KR20230137900A - Car-t 활성을 조정하기 위한 방법 및 조성물 - Google Patents
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Abstract
본원은 조작된 세포 및/또는 저면역원성 줄기 세포, 이로부터 분화된 조작된 및/또는 저면역원성 세포, 조작된 및/또는 저면역원성 CAR-T 세포 (일차 또는 조작된 및/또는 저면역원성 줄기 세포로부터 분화된 세포)를 포함하는 조작된 세포 및/또는 저면역원성 세포, 및 이들의 사용 및 생성의 관련된 방법을 개시한다. 본원은 MHC 클래스 I 및/또는 MHC 클래스 II 인간 백혈구 항원 및 T-세포 수용체의 감소된 발현을 나타내는 조작된 및/또는 저면역원성 세포를 제공한다. 일부 실시양태에서, 이러한 세포는 또한 하나 이상의 관용원성 인자, 예컨대, CD47 및 하나 이상의 키메라 항원 수용체 (CAR)를 외인성으로 발현한다.
Description
관련 출원에 대한 교차-참조
본 출원은 이의 개시내용이 그 전체가 본원에 참조로 원용되는, 2020년 12월 31일자로 출원된 미국 가출원 제63/133,171호; 2021년 1월 11일자로 출원된 미국 가출원 제63/136,172호; 2021년 4월 14일자로 출원된 미국 가출원 제63/175,003호; 2021년 10월 14일자로 출원된 미국 가출원 제63/255,795호; 및 2021년 12월 10일자로 출원된 미국 가출원 제63/288,477호에 대해 35 U.S.C.§ 119 (e) 하에서 우선권을 주장한다.
요약
규격품 CAR-T 세포 및 기타 치료적 세포는 제조의 용이성, 품질 관리 및 악성 오염 및 T 세포 기능장애의 회피를 포함하여 자가유래 세포-기반 전략에 비해 이점을 제공할 수 있다. 그러나, 조직부적합성 T 세포에 대한 활발한 숙주-대-이식편 면역 반응은 동종이계 CAR-T 세포의 확장 및 지속을 방지하고 이 접근법의 효험을 완화시킨다.
저면역원성 세포 이식이 다수의 장애, 병태 및 질환의 치료에 대해 과학적으로 실행가능하고 임상적으로 유망한 접근법이라는 동물 모델 및 인간 환자 둘 모두에서의 실질적인 증거가 있다.
수용자의 면역계에 의한 검출을 회피하는 세포-기반 요법을 생산하기 위한 신규 접근법, 조성물 및 방법에 대한 필요성이 남아 있다.
일부 실시양태에서, 야생형 세포 또는 대조군 세포에 비해, HLA-A, HLA-B, HLA-C, HLA-DP, HLA-DQ, HLA-DR, B2M, CIITA, TCR-알파, 및/또는 TCR-베타의 감소된 발현을 포함하는 조작된 세포를 제공하며, 조작된 세포는 CD47을 코딩하는 제1 외인성 폴리뉴클레오티드 및 키메라 항원 수용체 (CAR)를 코딩하는 제2 외인성 폴리뉴클레오티드를 포함하는 외인성 폴리뉴클레오티드의 세트를 추가로 포함하며, 여기서 제1 및/또는 제2 외인성 폴리뉴클레오티드는 세포의 하나 이상의 대립유전자의 특이적 유전자좌 내로 삽입된다. 일부 실시양태에서, 외인성 폴리뉴클레오티드는 예를 들어, 벡터를 이용한 바이러스 형질도입을 사용하여 세포의 하나 이상의 대립유전자 내로 삽입된다. 일부 실시양태에서, 벡터는 외인성 폴리뉴클레오티드를 운반하는 슈도타이핑된 자기-비활성화 렌티바이러스 벡터이다. 일부 실시양태에서, 벡터는 수포성 구내염 바이러스 당단백질 (VSV-G) 외피로 슈도타이핑된 자기-비활성화 렌티바이러스 벡터이며, 이는 외인성 폴리뉴클레오티드를 운반한다. 일부 실시양태에서, 외인성 폴리뉴클레오티드는 바이러스 형질도입을 사용하여 세포의 하나 이상의 대립유전자 내로 삽입된다. 일부 실시양태에서, 외인성 폴리뉴클레오티드는 렌티바이러스 기반 바이러스 벡터를 사용하여 세포의 하나 이상의 대립유전자 내로 삽입된다.
일부 실시양태에서, 특이적 유전자좌는 세이프 하버 또는 표적 유전자좌, B2M 유전자좌, CIITA 유전자좌, TRAC 유전자좌 및 TRB 유전자좌로 이루어진 군으로부터 선택된다. 많은 실시양태에서, CD47을 코딩하는 제1 외인성 폴리뉴클레오티드는 세이프 하버 또는 표적 유전자좌, B2M 유전자좌, CIITA 유전자좌, TRAC 유전자좌 및 TRB 유전자좌로 이루어진 군으로부터 선택된 특이적 유전자좌 내로 삽입된다. 일부 실시양태에서, CAR을 코딩하는 제2 외인성 폴리뉴클레오티드는 세이프 하버 또는 표적 유전자좌, B2M 유전자좌, CIITA 유전자좌, TRAC 유전자좌 및 TRB 유전자좌로 이루어진 군으로부터 선택된 특이적 유전자좌 내로 삽입된다. 일부 실시양태에서, 외인성 폴리뉴클레오티드는 예를 들어, 벡터를 이용한 바이러스 형질도입을 사용하여 세포의 하나 이상의 대립유전자 내로 삽입된다. 일부 실시양태에서, 벡터는 외인성 폴리뉴클레오티드를 운반하는 슈도타이핑된 자기-비활성화 렌티바이러스 벡터이다. 일부 실시양태에서, 벡터는 수포성 구내염 VSV-G 외피로 슈도타이핑된 자기-비활성화 렌티바이러스 벡터이고, 이는 외인성 폴리뉴클레오티드를 운반한다. 일부 실시양태에서, 외인성 폴리뉴클레오티드는 바이러스 형질도입을 사용하여 세포의 하나 이상의 대립유전자 내로 삽입된다. 일부 실시양태에서, 외인성 폴리뉴클레오티드는 렌티바이러스 기반 바이러스 벡터를 사용하여 세포의 하나 이상의 대립유전자 내로 삽입된다.
일부 실시양태에서, CD47을 코딩하는 제1 외인성 폴리뉴클레오티드 및 CAR을 코딩하는 제2 외인성 폴리뉴클레오티드는 상이한 유전자좌 내로 삽입된다. 많은 실시양태에서, CD47을 코딩하는 제1 외인성 폴리뉴클레오티드 및 CAR을 코딩하는 제2 외인성 폴리뉴클레오티드는 동일한 유전자좌 내로 삽입된다. 몇몇 실시양태에서, CD47을 코딩하는 제1 외인성 폴리뉴클레오티드 및 CAR을 코딩하는 제2 외인성 폴리뉴클레오티드는 B2M 유전자좌 내로 삽입된다. 일부 실시양태에서, CD47을 코딩하는 제1 외인성 폴리뉴클레오티드 및 CAR을 코딩하는 제2 외인성 폴리뉴클레오티드는 CIITA 유전자좌 내로 삽입된다. 많은 실시양태에서, CD47을 코딩하는 제1 외인성 폴리뉴클레오티드 및 CAR을 코딩하는 제2 외인성 폴리뉴클레오티드는 TRAC 유전자좌 내로 삽입된다. 일부 실시양태에서, CD47을 코딩하는 제1 외인성 폴리뉴클레오티드 및 CAR을 코딩하는 제2 외인성 폴리뉴클레오티드는 TRB 유전자좌 내로 삽입된다. 일부 실시양태에서, CD47을 코딩하는 제1 외인성 폴리뉴클레오티드 및 CAR을 코딩하는 제2 외인성 폴리뉴클레오티드는 세이프 하버 또는 표적 유전자좌 내로 삽입된다. 일부 실시양태에서, 세이프 하버 또는 표적 유전자좌는 CCR5 유전자 유전자좌, CXCR4 유전자 유전자좌, PPP1R12C (AAVS1로서 또한 알려짐) 유전자 유전자좌, 알부민 유전자 유전자좌, SHS231 유전자 유전자좌, CLYBL 유전자 유전자좌, Rosa 유전자 유전자좌 (예컨대, ROSA26 유전자 유전자좌), F3 유전자 유전자좌 (CD142로서 또한 알려짐), MICA 유전자 유전자좌, MICB 유전자 유전자좌, LRP1 유전자 유전자좌 (CD91 유전자 유전자좌로서 또한 알려짐), HMGB1 유전자 유전자좌, ABO 유전자 유전자좌, ad RHD 유전자 유전자좌, FUT1 유전자좌 및 KDM5D 유전자 유전자좌로 이루어진 군으로부터 선택된다. 다양한 실시양태에서, 세이프 하버 또는 표적 유전자좌는 AAVS1 유전자좌, CCR5 유전자좌 및 ROSA26 유전자좌로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, 외인성 폴리뉴클레오티드는 예를 들어, 벡터를 이용한 바이러스 형질도입을 사용하여 세포의 하나 이상의 대립유전자 내로 삽입된다. 일부 실시양태에서, 벡터는 외인성 폴리뉴클레오티드를 운반하는 슈도타이핑된 자기-비활성화 렌티바이러스 벡터이다. 일부 실시양태에서, 벡터는 수포성 구내염 VSV-G 외피로 슈도타이핑된 자기-비활성화 렌티바이러스 벡터이고, 이는 외인성 폴리뉴클레오티드를 운반한다. 일부 실시양태에서, 외인성 폴리뉴클레오티드는 바이러스 형질도입을 사용하여 세포의 하나 이상의 대립유전자 내로 삽입된다. 일부 실시양태에서, 외인성 폴리뉴클레오티드는 렌티바이러스 기반 바이러스 벡터를 사용하여 세포의 하나 이상의 대립유전자 내로 삽입된다.
일부 실시양태에서, CAR은 CD19-특이적 CAR 및 CD22-특이적 CAR로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, CAR은 이중특이적 CAR이다. 일부 실시양태에서, CAR은 CD19-특이적 CAR이다. 일부 실시양태에서, CAR은 CD22-특이적 CAR이다. 일부 실시양태에서, CAR은 이중특이적 CAR이다. 일부 실시양태에서, CAR은 CD19/CD22-이중특이적 CAR이다.
많은 실시양태에서, 조작된 세포는 HLA-A, HLA-B 및/또는 HLA-C 항원을 발현하지 않는다. 일부 실시양태에서, 조작된 세포는 B2M을 발현하지 않는다. 다른 실시양태에서, 조작된 세포는 HLA-DP, HLA-DQ 및/또는 HLA-DR 항원을 발현하지 않는다. 일부 실시양태에서, 조작된 세포는 CIITA를 발현하지 않는다. 일부 실시양태에서, 조작된 세포는 만능 줄기 세포, 유도 만능 줄기 세포, 유도 만능 줄기 세포로부터 분화된 T 세포, 일차 T 세포, 및 일차 T 세포로부터 유래된 세포로 이루어진 군으로부터 선택되고, 조작된 세포는 TCR-알파 및/또는 TCR-베타를 발현하지 않는다.
많은 실시양태에서, 조작된 세포는 만능 줄기 세포이다. 일부 실시양태에서, 조작된 세포는 유도 만능 줄기 세포이다.
일부 실시양태에서, 조작된 세포는 유도 만능 줄기 세포로부터 유래된 분화된 세포이다. 다양한 실시양태에서, 분화된 세포는 NK 세포 및 T 세포로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일부 실시양태에서, 조작된 세포는 일차 T 세포로부터 유래된 세포이다. 많은 실시양태에서, 일차 T 세포로부터 유래된 세포는 수용자 대상체와 상이한 1 명 이상의 공여자 대상체로부터의 일차 T 세포를 포함하는 T 세포의 풀로부터 유래된다.
일부 실시양태에서, 조작된 세포는 일차 NK 세포로부터 유래된 세포이다. 많은 실시양태에서, 일차 NK 세포로부터 유래된 세포는 수용자 대상체와 상이한 1 명 이상의 공여자 대상체로부터의 일차 NK 세포를 포함하는 NK 세포의 풀로부터 유래된다.
일부 실시양태에서, 조작된 세포는 다능성을 보유하고/하거나 분화 잠재력을 보유한다.
많은 실시양태에서, 제1 대상체 내로 전달된 후, 조작된 세포는 제2 대상체 내로 전달된 후에 야생형 세포와 비교하여 감소되는, (a) T 세포 반응, (b) NK 세포 반응, 및 (c) 대식세포 반응으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 반응을 나타낸다. 일부 경우에, 제1 대상체 및 제2 대상체는 상이한 대상체이다. 일부 경우에, 대식세포 반응이 탐식이다. 다양한 실시양태에서, 대상체 내로 전달된 후 조작된 세포는 대상체 내로 전달된 후에 야생형 세포와 비교하여, (a) 대상체 내의 감소된 TH1 활성화, (b) 대상체 내의 감소된 NK 세포 살해 및 (c) 대상체 내의 전체 PBMC에 의한 감소된 살해로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상을 나타낸다. 많은 실시양태에서, 대상체 내로 전달된 후 조작된 세포는 대상체 내로 전달된 후에 야생형 세포와 비교하여, (a) 대상체 내의 감소된 공여자 특이적 항체, (b) 대상체 내의 감소된 IgM 또는 IgG 항체, 및 (c) 대상체 내의 감소된 보체-의존적 세포독성 (CDC)으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상을 이끌어낸다.
일부 실시양태에서, 조작된 세포는 만능 줄기 세포, 유도 만능 줄기 세포, 유도 만능 줄기 세포로부터 분화된 T 세포, 일차 T 세포, 및 일차 T 세포로부터 유래된 세포로 이루어진 군으로부터 선택되고, 조작된 세포는 CD47을 코딩하는 제1 외인성 폴리뉴클레오티드 및/또는 CAR을 코딩하는 제2 외인성 폴리뉴클레오티드를 포함하는 B2M indel/indel , CIITA indel/indel , 및/또는 TRAC indel/indel 세포이다. 일부 실시양태에서, 제1 및/또는 제2 외인성 폴리뉴클레오티드는 바이러스 형질도입을 사용하여 T 세포의 하나 이상의 대립유전자 내로 삽입된다. 일부 실시양태에서, 제1 및/또는 제2 외인성 폴리뉴클레오티드는 렌티바이러스 기반 바이러스 벡터를 사용하여 T 세포의 하나 이상의 대립유전자 내로 삽입된다. 일부 실시양태에서, 조작된 세포는 만능 줄기 세포, 유도 만능 줄기 세포, 유도 만능 줄기 세포로부터 분화된 T 세포, 일차 T 세포, 및 일차 T 세포로부터 유래된 세포로 이루어진 군으로부터 선택되고, 조작된 세포는 TRAC 유전자좌 내로 삽입된, CD47을 코딩하는 제1 외인성 폴리뉴클레오티드 및/또는 CAR을 코딩하는 제2 외인성 폴리뉴클레오티드를 포함하는 B2M indel/indel , CIITA indel/indel , 및/또는 TRAC indel/indel 세포이다. 많은 실시양태에서, 조작된 세포는 만능 줄기 세포, 유도 만능 줄기 세포, 유도 만능 줄기 세포로부터 분화된 T 세포, 일차 T 세포, 및 일차 T 세포로부터 유래된 세포로 이루어진 군으로부터 선택되고, 조작된 세포는 TRAC 유전자좌 내로 삽입된, CD47을 코딩하는 제1 외인성 폴리뉴클레오티드 및 CAR을 코딩하는 제2 외인성 폴리뉴클레오티드를 포함하는 B2M indel/indel , CIITA indel/indel , 및/또는 TRAC indel/indel 세포이다. 많은 실시양태에서, 조작된 세포는 만능 줄기 세포, 유도 만능 줄기 세포, 유도 만능 줄기 세포로부터 분화된 T 세포, 일차 T 세포, 및 일차 T 세포로부터 유래된 세포로 이루어진 군으로부터 선택되고, 조작된 세포는 TRB 유전자좌 내로 삽입된, CD47을 코딩하는 제1 외인성 폴리뉴클레오티드 및/또는 CAR을 코딩하는 제2 외인성 폴리뉴클레오티드를 포함하는 B2M indel/indel , CIITA indel/indel , 및/또는 TRAC indel/indel 세포이다. 일부 실시양태에서, 조작된 세포는 만능 줄기 세포, 유도 만능 줄기 세포, 유도 만능 줄기 세포로부터 분화된 T 세포, 일차 T 세포, 및 일차 T 세포로부터 유래된 세포로 이루어진 군으로부터 선택되고, 조작된 세포는 TRB 유전자좌 내로 삽입된, CD47을 코딩하는 제1 외인성 폴리뉴클레오티드 및 CAR을 코딩하는 제2 외인성 폴리뉴클레오티드를 포함하는 B2M indel/indel , CIITA indel/indel , 및/또는 TRAC indel/indel 세포이다. 다수의 실시양태에서, 조작된 세포는 만능 줄기 세포, 유도 만능 줄기 세포, 유도 만능 줄기 세포로부터 분화된 T 세포, 일차 T 세포, 및 일차 T 세포로부터 유래된 세포로 이루어진 군으로부터 선택되고, 조작된 세포는 B2M 유전자좌 내로 삽입된, CD47을 코딩하는 제1 외인성 폴리뉴클레오티드 및/또는 CAR을 코딩하는 제2 외인성 폴리뉴클레오티드를 포함하는 B2M indel/indel , CIITA indel/indel , 및/또는 TRAC indel/indel 세포이다. 많은 실시양태에서, 조작된 세포는 만능 줄기 세포, 유도 만능 줄기 세포, 유도 만능 줄기 세포로부터 분화된 T 세포, 일차 T 세포, 및 일차 T 세포로부터 유래된 세포로 이루어진 군으로부터 선택되고, 조작된 세포는 B2M 유전자좌 내로 삽입된, CD47을 코딩하는 제1 외인성 폴리뉴클레오티드 및 CAR을 코딩하는 제2 외인성 폴리뉴클레오티드를 포함하는 B2M indel/indel , CIITA indel/indel , 및/또는 TRAC indel/indel 세포이다. 일부 실시양태에서, 조작된 세포는 만능 줄기 세포, 유도 만능 줄기 세포, 유도 만능 줄기 세포로부터 분화된 T 세포, 일차 T 세포, 및 일차 T 세포로부터 유래된 세포로 이루어진 군으로부터 선택되고, 조작된 세포는 CIITA 유전자좌 내로 삽입된, CD47을 코딩하는 제1 외인성 폴리뉴클레오티드 및/또는 CAR을 코딩하는 제2 외인성 폴리뉴클레오티드를 포함하는 B2M indel/indel , CIITA indel/indel , 및/또는 TRAC indel/indel 세포이다. 많은 실시양태에서, 조작된 세포는 만능 줄기 세포, 유도 만능 줄기 세포, 유도 만능 줄기 세포로부터 분화된 T 세포, 일차 T 세포, 및 일차 T 세포로부터 유래된 세포로 이루어진 군으로부터 선택되고, 조작된 세포는 CIITA 유전자좌 내로 삽입된, CD47을 코딩하는 제1 외인성 폴리뉴클레오티드 및 CAR을 코딩하는 제2 외인성 폴리뉴클레오티드를 포함하는 B2M indel/indel , CIITA indel/indel , 및/또는 TRAC indel/indel 세포이다. 일부 실시양태에서, 외인성 폴리뉴클레오티드는 예를 들어, 벡터를 이용한 바이러스 형질도입을 사용하여 세포의 하나 이상의 대립유전자 내로 삽입된다. 일부 실시양태에서, 벡터는 외인성 폴리뉴클레오티드를 운반하는 슈도타이핑된 자기-비활성화 렌티바이러스 벡터이다. 일부 실시양태에서, 벡터는 수포성 구내염 VSV-G 외피로 슈도타이핑된 자기-비활성화 렌티바이러스 벡터이고, 이는 외인성 폴리뉴클레오티드를 운반한다. 일부 실시양태에서, 외인성 폴리뉴클레오티드는 바이러스 형질도입을 사용하여 세포의 하나 이상의 대립유전자 내로 삽입된다. 일부 실시양태에서, 외인성 폴리뉴클레오티드는 렌티바이러스 기반 바이러스 벡터를 사용하여 세포의 하나 이상의 대립유전자 내로 삽입된다.
일부 실시양태에서, 조작된 세포는 만능 줄기 세포, 유도 만능 줄기 세포, 유도 만능 줄기 세포로부터 분화된 T 세포, 일차 T 세포, 및 일차 T 세포로부터 유래된 세포로 이루어진 군으로부터 선택되고, 조작된 세포는 TRAC 유전자좌 내로 삽입된, CD47을 코딩하는 제1 외인성 폴리뉴클레오티드 및/또는 CAR을 코딩하는 제2 외인성 폴리뉴클레오티드를 포함하는 B2M indel/indel , CIITA indel/indel , 및/또는 TRB indel/indel 세포이다. 많은 실시양태에서, 조작된 세포는 만능 줄기 세포, 유도 만능 줄기 세포, 유도 만능 줄기 세포로부터 분화된 T 세포, 일차 T 세포, 및 일차 T 세포로부터 유래된 세포로 이루어진 군으로부터 선택되고, 조작된 세포는 TRAC 유전자좌 내로 삽입된, CD47을 코딩하는 제1 외인성 폴리뉴클레오티드 및 CAR을 코딩하는 제2 외인성 폴리뉴클레오티드를 포함하는 B2M indel/indel , CIITA indel/indel , 및/또는 TRB indel/indel 세포이다. 많은 실시양태에서, 조작된 세포는 만능 줄기 세포, 유도 만능 줄기 세포, 유도 만능 줄기 세포로부터 분화된 T 세포, 일차 T 세포, 및 일차 T 세포로부터 유래된 세포로 이루어진 군으로부터 선택되고, 조작된 세포는 TRB 유전자좌 내로 삽입된, CD47을 코딩하는 제1 외인성 폴리뉴클레오티드 및/또는 CAR을 코딩하는 제2 외인성 폴리뉴클레오티드를 포함하는 B2M indel/indel , CIITA indel/indel , 및/또는 TRB indel/indel 세포이다. 일부 실시양태에서, 조작된 세포는 만능 줄기 세포, 유도 만능 줄기 세포, 유도 만능 줄기 세포로부터 분화된 T 세포, 일차 T 세포, 및 일차 T 세포로부터 유래된 세포로 이루어진 군으로부터 선택되고, 조작된 세포는 TRB 유전자좌 내로 삽입된, CD47을 코딩하는 제1 외인성 폴리뉴클레오티드 및 CAR을 코딩하는 제2 외인성 폴리뉴클레오티드를 포함하는 B2M indel/indel , CIITA indel/indel , 및/또는 TRB indel/indel 세포이다. 다수의 실시양태에서, 조작된 세포는 만능 줄기 세포, 유도 만능 줄기 세포, 유도 만능 줄기 세포로부터 분화된 T 세포, 일차 T 세포, 및 일차 T 세포로부터 유래된 세포로 이루어진 군으로부터 선택되고, 조작된 세포는 B2M 유전자좌 내로 삽입된, CD47을 코딩하는 제1 외인성 폴리뉴클레오티드 및/또는 CAR을 코딩하는 제2 외인성 폴리뉴클레오티드를 포함하는 B2M indel/indel , CIITA indel/indel , 및/또는 TRB indel/indel 세포이다. 많은 실시양태에서, 조작된 세포는 만능 줄기 세포, 유도 만능 줄기 세포, 유도 만능 줄기 세포로부터 분화된 T 세포, 일차 T 세포, 및 일차 T 세포로부터 유래된 세포로 이루어진 군으로부터 선택되고, 조작된 세포는 B2M 유전자좌 내로 삽입된, CD47을 코딩하는 제1 외인성 폴리뉴클레오티드 및 CAR을 코딩하는 제2 외인성 폴리뉴클레오티드를 포함하는 B2M indel/indel , CIITA indel/indel , 및/또는 TRB indel/indel 세포이다. 일부 실시양태에서, 조작된 세포는 만능 줄기 세포, 유도 만능 줄기 세포, 유도 만능 줄기 세포로부터 분화된 T 세포, 일차 T 세포, 및 일차 T 세포로부터 유래된 세포로 이루어진 군으로부터 선택되고, 조작된 세포는 CIITA 유전자좌 내로 삽입된, CD47을 코딩하는 제1 외인성 폴리뉴클레오티드 및/또는 CAR을 코딩하는 제2 외인성 폴리뉴클레오티드를 포함하는 B2M indel/indel , CIITA indel/indel , 및/또는 TRB indel/indel 세포이다. 많은 실시양태에서, 조작된 세포는 만능 줄기 세포, 유도 만능 줄기 세포, 유도 만능 줄기 세포로부터 분화된 T 세포, 일차 T 세포, 및 일차 T 세포로부터 유래된 세포로 이루어진 군으로부터 선택되고, 조작된 세포는 CIITA 유전자좌 내로 삽입된, CD47을 코딩하는 제1 외인성 폴리뉴클레오티드 및 CAR을 코딩하는 제2 외인성 폴리뉴클레오티드를 포함하는 B2M indel/indel , CIITA indel/indel , 및/또는 TRB indel/indel 세포이다. 일부 실시양태에서, 외인성 폴리뉴클레오티드는 예를 들어, 벡터를 이용한 바이러스 형질도입을 사용하여 세포의 하나 이상의 대립유전자 내로 삽입된다. 일부 실시양태에서, 벡터는 외인성 폴리뉴클레오티드를 운반하는 슈도타이핑된 자기-비활성화 렌티바이러스 벡터이다. 일부 실시양태에서, 벡터는 수포성 구내염 VSV-G 외피로 슈도타이핑된 자기-비활성화 렌티바이러스 벡터이고, 이는 외인성 폴리뉴클레오티드를 운반한다. 일부 실시양태에서, 외인성 폴리뉴클레오티드는 바이러스 형질도입을 사용하여 세포의 하나 이상의 대립유전자 내로 삽입된다. 일부 실시양태에서, 외인성 폴리뉴클레오티드는 렌티바이러스 기반 바이러스 벡터를 사용하여 세포의 하나 이상의 대립유전자 내로 삽입된다.
일부 실시양태에서, 조작된 세포는 TRAC 유전자좌 내로 삽입된, CD47을 코딩하는 제1 외인성 폴리뉴클레오티드 및/또는 CAR을 코딩하는 제2 외인성 폴리뉴클레오티드를 포함하는 B2M indel/indel , CIITA indel/indel , TRAC indel/indel , 및/또는 TRB indel/indel 세포이다. 많은 실시양태에서, 조작된 세포는 TRAC 유전자좌 내로 삽입된, CD47을 코딩하는 제1 외인성 폴리뉴클레오티드 및 CAR을 코딩하는 제2 외인성 폴리뉴클레오티드를 포함하는 B2M indel/indel , CIITA indel/indel , TRAC indel/indel , 및/또는 TRB indel/indel 세포이다. 많은 실시양태에서, 조작된 세포는 TRB 유전자좌 내로 삽입된, CD47을 코딩하는 제1 외인성 폴리뉴클레오티드 및/또는 CAR을 코딩하는 제2 외인성 폴리뉴클레오티드를 포함하는 B2M indel/indel , CIITA indel/indel , TRAC indel/indel , 및/또는 TRB indel/indel 세포이다. 일부 실시양태에서, 조작된 세포는 TRB 유전자좌 내로 삽입된, CD47을 코딩하는 제1 외인성 폴리뉴클레오티드 및 CAR을 코딩하는 제2 외인성 폴리뉴클레오티드를 포함하는 B2M indel/indel , CIITA indel/indel , TRAC indel/indel , 및/또는 TRB indel/indel 세포이다. 다수의 실시양태에서, 조작된 세포는 B2M 유전자좌 내로 삽입된, CD47을 코딩하는 제1 외인성 폴리뉴클레오티드 및/또는 CAR을 코딩하는 제2 외인성 폴리뉴클레오티드를 포함하는 B2M indel/indel , CIITA indel/indel , TRAC indel/indel , 및/또는 TRB indel/indel 세포이다. 많은 실시양태에서, 조작된 세포는 B2M 유전자좌 내로 삽입된, CD47을 코딩하는 제1 외인성 폴리뉴클레오티드 및 CAR을 코딩하는 제2 외인성 폴리뉴클레오티드를 포함하는 B2M indel/indel , CIITA indel/indel , TRAC indel/indel , 및/또는 TRB indel/indel 세포이다. 일부 실시양태에서, 조작된 세포는 CIITA 유전자좌 내로 삽입된, CD47을 코딩하는 제1 외인성 폴리뉴클레오티드 및/또는 CAR을 코딩하는 제2 외인성 폴리뉴클레오티드를 포함하는 B2M indel/indel , CIITA indel/indel , TRAC indel/indel , 및/또는 TRB indel/indel 세포이다. 많은 실시양태에서, 조작된 세포는 CIITA 유전자좌 내로 삽입된, CD47을 코딩하는 제1 외인성 폴리뉴클레오티드 및 CAR을 코딩하는 제2 외인성 폴리뉴클레오티드를 포함하는 B2M indel/indel , CIITA indel/indel , TRAC indel/indel , 및/또는 TRB indel/indel 세포이다. 일부 실시양태에서, 외인성 폴리뉴클레오티드는 예를 들어, 벡터를 이용한 바이러스 형질도입을 사용하여 세포의 하나 이상의 대립유전자 내로 삽입된다. 일부 실시양태에서, 벡터는 외인성 폴리뉴클레오티드를 운반하는 슈도타이핑된 자기-비활성화 렌티바이러스 벡터이다. 일부 실시양태에서, 벡터는 수포성 구내염 VSV-G 외피로 슈도타이핑된 자기-비활성화 렌티바이러스 벡터이고, 이는 외인성 폴리뉴클레오티드를 운반한다. 일부 실시양태에서, 외인성 폴리뉴클레오티드는 바이러스 형질도입을 사용하여 세포의 하나 이상의 대립유전자 내로 삽입된다. 일부 실시양태에서, 외인성 폴리뉴클레오티드는 렌티바이러스 기반 바이러스 벡터를 사용하여 세포의 하나 이상의 대립유전자 내로 삽입된다.
일부 실시양태에서, 야생형 세포 또는 대조군 세포에 비해, HLA-A, HLA-B, HLA-C, HLA-DP, HLA-DQ, HLA-DR, B2M, CIITA, TCR-알파, 및/또는 TCR-베타의 감소된 발현을 포함하는 조작된 세포를 제공한다.
일부 실시양태에서, 조작된 세포는 HLA-A, HLA-B 및/또는 HLA-C 항원을 발현하지 않는다. 많은 실시양태에서, 조작된 세포는 CIITA를 발현하지 않는다.
많은 실시양태에서, 조작된 세포는 HLA-DP, HLA-DQ 및/또는 HLA-DR 항원을 발현하지 않는다. 일부 실시양태에서, 조작된 세포는 B2M을 발현하지 않는다.
많은 실시양태에서, 조작된 세포는 만능 줄기 세포, 유도 만능 줄기 세포, 유도 만능 줄기 세포로부터 분화된 T 세포, 일차 T 세포, 및 일차 T 세포로부터 유래된 세포로 이루어진 군으로부터 선택되고, 조작된 세포는 TCR-알파를 발현하지 않는다. 많은 실시양태에서, 조작된 세포는 만능 줄기 세포, 유도 만능 줄기 세포, 유도 만능 줄기 세포로부터 분화된 T 세포, 일차 T 세포, 및 일차 T 세포로부터 유래된 세포로 이루어진 군으로부터 선택되고, 조작된 세포는 TCR-베타를 발현하지 않는다.
다양한 실시양태에서, 조작된 세포는 야생형 세포 또는 대조군 세포에 비해 CD47을 과발현한다.
일부 실시양태에서, 조작된 세포는 만능 줄기 세포이다. 많은 실시양태에서, 조작된 세포는 유도 만능 줄기 세포이다.
많은 실시양태에서, 조작된 세포는 유도 만능 줄기 세포로부터 유래된 분화된 세포이다. 일부 실시양태에서, 분화된 세포는 NK 세포 및 T 세포로 이루어진 군으로부터 선택된다.
많은 실시양태에서, 조작된 세포는 일차 T 세포로부터 유래된 세포이다. 몇몇 실시양태에서, 일차 T 세포로부터 유래된 세포는 수용자 대상체와 상이한 1 명 이상의 공여자 대상체로부터의 일차 T 세포를 포함하는 T 세포의 풀로부터 유래된다.
다양한 실시양태에서, 조작된 세포는 다능성을 보유하고/하거나 분화 잠재력을 보유한다.
일부 실시양태에서, 대상체 내로 전달된 후 조작된 세포는 제2 대상체 내로 전달된 후에 야생형 세포와 비교하여 감소되는, (a) T 세포 반응, (b) NK 세포 반응 및 (c) 대식세포 반응으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 반응을 이끌어낸다. 일부 경우에, 제1 대상체 및 제2 대상체는 상이한 대상체이다. 일부 경우에, 대식세포 반응이 탐식이다.
다양한 실시양태에서, 대상체 내로 전달된 후 조작된 세포는 대상체 내로 전달된 후에 야생형 세포와 비교하여, (a) 대상체 내의 감소된 TH1 활성화, (b) 대상체 내의 감소된 NK 세포 살해 및 (c) 대상체 내의 전체 PBMC에 의한 감소된 살해로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상을 나타낸다. 많은 실시양태에서, 대상체 내로 전달된 후 조작된 세포는 대상체 내로 전달된 후에 야생형 세포와 비교하여, (a) 대상체 내의 감소된 공여자 특이적 항체, (b) 대상체 내의 감소된 IgM 또는 IgG 항체, 및 (c) 대상체 내의 감소된 보체-의존적 세포독성 (CDC)으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상을 이끌어낸다.
일부 실시양태에서, 조작된 세포는 B2M indel/indel , CIITA indel/indel , TRAC indel/indel , 및/또는 TRB indel/indel 세포이다. 일부 경우에, 조작된 세포는 B2M indel/indel , CIITA indel/indel , TRAC indel/indel , 및/또는 TRB indel/indel 일차 T 세포이다. 일부 경우에, 조작된 세포는 저면역원성 유도 만능 줄기 세포로부터 분화된 B2M indel/indel , CIITA indel/indel , TRAC indel/indel , 및/또는 TRB indel/indel T 세포이다. 일부 실시양태에서, 조작된 세포는 만능 줄기 세포, 유도 만능 줄기 세포, 유도 만능 줄기 세포로부터 분화된 T 세포, 일차 T 세포, 및 일차 T 세포로부터 유래된 세포로 이루어진 군으로부터 선택되고, 조작된 세포는 B2M indel/indel , CIITA indel/indel , TRAC indel/indel 세포이다. 일부 경우에, 조작된 세포는 만능 줄기 세포, 유도 만능 줄기 세포, 유도 만능 줄기 세포로부터 분화된 T 세포, 일차 T 세포, 및 일차 T 세포로부터 유래된 세포로 이루어진 군으로부터 선택되고, 조작된 세포는 B2M indel/indel , CIITA indel/indel , TRAC indel/indel 일차 T 세포이다. 일부 실시양태에서, 조작된 세포는 만능 줄기 세포, 유도 만능 줄기 세포, 유도 만능 줄기 세포로부터 분화된 T 세포, 일차 T 세포, 및 일차 T 세포로부터 유래된 세포로 이루어진 군으로부터 선택되고, 조작된 세포는 B2M indel/indel , CIITA indel/indel , TRB indel/indel 세포이다. 일부 경우에, 조작된 세포는 만능 줄기 세포, 유도 만능 줄기 세포, 유도 만능 줄기 세포로부터 분화된 T 세포, 일차 T 세포, 및 일차 T 세포로부터 유래된 세포로 이루어진 군으로부터 선택되고, 조작된 세포는 B2M indel/indel , CIITA indel/indel , TRB indel/indel 일차 T 세포이다. 일부 경우에, 조작된 세포는 저면역원성 유도 만능 줄기 세포로부터 분화된 B2M indel/indel , CIITA indel/indel , TRAC indel/indel T 세포이다. 일부 실시양태에서, 조작된 세포는 B2M indel/indel , CIITA indel/indel , 및/또는 TRB indel/indel 세포이다. 일부 경우에, 조작된 세포는 B2M indel/indel , CIITA indel/indel , 및/또는 TRB indel/indel 일차 T 세포이다. 일부 경우에, 조작된 세포는 저면역원성 유도 만능 줄기 세포로부터 분화된 B2M indel/indel , CIITA indel/indel , 및/또는 TRB indel/indel T 세포이다.
일부 실시양태에서, 조작된 세포는 저면역원성 세포이다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 조작된 세포 중 임의의 것의 집단 및 약학적으로 허용가능한 첨가제, 담체, 희석제 또는 부형제를 포함하는 약학 조성물을 제공한다.
일부 실시양태에서, 약학적으로 허용가능한 첨가제, 담체, 희석제 또는 부형제는 Plasma-Lyte A®, 덱스트로스, 덱스트란, 소듐 클로라이드, 인간 혈청 알부민 (HSA), 디메틸설폭사이드 (DMSO) 및 이의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상을 포함한다. 일부 실시양태에서, 약학 조성물은 약학적으로 허용가능한 완충액을 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 약학적으로 허용가능한 완충액은 중성 완충 식염수 또는 포스페이트 완충된 식염수이다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 조작된 세포 중 임의의 것의 집단, 약 70-80% w/w의 농도의 CryoStor® CSB의 염기 용액, 및 약 20-30% w/w PlasmaLyte-A™, 약 0.3-5.3% w/v 인간 혈청 알부민 (HSA), 약 0-20% v/v 디메틸설폭사이드 (DMSO) 및 약 100-400 mM 트레할로스 중 하나 이상을 포함하는 약학 조성물을 제공한다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 조작된 세포 중 임의의 것의 집단, 약 20-30% w/w의 농도의 PlasmaLyte-A™의 염기 용액, 및 약 70-80% w/w CryoStor® CSB, 약 0.3-5.3% w/v 인간 혈청 알부민 (HSA), 약 0-20% v/v 디메틸설폭사이드 (DMSO) 및 약 100-400 mM 트레할로스 중 하나 이상을 포함하는 약학 조성물을 제공한다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 조작된 세포 중 임의의 것의 집단, 약 0.3-5.3% w/v 인간 혈청 알부민 (HSA), 및 약 70-80% w/w CryoStor® CSB, 약 20-30% w/w PlasmaLyte-A™, 약 0-20% v/v 디메틸설폭사이드 (DMSO) 및 약 100-400 mM 트레할로스 중 하나 이상을 포함하는 약학 조성물을 제공한다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 조작된 세포 중 임의의 것의 집단, 약 0-20% v/v 디메틸설폭사이드 (DMSO), 및 약 70-80% w/w CryoStor® CSB, 약 20-30% w/w PlasmaLyte-A™, 약 0.3-5.3% w/v 인간 혈청 알부민 (HSA) 및 약 100-400 mM 트레할로스 중 하나 이상을 포함하는 약학 조성물을 제공한다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 조작된 세포 중 임의의 것의 집단, 약 100-400 mM 트레할로스, 및 약 70-80% w/w CryoStor® CSB, 약 20-30% w/w PlasmaLyte-A™, 약 0.3-5.3% w/v 인간 혈청 알부민 (HSA) 및 약 0-20% v/v 디메틸설폭사이드 (DMSO) 중 하나 이상을 포함하는 약학 조성물을 제공한다.
일부 실시양태에서, 약학 조성물은 약 75% w/w의 CryoStor® CSB를 포함한다. 일부 실시양태에서, 약학 조성물은 약 25% w/w의 PlasmaLyte-A™를 포함한다. 일부 실시양태에서, 약학 조성물은 약 0.3% w/v의 HSA를 포함한다. 일부 실시양태에서, 약학 조성물은 약 7.5% v/v의 DMSO를 포함한다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 조작된 세포 중 임의의 것의 집단, 약 75% w/w의 농도의 CryoStor® CSB의 염기 용액, 약 25% w/w PlasmaLyte-A™, 약 0.3% w/v 인간 혈청 알부민 (HSA) 및 약 7.5% v/v 디메틸설폭사이드 (DMSO)를 포함하는 약학 조성물을 제공한다.
일부 실시양태에서, 조작된 세포의 집단은 최대 약 8.0x108 개의 세포이다. 많은 실시양태에서, 조작된 세포의 집단은 최대 약 6.0x108 개의 세포이다. 다른 실시양태에서, 조작된 세포의 집단은 약 1.0x106 내지 약 2.5x108 개의 세포이다. 일부 실시양태에서, 조작된 세포의 집단은 약 2.0x106 내지 약 2.0x108 개의 세포이다.
다양한 실시양태에서, 조작된 세포의 집단은 약 5 ml 내지 약 80 ml 범위이다. 많은 실시양태에서, 조작된 세포의 집단은 약 10 ml 내지 약 70 ml 범위이다. 일부 실시양태에서, 조작된 세포의 집단은 약 10 ml 내지 약 50 ml 범위이다.
일부 실시양태에서, 조성물은 단일 용량으로 투여하기 위해 제형화된다. 많은 실시양태에서, 조성물은 최대 3 회 용량으로 투여하기 위해 제형화된다.
일부 실시양태에서, 조성물은 약 60 분 이하의 시간의 지속기간이 걸리는 대상체에 대한 단일 용량의 투여를 위해 제형화된다. 많은 실시양태에서, 조성물은 약 30 분 이하의 시간의 지속기간이 걸리는 대상체에 대한 단일 용량의 투여를 위해 제형화된다.
일부 실시양태에서, 약학 조성물의 조작된 세포 또는 이의 자손의 집단은 투여 후 10 일 후에 대상체에서 40% 이상의 생존을 나타낸다. 다양한 실시양태에서, 약학 조성물의 조작된 세포 또는 이의 자손의 집단은 투여 후 약 2 주 후에 대상체에서 80% 이상의 생존을 나타낸다. 몇몇 실시양태에서, 약학 조성물의 조작된 세포 또는 이의 자손의 집단은 투여 후 약 3 주 후에 대상체에서 100% 이상의 생존을 나타낸다. 많은 실시양태에서, 약학 조성물의 조작된 세포 또는 이의 자손의 집단은 투여 후 약 4 주 후에 대상체에서 150% 이상의 생존을 나타낸다.
다른 실시양태에서, 본원에 기재된 조작된 세포 중 임의의 것의 집단 및 약학적으로 허용가능한 첨가제, 담체, 희석제 또는 부형제를 포함하는 약학 조성물의 투여를 포함하는 대상체에서 질환 또는 장애를 치료하기 위한 투여량 양생법을 제공하며, 여기서 약학 조성물은 약 1-3 회 용량으로 투여된다.
일부 실시양태에서, 투여되는 약학 조성물은 약 1-3 회 용량의 최대 약 6.0x108 개의 세포이다. 일부 실시양태에서, 투여되는 약학 조성물은 약 1-3 회 용량의 약 0.6x106 내지 약 6.0x108 개의 세포이다. 일부 실시양태에서, 투여되는 약학 조성물은 대상체가 50 kg 이하의 체중을 갖는 경우, 약 1-3 회 용량으로 대상체의 체중 kg당 약 0.2x106 내지 약 5.0x106 개의 세포이다. 일부 실시양태에서, 투여되는 약학 조성물은 대상체가 50 kg 초과의 체중을 갖는 경우, 약 1-3 회 용량으로 약 0.1x108 내지 약 2.5x108 개의 세포이다. 일부 실시양태에서, 투여되는 약학 조성물은 약 1-3 회 용량의, 대상체의 체중 kg당 약 2.0x106 개의 세포 및 최대 약 2.x 108 개의 세포이다.
일부 실시양태에서, 대상체에 대한 단일 용량의 투여는 약 60 분 이하의 시간의 지속기간이 걸린다. 일부 실시양태에서, 대상체에 대한 단일 용량의 투여는 약 30 분 이하의 시간의 지속기간이 걸린다.
일부 실시양태에서, 약학적으로 허용가능한 첨가제, 담체, 희석제 또는 부형제는 Plasma-Lyte A®, 덱스트로스, 덱스트란, 소듐 클로라이드, 인간 혈청 알부민 (HSA), 디메틸설폭사이드 (DMSO) 및 이의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상을 포함한다.
일부 실시양태에서, 약학 조성물은 약학적으로 허용가능한 완충액을 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 약학적으로 허용가능한 완충액은 중성 완충 식염수 또는 포스페이트 완충된 식염수이다.
일부 실시양태에서, 약학 조성물의 투여 후에, 세포 또는 이의 자손의 집단은 최대 9 개월까지 대상체에 존재한다. 일부 실시양태에서, 약학 조성물의 투여 후에, 세포 또는 이의 자손의 집단은 적어도 2 년 이상 대상체에 존재한다.
일부 실시양태에서, 약학 조성물의 투여 후에, 조작된 세포 또는 이의 자손의 집단은 투여 후 약 10 일 후에 대상체에서 40% 이상의 생존을 나타낸다. 일부 실시양태에서, 약학 조성물의 투여 후에, 조작된 세포 또는 이의 자손의 집단은 투여 후 약 2 주 후에 대상체에서 80% 이상의 생존을 나타낸다. 일부 실시양태에서, 약학 조성물의 투여 후에, 조작된 세포 또는 이의 자손의 집단은 투여 후 약 3 주 후에 대상체에서 100% 이상의 생존을 나타낸다. 일부 실시양태에서, 약학 조성물의 투여 후에, 조작된 세포 또는 이의 자손의 집단은 투여 후 약 4 주 후에 대상체에서 150% 이상의 생존을 나타낸다.
일부 실시양태에서, 각각의 용량이 1 내지 24 시간 범위의 간격으로 투여되도록 대상체에 대한 2-3 회 용량의 투여가 발생한다. 일부 실시양태에서, 각각의 용량이 1 일 내지 28 일 범위의 간격으로 투여되도록 대상체에 대한 2-3 회 용량의 투여가 발생한다. 일부 실시양태에서, 각각의 용량이 1 내지 6 주 범위의 간격으로 투여되도록 대상체에 대한 2-3 회 용량의 투여가 발생한다. 일부 실시양태에서, 각각의 용량이 1 내지 12 개월 또는 그 초과의 범위의 간격으로 투여되도록 대상체에 대한 2-3 회 용량의 투여가 발생한다.
본원은 (i) HLA-A, HLA-B, HLA-C, HLA-DP, HLA-DQ, HLA-DR, B2M, CIITA, TCR-알파 및/또는 TCR-베타의 감소된 발현을 포함하는 조작된 세포를 포함하는 약학 조성물을 투여하는 단계를 포함하는, 대상체에서 질환 또는 장애를 치료하기 위한 투여량 양생법을 제공하며, 조작된 세포는 CD47 및 키메라 항원 수용체 (CAR)를 코딩하는 외인성 폴리뉴클레오티드의 세트를 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 외인성 폴리뉴클레오티드의 세트는 예를 들어, 벡터를 이용한 바이러스 형질도입을 사용하여 T 세포의 하나 이상의 대립유전자 내로 삽입된다. 일부 실시양태에서, 벡터는 외인성 폴리뉴클레오티드의 세트를 운반하는 슈도타이핑된 자기-비활성화 렌티바이러스 벡터이다. 일부 실시양태에서, 벡터는 수포성 구내염 VSV-G 외피로 슈도타이핑되고 외인성 폴리뉴클레오티드의 세트를 운반하는 자기-비활성화 렌티바이러스 벡터이다. 일부 실시양태에서, 외인성 폴리뉴클레오티드의 세트는 렌티바이러스 기반 바이러스 벡터를 사용하여 T 세포의 하나 이상의 대립유전자 내로 삽입된다. 일부 실시양태에서, 외인성 폴리뉴클레오티드의 세트는 세이프 하버 또는 세포의 하나 이상의 대립유전자의 표적 유전자좌 내로 삽입된다; 그리고 (ii) 약학적으로 허용가능한 첨가제, 담체, 희석제 또는 부형제, 여기서 약학 조성물은 최대 약 6.0x108 개의 세포를 포함한다. 일부 실시양태에서, 외인성 폴리뉴클레오티드는 예를 들어, 벡터를 이용한 바이러스 형질도입을 사용하여 세포의 하나 이상의 대립유전자 내로 삽입된다. 일부 실시양태에서, 벡터는 외인성 폴리뉴클레오티드를 운반하는 슈도타이핑된 자기-비활성화 렌티바이러스 벡터이다. 일부 실시양태에서, 벡터는 수포성 구내염 VSV-G 외피로 슈도타이핑되고 외인성 폴리뉴클레오티드를 운반하는 자기-비활성화 렌티바이러스 벡터이다. 일부 실시양태에서, 외인성 폴리뉴클레오티드는 바이러스 형질도입을 사용하여 세포의 하나 이상의 대립유전자 내로 삽입된다. 일부 실시양태에서, 외인성 폴리뉴클레오티드는 렌티바이러스 기반 바이러스 벡터를 사용하여 세포의 하나 이상의 대립유전자 내로 삽입된다.
본원은 (i) HLA-A, HLA-B, HLA-C, HLA-DP, HLA-DQ, HLA-DR, B2M, CIITA, TCR-알파 및/또는 TCR-베타의 감소된 발현을 포함하는 조작된 세포를 포함하는 약학 조성물을 투여하는 단계를 포함하는 대상체에서 질환 또는 장애를 치료하기 위한 투여량 양생법을 제공하며, 조작된 세포는 CD47 및 키메라 항원 수용체 (CAR)를 코딩하는 외인성 폴리뉴클레오티드의 세트를 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 외인성 폴리뉴클레오티드의 세트는 바이러스 형질도입을 사용하여 T 세포의 하나 이상의 대립유전자 내로 삽입된다. 일부 실시양태에서, 외인성 폴리뉴클레오티드의 세트는 렌티바이러스 기반 바이러스 벡터를 사용하여 T 세포의 하나 이상의 대립유전자 내로 삽입된다. 일부 실시양태에서, 외인성 폴리뉴클레오티드의 세트는 세이프 하버 또는 세포의 하나 이상의 대립유전자의 표적 유전자좌 내로 삽입된다; 그리고 (ii) 약학적으로 허용가능한 첨가제, 담체, 희석제 또는 부형제, 여기서 약학 조성물은 1-3 회 용량으로 투여된다. 일부 실시양태에서, 외인성 폴리뉴클레오티드는 예를 들어, 벡터를 이용한 바이러스 형질도입을 사용하여 세포의 하나 이상의 대립유전자 내로 삽입된다. 일부 실시양태에서, 벡터는 외인성 폴리뉴클레오티드를 운반하는 슈도타이핑된 자기-비활성화 렌티바이러스 벡터이다. 일부 실시양태에서, 벡터는 수포성 구내염 VSV-G 외피로 슈도타이핑되고 외인성 폴리뉴클레오티드를 운반하는 자기-비활성화 렌티바이러스 벡터이다. 일부 실시양태에서, 외인성 폴리뉴클레오티드는 바이러스 형질도입을 사용하여 세포의 하나 이상의 대립유전자 내로 삽입된다. 일부 실시양태에서, 외인성 폴리뉴클레오티드는 렌티바이러스 기반 바이러스 벡터를 사용하여 세포의 하나 이상의 대립유전자 내로 삽입된다.
본원은 (i) HLA-A, HLA-B, HLA-C, HLA-DP, HLA-DQ, HLA-DR, B2M, CIITA, TCR-알파 및/또는 TCR-베타의 감소된 발현을 포함하는 조작된 세포이되, 조작된 세포는 CD47 및 키메라 항원 수용체 (CAR)를 코딩하는 외인성 폴리뉴클레오티드의 세트를 추가로 포함하고, 여기서 외인성 폴리뉴클레오티드의 세트는 세포의 하나 이상의 대립유전자의 세이프 하버 또는 표적 유전자좌 내로 삽입되는, 조작된 세포; 및 (ii) 약학적으로 허용가능한 첨가제, 담체, 희석제 또는 부형제를 포함하는 약학 조성물을 투여하는 단계를 포함하는, 대상체에서 질환 또는 장애를 치료하기 위한 투여량 양생법을 제공하며, 여기서 약학 조성물의 용량은 약 60 분 이하의 시간의 지속기간 동안 투여된다. 일부 실시양태에서, 외인성 폴리뉴클레오티드는 예를 들어, 벡터를 이용한 바이러스 형질도입을 사용하여 세포의 하나 이상의 대립유전자 내로 삽입된다. 일부 실시양태에서, 벡터는 외인성 폴리뉴클레오티드를 운반하는 슈도타이핑된 자기-비활성화 렌티바이러스 벡터이다. 일부 실시양태에서, 벡터는 수포성 구내염 VSV-G 외피로 슈도타이핑되고 외인성 폴리뉴클레오티드를 운반하는 자기-비활성화 렌티바이러스 벡터이다. 일부 실시양태에서, 외인성 폴리뉴클레오티드는 바이러스 형질도입을 사용하여 세포의 하나 이상의 대립유전자 내로 삽입된다. 일부 실시양태에서, 외인성 폴리뉴클레오티드는 렌티바이러스 기반 바이러스 벡터를 사용하여 세포의 하나 이상의 대립유전자 내로 삽입된다.
본원은 (i) HLA-A, HLA-B, HLA-C, HLA-DP, HLA-DQ, HLA-DR, B2M, CIITA, TCR-알파 및/또는 TCR-베타의 감소된 발현을 포함하는 조작된 세포; 및 (ii) 약학적으로 허용가능한 첨가제, 담체, 희석제 또는 부형제를 포함하는 약학 조성물을 투여하는 단계를 포함하는, 대상체에서 질환 또는 장애를 치료하기 위한 투여량 양생법을 제공하며, 여기서 약학 조성물은 최대 약 6.0 x 108 개의 세포를 포함한다.
본원은 (i) HLA-A, HLA-B, HLA-C, HLA-DP, HLA-DQ, HLA-DR, B2M, CIITA, TCR-알파 및/또는 TCR-베타의 감소된 발현을 포함하는 조작된 세포; 및 (ii) 약학적으로 허용가능한 첨가제, 담체, 희석제 또는 부형제를 포함하는 약학 조성물을 투여하는 단계를 포함하는, 대상체에서 질환 또는 장애를 치료하기 위한 투여량 양생법을 제공하며, 여기서 약학 조성물은 1-3 회 용량으로 투여된다.
본원은 (i) HLA-A, HLA-B, HLA-C, HLA-DP, HLA-DQ, HLA-DR, B2M, CIITA, TCR-알파 및/또는 TCR-베타의 감소된 발현을 포함하는 조작된 세포; 및 (ii) 약학적으로 허용가능한 첨가제, 담체, 희석제 또는 부형제를 포함하는 약학 조성물을 투여하는 단계를 포함하는, 대상체에서 질환 또는 장애를 치료하기 위한 투여량 양생법을 제공하며, 여기서 약학 조성물의 용량은 60 분 이하의 지속기간 동안 투여된다.
일부 실시양태에서, 대상체에 대한 본원에 기재된 조작된 세포 중 임의의 것 또는 본원에 기재된 약학 조성물 중 임의의 것 또는 본원에 기재된 투여량 양생법 중 임의의 것의 투여를 포함하는 대상체에서 암을 치료하는 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 암은 CD19+ 암이다.
일부 실시양태에서, 대상체에 대한 본원에 기재된 조작된 세포 중 임의의 것의 투여를 포함하는, 대상체에서 T 세포 고갈을 방지하거나 질환을 치료하는 방법이 제공하며, 여기서 CAR은 CD19/CD22-이중특이적 CAR이다.
일부 실시양태에서, 본원은 (i) 제1 시점에서 대상체에 대한 본원에 기재된 조작된 세포 중 임의의 것의 제1 집단을 포함하는 제1 투여량 양생법의 투여, 및 (ii) 제2 시점에서 대상체에 대한 본원에 기재된 조작된 세포 중 임의의 것의 제2 집단을 포함하는 제2 투여량 양생법의 투여을 포함하는, 대상체에서 T 세포 고갈을 방지하거나 질환을 치료하는 방법을 제공하며, 여기서 제1 투여량 양생법 및 제2 투여량 양생법은 상이하다.
일부 실시양태에서, 본원은 (i) 제1 시점에서 대상체에 대한 본원에 기재된 조작된 세포 중 임의의 것의 제1 집단을 포함하는 제1 투여량 양생법의 투여, 및 (ii) 제2 시점에서 대상체에 대한 본원에 기재된 조작된 세포 중 임의의 것의 제2 집단을 포함하는 제2 투여량 양생법의 투여를 포함하는, 대상체에서 T 세포 고갈을 방지하거나 질환을 치료하는 방법을 제공하며, 여기서 조작된 세포의 제1 집단 및 조작된 세포의 제2 집단 둘 모두는 동일한 키메라 항원 수용체를 포함한다.
일부 실시양태에서, 본원은 (i) 제1 시점에서 대상체에 대한 본원에 기재된 조작된 세포 중 임의의 것의 제1 집단을 포함하는 제1 투여량 양생법의 투여, 및 (ii) 제2 시점에서 대상체에 대한 본원에 기재된 조작된 세포 중 임의의 것의 제2 집단을 포함하는 제2 투여량 양생법의 투여를 포함하는, 대상체에서 T 세포 고갈을 방지하거나 질환을 치료하는 방법을 제공하며, 여기서 조작된 세포의 제1 집단 및 조작된 세포의 제2 집단 둘 모두는 상이한 키메라 항원 수용체를 포함한다.
일부 실시양태에서, 본원은 (i) 제1 시점에서 대상체에 대한 본원에 기재된 조작된 세포 중 임의의 것의 제1 집단을 포함하는 제1 투여량 양생법의 투여, 및 (ii) 제2 시점에서 대상체에 대한 본원에 기재된 조작된 세포 중 임의의 것의 제2 집단을 포함하는 제2 투여량 양생법의 투여를 포함하는, 대상체에서 T 세포 고갈을 방지하거나 질환을 치료하는 방법을 제공하며, 여기서 조작된 세포의 제1 집단 및 조작된 세포의 제2 집단 둘 모두는 상이한 키메라 항원 수용체를 포함한다.
일부 실시양태에서, 본원은 (i) 제1 시점에서 대상체에 대한 본원에 기재된 조작된 세포 중 임의의 것의 제1 집단을 포함하는 제1 투여량 양생법의 투여, 및 (ii) 제2 시점에서 대상체에 대한 본원에 기재된 조작된 세포 중 임의의 것의 제2 집단을 포함하는 제2 투여량 양생법의 투여를 포함하는, 대상체에서 T 세포 고갈을 방지하거나 질환을 치료하는 방법을 제공하며, 여기서 제1 집단의 조작된 세포는 제1 항원에 결합하는 제1 키메라 항원 수용체를 포함하고, 제2 집단의 조작된 세포는 제2 항원에 결합하는 제2 키메라 항원 수용체를 포함하며, 여기서 제1 항원 및 제2 항원은 동일하다.
일부 실시양태에서, 본원은 다음을 포함하는 대상체에서 T 세포 고갈을 방지하거나 질환을 치료하는 방법을 제공하며: (i) 제1 시점에서 대상체에 대한 본원에 기재된 조작된 세포 중 임의의 것의 제1 집단을 포함하는 제1 투여량 양생법의 투여, 및 (ii) 제2 시점에서 대상체에 대한 본원에 기재된 조작된 세포 중 임의의 것의 제2 집단을 포함하는 제2 투여량 양생법의 투여, 여기서 제1 집단의 조작된 세포는 제1 항원에 결합하는 제1 키메라 항원 수용체를 포함하고, 제2 집단의 조작된 세포는 제2 항원에 결합하는 제2 키메라 항원 수용체를 포함하며, 여기서 제1 항원과 제2 항원은 상이하다.
본원은 야생형 T 세포에 비해 HLA-A, HLA-B, HLA-C, HLA-DP, HLA-DQ, HLA-DR, B2M, CIITA, TCR-알파 및/또는 TCR-베타의 감소된 발현 및 키메라 항원 수용체 (CAR)를 코딩하는 제1 외인성 폴리뉴클레오티드를 포함하는 비-활성화된 T 세포를 제공한다. 일부 실시양태에서, 외인성 폴리뉴클레오티드는 예를 들어, 벡터를 이용한 바이러스 형질도입을 사용하여 세포의 하나 이상의 대립유전자 내로 삽입된다. 일부 실시양태에서, 벡터는 외인성 폴리뉴클레오티드를 운반하는 슈도타이핑된 자기-비활성화 렌티바이러스 벡터이다. 일부 실시양태에서, 벡터는 수포성 구내염 VSV-G 외피로 슈도타이핑되고 외인성 폴리뉴클레오티드를 운반하는 자기-비활성화 렌티바이러스 벡터이다. 일부 실시양태에서, 외인성 폴리뉴클레오티드는 바이러스 형질도입을 사용하여 세포의 하나 이상의 대립유전자 내로 삽입된다. 일부 실시양태에서, 외인성 폴리뉴클레오티드는 렌티바이러스 기반 바이러스 벡터를 사용하여 세포의 하나 이상의 대립유전자 내로 삽입된다.
일부 실시양태에서, 비-활성화된 T 세포는 일차 T 세포이다. 다른 실시양태에서, 비-활성화된 T 세포는 본 기술의 조작된 세포로부터 분화된다.
일부 실시양태에서, T 세포는 CD8+ T 세포이다.
일부 실시양태에서, 비-활성화된 T 세포는 항-CD3 항체, 항-CD28 항체, T 세포 활성화 사이토카인 또는 가용성 T 세포 공동자극 분자로 처리되지 않았다.
일부 실시양태에서, 항-CD3 항체는 OKT3이다. 일부 실시양태에서, 항-CD28 항체는 CD28.2이다. 일부 실시양태에서, T 세포 활성화 사이토카인은 IL-2, IL-7, IL-15 및 IL-21로 이루어진 T 세포 활성화 사이토카인의 군으로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, 가용성 T 세포 공동자극 분자는 항-CD28 항체, 항-CD80 항체, 항-CD86 항체, 항-CD137L 항체 및 항-ICOS-L 항체로 이루어진 가용성 T 세포 공동자극 분자의 군으로부터 선택된다.
일부 실시양태에서, 비-활성화된 T 세포는 활성화 마커를 발현하지 않는다.
일부 실시양태에서, 비-활성화된 T 세포는 CD3 및 CD28을 발현하고, 여기서 CD3 및/또는 CD28은 비활성이다.
일부 실시양태에서, 제1 외인성 폴리뉴클레오티드는 CD8 결합제를 포함하는 렌티바이러스 벡터에 의해 운반된다.
일부 실시양태에서, 비-활성화된 T 세포는 CD47을 코딩하는 제2 외인성 폴리뉴클레오티드를 추가로 포함한다.
일부 실시양태에서, 제1 및/또는 제2 외인성 폴리뉴클레오티드는 T 세포의 하나 이상의 대립유전자의 특이적 유전자좌 내로 삽입된다. 일부 실시양태에서, 제1 및/또는 제2 외인성 폴리뉴클레오티드는 바이러스 형질도입을 사용하여 T 세포의 하나 이상의 대립유전자 내로 삽입된다. 일부 실시양태에서, 제1 및/또는 제2 외인성 폴리뉴클레오티드는 렌티바이러스 기반 바이러스 벡터를 사용하여 T 세포의 하나 이상의 대립유전자 내로 삽입된다. 일부 실시양태에서, 벡터는 제1 및/또는 제2 외인성 폴리뉴클레오티드를 운반하는 슈도타이핑된 자기-비활성화 렌티바이러스 벡터이다. 일부 실시양태에서, 벡터는 수포성 구내염 VSV-G 외피로 슈도타이핑되고 제1 및/또는 제2 외인성 폴리뉴클레오티드를 운반하는 자기-비활성화 렌티바이러스 벡터이다. 일부 실시양태에서, 특이적 유전자좌는 세이프 하버 또는 표적 유전자좌, B2M 유전자좌, CIITA 유전자좌, TRAC 유전자좌 및 TRB 유전자좌로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, CD47을 코딩하는 제2 외인성 폴리뉴클레오티드는 세이프 하버 또는 표적 유전자좌, B2M 유전자좌, CIITA 유전자좌, TRAC 유전자좌 및 TRB 유전자좌로 이루어진 군으로부터 선택된 특이적 유전자좌 내로 삽입된다. 일부 실시양태에서, CAR을 코딩하는 제1 외인성 폴리뉴클레오티드는 세이프 하버 또는 표적 유전자좌, B2M 유전자좌, CIITA 유전자좌, TRAC 유전자좌 및 TRB 유전자좌로 이루어진 군으로부터 선택된 특이적 유전자좌 내로 삽입된다. 일부 실시양태에서, CD47을 코딩하는 제2 외인성 폴리뉴클레오티드 및 CAR을 코딩하는 제1 외인성 폴리뉴클레오티드는 상이한 유전자좌 내로 삽입된다. 일부 실시양태에서, CD47을 코딩하는 제2 외인성 폴리뉴클레오티드 및 CAR을 코딩하는 제1 외인성 폴리뉴클레오티드는 동일한 유전자좌 내로 삽입된다. 일부 실시양태에서, CD47을 코딩하는 제2 외인성 폴리뉴클레오티드 및 CAR을 코딩하는 제1 외인성 폴리뉴클레오티드는 B2M 유전자좌 내로 삽입된다. 일부 실시양태에서, CD47을 코딩하는 제2 외인성 폴리뉴클레오티드 및 CAR을 코딩하는 제1 외인성 폴리뉴클레오티드는 CIITA 유전자좌 내로 삽입된다. 일부 실시양태에서, CD47을 코딩하는 제2 외인성 폴리뉴클레오티드 및 CAR을 코딩하는 제1 외인성 폴리뉴클레오티드는 TRAC 유전자좌 내로 삽입된다. 일부 실시양태에서, CD47을 코딩하는 제2 외인성 폴리뉴클레오티드 및 CAR을 코딩하는 제1 외인성 폴리뉴클레오티드는 TRB 유전자좌 내로 삽입된다. 일부 실시양태에서, CD47을 코딩하는 제2 외인성 폴리뉴클레오티드 및 CAR을 코딩하는 제1 외인성 폴리뉴클레오티드는 세이프 하버 또는 표적 유전자좌 내로 삽입된다. 일부 실시양태에서, 세이프 하버 또는 표적 좌위는 CCR5 유전자 유전자좌, CXCR4 유전자 유전자좌, PPP1R12C (AAVS1로서 또한 알려짐) 유전자 유전자좌, 알부민 유전자 유전자좌, SHS231 유전자 유전자좌, CLYBL 유전자 유전자좌, Rosa 유전자 유전자좌 (예컨대, ROSA26 유전자 유전자좌), F3 유전자 유전자좌 (CD142로서 또한 알려짐), MICA 유전자 유전자좌, MICB 유전자 유전자좌, LRP1 유전자 유전자좌 (CD91 유전자 유전자좌로서 또한 알려짐), HMGB1 유전자 유전자좌, ABO 유전자 유전자좌, ad RHD 유전자 유전자좌, FUT1 유전자좌 및 KDM5D 유전자 유전자좌로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, 세이프 하버 또는 표적 유전자좌는 AAVS1 유전자좌, CCR5 유전자좌 및 ROSA26 유전자좌로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, 외인성 폴리뉴클레오티드는 예를 들어, 벡터를 이용한 바이러스 형질도입을 사용하여 세포의 하나 이상의 대립유전자 내로 삽입된다. 일부 실시양태에서, 벡터는 외인성 폴리뉴클레오티드를 운반하는 슈도타이핑된 자기-비활성화 렌티바이러스 벡터이다. 일부 실시양태에서, 벡터는 수포성 구내염 VSV-G 외피로 슈도타이핑되고 외인성 폴리뉴클레오티드를 운반하는 자기-비활성화 렌티바이러스 벡터이다. 일부 실시양태에서, 외인성 폴리뉴클레오티드는 바이러스 형질도입을 사용하여 세포의 하나 이상의 대립유전자 내로 삽입된다. 일부 실시양태에서, 외인성 폴리뉴클레오티드는 렌티바이러스 기반 바이러스 벡터를 사용하여 세포의 하나 이상의 대립유전자 내로 삽입된다.
일부 실시양태에서, CAR은 CD19-특이적 CAR 및 CD22-특이적 CAR로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, CAR은 이중특이적 CAR이다. 일부 실시양태에서, 이중특이적 CAR은 CD19/CD22-이중특이적 CAR이다.
일부 실시양태에서, 비-활성화된 T 세포는 HLA-A, HLA-B 및/또는 HLA-C 항원을 발현하지 않는다. 일부 실시양태에서, 비-활성화된 T 세포는 B2M을 발현하지 않는다. 일부 실시양태에서, 비-활성화된 T 세포는 HLA-DP, HLA-DQ 및/또는 HLA-DR 항원을 발현하지 않는다. 일부 실시양태에서, 비-활성화된 T 세포는 CIITA를 발현하지 않는다. 일부 실시양태에서, 비-활성화된 T 세포는 TCR-알파 및 TCR-베타를 발현하지 않는다.
일부 실시양태에서, 비-활성화된 T 세포는 TRAC 유전자좌 내로 삽입된 CD47을 코딩하는 제2 외인성 폴리뉴클레오티드 및/또는 CAR을 코딩하는 제1 외인성 폴리뉴클레오티드를 포함하는 B2Mindel/indel, CIITAindel/indel, TRACAindel/indel 세포이다.
일부 실시양태에서, 비-활성화된 T 세포는 TRAC 유전자좌 내로 삽입된 CD47을 코딩하는 제2 외인성 폴리뉴클레오티드 및 CAR을 코딩하는 제1 외인성 폴리뉴클레오티드를 포함하는 B2Mindel/indel, CIITAindel/indel, TRACindel/indel 세포이다.
일부 실시양태에서, 비-활성화된 T 세포는 TRB 유전자좌 내로 삽입된 CD47을 코딩하는 제2 외인성 폴리뉴클레오티드 및/또는 CAR을 코딩하는 제1 외인성 폴리뉴클레오티드를 포함하는 B2Mindel/indel, CIITAindel/indel, TRACindel/indel 세포이다.
일부 실시양태에서, 비-활성화된 T 세포는 TRB 유전자좌 내로 삽입된 CD47을 코딩하는 제2 외인성 폴리뉴클레오티드 및 CAR을 코딩하는 제1 외인성 폴리뉴클레오티드를 포함하는 B2Mindel/indel, CIITAindel/indel, TRACindel/indel 세포이다.
일부 실시양태에서, 비-활성화된 T 세포는 B2M 유전자좌 내로 삽입된 CD47을 코딩하는 제2 외인성 폴리뉴클레오티드 및/또는 CAR을 코딩하는 제1 외인성 폴리뉴클레오티드를 포함하는 B2Mindel/indel, CIITAindel/indel, TRACindel/indel 세포이다.
일부 실시양태에서, 비-활성화된 T 세포는 B2M 유전자좌 내로 삽입된 CD47을 코딩하는 제2 외인성 폴리뉴클레오티드 및 CAR을 코딩하는 제1 외인성 폴리뉴클레오티드를 포함하는 B2Mindel/indel, CIITAindel/indel, TRACindel/indel 세포이다.
일부 실시양태에서, 비-활성화된 T 세포는 CIITA 유전자좌 내로 삽입된 CD47을 코딩하는 제2 외인성 폴리뉴클레오티드 및/또는 CAR을 코딩하는 제1 외인성 폴리뉴클레오티드를 포함하는 B2Mindel/indel, CIITAindel/indel, TRACindel/indel 세포이다.
일부 실시양태에서, 비-활성화된 T 세포는 CIITA 유전자좌 내로 삽입된 CD47을 코딩하는 제2 외인성 폴리뉴클레오티드 및 CAR을 코딩하는 제1 외인성 폴리뉴클레오티드를 포함하는 B2Mindel/indel, CIITAindel/indel, TRACindel/indel 세포이다.
일부 실시양태에서, 외인성 폴리뉴클레오티드는 예를 들어, 벡터를 이용한 바이러스 형질도입을 사용하여 세포의 하나 이상의 대립유전자 내로 삽입된다. 일부 실시양태에서, 벡터는 외인성 폴리뉴클레오티드를 운반하는 슈도타이핑된 자기-비활성화 렌티바이러스 벡터이다. 일부 실시양태에서, 벡터는 수포성 구내염 VSV-G 외피로 슈도타이핑되고 외인성 폴리뉴클레오티드를 운반하는 자기-비활성화 렌티바이러스 벡터이다. 일부 실시양태에서, 외인성 폴리뉴클레오티드는 바이러스 형질도입을 사용하여 세포의 하나 이상의 대립유전자 내로 삽입된다. 일부 실시양태에서, 외인성 폴리뉴클레오티드는 렌티바이러스 기반 바이러스 벡터를 사용하여 세포의 하나 이상의 대립유전자 내로 삽입된다.
본원은 야생형 T 세포에 비해 HLA-A, HLA-B, HLA-C, HLA-DP, HLA-DQ, HLA-DR, B2M, CIITA, TCR-알파, 및/또는 TCR-베타의 감소된 발현을 포함하는 조작된 T 세포를 제공하며, 여기서 조작된 T 세포는 렌티바이러스 벡터에 의해 운반되는 키메라 항원 수용체 (CAR)를 코딩하는 제1 외인성 폴리뉴클레오티드를 추가로 포함한다. 본원은 야생형 T 세포에 비해 HLA-A, HLA-B, HLA-C, HLA-DP, HLA-DQ, HLA-DR, B2M, CIITA, TCR-알파 및/또는 TCR-베타의 감소된 발현을 포함하는 조작된 T 세포를 제공하며, 여기서 조작된 T 세포는 CD8 결합제를 포함하는 렌티바이러스 벡터에 의해 운반되는 키메라 항원 수용체 (CAR)를 코딩하는 제1 외인성 폴리뉴클레오티드를 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 외인성 폴리뉴클레오티드는 예를 들어, 벡터를 이용한 바이러스 형질도입을 사용하여 세포의 하나 이상의 대립유전자 내로 삽입된다. 일부 실시양태에서, 벡터는 외인성 폴리뉴클레오티드를 운반하는 슈도타이핑된 자기-비활성화 렌티바이러스 벡터이다. 일부 실시양태에서, 벡터는 수포성 구내염 VSV-G 외피로 슈도타이핑되고 외인성 폴리뉴클레오티드를 운반하는 자기-비활성화 렌티바이러스 벡터이다. 일부 실시양태에서, 외인성 폴리뉴클레오티드는 바이러스 형질도입을 사용하여 세포의 하나 이상의 대립유전자 내로 삽입된다. 일부 실시양태에서, 외인성 폴리뉴클레오티드는 렌티바이러스 기반 바이러스 벡터를 사용하여 세포의 하나 이상의 대립유전자 내로 삽입된다.
