KR102084539B1 - 헌팅턴병을 치료하기 위한 방법 및 조성물 - Google Patents

Abstract

헌팅턴 병을 치료하거나 또는 예방하기 위한 방법 및 조성물이 본 명세서에 개시된다.

Description

헌팅턴병을 치료하기 위한 방법 및 조성물{METHODS AND COMPOSITIONS FOR TREATING HUNTINGTON'S DISEASE}

관련출원과의 상호 참조

본 출원은 2012년 2월 29일 출원된 미국 가특허 출원 제61/605,028호의 우선권을 주장하며, 이 기초출원은 그의 전문이 본 명세서에 참조로서 포함된다.

기술분야

본 개시내용은 유전자 발현 및 게놈 편집 분야에 관한 것이다.

헌팅턴 무도병으로도 알려진 헌팅턴병(Huntington's Disease: HD)은 운동, 인지 및 정신의학적 교란의 진행성 장애이다. 약 10%의 경우에 21세 전에 개시되지만, 이 질병의 평균 개시 연령은, 35 내지 44세이며, 질병의 진단 후 평균 수명은 15 내지 18년이다. 유병률은 서양 유럽인 혈통의 100,000명의 사람 중에서 약 3 내지 7명이다.

헌팅턴병은 트라이뉴클레오타이드 반복체 확장 장애의 예이며, 1990년대 초에 처음으로 특성규명되었다(문헌[Di Prospero and Fischbeck (2005) Nature Reviews Genetics 6:756-765] 참조). 이들 장애는 3개 뉴클레오타이드 세트의 불안정한 반복체의 국소화된 확장을 수반하며, 확장된 반복체가 있는 유전자의 기능 상실, 독성 기능의 획득 또는 둘 다를 초래할 수 있다. 트라이뉴클레오타이드 반복체는 비암호 및 암호 유전자 영역을 포함하는 유전자의 어떤 부분에 위치될 수 있다. 암호 영역 내에 위치된 반복체는 반복된 글루타민 암호화 트라이플렛(triplet)(CAG) 또는 알라닌 암호화 트라이플렛(CGA) 중 하나를 전형적으로 수반한다. 비암호 서열 내에서 확장된 반복체 영역은 유전자의 비정상적 발현을 야기할 수 있는 한편, 암호 영역 내에서 확장된 반복체(또한 코돈 반복 장애로서 알려짐)는 미스폴딩 및 단백질 응집을 야기할 수 있다. 비정상 단백질과 병태생리적으로 관련된 정확한 원인은 종종 알려져 있지 않다. 전형적으로, 트라이뉴클레오타이드 확장된 야생형 유전자에서, 이들 영역은 정상 집단에서 가변적인 다수의 반복체 서열을 함유하지만, 병에 걸린 집단에서, 반복체의 수는 2배로부터 로그 차수 증가로 반복체의 수에서 증가될 수 있다. HD에서, 반복체는 거대 세포기질의 단백질 헌팅턴(Htt)의 N 말단 암호 영역 내에 삽입된다. 정상 Htt 대립유전자는 15 내지 20개 CAG 반복체를 함유하는 한편, 35개 이상의 반복체를 함유하는 대립유전자는 잠재적으로 HD 유발 대립유전자로 고려될 수 있고, 질병이 발생할 위험을 부여한다. 36 내지 39개의 반복체를 함유하는 대립유전자는 불완전하게 침투성인 것으로 고려되며, 해당 대립유전자를 은닉하는 해당 개체는 질병이 발생할 수도 있고 발생하지 않을 수도 있는 반면(또는 이후의 삶에서 증상이 발생할 수도 있음) 40개 이상의 반복체를 함유하는 대립유전자는 완전히 침투성인 것으로 고려된다. 사실, 이것을 지니는 HD 대립유전자를 함유하는 무증상 사람은 보고되지 않았다. 청소년기 발생 HD(<21세의 연령)를 지니는 해당 개체는 종종 60개 이상의 CAG 반복체를 가지는 것이 발견되었다. CAG 반복체에서의 증가에 추가로, 또한 영역이 폴리 글루타민보다는 폴리-세린 폴리펩타이드(+1 프레임시프트의 경우에 AGC 반복체에 의해 암호화됨) 트랙을 암호화하도록, HD는 반복 서열 내에서 +1 및 +2 프레임이동(frameshift)을 수반할 수 있는 것으로 나타났다(Davies and Rubinsztein (2006) Journal of Medical Genetics 43: 893-896).

HD에서, 돌연변이체 Htt 대립유전자는 보통 한쪽의 부모로부터 우성형질로서 유전된다. HD 환자로 태어난 어떤 환자는 다른 환자가 해당 장애로 고통받지 않는다면 질병이 발생할 50%의 기회를 가진다. 일부 경우에, 부모는 중간체 HD 대립유전자를 가질 수 있고, 무증상일 수 있는 반면, 반복체 확장에 기인하여, 아이는 해당 질병을 나타낸다. 추가로, HD 대립유전자는 예상으로서 알려진 현상을 나타낼 수 있되, 증가된 중증도 또는 개시 연령의 감소는 정자형성 동안 반복 영역의 불안정한 특성 때문에 몇몇 발생에 거쳐서 관찰된다.

더 나아가, Htt에서 트라이뉴클레오타이드 확장은 선조체에서 중형 돌기(medium spiny) 감마-아미노뷰티르산(gamma-aminobutyric acid: GABA) 투사 뉴런에서의 뉴런 상실을 야기하며, 뉴런 상실은 또한 신피질에서 일어난다. 엔케팔린을 함유하고 외부 담창구로 돌출된 중형 돌기 뉴런은 물질 P를 함유하고 내부 담창구로 돌출된 뉴런보다 더 많이 수반된다. 헌팅턴병을 지니는 사람에서 크게 영향받은 다른 뇌 영역은 흑질, 피층 3, 5 및 6, 해마의 CA1 영역, 두정엽에서의 각회, 소뇌의 푸르키네 세포(Purkinje cell), 시상하부의 외측융기핵, 및 시상의 중심정중 다발 옆 복합체(centromedialparafascicular complex)를 포함한다(Walker (2007) Lancet 369:218-228).

정상 Htt 단백질의 역할은 부족하게 이해되고 있지만, 이는 신경 발생, 아포토시스 세포사(apoptotic cell death) 및 소포 유통(vesicle trafficking)에 연루될 수 있다. 추가로, 야생형 Htt가 뇌 유래 신경영양인자(brain-derived neurotrophic factor: BDNF)의 생성, 선조 뉴런(striatal neuron)에 대한 생존조력(pro-survival) 인자를 자극한다는 증거가 있다. HD의 진행은 HD의 마우스 모델에서 BDNF 발현의 감소와 상호관련되며(Zuccato et al (2005) Pharmacological Research 52(2): 133-139), 아데노-관련 바이러스(adeno-associated viral: AAV) 벡터-매개 유전자 전달을 통한 BDNF 또는 신경교세포주 유래 신경영양인자(GDNF) 의 전달은 HD의 마우스 모델에서 선조 뉴런을 보호할 수 있다는 것을 나타내었다(Kells et al, (2004) Molecular Therapy 9(5): 682-688).

HD에 대한 치료 선택사항은 현재 매우 제한되어 있다. 샤페로닌의 과발현 또는 화합물 겔다나마이신에 의한 열 충격 반응의 유발과 같은 연장된 폴리-글루타민 트랙을 통해 일어나는 단백질 응집과 관련된 독성을 방지하도록 설계된 일부 가능성 있는 방법은 시험관내 모델에서 이들 독성에서의 감소를 나타내었다. 다른 처리는 질병의 임상적 징후에서 아포토시스의 역할을 표적화한다. 예를 들어, 한 명의 부모가 HD 대립유전자를 함유하고, 나머지 부모가 카스파제 1에 대한 우성 음성 대립유전자를 가지는 경우, 한 쌍의 마우스의 새끼에서의 동물 모델에서 카스파제 활성의 차단을 통해 질병 증상을 늦추는 것이 나타났다. 추가적으로, 카스파제에 의한 돌연변이체 HD Htt의 절단은 질병의 병원성에서 어떤 역할을 할 수 있다. 카스파제-6 저항성 돌연변이체 Htt를 운반하는 유전자이식 마우스는 정상 뉴런 기능을 유지하는 것으로 발견되었고, 비카스파제 저항성 돌연변이체 Htt 대립유전자를 운반하는 마우스에 비해 선조 신경퇴화를 발생시키지 않았다(문헌[Graham et al (2006) Cell 125: 1179-1191] 참조). 아포토시스 경로의 구성원을 표적화하는 분자는 또한 증상에 대해 느린 영향을 가지는 것으로 나타났다. 예를 들어, 화합물 zVAD-fmk 및 미노싸이클린(이들 둘 다 카스파제 활성을 저해함)은 마우스에서 질병 징후를 늦추는 것으로 나타났다. 약물 레마세마이드(remacemide)는 또한 작은 HD 인간 시험에서 사용되었는데, 화합물이 NDMA 수용체에 대한 돌연변이 Htt의 결합을 방지하여 신경 세포 상에서 독성 효과의 발휘를 방지하는 것으로 생각되었기 때문이다. 그러나, 이들 시험에서의 뉴런 기능에서 통계학적으로 유의한 개선은 관찰되지 않았다. 추가로, 헌팅턴 연구 그룹은 코엔자임 Q를 사용하여 무작위, 이중 맹검 연구를 수행하였다. 코엔자임 Q10으로 처리한 환자 중에서 더 느린 질병 진행에 대한 경향이 관찰되었지만, 전체 기능적 용량의 감소속도에서 유의한 변화가 없었다. (앞서 언급한 문헌[Di Prospero and Fischbeck]). 미국 특허 제2011/0082093호는 Htt에 대해 표적화된 특이적 아연 핑거 단백질을 개시한다.

따라서, 헌팅턴병의 치료 및 예방을 위한 조성물 및 방법에 대한 필요가 남아있다.

헌팅턴병을 치료하기 위한 방법 및 조성물이 본 명세서에 개시되어 있다. 특히 헌팅턴병을 치료하기 위해서 HD Htt 대립유전자를 변형시키기(예를 들어, 이것의 발현을 조절하는 것) 위한 방법 및 조성물이 제공된다. 또한 헌팅턴병의 동물 모델을 만들기 위한 방법 및 조성물이 제공된다.

따라서, 일 양태에서, HD 대립유전자(예를 들어, Htt)의 발현을 조절하는 유전자 조작된 DNA 결합 도메인(예를 들어, 아연 핑거 단백질 또는 TAL 효과기(TALE) 단백질)이 제공된다. 유전자 조작된 아연 핑거 단백질 또는 TALE는 비자연적으로 생기는 아연 핑거 또는 DNA 결합 도메인(예를 들어, 인식 나선 또는 RVD)이 변성되어(예를 들어, 선택 및/또는 합리적 설계에 의해) 사전 선택된 표적 부위에 결합되는 TALE 단백질이다. 본 명세서에 기재된 아연 핑거 단백질 중 어떤 것은 1, 2, 3, 4, 5, 6 이상의 아연 핑거를 포함할 수 있으며, 각각의 아연 핑거는 선택된 서열(들)(예를 들어, 유전자(들))에서 표적 하위부위에 결합되는 인식 나선을 가진다. 유사하게, 본 명세서에 기재된 TALE 단백질은 임의의 수의 TALE RVD를 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 적어도 하나의 RVD는 비특이적 DNA 결합을 가진다. 일부 실시형태에서, 적어도 하나의 인식 나선(또는 RVD)은 비자연적으로 생긴다. 특정 실시형태에서, 아연 핑거 단백질은 표 1A 및 1B에서 나타내는 인식 나선을 가진다. 다른 실시형태에서, 아연 핑거 단백질은 표 2A 및 2B에 나타낸 표적 서열에 결합된다. 일부 실시형태에서, 아연 핑거 단백질은 표 2C에서의 인식 나선을 포함한다. 특정 실시형태에서, 아연 핑거 단백질은, 예를 들어 피험체에 투여를 위해 약제학적 조성물로 제형화된다.

일 양태에서, Htt의 CAG 반복체 영역 바깥의 서열에 완전히 또는 부분적으로 결합된 리프레서(ZFP-TF 또는 TALE-TF)가 제공된다. 다른 양태에서, Htt의 CAG 반복체 영역 내의 서열에 결합된 ZFP 또는 TALE 리프레서(ZFP-TF 또는 TALE-TF)가 제공된다. 일부 실시형태에서, 이들 ZFP-TF 또는 TALE-TF는 야생형 길이의 반복체 트랙에 비해 확장된 트라이뉴클레오타이드 트랙에 유선적으로 결합되고, 이에 의해 확장된 대립유전자의 우선적 억제를 달성한다. 일부 실시형태에서, 이들 ZFP-TF 또는 TALE-TF는 DNA에 결합될 때 멀티머화되게 하는 단백질 상호작용 도메인("또는 다이머화 도메인")을 포함한다. 일부 실시형태에서, 이들 ZFP-TF 또는 TALE TF는 반복체 서열에 대한 협력적 DNA 결합을 달성하며, 따라서 확장된 대립유전자는 야생형 대립유전자보다 매우 다수의 ZFP 또는 TALE 단백질에 의해 더 효율적으로 결합되고, 돌연변이체 대립유전자를 우선적으로 억제시킨다. 이들 협력적 결합 ZFP-TF 또는 TALE TF는 DNA에 결합될 때 멀티머화시키는 단백질 상호작용 도메인을 추가로 함유할 수도 있거나, 또는 함유하지 않을 수도 있다. 일부 실시형태에서, ZFP TF 또는 TALE TF는 주어진 크기의 멀티머의 안정한 복합체를 형성하며, 따라서, 특정 최소 크기 이상의 CAG 트랙과 우선적으로 상호작용할 수 있되, 최소 크기는 야생형 CAG 트랙 길이를 초과한다.

특정 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 바와 같은 ZFP 또는 TALE 단백질(예를 들어, 투 핸드(two-handed), 멀티머화 등)은 돌연변이체 Htt 대립유전자의 발현을 우선적으로 변형시킨다. 일부 실시형태에서, ZFP 또는 TALE은 돌연변이체 Htt 대립유전자에 특이적으로 결합되되, 확장된 트랙은 폴리-글루타민을 암호화하는 한편, 다른 실시형태에서, ZFP 또는 TALE은 돌연변이체 Htt 대립유전자에 특이적으로 결합되되, 확장 트랙은 폴리-세린을 암호화한다. 따라서, 일부 실시형태에서, ZFP-TF 또는 TALE-TF는 Htt 대립유전자의 야생형과 돌연변이체 형태를 둘 다 조절한다. 특정 실시형태에서, ZFP 또는 TALE은 야생형 Htt 대립유전자만을 조절한다. 다른 실시형태에서, ZFP 또는 TALE은 Htt의 돌연변이체 형태만을 조절한다.

다른 실시형태에서, 확장된 HD Htt 대립유전자와 관련된 공지된 SNP에 우선적으로 결합되는 억제 ZFP-TF 또는 TALE-TF가 제공된다. 이 방법에서, ZFP-TF 또는 TALE-TF는 SNP를 함유하는 돌연변이체 Htt 대립유전자에 특이적인데, 이는 돌연변이체 Htt 대립유전자를 특이적으로 억제시킨다. 다른 양태에서, 야생형 대립유전자와 관련된 SNP와 상호작용함으로써 야생형 Htt 대립유전자를 특이적으로 활성화시키는 ZFP-TF 또는 TALE-TF가 제공된다. 이 방법에서는, 야생형 Htt 대립유전자만 활성화된다.

특정 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 바와 같은 아연 핑거 단백질(ZFP) 또는 TALE 단백질은 융합 단백질의 부분으로서 조절 도메인(또는 기능성 도메인)과 조작적 연결에서 위치될 수 있다. 기능성 도메인은, 예를 들어 전사 활성화 도메인, 전사 억제 도메인 및/또는 뉴클레아제(절단) 도메인일 수 있다. ZFP 또는 TALE에 의한 융합을 위해 활성화 도메인 또는 억제 도메인 중 하나를 선택함으로써, 이러한 융합 단백질은 유전자 발현을 활성화하거나 또는 억제하는데 사용될 수 있다. 일부 실시형태에서, 돌연변이체 Htt 발현을 하향조절하기 위해 사용될 수 있는 전사 억제 도메인에 융합된 본 명세서에 기재된 바와 같은 돌연변이체 Htt에 표적화된 ZFP 또는 TALE를 포함하는 융합 단백질이 제공된다. 일부 실시형태에서, 야생형 Htt 대립유전자를 상향 조절할 수 있는 전사 활성화 도메인에 융합된 야생형 Htt 대립유전자에 표적화된 ZFP 또는 TALE를 포함하는 융합 단백질이 제공된다. 특정 실시형태에서, 조절 도메인의 활성은, 세포의 전사 기작과의 상호작용이 외인성 리간드 없이 일어나지 않도록, 외인성 소분자 또는 리간드에 의해 조절된다. 이러한 외부 리간드는 ZFP-TF 또는 TALE-TF의 전사 기작과의 상호작용 정도를 제어한다. 조절 도메인(들)은 하나 이상의 ZFP 또는 TALE 사이에, 하나 이상의 ZFP 또는 TALE 외부에 및 이들의 임의의 조합을 포함하여, ZFP 또는 TALE 중 하나 이상의 임의의 부분(들)에 조작가능하게 연결될 수 있다. 본 명세서에 기재된 어떤 융합 단백질은 약제학적 조성물로 제형화될 수 있다.

일부 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 바와 같은 유전자 조작된 DNA 결합 도메인은 융합 단백질의 부분으로서 뉴클레아제(절단) 도메인과 조작적 결합에 위치될 수 있다. 다른 실시형태에서, 뉴클레아제 시스템, 예컨대 CRISPR/Cas 시스템은 DNA 내 표적 위치로 뉴클레아제를 표적화하기 위해 특이적 단일 가이드 RNA와 함께 이용될 수 있다. 특정 실시형태에서, 이러한 뉴클레아제 및 뉴클레아제 융합은 줄기 세포, 예컨대 유도 만능 줄기 세포(induced pluripotent stem cell: iPSC), 인간 배아 줄기 세포(human embryonic stem cell: hESC), 중간엽 줄기 세포(mesenchymal stem cell: MSC) 또는 신경 줄기 세포에서 돌연변이체 Htt 대립유전자를 표적화하기 위해 이용될 수 있되, 뉴클레아제 융합 활성은 다수의 야생형 CAG 반복체를 함유하는 Htt 대립유전자를 초래할 것이다. 특정 실시형태에서, 변형된 줄기 세포를 포함하는 약제학적 조성물이 제공된다.

또 다른 양태에서, 본 명세서에 기재된 DNA 결합 단백질 중 어떤 것을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드가 제공된다. 다른 양태에서, CRIPSR/Cas 뉴클레아제 및 단일 가이드 RHA를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드가 제공된다. 이러한 폴리뉴클레오타이드는 헌팅턴병을 치료하는 것이 바람직한 피험체에 투여될 수 있다.

또한 추가 양태에서, 본 발명은 헌팅턴병의 연구를 위한 구체적 모델 시스템의 생성을 위한 방법 및 조성물을 제공한다. 특정 실시형태에서, 본 명세서에서 돌연변이체 Htt 대립유전자는 세포 및 동물 계통을 만들기 위해 배아 줄기 세포를 사용하여 만들어지는 모델이 제공되되, 구체적 길이(예를 들어, 50, 80, 109 및 180 CAG 반복체)의 트라이뉴클레오타이드 확장 트랙은 아연 핑거 뉴클레아제(ZFN), TALE-뉴클레아제(TALEN), 또는 CRISPR/Cas 뉴클레아제 구동 표적화된 통합을 사용하여 야생형 Htt 대립유전자에 삽입된다. 특정 실시형태에서, 모델 시스템은 시험관내 세포주를 포함하는 한편, 다른 실시형태에서, 모델 시스템은 유전자이식 동물을 포함한다. 본 명세서에 기재된 동물 모델들 중 임의의 것에 있어서, 동물은, 예를 들어 설치류(예를 들어, 래트, 마우스), 영장류(예를 들어, 비인간 영장류) 또는 토끼일 수 있다.

또 다른 양태에서, 본 명세서에 기재된 폴리뉴클레오타이드 중 어떤 것을 포함하는 유전자 전달 벡터가 제공된다. 특정 실시형태에서, 벡터는 아데노바이러스 벡터(예를 들어, Ad5/F35 벡터), 벡터는 통합 적격 또는 통합-결함 렌티바이러스 벡터를 포함하는 렌티바이러스 벡터(lentiviral vector: LV) 또는 아데노바이러스 관련 바이러스 벡터(adenovirus associated vector vector: AAV)이다. 따라서, 또한 본 명세서에서 적어도 하나의 뉴클레아제(ZFN 또는 TALEN)를 암호화하는 서열 및/또는 표적 유전자 내로 표적화된 통합을 위한 공여체 서열을 포함하는, 아데노바이러스(Ad) 벡터, LV 또는 아데노바이러스 관련 바이러스 벡터(AAV)가 제공된다. 특정 실시형태에서, Ad 벡터는, 키메라 Ad 벡터, 예를 들어 Ad5/F35 벡터이다. 특정 실시형태에서, 렌티바이러스 벡터는 인테그라제-결함 렌티바이러스 벡터(IDLV) 또는 통합 적격 렌티바이러스 벡터이다. 특정 실시형태에서 벡터는 VSV-G 외피(envelope)를 지니거나, 또는 다른 외피를 지니는 유사 유형(pseudo-typed)이다.

일부 실시형태에서, 헌팅턴병에 대한 모델 시스템이 제공되되, 표적 대립유전자(예를 들어, 돌연변이체 Htt)는 발현 마커로 표지된다. 특정 실시형태에서, 돌연변이체 대립유전자(예를 들어, 돌연변이체 Htt)가 표지된다. 일부 실시형태에서, 야생형 대립유전자(예를 들어, 야생형 Htt)가 표지되며, 추가적인 실시형태에서, 야생형과 돌연변이체 대립유전자는 별개의 발현 마커로 표지된다. 특정 실시형태에서, 모델 시스템은 시험관내 세포주를 포함하는 한편, 다른 실시형태에서, 모델 시스템은 유전자이식 동물을 포함한다.

추가적으로, 핵산 및/또는 단백질(예를 들어, ZFP 또는 TALE 또는 ZFP 또는 TALE를 포함하는 융합 단백질)이 또한 제공된다. 예를 들어, 특정 조성물은 약제학적으로 허용가능한 담체 또는 희석제와 조합된, 조절 서열에 작동가능하게 연결된 본 명세서에 기재된 ZFP 또는 TALE 중 하나를 암호화하는 서열을 포함하는 핵산을 포함하되, 조절 서열은 세포 내 핵산을 발현시킨다. 특정 실시형태에서, 암호화된 ZFP 또는 TALE는 HD Htt 대립유전자에 특이적이다. 일부 실시형태에서, 약제학적 조성물은 HD Htt 대립유전자를 조절하는 ZFP 또는 TALE 및 신경영양인자를 조절하는 ZFP 또는 TALE를 포함한다. 단백질계 조성물은 본 명세서에 개시된 바와 같은 하나 이상의 ZFP 또는 TALE 및 약제학적으로 허용가능한 담체 또는 희석제를 포함한다.

또 다른 양태에서 또한 본 명세서에 기재된 바와 같은 단백질, 폴리뉴클레오타이드 및/또는 조성물 중 어떤 것을 포함하는 단리된 세포가 제공된다.

다른 양태에서, 본 명세서에서 본 명세서에 기재된 방법 및 조성물을 사용하여 헌팅턴병을 치료하고/하거나 예방하기 위한 방법이 제공된다. 일부 실시형태에서, 해당 방법은 폴리뉴클레오타이드 및/또는 단백질이 바이러스 벡터, 비바이러스 벡터(예를 들어, 플라스미드) 및/또는 이들의 조합을 사용하여 전달될 수 있는 조성물을 수반한다. 일부 실시형태에서, 해당 방법은 ZFP 또는 TALE을 포함하는 줄기 세포 집단을 포함하거나 또는 본 발명의 ZFN, TALEN 또는 CRISPR/Cas 뉴클레아제 시스템에 의해 변경된 조성물을 수반한다.

이들 및 다른 양태는 전체로서 본 개시내용에 비추어 당업자에게 용이하게 명백할 것이다.

