BR112020005569A2 - rna de interferência (rnai) variante - Google Patents

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Catherine O'Riordan
Adam Palermo
Brenda RICHARDS
Lisa M. STANEK
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Abstract

Fornecidas aqui são moléculas de RNAi para tratar doença de Huntington. Ainda fornecidos aqui são cassetes de expressão, veto-res (por exemplo, vetores de rAAV, adenovirais recombinantes, lentivirais recombinantes, e de HSV recombinantes), células, partículas virais, e composições farmacêuticas contendo o RNAi. Ainda mais fornecidos aqui são métodos e kits relacionados ao uso do RNAi, por exemplo, para tratar doença de Huntington.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "RNA DE INTERFERÊNCIA (RNAi) VARIANTE".
REFERÊNCIA CRUZADA AOS PEDIDOS RELACIONADOS
[001] Este pedido reivindica o benefício de prioridade do Pedi- do Provisório dos EUA No 62/561.843, depositado em 22 de setembro de 2017, que é, por meio deste, incorporado a título de referência em sua totalidade.
APRESENTAÇÃO DA LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS EM ARQUIVO DE TEXTO ASCII
[002] O conteúdo da apresentação seguinte em arquivo de texto ASCII é incorporado aqui a título de referência em sua totalidade: uma forma legível por computador (CRF) da Listagem de Sequências (no- me do arquivo: 159792014740SeqList.txt, data registrada: 20 de se- tembro de 2018, tamanho: 19 KB).
CAMPO DA INVENÇÃO
[003] A presente invenção refere-se a moléculas de RNAi varian- te. Em alguns aspectos, a invenção refere-se a RNAi variante para tra- tar doença de Huntington.
FUNDAMENTOS
[004] RNA de interferência (RNAi) mostrou ser uma ferramenta útil para silenciamento gênico em pesquisa básica da função gênica e mostra grande potencial como um agente terapêutico para suprimir genes associados com o desenvolvimento de várias doenças. Em na- tureza, a regulação de gene por RNAi ocorre através de RNAs peque- nos conhecidos como microRNAs (miRNAs) (Ambros, (2004) Nature 431:350 - 355; Krol et al., (2010) Nat. Rev. Genet. 11:597 - 610). Mi- croRNAs emergiram como poderosos reguladores de diversos proces- sos celulares, e quando liberados por vetores virais, miRNAs artificiais são continuamente expressados, resultando em uma supressão robus- ta e sustentada de genes alvos. A elucidação dos mecanismos envol-
vidos no processamento de miRNA permitiu aos cientistas cooptar o mecanismo de RNAi celular endógeno e direcionar a degradação de um produto genético alvo com o uso de miRNAs artificiais (consultar, para exemplo, Pub. de PG dos EUA 2014/0163214 e Davidson et al., (2012) Cell 150:873 - 875).
[005] Um obstáculo para o desenvolvimento clínico de RNAi é o potencial para o silenciamento fora do alvo onde a região de semente do RNAi (tipicamente nucleotídeos 1 a 7 ou 1 a 8) emparelha com se- quências em mRNAs não alvos na região não traduzida 3’ (UTR) le- vando à desestabilização de transcrito. Tentativas para reduzir o silen- ciamento fora do alvo incluem o uso de algoritmos para identificar se- quências de semente candidatas com especificidade alta para o mRNA alvo com potencial mínimo fora do alvo (Boudreau RL et al., (2012) Nucl. Acids Res. 41(1):e9) e colocar uma protuberância interna na região guia do RNAi (Terasawa et al., (2011) Journal of nucleic acids 2011:131579).
[006] RNAi foi investigado como um produto terapêutico para tra- tar doença de Huntington (HD). HD é uma doença neurodegenerativa hereditária causada por uma expansão da repetição de CAG no éxon 1 do gene huntingtina (HTT). A extensão resultante do trato de poliglu- tamina na região N-terminal confere um ganho de função tóxica à pro- teína huntingtina mutante (mHtt). O potencial de silenciamento da ex- pressão de mHtt como uma estratégia terapêutica para HD foi primeiro demonstrada em um modelo de camundongo condicional da doença (Yamamoto et al., (2000) Cell 101:57 - 66.). Quando a expressão de mHtt foi induzida nestes camundongos, aberrações patológicas e comportamentais tornam-se evidentes. A repressão mediada por tetra- ciclina subsequente do transgene de mHtt reverteu estas anormalida- des, indicando que uma redução de níveis de mHtt permitiu que me- canismos de depuração proteica dentro de neurônios normalizassem mudanças induzidas por mHtt. Consequentemente, estratégias tera- pêuticas que reduzem níveis de mHtt podem parar potencialmente a progressão da doença e aliviar os sintomas de HD. miRNAs que alve- jam Htt são fornecidos em WO 2016/130589, incorporado aqui em sua totalidade.
[007] Todas as referências citadas aqui, incluindo pedidos e pu- blicações de patentes, são incorporados a título de referência em sua totalidade.
BREVE SUMÁRIO DA INVENÇÃO
[008] Em alguns aspectos, a invenção fornece um RNAi compre- endendo uma primeira fita e uma segunda fita, em que a) a primeira fita e a segunda fita formam um dúplex; b) a primeira fita compreende uma região guia, em que a região guia compreende a sequência de ácido nucleico 5’-UGGCCGUCCAUCUUGGACCCG-3’ (SEQ ID NO: 1) ou 5’-AGUCGGUGUGGUUGACAAGCA-3’ (SEQ ID NO: 7); e c) a se- gunda fita compreende uma região não guia. Em algumas modalida- des, o nucleico a região guia compreende a sequência de ácido nu- cleico 5’-UGGCCGUCCAUCUUGGACCCG-3’ (SEQ ID NO: 1) e a re- gião não guia compreende a sequência 5’-CGGGUCCAAGA UGGA- CGGCCA-3’ (SEQ ID NO: 2). Em algumas modalidades, a primeira fita compreende uma sequência de ácido nucleico tendo cerca de 90 % de identidade à SEQ ID NO: 1 ou cerca de 90 % de identidade à SEQ ID NO: 2. Em outras modalidades, o nucleico a região guia compreende a sequência de ácido nucleico 5’-AGUCGGUGUGGUUGACAAGCA-3’ (SEQ ID NO: 7) e a região não guia compreende a sequência 5’- UGCUUGUCAACCACACCGACU-3’ (SEQ ID NO: 8). Em algumas modalidades, a segunda fita compreende uma sequência de ácido nu- cleico tendo cerca de 90 % de identidade à SEQ ID NO: 7 ou cerca de 90 % de identidade à SEQ ID NO: 8. Em algumas modalidades das modalidades acima, a primeira fita e a segunda fita são ligadas por meio de ligante de RNA capaz de formar uma estrutura de alça. Em algumas modalidades, o ligante de RNA compreende de 4 a 50 nucle- otídeos. Em algumas modalidades, a estrutura de alça compreende 4 a 20 nucleotídeos. Em algumas modalidades, o RNAi compreende 5’ a 3’ da segunda fita, do ligante de RNA, e da primeira fita. Em algumas modalidades, o RNAi compreende 5’ a 3’ da primeira fita, do ligante de RNA, e da segunda fita. Em algumas modalidades, o RNAi compreen- de a sequência de ácido nucleico da SEQ ID NO: 4 ou SEQ ID NO: 10. Em algumas modalidades, o RNAi compreende uma sequência de nu- cleotídeo de cerca de 90 % idêntica à sequência de nucleotídeo da SEQ ID NO: 4 ou SEQ ID NO: 10. Em algumas modalidades, o RNAi é um RNA interferente pequeno (siRNA), um microRNA (miRNA), ou um RNA pequeno em grampo (shRNA). Em algumas modalidades, o RNAi alveja o RNA que codifica um polipeptídeo associado com doença de Huntington. Em algumas modalidades, o polipeptídeo é huntingtina. Em algumas modalidades, a huntingtina compreende uma mutação associada com doença de Huntington.
[009] Em algumas modalidades dos aspectos e modalidades acima, a invenção fornece uma construção de expressão compreen- dendo o ácido nucleico que codifica o RNAi de qualquer uma das rei- vindicações 1 a 16. Em algumas modalidades, o ácido nucleico que codifica o RNAi compreende um andaime de miRNA. Em algumas modalidades, o ácido nucleico que codifica o RNAi é operavelmente ligado a um promotor. Em algumas modalidades, o promotor é seleci- onado de um promotor inicial imediato de citomegalovírus (CMV), um LTR de RSV, um LTR de MoMLV, um promotor de fosfoglicerato qui- nase-1 (PGK), um promotor de vírus símio 40 (SV40), um promotor de CK6, um promotor de transtirretina (TTR), um promotor de TK, um promotor responsivo à tetraciclina (TRE), um promotor de HBV, um promotor de hAAT, um promotor de LSP, um promotor específico de fígado quimérico (LSP), um promotor de E2F, um promotor de telome- rase (hTERT); um promotor de realçador de citomegalovírus/promotor de beta-actina de galinha/β-globina de coelho (CAG), um promotor de promotor alfa de fator de alongamento 1 (EFl-alfa), um promotor de β- glicuronidase humano, um promotor de β-actina de galinha (CBA), um promotor de LTR do vírus do sarcoma de Rous retroviral (RSV), um promotor de di-hidrofolato redutase, e um promotor de 13-actina. Em algumas modalidades, a construção de expressão compreende ainda um sinal de poliadenilação. Em algumas modalidades, o sinal de poli- adenilação é um sinal de poliadenilação de hormônio de crescimento bovino, um sinal de poliadenilação de SV40, ou um pA de TK de HSV.
[0010] Em algumas modalidades, a invenção fornece um vetor compreendendo a construção de expressão de qualquer uma das mo- dalidades descritas aqui. Em algumas modalidades, o vetor é um vetor de vírus adeno-associado recombinante (rAAV), um vetor adenoviral recombinante, um vetor lentiviral recombinante ou um vetor do vírus do herpes simples (HSV) recombinante. Em algumas modalidades, o ve- tor é um vetor adenoviral recombinante. Em algumas modalidades, o vetor adenoviral recombinante é derivado do sorotipo de Adenovírus 2, 1, 5, 6, 19, 3, 11, 7, 14, 16, 21, 12, 18, 31, 8, 9, 10, 13, 15, 17, 19, 20, 22, 23, 24-30, 37, 40, 41, AdHu2, AdHu 3, AdHu4, AdHu24, AdHu26, AdHu34, AdHu35, AdHu36, AdHu37, AdHu41, AdHu48, AdHu49, Ad- Hu50, AdC6, AdC7, AdC69, Ad bovino tipo 3, Ad canino tipo 2, Ad ovi- no, ou Ad porcino tipo 3. Em algumas modalidades, o vetor adenoviral recombinante é derivado do sorotipo adenoviral 2 ou uma variante do sorotipo adenoviral 5. Em algumas modalidades, o vetor é um vetor lentiviral recombinante. Em algumas modalidades, o vetor lentiviral re- combinante é derivado de um lentivírus pseudotipado com vírus da estomatite vesicular (VSV), vírus da coriomeningite linfocítica (LCMV), vírus Ross river (RRV), vírus Ebola, vírus Marburg, vírus Mokala, vírus da Raiva, RD114 ou variantes nestes. Em algumas modalidades, o vetor é um vetor de rHSV. Em algumas modalidades, o vetor de rHSV é derivado de rHSV-1 ou rHSV-2.
[0011] Em algumas modalidades dos aspectos e modalidades acima, o vetor é um vetor de rAAV. Em algumas modalidades, a cons- trução de expressão é flanqueada por uma ou mais sequências de re- petição terminal invertida (ITR) de AAV. Em algumas modalidades, a construção de expressão é flanqueada por duas ITRs de AAV. Em al- gumas modalidades, as ITRs de AAV são ITRs de AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAVrh8, AAVrh8R, AAV9, AAV10, AAVrh10, AAV11, AAV12, AAV2R471A, AAV DJ, um sorotipo de AAV de cabra, AAV bovino, ou AAV de camundongo. Em algumas modalidades, as ITRs de AAV são ITRs de AAV2. Em algumas moda- lidades, o vetor compreende ainda um ácido nucleico de preenchimen- to. Em algumas modalidades, o ácido nucleico de preenchimento está localizado a montante ou a jusante do ácido nucleico que codifica o RNAi. Em algumas modalidades, o vetor é um vetor de rAAV auto- complementar. Em algumas modalidades, o vetor compreende a pri- meira sequência de ácido nucleico que codifica o RNAi e uma segunda sequência de ácido nucleico que codifica um complemento do RNAi, em que a primeira sequência de ácido nucleico pode formar pares de base intrafita com a segunda sequência de ácido nucleico ao longo da maior parte ou todo seu comprimento. Em algumas modalidades, a primeira sequência de ácido nucleico e a segunda sequência de ácido nucleico são ligadas por uma ITR de AAV mutado, em que a ITR de AAV mutado compreende uma deleção da região D e compreende uma mutação da sequência de resolução terminal. Em algumas moda- lidades, a invenção fornece uma célula compreendendo qualquer um dos vetores (por exemplo, vetores de rAAV) descritos aqui.
[0012] Em algumas modalidades dos aspectos e modalidades acima, a invenção fornece uma partícula viral compreendendo qual- quer um dos vetores descritos aqui, em que a partícula viral é uma partícula de AAV encapsidando o vetor de rAAV, uma partícula adeno- viral encapsidando o vetor adenoviral recombinante, uma partícula len- tiviral encapsidando o vetor lentiviral recombinante ou uma partícula de HSV encapsidando o vetor de HSV recombinante. Em algumas moda- lidades, a partícula viral é uma partícula adenoviral encapsidando o vetor adenoviral recombinante. Em algumas modalidades, a partícula adenoviral compreende um capsídeo do sorotipo de Adenovírus 2, 1, 5, 6, 19, 3, 11, 7, 14, 16, 21, 12, 18, 31, 8, 9, 10, 13, 15, 17, 19, 20, 22, 23, 24-30, 37, 40, 41, AdHu2, AdHu 3, AdHu4, AdHu24, AdHu26, Ad- Hu34, AdHu35, AdHu36, AdHu37, AdHu41, AdHu48, AdHu49, Ad- Hu50, AdC6, AdC7, AdC69, Ad bovino tipo 3, Ad canino tipo 2, Ad ovi- no, ou Ad porcino tipo 3. Em algumas modalidades, a partícula adeno- viral compreende um capsídeo de sorotipo adenoviral 2 ou uma varian- te de um capsídeo de sorotipo adenoviral 5. Em algumas modalidades, a partícula viral é uma partícula lentiviral encapsidando o vetor lentivi- ral recombinante. Em algumas modalidades, a partícula lentiviral com- preende um capsídeo pseudotipado com vírus da estomatite vesicular (VSV), vírus da coriomeningite linfocítica (LCMV), vírus Ross river (RRV), vírus Ebola, vírus Marburg, vírus Mokala, vírus da Raiva, RD114 ou variantes nestes. Em algumas modalidades, a partícula viral é uma partícula de HSV. Em algumas modalidades, a partícula de HSV é uma partícula de rHSV-1 ou uma partícula de rHSV-2.
[0013] Em algumas modalidades, a invenção fornece uma partícu- la de AAV recombinante compreendendo qualquer um dos vetores de rAAV descritos aqui. Em algumas modalidades, a partícula de AAV viral compreende um AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAVrh8, AAVrh8R, AAV9, AAV10, AAVrh10, AAV11, AAV12, AAV2R471A, AAV2/2-7m8, AAV DJ, AAV2 N587A, AAV2 E548A,
AAV2 N708A, AAV V708K, um capsídeo de AAV de cabra, AAV1/AAV2 quimérico, AAV bovino, ou AAV de camundongo, capsí- deo de rAAV2-HBKO (consultar WO 2015/168666, que é incorporado aqui a título de referência). Em algumas modalidades, a ITR e o capsí- deo da partícula viral de rAAV são derivados do mesmo sorotipo de AAV. Em algumas modalidades, a ITR e o capsídeo da partícula viral de rAAV são derivados de diferentes sorotipos de AAV. Em algumas modalidades, a ITR é derivada de AAV2 e o capsídeo da partícula de rAAV é derivado de AAV1. Em algumas modalidades, o vetor de rAAV compreende 5’ a 3’ de uma ITR de AAV2, de um promotor, ácido nu- cleico que codifica o RNAi, de um sinal de poliadenilação, e de uma ITR de AAV2. Em algumas modalidades, o promotor é um promotor de CBA. Em algumas modalidades, o sinal de poliadenilação é um sinal de poliadenilação de hormônio de crescimento bovino. Em algumas modalidades, o vetor de rAAV compreende 5’ a 3’ de todos ou uma porção (por exemplo, uma porção funcional) de uma ITR de AAV2, o promotor de CBA, um íntron (por exemplo, um íntron quimérico), ácido nucleico que codifica o RNAi, um sinal de poliadenilação de hormônio de crescimento bovino, e uma ITR de AAV2. Em algumas modalida- des, o vetor compreende ainda um ácido nucleico de preenchimento. Em algumas modalidades, o ácido nucleico de preenchimento com- preende ainda o ácido nucleico que codifica um polipeptídeo repórter (por exemplo, proteína fluorescente verde (GFP)). Em algumas moda- lidades, o ácido nucleico de preenchimento está localizado a montante ou a jusante do ácido nucleico que codifica o RNAi.
[0014] Em algumas modalidades, a invenção fornece uma compo- sição (por exemplo, uma composição farmacêutica) compreendendo qualquer uma das partículas virais (por exemplo, partículas de rAAV) descritas aqui. Em algumas modalidades, a composição compreende ainda um veículo farmaceuticamente aceitável.
[0015] Em alguns aspectos, a invenção fornece um kit compreen- dendo qualquer um do RNAi descrito aqui. Em algumas modalidades, o kit compreende qualquer uma das partículas virais (por exemplo, partículas de rAAV) descritas aqui. Em algumas modalidades, o kit compreende qualquer uma das composições descritas aqui. Em algu- mas modalidades, o kit compreende ainda instruções para o uso.
[0016] Em alguns aspectos, a invenção fornece métodos para tra- tar doença de Huntington em um mamífero compreendendo adminis- trar ao mamífero um RNAi compreendendo uma primeira fita compre- endendo um primeiro ácido nucleico compreendendo a sequência 5’- UGGCCGUCCAUCUUGGACCCG-3’ (SEQ ID NO: 1) e uma segunda fita compreendendo um segundo ácido nucleico compreendendo a se- quência 5’-CGGGUCCAAGAUGGACGGCCA-3’ (SEQ ID NO: 2) ou uma primeira fita compreendendo um primeiro ácido nucleico compre- endendo a sequência 5’-AGUCGGUGUGGUUGACAAGCA-3’ (SEQ ID NO: 7) e uma segunda fita compreendendo um segundo ácido nuclei- co compreendendo a sequência 5’-UGCUUGUCAACCACACCGACU- 3’ (SEQ ID NO: 8). Em alguns aspectos, a invenção fornece métodos para inibir a expressão de htt em um mamífero com doença de Hun- tington compreendendo administrar ao mamífero um RNAi compreen- dendo uma primeira fita compreendendo um primeiro ácido nucleico compreendendo a sequência 5’-UGGCCGUCCAUCUUGGACCCG-3’ (SEQ ID NO: 1) e uma segunda fita compreendendo um segundo áci- do nucleico compreendendo a sequência 5’-CGGGUCCAAGAUGGAC GGCCA-3’ (SEQ ID NO: 2) ou uma primeira fita compreendendo um primeiro ácido nucleico compreendendo a sequência 5’-AGUCGGU GUGGUUGACAAGCA-3’ (SEQ ID NO: 7) e uma segunda fita compre- endendo um segundo ácido nucleico compreendendo a sequência 5’- UGCUUGUCAACCACACCGACU-3’ (SEQ ID NO: 10). Em alguns as- pectos, a invenção fornece métodos para inibir o acúmulo de htt em uma célula de um mamífero com doença de Huntington compreenden- do administrar ao mamífero um RNAi compreendendo uma primeira fita compreendendo um primeiro ácido nucleico compreendendo a se- quência 5’-UGGCCGUCCAUCUUGGACCCG-3’ (SEQ ID NO: 1) e uma segunda fita compreendendo um segundo ácido nucleico com- preendendo a sequência 5’-CGGGUCCAAGAUGGACGGCCA-3’ (SEQ ID NO: 2) ou uma primeira fita compreendendo um primeiro ácido nu- cleico compreendendo a sequência 5’-AGUCGGUGUGGUUGACAA GCA-3’ (SEQ ID NO: 7) e uma segunda fita compreendendo um se- gundo ácido nucleico compreendendo a sequência 5’-UGCUUGUC AACCACACCGACU-3’ (SEQ ID NO: 8).
[0017] Em algumas modalidades dos métodos acima, a primeira fita compreende uma sequência de ácido nucleico tendo cerca de 90 % de identidade a SEQ ID NO: 1 ou cerca de 90 % de identidade a SEQ ID NO: 7. Em algumas modalidades, a segunda fita compreende uma sequência de ácido nucleico tendo cerca de 90 % de identidade a SEQ ID NO: 2 ou cerca de 90 % de identidade a SEQ ID NO: 8. Em algumas modalidades, a primeira fita e a segunda fita são ligadas por meio de ligante de RNA capaz de formar uma estrutura de alça. Em algumas modalidades, o ligante de RNA compreende de 4 a 50 nucle- otídeos. Em algumas modalidades, a estrutura de alça compreende 4 a 20 nucleotídeos. Em algumas modalidades, o RNAi compreende 5’ a 3’ da segunda fita, do ligante de RNA, e da primeira fita. Em algumas modalidades, o RNAi compreende 5’ a 3’ da primeira fita, do ligante de RNA, e da segunda fita. Em algumas modalidades, o RNAi compreen- de a sequência de ácido nucleico da SEQ ID NO: 4 ou SEQ ID NO: 10. Em algumas modalidades, o RNAi compreende uma sequência de nu- cleotídeo de cerca de 90 % idêntica à sequência de nucleotídeo da SEQ ID NO: 4 ou SEQ ID NO: 10.
[0018] Em algumas modalidades dos métodos acima, o RNAi é codificado em uma construção de expressão. Em algumas modalida- des, o ácido nucleico que codifica o RNAi compreende um andaime de miRNA. Em algumas modalidades, o ácido nucleico que codifica o RNAi é operavelmente ligado a um promotor. Em algumas modalida- des, o promotor é capaz de expressar o RNAi no cérebro de um mamí- fero. Em algumas modalidades, o promotor é selecionado de um pro- motor inicial imediato de citomegalovírus (CMV), um LTR de RSV, um LTR de MoMLV, um promotor de fosfoglicerato quinase-1 (PGK), um promotor de vírus símio 40 (SV40), um promotor de CK6, um promotor de transtirretina (TTR), um promotor de TK, um promotor responsivo à tetraciclina (TRE), um promotor de HBV, um promotor de hAAT, um promotor de LSP, um promotor específico de fígado quimérico (LSP), um promotor de E2F, um promotor de telomerase (hTERT); um promo- tor de realçador de citomegalovírus/beta-actina de galinha/β-globina de coelho (CAG), um promotor de promotor alfa de fator de alongamento 1 (EFl-alfa) e um promotor de β-glicuronidase humano. Em algumas modalidades, o promotor é um promotor de β-actina de galinha híbrido. Em algumas modalidades, o ácido nucleico compreende ainda todos ou uma porção (por exemplo, porção funcional) de um íntron e um si- nal de poliadenilação. Em algumas modalidades, o sinal de poliadeni- lação é um sinal de poliadenilação de hormônio de crescimento bovi- no, e o íntron é um íntron quimérico.
[0019] Em algumas modalidades dos métodos acima, o RNAi é codificado em um vetor compreendendo a construção de expressão de qualquer uma das modalidades descritas aqui. Em algumas modalida- des, o vetor é um vetor de vírus adeno-associado recombinante (rA- AV), um vetor adenoviral recombinante, um vetor lentiviral recombinan- te ou um vetor do vírus do herpes simples (HSV) recombinante. Em algumas modalidades, o vetor é um vetor adenoviral recombinante. Em algumas modalidades, o vetor adenoviral recombinante é derivado de sorotipo de Adenovírus 2, 1, 5, 6, 19, 3, 11, 7, 14, 16, 21, 12, 18, 31, 8, 9, 10, 13, 15, 17, 19, 20, 22, 23, 24-30, 37, 40, 41, AdHu2, AdHu 3, AdHu4, AdHu24, AdHu26, AdHu34, AdHu35, AdHu36, AdHu37, AdHu41, AdHu48, AdHu49, AdHu50, AdC6, AdC7, AdC69, Ad bovino tipo 3, Ad canino tipo 2, Ad ovino, ou Ad porcino tipo 3. Em algumas modalidades, o vetor adenoviral recombinante é derivado de sorotipo adenoviral 2 ou uma variante de sorotipo adenoviral 5. Em algumas modalidades, o vetor é um vetor lentiviral recombinante. Em algumas modalidades, o vetor lentiviral recombinante é derivado de um lentiví- rus pseudotipado com vírus da estomatite vesicular (VSV), vírus da coriomeningite linfocítica (LCMV), vírus Ross river (RRV), vírus Ebola, vírus Marburg, vírus Mokala, vírus da Raiva, RD114 ou variantes nes- tes. Em algumas modalidades, o vetor é um vetor de rHSV. Em algu- mas modalidades, o vetor de rHSV é derivado de rHSV-1 ou rHSV-2.
[0020] Em algumas modalidades dos métodos acima, o vetor é um vetor de rAAV. Em algumas modalidades, a construção de expressão é flanqueada por uma ou mais sequências de repetição terminal inver- tida (ITR) de AAV. Em algumas modalidades, a construção de expres- são é flanqueada por duas ITRs de AAV. Em algumas modalidades, as ITRs de AAV são ITRs de AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAVrh8, AAVrh8R, AAV9, AAV10, AAVrh10, AAV11, AAV12, AAV2R471A, AAV DJ, um sorotipo de AAV de cabra, AAV bo- vino, ou AAV de camundongo. Em algumas modalidades, as ITRs de AAV são ITRs de AAV2. Em algumas modalidades, o vetor compreen- de ainda um ácido nucleico de preenchimento. Em algumas modalida- des, o ácido nucleico de preenchimento está localizado entre o promo- tor e o ácido nucleico que codifica o RNAi. Em algumas modalidades, o vetor é um vetor de rAAV autocomplementar. Em algumas modali- dades, o vetor compreende a primeira sequência de ácido nucleico que codifica o RNAi e uma segunda sequência de ácido nucleico que codifica um complemento do RNAi, em que a primeira sequência de ácido nucleico pode formar pares de base intrafita com a segunda se- quência de ácido nucleico ao longo da maior parte ou todo seu com- primento. Em algumas modalidades, a primeira sequência de ácido nucleico e a segunda sequência de ácido nucleico são ligadas por uma ITR de AAV mutado, em que a ITR de AAV mutado compreende uma deleção da região D e compreende uma mutação da sequência de re- solução terminal. Em algumas modalidades, a invenção fornece uma célula compreendendo qualquer um dos vetores (por exemplo, vetores de rAAV) descritos aqui.
[0021] Em algumas modalidades dos métodos acima, o vetor que codifica o RNAi é em uma partícula viral, em que a partícula viral é uma partícula de AAV encapsidando o vetor de rAAV, uma partícula adenoviral encapsidando o vetor adenoviral recombinante, uma partí- cula lentiviral encapsidando o vetor lentiviral recombinante ou uma par- tícula de HSV encapsidando o vetor de HSV recombinante. Em algu- mas modalidades, a partícula viral é uma partícula adenoviral encapsi- dando o vetor adenoviral recombinante. Em algumas modalidades, a partícula adenoviral compreende um capsídeo do sorotipo de Adenoví- rus 2, 1, 5, 6, 19, 3, 11, 7, 14, 16, 21, 12, 18, 31, 8, 9, 10, 13, 15, 17, 19, 20, 22, 23, 24-30, 37, 40, 41, AdHu2, AdHu 3, AdHu4, AdHu24, AdHu26, AdHu34, AdHu35, AdHu36, AdHu37, AdHu41, AdHu48, Ad- Hu49, AdHu50, AdC6, AdC7, AdC69, Ad bovino tipo 3, Ad canino tipo 2, Ad ovino, ou Ad porcino tipo 3. Em algumas modalidades, a partícu- la adenoviral compreende um capsídeo de sorotipo adenoviral 2 ou uma variante de um capsídeo de sorotipo adenoviral 5. Em algumas modalidades, a partícula viral é uma partícula lentiviral encapsidando o vetor lentiviral recombinante. Em algumas modalidades, a partícula lentiviral compreende um capsídeo pseudotipado com vírus da esto- matite vesicular (VSV), vírus da coriomeningite linfocítica (LCMV), ví-
rus Ross river (RRV), vírus Ebola, vírus Marburg, vírus Mokala, vírus da Raiva, RD114 ou variantes nestes. Em algumas modalidades, a partícula viral é uma partícula de HSV. Em algumas modalidades, a partícula de HSV é uma partícula de rHSV-1 ou uma partícula de rHSV-2.
[0022] Em algumas modalidades dos métodos acima, a invenção fornece uma partícula de AAV recombinante compreendendo qualquer um dos vetores de rAAV descritos aqui. Em algumas modalidades, a partícula de AAV viral compreende um AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAVrh8, AAVrh8R, AAV9, AAV10, AA- Vrh10, AAV11, AAV12, AAV2R471A, AAV2/2-7m8, AAV DJ, AAV2 N587A, AAV2 E548A, AAV2 N708A, AAV V708K, um capsídeo de AAV de cabra, AAV1/AAV2 quimérico, AAV bovino, ou AAV de ca- mundongo, capsídeo de sorotipo de rAAV2/HBoV1. Em algumas mo- dalidades, a ITR e o capsídeo da partícula viral de rAAV são derivados do mesmo sorotipo de AAV. Em algumas modalidades, a ITR e o cap- sídeo da partícula viral de rAAV são derivados de diferentes sorotipos de AAV. Em algumas modalidades, a ITR é derivada de AAV2 e o capsídeo da partícula de rAAV é derivado de AAV1. A invenção forne- ce um vetor compreendendo a construção de expressão de qualquer uma das modalidades descritas aqui. Em algumas modalidades, o ve- tor é um vetor de vírus adeno-associado recombinante (rAAV), um ve- tor adenoviral recombinante, um vetor lentiviral recombinante ou um vetor do vírus do herpes simples (HSV) recombinante. Em algumas modalidades, o vetor é um vetor adenoviral recombinante. Em algu- mas modalidades, o vetor adenoviral recombinante é derivado de soro- tipo de Adenovírus 2, 1, 5, 6, 19, 3, 11, 7, 14, 16, 21, 12, 18, 31, 8, 9, 10, 13, 15, 17, 19, 20, 22, 23, 24-30, 37, 40, 41, AdHu2, AdHu 3, Ad- Hu4, AdHu24, AdHu26, AdHu34, AdHu35, AdHu36, AdHu37, AdHu41, AdHu48, AdHu49, AdHu50, AdC6, AdC7, AdC69, Ad bovino tipo 3, Ad canino tipo 2, Ad ovino, ou Ad porcino tipo 3. Em algumas modalida- des, o vetor adenoviral recombinante é derivado de sorotipo adenoviral 2 ou uma variante de sorotipo adenoviral 5. Em algumas modalidades, o vetor é um vetor lentiviral recombinante. Em algumas modalidades, o vetor lentiviral recombinante é derivado de um lentivírus pseudotipado com vírus da estomatite vesicular (VSV), vírus da coriomeningite linfo- cítica (LCMV), vírus Ross river (RRV), vírus Ebola, vírus Marburg, vírus Mokala, vírus da Raiva, RD114 ou variantes nestes. Em algumas mo- dalidades, o vetor é um vetor de rHSV. Em algumas modalidades, o vetor de rHSV é derivado de rHSV-1 ou rHSV-2.
[0023] Em algumas modalidades dos aspectos e modalidades acima, o vetor é um vetor de rAAV. Em algumas modalidades, a cons- trução de expressão é flanqueada por uma ou mais sequências de re- petição terminal invertida (ITR) de AAV. Em algumas modalidades, a construção de expressão é flanqueada por duas ITRs de AAV. Em al- gumas modalidades, as ITRs de AAV são ITRs de AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAVrh8, AAVrh8R, AAV9, AAV10, AAVrh10, AAV11, AAV12, AAV2R471A, AAV DJ, um sorotipo de AAV de cabra, AAV bovino, ou AAV de camundongo. Em algumas modalidades, as ITRs de AAV são ITRs de AAV2. Em algumas moda- lidades, o vetor compreende ainda um ácido nucleico de preenchimen- to. Em algumas modalidades, o ácido nucleico de preenchimento está localizado entre o promotor e o ácido nucleico que codifica o RNAi. Em algumas modalidades, o vetor é um vetor de rAAV autocomplementar. Em algumas modalidades, o vetor compreende a primeira sequência de ácido nucleico que codifica o RNAi e uma segunda sequência de ácido nucleico que codifica um complemento do RNAi, em que a pri- meira sequência de ácido nucleico pode formar pares de base intrafita com a segunda sequência de ácido nucleico ao longo da maior parte ou todo seu comprimento. Em algumas modalidades, a primeira se-
quência de ácido nucleico e a segunda sequência de ácido nucleico são ligadas por uma ITR de AAV mutado, em que a ITR de AAV muta- do compreende uma deleção da região D e compreende uma mutação da sequência de resolução terminal. Em algumas modalidades, a in- venção fornece uma célula compreendendo qualquer um dos vetores (por exemplo, vetores de rAAV) descritos aqui.