일부 실시양태에서, 조작된 T 세포는 일차 T 세포이다. 다른 실시양태에서, 조작된 T 세포는 본 기술의 조작된 세포로부터 분화된다. 일부 실시양태에서, T 세포는 CD8+ T 세포이다.
일부 실시양태에서, 조작된 T 세포는 항-CD3 항체, 항-CD28 항체, T 세포 활성화 사이토카인 또는 가용성 T 세포 공동자극 분자로 처리되지 않았다. 일부 실시양태에서, 항-CD3 항체는 OKT3이고, 여기서 항-CD28 항체는 CD28.2이고, 여기서 T 세포 활성화 사이토카인은 IL-2, IL-7, IL-15, 및 IL-21로 이루어진 T 세포 활성화 사이토카인의 군으로부터 선택되며, 여기서 가용성 T 세포 공동자극 분자는 항-CD28 항체, 항-CD80 항체, 항-CD86 항체, 항-CD137L 항체, 및 항-ICOS-L 항체로 이루어진 가용성 T 세포 공동자극 분자의 군으로부터 선택된다.
일부 실시양태에서, 조작된 T 세포는 활성화 마커를 발현하지 않는다. 일부 실시양태에서, 조작된 T 세포는 CD3 및 CD28을 발현하고, 여기서 CD3 및/또는 CD28은 비활성이다.
일부 실시양태에서, 조작된 T 세포는 CD47을 코딩하는 제2 외인성 폴리뉴클레오티드를 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 제1 및/또는 제2 외인성 폴리뉴클레오티드는 T 세포의 하나 이상의 대립유전자의 특이적 유전자좌 내로 삽입된다. 일부 실시양태에서, 특이적 유전자좌는 세이프 하버 또는 표적 유전자좌, B2M 유전자좌, CIITA 유전자좌, TRAC 유전자좌 및 TRB 유전자좌로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, CD47을 코딩하는 제2 외인성 폴리뉴클레오티드는 세이프 하버 또는 표적 유전자좌, B2M 유전자좌, CIITA 유전자좌, TRAC 유전자좌 및 TRB 유전자좌로 이루어진 군으로부터 선택된 특이적 유전자좌 내로 삽입된다. 일부 실시양태에서, CAR을 코딩하는 제1 외인성 폴리뉴클레오티드는 세이프 하버 또는 표적 유전자좌, B2M 유전자좌, CIITA 유전자좌, TRAC 유전자좌 및 TRB 유전자좌로 이루어진 군으로부터 선택된 특이적 유전자좌 내로 삽입된다. 일부 실시양태에서, CD47을 코딩하는 제2 외인성 폴리뉴클레오티드 및 CAR을 코딩하는 제1 외인성 폴리뉴클레오티드는 상이한 유전자좌 내로 삽입된다. 일부 실시양태에서, CD47을 코딩하는 제2 외인성 폴리뉴클레오티드 및 CAR을 코딩하는 제1 외인성 폴리뉴클레오티드는 동일한 유전자좌 내로 삽입된다. 일부 실시양태에서, CD47을 코딩하는 제2 외인성 폴리뉴클레오티드 및 CAR을 코딩하는 제1 외인성 폴리뉴클레오티드는 B2M 유전자좌, CIITA 유전자좌, TRAC 유전자좌, TRB 유전자좌, 또는 세이프 하버 또는 표적 유전자좌 내로 삽입된다. 일부 실시양태에서, 세이프 하버 또는 표적 유전자좌는 CCR5 유전자 유전자좌, CXCR4 유전자 유전자좌, PPP1R12C (AAVS1로서 또한 알려짐) 유전자 유전자좌, 알부민 유전자 유전자좌, SHS231 유전자 유전자좌, CLYBL 유전자 유전자좌, Rosa 유전자 유전자좌 (예컨대, ROSA26 유전자 유전자좌), F3 유전자 유전자좌 (CD142로서 또한 알려짐), MICA 유전자 유전자좌, MICB 유전자 유전자좌, LRP1 유전자 유전자좌 (CD91 유전자 유전자좌로서 또한 알려짐), HMGB1 유전자 유전자좌, ABO 유전자 유전자좌, ad RHD 유전자 유전자좌, FUT1 유전자좌 및 KDM5D 유전자 유전자좌로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, 세이프 하버 또는 표적 유전자좌는 AAVS1 유전자좌, CCR5 유전자좌 및 ROSA26 유전자좌로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, 외인성 폴리뉴클레오티드는 예를 들어, 벡터를 이용한 바이러스 형질도입을 사용하여 세포의 하나 이상의 대립유전자 내로 삽입된다. 일부 실시양태에서, 벡터는 외인성 폴리뉴클레오티드를 운반하는 슈도타이핑된 자기-비활성화 렌티바이러스 벡터이다. 일부 실시양태에서, 벡터는 수포성 구내염 VSV-G 외피로 슈도타이핑되고 외인성 폴리뉴클레오티드를 운반하는 자기-비활성화 렌티바이러스 벡터이다. 일부 실시양태에서, 외인성 폴리뉴클레오티드는 바이러스 형질도입을 사용하여 세포의 하나 이상의 대립유전자 내로 삽입된다. 일부 실시양태에서, 외인성 폴리뉴클레오티드는 렌티바이러스 기반 바이러스 벡터를 사용하여 세포의 하나 이상의 대립유전자 내로 삽입된다.
일부 실시양태에서, CAR은 CD19-특이적 CAR 및 CD22-특이적 CAR로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일부 실시양태에서, 조작된 T 세포는 HLA-A, HLA-B 및/또는 HLA-C 항원을 발현하지 않고/않거나, 조작된 T 세포는 B2M을 발현하지 않고/않거나, 조작된 T 세포는 HLA-DP, HLA-DQ, 및/또는 HLA-DR 항원을 발현하지 않고/않거나, 조작된 T 세포는 CIITA를 발현하지 않고/않거나 조작된 T 세포는 TCR-알파 및 TCR-베타를 발현하지 않는다.
일부 실시양태에서, 조작된 T 세포는 TRAC 유전자좌 내로, TRB 유전자좌 내로, B2M 유전자좌 내로 또는 CIITA 유전자좌 내로 삽입된 CD47을 코딩하는 제2 외인성 폴리뉴클레오티드 및/또는 CAR을 코딩하는 제1 외인성 폴리뉴클레오티드를 포함하는 B2Mindel/indel, CIITAindel/indel, TRACindel/indel 세포이다. 일부 실시양태에서, 외인성 폴리뉴클레오티드는 예를 들어, 벡터를 이용한 바이러스 형질도입을 사용하여 세포의 하나 이상의 대립유전자 내로 삽입된다. 일부 실시양태에서, 벡터는 외인성 폴리뉴클레오티드를 운반하는 슈도타이핑된 자기-비활성화 렌티바이러스 벡터이다. 일부 실시양태에서, 벡터는 수포성 구내염 VSV-G 외피로 슈도타이핑되고 외인성 폴리뉴클레오티드를 운반하는 자기-비활성화 렌티바이러스 벡터이다. 일부 실시양태에서, 외인성 폴리뉴클레오티드는 바이러스 형질도입을 사용하여 세포의 하나 이상의 대립유전자 내로 삽입된다. 일부 실시양태에서, 외인성 폴리뉴클레오티드는 렌티바이러스 기반 바이러스 벡터를 사용하여 세포의 하나 이상의 대립유전자 내로 삽입된다.
일부 실시양태에서, 본 기술의 비-활성화된 T 세포 및/또는 조작된 T 세포는 대상체에 있다. 다른 실시양태에서, 본 기술의 비-활성화된 T 세포 및/또는 조작된 T 세포는 생체외에 있다.
일부 실시양태에서, 본 기술의 비-활성화된 T 세포 및/또는 조작된 T 세포는 CD8 결합제를 발현한다. 일부 실시양태에서, CD8 결합제는 항-CD8 항체이다. 일부 실시양태에서, 항-CD8 항체는 마우스 항-CD8 항체, 토끼 항-CD8 항체, 인간 항-CD8 항체, 인간화된 항-CD8 항체, 낙타류 (예컨대, 라마, 알파카, 낙타) 항-CD8 항체 및 이의 단편으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, 이의 단편은 scFV 또는 VHH이다. 일부 실시양태에서, CD8 결합제는 CD8 알파 쇄 및/또는 CD8 베타 쇄에 결합한다.
일부 실시양태에서, CD8 결합제는 바이러스 외피에 혼입된 막관통 도메인에 융합된다. 일부 실시양태에서, 렌티바이러스 벡터는 바이러스 융합 단백질로 슈도타이핑된다. 일부 실시양태에서, 바이러스 융합 단백질은 이의 천연 수용체에 대한 결합을 감소시키기 위한 하나 이상의 변형을 포함한다.
일부 실시양태에서, 바이러스 융합 단백질은 CD8 결합제에 융합된다. 일부 실시양태에서, 바이러스 융합 단백질은 CD8 결합제에 융합된 니파 바이러스 F 당단백질 및 니파 바이러스 G 당단백질을 포함한다. 일부 실시양태에서, 렌티바이러스 벡터는 T 세포 활성화 분자 또는 T 세포 공동자극 분자를 포함하지 않는다. 일부 실시양태에서, 렌티바이러스 벡터는 제1 외인성 폴리뉴클레오티드 및/또는 제2 외인성 폴리뉴클레오티드를 코딩한다.
일부 실시양태에서, 외인성 폴리뉴클레오티드는 예를 들어, 벡터를 이용한 바이러스 형질도입을 사용하여 세포의 하나 이상의 대립유전자 내로 삽입된다. 일부 실시양태에서, 벡터는 외인성 폴리뉴클레오티드를 운반하는 슈도타이핑된 자기-비활성화 렌티바이러스 벡터이다. 일부 실시양태에서, 벡터는 수포성 구내염 VSV-G 외피로 슈도타이핑되고 외인성 폴리뉴클레오티드를 운반하는 자기-비활성화 렌티바이러스 벡터이다. 일부 실시양태에서, 외인성 폴리뉴클레오티드는 바이러스 형질도입을 사용하여 세포의 하나 이상의 대립유전자 내로 삽입된다. 일부 실시양태에서, 외인성 폴리뉴클레오티드는 렌티바이러스 기반 바이러스 벡터를 사용하여 세포의 하나 이상의 대립유전자 내로 삽입된다.
일부 실시양태에서, 제1 대상체 내로 전달된 후에, 비-활성화된 T 세포 또는 조작된 T 세포는 제2 대상체 내로 전달된 후의 야생형 세포와 비교하여 감소된, (a) T 세포 반응, (b) NK 세포 반응 및 (c) 대식세포 반응으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 반응을 나타낸다. 일부 실시양태에서, 제1 대상체 및 제2 대상체는 상이한 대상체이다. 일부 실시양태에서, 대식세포 반응은 탐식이다.
일부 실시양태에서, 대상체 내로 전달된 후에, 비-활성화된 T 세포 또는 조작된 T 세포는 대상체 내로 전달된 후의 야생형 세포와 비교하여 (a) 대상체에서 감소된 TH1 활성화, (b) 대상체에서 감소된 NK 세포 살해 및 (c) 대상체에서 전체 PBMC에 의한 감소된 살해로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상을 나타낸다.
일부 실시양태에서, 대상체 내로 전달된 후에, 비-활성화된 T 세포 또는 조작된 T 세포는 대상체 내로 전달된 후의 야생형 세포와 비교하여 (a) 대상체에서 감소된 공여자 특이적 항체, (b) 대상체에서 감소된 IgM 또는 IgG 항체, 및 (c) 대상체에서 감소된 보체-의존적 세포독성 (CDC)으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상을 이끌어낸다.
일부 실시양태에서, 비-활성화된 T 세포 또는 조작된 T 세포는 대상체 내에서 CD8 결합제를 포함하는 렌티바이러스 벡터로 형질도입된다. 일부 실시양태에서, 렌티바이러스 벡터는 CAR 및/또는 CD47을 코딩하는 유전자를 운반한다.
본원은 본 기술의 비-활성화된 T 세포 및/또는 조작된 T 세포의 집단 및 약학적으로 허용가능한 첨가제, 담체, 희석제 또는 부형제를 포함하는 약학 조성물을 제공한다.
본원은 본 기술의 비-활성화된 T 세포 및/또는 조작된 T 세포의 집단을 포함하는 조성물, 또는 본 기술의 하나 이상의 약학 조성물을 대상체에 투여하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다.
일부 실시양태에서, 대상체에 조성물의 투여 전, 후 및/또는 이와 동시에 T 세포 활성화 치료가 투여되지 않는다. 일부 실시양태에서, T 세포 활성화 치료는 림프구고갈을 포함한다.
본원은 본 기술의 비-활성화된 T 세포 및/또는 조작된 T 세포의 집단을 포함하는 조성물, 또는 본 기술의 하나 이상의 약학 조성물을 대상체에 투여하는 단계를 포함하는, 암을 앓고 있는 대상체를 치료하는 방법을 제공하며, 여기서 대상체에 조성물의 투여 전, 후 및/또는 이와 동시에 T 세포 활성화 치료가 투여되지 않는다. 일부 실시양태에서, T 세포 활성화 치료는 림프구고갈을 포함한다.
본원은 본 기술의 비-활성화된 T 세포 및/또는 조작된 T 세포의 집단을 포함하는 조성물, 또는 본 기술의 하나 이상의 약학 조성물을 대상체에 투여하는 단계를 포함하는, 대상체 내에서 T 세포의 확장을 필요로 하는 대상체의 종양 세포를 인식하고 살해시킬 수 있는 T 세포를 확장시키는 방법을 제공하며, 여기서 대상체에 조성물의 투여 전, 후 및/또는 이와 동시에 T 세포 활성화 치료가 투여되지 않는다. 일부 실시양태에서, T 세포 활성화 치료는 림프구고갈을 포함한다.
본원은 본 기술의 비-활성화된 T 세포 및/또는 조작된 T 세포의 집단을 포함하는 약학 조성물, 또는 본 기술의 하나 이상의 약학 조성물, 및 약학적으로 허용가능한 첨가제, 담체, 희석제 또는 부형제의 투여를 포함하는, 대상체에서 질환 또는 장애를 치료하기 위한 투여량 양생법을 제공하며, 여기서 약학 조성물은 약 1-3 회 용량으로 투여된다.
본원은 야생형 세포 또는 대조군 세포에 비해 HLA-A, HLA-B, HLA-C, HLA-DP, HLA-DQ, HLA-DR, B2M, CIITA, TCR-알파, 및/또는 TCR-베타의 감소된 발현을 포함하는 조작된 세포를 제공하며, 조작된 세포는 CD47을 코딩하는 제1 외인성 폴리뉴클레오티드 및 키메라 항원 수용체 (CAR)를 코딩하는 제2 외인성 폴리뉴클레오티드를 포함하는 외인성 폴리뉴클레오티드의 세트를 추가로 포함하며, 여기서 제1 및/또는 제2 외인성 폴리뉴클레오티드는 세포의 하나 이상의 대립유전자의 특이적 유전자좌 내로 삽입된다.
일부 실시양태에서, 특이적 유전자좌는 세이프 하버 또는 표적 유전자좌, B2M 유전자좌, CIITA 유전자좌, TRAC 유전자좌 및 TRB 유전자좌로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일부 실시양태에서, CD47을 코딩하는 제1 외인성 폴리뉴클레오티드는 세이프 하버 또는 표적 유전자좌, B2M 유전자좌, CIITA 유전자좌, TRAC 유전자좌 및 TRB 유전자좌로 이루어진 군으로부터 선택된 특이적 유전자좌 내로 삽입된다.
일부 실시양태에서, CAR을 코딩하는 제2 외인성 폴리뉴클레오티드는 세이프 하버 또는 표적 유전자좌, B2M 유전자좌, CIITA 유전자좌, TRAC 유전자좌 및 TRB 유전자좌로 이루어진 군으로부터 선택된 특이적 유전자좌 내로 삽입된다.
일부 실시양태에서, CD47을 코딩하는 제1 외인성 폴리뉴클레오티드 및 CAR을 코딩하는 제2 외인성 폴리뉴클레오티드는 상이한 유전자좌 내로 삽입된다.
일부 실시양태에서, CD47을 코딩하는 제1 외인성 폴리뉴클레오티드 및 CAR을 코딩하는 제2 외인성 폴리뉴클레오티드는 동일한 유전자좌 내로 삽입된다.
일부 실시양태에서, CD47을 코딩하는 제1 외인성 폴리뉴클레오티드 및 CAR을 코딩하는 제2 외인성 폴리뉴클레오티드는 B2M 유전자좌 내로 삽입된다.
일부 실시양태에서, CD47을 코딩하는 제1 외인성 폴리뉴클레오티드 및 CAR을 코딩하는 제2 외인성 폴리뉴클레오티드는 CIITA 유전자좌 내로 삽입된다.
일부 실시양태에서, CD47을 코딩하는 제1 외인성 폴리뉴클레오티드 및 CAR을 코딩하는 제2 외인성 폴리뉴클레오티드는 TRAC 유전자좌 내로 삽입된다.
일부 실시양태에서, CD47을 코딩하는 제1 외인성 폴리뉴클레오티드 및 CAR을 코딩하는 제2 외인성 폴리뉴클레오티드는 TRB 유전자좌 내로 삽입된다.
일부 실시양태에서, CD47을 코딩하는 제1 외인성 폴리뉴클레오티드 및 CAR을 코딩하는 제2 외인성 폴리뉴클레오티드는 세이프 하버 또는 표적 유전자좌 내로 삽입된다.
일부 실시양태에서, 세이프 하버 유전자좌는 CCR5 유전자 유전자좌, PPP1R12C 유전자 유전자좌, CLYBL 유전자 유전자좌 및 Rosa 유전자 유전자좌로 이루어진 군으로부터 선택되고, 표적 유전자좌는 CXCR4 유전자 유전자좌, 알부민 유전자 유전자좌, SHS231 유전자 유전자좌, F3 (CD142) 유전자 유전자좌, MICA 유전자 유전자좌, MICB 유전자 유전자좌. LRP1 (CD91) 유전자 유전자좌, HMGB1 유전자 유전자좌, ABO 유전자 유전자좌, ad RHD 유전자좌, FUT1 유전자좌 및 KDM5D 유전자 유전자좌로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일부 실시양태에서, CAR은 CD19-특이적 CAR 및 CD22-특이적 CAR로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일부 실시양태에서, CD19-특이적 CAR은 악시카브타진 실로류셀, 리소카브타진 마라류셀, 브렉수카브타진 오토류셀, 및 티사젠류셀로 이루어진 군으로부터 선택된 CAR-T 세포 기반 요법 중 어느 하나의 CD19-특이적 CAR과 실질적으로 동등하다.
일부 실시양태에서, CAR은 이중특이적 CAR이다.
일부 실시양태에서, CAR은 CD19/CD22-이중특이적 CAR이다.
일부 실시양태에서, 조작된 세포는 HLA-A, HLA-B 및/또는 HLA-C 항원을 발현하지 않는다.
일부 실시양태에서, 조작된 세포는 B2M을 발현하지 않는다.
일부 실시양태에서, 조작된 세포는 HLA-DP, HLA-DQ 및/또는 HLA-DR 항원을 발현하지 않는다.
일부 실시양태에서, 조작된 세포는 CIITA를 발현하지 않는다.
일부 실시양태에서, 조작된 세포는 만능 줄기 세포, 유도 만능 줄기 세포, 유도 만능 줄기 세포로부터 분화된 T 세포, 일차 T 세포, 및 일차 T 세포로부터 유래된 세포로 이루어진 군으로부터 선택되며, 조작된 세포는 TCR-알파 및/또는 TCR-베타를 발현하지 않는다.
일부 실시양태에서, 조작된 세포는 만능 줄기 세포이다.
일부 실시양태에서, 조작된 세포는 유도 만능 줄기 세포이다.
일부 실시양태에서, 조작된 세포는 유도 만능 줄기 세포로부터 유래된 분화된 세포이다.
일부 실시양태에서, 분화된 세포는 NK 세포 및 T 세포로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일부 실시양태에서, 조작된 세포는 일차 T 세포로부터 유래된 세포이다.
일부 실시양태에서, 일차 T 세포로부터 유래된 세포는 수용자 대상체와 상이한 한 명 이상의 공여자 대상체로부터의 일차 T 세포를 포함하는 T 세포의 풀로부터 유래된다.
일부 실시양태에서, 조작된 세포는 다능성을 유지하고/하거나 분화 잠재력을 유지한다.
일부 실시양태에서, 제1 대상체 내로 전달된 후에, 조작된 세포는 제2 대상체 내로 전달된 후의 야생형 세포와 비교하여 감소된 (a) T 세포 반응, (b) NK 세포 반응 및 (c) 대식세포 반응으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 반응을 나타낸다.
일부 실시양태에서, 제1 대상체 및 제2 대상체는 상이한 대상체이다.
일부 실시양태에서, 대식세포 반응은 탐식이다.
일부 실시양태에서, 대상체 내로 전달된 후에, 조작된 세포는 대상체 내로 전달된 후의 야생형 세포와 비교하여 (a) 대상체에서 감소된 TH1 활성화, (b) 대상체에서 감소된 NK 세포 살해, 및 (c) 대상체에서 전체 PBMC에 의한 감소된 살해로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상을 나타낸다.
일부 실시양태에서, 대상체 내로 전달된 후에, 조작된 세포는 대상체 내로 전달된 후의 야생형 세포와 비교하여 (a) 대상체에서 감소된 공여자 특이적 항체, (b) 대상체에서 감소된 IgM 또는 IgG 항체, 및 (c) 대상체에서 감소된 보체-의존적 세포독성 (CDC)으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상을 이끌어낸다.
일부 실시양태에서, 조작된 세포는 만능 줄기 세포, 유도 만능 줄기 세포, 유도 만능 줄기 세포로부터 분화된 T 세포, 일차 T 세포, 및 일차 T 세포로부터 유래된 세포로 이루어진 군으로부터 선택되며, 조작된 세포는 TRAC 유전자좌 내로 삽입된 CD47을 코딩하는 제1 외인성 폴리뉴클레오티드 및/또는 CAR을 코딩하는 제2 외인성 폴리뉴클레오티드를 포함하는 B2Mindel/indel, CIITAindel/indel, TRACindel/indel 세포이다.
일부 실시양태에서, 조작된 세포는 만능 줄기 세포, 유도 만능 줄기 세포, 유도 만능 줄기 세포로부터 분화된 T 세포, 일차 T 세포, 및 일차 T 세포로부터 유래된 세포로 이루어진 군으로부터 선택되며, 조작된 세포는 TRAC 유전자좌 내로 삽입된 CD47을 코딩하는 제1 외인성 폴리뉴클레오티드 및 CAR을 코딩하는 제2 외인성 폴리뉴클레오티드를 포함하는 B2Mindel/indel, CIITAindel/indel, TRACindel/indel 세포이다.
일부 실시양태에서, 조작된 세포는 만능 줄기 세포, 유도 만능 줄기 세포, 유도 만능 줄기 세포로부터 분화된 T 세포, 일차 T 세포, 및 일차 T 세포로부터 유래된 세포로 이루어진 군으로부터 선택되며, 조작된 세포는 TRB 유전자좌 내로 삽입된 CD47을 코딩하는 제1 외인성 폴리뉴클레오티드 및/또는 CAR을 코딩하는 제2 외인성 폴리뉴클레오티드를 포함하는 B2Mindel/indel, CIITAindel/indel, TRACindel/indel 세포이다.
일부 실시양태에서, 조작된 세포는 만능 줄기 세포, 유도 만능 줄기 세포, 유도 만능 줄기 세포로부터 분화된 T 세포, 일차 T 세포, 및 일차 T 세포로부터 유래된 세포로 이루어진 군으로부터 선택되며, 조작된 세포는 TRB 유전자좌 내로 삽입된 CD47을 코딩하는 제1 외인성 폴리뉴클레오티드 및 CAR을 코딩하는 제2 외인성 폴리뉴클레오티드를 포함하는 B2Mindel/indel, CIITAindel/indel, TRACindel/indel 세포이다.
일부 실시양태에서, 조작된 세포는 만능 줄기 세포, 유도 만능 줄기 세포, 유도 만능 줄기 세포로부터 분화된 T 세포, 일차 T 세포, 및 일차 T 세포로부터 유래된 세포로 이루어진 군으로부터 선택되며, 조작된 세포는 B2M 유전자좌 내로 삽입된 CD47을 코딩하는 제1 외인성 폴리뉴클레오티드 및/또는 CAR을 코딩하는 제2 외인성 폴리뉴클레오티드를 포함하는 B2Mindel/indel, CIITAindel/indel, TRACindel/indel 세포이다.
일부 실시양태에서, 조작된 세포는 만능 줄기 세포, 유도 만능 줄기 세포, 유도 만능 줄기 세포로부터 분화된 T 세포, 일차 T 세포, 및 일차 T 세포로부터 유래된 세포로 이루어진 군으로부터 선택되며, 조작된 세포는 B2M 유전자좌 내로 삽입된 CD47을 코딩하는 제1 외인성 폴리뉴클레오티드 및 CAR을 코딩하는 제2 외인성 폴리뉴클레오티드를 포함하는 B2Mindel/indel, CIITAindel/indel, TRACindel/indel 세포이다.
일부 실시양태에서, 조작된 세포는 만능 줄기 세포, 유도 만능 줄기 세포, 유도 만능 줄기 세포로부터 분화된 T 세포, 일차 T 세포, 및 일차 T 세포로부터 유래된 세포로 이루어진 군으로부터 선택되며, 조작된 세포는 CIITA 유전자좌 내로 삽입된 CD47을 코딩하는 제1 외인성 폴리뉴클레오티드 및/또는 CAR을 코딩하는 제2 외인성 폴리뉴클레오티드를 포함하는 B2Mindel/indel, CIITAindel/indel, TRACindel/indel 세포이다.
일부 실시양태에서, 조작된 세포는 만능 줄기 세포, 유도 만능 줄기 세포, 유도 만능 줄기 세포로부터 분화된 T 세포, 일차 T 세포, 및 일차 T 세포로부터 유래된 세포로 이루어진 군으로부터 선택되며, 조작된 세포는 CIITA 유전자좌 내로 삽입된 CD47을 코딩하는 제1 외인성 폴리뉴클레오티드 및 CAR을 코딩하는 제2 외인성 폴리뉴클레오티드를 포함하는 B2Mindel/indel, CIITAindel/indel, TRACindel/indel 세포이다.
본원은 야생형 세포 또는 대조군 세포에 비해 HLA-A, HLA-B, HLA-C, HLA-DP, HLA-DQ, HLA-DR, B2M, CIITA, TCR-알파 및/또는 TCR-베타의 감소된 발현을 포함하는 조작된 세포를 제공한다.
일부 실시양태에서, 조작된 세포는 HLA-A, HLA-B 및/또는 HLA-C 항원을 발현하지 않는다.
일부 실시양태에서, 조작된 세포는 CIITA를 발현하지 않는다.
일부 실시양태에서, 조작된 세포는 HLA-DP, HLA-DQ, 및/또는 HLA-DR 항원을 발현하지 않는다.
일부 실시양태에서, 조작된 세포는 B2M을 발현하지 않는다.
일부 실시양태에서, 조작된 세포는 만능 줄기 세포, 유도 만능 줄기 세포, 유도 만능 줄기 세포로부터 분화된 T 세포, 일차 T 세포, 및 일차 T 세포로부터 유래된 세포로 이루어진 군으로부터 선택되며, 조작된 세포는 TCR-알파를 발현하지 않는다.
일부 실시양태에서, 조작된 세포는 만능 줄기 세포, 유도 만능 줄기 세포, 유도 만능 줄기 세포로부터 분화된 T 세포, 일차 T 세포, 및 일차 T 세포로부터 유래된 세포로 이루어진 군으로부터 선택되며, 조작된 세포는 TCR-베타를 발현하지 않는다.
일부 실시양태에서, 조작된 세포는 야생형 세포 또는 대조군 세포에 비해 CD47을 과발현한다.
일부 실시양태에서, 조작된 세포는 만능 줄기 세포이다.
일부 실시양태에서, 조작된 세포는 유도 만능 줄기 세포이다.
일부 실시양태에서, 조작된 세포는 유도 만능 줄기 세포로부터 유래된 분화된 세포이다.
일부 실시양태에서, 분화된 세포는 NK 세포 및 T 세포로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일부 실시양태에서, 조작된 세포는 일차 T 세포로부터 유래된 세포이다.
일부 실시양태에서, 일차 T 세포로부터 유래된 세포는 수용자 대상체와 상이한 한 명 이상의 공여자 대상체로부터의 일차 T 세포를 포함하는 T 세포의 풀로부터 유래된다.
일부 실시양태에서, 조작된 세포는 다능성을 유지하고/하거나 분화 잠재력을 유지한다.
일부 실시양태에서, 제1 대상체 내로 전달된 후에, 조작된 세포는 제2 대상체 내로 전달된 후의 야생형 세포와 비교하여 감소된, (a) T 세포 반응, (b) NK 세포 반응 및 (c) 대식세포 반응으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 반응을 나타낸다.
일부 실시양태에서, 제1 대상체 및 제2 대상체는 상이한 대상체이다.
일부 실시양태에서, 대식세포 반응은 탐식이다.
일부 실시양태에서, 대상체 내로 전달된 후에, 조작된 세포는 대상체 내로 전달된 후의 야생형 세포와 비교하여 (a) 대상체에서 감소된 TH1 활성화, (b) 대상체에서 감소된 NK 세포 살해, 및 (c) 대상체에서 전체 PBMC에 의한 감소된 살해로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상을 나타낸다.
일부 실시양태에서, 대상체 내로 전달된 후에, 조작된 세포는 대상체 내로 전달된 후의 야생형 세포와 비교하여 (a) 대상체에서 감소된 공여자-특이적 항체, (b) 대상체에서 감소된 IgM 또는 IgG 항체, 및 (c) 대상체에서 감소된 보체-의존적 세포독성 (CDC)으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상을 이끌어낸다.
일부 실시양태에서, 조작된 세포는 만능 줄기 세포, 유도 만능 줄기 세포, 유도 만능 줄기 세포로부터 분화된 T 세포, 일차 T 세포, 및 일차 T 세포로부터 유래된 세포로 이루어진 군으로부터 선택되며, 조작된 세포는 B2Mindel/indel, CIITAindel/indel, TRACindel/indel, 및/또는 TRBindel/indel 세포이다.
일부 실시양태에서, 조작된 세포는 저면역원성 세포이다.
일부 실시양태에서, 야생형 세포 또는 대조군 세포는 출발 재료이다.
일부 실시양태에서, 제1 및/또는 제2 외인성 폴리뉴클레오티드는 바이러스 형질도입을 사용하여 세포의 하나 이상의 대립유전자 내로 삽입된다.
일부 실시양태에서, 바이러스 형질도입은 렌티바이러스 기반 바이러스 벡터를 통해 이루어진다.
일부 실시양태에서, 렌티바이러스 기반 바이러스 벡터는 제1 및/또는 제2 외인성 폴리뉴클레오티드를 운반하는 슈도타이핑된 자기-비활성화 렌티바이러스 벡터이다.
일부 실시양태에서, 렌티바이러스 기반 바이러스 벡터는 수포성 구내염 VSV-G 외피로 슈도타이핑되고 제1 및/또는 제2 외인성 폴리뉴클레오티드를 운반하는 자기-비활성화 렌티바이러스 벡터이다.
본원에는 본원에 기재된 바와 같은 조작된 세포의 집단 및 약학적으로 허용가능한 첨가제, 담체, 희석제 또는 부형제를 포함하는 약학 조성물을 제공한다.
일부 실시양태에서, 약학적으로 허용가능한 첨가제, 담체, 희석제 또는 부형제는 Plasma-Lyte A®, 덱스트로스, 덱스트란, 소듐 클로라이드, 인간 혈청 알부민 (HSA), 디메틸설폭사이드 (DMSO) 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상을 포함한다.
조성물의 일부 실시양태에서, 조성물은 약학적으로 허용가능한 완충액을 추가로 포함한다.
일부 실시양태에서, 약학적으로 허용가능한 완충액은 중성 완충 식염수 또는 포스페이트 완충된 식염수이다.
본원은 본원에 기재된 바와 같은 조작된 세포의 집단, 약 70-80% w/w의 농도의 CryoStor® CSB의 염기 용액, 및 약 20-30% w/w PlasmaLyte-A™, 약 0.3-5.3% w/v 인간 혈청 알부민 (HSA), 약 0-20% v/v 디메틸설폭사이드 (DMSO) 및 약 100-400 mM 트레할로스 중 하나 이상을 포함하는 약학 조성물을 제공한다.
본원은 본원에 기재된 바와 같은 조작된 세포의 집단, 약 20-30% w/w의 농도의 PlasmaLyte-A™의 염기 용액, 및 약 70-80% w/w CryoStor® CSB, 약 0.3-5.3% w/v 인간 혈청 알부민 (HSA), 약 0-20% v/v 디메틸설폭사이드 (DMSO) 및 약 100-400 mM 트레할로스 중 하나 이상을 포함하는 약학 조성물을 제공한다.
본원은 본원에 기재된 바와 같은 조작된 세포의 집단, 약 0.3-5.3% w/v 인간 혈청 알부민 (HSA), 및 약 70-80% w/w CryoStor® CSB, 약 20-30% w/w PlasmaLyte-A™, 약 0-20% v/v 디메틸설폭사이드 (DMSO) 및 약 100-400 mM 트레할로스 중 하나 이상을 포함하는 약학 조성물을 제공한다.
본원은 본원에 기재된 바와 같은 조작된 세포의 집단, 약 0-20% v/v 디메틸설폭사이드 (DMSO), 및 약 70-80% w/w CryoStor® CSB, 약 20-30% w/w PlasmaLyte-A™, 약 0.3-5.3% w/v 인간 혈청 알부민 (HSA) 및 약 100-400 mM 트레할로스 중 하나 이상을 포함하는 약학 조성물을 제공한다.
본원은 본원에 기재된 바와 같은 조작된 세포의 집단, 약 100-400 mM 트레할로스, 및 약 70-80% w/w CryoStor® CSB, 약 20-30% w/w PlasmaLyte-A™, 약 0.3-5.3% w/v 인간 혈청 알부민 (HSA) 및 약 0-20% v/v 디메틸설폭사이드 (DMSO) 중 하나 이상을 포함하는 약학 조성물을 제공한다.
일부 실시양태에서, 약학 조성물은 약 75% w/w의 CryoStor® CSB를 포함한다.
일부 실시양태에서, 약학 조성물은 약 25% w/w의 PlasmaLyte-A™을 포함한다.
일부 실시양태에서, 약학 조성물은 약 0.3% w/v의 HSA를 포함한다.
일부 실시양태에서, 약학 조성물은 약 7.5% v/v의 DMSO를 포함한다.
본원은 본원에 기재된 바와 같은 조작된 세포의 집단, 약 75% w/w의 농도의 CryoStor® CSB의 염기 용액, 약 25% w/w PlasmaLyte-A™, 약 0.3% w/v 인간 혈청 알부민 (HSA) 및 약 7.5% v/v 디메틸설폭사이드 (DMSO)를 포함하는 약학 조성물을 제공한다.
일부 실시양태에서, 조작된 세포의 집단은 최대 약 8.0 x 108 개의 세포이다.
일부 실시양태에서, 조작된 세포의 집단은 최대 약 6.0 x 108 개의 세포이다.
일부 실시양태에서, 조작된 세포의 집단은 약 1.0 x 106 내지 약 2.5 x 108 개의 세포이다.
일부 실시양태에서, 조작된 세포의 집단은 약 2.0 x 106 내지 약 2.0 x 108 개의 세포이다.
일부 실시양태에서, 조작된 세포의 집단은 약 5 ml 내지 약 80 ml의 범위이다.
일부 실시양태에서, 조작된 세포의 집단은 약 10 ml 내지 약 70 ml의 범위이다.
일부 실시양태에서, 조작된 세포의 집단은 약 10 ml 내지 약 50 ml의 범위이다.
일부 실시양태에서, 조성물은 단일 용량으로 투여하기 위해 제형화된다.
일부 실시양태에서, 조성물은 최대 3 회 용량으로 투여하기 위해 제형화된다.
일부 실시양태에서, 조성물은 약 60 분 이하의 시간의 지속기간이 걸리는 대상체에 단일 용량의 투여를 위해 제형화된다.
일부 실시양태에서, 조성물은 약 30 분 이하의 시간의 지속기간이 걸리는 대상체에 단일 용량의 투여를 위해 제형화된다.
일부 실시양태에서, 약학 조성물의 조작된 세포 또는 이의 자손의 집단은 투여 후 10 일 후에 대상체에서 40% 이상의 생존을 나타낸다.
일부 실시양태에서, 약학 조성물의 조작된 세포 또는 이의 자손의 집단은 투여 후 약 2 주 후에 대상체에서 80% 이상의 생존을 나타낸다.
일부 실시양태에서, 약학 조성물의 조작된 세포 또는 이의 자손의 집단은 투여 후 약 3 주 후에 대상체에서 100% 이상의 생존을 나타낸다.
일부 실시양태에서, 약학 조성물의 조작된 세포 또는 이의 자손의 집단은 투여 후 약 4 주 후에 대상체에서 150% 이상의 생존을 나타낸다.
본원은 본원에 기재된 바와 같은 조작된 세포의 집단, 및 약학적으로 허용가능한 첨가제, 담체, 희석제 또는 부형제를 포함하는 약학 조성물의 투여를 포함하는, 대상체에서 질환 또는 장애를 치료하기 위한 투여량 양생법을 제공하며, 여기서 약학 조성물은 약 1-3 회 용량으로 투여된다.
일부 실시양태에서, 투여된 약학 조성물은 약 1-3 회 용량의 최대 약 6.0 x 108 개의 세포이다.
일부 실시양태에서, 투여된 약학 조성물은 약 1-3 회 용량의 약 0.6 x 106 내지 약 6.0 x 108 개의 세포이다.
일부 실시양태에서, 투여된 약학 조성물은 대상체가 50 kg 이하의 체중을 갖는 경우, 약 1-3 회 용량의 대상체의 체중 kg당 약 0.2 x 106 내지 약 5.0 x 106 개의 세포이다.
일부 실시양태에서, 투여된 약학 조성물은 대상체가 50 kg 초과의 체중을 갖는 경우, 약 1-3 회 용량의 약 0.1 x 108 내지 약 2.5 x 108 개의 세포이다.
일부 실시양태에서, 투여된 약학 조성물은 대상체의 체중 kg당 약 2.0 x 106 개의 세포, 및 약 1-3 회 용량의 최대 약 2.x 108 개의 세포이다.
일부 실시양태에서, 대상체에 대한 단일 용량의 투여는 약 60 분 이하의 시간의 지속기간이 걸린다.
일부 실시양태에서, 대상체에 대한 단일 용량의 투여는 약 30 분 이하의 시간의 지속기간이 걸린다.
일부 실시양태에서, 약학적으로 허용가능한 첨가제, 담체, 희석제 또는 부형제는 Plasma-Lyte A®, 덱스트로스, 덱스트란, 소듐 클로라이드, 인간 혈청 알부민 (HSA), 디메틸설폭사이드 (DMSO) 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상을 포함한다.
일부 실시양태에서, 약학 조성물은 약학적으로 허용가능한 완충액을 추가로 포함한다.
일부 실시양태에서, 약학적으로 허용가능한 완충액은 중성 완충 식염수 또는 포스페이트 완충된 식염수이다.
일부 실시양태에서, 약학 조성물의 투여, 세포 또는 이의 자손의 집단은 최대 9 개월까지 대상체에 존재한다.
일부 실시양태에서, 약학 조성물의 투여, 세포 또는 이의 자손의 집단은 적어도 2 년 이상 대상체에 존재한다.
일부 실시양태에서, 약학 조성물의 투여, 조작된 세포 또는 이의 자손의 집단은 투여 후 약 10 일 후에 대상체에서 40% 이상의 생존을 나타낸다.
일부 실시양태에서, 약학 조성물의 투여, 조작된 세포 또는 이의 자손의 집단은 투여 후 약 2 주 후에 대상체에서 80% 이상의 생존을 나타낸다.
일부 실시양태에서, 약학 조성물의 투여, 조작된 세포 또는 이의 자손의 집단은 투여 후 약 3 주 후에 대상체에서 100% 이상의 생존을 나타낸다.
일부 실시양태에서, 약학 조성물의 투여, 조작된 세포 또는 이의 자손의 집단은 투여 후 약 4 주 후에 대상체에서 150% 이상의 생존을 나타낸다.
일부 실시양태에서, 각각의 용량이 1 내지 24 시간 범위의 간격으로 투여되도록 대상체에 대한 2-3 회 용량의 투여가 발생한다.
일부 실시양태에서, 각각의 용량이 1 내지 28 일 범위의 간격으로 투여되도록 대상체에 대한 2-3 회 용량의 투여가 발생한다.
일부 실시양태에서, 각각의 용량이 1 내지 6 주 범위의 간격으로 투여되도록 대상체에 대한 2-3 회 용량의 투여가 발생한다.
일부 실시양태에서, 각각의 용량이 1 내지 12 개월 이상 범위의 간격으로 투여되도록 대상체에 대한 2-3 회 용량의 투여가 발생한다.
본원은 다음을 포함하는 약학 조성물을 투여하는 단계를 포함하는, 대상체에서 질환 또는 장애를 치료하기 위한 투여량 양생법을 제공하며,
(i) HLA-A, HLA-B, HLA-C, HLA-DP, HLA-DQ, HLA-DR, B2M, CIITA, TCR-알파 및/또는 TCR-베타의 감소된 발현을 포함하는 조작된 세포이되, 조작된 세포는 CD47 및 키메라 항원 수용체 (CAR)를 코딩하는 외인성 폴리뉴클레오티드의 세트를 추가로 포함하고, 여기서 외인성 폴리뉴클레오티드의 세트는 세포의 하나 이상의 대립유전자의 세이프 하버 또는 표적 유전자좌 내로 삽입되는, 조작된 세포; 및
(ii) 약학적으로 허용가능한 첨가제, 담체, 희석제 또는 부형제,
여기서 약학 조성물은 최대 약 6.0 x 108 개의 세포를 포함한다.
본원은 다음을 포함하는 약학 조성물을 투여하는 단계를 포함하는, 대상체에서 질환 또는 장애를 치료하기 위한 투여량 양생법을 제공하며,
(i) HLA-A, HLA-B, HLA-C, HLA-DP, HLA-DQ, HLA-DR, B2M, CIITA, TCR-알파 및/또는 TCR-베타의 감소된 발현을 포함하는 조작된 세포이되, 조작된 세포는 CD47 및 키메라 항원 수용체 (CAR)를 코딩하는 외인성 폴리뉴클레오티드의 세트를 추가로 포함하고, 여기서 외인성 폴리뉴클레오티드의 세트는 세포의 하나 이상의 대립유전자의 세이프 하버 또는 표적 유전자좌 내로 삽입되는, 조작된 세포; 및
(ii) 약학적으로 허용가능한 첨가제, 담체, 희석제 또는 부형제,
여기서 약학 조성물은 1-3 회 용량으로 투여된다.
본원은 다음을 포함하는 약학 조성물을 투여하는 단계를 포함하는, 대상체에서 질환 또는 장애를 치료하기 위한 투여량 양생법을 제공하며,
(i) HLA-A, HLA-B, HLA-C, HLA-DP, HLA-DQ, HLA-DR, B2M, CIITA, TCR-알파 및/또는 TCR-베타의 감소된 발현을 포함하는 조작된 세포이되, 조작된 세포는 CD47 및 키메라 항원 수용체 (CAR)를 코딩하는 외인성 폴리뉴클레오티드의 세트를 추가로 포함하고, 여기서 외인성 폴리뉴클레오티드의 세트는 세포의 하나 이상의 대립유전자의 세이프 하버 또는 표적 유전자좌 내로 삽입되는, 조작된 세포; 및
(ii) 약학적으로 허용가능한 첨가제, 담체, 희석제 또는 부형제,
여기서 약학적 조성물의 용량은 약 60 분 이하의 시간의 지속기간 동안 투여된다.
본원은 다음을 포함하는 약학 조성물을 투여하는 단계를 포함하는, 대상체에서 질환 또는 장애를 치료하기 위한 투여량 양생법을 제공하며,
(i) HLA-A, HLA-B, HLA-C, HLA-DP, HLA-DQ, HLA-DR, B2M, CIITA, TCR-알파 및/또는 TCR-베타의 감소된 발현을 포함하는 조작된 세포; 및
(ii) 약학적으로 허용가능한 첨가제, 담체, 희석제 또는 부형제,
여기서 약학 조성물은 최대 약 6.0 x 108 개의 세포를 포함한다.
본원은 다음을 포함하는 약학 조성물을 투여하는 단계를 포함하는, 대상체에서 질환 또는 장애를 치료하기 위한 투여량 양생법을 제공하며,
(i) HLA-A, HLA-B, HLA-C, HLA-DP, HLA-DQ, HLA-DR, B2M, CIITA, TCR-알파 및/또는 TCR-베타의 감소된 발현을 포함하는 조작된 세포; 및
(ii) 약학적으로 허용가능한 첨가제, 담체, 희석제 또는 부형제,
여기서 약학 조성물은 1-3 회 용량으로 투여된다.
본원은 다음을 포함하는 약학 조성물을 투여하는 단계를 포함하는, 대상체에서 질환 또는 장애를 치료하기 위한 투여량 양생법을 제공하며,
(i) HLA-A, HLA-B, HLA-C, HLA-DP, HLA-DQ, HLA-DR, B2M, CIITA, TCR-알파 및/또는 TCR-베타의 감소된 발현을 포함하는 조작된 세포; 및
(ii) 약학적으로 허용가능한 첨가제, 담체, 희석제 또는 부형제,
여기서 약학 조성물의 용량은 60 분 이하의 지속기간 동안 투여된다.
본원은 대상체에 대한 본원에 기재된 바와 같은 조작된 세포, 본원에 기재된 바와 같은 약학 조성물, 또는 본원에 기재된 바와 같은 투여량 양생법의 투여를 포함하는, 대상체에서 암을 치료하는 방법을 제공한다.
일부 실시양태에서, 암은 CD19+ 암이다.
본원은 대상체에 대한 본원에 기재된 바와 같은 조작된 세포의 투여를 포함하는, 대상체에서 T 세포 고갈을 예방하는 방법을 제공하며, 여기서 CAR은 CD19-특이적 CAR 또는 CD22-특이적 CAR이다.
일부 실시양태에서, CD19-특이적 CAR은 악시카브타진 실로류셀, 리소카브타진 마라류셀, 브렉수카브타진 오토류셀 및 티사젠렉류셀로 이루어진 군으로부터 선택된 CAR-T 세포 기반 요법 중 어느 하나의 CD19-특이적 CAR과 실질적으로 동등하다.
본원은 다음을 포함하는, 대상체에서 T 세포 고갈을 방지하거나 질환을 치료하는 방법을 제공하며:
(i) 제1 시점에서 대상체에 대한 본원에 기재된 바와 같은 조작된 세포의 제1 집단을 포함하는 제1 투여량 양생법의 투여, 및
(ii) 제2 시점에서 대상체에 대한 본원에 기재된 바와 같은 조작된 세포의 제2 집단을 포함하는 제2 투여량 양생법의 투여,
여기서 제1 투여량 양생법 및 제2 투여량 양생법은 상이하다.
다음을 포함하는, 대상체에서 T 세포 고갈을 방지하거나 질환을 치료하는 방법:
(i) 제1 시점에서 대상체에 대한 본원에 기재된 바와 같은 조작된 세포의 제1 집단을 포함하는 제1 투여량 양생법의 투여, 및
(ii) 제2 시점에서 대상체에 대한 본원에 기재된 바와 같은 조작된 세포의 제2 집단을 포함하는 제2 투여량 양생법의 투여,
여기서 조작된 세포의 제1 집단 및 조작된 세포의 제2 집단 둘 모두는 동일한 키메라 항원 수용체를 포함함.
본원은 다음을 포함하는, 대상체에서 T 세포 고갈을 방지하거나 질환을 치료하는 방법을 제공하며:
(i) 제1 시점에서 대상체에 대한 본원에 기재된 바와 같은 조작된 세포의 제1 집단을 포함하는 제1 투여량 양생법의 투여, 및
(ii) 제2 시점에서 대상체에 대한 본원에 기재된 바와 같은 조작된 세포의 제2 집단을 포함하는 제2 투여량 양생법의 투여,
여기서 조작된 세포의 제1 집단 및 조작된 세포의 제2 집단 둘 모두는 상이한 키메라 항원 수용체를 포함한다.
본원은 다음을 포함하는, 대상체에서 T 세포 고갈을 방지하거나 질환을 치료하는 방법을 제공하며:
(i) 제1 시점에서 대상체에 대한 본원에 기재된 바와 같은 조작된 세포의 제1 집단을 포함하는 제1 투여량 양생법의 투여, 및
(ii) 제2 시점에서 대상체에 대한 본원에 기재된 바와 같은 조작된 세포의 제2 집단을 포함하는 제2 투여량 양생법의 투여,
여기서 제1 집단의 조작된 세포는 제1 항원에 결합하는 제1 키메라 항원 수용체를 포함하고, 제2 집단의 조작된 세포는 제2 항원에 결합하는 제2 키메라 항원 수용체를 포함하며, 여기서 제1 항원 및 제2 항원은 동일하다.
본원은 다음을 포함하는, 대상체에서 T 세포 고갈을 방지하거나 질환을 치료하는 방법을 제공하며:
(i) 제1 시점에서 대상체에 대한 본원에 기재된 바와 같은 조작된 세포의 제1 집단을 포함하는 제1 투여량 양생법의 투여, 및
(ii) 제2 시점에서 대상체에 대한 본원에 기재된 바와 같은 조작된 세포의 제2 집단을 포함하는 제2 투여량 양생법의 투여,
여기서 제1 집단의 조작된 세포는 제1 항원에 결합하는 제1 키메라 항원 수용체를 포함하고, 제2 집단의 조작된 세포는 제2 항원에 결합하는 제2 키메라 항원 수용체를 포함하며, 여기서 제1 항원 및 제2 항원은 상이하다.
일부 실시양태에서, 조작된 세포는 활성화되지 않는다.
본원은 야생형 T 세포에 비해, HLA-A, HLA-B, HLA-C, HLA-DP, HLA-DQ, HLA-DR, B2M, CIITA, TCR-알파 및/또는 TCR-베타의 감소된 발현 및 키메라 항원 수용체 (CAR)를 코딩하는 제1 외인성 폴리뉴클레오티드를 포함하는 비-활성화된 T 세포를 제공한다.
일부 실시양태에서, 비-활성화된 T 세포는 일차 T 세포이다.
일부 실시양태에서, 비-활성화된 T 세포는 본원에 기재된 바와 같이 조작된 세포로부터 분화된다.
일부 실시양태에서, T 세포는 CD8+ T 세포이다.
일부 실시양태에서, 비-활성화된 T 세포는 항-CD3 항체, 항-CD28 항체, T 세포 활성화 사이토카인 또는 가용성 T 세포 공동자극 분자로 처리되지 않았다.
일부 실시양태에서, 항-CD3 항체는 OKT3이다.
일부 실시양태에서, 항-CD28 항체는 CD28.2이다.
일부 실시양태에서, T 세포 활성화 사이토카인은 IL-2, IL-7, IL-15 및 IL-21로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일부 실시양태에서, 가용성 T 세포 공동자극 분자는 항-CD28 항체, 항-CD80 항체, 항-CD86 항체, 항-CD137L 항체 및 항-ICOS-L 항체로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일부 실시양태에서, 비-활성화된 T 세포는 활성화 마커를 발현하지 않는다.
일부 실시양태에서, 비-활성화된 T 세포는 CD3 및 CD28을 발현하고, 여기서 CD3 및/또는 CD28은 비활성이다.
일부 실시양태에서, 제1 외인성 폴리뉴클레오티드는 CD8 결합제를 포함하는 렌티바이러스 벡터에 의해 운반된다.
일부 실시양태에서, 비-활성화된 T 세포는 CD47을 코딩하는 제2 외인성 폴리뉴클레오티드를 추가로 포함한다.
일부 실시양태에서, 제1 및/또는 제2 외인성 폴리뉴클레오티드는 T 세포의 하나 이상의 대립유전자의 특이적 유전자좌 내로 삽입된다.
일부 실시양태에서, 특이적 유전자좌는 세이프 하버 또는 표적 유전자좌, B2M 유전자좌, CIITA 유전자좌, TRAC 유전자좌 및 TRB 유전자좌로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일부 실시양태에서, CD47을 코딩하는 제2 외인성 폴리뉴클레오티드는 세이프 하버 또는 표적 유전자좌, B2M 유전자좌, CIITA 유전자좌, TRAC 유전자좌 및 TRB 유전자좌로 이루어진 군으로부터 선택된 특이적 유전자좌 내로 삽입된다.
일부 실시양태에서, CAR을 코딩하는 제1 외인성 폴리뉴클레오티드는 세이프 하버 또는 표적 유전자좌, B2M 유전자좌, CIITA 유전자좌, TRAC 유전자좌 및 TRB 유전자좌로 이루어진 군으로부터 선택된 특이적 유전자좌 내로 삽입된다.
일부 실시양태에서, CD47을 코딩하는 제2 외인성 폴리뉴클레오티드 및 CAR을 코딩하는 제1 외인성 폴리뉴클레오티드는 상이한 유전자좌 내로 삽입된다.
일부 실시양태에서, CD47을 코딩하는 제2 외인성 폴리뉴클레오티드 및 CAR을 코딩하는 제1 외인성 폴리뉴클레오티드는 동일한 유전자좌 내로 삽입된다.
일부 실시양태에서, CD47을 코딩하는 제2 외인성 폴리뉴클레오티드 및 CAR을 코딩하는 제1 외인성 폴리뉴클레오티드는 B2M 유전자좌 내로 삽입된다.
일부 실시양태에서, CD47을 코딩하는 제2 외인성 폴리뉴클레오티드 및 CAR을 코딩하는 제1 외인성 폴리뉴클레오티드는 CIITA 유전자좌 내로 삽입된다.
일부 실시양태에서, CD47을 코딩하는 제2 외인성 폴리뉴클레오티드 및 CAR을 코딩하는 제1 외인성 폴리뉴클레오티드는 TCR 유전자 유전자좌 내로 삽입된다.
일부 실시양태에서, CD47을 코딩하는 제2 외인성 폴리뉴클레오티드 및 CAR을 코딩하는 제1 외인성 폴리뉴클레오티드는 TRAC 유전자좌 내로 삽입된다.
일부 실시양태에서, CD47을 코딩하는 제2 외인성 폴리뉴클레오티드 및 CAR을 코딩하는 제1 외인성 폴리뉴클레오티드는 TRB 유전자좌 내로 삽입된다.
일부 실시양태에서, CD47을 코딩하는 제2 외인성 폴리뉴클레오티드 및 CAR을 코딩하는 제1 외인성 폴리뉴클레오티드는 세이프 하버 또는 표적 유전자좌 내로 삽입된다.
일부 실시양태에서, 세이프 하버 또는 표적 유전자좌는 CCR5 유전자 유전자좌, CXCR4 유전자 유전자좌, PPP1R12C 유전자 유전자좌, 알부민 유전자 유전자좌, SHS231 유전자 유전자좌, CLYBL 유전자 유전자좌, Rosa 유전자 유전자좌, F3 (CD142) 유전자 유전자좌, MICA 유전자 유전자좌, MICB 유전자 유전자좌, LRP1 (CD91) 유전자 유전자좌, HMGB1 유전자 유전자좌, ABO 유전자 유전자좌, RHD 유전자 유전자좌, FUT1 유전자좌, 및 KDM5D 유전자 유전자좌로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일부 실시양태에서, CAR은 CD19-특이적 CAR 및 CD22-특이적 CAR로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일부 실시양태에서, CD19-특이적 CAR은 악시카브타진 실로류셀, 리소카브타진 마라류셀, 브렉수카브타진 오토류셀 및 티사젠렉류셀로 이루어진 군으로부터 선택된 CAR-T 세포 기반 요법 중 어느 하나의 CD19-특이적 CAR과 실질적으로 동등하다.
일부 실시양태에서, CAR은 이중특이적 CAR이다.
일부 실시양태에서, 이중특이적 CAR은 CD19/CD22 이중특이적 CAR이다.
일부 실시양태에서, 비-활성화된 T 세포는 HLA-A, HLA-B 및/또는 HLA-C 항원을 발현하지 않는다.
일부 실시양태에서, 비-활성화된 T 세포는 B2M을 발현하지 않는다.
일부 실시양태에서, 비-활성화된 T 세포는 HLA-DP, HLA-DQ 및/또는 HLA-DR 항원을 발현하지 않는다.
일부 실시양태에서, 비-활성화된 T 세포는 CIITA를 발현하지 않는다.
일부 실시양태에서, 비-활성화된 T 세포는 TCR-알파 및/또는 TCR-베타를 발현하지 않는다.
일부 실시양태에서, 비-활성화된 T 세포는 TRAC 유전자좌 내로 삽입된 CD47을 코딩하는 제2 외인성 폴리뉴클레오티드 및/또는 CAR을 코딩하는 제1 외인성 폴리뉴클레오티드를 포함하는 B2Mindel/indel, CIITAindel/indel, TRACindel/indel 세포이다.
일부 실시양태에서, 비-활성화된 T 세포는 TRAC 유전자좌 내로 삽입된 CD47을 코딩하는 제2 외인성 폴리뉴클레오티드 및 CAR을 코딩하는 제1 외인성 폴리뉴클레오티드를 포함하는 B2Mindel/indel, CIITAindel/indel, TRACindel/indel 세포이다.
일부 실시양태에서, 비-활성화된 T 세포는 TRB 유전자좌 내로 삽입된 CD47을 코딩하는 제2 외인성 폴리뉴클레오티드 및/또는 CAR을 코딩하는 제1 외인성 폴리뉴클레오티드를 포함하는 B2Mindel/indel, CIITAindel/indel, TRACindel/indel 세포이다.
일부 실시양태에서, 비-활성화된 T 세포는 TRB 유전자좌 내로 삽입된 CD47을 코딩하는 제2 외인성 폴리뉴클레오티드 및 CAR을 코딩하는 제1 외인성 폴리뉴클레오티드를 포함하는 B2Mindel/indel, CIITAindel/indel, TRACindel/indel 세포이다.
일부 실시양태에서, 비-활성화된 T 세포는 B2M 유전자좌 내로 삽입된 CD47을 코딩하는 제2 외인성 폴리뉴클레오티드 및/또는 CAR을 코딩하는 제1 외인성 폴리뉴클레오티드를 포함하는 B2Mindel/indel, CIITAindel/indel, TRACindel/indel 세포이다.
일부 실시양태에서, 비-활성화된 T 세포는 B2M 유전자좌 내로 삽입된 CD47을 코딩하는 제2 외인성 폴리뉴클레오티드 및 CAR을 코딩하는 제1 외인성 폴리뉴클레오티드를 포함하는 B2Mindel/indel, CIITAindel/indel, TRACindel/indel 세포이다.
일부 실시양태에서, 비-활성화된 T 세포는 CIITA 유전자좌 내로 삽입된 CD47을 코딩하는 제2 외인성 폴리뉴클레오티드 및/또는 CAR을 코딩하는 제1 외인성 폴리뉴클레오티드를 포함하는 B2Mindel/indel, CIITAindel/indel, TRACindel/indel 세포이다.
일부 실시양태에서, 비-활성화된 T 세포는 CIITA 유전자좌 내로 삽입된 CD47을 코딩하는 제2 외인성 폴리뉴클레오티드 및 CAR을 코딩하는 제1 외인성 폴리뉴클레오티드를 포함하는 B2Mindel/indel, CIITAindel/indel, TRACindel/indel 세포이다.
본원은 야생형 T 세포에 비해, HLA-A, HLA-B, HLA-C, HLA-DP, HLA-DQ, HLA-DR, B2M, CIITA, TCR-알파 및/또는 TCR-베타의 감소된 발현을 포함하는 조작된 T 세포를 제공하며, 여기서 조작된 T 세포는 CD8 결합제를 포함하는 렌티바이러스 벡터에 의해 운반되는 키메라 항원 수용체 (CAR)를 코딩하는 제1 외인성 폴리뉴클레오티드를 추가로 포함한다.
일부 실시양태에서, 조작된 T 세포는 일차 T 세포이다.
일부 실시양태에서, 조작된 T 세포는 본원에 기재된 바와 같이 조작된 세포로부터 분화된다.
일부 실시양태에서, T 세포는 CD8+ T 세포이다.
일부 실시양태에서, 조작된 T 세포는 항-CD3 항체, 항-CD28 항체, T 세포 활성화 사이토카인 또는 가용성 T 세포 공동자극 분자로 처리되지 않았다.
일부 실시양태에서, 항-CD3 항체는 OKT3이며, 여기서 항-CD28 항체는 CD28.2이고, 여기서 T 세포 활성화 사이토카인은 IL-2, IL-7, IL-15 및 IL-21로 이루어진 군으로부터 선택되고, 가용성 T 세포 공동자극 분자는 항-CD28 항체, 항-CD80 항체, 항-CD86 항체, 항-CD137L 항체 및 항-ICOS-L 항체로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일부 실시양태에서, 조작된 T 세포는 활성화 마커를 발현하지 않는다.
일부 실시양태에서, 조작된 T 세포는 CD3 및 CD28을 발현하고, 여기서 CD3 및/또는 CD28은 비활성이다.
일부 실시양태에서, 조작된 T 세포는 CD47을 코딩하는 제2 외인성 폴리뉴클레오티드를 추가로 포함한다.
일부 실시양태에서, 제1 및/또는 제2 외인성 폴리뉴클레오티드는 T 세포의 하나 이상의 대립유전자의 특이적 유전자좌 내로 삽입된다.
일부 실시양태에서, 특이적 유전자좌는 세이프 하버 또는 표적 유전자좌, B2M 유전자좌, CIITA 유전자좌, TRAC 유전자좌 및 TRB 유전자좌로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일부 실시양태에서, CD47을 코딩하는 제2 외인성 폴리뉴클레오티드는 세이프 하버 또는 표적 유전자좌, B2M 유전자좌, CIITA 유전자좌, TRAC 유전자좌 및 TRB 유전자좌로 이루어진 군으로부터 선택된 특이적 유전자좌 내로 삽입된다.
일부 실시양태에서, CAR을 코딩하는 제1 외인성 폴리뉴클레오티드는 세이프 하버 또는 표적 유전자좌, B2M 유전자좌, CIITA 유전자좌, TRAC 유전자좌 및 TRB 유전자좌로 이루어진 군으로부터 선택된 특이적 유전자좌 내로 삽입된다.
일부 실시양태에서, CD47을 코딩하는 제2 외인성 폴리뉴클레오티드 및 CAR을 코딩하는 제1 외인성 폴리뉴클레오티드는 상이한 유전자좌 내로 삽입된다.
일부 실시양태에서, CD47을 코딩하는 제2 외인성 폴리뉴클레오티드 및 CAR을 코딩하는 제1 외인성 폴리뉴클레오티드는 동일한 유전자좌 내로 삽입된다.
일부 실시양태에서, CD47을 코딩하는 제2 외인성 폴리뉴클레오티드 및 CAR을 코딩하는 제1 외인성 폴리뉴클레오티드는 B2M 유전자좌, CIITA 유전자좌, TRAC 유전자좌, TRB 유전자좌, 또는 세이프 하버 또는 표적 유전자좌 내로 삽입된다.
일부 실시양태에서, 세이프 하버 또는 표적 유전자좌는 CCR5 유전자 유전자좌, CXCR4 유전자 유전자좌, PPP1R12C 유전자 유전자좌, 알부민 유전자 유전자좌, SHS231 유전자 유전자좌, CLYBL 유전자 유전자좌, Rosa 유전자 유전자좌, F3 (CD142) 유전자 유전자좌, MICA 유전자 유전자좌, MICB 유전자 유전자좌, LRP1 (CD91) 유전자 유전자좌, HMGB1 유전자 유전자좌, ABO 유전자 유전자좌, RHD 유전자 유전자좌, FUT1 유전자좌, 및 KDM5D 유전자 유전자좌로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일부 실시양태에서, CAR은 CD19-특이적 CAR 및 CD22-특이적 CAR로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일부 실시양태에서, CD19-특이적 CAR은 악시카브타진 실로류셀, 리소카브타진 마라류셀, 브렉수카브타진 오토류셀 및 티사젠렉류셀로 이루어진 군으로부터 선택된 CAR-T 세포 기반 요법 중 어느 하나의 CD19-특이적 CAR과 실질적으로 동등하다.
일부 실시양태에서, 조작된 T 세포는 HLA-A, HLA-B, 및/또는 HLA-C 항원을 발현하지 않고/않거나, 조작된 T 세포는 B2M을 발현하지 않고/않거나, 조작된 T 세포는 HLA-DP, HLA-DQ 및/또는 HLA-DR 항원을 발현하지 않고/않거나, 조작된 T 세포는 CIITA를 발현하지 않고/않거나, 조작된 T 세포는 TCR-알파 및/또는 TCR-베타를 발현하지 않는다.
일부 실시양태에서, 조작된 T 세포는 TRAC 유전자좌 내로, TRB 유전자좌 내로, B2M 유전자좌 내로 또는 CIITA 유전자좌 내로 삽입된, CD47을 코딩하는 제2 외인성 폴리뉴클레오티드 및/또는 CAR을 코딩하는 제1 외인성 폴리뉴클레오티드를 포함하는 B2Mindel/indel, CIITAindel/indel, TRACindel/indel 세포이다.
일부 실시양태에서, 비-활성화된 T 세포는 본원에 기재된 바와 같거나, 조작된 T 세포는 본원에 기재된 바와 같으며, 여기서 비-활성화된 T 세포 또는 조작된 T 세포는 대상체 내에 있다.
일부 실시양태에서, 비-활성화된 T 세포는 본원에 기재된 바와 같거나, 조작된 T 세포는 본원에 기재된 바와 같으며, 여기서 비-활성화된 T 세포 또는 조작된 T 세포는 생체외에 있다.
일부 실시양태에서, 비-활성화된 T 세포는 본원에 기재된 바와 같거나, 조작된 T 세포는 본원에 기재된 바와 같으며, 여기서 CD8 결합제는 항-CD8 항체이다.
일부 실시양태에서, 비-활성화된 T 세포 또는 조작된 T 세포는 본원에 기재된 바와 같으며, 여기서 항-CD8 항체는 마우스 항-CD8 항체, 토끼 항-CD8 항체, 인간 항-CD8 항체, 인간화된 항-CD8 항체, 낙타류 항-CD8 항체 및 이들의 단편으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일부 실시양태에서, 비-활성화된 T 세포 또는 조작된 T 세포는 본원에 기재된 바와 같으며, 이의 단편은 scFV 또는 VHH이다.
일부 실시양태에서, 비-활성화된 T 세포 또는 조작된 T 세포는 본원에 기재된 바와 같으며, 여기서 CD8 결합제는 CD8 알파 쇄 및/또는 CD8 베타 쇄에 결합한다.
일부 실시양태에서, 비-활성화된 T 세포 또는 조작된 T 세포는 본원에 기재된 바와 같으며, 여기서 CD8 결합제는 바이러스 외피에 혼입된 막관통 도메인에 융합된다.
일부 실시양태에서, 비-활성화된 T 세포 또는 조작된 T 세포는 본원에 기재된 바와 같으며, 여기서 렌티바이러스 벡터는 바이러스 융합 단백질로 슈도타이핑된다.
일부 실시양태에서, 비-활성화된 T 세포 또는 조작된 T 세포는 본원에 기재된 바와 같으며, 여기서 바이러스 융합 단백질은 이의 천연 수용체에 대한 결합을 감소시키기 위한 하나 이상의 변형을 포함한다.
일부 실시양태에서, 비-활성화된 T 세포 또는 조작된 T 세포는 본원에 기재된 바와 같으며, 여기서 바이러스 융합 단백질은 CD8 결합제에 융합된다.
일부 실시양태에서, 비-활성화된 T 세포 또는 조작된 T 세포는 본원에 기재된 바와 같으며, 여기서 바이러스 융합 단백질은 CD8 결합제에 융합된 니파 바이러스 F 당단백질 및 니파 바이러스 G 당단백질을 포함한다.
일부 실시양태에서, 비-활성화된 T 세포 또는 조작된 T 세포는 본원에 기재된 바와 같으며, 여기서 렌티바이러스 벡터는 T 세포 활성화 분자 또는 T 세포 공동자극 분자를 포함하지 않는다.
일부 실시양태에서, 비-활성화된 T 세포 또는 조작된 T 세포는 본원에 기재된 바와 같으며, 여기서 렌티바이러스 벡터는 제1 외인성 폴리뉴클레오티드 및/또는 제2 외인성 폴리뉴클레오티드를 코딩한다.
일부 실시양태에서, 비-활성화된 T 세포 또는 조작된 T 세포는 본원에 기재된 바와 같으며, 여기서 제1 대상체 내로 전달된 후, 비-활성화된 T 세포 또는 조작된 T 세포는 제2 대상체 내로 전달된 후의 야생형 세포와 비교하여 감소된, (a) T 세포 반응, (b) NK 세포 반응, 및 (c) 대식세포 반응으로 이루어진 군으로부터 서낵된 하나 이상의 반응을 나타낸다.
일부 실시양태에서, 비-활성화된 T 세포 또는 조작된 T 세포는 본원에 기재된 바와 같으며, 여기서 제1 대상체 및 제2 대상자는 상이한 대상체이다.
일부 실시양태에서, 비-활성화된 T 세포 또는 조작된 T 세포는 본원에 기재된 바와 같으며, 여기서 대식세포 반응은 탐식이다.
일부 실시양태에서, 비-활성화된 T 세포 또는 조작된 T 세포는 본원에 기재된 바와 같으며, 대상체 내로 전달된 후에, 비-활성화된 T 세포 또는 조작된 T 세포는 대상체 내로 전달된 후의 야생형 세포와 비교하여 (a) 대상체에서 감소된 TH1 활성화, (b) 대상체에서 감소된 NK 세포 살해, 및 (c) 대상체에서 전체 PBMC에 의한 감소된 살해로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상을 나타낸다.
일부 실시양태에서, 비-활성화된 T 세포 또는 조작된 T 세포는 본원에 기재된 바와 같으며, 대상체 내로 전달된 후에, 비-활성화된 T 세포 또는 조작된 T 세포는 대상체 내로 전달된 후의 야생형 세포와 비교하여 (a) 대상체에서 감소된 공여자 특이적 항체, (b) 대상체에서 감소된 IgM 또는 IgG 항체, 및 (c) 대상체에서 감소된 보체-의존적 세포독성 (CDC)으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상을 이끌어낸다.
일부 실시양태에서, 비-활성화된 T 세포 또는 조작된 T 세포는 본원에 기재된 바와 같으며, 여기서 비-활성화된 T 세포 또는 조작된 T 세포는 대상체 내에서 CD8 결합제를 포함하는 렌티바이러스 벡터로 형질도입된다.
일부 실시양태에서, 비-활성화된 T 세포 또는 조작된 T 세포는 본원에 기재된 바와 같으며, 여기서 렌티바이러스 벡터는 CAR 및/또는 CD47을 코딩하는 유전자를 운반한다.
본원은 본원에 기재된 바와 같은 비-활성화된 T 세포 또는 조작된 T 세포의 집단 및 약학적으로 허용가능한 첨가제, 담체, 희석제 또는 부형제를 포함하는 약학 조성물을 제공한다.
본원은 본원에 기재된 바와 같은 비-활성화된 T 세포, 본원에 기재된 바와 같은 조작된 T 세포, 또는 본원에 기재된 바와 같은 약학 조성물을 포함하는 조성물을 대상체에 투여하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다.
일부 실시양태에서, 대상체에 조성물의 투여 전, 후 및/또는 이와 동시에 T 세포 활성화 치료가 투여되지 않는다.
일부 실시양태에서, T 세포 활성화 치료는 림프구고갈을 포함한다.
본원은 본원에 기재된 바와 같은 비-활성화된 T 세포, 본원에 기재된 바와 같은 조작된 T 세포, 또는 본원에 기재된 바와 같은 약학 조성물을 포함하는 조성물을 대상체에 투여하는 단계를 포함하는, 암을 앓고 있는 대상체를 치료하는 방법을 제공하며, 여기서 대상체에 조성물의 투여 전, 후 및/또는 이와 동시에 T 세포 활성화 치료가 투여되지 않는다.
일부 실시양태에서, T 세포 활성화 치료는 림프구고갈을 포함한다.
본원에 기재된 바와 같은 비-활성화된 T 세포, 본원에 기재된 바와 같은 조작된 T 세포 또는 본원에 기재된 바와 같은 약학 조성물을 포함하는 조성물을 대상체에 투여하는 단계를 포함하는, 대상체 내에서 T 세포의 확장을 필요로 하는 대상체에서의 종양 세포를 인식하고 이를 살해시킬 수 있는 T 세포를 확장하기 위한 방법, 여기서 대상체가 조성물의 투여 전, 후 및/또는 이와 동시에 T 세포 활성화 치료가 투여되지 않는다.
일부 실시양태에서, T 세포 활성화 치료는 림프구고갈을 포함한다.
본원은 본원에 기재된 바와 같은 비-활성화된 T 세포 및/또는 본원에 기재된 바와 같은 조작된 T 세포, 및 약학적으로 허용가능한 첨가제, 담체, 희석제 또는 부형제를 포함하는 조성물을 포함하는 약학 조성물의 대상체의 집단으로의 투여를 포함하는, 대상체에서 질환 또는 장애를 치료하기 위한 투여량 양생법을 제공하며, 여기서 약학 조성물은 약 1-3 회 용량으로 투여된다.
본 개시내용은 2020 년 12 월 31 일에 제출된 미국 가출원 (대리인 관리 번호 112864-5057-PR) 및 대리인 관리 번호 18615-30046.00를 갖는 Morrison 및 Foerester에 의해 제출된 2021 년 1 월 11 일에 제출된 미국 가출원에 관한 것이며, 이의 내용은 그 전체가 본원에 참조로 원용된다. 조작된 및/또는 저면역원성 세포, 이의 생산 방법 및 이의 사용 방법에 대한 상세한 설명은 2020 년 8 월 13 일자로 출원된 미국 가출원 번호 63/065,342, 2015 년 5 월 9 일자로 출원된 WO2016/183041, 2018 년 1 월 14 일자로 출원된 WO2018/132783, 2019 년 7 월 17 일자로 출원된 WO2020/018615, 2019 년 7 월 17 일자로 출원된 WO2020/018620, 2020 년 2 월 16 일자로 출원된 WO2020/168317에서 찾아볼 수 있으며, 실시예, 서열 목록 및 도면을 포함하는 이의 개시내용은 이들 전체가 본원에 참조로 원용된다.
