KR20240055838A - 유도된 만능 줄기 세포 유래된 세포의 조성물 및 이의 사용 방법 - Google Patents

유도된 만능 줄기 세포 유래된 세포의 조성물 및 이의 사용 방법 Download PDF

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징 리우
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Abstract

본원 개시내용은 신경변성 질환의 진단, 예후 및 치료를 위한 새로운 표적, 바이오마커 및 치료학적 제제를 동정하는 것과 같은 신경 염증 연구를 위한 다세포 배양 모델을 제공한다. 본원에서는 본 세포 배양 모델을 사용하여 신경염증을 연구하기 위한 검정이 추가로 제공된다.

Description

유도된 만능 줄기 세포 유래된 세포의 조성물 및 이의 사용 방법
우선권 주장
[0001] 본 출원은 2021년 9월 10일자로 출원된 미국 가출원 번호 제63/242,900호에 대한 우선권을 주장하고, 이의 전문은 본원에 참조로 인용된다.
서열 목록의 도입
[0002] 본 출원은 전자적으로 제출된 서열 목록 XML을 포함하고, 이는 이의 전문이 참조로 인용된다. 2022년 9월 12일자로 생성된 상기 XML 서열목록은 파일명이 CDINP0110WO.xml이며, 크기가 2,828 바이트이다.
1. 분야
[0003] 본 발명은 일반적으로 분자 생물학 및 의약 분야에 관한 것이다. 보다 특히, 세포 분화 형태 유도된 만능 줄기 세포의 조성물 및 이의 사용 방법에 관한 것이다.
2. 관련 분야의 기재
[0004] 면역 기능 및 특히 조직 내 상주 대식세포는 질환 발병에 통합적 역할을 수행한다. 예를 들어, 신경 면역 축과 뇌 상주 대식세포인 미세아교세포는 알츠하이머 질환을 포함한 신경변성 질환 병태생리학에서 필수적인 역할을 하며, 이는 게놈 광범위 연관성 연구(Genome-wide Association Studies)와 오믹스(Omics) 연구 모두에서 뒷받침된다. 또한 조직 상주 대식세포는 NASH(쿠퍼(Kupffer) 세포), AMD(망막하 미세아교세포), 천식, COPD(폐포 대식세포), 및 HIV의 발병 기전에서 중요한 역할을 수행한다. 또한 수많은 연구에서 지질 조절 기능 장애가 망막 미세아교세포 드루젠 형성, 죽상 경화성 플라크 형성(말초 대식세포), 폐 거품 세포 및 뇌 AD 신경 병리에 기여하는 것으로 밝혀졌다. 조직 상주 대식세포의 지질 기능 장애가 항상성 기능에 어떻게 영향을 미치는지 이해하면 염증을 병인으로 하는 다양한 만성 질환을 치료하는 데 도움이 될 수 있다.
발명의 개요
[0005] 일부 구현예에서, 본원의 개시내용은 유도된 만능 줄기 세포(iPSC) 유래 미세아교세포, 성상 세포 및/또는 뉴런을 포함하는 세포 배양물을 배지 내에 제공한다. 본원에서는 세포 배양물의 제조 방법 및 이의 사용 방법이 추가로 제공된다.
[0006] 특정 양상에서, 배양물은 iPSC 유래된 미세아교세포, 성상세포 및 뉴런을 포함한다. 특정 양상에서, 세포 배양물은 삼배양물로 추가로 정의된다.
[0007] 일부 양상에서 뉴런은 흥분성 뉴런 또는 억제성 뉴런이다. 특정 양상에서 뉴런은 가바성 (gabaergic) 뉴런, 도파민성 뉴런 또는 글루타메이트성 뉴런이다.
[0008] 특정 양상에서 미세아교세포는 동질유전자적으로 가공된 iPSC 세포주로부터 유래한다. 특정 양상에서, 미세아교세포, 성상세포 및 뉴런은 동질유전자성이다. 일부 양상에서, 미세아교세포는 TREM2, P2RY12, TMEM119, IBA-1, 및/또는 CX3CR1에 대해 적어도 90% (예를 들어, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100%) 양성이다. 특정 양상에서 미세아교세포는 성숙한 미세아교세포이다. 특정 양상에서, 성상세포는 S100 베타, GFAP 및 CD44에 대해 양성이다. 일부 양상에서, 뉴런은 SCL1, BCL11B, Calb2, CD24, CDH1, CUX1 Cux2, DCX, DLG4, Dlx, Dlx2, Emx1, Emx2, eomes, ETV1, FOXG1, FOXP2, Fut4, GABRA2, GAD1, GAD2, GAPDH, GFAP, GRIN2B, HoxB4, HTR2C, ISL1, ITGB1, LHX2, Neurog1, NKX2-1, Nos1, NPY, NR4A2, PAX6, POU3F2, PVALB, RELN, SATB2, SLC17A6, SLC17A7, SLC17A8, SLC32A1, SOX1, Sox10, SST, SYN1, 및 Tbr1로 이루어진 그룹으로부터 선택된 적어도 2개(예를 들어, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10개 이상)의 마커에 대해 양성이다.
[0009] 특정 양상에서, 미세아교세포는 질환 관련 SNP를 발현하는 공여자로부터 유래한다. 일부 양상에서, 미세아교세포는 TREM2, APOE, CD33, BIN, ABCA7, SNPS 또는 신경변성과 관련된 유전자형을 갖는 질환 관련 iPSC 공여자로부터 생성된다. 일부 양상에서 미세아교세포는 TREM2, 메틸-CpG 결합 단백질 2(MeCP2) 및/또는 알파-시누클레인(SCNA)의 장애를 포함한다 특정 양상에서, 미세아교세포는 TREM2의 장애를 포함한다. 예를 들어, TREM2의 장애는 TREM2의 엑손 2에 있는 아미노산 58에서 TAL 뉴클레아제 매개 장애를 포함한다. 일부 양상에서, 미세아교세포는 TREM2의 이형접합성 장애를 포함한다. 다른 양상에서, 미세아교세포는 TREM2의 동형접합성 장애를 포함한다.
[0010] 일부 양상에서, 세포 배양물은 2차원(2D) 배양물이다. 특정 양상에서, 배지는 IL-34 및 M-CSF 또는 이들의 유사체 또는 모방체를 추가로 포함한다. 예를 들어, 배지는 50-200ng/mL(예를 들어, 50, 75, 100, 150, 175 또는 200ng/mL, 특히 100ng/mL)의 농도의 IL-34와 10-50ng/mL(예를 들어, 10, 25, 30, 40 또는 50ng/mL, 특히 25ng/mL)의 농도의 M-CSF를 추가로 포함한다. 추가적인 양상에서, 배지는 예를 들어, 10-100 ng/mL(예를 들어, 10, 25, 30, 40, 50, 75, 80, 90 또는 100 ng/mL, 특히 50 ng/mL)의 농도로 TGFβ 또는 이의 유사체 또는 모방체를 추가로 포함한다.
[0011] 일부 양상에서, 세포는 세포 표면 상에서 배양하거나 위치시킨다. 특정 양상에서, 세포는 폴리에틸렌이민(PEI)으로 코팅된 표면상에서 배양된다. 특정 양상에서, 세포는 세포외 매트릭스 단백질로 코팅된 표면상에서 배양된다. 특정 양상에서, 세포외 매트릭스는 뮤린 Engelbreth-Holm-Swarm 종양으로부터 정제된 기저막 추출물(BME)이다. 일부 양상에서, 세포외 매트릭스 단백질은 MATRIGEL®, GELTREX™, 콜라겐 또는 라미닌이다. 예를 들어, 세포외 매트릭스 단백질은 GELTREX™ 또는 라미닌이다.
[0012] 일부 양상에서, 세포 배양물은 3차원(3D) 배양물이다. 특정 양상에서, 3D 배양물은 뇌 오가노이드 배양물이다. 일부 양상에서 3D 배양물은 기능적 신경망을 포함한다. 특정 양상에서, 기능성 신경망은 칼슘 진동(calcium oscillation)을 포함한다.
[0013] 일부 양상에서, 배양물은 약 3:1 내지 1:3, 특히 약 2:1 내지 1:2, 예를 들어 약 1:1의 비율로 존재하는 미세아교세포와 성상세포를 포함한다. 특정 양상에서, 미세아교세포와 성상세포를 3:1 내지 1:3, 특히 약 2:1 내지 1:2, 예를 들어, 약 1:1의 비율로 배양물에 씨딩하였다. 특정 양상에서, 배양물은 미세아교세포, 성상세포 및 뉴런을 약 1:1:5 내지 1:1:10, 예를 들어, 1:1:6, 1:1:7, 1:1:8, 1:1:9 또는 1:1:10의 비율로 포함한다. 특정 양상에서, 배양물은 1:1:5, 1:1:6, 1:1:7, 1:1:8, 1:1:9 또는 1:1:10, 특히 약 1:1:5와 같은 약 1:1:5 내지 1:1:10의 비율로 씨딩된 미세아교세포, 성상 세포 및 뉴런을 포함한다. 일부 양상에서, 미세아교세포, 성상세포 및 뉴런은 약 3:1:5, 3:1:6, 3:1:7, 3:1:8, 3:1:9, 3:1:10, 3:2:5, 3:2:6, 3:2:7, 3:2:8, 3:2:9, 3:2:10; 1:3:5, 1:3:6, 1:3:7, 1:3:8, 1:3:9, 1:3:10, 2:3:5, 2:3:6, 2:3:7, 2:3:8, 2:3:9, 2:3:10, 2:1:5: 2:1:6, 2:1:6, 2:1:7, 2:1:8, 2:1:9, 2:1:10, 1:2:5, 1:2:6, 1:2:7, 1:2:8, 1:2:9, 또는 1:2:10 또는 이들 내에서 유래할 수 있는 임의의 범위와 같은 약 3:1:5 내지 1:3:10의 비율로 있다. 일부 양상에서, 미세아교세포, 성상세포 및 뉴런은 약 3:1:5, 3:1:6, 3:1:7, 3:1:8, 3:1:9, 3:1:10, 3:2:5, 3:2:6, 3:2:7, 3:2:8, 3:2:9, 3:2:10; 1:3:5, 1:3:6, 1:3:7, 1:3:8, 1:3:9, 1:3:10, 2:3:5, 2:3:6, 2:3:7, 2:3:8, 2:3:9, 2:3:10, 2:1:5: 2:1:6, 2:1:6, 2:1:7, 2:1:8, 2:1:9, 2:1:10, 1:2:5, 1:2:6, 1:2:7, 1:2:8, 1:2:9, 또는 1:2:10 또는 이들 내에서 유래할 수 있는 임의의 범위와 같은 약 3:1:5 내지 1:3:10의 비율로 씨딩하였다. 일부 양상에서, 배양물은 5,000세포/웰 내지 7,500세포/웰의 세포 밀도로 씨딩된 미세아교세포를 포함한다. 특정 양상에서, 배양물은 40,000세포/웰 내지 50,000세포/웰의 세포 밀도로 씨딩된 뉴런을 포함한다. 일부 양상에서, 배양물은 8,000 세포/웰 내지 10,000 세포/웰의 세포 밀도로 씨딩된 성상세포를 포함하고, 상기 배양물은 15,625 세포/cm2 내지 23,438 세포/cm2와 같이 15,000 세포/cm2 내지 25,000 세포/cm2의 세포 밀도로 미세아교세포를 포함한다. 일부 양상에서, 배양물은 125,000 세포/cm2 내지 160,000 세포/cm2의 세포 밀도, 예를 들어, 125,000 세포/cm2 내지 156,250 세포/cm2의 세포 밀도로 뉴런을 포함한다. 특정 양상에서, 배양물은 25,000 세포/cm2 내지 35,000 세포/cm2의 세포 밀도, 예를 들어, 25,000 세포/cm2 내지 31,250 세포/cm2의 세포 밀도로 성상세포를 포함한다.
[0014] 특정 양상에서 미세아교세포, 성상세포 및 뉴런은 적어도 10일 동안, 예를 들어, 적어도 11일, 12일, 13일, 14일, 15일, 16일, 17일, 18일, 19일, 20일 이상 동안 배양물 중에 있다. 특정 양상에서, 미세아교세포, 성상세포, 뉴런은 적어도 14일에 배양물 중에 있다. 일부 양상에서, 미세아교세포, 성상세포 및 뉴런은 적어도 14일에 배양물 중에 있고, 2:6:1의 비율로 존재한다. 일부 양상에서, 미세아교세포, 성상세포 및 뉴런은 적어도 14일에 배양물 중에 있고 약 15:1:1 내지 1:15:30, 예를 들어 약 10:1:1 내지 1:10:20, 약 8:1:1 내지 1:8:20, 약 5:1:1 내지 1:5:20 또는 약 3:1:1 내지 1:3:20의 비율로 존재한다.
[0015] 일부 양상에서, iPSC는 사람이다. 특정 양상에서, 제노 무함유(xeno-free), 피더(feeder) 무함유 및/또는 컨디셔닝된 배지 무함유이다. 특정 양상에서, 배지는 합성 배지이다.
[0016] 또 다른 구현예는 미세아교세포와 뉴런을 배양하기 위한 방법을 제공한다. 일부 양상에서, 미세아교세포 및 뉴런은 동질유전자성이다. 일부 양상에서, 뉴런은 GABA성 또는 글루타메이트성 뉴런이다. 특정 양상에서, GABA성 또는 글루타메이트성 뉴런 및 성상 세포의 공동 배양물은 미세아교세포의 단일 배양물에 비해 미세아교세포에 의한 증진된 식세포작용 활성을 초래한다. 일부 양상에서, 상기 방법은 가용성 TREM2를 검출함을 추가로 포함한다. 일부 양상에서, 성상세포는 동질유전자성이다.
[0017] 추가의 구현예는 뇌 미세혈관 내피세포(BMEC), 혈관주위세포 및 성상세포를 샌드위치 형태로 포함하는 세포 배양물을 제공한다. 특정 양상에서, 배양물은 추가로 혈뇌 장벽 모델로서 정의된다.
[0018] 일부 양상에서 샌드위치 형태는 2개 세포 층 사이에 세포 외 매트릭스 층을 포함한다. 특정 양상에서, 세포외 매트릭스 층은 적어도 2개의 세포 외 매트릭스 단백질을 포함한다. 예를 들어, 적어도 2개의 세포 외 매트릭스 단백질은 콜라겐 IV 및 피브로넥틴이다. 특정 양상에서, 샌드위치 형태는 정단면에는 BMEC, 중간에는 세포외 매트릭스 층, 및 기저측면에는 성상세포와 혈관주위세포를 포함한다. 일부 양상에서, 세포 외 매트릭스 층은 겔라틴을 추가로 포함한다.
[0019] 특정 양상에서, 샌드위치 형태는 추가로 투과성 막 삽입체를 포함한다. 일부 양상에서 투과성 막 삽입체는 폴리테트라플루오로에틸렌(PFTE), 폴리카보네이트 또는 폴리에틸렌 테레프탈레이트(PTE) 삽입체이다. 일부 양상에서 투과성 막 삽입체는 PFTE 삽입체이다. 예를 들어, PFTE 삽입체는 TRANSWELL™ 삽입체이다. 일부 양상에서 투과성 막 삽입체는 정단 측면에 사람 콜라겐 IV와 사람 피브로넥틴으로 코팅되어 있다. 일부 양상에서, 투과성 막 삽입체는 200, 250, 300, 350 또는 400 μg/mL와 같은 200-400 μg/mL 농도의 사람 콜라겐 IV 및 50, 75 또는 100 μg/mL와 같은 50-100 μg/mL 농도의 사람 피브로넥틴으로 코팅된다. 특정 양상에서, 투과성 막 삽입체의 기저측면은 0.01-0.2% 겔라틴, 특히 약 0.1% 겔라틴과 같은 겔라틴으로 코팅된다.
[0020] 일부 양상에서, 성상 세포와 혈관주위세포는 약 2:1 비율과 같은 약 2:1 내지 1:2의 비율로 존재한다. 일부 양상에서, 성상 세포와 혈관주위세포는 약 2:1 비율과 같은 약 2:1 내지 1:2의 비율로 배양물에 씨딩한다. 일부 양상에서, 성상 세포와 혈관주위세포는 투과성 막 삽입체의 기저측면상에 있다. 특정 양상에서, BMEC는 투과성 막 삽입체의 정단 측면상에 있다.
[0021] 특정 양상에서, BMEC는 EFRA2를 포함하는 배지에 있다. 일부 양상에서, BMEC, 성상세포 및 혈관주위세포는 Y-27632와 같은 ROCK 억제제를 포함하는 배지에 있다.
[0022] 일부 양상에서, BMEC, 성상 세포 및 혈관주위세포는 약 5:1:1 내지 1:3:3, 예를 들어, 4:1:2, 4:1:1, 4:2:1 또는 2:1:1의 비율로 존재한다. 일부 양상에서, BMEC, 성상 세포 및 혈관주위세포는 약 5:1:1 내지 1:3:3, 예를 들어, 4:1:2, 4:1:1, 4:2:1 또는 2:1:1의 비율로 씨딩한다. 일부 양상에서, BMEC는 1x106 세포/cm2 내지 1.5x106 세포/cm2의 세포 밀도, 예를 들어, 약 1.3x106의 세포 밀도로 씨딩한다. 특정 양상에서, 성상 세포는 300,000 세포/cm2 내지 700,000 세포/cm2의 세포 밀도, 예를 들어, 333,000 세포/cm2의 세포 밀도로 씨딩한다. 특정 양상에서, 혈관주위세포는 300,000 세포/cm2 내지 700,000 세포/cm2의 세포 밀도, 예를 들어, 666,000 세포/cm2의 세포 밀도로 씨딩한다.
[0023] 또 다른 구현예는 신경변성 질환을 치료하기 위한 치료학적 화합물을 스크리닝하는 방법을 제공하고, 상기 방법은 본원 구현예 및 이의 양상의 배양물(예를 들어, 유도된 만능 줄기 세포(iPSC) 유래된 미세아교세포, 성상 세포 및/또는 뉴런을 배지 중에 포함하는 세포 배양물 또는 뇌 미세혈관 내피 세포(BMEC), 혈관주위세포 및 성상 세포를 샌드위치 형태로 포함하는 세포 배양물)과 시험 화합물을 접촉시키는 단계; 및 세포의 기능적 활성을 측정하는 단계를 포함한다.
[0024] 일부 양상에서 기능적 활성의 증가는 시험 화합물이 신경변성 질환을 치료할 수 있음을 지적한다. 특정 양상에서 기능적 활성 측정은 수상돌기 면적(MAP2), 시냅스 수, 세포 수 또는 축삭 면적을 측정함을 포함한다. 특정 양상에서, 기능적 활성의 측정은 미세아교세포로부터 보체 C3의 방출을 검출하는 것을 포함한다. 특정 양상에서 미세아교세포에서 방출되는 보체 C3의 감소는 치료학적 화합물이 신경변성 질환을 치료할 수 있음을 지적한다.
[0025] 특정 양상에서, 상기 방법은 추가로 LPS와 배양물을 접촉시킴을 포함한다. 일부 양상에서 기능적 활성 측정은 LPS 자극 유무하에 배지에서 방출되는 분석물을 측정하는 것을 포함한다. 예를 들어, 분석물은 TNF 알파, IL-6, CCL2, CCL3, CCL4, IL-1 베타, IL-12, IL-13, IL-8, 인터페론 감마, IL1-Alpham FAS 리간드, IL-2, GMCSF, 그랜자임 B, ICAM-1 및/또는 CXCL11와 같은 M1 인자이다. 특정 양상에서 분석물은 IL-4, IL-10, IL-21, VEGF, CCL5, IL-17, IL1-RII, GCSG, CXCL5와 같은 M2 인자이다.
[0026] 특정 양상에서, 상기 방법은 TREM2 야생형 미세아교세포를 갖는 배양물, TREM2 이형접합성 녹아웃 미세아교세포를 갖는 배양물 및/또는 TREM2 동형접합성 녹아웃 미세아교세포를 갖는 배양물을 포함한다.
[0027] 일부 양상에서 기능적 활성 측정은 칼슘 신호 전달 또는 미세전극 배열(MEA)에 의해 신경 기능을 측정함을 포함한다. 특정 양상에서 기능적 활성 측정은 아밀로이드 베타 식세포작용 기능을 측정함을 포함한다.
[0028] 특정 양상에서, 신경변성 질환은 알츠하이머 질환 또는 다발성 경화증이다.
[0029] 추가의 구현예는 신경변성 질환의 모델로서 본원의 구현예 및 이의 양상의 배양물(예를 들어, 유도된 만능 줄기 세포(iPSC) 유래된 미세아교세포, 성상 세포 및/또는 뉴런을 배지 중에 포함하는 세포 배양물 또는 뇌 미세혈관 내피 세포(BMEC), 혈관주위세포 및 성상 세포를 샌드위치 형태로 포함하는 세포 배양물)의 용도를 제공한다.
[0030] 일부 양상에서, 상기 모델은 TREM2 야생형 미세아교세포를 갖는 배양물, TREM2 이형접합성 녹아웃 미세아교세포를 갖는 배양물 및/또는 TREM2 동형접합성 녹아웃 미세아교세포를 갖는 배양물을 포함한다. 특정 양상에서, 상기 모델은 APOE4/4, CD33, ABCA, BIN1 또는 R47H의 질환 관련 유전자형 SNP 또는 돌연변이를 보유한 가공되거나 환자 특이적 iPSC 유래 성상세포, 뉴런 및/또는 미세아교세포를 포함한다.
[0031] 또 다른 구현예는 신경변성 질환에 대한 스크리닝 방법을 제공하고, 상기 방법은 본원 구현예 및 이의 양상의 배양물(예를 들어, 유도된 만능 줄기 세포(iPSC) 유래된 미세아교세포, 성상 세포 및/또는 뉴런을 배지 중에 포함하는 세포 배양물 또는 뇌 미세혈관 내피 세포(BMEC), 혈관주위세포 및 성상 세포를 샌드위치 형태로 포함하는 세포 배양물)에서 일정 수준의 가용성 TREM2를 검출하는 단계를 포함한다.
[0032] 일부 양상에서, 배양물 중의 세포는 동질유전자적으로 가공된 iPSC 세포주로부터 또는 질환 관련 SNP 또는 신경변성과 관련된 돌연변이를 발현하는 공여자로부터 유래한다. 특정 양상에서 가용성 TREM2의 수준은 컨디셔닝된 배지에서 검출된다. 일부 양상에서, 검출은 ELISA를 수행함을 포함한다. 일부 양상에서, 대조군과 비교하여 가용성 TREM2 수준이 증가하면 신경변성 질환이 존재함을 지적한다. 일부 양상에서, 상기 방법은 추가로 미세아교세포 중에 COMT, NRXN2 및/또는 SST의 수준을 검출하는 단계를 포함한다. 특정 양상에서, 신경변성 질환은 알츠하이머 질환 또는 다발성 경화증이다.
[0033] 본원 개시내용의 추가의 구현예는 유도된 만능 줄기 세포(iPSC)를 분화시키기 위한 시험관내 방법을 위한 방법 및 조성물을 제공하고, 상기 방법은: (a) 세포 외 매트릭스 단백질 부재하에 하전된 표면상에서 iPSC를 배양하는 단계; 및 (b) iPSC를 내피 세포, 중간엽 줄기세포(MSC) 또는 조혈 전구 세포(HPC)로 분화시키는 단계를 포함한다.
[0034] 일부 양상에서, 하전된 표면은 양으로 하전되어 있다. 특정 양상에서 양으로 하전된 표면은 아민 표면 또는 폴리 L 라이신 표면이다. 특정 양상에서, 양으로 하전된 표면은 질소 함유 기능성 그룹을 포함한다. 다른 양상에서, 하전된 표면은 음으로 하전되어 있다. 특정 양상에서, 음으로 하전된 표면은 카복실 표면이다. 특정 양상에서, 음으로 하전된 표면은 산소 함유 기능성 그룹을 포함한다. 일부 양상에서, 하전된 표면은 중합체 표면이다. 예를 들어, 중합체 표면은 폴리스티렌 표면이다. 특정 양상에서 하전된 표면은 양으로 하전된 그룹과 음으로 하전된 그룹을 포함한다. 일부 양상에서 양으로 하전된 그룹은 질소 함유 그룹이고 음으로 하전된 그룹은 산소 함유 그룹이다.
[0035] 특정 양상에서, iPSC는 무혈청 합성 배지에서 배양한다. 일부 양상에서, 분화는 블레비스타틴 또는 H1152와 같은 ROCK 억제제의 존재 하에서 배양함을 포함한다. 특정 양상에서, 상기 방법은 라미닌, 피브로넥틴, 비트로넥틴, MATRIGEL™, 테나신, 엔탁틴, 트롬보스폰딘, 엘라스틴, 겔라틴 또는 콜라겐과 같은 세포 외 매트릭스 단백질이 부재이거나 필수적으로 부재이다.
[0036] 추가의 양상에서, 상기 방법은 단계 (a)전에 TREM2, MeCP2 및/또는 SCNA의 발현이 중단되도록 iPSC를 가공하는 것을 추가로 포함한다. 특정 양상에서, 가공은 TAL 뉴클레아제를 사용하여 TREM2의 엑손 2에 indel을 도입하는 것을 포함한다. 일부 양상에서, MeCP2의 중단된 발현은 MeCP2 단백질의 절단된 돌연변이체로서 정의된다. 특정 양상에서, 중단된 발현은 A53T와 같은 미스센스 포인트 돌연변이로 인한 것이다.
[0037] 일부 양상에서, 상기 방법은 전구 세포를 내피 세포로 분화시키는 것을 포함한다. 특정 양상에서, 단계 (a)는 전구 세포를 생성하기 위해 아민 표면상에서 배양하는 것을 포함하고, 단계 (b)는 내피 세포를 생성하기 위해 내피 분화 배지의 존재하에 카복실 표면상에서 배양하는 것을 포함한다. 특정 양상에서, 내피 세포는 CD31에 대해 양성이다.
[0038] 추가의 양상에서, 상기 방법은 내피 세포를 뇌 미세혈관 내피 세포(BMEC)로 분화시키는 것을 추가로 포함한다.
[0039] 일부 양상에서, 상기 방법은 내피 세포를 림프구 내피 세포로 분화시키는 것을 추가로 포함한다.
[0040] 특정 양상에서, 상기 방법은 전구 세포를 MSC로 분화시키는 것을 포함한다. 구체적인 양상에서, 분화는 MSC 배지의 존재하에 아민 표면상에서 전구 세포를 배양하는 것을 포함한다. 일부 양상에서, MSC는 CD73, CD44, 및 Cd105에 대해 양성이다. 특정 양상에서, 분화된 세포의 적어도 90%는 CD73에 대해 양성이다.
[0041] 추가의 양상에서, 상기 방법은 MSC를 혈관주위세포로 분화시키는 것을 추가로 포함한다. 특정 양상에서, 세포 외 단백질의 부재하에 혈관주위세포의 존재하에 MSC를 배양한다. 일부 양상에서, 혈관주위세포는 NG2, PDGFRβ 및 CD146에 대해 양성이다.
[0042] 일부 양상에서, 상기 방법은 전구 세포를 HPC로 분화시키는 것을 포함한다. 특정 양상에서, 상기 방법은 HPC를 미세아교세포로 분화시키는 것을 추가로 포함한다. 구체적인 양상에서, 분화는 미세아교세포 분화 배지의 존재하에 중성으로 하전된 표면 또는 초저 부착 표면상에서 HPC를 배양함을 포함한다. 특정 양상에서, 미세아교세포 분화 배지는 IL34, TGF 및 MCSF 또는 이들의 유사체 또는 모방체를 포함한다. 일부 양상에서 분화는 정상산소에서의 배양을 포함한다. 일부 양상에, 분화는 20 내지 25일 동안이다. 특정 양상에서, 미세아교세포는 CD45, CD11b, 및 CD33에 대해 양성이다. 특정 양상에서, 적어도 50% (예를 들어, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 50-60%, 60-70%, 또는 80-90%)의 분화된 세포는 CD11b에 대해 양성이다. 일부 양상에서, 적어도 90% (예를 들어, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100%)의 분화된 세포는 CD33에 대해 양성이다.
[0043] 특정 양상에서, 상기 방법은 세포의 정제를 포함하지 않는다. 일부 양상에서, 정제는 MACS를 수행하는 것으로서 추가로 정의된다.
[0044] 특정 양상에서, 상기 방법은 양호한 제조 관리 기준(GMP)을 준수한다. 일부 양상에서, 상기 방법은 저산소 조건하에 수행된다. 특정 양상에서, iPSC는 사람이다.
[0045] 또 다른 구현예에서, P2RY12, CX3CR1, TMEM119, IBA-1 및 TREM2에 적어도 90%(예를 들어, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 100%, 90-93%, 93-96% 또는 96-100%) 양성인 미세아교세포 집단을 포함하는 조성물이 제공된다. 일부 양상에서, 미세아교 세포 집단은 구현예의 방법에 의해 생성된다. 일부 양상에서, 미세아교세포 집단은 TREM2, APOE, CD33, BIN, ABCA7, SNPS 또는 신경변성과 관련된 유전자형을 갖는 질환 관련 iPSC 공여자로부터 생성된다. 특정 양상에서, 미세아교세포 집단은 TREM2, MeCP2 및/또는 SCNA의 발현이 중단되었다. 일부 양상에서, TREM2의 중단된 발현은 TREM2 발현의 동형접합성 녹아웃으로서 추가로 정의된다. 특정 양상에서, MeCP2의 중단된 발현은 MeCP2 단백질의 절단된 돌연변이체로서 추가로 정의된다. 일부 양상에서, SCNA의 중단된 발현은 A53T와 같은 미스센스 포인트 돌연변이로 인한 것이다.
[0046] 추가의 구현예는 본원 구현예의 미세아교세포 집단에 시험 화합물을 도입하는 것을 포함하는, 시험 화합물을 스크리닝하는 방법을 제공한다. 일부 양상에, 미세아교세포 집단은 아밀로이드-베타에 추가로 도입된다. 특정 양상에, 미세아교세포 집단은 LPS에 추가로 도입된다.
[0047] 또 다른 구현예는 본원 구현예의 방법에 의해 생성된 혈관주위세포 집단을 포함하는 조성물을 제공한다.
[0048] 또 다른 구현예에서, 본원 구현예에 의해 생성된 미세아교세포, 혈관주위세포 및 BMEC를 포함하는 혈뇌 장벽 모델이 본원에 제공된다.
[0049] 추가의 구현예는 미세아교세포를 생성하기 위한 방법을 제공하고, 상기 방법은 하기의 단계를 포함한다: (a) iPSC를 HPC로 분화시키는 단계; (b) HPC를 CD34 양성 세포로 분류하는 단계, 및 (c) HPC를 미세아교세포 분화 배지에서 배양하여 미세아교세포 집단을 생성하는 단계. 일부 양상에서, HPC는 본 구현예에 따라 분화된다. 특정 양상에서 분류는 CD34 자기 비드를 사용함을 포함한다. 특정 양상에서, 상기 방법은 CD43 양성 세포에 대한 HPC 분류를 포함하지 않는다. 특정 양상에서, 상기 방법은 ECM 단백질을 포함하지 않는다.
[0050] 일부 양상에서, 미세아교세포 분화 배지는 IL-34, TGFβ1 또는 M-CSF 또는 이들의 각각의 유사체 또는 모방체를 포함한다. 특정 양상에서, 미세아교세포 분화 배지는 200 ng/mL의 IL-34, 100 ng/mL의 TGFβ1 및 50 ng/mL의 M-CSF를 포함한다. 일부 양상에서, 세포에 48시간마다 미세아교세포 분화 배지를 공급한다.
[0051] 특정 양상에서, 미세아교세포 집단에서 세포의 적어도 90%(예를 들어, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 100%, 90-93%, 93-96%, 또는 96-100%)는 TREM-양성이다. 일부 양상에서, 적어도 10% (예를 들어, 15%, 20%, 25%, 30%, 10-15%, 15-20%, 또는 20-30%)의 HPC는 미세아교세포로 분화된다.
[0052] 특정 양상에서, 단계 (b)의 배양은 96 웰 포맷으로 수행된다. 특정 양상에서, 단계 (b)의 배양은 하전된 표면 상에서 수행된다. 일부 양상에서, 하전된 표면은 양으로 하전되어 있다. 예를 들어, 양으로 하전된 표면은 아민 표면이다. 다른 양상에서, 하전된 표면은 음으로 하전되어 있다. 예를 들어, 음으로 하전된 표면은 카복실 표면이다.
[0053] 추가의 양상에서, 상기 방법은 CD200 및/또는 프랙탈킨 또는 이들의 유사체 또는 모방체를 포함하는 배지에서 미세아교세포의 집단을 성숙화시킴을 추가로 포함한다. 일부 양상에서, 방법은 미세아교세포를 냉동보존하는 단계를 추가로 포함한다.
[0054] 일부 양상에서, HPC는 TREM2의 발현이 중단되도록 가공된 iPSC로부터 분화된다. 특정 양상에서, 가공은 TAL 뉴클레아제를 사용함을 포함한다.
[0055] 특정 양상에서, 냉동보존된 미세아교세포는 pHrodo 세균 입자에 대한 식세포작용 기능을 유지한다. 특정 양상에서, 냉동보존된 미세아교세포는 해동 후 성숙하여 자극제에 반응하고 상등액 배지에서 인터류킨, 케모킨 및 면역 조절 리간드를 분비할 수 있다.
[0056] 추가의 구현예는 (a) 글리코겐 신타제 키나제 3(GSK3) 억제제를 포함하는 배지에서 iPSC를 예비 컨디셔닝하는 단계; (b) iPSC를 NPC로 분화시키는 단계를 포함하는 iPSC로부터 신경 전구 세포(NPC)를 생산하기 위한 시험관 내 방법을 제공하고, 상기 방법은 SMAD 신호 전달의 억제를 포함하지 않는다.
[0057] 일부 양상에서, 단계 (a)전에 저산소 조건하에서 iPSC를 유지한다. 특정 양상에서, ROCK 억제제의 존재하에 iPSC를 씨딩한 다음 단계 (a)전에 ROCK 억제제의 부재하에 배양한다.
[0058] 특정 양상에서, GSK3 억제제는 CHIR99021, BIO 또는 SB-216763이다. 특정 양상에서, GSK3 억제제는 CHIR99021이고, 예를 들어, 이의 농도는 1 μM, 2 μM, 3 μM, 4 μM 또는 5 μM 농도, 특히 3 μM 농도이다. 일부 양상에서, 예비-컨디셔닝은 2 내지 4일, 예를 들어, 1, 2, 또는 3일동안이다.
[0059] 일부 양상에서, 단계 (a) 및/또는 단계 (b)의 iPSC는 세포 외 매트릭스(ECM) 단백질로 코팅된 표면상에서 배양한다. 특정 양상에서, ECM 단백질은 MATRIGEL™, 라미닌 또는 비트로넥틴이다. 특정 양상에서, ECM 단백질은 라미닌 또는 비트로넥틴이다.
[0060] 특정 양상에서, 단계 (a) 및 (b)는 정상산소 조건하에서 수행된다. 일부 양상에서 분화는 ECM 단백질로 코팅된 표면상에서 iPSC를 배양함을 포함한다. 특정 양상에서, ECM 단백질은 라미닌 또는 비트로넥틴이다. 일부 양상에서, 분화는 ROCK 억제제의 존재하에 초저 부착 플레이트 또는 스피너 플라스크상에서 iPSC를 배양함을 포함한다. 특정 양상에서, 단계 (b)는 6일, 7일, 8일, 9일 또는 10일과 같이 5 내지 10일 동안 수행된다.
[0061] 추가 양상에서, 상기 방법은 NPC에서 Tra-162, CD56, CD15, Sox1, 네스틴, β3 마이크로글로불린 및/또는 Pax-6의 발현을 검출하는 것을 추가로 포함한다. 일부 양상에서, 적어도 70% (예를 들어, 80%, 85%, 90%, 95%, 70-80%, 80-90%, 또는 90-100%)의 NPC는 CD56에 대해 양성이다.
[0062] 추가 양상에서, 상기 방법은 NPC를 성상 세포 또는 뉴런으로 추가로 분화시키는 것을 포함한다.
[0063] 또 다른 구현예는 미세아교세포 컨디셔닝된 배지에서 가용성 TREM2의 수준을 검출하는 것을 포함하는 신경변성 질환을 스크리닝하는 방법을 제공한다. 일부 양상에서, 검출은 ELISA를 수행함을 포함한다. 특정 양상에서, 미세아교세포는 질환 관련 SNP 또는 돌연변이를 발현하는 동질유전자적으로 가공된 iPSC 또는 공여자로부터 유래한다. 일부 양상에서, 미세아교세포는 본원의 구현예 또는 이의 양상의 방법에 의해 생성된다. 특정 양상에서, 대조군에 비해 수용성 TEM 수준이 증가하면 알츠하이머 질환 또는 다발성 경화증과 같은 신경변성 질환을 검출한다.
[0064] 추가의 구현예는 본원 구현예의 방법 또는 이의 양상에 의해 생성된 미세아교세포와 복수의 후보 제제를 접촉시키고 사이토킨 및/또는 케모킨 수준 및/또는 아밀로이드 베타 식세포작용 기능을 측정하는 것을 포함하는 치료학적 제제를 동정하기 위한 고속처리량 스크리닝을 수행하기 위한 방법을 제공한다.
[0065] 일부 양상에서, 미세아교세포는 동질유전자적으로 가공된 iPSC 세포주로부터 유래한 냉동보존된 미세아교세포, 질환 관련 SNP를 발현하는 공여자로부터 유래된 미세아교세포 또는 신경변성과 관련된 돌연변이를 발현하는 공여자로부터 유래한 미세아교세포이다. 일부 양상에서, 사이토킨 및/또는 케모킨은 IL6, IL10, IL3, TNFα, IL13, CCL2/MCP-1, CCL20/MIP-3α, CCL4/MIP-1β, CCL5/RANTES, CX3CL1/Fractalkine, CXCL1/GROα, CXCL10/IP-10, CXCL2/GROβ, 및 IL-8/CXCL8로 이루어진 그룹으로부터 선택된다.
[0066] 또한, 본원에서는 본원 구현예 및 이의 양상의 미세아교세포 및 내피 세포, 혈관주위세포, 성상세포 및/또는 신경 전구 세포를 포함하는 공동 배양물이 제공된다. 또 다른 구현예는 사람의 뇌 발달을 모방하기 위한 공동 배양물의 용도를 제공한다.
[0067] 본 발명의 다른 목적, 특성 및 이점은 하기의 상세한 설명으로부터 자명해질 것이다. 그러나, 상세한 설명 및 본 발명의 바람직한 구현예를 제시하는 구체적인 실시예는, 상기 상세한 설명으로부터 본 발명의 개념과 범위 내에서 다양한 변화 및 변형을 줄 수 있음이 당업계의 숙련자에게는 명백하기 때문에, 단지 예시로서만 제공되는 것임을 알아야 한다.
[0068] 하기의 도면은 본 명세서의 일부를 형성하고 본 발명의 특정 양상을 추가로 입증하기 위해 포함된다. 본 발명은 본원에 제공된 특정 구현예의 상세한 설명과 함께 이들 도면 중 하나 이상을 참조로 보다 잘 이해될 수 있다.
[0069] 도 1: 2D 및 3D HPC 분화 공정의 도식화.
[0070] 도 2: 2D 또는 3D HPC 분화 공정으로부터 유래된 6일차 HPC로부터 내피 세포의 유도의 도식화.
[0001] 도 3: CD31+ MACS를 사용하지 않고 연속적인 통과 정제를 사용하여 생성된 내피 세포의 특징 분석.
[0002] 도 4a-b: (도 4a) 리플레이트 3의 말단에서 세포의 형태. 내피 세포는 리플레이트 계대 2 또는 3의 말단에서 냉동보존할 수 있다. (도 4b) 내피 세포의 유도를 위해 사용되는 배지 제형.
[0003] 도 5a-5d: (도 5a) MSC 분화 공정의 개요. (도 5b) MSC 생성을 위한 배지 제형. (도 5c) MSC의 지방세포, 조골세포 및 연골로의 세 가지 계통 분화를 도시하는 도식. (도 5d) 6일차 MSC 전구 세포의 표현형 특징 분석.
[0004] 도 6: 아민 표면상에 순수한 MSC 집단의 출현. 냉동보존된 6일차 HPC 또는 6일차 분화 말기의 생배양물을 아민 하전 표면 플레이트상에 1 uM H1152(또는 블레비스타틴)의 존재하에 MSC 배지에 위치시켰다. 배양물을 P4에서 정상산소 및 정상 조직 배양 플레이트에 이전시켰다. MSC의 순도 사양은 P5에 도달하였다.
[0005] 도 7: 표면 MSC 마커 CD73, CD44, CD105, CD49d에 염색된 세포 및 내피 마커 CD31 및 CD144의 부재. 냉동보존된 6일차 HPC 또는 6일차 분화 말기의 생배양물을 아민 하전 표면 플레이트상에 1 uM H1152(또는 블레비스타틴)의 존재하에 MSC 배지에 위치시켰다. 배양물을 P5에서 정상산소 및 정상 조직 배양 플레이트에 이전시켰다. MSC의 순도 사양은 P6에 도달하였다.
[0006] 도 8a-8c: (도 8a) 삼계통 잠재력(Tri-lineage potential). MSC로부터 지방세포, 조골세포 및 연골세포를 생성하기 위한 다양한 단계. (도 8b) MSC의 삼계통 잠재력, 조골세포에 대한 알리자린 레드 염색, 연골세포에 대한 알시안 블루 염색, 지방세포에 대한 오일 레드 O 염색을 보여주는 사진. (도 8c) MSC 분화 배지에 1,000세포/cm2로 MSC를 분주하고 10~14일 동안 격일로 공급된다. 크리스탈 바이올렛을 사용하여 플레이트를 염색하고 총 콜로니 수를 계수하였다.
[0007] 도 9a-9h: MSC의 혈관주위 세로로의 전환. (도 9a) iCell MSC를 iPSC 유래된 혈관주위세포로 전환하는 공정의 개략도. (도 9b) iPSC-유래된 혈관주위세포를 생성하기 위한 배지 제형. (도 9c) iCell MSC, iPSC 유래된 혈관주위세포 및 ScienCell 1차 사람 뇌 혈관주위세포(HBVP)에서 공지된 혈관주위세포 마커 PDGFRβ, NG2 및 CD146에 대한 비교 유동 세포측정. 해동 시에는 iCell MSC에 대한 혈관주위세포 마커가 부재이고, 혈관주위세포 배지에서 P1이 끝날 때까지 세포주위세포 마커가 증가하였다. iPSC 유래된 혈관주위세포는 명시야 현미경을 통해 iPSC 유래 MSC(P2), iPSC 유래 혈관주위세포(P1)의 1차 HBVP (도 9d) 형태 및 ScienCell 1차 HBVP 형태보다 더 높은 순도의 혈관주위세포 특이적 마커를 보여준다. (도 9e) 표현형 및 마커 발현을 기준으로 PC1과 PC2 혈관주위세포 간의 차이를 기재하는 표. (도 9f) 해동 직후와 해동 5일 후 유동 세포측정을 통해 iPSC 유래 혈관주위 세포를 혈관주위세포 서브타입 특이적 마커 CD274, VCAM1, Desmin, DLK1 및 αSMA와 일반 혈관주위세포 마커 PDGFRβ, NG2, CD13 및 CD146에 대해 염색하였다. iPSC 유래 혈관주위세포는 수축성 혈관주위세포의 시그니처인 서브타입 PC2를 보여준다. (도 9G) 식세포작용 검정에서 iPSC 유래 혈관주위세포의 IncuCyte 생 이미지화 시스템 이미지. iPSC 유래 혈관주위세포는 대조군 수준 이상의 에스. 아우레우스 바이오입자의 관찰 가능한 식세포작용 활성을 보여준다. (A) iPSC 유래 혈관주위세포 단독의 대조군. (B) iPSC 유래 혈관주위세포 + NucGreen Dead 488(NG) 시약 대조군. (C) iPSC 유래 혈관주위세포 + 에스. 아우레우스 pHrodo 레드 바이오입자(BP). (D) iPSC 유래 혈관주위세포 + NucGreen Dead 488 시약(NG) + 에스. 아우레우스 pHrodo 레드 바이오입자(BP). 세포 씨딩 후 36일 16시간이 지난 시점부터 촬영한 모든 이미지. (도 9H) IncuCyte 소프트웨어로 분석한 총 레드 물체 통합 강도를 통한 식세포작용 활성의 정량화.
