CN113429487B

CN113429487B - 一种能在水环境中去除抗生素耐药基因的人工合成蛋白

Info

Publication number: CN113429487B
Application number: CN202110685532.3A
Authority: CN
Inventors: 王明钰; 徐海; 房萌
Original assignee: Shandong University
Current assignee: Shandong University
Priority date: 2021-06-21
Filing date: 2021-06-21
Publication date: 2022-04-22
Anticipated expiration: 2041-06-21
Also published as: CN113429487A

Abstract

本发明公开了一种能在水环境中去除抗生素耐药基因的人工合成蛋白，其含有抗生素耐药基因的结合位点，还含有通过ZF linker串联的锌指结构，并在其N端和C端连接有蛋白骨架。本发明还公开了所述蛋白在水环境中去除抗生素耐药基因中的应用，其中所述抗生素耐药基因优选磺胺类耐药基因sul1。实验证实本发明的蛋白能够特异性结合水环境中的抗生素耐药基因sul1，在模拟实际应用中的结合效率达到50％，预示其在水环境中对抗生素耐药基因的去除发挥显著作用，为解决无法在水环境中特异性去除耐药基因的不足奠定了实施基础，具有广阔的应用前景。

Description

一种能在水环境中去除抗生素耐药基因的人工合成蛋白

技术领域

本发明涉及一种能在水环境中去除抗生素耐药基因的人工合成蛋白及其应用，属于生物技术领域。

背景技术

水环境中抗生素耐药基因的处理技术目前尚有许多不足，传统的污水处理技术(过滤，沉淀，厌氧消化)只能对水环境中的微生物和污染物进行去除，并不能去除其中的耐药基因；包括紫外线在内的氧化及高级氧化技术所需紫外的剂量很高，且不具备选择性；膜技术通过孔径大小对水环境中的污染物和耐药基因进行截留，使用过程中膜结垢问题严重且成本较高；电化学技术则需持续施加电场。

通过研究生物体内能够结合DNA的蛋白质的结构和功能之间的关系，人们开发了设计并合成能够结合特异序列DNA的技术。这些技术被用于体内基因编辑，实现了高效的基因组改造。锌指核酸酶(Zinc Finger Nuclease，ZFN)技术是基于锌指结构域设计的一种DNA结合与剪切技术。目前开发了可以特异性识别结合49种三联核苷酸(共有64种组合)的锌指结构域(Zinc Finger，ZF)。通过将识别不同三联核苷酸的ZF串联，人们可以构建出能够结合大多数特异DNA片段的人工蛋白。使用这一技术，可实现特异性地靶向结合DNA片段，使得利用该技术在水环境中特异去除抗生素耐药基因而不影响其他基因成为可能。经检索，有关能够特异性结合抗生素耐药基因sul1的新型人工合成蛋白及其应用还未见报道。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明要解决的问题是提供一种能在水环境中去除抗生素耐药基因的人工合成蛋白及其应用。

本发明所述的能在水环境中去除抗生素耐药基因的人工合成蛋白，其特征在于：所述蛋白含有抗生素耐药基因的结合位点，还含有通过ZF linker串联的锌指结构，并在其N端和C端连接有蛋白骨架。

上述能在水环境中去除抗生素耐药基因的人工合成蛋白优选的实施方式是：所述人工合成蛋白含有能够特异性识别抗生素耐药基因sul1的结合位点，还含有通过ZFlinker串联的6个锌指结构，并在其N端和C端连接有SP1C蛋白骨架，该人工合成蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，编码该人工合成蛋白的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；其中，所述抗生素耐药基因sul1结合位点的核苷酸序列如SEQID NO.1所示，所述SP1C蛋白骨架是：N-term backbone：YKCPECGKSFS，C-term backbone：HQRTH，ZF linker：TGEKP，N-termfixed：LEPGEKP，C-term fixed：TGKKTS。