도 1은 본원에 기재된 저면역원성 T 세포의 특성화를 도시한다. 이러한 세포는 HLA-I 및 HLA-II 녹-아웃 및 CD47 녹-인 세포이다.
도 2는 저면역원성 T 세포의 NK 세포 매개된 살해의 부재를 도시한다. 대조적으로, 항-CD47 항체를 이용한 CD47의 차단은 세포의 NK 세포 매개된 살해를 초래하였다. 모의 T 세포는 동종이계 NK 세포에 의해 살해되지 않았다 (예상된 바와 같음). HLA-I/II가 결여된 T 세포는 NK 세포에 의해 살해되었다. HLA-I/II 녹아웃 및 CD47 녹-인 세포는 NK 세포에 의해 살해되지 않았다. 마그롤리맙 (예컨대, 항-CD47 항체)을 이용한 CD47의 차단은 HLA-I/II 녹아웃, CD47 녹-인 세포의 살해를 초래하여, CD47에 의한 보호가 강조된다.
도 3은 저면역원성 T 세포의 대식세포 매개된 살해의 부재를 도시한다. 대조군 T 세포는 동종이계 대식세포에 의해 살해되지 않았고, HLA-I/II가 결여된 T 세포는 대식세포에 의해 살해되었다. HLA-I/II 녹아웃 및 CD47 녹-인 세포는 대식세포에 의해 살해되지 않았다. 마그롤리맙 (예컨대, 항-CD47 항체)으로 CD47을 차단하면 HLA-I/II 녹아웃, CD47 녹-인 세포의 살해를 초래하여, CD47에 의한 보호가 강조된다.
도 4는 예시적인 저면역원성 CAR-T 세포에서 CD19-특이적 CAR 및 CD47 작제물의 발현을 도시한다. CD19-특이적 CAR-CD47 T 세포는 외인성 CD47을 높은 수준으로 발현하였다. 본원에 사용된 바와 같이, 용어 "CD19-특이적 CAR-CD47 T 세포"는 CD19-특이적 CAR 및 CD47을 외인성으로 발현하는 T 세포를 지칭한다.
도 5a 및 5b는 생체외에서 용량-의존적 방식으로 예시적인 저면역원성 CAR-T 세포 (CD19-특이적 CAR-CD47 T 세포)에 의한 CD19+ 종양 세포의 살해를 묘사한다. CD47 과발현은 CD19-특이적 CAR 활성에 영향을 미치지 않는 것으로 보였다. CD19-특이적 CAR-CD47 T 세포는 대조군 CD19-특이적 CAR-T 세포 ("CAR 저" (도 5a) 및 "CAR 고" (도 5b) 세포)와 유사한 살해를 나타냈다.
도 6a 및 6b는 생체외에서 용량-의존적 방식으로 예시적인 저면역원성 CAR-T 세포 (예컨대, CD19-특이적 CAR-CD47 T 세포) ("CAR 저" (도 6a) 및 " CAR 고" (도 6b) 세포)에 의한 CD19+ 종양 세포의 살해를 나타내는 실시간 세포 분석 데이터를 확인하는 유동 데이터를 묘사한다. CD47 과발현은 생체외 검정에서 CD19-특이적 CAR 활성 후에 나타나지 않았다.
도 7은 FACS 분류된 예시적인 저면역원성 CAR-T 세포 (CD19-특이적 CAR-CD47 T 세포)에 의한 CD19+ 종양 세포의 살해를 나타낸다. 표적 세포:이펙터 세포 비는 1:3이었고 세포 분석을 위한 실시간 정량적 마이크로전자 바이오센서 시스템 (xCELLigence® RTCA 시스템, Agilent)을 사용하여 48 시간 동안 유세포 분석법에 의해 살해를 분석하였다. 데이터는 내인성 CD47 발현을 갖는 CD19-특이적 CAR-T 세포가 종양 세포를 살해시켰다는 것을 보여준다. 또한, 외인성 CD47 발현을 갖는 CD19-특이적 CAR-T 세포는 종양 세포를 살해시켰다. 대조군 T 세포 (모의 T 세포)는 종양 세포를 살해시키지 않았다. CD47 과발현은 생체외 검정에서 CD19-특이적 CAR 활성에 영향을 미치지 않는 것으로 보인다.
도 8은 본원에 기재된 세포의 성장, 특히 CD19-특이적 CAR-T 세포 및 CD19-특이적 CAR-CD47 T 세포의 CD47-의존적 및 CD47-비의존적 성장을 도시한다.
도 9a-b는 인간 CD19+ 종양을 갖는 마우스 모델에서 예시적인 저면역원성 CAR-T 세포의 효험을 도시한다. 전체 동물 스캔은 CD19+ 종양 세포에 대한 CD19-특이적 CAR-T 세포, CD19-특이적 CAR-CD47 T 세포 및 모의 T 세포의 효과를 보여준다.
도 10은 다양한 이펙터 대 Nalm6 표적 비에서 예시적인 저면역원성 CAR-T 세포의 효험을 도시한다.
도 11은 CD19-특이적 CAR-T 세포 및 CD19-특이적 CAR-CD47 T 세포 내로 CRISPR/Cas9 기반 유전자 편집 시스템을 도입하기 위한 뉴클레오펙션 4 일 후에 저면역원성 CD19-특이적 CAR-CD47 T 세포 및 대조군 T 세포 (CD19-특이적 CAR-EGFRt T 세포 및 모의 T 세포)에서 TRAC, B2M 및 CIITA 삼중 녹아웃의 세포 생존력 및 빈도를 묘사한다.
도 12a 및 12b는 저면역원성 CD19-특이적 CAR-CD47 T 세포 및 대조군 T 세포 (CD19-특이적 CAR-EGFRt T 세포, 티사젠렉류셀 바이오시밀러/대용 세포 및 모의 T 세포)에서 예시적인 CD19-특이적 CAR의 빈도 (도 12a) 및 MFI (도 12b)를 묘사한다.
도 13은 저면역원성 CD19-특이적 CAR-CD47 T 세포 및 대조군 T 세포 (CD19-특이적 CAR-EGFRt T 세포, 티사젠류셀 바이오시밀러/대용 세포, CD47 발현 T 세포, 및 모의 T 세포)에서 예시적인 CD19-특이적 CAR 및 CD47 분자 둘 모두의 빈도를 도시한다.
도 14는 활성화-후 8 일차에 저면역원성 CD19-특이적 CAR-CD47 T 세포 및 대조군 T 세포 (CD19-특이적 CAR-EGFRt T 세포, 티사젠렉류셀 바이오시밀러/대용 세포 및 모의 T 세포)에서의 벡터 카피 수를 묘사한다.
도 15는 세포당 항체의 유세포 분석 추정을 위한 방법 (예컨대, QuantiBRITE™, BD Biosciences)을 사용하여 저면역원성 CD19-특이적 CAR-CD47 T 세포에서의 CD47 분자의 발현을 묘사한다. 이 검정에서, 외인성 CD47 발현은 세포당 200,000 개 초과의 분자이다.
도 16a-d, 17a-d-18a-c는 TRAC, B2M 및 CIITA 유전자의 삼중 유전자 비활성화 및 CD47 단백질의 과발현의 존재가 본원에 기재된 저면역원성 CD19-특이적 CAR-CD47 T 세포에서 예시적인 CD19-특이적 CAR의 활성에 영향을 미치지 않았음을 도시한다.
도 19-22는 CD19+ 종양 세포를 갖는 마우스 모델에서 본원에 기재된 저면역원성 CD19-특이적 CAR-CD47 T 세포의 효험을 제공한다. 전체 동물 스캔은 이러한 저면역원성 CD19-특이적 CAR-T 세포에 의한 종양 세포의 살해를 보여준다. 살해 활성은 용량-의존적 방식으로 나타났다.
도 23은 0 내지 28 일의 범위에 걸쳐 다양한 이펙터:종양 세포 비에서 저면역원성 CD19-특이적 CAR-CD47 T 세포의 효험을 도시한다.
도 24는 27 일의 범위에 걸쳐 저면역원성 CD19-특이적 CAR-CD47 T 세포에 의한 종양 세포의 살해를 묘사하는 전체 동물 스캔을 도시한다. 사용된 이펙터:종양 세포 비는 7:1이었다.
도 25는 연구에 사용된 예시적인 테스트 세포 및 대조군 세포를 도시한다. 예시적인 테스트 세포는 B2M, CIITA 및 TRAC 유전자의 게놈 편집을 보유하고 CD47 분자 및 CD19-특이적 키메라 항원 수용체를 과발현하는 저면역원성 CD19-특이적 CAR-CD47 T 세포를 포함한다. 대조군 세포는 CD47 및 EGFR을 공동-발현하는 면역원성 CD19-특이적 CAR-T 세포뿐만 아니라 티사젠렉류셀 바이오시밀러 또는 대용물을 포함한다.
도 26 및 도 27은 예시적인 저면역원성 CD19-특이적 CAR-CD47 T 세포 및 CD3, B2M, HLA-DR/HLA-DP/HLA-DQ 및 HLA-A/HLA-B/HLA-C 발현의 부재의 FACS 분석을 묘사한다.
도 28은 저면역원성 CD19-특이적 CAR-CD47 T 세포에서 CD47 및 CD19-CAR의 발현에 대한 FACS 분석을 도시한다.
도 29는 저면역원성 CD19-특이적 CAR-CD47 T 세포, CD19-특이적 CAR-EGFRt T 세포 및 모의 T 세포에서 FACS 및 ICE에 의해 결정된 바와 같은 CD3, B2M, TRAC, HLA-DR/HLA-DP/HLA-DQ 및 HLA-A/HLA-B/HLA-C의 발현을 묘사한다.
도 30은 저면역원성 CD19-특이적 CAR-CD47 T 세포가 생체외에서 CD19-특이적 CAR-T 세포를 제어하는 것과 동등하게 종양 세포를 살해시킬 수 있음을 보여준다. B 세포 백혈병 살해 동역학 및 B 세포 백혈병 총 살해가 묘사된다.
도 31은 CD47 트랜스진을 발현하는 TRAC, B2M 및 CIITA 삼중 녹아웃 CAR-T 세포 (B2M-/-, CIITA-/-, TRAC-/-, tKO/CD47 CAR-T 세포로서 또는 HIP CD19-CAR-T 세포로서 또한 알려진 CD47tg CD19-특이적 CAR-T 세포)의 사이토카인-비의존적 증식을 연구하기 위한 실시예 3의 실험적 접근법의 개략도를 제공한다.
도 32a 및 도 32b는 IL-2가 보충된 배지 또는 IL-2가 보충되지 않은 배지에서 배양된 B2M-/-, CIITA-/-, TRAC-/-, CD47tg CD19-특이적 CAR-T 세포 (tKO/CD47 CAR-T 세포 또는 HIP CD19-CAR-T 세포)의 증식을 예시하는 그래프를 묘사한다.
도 33은 실시예 4의 실험적 접근법의 개략도를 제공한다.
도 34는 이종이식된 마우스에서 Nalm6-luc 종양 세포를 검출하기 위한 생체내 생물발광 이미지를 도시한다. 마우스에 tKO/CD47 CAR-T 세포 (HIP CD19-CAR-T 세포), 대조군 CAR-T 세포 (CD19-CAR-T 세포), 미편집된 T 세포 또는 식염수를 투여하였다. 생물발광 이미지는 연구의 35 일차, 42 일차, 49 일차 및 56 일차에 종양 진행을 보여준다.
도 35는 이종이식된 마우스에서 검출된 Nalm6-luc 종양 세포를 나타내는 그래프를 제공한다. Nalm6-luc 보유 마우스의 이미지는 대조군 CAR-T (CD19-CAR-T) 처리된 마우스, 미편집된 T 세포-처리된 마우스 및 식염수-처리된 마우스와 비교할 때 tKO/CD47 CAR-T 세포 (HIP CD19-CAR-T 세포) 처리된 마우스에서 지연된 종양 성장을 나타낸다.
도 36은 tKO/CD47 CAR-T 세포 또는 HIP CD19-CAR-T 세포로서 또한 지칭되는 CD19-특이적 CAR을 발현하는 B2Mindel/indel, CIITAindel/indel, TRACindel/indel, CD47tg T 세포를 생성하기 위한 실험적 접근법의 개략도를 보여준다. 이러한 세포는 CD47-CAR 렌티바이러스 형질도입된 및 유전자 편집된 T 세포 (하단 행; HIP CAR-T 세포)이다. 다이어그램은 또한 2 개의 유형의 대조군 세포의 생성을 도시한다: 미형질도입된 및 미편집된 세포 (상단 행; 미편집된 T 세포) 및 CAR-EGFRt 렌티바이러스 형질도입된 및 미편집된 세포 (중간 행; 대조군 CAR-T 세포).
도 37은 정상적인 건강한 말초 혈액으로부터 수집된 풍부한 백혈구성분채집술 생성물로부터 CD8 T 세포 및 CD4 T 세포를 단리하기 위한 예시적인 일련의 양성 면역자기 세포 선택 전략의 흐름도를 도시한다.
도 38은 도 36에서 약술된 방법에 따라 생산된 HIP CAR-T 세포 (HIP CD19-CAR-T 세포), 대조군 CAR-T 세포 (CD19-CAR-T 세포) 및 미편집된 T 세포를 특성화하는 유세포 분석 데이터의 표를 제공한다.
도 39a-d는 실시예 6의 실험적 결과를 도시한다. 도 39a-b는 Th1 (IFNg) 반응의 Elispot 분석을 도시하고, 도 39c-d는 CD19-CAR-T 세포 (도 39c) 또는 HIP CD19-CAR-T 세포 (도 39d)를 사용한 살해 검정의 결과를 도시한다.
도 40a 및 도 40b는 표 20에 기재된 예시적인 제형으로 제형화된 HIP 세포의 생존력 및 살해 효능을 도시한다. 도 40a는 제형에서 제조된 HIP 세포의 냉동-전 (빈 마커) 또는 해동-후 (고체 마커) 생존력을 나타내고, 도 40b는 제형에서 제조된 HIP 세포의 NALM-6 살해 효능을 나타낸다.
도 41a-d는 미분류된 및 분류된 T 세포에 대한 Elispot에 의해 결정된 바와 같은 Th1 (IFNg) 반응을 보여준다.
도 42a-j는 실시예 9에 기재된 연구에 대한 시간 경과에 따른 종양 부담의 정량화를 나타낸다.
도 43a-h는 실시예 9에 기재된 연구에 대한 HIP CD19-CAR-T 세포 빈도 및 혈액 내 CD47의 발현을 보여준다. 구체적으로, 도 43a-f는 중간 출혈 및 희생의 시간에 평가된 혈액 내 HIP CD19-CAR-T 세포의 빈도를 나타내고, 도 43g는 5x106 개의 HIP CD19-CAR-T 세포 및 tKO CD19-CAR-T (HIP CD19-CAR-T) 처리된 그룹으로 재챌린지된 그룹에서 108 일차에 혈액 내 CD19-CAR-T 세포의 CD47MFI를 보여준다. CAR+ 세포 빈도 데이터에 대해 수행된 Tukey의 다중 비교 테스트를 사용한 일원 ANOVA 및 혈액 CD47MFI 데이터에서 수행된 Bonferroni의 다중 비교 테스트를 사용한 이원 ANOVA.
도 44는 실시예 10에 기재된 연구에 대한 탐색적 자율 성장 검정의 세포 카운트 결과를 도시한다.
본 개시내용의 다른 목적, 이점 및 실시양태는 다음의 상세한 설명으로부터 명백할 것이다.
도 2는 저면역원성 T 세포의 NK 세포 매개된 살해의 부재를 도시한다. 대조적으로, 항-CD47 항체를 이용한 CD47의 차단은 세포의 NK 세포 매개된 살해를 초래하였다. 모의 T 세포는 동종이계 NK 세포에 의해 살해되지 않았다 (예상된 바와 같음). HLA-I/II가 결여된 T 세포는 NK 세포에 의해 살해되었다. HLA-I/II 녹아웃 및 CD47 녹-인 세포는 NK 세포에 의해 살해되지 않았다. 마그롤리맙 (예컨대, 항-CD47 항체)을 이용한 CD47의 차단은 HLA-I/II 녹아웃, CD47 녹-인 세포의 살해를 초래하여, CD47에 의한 보호가 강조된다.
도 3은 저면역원성 T 세포의 대식세포 매개된 살해의 부재를 도시한다. 대조군 T 세포는 동종이계 대식세포에 의해 살해되지 않았고, HLA-I/II가 결여된 T 세포는 대식세포에 의해 살해되었다. HLA-I/II 녹아웃 및 CD47 녹-인 세포는 대식세포에 의해 살해되지 않았다. 마그롤리맙 (예컨대, 항-CD47 항체)으로 CD47을 차단하면 HLA-I/II 녹아웃, CD47 녹-인 세포의 살해를 초래하여, CD47에 의한 보호가 강조된다.
도 4는 예시적인 저면역원성 CAR-T 세포에서 CD19-특이적 CAR 및 CD47 작제물의 발현을 도시한다. CD19-특이적 CAR-CD47 T 세포는 외인성 CD47을 높은 수준으로 발현하였다. 본원에 사용된 바와 같이, 용어 "CD19-특이적 CAR-CD47 T 세포"는 CD19-특이적 CAR 및 CD47을 외인성으로 발현하는 T 세포를 지칭한다.
도 5a 및 5b는 생체외에서 용량-의존적 방식으로 예시적인 저면역원성 CAR-T 세포 (CD19-특이적 CAR-CD47 T 세포)에 의한 CD19+ 종양 세포의 살해를 묘사한다. CD47 과발현은 CD19-특이적 CAR 활성에 영향을 미치지 않는 것으로 보였다. CD19-특이적 CAR-CD47 T 세포는 대조군 CD19-특이적 CAR-T 세포 ("CAR 저" (도 5a) 및 "CAR 고" (도 5b) 세포)와 유사한 살해를 나타냈다.
도 6a 및 6b는 생체외에서 용량-의존적 방식으로 예시적인 저면역원성 CAR-T 세포 (예컨대, CD19-특이적 CAR-CD47 T 세포) ("CAR 저" (도 6a) 및 " CAR 고" (도 6b) 세포)에 의한 CD19+ 종양 세포의 살해를 나타내는 실시간 세포 분석 데이터를 확인하는 유동 데이터를 묘사한다. CD47 과발현은 생체외 검정에서 CD19-특이적 CAR 활성 후에 나타나지 않았다.
도 7은 FACS 분류된 예시적인 저면역원성 CAR-T 세포 (CD19-특이적 CAR-CD47 T 세포)에 의한 CD19+ 종양 세포의 살해를 나타낸다. 표적 세포:이펙터 세포 비는 1:3이었고 세포 분석을 위한 실시간 정량적 마이크로전자 바이오센서 시스템 (xCELLigence® RTCA 시스템, Agilent)을 사용하여 48 시간 동안 유세포 분석법에 의해 살해를 분석하였다. 데이터는 내인성 CD47 발현을 갖는 CD19-특이적 CAR-T 세포가 종양 세포를 살해시켰다는 것을 보여준다. 또한, 외인성 CD47 발현을 갖는 CD19-특이적 CAR-T 세포는 종양 세포를 살해시켰다. 대조군 T 세포 (모의 T 세포)는 종양 세포를 살해시키지 않았다. CD47 과발현은 생체외 검정에서 CD19-특이적 CAR 활성에 영향을 미치지 않는 것으로 보인다.
도 8은 본원에 기재된 세포의 성장, 특히 CD19-특이적 CAR-T 세포 및 CD19-특이적 CAR-CD47 T 세포의 CD47-의존적 및 CD47-비의존적 성장을 도시한다.
도 9a-b는 인간 CD19+ 종양을 갖는 마우스 모델에서 예시적인 저면역원성 CAR-T 세포의 효험을 도시한다. 전체 동물 스캔은 CD19+ 종양 세포에 대한 CD19-특이적 CAR-T 세포, CD19-특이적 CAR-CD47 T 세포 및 모의 T 세포의 효과를 보여준다.
도 10은 다양한 이펙터 대 Nalm6 표적 비에서 예시적인 저면역원성 CAR-T 세포의 효험을 도시한다.
도 11은 CD19-특이적 CAR-T 세포 및 CD19-특이적 CAR-CD47 T 세포 내로 CRISPR/Cas9 기반 유전자 편집 시스템을 도입하기 위한 뉴클레오펙션 4 일 후에 저면역원성 CD19-특이적 CAR-CD47 T 세포 및 대조군 T 세포 (CD19-특이적 CAR-EGFRt T 세포 및 모의 T 세포)에서 TRAC, B2M 및 CIITA 삼중 녹아웃의 세포 생존력 및 빈도를 묘사한다.
도 12a 및 12b는 저면역원성 CD19-특이적 CAR-CD47 T 세포 및 대조군 T 세포 (CD19-특이적 CAR-EGFRt T 세포, 티사젠렉류셀 바이오시밀러/대용 세포 및 모의 T 세포)에서 예시적인 CD19-특이적 CAR의 빈도 (도 12a) 및 MFI (도 12b)를 묘사한다.
도 13은 저면역원성 CD19-특이적 CAR-CD47 T 세포 및 대조군 T 세포 (CD19-특이적 CAR-EGFRt T 세포, 티사젠류셀 바이오시밀러/대용 세포, CD47 발현 T 세포, 및 모의 T 세포)에서 예시적인 CD19-특이적 CAR 및 CD47 분자 둘 모두의 빈도를 도시한다.
도 14는 활성화-후 8 일차에 저면역원성 CD19-특이적 CAR-CD47 T 세포 및 대조군 T 세포 (CD19-특이적 CAR-EGFRt T 세포, 티사젠렉류셀 바이오시밀러/대용 세포 및 모의 T 세포)에서의 벡터 카피 수를 묘사한다.
도 15는 세포당 항체의 유세포 분석 추정을 위한 방법 (예컨대, QuantiBRITE™, BD Biosciences)을 사용하여 저면역원성 CD19-특이적 CAR-CD47 T 세포에서의 CD47 분자의 발현을 묘사한다. 이 검정에서, 외인성 CD47 발현은 세포당 200,000 개 초과의 분자이다.
도 16a-d, 17a-d-18a-c는 TRAC, B2M 및 CIITA 유전자의 삼중 유전자 비활성화 및 CD47 단백질의 과발현의 존재가 본원에 기재된 저면역원성 CD19-특이적 CAR-CD47 T 세포에서 예시적인 CD19-특이적 CAR의 활성에 영향을 미치지 않았음을 도시한다.
도 19-22는 CD19+ 종양 세포를 갖는 마우스 모델에서 본원에 기재된 저면역원성 CD19-특이적 CAR-CD47 T 세포의 효험을 제공한다. 전체 동물 스캔은 이러한 저면역원성 CD19-특이적 CAR-T 세포에 의한 종양 세포의 살해를 보여준다. 살해 활성은 용량-의존적 방식으로 나타났다.
도 23은 0 내지 28 일의 범위에 걸쳐 다양한 이펙터:종양 세포 비에서 저면역원성 CD19-특이적 CAR-CD47 T 세포의 효험을 도시한다.
도 24는 27 일의 범위에 걸쳐 저면역원성 CD19-특이적 CAR-CD47 T 세포에 의한 종양 세포의 살해를 묘사하는 전체 동물 스캔을 도시한다. 사용된 이펙터:종양 세포 비는 7:1이었다.
도 25는 연구에 사용된 예시적인 테스트 세포 및 대조군 세포를 도시한다. 예시적인 테스트 세포는 B2M, CIITA 및 TRAC 유전자의 게놈 편집을 보유하고 CD47 분자 및 CD19-특이적 키메라 항원 수용체를 과발현하는 저면역원성 CD19-특이적 CAR-CD47 T 세포를 포함한다. 대조군 세포는 CD47 및 EGFR을 공동-발현하는 면역원성 CD19-특이적 CAR-T 세포뿐만 아니라 티사젠렉류셀 바이오시밀러 또는 대용물을 포함한다.
도 26 및 도 27은 예시적인 저면역원성 CD19-특이적 CAR-CD47 T 세포 및 CD3, B2M, HLA-DR/HLA-DP/HLA-DQ 및 HLA-A/HLA-B/HLA-C 발현의 부재의 FACS 분석을 묘사한다.
도 28은 저면역원성 CD19-특이적 CAR-CD47 T 세포에서 CD47 및 CD19-CAR의 발현에 대한 FACS 분석을 도시한다.
도 29는 저면역원성 CD19-특이적 CAR-CD47 T 세포, CD19-특이적 CAR-EGFRt T 세포 및 모의 T 세포에서 FACS 및 ICE에 의해 결정된 바와 같은 CD3, B2M, TRAC, HLA-DR/HLA-DP/HLA-DQ 및 HLA-A/HLA-B/HLA-C의 발현을 묘사한다.
도 30은 저면역원성 CD19-특이적 CAR-CD47 T 세포가 생체외에서 CD19-특이적 CAR-T 세포를 제어하는 것과 동등하게 종양 세포를 살해시킬 수 있음을 보여준다. B 세포 백혈병 살해 동역학 및 B 세포 백혈병 총 살해가 묘사된다.
도 31은 CD47 트랜스진을 발현하는 TRAC, B2M 및 CIITA 삼중 녹아웃 CAR-T 세포 (B2M-/-, CIITA-/-, TRAC-/-, tKO/CD47 CAR-T 세포로서 또는 HIP CD19-CAR-T 세포로서 또한 알려진 CD47tg CD19-특이적 CAR-T 세포)의 사이토카인-비의존적 증식을 연구하기 위한 실시예 3의 실험적 접근법의 개략도를 제공한다.
도 32a 및 도 32b는 IL-2가 보충된 배지 또는 IL-2가 보충되지 않은 배지에서 배양된 B2M-/-, CIITA-/-, TRAC-/-, CD47tg CD19-특이적 CAR-T 세포 (tKO/CD47 CAR-T 세포 또는 HIP CD19-CAR-T 세포)의 증식을 예시하는 그래프를 묘사한다.
도 33은 실시예 4의 실험적 접근법의 개략도를 제공한다.
도 34는 이종이식된 마우스에서 Nalm6-luc 종양 세포를 검출하기 위한 생체내 생물발광 이미지를 도시한다. 마우스에 tKO/CD47 CAR-T 세포 (HIP CD19-CAR-T 세포), 대조군 CAR-T 세포 (CD19-CAR-T 세포), 미편집된 T 세포 또는 식염수를 투여하였다. 생물발광 이미지는 연구의 35 일차, 42 일차, 49 일차 및 56 일차에 종양 진행을 보여준다.
도 35는 이종이식된 마우스에서 검출된 Nalm6-luc 종양 세포를 나타내는 그래프를 제공한다. Nalm6-luc 보유 마우스의 이미지는 대조군 CAR-T (CD19-CAR-T) 처리된 마우스, 미편집된 T 세포-처리된 마우스 및 식염수-처리된 마우스와 비교할 때 tKO/CD47 CAR-T 세포 (HIP CD19-CAR-T 세포) 처리된 마우스에서 지연된 종양 성장을 나타낸다.
도 36은 tKO/CD47 CAR-T 세포 또는 HIP CD19-CAR-T 세포로서 또한 지칭되는 CD19-특이적 CAR을 발현하는 B2Mindel/indel, CIITAindel/indel, TRACindel/indel, CD47tg T 세포를 생성하기 위한 실험적 접근법의 개략도를 보여준다. 이러한 세포는 CD47-CAR 렌티바이러스 형질도입된 및 유전자 편집된 T 세포 (하단 행; HIP CAR-T 세포)이다. 다이어그램은 또한 2 개의 유형의 대조군 세포의 생성을 도시한다: 미형질도입된 및 미편집된 세포 (상단 행; 미편집된 T 세포) 및 CAR-EGFRt 렌티바이러스 형질도입된 및 미편집된 세포 (중간 행; 대조군 CAR-T 세포).
도 37은 정상적인 건강한 말초 혈액으로부터 수집된 풍부한 백혈구성분채집술 생성물로부터 CD8 T 세포 및 CD4 T 세포를 단리하기 위한 예시적인 일련의 양성 면역자기 세포 선택 전략의 흐름도를 도시한다.
도 38은 도 36에서 약술된 방법에 따라 생산된 HIP CAR-T 세포 (HIP CD19-CAR-T 세포), 대조군 CAR-T 세포 (CD19-CAR-T 세포) 및 미편집된 T 세포를 특성화하는 유세포 분석 데이터의 표를 제공한다.
도 39a-d는 실시예 6의 실험적 결과를 도시한다. 도 39a-b는 Th1 (IFNg) 반응의 Elispot 분석을 도시하고, 도 39c-d는 CD19-CAR-T 세포 (도 39c) 또는 HIP CD19-CAR-T 세포 (도 39d)를 사용한 살해 검정의 결과를 도시한다.
도 40a 및 도 40b는 표 20에 기재된 예시적인 제형으로 제형화된 HIP 세포의 생존력 및 살해 효능을 도시한다. 도 40a는 제형에서 제조된 HIP 세포의 냉동-전 (빈 마커) 또는 해동-후 (고체 마커) 생존력을 나타내고, 도 40b는 제형에서 제조된 HIP 세포의 NALM-6 살해 효능을 나타낸다.
도 41a-d는 미분류된 및 분류된 T 세포에 대한 Elispot에 의해 결정된 바와 같은 Th1 (IFNg) 반응을 보여준다.
도 42a-j는 실시예 9에 기재된 연구에 대한 시간 경과에 따른 종양 부담의 정량화를 나타낸다.
도 43a-h는 실시예 9에 기재된 연구에 대한 HIP CD19-CAR-T 세포 빈도 및 혈액 내 CD47의 발현을 보여준다. 구체적으로, 도 43a-f는 중간 출혈 및 희생의 시간에 평가된 혈액 내 HIP CD19-CAR-T 세포의 빈도를 나타내고, 도 43g는 5x106 개의 HIP CD19-CAR-T 세포 및 tKO CD19-CAR-T (HIP CD19-CAR-T) 처리된 그룹으로 재챌린지된 그룹에서 108 일차에 혈액 내 CD19-CAR-T 세포의 CD47MFI를 보여준다. CAR+ 세포 빈도 데이터에 대해 수행된 Tukey의 다중 비교 테스트를 사용한 일원 ANOVA 및 혈액 CD47MFI 데이터에서 수행된 Bonferroni의 다중 비교 테스트를 사용한 이원 ANOVA.
도 44는 실시예 10에 기재된 연구에 대한 탐색적 자율 성장 검정의 세포 카운트 결과를 도시한다.
본 개시내용의 다른 목적, 이점 및 실시양태는 다음의 상세한 설명으로부터 명백할 것이다.
I. 서론
본원은 비제한적으로 인간 면역 회피 세포를 포함하는 WO2018132783에 기재된 저면역 편집 플랫폼에 부분적으로 기반한 조작된 또는 변형된 면역 회피 세포를 설명한다. 이러한 일차 및/또는 줄기 세포-유래된 이식의 대상체의 면역 거부의 문제를 극복하기 위해, 발명자들은 임의의 이식가능한 세포 유형에 대한 생존가능한 공급원을 나타내는 저면역원성 세포 (예컨대, 저면역원성 만능 세포, 이러한 세포로부터 유래된 분화된 세포, 및 일차 세포)를 개발하고 본원에 기재한다. 이러한 세포는 수용자 대상체에 대한 투여시 적응성 및/또는 선천적 면역 거부로부터 보호된다. 유리하게는, 본원에 개시된 세포는 대상체의 유전적 구성에 관계없이, 수용자 대상체에 대한 투여시 적응성 및 선천적 면역 거부로부터 보호되기 때문에, 이들은 수용자 대상체의 면역계에 의해 거부되지 않는다. 일부 실시양태에서, 조작된 및/또는 저면역원성 세포는 주요 조직적합성 복합체 (MHC) 클래스 I 및 클래스 II 항원 및/또는 T-세포 수용체를 발현하지 않는다. 특정 실시양태에서, 조작된 및/또는 저면역원성 세포는 MHC I 및 II 항원 및/또는 T-세포 수용체를 발현하지 않고 CD47 단백질을 과발현한다. 특정 실시양태에서, 조작된 및/또는 저면역원성 세포, 예컨대, 조작된 및/또는 저면역원성 T 세포는 MHC I 및 II 항원 및/또는 T-세포 수용체를 발현하지 않고, CD47 단백질을 과발현하고 외인성 CAR을 발현한다.
일부 실시양태에서, 본원에 약술된 저면역원성 세포는 선천적 면역 세포 거부에 영향을 받지 않는다. 일부 경우에, 저면역원성 세포는 NK 세포-매개된 용해에 감수성이지 않다. 일부 경우에, 저면역원성 세포는 대식세포 탐식에 감수성이지 않다. 일부 실시양태에서, 저면역원성 세포는 면역억제제가 거의 필요하지 않거나 전혀 필요하지 않은 수용자 대상체 내로 이식되는 보편적으로 적합한 세포 또는 조직 (예컨대, 보편적인 공여자 세포 또는 조직)의 공급원으로서 유용하다. 이러한 저면역원성 세포는 예컨대, 다능성을 포함하는 이식시 세포-특이적 특질 및 특징을 보유할 뿐만 아니라 생착할 수 있고 상응하는 천연 세포와 유사하게 기능한다.
본원에 개시된 기술은 관용원성 인자의 발현 및 인간 세포에서의 MHC I, MHC II 및/또는 TCR 발현의 조정 (예컨대, 감소 또는 제거)을 활용한다. 일부 실시양태에서, 희귀-절단 엔도뉴클레아제 (예컨대, CRISPR/Cas, TALEN, 징크 핑거 뉴클레아제, 메가뉴클레아제 및 귀소 엔도뉴클레아제 시스템)를 활용하는 게놈 편집 기술은 또한 세포에서 (예컨대, 면역 반응에 관여하는 유전자의 게놈 DNA를 결실시키거나 이러한 유전자 내로 게놈 DNA를 삽입하여, 유전자 발현이 영향을 받도록 함으로써) 면역 반응에 관여하는 유전자의 발현을 감소시키거나 제거하기 위해 사용된다. 일부 실시양태에서, 게놈 편집 기술 또는 다른 유전자 조정 기술은 인간 세포에 관용-유도 (관용원성) 인자를 삽입하여 세포 및 이들의 자손 (이로부터 제조된 임의의 분화된 세포 포함)이 수용자 대상체 내로 이식될 때 면역 인식을 회피할 수 있도록 하는 데 사용된다. 이와 같이, 본원에 기재된 세포는 MHC I, MHC II 및/또는 TCR 발현에 영향을 미치고 수용자 대상체의 면역계를 회피하는 하나 이상의 유전자 및 인자의 조정된 발현을 나타낸다.
게놈 편집 기술은 원하는 유전자좌 위치에서 이중-가닥 DNA 파손을 가능하게 한다. 이러한 제어된 이중-가닥 파손은 특이적 유전자좌 부위에서 상동성 재조합을 촉진한다. 이 공정은 핵산 분자, 예컨대, 염색체의 특이적 서열을, 서열을 인식하고 이에 결합하고 핵산 분자에서의 이중-가닥 파손을 유도하는 엔도뉴클레아제로 표적화하는 데 중점을 둔다. 이중-가닥 파손은 오류가 발생하기 쉬운 비-상동 단부-접합 (NHEJ) 또는 상동 재조합 (HR)에 의해 복구된다.
다수의 실시양태의 실시는 달리 구체적으로 반대로 명시하지 않는 한, 당업계의 기술 범위 내에 있는 화학, 생화학, 유기 화학, 분자 생물학, 미생물학, 재조합 DNA 기술, 유전학, 면역학 및 세포 생물학의 통상적인 방법을 사용할 것이며, 그 중 다수는 예시의 목적으로 아래에 설명되어 있다. 이러한 기술은 문헌에 충분히 설명되어 있다. 예컨대, Sambrook, 등, Molecular Cloning: A Laboratory Manual (3rd Edition, 2001); Sambrook, 등, Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2nd Edition, 1989); Maniatis 등, Molecular Cloning: A Laboratory Manual (1982); Ausubel 등, Current Protocols in Molecular Biology (John Wiley and Sons, updated July 2008); Short Protocols in Molecular Biology: A Compendium of Methods from Current Protocols in Molecular Biology, Greene Pub. Associates and Wiley-Interscience; Glover, DNA Cloning: A Practical Approach, vol. I & II (IRL Press, Oxford, 1985); Anand, Techniques for the Analysis of Complex Genomes, (Academic Press, New York, 1992); Transcription and Translation (B. Hames & S. Higgins, Eds., 1984); Perbal, A Practical Guide to Molecular Cloning (1984); Harlow and Lane, Antibodies, (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1998) Current Protocols in Immunology Q. E. Coligan, A. M. Kruisbeek, D. H. Margulies, E. M. Shevach and W. Strober, eds., 1991); Annual Review of Immunology; 뿐만 아니라 저널의 연구논문, 예컨대, Advances in Immunology 참고한다.
II. 정의
본 개시내용에 설명된 바와 같이, 다음 의용어가 사용될 것이며, 아래에 표시된 바와 같이 정의된다.
용어 "자가면역 질환"은 대상체가 자신의 조직 및/또는 세포에 대해 면역 반응을 일으키는 임의의 질환 또는 장애를 지칭한다. 자가면역 장애는 비제한적으로 피부 및 기타 결합 조직, 눈, 혈액 및 혈관뿐만 아니라 신경계, 위장계 및 내분비계의 질환을 포함하는 대상체(예를 들어, 인간)의 거의 모든 기관계에 영향을 미칠 수 있다. 자가면역 질환의 예는 하시모토 갑상선염, 전신성 홍반성 루푸스, 쇼그렌 증후군, 그레이브스병, 경피증, 류마티스 관절염, 다발성 경화증, 중증 근무력증 및 당뇨병을 포함하나, 이에 제한되지 않는다
본원에 사용된 바와 같은 용어 "암"은 고유한 특성 (예컨대, 정상 제어의 손실)이 미조절된 성장, 분화의 결여, 국소 조직 침습 및 전이를 초래하는 세포의 과증식으로서 정의된다. 본 발명의 방법과 관련하여, 암은 급성 림프구성암, 급성 골수성 백혈병, 폐포 횡문근육종, 방광암, 골암, 뇌암, 유방암, 항문의 암, 항문관 암 또는 항문직장암, 안암, 간내 담관 암, 관절의 암, 목, 담낭 또는 흉막의 암, 코, 비강 또는 중이의 암, 구강의 암, 외음부의 암, 만성 림프구성 백혈병, 만성 골수암, 결장암, 식도암, 자궁경부암, 섬유육종, 위장관 유암종, 호지킨 림프종, 하인두암, 신장암, 후두암, 백혈병, 액체 종양, 간암, 폐암, 림프종, 악성 중피종, 비만세포종, 흑색종, 다발성 골수종, 비인두암, 비-호지킨 림프종, 난소암, 췌장암, 복막, 장막 및 장간막암, 인두암, 전립선암, 직장암, 신장암, 피부암, 소장암, 연조직암, 고형 종양, 위암, 고환암, 갑상선암, 요관암 및/또는 방광암 중 임의의 것을 포함한 임의의 암일 수 있다. 본원에 사용된 바와 같이, 용어 "종양"은 구체적으로 명시되지 않는 한 악성 유형의 세포 또는 조직의 비정상적 성장을 지칭하며, 양성 유형 조직을 포함하지 않는다.
용어 "만성 감염성 질환"은 감염이 지속되는 감염원에 의해 유발되는 질환을 지칭한다. 이러한 질환은 간염 (A, B, 또는 C), 헤르페스 바이러스 (예컨대, VZV, HSV-1, HSV-6, HSV-II, CMV 및 EBV), 및 HIV/AIDS를 포함할 수 있다. 비-바이러스의 예는 만성 진균 질환, 예컨대, 아스페르길루스증, 칸디다증, 콕시디오이데스진균증, 크립토코커스 및 히스토플라스마증과 연관된 질환을 포함할 수 있다. 만성 박테리아 감염원의 비제한적인 예는 클라미디아 뉴모니아에(Chlamydia pneumoniae), 리스테리아 모노사이토게네스(Listeria monocytogenes), 및 미코박테리움 투버쿨로시스(Mycobacterium tuberculosis)일 수 있다. 일부 실시양태에서, 장애는 인간 면역결핍 바이러스 (HIV) 감염이다. 일부 실시양태에서, 장애는 후천성 면역결핍 증후군 (AIDS)이다.
본원에 사용된 바와 같이, "임상적 유효량"은 질환, 장애 또는 병태의 치료 및/또는 관리에서 임상적 이익을 제공하기에 충분한 양을 지칭한다. 일부 실시양태에서, 임상적 유효량은 질환, 장애 또는 병태에 대한 치료 표준에 대해 하나 이상의 개선된 임상적 엔드포인트를 생산하는 것으로 나타난 양이다. 일부 실시양태에서, 임상적 유효량은, 예를 들어, 임상적 시험에서 질환, 장애 또는 병태를 치료하기 위해 통계적으로 유의하고 의미 있는 효과를 제공하기에 충분한 것으로 입증된 양이다. 일부 실시양태에서, 임상적 유효량은 또한 치료적 유효량이다. 다른 실시양태에서, 임상적 유효량은 치료적 유효량이 아니다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 변경 또는 변형 (예를 들어, 유전적 변경 또는 변형 포함)은 표적 또는 선택된 폴리뉴클레오티드 서열의 감소된 발현을 초래한다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 변경 또는 변형은 표적 또는 선택된 폴리펩티드 서열의 감소된 발현을 초래한다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 변경 또는 변형은 표적 또는 선택된 폴리뉴클레오티드 서열의 증가된 발현을 초래한다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 변경 또는 변형은 표적 또는 선택된 폴리펩티드 서열의 증가된 발현을 초래한다.
추가적 또는 대안적 실시양태에서, 본 개시내용은 예컨대, TALEN 시스템 또는 RNA-가이드된 트랜스포사제를 활용하여 당업자에게 이용가능한 임의의 방식으로 표적 폴리뉴클레오티드 서열을 변경하는 것을 고려한다. CRISPR/Cas (예컨대, Cas9 및 Cas12a) 및 TALEN을 활용하는 방법의 예가 본원에서 상세히 설명되지만, 본 개시내용은 이러한 방법/시스템의 사용에 제한되지 않음을 이해해야 한다. 당업자에게 알려진 표적 세포에서의 발현을 감소시키거나 제거하기 위해 B2M과 같은 다른 표적화 방법이 본원에서 활용될 수 있다.
용어 "감소하다(decrease)", "감소된(reduced)", "감소(reduction)" 및 "감소하다(decrease)"는 모두 본원에서 통계적으로 유의한 양만큼의 감소를 의미하기 위해 일반적으로 사용된다. 그러나, 의심의 여지를 없애기 위해, 감소하다", "감소된", "감소" 및 "감소하다"는 참조 수준과 비교하여 10% 이상의 감소, 예를 들어, 참조 수준과 비교하여 약 20% 이상, 또는 약 30% 이상, 또는 약 40% 이상, 또는 약 50% 이상, 또는 약 60% 이상, 또는 약 70% 이상, 또는 약 80% 이상, 또는 약 90% 이상 또는 최대, 그리고 100% 감소 (즉, 참조 샘플과 비교하여 수준이 없음), 또는 10-100% 사이의 임의의 감소를 의미한다. 일부 실시양태에서, 세포는 미변경된 또는 미변형된 야생형 세포에 비해 하나 이상의 표적의 감소된 발현을 갖도록 조작된다.
일부 실시양태에서, 기재된 조작된 및 저면역원성 세포는 iPSC 또는 이의 자손으로부터 유래된다. 본원에 사용된 바와 같이, 용어 "iPSC 또는 이의 자손으로부터 유래된"은 생성된 초기 iPSC 및 이의 임의의 후속 자손을 포함한다. 본원에 사용된 바와 같이, 용어 "자손"은 예컨대, 1세대 자손을 포함하며, 즉, 자손은 예컨대, 전통적인 번식 방법에 의해 초기 iPSC로부터 직접 유래되거나, 수득되거나, 수득가능하거나 유래가능하다. 용어 "자손"은 또한 2세대, 3세대, 4세대, 5세대, 6세대, 7세대 또는 그 초과의 세대와 같은 추가 세대, 즉, 예컨대, 전통적인 번식 방법에 의해 이전 세대로부터 유래되거나, 수득되거나, 수득가능하거나, 유래될 수 있는 세포의 세대를 포함한다. 용어 "자손"은 또한 초기 iPSC 또는 이의 자손의 변형 또는 변경으로부터 생성된 변형된 세포를 포함한다.
용어 "공여자 대상체"는 세포가 수득될 수 있는 동물, 예를 들어, 인간을 지칭한다. 본원에서 상호교환적으로 사용된 바와 같은 "비-인간 동물" 및 "비-인간 포유류"는 포유류, 예컨대, 랫트, 마우스, 토끼, 양, 고양이, 개, 소, 돼지 및 비-인간 영장류를 포함한다. 용어 "공여자 대상체"는 또한 비제한적으로 포유류, 파충류, 양서류 및 어류를 포함하는 임의의 척추동물을 포함한다. 그러나, 유리하게는, 공여자 대상체는 포유류, 예컨대, 인간, 또는 다른 포유류, 예컨대, 길들여진 포유류, 예컨대, 개, 고양이, 및 말 등, 또는 생산 포유류, 예컨대, 소, 양 및 돼지 등이다. "공여자 대상체"는 또한 하나 초과의 공여자, 예를 들어, 하나 이상의 인간 또는 비-인간 동물 또는 비-인간 포유류를 지칭할 수 있다.
용어 "내인성"은 세포에 자연적으로 존재하는 참조 분자 또는 폴리펩티드를 지칭한다. 유사하게, 코딩 핵산의 발현과 관련하여 사용될 때 용어는 세포 내에 자연적으로 함유되고 외인성으로 도입되지 않은 코딩 핵산의 발현을 지칭한다. 유사하게, 프로모터 서열과 관련하여 사용될 때 용어는 세포 내에 자연적으로 함유되고 외인성으로 도입되지 않은 프로모터 서열을 지칭한다.
본원에 사용된 바와 같이 용어 "조작된 세포"는 예를 들어, 조작된 세포가 야생형 세포와 상이하도록 유전적 변경 또는 변형을 포함하는 인간 개입에 의해 적어도 일부 방식으로 변경된 세포를 지칭한다.
본원에 사용된 바와 같이, 발현될 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드의 맥락에서 용어 "외인성"은 참조된 분자 또는 참조된 폴리펩티드가 관심 세포 내로 도입됨을 의미하는 것으로 의도된다. 폴리펩티드는 예를 들어, 염색체 내로의 통합에 의해 또는 플라스미드 또는 발현 벡터와 같은 비-염색체 유전 물질로서 세포의 유전 물질 내로의 코딩 핵산의 도입에 의해 도입될 수 있다. 따라서, 코딩 핵산의 발현과 관련하여 사용되는 용어는 발현가능한 형태의 코딩 핵산의 세포 내로의 도입을 지칭한다. 외인성 폴리뉴클레오티드는 예를 들어, 벡터를 이용한 바이러스 형질도입을 사용하여 세포의 하나 이상의 대립유전자 내로 삽입될 수 있다. 일부 실시양태에서, 벡터는 외인성 폴리뉴클레오티드를 운반하는 슈도타이핑된 자기-비활성화 렌티바이러스 벡터이다. 일부 실시양태에서, 벡터는 수포성 구내염 VSV-G 외피로 슈도타이핑되고 외인성 폴리뉴클레오티드를 운반하는 자기-비활성화 렌티바이러스 벡터이다. 일부 실시양태에서, 외인성 폴리뉴클레오티드는 바이러스 형질도입을 사용하여 세포의 하나 이상의 대립유전자 내로 삽입된다. 일부 실시양태에서, 외인성 폴리뉴클레오티드는 렌티바이러스 기반 바이러스 벡터를 사용하여 세포의 하나 이상의 대립유전자 내로 삽입된다. 일부 실시양태에서, 외인성 폴리뉴클레오티드는 세포의 하나 이상의 대립유전자의 세이프 하버 또는 표적 유전자좌 내로 삽입된다.
"외인성" 분자는 일반적으로 세포에 존재하지 않지만 하나 이상의 유전적, 생화학적 또는 다른 방법에 의해 세포 내로 도입될 수 있는 분자, 작제물 및 인자 등이다. "세포 내 정상적인 존재"는 세포의 특정 발달 단계 및 환경 조건에 따라 결정된다. 따라서, 예를 들어, 뉴런의 배아 발달 동안에만 존재하는 분자는 성체 뉴런 세포에 대해 외인성 분자이다. 외인성 분자는 예를 들어, 오작동 내인성 분자의 기능 버전 또는 정상적으로 기능하는 내인성 분자의 오작동 버전을 포함할 수 있다.
외인성 분자 또는 인자는 무엇보다도 조합 화학 공정에 의해 생성되는 것과 같은 소분자, 또는 단백질, 핵산, 탄수화물, 지질, 당단백질, 지질단백질, 다당류, 위의 분자의 임의의 변형된 유도체, 또는 위의 분자 중 하나 이상을 포함하는 임의의 복합체일 수 있다. 핵산은 DNA 및 RNA를 포함하며, 단일- 또는 이중-가닥일 수 있고; 선형, 분지된 또는 원형일 수 있고; 임의의 길이일 수 있다. 핵산은 삼중체-형성 핵산뿐만 아니라 이중체를 형성할 수 있는 핵산을 포함한다. 예를 들어, 미국 특허 번호 5,176,996 및 5,422,251 참고한다. 단백질은 DNA-결합 단백질, 전사 인자, 염색질 리모델링 인자, 메틸화된 DNA 결합 단백질, 중합효소, 메틸라제, 데메틸라제, 아세틸라제, 데아세틸라제, 키나제, 포스파타제, 통합효소, 재조합효소, 리가제, 토포아이소머라제, 자이라제 및 헬리카제를 포함하나, 이에 제한되지 않는다.
외인성 분자 또는 작제물은 내인성 분자, 예컨대, 외인성 단백질 또는 핵산과 동일한 유형의 분자일 수 있다. 이러한 경우에, 외인성 분자는 세포 내 내인성 분자보다 더 높은 농도로 세포 내로 도입된다. 일부 경우에, 외인성 핵산은 감염 바이러스 게놈, 세포 내로 도입된 플라스미드 또는 에피좀, 또는 세포에 정상적으로 존재하지 않는 염색체를 포함할 수 있다. 외인성 분자를 세포 내로 도입하는 방법은 당업자에게 알려져 있고, 지질-매개된 전달 (즉, 중성 및 양이온성 지질을 포함하는 리포좀), 전기천공법, 직접 주사, 세포 융합, 입자 충격, 칼슘 포스페이트 공동-침전, DEAE-덱스트란-매개된 전달 및 바이러스 벡터-매개된 전달을 포함하나, 이에 제한되지 않는다.
본 개시내용의 목적을 위한 "유전자"는 이러한 조절 서열이 코딩 및/또는 전사된 서열에 인접해 있는지 여부에 관계없이, 유전자 산물을 코딩하는 DNA 영역뿐만 아니라 유전자 산물의 생산을 조절하는 모든 DNA 영역을 포함한다. 따라서, 유전자는 프로모터 서열, 종결자, 번역 조절 서열, 예컨대, 리보솜 결합 부위 및 내부 리보솜 진입 부위, 인핸서, 침묵자, 인슐레이터, 경계 요소, 복제 원점, 매트릭스 부착 부위 및/또는 유전자좌 제어 영역을 포함하나, 이에 필수적으로 제한되지 않는다.
"유전자 발현"은 유전자에 함유된 정보의 유전자 산물로의 전환을 지칭한다. 유전자 산물은 유전자 (예컨대, mRNA, tRNA, rRNA, 안티센스 RNA, 리보자임, 구조 RNA 또는 임의의 다른 유형의 RNA) 또는 mRNA의 번역에 의해 생산된 단백질의 직접 전사 산물일 수 있다. 유전자 산물은 또한 캡핑, 폴리아데닐화, 메틸화 및 편집과 같은 공정에 의해 변형되는 RNA, 및 예를 들어, 메틸화, 아세틸화, 인산화, 유비퀴틴화, ADP-리보실화, 미리스토일화 및/또는 글리코실화에 의해 변형된 단백질을 포함한다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "유전자 변형" 및 이의 문법적 등가물은 핵산, 예컨대, 유기체의 게놈 내의 핵산의 하나 이상의 변경을 지칭할 수 있다. 예를 들어, 유전자 변형은 유전자 또는 유전자의 일부 또는 다른 핵산 서열의 변경, 첨가 및/또는 결실을 지칭할 수 있다. 유전적으로 변형된 세포는 또한 유전자 또는 유전자의 일부가 첨가, 결실 및/또는 변경된 세포를 지칭할 수 있다. 유전적으로 변형된 세포는 또한 유전자 또는 유전자 부분이 아닌 핵산 서열이 첨가된 세포를 지칭할 수 있다. 유전자 변형은 예를 들어, 일시적인 녹-인 또는 녹-다운 메커니즘, 및 표적 유전자 또는 유전자 또는 핵산 서열의 일부의 영구적인 녹-인, 녹-다운 또는 녹-아웃을 초래하는 메커니즘 둘 모두를 포함한다. 유전자 변형은 예를 들어, 일시적인 녹-인 및 핵산 서열의 영구적인 녹-인을 초래하는 메커니즘 둘 모두를 포함한다. 유전자 변형은 또한 예를 들어, 감소된 또는 증가된 전사, 감소된 또는 증가된 mRNA 안정성, 감소된 또는 증가된 번역, 및 감소된 또는 증가된 단백질 안정성을 포함한다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "이식", "투여", "도입", "이식(implanting)" 및 "이식(transplanting)" 뿐만 아니라 이들의 문법적 변형은 원하는 부위에서 도입된 세포의 국소화 또는 적어도 부분적인 국소화 또는 전신 도입 (예컨대, 순환으로)를 초래하는 방법 또는 경로에 의해 세포 (예컨대, 본원에 기재된 세포)의 대상체로의 배치와 관련하여 상호교환적으로 사용된다. 세포는 원하는 부위에 직접 이식될 수 있거나, 대안적으로 이식된 세포 또는 세포의 구성요소의 적어도 일부가 생존가능한 상태로 유지되는 대상체의 원하는 위치에 대한 전달을 초래하는 임의의 적절한 경로에 의해 투여될 수 있다. 대상체에 투여한 후에 세포의 생존력의 기간은 몇 시간만큼 짧고, 예컨대, 24 시간에서 며칠에서 길게는 몇 년일 수 있다. 일부 실시양태에서, 세포는 또한 원하는 부위 이외의 위치, 예컨대, 뇌 또는 피하로, 예를 들어, 이식된 세포를 이식 위치에서 유지하고 이식된 세포의 이동을 피하기 위해 캡슐로 투여(예컨대, 주사)될 수 있다.
"HLA" 또는 "인간 백혈구 항원" 복합체는 인간의 MHC 단백질을 코딩하는 유전자 복합체이다. HLA 복합체를 구성하는 이러한 세포-표면 단백질은 항원에 대한 면역 반응의 조절을 담당한다. 인간에는, 2 개의 MHC, 클래스 I 및 클래스 II, "HLA-I" 및 "HLA-II"가 있다. HLA-I는 세포 내부로부터 펩티드를 제시하는 3 개의 단백질, HLA-A, HLA-B 및 HLA-C를 포함하며, HLA-I 복합체에 의해 제시된 항원은 킬러 T-세포 (CD8+ T-세포 또는 세포독성 T 세포로서 또한 알려짐)를 유인한다. HLA-I 단백질은 β-2 마이크로글로불린 (B2M)과 연관되어 있다. HLA-II는 HLA-DP, HLA-DM, HLA-DOB, HLA-DQ 및 HLA-DR의 5 개의 단백질을 포함하며, 이는 세포 외부에서 T 림프구로 항원을 제시한다. 이는 CD4+ 세포 (T-헬퍼 세포로서 또한 알려짐)를 자극한다. "MHC" 또는 "HLA"의 사용은 유전자가 인간 (HLA) 또는 뮤린 (MHC)으로부터 유래했는지 여부에 따라 달라지므로 제한하려는 의도가 아님을 이해해야 한다. 따라서, 포유동물 세포와 관련하여 이러한 용어는 본원에서 상호교환적으로 사용될 수 있다.
세포를 특성화하기 위해 본원에 사용된 바와 같이, 용어 "저면역원성"은 일반적으로 이러한 세포가 이식된 대상체에 의한 선천적 또는 후천적 면역 거부에 덜 취약하다는 것을 의미하며, 예컨대, 세포는 이러한 세포가 이식되는 대상체에 의한 동종이식거부 경향이 적다. 예를 들어, 변형을 포함하지 않는 동일한 세포 유형의 세포에 비해, 이러한 저면역원성 세포는 이러한 세포가 이식되는 대상체에 의한 선천적 또는 적응성 면역 거부에 약 2.5%, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 97.5%, 또는 99% 이상 덜 발생할 수 있다. 일부 실시양태에서, 게놈 편집 기술이 사용되어, MHC I 및 MHC II 유전자의 발현을 조정하고, 그에 따라 저면역원성 세포의 생성에 기여한다. 일부 실시양태에서, 저면역원성 세포는 MHC-미스매칭된 동종이계 수용자에서 면역 거부를 회피한다. 일부 경우에, 본원에 약술된 저면역원성 줄기 세포로부터 생산된 분화된 세포는 MHC-미스매칭된 동종이계 수용자에 투여(예컨대, 이식(transplanted) 또는 이식(grafted))될 때 면역 거부를 회피한다. 일부 실시양태에서, 저면역원성 세포는 T 세포-매개된 적응 면역 거부 및/또는 선천적 면역 세포 거부로부터 보호된다. 저면역원성 세포, 이의 생산 방법 및 이의 사용 방법에 대한 상세한 설명은 2015 년 5 월 9 일자로 출원된 WO2016183041; 2018 년 1 월 14 일자로 출원된 WO2018132783; 2018 년 3 월 20 일자로 출원된 WO2018176390; 2019 년 7 월 17 일자로 출원된 WO2020018615; 2019 년 7 월 17 일자로 출원된 WO2020018620; 2020 년 7 월 31 일자로 출원된 PCT/US2020/44635; 2019 년 8 월 1 일자로 출원된 US62/881,840; 2019 년 8 월 23 일자로 출원된 US62/891,180; 2020 년 4 월 27 일자로 출원된 US63/016,190; 및 2020 년 7 월 15 일자로 출원된 US63/052,360에서 발견되며, 실시예, 서열 목록 및 도면을 포함하는 개시내용은 그 전체가 본원에 참조로 원용된다.
세포의 저면역원성은 적응성 및 선천적 면역 반응을 이끌어내거나 이러한 적응성 및 선천적 면역 반응을 이끌어내는 것을 피하는 세포의 능력과 같은 세포의 면역원성을 평가함으로써 결정될 수 있다. 이러한 면역 반응은 당업자에 의해 인식되는 검정을 사용하여 측정될 수 있다. 일부 실시양태에서, 면역 반응 검정은 T 세포 증식, T 세포 활성화, T 세포 살해, 공여자 특이적 항체 생성, NK 세포 증식, NK 세포 활성화 및 대식세포 활성에 대한 저면역원성 세포의 효과를 측정한다. 일부 경우에, 저면역원성 세포 및 이의 유도체는 대상체에 대한 투여시 T 세포 및/또는 NK 세포에 의해 감소된 살해를 겪는다. 일부 경우에, 세포 및 이의 유도체는 미변형된 세포 또는 야생형 세포와 비교하여 감소된 대식세포 탐식을 나타낸다. 일부 실시양태에서, 저면역원성 세포는 상응하는 미변형된 야생형 세포와 비교하여 수용자 대상체에서 감소된 또는 저하된 면역 반응을 이끌어낸다. 일부 실시양태에서, 저면역원성 세포는 비면역원성이거나 수용자 대상체에서 면역 반응을 이끌어내지 못한다.
2 개 이상의 핵산 또는 폴리펩티드 서열의 맥락에서 용어 퍼센트 "동일성"은, 아래에 기재된 서열 비교 알고리즘 (예컨대, BLASTP 및 BLASTN 또는 당업자가 이용가능한 기타 알고리즘) 중 하나를 사용하거나 육안 검사에 의해 측정된 바와 같이, 최대 상응에 대해 비교하고 정렬될 때, 동일한 뉴클레오티드 또는 아미노산 잔기의 특정 백분율을 갖는 2 개 이상의 서열 또는 하위서열을 지칭한다. 용도에 따라, 퍼센트 "동일성"은 비교될 서열의 영역, 예컨대, 기능적 도메인에 걸쳐 존재할 수 있거나, 대안적으로, 비교될 2 개의 서열의 전체 길이에 걸쳐 존재할 수 있다. 서열 비교를 위해, 전형적으로 하나의 서열이 테스트 서열이 비교되는 참조 서열로서 역할을 한다. 서열 비교 알고리즘을 사용하는 경우, 테스트 및 참조 서열이 컴퓨터에 입력되고, 필요에 따라 하위서열 좌표가 지정되고, 서열 알고리즘 프로그램 매개변수가 지정된다. 그런 다음, 서열 비교 알고리즘은 지정된 프로그램 매개변수를 기반으로 참조 서열에 대한 테스트 서열(들)의 경우 퍼센트 서열 동일성을 계산한다.
비교를 위한 서열의 최적 정렬은 예컨대, Smith & Waterman, Adv. Appl. Math. 2:482 (1981)의 국소 상동성 알고리즘, Needleman & Wunsch, J. Mol. Biol. 48:443 (1970)의 상동성 정렬 알고리즘에 의해, Pearson & Lipman, Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 85:2444 (1988)의 유사성 탐색 방법에 의해, 이러한 알고리즘의 전산화된 구현에 의해 (Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, Wis.에서의 GAP, BESTFIT, FASTA, 및 TFASTA), 또는 육안 검사에 의해 (일반적으로 하기 Ausubel 등, 참고) 실시될 수 있다.
퍼센트 서열 동일성 및 서열 유사성을 결정하기에 적합한 알고리즘의 일 예는 Altschul 등, J. Mol. Biol. 215:403-410 (1990)에 기재되는 BLAST 알고리즘이다. BLAST 분석을 수행하기 위한 소프트웨어는 국립 생명공학 정보 센터를 통해 공개적으로 이용가능하다.
본원에 사용된 바와 같은 "면역 시그널링 인자"는 일부 경우에, 면역 시그널링 경로를 활성화시키는 분자, 단백질 및 펩티드 등을 지칭한다.
본원에 사용된 바와 같은 "면역억압 인자" 또는 "면역 조절 인자" 또는 "관용원성 인자"는 저면역 인자, 보체 억제제, 및 투여, 이식 또는 생착시 숙주 또는 수용자 대상체의 면역계에 의해 인식될 세포의 능력을 조정하거나 이에 영향을 미치는 다른 인자를 포함한다. 이들은 추가적인 유전자 변형과 조합될 수 있다.
용어 "증가하다", "증가하다" 또는 "향상시키다" 또는 "활성화하다"는 모두 일반적으로 정적으로 유의한 양의 증가를 의미하는 것으로 본원에서 사용되며; 의심의 여지를 없애기 위해 용어 "증가된", "증가하다" 또는 "향상시킨다" 또는 "활성화하다"는 참조 수준과 비교하여 10% 이상의 증가, 예를 들어, 참조 수준과 비교하여 약 20% 이상, 또는 약 30% 이상, 또는 약 40% 이상, 또는 약 50% 이상, 또는 약 60% 이상, 또는 약 70% 이상, 또는 약 80% 이상, 또는 약 90% 이상 또는 최대 그리고 100%의 증가 포함 또는 참조 수준과 비교하여 10-100% 사이의 임의의 증가, 또는 약 2-배 이상, 또는 약 3-배 이상, 또는 약 4-배 이상, 또는 약 5-배 이상 또는 약 10-배 이상의 증가, 또는 참조 수준과 비교하여 2-배 내지 10-배 또는 그 초과의 임의의 증가를 의미한다. 일부 실시양태에서, 기본 수준으로서 또한 지칭되는 참조 수준은 0이다.
일부 실시양태에서, 변경은 indel이다. 본원에 사용된 바와 같이, "indel"은 삽입, 결실 또는 이들의 조합으로 인한 돌연변이를 지칭한다. 당업자에 의해 이해될 것인 바와 같이, indel의 길이가 3의 배수가 아닌 한, 게놈 서열의 코딩 영역 내의 indel은 프레임시프트 돌연변이를 초래할 것이다. 일부 실시양태에서, 변경은 점 돌연변이이다. 본원에 사용된 바와 같이, "점 돌연변이"는 뉴클레오티드 중 하나를 대체하는 치환을 지칭한다. 본 개시내용의 유전자 편집 (예컨대, CRISPR/Cas) 시스템은 표적 폴리뉴클레오티드 서열에서 임의의 길이의 indel 또는 점 돌연변이를 유도하는 데 사용될 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, "녹다운"은 표적 mRNA 또는 상응하는 표적 단백질의 발현의 감소를 지칭한다. 녹다운은 일반적으로 RNA (예컨대, 비-표적화 제어 shRNA, siRNA 또는 miRNA)의 발현 수준의 감소를 매개하지 않는 비제어 분자의 투여 또는 발현 후 존재하는 수준과 관련하여 보고된다. 일부 실시양태에서, 표적 유전자의 녹다운은 조건부 또는 유도성 shRNA, 조건부 또는 유도성 siRNA, 조건부 또는 유도성 miRNA 또는 조건부 또는 유도성 CRISPR 간섭 (CRISPRi)을 통해 달성된다. 일부 실시양태에서, 표적 유전자의 녹다운은 조건부 또는 유도성 데그론 방법과 같은 단백질-기반 방법에 의해 달성된다. 일부 실시양태에서, 표적 유전자의 녹다운은 shRNA, siRNA, miRNA를 비롯한 유전자 변형 또는 유전자 편집 시스템 (예컨대, CRISPR/Cas)의 사용에 의해 달성된다.
녹다운은 일반적으로 정량적 중합효소 연쇄 반응 (qPCR) 증폭을 사용하여 mRNA 수준을 측정하거나, 웨스턴 블롯 또는 효소-연결된 면역흡착 검정 (ELISA)에 의해 단백질 수준을 측정함으로써 평가된다. 단백질 수준을 분석하면 mRNA 절단뿐만 아니라 번역 억제 둘 모두의 평가를 제공한다. 녹다운을 측정하기 위한 추가 기술에는 RNA 용액 혼성화, 뉴클레아제 보호, 노던 혼성화, 마이크로어레이를 사용한 유전자 발현 모니터링, 항체 결합, 방사면역검정 및 형광 활성화된 세포 분석을 포함한다. 당업자는 본원에 기재된 세부사항에 기반하여 표적 폴리뉴클레오티드 서열 또는 이의 일부를 녹아웃시키기 위해 본 개시내용의 유전자 편집 시스템 (예컨대, CRISPR/Cas)을 사용하는 방법을 용이하게 인식할 것이다.
본원에서 "녹인" 또는 "녹-인"은 숙주 세포의 염색체 유전자좌 내로 DNA 서열을 삽입함으로써 발생하는 유전자 변형을 의미한다. 이는 녹인 유전자, 유전자의 일부, 또는 핵산 서열 삽입된 산물의 발현의 개시 또는 증가된 수준, 예컨대, RNA 전사 수준 및/또는 코딩된 단백질 수준의 증가를 유발한다. 당업자에 의해 인식될 것인 바와 같이, 이는 숙주 세포에 유전자 또는 이의 일부의 하나 이상의 추가적인 카피를 삽입 또는 첨가하거나, 발현이 필요한 특이적 핵산 서열로 제조된 또는 이를 삽입한 단백질의 발현을 증가시키는 내인성 유전자의 조절 구성요소를 변경하는 것을 포함하는 여러 방식으로 달성될 수 있다. 이는 프로모터를 변형시키거나, 상이한 프로모터를 첨가하거나, 인핸서를 첨가하거나, 다른 조절 요소를 첨가하거나, 다른 유전자 발현 서열을 변형시킴으로써 달성될 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, "녹아웃" 또는 "녹-아웃"은 표적 폴리뉴클레오티드 서열의 번역 또는 기능을 방해하는 방식으로 표적 폴리뉴클레오티드 서열의 전부 또는 일부를 결실시키는 것을 포함한다. 예를 들어, 녹아웃은 표적 폴리뉴클레오티드 서열의 기능적 도메인 (예컨대, DNA 결합 도메인)을 포함하는 표적 폴리뉴클레오티드 서열에서 삽입 또는 결실 ("indel")의 유도에 의해 표적 폴리뉴클레오티드 서열을 변경함으로써 달성될 수 있다. 당업자는 본원에 기재된 세부사항에 기반하여 표적 폴리뉴클레오티드 서열 또는 이의 일부를 녹아웃시키기 위해 본 개시내용의 유전자 편집 시스템 (예컨대, CRISPR/Cas)을 사용하는 방법을 용이하게 인식할 것이다.
일부 실시양태에서, 유전자 변형 또는 변경은 표적 폴리뉴클레오티드 서열 또는 이의 일부의 녹아웃 또는 녹다운을 초래한다. 본 개시내용의 유전자 편집 시스템 (예컨대, CRISPR/Cas)을 사용하여 표적 폴리뉴클레오티드 서열 또는 이의 일부를 녹아웃시키는 것은 다양한 적용에 유용할 수 있다. 예를 들어, 세포에서 표적 폴리뉴클레오티드 서열을 녹아웃시키는 것은 연구 목적을 위해 생체외에서 수행될 수 있다. 엑스 비보 목적을 위해, 세포에서 표적 폴리뉴클레오티드 서열을 녹아웃시키는 것은 (예컨대, 엑스 비보에서 세포에서 돌연변이 대립유전자를 녹아웃하고 대상체 내로 녹아웃된 돌연변이 대립유전자를 포함하는 이들 세포를 도입함으로써) 표적 폴리뉴클레오티드 서열의 발현과 연관된 장애를 치료하거나 예방하는 데 또는 세포의 유전형 또는 표현형을 변화시키는 데 유용할 수 있다.
유전자 발현의 "조정"은 유전자의 발현 수준의 변화를 지칭한다. 발현의 조정은 유전자 활성화 및 유전자 억압을 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 조정은 또한 완전할 수 있는데, 즉 유전자 발현이 완전히 비활성화되거나 야생형 수준 이상으로 활성화되거나; 이는 유전자 발현이 부분적으로 감소되거나 야생형 수준의 일부 분획으로 부분적으로 활성화되는 부분적일 수 있다.
추가적인 또는 대안적인 양태에서, 본 개시내용은 예컨대, TAL 이펙터 뉴클레아제 (TALEN) 또는 징크 핑거 뉴클레아제 (ZFN) 시스템과 같은 뉴클레아제 시스템을 활용하여 당업자에게 이용가능한 임의의 방식으로 표적 폴리뉴클레오티드 서열을 변경하는 것을 고려한다. CRISPR/Cas (예컨대, Cas9 및 Cas12a) 및 TALEN을 활용하는 방법의 예가 본원에 상세히 설명되어 있지만, 개시내용이 이러한 방법/시스템의 사용에 제한되지 않는다는 것을 이해해야 한다. 당업자에게 알려진 표적 세포에서 발현을 감소시키거나 절제하기 위한 다른 표적화 방법이 본원에서 활용될 수 있다. 본원에 제공된 방법은 세포에서 표적 폴리뉴클레오티드 서열을 변경하는 데 사용될 수 있다. 본 개시내용은 임의의 목적을 위해 세포에서 표적 폴리뉴클레오티드 서열을 변경하는 것을 고려한다. 일부 실시양태에서, 세포 내의 표적 폴리뉴클레오티드 서열은 돌연변이 세포를 생산하도록 변경된다. 본원에 사용된 바와 같이, "돌연변이 세포"는 이의 원래 유전자형과 상이한 유전자형을 생성하는 세포를 지칭한다. 일부 경우에, "돌연변이 세포"는 예를 들어, 정상적으로 기능하는 유전자가 본 개시내용의 유전자 편집 시스템 (예컨대, CRISPR/Cas) 시스템을 사용하여 변경될 때 돌연변이 표현형을 나타낸다. 다른 경우에, "돌연변이 세포"는 예를 들어, 본 개시내용의 유전자 편집 시스템 (예컨대, CRISPR/Cas) 시스템을 사용하여 돌연변이 유전자형을 수정하는 경우 야생형 표현형을 나타낸다. 일부 실시양태에서, 세포 내의 표적 폴리뉴클레오티드 서열은 유전적 돌연변이를 수정하거나 복구하기 위해 (예컨대, 세포에 대한 정상적인 표현형을 복원하기 위해) 변경된다. 일부 실시양태에서, 세포 내의 표적 폴리뉴클레오티드 서열은 유전적 돌연변이를 유도하기 위해 (예컨대, 유전자 또는 게놈 요소의 기능을 붕괴시키기 위해) 변경된다.
본원에 사용된 바와 같이 용어 "천연 세포"는 달리 변형되지 않은 (예컨대, 조작된) 세포를 지칭한다. 일부 실시양태에서, 천연 세포는 자연 발생 야생형 또는 대조군 세포이다.
용어 "작동가능하게 연결된" 또는 "작동가능하게 연결된"은 2 개 이상의 구성요소 (예컨대, 서열 요소)의 병치와 관련하여 상호교환적으로 사용되며, 여기서 구성요소는 두 구성요소 모두가 정상적으로 기능하고, 구성요소 중 하나 이상이 다른 구성요소 중 하나 이상에 발휘되는 기능을 매개할 수 있는 가능성을 허용하도록 배열된다. 예시로서, 전사 조절 서열, 예컨대, 프로모터는 전사 조절 서열이 하나 이상의 전사 조절 인자의 존재 또는 부재에 반응하여 코딩 서열의 전사의 수준을 제어한다면 코딩 서열에 작동적으로 연결된다. 전사 조절 서열은 일반적으로 코딩 서열과 함께 시스로 작동적으로 연결되지만, 직접 이에 접할 필요는 없다. 예를 들어, 인핸서는 이들이 연속하지 않더라도 코딩 서열에 작동적으로 연결된 전사 조절 서열이다.