[0008] 도 10a-10g: 뇌 미세혈관 내피 세포(BMEC)의 생성. (도 10a) 뇌 미세혈관 내피 세포 생성의 도식 개요. (도 10b) ECRA 배지의 조성. (도 10c) Glut1/CD31의 공동 발현에 의한 BMEC의 유동세포측정 분석. (도 10d) 13일째 P 당단백질(녹색) 발현이 있는 BMEC의 면역조직화학적 염색. 핵을 Hoechst3342로 염색하고 ImageXpress(Molecular Devices, LLC)로 200X 배율로 이미지를 캡처하였다. (도 10e) 분주 후 몇일에 걸쳐 TEER 값을 측정하여 BMEC의 기능적 특징 분석. (도 10f) ECM을 사용하지 않고 예비컨디셔닝 단계와 하전된 표면상에 도포함을 포함하는 대안적 방법을 사용하여 뇌 미세혈관 내피 세포를 생성하는 도식 개요. 하전된 표면상에서 BMEC의 생성을 유도하기 위해 변형된 배지에 대한 기재. (도 10g) 7일째 분화된 뇌 미세혈관 내피 세포를 서로 다른 하전된 표면상에서 채취하고 CD31, p 당단백질/및 Glut-1 발현의 존재 및 만능성 마커(TRA-181) 발현의 부재에 대해 염색하여 순도를 정량화하였다.
[0009] 도 11: 3D 분화 공정을 사용한 HPC의 스케일업과 CD34 + 자기 비드를 사용한 후속 정제. CD34 자기 비드를 사용한 HPC의 스케일업 및 분류의 개략적 기재. 수동 및 CliniMAC를 매개된 분리를 통한 분류 공정의 효율성이 설명된다. 수행당 HPC의 실제 순도(분류된 분획에서 CD34 양성 세포의 퍼센트로 측정됨)와 공정의 효율성이 요약되어 있다.
[0010] 도 12: 미세아교세포 분화를 위한 배지 제형.
[0011] 도 13a-13b: (도 13a) CD34+ 분류된 HPC로부터 미세아교세포를 유도하는 개략적인 기재. HPC를 미세아교세포 분화 배지 MDM에 넣었다. 배양물에 48시간마다 MDM 또는 2X MDM을 공급하였다. 분화 12일째에 배양물을 분할하고 23일까지 2D 분화를 계속하였다. 23일째에 세포를 채취하여 미세아교세포 배양물에 대한 순도 마커의 존재에 대해 염색하였다. 배양물의 나머지는 냉동보존하였다. 미세아교세포 배양물의 순도는 냉동 보존 전후에 정량화하였다. (도 13b) 미세아교세포 분화 배지 및 미세아교세포 분화 배지가 도시된다.
[0012] 도 14: 냉동 보존 전과 후의 MDM 배지 존재 시 미세아교세포 순도 평가. 분화 23일째의 미세아교세포 배양물을 채취하여 미세아교세포 특이 마커의 존재에 대해 염색하였다. 나머지 세포는 제어 속도 동결기를 사용하여 냉동보존하였다. 냉동 보존된 세포를 해동하고 미세아교세포 특이적 마커의 존재에 대해 염색하였다. 세트 둘다에 대해 유동 세포측정에 의한 CD45, CD33, TREM2, 및 CD11b (도 14a)의 세포 표면 발현 및 CX3CR1 PU.1, IBA, P2RY12, TREM2 및 TMEM119의 세포내 발현.
[0013] 도 15a-c: 수동 대 제어 속도 동결기를 사용하여 냉동 보존 후 미세아교세포의 회수. HPC를 배지에 넣어 MDM의 존재하에 미세아교세포 분화를 개시하도록 하였다. 세포는 분화 20일(도 15b), 23일(도 15b), 26일(도 15c)에 수동 동결 프로토콜 또는 제어 속도 동결기(CRF)를 사용하여 냉동 보존하였다. 냉동 보존된 세포는 1주 동안 액체 질소로 옮겼다. 냉동 보존된 미세아교세포를 해동하여 미세아교세포 성숙화 배지(MMM)에 위치시켰다. 배양물에 새로운 성숙화 배지를 48시간 마다 공급하였다. 해동 후 3일, 5일, 7일, 10일, 12일, 14일째에 세포를 채취하여 초기 분주 수에 대해 생존 가능한 세포의 회수율을 정량화하였다.
[0014] 도 16: HPC를 미세아교세포로 전환하는 효율. 냉동 보존된 HPC는 MDM의 존재하에 미세아교세포로 분화시켰다(N=4). 인풋 HPC와 아웃풋 미세아교세포의 총 생존 가능한 수를 정량화하였다. 공정 효율은 미세아교세포 분화 23일째에 존재하는 TREM2 양성 세포의 순도와 절대 수를 인풋 생존 가능한 HPC의 절대 수로 나눈 값을 기준으로 계산하였다.
[0015] 도 17a-17c: 해동 20일(도 17a), 23일(도 17b), 26일(도 17c)에, 해동 3일 후 및 해동 10일 후에 수동으로 또는 제어 속도 동결기에서 냉동 보존된 미세아교세포의 순도 분석. 20일, 23일, 26일에 냉동 보존된 미세아교세포를 해동하고 미세아교세포 성숙화 배지에서 3일, 5일, 7일, 10일 및 12일 동안 배양하였다. 세포는 유동 세포측정에 의해 Pu1, IBA, CX3CR 및 P2RY12 발현의 존재에 대해 염색하였다.
[0016] 도 18a-18b: 에스. 아우레우스 바이오입자를 사용한 식세포작용 검정을 설정하기 위한 0일차(도 18a) 및 해동 후 3일차(도 18b)에 수동으로 또는 제어 속도 동결기에서 냉동 보존한 미세아교세포의 생존 가능한 수동 혈구계 세포 수.
[0017] 도 19: 수동 또는 제어 속도 동결기를 사용하여 분화 20일, 23일, 26일째에 냉동 보존된 미세아교세포의 기능적 특징 분석. 냉동 보존된 미세아교세포를 해동하고 웰당 200μl의 미세아교세포 성숙화 배지의 존재하에 96웰 플레이트에 15,000개의 생존 가능한 세포/웰로 분주하였다. 세포를 희석된 1μg/웰의 옵소닌화되거나 업소닌화되지 않은 pHrodo 레드 바이오입자(Thermo Fisher # A10010, 바이알당 2mg, -20°C에서 저장)로 처리하였다. IncuCyte에 플레이트를 놓고 해동 후 최대 5일까지 다양한 시점에 식세포작용 이미지를 촬영하였다. 제어 속도 냉동 방법을 통해 냉동보존된 세포는 보다 강력한 식세포작용을 나타낸다(세포 생존능이 높기 때문에). 수동 냉동 보존 방법은 모든 조건에 걸쳐 식세포작용의 저하/우측 전환율을 밝혔다(보다 낮은 세포 생존능으로 인해).
[0018] 도 20: IncuCyte 시스템상에서 생 이미지화를 통해 평가된 수동 또는 제어 속도 동결기를 사용하여 14일 생 미세아교세포 및 분화 20일, 23일 및 26일째에 냉동 보존된 미세아교세포의 기능적 특징분석. 냉동 보존된 미세아교세포를 해동하고 3일 동안 MMM에 분주하였다. 3일의 종료 시점에 생존 가능한 세포 수는 도 18b에 기재된 바와 같이 결정하였다. 15,000개의 생존 가능한 세포를 웰당 200μl의 미세아교세포 성숙화 배지(MMM)의 존재하에 96웰 플레이트에 분주하였다. 세포에 48시간마다 새로운 50μl의 MMM 배지를 공급하였다. 세포를 희석된 1μg/웰의 옵소닌화되거나 업소닌화되지 않은 pHrodo 레드 바이오입자(Thermo Fisher # A10010, 바이알당 2mg, -20°C에서 저장)로 처리하였다. IncuCyte에 플레이트를 놓고 해동 후 최대 5일, 7일 및 14일까지 다양한 시점에 식세포작용 이미지를 촬영하였다. 수동 냉동 보존 방법은 모든 조건에 걸쳐 식세포작용의 저하/우측 전환율을 밝혔다(보다 낮은 세포 생존능으로 인해).
[0019] 도 21: 식세포작용 효율 비율은 해동 후 샘플로부터 식세포작용 적혈구 수/총 세포 수로 나누어 결정하였다.
[0020] 도 22: pHrodo 아밀로이드 베타를 사용한 냉동 보존 미세아교세포의 기능적 특징 분석. 냉동 보존된 23일 미세아교세포를 해동하고 웰당 200μl의 미세아교세포 성숙화 배지의 존재하에 96웰 플레이트에 15,000개의 생존 가능한 세포/웰로 분주하였다. 세포를 pHrodo 아밀로이드 베타로 처리하였다. 대조군 세트는 pHrodo 아밀로이드 베타가 없는 배지와 함께 세포를 포함하였다. IncuCyte에 플레이트를 놓고 해동 후 최대 24시간까지 다양한 시점에 식세포작용 이미지를 촬영하였다.
[0021] 도 23a-23b: ECM의 부재하에 HPC의 미세아교세포로의 분화 및 스크리닝 적용에 적합한 96웰 포맷으로 소형화 HPC의 미세아교세포로의 분화(도 23a)와 실험에 사용된 상이한 하전된 표면의 도식. 초저부착(ULA), 조직 배양(TC) 및 비조직 배양(Non-TC) 용기(도 23b).
[0022] 도 24a-24b: 다양한 하전된 표면의 존재하에 23일미세아교세포의 최종 단계 순도 분석. 냉동 보존 HPC는 웰당 200μl의 미세아교세포 분화 배지의 존재하에 96웰 Primaria 플레이트 또는 초저부착, 조직 배양(TC) 또는 비조직 배양 플레이트(Non-TC)에 20,000-35,000 생존 세포/cm2의 밀도로 분주하였다. 세포에는 다음 23일 분화 동안 MDM의 웰 당 50μl의 배지를 48시간마다 공급하였다. 23일째에 냉각 PBS로 세포를 수거하고 자동화된 세포 계수기를 사용하여 총 생존 세포 수를 정량화하였다. 세포는 CD11b, CD45, CD33, TREM2의 표면 발현과 TREM2, IBA, P2RY12 및 TMEM119의 세포내 발현에 대해 염색하였다.
[0023] 도 25a-25b: 냉동 보존된 미세아교세포에 의해 방출되는 사이토킨 및 케모킨. 23일 냉동 보존된 미세아교세포를 MDM 배지에 해동하고 50,000세포/웰에서 Primaria 96 웰 플레이트에 분주하였다. 100 ng/ml LPS와 50 ng/ml 인터페론 감마로 자극을 개시하기 전에 세포를 3일동안 배양하였다. 자극은 24시간 동안 3중으로 수행하였다. 상등액을 회전 하강시켜 세포와 잔해를 제거한 후 즉시 -20°C에 위치시켰다. 상등액을 멀티플렉스 루미넥스 검정으로 분석하였다. 다수의 WT 배치의 평균(도 25a)과 WT, 동형접합 및 이형접합 TREM2 녹아웃(KO), MECP2 HM 및 A53T-SNCA 가공된 세포주(도 25b)를 나타낸다.
[0024] 도 26: 다수의 배치의 동형접합 및 이형접합 TREM2 녹아웃(KO), MECP2 및 A53T-SNCA 가공된 세포주로부터 유래된 냉동 보존 미세아교세포를 세포 내 마커 PU.1, IBA-1, CX3CR1, P2RY12 및 TMEM119뿐만 아니라 CD11b, CD45, TREM2의 표면 발현의 존재에 대해 염색하였다. 가공된 iPSC 세포주는 유동 세포측정에 의해 TREM2의 상응하는 발현을 밝혔다.
[0025] 도 27a-27b: (도 27a) 야생형(WT), 이형접합(HT) 및 동형접합(HO) TREM2 KO 가공된 iPSC로부터 유래한 냉동 보존 미세아교세포에서 가용성 TREM2의 방출. 가용성 TREM2(sTREM2)의 수준은 단순 단계 ELISA(AbCam)를 사용하여 WT 및 TREM2 이형접합 및 동형접합 KO 돌연변이체의 컨디셔닝된 배지에서 정량화하였다. WT 및 TREM2 KO 미세아교세포를 해동하고 96웰 Primaria 플레이트 내 성숙화 배지에서 동일한 밀도로 분주하였다. 소모된 배지는 해동 후 3일째와 해동 후 7일째에 수거하였다. 해동 후 3일째와 5일째에 배양물에 새로운 성숙화 배지를 절반씩 공급하였다. (도 27b) 야생형(WT), MECP2 HM 및 A53T-SNCA 가공된 iPSC로부터 유래한 냉동 보존 미세아교세포에서 가용성 TREM2의 방출. 가용성 TREM2(sTREM2)의 수준은 단순 단계 ELISA(AbCam)를 사용하여 WT, MECP2 HM 및 A53T-SNCA 가공된 세포주로부터 유래한 컨디셔닝된 배지로부터 정량화하였다. 미세아교세포를 해동하고 96웰 Primaria 플레이트 내 성숙화 배지에서 동일한 밀도로 분주하였다. 소모된 배지는 해동 후 3일째와 해동 후 7일째에 수거하였다. 해동 후 3일째와 5일째에 배양물에 새로운 성숙화 배지를 절반씩 공급하였다.
[0026] 도 28: WT, HT 및 HO TREM2 KO 가공된 미세아교세포 WT, 1185 HT TREM2 KO, 1187 HO TREM2 KO의 생존 동역학을 연구하기 위한 배지 제형의 목록. 미세아교세포를 32개의 다양한 사이토킨 제형을 함유한 250μl의 미세아교세포 기본 배지에서 96개 웰 플레이트로 웰당 15,000개의 생존 가능한 세포 밀도로 위치시켰다. 세포 생존률의 동역학은 IncuCyte 시스템상에서 캡처하였다. 다양한 배지 조성을 갖는 세포를 함유한 모든 웰에 2방울/mL로 희석한 NucGreen Dead를 첨가하여 시간에 따른 죽은 세포의 수를 캡처하였다. 이미지는 8시간마다 캡처하였고, 실험은 임의의 간헐적인 공급 없이 72시간 동안 계속하였다.
[0027] 도 29a-29c: WT (도 29a), 1185 HT TREM2 KO (도 29b), 1187 HO TREM2 KO (도 29c) 미세아교세포 생존률 동역학.
[0028] 도 30a-30c: WT (도 30a), 1185 HT TREM2 KO (도 30b), 1187 HO TREM2 KO (도 30c) 2개의 사이토킨과 함께 미세아교세포 생존률 동역학.
[0029] 도 31a-31c: WT (도 31a), 1185 HT TREM2 KO (도 31b), 1187 HO TREM2 KO (도 31c) 3개의 사이토킨과 함께 미세아교세포 생존률 동역학.
[0030] 도 32a-32c: WT (도 32a), 1185 HT TREM2 KO (도 32b), 1187 HO TREM2 KO (도 32c) 4개의 사이토킨과 함께 미세아교세포 생존률 동역학.
[0031] 도 33a-33e: WT, 1185 HT TREM2 KO, 1187 HO TREM2 KO 미세아교세포를 96 웰 플레이트에 15,000개의 생존 가능한 세포 밀도로 250 μl의 미세아교세포 기본 배지(도 33a) 또는 MMM(도 33b) 또는 IL-34가 보충된 미세아교세포 기본 배지(도 32c), 또는 IL-34가 보충된 미세아교세포 기본 배지(도 33d), 또는 MCSF가 보충된 미세아교세포 기본 배지(도 33d) 또는 단독의 IL-34가 보충된 기본 배지(도 33C) 또는 단독의 MSCF 또는 IL-34와 MCSF의 조합이 보충된 기본 배지(도 33e)에 위치시켰다. 세포 생존률의 동역학은 IncuCyte 시스템상에서 캡처하였다. 다양한 배지 조성을 갖는 세포를 함유한 모든 웰에 2방울/mL로 희석한 NucGreen Dead를 첨가하여 시간에 따른 죽은 세포의 수를 캡처하였다. 이미지는 8시간마다 캡처하였고, 실험은 임의의 간헐적인 공급 없이 7일 동안 계속하였다. NucGreen Dead의 강도는 배양물에서 죽은 세포를 정량화한다.
[0032] 도 34a-34h: 23일째에 pHrodo 레드 표지된 세균 바이오입자 및 pHrodo 레드 아밀로이드 베타와 함께 냉동 보존된 WT, 1185 HT TREM2 KO, 1187 HO TREM2 KO 미세아교세포의 기능적 특징 분석. 해동 후 3일 동안 단독의 MSCF(도 34c-d) 또는 IL-34(도 34e-f)가 보충된 250μl의 MMM(도 34a-b) 또는 MDM 기본 배지(AKA 미세아교세포 기본 배지)에서 96 웰 플레이트에 15,000 생존 가능한 세포/cm2의 밀도로 WT, 1185 HT TREM2KO, 1187 HO TREM2 KO 미세아교세포를 분주하였다. 세포를 희석된 1μg/웰의 옵소닌화되거나 옵소닌화되지 않은 pHrodo 바이오입자(Thermo Fisher # A10010, 바이알당 2mg, -20°C에서 저장)(도 34 a, c, e, g) 또는 pHrodo 아밀로이드 베타(도 34b, d, f, h)로 처리하였다. IncuCyte에 플레이트를 놓고 최대 30시간까지 다양한 시점에 식세포작용 이미지를 촬영하였다. 해동 후 WT와 가공된 미세아교세포는 식세포작용 기능을 나타냈다. 식세포작용의 동역학 및 효율은 WT, 1185 HT TREM2 KO, 1187 HO TREM2 KO 미세아교세포간에 다양하였다.
[0033] 도 35: 단순화된 성숙화 배지에서 미세아교세포 배양물의 순도. 성숙화 배지에 2개의 중요한 (IL-34, MSCF) 사이토킨의 조합이 보충된 MMM 또는 미세아교세포 기본 배지의 존재하에 23일 냉동 보존된 야생형(WT) 미세아교세포의 해동 후 순도. 세포를 채취하여 해동 후 3일, 7일, 14일째에 순도를 정량화하였고, 세포를 채취하여 유동 세포측정으로 세포 표면 및 세포 내 마커 염색을 위해 세포를 염색하여 분화 과정이 종료되었을 때 CD45, CD33, TREM2, CD11b, CX3CR1, P2RY12, TMEM119, IBA의 순도를 결정하였다. 냉동 보존된 미세아교세포는 MSCF와 IL-34가 보충된 성숙화 배지에서 생존능과 순도를 유지한다. 상기 단순화된 배지는 뇌 오가노이드인 TREM을 발육하기 위해 냉동 보존 미세아교세포를 뉴런 및 성상세포와 함께 공동 배양 적용을 위해 유용할 것이다.
[0034] 도 36a-36b: (도 36a) 냉동 보존된 미세아교세포를 이용한 스크리닝 실험을 도시하는 모식도. (도 36b) 스크리닝시 시험돤 화합물의 표.
[0035] 도 37a-37d: GW501516 (도 37a), 류세틴(Leucettine) L41 (도 37b), 피세아타놀(Piceatannol) (도 37c), 및 아젤리라곤(Azeliragon) (도 37d)을 사용한 미세아교세포 스크리닝 실험 결과.
[0036] 도 38a-38d: J147 (도 38a), 디부트릴(Dibutryl)-cAMP (도 38b), 이스라디핀(Isradipine) (도 38c), 및 벡사로텐(Bexarotene) (도 38d)을 사용한 미세아교세포 스크리닝 실험 결과.
[0037] 도 39a-39e: SB-431542(도 39a), SP600125(도 39b), GW2580(도 39c), PP2(도 39d), SB239063(도 39e)을 사용한 미세아교세포 스크리닝 실험 결과
[0038] 도 40a-40d: LPS 자극과 함께 GW501516 (도 40a), 류세틴 L41 (도 40b), 피세아타놀 (도 40c), 및 아젤리라곤 (도 40d)을 사용한 미세아교세포 스크리닝 실험 결과.
[0039] 도 41a-41e: LPS 자극과 함께 J147 (도 41a), 디부틸-cAMP (도 41b), 이스라디핀(도 41c), 벡사로텐(Bexarotene) (도 41d), 및 SB-43152 (도 41e)를 사용한 미세아교세포 스크리닝 실험 결과.
[0040] 도 42a-42d: LPS 자극과 함께 SP600125 (도 41a), GW2580 (도 42b), PP2 (도 42c), 및 SB239063 (도 42d)를 사용한 미세아교세포 스크리닝 실험 결과.
[0041] 도 43: 미세아교세포 스크리닝 실험 결과 요약.
[0042] 도 44a-44g: (도 44a) ATP/BzATP 모두 미량의 미세아교세포 - 비율. (도 44b) ATP/BzATP 샘플 미량의 미세아교세포 - 비율. (도 44c) 미세아교세포에서 BzATP에 대한 반응. (도 44d) 미세아교세포에서 ADP에 대한 차등적 반응. (도 44e) P2X7 길항제 AZ11645373의 존재하에 100μM BzATP와의 반응. (도 44f) P2X7 길항제 A438079의 존재하에 100μM BzATP와의 반응. (도 44g) AZD1283(P2Y12 수용체의 강력한 길항제)의 존재 하에서 미세아교세포에서 기능적 ADP 의존적 반응을 입증하기 위한 용량 의존적 반응.
[0043] 도 45a-45b: ANH 및 질환 관련 미세아교세포로부터 유래한 냉동 보존된 미세아교세포에서 가용성 TREM2의 방출을 해동 후 3일(도 45a) 또는 7일(도 45b)에 수거된 컨디셔닝된 배지로부터 단순 단계 ELISA(AbCam)를 사용하여 정량화하였다. ANH 및 DAM 관련 미세아교세포를 해동하고 96웰 Primaria 플레이트 내 성숙화 배지에서 동일한 밀도로 분주하였다. 소모된 배지는 해동 후 3일째와 해동 후 7일째에 수거하였다. 해동 후 3일째와 5일째에 배양물에 새로운 성숙화 배지를 절반씩 공급하였다.
[0044] 도 46a-46j: iPSC 공여자 패널로부터의 ANH 및 질환 관련 미세아교세포로부터 유래한 냉동 보존된 미세아교세포에 의해 방출되는 사이토킨과 케모킨 2일 냉동 보존된 미세아교세포를 MDM 배지에 해동시키고 50,000세포/웰에서 Primaria 96 웰 플레이트상에 분주하였다. 100 ng/ml LPS 또는 IL-4 + dBu-cAMP로 자극을 개시하기 전에 세포를 3일동안 배양하였다. 자극은 24시간 동안 3중으로 수행하였다. 상등액을 회전 하강시켜 세포와 잔해를 제거한 후 즉시 -20°C에 위치시켰다. 상등액을 멀티플렉스 Luminex 검정으로 분석하였다. LPS를 사용한 자극시, M1 분석물(도 46a), M2 분석물 (도 46b), 인터류킨 (도 46c), 케모킨(도 46d), 및 기타 분석물(도 46e)의 방출. IL-4 + dBu-cAMP를 사용한 자극시, M1 분석물(도 46f), M2 분석물 (도 46g), 인터류킨 (도 46h), 케모킨(도 46i), 및 기타 분석물(도 46j)의 방출.
[0045] 도 47a-47j: pHrodo 표지된 스타필로코커스 아우레우스 바이오입자 및 아밀로이드 베타를 사용하여 AHN 및 질환 관련 미세아교세포의 식세포작용 기능 입증: 384 웰 폴리-D-라이신 플레이트에 웰당 5,000개의 세포로 냉동 보존된 AHN 및 질환 관련 미세아교세포를 분주하였다. 에스. 아우레우스 바이오입자를 각각의 웰에 0.5 μg/mL로 첨가하고, 아밀로이드 베타를 1 mM/웰로 첨가하였다. 에스. 아우레우스 바이오입자 및 아밀로이드 베타의 식세포작용의 동역학은 IncuCyte 생세포 분석 시스템을 사용하여 총 레드 물체 통합 강도를 사용하여 정량화하였다. (도 47a) (ANH, 에스. 아우레우스), (도 47b) (ANH, 아밀로이드 베타), (도 47c) (R47H Vs ANH, 에스. 아우레우스), (도 47d) (R47H Vs ANH, 아밀로이드 베타), (FIG. 47E) (CD33 Vs ANH, 에스. 아우레우스), (도 47f) (CD33 Vs ANH, 아밀로이드 베타), (도 47g) (ABCA7 vs ANH, 에스. 아우레우스), (도 47h) (ABCA7 vs ANH, 아밀로이드 베타), (도 47i) (APOE 이소형 Vs ANH, 에스. 아우레우스), (도 47j) (APOE 이소형 Vs ANH, 아밀로이드 베타).
[0046] FIGS: 48a-48d: (도 48a) 이중 SMAD 억제를 사용하지 않고 iPSC로부터 신경 전구세포(NPC)를 생성하는 방법에 대한 개략적인 기재. 관련된 다양한 단계와 사용된 배지의 조성이 기재되어 있다. (도 48b) 3개의 iPSC 세포주에 걸쳐 NPC의 출현 동역학 요약. 만능 마커의 감소와 분화 과정의 상이한 날에 NPC 특정 마커의 출현. 배양물 중 다수의 계대를 거쳐 NPC로부터 유래한 성상세포에 대한 유동세포측정(도 48c) 염색에 의한 세포 표면 염색 및 세포 내 염색으로 수행한 순도의 정량화. 유동세포측정에 의한 세포 표면 및 세포 내 염색에 의해 정량화된 성상 세포의 순도. (도 48d) 세포 내 유동세포 측정에 의해 NPC의 뉴런으로의 분화 및 말기 뉴런의 순도 정량화.
[0047] 도 49: iPSC 유래 세포 계통 유도에 상용성인 표면의 개요.
[0001] 도 50a-50d: 삼배양물 배지의 존재하에 냉동 보존된 미세아교세포, 가바성(gabanergic) 뉴런 또는 글루타민성(glutanergic) 뉴런 및 성상세포로부터 생성된 14일 (도 50a) 단배양물, (도 50b) 이배양물, 및 (도 50c) 삼배양물의 면역조직화학 염색. 14일 배양물을 (PFA)를 사용하여 고정화시키고, 차단 완충액에 희석한 Pan 뉴런 마커(1:1500; Millipore, 카탈로그: MAB2300), 항-Iba1(1,500; Wako Chemicals, 카탈로그: 019-19741), 항-GFAP(1,500; Abcam, 카탈로그: ab4674)를 사용하여 염색하였다. 1차 항온처리 후 세포를 차단 완충액에 희석된 2차 항체 용액 염소 항-마우스 IgG1 Alexa Fluor 488 (1:1000; Invitrogen, 카탈로그: A21121), 염소 항-토끼 IgG Alexa Fluor 568 (1: 1000; Invitrogen, 카탈로그: A11011), 염소 항-닭 IgY Alexa Fluor 647(1:1000; Invitrogen, 카탈로그: A21449) 및 Hoechst 33342(1:10,000; Thermo Scientific, 카탈로그: 62249)를 사용하여 염색하였다. 플레이트를 세척하고 ImageXpress 마이크로 공초점 고함량 이미지화 시스템(Molecular Devices)상에서 이미지화를 수행하였다. (도 50d) 배지 보충물의 비교.
[0002] 도 51: 미세아교세포, 뉴런 및 성상세포의 삼배양물 모델.
[0003] 도 52: 뉴런 염증을 연구하기 위한 삼배양물 모델 설정에 대한 개략적인 기재.
[0048] 도 53: ANH, TREMHZ 및 TREM2HO로부터 유래한 가바성 뉴런, 성상세포 및 미세아교세포와의 단일배양물, 이배양물 및 삼배양물에서 방출되는 사이토킨과 케모킨의 비교 분석. 반응성 및 비반응성 성상세포에 의해 방출되는 분석물은 일배양물, 이배양물 및 삼배양물에서 정량화하였다.
[0004] 도 54: ANH, TREMHZ 및 TREM2HO로부터 유래한 GABA 뉴런, 성상세포 및 미세아교세포와의 단일배양물, 이배양물 및 삼배양물에서 방출되는 M1 사이토킨과 케모킨의 비교 분석.
[0005] 도 55: ANH, TREMHZ 및 TREM2HO로부터 유래한 GABA 뉴런, 성상세포 및 미세아교세포와의 단일배양물, 이배양물 및 삼배양물에서 방출되는 M2 사이토킨과 케모킨의 비교 분석.
[0006] 도 56: ANH, TREMHZ 및 TREM2HO로부터 유래한 GABA 뉴런, 성상세포 및 미세아교세포와의 단일배양물, 이배양물 및 삼배양물에서 방출되는 C3 보체의 비교 분석.
[0007] 도 57a-57b: Gluta 뉴런 및 성상세포와 함께 배양하고, MEA 기능성 검정으로 측정하는 경우, 미세아교세포가 신경세포 전기 생리학에 미치는 영향의 대표적인 예. (도 57a) MEA에 대한 Gluta 뉴런 및 성상세포. (도 57b) 미세아교세포의 모델 신경망으로의 첨가.
[0008] 도 58: 　TREM2HZKO 미세아교세포를 사용한 상응하는 동역학 식세포작용 검정으로부터 촬영한 pHrodo 레트 표지된 아밀로이드 베타 섬유 단일 배양물 및 삼배양물의 미세아교세포(AHN 및 TREM2HZKO) 식세포작용의 대표적 이미지.
[0009] 도 59: 모든 3개의 세포 유형의 세포 비율로 냉동 보존된 iPSC 유래 Gluta 뉴런, 성상세포 및 미세아교세포를 갖는 3D 삼배양물의 위상차 이미지.
[0010] 도 60: 미세아교세포와 성상세포의 존재 및 부재하에 냉동 보존된 Gluta 뉴런의 3D 배양물로부터 유래된 칼슘 과도 현상의 비교 분석.
[0011] 도 61: iPSC 유래된 냉동 보존된 BMEC, 혈관주위세포 및 성상세포로 샌드위치 공동 배양물을 설정하기 위한 다양한 단계의 개략적인 기재.
[0012] 도 62 냉동 보존된 BMEC의 TEER 기능. iPSC 유래 BMEC를 냉동보존하고, 해동시키고, FN/ColIV 코팅된 코닝 트랜스웰 삽입체상에 1.3 x106 세포/cm2의 BMEC 배지에 씨딩하였다. TEER 측정은 3일 내지 8일째에 수집하였다(도 61에 기재된 샌드위치 트랜스웰 공동 배양물에 대한 다음 날 넘버링 체계).
[0013] 도 63: 냉동보존된 BMEC 및 혈관주위 세포의 TEER 기능. iPSC 냉동 보존된 iPSC-유래된 혈관주위세포는 기저측면 막 상에 3개의 상이한 밀도 (666k/cm2, 333k/cm2, 500k/cm2)로 0일째 씨딩하였다. iPSC 유래 BMEC를 냉동 보존하고, 해동시키고 1일차에 정단부 트랜스웰 막에 1.3x106 세포/cm2 또는 1.0x106 세포/cm2로 BMEC 배지에 씨딩하였다. TEER 측정은 3일 내지 8일째에 수집하였다(도 61에 기재된 샌드위치 트랜스웰 공동 배양물에 대한 다음 날 넘버링 체계).
[0014] 도 64: 냉동 보존된 BMEC 및 혈관주위 세포의 TEER 기능. 냉동 보존된 성상세포는 기저측면 막 상에 3개의 상이한 밀도 (666k/cm2, 333k/cm2, 500k/cm2)로 0일째 씨딩하였다. iPSC 유래 BMEC를 냉동 보존하고, 해동시키고 1일차에 정단부 트랜스웰 막에 1.3x106 세포/cm2 또는 1.0x106 세포/cm2로 BMEC 배지에 씨딩하였다. TEER 측정은 3일 내지 8일째에 수집하였다(도 61에 기재된 샌드위치 트랜스웰 공동 배양물에 대한 다음 날 넘버링 체계).
[0015] 도 65: 냉동 보존된 BMEC, 혈관주위 세포 및 성상세포의 TEER 기능: iPSC 유래 혈관주위 세포 및 iCell 성상세포는 기저측면 막 상에 3개의 상이한 밀도 (666k/cm2, 333k/cm2, 500k/cm2)로 0일째 씨딩하였다. iPSC 유래 BMEC를 해동시키고 1일차에 정단부 트랜스웰 막에 1.3x106 세포/cm2 또는 1.0x106 세포/cm2로 BMEC 배지에 씨딩하였다. TEER 측정은 3일 내지 8일째에 수집되었다(도 61상에 기재된 샌드위치 트랜스웰 공동 배양물에 대한 다음 날 넘버링 체계).
[0049] 도 66: 뉴런, 성상세포, 미세아교세포 배양을 위한 예시적인 삼배양물 프로토콜의 개략도.
[0016] 도 67: TREM2의 부분적인 기능 상실은 콜레스테롤과 지방산 생합성 감소를 유도하였다. 동종 유전자 편집된 이형접합 및 동형접합 TREM2KO의 RNAseq 분석으로 동형접합 TREM2 기능 상실 연구에서 포착되지 않은 부분적 손실로 인한 특정 표현형을 동정하였다. 살펴본 바와 같이 TREM2 기능의 부분적 상실은 콜레스테롤 생합성의 주요 조절자인 SREBF2의 하향 조절을 증진시켜 콜레스테롤 및 지방산 합성체(synthome)를 감소시켰으며, 이는 지질 유출 증가와 일치한다.
[0050] 도 68: Gas6/Axl 축은 용량 의존적 방식으로 TREM2에 의존한다.
[0051] 도 69: Siglec 11 발현은 TREM2 기능의 부분적 상실에 의해 영향받는다.
[0052] 도 70a-70e: (도 70a) TREM2는 미세아교세포에서 GRN 발현을 조절한다. (도 70b) TREM2는 미세아교세포에서 다른 이온 채널의 발현을 조절한다. (도 70c) TREM2는 미세아교세포에서 리간드 게이팅된 이온 채널의 발현을 조절한다. (도 70d) TREM2는 미세아교세포에서 전압 게이팅된 이온 채널의 발현을 하향 조절한다. (도 70e) TREM2는 미세아교세포에서 전압 게이팅된 이온 채널의 발현을 상향 조절한다.
[0053] 도 71a-71b: (도 71a) TREM2는 미세아교세포에서 GPCR의 발현을 하향 조절한다. (도 71b) TREM2는 미세아교세포에서 GPCR의 발현을 상향 조절한다.
[0054] 도 72a-72b: (도 72a) TREM2는 미세아교세포에서 수송 단백질의 발현을 하향 조절한다. (도 72b) TREM2는 미세아교세포에서 수송 단백질의 발현을 상향 조절한다.
[0055] 도 73a-73b: (도 73a) TREM2는 미세아교세포에서 촉매 수용체의 발현을 하향 조절한다. (도 73b) TREM2는 미세아교세포에서 촉매 수용체의 발현을 상향 조절한다.
[0056] 도 74a-74c: (도 74a-74b) 세포 효소의 턴오버를 조절하여 대사와 기능에 영향을 미치는 TREM2의 효과. TREM2는 미세아교세포에서 효소의 발현을 하향 조절한다. (도 74c) TREM2는 미세아교세포에서 효소의 발현을 상향 조절한다.
[0057] 도 75: TREM2는 미세아교세포에서 핵 호르몬 수용체의 발현을 상향 조절한다.
[0058] 도 76a-76b: (도 76a) TREM2는 미세아교세포에서 발현된 기타 단백질의 발현을 하향 조절한다. (도 76b) TREM2는 미세아교세포에서 발현되는 다른 단백질의 발현을 상향 조절한다.
[0059] 도 77a-77b: WT TREM2를 보유한 미세아교세포(도 77a)와 TREM2 HZ 및 (도 77b) TREM2 HO를 갖는 동질유전자 미세아교세포의 비교 RNAseq 시그니처는 여러 전사체의 유의적인 하향 조절을 밝힌다.
[0060] 도 78: 단일-배양물에서 TREM2 iCell 미세아교세포의 예비 호흡 능력. iCell 미세아교세포(MGL)를 해동하고 Agilent Seahorse XFe96 Mito 스트레스 시험 검정을 위해 씨딩하기 전에 3일동안 성숙화시켰다. 미세아교세포를 폴리(에틸렌이민)와 Geltrex로 코팅된 96웰 Seahorse XF Pro M 세포 배양 플레이트 상에 웰당 30,000개의 세포로 유지 배지에 씨딩하고 밤새 배양하였다. 검정 당일, 배지를 Seahorse XF DMEM, 글루코스(10mM), 나트륨 피루베이트(1mM), 및 L-글루타메이트(2mM)를 포함하는 검정 배지로 교환하였다. 이어서 플레이트를 주변 CO2가 있는 37°C 항온처리기에서 1시간 동안 항온처리하였다. Agilent 세포 Mito 스트레스 시험 키트로부터 10x 최종 농도의 올리고마이신 A(10 uM), FCCP(30 uM), 및 로테논/안티마이신 A(5 uM)의 스톡 화합물을 검정 배지에서 제조하였다. 제조업체의 지침에 따라 XF Pro 센서 카트리지의 주사 포트에 올리고마이신 A, FCCP, 로테논/안티마이신 A를 부하하였다. 샘플은 Wave 제어기 소프트웨어 팩키지를 사용하여 Agilent Seahorse XF Pro 분석기를 사용하여 분석하였다. 검정 후 Hoechst 핵 염료(1:1000)를 사용하여 세포 수를 결정하고 ImageXpress MetaXpress 고함량 이미지화기를 사용하여 캡처하였다. 데이터는 세포당 산소 소비율 (OCR)로 정규화하였다. 야생형 미세아교세포는 TREM2 이형접합 및 동형접합 세포주에 비해 대사 호흡 심문(interrogation) 화합물에 일관되게 반응하여 보다 높은 예비 호흡 능력을 가졌다.
[0061] 도 79a-79c: (도 79a) iCell 미세아교세포는 iPSC 배경에 걸쳐 균일한 마커 발현을 잘못 수행한다. (도 79b) TREM2 녹아웃은 감소된 가용성 TREM2를 나타낸다. (도 79c) TREM2 녹아웃은 감소된 식세포작용 기능을 나타낸다.
[0062] 도 80a-80b: TREM2 R47H의 차등적 유전자 발현. (도 80a) 경로 분석으로 시냅스 후 막 수용체 수준의 상향 조절과 많은 RNA 해독 경로의 하향 조절을 밝혔다. (도 80b) TREM2 R47H 및 TREM2 HZ는 콜레스테롤 생합성 경로에서 주요 유전자의 발현을 감소시켰다. TREM2의 이형접합 돌연변이는 AD 위험을 증가시키는 반면 동형접합 돌연변이는 Nasu-Hakola 질환으로 공지된 신경학적 병태를 유도한다.
[0063] 뉴런, 성상세포, 미세아교세포와 같은 중추신경계의 세포와 뇌 미세혈관내피세포(BMEC) 및 혈관주위세포 간의 상호작용은 중추신경계의 손상에 대한 신경염증 반응에 영향을 미친다. 시험관내 성상세포 및 미세아교세포 배양물은 신경염증에 관여하는 특정 분자 경로를 연구하는 강력한 도구이지만; 세포 누화가 신경염증에 미치는 영향을 더 잘 이해하기 위해 다세포 배양 모델이 필요하다.
[0064] 따라서, 특정 구현예에서, 본원 개시내용은 신경변성 질환의 진단, 예후 및 치료를 위한 새로운 표적, 바이오마커 및 치료학적 제제를 동정하는 것과 같은 신경 염증 연구를 위한 다세포 시험관내 배양 모델을 제공한다. 하나의 구현예에서, 미세아교세포, 성상세포 및 뉴런의 삼배양물이 제공된다. 또 다른 구현예에서, BMEC, 성상세포 및 혈관주위세포를 포함하는 혈액 뇌 장벽 모델이 제공된다.
[0065] 본원에서는 본 세포 배양 모델을 사용하여 신경염증을 연구하기 위한 검정이 추가로 제공된다. 삼배양물 시스템 또는 BBB 모델의 결과는 생존, 시냅스 가지치기, Aβ 응집에 의한 미세아교세포 기능, p-tau 형성, 뉴런의 MEA 기능, 신경 염증 캐스케이드를 유발하기 위해 배지에서 방출되는 분석물, 모든 3개의 세포 유형 간의 누화일 수 있다.
[0066] AD 내 GWAS로 AD 위험의 주요 조절 인자로서 TREM2를 동정하였다. TREM2의 이형접합 돌연변이는 AD 위험을 증가시키는 반면 동형접합 돌연변이는 Nasu-Hakola 질환으로 공지된 신경학적 병태를 유도한다. 따라서 각각의 경우 CNS가 영향을 받지만, 이형접합 돌연변이와 동형접합 돌연변이의 병태생리와 임상 증상은 뚜렷이 구분된다. 최근에는 TREM2의 손실이 미세아교세포 기능에 미치는 영향과 AD 위험에 미치는 영향을 연구하기 위해 iPSC TREM2 KO 미세아교세포를 생성하였다(문헌참조: McQuade et al., 2020, Reich et al., 2021). 그러나 AD는 TREM2의 완전한 상실이 아니라 부분적인 기능 상실로 인해 발생하므로 이러한 미세아교세포 모델이 AD에서 TREM2의 역할을 적당히 규명할 수 있을지는 불분명하다. 따라서 AD 위험에 대한 TREM2 돌연변이의 역할을 더 잘 이해하기 위해 이형접합 TREM2 기능 상실 미세아교세포를 생성하였다. TREM2 미세아교세포의 부분적 손실에 대한 검증은 이형접합 TREM2 KO 미세아교세포가 AD 위험을 증가시키는 TREM2 돌연변이의 유전으로 인해 발생하는 표현형을 더 잘 모델링한다는 개념을 뒷받침하는 HetTREM2 KO 고유의 경로를 동정하였다.
