JP6490426B2 - ハンチントン病を治療するための方法および組成物 - Google Patents
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Description
本出願は、2012年2月29日に出願された米国仮出願第61/605,028号の利益を主張し、その開示は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
例えば、本発明は、以下の項目を提供する:
(項目1)
Htt遺伝子に結合する非天然型ジンクフィンガータンパク質であって、上記ジンクフィンガータンパク質は、F1〜F4、F1〜F5、およびF1〜F6と順序付けられた、4つ、5つ、または6つのジンクフィンガードメインを含み、上記ジンクフィンガードメインは、表1Bの単一の列に示される認識ヘリックス領域配列を含む、ジンクフィンガータンパク質。
(項目2)
上記ジンクフィンガータンパク質は、上記Htt遺伝子の上記CAG反復領域の外側のみに結合するか、またはその外側に部分的に結合する、項目1に記載のジンクフィンガータンパク質。
(項目3)
上記ジンクフィンガータンパク質は、上記Htt遺伝子の上記CAG反復領域内の配列に結合する、項目1に記載のジンクフィンガータンパク質。
(項目4)
DNAに結合したときにジンクフィンガータンパク質の多量体化を可能にする、二量体化ドメインをさらに含む、項目1〜3のいずれかに記載のジンクフィンガータンパク質。
(項目5)
項目1〜4のいずれかに記載のジンクフィンガータンパク質および機能的ドメインを含む、融合タンパク質。
(項目6)
上記機能的ドメインは、転写活性化ドメイン、転写抑制ドメイン、およびヌクレアーゼドメインからなる群から選択される、項目5に記載の融合タンパク質。
(項目7)
項目1〜4に記載の1つ以上のジンクフィンガータンパク質または項目5または6に記載の1つ以上の融合タンパク質をコードする、ポリヌクレオチド。
(項目8)
項目1〜4に記載の1つ以上のジンクフィンガータンパク質、項目5または6に記載の1つ以上の融合タンパク質、あるいは項目7に記載の1つ以上のポリヌクレオチドを含む、宿主細胞。
(項目9)
項目1〜4に記載の1つ以上のジンクフィンガータンパク質、項目5または6に記載の1つ以上の融合タンパク質、あるいは項目7に記載の1つ以上のポリヌクレオチドを含む、医薬組成物。
(項目10)
細胞内のHtt遺伝子の発現を修飾する方法であって、上記細胞に、項目5に記載の1つ以上の融合タンパク質をコードする1つ以上のポリヌクレオチドを投与することを含む、方法。
(項目11)
上記Htt遺伝子は、少なくとも1つの変異対立遺伝子を含む、項目10に記載の方法。
(項目12)
上記Htt遺伝子は、野生型である、項目10に記載の方法。
(項目13)
上記融合タンパク質は、ヌクレアーゼドメインを含み、上記Htt遺伝子の発現は、不活性化される、項目10〜12のいずれかに記載の方法。
(項目14)
細胞内のHtt遺伝子を修飾する方法であって、上記方法は、上記細胞に、項目5に記載の1つ以上の融合タンパク質をコードする1つ以上のポリヌクレオチドを投与することを含み、上記1つ以上の融合タンパク質は、ヌクレアーゼドメインを含み、上記Htt遺伝子の上記配列は修飾される、方法。
(項目15)
ハンチントン病を治療する方法であって、上記方法は、上記細胞に、項目5に記載の1つ以上の融合タンパク質をコードする1つ以上のポリヌクレオチドを、治療を必要とする対象に対して投与することを含む、方法。
(項目16)
ハンチントン病の研究のためのモデル系を生成する方法であって、項目14に記載の方法に従ってHtt遺伝子を修飾することを含む、方法。
(項目17)
上記Htt遺伝子は、1つ以上の変異対立遺伝子を含むように修飾される、項目16に記載の方法。
(項目18)
上記変異対立遺伝子は、伸長したトリヌクレオチド反復を含む、項目17に記載の方法。
(項目19)
上記細胞は、胚性幹細胞を含む、項目16〜18のいずれかに記載の方法。
