ）２，Ｅ２Ｃ−ＰＲ−ＬＬＬ−ＰＲ−（ＳＩＤ）２，ｎ；
【００６２】
ＰＲ、Ｂ３Ｂおよび抑制ドメインを用いる遺伝子スイッチ
Ｂ３Ｂ−ＰＲ−Ｌ−ＰＲ−（ＫＲＡＢ−Ａ）２，Ｂ３Ｂ−ＰＲ−ＬＬ−ＰＲ−（ＫＲＡＢ−Ａ）２，Ｂ３Ｂ−ＰＲ−ＬＬＬ−ＰＲ−（ＫＲＡＢ−Ａ）２，Ｂ３Ｂ７−ＰＲ−Ｌ−ＰＲ−（ＫＲＡＢ−Ａ）２，Ｂ３Ｂ７−ＰＲ−ＬＬ−ＰＲ−（ＫＲＡＢ−Ａ）２，Ｂ３Ｂ−ＰＲ−ＬＬＬ−ＰＲ−（ＫＲＡＢ−Ａ）２，Ｂ３Ｂ−ＰＲ−Ｌ−ＰＲ−（ＫＲＡＢ−Ａ）２，Ｂ３Ｂ−ＰＲ−ＬＬ−ＰＲ−（ＫＲＡＢ−Ａ）２，Ｂ３Ｂ−ＰＲ−ＬＬＬ−ＰＲ−（ＫＲＡＢ−Ａ）２，Ｂ３Ｂ−ＰＲ−Ｌ−ＰＲ−（ＫＲＡＢ−Ａ）２，Ｂ３ＢＰＲ−ＬＬ−ＰＲ−（ＫＲＡＢ−Ａ）２，Ｂ３Ｂ−ＰＲ−ＬＬＬ−ＰＲ−（ＫＲＡＢ−Ａ）２，Ｂ３Ｂ−ＰＲ−Ｌ−ＰＲ−（ＳＩＤ）２，Ｂ３Ｂ−ＰＲ−ＬＬ−ＰＲ−（ＳＩＤ）２，Ｂ３Ｂ−ＰＲ−ＬＬＬ−ＰＲ−（ＳＩＤ）２，Ｂ３Ｂ７−ＰＲ−Ｌ−ＰＲ−（ＳＩＤ）２，Ｂ３Ｂ７−ＰＲ−ＬＬ−ＰＲ−（ＳＩＤ）２，Ｂ３Ｂ−ＰＲ−ＬＬＬ−ＰＲ−（ＳＩＤ）２，Ｂ３Ｂ−ＰＲ−Ｌ−ＰＲ−（ＳＩＤ）２，Ｂ３Ｂ−ＰＲＬＬ−ＰＲ−（ＳＩＤ）２，Ｂ３Ｂ−ＰＲ−ＬＬＬ−ＰＲ−（ＳＩＤ）２，Ｂ３Ｂ−ＰＲ−Ｌ−ＰＲ−（ＳＨ））２，Ｂ３Ｂ−ＰＲ−ＬＬＰＲ−（ＳＩＤ）２，Ｂ３Ｂ−ＰＲ−ＬＬＬ−ＰＲ−（ＳＩＤ）２；
【００６３】
ＰＲ、Ｂ３Ｃ２および抑制ドメインを用いる遺伝子スイッチ
Ｂ３Ｃ２−ＰＲ−Ｌ−ＰＲ−（ＫＲＡＢ−Ａ）２，Ｂ３Ｃ２−ＰＲ−ＬＬ−ＰＲ−（ＫＲＡＢ−Ａ）２，Ｂ３Ｃ２−ＰＲ−ＬＬＬ−ＰＲ−（ＫＲＡＢ−Ａ）２，Ｂ３Ｃ２−ＰＲ−Ｌ−ＰＲ−（ＫＲＡＢ−Ａ）２，Ｂ３Ｃ２−ＰＲ−ＬＬ−ＰＲ−（ＫＲＡＢ−Ａ）２，Ｂ３Ｃ２−ＰＲ−ＬＬＬ−ＰＲ−（ＫＲＡＢ−Ａ）２，Ｂ３Ｃ２−ＰＲ−Ｌ−ＰＲ−（ＫＲＡＢ−Ａ）２，Ｂ３Ｃ２−ＰＲ−ＬＬ−ＰＲ−（ＫＲＡＢ−Ａ）２，Ｂ３Ｃ２−ＰＲ−ＬＬＬ−ＰＲ−（ＫＲＡＢ−Ａ）２，Ｂ３Ｃ２−ＰＲ−Ｌ−ＰＲ−（ＫＲＡＢ−Ａ）２，Ｂ３Ｃ２Ｂ−ＰＲ−ＬＬ−ＰＲ−（ＫＲＡＢ−Ａ）２，Ｂ３Ｃ２−ＰＲ−ＬＬＬ−ＰＲ−（ＫＲＡＢ−Ａ）２，Ｂ３Ｃ２−ＰＲ−Ｌ−ＰＲ−（ＳＩＤ）２，Ｂ３Ｃ２−ＰＲ−ＬＬ−ＰＲ−（ＳＩＤ）２，Ｂ３Ｃ２−ＰＲ−ＬＬＬ−ＰＲ−（ＳＩＤ）２，Ｂ３Ｃ２ＰＲ−Ｌ−ＰＲ−（Ｓ１Ｄ）２，Ｂ３Ｃ２−ＰＲ−ＬＬ−ＰＲ−（ＳＩＤ）２，Ｂ３Ｃ２−ＰＲ−ＬＬＬ−ＰＲ−（ＳＩＤ）２，Ｂ３Ｃ２ＰＲ−Ｌ−ＰＲ−（ＳＩＤ）２，Ｂ３Ｃ２−ＰＲ−ＬＬ−ＰＲ−（ＳＩＤ）２，Ｂ３Ｃ２−ＰＲ−ＬＬＬ−ＰＲ−（ＳＩＤ）２，Ｂ３Ｃ２−ＰＲ−Ｌ−ＰＲ−（ＳＩＤ）２，Ｂ３Ｃ２Ｂ−ＰＲ−ＬＬ−ＰＲ−（ＳＩＤ）２，Ｂ３Ｃ２−ＰＲ−ＬＬＬ−ＰＲ−（ＳＩＤ）２；
【００６４】
ＥＲ、Ｅ２Ｃおよび活性化ドメインを用いる遺伝子スイッチ
Ｅ２Ｃ−ＥＲ−Ｌ−ＥＲ−ＶＰ６４，Ｅ２Ｃ−ＥＲ−ＬＬ−ＥＲ−ＶＰ６４，Ｅ２Ｃ−ＥＲ−ＬＬＬ−ＥＲ−ＶＰ６４，Ｅ２Ｃ−ＥＲ−Ｌ−ＥＲ−ＶＰ６４，Ｅ２Ｃ−ＥＲ−ＬＬ−ＥＲ−ＶＰ６４，Ｅ２Ｃ−ＥＲ−ＬＬＬ−ＥＲ−ＶＰ６４，Ｅ２Ｃ−ＥＲ−Ｌ−ＥＲ−ＶＰ１６，Ｅ２Ｃ−ＥＲ−ＬＬ−ＥＲ−ＶＰ１６，Ｅ２Ｃ−ＥＲ−ＬＬＬ−ＥＲ−ＶＰ１６，Ｅ２Ｃ−ＥＲ−Ｌ−ＥＲ−ＶＰ１６，Ｅ２Ｃ−ＥＲ−ＬＬ−ＥＲ−ＶＰ１６，Ｅ２Ｃ−ＥＲ−ＬＬＬ−ＥＲ−ＶＰ１６；
【００６５】
ＥＲ、２Ｃ７および活性化ドメインを用いる遺伝子スイッチ
２Ｃ７−ＥＲ−Ｌ−ＥＲ−ＶＰ６４，２Ｃ７−ＥＲ−ＬＬ−ＥＲ−ＶＰ６４，２Ｃ７−ＥＲ−ＬＬＬ−ＥＲ−ＶＰ６４，２Ｃ７−ＥＲ−Ｌ−ＥＲ−ＶＰ６４，２Ｃ７−ＥＲ−ＬＬ−ＥＲ−ＶＰ６４，２Ｃ７−ＥＲ−ＬＬＬ−ＥＲ−ＶＰ６４，２Ｃ７−ＥＲ−Ｌ−ＥＲ−ＶＰ１６，２Ｃ７−ＥＲ−ＬＬ−ＥＲ−ＶＰ１６，２Ｃ７−ＥＲ−ＬＬＬ−ＥＲ−ＶＰ１６，２Ｃ７−ＥＲ−Ｌ−ＥＲ−ＶＰ１６，２Ｃ７−ＥＲ−ＬＬ−ＥＲ−ＶＰ１６，Ｅ２Ｃ−ＥＲ−ＬＬＬ−ＥＲ−ＶＰ１６；
【００６６】
ＥＲ、Ｂ３Ｂおよび活性化ドメインを用いる遺伝子スイッチ
Ｂ３Ｂ−ＥＲ−Ｌ−ＥＲ−ＶＰ６４，Ｂ３Ｂ−ＥＲ−ＬＬ−ＥＲ−ＶＰ６４，Ｂ３Ｂ−ＥＲ−ＬＬＬ−ＥＲ−ＶＰ６４，Ｂ３Ｂ７−ＥＲ−Ｌ−ＥＲ−ＶＰ６４，Ｂ３Ｂ７−ＥＲ−ＬＬ−ＥＲ−ＶＰ６４，Ｂ３Ｂ−ＥＲ−ＬＬＬ−ＥＲ−ＶＰ６４，Ｂ３ＢＥＲ−Ｌ−ＥＲ−ＶＰ１６，Ｂ３Ｂ−ＥＲ−ＬＬ−ＥＲ−ＶＰ１６，Ｂ３Ｂ−ＥＲ−ＬＬＬ−ＥＲ−ＶＰ１６，Ｂ３Ｂ−ＥＲ−Ｌ−ＥＲ−ＶＰ１６，Ｂ３Ｂ−ＥＲ−ＬＬ−ＥＲ−ＶＰ１６，Ｂ３Ｂ−ＥＲ−ＬＬＬ−ＥＲ−ＶＰ１６；
【００６７】
ＥＲ、Ｂ３Ｃ２および活性化ドメインを用いる遺伝子スイッチ
Ｂ３Ｃ２−ＥＲ−Ｌ−ＥＲ−ＶＰ６４，Ｂ３Ｃ２−ＥＲ−ＬＬ−ＥＲ−ＶＰ６４，Ｂ３Ｃ２−ＥＲ−ＬＬＬ−ＥＲ−ＶＰ６４，Ｂ３Ｃ２−ＥＲ−Ｌ−ＥＲ−ＶＰ６４，Ｂ３Ｃ２−ＥＲ−ＬＬ−ＥＲ−ＶＰ６４，Ｂ３Ｃ２−ＥＲ−ＬＬＬ−ＥＲ−ＶＰ６４，Ｂ３Ｃ２−ＥＲ−Ｌ−ＥＲ−ＶＰ１６，Ｂ３Ｃ２−ＥＲ−ＬＬ−ＥＲ−ＶＰ１６，Ｂ３Ｃ２−ＥＲ−ＬＬＬ−ＥＲ−ＶＰ１６，Ｂ３Ｃ２−ＥＲ−Ｌ−ＥＲ−ＶＰ１６，Ｂ３Ｃ２Ｂ−ＥＲ−ＬＬ−ＥＲ−ＶＰ１６，Ｂ３Ｃ２−ＥＲ−ＬＬＬ−ＥＲ−ＶＰ１６；
【００６８】
ＥＲ、Ｅ２Ｃおよび抑制ドメインを用いる遺伝子スイッチ
Ｅ２Ｃ−ＥＲ−Ｌ−ＥＲ−（ＫＲＡＢ−Ａ）２，Ｅ２Ｃ−ＥＲ−ＬＬ−ＥＲ−（ＫＲＡＢ−Ａ）２，Ｅ２Ｃ−ＥＲ−ＬＬＬ−ＥＲ−（ＫＲＡＢ−Ａ）２，Ｅ２Ｃ−ＥＲ−Ｌ−ＥＲ−（ＫＲＡＢ−Ａ）２，Ｅ２Ｃ−ＥＲ−ＬＬ−ＥＲ−（ＫＲＡＢ−Ａ）２，Ｅ２Ｃ−ＥＲ−ＬＬＬ−ＥＲ−（ＫＲＡＢ−Ａ）２，Ｅ２Ｃ−ＥＲ−Ｌ−ＥＲ−（ＫＲＡＢ−Ａ）２，Ｅ２Ｃ−ＥＲ−ＬＬ−ＥＲ−（ＫＲＡＢ−Ａ）２，Ｅ２Ｃ−ＥＲ−ＬＬＬ−ＥＲ−（ＫＲＡＢ−Ａ）２，Ｅ２Ｃ−ＥＲ−Ｌ−ＥＲ−（ＫＲＡＢ−Ａ）２，Ｅ２Ｃ−ＥＲ−ＬＬ−ＥＲ−（ＫＲＡＢ−Ａ）２，Ｅ２Ｃ−ＥＲ−ＬＬＬ−ＥＲ−（ＫＲＡＢ−Ａ）２，Ｅ２Ｃ−ＥＲ−Ｌ−ＥＲ（ＳＩＤ）２，Ｅ２Ｃ−ＥＲ−ＬＬ−ＥＲ−（ＳＩＤ）２，Ｅ２Ｃ−ＥＲ−ＬＬＬ−ＥＲ−（ＳＩＤ）２，Ｅ２Ｃ−ＥＲ−Ｌ−ＥＲ（ＳＩＤ）２，Ｅ２Ｃ−ＥＲ−ＬＬ−ＥＲ−（ＳＩＤ）２，Ｅ２Ｃ−ＥＲ−ＬＬＬ−ＥＲ−（ＳＩＤ）２，Ｅ２Ｃ−ＥＲ−Ｌ−ＥＲ（ＳＩＤ）２，Ｅ２Ｃ−ＥＲ−ＬＬ−ＥＲ−（ＳＩＤ）２，Ｅ２Ｃ−ＥＲ−ＬＬＬ−ＥＲ−（ＳＩＤ）２，Ｅ２Ｃ−ＥＲ−Ｌ−ＥＲ（ＳＩＤ）２，Ｅ２Ｃ−ＥＲ−ＬＬ−ＥＲ−（ＳＩＤ）２，Ｅ２Ｃ−ＥＲ−ＬＬＬ−ＥＲ−（ＳＩＤ）２；
【００６９】
ＥＲ、２Ｃ７および抑制ドメインを用いる遺伝子スイッチ
２Ｃ７−ＥＲ−Ｌ−ＥＲ−（ＫＲＡＢ−Ａ）２，２Ｃ７−ＥＲ−ＬＬ−ＥＲ−（ＫＲＡＢ−Ａ）２，２Ｃ７−ＥＲ−ＬＬＬＥＲ−（ＫＲＡＢ−Ａ）２，２Ｃ７−ＥＲ−Ｌ−ＥＲ−（ＫＲＡＢ−Ａ）２，２Ｃ７−ＥＲ−ＬＬ−ＥＲ−（ＫＲＡＢ−Ａ）２，２Ｃ７−ＥＲ−ＬＬＬ−ＥＲ−（ＫＲＡＢ−Ａ）２，２Ｃ７−ＥＲ−Ｌ−ＥＲ−（ＫＲＡＢ−Ａ）２，２Ｃ７−ＥＲ−ＬＬ−ＥＲ−（ＫＲＡＢ−Ａ）２，２Ｃ７−ＥＲ−ＬＬＬ−ＥＲ−（ＫＲＡＢ−Ａ）２，２Ｃ７−ＥＲ−Ｌ−ＥＲ−（ＫＲＡＢ−Ａ）２，２Ｃ７ＥＲ−ＬＬ−ＥＲ−（ＫＲＡＢ−Ａ）２，Ｅ２Ｃ−ＥＲ−ＬＬＬ−ＥＲ−（ＫＲＡＢ−Ａ）２，２Ｃ７−ＥＲ−Ｌ−ＥＲ−（ＳＩＤ）２，２Ｃ７−ＥＲ−ＬＬ−ＥＲ−（ＳＩＤ）２，２Ｃ７−ＥＲ−ＬＬＬ−ＥＲ−（ＳＩＤ）２，２Ｃ７−ＥＲ−Ｌ−ＥＲ−（ＳＩＤ）２，２Ｃ７ＥＲ−ＬＬ−ＥＲ−（ＳＩＤ）２，２Ｃ７−ＥＲ−ＬＬＬ−ＥＲ−（ＳＩＤ）２，２Ｃ７−ＥＲ−Ｌ−ＥＲ−（ＳＩＤ）２，２Ｃ７−ＥＲＬＬ−ＥＲ−（Ｓ１Ｄ）２，２Ｃ７−ＥＲ−ＬＬＬ−ＥＲ−（ＳＩＤ）２，２Ｃ７−ＥＲ−Ｌ−ＥＲ−（ＳＩＤ）２，２Ｃ７−ＥＲ−ＬＬ−ＥＲ−（ＳＩＤ）２，Ｅ２Ｃ−ＥＲ−ＬＬＬ−ＥＲ−（ＳＩＤ）２，ｎ；
【００７０】
ＥＲ、Ｂ３Ｂおよび抑制ドメインを用いる遺伝子スイッチ
Ｂ３Ｂ−ＥＲ−Ｌ−ＥＲ−（ＫＲＡＢ−Ａ）２，Ｂ３Ｂ−ＥＲ−ＬＬ−ＥＲ−（ＫＲＡＢ−Ａ）２，Ｂ３Ｂ−ＥＲ−ＬＬＬ−ＥＲ−（ＫＲＡＢ−Ａ）２，Ｂ３Ｂ７−ＥＲ−Ｌ−ＥＲ−（ＫＲＡＢ−Ａ）２，Ｂ３Ｂ７−ＥＲ−ＬＬ−ＥＲ−（ＫＲＡＢ−Ａ）２，Ｂ３Ｂ−ＥＲ−ＬＬＬ−ＥＲ−（ＫＲＡＢ−Ａ）２，Ｂ３Ｂ−ＥＲ−Ｌ−ＥＲ−（ＫＲＡＢ−Ａ）２，Ｂ３Ｂ−ＥＲ−ＬＬ−ＥＲ−（ＫＲＡＢ−Ａ）２，Ｂ３Ｂ−ＥＲ−ＬＬＬ−ＥＲ−（ＫＲＡＢ−Ａ）２，Ｂ３Ｂ−ＥＲ−Ｌ−ＥＲ−（ＫＲＡＢ−Ａ）２，Ｂ３Ｂ−ＥＲ−ＬＬ−ＥＲ−（ＫＲＡＢ−Ａ）２，Ｂ３Ｂ−ＥＲ−ＬＬＬ−ＥＲ−（ＫＲＡＢ−Ａ）２，Ｂ３Ｂ−ＥＲ−Ｌ−ＥＲ（ＳＩＤ）２，Ｂ３Ｂ−ＥＲ−ＬＬ−ＥＲ−（ＳＩＤ）２，Ｂ３Ｂ−ＥＲ−ＬＬＬ−ＥＲ−（ＳＩＤ）２，Ｂ３Ｂ７−ＥＲ−Ｌ−ＥＲ（ＳＩＤ）２，Ｂ３Ｂ７−ＥＲ−ＬＬ−ＥＲ−（ＳＩＤ）２，Ｂ３Ｂ−ＥＲ−ＬＬＬ−ＥＲ−（ＳＩＤ）２，Ｂ３Ｂ−ＥＲ−Ｌ−ＥＲ（ＳＩＤ）２，Ｂ３Ｂ−ＥＲ−ＬＬ−ＥＲ−（ＳＩＤ）２，Ｂ３Ｂ−ＥＲ−ＬＬＬ−ＥＲ−（ＳＩＤ）２，Ｂ３Ｂ−ＥＲ−Ｌ−ＥＲ（ＳＩＤ）２，Ｂ３Ｂ−ＥＲ−ＬＬ−ＥＲ−（ＳＩＤ）２，Ｂ３Ｂ−ＥＲ−ＬＬＬ−ＥＲ−（ＳＩＤ）２；
【００７１】
ＥＲ、Ｂ３Ｃ２および抑制ドメインを用いる遺伝子スイッチ