본원에 사용된 바와 같이 "만능 줄기 세포"는 3 개의 배엽 중 임의의 것으로 분화할 가능성을 갖는다: 내배엽 (예컨대, 위 연결, 위장관, 폐 등), 중배엽 (예컨대, 근육, 뼈, 혈액, 비뇨생식기 조직 등) 또는 외배엽 (예컨대, 표피 조직 및 신경계 조직). 본원에 사용된 바와 같이, 용어 "만능 줄기 세포"는 또한 "유도 만능 줄기 세포" 또는 "iPSC", 또는 비-만능 세포로부터 유래된 만능 줄기 세포의 유형을 포함한다. 일부 실시양태에서, 만능 줄기 세포는 만능 세포가 아닌 세포로부터 생산되거나 생성된다. 다시 말해서, 만능 줄기 세포는 비-만능 세포의 직접적 또는 간접적 자손일 수 있다. 모 세포의 예는 다양한 수단에 의해 만능 미분화 표현형을 유도하도록 재프로그래밍된 체세포를 포함한다. 이러한 "iPS" 또는 "iPSC" 세포는 특정 조절 유전자의 발현을 유도하거나 특정 단백질의 외인성 적용에 의해 생성될 수 있다. iPS 세포의 유도 방법은 당업계에 알려져 있으며 아래에 추가로 설명되어 있다. (예컨대, Zhou 등, Stem Cells 27 (11): 2667-74 (2009); Huangfu 등, Nature Biotechnol. 26 (7): 795 (2008); Woltjen 등, Nature 458 (7239): 766-770 (2009); 및 Zhou 등, Cell Stem Cell 8:381-384 (2009)를 참고하며; 이들 각각은 그 전체가 본원에 참조로 원용됨). 유도 만능 줄기 세포 (iPSCs)의 생성은 아래에 약술되어 있다. 본원에 사용된 바와 같이, "hiPSC"는 인간 유도 만능 줄기 세포이다. 일부 실시양태에서, 본원에 사용된 바와 같이, "만능 줄기 세포"는 또한 중간엽 줄기 세포 (MSC) 및/또는 배아 줄기 세포 (ESC)를 포함한다.
본원에 사용된 바와 같이, "프로모터", "프로모터 서열" 또는 "프로모터 영역"은 RNA 중합효소에 결합할 수 있고 다운스트림 코딩 또는 비-코딩 서열의 전사 개시에 관여하는 DNA 조절 영역/서열을 지칭한다. 일부 예에서, 프로모터 서열은 전사 개시 부위를 포함하고 백그라운드 위에서 검출가능한 수준에서 전사를 개시하는데 필요한 최소 수의 염기 또는 요소를 포함하도록 업스트림으로 확장된다. 일부 실시양태에서, 프로모터 서열은 RNA 중합효소의 결합을 담당하는 단백질 결합 도메인뿐만 아니라 전사 개시 부위를 포함한다. 진핵 프로모터는 종종 "TATA" 상자와 "CAT" 상자를 함유하지만 항상 그런 것은 아니다.
일부 실시양태에서, 기재된 조작된 및 저면역원성 세포는 일차 T 세포 또는 이의 자손으로부터 증식된다. 본원에 사용된 바와 같이, 용어 "일차 T 세포 또는 이의 자손으로부터 증식된"은 공여자 대상체로부터 단리된 초기 일차 T 세포 및 이의 임의의 후속 자손을 포함한다. 본원에 사용된 바와 같이, 용어 "자손"은 예를 들어, 1세대 자손을 포함하며, 즉 자손은 예를 들어, 전통적인 번식 방법에 의해 초기 일차 T 세포로부터 직접 유래되거나, 수득되거나, 수득가능하거나, 유래가능하다. 용어 "자손"은 또한 2세대, 3세대, 4세대, 5세대, 6세대, 7세대 또는 그 초과의 세대와 같은 추가 세대, 즉 예를 들어, 전통적인 번식 방법에 의해 이전 세대로부터 유래되거나, 수득되거나, 수득가능하거나, 유래가능한 세포의 세대를 포함한다. 용어 "자손"은 또한 초기 일차 T 세포 또는 이의 자손의 변형 또는 변경으로부터 생성된 변형된 세포를 포함한다.
용어 "수용자 환자"는 예방적 치료를 포함하여 본원에 기재된 세포를 이용한 치료가 제공되는 동물, 예를 들어, 인간을 지칭한다. 인간 환자와 같은 특이적 동물에 특이적인 감염, 병태 또는 질환 상태의 치료를 위해, 용어 환자는 특이적 동물을 지칭한다. 용어 "수용자 환자"는 또한 비제한적으로 포유류, 파충류, 양서류 및 어류를 포함하는 임의의 척추동물을 포함한다. 그러나, 유리하게는, 수용자 환자는 포유류, 예컨대, 인간, 또는 다른 포유류, 예컨대, 길들여진 포유류, 예컨대, 개, 고양이, 말 등, 또는 생산 포유류, 예컨대, 소, 양, 돼지 등이다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "조절 서열", "조절 요소" 및 "제어 요소"는 상호교환가능하며, 발현될 폴리뉴클레오티드 표적의 업스트림 (5' 비-코딩 서열), 내부 또는 다운스트림 (3' 비-번역된 서열)에 있는 폴리뉴클레오티드 서열을 지칭한다. 조절 서열은 예를 들어, 비제한적으로 전사의 시기, 전사의 양 또는 수준, RNA 처리 또는 안정성, 및/또는 관련된 구조적 뉴클레오티드 서열의 번역에 영향을 미친다. 조절 서열은 활성화제 결합 서열, 인핸서, 인트론, 폴리아데닐화 인식 서열, 프로모터, 억제인자 결합 서열, 스템-루프 구조, 번역 개시 서열, 번역 리더 서열, 전사 종결 서열, 번역 종결 서열, 및 프라이머 결합 부위 등을 포함할 수 있다. 대부분의 경우 조절 서열의 정확한 경계가 완전히 정의되지 않았기 때문에 상이한 길이의 뉴클레오티드 서열은 동일한 조절 또는 프로모터 활성을 가질 수 있다.
본원에 사용된 바와 같은 "세이프 하버 유전자좌"는 새로 삽입된 유전자 요소가 예측가능하게 기능할 수 있게 하고 또한 숙주 세포에 위험을 초래하는 방식으로 숙주 게놈의 변경을 유발하지 않을 수 있는 방식으로 트랜스진 또는 외인성 유전자의 발현을 허용하는 유전자 유전자좌를 지칭한다. 예시적인 "세이프 하버" 유전자좌는 CCR5 유전자, PPP1R12C (또한 AAVS1로도 알려짐) 유전자, CLYBL 유전자 및/또는 Rosa 유전자 (예컨대, ROSA26)를 포함하나, 이에 제한되지 않는다.
본원에 사용된 바와 같은 "표적 유전자좌"는 트랜스진 또는 외인성 유전자의 발현을 허용하는 유전자 유전자좌를 지칭한다. 예시적인 "표적 유전자좌"는 CXCR4 유전자, 알부민 유전자, SHS231 유전자좌, F3 유전자 (CD142로서 또한 알려짐), MICA 유전자, MICB 유전자, LRP1 유전자 (CD91로서 또한 알려짐), HMGB1 유전자, ABO 유전자, RHD 유전자, FUT1 유전자 및/또는 KDM5D 유전자 (HY로서 또한 알려짐)를 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 외인성 유전자를 코딩하는 외인성 폴리뉴클레오티드는 B2M, CIITA, TRAC, TRBC, CCR5, F3 (즉, CD142), MICA, MICB, LRP1, HMGB1, ABO, RHD, FUT1, KDM5D (즉, HY), PDGFRa, OLIG2 및/또는 GFAP에 대한 CDS 영역에서 삽입될 수 있다. 외인성 유전자를 코딩하는 외인성 폴리뉴클레오티드는 PPP1R12C (즉, AAVS1) 또는 CCR5에 대해 인트론 1 또는 2에 삽입될 수 있다. 외인성 유전자를 코딩하는 외인성 폴리뉴클레오티드는 CCR5에 대한 엑손 1 또는 2 또는 3에 삽입될 수 있다. 외인성 유전자를 코딩하는 외인성 폴리뉴클레오티드는 CLYBL에 대해 인트론 2에 삽입될 수 있다. 외인성 유전자를 코딩하는 외인성 폴리뉴클레오티드는 Ch-4:58,976,613 (즉, SHS231)에서 500 bp 윈도우에 삽입될 수 있다. 외인성 유전자를 코딩하는 외인성 폴리뉴클레오티드는 예를 들어, 인트론, 엑손 또는 세이프 하버 또는 표적 유전자좌 내의 코딩 서열 영역을 포함하는 외인성 유전자의 발현을 허용하는 전술한 세이프 하버 또는 표적 유전자좌의 임의의 적합한 영역에 삽입될 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, "표적"은 본원에 기재된 방법에 의해 조절가능하게 감소된 발현을 받는 유전자, 유전자의 일부, 게놈의 일부, 또는 단백질을 지칭할 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, "치료적 유효 용량"은 질환, 장애 또는 병태의 치료 및/또는 관리에서 치료적 이익을 제공하기에 충분한 양을 지칭한다. 일부 실시양태에서, 치료적 유효량은 질환, 장애 또는 병태, 또는 질환, 장애 또는 병태의 증상 또는 부작용의 진행을 호전, 경감, 안정화, 역전, 둔화, 약화 또는 지연시키기에 충분한 양이다. 일부 실시양태에서, 치료적 유효량은 또한 임상적 유효량이다. 다른 실시양태에서, 치료적 유효량은 임상적 유효량이 아니다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "치료하는" 및 "치료"는 본원에 기재된 세포의 치료적 또는 임상적 유효 용량을 대상체에 투여하여, 대상체가 질환의 하나 이상의 증상의 감소 또는 질환의 개선, 예를 들어, 유익하거나 원하는 치료적 또는 임상적 결과를 갖도록 하는 것을 포함한다. 이 기술의 목적을 위해, 유익하거나 원하는 치료적 또는 임상적 결과는, 검출가능 여부와 관계없이, 하나 이상의 증상의 완화, 질환의 정도의 저하, 질환의 상태의 안정화(즉, 악화되지 않음), 질환 진행의 지연 또는 둔화, 질환 상태의 호전 또는 완화, 및 관해(부분적이든 전체적이든)를 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 치료는 치료를 받지 않는 경우 예상된 생존 기간과 비교하여 생존 기간을 연장하는 것을 지칭할 수 있다. 따라서, 당업자는 치료가 질환 병태를 개선할 수 있지만 질환에 대한 완전한 치유가 아닐 수 있음을 인식한다. 일부 실시양태에서, 병태, 질환 또는 장애의 하나 이상의 증상은 병태, 질환 또는 장애의 치료시 5% 이상, 10% 이상, 20% 이상, 30% 이상, 40% 이상, 또는 50% 이상까지 완화된다.
이 기술의 목적을 위해, 유익하거나 원하는 치료적 또는 임상적 결과는, 검출가능 여부와 관계없이, 하나 이상의 증상의 완화, 질환의 정도의 저하, 질환의 상태의 안정화(즉, 악화되지 않음), 질환 진행의 지연 또는 둔화, 질환 상태의 호전 또는 완화, 및 관해 (부분적이든 전체적이든)를 포함하나, 이에 제한되지 않는다.
"벡터" 또는 "작제물"은 표적 세포에 유전자 서열을 전달할 수 있다. 전형적으로, "벡터 작제물", "발현 벡터" 및 "유전자 전달 벡터"는 관심 유전자의 발현을 지시할 수 있고 유전자 서열을 표적 세포로 전달할 수 있는 임의의 핵산 작제물을 의미한다. 따라서, 이 용어는 통합 벡터뿐만 아니라 클로닝 및 발현 비히클을 포함한다. 벡터 또는 작제물을 세포에 도입하는 방법은 당업자에게 알려져 있고, 지질-매개된 전달 (즉, 중성 및 양이온성 지질을 포함하는 리포솜), 전기천공법, 직접 주사, 세포 융합, 입자 충격, 칼슘 포스페이트 공동-침전, DEAE-덱스트란-매개된 전달 및/또는 바이러스 벡터-매개된 전달을 포함하나, 이에 제한되지 않는다.
일부 실시양태에서, 세포는 미변경된 또는 미변형된 야생형 세포에 비해 하나 이상의 표적의 감소된 또는 증가된 발현을 갖도록 조작된다. 일부 실시양태에서, 세포는 미변경된 또는 미변형된 야생형 세포에 비해 하나 이상의 표적의 구성적 감소 또는 증가된 발현을 갖도록 조작된다. 일부 실시양태에서, 세포는 미변경된 또는 미변형된 야생형 세포에 비해 하나 이상의 표적의 조절가능한 감소 또는 증가된 발현을 갖도록 조작된다. 일부 실시양태에서, 세포는 야생형 세포 또는 동일한 세포 유형의 대조군 세포에 비해 CD47의 증가된 발현을 포함한다. 세포의 맥락에서, "야생형" 또는 "wt" 또는 "대조군"은 자연에서 발견되는 임의의 세포를 의미한다. 야생형 또는 대조군 세포의 예는 자연에서 발견되는 일차 세포 및 T 세포를 포함한다. 그러나, 예로서, 조작된 세포의 맥락에서, 본원에 사용된 바와 같이, "야생형" 또는 "대조군"은 또한 MHC I 및/또는 II 및/또는 T-세포 수용체의 감소된 발현을 초래하는 핵산 변화를 함유할 수 있으나, CD47 단백질의 과발현을 초래하는 유전자 편집 절차를 거치지 않았던 조작된 세포를 의미할 수 있다. 예를 들어, 본원에 사용된 바와 같이, "야생형" 또는 "대조군"은 B2M, CIITA 및/또는 TRAC의 감소된 또는 녹아웃된 발현을 포함하는 조작된 세포를 의미한다. 또한 본원에 사용된 바와 같이, "야생형" 또는 "대조군"은 B2M, CIITA, TRAC 및/또는 TRBC의 감소된 또는 녹아웃된 발현을 포함하는 조작된 세포를 의미한다. 본원에 사용된 바와 같이, "야생형" 또는 "대조군"은 또한 CD47 단백질의 과발현을 초래하는 핵산 변화를 함유할 수 있지만 MHC I 및/또는 II 및/또는 T 세포 수용체의 발현 감소를 초래하는 유전자 편집 절차를 거치지 않았던 조작된 세포를 의미한다. iPSC 또는 이의 자손의 맥락에서, "야생형" 또는 "대조군"은 또한 다능성을 초래하는 핵산 변화를 함유할 수 있지만 MHC I 및/또는 II 및/또는 T 세포 수용체의 발현 감소 및/또는 CD47 단백질의 과발현을 달성하기 위해 본 개시내용의 유전자 편집 절차를 거치지 않았던 iPSC 또는 이의 자손을 의미한다. 예를 들어, 본원에 사용된 바와 같이, "야생형" 또는 "대조군"은 B2M, CIITA 및/또는 TRAC의 감소된 또는 녹아웃된 발현을 포함하는 iPSC 또는 이의 자손을 의미한다. 또한 본원에 사용된 바와 같이, "야생형" 또는 "대조군"은 B2M, CIITA, TRAC 및/또는 TRBC의 감소된 또는 녹아웃된 발현을 포함하는 iPSC 또는 이의 자손을 의미한다. 일차 T 세포 또는 이의 자손의 맥락에서, "야생형" 또는 "대조군"은 또한 MHC I 및/또는 II 및/또는 T-세포 수용체의 감소된 발현을 초래하는 아미노산 변화를 함유할 수 있으나, CD47 단백질의 과발현을 초래하는 유전자 편집 절차를 거치지 않았던 일차 T 세포 또는 이의 자손을 의미한다. 예를 들어, 본원에 사용된 바와 같이, "야생형" 또는 "대조군"은 B2M, CIITA 및/또는 TRAC의 감소된 또는 녹아웃된 발현을 포함하는 일차 T 세포 또는 이의 자손을 의미한다. 또한 본원에 사용된 바와 같이, "야생형" 또는 "대조군"은 B2M, CIITA, TRAC 및/또는 TRBC의 감소된 또는 녹아웃된 발현을 포함하는 일차 T 세포 또는 이의 자손을 의미한다. 또한 일차 T 세포 또는 이의 자손의 맥락에서, "야생형" 또는 "대조군"은 또한 CD47 단백질의 과발현을 초래하는 핵산 변화를 함유할 수 있으나, MHC I 및/또는 II 및/또는 T-세포 수용체의 감소된 발현을 초래하는 유전자 편집 절차를 거치지 않았던 일차 T 세포 또는 이의 자손을 의미한다. 일부 실시양태에서, 세포는 변형을 포함하지 않는 동일한 세포 유형의 세포에 비해 하나 이상의 표적의 조절 가능한 감소 또는 증가된 발현을 갖도록 조작된다. 일부 실시양태에서, 야생형 세포 또는 대조군 세포는 출발 재료이다. 일부 실시양태에서, 출발 재료는 공여자로부터 수집된 일차 세포이다. 일부 실시양태에서, 출발 재료는 예컨대, 류코팩을 통해 공여자로부터 수집된 일차 혈액 세포이다. 예를 들어, 공여자로부터 수득된 미변형된 T 세포는 본원에서 고려되는 야생형 또는 대조군 세포로 간주되는 출발 물질이다. 다른 경우에, iPSC 세포주 출발 재료는 본원에서 고려되는 바와 같이 야생형 또는 대조군 세포로 간주되는 출발 재료이다. 일부 실시양태에서, 출발 재료는 그렇지 않으면 조작된 세포를 생성하기 위해 하나 이상의 유전자의 변경된 발현을 갖도록 변형되거나 조작된다.
임의의 임의적 요소를 배제하도록 청구범위가 작성될 수 있음이 주목된다. 이와 같이, 이 진술은 청구범위 요소의 인용 또는 "부정적" 제한의 사용과 관련하여 "오직", 및 "만" 등과 같은 이러한 배타적 용어의 사용에 대한 선행 근거로서 역할을 하기 위한 것이다. 본 개시내용을 판독할 때 당업자에게 명백할 바와 같이, 본원에 설명되고 예시된 개별 실시양태 각각은 본 개시내용의 범주 또는 사상을 벗어나지 않으면서 다른 여러 실시양태 중 임의의 것의 특징과 용이하게 분리되거나 이와 조합되는 별개의 구성요소 및 특징을 갖는다. 임의의 언급된 방법은 언급된 사건의 순서 또는 논리적으로 가능한 임의의 다른 순서로 수행될 수 있다. 본원에 기재된 것들과 유사하거나 동등한 임의의 방법 및 재료가 본 개시내용의 실시 또는 테스트에서 또한 사용될 수 있지만, 이제 대표적인 예시적인 방법 및 재료가 기재된다.
달리 정의되지 않는 한, 본원에 사용된 모든 기술 및 과학 용어는 본 기술이 속하는 기술 분야의 당업자에게 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 값의 범위가 제공되는 경우, 문맥상 명확히 달리 지시하지 않는 한, 하한 단위의 10분의 1까지, 해당 범위의 상한 및 하한 사이의 각각의 개재 값 및 임의의 다른 언급된 또는 해당 언급된 범위에서의 개재 값이 본 개시내용 내에 포함됨이 이해된다. 이러한 더 작은 범위의 상한 및 하한은 독립적으로 더 작은 범위에 포함될 수 있으며 또한 본 기술 내에 포괄되며 언급된 범위에서 임의의 특별히 배제된 제한이 적용된다. 언급된 범위가 하나의 또는 둘 모두의 한계를 포함하는 경우, 포함된 하나의 또는 둘 모두의 한계를 제외한 범위도 본 기술에 포함된다. 특정 범위는 용어 "약"이 선행하는 수치 값과 함께 본원에 제시된다. 용어 "약"은 용어가 선행하는 정확한 수치뿐만 아니라 용어가 선행하는 수치에 가깝거나 근사 수치에 대한 문언적 지지를 제공하기 위해 본원에서 사용된다. 수치가 구체적으로 인용된 수치에 가깝거나 근사치인지 여부를 결정할 때, 인용되지 않은 수치에 가깝거나 근사치는 제시된 맥락에서 구체적으로 인용된 수치와 실질적으로 균등부를 제공하는 수치일 수 있다. 용어 약은 본원에서 값의 플러스 또는 마이너스 10퍼센트(10%)를 의미하는 데 사용된다. 예를 들어, "약 100"은 90에서 110 사이의 임의의 수를 지칭한다.
본 명세서에서 인용된 모든 공개물, 특허 및 특허 출원은 각각의 개별 공개물, 특허 또는 특허 출원이 참조로 포함되는 것으로 구체적이고 개별적으로 표시된 것과 동일한 정도로 본원에 참조로 포함된다. 또한, 각각의 인용된 공개물, 특허 또는 특허 출원은 공개물이 인용된 주제를 개시하고 설명하기 위해 본원에 참조로 포함된다. 임의의 공개물의 인용은 출원일 이전의 이의 개시내용에 대한 것이며 본원에 기재된 기술이 이전 기술로 인해 이러한 공개물보다 선행할 자격이 없다는 것을 인정하는 것으로 간주되어서는 안 된다. 또한 제공되는 공개일은 실제 공개일과 상이할 수 있으며, 독립적으로 확인해야 할 수 있다.
본 기술이 추가로 설명되기 전에, 이 기술이 설명된 특정 구현예에 제한되지 않으며, 물론 그 자체가 변할 수 있음이 이해되어야 한다. 또한 본 기술의 범위는 첨부된 청구범위에 의해서만 제한될 것이기 때문에 본원에 사용된 용어는 단지 특정 구현예를 설명하기 위한 것이며 제한하려는 의도가 아님이 이해되어야 한다. 본원에서 사용된 제목은 제한하는 것이 아니라 단지 독자를 지향하기 위한 것이지만 주제는 일반적으로 본원에서 개시된 기술에 적용됨이 이해되어야 한다.
III. 실시양태의 상세한 설명
A. 저면역원성 세포
일부 실시양태에서, 본 개시내용은 만능 줄기 세포 (예컨대, 만능 줄기 세포 및 유도 만능 줄기 세포 (iPSC)), 이러한 만능 줄기 세포로부터 유래된 분화된 세포 (예컨대, 비제한적으로 T 세포 및 NK 세포), 및 일차 세포 (예컨대, 비제한적으로 일차 T 세포 및 일차 NK 세포)에 관한 것이다. 일부 실시양태에서, 만능 줄기 세포, 이로부터 유래된 분화된 세포, 예컨대, T 세포 및 NK 세포, 및 일차 세포, 예컨대, 일차 T 세포 및 일차 NK 세포는 MHC 클래스 I 및/또는 또는 MHC 클래스 II 인간 백혈구 항원의 감소된 발현 또는 발현의 결여, 그리고 일부 경우에, T-세포 수용체 (TCR) 복합체의 감소된 발현 또는 발현의 결여에 대해 조작된다. 일부 실시양태에서, 저면역 (HIP) T 세포 및 일차 T 세포는 MHC 클래스 I 및/또는 MHC 클래스 II 인간 백혈구 항원의 감소된 발현 또는 발현의 결여 이외에 CD47 및 키메라 항원 수용체 (CAR)를 과발현하고, T-세포 수용체 (TCR) 복합체의 감소된 발현 또는 발현의 결여를 갖는다. 일부 실시양태에서, CAR은 CD19, CD22, CD38, CD123, CD138 및 BCMA로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나에 결합하는 항원 결합 도메인을 포함한다. 일부 실시양태에서, CAR은 CD19-특이적 CAR이다. 일부 실시양태에서, CAR은 CD22-특이적 CAR이다. 일부 경우에, CAR은 CD38-특이적 CAR이다. 일부 실시양태에서, CAR은 CD123-특이적 CAR이다. 일부 실시양태에서, CAR은 CD138-특이적 CAR이다. 일부 경우에, CAR은 BCMA-특이적 CAR이다. 일부 실시양태에서, CAR은 이중특이적 CAR이다. 일부 실시양태에서, 이중특이적 CAR은 CD19/CD22-이중특이적 CAR이다. 일부 실시양태에서, 이중특이적 CAR은 BCMA/CD38-이중특이적 CAR이다. 일부 실시양태에서, 기재된 세포는 CD19-특이적 CAR 및 상이한 CAR, 예컨대, 비제한적으로 CD22-특이적 CAR, CD38-특이적 CAR, CD123-특이적 CAR, CD138-특이적 CAR, 및 BCMA-특이적 CAR을 발현한다. 일부 실시양태에서, 기재된 세포는 CD22-특이적 CAR 및 상이한 CAR, 예컨대, 비제한적으로 CD19-특이적 CAR, CD38-특이적 CAR, CD123-특이적 CAR, CD138-특이적 CAR 및 BCMA-특이적 CAR을 발현한다. 일부 실시양태에서, 기재된 세포는 CD38-특이적 CAR 및 상이한 CAR, 예컨대, 비제한적으로 CD22-특이적 CAR, CD18-특이적 CAR, CD123-특이적 CAR, CD138-특이적 CAR, 및 BCMA-특이적 CAR을 발현한다. 일부 실시양태에서, 기재된 세포는 CD123-특이적 CAR 및 상이한 CAR, 예컨대, 비제한적으로 CD22-특이적 CAR, CD38-특이적 CAR, CD19-특이적 CAR, CD138-특이적 CAR 및 BCMA-특이적 CAR을 발현한다. 일부 실시양태에서, 기재된 세포는 CD138-특이적 CAR 및 상이한 CAR, 예컨대, 비제한적으로 CD22-특이적 CAR, CD38-특이적 CAR, CD123-특이적 CAR, CD19-특이적 CAR, 및 BCMA-특이적 CAR을 발현한다. 일부 실시양태에서, 기재된 세포는 BCMA-특이적 CAR 및 상이한 CAR, 예컨대, 비제한적으로 CD22-특이적 CAR, CD38-특이적 CAR, CD123-특이적 CAR, CD138-특이적 CAR 및 CD19-특이적 CAR을 발현한다. 일부 실시양태에서, 세포는 미변경된 또는 미변형된 야생형 세포 또는 대조군 세포를 포함하는 야생형 또는 대조군 세포와 비교하여 변형되거나 조작된다. 일부 실시양태에서, 야생형 세포 또는 대조군 세포는 출발 재료이다. 일부 실시양태에서, 출발 재료는 공여자로부터 수집된 일차 세포이다. 일부 실시양태에서, 출발 재료는 예컨대, 류코팩을 통해 공여자로부터 수집된 일차 혈액 세포이다. 일부 실시양태에서, 달리 그렇지 않으면 출발 재료는 조작된 세포를 생성하기 위해 하나 이상의 유전자의 변경된 발현을 갖도록 변형되거나 조작된다.
일부 실시양태에서, 조작된 및/또는 저면역 (HIP) T 세포 및 일차 T 세포는 CD47 및 키메라 항원 수용체 (CAR)를 과발현하고, B2M 유전자의 게놈 변형을 포함한다. 일부 실시양태에서, 조작된 및/또는 저면역 (HIP) T 세포 및 일차 T 세포는 CD47을 과발현하고, CIITA 유전자의 게놈 변형을 포함한다. 일부 실시양태에서, 조작된 및/또는 저면역 (HIP) T 세포 및 일차 T 세포는 CD47 및 CAR을 과발현하고, TRAC 유전자의 게놈 변형을 포함한다. 일부 실시양태에서, 조작된 및/또는 저면역 (HIP) T 세포 및 일차 T 세포는 CD47 및 CAR을 과발현하고, TRB 유전자의 게놈 변형을 포함한다. 일부 실시양태에서, 조작된 및/또는 저면역 (HIP) T 세포 및 일차 T 세포는 CD47 및 CAR을 과발현하고, B2M, CIITA, TRAC 및 TRB 유전자로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 게놈 변형을 포함한다. 일부 실시양태에서, 조작된 및/또는 저면역 (HIP) T 세포 및 일차 T 세포는 CD47 및 CAR을 과발현하고, B2M, CIITA, TRAC 및 TRB 유전자의 게놈 변형을 포함한다. 일부 실시양태에서, 세포는 CAR을 또한 발현하는 B2M -/-, CIITA -/-, TRAC -/-, CD47tg 세포이다. 일부 실시양태에서, 조작된 및/또는 저면역 (HIP) T 세포는 조작된 및/또는 저면역원성 유도 만능 줄기 세포와 같은 유도 만능 줄기 세포를 분화함으로써 생산된다. 일부 실시양태에서, 세포는 미변경된 또는 미변형된 야생형 세포 또는 대조군 세포를 포함하는 야생형 또는 대조군 세포와 비교하여 변형되거나 조작된다. 일부 실시양태에서, 야생형 세포 또는 대조군 세포는 출발 재료이다. 일부 실시양태에서, 출발 재료는 공여자로부터 수집된 일차 세포이다. 일부 실시양태에서, 출발 재료는 예컨대, 류코팩을 통해 공여자로부터 수집된 일차 혈액 세포이다. 일부 실시양태에서, 달리 그렇지 않으면 출발 재료는 조작된 세포를 생성하기 위해 하나 이상의 유전자의 변경된 발현을 갖도록 변형되거나 조작된다.
일부 실시양태에서, 조작된 및/또는 저면역 (HIP) T 세포 및 일차 T 세포는 CAR을 또한 발현하는 B2M -/-, CIITA -/-, TRB -/-, CD47tg 세포이다. 일부 실시양태에서, 세포는 CAR을 또한 발현하는 B2M -/-, CIITA -/-, TRAC -/- , TRB -/-, CD47tg 세포이다. 특정 실시양태에서, 세포는 CAR을 또한 발현하는 B2M indel/indel, CIITA indel/indel, TRAC indel/indel, CD47tg 세포이다. 특정 실시양태에서, 세포는 CAR을 또한 발현하는 B2M indel/indel, CIITA indel/indel, TRB indel/indel, CD47tg 세포이다. 특정 실시양태에서, 세포는 CAR을 또한 발현하는 B2M indel/indel, CIITA indel/indel, TRAC indel/indel, TRB indel/indel, CD47tg 세포이다. 일부 실시양태에서, 기재된, 조작된 또는 변형된 세포는 만능 줄기 세포, 유도 만능 줄기 세포, 이러한 만능 줄기 세포 및 유도 만능 줄기 세포로부터 분화된 NK 세포, 이러한 만능 줄기 세포 및 유도 만능 줄기 세포로부터 분화된 T 세포, 또는 일차 T 세포이다. 일차 T 세포의 비-제한적인 예는 CD3+ T 세포, CD4+ T 세포, CD8+ T 세포, 나이브 T 세포, 조절 T (Treg) 세포, 비-조절 T 세포, Th1 세포, Th2 세포, Th9 세포, Th17 세포, T-여포 헬퍼 (Tfh) 세포, 세포독성 T 림프구 (CTL), 이펙터 T (Teff) 세포, 중앙 기억 T (Tcm) 세포, 이펙터 기억 T (Tem) 세포, CD45RA를 발현하는 이펙터 기억 T 세포 (TEMRA 세포), 조직-상주 기억 (Trm) 세포, 가상 기억 T 세포, 선천적 기억 T 세포, 기억 줄기 세포 (Tsc), γδ T 세포, 및 T 세포의 임의의 기타 서브타입을 포함한다. 일부 실시양태에서, 일차 T 세포는 세포독성 T-세포, 헬퍼 T-세포, 기억 T-세포, 조절 T-세포, 종양 침윤 림프구 및 이들의 조합을 포함하는 군으로부터 선택된다. NK 세포 및 일차 NK 세포의 비-제한적인 예는 미성숙 NK 세포 및 성숙 NK 세포를 포함한다. 일부 실시양태에서, 세포는 미변경된 또는 미변형된 야생형 세포 또는 대조군 세포를 포함하는 야생형 또는 대조군 세포와 비교하여 변형되거나 조작된다. 일부 실시양태에서, 야생형 세포 또는 대조군 세포는 출발 재료이다. 일부 실시양태에서, 출발 재료는 공여자로부터 수집된 일차 세포이다. 일부 실시양태에서, 출발 재료는 예컨대, 류코팩을 통해 공여자로부터 수집된 일차 혈액 세포이다. 일부 실시양태에서, 달리 그렇지 않으면 출발 재료는 조작된 세포를 생성하기 위해 하나 이상의 유전자의 변경된 발현을 갖도록 변형되거나 조작된다.
일부 실시양태에서, 일차 T 세포는 수용자 대상체 (예컨대, 세포가 투여된 환자)와 상이한 하나 이상의 공여자 대상체로부터의 일차 T 세포의 풀로부터 유래한다. 일차 T 세포는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 50 또는 100 명 이상의 공여자 대상체로부터 수득되고, 함께 풀링될 수 있다. 일차 T 세포는 1 명 이상, 2 명 이상, 3 명 이상, 4 명 이상, 5 명 이상, 6 명 이상, 7 명 이상, 8 명 이상, 9 명 이상, 10 명 이상, 20 명 이상 또는 그 초과, 50 명 이상, 또는 100 명 이상의 공여자 대상체로부터 수득되고, 함께 풀링될 수 있다. 일부 실시양태에서, 일차 T 세포는 하나 또는 복수의 개체로부터 수확되고, 일부 경우에, 일차 T 세포 또는 일차 T 세포의 풀은 생체외에서 배양된다. 일부 실시양태에서, 일차 T 세포 또는 일차 T 세포의 풀은 CD47을 외인성으로 발현하도록 조작되고 생체외에서 배양된다.
특정 실시양태에서, 일차 T 세포 또는 일차 T 세포의 풀은 키메라 항원 수용체 (CAR)를 발현하도록 조작된다. CAR은 당업자에게 알려진 임의의 것일 수 있다. 유용한 CAR은 CD19, CD20, CD22, CD38, CD123, CD138 및 BCMA를 포함하는 군으로부터 선택된 항원에 결합하는 것들을 포함한다. 일부 경우에, CAR은 FDA-승인된 CAR-T 세포 치료제에 사용된 것들, 예컨대, 비제한적으로 티사젠렉류셀 및 악시카브타진 실로류셀 또는 임상 시험에서 조사 중인 다른 치료제에 사용되는 것들과 동일하거나 동등하다.
일부 실시양태에서, 일차 T 세포 또는 일차 T 세포의 풀은 미변형된 일차 T 세포와 비교하여 내인성 T 세포 수용체의 감소된 발현을 나타내도록 조작된다. 특정 실시양태에서, 일차 T 세포 또는 일차 T 세포의 풀은 미변형된 일차 T 세포와 비교하여 CTLA-4, PD-1, 또는 CTLA-4 및 PD-1 둘 모두의 감소된 발현을 나타내도록 조작된다. T 세포를 포함하는 세포를 유전적으로 변형시키는 방법은 예를 들어, WO2020/018620 및 WO2016/183041에 상세히 기재되어 있으며, 이들의 개시내용은 표, 부록, 서열 목록 및 도면을 포함하여 그 전체가 본원에 참조로 원용된다.
일부 실시양태에서, CAR-T 세포는 다음을 포함하는 군으로부터 선택된 CAR을 포함한다: (a) 항원 결합 도메인, 막관통 도메인 및 시그널링 도메인을 포함하는 1세대 CAR; (b) 항원 결합 도메인, 막관통 도메인 및 2 개 이상의 시그널링 도메인을 포함하는 2세대 CAR; (c) 항원 결합 도메인, 막관통 도메인 및 3 개 이상의 시그널링 도메인을 포함하는 3세대 CAR; 및 (d) 항원 결합 도메인, 막관통 도메인, 3 개 또는 4 개의 시그널링 도메인, 및 CAR의 성공적인 시그널링시 사이토카인 유전자의 발현을 유도하는 도메인을 포함하는 4세대 CAR.
일부 실시양태에서, CAR-T 세포는 항원 결합 도메인, 막관통 및 하나 이상의 시그널링 도메인을 포함하는 CAR을 포함한다. 일부 실시양태에서, CAR은 또한 링커를 포함한다. 일부 실시양태에서, CAR은 CD19 항원 결합 도메인을 포함한다. 일부 실시양태에서, CAR은 CD28 또는 CD8α 막관통 도메인을 포함한다. 일부 실시양태에서, CAR은 CD8α 신호 펩티드를 포함한다. 일부 실시양태에서, CAR은 위트로우 (Whitlow) 링커 GSTSGSGKPGSGEGSTKG (서열번호 15)를 포함한다. 일부 실시양태에서, CAR의 항원 결합 도메인은 비제한적으로 (a) 신생물 세포의 항원 특질을 표적화하는 항원 결합 도메인; (b) T 세포의 항원 특질을 표적화하는 항원 결합 도메인; (c) 자가면역 또는 염증성 장애의 항원 특질을 표적화화하는 항원 결합 도메인; (d) 노화 세포의 항원 특질을 표적화하는 항원 결합 도메인; (e) 감염성 질환의 항원 특질을 표적화하는 항원 결합 도메인; 및 (f) 세포의 세포 표면 항원에 결합하는 항원 결합 도메인을 포함하는 군으로부터 선택된다.
일부 실시양태에서, CAR은 하나 이상의 링커를 추가로 포함한다. scFv의 형식은 일반적으로 VH-링커-VL 또는 VL-링커-VH 배향으로 가요성 펩티드 서열 또는 "링커"에 의해 연결된 2 개의 가변 도메인이다. 명세서의 관점에서 당업자에게 알려진 임의의 적합한 링커가 CAR에 사용될 수 있다. 적합한 링커의 예는 GS 기반 링커 서열 및 위트로우 링커 GSTSGSGKPGSGEGSTKG (서열번호 15)를 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 일부 실시양태에서, 링커는 GS 또는 gly-ser 링커이다. 예시적인 gly-ser 폴리펩티드 링커는 아미노산 서열 Ser(Gly4Ser)n 뿐만 아니라 (Gly4Ser)n 및/또는 (Gly4Ser3)n을 포함한다. 일부 실시양태에서, n=1이다. 일부 실시양태에서, n=2이다. 일부 실시양태에서, n=3이며, 즉, Ser(Gly4Ser)3이다. 일부 실시양태에서, n=4이며, 즉 Ser(Gly4Ser)4이다. 일부 실시양태에서, n=5이다. 일부 실시양태에서, n=6이다. 일부 실시양태에서, n=7이다. 일부 실시양태에서, n=8이다. 일부 실시양태에서, n=9이다. 일부 실시양태에서, n=10이다. 다른 예시적인 gly-ser 폴리펩티드 링커는 아미노산 서열 Ser(Gly4Ser)n을 포함한다. 일부 실시양태에서, n=1이다. 일부 실시양태에서, n=2이다. 일부 실시양태에서, n=3이다. 다른 실시양태에서, n=4이다. 일부 실시양태에서, n=5이다. 일부 실시양태에서, n=6이다. 다른 예시적인 gly-ser 폴리펩티드 링커는 (Gly4Ser)n을 포함한다. 일부 실시양태에서, n=1이다. 일부 실시양태에서, n=2이다. 일부 실시양태에서, n=3이다. 일부 실시양태에서, n=4이다. 일부 실시양태에서, n=5이다. 일부 실시양태에서, n=6이다. 다른 예시적인 gly-ser 폴리펩티드 링커는 (Gly3Ser)n을 포함한다. 일부 실시양태에서, n=1이다. 일부 실시양태에서, n=2이다. 일부 실시양태에서, n=3이다. 일부 실시양태에서, n=4이다. 다른 실시양태에서, n=5이다. 또 다른 실시양태에서, n=6이다. 다른 예시적인 gly-ser 폴리펩티드 링커는 (Gly4Ser3)n을 포함한다. 일부 실시양태에서, n=1이다. 일부 실시양태에서, n=2이다. 일부 실시양태에서, n=3이다. 일부 실시양태에서, n=4이다. 일부 실시양태에서, n=5이다. 일부 실시양태에서, n=6이다. 다른 예시적인 gly-ser 폴리펩티드 링커는 (Gly3Ser)n을 포함한다. 일부 실시양태에서, n=1이다. 일부 실시양태에서, n=2이다. 일부 실시양태에서, n=3이다. 일부 실시양태에서, n=4이다. 다른 실시양태에서, n=5이다. 또 다른 실시양태에서, n=6이다.
일부 실시양태에서, 항원 결합 도메인은 항체, 항원-결합 부분 또는 이의 단편, scFv 및 Fab를 포함하는 군으로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, 항원 결합 도메인은 CD19, CD20, CD22, CD38, CD123, CD138 또는 BCMA에 결합한다. 일부 실시양태에서, 항원 결합 도메인은 항-CD19 scFv, 예컨대, 비제한적으로 FMC63이다.
일부 실시양태에서, 막관통 도메인은 TCRα, TCRβ, TCRζ, CD3ε, CD3γ, CD3δ, CD3ζ, CD4, CD5, CD8α, CD8β, CD9, CD16, CD28, CD45, CD22, CD33, CD34, CD37, CD40, CD40L/CD154, CD45, CD64, CD80, CD86, OX40/CD134, 4-1BB/CD137, CD154, FcεRIγ, VEGFR2, FAS, FGFR2B 및 이의 기능적 변이체의 막관통 영역을 포함하는 군으로부터 선택된 것을 포함한다.
일부 실시양태에서, CAR의 시그널링 도메인(들)은 공동자극 도메인(들)을 포함한다. 예를 들어, 시그널링 도메인은 보조자극 도메인을 함유할 수 있다. 또는, 시그널링 도메인은 하나 이상의 공동자극 도메인을 함유할 수 있다. 특정 실시양태에서, 시그널링 도메인은 공동자극 도메인을 포함한다. 다른 실시양태에서, 시그널링 도메인은 공동자극 도메인을 포함한다. 일부 경우에, CAR이 2 개 이상의 공동자극 도메인을 포함하는 경우, 2 개의 공동자극 도메인은 동일하지 않다. 일부 실시양태에서, 공동자극 도메인은 동일하지 않은 2 개의 공동자극 도메인을 포함한다. 일부 실시양태에서, 공동자극 도메인은 T 세포 활성화 동안 사이토카인 생산, CAR-T 세포 증식 및/또는 CAR-T 세포 지속성을 향상시킨다. 일부 실시양태에서, 공동자극 도메인은 T 세포 활성화 동안 사이토카인 생산, CAR-T 세포 증식 및/또는 CAR-T 세포 지속성을 향상시킨다.
본원에 기재된 바와 같이, 4세대 CAR은 항원 결합 도메인, 막관통 도메인, 3 개 또는 4 개의 시그널링 도메인, 및 CAR의 성공적인 시그널링시 사이토카인 유전자의 발현을 유도하는 도메인을 함유할 수 있다. 일부 경우에, 사이토카인 유전자는 저면역원성 세포의 내인성 또는 외인성 사이토카인 유전자이다. 일부 경우에, 사이토카인 유전자는 전-염증성 사이토카인을 코딩한다. 일부 실시양태에서, 전-염증성 사이토카인은 IL-1, IL-2, IL-9, IL-12, IL-18, TNF, IFN-감마 및 이의 기능적 단편을 포함하는 군으로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, CAR의 성공적인 시그널링시 사이토카인 유전자의 발현을 유도하는 도메인은 전사 인자 또는 기능적 도메인 또는 이의 단편을 포함한다.
일부 실시양태에서, CAR은 CD3 제타 (CD3ζ) 도메인 또는 면역수용체 티로신-기반 활성화 모티프 (ITAM), 또는 이의 기능적 변이체를 포함한다. 일부 실시양태에서, CAR은 (i) CD3 제타 도메인, 또는 면역수용체 티로신-기반 활성화 모티프 (ITAM), 또는 이의 기능적 변이체; 및 (ii) CD28 도메인, 또는 4-1BB 도메인, 또는 이의 기능적 변이체를 포함한다. 다른 실시양태에서, CAR은 (i) CD3 제타 도메인, 또는 면역수용체 티로신-기반 활성화 모티프 (ITAM), 또는 이의 기능적 변이체; (ii) CD28 도메인 또는 이의 기능적 변이체; 및 (iii) 4-1BB 도메인 또는 CD134 도메인 또는 이의 기능적 변이체를 포함한다. 특정 실시양태에서, CAR은 (i) CD3 제타 도메인, 또는 면역수용체 티로신-기반 활성화 모티프 (ITAM), 또는 이의 기능적 변이체; (ii) CD28 도메인 또는 이의 기능적 변이체; (iii) 4-1BB 도메인 또는 CD134 도메인 또는 이의 기능적 변이체; 및 (iv) 사이토카인 또는 공동자극 리간드 트랜스진을 포함한다. 일부 실시양태에서, CAR은 (i) 항-CD19 scFv; (ii) CD8α 힌지 및 막관통 도메인 또는 이의 기능적 변이체; (iii) 4-1BB 공동자극 도메인 또는 이의 기능적 변이체; 및 (iv) CD3ζ 시그널링 도메인 또는 이의 기능적 변이체를 포함한다.
CAR 작제물을 도입하거나 CAR-T 세포를 생산하는 방법은 당업자에게 잘 알려져 있다. 상세한 설명은 예를 들어, Vormittag 등, Curr Opin Biotechnol, 2018, 53, 162-181; and Eyquem 등, Nature, 2017, 543, 113-117에서 발견된다.
일부 실시양태에서, 일차 T 세포로부터 유래된 세포는 예를 들어, 내인성 T 세포 수용체 유전자 (예컨대, T 세포 수용체 알파 불변 영역 (TRAC) 또는 T 세포 수용체 베타 불변 영역 (TRB))의 붕괴에 의해 내인성 T 세포 수용체의 감소된 발현을 포함한다. 일부 실시양태에서, 본원에 개시된 바와 같은 폴리펩티드 (예컨대, 키메라 항원 수용체, CD47, 또는 본원에 개시된 다른 관용원성 인자)를 코딩하는 외인성 핵산은 붕괴된 T 세포 수용체 유전자에 삽입된다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드를 코딩하는 외인성 핵산은 TRAC 또는 TRB 유전자 유전좌좌에 삽입된다.
일부 실시양태에서, 일차 T 세포로부터 유래된 세포는 세포독성 T-림프구-연관된 단백질 4 (CTLA4) 및/또는 프로그래밍된 세포 사멸 (PD1)의 감소된 발현을 포함한다. CTLA4, PD1, 및 CTLA4 및 PD1 둘 모두의 발현을 감소시키거나 제거하는 방법은 당업자에게 인식되는 임의의 방법, 예컨대, 비제한적으로 희귀-절단 엔도뉴클레아제 및 RNA 침묵을 활용하는 유전자 변형 기술 또는 RNA 간섭 기술을 포함할 수 있다. 희귀-절단 엔도뉴클레아제의 비-제한적인 예는 임의의 Cas 단백질, TALEN, 징크 핑거 뉴클레아제, 메가뉴클레아제 및/또는 귀소 엔도뉴클레아제를 포함한다. 일부 실시양태에서, 본원에 개시된 바와 같은 폴리펩티드 (예컨대, 키메라 항원 수용체, CD47, 또는 본원에 개시된 다른 관용원성 인자)를 코딩하는 외인성 핵산은 CTLA4 및/또는 PD1 유전자 유전자좌에 삽입된다. 일부 실시양태에서, 세포는 미변경된 또는 미변형된 야생형 세포 또는 대조군 세포를 포함하는 야생형 또는 대조군 세포와 비교하여 변형되거나 조작된다. 일부 실시양태에서, 야생형 세포 또는 대조군 세포는 출발 재료이다. 일부 실시양태에서, 출발 재료는 공여자로부터 수집된 일차 세포이다. 일부 실시양태에서, 출발 재료는 예컨대, 류코팩을 통해 공여자로부터 수집된 일차 혈액 세포이다. 일부 실시양태에서, 달리 그렇지 않으면 출발 재료는 조작된 세포를 생성하기 위해 하나 이상의 유전자의 변경된 발현을 갖도록 변형되거나 조작된다. 일부 실시양태에서, 외인성 폴리뉴클레오티드는 예를 들어, 벡터를 이용한 바이러스 형질도입을 사용하여 세포의 하나 이상의 대립유전자 내로 삽입된다. 일부 실시양태에서, 벡터는 외인성 폴리뉴클레오티드를 운반하는 슈도타이핑된 자기-비활성화 렌티바이러스 벡터이다. 일부 실시양태에서, 벡터는 수포성 구내염 VSV-G 외피로 슈도타이핑되고 외인성 폴리뉴클레오티드를 운반하는 자기-비활성화 렌티바이러스 벡터이다. 일부 실시양태에서, 외인성 폴리뉴클레오티드는 바이러스 형질도입을 사용하여 세포의 하나 이상의 대립유전자 내로 삽입된다. 일부 실시양태에서, 외인성 폴리뉴클레오티드는 렌티바이러스 기반 바이러스 벡터를 사용하여 세포의 하나 이상의 대립유전자 내로 삽입된다.
일부 실시양태에서, CD47 트랜스진은 세포의 미리-선택된 유전자좌 내로 삽입된다. 일부 실시양태에서, CD47 트랜스진은 세포의 무작위 유전자좌 내로 삽입된다. 일부 실시양태에서, CAR을 코딩하는 트랜스진은 세포의 미리-선택된 유전자좌 내로 삽입된다. 일부 실시양태에서, CAR을 코딩하는 트랜스진은 세포의 무작위 유전자좌 내로 삽입된다. 특정 실시양태에서, CD47 트랜스진 및 CAR을 코딩하는 트랜스진은 세포의 미리-선택된 유전자좌 내로 삽입된다. 일부 실시양태에서, CAR을 코딩하는 트랜스진은 바이러스 벡터 형질도입/통합을 통해 세이프 하버 유전자좌를 포함하는 세포의 무작위 또는 미리-선택된 유전자좌 내로 삽입된다. 일부 실시양태에서, CD47 트랜스진 및 CAR을 코딩하는 트랜스진은 바이러스 벡터 형질도입/통합을 통해 세이프 하버 유전자좌를 포함하는 세포의 무작위 또는 미리-선택된 유전자좌 내로 삽입된다. 일부 실시양태에서, 벡터는 수포성 구내염 VSV-G 외피로 슈도타이핑된 자기-비활성화 렌티바이러스 벡터이다. 일부 실시양태에서, CAR을 코딩하는 트랜스진은 바이러스 형질도입을 사용하여 세포의 하나 이상의 대립유전자 내로 삽입된다. 일부 실시양태에서, 외인성 폴리뉴클레오티드는 렌티바이러스 기반 바이러스 벡터를 사용하여 세포의 하나 이상의 대립유전자 내로 삽입된다. 무작위 및/또는 미리-선택된 유전자좌는 세이프 하버 또는 표적 유전자좌일 수 있다. 세이프 하버 유전자좌의 비-제한적인 예는 CCR5 유전자 유전자좌, PPP1R12C (AAVS1로서 또한 알려짐) 유전자 유전자좌, 및 CLYBL 유전자 유전자좌, Rosa 유전자 유전자좌 (예컨대, ROSA26 유전자 유전자좌)를 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 표적 유전자좌의 비-제한적인 예는 CXCR4 유전자 유전자좌, 알부민 유전자 유전자좌, SHS231 유전자 유전자좌, F3 유전자 유전자좌 (CD142로서 또한 알려짐), MICA 유전자 유전자좌, MICB 유전자 유전자좌, LRP1 유전자 유전자좌 (CD91 유전자 유전자좌로서 또한 알려짐), HMGB1 유전자 유전자좌, ABO 유전자 유전자좌, ad RHD 유전자 유전자좌, FUT1 유전자 유전자좌 및 KDM5D 유전자 유전자좌를 포함하나, 이에 제한되지 않는다. CD47 트랜스진은 PPP1R12C (즉, AAVS1) 또는 CCR5에 대해 인트론 1 또는 2에 삽입될 수 있다. CD47 트랜스진은 CCR5에 대해 엑손 1 또는 2 또는 3에 삽입될 수 있다. CD47 트랜스진은 CLYBL에 대해 인트론 2에 삽입될 수 있다. CD47 트랜스진은 Ch-4:58,976,613 (즉, SHS231)의 500 bp 윈도우에 삽입될 수 있다. CD47 트랜스진은 예를 들어, 세이프 하버 또는 표적 유전자좌의 인트론, 엑손 또는 코딩 서열 영역을 포함하여 외인성 폴리뉴클레오티드의 발현을 허용하는 전술한 세이프 하버 또는 표적 유전자좌의 임의의 적합한 영역에 삽입될 수 있다. 일부 실시양태에서, 미리-선택된 유전자좌는 B2M 유전자좌, CIITA 유전자좌, TRAC 유전자좌 및 TRB 유전자좌로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, 미리-선택된 유전자좌는 B2M 유전자좌이다. 일부 실시양태에서, 미리-선택된 유전자좌는 CIITA 유전자좌이다. 일부 실시양태에서, 미리-선택된 유전자좌는 TRAC 유전자좌이다. 일부 실시양태에서, 미리-선택된 유전자좌는 TRB 유전자좌이다. 일부 실시양태에서, 외인성 폴리뉴클레오티드는 예를 들어, 벡터를 이용한 바이러스 형질도입을 사용하여 세포의 하나 이상의 대립유전자 내로 삽입된다. 일부 실시양태에서, 벡터는 외인성 폴리뉴클레오티드를 운반하는 슈도타이핑된 자기-비활성화 렌티바이러스 벡터이다. 일부 실시양태에서, 벡터는 수포성 구내염 VSV-G 외피로 슈도타이핑되고 외인성 폴리뉴클레오티드를 운반하는 자기-비활성화 렌티바이러스 벡터이다. 일부 실시양태에서, 외인성 폴리뉴클레오티드는 바이러스 형질도입을 사용하여 세포의 하나 이상의 대립유전자 내로 삽입된다. 일부 실시양태에서, 외인성 폴리뉴클레오티드는 렌티바이러스 기반 바이러스 벡터를 사용하여 세포의 하나 이상의 대립유전자 내로 삽입된다.
일부 실시양태에서, CD47 트랜스진 및 CAR을 코딩하는 트랜스진은 동일한 유전자좌 내로 삽입된다. 일부 실시양태에서, CD47 트랜스진 및 CAR을 코딩하는 트랜스진은 상이한 유전자좌 내로 삽입된다. 많은 경우에, CD47 트랜스진은 세이프 하버 또는 표적 유전자좌 내로 삽입된다. 많은 경우에, CAR을 코딩하는 트랜스진은 세이프 하버 또는 표적 유전자좌 내로 삽입된다. 일부 경우에, CD47 트랜스진은 B2M 유전자좌 내로 삽입된다. 일부 경우에, CAR을 코딩하는 트랜스진은 B2M 유전자좌 내로 삽입된다. 일부 경우에, CD47 트랜스진은 CIITA 유전자좌 내로 삽입된다. 특정 경우에, CAR을 코딩하는 트랜스진은 CIITA 유전자좌 내로 삽입된다. 특정한 경우에, CD47 트랜스진은 TRAC 유전자좌 내로 삽입된다. 특정한 경우에, CAR을 코딩하는 트랜스진은 TRAC 유전자좌 내로 삽입된다. 다른 많은 경우에, CD47 트랜스진은 TRB 유전자좌 내로 삽입된다. 많은 다른 경우에, CAR을 코딩하는 트랜스진은 TRB 유전자좌 내로 삽입된다. 일부 실시양태에서, CD47 트랜스진 및 CAR을 코딩하는 트랜스진은 세이프 하버 또는 표적 유전자좌 (예컨대, CCR5 유전자 유전자좌, CXCR4 유전자 유전자좌, PPP1R12C 유전자 유전자좌, 알부민 유전자 유전자좌, SHS231 유전자 유전자좌, CLYBL 유전자 유전자좌, Rosa 유전자 유전자좌, F3 (CD142) 유전자 유전자좌, MICA 유전자 유전자좌, MICB 유전자 유전자좌, LRP1 (CD91) 유전자 유전자좌, HMGB1 유전자 유전자좌, ABO 유전자 유전자좌, RHD 유전자 유전자좌 , FUT1 유전자좌 및 KDM5D 유전자 유전자좌) 내로 삽입된다.
특정 실시양태에서, CD47 트랜스진 및 CAR을 코딩하는 트랜스진은 세이프 하버 또는 표적 유전자좌 내로 삽입된다. 특정 실시양태에서, CD47 트랜스진 및 CAR을 코딩하는 트랜스진은 단일 프로모터에 의해 제어되고, 세이프 하버 또는 표적 유전자좌 내로 삽입된다. 특정 실시양태에서, CD47 트랜스진 및 CAR을 코딩하는 트랜스진은 이들 자신의 프로모터에 의해 제어되고, 세이프 하버 또는 표적 유전자좌 내로 삽입된다. 특정 실시양태에서, CD47 트랜스진 및 CAR을 코딩하는 트랜스진은 TRAC 유전자좌 내로 삽입된다. 특정 실시양태에서, CD47 트랜스진 및 CAR을 코딩하는 트랜스진은 단일 프로모터에 의해 제어되고, TRAC 유전자좌 내로 삽입된다. 특정 실시양태에서, CD47 트랜스진 및 CAR을 코딩하는 트랜스진은 이들 자신의 프로모터에 의해 제어되고, TRAC 유전자좌 내로 삽입된다. 일부 실시양태에서, CD47 트랜스진 및 CAR을 코딩하는 트랜스진은 TRB 유전자좌 내로 삽입된다. 일부 실시양태에서, CD47 트랜스진 및 CAR을 코딩하는 트랜스진은 단일 프로모터에 의해 제어되고, TRB 유전자좌 내로 삽입된다. 일부 실시양태에서, CD47 트랜스진 및 CAR을 코딩하는 트랜스진은 이들 자신의 프로모터에 의해 제어되고, TRB 유전자좌 내로 삽입된다. 다른 실시양태에서, CD47 트랜스진 및 CAR을 코딩하는 트랜스진은 B2M 유전자좌 내로 삽입된다. 다른 실시양태에서, CD47 트랜스진 및 CAR을 코딩하는 트랜스진은 단일 프로모터에 의해 제어되고, B2M 유전자좌 내로 삽입된다. 다른 실시양태에서, CD47 트랜스진 및 CAR을 코딩하는 트랜스진은 이들 자신의 프로모터에 의해 제어되고, B2M 유전자좌 내로 삽입된다. 다양한 실시양태에서, CD47 트랜스진 및 CAR을 코딩하는 트랜스진은 CIITA 유전자좌 내로 삽입된다. 다양한 실시양태에서, CD47 트랜스진 및 CAR을 코딩하는 트랜스진은 단일 프로모터에 의해 제어되고, CIITA 유전자좌 내로 삽입된다. 다양한 실시양태에서, CD47 트랜스진 및 CAR을 코딩하는 트랜스진은 이들 자신의 프로모터에 의해 제어되고, CIITA 유전자좌 내로 삽입된다. 일부 경우에, 기재된 임의의 트랜스진의 발현을 제어하는 프로모터는 구성적 프로모터이다. 다른 경우에, 기재된 임의의 트랜스진에 대한 프로모터는 유도성 프로모터이다. 일부 실시양태에서, 프로모터는 EF1α 프로모터이다. 일부 실시양태에서, 프로모터는 CAG 프로모터이다. 일부 실시양태에서, CD47 트랜스진 및 CAR을 코딩하는 트랜스진 둘 모두는 구성적 프로모터에 의해 제어된다. 일부 실시양태에서, CD47 트랜스진 및 CAR을 코딩하는 트랜스진 둘 모두는 유도성 프로모터에 의해 제어된다. 일부 실시양태에서, CD47 트랜스진은 구성적 프로모터에 의해 제어되고, CAR을 코딩하는 트랜스진은 유도성 프로모터에 의해 제어된다. 일부 실시양태에서, CD47 트랜스진은 유도성 프로모터에 의해 제어되고, CAR을 코딩하는 트랜스진은 구성적 프로모터에 의해 제어된다. 다양한 실시양태에서, CD47 트랜스진은 EF1α 프로모터에 의해 제어되고, CAR을 코딩하는 트랜스진은 EF1α 프로모터에 의해 제어된다. 일부 실시양태에서, CD47 트랜스진은 CAG 프로모터에 의해 제어되고, CAR을 코딩하는 트랜스진은 CAG 프로모터에 의해 제어된다. 일부 실시양태에서, CD47 트랜스진은 CAG 프로모터에 의해 제어되고, CAR을 코딩하는 트랜스진은 EF1α 프로모터에 의해 제어된다. 일부 실시양태에서, CD47 트랜스진은 EF1α 프로모터에 의해 제어되고, CAR을 코딩하는 트랜스진은 CAG 프로모터에 의해 제어된다. 일부 실시양태에서, CD47 트랜스진 및 CAR을 코딩하는 트랜스진 둘 모두의 발현은 단일 EF1α 프로모터에 의해 제어된다. 일부 실시양태에서, CD47 트랜스진 및 CAR을 코딩하는 트랜스진 둘 모두의 발현은 단일 CAG 프로모터에 의해 제어된다.
다른 실시양태에서, 본원에 개시된 본 개시내용은 CD47을 과발현(예컨대, CD47 단백질을 외인성으로 발현)하고 MHC 클래스 I 및/또는 MHC 클래스 II 인간 백혈구 항원의 감소된 발현 또는 발현의 결여를 갖고, T-세포 수용체 (TCR) 복합체의 감소된 발현 또는 발현의 결여를 갖는, 만능 줄기 세포 (예컨대, 만능 줄기 세포 및 유도 만능 줄기 세포 (iPSC)), 이러한 만능 줄기 세포로부터 유래된 분화된 세포 (예컨대, 저면역 (HIP) T 세포), 및 일차 T 세포에 관한 것이다. 일부 실시양태에서, 저면역 (HIP) T 세포 및 일차 T 세포는 CD47을 과발현하고 (예컨대, 외인성으로 CD47 단백질을 발현하고), MHC 클래스 I 및/또는 MHC 클래스 II 인간 백혈구 항원의 감소된 발현 또는 발현의 결여를 갖고, T-세포 수용체 (TCR) 복합체의 감소된 발현 또는 발현의 결여를 갖는다.
일부 실시양태에서, 만능 줄기 세포 (예컨대, 만능 줄기 세포 및 유도 만능 줄기 세포 (iPSC)), 이러한 만능 줄기 세포로부터 유래된 분화된 세포 (예컨대, 저면역 (HIP) T 세포), 및 일차 T 세포는 CD47을 과발현하고 B2M 유전자의 게놈 변형을 포함한다. 일부 실시양태에서, 만능 줄기 세포, 이러한 만능 줄기 세포로부터 유래된 분화된 세포 및 일차 T 세포는 CD47을 과발현하고, CIITA 유전자의 게놈 변형을 포함한다. 일부 실시양태에서, 만능 줄기 세포, 이러한 만능 줄기 세포로부터의 분화된 T 세포, 및 일차 T 세포는 CD47을 과발현하고, TRAC 유전자의 게놈 변형을 포함한다. 일부 실시양태에서, 만능 줄기 세포, 이러한 만능 줄기 세포로부터 분화된 T 세포, 및 일차 T 세포는 CD47을 과발현하고, TRB 유전자의 게놈 변형을 포함한다. 일부 실시양태에서, 만능 줄기 세포, 이러한 만능 줄기 세포로부터 분화된 T 세포, 및 일차 T 세포는 CD47을 과발현하고, B2M, CIITA, TRAC 및 TRB 유전자로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 게놈 변형을 포함한다. 일부 실시양태에서, 만능 줄기 세포, 이러한 만능 줄기 세포로부터 분화된 T 세포, 및 일차 T 세포는 CD47을 과발현하고, B2M, CIITA 및 TRAC 유전자의 게놈 변형을 포함한다. 일부 실시양태에서, 만능 줄기 세포, 이러한 만능 줄기 세포로부터 분화된 T 세포, 및 일차 T 세포는 CD47을 과발현하고, B2M, CIITA 및 TRB 유전자의 게놈 변형을 포함한다. 일부 실시양태에서, 만능 줄기 세포, 이러한 만능 줄기 세포로부터 분화된 T 세포, 및 일차 T 세포는 CD47을 과발현하고, B2M, CIITA, TRAC 및 TRB 유전자의 게놈 변형을 포함한다. 특정 실시양태에서, 만능 줄기 세포, 이러한 만능 줄기 세포로부터 유래된 분화된 세포 및 일차 T 세포는 B2M -/-, CIITA -/-, TRAC -/-, CD47tg 세포이다. 특정 실시양태에서, 세포는 B2M -/-, CIITA -/-, TRB -/-, CD47tg 세포이다. 특정 실시양태에서, 세포는 B2M -/-, CIITA -/-, TRAC -/-, TRB -/- , CD47tg 세포이다. 일부 실시양태에서, 세포는 B2M indel/indel, CIITA indel/indel, TRAC indel/indel, CD47tg 세포이다. 일부 실시양태에서, 세포는 B2M indel/indel, CIITA indel/indel, TRB indel/indel, CD47tg 세포이다. 일부 실시양태에서, 세포는 B2M indel/indel, CIITA indel/indel, TRAC indel/indel, TRB indel/indel, CD47tg 세포이다. 일부 실시양태에서, 기재된, 조작된 또는 변형된 세포는 만능 줄기 세포, 이러한 만능 줄기 세포로부터 분화된 T 세포 또는 일차 T 세포이다. 일차 T 세포의 비-제한적인 예는 CD3+ T 세포, CD4+ T 세포, CD8+ T 세포, 나이브 T 세포, 조절 T (Treg) 세포, 비-조절 T 세포, Th1 세포, Th2 세포, Th9 세포, Th17 세포, T-여포 헬퍼 (Tfh) 세포, 세포독성 T 림프구 (CTL), 이펙터 T (Teff) 세포, 중앙 기억 T (Tcm) 세포, 이펙터 기억 T (Tem) 세포, CD45RA를 발현하는 이펙터 기억 T 세포 (TEMRA 세포), 조직-상주 기억 (Trm) 세포, 가상 기억 T 세포, 선천적 기억 T 세포, 기억 줄기 세포 (Tsc), γδ T 세포, 및 T 세포의 임의의 기타 서브타입을 포함한다. 일부 실시양태에서, 세포는 미변경된 또는 미변형된 야생형 세포 또는 대조군 세포를 포함하는 야생형 또는 대조군 세포와 비교하여 변형되거나 조작된다. 일부 실시양태에서, 야생형 세포 또는 대조군 세포는 출발 재료이다. 일부 실시양태에서, 출발 재료는 공여자로부터 수집된 일차 세포이다. 일부 실시양태에서, 출발 재료는 예컨대, 류코팩을 통해 공여자로부터 수집된 일차 혈액 세포이다. 일부 실시양태에서, 달리 그렇지 않으면 출발 재료는 조작된 세포를 생성하기 위해 하나 이상의 유전자의 변경된 발현을 갖도록 변형되거나 조작된다.
일부 실시양태에서, CD47 트랜스진은 세포의 미리-선택된 유전자좌 내로 삽입된다. 미리-선택된 유전자좌는 세이프 하버 또는 표적 유전자좌일 수 있다. 세이프 하버 또는 표적 유전자좌의 비-제한적인 예는 CCR5 유전자 유전자좌, CXCR4 유전자 유전자좌, PPP1R12C 유전자 유전자좌, 알부민 유전자 유전자좌, SHS231 유전자 유전자좌, CLYBL 유전자 유전자좌, Rosa 유전자 유전자좌, F3 (CD142) 유전자 유전자좌, MICA 유전자 유전자좌, MICB 유전자 유전자좌, LRP1 (CD91) 유전자 유전자좌, HMGB1 유전자 유전자좌, ABO 유전자 유전자좌, RHD 유전자 유전자좌, FUT1 유전자좌 및 KDM5D 유전자 유전자좌를 포함한다. 일부 실시양태에서, 미리-선택된 유전자좌는 TRAC 유전자좌이다. 일부 실시양태에서, CD47 트랜스진은 세이프 하버 또는 표적 유전자좌 (예컨대, CCR5 유전자 유전자좌, CXCR4 유전자 유전자좌, PPP1R12C 유전자 유전자좌, 알부민 유전자 유전자좌, SHS231 유전자 유전자좌, CLYBL 유전자 유전자좌, Rosa 유전자 유전자좌, F3 (CD142) 유전자 유전자좌, MICA 유전자 유전자좌, MICB 유전자 유전자좌, LRP1 (CD91) 유전자 유전자좌, HMGB1 유전자 유전자좌, ABO 유전자 유전자좌, RHD 유전자 유전자좌, FUT1 유전자좌, 및 KDM5D 유전자 유전자좌) 내로 삽입된다. 특정 실시양태에서, CD47 트랜스진은 B2M 유전자좌 내로 삽입된다. 특정 실시양태에서, CD47 트랜스진은 B2M 유전자좌 내로 삽입된다. 특정 실시양태에서, CD47 트랜스진은 TRAC 유전자좌 내로 삽입된다. 특정 실시양태에서, CD47 트랜스진은 TRB 유전자좌 내로 삽입된다. 일부 실시양태에서, CD47 트랜스진은 바이러스 벡터 형질도입/통합을 통해 세이프 하버 유전자좌를 포함하여 세포의 미리-선택된 유전자좌 내로 삽입된다. 일부 실시양태에서, 벡터는 수포성 구내염 VSV-G 외피로 슈도타이핑된 자기-비활성화 렌티바이러스 벡터이다. 일부 실시양태에서, CD47 트랜스진은 바이러스 형질도입을 사용하여 세포의 하나 이상의 대립유전자 내로 삽입된다. 일부 실시양태에서, 외인성 폴리뉴클레오티드는 렌티바이러스 기반 바이러스 벡터를 사용하여 세포의 하나 이상의 대립유전자 내로 삽입된다.
일부 예에서, CD47 트랜스진의 발현은 구성적 프로모터에 의해 제어된다. 다른 경우에, CD47 트랜스진의 발현은 유도성 프로모터에 의해 제어된다. 일부 실시양태에서, 프로모터는 EF1알파 (EF1α) 프로모터이다. 일부 실시양태에서, 프로모터는 CAG 프로모터이다.
또 다른 실시양태에서, 본원에 개시된 본 개시내용은 MHC 클래스 I 및/또는 MHC 클래스 II 인간 백혈구 항원의 감소된 발현 또는 발현의 결여를 갖고 T-세포 수용체 (TCR) 복합체의 감소된 발현 또는 발현의 결여를 갖는, 만능 줄기 세포 (예컨대, 만능 줄기 세포 및 유도 만능 줄기 세포 (iPSC)), 이러한 만능 줄기 세포로부터 유래된 T 세포 (예컨대, 저면역 (HIP) T 세포) 및 일차 T 세포에 관한 것이다. 일부 실시양태에서, 세포는 MHC 클래스 I 항원, MHC 클래스 II 항원 및 TCR 복합체의 감소된 발현 또는 발현의 결여를 갖는다.
일부 실시양태에서, 만능 줄기 세포 (예컨대, iPSC), 이러한 것으로부터 유래된 분화된 세포 (예컨대, 이러한 것로부터 분화된 T 세포) 및 일차 T 세포는 B2M 유전자의 게놈 변형을 포함한다. 일부 실시양태에서, 만능 줄기 세포 (예컨대, iPSC), 이러한 것으로부터 유래된 분화된 세포 (예컨대, 이러한 것으로부터 분화된 T 세포) 및 일차 T 세포는 CIITA 유전자의 게놈 변형을 포함한다. 일부 실시양태에서, 만능 줄기 세포 (예컨대, iPSC), 이러한 것으로부터 분화된 T 세포, 및 일차 T 세포는 TRAC 유전자의 게놈 변형을 포함한다. 일부 실시양태에서, 만능 줄기 세포 (예컨대, iPSC), 이러한 것으로부터 분화된 T 세포, 및 일차 T 세포는 TRB 유전자의 게놈 변형을 포함한다. 일부 실시양태에서, 만능 줄기 세포 (예컨대, iPSC), 이러한 것으로부터 분화된 T 세포, 및 일차 T 세포는 B2M, CIITA 및 TRAC 유전자로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 게놈 변형을 포함한다. 일부 실시양태에서, 만능 줄기 세포 (예컨대, iPSC), 이러한 것으로부터 분화된 T 세포, 및 일차 T 세포는 B2M, CIITA 및 TRB 유전자로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 게놈 변형을 포함한다. 일부 실시양태에서, 만능 줄기 세포 (예컨대, iPSC), 이러한 것으로부터 분화된 T 세포, 및 일차 T 세포는 B2M, CIITA, TRAC 및 TRB 유전자로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 게놈 변형을 포함한다. 특정 실시양태에서, iPSC를 포함하는 세포, 이러한 것으로부터 분화된 T 세포, 및 일차 T 세포는 B2M -/-, CIITA -/-, TRAC -/- 세포이다. 특정 실시양태에서, iPSC를 포함하는 세포, 이러한 것으로부터 분화된 T 세포, 및 일차 T 세포는 B2M -/-, CIITA -/-, TRB -/- 세포이다. 일부 실시양태에서, iPSC를 포함하는 세포, 이러한 것으로부터 분화된 T 세포, 및 일차 T 세포는 B2M indel/indel, CIITA indel/indel, TRAC indel/indel 세포이다. 일부 실시양태에서, iPSC를 포함하는 세포, 이러한 것으로부터 분화된 T 세포, 및 일차 T 세포는 B2M indel/indel, CIITA indel/indel, TRB indel/indel 세포이다. 일부 실시양태에서, iPSC를 포함하는 세포, 이러한 것으로부터 분화된 T 세포, 및 일차 T 세포는 B2M indel/indel, CIITA indel/indel, TRAC indel/indel, TRB indel/indel 세포이다. 일부 실시양태에서, 기재된 변형된 세포는 만능 줄기 세포, 유도 만능 줄기 세포, 이러한 만능 줄기 세포 및 유도 만능 줄기 세포로부터 분화된 T 세포, 또는 일차 T 세포이다. 일차 T 세포의 비-제한적인 예는 CD3+ T 세포, CD4+ T 세포, CD8+ T 세포, 나이브 T 세포, 조절 T (Treg) 세포, 비-조절 T 세포, Th1 세포, Th2 세포, Th9 세포, Th17 세포, T-여포 헬퍼 (Tfh) 세포, 세포독성 T 림프구 (CTL), 이펙터 T (Teff) 세포, 중앙 기억 T (Tcm) 세포, 이펙터 기억 T (Tem) 세포, CD45RA를 발현하는 이펙터 기억 T 세포 (TEMRA 세포), 조직-상주 기억 (Trm) 세포, 가상 기억 T 세포, 선천적 기억 T 세포, 기억 줄기 세포 (Tsc), γδ T 세포, 및 T 세포의 임의의 기타 서브타입을 포함한다. 일부 실시양태에서, 세포는 미변경된 또는 미변형된 야생형 세포 또는 대조군 세포를 포함하는 야생형 또는 대조군 세포와 비교하여 변형되거나 조작된다. 일부 실시양태에서, 야생형 세포 또는 대조군 세포는 출발 재료이다. 일부 실시양태에서, 출발 재료는 공여자로부터 수집된 일차 세포이다. 일부 실시양태에서, 출발 재료는 예컨대, 류코팩을 통해 공여자로부터 수집된 일차 혈액 세포이다. 일부 실시양태에서, 달리 그렇지 않으면 출발 재료는 조작된 세포를 생성하기 위해 하나 이상의 유전자의 변경된 발현을 갖도록 변형되거나 조작된다.