本明細書に開示される方法の実践ならびに組成物の調製および使用は、別途指定されない限り、分子生物学、生化学、クロマチン構造および分析、計算化学、細胞培養、組換えDNA、ならびに当該分野の技術の範囲内である関連分野における従来の技術を用いる。これらの技術は、文献に完全に説明されている。例えば、Sambrook et al.MOLECULAR CLONING:A LABORATORY MANUAL,Second edition,Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989および第3版2001、Ausubel et al.,CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY,John Wiley&Sons,New York,1987および定期改訂版、METHODS IN ENZYMOLOGYシリーズ、Academic Press,San Diego、Wolffe,CHROMATIN STRUCTURE AND FUNCTION,Third edition,Academic Press,San Diego,1998、METHODS IN ENZYMOLOGY,Vol.304,“Chromatin”(P.M.Wassarman and A.P.Wolffe,eds.),Academic Press,San Diego,1999、ならびにMETHODS IN MOLECULAR BIOLOGY,Vol.119,“Chromatin Protocols”(P.B.Becker,ed.)Humana Press,Totowa,1999を参照されたい。
「核酸」、「ポリヌクレオチド」、および「オリゴヌクレオチド」という用語は、交換可能に使用され、線状または環状立体配座であり、かつ1本鎖または2本鎖形態のいずれかである、デオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチド重合体を指す。本開示の目的のために、これらの用語は、重合体の長さに関して限定的であると解釈されるべきではない。この用語は、天然ヌクレオチドの既知の類似体、ならびに塩基部分、糖部分および/またはリン酸部分において修飾されるヌクレオチド(例えば、ホスホロチオエート骨格)を包含することができる。一般に、特定のヌクレオチドの類似体は、同じ塩基対形成特異性を有し、すなわち、Aの類似体は、Tと塩基対形成する。
Httを含むが、これらに限定されない、トリヌクレオチド反復を含む任意の遺伝子において標的配列に特異的に結合するDNA結合ドメインを含む組成物が、本明細書に記載される。任意のDNA結合ドメインを、本明細書に開示される組成物および方法において使用することができる。
本明細書に記載されるDNA結合タンパク質(例えば、ZFPまたはTALE)および異種制御(機能的)ドメイン(またはその機能的断片)を含む、融合タンパク質もまた提供される。一般的なドメインには、例えば、転写因子ドメイン(活性化因子、抑制因子、共活性化因子、共抑制因子)、サイレンサー、癌遺伝子(例えば、myc、jun、fos、myb、max、mad、rel、ets、bcl、myb、mosファミリーメンバー等);DNA修復酵素およびそれらの関連因子と修飾因子;DNA再配列酵素およびそれらの関連因子と修飾因子;クロマチン関連タンパク質およびそれらの修飾因子(例えば、キナーゼ、アセチラーゼ、およびデアセチラーゼ);ならびにDNA修飾酵素(例えば、メチルトランスフェラーゼ、トポイソメラーゼ、ヘリカーゼ、リガーゼ、キナーゼ、ホスファターゼ、ポリメラーゼ、エンドヌクレアーゼ)およびそれらの関連因子と修飾因子が含まれる。DNA結合ドメインおよびヌクレアーゼ切断ドメインの融合に関する詳細については、米国特許出願公開第20050064474号、同第20060188987号、および同第2007/0218528号、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。
ある特定の実施形態において、融合タンパク質は、DNA結合結合ドメインおよび切断(ヌクレアーゼ)ドメインを含む。したがって、遺伝子修飾は、ヌクレアーゼ、例えば、遺伝子操作されたヌクレアーゼを使用して、達成され得る。遺伝子操作されたヌクレアーゼ技術は、天然型DNA結合タンパク質の遺伝子操作に基づく。例えば、調整されたDNA結合特異性を有するホーミングエンドヌクレアーゼの遺伝子操作が、記載されている。( Chames et al.(2005)Nucleic Acids Res 33(20):e178、Arnould et al.(2006)J.Mol.Biol.355:443−458)を参照されたい。加えて、ZFPの遺伝子操作もまた記載されている。例えば、米国特許第6,534,261号、同第6,607,882号、同第6,824,978号、同第6,979,539号、同第6,933,113号、同第7,163,824号、および同第7,013,219号を参照されたい。