[0024] Em algumas modalidades dos aspectos e modalidades acima, a invenção fornece uma partícula viral compreendendo qual- quer um dos vetores descritos aqui, em que a partícula viral é uma partícula de AAV encapsidando o vetor de rAAV, uma partícula adeno- viral encapsidando o vetor adenoviral recombinante, uma partícula len- tiviral encapsidando o vetor lentiviral recombinante ou uma partícula de HSV encapsidando o vetor de HSV recombinante. Em algumas moda- lidades, a partícula viral é uma partícula adenoviral encapsidando o vetor adenoviral recombinante. Em algumas modalidades, a partícula adenoviral compreende um capsídeo do sorotipo de Adenovírus 2, 1, 5, 6, 19, 3, 11, 7, 14, 16, 21, 12, 18, 31, 8, 9, 10, 13, 15, 17, 19, 20, 22, 23, 24-30, 37, 40, 41, AdHu2, AdHu 3, AdHu4, AdHu24, AdHu26, Ad- Hu34, AdHu35, AdHu36, AdHu37, AdHu41, AdHu48, AdHu49, Ad- Hu50, AdC6, AdC7, AdC69, Ad bovino tipo 3, Ad canino tipo 2, Ad ovi- no, ou Ad porcino tipo 3. Em algumas modalidades, a partícula adeno- viral compreende um capsídeo de sorotipo adenoviral 2 ou uma varian- te de um capsídeo de sorotipo adenoviral 5. Em algumas modalidades, a partícula viral é uma partícula lentiviral encapsidando o vetor lentivi- ral recombinante. Em algumas modalidades, a partícula lentiviral com- preende um capsídeo pseudotipado com vírus da estomatite vesicular (VSV), vírus da coriomeningite linfocítica (LCMV), vírus Ross river (RRV), vírus Ebola, vírus Marburg, vírus Mokala, vírus da Raiva, RD114 ou variantes nestes. Em algumas modalidades, a partícula viral é uma partícula de HSV. Em algumas modalidades, a partícula de
HSV é uma partícula de rHSV-1 ou uma partícula de rHSV-2.
[0025] Em algumas modalidades, a invenção fornece uma partícu- la de AAV recombinante compreendendo qualquer um dos vetores de rAAV descritos aqui. Em algumas modalidades, a partícula de AAV viral compreende um AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAVrh8, AAVrh8R, AAV9, AAV10, AAVrh10, AAV11, AAV12, AAV2R471A, AAV2/2-7m8, AAV DJ, AAV2 N587A, AAV2 E548A, AAV2 N708A, AAV V708K, um capsídeo de AAV de cabra, AAV1/AAV2 quimérico, AAV bovino, ou AAV de camundongo, capsí- deo de sorotipo de rAAV2/HBoV1. Em algumas modalidades, a ITR e o capsídeo da partícula viral de rAAV são derivados do mesmo soroti- po de AAV. Em algumas modalidades, a ITR e o capsídeo da partícula viral de rAAV são derivados de diferentes sorotipos de AAV. Em algu- mas modalidades, a ITR é derivada de AAV2 e o capsídeo da partícula de rAAV é derivado de AAV1. Em algumas modalidades, o vetor de rAAV compreende 5’ a 3’ de uma ITR de AAV2, de um promotor, ácido nucleico que codifica o RNAi, de um sinal de poliadenilação, e de uma ITR de AAV2. Em algumas modalidades, o promotor é um promotor de CBA. Em algumas modalidades, o sinal de poliadenilação é um sinal de poliadenilação de hormônio de crescimento bovino. Em algumas modalidades, o vetor de rAAV compreende 5’ a 3’ de uma ITR de AAV2, do promotor de CBA, de um íntron, ácido nucleico que codifica o RNAi, de um sinal de poliadenilação de hormônio de crescimento bovino, e de uma ITR de AAV2. Em algumas modalidades, o vetor compreende ainda um ácido nucleico de preenchimento. Em algumas modalidades, o ácido nucleico de preenchimento compreende ácido nucleico que codifica uma proteína fluorescente verde (GFP). Em al- gumas modalidades, o ácido nucleico de preenchimento está localiza- do entre o promotor e o ácido nucleico que codifica o RNAi.
[0026] Em algumas modalidades dos métodos acima, a partícula viral (por exemplo, a partícula de rAAV) está em uma composição (por exemplo, uma composição farmacêutica). Em algumas modalidades, a composição compreende ainda um veículo farmaceuticamente aceitá- vel.
BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS
[0027] A Figura 1A mostra uma sequência de DNA para miRNA de Htt 206 (SEQ ID NO: 22) e miRNA de Htt 207 (SEQ ID NO: 10). A Fi- gura 1B mostra um mapa de ssAAV2/1miRHtt.de. A Figura 1C mostra a sequência da fita de codificação de ssAAV2/1miRHtt.de (SEQ ID NO: 16) e a fita que não de codificação de ssAAV2/1miRHtt.de (SEQ ID NO: 19).
[0028] A Figura 2 mostra a capacidade de miRNA de Htt 170XA, miRNA de Htt 206 e miRNA de Htt 207 de mediar a redução de Htt in vitro. Valores são fornecidos como as médias ± SEM.
[0029] As Figuras 3A e 3B mostram a capacidade de AAV2/1- miRNA de Htt 206 e miRNA de AAV2/1-Htt 207 de mediar a redução de Htt como medido por proteína (Figura 3A) ou mRNA (Figura 3B). CTL-3 é um controle de miRNA que não de codificação. Valores são fornecidos como as médias ± SEM. * indica significativamente diferen- te de camundongos de CTL3, p<0,05; ANOVA seguido por teste post- hoc de Tukey.
[0030] As Figuras 4A e 4B mostram o peso corpóreo (Figura 4A) e peso cerebral (Figura 4B) um mês depois da administração de miRNA de AAV2/1-Htt 206 e miRNA de AAV2/1-Htt 207. CTL-3 é um controle de miRNA que não de codificação. * Significativamente diferente de camundongos de controle de CTL3, p<0,05; ANOVA seguido por teste post-hoc de Tukey.
[0031] As Figuras 5A a 5D mostram que Htt humana foi significati- vamente reduzida no estriado de camundongos da ninhada do tipo selvagem YAC128 e FVB injetados com AAV2/1-miRNA-Htt-207. Ní-
veis de proteína HTT humana são mostrados na Figura 5A. Níveis de proteína HTT de camundongo são mostrados na Figura 5B. Níveis de mRNA de HTT humana são mostrados na Figura 5C. Níveis de mRNA de HTT de camundongo são mostrados na Figura 5D.
[0032] As FIGURAS 6A e 6B mostram que o tratamento com AAV2/1-miRNA-Htt-207 podem corrigir déficits de coordenação motora em camundongos YAC128 como determinado pelo teste de rotarod (FIGURA 6A) e um fenótipo depressivo em camundongos YAC128 como determinado usando o teste de nado de Porsolt (FIGURA 6B). Camundongos foram do tipo selvagem (WT também referido como FVB) ou YAC128 (YAC) tratados com um controle de RNA que não de codificação (CTL3) ou AAV2/1-miRNA-Htt-207 (207). Figuras 6 * indi- cam uma deficiência significativa em camundongos de controle de miRNA que não de codificação CTL3, p<0,05; ANOVA seguido por tes- te post-hoc de Tukey comparado aos camundongos do tipo selvagem, camundongos do tipo selvagem tratados com AAV2/1-miRNA-Htt-207, e camundongos YAC128 tratados com AAV2/1-miRNA-Htt-207.
[0033] As FIGURAS 7A e 7B mostram pesos corpóreos (FIGURA 7A) e pesos cerebrais (FIGURA 7B) três meses após a infecção. Ca- mundongos foram do tipo selvagem (WT) ou YAC128 (YAC) tratados com um controle de RNA que não de codificação (CTL3) ou AAV2/1- miRNA-Htt-207 (207).
[0034] A FIGURA 8 mostra um mapa de um genoma vetorial de miRHtt 207 autocomplementar. Realçador de CMV/promotor de CBA é o realçador de CMV/promotor de beta actina de galinha. ∆ íntron qui- mérico é um íntron quimérico abreviado. BGH é o sinal de poliadenila- ção de hormônio de crescimento bovino. ∆ITR é uma ITR de AAV que carece da sequência de resolução terminal.
[0035] A FIGURA 9 mostra um mapa de um genoma vetorial de miRHtt 207 autocomplementar alternativo. Promotor de CBA é o pro-
motor de beta actina de galinha. ∆ íntron quimérico é um íntron quimé- rico abreviado. BGH é o sinal de poliadenilação de hormônio de cres- cimento bovino.
DESCRIÇÃO DETALHADA
[0036] Em alguns aspectos, a invenção fornece RNAi para tratar doença de Huntington, em que o RNAi compreende uma primeira fita compreendendo um primeiro ácido nucleico compreendendo a se- quência 5’-UGGCCGUCCAUCUUGGACCCG-3’ (SEQ ID NO: 1) e uma segunda fita compreendendo um segundo ácido nucleico com- preendendo a sequência 5’-CGGGUCCAAGAUGGACGGCCA-3’ (SEQ ID NO: 2), onde a primeira fita e segunda fita formam um dúplex. Em alguns aspectos, a invenção fornece RNAi para tratar doença de Hun- tington, em que o RNAi compreende uma primeira fita compreendendo um primeiro ácido nucleico compreendendo a sequência 5’- AGUCGGUGUGGUUGACAAGCA-3’ (SEQ ID NO: 7) e uma segunda fita compreendendo um segundo ácido nucleico compreendendo a se- quência 5’-UGCUUGUCAACCACACCGACU-3’ (SEQ ID NO: 8), onde a primeira fita e segunda fita formam um dúplex. Em alguns aspectos, a invenção fornece cassetes de expressão, vetores (por exemplo, ve- tores de AAV, adenovirais, lentivirais, ou de HSV recombinantes), célu- las, partículas virais (por exemplo, partículas virais de AAV, adenovi- rais, lentivirais, ou de HSV), e composições farmacêuticas compreen- dendo um RNAi da presente divulgação. Em outros aspectos, a inven- ção fornece métodos para tratar doença de Huntington, inibindo a ex- pressão de htt, e inibindo o acúmulo de htt em uma célula em um ma- mífero compreendendo administrar ao mamífero uma composição far- macêutica compreendendo um RNAi da presente divulgação. Ainda em outros aspectos, a invenção leva em consideração o uso de uma composição farmacêutica compreendendo um RNAi da presente divul- gação para tratar doença de Huntington (por exemplo, melhorar os sin-
tomas de doença de Huntington), inibir a expressão de htt, ou inibir o acúmulo de htt em uma célula em um mamífero com doença de Hun- tington. Ainda em outros aspectos, a invenção fornece kits para tratar doença de Huntington em um mamífero compreendendo um RNAi da presente divulgação. I. Técnicas Gerais
[0037] As técnicas e procedimentos descritos ou referenciados aqui são geralmente bem entendidos e comumente utilizados usando metodologia convencional por aqueles habilitados na técnica, tais co- mo, por exemplo, as metodologias amplamente utilizadas descritas em Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Sambrook et al., 4th ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 2012); Cur- rent Protocols in Molecular Biology (F.M. Ausubel, et al. eds., 2003); the series Methods in Enzymology (Academic Press, Inc.); PCR 2: A Practical Approach (M.J. MacPherson, B.D. Hames and G.R. Taylor eds., 1995); Antibodies, A Laboratory Manual (Harlow and Lane, eds., 1988); Culture of Animal Cells: A Manual of Basic Technique and Spe- cialized Applications (R.I. Freshney, 6th ed., J. Wiley and Sons, 2010); Oligonucleotide Synthesis (M.J. Gait, ed., 1984); Methods in Molecular Biology, Humana Press; Cell Biology: A Laboratory Notebook (J.E. Cel- lis, ed., Academic Press, 1998); Introduction to Cell and Tissue Culture (J.P. Mather and P.E. Roberts, Plenum Press, 1998); Cell and Tissue Culture: Laboratory Procedures (A. Doyle, J.B. Griffiths, and D.G. Newell, eds., J. Wiley and Sons, 1993-8); Handbook of Experimental Immunology (D.M. Weir and C.C. Blackwell, eds., 1996); Gene Trans- fer Vectors for Mammalian Cells (J.M. Miller and M.P. Calos, eds., 1987); PCR: The Polymerase Chain Reaction, (Mullis et al., eds., 1994); Current Protocols in Immunology (J.E. Coligan et al., eds., 1991); Short Protocols in Molecular Biology (Ausubel et al., eds., J. Wiley and Sons, 2002); Immunobiology (C.A. Janeway et al., 2004);
Antibodies (P. Finch, 1997); Antibodies: A Practical Approach (D. Cat- ty., ed., IRL Press, 1988-1989); Monoclonal Antibodies: A Practical Approach (P. Shepherd and C. Dean, eds., Oxford University Press, 2000); Using Antibodies: A Laboratory Manual (E. Harlow and D. Lane, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1999); The Antibodies (M. Zan- etti and J. D. Capra, eds., Harwood Academic Publishers, 1995); and Cancer: Principles and Practice of Oncology (V.T. DeVita et al., eds., J.B. Lippincott Company, 2011). II. Definições
[0038] Um "vetor", como usado aqui, refere-se a um plasmídeo ou vírus recombinante que compreende um ácido nucleico a ser liberado em uma célula hospedeira, in vitro ou in vivo.
[0039] O termo "polinucleotídeo" ou "ácido nucleico" como usado aqui refere-se a uma forma polimérica de nucleotídeos de qualquer comprimento, ribonucleotídeos ou desoxirribonucleotídeos. Assim, es- te termo inclui, mas não é limitado a, DNA ou RNA de fita única, dupla ou múltipa, DNA genômico, cDNA, híbridos de DNA-RNA, ou um polí- mero compreendendo bases de purina e pirimidina, ou outras bases de nucleotídeo naturais, quimicamente ou bioquimicamente modifica- das, não naturais, ou derivadas. A cadeia principal do polinucleotídeo pode compreender açúcares e grupos fosfato (como pode ser tipica- mente encontrado em RNA ou DNA), ou açúcar ou grupos fosfato mo- dificados ou substituídos. Alternativamente, a cadeia principal do poli- nucleotídeo pode compreender um polímero de subunidades sintéticas tais como fosforamidatos e, assim, pode ser um fosforamidato de oli- godesoxinucleosídeo (P-NH2) ou um oligômero de fosforamidato- fosfodiéster misto. Além disso, um polinucleotídeo de fita dupla pode ser obtido a partir do produto de polinucleotídeo de fita única da sínte- se química sintetizando-se a fita complementar e recozendo-se as fitas sob condições apropriadas, ou sintetizando-se a fita complementar no-
vamente usando uma DNA polimerase com um iniciador apropriado.
[0040] Os termos "polipeptídeo" e "proteína" são usados permuta- velmente para se referir a um polímero de resíduos de aminoácido, e não são limitados a um comprimento mínimo. Tais polímeros de resí- duos de aminoácido podem conter resíduos de aminoácido naturais ou não naturais, e incluem, mas não são limitados a, peptídeos, oligopep- tídeos, dímeros, trímeros, e multímeros de resíduos de aminoácido. Tanto proteínas de tamanho natural quanto fragmentos destas são abrangidos pela definição. Os termos também incluem modificações pós-expressão do polipeptídeo, por exemplo, glicosilação, sialilação, acetilação, fosforilação, e similares. Além disso, para os propósitos da presente invenção, um "polipeptídeo" refere-se a uma proteína que inclui modificações, tais como deleções, adições, e substituições (ge- ralmente conservativas em natureza), à sequência nativa, contanto que a proteína mantenha a atividade desejada. Estas modificações podem ser deliberadas, como através de mutagênese sítio-dirigida, ou podem ser acidentais, tais como através de mutações de hospedeiros que produzem as proteínas ou erros devido à amplificação por PCR.
[0041] Um "vetor viral recombinante" refere-se a um vetor de poli- nucleotídeo recombinante compreendendo uma ou mais sequências heterólogas (isto é, sequência de ácido nucleico não de origem viral). No caso de vetores de AAV recombinantes, o ácido nucleico recombi- nante é flanqueado por pelo menos uma, e em algumas modalidades, duas sequências de repetição terminal invertida (ITRs).
[0042] Um "vetor de AAV recombinante (vetor de rAAV)" refere-se a um vetor de polinucleotídeo compreendendo uma ou mais sequên- cias heterólogas (isto é, sequência de ácido nucleico não de origem de AAV) que são flanqueadas por pelo menos uma, e em algumas moda- lidades, duas sequências de repetição terminal invertida de AAV (ITRs). Tais vetores de rAAV podem ser replicados e empacotados em partículas virais infecciosas quando presentes em uma célula hospe- deira que foi infectada com um vírus auxiliar adequado (ou que está expressando funções auxiliares adequadas) e que está expressando produtos genéticos de rep e cap de AAV (isto é, proteínas Rep e Cap de AAV). Quando um vetor de rAAV é incorporado em um polinucleo- tídeo maior (por exemplo, em um cromossomo ou em um outro vetor tal como um plasmídeo usado para clonagem ou transfecção), então o vetor de rAAV pode ser referido como um "pró-vetor" que pode ser "resgatado" por replicação e encapsidação na presença de funções de empacotamento de AAV e funções auxiliares adequadas. Um vetor de rAAV pode estar em qualquer uma de várias formas, incluindo, mas não limitadas a, plasmídeos, cromossomos artificiais lineares, comple- xado com lipídeos, encapsulado dentro de lipossomos, e encapsidado em uma partícula viral, particularmente uma partícula de AAV. Um ve- tor de rAAV pode ser empacotado em um capsídeo viral de AAV para gerar uma "partícula viral adeno-associada recombinante (partícula de rAAV)".
[0043] Um "vetor adenoviral recombinante" refere-se a um vetor de polinucleotídeo compreendendo uma ou mais sequências heterólogas (isto é, sequência de ácido nucleico não de origem adenoviral) que são flanqueadas por pelo menos uma sequência de repetição terminal in- vertida de adenovírus (ITR). Em algumas modalidades, o ácido nuclei- co recombinante é flanqueado por duas sequências de repetição ter- minal invertida (ITRs). Tais vetores virais recombinantes podem ser replicados e empacotados em partículas virais infecciosas quando presentes em uma célula hospedeira que está expressando genes adenovirais essenciais suprimidos do genoma viral recombinante (por exemplo, genes E1, genes E2, genes E4, etc.). Quando um vetor viral recombinante é incorporado em um polinucleotídeo maior (por exem- plo, em um cromossomo ou em um outro vetor tal como um plasmídeo usado para clonagem ou transfecção), então o vetor viral recombinan- te pode ser referido como um "pró-vetor" que pode ser "resgatado" por replicação e encapsidação na presença de funções de empacotamen- to de adenovírus. Um vetor viral recombinante pode estar em qualquer uma de várias formas, incluindo, mas não limitadas a, plasmídeos, cromossomos artificiais lineares, complexado com lipídeos, encapsu- lado dentro de lipossomos, e encapsidado em uma partícula viral, por exemplo, uma partícula adenoviral. Um vetor viral recombinante pode ser empacotado em um capsídeo viral de adenovírus para gerar uma "partícula adenoviral recombinante".
[0044] Um "vetor lentiviral recombinante" refere-se a um vetor de polinucleotídeo compreendendo uma ou mais sequências heterólogas (isto é, sequência de ácido nucleico não de origem lentiviral) que são flanqueadas por pelo menos uma sequência de repetição terminal len- tiviral (LTRs). Em algumas modalidades, o ácido nucleico recombinan- te é flanqueado por duas sequências de repetição terminais lentivirais (LTRs). Tais vetores virais recombinantes podem ser replicados e em- pacotados em partículas virais infecciosas quando presentes em uma célula hospedeira que foi infectada com uma função auxiliar adequada. Um vetor lentiviral recombinante pode ser empacotado em um capsí- deo lentiviral para gerar uma "partícula lentiviral recombinante".
[0045] Um "vetor de herpes simples recombinante (vetor de HSV recombinante)" refere-se a um vetor de polinucleotídeo compreenden- do uma ou mais sequências heterólogas (isto é, sequência de ácido nucleico não de origem de HSV) que são flanqueadas por sequências de repetição terminais de HSV. Tais vetores virais recombinantes po- dem ser replicados e empacotados em partículas virais infecciosas quando presentes em uma célula hospedeira que foi infectada com uma função auxiliar adequada. Quando um vetor viral recombinante é incorporado em um polinucleotídeo maior (por exemplo, em um cro-
mossomo ou em um outro vetor tal como um plasmídeo usado para clonagem ou transfecção), então o vetor viral recombinante pode ser referido como um "pró-vetor" que pode ser "resgatado" por replicação e encapsidação na presença de funções de empacotamento de HSV. Um vetor viral recombinante pode estar em qualquer uma de várias formas, incluindo, mas não limitadas a, plasmídeos, cromossomos arti- ficiais lineares, complexado com lipídeos, encapsulado dentro de li- possomos, e encapsidado em uma partícula viral, por exemplo, uma partícula de HSV. Um vetor viral recombinante pode ser empacotado em um capsídeo de HSV para gerar uma "partícula viral de herpes simples recombinante".
[0046] "Heterólogo" significa derivado de uma entidade genotipi- camente distinta daquela do restante da entidade à qual ele é compa- rado ou na qual ele é introduzido ou incorporado. Por exemplo, um po- linucleotídeo introduzido por técnicas de engenharia genética em um tipo celular diferente é um polinucleotídeo heterólogo (e, quando ex- pressado, pode codificar um polipeptídeo heterólogo). Similarmente, uma sequência celular (por exemplo, um gene ou porção deste) que é incorporada em um vetor viral é uma sequência de nucleotídeo heteró- logo com respeito ao vetor.
[0047] O termo "transgene" refere-se a um polinucleotídeo que é introduzido em uma célula e é capaz de ser transcrito em RNA e opci- onalmente, traduzido e/ou expressado sob condições apropriadas. Em aspectos, ele confere uma propriedade desejada a uma célula na qual ele foi introduzido, ou de outro modo leva a um efeito terapêutico ou diagnóstico desejado. Em um outro aspecto, ele pode ser transcrito em uma molécula que medeia o RNA de interferência, tal como miRNA, siRNA, ou shRNA.
[0048] "Promotor de β-actina de galinha (CBA)" refere-se a uma sequência de polinucleotídeo derivada de um gene de β-actina de ga-
linha (por exemplo, beta actina de Gallus gallus, representada por GenBank Entrez Gene ID 396526). Como usado aqui, "promotor de β- actina de galinha" pode se referir a um promotor contendo um elemen- to realçador inicial de citomegalovírus (CMV), o promotor e primeiro éxon e íntron do gene de β-actina de galinha, e o aceitante de splice do gene de beta-globina de coelho, tais como as sequências descritas em Miyazaki, J. et al. (1989) Gene 79(2):269 - 77. Como usado aqui, o termo "promotor de CAG" pode ser usado permutavelmente. Como usado aqui, o termo "promotor de realçador inicial de CMV/beta actina de galinha (CAG)" pode ser usado permutavelmente.
[0049] Os termos "partículas de genoma (gp)", "equivalentes de genoma", ou "cópias de genoma" como usado em referência a um títu- lo viral, referem-se ao número de viríons contendo o genoma de DNA de AAV recombinante, não obstante da infectividade ou funcionalida- de. O número de partículas de genoma em uma preparação de vetor particular pode ser medido por procedimentos tal como descrito nos Exemplos aqui, ou por exemplo, em Clark et al. (1999) Hum. Gene Ther., 10:1031 - 1039; Veldwijk et al. (2002) Mol. Ther., 6:272 - 278.
[0050] O termo "genoma vetorial (vg)" como usado aqui pode se referir a um ou mais polinucleotídeos compreendendo um conjunto das sequências de polinucleotídeo de um vetor, por exemplo, um vetor vi- ral. Um genoma vetorial pode ser encapsidado em uma partícula viral. Dependendo do vetor viral particular, um genoma vetorial pode com- preender DNA de fita única, DNA de fita dupla, ou RNA de fita única, ou RNA de fita dupla. Um genoma vetorial pode incluir sequências en- dógenas associadas com um vetor viral particular e/ou quaisquer se- quências heterólogas inseridas em um vetor viral particular através de técnicas recombinantes. Por exemplo, um genoma vetorial de AAV re- combinante pode incluir pelo menos uma sequência de ITR flanquean- do um promotor, um preenchimento, uma sequência de interesse (por exemplo, um RNAi), e uma sequência de poliadenilação. Um genoma vetorial completo pode incluir um conjunto completo das sequências de polinucleotídeo de um vetor. Em algumas modalidades, o título de ácido nucleico de um vetor viral pode ser medido em termos de vg/mL. Métodos adequados para medir este título são conhecidos na técnica (por exemplo, PCR quantitativa).
[0051] Como usado aqui, o termo "inibir" pode se referir à ação de bloquear, reduzir, eliminar, ou de outro modo antagonizar a presença, ou uma atividade de um alvo particular. Inibição pode se referir à inibi- ção parcial ou inibição completa. Por exemplo, inibir a expressão de um gene pode se referir a qualquer ação levando a uma obstrução, redução, eliminação, ou qualquer outro antagonismo da expressão gê- nica, incluindo redução de abundância de mRNA (por exemplo, silen- ciamento da transcrição de mRNA), degradação de mRNA, inibição da tradução de mRNA, e assim por diante. Em algumas modalidades, ini- bir a expressão de HTT pode se referir a uma obstrução, redução, eli- minação, ou qualquer outro antagonismo da expressão de HTT, inclu- indo redução de abundância de mRNA de HTT (por exemplo, silenci- amento da transcrição de mRNA de HTT), degradação de mRNA de HTT, inibição da tradução de mRNA de HTT, e assim por diante. Co- mo um outro exemplo, inibir o acúmulo de uma proteína em uma célula pode se referir a qualquer ação levando a uma obstrução, redução, eliminação, ou outro antagonismo da expressão da proteína, incluindo redução da abundância de mRNA (por exemplo, silenciamento da transcrição de mRNA), degradação de mRNA, inibição da tradução de mRNA, degradação da proteína, e assim por diante. Em algumas mo- dalidades, inibir o acúmulo de proteína HTT em uma célula refere-se a uma obstrução, redução, eliminação, ou outro antagonismo da expres- são da proteína HTT em uma célula, incluindo redução da abundância de mRNA de HTT (por exemplo, silenciamento da transcrição de mRNA de HTT), degradação de mRNA de HTT, inibição da tradução de mRNA de HTT, degradação da proteína HTT, e assim por diante.
[0052] Os termos "unidade de infecção (iu)", "partícula infecciosa", ou "unidade de replicação", como usado em referência a um título viral, referem-se ao número de partículas de vetor de AAV recombinante infecciosas e competentes de replicação como medido pelo ensaio de centro infeccioso, também conhecido como ensaio de centro de repli- cação, como descrito, por exemplo, em McLaughlin et al. (1988) J. Vi- rol., 62:1963 - 1973.
[0053] O termo "unidade de transdução (tu)" como usado em refe- rência a um título viral, refere-se ao número de partículas de vetor de AAV recombinante infecciosas que resulta na produção de um produto de transgene funcional como medido em ensaios funcionais tal como descrito nos Exemplos aqui, ou por exemplo, em Xiao et al. (1997) Exp. Neurobiol., 144:113 - 124; ou em Fisher et al. (1996) J. Virol., 70:520 - 532 (LFU assay).
[0054] Uma sequência de "repetição terminal invertida" ou "ITR" é um termo bem entendido na técnica e refere-se a sequências relativa- mente curtas encontradas nos términos de genomas virais que estão em orientação oposta.
[0055] Uma sequência de "repetição terminal invertida (ITR) de AAV", um termo bem entendido na técnica, é uma sequência de apro- ximadamente 145 nucleotídeos que está presente em ambos os térmi- nos do genoma de AAV de fita única nativa. Os 125 nucleotídeos mais externos da ITR podem estar presentes em qualquer uma de duas ori- entações alternativas, levando à heterogeneidade entre diferentes ge- nomas de AAV e entre as duas extremidades de um único genoma de AAV. Os 125 nucleotídeos mais externo também contêm várias regi- ões mais curtas de autocomplementaridade (designadas regiões A, A’, B, B’, C, C’ e D), permitindo que o pareamento de base intrafita ocorra dentro desta porção da ITR.
[0056] Uma "sequência de resolução terminal" ou "trs" é uma se- quência na região D da ITR de AAV que é clivada por proteínas de rep de AAV durante a replicação de DNA viral. Uma sequência de resolu- ção terminal mutante é refratária à clivagem por proteínas de rep de AAV.
[0057] "Funções auxiliares de AAV" referem-se às funções que permitem que AAV seja replicado e empacotado por uma célula hos- pedeira. Funções auxiliares de AAV podem ser fornecidas em qual- quer uma de várias formas, incluindo, mas não limitadas a, vírus auxi- liar ou genes de vírus auxiliar que auxiliam na replicação e empacota- mento de AAV. Outras funções auxiliares de AAV são conhecidas na técnica tais como agentes genotóxicos.
[0058] Um "vírus auxiliar" para AAV refere-se a um vírus que per- mite que AAV (que é um parvovírus defeituoso) seja replicado e em- pacotado por uma célula hospedeira. Um vírus auxiliar fornece "fun- ções auxiliares" que levam em consideração a replicação de AAV. Vá- rios tais vírus auxiliares foram identificados, incluindo adenovírus, her- pesvírus e, poxvírus tais como vaccinia e baculovírus. Os adenovírus abrangem vários subgrupos diferentes, embora o Adenovírus tipo 5 do subgrupo C (Ad5) seja o mais comumente usado. Numerosos adenoví- rus de origem humana, mamífera não humana e aviária são conheci- dos e estão disponíveis a partir de depositários tais como o ATCC. Ví- rus da família do herpes, que também estão disponíveis a partir de de- positários tais como ATCC, incluem, por exemplo, vírus do herpes simples (HSV), vírus Epstein-Barr (EBV), citomegalovírus (CMV) e ví- rus da pseudo-raiva (PRV). Exemplos de funções auxiliares de adeno- vírus para a replicação de AAV incluem funções de E1A, funções de E1B, funções de E2A, funções de VA e funções de E4orf6. Baculovírus disponíveis a partir de depositários incluem vírus da poliedrose nuclear por Autographa californica.
[0059] Uma preparação de rAAV é dita ser "substancialmente li- vre" de vírus auxiliar se a razão de partículas de AAV infecciosas para partículas de vírus auxiliar infecciosas for pelo menos cerca de 102:1; pelo menos cerca de 104:1, pelo menos cerca de 106:1; ou pelo menos cerca de 108:1 ou mais. Em algumas modalidades, preparações tam- bém são livres de quantidades equivalentes de proteínas de vírus auxi- liar (isto é, proteínas como estariam presentes como um resultado de um tal nível de vírus auxiliar se as impurezas de partícula de vírus au- xiliar observadas acima estivessem presentes em forma interrompida). A contaminação por proteína viral e/ou celular pode ser geralmente observada como a presença de faixas de manchamento com Coomas- sie em géis SDS (por exemplo, o aparecimento de faixas exceto aque- las correspondendo às proteínas de capsídeo de AAV VPl, VP2 e VP3).
[0060] "Porcentagem (%) de identidade de sequência" com respei- to a uma sequência de polipeptídeo ou ácido nucleico de referência é definida como a porcentagem de resíduos de aminoácido ou nucleotí- deos em uma sequência candidata que são idênticos com os resíduos de aminoácido ou nucleotídeos na sequência de polipeptídeo ou ácido nucleico referência, depois de alinhar as sequências e introduzir inter- valos, se necessário, para obter a porcentagem máxima de identidade de sequência, e não considerando quaisquer substituições conservati- vas como parte da identidade de sequência. Alinhamento para propó- sitos de determinar a porcentagem de identidade de sequência de aminoácido ou ácido nucleico pode ser obtido em vários modos que estão dentro da habilidade na técnica, por exemplo, usando programas de computador publicamente disponíveis, por exemplo, aqueles descri- tos em Current Protocols in Molecular Biology (Ausubel et al., eds., 1987), Supp. 30, section 7.7.18, Table 7.7.1, e incluindo o software
BLAST, BLAST-2, ALIGN ou Megalign (DNASTAR). Um programa de alinhamento preferido é ALIGN Plus (Scientific and Educational Sof- tware, Pennsylvania). Aqueles habilitados na técnica podem determi- nar os parâmetros apropriados para medir o alinhamento, incluindo quaisquer algoritmos necessários para obter alinhamento máximo so- bre o comprimento total das sequências sendo comparadas.