본 개시내용의 세포는 MHC 클래스 I 항원, MHC 클래스 II 항원 및/또는 TCR 복합체의 감소된 발현 또는 발현의 결여를 나타낸다. MHC I 및/또는 MHC II 발현의 감소는 예를 들어, 다음 중 하나 이상에 의해 달성될 수 있다: (1) 다형성 HLA 대립유전자 (HLA-A, HLA-B, HLA-C) 및 MHC-II 유전자의 직접 표적화; (2) 모든 MHC-I 분자의 표면 트래피킹을 방지할 것인 B2M의 제거; (3) 모든 MHC-II 분자의 표면 트래피킹을 방지할 것인 CIITA의 제거; 및/또는 (4) HLA 발현에 중요한, MHC 인핸소좀의 구성요소, 예컨대, LRC5, RFX5, RFXANK, RFXAP, IRF1, NF-Y (NFY-A, NFY-B, NFY-C 포함) 및 CIITA의 결실.
일부 실시양태에서, HLA 발현은 개별 HLA를 표적화함으로써 (예컨대, HLA-A, HLA-B, HLA-C, HLA-DP, HLA-DQ, 및 /또는 HLA-DR를 녹아웃, 녹다운, 또는 이의 발현의 감소시킴으로써), HLA 발현의 전사 조절인자를 표적화함으로써 (예컨대, NLRC5, CIITA, RFX5, RFXAP, RFXANK, NFY-A, NFY-B, NFY-C 및/또는 IRF-1를 녹아웃, 녹다운, 또는 이의 발현의 감소시킴으로써), MHC 클래스 I 분자의 표면 트래피킹 차단함으로써 (예컨대, B2M 및/또는 TAP1를 녹아웃, 녹다운, 또는 이의 발현의 감소시킴으로써) 및/또는 HLA-Razor로 표적화함으로써 (예컨대, WO2016183041 참고) 방해된다.
일부 실시양태에서, 비제한적으로 만능 줄기 세포, 유도 만능 줄기 세포, 이러한 줄기 세포로부터 유래된 분화된 세포, 및 일차 T 세포를 포함하는 본원에 개시된 세포는 MHC-I 및/또는 MHC-II에 상응하는 하나 이상의 인간 백혈구 항원 (예컨대, HLA-A, HLA-B, HLA-C, HLA-DP, HLA-DQ, 및/또는 HLA-DR)을 발현하지 않으며, 따라서 저면역원성인 것으로서 특징지어진다. 예를 들어, 특정 실시양태에서, 개시된 만능 줄기 세포 및 유도 만능 줄기 세포는 줄기 세포 또는 이로부터 제조된 분화된 줄기 세포가 다음의 MHC-I 분자 중 하나 이상을 발현하지 않거나 이의 감소된 발현을 나타내도록 변형되었다: HLA-A, HLA-B 및 HLA-C. 일부 실시양태에서, HLA-A, HLA-B 및 HLA-C 중 하나 이상은 세포의 "녹-아웃"될 수 있다. 녹-아웃된 HLA-A 유전자, HLA-B 유전자 및/또는 HLA-C 유전자를 갖는 세포는 각각의 녹-아웃된 유전자의 감소된 또는 제거된 발현을 나타낼 수 있다.
일부 실시양태에서, HLA 유전자에서 보존된 영역을 표적화함으로써 모든 MHC 클래스 I 대립유전자의 동시 결실을 허용하는 가이드 RNA, shRNA, siRNA 또는 miRNA는 HLA Razor로서 식별된다. 일부 실시양태에서, gRNA는 CRISPR 시스템의 일부이다. 대안적인 실시양태에서, gRNA는 TALEN 시스템의 일부이다. 일부 실시양태에서, HLA에서 식별된 보존된 영역을 표적화하는 HLA Razor는 WO2016183041에 기재되어 있다. 일부 실시양태에서, 식별된 보존된 영역을 표적화하는 다중 HLA Razor가 활용된다. 일반적으로 HLA에서 보존된 영역을 표적화하는 임의의 가이드, siRNA, shRNA 또는 miRNA 분자는 HLA Razor로서 작용할 수 있음이 이해된다.
제공된 방법은 세포, 예컨대, 비제한적으로 만능 줄기 세포, 분화된 세포 및 일차 T 세포에서 MHC 클래스 I 발현 및/또는 MHC 클래스 II 발현의 비활성화 또는 절제에 유용하다. 일부 실시양태에서, 희귀-절단 엔도뉴클레아제 (예컨대, CRISPR/Cas, TALEN, 징크 핑거 뉴클레아제, 메가뉴클레아제 및 귀소 엔도뉴클레아제 시스템)를 활용하는 게놈 편집 기술은 또한 (예컨대, 면역 반응에 관여하는 유전자의 게놈 DNA를 결실시키거나 유전자 발현에 영향을 미치도록 이러한 유전자 내로 게놈 DNA를 삽입함으로써) 세포에서 면역 반응에 관여하는 유전자의 발현을 감소시키거나 제거하는 데 사용된다. 특정 실시양태에서, 게놈 편집 기술 또는 다른 유전자 조정 기술은 인간 세포에 관용-유도 인자를 삽입하여, 인간 세포 및 그로부터 제조된 분화된 세포를 저면역원성 세포로 만드는 데 사용된다. 이와 같이, 저면역원성 세포는 MHC I 및 MHC II 발현의 감소된 또는 제거된 발현을 갖는다. 일부 실시양태에서, 세포는 수용자 대상체에서 비면역원성이다 (예컨대, 선천적 및/또는 적응성 면역 반응을 유도하지 않음).
일부 실시양태에서, 세포는 CD47, 및 DUX4, CD24, CD27, CD35, CD46, CD55, CD59, CD200, HLA-C, HLA-E, HLA-E 중쇄, HLA-G, PD-L1, IDO1, CTLA4-Ig, C1-억제제, IL-10, IL-35, IL-39, FasL, CCL21, CCL22, Mfge8, CD16, CD52, H2-M3, CD16 Fc 수용체, IL15-RF 및/또는 Serpinb9로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 인자의 발현을 증가시키는 변형을 포함한다.
일부 실시양태에서, 세포는 MHC 클래스 I 분자, MHC 클래스 II 분자, 또는 MHC 클래스 I 및 MHC 클래스 II 분자의 발현을 조절하는 하나 이상의 표적 폴리뉴클레오티드 서열의 게놈 변형을 포함한다. 일부 실시양태에서, 유전자 편집 시스템은 하나 이상의 표적 폴리뉴클레오티드 서열을 변형시키는 데 사용된다. 일부 실시양태에서, 표적화된 폴리뉴클레오티드 서열은 B2M, CIITA 및 NLRC5를 포함하는 군으로부터 선택된 하나 이상이다. 일부 실시양태에서, 세포는 B2M 유전자에 대한 유전자 편집 변형을 포함한다. 일부 실시양태에서, 세포는 CIITA 유전자에 대한 유전자 편집 변형을 포함한다. 일부 실시양태에서, 세포는 NLRC5 유전자에 대한 유전적 편집 변형을 포함한다. 일부 실시양태에서, 세포는 B2M 및 CIITA 유전자에 대한 유전자 편집 변형을 포함한다. 일부 실시양태에서, 세포는 B2M 및 NLRC5 유전자에 대한 유전자 편집 변형을 포함한다. 일부 실시양태에서, 세포는 CIITA 및 NLRC5 유전자에 대한 유전자 편집 변형을 포함한다. 다수의 실시양태에서, 세포는 B2M, CIITA 및 NLRC5 유전자에 대한 유전자 편집 변형을 포함한다. 특정 실시양태에서, 세포의 게놈은 HLA 발현의 중요한 구성요소를 감소시키거나 결실하도록 변경되었다. 일부 실시양태에서, 세포는 미변경된 또는 미변형된 야생형 세포 또는 대조군 세포를 포함하는 야생형 또는 대조군 세포와 비교하여 변형되거나 조작된다. 일부 실시양태에서, 야생형 세포 또는 대조군 세포는 출발 재료이다. 일부 실시양태에서, 출발 재료는 공여자로부터 수집된 일차 세포이다. 일부 실시양태에서, 출발 재료는 예컨대, 류코팩을 통해 공여자로부터 수집된 일차 혈액 세포이다. 일부 실시양태에서, 달리 그렇지 않으면 출발 재료는 조작된 세포를 생성하기 위해 하나 이상의 유전자의 변경된 발현을 갖도록 변형되거나 조작된다.
일부 실시양태에서, 본 개시내용은 유전자가 편집되어 게놈 DNA의 연속 스트레치를 결실시켜, 그에 의해 세포 또는 이의 집단에서 MHC 클래스 I 분자의 표면 발현을 감소 또는 제거하는 게놈을 포함하는 세포 (예컨대, 줄기 세포, 유도 만능 줄기 세포, 분화된 세포, 예컨대, 일차 NK 세포, CAR-NK 세포, 일차 T 세포 또는 CAR-T 세포) 또는 이의 집단을 제공한다. 특정 실시양태에서, 본 개시내용은 유전자가 편집되어 게놈 DNA의 연속 스트레치를 결실시켜, 그에 의해 세포 또는 이의 집단에서 MHC 클래스 II 분자의 표면 발현을 감소 또는 제거하는 게놈을 포함하는 세포 (예컨대, 줄기 세포, 유도 만능 줄기 세포, 분화된 세포, 예컨대, 일차 NK 세포, CAR-NK 세포, 일차 T 세포 또는 CAR-T 세포) 또는 이의 집단을 제공한다. 다수의 실시양태에서, 본 개시내용은 하나 이상의 유전자가 편집되어 게놈 DNA의 연속 스트레치를 결실시켜, 그에 의해 세포 또는 이의 집단에서 MHC 클래스 I 및 II 분자의 표면 발현을 감소 또는 제거하는 게놈을 포함하는 세포 (예컨대, 줄기 세포, 유도 만능 줄기 세포, 분화된 세포, 조혈 줄기 세포, 일차 T 세포 또는 CAR-T 세포) 또는 이의 집단을 제공한다.
특정 실시양태에서, MHC I 분자 및/또는 MHC II 분자의 발현은 게놈 DNA의 연속 스트레치를 표적화 및 결실시켜, 그에 의해 B2M, CIITA 및 NLRC5로 이루어진 군으로부터 선택된 표적 유전자의 발현을 감소 또는 제거함으로써 조정된다. 일부 실시양태에서, 본원은 외인성 CD47 단백질 및 비활성화된 또는 변형된 CIITA 유전자 서열, 그리고 일부 경우에, B2M 유전자 서열을 비활성화시키거나 변형시키는 추가적인 유전자 변형을 포함하는 유전적으로 편집된 세포 (예컨대, 변형된 인간 세포)를 설명한다. 일부 실시양태에서, 본원은 외인성 CD47 단백질 및 비활성화된 또는 변형된 CIITA 유전자 서열, 그리고 일부 경우에, NLRC5 유전자 서열을 비활성화시키거나 변형시키는 추가적인 유전자 변형을 포함하는 유전적으로 편집된 세포를 설명한다. 일부 실시양태에서, 본원은 외인성 CD47 단백질 및 비활성화된 또는 변형된 B2M 유전자 서열, 그리고 일부 경우에, NLRC5 유전자 서열을 비활성화시키거나 변형시키는 추가적인 유전자 변형을 포함하는 유전적으로 편집된 세포를 설명한다. 일부 실시양태에서, 외인성 CD47 단백질 및 비활성화된 또는 변형된 B2M 유전자 서열, 그리고 일부 경우에 CIITA 유전자 서열 및 NLRC5 유전자 서열을 비활성화시키거나 변형시키는 추가적인 유전자 변형을 포함하는 유전적으로 편집된 세포를 설명한다.
본원은 다음 중 어느 하나의 발현을 조절하는 하나 이상의 표적화된 폴리뉴클레오티드 서열의 변형을 나타내는 세포를 제공한다: (a) MHC I 항원, (b) MHC II 항원, (c) TCR 복합체, (d) MHC I 및 II 항원 둘 모두, 및 (e) MHC I 및 II 항원 및 TCR 복합체. 특정 실시양태에서, 변형은 CD47의 발현 증가를 포함한다. 일부 실시양태에서, 세포는 외인성 또는 재조합 CD47 폴리펩티드를 포함한다. 특정 실시양태에서, 변형은 키메라 항원 수용체의 발현을 포함한다. 일부 실시양태에서, 세포는 외인성 또는 재조합 키메라 항원 수용체 폴리펩티드를 포함한다.
일부 실시양태에서, 세포는 MHC I 항원, MHC II 항원 및/또는 TCR 복합체의 발현을 조절하는 하나 이상의 표적화된 폴리뉴클레오티드 서열의 게놈 변형을 포함한다. 일부 실시양태에서, 유전자 편집 시스템은 하나 이상의 표적화된 폴리뉴클레오티드 서열을 변형시키기 위해 사용된다. 일부 실시양태에서, 폴리뉴클레오티드 서열은 B2M, CIITA, TRAC 및 TRB로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 유전자를 표적화한다. 특정 실시양태에서, T 세포의 게놈 (예컨대, 저면역원성 iPSC로부터 분화된 T 세포 및 일차 T 세포)은 HLA 및 TCR 발현의 중요한 구성요소, 예컨대, HLA-A 항원, HLA-B 항원, HLA-C 항원, HLA-DP 항원, HLA-DQ 항원, HLA-DR 항원, TCR-알파 및 TCR-베타를 감소시키거나 결실시키도록 변경되었다.
일부 실시양태에서, 본 개시내용은 유전자가 편집되어 게놈 DNA의 연속 스트레치를 결실시켜, 그에 의해 세포 또는 이의 집단에서 MHC 클래스 I 분자의 표면 발현을 감소 또는 제거하는 게놈을 포함하는 세포 또는 이의 집단을 제공한다. 특정 실시양태에서, 본 개시내용은 유전자가 편집되어 게놈 DNA의 연속 스트레치를 결실시켜, 그에 의해 세포 또는 이의 집단에서 MHC 클래스 II 분자의 표면 발현을 감소 또는 제거하는 게놈을 포함하는 세포 또는 이의 집단을 제공한다. 특정 실시양태에서, 본 개시내용은 유전자가 편집되어 게놈 DNA의 연속 스트레치를 결실시켜, 그에 의해 세포 또는 이의 집단에서 TCR 분자의 표면 발현을 감소 또는 제거하는 게놈을 포함하는 세포 또는 이의 집단을 제공한다. 다수의 실시양태에서, 본 개시내용은 하나 이상의 유전자가 편집되어 게놈 DNA의 연속 스트레치를 결실시켜, 그에 의해 세포 또는 이의 집단에서 MHC 클래스 I 및 II 분자 및 TCR 복합체의 표면 발현을 감소 또는 제거하는 게놈을 포함하는 세포 또는 이의 집단을 제공한다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 세포 및 방법은 CIITA 유전자 서열을 절단하기 위해 인간 세포를 게놈적으로 편집하는 것뿐만 아니라 하나 이상의 추가적인 표적 폴리뉴클레오티드 서열, 예컨대, 비제한적으로 B2M TRAC 및 TRB를 변경시키기 위해 이러한 세포의 게놈을 편집하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 세포 및 방법은 B2M 유전자 서열을 절단하기 위해 인간 세포를 게놈적으로 편집하는 것뿐만 아니라 하나 이상의 추가적인 표적 폴리뉴클레오티드 서열, 예컨대, 비제한적으로 CIITA, TRAC 및 TRB를 변경시키기 위해 이러한 세포의 게놈을 편집하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 세포 및 방법은 TRAC 유전자 서열을 절단하기 위해 인간 세포를 게놈적으로 편집하는 것뿐만 아니라 하나 이상의 추가적인 표적 폴리뉴클레오티드 서열, 예컨대, 비제한적으로 B2M, CIITA 및 TRB를 변경시키기 위해 이러한 세포의 게놈을 편집하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 세포 및 방법은 TRB 유전자 서열을 절단하기 위해 인간 세포를 게놈적으로 편집하는 것뿐만 아니라 하나 이상의 추가적인 표적 폴리뉴클레오티드 서열, 예컨대, 비제한적으로 B2M, CIITA 및 TRAC를 변경시키기 위해 이러한 세포의 게놈을 편집하는 것을 포함한다.
본원은 야생형 줄기 세포에 비해 HLA-A, HLA-B, HLA-C, HLA-DP, HLA-DQ, HLA-DR, B2M, CIITA, TCR-알파 및 TCR-베타의 감소된 발현을 포함하는 저면역원성 줄기 세포를 제공하며, 저면역원성 줄기 세포는 CD47을 코딩하는 제1 외인성 폴리뉴클레오티드 및 키메라 항원 수용체 (CAR)를 코딩하는 제2 외인성 폴리뉴클레오티드를 포함하는 외인성 폴리뉴클레오티드의 세트를 추가로 포함하며, 여기서 제1 및/또는 제2 외인성 폴리뉴클레오티드는 세포의 하나 이상의 대립유전자의 특이적 유전자좌 내로 삽입된다. 또한 본원은 야생형 일차 T 세포에 비해 HLA-A, HLA-B, HLA-C, HLA-DP, HLA-DQ, HLA-DR, B2M, CIITA, TCR-알파 및 TCR-베타의 감소된 발현을 포함하는 일차 T 세포의 임의의 서브타입을 포함하는 저면역원성 일차 T 세포를 제공하며, 저면역원성 줄기 세포는 CD47을 코딩하는 제1 외인성 폴리뉴클레오티드 및 키메라 항원 수용체 (CAR)를 코딩하는 제2 외인성 폴리뉴클레오티드를 포함하는 외인성 폴리뉴클레오티드의 세트를 추가로 포함하며, 여기서 제1 및/또는 제2 외인성 폴리뉴클레오티드는 세포의 하나 이상의 대립유전자의 특이적 유전자좌 내로 삽입된다. 추가로 본원은 야생형 일차 T 세포에 비해 HLA-A, HLA-B, HLA-C, HLA-DP, HLA-DQ, HLA-DR, B2M, CIITA, TCR-알파 및 TCR-베타의 감소된 발현을 포함하는 저면역원성 유도 만능 줄기 세포로부터 분화된 저면역원성 T 세포를 제공하며, 저면역원성 줄기 세포는 CD47을 코딩하는 제1 외인성 폴리뉴클레오티드 및 키메라 항원 수용체 (CAR)를 코딩하는 제2 외인성 폴리뉴클레오티드를 포함하는 외인성 폴리뉴클레오티드의 세트를 추가로 포함하며, 여기서 제1 및/또는 제2 외인성 폴리뉴클레오티드는 세포의 하나 이상의 대립유전자의 특이적 유전자좌 내로 삽입된다.
일부 실시양태에서, 기재된 조작된 세포의 집단은 수용자 환자에 대한 투여시 NK 세포 매개된 세포독성을 회피한다. 일부 실시양태에서, 조작된 세포의 집단은 NK 세포의 하나 이상의 하위집단에 의한 NK 세포 매개된 세포독성을 회피한다. 일부 실시양태에서, 조작된 세포의(eis) 집단은 수용자 환자에 대한 투여시 미성숙 및/또는 성숙 NK 세포를 포함하는 NK 세포에 의한 세포 용해로부터 보호된다. 일부 실시양태에서, 조작된 세포의 집단은 수용자 환자에 대한 투여시 대식세포 탐식을 회피한다. 일부 실시양태에서, 조작된 세포의 집단은 수용자 환자에 대한 투여시 세포에 대한 선천적 및/또는 적응성 면역 반응을 유도하지 않는다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 세포는 안전 스위치를 포함한다. 본원에 사용된 용어 "안전 스위치"는 하향조절되거나 상향조절될 때, 예컨대, 숙주의 면역계에 의한 인식을 통해 세포의 클리어런스 또는 사멸을 야기하는 관심 유전자 또는 단백질의 발현을 제어하기 위한 시스템을 지칭한다. 이상 임상 반응의 경우 외인성 분자에 의해 촉발될 안전 스위치가 설계될 수 있다. 안전 스위치는 DNA, RNA 및 단백질 수준의 발현을 조절함으로써 조작될 수 있다. 안전 스위치는 이상 반응에 대한 반응으로 세포 활성을 제어할 수 있는 단백질 또는 분자를 포함한다. 일 실시양태에서, 안전 스위치는 비활성 상태로 발현되고 외부에서 선택적으로 제공되는 약제에 의한 스위치의 활성화시 안전 스위치를 발현하는 세포에 치명적인 "살해 스위치"이다. 일 실시양태에서, 안전 스위치 유전자는 작제물에서 관심 유전자와 관련하여 시스-작용한다. 안전 스위치의 활성화는 세포가 아폽토시스 또는 괴사를 통해 자신만 단독으로 또는 자신 및 이웃 세포를 살해시키도록 유발한다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 세포, 예컨대, 비제한적으로 T 세포, CAR-T 세포, NK 세포, 및/또는 CAR-NK 세포를 포함하는, 줄기 세포, 유도 만능 줄기 세포, 조혈 줄기 세포, 일차 세포 또는 분화된 세포는 안전 스위치를 포함한다.
일부 실시양태에서, 안전 스위치는 CD47 및 SIRPα의 상호작용을 억제하거나 차단하는 치료제를 포함한다. 일부 양태에서, CD47-SIRPα 차단제는 CD47, SIRPα 또는 둘 모두의 세포 표면 발현을 중화, 차단, 길항 또는 방해하는 약제이다. 일부 실시양태에서, CD47-SIRPα 차단제는 CD47, SIRPα 또는 둘 모두의 상호작용을 억제하거나 차단한다. 일부 실시양태에서, CD47-SIRPα 차단제 (예컨대, CD47-SIRPα 차단제, 억제제, 감소제, 길항제, 중화제 또는 간섭제)는 CD47에 결합하는 항체 또는 이의 단편, CD47에 결합하는 이중특이적 항체, CD47에 결합하는 면역사이토카인 융합 단백질, CD47 함유 융합 단백질, SIRPα에 결합하는 항체 또는 이의 단편, SIRPα에 결합하는 이중특이적 항체, SIRPα에 결합하는 면역사이토카인 융합 단백질, SIRPα 함유 융합 단백질, 및 이들의 조합을 포함하는 군으로부터 선택된 약제를 포함한다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 세포는 "자살 유전자" (또는 "자살 스위치")를 포함한다. 자살 유전자는 저면역원성 세포가 원하지 않은 방식으로 성장하고 분열할 경우 사멸을 유발할 수 있다. 자살 유전자 절제 접근법은 특이적 화합물에 의해 활성화될 때만 세포 살해를 초래하는 단백질을 코딩하는 유전자 전달 벡터에 자살 유전자를 포함한다. 자살 유전자는 무독성 화합물을 고독성 대사산물로 선택적으로 전환시키는 효소를 코딩할 수 있다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 세포, 예컨대, 비제한적으로 T 세포, CAR-T 세포, NK 세포, 및/또는 CAR-NK 세포를 포함하는, 줄기 세포, 유도 만능 줄기 세포, 조혈 줄기 세포, 일차 세포 또는 분화된 세포는 자살 유전자를 포함한다.
일부 실시양태에서, 기재된 조작된 세포의 집단은 수용자 대상체에 대한 투여시 감소된 수준의 면역 활성화를 이끌어내거나 면역 활성화를 이끌어내지 않는다. 일부 실시양태에서, 세포는 수용자 대상체에서 감소된 수준의 전신 TH1 활성화를 이끌어내거나 전신 TH1 활성화를 이끌어내지 않는다. 일부 실시양태에서, 세포는 수용자 대상체에서 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC)의 감소된 수준의 면역 활성화를 이끌어내거나 PBMC의 면역 활성화를 이끌어내지 않는다. 일부 실시양태에서, 세포는 수용자 대상체에 대한 투여시 세포에 대한 감소된 수준의 공여자-특이적 IgG 항체를 이끌어내거나 공여자 특이적 IgG 항체를 이끌어내지 않는다. 일부 실시양태에서, 세포는 수용자 대상체에서 세포에 대한 감소된 수준의 IgM 및 IgG 항체 생산을 이끌어내거나 IgM 및 IgG 항체 생산을 이끌어내지 않는다. 일부 실시양태에서, 세포는 수용자 대상체에 대한 투여시 감소된 수준의 세포독성 T 세포 살해를 이끌어낸다.
B. CIITA
일부 실시양태에서, 본원에 개시된 기술은 클래스 II 트랜스활성화제 (CIITA) 발현을 표적화 및 조정 (예컨대, 감소 또는 제거)함으로써 MHC II 유전자의 발현을 조정 (예컨대, 감소 또는 제거)한다. 일부 실시양태에서, 조정은 CRISPR/Cas 시스템을 사용하여 발생한다. CIITA는 단백질의 LR 또는 뉴클레오티드 결합 도메인 (NBD) 류신-풍부 반복부 (LRR) 패밀리의 구성원이며, MHC 인핸소좀과 회합함으로써 MHC II의 전사를 조절한다.
일부 실시양태에서, 본 개시내용의 표적 폴리뉴클레오티드 서열은 CIITA의 변이체이다. 일부 실시양태에서, 표적 폴리뉴클레오티드 서열은 CIITA의 상동체이다. 일부 실시양태에서, 표적 폴리뉴클레오티드 서열은 CIITA의 오솔로그이다.
일부 실시양태에서, CIITA의 감소된 또는 제거된 발현은 HLA-DP, HLA-DM, HLA-DOA, HLA-DOB, HLA-DQ 및 HLA-DR인 다음의 MHC 클래스 II 중 하나 이상의 발현을 감소시키거나 제거한다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 세포는 CIITA 단백질을 코딩하는 유전자 유전자좌에서 유전자 변형을 포함한다. 다시 말해서, 세포는 CIITA 유전자좌에서 유전자 변형을 포함한다. 일부 경우에, CIITA 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 서열은 RefSeq 번호 NM_000246.4 및 NCBI Genbank 번호 U18259에 제시되어 있다. 일부 경우에, CIITA 유전자 유전자좌는 NCBI Gene ID 번호 4261에 기재되어 있다. 특정 경우에서, CIITA의 아미노산 서열은 NCBI GenBank 번호 AAA88861.1로서 묘사된다. CIITA 단백질 및 유전자 유전자좌에 대한 추가적인 설명은 Uniprot 번호 P33076, HGNC 참조 번호 7067 및 OMIM 참조 번호 600005에서 찾아볼 수 있다.
일부 실시양태에서, 본원에 약술된 저면역원성 세포는 CIITA 유전자를 표적화하는 유전자 변형을 포함한다. 일부 실시양태에서, 희귀-절단 엔도뉴클레아제에 의한 CIITA 유전자를 표적화하는 유전자 변형은 Cas 단백질 또는 Cas 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 및 CIITA 유전자를 특이적으로 표적화하기 위한 하나 이상의 가이드 리보핵산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, CIITA 유전자를 특이적으로 표적화하기 위한 하나 이상의 가이드 리보핵산 서열은 본원에 참조로 원용되는 WO2016183041의 표 12의 서열번호 5184-36352로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, 세포는 수용자 대상체에서 선천적 및/또는 적응성 면역 반응을 유도하는 감소된 능력을 갖는다. 일부 실시양태에서, 본원에 개시된 바와 같은 폴리펩티드 (예컨대, 키메라 항원 수용체, CD47, 또는 본원에 개시된 다른 관용원성 인자)를 코딩하는 외인성 핵산은 CIITA 유전자에 삽입된다.
CIITA 유전자가 비활성화되었는지 여부를 테스트하기 위한 검정은 본원에 알려져 있고 설명되어 있다. 일부 실시양태에서, PCR에 의한 CIITA 유전자의 생성된 유전자 변형 및 HLA-II 발현의 감소는 FACS 분석에 의한 검정일 수 있다. 다른 실시양태에서, CIITA 단백질 발현은 CIITA 단백질에 대한 항체로 탐침된 세포 용해물의 웨스턴 블롯을 사용하여 검출된다. 다른 실시양태에서, 역전사효소 중합효소 연쇄 반응 (RT-PCR)은 비활성화 유전자 변형의 존재를 확인하기 위해 사용된다. 일부 실시양태에서, 외인성 폴리뉴클레오티드는 예를 들어, 벡터를 이용한 바이러스 형질도입을 사용하여 세포의 하나 이상의 대립유전자 내로 삽입된다. 일부 실시양태에서, 벡터는 외인성 폴리뉴클레오티드를 운반하는 슈도타이핑된 자기-비활성화 렌티바이러스 벡터이다. 일부 실시양태에서, 벡터는 수포성 구내염 VSV-G 외피로 슈도타이핑되고 외인성 폴리뉴클레오티드를 운반하는 자기-비활성화 렌티바이러스 벡터이다. 일부 실시양태에서, 외인성 폴리뉴클레오티드는 바이러스 형질도입을 사용하여 세포의 하나 이상의 대립유전자 내로 삽입된다. 일부 실시양태에서, 외인성 폴리뉴클레오티드는 렌티바이러스 기반 바이러스 벡터를 사용하여 세포의 하나 이상의 대립유전자 내로 삽입된다.
C. B2M
일부 실시양태에서, 본원에 개시된 기술은 부속 쇄 B2M의 발현을 표적화 및 조정 (예컨대, 감소 또는 제거)함으로써 MHC-I 유전자의 발현을 조정 (예컨대, 감소 또는 제거)한다. 일부 실시양태에서, 조정은 CRISPR/Cas 시스템을 사용하여 발생한다. B2M의 발현을 조정함으로써 (예컨대, 감소 또는 결실시킴으로써) MHC-I 분자의 표면 트래피킹이 차단되고 세포가 저면역원성이 된다. 일부 실시양태에서, 세포는 수용자 대상체에서 선천적 및/또는 적응성 면역 반응을 유도하는 감소된 능력을 갖는다.
일부 실시양태에서, 본 개시내용의 표적 폴리뉴클레오티드 서열은 B2M의 변이체이다. 일부 실시양태에서, 표적 폴리뉴클레오티드 서열은 B2M의 상동체이다. 일부 실시양태에서, 표적 폴리뉴클레오티드 서열은 B2M의 오솔로그이다.
일부 실시양태에서, B2M의 감소된 또는 제거된 발현은 다음의 MHC I 분자 중 하나 이상의 발현을 감소시키거나 제거한다: HLA-A, HLA-B 및 HLA-C.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 세포는 B2M 단백질을 코딩하는 유전자 유전자좌에서 유전자 변형을 포함한다. 다시 말해서, 세포는 B2M 유전자좌에서 유전자 변형을 포함한다. 일부 경우에, B2M 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 서열은 RefSeq. 번호 NM_004048.4 및 Genbank 번호 AB021288.1에 제시되어 있다. 일부 경우에, B2M 유전자 유전자좌는 NCBI 유전자 ID 번호 567에 기재되어 있다. 특정 경우에, B2M의 아미노산 서열은 NCBI GenBank 번호 BAA35182.1로서 묘사되어 있다. B2M 단백질 및 유전자 유전자좌에 대한 추가적인 설명은 Uniprot 번호 P61769, HGNC 참조 번호 914 및 OMIM 참조 번호 109700에서 찾아볼 수 있다.
일부 실시양태에서, 본원에 약술된 저면역원성 세포는 B2M 유전자를 표적화하는 유전자 변형을 포함한다. 일부 실시양태에서, 희귀-절단 엔도뉴클레아제에 의한 B2M 유전자를 표적화하는 유전자 변형은 Cas 단백질 또는 Cas 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 및 B2M 유전자를 특이적으로 표적화하기 위한 하나 이상의 가이드 리보핵산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, B2M 유전자를 특이적으로 표적화하기 위한 하나 이상의 가이드 리보핵산 서열은 본원에 참조로 원용되는 WO2016183041의 표 15의 서열번호 81240-85644로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, 본원에 개시된 바와 같은 폴리펩티드 (예컨대, 키메라 항원 수용체, CD47, 또는 본원에 개시된 다른 관용원성 인자)를 코딩하는 외인성 핵산은 B2M 유전자에 삽입된다. 일부 실시양태에서, 외인성 폴리뉴클레오티드는 예를 들어, 벡터를 이용한 바이러스 형질도입을 사용하여 세포의 하나 이상의 대립유전자 내로 삽입된다. 일부 실시양태에서, 벡터는 외인성 폴리뉴클레오티드를 운반하는 슈도타이핑된 자기-비활성화 렌티바이러스 벡터이다. 일부 실시양태에서, 벡터는 수포성 구내염 VSV-G 외피로 슈도타이핑되고 외인성 폴리뉴클레오티드를 운반하는 자기-비활성화 렌티바이러스 벡터이다. 일부 실시양태에서, 외인성 폴리뉴클레오티드는 바이러스 형질도입을 사용하여 세포의 하나 이상의 대립유전자 내로 삽입된다. 일부 실시양태에서, 외인성 폴리뉴클레오티드는 렌티바이러스 기반 바이러스 벡터를 사용하여 세포의 하나 이상의 대립유전자 내로 삽입된다.
B2M 유전자 비활성화되었는지 여부를 테스트하기 위한 검정은 본원에 알려져 있고 설명되어 있다. 일부 실시양태에서, PCR에 의한 B2M 유전자의 생성된 유전자 변형 및 HLA-I 발현의 감소는 FACS 분석에 의한 검정일 수 있다. 다른 실시양태에서, B2M 단백질 발현은 B2M 단백질에 대한 항체로 탐침된 세포 용해물의 웨스턴 블롯을 사용하여 검출된다. 다른 실시양태에서, 역전사효소 중합효소 연쇄 반응 (RT-PCR)은 비활성화 유전자 변형의 존재를 확인하기 위해 사용된다.
D.NLRC5
많은 실시양태에서, 본원에 개시된 기술은 NLR 패밀리, 5/NOD27/CLR16.1 (NLRC5)을 함유하는 CARD 도메인의 발현을 표적화 및 조정 (예컨대, 감소시키거나 제거)함으로써 MHC-I 유전자의 발현을 조정한다 (예컨대, 감소시키거나 제거한다). 일부 실시양태에서, 조정은 CRISPR/Cas 시스템을 사용하여 발생한다. NLRC5는 MHC-I-매개된 면역 반응의 중요한 조절인자이며, CIITA와 마찬가지로, NLRC5는 IFN-γ에 의해 고도로 유도성이며, 핵 내로 전위될 수 있다. NLRC5는 MHC-I 유전자의 프로모터를 활성화하고, MHC-I뿐만 아니라 MHC-I 항원 제시에 관여하는 관련된 유전자의 전사를 유도한다.
일부 실시양태에서, 표적 폴리뉴클레오티드 서열은 NLRC5의 변이체이다. 일부 실시양태에서, 표적 폴리뉴클레오티드 서열은 NLRC5의 동족체이다. 일부 실시양태에서, 표적 폴리뉴클레오티드 서열은 NLRC5의 오솔로그이다.
일부 실시양태에서, NLRC5의 감소된 또는 제거된 발현은 다음의 MHC I 분자 - HLA-A, HLA-B 및 HLA-C 중 하나 이상의 발현을 감소시키거나 제거한다.
일부 실시양태에서, 본원에 약술된 세포는 NLRC5 유전자를 표적화하는 유전자 변형을 포함한다. 일부 실시양태에서, 희귀-절단 엔도뉴클레아제에 의한 NLRC5 유전자를 표적화하는 유전자 변형은 Cas 단백질 또는 Cas 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 및 NLRC5 유전자를 특이적으로 표적화하기 위한 하나 이상의 가이드 리보핵산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, NLRC5 유전자를 특이적으로 표적화하기 위한 하나 이상의 가이드 리보핵산 서열은 WO2016183041의 부록 3 또는 표 14의 서열번호 36353-81239로 이루어진 군으로부터 선택되며, 개시내용은 그 전체가 참조로 원용된다.
NLRC5 유전자가 비활성화되었는지 여부를 테스트하기 위한 검정은 본원에 알려져 있고 설명되어 있다. 일부 실시양태에서, PCR에 의한 NLRC5 유전자의 생성된 유전자 변형 및 HLA-I 발현의 감소는 FACS 분석에 의한 검정일 수 있다. 다른 실시양태에서, NLRC5 단백질 발현은 NLRC5 단백질에 대한 항체로 탐침된 세포 용해물의 웨스턴 블롯을 사용하여 검출된다. 다른 실시양태에서, 역전사효소 중합효소 연쇄 반응 (RT-PCR)은 비활성화 유전자 변형의 존재를 확인하기 위해 사용된다.
E. TRAC
많은 실시양태에서, 본원에 개시된 기술은 T 세포 수용체 알파 쇄의 불변 영역의 발현을 표적화 및 조정 (예컨대, 감소 또는 제거)함으로써 TRAC 유전자를 포함하는 TCR 유전자의 발현을 조정 (예컨대, 감소 또는 제거)한다. 일부 실시양태에서, 조정은 CRISPR/Cas 시스템을 사용하여 발생한다. TRAC의 발현을 조정함으로써 (예컨대, 감소 또는 결실시킴으로써) TCR 분자의 표면 트래피킹이 차단된다. 일부 실시양태에서, 세포는 또한 수용자 대상체에서 선천적 및/또는 적응성 면역 반응을 유도하는 감소된 능력을 갖는다.
일부 실시양태에서, 본 개시내용의 표적 폴리뉴클레오티드 서열은 TRAC의 변이체이다. 일부 실시양태에서, 표적 폴리뉴클레오티드 서열은 TRAC의 상동체이다. 일부 실시양태에서, 표적 폴리뉴클레오티드 서열은 TRAC의 오솔로그이다.
일부 실시양태에서, TRAC의 감소된 또는 제거된 발현은 TCR 표면 발현을 감소시키거나 제거한다.
일부 실시양태에서, 세포, 예컨대, 비제한적으로 만능 줄기 세포, 유도 만능 줄기 세포, 유도 만능 줄기 세포로부터 분화된 T 세포, 일차 T 세포, 및 일차 T 세포로부터 유래된 세포는 TRAC 단백질을 코딩하는 유전자 유전자좌에서 유전자 변형을 포함한다. 다시 말해서, 세포는 TRAC 유전자좌에서 유전자 변형을 포함한다. 일부 경우에, TRAC 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 서열은 Genbank 번호 X02592.1에 제시되어 있다. 일부 경우에, TRAC 유전자 유전자좌는 RefSeq. 번호 NG_001332.3 및 NCBI Gene ID 번호 28755에 기재되어 있다. 특정 경우에, TRAC의 아미노산 서열은 Uniprot 번호 P01848로서 묘사된다. TRAC 단백질 및 유전자 유전자좌에 대한 추가적인 설명은 Uniprot 번호 P01848, HGNC 참조 번호 12029 및 OMIM 참조 번호 186880에서 찾아볼 수 있다.
일부 실시양태에서, 본원에 약술된 저면역원성 세포는 TRAC 유전자를 표적화하는 유전자 변형을 포함한다. 일부 실시양태에서, 희귀-절단 엔도뉴클레아제에 의한 TRAC 유전자를 표적화하는 유전자 변형은 Cas 단백질 또는 Cas 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 및 TRAC 유전자를 특이적으로 표적화하기 위한 하나 이상의 가이드 리보핵산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, TRAC 유전자를 특이적으로 표적화하기 위한 하나 이상의 가이드 리보핵산 서열은 본원에 참조로 원용되는 US20160348073의 서열번호 532-609 및 9102-9797로 이루어진 군으로부터 선택된다.
TRAC 유전자가 비활성화되었는지 여부를 테스트하기 위한 검정은 본원에 알려져 있고 설명되어 있다. 일부 실시양태에서, PCR에 의한 TRAC 유전자의 생성된 유전자 변형 및 TCR 발현의 감소는 FACS 분석에 의한 검정일 수 있다. 다른 실시양태에서, TRAC 단백질 발현은 TRAC 단백질에 대한 항체로 탐침된 세포 용해물의 웨스턴 블롯을 사용하여 검출된다. 다른 실시양태에서, 역전사효소 중합효소 연쇄 반응 (RT-PCR)은 비활성화 유전자 변형의 존재를 확인하기 위해 사용된다.
F.TRB
많은 실시양태에서, 본원에 개시된 기술은 T 세포 수용체 베타 쇄의 불변 영역의 발현을 표적화 및 조정 (예컨대, 감소 또는 제거)함으로써 T 세포 항원 수용체, 베타 쇄를 코딩하는 유전자를 포함하는 TCR 유전자(예컨대, TRB, TRBC 또는 TCRB 유전자)의 발현을 조정 (예컨대, 감소 또는 제거)한다. 일부 실시양태에서, 조정은 CRISPR/Cas 시스템을 사용하여 발생한다. TRB의 발현을 조정함으로써 (예컨대, 감소 또는 결실시킴으로써), TCR 분자의 표면 트래피킹이 차단된다. 일부 실시양태에서, 세포는 또한 수용자 대상체에서 선천적 및/또는 적응성 면역 반응을 유도하는 감소된 능력을 갖는다.
일부 실시양태에서, 본 개시내용의 표적 폴리뉴클레오티드 서열은 TRB의 변이체이다. 일부 실시양태에서, 표적 폴리뉴클레오티드 서열은 TRB의 상동체이다. 일부 실시양태에서, 표적 폴리뉴클레오티드 서열은 TRB의 오솔로그이다.
일부 실시양태에서, TRB의 감소된 또는 제거된 발현은 TCR 표면 발현을 감소시키거나 제거한다.
일부 실시양태에서, 세포, 예컨대, 비제한적으로 만능 줄기 세포, 유도 만능 줄기 세포, 유도 만능 줄기 세포로부터 분화된 T 세포, 일차 T 세포, 및 일차 T 세포로부터 유래된 세포는 TRB 단백질을 코딩하는 유전자 유전자좌에서 유전자 변형을 포함한다. 다시 말해서, 세포는 TRB 유전자 유전자좌에서 유전자 변형을 포함한다. 일부 경우에, TRB 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 서열은 UniProt 번호 P0DSE2에 제시되어 있다. 일부 경우에, TRB 유전자 유전자좌는 RefSeq. 번호 NG_001333.2 및 NCBI Gene ID 번호 6957에 기재되어 있다. 특정 경우에, TRB의 아미노산 서열은 Uniprot 번호 P01848로서 묘사된다. TRB 단백질 및 유전자 유전자좌에 대한 추가적인 설명은 GenBank 번호 L36092.2, Uniprot 번호 P0DSE2 및 HGNC 참조 번호 12155에서 찾아볼 수 있다.
일부 실시양태에서, 본원에 약술된 저면역원성 세포는 TRB 유전자를 표적화하는 유전자 변형을 포함한다. 일부 실시양태에서, 희귀-절단 엔도뉴클레아제에 의한 TRB 유전자를 표적화하는 유전자 변형은 Cas 단백질 또는 Cas 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 및 TRB 유전자를 특이적으로 표적화하기 위한 하나 이상의 가이드 리보핵산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, TRB 유전자를 특이적으로 표적화하기 위한 하나 이상의 가이드 리보핵산 서열은 본원에 참조로 원용되는 US20160348073의 서열번호 610-765 및 9798-10532로 이루어진 군으로부터 선택된다.
TRB 유전자가 비활성화되었는지 여부를 테스트하기 위한 검정은 본원에 알려져 있고 설명되어 있다. 일부 실시양태에서, PCR에 의한 TRB 유전자의 생성된 유전자 변형 및 TCR 발현의 감소는 FACS 분석에 의한 검정일 수 있다. 다른 실시양태에서, TRB 단백질 발현은 TRB 단백질에 대한 항체로 탐침된 세포 용해물의 웨스턴 블롯을 사용하여 검출된다. 다른 실시양태에서, 역전사효소 중합효소 연쇄 반응 (RT-PCR)은 비활성화 유전자 변형의 존재를 확인하기 위해 사용된다.
G. CD142
많은 실시양태에서, 본원에 개시된 기술은 조직 인자, 인자 III 및 F3으로서 또한 알려져 있는 CD142의 발현을 조정 (예컨대, 감소 또는 제거)한다. 일부 실시양태에서, 조정은 유전자 편집 시스템 (예컨대, CRISPR/Cas)을 사용하여 발생한다.
일부 실시양태에서, 표적 폴리뉴클레오티드 서열은 CD142 또는 CD142의 변이체이다. 일부 실시양태에서, 표적 폴리뉴클레오티드 서열은 CD142의 동족체이다. 일부 실시양태에서, 표적 폴리뉴클레오티드 서열은 CD142의 오솔로그이다.
일부 실시양태에서, 본원에 약술된 세포는 CD142 유전자를 표적화하는 유전자 변형을 포함한다. 일부 실시양태에서, 희귀-절단 엔도뉴클레아제에 의한 CD142 유전자를 표적화하는 유전자 변형은 Cas 단백질 또는 Cas 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 및 CD142 유전자를 특이적으로 표적화하기 위한 하나 이상의 가이드 리보핵산 (gRNA) 서열을 포함한다. CD142를 표적화하는 gRNA 서열을 식별하는 유용한 방법은 아래에 기재되어 있다.
CD142 유전자가 비활성화되었는지 여부를 테스트하기 위한 검정은 본원에 알려져 있고 설명되어 있다. 일부 실시양태에서, PCR에 의한 CD142 유전자의 생성된 유전자 변형 및 CD142 발현의 감소는 FACS 분석에 의한 검정일 수 있다. 다른 실시양태에서, CD142 단백질 발현은 CD142 단백질에 대한 항체로 탐침된 세포 용해물의 웨스턴 블롯을 사용하여 검출된다. 다른 실시양태에서, 역전사효소 중합효소 연쇄 반응 (RT-PCR)은 비활성화 유전자 변형의 존재를 확인하기 위해 사용된다.
인간 CD142에 대한 유용한 게놈적, 폴리뉴클레오티드 및 폴리펩티드 정보는 예를 들어, GeneCard 식별자 GC01M094530, HGNC 번호 3541, NCBI Gene ID 2152, NCBI RefSeq 번호 NM_001178096.1, NM_001993.4, NP_001171567.1, 및 NP_001984.1, 및 UniProt 번호 P13726 등에 제공되어 있다.
H. CTLA-4
일부 실시양태에서, 표적 폴리뉴클레오티드 서열은 CTLA-4 또는 CTLA-4의 변이체이다. 일부 실시양태에서, 표적 폴리뉴클레오티드 서열은 CTLA-4의 상동체이다. 일부 실시양태에서, 표적 폴리뉴클레오티드 서열은 CTLA-4의 오솔로그이다.
일부 실시양태에서, 본원에 약술된 세포는 CTLA-4 유전자를 표적화하는 유전자 변형을 포함한다. 특정 실시양태에서, 일차 T 세포는 CTLA-4 유전자를 표적화하는 유전자 변형을 포함한다. 유전자 변형은 일차 T 세포 및 CAR-T 세포를 포함하는 T 세포에서 CTLA-4 폴리뉴클레오티드 및 CTLA-4 폴리펩티드의 발현을 감소시킬 수 있다. 일부 실시양태에서, 희귀-절단 엔도뉴클레아제에 의한 CTLA-4 유전자를 표적화하는 유전자 변형은 Cas 단백질 또는 Cas 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 및 CTLA-4 유전자를 특이적으로 표적화하기 위한 하나 이상의 가이드 리보핵산 (gRNA) 서열을 포함한다. CTLA-4를 표적화하는 gRNA 서열을 식별하는 유용한 방법은 아래에 기재되어 있다.
CTLA-4 유전자가 비활성화되었는지 여부를 테스트하기 위한 검정은 본원에 알려져 있고 설명되어 있다. 일부 실시양태에서, PCR에 의한 CTLA-4 유전자의 생성된 유전자 변형 및 CTLA-4 발현의 감소는 FACS 분석에 의한 검정일 수 있다. 다른 실시양태에서, CTLA-4 단백질 발현은 CTLA-4 단백질에 대한 항체로 탐침된 세포 용해물의 웨스턴 블롯을 사용하여 검출된다. 다른 실시양태에서, 역전사효소 중합효소 연쇄 반응 (RT-PCR)은 비활성화 유전자 변형의 존재를 확인하기 위해 사용된다.
인간 CTLA-4에 대한 유용한 게놈적, 폴리뉴클레오티드 및 폴리펩티드 정보는 예를 들어, GeneCard 식별자 GC02P203867, HGNC 번호 2505, NCBI Gene ID 1493, NCBI RefSeq 번호 NM_005214.4, NM_001037631.2, NP_001032720.1 및 NP_005205.2, 및 UniProt 번호 P16410 등에 제공되어 있다.
I. PD-1
일부 실시양태에서, 표적 폴리뉴클레오티드 서열은 PD-1 또는 PD-1의 변이체이다. 일부 실시양태에서, 표적 폴리뉴클레오티드 서열은 PD-1의 상동체이다. 일부 실시양태에서, 표적 폴리뉴클레오티드 서열은 PD-1의 올소로그이다.
일부 실시양태에서, 본원에 약술된 세포는 프로그래밍된 세포 사멸 단백질 1 (PD-1) 단백질을 코딩하는 유전자 또는 PDCD1 유전자를 표적화하는 유전자 변형을 포함한다. 특정 실시양태에서, 일차 T 세포는 PDCD1 유전자를 표적화하는 유전자 변형을 포함한다. 유전자 변형은 일차 T 세포 및 CAR-T 세포를 포함하는 T 세포에서 PD-1 폴리뉴클레오티드 및 PD-1 폴리펩티드의 발현을 감소시킬 수 있다. 일부 실시양태에서, 희귀-절단 엔도뉴클레아제에 의한 PDCD1 유전자를 표적화하는 유전자 변형은 Cas 단백질 또는 Cas 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 및 PDCD1 유전자를 특이적으로 표적화하기 위한 하나 이상의 가이드 리보핵산 (gRNA) 서열을 포함한다. PD-1을 표적화하는 gRNA 서열을 식별하는 유용한 방법은 아래에 기재되어 있다.
PDCD1 유전자가 비활성화되었는지 여부를 테스트하기 위한 검정은 본원에 알려져 있고 설명되어 있다. 일부 실시양태에서, PCR에 의한 PDCD1 유전자의 생성된 유전자 변형 및 PD-1 발현의 감소는 FACS 분석에 의한 검정일 수 있다. 다른 실시양태에서, PD-1 단백질 발현은 PD-1 단백질에 대한 항체로 탐침된 세포 용해물의 웨스턴 블롯을 사용하여 검출된다. 다른 실시양태에서, 역전사효소 중합효소 연쇄 반응 (RT-PCR)은 비활성화 유전자 변형의 존재를 확인하기 위해 사용된다.
PDCD1 유전자를 포함하는 인간 PD-1에 대한 유용한 게놈적, 폴리뉴클레오티드 및 폴리펩티드 정보는 예를 들어, GeneCard 식별자 GC02M241849, HGNC 번호 8760, NCBI Gene ID 5133, Uniprot 번호 Q15116, 및 NCBI RefSeq 번호 NM_005018.2 및 NP_005009.2에 제공되어 있다.
J. CD47
일부 실시양태에서, 본 개시내용은 관용원성 인자 (예컨대, 면역조정 폴리펩티드) CD47을 발현하도록 변형된 세포 또는 이의 집단을 제공한다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용은 CD47을 발현하도록 세포 게놈을 변경하는 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 줄기 세포는 외인성 CD47을 발현한다. 일부 경우에, 세포는 인간 CD47 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 발현 벡터를 발현한다. 일부 실시양태에서, 세포는 상동성-지시된 복구를 사용하여 CD47을 코딩하는 통합된 외인성 폴리뉴클레오티드를 포함하도록 유전적으로 변형된다. 일부 경우에, 세포는 뉴클레오티드 서열이 세이프 하버 또는 표적 유전자좌의 하나 이상의 대립유전자 내로 삽입되도록 인간 CD47 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 발현한다. 일부 경우에, 세포는 인간 CD47 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 발현하며, 여기서 뉴클레오티드 서열은 AAVS1 유전자좌의 하나 이상의 대립유전자 내로 삽입된다. 일부 경우에, 세포는 인간 CD47 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 발현하며, 여기서 뉴클레오티드 서열은 CCR5 유전자좌의 하나 이상의 대립유전자 내로 삽입된다. 일부 경우에, 세포는 인간 CD47 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 발현하며, 여기서 뉴클레오티드 서열은 세이프 하버 또는 표적 유전자 유전자좌, 예컨대, 비제한적으로 CCR5 유전자 유전자좌, CXCR4 유전자 유전자좌, PPP1R12C 유전자 유전자좌, 알부민 유전자 유전자좌, SHS231 유전자 유전자좌, CLYBL 유전자 유전자좌, Rosa 유전자 유전자좌, F3 (CD142) 유전자 유전자좌, MICA 유전자 유전자좌, MICB 유전자 유전자좌, LRP1 (CD91) 유전자 유전자좌, HMGB1 유전자 유전자좌, ABO 유전자 유전자좌, RHD 유전자 유전자좌, FUT1 유전자좌 및 KDM5D 유전자 유전자좌의 하나 이상의 대립유전자 내로 삽입된다. 일부 경우에, 세포는 인간 CD47 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 발현하며, 여기서 뉴클레오티드 서열은 TRAC 유전자좌의 하나 이상의 대립유전자 내로 삽입된다.
CD47은 백혈구 표면 항원이며, 세포 부착 및 인테그린의 조정에서 역할을 한다. 이는 세포의 표면에서 발현되며, 순환하는 대식세포에 세포를 먹지 말라고 신호를 보낸다.
일부 실시양태에서, 본원에 약술된 세포는 NCBI 참조 서열번호 NP_001768.1 및 NP_942088.1에 제시된 바와 같은 아미노산에 대해 95% 이상 (예컨대, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 이상)의 서열 동일성을 갖는 CD47 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 본원에 약술된 세포는 NCBI 참조 서열번호 NP_001768.1 및 NP_942088.1에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 갖는 CD47 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 세포는 NCBI 참조 번호 NM_001777.3 및 NM_198793.2에 제시된 서열에 대해 85% 이상 (예컨대, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 이상)의 서열 동일성을 갖는 CD47의 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 세포는 NCBI 참조 서열번호 NM_001777.3 및 NM_198793.2에 제시된 바와 같은 CD47에 대한 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, CD47 폴리뉴클레오티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열은 코돈 최적화 서열이다. 일부 실시양태에서, CD47 폴리뉴클레오티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열은 인간 코돈 최적화 서열이다.
일부 실시양태에서, 세포는 NCBI 참조 서열번호 NP_001768.1 및 NP_942088.1에 제시된 바와 같은 아미노산 서열에 대해 95% 이상 (예컨대, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 이상)의 서열 동일성을 갖는 CD47 폴리펩티드를 포함한다. 일부 실시양태에서, 본원에 약술된 세포는 NCBI 참조 서열번호 NP_001768.1 및 NP_942088.1에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 갖는 CD47 폴리펩티드를 포함한다.
신호 서열이 있고 신호 서열이 없는 인간 CD47의 예시적인 아미노산 서열은 표 1에 제공되어 있다.
표 1. 인간 CD47의 아미노산 서열
일부 실시양태에서, 세포는 서열번호 13의 아미노산 서열에 대해 95% 이상 (예컨대, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 이상)의 서열 동일성을 갖는 CD47 폴리펩티드를 포함한다. 일부 실시양태에서, 세포는 서열번호 13의 아미노산 서열을 갖는 CD47 폴리펩티드를 포함한다. 일부 실시양태에서, 세포는 서열번호 14의 아미노산 서열에 대해 95% 이상 (예컨대, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 이상)의 서열 동일성을 갖는 CD47 폴리펩티드를 포함한다. 일부 실시양태에서, 세포는 서열번호 14의 아미노산 서열을 갖는 CD47 폴리펩티드를 포함한다.
일부 실시양태에서, 세포는 서열번호 13의 아미노산 서열에 대해 95% 이상 (예컨대, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 이상)의 서열 동일성을 갖는 CD47 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 세포는 서열번호 13의 아미노산 서열을 갖는 CD47 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 세포는 서열번호 14의 아미노산 서열에 대해 95% 이상 (예컨대, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 이상)의 서열 동일성을 갖는 CD47 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 세포는 서열번호 14의 아미노산 서열을 갖는 CD47 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 뉴클레오티드 서열은 특정 세포에서의 발현을 위해 코돈 최적화된다.
일부 실시양태에서, 적합한 유전자 편집 시스템 (예컨대, CRISPR/Cas 시스템 또는 본원에 기재된 유전자 편집 시스템 중 임의의 것)은 저면역원성 세포의 게놈 유전자좌 내로, CD47을 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 삽입을 용이하게 하기 위해 사용된다. 일부 경우에, CD47을 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 세이프 하버 또는 표적 유전자좌, 예컨대, 비제한적으로 AAVS1, CCR5, CLYBL, ROSA26, SHS231, F3 (CD142), MICA, MICB, LRP1 (CD91), HMGB1, ABO, RHD, FUT1 또는 KDM5D 유전자 유전자좌 내로 삽입된다. 일부 실시양태에서, CD47을 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 B2M 유전자 유전자좌, CIITA 유전자 유전자좌, TRAC 유전자 유전자좌, 또는 TRB 유전자 유전자좌 내로 삽입된다. 일부 실시양태에서, CD47을 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 본원에 제공된 표 15에 묘사된 유전자 유전자좌 중 어느 하나 내로 삽입된다. 특정 실시양태에서, CD47을 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 프로모터에 작동가능하게 연결된다.
일부 실시양태에서, CD47을 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 바이러스 형질도입을 사용하여 T 세포의 하나 이상의 대립유전자 내로 삽입된다. 일부 실시양태에서, CD47을 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 렌티바이러스 기반 바이러스 벡터를 사용하여 T 세포의 하나 이상의 대립유전자 내로 삽입된다. 일부 실시양태에서, 렌티바이러스 기반 바이러스 벡터는 CD47을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 운반하는 슈도타이핑된 자기-비활성화 렌티바이러스 벡터이다. 일부 실시양태에서, 렌티바이러스 기반 바이러스 벡터는 수포성 구내염 VSV-G 외피로 슈도타이핑되고 CD47을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 운반하는 자기-비활성화 렌티바이러스 벡터이다.
다른 실시양태에서, CD47 단백질 발현은 CD47 단백질에 대한 항체로 탐침된 세포 용해물의 웨스턴 블롯을 사용하여 검출된다. 다른 실시양태에서, 역전사효소 중합효소 연쇄 반응 (RT-PCR)은 외인성 CD47 mRNA의 존재를 확인하기 위해 사용된다.
K. CD24
일부 실시양태에서, 본 개시내용은 관용원성 인자 (예컨대, 면역조정 폴리펩티드) CD24를 발현하도록 변형된 세포 또는 이의 집단을 제공한다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용은 CD24를 발현하도록 세포 게놈을 변경하는 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 줄기 세포는 외인성 CD24를 발현한다. 일부 경우에, 세포는 인간 CD24 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 발현 벡터를 발현한다. 일부 실시양태에서, 외인성 폴리뉴클레오티드는 예를 들어, 벡터를 이용한 바이러스 형질도입을 사용하여 세포의 하나 이상의 대립유전자 내로 삽입된다. 일부 실시양태에서, 벡터는 외인성 폴리뉴클레오티드를 운반하는 슈도타이핑된 자기-비활성화 렌티바이러스 벡터이다. 일부 실시양태에서, 벡터는 수포성 구내염 VSV-G 외피로 슈도타이핑되고 외인성 폴리뉴클레오티드를 운반하는 자기-비활성화 렌티바이러스 벡터이다. 일부 실시양태에서, 외인성 폴리뉴클레오티드는 바이러스 형질도입을 사용하여 세포의 하나 이상의 대립유전자 내로 삽입된다. 일부 실시양태에서, 외인성 폴리뉴클레오티드는 렌티바이러스 기반 바이러스 벡터를 사용하여 세포의 하나 이상의 대립유전자 내로 삽입된다.
열 안정성 항원 또는 소-세포 폐암 클러스터 4 항원으로서 또한 지칭되는 CD24는 글리코실화된 글리코실포스파티딜이노시톨-고정된 표면 단백질이다 (Pirruccello 등, J Immunol, 1986, 136, 3779-3784; Chen 등, Glycobiology, 2017, 57, 800-806). 이는 선천적 면역 세포 상의 Siglec-10에 결합한다. 최근 Siglec-10을 통한 CD24가 선천적 면역 체크포인트로서 작용하는 것으로 나타났다 (Barkal 등, Nature, 2019, 572, 392-396).
일부 실시양태에서, 본원에 약술된 세포는 NCBI 참조 번호 NP_001278666.1, NP_001278667.1, NP_001278668.1 및 NP_037362.1에 제시된 아미노산 서열에 대해 95% 이상 (예컨대, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 이상)의 서열 동일성을 갖는 CD24 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 본원에 약술된 세포는 NCBI 참조 번호 NP_001278666.1, NP_001278667.1, NP_001278668.1 및 NP_037362.1에 제시된 아미노산 서열을 갖는 CD24 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
일부 실시양태에서, 세포는 NCBI 참조 번호 NM_00129737.1, NM_00129738.1, NM_001291739.1 및 NM_013230.3에 제시된 서열에 대해 85% 이상 (예컨대, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 이상)의 서열 동일성을 갖는 뉴클레이티드 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 세포는 NCBI 참조 번호 NM_00129737.1, NM_00129738.1, NM_001291739.1 및 NM_013230.3에 제시된 바와 같은 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
일부 실시양태에서, 적합한 유전자 편집 시스템 (예컨대, CRISPR/Cas 시스템 또는 본 명세서에 기재된 임의의 유전자 편집 시스템)은 저면역원성 세포의 게놈 유전자좌 내로, CD24를 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 삽입을 용이하게 하기 위해 사용된다. 일부 경우에, CD24를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 세이프 하버 또는 표적 유전자좌, 예컨대, 비제한적으로 AAVS1, CCR5, CLYBL, ROSA26, SHS231, F3 (CD142), MICA, MICB, LRP1 (CD91), HMGB1, ABO, RHD, FUT1 또는 KDM5D 유전자 유전자좌 내로 삽입된다. 일부 실시양태에서, CD24를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 B2M 유전자 유전자좌, CIITA 유전자 유전자좌, TRAC 유전자 유전자좌, 또는 TRB 유전자 유전자좌 내로 삽입된다. 일부 실시양태에서, CD24를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 본원에 제공된 표 15에 묘사된 유전자 유전자좌 중 어느 하나 내로 삽입된다. 특정 실시양태에서, CD24를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 프로모터에 작동가능하게 연결된다.
다른 실시양태에서, CD24 단백질 발현은 CD24 단백질에 대한 항체로 탐침된 세포 용해물의 웨스턴 블롯을 사용하여 검출된다. 다른 실시양태에서, 역전사효소 중합효소 연쇄 반응 (RT-PCR)은 외인성 CD24 mRNA의 존재를 확인하기 위해 사용된다.
일부 실시양태에서, 적합한 유전자 편집 시스템 (예컨대, CRISPR/Cas 시스템 또는 본원에 기재된 유전자 편집 시스템 중 임의의 것)은 저면역원성 세포의 게놈 유전자좌 내로, CD24를 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 삽입을 용이하게 하기 위해 사용된다. 일부 경우에, CD24를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 세이프 하버 또는 표적 유전자좌, 예컨대, 비제한적으로 AAVS1, CCR5, CLYBL, ROSA26, SHS231, F3 (CD142로서 또한 알려짐), MICA, MICB, LRP1 (CD91로서 또한 알려짐), HMGB1, ABO, RHD, FUT1 또는 KDM5D 유전자 유전자좌 내로 삽입된다. 일부 실시양태에서, CD24를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 B2M 유전자 유전자좌, CIITA 유전자 유전자좌, TRAC 유전자 유전자좌, 또는 TRB 유전자 유전자좌 내로 삽입된다. 일부 실시양태에서, CD24를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 본원에 제공된 표 15에 묘사된 유전자 유전자좌 중 어느 하나 내로 삽입된다. 특정 실시양태에서, CD24를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 프로모터에 작동가능하게 연결된다.
L. DUX4
일부 실시양태에서, 본 개시내용은 DUX4와 같은 관용원성 인자 또는 면역억압 인자의 발현을 증가시키기 위해 변형된 게놈을 포함하는 세포 (예컨대, 줄기 세포, 유도 만능 줄기 세포, 분화된 세포, 조혈 줄기 세포, 일차 T 세포 또는 CAR-T 세포) 또는 이의 집단을 제공한다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용은 외인성 폴리뉴클레오티드를 통하는 것을 포함하여, DUX4의 증가된 발현을 제공하기 위해 세포의 게놈을 변경하는 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 개시내용은 외인성으로 발현된 DUX4 단백질을 포함하는 세포 또는 이의 집단을 제공한다. 일부 실시양태에서, DUX4의 증가된 발현은 다음의 MHC I 분자 - HLA-A, HLA-B 및 HLA-C 중 하나 이상의 발현을 억압, 감소 또는 제거한다. 일부 실시양태에서, 외인성 폴리뉴클레오티드는 예를 들어, 벡터를 이용한 바이러스 형질도입을 사용하여 세포의 하나 이상의 대립유전자 내로 삽입된다. 일부 실시양태에서, 벡터는 외인성 폴리뉴클레오티드를 운반하는 슈도타이핑된 자기-비활성화 렌티바이러스 벡터이다. 일부 실시양태에서, 벡터는 수포성 구내염 VSV-G 외피로 슈도타이핑되고 외인성 폴리뉴클레오티드를 운반하는 자기-비활성화 렌티바이러스 벡터이다. 일부 실시양태에서, 외인성 폴리뉴클레오티드는 바이러스 형질도입을 사용하여 세포의 하나 이상의 대립유전자 내로 삽입된다. 일부 실시양태에서, 외인성 폴리뉴클레오티드는 렌티바이러스 기반 바이러스 벡터를 사용하여 세포의 하나 이상의 대립유전자 내로 삽입된다.
DUX4는 배아 조직 및 유도된 만능 줄기 세포에서 활성이고 정상의 건강한 체세포 조직에서는 침묵하는 전사 인자이다 (Feng 등, 2015, ELife4; De Iaco 등, 2017, Nat Genet, 49, 941-945; Hendrickson 등, 2017, Nat Genet, 49, 925-934; Snider 등, 2010, PLoS Genet, e1001181; Whiddon 등, 2017, Nat Genet). DUX4 발현은 주요 조직적합성 복합체 (MHC) 클래스 I 유전자 발현 (예컨대, B2M, HLA-A, HLA-B 및 HLA-C의 발현)의 IFN-감마 매개된 유도를 차단하도록 작용한다. DUX4 발현은 MHC 클래스 I에 의한 억압된 항원 제시와 연루되어 있다 (Chew 등, Developmental Cell, 2019, 50, 1-14). DUX4는 절단-단계 유전자 발현 (전사) 프로그램에서 전사 인자로서 기능한다. 이의 표적 유전자는 코딩 유전자, 비코딩 유전자 및 반복 요소를 포함하나, 이에 제한되지 않는다.
DUX4에는 2 개 이상의 아이소폼이 있으며, 가장 긴 아이소폼은 DUX4 C-말단 전사 활성화 도메인을 포함한다. 아이소폼은 대안 스플라이싱에 의해 생산된다. 예컨대, Geng 등, 2012, Dev Cell, 22, 38-51; Snider 등, 2010, PLoS Genet, e1001181 참고한다. DUX4의 활성 아이소폼은 이의 N-말단 DNA-결합 도메인 및 이의 C-말단 활성화 도메인을 포함한다. 예컨대, Choi 등, 2016, Nucleic Acid Res, 44, 5161-5173 참고한다.
DUX4의 CpG 모티프의 수를 감소시키면 DUX4 트랜스진의 침묵이 감소하는 것으로 나타났다 (Jagannathan 등, Human Molecular Genetics, 2016, 25(20):4419-4431). 위의 Jagannathan 등에 제공된 핵산 서열은 DUX4 단백질 서열을 보존하면서 CpG 부위의 총 수를 감소시키기 위해 하나 이상의 염기 치환을 포함하는 DUX4의 코돈 변경된 서열을 나타낸다. 핵산 서열은 Addgene, 카탈로그 번호 99281로부터 상업적으로 이용가능하다.
많은 실시양태에서, 적어도 하나 이상의 폴리뉴클레오티드는 세포, 예컨대, 줄기 세포, 유도 만능 줄기 세포, 분화된 세포, 조혈 줄기 세포, 일차 T 세포 또는 CAR-T 세포에 의한 DUX4의 외인성 발현을 용이하게 하기 위해 활용될 수 있다.
일부 실시양태에서, 적합한 유전자 편집 시스템 (예컨대, CRISPR/Cas 시스템 또는 본원에 기재된 유전자 편집 시스템 중 임의의 것)은 저면역원성 세포의 게놈 유전자좌 내로, DUX4를 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 삽입을 용이하게 하기 위해 사용된다. 일부 경우에, DUX4를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 세이프 하버 또는 표적 유전자좌, 예컨대, 비제한적으로 AAVS1, CCR5, CLYBL, ROSA26, SHS231, F3 (CD142), MICA, MICB, LRP1 (CD91), HMGB1, ABO, RHD, FUT1 또는 KDM5D 유전자 유전자좌 내로 삽입된다. 일부 실시양태에서, DUX4를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 B2M 유전자 유전자좌, CIITA 유전자 유전자좌, TRAC 유전자 유전자좌, 또는 TRB 유전자 유전자좌 내로 삽입된다. 일부 실시양태에서, DUX4를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 본원에 제공된 표 15에 묘사된 유전자 유전자좌 중 어느 하나 내로 삽입된다. 특정 실시양태에서, DUX4를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 프로모터에 작동가능하게 연결된다.
일부 실시양태에서, DUX4를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 바이러스 형질도입을 사용하여 T 세포의 하나 이상의 대립유전자 내로 삽입된다. 일부 실시양태에서, DUX4를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 렌티바이러스 기반 바이러스 벡터를 사용하여 T 세포의 하나 이상의 대립유전자 내로 삽입된다. 일부 실시양태에서, 렌티바이러스 기반 바이러스 벡터는 DUX4를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 운반하는 슈도타이핑된 자기-비활성화 렌티바이러스 벡터이다. 일부 실시양태에서, 렌티바이러스 기반 바이러스 벡터는 수포성 구내염 VSV-G 외피로 슈도타이핑되고 DUX4를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 운반하는 자기-비활성화 렌티바이러스 벡터이다.
일부 실시양태에서, DUX4를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열은 DUX4 단백질 서열을 보존하면서 CpG 부위의 총 수를 감소시키기 위한 하나 이상의 염기 치환을 포함하는 DUX4의 코돈 변경된 뉴클레오티드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, CpG 부위의 총 수를 감소시키기 위해 하나 이상의 염기 치환을 포함하는 DUX4를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열은 2020 년 7 월 31 일자로 출원된 PCT/US2020/44635의 서열번호 1에 대해 85% 이상 (예컨대, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%)의 서열 동일성을 갖는다. 일부 실시양태에서, DUX4를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열은 PCT/US2020/44635의 서열번호 1이다.
일부 실시양태에서, DUX4를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열은 PCT/US2020/44635에 제공된 바와 같은 서열번호 2, 서열번호 3, 서열번호 4, 서열번호 5, 서열번호 6, 서열번호 7, 서열번호 8, 서열번호 9, 서열번호 10, 서열번호 11, 서열번호 12, 서열번호 13, 서열번호 14, 서열번호 15, 서열번호 16, 서열번호 17, 서열번호 18, 서열번호 19, 서열번호 20, 서열번호 21, 서열번호 22, 서열번호 23, 서열번호 24, 서열번호 25, 서열번호 26, 서열번호 27, 서열번호 28, 및 서열번호 29를 포함하는 군으로부터 선택된 서열에 대해 95% 이상 (예컨대, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%)의 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드 서열을 코딩하는 뉴클레오티드 서열이다. 일부 실시양태에서, DUX4를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열은 서열번호 2, 서열번호 3, 서열번호 4, 서열번호 5, 서열번호 6, 서열번호 7, 서열번호 8, 서열번호 9, 서열번호 10, 서열번호 11, 서열번호 12, 서열번호 13, 서열번호 14 , 서열번호 15, 서열번호 16, 서열번호 17, 서열번호 18, 서열번호 19, 서열번호 20, 서열번호 21, 서열번호 22, 서열번호 23, 서열번호 24, 서열번호 25, 서열번호 26, 서열번호 27, 서열번호 28 및 서열번호 29를 포함하는 군으로부터 선택되는 폴리펩티드 서열을 코딩하는 뉴클레오티드 서열이다. 서열번호 2-29로서 제시된 아미노산 서열은 PCT/US2020/44635의 도 1a-1g에 도시되어 있다.