本明細書に記載されるタンパク質(例えば、ZFP、TALE、CRISPR/Cas)、それらをコードするポリヌクレオチド、ならびにタンパク質および/またはポリヌクレオチドを含む組成物は、例えば、ZFP−TF、TALE−TFタンパク質の注射による手段、またはZFNもしくはTALENコードmRNAの使用による手段を含む、任意の好適な手段によって標的細胞に送達されてもよい。好適な細胞には、真核および原核細胞および/または細胞株が含まれるが、これらに限定されない。かかる細胞またはかかる細胞から生成される細胞株の非限定的な例としては、COS、CHO(例えば、CHO−S、CHO−K1、CHO−DG44、CHO−DUXB11、CHO−DUKX、CHOK1SV)、VERO、MDCK、WI38、V79、B14AF28−G3、BHK、HaK、NS0、SP2/0−Ag14、HeLa、HEK293(例えば、HEK293−F、HEK293−H、HEK293−T)、およびperC6細胞、ならびにヨトウガ(Sf)等の昆虫細胞、またはサッカロミセス属、ピチア属、およびシゾサッカロミセス属等の真菌細胞が挙げられる。ある特定の実施形態において、細胞株は、CHO−K1、MDCK、またはHEK293細胞株である。好適な細胞にはまた、例として、胚性幹細胞、人工多能性幹細胞、造血幹細胞、ニューロン幹細胞、および間葉系幹細胞等の、幹細胞が含まれる。
開示される組成物および方法は、治療適用および研究適用を含むが、これらに限定されない、Htt対立遺伝子を調節することが望ましい任意の適用のために使用することができる。
Httを標的とするジンクフィンガータンパク質を、本質的に米国特許第6,534,261号に記載されるように遺伝子操作した。表1Aおよび1Bは、例となるHtt標的化ZFPのDNA結合ドメインの認識ヘリックスを示す一方で、表2Aおよび2Bは、これらのZFPの標的配列を示す。
Httの両方の対立遺伝子を抑制するために(対立遺伝子非特異的)、ZFPを、Httプロモーターおよびエクソン1領域に結合するように設計し、この標的部位は、完全にCAG反復内にはなかった。図1Aを参照されたい。Htt抑制ZFP TFの活性を試験するために、ZFP TFをヒト細胞内にトランスフェクトし、Httの発現を、リアルタイムRT−PCRを使用して監視した。
変異Htt対立遺伝子の選択的抑制を達成するために、ZFPをCAG反復内で結合するように設計した。図1Bは、1種類のかかるZFPを示し、このうちジンクフィンガーの連続したアレイが抑制ドメイン(例えば、KOX1からのKRABドメイン)に連結され、これらのZFPは、転写抑制に必要とされる閾値占有率が伸長したCAG反復上でのみ確立され得るように、適切な親和性をもって設計することができる。図1C、1D、および1Eは、伸長したCAG反復への特異的結合を可能にし得るZFP設計の3つの他の例を示す。
5’GAAGATCTCACTTGGGGTCCTCAGGTCGTGCCGAC(配列番号139)
および次の逆方向プライマー:
5’GTATCCAAGCTTCAGCTTTTCCAGGGTCGCCTAGGCGGTCT.(配列番号140)を使用して増幅した。
5’GCCTAGGCGACCCTGGAAAAGCTGATGAAGGCC(配列番号141)
および次の逆方向プライマー:5’
5’GTATCCAAGCTTGAGCTGCAGCGGGCCCAAACTCACG(配列番号142)を使用して増幅した。
図4Aは、CAG18/45 HD線維芽細胞株において、ZFP−TF 30640、30643、30645、および33074(全てがCAG反復に標的を定められ、KRAB抑制ドメインを使用する)を試験した結果を示す。異なる量のZFP mRNAを、Amaxaヌクレオフェクターを使用して、示されるようにトランスフェクトし、変異Htt(右側のバー)、野生型Htt(中央のバー)、および総Htt(両方の対立遺伝子、左側のバー)の発現を、トランスフェクション後24時間時点で上述のように測定した。ZFP 30640、30645、および33074は、3μg〜10ngのZFP mRNA用量範囲全体にわたって対立遺伝子特異的抑制を主導する一方で、30643は、30ng以上である用量で両方の対立遺伝子を有意に抑制するように思われ、10ng用量で対立遺伝子選択性を示し始める。