도 1, 패널 a 내지 e는 야생형 및 돌연변이체(헌팅턴병, HD) 헌팅턴(Htt) 대립유전자 및 해당 대립유전자에 결합된 다양한 ZFP-TF를 도시하는 개략도. 도 1a는 CAG 반복체 밖에서 결합된 ZFP 설계를 나타내며, 따라서 야생형 대립유전자 및 돌연변이체(HD) 대립유전자에 동일하게 결합되는 것으로 예측된다. "KRAB"는 KOX1 유전자로부터의 KRAB 억제 도메인을 지칭하고, "ZFP"는 아연 핑거 DNA 결합 단백질을 지칭한다. "표준 ZFP TF"는 ZFP 전사 인자 융합 단백질이며, 이때 아연 핑거 DNA 결합 도메인은 KRAB 억제 도메인에 결합된다. 도 1b는 CAG 영역 내에 결합되도록 설계된 ZFP-TF를 나타낸다. 도 1c는 ZFP 전사 인자인 "투 핸드 ZFP TF"를 도시하며, 이때 아연 핑거 도메인의 2개의 클러스터는 강성 단백질 서열에 의해 분리된다. 기능성(억제) 도메인은 이 도면에서 하나의 ZFP에 대해 외부에 도시되지만, 기능성 도메인은 단백질의 단부 중 하나에서 ZFP 사이에 또는 ZFP에 대해 외부에 있을 수 있다는 것은 명백할 것이다. 도 1d는 멀티머화 도메인을 통해 멀티머화할 수 있는 ZFP TF인 "멀티머화 ZFP TF"를 도시한다(작은 점이 있는 박스로서 도시함). 도 1e는 2개의 아연 핑거 DNA 결합 도메인이 가요성 링커에 의해 연결되고, 또한 KRAB 도메인에 융합되는 ZFP-ZFP-KRAB 구성을 도시한다. 모든 융합 단백질에서, 기능성 도메인은 DNA 결합 도메인의 단부 중 하나 상에 있을 수 있고, DNA 결합 도메인은 매우 다수의 아연 핑거를 포함할 수 있다는 것은 당업자에게 명백할 것이다. 또한 기능성 도메인(예를 들어, 활성화, 억제, 절단 도메인)을 검정색 다이아몬드를 지니는 박스로서 도 1에서 도시한다. 도면에서 제시되는 예시적인 모델이 TALE TF에도 적용될 수 있다는 것은 당업자에게 명백할 것이다.
도 2, 패널 a 내지 e는 CAG 반복체 서열에 결합되지 않는 ZFP TF를 사용하는 도 1a에 기재된 바와 같은 ZFP에 의한 Htt의 대립유전자 둘 다의 억제를 도시한 도면. 표 1A 및 1B에 나타낸 바와 같은 ZFP 식별 번호를 막대 아래에 표시한다. 도 2a는 인간 유전자에서의 5개 좌위에 표적화된 ZFP를 사용하는 HEK293 세포에서의 인간 Htt 대립유전자의 억제를 도시한다. 인간 Htt 유전자의 다이어그램을 나타내며, ZFP 결합 부위의 위치를 나타낸다. 각각의 ZFP 그룹에 대해, 각각의 막대는 독립적 형질감염을 나타낸다. 도 2b는 GFP 대조군 또는 18856 ZFP TF 리프레서(KOX1의 KRAB 억제 도메인을 포함함)로 형질감염된 HEK293 세포에서의 Htt 단백질 수준을 나타내는 웨스턴 블롯을 도시하며, 여기서 NFκB p65 수준("p65")을 사용하여 동일한 단백질 부하를 확인하였다. 웨스턴 블롯은 ZFP-TF에 의한 Htt 발현의 억제를 확인하였다. 도 2c는 Neuro2A 세포에서 마우스 Htt 특이적 ZFP에 대해 도 2a와 유사한 데이터 세트를 도시한다. 도 2a에서와 같이, 마우스 Htt 유전자의 다이어그램을 나타내며, ZFP 결합 부위의 위치를 나타낸다. 도 2d 및 2e는 불멸 선조 세포에서 마우스 Htt 유전자 발현(RNA)의 억제를 입증하며, 여기서 형질감염을 위해 상이한 용량의 ZFP-TF mRNA가 사용되었다. 도 2b를 제외한 모든 경우에, Htt mRNA 수준을 실시간 RT-PCR에 의해 측정하였고, 액틴 mRNA의 수준에 대해 정규화하였다.
도 3, 패널 a 내지 g는 도 1b에서 도시한 바와 같이 CAG 반복체 영역 내에서 ZFP 결합을 사용하는 것에 의한 돌연변이체 Htt의 선택적 억제를 도시한 도면. 이 모델은 돌연변이체 대립유전자에서의 더 긴 CAG 반복체 영역이 CAG-표적화된 ZFP 리프레서 분자의 결합을 증가시킨다는 것을 도시한다. 도 3a는 HEK293 세포에서 CAG-표적화된 ZFP에 의한 내인성 Htt 유전자(정상 CAG 반복체 길이를 지님) 상에서 상이한 리프레서 활성을 도시한다. 도 3b는 10 내지 47 CAG 반복체의 범위에 있는 다양한 길이의 CAG 반복체를 함유하는 Htt 프로모터/엑손1 단편에 의해 제어된 루시퍼라제 리포터의 억제를 나타낸다. CAG10(2개의 표시된 조건의 각각에 대해 가장 좌측의 막대)은 10 CAG 반복체를 지니는 결과를 나타내며; CAG17(2개의 표시한 조건의 각각에 대해 좌측으로부터 두 번째 막대)은 17 CAG 반복체에 의한 결과를 나타내고; CAG23(2개의 표시 조건의 각각에 대해 우측으로부터 두 번째 막대)은 23 CAG 반복체에 의한 결과를 나타내며; CAG47(2개의 표시 조건의 각각에 대해 가장 우측의 막대)은 47 CAG 반복체에 의한 결과를 나타낸다. 그래프 위쪽의 도식은 본 시스템에서 사용된 Htt 프로모터, 엑손 1, CAG 반복체 및 리포터 루시퍼라제 유전자의 배열을 도시한다. 데이터는 CAG의 수의 증가가 CAG-표적화된 ZFP에 의해 Htt 프로모터로부터 감소된 발현을 야기한다는 것을 입증한다. 더 나아가, 도 3c는 상대적으로 약한 CAG-표적화된 ZFP가 정상 길이의 CAG 반복체뿐만 아니라 강한 CAG 리프레서를 함유하는 루시퍼라제 리포터를 억제하지 않는 반면, 그것이 시험한 모든 용량에서 강한 CAG-표적화된 ZFP로서 확장된 CAG 반복체를 함유하는 루시퍼라제 리포터의 유사한 억제를 구동한다는 것을 입증한다. "pRL-Htt-CAG23-인트론 1"(각 쌍의 좌측 막대)은 야생형 대립유전자로부터의 발현에 대응하는 한편, "pRL-HttCAG47-인트론 1"(각 쌍의 우측 막대)은 돌연변이체 확장된 Htt 대립유전자(47 CAG 반복체를 함유)로부터의 발현과 상관관계가 있다. 도 3d는 HdH(Q111/Q7) 녹-인(knock-in) 마우스로부터 유래된 불멸화된 마우스 선조 세포에서 CAG-표적화된 ZFP에 의한 돌연변이체 Htt(111 CAG)의 억제를 도시하는 그래프이다. 야생형 발현은 각 쌍의 좌측 막대에서 나타내며, 녹-인 발현은 각 쌍의 우측 막대에서 나타낸다. KRAB 억제 도메인에 융합된 구체화된 ZFP를 포함하는 ZFP-TF를 형질감염에서 3가지 상이한 농도의 ZFP mRNA를 사용하여 시험하였다. 도 3e는 HD 환자 유래 섬유아세포주(CAG15/70)에서 CAG-표적화된 ZFP에 의한 돌연변이체 Htt를 도시한다. 이 섬유아세포주에서, 야생형 Htt 대립유전자는 15 CAG 반복체("099T(CAG15)", 각각의 표시된 조건의 중간 막대)를 포함하고, 돌연변이체 확장된 Htt 대립유전자는 70 CAG 반복체("099C(CAG70)", 각각의 표시한 조건의 우측 막대)를 포함한다. 도 3f는 4명의 상이한 HD 환자 유래 섬유아세포 세포주에서 돌연변이체 Htt 발현의 선택적 억제를 나타낸다. 각 그룹 위의 숫자는 야생형 Htt 대립유전자(예를 들어 15 또는 18)에 대한 그리고 돌연변이체 대립유전자(예를 들어 70, 67, 45 및 44)에 대한 CAG 반복체의 수를 나타내며; 2가지 상이한 용량의 ZFP mRNA를 시험하였다. 각 쌍의 좌측 막대는 야생형 Htt 발현을 나타내고, 각각의 우측 막대는 돌연변이체 Htt의 발현을 나타낸다. 도 3g는 ZFP-TF 30640, 32528 및 30657의 존재에서 웨스턴 블롯 분석에 의해 분석한 바와 같은 HD 유래 환자 섬유아세포에서의 Htt 발현을 도시한다. 더 낮은 이동 단백질 밴드는 확장된 돌연변이체 Htt 대립유전자에 의해 생성된 것이다. 32528은 Htt의 전사 시작 부위(transcription start site: TSS)에 결합하며, 따라서 대립유전자 둘 다로부터의 발현을 저해하는 한편, 30640 및 30657은 CAG 반복체(CAG)에 결합된다.
도 4, 패널 A 및 B는 CAG 반복체에 표적화된 ZFP의 패널에 의한 HD 환자 유래 섬유아세포주에서의 돌연변이체 Htt의 억제를 도시한 도면. 0.1ng 내지 3㎍의 RNA 농도 범위를 사용하였다. 도 4A 및 4B에서, 각각의 표시한 조건의 좌측 막대는 전체 Htt 발현을 나타내며, 중간 막대는 섬유아세포에서 Htt의 발현을 나타내고, 이때 Htt 대립유전자는 18 CAG 반복체("099T(CAG18)"를 포함하며, 돌연변이체 확장된 Htt 대립유전자는 45 CAG 반복체 099T(CAG45를 포함한다.
도 5는 HD 환자 유래 섬유아세포에서 Htt 및 다른 CAG-함유 유전자의 발현에 대한 CAG-표적화된 ZFP 리프레서의 효과를 나타낸다. 각각의 표시한 조건 아래의 좌측 막대는 30640에 의한 결과를 나타내고; 각각의 표시한 조건 아래의 중간 막대는 30675에 의한 결과를 나타내며; 우측 막대는 모의(mock) 형질감염을 나타낸다.
도 6, 패널 A 및 B는 3개의 CAG-표적화된 ZFP의 게놈-와이드 특이성을 시험하는 실험을 도시한 도면. 도 6a는 30640, 30645 또는 33074를 사용하는 HD 섬유아세포(CAG18(중간 막대)/CAG45, 우측 막대)의 6개 생물학적 복제물(6개 별개의 형질감염)에 대해 수행한 Htt 억제의 qPCR 분석을 도시한 도면. 그 다음에 qPCR에 의한 4개의 가장 유사한 복제물을 현미경 분석을 위해 선택하였고, 데이터를 도 6B에 제시한다.
도 7은 CAG17/69 신경 줄기 세포(NSC)에서의 Htt 억제를 도시한 도면. 세포를 표시한 용량에서 ZFP mRNA로 형질감염시켰다. 각각의 표시한 용량 아래의 좌측 막대는 CAG17 세포에서의 결과를 나타내고, 중간 막대는 야생형 세포에서의 결과를 나타내며, 우측 막대는 CAG69 세포에서의 결과를 나타낸다.
도 8은 ZFP TF로 처리된 HD 배아 줄기 세포(ESC)(CAG 17/48)로부터 분화된 뉴런에서의 Htt 발현을 도시한다. 세포를 표시한 용량에서 ZFP mRNA로 형질감염시켰다.
도 9는 ZFP TF 30640으로 처리 후 R6/2 마우스에서 돌연변이체 Htt 이식유전자 발현의 억제를 도시한 도면.
도 10, 패널 a 내지 d는 도 1d에서 도시한 바와 같이 확장된 CAG 반복체를 특이적으로 표적화하는 멀티머화 도메인을 지니는 ZFP를 도시한 도면. 도 10a는 4개의 성분을 가지는 단일 ZFP를 나타낸다: (i) KOX 리프레서 도메인(타원형 표지된 "리프레서"); (ii) (CAG)N 또는 이 서열의 순열에 결합되는 2 내지 6개 핑거 배열(2개를 나타냄, 작은 타원은 "Z"로 표시함); 및 (iii) 역평행 구성에서 상호작용하는 2개의 다이머화 도메인(직사각형은 "d1" 및 "d2"를 표지함). 이들 도메인은 CAG 트랙의 부수적 그루브 내에서 ZFP가 중합체화되게 한다. 도 10b는 3개의 ZFP의 멀티머에 의한 결합 사건의 개요를 나타낸다. 임의의 수의 멀티머가 사용될 수 있고, 기능성 도메인은 개개의 ZFP 중 하나 이상에 대해 어디에서나 위치될 수 있으며, 이들 다이어그램은 TALE-TF에도 적용될 수 있다는 것은 명백할 것이다. 도 10c는 다이머화 아연 핑거(DZ) 사이의 상호작용을 통해 멀티머화되도록 설계된 4개의 ZFP 모노머 스캐폴드의 단백질 서열을 나타낸다. 스캐폴드는 DZ1(서열번호 180), DZ2(서열번호 181), DZ3(서열번호 182) 및 DZ4(서열번호 183)로 칭해진다. 다이머화된 아연 핑거 도메인은 밑줄 표시된 반면, 억제 도메인 및 핵 국소화 서열은 볼드체 밑줄 및 이탤릭체로(각각) 표시된다. 도 10d는 또 꼬인 나선(coiled-coil: CC) 사이의 상호작용을 통해 멀티머화되도록 설계된 7개의 ZFP 모노머 스캐폴드의 단백질 서열을 나타낸다. 스캐폴드는 CC1(서열번호 184), CC2(서열번호 185), CC3(서열번호 186), CC4(서열번호 187), CC5(서열번호 188), CC6(서열번호 189) 및 CC7(서열번호 190)로 칭해진다. 또 꼬인 나선 서열은 밑줄 표시된 반면, 억제 도메인 및 핵 국소화 서열은 볼드체 밑줄 및 이탤릭체로(각각) 표시된다. 설계 간에 변하는 각각의 스캐폴드의 ZFP 영역의 위치를 "[ZFP]"에 의해 표시한다. 설계 간에 변하는 각각의 스캐폴드의 (DNA-결합) ZFP 영역의 위치를 "[ZFP]"에 의해 표시한다.
도 11, 패널 a 및 b는 다이머화 도메인을 지니는 ZFP-TF의 활성을 도시한 도면. 도 11a에서, "또 꼬인 나선"(CC) 도메인을 지니는 ZFP-TF를 루시퍼라제 리포터로 시험하였다. pRL-Htt CAG17(각 쌍의 좌측 막대)은 17개 CAG를 지니는 인간 Htt 프로모터/엑손1 단편에 의해 제어된 레닐라(renilla) 루시퍼라제 리포터를 나타내고; pGL3-Htt-CAG47(각 쌍의 우측 막대)은 47 CAG 반복체를 지니는 인간 Htt 프로모터/엑손1 단편에 의해 제어된 반딧불이 루시퍼라제 리포터 수용체를 나타낸다. 다양한 다이머화 도메인의 설명에 대해 실시예 10의 내용을 참조한다. 도 11b에서, 다이머화 아연 핑거 "DZ" 도메인을 지니는 ZFP를 동일 루시퍼라제 리포터로 시험하였고, 일부 ZFP-TF 다이머화 도메인에 의한 증가된 억제를 입증하였다. 각 이중선에서의 좌측 막대는 17 CAG 반복체 Htt 대립유전자로부터의 발현을 나타내는 한편, 우측 막대는 47 CAG 반복체 Htt 대립유전자로부터의 발현을 나타낸다.
도 12, 패널 A 및 B는 ZFP-ZFP-KOX 단백질에 의한 Htt의 억제를 도시한다. 도 12A는 단일 33088 및 33084 ZFP-TF에 의한 Htt 억제, 및 야생형(좌측 막대), CAG18(중간 막대) 및 CAG45(우측 막대)(도 12A) HD 섬유아세포에서 33088-33088 및 33088-33084 ZFP-ZFP-KOX 단백질에 의한 억제를 도시하며; 도 12B는 야생형(좌측 막대), CAG 20(중간 막대) 및 CAG41(좌측 막대) HD 섬유아세포에서 33088-33088 및 33088-33084 ZFP-ZFP-KOX에 의한 Htt 억제를 도시한다.
도 13, 패널 a 내지 e는 마우스 Htt의 활성화를 도시한다. 도 13a는 p65 활성화 도메인에 융합된 ZFP를 사용하여 Neuro2A 세포에서의 RNA 수준에서 마우스 Htt 유전자의 ZFP-TF-구동 상향조절을 입증한다. 이중 막대는 2회 형질감염을 나타낸다. 도 13b는 ZFP에 의해 구동된 증가된 Htt 단백질 생성을 입증하는 웨스턴 블롯을 도시한다. 도 13c는 야생형 마우스 Htt 대립유전자 및 "녹 인" Htt 대립유전자를 도시하며, 여기서 마우스 서열(엑손1의 대부분 및 인트론 1의 부분, 야생형 대립유전자 개략도 위의 선)은 대응하는 인간 서열을 CAG 확장(녹-인 대립유전자 개략도 위의 선)으로 대체하였다. 도 13d는, ZFP(a 및 b에 나타냄)가 마우스 서열에 특이적으로 결합되게끔 설계하기 위해 녹-인 대립유전자가 충분한 서열 분기(sequence divergence)를 가지도록, 대응하는 인간 서열(서열번호 192)로 대체된 마우스 서열(서열번호 191) 간의 배열을 도시한다. 도 13e는 HdhQ111/Q7 녹-인 마우스로부터 유래된 불멸 선조 세포에서의 야생형 마우스 Htt 대립유전자의 특이적 활성화를 도시한다. 좌측 막대는 야생형 세포에서의 결과를 나타내고, 우측 막대는 녹-인 돌연변이체 대립유전자 세포에서의 결과를 나타낸다.
도 14, 패널 A 및 B는 Htt 특이적 ZFN 쌍을 지니는 K562 세포의 처리 후 Cel-I 미스매치 분석(서베이어(Surveyor)(상표명), 트랜스게노믹스(Transgenomics)) 결과를 도시한다. 활성 ZFN에 대한 NHEJ 활성(삽입-결실) 백분율은 대응하는 레인의 바닥에서 나타낸다. "GFP"는 GFP 암호화 플라스미드에 의해 형질감염된 세포를 나타낸다. 도 14A는 초기 Htt 엑손을 절단하는 ZFN으로부터의 결과를 도시하는 한편, 도 14B는 정지 코돈 근처를 절단하는 ZFN으로부터의 결과를 도시한다. 불활성 ZFN 쌍이 또한 관찰되었다(레인은 삽입-결실 백분율의 주석을 달지 않았음).
도 15는 몇몇 후보 TALE-TF 단백질에 대한 Htt 억제 결과의 그래프를 도시한 도면. TALE-TF를 HD 환자 유래 섬유아세포(CAG 20/41)에서 시험하였다. 결과는 TALE TF의 일부가 전반적인 Htt 발현을 억제하는데 활성인 반면, 다른 것은 돌연변이체 Htt-우선 억제를 나타내었다는 것을 입증한다.

헌팅턴병(HD)을 치료하기 위한 조성물 및 방법이 본 명세서에 개시된다. 특히, 헌팅턴병을 치료하거나 또는 예방하는데 사용을 위한 아연 핑거 단백질(ZFP TF) 또는 TALE(TALE-TF)을 포함하는 Htt-조절 전사 인자 및 이러한 단백질을 이용하는 방법이 제공된다. 예를 들어, 돌연변이체 Htt 대립유전자의 발현을 억제하거나 또는 야생형 Htt 대립유전자의 발현을 활성화하는 ZFP-TF 또는 TALE-TF가 제공된다. 추가로, HD와 관련된 유전자의 게놈 구조를 변형시키는 아연 핑거 뉴클레아제(ZFN), TALE 뉴클레아제(TALEN) 또는 CRISPR/Cas 뉴클레아제 시스템이 제공된다. 예를 들어, Htt의 돌연변이체 형태의 일부를 특이적으로 변경시킬 수 있는 ZFN, TALEN 또는 CRISPR/Cas 뉴클레아제 시스템이 제공된다. 이들은 유전자 조작된 아연 핑거 단백질 또는 유전자 조작된 TALE 단백질, 즉, 사전 결정된 핵산 표적 서열에 결합되는 비자연적으로 생기는 단백질을 사용하는 조성물 및 방법을 포함한다.

따라서, 본 명세서에 기재된 방법 및 조성물은 헌팅턴병의 치료 및 예방을 위한 방법을 제공하며, 이들 방법 및 조성물은 표적 유전자를 조절할 수 있는 아연 핑거 전사 인자 또는 TALE 전사 인자뿐만 아니라 Htt를 변형시키거나 또는 편집할 수 있는 유전자 조작된 아연 핑거 및 TALE 뉴클레아제 및 CRISPR/Cas 뉴클레아제 시스템을 포함할 수 있다.

일반

본 명세서에 개시된 방법뿐만 아니라 조성물의 제조 및 사용은, 달리 표시되지 않는다면, 분자 생물학, 생화학, 염색질 구조 및 분석, 컴퓨터 화학, 세포 배양, 재조합 DNA 및 당업계의 기술 내에 있는 관련 분야에서의 통상적인 기법을 사용한다. 이들 기법은 문헌에서 완전하게 설명된다. 예를 들어, 문헌[Sambrook et al . MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, Second edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989 and Third edition, 2001; Ausubel et al ., CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, John Wiley & Sons, New York, 1987 및 정기 업데이트; METHODS IN ENZYMOLOGY 시리즈, Academic Press, San Diego; Wolffe, CHROMATIN STRUCTURE AND FUNCTION, Third edition, Academic Press, San Diego, 1998; METHODS IN ENZYMOLOGY, Vol. 304, "Chromatin" (P.M. Wassarman and A. P. Wolffe, eds.), Academic Press, San Diego, 1999; 및 METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY, Vol. 119, "Chromatin Protocols" (P.B. Becker, ed.) Humana Press, Totowa, 1999] 참조.

정의

용어 "핵산", "폴리뉴클레오타이드" 및 "올리고뉴클레오타이드"는 상호호환적으로 사용되며, 선형 또는 원형 입체구조에서 및 단일- 또는 이중-가닥 형태에서의 데옥시리보뉴클레오타이드 또는 리보뉴클레오타이드 중합체를 지칭한다. 본 개시내용의 목적을 위해, 이들 용어는 중합체의 길이에 대한 제한으로서 해석되어서는 안 된다. 용어는 천연 뉴클레오타이드뿐만 아니라 염기, 당 및/또는 포스페이트 모이어티(예를 들어, 포스포로티오에이트 백본)에서 변형된 뉴클레오타이드의 공지된 유사체를 포함한다. 일반적으로, 특정 뉴클레오타이드의 유사체는 동일한 염기-쌍 특이성을 가지며; 즉, A의 유사체는 T와 염기쌍을 이룰 것이다.

용어 "폴리펩타이드", "펩타이드" 및 "단백질"은 아미노산 잔기의 중합체를 지칭하기 위해 상호호환적으로 사용된다. 해당 용어는 또한 아미노산 중합체에 적용되며, 이때 하나 이상의 아미노산은 대응하는 자연적으로 생기는 아미노산의 화학적 유사체 또는 변형된 유도체이다.

"결합"은 거대분자 간(예를 들어, 단백질과 핵산 간) 서열 특이적, 비공유적 상호작용을 지칭한다. 전체로서 상호작용이 서열 특이적이라면, 결합 상호작용의 모든 성분이 서열 특이적(예를 들어, DNA 백본에서 인산염 잔기와 접촉됨)일 필요는 없다. 이러한 상호작용은 대체로 10^-6　M^-1 이하의 해리 상수(K_d)를 특징으로 한다. "친화도"는 결합강도를 지칭하며: 증가된 결합 친화도는 더 낮은 K_d와 상관관계가 있다.

"결합 단백질"은 다른 분자에 비공유적으로 결합될 수 있는 단백질이다. 결합 단백질은, 예를 들어 DNA 분자(DNA-결합 단백질), RNA 분자(RNA-결합 단백질) 및/또는 단백질 분자(단백질-결합 단백질)에 결합될 수 있다. 단백질-결합 단백질의 경우에, 그것은 그 자체에 결합될 수 있고/있거나(호모다이머, 호모트라이머 등을 형성함) 그것은 상이한 단백질 또는 단백질들의 하나 이상의 분자에 결합될 수 있다. 결합 단백질은 한 가지 이상의 결합 활성 유형을 가질 수 있다. 예를 들어, 아연 핑거 단백질은 DNA-결합, RNA-결합 및 단백질 결합 활성을 가진다.

"아연 핑거 DNA 결합 단백질"(또는 결합 도메인)은 결합 도메인 내의 아미노산 서열 영역인 하나 이상의 아연 핑거(이것의 구조는 아연 이온의 배위를 통해 안정화됨)를 통해 서열 특이적 방식으로 DNA에 결합하는, 단백질 또는 더 큰 단백질 내의 도메인이다. 용어 아연 핑거 DNA 결합 단백질은 종종 아연 핑거 단백질 또는 ZFP로서 약칭된다.

"TALE DNA 결합 도메인" 또는 "TALE"는 하나 이상의 TALE 반복체 도메인/단위를 포함하는 폴리펩타이드이다. 반복체 도메인은 TALE의 그의 유사한 표적 DNA 서열에 대한 결합에 수반된다. 단일 "반복체 단위"(또한 "반복체"로서 지칭됨)는 전형적으로 길이가 33 내지 35개의 아미노산이고, 자연적으로 생기는 TALE 단백질 내의 다른 TALE 반복체 서열과 적어도 일부 서열 상동성을 나타낸다.

아연 핑거 결합 도메인 또는 TALE DNA 결합 도메인은, 예를 들어 자연적으로 생기는 아연 핑거 단백질의 인식 나선 영역의 유전자조작을 통해(하나 이상의 아미노산을 변성시킴) 또는 TALE 단백질의 RVD를 유전자조작함으로써 사전결정된 뉴클레오타이드 서열에 결합되도록 "유전자조작"될 수 있다. 따라서, 유전자 조작된 아연 핑거 단백질 또는 TALE은 비자연적으로 생기는 단백질이다. 아연 핑거 단백질 또는 TALE을 유전자조작하기 위한 방법의 비제한적 예는 설계 및 선택이다. 설계된 아연 핑거 단백질 또는 TALE은 설계/조성이 원칙적으로 합리적 기준으로부터 초래되는 자연에서 생기지 않는 단백질이다. 설계를 위한 합리적 기준은 기존의 ZFP 설계 및 결합 데이터의 정보를 저장하는 데이터베이스에서 정보를 처리하기 위한 치환 규칙 및 컴퓨터화된 알고리즘의 적용을 포함한다. 예를 들어, 미국 특허 제6,140,081호; 제6,453,242호; 및 제6,534,261호 참조; 또한 WO　98/53058호; WO　98/53059호; WO　98/53060호; WO　02/016536호 및 WO　03/016496호 및 미국공개 제20110301073호 참조.

"선택된" 아연 핑거 단백질 또는 TALE은 생성이 경험적 프로세스, 예컨대 파지 디스플레이, 상호작용 트랩 또는 혼성체 선택으로부터 주로 초래되는 자연에서 발견되지 않는 단백질이다. 예를 들어, 미국 특허 제5,789,538호; 미국 특허 제5,925,523호; 미국 특허 제6,007,988호; 미국 특허 제6,013,453호; 미국 특허 제6,200,759호; WO　95/19431호; WO　96/06166호; WO　98/53057호; WO　98/54311호; WO　00/27878호; WO　01/60970호 WO　01/88197호, WO　02/099084호 및 WO 2011/146121호(미국 특허 공개 제20110301073호) 참조.

"재조합"은 2개의 폴리뉴클레오타이드 간의 유전적 정보의 교환 프로세스를 지칭한다. 본 개시내용의 목적을 위해, "상동성 재조합(homologous recombination: HR)"은, 예를 들어 상동성-관련 회복 메커니즘을 통해 세포에서 이중-가닥 파손의 회복 동안 일어나는 이러한 교환의 전문화된 형태를 지칭한다. 이 프로세스는 뉴클레오타이드 서열 상동성을 필요로 하며, "표적" 분자(즉, 이중-가닥 파손을 경험한 것)의 주형 회복에 대해 "공여체" 분자를 사용하며, "비교차 유전자 전환" 또는 "짧은 트랙 유전자 전환"으로서 여러 가지로 공지되어 있는데, 그것이 공여체로부터 표적까지의 유전적 정보의 전달을 야기하기 때문이다. 어떤 특정 이론에 의해 구속되지 않고, 이러한 전달은 파괴된 표적과 공여체 간에 형성된 헤테로듀플렉스 DNA의 미스매치 수정 및/또는 "합성-의존적 가닥 어닐링"을 수반할 수 있는데, 이때 공여체는 표적의 부분 및/또는 관련된 프로세스가 될 유전적 정보를 재합성하기 위해 사용된다. 이러한 전문화된 HR은 종종 공여체 폴리뉴클레오타이드 서열의 부분 또는 모두가 표적 폴리뉴클레오타이드에 포함되도록 표적 분자 서열의 변성을 초래한다.

본 개시내용의 방법에서, 본 명세서에 기재된 바와 같은 하나 이상의 표적화된 뉴클레아제는 사전결정된 부위에서 표적 서열(예를 들어, 세포의 염색질)에서의 이중 가닥 파손을 만들며, 파손 영역에서 뉴클레오타이드 서열에 대해 상동성을 갖는 "공여체" 폴리뉴클레오타이드는 세포에 도입될 수 있다. 이중-가닥 파손의 존재는 공여체 서열의 통합을 가능하게 하는 것으로 나타났다. 공여체 서열은 물리적으로 통합될 수 있거나, 또는 대안적으로 공여체 폴리뉴클레오타이드는 상동성 재조합을 통해 파손의 회복을 위한 주형으로서 사용되며, 세포의 염색질 내로 공여체 내에서와 같은 뉴클레오타이드 서열의 모두 또는 부분의 도입을 초래한다. 따라서, 세포 염색질 내 첫 번째 서열은 변성될 수 있고, 특정 실시형태에서, 공여체 폴리뉴클레오타이드 내에 존재하는 서열로 전환될 수 있다. 따라서, 용어 "대체하다" 또는 "대체"의 사용은 하나의 뉴클레오타이드 서열의 다른 것으로 대체(즉, 정보적 의미에서 서열의 대체)를 나타내는 것으로 이해될 수 있고, 하나의 폴리뉴클레오타이드의 다른 것으로 물리적 또는 화학적 대체를 본질적으로 필요로 하지 않는다.

본 명세서에 기재된 방법 중 어떤 것에서, 아연-핑거 또는 TALE 단백질의 추가적인 쌍은 세포 내의 추가적인 표적 부위의 추가적인 이중 가닥 절단을 위해 사용될 수 있다.

세포 염색질에서의 관심 대상 영역에서 서열의 표적화된 재조합 및/또는 대체 및/또는 변경을 위한 방법의 특정 실시형태에서, 염색체 서열은 상동성 재조합에 의해 외인성 "공여체" 뉴클레오타이드 서열로 변성된다. 파손 영역에 상동성인 서열이 존재한다면, 이러한 상동성 재조합은 세포의 염색질 내 이중 가닥 파손의 존재에 의해 자극된다.

본 명세서에 기재된 방법 중 어떤 것에서, 첫 번째 뉴클레오타이드 서열("공여체 서열")은 관심 영역 내 게놈 서열에 대해 상동성이지만, 동일하지 않은 서열을 함유할 수 있고, 이에 의해 상동성 재조합을 자극하여 관심 대상 영역에서 동일하지 않은 서열을 삽입한다. 따라서, 특정 실시형태에서, 관심 대상 영역에서의 서열에 상동성인 공여체 서열의 부분은 대체된 게놈 서열에 대해 약 80% 내지 99%(또는 그 사이의 임의의 정수) 서열 동일성을 나타낸다. 다른 실시형태에서, 예를 들어 100개 이상의 인접한 염기쌍의 공여체와 게놈 서열 간에 단지 1개의 뉴클레오타이드가 상이하다면, 공여체와 게놈 서열 간의 상동성은 99% 초과이다. 특정 경우에, 공여체 서열의 비상동 부분은 새로운 서열이 관심 대상의 영역 내로 도입되도록 관심 대상의 영역에 존재하지 않는 서열을 함유할 수 있다. 이들 예에서, 비상동 서열은 대체로 관심 대상의 영역에서 서열과 상동성이거나 또는 동일한, 50 내지 1,000개 염기쌍(또는 그 사이의 어떤 정수값) 또는 1,000개 초과의 임의의 수의 염기쌍의 서열에 측접한다. 다른 실시형태에서, 공여체 서열은 첫 번째 서열에 비상동성이며, 비상동 재조합 메커니즘에 의해 게놈에 삽입된다.

본 명세서에 기재된 방법 중 어떤 것은 관심 대상의 유전자(들)의 발현을 파괴하는 공여체 서열의 표적화된 통합에 의해 세포 내 하나 이상의 표적 서열의 부분적 또는 완전한 불활성화를 위해 사용될 수 있다. 부분적으로 또는 완전하게 불활성화된 유전자를 지니는 세포주가 또한 제공된다.

더 나아가, 본 명세서에 기재된 바와 같은 표적화된 통합 방법은 또한 하나 이상의 외인성 서열을 통합하기 위해 사용될 수 있다. 외인성 핵산 서열은, 예를 들어, 하나 이상의 유전자 또는 cDNA 분자, 또는 암호 또는 비암호 서열의 어떤 유형뿐만 아니라 하나 이상의 제어 구성요소(예를 들어, 프로모터)를 포함할 수 있다. 추가로, 외인성 핵산 서열은 하나 이상의 RNA 분자(예를 들어, 짧은 헤어핀 RNA(small hairpin RNA: shRNA), 저해적 RNA(inhibitory RNA: RNAi), 마이크로RNA(microRNA: miRNA) 등)를 생성할 수 있다.

"절단"은 DNA 분자의 공유적 백본의 파괴를 지칭한다. 절단은 포스포다이에스터 결합의 효소적 또는 화학적 가수분해를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는 다수의 방법에 의해 개시될 수 있다. 단일-가닥 절단과 이중-가닥 절단이 둘 다 가능하며, 이중-가닥 절단은 2개의 별개의 단일-가닥 절단 사건의 결과로서 일어날 수 있다. DNA 절단은 평활 말단(blunt end) 또는 엇갈린 말단(staggered end) 중 하나의 생성을 초래할 수 있다. 특정 실시형태에서, 융합 폴리펩타이드는 표적화된 이중 가닥 DNA 절단을 위해 사용된다.

"절단 절반-도메인"은 제2 폴리펩타이드(동일 또는 상이함)와 함께 절단 활성(바람직하게는 이중-가닥 절단 활성)을 가지는 복합체를 형성하는 폴리펩타이드 서열이다. 용어 "제1 및 제2 절단 절반 도메인"; " + 및 - 절단 절반-도메인" 및 "우측 및 좌측 절단 절반-도메인"은 다이머화되는 절단 절반-도메인의 쌍을 지칭하기 위해 상호호환적으로 사용된다.

"유전자 조작된 절단 절반-도메인"은 다른 절단 절반-도메인(예를 들어, 다른 유전자 조작된 절단 절반-도메인)과 절대적인 헤테로다이머를 형성하기 위해 변형된 절단 절반-도메인이다. 또한 미국 특허 공개 제2005/0064474호, 제20070218528호, 제2008/0131962호 및 제2011/0201055호를 참조하며, 이들은 그들의 전문이 본 명세서에 참조로서 포함된다.

용어 "서열"은 DNA 또는 RNA일 수 있는 임의의 길이의 뉴클레오타이드 서열을 지칭하며; 선형, 원형 또는 분지형일 수 있고, 단일-가닥 또는 이중 가닥 중 하나 일 수 있다. 용어 "공여체 서열"은 게놈 내로 삽입되는 뉴클레오타이드 서열을 지칭한다. 공여체 서열은 임의의 길이, 예를 들어 길이로 2 내지 10,000 뉴클레오타이드(또는 그 사이의 또는 그 이상의 임의의 정수 값), 바람직하게는 길이로 약 100 내지 1,000 뉴클레오타이드(또는 그 사이의 임의의 정수), 더 바람직하게는 길이로 약 200 내지 500 뉴클레오타이드를 가질 수 있다.

"염색질"은 세포 게놈을 포함하는 핵단백질 구조이다. 세포의 염색질은 핵산, 주로 DNA 및 히스톤 및 비히스톤 염색체 단백질을 포함하는 단백질을 포함한다. 대다수의 진핵 세포 염색질은 뉴클레오솜의 형태로 존재하되, 뉴클레오솜 코어는 히스톤 H2A, H2B, H3 및 H4의 각각 2개를 포함하는 옥타머와 관련된 대략 150개 염기쌍의 DNA를 포함하고; (유기체에 따라서 가변 길이의) 링커 DNA는 뉴클레오좀 코어 간에 연장된다. 히스톤 H1의 분자는 대체로 링커 DNA와 결합된다. 본 개시내용의 목적을 위해, 용어 "염색질"은 모든 유형의 세포 핵단백질, 즉 원핵과 진핵을 둘 다 포함하는 것을 의미한다. 세포 염색질은 염색체와 에피솜 염색질을 둘 다 포함한다.

"염색체"는 세포 게놈의 모두 또는 일부를 포함하는 염색질 복합체이다. 세포 게놈은 종종 세포 게놈을 포함하는 모든 염색체의 수집물인 그의 핵형을 특징으로 한다. 세포의 게놈은 하나 이상의 염색체를 포함할 수 있다.

"에피솜"은 복제 핵산, 핵단백질 복합체, 또는 세포의 염색체 핵형의 부분이 아닌 핵산을 포함하는 다른 구조이다. 에피솜의 예는 플라스미드 및 특정 바이러스 게놈을 포함한다.

"표적 부위" 또는 "표적 서열"은 결합 분자가 결합되고, 결합을 위해 충분한 조건이 존재하도록 제공된 핵산의 일부를 정의하는 핵산 서열이다.

"외인성" 분자는 세포에서 정상적으로 존재하지 않지만, 하나 이상의 유전적, 생화학적 또는 다른 방법에 의해 세포 내로 도입될 수 있는 분자이다. "세포에서의 정상적 존재"는 특정 발생 단계 및 세포의 환경적 조건에 대해 결정된다. 따라서, 예를 들어, 근육의 배아 발생 동안만 존재하는 분자는 성인 근육 세포에 대해 외인성 분자이다. 유사하게, 열 충격에 의해 유발된 분자는 비열충격 세포에 대한 외인성 분자이다. 외인성 분자는, 예를 들어 제대로 작용하지 못하는 내인성 분자의 기능성 형태 또는 정상적으로 작용하는 내인성 분자의 제대로 작용하지 못하는 형태를 포함할 수 있다.