Ｂ３Ｃ２−ＥＲ−Ｌ−ＥＲ−（ＫＲＡＢ−Ａ）２，Ｂ３Ｃ２−ＥＲ−ＬＬ−ＥＲ−（ＫＲＡＢ−Ａ）２，Ｂ３Ｃ２−ＥＲ−ＬＬＬ−ＥＲ−（ＫＲＡＢ−Ａ）２，Ｂ３Ｃ２−ＥＲ−Ｌ−ＥＲ−（ＫＲＡＢ−Ａ）２，Ｂ３Ｃ２−ＥＲ−ＬＬ−ＥＲ−（ＫＲＡＢ−Ａ）２，Ｂ３Ｃ２−ＥＲ−ＬＬＬ−ＥＲ−（ＫＲＡＢ−Ａ）２，Ｂ３Ｃ２−ＥＲ−Ｌ−ＥＲ−（ＫＲＡＢ−Ａ）２，Ｂ３Ｃ２−ＥＲ−ＬＬ−ＥＲ−（ＫＲＡＢ−Ａ）２，Ｂ３Ｃ２−ＥＲ−ＬＬＬ−ＥＲ−（ＫＲＡＢ−Ａ）２，Ｂ３Ｃ２−ＥＲ−Ｌ−ＥＲ−（ＫＲＡＢ−Ａ）２，Ｂ３Ｃ２Ｂ−ＥＲ−ＬＬ−ＥＲ−（ＫＲＡＢ−Ａ）２，Ｂ３Ｃ２−ＥＲ−ＬＬＬ−ＥＲ−（ＫＲＡＢ−Ａ）２，Ｂ３Ｃ２ＥＲ−Ｌ−ＥＲ−（ＳＩ）２，Ｂ３Ｃ２−ＥＲ−ＬＬ−ＥＲ−（ＳＩＤ）２，Ｂ３Ｃ２−ＥＲ−ＬＬＬ−ＥＲ−（ＳＩＤ）２，Ｂ３Ｃ２ＥＲ−Ｌ−ＥＲ−（ＳＩＤ）２，Ｂ３Ｃ２−ＥＲ−ＬＬ−ＥＲ−（ＳＩＤ）２，Ｂ３Ｃ２−ＥＲ−ＬＬＬ−ＥＲ−（ＳＩＤ）２，Ｂ３Ｃ２ＥＲ−Ｌ−ＥＲ−（ＳＩ）２，Ｂ３Ｃ２−ＥＲ−ＬＬ−ＥＲ−（ＳＩＤ）２，Ｂ３Ｃ２−ＥＲ−ＬＬＬ−ＥＲ−（ＳＩＤ）２，Ｂ３Ｃ２ＥＲ−Ｌ−ＥＲ−（ＳＩ）２，Ｂ３Ｃ２Ｂ−ＥＲ−ＬＬ−ＥＲ−（ＳＩＤ）２，Ｂ３Ｃ２−ＥＲ−ＬＬＬ−ＥＲ−（ＳＩＤ）２。
図９は、ポリペプチドＥ２Ｃ−ＥＲ−Ｌ−ＥＲ−ＶＰ６４のヌクレオチド（配列番号３９）およびアミノ酸残基配列（配列番号４０）を示す。図１０は、ポリペプチドＥ２Ｃ−ＥＲ−ＬＬ−ＥＲ−ＶＰ６４のヌクレオチド（配列番号４１）およびアミノ酸残基配列（配列番号４２）を示す。
【００７２】
ＩＩＩ．ポリヌクレオチド、発現ベクターおよび宿主細胞
関連した態様において、本発明は、この発明のポリペプチド遺伝子スイッチをコード化するポリヌクレオチド、これらのポリヌクレオチドを含む発現ベクター、これらのポリヌクレオチドを含む細胞およびこれらの発現ベクターを含む形質変換細胞、を提供する。遺伝子治療に第一に有用なベクターとしては、ヒトアデノウイルスベクター、アデノ−関連ベクター、マウスもしくはレンチウイルス誘導化レテロウイルス性ベクター、または、リポソーム、ポリマーおよび他のＤＮＡ含有複合体を含む、種々の非−ウイルス性組成物が、非限定的に挙げられる。そのようなベクターシステムを使用して、ベクターシステム次第でインビトロもしくはインビボのどちらかで、遺伝子スイッチを送達することができる。例えばアデノウイルでは、ベクターを静脈内投与して；肺内に、または連結反応もしくは他の方法により一時的に局在化した血管区画内に、直接に導入して、肝臓および他の器官を形質導入することができる。そのようなベクターを構築する方法ならびに説明した発明のための方法および使用法は遺伝子治療の分野における当業者に公知である。
【００７３】
ＩＶ．ヌクレオチド機能を調節する方法
本発明はさらに、遺伝子のような望ましいヌクレオチド配列の発現を調節するプロセスを提供する。このプロセスに従って、標的ヌクレオチド配列を効果的な量の遺伝子スイッチおよびリガンドに露出させるが、ここでは遺伝子スイッチのリガンド結合ドメインは標的ヌクレオチドの一部分に結合し、そしてリガンドは遺伝子スイッチの少なくとも一つのリガンド結合ドメインに結合する。露出はインビトロ、インシツもしくはインビボで行われ得る。用語“効果的な量”とは、ヌクレオチド（例えば、構造的遺伝子もしくはＲＮＡの翻訳）の転写を調節するその量をいう。
【００７４】
用語“調節する”とは、機能の抑制、強化もしくは誘導をいう。例えば、この発明のポリペプチドは、プロモーター内でモチーフに結合することによりプロモーター配列を調整し、それによりプロモーターヌクレオチド配列に機能するように結合した遺伝子の転写を強化するか抑制し得る。これに代えて、調整は遺伝子の阻害を含み得るが、そこではポリペプチドは構造的遺伝子と結合し、そしてＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼが遺伝子を通じて読み取ることを阻止し、かくして遺伝子の転写を阻害する。これに代えて、調整は転写物の翻訳の阻害を含み得る。
【００７５】
遺伝子のプロモーター領域は、典型的には構造的遺伝子について５’にある調節要素を含む。もし遺伝子が活性化されると、転写因子として知られるタンパク質は遺伝子のプロモーター領域に付着する。この集合は、酵素が第二の遺伝子セグメントをＤＮＡからＲＮＡへ転写させ得ることによる“オンスイッチ”に似ている。大抵の場合には、得られたＲＮＡ分子は特異的タンパク質の合成用の鋳型として役立つ；時々ＲＮＡ自身が最終生成物である。
【００７６】
遺伝子発現もしくは転写の調節は、標的遺伝子をこの発明のポリペプチドスイッチに露出させることによるか、もしくは好ましくは、標的遺伝子を含む細胞を遺伝子スイッチをコード化するポリヌクレオチド配列を含む発現ベクターと形質転換させることによるかの両方により、達成させることができる。
以下の実施例はこの発明の特定の実施態様を例示するが、明細書もしくは請求項をいかなる点からも限定するものではない。
【００７７】
実施例１：一般方法
亜鉛フィンガータンパク質の構築．Ｂ３およびＮ１亜鉛フィンガータンパク質の構築には、Ｚｉｆ２６８フィンガー２変異体、ｐｍＧＡＡ、ｐｍＧＡＣ、ｐｍＧＧＡ、ｐｍＧＧＧおよびｐＧＴＡからのＤＮＡ認識へリックスが利用された［Ｓｅｇａｌ，Ｄ．Ｊ．，Ｄｒｅｉｅｒ，Ｂ．，Ｂｅｅｒｌｉ，Ｒ．Ｒ．，ａｎｄＢａｒｂａｓ，Ｃ．Ｆ．，ＩＩＩ（１９９９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９６，２７５８−２７６３］。それぞれの９−ｂｐ標的部位に結合する三フィンガータンパク質を、三フィンガータンパク質Ｓｐ１Ｃのフレームワーク内で適切な認識へリックスを移植させることにより構築した［Ｄｅｓｊａｒｌａｉｓ，Ｊ．Ｒ．，ａｎｄＢｅｒｇ，Ｊ．Ｍ．（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９０，２２５６−２２６０］；二つの三フィンガータンパク質をコード化するＤＮＡフラグメントを、記述のように６個の重複オリゴヌクレオチドから集合させた［Ｂｅｅｒｌｉ，Ｒ．Ｒ．，Ｓｅｇａｌ，Ｄ．Ｊ．，Ｄｒｅｉｅｒ，Ｂ．，ａｎｄＢａｒｂａｓ，Ｃ．Ｆ．，ＩＩＩ（１９９８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９５，１４６２８−１４６３３］。それから、三フィンガータンパク質コード化領域をＳｆｉ１消化経由で細菌の発現ベクターｐＭａｌ−ＣＳＳ内にクローン化した。
【００７８】
タンパク質の精製．亜鉛緩衝液Ａ（ＺＢＡ：１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ、ｐＨ７．５／９０ｍＭ　ＫＣｌ、１ｍＭ　ＭｇＣｌ_２，９０μＭ　ＺｎＣｌ_２）／１％ＢＳＡ／５ｍＭ　ＤＴＴ）をカラム緩衝液として用いた以外は、「タンパク質融合および精製システム」（ＮｅｗＥｎｇｌａｎｄＢｉｏｌａｂｓ）を使用して、マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）融合タンパク質を＞９０％等質性にまで精製した。タンパク質の純度および濃度を、ＢＳＡ標準との比較によりクーマシーブルー−染色１５％ＳＤＡ−ＰＡＧＥゲルから測定した。
【００７９】
ＥＬＩＳＡ分析．９６−ウエルＥＬＩＳＡ平板中に、ストレプタビジン（Ｐｉｅｒｃｅ）０．２μｇをそれぞれのウエルに３７℃１時間で加え、それから水で二回洗浄した。ビオチン化した標的オリゴヌクレオチド（０．０２５μｇ）を同一様式で加えた。ＺＢＡ／３％ＢＳＡをブロッキングのために加えたが、インキュベーションの後でウエルを洗浄しなかった。全ての連続したインキュベーションを室温で行った。トップのウエル中で精製ＭＢＰ融合タンパク質２μｇから出発して、２倍順次希釈液を１ｘ結合緩衝液（ＺＢＡ／１％ＢＳＡ／５ｍＭ　ＤＴＴ／０．１２μｇ／μｌせん断ニシン精液ＤＮＡ）中に加えた。試料を室温で１時間インキュベートしてから、水で１０回洗浄した。ＺＢＡ／１％ＢＳＡ中のマウス抗−結合タンパク質ｍＡｂ（Ｓｉｇｍａ）をウエルに３０分間加えてから、水で１０回洗浄した。アルカリ性ホスファターゼに複合したヒツジ抗−マウスＩｇＧ　ｍＡＢ（Ｓｉｇｍａ）をウエルに３０分間加えてから、水で１０回洗浄した。アルカリ性ホスファターゼ基質（Ｓｉｇｍａ）を加え、そしてＯＤ_４０５をＳＯＦＴｍａｘ２．３５（ＭｏｌｅｃｕｌａｒＤｅｖｉｃｅｓ）で定量した。
【００８０】
ゲル移動度シフトアッセイ．標的オリゴヌクレオチドをそれらの３’末端において［^３２Ｐ］でラベルし、そしてゲルを精製した。タンパク質の３倍順次希釈液１１部を２０μｌの結合反応液（１ｘ結合緩衝液／１０％グリセロール／〜１ｐＭの標的オリゴヌクレオチド）中で室温で３時間インキュベートし、それから０．５ｘＴＢＥ緩衝液中で５％ポリアクリルアミド上で分割した。「ＰｈｏｓｐｈｏｒＩｍａｇｅｒａｎｄＩｍａｇｅＱｕａｎｔＳｏｆｔｗａｒｅ」（ＭｏｌｅｃｕｌａｒＤｙｎａｍｉｃｓ）を使用して、乾燥ゲルの分析を行い、そしてＫ_Ｄをスキャッチャード分析により測定した。
【００８１】