Para os propósitos aqui, a % de identidade de sequência de aminoácido de uma sequência de aminoácido fornecida A para, com, ou contra uma sequência de aminoácido fornecida B (que pode alternativamente ser expressada como uma sequência de aminoácido fornecida A que tem ou compreende uma certa % de identidade de sequência de aminoáci- do para, com, ou contra uma sequência de aminoácido fornecida B) é calculada como segue: 100 vezes a fração X/Y, onde X é o número de resíduos de aminoácido contado como combinações idênticas pelo programa de alinhamento de sequência neste alinhamento do progra- ma de A e B, e onde Y é o número total de resíduos de aminoácido em B.
Será avaliado que onde o comprimento da sequência de aminoáci- do A não é igual ao comprimento da sequência de aminoácido B, a % de identidade de sequência de aminoácido de A para B não se iguala- rá a % de identidade de sequência de aminoácido de B para A.
Para os propósitos aqui, a % de identidade de sequência de ácido nucleico de uma sequência de ácido nucleico fornecida C para, com, ou contra uma sequência de ácido nucleico fornecida D (que pode ser alternati- vamente expressada como uma sequência de ácido nucleico fornecida C que tem ou compreende uma certa % de identidade de sequência de ácido nucleico para, com, ou contra uma sequência de ácido nu- cleico fornecida D) é calculada como segue: 100 vezes a fração W/Z, onde W é o número de nucleotídeos contados como combinações idênticas pelo programa de alinhamento de sequência em que o ali- nhamento do programa de C e D, e onde Z é o número total de nucleo-
tídeos em D. Será avaliado que onde o comprimento da sequência de ácido nucleico C não é igual ao comprimento da sequência de ácido nucleico D, a % de identidade de sequência de ácido nucleico de C para D não se igualará a % de identidade de sequência de ácido nu- cleico de D para C.
[0061] Uma molécula (por exemplo, ácido nucleico ou proteína) ou célula "isolada" significa que ela foi identificada e separada e/ou recu- perada de um componente de seu ambiente natural.
[0062] Uma "quantidade eficaz" é uma quantidade suficiente para efetuar resultados benéficos ou desejados, incluindo resultados clíni- cos (por exemplo, melhora dos sintomas, obtenção de parâmetros de avaliação clínicos, e similares). Uma quantidade eficaz pode ser admi- nistrada em uma ou mais administrações. Em termos de um estado da doença, uma quantidade eficaz é uma quantidade suficiente para me- lhorar, estabilizar, ou retardar o desenvolvimento de uma doença.
[0063] Um "indivíduo" ou "sujeito" é um mamífero. Mamíferos in- cluem, mas não são limitados a, animais domesticados (por exemplo, vacas, ovelha, gatos, cães, e cavalos), primatas (por exemplo, seres humanos e primatas não humanos tais como macacos), coelhos, e ro- edores (por exemplo, camundongos e ratos). Em certas modalidades, o indivíduo ou sujeito é um ser humano.
[0064] Como usado aqui, "tratamento" é uma abordagem para ob- ter resultados clínicos benéficos ou desejados. Para os propósitos des- ta invenção, resultados clínicos benéficos ou desejados incluem, mas não são limitados a, alívio dos sintomas, diminuição da extensão da doença, estado estabilizado (por exemplo, sem piora) da doença, pre- venção da propagação (por exemplo, metástase) da doença, retardo ou desaceleração da progressão da doença, melhora ou paliação do estado da doença, e remissão (se parcial ou total), se detectável ou indetectável. "Tratamento" também pode significar o prolongamento da sobrevivência quando comparado à sobrevivência esperada se não recebendo tratamento.
[0065] Como usado aqui, o termo "tratamento profilático" refere-se ao tratamento, em que um indivíduo é conhecido ou suspeito de ter ou estar em risco de ter um transtorno, mas que não exibiu nenhum sin- toma ou exibiu sintomas mínimos do transtorno. Um indivíduo passan- do por tratamento profilático pode ser tratado antes do início dos sin- tomas.
[0066] "Doença de Huntington (HD)" refere-se ao transtorno cere- bral progressivo tipicamente causado por mutações no gene HTT (também conhecido como huntingtina, HD ou IT15). Ele pode ser ca- racterizado por sintomas incluindo movimentos anormais (denomina- dos coreia), perda gradual da função motora, enfermidade emocional ou psiquiátrica, e cognição progressivamente prejudicada. Embora a maioria dos sintomas aparece nos 30 e 40 anos, formas juvenis da doença também foram observada. Para mais descrição de HD, consul- tar OMIM Entry No 143100.
[0067] "Huntingtina (HTT)" pode se referir ao gene ou a um produ- to de polipeptídeo deste associado com a maioria dos casos de doen- ça de Huntington. A função normal de huntingtina não é completamen- te entendida. Entretanto, mutações no gene huntingtina são conheci- das causar HD. Estas mutações são tipicamente hereditárias em uma forma dominante autossômica e envolvem a expansão de repetições de CAG de trinucleotídeo no gene HTT, levando a um trato de poliglu- tamina (poliQ) na proteína Htt.
[0068] Como usado aqui, um "RNAi" pode se referir a qualquer molécula de RNA que induz o RNA de interferência em uma célula. Exemplos de RNAi incluem sem limitação RNAs inibitórios pequenos (siRNAs), microRNAs (miRNAs), e RNAs em grampo de cabelo pe- quenos (shRNAs).
[0069] "Andaime de miRNA" pode se referir a um polinucleotídeo contendo (i) uma sequência de fita dupla alvejando um gene de inte- resse para knockdown por RNAi e (ii) sequências adicionais que for- mam uma estrutura de haste-alça assemelhando-se àquela de miR- NAs endógenos. Uma sequência alvejando um gene de interesse para RNAi (por exemplo, uma sequência de ~20-nt, curta) pode ser ligada às sequências que criam uma haste-alça semelhante a miRNA e uma sequência que emparelha por base com a sequência de interesse para formar um dúplex quando o polinucleotídeo é montado na estrutura secundária semelhante a miRNA. Como descrito aqui, este dúplex po- de hibridizar imperfeitamente, por exemplo, ele pode conter uma ou mais bases não pareadas ou mal pareadas. Após a clivagem deste polinucleotídeo por Dicer, este dúplex contendo a sequência alvejando um gene de interesse pode ser desenrolado e incorporado no comple- xo de RISC. Um andaime de miRNA pode se referir ao miRNA por si só ou a um polinucleotídeo de DNA que codifica o miRNA. Um exem- plo de um andaime de miRNA é a sequência de miR-155 (Lagos- Quintana, M. et al. (2002) Curr. Biol. 12:735 - 9). Kits comercialmente disponíveis para clonar uma sequência em um andaime de miRNA são conhecidos na técnica (por exemplo, o Invitrogen™ BLOCK-iT™ Pol II miR RNAi expression vector kit da Life Technologies, Thermo Fisher Scientific; Waltham, MA).
[0070] Como usado aqui, uma "protuberância" refere-se a uma re- gião de ácido nucleico que não é complementar ao ácido nucleico oposto a ele em um ácido nucleico do dúplex. Por exemplo, uma pro- tuberância pode se referir a uma sequência de ácido nucleico que não é complementar ao ácido nucleico oposto em um ácido nucleico do dúplex onde a protuberância é flanqueada por regiões de ácido nuclei- co que são complementares ao ácido nucleico oposto em um ácido nucleico do dúplex. Em alguns exemplos, a protuberância pode ser qualquer uma de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ou maior do que 10 bases em comprimento. Em alguns exemplos, a protuberância pode ser o resultado do mal pareamento (por exemplo, a fita oposta contém uma base que não é complementar) ou a protuberância pode ser o resulta- do do não pareamento (por exemplo, a fita oposta compreende ácido nucleico complementar ao ácido nucleico flanqueando a protuberância, mas a fita oposta não contém o ácido nucleico oposto à protuberân- cia).
[0071] Como usado aqui, o termo ácido nucleico de "senso" é um ácido nucleico compreendendo uma sequência que codifica todo ou uma parte de um transgene. Em alguns exemplos, o mRNA para um transgene é um ácido nucleico de senso.
[0072] Como usado aqui, ácido nucleico "antissenso" é uma se- quência de ácido nucleico que é complementar a um ácido nucleico de "senso". Por exemplo, um ácido nucleico antissenso pode ser com- plementar a um mRNA que codifica um transgene.
[0073] Como usado aqui, a "região guia" de um RNAi é a fita do RNAi que se liga ao mRNA alvo, tipicamente na base da complemen- taridade. A região de complementaridade pode abranger toda ou uma porção da região guia. Tipicamente, a região de complementaridade inclui pelo menos a região de semente. Em muitos casos, a região an- tissenso de um RNAi é a região guia.
[0074] Como usado aqui, a "região passageira", ou "região não guia", usada permutavelmente aqui, de um RNAi é a região do RNAi que é complementar à região guia. Em muitos casos, a região de sen- so de um RNAi é a região passageira.
[0075] Como usado aqui, a "região de semente" de um RNAi (por exemplo, miRNA) é uma região de cerca de 1 a 8 nucleotídeos em comprimento de um microRNA. Em alguns exemplos, a região de se- mente e a 3′-UTR de seu mRNA alvo pode ser um determinante chave no reconhecimento de RNAi.
[0076] Como usado aqui, "silenciamento gênico fora do alvo" refe- re-se ao pareamento de uma região de semente de um RNAi com se- quências em 3′-UTRs de mRNAs não intencionados e direciona a re- pressão traducional e a desestabilização destes transcritos (por exem- plo, reduz a expressão dos mRNAs não intencionados).
[0077] Referência a "cerca de" um valor ou parâmetro aqui inclui (e descreve) modalidades que são dirigidas a este valor ou parâmetro por si. Por exemplo, a descrição se referindo a "cerca de X" inclui a descrição de "X".
[0078] Como usado aqui, a forma no singular dos artigos "um", "uma", e "o", "a" inclui referências no plural a menos que indicado de outro modo.
[0079] É entendido que aspectos e modalidades da invenção des- crita aqui incluem "compreendendo", "consistindo", e/ou "consistindo essencialmente em" aspectos e modalidades. III. RNAi
[0080] Em alguns aspectos, a invenção fornece RNA de htt de al- vejamento de RNAi melhorado para o tratamento de doença de Hun- tington. Em algumas modalidades, o RNAi é um RNA interferente pe- queno (siRNA), um microRNA (miRNA), ou um RNA pequeno em grampo (shRNA). Um RNA interferente pequeno ou interferente (siR- NA) é conhecido na técnica como uma molécula de RNA de fita dupla de aproximadamente 19 a 25 (por exemplo, 19 a 23) pares de base em comprimento que induz o RNAi em uma célula. Um RNA pequeno em grampo (shRNA) é conhecido na técnica como uma molécula de RNA compreendendo aproximadamente 19 a 25 (por exemplo, 19 a 23) pares de base de RNA de fita dupla ligada por uma alça curta (por exemplo, ~4 a 11 nucleotídeos) que induz o RNAi em uma célula. Em algumas modalidades, o RNAi compreende uma primeira fita e uma segunda fita, em que a) a primeira fita e a segunda fita formam um dú- plex; b) a primeira fita compreende uma região guia, em que a região guia compreende a sequência de ácido nucleico 5’-UGGCC GUC- CAUCUUGGACCCG-3’ (SEQ ID NO: 1) ou 5’-AGUCGGUGU GGUU- GACAAGCA-3’ (SEQ ID NO: 7); e c) a segunda fita compreende uma região não guia. Em algumas modalidades, o nucleico a região guia compreende a sequência de ácido nucleico 5’-UGGCCGUCC AU- CUUGGACCCG-3’ (SEQ ID NO: 1) e a região não guia compreende a sequência 5’-CGGGUCCAAGAUGGACGGCCA-3’ (SEQ ID NO: 2). Em outras modalidades, o nucleico a região guia compreende a se- quência de ácido nucleico 5’-AGUCGGUGUGGUUGACAAGCA-3’ (SEQ ID NO: 7) e a região não guia compreende a sequência 5’- UGCUUGUCAACCACACCGACU-3’ (SEQ ID NO: 8).
[0081] Em algumas modalidades, a primeira fita compreende uma região guia, em que a região guia compreende uma sequência de áci- do nucleico tendo mais do que cerca de 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % de identidade a 5’-UGGCCGUCCAUC UUGGACCCG-3’ (SEQ ID NO: 1). Em algumas modalidades, a primei- ra fita compreende uma região guia, em que a região guia compreende uma sequência de ácido nucleico tendo mais do que cerca de 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % de identidade a 5’- UGGCCGUCCAUCUUGGACCCG-3’ (SEQ ID NO: 1) mas mantém pelo menos um motivo de CpG. Em algumas modalidades, a primeira fita compreende uma região guia, em que a região guia compreende uma sequência de ácido nucleico tendo mais do que cerca de 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % de identidade a 5’- AGUCGGUGUGGUUGACAAGCA-3’ (SEQ ID NO: 7). Em algumas modalidades, a primeira fita compreende uma região guia, em que a região guia compreende uma sequência de ácido nucleico tendo mais do que cerca de 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99
% de identidade a 5’-AGUCGGUGUGGUUGACAAGCA-3’ (SEQ ID NO: 7) mas mantém pelo menos um motivo de CpG. Em algumas mo- dalidades, a segunda fita compreende uma região não guia, em que a região não guia compreende uma sequência de ácido nucleico tendo mais do que cerca de 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % de identidade a 5’-CGGGUCCAAGAUGGACGGCCA-3’ (SEQ ID NO: 2). Em algumas modalidades, a segunda fita compreende uma região não guia, em que a região não guia compreende uma sequên- cia de ácido nucleico tendo mais do que cerca de 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % de identidade a 5’-CGGGUCCAA GAUGGACGGCCA-3’ (SEQ ID NO: 2) mas mantém pelo menos um motivo de CpG. Em algumas modalidades, a segunda fita compreende uma região não guia, em que a região não guia compreende uma se- quência de ácido nucleico tendo mais do que cerca de 75%,80%, 85%, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % de identidade a 5’-UGCUU GU- CAACCACACCGACU-3’ (SEQ ID NO: 8). Em algumas modalidades, a segunda fita compreende uma região não guia, em que a região não guia compreende uma sequência de ácido nucleico tendo mais do que cerca de 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % de identidade a 5’-UGCUUGUCAACCACACCGACU-3’ (SEQ ID NO: 8) mas mantém pelo menos um motivo de CpG.
[0082] Em algumas modalidades, o RNAi compreende a sequên- cia de ácido nucleico da SEQ ID NO: 4. Em algumas modalidades, o RNAi compreende uma sequência de ácido nucleico tendo mais do que cerca de 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % de identidade a SEQ ID NO: 4. Em algumas modalidades, o RNAi compreende uma sequência de ácido nucleico tendo mais do que cer- ca de 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % de iden- tidade a SEQ ID NO: 4 mas mantém pelo menos uma sequência (por exemplo, em uma sequência de semente). Em algumas modalidades,
o RNAi é miRNA-207. Em outras modalidades, o RNAi é miRNA-206.
[0083] Em algumas modalidades, o RNAi compreende a sequên- cia de ácido nucleico da SEQ ID NO: 10. Em algumas modalidades, o RNAi compreende uma sequência de ácido nucleico tendo mais do que cerca de 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % de identidade a SEQ ID NO: 10. Em algumas modalidades, o RNAi compreende uma sequência de ácido nucleico tendo mais do que cer- ca de 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % de iden- tidade a SEQ ID NO: 10 mas mantém pelo menos uma sequência de CpG (por exemplo, em uma sequência de semente). Em algumas mo- dalidades, o RNAi é miRNA-207. Em algumas modalidades, o RNAi é miRNA-206.
[0084] Um microRNA (miRNA) é conhecido na técnica como uma molécula de RNA que induz o RNAi em uma célula compreendendo uma sequência curta (por exemplo, 19 a 25 pares de base) de RNA de fita dupla ligada por uma alça e contendo uma ou mais sequências adicionais de RNA de fita dupla compreendendo uma ou mais protube- râncias (por exemplo, pares de base mal pareados ou não pareados). Como usado aqui, o termo "miRNA" abrange miRNAs endógenos bem como miRNAs exógenos ou heterólogos. Em algumas modalidades, "miRNA" pode se referir a um pri-miRNA ou um pré-miRNA. Durante o processamento de miRNA, um transcrito de pri-miRNA é produzido. O pri-miRNA é processado por Drosha-DGCR8 para produzir um pré- miRNA excisando-se uma ou mais sequências para deixar um pré- miRNA com uma região de flanqueamento em 5’, uma fita guia, uma região de alça, uma fita não guia, e uma região de flanqueamento em 3’; ou uma região de flanqueamento em 5’, uma fita não guia, uma re- gião de alça, uma fita guia, e uma região de flanqueamento em 3’. O pré-miRNA depois é exportado para o citoplasma e processado por Dicer para produzir um siRNA com uma fita guia e uma fita não guia
(ou passageiro). A fita guia depois é usada pelo complexo de RISC para catalisar o silenciamento gênico, por exemplo, reconhecendo-se uma sequência de RNA alvo complementar à fita guia. Outra descrição de miRNAs pode ser encontrada, por exemplo, em WO 2008/150897. O reconhecimento de uma sequência alvo por um miRNA é principal- mente determinado por pareamento entre a sequência de semente al- vo e de miRNA, por exemplo, nucleotídeos 1 a 8 (5’ para 3’) da fita guia (consultar, para exemplo, Boudreau, R.L. et al. (2013) Nucleic Acids Res. 41:e9).
[0085] Na estrutura de pri/pré-miRNA, a interface fita guia:fita não guia em um dúplex é formada em parte através de pareamento de ba- se complementar (por exemplo, pareamento de base de Watson- Crick). Entretanto, em algumas modalidades, este pareamento de ba- se complementar não se estende através do dúplex inteiro. Em algu- mas modalidades, uma protuberância na interface pode existir em uma ou mais posições de nucleotídeo. Como usado aqui, o termo "protube- rância" pode se referir a uma região de ácido nucleico que não é com- plementar ao ácido nucleico oposto a ele em um dúplex. Em algumas modalidades, a protuberância é formada quando as regiões de ácidos nucleicos complementares se ligam entre si, ao passo que as regiões da região não complementar central não se ligam. Em algumas moda- lidades, a protuberância é formada quando as duas fitas de ácido nu- cleico posicionadas entre as duas regiões complementares são de comprimentos diferentes. Como descrito abaixo, uma protuberância pode compreender 1 ou mais nucleotídeos.
[0086] Durante o processamento de miRNA, o miRNA é clivado em um sítio de clivagem adjacente à interface fita guia:fita não guia, liberando assim o dúplex de siRNA dos fitas guia e não guia. Em al- gumas modalidades, o miRNA compreende uma protuberância na fita de senso ou antissenso adjacente ao sítio de clivagem. De outro mo-
do, em algumas modalidades, o miRNA compreende uma protuberân- cia na fita guia ou não guia adjacente à sequência de semente. Con- sultar a FIGURA 1A.
[0087] Em algumas modalidades, o miRNA compreende uma pro- tuberância na fita guia oposta ao sítio de clivagem 5’ da fita não guia madura. Em algumas modalidades, o miRNA compreende uma protu- berância oposta ao nucleotídeo 5’ da fita não guia. Em algumas moda- lidades, o miRNA compreende uma protuberância na fita de senso oposta ao sítio de clivagem 3’ da fita guia madura. Em algumas moda- lidades, o miRNA compreende uma protuberância oposta ao nucleotí- deo 3’ da fita guia.
[0088] Em algumas modalidades, o RNAi compreende uma primei- ra fita e uma segunda fita, em que a) a primeira fita e a segundo for- mam um dúplex; b) a primeira fita compreende uma região guia de pe- lo menos 11 bases, em que a região guia compreende uma região de semente compreendendo as bases 1-N da fita guia, em que N = 7 ou N = 8; e c) a segunda fita compreende uma região não guia de pelo menos 11 bases, em que a região não guia compreende uma protube- rância sequência oposta a qualquer uma ou mais das bases 1-(N+2) da região guia no dúplex. Em algumas modalidades, em que N = 7 e a protuberância é oposta à base 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, ou 9 da região guia. Em outras modalidades, N = 8 e a protuberância é oposta à base 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, ou 10 da região guia.
[0089] Em algumas modalidades, o RNAi compreende uma primei- ra fita e uma segunda fita, em que a) a primeira fita e a segunda for- mam um dúplex; b) a primeira fita compreende uma região guia de pe- lo menos 10 bases, em que a região guia compreende uma região de semente compreendendo as bases 1-N da fita guia, em que N = 7 ou N = 8; e c) a segunda fita compreende uma região não guia de pelo menos 10 bases, em que a região não guia compreende uma sequên-
cia de protuberância oposta de qualquer uma ou mais das bases 1- (N+1) da região guia no dúplex. Em algumas modalidades, em que N = 7 e a protuberância é oposta à base 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, ou 8 da região guia. Em outras modalidades, N = 8 e a protuberância é oposta à base 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, ou 9 da região guia.
[0090] Em algumas modalidades, a região não guia compreende uma sequência de protuberância oposta de qualquer uma ou mais das bases 1-N da região guia no dúplex. Em algumas modalidades, N = 7 e a protuberância é oposta à base 1, 2, 3, 4, 5, 6 ou 7 da região guia. Em outras modalidades, N = 8 e a protuberância é oposta à base 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 ou 8 da região guia.
[0091] Em algumas modalidades, o RNAi compreende uma primei- ra fita e uma segunda fita, em que a) a primeira fita e a segunda for- mam um dúplex, b) a primeira fita compreende uma região guia de pe- lo menos 9 bases, em que a região guia compreende uma região de semente compreendendo as bases 2 a 7 ou 2 a 8 da fita guia, e c) a segunda fita compreende uma região não guia de pelo menos 9 bases, em que a região não guia compreende uma sequência de protuberân- cia oposta à base 1 ou base 9 da região guia no dúplex.
[0092] Em algumas modalidades, o RNAi compreende uma primei- ra fita e uma segunda fita, em que a) a primeira fita e a segunda for- mam um dúplex, b) a primeira fita compreende uma região guia de pe- lo menos 9 bases, em que a região guia compreende uma região de semente compreendendo as bases 2 a 7 ou 2 a 8 da fita guia, e c) a segunda fita compreende uma região não guia de pelo menos 9 bases, em que a região não guia compreende uma sequência de protuberân- cia oposta à base 1 da região guia no dúplex.
[0093] Em algumas modalidades, a protuberância é formada por uma ou mais bases da fita não guia no dúplex que carece de uma ba- se complementar na região guia, em que a protuberância é flanqueada por bases que emparelham por base com a fita guia. Em algumas mo- dalidades, a sequência de protuberância tem cerca de 1 a 10 nucleotí- deos. Em algumas modalidades, a sequência de protuberância tem cerca de 2 a 15 nucleotídeos. Em algumas modalidades, a sequência de protuberância tem cerca de 1, cerca de 2, cerca de 3, cerca de 4, cerca de 5, cerca de 6, cerca de 7, cerca de 8, cerca de 9, cerca de 10, cerca de 11, cerca de 12, cerca de 13, cerca de 14, ou cerca de 15 nucleotídeos.
[0094] A segurança de terapias com base em RNAi pode ser pre- judicada pela capacidade de RNAs inibitórios pequenos (siRNAs) de se ligar a mRNAs não intencionados e reduzir sua expressão, um efei- to conhecido como silenciamento gênico fora do alvo. O alvejamento fora do alvo principalmente ocorre quando a região de semente (nu- cleotídeos 2 a 8 do RNA pequeno) emparelha com as sequências em 3′-UTRs de mRNAs não intencionados e direciona a repressão tradu- cional e a desestabilização destes transcritos. O RNAi de alvejamento fora do alvo reduzido pode ser designado substituindo-se as bases dentro das sequências guias e não guias; por exemplo, criando-se os motivos de CpG. Substituições potenciais que podem resultar em uma contagem fora do alvo significativamente mais baixa podem ser avali- adas usando o algoritmo SiSPOTR, um algoritmo de projeto de siRNA focado em especificidade que identifica sequências candidatas com potenciais de alvejamento fora do alvo mínimo e capacidades de silen- ciamento potentes (Boudreau et al, Nucleic Acids Res. 2013 Jan; 41(1) e9. Uma contagem de SiSPOTR reduzida prevê sequências que têm um número mais baixo de alvos fora de alvo humanos potenciais com- parados a moléculas de RNAi precursoras. Em algumas modalidades da invenção, o RNAi é melhorado para reduzir o silenciamento gênico fora do alvo. Em algumas modalidades, o RNAi compreende um ou mais motivos de CpG. Em algumas modalidades, o RNAi compreende um ou mais motivos de CpG em uma região de semente.
[0095] Em algumas modalidades, a primeira fita e a segunda fita são ligadas por meio de um RNA (por exemplo, um ligante de RNA) capaz de formar uma estrutura de alça. Como é comumente conhecido na técnica, uma estrutura de alça de RNA (por exemplo, uma haste- alça ou grampo de cabelo) é formada quando uma molécula de RNA compreende duas sequências de RNA que emparelham por base en- tre si separadas por uma sequência de RNA que não emparelha por base entre si. Por exemplo, uma estrutura de alça pode se formar na molécula de RNA A-B-C se as sequências A e C são complementares ou parcialmente complementares tal que elas emparelham por base entre si, mas as bases na sequência B não emparelham por base en- tre si.
[0096] Em algumas modalidades, o RNA capaz de formar uma es- trutura de alça compreende de 4 a 50 nucleotídeos. Em certas modali- dades, o RNA capaz de formar uma estrutura de alça compreende 13 nucleotídeos. Em algumas modalidades, o número de nucleotídeos no RNA capazes de formar uma alça é de 4 a 50 nucleotídeos ou qual- quer número inteiro entre os mesmos. Em algumas modalidades, de 0 a 50 % da alça pode ser complementar a uma outra porção da alça. Como usado aqui, o termo "estrutura de alça" é uma sequência que une duas fitas complementares de ácido nucleico. Em algumas moda- lidades, 1 a 3 nucleotídeos da estrutura de alça são contíguos às fitas complementares de ácido nucleico e podem ser complementares a 1 a 3 nucleotídeos da porção distal da estrutura de alça. Por exemplo, os três nucleotídeos na extremidade 5’ da estrutura de alça podem ser complementares aos três nucleotídeos na extremidade 3’ da estrutura de alça.
[0097] Em algumas modalidades, o ácido nucleico que codifica um RNAi da presente divulgação compreende um andaime de miRNA he-
terólogo. Em algumas modalidades, o uso de um andaime de miRNA heterólogo é usado para modular a expressão de miRNA; por exem- plo, para aumentar a expressão de miRNA ou para diminuir a expres- são de miRNA. Qualquer andaime de miRNA conhecido na técnica pode ser usado. Em algumas modalidades, o andaime de miRNA é derivado de um andaime de miR-155 (consultar, para exemplo, Lagos- Quintana, M. et al. (2002) Curr. Biol. 12:735 - 9 e the Invitrogen™ BLOCK-iT™ Pol II miR RNAi expression vector kit da Life Technolo- gies, Thermo Fisher Scientific; Waltham, MA). IV. Doença de Huntington e modelos experimentais desta
[0098] Doença de Huntington (HD) é uma doença neurodegenera- tiva hereditária causada por uma expansão da repetição de CAG no éxon 1 do gene huntingtina (HTT). A extensão resultante do trato de poliglutamina na região N-terminal confere um ganho de função tóxica à proteína huntingtina mutante (mHtt). A toxicidade de mHtt pode sur- gir da formação de agregados contendo mHtt insolúvel, desregulação transcricional, e perturbações na homeostase proteica, todos os quais podem levar à morte neuronal (Saudou et al. (1998) Cell, 95:55 - 66; Zuccato et al. (2003) Nat. Genet. 35:76 - 83; Schaffar et al. (2004) Mol. Cell. 15:95 - 105; Benn et al., (2008) J. Neurosci. 28:10720 - 10733). Descobertas patológicas em pacientes com HD incluem adelgaçamen- to cortical e uma perda progressiva notável de neurônios estriados (Rosas et al., (2002) Neurology 58:695 - 701). O início da doença tipi- camente ocorre durante a terceira a quarta década de vida; os sinto- mas incluem movimentos coreiformes, coordenação prejudicada, de- mência progressiva, e outros distúrbios psiquiátricos (Vonsattel et al., (1985) J. Neuropathol. Exp. Neurol. 44:559 - 577). Na maioria dos ca- sos, os sintomas começam a aparecer entre 30 e 40 anos de idade com interrupções sutis nas habilidades motoras, cognição, e persona- lidade. Com o passar do tempo, este progresso em movimentos incon-
troláveis, espasmódicos e perda de controle muscular, demência, e enfermidade psiquiátrica tal como depressão, agressividade, ansieda- de, e comportamentos obsessivos-compulsivos. A morte tipicamente ocorre 10 a 15 anos depois do início de sintomas. Menos do que 10 % de casos de HD envolve uma forma de início juvenil da doença, carac- terizada por uma progressão mais rápida da doença. É considerado que aproximadamente 1 em 10.000 americanos tenha HD.
[0099] Embora a base genética de HD fosse conhecida por quase 20 anos, terapias correntes são muito paliativas e não tratam a causa subjacente da doença. Isto é provavelmente devido em parte ao fato de que a etiologia desta doença é complexa, com efeitos prejudiciais observados em uma ampla variedade de processos celulares. Conse- quentemente, o foco do desenvolvimento de fármacos foi dirigido em tratar o gatilho causador do problema primário, isto é, o gene HTT mu- tante por si só.
[00100] A maioria dos casos de HD é associada com uma expan- são de repetição de CAG de trinucleotídeo no gene HTT. O número de repetições de CAG no gene HTT é fortemente correlacionado com a manifestação de HD. Por exemplo, indivíduos com 35 ou menos repe- tições tipicamente não desenvolvem HD, mas indivíduos com entre 27 e 35 repetições têm um maior risco de terem prole com HD. Indivíduos com entre 36 e 40 a 42 repetições têm uma penetrância incompleta de HD, ao passo que indivíduos com mais do que 40 a 42 repetições mostram penetrância completa. Casos de HD de início juvenil podem ser associados com tamanhos de repetição de CAG de 60 ou mais.
[00101] A proteína Htt poliQ-expandida resultante desta expansão de repetição de CAG é associada com agregados celulares ou corpos de inclusão, perturbações à homeostase proteica, e desregulação transcricional. Embora estes fenótipos tóxicos possam ser observados por todo o corpo, eles são o mais tipicamente associados com a morte de célula neuronal no SNC. Pacientes com HD frequentemente exibem adelgaçamento cortical e uma perda progressiva, notável de neurônios estriados. O estriado parece ser a região mais vulnerável do cérebro em HD (particularmente os neurônios espinhosos médios estriados), com efeitos iniciais observados no putâmen e núcleo caudado. A mor- te celular nos neurônios espinhosos estriados, números aumentados de astrócitos, e ativação da micróglia são observados nos cérebros de pacientes com HD. HD também pode afetar certas regiões do hipo- campo, córtex cerebral, tálamo, hipotálamo, e cerebelo.
[00102] As abordagens propostas para bloquear a expressão de Htt incluem o uso de oligonucleotídeos de antissenso (ASOs) bem como RNA de interferência (RNAi) que usa RNAs de dúplex (dsRNAs) ou RNAs de fita única quimicamente modificados (ssRNAs) (Harper et al., (2005) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 102:5820 - 5825; DiFiglia et al., (2007) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 104:17204 - 17209; Boudreau et al., (2009b) Mol. Ther. 17:1053 - 1063; Drouet et al., (2009) Ann. Neurol, 65:276 - 285; Sah et al., (2011) J. Clin. Invest. 121:500 - 507; Matsui et al., (2012) Drug Discov. Today 17:443 - 450; Yu et al., (2012) Cell 150:895 - 908). Entretanto, obstáculos para traduzir uma abordagem de ASO na clínica podem incluir a necessidade de incorporar um dis- positivo para facilitar infusões repetidas e crônicas de ASO no SNC, e a necessidade de distribuir adequadamente o fármaco às regiões al- vos em um cérebro grande.