上述能在水环境中去除抗生素耐药基因的人工合成蛋白的获取方法是：先对耐药基因sul1特异结合位点序列进行筛选确定，得到相应的锌指结构，并将锌指结构进行串联，并在N，C端连接蛋白骨架，将编码该蛋白的核酸进行人工合成，然后通过酶切连接的方法将其连接到表达载体pET-21b，并转化到E.coli BL21(DE3)中进行表达，最后通过镍柱亲和层析，离子交换层析方法分离获得高纯度能在水环境中去除抗生素耐药基因的人工合成蛋白，命名为sul1结合蛋白。进一步经EMSA和ITC实验证实该人工合成蛋白可以和sul1基因特异结合。

本发明所述能在水环境中去除抗生素耐药基因的人工合成蛋白在水环境中去除抗生素耐药基因中的应用，其中所述抗生素耐药基因是指磺胺类耐药基因sul1，林可酰胺类耐药基因，氨基糖苷类耐药基因，喹诺酮类耐药基因，大环内酯类耐药基因，beta-内酰胺类耐药基因，四环素类耐药基因，糖肽类耐药基因，恶唑烷酮类耐药基因，多肽类耐药基因，氨基香豆素类耐药基因，核苷酸类耐药基因，利福平类耐药基因，甲氧苄啶类(二氨基嘧啶类)耐药基因，氯霉素类耐药基因，有机砷类耐药基因，多胺类耐药基因，芬尼法霉素类耐药基因，截短侧耳素类耐药基因，游离脂肪酸类耐药基因，碳青霉烯类耐药基因，脂肽类耐药基因，大环类耐药基因，生物碱类耐药基因，安莎霉素类耐药基因，醌类耐药基因，去污剂类耐药基因，萜类耐药基因，离子通道类耐药基因，金属通道类耐药基因，砜类耐药基因，聚酮类耐药基因，二芳基喹啉类耐药基因，硝基呋喃类耐药基因，硝基咪唑类耐药基因。

其中，优选的实施方式是所述能在水环境中去除抗生素耐药基因的人工合成蛋白在水环境中去除磺胺类耐药基因sul1中的应用。该应用是利用本发明所述新型人工合成蛋白与sul1基因结合位点能够特异性结合的原理对水环境中的sul1耐药基因进行特异性结合并去除。

具体的应用方法是：将SEQ ID NO.2所示的人工合成蛋白通过固定化的方法固定于琼脂糖凝胶上并装填成柱，让含有抗生素耐药基因的水流经该凝胶柱，人工合成蛋白会特异性结合水环境中的磺胺类耐药基因sul1并相应去除；同时构建标准质粒进行qPCR标准曲线的制备，将含有抗生素耐药基因的水流过柱子，对流经前后的水样进行qPCR定量，确定水环境中sul1耐药基因的实际结合效率；其中，所述装填成柱的方法是将琼脂糖凝胶4FF经过环氧氯丙烷，硫代硫酸钠和DTT处理之后使其带有巯基，然后将琼脂糖凝胶4FF和新型人工合成蛋白的半胱氨酸通过二硫键进行共价交联，装填成柱；所述标准质粒是命名为pET-STD的含磺胺类耐药基因sul1 PCR产物的质粒。

本发明公开了一种能在水环境中去除抗生素耐药基因的人工合成蛋白及其应用。本发明中设计了一种能够特异性结合抗生素耐药基因sul1的新型人工合成蛋白，所述的新型人工合成蛋白是选取耐药基因的特异序列，进行设计并合成编码基因，通过E.coli BL21(DE3)进行原核表达后，利用亲和层析，离子交换层析等蛋白质纯化手段，最终获得高纯度，高表达量的新型人工合成蛋白。通过对该蛋白与相应的耐药基因的相互作用从而证明了该蛋白在能够结合水环境中的抗生素耐药基因sul1，在模拟实际应用中发现本发明所述人工蛋白与抗生素耐药基因的结合效率达到50％，预示其在水环境中对抗生素耐药基因的去除发挥显著作用。

本发明所述的能够特异性结合抗生素耐药基因sul1的新型人工合成蛋白制备方法简便，产量大，纯度高；实验证实结合效率好，可以解决无法在水环境中特异性去除耐药基因的不足，具有广阔的应用前景。