二つの半部位の最適な間隔と配向を決定するためのレポーター構築体．Ｃ７二量体−ＴＡＴＡフラグメントを、ｐ１７ｘＴＡＴＡ−ｌｕｃ（Ｓ．Ｙ．Ｔｓａｉからの寄贈）を鋳型として使用し、Ｃ７二量体−ＴＡＴＡプライマー（直接繰返しについて、５’−ＧＡＧＧＧＴＡＣＣＧＣＧＴＧＧＧＣＧＡ_０−５ＧＣＧＴＧＧＧＣＧＡＧＴＣＧＡＣＴＣＴＡＧＡＧＧＧＴＡＴＡＴＡＡＴＧＧ−３’ （配列番号１）；逆方向繰返しについて、５’−ＧＡＧＧＧＴＡＣＣＧＣＧＴＧＧＧＣＧＡ_０ _５ＣＧＣＣＣＡＣＧＣＡＧＴＣＧＡＣＴＣＴＡＧＡＧＧＧＴＡＴＡＴＡＡＴＧＧ−３’ （配列番号２）；裏返し繰返しについて、５’−ＧＡＧＧＧＴＡＣＣＣＧＣＣＣＡＣＧＣＡｏ−５ＧＣＧＴＧＧＣＧＡＧＴＣＧＡＣＴＣＴＡＧＡＧＧＧＴＡＴＡＴＡＡＴＧＧ−３’ （配列番号３）およびＧＬプライマー２（５’−ＣＴＴＴＡＴＧＴＴＴＴＴＧＧＣＧＴＣＴＴＣＣ−３’ （配列番号４）；Ｐｒｏｍｅｇａ）とのＰＣＲ増幅により生成した。制限エンドヌクレアーゼＫｐｎ１およびＮｃｏ１との消化を経由して、ＰＣＲ生産物をｐＧＬ３−Ｂａｓｉｃ（Ｐｒｏｍｅｇａ）内にクローン化した。
【００８２】
ＲＵ４８６−およびタモキシフェン−誘導性プロモーター構築体．１０ｘＣ７−ＴＡＴＡ、１０ｘＢ３−ＴＡＴＡおよび１０ｘＮ１−ＴＡＴＡフラグメントを二対の相補的オリゴヌクレオチドそれぞれから集合させ、そしてホタルのルシフェラーゼコード化領域の上流で、Ｓａｃ１−Ｘｍａｌ直線化ｐＧＬ３−Ｂａｓｉｃ（Ｐｒｏｍｅｇａ）中にクローン化して、プラスミド１０ｘＣ７−ＴＡＴＡ−ｌｕｃ、１０ｘＢ３−ＴＡＴＡ−ｌｕｃおよび１０ｘＮ１−ＴＡＴＡ−ｌｕｃを創成した。１０ｘＮ１−ＴＡＴＡ−ｌａｃＺレポーター構築体を生成するために、ｌａｃＺコード化領域をｐβｇａｌ−Ｂａｓｉｃ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）から切除し、そしてＨｉｎｄ３−ＢａｍＨ１消化を経由して１０ｘＮ１−ＴＡＴＡ−ｌｕｃのルシフェラーゼコード化領域を置換するために使用した。
【００８３】
ルシフェラーゼおよびβ−ｇａｌレポーターアッセイ．全てのトランスフェクションについて、ヒーラ細胞を２４−ウエル皿中で平板培養し、そして４０〜６０％の密集度において使用した。ルシフェラーゼレポーターアッセイのために、１７５ｎｇのレポータープラスミド（ｐＧＬ３中の構築体もしくは、負のコントロールとして、ｐＧＬ３−Ｂａｓｉｃ）および２５ｎｇのエフェクタープラスミド（ｐｃＤＮＡ３中の亜鉛フィンガーステロイド受容体もしくは、負のコントロールとして、空のｐｃＤＮＡ３）をリポフェクタミン試薬（ＧｉｂｃｏＢＲＬ）を用いてトランスフェクトした。大よそ２４時間後に、１０ｎＭ　ＲＵ４８６（Ｂｉｏｍｏｌ）、１００ｎＭ　４−ＯＨＴ（Ｓｉｇｍａ）もしくは５ｍＭポナステロンＡ（Ｉｎｔｒｏｇｅｎ）の添加により発現を誘導した。トランスフェクションの２４時間後に、細胞抽出物を作製し、そしてＭｉｃｒｏＬｕｍａｔＬＢ９６Ｐルミノメータ（ＥＧ＆ＧＢｅｒｔｈｏｌｄ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）中でＰｒｏｍｅｇａルシフェラーゼアッセイ試薬を使用してルシフェラーゼ活性をアッセイした。二重レポーターアッセイのために、シフェラーゼレポータープラスミド８５ｎｇ、ｂ−ｇａｌレポータープラスミド８５ｎｇおよび二つのエフェクタープラスミドそれぞれの１５ｎｇをトランスフェクトした。発光ｂ−ガラクトシダーゼ検出キットＩＩ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を使用して、ｂ−ｇａｌ活性を測定した。
【００８４】
Ｎ−末端エフェクタードメインを持つ亜鉛フィンガーステロイド受容体融合構築体．ＶＰ１６コード化領域を、プライマーＶＰＮｈｅ−Ｆ（５’−ＧＡＧＧＡＧＧＡＧＧＡＧＧＣＴＡＧＣＧＣＣＡＣＣＡＴＧＧＧＧＣＧＣＧＣＣＧＧＣＧＣＴＣＣＣＣＣＧＡＣＣＧＡＴＧＴＣＡＧＣＣＴＧ−３’）（配列番号５）およびＶＰＨｉｎｄ−Ｂ（５’−ＧＡＧＧＡＧＧＡＧＧＡＧＡＡＧＣＴＴＧＴＴＡＡＴＴＡＡＡＣＣＧＴＡＣＴＣＧＴＣＡＡＴＴＣＣＡＡＧＧＧＣＡＴＣＧ−３’）（配列番号６）もしくはＶＰＮＬＳＨｉｎｄ−Ｂ（５’−ＧＡＧＧＡＧＧＡＧＧＡＧＡＡＧＣＴＴＡＡＣＴＴＴＧＣＧＴＴＴＣＴＴＴＴＴＣＧＧＧＴＴＡＡＴＴＡＡＡＣＣＧＴＡＣＴＣＧＴＣＡＡＴＴＣＣＡＡＧＧＧＣＡＴＣＧ−３’）（配列番号７）を使用して、ｐｃＤＮＡ３／Ｃ７−ＶＰ１６からＰＣＲ増幅した。Ｃ７コード化領域を、プライマーＣ７Ｈｉｎｄ−Ｆ（５’−ＧＡＧＧＡＧＧＡＧＧＡＧＡＡＧＣＴＴＧＧＧＧＣＣＡＣＧＧＣＧＧＣＣＣＴＣＧＡＧＣＣＣＴＡＴＧＣ３’）（配列番号８）およびＣ７Ｂａｍ−Ｂ（５’−ＧＡＧＧＡＧＧＧＡＴＣＣＣＣＣＴＧＧＣＣＧＧＣＣＴＧＧＣＣＡＣＴＡＧＴＴＣＴＡＧＡＧＴＣ−３’）（配列番号９）もしくはＣ７ＮＬＳＢａｍ−Ｂ（５’−ＧＡＧＧＡＧＧＧＡＴＣＣＣＣＡＡＣＴＴＴＧＣＧＴＴＴＣＴＴＴＴＴＣＧＧＣＴＧＧＣＣＧＧＣＣＴＧＧＣＣＡＣＴＡＧＴＴＣＴＡＧＡＧＴＣ−３’）（配列番号１０）を使用して、同一のプラスミドから増幅した。
【００８５】
ヒトＰＲ先端切断ＬＢＤ（アミノ酸６４５〜９１４）を、プライマーＰＲＢａｍ−Ｆ（５’−ＧＡＧＧＡＧＧＡＧＧＡＧＧＧＡＴＣＣＡＧＴＣＡＧＡＧＴＴＧＴＧＡＧＡＧＣＡＣＴＧＧＡＴＧＣ
ＴＧ−３’）（配列番号１１）およびＰＲＥｃｏ−Ｂ（５’−ＧＡＧＧＡＧＧＡＡＴＴＣＴＣＡＡＧＣＡＡＴＡＡＣＴＴＣＡＧＡＣＡＴＣＡＴＴＴＣＴＧＧＡＡＡＴＴＣ−３’）（配列番号１２）を使用して、ＰＡＰＣＭＶＧＬ９１４ＶＰｃ’−ＳＶ［Ｗａｎｇ，Ｙ．，Ｘｕ，Ｊ．，Ｐｉｅｒｓｏｎ，Ｔ．，Ｏ’Ｍａｌｌｅｙ，Ｂ．Ｗ．，ａｎｄＴｓａｉ，Ｓ．Ｙ．（１９９７）ＧｅｎｅＴｈｅｒａｐｙ４，４３２−４４１］から増幅した。それから、ＶＰ１６−Ｃ７−ＰＲ、ＶＰ１６−ＮＬＳ−Ｃ７−ＰＲおよびＶＰ１６−Ｃ７−ＮＬＳ−ＰＲコード化領域を、ＰＣＲプライマー中に組み入れたＮｈｅ１、Ｈｉｎｄ３、ＢａｍＨ１およびＥｃｏＲ１制限部位を使用して、ｐｃＤＮＡ３．１（＋）Ｚｅｏ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中に集合させた。得られた構築体中で、Ｃ７コード化領域を二つのＳｆｉ１部位により挟み、そしてＶＰ１６コード化領域をＡｓｃ１およびＰａｃ１により挟んだ。これらの制限部位を導入して、ＤＢＤおよびエフェクタードメインそれぞれの交換を容易にした。
【００８６】
ＶＰ１６−Ｃ７−ＥＲ、ＶＰ１６−ＮＬＳ−Ｃ７−ＥＲおよびＶＰ１６−Ｃ７−ＮＬＳ−ＥＲ構築体を生成させるために、点突然変異マウスＥＲ　ＬＢＤコード化領域（アミノ酸２８１〜５９９、Ｇ５２５Ｒ）をｐＢａｂｅ／Ｍｙｃ−ＥＲ［Ｌｉｔｔｌｅｗｏｏｄ，Ｔ．Ｄ．，Ｈａｎｃｏｃｋ，Ｄ．Ｃ．，Ｄａｎｉｅｌｉａｎ，Ｐ．Ｓ．，Ｐａｒｋｅｒ，Ｍ．Ｇ．，ａｎｄＥｖａｎ，Ｇ．Ｉ．（１９９５）Ｎｕｃｌ．ＡｃｉｄｓＲｅｓ．２３，１６８６−１６９０］から切除し、そしてＢａｍＨ１−ＥｃｏＲ１制限消化を経由してＰＢ　ＬＢＤコード化領域を置換するために使用した。
【００８７】
Ｂ３もしくはＮ１　ＤＢＤを持つ融合構築体を生成させるために、Ｃ７をＳｆｉ１消化を経由してＢ３もしくはＮ１コード化領域により置換した。ＶＰ６４エフェクタードメインを含む融合構築体を、Ａｓｃ１−Ｐａｃ１消化を経由してＶＰ６４コード化領域によりＶＰ１６を置換することにより生成した。
【００８８】
Ｃ−末端エフェクタードメインを持つ亜鉛フィンガーステロイド受容体融合構築体．先端を切ったヒトＰＲ　ＬＢＤを、プライマーＰＲＦｓｅ−Ｆ（５’−ＧＡＧ
ＧＡＧＧＡＧＧＡＧＧＡＧＧＧＣＣＧＧＣＣＧＣＧＴＣＧＡＣＣＡＧＧＴＣＡＧＡＧＴＴＧＴＧＡＧＡＧＣＡＣＴＧＧＡＴＧＣ−３’）（配列番号１３）およびＰＲＡｓｃ−Ｂ（５’−ＧＡＧＧＡＧＧＡＧＧＡＧＧＡＧＧＧＣＧＣＧＣＣＣＣＧＴＣＧＡＣＣＣＡＧＣＡＡＴＡＡＣＴＴＣＡＧＡＣＡＴＣＡＴＴＴＣＴＧＧ−３’）（配列番号１４）を使用して、ＰＡＰＣＭＶＧＬ９１４ＶＰｃ’−ＳＶ［Ｗａｎｇ，Ｙ．，Ｘｕ，Ｊ．，Ｐｉｅｒｓｏｎ，Ｔ．，Ｏ’Ｍａｌｌｅｙ，Ｂ．Ｗ．，ａｎｄＴｓａｉ，Ｓ．Ｙ．（１９９７）ＧｅｎｅＴｈｅｒａｐｙ４，４３２−４４１］から増幅した。点突然変異マウスＥＲ　ＬＢＤを、プライマーＥＲＦｓｅ−Ｆ（５’−ＧＡＧＧＡＧＧＡＧＧＡＧＧＡＧＧＧＣＣＧＧＣＣＧＣＣＧＡＡＡＴＧＡＡＡＴＧＧＧＴＧＣＴＴＣＡＧＧＡＧＡＣ−３’）（配列番号１５）およびＥＲＡｓｃ−Ｂ（５’−ＧＡＧＧＡＧＧＡＧＧＡＧＧＡＧＧＧＣＧＣＧＣＣＣＧＡＴＣＧＴＧＴＴＧＧＧＧＡＡＧＣＣＣＴＣＴＧＣＴＴＣ−３’）（配列番号１６）を使用して、ｐＢａｂｅ／Ｍｙｃ−ＥＲ［Ｌｉｔｔｌｅｗｏｏｄ，Ｔ．Ｄ．，Ｈａｎｃｏｃｋ，Ｄ．Ｃ．，Ｄａｎｉｅｌｉａｎ，Ｐ．Ｓ．，Ｐａｒｋｅｒ，Ｍ．Ｇ．，ａｎｄＥｖａｎ，Ｇ．Ｉ．（１９９５）Ｎｕｃｌ．ＡｃｉｄｓＲｅｓ．２３，１６８６−１６９０］から増幅した。それから、得られたＰＣＲ生産物を、制限エンドヌクレアーゼＦｓｅ１およびＡｓｃ１との消化を経由して、Ｅ２ＣおよびＶＰ１６コード化領域の間で、ｐｃＤＮＡ３／Ｅ２Ｃ−ＶＰ１６［Ｂｅｅｒｌｉ，Ｒ．Ｒ．，Ｓｅｇａｌ，Ｄ．Ｊ．，Ｄｒｅｉｅｒ，Ｂ．，ａｎｄＢａｒｂａｓ，Ｃ．Ｆ．，ＩＩＩ（１９９８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９５，１４６２８−１４６３３］内に挿入した。
【００８９】
Ｂ３もしくはＮ１　ＤＢＤを持つ融合構築体を生成させるために、Ｓｆｉ１消化を経由して、Ｅ２ＣをＢ３もしくはＮ１コード化領域により置換した。ＶＰ６４エフェクタードメインを含む融合構築体を、Ａｓｃ１−Ｐａｃ１消化を経由するＶＰ６４コード化領域によりＶＰ１６を置換することにより生成した。