일부 경우에, DUX4 폴리펩티드는 GenBank 수탁 번호 ACN62209.1에 제시된 서열 또는 GenBank 수탁 번호 ACN62209.1에 제시된 아미노산 서열에 대해 95% 이상의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 경우에, DUX4 폴리펩티드는 NCBI RefSeq 번호 NP_001280727.1에 제시된 서열 또는 NCBI RefSeq 번호 NP_001280727.1에 제시된 아미노산 서열에 대해 95% 이상의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 경우에, DUX4 폴리펩티드는 GenBank 수탁 번호 ACP30489.1에 제시된 서열 또는 GenBank 수탁 번호 ACP30489.1에 제시된 아미노산 서열에 대해 95% 이상의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 경우에, DUX4 폴리펩티드는 UniProt 번호 P0CJ85.1에 제시된 서열 또는 UniProt 번호 P0CJ85.1에 제시된 아미노산 서열에 대해 95% 이상의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 경우에, DUX4 폴리펩티드는 GenBank 수탁 번호 AUA60622.1에 제시된 서열 또는 GenBank 수탁 번호 AUA60622.1에 제시된 아미노산 서열에 대해 95% 이상의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 경우에, DUX4 폴리펩티드는 GenBank 수탁 번호 ADK24683.1에 제시된 서열 또는 GenBank 수탁 번호 ADK24683.1에 제시된 아미노산 서열에 대해 95% 이상의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 경우에, DUX4 폴리펩티드는 GenBank 수탁 번호 ACN62210.1에 제시된 서열 또는 GenBank 수탁 번호 ACN62210.1에 제시된 아미노산 서열에 대해 95% 이상의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 경우에, DUX4 폴리펩티드는 GenBank 수탁 번호 ADK24706.1에 제시된 서열 또는 GenBank 수탁 번호 ADK24706.1에 제시된 아미노산 서열에 대해 95% 이상의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 경우에, DUX4 폴리펩티드는 GenBank 수탁 번호 ADK24685.1에 제시된 서열 또는 GenBank 수탁 번호 ADK24685.1에 제시된 아미노산 서열에 대해 95% 이상의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 경우에, DUX4 폴리펩티드는 GenBank 수탁 번호 ACP30488.1에 제시된 서열 또는 GenBank 수탁 번호 ACP30488.1에 제시된 아미노산 서열에 대해 95% 이상의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 경우에, DUX4 폴리펩티드는 GenBank 수탁 번호 ADK24687.1에 제시된 서열 또는 GenBank 수탁 번호 ADK24687.1에 제시된 아미노산 서열에 대해 95% 이상의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 경우에, DUX4 폴리펩티드는 GenBank 수탁 번호 ACP30487.1에 제시된 서열 또는 GenBank 수탁 번호 ACP30487.1에 제시된 아미노산 서열에 대해 95% 이상의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 경우에, DUX4 폴리펩티드는 GenBank 수탁 번호 ADK24717.1에 제시된 서열 또는 GenBank 수탁 번호 ADK24717.1에 제시된 아미노산 서열에 대해 95% 이상의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 경우에, DUX4 폴리펩티드는 GenBank 수탁 번호 ADK24690.1에 제시된 서열 또는 GenBank 수탁 번호 ADK24690.1에 제시된 아미노산 서열에 대해 95% 이상의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 경우에, DUX4 폴리펩티드는 GenBank 수탁 번호 ADK24689.1에 제시된 서열 또는 GenBank 수탁 번호 ADK24689.1에 제시된 아미노산 서열에 대해 95% 이상의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 경우에, DUX4 폴리펩티드는 GenBank 수탁 번호 ADK24692.1에 제시된 서열 또는 GenBank 수탁 번호 ADK24692.1에 제시된 아미노산 서열에 대해 95% 이상의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 경우에, DUX4 폴리펩티드는 GenBank 수탁 번호 ADK24693.1에 제시된 서열 또는 GenBank 수탁 번호 ADK24693.1에 제시된 아미노산 서열에 대해 95% 이상의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 경우에, DUX4 폴리펩티드는 GenBank 수탁 번호 ADK24712.1에 제시된 서열 또는 GenBank 수탁 번호 ADK24712.1에 제시된 아미노산 서열에 대해 95% 이상의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 경우에, DUX4 폴리펩티드는 GenBank 수탁 번호 ADK24691.1에 제시된 서열 또는 GenBank 수탁 번호 ADK24691.1에 제시된 아미노산 서열에 대해 95% 이상의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 경우에, DUX4 폴리펩티드는 UniProt 번호 P0CJ87.1에 제시된 서열 또는 UniProt 번호 P0CJ87.1에 제시된 아미노산 서열에 대해 95% 이상의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 경우에, DUX4 폴리펩티드는 GenBank 수탁 번호 ADK24714.1에 제시된 서열 또는 GenBank 수탁 번호 ADK24714.1에 제시된 아미노산 서열에 대해 95% 이상의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 경우에, DUX4 폴리펩티드는 GenBank 수탁 번호 ADK24684.1에 제시된 서열 또는 GenBank 수탁 번호 ADK24684.1에 제시된 아미노산 서열에 대해 95% 이상의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 경우에, DUX4 폴리펩티드는 GenBank 수탁 번호 ADK24695.1에 제시된 서열 또는 GenBank 수탁 번호 ADK24695.1에 제시된 아미노산 서열에 대해 95% 이상의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 경우에, DUX4 폴리펩티드는 GenBank 수탁 번호 ADK24699.1에 제시된 서열 또는 GenBank 수탁 번호 ADK24699.1에 제시된 아미노산 서열에 대해 95% 이상의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 경우에, DUX4 폴리펩티드는 NCBI RefSeq 번호 NP_001768.1에 제시된 서열 또는 NCBI RefSeq 번호 NP_001768에 제시된 아미노산 서열에 대해 95% 이상의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 경우에, DUX4 폴리펩티드는 NCBI RefSeq No. NP_942088.1에 제시된 서열 또는 NCBI RefSeq No. NP_942088.1에 제시된 아미노산 서열과 95% 이상의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 경우에, DUX4 폴리펩티드는 PCT/US2020/44635에 제공된 서열번호 28 또는 PCT/US2020/44635에 제공된 서열번호 28의 아미노산 서열과 95% 이상의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 경우에, DUX4 폴리펩티드는 PCT/US2020/44635에 제공된 서열번호 29 또는 PCT/US2020/44635에 제공된 서열번호 29의 아미노산 서열에 대해 95% 이상의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다.
다른 실시양태에서, 관용원성 인자의 발현은 발현 벡터를 사용하여 용이해진다. 일부 실시양태에서, 발현 벡터는 DUX4 단백질 서열을 보존하면서 CpG 부위의 총 수를 감소시키기 위한 하나 이상의 염기 치환을 포함하는 코돈 변경된 서열인 DUX4를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함한다. 일부 경우에, DUX4의 코돈 변경된 서열은 PCT/US2020/44635의 서열번호 1을 포함한다. 일부 경우에, DUX4의 코돈 변경된 서열은 PCT/US2020/44635의 서열번호 1이다. 다른 실시양태에서, 발현 벡터는 PCT/US2020/44635의 서열번호 1을 포함하는 DUX4를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 발현 벡터는 PCT/US2020/44635의 서열번호 2, 서열번호 3, 서열번호 4, 서열번호 5, 서열번호 6, 서열번호 7, 서열번호 8, 서열번호 9, 서열번호 10, 서열번호 11, 서열번호 12, 서열번호 13, 서열번호 14, 서열번호 15, 서열번호 16, 서열번호 17, 서열번호 18, 서열번호 19, 서열번호 20, 서열번호 21, 서열번호 22, 서열번호 23, 서열번호 24, 서열번호 25, 서열번호 26, 서열번호 27, 서열번호 28 및 서열번호 29를 포함하는 군으로부터 선택된 서열에 대해 95% 이상의 서열 동일성을 갖는 DUX4 폴리펩티드 서열을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 발현 벡터는 PCT/US2020/44635의 서열번호 2, 서열번호 3, 서열번호 4, 서열번호 5, 서열번호 6, 서열번호 7, 서열번호 8, 서열번호 9, 서열번호 10, 서열번호 11, 서열번호 12, 서열번호 13, 서열번호 14, 서열번호 15, 서열번호 16, 서열번호 17, 서열번호 18, 서열번호 19, 서열번호 20, 서열번호 21, 서열번호 22, 서열번호 23, 서열번호 24, 서열번호 25, 서열번호 26, 서열번호 27, 서열번호 28 및 서열번호 29를 포함하는 군으로부터 선택된 DUX4 폴리펩티드 서열을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함한다.
DUX4 발현의 증가는 웨스턴 블롯, ELISA 검정, FACS 검정 및 면역검정 등과 같은 알려진 기술을 사용하여 검정될 수 있다.
M. 추가적인 관용원성 인자
많은 실시양태에서, 하나 이상의 관용원성 인자는 게놈-편집된 세포 내로 삽입되거나 재삽입되어, 면역-특권 보편적인 공여자 세포, 예컨대, 보편적인 공여자 줄기 세포, 보편적인 공여자 T 세포, 또는 보편적인 공여자 세포를 생성할 수 있다. 특정 실시양태에서, 본원에 개시된 저면역원성 세포는 하나 이상의 관용원성 인자를 발현하도록 추가로 변형되었다. 예시적인 관용원성 인자는 제한 없이, CD47, DUX4, CD24, CD27, CD35, CD46, CD55, CD59, CD200, HLA-C, HLA-E, HLA-E 중쇄, HLA-G, PD-L1, IDO1, CTLA4-Ig, C1-억제제, IL-10, IL-35, FasL, CCL21, CCL22, Mfge8, CD16, CD52, H2-M3, CD16 Fc 수용체, IL15-RF 및 Serpinb9 중 하나 이상을 포함한다. 일부 실시양태에서, 관용원성 인자는 CD200, HLA-G, HLA-E, HLA-C, HLA-E 중쇄, PD-L1, IDO1, CTLA4-Ig, IL-10, IL-35, FasL, Serpinb9, CCL21, CCL22 및 Mfge8로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, 관용원성 인자는 DUX4, HLA-C, HLA-E, HLA-F, HLA-G, PD-L1, CTLA-4-Ig, C1-억제제 및 IL-35로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, 관용원성 인자는 HLA-C, HLA-E, HLA-F, HLA-G, PD-L1, CTLA-4-Ig, C1-억제제 및 IL-35로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, 관용원성 인자는 CD47, DUX4, CD24, CD27, CD35, CD46, CD55, CD59, CD200, HLA-C, HLA-E, HLA-E 중쇄, HLA-G, PD-L1, IDO1, CTLA4-Ig, C1-억제제, IL-10, IL-35, FasL, CCL21, CCL22, Mfge8, CD16, CD52, H2-M3, CD16 Fc 수용체, IL15-RF 및 Serpinb9를 포함하는 군으로부터 선택된다.
일부 실시양태에서, 하나 이상의 관용원성 인자를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 바이러스 형질도입을 사용하여 T 세포의 하나 이상의 대립유전자 내로 삽입된다. 일부 실시양태에서, 하나 이상의 관용원성 인자를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 렌티바이러스 기반 바이러스 벡터를 사용하여 T 세포의 하나 이상의 대립유전자 내로 삽입된다. 일부 실시양태에서, 렌티바이러스 기반 바이러스 벡터는 하나 이상의 관용원성 인자를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 운반하는 슈도타이핑된 자기-비활성화 렌티바이러스 벡터이다. 일부 실시양태에서, 렌티바이러스 기반 바이러스 벡터는 수포성 구내염 VSV-G 외피로 슈도타이핑되고 하나 이상의 관용원성 인자를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 운반하는 자기-비활성화 렌티바이러스 벡터이다.
인간 CD27 (CD27L 수용체, 종양 괴사 인자 수용체 슈퍼패밀리 구성원 7, TNFSF7, T 세포 활성화 항원 S152, Tp55 및 T14로서 또한 알려져 있음)에 대한 유용한 게놈적, 폴리뉴클레오티드 및 폴리펩티드 정보는 예를 들어, GeneCard 식별자 GC12P008144, HGNC 번호 11922, NCBI Gene ID 939, Uniprot 번호 P26842, 및 NCBI RefSeq 번호 NM_001242.4 및 NP_001233.1에 제공되어 있다.
인간 CD46에 대한 유용한 게놈적, 폴리뉴클레오티드 및 폴리펩티드 정보는 예를 들어, GeneCard 식별자 GC01P207752, HGNC 번호 6953, NCBI Gene ID 4179, Uniprot 번호 P15529, 및 NCBI RefSeq 번호 NM_002389.4, NM_153826.3, NM_172350.2, NM_172351.2, NM_172352.2 NP_758860.1, NM_172353.2, NM_172359.2, NM_172361.2, NP_002380.3, NP_722548.1, NP_758860.1, NP_758861.1, NP_758862.1, NP_758863.1, NP_758869.1, 및 NP_758871.1에 제공되어 있다.
인간 CD55 (보체 붕괴-촉진 인자로서 또한 알려짐)에 대한 유용한 게놈적, 폴리뉴클레오티드 및 폴리펩티드 정보는 예를 들어, GeneCard 식별자 GC01P207321, HGNC No. 2665, NCBI Gene ID 1604, Uniprot 번호 P08174, 및 NCBI RefSeq 번호 NM_000574.4, NM_001114752.2, NM_001300903.1, NM_001300904.1, NP_000565.1, NP_001108224.1, NP_001287832.1, 및 NP_001287833.1에 제공되어 있다.
인간 CD59에 대한 유용한 게놈적, 폴리뉴클레오티드 및 폴리펩티드 정보는 예를 들어, GeneCard 식별자 GC11M033704, HGNC 번호 1689, NCBI Gene ID 966, Uniprot 번호 P13987, 및 NCBI RefSeq 번호 NP_000602.1, NM_000611.5, NP_001120695.1, NM_001127223.1, NP_001120697.1, NM_001127225.1, NP_001120698.1, NM_001127226.1, NP_001120699.1, NM_001127227.1, NP_976074.1, NM_203329.2, NP_976075.1, NM_203330.2, NP_976076.1, 및 NM_203331.2에 제공되어 있다.
인간 CD200에 대한 유용한 게놈적, 폴리뉴클레오티드 및 폴리펩티드 정보는 예를 들어, GeneCard 식별자 GC03P112332, HGNC 번호 7203, NCBI Gene ID 4345, Uniprot 번호 P41217, 및 NCBI RefSeq 번호 NP_001004196.2, NM_001004196.3, NP_001305757.1, NM_001318828.1, NP_005935.4, NM_005944.6, XP_005247539.1, 및 XM_005247482.2에 제공되어 있다.
인간 HLA-C에 대한 유용한 게놈적, 폴리뉴클레오티드 및 폴리펩티드 정보는 예를 들어, GeneCard 식별자 GC06M031272, HGNC 번호 4933, NCBI Gene ID 3107, Uniprot 번호 P10321, 및 NCBI RefSeq 번호 NP_002108.4 및 NM_002117.5에 제공되어 있다.
인간 HLA-E에 대한 유용한 게놈적, 폴리뉴클레오티드 및 폴리펩티드 정보는 예를 들어, GeneCard 식별자 GC06P047281, HGNC 번호 4962, NCBI Gene ID 3133, Uniprot 번호 P13747, 및 NCBI RefSeq 번호 NP_005507.3 및 NM_005516.5에 제공되어 있다.
인간 HLA-G에 대한 유용한 게놈적, 폴리뉴클레오티드 및 폴리펩티드 정보는 예를 들어, GeneCard 식별자 GC06P047256, HGNC 번호 4964, NCBI Gene ID 3135, Uniprot 번호 P17693, 및 NCBI RefSeq 번호 NP_002118.1 및 NM_002127.5에 제공되어 있다.
인간 PD-L1 또는 CD274에 대한 유용한 게놈적, 폴리뉴클레오티드 및 폴리펩티드 정보는 예를 들어, GeneCard 식별자 GC09P005450, HGNC 번호 17635, NCBI Gene ID 29126, Uniprot 번호 Q9NZQ7, 및 NCBI RefSeq 번호 NP_001254635.1, NM_001267706.1, NP_054862.1, 및 NM_014143.3에 제공되어 있다.
인간 IDO1에 대한 유용한 게놈적, 폴리뉴클레오티드 및 폴리펩티드 정보는 예를 들어, GeneCard 식별자 GC08P039891, HGNC 번호 6059, NCBI Gene ID 3620, Uniprot 번호 P14902, 및 NCBI RefSeq 번호 NP_002155.1 및 NM_002164.5에 제공되어 있다.
인간 IL-10에 대한 유용한 게놈적, 폴리뉴클레오티드 및 폴리펩티드 정보는 예를 들어, GeneCard 식별자 GC01M206767, HGNC 번호 5962, NCBI Gene ID 3586, Uniprot 번호 P22301, 및 NCBI RefSeq 번호 NP_000563.1 및 NM_000572.2에 제공되어 있다.
인간 Fas 리간드 (이는 FasL, FASLG, CD178 및 TNFSF6 등으로서 알려져 있음)에 대한 유용한 게놈적, 폴리뉴클레오티드 및 폴리펩티드 정보는 예를 들어, GeneCard 식별자 GC01P172628, HGNC 번호 11936, NCBI Gene ID 356, Uniprot 번호 P48023, 및 NCBI RefSeq 번호 NP_000630.1, NM_000639.2, NP_001289675.1, 및 NM_001302746.1에 제공되어 있다.
인간 CCL21에 대한 유용한 게놈적, 폴리뉴클레오티드 및 폴리펩티드 정보는 예를 들어, GeneCard 식별자 GC09M034709, HGNC 번호 10620, NCBI Gene ID 6366, Uniprot 번호 O00585, 및 NCBI RefSeq 번호 NP_002980.1 및 NM_002989.3에 제공되어 있다.
인간 CCL22에 대한 유용한 게놈적, 폴리뉴클레오티드 및 폴리펩티드 정보는 예를 들어, GeneCard 식별자 GC16P057359, HGNC 번호 10621, NCBI Gene ID 6367, Uniprot 번호 O00626, 및 NCBI RefSeq 번호 NP_002981.2, NM_002990.4, XP_016879020.1, 및 XM_017023531.1에 제공되어 있다.
인간 MFGE8에 대한 유용한 게놈적, 폴리뉴클레오티드 및 폴리펩티드 정보는 예를 들어, GeneCard 식별자 GC15M088898, HGNC 번호 7036, NCBI Gene ID 4240, Uniprot 번호 Q08431, 및 NCBI RefSeq 번호 NP_001108086.1, NM_001114614.2, NP_001297248.1, NM_001310319.1, NP_001297249.1, NM_001310320.1, NP_001297250.1, NM_001310321.1, NP_005919.2, 및 NM_005928.3에 제공되어 있다.
인간 SerpinB9에 대한 유용한 게놈적, 폴리뉴클레오티드 및 폴리펩티드 정보는 예를 들어, GeneCard 식별자 GC06M002887, HGNC 번호 8955, NCBI Gene ID 5272, Uniprot 번호 P50453, 및 NCBI RefSeq 번호 NP_004146.1, NM_004155.5, XP_005249241.1, 및 XM_005249184.4에 제공되어 있다.
유전자 및 인자 (단백질)의 발현을 조정하는 방법은 게놈 편집 기술, RNA 또는 단백질 발현 기술 등을 포함한다. 이들 기술 모두에 대해, 본원에 약술된 바와 같은 재조합 핵산을 생성하기 위해 잘 알려진 재조합 기술이 사용된다.
일부 실시양태에서, 세포 (예컨대, 줄기 세포, 유도 만능 줄기 세포, 분화된 세포, 조혈 줄기 세포, 일차 T 세포 또는 CAR-T 세포)는 B2M 및 CIITA 유전자를 비활성화시키고 CD47 및 DUX4, CD47 및 CD24, CD47 및 CD27, CD47 및 CD46, CD47 및 CD55, CD47 및 CD59, CD47 및 CD200, CD47 및 HLA-C, CD47 및 HLA-E, CD47 및 HLA-E 중쇄, CD47 및 HLA-G, CD47 및 PD-L1, CD47 및 IDO1, CD47 및 CTLA4-Ig, CD47 및 C1-억제제, CD47 및 IL-10, CD47 및 IL-35, CD47 및 IL-39, CD47 및 FasL, CD47 및 CCL21, CD47 및 CCL22, CD47 및 Mfge8, 및 CD47 및 Serpinb9, 및 이들의 임의의 조합을 포함하는 군으로부터 선택된 복수의 외인성 폴리펩티드를 발현하는 유전자 변형을 보유한다. 일부 경우에, 이러한 세포는 또한 CD142 유전자를 비활성화시키는 유전자 변형을 보유한다.
일부 경우에, 유전자 편집 시스템, 예컨대, CRISPR/Cas 시스템은 세이프 하버 또는 표적 유전자좌, 예컨대, AAVS1 유전자좌 내로 관용원성 인자와 같은 관용원성 인자의 삽입을 용이하게 하여, 능동적으로 면역 거부를 억제하는 데 사용된다. 일부 경우에, 관용원성 인자는 발현 벡터를 사용하여 세이프 하버 또는 표적 유전자좌 내로 삽입된다. 일부 실시양태에서, 세이프 하버 또는 표적 유전자좌는 AAVS1, CCR5, CLYBL, ROSA26, SHS231, F3 (CD142로서 또한 알려짐), MICA, MICB, LRP1 (CD91로서 또한 알려짐), HMGB1, ABO, RHD, FUT1, 또는 KDM5D 유전자 유전자좌이다.
일부 실시양태에서, 표적 유전자 (예컨대, DUX4, CD47 또는 다른 관용원성 인자 유전자)의 발현은 (1) 내인성 표적 유전자 (예컨대, DUX4, CD47 또는 다른 관용원성 인자 유전자)에 특이적인 부위-특이적 결합 도메인 및 (2) 전사 활성화제를 함유하는 융합 단백질 또는 단백질 복합체의 발현에 의해 증가된다.
일부 실시양태에서, 조절 인자는 가이드 RNA (gRNA)와 같은 부위 특이적 DNA-결합 핵산 분자를 포함한다. 일부 실시양태에서, 방법은 부위 특이적 DNA-결합 표적화된 단백질, 예컨대, 징크 핑거 단백질 (ZFP) 또는 ZFP를 함유하는 융합 단백질에 의해 달성되며, 이는 또한 징크 핑거 뉴클레아제 (ZFN)로서 알려져 있다.
일부 실시양태에서, 조절 인자는 DNA 결합 단백질 또는 DNA-결합 핵산을 사용하는 것과 같은 부위-특이적 결합 도메인을 포함하며, 이는 표적화된 영역에서 유전자에 특이적으로 결합하거나, 이와 혼성화된다. 일부 실시양태에서, 제공된 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드는 변형된 뉴클레아제와 같은 부위-특이적 뉴클레아제에 커플링되거나 이와 복합체화된다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 투여는 변형된 뉴클레아제, 예컨대, 메가뉴클레아제 또는 RNA-가이드된 뉴클레아제, 예컨대, 클러스터링된 규칙적으로 산재된 짧은 회문 핵산 (CRISPR)-Cas 시스템, 예컨대, CRISPR-Cas9 시스템의 DNA-표적화 단백질을 포함하는 융합을 사용하여 수행된다. 일부 실시양태에서, 뉴클레아제는 뉴클레아제 활성이 결여되도록 변형된다. 일부 실시양태에서, 변형된 뉴클레아제는 촉매적으로 사멸된 dCas9이다.
일부 실시양태에서, 부위 특이적 결합 도메인은 뉴클레아제로부터 유래될 수 있다. 예를 들어, 귀소 엔도뉴클레아제 및 메가뉴클레아제의 인식 서열, 예컨대, I-SceI, I-CeuI, PI-PspI, PI-Sce, I-SceIV, I-CsmI, I-PanI, I-SceII, I-PpoI, I-SceIII, I-CreI, I-TevI, I-TevII 및 I-TevIII. 또한 미국 특허 번호 5,420,032; 미국 특허 번호 6,833,252; Belfort 등, (1997) Nucleic Acids Res. 25:3379-3388; Dujon 등, (1989) Gene 82:115-118; Perler 등, (1994) Nucleic Acids Res. 22, 1125-1127; Jasin (1996) Trends Genet. 12:224-228; Gimble 등, (1996) J. Mol. Biol. 263:163-180; Argast 등, (1998) J. Mol. Biol. 280:345-353 및 New England Biolabs 카탈로그 참고한다. 게다가, 귀소 엔도뉴클레아제 및 메가뉴클레아제의 DNA-결합 특이성은 비-자연 표적 부위에 결합하도록 조작될 수 있다. 예를 들어, Chevalier 등, (2002) Molec. Cell 10:895-905; Epinat 등, (2003) Nucleic Acids Res. 31 :2952-2962; Ashworth 등, (2006) Nature 441 :656-659; Paques 등, (2007) Current Gene Therapy 7:49-66; 미국 특허 공개공보 번호 2007/0117128 참고한다.
징크 핑거, TALE 및 CRISPR 시스템 결합 도메인은 예를 들어, 자연 발생 징크 핑거 또는 TALE 단백질의 인식 나선 영역의 조작 (하나 이상의 아미노산 변경)을 통해 소정된 뉴클레오티드 서열에 결합하도록 "조작"될 수 있다. 조작된 DNA 결합 단백질 (징크 핑거 또는 TALE)은 비-자연 발생하는 단백질이다. 설계를 위한 합리적인 기준은 기존 ZFP 및/또는 TALE 설계 및 결합 데이터의 정보를 저장하는 데이터베이스에서 정보를 처리하기 위한 치환 규칙 및 컴퓨터화된 알고리즘의 적용을 포함한다. 예를 들어, 미국 특허 번호 6,140,081; 6,453,242; 및 6,534,261 참고; 또한 WO 98/53058; WO 98/53059; WO 98/53060; WO 02/016536 및 WO 03/016496 및 미국 공개공보 번호 20110301073 참고한다.
일부 실시양태에서, 부위-특이적 결합 도메인은 서열-특이적 방식으로 DNA에 결합하는 하나 이상의 징크-핑거 단백질 (ZFP) 또는 이의 도메인을 포함한다. ZFP 또는 이의 도메인은 아연 이온의 배위를 통해 구조가 안정화되는 결합 도메인 내의 아미노산 서열의 영역인 하나 이상의 징크 핑거를 통해 서열-특이적 방식으로 DNA에 결합하는 더 큰 단백질 내의 단백질 또는 도메인이다.
ZFP 중에는 개별 핑거의 조립에 의해 생성된 전형적으로 9-18 개의 뉴클레오티드 길이의 특이적 DNA 서열을 표적화하는 인공 ZFP 도메인이 있다. ZFP는 단일 핑거 도메인이 대략 30 개의 아미노산 길이이고 아연을 통해 조정된 2 개의 불변 히스티딘 잔기와 단일 베타 회전의 2 개의 시스테인을 함유하고 2, 3, 4, 5 또는 6 개의 핑거를 갖는 알파 나선을 함유하는 것들을 포함한다. 일반적으로, ZFP의 서열-특이성은 징크 핑거 인식 나선 상의 4 개의 나선 위치 (-1, 2, 3 및 6)에서 아미노산 치환을 함으로써 변경될 수 있다. 따라서, 일부 실시양태에서, ZFP 또는 ZFP-함유 분자는 비-자연 발생적이며, 예컨대, 선택된 표적 부위에 결합하도록 조작된다. 예를 들어, 모두가 그 전체가 본원에 참조로 원용되는, Beerli 등 (2002) Nature Biotechnol. 20:135-141; Pabo 등 (2001) Ann. Rev. Biochem. 70:313-340; Isalan 등 (2001) Nature Biotechnol. 19:656-660; Segal 등 (2001) Curr. Opin. Biotechnol. 12:632-637; Choo 등 (2000) Curr. Opin. Struct. Biol. 10:411-416; 미국 특허 번호 6,453,242; 6,534,261; 6,599,692; 6,503,717; 6,689,558; 7,030,215; 6,794,136; 7,067,317; 7,262,054; 7,070,934; 7,361,635; 7,253,273; 및 미국 특허 공개공보 번호 2005/0064474; 2007/0218528; 2005/0267061을 참고한다.
많은 유전자-특이적 조작된 징크 핑거가 상업적으로 이용가능하다. 예를 들어, Sangamo Biosciences (Richmond, CA, USA)는 Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA)와 협력하여 징크-핑거 작제를 위한 플랫폼 (CompoZr)을 개발하여, 조사자들이 징크-핑거 작제 및 검증을 전제적으로 우회할 수 있도록 하고, 수천 개의 단백질에 대해 구체적으로 표적화된 징크 핑거를 제공한다 (Gaj 등, Trends in Biotechnology, 2013, 31(7), 397-405). 일부 실시양태에서, 상업적으로 이용가능한 징크 핑거가 사용되거나 맞춤 설계된다.
일부 실시양태에서, 부위-특이적 결합 도메인은 자연 발생 또는 조작된 (비-자연 발생) 전사 활성화제-유사 단백질 (TAL) DNA 결합 도메인, 예컨대, 전사 활성화제-유사 단백질 이펙터 (TALE) 단백질을 포함하며, 예컨대, 그 전체가 본원에 참조로 원용되는 미국 특허 공개공보 번호 20110301073을 참고한다.
일부 실시양태에서, 부위-특이적 결합 도메인은 CRISPR/Cas 시스템으로부터 유래된다. 일반적으로, "CRISPR 시스템"은 Cas 유전자를 코딩하는 서열, tracr (트랜스-활성화 CRISPR) 서열 (예컨대, tracrRNA 또는 활성 부분적 tracrRNA), tracr-메이트 서열 (내인성 CRISPR 시스템의 맥락에서 "직접 반복물" 및 tracrRNA-처리된 부분 직접 반복물을 포함), 가이드 서열 (내인성 CRISPR 시스템의 맥락에서 "스페이서" 또는 "표적화 서열"로서 또한 지칭됨) 및/또는 CRISPR 유전자좌로부터의 다른 서열 및 전사물을 포함하여 CRISPR-연관된 ("Cas") 유전자의 발현에 관련된 또는 이의 활성을 지시하는 전사물 및 기타 요소를 총체적으로 지칭한다.
일반적으로, 가이드 서열은 표적 서열과 혼성화하고 표적 서열에 대한 CRISPR 복합체의 서열-특이적 결합을 지시하기 위해 표적 폴리뉴클레오티드 서열과 충분한 상보성을 갖는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 표적화 도메인을 포함한다. 일부 실시양태에서, 적합한 정렬 알고리즘을 사용하여 최적으로 정렬될 때 가이드 서열 및 이의 상응하는 표적 서열 사이의 상보성의 정도는 약 또는 약 50%, 60%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97.5%, 99% 초과 또는 그 초과이다. 일부 예에서, gRNA의 표적화 도메인은 상보적이며, 예컨대, 표적 핵산 상의 표적 서열에 대해 80, 85, 90, 95, 98 또는 99% 이상 상보적, 예컨대, 완전히 상보적이다.
일부 실시양태에서, 표적 부위는 표적 유전자의 전사 개시 부위의 업스트림이다. 일부 실시양태에서, 표적 부위는 유전자의 전사 개시 부위에 인접한다. 일부 실시양태에서, 표적 부위는 유전자의 전사 개시 부위의 다운스트림의 RNA 중합효소 정지 부위에 인접한다.
일부 실시양태에서, 표적화 도메인은 표적 유전자의 프로모터 영역을 표적화하여, 전사 개시, 하나 이상의 전사 인핸서 또는 활성화제의 결합 및/또는 RNA 중합효소를 촉진하도록 구성된다. 하나 이상의 gRNA를 사용하여 유전자의 프로모터 영역을 표적화할 수 있다. 일부 실시양태에서, 유전자의 하나 이상의 영역이 표적화될 수 있다. 특정 양태에서, 표적 부위는 유전자의 전사 출발 부위 (TSS)의 어느 하나의 측면 상의 600 개의 염기쌍 내에 있다.
프로모터 및 활성화제를 포함하는 조절 영역의 엑손 서열 및 서열들을 포함하는, 유전자를 표적화하는 서열이거나 이를 포함하는 gRNA 서열을 설계하거나 식별하는 것은 당업자의 수준 내에 있다. CRISPR 게놈 편집을 위한 게놈 전체 gRNA 데이터베이스는 공개적으로 이용가능하며, 이는 인간 게놈 또는 마우스 게놈에 있는 유전자의 구성적 엑손에 예시적인 단일 가이드 RNA (sgRNA) 표적 서열을 함유한다 (예컨대, genescript.com/gRNA-database.html 참고; 또한, Sanjana 등 (2014) Nat. Methods, 11:783-4; www.e-crisp.org/E-CRISP/; crispr.mit.edu/ 참고). 일부 실시양태에서, gRNA 서열은 비-표적 유전자에 대한 최소의 오프-표적 결합을 갖는 서열이거나 이를 포함한다.
일부 실시양태에서, 조절 인자는 기능적 도메인, 예컨대, 전사 활성화제를 추가로 포함한다.
일부 실시양태에서, 전사 활성화제는 표적 유전자의 하나 이상의 조절 요소, 예컨대, 하나 이상의 전사 제어 요소이거나 이를 포함하며, 그에 의해 위에 제공된 바와 같은 부위-특이적 도메인은 이러한 유전자의 발현을 구동하기 위해 인식된다. 일부 실시양태에서, 전사 활성화제는 표적 유전자의 발현을 구동한다. 일부 경우에, 전사 활성화제는 이종 트랜스활성화 도메인의 전부 또는 일부일 수 있거나 이를 함유할 수 있다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 전사 활성화제는 단순 포진-유래된 트랜스활성화 도메인, Dnmt3a 메틸트랜스퍼라제 도메인, p65, VP16 및 VP64로부터 선택된다.
일부 실시양태에서, 조절 인자는 징크 핑거 전사 인자 (ZF-TF)이다. 일부 실시양태에서, 조절 인자는 VP64-p65-Rta (VPR)이다.
특정 실시양태에서, 조절 인자는 전사 조절 도메인을 추가로 포함한다. 공통 도메인은 예컨대, 전사 인자 도메인 (활성화제, 억제인자, 공동-활성화제, 공동-억제인자), 침묵자, 발암유전자 (예컨대, myc, jun, fos, myb, max, mad, rel, ets, bcl, myb, mos 패밀리 등); DNA 복구 효소 및 이들의 연관된 인자 및 변경자; DNA 재배열 효소 및 이들의 연관된 인자 및 변경자; 염색질 회합된 단백질 및 이들의 변경자 (예컨대, 키나제, 아세틸라제 및 데아세틸라제); 및 DNA 변형 효소 (예컨대, DNMT 패밀리의 구성원과 같은 메틸트랜스퍼라제 (예컨대, DNMT1, DNMT3A, DNMT3B, DNMT3L 등, 토포이소머라제, 헬리카제, 리가제, 키나제, 포스파타제, 폴리머라제, 엔도뉴클레아제) 및 이들의 연관된 인자 및 변경자를 포함한다. 예컨대, 그 전체가 본원에 참조로 원용되는 미국 공개공보 번호 2013/0253040을 참고한다.
활성화를 달성하기 위한 적합한 도메인은 HSV VP 16 활성화 도메인 (예컨대, Hagmann 등, J. Virol. 71, 5952-5962 (1 97) 참고) 핵 호르몬 수용체 (예컨대, Torchia 등, Curr. Opin. Cell. Biol. 10:373-383 (1998) 참고); 핵 인자 카파 B의 p65 서브유닛 (Bitko & Bank, J. Virol. 72:5610-5618 (1998) 및 Doyle & Hunt, Neuroreport 8:2937-2942 (1997)); Liu 등, Cancer Gene Ther. 5:3-28 (1998)), 또는 인공 키메라 기능적 도메인, 예컨대, VP64 (Beerli 등, (1998) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95:14623-33), 및 데그론 (Molinari 등, (1999) EMBO J. 18, 6439-6447)을 포함한다. 추가적인 예시적인 활성화 도메인은 Oct 1, Oct-2A, Spl, AP-2 및 CTF1 (Seipel etal, EMBOJ. 11, 4961-4968 (1992) 뿐만 아니라, p300, CBP, PCAF, SRC1 PvALF, AtHD2A 및 ERF-2를 포함한다. 예를 들어, Robyr 등, (2000) Mol. Endocrinol. 14:329-347; Collingwood 등, (1999) J. Mol. Endocrinol 23:255-275; Leo 등, (2000) Gene 245:1-11; Manteuffel-Cymborowska (1999) Acta Biochim. Pol. 46:77-89; McKenna 등, (1999) J. Steroid Biochem. Mol. Biol. 69:3-12; Malik 등, (2000) Trends Biochem. Sci. 25:277-283; 및 Lemon 등, (1999) Curr. Opin. Genet. Dev. 9:499-504 참고한다. 추가적인 예시적인 활성화 도메인은 OsGAI, HALF-1, Cl, AP1, ARF-5, -6,-1 및 -8, CPRF1, CPRF4, MYC-RP/GP, 및 TRAB1을 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 예를 들어, Ogawa 등, (2000) Gene 245:21-29; Okanami 등, (1996) Genes Cells 1 :87-99; Goff 등, (1991) Genes Dev. 5:298-309; Cho 등, (1999) Plant Mol Biol 40:419-429; Ulmason 등, (1999) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96:5844-5849; Sprenger-Haussels 등, (2000) Plant J. 22:1-8; Gong 등, (1999) Plant Mol. Biol. 41:33-44; 및 Hobo 등, (1999) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96:15,348-15,353 참고한다.
유전적 억제인자를 만들기 위해 사용될 수 있는 예시적인 억압 도메인은 KRAB A/B, KOX, TGF-베타-유도성 초기 유전자 (TIEG), v-erbA, SID, MBD2, MBD3, DNMT 패밀리의 구성원 (예컨대, DNMT1, DNMT3A, DNMT3B, DNMT3L 등), Rb 및 MeCP2를 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 예를 들어, Bird 등, (1999) Cell 99:451-454; Tyler 등, (1999) Cell 99:443-446; Knoepfler 등, (1999) Cell 99:447-450; 및 Robertson 등, (2000) Nature Genet. 25:338-342 참고한다. 추가적인 예시적인 억압 도메인은 ROM2 및 AtHD2A를 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 예를 들어, Chem 등, (1996) Plant Cell 8:305-321; 및 Wu 등, (2000) Plant J. 22:19-27 참고한다.
일부 경우에, 도메인은 염색체의 후생적 조절에 관여한다. 일부 실시양태에서, 도메인은 히스톤 아세틸트랜스퍼라제 (HAT), 예컨대, 핵 국소화된 유형-A, 예컨대, MYST 패밀리 구성원 MOZ, Ybf2/Sas3, MOF 및 Tip60, GNAT 패밀리 구성원 Gcn5 또는 pCAF, p300 패밀리 구성원 CBP, p300 또는 Rttl09이다 (Bemdsen and Denu (2008) Curr Opin Struct Biol 18(6):682-689). 다른 경우에, 도메인은 히스톤 데아실라제 (HD AC), 예컨대, 클래스 I (HDAC-1, 2, 3 및 8), 클래스 II (HDAC IIA (HDAC-4, 5, 7 및 9), HD AC IIB (HDAC 6 및 10)), 클래스 IV (HDAC-11), 클래스 III (시르투인 (SIRT)으로서 또한 알려짐; SIRT1-7)이다n(Mottamal 등, (2015) Molecules 20(3):3898-394l 참고). 일부 실시양태에서 사용되는 다른 도메인은 히스톤 포스포릴라제 또는 키나제이며, 여기서 예는 MSK1, MSK2, ATR, ATM, DNA-PK, Bubl, VprBP, IKK-a, PKCpi, Dik/Zip, JAK2, PKC5, WSTF 및 CK2를 포함한다. 일부 실시양태에서, 메틸화 도메인이 사용되고, Ezh2, PRMT1/6, PRMT5/7, PRMT 2/6, CARM1, set7/9, MLL, ALL-1, Suv 39h, G9a, SETDB1, Ezh2, Set2, Dot1, PRMT 1/6, PRMT 5/7, PR-Set7 및 Suv4-20h와 같은 그룹으로부터 선택될 수 있다, 수모화 및 비오티닐화에 관여하는 도메인 (Lys9, 13, 4, 18 및 12)은 또한 일부 실시양태에서 사용될 수 있다 (검토는 Kousarides (2007) Cell 128:693-705 참고).
융합 분자는 당업자에게 잘 알려진 클로닝 및 생화학적 컨쥬게이션의 방법에 의해 작제된다. 융합 분자는 DNA-결합 도메인 및 기능적 도메인 (예컨대, 전사 활성화 또는 억압 도메인)을 포함한다. 융합 분자는 또한 임의로 핵 국소화 신호 (예컨대, 예를 들어, SV40 배지 T-항원으로부터의 신호) 및 에피토프 태그 (예컨대, 예를 들어, FLAG 및 헤마글루티닌)를 포함한다. 융합 단백질 (및 이를 코딩하는 핵산)은 융합의 구성요소 간에 번역 리딩 프레임이 보존되도록 설계된다.
한편으로는, 기능적 도메인 (또는 이의 기능적 단편)의 폴리펩티드 구성요소 및 다른 한편으로는 비-단백질 DNA-결합 도메인 (예컨대, 항생제, 인터칼레이터, 마이너 그루브 바인더, 핵산) 사이의 융합물은, 당업자에게 알려진 생화학적 컨쥬게이션의 방법에 의해 작제된다. 예를 들어, Pierce Chemical Company (Rockford, IL) 카탈로그 참고한다. 마이너 그루브 바인더 및 폴리펩티드 사이의 융합을 만드는 방법 및 조성물이 설명되었다. Mapp 등, (2000) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97:3930-3935. 마찬가지로, 폴리펩티드 구성요스 기능 도메인과 회합된 sgRNA 핵산 구성요소를 포함하는 CRISPR/Cas TF 및 뉴클레아제는 또한 당업자에게 알려져 있고 본원에 상세히 설명되어 있다.
일부 실시양태에서, 본 개시내용은 CD47을 발현하도록 세포 게놈이 변형된 게놈을 포함하는 세포 (예컨대, 일차 T 세포 및 저면역원성 줄기 세포 및 이의 유도체) 또는 이의 집단을 제공한다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용은 CD47을 발현하도록 세포 게놈을 변경하는 방법을 제공한다. 특정 실시양태에서, 하나 이상의 리보핵산 또는 한 쌍 이상의 리보핵산은 CD47의 세포주로의 삽입을 용이하게 하기 위해 활용될 수 있다. 특정 실시양태에서, 하나 이상의 리보핵산 또는 한 쌍 이상의 리보핵산은 본원에 참조로 원용되는 WO2016183041의 표 29의 서열번호 200784-231885로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일부 실시양태에서, 본 개시내용은 세포 게놈이 HLA-C를 발현하도록 변형된 게놈을 포함하는 세포 (예컨대, 일차 T 세포 및 저면역원성 줄기 세포 및 이의 유도체) 또는 이의 집단을 제공한다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용은 HLA-C를 발현하도록 세포 게놈을 변경하는 방법을 제공한다. 특정 실시양태에서, 하나 이상의 리보핵산 또는 한 쌍 이상의 리보핵산은 HLA-C의 세포주로의 삽입을 용이하게 하기 위해 활용될 수 있다. 특정 실시양태에서, 하나 이상의 리보핵산 또는 한 쌍 이상의 리보핵산은 본원에 참조로 원용되는 WO2016183041의 표 10의 서열번호 3278-5183으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일부 실시양태에서, 본 개시내용은 세포 게놈이 HLA-E를 발현하도록 변형된 게놈을 포함하는 세포 (예컨대, 일차 T 세포 및 저면역원성 줄기 세포 및 이의 유도체) 또는 이의 집단을 제공한다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용은 HLA-E를 발현하도록 세포 게놈을 변경하는 방법을 제공한다. 특정 실시양태에서, 하나 이상의 리보핵산 또는 한 쌍 이상의 리보핵산은 HLA-E의 세포주로의 삽입을 용이하게 하기 위해 활용될 수 있다. 특정 실시양태에서, 하나 이상의 리보핵산 또는 한 쌍 이상의 리보핵산은 본원에 참조로 원용되는 WO2016183041의 표 19의 서열번호 189859-193183으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일부 실시양태에서, 본 개시내용은 세포 게놈이 HLA-F를 발현하도록 변형된 게놈을 포함하는 세포 (예컨대, 일차 T 세포 및 저면역원성 줄기 세포 및 이의 유도체) 또는 이의 집단을 제공한다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용은 HLA-F를 발현하도록 세포 게놈을 변경하는 방법을 제공한다. 특정 실시양태에서, 하나 이상의 리보핵산 또는 한 쌍 이상의 리보핵산은 HLA-F의 세포주로의 삽입을 용이하게 하기 위해 활용될 수 있다. 특정 실시양태에서, 하나 이상의 리보핵산 또는 한 쌍 이상의 리보핵산은 본원에 참조로 원용되는 WO2016183041의 표 45의 서열번호 688808-399754로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일부 실시양태에서, 본 개시내용은 세포 게놈이 HLA-G를 발현하도록 변형된 게놈을 포함하는 세포 (예컨대, 일차 T 세포 및 저면역원성 줄기 세포 및 이의 유도체) 또는 이의 집단을 제공한다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용은 HLA-G를 발현하도록 세포 게놈을 변경하는 방법을 제공한다. 특정 실시양태에서, 하나 이상의 리보핵산 또는 한 쌍 이상의 리보핵산은 HLA-G의 줄기 세포주로의 삽입을 용이하게 하기 위해 활용될 수 있다. 특정 실시양태에서, 하나 이상의 리보핵산 또는 한 쌍 이상의 리보핵산은 본원에 참조로 원용되는 WO2016183041의 표 18의 서열번호 188372-189858로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일부 실시양태에서, 본 개시내용은 세포 게놈이 PD-L1을 발현하도록 변형된 게놈을 포함하는 세포 (예컨대, 일차 T 세포 및 저면역원성 줄기 세포 및 이의 유도체) 또는 이의 집단을 제공한다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용은 PD-L1을 발현하도록 세포 게놈을 변경하는 방법을 제공한다. 특정 실시양태에서, 하나 이상의 리보핵산 또는 한 쌍 이상의 리보핵산을 PD-L1의 줄기 세포주로의 삽입을 용이하게 하기 위해 활용될 수 있다. 특정 실시양태에서, 하나 이상의 리보핵산 또는 한 쌍 이상의 리보핵산은 본원에 참조로 원용되는 WO2016183041의 표 21의 서열번호 193184-200783으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일부 실시양태에서, 본 개시내용은 세포 게놈이 CTLA4-Ig를 발현하도록 변형된 게놈을 포함하는 세포 (예컨대, 일차 T 세포 및 저면역원성 줄기 세포 및 이의 유도체) 또는 이의 집단을 제공한다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용은 CTLA4-Ig를 발현하도록 세포 게놈을 변경하는 방법을 제공한다. 특정 실시양태에서, 하나 이상의 리보핵산 또는 한 쌍 이상의 리보핵산은 CTLA4-Ig의 줄기 세포주로의 삽입을 용이하게 하기 위해 활용될 수 있다. 특정 실시양태에서, 하나 이상의 리보핵산 또는 한 쌍 이상의 리보핵산은 서열 목록을 포함하여 WO2016183041에 개시된 어느 하나로부터 선택된다.
일부 실시양태에서, 본 개시내용은 세포 게놈이 CI-억제제를 발현하도록 변형된 게놈을 포함하는 세포 (예컨대, 일차 T 세포 및 저면역원성 줄기 세포 및 이의 유도체) 또는 이의 집단을 제공한다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용은 CI-억제제를 발현하도록 세포 게놈을 변경하는 방법을 제공한다. 특정 실시양태에서, 하나 이상의 리보핵산 또는 한 쌍 이상의 리보핵산은 CI-억제제의 줄기 세포주로의 삽입을 용이하게 하기 위해 활용될 수 있다. 특정 실시양태에서, 하나 이상의 리보핵산 또는 한 쌍 이상의 리보핵산은 서열 목록을 포함하여 WO2016183041에 개시된 어느 하나로부터 선택된다.
일부 실시양태에서, 본 개시내용은 세포 게놈이 IL-35를 발현하도록 변형된 게놈을 포함하는 세포 (예컨대, 일차 T 세포 및 저면역원성 줄기 세포 및 이의 유도체) 또는 이의 집단을 제공한다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용은 IL-35를 발현하도록 세포 게놈을 변경하는 방법을 제공한다. 특정 실시양태에서, 하나 이상의 리보핵산 또는 한 쌍 이상의 리보핵산은 IL-35의 줄기 세포주로의 삽입을 용이하게 하기 위해 활용될 수 있다. 특정 실시양태에서, 하나 이상의 리보핵산 또는 한 쌍 이상의 리보핵산은 서열 목록을 포함하여 WO2016183041에 개시된 어느 하나로부터 선택된다.
일부 실시양태에서, 관용원성 인자는 발현 벡터를 사용하여 세포에서 발현된다. 일부 실시양태에서, 관용원성 인자는 관용원성 인자 서열의 세포의 게놈으로의 통합을 매개하는 바이러스 발현 벡터를 사용하여 세포에 도입된다. 예를 들어, 세포에서 CD47을 발현하기 위한 발현 벡터는 CD47을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함한다. 발현 벡터는 유도성 발현 벡터일 수 있다. 발현 벡터는 바이러스 벡터, 예컨대, 비제한적으로 렌티바이러스 벡터일 수 있다. 일부 실시양태에서, 관용원성 인자는 조건부 또는 유도성 트랜스포사제, 조건부 또는 유도성 PiggyBac 트랜스포존, 조건부 또는 유도성 슬리핑 뷰티 (SB11) 트랜스포존, 조건부 또는 유도성 Mos1 트랜스포존, 및 조건부 또는 유도성 Tol2 트랜스포존으로 이루어진 군으로부터 선택된 융합원-매개된 전달 또는 트랜스포사제 시스템을 사용하여 세포 내로 도입된다.
일부 실시양태에서, 본 개시내용은 세포 게놈이 HLA-A, HLA-B, HLA-C, RFX-ANK, CIITA, NFY-A, NLRC5, B2M, RFX5, RFX-AP, HLA-G, HLA-E, NFY-B, PD-L1, NFY-C, IRF1, TAP1, GITR, 4-1BB, CD28, B7-1, CD47, B7-2, OX40, CD27, HVEM, SLAM, CD226, ICOS, LAG3, TIGIT, TIM3, CD160, BTLA, CD244, LFA-1, ST2, HLA-F, CD30, B7-H3, VISTA, TLT, PD-L2, CD58, CD2, HELIOS, 및 IDO1로 이루어진 군으로부터 선택된 폴리펩티드 중 어느 하나를 발현하도록 변형된 게놈을 포함하는 세포 (예컨대, 일차 T 세포 및 저면역원성 줄기 세포 및 이의 유도체) 또는 이의 집단을 제공한다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용은 HLA-A, HLA-B, HLA-C, RFX-ANK, CIITA, NFY-A, NLRC5, B2M, RFX5, RFX-AP, HLA-G, HLA-E, NFY-B, PD-L1, NFY-C, IRF1, TAP1, GITR, 4-1BB, CD28, B7-1, CD47, B7-2, OX40, CD27, HVEM, SLAM, CD226, ICOS, LAG3, TIGIT, TIM3, CD160, BTLA, CD244, LFA-1, ST2, HLA-F, CD30, B7-H3, VISTA, TLT, PD-L2, CD58, CD2, HELIOS, 및 IDO1로 이루어진 군으로부터 선택된 폴리펩티드 중 어느 하나를 발현하도록 세포 게놈을 변경하는 방법을 제공한다. 특정 실시양태에서, 하나 이상의 리보핵산 또는 한 쌍 이상의 리보핵산은 선택된 폴리펩티드의 줄기 세포주로의 삽입을 용이하게 하기 위해 활용될 수 있다. 특정 실시양태에서, 하나 이상의 리보핵산 또는 한 쌍 이상의 리보핵산은 WO2016183041의 부록 1-47 및 서열 목록에 개시된 어느 하나로부터 선택되며, 개시내용은 본원에 참조로 원용된다.
일부 실시양태에서, 적합한 유전자 편집 시스템 (예컨대, CRISPR/Cas 시스템 또는 본원에 기재된 유전자 편집 시스템 중 임의의 것)은 저면역원성 세포의 게놈 유전자좌 내로의, 관용원성 인자를 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 삽입을 용이하게 하기 위해 사용된다. 일부 경우에, 관용원성 인자를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 세이프 하버 또는 표적 유전자좌, 예컨대, 비제한적으로 AAVS1, CCR5, CLYBL, ROSA26, SHS231, F3 (CD142), MICA, MICB, LRP1 (CD91), HMGB1, ABO, RHD, FUT1 또는 KDM5D 유전자 유전자좌 내로 삽입된다. 일부 실시양태에서, 관용원성 인자를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 B2M 유전자 유전자좌, CIITA 유전자 유전자좌, TRAC 유전자 유전자좌, 또는 TRB 유전자 유전자좌 내로 삽입된다. 일부 실시양태에서, 관용원성 인자를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 본원에 제공된 표 15에 묘사된 유전자 유전자좌 중 어느 하나 내로 삽입된다. 특정 실시양태에서, 관용원성 인자를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 프로모터에 작동가능하게 연결된다.
일부 실시양태에서, 세포는 변형을 포함하지 않는 동일한 세포 유형의 세포에 비해 증가된 양의 CD47, DUX4, CD24, CD27, CD35, CD46, CD55, CD59, CD200, HLA-C, HLA-E, HLA-E 중쇄, HLA-G, PD-L1, IDO1, CTLA4-Ig, C1-억제제, IL-10, IL-35, FasL, CCL21, CCL22, Mfge8, CD16, CD52, H2-M3, CD16 Fc 수용체, IL15-RF, 및/또는 Serpinb9중 하나 이상을 발현하도록 조작된다.
N. 키메라 항원 수용체
본원은 키메라 항원 수용체 (CAR)를 포함하는 저면역원성 세포를 제공한다. 일부 실시양태에서, CAR은 CD19에 결합한다. 일부 실시양태에서, CAR은 CD22에 결합한다. 일부 실시양태에서, CAR은 CD19에 결합한다. 일부 실시양태에서, CAR은 CD19 및 CD22에 결합한다. 일부 실시양태에서, CAR은 1세대 CAR, 2세대 CAR, 3세대 CAR 및 4세대 CAR로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, CAR은 단일 표적 항원에 결합하는 단일 결합 도메인을 포함한다. 일부 실시양태에서, CAR은 하나 초과의 표적 항원, 예컨대, 2 또는 3 개 이상의 표적 항원에 결합하는 단일 결합 도메인을 포함한다. 일부 실시양태에서, CAR은 각각의 결합 도메인이 상이한 표적 항원에 결합하도록 2 개의 결합 도메인을 포함한다. 일부 실시양태에서, CAR은 각각의 결합 도메인이 동일한 표적 항원에 결합하도록 2 개의 결합 도메인을 포함한다. CD19-특이적, CD22-특이적 및 CD19/CD22-이중특이적 CAR을 포함하는 예시적인 CAR의 상세한 설명은 WO2012/079000, WO2016/149578 및 WO2020/014482에서 찾을 수 있으며, 서열 목록 및 도면을 포함하는 개시내용은 그 전체가 본원에 참조로 원용된다.
일부 실시양태에서, CD19 특이적 CAR은 항-CD19 단일-쇄 항체 단편 (scFv), 막관통 도메인, 예컨대, 인간 CD8α로부터 유래된 것, 4-1BB (CD137) 공동-자극 시그널링 도메인, 및 CD3ζ 시그널링 도메인을 포함한다. 일부 실시양태에서, CD22 특이적 CAR은 항-CD22 scFv, 막관통 도메인, 예컨대, 인간 CD8α로부터 유래된 것, 4-1BB (CD137) 공동-자극 시그널링 도메인, 및 CD3ζ 시그널링 도메인을 포함한다. 일부 실시양태에서, CD19/CD22-이중특이적 CAR은 항-CD19 scFv, 항-CD22 scFv, 막관통 도메인, 예컨대, 인간 CD8α로부터 유래된 것, 4-1BB (CD137) 공동-자극 시그널링 도메인, 및 CD3ζ 시그널링 도메인을 포함한다.
일부 실시양태에서, CAR은 T 세포에 의해 운반되는 상업적 CAR 작제물을 포함한다. 상업적 CAR-T 세포 기반 요법의 비-제한적인 예는 브렉수카브타진 오토류셀 (TECARTUS®), 악시카브타진 실로류셀 (YESCARTA®), 이데카브타진 비클루셀 (ABECMA®), 리소카브타진 마라류셀 (BREYANZI®), 티사젠렉류셀 (KYMRIAH®), Cartesian Therapeutics로부터의 Descartes-08 및 Descartes-11, Novartis로부터의 CTL110, Poseida Therapeutics로부터의 P-BMCA-101, Autolus Limited로부터의 AUTO4, Cellectis로부터의 UCARTCS, Precision Biosciences로부터의 PBCAR19B 및 PBCAR269A, Fate Therapeutics로부터의 FT819, 및 Clyad Oncology로부터의 CYAD-211을 포함한다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 저면역원성 세포는 항원 결합 도메인을 포함하는 키메라 항원 수용체 (CAR)를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 저면역원성 세포는 항원 결합 도메인을 포함하는 키메라 항원 수용체 (CAR)를 포함한다. 일부 실시양태에서, 폴리뉴클레오티드는 항원 결합 도메인을 포함하는 키메라 항원 수용체 (CAR)이거나 이를 포함한다. 일부 실시양태에서, CAR은 항원 결합 도메인, 막관통 도메인 및 하나 이상의 시그널링 도메인 (예컨대, 1, 2 또는 3 개의 시그널링 도메인)을 포함하는 1세대 CAR이거나 이를 포함한다. 일부 실시양태에서, CAR은 항원 결합 도메인, 막관통 도메인 및 2 개 이상의 시그널링 도메인을 포함하는 2세대 CAR을 포함한다. 일부 실시양태에서, CAR은 항원 결합 도메인, 막관통 도메인 및 3 개 이상의 시그널링 도메인을 포함하는 3세대 CAR을 포함한다. 일부 실시양태에서, 항원 결합 도메인, 막관통 도메인, 3 또는 4 개의 시그널링 도메인, 및 CAR의 성공적인 시그널링시 사이토카인 유전자의 발현을 유도하는 도메인을 포함하는 4세대 CAR. 일부 실시양태에서, 항원 결합 도메인은 항체, 항체 단편, scFv 또는 Fab이거나 이를 포함한다.
1. 항원 결합 도메인 (ABD)은 신생물 세포 또는 암세포의 항원 특질을 표적화함
일부 실시양태에서, 항원 결합 도메인 (ABD)은 신생물 세포의 항원 특질을 표적화한다. 다시 말해서, 항원 결합 도메인은 신생물 세포 또는 암세포에 의해 발현되는 항원을 표적화한다. 일부 실시양태에서, ABD는 종양 회합된 항원에 결합한다. 일부 실시양태에서, 신생물 세포 또는 종양 회합된 항원의 항원 특질 (예컨대, 신생물 세포 또는 암세포와 회합된 항원)은 세포 표면 수용체, 이온 채널-연결된 수용체, 효소-연결된 수용체, G 단백질-커플링된 수용체, 수용체 티로신 키나제, 티로신 키나제 회합된 수용체, 수용체-유사 티로신 포스파타제, 수용체 세린/트레오닌 키나제, 수용체 구아닐릴 사이클라제, 히스티딘 키나제 회합된 수용체, 표피 성장 인자 수용체 (EGFR)(ErbB1/EGFR, ErbB2/HER2, ErbB3/HER3 및 ErbB4/HER4 포함), 섬유아세포 성장 인자 수용체 (FGFR)(FGF1, FGF2, FGF3, FGF4, FGF5, FGF6, FGF7, FGF18 및 FGF21 포함), 혈관 내피 성장 인자 수용체 (VEGFR)(VEGF-A, VEGF-B, VEGF-C, VEGF-D 및 PIGF 포함), RET 수용체 및 Eph 수용체 패밀리 (EphA1, EphA2, EphA3, EphA4, EphA5, EphA6, EphA7, EphA8, EphA9, EphA10, EphB1, EphB2. EphB3, EphB4 및 EphB6 포함), CXCR1, CXCR2, CXCR3, CXCR4, CXCR6, CCR1, CCR2, CCR3, CCR4, CCR5, CCR6, CCR8, CFTR, CIC-1, CIC-2, CIC-4, CIC-5, CIC-7, CIC-Ka, CIC-Kb, 베스트로핀, TMEM16A, GABA 수용체, 글리신 수용체, ABC 수송체, NAV1.1, NAV1.2, NAV1.3, NAV1.4, NAV1.5, NAV1.6, NAV1.7, NAV1.8, NAV1.9, 스핑고신-1-포스페이트 수용체 (S1P1R), NMDA 채널, 막관통 단백질, 멀티스팬 막관통 단백질, T-세포 수용체 모티프, T-세포 알파 쇄, T-세포 β 쇄, T-세포 γ 쇄, T-세포 δ 쇄, CCR7, CD3, CD4, CD5, CD7, CD8, CD11b, CD11c, CD16, CD19, CD20, CD21, CD22, CD25, CD28, CD34, CD35, CD40, CD45RA, CD45RO, CD52, CD56, CD62L, CD68, CD80, CD95, CD117, CD127, CD133, CD137 (4-1BB), CD163, F4/80, IL-4Ra, Sca-1, CTLA-4, GITR, GARP, LAP, 그랜자임 B, LFA-1, 트랜스페린 수용체, NKp46, 퍼포린, CD4+, Th1, Th2, Th17, Th40, Th22, Th9, Tfh, 표준 Treg. FoxP3+, Tr1, Th3, Treg17, TREG; CDCP, NT5E, EpCAM, CEA, gpA33, 뮤신, TAG-72, 탄산탈수효소 IX, PSMA, 폴레이트 결합 단백질, 강글리오시드 (예컨대, CD2, CD3, GM2), Lewis-γ2, VEGF, VEGFR 1/2/3, αVβ3, α5β1, ErbB1/EGFR, ErbB1/HER2, ErB3, c-MET, IGF1R, EphA3, TRAIL-R1, TRAIL-R2, RANKL, FAP, 테나신, PDL-1, BAFF, HDAC, ABL, FLT3, KIT, MET, RET, IL-1β, ALK, RANKL, mTOR, CTLA-4, IL-6, IL-6R, JAK3, BRAF, PTCH, Smoothened, PIGF, ANPEP, TIMP1, PLAUR, PTPRJ, LTBR, ANTXR1, 폴레이트 수용체 알파 (FRa), ERBB2 (Her2/neu), EphA2, IL-13Ra2, 표피 성장 인자 수용체 (EGFR), 메소텔린, TSHR, CD19, CD123, CD22, CD30, CD171, CS-1, CLL-1, CD33, EGFRvIII, GD2, GD3, BCMA, MUC16 (CA125), L1CAM, LeY, MSLN, IL13Rα1, L1-CAM, Tn Ag, 전립선 특이적 막 항원 (PSMA), ROR1, FLT3, FAP, TAG72, CD38, CD44v6, CEA, EPCAM, B7H3, KIT, 인터류킨-11 수용체 a (IL-11Ra), PSCA, PRSS21, VEGFR2, LewisY, CD24, 혈소판-유래된 성장 인자 수용체-베타 (PDGFR-베타), SSEA-4, CD20, MUC1, NCAM, 프로스타제, PAP, ELF2M, 에프린 B2, IGF-1 수용체, CAIX, LMP2, gpl00, bcr-abl, 티로시나제, 푸코실 GM1, sLe, GM3, TGS5, HMWMAA, o-아세틸-GD2, 폴레이트 수용체 베타, TEM1/CD248, TEM7R, CLDN6, GPRC5D, CXORF61, CD97, CD179a, ALK, 폴리시알산, PLACl, GloboH, NY-BR-1, UPK2, HAVCR1, ADRB3, PANX3, GPR20, LY6K, OR51E2, TARP, WT1, NY-ESO-1, LAGE-la, MAGE-A1, 레구마인, HPV E6, E7, ETV6-AML, 정자 단백질 17, XAGE1, Tie 2, MAD-CT-1, MAD-CT-2, 주요 조직적합성 복합체 클래스 I-관련된 유전자 단백질 (MR1), 유로키나제-타입 플라스미노겐 활성화제 수용체 (uPAR), Fos-관련된 항원 1, p53, p53 돌연변이체, 프로스테인, 서바이빈, 텔로머라제, PCTA-1/갈렉틴 8, MelanA/MART1, Ras 돌연변이체, hTERT, 육종 전위 중단점, ML-IAP, ERG (TMPRSS2 ETS 융합 유전자), NA17, PAX3, 안드로겐 수용체, 사이클린 B1, MYCN, RhoC, TRP-2, CYPIB I, BORIS, SART3, PAX5, OY-TES1, LCK, AKAP-4, SSX2, RAGE-1, 인간 텔로머라아제 역전사효소, RU1, RU2, 장 카복실 에스테라제, mut hsp70-2, CD79a, CD79b, CD72, LAIR1, FCAR, LILRA2, CD300LF, CLEC12A, BST2, EMR2, LY75, GPC3, FCRL5, IGLL1, 신생항원, CD133, CD15, CD184, CD24, CD56, CD26, CD29, CD44, HLA-A, HLA-B, HLA-C, (HLA-A,B,C) CD49f, CD151 CD340, CD200, tkrA, trkB 또는 trkC, 또는 이의 항원 단편 또는 항원 일부로부터 선택된다.
2. ABD는 T 세포의 항원 특질은 표적화함
일부 실시양태에서, 항원 결합 도메인은 T 세포의 항원 특질을 표적화한다. 일부 실시양태에서, ABD는 T 세포와 회합된 항원에 결합한다. 일부 경우에, 이러한 항원은 T 세포에 의해 발현되거나 T 세포의 표면에 위치한다. 일부 실시양태에서, T 세포의 항원 특질 또는 T 세포 회합된 항원은 T 세포의 세포 표면 수용체, 막 수송 단백질 (예컨대, 능동 또는 수동 수송 단백질, 예컨대, 예를 들어, 이온 채널 단백질, 공극-형성 단백질 등), 막관통 수용체, 막 효소 및/또는 세포 부착 단백질 특질로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, T 세포의 항원 특질은 G 단백질-커플링된 수용체, 수용체 티로신 키나제, 티로신 키나제 회합된 수용체, 수용체-유사 티로신 포스파타제, 수용체 세린/트레오닌 키나제, 수용체 구아닐릴 사이클라제, 히스티딘 키나제 회합된 수용체, AKT1; AKT2; AKT3; ATF2; BCL10; CALM1; CD3D (CD3δ); CD3E (CD3ε); CD3G (CD3γ); CD4; CD8; CD28; CD45; CD80 (B7-1); CD86 (B7-2); CD247 (CD3ζ); CTLA-4 (CD152); ELK1; ERK1 (MAPK3); ERK2; FOS; FYN; GRAP2 (GADS); GRB2; HLA-DRA; HLA-DRB1; HLA-DRB3; HLA-DRB4; HLA-DRB5; HRAS; IKBKA (CHUK); IKBKB; IKBKE; IKBKG (NEMO); IL2; ITPR1; ITK; JUN; KRAS2; LAT; LCK; MAP2K1 (MEK1); MAP2K2 (MEK2); MAP2K3 (MKK3); MAP2K4 (MKK4); MAP2K6 (MKK6); MAP2K7 (MKK7); MAP3K1 (MEKK1); MAP3K3; MAP3K4; MAP3K5; MAP3K8; MAP3K14 (NIK); MAPK8 (JNK1); MAPK9 (JNK2); MAPK10 (JNK3); MAPK11 (p38β); MAPK12 (p38γ); MAPK13 (p38δ); MAPK14 (p38α); NCK; NFAT1; NFAT2; NFKB1; NFKB2; NFKBIA; NRAS; PAK1; PAK2; PAK3; PAK4; PIK3C2B; PIK3C3 (VPS34); PIK3CA; PIK3CB; PIK3CD; PIK3R1; PKCA; PKCB; PKCM; PKCQ; PLCY1; PRF1 (퍼포린); PTEN; RAC1; RAF1; RELA; SDF1; SHP2; SLP76; SOS; SRC; TBK1; TCRA; TEC; TRAF6; VAV1; VAV2; 또는 ZAP70일 수 있다.
3. ABD는 자가면역 또는 염증성 장애의 항원 특성을 표적화함
일부 실시양태에서, 항원 결합 도메인은 자가면역 또는 염증성 장애의 항원 특질을 표적화한다. 일부 실시양태에서, ABD는 자가면역 또는 염증성 장애와 연관된 항원에 결합한다. 일부 경우에, 항원은 자가면역 또는 염증성 질환과 연관된 세포에 의해 발현된다. 일부 실시양태에서, 자가면역 또는 염증성 장애는 만성 이식편-대-숙주 질환 (GVHD), 루푸스, 관절염, 면역 복합체 사구체신염, 굿파스쳐 증후군, 포도막염, 간염, 전신 경화증 또는 피부경화증, 유형 I 당뇨병, 다발성 경화증, 한랭 응집소 질환, 천포창, 그레이브스병, 자가면역 용혈성 빈혈, 혈우병 A, 원발성 쇼그렌 증후군, 혈전성 혈소판감소증 자반병, 시신경척수염, 에반 증후군, IgM 매개된 신경병증, 한랭글로불린혈증, 피부근염, 특발성 혈소판감소증, 강직성 척추염, 수포성 유천포창, 후천성 혈관부종, 만성 두드러기, 항인지질 탈수초성 다발신경병증, 및 자가면역 혈소판감소증 또는 호중구감소증 또는 순수 적혈구 무형성증으로부터 선택되는 반면, 동종면역 질환의 예시적인 비-제한적인 예는 동종감작 (예를 들어, Blazar 등, 2015, Am. J. Transplant, 15(4):931-41 참고), 또는 조혈 또는 고형 장기 이식, 수혈, 태아 동종감작을 동반한 임신, 신생아 동종면역 혈소판감소증, 신생아의 용혈성 질환, 효소 또는 단백질 대체 요법으로 치료되는 유전적 또는 후천적 결핍 장애의 대체로 발생할 수 있는 외래 항원에 대한 감작, 혈액 제품 및 유전자 요법으로 인한 이종감작을 포함한다. 일부 실시양태에서, 자가면역 또는 염증성 장애의 항원 특질은 세포 표면 수용체, 이온 채널-연결된 수용체, 효소-연결된 수용체, G 단백질-커플링된 수용체, 수용체 티로신 키나제, 티로신 키나제 회합된 수용체, 수용체-유사 티로신 포스파타제, 수용체 세린/트레오닌 키나제, 수용체 구아닐릴 사이클라제 또는 히스티딘 키나제 회합된 수용체로부터 선택된다.
일부 실시양태에서, CAR의 항원 결합 도메인은 B 세포, 형질 세포 또는 형질아세포 상에서 발현되는 리간드에 결합한다. 일부 실시양태에서, CAR의 항원 결합 도메인은 CD10, CD19, CD20, CD22, CD24, CD27, CD38, CD45R, CD138, CD319, BCMA, CD28, TNF, 인터페론 수용체, GM-CSF, ZAP-70, LFA-1, CD3 감마, CD5 또는 CD2에 결합한다. 예컨대, 이의 내용이 본원에 참조로 원용되는 US 2003/0077249; WO 2017/058753; WO 2017/058850을 참고한다.
4. ABD는 노화 세포의 항원 특질을 표적화함
일부 실시양태에서, 항원 결합 도메인은 노화 세포의 항원 특질, 예컨대, 유로키나제-타입 플라스미노겐 활성화제 수용체 (uPAR)를 표적화한다. 일부 실시양태에서, ABD는 노화 세포와 회합된 항원에 결합한다. 일부 경우에, 항원이 노화 세포에 의해 발현된다. 일부 실시양태에서, CAR은 노화 세포의 이상 축적을 특징으로 하는 장애, 예컨대, 간 및 폐 섬유증, 죽상동맥경화증, 당뇨병 및 골관절염의 치료 또는 예방에 사용될 수 있다.
5. ABD는 간염성 질환의 항원 특질을 표적화함
일부 실시양태에서, 항원 결합 도메인은 감염성 질환의 항원 특질을 표적화한다. 일부 실시양태에서, ABD는 감염성 질환과 연관된 항원에 결합한다. 일부 경우에, 항원은 감염성 질환에 영향을 받은 세포에 의해 발현된다. 일부 실시양태에서, 감염성 질환은 HIV, B형 간염 바이러스, C형 간염 바이러스, 인간 헤르페스 바이러스, 인간 헤르페스 바이러스 8 (HHV-8, 카포시 육종-연관된 헤르페스 바이러스 (KSHV)), 인간 T-림프영양 바이러스-1 (HTLV-1), 메르켈 세포 폴리오마바이러스 (MCV), 시미안 바이러스 40 (SV40), 엡스타인-바 바이러스, CMV, 인간 파필로마바이러스로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, 감염성 질환의 항원 특질은 세포 표면 수용체, 이온 채널-연결된 수용체, 효소-연결된 수용체, G 단백질-커플링된 수용체, 수용체 티로신 키나제, 티로신 키나제 회합된 수용체, 수용체-유사 티로신 포스파타제, 수용체 세린/트레오닌 키나제, 수용체 구아닐릴 사이클라제, 히스티딘 키나제 회합된 수용체, HIV Env, gpl20 또는 HIV-1 Env 상의 CD4-유도된 에피토프로부터 선택된다.
6. ABD는 세포의 세포 표면 항원에 결합함
일부 실시양태에서, 항원 결합 도메인은 세포의 세포 표면 항원에 결합한다. 일부 실시양태에서, 세포 표면 항원은 특정 또는 특이적 세포 유형의 특질이다 (예컨대, 이에 의해 발현된다). 일부 실시양태에서, 세포 표면 항원은 하나 초과의 유형의 세포의 특질이다.
일부 실시양태에서, CAR 항원 결합 도메인은 T 세포 상의 세포 표면 항원과 같은 T 세포의 세포 표면 항원 특질에 결합한다. 일부 실시양태에서, T 세포의 항원 특질은 T 세포의 세포 표면 수용체, 막 수송 단백질 (예컨대, 능동 또는 수동 수송 단백질, 예컨대, 예를 들어, 이온 채널 단백질, 공극-형성 단백질 등), 막관통 수용체, 막 효소, 및/또는 세포 부착 단백질 특질일 수 있다. 일부 실시양태에서, T 세포의 항원 특질은 G 단백질-커플링된 수용체, 수용체 티로신 키나제, 티로신 키나제 회합된 수용체, 수용체-유사 티로신 포스파타제, 수용체 세린/트레오닌 키나제, 수용체 구아닐릴 사이클라제 또는 히스티딘 키나제 회합된 수용체일 수 있다.
일부 실시양태에서, CAR의 항원 결합 도메인은 T 세포 수용체에 결합한다. 일부 실시양태에서, T 세포 수용체는 AKT1; AKT2; AKT3; ATF2; BCL10; CALM1; CD3D (CD3δ); CD3E (CD3ε); CD3G (CD3γ); CD4; CD8; CD28; CD45; CD80 (B7-1); CD86 (B7-2); CD247 (CD3ζ); CTLA-4 (CD152); ELK1; ERK1 (MAPK3); ERK2; FOS; FYN; GRAP2 (GADS); GRB2; HLA-DRA; HLA-DRB1; HLA-DRB3; HLA-DRB4; HLA-DRB5; HRAS; IKBKA (CHUK); IKBKB; IKBKE; IKBKG (NEMO); IL2; ITPR1; ITK; JUN; KRAS2; LAT; LCK; MAP2K1 (MEK1); MAP2K2 (MEK2); MAP2K3 (MKK3); MAP2K4 (MKK4); MAP2K6 (MKK6); MAP2K7 (MKK7); MAP3K1 (MEKK1); MAP3K3; MAP3K4; MAP3K5; MAP3K8; MAP3K14 (NIK); MAPK8 (JNK1); MAPK9 (JNK2); MAPK10 (JNK3); MAPK11 (p38β); MAPK12 (p38γ); MAPK13 (p38δ); MAPK14 (p38α); NCK; NFAT1; NFAT2; NFKB1; NFKB2; NFKBIA; NRAS; PAK1; PAK2; PAK3; PAK4; PIK3C2B; PIK3C3 (VPS34); PIK3CA; PIK3CB; PIK3CD; PIK3R1; PKCA; PKCB; PKCM; PKCQ; PLCY1; PRF1 (퍼포린); PTEN; RAC1; RAF1; RELA; SDF1; SHP2; SLP76; SOS; SRC; TBK1; TCRA; TEC; TRAF6; VAV1; VAV2; 또는 ZAP70일 수 있다.