実施例3(図3E)において単離されたRNAを使用して、他のCAG反復含有遺伝子の抑制を分析し、その結果が図5に描写される。次の遺伝子の発現レベルを、リアルタイムPCRを使用して検査し、アクチンのそれらに対して正規化した:アタキシン2(「ATXN2」)、ダイナミン(「DNM1」)、Fボックスオンリータンパク質11(「FBXO11」)、硝酸塩レダクターゼ(「NAP」)、複製起点認識複合体サブユニット4(「ORC4」)、ホスホキナーゼ(「PHK」)、OCT3/4タンパク質(「POU3」)、THAPドメイン含有アポトーシス関連タンパク質2(「THAPII」)、TATA結合タンパク質(「TBP」)、およびスタニオカルシン1(「STC1」)。加えて、転写開始部位(TSS)に対するCAG反復配列の箇所を書き留め、それは図3Fにおいて「TSS@」として示され、ここで「+」は、TSSの下流であるCAG反復の塩基の位置を示し、「−」は、TSSの上流であるCAG反復の塩基の位置を示す。また、CAG反復の数(「番号CAG」)が各遺伝子につき示される。
HD線維芽細胞(CAG18/45)をトランスフェクトして、CAG標的化ZFPのゲノム全域にわたる特異性をマイクロアレイ分析によって研究した(図6)。ZFPを、示される用量でmRNAトランスフェクション(Amaxaヌクレオフェクション)によって送達、すなわち、ZFP 30640、30645、および33074を、それぞれ75ng、15ng、および15ng用量で六重にトランスフェクトした。GFP−Kox mRNA(150ng)を対照としてトランスフェクトし、それを担体として使用して、全ての試料中のトランスフェクトされたmRNAの総量を150ngにした。CAG18(099T、中央のバー)およびCAG45(099C、右側のバー)対立遺伝子からの発現を、対立遺伝子特異的qPCR試薬によって、トランスフェクション後24時間時点で上述のように測定した(試料(1〜6)の各々は、生物学的反復実験試料(別個のトランスフェクション)である)。HttレベルをGAPDHのそれらに対して正規化した。Httの変異対立遺伝子特異的抑制が3つ全てのZFPについて観察された。4つの最も類似した反復実験試料を次いで、マイクロアレイ分析(Affymetrix HGU133プラス2.0)のために次のように選定した:GFP反復実験試料1、3、4、および6;30640反復実験試料2、3、5、および6;30645反復実験試料2、3、5、および6;ならびに33074反復実験試料1、3、4、および5をマイクロアレイ分析に使用した。Robust Multi−array Average(RMA)を使用して、各プローブセットからの原シグナルを正規化し、T検定を使用してZFPでトランスフェクトされた試料をGFPでトランスフェクトされた試料と比較し、「変更」呼び出しを、対照試料と比べて2倍超の差異および0.05未満のT検定P値を有する遺伝子(プローブセット)に対して行った。その基準に基づいて、30640は、スタニオカルシン1(STC1)および伸長したシナプトタグミン様タンパク質1(ESYT1)の2つの遺伝子のみを抑制し、30645および33074は、それぞれSTC1およびインターロイキン17受容体A(ILR17RA)である各々1つの遺伝子しか抑制しなかった。アレイ上のHttプローブセットが野生型Htt mRNAおよび変異Htt mRNAの両方を検出するので、Httは抑制された(2倍超の抑制)遺伝子として検出されなかった。この実験は、変異Htt特異的ZFPが、Httの効率的な対立遺伝子特異的抑制を主導するレベルで発現されるとき、ゲノム全域にわたる非常に高い特異性をもって作動し得ることを実証する。
HD iPSC/ESCをアキュターゼにより継代し、マトリゲルコーティングプレート上で、E8培地(Life Technologies)中で培養した。神経幹細胞を、StemPro Neural Induction Medium(Life Technologies)を使用して誘導した。簡潔に述べると、iPSC/ESCを、ゲルトレックス(geltrex)コーティングされた6ウェル皿中に200,000細胞/ウェルで播種し、10〜20%コンフルエントとなったときに培地をStemPro Neural Induction Mediumに変更した。培地を2日毎に変更し、7日目にNSCを採取し、増殖させた。StemPro NSC SFM medium(Life Technologies)を使用して、NSCを培養した。HD NSC(CAG17/69、Coriell GM23225 iPSCに由来)を、1.5または0.5μgのZFP mRNAで、ヌクレオフェクションを使用してトランスフェクトした。トランスフェクションの48時間後、細胞を採取し、発現をRT−PCRによって定量した。Htt発現の対立遺伝子特異的検出を、SNP(rs1143646)ベースの遺伝子型決定アッセイ4351376番(Applied Biosystems)を使用して行った。試験されたZFP用量で、30640は、変異Httの対立遺伝子特異的抑制を提供し、30643は、野生型Httの約50%の抑制および変異Httの約90%の抑制を提供し、30648は、両方の対立遺伝子を抑制した(図7)。これらのZFPの挙動は、HD線維芽細胞内のそれと一致していた(図4)。各試料についての総Httレベル(中央のバー)は、変異Httのレベルおよび野生型Httレベルと一致していた。