외인성 분자는, 특히 소분자일 수 있으며, 예컨대 조합적 화학 프로세스, 또는 거대분자, 예컨대 단백질, 핵산, 탄수화물, 지질, 당단백질, 리포단백질, 다당류, 상기 분자의 임의의 변형된 유도체, 또는 상기 분자 중 하나 이상을 포함하는 임의의 복합체일 수 있다. 핵산은 DNA 및 RNA를 포함하고, 단일- 또는 이중-가닥일 수 있으며; 선형, 분지형 또는 원형일 수 있고; 임의의 길이를 가질 수 있다. 핵산은 듀플렉스를 형성할 수 있는 것뿐만 아니라 트라이플렉스-형성 핵산을 포함한다. 예를 들어, 미국 특허 제5,176,996호 및 제5,422,251호 참조. 단백질은, DNA-결합 단백질, 전사 인자, 염색질 리모델링 인자, 메틸화된 DNA 결합 단백질, 중합효소, 메틸라제, 데메틸라제, 아세틸라제, 데아세틸라제, 키나제, 포스파타제, 인테그라제, 재조합효소, 리가제, 토포아이소머라제, 자이레이즈 및 헬리카제를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다.

내인성 분자는 내인성 분자, 예를 들어 외인성 단백질 또는 핵산과 동일한 유형의 분자일 수 있다. 예를 들어, 외인성 핵산은 바이러스 게놈, 플라스미드 또는 세포 내로 도입된 에피솜, 또는 세포 내에 정상적으로 존재하지 않는 염색체를 포함할 수 있다. 세포 내로 외인성 분자의 도입을 위한 방법은 당업자에게 공지되어 있으며, 지질-매개 전달(즉, 중성 및 양이온성 지질을 포함하는 리포솜), 전기천공법, 직접 주사, 세포 융합, 유전자총, 인산칼슘 공동 침전, DEAE-덱스트란-매개 전달 및 바이러스 벡터-매개 전달을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. 외인성 분자는 또한 내인성 분자와 동일한 유형의 분자일 수 있지만, 그것이 유래된 세포와 상이한 종으로부터 유래될 수 있다. 예를 들어, 인간 핵산 서열은 마우스 또는 햄스터로부터 본래 유래된 세포주 내로 도입될 수 있다.

대조적으로, "내인성" 분자는 특정 환경적 조건 하에서 특정 발생 단계에서 특정 세포에 정상적으로 존재하는 것이다. 예를 들어, 내인성 핵산은 염색체, 미토콘드리아 게놈, 엽록체 또는 다른 세포소기관, 또는 자연적으로 생기는 에피솜 핵산을 포함할 수 있다. 추가적인 내인성 분자는 단백질, 예를 들어, 전사 인자 및 효소를 포함할 수 있다.

"융합" 분자는 2 이상의 서브유닛 분자가 바람직하게는 공유적으로 연결된 분자이다. 서브유닛 분자는 동일한 화학적 유형의 분자일 수 있거나, 또는 상이한 화학적 유형의 분자일 수 있다. 융합 분자의 제1 유형의 예는 융합 단백질(예를 들어, ZFP 또는 TALE DNA-결합 도메인과 하나 이상의 활성화 도메인 간의 융합) 및 융합 핵산(예를 들어, 상기 기재한 융합 단백질을 암호화하는 핵산)을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. 융합 분자의 제2 유형의 예는 트라이플렉스-형성 핵산과 폴리펩타이드 간의 융합, 및 부수적 그루브 결합제와 핵산 간의 융합을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다.

세포 내 융합 단백질의 발현은 세포에 대한 융합 단백질의 전달로부터 또는 세포에 대해 융합 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오다이드의 전달에 의해 초래될 수 있되, 폴리뉴클레오타이드는 전사되고, 전사체는 번역되어 융합 단백질을 만든다. 트랜스-스플라이싱, 폴리펩타이드 절단 및 폴리펩타이드 결찰은 또한 세포 내 단백질의 발현에 수반될 수 있다. 세포에 대한 폴리뉴클레오타이드 및 폴리펩타이드 전달을 위한 방법은 본 개시내용의 어디에서나 제공된다.

"멀티머화 도메인"은(또한 "다이머화 도메인" 또는 "단백질 상호작용 도메인"으로서 지칭됨) ZFP TF 또는 TALE TF의 아미노, 카복시 또는 아미노 및 카복시 말단 영역에서 포함된 도메인이다. 트라이뉴클레오타이드 반복체 도메인의 더 큰 트랙은 길이의 야생형 수를 지니는 더 짧은 트랙에 대해 멀티머화된 ZFP TF 또는 TALE TF에 의해 우선적으로 결합되도록, 이들 도메인은 다수의 ZFP TF 또는 TALE TF 단위를 멀티머화시킨다. 멀티머화 도메인의 예는 류신 지퍼를 포함한다. 멀티머화 도메인은 또한 소분자에 의해 조절될 수 있되, 멀티머화 도메인은 소분자 또는 외부 리간드의 존재에서만 다른 멀티머화 도메인과 상호작용하게 하는 적절한 구조를 추정한다. 이 방법에서, 외인성 리간드는 이들 도메인의 활성을 조절하기 위해 사용될 수 있다.

본 개시내용의 목적을 위해 "유전자"는, 이러한 조절 서열이 암호 및/또는 전사된 서열에 인접하든 아니든, 유전자 산물을 암호화하는 DNA 영역(이하참조)뿐만 아니라 유전자 산물의 생성을 조절하는 DNA 영역을 포함한다. 따라서, 유전자는 필수적으로 제한되는 것은 아니지만, 프로모터 서열, 종결자, 번역 조절 서열, 예컨대 리보솜 결합 부위 및 내부 리보솜 유입 부위, 인핸서, 사일런서, 절연인자, 경계 요소, 복제 원점, 매트릭스 부착 부위 및 좌위 제어 영역을 포함한다.

"유전자 발현"은 유전자에 함유된 정보의 유전자 산물로의 전환을 지칭한다. 유전자 산물은 유전자의 직접적 전사 산물(예를 들어, mRNA, tRNA, rRNA, 안티센스 RNA, 리보자임, 구조적 RNA 또는 임의의 다른 유형의 RNA) 또는 mRNA의 번역에 의해 생성되는 단백질일 수 있다. 유전자 산물은 또한 캡핑, 폴리아데닐화, 메틸화 및 편집과 같은 프로세스에 의해 변형된 RNA, 및 예를 들어 메틸화, 아세틸화, 인산화, 유비퀴틴화, ADP-리보실화, 미리스틸화 및 글라이코실화에 의해 변형된 단백질을 포함한다.

유전자 발현의 "변형"은 유전자 활성에서의 변화를 지칭한다. 발현의 조절은, 이하에 제한되는 것은 아니지만, 유전자 활성화 및 유전자 억제를 포함할 수 있다. 게놈 편집(예를 들어, 절단, 변성, 불활성화, 무작위 돌연변이)은 발현을 조절하기 위해 사용될 수 있다. 유전자 불활성화는 본 명세서에 기재한 바와 같은 ZFP 또는 TALE 단백질을 포함하지 않는 세포에 비해 유전자 발현에서의 어떤 감소를 지칭한다. 따라서, 유전자 불활성화는 부분적일 수 있거나 또는 완전할 수 있다.

"관심 대상의 영역"은, 예를 들어 외인성 분자에 결합되는 것이 바람직한 유전자 내의 또는 인접한 유전자 또는 비암호 서열과 같은 세포 염색질의 어떤 영역이다. 결합은 표적화된 DNA 절단 및/또는 표적화된 재조합의 목적을 위한 것일 수 있다. 관심 대상의 영역은, 예를 들어 염색체, 에피솜, 세포소기관 게놈(예를 들어, 미토콘드리아, 엽록체), 또는 감염성 바이러스 게놈에 존재할 수 있다. 관심 대상의 영역은 유전자의 암호 영역 내, 전사된 비암호 영역, 예를 들어 리더 서열, 트레일러 서열 또는 인트론 내, 또는 암호 영역 상류의 또는 하류의 비전사된 영역 내 일 수 있다. 관심 대상의 영역은 길이로 단일 뉴클레오타이드 쌍 또는 2,000개까지의 뉴클레오타이드쌍, 또는 뉴클레오타이드 쌍의 임의의 정수 값만큼 작을 수 있다.

"진핵" 세포는 진균 세포(예컨대 효모), 식물 세포, 동물 세포, 포유류 세포 및 인간 세포(예를 들어, T-세포)를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다.

용어 "조작적 결합" 및 "조작적으로 연결된" (또는 "작동가능하게 연결된")은 2 이상의 성분(예컨대 서열 구성요소)의 병치에 대한 언급에 대해 상호호환적으로 사용되며, 이때 성분 둘 다 정상적으로 작용하고 성분 중 적어도 하나가 다른 성분 중 적어도 하나에 대해 발휘되는 기능을 매개할 수 있는 가능성을 허용하도록 성분이 배열된다. 예시의 방법에 의해, 전사 조절 서열, 예컨대 프로모터는 전사 조절 서열이 하나 이상의 전사 조절 인자의 존재 또는 부재에 반응하여 암호 서열의 전사 수준을 제어한다면, 암호 서열에 조작적으로 연결된다. 전사 조절 서열은 대체로 암소 서열과 시스로 조작적으로 연결되지만, 그것에 직접 인접할 필요는 없다. 예를 들어, 인핸서는 그것이 인접하지 않음에도 불구하고, 암호 서열에 조작적으로 연결된 전사 조절 서열이다.

융합 폴리펩타이드에 대해, 용어 "조작적으로 연결된"은 마치 그것이 연결되지 않은 경우와 같이 각각의 성분이 다른 성분에 대한 결합에서 동일한 기능을 수행한다는 사실을 지칭할 수 있다. 예를 들어, ZFP 또는 TALE DNA-결합 도메인이 활성화 도메인에 융합된 융합 폴리펩타이드에 대해, ZFP 또는 TALE DNA-결합 도메인 및 활성화 도메인은, 융합 폴리펩타이드에서, ZFP 또는 TALE DNA-결합 도메인 부분이 그의 표적 부위 및/또는 그의 결합 부위에 결합될 수 있는 한편, 활성화 도메인이 유전자 발현을 상향조절할 수 있다면, 조작적 결합이다. 유전자 발현을 조절할 수 있는 도메인에 융합된 ZFP는 총괄적으로 "ZFP-TF" 또는 "아연 핑거 전사 인자"로서 지칭되는 한편, 유전자 발현을 조절할 수 있는 도메인에 융합된 TALE은 총괄적으로 "TALE-TF" 또는 "TALE 전사 인자"로서 지칭된다. ZFP DNA-결합 도메인이 절단 도메인에 융합된 융합 폴리펩타이드("ZFN" 또는 "아연 핑거 뉴클레아제")일 때, ZFP DNA-결합 도메인 및 절단 도메인이 만약 융합 폴리펩타이드에서 조작적 결합이라면, ZFP DNA-결합 도메인 부분은 그의 표적 부위 및/또는 그의 결합 부위에 결합될 수 있는 한편, 절단 도메인은 표적 부위의 빈 공간 내 DNA를 절단할 수 있다. TALE DNA-결합 도메인이 절단 도메인에 융합되는 융합 폴리펩타이드("TALEN" 또는 "TALE 뉴클레아제")일 때, TALE DNA-결합 도메인 및 절단 도메인이 만약 융합 폴리펩타이드에서 조작적 결합이라면, TALE DNA-결합 도메인 부분은 그의 표적 부위 및/또는 그의 결합 부위에 결합될 수 있는 한편, 절단 도메인은 표적 부위의 빈 공간 내 DNA를 절단할 수 있다.

단백질, 폴리펩타이드 또는 핵산의 "기능성 단편"은 서열이 전장 단백질, 폴리펩타이드 또는 핵산과 동일하지 않고, 전장 단백질, 폴리펩타이드 또는 핵산과 동일한 기능을 아직 보유하는 단백질, 폴리펩타이드 또는 핵산이다. 기능성 단편은 대응하는 천연 분자보다 더 많거나, 더 적거나 또는 동일한 수의 잔기를 소유할 수 있고/있거나 하나 이상의 아미노산 또는 뉴클레오타이드 치환을 함유할 수 있다. 핵산의 기능(예를 들어, 암호 기능, 다른 핵산에 혼성화하는 능력)을 결정하기 위한 방법은 당업계에 잘 공지되어 있다. 유사하게, 단백질 기능을 결정하기 위한 방법은 잘 공지되어 있다. 예를 들어, 폴리펩타이드의 DNA-결합 기능은, 예를 들어 필터-결합, 전기 영동적 이동성 변화, 또는 면역침전 분석에 의해 결정될 수 있다. DNA 절단은 겔 전기영동에 의해 분석될 수 있다. 문헌[Ausubel et al., 상기 참조] 참조. 다른 단백질과 상호작용하기 위한 단백질의 능력은, 예를 들어 공동 침전, 2혼성체 분석 또는 유전적과 생화학적으로 상보화(complementation),에 의해 결정될 수 있다. 예를 들어, 문헌[Fields et al . (1989) Nature 340:245-246]; 미국 특허 제5,585,245호 및 PCT WO 98/44350호 참조.

"벡터"는 표적 세포에 유전자 서열을 전달할 수 있다. 전형적으로, "벡터 작제물", "발현 벡터" 및 "유전자 전달 벡터"는 관심 대상의 유전자 발현을 지시할 수 있고, 표적 세포에 유전자 서열을 전달할 수 있는 어떤 핵산 작제물을 의미한다. 따라서, 해당 용어는 클로닝, 및 발현 비히클(expression vehicle)뿐만 아니라 통합 벡터를 포함한다.

"리포터 유전자" 또는 "리포터 서열"은, 바람직하게는 일상적인 분석에서 필수적이지 않음에도 불구하고, 용이하게 측정되는 단백질 산물을 생성하는 어떤 서열을 지칭한다. 적합한 리포터 유전자는 항생물질 저항성(예를 들어, 암피실린 저항성, 네오마이신 저항성, G418 저항성, 퓨로마이신 저항성)을 매개하는 단백질을 암호화하는 서열, 착색 또는 형광 또는 발광 단백질(예를 들어, 녹색 형광 단백질, 향상된 녹색 형광 단백질, 적색 형광 단백질, 루시퍼라제), 및 향상된 세포 성장 및/또는 유전자 증폭(예를 들어 다이하이드로폴레이트 환원효소)을 매개하는 단백질을 암호화하는 서열을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. 에피토프 태그는, 예를 들어 FLAG, His, myc, Tap, HA 또는 어떤 검출가능한 아미노산 서열의 하나 이상의 복제물을 포함한다. "발현 태그"는 관심 대상의 유전자의 발현을 모니터링하기 위해 원하는 유전자 서열에 작동가능하게 연결될 수 있는 리포터를 암호화하는 서열을 포함한다.

DNA -결합 도메인

본 명세서에서 Htt를 포함하지만, 이것으로 제한되지 않는 트라이뉴클레오타이드 반복체를 포함하는 어떤 유전자에서 표적 서열에 특이적으로 결합되는 DNA 결합 도메인을 포함하는 조성물이 기재된다. 임의의 DNA-결합 도메인은 본 명세서에 개시된 조성물 및 방법에서 사용될 수 있다.

특정 실시형태에서, DNA 결합 도메인은 아연 핑거 단백질을 포함한다. 바람직하게는, 아연 핑거 단백질은 선택의 표적 부위에 결합되도록 유전자 조작된다는 점에서 비자연적으로 생긴다. 예를 들어, 문헌[Beerli et al . (2002) Nature Biotechnol . 20:135-141; Pabo et al . (2001) Ann . Rev . Biochem . 70:313-340; Isalan et al . (2001) Nature Biotechnol . 19:656-660; Segal et al . (2001) Curr . Opin . Biotechnol . 12:632-637; Choo et al . (2000) Curr . Opin . Struct . Biol. 10:411-416]; 미국 특허 제6,453,242호; 제6,534,261호; 제6,599,692호; 제6,503,717호; 제6,689,558호; 제7,030,215호; 제6,794,136호; 제7,067,317호; 제7,262,054호; 제7,070,934호; 제7,361,635호; 제7,253,273호; 및 미국 특허 공개 제2005/0064474호; 2007/0218528호; 2005/0267061호를 참조하며, 이들 모두는 그들의 전문이 본 명세서에 참조로서 포함된다.

유전자 조작된 아연 핑거 결합 도메인은 자연적으로 생기는 아연 핑거 단백질에 비해 신규한 결합 특이성을 가질 수 있다. 유전자조작 방법은 합리적 설계 및 다양한 유형의 선택을 포함한다. 합리적 설계는, 예를 들어 삼중(또는 사중) 뉴클레오타이드 서열 및 개개의 아연 핑거 아미노산 서열을 포함하는 데이터베이스를 사용하는 것을 포함하며, 이때 각각의 삼중 또는 사중 뉴클레오타이드 서열은 특정 삼중 또는 사중 서열에 결합되는 아연 핑거의 하나 이상의 아미노산 서열과 결합된다. 예를 들어, 공동 출원된 미국 특허 제6,453,242호 및 제6,534,261호를 참조하며, 이들은 그들의 전문이 본 명세서에 참조로서 포함된다.

파지 디스플레이 및 2혼성체 시스템을 포함하는, 예시적인 선택 방법은 미국 특허 제5,789,538호; 제5,925,523호; 제6,007,988호; 제6,013,453호; 제6,410,248호; 제6,140,466호; 제6,200,759호; 및 제6,242,568호뿐만 아니라; WO　98/37186호; WO　98/53057호; WO　00/27878호; WO　01/88197호 및 GB 2,338,237호에 개시되어 있다. 추가로, 아연 핑거 결합 도메인에 대한 결합 특이성의 향상은, 예를 들어 공동 출원된 WO　02/077227호에 기재되었다.

추가로, 이들 및 다른 참고문헌에 개시된 바와 같이, 아연 핑거 도메인 및/또는 멀티 핑거 아연 핑거 단백질은, 예를 들어 길이로 5개 이상의 아미노산의 링커를 포함하는 임의의 적합한 링커 서열을 사용하여 함께 연결될 수 있다. 또한, 길이로 6개 이상의 아미노산의 예시적 링커 서열에 대해 미국 특허 제6,479,626호; 제6,903,185호; 및 제7,153,949호 참조. 본 명세서에 기재된 단백질은 단백질의 개개의 아연 핑거 사이에 적합한 링커의 어떤 조합을 포함할 수 있다. 추가로, 아연 핑거 결합 도메인에 대한 결합 특이성의 향상은, 예를 들어 공동 출원된 WO　02/077227호에 기재되어 있다.

표적 부위의 선택; 융합 단백질(및 이를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드)의 설계 및 구성을 위한 ZFP 및 방법은 당업자에게 공지되어 있으며, 미국 특허 제6,140,0815호; 제789,538호; 제6,453,242호; 제6,534,261호; 제5,925,523호; 제6,007,988호; 제6,013,453호; 제6,200,759호; WO　95/19431호; WO　96/06166호; WO　98/53057호; WO　98/54311호; WO　00/27878호; WO　01/60970호 WO　01/88197호; WO　02/099084호; WO　98/53058호; WO　98/53059호; WO　98/53060호; WO　02/016536호 및 WO　03/016496호에 상세하게 기재되어 있다.

추가로, 이들 및 다른 참고문헌에 개시된 바와 같이, 아연 핑거 도메인 및/또는 다수 핑거 아연 핑거 단백질은, 예를 들어 길이로 5개 이상의 아미노산 링커를 포함하는 어떤 적합한 링커 서열을 사용하여 함께 연결될 수 있다. 또한 길이로 6개 이상의 아미노산의 예시적 링커 서열에 대해 미국 특허 제6,479,626호; 제6,903,185호; 및 제7,153,949호 참조. 본 명세서에 기재된 단백질은 단백질의 개개 아연 핑거 간의 적합한 링커의 어떤 조합을 포함할 수 있다.

특정 실시형태에서, DNA 결합 도메인은 Htt 유전자 내 표적 부위에 결합되고(서열 특이적 방식으로), Htt의 발현을 조절하는 유전자 조작된 아연 핑거 단백질이다. ZFP는 돌연변이체 Htt 대립유전자 또는 야생형 Htt 서열 중 하나에 선택적으로 결합될 수 있다. Htt 표적 부위는 전형적으로 적어도 하나의 아연 핑거를 포함하지만, 다수의 아연 핑거(예를 들어, 2, 3, 4, 5, 6 이상의 핑거)를 포함할 수 있다. 보통, ZFP는 적어도 3개의 핑거를 포함한다. 특정 ZFP는 4, 5 또는 6개의 핑거를 포함하는 한편, 일부 ZFP는 8, 9, 10, 11 또는 12개 핑거를 포함한다. 3개의 핑거를 포함하는 ZFP는 전형적으로 9 또는 10개의 뉴클레오타이드를 포함하는 표적 부위를 인식하며; 4개의 핑거를 포함하는 ZFP는 전형적으로 12 내지 14개의 뉴클레오타이드를 포함하는 표적 부위를 인식하는 한편; 6개의 핑거를 갖는 ZFP는 18개 내지 21개 뉴클레오타이드를 포함하는 표적 부위를 인식할 수 있다. ZFP는 또한 하나 이상의 조절 도메인을 포함하는 융합 단백질일 수 있는데, 이 도메인은 전사 활성화 또는 억제 도메인일 수 있다. 일부 실시형태에서, 융합 단백질은 함께 연결된 2개의 ZFP DNA 결합 도메인을 포함한다. 따라서 이들 아연 핑거 단백질은 8, 9, 10, 11, 12 이상의 핑거를 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 2개의 DNA 결합 도메인은 하나의 DNA 결합 도메인이 4, 5 또는 6개 아연 핑거를 포함하고, 제2 DNA 결합 도메인이 추가적인 4, 5 또는 5개의 아연 핑거를 포함하도록 확장가능한 가요성 링커를 통해 연결된다. 일부 실시형태에서, 링커는 핑거 배열이 8, 9, 10, 11 또는 12 이상의 핑거를 포함하는 하나의 DNA 결합 도메인을 포함하기 위한 표준 핑거 간 링커이다. 다른 실시형태에서, 링커는 가요성 링커와 같은 비전형적 링커이다. DNA 결합 도메인은 적어도 하나의 조절 도메인에 융합되고, 'ZFP-ZFP-TF' 구조로서 생각될 수 있다. 이들 실시형태의 구체적 예는 가요성 링커와 연결되고 KOX 리프레서 및 "ZFP-KOX-ZFP-KOX"에 융합된 2개의 DNA를 포함하는 ZFP-ZFP-KOX로서 지칭될 수 있으며, 여기서 2개의 ZFP-KOX 융합 단백질은 링커를 통해 함께 융합된다.

대안적으로, DNA-결합 도메인은 뉴클레아제로부터 유래될 수 있다. 예를 들어, 귀소(homing) 엔도뉴클레아제 및 메가뉴클레아제, 예컨대 I-SceI, I-CeuI, PI-PspI, PI-Sce, I-SceIV, I-CsmI, I-PanI, I-SceII, I-PpoI, I-SceIII, I-CreI, I-TevI, I-TevII 및 I-TevIII의 인식 서열이 공지되어 있다. 또한 미국 특허 제5,420,032호; 미국 특허 제6,833,252호; 문헌[Belfort et al . (1997) Nucleic Acids Res . 25:3379-3388; Dujon et al . (1989) Gene 82:115-118; Perler et al . (1994) Nucleic Acids Res. 22, 1125-1127; Jasin (1996) Trends Genet . 12:224-228; Gimble et al. (1996) J. Mol . Biol . 263:163-180; Argast et al . (1998) J. Mol . Biol . 280:345-353] 및 뉴잉글랜드 바이오랩스(New England Biolabs) 카탈로그 참조. 추가로, 귀소 엔도뉴클레아제 및 메가뉴클레아제의 DNA-결합 특이성은 비천연 표적 부위에 결합되도록 유전자 조작될 수 있다. 예를 들어, 문헌[Chevalier et al. (2002) Molec . Cell 10:895-905; Epinat et al . (2003) Nucleic Acids Res . 31:2952-2962; Ashworth et al . (2006) Nature 441:656-659; Paques et al . (2007) Current Gene Therapy 7:49-66]; 미국 특허 공개 제20070117128호 참조.

"투 핸드" 아연 핑거 단백질은 아연 핑거 DNA 결합 도메인의 2개 클러스터가 아미노산을 개재함으로써 분리되고, 따라서 2개의 아연 핑거 도메인이 2개의 불연속 표적 부위에 결합되는 해당 단백질이다. 아연 핑거 결합 단백질의 투 핸드 유형의 예는 SIP1이며, 여기서 4개 아연 핑거의 클러스터는 단백질의 아미노 말단에서 위치되고, 3개 핑거의 클러스터는 카복실 말단에 위치된다(문헌[Remacle et al, (1999) EMBO Journal 18 (18): 5073-5084] 참조). 이들 단백질에서 아연 핑거의 각 클러스터는 독특한 표적 서열에 결합될 수 있고, 2개의 표적 서열 사이의 간격은 다수의 뉴클레오타이드를 포함할 수 있다. 투 핸드 ZFP는 기능성 도메인을 포함할 수 있으며, ZFP 중 하나 또는 둘 다에 융합될 수 있다. 따라서, 기능성 도메인은 하나 또는 둘 다의 ZFP의 외부에 부착될 수 있거나(도 1c 참조) 또는 ZFP 사이에 위치될 수 있다(ZFP 둘 다에 부착됨)는 것은(도 4 참조) 명백할 것이다.

Htt-태그된 ZFP의 구체적 예는 표 1A 및 표 1B에 개시된다. 이 표에서의 제1 열은 ZFP에 대해 내부 준거 명칭(숫자)이며 표 2A 및 표 2B의 열 1에서 동일한 명칭에 대응된다. "F"는 핑거를 지칭하며, "F" 다음의 숫자는 아연 핑거를 지칭한다(예를 들어, "F1"은 핑거 1을 지칭한다).

(표 1A)

(표 1B)

이들 단백질의 표적 부위에 대한 서열 및 위치를 표 2A 및 표 2B에 개시한다. 표 2A 및 표 2B는 표시된 아연 핑거 단백질에 대한 표적 서열을 나타낸다. ZFP 인식 나선에 의해 접촉되는 표적 부위에서의 뉴클레오타이드는 대문자로 나타내며; 비접촉 뉴클레오타이드는 소문자로 나타낸다.

(표 2A)

(표 2B)

특정 실시형태에서, DNA-결합 도메인은 자연적으로 생기거나 또는 유전자 조작된(비자연적으로 생기는) TAL 효과기(TALE) DNA 결합 도메인을 포함한다. 예를 들어, 미국 특허 공개 제20110301073호를 참조하며, 이는 그의 전문이 본 명세서에 참조로서 포함된다. 산토모나스(Xanthomonas)속의 식물 병원성 박테리아는 중요한 농작물에서의 다수의 질병을 야기하는 것으로 알려져 있다. 산토모나스의 병원성은 식물 세포 내로 25가지 이상의 상이한 효과기 단백질을 주사하는 보존된 III형 분비(T3S) 시스템에 의존한다. 이들 중에서, 주사된 단백질은 식물 전사 활성체를 모방하고 식물 전사체를 조작하는 전사 활성체-유사 효과기(TALE)이다(문헌[Kay et al (2007) Science 318:648-651] 참조). 이들 단백질은 DNA 결합 도메인 및 전사 활성화 도메인을 함유한다. 가장 잘 특성규명된 TALE 중 하나는 산토모나스 캄페스트그리스 베시카토리아(Xanthomonas campestgris pv. Vesicatoria)로부터의 AvrBs3이다(문헌[Bonas et al (1989) Mol Gen Genet 218: 127-136] 및 WO2010079430 참조). TALE는 종열중복의 집중된 도메인을 함유하며, 각각의 반복체는 이들 단백질의 DNA 결합 특이성에 대해 중요한 대략 34개의 아미노산을 함유한다. 추가로, 그들은 핵 국소화 서열 및 산성 전사 활성화 도메인을 함유한다(검토를 위해 문헌[Schornack S, et al (2006) J Plant Physiol 163(3): 256-272] 참조). 추가로, 식물병원성 박테리아 랄스토니아 솔라나시아룸(Ralstonia solanacearum) 2개 유전자에서, 산토모나스의 AvrBs3 패밀리에 대해 상동성인 지정된 brg11 및 hpx17이 랄스토니아 솔라나시아룸 생태형 1 균주 GMI1000에서 및 생태형 4 균주 RS1000에서 발견되었다(문헌[Heuer et al (2007) Appl and Envir Micro 73(13): 4379-4384] 참조). 이들 유전자는 서로 뉴클레오타이드 서열이 98.9% 동일하지만, hpx17의 반복체 도메인에서 1,575 bp의 결실만큼 상이하다. 그러나, 유전자 산물은 둘 다 산토모나스의 AvrBs3 패밀리 단백질과 40% 미만의 서열 동일성을 가진다.

이들 TALE의 특이성은 종열중복에서 발견된 서열에 의존한다. 관련된 서열은 대략 102bp를 포함하며, 반복체는 전형적으로 서로 91% 내지 100% 상동성이다(Bonas et al , 상기 참조). 반복체의 다형성은 보통 위치 12 및 13에 위치되며, TALE의 표적 서열에서 인접한 뉴클레오타이드의 동일성을 지니는 위치 12 및 13에서 초가변 2잔기의 동일성 사이의 1 대 1 대응이 나타난다(문헌[Moscou and Bogdanove, (2009) Science 326:1501 및 Boch et al (2009) Science 326:1509-1512] 참조). 실험적으로, 이들 TALE의 DNA 인식을 위한 암호는 위치 12 및 13에서 HD 서열이 사이토신(C)에 대한 결합을 결합을 야기하고, NG는 T에 결합되며, NI는 A, C, G 또는 T에 결합되고, NN은 A 또는 G에 결합되며, IG는 T에 결합되도록 결정되었다. 이들 DNA 결합 반복체는 새로온 조합 및 반복체의 수로 단백질 내에 조립되어 새로운 서열과 상호작용할 수 있고 식물 세포 내 비내인성 리포터 유전자의 발현을 활성화시킬 수 있는 인공 전사 인자를 만들었다(Boch et al , 상기 참조). 유전자 조작된 TAL 단백질은 FokI 절단 절반 도메인에 연결되어 효모 리포터 분석(플라스미드 기반 표적)에서 활성을 나타내는 TAL 효과기 도메인 뉴클레아제 융합(TALEN)을 수득한다. Christian et al ((2010)< Genetics epub 10.1534/genetics.110.120717). 또한, 미국 특허 공개 제20110301073호를 참조하며, 이는 그의 전문이 본 명세서에 참조로서 포함된다.

ZFP 또는 TALE 단백질과 함께 사용되는 설계된 다이머화 도메인의 구체적 예는 표 3에 열거된다. 2가지 유형의 도메인, 또 꼬인 나선(CC) 및 다이머화 아연 핑거(DZ)의 아미노산 서열이 열거된다.

융합 단백질

본 명세서에 기재된 바와 같은 DNA-결합 단백질(예를 들어, ZFP 또는 TALE) 및 이종성 조절(기능성) 도메인(또는 이의 기능성 단편)을 포함하는 융합 단백질이 또한 제공된다. 보통의 도메인은, 예를 들어 전사 인자 도메인(활성체, 리프레서, 공활성체, 코리프레서), 사일런서, 발암유전자(예를 들어, myc, jun, fos, myb, max, mad, rel, ets, bcl, myb, mos 패밀리 구성원 등); DNA 회복 효소 및 그의 관련된 인자 및 변형제; DNA 재배열 효소 및 그의 관련된 인자 및 변형제; 염색질 관련 단백질 및 그의 변형제(예를 들어 키나제, 아세틸라제 및 데아세틸라제); 및 DNA 변형 효소(예를 들어, 메틸트랜스퍼라제, 토포아이소머라제, 헬리카제, 리가제, 키나제, 포스파타제, 중합효소, 엔도뉴클레아제) 및 그의 관련 인자 및 변형제를 포함한다. DNA-결합 도메인 및 뉴클레아제 절단 도메인의 융합에 관한 상세한 설명을 위해 미국 특허 출원 공개 제20050064474호; 제20060188987호 및 제2007/0218528호를 참조하며, 이들의 전문은 본 명세서에 참조로서 포함된다.