附图说明

图1是PCR扩增及琼脂糖凝胶电泳结果。

其中：M为marker(从上到下分别为15000bp，10000bp，7500bp，5000bp，2500bp，1000bp，250bp)；左四泳道为T7标准引物得到的PCR产物，模板为转化后随机挑选的E.coliBL21阳性克隆。后续会进行测序判断该人工合成蛋白的核酸序列是否正确。

图2为纯化后本发明所述人工合成蛋白的SDS-PAGE电泳图。

其中：M代表蛋白Marker。

图3为本发明所述人工合成蛋白与抗生素耐药基因sul1的EMSA结果图。

其中：a图为DNA探针含有结合位点，b图为DNA探针不含有结合位点。结合位点为SEQ ID NO.1。由ab图对比可以看出该人工合成蛋白具有很好的特异性，并且能够与含有结合位点的DNA探针结合，分子量变大从而出现凝胶迁移现象。c图为a图结果的非线性曲线拟合结果，横坐标为蛋白的量，纵坐标结合比用image lab软件对条带印记进行定量，用GraphPad Prism9进行非线性拟合分析，得到亲和力常数(K_D值)为1.4μM。

图4为本发明所述人工合成蛋白与抗生素耐药基因sul1的等温滴定热法(ITC)结果图。

结果表明：通过人工合成蛋白滴定DNA，显示结合效率较好，系统自动生成其随时间变化的热力学曲线(上图)，亲和力常数(K_D值)为9.06μM(下图)。

图5为通过将本发明所述人工合成蛋白进行固定化后，在实验室条件下模拟的水环境中sul1耐药基因的实际结合效率结果图。

其中：上图是sul1标准品(sul1标准质粒pET-STD)的标准曲线图，下图是sul1抗性基因前后变化曲线。下图中上方曲线为每个时间样品流经凝胶柱前的sul1基因丰度，下中部曲线为每个时间中流经凝胶柱后的sul1基因丰度；对比发现：在实际条件下(室温，pH＝7,500μL/min)，结合的实际效率为50％。

具体实施方式

下面结合具体附图和实施例对本发明内容进行详细说明。如下所述例子仅是本发明的较佳实施方式而已，应该说明的是，下述说明仅仅是为了解释本发明，并非对本发明作任何形式上的限制，凡是依据本发明的技术实质对实施方式所做的任何简单修改，等同变化与修饰，均属于本发明技术方案的范围内。

下述实施例中，所使用的材料、试剂菌株等，如无特殊说明，均从商业途径得到。

其中：E.coli BL21(DE3)细胞购买自Lucigen公司，pET-21b质粒载体购买自上海派森诺生物科技有限公司。凝胶柱的规格为300mm*10mm，柱体积为24mL，购置于鼎国生物技术有限公司。质粒小提试剂盒、DNA纯化回收试剂盒、细菌基因组DNA提取试剂盒购自天根生化科技(北京)有限公司。PMD19-T连接载体，限制性内切酶、T4 DNA连接酶购自Thermo公司。镍柱和阳离子交换柱，PD-10脱盐柱均来自于美国GE公司。

实施例1：设计新型人工蛋白，并合成核酸序列，获得阳性表达菌株。

通过网站https://www.scripps.edu/barbas/zfdesign/zfdesignhome.php对能够特异性结合DNA的蛋白进行设计。

首先通过网站对抗生素耐药基因sul1的全长序列进行分析，不断筛选得到长度为SEQID NO.1所示的18bp的结合位点。针对选择的结合位点，网站会自动生成6个锌指结构，每个锌指结构可以特异性识别结合位点上3bp的序列，将这6个锌指结构通过ZF linker串联起来，并在其N端和C端加上SP1C蛋白骨架，增加其稳定性，此时得到了设计的新型人工合成蛋白和其氨基酸序列(SEQ NO.2所示的氨基酸序列)。

通过ENBOSS backtranseq网站(https://www.bioinformatics.nl/cgi-bin/ emboss/backtranseq)将该人工合成蛋白的氨基酸序列转化为核酸序列，并设计酶切位点方便后续连接。