HD NSCをアキュターゼにより、ゲルトレックスコーティングされたプレート上で継代した。培地を、(bFGFおよびEGF)を含まないStemPro NSC SFM mediumを含有する神経分化培地に変更することによって、ニューロン分化を誘導した。培地を最大21日間にわたって3〜4日毎に変更した。ニューロンを、神経分化培地中の培養によってNSC(CAG17/48、HD ESCに由来)から誘導した。神経誘導後15日目に、細胞を1.0または0.5μgのZFP mRNAで、ヌクレオフェクションを使用してトランスフェクトした。トランスフェクションの48時間後、細胞を採取し、遺伝子発現をRT−PCRによって定量した。この患者の株は、野生型および変異HttのqPCRベースの対立遺伝子特異的検出を可能にするSNPを含有しないので、総Httレベルしか測定することができない。我々は、30640および33074がHD線維芽細胞およびNSCにおいてCAG18対立遺伝子もCAG17対立遺伝子も抑制しないことを示したので、30640処理および33074処理試料中で観察された総Httのレベルは、変異対立遺伝子(CAG48)の対立遺伝子特異的抑制と一致している。試験されたZFP用量での30643および30648によるより強力な抑制もまた、HD線維芽細胞内のこれらのZFPの挙動と一致している(図8)。
R6/2マウス(約120回CAG反復を有する変異ヒトHttエクソン1の導入遺伝子を担持する、Mangiarini et al,(1996)Cell 15:197を参照されたい)に、CMVプロモーターによって主導されるZFP 30640−KOXまたはGFPのいずれかをコードする組替えAAV2/6の3e10ベクターゲノムの定位的な両側線条体注射を与えた。マウスに5週齢時点で注射し、分子分析のために8週齢時点で屠殺した。左および右線条体を各半球から切り離し、急速冷凍した。変異Htt導入遺伝子の抑制を評価するために、総RNAをTRIzol Plus(Life Technologies)により各線条体から抽出し、続いてHigh Capacity RT(Life Technologies)を使用してcDNA合成を行った。その後、R6/2導入遺伝子発現をqPCRによって測定し、3つの参照遺伝子(Atp5b、Eif4a2、UbC)の幾何平均に対して、Bennらによって以前に記載されたように正規化した((2008)Molecular Neurodegeneration:3,17)。我々は、4つのZFP処理線条体において、4つのGFP処理対照線条体と比べて変異Htt導入遺伝子の統計的に有意な抑制(P<0.001)を観察した(図9)。平均R6/2抑制は、GFP処理対照の64.9%であった。線条体の完全な網羅が単回の定位的な注射を使用しては達成されなかったこと、およびAAV2/6がニューロン細胞に優先的に形質導入することから、観察された抑制(約35%)の倍率は、AAVベクターにより形質導入された細胞内の実際の抑制を過小評価する可能性が高い。
ジンクフィンガー転写因子を、短いCAG反復と長いGAG反復との間をよりよく識別するように遺伝子操作するために、我々は、個々のジンクフィンガー転写因子のDNA結合親和性を減少させると同時に、CAG反復内の隣接した副部位に結合した融合タンパク質の異なるコピー間の相互作用強度を増加させることにした。個々のジンクフィンガー転写因子のDNA結合親和性を減少させるために、我々は、より少数のジンクフィンガーを有するかつ/または最適に満たない親和性でDNAに結合することが予想されるアミノ酸配列を有する、ジンクフィンガードメインを生成した。CAG反復内の隣接した副部位に結合した融合タンパク質の異なるコピー間の相互作用強度を増加させるために、我々は、種々の二量体化ドメインを我々のジンクフィンガー転写因子に融合した。