[00103] Para contornar estes problemas potenciais com ASO, utili- zar a expressão mediada por AAV de um RNAi (por exemplo, siRNA), que oferece o potencial para segurança aumentada, eficiência aumen- tada, e eficácia mais duradoura, pode ser vantajoso. Visto que pacien- tes com HD expressam alelos de Htt tanto mutantes quanto do tipo selvagem, a maioria de sequências de alvejamento de siRNA prova- velmente degradará ambos os alelos. Entretanto, o silenciamento de
Htt não específico de alelo em camundongos com HD mostrou ser bem tolerado e pode fornecer o mesmo benefício como reduzir o Htt mutante sozinho (Boudreau et al., (2009b) Mol. Ther. 17:1053 - 1063; Drouet et al., (2009) Ann. Neurol. 65:276 - 285; Kordasiewicz et al., (2012) Neuron 74(6):1031 - 1044). Além disso, a supressão parcial e sustentada de Htt do tipo selvagem no putâmen de primatas não hu- manos a seguir de RNAi mediado por AAV supostamente não teve ne- nhum efeito adverso, o que sugere que o cérebro adulto pode tolerar níveis reduzidos de Htt do tipo selvagem (McBride et al., (2011) Mol. Ther. 19:2152 - 2162; Grondin et al., (2012) Brain 135:1197 - 1209).
[00104] Modelos animais de HD podem ser usados para testar es- tratégias terapêuticas potenciais, tais como as composições e métodos da presente divulgação. Modelos de camundongo para HD são conhe- cidos na técnica. Estes incluem modelos de camundongo com frag- mentos de HTT mutante tal como os camundongos com HD R6/1 e N171-82Q (Harper et al., (2005) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 102:5820- 5825, Rodriguez-Lebron et al., (2005) Mol. Ther. 12:618-633, Machida et al., (2006) Biochem. Biophys. Res. Commun. 343:190-197). Um ou- tro exemplo de um modelo de HD de camundongo descrito aqui é o modelo de camundongo YAC128. Este modelo porta um cromossomo artificial de levedura (YAC) expressando um gene HTT humano mutan- te com 128 repetições de CAG, e camundongos YAC128 exibem acú- mulo significativo e generalizado de agregados de Htt no estriado em 12 meses de idade (Slow et al., (2003) Hum. Mol. Genet. 12:1555 - 1567, Pouladi et al., (2012) Hum. Mol. Genet. 21:2219 - 2232).
[00105] Outros modelos animais para HD também podem ser usa- dos. Por exemplo, modelos de rato (von Horsten, S. et al. (2003) Hum. Mol. Genet. 12:617 - 24) e macaco-reso (Yang, S.H. et al. (2008) Natu- re 453:921 - 4) transgênicos foram descritos. Modelos não genéticos também são conhecidos. Estes, o mais frequentemente, envolvem o uso de compostos excitotóxicos (tais como ácido quinolínico ou ácido caínico) ou toxinas mitocondriais (tais como ácido 3-nitropropiônico e ácido malônico) para induzir morte celular de neurônio estriado em ro- edores ou primatas não humanos (para mais descrição e referências, consultar Ramaswamy, S. et al. (2007) ILAR J. 48:356 - 73). V. Métodos para tratar doença de Huntington
[00106] Em alguns aspectos, a invenção fornece métodos e com- posições para tratar doença de Huntington em um mamífero compre- endendo administrar ao mamífero uma composição farmacêutica da presente divulgação (por exemplo, uma composição farmacêutica compreendendo uma partícula viral da presente divulgação). Em al- guns aspectos, a invenção fornece métodos e composições para inibir a expressão de htt em um mamífero com doença de Huntington com- preendendo administrar ao mamífero uma composição farmacêutica da presente divulgação (por exemplo, uma composição farmacêutica compreendendo uma partícula viral da presente divulgação). Em al- guns aspectos, a invenção fornece métodos e composições para inibir o acúmulo de htt em uma célula de um mamífero com doença de Hun- tington compreendendo administrar ao mamífero uma composição farmacêutica da presente divulgação (por exemplo, uma composição farmacêutica compreendendo uma partícula viral da presente divulga- ção).
[00107] Em alguns aspectos, a invenção fornece métodos e com- posições para melhorar um sintoma de HD, compreendendo a admi- nistração de uma quantidade eficaz de partículas virais recombinantes compreendendo um vetor que codifica um RNAi da presente divulga- ção ao cérebro de um mamífero. Em algumas modalidades, os sinto- mas de HD incluem, mas não são limitados a, coreia, rigidez, movi- mentos corporais incontroláveis, perda de controle muscular, carência de coordenação, inquietude, movimentos oculares reduzidos, postura anormal, instabilidade, marcha atáxica, expressão facial anormal, pro- blemas da fala, dificuldades de mastigação e/ou deglutição, perturba- ção do sono, convulsões, demência, déficits cognitivos (por exemplo, capacidades diminuídas relacionadas a planejamento, pensamento abstrato, flexibilidade, aquisição de regras, sensibilidade interpessoal, autocontrole, atenção, aprendizagem, e memória), depressão, ansie- dade, mudanças na personalidade, agressividade, comportamento compulsivo, comportamento obsessivo-compulsivo, hipersexualidade, psicose, apatia, irritabilidade, pensamentos suicidas, perda de peso, atrofia muscular, insuficiência cardíaca, tolerância à glicose reduzida, atrofia testicular, e osteoporose.
[00108] Em alguns aspectos, a invenção fornece métodos para pre- venir ou retardar a progressão de HD. HD dominante autossômica é uma doença genética que pode ser genotipada. Por exemplo, o núme- ro de repetições de CAG em HTT pode ser determinado por dimensio- namento de repetição com base em PCR. Este tipo de diagnose pode ser realizado em qualquer estágio de vida através do teste direto de jovens ou adultos (por exemplo, junto com a apresentação de sinto- mas clínicos), teste de triagem pré-natal ou exclusão pré-natal (por exemplo, por biópsia do vilo coriônico ou amniocentese), ou triagem pré-implante de embriões. Como tal, os métodos descritos aqui podem ser usados como um tratamento profilático de HD visto que a diagnose pode ocorrer antes do início dos sintomas. Por exemplo, HD pode ser diagnosticada por teste genético (teste pré-natal, teste no nascimento, etc.) e tratada profilaticamente (por exemplo, usando uma partícula de rAAV descrita aqui) antes do início dos sintomas (por exemplo, perda celular do SNC) para impedir o início dos sintomas e/ou progressão de HD. Pacientes com HD podem exibir encolhimento dos núcleos cau- dados e/ou putâmen e/ou córtex e/ou ventrículos alargados como ob- servado por imagiologia cerebral. Estes sintomas, combinados com um histórico familiar de HD e/ou sintomas clínicos, podem indicar HD.
[00109] Meios para determinar a melhora dos sintomas de HD são conhecidos na técnica. Por exemplo, a Escala de Classificação de Do- ença de Huntington Unificada (UHDRS) pode ser usada para avaliar a função motora, função cognitiva, anormalidades comportamentais, e capacidade funcional (consultar, para exemplo, Huntington Study Group (1996) Movement Disorders 11:136 - 42). Esta escala de classi- ficação foi desenvolvida para fornecer um teste abrangente, uniforme para múltiplas facetas da patologia da doença, incorporando elemen- tos de testes tais como a Escala de Atividades e Vida Diária de HD, escala de severidade de coreia de Marsden e Quinn, as escalas de Incapacidade Física e Independência, a escala de classificação motora de HD (HDMRS), a escala de capacidade funcional de HD (HDFCS), e o exame neurológico quantificado (QNE). Outro teste útil para determi- nar a melhora de sintomas de HD pode incluir sem limitação a Montre- al Cognitive Assessment, imagiologia cerebral (por exemplo, MRI), Ca- tegory Fluency Test, Trail Making Test, Map Search, Stroop Word Re- ading Test, Speeded Tapping Task, e o Symbol Digit Modalities Test.
[00110] Em alguns aspectos da invenção, os métodos e composi- ções são usados para o tratamento de seres humanos com HD. Como descrito acima, HD é hereditária em uma maneira dominante autos- sômica e causada por expansão de repetição de CAG no gene HTT. HD de início juvenil é o mais frequentemente herdada do lado paterno. Fenótipos semelhantes à doença de Huntington também foram corre- lacionados com outros locos genéticos, tais como HDL1, PRNP, HDL2, HDL3, e HDL4. É considerado que outros locos genéticos podem mo- dificar a manifestação de sintomas de HD, incluindo mutações nos ge- nes GRIN2A, GRIN2B, MSX1, GRIK2, e APOE.
[00111] Em alguns aspectos, a invenção fornece um RNAi melho- rado para alvejar mRNA de htt em um mamífero com doença de Hun-
tington. Em algumas modalidades, o RNAi compreende uma primeira fita compreendendo um primeiro ácido nucleico compreendendo a se- quência 5’-UGGCCGUCCAUCUUGGACCCG-3’ (SEQ ID NO: 1) e uma segunda fita compreendendo um segundo ácido nucleico com- preendendo a sequência 5’-CGGGUCCAAGAUGGACGGCCA-3’ (SEQ ID NO: 2). Um RNAi descrito aqui (por exemplo, como parte de um ve- tor de rAAV) pode encontrar uso, inter alia, no tratamento de doença de Huntington.
[00112] Em alguns aspectos, a invenção fornece um RNAi melho- rado para alvejar mRNA de htt em um mamífero com doença de Hun- tington. Em algumas modalidades, o RNAi compreende uma primeira fita compreendendo um primeiro ácido nucleico compreendendo a se- quência 5’-AGUCGGUGUGGUUGACAAGCA-3’ (SEQ ID NO: 7) e uma segunda fita compreendendo um segundo ácido nucleico compreen- dendo a sequência 5’-UGCUUGUCAACCACACCGACU-3’ (SEQ ID NO: 8). Um RNAi descrito aqui (por exemplo, como parte de um vetor de rAAV) pode encontrar uso, inter alia, no tratamento de doença de Huntington.
[00113] Em algumas modalidades da invenção, o RNAi é melhora- do para reduzir o silenciamento gênico fora do alvo. Em algumas mo- dalidades, o RNAi compreende um ou mais motivos de CpG. Em al- gumas modalidades, o RNAi compreende um ou mais motivos de CpG em uma região de semente.
[00114] Em algumas modalidades, a primeira fita compreende uma sequência de ácido nucleico tendo mais do que cerca de qualquer um de 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % ou 99 % de iden- tidade a SEQ ID NO: 1 mas mantém o motivo de CpG. Em algumas modalidades, a segunda fita compreende uma sequência de ácido nu- cleico tendo mais do que cerca de qualquer um de 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % ou 99 % de identidade a SEQ ID NO: 2 mas mantém o motivo de CpG.
[00115] Em algumas modalidades, a primeira fita compreende uma sequência de ácido nucleico tendo mais do que cerca de qualquer um de 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % ou 99 % de iden- tidade a SEQ ID NO: 7 mas mantém o motivo de CpG. Em algumas modalidades, a segunda fita compreende uma sequência de ácido nu- cleico tendo mais do que cerca de qualquer um de 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % ou 99 % de identidade a SEQ ID NO: 8 mas mantém o motivo de CpG.
[00116] Em algumas modalidades, o RNAi é um RNA interferente pequeno (siRNA), um microRNA (miRNA), ou um RNA pequeno em grampo (shRNA). Um RNA interferente pequeno ou interferente (siR- NA) é conhecido na técnica como uma molécula de RNA de fita dupla de aproximadamente 19 a 25 (por exemplo, 19 a 23) pares de base em comprimento que induz o RNAi em uma célula. Um RNA pequeno em grampo (shRNA) é conhecido na técnica como uma molécula de RNA compreendendo aproximadamente 19 a 25 (por exemplo, 19 a 23) pares de base de RNA de fita dupla ligada por uma alça curta (por exemplo, ~4 a 11 nucleotídeos) que induz o RNAi em uma célula.
[00117] Em algumas modalidades, o miRNA compreende uma se- quência guia que é cerca de 90 % idêntica a SEQ ID NO: 1. Em algu- mas modalidades, o miRNA compreende uma sequência guia que é cerca de qualquer um de 90 % idêntica, 91 % idêntica, 92 % idêntica, 93 % idêntica, 94 % idêntica, 95 % idêntica, 96 % idêntica, 97 % idên- tica, 98 % idêntica, 99 % idêntica, ou 100 % idêntica a SEQ ID NO: 1.
[00118] Em algumas modalidades, o miRNA compreende uma se- quência não guia que é cerca de 90 % idêntica a SEQ ID NO: 2. Em algumas modalidades, o miRNA compreende uma sequência não guia que é cerca de qualquer um de 90 % idêntica, 91 % idêntica, 92 % idêntica, 93 % idêntica, 94 % idêntica, 95 % idêntica, 96 % idêntica, 97
% idêntica, 98 % idêntica, 99 % idêntica, ou 100 % idêntica a SEQ ID NO: 2.
[00119] Em algumas modalidades, o miRNA compreende uma se- quência guia que é cerca de 90 % idêntica a SEQ ID NO: 7. Em algu- mas modalidades, o miRNA compreende uma sequência guia que é cerca de qualquer um de 90 % idêntica, 91 % idêntica, 92 % idêntica, 93 % idêntica, 94 % idêntica, 95 % idêntica, 96 % idêntica, 97 % idên- tica, 98 % idêntica, 99 % idêntica, ou 100 % idêntica a SEQ ID NO: 7.
[00120] Em algumas modalidades, o miRNA compreende uma se- quência não guia que é cerca de 90 % idêntica a SEQ ID NO: 8. Em algumas modalidades, o miRNA compreende uma sequência não guia que é cerca de qualquer um de 90 % idêntica, 91 % idêntica, 92 % idêntica, 93% idêntica, 94% idêntica, 95% idêntica, 96% idêntica, 97% idêntica, 98% idêntica, 99% idêntica, ou 100 % idêntica a SEQ ID NO:
8.
[00121] Em algumas modalidades, a primeira fita e a segunda fita são ligadas por meio de RNA capaz de formar uma estrutura de alça. Como é comumente conhecido na técnica, uma estrutura de alça de RNA (por exemplo, uma haste-alça ou grampo de cabelo) é formada quando uma molécula de RNA compreende duas sequências de RNA que emparelham por base entre si separadas por uma sequência de RNA que não emparelha por base entre si. Por exemplo, uma estrutu- ra de alça pode se formar na molécula de RNA A-B-C se as sequên- cias A e C forem complementares ou parcialmente complementares tal que elas emparelham por base entre si, mas as bases na sequência B não emparelham por base entre si.
[00122] Em algumas modalidades, o RNA capaz de formar uma es- trutura de alça compreende de 4 a 50 nucleotídeos. Em certas modali- dades, o RNA capaz de formar uma estrutura de alça compreende 13 nucleotídeos. Em certas modalidades, o RNA capaz de formar uma estrutura de alça compreende a sequência de nucleotídeo GUUUUG GCCACUGACUGAC (SEQ ID NO: 13). Em algumas modalidades, o genoma vetorial compreende uma sequência de nucleotídeo que é pe- lo menos de cerca de qualquer um de 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, ou 99 % idêntica à sequência da SEQ ID NO: 13.
[00123] Em alguns aspectos, a invenção fornece métodos compre- endendo administrar a um mamífero (por exemplo, um mamífero com HD) um RNAi compreendendo uma primeira fita compreendendo um primeiro ácido nucleico compreendendo a sequência 5’-UGGCCG UCCAUCUUGGACCCG-3’ (SEQ ID NO: 1) e uma segunda fita com- preendendo um segundo ácido nucleico compreendendo a sequência 5’-CGGGUCCAAGAUGGACGGCCA-3’ (SEQ ID NO: 2). Em algumas modalidades, uma partícula viral recombinante compreende o RNAi. Em algumas modalidades, a partícula viral recombinante é uma partí- cula de AAV encapsidando um vetor de rAAV, uma partícula adenovi- ral encapsidando um vetor adenoviral recombinante, uma partícula len- tiviral encapsidando um vetor lentiviral recombinante ou uma partícula de HSV encapsidando um vetor de HSV recombinante em que o vetor de rAAV, o vetor adenoviral, o vetor lentiviral ou o vetor de HSV codifi- ca o RNAi.
[00124] Em alguns aspectos, a invenção fornece métodos compre- endendo administrar a um mamífero (por exemplo, um mamífero com HD) um RNAi compreendendo um primeiro ácido nucleico compreen- dendo a sequência 5’-AGUCGGUGUGGUUGACAAGCA-3’ (SEQ ID NO: 7) e uma segunda fita compreendendo um segundo ácido nuclei- co compreendendo a sequência 5’-UGCUUGUCAACCACACCGACU- 3’ (SEQ ID NO: 8). Em algumas modalidades, uma partícula viral re- combinante compreende o RNAi. Em algumas modalidades, a partícu- la viral recombinante é uma partícula de AAV encapsidando um vetor de rAAV, uma partícula adenoviral encapsidando um vetor adenoviral recombinante, uma partícula lentiviral encapsidando um vetor lentiviral recombinante ou uma partícula de HSV encapsidando um vetor de HSV recombinante em que o vetor de rAAV, o vetor adenoviral, o vetor lentiviral ou o vetor de HSV codifica o RNAi.
[00125] Em algumas modalidades, a liberação de partículas virais recombinantes é por injeção de partículas virais ao cérebro. Em algu- mas modalidades, a liberação de partículas virais recombinantes é por injeção de partículas virais ao estriado. A administração intraestriado libera partículas virais recombinantes a uma área do cérebro, o estria- do (incluindo o putâmen e núcleo caudado), que é altamente afetada por HD. Além disso, e sem desejar estar ligado à teoria, é considerado que partículas virais recombinantes (por exemplo, partículas de rAAV) injetadas no estriado também podem ser dispersas (por exemplo, atra- vés de transporte retrógrado) a outras áreas do cérebro, incluindo, sem limitação, áreas de projeção (por exemplo, o córtex). Em algumas modalidades, as partículas virais recombinantes são liberadas por libe- ração realçada por convecção (por exemplo, liberação realçada por convecção ao estriado).
[00126] Em alguns aspectos, a invenção fornece métodos para tra- tar doença de Huntington em um mamífero compreendendo adminis- trar ao mamífero a composição farmacêutica da presente divulgação. Em alguns aspectos, a invenção fornece métodos para inibir o acúmu- lo de htt em uma célula de um mamífero com doença de Huntington compreendendo administrar ao mamífero a composição farmacêutica da presente divulgação. Em alguns aspectos, a invenção fornece mé- todos para inibir a expressão de htt em um mamífero com doença de Huntington compreendendo administrar ao mamífero a composição farmacêutica da presente divulgação. Em algumas modalidades, o htt é um htt mutante (por exemplo, um htt compreendendo mais do que
35, mais do que 36, mais do que 37, mais do que 38, mais do que 39, mais do que 40, mais do que 41, ou mais do que 42 repetições de CAG). Em algumas modalidades, a expressão e/ou acúmulo de um htt do tipo selvagem também são inibidos. Como descrito aqui, e sem de- sejar estar ligado à teoria, é considerado que a inibição da expressão e/ou acúmulo de htt mutante em um mamífero com HD é altamente benéfica, mas a inibição da expressão e/ou acúmulo de htt do tipo sel- vagem no mesmo mamífero como um efeito colateral (por exemplo, de um RNAi da presente divulgação) pode ser bem tolerada (por exem- plo, produz pouco ou nenhum efeito colateral não intencionado).
[00127] Em algumas modalidades, uma célula compreende um ve- tor (por exemplo, um vetor compreendendo uma construção de ex- pressão que codifica um RNAi da presente divulgação). Em algumas modalidades, o vetor é um vetor de rAAV. Em algumas modalidades, o vetor é um vetor adenoviral recombinante, um vetor lentiviral recombi- nante ou um vetor do vírus do herpes simples (HSV) recombinante. Em algumas modalidades, a célula é uma célula do sistema nervoso central (SNC).
[00128] Em algumas modalidades, a administração de uma quanti- dade eficaz de partículas virais recombinantes compreendendo um vetor que codifica um RNAi da presente divulgação transduz neurônios (por exemplo, neurônios estriados, tais como neurônios espinhosos) no sítio de administração ou próximo ao mesmo. Em algumas modali- dades, mais do que cerca de qualquer um de 5 %, 10 %, 15 %, 20 %, 25 %, 30 %, 35 %, 40 %, 45 %, 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 % ou 100 % de neurônios são transduzidos. Em algumas modalidades, cerca de 5 % a cerca de 100 %, cerca de 10 % a cerca de 50 %, cerca de 10 % a cerca de 30 %, cerca de 25 % a cerca de 75 %, cerca de 25 % a cerca de 50 %, ou cerca de 30 % a cerca de 50 % dos neurônios são transduzidos. Métodos para identificar neurônios transduzidos por partículas virais recombinantes que expressam miRNA são conhecidos na técnica; por exemplo, imuno-histoquímica, detecção de RNA (por exemplo, qPCR, Northern blotting, RNA-seq, hibridização in situ, e si- milares) ou o uso de um marcador co-expressado tal como proteína fluorescente verde realçada pode ser usada para detectar a expres- são.
[00129] Em algumas modalidades da invenção, os métodos com- preendem a administração ao cérebro de um mamífero de uma quan- tidade eficaz de partículas virais recombinantes compreendendo um vetor que codifica um RNAi da presente divulgação para tratar um mamífero, por exemplo, um ser humano, com HD. Em algumas moda- lidades, a composição é injetada a um ou mais locais no cérebro para permitir a expressão de um RNAi da presente divulgação pelo menos nos neurônios. Em algumas modalidades, a composição é injetada em qualquer um de um, dois, três, quatro, cinco, seis, sete, oito, nove, dez ou mais do que dez locais no cérebro. Em algumas modalidades, a composição é injetada no estriado. Em algumas modalidades, a com- posição é injetada no estriado dorsal. Em algumas modalidades, a composição é injetada no putâmen. Em algumas modalidades, a com- posição é injetada no núcleo caudado. Em algumas modalidades, a composição é injetada no putâmen e no núcleo caudado.
[00130] Em algumas modalidades, as partículas virais recombinan- tes são administradas a um hemisfério do cérebro. Em algumas moda- lidades, as partículas virais recombinantes são administradas a ambos os hemisférios do cérebro.
[00131] Em algumas modalidades, as partículas virais recombinan- tes são administradas a mais do que um local simultaneamente ou se- quencialmente. Em alguma modalidade, injeções múltiplas de partícu- las virais recombinantes não são mais do que uma hora, duas horas, três horas, quatro horas, cinco horas, seis horas, nove horas, doze ho-
ras ou 24 horas à parte.
[00132] Em algumas modalidades, a invenção fornece um método para tratar um ser humano com HD administrando-se uma quantidade eficaz de uma composição farmacêutica compreendendo um vetor vi- ral recombinante que codifica um RNAi da presente divulgação para suprimir a atividade de um HTT mutante. Em algumas modalidades, a composição farmacêutica compreende um ou mais excipientes farma- ceuticamente aceitáveis.
[00133] Em algumas modalidades, os métodos compreendem ad- ministrar uma quantidade eficaz de uma composição farmacêutica compreendendo um vetor viral recombinante que codifica um RNAi da presente divulgação para suprimir a atividade de um HTT mutante. Em algumas modalidades, o título viral das partículas virais (por exemplo, partículas de rAAV) é pelo menos cerca de qualquer um de 5 × 1012, 6 × 1012, 7 × 1012, 8 × 1012, 9 × 1012, 10 × 1012, 11 × 1012, 15 × 1012, 20 × 1012, 25 × 1012, 30 × 1012, ou 50 × 1012 cópias de genoma/mL. Em al- gumas modalidades, o título viral das partículas virais (por exemplo, partículas de rAAV) é cerca de qualquer um de 5 × 1012 a 6 × 1012, 6 × 1012 a 7 × 1012, 7 × 1012 a 8 × 1012, 8 × 1012 a 9 × 1012, 9 × 1012 a 10 × 1012, 10 × 1012 a 11 × 1012, 11 × 1012 a 15 × 1012, 15 × 1012 a 20 × 1012, 20 × 1012 a 25 × 1012, 25 × 1012 a 30 × 1012, 30 × 1012 a 50 × 1012, ou 50 × 1012 a 100 × 1012 cópias de genoma/mL. Em algumas modalidades, o título viral das partículas virais (por exemplo, partículas de rAAV) é cerca de qualquer um de 5 × 1012 a 10 × 1012, 10 × 1012 a 25 × 1012, ou 25 × 1012 a 50 × 1012 cópias de genoma/mL. Em algumas modalidades, o título viral das partículas virais (por exemplo, partículas de rAAV) é pelo menos cerca de qualquer um de 5 × 109, 6 × 109, 7 × 109, 8 × 109, 9 × 109, 10 × 109, 11 × 109, 15 × 109, 20 × 109, 25 × 109, 30 × 109, ou 50 × 109 unidades de transdução/mL. Em algumas moda- lidades, o título viral das partículas virais (por exemplo, partículas de rAAV) é cerca de qualquer um de 5 × 109 a 6 × 109, 6 × 109 a 7 × 109, 7 × 109 a 8 × 109, 8 × 109 a 9 × 109, 9 × 109 a 10 × 109, 10 × 109 a 11 × 109, 11 × 109 a 15 × 109, 15 × 109 a 20 × 109, 20 × 109 a 25 × 109, 25 × 109 a 30 × 109, 30 × 109 a 50 × 109 ou 50 × 109 a 100 × 109 unidades de transdução/mL. Em algumas modalidades, o título viral das partícu- las virais (por exemplo, partículas de rAAV) é cerca de qualquer um de 5 × 109 a 10 × 109, 10 × 109 a 15 × 109, 15 × 109 a 25 × 109, ou 25 × 109 a 50 × 109 unidades de transdução/mL. Em algumas modalidades, o título viral das partículas virais (por exemplo, partículas de rAAV) é pelo menos qualquer um de cerca de 5 × 1010, 6 × 1010, 7 × 1010, 8 × 1010, 9 × 1010, 10 × 1010, 11 × 1010, 15 × 1010, 20 × 1010, 25 × 1010, 30 × 1010, 40 × 1010, ou 50 × 1010 unidades infecciosas/mL. Em algumas modalidades, o título viral das partículas virais (por exemplo, partículas de rAAV) é pelo menos qualquer um de cerca de 5 × 1010 a 6 × 1010, 6 × 1010 a 7 × 1010, 7 × 1010 a 8 × 1010, 8 × 1010 a 9 × 1010, 9 × 1010 a 10 × 1010, 10 × 1010 a 11 × 1010, 11 × 1010 a 15 × 1010, 15 × 1010 a 20 × 1010, 20 × 1010 a 25 × 1010, 25 × 1010 a 30 × 1010, 30 × 1010 a 40 × 1010, 40 × 1010 a 50 × 1010, ou 50 × 1010 a 100 × 1010 unidades infecci- osas/mL. Em algumas modalidades, o título viral das partículas virais (por exemplo, partículas de rAAV) é pelo menos qualquer um de cerca de 5 × 1010 a 10 × 1010, 10 × 1010 a 15 × 1010, 15 × 1010 a 25 × 1010, ou 25 × 1010 a 50 × 1010 unidades infecciosas/mL.
[00134] Em algumas modalidades, a dose de partículas virais admi- nistradas ao indivíduo é pelo menos cerca de qualquer uma de 1 × 108 a cerca de 1 × 1013 cópias de genoma/kg de peso corpóreo. Em algu- mas modalidades, a dose de partículas virais administradas ao indiví- duo é cerca de qualquer uma de 1 × 108 a cerca de 1 × 1013 cópias de genoma/kg de peso corpóreo.
[00135] Em algumas modalidades, a quantidade total de partículas virais administradas ao indivíduo é pelo menos cerca de qualquer uma de 1 × 109 a cerca de 1 × 1014 cópias de genoma. Em algumas moda- lidades, a quantidade total de partículas virais administradas ao indiví- duo é cerca de qualquer uma de 1 × 109 a cerca de 1 × 1014 cópias de genoma.
[00136] Em algumas modalidades da invenção, o volume da com- posição injetada ao estriado é mais do que cerca de qualquer um de 1 µl, 2 µl, 3 µl, 4 µl, 5 µl, 6 µl, 7 µl, 8 µl, 9 µl, 10 µl, 15 µl, 20 µl, 25 µl, 50 µl, 75 µl, 100 µl, 200 µl, 300 µl, 400 µl, 500 µl, 600 µl, 700 µl, 800 µl, 900 µl, ou 1 mL, ou qualquer quantidade entre os mesmos.
[00137] Em algumas modalidades, um primeiro volume da compo- sição é injetado em uma primeira região do cérebro, e um segundo volume da composição é injetado em uma segunda região do cérebro. Por exemplo, em algumas modalidades, um primeiro volume da com- posição é injetado no núcleo caudado, e um segundo volume da com- posição é injetado no putâmen. Em algumas modalidades, um volume de 1X da composição é injetado no núcleo caudado, e um volume de 1,5X, 2X, 2,5X, 3X, 3,5X, ou 4X da composição é injetado no putâmen, onde X é um volume que é maior do que cerca de qualquer um de 1 µl, 2 µl, 3 µl, 4 µl, 5 µl, 6 µl, 7 µl, 8 µl, 9 µl, 10 µl, 15 µl, 20 µl, 25 µl, 50 µl, 75 µl, 100 µl, 200 µl, 300 µl, 400 µl, 500 µl, 600 µl, 700 µl, 800 µl, 900 µl, ou 1 mL, ou qualquer quantidade entre os mesmos.
[00138] As composições da invenção (por exemplo, partículas virais recombinantes compreendendo um vetor que codifica um RNAi da presente divulgação) podem ser usadas sozinhas ou em combinação com um ou mais agentes terapêuticos adicionais para tratar HD. O in- tervalo entre a administração sequencial pode ser em termos de pelo menos (ou, alternativamente, menos do que) minutos, horas, ou dias. V. Construções e Vetores de Expressão de RNAi
[00139] A invenção fornece construções, vetores e partículas virais de expressão para a expressão do RNAi descrito aqui.
[00140] Em algumas modalidades, o ácido nucleico que codifica um RNAi da presente divulgação compreende um andaime de miRNA he- terólogo. Em algumas modalidades, uso de um andaime de miRNA heterólogo é usado para modular a expressão de miRNA; por exem- plo, para aumentar a expressão de miRNA ou para diminuir a expres- são de miRNA. Qualquer andaime de miRNA conhecido na técnica pode ser usado. Em algumas modalidades, o andaime de miRNA é derivado de um andaime de miR-155 (consultar, para exemplo, Lagos- Quintana, M. et al. (2002) Curr. Biol. 12:735 - 9 e o Invitrogen™ BLOCK-iT™ Pol II miR RNAi expression vector kit da Life Technolo- gies, Thermo Fisher Scientific; Waltham, MA). Em algumas modalida- des, o ácido nucleico que codifica um RNAi da presente divulgação compreende um andaime de miRNA. Em algumas modalidades, o an- daime de miRNA é fornecido pela SEQ ID NO: 14.
[00141] Em algumas modalidades, o RNAi alveja o RNA que codifi- ca um polipeptídeo associado com doença de Huntington (por exem- plo, HTT mutante). Sem desejar estar ligado à teoria, é considerado que um RNAi pode ser usado para reduzir ou eliminar a expressão e/ou atividade de um polipeptídeo cujo ganho de função foi associado com a doença de Huntington (por exemplo, HTT mutante).
[00142] Em algumas modalidades, o transgene (por exemplo, um RNAi da presente divulgação) é operavelmente ligado a um promotor. Promotores exemplares incluem, mas não são limitados, ao promotor inicial imediato de citomegalovírus (CMV), ao LTR de RSV, ao LTR de MoMLV, ao promotor de fosfoglicerato quinase-1 (PGK), a um promo- tor de vírus símio 40 (SV40) e a um promotor de CK6, a um promotor de transtirretina (TTR), a um promotor de TK, a um promotor responsi- vo à tetraciclina (TRE), a um promotor de HBV, a um promotor de hA- AT, a um promotor de LSP, a promotores específicos de fígado quimé- ricos (LSPs), ao promotor de E2F, ao promotor de telomerase
(hTERT); ao realçador de citomegalovírus/promotor de beta-actina de galinha/β-globina de coelho (promotor de CAG; Niwa et al., Gene, 1991, 108(2):193 - 9) e ao promotor de promotor alfa de fator de alon- gamento 1 (EFl-alfa) (Kim et al., Gene, 1990, 91(2):217 - 23 e Guo et al., Gene Ther., 1996, 3(9):802 - 10). Em algumas modalidades, o promotor compreende um promotor de β-glicuronidase humano ou um realçador de citomegalovírus ligado a um promotor de β-actina de gali- nha (CBA). O promotor pode ser um promotor constitutivo, induzível ou reprimível. Em algumas modalidades, a invenção fornece um vetor re- combinante compreendendo o ácido nucleico que codifica um transge- ne heterólogo da presente divulgação operavelmente ligado a um promotor de CBA. Promotores exemplares e descrições podem ser encontrados, por exemplo, na Pub. de PG dos EUA 20140335054. Em algumas modalidades, o promotor é um promotor de CBA, um promo- tor de CBA mínimo, um promotor de CMV ou um promotor de GUSB.
[00143] Exemplos de promotores constitutivos incluem, sem limita- ção, o promotor de LTR do vírus do sarcoma de Rous retroviral (RSV) (opcionalmente com o realçador de RSV), o promotor de citomegaloví- rus (CMV) (opcionalmente com o realçador de CMV) [consultar, para exemplo, Boshart et al, Cell, 41:521 - 530 (1985)], o promotor de SV40, o promotor de di-hidrofolato redutase, o promotor de 13-actina, o promotor de fosfoglicerol quinase (PGK), e o promotor de EFla [Invi- trogen].