得到所述核酸序列后交由派森诺生物科技有限公司进行合成。合成得到含有NdeI和XhoI酶切位点的核酸序列。然后对pET-21b进行酶切，酶切为点位NdeI和XhoI，然后将得到的核酸序列用酶切好的pET-21b载体进行连接反应，得到新的表达载体，命名为pET-sul1。

将构建好的表达载体pET-sul1通过化学转化导入E.coli BL21(DE3)中，通过蓝白斑筛选挑取阳性克隆，将挑取的阳性克隆进行PCR反应，测序验证序列的正确性，此时获得了阳性表达菌株。

如上所示是人工合成蛋白的结构描述，其中为一个锌指结构，倘若多个锌指结构串联，只需要通过ZF linker连接即可。

N-term backbone：YKCPECGKSFS

C-term backbone：HQRTH

ZF linker：TGEKP

N-term fixed：LEPGEKP

C-term fixed：TGKKTS

以上为人工合成蛋白N，C端连接的蛋白骨架(SP1C骨架)。

PCR产物及质粒载体的酶切反应：

质粒载体的酶切体系：

反应条件：37℃反应6-8h。

PCR产物和载体双酶切后的产物经1％琼脂糖凝胶电泳，并使用DNA 凝胶回收试剂盒进行纯化回收。

连接反应体系：

充分混匀后离心数秒，将管壁液滴收到管底，16℃连接过夜，得到重组质粒。

重组质粒的转化：

(1)感受态细胞的制备

①挑取E.coli BL21单菌落(或挑取保存菌种)接种至10ml左右液体LB，37℃，210rpm过夜培养。

②取5ml菌液接种于500mlLB中，37℃，210rpm，摇70-80min OD可达0.375左右。

③将菌液放置于冰水混合物上10min，同时预冷50ml离心管。

④将菌液转移到离心管中，4℃，3700rpm，10min收集菌体。弃上清，将残液尽量倒尽

⑤每个离心管中加入大约10ml冰预冷的激活buffer(0.1M CaCl2)，用灭过菌的5ml枪尖(枪口要尽量粗一些)打散沉淀，然后再向每个管中加大约30ml冰预冷的激活buffer，颠倒混匀，冰上静置20min；

⑥4℃，3700rpm，离心10min；弃上清，将残液倒净，按500ml菌液12ml冰预冷储存buffer(0.1M CaCl2,15％甘油)的量，将沉淀打散，(分次转移，然后吹吸打散)。

⑦将感受态分装到冰预冷的灭菌EP中，每管100微升，置于冰上(准备一盆冰水混合物)。

⑧感受态-80℃冻存。

(2)细菌转化实验

①事先将恒温水浴的温度调到42℃。

②从-80℃超低温冰柜中取出一管(100μL)感受态菌，立即插入冰上，冰浴5～10min。

③加入5μl连接好的质粒混合液(DNA 含量不超过100ng)，轻轻震荡后放置冰上20min。

④轻轻摇匀后插入42℃水浴中1～2min进行热休克，然后迅速放回冰中，静置3～5min。

⑤在超净工作台中向上述各管中分别加入700μl LB培养基(不含抗菌素)轻轻混匀，然后固定到摇床的弹簧架上37℃震荡1h。

⑥在超净工作台中取上述转化混合液100～200μl，滴到含AMP的固体LB平板培养皿中，用酒精灯烧过的玻璃涂布，37℃培养过夜。

阳性克隆的鉴定：

(1)菌落PCR鉴定

挑取单菌落，37℃振荡培养6-8h，吸取1μL菌液，按照50μLPCR反应体系，进行PCR鉴定。若为阳性克隆，通过琼脂糖凝胶电泳可检测到一条目的条带，见图1。

PCR体系如下：

PCR程序设置如下：

PCR所需引物：

T7 TAATACGACTCACTATAGGG

T7-ter TGCTAGTTATTGCTCAGCGG

(2)DNA测序

将鉴定后的阳性克隆，送至测序公司进行测序，确定得到的阳性克隆中所插入的核苷酸序列为SEQ ID NO.3所示的核酸序列。

实施例2：发酵培养阳性表达菌株，分离纯化人工合成蛋白。

种子培养：以常规方法挑取阳性克隆置于5mL的含有相应抗生素的液体LB培养基中，在37℃振荡培养5-6h；其中上述LB液体培养基的配制为：分别称取10g蛋白胨，10g氯化钠，5g酵母提取物，加入700-800毫升去离子水，用磁力搅拌器搅拌至完全溶解，定容至1000ml。再用NaOH调节pH至7.0，分装并灭菌。使用时加入1‰的抗生素。