【００９０】
ヘテロ二量体スイッチ構築体．Ｅ２Ｃ−ＥＲ融合体の構築のために、点突然変異マウスＥＲ　ＬＢＤを、プライマーＥＲＦｓｅ−ＦおよびＥＲＰａｃ−Ｂ（５’−ＧＡＧＧＡＧＧＡＧＧＡＧＧＡＧＴＴＡＡＴＴＡＡＧＡＴＣＧＴＧＴＴＧＧＧＧＡＡＧＣＣＣＴＣＴＧＣＴＴＣ−３’）（配列番号１７）を使用して、ｐＢａｂｅ／Ｍｙｃ−ＥＲ［Ｌｉｔｔｌｅｗｏｏｄ，Ｔ．Ｄ．，Ｈａｎｃｏｃｋ，Ｄ．Ｃ．，Ｄａｎｉｅｌｉａｎ，Ｐ．Ｓ．，Ｐａｒｋｅｒ，Ｍ．Ｇ．，ａｎｄＥｖａｎ，Ｇ．Ｉ．（１９９５）Ｎｕｃｌ．ＡｃｉｄｓＲｅｓ．２３，１６８６−１６９０］から増幅した。それから、ＰＣＲ生産物を構築体ｐｃＤＮＡ３／Ｅ２Ｃ−ＶＰ６４内に挿入し、制限エンドヌクレアーゼＦｓｅ１およびＰａｃ１との消化を経由して、ＶＰ６４コード化領域を置換した。ＥＲ−ＶＰ６４融合体を生成させるために、ＥＲ　ＬＢＤを、プライマーＥＲＡＴＧＢａｍ−Ｆ（５’−ＧＡＧＧＡＧＧＡＧＧＡＧＧＧＡＴＣＣＧＣＣＡＣＣＡＴＧＣＧＡＡＡＴＧＡＡＡＴＧＧＧＴＧＣＴＴＣＡＧＧＡＧＡＣ−３’）（配列番号１８）およびＥＲＡｓｃ−Ｂを使用して増幅した。それから、ＰＣＲ生産物をｐｃＤＮＡ３／Ｅ２Ｃ−ＶＰ６４［Ｂｅｅｒｌｉ，Ｒ．Ｒ．，Ｓｅｇａｌ，Ｄ．Ｊ．，Ｄｒｅｉｅｒ，Ｂ．，ａｎｄＢａｒｂａｓ，Ｃ．Ｆ．，ＩＩＩ（１９９８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９５，１４６２８１４６３３］内に挿入して、ＢａｍＨ１−Ａｓｃ１の消化を経由して、Ｅ２Ｃコード化領域を置換した。
【００９１】
単鎖スイッチ構築体．ＥＲ　ＬＢＤを持つ単鎖融合体の構築のために、点突然変異マウスＥＲ　ＬＢＤを、プライマーＥＲＦｓｅ−ＦおよびＥＲＳｐｅｌ−Ｂ（５’−ＧＡＧＧＡＧＧＡＧＧＡＧＧＡＧＧＡＧＡＣＴＡＧＴＧＧＡＡＣＣＡＣＣＣＣＣＡＣＣＡＣＣＧＣＣＣＧＡＧＣＣＡＣＣＧＣＣＡＣＣＡＧＡＧＧＡＧＡＴＣＧＴＧＴＴＧＧＧＧＡＡＧＣＣＣＴＣＴＧＣ−３’）（配列番号１９）を使用するか、またはプライマーＥＲＮｈｅ１−Ｆ１（１８アミノ酸リンカー構築体について；５’−ＧＡＧＧＡＧＧＡＧＧＡＧＧＡＧＧＡＧＧＣＴＡＧＣＧＧＣＧＧＴＧＧＣＧＧＴＧＧＣＴＣＣＴＣＴＧＧＴＧＧＣＧＧＴＧＧＣＧＧＴＴＣＴＴＣＣＡＡＴＧＡＡＡＴＧＧＧＴＧＣＴＴＣＡＧＧＡＧＡＣ−３’）（配列番号２０）もしくはＥＲＮｈｅ１−Ｆ２（３０アミノ酸リンカー構築体について；５’−ＧＡＧＧＡＧＧＡＧＧＡＧＧＡＧＧＡＧＧＣＴＡＧＣＴＣＴＴＣＣＡＡＴＧＡＡＡＴＧＧＧＴＧＣＴＴＣＡＧＧＡＧＡＣ−３’）（配列番号２１）のどちらか、およびＥＲＡｓｃ−Ｂを使用して、ｐＢａｂｅ／Ｍｙｃ−ＥＲ［Ｌｉｔｔｌｅｗｏｏｄ，Ｔ．Ｄ．，Ｈａｎｃｏｃｋ，Ｄ．Ｃ．，Ｄａｎｉｅｌｉａｎ，Ｐ．Ｓ．，Ｐａｒｋｅｒ，Ｍ．Ｇ．，ａｎｄＥｖａｎ，Ｇ．Ｉ．（１９９５）Ｎｕｃｌ．ＡｃｉｄｓＲｅｓ．２３，１６８６−１６９０］から増幅した。それから、ＰＣＲ生産物を、Ｆｓｅ１およびＳｐｅ１もしくはＮｈｅ１およびＡｓｃ１それぞれと消化し、そしてＦｓｅ１−Ａｓｃ１直線化ｐｃＤＮＡ３／Ｅ２Ｃ−ＶＰ６４［Ｂｅｅｒｌｉ，Ｒ．Ｒ．，Ｓｅｇａｌ，Ｄ．Ｊ．，Ｄｒｅｉｅｒ，Ｂ．，ａｎｄＢａｒｂａｓ，Ｃ．Ｆ．，ＩＩＩ（１９９８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９５，１４６２８−１４６３３］内に挿入した。
【００９２】
ＲＸＲ−ＥｃＲ単鎖融合体の構築のために、ヒトレチノイドＸ受容体（ｈＲＸＲα、アミノ酸３７３〜６５４）のリガンド結合ドメインを、プライマーＲＸＲＦｓｅ−Ｆ（５’−ＧＡＧＧＡＧＧＡＧＧＧＣＣＧＧＣＣＧＧＧＡＡＧＣＣＧＴＧＣＡＧＧＡＧＧＡＧＣＧＧＣ−３’）（配列番号２２）およびＲＸＲＳｐｅ−Ｂ（５’−ＧＡＧＧＡＧＧＡＧＧＡＧＧＡＧＡＣＴＡＧＴＧＧＡＡＣＣＡＣＣＣＣＣＡＣＣＡＣＣＧＣＣＣＧＡＧＣＣＡＣＣＧＣＣＡＣＣＡＧＡＧＧＡＡＧＴＣＡＴＴＴＧＧＴＧＣＧＧＣＧＣＣＴＣＣＡＧＣ−３’）（配列番号２３）を用いてｐｖｇＲＸＲ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）からＰＣＲ増幅した。エクジソン受容体（ＥｃＲ、アミノ酸２０２〜４６２、ショウジョウバエのメラノガステル）のリガンド結合ドメインを、プライマーＥｃＲＮｈｅ−Ｆ１（１８アミノ酸リンカー構築体について；５’−ＧＡＧＧＡＧＧＡＧＧＡＧＧＣＴＡＧＣＴＣＴＴＣＣＧＧＴＧＧＣＧＧＣＣＡＡＧＡＣＴＴＴＧＴＴＡＡＧＡＡＧＧ−３’）（配列番号２４）もしくはＥｃＲＮｈｅ−Ｆ２（３０アミノ酸リンカー構築体について；５’−ＧＡＧＧＡＧＧＡＧＧＡＧＧＣＴＡＧＣＧＧＣＧＧＴＧＧＣＧＧＴＧＧＣＴＣＣＴＣＴＧＧＴＧＧＣＧＧＴＧＧＣＧＧＴＴＣＴＴＣＣＧＧＴＧＧＣＧＧＣＣＡＡＧＡＣＴＴＴＧＴＴＡＡＧＡＡＧＧ−３’）（配列番号２５）、およびＥｃＲＡｓｃ−Ｂ（５’−ＧＡＧＧＡＧＧＡＧＧＧＣＧＣＧＣＣＣＧＧＣＡＴＧＡＡＣＧＴＣＣＣＡＧＡＴＣＴＣＣＴＣＧＡＧ−３’）（配列番号２６）を使用して、ｐＶｇＲＸＲからＰＣＲ増幅した。それから、ＰＣＲ生産物を、それぞれ、Ｆｓｅ１およびＳｐｅ１もしくはＮｈｅ１およびＡｓｃ１で消化し、そしてＦｓｅ１−Ａｓｃ１直線化ｐｃＤＮＡ３／Ｅ２Ｃ−ＶＰ６４［Ｂｅｅｒｌｉ，Ｒ．Ｒ．，Ｓｅｇａｌ，Ｄ．Ｊ．，Ｄｒｅｉｅｒ，Ｂ．，ａｎｄＢａｒｂａｓ，Ｃ．Ｆ．，ＩＩＩ（１９９８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９５，１４６２８−１４６３３］内に挿入した。ＤＮＡ結合ドメインをＳｆｉ１消化を経由して交換し、エフェクタードメインをＡｓｃ１−Ｐａｃ１消化を経由して交換した。
【００９３】
３６アミノ酸リンカー、Ｅ２Ｃ−ＲＬＬＥ−ＶＰ６４融合体を生成させるために、ＲＸＲ　ＬＢＤを、プライマーＲＸＲＦｓｃ−ＦおよびＲＸＲＳｐｅＬＬ−Ｂ（５’−ＧＡＧＧＡＧＧＡＧＧＡＧＧＡＧＡＣＴＡＧＴＡＧＡＧＣＣＡＣＣＧＣＣＣＣＣＴＴＣＡＧＡＡＣＣＧＣＣＣＧＡＧＣＣＡＣＣＧＣＣＡＣＣＡＧＡＧＧ３’）（配列番号２７）を使用してｐｃＤＮＡ３／Ｅ２Ｃ−ＲＥ−ＶＰ６４からＰＣＲ増幅した。ＥｃＲ　ＬＢＤを、プライマーＥｃＲＮｈｅＬＬ−Ｆ（５’−ＧＡＧＧＡＧＧＡＧＧＡＧＧＣＴＡＧＣＧＧＧＧＧＴＴＣＧＧＡＧＧＧＴＧＧＣＧＧＧＴＣＴＧＡＧＧＧＴＧＧＧＧＧＴＧＧＴＴＣＣＡＣＴＡＧＣＴＣＴＴＣＣ−３’）（配列番号２８）およびＥｃＲＡｓｃ−Ｂを使用して同一のプラスミドから増幅した。ＰＣＲ生産物を、上述のようにｐｃＤＮＡ３／Ｅ２Ｃ−ＶＰ６４内に挿入した。
【００９４】
実施例２：遺伝子スイッチ
ホルモン調節亜鉛フィンガーステロイド受容体融合タンパク質の生成．以前の研究は標的遺伝子発現について工学的Ｃ２−Ｈ２亜鉛フィンガータンパク質の潜在性を示してきている［Ｌｉｕ，Ｑ．，Ｓｅｇａｌ，Ｄ．Ｊ．，Ｇｈｉａｒａ，Ｊ．Ｂ．，ａｎｄＢａｒｂａｓ，Ｃ．Ｆ．，ＩＩＩ（１９９７）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９４，５５２５−５５３０；Ｋｉｍ，Ｊ．Ｓ．，ａｎｄＰａｂｏ，Ｃ．Ｏ．（１９９７）ＪＢｉｏｌＣｈｅｍ２７２，２９７９５−２９８００；．Ｂｅｅｒｌｉ，Ｒ．Ｒ．，Ｓｅｇａｌ，Ｄ．Ｊ．，Ｄｒｅｉｅｒ，Ｂ．，ａｎｄＢａｒｂａｓ，Ｃ．Ｆ．，ＩＩＩ（１９９８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９５，１４６２８−１４６３３；Ｂｅｅｒｌｉ，Ｒ．Ｒ．，Ｄｒｅｉｅｒ，Ｂ．，ａｎｄＢａｒｂａｓ，Ｃ．Ｆ．，ＩＩＩ（２０００）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９７，１４９５−１５００］。
【００９５】
しかしながら、工学的Ｃ２−Ｈ２亜鉛フィンガータンパク質の潜在性を十分に実現するためには、それらのさもなければ構成的なＤＮＡ結合活性をリガンド依存性にさせることが望ましい。ヒトプロゲステロン受容体（ｈＰＲ）およびマウスエストロゲン受容体（ｍＥＲ）のリガンド結合ドメイン（ＬＢＤ）は、合成的アンタゴニストへの結合を保持しながら、天然のホルモンへの結合を欠如するように修飾した後で、異種のタンパク質の調節に以前から使用されてきている［Ｌｉｔｔｌｅｗｏｏｄ，Ｔ．Ｄ．，Ｈａｎｃｏｃｋ，Ｄ．Ｃ．，Ｄａｎｉｅｌｉａｎ，Ｐ．Ｓ．，Ｐａｒｋｅｒ，Ｍ．Ｇ．，ａｎｄＥｖａｎ，Ｇ．Ｉ．（１９９５）Ｎｕｃｌ．ＡｃｉｄｓＲｅｓ．２３，１６８６−１６９０；Ｗａｎｇ，Ｙ．，Ｘｕ，Ｊ．，Ｐｉｅｒｓｏｎ，Ｔ．，Ｏ’Ｍａｌｌｅｙ，Ｂ．Ｗ．，ａｎｄＴｓａｉ，Ｓ．Ｙ．（１９９７）ＧｅｎｅＴｈｅｒａｐｙ４，４３２−４４１１］。
【００９６】