[00144] Promotores induzíveis permitem a regulação da expressão gênica e podem ser regulados por compostos exogenamente forneci- dos, fatores ambientais tais como temperatura, ou a presença de um estado fisiológico específico, por exemplo, fase aguda, um estado de diferenciação particular da célula, ou em células replicantes apenas. Promotores induzíveis e sistemas induzíveis estão disponíveis a partir de uma variedade de fontes comerciais, incluindo, sem limitação, Invi-
trogen, Clontech e Ariad. Muitos outros sistemas foram descritos e po- dem ser facilmente selecionados por uma pessoa de habilidade na técnica. Exemplos de promotores induzíveis regulados por promotores exogenamente fornecidos incluem o promotor de metalotionina (MT) de ovelha induzível por zinco, o promotor do vírus de tumor mamário (MMTV) de camundongo induzível por dexametasona (Dex), o sistema de promotor de T7 polimerase (WO 98/10088); o promotor de inseto, ecdisona (No et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 93:3346 - 3351 (1996)), o sistema reprimível por tetraciclina (Gossen et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:5547 - 5551 (1992)), o sistema induzível por tetraciclina (Gossen et al, Science, 268:1766 - 1769 (1995), consultar também Harvey et al, Curr. Opin. Chem. Biol., 2:512 - 518 (1998)), o sistema induzível por RU486 (Wang et al, Nat. Biotech., 15:239 - 243 (1997) e Wang et al, Gene Ther., 4:432 - 441 (1997)) e o sistema induzível por rapamicina (Magari et al, J. Clin. Invest., 100:2865 - 2872 (1997)). Ain- da outros tipos de promotores induzíveis que podem ser úteis neste contexto são aqueles que são regulados por um estado fisiológico es- pecífico, por exemplo, temperatura, fase aguda, um estado de diferen- ciação particular da célula, ou em células replicantes apenas.
[00145] Em uma outra modalidade, o promotor nativo, ou fragmento deste, para o transgene será usado. O promotor nativo pode ser prefe- rido quando se deseja que a expressão do transgene imite a expres- são nativa. O promotor nativo pode ser usado quando a expressão do transgene deve ser regulada do ponto de vista temporal ou de desen- volvimento, ou em uma maneira específica de tecido, ou em resposta aos estímulos transcricionais específicos. Em uma outra modalidade, outros elementos de controle de expressão nativa, tais como elemen- tos realçadores, sítios de poliadenilação ou sequências de consenso Kozak também podem ser usados para imitar a expressão nativa.
[00146] Em algumas modalidades, as sequências reguladoras co-
municam capacidades de expressão gênica específicas de tecido. Em alguns casos, as sequências reguladoras específicas de tecido se li- gam a fatores de transcrição específicos de tecido que induzem a transcrição em uma maneira específica de tecido. Tais sequências re- guladoras específicas de tecido (por exemplo, promotores, realçado- res, etc.) são bem conhecidas na técnica. Sequências reguladoras es- pecíficas de tecido exemplares incluem, mas não são limitadas aos promotores específicos de tecido seguintes: neuronal tal como o pro- motor de enolase específico de neurônio (NSE) (Andersen et al., Cell. Mol. Neurobiol., 13:503 - 15 (1993)), promotor de gene de cadeia leve de neurofita (Piccioli et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88:5611 - 5 (1991)), e o promotor de gene vgf específico de neurônio (Piccioli et al., Neuron, 15:373 - 84 (1995)). Em algumas modalidades, o promotor específico de tecido é um promotor de um gene selecionado de: nú- cleos neuronais (NeuN), proteína glial fibrilar ácida (GFAP), polipose coli adenomatosa (APC), e molécula 1 adaptadora de ligação a cálcio ionizado (Iba-1). Outros promotores específicos de tecido apropriados estarão evidentes ao técnico habilitado. Em algumas modalidades, o promotor é um promotor de beta-actina de galinha (CBA).
[00147] Em algumas modalidades, o promotor expressa o ácido nu- cleico heterólogo em uma célula do SNC. Como tal, em algumas mo- dalidades, um polipeptídeo terapêutico ou um ácido nucleico terapêuti- co da invenção pode ser usado para tratar um transtorno do SNC. Em algumas modalidades, o promotor expressa o ácido nucleico heterólo- go em uma célula cerebral. Uma célula cerebral pode se referir a qual- quer célula cerebral conhecida na técnica, incluindo, sem limitação, um neurônio (tal como um neurônio sensorial, neurônio motor, interneurô- nio, neurônio dopaminérgico, neurônio espinhoso médio, neurônio co- linérgico, neurônio GABAérgico, neurônio piramidal, etc.), uma célula glial (tal como micróglia, macróglia, astrócitos, oligodendrócitos, célu-
las ependimárias, glia radial, etc.), uma célula do parênquima cerebral, célula microglial, célula ependemária, e/ou uma célula de Purkinje. Em algumas modalidades, o promotor expressa o ácido nucleico heterólo- go em um neurônio e/ou célula glial. Em algumas modalidades, o neu- rônio é um neurônio espinhoso médio do núcleo caudado, um neurônio espinhoso médio do putâmen, um neurônio da camada IV do córtex e/ou um neurônio da camada V do córtex.
[00148] Vários promotores que expressam transcritos (por exemplo, um transgene heterólogo) em células do SNC, células cerebrais, neu- rônios, e células gliais são conhecidos na técnica e descritos aqui. Tais promotores podem compreender sequências de controle normalmente associadas com as sequências de controle de gene ou heterólogo se- lecionadas. Frequentemente, sequências de controle de heterólogo úteis incluem aquelas derivadas de sequências que codificam genes mamíferos ou virais. Os exemplos incluem, sem limitação, o promotor inicial de SV40, promotor de LTR de vírus do tumor mamário de ca- mundongo, promotor tardio maior de adenovírus (Ad MLP), um promo- tor de vírus do herpes simples (HSV), um promotor de citomegalovírus (CMV) tal como a região promotora inicial imediata de CMV (CMVIE), um promotor de sarcoma de Rous vírus (RSV), promotores sintéticos, promotores híbridos, e similares. Além disso, sequências derivadas de genes não virais, tal como o gene de metalotioneína de murino, tam- bém podem ser usadas. Tais sequências promotoras estão comerci- almente disponíveis a partir de, por exemplo, Stratagene (San Diego, CA). Promotores específicos de SNC e promotores induzíveis podem ser usados. Exemplos de promotores específicos de SNC incluem, sem limitação, aqueles isolados de Genes específicos do SNC tais como proteína básica de mielina (MBP), proteína glial fibrilar ácida (GFAP), e enolase específica de neurônio (NSE). Exemplos de promo- tores induzíveis incluem elementos responsivos ao DNA para ecdiso-
na, tetraciclina, metalotioneína, e hipóxia, inter alia.
[00149] A presente invenção considera o uso de um genoma viral recombinante para a introdução de uma ou mais sequências de ácido nucleico que codificam um RNAi como descrito aqui ou empacotamen- to em uma partícula de AAV viral. O genoma viral recombinante pode incluir qualquer elemento para estabelecer a expressão de um RNAi, por exemplo, todo ou uma porção funcional de um promotor, um íntron (por exemplo, um íntron quimérico)), um ácido nucleico heterólogo, uma ITR, um elemento de ligação a ribossomo, terminador, realçador, marcador de seleção, íntron, sinal de poliA, e/ou origem de replicação. Em algumas modalidades, o vetor de rAAV compreende um ou mais de um realçador, um íntron (por exemplo, um par de doador de spli- ce/aceitante de splice), um sítio de fixação à matriz, ou um sinal de poliadenilação. Uma variedade de íntrons para o uso na invenção é conhecida àqueles de habilidade na técnica, e inclui o íntron de MVM, o íntron truncado de F IX 1, o SA de cadeia pesada de β-globina SD/imunoglobina, o SD de adenovírus/AS de imunoglobina, o SD/SA tardio de SV40 (19S/16S), e o SD de adenovírus híbrido/SA de IgG. (Wu et al. 2008, Kurachi et al., 1995, Choi et al. 2014), Wong et al. 1985, Yew et al. 1997, Huang e Gorman (1990).
[00150] Em algumas modalidades, a administração de uma quanti- dade eficaz de partículas de rAAV compreendendo um vetor que codi- fica um RNAi transduz células (por exemplo, células do SNC, células cerebrais, neurônios, e/ou células gliais) no sítio de administração ou próximo ao mesmo (por exemplo, o estriado e/ou córtex) ou mais dis- tais ao sítio de administração. Em algumas modalidades, mais do que cerca de qualquer um de 5 %, 10 %, 15 %, 20 %, 25 %, 30 %, 35 %, 40 %, 45 %, 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 % ou 100 % de neurô- nios são transduzidos. Em algumas modalidades, cerca de 5 % a cer- ca de 100 %, cerca de 10 % a cerca de 50 %, cerca de 10 % a cerca de 30 %, cerca de 25 % a cerca de 75 %, cerca de 25 % a cerca de 50 %, ou cerca de 30 % a cerca de 50 % dos neurônios são transduzidos. Métodos para identificar neurônios transduzidos por partículas virais recombinantes expressando miRNA são conhecidos na técnica; por exemplo, imuno-histoquímica, detecção de RNA (por exemplo, qPCR, Northern blotting, RNA-seq, hibridização in situ, e similares) ou o uso de um marcador co-expressado tal como proteína fluorescente verde realçada pode ser usado para detectar a expressão.
[00151] Em alguns aspectos, a invenção fornece partículas virais compreendendo um genoma autocomplementar recombinante (por exemplo, um vetor de rAAV autocomplementar). Partículas virais de AAV com genomas vetoriais autocomplementares e métodos de uso de genomas de AAV autocomplementares são descritas nas Patentes dos EUA Nos 6.596.535; 7.125.717; 7.465.583; 7.785.888; 7.790.154;
7.846.729; 8.093.054; e 8.361.457; e Wang Z., et al., (2003) Gene Ther 10:2105 - 2111, cada uma das quais é incorporada aqui a título de referência em sua totalidade. Um rAAV compreendendo um geno- ma autocomplementar prontamente formará uma molécula de DNA de fita dupla em virtude de suas sequências parcialmente complementa- res (por exemplo, fitas de codificação e não codificação complementa- res de um ácido nucleico heterólogo). Em algumas modalidades, o ve- tor compreende a primeira sequência de ácido nucleico que codifica o ácido nucleico heterólogo e uma segunda sequência de ácido nucleico que codifica um complemento do ácido nucleico, onde a primeira se- quência de ácido nucleico pode formar pares de base intrafita com a segunda sequência de ácido nucleico ao longo da maior parte ou todo seu comprimento.
[00152] Em algumas modalidades, a primeira sequência de ácido nucleico heterólogo que codifica um RNAi e uma segunda sequência de ácido nucleico heterólogo que codifica o complemento do RNAi são ligadas por uma ITR mutada (por exemplo, a ITR direita). Em algumas modalidades, a ITR compreende a sequência de polinucleotídeo 5’-
CCACTCCCTCTCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGGGCG
ACCAAAGGTCGCCCGACGCCCGGGCTTTGCCCGGGCGGCCTCA GTGAGCGAGCGAGCGCGCAGAGAGGGA-3 (SEQ ID NO: 15). A ITR mutada compreende uma deleção da região D compreendendo a se- quência de resolução terminal. Como um resultado, na replicação de um genoma viral de AAV, as proteínas de rep não clivarão o genoma viral na ITR mutada e como tal, um genoma viral recombinante com- preendendo a seguinte ordem 5’ para 3’ será empacotado em um cap- sídeo viral: uma ITR de AAV, a primeira sequência de polinucleotídeo heterólogo incluindo sequências reguladoras, a ITR de AAV mutado, o segundo polinucleotídeo heterólogo em orientação reversa ao primeiro polinucleotídeo heterólogo e uma terceira ITR de AAV. VI. Partículas virais e métodos de produzir partículas virais
[00153] A invenção fornece, inter alia, partículas virais recombinan- tes compreendendo um ácido nucleico que codifica um RNAi da pre- sente divulgação, bem como métodos de uso destas para tratar uma doença ou transtorno em um mamífero; por exemplo, doença de Hun- tington. Partículas virais
[00154] A invenção fornece partículas virais compreendendo o RNAi como divulgado aqui. Em algumas modalidades, a invenção for- nece partículas virais para liberar o RNAi da invenção como divulgado aqui. Por exemplo, a invenção fornece métodos de usar partículas vi- rais recombinantes para liberar o RNAi para tratar uma doença ou transtorno em um mamífero; por exemplo, partículas de rAAV compre- endendo RNAi para tratar HD. Em algumas modalidades, a partícula viral recombinante é uma partícula de AAV recombinante. Em algumas modalidades, a partícula viral é uma partícula de AAV recombinante compreendendo um ácido nucleico compreendendo uma sequência de um RNAi da presente divulgação flanqueada por uma ou duas ITRs.
O ácido nucleico é encapsidado na partícula de AAV.
A partícula de AAV também compreende proteínas de capsídeo.
Em algumas modalida- des, o ácido nucleico compreende a(s) sequência(s) de codificação de interesse (por exemplo, ácido nucleico de um RNAi da presente divul- gação) operativamente se ligaram a componentes na direção da trans- crição, sequências de controle incluindo sequências de iniciação e terminação da transcrição, formando desse modo um cassete de ex- pressão.
O cassete de expressão é flanqueado na extremidade 5’ e 3’ por pelo menos uma sequência de ITR de AAV funcional.
Por "se- quência de ITR de AAV funcional" significa que as sequências de ITR funcionam como intencionado para o resgate, replicação e empacota- mento do virion de AAV.
Consultar Davidson et al., PNAS, 2000, 97(7)3428 - 32; Passini et al., J.
Virol., 2003, 77(12):7034 - 40; e Pe- chan et al., Gene Ther., 2009, 16:10 - 16, todos os quais são incorpo- rados aqui em sua totalidade a título de referência.
Para praticar al- guns aspectos da invenção, os vetores recombinantes compreendem pelo menos todas as sequências de AAV essencial para encapsidação e as estruturas físicas para infecção pelo rAAV.
ITRs de AAV para o uso nos vetores da invenção não precisam ter uma sequência de nu- cleotídeo do tipo selvagem (por exemplo, como descrito em Kotin, Hum.
Gene Ther., 1994, 5:793 - 801), e podem ser alteradas pela in- serção, deleção ou substituição de nucleotídeos ou as ITRs de AAV podem ser derivadas de qualquer um de vários sorotipos de AAV.
Mais do que 40 sorotipos de AAV são correntemente conhecidos, e novos sorotipos e variantes de sorotipos existentes continuam a ser identifi- cados.
Consultar Gao et al., PNAS, 2002, 99(18): 11854 - 6; Gao et al., PNAS, 2003, 100(10):6081 - 6; e Bossis et al., J.
Virol., 2003, 77(12):6799 - 810. O uso de qualquer sorotipo de AAV é considerado dentro do escopo da presente invenção.
Em algumas modalidades, um vetor de rAAV é um vetor derivado de um sorotipo de AAV, incluindo sem limitação, ITRs de AAV são ITRs de AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAVrh8, AAVrh8R, AAV9, AAV10, AA- Vrh10, AAV11, AAV12, AAV2R471A, AAV DJ, um sorotipo de capsí- deo de AAV de cabra, AAV bovino, ou AAV de camundongo ou seme- lhantes.
Em algumas modalidades, o ácido nucleico no AAV compre- ende uma ITR de ITRs de AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAVrh8, AAVrh8R, AAV9, AAV10, AAVrh10, AAV11, AAV12, AAV2R471A, AAV DJ, um sorotipo de capsídeo de AAV de cabra, AAV bovino, ou AAV de camundongo ou semelhantes.
Em al- gumas modalidades, o ácido nucleico no AAV codifica ainda um RNAi como descrito aqui.
Por exemplo, o ácido nucleico no AAV pode com- preender pelo menos uma ITR de qualquer sorotipo de AAV conside- rado aqui e pode codificar ainda um RNAi compreendendo uma fita que compreende uma região guia e uma outra fita que compreende uma região não guia.
Em uma modalidade, o ácido nucleico no AAV pode compreender pelo menos uma ITR de qualquer sorotipo de AAV e pode codificar ainda um RNAi compreendendo uma primeira fita compreendendo um primeiro ácido nucleico compreendendo a se- quência 5’-UGGCCGUCCAUCUUGGACCCG-3’ (SEQ ID NO: 1) e uma segunda fita compreendendo um segundo ácido nucleico com- preendendo a sequência 5’-CGGGUCCAAGAUGGACGGCCA-3’ (SEQ ID NO: 2). Em algumas modalidades, o ácido nucleico no AAV com- preende o ácido nucleico em 5’ a 3’ que codifica o seguinte: uma ITR (por exemplo, uma ITR de AAV2), um promotor, um ácido nucleico que codifica um RNAi como divulgado aqui, um sinal de poliadenilação, e uma ITR de AAV (por exemplo, uma ITR de AAV2). Em algumas mo- dalidades, o ácido nucleico no AAV compreende o ácido nucleico em 5’ a 3’ que codifica o seguinte: uma ITR (por exemplo, uma ITR de
AAV2), um promotor, um ácido nucleico que codifica um RNAi com- preendendo uma primeira fita compreendendo um primeiro ácido nu- cleico compreendendo a sequência 5’-UGGCCGUCCA UCUUGGAC- CCG-3’ (SEQ ID NO: 1) e uma segunda fita compreendendo um se- gundo ácido nucleico compreendendo a sequência 5’-CGGGUCCAA GAUGGACGGCCA-3’ (SEQ ID NO: 2), um sinal de poliadenilação, e uma ITR de AAV (por exemplo, uma ITR de AAV2). Em algumas mo- dalidades, o ácido nucleico no AAV compreende o ácido nucleico em 5’ a 3’ que codifica o seguinte: uma ITR (por exemplo, uma ITR de AAV2), um promotor de CBA, um ácido nucleico que codifica um RNAi como divulgado aqui, um sinal de poliadenilação (por exemplo, um po- liA de hormônio de crescimento bovino), e uma ITR de AAV (por exemplo, uma ITR de AAV2). Em algumas modalidades, o ácido nu- cleico no AAV compreende o ácido nucleico em 5’ a 3’ que codifica o seguinte: toda ou uma porção funcional de uma ITR (por exemplo, uma ITR de AAV2), um promotor de CBA, um íntron (por exemplo, um íntron quimérico), um ácido nucleico que codifica um RNAi compreen- dendo uma primeira fita compreendendo um primeiro ácido nucleico compreendendo a sequência 5’-UGGCCGUCCAUCUUGGACCCG-3’ (SEQ ID NO: 1), e uma segunda fita compreendendo um segundo áci- do nucleico compreendendo a sequência 5’-CGGGUCCAAGAUGGA CGGCCA-3’ (SEQ ID NO: 2), um sinal de poliadenilação (por exemplo, um poliA de hormônio de crescimento bovino), e uma ITR de AAV (por exemplo, uma ITR de AAV2). Em algumas modalidades, a primeira fita e segunda fita formam um dúplex. Em algumas modalidades, a primei- ra fita é ligada à segunda fita por um ligante. Em algumas modalida- des, o ligante compreende a sequência de ácido nucleico da SEQ ID NO: 13.
[00155] Em algumas modalidades, o ácido nucleico no AAV com- preende o ácido nucleico em 5’ a 3’ que codifica o seguinte: uma ITR
(por exemplo, uma ITR de AAV2), um promotor de CBA, um ácido nu- cleico que codifica um RNAi compreendendo uma primeira fita com- preendendo um primeiro ácido nucleico compreendendo a sequência 5’-CGGGUCCAAGAUGGACGGCCA-3’ (SEQ ID NO: 2), e uma se- gunda fita compreendendo um segundo ácido nucleico compreenden- do a sequência 5’-UGGCCGUCCAUCUUGGACCCG-3’ (SEQ ID NO: 1), um sinal de poliadenilação (por exemplo, um poliA de hormônio de crescimento bovino), e uma ITR de AAV (por exemplo, uma ITR de AAV2). Em algumas modalidades, a primeira fita e segunda fita for- mam um dúplex. Em algumas modalidades, a primeira fita é ligada à segunda fita por um ligante. Em algumas modalidades, o ligante com- preende a sequência de ácido nucleico da SEQ ID NO: 13.
[00156] Em uma outra modalidade, o ácido nucleico no AAV pode compreender pelo menos uma ITR de qualquer sorotipo de AAV con- siderado aqui e pode codificar ainda um RNAi compreendendo uma primeira fita compreendendo um primeiro ácido nucleico compreen- dendo a sequência 5’-AGUCGGUGUGGUUGACAAGCA-3’ (SEQ ID NO: 7) e uma segunda fita compreendendo um segundo ácido nuclei- co compreendendo a sequência 5’-UGCUUGUCAACCACACCGACU- 3’ (SEQ ID NO: 8). Em algumas modalidades, o ácido nucleico no AAV compreende o ácido nucleico em 5’ a 3’ que codifica o seguinte: uma ITR (por exemplo, uma ITR de AAV2), um promotor, um ácido nucleico que codifica um RNAi como divulgado aqui, um sinal de poliadenila- ção, e uma ITR de AAV (por exemplo, uma ITR de AAV2). Em algu- mas modalidades, o ácido nucleico no AAV compreende o ácido nu- cleico em 5’ a 3’ que codifica o seguinte: uma ITR (por exemplo, uma ITR de AAV2), um promotor, um ácido nucleico que codifica um RNAi compreendendo uma primeira fita compreendendo um primeiro ácido nucleico compreendendo a sequência 5’-AGUCGGUGUGGUUGAC AAGCA-3’ (SEQ ID NO: 7) e uma segunda fita compreendendo um segundo ácido nucleico compreendendo a sequência 5’-UGCUUG UCAACCACACCGACU-3’ (SEQ ID NO: 8), um sinal de poliadenilação, e uma ITR de AAV (por exemplo, uma ITR de AAV2). Em algumas modalidades, o ácido nucleico no AAV compreende o ácido nucleico em 5’ a 3’ que codifica o seguinte: uma ITR (por exemplo, uma ITR de AAV2), um promotor de CBA, um íntron quimérico, um ácido nucleico que codifica um RNAi como divulgado aqui, um sinal de poliadenilação (por exemplo, um poliA de hormônio de crescimento bovino), e uma ITR de AAV (por exemplo, uma ITR de AAV2). Em algumas modalida- des, o ácido nucleico no AAV compreende o ácido nucleico em 5’ a 3’ que codifica o seguinte: uma ITR (por exemplo, uma ITR de AAV2), um promotor de CBA, um íntron quimérico, um ácido nucleico que co- difica um RNAi compreendendo uma primeira fita compreendendo um primeiro ácido nucleico compreendendo a sequência 5’-AGUCGGU GUGGUUGACAAGCA-3’ (SEQ ID NO: 7), e uma segunda fita com- preendendo um segundo ácido nucleico compreendendo a sequência 5’-UGCUUGUCAACCACACCGACU-3’ (SEQ ID NO: 8), um sinal de poliadenilação (por exemplo, um poliA de hormônio de crescimento bovino), e uma ITR de AAV (por exemplo, uma ITR de AAV2). Em al- gumas modalidades, a primeira fita e segunda fita formam um dúplex. Em algumas modalidades, a primeira fita é ligada à segunda fita por um ligante. Em algumas modalidades, o ligante compreende a se- quência de ácido nucleico da SEQ ID NO: 13.
[00157] Em uma outra modalidade, o ácido nucleico no AAV pode compreender pelo menos uma ITR de qualquer sorotipo de AAV con- siderado aqui e pode codificar ainda um RNAi compreendendo uma primeira fita compreendendo um primeiro ácido nucleico compreen- dendo a sequência 5’-UGCUUGUCAACCACACCGACU-3’ (SEQ ID NO: 8) e uma segunda fita compreendendo um segundo ácido nuclei- co compreendendo a sequência AGUCGGUGUGGUUGACAAGCA-3’
(SEQ ID NO: 7). Em algumas modalidades, o ácido nucleico no AAV compreende o ácido nucleico em 5’ a 3’ que codifica o seguinte: uma ITR (por exemplo, uma ITR de AAV2), um promotor, um ácido nucleico que codifica um RNAi como divulgado aqui, um sinal de poliadenila- ção, e uma ITR de AAV (por exemplo, uma ITR de AAV2). Em algu- mas modalidades, o ácido nucleico no AAV compreende o ácido nu- cleico em 5’ a 3’ que codifica o seguinte: uma ITR (por exemplo, uma ITR de AAV2), um promotor, um íntron, um ácido nucleico que codifica um RNAi compreendendo uma primeira fita compreendendo um pri- meiro ácido nucleico compreendendo a sequência 5’-UGCUUGUCA ACCACACCGACU-3’ (SEQ ID NO: 8) e uma segunda fita compreen- dendo um segundo ácido nucleico compreendendo a sequência 5’- AGUCGGUGUGGUUGACAAGCA-3’ (SEQ ID NO: 7), um sinal de po- liadenilação, e uma ITR de AAV (por exemplo, uma ITR de AAV2). Em algumas modalidades, o ácido nucleico no AAV compreende o ácido nucleico em 5’ a 3’ que codifica o seguinte: uma ITR (por exemplo, uma ITR de AAV2), um promotor de CBA, um ácido nucleico que codi- fica um RNAi como divulgado aqui, um sinal de poliadenilação (por exemplo, um poliA de hormônio de crescimento bovino), e uma ITR de AAV (por exemplo, uma ITR de AAV2). Em algumas modalidades, o ácido nucleico no AAV compreende o ácido nucleico em 5’ a 3’ que codifica o seguinte: uma ITR (por exemplo, uma ITR de AAV2), um promotor de CBA, um íntron, um ácido nucleico que codifica um RNAi compreendendo uma primeira fita compreendendo um primeiro ácido nucleico compreendendo a sequência 5’-UGCUUGUCAACCACACC GACU-3’, e uma segunda fita compreendendo um segundo ácido nu- cleico compreendendo a sequência 5’-AGUCGGUGUGGUUGAC AAGCA-3’ (SEQ ID NO: 7), um sinal de poliadenilação (por exemplo, um poliA de hormônio de crescimento bovino), e uma ITR de AAV (por exemplo, uma ITR de AAV2). Em algumas modalidades, a primeira fita e segunda fita formam um dúplex. Em algumas modalidades, a primei- ra fita é ligada à segunda fita por um ligante. Em algumas modalida- des, o ligante compreende a sequência de ácido nucleico da SEQ ID NO: 13.
[00158] Em algumas modalidades, um vetor pode incluir um (um ou mais) ácido nucleico de preenchimento. Em algumas modalidades, o ácido nucleico de preenchimento pode compreender uma sequência que codifica um polipeptídeo repórter. Como será avaliado por aqueles de habilidade na técnica, o ácido nucleico de preenchimento pode ser localizado em uma variedade de regiões dentro do vetor, e pode ser compreendido de uma sequência contínua (por exemplo, um único ácido nucleico de preenchimento em um único local) ou sequências múltiplas (por exemplo, mais do que um ácido nucleico de preenchi- mento em mais do que um local (por exemplo, 2 locais, 3 locais, etc.) dentro do vetor. Em algumas modalidades, o ácido nucleico de preen- chimento pode ser localizado a jusante da sequência de RNAi. Em modalidades, o ácido nucleico de preenchimento pode ser localizado a montante da sequência de RNAi (por exemplo, entre o promotor e o ácido nucleico que codifica o RNAi). Como também será avaliado por aqueles de habilidade na técnica uma variedade de ácidos nucleicos pode ser usada como um ácido nucleico de preenchimento. Em algu- mas modalidades, o ácido nucleico de preenchimento compreende to- da ou uma porção de uma sequência de preenchimento de alfa-1- antitripsina humana (AAT) ou uma sequência de preenchimento de clone P1 de cromossomo 16 C16 P1 (C16 humano). Em algumas mo- dalidades, a sequência de preenchimento compreende todo ou uma porção de um gene. Por exemplo, a sequência de preenchimento compreende uma porção da sequência de AAT humana. Uma pessoa habilitada na técnica reconheceria que diferentes porções de um gene (por exemplo, a sequência de AAT humana) podem ser usadas como um fragmento de preenchimento. Por exemplo, o fragmento de preen- chimento pode ser da extremidade 5’ do gene, da extremidade 3’ do gene, o centro de um gene, uma porção que não de codificação do gene (por exemplo, um íntron), uma região de codificação do gene (por exemplo, um éxon), ou uma mistura de porções que não de codi- ficação e de codificação de um gene. Uma pessoa habilitada na técni- ca também reconheceria que toda ou uma porção da sequência de preenchimento pode ser usada como uma sequência de preenchimen- to. Em algumas modalidades, a sequência de preenchimento compre- ende a sequência de nucleotídeo da SEQ ID NO: 18.
[00159] Em outras modalidades, a partícula de rAAV compreende proteínas de capsídeo de AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AA6, AAV7, AAV8, AAV9, AAVrh,8, AAVrh8R, AAVrh,10, AAV11, AAV12, ou mutantes destas proteínas de capsídeo. Em algumas modalidades, uma proteína de capsídeo mutante mantém a capacidade para formar um capsídeo de AAV. Em algumas modalidades, a partícula de rAAV compreende capsídeo mutante de tirosina de AAV5 (Zhong L. et al., (2008) Proc Natl Acad Sci U S A 105(22):7827 - 7832. Em outras mo- dalidades, a partícula de rAAV compreende proteínas de capsídeo de um sorotipo de AAV de Clades A-F (Gao, et al., J. Virol. 2004, 78(12):6381).
[00160] Diferentes sorotipos de AAV são usados para otimizar a transdução de células alvos particulares ou para alvejar tipos celulares específicos dentro de um tecido alvo particular (por exemplo, um teci- do doente). Uma partícula de rAAV pode compreender proteínas virais e ácidos nucleicos virais do mesmo sorotipo ou um sorotipo misto. Por exemplo, em algumas modalidades, uma partícula de rAAV pode com- preender proteínas de capsídeo de AAV1 e pelo menos uma ITR de AAV2 ou ela pode compreender proteínas de capsídeo de AAV2 e pe- lo menos uma ITR de AAV1. Qualquer combinação de sorotipos de
AAV para a produção de uma partícula de rAAV é fornecida aqui como se cada combinação fosse expressamente estabelecida aqui. Em al- gumas modalidades, a invenção fornece partículas de rAAV compre- endendo um capsídeo de AAV1 e um vetor de rAAV da presente divul- gação (por exemplo, um cassete de expressão compreendendo o áci- do nucleico que codifica um RNAi da presente divulgação), flanquea- das por pelo menos uma ITR de AAV2. Em algumas modalidades, a invenção fornece partículas de rAAV compreendendo um capsídeo de AAV2.
[00161] Em alguns aspectos, a invenção fornece partículas virais compreendendo um genoma autocomplementar recombinante. Partí- culas virais de AAV com genomas autocomplementares e métodos de uso de genomas de AAV autocomplementares são descritos nas Pa- tentes dos EUA Nos 6.596.535; 7.125.717; 7.465.583; 7.785.888;
7.790.154; 7.846.729; 8.093.054; e 8.361.457; e Wang Z., et al., (2003) Gene Ther 10:2105 - 2111, cada uma das quais é incorporada aqui a título de referência em sua totalidade. Um rAAV compreenden- do um genoma autocomplementar prontamente formará uma molécula de DNA de fita dupla em virtude de suas sequências parcialmente complementares (por exemplo, fitas de codificação e não codificação complementares de um transgene). Em algumas modalidades, a in- venção fornece uma partícula de AAV viral compreendendo um geno- ma de AAV, em que o genoma de rAAV compreende uma primeira se- quência de polinucleotídeo heterólogo (por exemplo, um RNAi da pre- sente divulgação) e uma segunda sequência de polinucleotídeo hete- rólogo (por exemplo, fita antissenso de um RNAi da presente divulga- ção) em que a primeira sequência de polinucleotídeo heterólogo pode formar pares de base intrafita com a segunda sequência de polinucleo- tídeo ao longo da maior parte ou todo seu comprimento. Em algumas modalidades, a primeira sequência de polinucleotídeo heterólogo e uma segunda sequência de polinucleotídeo heterólogo são ligadas por uma sequência que facilita o pareamento de base intrafita; por exem- plo, uma estrutura de DNA em grampo de cabelo. Estruturas em grampo de cabelo são conhecidas na técnica, por exemplo em molé- culas de miRNA ou siRNA. Em algumas modalidades, a primeira se- quência de polinucleotídeo heterólogo e uma segunda sequência de polinucleotídeo heterólogo são ligadas por uma ITR mutada (por exemplo, a ITR direita). Em algumas modalidades, a ITR compreende a sequência de polinucleotídeo 5’-CCACTCCCTCTCTGCGCGCT
CGCTCGCTCACTGAGGCCGGGCGACCAAAGGTCGCCCGACGCC
CGGGCTTTGCCCGGGCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAG AGAGGGA-3 (SEQ ID NO: 15). A ITR mutada compreende uma dele- ção da região D compreendendo a sequência de resolução terminal. Como um resultado, na replicação de um genoma viral de AAV, as proteínas de rep não clivarão o genoma viral na ITR mutada e como tal, um genoma viral recombinante compreendendo a seguinte ordem 5’ a 3’ será empacotado em um capsídeo viral: uma ITR de AAV, a primeira sequência de polinucleotídeo heterólogo incluindo sequências reguladoras, a ITR de AAV mutado, o segundo polinucleotídeo heteró- logo em orientação reversa ao primeiro polinucleotídeo heterólogo e uma terceira ITR de AAV. Em algumas modalidades, a invenção for- nece partículas virais de AAV compreendendo um genoma viral re- combinante compreendendo uma ITR de AAV2 funcional, uma primei- ra sequência de polinucleotídeo que codifica um RNAi da presente di- vulgação, uma ITR mutada de AAV2 compreendendo uma deleção da região D e que carece de uma sequência de resolução terminal funci- onal, uma segunda sequência de polinucleotídeo compreendendo a sequência complementar à sequência que codifica um RNAi da pre- sente divulgação, da primeira sequência de polinucleotídeo e uma ITR de AAV2 funcional.