활성화를 달성하기 위한 적합한 도메인은 HSV VP16 활성화 도메인(예를 들어, 문헌[Hagmann et al., J. Virol. 71, 5952-5962 (1997)] 참조) 핵 호르몬 수용체(예를 들어, 문헌[Torchia et al., Curr . Opin . Cell . Biol. 10:373-383 (1998)] 참조); 핵 인자 카파 B의 p65 서브유닛(Bitko & Barik, J. Virol. 72:5610-5618 (1998) 및 Doyle & Hunt, Neuroreport 8:2937-2942 (1997)); Liu et al., Cancer Gene Ther. 5:3-28 (1998)), 또는 인공 키메라 기능성 도메인, 예컨대 VP64(Beerli et al., (1998) Proc . Natl . Acad . Sci . USA 95:14623-33), 및 데그론(degron)(Molinari et al., (1999) EMBO J. 18, 6439-6447)을 포함한다. 추가적인 예시적 활성화 도메인은 Oct 1, Oct-2A, Sp1, AP-2 및 CTF1(Seipel et al ., EMBO J. 11, 4961-4968 (1992)뿐만 아니라 p300, CBP, PCAF, SRC1 PvALF, AtHD2A 및 ERF-2를 포함한다. 예를 들어, 문헌[Robyr et al . (2000) Mol . Endocrinol . 14:329-347; Collingwood et al. (1999) J. Mol. Endocrinol. 23:255-275; Leo et al . (2000) Gene 245:1-11; Manteuffel-Cymborowska (1999) Acta Biochim . Pol. 46:77-89; McKenna et al . (1999) J. Steroid Biochem . Mol . Biol. 69:3-12; Malik et al . (2000) Trends Biochem . Sci . 25:277-283; 및 Lemon et al . (1999) Curr . Opin. Genet . Dev. 9:499-504] 참조. 추가적인 예시적 활성화 도메인은, OsGAI, HALF-1, C1, AP1, ARF-5, -6, -7 및 -8, CPRF1, CPRF4, MYC-RP/GP, 그리고 TRAB1을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. 예를 들어, 문헌[Ogawa et al . (2000) Gene 245:21-29; Okanami et al . (1996) Genes Cells 1:87-99; Goff et al . (1991) Genes Dev. 5:298-309; Cho et al. (1999) Plant Mol. Biol . 40:419-429; Ulmason et al . (1999) Proc . Natl . Acad . Sci . USA 96:5844-5849; Sprenger-Haussels et al . (2000) Plant J. 22:1-8; Gong et al . (1999) Plant Mol . Biol . 41:33-44; 및 Hobo et al. (1999) Proc . Natl . Acad . Sci . USA 96:15,348-15,353] 참조.

DNA-결합 도메인과 기능성 도메인 간의 융합 단백질(또는 이를 암호화하는 핵산)의 형성에서, 활성화 도메인과 상호작용하는 분자 또는 활성화 도메인은 기능성 도메인으로서 적합하다. 본질적으로 표적 유전자에 대해 활성화 복합체 및/또는 활성화 활성(예를 들어, 히스톤 아세틸화)을 채택할 수 있는 임의의 분자는 융합 단백질의 활성화 도메인으로서 유용하다. 융합 분자에서 기능성 도메인으로서 사용에 적합한 ISWI-함유 도메인 및/또는 메틸 결합 도메인 단백질과 같은 절연인자 도메인, 국소화 도메인 및 염색질 리모델링 단백질은, 예를 들어 공동 출원된 미국 특허 제2002/0115215호 및 제2003/0082552호 및 공동 출원된 WO 02/44376호에서 기재된다.

예시적인 억제 도메인은 KRAB A/B, KOX, TGF-베타-유도성 초기 유전자(TIEG), v-erbA, SID, MBD2, MBD3, DNMT 패밀리의 구성원(예를 들어, DNMT1, DNMT3A, DNMT3B), Rb, 및 MeCP2를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. 예를 들어, 문헌[Bird et al. (1999) Cell 99:451-454; Tyler et al. (1999) Cell 99:443-446; Knoepfler et al . (1999) Cell 99:447-450; 및 Robertson et al. (2000) Nature Genet. 25:338-342] 참조. 추가적인 예시적 억제 도메인은 ROM2 및 AtHD2A를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. 예를 들어, 문헌[Chem et al . (1996) Plant Cell 8:305-321; 및 Wu et al . (2000) Plant J. 22:19-27] 참조.

융합 분자는 당업자에게 잘 공지된 클로닝 및 생화학적 컨쥬게이션 방법에 의해 구성된다. 융합 분자는 DNA-결합 도메인 및 기능성 도메인(예를 들어, 전사 활성화 또는 억제 도메인)을 포함한다. 융합 분자는 또한 핵 국소화 신호(예를 들어 SV40 배지 T-항원으로부터의 신호) 및 에피토프 태그(예를 들어, FLAG 및 혈구응집소)를 선택적으로 포함한다. 융합 단백질(및 그것을 암호화하는 핵산)은 번역 리딩 프레임(translational reading frame)이 융합 성분 중에 보존되도록 설계된다.

한편으로 기능성 도메인(또는 이의 기능성 단편)의 폴리펩타이드 성분과 다른 한편으로 비단백질 DNA-결합 도메인(예를 들어, 항생물질, 삽입제, 부수적 그루브 결합제, 핵산) 간의 융합은 당업자에게 공지된 생화학적 컨쥬게이션 방법에 의해 구성된다. 예를 들어 피어스 케미컬 컴퍼니(Pierce Chemical Company)(일리노이주 락포드에 소재) 카탈로그 참조. 부수적 그루브 결합제와 폴리펩타이드 간의 융합을 만들기 위한 방법 및 조성물이 기재되었다. 문헌[Mapp et al . (2000) Proc . Natl. Acad . Sci . USA 97:3930-3935].

특정 실시형태에서, DNA 결합 도메인에 의해 결합된 표적 부위는 세포의 염색질의 접근가능한 영역에 존재한다. 접근가능한 영역은, 예를 들어 공동출원된 국제특허출원 공개 WO 01/83732호에 기재되어 있다. 표적 부위가 세포 염색질의 접근가능한 영역에 존재하지 않는다면, 하나 이상의 접근가능한 영역은 공동 출원된 WO 01/83793호에 기재된 바와 같이 만들어질 수 있다. 추가적인 실시형태에서, 융합 분자의 DNA-결합 도메인은 그의 표적 부위가 접근가능한 영역인지 여부와 관계없이 세포 염색질에 결합될 수 있다. 예를 들어, 이러한 DNA-결합 도메인은 링커 DNA 및/또는 뉴클레오솜 DNA에 결합될 수 있다. 이런 유형의 "개척자(pioneer)" DNA 결합 도메인의 예는 특정 스테로이드 수용체에서 및 간세포핵인자3(hepatocyte nuclear factor 3: HNF3)에서 발견된다. 문헌[Cordingley et al. (1987) Cell 48:261-270; Pina et al. (1990) Cell 60:719-731; 및 Cirillo et al . (1998) EMBO J. 17:244-254].

융합 분자는 당업자에게 공지된 것과 같이 약제학적으로 허용가능한 담체와 함께 제형화될 수 있다. 예를 들어, 문헌[Remington's Pharmaceutical Sciences, 17th ed., 1985]; 및 공동 출원된 WO 00/42219 참조.

융합 분자의 기능성 성분/도메인은, 일단 융합 분자가 그의 DNA 결합 도메인을 통해 표적 서열에 결합된다면, 유전자의 전사에 영향을 미칠 수 있는 다양한 상이한 성분 중 어떤 것으로부터 선택될 수 있다. 따라서, 기능성 성분은 다양한 전사 인자 도메인, 예컨대 활성체, 리프레서, 공활성체, 코리프레서, 및 사일런서를 포함할 수 있지만, 이들로 제한되지 않는다.

추가적인 예시적 기능성 도메인은, 예를 들어 공동 출원된 미국 특허 제6,534,261호 및 미국 특허 출원 공개 제2002/0160940호에 개시되어 있다.

외인성 소분자 또는 리간드에 의해 조절되는 기능성 도메인이 또한 선택될 수 있다. 예를 들어, 레오스윗치(RheoSwitch)(등록상표) 기술이 사용될 수 있되, 기능성 도메인만이 외부 레오켐(RheoChem)(상표명) 리간드의 존재에서 그의 활성 입체구조를 추정한다(예를 들어, 미국 특허 제20090136465호). 따라서, ZFP 또는 TALE은 조절가능한 기능성 도메인에 작동가능하게 연결될 수 있되, ZFP-TF 또는 TALE-TF의 얻어진 활성은 외부 리간드에 의해 제어된다.

뉴클레아제

특정 실시형태에서, 융합 단백질은 DNA-결합 결합 도메인 및 절단(뉴클레아제) 도메인을 포함한다. 이와 같이, 유전자 변형은 뉴클레아제, 예를 들어 유전자 조작된 뉴클레아제를 사용하여 달성될 수 있다. 유전자 조작된 뉴클레아제 기법은 자연적으로 생기는 DNA-결합 단백질의 유전자 조작에 기반한다. 예를 들어, 맞춤 DNA-결합 특이성을 이용하는 귀소 엔도뉴클레아제의 유전자조작이 기재되었다. (문헌[Chames et al. (2005) Nucleic Acids Res 33(20):e178; Arnould et al. (2006) J. Mol . Biol . 355:443-458] 참조). 추가로, ZFP의 유전자 조작이 또한 기재되었다. 예를 들어, 미국 특허 제6,534,261호; 제6,607,882호; 제6,824,978호; 제6,979,539호; 제6,933,113호; 제7,163,824호; 및 제7,013,219호 참조.

추가로, ZFP 및 TALE은 뉴클레아제 도메인에 융합되어 그들의 유전자 조작된(ZFP 또는 TALE) DNA 결합 도메인을 통해 그들의 의도된 핵산 표적을 인식할 수 있고, 뉴클레아제 활성을 통해 DNA가 ZFP 또는 TALE DNA 결합 부위 근처를 절단하도록 야기하는 ZFN 및 TALEN-기능성 독립체를 만들었다. 예를 들어 문헌[Kim et al. (1996) Proc Natl Acad Sci USA 93(3):1156-1160] 참조. 더 최근에, ZFN은 다양한 유기체에서 게놈 변형을 위해 사용되었다. 예를 들어, 미국 특허 공개 제20030232410호; 제20050208489호; 제20050026157호; 제20050064474호; 제20060188987호; 제20060063231호; 및 국제특허출원 공개 WO 07/014275호 참조.

따라서, 본 명세서에 기재된 방법 및 조성물은 광범위하게 적용가능하며 관심 대상의 어떤 뉴클레아제를 수반할 수 있다. 뉴클레아제의 비제한적 예는 메가뉴클레아제, TALEN 및 아연 핑거 뉴클레아제를 포함한다. 뉴클레아제는 이종성 DNA-결합 및 절단 도메인(예를 들어, 아연 핑거 뉴클레아제; TALEN; 이종성 절단 도메인을 지니는 메가뉴클레아제 DNA-결합 도메인)을 포함할 수 있거나 또는 대안적으로, 자연적으로 생기는 뉴클레아제의 DNA-결합 도메인은 선택된 표적 부위(같은 기원의 결합 부위와 상이한 부위에 결합되도록 유전자 조작된 메가뉴클레아제)에 결합되도록 변성될 수 있다.

특정 실시형태에서, 뉴클레아제는 메가뉴클레아제(귀소 엔도뉴클레아제)이다. 자연적으로 생기는 메가뉴클레아제는 15 내지 40개 염기쌍 절단 부위를 인식하며, 보통 4가지의 패밀리로 그룹화된다: LAGLIDADG 패밀리, GIY-YIG 패밀리, His-Cyst 박스 패밀리 및 HNH 패밀리. 예시적인 귀소 엔도뉴클레아제는 I-SceI, I-CeuI, PI-PspI, PI-Sce, I-SceIV, I-CsmI, I-PanI, I-SceII, I-PpoI, I-SceIII, I-CreI, I-TevI, I-TevII 및 I-TevIII을 포함한다. 그들의 인식 서열은 공지되어 있다. 또한 미국 특허 제5,420,032호; 미국 특허 제6,833,252호; Belfort et al . (1997) Nucleic Acids Res . 25:3379-3388; Dujon et al . (1989) Gene 82:115-118; Perler et al . (1994) Nucleic Acids Res. 22, 1125-1127; Jasin (1996) Trends Genet. 12:224-228; Gimble et al. (1996) J. Mol . Biol . 263:163-180; Argast et al. (1998) J. Mol . Biol . 280:345-353 및 뉴잉글랜드 바이오랩스 카탈로그 참조.

자연적으로 생기는 메가뉴클레아제로부터의, 주로 LAGLIDADG 패밀리로부터의 DNA-결합 도메인은 식물, 효모, 초파리, 포유류 세포 및 마우스에서 부위 특이적 게놈 변형을 촉진하기 위해 사용되었지만, 이 접근은 메가뉴클레아제 인식 서열을 보존하는 상동성 유전자의 변형으로(Monet et al. (1999), Biochem . Biophysics . Res . Common . 255: 88-93) 또는 인식 서열이 도입된 사전 유전자 조작된 게놈으로 제한되었다(Route et al. (1994), Mol . Cell. Biol. 14:8096-106; Chilton et al . (2003) Plant Physiology 133:956-65; Puchta et al. (1996), Proc. Natl . Acad . Sci . USA 93: 5055-60; Rong et al. (2002), Genes Dev. 16: 1568-81; Gouble et al. (2006), J. Gene Med . 8(5):616-622). 따라서, 의학적으로 또는 생체기술적으로 적절한 부위에서 신규한 결합 특이성을 나타내는 메가뉴클레아제를 유전자 조작하기 위한 시도가 만들어졌다(문헌[Porteus et al. (2005), Nat . Biotechnol. 23: 967-73; Sussman et al. (2004), J. Mol . Biol . 342: 31-41; Epinat et al . (2003), Nucleic Acids Res. 31: 2952-62; Chevalier et al . (2002) Molec . Cell 10:895-905; Epinat et al . (2003) Nucleic Acids Res . 31:2952-2962; Ashworth et al . (2006) Nature 441:656-659; Paques et al . (2007) Current Gene Therapy 7:49-66]; 미국 특허 공개 제20070117128호; 제20060206949호; 제20060153826호; 20060078552호; 및 제 20040002092호). 추가로, 메가뉴클레아제로부터 자연적으로 생기는 또는 유전자 조작된 DNA-결합 도메인은 또한 이종성 뉴클레아제로부터의 절단 도메인(예를 들어, FokI)에 의해 작동가능하게 연결되었다.

다른 실시형태에서, 뉴클레아제는 아연 핑거 뉴클레아제(ZFN)이다. ZFN은 선택 유전자 내 표적 부위 및 절단 도메인 또는 절단 절반-도메인에 결합되도록 유전자 조작된 아연 핑거 단백질을 포함한다.

상기 상세하게 기재한 바와 같이, 아연 핑거 결합 도메인은 선택 서열에 결합되도록 유전자 조작될 수 있다. 예를 들어, 문헌[Beerli et al . (2002) Nature Biotechnol . 20:135-141; Pabo et al . (2001) Ann . Rev . Biochem . 70:313-340; Isalan et al . (2001) Nature Biotechnol . 19:656-660; Segal et al . (2001) Curr . Opin . Biotechnol . 12:632-637; Choo et al . (2000) Curr . Opin. Struct . Biol . 10:411-416] 참조. 유전자 조작된 아연 핑거 결합 도메인은 자연적으로 생기는 아연 핑거 단백질에 비해 신규한 결합 특이성을 가질 수 있다. 유전자조작 방법은 합리적 설계 및 다양한 유형의 선택을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. 합리적 설계는, 예를 들어 삼중(또는 사중) 뉴클레오타이드 서열 및 개개의 아연 핑거 아미노산 서열을 포함하는 데이터베이스를 사용하는 것을 포함하며, 이때 각각의 삼중 또는 사중 뉴클레오타이드 서열에 결합되는 아연 핑거의 하나 이상의 아미노산 서열과 결합된다. 예를 들어, 본 명세서에 전문이 참조로서 포함된 공동 출원된 미국 특허 제6,453,242호 및 제6,534,261호 참조.

파지 디스플레이 및 2-혼성체 시스템을 포함하는 예시적인 선택 방법은 미국 특허 제5,789,538호; 제5,925,523호; 제6,007,988호; 제6,013,453호; 제6,410,248호; 제6,140,466호; 제6,200,759호; 및 제6,242,568호뿐만 아니라; WO　98/37186호; WO　98/53057호; WO　00/27878호; WO　01/88197호 및 GB 2,338,237호에 개시되어 있다. 추가로, 아연 핑거 결합 도메인의 결합 특이성의 향상은, 예를 들어 공동 출원된 WO　02/077227호에 기재되어 있다.

추가로, 이들 및 다른 참고문헌에 개시된 바와 같이, 아연 핑거 도메인 및/또는 멀티 핑거 아연 핑거 단백질은, 예를 들어, 길이로 5개 이상의 아미노산의 링커를 포함하는 어떤 적합한 링커 서열(예를 들어, TGEKP(서열번호 135), TGGQRP(서열번호 136), TGQKP(서열번호 137), 및/또는 TGSQKP(서열번호 138))을 사용하여 함께 연결될 수 있다. 예를 들어, 길이로 6개 이상의 아미노산의 예시적 링커 서열에 대해 미국 특허 제6,479,626호; 제6,903,185호; 및 제7,153,949호 참조. 본 명세서에 기재된 단백질은 단백질의 개개의 아연 핑거 사이의 적합한 링커의 어떤 조합을 포함할 수 있다. 또한, 미국 가특허 출원 공개 제20110287512호 참조.

CRISPR(Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats)/Cas (CRISPR Associated) 뉴클레아제 시스템은 게놈 유전자조작을 위해 사용될 수 있는 박테리아 시스템에 기반한 최근에 유전자 조작된 뉴클레아제 시스템이다. 이는 다수의 박테리아 및 고세균(archea)의 적응 면역 반응의 부분에 기반한다. 바이러스 또는 플라스미드가 박테리아에 침입할 때, 침입자의 DNA 세그먼트는 면역 반응에 의해 CRISPR RNA(crRNA)로 전환된다. 그 다음에 이 crRNA는 부분적 상보성을 통해, 프로토스페이서(protospacer)로 불리는 표적 DNA에서 crRNA와 상동성인 영역에 대해 Cas9 뉴클레아제를 인도하기 위해 tracrRNA로 불리는 RNA의 다른 유형과 결합된다. Cas9는 crRNA 전사체 내에 함유된 20-뉴클레오타이드 가이드 서열에 의해 구체화된 부위에서의 DSB에서 평활 말단을 만들기 위해 DNA를 절단한다. Cas9는 부위 특이적 DNA 인식 및 절단을 위해 crRNA와 tracrRNA를 둘 다 필요로 한다. 이 시스템은 현재 crRNA 및 tracrRNA가 하나의 분자("단일 가이드 RNA")로 합쳐질 수 있고, 단일 가이드 RNA의 crRNA 동일 부분이 유전자조작되어 임의의 원하는 서열을 표적화하도록 Cas9 뉴클레아제를 인도하기 위해 유전자조작되었다(문헌[Jineket al (2012) Science 337, p. 816-821, Jineket al, (2013), eLife 2:e00471, 및 David Segal, (2013) eLife 2:e00563] 참조). 따라서, CRISPR/Cas 시스템은 게놈 내 원하는 표적에서 DSB를 만들도록 유전자조작될 수 있거나, DSB의 회복은 회복 저해제의 사용에 의해 영향받아서 오류유발회복(error prone repair)에서의 증가를 야기할 수 있다.

뉴클레아제, 예컨대 ZFN, TALEN 및/또는 메가뉴클레아제는 또한 뉴클레아제(절단 도메인, 절단 절반 도메인)를 포함한다. 상기 주목한 바와 같이, 절단 도메인은 DNA-결합 도메인, 예를 들어 아연 핑거 DNA-결합 도메인 및 뉴클레아제로부터의 절단 도메인 또는 메가뉴클레아제 DNA-결합 도메인 및 상이한 뉴클레아제로부터의 절단 도메인에 대해 상동성일 수 있다. 이종성 절단 도메인은 어떤 엔도뉴클레아제 또는 엑소뉴클레아제로부터 얻을 수 있다. 절단 도메인이 유래될 수 있는 예시적 엔도뉴클레아제는 제한 엔도뉴클레아제 및 귀소 엔도뉴클레아제를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. 예를 들어, 2002-2003 카탈로그, 매사추세츠주 비버리에 소재한 뉴잉글랜드 바이오랩스; 및 문헌[Belfort et al. (1997) Nucleic Acids Res . 25:3379-3388] 참조. DNA를 절단하는 추가적인 효소는 공지되어 있다(예를 들어, S1 뉴클레아제; 녹두 뉴클레아제; 췌장 DNase I; 마이크로코칼 뉴클레아제; 효모 HO 엔도뉴클레아제; 또한 문헌[Linn et al . (eds.) Nucleases, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1993] 참조). 이들 효소 중 하나 이상(또는 이의 기능성 단편)은 절단 도메인 및 절단 절반-도메인의 공급원으로서 사용될 수 있다.

유사하게, 절단 절반 도메인은 절단 활성을 위한 다이머화를 필요로 하는 상기 제시한 바와 같은 어떤 뉴클레아제 또는 이의 부분으로부터 유래될 수 있다. 일반적으로, 융합 단백질이 절단 절반-도메인을 포함한다면, 2개의 융합 단백질은 절단에 필요로 된다. 대안적으로, 2개의 절단 절반-도메인을 포함하는 단일 단백질이 사용될 수 있다. 2개의 절단 절반-도메인은 동일한 엔도뉴클레아제(또는 이의 기능성 단편)으로부터 유래될 수 있거나, 또는 각각의 절단 절반-도메인은 상이한 엔도뉴클레아제(또는 이의 기능성 단편)로부터 유래될 수 있다. 추가로, 절단 절반 도메인이, 예를 들어 다이머화에 의해 기능성 절단 도메인을 형성하게 하는 서로에 대한 공간적 배향에서 2개의 융합 단백질의 그들의 각각의 표적 부위에 대한 결합이 절단 절반-도메인을 위치시키도록 2개의 융합 단백질에 대한 표적 부위가 바람직하게 배치된다. 따라서, 특정 실시형태에서, 표적 부위의 근처 에지는 5 내지 8개 뉴클레오타이드에 의해 또는 15개 내지 18개 뉴클레오타이드에 의해 분리된다. 그러나 임의의 진정수(integral number)의 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 쌍은 2개의 표적 부위 사이에 개재될 수 있다(예를 들어, 2 내지 50개 뉴클레오타이드 또는 그 이상). 일반적으로, 절단 부위는 표적 부위 사이에 놓인다.

제한 엔도뉴클레아제(제한 효소)는 다수의 종에서 존재하며, DNA에 대해 서열-특이적으로 결합될 수 있고(인식 부위에서), 결합 부위에서 또는 근처에서 DNA를 절단시킬 수 있다. 특정 제한 효소(예를 들어, IIS형)는 인식 부위로부터 제거된 부위에서 DNA를 절단하며, 분리가능한 결합 및 절단 도메인을 가진다. 예를 들어, IIS형 효소 Fok　I은 하나의 가닥에 대해 그의 인식 부위로부터 9개의 뉴클레오타이드에서 및 다른 가닥에 대해 그의 인식 부위로부터 13개의 뉴클레오타이드에서 DNA의 이중 가닥 절단을 촉매한다. 예를 들어, 미국 특허 제5,356,802호; 제5,436,150호 및 제 5,487,994호뿐만 아니라; 문헌[Li et al . (1992) Proc . Natl . Acad. Sci . USA 89:4275-4279; Li et al . (1993) Proc . Natl . Acad . Sci . USA 90:2764-2768; Kim et al . (1994a) Proc . Natl . Acad . Sci . USA 91:883-887; Kim et al. (1994b) J. Biol . Chem . 269:31,978-31,982] 참조. 따라서, 일 실시형태에서, 융합 단백질은 적어도 하나의 IIS형 제한 효소 및 하나 이상의 아연 핑거 결합 도메인으로부터의 절단 도메인(또는 절단 절반 도메인)을 포함하며, 이는 유전자조작될 수도 있거나 또는 유전자 조작되지 않을 수도 있다.

절단 도메인이 결합 도메인으로부터 분리될 수 있는 예시적 IIS형 제한 효소는 Fok 　I이다. 이 특정 효소는 다이머로서 활성이다. 문헌[Bitinaite et al. (1998) Proc . Natl . Acad . Sci . USA 95: 10,570-10,575]. 따라서, 본 개시내용의 목적을 위해, 개시된 융합 단백질에서 사용된 Fok　I 효소의 부분은 절단 절반-도메인으로 고려된다. 따라서, 아연 핑거- 또는 TALE-Fok　I 융합을 사용하는 세포의 서열의 표적화된 이중-가닥 절단 및/또는 표적화된 대체를 위해, 2개의 융합 단백질(각각은 FokI 절단 절반-도메인을 포함함)은 촉매적으로 활성인 절단 도메인을 재구성하기 위해 사용될 수 있다. 대안적으로, 아연 핑거 결합 도메인 및 2개의 Fok　I 절단 절반-도메인을 함유하는 단일 폴리펩타이드 분자가 또한 사용될 수 있다. 아연 핑거- 또는 TALE-Fok　I 융합을 사용하는 표적화된 절단 및 표적화된 서열 변성에 대한 파라미터는 본 명세서의 다른 곳에서 제공된다.

절단 도메인 또는 절단 절반-도메인은 절단 활성을 보유하거나, 또는 멀티머화(예를 들어, 다이머화)하는 능력을 보유하여 기능성 절단 도메인을 형성하는 단백질의 어떤 부분일 수 있다.

예시적 IIS형 제한 효소는 본 명세서에 전문이 포함된 국제특허 공개 WO 07/014275호에 기재되어 있다. 추가적인 제한 효소는 또한 분리가능한 결합 및 절단 도메인을 함유하고, 이들은 본 개시내용에 의해 고려된다. 예를 들어, 문헌[Roberts et al . (2003) Nucleic Acids Res . 31:418-420] 참조.

특정 실시형태에서, 절단 도메인은, 예를 들어 미국 특허 공개 제20050064474 및 20060188987에서 및 미국 출원 제11/805,850호(2007년 5월 23일 출원)에서 기재한 바와 같이 호모다이머화를 최소화하거나 또는 방지하는 하나 이상의 유전자 조작된 절단 절반-도메인(또한 다이머화 도메인 돌연변이체로서 지칭됨)을 포함하며, 이들의 모든 개시내용은 그들의 전문이 본 명세서에 참조로서 포함된다. Fok I의 위치 446, 447, 479, 483, 484, 486, 487, 490, 491, 496, 498, 499, 500, 531, 534, 537 및 538에서 아미노산 잔기는 모두 Fok I 절단 절반-도메인의 다이머화에 영향을 미치기 위한 모든 표적이다. 절대 헤테로다이머를 형성하는 Fok I의 예시적인 유전자 조작된 절단 절반-도메인은 쌍을 포함하는데, 이때 제1 절단 절반-도메인이 Fok I의 위치 490 및 538에서 아미노산 잔기에서 돌연변이를 포함하고 제2 절단 절반-도메인은 아미노산 잔기 486 및 499에서 돌연변이를 포함한다.

따라서, 일 실시형태에서, 490에서 돌연변이는 Glu(E)이 Lys(K)으로 대체되고; 538에서 돌연변이는 Iso(I)이 Lys(K)으로 대체되며; 486에서 돌연변이는 Gln(Q)이 Glu(E)로 대체되고; 위치 499에서 돌연변이는 Iso(I)이 Lys(K)으로 대체된다. 구체적으로, 본 명세서에 기재된 유전자 조작된 절단 절반-도메인은 일 절단 절반-도메인에서 위치 490(E→K) 및 538(I→K)을 돌연변이시켜 유전자 조작된 절단 절반-도메인 지정 "E490K:I538K"를 생성함으로써, 그리고 다른 절단 절반-도메인에서 위치 486(Q→E) 및 499(I→L)를 돌연변이시켜 유전자 조작된 절단 절반-도메인 지정 "Q486E:I499L"을 생성함으로써 제조되었다. 본 명세서에 기재된 유전자 조작된 절단 절반-도메인은 절대 헤테로다이머 돌연변이체이며, 이때 비정상적 절단은 최소화되거나 또는 없어진다. 예를 들어, 본 개시내용에 전문이 참조로서 포함된 미국 특허 공개 제2008/0131962호 및 제2011/0201055호 참조. 특정 실시형태에서, 유전자 조작된 절단 절반-도메인은 위치 486, 499 및 496(야생형 FokI에 대해 넘버링)에서 돌연변이, 예를 들어 위치 486에서 야생형 Gln(Q) 잔기를 Glu(E) 잔기로, 위치 499에서 야생형 Iso(I) 잔기를 Leu(L) 잔기로 및 위치 496에서 야생형 Asn (N) 잔기를 Asp(D) 또는 Glu(E) 잔기로 대체하는 돌연변이(또한 각각 "ELD" 및 "ELE" 도메인으로서 지칭됨)를 포함한다. 다른 실시형태에서, 유전자 조작된 절단 절반-도메인은 위치 490, 538 및 537에서의 돌연변이(야생형 FokI에 대해 넘버링), 예를 들어 위치 490에서 야생형 Glu(E) 잔기를 Lys(K) 잔기로, 위치 538에서 야생형 Iso(I) 잔기를 Lys(K) 잔기로, 위치 537에서 야생형 His(H) 잔기를 Lys(K) 잔기 또는 Arg(R) 잔기로 대체하는 돌연변이(또한 각각 "KKK" 및 "KKR"로서 지칭됨)를 포함한다. 다른 실시형태에서, 유전자 조작된 절단 절반-도메인은 위치 490 및 537에서 돌연변이(야생형 FokI에 대해 넘버링됨), 예를 들어 위치 490에서 야생형 Glu(E) 잔기를 Lys(K) 잔기로 및 위치 537에서 야생형 His(H) 잔기를 Lys(K) 잔기 또는 Arg(R) 잔기로 대체하는 돌연변이(또한 각각 "KIK" 및 "KIR" 도메인으로서 지칭됨)를 포함한다. (미국 특허 공개 제20110201055호 참조).

본 명세서에 기재된 유전자 조작된 절단 절반-도메인은 어떤 적합한 방법을 사용하여, 예를 들어, 미국 특허 공개 제20050064474호 및 20080131962호에 기재된 바와 같은 야생형 절단 절반-도메인(Fok I)의 부위 지정 돌연변이유발에 의해 제조될 수 있다.

대안적으로, 뉴클레아제는 소위 "분할-효소" 기법을 사용하여 핵산 표적 부위에서 생체내에 조립될 수 있다(예를 들어, 미국 특허 공개 제20090068164호). 이러한 분할 효소 성분은 별개의 발현 작제물 상에서 발현될 수 있거나, 또는 개개 성분이, 예를 들어 자기-절단 2A 펩타이드 또는 IRES 서열에 의해 분할되는 하나의 오픈 리딩 프레임(open reading frame)에서 연결될 수 있다. 성분은 개개의 아연 핑거 결합 도메인 또는 메가뉴클레아제 핵산 결합 도메인의 도메인일 수 있다.

일부 실시형태에서, DNA 결합 도메인은 식물 병원균 산토모나스(문헌[Boch et al, (2009) Science 326: 1509-1512 및 Moscou and Bogdanove, (2009) Science 326: 1501] 참조) 및 랄스토니아(Ralstonia)(문헌[Heuer et al (2007) Applied and Environmental Microbiology 73(13): 4379-4384])으로부터 유래된 것과 유사한 TAL 효과기로부터의 유전자 조작된 도메인이다. 또한, 국제특허출원 공개 WO2010/079430호 참조.