二量体化ドメインは、「パラレル」な様式で相互作用し、それらを含有する融合タンパク質の「頭−頭(head−to−head)」または「尾−尾(tail−to−tail)」二量体を産出することができる。1つの可能性のある二量体化戦略は、「頭−尾(head−to−tail)」配向で結合する、同一のZFP−転写因子融合物のアレイを必要とし、故に、この戦略は、「アンチパラレル」な様式で相互作用する二量体化ドメインを必要とする。例えば、McClain et al.(2001)J.Am.Chem.Soc.123:3151−3152)および二量体化ジンクフィンガーペプチド(Giesecke et al.(2006),Molecular Systems Biology 2:2006.2011)を参照されたい。
ZFP−ZFP−KOX設計のものであるZFP TFをHD線維芽細胞内で試験した。これらの実験において、2つのZFP DNA結合ドメインを柔軟なリンカー(LRQKDAARGSAAMAERPFQ、配列番号179)で一緒に連結し、KOX抑制ドメインに融合した。リンカーを保存されたヒスチジンとシステインとの間に配置した。タンパク質を、示される用量のZFP mRNAを使用して上述のように試験した。CAG18/45(図12A)およびCAG20/41(図12B)HD線維芽細胞株におけるこれらの結果は、活性のより低いZFP DNA結合ドメインをこの様式で連結することが、対立遺伝子特異的抑制を主導する複合的なZFPをもたらし得ることを実証した。
本明細書に記載されるZFPをまた、Htt発現を活性化するそれらの能力について評
価した。マウスHttの+200〜+467bp領域(転写開始部位に対して)に標的を定められたZFPを、NFκB p65サブユニットの転写活性化ドメインに融合した。この標的化する領域を選定したのは、この断片が、HDの種々のノックインマウスモデルにおけるヒトHttからの対応する配列(エクソン1配列の大部分およびいくつかのイントロン1配列)によって置換されたためであり(Menalled et al.(2003)J.Comp.Neurol 4651:11−26、Wheeler et al.(2000)Hum Mol Genet 8:115−122)、したがってこの領域に標的を定められたZFPは、それらの動物において野生型対立遺伝子を選択的に活性化することができるが、ノックイン対立遺伝子は活性化しない。
インビボでのHtt特異的ZFP TFの有効性を試験するために、ZFPをコードするAAV2ベクターを産生する。これらのAAV2ベースの構築物を次いで、マウスの脳に送達する。ヒトHtt特異的ZFP TFについては、AAVベクターを、R6.2マウスまたはBAC HDマウス(C57Bl/6またはFVB/N株)に送達して、ヒト導入遺伝子の抑制、ならびにHD様表現型の変化を評価する。マウスHtt特異的ZFP(活性化因子または抑制因子)については、AAVベクターを、野生型マウス(C57Bl/6またはFVB/N)またはヒトHttノックインマウス(HdhQ111/Q7、HdhQ140/Q7、またはHdhQ175/Q7)に送達して、内因性マウスHtt発現の活性化または抑制を評価する。CAG伸長対立遺伝子を優先的に標的とするZFPについては、AAVベクターを、R6.2マウスまたはヒトHttノックインマウス(HdhQ111/Q7、HdhQ140/Q7、またはHdhQ175/Q7)に送達して、野生型対立遺伝子対伸長したHtt対立遺伝子の選択的抑制を検査する。屠殺に次いで、脳組織をTaqmanリアルタイムRT−PCRによってHtt発現について分析し、Htt遺伝子がZFP−TFによって調節されることを実証する。
上で特定されたHtt特異的ZFP TFを、脳神経栄養因子に特異的なZFP TFと共トランスフェクトする。使用された脳神経栄養因子に特異的なZFP TFは、GDNFまたはBDNFのいずれかに特異的である。
ヒトHttおよびマウスHttを標的とするZFNを、CAG反復に隣接する配列、すなわち最初のコードATG、停止コドンの近くの配列、ならびに先のエクソンにおける配列を標的とするように設計した。ZFNを設計し、プラスミドまたはアデノウイルスベクターに、本質的にUrnov et al.(2005)Nature 435(7042):646−651、Perez et al(2008)Nature Biotechnology 26(7):808−816、および米国特許公開第2008/0131962号に記載されるように組み込んだ。