[00162] Em algumas modalidades, a partícula viral é uma partícula adenoviral. Em algumas modalidades, a partícula adenoviral é uma partícula adenoviral recombinante, por exemplo, um vetor de polinu- cleotídeo compreendendo um RNAi da presente divulgação entre duas ITRs. Em algumas modalidades, a partícula adenoviral carece de ou contém uma cópia defeituosa de um ou mais genes E1, que torna a replicação de adenovírus defeituosa. Adenovírus incluem um genoma de DNA de fita dupla, linear dentro de um capsídeo icosaédrico não envelopado, grande (~950Å). Adenovírus têm um genoma grande que pode incorporar mais do que 30kb de sequência heteróloga (por exemplo, no lugar da região E1 e/ou E3), tornando-os unicamente adequados para o uso com genes heterólogos maiores. Eles também são conhecidos infectar células divisoras e não divisoras e não inte- gram naturalmente no genoma do hospedeiro (embora variantes híbri- das possam possuir esta capacidade). Em algumas modalidades, o vetor adenoviral pode ser um vetor adenoviral de primeira geração com uma sequência heteróloga no lugar de E1. Em algumas modali- dades, o vetor adenoviral pode ser um vetor adenoviral de segunda geração com mutações ou deleções adicionais em E2A, E2B, e/ou E4. Em algumas modalidades, o vetor adenoviral pode ser um vetor ade- noviral de terceira geração ou estripado que carece de todos os genes de codificação viral, mantendo apenas as ITRs e sinal de empacota- mento e requerendo um adenovírus auxiliar em trans para replicação, e empacotamento. Partículas adenovirais foram investigadas para o uso como vetores para a transfecção transitória de células mamíferas bem como vetores de terapia genética. Para mais descrição, consultar, para exemplo, Danthinne, X. e Imperiale, M.J. (2000) Gene Ther. 7:1707 - 14 e Tatsis, N. e Ertl, H.C. (2004) Mol. Ther. 10:616 - 29.
[00163] Em algumas modalidades, a partícula viral é uma partícula adenoviral recombinante compreendendo um ácido nucleico que codi-
fica um RNAi da presente divulgação.
O uso de qualquer sorotipo ade- noviral é considerado dentro do escopo da presente invenção.
Em al- gumas modalidades, o vetor adenoviral recombinante é um vetor deri- vado de um sorotipo adenoviral, incluindo sem limitação, AdHu2, AdHu 3, AdHu4, AdHu5, AdHu7, AdHu11, AdHu24, AdHu26, AdHu34, Ad- Hu35, AdHu36, AdHu37, AdHu41, AdHu48, AdHu49, AdHu50, AdC6, AdC7, AdC69, Ad bovino tipo 3, Ad canino tipo 2, Ad ovino, e Ad por- cino tipo 3. A partícula adenoviral também compreende proteínas de capsídeo.
Em algumas modalidades, as partículas virais recombinan- tes compreendem uma partícula adenoviral em combinação com uma ou mais proteínas de capsídeo viral estranho.
Tais combinações po- dem ser referidas como partículas adenovirais recombinantes pseudo- tipadas.
Em algumas modalidades, proteínas de capsídeo viral estra- nho usadas em partículas adenovirais recombinantes pseudotipadas são derivadas de um vírus estranho ou de um outro sorotipo adenovi- ral.
Em algumas modalidades, as proteínas de capsídeo viral estranho são derivadas de, incluindo sem limitação, reovírus tipo 3. Exemplos de combinações de vetor e proteína de capsídeo usadas em partículas adenovirais pseudotipadas podem ser encontrados nas seguintes refe- rências (Tatsis, N. et al. (2004) Mol.
Ther. 10(4):616 - 629 e Ahi, Y. et al. (2011) Curr.
Gene Ther. 11(4):307 - 320). Diferentes sorotipos de adenovírus podem ser usados para otimizar a transdução de células alvos particulares ou para alvejar tipos celulares específicos dentro de um tecido alvo particular (por exemplo, um tecido doente). Tecidos ou células alvejados por sorotipos adenovirais específicos, incluem sem limitação, pulmão (por exemplo, HuAd3), baço e fígado (por exemplo, HuAd37), músculo liso, sinoviócitos, células dendríticas, células cardi- ovasculares, linhagens de célula tumoral (por exemplo, HuAd11), e células dendríticas (por exemplo, HuAd5 pseudotipado com reovírus tipo 3, HuAd30, ou HuAd35). Para mais descrição, consultar Ahi, Y. et al. (2011) Curr. Gene Ther. 11(4):307 - 320, Kay, M. et al. (2001) Nat. Med. 7(1):33 - 40, e Tatsis, N. et al. (2004) Mol. Ther. 10(4):616 - 629. Vetores adenovirais foram administrados por administração intraestri- ado (consultar, para exemplo, Mittoux, V. et al. (2002) J. Neurosci. 22:4478 - 86).
[00164] Em algumas modalidades, a partícula viral é uma partícula lentiviral. Em algumas modalidades, a partícula lentiviral é uma partí- cula lentiviral recombinante, por exemplo, um vetor de polinucleotídeo que codifica um RNAi da presente divulgação entre duas LTRs. Lenti- vírus são retrovírus de ssRNA de sentido positivo com um genoma de aproximadamente 10 kb. Lentivírus são conhecidos integrar no geno- ma de células divisoras e não divisoras. Partículas lentivirais podem ser produzidas, por exemplo, transfectando-se plasmídeos múltiplos (tipicamente o genoma lentiviral e os genes necessários para replica- ção e/ou empacotamento são separados para impedir a replicação vi- ral) em uma linhagem de célula de empacotamento, que empacota o genoma lentiviral modificado em partículas lentivirais. Em algumas modalidades, uma partícula lentiviral pode se referir a um vetor de pri- meira geração que carece da proteína de envelope. Em algumas mo- dalidades, uma partícula lentiviral pode se referir a um vetor de segun- da geração que carece de todos os genes exceto as regiões de gag/pol e tat/rev. Em algumas modalidades, uma partícula lentiviral pode se referir a um vetor de terceira geração que apenas contém os genes rev, gag, e pol endógenos e tem um LTR quimérico para trans- dução sem o gene tat (consultar Dull, T. et al. (1998) J. Virol. 72:8463 - 71). Para mais descrição, consultar Durand, S. e Cimarelli, A. (2011) Viruses 3:132 - 59.
[00165] Em algumas modalidades, a partícula viral é uma partícula lentiviral recombinante compreendendo um ácido nucleico que codifica um RNAi da presente divulgação. O uso de qualquer vetor lentiviral é considerado dentro do escopo da presente invenção.
Em algumas modalidades, o vetor lentiviral é derivado de um lentivírus incluindo, sem limitação, vírus da imunodeficiência humana-1 (HIV-1), vírus da imunodeficiência humana-2 (HIV-2), vírus da imunodeficiência símia (SIV), vírus da imunodeficiência felina (FIV), vírus da anemia infeccio- sa equina (EIAV), vírus da imunodeficiência bovina (BIV), vírus da do- ença de Jembrana (JDV), vírus visna (VV), e vírus da artrite encefalite caprina (CAEV). A partícula lentiviral também compreende proteínas de capsídeo.
Em algumas modalidades, as partículas virais recombi- nantes compreendem um vetor lentiviral em combinação com uma ou mais proteínas de capsídeo viral estranho.
Tais combinações podem ser referidas como partículas lentivirais recombinantes pseudotipadas.
Em algumas modalidades, proteínas de capsídeo viral estranho usa- das em partículas lentivirais recombinantes pseudotipadas são deriva- das de um vírus estranho.
Em algumas modalidades, a proteína de capsídeo viral estranho usada em partículas lentivirais recombinantes pseudotipadas é a glicoproteína do vírus da estomatite vesicular (VSV- GP). VSV-GP interage com um receptor celular ubíquo, fornecendo amplo tropismo tecidual a partículas lentivirais recombinantes pseudo- tipadas.
Além disso, VSV-GP é considerada fornecer estabilidade mais alta a partículas lentivirais recombinantes pseudotipadas.
Em outras modalidades, as proteínas de capsídeo viral estranho são derivadas de, incluindo sem limitação, vírus Chandipura, vírus da Raiva, vírus Mokola, vírus da coriomeningite linfocítica (LCMV), vírus Ross River (RRV), vírus Sindbis, vírus Semliki Forest (SFV), vírus da encefalite equina venezuelana, vírus Ebola Reston, vírus Ebola Zaire, vírus Mar- burg, vírus Lassa, vírus da leucose aviária (ALV), retrovírus de ovelha Jaagsiekte (JSRV), vírus da leucemia de murino Moloney (MLV), vírus da leucemia ape de Gibbon (GALV), retrovírus endógeno felino (RD114), vírus linfotrópico T humano 1 (HTLV-1), vírus espumoso hu-
mano, vírus Maedi-Visna (MVV), SARS-CoV, vírus Sendai, vírus sinci- cial respiratório (RSV), vírus parainfluenza humano tipo 3, vírus da Hepatite C (HCV), vírus Influenza, vírus da peste aviária (FPV), ou ví- rus nucleopoliédrico múltiplo de Autographa californica (AcMNPV). Exemplos de combinações de vetor e proteína de capsídeo usados em partículas lentivirais pseudotipadas podem ser encontrados, por exemplo, em Cronin, J. et al. (2005). Curr. Gene Ther. 5(4):387 - 398. Diferentes partículas lentivirais recombinantes pseudotipadas podem ser usadas para otimizar a transdução de células alvos particulares ou para alvejar tipos celulares específicos dentro de um tecido alvo parti- cular (por exemplo, um tecido doente). Por exemplo, tecidos alvejados por partículas lentivirais recombinantes pseudotipadas específicas, in- cluem sem limitação, fígado (por exemplo, pseudotipadas com uma proteína de VSV-G, LCMV, RRV, ou SeV F), pulmão (por exemplo, pseudotipadas com uma proteína de Ebola, Marburg, SeV F e HN, ou JSRV), células das ilhotas pancreáticas (por exemplo, pseudotipadas com uma proteína de LCMV), sistema nervoso central (por exemplo, pseudotipadas com uma proteína de VSV-G, LCMV, Raiva, ou Moko- la), retina (por exemplo, pseudotipadas com uma proteína de VSV-G ou Mokola), monócitos ou músculo (por exemplo, pseudotipadas com um proteína de Mokola ou Ebola), sistema hematopoiético (por exem- plo, pseudotipadas com uma proteína de RD114 ou GALV), ou células cancerosas (por exemplo, pseudotipadas com uma proteína de GALV ou LCMV). Para mais descrição, consultar Cronin, J. et al. (2005). Curr. Gene Ther. 5(4):387 - 398 e Kay, M. et al. (2001) Nat. Med. 7(1):33 - 40.
[00166] Em algumas modalidades, a partícula viral é uma partícula de vírus do herpes simples (HSV). Em algumas modalidades, a partí- cula de HSV é uma partícula de rHSV, por exemplo, um vetor de poli- nucleotídeo que codifica um RNAi da presente divulgação entre duas
TRs. HSV é um vírus de DNA de fita dupla, envelopado com um ge- noma de aproximadamente 152 kb. Vantajosamente, aproximadamen- te metade de seus genes são não essenciais e podem ser suprimidos para acomodar a sequência heteróloga. Partículas de HSV infectam células não divisoras. Além disso, elas estabelecem naturalmente la- tência em neurônios, percorrem por transporte retrógrado, e podem ser transferidas através de sinapses, tornando-as vantajosas para a transfecção de neurônios e/ou abordagens de terapia genética envol- vendo o sistema nervoso. Em algumas modalidades, a partícula de HSV pode ser defeituosa de replicação ou competente de replicação (por exemplo, competente para um único ciclo de replicação através da inativação de um ou mais genes tardios). Para mais descrição, consultar Manservigi, R. et al. (2010) Open Virol. J. 4:123 - 56.
[00167] Em algumas modalidades, a partícula viral é uma partícula de rHSV compreendendo um ácido nucleico que codifica um RNAi da presente divulgação. O uso de qualquer vetor de HSV é considerado dentro do escopo da presente invenção. Em algumas modalidades, o vetor de HSV é derivado de um sorotipo de HSV, incluindo sem limita- ção, HSV-1 e HSV-2. A partícula de HSV também compreende proteí- nas de capsídeo. Em algumas modalidades, as partículas virais re- combinantes compreendem um vetor de HSV em combinação com uma ou mais proteínas de capsídeo viral estranho. Tais combinações podem ser referidas como partículas de rHSV pseudotipadas. Em al- gumas modalidades, proteínas de capsídeo viral estranho usadas em partículas de rHSV pseudotipadas são derivadas de um vírus estranho ou de um outro sorotipo de HSV. Em algumas modalidades, a proteína de capsídeo viral estranho usada em uma partícula de rHSV pseudoti- pada é uma glicoproteína do vírus da estomatite vesicular (VSV-GP). VSV-GP interage com um receptor celular ubíquo, fornecendo amplo tropismo tecidual às partículas de rHSV pseudotipadas. Além disso,
VSV-GP é considerada fornecer estabilidade mais alta a partículas de rHSV pseudotipadas. Em outras modalidades, a proteína de capsídeo viral estranho pode ser de um sorotipo de HSV diferente. Por exemplo, um vetor de HSV-1 pode conter uma ou mais proteínas de capsídeo de HSV-2. Diferentes sorotipos de HSV podem ser usados para otimi- zar a transdução de células alvos particulares ou para alvejar tipos ce- lulares específicos dentro de um tecido alvo particular (por exemplo, um tecido doente). Tecidos ou células alvejados por sorotipos adenovi- rais específicos incluem sem limitação, sistema nervoso central e neu- rônios (por exemplo, HSV-1). Para mais descrição, consultar Manser- vigi, R. et al. (2010) Open Virol J 4:123 - 156, Kay, M. et al. (2001) Nat. Med. 7(1):33 - 40, e Meignier, B. et al. (1987) J. Infect. Dis. 155(5):921 - 930. Produção de partículas virais
[00168] Partículas de rAAV podem ser produzidas usando métodos conhecidos na técnica. Consultar, para exemplo, as Pat. dos EUA Nos
6.566.118; 6.989.264; e 6.995.006. Em praticar a invenção, células hospedeiras para produzir partículas de rAAV incluem células mamífe- ras, células de inseto, células vegetais, microrganismos e levedura. Células hospedeiras também podem ser células de empacotamento em que os genes rep e cap de AAV são estavelmente mantidas na cé- lula hospedeira ou células produtoras em que o genoma vetorial de AAV é estavelmente mantido. Células de empacotamento e produtoras exemplares são derivadas de células 293, A549 ou HeLa. Vetores de AAV são purificados e formulados usando técnicas padrão conhecidas na técnica.
[00169] Métodos conhecidos na técnica para a produção de vetores de rAAV incluem mas não são limitados a transfecção, produção de linhagem celular estável, e sistemas de produção de vírus híbrido in- feccioso que incluem híbridos de adenovírus-AAV, híbridos de herpes-
vírus-AAV (Conway, JE et al., (1997) J. Virology 71(11):8780 - 8789) e híbridos de baculovírus-AAV. Todas as culturas de produção de rAAV para a produção de partículas virais de rAAV requerem; 1) células hospedeiras adequadas, incluindo, por exemplo, linhagens celulares derivadas de ser humano tais como células HeLa, A549, ou 293, ou linhagens celulares derivadas de inseto tais como SF-9, no caso de sistemas de produção de baculovírus; 2) função de vírus auxiliar ade- quada, fornecida pelo adenovírus do tipo selvagem ou mutante (tal como adenovírus sensível à temperatura), vírus do herpes, baculoví- rus, ou uma construção de plasmídeo fornecendo funções auxiliares; 3) genes e produtos genéticos rep e cap de AAV; 4) um ácido nucleico (tal como um ácido nucleico terapêutico) flanqueado por pelo menos uma sequência de ITR de AAV; e 5) meios adequados e componentes dos meios para sustentar a produção de rAAV. Em algumas modalida- des, os produtos genéticos de rep e cap de AAV podem ser de qual- quer sorotipo de AAV. Em geral, mas não obrigatório, o produto gené- tico rep de AAV é do mesmo sorotipo como as ITRs do genoma vetori- al de rAAV contanto que os produtos genéticos rep possam funcionar para replicar e empacotar o genoma de rAAV. Meios adequados co- nhecidos na técnica podem ser usados para a produção de vetores de rAAV. Estes meios incluem, sem limitação, meios produzidos por Hyclone Laboratories e JRH incluindo Meio de Eagle Modificado (MEM), Meio de Eagle Modificado por Dulbecco (DMEM), formulações personalizadas tais como aquelas descritas na Patente dos EUA No
6.566.118, e meios Sf-900 II SFM como descrito na Patente dos EUA No 6.723.551, cada uma das quais é incorporada aqui a título de refe- rência em sua totalidade, particularmente com respeito a formulações de meios personalizados para o uso na produção de vetores de AAV recombinantes. Em algumas modalidades, as funções auxiliares de AAV são fornecidas por adenovírus ou HSV. Em algumas modalida-
des, as funções auxiliares de AAV são fornecidas por baculovírus e a célula hospedeira é uma célula de inseto (por exemplo, células de Spodoptera frugiperda (Sf9)).
[00170] Em algumas modalidades, partículas de rAAV podem ser produzidas por um método de transfecção tripla, tal como o método de transfecção tripla exemplar fornecido infra. Brevemente, um plasmídeo contendo um gene rep e um gene de capsídeo, junto com um plasmí- deo adenoviral auxiliar, pode ser transfectado (por exemplo, usando o método de fosfato de cálcio) em uma linhagem celular (por exemplo, células HEK-293), e o vírus pode ser coletado e opcionalmente purifi- cado. Como tal, em algumas modalidades, a partícula de rAAV foi pro- duzida por transfecção tripla de um ácido nucleico que codifica o vetor de rAAV, um ácido nucleico que codifica rep e cap de AAV, e um ácido nucleico que codifica funções auxiliares de vírus AAV em uma célula hospedeira, em que a transfecção dos ácidos nucleicos às células hospedeiras gera uma célula hospedeira capaz de produzir partículas de rAAV.
[00171] Em algumas modalidades, partículas de rAAV podem ser produzidas por um método de linhagem de célula produtora, tal como o método de linhagem de célula produtora exemplar fornecido infra (consultar também (referenciado em Martin et al., (2013) Human Gene Therapy Methods 24:253 - 269). Brevemente, uma linhagem celular (por exemplo, uma linhagem de célula HeLa) pode ser estavelmente transfectada com um plasmídeo contendo um gene rep, um gene de capsídeo, e uma sequência de ácido nucleico promotor-heterólogo. Linhagens celulares podem ser triadas para selecionar um clone prin- cipal para a produção de rAAV, que depois pode ser expandido para um biorreator de produção e infectado com um adenovírus (por exem- plo, um adenovírus do tipo selvagem) como auxiliar para iniciar a pro- dução de rAAV. O vírus pode ser subsequentemente colhido, o adeno-
vírus pode ser inativado (por exemplo, por calor) e/ou removido, e as partículas de rAAV podem ser purificadas. Como tal, em algumas mo- dalidades, a partícula de rAAV foi produzida por uma linhagem de cé- lula produtora compreendendo um ou mais de ácido nucleico que codi- fica o vetor de rAAV, um ácido nucleico que codifica rep e cap de AAV, e um ácido nucleico que codifica funções auxiliares de vírus AAV.
[00172] Em alguns aspectos, um método é fornecido para produzir qualquer partícula de rAAV como divulgado aqui compreendendo (a) cultivar uma célula hospedeira sob uma condição de modo que partí- culas de rAAV sejam produzidas, em que a célula hospedeira compre- ende (i) um ou mais genes de empacotamento de AAV, em que cada um do dito gene de empacotamento de AAV codifica uma proteína de replicação e/ou encapsidação de AAV; (ii) um pró-vetor de rAAV com- preendendo um ácido nucleico que codifica um RNAi da presente di- vulgação como descrito aqui flanqueado por pelo menos uma ITR de AAV, e (iii) uma função auxiliar de AAV; e (b) recuperar as partículas de rAAV produzidas pela célula hospedeira. Em algumas modalidades, o RNAi compreende a sequência de nucleotídeo da SEQ ID NO: 7. Em algumas modalidades, a dita pelo menos uma ITR de AAV é selecio- nada do grupo consistindo em ITRs de ITRs de AAV são AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAVrh8, AAVrh8R, AAV9, AAV10, AAVrh10, AAV11, AAV12, AAV2R471A, AAV DJ, um sorotipo de capsídeo de AAV de cabra, AAV bovino, ou AAV de camundongo ou semelhantes. Em algumas modalidades, a dita proteína de encap- sidação é selecionada do grupo consistindo em AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6 (por exemplo, um capsídeo de AAV6 do tipo sel- vagem, ou um capsídeo de AAV6 variante tal como ShH10, como des- crito na Pub. de PG dos EUA 2012/0164106), AAV7, AAV8, AAVrh8, AAVrh8R, AAV9 (por exemplo, um capsídeo de AAV9 do tipo selva- gem, ou um capsídeo de AAV9 modificado como descrito na Pub. de
PG dos EUA 2013/0323226), AAV10, AAVrh10, AAV11, AAV12, um mutante de capsídeo de tirosina, um mutante de capsídeo de ligação à heparina, um capsídeo de AAV2R471A, um capsídeo de AAVAAV2/2- 7m8, um capsídeo de AAV DJ (por exemplo, um capsídeo de AAV- DJ/8, um capsídeo de AAV-DJ/9, ou quaisquer outros dos capsídeos descritos na Pub. de PG dos EUA 2012/0066783), capsídeo de AAV2 N587A, capsídeo de AAV2 E548A, capsídeo de AAV2 N708A, capsí- deo de AAV V708K, capsídeo de AAV de cabra, capsídeo de AAV1/AAV2 quimérico, capsídeo de AAV bovino, capsídeo de AAV de camundongo, capsídeo de rAAV2/HBoV1, ou um capsídeo de AAV descrito na Pat. dos EUA No 8.283.151 ou Publicação Internacional No WO/2003/042397. Em algumas modalidades, uma proteína de capsí- deo mutante mantém a capacidade de formar um capsídeo de AAV.
Em algumas modalidades, a proteína de encapsidação é uma proteína de capsídeo mutante de AAV5 tirosina.
Em outras modalidades, a par- tícula de rAAV compreende proteínas de capsídeo de um sorotipo de AAV de Clades A-F.
Em algumas modalidades, as partículas de rAAV compreendem um capsídeo de AAV1 e um genoma recombinante compreendendo ITRs de AAV2, uma ITR de AAV2 mutante e ácido nucleico que codifica um RNAi da presente divulgação.
Em uma outra modalidade, as partículas de rAAV são purificadas.
O termo "purifica- do" como usado aqui inclui uma preparação de partículas de rAAV destituída de pelo menos alguns dos outros componentes que também podem estar presentes onde as partículas de rAAV ocorrem natural- mente ou são inicialmente preparadas a partir dos mesmos.
Assim, por exemplo, partículas de rAAV isoladas podem ser preparadas usando uma técnica de purificação para enriquecê-la de uma mistura de ori- gem, tal como um lisato de cultura ou sobrenadante da cultura de pro- dução.
O enriquecimento pode ser medido em uma variedade de mo- dos, tais como, por exemplo, pela proporção de partículas resistentes a DNase (DRPs) ou cópias de genoma (gc) presentes em uma solu- ção, ou por infectividade, ou ele pode ser medido em relação a uma substância potencialmente interferente, secundária presente na mistu- ra de origem, tal como contaminantes, incluindo contaminantes da cul- tura de produção ou contaminantes dentro do processo, incluindo vírus auxiliar, componentes do meio, e similares.
[00173] Numerosos métodos são conhecidos na técnica para a pro- dução de partículas de vetor adenoviral. Por exemplo, para um vetor adenoviral estripado, o genoma do vetor adenoviral e um genoma adenoviral auxiliar podem ser transfectados em uma linhagem de célu- la de empacotamento (por exemplo, uma linhagem de célula 293). Em algumas modalidades, o genoma adenoviral auxiliar pode conter sítios de recombinação flanqueando seu sinal de empacotamento, e ambos os genomas podem ser transfectados em uma linhagem de célula de empacotamento que expressa uma recombinase (por exemplo, o sis- tema Cre/loxP pode ser usado), tal que o vetor adenoviral de interesse é empacotado mais eficientemente do que o adenovírus auxiliar (con- sultar, para exemplo, Alba, R. et al. (2005) Gene Ther. 12 Suppl 1:S18 - 27). Vetores adenovirais podem ser colhidos e purificados usando métodos padrão, tais como aqueles descritos aqui.
[00174] Numerosos métodos são conhecidos na técnica para a pro- dução de partículas de vetor lentiviral. Por exemplo, para um vetor len- tiviral de terceira geração, um vetor contendo o genoma lentiviral de interesse com genes gag e pol pode ser cotransfectado em uma linha- gem de célula de empacotamento (por exemplo, uma linhagem de cé- lula 293) junto com um vetor contendo um gene rev. O genoma lentivi- ral de interesse também contém um LTR quimérico que promove a transcrição na ausência de Tat (consultar Dull, T. et al. (1998) J. Virol. 72:8463 - 71). Vetores lentivirais podem ser colhidos e purificados usando métodos (por exemplo, Segura MM, et al., (2013) Expert Opin
Biol Ther. 13(7):987 - 1011) descritos aqui.
[00175] Numerosos métodos são conhecidos na técnica para a pro- dução de partículas de HSV. Vetores de HSV podem ser colhidos e purificados usando métodos padrão, tais como aqueles descritos aqui. Por exemplo, para um vetor de HSV defeituoso de replicação, um ge- noma de HSV de interesse que carece de todos os genes iniciais ime- diatos (IE) pode ser transfectado em uma linhagem celular comple- mentar que fornece genes necessários para a produção viral, tal como ICP4, ICP27, e ICP0 (consultar, para exemplo, Samaniego, L.A. et al. (1998) J. Virol. 72:3307 - 20). Vetores de HSV podem ser colhidos e purificados usando métodos descritos (por exemplo, Goins, WF et al., (2014) Herpes Simplex Virus Methods in Molecular Biology 1144:63 - 79).
[00176] Também fornecidas aqui são composições farmacêuticas compreendendo uma partícula viral recombinante compreendendo um transgene que codifica um RNAi da presente divulgação e um veículo farmaceuticamente aceitável. As composições farmacêuticas podem ser adequadas para qualquer modo de administração descrito aqui. Uma composição farmacêutica de uma partícula viral recombinante compreendendo um ácido nucleico que codifica um RNAi da presente divulgação pode ser introduzida ao cérebro. Por exemplo, uma partícu- la viral recombinante compreendendo um ácido nucleico que codifica um RNAi da presente divulgação pode ser administrada intraestriado. Qualquer uma das partículas virais recombinantes da presente divul- gação pode ser usada, incluindo partículas de rAAV, adenovirais, lenti- virais, e HSV.
[00177] Em algumas modalidades, as composições farmacêuticas compreendendo uma partícula viral recombinante compreendendo um transgene que codifica um RNAi da presente divulgação descrito aqui e um veículo farmaceuticamente aceitável são adequadas para admi-
nistração ao ser humano. Tais veículos são bem conhecidos na técni- ca (consultar, para exemplo, Remington’s Pharmaceutical Sciences, 15th Edition, pp. 1035 - 1038 e 1570 - 1580). Em algumas modalida- des, as composições farmacêuticas compreendendo um rAAV descrito aqui e um veículo farmaceuticamente aceitável é adequado para inje- ção no cérebro de um mamífero (por exemplo, administração intraes- triado). Em algumas modalidades, as composições farmacêuticas compreendendo uma partícula lentiviral recombinante descrita aqui e um veículo farmaceuticamente aceitável são adequadas para injeção no cérebro de um mamífero (por exemplo, administração intraestria- do). Em algumas modalidades, as composições farmacêuticas com- preendendo uma partícula adenoviral recombinante descrita aqui e um veículo farmaceuticamente aceitável são adequadas para injeção no cérebro de um mamífero (por exemplo, administração intraestriado). Em algumas modalidades, as composições farmacêuticas compreen- dendo uma partícula de HSV recombinante descrita aqui e um veículo farmaceuticamente aceitável são adequadas para injeção no cérebro de um mamífero (por exemplo, administração intraestriado).
[00178] Tais veículos farmaceuticamente aceitáveis podem ser lí- quidos estéreis, tais como água e óleo, incluindo aqueles de origem de petróleo, animal, vegetal ou sintética, tal como óleo de amendoim, óleo de soja, óleo mineral, e similares. Soluções salinas e soluções aquo- sas de dextrose, polietilenoglicol (PEG) e glicerol também podem ser utilizadas como veículos líquidos, particularmente para soluções inje- táveis. A composição farmacêutica pode compreender ainda ingredien- tes adicionais, por exemplo conservantes, tampões, agentes de tonici- dade, antioxidantes e estabilizadores, agentes umectantes ou clarifi- cantes não iônicos, agentes aumentadores de viscosidade, e similares. As composições farmacêuticas descritas aqui podem ser empacotadas em dosagens unitárias únicas ou em formas de multidosagem. As composições são geralmente formuladas como solução estéril e subs- tancialmente isotônica. VII. Artigos de Fabricação e Kits
[00179] Também fornecidos são kits ou artigos de fabricação para o uso nos métodos descritos aqui. Em aspectos, os kits compreendem as composições descritas aqui (por exemplo, uma partícula viral re- combinante da presente divulgação, tal como uma partícula de rAAV compreendendo o ácido nucleico que codifica um RNAi da presente divulgação) em empacotamento adequado. Empacotamentos adequa- dos para composições (tais como composições intraestriado) descritas aqui são conhecidos na técnica, e incluem, por exemplo, frascos (tais como frascos selados), vasos, ampolas, garrafas, jarras, empacota- mento flexível (por exemplo, sacos de Mylar ou plásticos selados), e similares. Estes artigos de fabricação podem ser ainda esterilizados e/ou selados.
[00180] A presente invenção também fornece kits compreendendo composições descritas aqui e pode compreender ainda instrução(ões) sobre os métodos de usar a composição, tais como os usos descritos aqui. Os kits descritos aqui podem incluir ainda outros materiais dese- jáveis a partir de um ponto de vista comercial e do usuário, incluindo outros tampões, diluentes, filtros, agulhas, seringas, e bulas com ins- truções para realizar quaisquer métodos descritos aqui. Por exemplo, em algumas modalidades, o kit compreende uma composição de par- tículas virais recombinantes compreendendo um transgene que codifi- ca um RNAi da presente divulgação para a liberação de pelo menos 1 × 109 cópias de genoma no cérebro de um mamífero (por exemplo, através de administração intraestriado) a um primata como descrito aqui, um veículo farmaceuticamente aceitável adequado para injeção no cérebro de um primata, e um ou mais de: um tampão, um diluente, um filtro, uma agulha, uma seringa, e uma bula com instruções para realizar as injeções no cérebro de um primata (por exemplo, adminis- tração intraestriado). Em algumas modalidades, o kit compreende ins- truções para tratar doença de Huntington com as partículas virais re- combinantes descritas aqui. Em algumas modalidades, o kit compre- ende instruções para usar as partículas virais recombinantes descritas aqui de acordo com qualquer um dos métodos descritos aqui.
EXEMPLOS
[00181] A invenção será mais completamente entendida a título de referência aos exemplos seguintes. Eles não devem, entretanto, ser interpretados como limitando o escopo da invenção. É entendido que os exemplos e modalidades descritos aqui são para propósitos ilustra- tivos apenas e que várias modificações ou mudanças à luz desta se- rão sugeridas a pessoas habilitadas na técnica e devem ser incluídas dentro do espírito e alcance deste pedido e escopo das reivindicações anexas. Exemplo 1: AAV2/1-miRNA-Htt reduz a expressão de Htt in vitro.