뉴클레아제(예를 들어, ZFN 또는 TALEN)는 사용 전, 예를 들어 WO 2009/042163호 및 20090068164호에서 기재된 것과 같은 효모 기반 염색체 시스템에서 활성에 대해 선별될 수 있다. 뉴클레아제 발현 작제물은 당업계에 공지된 방법을 사용하여 용이하게 설계될 수 있다. 예를 들어, 미국 특허 공개 제20030232410호; 제20050208489호; 제20050026157호; 제20050064474호; 제20060188987호; 제20060063231호; 및 국제특허출원 공개 WO 07/014275호 참조. 뉴클레아제의 발현은 구성적 프로모터 또는 유도성 프로모터, 예를 들어 라피노스 및/또는 갈락토스의 존재에서 활성화되고 글루코스의 존재에서 억제된 갈락토키나제 프로모터의 제어 하에 있을 수 있다.

전달

단백질(예를 들어, ZFP, TALE, CRISPR/Cas), 이를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 및 본 명세서에 기재된 단백질 및/또는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 조성물은, 예를 들어 ZFP-TF, TALE-TF 단백질의 주사에 의해 또는 ZFN 또는 TALEN 암호화 mRNA의 사용에 의하는 것을 포함하는 어떤 적합한 수단에 의해 표적 세포에 전달될 수 있다. 적합한 세포는 진핵 및 원핵 세포 및/또는 세포주를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. 이러한 세포로부터 만들어진 이러한 세포 또는 세포주의 비제한적 예는 COS, CHO(예를 들어, CHO-S, CHO-K1, CHO-DG44, CHO-DUXB11, CHO-DUKX, CHOK1SV), VERO, MDCK, WI38, V79, B14AF28-G3, BHK, HaK, NS0, SP2/0-Ag14, HeLa, HEK293(예를 들어, HEK293-F, HEK293-H, HEK293-T), 및 perC6 세포뿐만 아니라 곤충 세포, 예컨대 스포돕테라 푸기페르다(Spodoptera fugiperda: Sf), 또는 진균 세포, 예컨대 사카로마이세스(Saccharomyces), 피키아(Pichia) 및 쉬조사카로마이세스(Schizosaccharomyces)를 포함한다. 특정 실시형태에서, 세포주는 CHO-K1, MDCK 또는 HEK293 세포주이다. 적합한 세포는 또한, 예로서, 배아 줄기 세포, 유도 만능 줄기 세포, 조혈모세포, 신경 줄기 세포 및 중간엽 줄기 세포와 같은 줄기세포를 포함한다.

본 명세서에 기재된 바와 같은 아연 핑거 단백질을 포함하는 단백질의 전달 방법은, 예를 들어, 미국 특허 제6,453,242호; 제6,503,717호; 제6,534,261호; 제6,599,692호; 제6,607,882호; 제6,689,558호; 제6,824,978호; 제6,933,113호; 제6,979,539호; 제7,013,219호; 및 제7,163,824호에 기재되어 있으며, 이들 모두는 본 명세서에 전문이 참조로서 포함된다.

본 명세서에 기재된 바와 같은 아연 핑거, TALE 또는 CRISPR/Cas 단백질은 또한 아연 핑거, TALE 또는 CRISPR/Cas 단백질(들) 중 하나 이상을 암호화하는 서열을 함유하는 벡터를 사용하여 전달될 수 있다. 플라스미드 벡터, 레트로바이러스 벡터, 렌티바이러스 벡터, 아데노바이러스 벡터, 폭스바이러스 벡터; 헤르페스 바이러스 벡터 및 아데노-관련 바이러스 벡터 등을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는 임의의 벡터 시스템이 사용될 수 있다. 또한, 본 명세서에 전문이 참조로서 포함된 미국 특허 제6,534,261호; 제6,607,882호; 제6,824,978호; 제6,933,113호; 제6,979,539호; 제7,013,219호; 및 제7,163,824호 참조. 더 나아가, 이들 벡터 중 어떤 것은 하나 이상의 아연 핑거 또는 TALE 단백질-암호화 서열을 포함할 수 있다는 것이 명백할 것이다. 따라서, 하나 이상의 ZFP, TALE 또는 CRISPR/Cas 단백질이 세포 내로 도입될 때, ZFP, TALE 또는 CRISPR/Cas 단백질을 암호화하는 서열은 동일 벡터 상에서 또는 상이한 벡터 상에서 수행될 수 있다. 다양한 벡터가 사용될 때, 각각의 벡터는 하나 또는 다수의 ZFP, TALE 또는 CRISPR/Cas 시스템을 암호화하는 서열을 포함할 수 있다.

통상적인 바이러스 및 비바이러스 기반 유전자 전달 방법은 세포(예를 들어, 포유류 세포) 및 표적 조직에서 유전자 조작된 ZFP, TALE 또는 CRISPR/Cas 시스템을 암호화하는 핵산을 도입하기 위해 사용될 수 있다. 이러한 방법은 또한 ZFP, TALE 또는 CRISPR/Cas 시스템을 암호화하는 세포를 시험관내 세포에 투여하기 위해 사용될 수 있다. 특정 실시형태에서, ZFP, TALE 또는 CRISPR/Cas 시스템을 암호화하는 핵산은 생체내 또는 생체밖 유전자 치료 용도를 위해 투여된다. 비바이러스 벡터 전달 시스템은 리포솜 또는 폴록사머와 같은 전달 비히클과 복합체화된 DNA 플라스미드, 네이키드 핵산, 및 핵산을 포함한다. 바이러스 벡터 전달 시스템은 세포에 전달 후 에피솜 또는 통합된 게놈 중 하나를 가지는 DNA 및 RNA 바이러스를 포함한다. 유전자 치료 절차의 검토를 위해, 문헌[Anderson, Science 256:808-813 (1992); Nabel & Felgner, TIBTECH 11:211-217 (1993); Mitani & Caskey, TIBTECH 11:162-166 (1993); Dillon, TIBTECH 11:167-175 (1993); Miller, Nature 357:455-460 (1992); Van Brunt, Biotechnology 6(10):1149-1154 (1988); Vigne, Restorative Neurology and Neuroscience 8:35-36 (1995); Kremer & Perricaudet, British Medical Bulletin 51(1):31-44 (1995); Haddada et al., in Current Topics in Microbiology and Immunology Doerfler and

(eds.) (1995); 및 Yu et al ., Gene Therapy 1:13-26 (1994)] 참조.

핵산의 비바이러스 전달 방법은 전기천공법, 리포펙션, 현미주사, 유전자총, 바이로좀, 리포솜, 면역리포솜, 다양이온 또는 지질:핵산 컨쥬게이트, 네이키드 DNA, 네이키드 RNA, 인공 비리온, 및 DNA의 작용제-향상된 흡수를 포함한다. 예를 들어, 소니트론 2000(Sonitron 2000) 시스템(리치-마르(Rich-Mar))을 사용하는 초음파천공법이 또한 핵산의 전달을 위해 사용될 수 있다. 바람직한 실시형태에서, 하나 이상의 핵산은 mRNA로서 전달된다. 또한 번역 효율 및/또는 mRNA 안정성을 증가시키기 위해 캡핑된 mRNA의 사용이 바람직하다. ARCA(안티-리버스 캡 유사체(anti-reverse cap analog)) 캡 또는 이의 변이체가 특히 바람직하다. 본 명세서에 참조로서 포함된 미국 특허 제7074596호 및 미국 특허 제8153773호 참조.

추가적인 예시적 핵산 전달 시스템은 아막사 바이오시스템즈(Amaxa Biosystems)(독일 쾰른에 소재), 맥스사이트 인코포레이티드(Maxcyte, Inc.)(메릴랜드주 락빌에 소재), 비티엑스 몰레큘러 딜리버리 시스템즈(BTX Molecular Delivery Systems)(매사추세츠주 홀리스톤에 소재) 및 코페르니쿠스 세라퓨틱스 인코포레이티드(Copernicus Therapeutics Inc,)(예를 들어 미국 특허 제6008336호 참조)에 의해 제공되는 것을 포함한다. 리포펙션은, 예를 들어 미국 특허 제5,049,386호; 제4,946,787호; 및 제4,897,355호에 기재되어 있으며) 리포펙션 시약은 상업적으로 시판된다(예를 들어, 트랜스펙탐(Transfectam)(상표명) 및 리포펙틴(Lipofectin)(상표명) 및 리포펙타민(Lipofectamine)(상표명)RNAiMAX). 폴리뉴클레오타이드의 효율적인 수용체-인식 리포펙션에 적합한 양이온성 및 중성 지질은 Felgner, WO 91/17424, WO 91/16024의 그것을 포함한다. 전달은 세포(생체밖 투어) 또는 표적 조직(생체내 투여)에 대한 것일 수 있다.

면역지질 복합체와 같은 표적화된 리포솜을 포함하는, 지질:핵산 복합체의 제조는 당업자에게 잘 공지되어 있다(예를 들어, 문헌[Crystal, Science 270:404-410 (1995); Blaese et al ., Cancer Gene Ther . 2:291-297 (1995); Behr et al ., Bioconjugate Chem. 5:382-389 (1994); Remy et al ., Bioconjugate Chem . 5:647-654 (1994); Gao et al ., Gene Therapy 2:710-722 (1995); Ahmad et al ., Cancer Res. 52:4817-4820 (1992); 미국 특허 제4,186,183호, 제4,217,344호, 제4,235,871호, 제4,261,975호, 제4,485,054호, 제4,501,728호, 제4,774,085호, 제4,837,028호 및 제4,946,787호] 참조).

추가적인 전달 방법은 EnGeneIC 전달 비히클(EDV) 내로 전달되는 핵산의 패키징 용도를 포함한다. 이들 EDV는 항체의 하나의 암(arm)이 표적 조직에 대해 특이성을 가지고, 나머지 암이 EDV에 대해 특이성을 가지는 이중특이성 항체를 사용하여 표적에 특이적으로 전달된다. 항체는 표적 세포에 EDV를 가져온 다음, EDV는 내포 작용(endocytosis)에 의해 세포 내로 들어온다. 일단 세포 내에서, 내용물은 방출된다(문헌[MacDiarmid et al (2009) Nature Biotechnology 27(7):643] 참조).

유전자 조작된 ZFP, TALE 또는 CRISPR/Cas 시스템을 암호화하는 핵산의 전달을 위한 RNA 또는 DNA 바이러스 기반 시스템의 사용은 신체 내 특이적 세포에 바이러스를 표적화하고 핵에 대한 바이러스 페이로드를 수송하기 위한 고도로 진보된 프로세스를 이용한다. 바이러스 벡터는 환자에 직접적으로(생체내) 투여될 수 있거나 또는 그들은 시험관내 세포를 처리하기 위해 사용될 수 있고, 변형된 세포는 환자에게(생체밖) 투여된다. ZFP, TALE 또는 CRISPR/Cas 시스템의 전달을 위한 통상적인 바이러스 기반 시스템은 유전자 전달을 위해 레트로바이러스, 렌티바이러스, 아데노바이러스, 아데노-관련, 백시니아 및 단순 헤르페스 바이러스 벡터를 포함한다. 숙주 게놈에서의 통합은 레트로바이러스, 렌티바이러스 및 아데노-관련 바이러스 유전자 전달 방법에 의해 가능하며, 종종 삽입된 이식유전자의 장기간 발현을 초래한다. 추가적으로, 높은 형질도입 효율이 다수의 상이한 세포 유형 및 표적 조직에서 관찰되었다.

레트로바이러스의 향성(tropism)은 외래 외피 단백질을 도입히고, 표적 세포의 잠재적 표적 집단을 확장시킴으로써 변경될 수 있다. 렌티바이러스 벡터는 미분화 세포를 형질도입하거나 또는 감염시킬 수 있고, 전형적으로 높은 바이러스 역가를 생성할 수 있는 레트로바이러스 벡터이다. 레트로바이러스 유전자 전달 시스템의 선택은 표적 조직에 의존한다. 레트로바이러스 벡터는 시스-작용성의 외래 서열의 6 내지 10kb까지에 대한 패키징 용량을 지니는 긴 말단 반복체를 포함한다. 최소 시스-작용성 LTR은 복제 및 벡터의 패키징에 충분하며, 그 다음에 이는 표적 세포 내로 치료적 유전자를 통합하기 위해 사용되어 영구한 이식유전자 발현을 제공한다. 널리 사용되는 레트로바이러스 벡터는 마우스 백혈병 바이러스(MuLV), 긴팔원숭이 백혈병 바이러스(GaLV), 유인원 면역결핍 바이러스(SIV), 인간 면역결핍 바이러스(HIV), 및 이들의 조합을 포함한다(예를 들어, 문헌[Buchscher et al ., J. Virol. 66:2731-2739 (1992); Johann et al ., J. Virol . 66:1635-1640 (1992); Sommerfelt et al ., Virol . 176:58-59 (1990); Wilson et al., J. Virol . 63:2374-2378 (1989); Miller et al., J. Virol . 65:2220-2224 (1991)]; PCT/US94/05700 참조).

일시적 발현이 바람직한 적용에서, 아데노바이러스 기반 시스템이 사용될 수 있다. 아데노바이러스 기반 벡터는 다수의 세포 유형에서 매우 높은 형질도입 효율이 가능하며, 세포 분화를 필요로 하지 않는다. 이러한 벡터에 의해, 높은 역가 및 높은 수준의 발현이 얻어졌다. 이 벡터는 상대적으로 단순한 시스템에서 다량으로 생성될 수 있다. 아데노-관련 바이러스("AAV") 벡터는 또한, 예를 들어 핵산 및 펩타이드의 시험관내 생성에서, 및 생체내 및 생체밖에서 표적 핵산에 의해 세포를 형질도입하기 위해 사용된다(예를 들어, 문헌[West et al ., Virology 160:38-47 (1987); 미국 특허 제4,797,368; WO 93/24641; Kotin, Human Gene Therapy 5:793-801 (1994); Muzyczka, J. Clin . Invest . 94:1351 (1994)] 참조. 재조합 AAV 벡터의 구성은 미국 특허 제5,173,414호; 문헌[Tratschin et al ., Mol . Cell . Biol . 5:3251-3260 (1985); Tratschin, et al ., Mol . Cell . Biol . 4:2072-2081 (1984); Hermonat & Muzyczka, PNAS 81:6466-6470 (1984); 및 Samulski et al ., J. Virol . 63:03822-3828 (1989)]을 포함하는 다수의 간행물에 기재되어 있다.

적어도 6개 바이러스 벡터 접근이 임상 시험에서의 유전자 전달을 위해 현재 이용가능한데, 이는 형질도입 작용제를 만들기 위해 헬퍼 세포주 내로 삽입된 유전자에 의한 결함 벡터의 보완을 수반하는 접근을 이용한다.

pLASN 및 MFG-S는 임상 시험에서 사용된 레트로바이러스 벡터의 예이다(Dunbar et al ., Blood 85:3048-305 (1995); Kohn et al ., Nat . Med. 1:1017-102 (1995); Malech et al ., PNAS 94:22 12133-12138 (1997)). PA317/pLASN은 유전자 치료 시험에서 사용된 제1 치료적 벡터였다(Blaese et al ., Science 270:475-480 (1995)). 50% 이상의 형질도입 효율이 MFG-S 패키징된 벡터에 대해 관찰되었다. (Ellem et al ., Immunol Immunother. 44(1):10-20 (1997); Dranoff et al ., Hum . Gene Ther . 1:111-2 (1997).

재조합 아데노-관련 바이러스 벡터(rAAV)는 결함 및 비병원성 파보바이러스 아데노-관련 2형 바이러스에 기반한 유망한 대안적인 유전자 전달 시스템이다. 모든 벡터는 이식유전자 발현 카세트에 측접하는 AAV 145 bp 역 말단 반복체만을 보유하는 플라스미드로부터 유래된다. 형질도입된 세포의 게놈 내로 통합에 기인하는 효율적인 유전자 전달 및 안정한 이식유전자 전달은 이 벡터 시스템에 대한 중요한 특징이다. (Wagner et al ., Lancet 351:9117 1702-3 (1998), Kearns et al ., Gene Ther. 9:748-55 (1996)). AAV1, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV8AAV 8.2, AAV9, 및 AAV rh10을 포함하는 다른 AAV 혈청형 및 위형(pseudotyped) AAV, 예컨대 AAV2/8, AAV2/5 및 AAV2/6은 또한 본 발명에 따라 사용될 수 있다.

복제-결함 재조합 아데노바이러스 벡터(Ad)는 고 역가에서 생성될 수 있고, 다수의 상이한 세포 유형을 용이하게 감염시킬 수 있다. 대부분의 아데노바이러스 벡터는 이식유전자가 Ad E1a, E1b, 및/또는 E3 유전자를 대체하도록 유전자조작되며; 후속적으로, 복제 결함 벡터는 도중에 결실된 유전자 기능을 공급하는 인간 293 세포에서 증식된다. Ad 벡터는 간, 신장 및 근육에서 발견되는 것과 같은 비분화, 분화 세포를 포함하는 생체내 다양한 유형의 조직에 형질도입될 수 있다. 통상적인 Ad 벡터는 큰 운반 능력을 가진다. 근육내 주사에 의한 항종양 면역화를 위한폴리뉴클레오타이드 치료에 수반된 임상 시험에서 Ad 벡터의 사용의 예(Sterman et al ., Hum . Gene Ther . 7:1083-9 (1998)). 임상 시험에서 유전자 전달을 위한 아데노바이러스 벡터 사용의 추가적인 예는 문헌[Rosenecker et al ., Infection 24:1 5-10 (1996); Sterman et al ., Hum . Gene Ther . 9:7 1083-1089 (1998); Welsh et al., Hum . Gene Ther . 2:205-18 (1995); Alvarez et al ., Hum . Gene Ther. 5:597-613 (1997); Topf et al ., Gene Ther. 5:507-513 (1998); Sterman et al ., Hum . Gene Ther . 7:1083-1089 (1998)]을 포함한다.

패키징 세포는 숙주 세포를 감염시킬 수 있는 바이러스 입자를 형성하기 위해 사용된다. 이러한 세포는 아데노바이러스를 패키징하는 293 세포 및 레트로바이러스를 패키징하는

2 세포 또는 PA317 세포를 포함한다. 유전자 치료에 사용되는 바이러스 벡터는 보통 핵산 벡터를 바이러스 입자 내로 패키징하는 생성자 세포주에 의해 만들어진다. 벡터는 패키징에 필요한 최소 바이러스 서열 및 (적용가능하다면) 숙주 내로 후속적 통합을 함유하며, 다른 바이러스 서열은 발현되는 단백질을 암호화하는 발현 카세트에 의해 대체된다. 상실된 바이러스 기능은 패키징 세포주에 의해 도중에 공급된다. 예를 들어, 유전자 치료에서 사용되는 AAV 벡터는 숙주 게놈 내로 패키징 및 통합을 위해 필요한 AAV 게놈으로부터의 역 말단 반복체(inverted terminal repeat: ITR) 서열만을 소유한다. 바이러스 DNA는 다른 AAV 유전자, 즉 rep 및 cap를 암호화하는 헬퍼 플라스미드를 함유하지만, ITR 서열을 결여하는 세포주에서 패키징된다. 세포주는 또한 헬퍼로서 아데노바이러스로 감염된다. 헬퍼 바이러스는 AAV 벡터의 복제 및 헬퍼 플라스미드로부터 AAV 유전자의 발현을 촉진한다. 헬퍼 플라스미드는 ITR 서열의 결여 때문에 유의한 양으로 패키징되지 않는다. 아데노바이러스에 의한 오염은, 예를 들어 아데노바이러스에 대해 AAV보다 더 만감한 열 처리에 의해 감소될 수 있다.

다수의 유전자 치료 적용에서, 유전자 치료 벡터는 특정 조직 유형에 대해 높은 정도의 특이성으로 전달되는 것이 바람직하다. 따라서, 바이러스 벡터는 바이러스의 외면에 대해 바이러스 외피 단백질과 함께 융합 단백질로서 리간드를 발현시킴으로써 주어진 세포 유형에 대해 특이성을 가지도록 변형될 수 있다. 리간드는 관심 대상의 세포 유형에 존재하는 것으로 알려진 수용체에 대한 친화도를 가지도록 선택된다. 예를 들어, 문헌[Han et al ., Proc . Natl . Acad . Sci . USA 92:9747-9751 (1995)]은 몰로니 마우스 백혈병 바이러스가 gp70에 융합된 인간 헤레귤린(heregulin)을 발현시키기 위해 변형될 수 있고, 재조합 바이러스가 인간 표피 성장 인자 수용체를 발현시키는 특정 인간 유방암 세포를 감염시킨다는 것을 보고하였다. 이 원칙은 다른 바이러스-표적 세포쌍으로 연장될 수 있으며, 여기서 표적 세포는 수용체를 발현시키고, 바이러스는 세포-표면 수용체에 대한 리간드를 포함하는 융합 단백질을 발현시킨다. 예를 들어, 섬유상 파지는 사실상 임의의 선택된 세포 수용체에 대해 특이적 결합 친화도를 갖는 항체 단편(예를 들어, FAB 또는 Fv)을 나타내도록 유전자 조작될 수 있다. 상기 설명이 바이러스 벡터에 대해 주로 적용되지만, 동일한 원칙이 비바이러스 벡터에 적용될 수 있다. 이러한 벡터는 특이적 표적 세포에 의한 흡수를 선호하는 특이적 흡수 서열을 함유하도록 유전자조작될 수 있다.

유전자 치료 벡터는 개개의 환자에 생체내 투여에 의해, 전형적으로 전신 투여(예를 들어, 정맥내, 복막내, 근육내, 진피하 또는 두개내 주입) 또는 국소 적용에 의해 이하에 기재되는 바와 같이 전달될 수 있다. 대안적으로, 벡터는 생체밖 세포, 예컨대 개개의 환자로부터 설명된 세포(예를 들어, 림프구, 골수 흡입, 조직 생검) 또는 보편적 공여체 조혈모세포 줄기 세포에 전달된 다음, 보통 벡터에 포함된 세포에 대한 선택 후 환자에 세포가 재이식될 수 있다.

진단, 연구를 위한, 또는 유전자 치료를 위한 생체밖 세포 형질감염(예를 들어, 숙주 유기체 내로 형질감염된 세포의 재주입을 통해)은 당업자에게 잘 공지되어 있다. 바람직한 실시형태에서, 세포는 피험체 유기체로부터 단리되며, ZFP, TALE 또는 CRISPR/Cas 시스템 핵산(유전자 cDNA 또는 mRNA)으로 형질감염되고, 피험체 유기체(예를 들어, 환자)에 다시 재주입된다. 바람직한 실시형태에서, 하나 이상의 핵산은 mRNA로서 전달된다. 또한 번역 효율 및/또는 mRNA 안정성을 증가시키기 위해 캡핑된 mRNA의 사용이 바람직하다. ARCA(안티-리버스 캡 유사체) 캡 또는 이의 변이체가 특히 바람직하다. 본 명세서에 전문이 참조로서 포함되는 미국 특허 제7,074,596호 및 제8,153,773호 참조. 생체밖 형질감염에 적합한 다양한 세포 유형은 잘 공지되어 있다(예를 들어, 문헌[Freshney et al ., Culture of Animal Cells, A Manual of Basic Technique (3rd ed. 1994)] 및 환자로부터 세포를 단리시키고 배양하는 방법의 논의에 대해 그것에 인용된 참고문헌 참조).

일 실시형태에서, 줄기 세포는 세포 형질감염 및 유전자 치료를 위한 생체밖 절차에서 사용된다. 줄기 세포들을 사용하는 것의 이점은 그들이 시험관내에서 다른 세포 유형으로 분화될 수 있거나, 또는 그들이 골수에 주입되는 포유류(예컨대, 세포의 공여체) 내로 도입될 수 있다는 점이다. GM-CSF, IFN-γ 및 TNF-α와 같은 사이토카인을 사용하여 임상적으로 중요한 면역 세포 유형으로 시험관내 CD34+ 세포를 분화시키기 위한 방법은 공지되어 있다(문헌[Inaba et al ., J. Exp . Med. 176:1693-1702 (1992)] 참조).

줄기 세포는 공지된 방법을 사용하여 형질도입 및 분화를 위해 단리된다. 예를 들어, 줄기 세포는 CD4+ 및 CD8+(T 세포), CD45+(panB 세포), GR-1(과립성백혈구), 및 Iad(분화된 항원 제시 세포)와 같은 원치않는 세포에 결합되는 항체로 골수 세포를 패닝(panning)함으로써 골수 세포로부터 단리된다(문헌[Inaba et al ., J. Exp . Med. 176:1693-1702 (1992)] 참조).

변형된 줄기 세포는 또한 일부 실시형태에서 사용될 수 있다. 예를 들어, 아포토시스에 저항성으로 만들어진 신경 줄기 세포는 줄기세포가 또한 본 발명의 ZFP TF를 함유하는 치료적 조성물로서 사용될 수 있다. 아포토시스에 대한 저항성은, 예를 들어 줄기 세포에서 BAX- 또는 BAK-특이적 TALEN 또는 ZFN(미국 특허 공개 제20100003756호 참조) 또는 카스파제에서 파괴된 것을 사용하여, 예를 들어 또한 카스파제-6 특이적 ZFN을 사용하여 BAX 및/또는 BAK를 녹아웃시킴으로써 일어날 수 있다. 이들 세포는 돌연변이체 또는 야생형 Htt를 조절하는 것으로 알려진 ZFP TF 또는 TALE TF로 형질감염될 수 있다.

치료적 ZFP 핵산을 함유하는 벡터(예를 들어, 레트로바이러스, 아데노바이러스, 리포솜 등)는 생체내 세포의 형질도입을 위해 유기체에 직접 투여될 수 있다. 대안적으로, 네이키드 DNA가 투여될 수 있다. 투여는 주사, 주입, 국소 적용 및 전기천공법을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는 혈액 또는 조직 세포와 궁극적 접촉에 분자를 도입하기 위해 보통 사용되는 경로 중 어떤 것에 의한다. 이러한 핵산을 투여하는 적합한 방법이 이용가능하며, 당업자에게 잘 공지되어 있고, 하나 이상의 경로가 특정 조성물을 투여하기 위해 사용될 수 있지만, 특정 경로는 종종 다른 경로보다 더 즉각적이고 더 효과적인 반응을 제공할 수 있다.

조혈모세포 줄기 세포 내로 DNA 도입 방법은, 예를 들어 미국 특허 제5,928,638호에 개시되어 있다. 조혈모세포 줄기 세포, 예를 들어, CD34⁺ 세포 내로 이식유전자의 도입에 유용한 벡터는 아데노바이러스 35형을 포함한다.

면역 세포(예를 들어, T 세포) 내로 이식유전자의 도입에 적합한 벡터는 비통합 렌티바이러스 벡터를 포함한다. 예를 들어, 문헌[Ory et al . (1996) Proc . Natl. Acad . Sci . USA 93:11382-11388; Dull et al . (1998) J. Virol . 72:8463-8471; Zuffery et al . (1998) J. Virol . 72:9873-9880; Follenzi et al . (2000) Nature Genetics 25:217-222] 참조.

약제학적으로 허용가능한 담체는 투여되는 특정 조성물에 의해서 뿐만 아니라 조성물을 투여하기 위해 사용되는 특정 방법에 의해 부분적으로 결정된다. 따라서, 이하에 기재된 바와 같이 이용가능한 약제학적 조성물의 매우 다양한 적합한 제형이 있다(예를 들어, 문헌[Remington's Pharmaceutical Sciences, 17th ed., 1989] 참조).

상기 주목한 바와 같이, 개시된 방법 및 조성물은, 원핵 세포, 진균 세포, 고세균 세포, 식물 세포, 곤충 세포, 동물 세포, 척추동물 세포, 포유류 세포 및 인간 세포를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는 임의의 세포 유형에서 사용될 수 있다. 단백질 발현을 위한 적합한 세포주는 당업자에게 공지되어 있으며, COS, CHO(예를 들어, CHO-S, CHO-K1, CHO-DG44, CHO-DUXB11), VERO, MDCK, WI38, V79, B14AF28-G3, BHK, HaK, NS0, SP2/0-Ag14, HeLa, HEK293(예를 들어, HEK293-F, HEK293-H, HEK293-T), perC6, 곤충 세포, 예컨대 스포돕테라 푸기페르다(Spodoptera fugiperda: Sf), 또는 진균 세포, 예컨대 사카로마이세스(Saccharomyces), 피키아(Pichia) 및 쉬조사카로마이세스(Schizosaccharomyces)를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. 이들 세포주의 자손, 변이체 및 유도체가 또한 사용될 수 있다.

적용

개시된 조성물 및 방법은 치료적 및 연구 적용을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는 Htt 대립유전자를 조절하기 위해 요망되는 임의의 적용을 위해 사용될 수 있다.

ZFP TF 또는 TALE TF를 억제하는 Htt가 치료적 작용제로서 사용될 수 있는 질병 및 질환은 헌팅턴병을 포함하지만, 이것으로 제한되지 않는다. 추가적으로, Htt의 돌연변이체 대립유전자에 특이적인 ZFN 또는 TALEN을 포함하는 방법 및 조성물은 헌팅턴병의 치료를 위한 치료제로서 사용될 수 있다.

HD Htt 대립유전자를 억제하는 ZFP-TF 또는 TALE TF는 또한 GDNF 및 BDNF를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는 신경영양인자를 활성화시키는 ZFP-TF 또는 TALE-TF와 함께 사용될 수 있다. 이들 ZFP 또는 TALE(또는 이들 ZFP 또는 TALE를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드)은 동시에(예를 들어, 동일한 약제학적 조성물에서) 투여될 수 있거나 또는 임의의 순서로 순차적으로 투여될 수 있다.

헌팅턴병의 치료를 위한 방법 및 조성물은 또한 줄기 세포 조성물을 포함하되, 줄기 세포 내의 Htt 대립 유전자의 돌연변이체 복제물은 Htt-특이적 ZFN 또는 TALEN을 사용하여 야생형 Htt 대립유전자로 변형되었다.

본 발명의 방법 및 조성물은 또한 시험관내 및 생체내 모델, 예를 들어 이들 장애를 연구하도록 하는 트라이뉴클레오타이드 반복체 장애의 동물 모델의 설계 및 실행에 유용하다. 적합한 시험관내 모델의 비제한적 예는 섬유아세포를 포함하는 임의의 유기체로부터의 세포 또는 세포주를 포함한다. 동물 모델로서 사용을 위한 적합한 동물의 비제한적 예는 무척추동물(예쁜꼬마선충(C. elegans), 초파리), 설치류(예를 들어, 래트 또는 마우스), 영장류(예를 들어, 비인간 영장류)를 포함한다.

실시예

실시예 1: Htt - 표적화된 아연 핑거 단백질 전사 인자( ZFP - TF ) 및 ZFN 의 설계 및 구성

Htt에 대해 표적화된 아연 핑거 단백질을 미국 특허 제6,534,261호에 본질적으로 기재된 바와 같이 유전자조작하였다. 표 1A 및 표 1B는 예시적 Htt-표적화된 ZFP의 DNA 결합 도메인의 인식 나선을 나타낸 반면, 표 2A 및 표 2B는 이들 ZFP의 표적 서열을 나타낸다.

아연 핑거의 하나의 인접한 배열을 지니는 ZFP를 CAG 반복체 영역 내에서 완전히 표적 부위에 대해 설계하였다(도 1b). 이러한 ZFP는 더 높은 친화도 및/또는 더 높은 네트 점유도로 더 긴 돌연변이체 트랙에 결합될 수 있는데, 이는 돌연변이체 대립유전자의 선택적 억제를 달성한다. ZFN를 또한 부분적으로 또는 전적으로 CAG 영역의 밖에 놓이고(도 1a), 따라서 야생형 및 돌연변이체 대립유전자에 동일하게 결합될 표적화된 부위는 유사한 효율로 대립유전자 둘 다로부터의 발현을 조절하도록 설계하였다. CAG 영역을 인식하기 위한 아연 핑거 단백질을 설계할 때, 1- 및 2-개의 핑거 모듈 세트를 '믹스 앤 매치' 조합에서 사용할 수 있다. 해당 모듈을 이하의 표 2C에서 나타낸다.