7. 막관통 도메인
일부 실시양태에서, CAR 막관통 도메인은 T 세포 수용체, CD28, CD3 엡실론, CD45, CD4, CD5, CD8, CD9, CD16, CD22, CD33, CD37, CD64, CD80, CD86, CD134, CD137, CD154 또는 이들의 기능적 변이체의 알파, 베타 또는 제타 쇄의 적어도 막관통 영역을 포함한다. 일부 실시양태에서, 막관통 도메인은 CD8α, CD8β, 4-1BB/CD137, CD28, CD34, CD4, FcεRIγ, CD16, OX40/CD134, CD3ζ, CD3ε, CD3γ, CD3δ, TCRα, TCRβ, TCRζ, CD32, CD64, CD64, CD45, CD5, CD9, CD22, CD37, CD80, CD86, CD40, CD40L/CD154, VEGFR2, FAS 및 FGFR2B의 적어도 막관통 영역(들) 또는 이의 기능적 변이체를 포함한다. 항원 결합 도메인 결합
8. 시그널링 도메인 또는 복수의 시그널링 도메인
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 CAR은 B7-1/CD80; B7-2/CD86; B7-H1/PD-L1; B7-H2; B7-H3; B7-H4; B7-H6; B7-H7; BTLA/CD272; CD28; CTLA-4; Gi24/VISTA/B7-H5; ICOS/CD278; PD-1; PD-L2/B7-DC; PDCD6); 4-1BB/TNFSF9/CD137; 4-1BB 리간드/TNFSF9; BAFF/BLyS/TNFSF13B; BAFF R/TNFRSF13C; CD27/TNFRSF7; CD27 리간드/TNFSF7; CD30/TNFRSF8; CD30 리간드/TNFSF8; CD40/TNFRSF5; CD40/TNFSF5; CD40 리간드/TNFSF5; DR3/TNFRSF25; GITR/TNFRSF18; GITR 리간드/TNFSF18; HVEM/TNFRSF14; LIGHT/TNFSF14; 림프톡신-알파/TNF-베타; OX40/TNFRSF4; OX40 리간드/TNFSF4; RELT/TNFRSF19L; TACI/TNFRSF13B; TL1A/TNFSF15; TNF-알파; TNFRII/TNFRSF1B); 2B4/CD244/SLAMF4; BLAME/SLAMF8; CD2; CD2F-10/SLAMF9; CD48/SLAMF2; CD58/LFA-3; CD84/SLAMF5; CD229/SLAMF3; CRACC/SLAMF7; NTB-A/SLAMF6; SLAM/CD150); CD2; CD7; CD53; CD82/Kai-1; CD90/Thy1; CD96; CD160; CD200; CD300a/LMIR1; HLA 클래스 I; HLA-DR; 이카로스; 인테그린 알파 4/CD49d; 인테그린 알파 4 베타 1; 인테그린 알파 4 베타 7/LPAM-1; LAG-3; TCL1A; TCL1B; CRTAM; DAP12; 덱틴-1/CLEC7A; DPPIV/CD26; EphB6; TIM-1/KIM-1/HAVCR; TIM-4; TSLP; TSLP R; 림프구 기능 연관된 항원-1 (LFA-1); NKG2C, CD3 제타 도메인, 면역수용체 티로신-기반 활성화 모티프 (ITAM), CD27, CD28, 4-1BB, CD134/OX40, CD30, CD40, PD-1, ICOS, 림프구 기능-연관된 항원-1 (LFA-1), CD2, CD7, LIGHT, NKG2C, B7-H3, CD83과 특이적으로 결합하는 리간드 또는 이의 기능적 단편 중 하나 이상으로부터 선택된 하나 또는 하나 이상의 시그널링 도메인을 포함한다.
일부 실시양태에서, 하나 이상의 시그널링 도메인은 CD3 제타 도메인 또는 면역수용체 티로신-기반 활성화 모티프 (ITAM), 또는 이의 기능적 변이체를 포함한다. 다른 실시양태에서, 하나 이상의 시그널링 도메인은 (i) CD3 제타 도메인, 또는 면역수용체 티로신-기반 활성화 모티프 (ITAM), 또는 이의 기능적 변이체; 및 (ii) CD28 도메인, 또는 4-1BB 도메인, 또는 이의 기능적 변이체를 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 하나 이상의 시그널링 도메인은 (i) CD3 제타 도메인, 또는 면역수용체 티로신-기반 활성화 모티프 (ITAM), 또는 이의 기능적 변이체; (ii) CD28 도메인 또는 이의 기능적 변이체; 및 (iii) 4-1BB 도메인 또는 CD134 도메인 또는 이의 기능적 변이체를 포함한다. 일부 실시양태에서, 하나 이상의 시그널링 도메인은 (i) CD3 제타 도메인, 또는 면역수용체 티로신-기반 활성화 모티프 (ITAM), 또는 이의 기능적 변이체; (ii) CD28 도메인 또는 이의 기능적 변이체; (iii) 4-1BB 도메인, CD134 도메인 또는 이의 기능적 변이체; 및 (iv) 사이토카인 또는 공동자극 리간드 트랜스진을 포함한다.
일부 실시양태에서, 2 개 이상의 시그널링 도메인은 CD3 제타 도메인 또는 면역수용체 티로신-기반 활성화 모티프 (ITAM), 또는 이의 기능적 변이체를 포함한다. 다른 실시양태에서, 2 개 이상의 시그널링 도메인은 (i) CD3 제타 도메인, 또는 면역수용체 티로신-기반 활성화 모티프 (ITAM), 또는 이의 기능적 변이체; 및 (ii) CD28 도메인, 또는 4-1BB 도메인, 또는 이의 기능적 변이체를 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 하나 이상의 시그널링 도메인은 (i) CD3 제타 도메인, 또는 면역수용체 티로신-기반 활성화 모티프 (ITAM), 또는 이의 기능적 변이체; (ii) CD28 도메인 또는 이의 기능적 변이체; 및 (iii) 4-1BB 도메인, CD134 도메인 또는 이의 기능적 변이체를 포함한다. 일부 실시양태에서, 2 개 이상의 시그널링 도메인은 (i) CD3 제타 도메인, 또는 면역수용체 티로신-기반 활성화 모티프 (ITAM), 또는 이의 기능적 변이체; (ii) CD28 도메인 또는 이의 기능적 변이체; (iii) 4-1BB 도메인, CD134 도메인 또는 이의 기능적 변이체; 및 (iv) 사이토카인 또는 공동자극 리간드 트랜스진을 포함한다.
일부 실시양태에서, 3 개 이상의 시그널링 도메인은 CD3 제타 도메인 또는 면역수용체 티로신-기반 활성화 모티프 (ITAM), 또는 이의 기능적 변이체를 포함한다. 다른 실시양태에서, 3 개 이상의 시그널링 도메인은 (i) CD3 제타 도메인, 또는 면역수용체 티로신-기반 활성화 모티프 (ITAM), 또는 이의 기능적 변이체; 및 (ii) CD28 도메인, 또는 4-1BB 도메인, 또는 이의 기능적 변이체를 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 3 개 이상의 시그널링 도메인은 (i) CD3 제타 도메인, 또는 면역수용체 티로신-기반 활성화 모티프 (ITAM), 또는 이의 기능적 변이체; (ii) CD28 도메인 또는 이의 기능적 변이체; 및 (iii) 4-1BB 도메인, CD134 도메인 또는 이의 기능적 변이체를 포함한다. 일부 실시양태에서, 3 개 이상의 시그널링 도메인은 (i) CD3 제타 도메인, 또는 면역수용체 티로신-기반 활성화 모티프 (ITAM), 또는 이의 기능적 변이체; (ii) CD28 도메인 또는 이의 기능적 변이체; (iii) 4-1BB 도메인, CD134 도메인 또는 이의 기능적 변이체; 및 (iv) 사이토카인 또는 공동자극 리간드 트랜스진을 포함한다.
일부 실시양태에서, CAR은 CD3 제타 도메인 또는 면역수용체 티로신-기반 활성화 모티프 (ITAM), 또는 이의 기능적 변이체를 포함한다. 일부 실시양태에서, CAR은 (i) CD3 제타 도메인, 또는 면역수용체 티로신-기반 활성화 모티프 (ITAM), 또는 이의 기능적 변이체; 및 (ii) CD28 도메인, 또는 4-1BB 도메인, 또는 이의 기능적 변이체를 포함한다.
일부 실시양태에서, CAR은 (i) CD3 제타 도메인, 또는 면역수용체 티로신-기반 활성화 모티프 (ITAM), 또는 이의 기능적 변이체; (ii) CD28 도메인 또는 이의 기능적 변이체; 및 (iii) 4-1BB 도메인, CD134 도메인 또는 이의 기능적 변이체를 포함한다.
일부 실시양태에서, CAR은 (i) CD3 제타 도메인, 또는 면역수용체 티로신-기반 활성화 모티프 (ITAM), 또는 이의 기능적 변이체; (ii) CD28 도메인, 또는 4-1BB 도메인, 또는 이의 기능적 변이체, 및/또는 (iii) 4-1BB 도메인, 또는 CD134 도메인, 또는 이의 기능적 변이체를 포함한다.
일부 실시양태에서, CAR은 (i) CD3 제타 도메인, 또는 면역수용체 티로신-기반 활성화 모티프 (ITAM), 또는 이의 기능적 변이체; (ii) CD28 도메인 또는 이의 기능적 변이체; (iii) 4-1BB 도메인, CD134 도메인 또는 이의 기능적 변이체; 및 (iv) 사이토카인 또는 공동자극 리간드 트랜스진을 포함한다.
9. CAR의 성공적인 시그널링시 사이토카인 유전자의 발현을 유도하는 도메인
일부 실시양태에서, 1세대, 2세대, 3세대 또는 4세대 CAR은 CAR의 성공적인 시그널링시 사이토카인 유전자의 발현을 유도하는 도메인을 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 사이토카인 유전자는 CAR의 성공적인 시그널링시 사이토카인 유전자의 발현을 유도하는 도메인을 포함하는 CAR을 포함하는 표적 세포에 대해 내인성 또는 외인성이다. 일부 실시양태에서, 사이토카인 유전자는 전-염증성 사이토카인을 코딩한다. 일부 실시양태에서, 사이토카인 유전자는 IL-1, IL-2, IL-9, IL-12, IL-18, TNF 또는 IFN-감마 또는 이의 기능적 단편을 코딩한다. 일부 실시양태에서, CAR의 성공적인 시그널링시 사이토카인 유전자의 발현을 유도하는 도메인은 전사 인자 또는 이의 기능적 도메인 또는 단편이거나 이를 포함한다. 일부 실시양태에서, CAR의 성공적인 시그널링시 사이토카인 유전자의 발현을 유도하는 도메인은 전사 인자 또는 이의 기능적 도메인 또는 단편이거나 이를 포함한다. 일부 실시양태에서, 전사 인자 또는 이의 기능적 도메인 또는 단편은 활성화된 T 세포의 핵 인자 (NFAT), NF-kB, 또는 이의 기능적 도메인 또는 단편이거나 이를 포함한다. 예컨대, Zhang. C. 등, Engineering CAR-T cells. Biomarker Research. 5:22 (2017); WO 2016126608; Sha, H. 등 Chimaeric antigen receptor T-cell therapy for tumour immunotherapy. Bioscience Reports Jan 27, 2017, 37 (1) 참고한다.
일부 실시양태에서, CAR은 하나 이상의 스페이서를 추가로 포함하고, 예컨대, 스페이서는 항원 결합 도메인 및 막관통 도메인 사이의 제1 스페이서이다. 일부 실시양태에서, 제1 스페이서는 면역글로불린 불변 영역 또는 이의 변이체 또는 변형된 버전의 적어도 일부를 포함한다. 일부 실시양태에서, 스페이서는 막관통 도메인 및 시그널링 도메인 사이의 제2 스페이서이다. 일부 실시양태에서, 제2 스페이서는 올리고펩티드이며, 예컨대, 여기서 올리고펩티드는 글리신 및 세린 잔기, 예컨대, 비제한적으로 글리신-세린 이중항을 포함한다. 일부 실시양태에서, CAR은 2 개 이상의 스페이서, 예컨대, 항원 결합 도메인 및 막관통 도메인 사이의 스페이서, 및 막관통 도메인 및 시그널링 도메인 사이의 스페이서를 포함한다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 세포 중 어느 하나는 CAR 또는 1세대 CAR을 코딩하는 핵산을 포함한다. 일부 실시양태에서, 1세대 CAR은 항원 결합 도메인, 막관통 도메인 및 시그널링 도메인을 포함한다. 일부 실시양태에서, 시그널링 도메인은 T 세포 활성화 동안 다운스트림 시그널링을 매개한다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 세포 중 어느 하나는 CAR 또는 2세대 CAR을 코딩하는 핵산을 포함한다. 일부 실시양태에서, 2세대 CAR은 항원 결합 도메인, 막관통 도메인 및 2 개의 시그널링 도메인을 포함한다. 일부 실시양태에서, 시그널링 도메인은 T 세포 활성화 동안 다운스트림 시그널링을 매개한다. 일부 실시양태에서, 시그널링 도메인은 공동자극 도메인이다. 일부 실시양태에서, 공동자극 도메인은 T 세포 활성화 동안 사이토카인 생산, CAR-T 세포 증식 및/또는 CAR-T 세포 지속성을 향상시킨다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 세포 중 어느 하나는 CAR 또는 3세대 CAR을 코딩하는 핵산을 포함한다. 일부 실시양태에서, 3세대 CAR은 항원 결합 도메인, 막관통 도메인 및 3 개 이상의 시그널링 도메인을 포함한다. 일부 실시양태에서, 시그널링 도메인은 T 세포 활성화 동안 다운스트림 시그널링을 매개한다. 일부 실시양태에서, 시그널링 도메인은 공동자극 도메인이다. 일부 실시양태에서, 공동자극 도메인은 T 세포 활성화 동안 사이토카인 생산, CAR-T 세포 증식, 및/또는 CAR-T 세포 지속성을 향상시킨다. 일부 실시양태에서, 3세대 CAR은 2 개 이상의 공동자극 도메인을 포함한다. 일부 실시양태에서, 2 개 이상의 공동자극 도메인은 동일하지 않다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 세포 중 어느 하나는 CAR 또는 4세대 CAR을 코딩하는 핵산을 포함한다. 일부 실시양태에서, 4세대 CAR은 항원 결합 도메인, 막관통 도메인, 및 2, 3 또는 4 개 이상의 시그널링 도메인을 포함한다. 일부 실시양태에서, 시그널링 도메인은 T 세포 활성화 동안 다운스트림 시그널링을 매개한다. 일부 실시양태에서, 시그널링 도메인은 공동자극 도메인이다. 일부 실시양태에서, 공동자극 도메인은 T 세포 활성화 동안 사이토카인 생산, CAR-T 세포 증식, 및/또는 CAR-T 세포 지속성을 향상시킨다.
10. 항체 또는 이의 항원-결합 부분을 포함하는 ABD
일부 실시양태에서, CAR 항원 결합 도메인은 항체 또는 이의 항원-결합 부분이거나 이를 포함한다. 일부 실시양태에서, CAR 항원 결합 도메인은 scFv 또는 Fab이거나 이를 포함한다. 일부 실시양태에서, CAR 항원 결합 도메인은 CD19 항체; CD22 항체; T-세포 알파 쇄 항체; T-세포 β 쇄 항체; T-세포 γ 쇄 항체; T-세포 δ 쇄 항체; CCR7 항체; CD3 항체; CD4 항체; CD5 항체; CD7 항체; CD8 항체; CD11b 항체; CD11c 항체; CD16 항체; CD20 항체; CD21 항체; CD25 항체; CD28 항체; CD34 항체; CD35 항체; CD40 항체; CD45RA 항체; CD45RO 항체; CD52 항체; CD56 항체; CD62L 항체; CD68 항체; CD80 항체; CD95 항체; CD117 항체; CD127 항체; CD133 항체; CD137 (4-1BB) 항체; CD163 항체; F4/80 항체; IL-4Ra 항체; Sca-1 항체; CTLA-4 항체; GITR 항체 GARP 항체; LAP 항체; 그랜자임 B 항체; LFA-1 항체; MR1 항체; uPAR 항체; 또는 트랜스페린 수용체 항체의 scFv 또는 Fab 단편을 포함한다.
일부 실시양태에서, CAR은 공동자극 도메인인 시그널링 도메인을 포함한다. 일부 실시양태에서, CAR은 제2 공동자극 도메인을 포함한다. 일부 실시양태에서, CAR은 2 개 이상의 공동자극 도메인을 포함한다. 일부 실시양태에서, CAR은 3 개 이상의 공동자극 도메인을 포함한다. 일부 실시양태에서, CAR은 CD27, CD28, 4-1BB, CD134/OX40, CD30, CD40, PD-1, ICOS, 림프구 기능-연관된 항원-1 (LFA-1), CD2, CD7, LIGHT, NKG2C, B7-H3, CD83과 특이적으로 결합하는 리간드 중 하나 이상으로부터 선택된 공동자극 도메인을 포함한다. 일부 실시양태에서, CAR이 2 개 이상의 공동자극 도메인을 포함하는 경우, 2 개의 공동자극 도메인은 상이하다. 일부 실시양태에서, CAR이 2 개 이상의 공동자극 도메인을 포함하는 경우, 2 개의 공동자극 도메인은 동일하다.
본원에 기재된 CAR에 더하여, 다양한 키메라 항원 수용체 및 이를 코딩하는 뉴클레오티드 서열이 당업계에 알려져 있고, 본원에 기재된 바와 같이 생체내 및 생체외 표적 세포의 푸소좀 전달 및 재프로그래밍에 적합할 것이다. 예컨대, WO2013040557; WO2012079000; WO2016030414; Smith T, 등, Nature Nanotechnology. 2017. DOI: 10.1038/NNANO.2017.57을 참고하며, 이의 개시내용은 본원에 참조로 원용된다.
11. CAR에 대한 추가적인 설명
특정 실시양태에서, 세포는 CAR을 코딩하는 외인성 폴리뉴클레오티드를 포함할 수 있다. CAR (키메라 면역수용체, 키메라 T 세포 수용체 또는 인공 T 세포 수용체로서 또한 지칭됨)는 숙주 세포 (예컨대, T 세포)에 특이적 단백질을 표적화하는 새로운 능력을 부여하도록 조작된 수용체 단백질이다. 수용체는 항원-결합 및 T 세포 활성화 기능을 단일 수용체로 조합하기 때문에 키메라이다. 본 개시내용의 폴리시스트론 벡터는 다양한 표적 항원에 대한 세포-기반 요법에 사용하기 위해 숙주 세포 (예컨대, T 세포)에서 하나 이상의 CAR을 발현하는 데 사용될 수 있다. 하나 이상의 발현 카세트에 의해 발현된 CAR은 동일하거나 상이할 수 있다. 이들 실시양태에서, CAR은 표적 항원, 막관통 도메인 및 세포내 시그널링 도메인에 특이적으로 결합하는 세포외 결합 도메인 ("바인더"로서 또한 지칭됨)을 포함할 수 있다. 특정 실시양태에서, CAR은 하나 이상의 신호 펩티드, 하나 이상의 세포외 힌지 도메인 및/또는 하나 이상의 세포내 공동자극 도메인을 포함하는 하나 이상의 추가적인 요소를 추가로 포함할 수 있다. 도메인은 서로 직접 인접할 수 있거나, 도메인을 연결하는 하나 이상의 아미노산이 있을 수 있다. CAR을 코딩하는 뉴클레오티드 서열은 포유동물 서열, 예를 들어, 마우스 서열, 영장류 서열, 인간 서열 또는 이들의 조합으로부터 유래될 수 있다. CAR을 코딩하는 뉴클레오티드 서열이 인간이 아닌 경우, CAR의 서열은 인간화될 수 있다. CAR을 코딩하는 뉴클레오티드 서열은 또한 포유동물 세포, 예를 들어, 인간 세포에서의 발현을 위해 코돈-최적화될 수 있다. 이들 실시양태 중 임의의 것에서, CAR을 코딩하는 뉴클레오티드 서열은 본원에 개시된 뉴클레오티드 서열 중 임의의 것과 80% 이상 동일 (예컨대, 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상, 또는 100% 동일)할 수 있다. 서열 변이는 코돈-최적화, 인간화, 제한 효소-기반 클로닝 스카 및/또는 기능적 도메인을 연결하는 추가적인 아미노산 잔기 등으로 인한 것일 수 있다.
특정 실시양태에서, CAR은 N-말단에서 신호 펩티드를 포함할 수 있다. 신호 펩티드의 비-제한적인 예는 CD8α 신호 펩티드, IgK 신호 펩티드, 및 과립구-대식세포 콜로니-자극 인자 수용체 서브유닛 알파 (GMCSFR-α, 콜로니 자극 인자 2 수용체 서브유닛 알파 (CSF2RA)로서 또한 알려짐) 신호 펩티드 및 이의 변이체를 포함하고, 이의 아미노산 서열은 하기 표 2에 제공되어 있다.
표 2. 신호 펩티드의 예시적인 서열
특정 실시양태에서, CAR의 세포외 결합 도메인은 하나의 표적 항원 또는 다중 표적 항원에 특이적인 하나 이상의 항체를 포함할 수 있다. 항체는 항체 단편, 예를 들어, scFv, 또는 단일-도메인 항체 단편, 예를 들어, VHH일 수 있다. 특정 실시양태에서, scFv는 링커에 의해 연접된 항체의 중쇄 가변 영역 (VH) 및 경쇄 가변 영역 (VL)을 포함할 수 있다. VH 및 VL은 순서, 즉, VH-링커-VL 또는 VL-링커-VH로 연접될 수 있다. 링커의 비-제한적인 예는 위트로우 링커, (G4S)n (n은 양의 정수, 예컨대, 1, 2, 3, 4, 5, 6 등일 수 있음) 링커 및 이의 변이체를 포함한다. 특정 실시양태에서, 항원은 종양 세포에서 독점적으로 또는 우선적으로 발현되는 항원, 또는 자가면역 또는 염증성 질환의 특질인 항원일 수 있다. 예시적인 표적 항원은 CD5, CD19, CD20, CD22, CD23, CD30, CD70, 카파, 람다 및 B 세포 성숙 인자 (BCMA), G-단백질 커플링된 수용체 패밀리 C 그룹 5 구성원 D (GPRC5D)(백혈병과 연관됨); CS1/SLAMF7, CD38, CD138, GPRC5D, TACI 및 BCMA (골수종과 연관됨); GD2, HER2, EGFR, EGFRvIII, B7H3, PSMA, PSCA, CAIX, CD171, CEA, CSPG4, EPHA2, FAP, FRα, IL-13Rα, 메소텔린, MUC1, MUC16 및 ROR1 (고형 종양과 연관됨)을 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 이들 실시양태 중 임의의 것에서, CAR의 세포외 결합 도메인은 숙주 세포에서의 발현을 위해 코돈-최적화될 수 있거나, 세포외 결합 도메인의 기능을 증가시키는 변이체 서열을 가질 수 있다.
특정 실시양태에서, CAR은 스페이서로서 또한 지칭되는 힌지 도메인을 포함할 수 있다. 용어 "힌지" 및 "스페이서"는 본 개시내용에서 상호교환적으로 사용될 수 있다. 힌지 도메인의 비-제한적인 예는 CD8α 힌지 도메인, CD28 힌지 도메인, IgG4 힌지 도메인, IgG4 힌지-CH2-CH3 도메인 및 이들의 변이체를 포함하며, 이들의 아미노산 서열은 하기 표 3에 제공되어 있다.
표 3. 힌지 도메인의 예시적인 서열
특정 실시양태에서, CAR의 막관통 도메인은 T 세포 수용체, CD28, CD3ε, CD45, CD4, CD5, CD8, CD9, CD16, CD22, CD33, CD37, CD64, CD80, CD86, CD134, CD137, CD154, 또는 이들 서열 각각의 인간 버전을 포함하는 이들의 기능적 변이체의 알파, 베타 또는 제타 쇄의 막관통 영역을 포함할 수 있다. 다른 실시양태에서, 막관통 도메인은 CD8α, CD8β, 4-1BB/CD137, CD28, CD34, CD4, FcεRIγ, CD16, OX40/CD134, CD3ζ, CD3ε, CD3γ, CD3δ, TCRα, TCRβ, TCRζ, CD32, CD64, CD64, CD45, CD5, CD9, CD22, CD37, CD80, CD86, CD40, CD40L/CD154, VEGFR2, FAS 및 FGFR2B 또는 이들 서열 각각의 인간 버전을 포함하는 이들의 기능적 변이체의 막관통 영역을 포함할 수 있다. 표 4는 몇 가지 예시적인 막관통 도메인의 아미노산 서열을 제공한다.
표 4. 막관통 도메인의 예시적인 서열
특정 실시양태에서, CAR의 세포내 시그널링 도메인 및/또는 세포내 공동자극 도메인은 B7-1/CD80, B7-2/CD86, B7-H1/PD-L1, B7-H2, B7-H3, B7-H4, B7-H6, B7-H7, BTLA/CD272, CD28, CTLA-4, Gi24/VISTA/B7-H5, ICOS/CD278, PD-1, PD-L2/B7 -DC, PDCD6, 4-1BB/TNFSF9/CD137, 4-1BB 리간드/TNFSF9, BAFF/BLyS/TNFSF13B, BAFF R/TNFRSF13C, CD27/TNFRSF7, CD27 리간드/TNFSF7, CD30/TNFRSF8, CD30 리간드/TNFSF8, CD40/TNFRSF5, CD40/TNFSF5, CD40 리간드/TNFSF5, DR3/TNFRSF25, GITR/TNFRSF18, GITR 리간드/TNFSF18, HVEM/TNFRSF14, LIGHT/TNFSF14, 림프톡신-알파/TNFβ, OX40/TNFRSF4, OX40 리간드/TNFSF4, RELT/TNFRSF19L, TACI/TNFRSF13B, TL1A/TNFSF15, TNFα, TNF RII/TNFRSF1B, 2B4/CD244/SLAMF4, BLAME/SLAMF8, CD2, CD2F-10/SLAMF9, CD48/SLAMF2, CD58/LFA-3, CD84/SLAMF5, CD229/SLAMF3, CRACC/SLAMF7, NTB-A/SLAMF6, SLAM/CD150, CD2, CD7, CD53, CD82/Kai-1, CD90/Thy1, CD96, CD160, CD200, CD300a/LMIR1, HLA 클래스 I, HLA-DR, 이카로스, 인테그린 알파 4/CD49d, 인테그린 알파 4 베타 1, 인테그린 알파 4 베타 7/LPAM-1, LAG-3, TCL1A, TCL1B, CRTAM, DAP12, 덱틴-1/CLEC7A, DPPIV/CD26, EphB6, TIM -1/KIM-1/HAVCR, TIM-4, TSLP, TSLP R, 림프구 기능 연관된 항원-1 (LFA-1), NKG2C, CD3ζ, 면역수용체 티로신-기반 활성화 모티프 (ITAM), CD27, CD28, 4 -1BB, CD134/OX40, CD30, CD40, PD-1, ICOS, 림프구 기능-연관된 항원-1 (LFA-1), CD2, CD7, LIGHT, NKG2C, B7-H3, CD83과 특이적으로 결합하는 리간드, 및 이들 서열 각각의 인간 버전을 포함하는 이의 기능적 변이체로부터 선택된 하나 이상의 시그널링 도메인을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 세포내 시그널링 도메인 및/또는 세포내 공동자극 도메인은 CD3ζ 도메인, ITAM, CD28 도메인, 4-1BB 도메인 또는 이의 기능적 변이체로부터 선택된 하나 이상의 시그널링 도메인을 포함한다. 표 5는 몇몇 예시적인 세포내 공동자극 및/또는 시그널링 도메인의 아미노산 서열을 제공한다. 특정 실시양태에서, 하기 기재된 바와 같은 티사젠렉류셀의 경우에서와 같이, 서열번호 18의 CD3ζ 시그널링 도메인은 아미노산 위치 14에서 돌연변이, 예컨대, 글루타민 (Q)에서 라이신 (K)으로의 돌연변이를 가질 수 있다 (서열번호 115 참고).
표 5. 세포내 공동자극 및/또는 시그널링 도메인의 예시적인 서열
폴리시스트론 벡터가 2 개 이상의 CAR을 코딩하는 특정 실시양태에서, 2 개 이상의 CAR은 기재된 바와 같이 동일한 기능적 도메인 또는 하나 이상의 상이한 기능적 도메인을 포함할 수 있다. 예를 들어, 2 개 이상의 CAR은 서열 유사성으로 인한 재조합의 위험을 최소화하기 위해, 상이한 신호 펩티드, 세포외 결합 도메인, 힌지 도메인, 막관통 도메인, 공동자극 도메인, 및/또는 세포내 시그널링 도메인을 포함할 수 있다. 또는, 대안적으로, 2 개 이상의 CAR은 동일한 도메인을 포함할 수 있다. 동일한 도메인(들) 및/또는 백본이 사용되는 경우, 재조합의 위험을 최소화하기 위해 뉴클레오티드 서열 수준에서 코돈 분기(divergence)를 도입하는 것은 선택 사항이다.
CD19 CAR
일부 실시양태에서, CAR은 CD19 CAR ("CD19-CAR")이고, 이들 실시양태에서, 폴리시스트론 벡터는 CD19 CAR을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 함유하는 발현 카세트를 포함한다. 일부 실시양태에서, CD19 CAR은 신호 펩티드, CD19에 특이적으로 결합하는 세포외 결합 도메인, 힌지 도메인, 막관통 도메인, 세포내 공동자극 도메인, 및/또는 세포내 시그널링 도메인을 탠덤으로 포함할 수 있다.
일부 실시양태에서, CD19 CAR의 신호 펩티드는 CD8α 신호 펩티드를 포함한다. 일부 실시양태에서, CD8α 신호 펩티드는 서열번호 6에 제시된 아미노산 서열, 또는 서열번호 6에 제시된 아미노산 서열과 80% 이상 동일한 (예컨대, 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상 또는 100% 동일한) 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진다. 일부 실시양태에서, 신호 펩티드는 IgK 신호 펩티드를 포함한다. 일부 실시양태에서, IgK 신호 펩티드는 서열번호 7에 제시된 아미노산 서열, 또는 서열번호 7에 제시된 아미노산 서열과 80% 이상 동일한 (예컨대, 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상 또는 100% 동일한) 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진다. 일부 실시양태에서, 신호 펩티드는 GMCSFR-α 또는 CSF2RA 신호 펩티드를 포함한다. 일부 실시양태에서, GMCSFR-α 또는 CSF2RA 신호 펩티드는 서열번호 8에 제시된 아미노산 서열, 또는 서열번호 8에 제시된 아미노산과 80% 이상 동일한 (예컨대, 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상 또는 100% 동일한) 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진다.
일부 실시양태에서, CD19 CAR의 세포외 결합 도메인은 CD19, 예를 들어, 인간 CD19에 특이적이다. CD19 CAR의 세포외 결합 도메인은 숙주 세포에서의 발현을 위해 또는 세포외 결합 도메인의 기능을 증가시키기 위한 변이체 서열을 갖도록 코돈-최적화될 수 있다. 일부 실시양태에서, 세포외 결합 도메인은 면역글로불린 분자, 예를 들어, scFv의 면역원성 활성 부분을 포함한다.
일부 실시양태에서, CD19 CAR의 세포외 결합 도메인은 링커에 의해 연접된 FMC63의 중쇄 가변 영역 (VH) 및 경쇄 가변 영역 (VL)을 포함하는 FMC63 단클론 항체 (FMC63)로부터 유래된 scFv를 포함한다. FMC63 및 유래된 scFv는 Nicholson 등, Mol. Immun. 34(16-17):1157-1165 (1997) 및 PCT 출원 공개공보 번호 WO2018/213337에 기재되어 있으며, 이들 각각의 전체 내용은 본원에 참조로 원용된다. 일부 실시양태에서, 전체 FMC63-유래된 scFv (FMC63 scFv로서 또한 지칭됨) 및 이의 상이한 부분의 아미노산 서열은 하기 표 6에 제공된다. 일부 실시양태에서, CD19-특이적 scFv는 서열번호 19, 20 또는 25에 제시된 아미노산 서열, 또는 서열번호 19, 20 또는 25에 제시된 아미노산과 80% 이상 동일한 (예컨대, 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99%, 또는 100% 동일한) 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진다. 일부 실시양태에서, CD19-특이적 scFv는 서열번호 21-23 및 26-28에 제시된 아미노산 서열을 갖는 하나 이상의 CDR을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, CD19-특이적 scFv는 서열번호 21-23에 제시된 아미노산 서열을 갖는 하나 이상의 CDR을 갖는 경쇄를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, CD19-특이적 scFv는 서열번호 26-28에 제시된 아미노산 서열을 갖는 하나 이상의 CDR을 갖는 중쇄를 포함할 수 있다. 이들 실시양태 중 임의의 것에서, CD19-특이적 scFv는 하나 이상의 아미노산 치환을 포함하거나, 식별된 서열 중 임의의 것과 80% 이상 동일한 (예컨대, 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상 또는 100% 동일한) 서열을 포함하는 하나 이상의 CDR을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, CD19 CAR의 세포외 결합 도메인은 본원에 기재된 바와 같은 하나 이상의 CDR을 포함하거나 이로 이루어진다.
일부 실시양태에서, scFv의 VH 및 VL 부분을 연결하는 링커는 서열번호 24에 제시된 아미노산 서열을 갖는 위트로우 링커이다. 일부 실시양태에서, 위트로우 링커는 상이한 링커, 예를 들어, 서열번호 30에 제시된 아미노산 서열을 갖는 3xG4S 링커로 대체될 수 있으며, 이는 서열번호 29에 제시된 아미노산 서열을 갖는 상이한 FMC63-유래된 scFv를 발생시킨다. 이들 중 특정 실시양태에서, CD19-특이적 scFv는 서열번호 29에 제시된 아미노산 서열, 또는 서열번호 29에 제시된 아미노산 서열과 80% 이상 동일한 (예컨대, 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상 또는 100% 동일한) 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진다.
표 6. 항-CD19 scFv 및 구성요소의 예시적인 서열
일부 실시양태에서, CD19 CAR의 세포외 결합 도메인은 예를 들어, SJ25C1 (Bejcek 등, Cancer Res. 55:2346-2351 (1995)), HD37 (Pezutto 등, J. Immunol. 138(9):2793-2799 (1987)), 4G7 (Meeker 등, Hybridoma 3:305-320 (1984)), B43 (Bejcek (1995)), BLY3 (Bejcek (1995)), B4 (Freedman 등, 70:418-427 (1987)), B4 HB12b (Kansas & Tedder, J. Immunol. 147:4094-4102 (1991); Yazawa 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 102:15178-15183 (2005); Herbst 등, J. Pharmacol. Exp. Ther. 335:213-222 (2010)), BU12 (Callard 등, J. Immunology, 148(10): 2983-2987 (1992)), 및 CLB-CD19 (De Rie Cell. Immunol. 118:368-381(1989))를 포함하는 CD19에 특이적인 항체로부터 유래된다. 이들 실시양태 중 임의의 것에서, CD19 CAR의 세포외 결합 도메인은 항체 중 임의의 것의 VH, VL 및/또는 하나 이상의 CDR을 포함하거나 이로 이루어질 수 있다.
일부 실시양태에서, CD19 CAR의 힌지 도메인은 CD8α 힌지 도메인, 예를 들어, 인간 CD8α 힌지 도메인을 포함한다. 일부 실시양태에서, CD8α 힌지 도메인은 서열번호 9에 제시된 아미노산 서열, 또는 서열번호 9에 제시된 아미노산 서열과 80% 이상 동일한 (예컨대, 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상 또는 100% 동일한) 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어질 수 있다. 일부 실시양태에서, 힌지 도메인은 CD28 힌지 도메인, 예를 들어, 인간 CD28 힌지 도메인을 포함한다. 일부 실시양태에서, CD28 힌지 도메인은 서열번호 10에 제시된 아미노산 서열, 또는 서열번호 10에 제시된 아미노산 서열과 80% 이상 동일한 (예컨대, 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상 또는 100% 동일한) 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어질 수 있다. 일부 실시양태에서, 힌지 도메인은 IgG4 힌지 도메인, 예를 들어, 인간 IgG4 힌지 도메인을 포함한다. 일부 실시양태에서, IgG4 힌지 도메인은 서열번호 11 또는 서열번호 12에 제시된 아미노산 서열, 또는 서열번호 11 또는 서열번호 12에 제시된 아미노산 서열과 80% 이상 동일한 (예컨대, 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상 또는 100% 동일한) 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어질 수 있다. 일부 실시양태에서, 힌지 도메인은 IgG4 힌지-Ch2-Ch3 도메인, 예를 들어, 인간 IgG4 힌지-Ch2-Ch3 도메인을 포함한다. 일부 실시양태에서, IgG4 힌지-Ch2-Ch3 도메인은 서열번호 13에 제시된 아미노산 서열, 또는 서열번호 13에 제시된 아미노산 서열과 80% 이상 동일한 (예컨대, 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상 또는 100% 동일한) 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어질 수 있다.
일부 실시양태에서, CD19 CAR의 막관통 도메인은 CD8α 막관통 도메인, 예를 들어, 인간 CD8α 막관통 도메인을 포함한다. 일부 실시양태에서, CD8α 막관통 도메인은 서열번호 14에 제시된 아미노산 서열, 또는 서열번호 14에 제시된 아미노산 서열과 80% 이상 동일한 (예컨대, 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상 또는 100% 동일한) 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어질 수 있다. 일부 실시양태에서, 막관통 도메인은 CD28 막관통 도메인, 예를 들어, 인간 CD28 막관통 도메인을 포함한다. 일부 실시양태에서, CD28 막관통 도메인은 서열번호 15에 제시된 아미노산 서열, 또는 서열번호 15에 제시된 아미노산 서열과 80% 이상 동일한 (예컨대, 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상 또는 100% 동일한) 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어질 수 있다.
일부 실시양태에서, CD19 CAR의 세포내 공동자극 도메인은 4-1BB 공동자극 도메인을 포함한다. CD137로서 또한 알려진 4-1BB는 강력한 공동자극 신호를 T 세포에 전달하여, 분화를 촉진하고 T 림프구의 장기간 생존을 향상시킨다. 일부 실시양태에서, 4-1BB 공동자극 도메인은 인간이다. 일부 실시양태에서, 4-1BB 공동자극 도메인은 서열번호 16에 제시된 아미노산 서열, 또는 서열번호 16에 제시된 아미노산 서열과 80% 이상 동일한 (예컨대, 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상 또는 100% 동일한) 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어질 수 있다. 일부 실시양태에서, 세포내 공동자극 도메인은 CD28 공동자극 도메인을 포함한다. CD28은 T 세포의 다른 공동-자극 분자이다. 일부 실시양태에서, CD28 공동자극 도메인은 인간이다. 일부 실시양태에서, CD28 공동자극 도메인은 서열번호 17에 제시된 아미노산 서열, 또는 서열번호 17에 제시된 아미노산 서열과 80% 이상 동일한 (예컨대, 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상 또는 100% 동일한) 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어질 수 있다. 일부 실시양태에서, CD19 CAR의 세포내 공동자극 도메인은 기재된 바와 같이 4-1BB 공동자극 도메인 및 CD28 공동자극 도메인을 포함한다.
일부 실시양태에서, CD19 CAR의 세포내 시그널링 도메인은 CD3 제타 (ζ) 시그널링 도메인을 포함한다. CD3ζ는 T 세포 수용체 (TCR)와 회합하여, 신호를 생산하고, 면 수용체 티로신-기반 활성화 모티프 (ITAM)를 함유한다. CD3ζ 시그널링 도메인은 T 세포 활성화에 필요한 초기 신호를 기능적으로 전달하기에 충분한 제타 쇄의 세포질 도메인으로부터의 아미노산 잔기를 지칭한다. 일부 실시양태에서, CD3ζ 시그널링 도메인은 인간이다. 일부 실시양태에서, CD3ζ 시그널링 도메인은 서열번호 18에 제시된 아미노산 서열, 또는 서열번호 18에 제시된 아미노산 서열과 80% 이상 동일한 (예컨대, 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상 또는 100% 동일한) 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어질 수 있다.
일부 실시양태에서, 폴리시스트론 벡터는 예를 들어, 서열번호 19 또는 서열번호 29에 제시된 서열을 갖는 CD19-특이적 scFv, 서열번호 9의 CD8α 힌지 도메인, 서열번호 14의 CD8α 막관통 도메인, 서열번호 16의 4-1BB 공동자극 도메인, 서열번호 18의 CD3ζ 시그널링 도메인, 및/또는 이의 변이체 (즉, 개시된 서열과 80% 이상 동일한, 예를 들어, 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 또는 99 이상 동일한 서열을 가짐)를 포함하는 CD19 CAR을 포함하여, CD19 CAR을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 함유하는 발현 카세트를 포함한다. 이들 실시양태 중 임의의 것에서, CD19 CAR은 기재된 바와 같은 신호 펩티드 (예컨대, CD8α 신호 펩티드)를 추가적으로 포함할 수 있다.
일부 실시양태에서, 폴리시스트론 벡터는 예를 들어, 서열번호 19 또는 서열번호 29에 제시된 서열을 갖는 CD19-특이적 scFv, 서열번호 11 또는 서열번호 12의 IgG4 힌지 도메인, 서열번호 15의 CD28 막관통 도메인, 서열번호 16의 4-1BB 공동자극 도메인, 서열번호 18의 CD3ζ 시그널링 도메인, 및/또는 이의 변이체 (즉, 개시된 서열과 80% 이상 동일한, 예를 들어, 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 또는 99 이상 동일한 서열을 가짐)를 포함하는 CD19 CAR를 포함하여, CD19 CAR을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 함유하는 발현 카세트를 포함한다. 이들 실시양태 중 임의의 것에서, CD19 CAR은 기재된 바와 같은 신호 펩티드 (예컨대, CD8α 신호 펩티드)를 추가적으로 포함할 수 있다.
일부 실시양태에서, 폴리시스트론 벡터는 예를 들어, 서열번호 19 또는 서열번호 29에 제시된 서열을 갖는 CD19-특이적 scFv, 서열번호 10의 CD28 힌지 도메인, 서열번호 15의 CD28 막관통 도메인, 서열번호 17의 CD28 공동자극 도메인, 서열번호 18의 CD3ζ 시그널링 도메인, 및/또는 이의 변이체 (즉, 개시된 서열과 80% 이상 동일한, 예를 들어, 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 또는 99 이상 동일한 서열을 가짐)를 포함하는 CD19 CAR를 포함하여, CD19 CAR을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 함유하는 발현 카세트를 포함한다. 이들 실시양태 중 임의의 것에서, CD19 CAR은 기재된 바와 같은 신호 펩티드 (예컨대, CD8α 신호 펩티드)를 추가적으로 포함할 수 있다.
일부 실시양태에서, 폴리시스트론 벡터는 서열번호 116에 제시된 CD19 CAR을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 함유하거나, 서열번호 116에 제시된 뉴클레오티드 서열과 80% 이상 동일한 (예컨대, 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상 또는 100% 동일한) 발현 카세트를 포함한다 (표 7 참고). 코딩된 CD19 CAR은 서열번호 117에 제시된 상응하는 아미노산 서열을 갖거나, 서열번호 117에 제시된 아미노산 서열과 80% 이상 동일 (예컨대, 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상 또는 100% 동일)하며, 다음의 구성요소를 포함한다: CD8α 신호 펩티드, FMC63 scFv (VL-위트로우 링커-VH), CD8α 힌지 도메인, CD8α 막관통 도메인, 4-1BB 공동자극 도메인 및 CD3ζ 시그널링 도메인.
일부 실시양태에서, 폴리시스트론 벡터는 CD19 CAR의 상업적으로 이용가능한 실시양태를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 함유하는 발현 카세트를 포함한다. T 세포에 의해 발현 및/또는 코딩되는 CD19 CAR의 상업적으로 이용가능한 실시양태의 비-제한적인 예는 티사젠렉류셀, 리소카브타진 마라류셀, 악시카브타진 실로류셀 및 브렉수카브타진 오토류셀을 포함한다.
일부 실시양태에서, 폴리시스트론 벡터는 티사젠렉류셀 또는 이의 일부를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 함유하는 발현 카세트를 포함한다. 티사젠렉류셀은 다음의 구성요소를 갖는 CD19 CAR을 포함한다: CD8α 신호 펩티드, FMC63 scFv (VL-3xG4S 링커-VH), CD8α 힌지 도메인, CD8α 막관통 도메인, 4-1BB 공동자극 도메인 및 CD3ζ 시그널링 도메인. 티사젠렉류셀에서의 CD19 CAR의 뉴클레오티드 및 아미노산 서열은 표 7에 제공되며, 서열의 주석은 표 8에 제공된다.
일부 실시양태에서, 폴리시스트론 벡터는 리소카브타진 마라류셀 또는 이의 일부를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 함유하는 발현 카세트를 포함한다. 리소카브타진 마라류셀은 다음의 구성요소를 갖는 CD19 CAR을 포함한다: GMCSFR-α 또는 CSF2RA 신호 펩티드, FMC63 scFv (VL-위트로우 링커-VH), IgG4 힌지 도메인, CD28 막관통 도메인, 4-1BB 공동자극 도메인 및 CD3ζ 시그널링 도메인. 리소카브타진 마라류셀에서의 CD19 CAR의 뉴클레오티드 및 아미노산 서열은 표 7에 제공되며, 서열의 주석은 표 9에 제공된다.
일부 실시양태에서, 폴리시스트론 벡터는 악시카브타진 실로류셀 또는 이의 일부를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 함유하는 발현 카세트를 포함한다. 악시카브타진 실로류셀은 다음의 구성요소를 갖는 CD19 CAR을 포함한다: GMCSFR-α 또는 CSF2RA 신호 펩티드, FMC63 scFv (VL-위트로우 링커-VH), CD28 힌지 도메인, CD28 막관통 도메인, CD28 공동자극 도메인 및 CD3ζ 시그널링 도메인. 악시카브타진 실로류셀에서의 CD19 CAR의 뉴클레오티드 및 아미노산 서열은 표 7에 제공되며, 서열의 주석은 표 10에 제공된다.
일부 실시양태에서, 폴리시스트론 벡터는 브렉수카브타진 오토류셀 또는 이의 일부를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 함유하는 발현 카세트를 포함한다. 브렉수카브타진 오토류셀은 다음의 구성요소를 갖는 CD19 CAR을 포함한다: GMCSFR-α 신호 펩티드, FMC63 scFv, CD28 힌지 도메인, CD28 막관통 도메인, CD28 공동자극 도메인 및 CD3ζ 시그널링 도메인.
일부 실시양태에서, 폴리시스트론 벡터는 서열번호 31, 33 또는 35에 제시된 바와 같은 CD19 CAR을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 함유하거나 서열번호 31, 33 또는 35에 제시된 뉴클레오티드 서열과 80% 이상 동일한 (예컨대, 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상 또는 100% 동일한) 발현 카세트를 포함한다. 코딩된 CD19 CAR은 각각 서열번호 32, 34 또는 36에 제시된 상응하는 아미노산 서열을 갖거나, 각각 서열번호 32, 34 또는 36에 제시된 아미노산 서열과 80% 이상 동일 (예컨대, 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상 또는 100% 동일)하다.
표 7. CD19 CAR의 예시적인 서열
표 8. 티사젠렉류셀 CD19 CAR 서열의 주석
표 9. 리소카브타진 마라류셀 CD19 CAR 서열의 주석
표 10. 악시카브타진 실로류셀 CD19 CAR 서열의 주석
일부 실시양태에서, 폴리시스트론 벡터는 서열번호 31, 33 또는 35에 제시된 바와 같은 CD19 CAR을 코딩하는 뉴클레오티드 서열, 또는 서열번호 31, 33 또는 35에 제시된 뉴클레오티드 서열과 80% 이상 동일한 (예컨대, 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상 또는 100% 동일한) 뉴클레오티드 서열을 함유하는 발현 카세트를 포함한다. 코딩된 CD19 CAR은 각각 서열번호 32, 34 또는 36에 제시된 상응하는 아미노산 서열을 갖거나, 각각 서열번호 32, 34 또는 36에 제시된 아미노산 서열과 80% 이상 동일 (예컨대, 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상 또는 100% 동일)하다.
CD20 CAR
일부 실시양태에서, CAR은 CD20 CAR ("CD20-CAR")이고, 이들 실시양태에서, 폴리시스트론 벡터는 CD20 CAR을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 함유하는 발현 카세트를 포함한다. CD20은 pro-B 단계 초기에 B 세포의 표면에서 발견되고 B 세포 성숙까지 점진적으로 증가하는 수준에서 뿐만 아니라 대부분의 B-세포 신생물의 세포에서 발견되는 항원이다. CD20 양성 세포는 때때로 호지킨 질환, 골수종 및 흉선종의 경우에도 발견된다. 일부 실시양태에서, CD20 CAR은 신호 펩티드, CD20에 특이적으로 결합하는 세포외 결합 도메인, 힌지 도메인, 막관통 도메인, 세포내 공동자극 도메인, 및/또는 세포내 시그널링 도메인을 탠덤으로 포함할 수 있다.
일부 실시양태에서, CD20 CAR의 신호 펩티드는 CD8α 신호 펩티드를 포함한다. 일부 실시양태에서, CD8α 신호 펩티드는 서열번호 6에 제시된 아미노산 서열, 또는 서열번호 6에 제시된 아미노산 서열과 80% 이상 동일한 (예컨대, 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상 또는 100% 동일한) 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진다. 일부 실시양태에서, 신호 펩티드는 IgK 신호 펩티드를 포함한다. 일부 실시양태에서, IgK 신호 펩티드는 서열번호 7에 제시된 아미노산 서열, 또는 서열번호 7에 제시된 아미노산 서열과 80% 이상 동일한 (예컨대, 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상 또는 100% 동일한) 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진다. 일부 실시양태에서, 신호 펩티드는 GMCSFR-α 또는 CSF2RA 신호 펩티드를 포함한다. 일부 실시양태에서, GMCSFR-α 또는 CSF2RA 신호 펩티드는 서열번호 8에 제시된 아미노산 서열, 또는 서열번호 8에 제시된 아미노산 서열과 80% 이상 동일한 (예컨대, 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상 또는 100% 동일한) 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진다.
일부 실시양태에서, CD20 CAR의 세포외 결합 도메인은 CD20, 예를 들어, 인간 CD20에 특이적이다. CD20 CAR의 세포외 결합 도메인은 숙주 세포에서의 발현을 위해 또는 세포외 결합 도메인의 기능을 증가시키기 위한 변이체 서열을 갖도록 코돈-최적화될 수 있다. 일부 실시양태에서, 세포외 결합 도메인은 면역글로불린 분자, 예를 들어, scFv의 면역원성 활성 부분을 포함한다.
일부 실시양태에서, CD20 CAR의 세포외 결합 도메인은 예를 들어, Leu16, IF5, 1.5.3, 리툭시맙, 오비누투주맙, 이브리투모맙, 오파투무맙, 토시투무맙, 오드로넥스타맙, 벨투주맙, 유블리툭시맙 및 오크렐리주맙을 포함하여 CD20에 특이적인 항체로부터 유래된다. 이들 실시양태 중 임의의 것에서, CD20 CAR의 세포외 결합 도메인은 항체 중 임의의 것의 VH, VL 및/또는 하나 이상의 CDR을 포함하거나 이로 이루어질 수 있다.
일부 실시양태에서, CD20 CAR의 세포외 결합 도메인은 링커에 의해 연접된 Leu16의 중쇄 가변 영역 (VH) 및 경쇄 가변 영역 (VL)을 포함하는 Leu16 단클론 항체로부터 유래된 scFv를 포함한다. Wu 등, Protein Engineering. 14 (12):1025-1033 (2001) 참고한다. 일부 실시양태에서, 링커는 3xG4S 링커이다. 다른 실시양태에서, 링커는 본원에 기재된 바와 같은 위트로우 링커이다. 일부 실시양태에서, 전체 Leu16-유래된 scFv (Leu16 scFv로서 또한 지칭됨)의 상이한 부분 및 이의 상이한 부분의 아미노산 서열은 하기 표 11에 제공되어 있다. 일부 실시양태에서, CD20-특이적 scFv는 서열번호 37, 38, 또는 42에 제시된 아미노산 서열, 또는 서열번호 37, 38, 또는 42에 제시된 아미노산 서열과 80% 이상 동일한 (예컨대, 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상 또는 100% 동일한) 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진다. 일부 실시양태에서, CD20 특이적 scFv는 서열번호 39-41, 43 및 44에 제시된 아미노산 서열을 갖는 하나 이상의 CDR을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, CD20-특이적 scFv는 서열번호 39-41에 제시된 아미노산 서열을 갖는 하나 이상의 CDR을 갖는 경쇄를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, CD20-특이적 scFv는 서열번호 43-44에 제시된 아미노산 서열을 갖는 하나 이상의 CDR을 갖는 중쇄를 포함할 수 있다. 이들 실시양태 중 임의의 것에서, CD20-특이적 scFv는 하나 이상의 아미노산 치환을 포함하거나 식별된 서열 중 임의의 것과 80% 이상 동일한 (예컨대, 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상, 또는 100% 동일한) 서열을 포함하는 하나 이상의 CDR을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, CD20 CAR의 세포외 결합 도메인은 본원에 기재된 바와 같은 하나 이상의 CDR을 포함하거나 이로 이루어진다.
표 11. 항-CD20 scFv 및 구성요소의 예시적인 서열
일부 실시양태에서, CD20 CAR의 힌지 도메인은 CD8α 힌지 도메인, 예를 들어, 인간 CD8α 힌지 도메인을 포함한다. 일부 실시양태에서, CD8α 힌지 도메인은 서열번호 9에 제시된 아미노산 서열, 또는 서열번호 9에 제시된 아미노산 서열과 80% 이상 동일한 (예컨대, 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상 또는 100% 동일한) 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진다. 일부 실시양태에서, 힌지 도메인은 CD28 힌지 도메인, 예를 들어, 인간 CD28 힌지 도메인을 포함한다. 일부 실시양태에서, CD28 힌지 도메인은 서열번호 10에 제시된 아미노산 서열, 또는 서열번호 10에 제시된 아미노산 서열과 80% 이상 동일한 (예컨대, 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상 또는 100% 동일한) 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진다. 일부 실시양태에서, 힌지 도메인은 IgG4 힌지 도메인, 예를 들어, 인간 IgG4 힌지 도메인을 포함한다. 일부 실시양태에서, IgG4 힌지 도메인은 서열번호 11 또는 서열번호 12에 제시된 아미노산 서열, 또는 서열번호 11 또는 서열번호 12에 제시된 아미노산 서열과 80% 이상 동일한 (예컨대, 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상 또는 100% 동일한) 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진다. 일부 실시양태에서, 힌지 도메인은 IgG4 힌지-Ch2-Ch3 도메인, 예를 들어, 인간 IgG4 힌지-Ch2-Ch3 도메인을 포함한다. 일부 실시양태에서, IgG4 힌지-Ch2-Ch3 도메인은 서열번호 13에 제시된 아미노산 서열, 또는 서열번호 13에 제시된 아미노산 서열과 80% 이상 동일한 (예컨대, 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상 또는 100% 동일한) 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진다.
일부 실시양태에서, CD20 CAR의 막관통 도메인은 CD8α 막관통 도메인, 예를 들어, 인간 CD8α 막관통 도메인을 포함한다. 일부 실시양태에서, CD8α 막관통 도메인은 서열번호 14에 제시된 아미노산 서열, 또는 서열번호 14에 제시된 아미노산 서열과 80% 이상 동일한 (예컨대, 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상 또는 100% 동일한) 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진다. 일부 실시양태에서, 막관통 도메인은 CD28 막관통 도메인, 예를 들어, 인간 CD28 막관통 도메인을 포함한다. 일부 실시양태에서, CD28 막관통 도메인은 서열번호 15에 제시된 아미노산 서열, 또는 서열번호 15에 제시된 아미노산 서열과 80% 이상 동일한 (예컨대, 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상 또는 100% 동일한) 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진다.
일부 실시양태에서, CD20 CAR의 세포내 공동자극 도메인은 4-1BB 공동자극 도메인, 예를 들어, 인간 4-1BB 공동자극 도메인을 포함한다. 일부 실시양태에서, 4-1BB 공동자극 도메인은 서열번호 16에 제시된 아미노산 서열, 또는 서열번호 16에 제시된 아미노산 서열과 80% 이상 동일한 (예컨대, 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상 또는 100% 동일한) 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진다. 일부 실시양태에서, 세포내 공동자극 도메인은 CD28 공동자극 도메인, 예를 들어, 인간 CD28 공동자극 도메인을 포함한다. 일부 실시양태에서, CD28 공동자극 도메인은 서열번호 17에 제시된 아미노산 서열, 또는 서열번호 17에 제시된 아미노산 서열과 80% 이상 동일한 (예컨대, 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상 또는 100% 동일한) 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진다.
일부 실시양태에서, CD20 CAR의 세포내 시그널링 도메인은 CD3 제타 (ζ) 시그널링 도메인, 예를 들어, 인간 CD3ζ 시그널링 도메인을 포함한다. 일부 실시양태에서, CD3ζ 시그널링 도메인은 서열번호 18에 제시된 아미노산 서열, 또는 서열번호 18에 제시된 아미노산 서열과 80% 이상 동일한 (예컨대, 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상 또는 100% 동일한) 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진다.
일부 실시양태에서, 폴리시스트론 벡터는 예를 들어, 서열번호 37에 제시된 서열을 갖는 CD20-특이적 scFv, 서열번호 9의 CD8α 힌지 도메인, 서열번호 14의 CD8α 막관통 도메인, 서열번호 16의 4-1BB 공동자극 도메인, 서열번호 18의 CD3ζ 시그널링 도메인, 및/또는 이의 변이체 (즉, 개시된 서열과 80% 이상 동일한, 예를 들어, 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 또는 99 이상 동일한 서열을 가짐)를 포함하는 CD20 CAR을 포함하여, CD20 CAR을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 함유하는 발현 카세트를 포함한다.
일부 실시양태에서, 폴리시스트론 벡터는 예를 들어, 서열번호 37에 제시된 서열을 갖는 CD20-특이적 scFv, 서열번호 10의 CD28 힌지 도메인, 서열번호 14의 CD8α 막관통 도메인, 서열번호 16의 4-1BB 공동자극 도메인, 서열번호 18의 CD3ζ 시그널링 도메인, 및/또는 이의 변이체 (즉, 개시된 서열과 80% 이상 동일한, 예를 들어, 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 또는 99 이상 동일한 서열을 가짐)를 포함하는 CD20 CAR을 포함하여, CD20 CAR을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 함유하는 발현 카세트를 포함한다.
일부 실시양태에서, 폴리시스트론 벡터는 예를 들어, 서열번호 37에 제시된 서열을 갖는 CD20-특이적 scFv, 서열번호 11 또는 서열번호 12의 IgG4 힌지 도메인, 서열번호 14의 CD8α 막관통 도메인, 서열번호 16의 4-1BB 공동자극 도메인, 서열번호 18의 CD3ζ 시그널링 도메인, 및/또는 이의 변이체 (즉, 개시된 서열과 80% 이상 동일한, 예를 들어, 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 또는 99 이상 동일한 서열을 가짐)를 포함하는 CD20 CAR을 포함하여, CD20 CAR을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 함유하는 발현 카세트를 포함한다.
일부 실시양태에서, 폴리시스트론 벡터는 예를 들어, 서열번호 37에 제시된 서열을 갖는 CD20-특이적 scFv, 서열번호 9의 CD8α 힌지 도메인, 서열번호 15의 CD28 막관통 도메인, 서열번호 16의 4-1BB 공동자극 도메인, 서열번호 18의 CD3ζ 시그널링 도메인, 및/또는 이의 변이체 (즉, 개시된 서열과 80% 이상 동일한, 예를 들어, 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 또는 99 이상 동일한 서열을 가짐)를 포함하는 CD20 CAR을 포함하여, CD20 CAR을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 함유하는 발현 카세트를 포함한다.
일부 실시양태에서, 폴리시스트론 벡터는 예를 들어, 서열번호 37에 제시된 서열을 갖는 CD20-특이적 scFv, 서열번호 10의 CD28 힌지 도메인, 서열번호 15의 CD28 막관통 도메인, 서열번호 16의 4-1BB 공동자극 도메인, 서열번호 18의 CD3ζ 시그널링 도메인, 및/또는 이의 변이체 (즉, 개시된 서열과 80% 이상 동일한, 예를 들어, 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 또는 99 이상 동일한 서열을 가짐)를 포함하는 CD20 CAR을 포함하여, CD20 CAR을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 함유하는 발현 카세트를 포함한다.
일부 실시양태에서, 폴리시스트론 벡터는 예를 들어, 서열번호 37에 제시된 서열을 갖는 CD20-특이적 scFv, 서열번호 11 또는 서열번호 1의 IgG4 힌지 도메인, 서열번호 15의 CD28 막관통 도메인, 서열번호 16의 4-1BB 공동자극 도메인, 서열번호 18의 CD3ζ 시그널링 도메인, 및/또는 이의 변이체 (즉, 개시된 서열과 80% 이상 동일한, 예를 들어, 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 또는 99 이상 동일한 서열을 가짐)를 포함하는 CD20 CAR을 포함하여, CD20 CAR을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 함유하는 발현 카세트를 포함한다.
CD22 CAR
일부 실시양태에서, CAR은 CD22 CAR ("CD22-CAR")이고, 이들 실시양태에서, 폴리시스트론 벡터는 CD22 CAR을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 함유하는 발현 카세트를 포함한다. B 세포 수용체 (BCR) 시그널링에 대한 억제 수용체로서 기능하는 성숙한 B 세포의 표면에서 주로 발견되는 막관통 단백질인 CD22. CD22는 B 세포 림프종 및 백혈병 (예컨대, B-만성 림프구성 백혈병, 털 세포 백혈병, 급성 림프구성 백혈병 (ALL) 및 버킷 림프종)의 60-70%에서 발현되며, B 세포 발달의 초기 단계 또는 줄기 세포에서 세포 표면 상에 존재하지 않는다. 일부 실시양태에서, CD22 CAR은 신호 펩티드, CD22에 특이적으로 결합하는 세포외 결합 도메인, 힌지 도메인, 막관통 도메인, 세포내 공동자극 도메인, 및/또는 세포내 시그널링 도메인을 탠덤으로 포함할 수 있다.
일부 실시양태에서, CD22 CAR의 신호 펩티드는 CD8α 신호 펩티드를 포함한다. 일부 실시양태에서, CD8α 신호 펩티드는 서열번호 6에 제시된 아미노산 서열, 또는 서열번호 6에 제시된 아미노산 서열과 80% 이상 동일한 (예컨대, 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상 또는 100% 동일한) 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진다. 일부 실시양태에서, 신호 펩티드는 IgK 신호 펩티드를 포함한다. 일부 실시양태에서, IgK 신호 펩티드는 서열번호 7에 제시된 아미노산 서열, 또는 서열번호 7에 제시된 아미노산 서열과 80% 이상 동일한 (예컨대, 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상 또는 100% 동일한) 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진다. 일부 실시양태에서, 신호 펩티드는 GMCSFR-α 또는 CSF2RA 신호 펩티드를 포함한다. 일부 실시양태에서, GMCSFR-α 또는 CSF2RA 신호 펩티드는 서열번호 8에 제시된 아미노산 서열, 또는 서열번호 8에 제시된 아미노산 서열과 80% 이상 동일한 (예컨대, 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상 또는 100% 동일한) 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진다.
일부 실시양태에서, CD22 CAR의 세포외 결합 도메인은 CD22, 예를 들어, 인간 CD22에 특이적이다. CD22 CAR의 세포외 결합 도메인은 숙주 세포에서의 발현을 위해 또는 세포외 결합 도메인의 기능을 증가시키는 변이체 서열을 갖도록 코돈-최적화될 수 있다. 일부 실시양태에서, 세포외 결합 도메인은 면역글로불린 분자, 예를 들어, scFv의 면역원성 활성 부분을 포함한다.
일부 실시양태에서, CD22 CAR의 세포외 결합 도메인은 예를 들어, SM03, 이노투주맙, 에프라투주맙, 목세투모맙 및 피나투주맙을 포함하여 CD22에 특이적인 항체로부터 유래된다. 이들 실시양태 중 임의의 것에서, CD22 CAR의 세포외 결합 도메인은 항체 중 임의의 것의 VH, VL 및/또는 하나 이상의 CDR을 포함하거나 이로 이루어질 수 있다.
일부 실시양태에서, CD22 CAR의 세포외 결합 도메인은 링커에 의해 연접된 m971의 중쇄 가변 영역 (VH) 및 경쇄 가변 영역 (VL)을 포함하는 m971 단클론 항체 (m971)로부터 유래된 scFv를 포함한다. 일부 실시양태에서, 링커는 3xG4S 링커이다. 다른 실시양태에서, 위트로우 링커가 대신 사용될 수 있다. 일부 실시양태에서, 전체 m971-유래된 scFv (m971 scFv로서 또한 지칭됨) 및 이의 상이한 부분의 아미노산 서열은 하기 표 12에 제공되어 있다. 일부 실시양태에서, CD22-특이적 scFv는 서열번호 45, 46 또는 50에 제시된 아미노산 서열, 또는 서열번호 45, 46 또는 50에 제시된 아미노산 서열과 80% 이상 동일한 (예컨대, 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상 또는 100% 동일한) 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진다. 일부 실시양태에서, CD22-특이적 scFv는 서열번호 47-49 및 51-53에 제시된 아미노산 서열을 갖는 하나 이상의 CDR을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, CD22-특이적 scFv는 서열번호 47-49에 제시된 아미노산 서열을 갖는 하나 이상의 CDR을 갖는 중쇄를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, CD22-특이적 scFv는 서열번호 51-53에 제시된 아미노산 서열을 갖는 하나 이상의 CDR을 갖는 경쇄를 포함할 수 있다. 이들 실시양태 중 임의의 것에서, CD22-특이적 scFv는 하나 이상의 아미노산 치환을 포함하거나 식별된 서열 중 임의의 것과 80% 이상 동일한 (예컨대, 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상, 또는 100% 동일한) 서열을 포함하는 하나 이상의 CDR을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, CD22 CAR의 세포외 결합 도메인은 본원에 기재된 바와 같은 하나 이상의 CDR을 포함하거나 이로 이루어진다.
일부 실시양태에서, CD22 CAR의 세포외 결합 도메인은 m971-L7로부터 유래된 scFv를 포함하며, 이는 모 항체 m971과 비교하여 유의하게 개선된 (약 2 nM 내지 50 pM 미만 개선된) CD22 결합 친화도를 갖는 m971의 친화도 성숙된 변이체이다. 일부 실시양태에서, m971-L7로부터 유래된 scFv는 3xG4S 링커에 의해 연접된 m971-L7의 VH 및 VL을 포함한다. 다른 실시양태에서, 위트로우 링커가 대신 사용될 수 있다. 일부 실시양태에서, 전체 m971-L7-유래된 scFv (m971-L7 scFv로서 또한 지칭됨) 및 이의 상이한 부분의 아미노산 서열은 하기 표 12에 제공되어 있다. 일부 실시양태에서, CD22-특이적 scFv는 서열번호 54, 55 또는 59에 제시된 아미노산 서열, 또는 서열번호 54, 55 또는 59에 제시된 아미노산 서열과 80% 이상 동일한 (예컨대, 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상 또는 100% 동일한) 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진다. 일부 실시양태에서, CD22-특이적 scFv는 서열번호 56-58 및 60-62에 제시된 아미노산 서열을 갖는 하나 이상의 CDR을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, CD22-특이적 scFv는 서열번호 56-58에 제시된 아미노산 서열을 갖는 하나 이상의 CDR을 갖는 중쇄를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, CD22-특이적 scFv는 서열번호 60-62에 제시된 아미노산 서열을 갖는 하나 이상의 CDR을 갖는 경쇄를 포함할 수 있다. 이들 실시양태 중 임의의 것에서, CD22-특이적 scFv는 하나 이상의 아미노산 치환을 포함하거나 식별된 서열 중 임의의 것과 80% 이상 동일한 (예컨대, 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상, 또는 100% 동일한) 서열을 포함하는 하나 이상의 CDR을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, CD22 CAR의 세포외 결합 도메인은 본원에 기재된 바와 같은 하나 이상의 CDR을 포함하거나 이로 이루어진다.
표 12. 항-CD22 scFv 및 구성요소의 예시적인 서열
일부 실시양태에서, CD22 CAR의 세포외 결합 도메인은 면역독소 HA22 또는 BL22를 포함한다. 면역독소 BL22 및 HA22는 박테리아 독소에 융합된 CD22에 특이적인 scFv를 포함하고, 따라서 CD22를 발현하는 암세포의 표면에 결합하고 암세포를 살해시킬 수 있는 치료제이다. BL22는 슈도모나스 외독소 A의 38-kDa 절삭된 형태에 융합된 항-CD22 항체, RFB4의 dsFv를 포함한다 (Bang 등, Clin. Cancer Res., 11:1545-50 (2005)). HA22 (CAT8015, 목세투모맙 파수도톡스)는 BL22의 돌연변이된 고친화도 버전이다 (Ho 등, J. Biol. Chem., 280 (1): 607-17 (2005)). CD22에 특이적인 HA22 및 BL22의 항원 결합 도메인의 적합한 서열은 예를 들어, 그 전체가 본원에 참조로 원용되는 미국 특허 번호 7,541,034; 7,355,012; 및 7,982,011에 개시되어 있다.
일부 실시양태에서, CD22 CAR의 힌지 도메인은 CD8α 힌지 도메인, 예를 들어, 인간 CD8α 힌지 도메인을 포함한다. 일부 실시양태에서, CD8α 힌지 도메인은 서열번호 9에 제시된 아미노산 서열, 또는 서열번호 9에 제시된 아미노산 서열과 80% 이상 동일한 (예컨대, 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상 또는 100% 동일한) 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진다. 일부 실시양태에서, 힌지 도메인은 CD28 힌지 도메인, 예를 들어, 인간 CD28 힌지 도메인을 포함한다. 일부 실시양태에서, CD28 힌지 도메인은 서열번호 10에 제시된 아미노산 서열, 또는 서열번호 10에 제시된 아미노산 서열과 80% 이상 동일한 (예컨대, 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상 또는 100% 동일한) 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진다. 일부 실시양태에서, 힌지 도메인은 IgG4 힌지 도메인, 예를 들어, 인간 IgG4 힌지 도메인을 포함한다. 일부 실시양태에서, IgG4 힌지 도메인은 서열번호 11 또는 서열번호 12에 제시된 아미노산 서열, 또는 서열번호 11 또는 서열번호 12에 제시된 아미노산 서열과 80% 이상 동일한 (예컨대, 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상 또는 100% 동일한) 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진다. 일부 실시양태에서, 힌지 도메인은 IgG4 힌지-Ch2-Ch3 도메인, 예를 들어, 인간 IgG4 힌지-Ch2-Ch3 도메인을 포함한다. 일부 실시양태에서, IgG4 힌지-Ch2-Ch3 도메인은 서열번호 13에 제시된 아미노산 서열, 또는 서열번호 13에 제시된 아미노산 서열과 80% 이상 동일한 (예컨대, 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상 또는 100% 동일한) 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진다.
일부 실시양태에서, CD22 CAR의 막관통 도메인은 CD8α 막관통 도메인, 예를 들어, 인간 CD8α 막관통 도메인을 포함한다. 일부 실시양태에서, CD8α 막관통 도메인은 서열번호 14에 제시된 아미노산 서열, 또는 서열번호 14에 제시된 아미노산 서열과 80% 이상 동일한 (예컨대, 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상 또는 100% 동일한) 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진다. 일부 실시양태에서, 막관통 도메인은 CD28 막관통 도메인, 예를 들어, 인간 CD28 막관통 도메인을 포함한다. 일부 실시양태에서, CD28 막관통 도메인은 서열번호 15에 제시된 아미노산 서열, 또는 서열번호 15에 제시된 아미노산 서열과 80% 이상 동일한 (예컨대, 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상 또는 100% 동일한) 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진다.
일부 실시양태에서, CD22 CAR의 세포내 공동자극 도메인은 4-1BB 공동자극 도메인, 예를 들어, 인간 4-1BB 공동자극 도메인을 포함한다. 일부 실시양태에서, 4-1BB 공동자극 도메인은 서열번호 16에 제시된 아미노산 서열, 또는 서열번호 16에 제시된 아미노산 서열과 80% 이상 동일한 (예컨대, 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상 또는 100% 동일한) 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진다. 일부 실시양태에서, 세포내 공동자극 도메인은 CD28 공동자극 도메인, 예를 들어, 인간 CD28 공동자극 도메인을 포함한다. 일부 실시양태에서, CD28 공동자극 도메인은 서열번호 17에 제시된 아미노산 서열, 또는 서열번호 17에 제시된 아미노산 서열과 80% 이상 동일한 (예컨대, 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상 또는 100% 동일한) 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진다.
일부 실시양태에서, CD22 CAR의 세포내 시그널링 도메인은 CD3 제타 (ζ) 시그널링 도메인, 예를 들어, 인간 CD3ζ 시그널링 도메인을 포함한다. 일부 실시양태에서, CD3ζ 시그널링 도메인은 서열번호 18에 제시된 아미노산 서열, 또는 서열번호 18에 제시된 아미노산 서열과 80% 이상 동일한 (예컨대, 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상 또는 100% 동일한) 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진다.
일부 실시양태에서, 폴리시스트론 벡터는 예를 들어, 서열번호 45 또는 서열번호 54에 제시된 서열을 갖는 CD22-특이적 scFv, 서열번호 9의 CD8α 힌지 도메인, 서열번호 14의 CD8α 막관통 도메인, 서열번호 16의 4-1BB 공동자극 도메인, 서열번호 18의 CD3ζ 시그널링 도메인, 및/또는 이의 변이체 (즉, 개시된 서열과 80% 이상 동일한, 예를 들어, 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 또는 99 이상 동일한 서열을 가짐)를 포함하는 CD22 CAR을 포함하여, CD22 CAR을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 함유하는 발현 카세트를 포함한다.
일부 실시양태에서, 폴리시스트론 벡터는 예를 들어, 서열번호 45 또는 서열번호 54에 제시된 서열을 갖는 CD22-특이적 scFv, 서열번호 10의 CD28 힌지 도메인, 서열번호 14의 CD8α 막관통 도메인, 서열번호 16의 4-1BB 공동자극 도메인, 서열번호 18의 CD3ζ 시그널링 도메인, 및/또는 이의 변이체 (즉, 개시된 서열과 80% 이상 동일한, 예를 들어, 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 또는 99 이상 동일한 서열을 가짐)를 포함하는 CD22 CAR을 포함하여, CD22 CAR을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 함유하는 발현 카세트를 포함한다.