[00182] O RNA de interferência (RNAi) fornece uma abordagem pa- ra o tratamento de muitas doenças humanas. Entretanto, a segurança de terapias com base em RNAi pode ser prejudicada pela capacidade de RNAs inibitórios pequenos (siRNAs) de se ligarem a mRNAs não intencionados e reduzirem sua expressão, um efeito conhecido como silenciamento gênico fora do alvo. O alvejamento fora do alvo princi- palmente ocorre quando a região de semente (nucleotídeos 2 a 8 do RNA pequeno) emparelha com as sequências em 3′-UTRs de mRNAs não intencionados e direciona a repressão e desestabilização traduci- onais destes transcritos. Até agora, a maioria das sequências de RNAi terapêuticas são selecionadas principalmente quanto à eficácia de si- lenciamento gênico, e mais tarde avaliadas quanto à segurança. Dois siRNAs foram gerados para tratar doença de Huntington (HD), um transtorno neurodegenerativo dominante, com potencial de alvejamen-
to fora do alvo mínimo (isto é, aqueles com uma escassez de comple- mentos de semente dentro de todas as 3′-UTRs humanas e de maca- co-reso conhecidas) que demonstra silenciamento de huntingtina po- tente no cérebro do camundongo com um perfil fora do alvo baixo in silico (Tabela 1, Figura 1A). Uma sequência (207) foi testada quanto à sua capacidade de resgatar fenótipos comportamentais no modelo de camundongo YAC128 de HD. A liberação no estriado de AAV2/1- miRNA-Htt-207 não apenas reduz níveis de mRNA e proteína Htt no cérebro, mas também corrige os perfis comportamentais aberrantes em camundongos YAC128 e demonstra atividade guia de fita alta e processamento em 5’ preciso, minimizando o potencial para efeitos fora de alvo. TABELA 1. Sequências de miRNA e complemento reverso (alvo) para 206 e 207 bem como para as sequências de topo e fundo para clona- gem, incluindo projeções do sítio de restrição. ID do Componente Sequência SEQ miRNA ID NO: 206 sequência de miRNA (antissenso, 5’→3’) uGGCCGUCCAUCUUGGACCCG 1 206 complemento reverso CGGGUCCAAGAUGGACGGCCa 2 (senso, 5’→3’) 206 sequência de DNA que codifica o dúplex de miRNA GTGGCCGTCCATCTTGGACC 3
CGGTTTTGGCCACTGACTGA
CCGGGTCCAATGGACGGCCA 206 sequência de RNA de dúplex de miRNA GUGGCCGUCCAUCUUGGACC 4
CGGUUUUGGCCACUGACUGA
CCGGGUCCAAUGGACGGCCA 206 sequência de topo para clonagem (5’→3’) de haste-alça TGCTGTGGCCGTCCATCTTG 5 que contém a sequência de miRNA real, incluindo proje- GACCCGGTTTTGGCCACTGA ções do sítio de restrição para clonagem* CTGACCGGGTCCAATGGACG
GCCA 206 sequência de fundo para clonagem (5’→3’) de complemen- CCTGTGGCCGTCCATTGGAC 6 to reverso da sequência em coluna para o lado esquerdo, CCGGTCAGTCAGTGGCCAAA incluindo projeções do sítio de restrição para clonagem* ACCGGGTCCAAGATGGACGG
CCAC 207 sequência de miRNA (antissenso, 5’→3’) AGUCGGUGUGGUUGACAAGCA 7 207 complemento reverso UGCUUGUCAACCACACCGACU 8 (senso, 5’→3’) 207 sequência de DNA que codifica o dúplex de miRNA AGTCGGTGTGGTTGACAAGCA 9
GTTTTGGCCACTGACTGACTG
CTTGTCCCACACCGACT 207 sequência de RNA de dúplex de miRNA AGUCGGUGUGGUUGACAAGCA 10
GUUUUGGCCACUGACUGACUG
CUUGUCCCACACCGACU 207 sequência de topo para clonagem (5’→3’) de haste-alça TGCTGAGTCGGTGTGGTTGA 11 que contém a sequência de miRNA real, incluindo proje- CAAGCAGTTTTGGCCACTGA ções do sítio de restrição para clonagem* CTGACTGCTTGTCCCACACC
GACT 207 sequência de fundo para clonagem (5’→3’) de complemen- CCTGAGTCGGTGTGGGACAA 12 to reverso de sequência em coluna para o lado esquerdo, GCAGTCAGTCAGTGGCCAAA incluindo projeções do sítio de restrição para clonagem* ACTGCTTGTCAACCACACCG
ACTC
*Para sequências para clonagem-Projeções do sítio de restrição para clonagem são sublinhadas; sequências de miRNA em negrito; se- quência de alça em texto simples; bases 1 a 8 de complemento rever- so de miRNA em negrito, itálico; bases 11 a 21 (11 a 20 para 170XX) de complemento reverso de miRNA em itálico.
[00183] A capacidade de AAV2/1-miRNA-Htt 206 e 207 de mediar a redução de mRNA de huntingtina humana foi testada in vitro usando células de rim embrionário humano (HEK293). Os plasmídeos de ex- pressão AAV2/1-miRNA-206 e 207, bem como um plasmídeo de con- trole positivo (170XA) contendo uma sequência de miRNA previamen- te mostrada para reduzir níveis de Htt em aproximadamente 50 %, fo- ram células HEK293 transfectadas (8 réplicas por tratamento). As célu- las foram transfectadas usando reagente de transfecção Fugene e co- lhidas 48 horas mais tarde. O RNA total foi isolado usando o TaqMan® Cells-to-CT™ Kit (Ambion). Níveis de RNA foram medidos por RT-PCR em tempo real quantitativa (conduzida e analisada em um ABI Prisma 7500 Sequence Detector (Applied Biosystems)). Níveis de expressão foram normalizados a PPIA (peptidilprolil isomerase) humana. Como mostrado na Figura 2, níveis de mRNA de Htt humana foram reduzidos a seguir da transfecção tanto com os plasmídeos 206 quanto 207 comparados aos controles não tratados. O nível de redução de Htt foi aproximadamente equivalente comparado ao controle positivo de 170XA. Exemplo 2: AAV2/1-miRNA-Htt reduz a expressão de Htt in vivo.
[00184] A capacidade de AAV2/1-miRNA-206 e 207 de reduzir ní- veis de proteína HTT no estriado de camundongos YAC128 com HD foi testada. Camundongos YAC128 adultos receberam injeções intra- estriado bilaterais de AAV2/1-miRNA-Htt 206 (1e10 vgs/sítio) ou AAV2/1-miRNA-Htt 207 (1e10 vgs/sítio), ou AAV2/1-CTL3 (um controle de miRNA que não de codificação) (1e10 vgs/sítio). Um mês a seguir da injeção de AAV, os animais foram sacrificados e perfundidos com PBS. Os cérebros foram coletados para análises histológicas e bio- químicas. Para as análises bioquímicas a região do estriado de um hemisfério foi microdissecada e congelada rapidamente em nitrogênio líquido. Níveis de estriado de mRNA de Htt humana mutante e de ca- mundongo e proteína HTT foram avaliados por QPCR e Western blot respectivamente. mRNA de Htt humana mutante e Htt de camundongo foi significativamente reduzido em camundongos injetados com AAV2/1-miRNA-Htt 206 e AAV2/1-miRNA-Htt 207 quando comparados aos animais de controle de CTL3 (Figura 3A). PPIA serviu como um gene de controle de normalização para todos os ensaios de QPCR. Proteína HTT humana e de camundongo mutante foi significativamen- te reduzida em todos os camundongos injetados com AAV2/1-miRNA- Htt quando comparados aos animais de controle de CTL3 e uma ex- tensão equivalente de redução (aproximadamente 50 %, p<0,05) foi observada através de todos os tratamentos (Figura 3B). Beta-tubulina serviu como um gene de controle de normalização para todos os wes- tern blots.
[00185] O efeito de AAV2/1-miRNA-Htt 206 e 207 sobre os pesos cerebrais e corpóreos de camundongos YAC128 foi avaliado. Os pe- sos corpóreos dos animais no dia da cirurgia foram comparados aos pesos corpóreos tomados no dia do sacrifício, 1 mês após a injeção (Figura 4A). Não houve nenhuma diferença entre AAV2/1-miRNA-Htt 206 e 207 comparados aos controles de CTL3. Todos os camundon- gos pareceram saudáveis, alertas, e responsivos um mês após o tra- tamento e nenhuma perda de peso foi observada em qualquer grupo de tratamento. Pesos cerebrais a úmido foram registrados depois da perfusão com PBS e dissecação cerebral. Um aumento estatistica- mente significativo em pesos cerebrais de camundongos YAC128 tra- tados com AAV2/1-miRNA-Htt 206 e 207 foi observado comparados aos controles tratados com CTL3 (Figura 4B). Exemplo 3: AAV2/1-miRNA-Htt corrige déficits comportamentais e de coordenação em camundongos YAC128
[00186] A capacidade de liberação no estriado de AAV2/1-miRNA- Htt-207 para corrigir os fenótipos comportamentais aberrantes em ca- mundongos YAC128 foi avaliada. O impacto da redução mediada por AAV2/1-miRNA-Htt 207 de níveis de Htt mutante nos déficits fenotípi- cos bem caracterizados que estão presentes no modelo de camun- dongo YAC128 de HD também foi examinada. Camundongos da ni- nhada do tipo selvagem YAC128 e FVB correspondidos por idade (3 meses de idade) receberam injeções intraestriado bilaterais de AAV2/1-miRNA-Htt-207 (2e10vg/sítio) ou vetor de controle de AAV2/1- CTL3 (2e10 vgs/sítio). Os camundongos receberam teste comporta- mental e foram sacrificados 3 meses depois do tratamento. A análise Western blot de homogeneizados cerebrais mostrou que os níveis de proteína HTT humana mutante foram significativamente reduzidos no estriado de camundongos da ninhada do tipo selvagem YAC128 e FVB injetados com AAV2/1-miRNA-Htt-207 (aproximadamente 50 % de redução, p<0,01) quando comparados aos controles tratados com AAV2/1-CTL3. Níveis de proteína HTT de camundongo não foram sig- nificativamente reduzidos neste estudo (Figuras 5A e 5B). A análise de PCR quantitativa em tempo real indicou uma redução proporcional em níveis de mRNA (Figuras 5C e 5D).
[00187] Os camundongos YAC128 foram relatados exibir déficits de coordenação motora (que podem ser revelados usando o teste de ro- tarod) e um fenótipo depressivo (que pode ser revelado usando o teste de nado de Porsolt) começando em 3 meses de idade (Slow et al., 2003, Van Raamsdonk et al., 2007). O teste rotarod de camundongos YAC128 tratados com AAV2/1-CTL3 em 3 meses após injeção mos- trou déficits de coordenação motora significativos quando comparados às ninhadas do tipo selvagem tratadas com AAV2/1-CTL3 (ANOVA, p<0,05) (Figura 6A). Entretanto, camundongos YAC128 que foram tra- tados com AAV2/1-miRNA-Htt-207 mostraram níveis de desempenho que foram indistinguíveis daqueles de camundongos do tipo selvagem (ANOVA, Tukey’s post-hoc; WT 207 vs.
YAC128 207, p=NS; WT CTL3 vs.
YAC128 CTL3, p<0,05). Consequentemente, a redução parcial de níveis de Htt mutante foi suficiente para corrigir os déficits motores de camundongos YAC128. Não houve nenhuma diferença significativa no desempenho de rotarod entre camundongos do tipo selvagem que re- ceberam AAV2/1-miRNA-Htt-207 e camundongos do tipo selvagem que receberam AAV2/1-CTL3. Relatos prévios indicaram que camun- dongos YAC128 exibem um fenótipo depressivo que pode ser detec- tado usando o teste de nado de Porsolt (Pouladi et al., 2009). Os ani- mais são julgados exibir um estado depressivo se eles forem imóveis por um período prolongado quando colocados em um recipiente de água.
Usando um teste de velocidade do nado básico (onde a latência do nado para atingir uma plataforma foi medida) os pesquisadores demonstraram que este fenótipo depressivo no teste de nado de Por- solt não está relacionado à capacidade de nado dos camundongos YAC128 e é independente dos déficits de coordenação motora bem documentados observados neste modelo (Pouladi et al., 200). Camun- dongos YAC128 e de ninhada WT de três meses de idade foram inje- tados com vetores de AAV2/1-miRNA-Htt-207 ou AAV2/1-CTL3 e tes- tados 3 meses mais tarde no teste de nado de Porsolt.
Camundongos YAC128 tratados com CTL3 exibiram um período de tempo aumenta- do em um estado imóvel quando comparados aos camundongos YAC tratados com AAV2/1-miRNA-Htt-207 ou animais do tipo selvagem tra- tados com AAV2/1-CTL3 (Figura 6B; ANOVA p<0,05). Novamente, não houve nenhuma diferença significativa no desempenho de ca- mundongos do tipo selvagem que receberam AAV2/1-miRNA-Htt ou
AAV2/1-CTL3. Camundongos YAC128 que foram injetados com AAV2/1-miRNA-Htt-207 gastaram significativamente menos tempo em um estado imóvel do que os controles tratados com AAV2/1-CTL3. De fato, o desempenho de camundongos YAC128 tratados com AAV2/1- miRNA-Htt-207 foi similar àquele de suas ninhadas do tipo selvagem, sugerindo uma correção quase completa deste fenótipo aberrante (ANOVA, Tukey’s post-hoc; YAC 207 vs. YAC CTL3, p<0,05).
[00188] O efeito de AAV2/1-miRNA-Htt 207 sobre os pesos cere- brais e corpóreos de camundongos YAC128 foi avaliado. Os pesos corpóreos dos animais no dia da cirurgia foram comparados aos pesos corpóreos tomados no dia do sacrifício, 3 meses após a injeção. Não houve nenhuma diferença no peso corpóreo entre camundongos trata- dos com AAV2/1-miRNA-Htt 207 comparados aos controles tratados com CTL3 (Figura 7A). Todos os camundongos pareceram saudáveis, alertas, e responsivos três meses após o tratamento e nenhuma perda de peso foi observada em qualquer grupo de tratamento. Os pesos cerebrais a úmido foram registrados depois da perfusão com PBS e dissecação cerebral. Não houve nenhuma diferença em pesos cere- brais de camundongos YAC128 tratados com AAV2/1-miRNA-Htt 207 comparados com controles tratados com CTL3 (Figura 7B). Exemplo 4. miRNA’s demonstram atividade guia alta e processamento em 5’ preciso a seguir da liberação in vivo
[00189] Camundongos YAC128 foram tratados com AAV2/1- miRNA-Htt 206 ou AAV2/1-miRNA-Htt 207 por intermédio de injeção intracraniana. Após o tratamento, o estriado foi removido, e o RNA to- tal foi isolado. Bibliotecas de sequenciamento de RNA pequenas foram construídas usando o NEBNext Small RNA Library Prep Set (New En- gland Biolabs), e o sequenciamento foi realizado no instrumento Illu- mina MiSeq. Amostras de 2 camundongos separados foram analisa- das para cada tratamento. Aqui o total de todas as leituras de miRNA incluindo sequências endógenas é mostrado bem como as leituras guia e passageiras totais para cada vetor de tratamento. O tratamento com vetor de AAV2/1-miRNA-Htt 202T foi incluído neste experimento como um controle visto que ele foi previamente sequenciado. A por- centagem de posição de início esperada para cada fita guia e passa- geiro foi > 99 %, e o vetor 207 teve razões de fita guia:passageiro altas de 76,1 % e 79,3 %. Tabela 2. Atividade guia e processamento em 5’ Vetor 202T# 206 207 ID da amostra No. 202 23 28 33 34 Leituras totais* 1.898.745 3.184.602 3.307.273 3.386.131 2.599.808 No. de Leituras totais (guia) 47.001 196 186 11.801 39.177 % dentro da posição de início esperada 99,1 100 99,5 97,9 97,6 No. de Leituras totais (passageira) 465,981 554 719 3.075 12.327 % dentro da posição de início esperada 99,2 99,1 99,4 99,5 99,2 % de Guia 0,2 26,1 20,6 79,3 79,1 Exemplo 5. Vetor de miRHtt207 autocomplementar
[00190] O cassete de expressão 207 miRHtt pode ser empacotado como um genoma vetorial autocomplementar. Para obter isto, o plas- mídeo de ITR é designado como sendo de apenas 2,3kb em tamanho, isto facilita o empacotamento de um vetor dimérico de 4,6kb; 4,6 kb é a capacidade de empacotamento de um vetor de AAV. O plasmídeo de ITR pode ser designado como tendo uma 5’WT ITR e uma 3’ITR (∆ ITR) truncada, suprimida de D mutada, como descrito na Figura 8. Os genomas vetoriais prognosticados que podem ser empacotados são o genoma vetorial autocomplementar, que seria de 3165 bp, e conteria uma 5’ e 3’ WT ITR e um terceira delta ITR interna (por exemplo, um íntron quimérico). Adicionalmente, espera-se que alguns genomas ve- toriais monoméricos sejam empacotados, e estes sejam de 1656bp em tamanho.
[00191] Uma abordagem alternativa para gerar um vetor de AAV miRHtt 207 autocomplementar isto é, empacotando dois genomas ve-
toriais por capsídeo, seria fabricar uma fita única pequena, isto é, ge- noma vetorial de 1755bp, de modo que duas cópias do genoma vetori- al sejam empacotadas como uma espécie intermediária de replicação, 3365 bp, (Figura 9). Neste exemplo, o plasmídeo de ITR teria uma 5’ e 3’ WT ITR e o intermediário de replicação, 3365bp, teria três WT ITRs, uma 5’ e 3’ ITR e uma ITR interna. A espécie de genoma vetorial de fita única, 1755bp, também pode ser empacotada.
SEQUÊNCIAS ADICIONAIS
[00192] Todas as sequências de polipeptídeo são apresentadas como N-terminal a C-terminal a menos que indicado de outro modo. Todas as sequências de ácido nucleico são apresentadas como 5’ a 3’ a menos que indicado de outro modo. Sequência de DNA de andaime de miRNA Ctggaggcttgctgaaggctgtatgctgttagacaatgattcacacggtgttttggccactgactg acaccgtgtgtcattgtctaacaggacacaaggcctgttactagcactcacatggaacaaatg gcc (SEQ ID NO: 14) ITR de AAV variante para vetores de scAAV
CCACTCCCTCTCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGGGC
GACCAAAGGTCGCCCGACGCCCGGGCTTTGCCCGGGCGGCCT CAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGAGAGGGA (SEQ ID NO: 15). ssAAV2/1miRHtt.de
TTGGCCACTCCCTCTCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCG CCCGGGCAAAGCCCGGGCGTCGGGCGACCTTTGGTCGCCCGG CCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGAGAGGGAGTGGCCAACT CCATCACTAGGGGTTCCTCTATATTACCCTGCTAGGCAATTGGA TCCCGGACCGTCGACATTGATTATTGACTAGTTATTAATAGTAATC AATTACGGGGTCATTAGTTCATAGCCCATATATGGAGTTCCGCGT TACATAACTTACGGTAAATGGCCCGCCTGGCTGACCGCCCAA CGACCCCCGCCCATTGACGTCAATAATGACGTATGTTCCCATAG TAACGCCAATAGGGACTTTCCATTGACGTCAATGGGTGGAGTA TTTACGGTAAACTGCCCACTTGGCAGTACATCAAGTGTATCATA TGCCAAGTACGCCCCCTATTGACGTCAATGACGGTAAATGGCC CGCCTGGCATTATGCCCAGTACATGACCTTATGGGACTTTCCT ACTTGGCAGTACATCTACGTATTAGTCATCGCTATTACCATGG TCGAGGTGAGCCCCACGTTCTGCTTCACTCTCCCCATCTCCCCCC CCTCCCCACCCCCAATTTTGTATTTATTTATTTTTTAATTATTTTGT GCAGCGATGGGGGCGGGGGGGGGGGGGGGGCGCGCGCCAG GCGGGGCGGGGCGGGGCGAGGGGCGGGGCGGGGCGAGGCG GAGAGGTGCGGCGGCAGCCAATCAGAGCGGCGCGCTCCGAAA GTTTCCTTTTATGGCGAGGCGGCGGCGGCGGCGGCCCTATAA AAAGCGAAGCGCGCGGCGGGCGGGAGTCGCTGCGCGCTGCC TTCGCCCCGTGCCCCGCTCCGCCGCCGCCTCGCGCCGCCCG CCCCGGCTCTGACTGACCGCGTTACTCCCACAGGTGAGCGGG CGGGACGGCCCTTCTCCTCCGGGCTGTAATTAGCGCTTGGTTTA ATGACGGCTTGTTTCTTTTCTGTGGCTGCGTGAAAGCCTT GAGGGGCTCCGGGAGGGCCCTTTGTGCGGGGGGAGCGG- CTCGGGGGGTGCGTGCGTGTGTGTGTGCGTGGGGAGCGCCG- CGTGCGGCTCCGCGCTGCCCGGCGGCTGTGAGCGCTGCGGG- CGCGGCGCGGGGCTTTGTGCGCTCCGCAGTGTGCGCGAGGG- GAGCGCGGCCGGGGGCGGTGCCCCGCGGTGCGGGGGGGG- CTGCGAGGGGAACAAAGGCTGCGTGCGGGGTGTGTGCG- TGGGGGGGTGAGCAGGGGGTGTGGGCGCGTCGGTCGGGCTG- CAACCCCCCCTGCACCCCCCTCCCCGAGTTGCTGAGCACGG- CCCGGCTTCGGGTGCGGGGCTCCGTACGGGGCGTGGCG- CGGGGCTCGCCGTGCCGGGCGGGGGGTGGCGGCAGG- TGGGGGTGCCGGGCGGGGCGGGGCCGCCTCGGGCCGGGGA- GGGCTCGGGGGAGGGGCGCGGCGGCCCCCGGAGCGCCGG- CGGCTGTCGAGGCGCGGCGAGCCGCAGCCATTGCCTTTTATGG- TAATCGTGCGAGAGGGCGCAGGGACTTCCTTTGTCCCAAATCTG- TGCGGAGCCGAAATCTGGGAGGCGCCGCCGCACCCCCTCTAG- CGGGCGCGGGGCGAAGCGGTGCGGCGCCGGCAGGAAGGAAA- TGGGCGGGGAGGGCCTTCGTGCGTCGCCGCGCCGCCG- TCCCCTTCTCCCTCTCCAGCCTCGGGGCTGTCCGCGGGGGGA- CGGCTGCCTTCGGGGGGGACGGGGCAGGGCGGGGTTCGGCTT- CTGGCGTGTGACCGGCGGCTCTAGAGCCTCTGCTAACCATGTT- CATGCCTTCTTCTTTTTCCTACAGCTCCTGGGCAACGTGCTGGT- TATTGTGCTGTCTCATCATTTTGGCAAAGAATTCTTCGAAAGA- TCTGCTAGCCTGGAGGCTTGCTGAAGGCTGTATGCTGAGTCGG- TGTGGTTGACAAGCAGTTTTGGCCACTGACTGACTGCTTG- TCCCACACCGACTCAGGACACAAGGCCTGTTACTAGCACTCACA- TGGAACAAATGGCCATGCATCTAGAGGGCCCTATTCTATAGTGT- CACCTAAATGCTAGAGCTCGCTGATCAGCCTCGACTGTGCCTTC- TAGTTGCCAGCCATCTGTTGTTTGCCCCTCCCCCGTGCCTT- CCTTGACCCTGGAAGGTGCCACTCCCACTGTCCTTTCCTAA- TAAAATGAGGAAATTGCATCGCATTGTCTGAGTAGGTGTCATTC- TATTCTGGGGGGTGGGGTGGGGCAGGACAGCAAGGGGGAGGA- TTGGGAAGACAATAGCAGGCATGCTGGGGAGCTAGAGTCGAC- CGGACCGGTGGAAGTCCTCTTCCTCGGTGTCCTTGACTT- CAAAGGGTCTCTCCCATTTGCCTGGAGAGAGGGGAAGGTGGG- CATCACCAGGGGTGAGTGAAGGTTTGGAAGAGTGTAGCAGAA- TAAGAAACCATGAGTCCCCTCCCTGAGAAGCCCTGAG- CCCCCTTGACGACACACATCCCTCGAGGCTCAGCTTCAT- CATCTGTAAAAGGTGCTGAAACTGACCATCCAAGCTG- CCGAAAAAGATTGTGTGGGGATAATTCAAAACTAGAGGAAGATG- CAGAATTTCTACATCGTGGCGATGTCAGGCTAAGAGATG- CCATCGTGGCTGTGCATTTTTATTGGAATCATATGTTTA- TTTGAGGGTGTCTTGGATATTACAAATAAAATGTTGGAGCATCA- GGCATATTTGGTACCTTCTGTCTAAGGCTCCCTGCCCCTTGTTAA- TTGGCAGCTCAGTTATTCATCCAGGGCAAACATTCTGCTTACTA- TTCCTGAGAGCTTTCCTCATCCTCTAGATTGGCAGGGGAAATG- CAGATGCCTGAGCAGCCTCCCCTCTGCCATACCAACAGAGCTT- CACCATCGAGGCATGCAGAGTGGACAGGGGCCTCAGGGAC- CCCTGATCCCAGCTTTCTCATTGGACAGAAGGAGGAGAC- TGGGGCTGGAGAGGGACCTGGGCCCCCACTAAGGCCACAGCA- GAGCCAGGACTTTAGCTGTGCTGACTGCAGCCTGGCTTG- CCTCCACTGCCCTCCTTTGCCTCAAGAGCAAGGGAGCCTCAGAG- TGGAGGAAGCAGCCCCTGGCCTTGCCTCCCACCTCCCCTCCCC- TATGCTGTTTTCCTGGGACAGTGGGAGCTGGCTTAGAATG- CCCTGGGGCCCCCAGGACCCTGGCATTTTAACCCCTCAGGGG- CAGGAAGGCAGCCTGAGATACAGAAGAGTCCATCACCTGCTGTA- TGCCACACACCATCCCCACAGTTACGTACTAGTTCGAAGCCACG- CGGACCGTTATAGTTACGAGGAACCCCTAGTGATGGAGTTGG- CCACTCCCTCTCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGGG- CGACCAAAGGTCGCCCGACGCCCGGGCTTTGCCCGGGCGG- CCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGAGAGGGAGTGGCCAAA-
GATCT (SEQ ID NO: 16) Sequência de DNA de mIR207 mostrada em negrito (SEQ ID NO: 17) Sequência de preenchimento mostrada em itálico (SEQ ID NO: 18) Porção de gene A1AT aattcgcccttgggcctaggcaattggatccgccggcagagaaaacatcccagggatttaca- gatcacatgcaggcagggaccagctcaacccttctttaatgtcatccagggagggggccagg- gatggaggggaggggttgaggagcgagaggcagttatttttgggtgggattcaccactttt- cccatgaagaggggagacttggtattttgttcaatcattaagaagacaaagggtttg- ttgaacttgacctcgggggggatagacatgggtatggcctctaaaaacatggccccagcag- cttcagtccctttctcgtcgatggtcagcacagccttatgcacggcctggaggggagagaag- cagagacacgttgtaaggctgatcccaggcctcgagcaaggctcacgtggacacctcccag- gaagcgctcactccccctggacggccctggccctgcacatcctctccctccctgtcacata- ggccttgctcctcctcaaggctttggctgatggggctggctcccctctgtccatcttcctga- caagcgcctctccccctgctcaggtgcacccacaactcagaacagggaagagcatcgtcac-
tccacgtctgcctccagggctctctcctttctagtacacggcttgaagctccttgaggacacg- gaccctggcagtgaccttcacagtgcccagaccccaagataatgcagccattcatggaactg- caggttgttcattggtcgcctttagttttccaaaataagtgtcactttagctgaaatcatt- cattaattcagacaccaaatctcacagatcgaaggagtcagaaattcctttgaaacaact- tagcccaaacctttctgtgtcagtatggataaatcaaggcccaatgtctagaaggtcttggg- caaagttgaaattcagggtcagtgacacaacctcaagggaggccccgaaagtgccagctgca- cagcagcccctgcctggctttgctgtttgcccaccgtcccgtgtcagtgaatcacggg- catcttcaggagctcagcctgggtcttcatttgtttccctcggccccttcctcagcctcagga- cagtgctgcagcccccacacattcttccctacagataccatggtgcaacaaggtcgtcaggg- tgatctcaccttggagagcttcaggggtgcctcctctgtgaccccggagaggtcag- ccccattgctgaagaccttagtgatgcccagttgacccaggacgctcttcagatcataggtt- ccagtaatggacagtttgggtaaatgtaagctggcagacctgtcgtgcagaaaagaaatt- caaggcatggcacagcattcctcttgttcttctgggacccaccacagtgcaagtgtttt- cttttctgattatttctgccacttactcctgtgtcctccacccacactaagatgggaac- tcggctttggtttgttctacttttagctcttctacattgagtcaaagaatgttaacatcgaa- tgaatcacaaaagcttgaaatgccacctcctctgatattctaggtgtcctggaagcctgtct- catcttgccctgtagtgttgggtcacctggcccccagcctgtaacatccccagggccctaca- cccagagaaacacggggctggtggcagtgcccagtgacaaccgtttagtgga- taagagaagagtgaccacaccaggctgagtgctcctctctggttttccatggggagacaatg- ccaccctgagcagggtctggtgtgagcggcagctggctctgggctctctgatccgttac- cctctcagcctctttgttctttctcaacccctggagcagagacctcaggaggtgctggcatg- gaacagagaaattccagcctcgattcctattatgaacccgacaccttttgtatttt- catcttggttttacagtgtacaaaacgaactagatcagcagggcatgggcataatcacgaatg- cacacacatacactaatgtgtggctcatgtttaagtatcacttactacaggacacccaatc- taacagcaccgataaagtgacagagaaacgcaagccttctgcgaacatggcctggctgttcca- attccgaaccttgcttttctgggccttgccacacaggctcttcccccgtccccccagggaca- ttctacccttgaactccacactccactgctgcctttgccaggaagcccatctgtt- cctttttggttctgccagaacgtgtggtggtgctgctgtccctgccttgggcactggata- ttgggaagggacagtgtccacactggagtgggaagttcccagggacgagacctttacctcct- caccctgggtactgttctcctcatggagcatggacggcgctgcctgaactcagtggtggcct-
cattctggaagccaagtttatacagagtagcagtgacccagggatgtggggttcaccctcct- cagccctctggccagtcctgatgggcctcagtcccaacatggctaagaggtgtgggcagctt- cttggtcaccctcaggttggggaatcaccttctgtcttcattttccaggaacttggtgatga- tatcgtgggtgagttcatttaccaggtgctgtagtttcccctcatcaggcaggaagaaga- tggcggtggcattgcccaggtatttcatcagcagcacccagctggacagcttcttacagtg- ctggatgttaaacatgcctaaacgcttcatcataggcaccttcacggtggtcacctgg- tccacgtggaagtcctcttcctcggtgtccttgacttcaaagggtctctcccatttgcctg- gagagaggggaaggtgggcatcaccaggggtgagtgaaggtttggaagagtgtag- cagaataagaaaccatgagtcccctccctgagaagccctgagcccccttgacgaca- cacatccctcgaggctcagcttcatcatctgtaaaaggtgctgaaactgaccatccaag- ctgccgaaaaagattgtgtggggataattcaaaactagaggaagatgcagaatttctaca- tcgtggcgatgtcaggctaagagatgccatcgtggctgtgcatttttattggaatcatatgtt- tatttgagggtgtcttggatattacaaataaaatgttggagcatcaggcatatttggtac- cttctgtctaaggctccctgccccttgttaattggcagctcagttattcatccagggcaaa- cattctgcttactattcctgagagctttcctcatcctctagattggcaggggaaatgcaga- tgcctgagcagcctcccctctgccataccaacagagcttcaccatcgaggcatgcagagtgga- caggggcctcagggacccctgatcccagctttctcattggacagaaggaggagactggggctg- gagagggacctgggcccccactaaggccacagcagagccaggactttagctgtgctgactg- cagcctggcttgcctccactgccctcctttgcctcaagagcaagggagcctcagagtggagga- agcagcccctggccttgcctcccacctcccctcccctatgctgttttcctgggacagtggga- gctggcttagaatgccctggggcccccaggaccctggcattttaacccctcaggggcagga- aggcagcctgagatacagaagagtccatcacctgctgtatgccacacaccatccccacagt- tacgtactagttcgaagccacgcgtccgaagggcgaatt (SEQ ID NO: 20) A sequência de preenchimento usada em algumas modalidades é sub- linhada Sequência de íntron quimérico delta ggagtcgctgcgcgctgccttcgccccgtgccccgctccgccgccgcctcgcgccgcccg- ccccggctctgactgaccgcgttactcccacaggtgagcgggcgggacggccctt- ctcctccgggctgtaattagcgcttggtttaatgacggcttgtttcttttctgtggctgcg-
tgaaagccttgaggggctccgggagctagagcctctgctaaccatgttcatgccttctt- ctttttcctacagctcctgggcaacgtgctggttattgtgctgtctcatcattttggcaaaga- attcctcgaagatccggtacccaattccggggccccacgctgcgcatccgcg (SEQ ID NO: 21)

Claims (128)

REIVINDICAÇÕES
1. RNA de interferência (RNAi), caracterizado pelo fato de que compreende uma primeira fita e uma segunda fita, em que a) a primeira fita e a segunda fita formam um dúplex; b) a primeira fita compreende uma região guia, em que a região guia compreende a sequência de ácido nucleico 5’-UGGCC GUCCAUCUUGGACCCG-3’ (SEQ ID NO: 1) ou 5’-AGUCGGUGUG GUUGACAAGCA-3’ (SEQ ID NO: 7); e c) a segunda fita compreende uma região não guia.