[0067] 따라서, 추가 구현예는 신경변성과 관련된 신경 염증 캐스케이드를 조절하는 TREM2의 역할과 미세아교세포 식세포작용에서 TREM2의 역할을 확인하기 위한 iPSC 유래 "브레인 인 디쉬(brain-in-a-dish)" 삼배양물 모델을 제공한다. 또한, 이형접합 TREM2 녹아웃 미세아교세포는 AD 분자 바이오마커를 동정하기 위해 사용될 수 있다. 이형접합 TREM2 녹아웃 미세아교세포는 미세아교세포가 방출하는 미세아교세포 유래된 세포외 소포에서 발견되는 바이오마커를 포함하는 대사체, 지질체 및 분비체의 변화를 동정하는 데 사용할 수 있고, 이는 본 연구에서 확인된 경로 변화를 반영하여 약물 치료 후 표현형 구제뿐만 아니라 AD 진행의 바이오마커로 작용할 수 있다. 예를 들어, 본 연구에서는 TREM2의 하향 조절에 의한 콜레스테롤 생합성 경로의 교란, TREM2 교란을 통한 Gas6-Axl 축의 용량 의존적 감소, CD33의 신경 보호 효과를 극복할 수 있는 TREM2HZ를 통한 Siglec-11의 부분적 손실, 미세아교세포에서 리간드 게이팅된 이온 채널의 상향 조절, 전압 게이팅된 이온 채널, GPCR, 촉매 수용체, 효소 및 핵 수용체의 발현 변화, COMT의 하향 조절과 관련된 TREM2의 하향 조절, NRXN2 및 SST 발현 사이의 직접적인 연관성을 동정하였다.
[0068] 추가로, 특정 구현예에서, 본원 개시내용은 유도 만능 줄기 세포(iPSC)로부터 내피 세포, 중간엽 줄기 세포(MSC) 및 조혈 전구 세포(HPC)와 같은 여러 계통의 세포를 생산하기 위한 방법을 제공한다. 일반적으로 상기 방법은 하전된 표면을 사용함에 의해 다양한 계통 세포로 iPSC를 분화시키는 것을 포함한다. 구체적으로, 세포외 매트릭스(ECM) 단백질의 부재하의 분화 방법일 수 있고, 계대에 의한 자가 정제를 가능하게 하고, 예를 들어, MSC 및 내피 세포 생산을 가능하게 한다.
[0069] 추가의 구현예에서, 내피 세포를 뇌 미세혈관 내피 세포(BMEC) 또는 림프 내피 세포로 분화시키고, MSC를 혈관주위세포로 분화시키고, HPC를 미세아교세포로 분화시키기 위한 방법이 제공된다. 상기 공정은 MACS 정제나 ECM 단백질 용도와 같은 정제 없이도 내피 세포와 MSC의 효율적인 생성을 가능하게 한다. 상기 공정은 양호한 제조 수행(GMP)을 준수하도록 조정될 수 있다.
[0070] 내피 세포는 인체에서 혈관, 림프관을 감싸고 모세혈관을 형성하는 상호 연결된 세포의 네트워크를 구성한다. 내피 세포는 영양 물질의 흐름을 조절하고 다양한 생물학적 활성 분자를 생성 및 반응하며 혈관 독성, 혈관 투과성 및 조직 허혈 치료 및 이식편의 생물가공을 포함한 치료학적 용도에 대한 화합물 및 약물을 스크리닝하기 위한 도구 공간에서 잠재적인 용도를 제공한다. 내피 세포를 유래하기 위해 많은 프로토콜이 사용되어 왔다. 거의 모든 공정에서 내피 세포의 순수한 배양을 생성하기 위해 CD31 마이크로비드를 사용한 자기 활성화 세포 분류(MAC) 분리가 필요하다.
[0071] 특정 구현예에서, 본원 개시내용은 2단계 공정에 의해 에피좀적으로 재프로그램화된 iPSC와 같은 iPSC로부터 내피 세포의 순수한 집단을 생성하는 방법을 제공한다. iPSC 세포는 양으로 하전된 아민 표면상에서 혈액 생성 전구 세포(HPC)로 전환된 후 음으로 하전된 카복실 표면의 존재하에 내피 세포의 추가 증식 및 후속 정제가 이루어질 수 있다. 내피 세포는 MAC 정제 단계 없이 혈액 생성 내피 세포에 의해 유래될 수 있다. 세포는 CD31/ CD144/ CD105를 고순도로 발현하고, 순도를 유지하도록 증식될 수 있고 초기 및 후기 계대에서 냉동 보존될 수 있다.
[0072] 성체 사람 조직으로부터 단리된 중간엽 줄기세포(MSC)는 시험관내에서 증식하고 다능성을 유지할 수 있어 재생 의학에 매력적인 세포 공급원이 될 수 있다. 그러나 현재 제조 용법 하에서 자가 재생의 가용성과 능력은 제한된다. iPSC는 현재 대안적 유사 세포 공급원을 MSC에 제공한다. 따라서, 본원 개시내용의 특정 구현예는 GMP 상용성 조건을 사용하여양으로 하전된 아민 표면상에서 중배엽 분화를 개시함으로써, 에피좀적으로 재프로그램화된 iPSC와 같은 iPSC로부터 MSC를 분화시키기 위한 방법을 제공한다. 성기 공정에 의해 유래된 MSC는 자가 재생 및 다능성을 나타낼 뿐만 아니라 MSC 계통에 대한 모든 순도 마커를 발현한다. 이들 세포는 임상 적용을 위해 스케일업될 수 있다.
[0073] 추가 구현예에서, 본원 개시내용은 MSC를 혈관주위세포(PC)로 분화시키는 방법을 제공한다. 벽화(mural) 세포로서도 공지된 세포주위세포는 혈액 미세 혈관(즉, 모세혈관, 세동맥 및 정맥)을 감싸고 있고 일반적으로 혈관 신생에 조직적 또는 구조적 역할을 갖는 것으로 이해된다. 위치, 형태, 유전자 또는 단백질 발현 패턴, 혈관 주변 밀도를 포함하는 다수의 기준을 사용하여 미성숙 및 성숙한 세포주위세포를 동정한다. 일반적으로, 본원에 제공된 방법에 따라 수득된 세포주위세포는 제한 없이 PDGFRβ, 데스민(DES), CD13(ANPEP; 알라닐(막)아미노펩티다제), α-SMA, RGS5(G 단백질 신호전달 5의 조절자), NG2(CSPG4로서도 공지된, 콘드로이틴 설페이트 프로테오글리칸 4), CD248(엔도시알린), ANG-1, CD146, CD44, CD90 및 CD13과 같은 공지된 혈관주위세포 마커의 발현을 기준으로 동정될 수 있다.
[0074] 미세아교세포는 뇌 발달, 항상성 유지, 면역 조절에 중요한 역할을 수행하는 중추 신경계의 선천성 면역 세포이다. 이들은 사람의 태아 및 1차 조직에서 획득하기 어렵다. 따라서, 본원 개시내용의 추가 구현예는 한정된 조건 하에서, 에피좀적으로 재프로그램화된 iCell HPC와 같은 HPC로부터 사람 iPSC 유래된 미세아교세포(iMGL)를 생성, 특징분석 및 냉동 보존하기 위한 방법을 제공한다. 냉동보존된 iMGL은 순도를 유지하고 면역 조절 사이토킨과 식세포작용 pHrodo 적색 표지화된 세균 바이오 입자 및 아밀로이드 베타 응집체를 분비한다. 본질적으로 무한한 양의 iMGL을 생산하는 능력은 정상 및 질환 상태에서의 미세아교세포의 역할에 대한 사람 신경과학 연구를 가속화할 수 있는 큰 전망을 갖고 있다.　
[0075] 본원에서는 TREM2, MeCP2 및/또는 SCNA에 장애가 있는 미세아교세포가 추가로 제공된다. 환자 유래 iPSC로부터 유래한 이들 미세아교세포는 2D 또는 3D 오가노이드 시스템에서 사람 미세아교세포, 뉴런, 성상세포 간의 복잡한 상호작용을 이해하고 신경 재생성 질환을 모방할 수 있는 보다 정확한 모델을 생성하는 시험관 내 도구를 제공한다.
[0076] 또한 본원에서는 SMAD 신호 전달의 억제 없이 iPSC를 신경 전구 세포(NPC)로 분화시키는 방법도 제공된다. 이들 NPC를 iPSC 유래 미세아교세포와 공동 배양하여 정상 및/또는 질환 특이적 iPSC 세포에서 유래한 디쉬에서 사람의 뇌 발달과 신경 계통, 미세아교세포, 내피 세포, 혈관주위세포 및 성상세포 간의 복잡한 세포 간 상호작용을 모방하기 위한 장기 공동 배양물 검정을 생성할 수 있다. iPSC는 NPC를 생성하기 위한 분화가 개시되기 전에 저산소 조건하에 유지될 수 있다. 신경 전구체 분화를 개시하기 위해, ECM 코팅 표면상에 ROCK 억제제 또는 블레비스타틴의 존재하에 iPSC를 씨딩할 수 있다. 세포는 ROCK 억제제의 부재하에 향후 48시간 동안 배지에 위치시킬 수 있다. 다음으로, 세포를 정상산소 조건하에서 매일 배지를 교체하면서 72시간 동안 GSK3 억제제가 보충된 DMEMF12 배지에서 예비 컨디셔닝시킨다. 예비컨디셔닝 단계가 끝나면 세포를 채취하여 ECM 코팅된 플레이트상에서 2D 포맷으로 다시 분주하거나, ROCK 억제제 또는 블리비스타틴의 존재하에 초저부착 플레이트 또는 스피너 플라스크를 사용하여 3D 응집체로서 분주할 수 있다. 정상 산소 조건 하에서 다음 8일 동안 N2가 보충된 E6 배지를 격일로 배양물을 공급하여 NPC를 생성할 수 있다. NPC 생성에 관여하는 여러 단계는 도 45a에 설명되어 있다.
[0077] 본 방법에 의해 생성된 세포는 질환 모델링, 약물 개발 및 재생 의학에 사용될 수 있다. 또한, 본원에서는 뇌 오가노이드 또는 혈뇌 장벽(BBB) 모델의 생산을 위해 본 발명의 세포(예를 들어, MSC, 내피세포, 신경 전구 세포 및 혈관주위세포)를 사용하는 방법이 제공된다.
I. 정의
[0078] 본원 명세서에서, 단수형 관사("a" 또는 "an")는 하나 이상을 의미할 수 있다. 본원 청구항에서, 단수형 관사 ("a" 또는 "an")는 "포함하는" 이라는 단어와 함께 사용되는 경우 하나 또는 하나 이상을 의미할 수 있다.
[0079] 청구항에서 "또는" 이라는 용어의 사용은, 그것이 명시적으로 대안만을 언급하지 않는 한 또는 명세서가 대안 및 "및/또는"만을 언급하는 정의를 뒷받침하고 있더라도 그 대안이 상호 배타적이지 않는 한 "및/또는"을 의미하는 것으로 사용된다. 본원에서 "또 다른" 이라는 말은 적어도 두번째 또는 그 이상을 의미할 수 있다.
[0080] "필수적으로"라는 용어는 방법 또는 조성물이 특정 단계 또는 재료만을 포함하고 이러한 방법 및 조성물의 기본적이고 신규한 특징에 실질적으로 영향을 미치지 않는 것들로 이해되어야 한다.　
[0081] 본원에 사용된 바와 같이, 특정 물질 또는 재료가 “실질적으로 부재”인 조성물 또는 매질은 물질 또는 재료의 ≤30%, ≤20%, ≤15%, 보다 바람직하게 ≤10%, 보다 더 바람직하게 ≤5%, 또는 가장 바람직하게 ≤1%를 함유한다.　
[0082] 본원에 사용된 "실질적으로" 또는 "대략"이라는 용어는 관련된 기본 기능의 변화를 초래하지 않고 허용될 수 있는 임의의 정량적 비교, 값, 측정 또는 기타 표현을 수식하기 위해 적용될 수 있다.
[0083] 용어 "약"은 일반적으로 명시된 값을 측정하기 위한 표준 분석 기술을 사용하여 결정된 명시된 값의 표준 편차 이내를 의미한다.　 상기 용어는 명시된 값의 플러스 또는 마이너스 5%를 언급함으로써 사용될 수도 있다.
[0084] 본원에 사용된 바와 같은 특정 성분과 관련하여 “필수적으로 부재”는 본원에서 특정 성분의 어느 것도 의도적으로 조성물에 제형화되지 않고/않거나 오염물로서 또는 미량으로만 존재함을 의미하기 위해 사용된다. 따라서, 조성물의 의도치 않은 임의의 오염으로 야기된 특정 성분의 총량은 0.05% 미만, 바람직하게는 0.01%이다. 표준 분석 방법으로 특정 성분의 양이 검출될 수 없는 조성물이 가장 바람직하다.
[0085] “피더 부재” 또는 “피더 독립적인”은 본원에서 피더 세포층에 대한 대체물로서 사이토킨과 성장 인자 (예를 들어, TGFβ, bFGF, LIF, 이의 유사체 또는 모방체)가 보충된 배양물을 지칭하기 위해 사용된다. 따라서, “피더 부재” 또는 피더 독립적인 배양 시스템 및 배지는 만능 세포를 배양하여 미분화 및 증식 상태로 유지하는데 사용될 수 있다. 일부의 경우, 피더(feeder)가 없는 배양물은 동물계 매트릭스 (예를 들어 MATRIGEL™)를 이용하거나, 또는 피브로넥틴, 콜라겐 또는 비트로넥틴과 같은 기질 상에서 성장한다. 이러한 접근법들은 사람 줄기 세포가 마우스 섬유아세포 “피더 층”에 대한 필요없이 필수적으로 미분화 상태로 남아있도록 해준다.
[0086] “피더 층”은 배양 접시의 바닥 상에서와 같은 세포의 코팅층으로 정의된다. 상기 피더 세포는 배양 배지로 영양분을 방출하여 만능 줄기 세포와 같은 다른 세포가 부착할 수 있는 표면을 제공할 수 있다.
[0087] 배지, 세포외 매트릭스 또는 배양 조건과 관련하여 사용되는 “합성 (defined)” 또는 “완전 합성 (fully defined)” 이라는 용어는 거의 모든 성분들의 화학 조성과 양이 공지된 배지, 세포외 매트릭스 또는 배양 조건을 가리킨다. 예를 들어, 합성 배지는 소태아 혈청, 소 혈청 알부민 또는 사람 혈청 알부민에서와 같이 규정되지 않은 인자들은 포함하지 않는다. 일반적으로, 합성 배지는 재조합 알부민, 화학적으로 합성된 지질 및 재조합 인슐린이 보충된 기본 배지 (예를 들어, 둘베코의 변형된 이글 배지 (DMEM), F12, 또는 아미노산, 비타민, 무기염, 버퍼, 산화방지제 및 에너지원을 포함하는 로스웰 파크 메모리얼 인스티튜트 (Roswell Park Memorial Institute, RPMI) 배지 1640)를 포함한다. 완전 합성 배지의 예는 Essential 8™ 배지이다.
[0088] 사람 세포와 함께 사용되는 배지, 세포외 매트릭스 또는 배양 시스템에 대해, 용어 “제노-프리(Xeno-Free) (Xf)”는 사용되는 물질이 비-사람 동물-기원이 아닌 조건을 언급한다.
[0089] “치료" 또는 "치료하는"은, (1) 질환의 병리 또는 증상을 경험하거나 나타내는 대상체 또는 환자에서 질환을 억제하는 것 (예를 들어, 병리 및/또는 증상의 추가 진행을 저지하는 것), (2) 질환의 병리 또는 증상을 경험하거나 나타내는 대상체 또는 환자에서 질환을 개선하는 것 (예를 들어, 병리 및/또는 증상을 역전시키는 것), 및/또는 (3) 질환의 병리 또는 증상을 경험하거나 나타내는 대상체 또는 환자에서 임의의 측정가능한 감소를 달성하는 것을 포함한다.
[0090] “예방항적으로 치료하는”은 다음을 포함한다: (1) 질환의 위험에 처할 수 있고/있거나 질환에 걸리기 쉬울 수 있지만 아직 질환의 임의 또는 모든 병리 또는 증상을 경험하지 않았거나 나타내지 않는 대상체 또는 환자에서 질환의 발병을 감소시키거나 이의 위험을 완화시키는 것, 및/또는 (2) 질환의 위험에 있을 수 있고/있거나 질환에 걸리기 쉬울 수 있지만 아직 질환의 임의 또는 모든 병리 또는 증상을 경험하지 않았거나 나타내지 않는 대상체 또는 환자에서 질환의 병리 또는 증상의 발병을 지연시키는 것.
[0091] 본 명세서에서 사용되는 용어 "환자" 또는 "대상체"는 살아있는 포유동물 유기체, 예를 들어, 사람, 원숭이, 소, 양, 염소, 개, 고양이, 마우스, 래트, 기니피그 또는 이들의 유전자전이 종을 의미한다. 특정 구현예에서, 환자 또는 대상체는 영장류이다. 사람 환자의 비제한적인 예는 성인, 청소년, 유아 및 태아이다.
[0092] 해당 용어가 명세서 및/또는 청구항에서 사용되는 용어 "효과적인"은 원하거나 예상되거나 의도된 결과를 달성하기에 적절한 것을 의미한다. 환자 또는 대상체를 화합물로 치료하는 맥락에서 사용될 때의 "유효량", "치료학적 유효량" 또는 "약제학적 유효량"은 질환을 치료하거나 예방하기 위해 대상체 또는 환자에게 투여될 때 상기 질환의 치료 또는 예방을 달성하기에 충분한 화합물의 양을 의미한다.
[0093] 본 명세서에서 일반적으로 사용되는 "약제학적으로 허용되는"은, 타당한 의학적 판단의 범위 내에서, 과도한 독성, 자극, 알러지 반응 또는 다른 문제 또는 합병증 없이, 합리적인 유익/위험 비율에 적합하고, 사람 및 동물의 조직, 기관 및/또는 체액과의 접촉에 사용하기에 적합한 화합물, 물질, 조성물 및/또는 제형을 의미한다.
[0094] "유도성 만능 줄기 세포 (iPSC)"는 인자들 (본원에서 재프로그래밍 인자로 지칭함) 조합의 발현 또는 그 발현을 유도함으로써 체세포를 재프로그래밍하여 생성된 세포이다. iPSC는 태아, 출생후, 신생, 발육기, 또는 성체 체세포를 사용하여 제조될 수 있다. 특정 구현예에서, 체세포를 만능 줄기 세포로 재프로그래밍하는데 사용될 수 있는 인자들로는, 예를 들어, Oct4 (Oct 3/4로도 언급됨), Sox2, c-Myc, Klf4, Nanog 및 Lin28을 포함한다. 일부 구현예에서, 체세포는 2개 이상의 재프로그래밍 인자, 3개 이상의 재프로그래밍 인자, 또는 4개의 재프로그래밍 인자를 발현시켜 체세포를 만능 줄기 세포로 재프로그래밍함으로써 재프로그래밍된다.
[0095] "세포외 매트릭스 단백질"은 주변 세포에 구조적 및 생화학적 지원을 제공하는 분자를 지칭한다. 세포외 매트릭스 단백질은 재조합체일 수 있고, 또한 이의 단편 또는 펩타이드를 지칭할 수도 있다. 예는 콜라겐 및 헤파린 설페이트를 포함한다.
[0096] “3차원(3D) 배양”이란 생물학적 세포가 모든 3차원에서 성장하거나 주변 환경과 상호작용할 수 있도록 인위적으로 생성된 환경을 지칭한다. 3D 배양은 생물반응기, 세포가 구형으로 성장할 수 있는 소형 캡슐 또는 비접착식 배양 플레이트와 같은 다양한 세포 배양 컨테이너에서 성장할 수 있다. 특정 양상에서, 3-D 배양물은 스캐폴드 부재이다. 대조적으로, “2차원 (2-D)” 배양물은 접착 표면 상에 단층과 같은 세포 배양물을 지칭한다.
[0097] 본원에 사용된 바와 같은, 유전자의 "파괴"는 파괴 부재하에 유전자 생성물의 발현 수준과 비교하여, 세포에서 대상체 유전자에 의해 암호화된 하나 이상의 유전자 생성물의 발현의 제거 또는 감소를 언급한다. 예시적인 유전자 생성물은 유전자에 의해 암호화된 mRNA 및 단백질 생성물을 포함한다. 일부 경우에 파괴는 일시적이거나 가역적이고 다른 경우에 영구적이다. 일부 경우에 파괴는 절단된 또는 비-기능성 생성물이 생성될 수 있다는 사실에도 불구하고 기능성 또는 전장 단백질 또는 mRN에 대한 것이다. 본원에서 일부 구현예에서, 발현과는 반대로 유전자 활성 또는 기능은 파괴된다. 유전자 파괴는 일반적으로 인공 방법에 의해, 즉, 화합물, 분자, 복합체 또는 조성물의 첨가 또는 유도에 의해 및/또는 DNA 수준에서와 같이 유전자의 핵산 또는 이와 연관된 핵산의 파괴에 의해 유도된다. 유전자 파괴를 위한 예시적 방법은 유전자 사일런싱, 녹다운, 녹아웃, 및/또는 유전자 편집과 같은 유전자 파괴 기술을 포함한다. 이의 예는 안티센스 기술, 예를 들어, 일반적으로 발현의 일시적 감소를 유도하는, RNAi, siRNA, shRNA, 및/또는 리보자임과 같은 안티센스 기술, 및 예를 들어, 절단 유도 및/또는 상동성 재조합에 의한 표적화된 유전자 불활성화 또는 파괴를 유도하는 유전자 편집 기술을 포함한다. 이의 예는 삽입, 돌연변이 및 결실을 포함한다. 상기 파괴는 전형적으로 유전자에 의해 암호화된 정상 또는 “야생형” 생성물 발현의 억제 및/또는 완전한 부재를 유도한다. 상기 유전자 파괴의 예는 삽입, 프레임시프트(frameshift) 및 미스센스 돌연변이, 전체 유전자의 결실을 포함하는, 유전자 또는 유전자 일부의 결실, 녹인 (knock-in) 및 녹아웃(knock-out)이다. 상기 파괴는 암호화 영역에서, 예를 들어, 하나 이상의 엑손에서 발생하여 예를 들어, 종료 코돈의 삽입에 의한 것과 같이 전장 생성물, 기능성 생성물 또는 임의의 생성물을 생성하지 못하는 능력을 유도할 수 있다. 상기 파괴는 또한 유전자의 전사를 방지하도록, 프로모터 또는 인핸서 또는 전사의 활성화에 영향을 미치는 다른 영역 내 파괴에 의해 발생할 수 있다. 유전자 파괴는 상동성 재조합에 의한 표적화된 유전자 불활성화를 포함하는, 유전자 표적화를 포함한다.
II. iPSC 분화 방법
A. HPCs
[0098] iPSC는 본원에 참조로 인용되는 미국 특허 제8,372,642호에 기재된 바와 같이 당업계에 공지된 방법에 의해 HPC로 분화될 수 있다. 하나의 방법에서, BMP4, VEGF, Flt3 리간드, IL-3, 및 GM-CSF의 조합을 사용하여 조혈 분화를 촉진시킬 수 있다. 특정 구현예에서, 세포 배양물의 분화를 위해 iPSC를 제조하기 위한 제1 배지, BMP4, VEGF, 및 FGF를 포함하는 제2 배지에 이어서 Flt3 리간드, SCF, TPO, IL-3, 및 IL-6을 포함하는 제3 배지에 세포 배양물로 순차적 노출은 만능 세포를 HPC 및 조혈 세포로 분화시킬 수 있다. 제2 합성 배지는 또한 헤파린을 포함할 수 있다. 추가로, BMP4 및 VEGF를 함유하는 배지에서 FGF-2 (50 ng/ml)의 내포는 만능 세포로부터 조혈 전구 세포의 생성 효율을 증진시킬 수 있다. 추가로, 제1 합성 배지에서 글리코겐 신타제 키나제 3 (GSK3) 억제제 (예를 들어, CHIR99021, BIO, 및 SB-216763)의 내포는 추가로 HPC의 생성을 추가로 증진시킬 수 있다.
[0099] 일반적으로, 만능 세포의 조혈 전구체 세포로의 분화는 한정되거나 비한정된 조건을 사용하여 수행될 수 있다. 한정된 조건은 일반적으로 수득한 세포가 사람 대상체에게 투여되는 것으로 의도되는 구현예에서 바람직할 수 있는 것으로 인지된다. 조혈 줄기 세포는 한정된 조건 (예를 들어, TeSR 배지를 사용하여) 하에서 만능 줄기 세포로부터 유래될 수 있고, 조혈 세포는 만능 세포로부터 유래된 배아체로부터 생성될 수 있다. 다른 구현예에서, 만능 세포는 OP9 세포 또는 마우스 배아 섬유아세포 상에서 동시 배양되고 후속적으로 분화될 수 있다.
[00100] 만능 세포는 분화 공정의 일부로서 배아체 또는 응집물을 형성하도록 될 수 있다. 분화를 유도하기 위해, “배아체”(EB) 또는 성장하는 세포의 클러스터의 형성은 일반적으로 사람 만능 줄기 세포의 EB로의 시험관내 응집을 포함하고 내배엽, 외배엽 및 중배엽 기원을 나타내는 다중 조직 유형으로의 자발적 및 무작위 분화를 가능하게 한다. 따라서 3차원 EB를 사용하여 조혈 세포 및 내피 세포의 일부 분획물을 생성할 수 있다.
[00101] 응집물 형성을 촉진시키기 위해, 세포는 75% IMDM (Gibco), RA 보충물 없이 0.05% N2 및 B-27이 보충된 25% 햄스 개질된 F12 (Cellgro), 200 mM 1-글루타민, 0.05 mg/ml 아스코르브산-2-포스페이트 마그네슘 염(Asc 2-P) (WAKO), 및 4.5 x 10-4 MTG로 이루어진, 무혈청 분화 (SFD) 배지에서 밤새 항온처리를 위해 저-접착 플레이트에 전달될 수 있다. 다음 날, 세포는 각각의 웰로부터 수거하고 원심분리할 수 있다. 세포는 이어서 제1의 4일 분화 동안 약 50 ng/ml 골 형태형성 인자 (BMP4), 약 50 ng/ml 혈관 내피 성장 인자(VEGF), 및 50 ng/ml zb FGF가 보충된 SFD 기본 배지로 이루어진, “EB 분화 배지”에 재현탁시킬 수 있다. 세포는 48시간 마다 절반 공급한다. 분화 5일째에, 배지는 50 ng/ml 줄기 세포 인자 (SCF), 약 50 ng/ml Flt-3 리간드 (Flt-3L), 50 ng/ml 인터류킨-6 (IL-6), 50 ng/ml 인터류킨-3 (IL-3), 50 ng/ml 트롬보포이에틴 (TPO)이 보충된 SFD 배지로 구성된 제2 배지로 대체한다. 세포에 신선한 분화 배지가 49시간 마다 절반 공급된다. 배지 변화는 5분 동안 300g에서 분화 배양물을 회전 침강시키고 분화 배양물로부터 용적 절반을 흡인시키고 이를 새로운 배지로 새롭게 함에 의해 수행된다. 특정 구현예에서, EB 분화 배지는 약 BMP4 (예를 들어, 약 50 ng/ml), VEGF (예를 들어, 약 50 ng/ml), 및 임의로 FGF-2 (예를 들어, 약 25-75 ng/ml 또는 약 50 ng/ml)을 포함할 수 있다. 상등액은 흡인될 수 있고 분화 배지로 대체될 수 있다. 대안적으로 세포에 2일 마다 신선한 배지가 절반 공급될 수 있다. 세포는 분화 공정 동안에 상이한 시점에서 수확될 수 있다.
[00102] HPC는 합성 배지를 사용하여 만능 줄기 세포로부터 배양될 수 있다. 합성 배지를 사용하여 만능 세포를 조혈 CD34+ 줄기 세포로 분화시키기 위한 방법은 예를 들어, 이의 전문이 본원에 참조로 인용된 미국 출원 제12/715,136호에 기재되어 있다. 이들 방법은 본원의 개시내용에 따라 사용될 수 있는 것으로 예상된다.
[00103] 예를 들어, 합성 배지를 사용하여 조혈 CD34+ 분화를 유도할 수 있다. 합성 배지는 성장 인자 BMP4, VEGF, Flt3 리간드, IL-3 및/또는 GMCSF를 함유할 수 있다. 만능 세포는 BMP4, VEGF, 및 임으로 FGF-2를 포함하는 제1의 합성 배지에서 배양하고 이어서 (Flt3 리간드, IL-3, 및 GMCSF) 또는 (Flt3 리간드, IL-3, IL-6, 및 TPO)를 포함하는 제2 배지에서 배양할 수 있다. 제1 및 제2의 배지는 또한 하나 이상의 SCF, IL-6, G-CSF, EPO, FGF-2, 및/또는 TPO를 포함할 수 있다. 실질적으로 저산소 조건(예를 들어, 20% O2 미만)은 추가로 조혈 또는 내피 분화를 촉진시킬 수 있다.
[00104] 세포는 실질적으로 기계적 또는 효소적 수단 (예를 들어, 트립신 또는 TrypLETM를 사용하여)을 통해 개별화될 수 있다. ROCK 억제제(예를 들어, H1152 또는 Y-27632)는 또한 상기 배지에 포함될 수 있다. 이들 근접법은 예를 들어, 로봇 자동화를 사용하여 자동화될 수 있는 것으로 예상된다.
[00105] 특정 구현예에서, 실질적으로 저산소 조건을 사용하여 만능 세포의 조혈 전구 세포로의 분화를 촉진시킬 수 있다. 당업자에 의해 인지되는 바와 같이, 약 20.8% 미만의 대기 산소 함량은 저산소인 것으로 고려된다. 배양물 중 사람 세포는 주위 공기와 비교하여 감소된 산소 함량을 갖는 대기 조건에서 성장시킬 수 있다. 상기 상대적인 저산소증은 배양 배지에 노출된 대기 산소를 감소시킴에 의해 성취될 수 있다. 배아 세포는 주위 수준의 이산화탄소와 함께, 전형적으로 약 1% 내지 약 6%의 감소된 산소 조건하에서 생체내 발육시킨다. 이론에 국한시키고자 하는 것 없이, 저산소 조건은 특정 배아 발육 조건의 양상을 모방할 수 있는 것으로 예상된다. 하기 실시예에 나타낸 바와 같이, 저산소 조건은 특정 구현예에서 사용하여 유도 만능 세포를 HPC와 같은 보다 분화된 세포 유형으로의 추가 분화를 촉진시킬 수 있다.
[00106] 하기의 저산소 조건을 사용하여 만능 세포의 조혈 전구세포로의 분화를 촉진시킬 수 있다. 특정 구현예에서, 약 20% 미만, 약 19% 미만, 약 18% 미만, 약 17% 미만, 약 16% 미만, 약 15% 미만, 약 14% 미만, 약 13% 미만, 약 12% 미만, 약 11% 미만, 약 10% 미만, 약 9% 미만, 약 8% 미만, 약 7% 미만, 약 6% 미만, 약 5% 미만, 약 5%, 약 4%, 약 3%, 약 2%, 또는 약 1%의 대기 산소 함량을 사용하여 조혈 전구체 세포로의 분화를 촉진시킬 수 있다. 특정 구현예에서, 저산소 대기는 약 5% 산소 가스를 포함한다.
[00107] 임의의 소정의 조혈 전구세포 확장에서 사용되는 특정 배지에 상관 없이, 사용되는 배지는 바람직하게 약 0.1 ng/mL 내지 약 500 ng mL, 보다 일반적으로 10 ng/mL 내지 100 ng/mL의 농도로 적어도 하나의 사이토킨이 보충된다. 적합한 사이토카인은 c-키트 리간드(KL) (또한 강철 인자 (Stl), 비만 세포 성장 인자 (MGF), 및 줄기세포 인자 (SCF)), IL-6, G-CSF, IL-3, GM-CSF, IL-1α, IL-11 MIP-1α, LIF, c-mpl 리간드/TPO, 및 flk2/flk3 리간드(Flt2L 또는 Flt3L)을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 특히, 배양물은 SCF, Flt3L 및 TPO 중 적어도 하나를 포함한다. 보다 특히, 배양물은 SCF, Flt3L 및 TPO를 포함한다.
[00108] 하나의 구현예에서, 사이토킨은 배지에 함유되고 배지 관류에 의해 보충된다. 대안적으로, 생물반응기 시스템을 사용하는 경우, 사이토킨은 별도의 주입구 포트를 통해 농축된 용액으로서 배지 관류 없이 별도로 첨가될 수 있다. 사이토킨이 관류 없이 첨가되는 경우, 이들은 전형적으로 새로운 사이토킨이 대략 2 내지 4일마다 첨가되면서 생물반응기 내 용적의 10분의 1 내지 1/100과 동일한 양으로 10x 내지 100x 용액으로서 첨가된다. 추가로, 새로운 농축된 사이토킨은 또한 관류된 배지에서 사이토킨에 추가로 별도로 첨가될 수 있다.
예시적인 HPC 분화 방법
[00109] 2D HPC 분화: iPSC는 E8의 존재하에 MATRIGEL™ 또는 비트로넥틴 상에 유지될 수 있고 적어도 5 내지 10계대 동안 저산소증에 적응될 수 있다. 세포를 서브컨플루언트 iPSC에서 분리하여 5 uM 블레비스타틴이 보충된 무혈청 합성 (SFD) 배지의 존재하에 아민 배양 디쉬상에 25만 세포/웰의 밀도로 분주한다. 분주 후 24시간에 50ng/ml의 BMP4, VEGF 및 FGF2가 보충된 SFD 배지를 배양액에 첨가한다. 다음날 새로운 배지를 교체하여 블레비스타틴을 제거한다. 분화 과정 5일째에 세포를 50ng/ml Flt-3 리간드, SCF, TP0, IL3 및 IL6가 포함된 배지에 5U/ml의 헤파린과 함께 위치시킨다. 세포는 분화 공정 전반에 걸쳐 48시간 마다 공급한다. 전체 공정은 저산소 조건과 하전된 아민 플레이트에서 수행된다. HPC는 CD43/CD34 세포와 CFU의 존재에 의해 정량화된다.
[00110] 3D HPC 분화: 세포를 서브컨플루언트 iPSC에서 분리하여 5 uM 블레비스타틴 또는 1 μM H1152가 보충된 무혈청 합성 (SFD) 배지의 존재하에 스피너 플라스크에 25만 내지 50만 세포/ml의 밀도로 분주한다. 분주 후 24시간에 50ng/ml의 BMP4, VEGF 및 FGF2가 보충된 SFD 배지로 교체하였다. 분화 과정 5일째에 세포를 50ng/ml Flt-3 리간드, SCF, TP0, IL3 및 IL6가 포함된 배지에 5-10 U/ml의 헤파린과 함께 위치시킨다. 세포는 분화 과정 전반에 걸쳐 48시간 마다 공급하였다. 전체 공정은 저산소 조건하에서 수행하였다. HPC는 CD43/CD34에 의해 정량화한다. HPC는 CD34 비드를 사용하여 분류된 MACS이다.
B. 유전자 파괴
[00111] 특정 양상에서, TREM2, MeCP2 및/또는 SCNA 유전자 발현, 활성 또는 기능은 PSC(예를 들어, ESC 또는 iPSC)와 같은 세포에서 파괴된다. 일부 구현예에서, 유전자 파괴는 유전자 내 파괴, 예를 들어, 녹-아웃, 삽입, 미스센스 또는 프레임시프트 돌연변이, 예를 들어, 이중대립유전자 프레임시프트 돌연변이, 유전자 전부 또는 일부의 결실, 예를 들어,따라서, 하나 이상의 엑손 또는 일부, 및/또는 녹-인을 실행함에 의해 수행된다. 예를 들어, 상기 파괴는 DNA-결합 표적화된 뉴클레아제, 예를 들어, 아연 핑거 뉴클레아제(ZFN) 및 전사 활성화인자 유사 이펙터 뉴클레아제 (TALEN), 및 RNA-가이드된 뉴클레아제, 예를 들어, CRlSPR-연합된 뉴클레아제 (Cas)를 포함하고, 구체적으로 유전자 또는 이의 일부의 서열에 표적화되도록 디자인된 서열 특이적 또는 표적화된 뉴클레아제에 의해 실행될 수 있다.
[00112] 일부 구현예에서, 유전자의 발현, 활성 및/또는 기능의 파괴는 유전자를 파괴함에 의해 수행된다. 일부 양상에서, 유전자는 이의 발현이 유전자 파괴의 부재 또는 파괴를 수행하기 위해 도입된 성분들의 부재하의 발현과 비교하여 적어도 또는 약 20, 30, 또는 40%, 일반적으로 적어도 또는 약 50, 60, 70, 80, 90, 또는 95%까지 감소되도록 파괴된다.
[00113] 일부 구현예에서, 상기 파괴는 유전자의 발현이 후기 시점에 회복되도록 일시적이거나 가역적이다. 다른 구현예에서, 상기 파괴는 가역적이거나 일시적이지 않고, 예를 들어, 영구적이다.
[00114] 일부 구현예에서, 유전자 파괴는 전형적으로 표적화된 방식으로 유전자 내 하나 이상의 이중 가닥 파열 및/또는 하나 이상의 단일 가닥 파열의 유도에 의해 수행된다. 일부 구현예에서, 이중 가닥 또는 단일 가닥 파열은 뉴클레아제, 예를 들어, 엔도뉴클레아제, 예를 들어, 유전자-표적화된 뉴클레아제에 의해 수행된다. 일부 양상에서, 상기 파열은 유전자의 암호화 영역 내, 예를 들어, 엑손내 유도된다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 상기 유도는 암호화 영역의 N-말단 부위 부근에서, 예를 들어, 제1 엑손내, 제2 엑손 내 또는 후속 엑손내에서 일어난다.
[00115] 일부 양상에서, 이중 가닥 또는 단일 가닥 파열은 예를 들어, 비-상동성 말단-접합 (NHEJ) 또는 상동성-지시된 복구(HDR)에 의해 세포성 복구 공정을 통해 복구를 진행한다. 일부 양상에서, 상기 복구 공정은 오류가 발생하기 용이하고, 유전자의 완전한 녹아웃을 유도할 수 있는, 프레임시프트 돌연변이, 예를 들어, 양대립유전자 프레임시프트 돌연변이와 같은 유전자의 파괴를 유도한다. 예를 들어, 일부 양상에서, 상기 파괴는 결실, 돌연변이 및/또는 삽입을 유도함을 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 파괴는 조기 정지 코돈의 존재를 유도한다. 일부 양상에서, 삽입, 결실, 전좌, 프레임시프트 돌연변이 및/또는 미성숙한 중지 코돈의 존재는 유전자의 발현, 활성 및/또는 기능의 파괴를 유도한다.
[00116] 일부 구현예에서, 유전자 파괴는 예를 들어, RNA 간섭 (RNAi), 짧은 간섭 RNA (siRNA), 짧은 헤어핀 (shRNA)에 의한 안티센스 기술을 사용하여 성취되고/되거나 리보자임을 사용하여 유전자의 발현을 선택적으로 서프레싱하거나 리프레싱한다. siRNA 기술은 유전자로부터 전사되는 mRNA의 뉴클레오타이드 서열과 상동성인 서열 및 상기 뉴클레오타이드 서열과 상보적인 서열을 갖는 이중 가닥 RNA 분자를 사용하는 RNAi이다. siRNA는 일반적으로 유전자로부터 전사되는 mRNA의 하나의 영역과 상동성/상보성이거나 상이한 영역과 상동성/상보성인 다수의 RNA 분자를 포함하는 siRNA일 수 있다. 일부 양상에서, siRNA는 폴리시스트론성 작제물에 포함된다. 특정 양상에서, 상기 siRNA는 내인성 mRNA로부터 야생형 및 돌연변이체 단백질 해독을 둘다 억제한다.
[00117] 일부 구현예에서, 상기 파괴는 유전자에 특이적으로 결합하거나 이에 하이브리드화하는, DNA-표적화 분자, 예를 들어, DNA-결합 단백질 또는 DNA-결합 핵산, 또는 복합체, 화합물 또는 이를 함유하는 조성물을 사용하여 성취된다. 일부 구현예에서, DNA-표적화 분자는 DNA-결합 도메인, 예를 들어, 아연 핑거 단백질(ZFP) DNA-결합 도메인, 전사 활성화인자-유사 단백질 (TAL) 또는 TAL 이펙터 (TALE) DNA-결합 도메인, 클러스터링된 규칙적으로 이격된 팔린드롬 반복체 (CRISPR) DNA-결합 도메인, 또는 메가뉴클레아제로부터의 DNA-결합 도메인을 포함한다. 아연 핑거, TALE, 및 CRISPR 시스템 결합 도메인은 예를 들어, 천연적으로 존재하는 아연 핑거 또는 TALE 단백질의 인지 나선 영역의 가공 (하나 이상의 아미노산을 변경하는)을 통해 소정의 뉴클레오타이드 서열에 결합하도록 가공될 수 있다. 가공된 DNA 결합 단백질(아연 핑거 또는 TALE)은 천연적으로 존재하지 않는 단백질이다. 디자인을 위한 합리적 기준에는 기존 ZFP 및/또는 TALE 디자인의 정보와 결합 데이터를 저장하는 데이터베이스에서 정보를 처리하기위한 대체 규칙 및 컴퓨터 알고리즘의 적용이 포함된다. 예를 들어, 미국 특허 제6,140,081호; 제6,453,242호; 및 제6,534,261호를 참조하고; 또한 WO 98/53058; WO 98/53059; WO 98/53060; WO 02/016536 및 WO 03/016496 및 미국 공개 공보 제2011/0301073호를 참조한다.
[00118] 일부 구현예에서, DNA 표적화 분자, 복합체 또는 조합은 DNA 결합 분자 및 유전자의 억제 또는 파괴를 용이하게 하는 이펙터 도메인과 같은 하나 이상의 추가 도메인을 포함한다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 유전자 파괴는 DNA 결합 단백질 및 이종성 조절 도메인 또는 이들의 기능성 단편을 포함하는 융합 단백질에 의해 수행된다. 일부 양상에서 도메인은 예를 들어 활성화제, 억제제, 공동 활성화제, 공동 억제제, 사일런서, 종양 유전자, DNA 복구 효소 및 이들의 관련 인자 및 변형제, DNA 재배열 효소 및 이들의 관련 인자 및 변형제, 염색질 관련 단백질 및 이들의 변형제 등과 같은 전사인자 도메인, 예를 들어, 키나제, 아세틸라제 및 탈아세틸라제, DNA 변형 효소, 예를 들어, 메틸트랜스퍼라제, 토포이소머라제, 헬리카제, 리가제, 키나제, 포스파타제, 폴리머라제, 엔도뉴클레아제 및 이들의 관련 인자 및 변형제를 포함한다. 예를 들어, DNA 결합 도메인과 뉴클레아제 절단 도메인의 융합에 관한 자세한 내용은 미국 특허 출원 공개번호 2005/0064474, 2006/0188987 및 2007/0218528을 이들의 전문으로 참조로 인용된다. 일부 양상에서, 추가의 도메인은 뉴클레아제 도메인이다. 따라서, 일부 구현예에서, 유전자 파괴는 뉴클레아제 및 뉴클레아제 함유 복합체 또는 융합 단백질과 같은 가공된 단백질을 사용하여 유전자 또는 게놈 편집에 의해 촉진되고 상기 단백질은 비특이적 DNA 절단 분자에 융합되거나 복합체화된 서열 특이적 DNA 결합 도메인으로 구성되어 있다.