かくして、Ｚｉｆ２６８変異体Ｃ７［Ｗｕ，Ｈ．，Ｙａｎｇ，Ｗ．−Ｐ．，ａｎｄＢａｒｂａｓ，Ｃ．Ｆ．，ＩＩＩ（１９９５）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９２，３４４−３４８］を、転写活性化ドメインプラス二つの核ホルモン受容体のどちらかのＬＢＤに融合した。ＶＰ６４−Ｃ７−ＰＲ融合タンパク質は、Ｎ−末端ＶＰ６４活性化ドメイン［Ｂｅｅｒｌｉ，Ｒ．Ｒ．，Ｓｅｇａｌ，Ｄ．Ｊ．，Ｄｒｅｉｅｒ，Ｂ．，ａｎｄＢａｒｂａｓ，Ｃ．Ｆ．，ＩＩＩ（１９９８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９５，１４６２８−１４６３３］、およびプロゲステロンアンタゴニストＲＵ４８６／ミフェプリストンに応答的であるがプロゲステロンにはそうでない［Ｗａｎｇ，Ｙ．，Ｘｕ，Ｊ．，Ｐｉｅｒｓｏｎ，Ｔ．，Ｏ’Ｍａｌｌｅｙ，Ｂ．Ｗ．，ａｎｄＴｓａｉ，Ｓ．Ｙ．（１９９７）ＧｅｎｅＴｈｅｒａｐｙ４，４３２−４４１］、アミノ酸９１５〜９３３を欠如するＣ−末端ｈＰＲ　ＬＢＤ（アミノ酸６４５〜９１４）、を含む。ＶＰ６４−Ｃ７−ＥＲ融合タンパク質は、単一のアミノ酸置換（Ｇ５２５Ｒ）を持つＣ−末端ｍＥＲ　ＬＢＤ（アミノ酸２８２〜５９９）を含み、そしてエストロゲンアンタゴニスト４−ヒドロキシ−タモキシフェン（４−ＯＨＴ）には応答的であるがエストロゲンにはそうでない［Ｌｉｔｔｌｅｗｏｏｄ，Ｔ．Ｄ．，Ｈａｎｃｏｃｋ，Ｄ．Ｃ．，Ｄａｎｉｅｌｉａｎ，Ｐ．Ｓ．，Ｐａｒｋｅｒ，Ｍ．Ｇ．，ａｎｄＥｖａｎ，Ｇ．Ｉ．（１９９５）Ｎｕｃｌ．ＡｃｉｄｓＲｅｓ．２３，１６８６−１６９０］。
【００９７】
亜鉛フィンガーステロイド受容体融合タンパク質についての最適応答要素の決定．天然由来のステロイド受容体は、二量体としてＤＮＡに結合し、そして反復性配列からなる応答要素を典型的に認識する［Ｅｖａｎｓ，Ｒ．Ｍ．（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ２４０，８８９−８９５；Ｃａｒｓｏｎ−Ｊｕｒｉｃａ，Ｍ．Ａ．，Ｓｃｈｒａｄｅｒ，Ｗ．Ｔ．，ａｎｄ０’Ｍａｌｌｅｙ，Ｗ．（１９９０）ＥｎｄｏｃｒｉｎｅＲｅｖｉｅｗｓｌｌ，２０１−２２０］。さらに、幾らかな場合においても、直接繰返し体が受容体二量体のための結合部位として役立ち得ることが実証された［Ａｕｍａｉｓ，Ｊ．Ｐ．，Ｌｅｅ，Ｈ．Ｓ．，ＤｅＧａｎｎｅｓ，Ｃ．，Ｈｏｒｓｆｏｒｄ，Ｊ．，ａｎｄＷｈｉｔｅ，Ｊ．Ｈ．（１９９６）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１，１２５６８−１２５７７］。天然由来の受容体二量体によるＤＮＡ認識におけるこの明らかな柔軟性があるとしても、人工的な、亜鉛フィンガーベースの転写スイッチに対する応答要素の最適構造は未知であった。しかしながら、標的遺伝子発現のための効率的な、ホルモン誘導性システムを開発するには、結合部位構成の詳細な知識が必要である。
【００９８】
亜鉛フィンガー−ＬＢＤ融合タンパク質のための応答要素の二つの半部位の最適な配向と間隔を決定するために、一連のレポータープラスミドを構築した。それぞれは、ＴＡＴＡボックスおよびホタルのルシフェラーゼコード化領域の上流に、二つのＣ７結合部位を含む。この二つのＣ７結合部位を、異なる配向（直接な、逆方向の、もしくは裏返しの繰返し）においてかつ種々の間隔（間隔無しか１〜５ｂｐ間隔）を持って導入した。ＶＰ６４−Ｃ−ＰＲもしくはＶＰ６４−Ｃ７−ＥＲ融合構築体の発現を指示するプラスミドを、それから種々のレポータープラスミドと共−トランスフェクトさせ、そしてホルモン誘導ルシフェラーゼ発現のアッセイをした。意義深いことに、Ｃ７二量体結合部位のそれぞれは、異なる効率性においてではあるが、ＰＲおよびＥＲベースのタンパク質の両方についての応答要素として作用することができた。対照的に、単一のＣ７結合部位を持つレポータープラスミドは活性化されないで、転写のホルモン−誘導活性化は二量体により仲介されたことを示した。
【００９９】
最適な間隔は二つの半部位の配向に依存する。ＰＲ融合タンパク質の場合には、最適な間隔は、逆方向の繰返し体について２〜３ｂｐに、裏返しの繰返し体について３ｂｐにあるように見えた。直接な繰返し体からなる応答要素は単一の最適な間隔を持たなかった；最良の応答は４〜５ｂｐもしくは全く間隔無しで得られた。ＥＲ融合タンパク質については、最適な間隔は、直接な繰返し体について３〜４ｂｐに、逆方向の繰返し体について１〜２ｂｐに、そして裏返しの繰返し体について３ｂｐにあった。特記すべきことには、テストした応答要素次第で、ＰＲおよびＥＲ融合タンパク質の基礎の、即ちリガンド−非依存性の、活性において有意な変動があったことである。最も注目すべきことには、直接の繰返し体の間隔を３から４ｂｐへ増加させることは、ＶＰ６４−Ｃ−ＰＲの１．９倍高い基礎活性に、そしてＶＰ６４−Ｃ７−ＥＲの場合には３．７倍の増加に至った。
【０１００】
特にもし遺伝子生成物が有毒であれば、興味のある特定の遺伝子の発現レベルについて厳しい制御がしばしば必要とされる、誘導プロモーターシステムにとって高い基礎活性は極度に望ましくない。かくして、適切な応答要素を選ぶには、特別な注意をホルモン誘導性のみならず、調節タンパク質の存在下の基礎活性にもまた払わねばならない。３個のヌクレオチドの間隔での直接繰返し体からなる応答要素は、それがＰＲおよびＥＲ融合タンパク質の両方に適合性であったので、ホルモン誘導性の人工的プロモーター中の使用に良い選択であると考えられた。意義深いことに、ＰＲおよびＥＲ融合タンパク質のどちらかの存在下でのその基礎活性は全てのテストした応答要素の中で最低であった。さらに、転写の良好なホルモン誘導活性化がＶＰ６４−Ｃ７−ＰＲ（３．９倍）およびＶＰ６４−Ｃ７−ＥＲ（９．５倍）の両方で観察された。
【０１０１】
新規ＤＮＡ結合ドメインの生成．Ｃ７ＤＮＡ結合ドメインの使用は上述の予備的研究に良く適していた一方で、それは誘導性転写調節体内への組入れにとって良い選択でないかもしれない。Ｃ７タンパク質は、増加した親和性を持つが不変の特異性も持つ［Ｗｕ，Ｈ．，Ｙａｎｇ，Ｗ．−Ｐ．，ａｎｄＢａｒｂａｓ，Ｃ．Ｆ．，ＩＩＩ（１９９５）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．ＡｃａｄＳｃｉ．ＵＳＡ９２，３４４−３４８］マウス転写因子Ｚｉｆ２６８の変異体である［Ｐａｖｌｅｔｉｃｈ，Ｎ．Ｐ．，ａｎｄＰａｂｏ，Ｃ．Ｏ．（１９９１）Ｓｃｉｅｎｃｅ２５２，８０９−８１７］。代わりのＤＮＡ結合ドメインの使用はキメラ調節体の潜在的多型質発現性効果を最少にしたと、我々は理由付けした。先に、我々は、１６個の５’−ＧＮＮ−３’　ＤＮＡトリプレットのそれぞれに特異的な、予め規定した亜鉛フィンガードメインのファミリーから亜鉛フィンガータンパク質を迅速に集合させる戦略を説明した［Ｂｅｅｒｌｉ，Ｒ．Ｒ．，Ｓｅｇａｌ，Ｄ．Ｊ．，Ｄｒｅｉｅｒ，Ｂ．，ａｎｄＢａｒｂａｓ，Ｃ．Ｆ．，ＩＩＩ（１９９８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９５，１４６２８−１４６３３；Ｓｅｇａｌ，Ｄ．Ｊ．，Ｄｒｅｉｅｒ，Ｂ．，Ｂｅｅｒｌｉ，Ｒ．Ｒ．，ａｎｄＢａｒｂａｓ，Ｃ．Ｆ．，ＩＩＩ（１９９９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９６，２７５８−２７６３］。
【０１０２】
いかなる望ましい５’−（ＧＮＮ）_３−３’ 配列を結合する三フィンガータンパク質を、コンセンサスな三フィンガータンパク質Ｓｐ１Ｃ［Ｄｅｓｊａｒｌａｉｓ，Ｊ．Ｒ．，ａｎｄＢｅｒｇ，Ｊ．Ｍ．（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９０，２２５６−２２６０］のフレームワーク内で塩基−特異的ＤＮＡ調節に関与するアミノ酸残基を移植することにより、迅速に作製することができる。今まで、優に１００個を超える三フィンガータンパク質が我々の研究室で作製されてきている。それらの中の二つ、Ｂ３およびＮ１、を選んで誘導性転写調節体に使用した（図１）。Ｂ３およびＮ１タンパク質は、配列５’−ＧＧＡＧＧＧＧＡＣ−３’ もしくは５’−ＧＧＧＧＴＡＧＡＡ３’ にそれぞれ結合するようにデザインされている。これらのＤＮＡ結合特異性を確認するために、これらのタンパク質をＭＢＰ−融合体として精製し、そして、５’−（ＧＮＮ）_３−３’ 配列を含むオリゴヌクレオチドの任意選択を用いるＥＬＩＳＡ分析によりテストした（図１Ｂ）。
【０１０３】
意義深いことに、両方のタンパク質はそれらの標的配列を認識し、そしてテストした他の５’−（ＧＮＮ）_３−３’ 配列のいずれにも何も交差反応性を示さなかった。しかしながら、ＥＬＩＳＡにより判断すると、Ｎ１の結合はＢ３の結合よりはるかに弱かった。それ故に、電気泳動移動度シフトアッセイにより親和性を測定した。Ｂ３タンパク質は、我々が先に三フィンガータンパク質について報告したＫ_Ｄ値に同様の、１５ｎＭのＫ_Ｄ値でその標的配列と結合した［Ｂｅｅｒｌｉ，Ｒ．Ｒ．，Ｓｅｇａｌ，Ｄ．Ｊ．，Ｄｒｅｉｅｒ，Ｂ．，ａｎｄＢａｒｂａｓ，Ｃ．Ｆ．，ＩＩＩ（１９９８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９５，１４６２８−１４６３３］。対照的に、その標的に対するＮ１親和性は劇的にさらに低く、我々はそのＫ_Ｄ値を５〜１０μＭの範囲にあったと評価する。二つのタンパク質がそれぞれの標的配列に対して非常に異なる親和性を持ったという事実は、それは誘導性発現システムの機能性への親和性の影響を検討することを可能にするので、ポジティブと考えられた。