2. RNA de interferência (RNAi), de acordo com a reivindica- ção 1, caracterizado pelo fato de que o nucleico da região guia com- preende a sequência de ácido nucleico 5’-UGGCCGUCCAUCUUGG ACCCG-3’ (SEQ ID NO: 1) e a região não guia compreende a sequên- cia 5’-CGGGUCCAAGAUGGACGGCCA-3’ (SEQ ID NO: 2).
3. RNA de interferência (RNAi), de acordo com a reivindica- ção 2, caracterizado pelo fato de que a primeira fita compreende uma sequência de ácido nucleico tendo cerca de 90 % de identidade a SEQ ID NO: 1 ou cerca de 90 % de identidade a SEQ ID NO: 2.
4. RNA de interferência (RNAi), de acordo com a reivindica- ção 1, caracterizado pelo fato de que o nucleico a região guia compre- ende a sequência de ácido nucleico 5’-AGUCGGUGUGGUUGAC AAGCA-3’ (SEQ ID NO: 7) e a região não guia compreende a sequên- cia 5’-UGCUUGUCAACCACACCGACU-3’ (SEQ ID NO: 8).
5. RNA de interferência (RNAi), de acordo com a reivindica- ção 4, caracterizado pelo fato de que a segunda fita compreende uma sequência de ácido nucleico tendo cerca de 90 % de identidade a SEQ ID NO: 7 ou cerca de 90 % de identidade a SEQ ID NO: 8.
6.RNA de interferência (RNAi), de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizado pelo fato de que a primei- ra fita e a segunda fita são ligadas por meio de um ligante de RNA ca-
paz de formar uma estrutura de alça.
7. RNA de interferência (RNAi), de acordo com a reivindica- ção 6, caracterizado pelo fato de que o ligante de RNA compreende de 4 a 50 nucleotídeos.
8. RNA de interferência (RNAi), de acordo com a reivindica- ção 6 ou 7, caracterizado pelo fato de que a estrutura de alça compre- ende 4 a 20 nucleotídeos.
9. RNA de interferência (RNAi), de acordo com qualquer uma das reivindicações 6 a 8, caracterizado pelo fato de que o RNAi compreende 5’ a 3’ da segunda fita, do ligante de RNA, e da primeira fita.
10. RNA de interferência (RNAi), de acordo com qualquer uma das reivindicações 6 a 8, caracterizado pelo fato de que o RNAi compreende 5’ a 3’ da primeira fita, do ligante de RNA, e da segunda fita.
11. RNA de interferência (RNAi), de acordo com a reivindi- cação 10, caracterizado pelo fato de que o RNAi compreende a se- quência de ácido nucleico da SEQ ID NO: 4 ou SEQ ID NO: 10.
12. RNA de interferência (RNAi), de acordo com a reivindi- cação 11, caracterizado pelo fato de que o RNAi compreende uma se- quência de nucleotídeo de cerca de 90 % idêntica à sequência de nu- cleotídeo da SEQ ID NO: 4 ou SEQ ID NO: 10.
13. RNA de interferência (RNAi), de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 12, caracterizado pelo fato de que o RNAi é um RNA interferente pequeno (siRNA), um microRNA (miRNA), ou um RNA pequeno em grampo (shRNA).
14. RNA de interferência (RNAi), de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 13, caracterizado pelo fato de que o RNAi alveja o RNA que codifica um polipeptídeo associado com doença de Huntington.
15. RNA de interferência (RNAi), de acordo com a reivindi- cação 14, caracterizado pelo fato de que o polipeptídeo é huntingtina.
16. RNA de interferência (RNAi), de acordo com a reivindi- cação 15, caracterizado pelo fato de que a huntingtina compreende uma mutação associada com doença de Huntington.
17. Construção de expressão, caracterizada pelo fato de que compreende o ácido nucleico que codifica a RNAi como definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 16.
18. Construção de expressão, de acordo com a reivindica- ção 17, caracterizada pelo fato de que o ácido nucleico que codifica o RNAi compreende um andaime de miRNA.
19. Construção de expressão, de acordo com a reivindica- ção 17 ou 18, caracterizada pelo fato de que o ácido nucleico que co- difica o RNAi é operavelmente ligado a um promotor.
20. Construção de expressão, de acordo com a reivindica- ção 19, caracterizada pelo fato de que o promotor é selecionado de um promotor inicial imediato de citomegalovírus (CMV), um LTR de RSV, um LTR de MoMLV, um promotor de fosfoglicerato quinase-1 (PGK), um promotor de vírus símio 40 (SV40), um promotor de CK6, um promotor de transtirretina (TTR), um promotor de TK, um promotor responsivo à tetraciclina (TRE), um promotor de HBV, um promotor de hAAT, um promotor de LSP, um promotor específico de fígado quimé- rico (LSP), um promotor de E2F, um promotor de telomerase (hTERT); um promotor de realçador de citomegalovírus/promotor de beta-actina de galinha/β-globina de coelho (CAG), um promotor de promotor alfa de fator de alongamento 1 (EFl-alfa), um promotor de β-glicuronidase humano, um promotor de β-actina de galinha (CBA), um promotor de LTR do vírus do sarcoma de Rous retroviral (RSV), um promotor de di- hidrofolato redutase, e um promotor de 13-actina.
21. Construção de expressão, de acordo com qualquer uma das reivindicações 17 a 20, caracterizada pelo fato de que a constru- ção de expressão compreende ainda um íntron.
22. Construção de expressão, de acordo com a reivindica- ção 21, caracterizada pelo fato de que o íntron é um íntron quimérico.
23. Construção de expressão, de acordo com a reivindica- ção 21, caracterizada pelo fato de que o vetor de expressão é um ve- tor autocomplementar e o íntron é um íntron quimérico delta.
24. Construção de expressão, de acordo com qualquer uma das reivindicações 17 a 23, caracterizada pelo fato de que a constru- ção de expressão compreende ainda um sinal de poliadenilação.
25. Construção de expressão, de acordo com a reivindica- ção 24, caracterizada pelo fato de que o sinal de poliadenilação é um sinal de poliadenilação de hormônio de crescimento bovino, um sinal de poliadenilação de SV40, ou um pA de TK de HSV.
26. Vetor, caracterizado pelo fato de que compreende a construção de expressão como definida em qualquer uma das reivindi- cações 17 a 25.
27. Vetor, de acordo com a reivindicação 26, caracterizado pelo fato de que o vetor é um vetor de vírus adeno-associado recom- binante (rAAV), um vetor adenoviral recombinante, um vetor lentiviral recombinante ou um vetor do vírus do herpes simples (HSV) recombi- nante.
28. Vetor, de acordo com a reivindicação 27, caracterizado pelo fato de que o vetor é um vetor adenoviral recombinante.
29. Vetor, de acordo com a reivindicação 28, caracterizado pelo fato de que o vetor adenoviral recombinante é derivado de soroti- po de Adenovírus 2, 1, 5, 6, 19, 3, 11, 7, 14, 16, 21, 12, 18, 31, 8, 9, 10, 13, 15, 17, 19, 20, 22, 23, 24-30, 37, 40, 41, AdHu2, AdHu 3, Ad- Hu4, AdHu24, AdHu26, AdHu34, AdHu35, AdHu36, AdHu37, AdHu41, AdHu48, AdHu49, AdHu50, AdC6, AdC7, AdC69, Ad bovino tipo 3, Ad canino tipo 2, Ad ovino, ou Ad porcino tipo 3.
30. Vetor, de acordo com a reivindicação 28, caracterizado pelo fato de que o vetor adenoviral recombinante é derivado de soroti- po adenoviral 2 ou uma variante de sorotipo adenoviral 5.
31. Vetor, de acordo com a reivindicação 27, caracterizado pelo fato de que o vetor é um vetor lentiviral recombinante.
32. Vetor, de acordo com a reivindicação 31, caracterizado pelo fato de que o vetor lentiviral recombinante é derivado de um lenti- vírus pseudotipado com vírus da estomatite vesicular (VSV), vírus da coriomeningite linfocítica (LCMV), vírus Ross river (RRV), vírus Ebola, vírus Marburg, vírus Mokala, vírus da Raiva, RD114 ou variantes nes- tes.
33. Vetor, de acordo com a reivindicação 27, caracterizado pelo fato de que o vetor é um vetor de rHSV.
34. Vetor, de acordo com a reivindicação 33, caracterizado pelo fato de que o vetor de rHSV é derivado de rHSV-1 ou rHSV-2.
35. Vetor, de acordo com a reivindicação 27, caracterizado pelo fato de que o vetor é um vetor de rAAV.
36. Vetor de rAAV, de acordo com a reivindicação 35, ca- racterizado pelo fato de que a construção de expressão é flanqueada por uma ou mais sequências de repetição terminal invertida (ITR) de AAV.
37. Vetor de rAAV, de acordo com a reivindicação 36, ca- racterizado pelo fato de que a construção de expressão é flanqueada por duas ITRs de AAV.
38. Vetor de rAAV, de acordo com a reivindicação 36 ou 37, caracterizado pelo fato de que as ITRs de AAV são ITRs de AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAVrh8, AAVrh8R, AAV9, AAV10, AAVrh10, AAV11, AAV12, AAV2R471A, AAV DJ, um sorotipo de AAV de cabra, AAV bovino, ou AAV de camundongo.
39. Vetor de rAAV, de acordo com qualquer uma das rei- vindicações 36 a 38, caracterizado pelo fato de que as ITRs de AAV são ITRs de AAV2.
40. Vetor de rAAV, de acordo com qualquer uma das rei- vindicações 36 a 39, caracterizado pelo fato de que o vetor compreen- de ainda um ácido nucleico de preenchimento.
41. Vetor de rAAV, de acordo com a reivindicação 40, ca- racterizado pelo fato de que o ácido nucleico de preenchimento está localizado a montante ou a jusante do ácido nucleico que codifica o RNAi.
42. Vetor de rAAV, de acordo com qualquer uma das rei- vindicações 36 a 41, caracterizado pelo fato de que o vetor é um vetor de rAAV autocomplementar.
43. Vetor de rAAV, de acordo com a reivindicação 42, ca- racterizado pelo fato de que o vetor compreende a primeira sequência de ácido nucleico que codifica o RNAi e uma segunda sequência de ácido nucleico que codifica um complemento do RNAi, em que a pri- meira sequência de ácido nucleico pode formar pares de base intrafita com a segunda sequência de ácido nucleico ao longo da maior parte ou todo seu comprimento.
44. Vetor de rAAV, de acordo com a reivindicação 43, ca- racterizado pelo fato de que a primeira sequência de ácido nucleico e a segunda sequência de ácido nucleico são ligadas por uma ITR de AAV mutado, em que a ITR de AAV mutado compreende uma deleção da região D e compreende uma mutação da sequência de resolução terminal.
45. Célula, caracterizada pelo fato de que compreende o vetor como definido em qualquer uma das reivindicações 26 a 35, ou o vetor de rAAV como definido em qualquer uma das reivindicações 36 a
44.
46. Partícula viral compreendendo o vetor, como definido na reivindicação 26, caracterizada pelo fato de que a partícula viral é uma partícula de AAV encapsidando o vetor de rAAV, uma partícula adenoviral encapsidando o vetor adenoviral recombinante, uma partí- cula lentiviral encapsidando o vetor lentiviral recombinante ou uma par- tícula de HSV encapsidando o vetor de HSV recombinante.
47. Partícula viral, de acordo com a reivindicação 46, carac- terizada pelo fato de que a partícula viral é uma partícula adenoviral encapsidando o vetor adenoviral recombinante.
48. Partícula viral, de acordo com a reivindicação 47, carac- terizada pelo fato de que a partícula adenoviral compreende um capsí- deo do sorotipo de Adenovírus 2, 1, 5, 6, 19, 3, 11, 7, 14, 16, 21, 12, 18, 31, 8, 9, 10, 13, 15, 17, 19, 20, 22, 23, 24-30, 37, 40, 41, AdHu2, AdHu 3, AdHu4, AdHu24, AdHu26, AdHu34, AdHu35, AdHu36, Ad- Hu37, AdHu41, AdHu48, AdHu49, AdHu50, AdC6, AdC7, AdC69, Ad bovino tipo 3, Ad canino tipo 2, Ad ovino, ou Ad porcino tipo 3.
49. Partícula viral, de acordo com a reivindicação 48, carac- terizada pelo fato de que a partícula adenoviral compreende um capsí- deo de sorotipo adenoviral 2 ou uma variante de um capsídeo de soro- tipo adenoviral 5.
50. Partícula viral, de acordo com a reivindicação 46, carac- terizada pelo fato de que a partícula viral é uma partícula lentiviral en- capsidando o vetor lentiviral recombinante.
51. Partícula viral, de acordo com a reivindicação 50, carac- terizada pelo fato de que a partícula lentiviral compreende um capsí- deo pseudotipado com vírus da estomatite vesicular (VSV), vírus da coriomeningite linfocítica (LCMV), vírus Ross river (RRV), vírus Ebola, vírus Marburg, vírus Mokala, vírus da Raiva, RD114 ou variantes nes- tes.
52. Partícula viral, de acordo com a reivindicação 46, carac-
terizada pelo fato de que a partícula viral é uma partícula de HSV.
53. Partícula viral, de acordo com a reivindicação 52, carac- terizada pelo fato de que a partícula de HSV é uma partícula de rHSV- 1 ou uma partícula de rHSV-2.
54. Partícula de AAV recombinante, caracterizada pelo fato de que compreende o vetor de rAAV como definido em qualquer uma das reivindicações 36 a 44.
55. Partícula de rAAV, de acordo com a reivindicação 54, caracterizada pelo fato de que a partícula de AAV viral compreende um AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAVrh8, AAVrh8R, AAV9, AAV10, AAVrh10, AAV11, AAV12, AAV2R471A, AAV2/2-7m8, AAV DJ, AAV2 N587A, AAV2 E548A, AAV2 N708A, AAV V708K, AAV2-HBKO, AAVDJ8, AAVPHP.B, AAVPHP.eB, AAVBR1, AAVHSC15, AAVHSC17, um capsídeo de AAV de cabra, AAV1/AAV2 quimérico, AAV bovino, ou AAV de camundongo, capsídeo de sorotipo de rAAV2/HBoV1.
56. Partícula de rAAV, de acordo com a reivindicação 54 ou 55, caracterizada pelo fato de que a ITR e o capsídeo da partícula viral de rAAV são derivados do mesmo sorotipo de AAV.
57. Partícula de rAAV, de acordo com a reivindicação 54 ou 55, caracterizada pelo fato de que a ITR e o capsídeo da partícula viral de rAAV são derivados de diferentes sorotipos de AAV.
58. Partícula de rAAV, de acordo com a reivindicação 57, caracterizada pelo fato de que a ITR é derivada de AAV2 e o capsídeo da partícula de rAAV é derivado de AAV1.
59. Composição, caracterizada pelo fato de que compreen- de a partícula viral como definida em qualquer uma das reivindicações 41 a 50, ou a partícula de rAAV como definida em qualquer uma das reivindicações 54 a 58.
60. Composição, de acordo com a reivindicação 59, carac-
terizada pelo fato de que a composição compreende ainda um veículo farmaceuticamente aceitável.
61. Kit, caracterizado pelo fato de que compreende o RNAi como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 16.
62. Kit, caracterizado pelo fato de que compreende a partí- cula viral como definida em qualquer uma das reivindicações 44 a 53, ou a partícula de AAV como definida em qualquer uma das reivindica- ções 54 a 58.
63. Kit, caracterizado pelo fato de que compreende a com- posição como definida na reivindicação 59 ou 60.
64. Kit, de acordo com qualquer uma das reivindicações 61 a 63, caracterizado pelo fato de que compreende ainda instruções pa- ra o uso.
65. Método para tratar doença de Huntington em um mamí- fero, caracterizado pelo fato de que compreende administrar ao mamí- fero um RNAi compreendendo uma primeira fita compreendendo um primeiro ácido nucleico compreendendo a sequência 5’- UGGCCGUCCAUCUUGGACCCG-3’ (SEQ ID NO: 1) e uma segunda fita compreendendo um segundo ácido nucleico compreendendo a se- quência 5’-CGGGUCCAAGAUGGACGGCCA-3’ (SEQ ID NO: 2) ou uma primeira fita compreendendo um primeiro ácido nucleico compre- endendo a sequência 5’-AGUCGGUGUGGUUGACAAGCA-3’ (SEQ ID NO: 7) e uma segunda fita compreendendo um segundo ácido nuclei- co compreendendo a sequência 5’-UGCUUGUCAACCACACCGACU- 3’ (SEQ ID NO: 8).
66. Método para inibir a expressão de htt em um mamífero com doença de Huntington, caracterizado pelo fato de que compreen- de administrar ao mamífero um RNAi compreendendo uma primeira fita compreendendo um primeiro ácido nucleico compreendendo a se- quência 5’-UGGCCGUCCAUCUUGGACCCG-3’ (SEQ ID NO: 1) e uma segunda fita compreendendo um segundo ácido nucleico com- preendendo a sequência 5’-CGGGUCCAAGAUGGACGGCCA-3’ (SEQ ID NO: 2) ou uma primeira fita compreendendo um primeiro ácido nu- cleico compreendendo a sequência 5’- AGUCGGUGUGGUUGACAAGCA-3’ (SEQ ID NO: 7) e uma segunda fita compreendendo um segundo ácido nucleico compreendendo a se- quência 5’-UGCUUGUCAACCACACCGACU-3’ (SEQ ID NO: 8).
67. Método para inibir o acúmulo de htt em uma célula de um mamífero com doença de Huntington, caracterizado pelo fato de que compreende administrar ao mamífero um RNAi compreendendo uma primeira fita compreendendo um primeiro ácido nucleico compre- endendo a sequência 5’-UGGCCGUCCAUCUUGGACCCG-3’ (SEQ ID NO: 1) e uma segunda fita compreendendo um segundo ácido nuclei- co compreendendo a sequência 5’-CGGGUCCAAGAUGGACGGCCA- 3’ (SEQ ID NO: 2) ou uma primeira fita compreendendo um primeiro ácido nucleico compreendendo a sequência 5’- AGUCGGUGUGGUUGACAAGCA-3’ (SEQ ID NO: 7) e uma segunda fita compreendendo um segundo ácido nucleico compreendendo a se- quência 5’-UGCUUGUCAACCACACCGACU-3’ (SEQ ID NO: 8).
68. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 65 a 67, caracterizado pelo fato de que a primeira fita compreen- de uma sequência de ácido nucleico tendo cerca de 90 % de identida- de a SEQ ID NO: 1 ou cerca de 90 % de identidade a SEQ ID NO: 7.
69. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 65 a 67, caracterizado pelo fato de que a segunda fita compreen- de uma sequência de ácido nucleico tendo cerca de 90 % de identida- de a SEQ ID NO: 2 ou cerca de 90 % de identidade a SEQ ID NO: 8.
70. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 65 a 69, caracterizado pelo fato de que a primeira fita e a segun- da fita são ligadas por meio de um ligante de RNA capaz de formar uma estrutura de alça.
71. Método, de acordo com a reivindicação 70, caracteriza- do pelo fato de que o ligante de RNA compreende de 4 a 50 nucleotí- deos.
72. Método, de acordo com a reivindicação 70 ou 71, carac- terizado pelo fato de que a estrutura de alça compreende 4 a 20 nu- cleotídeos.
73. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 70 a 72, caracterizado pelo fato de que o RNAi compreende 5’ a 3’ da segunda fita, do ligante de RNA, e da primeira fita.
74. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 70 a 72, caracterizado pelo fato de que o RNAi compreende 5’ a 3’ da primeira fita, do ligante de RNA, e da segunda fita.
75. Método, de acordo com a reivindicação 74, caracteriza- do pelo fato de que o RNAi compreende a sequência de ácido nucleico da SEQ ID NO: 4 ou SEQ ID NO: 10.
76. Método, de acordo com a reivindicação 74, caracteriza- do pelo fato de que o RNAi compreende uma sequência de nucleotí- deo de cerca de 90 % idêntica à sequência de nucleotídeo da SEQ ID NO: 4 ou SEQ ID NO: 10.
77. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 65 a 76, caracterizado pelo fato de que o RNAi é codificado em uma construção de expressão.
78. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 65 a 77, caracterizado pelo fato de que o ácido nucleico que codi- fica o RNAi compreende um andaime de miRNA.
79. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 65 a 78, caracterizado pelo fato de que o ácido nucleico que codi- fica o RNAi é operavelmente ligado a um promotor.
80. Método, de acordo com a reivindicação 79, caracteriza-
do pelo fato de que o promotor é capaz de expressar o RNAi no cére- bro de um mamífero.
81. Método, de acordo com a reivindicação 80, caracteriza- do pelo fato de que o promotor é selecionado de um promotor inicial imediato de citomegalovírus (CMV), um LTR de RSV, um LTR de MoMLV, um promotor de fosfoglicerato quinase-1 (PGK), um promotor de vírus símio 40 (SV40), um promotor de CK6, um promotor de trans- tirretina (TTR), um promotor de TK, um promotor responsivo à tetraci- clina (TRE), um promotor de HBV, um promotor de hAAT, um promotor de LSP, um promotor específico de fígado quimérico (LSP), um promo- tor de E2F, um promotor de telomerase (hTERT); um promotor de re- alçador de citomegalovírus/beta-actina de galinha/β-globina de coelho (CAG), um promotor de promotor alfa de fator de alongamento 1 (EFl- alfa) e um promotor de β-glicuronidase humano.
82. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 79 a 81, caracterizado pelo fato de que o promotor é um promo- tor de β-actina de galinha híbrido (CBA) compreendendo um realçador de CMV e um promotor de β-actina de galinha.
83. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 77 a 82, caracterizado pelo fato de que o cassete de expressão compreende ainda um íntron.
84. Método, de acordo com a reivindicação 83, caracteriza- do pelo fato de que o íntron é um íntron quimérico.
85. Método, de acordo com a reivindicação 83, caracteriza- do pelo fato de que o cassete de expressão é um vetor autocomple- mentar e o íntron é um íntron quimérico delta.
86. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 77 a 85, caracterizado pelo fato de que o ácido nucleico compre- ende ainda um sinal de poliadenilação.
87. Método, de acordo com a reivindicação 86, caracteriza-
do pelo fato de que o sinal de poliadenilação é um sinal de poliadenila- ção de hormônio de crescimento bovino.
88. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 77 a 87, caracterizado pelo fato de que a construção de expres- são é codificada por um vetor.
89. Método, de acordo com a reivindicação 88, caracteriza- do pelo fato de que o vetor é um vetor de vírus adeno-associado re- combinante (rAAV), um vetor adenoviral recombinante, um vetor lenti- viral recombinante ou um vetor do vírus do herpes simples (HSV) re- combinante.
90. Método, de acordo com a reivindicação 89, caracteriza- do pelo fato de que o vetor é um vetor adenoviral recombinante.
91. Método, de acordo com a reivindicação 90, caracteriza- do pelo fato de que o vetor adenoviral recombinante é derivado de so- rotipo de Adenovírus 2, 1, 5, 6, 19, 3, 11, 7, 14, 16, 21, 12, 18, 31, 8, 9, 10, 13, 15, 17, 19, 20, 22, 23, 24-30, 37, 40, 41, AdHu2, AdHu 3, Ad- Hu4, AdHu24, AdHu26, AdHu34, AdHu35, AdHu36, AdHu37, AdHu41, AdHu48, AdHu49, AdHu50, AdC6, AdC7, AdC69, Ad bovino tipo 3, Ad canino tipo 2, Ad ovino, ou Ad porcino tipo 3.
92. Método, de acordo com a reivindicação 91, caracteriza- do pelo fato de que o vetor adenoviral recombinante é derivado de so- rotipo adenoviral 2 ou uma variante de sorotipo adenoviral 5.
93. Método, de acordo com a reivindicação 89, caracteriza- do pelo fato de que o vetor é um vetor lentiviral recombinante.
94. Método, de acordo com a reivindicação 93, caracteriza- do pelo fato de que o vetor lentiviral recombinante é derivado de um lentivírus pseudotipado com vírus da estomatite vesicular (VSV), vírus da coriomeningite linfocítica (LCMV), vírus Ross river (RRV), vírus Ebola, vírus Marburg, vírus Mokala, vírus da Raiva, RD114 ou varian- tes nestes.
95. Método, de acordo com a reivindicação 89, caracteriza- do pelo fato de que o vetor é um vetor de rHSV.
96. Método, de acordo com a reivindicação 95, caracteriza- do pelo fato de que o vetor de rHSV é derivado de rHSV-1 ou rHSV-2.
97. Método, de acordo com a reivindicação 89, caracteriza- do pelo fato de que o vetor é um vetor de AAV recombinante (rAAV).
98. Método, de acordo com a reivindicação 97, caracteriza- do pelo fato de que a construção de expressão é flanqueada por uma ou mais sequências de repetição terminal invertida (ITR) de AAV.
99. Método, de acordo com a reivindicação 98, caracteriza- do pelo fato de que a construção de expressão é flanqueada por duas ITRs de AAV.
100. Método, de acordo com a reivindicação 98 ou 99, ca- racterizado pelo fato de que as ITRs de AAV são ITRs de AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAVrh8, AAVrh8R, AAV9, AAV10, AAVrh10, AAV11, AAV12, AAV2R471A, AAV DJ, um sorotipo de AAV de cabra, AAV bovino, ou AAV de camundongo.
101. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 98 a 100, caracterizado pelo fato de que as ITRs de AAV são ITRs de AAV2.
102. Método, de acordo com a reivindicação 101, caracteri- zado pelo fato de que o vetor de rAAV compreende 5’ a 3’ de uma ITR de AAV2, um promotor, um íntron, ácido nucleico que codifica o RNAi, um sinal de poliadenilação, e uma ITR de AAV2.
103. Método, de acordo com a reivindicação 102, caracteri- zado pelo fato de que o promotor é um promotor de CBA.
104. Método, de acordo com a reivindicação 102, caracteri- zado pelo fato de que o íntron é um íntron quimérico, um íntron quimé- rico delta ou um íntron quimérico abreviado.
105. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica-
ções 102 a 104, caracterizado pelo fato de que o sinal de poliadenila- ção é um sinal de poliadenilação de hormônio de crescimento bovino.
106. Método, de acordo com a reivindicação 101, caracteri- zado pelo fato de que o vetor de rAAV compreende 5’ a 3’ de uma ITR de AAV2, o promotor de CBA, um íntron quimérico, ácido nucleico que codifica o RNAi, um sinal de poliadenilação de hormônio de crescimen- to bovino, e uma ITR de AAV2.
107. Método, de acordo com a reivindicação 106, caracteri- zado pelo fato de que o vetor compreende ainda um ácido nucleico de preenchimento.
108. Método, de acordo com a reivindicação 107, caracteri- zado pelo fato de que o ácido nucleico de preenchimento compreende ainda o ácido nucleico que codifica um polipeptídeo repórter.
109. Método, de acordo com a reivindicação 107 ou 108, caracterizado pelo fato de que o ácido nucleico de preenchimento está localizado a montante ou a jusante do ácido nucleico que codifica o RNAi.
110. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 97 a 109, caracterizado pelo fato de que o vetor é um vetor auto- complementar.
111. Método, de acordo com a reivindicação 110, caracteri- zado pelo fato de que o vetor compreende a primeira sequência de ácido nucleico que codifica o RNAi e uma segunda sequência de ácido nucleico que codifica um complemento do RNAi, em que a primeira sequência de ácido nucleico pode formar pares de base intrafita com a segunda sequência de ácido nucleico ao longo da maior parte ou todo seu comprimento.
112. Método, de acordo com a reivindicação 111, caracteri- zado pelo fato de que a primeira sequência de ácido nucleico e a se- gunda sequência de ácido nucleico são ligadas por uma ITR de AAV mutado, em que a ITR de AAV mutado compreende uma deleção da região D e compreende uma mutação da sequência de resolução ter- minal.
113. Método, de acordo com a reivindicação 88 ou 89, ca- racterizado pelo fato de que o vetor é encapsidado em uma partícula de rAAV, o vetor adenoviral recombinante é encapsidado em uma par- tícula adenoviral, o vetor lentiviral recombinante é encapsidado em uma partícula lentiviral ou o vetor de HSV recombinante é encapsidado em um HSV.
114. Método, de acordo com a reivindicação 113, caracteri- zado pelo fato de que a partícula viral é uma partícula adenoviral en- capsidando o vetor adenoviral recombinante.
115. Método, de acordo com a reivindicação 114, caracteri- zado pelo fato de que a partícula adenoviral compreende um capsídeo do sorotipo de Adenovírus 2, 1, 5, 6, 19, 3, 11, 7, 14, 16, 21, 12, 18, 31, 8, 9, 10, 13, 15, 17, 19, 20, 22, 23, 24-30, 37, 40, 41, AdHu2, AdHu 3, AdHu4, AdHu24, AdHu26, AdHu34, AdHu35, AdHu36, AdHu37, AdHu41, AdHu48, AdHu49, AdHu50, AdC6, AdC7, AdC69, Ad bovino tipo 3, Ad canino tipo 2, Ad ovino, ou Ad porcino tipo 3.
116. Método, de acordo com a reivindicação 115, caracteri- zado pelo fato de que a partícula adenoviral compreende um capsídeo de sorotipo adenoviral 2 ou uma variante de um capsídeo de sorotipo adenoviral 5.
117. Método, de acordo com a reivindicação 113, caracteri- zado pelo fato de que a partícula viral é uma partícula lentiviral encap- sidando o vetor lentiviral recombinante.
118. Método, de acordo com a reivindicação 117, caracteri- zado pelo fato de que a partícula lentiviral compreende um capsídeo pseudotipado com vírus da estomatite vesicular (VSV), vírus da corio- meningite linfocítica (LCMV), vírus Ross river (RRV), vírus Ebola, vírus
Marburg, vírus Mokala, vírus da Raiva, RD114 ou variantes nestes.
119. Método, de acordo com a reivindicação 113, caracteri- zado pelo fato de que a partícula viral é uma partícula de HSV.
120. Método, de acordo com a reivindicação 119, caracteri- zado pelo fato de que a partícula de HSV é uma partícula de rHSV-1 ou uma partícula de rHSV-2.
121. Método, de acordo com a reivindicação 113, caracteri- zado pelo fato de que a partícula viral é uma partícula de AAV recom- binante.
122. Método, de acordo com a reivindicação 121, caracteri- zado pelo fato de que a partícula de AAV viral compreende um AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAVrh8, AAVrh8R, AAV9, AAV10, AAVrh10, AAV11, AAV12, AAV2R471A, AAV2/2-7m8, AAV DJ, AAV2 N587A, AAV2 E548A, AAV2 N708A, AAV2 V708K, AAV2-HBKO, AAVDJ8, AAVPHP.B, AAVPHP.eB, AAVBR1, AA- VHSC15, AAVHSC17, AAV de cabra, AAV1/AAV2 quimérico, AAV bo- vino, AAV de camundongo, ou capsídeo de sorotipo de rAAV2/HBoV1.
123. Método, de acordo com a reivindicação 121 ou 122, caracterizado pelo fato de que a ITR e o capsídeo da partícula viral de rAAV são derivados do mesmo sorotipo de AAV.
124. Método, de acordo com a reivindicação 121 ou 122, caracterizado pelo fato de que a ITR e o capsídeo das partículas virais de rAAV são derivados de diferentes sorotipos de AAV.
125. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 121 a 124, caracterizado pelo fato de que a partícula viral de rA- AV compreende o capsídeo de AAV2.
126. Método, de acordo com a reivindicação 125, caracteri- zado pelo fato de que a partícula viral de rAAV compreende um capsí- deo de AAV1, e em que o vetor compreende ITRs de AAV2.
127. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica-
ções 65 a 112, caracterizado pelo fato de que a partícula viral como definida em qualquer uma das reivindicações 113 a 120, ou a partícula de rAAV como definida em qualquer uma das reivindicações 121 a 126, está em uma composição.
128. Método, de acordo com a reivindicação 127, caracteri- zado pelo fato de que a composição compreende ainda um veículo farmaceuticamente aceitável.
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