[00119] 일부 양상에서 이들 표적화된 키메라 뉴클레아제 또는 뉴클레아제 함유 복합체는 표적화된 이중 가닥 절단 또는 단일 가닥 절단을 유도함에 의해 오류 성향의 비상동성 말단 연결(NHEJ) 및 상동성 지시된 복구(HDR)를 포함한 세포 DNA 복구 기전을 자극하여 정밀한 유전학적 변형을 수행한다. 일부 구현예에서, 뉴클레아제는 아연 핑거 뉴클레아제(ZFN), TALE 뉴클레아제(TALEN), 및 CRISPR 관련(Cas) 단백질과 같은 RNA 가이드 엔도뉴클레아제(RGEN), 또는 메가뉴클레아제와 같은 엔도뉴클레아제이다.
[00120] 일부 구현예에서, 공여자 핵산, 예를 들어, 공여자 플라스미드 또는 유전학적으로 가공된 항원 수용체를 암호화하는 핵산이 제공되고, DSB의 도입에 따른 유전자 편집 부위에서 HDR에 의해 삽입된다. 따라서, 일부 구현예에서, 유전자의 파괴 및 항원 수용체, 예를 들어, CAR의 도입은 동시에 수행되며, 이에 따라 유전자는 부분적으로 CAR-암호화 핵산의 녹인 또는 삽입에 의해 파괴된다.
[00121] 일부 구현예에서, 어떠한 공여자 핵산이 제공되지 않는다. 일부 양상에서 DSB 도입 후 NHEJ 매개 복구는 미스센스 돌연변이 또는 프레임시프트를 생성하여 유전자 파괴를 유발할 수 있는 삽입 또는 결실 돌연변이를 초래한다.
1. ZFP 및 ZFN
[00122] 일부 구현예에서, DNA-표적화 분자는 엔도뉴클레아제와 같은 이펙터 단백질에 융합된 하나 이상의 아연 핑거 단백질 (ZFP) 또는 전사 활성화인자-유사 단백질 (TAL)과 같은 DNA-결합 단백질을 포함한다. 예는 ZFN, TALE, 및 TALEN을 포함한다.
[00123] 일부 구현예에서, DNA-표적화 분자는 하나 이상의 아연-핑거 단백질 (ZFP) 또는 서열-특이적 방식으로 DNA에 결합하는 이의 도메인을 포함한다. ZFP 또는 이의 도메인은 이의 구조가 아연 이온의 배위를 통해 안정화되는 결합 도메인 내 아미노산 서열 영역인, 하나 이상의 아연 핑거를 통해 서열-특이적 방식으로 DNA에 결합하는 대형 단백질 내 단백질 또는 도메인이다. 용어 아연 핑거 DNA 결합 단백질은 흔히 아연 핑거 단백질 또는 ZFP로서 축약된다. ZFP 중에는 개별 핑거의 어셈블리에 의해 생성되는 전형적으로 9 내지 18개 뉴클레오타이드 길이의 특이적 DNA 서열을 표적화하는 인공 ZFP 도메인이 있다.
[00124] ZFP는 단일 핑거 도메인이 대략 30개 아미노산 길이이고 단일 베터 턴의 2개 시스테인과 함께 아연을 통해 배위된 2개의 영구 히스티딘 잔기를 함유하고 2, 3, 4, 5 또는 6개 핑거를 갖는 알파 나선을 함유하는 것들을 포함한다. 일반적으로, ZFP의 서열-특이성은 아연 핑거 인지 나선 상에 4개의 나선 위치 (-1, 2, 3 및 6)에서 아미노산을 치환함에 의해 변경될 수 있다. 따라서, 일부 구현예에서, ZFP 또는 ZFP-함유 분자는 비-천연적으로 존재하는 것이고, 예를 들어, 선택된 표적 부위에 결합하도록 가공된다.
[00125] 일부 양상에서, MeCP2의 파괴는 유전자 내 첫 번째 표적 부위를 첫 번째 ZFP와 접촉시켜 유전자를 파괴함으로써 수행된다. 일부 구현예에서, 유전자 내 표적 부위는 6개의 핑거와 조절 도메인을 포함하는 융합 ZFP와 접촉하여 유전자의 발현을 억제한다.
[00126] 일부 구현예에서, 접촉시키는 단계는 추가로 유전자 내 제2 표적 부위를 제2 ZFP와 접촉시킴을 포함한다. 일부 양상에서, 제1 및 제2 표적 부위는 인접해 있다. 일부 구현예에서, 제1 및 제2 ZFP는 공유적으로 연결된다. 일부 양상에서 첫 번째 ZFP는 조절 도메인 또는 적어도 2개의 조절 도메인을 포함하는 융합 단백질이다.
[00127] 일부 구현예에서, 제1 및 제2 ZFP는 각각 조절 도메인을 포함하거나 각각 적어도 2개의 조절 도메인을 포함하는 융합 단백질이다. 일부 구현예에서, 조절 도메인은 전사 억제제, 전사 활성화제, 엔도뉴클레아제, 메틸 트랜스퍼라제, 히스톤 아세틸 트랜스퍼라제 또는 히스톤 데아세틸라제이다.
[00128] 일부 구현예에서, ZFP는 프로모터에 작동 가능하게 연결된 ZFP 핵산에 의해 암호화된다. 일부 양상에서, 방법은 핵산을 지질:핵산 복합체 또는 나출된 핵산에서 세포에 먼저 투여하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, ZFP는 프로모터에 작동 가능하게 연결된 ZFP 핵산을 포함하는 발현 벡터에 의해 암호화된다. 일부 구현예에서, ZFP는 유도성 프로모터에 작동 가능하게 연결된 핵산에 의해 암호화된다. 일부 양상에서, ZFP는 약한 프로모터에 작동 가능하게 연결된 핵산에 의해 암호화된다.
[00129] 일부 구현예에서, 표적 부위는 유전자의 전사 개시 부위의 업스트림에 있다. 일부 구현예에서, 표적 부위는 유전자의 전사 개시 부위에 인접해 있다. 일부 양상에서, 표적 부위는 유전자의 전사 개시 부위의 다운스트림에 있는 RNA 폴리머라제 중단 부위에 인접해 있다.
[00130] 일부 구현예에서, DNA-표적화 분자는 아연-핑거 뉴클레아제 (ZFN)을 형성하기 위해 DNA 절단 도메인에 융합된 아연-핑거 DNA 결합 도메인이거나 이를 포함한다. 일부 구현예에서, 융합 단백질은 적어도 하나의 Type liS 제한 효소로부터 절단 도메인 (또는 절단 절반-도메인) 및 가공될 수 있거나 가공될 수 없는 하나 이상의 아연 핑거를 포함한다. 일부 구현예에서, 절단 도메인은 유형 liS 제한 엔도뉴클레아제 Fok I로부터 유래한다. Fok I는 일반적으로 하나의 가닥 상에 이의 인지 부위로부터의 9개 뉴클레오타이드 및 다른 가닥 상에 이의 인지 부위로부터 13개 뉴클레오타이드에서 DNA의 이중 가닥 절단을 촉매한다.
[00131] 일부 구현예에서, ZFN은 가공된 세포에 존재하는 유전자를 표적화한다. 일부 양상에서, ZFN은 이중 가닥 절단(DSB)을 예를 들어, 유전자의 암호화 영역 내 미리 결정된 부위에서 효율적으로 생성한다. 표적화된 일반적인 영역에는 엑손, N 말단 영역을 암호화하는 영역, 제1 엑손, 제2 엑손, 프로모터 또는 인핸서 영역을 포함한다. 일부 구현예에서, ZFN의 일시적 발현은 가공된 세포에서 표적 유전자의 매우 효율적이고 영구적인 파괴를 촉진한다. 특히, 일부 구현예에서, ZFN의 전달은 50%를 초과하는 효율로 유전자의 영구적 파괴를 초래한다.
[00132] 많은 유전자-특이적 가공된 아연 핑거는 시판되고 있다. 예를 들어, 제조원(Sangamo Biosciences (Richmond, CA, USA))은 제조원(Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA))과 협력하에 아연-핑거 작제를 위한 플랫폼 (CompoZr)을 개발하여 연구자가 아연-핑거 작제 및 확증을 함께 우회하도록 하여 수천개의 단백질에 대해 특이적으로 표적화된 아연 핑거를 제공한다(문헌참조: Gaj et al., Trends in Biotechnology, 2013, 31(7), 397-405). 일부 구현예에서, 시판되는 아연 핑거를 사용하거나 맞춤식으로 디자인된다.
2. TAL, TALE 및 TALEN
[00133] 일부 구현예에서, DNA-표적화 분자는 천연적으로 존재하거나 전사 활성화인자-유사 단백질 이펙터 (TALE) 단백질에서와 같이 가공된 (비-천연적으로 존재하는) 전사 활성화인자 유사 단백질 (TAL) DNA 결합 도메인을 포함한다. 예를 들어, 미국 특허 공개 공보 제2011/0301073호를 참조하고 이의 전문이 본원에 참조로 인용된다.
[00134] TALE DNA 결합 도메인 또는 TALE는 하나 이상의 TALE 반복체 도메인/유닛을 포함하는 폴리펩타이드이다. 반복체 도메인은 TALE의 이의 동족 표적 DNA 서열로의 결합에 관여한다. 단일 "반복체 유닛" (또한 “반복체”로서 언급됨)은 전형적으로 33 내지 35개 아미노산 길이이고 천연적으로 존재하는 TALE 단백질 내 다른 TALE 반복체 서열과 적어도 일부 서열 상동성을 나타낸다. 각각의 TALE 반복체 유닛은 전형적으로 반복체의 위치 12 및/또는 13에서 반복체 가변 이잔기(RVD)를 구성하는 1 또는 2개 DNA-결합 잔기를 포함한다. 이들 TALE의 DNA 인지를 위한 천연 (정준 (canonical)) 코드는 위치 12 및 13에서 HD 서열이 사이토신 (C)로의 결합을 유도하도록 결정되었다. NG의 T로의 결합, NI의 A로의 결합, NN의 G 또는 A로의 결합 및 NO의 T로의 결합 및 비-정준 (비전형적) RVD는 또한 공지되어 있다. 미국 특허 공개 공보 제2011/0301073호를 참조한다. 일부 구현예에서, TALE는 표적 DNA 서열에 대한 특이성과 함께 TAL 어레이의 디자인에 의해 임의의 유전자에 표적화될 수 있다. 표적 서열은 일반적으로 티미딘으로 시작한다.
[00135] 일부 구현예에서, 상기 분자는 DNA 결합 엔도뉴클레아제, 예를 들어, TALE 뉴클레아제(TALEN)이다. 일부 양상에서, TALEN은 TALE로부터 유래된 DNA-결합 도메인 및 핵산 표적 서열을 절단하기 위한 뉴클레아제 촉매 도메인을 포함하는 융합 단백질이다.
[00136] 일부 구현예에서, TALEN은 유전자 내 표적 서열을 인지하고 절단한다. 일부 양상에서, DNA의 절단은 이중 가닥 파열을 유도한다. 일부 양상에서, 상기 파열은 상동성 재조합 또는 비-상동성 말단 연결 (NHEJ)의 속도를 자극한다. 일반적으로, NHEJ는 불완전 복구 공정이고 이는 흔히 절단 부위에서 DNA 서열에 대한 변화를 유도한다. 일부 양상에서, 복구 기전은 직접적인 재-연결을 통해 또는 소위 미세상동성-매개된 말단 연결을 통해 (문헌참조: Critchlow and Jackson, 1998) 또는 소위 마이크로상동성 매개된 말단 연결을 통해 2개의 DNA 말단에 잔류하는 것의 재연결을 포함한다. 일부 구현예에서, NHEJ를 통한 복구는 작은 삽입 또는 결실을 유도하고 이를 사용하여 유전자를 파괴하고 이로써 리프레싱할 수 있다. 일부 구현예에서, 상기 변형은 적어도 하나의 뉴클레오타이드의 치환, 결실 또는 첨가일 수 있다. 일부 양상에서, 절단-유도된 돌연변이유발 이벤트, 즉, NHEJ 이벤트에 연속한 돌연변이유발 이벤트가 일어난 세포는 당업계에 널리 공지된 방법에 의해 동정되고/되거나 선택될 수 있다.
[00137] 일부 구현예에서, TALE 반복체는 유전자를 특이적으로 표적화하도록 어셈블리된다. 18,740개의 사람 단백질-암호화 유전자를 표적화하는 TALEN의 라이브러리를 작제하였다. 맞춤 디자인된 TALE 어레이는 제조원(Cellectis Bioresearch (Paris, France), Transposagen Biopharmaceuticals (Lexington, KY, USA), 및 Life Technologies (Grand Island, NY, USA))을 통해 시판되고 있다.
[00138] 일부 구현예에서, TALEN은 하나 이상의 플라스미드 벡터에 의해 암호화된 전이유전자로서 도입된다. 일부 양상에서, 플라스미드 벡터는 상기 벡터를 수용한 세포의 동정 및/또는 선택을 위해 제공되는 선택 마커를 함유할 수 있다.
3. RGEN (CRISPR/Cas 시스템)
[00139] 일부 구현예에서, 파괴는 RNA-가이드된 엔도뉴클레아제 (RGEN)을 통한 파괴와 같은, 하나 이상의 DNA-결합 핵산을 사용하여 수행된다. 예를 들어, 상기 파괴는 클러스터링된 규칙적으로 이격된 짧은 팔린드롬 반복체 (CRISPR) 및 CRISPR-연합 (Cas) 단백질을 사용하여 수행될 수 있다. 일반적으로, "CRISPR 시스템"은 총체적으로 Cas 유전자를 암호화하는 서열, tracr (트랜스-활성화 CRISPR) 서열(예를 들어, tracrRNA 또는 활성 부분 tracrRNA), tracr-쌍(mate) 서열 (내인성 CRISPR 시스템과 관련하여 “직접적인 반복체” 및 tracrRNA-가공된 부분 직접적인 반복체), 가이드 서열(또한, 내인성 CRISPR 시스템과 관련하여 “스페이서”로서 언급되는)), 및/또는 CRISPR 유전자좌로부터 다른 서열 및 전사체를 포함하는, CRISPR-연합 (“Cas”) 유전자의 발현에 관여하거나 이의 활성을 지시하는 전사체 및 다른 요소들을 언급한다.
[00140] CRISPR/Cas 뉴클레아제 또는 CRISPR/Cas 뉴클레아제 시스템은 뉴클레아제 기능 (예를 들어, 2개의 뉴클레아제 도메인)과 함께 DNA 및 Cas 단백질 (예를 들어, Cas9)에 서열 특이적으로 결합하는 비-암호화 RNA 분자(가이드) RNA를 포함할 수 있다. CRISPR 시스템의 하나 이상의 요소들은 예를 들어, 내인성 CRISPR 시스템을 포함하는 특정 유기체, 예를 들어, 스트렙토코커스 피오게네스(Streptococcus pyogenes)로부터 유래된 I형, II형, 또는 III형 CRISPR 시스템으로부터 유래할 수 있다.
[00141] 일부 양상에서, Cas 뉴클레아제 및 gRNA (표적 서열 및 고정된 tracrRNA에 특이적인 crRNA의 융합을 포함하는)는 세포에 도입한다. 일반적으로, gRNA의 5’ 말단에서 표적 부위는 Cas 뉴클레아제를 상보성 염기 쌍형성을 사용하여 표적 부위, 예를 들어, 유전자에 표적화시킨다. 표적 부위는 전형적으로 NGG 또는 NAG와 같은, 프로토스페이서 인접 모티프 (PAM) 서열의 바로 5’ 위치를 기준으로 선택될 수 있다. 이와 관련하여, gRNA는 가이드 RNA의 처음 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 14, 12, 11, 또는 10개의 뉴클레오타이드를 표적 DNA 서열에 상응하도록 변형시킴에 의해 목적하는 서열에 표적화된다. 일반적으로, CRISPR 시스템은 표적 서열의 부위에서 CRISPR 복합체의 형성을 촉진시키는 요소들에 의해 특징화된다. 전형적으로, "표적 서열"은 일반적으로 가이드 서열이 상보성을 갖도록 디자인된 서열을 언급하고, 여기서, 표적 서열과 가이드 서열 간의 하이브리드화는 CRISPR 복합체의 형성을 촉진시킨다. 완전한 상보성은 필수적으로 요구되지 않고, 단, 하이브리드화를 유발하고 CRISPR 복합체의 형성을 촉진시키기에 충분한 상보성이 있다.
[00142] CRISPR 시스템은 표적 부위에서 이중 가닥 절단 (DSB)에 이어서 본원에 논의된 바와 같은 붕괴를 유도할 수 있다. 다른 구현예에서, “닉카제”로 간주되는 Cas9 변이체를 사용하여 표적 부위에서 단일 가닥을 닉킹(nick)한다. 쌍 형성 닉카제를 사용하여, 예를 들어, 각각 닉의 동시 도입시, 5’ 오버행이 도입되도록 하는 한쌍의 상이한 gRNA 표적화 서열에 의해 지시되는 특이성을 개선시킬 수 있다. 다른 구현예에서, 촉매적 불활성 Cas9는 전사 리프레서 또는 활성화인자와 같은 이종성 이펙터 도메인에 융합되어 유전자 발현에 영향을 미친다.
[00143] 표적 서열은 DNA 또는 RNA 폴리뉴클레오타이드와 같은 임의의 폴리뉴클레오타이드를 포함할 수 있다. 표적 서열은 세포의 핵 또는 세포질에, 예를 들어, 세포의 기관 내 위치할 수 있다. 일반적으로, 표적 서열을 포함하는 표적화된 유전자좌로의 재조합을 위해 사용될 수 있는 서열 또는 주형은 "편집 주형" 또는 "편집 폴리뉴클레오타이드" 또는 "편집 서열"로서 언급된다. 일부 양상에서, 외인성 주형 폴리뉴클레오타이드는 편집 주형으로서 언급될 수 있다. 일부 양상에서, 재조합은 상동성 재조합이다.
[00144] 전형적으로, 내인성 CRISPR 시스템과 관련하여, CRISPR 복합체 (표적 서열에 하이브리드화되고 하나 이상의 Cas 단백질과 복합체화된 가이드 서열을 포함하는)의 형성은 표적 서열에서 또는 이의 부근에서 (예를 들어, 이로부터 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 50개 이상의 염기쌍 내) 하나의 가닥 또는 가닥 둘다의 절단을 유도한다. 야생형 tracr 서열 전부 또는 일부 (예를 들어, 야생형 tracr 서열의 약 또는 약 20, 26, 32, 45, 48, 54, 63, 67, 85, 또는 이상의 뉴클레오타이드)를 포함할 수 있거나 이들로 이루어질 수 있는 tracr 서열은 또한 예를 들어, tracr 서열의 적어도 일부를 가이드 서열에 작동적으로 연결된 tracr 쌍 서열의 전부 또는 일부에 하이브리드화함에 의해 CRISPR 복합체의 일부를 형성할 수 있다. tracr 서열은 하이브리드화하고 CRISPR 복합체의 형성에 관여하는 tracr 쌍 서열에 충분한 상보성, 예를 들어, 최적으로 정렬되는 경우 tracr 쌍 서열의 길이를 따라 적어도 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%또는 99%의 서열 상보성을 갖는다.
[00145] CRISPR 시스템의 하나 이상의 요소들의 발현을 구동시키는 하나 이상의 벡터는 세포에 도입되어 CRISPR 시스템의 요소들의 발현이 하나 이상의 표적 부위에서 CRISRR 복합체의 형성을 지시할 수 있다. 성분들은 또한 단백질 및/또는 RNA로서 세포에 전달될 수 있다. 예를 들어, Cas 효소, tracr-쌍 서열에 연결된 가이드 서열 및 tracr 서열은 각각 별도의 벡터 상에 별도의 조절 요소들에 작동적으로 연결될 수 있다. 대안적으로, 동일하거나 상이한 조절 요소들로부터 발현되는 2개 이상의 요소들은 제1 벡터에 포함되지 않은 CRISPR 시스템의 임의의 성분들을 제공하는 하나 이상의 추가의 벡터와 함께 단일 벡터에 조합될 수 있다. 벡터는 제한 엔도뉴클레아제 인지 서열 (또한 “클로닝 부위”로서 언급되는)과 같은 하나 이상의 삽입 부위를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 삽입 부위는 하나 이상의 벡터의 하나 이상의 서열 요소들의 업스트림 및/또는 다운스트림에 위치한다. 다수의 상이한 가이드 서열이 사용되는 경우, 단일 발현 작제물은 세포 내 다수의 상이한 상응하는 표적 서열에 CRISPR 활성을 표적화하기 위해 사용될 수 있다.
[00146] 벡터는 Cas 단백질과 같은 CRISPR 효소를 암호화하는 효소-암호화 서열에 작동적으로 연결된 조절 요소를 포함할 수 있다. Cas 단백질의 비제한적인 예는 Cas1, Cas1B, Cas2, Cas3, Cas4, Cas5, Cas6, Cas7, Cas8, Cas9 (또한 Csn1 및 Csx12로서 공지된), Cas10, Csy1, Csy2, Csy3, Cse1, Cse2, Csc1, Csc2, Csa5, Csn2, Csm2, Csm3, Csm4, Csm5, Csm6, Cmr1, Cmr3, Cmr4, Cmr5, Cmr6, Csb1, Csb2, Csb3, Csx17, Csx14, Csx10, Csx16, CsaX, Csx3, Csx1, Csx15, Csfl, Csf2, Csf3, Csf4, 이의 상동체 또는 이의 변형된 버젼을 포함한다. 이들 효소는 공지되어 있고; 예를 들어, 에스. 피오게네스 Cas9 단백질의 아미노산 서열은 승인 번호 Q99ZW2하에 SwissProt 데이터베이스에서 발견될 수 있다.
[00147] CRISPR 효소는 Cas9 (예를 들어, 에스. 피오게네스로부터 또는 에스. 뉴모니아로부터)일 수 있다. CRISPR 효소는 예를 들어, 표적 서열 내 및/또는 표적 서열의 보체 내, 표적 서열의 위치에서 가닥 하나 또는 가닥 둘다의 절단을 지시할 수 있다. 상기 벡터는 상응하는 야생형 효소와 관련하여 돌연변이된 CRISPR 효소를 암호화하여 상기 돌연변이된 CRISPR 효소는 표적 서열을 함유하는 표적 폴리뉴클레오타이드의 가닥 하나 또는 가닥 둘다를 절단하는 능력이 부재일 수 있다. 예를 들어, 에스. 피오게네스로부터의 Cas9의 RuvC I 촉매 도메인에서 아스파르테이트 대 알라닌 치환 (D10A)은 가닥 둘다를 절단하는 뉴클레아제로부터 닉카제 (단일 가닥을 절단하는)로 Cas9를 전환시킨다. 일부 구현예에서, Cas9 닉카제는 가이드 서열(들), 예를 들어, 각각 DNA 표적의 센스 및 안티센스 가닥을 표적화하는 2개의 가이드 서열과 조합하여 사용될 수 있다. 상기 조합은 가닥 둘다를 닉킹하도록 하고 NHEJ 또는 HDR을 유도하기 위해 사용된다.
[00148] 일부 구현예에서, CRISPR 효소를 암호화하는 효소 암호화 서열은 특정 세포에서, 예를 들어, 진핵 세포에서의 발현을 위해 코돈 최적화되어 있다. 진핵 세포는 특정 유기체, 예를 들어, 사람, 마우스, 래트, 토끼, 개 또는 비-사람 영장류를 포함하는 포유동물의 세포이거나 이들로부터 유래된 세포일 수 있다. 일반적으로, 코돈 최적화는 고유 서열의 적어도 하나의 코돈을 고유 아미노산 서열을 유지하면서 숙주 세포의 유전자에서 보다 흔하게 또는 가능 흔하게 사용되는 코돈으로 대체함에 의해 관심 대상의 숙주 세포에서 증진된 발현을 위해 핵산 서열을 변형시키는 공정을 언급한다. 다양한 종은 특정 아미노산의 특정 코돈에 대해 특정 편향을 나타낸다. 코돈 편향(유기체 간의 코돈 용법에서의 차이)은 흔히 전령 RNA (mRNA)의 해독 효율과 상호관련되고, 이는 이어서 무엇 보다 해독될 코돈의 성질 및 특정 운반 RNA (tRNA) 분자의 가용성에 의존하는 것으로 사료된다. 세포에서 선택된 tRNA의 우세는 일반적으로 펩타이드 합성에서 가장 흔하게 사용되는 코돈을 반영한다. 따라서, 유전자들은 코돈 최적화를 기준으로 소정의 유기체에서 최적의 유전자 발현을 위해 조정될 수 있다.
[00149] 일반적으로, 가이드 서열은 표적 서열과 하이브리드화하고 CRISPR 복합체의 표적 서열로의 서열-특이적 결합을 지시하기에 충분히 표적 폴리뉴클레오타이드 서열과 상보성을 갖는 임의의 폴리뉴클레오타이드 서열이다. 일부 구현예에서, 가이드 서열과 이의 상응하는 표적 서열 간의 상보성 정도는 적합한 정렬 알고리즘을 사용하여 최적으로 정렬되는 경우 약 또는 약 50%, 60%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97.5%, 99%이상이다.
[00150] 최적의 정렬은 서열을 정렬시키기위한 임의의 적합한 알고리즘을 사용하여 결정될 수 있고 상기 알고리즘의 비제한적인 예는 스미스-워터맨 (Smith-Waterman) 알고리즘, 니들맨-운쉬(Needleman-Wunsch) 알고리즘, 버로우-휠러 트랜스폼 (Burrows-Wheeler Transform)을 기반으로 하는 알고리즘 (예를 들어, 버로우 휠러 얼라이너(Burrows Wheeler Aligner), 클러스탈 더블유 (Clustal W), 클러스탈 엑스(Clustal X), BLAT, 노보얼라인(Novoalign) (Novocraft Technologies, ELAND (Illumina, San Diego, Calif.), SOAP (soap.genomics.org.cn에서 가용한), 및 Maq (maq.sourceforge.net에서 가용한)를 포함한다.
[00151] CRISPR 효소는 하나 이상의 이종성 단백질 도메인을 포함하는 융합 단백질의 일부일 수 있다. CRISPR 효소 융합 단백질은 임의의 추가의 단백질 서열 및 임의로 임의의 2개의 도메인 사이의 링커 서열을 포함할 수 있다. CRISPR 효소에 융합될 수 있는 단백질 도메인의 예는 제한 없이, 에피토프 태그, 리포터 유전자 서열, 및 하기의 활성 중 하나 이상을 갖는 단백질 도메인을 포함한다: 메틸라제 활성, 데메틸라제 활성, 전사 활성화 활성, 전사 억제 활성, 전사 방출 인자 활성, 히스톤 변형 활성, RNA 절단 활성 및 핵산 결합 활성. 에피토프 태그의 비제한적인 예는 히스티딘 (His) 태그, V5 태그, FLAG 태그, 인플루엔자 헤마글루티닌 (HA) 태그, Myc 태그, VSV-G 태그, 및 티오레독신 (Trx) 태그를 포함한다. 리포터 유전자의 예는 글루타티온-5-트랜스퍼라제 (GST), 서양고추냉이 퍼옥시다제 (HRP), 클로람페니콜 아세틸트랜스퍼라제 (CAT) 베타 갈락토시다제, 베타-글루쿠로니다제, 루시퍼라제, 녹색 형광성 단백질 (GFP), HcRed, DsRed, 시안(cyan) 형광성 단백질 (CFP), 황색 형광성 단백질 (YFP), 및 청색 형광 단백질 (BFP)를 포함하는 자가형광 단백질을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. CRISPR 효소는 말토스 결합 단백질 (MBP), S-태그, Lex A DNA 결합 도메인 (DBD) 융합체, GAL4A DNA 결합 도메인 융합체 및 헤르페스 심플렉스 바이러스 (HSV) BP 16 단백질 융합체를 포함하지만 이에 제한되지 않는, DNA 분자에 결합하거나 다른 세포 분자에 결합하는 단백질 또는 단백질의 단편을 암호화하는 유전자 서열에 융합될 수 있다.
C. 하전된 세포 표면
[00152] 일부 구현예에서, 본원 개시내용은 세포 배양을 위한 하전된 표면에 관한 것이다. 하전된 표면은 아민 표면 또는 질소 함유 작용 그룹과 같이 양으로 하전되거나 카복실 표면 또는 산소 함유 작용 그룹과 같이 음으로 하전될 수 있다. 세포 표면을 처리하여 배양 용기의 표면 전하를 변경할 수 있다.
[00153] 일부 양상에서, 표면은 중성으로 하전되고, 예를 들어, 표면은 음으로 하전되고 양으로 하전된 작용 그룹을 포함한다. 예를 들어, CORNING PRIMARIA® 표면은 폴리스티렌 표면상에 산소 함유(음전하) 및 질소 함유(양전하) 작용 그룹의 독특한 혼합물을 특성으로 한다. 상기 표면은 기존 TC 표면상에서 배양할 때 부착력이 불량하거나 분화 잠재력이 제한될 수 있는 세포의 성장을 지원한다. 일부 양상에서, 표면은 ULA 표면 코팅을 포함한다. 예를 들어, 코닝의 초저부착 표면은 친수성 및 중성으로 하전된 공유 결합 하이드로겔 층이다. 단백질 및 기타 생분자는 소수성 또는 이온 상호작용을 통해 폴리스티렌 표면에 수동적으로 흡착되므로 상기 하이드로겔은 이러한 힘을 통해 비특이적 고정화를 자연적으로 억제하여 후속 세포 부착을 억제한다. 상기 표면은 매우 안정적이고 세포 독성이 없고 생물학적으로 불활성이며 분해되지 않는다. HPC로부터의 미세아교세포 생성을 지원할 수 있는 다른 예는 다음을 포함한다: Corning CellBIND 배양(미국 특허 6,617,152)은 고에너지 마이크로파 플라즈마를 사용하여 폴리스티렌 표면에 더 많은 산소를 혼입하여 기존 플라즈마 또는 코로나 방전 처리된 표면에 비해 친수성(습윤성)이 되게함과 동시에 표면의 안정성을 증가시킨다. Corning Synthemax 자가 코팅 기질은 RGD 모티프와 플랭킹 서열을 포함하는 독특한 무동물성 합성 비트로넥틴 기반 펩타이드이다. 합성 펩타이드는 최적의 세포 결합 및 신호 전달을 위해 펩타이드를 수동적으로 코팅하고 배향하며 제시하기 위해 중합체 백본에 공유 결합된다.
[00154] 세포 배양 표면은 플라즈마 중합된 필름으로 코팅할 수 있다. 플라즈마 중합의 공급원은 하나 이상의 단량체이다. 유용한 중합 가능한 단량체는 올레핀 아민, 할로겐화 올레핀, 올레핀 카르복실산 및 카복실레이트, 올레핀 니트릴 화합물, 산소화 올레핀 및 올레핀 탄화수소와 같은 불포화 유기 화합물을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 올레핀은 비닐 및 알릴 형태를 포함할 수 있다. 다른 구현예에서, 사이클로헥산, 사이클로펜탄 및 사이클로프로판과 같은 사이클릭 화합물이 사용될 수 있다.
[00155] 당업자가 인지하는 바와 같이, 다양한 플라즈마 중합 기술은 세포 배양 표면 상에 하나 이상의 단량체를 침착시키기 위해 활용될 수 있다. 바람직하게는, 양으로 하전된 중합된 필름이 표면상에 침착된다. 당업자가 인지하는 바와 같이, 플라즈마 중합된 표면은 함께 사용되는 단백질에 따라 음전하를 가질 수 있다. 아민은 중합체의 단량체 공급원으로 사용하는 것이 바람직하다. 일부 구현예에서, 플라즈마 중합된 단량체는 플라즈마 공급원을 사용하여 가스 단량체의 중합을 개시하고 배양 용기 상에 얇은 중합체 필름이 침착되도록 에너지를 제공하는 가스 방전을 생성하여 만들어진다. 사이클릭 화합물이 활용될 수 있고 이는 글로우 방전 방법에 의해 가스 플라즈마를 포함할 수 있다. 예를 들어 1,2-디아미노사이클로헥산과 같은 이러한 사이클릭 화합물의 유도체도 일반적으로 가스 플라즈마에서 중합할 수 있다.
[00156] 중합가능한 단량체의 혼합물이 사용될 수 있다. 추가로 중합 가능한 단량체는 일반적으로 그 자체로 중합 가능한 것으로 간주되지 않는 다른 가스(예를 들어, 아르곤, 질소 및 수소)와 블렌딩될 수 있다.
[00157] 접착 배양을 위해 유용한 임의의 배양 용기가 사용될 수 있는 것으로 고려된다. 본원 개시내용에 의해 고려되는 바람직한 세포 배양 용기 구성은 다중웰 플레이트(예를 들어, 6웰, 12웰 및 24웰 플레이트), 디쉬(예를 들어, 페트리 디쉬), 시험관, 배양 플라스크, 롤러병, 튜브 또는 진탕 플라스크 등을 포함한다.
[00158] 세포 배양 표면용 재료는 플라스틱(예를 들어, 폴리스티렌, 아크릴로니트릴 부타디엔 스티렌, 폴리카보네이트); 유리; 미세 다공성 필터(예를 들어, 셀룰로스, 나일론, 유리 섬유, 폴리에스테르, 폴리카보네이트); 배치 또는 연속 세포 배양 또는 유전학적 가공(예를 들어, 생물반응기)에 사용되는, 중공 섬유 튜브 또는 마이크로 운반 비드를 포함하는 생물반응기용 재료; 폴리테트라플루오로에틸렌(Teflon®), 세라믹 및 관련 중합체 재료를 포함할 수 있다.
[00159] 특정 양상에서, 세포 배양물에는 라미닌, 피브로넥틴, 비트로넥틴, MATRIGEL™, 테나신, 엔탁틴, 트롬보스폰딘, 엘라스틴, 겔라틴, 콜라겐, 피브릴린, 메로신, 앵커린, 콘드로넥틴, 연결 단백질, 골 시알로단백질, 오스테오칼신, 오스테오폰틴, 에피넥틴, 히알루로넥틴, 운둘린, 에필리그린 및 칼리닌 같은 임의의 세포 외 매트릭스 단백질이 없거나 본질적으로 없다.
D. HPC의 미세아교세포로의 분화
[00160] 미세아교세포는 뇌 발달, 항상성 유지, 면역 조절에 중요한 역할을 수행하는 중추 신경계의 선천성 면역 세포이다. 이들은 사람의 태아 및 1차 조직에서 획득하기 어렵다. 특정 구현예에서, 본 방법은 정의된 조건 하에서 에피좀적으로 재프로그램화된 HPC로부터 사람 iPSC 유래 미세아교세포(iMGL)의 생성, 특징화 및 냉동보존을 기재한다. 냉동보존된 iMGL은 순도를 유지하고 면역 조절 사이토킨과 식세포작용 pHrodo 적색 표지화된 세균 바이오 입자 및 아밀로이드 베타 응집체를 분비한다. 본질적으로 무한한 양의 iMGL을 생산할 수 있는 능력은 정상 및 질환 상태에서의 미세아교세포의 역할에 대한 사람 신경과학 연구를 가속화할 수 있는 큰 전망을 갖고 있다.　
[00161] 예시적인 방법에서, 신선하거나 냉동보존된 HPC를 해동하고 FLT-3 리간드 및 IL-3을 포함하는 미세아교세포 분화 배지에서 분주한다. 세포는 10-50K/cm2의 밀도, 예를 들어, 20-35K/cm2로 분주할 수 있다. 미세아교세포 분화 배지는 IL-34, TGFβ1 또는 M-CSF(MDM) 또는 이들의 각각의 유사체 또는 모방체를 포함할 수 있다. 배양은 MATRIGEL™ 코팅 플레이트 또는 프리마리아 플레이트 또는 초저부착 플레이트와 같은 하전 표면, 조직 배양 플레이트(TC) 또는 비조직 배양 플레이트(Non-TC)에서 수행될 수 있고 96 웰 플레이트(예를 들어, 웰당 200 μl 미세아교세포 분화 배지)와 같이 처리량이 높을 수 있다. 세포는 분화 23일 후 2X 미세아교세포 분화 배지(MDM)를 웰당 50μl의 배지로 48시간마다 절반씩 공급할 수 있다. 특정 양상에서, 분화는 ECM 단백질, 예를 들어, MATRIGEL®의 부재하에 수행된다. 23일째에 냉각 PBS로 세포를 수거하고 자동화된 세포 계수기를 사용하여 총 생존 세포 수를 정량화한다. 세포는 CD11b, CD11c, CD45, CD33, TREM-2의 표면 발현과 TREM-2, IBA, CX3CR1, P2RY12 및 TMEM119의 세포내 발현에 대해 염색된다.
E. 내피 세포
[00162] E8의 존재하에 MATRIGEL™ 또는 비트로넥틴 상에 유지된 iPSC는 적어도 5 내지 10계대 동안 저산소증에 적응될 수 있다. 세포를 서브컨플루언트 iPSC로부터 분리하여 5 uM 블레비스타틴 또는 1 uM H1152 보충된 무혈청 합성 (SFD) 배지의 존재하에 아민 배양 디쉬상에 25만 세포/웰의 밀도로 분주한다. 분주 후 24시간에 50ng/ml의 BMP4, VEGF 및 FGF2가 보충된 SFD 배지를 배양물액에 첨가할 수 있다. 세포는 분화 공정 전반에 걸쳐 48시간 마다 공급할 수 있다. 전체 공정은 저산소 조건하에서 수행할 수 있다. 분화 종료시에 채취한 세포를 냉동 보존하거나 카복실 표면상에서 25k/cm2의 밀도로 다시 분주하여 VascuLife VEGF 내피 배지 또는 SFD 내피 배지의 존재 하에서 내피 분화를 개시할 수 있다.
[00163] 예시적인 방법에서는, 냉동 보존된 6일 HPC 또는 생 배양물을 VascuLife VEGF 내피 배지 또는 SFD 내피 배지와 저산소 조건의 존재하에서 카복실 표면상에 25k/cm2로 분주한다. 세포에 분주 후 24시간에 새로운 내피 배지를 공급하고, 이들이 컨플루언시에 도달할 때까지 48시간마다 배양물을 공급하였다. 세포가 컨플루언시에 도달하는 데 5~6일이 걸릴 수 있다. 세포를 TrypLE Select를 사용하여 수거하고, 표면 내피 마커 CD31, CD105 및 CD144에 대해 염색하고, 내피 배지를 사용하여 10 k/cm2로 카복실 표면상에 재분주하고, 저산소 항온처리기 조건에 위치시켰다. 세포에는 분리 후 2일, 4일, 6일째에 내피 배지를 충분히 공급한다. 7일째에는 세포를 채취하고 염색하고 동일한 방식으로 3회 추가로 다시 분주한다.
[00164] 일부 구현예에서, 내피 세포는 뇌 미세 혈관 내피 세포로 전환된다. 예시적인 방법에서, 생 또는 냉동 보존된 HPC(예를 들어, BMP4, VEGF 및 FGF2가 보충된 SFD의 존재하에 아민 표면상에서 유래된 7일 HPC)를 피브로넥틴(예를 들어, 50-200 μg/mL, 특히 100 μg/mL) 및 콜라겐 I(예를 들어, 100-500 μg/mL, 특히 400 μg/mL)을 함유하는 ECM 상에 ECRA 배지(사람 내피세포 SFM [Gibco], 1% 혈소판 불량 혈장 유래 소 혈청 [Fisher], 20ng/mL bFGF [Promega], 10uM 레티노산)와 함께 분주한다. 세포는 50-100 k/cm2, 특히 75 k/cm2의 밀도로 분주할 수 있다. 배양물은 저산소 항온처리기 조건하에서 유지할 수 있다. 배양물에는 컨플루언트할 때까지 격일로 ECRA 배지를 공급할 수 있다. 이어서 TrypLE을 사용함에 의해 컨플루언트 배양물을 채취한다. 채취한 세포상에서 염색을 수행하여 PECAM-1(CD31) 및 GLUT-1을 검출할 수 있다. 채취한 세포는 예를 들어, ECRA 배지와 함께 트랜스웰 삽입체상에 다시 분주될 수 있고, 저산소 항온처리기 조건에 위치시킬 수 있다. 배양물에는 컨플루언트할 때까지 격일로 ECRA 배지를 공급할 수 있다. 컨플루언트 배양물은 경내피 전기 저항(TEER)에 대해 시험될 수 있다.　
F. 중간엽 세포
[00165] 일부 구현예에서, iPSC는 MSC로 분화된다. 예를 들어, 도 5c는 MSC를 생성하기 위한 2D HPC 분화 공정의 개략도를 보여준다. E8의 존재하에 MATRIGEL™ 또는 비트로넥틴 상에 유지된 iPSC는 적어도 5 내지 10계대 동안 저산소증에 적응된다. 세포를 서브컨플루언트 iPSC로부터 분리하고 5 uM 블레비스타틴 또는 10 uM H1152가 보충된 무혈청 합성 (SFD) 배지의 존재하에 아민 배양 디쉬상에 25만 세포/웰의 밀도로 분주한다. 분주 후 24시간에 50ng/ml의 BMP4, VEGF 및 FGF2가 보충된 SFD 배지를 배양액에 첨가한다. 세포는 분화 공정 전반에 걸쳐 48시간 마다 공급한다. 전체 공정은 저산소 조건하에서 수행한다. 분화 6일 또는 7일의 종료시에 세포를 GMP -MSC 배지에 넣는다. 세포를 컨플루언시까지 성장시키고 각 계대의 종료시에 수확한 다음, 5 uM 블레비스타틴 또는 10 uM H1152를 보충한 GMP-MSC 배지에서 50K/cm2의 밀도로 아민 표면상에 다시 분주하여 MSC의 성장 및 증식을 선택적으로 허용한다.
[00166] 일부 양상에서, 냉동보존된 6일 HPC 또는 6일 분화 종료시에 생배양물을 아민 하전된 표면 플레이트상에 10 uM H1152의 존재하에 MSC 배지에 위치시켰다. 세포에 분주 후 24시간에 새로운 MSC 배지를 공급하고, 배양물은 이들이 컨플루언시에 도달할 때까지 48시간마다 공급하였다. 세포가 컨플루언시에 도달하는 데는 5-6일 소요되었다. 세포는 TrypLE를 사용하여 채취하고, 표면 MSC 마커 CD73, CD44, CD105, CD49d에 대해 및 내피 마커 CD31 및 CD144의 부재에 대해 염색하였다. 신흥 배양물은 저산소 조건과 아민 표면에서 상기된 공정을 사용하여 3회 계대한다. 배양물을 P4에서 정상산소 및 정상 조직 배양 플레이트에 이전시켰다.