切断活性を試験するために、上述のヒトHtt特異的ZFNの対をコードするプラスミドをK562細胞内にトランスフェクトした。K562細胞をAmerican Type Culture Collectionから入手し、推奨されるように、10%の適格な仔ウシ胎児血清(FCS,Cyclone)を補充したF−12培地(Invitrogen)中で成長させた。細胞を、TrypLE Select(商標)プロテアーゼ(Invitrogen)を使用してプラスチックウェアから分離した。トランスフェクションのために、100万個のK562細胞を、2μgのジンクフィンガーヌクレアーゼプラスミドおよび100μLのAmaxa溶液Tと混合した。細胞を、Amaxa Nucleofector II(商標)中で、プログラムU−23を使用してトランスフェクトし、1.4mLの温かいF−12培地+10%FCS中に回収した。
上述のCAG反復に隣接する配列に対して最も大きい切断活性を有するHtt特異的ZFNを、標的化組み込み戦略に使用して、様々な長さのCAG反復をHttの野生型コピーに導入する。50、80、109、および180回反復CAG単位を含有するドナーを構築する。これらのドナーを次いで、上述のHtt特異的ZFNをコードするプラスミドと共にK562細胞内にトランスフェクトする。ドナー組み込みの検証を、ゲノムDNA単離、PCR増幅(上述のように)、続いて目的領域の配列決定によって達成する。
先のエクソンを切断するZFNは、非相同末端結合(NHEJ)の結果として小さい挿入または欠失(インデル)をもたらし得、これはHttの一方または両方の対立遺伝子が妨害された細胞モデルを生成し得る。
最初のまたは最後のコードエクソンに対して最も大きい切断活性を有するZFNを使用して、野生型および変異Htt対立遺伝子を異なるレポータータンパク質でタグ付けする。各レポーター(AおよびB)に対するドナーDNAを、先頭のZFN対(複数可)の切断部位に基づいて設計して、レポーター遺伝子の標的化組み込みがHttへのフレーム内融合をもたらすことを可能にする。最も高い組み込み頻度を提供するドナーDNA構築物を選択するために、ドナーDNAを、先頭のZFN対(複数可)と、K562細胞内に共トランスフェクトする。
TALE DNA結合ドメインをKox1タンパク質(TALE TF)からのKRAB抑制ドメインに連結し、それを使用して、HD患者(CAG 20/41)由来の線維芽細胞内のHtt遺伝子の抑制を試験する。TALEタンパク質の構築を以前に記載されたように行い(譲受人共通の米国特許公開第20110301073号および譲受人共通の米国特許出願第13/679,684号を参照されたく、それらの両方は、参照により本明細書に組み込まれる)、3つの異なるC末端構造:+63、+231、および+278を用いて米国公開特許第20110301073号に記載されるように構築した。TALE TF発現プラスミドを構築するために、以前に記載されたTALEN発現プラスミド(米国公開特許第20110301073号を参照されたい)を使用したが、TALEN内に使用されたFokIドメインをKRAB抑制ドメインで置換したことを除く。TALEタンパク質およびKRABドメインのC末端の連結が下に示され、ここでKRABドメイン配列は下線によって示される。太字および斜体文字は、三重フラッグタグを示し、太字文字は、核局在化配列を示し、「[反復]」は、TALE反復単位アレイ(全反復とC末端半反復)の箇所を示し、波線を引かれた部分は、KRABドメインの配列を示す:
Claims (20)
- Htt遺伝子に結合する非天然型ジンクフィンガータンパク質であって、前記ジンクフィンガータンパク質は、以下:
(i)
F1: RSDNLSE (配列番号60);
F2: KRCNLRC (配列番号61);
F3: QSGDLTR (配列番号18);
F4: QSGDLTR (配列番号18);
F5: RSDNLSE (配列番号60);および
F6: KRCNLRC (配列番号61);または
(ii)
F1: RSDNLSE (配列番号60);
F2: KRCNLRC (配列番号61);
F3: QSSDLSR (配列番号31);
F4: QWSTRKR (配列番号63);
F5: QSSDLSR (配列番号31);および
F6: QWSTRKR (配列番号63);または
(iii)
F1: RSDNLSE (配列番号60);
F2: KRCNLRC (配列番号61);
F3: RSDNLSE (配列番号60);
F4: KRCNLRC (配列番号61);
F5: RSDNLSE (配列番号60);および
F6: KRCNLRC (配列番号61);または
(iv)