(표 2C)

벡터가 또한 ZFP TF를 암호화하는 서열에 작동가능하게 연결된 트라이뉴클레오타이드 반복체의 트랙을 따라 발현된 단백질의 멀티머화를 가능하게 하는 1 이상의 단백질 상호작용 도메인(또한 다이머화 또는 단백질 상호작용 도메인으로 불림)을 암호화하는 서열을 함유한다는 것을 제외하고 ZFP TF의 멀티머화를 또한 구성한다. 도 1d 및 도 10 참조. 표 3은 CAG 반복체 영역에 대해 표적화된 ZFP와 함께 사용된 이합체화 도메인 설계를 나타낸다. 도 10c는 이합체화 아연 핑거(DZ) 사이, 즉, DZ1 - DZ4의 상호작용을 통해 멀티머화되도록 설계된 4개의 ZFP 모노머 스캐폴드의 단백질 서열을 나타낸다. 설계는 문헌[Mol . Syst . Biol. (2006) 2:2006.2011]에서 기재된 작업에 기반한다. 도 10d는 또 꼬인 나선(CC)사이, 즉, CC1 내지 CC7의 상호작용을 통해 멀티머화되도록 설계된 7개의 ZFP 모노머 스캐폴드의 단백질 서열을 나타낸다. CC#1의 설계는 (J. Am . Chem . Soc. (2001), 123:3151-3152)에 기재된 작업에 기반하는 반면, CC#2, CC#3 및 CC#4는 (J. Am . Chem . Soc. (2000), 122:5658-5659)에 기반한다. CC 및 DZ 도메인은 CAG 트랙의 부수적 그루브 내에서 ZFP가 중합되도록 한다(도 10b에서 도시). 적절한 결합 특성을 지니는 핑거 배열 및 이합체화 도메인을 선택함으로써, 효율적인 결합은 질병 대립유전자의 확장된 CAG 트랙에 대해서만 일어날 것이다.

ZFP-TF를 핵 국소화 서열, Htt 대립 유전자에 표적화된 유전자 조작된 아연 핑거 DNA-결합 도메인(표 1A 및 표 1B) 및 인간 KOX1 단백질로부터의 KRAB 억제 도메인을 포함하는 융합 단백질로서 구성하였다. 도 1a, 도 1b 및 도 1d 참조. 설계된 DNA-결합 도메인은 9-18 bp 서열(표 2A 및 표 2B)을 인식하는 3 내지 6개 핑거 모듈을 함유한다. ZFP 인식 나선에 의해 접촉되는 표적 부위에서의 뉴클레오타이드는 대문자로 나타내고; 비접촉 뉴클레오타이드는 소문자로 나타낸다. 또한 2개의 ZFP DNA 결합 도메인이 가요성 링커와 융합되고 KRAB 억제 도메인에 융합되는 ZFP-ZFP-TF 분자를 구성하였다(도 1e). DNA 결합 도메인을 표 2A 및 표 2B로부터 선택하였다.

실시예 2: 인간 및 마우스 세포에서 Htt 의 대립유전자 둘 다의 억제.

Htt(비대립유전자-특이적)의 대립유전자를 둘 다 억제하기 위해, ZFP를 Htt 프로모터 및 엑손 1 영역에 결합되도록 설계하되, 표적 부위는 완전히 CAG 반복체 내에 있지 않았다. 도 1a 참조. Htt 억제 ZFP TF의 활성을 시험하기 위해, ZFP TF를 인간 세포 내로 형질감염시켰고, Htt의 발현을 실시간 RT-PCR을 사용하여 모니터링하였다.

인간 HEK293 세포(Graham et al (1977) J Gen Virol 36　:59-74)를 10% FBS로 보충한 DMEM 중에서 배양시켰고, 1e⁵ 세포를 제조업자의 설명서에 따라 아막사 뉴클레오펙터(Amaxa Nucleofector)(등록상표)에 의해 표시한 ZFP-KOX 융합을 암호화하는 플라스미드 DNA 1㎍으로 형질감염시켰다.

형질감염된 세포를 2일 동안 인큐베이션 시켰고, 내인성 인간 헌팅턴(Htt) 및 정규화 대조군 베타-액틴(ACTB)의 수준을 표준 프로토콜에 따라 Hs00918176_m1 및 4352935E 프라이머 및 프로브(어플라이드 바이오시스텝즈(Applied Biosystems))를 각각 사용하여 실시간 PCR에 의해 분석하였다. 모의-형질감염 샘플(1로서 설정)에 대해 정규화된 Htt/ACTB 비로서 Htt 수준을 표현하였다.

도 2a에서 나타낸 바와 같이, Htt-표적화된 ZFP는 Htt 발현을 억제하였다. Htt 단백질 수준에서의 감소를 확인하기 위해 표준 프로토콜을 사용하여 웨스턴 블롯 분석을 행하였고(도 2b); p65 단백질을 장입 대조군으로서 사용하였다.

마우스 Htt-특이적 ZFP TF 리프레서를 제조업자의 프로토콜에 따라 리포펙타민(등록상표) 2000 키트(인비트로젠)를 사용하여 Neuro2A 세포 내로 일시적으로 형질감염시켰다(Klebe & Ruddle (1969) J. Cell Biol. 43: 69A). ABI 태그만(Taqman)(등록상표) 프라이머/프로브 세트 Mm01213820 m1 및 4352933E를 각각 사용하는 형질감염 후 48시간에 mHtt 및 ACTB mRNA 수준을 측정하였다. ZFP 형질감염된 샘플에 대한 mHtt/ACTB 비를 GFP 대조군(1로서 설정)에 대한 비로 정규화시켰다.

도 2c에서 나타낸 바와 같이, ZFP는 마우스 Htt 발현을 억제하였다. 추가로, 마우스 Htt-특이적 ZFP-TF 리프레서는 Htt 녹-인 마우스로부터 유래된 불멸 선조 세포, STHdh(Q111/Q7)에서 마우스 Htt를 억제할 수 있다(Trettel et al. (2000) Hum . Mol . Genet 9 : 2799-2809). 도 2d 및 도 2e 참조. 표시한 ZFP에 대한 mRNA를 mMessage mMachine 키트(앰비온(Ambion))를 사용하여 만들었고, 이들 mRNA의 0.1, 0.5 또는 2㎍을 상기 기재한 바와 같이 아막사 뉴클레오펙터를 사용하여 형질감염시켰다. 상기 기재한 바와 같이 mHtt 및 ACTB 발현 분석을 위한 형질감염 후 48시간에 세포를 채취하였다. Neuro2A 세포에 비해 선조 세포에서 더 유의한 억제를 관찰하였고, 이는 선조 세포에서 mRNA 형질감염을 통해 효율적으로 달성된 향상된 형질감염의 결과일 수 있다.

실시예 3: 인간 및 마우스 세포에서 돌연변이체 Htt 의 선택적 억제

돌연변이체 Htt 대립유전자의 선택적 억제를 달성하기 위해, ZFP를 CAG 반복체 내에서 결합되도록 설계하였다. 도 1b는 이러한 ZFP의 한 가지 유형을 나타내며, 아연 핑거의 연속적 배열은 억제 도메인에 연결되고(예를 들어, KOX1으로부터의 KRAB 도메인); 이들 ZFP는 전사적 억제로부터 필요한 역치 사용이 확장된 CAG 반복체 상에서만 확립될 수 있도록 적절한 친화도로 설계될 수 있다. 도 1c, 도 1d 및 도 1e는 확장된 CAG 반복체에 특이적으로 결합시킬 수 있는 ZFP 설계의 3가지 다른 예를 나타낸다.

도 1b에서 도시한 바와 같이 설계한 ZFP를 HEK293 세포에 도입하였고, Htt 발현을 평가하였다. ZFP-암호화 작제물을 표준 프로토콜을 사용하여 FugeneHD를 사용하여 HEK293 세포에 형질감염시켰다. 형질감염 후 72시간에 전체 RNA를 단리시켰고, 내부 대조군 베타-액틴(ACTB)에 대한 내인성 인간 헌팅턴(Htt) 수준을 Hs00918176_m1 및 4352935E 프라이머 및 프로브(어플라이드 바이오시스템즈(Applied Biosystems))를 각각 사용하여 실시간 PCR에 의해 분석하였다. ZFP 형질감염 샘플에 대한 Htt/ACTB 비를 GFP 대조군(1로 설정)에 대해 정규화시켰다.

도 3a에서 나타낸 바와 같이, ZFP 리프레서(KRAB 억제 도메인과 융합)를 CAG 반복체에, 즉, HEK293 세포에서 상부 또는 하부 가닥에 결합되도록 설계하였고(도 1b), Htt 발현을 효과적으로 억제하였다. 도 3a는 발현이 2회 형질감염에서 측정된 전사 리프레서(도면에서 별개의 막대) 및 완료된 다회 실시간 PCR분석(에러바)을 도시한다. 개개의 ZFP에 의한 상이한 수준은 그들이 CAG 반복체 영역에 대해 상이한 친화도를 가진다는 것을 시사한다. HEK293 세포에서 Htt 대립유전자가 16 및 17 CAG를 가지기 때문에, 이 결과는 또한 "더 약한" ZFP, 예컨대 30640이 효과적으로 야생형(미확장) CAG 반복체 길이를 지니는 Htt 대립유전자를 억제하지 않는다는 것을 시사한다.

30640과 같은 ZFP가 확장된 CAG 반복체를 지니는 Htt 대립유전자의 전사를 억제할 수 있는지 여부를 시험하기 위해, 상이한 CAG 반복체 길이를 함유하는 Htt 프로모터/엑손 1 단편에 의해 제어된 루시퍼라제 리포터를 구성하였다. 우선, 인간 Htt 프로모터/엑손1 단편을 정방향 프라이머를 사용하여 HEK293 게놈 DNA로부터 증폭시켰다:

5' GAAGATCTCACTTGGGGTCCTCAGGTCGTGCCGAC(서열번호 139)

및 역방향 프라이머:

5' GTATCCAAGCTTCAGCTTTTCCAGGGTCGCCTAGGCGGTCT(서열번호 140).

정방향 프라이머를 BglII 부위에 도입하고, 역방향 프라이머는 Htt의 첫 번째 ATG를 TAG로 변화시키며, AvrII 부위를 만들고, 또한 HindIII 부위를 포함한다. PCR 산물을 BglII 및 HindIII으로 분해시켰고, 동일한 효소로 분해한 pRL-TK 벡터(프로메가(Promega))에 결찰시켜 작제물 pRL-Htt를 만들었다. 그 다음에 인간 Htt 엑손1 단편(암호 서열 - 첫 번째 ATG)를 정방향 프라이머를 사용하여 확장된 CAG 반복체를 지니는 HD 환자로부터의 HEK293 게놈 DNA 또는 게놈 DNA로부터 증폭시켰다:

5' GCCTAGGCGACCCTGGAAAAGCTGATGAAGGCC(서열번호 141)

및 역방향 프라이머: 5'

5' GTATCCAAGCTTGAGCTGCAGCGGGCCCAAACTCACG(서열번호 142).

정방향 프라이머는 AvrII 부위를 도입하고, 역방향 프라이머는 HindIII 부위를 도입한다. PCR 산물을 AvrII 및 HindIII으로 분해시켰고, 동일한 효소로 분해한 pRL-Htt 벡터에 결찰시켰다. 10, 17, 23 또는 47 CAG 반복체를 지니는 클론(pRL-Htt-CAG(x))을 시퀀싱에 의해 확인하였다.

pRL-Htt-CAG(x) 리포터(300ng) 및 pGL3-프로모터 리포터(100ng, 정규화 대조군으로서 사용함, 프로메가(Progema))를 100ng의 ZFP 30640 발현 벡터와 함께 또는 발현 벡터 없이 HEK293 세포에 형질감염시켰다. 반딧불이(pGL 리포터) 및 레닐라(renilla)(pRL 리포터) 루시퍼라제 활성을 형질도입 후 24시간에 측정하였다. 레닐라 루시퍼라제 수준을 동일한 형질감염된 샘플로부터의 반딧불이 루시퍼라제에 대해 정규화시켰고, 추가로, "리포터만의" 샘플의 레닐라/반딧불이 비에 대해 정규화시켰다.

도 3b에서 나타낸 바와 같이, ZFP-TF 30640에 의한 루시퍼라제 리포터의 억제는 CAG 반복체의 길이가 증가함에 따라 증가되는데, 이는 30640과 유사한 DNA 결합 친화도를 지니는 ZFP가 확장된 CAG 반복체를 통해 Htt 프로모터 활성을 억제할 수 있으며, 억제 수준은 CAG 반복체 길이에 의존한다는 것을 시사한다.

도 3c는 "강한" ZFP-TF 30657을 또한 시험하였다는 것을 제외하고 도 3b에서와 같은 유사한 실험을 나타내며, 30640과 30657은 둘 다 표시한 바와 같은 다회 용량에서 시험하였다. 모든 용량 수준에서, 30640은 pRL-Htt-CAG23 리포터(CAG 반복체 길이-의존적 억제)보다 pRL-Htt-CAG47 리포터의 더 큰 억제를 제공하는 반면, 30657은 리포터 둘 다 유사한 수준으로 억제하였다. pRL-Htt-CAG23 리포터에 대해, 30640은 모든 용량 수준에서 30657보다 더 적은 억제를 제공하였는데, 정상 CAG 반복체 길이를 지니는 내인성 Htt 대립유전자에 대한 그의 활성에서 차이를 요약하지만(HEK293 세포, 도 3a); pRL-Htt-CAG47 리포터에 대해, 30640 및 30657는 모든 용량 수준에서 유사한 억제를 제공하는데, 이는 필시 확장된 CAG 표적만이 이러한 ZFP에 의해 확립되는 억제에 필요한 역치 점유를 허용할 수 있기 때문에, 확장된 CAG 반복체를 통해 30640과 같은 "더 약한" ZFP가 확장된 CAG 반복체를 통해 Htt 프로모터를 효율적으로 억제할 수 있다는 것을 시사한다.

도 3d는 ZFP-TF 30640 및 30657(KOX1의 KRAB 억제 도메인에 융합됨)이 Hdh(Q111/Q7) 녹-인 마우스로부터 유래된 불멸 선조 세포에서 녹-인 Htt 대립유전자 (CAG111)를 억제할 수 있다는 것을 나타내는데, 루시퍼라제 리포터의 CAG 반복체 길이-의존적 억제를 구동하는 30640과 같은 ZFP가 또한 CAG 반복체를 확장시킨 내인성 Htt 대립유전자로부터의 발현을 억제할 수 있다는 것을 입증한다. 나타낸 ZFP에 대한 mRNA를 mMessage mMachine 키트(앰비온(Ambion))를 사용하여 만들었고, 아막사 뉴클레오펙터를 사용하여 표시한 용량에서 Hdh(Q111/Q7) 세포에 형질감염시켰다. wt 마우스 Htt 대립유전자로부터의 발현을 검출하기 위해, 정방향 프라이머 CAGGTCCGGCAGAGGAACC(서열번호 193) 및 역방향 프라이머 TTCACACGGTCTTTCTTGGTGG(서열번호 194)를 실시간 RT-PCR에서 사용하여; 녹인 Htt 대립유전자로부터의 발현을 검출하기 위해, 정방향 프라이머 GCCCGGCTGTGGCTGA(서열번호 195) 및 역방향 프라이머 TTCACACGGTCTTTCTTGGTGG(서열번호 196)를 사용하였다.

도 3e는 정상 및 돌연변이체 Htt 대립유전자 각각에 대해 15 및 70 CAG를 갖는 HD 환자-유래 섬유아세포주(코리엘 GM21756)에서 ZFP-TF 30640 및 30657을 시험하는 것의 결과를 나타낸다. SNP-기반 대립유전자-특이적 실시간 PCR 분석을 우선 확립하여 야생형 또는 돌연변이체 Htt 대립유전자로부터 특이적으로 검출시켰다. SNP의 단계화(phasing)(rs363099 T/C)를 문헌[Carroll et al. (Mol Ther. (2011) 19:2178-85)]에 의해 결정하였고; "T"는 정상 대립유전자 상에 있으며, "C"는 돌연변이체 대립유전자 상에 있다. 돌연변이체 대립유전자(099C)로부터 Htt 발현을 검출하기 위해, 섬유아세포로부터의 cDNA를 정방향 프라이머 099C.F(5' AGTTTGGAGGGTTTCTC, 서열번호 143) 및 역방향 프라이머 099.R5(5' TCGACTAAAGCAGGATTTCAGG, 서열번호 144)를 사용하여 실시간 PCR(SsoFast EvaGreen Supermix, Bio-Rad)에 의해 증폭시켰고; 어닐링/연장 온도는 55.6℃였다. 야생형 대립유전자(099T)로부터의 Htt 발현을 검출하기 위해, 섬유아세포 cDNA의 실시간 PCR을 정방향 프라이머 099T.F(5'AGTTTGGAGGGTTTCTT, 서열번호 145), 역방향 프라이머 099.R5 및 3' 인산화된 차단제 올리고 099T.BL(5' AGGGTTTCTCCGCTCAGC-3' 포스, 서열번호 146)을 사용하여 행하였으며; 어닐링/연장 온도는 58.3℃였다. 전체 인간 헌팅턴(hHtt, wt과 돌연변이체 대립유전자 둘다) 수준 및 정규화 대조군 베타-액틴(ACTB) 수준을 프라이머/프로브 Hs00918176_m1 및 4352935E(어플라이드 바이오시스템즈(Applied Biosystems))를 각각 사용하여 실시간 PCR에 의해 분석하였다. 도 3e에서 나타낸 실험에 대해, 나타낸 ZFP에 대한 mRNA를 mMessage mMachine 키트(앰비온(Ambion))를 사용하여 만들었고, 1㎍의 mRNA를 상기와 같은 아막사 뉴클레오펙터를 사용하여 형질감염시켰다. 세포를 형질감염 후 48시간에 채취하였고; 정상(CAG15, 099T), 돌연변이체(CAG70, 099C) Htt 대립유전자 및 전체 Htt(hHtt)로부터의 mRNA 수준을 상기와 같이 정량화하였으며, ACTB 수준으로 정규화하였고; 각 샘플에 대한 Htt/ACTB 비를 모의-형질감염 샘플에 대해 추가로 정규화하였다. "강한" CAG-표적화된 ZFP 30657는 예상한 바와 같이(도 3a의 HEK293 세포에서의 그의 활성에 기반함) 대립유전자를 둘 다 억제하였다. 리포터의 CAG 반복체 길이-의존적 억제를 나타낸 ZFP 30640은 야생형 대립유전자의 <10% 억제를 제공하는 한편, >90%의 돌연변이체 대립유전자를 억제하였다. 각 샘플에서 전체 Htt 수준은 동일한 샘플에서 야생형 및 돌연변이체 Htt 수준과 일치하였다.

ZFP-30640을 또한 정상 섬유아세포주뿐만 아니라, Htt 유전자에서 상이한 CAG 반복체 길이를 함유하는 다른 HD 섬유아세포주에서 시험하였다(도 3f). 각각의 대립유전자로부터의 Htt 발현을 상기 기재한 바와 같이 검출하였다. 정상 섬유아세포주에서 Htt 억제는 관찰되지 않았다(CAG18/18). 대조적으로, 우수한 대립유전자 차별을 고용량과 저용량의 형질감염된 30640 mRNA 둘 다에서의 CAG 15/67 및 CAG15/70에서 관찰하였고; 돌연변이체 대립유전자(CAG 18/44 및 CAG 18/45)에 대한 중간체 CAG 반복체 길이를 지니는 2개의 HD 섬유아세포에 대해 유사한 결과를 얻었으며 - 확장된 대립유전자는 고용량과 저용량의 30640 둘 다에서 ~80%만큼 억제되었고, 아직 CAG18 대립유전자는 영향받지 않은 채로 남아있었다. 하나로 합쳐서 생각하면, 이들 데이터는 30640과 같은 대립유전자 특이적 리프레서가 CAG18/44 및 CAG18/45와 같은 더 우세한 질병 유전자형에 대해 강한 CAG 대립유전자 길이 선택성을 유지할 수 있다는 것을 나타낸다.

30640과 같은 ZFP는 2명의 환자-유래 섬유아세포주에서 돌연변이체 Htt 단백질 수준을 선택적으로 하향 조절한다는 것을 나타내기 위해 웨스턴 블롯 분석을 사용하였는데, 이는 qPCR 분석에 의해 나타낸 대립유전자-특이적 조절을 확인한다(도 3g). ZFP를 1.5e5 세포의 4개 복제물 내로 300ng 용량에서 mRNA 형질감염(아막사 뉴클레오펙션)에 의해 전달하였고, 12-웰 플레이트에서 플레이팅 전 풀링시켰다. 48시간에, 세포를 세척하였고, 단백질 추출물 제조를 위해 채취하였다. 대략 2.5㎍의 추출물을 5% 트리스-아세테이트 겔 상에 장입하였고, MAB2166(밀리포어(Millipore))에 의해 검출하였다. 추가적으로, 동일한 샘플을 4% 내지 15% 트리스-HCl 겔(바이오-래드(Bio-Rad)) 상에 장입하였고, 장입 대조군으로서 항 B-액틴(1:20,000, 시그마(Sigma))에 의한 검출을 위해 표준 방법을 사용하여 옮겼다. Htt mRNA를 측정하는 qPCR 연구를 기반으로, 30640은 CAG 반복체를 표적화하는 대립유전자-특이적 리프레서이고; 32528은 전사 시작 부위(transcription start site: TSS)를 표적화하는 2대립유전자 리프레서이며, 30657은 사용되는 용량에서 Htt 대립유전자를 억제하는 CAG-표적화된 리프레서이다. 웨스턴 블롯은 30640이 HD 환자-유래 세포주 둘 다에서 돌연변이체 Htt(상부 밴드)의 수준을 유의하게 감소시킨 반면, 32528 및 30657은 대립유전자 유사성을 둘 다 억제하였다는 것을 나타내었다.

실시예 4: Htt 의 대립유전자 특이적 억제를 구동하는 추가적인 CAG - 표적화된 ZFP 설계.

도 4A는 CAG18/45 HD 섬유아세포주에서 ZFP-TF 30640, 30643, 30645 및 33074(모두 CAG 반복체에 대해 표적화되고 KRAB 억제 도메인을 사용함) 시험 결과를 나타낸다. 상이한 양의 ZFP mRNA를 표시한 바와 같이 아막사 뉴클레오펙터를 사용하여 형질감염시켰고, 돌연변이체 Htt(우측 막대), 야생형 Htt(중간 막대) 및 전체 Htt(대립유전자 둘 다, 좌측 막대)의 발현을 형질감염 후 24시간에 상기 기재한 바와 같이 측정하였다. ZFP 30640, 30645 및 33074는 전체 3㎍ 내지 10ng ZFP mRNA 용량 범위에 걸쳐 대립유전자-특이적 억제를 구동한 반면; 30643은 30ng 이상의 용량에서 유의하게 대립유전자를 둘 다 억제하는 것으로 나타나며, 10ng 용량에서 대립유전자 선택성을 나타내기 시작한다.

도 4B는 CAG15/70 HD 섬유아세포주에서 ZFP 30643, 30648, 30657 및 30658(모두 CAG 반복체에 대해 표적화되고, KRAB 억제 도메인을 사용함) 시험 결과를 나타낸다. 상이한 양의 ZFP mRNA를 표시한 바와 같이 아막사 뉴클레오펙터를 사용하여 형질감염시켰고, 돌연변이체 Htt(우측 막대), 야생형 Htt(중간 막대) 및 전체 Htt(대립유전자 둘 다, 좌측 막대)의 발현을 형질감염 후 24시간에 상기 기재한 바와 같이 측정하였다. 앞의 도면에서 시험한 ZFP에 비해(30640, 30645 및 33074), 이들 ZFP는 더 낮은 용량에서 돌연변이체 Htt-특이적 억제를 구동한다. 이들 결과는 생체내에서 달성될 수 있는 ZFP 발현 수준에 의존하며(예를 들어, HD 환자의 뇌에서), 돌연변이체 Htt의 대립유전자-특이적 억제가 적절한 ZFP 설계를 사용하여 달성될 수 있다는 것을 시사한다.

실시예 5: 교호(alternate) CAG -함유 유전자의 억제

실시예 3에서 단리한 RNA를 사용하여(도 3e), 다른 CAG 반복체 함유 유전자의 억제를 분석하였고, 결과를 도 5에서 도시한다. 다음의 유전자의 발현 수준을 실시간 PCR을 사용하여 시험하였고, 액틴에 대해 정규화하였다: 아탁신 2("ATXN2"); 다이나민("DNM1"); 단백질 11만의 F-박스("FBXO11"), 질산 환원효소("NAP"); 복제원점 복합체 서브유닛 4("ORC4"); 포스포키나제("PHK"); OCT3/4 단백질("POU3"); 아포토시스 관련 단백질 2를 함유하는 THAP 도메인("THAPII"); TATA 결합 단백질("TBP"); 및 스타니오칼신 1("STC1"). 추가로, 전사 시작 부위(TSS)에 대한 CAG 반복체 서열의 위치를 주목하였고, 도 3f에서 "TSS@"로서 표시하였으며, 여기서 "+"는 TSS의 하류의 CAG 반복체의 염기 위치를 나타내고, "-"는 TSS의 상류의 CAG 반복체의 염기 위치를 나타낸다. 또한, CAG 반복체의 수("#CAG")를 각 유전자에 대해 표시한다.

데이터는 30640에 의해 돌연변이체 확장된 Htt 대립유전자의 억제는 고도로 특이적이며, CAG 반복체는 그의 전사 시작 부위에 상대적으로 가까운 CAG 반복체 함유의 서브세트만이 30640과 같은 ZFP의 억제 표적일 수 있다는 것을 입증한다.

실시예 6: Htt 의 대립유전자-특이적 ZFP 리프레서의 게놈- 와이드 특이성

HD 섬유아세포(CAG18/45)를 형질감염시켜 마이크로어레이 분석에 의해 CAG-표적화된 ZFP의 게놈-와이드 특이성을 연구하였다(도 6). ZFP를 표시 용량에서 mRNA 형질감염(아막사 뉴클레오펙션)에 의해 전달하였고 - ZFP 30640, 30645 및 33074를 각각 75ng, 15ng 및 15ng 용량에서 6회 형질감염시켰으며; GFP-Kox mRNA(150ng)를 대조군으로서 형질감염시켰고, 모든 샘플에서 150ng으로 형질감염된 mRNA의 전체량을 초래하는 담체로서 사용하였다. CAG18(099T, 중간 막대) 및 CAG45 (099C, 우측 막대) 대립유전자로부터의 발현을 상기 기재한 바와 같이 형질감염 후 24시간에 대립유전자-특이적 qPCR 시약에 의해 측정하였고, 여기서 각각의 샘플(1 내지 6)은 생물학적 복제물이다(별개의 형질감염). Htt 수준을 GAPDH의 수준에 대해 정규화시켰다. Htt의 돌연변이체 대립유전자-특이적 억제를 모두 3개의 ZFP에 대해 관찰하였다. 그 다음에 4개의 가장 유사한 복제물을 다음과 같은 마이크로어레이 분석(애피메트릭스(Affymetrix) HGU133plus2.0): GFP 복제 1, 3, 4 및 6; 30640 복제 2, 3, 5 및 6; 30645 복제 2, 3, 5 및 6; 및 33074 복제 1, 3, 4 및 5를 마이크로어레이 분석을 위해 사용하였다. 강한 멀티-어레이 평균(Robust Multi-array Average: RMA)을 사용하여 각 프로브 세트로부터의 원 신호를 정규화시켰고; ZFP-형질감염된 샘플을 T-검정을 사용하여 GFP-형질감염 샘플과 비교하였으며; "변화" 호출은 대조군 샘플에 대해 >2배의 차이를 지니고 T-검정 P-값<0.05인 유전자(프로브 세트) 상에서 만들었다. 해당 기준에 기반하여, 30640은 단지 2개의 유전자, 즉, 스타니오칼신 1(STC1) 및 연장된 시냅토타그민-유사 단백질 1(ESYT1)만을 억제하였고; 30645 및 33074는 각각 하나의 유전자, STC1 및 인터류킨 17 수용체 A(ILR17RA)만을 각각 억제하였다. Htt를 억제된(>2-배 억제) 유전자로서 검출하지 않았는데, 어레이 상의 Htt 프로브는 wt와 돌연변이체 Htt mRNA 둘 다를 검출하기 때문이다. 이 실험은 Htt의 효율적 대립유전자-특이적 억제를 구동하는 수준에서 발현될 때, 돌연변이체 Htt-특이적 ZFP가 매우 높은 특이성 게놈-와이드로 조작될 수 있다는 것을 입증한다.

실시예 7: HD 중성 줄기 세포( NSC )에서 대립유전자 특이적 억제

HD iPSC/ESC를 아큐타제(accutase)에 의해 통과시켰고, E8 배지(라이프 테크놀로지즈(Life Technologies))에서 매트리겔 코팅된 플레이트 상에서 배양시켰다. 중성 줄기 세포를 스템프로 신경 유도 배지(StemPro Neural Induction Medium)(라이프 테크놀로지즈)를 사용하여 유도하였다. 간략하게, iPSC/ESC를 200,000개 세포/웰에 의해 겔트렉스(geltrex) 코팅된 6개 웰 접시에 파종하였고, 10% 내지 20% 컨플류언스되었을 때, 배지를 스템프로 신경 유도 배지로 바꾸었다. 배지를 2일마다 바꾸었고, NSC를 채취하였으며, 제7일에 확장하였다. 스템프로 NSC SFM 배지(라이프 테크놀로지즈)를 사용하여 NSC를 배양시켰다. HD NSC(CAG17/69, 코리엘(Coriell) GM23225 iPSC로부터 유래)를 뉴클레오펙션을 사용하여 1.5 또는 0.5㎍의 ZFP mRNA로 형질감염시켰다. 형질감염 후 48시간에 세포를 채취하였고, RT-PCR에 의해 발현을 정량화하였다. Htt 발현의 대립유전자-특이적 검출을 SNP(rs1143646) 기반 유전자형 분석 #4351376(어플라이드 바이오시스템즈)를 사용하여 수행하였다. 시험한 ZFP 용량에서, 30640은 돌연변이체 Htt의 대립유전자-특이적 억제를 제공하였고, 30643은 wt Htt의 ~50% 억제 및 돌연변이체 Htt의 ~90% 억제를 제공하였으며, 30648은 대립유전자를 둘 다 억제하였고(도 7); 이들 ZFP의 거동은 HD 섬유아세포의 거동과 일치된다(도 4). 각 샘플에 대한 전체 Htt 수준(중간 막대)은 돌연변이체의 수준 및 wt Htt 수준과 일치된다.

실시예 8: 분화된 HD 뉴런에서 Htt 억제

HD NSC를 겔트렉스 코팅된 플레이트 상의 아쿠타제로 통과시켰다. 배지를 (bFGF 및 EGF)가 없는 스템프로 NSC SFM 배지를 함유하는 신경 분화 배지로 바꿈으로써 뉴런 분화를 유발하였다. 21일까지 3일 내지 4일마다 배지를 바꾸었다. 뉴런은 신경 분화 배지 내 배양에 의해 NSC(CAG17/48, HD ESC로부터 유래)로부터 유래되었다. 신경 유도 후 제15일에, 뉴클레오펙션을 사용하여 1.0 또는 0.5㎍ ZFP mRNA에 의해 세포를 형질감염시켰다. 형질감염 후 48시간에 세포를 채취하였고, 세포 발현을 RT-PCR에 의해 정량화하였다. 이 환자 계통은 wt 및 돌연변이체 Htt를 qPCR-기반 대립유전-특이적으로 검출하게 하는 SNP를 함유하지 않기 때문에, 전체 Htt 수준만을 측정할 수 있다. 본 발명자들은 30640 및 33074가 HD 섬유아세포 및 NSC에서의 CAG18 또는 CAG17 대립유전자를 억제하지 않는다는 것을 나타내었기 때문에, 30640- 및 33074-처리된 샘플에서 관찰된 전체 Htt의 수준은 돌연변이체 대립유전자(CAG48)의 대립유전자-특이적 억제와 일치된다. 시험한 ZFP 용량에서 30643 및 30648에 의한 더 강한 억제는 또한 HD 섬유아세포에서 이들 ZFP의 거동과 일치된다(도 8).