[00167] 일부 양상에서, MSC는 추가로 혈관주위세포로 분화될 수 있다. 예시적인 방법에서, MSC는 ScienCell 혈관주위세포 배지(카탈로그: 1201)에 씨딩하고(예를 들어, 조직 배양 플라스틱(TCP) 6웰 플레이트에서상에서 1-20k/cm2, 특히 10k/cm2의 세포 밀도로) 정상산소 항온처리기 조건에 위치시킨다. 배양물에는 컨플루언트할 때까지 격일로 ScienCell 혈관주위세포 배지를 공급할 수 있다. 컨플루언트 배양물은 예를 들어, TrypLE을 사용함에 의해 채취할 수 있다. 염색은 채취한 세포에 대해 수행하여 신경아교세포 항원 2/콘드로이틴 황산 프로테오글리칸(NG2) 및 PDGFR-베타(CD140b)를 검출할 수 있다. 채취한 세포는 ScienCell 혈관주위세포 배지에서 (예를 들어 1-20k/cm2의 세포 밀도, 특히 TCP 6웰 플레이트상에서 10k/cm2의 세포 밀도로) 다시 분주할 수 있다. 배양물에는 컨플루언트할 때까지 격일로 ScienCell 혈관주위세포 배지를 공급할 수 있고 앞서 설명한 것과 동일한 방식으로 채취하고 염색할 수 있다. 이어서 세포는 배양물의 순도가 확장 및 유지될 때까지 다시 분주한다. 추가로, 세포는 CD146, CD49a, CD166, CD54, CD73, CD105, CD13, CD56, CD49d, 및/또는 Cd44의 존재에 대해 양성으로 염색될 수 있다.
G. 분화 배지
[00168] 세포는 각각의 특정 세포 집단의 성장을 지원하는데 필요한 영양분으로 배양될 수 있다. 일반적으로 세포는 탄소 공급원, 질소 공급원, 완충액을 포함한 성장 배지에서 배양하여 pH를 유지한다. 배지는 지방산 또는 지질, 아미노산 (예를 들어, 비필수 아미노산), 비타민(들), 성장 인자, 사이토킨, 항산화제 물질, 피루브산, 완충제 pH 지시제 및 무기염을 포함할 수도 있다. 전형적인 증식 배지는 줄기 세포 성장을 향상시키기 위해 다양한 영양분, 예를 들어 비필수 아미노산 및 비타민이 보충된 최소 필수 배지, 예를 들어 둘베코의 변형된 이글 배지 (DMEM) 또는 ESSENTIAL 8™ (E8™) 배지를 포함한다. 최소 필수 배지의 예로는, 이에 제한되지는 않지만, 최소 필수 배지 이글 (MEM) 알파 배지, 둘베코의 변형된 이글 배지 (DMEM), RPMI-1640 배지, 199 배지 및 F12 배지를 포함한다. 추가로, 최소 필수 배지는 말, 송아지 또는 소태아 혈청과 같은 첨가물로 보충될 수 있다. 다르게는, 배지는 무혈청일 수 있다. 다른 경우에 있어서, 증식 배지는 본원에서 배양액 중에서 줄기 세포와 같은 미분화 세포를 성장시켜 유지하는데 최적화된 무혈청 제제로 지칭되는 “녹아웃 혈청 대체물”을 포함할 수 있다. 녹아웃™ 혈청 대체물은, 예를 들어, 본원에 참고로 포함되는 미국 특허출원 2002/0076747호에 개시되어 있다. 바람직하게는, PSC는 완전 합성되고 피더가 없는 배지 중에서 배양한다.
[00169] 일부 구현예에서, 배지는 혈청에 대한 임의의 대체물을 포함하거나 포함하지 않을 수 있다. 혈청에 대한 대용물로는 알부민 (예를 들어, 지질이 풍부한 알부민, 알부민 대체물, 예를 들어 재조합 알부민, 식물성 전분, 덱스트란 및 단백질 가수분해산물), 트랜스페린 (또는 다른 철 운반체), 지방산, 인슐린, 콜라겐 전구체, 미량원소, 2-머캅토에탄올, 3'-티올글리세롤, 또는 이의 균등물을 적절하게 포함하는 물질을 포함할 수 있다. 혈청에 대한 대체물은 예를 들어 국제특허공보 WO 98/30679호에 개시된 방법에 의해 제조될 수 있다. 다르게는, 보다 편리함을 위해 임의의 임의의 시판되는 물질이 사용될 수 있다. 시판되는 물질로는 녹아웃™ 혈청 대체물 (KSR), 화학적으로 합성된 지질 농축물 (Gibco) 및 GLUTAMAX™ (Gibco)을 포함한다.
[00170] 다른 배양 조건들은 적절하게 정의될 수 있다. 예를 들어, 배양 온도는 약 30 내지 40°C, 예를 들어, 적어도 또는 약 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39°C일 수 있지만, 특별히 이들에 제한되지 않는다. 하나의 구현예에서, 세포를 37°C에서 배양한다. CO2 농도는 약 1 내지 10%, 예를 들어, 약 2 내지 5% 또는 상기 수치에서 추론가능한 임의의 범위일 수 있다. 산소 분압은 적어도, 이하, 또는 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20%, 또는 상기 수치에서 추론가능한 임의의 범위일 수 있다.
H. 다세포 세포 배양물
[00171] 특정 구현예에서, 본원 개시내용은 신경변성 질환의 진단, 예후 및 치료를 위한 새로운 표적, 바이오마커 및 치료학적 제제를 동정하는 것과 같은 신경 염증 연구를 위한 다세포 배양 모델을 제공한다. 하나의 구현예에서, 미세아교세포, 성상세포 및 뉴런의 삼배양물이 제공된다.
[00172] 뉴런은 각각 표적 뉴런의 활성을 증가시키거나 감소시키는 흥분성 뉴런 및/또는 억제성 뉴런일 수 있다. 대뇌피질(가바성/억제성) 뉴런, 도파민성 뉴런, 콜린성 뉴런, 세로토닌성 뉴런, 글루탐산성 뉴런, 스트리크닌 민감성 글리신 수용체를 발현하는 뉴런, 아세틸콜린 뉴런, 에피네프린 또는 노르에피네프린 뉴런 또는 히스타민 반응성 뉴런을 사용할 수 있다.
[00173] 글루타메이트성 뉴런은 중추신경계(CNS)에서 가장 흔한 흥분성 신경전달물질 중 하나인 글루타메이트를 생성한다.　글루타메이트는 학습, 인지, 기억과 같은 기본적인 공정에 중요한 역할을 하고, 글루타메이트성 전달의 조절 장애는 여러 신경학적 병태를 유발할 수 있다.
[00174] 가바성 뉴런은 포유동물 중추신경계(CNS)의 주요 억제 신경전달물질인 감마-아미노부티르산(GABA)을 생성한다. GABA는 주로 글루타메이트로부터 합성되고, 글루타메이트 데카복실라제(GAD)에 의해 촉매되고, 시냅스의 30 - 40%에 존재한다. GABA는 Cl- 유입 또는 K+ 유출을 유도하여 과분극화된 뉴런과 활동 전위 감소를 초래한다.　GABA 신경전달 기능 장애는 정신분열증과 간질을 포함한 여러 장애를 초래할 수 있다.　
[00175] 중뇌의 도파민성 뉴런은 포유동물 중추신경계에서 도파민(DA)의 주요 공급원이다. 이들의 손실은 가장 현저한 사람 신경학적 장애 중 하나인 파킨슨 질환(PD)과 관련이 있다. 일부 구현예에서, 해마, 편도체, 말초(주변 뉴런), 운동 뉴런 또는 피질 뉴런(예를 들어, 글루타메이트성 또는 흥분성 뉴런)에서 전형적으로 발견되는 뉴런 유형은 다양한 구현예에서 사용될 수 있다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 콜린성 뉴런은 예를 들어 US 8,513,017 또는 US 8,796,022에 기재된 바와 같이 생성될 수 있다. 일부 구현예에서, 운동 뉴런은 예를 들어, US 8,735,149에 기재된 바와 같이 생성될 수 있다. 일부 구현예에서, 도파민성 뉴런은 WO2013067362; WO2013163228; WO2012080248; 또는 Wo2011130675에 기재된 바와 같이 생성될 수 있다.
[00176] 글루타메이트성 및 가바성 뉴런은 SCL1, BCL11B, Calb2, CD24, CDH1, CUX1 Cux2, DCX, DLG4, Dlx, Dlx2, Emx1, Emx2, eomes, ETV1, FOXG1, FOXP2, Fut4, GABRA2, GAD1, GAD2, GAPDH, GFAP, GRIN2B, HoxB4, HTR2C, ISL1, ITGB1, LHX2, Neurog1, NKX2-1, Nos1, NPY, NR4A2, PAX6, POU3F2, PVALB, RELN　,　　SATB2　　 SLC17A6, SLC17A7, SLC17A8, SLC32A1, SOX1, Sox10, SST, SYN1, 및 Tbr1에 대해 양성일 수 있다. 가바성 뉴런은 SL3A1, GAD2, 및 DlX2의 발현을 특징으로 할 수 있다. 글루타메이트성 뉴런은 Emx2, SLC17A6 및 Tbr1의 발현을 특징으로 할 수 있다.
[00177] 일부 구현예에서, 배아 줄기 세포 또는 iPS 세포와 같은 만능 줄기 세포로부터 가바성, 글루타메이트성, 도파민성 또는 콜린성 뉴런을 생성하기 위해 다음과 같은 방법을 사용할 수 있다. 예를 들어, 일부 구현예에서는 미국 특허 출원 2012/0276063의 방법을 사용하여 만능 줄기세포로부터 뉴런을 생성할 수 있다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 응집체 형성이 시작되기 전에(세포가 아직 부착 배양 중인 동안) iPS 세포와 같은 만능 세포를 배양하는 데 사용되는 배지(예를 들어, TeSR 또는 Essential8 배지와 같은 합성 배지로부터 배제)로부터 bFGF 및 TGFβ이 배재될 수 있고, 이어서 이는 만능 세포의 뉴런 분화를 촉진하는 데 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, iPS 세포가 응집체 형성 전 몇일 동안 TeSR 성장 인자의 부재하에 "프라이밍", 즉 기본 섬유아세포 성장 인자(bFGF) 및 형질 전환 성장 인자 β(TGFβ)를 갖지 없는 임의의 배지에서 배양되는 경우, 세포는 순도, 신속성 및 일관성을 갖춘 신경 계통으로 발달할 수 있다. 뉴런을 제조하기 위한 다른 방법은 문헌(참조: Zhang et al. (2013), US 7,820,439, PCT Publn. No. WO 2011/091048, US 8,153,428, US 8,252,586, 및 US 8,426,200)의 방법을 포함한다.
[00178] iPS 세포를 포함한 만능 세포로부터 유래한 신경 세포 유형의 배양물은 또한 시판되고 있고 구매할 수 있다. 예를 들어, iCell® 뉴런, iCell® 도파뉴런, 및 iCell® 성상세포는 사람 iPS 세포로부터 유래하고, 제조사(Cellular Dynamics International(Madison, Wisconsin))에서 구입할 수 있다. iCell® 뉴런은 사람 유도 만능 줄기 세포(iPSC) 유래 뉴런으로, 본래의 사람 뉴런의 생화학적, 전기생리학적, 및 병리생리학적 특성을 나타낸다. 고순도, 기능적 관련성 및 사용 편의성으로 인해 iCell® 뉴런은 기본 연구 및 여러 약물 개발 분야의 신경생물학 조사에 매우 유용한 시험관내 시험 시스템을 나타낸다.
[00179] 일부 구현예에서, 합성 배지(즉, 조직, 피더 세포 또는 세포 컨디셔닝된 배지를 포함하지 않는 배지)는 iPS 세포와 같은 만능 세포로부터 뉴런 또는 성상 세포를 생성하는 데 사용될 수 있다.
[00180] iPS 세포로부터 뉴런 또는 성상세포를 생산하기 위해 사용되는 배지에는 또한 혈청 및/또는 혈청 유래 성장 인자가 필수적으로 없을 수도 있다. 추가의 구현예에서, 배지는 BMP 신호전달 및/또는 액티빈/결절/TGFβ/GDF 신호전달의 양성 조절제 또는 억제제를 포함하여 외부에서 첨가된 TGFβ 슈퍼패밀리 신호전달 조절제를 갖거나 필수적으로 없을 수 있다. 예를 들어, BMP 신호전달 억제제는 도르소모르핀일 수 있고, 액티빈/결절/TGFβ/GDF 신호전달 억제제는 Sb431542일 수 있다. 여전히 추가의 구현예에서, 배지는 외부에서 첨가된 다른 FGF 신호전달 조절제, 특히 FGF 억제제를 갖거나 필수적으로 없을 수 있다.
[00181] 특정 구현예에서, 배양된 세포를 포함하는 성숙 신경 세포는 Dcx, MAP-2, 시냅신 1, TuJ1, NSE, Map2a, Gap43, NF, CD24, CDH2/CD325, 시냅토피신 및 CD56/NCAM 중 하나 이상의 발현에 의해 성숙 신경 세포로 동정될 수 있다. 이러한 세포 배양물은 본원에 기재된 방법 또는 나중에 개발된 방법을 포함한 다른 방법에 의해 생성될 수 있다.
[00182] 신경 세포는 다수의 표현형 기준에 따라 특징화될 수 있다. 상기 기준에는 형태적 특성의 현미경 관찰, 발현된 세포 마커의 검출 또는 정량화, 효소 활성, 신경 전달 물질 및 이들의 수용체, 전기 생리학적 기능을 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
[00183] 다양한 구현예에서 사용될 수 있는 특정 세포는 신경 세포의 특징적인 형태학적 특성을 갖는다. 이들 특성은 당업자에 이해 인지된다. 예를 들어 뉴런에는 작은 세포체와 축삭과 수상 돌기를 연상시키는 여러 가지 프로세스를 포함한다.
[00184] 신경 세포는 도파민성 뉴런(마커는 TH, AaDC, Dat, Otx-2, FoxA2, LMX1A 및 VMAT2를 포함한다), 콜린성 뉴런(마커는 NGF, ChAT를 포함한다), 가바성 뉴런(마커는 GAD67 및 vGAT를 포함한다), 글루타메이트성 뉴런(마커는 vGLUT1을 포함한다), 세로토닌성 뉴런, 운동 뉴런(마커는 HB9, SMN, ChAT, NKX6을 포함한다), 감각 뉴런(마커는 POU4F1 및 페리페린을 포함한다), 성상교세포(마커는 GFAP 및 Tapa1을 포함한다), 및 희돌기아교세포(마커는 O1, O4, CNPase 및 MBP를 포함한다)를 포함하지만 이에 제한되지 않는 특정 종류의 신경 세포에 특징적인 표현형 마커를 발현하는지에 따라 특징화될 수 있다. 신경 세포는 특정 종류의 신경 세포 유형의 1, 2, 3, 4, 5개 이상의 마커를 발현할 수 있다.
[00185] 성상세포는 중추신경계에 있는 신경교세포의 서브타입이다. 이들은 또한 성상세포 신경교세포로서 공지되어 있다. 일반적으로 별 모양을 하고 있는 이들의 많은 과정은 일반적으로 생체 내 뉴런이 만드는 시냅스를 둘러싸고 있다. 성상세포는 조직학적 분석을 사용하여 고전적으로 동정되고; 이들 세포 중 다수는 중간 필라멘트 신경교 섬유소 산성 단백질(GFAP)을 발현한다. CNS에는 섬유성, 원형질성 및 방사형의 3개 형태의 성상세포가 존재한다. 섬유성 신경교세포는 일반적으로 백질 내에 위치하고 세포 소기관이 상대적으로 적고 분지되지 않은 긴 세포 과정을 나타낸다. 이러한 유형은 흔히 세포가 모세혈관 벽에 근접해 있는 경우, 세포를 모세혈관 벽 외부에 물리적으로 연결하는 “혈관 발”을 갖는다. 원형질 신경교세포는 회백질 조직에서 발견되고, 보다 많은 양의 세포 소기관을 가지고 있고, 짧고 고도로 분지된 3차 과정을 나타낸다. 방사형 신경교세포는 심실 축에 수직인 평면에 배치된다. 방사형 신경교세포는 발달 동안에 주로 존재하고 생체 내에서 뉴런 이동에 중요한 역할을 할 수 있다. 망막의 뮬러(Mueller) 세포와 소뇌 피질의 베르그만(Bergmann) 신경교 세포는 예외적이고, 성인이 되어서도 여전히 존재한다. 배아 줄기세포 또는 iPS 세포와 같은 만능 줄기세포로부터 성상세포를 생성하는 데는 다양한 방법이 사용될 수 있다. 이들 방법은 예를 들어 미국 특허 출원 2012/0276063에 기재된 방법을 포함하고, 이는 면책 조항 없이 본원에 전문이 참조로 인용된다.
[00186] 일부 양상에서, 세포 배양물은 합성 올리고머와 같은 외인성 Aβ 올리고머를 추가로 포함할 수 있다.
[00187] 세포 배양물은 3D 세포 배양물일 수 있다. 3D 세포 배양물은 뇌 오가노이드일 수 있다. 본원과 관련하여 사용되는 “오가노이드”라는 용어는 장기의 조직과 기능을 모방한 3차원 세포 구조를 지칭한다. 오가노이드는 세포 분류와 공간적으로 제한된 계통 책무를 통해 스스로 조직화되는 조직별 세포 유형으로 이루어진다. 오가노이드는 배아 줄기세포 또는 유도 만능 줄기세포와 같은 줄기세포로부터 유래할 수 있다. '뇌 오가노이드'라는 용어는 뇌와 유사한 해부학적 특성을 갖는 오가노이드를 지칭한다. 일반적으로 뇌 오가노이드는 뇌의 다양한 세포 유형으로 구성되는 것으로 이해된다. 이들 세포 유형은 상이한 발달 잠재력을 가질 수 있고, 일부 세포 유형은 다른 세포 유형보다 덜 분화되어 있다. 일부 양상에서, 뇌 오가노이드는 망막, 피질, 중뇌, 후뇌, 뇌간 및/또는 척수의 구조와 세포 유형을 포함할 수 있다.
[00188] 또 다른 구현예에서, BMEC, 성상세포 및 혈관주위세포를 포함하는 혈액 뇌 장벽 모델이 제공된다. 모델은 정단(즉, 혈액) 측면의 BMEC, ECM 단백질 층(예를 들어, 콜라겐 IV 및 피브로넥틴), 및 기저측(즉, 뇌) 쪽의 성상세포 및 혈관주위세포를 포함하는 샌드위치 포맷일 수 있다. 샌드위치 포맷은 정단면과 기저측면 사이에 투과성 막 삽입체를 추가로 포함할 수 있다. ECM 단백질은 막의 정점 측면상에 있을 수 있다. 일부 양상에서, 막은 콜라겐, 라미닌, 프로테오글리칸, 비트로넥틴, 피브로넥틴, 폴리-D-라이신 및/또는 다당류로 코팅될 수 있다. 막의 기저측면은 겔라틴 층을 추가로 포함할 수 있다. 대안적으로, 기저측면은 폴리알킬렌 옥사이드, 폴록사민, 셀룰로스, 하이드 록시알킬화된 셀룰로스, 폴리펩타이드, 폴리사카라이드, 탄수화물, 단백질, 이들의 공중합체 또는 이들의 조합으로 코팅될 수 있고, 보다 특히 폴리(에틸렌 글리콜), 폴리(에틸렌 옥사이드), 폴리(비닐 알코올), 폴리(비닐피롤리돈), 폴리(에틸록사졸린), 폴리(에틸렌옥사이드)-코-폴리프로필렌옥사이드) 블록 공중합체, 카복시메틸 셀룰로스, 하이드록시에틸 셀룰로스, 메틸하이드록시프로필 셀룰로스, 폴리슈크로스, 히알루론산, 덱스트란, 헤파란 설페이트, 콘드로이틴 설페이트, 헤파린, 알기네이트, 콜라겐, 알부민, 난알부민, 이의 공중합체 또는 이들의 조합으로 구성되거나 이들로부터 유래한다.
[00189] 일부 구현예에서, 모델은 미세유동 장치에 제공될 수 있다. 시험관내 혈관 모델의 형태를 포함하여 세포 지원에 유용한 다양한 미세 유동 장치 구성이 당업자에게 공지되어 있다. 예를 들어, US 2011/0053207 및 US 2014/0038279를 참조하고, 이는 본원에 참조로 인용된다. 일반적으로, 본원에 교시된 바와 같은 혈액 뇌 장벽 모델을 포함하는 미세 유동 장치는, 내피 세포 층 및 신경 세포 층이 모델의 내피 세포 층과 유체 접촉하는 제1 챔버 또는 개구부와 모델의 신경 세포 층과 유체 접촉하는 제2 챔버 또는 개구부 사이의 경계를 한정하도록 혈액 뇌 장벽 모델을 수용하는 차원을 갖는 챔버를 포함할 수 있다. 유체는 배지 또는 완충액과 같은 액체일 수 있다. 장치는 각 챔버에 대한 유체 유입구 및 유체 배출구, 이에 연결된 유체 저장소(예를 들어, 배지 저장소) 등을 추가로 포함할 수 있다.
[00190] 일부 구현예에서, 세포 배양물에 사용되는 세포는 건강한 공여자로부터 수득된 세포로부터 생성된 iPS 세포로부터 생성된다. 다른 구현예에서, 공여자는 질환을 갖는다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 공여자는 질환, 예를 들어 신경학적 또는 신경변성 질환, 예를 들어, 간질, 자폐증, 주의력 결핍 과잉 행동 장애(ADHD), 근위축성 측색 경화증(ALS), 샤르코-마리-투스(Charcot-Marie-Tooth(CMT)), 헌팅턴 질환, 가족성 간질, 정신분열증, 가족성 알츠하이머 질환, 프리드리히 운동 실조증, 척수 소뇌 운동 실조증, 척추 근육 위축증, 유전성 경련성 마비, 백혈구 감소증, 페닐케톤뇨증, 테이-삭스 질환(Tay-Sachs disease), 윌슨 질환(Wilson disease), 중독 장애, 우울증 또는 기분 장애를 갖는다. 질환은 유전학적 질환이거나 특정 신경학적 질환에 대한 증가된 유전학적 민감성일 수 있다.
[00191] 본원에서는 본 세포 배양 모델을 사용하여 신경염증을 연구하기 위한 검정이 추가로 제공된다. 삼배양물 시스템 또는 BBB 모델의 결과는 생존, 시냅스 가지치기, Aβ 응집에 의한 미세아교세포 기능, p-tau 형성, 뉴런의 MEA 기능, 신경 염증 캐스케이드를 유발하기 위해 배지에서 방출되는 분석물, 모든 3개의 세포 유형 간의 누화일 수 있다.
[00192] 상기 세포를 일반적으로 적절한 배양 용기, 예를 들어, 플라스크, 6웰, 24웰, 또는 96웰 플레이트와 같은 조직 배양 플레이트에 씨딩한다. 세포를 배양하는데 사용되는 배양 용기로는, 줄기 세포를 배양할 수 있다면 특별히 제한되지는 않지만, 플라스크, 조직 배양용 플라스크, 접시, 페트리 접시, 조직 배양용 접시, 멀티 접시, 마이크로 플레이트, 마이크로웰 플레이트, 멀티플레이트, 멀티웰 플레이트, 마이크로 슬라이드, 챔버 슬라이드, 튜브, 트레이, CELLSTACK® 챔버, 배양백 및 회전병을 포함할 수 있다. 세포는 배양의 필요에 따라 적어도 또는 약 0.2, 0.5, 1, 2, 5, 10, 20, 30, 40, 50 ml, 100 ml, 150 ml, 200 ml, 250 ml, 300 ml, 350 ml, 400 ml, 450 ml, 500 ml, 550 ml, 600 ml, 800 ml, 1000 ml, 1500 ml, 또는 상기 수치에서 추론가능한 임의의 범위의 부피 중에서 배양될 수 있다. 특정 구현예에서, 배양 용기는 세포가 증식될 수 있도록 생물학적으로 활성인 환경을 지원하는 생체외 임의의 장치 또는 시스템을 지칭할 수 있는 생물반응기일 수 있다. 상기 생물반응기는 적어도 또는 약 2, 4, 5, 6, 8, 10, 15, 20, 25, 50, 75, 100, 150, 200, 500 리터, 1, 2, 4, 6, 8, 10, 15 입방 미터 또는 상기 수치에서 추론가능한 임의의 범위의 부피를 가질 수 있다.
I. 냉동보존
[00193] 본원에 기재된 방법에 의해 생산된 세포는 I 단계, II 단계 또는 III 단계와 같은 공정의 어느 단계에서든 냉동보존될 수 있으며, 예를 들어 본원에 참조로 인용된 PCT 공개번호 2012/149484 A2를 참조한다. 세포는 기질과 함께 또는 기질없이 냉동보존될 수 있다. 여러 구현예에서, 저장 온도는 약 -50°C 내지 약 -60°C, 약 -60°C 내지 약 -70°C, 약 -70°C 내지 약 -80°C, 약 -80°C 내지 약 -90°C, 약 -90°C 내지 약 -100°C 범위이고, 이들의 중첩 범위도 포함한다. 일부 구현예에서, 냉동보존된 세포의 저장 (예를 들어, 유지)를 위해 보다 낮은 온도를 사용한다. 여러 구현예에서, 액체 질소 (또는 이와 유사한 다른 액체 냉각제)를 사용하여 세포를 저장한다. 추가의 구현예에서, 세포를 약 6시간 이상 동안 저장한다. 추가의 구현예에서, 세포를 약 72시간 저장한다. 여러 구현예에서, 세포를 48시간 내지 약 1주 저장한다. 또 다른 구현예에서, 세포를 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7주, 또는 8주 동안 저장한다. 추가의 구현예에서, 세포는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 또는 12 개월 동안 저장한다. 더 긴 시간 동안 세포를 저장할 수도 있다. 세포를 별도로 또는 본원에 개시된 임의의 기질과 같은 기질 상에서 저온보존할 수도 있다.
[00194] 일부 구현예에서, 추가의 동결보호제를 사용할 수 있다. 예를 들어, 세포는 하나 이상의 냉동보호제, 예컨대 DM80, 혈청 알부민, 예컨대 사람 또는 소 혈청 알부민을 포함하는 냉동보존 용액 중에서 냉동보존될 수 있다. 특정 구현예에서, 상기 용액은 약 1 %, 약 1.5%, 약 2%, 약 2.5%, 약 3%, 약 4%, 약 5%, 약 6%, 약 7%, 약 8%, 약 9% 또는 약 10%의 DMSO를 포함한다. 다른 구현예에서, 상기 용액은 약 1% 내지 약 3%, 약 2% 내지 약 4%, 약 3% 내지 약 5%, 약 4% 내지 약 6%, 약 5% 내지 약 7%, 약 6% 내지 약 8%, 약 7% 내지 약 9%, 또는 약 8% 내지 약 10%의 디메틸설폭시드 (DMSO) 또는 알부민을 포함한다. 구체적인 구현예에서, 상기 용액은 2.5%의 DMSO를 포함한다. 또 다른 구체적인 구현예에서, 상기 용액은 10%의 DMSO를 포함한다.
[00195] 세포는 예를 들어, 냉동보존을 하는 동안 약 1 °C/분으로 냉각할 수 있다. 일부 구현예에서, 상기 냉동보존 온도는 약 -80°C 내지 약 -180°C, 또는 약 -125°C 내지 약 -140°C이다. 일부 구현예에서, 세포는 약 1°C/분으로 냉각시키기 전에 4°C로 냉각된다. 냉동보존된 세포의 사용을 위해 해동하기 전에 액체 질소의 증기상으로 해당 냉동보존된 세포를 이동시킬 수 있다. 일부 구현예에서, 예를 들어, 세포가 일단 약 -80°C에 도달하면, 이들을 액체 질소 저장소로 이동시킨다. 냉동보존은 제어된-속도의 동결기 (controlled-rate freezer)를 사용하여 수행될 수도 있다. 냉동보존된 세포는 예를 들어, 약 25°C 내지 약 40°C의 온도에서, 통상 약 37°C의 온도에서 해동될 수 있다.
III. 사용 방법
[00196] 본원의 개시내용은 다수의 다중 계통의 세포를 생산할 수 있는 방법과 CNS의 세포를 포함하는 조성물을 제공한다. 이들 세포 집단은 다수의 중요한 연구, 개발 및 상업적 목적을 위해 사용될 수 있다. 이들은 몇 가지 거론하자면, 세포의 생체내 이식 또는 주입; 항-바이러스, 세포 독성 화합물, 발암물질, 돌연변이원 성장/조절 인자, 약제학적 화합물 등의 시험관내 스크리닝; 간 질환 또는 감염의 기전에 대한 해명; 약물 및/또는 성장 인자가 작용하는 기전을 연구하고; 환자 내 암을 진단하고 모니터링하고; 유전자 치료요법; 및 생물학적 활성 생성물의 제조를 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
[00197] 본원에 제공된 다세포 배양물은 예를 들어 신경 분화 또는 생존률에 대한 분자의 효과를 시험하거나 독성을 시험하거나 신경 또는 신경세포 기능에 대한 효과에 대해 분자를 시험하는 데 사용될 수 있다. 이것은 뉴런 활성, 가소성(예를 들어, 장기적 강화) 또는 기능에 영향을 미치는 화합물을 동정하기 위한 스크리닝을 포함할 수 있다. 세포 배양물은 신경 줄기세포, 신경 전구세포 또는 분화된 신경 또는 신경 세포 유형의 생물학과 상호 작용하고 영향을 미치는 새로운 약물 및 화합물의 발견, 개발 및 시험에 사용될 수 있다. 또한 신경 세포는 축삭 유도, 신경변성 질환, 신경 가소성, 학습 및 기억을 포함하지만 이에 제한되지 않는 신경 발달 및 기능 장애의 세포 및 분자적 기초를 동정하기 위해 디자인되는 연구에서 큰 유용성을 가질 수 있다. 이러한 신경생물학 연구는 이들 과정의 새로운 분자 성분을 동정하고 기존 약물과 화합물에 대한 새로운 용도를 제공할 뿐만 아니라 새로운 약물 표적 또는 약물 후보를 동정하는 데 사용될 수 있다.
[00198] 일부 구현예에서, 하나 이상의 특정 화합물을 시험하여 해당 화합물이 질환 치료에 유익할 수 있는 효과를 갖는지를 결정할 수 있다. 기능적 활성에 대한 화합물의 효과를 기초로, 당업자는 상기 화합물이 질환의 치료를 위해 유용할 수 있는지를 결정할 수 있다. 일부 구현예에서, 세포는 신경학적 또는 신경변성 질환(예를 들어, 자폐증, 간질, ADHD, 정신분열증, 양극성 장애 등)과 같은 질환(예를 들어, 유전학적 질환 또는 유전학적 성분 또는 위험 인자를 갖는 질환)을 가진 대상체로부터의 iPS 세포로부터 유래한다. 일부 구현예에서, 세포는 제1 화합물 또는 독소의 존재 하에서 배양되어 신경 배양물이 질환 상태와 유사한 성질을 나타낼 수 있고, 이들 구현예에서, 제2 화합물이 제1 화합물 또는 독소의 효과를 완화 또는 감소시킬 수 있는지 확인하기 위해 제2 화합물이 세포 배양물에 제공될 수 있다. 다른 구현예에서, 세포 배양물은 화합물이 세포 배양에 독성 또는 부작용을 생성하는지를 결정하기 위해 사용될 수 있다.
[00199] 예를 들어, 하나 이상의 후보 제제를 다양한 농도로 배양 배지에 첨가할 수 있다. 세포에서 발현되는 관심 대상의 폴리펩타이드의 발현을 촉진하는 제제는 유용한 것으로 간주되고; 이러한 제제는 예를 들어 신경 발달 또는 신경 기능의 결함을 특징으로 하는 손상, 질환 또는 장애를 예방, 지연, 개선, 안정화 또는 치료하기 위한 치료제로서 사용될 수 있다. 일단 동정되면, 제제는 신경학적 병태를 치료하거나 예방하기 위해 사용될 수 있다. 다른 구현예에서, 오가노이드 세포의 활성 또는 기능은 후보 화합물의 존재 및 부재하에서 비교된다. 세포의 활성 또는 기능을 바람직하게 변경하는 화합물은 본원 방법에서 유용한 것으로 선택된다.
[00200] 본원 방법에서 유용한 제제는 당업자에게 공지된 방법에 따라 천연물 또는 합성(또는 반합성) 추출물 또는 화학 라이브러리 또는 폴리펩타이드 또는 핵산 라이브러리의 대규모 라이브러리로부터 동정될 수 있다. 약물 발견 및 개발 분야의 당업자는 시험 추출물 또는 화합물의 정확한 공급원이 본원 방법의 스크리닝 절차(들)에 중요하지 않다는 것을 이해할 것이다. 스크리닝에 사용되는 제제는 신경학적 질환 병태의 치료를 위한 치료제로 공지된 것들을 포함할 수 있다. 대안적으로 본원에 기재된 방법을 사용하여 거의 모든 수의 공지되지 않은 화학 추출물 또는 화합물을 스크리닝할 수 있다. 이러한 추출물 또는 화합물의 예는 식물, 진균류, 원핵생물 또는 동물 기반 추출물, 발효 브로쓰, 합성 화합물 및 기존의 폴리펩타이드의 변형을 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
[00201] 세포의 기능적 활성을 결정하기 위한 검정은 생존률 검정, 미세아교세포 식세포작용 검정, 칼슘 검정, MEA 검정, 현미경 검정에 의한 시냅스 가지치기, 다양한 경로의 인산화된 중간체를 추적하는 신호 전달, 정상 및 질환 특정 세포 유형으로 단일배양물, 이배양물 또는 삼배양물에서 배지에서 방출되는 분석물 분석을 포함할 수 있다. 예를 들어, 동질유전자적으로 가공되거나 환자 특정 세포를 AHN 대조군과 비교하는 질환 모델링 적용을 위해, 아밀로이드 베타, 미엘린, 시냅토솜 또는 Tau와 같은 신경 재생 단백질에 대한 처리나 노출은 감소된 칼슘 신호전달 및 전기 활성 및 증가된 신경염증성 사이토킨을 초래한다. 일부 양상에서 기능적 활성 측정은 수상돌기 면적(예를 들어, MAP2), 시냅스 수(예를 들어, 시냅신 1/2), 세포 수(예를 들어, CUX2) 또는 축삭 면적(예를 들어, 베타 III 튜불린)을 측정함을 포함한다. 예를 들어, 이들 기능적 활성 측정값 중 어느 하나에서 증가(예를 들어, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80% 또는 90% 초과)는 후보 제제를 나타낼 수 있다.
[00202] 일부 양상에서 초기 병원성 변화는 신경변성의 시작과 관련된 유전자 발현 프로필의 변경 또는 주로 하향 조절을 관찰하여 정량화할 수 있다. 특정 양상에서, 신경 염증성 사이토킨의 방출과 관련된 면역 관련 유전자의 상향 조절은 신경변성과 연관된 것으로 측정될 수 있다. 일부 양상에서, 방법은 미세아교세포에서 Gas6-Axl, Siglec-11, 리간드 게이팅된 이온 채널, 전압 게이팅된 이온 채널, GPCR, 촉매 수용체, 효소, 핵 수용체, COMT, NRXN2 및/또는 SST의 수준을 검출하는 것을 포함할 수 있다. 일부 양상에서, GPCR은 ADGRD1, ADGRE3, ADGRE5, ADGRG1, ADGRG3, ADORA2B, ADRB1, ADRB2, C5AR1, C5AR2, CCR2, CXCR2, CXCR4, EDNRA, FPR3, FZD1, GPBAR1, GPR157, LTB4R, LTB4R2, P2RX1, P2RY1, P2RY12, PTGER4 및/또는 SUCNR1을 포함한다. 특정 양상에서, GPCR은 AVPR2, CNR2, GPR18, GPR84 및/또는 LPAR6을 포함한다. 특정 양상에서 리간드-게이팅된 이온 채널은 P2XRX1, P2RY12 및/또는 P2RY10을 포함한다.
[00203] 검정은 높은 고속처리량 방식으로 수행될 수 있다. 예를 들어, 세포 배양물은 잠재적 치료학적 분자의 동정을 위해, 배양 디쉬, 플라스크, 롤러 병 또는 플레이트 (예를 들어, 단일 다중 웰 디쉬 또는 디쉬, 예를들어, 8, 16, 32, 64, 96, 384 및 1536개의 다중-웰 플레이트 또는 디쉬) 상에 임의로 정해진 위치에 위치시키거나 배치시킬 수 있다. 스크리닝될 수 있는 라이브러리로는, 예를 들어, 소분자 라이브러리, siRNA 라이브러리, 및 아데노바이러스 형질감염 벡터 라이브러리를 포함한다. 스크리닝 플랫폼은 로봇 자동화와 같이 자동화될 수 있다. 배양 플랫폼은 자동화된 세포 세척기와 고함량 이미지화기를 포함할 수 있다.
[00204] 일부 양상에서, 본원의 검정은 멸균 세균 감염(지질 다당류(LPS) 노출), 기계적 손상(스크래치) 및 발작 활성(글루타메이트 유도된 흥분 독성)을 모방한 다양한 신경 염증 자극에 대한 본원의 세포 배양물의 반응을 정량화할 수 있다. 대조군 및 LPS 노출된 배양물의 분비된 사이토킨 프로필을 측정할 수 있다.
[00205] 본원에 기재된 혈뇌 장벽 모델은 약물의 혈뇌 장벽 통과에 대한 약역학 또는 약동역학 시험 등을 위한 화합물 또는 치료 스크리닝 또는 시험(예를 들어, 효능, 독성 또는 기타 대사 또는 생리학적 활성에 대한)을 위해 사용될 수 있다. 이러한 시험은 해당 생성물의 구성 세포를 생존 상태로 유지하는 조건(예를 들어, 산소화된 배양 배지에서)에서 본원에 기재된 바와 같이 시험관 내 혈뇌 장벽 모델을 제공하고; 시험될 화합물(예를 들어, 약물 후보물)을 세포에 적용하고(예를 들어, 내피층에 투여함에 의해); 이어서, 상기 화합물이 혈뇌 장벽을 통과할 수 있는지 및/또는 포유동물 대상체에 전신적으로 전달될 경우 뇌에서 치료학적 효능, 독성 또는 기타 대사 또는 생리학적 활성을 가질 수 있는지를 나타낼 수 있는(예를 들어, 혈관 내) 내피층을 통한 화합물의 침투 및/또는 기타 생리학적 반응(예를 들어, 손상, 흉터 조직 형성, 감염, 세포 증식, bum, 세포 사멸, 히스타민 방출, 사이토zls 방출, 유전자 발현의 변화 등과 같은 마커 방출)을 검출함에 의해 수행될 수 있다. 혈뇌 장벽의 대조군 샘플은 대조군 화합물(예를 들어, 생리학적 식염수, 화합물 비히클 또는 담체)이 적용될 수 있는 유사한 조건하에서 유지하여, 비교 결과를 성취하거나, 과거 데이터와의 비교 또는 희석된 수준의 시험 화합물을 적용하여 수득된 데이터와의 비교 등을 기반으로 손상을 결정할 수 있다.
[00206] 시험 화합물이 면역학적 활성을 갖는지를 결정하는 방법은 혈뇌 장벽 모델의 미세아교세포 또는 성상세포에 의한 또는 호중구 및 대식세포와 같은 선천적 면역 세포의 신경 세포층으로의 이동을 평가함에 의한 면역글로불린 생성, 케모킨 생성 및 사이토킨 생성에 대한 시험을 포함할 수 있다.
[00207] 본원에 교시된 모델을 사용하여 시험할 수 있는 혈뇌 장벽(예를 들어, 사람 혈뇌 장벽)을 통과하는 방법은 다양한 파라세포의 단단한 접합의 투과성, 세포층을 통한 수동 확산, 수용체 매개 통과세포외배출 및/또는 세포 유출 억제를 평가함을 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
[00208] 일부 구현예에서, 모델은 약물의 혈뇌 장벽을 통한 제제 통과의 약력학 또는 약동역학 서험을 위해 대상체의 맞춤형 시험(예를 들어, 효능, 독성 또는 기타 대사 또는 생리학적 활성) 등에 사용될 수 있고, 모델의 세포 중 적어도 일부는 대상체로부터 유래된 세포일 수 있다. 예를 들어, 대상체의 섬유아세포는 유도 만능 줄기세포(예를 들어, 유도 만능 신경 줄기세포)로 지시될 수 있고, 이후 상기 세포는 신경세포, 희소교세포, 내피 세포, 성상세포 또는 미세아교세포와 같은 하나 이상의 모델용 세포 유형으로 지시된다.
[00209] 추가로 본원에서는 TREM2 효능제를 투여함에 의해 신경변성 질환을 치료하는 방법이 제공된다. TREM2 효능제는 TREM2 기능을 유발하는 항체이거나 비장 티로신 키나제(pSyk), PI3K, TYRO 단백질 티로신 키나제 결합 단백질(TYROBP), 12kDa의 DNAX 활성화 단백질(DAP12), AKT 키나제 또는 PLCγ 경로와 같이 TREM2가 촉발하는 다운스트림 신호전달 경로의 활성화제일 수 있다.
[00210] "신경변성 질환 또는 장애" 및 "신경학적 장애"라는 용어는 말초 신경계 또는 중추 신경계가 주로 관여하는 질환 또는 장애를 포괄한다. 본원에 제공된 화합물, 조성물 및 방법은 신경학적 또는 신경변성 질환 및 장애의 치료에 사용될 수 있다. 본원에 사용되는 "신경변성 질환", "신경변성 장애", "신경학적 질환" 및 "신경학적 장애"라는 용어는 상호교환적으로 사용된다.
[00211] 신경학적 장애 또는 질환의 예는 만성 신경학적 질환, 예를 들어, 당뇨병성 말초 신경병증(제3 신경 마비, 단신경병증, 단신경병증 다발성, 당뇨병성 근위축증, 자율신경병증 및 흉복부 신경병증 포함), 알츠하이머 질환, 연령 관련 기억 상실, 노쇠, 연령 관련 치매, 픽 질환, 미만성 루이소체 질환, 진행성 초핵성 마비(스틸-리차드슨(Steel-Richardson) 증후군), 다계통 변성(샤이-드래거(Shy-Drager) 증후군), 근위축성 측색 경화증("ALS")을 포함한 운동 신경 질환, 변성 운동 실조증, 피질 기저 변성, Guam의 ALS-괌의 파킨슨-치매 복합 질환, 아급성 경화성 범뇌염, 헌팅턴 질환, 파킨슨 질환, 다발성 경화증("MS" ), 시누클레인병증, 1차 진행성 실어증, 선조성 변성, 마차도-조셉 질환/척수소뇌실조증 3형 및 올리브폰토소뇌변성, 질 드 라(Gilles De La) 투레트 질환, 구근 및 가성 구근 마비, 척추 및 척수소뇌근 위축증(케네디 질환), 1차 측색 경화증, 가족성 경련성 마비, 베르니케-코르사코프(Wernicke-Korsakoff) 관련 치매(알코올 유도 치매), 베르드니히-호프만(Werdnig-Hoffmann) 질환, 쿠겔베르크-웰란더 (Kugelberg-Welander) 질환, 테이-삭(Tay-Sach) 질환, 샌드호프(Sandhoff) 질환, 가족성 경련성 질환, 워히파트-쿠겔베르크-웰란더(Wohifart-Kugelberg-Welander) 질환, 경련성 마비, 진행성 다초점 백질뇌병증, 및 프리온 질환(크루츠펠트 야곱(Creutzfeldt-Jakob), 거스트만-스트라슬러-샤인커(Gerstmann-Straussler-Scheinker) 질환, 쿠루(Kuru) 및 치명적인 가족성 불면증 포함)을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 또한 본원 개시내용의 방법에 포함된 다른 병태는 연령 관련 치매 및 기타 치매, 및 혈관성 치매, 미만성 백질 질환(빈스방거(Binswanger) 질환), 내분비 또는 대사성 기원의 치매, 두부 외상 및 미만성 뇌 손상 치매, 푸길리스티카 치매 및 전두엽 치매를 포함한 기억 상실 병태를 포함한다. 또한 색전성 폐색 및 혈전성 폐색 및 모든 유형의 두개 내 출혈(경막외, 경막하, 지주막하 및 뇌내 출혈 포함), 두개 내 및 척추 내 병변(타박상, 관통, 전단, 압박 및 열상 포함)을 포함하는 대뇌 허혈 또는 경색으로 인한 기타 신경변성 장애도 포함된다. 따라서 상기 용어는 뇌졸중, 외상성 뇌 손상, 정신분열증, 말초 신경 손상, 저혈당, 척수 손상, 간질, 무산소증 및 저산소증을 포함하는 것들과 같은 급성 신경변성 장애를 포괄한다.