F1: RSDNLSE (配列番号60);
F2: KRCNLRC (配列番号61);
F3: QSSDLSR (配列番号31);
F4: QWSTRKR (配列番号63);および
F5: QSGDLTR (配列番号18);または
(v)
F1: QSSDLSR (配列番号31);
F2: QWSTRKR (配列番号63);
F3: QSSDLSR (配列番号31);
F4: QWSTRKR (配列番号63);および
F5: QSGDLTR (配列番号18);または
(vi)
F1: QSGDLTR (配列番号18);
F2: QSSDLSR (配列番号31);
F3: QWSTRKR (配列番号63);
F4: QSSDLSR (配列番号31);および
F5: QWSTRKR (配列番号63);または
(vii)
F1: RSDNLSE (配列番号60);
F2: KRCNLRC (配列番号61);
F3: QSGDLTR (配列番号18);
F4: QSSDLSR (配列番号31);および
F5: QWSTRKR (配列番号63)
のF1〜F5、およびF1〜F6と順序付けられた、5つ、または6つのジンクフィンガードメインを含み、前記ジンクフィンガータンパク質は、配列GCAGCAGCAGCAGCAを含む標的部位に結合する、ジンクフィンガータンパク質。 - 前記ジンクフィンガータンパク質は、F1〜F5、およびF1〜F6と順序付けられた、5つ、または6つのジンクフィンガードメインを含む、請求項1に記載のジンクフィンガータンパク質。
- 前記ジンクフィンガータンパク質は、前記Htt遺伝子の前記CAG反復領域内の配列に結合する、請求項1または請求項2に記載のジンクフィンガータンパク質。
- DNAに結合したときにジンクフィンガータンパク質の多量体化を可能にする、二量体化ドメインをさらに含む、請求項1〜3のいずれかに記載のジンクフィンガータンパク質。
- 請求項1〜4のいずれかに記載のジンクフィンガータンパク質と、機能的ドメインとを含む、融合タンパク質であって、前記機能的ドメインは、転写活性化ドメイン、転写抑制ドメイン、およびヌクレアーゼドメインからなる群から選択される、融合タンパク質。
- 請求項1〜4のいずれかに記載の1つ以上のジンクフィンガータンパク質、または請求項5に記載の融合タンパク質をコードする、ポリヌクレオチド。
- 請求項1〜4のいずれかに記載の1つ以上のジンクフィンガータンパク質、請求項5に記載の融合タンパク質、または請求項6に記載のポリヌクレオチドを含む、宿主細胞。
- 請求項1〜4のいずれかに記載の1つ以上のジンクフィンガータンパク質、請求項5に記載の融合タンパク質、または請求項6に記載のポリヌクレオチドを含む、医薬組成物。
- 細胞内のHtt遺伝子の発現を修飾するための、請求項5に記載の1つ以上の融合タンパク質をコードする1つ以上のポリヌクレオチドを含む医薬組成物。
- 前記Htt遺伝子は、少なくとも1つの変異対立遺伝子を含む、請求項9に記載の医薬組成物。
- 前記Htt遺伝子は、野生型である、請求項9に記載の医薬組成物。
- 前記融合タンパク質は、ヌクレアーゼドメインまたは抑制ドメインを含み、前記Htt遺伝子の発現は、不活性化される、請求項9〜11のいずれかに記載の医薬組成物。
- 細胞内のHtt遺伝子を修飾するための医薬組成物であって、前記医薬組成物は、請求項5に記載の1つ以上の融合タンパク質をコードする1つ以上のポリヌクレオチドを含み、前記1つ以上の融合タンパク質は、ヌクレアーゼドメインを含み、前記Htt遺伝子の配列は、修飾される、医薬組成物。
- ハンチントン病の研究のためのモデル系を生成するインビトロ方法であって、前記方法は、細胞に、請求項5に記載の1つ以上の融合タンパク質をコードする1つ以上のポリヌクレオチドを投与することを含み、前記1つ以上の融合タンパク質は、ヌクレアーゼドメインを含み、前記Htt遺伝子の配列は、修飾される、インビトロ方法。
- 前記Htt遺伝子は、1つ以上の変異対立遺伝子を含むように修飾される、請求項14に記載の方法。
- 前記変異対立遺伝子は、伸長したトリヌクレオチド反復を含む、請求項15に記載の方法。
- 前記細胞は、胚性幹細胞を含む、請求項14に記載の方法。
- 請求項9に記載の医薬組成物を含む単離された細胞。
- 請求項13に記載の医薬組成物を含む単離された細胞。
- 請求項18または19に記載の1つ以上の細胞を含む、ハンチントン病を治療するための医薬組成物。
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