【０１０４】
遺伝子発現の制御のためのＲＵ４８６−および４−ＯＨＲ−誘導性システム．比較分析を容認するために、一連のＲＵ４８６−および４−ＯＨＲ−誘導性転写調節体を、Ｂ３もしくはＮ１　ＤＮＡ結合ドメインのどちらかを含んで構築した。活性化ドメインの配置の役目を、タンパク質のＮ−もしくはＣ−末端のどちらかにそれを融合させることにより、検討した。二つの異なる活性化ドメインを比較した：単純ヘルペスウイルスＶＰ１６転写促進ドメイン［Ｓａｄｏｗｓｋｉ，Ｉ．，Ｍａ，Ｊ．，Ｔｒｉｅｚｅｎｂｅｒｇ，Ｓ．，ａｎｄＰｔａｓｈｎｅ，Ｍ．（１９８８）Ｎａｔｕｒｅ３３５，５６３−５６４］、および、ＶＰ１６の最少活性化ドメインの４個の縦列繰返し体［Ｂｅｅｒｌｉ，Ｒ．Ｒ．，Ｓｅｇａｌ，Ｄ．Ｊ．，Ｄｒｅｉｅｒ，Ｂ．，ａｎｄＢａｒｂａｓ，Ｃ．Ｆ．，ＩＩＩ（１９９８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９５，１４６２８−１４６３３］からなるところの合成的ＶＰ６４活性化ドメインである。
【０１０５】
Ｂ３およびＮ１　ＤＮＡ標的配列、ならびに上で規定した最適応答要素構造に基づいて合成プロモーターを構築した。１０ｘＢ３−ＴＡＴＡ−ｌｕｃおよび１０ｘＮ１−ＴＡＴＡ−ｌｕｃはそれぞれ、ＴＡＴＡボックスおよびホタルのルシフェラーゼコード化領域の上流に、３個のヌクレオチドだけ間隔を取った直接の繰返し体からなる、５個の応答要素を含む。応答要素はお互いに６個のヌクレオチドだけ隔てられているが、これは５個の二量体の随伴性結合を可能にし、かくしてプロモーター活性を極大にするであろう。種々の融合構築体の活性を、ヒーラ細胞中で同系のＴＡＴＡレポータープラスミドでの過渡的な共トランスフェクションにより評価した（表１）。
【０１０６】
【表３】

【０１０７】
一般的に、ＥＲ融合タンパク質はさらに強い転写促進体であると判明し、そして４−ＯＨＴ−誘導ルシフェラーゼ活性は、ＰＲ融合タンパク質により仲介される４８６−誘導ルシフェラーゼ活性より普通は３〜６倍高い。しかしながら、ＥＲキメラの基礎の、即ちリガンド非依存性の、活性はしばしば幾らかさらに高かったので、それらのホルモン−誘導性のひだ−刺激は一般的にはさらに良くはなかった。二桁の大きさの過剰にあるホルモン−依存性遺伝子活性化はＰＲおよびＥＲ融合タンパク質の両方で共通して観察されたが、それらの値はＧａ１４−ＰＲ融合タンパク質について以前に報告されたもの［Ｗａｎｇ，Ｙ．，Ｘｕ，Ｊ．，Ｐｉｅｒｓｏｎ，Ｔ．，Ｏ’Ｍａｌｌｅｙ，Ｂ．Ｗ．，ａｎｄＴｓａｉ，Ｓ．Ｙ．（１９９７）ＧｅｎｅＴｈｅｒａｐｙ４，４３２−４４１］より有意にさらに良い。
【０１０８】
活性化ドメインの配置はキメラ調節体の活性に有意な影響を与えた。しかしながら、好ましい配置は活性化ドメインの性質に依存する。ＶＰ１６ドメインは、Ｃ−末端に配置されると、さらに強力な活性化体を与えた一方で、ＶＰ６４はＮ−末端でさらに活性であった。したがって、直接比較は、Ｎ−末端ＶＰ６４はＮ−末端ＶＰ１６ドメインよりさらに強力であり、そしてＣ−末端ＶＰ１６はＣ−末端ＶＰ６４ドメインよりさらに強力であったことを示した。活性化ドメインの性質および配置はまた、キメラ調節体の基礎活性に影響を与えると見出された。特に、比較的高い基礎活性が、Ｎ−末端ＶＰ６４ドメインを持つ調整体の場合に、観察された。
【０１０９】
ＤＮＡ結合ドメインの性質はキメラのリガンド依存性の程度に主要な影響を与えた。ＤＮＡ結合ドメインとしてのＮ１タンパク質の使用は、Ｂ３の使用より、プロモーター活性の有意に良いひだ刺激を持つ、さらに密に調節した融合構築体に至ったが、これはおそらくＮ１およびＢ３の間の劇的な親和性の相違に因るためであろう。特に、Ｎ１−ＥＲ−ＶＰ６４調節体は何の有意な基礎活性を持たないで、そして１０ｘＮ１−ＴＡＴＡ最少プロモーターについて４６４〜１３１９倍の４−ＯＨＴ−誘導活性化を仲介する能力があった（表１）。３桁の大きさの範囲に及ぶ遺伝子発現のリガンド−誘導活性化の程度は、それが遺伝子調節のテトラサイクリン制御システムについてこれまで報告されているだけなので［Ｇｏｓｓｅｎ，Ｍ．，ａｎｄＢｕｊａｒｄ，Ｈ．（１９９２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８９，５５４７−５５５１；Ｇｏｓｓｅｎ，Ｍ．，Ｆｒｅｕｎｄｌｉｅｂ，Ｓ．，Ｂｅｎｄｅｒ，Ｇ．，Ｍｉｉｌｌｅｒ，Ｇ．，Ｈｉｌｌｅｎ，Ｗ．，ａｎｄＢｕｊａｒｄ，Ｈ．（１９９５）Ｓｃｉｅｎｃｅ２６８，１７６６−１７６９］、特に顕著である。
【０１１０】
多重プロモーターの随伴性調節．亜鉛フィンガー技法により、タンパク質工学の使用に入手可能な、大レパトリ−のＤＮＡ結合特異性体が作られてきた［Ｂｅｅｒｌｉ，Ｒ．Ｒ．，Ｓｅｇａｌ，Ｄ．Ｊ．，Ｄｒｅｉｅｒ，Ｂ．，ａｎｄＢａｒｂａｓ，Ｃ．Ｆ．，ＩＩＩ（１９９８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９５，１４６２８−１４６３３；Ｓｅｇａｌ，Ｄ．Ｊ．，Ｄｒｅｉｅｒ，Ｂ．，Ｂｅｅｒｌｉ，Ｒ．Ｒ．，ａｎｄＢａｒｂａｓ，Ｃ．Ｆ．，ＩＩＩ（１９９９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９６，２７５８−２７６３；Ｂｅｅｒｌｉ，Ｒ．Ｒ．，Ｄｒｅｉｅｒ，Ｂ．，ａｎｄＢａｒｂａｓ，Ｃ．Ｆ．，ＩＩＩ（２０００）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９７，１４９５−１５００］。異なるステロイドホルモン受容体−誘導化調節ドメイン［Ｌｉｔｔｌｅｗｏｏｄ，Ｔ．Ｄ．，Ｈａｎｃｏｃｋ，Ｄ．Ｃ．，Ｄａｎｉｅｌｉａｎ，Ｐ．Ｓ．，Ｐａｒｋｅｒ，Ｍ．Ｇ．，ａｎｄＥｖａｎ，Ｇ．Ｉ．（１９９５）Ｎｕｃｌ．ＡｃｉｄｓＲｅｓ．２３，１６８６−１６９０；Ｗａｎｇ，Ｙ．，Ｘｕ，Ｊ．，Ｐｉｅｒｓｏｎ，Ｔ．，Ｏ’Ｍａｌｌｅｙ，Ｂ．Ｗ．，ａｎｄＴｓａｉ，Ｓ．Ｙ．（１９９７）ＧｅｎｅＴｈｅｒａｐｙ４，４３２−４４１］の入手可能性、および実質的にどの望ましい標的配列にもキメラ調節体を転送する能力は、多重遺伝子の発現を同時に独立して調節することを可能にするであろう。
【０１１１】
この可能性を試験するために、レポータープラスミドを、１０ｘＮ１−ＴＡＴＡ最少プロモーターの制御下でβ−ガラクトシダーゼ（β−ｇａｌ）の発現に向けて構築した。それから、キメラ調節体Ｂ３−ＰＲ−ＶＰ１６およびＮ１−ＥＲ−ＶＰ６４を、ヒーラ細胞中で１０ｘＢ３−ＴＡＴＡ―ｌｕｃおよび１０ｘＮ１−ＴＡＴＡ−β−ｇａｌレポータープラスミドと一緒に過渡的に発現した。トランスフェクトした細胞をＲＵ４８６もしくは４−ＯＨＴで処理し、そしてルシフェラーゼとβ−ｇａｌ活性をモニターした。意義深いことに、ＲＵ４８６は、β−ｇａｌレポーター遺伝子活性に何の影響も与えることなく、ルシフェラーゼの発現を誘導した。４−ＯＨＴは、他方、ルシフェラーゼ発現に影響しなかったが、β−ｇａｌ発現を効果的に活性化した。これらの結果が立証することは、二つの調節体／プロモーター組合せはお互いに独立して作用すること、および多重遺伝子は、望ましいホルモンの選択的添加により効果的にかつ独立して調節され得ることである。
【０１１２】
単量体ホルモン−依存性遺伝子スイッチの開発．ＤＮＡ結合タンパク質を望ましい特異性体をもって工学する能力は、内因性遺伝子に支配的な調節効果を課す能力のある、人工的転写因子を生成することを可能にする［Ｂｅｅｒｌｉ，Ｒ．Ｒ．，Ｄｒｅｉｅｒ，Ｂ．，ａｎｄＢａｒｂａｓ，Ｃ．Ｆ．，ＩＩＩ（２０００）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９７，１４９５−１５００］。この技法を多く応用するためには、内因性遺伝子発現への効果は可逆的であることが望まれるであろう。ステロイドホルモン受容体ＬＢＤの使用は、内因性遺伝子発現の調節を可逆性にさせる潜在性を有する。しかしながら、一つの主な欠点は、ステロイドホルモン受容体、ならびにここで説明したキメラ調節体、は二量体としてＤＮＡに結合するという事実である。かくして、融合タンパク質Ｃ７−ＥＲ−ＶＰ６４をヒーラ細胞中で過渡的に発現したときには、それは単一のＣ７結合部位を保持するレポーター構築体を調節できなかったが、一方ではそれは、二つのＣ７結合部位を有し、それ故に二量体の結合を収容したレポーターを容易に調節した（図２Ｂ）。
【０１１３】
さらに別の問題が起きたのはＣ７　ＤＢＤをＥ２Ｃで置換したときであるが、これは六亜鉛フィンガードメインを含みそして１８−ｂｐ配列５’−ＧＧＧＧＣＣＧＧＡＧＣＣＧＣＡＧＴＧ−３’ （配列番号２９）をがん原遺伝子ｃ−ｃｅｒＢ−２の５’−ＵＴＲ中で認識する［Ｙａｍａｍｏｔｏ，Ｔ．，Ｉｋａｗａ，Ｓ．，Ａｋｉｙａｍａ，Ｔ．，Ｓｅｍｂａ，Ｋ．，Ｎｏｍｕｒａ，Ｎ．，Ｍｉｙａｊｉｍａ，Ｎ．，Ｓａｉｔｏ，Ｔ．，ａｎｄＴｏｙｏｓｈｉｍａ，Ｋ．（１９８６）Ｎａｔｕｒｅ３１９，２３０−２３４；Ｂｅｅｒｌｉ，Ｒ．Ｒ．，Ｓｅｇａｌ，Ｄ．Ｊ．，Ｄｒｅｉｅｒ，Ｂ．，ａｎｄＢａｒｂａｓ，Ｃ．Ｆ．，ＩＩＩ（１９９８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９５，１４６２８−１４６３３］。Ｅ２Ｃ−ＥＲ−ＶＰ６４融合タンパク質は単一のＥ２Ｃ結合部位を保持するレポーター上で、ＥＲ　ＬＢＤの無いＥ２Ｃ−ＶＰ６４融合体と殆んど同じ活性をもって本質的に活性であったし、かつホルモンに良く応答しなかった。明らかに、高い親和性を持つＤＮＡの拡張ストレッチを認識する、大きいＤＮＡ結合ドメインの使用はキメラをホルモン−および二量化−非依存性にさせる。