A. 약제학적 조성물
[00212] 또한, 본원에서 본원의 세포 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약제학적 조성물 및 제형이 제공된다.
[00213] 따라서 본 발명에 따라 대상체에 투여하기 위한 세포 조성물은 화합물을 약학적으로 사용할 수 있는 제제로의 처리를 용이하게 하는 부형제 및 보조제를 포함하는 하나 이상의 생리적으로 허용되는 담체를 사용하여 임의의 종래의 방식으로 제형화할 수 있다. 적절한 제형은 선택되는 투여 경로에 의존한다.
[00214] [0204] 본원에 기재된 바와 같은 약제학적 조성물 및 제형은 동결건조된 제형 또는 수용액 형태로, 하나 이상의 임의의 약제학적으로 허용되는 담체와 목적하는 정도의 순도를 갖는 활성 성분 (예를 들어, 세포)을 혼합함에 의해 제조할 수 있다(Remington's Pharmaceutical Sciences 22nd edition, 2012). 약제학적으로 허용되는 담체는 일반적으로 사용되는 용량 및 농도에서 수용자에게 비독성이고 다음을 포함하지만 이에 제한되지 않는다: 완충액, 예를 들어, 포스페이트, 시트레이트, 및 다른 유기산; 아스코르브산 및 메티오닌을 포함하는 항산화제; 보존제(예를 들어, 옥타데실디메틸벤질 암모늄 클로라이드; 헥사메토늄 클로라이드; 벤즈알코늄 클로라이드; 벤즈에토늄 클로라이드; 페놀, 부틸 또는 벤질 알콜; 알킬 파라벤, 예를 들어, 메틸 또는 프로필 파라벤; 카테콜; 레소르시놀; 사이클로헥산올; 3-펜타놀; 및 m-크레졸); 저분자량 (약 10개 잔기 미만) 폴리펩타이드; 단백질, 예를 들어, 혈청 알부민, 겔라틴, 또는 면역글로불린; 친수성 중합체, 예를 들어, 폴리비닐피롤리돈; 아미노산, 예를 들어, 글라이신, 글루타민, 아스파라긴, 히스티딘, 아르기닌, 또는 라이신; 모노사카라이드, 디사카라이드, 및 글루코스, 만노스 또는 덱스트린을 포함하는 다른 탄수화물; 킬레이팅 제제, 예를 들어, EDTA; 슈가, 예를 들어, 슈크로스, 만니톨, 트레할로스 또는 소르비톨; 염-형성 역이온, 예를 들어, 나트륨; 금속 착물 (예를 들어, Zn- 단백질 착물); 및/또는 비-이온 계면활성제, 예를 들어, 폴리에틸렌 글리콜 (PEG). 본원에서 예시적인 약제학적으로 허용되는 담체는 조직 사이의 약물 분산제, 예를 들어, 가용성 중성 -활성 하이알루로니다제 당단백질 (sHASEGP), 예를 들어, 사람 가용성 PH-20 하이알루로니다제 당단백질, 예를 들어, rHuPH20 (HYLENEX®, Baxter International, Inc.)을 추가로 포함한다. 특정 예시적인 sHASEGP, 및 rHuPH20을 포함하는 사용 방법은 미국 특허 공개 공보 제2005/0260186호 및 제2006/0104968호에 기재되어 있다. 하나의 양상에서, sHASEGP는 콘드로이티나제와 같은 하나 이상의 추가의 글리코스아미노글리카나제와 조합된다.
B. 상업적, 치료학적 및 연구 목적을 위한 분배
[00215] 일부 구현예에서, 제조, 유통 또는 사용시 어느 때라도 존재하는 세포를 포함하는 시약 시스템이 제공된다. 상기 키트는 흔히 동일한 게놈을 공유하는, 미분화 만능 줄기 세포 또는 다른 분화 세포 유형과 조합하여 본원에 기재된 세포의 임의의 조합을 포함할 수 있다. 각 세포 유형은 동일한 실체 또는 사업상 관계를 공유하는 서로 다른 실체들의 제어 하에, 동시에 또는 다른 시점에, 동일한 시설 내에서 또는 서로 다른 장소에서, 함께 또는 별도의 컨테이너로 팩키징될 수 있다. 약제학적 조성물은 임의로 기계 독성학과 같은 목적하는 목적에 대한 서면 지침과 함께 적절한 컨테이너에 팩키징될 수 있다.
[00216] 일부 구현예에서, 예를 들어, 세포의 생성을 위한 하나 이상의 배지 및 성분들을 포함할 수 있는 키트가 제공된다. 시약 시스템은 수성 배지 중에 또는 동결건조된 형태로 적절히 포장될 수 있다. 키트 용기의 수단으로는 일반적으로 바이알, 시험관, 플라스크, 병, 주사기, 또는 성분이 배치될 수 있는 다른 용기 수단, 바람직하게는 적절히 분취될 수 있는 다른 용기 수단 중 하나 이상을 포함한다. 키트 내에 하나 이상의 성분이 존재하는 경우, 상기 키트는 일반적으로 추가의 성분들이 별도로 배치될 수 있는 제2, 제3 또는 다른 추가의 용기들을 포함할 것이다. 그러나, 성분들을 다양하게 조합하여 하나의 바이알에 포함시킬 수도 있다. 키트의 성분들은 건조 분말로 제공될 수도 있다. 시약 및/또는 성분들이 건조 분말로 제공되는 경우, 상기 분말은 적절한 용매를 첨가하여 재구성될 수 있다. 용매는 또한 또 다른 컨테이너 수단으로 제공될 수 있는 것으로 고려된다. 본원 개시내용의 키트는 또한 전형적으로 상업적 판매를 위해 긴밀하게 밀폐된 상태로 키트 구성성분들을 포함하기 위한 수단을 포함할 것이다. 이러한 컨테이너들로는 목적하는 바이알이 보유되는 사출 성형 또는 취입 성형 플라스틱 컨테이너를 포함할 수 있다. 또한, 상기 키트는 인쇄형 또는 전자 포맷, 예를 들어 디지털 포맷의 사용 지침서를 포함할 수도 있다.
IV. 실시예
[00217] 하기의 실시예를 들어 본 발명의 바람직한 구현예를 설명한다. 당업계의 숙련자라면, 하기의 실시예에 기술된 기법들이 본 발명을 잘 수행하기 위해 본 발명자들에 의해 발견된 기법들을 대표하는 것이기 때문에, 발명의 수행에 대한 바람직한 양태를 구성하는 것으로 간주될 수 있음을 알 수 있을 것이다. 그러나, 당업계의 숙련자라면, 본 명세서의 내용을 고려하여, 개시된 구체적인 구현예에 있어서 본 발명의 개념과 범위를 벗어나지 않으면서 여러가지 변화를 주어도 그와 비슷하거나 유사한 결과를 얻을 수 있다는 사실을 알 수 있을 것이다.
실시예 1 - 내피 세포의 생성
[00218] E8의 존재하에 MATRIGEL™ 또는 비트로넥틴 상에 유지된 iPSC는 적어도 5 내지 10회 계대 동안 저산소증에 적응시켰다. 세포를 서브컨플루언트 iPSC로부터 분리하고, 5 uM 블레비스타틴 또는 1 uM H1152가 보충된 무혈청 합성 (SFD) 배지의 존재하에 아민 배양 디쉬상에 25만 세포/웰의 밀도로 분주하였다. 분주 후 24시간에 50ng/ml의 BMP4, VEGF 및 FGF2가 보충된 SFD 배지를 배양액에 첨가한다. 세포는 분화 공정 전반에 걸쳐 48시간 마다 공급한다. 전체 공정은 저산소 조건하에서 수행한다. 분화 종료시에 세포를 채취하고, 냉동 보존하거나 카복실 표면상에 25k/cm2의 밀도로 다시 분주하여 VascuLife VEGF 내피 배지 또는 SFD 내피 배지의 존재 하에서 내피 분화를 개시할 수 있다(도 2).
[00219] 냉동 보존된 6일 HPC 또는 생 배양물을 VascuLife VEGF 내피 배지 및 1uM H1152 및 저산소 조건의 존재하에서 카복실 표면상에 25k/cm2로 분주한다. 세포에 분주 후 24시간에 새로운 VascuLife를 공급하고, 배양물은 이들이 컨플루언시에 도달할 때까지 48시간마다 공급하였다. 세포가 컨플루언시에 도달하는 데는 5-6일 소요되었다. 세포를 최소 교반 또는 피펫팅과 함께 Accumax를 사용하여 수거하고, 표면 내피 마커 CD31, CD105 및 CD144에 대해 염색하고, VascuLife + H1152를 사용하여 25 k/cm2로 카복실 표면상에 재분주하고, 저산소 항온처리기 조건에 위치시켰다. 세포에는 분리 후 2일, 4일, 6일째에 완전한 VascuLife 공급물을 제공하였다. 7일째에는 세포를 채취하고 염색하고 동일한 방식으로 3회 추가로 다시 분주하였다. 히스토그램은 각 재분주 단계에서 내피 세포의 순도가 증가하는 것을 도시한다. CD31+ MACS를 사용하지 않고 연속적인 계대 정제를 사용하여 순수한 내피 세포를 생성하였다. 내피 세포는 재분주 계대 3의 종료시에 냉동보존될 수 있다.
실시예 2 - 중간엽 줄기 세포의 생성
[00220] 도 5c는 MSC를 생성하기 위한 2D HPC 분화 공정의 개략도를 보여준다. E8의 존재하에 MATRIGEL™ 또는 비트로넥틴 상에 유지된 iPSC는 적어도 5 내지 10회 계대 동안 저산소증에 적응시켰다. 세포를 서브컨플루언트 iPSC로부터 분리하고, 5 uM 블레비스타틴 또는 1 uM H1152가 보충된 무혈청 합성 (SFD) 배지의 존재하에 아민 배양 디쉬상에 25만 세포/웰의 밀도로 분주하였다. 분주 후 24시간에 50ng/ml의 BMP4, VEGF 및 FGF2가 보충된 SFD 배지를 배양액에 첨가하였다. 세포는 분화 과정 전반에 걸쳐 48시간 마다 공급하였다. 전체 공정은 저산소 조건하에서 수행하였다. 분화 6일/7일의 종료시에 세포를 GMP -MSC 배지에 위치시켰다. 수거 후 전구체 집단의 표현형을 분석하였다(도 5c). 세포를 컨플루언시까지 성장시키고 각 계대의 종료시에 채취한 다음, 5 uM 블레비스타틴 또는 1 uM H1152를 보충한 GMP-MSC 배지에서 50K/cm2의 밀도로 아민 표면상에 다시 분주하여 MSC의 성장 및 증식을 선택적으로 허용한다.
[00221] 2D HPC 분화로부터 출현하는 6일 분화 종료시에 3D/2D HPC 분화 또는 생존 배양물로부터 냉동보존된 6일 HPC를 아민 하전된 표면 플레이트상에 1 uM H1152의 존재하에 MSC 배지의 존재하에 위치시켰다. 세포에 분주 후 24시간에 새로운 MSC 배지를 공급하고, 배양물은 이들이 컨플루언시에 도달할 때까지 48시간마다 공급하였다. 세포가 컨플루언시에 도달하는 데는 5-6일 소요되었다. 세포는 TrypLE를 사용하여 채취하고, 표면 MSC 마커 CD73, CD44, CD105, CD49d에 대해 및 내피 마커 CD31 및 CD144의 부재에 대해 염색하였다. 신흥 배양물은 저산소 조건과 아민 표면하에서 상기된 공정을 사용하여 3회 계대하였다. 배양물을 P4에서 정상산소 및 정상 조직 배양 플레이트에 이전시켰다. MSC의 순도 사양은 P6에 도달하였다(도 6, 7). 도 8a에 기재된 바와 같이 P3에서 냉동 보존된 MSC를 해동하고 계통 특이적 분화 매트릭스에 배치하여 골세포, 연골세포 및 지방세포를 생성할 수 있는 3계통 잠재력을 입증하였다(도 8b). 냉동 보존된 MSC의 클론 증식 능력은 10cm 조직 배양 플레이트에 1000세포/cm2의 밀도로 MSC를 분주함에 의해 입증되었다. 세포에 2주 동안 MSC 배지를 공급하고 번갈아 격일로 배지를 교체하였다. 출현 콜로니를 결정 바이올렛으로 염색시키고 저장하였다(도 8c).
실시예 3 - MSC로부터 혈관주위세포의 생성
[00222] iCell MSC와 iPSC 유래된 혈관주위세포를 50% 컨플루언시에서 샘플링하고 유동 세포측정에 의해 공지된 혈관주위세포 마커 PDGFRβ, NG2 및 CD146에 대해 분석하였다. 냉동 보존된 MSC를 해동하고 MSC 유지 배지 중에 세포외 매트릭스(ECM)가 없는 6웰 플레이트에 35,000세포/cm2로 분주하였다(도 9a). 세포가 컨플루언시에 도달하도록 허용하고 세포를 SFD 혈관주위세포 배지(SPM)에서 세포 외 매트릭스(ECM)가 없는 6웰 플레이트에서 15,000세포/cm2로 재분주하였다(도 9a; 도 9b).
[00223] 1차 사람 뇌혈관주위세포(HBVP)(ScienCell # 1200)를 해동하고 폴리-L-오르니틴이 코팅된 6웰 플레이트상에 혈관주위세포 배지(ScienCell # 1201) 중에 5,000개의 세포/cm2로 분주하였다. 이들 세포는 분화 공정 중에 양성 대조군으로서 사용되었다. ScienCell HBVP, iCell MSC 및 iPSC 유래된 혈관주위세포는 공지된 혈관주위세포 마커 PDGFRβ, NG2 및 CD146에 대해 유동 세포측정에 의해 분석하였다(도 9c). 해동 시 iCell MSC의 혈관주위세포 마커는 부재였다. HBVP와 iPSC 유래된 혈관주위세포는 공지된 혈관주위세포 마커인 PDGFRβ, NG2 및 CD146의 발현을 보여주고, iPSC 유래된 혈관주위세포는 ScienCell HBVP보다 순도가 높다(도 9c). iPSC 유래된 혈관주위세포는 ScienCell HBVP와 유사한 형태를 나타낸다(도 9d).
[00224] 이들의 기능을 기초로, 혈관주위세포는 표현형적으로 Pc1(염증 촉진성) 또는 PC2(수축성)로 분류할 수 있다(문헌참조: Rustenhoven et al., 2017). 서브타입 둘다의 시그니처는 도 9e에 기재한다. 해동 후, PC1 및 PC2 마커 CD274, VCAM1, 칼포닌, 데스민, DLK1 및 αSMA에 대한 유동 세포측정을 통해 iPSC 유래된 혈관주위세포를 서브타입으로 분류하였다(도 9f). iPSC 유래 혈관주위세포는 수축성 혈관주위세포의 시그니처인 서브타입 PC2를 보여준다.
[00225] 만성 및 급성 BBB 모델에서 나타나는 비특이적 식세포작용 흡수 외에도, 혈관주위세포는 생리학적 및 병리학적인 조건 둘다에서 특정 거대 분자의 제거를 처리하여 신경세포 미세환경을 특이적으로 조절한다(문헌참조: Winkler et al., 2014). iPSC 유래된 혈관주위세포는 SPM 중에 PDL 코팅 (Greiner # 655946)을 갖는 96웰 플레이트에 15,000 세포/cm2로 분주하였다. 세포를 분주 후 3일 동안 휴식시킨 다음, 세포에 죽은 지표인 NucGreen Dead 488(Invitrogen # R37109)과 에스. 아우레우스 pHrodo 레드 바이오입자(Invitrogen # A10010)를 첨가하였다. 상기 플레이트를 매주 공급물(동일한 농도의 생/사 및 바이오입자 시약 포함)과 함께 1개월 이상 동안 IncuCyte 생 이미지화 시스템상에 위치시켰다. iPSC 유래 혈관주위세포는 대조군 이상의 에스. 아우레우스 바이오입자의 관찰 가능한 식세포작용 활성을 보여준다.
실시예 4 - 뇌 미세혈관 내피 세포(BMEC)의 생성
[00226] E8의 존재하에 MATRIGEL™ 또는 비트로넥틴 상에 유지된 iPSC는 적어도 5 내지 10회 계대 동안 저산소증에 적응시켜 뇌 미세혈관 내피 세포를 생성하였다. 생 또는 냉동 보존된 HPC(예를 들어, BMP4, VEGF 및 FGF2, 예를 들어, BMP4 및 FGF2가 보충된 SFD의 존재하에 아민 표면상에서 유래된 6일 HPC)를 ECRA 배지(사람 내피세포 SFM [Gibco], 1% 혈소판 불량 혈장 유래 소 혈청 [Fisher], 20ng/mL bFGF [Promega], 10uM 레티노산)와 함께 피브로넥틴(예를 들어, 50-200 μg/mL, 특히 100 μg/mL) 및 콜라겐 IV(예를 들어, 100-500 μg/mL, 특히 400 μg/mL)을 함유하는 ECM 상에 분주하였다. 세포는 50-100 k/cm2, 특히 75 k/cm2의 밀도로 분주하였다. 배양액을 매일 공급하고 저산소 배양기 조건하에서 유지하였다. 배양물에는 컨플루언트할 때까지 격일로 ECRA 배지를 공급한다. 이어서 TrypLE을 사용함에 의해 컨플루언트 배양물을 채취한다. 채취한 세포상에 염색을 수행하여 PECAM-1(CD31)과 GLUT-1을 검출하여 BMEC의 실체를 확인하였다(도 10b). 채취한 세포는 예를 들어, ECRA 배지와 함께 트랜스웰 삽입체상에 다시 분주하고, 저산소 항온처리기 조건에 위치시킨다. (도 10a). 배양물에는 컨플루언트할 때까지 격일로 ECRA 배지를 공급할 수 있다. 컨플루언트 배양물은 유동세포 측정(도 10c)과 면역세포화학(도 10d) 및 경내피전기저항(TEER)에 의해 P-gp, CD105, Glu-1 및 CD31 발현의 존재에 대해 시험할 수 있고, 블랭크 배지와 비교할 수 있다(도 10e). 면역조직화학을 위해 세포를 200μl DPBS로 3회 세척한 후 토끼 항-P-gp 항체(차단 완충액(10%FBS, DPBS의 0.01% TritonX)에 1:50)로 4°C에서 밤새 항온처리하였다. 200μl DPBS로 3회 세척한 후, P-gp를 2차 항체(1:1000, Donkey 항-토끼 IgG Alexa Fluor 488(Invitrogen))로 염색하였다. 핵을 Hoechst3342로 염색하고 이미지는 ImageXpress(Molecular Devices, LLC)로 200X 배율로 캡처하였다.
실시예 5 - 미세아교세포의 생성
[00227] E8의 존재하에 MATRIGEL™ 또는 비트로넥틴 상에 유지된 iPSC는 적어도 5 내지 10회 계대 동안 저산소증에 적응시켰다. 2D HPC 분화: 세포를 서브컨플루언트 iPSC로부터 분리하고, 5 uM 블레비스타틴 또는 1 uM H1152가 보충된 무혈청 합성 (SFD) 배지의 존재하에 아민 배양 디쉬상에 25만-50만 세포/웰의 밀도로 분주하였다. 분주 후 24시간에 50ng/ml의 BMP4, VEGF 및 FGF2가 보충된 SFD 배지를 배양액에 첨가하였다. 다음 날 완전한 배지 교환을 수행하였다.
[00228] 분화 과정 5일째에 세포를 50ng/ml Flt-3 리간드, SCF, TP0, IL3 및 Il6를 함유한 배지에 5U/ml의 헤파린과 함께 위치시켰다. 세포는 분화 과정 전반에 걸쳐 48시간 마다 공급하였다. 전체 공정은 저산소 조건하에서 수행하였다. HPC는 CD43/CD34 세포의 존재에 의해 정량화하였다.
[00229] 3D HPC 분화: 세포를 서브컨플루언트 iPSC로부터 분리하여 5 uM 블레비스타틴 또는 1 μM H1152가 보충된 무혈청 합성 (SFD) 배지의 존재하에 스피너 플라스크에 25만 내지 50만 세포/ml의 밀도로 분주하였다. 분주 후 24시간에 50ng/ml의 BMP4, VEGF 및 FGF2가 보충된 SFD 배지로 교체하였다. 분화 과정 5일째에 세포를 50ng/ml Flt-3 리간드, SCF, TP0, IL3 및 Il6를 함유한 배지에 5U/ml의 헤파린과 함께 위치시켰다. 세포는 분화 과정 전반에 걸쳐 48시간 마다 공급하였다. 전체 공정은 저산소 조건하에서 수행하였다. HPC는 CD43/CD34의 존재에 의해 정량화하였다. 상기 공정의 개요와 효율성은 (도 11)에, 배지 조성은 (도 12)에 열거한다.
[00230] HPC를 미세아교세포 분화 배지 MDM 또는 2X-MDM에 위치시켰다(도 11). 배양물은 48시간 마다 공급하였다. 분화 23일째의 미세아교세포 배양물에 대한 순도 마커를 냉동 보존 전후에 정량화하였다(도 13a, 도 13b).
[00231] 23일 생존 및 냉동 보존된 미세아교세포 배양물은 순도에 대해 평가하였다. 분화 23일째의 미세아교세포 배양물을 채취하여 미세아교세포 특이 마커의 존재에 대해 염색하였다. 나머지 세포는 제어 속도 동결기를 사용하여 냉동보존하였다. 냉동 보존된 세포를 해동하고 미세아교세포 특이적 마커의 존재에 대해 염색하였다. 세트 둘다에 대해 유동 세포측정에 의한 CD45, CD33, TREM2, 및 CD11b (도 14a)의 세포 표면 발현 및 PU.1, IBA, P2RY12, TREM2 및 TMEM119의 세포내 발현(도 14b). 그 결과, 냉동 보존된 미세아교세포는 냉동 보존 후에도 순도를 유지하는 것으로 나타났다.
[00232] HPC를 배지에 넣어 MDM의 존재하에 미세아교세포 분화를 개시하고 2X-MDM으로 간헐적 공급을 수행하였다. 세포는 분화 20일, 23일 및 26일에 수동 동결 프로토콜 또는 제어 속도 동결기(CRF)를 사용하여 냉동 보존하였다. 냉동 보존된 세포는 1주 동안 액체 질소로 옮겼다. 냉동 보존된 미세아교세포를 해동하고 미세아교세포 성숙화 배지(MMM)에 위치시켰다. 배양물에 새로운 미세아교세포 성숙화 배지를 48시간 마다 공급하였다. 해동 후 3일, 5일, 7일, 10일, 12일 및 14일째에 세포를 채취하여 초기 분주 수에 대해 생존 가능한 세포의 회수율을 정량화하였다(도 15a-15c).
[00233] 냉동 보존된 HPC는 MDM의 존재하에 미세아교세포로 분화시켰다. 인풋 HPC와 아웃풋 미세아교세포의 총 생존 가능한 수를 정량화하였다. 공정 효율은 미세아교세포 분화 23일째에 존재하는 TREM2 양성 세포의 순도와 절대 수를 인풋 생존 가능한 HPC의 절대 수로 나눈 값을 기준으로 계산하였다(도 16).
[00234] 분화 20일(도 17a), 23일(도 17b) 또는 26일(도 17c)에 냉동 보존된 미세아교세포를 미세아교세포 성숙화 배지(MMM)에서 해동하고 48시간마다 새로운 배지를 공급하였다. 해동 후 3일, 7일, 10일째에 총 생존능과 절대 세포 수를 정량화하였다. 데이터에 따르면 해동 후 23일 미세아교세포가 26일 미세아교세포보다 더 높은 회수율을 보여주었다(도 17a-17c).
[00235] 이어서, 분화 공정 20일, 23일 및 26일째에 냉동 보존된 미세아교세포에 대해 기능적 평가를 수행하였다. 세포를 해동하고 웰당 200μl의 미세아교세포 성숙화 배지의 존재하에 96웰 플레이트에 15,000개의 생존 가능한 세포/웰로 분주하였다. 세포를 희석된 1μg/웰의 옵소닌화되거나 업소닌화되지 않은 pHrodo 레드 바이오입자(Thermo Fisher # A10010, 바이알당 2mg, -20°C에서 저장)로 처리하였다. IncuCyte에 플레이트를 놓고 해동 후 최대 5일까지 다양한 시점에 식세포작용 이미지를 촬영하였다. 제어 속도 동결기 방법을 통해 냉동보존된 세포는 보다 강력한 식세포작용을 나타낸다(세포 생존능이 높기 때문에(도 19)).
[00236] 기능적 평가는 해동 후 이후 시점으로 연장되었다. 식세포작용 잠재력은 IncuCyte 시스템상에서 생 이미지화를 통해 평가된 수동 또는 제어 속도 동결기를 사용하여 분화 20일, 23일 및 26일에 냉동보존된 미세아교세포에 대해 해동후 5일, 7일 및 14일에 평가하였다. 냉동 보존된 미세아교세포를 해동하고 3일 동안 MMM에 분주하였다. 3일의 종료 시점에 생존 가능한 세포 수는 도 18b에 기재된 바와 같이 결정하였다. 15,000개의 생존 가능한 세포를 96웰 플레이트에 웰당 200μl의 미세아교세포 성숙화 배지(MMM)와 희석된 1μg/웰의 옵소닌화되거나 옵소닌화되지 않은 pHrodo 레드 바이오입자의 존재하에 위치시키고 플레이트를 IcuCyte에 상에 위치시키고 해동 후 5일, 7일 및 14일까지 다양한 시점에서 식세포작용 이미지를 촬영하였다. 수동 냉동 보존 방법은 모든 조건에 걸쳐 식세포작용의 저하된/우측 전환율을 밝혔다(보다 낮은 세포 생존능으로 인해).
[00237] 식세포작용 지수는 세균과 식세포 현탁액의 제한된 항온처리 기간 동안 식세포당 섭취한 세균 수를 계수함에 의해 결정되는 식세포작용 활성의 척도이다. 냉동 보존된 미세아교세포가 표지된 세균 입자를 포식하는 능력은 식세포작용 레드 물체 수/총 생세포 수의 비율로 정량화하였다. 상기 비율을 식세포작용 지수로 결정하였다(도 21).
[00238] 냉동 보존된 미세아교세포를 해동하고 웰당 200μl의 미세아교세포 성숙화 배지의 존재하에 96웰 플레이트에 15,000개의 생존 가능한 세포/웰로 분주하였다. 세포를 희석된 1μg/웰의 옵소닌화되거나 업소닌화되지 않은 pHrodo 레드 바이오입자(Thermo Fisher # A10010, 바이알당 2mg, -20°C에서 저장)로 처리하였다. IncuCyte에 플레이트를 놓고 해동 후 최대 5일까지 다양한 시점에 식세포작용 이미지를 촬영하였다. 제어 속도 동결기 방법을 통해 냉동 보존된 세포는 보다 강력한 식세포작용을 나타낸다(세포 생존능이 높기 때문에(도 22)).
[00239] 이어서, ECM의 부재 및 스크리닝 적용이 가능한 96웰 포맷으로 HPC를 미세아교세포로 분화시키는 방법을 추가로 개발하였다. 초저부착(ULA), 조직 배양(TC) 및 비조직 배양(Non-TC) 용기(도 23a) 상에서 분화를 수행하였다. 냉동 보존된 HPC는 웰당 200ul의 미세아교세포 분화 배지의 존재하에 96웰 Primaria 플레이트 또는 초저부착, 조직 배양물(TC) 또는 비조직 배양 플레이트(Non-TC)상에 20,000-35,000 생존 가능한 세포/cm2의 밀도로 분주하였다. 세포에는 다음 23일 분화 동안 MDM의 웰 당 50μl의 배지를 48시간마다 공급하였다. 23일째에 냉각 PBS로 세포를 수거하고 자동화된 세포 계수기를 사용하여 총 생존 세포 수를 정량화하였다. 세포는 CD11b, CD45, CD33, TREM2의 표면 발현과 TREM2, IBA, P2RY12 및 TMEM119의 세포내 발현에 대해 염색하였다(도 24a-24b).
[00240] 표 1: 하전된 표면 상에 미세아교세포를 생성하는 공정 효율.
[00241] 냉동 보존된 미세아교세포에 의해 방출되는 사이토킨 및 케모킨. 23일 냉동 보존된 미세아교세포를 MDM 배지에 해동하고 50,000세포/웰에서 Primaria 96 웰 플레이트에 분주하였다. 100 ng/ml LPS와 50 ng/ml 인터페론 감마로 자극을 개시하기 전에 세포를 3일동안 배양하였다. 자극은 24시간 동안 3중으로 수행하였다. 상등액을 회전 하강시켜 세포와 잔해를 제거한 후 즉시 -20°C에 위치시켰다. 상등액을 멀티플렉스 Luminex 검정으로 분석하였다.
실시예 6 - 신경변성 질환을 모방하는 변이체를 생성하기 위한 iPSC의 가공
[00242] 엑손 2에 indel을 도입하여 프레임시프트 및 미성숙한 해독 종결을 유도함에 의해 TREM2 기능을 중단시켰다. TAL-뉴클레아제 (하기 쌍 TREM2)는 엑소 2 내의 아미노산 58 주변에 집중된 DNA 서열에 결합하도록 디자인하였다. 가공을 위해 사용된 세포주는 FCDI iPSC 세포주 01279.107이었다. SV40 프로모터의 제어하에 블라스티딘 내성을 발현하는 공동 선택 플라스미드와 TAL 뉴클레아제 mRNA를 125V/950uF의 설정으로 BioRad Gene Pulser Xcell 시스템을 사용하여 세포에 전기 천공하였다. 세포를 분주하고 전기 천공 후 1일과 2일에 짧은 블라스티시딘 선택을 적용하였다. 생존 세포를 성장시키고 이어서 전기 천공 후 7일째에 96 웰 플레이트에 단일 세포를 분류하였다. 약 2주 후, 81개의 클론을 선별하고 PCR과 서열분석에 의해 유전자형을 분류하였다.
[00243] 서열분석된 81개의 클론 중 7개가 서열 변형을 보여주었다. 3개의 클론은 하나의 염기쌍이 삽입된 1개의 대립유전자를 포함하고, 3개의 클론은 하나의 염기쌍이 결실된 1개의 대립유전자를 포함하고, 1개의 클론은 1개의 염기쌍 삽입체를 포함하는 1개의 대립유전자 및 4개의 염기쌍이 결실된 1개의 대립유전자를 갖는 복합 이형접합체였다. 제7 클론은 프레임시프트를 도입할 것으로 예상되지 않았던 24개의 염기쌍이 결실되어 있다. 클론을 확장하고, 냉동 보존하고, 서열 확인 및 핵형 분석을 거쳤다. 미세아교세포로 분화시킨 후, 2개의 주요 클론을 이형접합체 또는 동형 접합체 장애의 장애로서 선택하였다. 이형접합 클론 01279.1185는 1bp 삽입체를 갖는 대립유전자를 포함하고 있어 TREM2의 60번 위치에서 프레임시프트 및 45번 아미노산 다음에 종결을 유도한다. 동형접합 클론 01279.1187은 59번 위치에 1bp 프레임시프트 삽입과 16개 아미노산 후 종결된 대립유전자와 59번 위치에서 4bp 결실을 가져 프레임시프트 및 이후 46번 아미노산 뒤에 종결을 유도하는 제2 대립유전자를 포함하였다.
[00244] 　표 2: 표적 서열.
[00245] 표 3
실시예 7 - 신경변성을 모방한 추가적인 동질유전자 가공된 세포주의 생성:
[00246] 파킨슨 질환 모델은 뉴클레아제 매개된 상동성 재조합과 공여자 올리고 SJD 14-133에 의해 유전학적으로 에피솜적으로 재프로그램화된 iPSC 01279를 가공하여 생산되었다. 그 결과 생성된 iPSC는 아미노산 53이 알라닌에서 트레오닌으로 변화되어 알파-시누클린 유전자(SNCA)에서 A53T 변이체를 생성하는 SNP rs104893877 및 SNCA A53T iPSC 세포주를 초래하는 2개의 사일런트 돌연변이를 포함하였다.
[00247] 뉴클레아제 매개 상동성 재조합과 공여자 플라스미드 p1553을 사용하여 Rett 증후군을 연구하기 위한 동질유전자 가공된 모델을 생성하였다. 공여자 플라스미드 p1553은 메틸 CpG 결합 도메인 앞에 일련의 정지 코돈을 삽입한 후 LoxP 부위에 의해 플랭킹된 PGKp-PuromycinR-SV40pA 선택 카세트를 삽입하였다. 모 세포주 01279로부터 유래된 MECP2 HM 세포주는 Rett 증후군에 대한 질환 모델을 제공하였다.
[00248] 동질유전자 가공된 iPSC로부터 HPC 및 미세아교세포의 생성: 01279로부터 유래된 동형접합성 및 이형접합성 TREM2 KO iPSC와 01279로부터 유래한 SNCA A53T 및 MECP2 HM 가공된 세포주는 저산소 조건에 적응된 E8 및 MATRIGEL™의 존재하에 10회 계대동안 이들 계대시킴에 의해 유지하였다. 세포를 핵형 분류하고 3D HPC 분화 프로토콜을 통해 HPC 분화를 개시하도록 iPSC 뱅크를 만들었다. 세포를 서브컨플루언트 iPSC로부터 분리하여 5 uM 블레비스타틴 또는 1 μM H1152가 보충된 무혈청 합성 (SFD) 배지의 존재하에 스피너 플라스크에 25만 내지 50만 세포/ml의 밀도로 분주하였다. 분주 후 24시간에 50ng/ml의 BMP4, VEGF 및 FGF2가 보충된 SFD 배지로 교체하였다. 분화 공정 5일째에 세포를 50ng/ml Flt-3 리간드, SCF, TP0, IL3 및 IL6가 포함된 배지에 5-10 U/ml의 헤파린과 함께 위치시킨다. 세포는 13일 분화 공정 전반에 걸쳐 48시간 마다 공급한다. 전체 공정은 저산소 조건하에서 수행한다. HPC는 CD43/CD34에 의해 정량화한다. HPC는 CD34 비드를 사용하여 MAC 분류 후 냉동 보존한다. 실시예 5에 기재된 대로 냉동 보존된 HPC를 해동하고 세포를 23일 분화 공정에 넣어 미세아교세포를 생성하였다.
[00249] 23일 야생형 및 TREM 가공된 클론의 냉동 보존된 미세아교세포를 해동시키고 유동 세포측정으로 CD45와 함께 TREM-2 발현의 존재를 정량화하였다(도 26).
[00250] 동질유전자 가공된 세포주로부터 유래한 냉동 보존된 23일 미세아교세포를 해동하고 미세아교세포 특이 마커의 존재에 대해 염색하였다. 세포를 염색하여 유동세포측정에 의해 CD45, CD33, TREM2 및 CD11b의 세포 표면 발현과 PU.1, IBA, P2RY12, TREM2 및 TMEM119 단백질의 세포 내 발현을 정량화하였다. 도 26은 모든 4개의 동질유전자 가공된 iPSC에 걸쳐 수득된 순도를 요약한다. 결과는 분화 프로토콜을 변경하지 않고도 동질유전자 가공된 iPSC로부터 고순수 미세아교세포의 생성을 입증한다.
[00251] 해동 후 미세아교세포에 의해 분비된 가용성 TREM2(sTREM2) 단백질의 수준은 단순 단계 ELISA(AbCam)를 사용하여 WT 및 TREM2 이형접합성 및 동형접합성 KO 돌연변이체로부터 수거된 배지에서 정량화하였다. WT 및 TREM2 KO 미세아교세포를 해동하고 96웰 Primaria 플레이트 내 성숙화 배지에서 동일한 밀도로 분주하였다. 소모된 배지는 해동 후 3일째와 해동 후 7일째에 수거하였다. 해동 후 3일째와 5일째에 배양물에 새로운 성숙화 배지를 절반씩 공급하였다. 데이터는 WT, 이형접합성 TREM2 KO 및 동형접합성 KO 미세아교세포 사이의 가용성 TREM2 수준에 차이가 있음을 밝혔다. 상기 검정은 WT와 TREM2로 가공된 iPSC를 구별하기 위한 기능적 검정으로서 사용될 수 있다.
[00252] 해동 후 미세아교세포에 의해 분비된 가용성 TREM2(sTREM2) 단백질의 수준은 단순 단계 ELISA(AbCam)를 사용하여 WT 및 TREM2 이형접합성 및 동형접합성 KO 돌연변이체, MECP2HM 및 SNCA-A53T로부터 수거된 컨디셔닝된 배지로부터 정량화하였다. WT 및 TREM2 KO 미세아교세포를 해동하고 96웰 Primaria 플레이트 내 성숙화 배지에서 동일한 밀도로 분주하였다. 소모된 배지는 해동 후 3일째와 해동 후 7일째에 수거하였다. 해동 후 3일째와 5일째에 배양물에 새로운 성숙화 배지를 절반씩 공급하였다. 데이터는 WT, 이형접합성 TREM2 KO 및 동형접합성 KO 미세아교세포 사이의 가용성 TREM2 수준에 차이가 있음을 밝혔다. 상기 검정은 WT와 TREM2로 가공된 iPSC를 구별하기 위한 기능적 검정으로서 사용될 수 있다. A53T-SNCA 미세아교세포에서는 방출 가용성 TREM2가 손상된 반면, MECP2HM 미세아교세포에서는 배지에서 방출되는 sTREM의 수준에 임의의 변경을 밝혔다(도 27b).
[00253] 동질유전자적으로 가공된 냉동 보존된 미세아교세포에 의해 방출되는 사이토킨 및 케모킨. WT, 1185 HT TREM2 KO, 1187 HO TREM2 KO A53T-SNCA 및 MeCP2HM로부터 유래된 23일 냉동 보존된 미세아교세포를 MDM 배지에 해동시키고 50,000세포/웰에서 Primaria 96 웰 플레이트에 분주하였다. 100 ng/ml LPS로 자극을 개시하기 전에 세포를 3일동안 분주하여 M1 매개된 반응을 조사하였다. 자극은 24시간 동안 3중으로 수행하였다. 상등액을 회전 하강시켜 세포와 잔해를 제거한 후 즉시 -20°C에 위치시켰다. 상등액을 멀티플렉스 루미넥스 검정으로 분석하였다. 상기 멀티플렉스 루미넥스 검정 결과는 도 27c에서 히트 맵으로서 캡처한다. 가공된 세포주는 ANH 대조군에 비해 보다 높은 수준의 IL-6을 분비하였다. TREM2 HZ와 TREM2 HO 및 MeCP2HM 미세아교세포는 ANH에 비해 TNF 알파를 덜 방출하지만 IL6 수준을 증가시켰다. A53T-SNCA 미세아교세포는 AHN 대조군 미세아교세포와 비교하여 유사한 수준의 IL-6 및 TNF 알파를 방출하였다.
[00254] 모든 가공된 세포주는 M1 자극(LPS)으로 처리했을 때 M2 사이토킨 IL-10을 방출하였다. MECP2HM 미세아교세포는 AHN 대조군 미세아교세포에 비해 IL-10을 적게 방출하였다(도 27e). AHN과 가공된 미세아교세포는 LPS 자극에 반응하여 CCL2/MCP-1, CCL20/MIP-3 알파, CCL4/MIP-1 베타, CCL5/RANTES, CX3CL1/프랙탈킨, CXCL1/GRO 알파, CXCL10/IP-10, CXCL2/GRO 베타, IL-8/CXCL8을 방출할 수 있다. 사이토킨 방출 수준에는 일부 고유한 차이가 있다. TREM2HO는 알츠하이머 질환(AD) 발병 동안에 방출되는 주요 분석 물인 CCL4의 최고 수준을 밝혔다. MECP2HM, TREM2HZ 및 TREM2HO 미세아교세포는 보다 높은 수준의 CXCL1/ GRO를 방출하였고, 이는 미생물 사멸을 돕고 식세포작용 동안에 염증 반응을 유발하는 보조 세포 유형 과립구를 동원하려는 시도를 의미하고, MECPHM 미세아교세포는 IL-8/CXC18을 자발적으로 분비하는 것으로 나타났다. 상기 분석물은 뇌 손상 시 상승하고 염증 촉진성 프로테아제 및 MMP-2 및 MMP-9의 발현을 유도한다. MECPHM 미세아교세포는 보다 높은 수준의 IL-6를 분비하였다. 이들 결과는 MECPHM이 염증 촉진성 반응에 대해 프라이밍됨을 시사한다. 가공된 미세아교세포와 AHN 미세아교세포는 LPS에 반응하여 배지에서 유사한 수준의 PDL-1, CD40, FLT-3 및 PDGFAA를 방출하였다.
[00255] 냉동 보존된 미세아교세포를 성숙화 배지에서 해동하고 48시간 동안 회수시킨 후 스크리닝 실험을 수행하였다(도 36). 384 웰 플레이트의 웰당 TREM2 WT 및 TREM2 HOKO로부터의 5,000개의 미세아교세포를 40 uL 배지에 24시간 동안 배양하였다. 제1 세트 (플레이트 1)에서, 세포를 1μM 최종 농도의 화합물로 전처리하였다. 세포를 화합물로 처리한지 24시간 후, pHrodo 표지된 아밀로이드-베타를 최종 농도 1μM로 플레이트 1에 첨가하고 96시간 동안 IncuCyteS3상에서 식세포작용을 캡처하였다(도 37-39). 제2 세트(플레이트 2)에서, 세포를 24시간 동안 배양한 후 1μg/mL의 최종 농도에서 1ug/ml LPS로 처리하였다(도 40-42). LPS에 노출된 지 24시간 후 및 배양 개시하지 48시간 후, pHrodo 표지된 아밀로이드-베타는 1 μM의 최종 농도로 플레이트 2에 첨가하였다. 세포는 최대 96시간 동안 한 시간에 1회 IncuCyte를 사용하여 이미지화하였다. 식세포작용 데이터는 총 레드 물체 통합 강도 X μM2/이미지로 캡처하였다. 모든 치료를 위한 최종 용적은 일정하게 유지되었다. 스크리닝의 결과는 도 43에 요약한다.