菌体扩大培养：将种子液按体积比5％的量接入1L含有抗生素的LB液体培养基中，37℃振荡培养至菌浓OD₆₀₀为0.6-0.8时，降温至16℃；加入终浓度为0.5mM的IPTG，过夜诱导表达。其中上述IPTG的配制为：用电子天平准确称取24mg IPTG粉末，加入700ml去离子水溶解，再加入去离子水定容至1ml，使用滤膜过滤后在-20℃保存。

收集菌体：4000rpm，4℃离心15min，弃去上清，收获菌体；加入重悬溶液(20mMPBS,pH7.4,300mM NaCl，20mM imidazole)，振荡沉淀菌体细胞；再加入少量蛋白酶抑制剂PMSF(Phenylmethyl sulfonyl fluoride，苯甲酸磺酰氟)。

超声破碎菌体细胞：超声3s，间隔6s，400W，工作60次。

超速离心：细胞裂解液6000rpm，4℃离心60min，收集含有可溶性蛋白的上清液，进行下一步的分离纯化。

Ni-NTA亲和层析：将收集的含有可溶性蛋白的上清液体倒入再生好的Ni-NTA 柱中；上清液流净后，以wash buffer(20mM PBS，pH7.4，300mM NaCl，40mM imidazole)冲洗10个柱体积，除去非特异性吸附的蛋白；最后使用elution buffer(20mM PBS，pH7.4，300mMNaCl，250mM imidazole)将目的蛋白洗脱下来，用干净预冷烧杯收集；使用SDS-PAGE电泳检测蛋白是否可溶，可溶的蛋白是否能够与Ni-NTA 结合，是否能够被洗脱下来，及蛋白的浓度。

离子交换层析纯化：将Ni-NTA亲和层析系脱下的可溶性蛋白上样到已使用溶液A(20mM PBS，pH7.4)平衡好的离子交换柱上，使用溶液A与溶液B(20mM PBS，pH7.4，300mMNaCl)进行线性梯度洗脱。观察280nm的吸光值(A280)变化情况，收集各个出峰位置附近的收集管，并进行SDS-PAGE电泳，以便得到目的蛋白质。如图2所示，该人工合成蛋白的大小为19.8kDa，等电点为9.4。

去除人工合成蛋白中的咪唑：因不确定咪唑是否会对该人工合成蛋白Sul1和抗生素耐药基因sul1的结合造成影响，这里对得到的蛋白溶液进行去除咪唑的处理。1)平衡PD-10柱，可以用纯水，也可以用适宜的缓冲液，视脱盐的目的而定。2)上样，在柱子平衡后，将样品(1.5-2.5ml)加到柱子顶上。3)洗脱，样品全部进入柱子内后，柱顶加入水或适宜缓冲液洗脱。(自然流速)从加样开始计算，收集2.5～5.5ml的流出液为脱盐蛋白峰。如果不放心，上样，洗脱，用EP管每管收集1ml，经SDS-PAGE电泳检测后，再合并样品液。4)过柱后，充分洗涤，用20％乙醇、0.05％NaN3或0.05mol/L NaOH保存柱子。此时得到的蛋白溶液不含有咪唑。