실시예 9: CAG 표적화된 리프레서는 R6 /2 마우스에서의 돌연변이체 Htt 이식유전자를 억제한다

R6/2 마우스(~120 CAG 반복체를 지니는 돌연변이체 인간 Htt 엑손1의 이식유전자를 운반함, 문헌[Mangiarini et al, (1996) Cell 15:197])는 CMV 프로모터에 의해 구동되는 ZFP 30640-KOX 또는 GFP를 암호화하는 재조합 AAV2/6의 3e10 벡터 게놈의 정위적 쌍방 선조 주입을 받았다. 마우스에 5주령에서 주입하였고, 8주령에서 분자 분석을 위해 희생시켰다. 좌 및 우 선조체를 각각의 냉동시킨 반구 및 스냅으로부터 절단하였다. 돌연변이체 Htt 이식유전자의 억제를 평가하기 위해, 전체 RNA를 TRIzol Plus(라이프 테크놀로지즈)에 의해 각각의 선조체로부터 추출한 다음 고용량 RT(High Capacity RT)(라이프 테크놀로지즈)를 사용하여 cDNA를 합성하였다. 후속적으로, R6/2 이식유전자 발현을 qPCR에 의해 측정하였고, 문헌[Benn et al. ((2008) Molecular Neurodegeneration: 3, 17)]에 의해 이전에 기재된 바와 같이 3가지 참조 유전자(Atp5b, Eif4a2, UbC)의 기하학적 평균에 대해 정규화하였다. 본 발명자들은 4가지의 GFP-처리 대조군 선조체에 대해 4가지의 ZFP-처리 선조체에서의 돌연변이체 Htt 이식유전자의 통계학적으로 유의한 억제(P <0.001)를 관찰하였다(도 9). 평균 R6/2 억제는 GFP-처리 대조군의 64.9%였다. 선조체의 완전한 범위는 단일 정위적 주사를 사용하여 달성되지 않았고, AAV2/6은 신경 세포를 우선적으로 형질도입하였으며, 관찰한 억제의 배수(~35%)는 AAV 벡터에 의해 형질도입된 세포에서의 실제 억제의 추정 하에 있을 가능성이 있다.

실시예 10: 다이머화 / 멀티머화 도메인을 지니는 ZFP 를 사용하는 돌연변이체 Htt의 선택적 억제

짧은 CAG와 긴 GAG 반복체 간을 더 양호하게 식별하는 아연 핑거 전사 인자를 유전자 조작하기 위해, 본 발명자들은 개개의 아연 핑거 전사 인자의 DNA-결합 친화도를 감소시키고 CAG 반복 내의 인접한 활성부위에 결합된 융합 단백질의 상이한 복제물 간의 상호작용 강도를 증가시키는 것을 추구하였다. 개개의 아연 핑거 전사 인자의 DNA-결합 친화도를 감소시키기 위해, 본 발명자들은 최적 미만의 친화도로 DNA에 결합하도록 아연 핑거가 거의 없고/없거나 예상한 아미노산 서열을 지니는 아연 핑거 도메인을 만들었다. CAG 반복체 내의 인접한 하위부위에 결합된 융합 단백질의 상이한 복제물 간의 상호작용 강도를 증가시키기 위해, 본 발명자들은 본 발명자의 아연 핑거 전사 인자에 다양한 다이머화 도메인을 융합하였다. 다이머화 도메인들은 "평행" 방식에서 상호작용할 수 있고, 그들을 함유하는 융합 단백질의 "머리 대 머리" 또는 "꼬리 대 꼬리" 다이머를 수득하였다. 하나의 잠재적 다이머화 전략은 "머리 대 꼬리" 배향에서 결합되는 동일한 ZFP-전사 인자 융합의 배열을 필요로 하며, 따라서 이 전력은 "역평행" 방식에서 상호작용하는 다이머화 도메인을 필요로 한다. 예를 들어, 문헌[McClain et al . (2001) J. Am . Chem . Soc. 123:3151-3152)] 및 다이머화 아연 핑거 펩타이드(Giesecke et al . (2006), Molecular Systems Biology 2:2006.2011) 참조.

다이머화 작제물 CC1 및 CC2는 역평행 꼬인 나선의 쌍에 기반하였다(McClain et al, 상기 참조, Ghosh et al . (2000) J Am Chem Soc 122:5658-5659). 다이머화 작제물 CC3 및 CC4는 각각 4개의 잔기 또는 7개의 잔기가 없는 CC2의 절단된 형태였다. 다이머화 작제물 DZ1, DZ2, DZ3 및 DZ4는 다이머화 아연 핑거 도메인의 쌍에 기반하였다(Giesecke et al, 상기 참조). 각 경우에, 쌍의 한 구성원을 아연 핑거 DNA 결합 도메인의 N-말단에 융합하였고, 쌍의 나머지 구성원을 아연 핑거 DNA 결합 도메인의 C-말단에 융합하였다. 글라이신 및 세린 잔기가 풍부한 짧은 링커를 사용하여 아연 핑거 결합 도메인에 다이머화 도메인을 융합시켰다. 본 발명의 추가적인 실시형태는 교호 길이 및/또는 아미노산 조성을 지니는 링커를 이용한다. 하나 이상의 잔기가 제거된 링커 또는 하나 이상의 글라이신 또는 세린 잔기의 다른 아미노산으로 변화를 지니는 링커는 이들 링커의 가요성을 감소시킬 것이며, 긴 것과 짧은 CAG 반복체 사이의 식별을 개선시킬 수 있다.

돌연변이체 Htt 대립유전자의 선택적 억제를 달성하기 위해, ZFP를 도 1d 및 도 10a 및 도 4B에서 도시한 바와 같이 설계하였다. 도 10c 및 도 10d는 멀티머화 도메인의 서열을 나타낸다. 도 11a 및 도 11b는 각각 CC 및 DZ 도메인을 포함하는 ZFP-TF가 그의 표적을 억제하는 능력을 측정하도록 설계된 실험 결과를 도시한다. 이들 실험에 대해, 나타낸 ZFP 작제물(50ng)을 pRL-Htt-CAG17 (200ng), pGL3-Htt-CAG47 (200ng) 및 pVax-SEAP(분비된 알칼린 포스파타제, 10ng, 정규화 대조군으로서 사용함)을 HEK293 세포내로 공동 형질감염시켰다. 루시퍼라제 활성 및 분비된 알칼린 포스파타제 활성을 형질감염 후 24시간에 측정하였다. 각 샘플에 대한 레닐라 루시퍼라제(CAG17)/SEAP 및 반딧불이 루시퍼라제(CAG47)/SEAP 비를 리포터 만의 샘플에 대해 정규화시켰다. pGL-프로모터 작제물(프로메가)을 pRL-TK 작제물 대신 사용한 것을 제외하고, pGL3-Htt-CAG47 리포터를 pRL-Htt-CAG47 리포터와 동일한 방법으로 구성하였다(실시예 3 참조).

도 11a에서 나타낸 바와 같이, 하나 이상의 CC 도메인-함유 작제물로서 시험할 때 3개의 ZFP는 동일한 ZFP이지만 CC 도메인이 없는 작제물에 비해 리포터 중 하나 또는 둘 다의 억제를 향상시켰다. 도 11b는 DZ1 및 DZ3 도메인이 리포터 둘 다에 대한 32220의 발현을 향상시켰음을 나타낸다.

이들 결과는 CC 및 DZ 도메인이 일반적으로 멀티머화된 ZFP의 친화도를 증가시킬 수 있고, DNA 결합 도메인 및 다이머화 도메인의 설계는 최적의 CAG-반복체 길이 식별을 수득할 수 있다는 것을 시사한다.

실시예 11: ZFP - ZFP - Kox 설계를 지니는 돌연변이체 Htt 의 선택적 억제

ZFP TF를 ZFP-ZFP-KOX 설계를 가지는 HD 섬유아세포에서 시험하였다. 이들 실험에서, 2개의 ZFP DNA 결합 도메인을 가요성 링커(LRQKDAARGSAAMAERPFQ, 서열번호 179)와 함께 연결하였고, KOX 억제 도메인에 융합시켰다. 보존된 히스티딘과 시스테인 사이에 링커를 놓았다. 표시한 용량에서 ZFP mRNA를 사용하여 상기 기재한 바와 같이 단백질을 시험하였다. CAG18/45(도 12A) 및 CAG20/41(도 12B) HD 섬유아세포주에서 이들 결과는 이 방식에서 덜 활성인 ZFP DNA 결합 도메인을 연결하는 것이 대립유전자-특이적 억제를 구동하는 복합체 ZFP를 초래할 수 있다는 것을 입증하였다.

실시예 12: 마우스 세포에서 Htt 의 활성화

본 명세서에 기재된 바와 같은 ZFP를 또한 Htt 발현을 활성화시키는 그의 능력에 대해 평가하였다. 마우스의 Htt의 +200 내지 +467 bp 영역(전사 시작 부위에 대해)에 대해 표적화된 ZFP를 NFkB p65 서브유닛의 전사 활성화 도메인에 융합시켰다. 이 단편은 HD의 다양한 녹-인 마우스 모델에서 인간 Htt로부터 대응하는 서열(다수의 엑손 1 및 일부 인트론 1 서열)에 의해 대체되기 때문에 이 표적화 영역을 선택하였고(Menalled et al. (2003) J. Comp . Neurol 4651:11-26; Wheeler et al. (2000) Hum Mol Genet 8:115-122), 따라서 이 영역에 대해 표적화된 ZFP는 해당 동물에서의 야생형 대립유전자를 선택적으로 활성화시킬 수 있지만, 녹-인 대립유전자는 그렇지 않다.

ZFP를 Neuro2A 세포(Htt 대립유전자늘 둘 다 이들 세포에서 야생형임) 내로 형질감염시켰고, 마우스 Htt 및 ACTB mRNA 수준을 실시예 2에서 기재한 바와 같이 측정하였다(2회 형질감염 및 다회 분석).

도 13에서 나타낸 바와 같이, 모의 형질감염에 비해 Htt mRNA 수준에서의 증가를 ZFP-TF를 둘 다 사용하여 검출하였다. 도 13a 참조. 증가된 Htt 단백질 수준을 웨스턴 블롯에 의해 확인하였다. 도 13b 참조.

녹-인 Htt 대립유전자의 발생을 도 13c에서 도시하며; 서열 정렬(도 13d)은 대체된 마우스 서열과 대응하는 인간 서열 간의 분기를 나타낸다. 도 13e는 이러한 ZFP 활성체를 HdhQ111/Q7 녹-인 마우스로부터 유래된 불멸 선조 세포 내로 형질감염시켰을 때, 야생형 Htt만이 선택적으로 활성화되었다는 것을 나타낸다.

실시예 13: 생체내 Htt 발현의 조절

생체내 Htt-특이적 ZFP TF의 효율을 시험하기 위해, ZFP를 암호화하는 AAV2 벡터를 생성한다. 이들 AAV2 기반 작제물을 그 다음에 마우스의 뇌에 전달한다. 인간 Htt-특이적 ZFP TF에 대해, AAV 벡터를 R6.2 마우스 또는 BAC HD 마우스(C57Bl/6 또는 FVB/N 균주)에 전달하여 인간 이식유전자의 억제뿐만 아니라 HD-유사 표현형에서의 변화를 평가한다. 마우스 Htt-특이적 ZFP(활성체 또는 리프레서)에 대해, AAV 벡터를 야생형 마우스(C57Bl/6 또는 FVB/N) 또는 인간 Htt 녹-인 마우스(HdhQ111/Q7, HdhQ140/Q7 또는 HdhQ175/Q7)에 전달하여 내인성 마우스 Htt 발현의 활성화 또는 억제를 평가한다. CAG-확장 대립유전자를 우선적으로 표적화하는 ZFP에 대해, AAV 벡터를 R6.2 마우스 또는 인간 Htt 녹-인 마우스(HdhQ111/Q7, HdhQ140/Q7 또는 HdhQ175/Q7)에 전달하여 wt 대 확장된 Htt 대립유전자의 선택적 억제를 시험한다. 희생 후, 뇌 조직을 태그만(Taqman) 실시간 RT-PCR에 의한 Htt 발현에 대해 분석하고, Htt 유전자를 ZFP-TF에 의해 조절한다.

실시예 14: 신경영양인자 및 HD Htt 대립유전자-특이적 ZFP TF 의 공동 형질감염

상기 확인한 Htt-특이적 ZFP TF를 뇌 신경영양인자에 특이적인 ZFP TF로 공동 형질감염시킨다. 사용한 뇌 신경영양인자에 특이적인 ZFP TF는 GDNF 또는 BDNF에 대해 특이적이다.

실시예 15: Htt - 표적화된 아연 핑거 뉴클레아제( ZFN )의 설계 및 구성

ZFN 표적화 인간 Htt 및 마우스 Htt를 CAG 반복체에 측접하는 서열, 제1 암호 ATG 근처의 서열, 정지 코돈뿐만 아니라 초기 엑손을 표적화하도록 설계하였다. ZFN을 설계하였고, 문헌[Urnov et al. (2005) Nature 435(7042):646-651, Perez et al (2008) Nature Biotechnology 26(7): 808-816], 및 미국 특허 공개 제2008/0131962호에 본질적으로 기재된 바와 같은 플라스미드 또는 아데노바이러스 벡터에 포함하였다.

실시예 16: Htt -특이적 ZFN 의 절단 활성

절단 활성을 시험하기 위해, 상기 기재한 인간 Htt-특이적 ZFN의 쌍을 암호화하는 플라스미드를 K562 세포 내로 형질감염시켰다. K562 세포를 미국 미생물 보존센터(American Type Culture Collection: ATCC)로부터 얻었고, 10%로 약화시킨 소 태아 혈청(fetal calf serum: FCS, 사이클론(Cyclone))으로 보충한 F-12 배지(인비트로젠)에서 권고되는 바와 같이 성장시켰다. TrypLE Select(상표명) 프로테아제(인비트로젠)를 사용하여 세포를 플라스틱으로부터 해리시켰다. 형질감염을 위해, 1백만개의 K562 세포를 2㎍의 아연-핑거 뉴클레아제 플라스미드 및 100㎕ 아막사 용액 T와 혼합하였다. 프로그램 U-23을 사용하여 아막사 뉴클레오펙터 II(상표명)에서 세포를 형질감염시켰고, 1.4㎖ 따뜻한 F-12 배지 + 10% FCS 내로 회수하였다.

게놈 DNA를 채취하였고, 의도된 절단 부위를 포함하는 일부 Htt 좌위를 PCR 증폭시켰다. 인비트로젠제의 아큐프림(Accuprime) HiFi 폴리머라제를 사용하는 PCR을 다음과 같이 수행하였다: 94℃에서 처음 3분 변성시킨 후, 30 주기의 PCR을 94℃에서 30초 제2 변성 단계에 의해 수행한 다음, 58℃에서 30초 어닐링 단계 다음에, 68℃에서 30초 연장 단계. 30 주기의 완료 후, 반응물을 68℃에서 7분 동안 인큐베이션시킨 다음, 10℃에서 무기한으로 인큐베이션시켰다.

K562 Htt-특이적 ZFN 처리된 세포로부터의 게놈 DNA를, 예를 들어 미국 특허 공개 제20080015164호; 제20080131962호 및 제20080159996호에 기재된 바와 같은 서베이어(상표명) 뉴클레아제(트랜스게노믹(Transgenomic))에 의해 시험하였다.

마우스 Htt-특이적 ZFN의 쌍을 암호화하는 플라스미드를 Neuro-2a 세포에서 유사한 방식으로 시험하였다.

도 14A 및 도 14B는 관찰한 삽입결실의 양에 의해 앞서 기재한 바와 같이, ZFN이 분석한 8 내지 40%의 유전자 변형 효율을 지니는 Htt 유전자를 표적화할 수 있다는 것을 나타낸다.

실시예 17: 다양한 길이의 트라이뉴클레오타이드 반복체의 표적화된 통합

상기 기재한 바와 같은 CAG 반복체에 측접하는 서열에 대해 가장 큰 절단 활성을 지니는 Htt-특이적 ZFN을 Htt의 야생형 복제물 내로 다양한 길이의 CAG 반복체를 도입하는 표적화된 통합 전략에서 사용한다. 50, 80, 109 및 180 반복체 CAG 단위를 함유하는 공여체를 구성한다. 그 다음에 이들 공여체를 상기 기재한 바와 같은 Htt-특이적 ZFN을 암호화하는 플라스미드를 지니는 K562 세포 내로 형질감염시킨다. 공여체 통합의 확인을 게놈 DNA 단리, PCR 증폭(상기 기재한 바와 같음) 다음에 관심 대상 영역의 시퀀싱에 의해 달성한다.

Htt 대립유전자 내로 공여체 대립유전자의 표적화된 통합을 야기하는 K562 세포에서 확인되는 ZFN을 사용하여 가변 길이 공여체 핵산을 인간 배아 줄기 세포(hESC) 내로 삽입한다. 성공적인 공여체 통합을 상기 기재한 바와 같이 게놈 DNA 단리, PCR 및 시퀀싱에 의해 확인한다.

실시예 18: 야생형 및/또는 돌연변이체 Htt 의 파괴/녹아웃

초기 엑손에서 절단되는 ZFN은 비상동성 단부 결합(non-homologous end joining: NHEJ) 결과로서 작은 삽입 또는 결실(삽입-결실)을 초래할 수 있고, 이는 파괴된 Htt의 하나 또는 둘 다를 지니는 세포 모델을 만들 수 있다.

표시한 ZFN 쌍을 상기 기재한 바와 같이 제조하였고, 예를 들어 8에 기재한 바와 같은 Cel I 미스매치를 사용하여 절단 활성에 대해 시험하였다. 이들 ZFN 쌍은 인간 Htt의 초기 엑손을 표적화하며, 따라서 야생형 또는 돌연변이체 Htt 대립유전자 중 하나를 녹아웃하기 위해 사용될 수 있다.

도 14A에서 나타낸 바와 같이, ZFP 쌍 29627/29628, 29631/29632(엑손 12) 및 29637/29638(엑손 18)은 Htt 유전자를 절단하였고, 따라서 녹-아웃 세포주를 만들기 위해 이용할 수 있다.

실시예 19: 야생형 및 HD Htt 대립유전자의 발현 태그.

첫 번째 또는 마지막 암호 엑손에 대해 가장 큰 절단 활성을 지니는 ZFN을 사용하여 상이한 리포터 단백질을 지니는 야생형 및 돌연변이체 Htt 대립유전자를 태그한다. 각 리포터(A 및 B)에 대한 공여체 DNA를 Htt에 대한 프레임 내 융합을 만들기 위해 리포터 유전자를 표적화 통합시키는 선두 ZFN 쌍(들)의 절단 부위를 기반으로 설계하였다. 공여체 DNA를 가장 높은 통합 빈도를 제공하는 공여체 DNA 작제물을 선택하기 위한 K562 세포 내로 선두 ZFN 쌍(들)으로 공동 형질감염시킨다.

ZFN 쌍을 상기 기재한 바와 같이 제조하였고, 예를 들어 8에 기재한 바와 같은 Cel I 미스매치를 사용하여 절단 활성에 대해 시험하였다. 사용한 ZFN 쌍은 Htt 암호 서열의 3' 단부를 표적화하고, 따라서 야생형 또는 돌연변이체 Htt 대립유전자 중 하나를 표적화하기 위해 사용할 수 있다. 도 14B에 나타낸 바와 같이, ZFP 쌍 25917/25916, 25920/25921 및 25923/25922는 Htt 유전자를 절단할 수 있고, 리포터 태그의 도입을 위해 이용할 수 있다.

대응하는 ZFN과 마찬가지로 리포터 A에 대해 선택된 공여체 DNA 작제물을 돌연변이체 Htt 유전자(예를 들어, 섬유아세포, 유도 만능 세포)로부터 유래된 세포에 전달한다. 클론이 유래되고, 리포터 A의 표적 통합을 위해 선별한다. 이종성 사건이 요망되며, 표적화된 대립유전자를 PCR에 의해 확인한다. 단일 리포터 태그 Htt 대립유전자 및 다른 대립유전자 상의 미변형 ZFN 표적 서열을 함유하는 클론을 선택하고; 리포터 B 및 대응하는 ZFN에 대한 공여체 작제물을 형질감염시켜 리포터 B에 의해 제2 대립유전자를 태그한다.

얻어진 마우스 배아 줄기 세포 클론은 각각의 대립유전자로부터의 발현을 수송하게 하는 2개의 상이한 마커로 태그된 야생형 Htt 대립유전자 및 돌연변이체 대립유전자를 함유하고; 이들 세포를 사용하여 표준 프로토콜을 사용하는 트라이뉴클레오타이드 반복체 장애의 마우스 모델을 만든다.

실시예 20: Htt 에 대한 활성 TALE - TF 단백질의 구성.

TALE DNA 결합 도메인을 Kox1 단백질(TALE TF)로부터의 KRAB 억제 도메인에 연결하였고, HD 환자(CAG 20/41)-유래 섬유아세포에서의 Htt 유전자의 억제를 시험하기 위해 사용하였다. TALE 단백질의 구성을 앞서 기재한 바와 같이 행하였고(공동 출원된 미국 특허 공개 제20110301073호 및 공동 출원된 미국 특허 출원 제13/679,684호 참조, 이들 둘 다 본 명세서에 참조로서 포함됨), 3개의 상이한 C-말단 구조로 구성하였다: 미국 특허 제20110301073호에 기재한 바와 같은 +63, +231 및 +278. TALE TF 발현 플라스미드를 구성하기 위해, TALEN에서 사용한 FokI 도메인을 KRAB 억제 도메인으로 대체한 것을 제외하고, 앞서 기재한 TALEN 발현 플라스미드(미국 특허 제20110301073호 참조)를 사용하였다. TALE 단백질 및 KRAB 도메인의 C-말단의 결합을 이하에 나타내며, 여기서 KRAB 도메인 서열을 밑줄로 표시한다. 볼드 및 이탤릭체 텍스트는 삼중 플래그 태그를 나타내며, 볼드 텍스트는 핵 국소화 서열을 나타내며, "[반복체]"는 TALE 반복체 단위 배열(전체 반복체 + C-말단의 절반 반복체)의 위치를 나타내고, 물결 밑줄 부분은 KRAB 도메인 서열을 나타낸다:

정규 RVD-염기 대응도("TALE 암호": A에 대해 NI, C에 대해 HD, G에 대해 NN(절반 반복체에서 NK), T에 대해 NG)를 사용하여 염기 인식을 달성하였다. 일부 TALE TF에서, 단백질을 DNA의 센스(5'-3') 가닥에 결합하도록 설계하는 한편, 나머지에서, TALE TF를 안티-센스(3'-5') 가닥에 결합되도록 설계한다. TALE TF의 이런 세트를 Htt 유전자의 CAG 반복체를 표적화하도록 설계하였다. TALE DNA 결합 단백질은 종종 표적의 5' 단부에서 'T' 뉴클레오타이드 염기와 우선적으로 상호작용하고, 따라서 표적은 CAG 반복체 영역이기 때문에, 안티-센스 DNA 가닥에 결합되는 단백질 및 표적의 5' 세 번째에서 염기 'T'를 지니는 CTG 반복체 서열은 더 양호한 결합 친화도 및 특이성 및 따라서 리프레서 활성을 가질 수 있다는 것을 예측할 수 있다.

시험한 TALE TF에 대한 표적 및 수치적 식별자를 이하의 표 4에서 나타낸다. 수치적 식별자를 "SBS#"로 표지하고, 센스 또는 안티센스 가닥에 대한 특이성 ("S/A")뿐만 아니라 표적, 반복 단위의 수 또는 RVD 및 C-말단 유형을 나타낸다.

그 다음에 표에서의 TALE TF를 HD 환자(CAG 20/41) 유래 섬유아세포에서 Htt 억제에 대해 시험하고, 결과를 도 15에 나타낸다. 이 실험에서, 세포를 1000, 100 또는 10ng의 TALE-TF 암호화 mRNA로 형질감염시켰다. 분석한 각 TALE TF에 대한 결과를 3개의 그룹으로 나타내는데, 이는 3개의 형질감염된 mRNA 양을 나타낸다. 각 그룹화에서, 또한 3개의 샘플이 있으며: 좌측 막대는 전체 Htt 발현을 나타내고, 중간 막대는 CAG20 Htt 대립유전자로부터의 발현을 나타내며, 우측 막대는 CAG41 Htt 대립유전자로부터의 발현을 나타낸다. 데이터는 일부 TALE TF는 Htt 대립유전자(예를 들어 102454 참조) 둘 다를 억제할 수 있는 반면, 나머지 TALE TF는 연장된 CAG 반복체에 의해 돌연변이체 Htt를 선택적으로 저해할 수 있다(예를 들어 102451 및 102472)는 것을 입증한다.

본 명세서에 언급한 모든 특허, 특허 출원 및 간행물은 그들의 전문이 본 명세서에 참조로서 포함된다.

개시내용은 이해의 명확함의 목적을 위해 예시 및 실시예의 방법에 의해 일부 상세하게 제공되었지만, 다양한 변화 및 변형이 본 개시내용의 정신 또는 범주로부터 벗어나는 일 없이 실행될 수 있다는 것은 당업자에게 명확할 것이다. 따라서, 앞서 언급한 설명 및 실시예는 제한으로서 해석되어서는 안 된다.