[00256] 성숙화 배지에서 해동 후 미세아교세포 생존률에 필요한 사이토킨을 이해하기 위해 32개의 상이한 배지 제형으로 개략적인 매트릭스를 계획하였다(도 28). 96 웰 플레이트에 15,000개의 생존 가능한 세포 밀도로 WT, 1185 HT TREM2 KO, 1187 HO TREM2 KO 미세아교세포를 250 μl의 미세아교세포 기본 배지 또는 MMM 또는 성숙 배지에 단일 사이토킨(도 29), 2개의 사이토킨(도 30), 3개의 사이토킨(도 31) 또는 4개의 사이토킨(도 32)이 보충된 미세아교세포 기본 배지에 위치시켰다. 세포 생존률의 동역학은 IncuCyte 시스템상에서 캡처하였다. 다양한 배지 조성을 갖는 세포를 함유한 모든 웰에 2방울/mL로 희석한 NucGreen Dead를 첨가하여 시간에 따른 죽은 세포의 수를 캡처하였다. 이미지는 8시간마다 캡처하였고, 실험은 임의의 간헐적인 공급 없이 72시간 동안 계속하였다. NucGreen Dead의 강도는 배양물에서 죽은 세포를 정량화한다.
[00257] WT, 1185 HT TREM2 KO, 1187 HO TREM2 KO 미세아교세포를 96 웰 플레이트에 15,000개의 생존 가능한 세포 밀도로 250 μl의 미세아교세포 기본 배지(도 33a) 또는 MMM(도 33b), IL-34가 보충된 미세아교세포 기본 배지(26c), IL-34가 보충된 미세아교세포 기본 배지(도 33d), MCSF가 보충된 미세아교세포 기본 배지(도 33d) 또는 단독의 IL-34가 보충된 기본 배지(도 33c) 또는 MSCF 또는 IL-34와 MCSF의 조합이 보충된 기본 배지(도 33e)에 위치시켰다. 세포 생존률의 동역학은 IncuCyte 시스템상에서 캡처하였다. 다양한 배지 조성을 갖는 세포를 함유한 모든 웰에 2방울/mL로 희석한 NucGreen Dead를 첨가하여 시간에 따른 죽은 세포의 수를 캡처하였다. 이미지는 8시간마다 캡처하였고, 실험은 임의의 간헐적인 공급 없이 7일 동안 계속하였다. NucGreen Dead의 강도는 배양물에서 죽은 세포를 정량화한다.
[00258] 23일째에 pHrodo 레드 표지된 세균 바이오입자 및 pHrodo 레드 아밀로이드 베타와 함께 냉동 보존된 WT, 1185 HT TREM2 KO, 1187 HO TREM2 KO 미세아교세포에 대해 기능적 특징을 평가하였다. 해동 후 3일 동안 단독의 MSCF(도 34c-d) 또는 IL-34(도 34e-f) 또는 Il-34와 MCSF의 조합(도 33g-h)이 보충된 250μl의 MMM(도 34a-b) 또는 MDM 기본 배지(AKA 미세아교세포 기본 배지)에서 96 웰 플레이트에 15,000-30,000 생존 가능한 세포/cm2의 밀도로 WT, 1185 HT TREM2, 1187 HO TREM2 KO 미세아교세포를 분주하였다. 세포를 희석된 1μg/웰의 옵소닌화되거나 옵소닌화되지 않은 pHrodo 바이오입자(Thermo Fisher # A10010, 바이알당 2mg, -20°C에서 저장)(도 34 a, c, e, g) 또는 pHrodo 아밀로이드 베타(도 34b, d, f, h)로 처리하였다. IncuCyte에 플레이트를 놓고 최대 30시간까지 다양한 시점에 식세포작용 이미지를 촬영하였다. 해동 후 WT와 가공된 미세아교세포는 식세포작용 기능을 나타냈다. 식세포작용의 동역학 및 효율은 WT, 1185 HT TREM2 KO, 1187 HO TREM2 KO 미세아교세포간에 다양하였다.
[00259] 성숙화 배지에 2개의 중요한 (IL-34, MSCF) 사이토킨의 조합이 보충된 MMM 또는 미세아교세포 기본 배지의 존재하에 23일 냉동 보존된 야생형(WT) 미세아교세포의 해동 후 순도를 결정하였다(도 35). 세포를 채취하여 해동 후 3일, 7일, 14일째에 순도를 정량화하였고, 세포를 채취하여 유동 세포측정으로 세포 표면 및 세포 내 마커 염색을 위해 세포를 염색하여 분화 공정이 종료되었을 때 CD45, CD33, TREM2, CD11b, CX3CR1, P2RY12, TMEM119, IBA의 순도를 결정하였다. 냉동 보존된 미세아교세포는 MSCF와 IL-34가 보충된 성숙화 배지에서 생존능과 순도를 유지한다. 상기 단순화된 배지는 신경변성과 관련된 많은 SNP 및 돌연변이의 기여도를 연구하기 위한 뇌 오가노이드 모델 개발을 위해 냉동 보존된 미세아교세포와 뉴런 및 성상세포의 공동 배양 응용에 유용할 것이다.
실시예 8 - 환자 유래 iPSC로부터 질환 관련 미세아교세포 생성
[00260] 최근의 유전학적 연구는 미세아교세포가 풍부한 여러 유전자의 다형성이 알츠하이머 질환(AD), 파킨슨 질환(PD) 및 여러 신경변성 질환의 발병 위험 변화와 관련이 있는 것으로 나타났다. GWAS 연구의 위험 관련 SNP 목록을 요약하면, 말기 미세아교세포 패널은 APOE 이소형과 함께 TREM2, CD33, ABCA7에 돌연변이를 나타내는 공여자로부터 생성하였다. 환자 유래 iPSC로부터 유래한 냉동 보존된 미세아교세포는 2D 또는 3D 오가노이드 시스템에서 사람 미세아교세포, 뉴런, 성상세포 간의 복잡한 상호작용을 이해하고 신경변성 질환을 모방할 수 있는 보다 정확한 모델을 생성하는 시험관 내 도구를 제공한다.
[00261] 에피솜적으로 재프로그래밍된 AHN 및 질환 특이적 iPSC로부터 HPC의 생성: 정상 및 질환 특이적 공여자로부터 생성된 에피솜적으로 재프로그래밍된 iPSC는 조혈 세포로 이어서 미세아교세포로 분화시키기 위해 공급원 물질을 뱅킹하기 전에 E8/ MATRIGEL™을 사용하여 적어도 5-10회 계대 동안 저산소증에 순응시켰다. iPSC 패널의 유전자형은 표 4에 기재되어 있다. 모든 공여자로부터 유래한 iPSC를 핵형 분석하고, 실시예 5에 기재된 바와 같이 3D HPC 분화 프로토콜을 통해 HPC 분화를 개시하도록 iPSC 뱅크를 만들었다. 실시예 5에 기재된 대로 냉동 보존된 HPC를 해동하고 세포를 23일 분화 공정에 넣어 미세아교세포를 생성하였다. 다양한 공여자로부터 유래한 냉동 보존된 23일 미세아교세포를 해동하고 미세아교세포 특이적 마커의 존재에 대해 염색하였다. 세포를 유동세포 측정에 의해 CD45, CD33, TREM2 및 CD11b의 세포 표면 발현과 PU.1, IBA, P2RY12, TREM2 및 TMEM119 단백질의 세포 내 발현에 대해 염색하였다. 표 5에는 모든 AHN 및 질환 관련 미세아교세포(DAM)에 걸쳐 수득된 순도가 요약되어 있다. 상기 결과는 분화 프로토콜의 변화 없이 건강하고 질환에 특정한 공여자 패널로부터 고도로 순수한 미세아교세포의 생성을 입증한다.
[00262] 표 4: 겉보기에 건강한 정상(ANH) 및 질병 관련 미세아교세포(DAM) 패널로부터 냉동 보존된 미세아교세포의 생성
[00263] 표 5. 겉보기에 건강한 정상(ANH) 및 알츠하이머 질환(AD) 공여자 샘플의 순도 개요.
[00264] 해동 후 미세아교세포에 의해 분비된 가용성 TREM2(sTREM2) 단백질의 수준은 단순 단계 ELISA(AbCam)를 사용하여 iPSC 패널로부터 생성된 미세아교세포로부터 수거된 컨디셔닝된 배지로부터 정량화하였다. 겉보기에 건강한 정상 공여자와 질환 특이적 공여자로부터 생성된 미세아교세포를 해동하고 96 웰 Primaria 플레이트의 성숙화 배지에서 동일한 밀도로 분주하였다. 소모된 배지는 해동 후 3일째와 해동 후 7일째에 수거하였다. 해동 후 3일째와 5일째에 배양물에 새로운 성숙화 배지를 절반씩 공급하였다.
[00265] 데이터에 따르면 R47H 유전자형을 나타내는 공여자로부터 유래한 다양한 미세아교세포 샘플 간의 가용성 TREM2 수준에 차이가 있는 것으로 나타났는데, 해동 후 3일째에 가용성 TREM 수준이 가장 높았고 해동 후 7일째에도 높은 수준을 유지하였다. 상기 공여자가 무증상이었기 때문에 AHN으로 분류되었지만, iPSC 유래 미세아교세포는 고수준의 sTREM을 분비하였다. 상기 데이터는 알츠하이머 질환 환자의 뇌척수액에서 관찰되는 높은 수준의 sTREM2와 일치하고 상기 돌연변이 상태와 관련이 있다(문헌참조: Cheng et al., 2016). 상기 데이터는 신경변성 질환 발병에 대한 스크리닝 예측 키트를 디자인하는 데 iPSC 유래 미세아교세포를 사용하기 위한 강력한 예시이다. AD가 발병한 APOE4/4/ 유전자형을 가진 젊은 공여자는 동일한 유전자형을 가진 고령 공여자에 비해 높은 수준의 가용성 TREM을 나타냈다. CD33 또는 ABCA7 유전자에 SNP의 존재는 상등액 배지에서 가용성 TREM의 방출을 증진시키지 않는 것으로 나타났다. AHN 공여자 12068은 해동 후 3일과 7일에 높은 수준의 가용성 TREM을 나타냈다.
[00266] 신경염증은 많은 신경변성 질환의 진행과 발병기전에 기여한다. 뇌에 상주하는 미세아교세포와 성상세포는 자극과 미세 환경에 따라 뇌에서 염증 촉진 및 항염증 역할 둘다를 할 수 있는 사이토킨을 방출한다. 이러한 염증 촉진과 항염증 프로필 사이의 변동은 AD 및 기타 신경변성 질환의 발병과 관련이 있다. 질환 관련 미세아교세포(DAM)에서 방출되는 사이토킨과 케모킨의 수준을 정량화하기 위해, 냉동 보존된 AHN과 DAM 미세아교세포를 MDM 배지에 해동시키고 50,000세포/웰에서 Primaria 96 웰 플레이트에 분주하였다. 자극을 개시하기 전 3일 동안 세포를 100ng/ml LPS와 함께 배양하여 M1 매개 반응을 확인하거나 10ng/ml IL-4와 10uM dBu-cAMP를 함께 사용하여 M2 특이적 반응을 유발하였다. 자극은 24시간 동안 3중으로 수행하였다. 상등액을 회전 하강시켜 세포와 잔해를 제거한 후 즉시 -20°C에 위치시켰다. 상등액을 멀티플렉스 루미넥스 검정으로 분석하였다. 상기 멀티플렉스 루미넥스 검정 결과는 도 27c에서 히트 맵으로서 캡처한다.
[00267] 케모킨 CCL1, CCL2, CCL3, CCL4, CCL8, CCL11, CCL13,CCL17, CCL18, CCL20, CCL22, CCL24는 화학 유인 물질로 작용하며 골수 세포, 과립구, 림프 세포 또는 신경 전구 세포를 염증 부위로의 동원을 매개하고 식세포작용 반응을 증진시켜 일반적으로 알츠하이머 질환(AD) 또는 다발성 경화증에서 상향 조절된다. LPS 또는 dBu-cAMP에 반응하여 APOE E4/E4, AP0E E2/E4, TREM2 R47H, ABCA7 G1527A 및 CD33(rs429358 SNP 보유)으로부터 유래한 미세아교세포는 AHN 세포주에 비해 이러한 모든 분석 물질을 더 높은 수준으로 방출하였다. 배수 증가는 다양한 미세아교세포 유전자형에 따라 0.1배에서 최대 7배까지 다양하였다. 질환 관련 미세아교세포로부터 수득된 상기 데이터는 AD 뇌 샘플에서 CCL2 및 CCL5 발현이 증가한다는 이전의 연구 결과를 뒷받침한다. 뇌와 뇌척수액(CSF)에서의 CCL2 발현은 AD 중증도를 예측하는 신뢰할 수 있는 지표로 보고되었다(문헌참조: Westin et al.)
[00268] APOE E4/E4, AP0E E2/E4, TREM2 R47H, ABCA7 G1527A 및 CD33 (rs429358 SNP 보유) 유래된 미세아교세포는 M2 분극화와 관련된 염증 및 염증성 질환의 마커인 미미하게 상승된 수준의 가용성 Cd163을 방출하였다. sCD163의 방출은 단핵구 과활성화를 방지하고 염증 촉진성 사이토킨인 TNF-알파, IL-1베타, IL-6 및 IL-8의 분비를 감소시킨다. 신경 염증 동안 조직 리모델링에 중요한 역할을 하는 키티나제-3에서도 유사한 경향이 관찰되었다(문헌참조: Melief et al., 2012); Minett et al., 2016).
[00269] PD-L1과 이의 수용체인 PD-1은 T세포 활성화, 내성, 면역 매개 조직 손상 사이의 균형을 조절하는 억제 신호를 유발한다. LPS에 대한 반응으로 APOE E4/E4 유래된 미세아교세포는 AHN 유래 미세아교세포에 비해 증가하지 않았다. TREM2 R47H, APOE E2/E4, 및 CD33 (rs429358 SNP 보유) 유래된 미세아교세포는 AHN 세포주에 비해 증가를 나타냈다. IL-4 + dBu-cAMP에 대한 반응으로 APOE E4/E4, TREM2 R47H, ABCA7 G1527A는 AHN 세포주에 비해 미미한 증가를 나타낸 반면, APOE E2/E4 유래된 미세아교세포는 AHN 유래된 미세아교세포에 비해 7배 증가하였다.
[00270] APOE E4/E4, AP0E E2/E4, TREM2 R47H, ABCA7 G1527A 및 CD33(rs429358 SNP 보유) 유래된 미세아교세포는 신경 염증 동안 주화성, 생존률을 촉진하고 TNF-알파 및 산화질산의 수준을 감소시켜 신경 보호를 증진시키는 가용성 케모킨인 가용성 프랙탈킨을 약간 증가된 수준으로 방출하였다.
[00271] APOE E4/E4, AP0E E2/E4 및 ABCA7 G1527A 유래된 미세아교세포는 LPS와 dBu-cAMP 둘다에 반응하여 높은 수준의 CXCL1/GRO 알파를 방출한 반면, TREM2 R47H 및 CD33 유래된 미세아교세포는 사이토킨 방출 수준의 미미한 증가를 나타냈고 이는 상기 분석물과 APOE 및 ABCA7 유전자형의 상관관계를 시사한다. 최근 연구에 따르면 CXCL1은 AD 발병 시 염증 반응에 기여할 수 있지만, 상기 질환의 발병 기전에서 AD의 소인을 부여하는 잠재적 유전자 인자로는 기여하지 않는 것으로 나타났다. 생리학적 조건하에서 CX3CR1은 미세아교세포의 활성화를 제한하여 미세아교세포의 항상성을 유지한다. 자극 후 방출되는 상기 사이토킨의 높은 수준은 APOE 또는 ABCA7 G1527A 유전자형과 관련된 질환 관련된 미세아교세포에서 항상성 기능을 보존하기 위한 CX3CR1에 의한 구제 기전이 개시되었음을 지적한다. 대안적으로, APOE E4/E4 및 ABCA7 G1527A 활성화 미세아교세포에 의해 분비되는 높은 수준의 CX3CR1은 신경변성을 촉진하는 신호일 수 있다(문헌참조: Atagi et al., 2015; Wolfe et al., 2018).
[00272] APOE E4/E4 및 AP0E E2/E4 유래된 미세아교세포는 LPS와 IL4/dBu-cAMP 둘다에 반응하여 높은 수준의 IL-6를 방출한 반면, 다른 모든 유전자형은 AHN과 유사한 수준의 IL-6를 분비하였다. IL-6 분비는 과립구를 끌어당기고 세포 매개 체액성 Th2 반응을 촉진하며 염증을 유발한다. 상기 기전은 다시 APOE E4/E4 유전자형과 관련된 보다 큰 신경 염증을 뒷받침한다.
[00273] ABCA7 G1527A 유래된 미세아교세포는 LPS에 반응하여 높은 수준의 IL-1 베타 및 IL-1 알파를 분비한 반면, 다른 유전자형은 AHN 미세아교세포와 유사한 수준을 분비하였다.
[00274] APOE E4/E4, AP0E E2/E4 및 ABCA7 G1527A 유래된 미세아교세포도 LPS에 반응하여 dBu-cAMP보다 높은 수준의 IL-8/CXCL8을 방출하였다. ABCA7 G1527A 유래된 미세아교세포는 높은 수준의 IL-8을 방출하여 뇌 손상에 기여하는 염증 촉진 반응의 발병을 시사한다.
[00275] 또한 미세아교세포는 단백질용해 효소와 매트릭스 메탈로프로테이나제를 분비하여 Aβ 침착을 제거하고 AD 공정을 제한하여 AD에서 신경 보호 역할을 수행할 수 있다. APOE E4/E4, AP0E E2/E4, TREM2 R47H, ABCA7 G1527A 및 CD33(rs429358 SNP 보유) 유래된 미세아교세포는 AHN 유래된 미세아교세포에 비해 미미하게 상승된 수준의 MMP-9 및 MMP-12를 방출하였다.
[00276] R47H TREM2 유래된 미세아교세포는 LPS 또는 M1 자극에 의해 자극되었을 때 AHN 유래된 미세아교세포에 비해 7배 이상 많은 IL-12 p70을 방출하였다. 반면, AP0E E2/E4는 IL4+ dBu-cAMP 또는 M2 자극에 대한 반응으로 AHN 유래된 미세아교세포에 비해 7배 이상 많은 IL-12 p70을 방출하였다. 다른 유전자형은 IL-12 분비 수준의 약간 증가를 나타냈다. 1차 미세아교세포는 뇌에서 IL-12를 생성하여 감염 동안에 또는 CNS의 Th1 세포 매개 자가면역 질환에서 면역 반응을 제어한다. R47H TREM2 유래된 미세아교세포에 의한 IL-12 수준의 증가는 NK세포와 T세포의 세포 독성 활성이 강력하게 활성화되었음을 의미한다.
[00277] 마지막으로, APOE E4/E4, AP0E E2/E4, ABCA7 G1527A 유래된 미세아교세포는 유사하거나 미미하게 높은 수준의 IL-13, IL-18, IL-23 및 알파 시누클레인을 방출하여 이는 이들 분석물과 상기 언급된 유전자형 간의 상관관계가 없음을 시사하였다.
[00278] 신경염증은 알츠하이머 질환(AD)의 발병 기전과 진행에 중요한 기여인자이다. 여러 염증 매개체의 조합은 특정 SNP 돌연변이와 관련된 고유한 시그니처를 생성한다. 질환 특이적 공여자로부터의 iPSC 유래된 미세아교세포는 다양한 미세아교세포 SNP 및 돌연변이 관련 유전자형과 관련된 주요 시그니처 사이토킨을 결정하는 데 사용될 수 있다.
[00279] 미세아교세포의 식세포작용 기능은 신경 보호 효과를 보존하는 데 중요하다. 미세아교세포 매개 식세포작용은 질환 특이적 SNP 또는 돌연변이에 의해 손상될 수 있고, 이는 이어서 뇌의 중요한 항상성 기전에 영향을 미칠 수 있다. 질환 관련 SNP가 미세아교세포의 식세포작용 기능에 미치는 역할을 비교하기 위해 pHrodo 표지된 세균 에스. 아우레우스 및 아밀로이드 베타의 존재하에 질환 관련 미세아교세포(DAM)의 식세포작용 기능을 평가하였다. 상기 기능은 고처리량의 스크리닝 적용에 사용할 수 있다.
[00280] 이들 미세아교세포 발현된 질환 관련 유전자 중에서 골수성 세포 2(TREM2) 및 APO E 이소형에서 발현되는 유발 수용체를 암호화하는 유전자의 서열 변이체는 AD의 월등한 위험 증가와 관련이 있다. APOE는 뇌의 주요 콜레스테롤 캐리어이고, 지질 트래픽킹, 콜레스테롤 항상성 및 시냅스 안정성에 필수적인 역할을 수행한다. 항-ApoE 면역치료요법은 아밀로이드 축적과 침착을 억제하여 Aβ 응집 및 제거에서 ApoE의 역할을 추가로 뒷받침한다. ApoE 발현은 질환 관련 미세아교세포에서 유의적으로 상향 조절되는 것으로 나타났다. ApoE4/E4 이소형은 시험관 내에서 운동성과 삭세포작용을 상향 조절함에 의해 미세아교세포 생리학에 본질적으로 영향을 미치는 것으로 나타났다. ApoE4/E4 과발현은 다른 이소형과 대조적으로 A베타의 흡수를 감소시키는 것으로 나타났다. 신경변성에서 세 번째로 가장 흔한 주요 ApoE 이소형인 ApoE2의 역할은 가족성 AD에서 질환 발병을 지연시키는 것으로 나타났다. iPSC 유래 미세아교세포 기능에 대한 ApoE-이소형 특이적 영향은 현재까지 철저히 조사되지 않았다.
[00281] TREM2는 지질을 감지하고 미엘린 식세포작용을 매개한다. TREM2의 기능 상실(LOF) 변이체는 아밀로이드 플라크 씨딩 증가, 아밀로이드 클러스터링 감소, ApoE 촉발인자 신호 캐스케이드와의 추가적인 상호작용으로 인해 기능 장애가 있는 아밀로이드 플라크에서 미세아교세포 클러스터링 및 ApoE 축적을 감소시키는 것과 관련이 있는 것으로 나타났다.
[00282] 질환 관련 SNP가 미세아교세포의 식세포작용 기능에 미치는 역할을 비교하기 위해 세균 에스. 아우레우스 및 아밀로이드 베타의 존재하에 질환 관련 미세아교세포(DAM)의 식세포작용 기능을 평가하였다.
[00283] 동일한 맥락에서, ATP 결합 카세트 수송체 A7(ABCA7)은 게놈 전체 연관성 연구에서 후기 발병 알츠하이머 질환의 감수성 요인으로 동정되었다. ABCA7은 식세포작용을 매개하고 막 트래픽킹에 영향을 미치는 것으로 나타났다. ABCA7은 AD와 밀접한 관련이 있다. Abca7-/- 마우스에서는 아밀로이드-베타의 식세포작용 제거 능력이 손상된다. ABCA7의 G1527A 치환과 관련된 미스센스 변이체를 갖는 환자로부터 유래된 iPSC는 BCA7이 뇌의 A베타 항상성 조절에서 식세포작용 기능에 변화를 일으키는 역할을 한다는 것을 보여준다.
[00284] CD33은 미세아교세포의 식세포작용을 조절하여 알츠하이머 질환(AD) 감수성과 관련된 면역조절 수용체이다. TREM2는 CD33의 다운스트림에서 미세아교세포 생리 및 대사를 조절하는 데 상호작용하므로, WT 및 CD33 rs3865444 SNP를 발현하는 iPSC 유래된 미세아교세포를 사용하여 식세포작용 기능 손상과 관련된 CD33의 역할을 검증할 수 있다(문헌참조: Caldeira et al., 2017).
[00285] 냉동 보존된 AHN 및 DAM 미세아교세포를 해동하고 성숙화 배지에서 3일 동안 배양하고, pHrodo 아밀로이드 베타 및 pHrodo 에스. 아우레우스에 노출시켰다. 식세포작용의 동역학은 IncuCyte 생세포 분석 시스템을 사용하여 측정하였다. 기능적 반응을 정량화하기 위해 총 레드 물체 통합 강도를 사용하였다.
[00286] TREM2 R47H 미세아교세포와 ABCA7-G1527A 미세아교세포는 AHN 미세아교세포에 비해 세균 에스. 아우레우스에 대한 강력한 식세포작용 능력을 밝혔다. CD33(rs429358 SNP 보유) 미세아교세포는 AHN 미세아교세포와 비교하여 세균 에스. 아우레우스와 유사한 식세포작용 능력을 보이는 것으로 나타났다. TREM2 R47H 미세아교세포, ABCA7-G1527A 미세아교세포 및 CD33(rs429358 SNP 보유) 미세아교세포는 아밀로이드 베타의 존재하에 AHN 미세아교세포에 비해 식세포작용의 강도가 감소하는 것으로 나타났다.
[00287] CW13030EE1 APOE 4/4는 AHN 미세아교세포에 비해 에스. 아우레우스 및 아밀로이드 베타를 사용한 식세포작용의 강도가 더 높은 것으로 나타났다. CW13098AA1 APOE 4/4는 AHN 미세아교세포에 비해 에스. 아우레우스 및 아밀로이드 베타 둘다를 사용한 식세포작용의 강도가 더 낮은 것으로 나타났다. CW13005AA1 APOE 2/4 미세아교세포는 AHN 유래 미세아교세포에 비해 아밀로이드 베타에 대한 강력한 식세포작용 능력과 에스. 아우레우스에 대한 식세포작용이 감소한 것으로 나타났다. CW13074AA1 APOE 4/4 미세아교세포는 AHN 미세아교세포와 유사한 에스. 아우레우스에 대한 식세포작용 경향을 나타냈고, AHN 미세아교세포주에 대해서는 아밀로이드 베타에 대한 식세포작용이 약간 증진되는 것으로 나타났다.
[00288] 항상성, 염증 촉진성 및 항염증성 미세아교세포 서브타입을 표적화하는 유전학적 변화에 대한 포괄적인 이해는 새로운 생물학적 통찰력을 제공하고 신경변성 질환에 대한 면역조절 치료학적 접근법에 대한 표적 우선순위 지정을 용이하게 할 수 있다.
실시예 9- 미세아교세포의 추가 특징 분석
[00289] ATP 및 ADP와 같은 세포 외 뉴클레오타이드는 "퓨린성 신호 전달" 경로라고 하는 수용체 매개 경로를 유도하는 것으로 공지되어 있다. 조직 항상성, 상처 치유, 신경변성, 면역력, 염증 및 암과 같은 생리학적 공정은 퓨린성 신호 전달에 의해 조절된다. 세포 외 ATP와 P2 수용체는 미세아교세포 활성화 기전에 중요하다. P2X 수용체는 ATP 또는 이들의 유도체에 결합하는 이온성 수용체이다. P2Y 수용체 중 하나는 ADP에 응답하는 G-단백질 커플링된 수용체이다. 병리학적 조건하에서 ATP와 같은 뉴클레오타이드는 손상된 세포로부터 방출되거나 누출되어 '나를 찾아라' 또는 '나를 먹어라' 신호로 작용하여 미세아교세포의 공정 연장, 화학주성 및 식세포작용을 유발한다. P2 수용체 활성화는 또한 인터류킨-1b(IL-1b), 인터류킨-6(IL-6), 및 종양 괴사 인자 알파(TNFα)를 포함하는, 미세아교세포로부터 사이토킨 생성을 유도한다. 이러한 염증 촉진성 매개체는 성상세포에서 G 단백질 커플링된 수용체(GPCR)의 발현과 기능을 역학적으로 변화시키는 것으로 나타났다.
[00290] 미세아교세포의 퓨린성 수용체 반응을 특징 분석하였다. 미세아교세포를 미세아교세포 분화 배지에서 해동시키고, 200,000세포/웰의 세포 현탁액으로 재구성하였다. 384 웰 플레이트의 웰당 15μl의 미세아교세포 세포 현탁액을 첨가하였다. 세포를 다양한 용량(0-1000nM)의 BzATP와 ADP로 처리하였다. 또한 AZ11645373(P2X7 길항제)과 AZD1283(P2Y12 수용체의 강력한 길항제)의 존재하에 BzATP와 ADP에 대한 반응도 측정하였다. 모든 처리에 대해, 10 ul의 4X 스톡의 화합물 또는 억제제를 세포에 첨가하였다. 세포를 검정 전 30분 동안 억제제의 존재 또는 부재하에 화합물에 노출시켰다. FLPR 칼슘-6 한 병을 검정 완충액 B와 함께 11ml로 재구성하였고 화합물의 존재하에 세포 현탁액에 15μl의 염료 용액을 첨가하였다. 세포를 37°C에서 1.5시간 동안 항온처리하고 FDSS μCELL 시스템에서 이미지화를 수행하였다.
[00291] 도 44a는 모두 미량의 ATP/BzATP를 갖는 미세아교세포를 보여주고, 도 44b는 미량의 ATP/BzATP 샘플을 갖는 미세아교세포를 보여준다. 도 44c-f는 P2X7 길항제 AZ11645373의 존재하에 BzATP, ADP, BzATP에 대한 미세아교세포의 반응 및 P2X7 길항제 A438079의 존재하에 BzATP의 반응을 보여준다. 도 44g는 AZD1283의 존재하에 미세아교세포에서 기능적 ADP 의존적 반응을 입증하기 위한 용량 의존적 반응을 보여준다.
실시예 10- iPSC로부터 신경 전구 세포의 생성
[00292] 시험관내 질환 모델의 성공적인 개발은 환자 유래 iPSC로부터 유래된 대량의 말기 계통의 가용성에 의존한다. 신경 전구 세포(NPC)는 뉴런과 신경교를 생성하는 능력을 갖는 자가 재생 전구 세포이다(문헌참조: Breunig et al., 2011). 1차 신경 세포 및 iPSC로부터 NPC를 생성하기 위한 다양한 효율성을 갖는 확립된 프로토콜이 많이 있다(문헌참조: Shi et al., 2012a, Shi et al., 2012b). 최근 프로토콜의 대부분은 SMAD 신호 전달 경로의 억제에 의존한다. 본원은 이중 SMAD 억제 경로를 사용하지 않고 외배엽을 향한 iPSC의 자발적인 전환(drift)을 활용하여 상이한 iPSC 세포주에 걸쳐 NPC를 생성하는 간단한 프로토콜을 기재한다. 이러한 세포 유형을 생성하는 근거는 정상 및 질환 특이적 iPSC 세포로부터 유래된 디쉬에서 신경 계통, 미세아교세포, 내피세포, 혈관주위세포 및 성상세포 간의 복잡한 세포 간 상호작용과 사람의 뇌 발달을 모방하기 위한 장기적인 공동 배양 검정을 생성하기 위해 iPSC 유래된 미세아교세포와 쌍을 이루기 위한 것이다.
[00293] 본 연구에서는 MATRIGEL™, 라미닌 또는 비트로넥틴 코팅 플레이트와 E8 배지에서 여러 개의 에피솜적으로 재프로그램화된 iPSC 세포주를 유지하였다. 신경 전구 세포를 생성하기 위해 분화가 개시되기 전에 저산소증 조건하에서 iPSC를 유지하였다. 신경 전구체 분화를 개시하기 위해 iPSC를 수거하고 락(rock) 억제제의 존재하에 E8 배지를 사용하여 MATRIGELTM, 라미닌 또는 비트로넥틴 플레이트상에 15K/cm2로 씨딩하였다. 세포를 락(rock) 억제제의 부재하에 다음 48시간 동안 새로운 E8 배지에 놓았다. 다음 단계는 정상 산소 조건하에서 배지를 매일 변화시키면서 72시간 동안 3 μM CHIR이 보충된 DMEMF12 배지에 iPSC 배양물을 위치시킴을 포함하는 예비 컨디셔닝 단계를 포함하였다. 세포는 사전 컨디셔닝 단계의 종료시 채취하였고, MATRIGELTM, 라미닌 또는 비트로넥틴 플레이트상에서 30K/cm2의 2D 포맷으로 재분주하거나 락 억제제의 존재하에 ml 당 30만 세포의 밀도로 초저접착(ULA)(Ultra Low Attachment) 플레이트 또는 스피너 플라스크를 사용하여 3D 응집체를 생성하였다. 정상 산소 조건 하에서 다음 8일 동안 N2가 보충된 E6 배지를 격일로 배양물에 공급하였다. 분화 14일째에 배양물을 수거하고 TrypLE를 사용하여 개별화하였다. 세포는 유동 세포측정용 세포 표면 염색에 의해 Tra-162, CD56, CD15의 존재에 대해 및 유동 세포측정용 세포 내 염색에 의해 Sox1, 네스틴, β3 마이크로글로불린 및 Pax-6 발현의 존재에 대해 염색하였다. NPC 생성에 관여하는 상이한 단계는 도 45a에 명시되어 있다. 3개의 iPSC 세포주에 걸쳐 상이한 분화일에 NPC 마커의 출현은 도 45b에 요약되어 있다. CD56은 상기 방법에 의해 유래된 NPC에 대한 마커로 사용되었다. 세포를 CS10을 사용하여 냉동보존하였고, 이들은 해동 후 순도와 증식 가능성을 유지하였다. NPC를 다운스트림 분화 프로토콜에 위치시켜 성상세포 및 범 뉴런을 생성하였다.
[00294] 성상세포는 줄리아 등(Julia et al)에 의해 명시된 프로토콜에 따라 NPC로부터 분화시켰다. 14일 NPC 세포를 사이언스 세포 성상세포 배지에서 15k/cm 2로 MATRIGEL™ 코팅된 6 웰 플레이트상에 분주하였다. 상기 플레이트는 2일 마다 배지를 완전히 교체하였다. 6일 마다 또는 배양액이 ~90% 컨플루언트한 경우, Accumax를 사용하여 플레이트를 채취하고 15k/cm2에서 MATRIGEL™로 코팅된 6개 웰 플레이트상에 다시 분주하였다. 상기된 바와 같이 배양물을 공급하고 4회 계대를 위해 재분주하였다. 4회 계대 종료시에, 배양물을 표면 마커, CD44 및 글루타메이트 아스파르테이트 수송체(GLAST)와 세포 내 마커, 신경교 섬유소 산성 단백질(GFAP), 흥분성 아미노산 수송체 1(EAAT1), 글루타민 신테타제(GS), 아쿠아포린 4(AQP4) 및 S100 칼슘 결합 단백질 B(S100β)로 염색하였다(도 45c).
[00295] 슬로사렉 등(Slosarek et al)이 개발한 프로토콜을 사용하여 NPC에서 대뇌피질 글루타메이트성 뉴런을 생성하였고, 1 μM 사이클릭 AMP, 10 ng/ml 뇌 유래 신경성 인자(BDNF) 및 10 ng/ml 신경교 유래된 신경성 인자(GDNF)를 30일 동안 보충한 E6 배지에 14일 NPC를 분주하였다. 이어서 배지를 대뇌피질 신경 분화 배지(E6 배지, 1 μM 사이클릭 AMP, 10 ng/ml BDNF, 10 ng/ml GDNF, 100 ng/ml 인슐린 유사 성장 인자-I, 2% B27 보충물)로 변경하여 30일간 추가로 배양하였다(문헌참조: Brennand et al., 2011). 대뇌피질 글루타메이트성 뉴런은 14-36일 사이에 다른 iPSC 세포주에 대해 관찰되었다. 신경 배양물의 순도는 β3 튜불린, MAP2 발현의 존재에 대해 염색함에 의해 확인하였다.
실시예 11 - 뉴런, 미세아교세포 및 성상세포를 포함하는 삼배양물
[00296] 먼저 iCell 미세아교세포를 성숙화시킴에 의해 삼배양물을 설정하였다. 냉동 보존된 미세아교세포를 삼배양 전에 초저접착(ULA) 6 웰 플레이트에서 3일 동안 해동시켰다. 세포를 IL-34 (100 ng/mL; Peprotech / 200-34), TGFβ1 (50 ng/mL; R&D Systems / 240-B), M-CSF (25 ng/mL; Peprotech / 300-25), CD200 (100 ng/mL; Acro Biosystems / OX2-H5228) 및 프랙탈킨 (100 ng/mL; Peprotech / 300-31)을 함유하는 미세아교세포 성숙화 배지의 존재하에 위치시켰다.
[00297] 미세아교세포 성숙화 배지
[00298] OX-2 막 당단백질(OX-2)로도 알려진 CD200은 2개의 면역글로불린 도메인(1 Ig 유사 C2형(면역글로불린 유사) 도메인 및 Ig 유사 V형(면역글로불린 유사) 도메인)을 포함하는 1형 막 당단백질로서 면역글로불린 슈퍼패밀리에 속한다. CD200 / OX-2는 여러 세포 유형에서 광범위하게 발현된다. CD200은 주로 골수 세포에서 발현되는 구조적으로 관련된 수용체(CD200R)와 상호작용하고 대식세포 및 비만 세포 기능 조절에 관여한다. CD200은 또한 이식 거부 반응, 자가 면역 질환 및 자연 유산을 예방하는 데 중요한 역할을 한다.
[00299] 프랙탈킨은 CX3CR1 수용체를 통해 신호를 전달하는 CX3CL 케모킨이다. 프랙탈킨은 단핵구, 미세아교세포 및 NK 세포를 화학적으로 유인하는 것으로 나타났다. 프랙탈킨은 현재로서는 케모킨 도메인의 첫 번째와 두 번째 시스테인 잔기 사이에 3개의 아미노산 잔기를 포함하는 유일한 CXC3C 케모킨이다.
[00300] 해동 후 미세아교세포 삼배양물을 채취하고 세척하고 세포 펠렛을 삼배양물에 희석하여(표 6) 96 웰 플레이트의 7,500세포/70uL/웰을 수득하였다. 세포는 96웰 플레이트의 웰당 7,500세포의 밀도로 씨딩할 수 있다.
[00301] 표 6: 삼배양물 배지의 조성
[00302] 냉동 보존된 GABA 뉴런을 해동하고 다시 현탁시켜 삼배양물 배지에서 96웰 플레이트의 50,000세포/70uL/웰을 수득하였다. 뉴런은 96웰 플레이트의 웰당 50,000세포의 밀도로 씨딩할 수 있다. 유사하게, 냉동 보존된 성상세포를 해동하고 삼배양물 배지에서 96웰 플레이트의 8,000개 세포/70uL/웰을 수득하였다. 성상세포는 96웰 플레이트의 8,000개 세포/70uL/웰의 밀도로 씨딩할 수 있다.
[00303] 배양 설정 전날에, 관심 대상의 세포를 분주하기 전에 PEI/Geltrex 용액(0.07% 농도의 PEI 및 12~18 ng/mL 농도의 Geltrex)으로 코팅하고 세정하였다. 모든 세포 유형은 단일배양물, 이배양물 또는 삼배양물을 생성하기 위해 분주하였다. 분주 당일에, 미세아교세포 70uL, GABA 뉴런 70uL, iCell 성상세포 70uL를 각각 위에서 언급한 밀도로 조정하여 각각의 웰에 분주하였다. 평평한 표면에서 플레이트를 서서히 진탕시켜 세포를 확산시키고 37°C, 5% CO2에서 배양하였다. 세포에는 4일마다 플레이트로부터 삼배양물 배지를 절반씩 공급하였다. 뉴런, 성상세포, 미세아교세포의 단일배양물과 뉴런과 성상세포, 성상세포와 미세아교세포 또는 뉴런과 미세아교세포의 이배양물의 조합은 또한 동일한 밀도에서 생성하였다. 단일배양물, 이배양물, 삼배양물은 삼배양물 배지에서 및 14일 동안 세포 유형의 정확한 비율을 유지한 후 최종 단계 염색 또는 검정을 수행하였다. 상기 설정에 대한 개략적인 기재는 (도 66)에 기재되어 있다.
[00304] 14일 배양물을 24시간 동안 LPS로 자극하고 자극이 있는 배양물과 자극이 없는 배양물, 및 단일배양물과 이배양물 조합을 고정화하고 용액의 존재를 검출하기 위해 염색하고 범 신경 마커(1:1500; Millipore, 카탈로그: MAB2300), 항-Iba1(1:500; Wako Chemicals, 카탈로그: 019-19741), 항-GFAP(1:500; Abcam, 카탈로그: ab4674)를 사용하여 제조하였다. 단일배양물(도 50a), 이배양물(도 50b) 및 삼배양물(도 50c)의 이미지, 미세아교세포 인자(TGFβ, IL-34 및 MSCF)가 있거나 없는 삼배양물 배지에서의 이미지 콜라주를 나타내고(도 50d) 마지막으로 삼배양물의 고해상도 이미지를 나타낸다(도 50e). 모든 이미지는 ImageXpress 마이크로 공초점 고함량 이미지화 시스템(Molecular Devices)을 사용하여 캡처하였다. 삼배양물에서 생존하는 세포의 정량화는 후지필름 AI 기반 이미지 분석 소프트웨어에 의해 수행하였다(도 51a-51b)
[00305] 미세아교세포, 성상세포 및 뉴런의 삼배양물 시스템은 겉보기에 건강한 미세아교세포를 TREM2HZ 및 TREM2HO 미세아교세포로 대체하여 질환 관련된 차이에 대해 시험하였다. 단일배양물, 이배야물, 삼배양물 조합에 의해 방출되는 다양한 사이토킨과 케모킨의 비교 분석은 LPS 자극의 존재 및 부재하에 평가하였다. 실험 디자인의 개략도는 (도 52)에 도시된다.
[00306] 공동배양 시스템은 자극을 1 ug/mL LPS로 개시하기 전에 14일 동안 유지되었다. 자극은 24시간 동안 2중으로 수행하였다. 상등액을 회전 하강시켜 세포와 잔해를 제거한 후 즉시 -20°C에 위치시켰다. 상등액을 멀티플렉스 루미넥스 검정을 통해 3중으로 분석하였다.
[00307] 루미넥스 검정에 대한 결과는 도 53-56에 히트맵으로서 나타낸다. 반응성 성상세포(CX3CL1)와 비반응성 성상세포(FGF2)가 방출하는 사이토킨의 편집은 도 53에 요약되어 있다. 배지에서 방출되는 모든 M1 인자(TNF 알파, IL-6, CCL2, CCL3, CCL4, IL-1 베타, IL-12, IL-13, IL-8, 인터페론 감마, IL1-Alpham FAS 리간드, IL-2, GMCSF, 그랜자임 B, ICAM-1, CXCL11)의 편집은 도 54에 요약되어 있다. M2 (항-염증) 인자(IL-4, IL-10, IL-21, VEGF, CCL5, IL-17, IL1-RII, GCSG, CXCL5)의 편집은 도 55에 요약되어 있다. C3 보체 시스템의 방출은 도 56에 요약되어 있다.
[00308] 미세아교세포는 미세전극 어레이(MEA)상에서 신경망 활성에 영향을 미친다. 글루타 뉴런과 성상세포의 동조 파열 공동배양물(세포 비율 4:1 내지 6:1)은 B27, NSS, N2 및 라미닌이 보충된 BrainPhys 배지에서 2주 후에 확립되었다. 이후 2주차, 3주차, 4주차 또는 그 이후에 기존 배양물에 미세아교세포를 성상세포와 유사한 세포 수(0.25:1에서 1:1 범위의 MGL:ASC 비율)로 추가하면 신경망 파열 구조가 변경되어 MEA상에서 시각화 및 정량화되었다. 미세아교세포의 영향은 단기간 또는 장기간 지속될 수 있고 배지와 보충물에 의해 크게 영향을 받을 수 있으므로 신경망을 개선하기 위한 다양한 전략을 제공한다(도 57).