结果如图2所示，Sul1结合蛋白全长含有176个氨基酸，大小大约为19.8kDa，等电点为9.4。

实施例3：新型人工合成蛋白与抗生素耐药基因sul1的相互作用

凝胶迁移实验(EMSA)是一种常见用于研究蛋白-DNA 和蛋白-RNA 相互作用的一种方法，将蛋白质和核酸结合，然后在自然条件下通过聚丙烯酰胺或琼脂糖凝胶对混合物进行电泳，由于它的易用性、多功能性、高灵敏度，已经成为了一种常用的亲和力电泳技术。完整的EMSA 通常包括三个步骤：①DNA 探针的标记，②分离标记的探针，③DNA-蛋白质结合反应的制备及其在天然聚丙烯酰胺凝胶电泳上的分析。原理也很简单，即不同分子在凝胶中移动的速度取决于他们的大小和电荷，在较小的程度上取决于它们的形状。在正确的实验条件下，DNA 或RNA与蛋白质之间的相互作用得以稳定，并且在凝胶上结合的核酸和未结合的核酸的比例反映了结合反应中游离的探针和结合的探针的比例。如果已知蛋白质和探针的起始浓度，则可以确定蛋白质对核酸的亲和力。

等温滴定热法(ITC)是一种新兴的无标记技术，无需对DNA进行标记，就能够确定溶液中物质相互作用的热力学参数。它最长用于研究大分子(蛋白质或者DNA等)和小分子(药用化合物)的结合。它由两个封闭的单元组成分别是样品池和参比池。将要研究的化合物样品放在样品池中，而另一个池为参比池，用作对照，并含有溶解样品的缓冲液。在EMSA很难确定蛋白和DNA亲和力的情况下，可以使用ITC来确定。它不仅提供了结合亲和力，而且还提供了结合的热力学。

①凝胶迁移实验(EMSA)

实验步骤详见碧云天EMSA探针生物素标记试剂盒(GS008)和化学发光法EMSA试剂盒(GS009)说明书。

EMSA中所需的探针序列如下

含有结合位点的探针序列：

F:GTGACGGTGTTCGGCATT

R:AATGCCGAACACCGTCAC

不含有结合位点的探针序列：

F:AGCGCAAGAGTCCGTCAC

R:GTGACGGACTCTTGCGCT

②等温滴定热法(ITC)

(1)将含有结合位点的DNA 序列由公司合成干粉，并用20mM PBS缓冲液(150mMNaCl)溶解稀释至10μM；将纯化的蛋白溶液用20mM PBS缓冲液(150mM NaCl)稀释至100μM，置于冰上备用；

(2)操作前需要先清理仪器的样品池和参比池，通过向样品池，参比池和滴定注射器加入脱气的超纯水。随后用“cell water rinse”命令，用超纯水清晰样品池。使用“syringe wash”命令，清洗滴定注射器。

(3)取下上样针，用缓冲液反复润洗多次，然后吸取300μL的样品，并确保针中无气泡。然后将上样针垂直放入样品池，缓慢匀速推下注射器，使超纯水溢出管口，反复吹打赶走气泡。慢慢将上样针抽出，吸走管口溢出的样品。用同样的方法在参比池加入超纯水。

(4)将大约60μL样品加入PCR管，并固定在槽中，使用“syringe fill”命令进行加样。在加样完成后，将注射器放入样品池中并固定好。

(5)按照如下设定参数：

(6)使用DNA溶液滴定蛋白质，滴定完成后，使用系统自带的分析软甲对曲线进行分析，得到结合蛋白和DNA的拟合曲线和K_D值。

EMSA结果如图3所示，a图为sul1含有结合位点的DNA探针，在蛋白：DNA的摩尔量为4:1时，未出现游离的探针，此时DNA和Sul1结合蛋白已经全部结合；b图为不含结合位点的DNA探针与Sul1结合蛋白的EMSA结果，未出现凝胶迁移现象。这个实验证明了Sul1结合蛋白的特异性，能够特异性的与抗生素耐药基因结合，且特异性较好。c图是对a图进行的有关K_D值的分析，横坐标为不断增加的Sul1结合蛋白的浓度，纵坐标为结合的与未结合的探针的百分比，可用image lab对印记进行分析得到，通过GraphPad prism9绘制非线性拟合曲线，自动得到该sul1抗生素耐药基因与Sul1结合蛋白的亲和力常数为1.4μM。