【０１１４】
この問題を克服するために、我々は、ホルモン−非依存性様式で単一の結合部位を通じて遺伝子発現を調節する能力があるようにデザインした、二つのタイプのＥＲ−ベースのキメラ調節体を生成した。最初の戦略において、ＥＲ　ＬＢＤに融合した工学的亜鉛フィンガータンパク質、ならびにＶＰ６４活性化ドメインからなる、ヘテロ二量体調節体を生成した（図２Ａ）。このヘテロ二量体調節体をヒーラ細胞中で発現したときに、４−ＯＨＴの不存在下でＥ２Ｃ−ＴＡＴＡ−ｌｕｃレポータープラスミド上に有意な活性を何も持たなかった。ホルモンの添加はルシフェラーゼ発現の３〜５倍の刺激に至ったが、これは機能的へテロ二量体の形成を示す。しかしながら、ホルモン−誘導レポーター遺伝子活性化はＥ２Ｃ−ＶＰ６４融合タンパク質によって誘導されたものより有意に低かったが、おそらく少なくとも部分的にＥ２Ｃ−ＥＲおよびＥＲ−ＶＰ６４ホモ二量体の形成に因るのであろう。Ｅ２Ｃ−ＥＲもしくはＥＲ−ＶＰ６４のどちらも単独ではルシフェラーゼ発現を誘導しなかったので、ホモ二量体は不活性であった。
【０１１５】
第二の戦略において、柔軟なポリペプチドリンカーを通じて、一つの単一ポリペプチド中で二量化パートナーＥ２Ｃ−ＥＲおよびＥＲ−ＶＰ６４を結合することにより、融合タンパク質を生成した。長さが１８および３０アミノ酸の二つのリンカーをテストして、タンパク質Ｅ２Ｃ−ｓｃＥＲ／１８−ＶＰ６４およびＥ２Ｃ−ｓｃＥＲ／３０−ＶＰ６４を創成した（図２Ａ）。これらのタンパク質は、分子間よりはむしろ、分子内の二量化を経由して二量化され、それ故に単量体として機能的であると予期された。二つのＥＲ　ＬＢＤの一つの単一鎖融合構築体内への組合せは、さらに効率的なホルモン−誘導二量化を可能にし、それ故にさらに効率的な活性化体を生ずるであろう。実際、Ｅ２Ｃ−ｓｃＥＲ／１８−ＶＰ６４およびＥ２Ｃ−ｓｃＥＲ／３０−ＶＰ６４をヒーラ細胞中で過渡的に発現したとき、それらは、大きくホルモン−依存性な様式でＥ２Ｃ−ＴＡＴＡ−ｌｕｃレポーターを活性化した（図２Ｂ、２Ｃおよび２Ｄ）。かくして、天然ステロイドホルモン受容体のものと同様な応答要素を必要とする二量体調節体を、単量体、リガンド−依存性の転写因子内で成功裏に変化させた。
【０１１６】
ＥｃＲおよびＲＸＲ　ＬＢＤに基づく単量体遺伝子スイッチ．二つのＬＢＤを持つ融合によるリガンド−依存性の単量体遺伝子スイッチの生成は一般的に応用可能な戦略であることを示すために、他の核ホルモン受容体の利用をテストした。特に、ショウジョウバエのエクジソン受容体（ＥｃＲ）のＬＢＤの利用を検討した。ショウジョウバにおいては、この受容体はＥｃＲおよびウルトラスピラクル（ＵＳＰ）遺伝子の生成物の間でヘテロ二量体として機能する［Ｙａｏ，Ｔ．−Ｐ．，Ｆｏｒｍａｎ，Ｂ．Ｍ．，Ｊｉａｎｇ，Ｚ．，Ｃｈｅｒｂａｓ，Ｌ．，Ｃｈｅｎ，Ｊ．−Ｄ．，ＭｃＫｅｏｗｎ，Ｍ．，Ｃｈｅｒｂａｓ，Ｐ．，ａｎｄＥｖａｎｓ，Ｒ．Ｍ．（１９９３）Ｎａｔｕｒｅ３６６，４７６−４７９］。しかしながら、示されてきたことは、ＥｃＲはまた、ＵＳＰの脊椎動物同族体レチノイドＸ受容体（ＲＸＲ）と、エクジソンアゴニストのムリステロンＡもしくはポナステロンＡ（ＰｏｎＡ）に応答して効率的にヘテロ二量化することである［Ｎａｋａｎｉｓｈｉ，Ｋ．（１９９２）Ｓｔｅｒｏｉｄｓ５７，６４９−６５７；Ｙａｏ，Ｔ．−Ｐ．，Ｆｏｒｍａｎ，Ｂ．Ｍ．，Ｊｉａｎｇ，Ｚ．，Ｃｈｅｒｂａｓ，Ｌ．，Ｃｈｅｎ，Ｊ．−Ｄ．，ＭｃＫｅｏｗｎ，Ｍ．，Ｃｈｅｒｂａｓ，Ｐ．，ａｎｄＥｖａｎｓ，Ｒ．Ｍ．（１９９３）Ｎａｔｕｒｅ３６６，４７６−４７９；Ｎｏ，Ｄ．，Ｙａｏ，Ｔ．−Ｐ．，ａｎｄＥｖａｎｓ，Ｒ．Ｍ．（１９９６）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９３，３３４６−３３５１］。
【０１１７】
それ故に、ＥｃＲおよびＲＸＲ　ＬＢＤを使用して、上述のｓｃＥＲキメラに類似の単量体遺伝子スイッチを作製した（図３Ａ）。かくして、ヒトＲＸＲαＬＢＤ（アミノ酸３７３〜６５４）およびショウジョウバエＥｃＲ　ＬＢＤ（アミノ酸２０２〜４６２）をＥ２Ｃ　ＤＢＤおよびＶＰ６４活性化ドメインの間に挿入して、Ｅ２Ｃ−ＲＥ−ＶＰ６４を創成した。この融合構築体においては、二つのＬＢＤは、Ｅ２Ｃ−ｓｃＥＲ／１８−ＶＰ６４中で使用されたと同一の１８アミノ酸の柔軟なリンカーにより連結されている。このキメラ調節体を、Ｅ２Ｃ−ＴＡＴＡ−ｌｕｃレポータープラスミドと一緒にヒーラ細胞中で過度的に発現したときに、有意な基礎活性が観察された。しかしながら、活性をＰｏｎＡにより３−倍増加させることができたので、この人工的構築体はホルモン−応答的であったことを示す。このリガンド依存性を改良するために、ＲＸＲおよびＥｃＲ　ＬＢＤを連結するリンカーの長さを増加したが、これは単鎖ＥＲ構築体の場合に有益であるように見えた手段である。より長いリンカーは、非リガンド化した状態で、ＬＢＤがそれらの接触を最適化してかつ立体配座障害に加えることを可能にするであろう。実際、リンカーを３０アミノ酸（ＥＣ２−ＲＬＥ−ＶＰ６４中）もしくは３６アミノ酸（ＥＣ２−ＲＬＬＥ−ＶＰ６４中）へ延長したときに、基礎活性は有意に減少し、そしてＰｏｎＡは９〜１０倍の活性化に至ったが、応答性の程度は単鎖ＥＲ融合構築体のものと匹敵した（図３Ｂ）。かくして、核ホルモン受容体ＬＢＤ対の順次連結は、単量体のＤＮＡ結合タンパク質をリガンド−依存性にさせる一般的に応用可能な戦術であるように思われる。
【０１１８】
融合タンパク質に使用したｈＰＲおよびｍＥＲ　ＬＢＤは、ｈＰＲ中でアミノ酸６３７および６４４の間に、ならびにｍＥＲ中でアミノ酸２６０および２６７の間に位置する、それらの天然ＳＶ４０−様核局在化シグナル（ＮＬＳ）を包含しなかった［Ｃａｒｓｏｎ−Ｊｕｒｉｃａ，Ｍ．Ａ．，Ｓｃｈｒａｄｅｒ，Ｗ．Ｔ．，ａｎｄ０’Ｍａｌｌｅｙ，Ｗ．（１９９０）ＥｎｄｏｃｒｉｎｅＲｅｖｉｅｗｓ１１，２０１−２２０１］。このＮＬＳはｈＰＲのホルモン−依存性核局在化に必要とされない一方で、ステロイド受容体の細胞以下の局在化の調節は複雑であるように思われ、そしてＳＶ４０−様ＮＬＳの存在がキメラタンパク質の適切な機能に必要であったかどうかは、演繹的には明白でなかった。かくして、ＶＰ１６およびＣ７の間もしくはＣ７およびＬＢＤの間のどちらかで、ＳＶ４０　ＮＬＳ（ＰＫＫＫＲＫＶ）（単一字のアミノ酸コードで配列番号３０）を組み入れた、さらに別の構築体を作製した。
【０１１９】
それから、キメラ転写調節体を、ホルモン依存性様式で１０ｘＣ７−ＴＡＴＡ−ｌｕｃレポータープラスミドを調節するそれらの能力についてテストした。１０ｘＣ７−ＴＡＴＡ−ｌｕｃは、ホタルのルシフェラーゼコード化領域の上流で、５個のヌクレオチドにより間隔を取った１０個のＣ７結合部位［５’−ＧＣＧＴＧＧＧＣＧ−３’］およびＴＡＴＡボックスを含む。それぞれの融合タンパク質は、大きくホルモン依存性の様式でルシフェラーゼの発現を上向き調節した。ＲＵ４８６はＶＰ１６−Ｃ７−ＰＲの活性を２６倍刺激したが、一方４−ＯＨＴはＶＰ１６−Ｃ７−ＥＲの４３倍の活性化に至った。ＲＵ４８６およびＥＲの間もしくは４−ＯＨＴおよびＰＲの間に検出可能な交差反応性は何も無かった。いずれかの位置におけるＮＬＳの存在は、それが、おそらく増加した核局在化を通じて、融合構築体の増加した基礎（即ち、ホルモン−非依存性）活性に至ったので、必要としないばかりでなく望ましくさえ無かった。かくして、ｈＰＲ（アミノ酸６４５〜９１４）およびｍＥＲ（アミノ酸２８１〜５９９、Ｇ５２５Ｒ）ＬＢＤはホルモン−依存性を亜鉛フィンガータンパク質に付与することができる。
【０１２０】
多重遺伝子、もしくは遺伝子のアレル、の発現を可逆的に制御する能力は多くの基礎研究応用に非常に有用であると証明できたであろう。特に、小さくかつ無毒のリガンドによる、一つの遺伝子、しかし別物でない（逆も真）、の選択的でかつ非依存的な発現は、インビトロおよびインビボの両方で、遺伝子機能の比較分析を容認するであろう。我々が示しているのは、標的遺伝子発現を制御するための我々のモジュラーシステムは、ＲＵ４８６−依存性ルシフェラーゼ誘導および４−ＯＨＴ−誘導β−ｇａｌ発現により証明されたように、同一のトランスフェクトした細胞内で二つの遺伝子の発現を、実際、独立して制御することができることである。ＲＵ４８６によるβ−ｇａｌ誘導の欠如および４−ＯＨＴによるルシフェラーゼ誘導は、ここで説明したキメラ調節体の特異性を間違いなく立証する。利用したＤＮＡ結合ドメインの素晴らしい特異性を保持するだけでなく、また、ＲＵ４８６およびＥＲ　ＬＢＤの間、もしくは４−ＯＨＴおよびＰＲ　ＬＢＤの間に検出可能な交差反応はなにも無い。
【図面の簡単な説明】