[00309] 미세아교세포, 성상세포 및 글루타뉴런의 3D 또는 2D 배양물은 비타민 A, 0.5mM 글루타맥스 N2 플러스 배지 보충물, 460μM 티오글리세롤, 1X 인슐린-트랜스페린-셀레늄, 5.4 μg/ml의 사람 인슐린 용액 10-25 ng/ml BDNF, 10-25 ng/ml GDNF, 1mM 크레아틴, 200 nM L-아스코르브산, 1 μg/ml 라미닌 또는 피브로넥틴, 5-15 ng/ml TGF- b, 100 ng/ml 사람 IL-34, 100 ng/ml 사람 M-CSF, 1.5μg/ml 콜레스테롤, 1 ng/ml 9 또는 11 에이코세노산, 100 ng/ml 올레산 또는 리놀렌산을 포함하는 B27이 보충된 BrainPhys ?琉ㅀ? 배지에서 배양될 수 있다.
[00310] 미세아교세포는 표준 조건하에서 단일 배양 시 다양한 기질(바이오입자, 아밀로이드 베타, Tau, 시냅토좀 등)의 강력한 식세포작용을 입증한다. 질환 모델링을 위한 iPSC 유래된 미세아교세포(TREM2 HZ 및 TREM2 HO 포함) 패널은 식세포작용 검정에서 다양한 특성과 동역학을 나타냈다. GABA- 또는 글루타뉴런과 성상세포를 사용하여 보다 복잡한 이배양물 및 삼배양물의 생성은 증진된 식세포작용 활성을 초래하였다(도 58). 상기 플랫폼 접근법은 미세아교세포 생물학, 표현형 및 기능에 대한 TREM2 변이체의 다양한 기전을 조사하는 데 사용할 수 있다.
[00311] 성상세포, 미세아교세포 및 글루타 뉴런으로 3D 삼배양물 회전 타원체(spheroid)를 형성하여 미세아교세포와 성상세포가 신경세포 MEA 기능에 미치는 역할을 연구하였다. 냉동 보존된 미세아교세포, 성상세포 및 글루타 뉴런을 IL-34 및 MCSF가 보충된 NB 완전 배지(NB+글루타맥스+B27-VitA+NSS)에 해동시켰다. 3개의 세포 유형 간의 광범위한 비율을 시험하였고, 도 59에 나타낸 대표적 이미지는 5k:5k:30k(미세아교세포: 성상세포: 글루타뉴런)의 비율을 사용하여 생성되었다. 회전 타원체는 NB 완전 배지에 IL-34 및 MCSF를 첨가한 S-Bio V 바닥 96웰 플레이트에서 형성되었다. 48시간 후 배지를 Brainphys 완전 배지(Brainphys+N2+B27-vitA+NSS )로 전환하여 2주 동안 배양물을 유지하였다.
[00312] 칼슘 과도 현상의 기능적 평가는 3개의 세포 유형이 모두 존재하는 7일차와 15일차에 삼배양물 회전 타원체에서 수행되었다. 칼슘 과도 현상은 EarlyTox 칼슘 염료(Molecular Devices)를 사용하여 측정하고 CLARIOstar 기구상에서 기록하였다. 어셈블리 후 7일과 같이 조기에 삼배양물 회전 타원체에서 강력한 자발적 칼슘 진동을 검출하여 도 60에 나타낸 바와 같이 완전히 기능적 신경망의 존재를 알 수 있었다. 칼슘 진동은 칼슘 농도의 전압으로 인해 방출을 변화시키는 형광 염료에 의해 검출될 수 있다. 이를 검출할 수 있는 기구는 FDSS, 플리퍼 또는 시간 경과 공초점 이미지화이다.
실시예 12- 냉동 보존된 BMEC, 혈관주위세포 및 성상세포를 사용하여 혈뇌 장벽 모델 설정
[00313] 혈뇌 장벽(BBB) 모델은 냉동 보존된 iPSC 유래 BMEC, 혈관주위세포 및 성상세포를 사용하여 생성하였다. 모든 3개의 세포 유형의 특정 비율로 샌드위치 BBB를 설정하는데 관여하는 순차적 단계는 도 61에 도시되어 있다. 설정에 대한 세부 사항은 다음과 같이 기재된다: 트랜스웰의 정단부(혈액 측면)를 콜라겐-IV(200-400 μg/mL)/피브로넥틴(50-100 μg/mL)으로 코팅하고 4°C에서 밤새 방치하거나 37°C에서 4시간 동안 항온처리하였다. 뚜껑이 있는 플레이트 전체를 뒤집어 트랜스웰을 방해하지 않고 플레이트 바닥을 제거하였다. 역전된 트랜스웰의 기저측면(뇌 측면)을 0.1% 겔라틴을 사용하여 실온에서 30-60분 동안 코팅하였다. 스페이서를 사용하여 플레이트의 바닥을 다시 원위치시켜 코팅된 트랜스웰의 기저측면이 방해받지 않도록 하였다. 트랜스웰은 정단부와 기저측면 코팅 측면의 증발을 감소시키기 위해 덮개를 씌웠다. 성상세포와 혈관주위세포를 10% FBS를 함유한 IMDM 배지에 해동시키고 600g에서 8분간 회전시켰다. 이어서 세포를 계수하고 Y-27632를 함유한 성상세포:혈관주위세포 배지(A:P 배지)에서 1:2 비율로 조합하였다(표 7). 성상세포는 333,333 세포/cm2으로 분주하고, 혈관주위세포는 666,666 세포/cm2로 분주하였다. 0.1% 겔라틴을 트랜스웰의 역위된 기저측면으로부터 제거하고 조합된 세포 현탁액을 트랜스웰당 100-170 μL로 트랜스웰의 역위된 기저측면상에 분주하였다. 플레이트의 바닥을 역위된 트랜스웰 상에 스페이서 위에 원위치시켜 플레이트를 4시간 동안 정상산소 대기(5% O2)에서 항온처리하였다. 다음으로 플레이트를 BSC에 넣고 플레이트의 바닥과 스페이서를 제거한다. 이어서 플레이트의 바닥을 돌려놓고 플레이트를 원래 배향으로 뒤집었다. 콜라겐/피브로넥틴을 트랜스웰의 정단 측면으로부터 제거하고 각 웰에 300μL를 트랜스웰의 정단 측면에 첨가하고, 1mL을 A:P 배지의 웰에 첨가하였다. 이어서 플레이트를 37°C의 정상산소 대기에서 밤새 항온처리하였다. BMEC를 해동하여 EFRA2 + Y-27632에 1:1 비율로 위치시켰다. 트랜스웰의 정단 측면에서 A:P 배지를 제거하고 300 μL EFRA2 + Y-27632에 BMEC를 1.3 X 106/cm2로 트랜스웰의 정단 측면상에 씨딩하였다. 웰의 배지를 흡인하고 1mL의 EFRA2 + Y-27632를 첨가하였다. 플레이트를 37°C에서 정상산소 대기에 위치시켰다.
[00314] 도 62는 3~8일째에 해동하고 FN/ColIV 코팅된 코닝 트랜스웰 삽입체상에 해동 후 1.3 x106 세포/cm2로 BMEC 배지에 분주한 냉동 보존 BMEC의 TEER 기능을 도시한다. 도 63은 냉동보존된 BMEC 및 혈관주위세포의 TEER 기능을 도시한다. 도 64는 냉동 보존된 BMEC와 성상세포의 TEER 기능을 도시하고, 마지막으로 도 65는 냉동 보존된 BMEC, 혈관주위세포 및 성상세포의 TEER 기능을 도시한다. 삼배양물을 설정하는 데 사용되는 모든 세포 유형의 비율은 표 8에 기재한다.
[00315] 표 7. 성상세포:혈관주위세포 배지 및 EFRA2 배지 조성.
[00316] 표 8. 혈뇌 장벽을 설정하기 위한 세포 비율.
실시예 13 - 미세아교세포에서 TREM2의 역할 특징 분석
[00317] AD 내 GWAS로 AD 위험의 주요 조절 인자로서 TREM2를 동정하였다. TREM2의 이형접합 돌연변이는 AD 위험을 증가시키는 반면 동형접합 돌연변이는 Nasu-Hakola 질환으로 공지된 신경학적 병태를 유도한다. 따라서 각각의 경우 CNS가 영향을 받지만, 이형접합 돌연변이와 동형접합 돌연변이의 병태생리와 임상 증상은 뚜렷이 구분된다. AD 위험에 대한 TREM2 돌연변이의 역할을 보다 잘 이해하기 위해 이형접합성 TREM2 기능 상실 미세아교세포를 생성하였다. TREM2 미세아교세포의 부분적 손실에 대한 검증은 이형접합 TREM2 KO 미세아교세포가 AD 위험을 증가시키는 TREM2 돌연변이의 유전으로 인해 발생하는 표현형을 더 잘 모델링한다는 개념을 뒷받침하는 HetTREM2 KO 고유의 경로를 동정하였다.
[00318] AD에 대한 약물 투여 가능한 경로를 동정하기 위한 이형접합성 TREM2 LOF 미세아교세포의 용도. TREM2의 이형접합성 돌연변이는 AD를 유발하지만 동형접합성은 Nasu-Hakola 질환을 유도한다. AHN 동질유전자 미세아교세포와 비교하여 HZ 및 HO TREM2 KO 세포주를 조사한 결과, TREM2 기능의 부분적 상실로 인해 변경된 독특한 경로가 동정되었는데, 이는 TREM2 기능 미세아교세포 돌연변이체의 완전한 상실에서는 덜 분명하거나 나타나지 않았다. 예를 들어, 콜레스테롤 생합성의 마스터 전사 조절 인자인 SREBF2의 유전자 발현은 콜레스테롤 생합성 효소 유전자의 동반 감소와 함께 유의적으로 감소하여 TREM2 기능의 부분적이지만 완전한 상실로 인해 콜레스테롤 합성의 하향 조절을 시사한다(도 67). 또한, HZ TREM2의 표현형은 지방산 대사/이화작용의 재프로그래밍을 동정하여 TREM2 신호 전달이 미세아교세포에서 지질 항상성을 조절하는 데 필수적인 역할을 한다는 것을 지적한다. 따라서 AD 및 기타 신경 질환에서 미세아교세포 기능과 항상성을 회복하는 새로운 치료 표적으로 작용할 수 있는 TREM2 부분적 기능 상실의 맥락에서만 독특한 경로가 밝혀졌다.
[00319] 간 기능, 폐 기능, 시력 상실을 개선하고 죽상 경화증을 감소시키기 위한 이형접합성 TREM2 기능 상실을 통해 동정된 경로의 표적화. TREM2가 다른 조직 상주 대식세포(폐포 대식세포, 쿠퍼 세포, 망막하 미세아교세포)에서도 발현된다는 점을 고려할 때, hetTREM2 KO의 생성은 TREM2 신호 전달이 지질 항상성을 조절하고, TREM2가 만성 질환의 병인론에 중요한 역할을 하는 다른 조직 상주 대식세포의 지질 기능부전을 회복하는 치료학적 표적으로 작용할 수 있음을 동정하였다.
[00320] 콜레스테롤 생합성을 하향 조절하지 않고 인터페론 신호 전달을 증진시키기 위한 TREM2 기능의 표적화. 추가로, 인터페론 시그니처를 동정하였다. 최근 연구는 인터페론 신호 전달과 콜레스테롤 생합성 간의 연관성을 밝혔다. 따라서 인터페론 축은 조직 상주 대식세포의 맥락에서 콜레스테롤 생합성을 조절하여 항상성 기능을 회복하기 위해 표적화될 수 있다.
[00321] TREM2를 통한 Gas6-Axl 축의 표적화. HZ 및 HO TREM2 미세아교세포를 검사한 결과, Gas6/Axl 축의 유전자 발현에 대한 용량 반응이 동정되었다(도 68). Axl 신호전달 축은 AD 및 기타 신경학적 질환에서 신경변성 캐스케이드에 반응하는데 역할을 하는 질환 관련 미세아교세포와 관련이 있다(문헌참조: Krasemann et al., 2018). 따라서 TREM2 활성화는 Gas6/Axl 신호전달 증진시키고 DAM 표현형을 증진시킨다. 그러나 Gas6/Axl 경로는 또한 종양 미세 환경에서 면역 억제 환경을 지원하는 역할도 한다. 따라서 TREM2를 길항하고 Gas6/Axl을 하향 조절하면 면역 세포 동원을 증진시킬 수 있다(문헌참조: Tanaka and Siemann, 2020).
[00322] TREM2를 통한 Siglec-11의 활성화는 신경보호성이다. HZ TREM2 미세아교세포를 사용하여 부분적이지만 완전하지 않은 TREM2 상실에 영향을 받는 특정 유전자로서 미세아교세포 신경독성을 방지하는 CD33 관련 단백질인 Siglec 11의 하향 조절을 동정하였다(문헌참조: Wang and Neumann, 2010)(그림 69). TREM2-Siglec11 축은 HZ TREM2 미세아교세포에서만 명백하게 나타났다. 따라서 TREM2의 활성화는 미세아교세포 Siglec-11의 상향 조절을 통한 신경보호성일 수 있다.
[00323] FTD에서 GRN 기능을 복원하기 위한 TREM2를 표적화. HZ 및 HO LOF 미세아교세포는 TREM2 신호 전달의 상실로 인한 GRN의 하향 조절을 입증하였다(도 70). 따라서 TREM2의 활성화는 GRN 수준을 증진시킬 수 있고 FTD에서 GRN 기능 상실 표현형을 복원할 수 있다.
[00324] 이온 채널에 대한 TREM2의 효과. TREM2HZ 및 TREM2HO에 의한 감마 아미노부티르산 수용체 서브유닛 엡실론(GABRE)의 용량 의존적 증가는 미세아교세포를 활성화하여 인터류킨-6 및 인터류킨-12p40을 방출할 수 있다.
[00325] TREM2에 의한 시스테인-루프 슈퍼패밀리의 리간드 게이팅된 이온 채널의 아연 활성화 리간드 게이팅된 이온 채널의 증진된 발현은 신경염증에 대한 관련 기능 모델을 생성하는 데 있어 TREM2와 이온 채널의 발현 사이의 직접적인 연관성을 암시한다.
[00326] G-단백질 커플링된 수용체(GPCR)는 중추신경계(CNS) 장애에 대한 새로운 치료제를 개발하기 위해 가장 자주 표적화되는 수용체 중 하나이다. 특히 현재 내인성 리간드나 명확하게 한정된 기능이 알려지지 않은 100개의 오펀(orphan) GPCR의 경우 GPOCR에 대한 새로운 기능이 발견됨에 따라 GPCR을 표적화하는 약물의 수가 증가할 것으로 예상된다.
[00327] TREM2가 결핍된 미세아교세포는 이들의 대사에 전반적인 변화를 진행하여, 그 결과 ATP 수준은 감소하고 스트레스와 사멸의 징후를 나타낸다. 오늘날 많은 약제의 퍼센트가 GPCR을 표적화하고 TREM2가 많은 GPCR의 변화를 유도한다는 점을 고려하면 TREM2가 미세아교세포 생존 및 기능의 조절인자일 뿐만 아니라 리간드일 수 있음을 시사한다. GPCR은 약물 표적화 응용 분야에 사용될 수 있는 TREM2에 의해 조절되는 것으로 밝혀졌다. TREM2 발현의 교란은 ADGRD1, ADGRE3, ADGRE5, ADGRG1, ADGRG3, ADORA2B, ADRB1, ADRB2, C5AR1, C5AR2, CCR2, CXCR2, CXCR4, EDNRA, FPR3, FZD1, GPBAR1, GPR157, LTB4R, LTB4R2, P2RX1, P2RY1, P2RY12, PTGER4 및 SUCNR1을 하향조절하였다. TREM2 발현은 AVPR2, CNR2, GPR18, GPR84 및 LPAR6의 발현을 하향 조절하였다.
[00328] TREM2의 하향 조절은 높은 칼슘 투과성을 가진 리간드 게이팅된 이온 채널로 기능하는 P2XRX1, P2RY12 및 P2RY10의 발현의 용량 의존적 감소를 초래하였다. TREM2에 의해 구동된 P2RX 및 P2RY 수준의 감소는 칼슘 신호전달에 의해 조절되는 세포 부착 및 축삭 유도와 같이 사람 미세아교세포의 노화와 관련된 변화에서 TREM2의 역할을 뒷받침한다.
[00329] 수송 단백질에 대한 TREM2의 효과. ATP 결합 카세트(ABC) 수송체는 막 결합 단백질로, 흔히 농도 구배에 대한 ATP 가수분해에 의한 에너지를 소모하면서 세포막을 가로질러 내인성 및 이종성 생체 용질을 능동적으로 이동시킨다. ABC 수송체는 Aβ 단백질의 생산, 분해 및 제거 공정에서 단백질로서 발견되었다. 특정 수송 단백질은 대사와 식세포작용 기능을 조절하고 DAM(질환 관련 미세아교세포)을 생성하는 역할을 하는 TREM2에 의해 조절되는 것으로 밝혀졌다.
[00330] TP6ViG2는 진핵세포의 세포 내 구획의 산성화를 매개하여 흡수 및 분류 기능을 수행하는 다중 서브유닛 효소이다. TREM2 HZ 및 TREM2 HO 세포주에 의한 ATP6ViG2의 하향 조절은 단백질 분류, 자이모겐 활성화, 수용체 매개 세포내이입 및 시냅스 소포 양성자 농도 구배 생성에 대한 TREM2의 역할을 뒷받침한다.
[00331] ATP8A1은 다양한 막의 외부에서 내부로 아미노인지질을 수송하는 것과 커플링된 ATP의 가수분해를 촉매하고 인지질의 비대칭 분포의 유지를 보장한다. TREM2 HZ 및 TREM2 HO 세포주에서 ATP8A1의 하향 조절은 미세아교세포 기능의 대사와 이동에 대한 TREM2의 역할을 뒷받침한다.
[00332] 막 수송 단백질의 용질 캐리어(SLC) 그룹은 세포막에 위치한 66개의 계열로 구성된 400개 이상의 구성원을 포함한다. SLC 수송체는 뉴런과 신경교세포에 필수 영양소와 삼투액을 공급하는 역할 외에도 아미노산 신경전달물질의 시냅스 전달을 종결하는 역할을 수행한다. TREM2의 교란에 의해 영향받는 것으로 밝혀진 SLC 계열 구성원은 ABCA3, ABCA7, ABCG1, ATP10A, ATP13A1, ATP13A2, ATP2A3, ATP6V1E2, ATP8A1, EPB41, SLC10A3, SLC15A3, SLC16A1, SLC16A3, SLC18A2, SLC19A1, SLC22A23, SLC25A1, SLC25A23, SLC25A4, SLC25A45, SLC26A11, SLC29A2, SLC29A3, SLC2A1, SLC2A5, SLC37A1, SLC37A2, SLC38A1, SLC38A5, SLC40A1, SLC41A2, SLC43A3, SLC44A2, SLC45A3, SLC47A1, SLC6A12, SLC6A8, SLC7A1, SLC7A5, SLCO4C1, 및 SPNS3을 포함한다. TREM2의 교란은 또한 수송체 SLC11A1, ABCC5, SLC25A20, SLC35E3, ABCA1, SLC25A27,SLC15A2 및 SLC25A42의 발현을 상향조절하였다.
[00333] 이들 수송된 단백질 중 다수는 pH를 조절하고 세포 내 구획을 산성화하며 모노카복실레이트 수송을 촉진하고 약제, 독소, 호르몬의 수송을 증진시키며 미토콘드리아의 투과성을 증가시킨다. 상기 데이터는 생리학적 및 생존 기능을 형성하는 미세아교세포에 대한 다양한 수송체의 발현을 확인시켜 준다. TREM2가 수송체의 서브세트를 하향 조절하거나 상향 조절하는 데 미치는 TREM2의 효과는 생존, 식세포작용 기능 및 신경변성 질환 발병에서 이들의 협력적인 역할을 밝힌다.
[00334] TREM 2는 신경 염증의 발병을 조절하는 많은 주요 단백질의 발현을 하향 조절하였다. TREM2는 ACVR1B, ACVRL1.AXL.CIITA CSF2RBCSF3R, EPHB6, IL11RA, IL17RA, IL21R, IL27RA, IL6R, IL6ST, IL7R, ITGAM, ITGAX, ITGB3, LMTK3, NLRP1, TLR3, TLR5, TNFRSF11A, TNFRSF12A, TNFRSF21, TNFRSF25, 및 TNFRSF9를 하향조절하였다. TREM2의 하향 조절은 IL21R, ITGA2B, ITGA7, RYK, TLR2, TNFRSF10C 및 FAS의 발현을 증진시켰다. 많은 이들 분자는 신경 변성을 검출하기 위한 진단 키트에 사용될 수 있다.
[00335] TREM2는 미세아교세포에서 발현되는 하기의 효소의 발현을 하향조절하였다: LIPG, INPP5A, PADI4, GRK5. PCSK5, NEK2, ACE, PTK2, TSSK6, MMP19, SMPD3, PDE3B, PDE6G PRSS8, TPSAB1, PRKACB, DAGLA, QPCT, CDK14, ACE2, CPA3, NT5M, PIK3R6, RPS6KA5, PCSK4, TTK, HDC, CAMKK1, INPP1, MAPK12, LPIN1, IRAK2, PLK2, PDE6B, NAT8L, PROC, SPHK1, HPGD, CIT, INPP5E, CDK18, PTGS2,CASK, PLK1, FAAH,BCR, HDAC4, DMPK, ITPKB, ADA, CES1, MVK, TESK2, PIK3CA,TGM2, CFD, BUB1B, DPEP2, ENPP2, CYP27A1, ULK2, PIK3CB. SQLEKMT5C, AURKB, MAPK13, MAP3K12, TOP2A, PKMYT1, HMGCS1, ACAT2, DNMT3A, RRM2, CYP51A1, MGLL, KMT5A, BACE1, PIK3CG, TRIB1. PIK3R2, FASN, MMP2, ADCK2, LSS, GRK6, HMGCR, SRC, ACSS2, STK38L, FGR, IDI1, KDM5C, ABHD2, KSR1, LTC4S, FURIN, MVD, PRKAR2A, RPS6KA4, DAPK1, MPST, FDFT1, ADAM10, DDAH2, LGMN, PKN1, FDPS, SGK1, GAA, CPM, ALDH2, ASAH1, 및 CTSD.
[00336] TREM2는 미세아교세포에서 발현되는 하기의 효소의 발현을 상향조절하였다: MMP9, CASP5, LIMK2, PLA2G4C, RAB27A, CFB, CYP2R1, CTSK, NUDT7, PRKY, ANPEP, SMPDL3A, PLA2G4B, STK32B, 및 PDK4.
[00337] TREM2는 미세아교세포에서 발현되는 하기의 단백질의 발현을 하향조절하였다: BCL2, BIRC5, BIRC7, BRPF3, CD1D, CD22, CD276, CD37, CD6, CD74, CRY1, EPAS1, FABP3, FCGR3A, FCMR, HSPA1B, ILDR2, KIF11, LILRA4, NOTCH4, RBP1, RBP4, RBP7, RGS1, RGS2, RGS3, TACSTD2, TUBA1A 및 XIAP. TREM2는 미세아교세포에서 발현되는 하기의 단백질의 발현을 상향조절하였다: CD14, CD36, CD80, CLEC4E, FCER1G, LAG3, LY96, PVRIG, RBP5, 및 SLAMF7. 본 연구는 COMT, NRXN2 및 SST 발현의 하향 조절과 관련된 TREM2의 교란/하향 조절 사이의 직접적인 연관성을 처음으로 보여준다.
[00338] COMT 유전자는 성격, 계획, 행동 억제, 추상적 사고, 감정, 작업(단기) 기억을 조절하는 카테콜-O-메틸 트랜스퍼라제라는 효소를 암호화한다. COMT는 O-메틸화를 촉매하여 카테콜아민 신경전달물질, 카테콜 호르몬을 비활성화하고 L-DOPA, 알파-메틸 DOPA 및 이소프로테레놀과 같은 신경 활성 약물의 생물학적 반감기를 단축시킨다. 산발성 AD의 COMT 수준은 매우 다양하다. AD에 대한 BDNF, COMT 및 APOE의 여러 위험 대립유전자의 축적에 기반한 유전학적 위험 스코어는 AD에서 후기 인지 장애를 예측하는 데 사용되었다(문헌참조: Wollam et al., 2015). NRXN2는 세포 접착 분자 및 수용체로서 기능하는 누렉신 계열에 속한다. 마우스에서 NRXN2의 결실은 자폐증 관련 행동을 유도한다. 소마토스타틴(SST) 호르몬은 CNS에서 신경 전달과 세포의 증식 속도를 제어한다.
[00339] TREM2HZ 미세아교세포는 COMT, NRXN2 및 SST 외에도 레틴알데하이드로부터 레티노산(RA)의 합성을 촉매하는 알데하이드 데하이드로게나제(ALDH1A2)를 추가로 하향 조절하였다. 호메오박스 3(HOXB3)은 발달에 관여하는 호메오박스 DNA 결합 도메인을 가진 핵 단백질이다. 공간 학습, 기억 및 정보 처리와 같은 고수준의 인지 작용을 조절하기 위해 신경세포 가소성을 조절하는 인슐린 유사 성장 인자 결합 단백질 2(IGFBP2)와 엘라스틴, 피브로넥틴, 라미닌, 비트로넥틴, 콜라겐 유형 I, III, IV를 분해하고 이동을 촉진하는 세린 프로테아제인 프로테이나제 3(PRTN3)이 그 예시이다.
[00340] TREM2HO 미세아교세포는 COMT, NRXN2 및 SST 외에도 통합 막 단백질을 기본 스펙트린-액틴 세포 골격에 연결하고 세포 운동성, 활성화, 증식 및 특수 막 모메인의 유지와 같은 활성에 중요한 역할을 하는 안키린(ANK1)을 추가로 하향 조절하였다. ANKI는 인터페론 신호전달 경로와 상호 작용한다. 임신 상향 조절된 비유비쿼터스 CaM 키나제(PNCK)는 칼모둘린 키나제 계열의 고유 구성원이다. PNCK는 주로 중추신경계에서 발현된다. 이것은 CREB1과 SYN1/시냅신을 인산화하고 미세아교세포를 활성화시키는 신호전달 경로를 촉발한다. CaMKII는 AD에서 조절 불능이고 이러한 조절 불능은 시냅스 변성, NFT 형성 및 기억력 결핍의 주요 원인이다. TREM2에 의한 PNCK의 하향 조절은 미세아교세포 증식 및 활성화에서 PNCK의 역할을 시사한다. 하향 조절되는 다른 유전자는 GFP와 뉴클레오타이드에 결합하는 튜불린 베타-4a 쇄(TUBB4), 멸균 알파 모티브 도메인 함유 11(SAMD11) 및 B9 도메인 함유 단백질(B9D1)을 포함한다. 이들 유전자는 미세아교세포의 세포 접착, 증식, 이동 기능을 한다. 나열된 유전자의 하향 조절은 TREM2와 함께 AD 발병의 기여 인자일 수 있다.
* * *
[00341] 본원에 개시되고 청구된 모든 방법들은 본 명세서의 내용을 고려하여 과도한 실험없이 만들어 수행할 수 있다. 본 발명의 조성물 및 방법은 바람직한 구현예의 관점에서 기술되었지만, 본 발명의 당업계의 개념, 의미 및 범위를 벗어나지 않으면서 다양한 변화들을 본원에 기술된 방법들, 상기 방법의 단계들 또는 상기 방법 단계들의 순서에 적용할 수 있다는 사실은 당업계의 숙련자들에게는 명백할 것이다. 보다 구체적으로, 화학적 및 생리학적으로 모두 관련되어 있는 특정 제제의 경우 이들을 사용하여도 동일하거나 유사한 결과가 달성된다면 본원에 기술된 제제를 대체할 수 있음도 명백할 것이다. 당업계의 숙련자들에게 명백한 이러한 모든 유사한 대체물 및 변형은 첨부된 특허청구범위에 정의된 본 발명의 의미, 범위 및 개념에 속하는 것으로 간주된다.
참고문헌
하기의 참고문헌은 이들이 예시적인 절차 또는 본원에 제시된 것들에 보충적인 기타 세부사항을 제공하는 정도로 구체적으로 본원에 참조로 인용된다.

Claims (94)

  1. 배지에 유도된 만능 줄기 세포(iPSC) 유래 미세아교세포, 성상세포 및/또는 뉴런을 포함하는 세포 배양물.
  2. 제1항에 있어서, 상기 배양물이 iPSC 유래된 미세아교세포, 성상세포 및 뉴런을 포함하는, 배양물.
  3. 제1항에 있어서, 상기 세포 배양물이 삼배양물로서 추가로 한정되는, 배양물.
  4. 제1항에 있어서, 상기 뉴런이 흥분성 뉴런 또는 억제성 뉴런인, 배양물.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 뉴런이 가바성(gabaergic) 뉴런, 도파민성(dopaminergic) 뉴런 또는 글루타메이트성(glutamatergic) 뉴런인, 배양물.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 미세아교세포가 동질유전자적으로 가공된 iPSC 세포주로부터 유래된, 배양물.
  7. 제6항에 있어서, 상기 미세아교세포가 TREM2, P2RY12, TMEM119, IBA-1, 및/또는 CX3CR1에 대해 적어도 90% 양성인, 배양물.
  8. 제7항에 있어서, 상기 미세아교세포가 성숙한 미세아교세포인, 배양물.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 성상세포가 S100 베타, GFAP, 및 CD44에 대해 양성인, 배양물.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 뉴런이 SCL1, BCL11B, Calb2, CD24, CDH1, CUX1 Cux2, DCX, DLG4, Dlx, Dlx2, Emx1, Emx2, eomes, ETV1, FOXG1, FOXP2, Fut4, GABRA2, GAD1, GAD2, GAPDH, GFAP, GRIN2B, HoxB4, HTR2C, ISL1, ITGB1, LHX2, Neurog1, NKX2-1, Nos1, NPY, NR4A2, PAX6, POU3F2, PVALB, RELN, SATB2, SLC17A6, SLC17A7, SLC17A8, SLC32A1, SOX1, Sox10, SST, SYN1, 및 Tbr1로 이루어진 그룹으로부터 선택된 적어도 2개의 마커에 대해 양성인, 배양물.
  11. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 미세아교세포가 질환 관련 SNP를 발현하는 공여자로부터 유래된, 배양물.
  12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 미세아교세포가 TREM2, APOE, CD33, BIN, ABCA7, SNPS 또는 신경변성과 관련된 유전자형을 갖는 질환 관련된 iPSC 공여자로부터 생성되는, 배양물.
  13. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 미세아교세포가 TREM2, 메틸-CpG 결합 단백질 2(MeCP2) 및/또는 알파-시누클레인(SCNA)내의 장애를 포함하는, 배양물.
  14. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 미세아교세포가 TREM2내의 장애를 포함하는, 배양물.
  15. 제14항에 있어서, TREM2내의 장애가 TREM2의 엑손 2에서 아미노산 58에서 TAL 뉴클레아제 매개 장애를 포함하는, 배양물.
  16. 제14항에 있어서, 상기 미세아교세포가 TREM2의 이형접합성 장애를 포함하는, 배양물.
  17. 제14항에 있어서, 상기 미세아교세포가 TREM2의 동형접합성 장애를 포함하는, 배양물.
  18. 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포 배양물이 2차원(2D) 배양물인, 배양물.
  19. 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 배지가 IL-34 및 M-CSF 또는 이들의 유사체 또는 모방체를 추가로 포함하는, 배양물.
  20. 제1항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 배지가 100 ng/mL의 농도로 IL-34 및 25 ng/mL의 농도로 M-CSF를 추가로 포함하는, 배양물.
  21. 제1항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 배지가 TGFβ 또는 이의 유사체 또는 모방체를 추가로 포함하는, 배양물.
  22. 제1항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 배지가 50 ng/mL의 농도로 TGFβ를 존재하는, 배양물.
  23. 제1항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포가 세포 표면상에서 배양되는, 배양물.
  24. 제1항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포가 폴리에틸렌이민으로 코팅된 표면상에서 배양되는, 배양물.
  25. 제1항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포가 세포외 매트릭스 단백질로 코팅된 표면상에서 배양되는, 배양물.
  26. 제26항에 있어서, 상기 세포외 매트릭스가 뮤린 Engelbreth-Holm-Swarm 종양으로부터 정제된 기저막 추출물(BME)인, 배양물.
  27. 제25항에 있어서, 상기 세포외 매트릭스 단백질이 MATRIGEL®, GELTREX™, 콜라겐 또는 라미닌인, 배양물.
  28. 제25항 또는 제26항에 있어서, 상기 세포외 매트릭스 단백질이 GELTREX™인, 배양물.
  29. 제25항 또는 제26항에 있어서, 상기 세포외 매트릭스 단백질이 라미닌인, 배양물.
  30. 제1항 내지 제28항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포 배양물이 3차원(3D) 배양물인, 배양물.
  31. 제29항에 있어서, 상기 3D 배양물이 뇌 오가노이드 배양물인, 배양물.
  32. 제30항 또는 제31항에 있어서, 상기 3D 배양물이 기능적 신경망을 포함하는, 배양물.
  33. 제32항에 있어서, 상기 기능적 신경망이 칼슘 진동(calcium oscillation)을 포함하는, 배양물.
  34. 제1항 내지 제33항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 미세아교세포, 성상세포 및 뉴런이 동질유전자성인, 배양물.
  35. 제1항 내지 제34항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 배양물이 미세아교세포와 성상세포를 1:1의 비율로 포함하는, 배양물.
  36. 제1항 내지 제34항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 배양물이 미세아교세포, 성상세포 및 뉴런을 1:1:5의 비율로 포함하는, 배양물.
  37. 제1항 내지 제36항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 배양물이 15,000개의 세포/cm2 내지 25,000개의 세포/cm2의 세포 밀도로 미세아교세포를 포함하는, 배양물.
  38. 제1항 내지 제36항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 배양물이 125,000개의 세포/cm2 내지 160,000개의 세포/cm2의 세포 밀도로 뉴런을 포함하는, 배양물.
  39. 제1항 내지 제36항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 배양물이 25,000개의 세포/cm2 내지 35,000개의 세포/cm2의 세포 밀도로 성상세포를 포함하는, 배양물.
  40. 제1항 내지 제36항 중 어느 한 항에 있어서, 미세아교세포, 성상세포 및 뉴런이 적어도 14일 동안 배양물에 중에 있는, 배양물.
  41. 제40항에 있어서, 상기 미세아교세포, 성상세포 및 뉴런이 2:6:1의 비율로 존재하는, 배양물.
  42. 제1항 내지 제40항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 iPSC가 사람인, 배양물.
  43. 제1항 내지 제42항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 배양물이 제노(xeno) 무함유, 피더(feeder) 무함유 및/또는 컨디셔닝된 배지 무함유인, 배양물.
  44. 제1항 내지 제42항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 배지가 합성 배지인, 배양물.
  45. 뇌 미세혈관 내피세포(BMEC), 혈관주위세포 및 성상세포를 샌드위치 포맷으로 포함하는 세포 배양물.
  46. 제45항에 있어서, 혈뇌 장벽 모델로서 추가로 한정되는, 배양물.
  47. 제45항 또는 제46항에 있어서, 상기 샌드위치 포맷이 2개의 세포층 사이의 세포 외 매트릭스 층을 포함하는, 배양물.
  48. 제47항에 있어서, 상기 세포외 매트릭스 층이 적어도 2개의 세포 외 매트릭스 단백질을 포함하는, 배양물.
  49. 제48항에 있어서, 상기 적어도 2개의 세포 외 매트릭스 단백질이 콜라겐 IV 및 피브로넥틴인, 배양물.
  50. 제45항 내지 제48항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 샌드위치 포맷이 정단 측면 상에 BMEC, 중간에는 세포외 매트릭스 층, 및 기저측면상에 성상세포와 혈관주위세포를 포함하는, 배양물.
  51. 제50항에 있어서, 상기 세포 외 매트릭스 층이 겔라틴 및 성상 세포 및 혈관주위세포를 추가로 포함하는, 배양물.
  52. 제45항 내지 제50항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 샌드위치 포맷이 투과성 막 삽입체를 추가로 포함하는, 배양물.
  53. 제52항에 있어서, 상기 투과성 막 삽입체가 폴리테트라플루오로에틸렌(PFTE), 폴리카보네이트 또는 폴리에틸렌 테레프탈레이트(PTE) 삽입체인, 배양물.
  54. 제52항에 있어서, 상기 투과성 막 삽입체가 PFTE 삽입체인, 배양물.
  55. 제54항에 있어서, 상기 PFTE 삽입체가 TRANSWELL™ 삽입체인, 배양물.
  56. 제45항 내지 제55항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 투과성 막 삽입체가 정단 측면상에 사람 콜라겐 IV와 사람 피브로넥틴으로 코팅되는, 배양물.
  57. 제56항에 있어서, 상기 투과성 막 삽입체가 200-400 μg/mL 농도의 사람 콜라겐 IV 및 50-100 μg/mL 농도의 사람 피브로넥틴으로 코팅된, 배양물.
  58. 제45항 내지 제57항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 투과성 막 삽입체의 기저 측면이 겔라틴으로 코팅된, 배양물.
  59. 제58항에 있어서, 상기 투과성 막 삽입체의 기저 측면이 0.1% 겔라틴으로 코팅된, 배양물.
  60. 제45항 내지 제59항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 성상세포와 혈관주위세포가 1:2 비율로 존재하는, 배양물.
  61. 제45항 내지 제60항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 성상 세포와 혈관주위세포가 투과성 막 삽입체의 기저 측면상에 있는, 배양물.
  62. 제45항 내지 제61항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 BMEC가 상기 투과성 막 삽입체의 정단 측면 상에 있는, 배양물.
  63. 제45항 내지 제62항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 BMEC가 EFRA2를 포함하는 배지에 있는, 배양물.
  64. 제45항 내지 제63항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 BMEC, 성상세포 및 혈관주위세포가 ROCK 억제제를 포함하는 배지 내에 있는, 배양물.
  65. 제64항에 있어서, 상기 ROCK 억제제가 Y-27632인, 배양물.
  66. 제45항 내지 제65항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 BMEC, 성상세포 및 혈관주위세포가 4:1:2, 4:1:1, 4:2:1 또는 2:1:1의 비율로 존재하는, 배양물.
  67. 제45항 내지 제65항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 BMEC가 1x106개의 세포/cm2 내지 1.5x106개의 세포/cm2의 세포 밀도. 1 (1.3x106)로 씨딩되는, 배양물.
  68. 제45항 내지 제65항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 성상세포가 300,000개의 세포/cm2 내지 700,000개의 세포/cm2의 세포 밀도(333K)로 씨딩되는, 배양물.
  69. 제45항 내지 제65항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 혈관주위세포가 300,000개의 세포/cm2 내지 700,000개의 세포/cm2의 세포 밀도(666K)로 씨딩되는, 배양물.
  70. 신경변성 질환을 치료하기 위한 치료학적 화합물을 스크리닝하기 위한 방법으로서, 상기 방법이:
    (a) 시험 화합물을 제1항 내지 제66항 중 어느 한 항의 배양물과 접촉시키는 단계; 및
    (b) 상기 세포의 기능적 활성을 측정하는 단계를 포함하는, 방법.
  71. 제70항에 있어서, 기능적 활성의 증가가 시험 화합물이 신경변성 질환을 치료할 수 있음을 지적하는, 방법.
  72. 제70항에 있어서, 상기 기능적 활성 측정이 수상돌기 면적(MAP2), 시냅스 수, 세포 수 또는 축삭 면적을 측정함을 포함하는, 방법.
  73. 제70항에 있어서, 상기 기능적 활성의 측정이 미세아교세포로부터 보체 C3의 방출을 검출함을 포함하는, 방법.
  74. 제73항에 있어서, 상기 미세아교세포로부터 방출되는 보체 C3의 감소가 치료학적 화합물이 신경변성 질환을 치료할 수 있음을 지적하는, 방법.
  75. 제70항에 있어서, 상기 배양물을 LPS와 접촉시킴을 추가로 포함하는, 방법.
  76. 제75항에 있어서, 기능적 활성 측정이 LPS 자극의 존재 및 부재하에 배지에서 방출되는 분석물을 측정함을 포함하는, 방법.
  77. 제76항에 있어서, 상기 분석물이 M1 인자인, 방법.
  78. 제77항에 있어서, 상기 M1 인자가 TNF 알파, IL-6, CCL2, CCL3, CCL4, IL-1 베타, IL-12, IL-13, IL-8, 인터페론 감마, IL1-Alpham FAS 리간드, IL-2, GMCSF, 그랜자임 B, ICAM-1 및/또는 CXCL11인, 방법.
  79. 제76항에 있어서, 상기 분석물이 M2 인자인, 방법.
  80. 제79항에 있어서, 상기 M2 인자가 IL-4, IL-10, IL-21, VEGF, CCL5, IL-17, IL1-RII, GCSG, CXCL5인, 방법.
  81. 제70항 내지 제80항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 단계(a)가 TREM2 야생형 미세아교세포를 갖는 배양물, TREM2 이형접합성 녹아웃 미세아교세포를 갖는 배양물 및/또는 TREM2 동형접합성 녹아웃 미세아교세포를 갖는 배양물을 포함하는, 방법.
  82. 제70항에 있어서, 기능적 활성 측정이 칼슘 신호 전달 또는 미세전극 정렬(MEA)에 의해 신경 기능을 측정함을 포함하는, 방법.
  83. 제70항에 있어서, 기능적 활성 측정이 아밀로이드 베타 식세포작용 기능을 측정함을 포함하는, 방법.
  84. 제70항에 있어서, 상기 신경변성 질환이 알츠하이머 질환 또는 다발성 경화증인, 방법.
  85. 신경변성 질환의 모델로서 제1항 내지 제66항 중 어느 한 항의 배양물의 용도.
  86. 제85항에 있어서, 상기 모델이 TREM2 야생형 미세아교세포를 갖는 배양물, TREM2 이형접합성 녹아웃 미세아교세포를 갖는 배양물 및/또는 TREM2 동형접합성 녹아웃 미세아교세포를 갖는 배양물을 포함하는, 용도.
  87. 제85항에 있어서, 상기 모델이 APOE4/4, CD33, ABCA, BIN1 또는 R47H의 질환 관련 유전자형 SNP 또는 돌연변이를 보유한 가공되거나 환자 특이적 iPSC 유래 성상세포, 뉴런 및/또는 미세아교세포를 포함하는, 용도.
  88. 제1항 내지 제66항 중 어느 한 항의 배양물에서 가용성 TREM2의 수준을 검출하는 것을 포함하는, 신경변성 질환을 스크리닝하는 방법.
  89. 제88항에 있어서, 상기 배양물 중의 세포가 동질유전자적으로 가공된 iPSC 세포주로부터 또는 SNP 관련 질환 또는 신경변성과 관련된 돌연변이를 발현하는 공여자로부터 유래된, 방법.
  90. 제88항 또는 제89항에 있어서, 가용성 TREM2의 수준이 컨디셔닝된 배지에서 검출되는, 방법.
  91. 제90항에 있어서, 검출이 ELISA를 수행함을 포함하는, 방법.
  92. 제88항 내지 제91항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 대조군과 비교하여 가용성 TREM2의 증가된 수준의 검출이 신경변성 질환의 존재를 지적하는, 방법.
  93. 제88항 내지 제92항 중 어느 한 항에 있어서, 미세아교세포에서 COMT, NRXN2 및/또는 SST의 수준을 검출함을 추가로 포함하는, 방법.
  94. 제88항 내지 제92항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 신경변성 질환이 알츠하이머 질환 또는 다발성 경화증인, 방법.
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