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Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 74 His His Ser Ala Arg Arg Cys 1 5 <210> 75 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 75 Asp Asn Ser Ser Arg Thr Arg 1 5 <210> 76 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 76 His Lys Gln His Arg Asp Ala 1 5 <210> 77 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 77 Arg Arg Thr Asp Leu Arg Arg 1 5 <210> 78 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 78 Asp Pro Ser Asn Arg Val Gly 1 5 <210> 79 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 79 Arg Ser Ala Asp Leu Ser Arg 1 5 <210> 80 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 80 Arg Asn Asp Asp Arg Lys Lys 1 5 <210> 81 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 81 Gln Lys Val Thr Leu Ala Ala 1 5 <210> 82 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 82 Arg Arg Ser Thr Leu Arg Ser 1 5 <210> 83 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 83 Asp Arg Ser Ala Leu Ser Arg 1 5 <210> 84 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 84 Gln Ser Gly Ser Leu Thr Arg 1 5 <210> 85 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 85 Leu Lys Trp Asn Leu Arg Thr 1 5 <210> 86 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 86 Leu Lys Trp Asp Arg Gln Thr 1 5 <210> 87 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 87 Asp Arg Ser His Leu Ser Arg 1 5 <210> 88 <211> 28 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> Description of Unknown: Human or mouse target sequence <400> 88 acgctgcgcc ggcggaggcg gggccgcg 28 <210> 89 <211> 28 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> Description of Unknown: Human or mouse target sequence <400> 89 agccggccgt ggactctgag ccgaggtg 28 <210> 90 <211> 28 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> Description of Unknown: Human or mouse target sequence <400> 90 gtggcgatgc ggggggcgtg gtgaggta 28 <210> 91 <211> 28 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> Description of Unknown: Human or mouse target sequence <400> 91 ccgggacggg tccaagatgg acggccgc 28 <210> 92 <211> 28 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> Description of Unknown: Human or mouse target sequence <400> 92 ccgtcccggc agcccccacg gcgccttg 28 <210> 93 <211> 28 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> Description of Unknown: Human or mouse target sequence <400> 93 cgggtccaag atggacggcc gctcaggt 28 <210> 94 <211> 28 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> Description of Unknown: Human or mouse target sequence <400> 94 ctgctgctgc tgctggaagg acttgagg 28 <210> 95 <211> 28 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> Description of Unknown: Human or mouse target sequence <400> 95 tcagatggga cggcgctgac ctggctgg 28 <210> 96 <211> 28 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> Description of Unknown: Human or mouse target sequence <400> 96 ctgccatgga cctgaatgat gggaccca 28 <210> 97 <211> 28 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> Description of Unknown: Human or mouse target sequence <400> 97 gtggtctggg agctgtcgct gatgggcg 28 <210> 98 <211> 28 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> Description of Unknown: Human or mouse target sequence <400> 98 ccgaagggcc tgattcagct gttacccc 28 <210> 99 <211> 28 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> Description of Unknown: Human or mouse target sequence <400> 99 aacttgcaag taacagaaga ctcatcct 28 <210> 100 <211> 28 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> Description of Unknown: Human or mouse target sequence <400> 100 cttgtacagc tgtgagggtg agcataat 28 <210> 101 <211> 28 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> Description of Unknown: Human or mouse target sequence <400> 101 gccatggtgg gagagactgt gaggcggc 28 <210> 102 <211> 28 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> Description of Unknown: Human or mouse target sequence <400> 102 ctcagcaggt ggtgaccttg tggacatt 28 <210> 103 <211> 28 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> Description of Unknown: Human or mouse target sequence <400> 103 gcgctcagca ggtggtgacc ttgtggac 28 <210> 104 <211> 28 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> Description of Unknown: Human or mouse target sequence <400> 104 atggtgggag agactgtgag gcggcagc 28 <210> 105 <211> 28 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> Description of Unknown: Human or mouse target sequence <400> 105 tgggagagac tgtgaggcgg cagctggg 28 <210> 106 <211> 28 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> Description of Unknown: Human or mouse target sequence <400> 106 atggcgctca gcaggtggtg accttgtg 28 <210> 107 <211> 28 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> Description of Unknown: Human or mouse target sequence <400> 107 cagcagcagc agcagcagca gcagcagc 28 <210> 108 <211> 28 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> Description of Unknown: Human or mouse target sequence <400> 108 ctgctgctgc tgctgctgct ggaaggac 28 <210> 109 <211> 28 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> Description of Unknown: Human or mouse target sequence <400> 109 tgctgctgct gctgctgctg ctggaagg 28 <210> 110 <211> 28 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> Description of Unknown: Human or mouse target sequence <400> 110 agcagcagca gcagcagcag cagcagca 28 <210> 111 <211> 28 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> Description of Unknown: Human or mouse target sequence <400> 111 tgctgctgct gctgctgctg ctggaagg 28 <210> 112 <211> 28 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> Description of Unknown: Human or mouse target sequence <400> 112 ggctggcttt tgcgggaagg ggcggggc 28 <210> 113 <211> 28 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> Description of Unknown: Human or mouse target sequence <400> 113 gaattgacag gcggatgcgt cgtcctct 28 <210> 114 <211> 28 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> Description of Unknown: Human or mouse target sequence <400> 114 attctgcggg tctggcgtgg cctcgtct 28 <210> 115 <211> 28 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> Description of Unknown: Human or mouse target sequence <400> 115 gtgacgtcat gccggcggag acgaggcc 28 <210> 116 <211> 28 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> Description of Unknown: Human or mouse target sequence <400> 116 gtgcgtcccg tgacgtcatg ccggcgga 28 <210> 117 <211> 28 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> Description of Unknown: Human or mouse target sequence <400> 117 gccgcgaggg ttgccgggac gggcccaa 28 <210> 118 <211> 28 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> Description of Unknown: Human or mouse target sequence <400> 118 ccgcgagggt tgccgggacg ggcccaag 28 <210> 119 <211> 28 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> Description of Unknown: Human or mouse target sequence <400> 119 catcgggcag gaagccgtca tggcaacc 28 <210> 120 <211> 28 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> Description of Unknown: Human or mouse target sequence <400> 120 tcctgcccga tgggacagac cctgaaga 28 <210> 121 <211> 28 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> Description of Unknown: Human or mouse target sequence <400> 121 gtactgagca atgctgtagt cagcaatc 28 <210> 122 <211> 53 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 122 Thr Lys Cys Val His Cys Gly Ile Val Phe Leu Asp Glu Val Met Tyr 1 5 10 15 Ala Leu His Met Ser Cys His Gly Phe Arg Asp Pro Phe Glu Cys Asn 20 25 30 Ile Cys Gly Tyr His Ser Gln Asp Arg Tyr Glu Phe Ser Ser His Ile 35 40 45 Val Arg Gly Glu His 50 <210> 123 <211> 53 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 123 Phe Lys Cys Glu His Cys Arg Ile Leu Phe Leu Asp His Val Met Phe 1 5 10 15 Thr Ile His Met Gly Cys His Gly Phe Arg Asp Pro Phe Lys Cys Asn 20 25 30 Met Cys Gly Glu Lys Cys Asp Gly Pro Val Gly Leu Phe Val His Met 35 40 45 Ala Arg Asn Ala His 50 <210> 124 <211> 53 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 124 His His Cys Gln His Cys Asp Met Tyr Phe Ala Asp Asn Ile Leu Tyr 1 5 10 15 Thr Ile His Met Gly Cys His Gly Tyr Glu Asn Pro Phe Glu Cys Asn 20 25 30 Ile Cys Gly Tyr His Ser Gln Asp Arg Tyr Glu Phe Ser Ser His Ile 35 40 45 Val Arg Gly Glu His 50 <210> 125 <211> 110 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 125 His His Cys Gln His Cys Asp Met Tyr Phe Ala Asp Asn Ile Leu Tyr 1 5 10 15 Thr Ile His Met Gly Cys His Ser Cys Asp Asp Val Phe Lys Cys Asn 20 25 30 Met Cys Gly Glu Lys Cys Asp Gly Pro Val Gly Leu Phe Val His Met 35 40 45 Ala Arg Asn Ala His Gly Glu Lys Pro Thr Lys Cys Val His Cys Gly 50 55 60 Ile Val Phe Leu Asp Glu Val Met Tyr Ala Leu His Met Ser Cys His 65 70 75 80 Gly Phe Arg Asp Pro Phe Glu Cys Asn Ile Cys Gly Tyr His Ser Gln 85 90 95 Asp Arg Tyr Glu Phe Ser Ser His Ile Val Arg Gly Glu His 100 105 110 <210> 126 <211> 110 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 126 Phe Lys Cys Glu His Cys Arg Ile Leu Phe Leu Asp His Val Met Phe 1 5 10 15 Thr Ile His Met Gly Cys His Gly Phe Arg Asp Pro Phe Lys Cys Asn 20 25 30 Met Cys Gly Glu Lys Cys Asp Gly Pro Val Gly Leu Phe Val His Met 35 40 45 Ala Arg Asn Ala His Gly Glu Lys Pro Phe Tyr Cys Glu His Cys Glu 50 55 60 Ile Thr Phe Arg Asp Val Val Met Tyr Ser Leu His Lys Gly Tyr His 65 70 75 80 Gly Phe Arg Asp Pro Phe Glu Cys Asn Ile Cys Gly Tyr His Ser Gln 85 90 95 Asp Arg Tyr Glu Phe Ser Ser His Ile Val Arg Gly Glu His 100 105 110 <210> 127 <211> 30 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 127 Ala Gln Leu Glu Lys Glu Leu Gln Ala Leu Glu Lys Lys Leu Ala Gln 1 5 10 15 Leu Glu Trp Glu Asn Gln Ala Leu Glu Lys Glu Leu Ala Gln 20 25 30 <210> 128 <211> 30 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 128 Ala Gln Leu Lys Lys Lys Leu Gln Ala Asn Lys Lys Glu Leu Ala Gln 1 5 10 15 Leu Lys Trp Lys Leu Gln Ala Leu Lys Lys Lys Leu Ala Gln 20 25 30 <210> 129 <211> 30 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 129 Glu Gln Leu Glu Lys Lys Leu Gln Ala Leu Glu Lys Lys Leu Ala Gln 1 5 10 15 Leu Glu Trp Lys Asn Gln Ala Leu Glu Lys Lys Leu Ala Gln 20 25 30 <210> 130 <211> 29 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 130 Ala Leu Lys Lys Glu Leu Gln Ala Asn Lys Lys Glu Leu Ala Gln Leu 1 5 10 15 Lys Trp Glu Leu Gln Ala Leu Lys Lys Glu Leu Ala Gln 20 25 <210> 131 <211> 26 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 131 Glu Gln Leu Glu Lys Lys Leu Gln Ala Leu Glu Lys Lys Leu Ala Gln 1 5 10 15 Leu Glu Trp Lys Asn Gln Ala Leu Glu Lys 20 25 <210> 132 <211> 25 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 132 Glu Leu Gln Ala Asn Lys Lys Glu Leu Ala Gln Leu Lys Trp Glu Leu 1 5 10 15 Gln Ala Leu Lys Lys Glu Leu Ala Gln 20 25 <210> 133 <211> 23 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 133 Glu Gln Leu Glu Lys Lys Leu Gln Ala Leu Glu Lys Lys Leu Ala Gln 1 5 10 15 Leu Glu Trp Lys Asn Gln Ala 20 <210> 134 <211> 23 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 134 Gln Ala Asn Lys Lys Glu Leu Ala Gln Leu Lys Trp Glu Leu Gln Ala 1 5 10 15 Leu Lys Lys Glu Leu Ala Gln 20 <210> 135 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 135 Thr Gly Glu Lys Pro 1 5 <210> 136 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 136 Thr Gly Gly Gln Arg Pro 1 5 <210> 137 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 137 Thr Gly Gln Lys Pro 1 5 <210> 138 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 138 Thr Gly Ser Gln Lys Pro 1 5 <210> 139 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 139 gaagatctca cttggggtcc tcaggtcgtg ccgac 35 <210> 140 <211> 41 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 140 gtatccaagc ttcagctttt ccagggtcgc ctaggcggtc t 41 <210> 141 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 141 gcctaggcga ccctggaaaa gctgatgaag gcc 33 <210> 142 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 142 gtatccaagc ttgagctgca gcgggcccaa actcacg 37 <210> 143 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 143 agtttggagg gtttctc 17 <210> 144 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 144 tcgactaaag caggatttca gg 22 <210> 145 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 145 agtttggagg gtttctt 17 <210> 146 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 146 agggtttctc cgctcagc 18 <210> 147 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 147 Gln Ser Gly Ala Leu Ala Arg 1 5 <210> 148 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 148 Arg Ser Ala Val Leu Ser Glu 1 5 <210> 149 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 149 Arg Ser Asp Asp Leu Ser Lys 1 5 <210> 150 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 150 Asp Asn Ser Asn Arg Ile Lys 1 5 <210> 151 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 151 Asp Asp Ser His Arg Lys Asp 1 5 <210> 152 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 152 Arg Ser Asp His Leu Thr Gln 1 5 <210> 153 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 153 Arg Ser Asp Ser Leu Leu Arg 1 5 <210> 154 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 154 Arg Arg Asp Trp Leu Pro Gln 1 5 <210> 155 <211> 28 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> Description of Unknown: Human or mouse target sequence <400> 155 cgcactcgcc gcgagggttg ccgggacg 28 <210> 156 <400> 156 000 <210> 157 <211> 28 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> Description of Unknown: Human or mouse target sequence <400> 157 agcagcagca gcagcagcag cagcagca 28 <210> 158 <211> 28 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> Description of Unknown: Human or mouse target sequence <400> 158 ctgctgctgc tgctgctgct gctggaag 28 <210> 159 <211> 28 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> Description of Unknown: Human or mouse target sequence <400> 159 cctgtccaga gggtcgcggt acctccct 28 <210> 160 <211> 28 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> Description of Unknown: Human or mouse target sequence <400> 160 tgccggacct ggcagcggcg gtggtggc 28 <210> 161 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 161 Arg Ser Asp Asn Leu Ser Glu Lys Arg Cys Asn Leu Arg Cys 1 5 10 <210> 162 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 162 Arg Ser Asp Asn Leu Ser Glu Lys Pro Tyr Asn Leu Arg Thr 1 5 10 <210> 163 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 163 Arg Ser Asp Asn Leu Ser Glu Arg Leu Trp Asn Arg Lys Gln 1 5 10 <210> 164 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 164 Arg Ser Asp Asn Leu Ser Val Arg Arg Trp Asn Leu Arg Ala 1 5 10 <210> 165 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 165 Arg Ser Asp Asn Leu Ser Val Arg Lys Trp Asn Arg Asp Ser 1 5 10 <210> 166 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 166 Arg Ser Asp Asn Leu Ser Glu Asn Thr Ser Pro Leu Met Leu 1 5 10 <210> 167 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 167 Arg Ser Asp Asn Leu Ser Glu Arg Arg Tyr Asn Leu Val Lys 1 5 10 <210> 168 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 168 Arg Ser Asp Thr Leu Ser Glu Arg Arg Trp Thr Leu Val Gly 1 5 10 <210> 169 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 169 Gln Ser Ser Asp Leu Ser Arg Gln Trp Ser Thr Arg Lys Arg 1 5 10 <210> 170 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 170 Arg Ser Ala His Leu Ser Arg Gln Ser Gly Asp Leu Thr Arg 1 5 10 <210> 171 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 171 Gln Ser Gly Asp Leu Thr Arg Gln Ser Gly Asp Leu Thr Arg 1 5 10 <210> 172 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 172 Gln Ser Gly Asp Leu Thr Arg Gln Ser Ser Asp Leu Arg Arg 1 5 10 <210> 173 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 173 Gln Ser Ser Asp Leu Ser Arg Gln Ser Ser Asp Leu Arg Arg 1 5 10 <210> 174 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 174 Gln Ser Ser Asp Leu Ser Arg His Arg Ser Thr Arg Asn Arg 1 5 10 <210> 175 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 175 Met Ala Cys Cys Arg Tyr Ala 1 5 <210> 176 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 176 Arg Ser Ala Asn Leu Arg Glu 1 5 <210> 177 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Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 187 Met Ala Pro Lys Lys Lys Arg Lys Val Gly Ile His Gly Val Leu Arg 1 5 10 15 Gly Ala Ala Gly Gly Glu Gln Leu Glu Lys Lys Leu Gln Ala Leu Glu 20 25 30 Lys Lys Leu Ala Gln Leu Glu Trp Lys Asn Gln Ala Gly Gly Ser Gly 35 40 45 Val Pro 50 <210> 188 <211> 52 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 188 Met Ala Pro Lys Lys Lys Arg Lys Val Gly Ile His Gly Val Leu Ala 1 5 10 15 Ala Gly Gly Glu Gln Leu Glu Lys Lys Leu Gln Ala Leu Glu Lys Lys 20 25 30 Leu Ala Gln Leu Glu Trp Lys Asn Gln Ala Leu Glu Lys Lys Leu Ala 35 40 45 Gln Gly Val Pro 50 <210> 189 <211> 55 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 189 Met Ala Pro Lys Lys Lys Arg Lys Val Gly Ile His Gly Val Leu Ala 1 5 10 15 Ala Gly Gly Glu Gln Leu Glu Lys Lys Leu Gln Ala Leu Glu Lys Lys 20 25 30 Leu Ala Gln Leu Glu Trp Lys Asn Gln Ala Leu Glu Lys Lys Leu 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gccgccgcct cctcagcttc 180 ctcagccgcc gccgcaggca cagccgctgc tgcctcagcc gcagccgccc ccgccgccgc 240 ccccgccgcc acccggcccg gctgtggctg aggagccgct gcaccgaccg tgagtttggg 300 <210> 193 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 193 caggtccggc agaggaacc 19 <210> 194 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 194 ttcacacggt ctttcttggt gg 22 <210> 195 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 195 gcccggctgt ggctga 16 <210> 196 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 196 ttcacacggt ctttcttggt gg 22 <210> 197 <211> 175 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 197 Met Asp Tyr Lys Asp His Asp Gly Asp Tyr Lys Asp His Asp Ile Asp 1 5 10 15 Tyr 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Unknown: Target sequence <400> 202 gcagcagcag cagca 15 <210> 203 <211> 12 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> Description of Unknown: Target sequence <400> 203 gcagcagcag ca 12 <210> 204 <211> 21 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> Description of Unknown: Target sequence <400> 204 ctgctgctgc tgctgctgct g 21 <210> 205 <211> 18 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> Description of Unknown: Target sequence <400> 205 ctgctgctgc tgctgctg 18 <210> 206 <211> 15 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> Description of Unknown: Target sequence <400> 206 ctgctgctgc tgctg 15 <210> 207 <211> 12 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> Description of Unknown: Target sequence <400> 207 ctgctgctgc tg 12 <210> 208 <211> 29 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> Description of Unknown: Human or mouse target sequence <400> 208 ctgctgctgc tgctgctgct gctggaagg 29 <210> 209 <211> 28 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> Description of Unknown: Human or mouse target sequence <400> 209 gcggcgagtg cgtcccgtga cgtcatgc 28 <210> 210 <211> 170 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 210 Gly Gly Arg Pro Ala Leu Glu Ser Ile Val Ala Gln Leu Ser Arg Pro 1 5 10 15 Asp Pro Ala Leu Ala Ala Leu Thr Asn Asp His Leu Val Ala Leu Ala 20 25 30 Cys Leu Gly Gly Arg Pro Ala Leu Asp Ala Val Lys Lys Gly Leu Pro 35 40 45 His Ala Pro Ala Leu Ile Lys Arg Thr Asn Arg Arg Ile Pro Glu Arg 50 55 60 Thr Ser His Arg Val Ala Gly Ser Gly Met Asp Ala Lys Ser Leu Thr 65 70 75 80 Ala Trp Ser Arg Thr Leu Val Thr Phe Lys Asp Val Phe Val Asp Phe 85 90 95 Thr Arg Glu Glu Trp Lys Leu Leu Asp Thr Ala Gln Gln Ile Val Tyr 100 105 110 Arg Asn Val Met Leu Glu Asn Tyr Lys Asn Leu Val Ser Leu Gly Tyr 115 120 125 Gln Leu Thr Lys Pro Asp Val Ile Leu Arg Leu Glu Lys Gly Glu Glu 130 135 140 Pro Trp Leu Val Glu Arg Glu Ile His Gln Glu Thr His Pro Asp Ser 145 150 155 160 Glu Thr Ala Phe Glu Ile Lys Ser Ser Val 165 170 <210> 211 <211> 338 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 211 Gly Gly Arg Pro Ala Leu Glu Ser Ile Val Ala Gln Leu Ser Arg Pro 1 5 10 15 Asp Pro Ala Leu Ala Ala Leu Thr Asn Asp His Leu Val Ala Leu Ala 20 25 30 Cys Leu Gly Gly Arg Pro Ala Leu Asp Ala Val Lys Lys Gly Leu Pro 35 40 45 His Ala Pro Ala Leu Ile Lys Arg Thr Asn Arg Arg Ile Pro Glu Arg 50 55 60 Thr Ser His Arg Val Ala Asp His Ala Gln Val Val Arg Val Leu Gly 65 70 75 80 Phe Phe Gln Cys His Ser His Pro Ala Gln Ala Phe Asp Asp Ala Met 85 90 95 Thr Gln Phe Gly Met Ser Arg His Gly Leu Leu Gln Leu Phe Arg Arg 100 105 110 Val Gly Val Thr Glu Leu Glu Ala Arg Ser Gly Thr Leu Pro Pro Ala 115 120 125 Ser Gln Arg Trp Asp Arg Ile Leu Gln Ala Ser Gly Met Lys Arg Ala 130 135 140 Lys Pro Ser Pro Thr Ser Thr Gln Thr Pro Asp Gln Ala Ser Leu His 145 150 155 160 Ala Phe Ala Asp Ser Leu Glu Arg Asp Leu Asp Ala Pro Ser Pro Thr 165 170 175 His Glu Gly Asp Gln Arg Arg Ala Ser Ser Arg Lys Arg Ser Arg Ser 180 185 190 Asp Arg Ala Val Thr Gly Pro 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Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 227 cagcagcagc agcagcagca gcagcagcag cagcagcagc agcagcagca gcagcagcag 60 cagcagcagc agcagcagca gcagcagcag cagcagcagc agcag 105 <210> 228 <211> 117 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <220> <221> misc_feature <222> (1)..(117) <223> This sequence may encompass 36-39 repeating "CAG" units <400> 228 cagcagcagc agcagcagca gcagcagcag cagcagcagc agcagcagca gcagcagcag 60 cagcagcagc agcagcagca gcagcagcag cagcagcagc agcagcagca gcagcag 117 <210> 229 <211> 180 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 229 cagcagcagc agcagcagca gcagcagcag cagcagcagc agcagcagca gcagcagcag 60 cagcagcagc agcagcagca gcagcagcag cagcagcagc agcagcagca gcagcagcag 120 cagcagcagc agcagcagca gcagcagcag cagcagcagc agcagcagca gcagcagcag 180 <210> 230 <211> 150 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 230 cagcagcagc agcagcagca gcagcagcag cagcagcagc agcagcagca gcagcagcag 60 cagcagcagc agcagcagca gcagcagcag cagcagcagc agcagcagca gcagcagcag 120 cagcagcagc agcagcagca gcagcagcag 150 <210> 231 <211> 240 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 231 cagcagcagc agcagcagca gcagcagcag cagcagcagc agcagcagca gcagcagcag 60 cagcagcagc agcagcagca gcagcagcag cagcagcagc agcagcagca gcagcagcag 120 cagcagcagc agcagcagca gcagcagcag cagcagcagc agcagcagca gcagcagcag 180 cagcagcagc agcagcagca gcagcagcag cagcagcagc agcagcagca gcagcagcag 240 <210> 232 <211> 327 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 232 cagcagcagc agcagcagca gcagcagcag cagcagcagc agcagcagca gcagcagcag 60 cagcagcagc agcagcagca gcagcagcag cagcagcagc agcagcagca gcagcagcag 120 cagcagcagc agcagcagca gcagcagcag cagcagcagc agcagcagca gcagcagcag 180 cagcagcagc agcagcagca gcagcagcag cagcagcagc agcagcagca gcagcagcag 240 cagcagcagc agcagcagca gcagcagcag cagcagcagc agcagcagca gcagcagcag 300 cagcagcagc agcagcagca gcagcag 327 <210> 233 <211> 540 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 233 cagcagcagc agcagcagca gcagcagcag cagcagcagc agcagcagca gcagcagcag 60 cagcagcagc agcagcagca gcagcagcag cagcagcagc agcagcagca gcagcagcag 120 cagcagcagc agcagcagca gcagcagcag cagcagcagc agcagcagca gcagcagcag 180 cagcagcagc agcagcagca gcagcagcag cagcagcagc agcagcagca gcagcagcag 240 cagcagcagc agcagcagca gcagcagcag cagcagcagc agcagcagca gcagcagcag 300 cagcagcagc agcagcagca gcagcagcag cagcagcagc agcagcagca gcagcagcag 360 cagcagcagc agcagcagca gcagcagcag cagcagcagc agcagcagca gcagcagcag 420 cagcagcagc agcagcagca gcagcagcag cagcagcagc agcagcagca gcagcagcag 480 cagcagcagc agcagcagca gcagcagcag cagcagcagc agcagcagca gcagcagcag 540 <210> 234 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 234 cagcagcagc agcagcagca gcagcagcag 30 <210> 235 <211> 141 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 235 cagcagcagc agcagcagca gcagcagcag cagcagcagc agcagcagca gcagcagcag 60 cagcagcagc agcagcagca gcagcagcag cagcagcagc agcagcagca gcagcagcag 120 cagcagcagc agcagcagca g 141 <210> 236 <211> 51 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 236 cagcagcagc agcagcagca gcagcagcag cagcagcagc agcagcagca g 51 <210> 237 <211> 69 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 237 cagcagcagc agcagcagca gcagcagcag cagcagcagc agcagcagca gcagcagcag 60 cagcagcag 69 <210> 238 <211> 333 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 238 cagcagcagc agcagcagca gcagcagcag cagcagcagc agcagcagca gcagcagcag 60 cagcagcagc agcagcagca gcagcagcag cagcagcagc agcagcagca gcagcagcag 120 cagcagcagc agcagcagca gcagcagcag cagcagcagc agcagcagca gcagcagcag 180 cagcagcagc agcagcagca gcagcagcag cagcagcagc agcagcagca gcagcagcag 240 cagcagcagc agcagcagca gcagcagcag cagcagcagc agcagcagca gcagcagcag 300 cagcagcagc agcagcagca gcagcagcag cag 333 <210> 239 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 239 cagcagcagc agcagcagca gcagcagcag cagcagcagc agcag 45 <210> 240 <211> 210 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 240 cagcagcagc agcagcagca gcagcagcag cagcagcagc agcagcagca gcagcagcag 60 cagcagcagc agcagcagca gcagcagcag cagcagcagc agcagcagca gcagcagcag 120 cagcagcagc agcagcagca gcagcagcag cagcagcagc agcagcagca gcagcagcag 180 cagcagcagc agcagcagca gcagcagcag 210 <210> 241 <211> 300 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 241 cagcagcagc agcagcagca gcagcagcag cagcagcagc agcagcagca gcagcagcag 60 cagcagcagc agcagcagca gcagcagcag cagcagcagc agcagcagca gcagcagcag 120 cagcagcagc agcagcagca gcagcagcag cagcagcagc agcagcagca gcagcagcag 180 cagcagcagc agcagcagca gcagcagcag cagcagcagc agcagcagca gcagcagcag 240 cagcagcagc agcagcagca gcagcagcag cagcagcagc agcagcagca gcagcagcag 300 <210> 242 <211> 201 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 242 cagcagcagc agcagcagca gcagcagcag cagcagcagc agcagcagca gcagcagcag 60 cagcagcagc agcagcagca gcagcagcag cagcagcagc agcagcagca gcagcagcag 120 cagcagcagc agcagcagca gcagcagcag cagcagcagc agcagcagca gcagcagcag 180 cagcagcagc agcagcagca g 201 <210> 243 <211> 135 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 243 cagcagcagc agcagcagca gcagcagcag cagcagcagc agcagcagca gcagcagcag 60 cagcagcagc agcagcagca gcagcagcag cagcagcagc agcagcagca gcagcagcag 120 cagcagcagc agcag 135 <210> 244 <211> 132 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 244 cagcagcagc agcagcagca gcagcagcag cagcagcagc agcagcagca gcagcagcag 60 cagcagcagc agcagcagca gcagcagcag cagcagcagc agcagcagca gcagcagcag 120 cagcagcagc ag 132 <210> 245 <211> 54 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 245 cagcagcagc agcagcagca gcagcagcag cagcagcagc agcagcagca gcag 54 <210> 246 <211> 207 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 246 cagcagcagc agcagcagca gcagcagcag cagcagcagc agcagcagca gcagcagcag 60 cagcagcagc agcagcagca gcagcagcag cagcagcagc agcagcagca gcagcagcag 120 cagcagcagc agcagcagca gcagcagcag cagcagcagc agcagcagca gcagcagcag 180 cagcagcagc agcagcagca gcagcag 207 <210> 247 <211> 144 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 247 cagcagcagc agcagcagca gcagcagcag cagcagcagc agcagcagca gcagcagcag 60 cagcagcagc agcagcagca gcagcagcag cagcagcagc agcagcagca gcagcagcag 120 cagcagcagc agcagcagca gcag 144 <210> 248 <211> 60 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 248 cagcagcagc agcagcagca gcagcagcag cagcagcagc agcagcagca gcagcagcag 60 <210> 249 <211> 123 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 249 cagcagcagc agcagcagca gcagcagcag cagcagcagc agcagcagca gcagcagcag 60 cagcagcagc agcagcagca gcagcagcag cagcagcagc agcagcagca gcagcagcag 120 cag 123 <210> 250 <211> 9 <212> PRT <213> Unknown <220> <223> Description of Unknown: Unknown family peptide <400> 250 Leu Ala Gly Leu Ile Asp Ala Asp Gly 1 5 <210> 251 <211> 48 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 251 cagcagcagc agcagcagca gcagcagcag cagcagcagc agcagcag 48 <210> 252 <211> 360 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 252 cagcagcagc agcagcagca gcagcagcag cagcagcagc agcagcagca gcagcagcag 60 cagcagcagc agcagcagca gcagcagcag cagcagcagc agcagcagca gcagcagcag 120 cagcagcagc agcagcagca gcagcagcag cagcagcagc agcagcagca gcagcagcag 180 cagcagcagc agcagcagca gcagcagcag cagcagcagc agcagcagca gcagcagcag 240 cagcagcagc agcagcagca gcagcagcag cagcagcagc agcagcagca gcagcagcag 300 cagcagcagc agcagcagca gcagcagcag cagcagcagc agcagcagca gcagcagcag 360 <210> 253 <211> 75 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 253 cagcagcagc agcagcagca gcagcagcag cagcagcagc agcagcagca gcagcagcag 60 cagcagcagc agcag 75 <210> 254 <211> 108 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 254 cagcagcagc agcagcagca gcagcagcag cagcagcagc agcagcagca gcagcagcag 60 cagcagcagc agcagcagca gcagcagcag cagcagcagc agcagcag 108 <210> 255 <211> 117 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 255 cagcagcagc agcagcagca gcagcagcag cagcagcagc agcagcagca gcagcagcag 60 cagcagcagc agcagcagca gcagcagcag cagcagcagc agcagcagca gcagcag 117 <210> 256 <211> 72 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 256 cagcagcagc agcagcagca gcagcagcag cagcagcagc agcagcagca gcagcagcag 60 cagcagcagc ag 72 <210> 257 <211> 126 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 257 cagcagcagc agcagcagca gcagcagcag cagcagcagc agcagcagca gcagcagcag 60 cagcagcagc agcagcagca gcagcagcag cagcagcagc agcagcagca gcagcagcag 120 cagcag 126 <210> 258 <211> 87 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 258 cagcagcagc agcagcagca gcagcagcag cagcagcagc agcagcagca gcagcagcag 60 cagcagcagc agcagcagca gcagcag 87 <210> 259 <211> 120 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 259 cagcagcagc agcagcagca gcagcagcag cagcagcagc agcagcagca gcagcagcag 60 cagcagcagc agcagcagca gcagcagcag cagcagcagc agcagcagca gcagcagcag 120 <210> 260 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 260 gcagcagcag cagcagcagc 20 <210> 261 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 261 cagcagcagc agcagcagca g 21

Claims (21)

1. Htt 유전자에 결합하는 비자연적으로 생기는 아연 핑거 단백질로서, 상기 아연 핑거 단백질은 F1 내지 F5 및 F1 내지 F6의 순서로 5 또는 6개의 아연 핑거 도메인을 포함하되, 상기 F1 내지 F5 및 F1 내지 F6는 다음의:
   (i) F1: RSDNLSE (SEQ ID NO:60);
   F2: KRCNLRC (SEQ ID NO:61);
   F3: QSGDLTR (SEQ ID NO:18);
   F4: QSGDLTR (SEQ ID NO:18);
   F5: RSDNLSE (SEQ ID NO:60); 및
   F6: KRCNLRC (SEQ ID NO:61),
   (ii) F1: RSDNLSE (SEQ ID NO:60);
   F2: KRCNLRC (SEQ ID NO:61);
   F3: QSSDLSR (SEQ ID NO:31);
   F4: QWSTRKR (SEQ ID NO:63);
   F5: QSSDLSR (SEQ ID NO:31); 및
   F6: QWSTRKR (SEQ ID NO:63),
   (iii) F1: RSDNLSE (SEQ ID NO:60);
   F2: KRCNLRC (SEQ ID NO:61);
   F3: RSDNLSE (SEQ ID NO:60);
   F4: KRCNLRC (SEQ ID NO:61);
   F5: RSDNLSE (SEQ ID NO:60); 및
   F6: KRCNLRC (SEQ ID NO:61),
   (iv) F1: RSDNLSE (SEQ ID NO:60);
   F2: KRCNLRC (SEQ ID NO:61);
   F3: QSSDLSR (SEQ ID NO:31);
   F4: QWSTRKR (SEQ ID NO:63); 및
   F5: QSGDLTR (SEQ ID NO:18),
   (v) F1: QSSDLSR (SEQ ID NO:31);
   F2: QWSTRKR (SEQ ID NO:63);
   F3: QSSDLSR (SEQ ID NO:31);
   F4: QWSTRKR (SEQ ID NO:63); 및
   F5: QSGDLTR (SEQ ID NO:18);
   (vi) F1: QSGDLTR (SEQ ID NO:18);
   F2: QSSDLSR (SEQ ID NO:31);
   F3: QWSTRKR (SEQ ID NO:63);
   F4: QSSDLSR (SEQ ID NO:31); 및
   F5: QWSTRKR (SEQ ID NO:63), 또는
   (vii) F1: RSDNLSE (SEQ ID NO:60);
   F2: KRCNLRC (SEQ ID NO:61);
   F3: QSGDLTR (SEQ ID NO:18);
   F4: QSSDLSR (SEQ ID NO:31); 및
   F5: QWSTRKR (SEQ ID NO:63)
   인 아연 핑거 단백질.
2. 제1항에 있어서, 상기 아연 핑거 단백질은 Htt 유전자의 CAG 반복체 영역 내의 표적 부위에 결합하는 것을 특징으로 하는 아연 핑거 단백질.
3. 제2항에 있어서, 표적 부위는 서열 GCAGCAGCAGCAGCA을 포함하는 것을 특징으로 하는 아연 핑거 단백질.
4. 제1항에 있어서, 상기 아연 핑거 단백질은 F1 내지 F6을 포함하되, F1 내지 F6는 다음의:
   F1: RSDNLSE (SEQ ID NO:60);
   F2: KRCNLRC (SEQ ID NO:61);
   F3: QSGDLTR (SEQ ID NO:18);
   F4: QSGDLTR (SEQ ID NO:18);
   F5: RSDNLSE (SEQ ID NO:60); 및
   F6: KRCNLRC (SEQ ID NO:61)
   인 것을 특징으로 하는 아연 핑거 단백질.
5. 제1항 내지 4항 중 어느 한 항에 있어서, DNA에 결합될 때 아연 핑거 단백질을 멀티머화시키는 다이머화 도메인을 더 포함하는, 아연 핑거 단백질.
6. 제1항의 아연 핑거 단백질 및 기능성 도메인을 포함하는 융합 단백질로서, 상기 기능성 도메인은 전사 활성화 도메인, 전사 억제 도메인 및 뉴클레아제 도메인으로 이루어진 군으로부터 선택된 것인, 융합 단백질.
7. 제1항의 하나 이상의 아연 핑거 단백질을 암호화하는, 폴리뉴클레오타이드.
8. 제6항에 따른 융합 단백질을 암호화하는, 폴리뉴클레오타이드.
9. 제1항의 하나 이상의 아연 핑거 단백질, 제6항에 따른 융합 단백질 또는 제7항 내지 제8항에 따른 폴리뉴클레오타이드를 포함하는, 숙주 세포.
10. 제1항의 하나 이상의 아연 핑거 단백질, 제6항에 따른 융합 단백질 또는 제7항 내지 제8항에 따른 폴리뉴클레오타이드를 포함하는, 헌팅턴병(HD)을 치료하는데 사용하기 위한 약제학적 조성물.
11. 헌팅턴병의 연구를 위한 모델 시스템을 만드는 방법으로서, 상기 방법은 제1항에 따른 아연 핑거 단백질, 제6항에 따른 융합 단백질 또는 제7항 내지 제8항에 따른 폴리뉴클레오타이드를 사용하여 Htt 유전자를 변형시키는 단계를 포함하는, 헌팅턴병의 연구를 위한 모델 시스템을 만드는 방법.
12. 제11항에 있어서, 상기 Htt 유전자는 하나 이상의 돌연변이체 대립유전자를 포함하도록 변형된 것인, 헌팅턴병의 연구를 위한 모델 시스템을 만드는 방법.
13. 제12항에 있어서, 상기 돌연변이체 대립유전자는 확장된 트라이뉴클레오타이드 반복체를 포함하는 것인, 헌팅턴병의 연구를 위한 모델 시스템을 만드는 방법.
14. 제11항에 있어서, 세포는 배아 줄기 세포를 포함하는 것인, 헌팅턴병의 연구를 위한 모델 시스템을 만드는 방법.
15. 제1항에 따른 아연 핑거 단백질, 제6항에 따른 융합 단백질 또는 제7항 내지 제8항에 따른 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 세포.
16. 제15항에 있어서, 세포에서 Htt 발현이 억제된 세포.
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