【図１Ａ】図１は、新規なＤＮＡ結合特異性を持つデザインした亜鉛フィンガータンパク質の生成を示し、図１Ａは三フィンガータンパク質Ｂ３およびＮ１のアミノ酸配列である。肉太の字体で示す、ＤＮＡ認識へリックス位置の−２〜６が、三フィンガータンパク質Ｓｐ１Ｃのフレームワークの中に移植された。逆並行βシートおよびαへリックスの位置、亜鉛フィンガードメインのホールマークは示すごとくである。それぞれのフィンガーのＤＮＡ結合特異性は左に示されている。Ｆ１〜３はフィンガー１〜３である。
【図１Ｂ】図１は、新規なＤＮＡ結合特異性を持つデザインした亜鉛フィンガータンパク質の生成を示し、図１ＢはＤＮＡ結合特異性のＥＬＩＳＡ分析である。亜鉛フィンガータンパク質は、ＭＢＰ融合体として大腸菌中で発現され、精製されたものである。結合特異性は、示した５’−（ＧＮＮ）_３−３’ 配列を含む固定化、ビオチン化ヘアピンオリゴヌクレオチドへの結合を測定することにより分析された。黒色の棒線はＢ３であり；灰色の棒線はＮ１である。最大のシグナルは１に正規化された。特異的標的配列への結合についてのＫ_Ｄ値は、電気泳動移動度シフトアッセイにより測定されたもので、相当する棒線の上にラベルされている。
【図２】図２は、ホルモン依存性、単鎖ＥＲ融合構築体の遺伝子発現の調節を示し、図２ＡはＥＲ融合タンパク質の構造である。Ｅ２Ｃは六フィンガータンパク質であり；Ｌは柔軟なペプチドリンカーである。図２Ｂは、二量体として単一のＥＲ−ＬＢＤ結合を持つ融合タンパク質である。ヒーラ細胞は、Ｃ７−ＥＲ−ＶＰ６４発現ベクターおよび、一つもしくは二つのどちらかのＣ７結合部位を保持する、示したＴＡＴＡルシフェラーゼのレポータープラスミドで共トランスフェクトされた。トランスフェクションの２４時間後に、細胞を未処理で放置するか（−）もしくは１００ｎＭの４−ＯＨＴを加える（＋）かをした。全細胞抽出物中のルシフェラーゼ活性はトランスフェクションの４８時間後に測定された。それぞれの棒線は二回測定の平均値（±ＳＤ）を提示する。図２Ｃは融合タンパク質を発現しない制御プラスミドｐｃＤＮＡ３である。図２Ｃ、Ｄは、二つのＥＲ−ＬＢＤを持つ融合タンパク質により単一の結合部位を通じる転写の調節である。ヒーラ細胞は、示した発現ベクターおよびＴＡＴＡボックスの上流に単一のＥｃ２結合部位を保持する、Ｅ２Ｃ−ＴＡＴＡ−ルシフェラーゼのレポータープラスミドで共トランスフェクトされ、そして４−ＯＨＴ誘導およびルシフェラーゼ活性の測定は図２Ｂでの説明のように行われた。
【図３】図３は、ホルモン依存性、単鎖ＲＸＲ／ＥｃＲ融合構築体の遺伝子発現の調節を示す。図３ＡはＲＸＲ／ＥｃＲ融合タンパク質の構造である。図３Ｂは、単一の結合部位を通じる転写の調節である。ヒーラ細胞は、示した発現ベクターおよび、単一のＥｃ２結合部位を保持する、ＴＡＴＡルシフェラーゼのレポータープラスミドで共トランスフェクトされた。トランスフェクションの２４時間後に、細胞を未処理で放置するか（−）もしくは５ｎＭのポナステロンＡを加える（＋）かをした。全細胞抽出物中のルシフェラーゼ活性はトランスフェクションの４８時間後に測定された。それぞれの棒線は二回測定の平均値（±ＳＤ）を提示する。ｐｃＤＮＡ３．１は融合タンパク質を発現しない制御プラスミドである。
【図４】図４は、亜鉛フィンガー結合ドメインＢ３Ｂのヌクレオチド（配列番号３１）およびアミノ酸残基配列（配列番号３２）を示す。
【図５】図５は、亜鉛フィンガー結合ドメイン２Ｃ７のヌクレオチド（配列番号３３）およびアミノ酸残基配列（配列番号３４）を示す。
【図６】図６は、亜鉛フィンガー結合ドメインＢ３Ｃ２のヌクレオチド（配列番号３５）およびアミノ酸残基配列（配列番号３６）を示す。
【図７】図７は、抑制ドメイン（ＫＲＡＢ−Ａ）２のヌクレオチド（配列番号３７）を示す。
【図８】図８は、抑制ドメイン（ＳＩＤ）２のヌクレオチド（配列番号３８）を示す。
【図９】図９は、ポリペプチドＥ２Ｃ−ＥＲ−Ｌ−ＥＲ−ＶＰ６４のヌクレオチド（配列番号３９）およびアミノ酸残基配列（配列番号４０）を示す。
【図１０】図１０は、ポリペプチドＥ２Ｃ−ＥＲ−ＬＬ−ＥＲ−ＶＰ６４のヌクレオチド（配列番号４１）およびアミノ酸残基配列（配列番号４２）を示す。

Claims

第一機能性ドメインに機能するように結合した核ホルモン受容体から誘導化される二つのリガンド結合ドメインを含む非天然由来のポリペプチド。
二つのリガンド結合ドメインがペプチドリンカーにより共有結合されている、請求項１に記載のポリペプチド。
リンカーが約１５〜約４０個のアミノ酸残基を含んでいる、請求項２に記載のポリペプチド。
リンカーが約１５〜約３５個のアミノ酸残基を含んでいる、請求項２に記載のポリペプチド。
リンカーが約１８〜約３０個のアミノ酸残基を含んでいる、請求項２に記載のポリペプチド。
第一および第二リガンド結合ドメインが異なる核ホルモン受容体から誘導化されている、請求項１に記載のポリペプチド。
第一および第二結合ドメインが同一の核ホルモン受容体から誘導化されている、請求項１に記載のポリペプチド。
核ホルモン受容体が、エストロゲン受容体、プロゲステロン受容体、エクジソン受容体もしくはレチノイドＸ酸受容体である、請求項１に記載のポリペプチド。
少なくとも一つのリガンド結合ドメインがレチノイドＸ酸受容体から誘導化される、請求項７に記載のポリペプチド。
第一機能性ドメインが、ＤＮＡ結合ドメインである、請求項１に記載のポリペプチド。
ＤＮＡ結合ドメインが少なくとも一つの亜鉛フィンガーＤＮＡ結合モチーフを含む、請求項１０に記載のポリペプチド。
２〜１２個の亜鉛フィンガーＤＮＡ結合モチーフを含む、請求項１１に記載のポリペプチド。
２〜６個の亜鉛フィンガーＤＮＡ結合モチーフを含む、請求項１１に記載のポリペプチド。
亜鉛フィンガーＤＮＡ結合モチーフが、式中ＧはグアニジンでありそしてＮはいかなるヌクレオチドである、式（ＧＮＮ）_１〜６のヌクレオチド配列に特異的に結合する、請求項１１に記載のポリペプチド。
第一機能性ドメインが、転写調節ドメインである、請求項１に記載のポリペプチド。
一つのリガンド結合ドメインもしくは第一機能性ドメインのどちらかに機能するように結合した第二機能性ドメインをさらに含む、請求項１に記載のポリペプチド。
第一機能性ドメインがＤＮＡ結合ドメインでありそして第二機能性ドメインが転写調節ドメインである、請求項１６に記載のポリペプチド。
ＤＮＡ結合ドメインが少なくとも一つの亜鉛フィンガーＤＮＡ結合モチーフを含む、請求項１６に記載のポリペプチド。
２〜１２個の亜鉛フィンガーＤＮＡ結合モチーフを含む、請求項１８に記載のポリペプチド。
２〜６個の亜鉛フィンガーＤＮＡ結合モチーフを含む、請求項１８に記載のポリペプチド。
亜鉛フィンガーＤＮＡ結合モチーフが、式中ＧはグアニジンでありそしてＮはいかなるヌクレオチドである、式（ＧＮＮ）_１〜６のヌクレオチド配列に特異的に結合する、請求項１８に記載のポリペプチド。
転写調節ドメインが活性化ドメインである、請求項１７に記載のポリペプチド。
転写調節ドメインが抑制ドメインである、請求項１７に記載のポリペプチド。
（ａ）２〜６個の亜鉛フィンガーＤＮＡ結合モチーフを有するＤＮＡ結合ドメイン；（ｂ）ＤＮＡ結合ドメインに機能するように結合したレチノイドＸ受容体から誘導化される第一リガンド結合ドメイン、１８〜３６個のアミノ酸残基のペプチドスペーサーを持つ第一リガンド結合ドメインに機能するように結合したエクジソン受容体から誘導化される第二リガンド結合ドメイン；および（ｃ）第二リガンド結合ドメインに機能するように結合した転写調節ドメイン、を含む非天然由来のポリペプチド。
（ａ）３〜６個の亜鉛フィンガーＤＮＡ結合モチーフを有するＤＮＡ結合ドメイン；（ｂ）ＤＮＡ結合ドメインに機能するように結合したプロゲステロン受容体から誘導化される第一リガンド結合ドメイン、１８〜３６個のアミノ酸残基のペプチドスペーサーを持つ第一リガンド結合ドメインに機能するように結合したプロゲステロン受容体から誘導化される第二リガンド結合ドメイン；および（ｃ）第二リガンド結合ドメインに機能するように結合した転写調節ドメイン、を含む非天然由来のポリペプチド。
請求項１に記載のポリペプチドをコード化する、ポリヌクレオチド。
請求項１７に記載のポリペプチドをコード化する、ポリヌクレオチド。
請求項２６に記載のポリヌクレオチドを含む、発現ベクター。
請求項２７に記載のポリヌクレオチドを含む、発現ベクター。
請求項２６に記載のポリヌクレオチドを含む、細胞。
請求項２７に記載のポリヌクレオチドを含む、細胞。
請求項２８に記載の発現ベクターで形質転換される、宿主細胞。
請求項２９に記載の発現ベクターで形質転換される、宿主細胞。
規定した配列を含む標的ヌクレオチドの機能を調節するプロセスであって、ポリペプチドのＤＮＡ結合ドメインが規定した配列に結合する、ポリペプチドのリガンド結合ドメインの一つに結合するドメインの存在下に標的ヌクレオチドを請求項１に記載のポリペプチドに露出させることを含む、プロセス。
規定した配列を含む標的ヌクレオチドの機能を調節するプロセスであって、ポリペプチドの機能性ドメインが標的ヌクレオチドの機能を変える、ポリペプチドのリガンド結合ドメインの一つに結合するドメインの存在下に標的ヌクレオチドを請求項１７に記載のポリペプチドに露出させることを含む、プロセス。