ITC的结果如图4所示，通过用100nM的蛋白溶液滴定10nM的DNA，自动生成其随时间变化的热力学曲线，得到的K_D值为9.06μM。

实施例4：利用固定化验证本发明所述人工合成蛋白实际环境中水环境抗生素耐药基因sul1的结合效率

①蛋白固定化

1.根据柱子大小取所需要的凝胶，这里所用凝胶柱的规格为300mm*10mm,所用的凝胶为30g，用去离子水清洗掉凝胶含有的20％乙醇，随后抽干水和乙醇。

2.将30g吸干的琼脂糖凝胶4FF用5mL环氧氯丙烷处理，并加入15mL 1M的NaOH，25℃搅拌反应2h。活化的凝胶在玻璃滤器中洗涤至中性。

3.将环氧氯丙烷活化的30g琼脂糖凝胶悬浮在50mM的磷酸盐缓冲液中(pH＝6.5)，加入2M的硫代硫酸钠15mL，室温下震荡6h。然后用蒸馏水将硫代硫酸钠洗涤干净。得到的硫代硫酸盐凝胶可悬浮于蒸馏水中保存。

4.硫代硫酸盐凝胶的还原。将30g硫代硫酸盐凝胶悬浮在100mM的碳酸氢钠溶液中，加入6mL 5mM的DTT，DTT溶解于1mM的EDTA溶液中。室温反应30min。之后将琼脂糖用30mL的碳酸氢钠溶液(100mM)在玻璃滤器上洗涤，最后用100mL EDTA 溶液(1mM)洗涤。

5.将琼脂糖凝胶4FF吸干并溶解在45mL的醋酸钠溶液(0.2M，pH＝5.0)中，在连续震荡的情况下加入30％的过氧化氢，初始加入1.8mL，然后在30、90、150min分别加入2.2mL过氧化氢。然后孵育30个小时。完成后将氧化的琼脂糖凝胶4FF转移到玻璃滤器中，用0.1M的醋酸钠洗涤，直至除去过氧化氢。具有活性的凝胶保存在0.2M的乙酸钠溶液中(0.2M)，4℃保存至使用。

6.若蛋白结构中的巯基不被包裹，可直接进行交联。若巯基被包裹，则应先使用DTT还原蛋白，然后去除过量DTT。

7.将蛋白和处理过的琼脂糖凝胶4FF溶解于20mM的PBS(20mM磷酸钠，150mM NaCl，pH＝7.5)，4℃孵育24h。然后用之前的PBS缓冲液进行冲洗，在4℃下保存至使用。

②标准质粒制备和标准曲线制作

1.sul1基因的PCR扩增

F：CGGCGTGGGCTACCTGAACG

R：GCCGATCGCGTGAAGTTCCG

PCR体系如下：

2.将步骤1中所得的抗生素耐药基因sul1 PCR产物通过胶回收，进行TA克隆与PMD19-T Simple Vector相连。体系为PMD19-T Simple Vector(1μL)、DNA(1μL)、ddH2O(3μL)和Sollution I(5μL)，混匀并在4℃冰箱过夜连接。将连接好的质粒进行胶回收，用核酸检测仪测定浓度，浓度为87ng/μL，作为标准质粒计算拷贝数，标准质粒命名为pET-STD。

拷贝数计算方式：

Copies＝NA×C/N*660

其中：NA为阿伏伽德罗常数，C为质粒浓度，N为碱基个数。

后续将标准质粒pET-STD进行稀释，每个梯度稀释10倍，共稀释7个梯度，通过qPCR进行绝对定量制作标准曲线。

③qPCR定量

(1)扩增体系如下

(2)程序设置如下：

结果如图5上图所示，上图为sul1标准质粒pET-STD标准曲线图，根据R2要求在0.99-1，所得的标准曲线符合要求，可用于后续的sul1耐药基因的定量。

实施例2纯化得到的sul1结合蛋白通过二硫键与琼脂糖凝胶4FF共价交联，通过比较交联前后蛋白浓度的变化，发现30mg琼脂糖凝胶4FF共交联了142mg Sul1结合蛋白，将其装填成柱后，调整上样前sul1耐药基因的浓度使其不会过载，然后以500μL/min的流速缓慢流过凝胶柱，每个半个小时收集一次上样前和上样后的样品，共收集了8个小时16个样品，用于后续基因的绝对定量。

绝对定量结果如图5下图所示，上样前的浓度理论上是个定值，本实施例选取了其中一个时间进行了测定，得到的拷贝数为3.3×10⁵copies/μL，对收集的16个上样后样品进行测定，发现其拷贝数在1.5×10⁵copies/μL附近，结合效率在50％。

序列表

<110>山东大学

<120>一种能在水环境中去除抗生素耐药基因的人工合成蛋白

<141>2021-6-15

<160>3

<210> 1

<211> 18

<212> DNA

<213>人工序列

<221> sul1耐药基因结合位点的核苷酸序列

<222>（1）…（18）

<400> 1

ggtgacggtg ttcggcat 18

<210> 2

<211> 176

<212> PRT

<213>人工序列

<221>sul1特异性结合蛋白的氨基酸序列

<222>（1）…（176）

<400>2

LEPGEKPYKC PECGKSFSTS GNLTEHQRTH TGEKPYKCPE CGKSFSRSDK LTEHQRTHTG 60

EKPYKCPECG KSFSTSGSLV RHQRTHTGEK PYKCPECGKS FSTSGHLVRH QRTHTGEKPY 120

KCPECGKSFS DPGNLVRHQR THTGEKPYKC PECGKSFSTS GHLVRHQRTH TGKKTS 176

<210> 3

<211> 528

<212> DNA

<213>人工序列

<221> 编码sul1特异性结合蛋白的核苷酸序列

<222>（1）…（528）

<400> 3

ctggaaccgg gtgaaaaacc gtacaaatgc ccggaatgcg gtaaatcttt ctctacctct 60

ggtaacctga ccgaacacca gcgtacccac accggtgaaa aaccgtacaa atgcccggaa 120

tgcggtaaat ctttctctcg ttctgacaaa ctgaccgaac accagcgtac ccacaccggt 180

gaaaaaccgt acaaatgccc ggaatgcggt aaatctttct ctacctctgg ttctctggtt 240

cgtcaccagc gtacccacac cggtgaaaaa ccgtacaaat gcccggaatg cggtaaatct 300

ttctctacct ctggtcacct ggttcgtcac cagcgtaccc acaccggtga aaaaccgtac 360

aaatgcccgg aatgcggtaa atctttctct gacccgggta acctggttcg tcaccagcgt 420

acccacaccg gtgaaaaacc gtacaaatgc ccggaatgcg gtaaatcttt ctctacctct 480

ggtcacctgg ttcgtcacca gcgtacccac accggtaaaa aaacctct 528

Claims

1.一种能在水环境中去除抗生素耐药基因的人工合成蛋白，其特征在于：所述人工合成蛋白含有能够特异性识别抗生素耐药基因sul1的结合位点，还含有通过锌指结构连接体串联的6个锌指结构，并在其N端和C端连接有SP1C蛋白骨架，该人工合成蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，编码该人工合成蛋白的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；其中，所述抗生素耐药基因sul1结合位点的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述SP1C蛋白骨架是：氮端主干：YKCPECGKSFS，碳端主干：HQRTH，锌指结构连接体：TGEKP，氮端固定：LEPGEKP，碳端固定：TGKKTS。

2.权利要求1所述能在水环境中去除抗生素耐药基因的人工合成蛋白在水环境中去除磺胺类耐药基因sul1中的应用。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，应用方法是：将SEQ ID NO.2所示的人工合成蛋白通过固定化的方法固定于琼脂糖凝胶上并装填成柱，让含有抗生素耐药基因的水流经该凝胶柱，人工合成蛋白会特异性结合水环境中的磺胺类耐药基因sul1并相应去除；同时构建标准质粒进行qPCR标准曲线的制备，将含有抗生素耐药基因的水流过柱子，对流经前后的水样进行qPCR定量，确定水环境中sul1耐药基因的实际结合效率；其中，所述装填成柱的方法是将琼脂糖凝胶4FF经过环氧氯丙烷，硫代硫酸钠和DTT处理之后使其带有巯基，然后将琼脂糖凝胶4FF和人工合成蛋白的半胱氨酸通过二硫键进行共价交联，装填成柱；所述标准质粒是命名为pET-STD的含磺胺类耐药基因sul1 PCR产物的质粒。