일부 실시양태에서, 폴리시스트론 벡터는 예를 들어, 서열번호 45 또는 서열번호 54에 제시된 서열을 갖는 CD22-특이적 scFv, 서열번호 11 또는 서열번호 12의 IgG4 힌지 도메인, 서열번호 14의 CD8α 막관통 도메인, 서열번호 16의 4-1BB 공동자극 도메인, 서열번호 18의 CD3ζ 시그널링 도메인, 및/또는 이의 변이체 (즉, 개시된 서열과 80% 이상 동일한, 예를 들어, 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 또는 99 이상 동일한 서열을 가짐)를 포함하는 CD22 CAR을 포함하여, CD22 CAR을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 함유하는 발현 카세트를 포함한다.
일부 실시양태에서, 폴리시스트론 벡터는 예를 들어, 서열번호 45 또는 서열번호 54에 제시된 서열을 갖는 CD22-특이적 scFv, 서열번호 9의 CD8α 힌지 도메인, 서열번호 15의 CD28 막관통 도메인, 서열번호 16의 4-1BB 공동자극 도메인, 서열번호 18의 CD3ζ 시그널링 도메인, 및/또는 이의 변이체 (즉, 개시된 서열과 80% 이상 동일한, 예를 들어, 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 또는 99 이상 동일한 서열을 가짐)를 포함하는 CD22 CAR을 포함하여, CD22 CAR을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 함유하는 발현 카세트를 포함한다.
일부 실시양태에서, 폴리시스트론 벡터는 예를 들어, 서열번호 45 또는 서열번호 54에 제시된 서열을 갖는 CD22-특이적 scFv, 서열번호 10의 CD28 힌지 도메인, 서열번호 15의 CD28 막관통 도메인, 서열번호 16의 4-1BB 공동자극 도메인, 서열번호 18의 CD3ζ 시그널링 도메인 및/또는 이의 변이체 (즉, 개시된 서열과 80% 이상 동일한, 예를 들어, 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 또는 99 이상 동일한 서열을 가짐)를 포함하는 CD22 CAR을 포함하여, CD22 CAR을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 함유하는 발현 카세트를 포함한다.
일부 실시양태에서, 폴리시스트론 벡터는 예를 들어, 서열번호 45 또는 서열번호 54에 제시된 서열을 갖는 CD22 특이적 scFv, 서열번호 11 또는 서열번호 12의 IgG4 힌지 도메인, 서열번호 15의 CD28 막관통 도메인, 서열번호 16의 4-1BB 공동자극 도메인, 서열번호 18의 CD3ζ 시그널링 도메인, 및/또는 이의 변이체 (즉, 개시된 서열과 80% 이상 동일한, 예를 들어, 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 또는 99 이상 동일한 서열을 가짐)를 포함하는 CD22 CAR을 포함하여, CD22 CAR을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 함유하는 발현 카세트를 포함한다.
BCMA CAR
일부 실시양태에서, CAR은 BCMA CAR ("BCMA-CAR")이고, 이들 실시양태에서, 폴리시스트론 벡터는 BCMA CAR을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 함유하는 발현 카세트를 포함한다. BCMA는 B 세포 계통의 세포에서 발현되는 종양 괴사 패밀리 수용체 (TNFR) 구성원으로, 최종적으로 분화된 B 세포 또는 성숙한 B 림프구에서 가장 많이 발현된다. BCMA는 장기간 체액성 면역을 유지하기 위해 형질 세포의 생존을 매개하는데 관여한다. BCMA의 발현은 최근에 다수의 암, 예컨대, 다발성 골수종, 호지킨 및 비-호지킨 림프종, 다양한 백혈병 및 교모세포종과 관련이 있다. 일부 실시양태에서, BCMA CAR은 신호 펩티드, BCMA에 특이적으로 결합하는 세포외 결합 도메인, 힌지 도메인, 막관통 도메인, 세포내 공동자극 도메인, 및/또는 세포내 시그널링 도메인을 탠덤으로 포함할 수 있다.
일부 실시양태에서, BCMA CAR의 신호 펩티드는 CD8α 신호 펩티드를 포함한다. 일부 실시양태에서, CD8α 신호 펩티드는 서열번호 6에 제시된 아미노산 서열, 또는 서열번호 6에 제시된 아미노산 서열과 80% 이상 동일한 (예컨대, 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상 또는 100% 동일한) 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진다. 일부 실시양태에서, 신호 펩티드는 IgK 신호 펩티드를 포함한다. 일부 실시양태에서, IgK 신호 펩티드는 서열번호 7에 제시된 아미노산 서열, 또는 서열번호 7에 제시된 아미노산 서열과 80% 이상 동일한 (예컨대, 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상 또는 100% 동일한) 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진다. 일부 실시양태에서, 신호 펩티드는 GMCSFR-α 또는 CSF2RA 신호 펩티드를 포함한다. 일부 실시양태에서, GMCSFR-α 또는 CSF2RA 신호 펩티드는 서열번호 8에 제시된 아미노산 서열, 또는 서열번호 8에 제시된 아미노산 서열과 80% 이상 동일한 (예컨대, 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상 또는 100% 동일한) 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진다.
일부 실시양태에서, BCMA CAR의 세포외 결합 도메인은 BCMA, 예를 들어, 인간 BCMA에 특이적이다. BCMA CAR의 세포외 결합 도메인은 숙주 세포에서의 발현을 위해 또는 세포외 결합 도메인의 기능을 증가시키는 변이체 서열을 갖도록 코돈-최적화될 수 있다.
일부 실시양태에서, 세포외 결합 도메인은 면역글로불린 분자, 예를 들어, scFv의 면역원성 활성 부분을 포함한다. 일부 실시양태에서, BCMA CAR의 세포외 결합 도메인은 예를 들어, 벨란타맙, 에를라나타맙, 테클리스타맙, LCAR-B38M 및 실타카브타진을 포함하여 BCMA에 특이적인 항체로부터 유래된다. 이들 실시양태 중 임의의 것에서, BCMA CAR의 세포외 결합 도메인은 항체 중 임의의 것의 VH, VL 및/또는 하나 이상의 CDR을 포함하거나 이로 이루어질 수 있다.
일부 실시양태에서, BCMA CAR의 세포외 결합 도메인은 Carpenter 등, Clin. Cancer Res. 19(8):2048-2060 (2013)에 기재된 바와 같은 뮤린 단클론 항체인 C11D5.3으로부터 유래된 scFv를 포함한다. 또한 PCT 출원 공개공보 번호 WO2010/104949를 참고한다. C11D5.3-유래된 scFv는 위트로우 링커에 의해 연접된 C11D5.3의 중쇄 가변 영역 (VH) 및 경쇄 가변 영역 (VL)을 포함할 수 있으며, 이의 아미노산 서열은 하기 표 13에 제공되어 있다. 일부 실시양태에서, BCMA-특이적 세포외 결합 도메인은 서열번호 63, 64 또는 68에 제시된 아미노산 서열, 또는 서열번호 63, 64 또는 68에 제시된 아미노산 서열과 80% 이상 동일한 (예컨대, 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상 또는 100% 동일한) 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진다. 일부 실시양태에서, BCMA 특이적 세포외 결합 도메인은 서열번호 65-67 및 69-71에 제시된 아미노산 서열을 갖는 하나 이상의 CDR을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, BCMA-특이적 세포외 결합 도메인은 서열번호 65-67에 제시된 아미노산 서열을 갖는 하나 이상의 CDR을 갖는 경쇄를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, BCMA-특이적 세포외 결합 도메인은 서열번호 69-71에 제시된 아미노산 서열을 갖는 하나 이상의 CDR을 갖는 중쇄를 포함할 수 있다. 이들 실시양태 중 임의의 것에서, BCMA-특이적 scFv는 하나 이상의 아미노산 치환을 포함하거나 식별된 서열 중 임의의 것과 80% 이상 동일한 (예컨대, 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상, 또는 100% 동일한) 서열을 포함하는 하나 이상의 CDR을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, BCMA CAR의 세포외 결합 도메인은 본원에 기재된 바와 같은 하나 이상의 CDR을 포함하거나 이로 이루어진다.
일부 실시양태에서, BCMA CAR의 세포외 결합 도메인은 Carpenter 등, Clin. Cancer Res. 19(8):2048-2060 (2013) 및 PCT 출원 공개공보 번호 WO2010/104949에 기재된 바와 같은 다른 뮤린 단클론 항체인 C12A3.2로부터 유래된 scFv를 포함하며, 이의 아미노산 서열은 또한 하기 표 13에 제공되어 있다. 일부 실시양태에서, BCMA-특이적 세포외 결합 도메인은 서열번호 72, 73 또는 77에 제시된 아미노산 서열, 또는 서열번호 72, 73 또는 77에 제시된 아미노산 서열과 80% 이상 동일한 (예컨대, 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상 또는 100% 동일한) 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진다. 일부 실시양태에서, BCMA-특이적 세포외 결합 도메인은 서열번호 74-76 및 78-80에 제시된 아미노산 서열을 갖는 하나 이상의 CDR을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, BCMA-특이적 세포외 결합 도메인은 서열번호 74-76에 제시된 아미노산 서열을 갖는 하나 이상의 CDR을 갖는 경쇄를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, BCMA-특이적 세포외 결합 도메인은 서열번호 78-80에 제시된 아미노산 서열을 갖는 하나 이상의 CDR을 갖는 중쇄를 포함할 수 있다. 이들 실시양태 중 임의의 것에서, BCMA-특이적 scFv는 하나 이상의 아미노산 치환을 포함하거나 식별된 서열 중 임의의 것과 80% 이상 동일한 (예컨대, 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상, 또는 100% 동일한) 서열을 포함하는 하나 이상의 CDR을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, BCMA CAR의 세포외 결합 도메인은 본원에 기재된 바와 같은 하나 이상의 CDR을 포함하거나 이로 이루어진다.
일부 실시양태에서, BCMA CAR의 세포외 결합 도메인은 Friedman 등, Hum. Gene Ther. 29(5):585-601 (2018))에서 BB2121로서 지칭되는, 인간 BCMA에 대해 높은 특이성을 갖는 뮤린 단클론 항체를 포함한다. 또한, PCT 출원 공개공보 번호 WO2012163805를 참고한다.
일부 실시양태에서, BCMA CAR의 세포외 결합 도메인은 LCAR-B38M로서 또한 지칭되는, Zhao 등, J. Hematol. Oncol. 11(1):141 (2018)에 기재된 바와 같은 BCMA의 2 개의 에피토프에 결합할 수 있는 2 개의 중쇄의 단일 가변 단편 (VHH)을 포함한다. 또한, PCT 출원 공개공보 번호 WO2018/028647을 참고한다.
일부 실시양태에서, BCMA CAR의 세포외 결합 도메인은 FHVH33로서 또한 지칭되는, Lam 등, Nat. Commun. 11(1):283 (2020)에 기재된 바와 같은 전체 인간 중쇄 가변 도메인 (FHVH)을 포함한다. 또한, PCT 출원 공개공보 번호 WO2019/006072를 참고한다. FHVH33의 아미노산 서열 및 이의 CDR은 하기 표 13에 제공되어 있다. 일부 실시양태에서, BCMA-특이적 세포외 결합 도메인은 서열번호 81에 제시된 아미노산 서열, 또는 서열번호 81에 제시된 아미노산 서열과 80% 이상 동일한 (예컨대, 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상 또는 100% 동일한) 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진다. 일부 실시양태에서, BCMA-특이적 세포외 결합 도메인은 서열번호 82-84에 제시된 아미노산 서열을 갖는 하나 이상의 CDR을 포함할 수 있다. 이들 실시양태 중 임의의 것에서, BCMA-특이적 세포외 결합 도메인은 하나 이상의 아미노산 치환을 포함하거나 식별된 서열 중 임의의 것과 80% 이상 동일한 (예컨대, 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상, 또는 100% 동일한) 서열을 포함하는 하나 이상의 CDR을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, BCMA CAR의 세포외 결합 도메인은 본원에 기재된 바와 같은 하나 이상의 CDR을 포함하거나 이로 이루어진다.
일부 실시양태에서, BCMA CAR의 세포외 결합 도메인은 미국 특허 번호 11,026,975 B2에 기재된 바와 같은 CT103A (또는 CAR0085)로부터 유래된 scFv를 포함하며, 이의 아미노산 서열은 하기 표 13에 제공되어 있다. 일부 실시양태에서, BCMA-특이적 세포외 결합 도메인은 서열번호 118, 119 또는 123에 제시된 아미노산 서열, 또는 서열번호 118, 119 또는 123에 제시된 아미노산 서열과 80% 이상 동일한 (예컨대, 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상 또는 100% 동일한) 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진다. 일부 실시양태에서, BCMA-특이적 세포외 결합 도메인은 서열번호 120-122 및 124-126에 제시된 아미노산 서열을 갖는 하나 이상의 CDR을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, BCMA-특이적 세포외 결합 도메인은 서열번호 120-122에 제시된 아미노산 서열을 갖는 하나 이상의 CDR을 갖는 경쇄를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, BCMA-특이적 세포외 결합 도메인은 서열번호 124-126에 제시된 아미노산 서열을 갖는 하나 이상의 CDR을 갖는 중쇄를 포함할 수 있다. 이들 실시양태 중 임의의 것에서, BCMA-특이적 scFv는 하나 이상의 아미노산 치환을 포함하거나 식별된 서열 중 임의의 것과 80% 이상 동일한 (예컨대, 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상, 또는 100% 동일한) 서열을 포함하는 하나 이상의 CDR을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, BCMA CAR의 세포외 결합 도메인은 본원에 기재된 바와 같은 하나 이상의 CDR을 포함하거나 이로 이루어진다.
추가적으로, BCMA에 대한 CAR 및 바인더는 미국 출원 공개공보 번호 2020/0246381 A1 및 2020/0339699 A1에 기재되어 있으며, 이들 각각의 전체 내용은 본원에 참조로 원용된다.
표 13. 항-BCMA 바인더 및 구성요소의 예시적인 서열
일부 실시양태에서, BCMA CAR의 힌지 도메인은 CD8α 힌지 도메인, 예를 들어, 인간 CD8α 힌지 도메인을 포함한다. 일부 실시양태에서, CD8α 힌지 도메인은 서열번호 9에 제시된 아미노산 서열, 또는 서열번호 9에 제시된 아미노산 서열과 80% 이상 동일한 (예컨대, 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상 또는 100% 동일한) 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진다. 일부 실시양태에서, 힌지 도메인은 CD28 힌지 도메인, 예를 들어, 인간 CD28 힌지 도메인을 포함한다. 일부 실시양태에서, CD28 힌지 도메인은 서열번호 10에 제시된 아미노산 서열, 또는 서열번호 10에 제시된 아미노산 서열과 80% 이상 동일한 (예컨대, 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상 또는 100% 동일한) 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진다. 일부 실시양태에서, 힌지 도메인은 IgG4 힌지 도메인, 예를 들어, 인간 IgG4 힌지 도메인을 포함한다. 일부 실시양태에서, IgG4 힌지 도메인은 서열번호 11 또는 서열번호 12에 제시된 아미노산 서열, 또는 서열번호 11 또는 서열번호 12에 제시된 아미노산 서열과 80% 이상 동일한 (예컨대, 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상 또는 100% 동일한) 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진다. 일부 실시양태에서, 힌지 도메인은 IgG4 힌지-Ch2-Ch3 도메인, 예를 들어, 인간 IgG4 힌지-Ch2-Ch3 도메인을 포함한다. 일부 실시양태에서, IgG4 힌지-Ch2-Ch3 도메인은 서열번호 13에 제시된 아미노산 서열, 또는 서열번호 13에 제시된 아미노산 서열과 80% 이상 동일한 (예컨대, 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상 또는 100% 동일한) 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진다.
일부 실시양태에서, BCMA CAR의 막관통 도메인은 CD8α 막관통 도메인, 예를 들어, 인간 CD8α 막관통 도메인을 포함한다. 일부 실시양태에서, CD8α 막관통 도메인은 서열번호 14에 제시된 아미노산 서열, 또는 서열번호 14에 제시된 아미노산 서열과 80% 이상 동일한 (예컨대, 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상 또는 100% 동일한) 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진다. 일부 실시양태에서, 막관통 도메인은 CD28 막관통 도메인, 예를 들어, 인간 CD28 막관통 도메인을 포함한다. 일부 실시양태에서, CD28 막관통 도메인은 서열번호 15에 제시된 아미노산 서열, 또는 서열번호 15에 제시된 아미노산 서열과 80% 이상 동일한 (예컨대, 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상 또는 100% 동일한) 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진다.
일부 실시양태에서, BCMA CAR의 세포내 공동자극 도메인은 4-1BB 공동자극 도메인, 예를 들어, 인간 4-1BB 공동자극 도메인을 포함한다. 일부 실시양태에서, 4-1BB 공동자극 도메인은 서열번호 16에 제시된 아미노산 서열, 또는 서열번호 16에 제시된 아미노산 서열과 80% 이상 동일한 (예컨대, 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상 또는 100% 동일한) 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진다. 일부 실시양태에서, 세포내 공동자극 도메인은 CD28 공동자극 도메인, 예를 들어, 인간 CD28 공동자극 도메인을 포함한다. 일부 실시양태에서, CD28 공동자극 도메인은 서열번호 17에 제시된 아미노산 서열, 또는 서열번호 17에 제시된 아미노산 서열과 80% 이상 동일한 (예컨대, 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상 또는 100% 동일한) 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진다.
일부 실시양태에서, BCMA CAR의 세포내 시그널링 도메인은 CD3 제타 (ζ) 시그널링 도메인, 예를 들어, 인간 CD3ζ 시그널링 도메인을 포함한다. 일부 실시양태에서, CD3ζ 시그널링 도메인은 서열번호 18에 제시된 아미노산 서열, 또는 서열번호 18에 제시된 아미노산 서열과 80% 이상 동일한 (예컨대, 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상 또는 100% 동일한) 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진다.
일부 실시양태에서, 폴리시스트론 벡터는 예를 들어, 기재된 바와 같은 BCMA-특이적 세포외 결합 도메인 중 임의의 것, 서열번호 9의 CD8α 힌지 도메인, 서열번호 14의 CD8α 막관통 도메인, 서열번호 16의 4-1BB 공동자극 도메인, 서열번호 18의 CD3ζ 시그널링 도메인, 및/또는 이의 변이체 (즉, 개시된 서열과 80% 이상 동일한, 예를 들어, 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 또는 99 이상 동일한 서열을 가짐)를 포함하는 BCMA CAR을 포함하여, BCMA CAR을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 함유하는 발현 카세트를 포함한다. 이들 실시양태 중 임의의 것에서, BCMA CAR은 기재된 바와 같은 신호 펩티드 (예컨대, CD8α 신호 펩티드)를 추가적으로 포함할 수 있다.
일부 실시양태에서, 폴리시스트론 벡터는 예를 들어, 기재된 바와 같은 BCMA-특이적 세포외 결합 도메인 중 임의의 것, 서열번호 9의 CD8α 힌지 도메인, 서열번호 14의 CD8α 막관통 도메인, 서열번호 17의 CD28 공동자극 도메인, 서열번호 18의 CD3ζ 시그널링 도메인, 및/또는 이의 변이체 (즉, 개시된 서열과 80% 이상 동일한, 예를 들어, 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 또는 99 이상 동일한 서열을 가짐)를 포함하는 BCMA CAR을 포함하여, BCMA CAR을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 함유하는 발현 카세트를 포함한다. 이들 실시양태 중 임의의 것에서, BCMA CAR은 기재된 바와 같은 신호 펩티드를 추가적으로 포함할 수 있다.
일부 실시양태에서, 폴리시스트론 벡터는 서열번호 127에 제시된 바와 같은 BCMA CAR을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 함유하거나 서열번호 127에 제시된 뉴클레오티드 서열과 80% 이상 동일한 (예컨대, 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상, 또는 100% 동일한) 발현 카세트를 포함한다 (표 14 참고). 코딩된 BCMA CAR은 서열번호 128에 제시된 상응하는 아미노산 서열을 갖거나 서열번호 128에 제시된 아미노산 서열과 80% 이상 동일 (예컨대, 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상 또는 100% 동일)하며, 다음 구성요소를 포함한다: CD8α 신호 펩티드, CT103A scFv (VL-위트로우 링커-VH), CD8α 힌지 도메인, CD8α 막관통 도메인, 4-1BB 공동자극 도메인 및 CD3ζ 시그널링 도메인.
일부 실시양태에서, 폴리시스트론 벡터는 예를 들어, 이데카브타진 비클류셀 (ide-cel, bb2121이라고도 함)을 포함하는 BCMA CAR의 상업적으로 이용가능한 실시양태를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 함유하는 발현 카세트를 포함한다. 일부 실시양태에서, 폴리시스트론 벡터는 이데카브타진 비클류셀 또는 이의 일부를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 함유하는 발현 카세트를 포함한다. 이데카브타진 비클류셀은 다음의 구성요소를 포함하는 BCMA CAR을 포함한다: BB2121 바인더, CD8α 힌지 도메인, CD8α 막관통 도메인, 4-1BB 공동자극 도메인 및 CD3ζ 시그널링 도메인.
표 14. BCMA CAR의 예시적인 서열
O. 저면역원성 세포의 특질
일부 실시양태에서, 저면역원성 줄기 세포의 집단은 대조군 줄기 세포 (예컨대, 야생형 줄기 세포 또는 면역원성 줄기 세포)와 비교하여 만능성을 유지한다. 일부 실시양태에서, 저면역원성 줄기 세포의 집단은 대조군 줄기 세포 (예컨대, 야생형 줄기 세포 또는 면역원성 줄기 세포)와 비교하여 분화 가능성을 유지한다.
일부 실시양태에서, 저면역원성 세포, 예컨대, 저면역원성 CAR-T 세포의 투여된 집단은 대상체 또는 환자에서 감소된 수준 또는 더 낮은 수준의 면역 활성화를 이끌어낸다. 일부 경우에, 세포에 의해 이끌어내진 면역 활성화의 수준은 면역원성 세포의 투여에 의해 생산된 면역 활성화의 수준과 비교하여 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 이상 더 낮다. 일부 실시양태에서, 투여된 저면역원성 세포의 집단은 대상체 또는 환자에서 면역 활성화를 이끌어내지 못한다.
일부 실시양태에서, 저면역원성 세포, 예컨대, 저면역원성 CAR-T 세포의 투여된 집단은 대상체 또는 환자에서 감소된 수준 또는 더 낮은 수준의 T 세포 반응을 이끌어낸다. 일부 경우에, 세포에 의해 이끌어내진 T 세포 반응의 수준은 면역원성 세포의 투여에 의해 생산된 T 세포 반응의 수준과 비교하여 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 이상 더 낮다. 일부 실시양태에서, 투여된 저면역원성 세포의 집단은 대상체 또는 환자에서 세포에 대한 T 세포 반응을 이끌어내지 못한다.
일부 실시양태에서, 저면역원성 세포, 예컨대, 저면역원성 CAR-T 세포의 투여된 집단은 대상체 또는 환자에서 감소된 수준 또는 더 낮은 수준의 NK 세포 반응을 이끌어낸다. 일부 경우에, 세포에 의해 이끌어내진 NK 세포 반응의 수준은 면역원성 세포의 투여에 의해 생산된 NK 세포 반응의 수준과 비교하여 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 이상 더 낮다. 일부 실시양태에서, 투여된 저면역원성 세포의 집단은 대상체 또는 환자에서 세포에 대한 NK 세포 반응을 이끌어내지 못한다.
일부 실시양태에서, 저면역원성 세포, 예컨대, 저면역원성 CAR-T 세포의 투여된 집단은 대상체 또는 환자에서 감소된 수준 또는 더 낮은 수준의 대식세포 탐식을 이끌어낸다. 일부 경우에, 세포에 의해 이끌어내진 NK 세포 반응의 수준은 면역원성 세포의 투여에 의해 생산된 대식세포 탐식의 수준과 비교하여 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 이상 더 낮다. 일부 실시양태에서, 투여된 저면역원성 세포의 집단은 대상체 또는 환자에서 세포의 대식세포 탐식을 이끌어내지 못한다.
일부 실시양태에서, 저면역원성 세포, 예컨대, 저면역원성 CAR-T 세포의 투여된 집단은 대상체 또는 환자에서 전신 TH1 활성화의 감소된 수준 또는 더 낮은 수준을 이끌어낸다. 일부 경우에, 세포에 의해 이끌어내진 전신 TH1 활성화의 수준은 면역원성 세포의 투여에 의해 생산된 전신 TH1 활성화의 수준과 비교하여 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 이상 더 낮다. 일부 실시양태에서, 투여된 저면역원성 세포의 집단은 대상체 또는 환자에서 전신 TH1 활성화를 이끌어내지 못한다.
일부 실시양태에서, 저면역원성 세포, 예컨대, 저면역원성 CAR-T 세포의 투여된 집단은 대상체 또는 환자에서 감소된 수준 또는 더 낮은 수준의 NK 세포 살해를 이끌어낸다. 일부 경우에, 세포에 의해 이끌어내진 NK 세포 살해의 수준은 면역원성 세포의 투여에 의해 생산된 NK 세포 살해의 수준과 비교하여 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 이상 더 낮다. 일부 실시양태에서, 투여된 저면역원성 세포의 집단은 대상체 또는 환자에서 NK 세포 살해를 이끌어내지 못한다.
일부 실시양태에서, 저면역원성 세포, 예컨대, 저면역원성 CAR-T 세포의 투여된 집단은 대상체 또는 환자에서 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC)의 면역 활성화의 감소된 수준 또는 더 낮은 수준을 이끌어낸다. 일부 경우에, 세포에 의해 이끌어내진 PBMC의 면역 활성화의 수준은 면역원성 세포의 투여에 의해 생산된 PBMC의 면역 활성화의 수준과 비교하여 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 이상 더 낮다. 일부 실시양태에서, 투여된 저면역원성 세포의 집단은 대상체 또는 환자에서 PBMC의 면역 활성화를 이끌어내지 못한다.
일부 실시양태에서, 저면역원성 세포, 예컨대, 저면역원성 CAR-T 세포의 투여된 집단은 대상체 또는 환자에서 공여자-특이적 IgG 항체의 감소된 수준 또는 더 낮은 수준을 이끌어낸다. 일부 경우에, 세포에 의해 이끌어내진 공여자-특이적 IgG 항체의 수준은 면역원성 세포의 투여에 의해 생산된 공여자-특이적 IgG 항체의 수준과 비교하여 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 이상 더 낮다. 일부 실시양태에서, 투여된 저면역원성 세포의 집단은 대상체 또는 환자에서 공여자-특이적 IgG 항체를 이끌어내지 못한다.
일부 실시양태에서, 저면역원성 세포, 예컨대, 저면역원성 CAR-T 세포의 투여된 집단은 대상체 또는 환자에서 공여자-특이적 IgM 항체의 감소된 수준 또는 더 낮은 수준을 이끌어낸다. 일부 경우에, 세포에 의해 이끌어내진 공여자-특이적 IgM 항체의 수준은 면역원성 세포의 투여에 의해 생산된 공여자-특이적 IgM 항체의 수준과 비교하여 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 이상 더 낮다. 일부 실시양태에서, 투여된 저면역원성 세포의 집단은 대상체 또는 환자에서 공여자-특이적 IgM 항체를 이끌어내지 못한다.
일부 실시양태에서, 저면역원성 세포, 예컨대, 저면역원성 CAR-T 세포의 투여된 집단은 대상체 또는 환자에서 IgM 및 IgG 항체 생산의 감소된 수준 또는 더 낮은 수준을 이끌어낸다. 일부 경우에, 세포에 의해 이끌어내진 IgM 및 IgG 항체 생산의 수준은 면역원성 세포의 투여에 의해 생산된 IgM 및 IgG 항체 생산의 수준과 비교하여 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 이상 더 낮다. 일부 실시양태에서, 투여된 저면역원성 세포의 집단은 대상체 또는 환자에서 IgM 및 IgG 항체 생산을 이끌어내지 못한다.
일부 실시양태에서, 저면역원성 세포, 예컨대, 저면역원성 CAR-T 세포의 투여된 집단은 대상체 또는 환자에서 세포독성 T 세포 살해의 감소된 수준 또는 더 낮은 수준을 이끌어낸다. 일부 경우에, 세포에 의해 이끌어내진 세포독성 T 세포 살해의 수준은 면역원성 세포의 투여에 의해 생산된 세포독성 T 세포 살해의 수준과 비교하여 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 이상 더 낮다. 일부 실시양태에서, 투여된 저면역원성 세포의 집단은 대상체 또는 환자에서 세포독성 T 세포 살해를 이끌어내지 못한다.
일부 실시양태에서, 저면역원성 세포, 예컨대, 저면역원성 CAR-T 세포의 투여된 집단은 대상체 또는 환자에서 보체-의존적 세포독성 (CDC)의 감소된 수준 또는 더 낮은 수준을 이끌어낸다. 일부 경우에, 세포에 의해 이끌어내진 CDC의 수준은 면역원성 세포의 투여에 의해 생산된 CDC의 수준과 비교하여 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 이상 더 낮다. 일부 실시양태에서, 투여된 저면역원성 세포의 집단은 대상체 또는 환자에서 CDC를 이끌어내지 못한다.
P. 일차 T 세포로부터의 치료적 세포
본원은 비제한저그로 면역 인식을 회피하는 일차 T 세포를 포함하는 저면역원성 세포를 제공한다. 일부 실시양태에서, 저면역원성 세포는 일차 T 세포와 같은 T 세포로부터 생산 (예컨대, 생성, 배양 또는 유래)된다. 일부 경우에, 일차 T 세포는 대상체 또는 개체로부터 수득 (예컨대, 수확, 추출, 제거 또는 채취)된다. 일부 실시양태에서, 일차 T 세포는 T 세포가 하나 이상의 대상체 (예컨대, 한명 이상의 건강한 인간을 포함하는 한명 이상의 인간)로부터 유래되도록 T 세포의 풀로부터 생산된다. 일부 실시양태에서, 일차 T 세포의 풀은 1-100 명, 1-50 명, 1-20 명, 1-10 명, 1 명 이상, 2 명 이상, 3 명 이상, 4 명 이상, 5 명 이상, 10 명 이상, 20 명 이상, 30 명 이상, 40 명 이상, 50 명 이상, 또는 100 명 이상의 대상체로부터 유래된다. 일부 실시양태에서, 공여자 대상체는 환자 (예컨대, 치료적 세포가 투여되는 수용자)와 상이하다. 일부 실시양태에서, T 세포의 풀은 환자로부터의 세포를 포함하지 않는다. 일부 실시양태에서, T 세포의 풀이 수득되는 공여자 대상체 중 한명 이상은 환자와 상이하다.
일부 실시양태에서, 저면역원성 세포는 환자 (예컨대, 투여시 수용자)에서 선천적 및/또는 후천적 면역 반응을 활성화하지 않는다. 장애의 치료를 필요로 하는 대상체 (예컨대, 수용자) 또는 환자에 저면역원성 세포의 집단을 투여함으로써 장애를 치료하는 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 저면역원성 세포는 비제한적으로 본원에 기재된 키메라 항원 수용체를 포함하는 키메라 항원 수용체를 발현하도록 조작된 (예컨대, 변형된) T 세포를 포함한다. 일부 경우에, T 세포는 한 명 이상의 개체로부터의 일차 T 세포의 집단 또는 하위집단이다. 일부 실시양태에서, 조작된 또는 변형된 T 세포와 같은 본원에 기재된 T 세포는 내인성 T 세포 수용체의 감소된 발현을 포함한다.
일부 실시양태에서, 본 개시내용은 CD47 및 CAR을 과발현하고, MHC 클래스 I 및/또는 MHC 클래스 II 인간 백혈구 항원의 감소된 발현 또는 발현의 결여를 갖고, TCR 복합체 분자의 감소된 발현 또는 발현의 결여를 갖는 저면역원성 일차 T 세포에 관한 것이다. 본원에 약술된 세포는 CD47 및 CAR을 과발현하고, 면역 인식을 회피한다. 일부 실시양태에서, 일차 T 세포는 MHC 클래스 I 항원, MHC 클래스 II 항원 및/또는 TCR 복합체 분자의 감소된 수준 또는 활성을 나타낸다. 특정 실시양태에서, 일차 T 세포는 CD47 및 CAR을 과발현하고, B2M 유전자에 게놈 변형을 보유한다. 일부 실시양태에서, T 세포는 CD47 및 CAR을 과발현하고 CIITA 유전자에 게놈 변형을 보유한다. 일부 실시양태에서, 일차 T 세포는 CD47 및 CAR을 과발현하고, TRAC 유전자에 게놈 변형을 보유한다. 일부 실시양태에서, 일차 T 세포는 CD47 및 CAR을 과발현하고, TRB 유전자에 게놈 변형을 보유한다. 일부 실시양태에서, T 세포는 CD47 및 CAR을 과발현하고, 다음의 유전자 중 하나 이상에서 게놈 변형을 보유한다: B2M, CIITA, TRAC 및 TRB 유전자.
본 개시내용의 예시적인 T 세포는 세포독성 T 세포, 헬퍼 T 세포, 기억 T 세포, 중앙 기억 T 세포, 이펙터 기억 T 세포, 이펙터 기억 RA T 세포, 조절 T 세포, 조직 침윤성 림프구, 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 특정 실시양태에서, T 세포는 CCR7, CD27, CD28 및 CD45RA를 발현한다. 일부 실시양태에서, 중앙 T 세포는 CCR7, CD27, CD28 및 CD45RO를 발현한다. 다른 실시양태에서, 이펙터 기억 T 세포는 PD-1, CD27, CD28 및 CD45RO를 발현한다. 다른 실시양태에서, 이펙터 기억 RA T 세포는 PD-1, CD57 및 CD45RA를 발현한다.
일부 실시양태에서, T 세포는 변형된 (예컨대, 조작된) T 세포이다. 일부 경우에, 변형된 T 세포는 세포가 손상된 세포, 이형성 세포, 감염된 세포, 면역원성 세포, 염증 세포, 악성 세포, 후형질 세포, 돌연변이 세포 및 이들의 조합 중 하나 이상의 표면 상에 발현된 관심 항원 또는 에피토프에 특이적으로 결합하는 하나 이상의 키메라 항원 수용체를 발현하도록 유발하는 변형을 포함한다. 다른 경우에, 변형된 T 세포는 세포가 인접한 세포, 조직 또는 기관에 근접할 때 세포가 인접한 세포, 조직 또는 기관에서 관심 생물학적 효과를 조정하는 하나 이상의 단백질을 발현하도록 유발하는 변형을 포함한다. 일차 T 세포에 대한 유용한 변형은 US2016/0348073 및 WO2020/018620에 상세히 기재되어 있으며, 이들의 개시내용은 그 전체가 본원에 원용된다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 저면역원성 세포는 비제한적으로 본원에 기재된 키메라 항원 수용체를 포함하는 키메라 항원 수용체를 발현하도록 조작된 (예컨대, 변형된) T 세포를 포함한다. 일부 경우에, T 세포는 한 명 이상의 개체로부터의 일차 T 세포의 집단 또는 하위집단이다. 일부 실시양태에서, 조작된 또는 변형된 T 세포와 같은 본원에 기재된 T 세포는 내인성 T 세포 수용체의 감소된 발현을 포함한다. 일부 실시양태에서, 조작된 또는 변형된 T 세포와 같은 본원에 기재된 T 세포는 세포독성 T-림프구-회합된 단백질 4 (CTLA-4)의 감소된 발현을 포함한다. 다른 실시양태에서, 조작된 또는 변형된 T 세포와 같은 본원에 기재된 T 세포는 프로그래밍된 세포 사멸 (PD-1)의 감소된 발현을 포함한다. 특정 실시양태에서, 조작된 또는 변형된 T 세포와 같은 본원에 기재된 T 세포는 CTLA-4 및 PD-1의 감소된 발현을 포함한다. CTLA-4, PD-1, 및 CTLA-4 및 PD-1 둘 모두의 발현을 감소시키거나 제거하는 방법은 당업자에 의해 인식되는 임의의 방법, 예컨대, 비제한적으로 희귀-절단 엔도뉴클레아제 및 RNA 침묵을 활용하는 유전자 변형 기술 또는 RNA 간섭 기술을 포함할 수 있다. 희귀-절단 엔도뉴클레아제의 비-제한적인 예는 임의의 Cas 단백질, TALEN, 징크 핑거 뉴클레아제, 메가뉴클레아제 및 귀소 엔도뉴클레아제를 포함한다. 일부 실시양태에서, 본원에 개시된 바와 같은 폴리펩티드 (예컨대, 키메라 항원 수용체, CD47, 또는 본원에 개시된 다른 관용원성 인자)를 코딩하는 외인성 핵산은 CTLA-4 및/또는 PD-1 유전자 유전자좌에 삽입된다. 일부 실시양태에서, 외인성 폴리뉴클레오티드는 예를 들어, 벡터를 이용한 바이러스 형질도입을 사용하여 세포의 하나 이상의 대립유전자 내로 삽입된다. 일부 실시양태에서, 벡터는 외인성 폴리뉴클레오티드를 운반하는 슈도타이핑된 자기-비활성화 렌티바이러스 벡터이다. 일부 실시양태에서, 벡터는 수포성 구내염 VSV-G 외피로 슈도타이핑되고 외인성 폴리뉴클레오티드를 운반하는 자기-비활성화 렌티바이러스 벡터이다. 일부 실시양태에서, 외인성 폴리뉴클레오티드는 바이러스 형질도입을 사용하여 세포의 하나 이상의 대립유전자 내로 삽입된다. 일부 실시양태에서, 외인성 폴리뉴클레오티드는 렌티바이러스 기반 바이러스 벡터를 사용하여 세포의 하나 이상의 대립유전자 내로 삽입된다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 T 세포, 예컨대, 조작된 또는 변형된 T 세포는 PD-L1의 향상된 발현을 포함한다.
일부 실시양태에서, 저면역원성 T 세포는 CAR을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하고, 여기서 폴리뉴클레오티드는 게놈 유전자좌에 삽입된다. 일부 실시양태에서, CAR을 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 세포의 게놈 내로 무작위로 통합된다. 일부 실시양태에서, CAR을 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 바이러스 벡터 형질도입을 통해 세포의 게놈 내로 무작위로 통합된다. 일부 실시양태에서, CAR을 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 렌티바이러스 벡터 형질도입을 통해 세포의 게놈 내로 무작위로 통합된다. 일부 실시양태에서, 폴리뉴클레오티드는 세이프 하버 또는 표적 유전자좌, 예컨대, 비제한적으로 AAVS1, CCR5, CLYBL, ROSA26, SHS231, F3 (CD142로서 또한 알려짐), MICA, MICB, LRP1 (CD91로서 또한 알려짐), HMGB1, ABO, RHD, FUT1 또는 KDM5D 유전자 유전자좌 내로 삽입된다. 일부 실시양태에서, 폴리뉴클레오티드는 B2M, CIITA, TRAC, TRB, PD-1 또는 CTLA-4 유전자에 삽입된다.
일부 실시양태에서, 저면역원성 T 세포는 발현 벡터를 사용하여 세포에서 발현되는 CAR을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 일부 실시양태에서, CAR은 세포의 게놈으로의 CAR 서열의 통합을 매개하는 바이러스 발현 벡터를 사용하여 세포에 도입된다. 예를 들어, 세포에서 CAR을 발현하기 위한 발현 벡터는 CAR을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함한다. 발현 벡터는 유도성 발현 벡터일 수 있다. 발현 벡터는 바이러스 벡터, 예컨대, 비제한적으로 렌티바이러스 벡터일 수 있다.
본원에 제공된 저면역원성 T 세포는 비제한적으로 B 세포 급성 림프아구성 백혈병 (B-ALL), 미만성 거대 B-세포 림프종, 간암, 췌장암, 유방암, 난소암, 결장직장암, 폐암, 비-소세포 폐암, 급성 골수성 림프성 백혈병, 다발성 골수종, 위암, 위 선암종, 췌장 선암종, 교모세포종, 신경아세포종, 폐 편평 세포 암종, 간세포 암종 및 방광암을 포함하는 적합한 암의 치료에 유용하다.
Q. 저면역성 만능 줄기 세포로부터 분화된 치료적 세포
본원은 면역 인식을 회피하는 만능 줄기 세포로부터 유래된 세포를 포함하는 저면역원성 세포를 제공한다. 일부 실시양태에서, 세포는 환자 또는 대상체 (예컨대, 투여시 수용자)에서 선천적 및/또는 적응성 면역 반응을 활성화하지 않는다. 장애의 치료를 필요로 하는 수용자 대상체에 대한 저면역원성 세포의 집단의 반복 투약을 포함하는 장애를 치료하는 방법을 제공한다.
일부 실시양태에서, 만능 줄기 세포 및 이러한 만능 줄기 세포로부터 분화된 임의의 세포는 MHC 클래스 I 인간 백혈구 항원의 감소된 발현을 나타내도록 변형된다. 다른 실시양태에서, 만능 줄기 세포 및 이러한 만능 줄기 세포로부터 분화된 임의의 세포는 MHC 클래스 II 인간 백혈구 항원의 감소된 발현을 나타내도록 변형된다. 특정 실시양태에서, 만능 줄기 세포 및 이러한 만능 줄기 세포로부터 분화된 임의의 세포는 TCR 복합체의 감소된 발현을 나타내도록 변형된다. 일부 실시양태에서, 만능 줄기 세포 및 이러한 만능 줄기 세포로부터 분화된 임의의 세포는 MHC 클래스 I 및 II 인간 백혈구 항원의 감소된 발현을 나타내도록 변형된다. 일부 실시양태에서, 만능 줄기 세포 및 이러한 만능 줄기 세포로부터 분화된 임의의 세포는 MHC 클래스 I 및 II 인간 백혈구 항원 및 TCR 복합체의 감소된 발현을 나타내도록 변형된다.
일부 실시양태에서, 만능 줄기 세포 및 이러한 만능 줄기 세포로부터 분화된 임의의 세포는 MHC 클래스 I 및/또는 II 인간 백혈구 항원의 감소된 발현을 나타내고 증가된 CD47 발현을 나타내도록 변형된다. 일부 경우에, 세포는 하나 이상의 CD47 트랜스진을 보유함으로써 CD47을 과발현한다. 일부 실시양태에서, 만능 줄기 세포 및 이러한 만능 줄기 세포로부터 분화된 임의의 세포는 MHC 클래스 I 및 II 인간 백혈구 항원의 감소된 발현을 나타내고 증가된 CD47 발현을 나타내도록 변형된다. 일부 실시양태에서, 만능 줄기 세포 및 이러한 만능 줄기 세포로부터 분화된 임의의 세포는 MHC 클래스 I 및 II 인간 백혈구 항원 및 TCR 복합체의 감소된 발현을 나타내고 증가된 CD47 발현을 나타내도록 변형된다.
일부 실시양태에서, 만능 줄기 세포 및 이러한 만능 줄기 세포로부터 분화된 임의의 세포는 MHC 클래스 I 및/또는 II 인간 백혈구 항원의 감소된 발현을 나타내고, 증가된 CD47 발현을 나타내고, 키메라 항원 수용체를 외인성으로 발현하도록 변형된다. 일부 경우에, 세포는 하나 이상의 CD47 트랜스진을 보유함으로써 CD47 폴리펩티드를 과발현한다. 일부 경우에, 세포는 하나 이상의 CAR 트랜스진을 보유함으로써 CAR 폴리펩티드를 과발현한다. 일부 실시양태에서, 만능 줄기 세포 및 이러한 만능 줄기 세포로부터 분화된 임의의 세포는 MHC 클래스 I 및 II 인간 백혈구 항원의 감소된 발현을 나타내고, 증가된 CD47 발현을 나타내고, 키메라 항원 수용체를 외인성으로 발현하도록 변형된다. 일부 실시양태에서, 만능 줄기 세포 및 이러한 만능 줄기 세포로부터 분화된 임의의 세포는 MHC 클래스 I 및 II 인간 백혈구 항원 및 TCR 복합체의 감소된 발현을 나타내고, 증가된 CD47 발현을 나타내고, 키메라 항원 수용체를 외인성으로 발현하도록 변형된다.
이러한 만능 줄기 세포는 저면역원성 줄기 세포이다. 이러한 분화된 세포는 저면역원성 세포이다.
본원에 기재된 만능 줄기 세포 중 임의의 것은 유기체 및 조직의 임의의 세포로 분화될 수 있다. 일부 실시양태에서, 세포는 MHC 클래스 I 및/또는 II 인간 백혈구 항원의 감소된 발현 및 TCR 복합체의 감소된 발현을 나타낸다. 일부 경우에, MHC 클래스 I 및/또는 II 인간 백혈구 항원의 발현은 동일한 세포 유형의 미변형된 세포 또는 야생형 세포와 비교하여 감소된다. 일부 경우에, TCR 복합체의 발현은 동일한 세포 유형의 미변형된 세포 또는 야생형 세포와 비교하여 감소된다. 일부 실시양태에서, 세포는 증가된 CD47 발현을 나타낸다. 일부 경우에, CD47의 발현은 동일한 세포 유형의 미변형된 세포 또는 야생형 세포와 비교하여 본 개시내용에 포함된 세포에서 증가된다. 일부 실시양태에서, 세포는 외인성 CAR 발현을 나타낸다. MHC 클래스 I 및/또는 II 인간 백혈구 항원 및 TCR 복합체의 수준을 감소시키고 CD47 및 CAR의 발현을 증가시키는 방법이 본원에 기재되어 있다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 방법에 사용되는 세포는 환자 (예컨대, 수용자 대상체)에 투여될 때 면역 인식 및 반응을 회피한다. 세포는 생체외 및 생체내에서 면역 세포에 의한 살해를 회피할 수 있다. 일부 실시양태에서, 세포는 대식세포 및 NK 세포에 의한 살해를 회피한다. 일부 실시양태에서, 세포는 면역 세포 또는 대상체의 면역계에 의해 무시된다. 다시 말해서, 본원에 기재된 방법에 따라 투여된 세포는 면역계의 면역 세포에 의해 검출가능하지 않다. 일부 실시양태에서, 세포는 클로킹되어(cloaked) 면역 거부를 피한다.
만능 줄기 세포 및 이러한 만능 줄기 세포로부터 분화된 임의의 세포가 면역 인식을 회피하는지 여부를 결정하는 방법은 IFN-γ Elispot 검정, 미세아교세포 살해 검정, 세포 생착 동물 모델, 사이토카인 방출 검정, ELISA, 생물발광 이미징 또는 크롬 방출 검정 또는 세포 분석을 위한 실시간 정량적 마이크로전자 바이오센서 시스템 (xCELLigence® RTCA 시스템, Agilent)을 사용한 살해 검정, 혼합된-림프구 반응, 면역형광 분석 등을 포함하나, 이에 제한되지 않는다.
본원에 약술된 치료적 세포는 장애, 예컨대, 비제한적으로 암, 유전적 장애, 만성 감염성 질환, 자가면역 장애, 및 신경학적 장애 등을 치료하는 데 유용하다.
1. 저면역원성 만능 세포로부터 분화된 T 림프구
본원에 제공된, T 림프구 (일차 T 세포를 포함하는 T 세포)는 본원에 기재된 HIP 세포 (예컨대, 저면역원성 iPSC)로부터 유래된다. 만능 줄기 세포 (예컨대, iPSC)로부터 CAR-T 세포를 포함하는 T 세포를 생성하는 방법은 예를 들어, Iriguchi 등, Nature Communications 12, 430 (2021); Themeli 등, Cell Stem Cell, 16(4):357-366 (2015); Themeli 등, Nature Biotechnology 31:928-933 (2013)에 기재되어 있다.
T 림프구 유래된 저면역원성 세포는 면역 인식을 회피하는 일차 T 세포를 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 일부 실시양태에서, 저면역원성 세포는 일차 T 세포와 같은 T 세포로부터 생산 (예컨대, 생성, 배양 또는 유래)된다. 일부 경우에, 일차 T 세포는 대상체 또는 개체로부터 수득 (예컨대, 수확, 추출, 제거 또는 채취)된다. 일부 실시양태에서, 일차 T 세포는 T 세포가 하나 이상의 대상체 (예컨대, 하나 이상의 건강한 인간을 포함하는 하나 이상의 인간)로부터 유래되도록 T 세포의 풀로부터 생산된다. 일부 실시양태에서, 일차 T 세포의 풀은 1-100 명, 1-50 명, 1-20 명, 1-10 명, 1 명 이상, 2 명 이상, 3 명 이상, 4 명 이상, 5 명 이상, 10 명 이상, 20 명 이상, 30 명 이상, 40 명 이상, 50 명 이상, 또는 100 명 이상의 대상체로부터 유래된다. 일부 실시양태에서, 공여자 대상체는 환자 (예컨대, 치료적 세포가 투여되는 수용자)와 상이하다. 일부 실시양태에서, T 세포의 풀은 환자로부터의 세포를 포함하지 않는다. 일부 실시양태에서, T 세포의 풀이 수득되는 공여자 대상체 중 한 명 이상은 환자와 상이하다.
일부 실시양태에서, 저면역원성 세포는 환자 (예컨대, 투여시 수용자)에서 면역 반응을 활성화하지 않는다. 장애의 치료를 필요로 하는 대상체 (예컨대, 수용자) 또는 환자에 저면역원성 세포의 집단을 투여함으로써 장애를 치료하는 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 저면역원성 세포는 비제한적으로 본원에 기재된 키메라 항원 수용체를 포함하는 키메라 항원 수용체를 발현하도록 조작된 (예컨대, 변형된) T 세포를 포함한다. 일부 경우에, T 세포는 한 명 이상의 개체로부터의 일차 T 세포의 집단 또는 하위집단이다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 T 세포, 예컨대, 조작된 또는 변형된 T 세포는 내인성 T 세포 수용체의 감소된 발현을 포함한다.
일부 실시양태에서, HIP-유래된 T 세포는 키메라 항원 수용체 (CAR)를 포함한다. 임의의 적합한 CAR은 본원에 기재된 CAR을 포함하는 hyHIP-유래된 T 세포에 포함될 수 있다. 일부 실시양태에서, 저면역원성 유도 만능 줄기 세포-유래된 T 세포는 CAR을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하고, 여기서 폴리뉴클레오티드는 게놈 유전자좌 내로 삽입된다. 일부 실시양태에서, 폴리뉴클레오티드는 세이프 하버 또는 표적 유전자좌 내로 삽입된다. 일부 실시양태에서, 폴리뉴클레오티드는 B2M, CIITA, TRAC, TRB, PD-1 또는 CTLA-4 유전자에 삽입된다. 본원에 기재된 유전자 편집 방법 (예컨대, CRISPR/Cas 시스템)을 포함하는 저면역원성 세포의 게놈 유전자좌 내로 CAR을 삽입하기 위해 임의의 적합한 방법이 사용될 수 있다.
본원에 제공된 HIP-유래된 T 세포는 비제한적으로 B 세포 급성 림프아구성 백혈병 (B-ALL), 미만성 거대 B-세포 림프종, 간암, 췌장암, 유방암, 난소암, 결장직장암, 폐암, 비-소세포 폐암, 급성 골수성 림프구성 백혈병, 다발성 골수종, 위암, 위 선암종, 췌장 선암종, 교모세포종, 신경아세포종, 폐 편평 세포 암종, 간세포 암종, 및 방광암을 포함하는 적합한 암의 치료에 유용하다.
2. 저면역원성 만능 세포로부터 유래된 NK 세포
본원에 제공된 자연 살해 (NK) 세포는 본원에 기재된 HIP 세포 (예컨대, 저면역원성 iPSC)로부터 유래된다.
NK 세포 ('큰 과립 림프구'로서 또한 정의됨)는 일반적인 림프구 전구체 (또한 B 림프구 및 T 림프구를 생성함)로부터 분화된 세포 계통을 나타낸다. T-세포와 달리, NK 세포는 자연적으로 원형질막에 CD3를 포함하지 않는다. 중요하게는, NK 세포는 TCR을 발현하지 않으며, 전형적으로 다른 항원-특이적 세포 표면 수용체가 또한 결여된다 (뿐만 아니라 TCR 및 CD3가 결여됨, 이들은 또한 면역글로불린 B-세포 수용체를 발현하지 않으며, 대신 전형적으로 CD16 및 CD56을 발현함). NK 세포 세포독성 활성은 감작을 필요로 하지 않지만 IL-2를 포함하여 다양한 사이토카인을 사용한 활성화에 의해 향상된다. NK 세포는 일반적으로 항원-수용체-매개된 시그널링에 필요한 적절한 또는 완전한 시그널링 경로가 결여된 것으로 생각되며, 따라서 항원 수용체-의존적 시그널링, 활성화 및 확장이 가능한 것으로 생각되지 않는다. NK 세포는 세포독성이 있으며, 이들의 세포독성 활성을 조정하기 위해 활성화 및 억제 수용체 시그널링의 균형을 맞춘다. 예를 들어, CD16을 발현하는 NK 세포는 감염된 세포에 결합된 항체의 Fc 도메인에 결합하여, NK 세포 활성화를 초래할 수 있다. 반대로, 높은 수준의 MHC 클래스 I 단백질을 발현하는 세포에 대해서는 활성이 감소한다. 표적 세포와 접촉하면, NK 세포는 단백질, 예컨대, 퍼포린, 및 효소, 예컨대, 프로테아제 (그랜자임)를 방출한다. 퍼포린은 표적 세포의 세포막에 공극을 형성하여, 아폽토시스 또는 세포 용해를 유도할 수 있다.
만능 줄기 세포 (예컨대, iPSC)로부터 CAR-NK-세포를 포함하는 NK 세포를 생성하기 위해 사용될 수 있는 다수의 기술이 있으며; 예를 들어, 이들 모두가 구체적으로 분화를 위한 방법론 및 시약을 위해 그 전체가 참조로 본원에 원용되는, Zhu 등, Methods Mol Biol. 2019; 2048:107-119; Knorr 등, Stem Cells Transl Med. 2013 2(4):274-83. doi: 10.5966/sctm.2012-0084; Zeng 등, Stem Cell Reports. 2017 Dec 12;9(6):1796-1812; Ni 등, Methods Mol Biol. 2013;1029:33-41; Bernareggi 등, Exp Hematol. 2019 71:13-23; Shankar 등, Stem Cell Res Ther. 2020;11(1):234를 참고한다. 분화는 일반적으로 비제한적으로 CD56, KIRs, CD16, NKp44, NKp46, NKG2D, TRAIL, CD122, CD27, CD244, NK1.1, NKG2A/C, NCR1, Ly49, CD49b, CD11b, KLRG1, CD43, CD62L 및/또는 CD226을 포함하는 NK 세포 회합된 및/또는 특이적 마커의 존재를 평가함으로써 당업계에 알려진 바와 같이 검정될 수 있다.
일부 실시양태에서, 저면역원성 만능 세포는 간세포 기능성의 상실 또는 간의 간경화를 다루기 위해 간세포로 분화된다. HIP 세포를 간세포로 분화시키는 데 사용될 수 있는 다수의 기술이 있으며; 예를 들어, 이들 모두가 구체적으로 분화를 위한 방법론 및 시약을 위해 그 전체가 참조로 본원에 원용되는, Pettinato 등, doi: 10.1038/spre32888, Snykers 등, Methods Mol Biol., 2011 698:305-314, Si-Tayeb 등, Hepatology, 2010, 51:297-305 and Asgari 등, Stem Cell Rev., 2013, 9(4):493-504를 참고한다. 분화는 일반적으로 비제한적으로 알부민, 알파 태아단백질 및 피브리노겐을 포함하는 간세포 회합된 및/또는 특이적 마커의 존재를 평가함으로써 당업계에 알려진 바와 같이 검정될 수 있다. 분화는 또한 암모니아의 대사, LDL 저장 및 흡수, ICG 흡수 및 방출, 글리코겐 저장과 같은 기능적으로 측정될 수 있다.
일부 실시양태에서, NK 세포는 환자 (예컨대, 투여시 수용자)에서 선천적 및/또는 적응성 면역 반응을 활성화하지 않는다. 장애의 치료를 필요로 하는 대상체 (예컨대, 수용자) 또는 환자에 NK 세포의 집단을 투여함으로써 장애를 치료하는 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 NK 세포는 비제한적으로 본원에 기재된 키메라 항원 수용체를 포함하는 키메라 항원 수용체를 발현하도록 조작된 (예컨대, 변형된) NK 세포를 포함한다. 본원에 기재된 CAR을 포함하여 임의의 적합한 CAR이 NK 세포에 포함될 수 있다. 일부 실시양태에서, NK 세포는 CAR을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하며, 여기서 폴리뉴클레오티드는 게놈 유전자좌에 삽입된다. 일부 실시양태에서, 폴리뉴클레오티드는 세이프 하버 또는 표적 유전자좌 내로 삽입된다. 일부 실시양태에서, 폴리뉴클레오티드는 B2M, CIITA, PD1 또는 CTLA4 유전자에 삽입된다. 본원에 기재된 유전자 편집 방법 (예컨대, CRISPR/Cas 시스템)을 포함하는 임의의 적합한 방법은 CAR을 NK 세포의 게놈 유전자좌 내로 삽입하기 위해 사용될 수 있다.
R. 유전자 변형의 방법
일부 실시양태에서, 본원의 벡터는 세포 내로 또는 세포의 게놈 내로를 포함하여 다른 핵산 분자를 전달 또는 수송할 수 있는 핵산 분자이다. 전달된 핵산은 일반적으로 벡터 핵산 분자에 연결, 예를 들어, 이 내로 삽입된다. 벡터는 세포에서 자율 복제를 지시하는 서열을 포함할 수 있거나, 숙주 세포 DNA 내로의 통합을 허용하기에 충분한 서열을 포함할 수 있다. 유용한 벡터는 예를 들어, 플라스미드 (예컨대, DNA 플라스미드 또는 RNA 플라스미드), 트랜스포존, 코스미드, 박테리아 인공 염색체 및 바이러스 벡터를 포함한다. 유용한 바이러스 벡터는 예컨대, 복제 결함 레트로바이러스 및 렌티바이러스를 포함한다. 비-바이러스 벡터는 핵산 분자의 세포 내로의 진입을 용이하게 하기 위해 전달 비히클을 필요로 할 수 있다.
바이러스 벡터는 전형적으로 핵산 분자의 전달 또는 세포의 게놈 내로의 통합 또는 핵산 전달을 매개하는 바이러스 입자로의 통합을 용이하게 하는 바이러스-유래된 핵산 요소를 포함하는 핵산 분자를 포함할 수 있다. 바이러스 입자는 전형적으로 핵산(들)에 더하여 다양한 바이러스 구성요소 및 또한 때때로 숙주 세포 구성요소를 포함할 것이다. 바이러스 벡터는 예컨대, 핵산을 세포 내로, 또는 전달된 핵산 (예컨대, 네이키드 DNA로서)으로 전달할 수 있는 바이러스 또는 바이러스 입자를 포함할 수 있다. 바이러스 벡터 및 전달 플라스미드는 주로 바이러스로부터 유래된 구조적 및/또는 기능적 유전적 요소를 포함할 수 있다. 레트로바이러스 벡터는 구조적 및 기능적 유전적 요소를 함유하는 바이러스 벡터 또는 플라스미드, 또는 주로 레트로바이러스로부터 유래되는 이들의 일부를 포함할 수 있다.
본원에 기재된 일부 벡터에서, 복제에 기여하거나 복제에 필수적인 하나 이상의 단백질 코딩 영역의 적어도 일부는 상응하는 야생형 바이러스와 비교하여 부재할 수 있다. 이는 바이러스 벡터 복제-결함을 만든다. 일부 실시양태에서, 벡터는 표적 비-분열 숙주 세포를 형질도입하고/하거나 이의 게놈을 숙주 게놈 내로 통합할 수 있다.
일부 실시양태에서, 레트로바이러스 핵산은 다음 중 하나 이상 (예컨대, 전부)을 포함한다: 5' 프로모터 (예컨대, 전체 패키징된 RNA의 발현을 제어하기 위해), 5' LTR (예컨대, R (폴리아데닐화 꼬리 신호) 및/또는 프라이머 활성화 신호를 포함하는 U5를 포함함), 프라이머 결합 부위, psi 패키징 신호, 핵 수출을 위한 RRE 요소, 트랜스진 발현을 제어하기 위한 트랜스진의 바로 업스트림의 프로모터, 트랜스진 (또는 다른 외인성 약제 요소), 폴리퓨린 트랙트 및 3' LTR (예컨대, 돌연변이된 U3, R 및 U5를 포함함). 일부 실시양태에서, 레트로바이러스 핵산은 cPPT, WPRE 및/또는 인슐레이터 요소 중 하나 이상을 추가로 포함한다.
레트로바이러스는 전형적으로 이의 게놈 RNA의 선형 이중-가닥 DNA 카피로의 역전사에 의해 복제되고, 후속적으로 이의 게놈 DNA를 숙주 게놈으로 공유적으로 통합한다. 야생형 레트로바이러스 게놈의 구조는 종종 5' 긴 말단 반복부 (LTR) 및 3' LTR을 포함하며, 그 사이 또는 그 안에는 게놈이 패키징될 수 있도록 하는 패키징 신호, 프라이머 결합 부위, 숙주 세포 게놈 내로의 통합을 가능하게 하는 통합 부위, 및 바이러스 입자의 조립을 촉진하는 패키징 구성요소를 코딩하는 gag, pol 및 env 유전자가 위치한다. 보다 복잡한 레트로바이러스는 HIV에서의 rev 및 RRE 서열과 같은 추가적인 특징부를 가지고 있어, 통합된 프로바이러스의 RNA 전사물을 핵으로부터 감염된 표적 세포의 세포질로 효율적으로 내보낼 수 있다. 프로바이러스에서, 바이러스 유전자는 긴 말단 반복부 (LTR)로 칭하는 영역에 의해 양쪽 단부에 측접된다. LTR은 프로바이러스 통합 및 전사에 관여한다. LTR은 또한 인핸서-프로모터 서열로서 작용하며, 바이러스 유전자의 발현을 제어할 수 있다. 레트로바이러스 RNA의 캡시드화는 바이러스 게놈의 5' 단부에 위치한 psi 서열 덕분에 발생한다.
LTR 자체는 전형적으로 U3, R 및 U5라고 하는 3 개의 요소로 나눌 수 있는 유사한 (예컨대, 동일한) 서열이다. U3은 RNA의 3' 단부에 고유한 서열로부터 유래된다. R은 RNA의 양쪽 단부에서 반복되는 서열로부터 유래되고, U5는 RNA의 5' 단부에 고유한 서열로부터 유래된다. 3 개의 요소의 크기는 상이한 레트로바이러스 간에 상당히 다를 수 있다.
바이러스 게놈의 경우, 전사 개시의 부위는 전형적으로 하나의 LTR에서 U3 및 R 사이의 경계에 있고, 폴리 (A) 첨가 (종결)의 부위는 다른 LTR에서 R 및 U5 사이의 경계에 있다. U3는 프로바이러스의 대부분의 전사 제어 요소를 함유하고 있으며, 이는 세포 및 일부 경우에, 바이러스 전사 활성화제 단백질에 반응하는 프로모터 및 다중 인핸서 서열을 포함한다. 일부 레트로바이러스는 유전자 발현의 조절에 관여하는 단백질을 코딩하는 다음의 유전자 중 임의의 하나 이상을 포함한다: tot, rev, tax 및 rex.
구조 유전자 gag, pol 및 env 자체와 관련하여, gag는 바이러스의 내부 구조 단백질을 코딩한다. Gag 단백질은 성숙한 단백질 MA (매트릭스), CA (캡시드) 및 NC (뉴클레오캡시드)로 단백분해적으로 처리된다. pol 유전자는 게놈의 복제를 매개하는 RNase H 및 인테그라제 (IN)와 연관된 DNA 중합효소를 함유하는 역전사효소 (RT)를 코딩한다. env 유전자는 세포 수용체 단백질과 특이적으로 상호작용하는 복합체를 형성하는 비리온의 표면 (SU) 당단백질 및 막관통 (TM) 단백질을 코딩한다. 이러한 상호작용은 예컨대, 바이러스 막과 세포막의 융합에 의해 감염을 촉진한다.
복제-결함 레트로바이러스 벡터 게놈에서, gag, pol 및 env는 부재하거나 기능하지 않을 수 있다. RNA의 양쪽 단부에 있는 R 영역은 전형적으로 반복되는 서열이다. U5 및 U3은 각각 RNA 게놈의 5' 및 3' 단부에서 고유한 서열을 나타낸다. 레트로바이러스는 gag, pol 및 env 이외의 단백질을 코딩하는 추가적인 유전자를 또한 함유할 수 있다. 추가적인 유전자의 예는 (HIV에서) vif, vpr, vpx, vpu, tat, rev 및 nef 중 하나 이상을 포함한다. EIAV는 (다른 것들 중에서) 추가적인 유전자 S2를 갖는다.
특정 실시양태에서 사용하기에 적합한 예시적인 레트로바이러스는 다음을 포함하나, 이에 제한되지 않는다: 몰로니 뮤린 백혈병 바이러스 (M-MuLV), 몰로니 뮤린 육종 바이러스 (MoMSV), 하비 뮤린 육종 바이러스 (HaMuSV), 뮤린 유선 종양 바이러스 (MuMTV), 긴팔 원숭이 백혈병 바이러스 (GaLV), 고양이 백혈병 바이러스 (FLV), 스푸마바이러스, 프렌드 뮤린 백혈병 바이러스, 뮤린 줄기 세포 바이러스 (MSCV) 및 라우스 육종 바이러스 (RSV)) 및 렌티바이러스.
일부 실시양태에서, 레트로바이러스는 감레트로바이러스(Gammretrovirus)이다. 일부 실시양태에서 레트로바이러스는 엡실론레트로바이러스이다. 일부 실시양태에서, 레트로바이러스는 알파레트로바이러스이다. 일부 실시양태에서, 레트로바이러스는 베타레트로 바이러스이다. 일부 실시양태에서, 레트로바이러스는 델타레트로 바이러스이다. 일부 실시양태에서, 레트로바이러스는 스푸마레트로바이러스이다. 일부 실시양태에서, 레트로바이러스는 내인성 레트로바이러스이다. 일부 실시양태에서, 레트로바이러스는 렌티바이러스이다.
일부 실시양태에서, 레트로바이러스 또는 렌티바이러스 벡터는 하나 이상의 인슐레이터 요소, 예컨대, 본원에 기재된 인슐레이터 요소를 추가로 포함한다. 다양한 실시양태에서, 벡터는 외인성 약제를 코딩하는 폴리뉴클레오티드에 작동가능하게 연결된 프로모터를 포함한다. 벡터는 하나 이상의 LTR을 가질 수 있으며, 여기서 LTR은 하나 이상의 변형, 예컨대, 하나 이상의 뉴클레오티드 치환, 첨가 또는 결실을 포함한다. 벡터는 형질도입 효율 (예컨대, cPPT/FLAP)을 증가시키는 보조 요소, 바이러스 패키징 (예컨대, Psi (Y) 패키징 신호, RRE) 및/또는 외인성 유전자 발현을 증가시키는 다른 요소 (예컨대, 폴리 (A) 서열) 중 하나 이상을 추가로 포함할 수 있으며, 임의로 WPRE 또는 HPRE를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 렌티바이러스 핵산은 예컨대, 5'으로부터 3'으로의, 프로모터 (예컨대, CMV), R 서열 (예컨대, TAR 포함), U5 서열 (예컨대, 통합을 위한), PBS 서열 (예컨대, 역전사를 위한), DIS 서열 (예컨대, 게놈 이합체화를 위한), psi 패키징 신호, 부분적 gag 서열, RRE 서열 (예컨대, 핵 수출을 위한), cPPT 서열 (예컨대, 핵 도입을 위한), 외인성 약제의 발현을 구동하는 프로모터, 외인성 약제를 코딩하는 유전자, WPRE 서열 (예컨대, 효율적인 트랜스진 발현을 위한), PPT 서열 (예컨대, 역전사를 위한), R 서열 (예컨대, 폴리아데닐화 및 종결을 위한) 및 U5 신호 (예컨대, 통합을 위한) 중 하나 이상, 예컨대, 이의 전부를 포함한다.
예시적인 렌티바이러스는 다음을 포함하나, 이에 제한되지 않는다: HIV (HIV 유형 1 및 HIV 유형 2를 포함하는 인간 면역결핍 바이러스); 비스나-매디 바이러스 (VMV) 바이러스; 염소 관절염-뇌염 바이러스 (CAEV); 말 전염성 빈혈 바이러스 (EIAV); 고양이 면역결핍 바이러스 (FIV); 소 면역 결핍 바이러스 (BIV); 및 시미안 면역결핍 바이러스 (SIV). 일부 실시양태에서, HIV 기반 벡터 백본 (즉, HIV 시스-작용 서열 요소)이 사용된다. 렌티바이러스 벡터는 주로 렌티바이러스로부터 유래되는 LTR을 포함하는 구조적 및 기능적 유전적 요소 또는 이의 일부를 함유하는 바이러스 벡터 또는 플라스미드를 포함할 수 있다.
실시양태에서, 렌티바이러스 벡터 (예컨대, 렌티바이러스 발현 벡터)는 렌티바이러스 전달 플라스미드 (예컨대, 네이키드 DNA로서) 또는 감염성 렌티바이러스 입자를 포함할 수 있다. 요소, 예컨대, 클로닝 부위, 프로모터, 조절 요소, 이종 핵산 등과 관련하여, 이러한 요소의 서열은 렌티바이러스 입자에서 RNA 형태로 존재할 수 있고 DNA 플라스미드에서 DNA 형태로 존재할 수 있음을 이해해야 한다.
실시양태에서, 렌티바이러스 벡터는 패키징 구성요소의 존재 하에 RNA 게놈의 표적 세포를 감염시킬 수 있는 바이러스 입자로의 패키징할 수 있도록 하는 충분한 레트로바이러스 유전 정보를 갖는 벡터이다. 표적 세포의 감염은 역전사 및 표적 세포 게놈으로의 통합을 포함할 수 있다. RLV는 전형적으로 벡터에 의해 표적 세포로 전달될 비-바이러스 코딩 서열을 운반한다. 실시양태에서, RLV는 표적 세포 내에서 감염성 레트로바이러스 입자를 생산하기 위해 독립적으로 복제할 수 없다. 일반적으로 RLV에는 기능적 gag-pol 및/또는 env 유전자 및/또는 복제와 관여된 기타 유전자가 결여되어 있다. 벡터는 예컨대, 그 전체가 본원에 참조로 원용되는 PCT 특허 출원 WO 99/15683에 기재된 바와 같이 스플릿-인트론 벡터로서 구성될 수 있다.
일부 실시양태에서, 렌티바이러스 벡터는 최소 바이러스 게놈을 포함하며, 예컨대, 그 전체가 본원에 참조로 원용되는 WO 98/17815에 기재된 바와 같이 표적 숙주 세포에 관심 뉴클레오티드 서열을 감염, 형질도입 및 전달하는 데 필요한 기능성을 제공하기 위해 예컨대, 바이러스 벡터는 비-필수 요소를 제거하고 필수 요소를 유지하도록 조작되었다.
최소 렌티바이러스 게놈은 예컨대, (5')R-U5-하나 이상의 제1 뉴클레오티드 서열-U3-R(3')을 포함할 수 있다. 그러나, 공급원 세포 내에서 렌티바이러스 게놈을 생산하기 위해 사용되는 플라스미드 벡터는 또한 공급원 세포에서 게놈의 전사를 지시하기 위해 렌티바이러스 게놈에 작동가능하게 연결된 전사 조절 제어 서열을 포함할 수 있다. 이들 조절 서열은 전사된 레트로바이러스 서열, 예컨대, 5' U3 영역과 회합된 자연 서열을 포함할 수 있거나, 이들은 이종 프로모터, 예컨대, 다른 바이러스 프로모터, 예를 들어, CMV 프로모터를 포함할 수 있다. 일부 렌티바이러스 게놈은 효율적인 바이러스 생산을 촉진하기 위한 추가적인 서열을 포함한다. 예를 들어, HIV의 경우에, rev 및 RRE 서열이 포함될 수 있다.
일부 실시양태에서, 희귀-절단 엔도뉴클레아제는 희귀-절단 엔도뉴클레아제를 코딩하는 핵산의 형태로 표적 폴리뉴클레오티드 서열을 함유하는 세포 내로 도입된다. 핵산을 세포 내로 도입하는 과정은 임의의 적합한 기술에 의해 달성될 수 있다. 적합한 기술은 칼슘 포스페이트 또는 지질-매개된 형질주입, 전기천공법 및 바이러스 벡터를 사용한 형질도입 또는 감염을 포함한다. 일부 실시양태에서, 핵산은 DNA를 포함한다. 일부 실시양태에서, 핵산은 본원에 기재된 바와 같이 변형된 DNA를 포함한다. 일부 실시양태에서, 핵산은 mRNA를 포함한다. 일부 실시양태에서, 핵산은 본원에 기재된 바와 같은 변형된 mRNA (예컨대, 합성, 변형된 mRNA)를 포함한다.
본 개시내용은 본 개시내용의 유전자 편집 시스템 (예컨대, CRISPR/Cas)을 활용하여 당업자에게 이용가능한 임의의 방식으로 표적 폴리뉴클레오티드 서열을 변경하는 것을 고려한다. 세포에서 표적 폴리뉴클레오티드 서열을 변경할 수 있는 임의의 CRISPR/Cas 시스템이 사용될 수 있다. 이러한 CRISPR-Cas 시스템은 다양한 Cas 단백질을 사용할 수 있다 (Haft 등 PLoS Comput Biol. 2005; 1(6)e60). CRISPR/Cas 시스템이 세포에서 표적 폴리뉴클레오티드 서열을 변경하도록 허용하는 이러한 Cas 단백질의 분자 기계는 RNA 결합 단백질, 엔도- 및 엑소-뉴클레아제, 헬리카제 및 중합효소를 포함한다. 일부 실시양태에서, CRISPR/Cas 시스템은 CRISPR 유형 I 시스템이다. 일부 실시양태에서, CRISPR/Cas 시스템은 CRISPR 유형 II 시스템이다. 일부 실시양태에서, CRISPR/Cas 시스템은 CRISPR 유형 V 시스템이다.
본 개시내용의 CRISPR/Cas 시스템은 세포에서 임의의 표적 폴리뉴클레오티드 서열을 변경하기 위해 사용될 수 있다. 당업자는 임의의 특정 세포에서 변경될 바람직한 표적 폴리뉴클레오티드 서열이 게놈 서열의 발현이 장애와 연관되거나 그렇지 않으면 세포 내로 병원체의 유입을 용이하게 하는 임의의 게놈 서열에 상응할 수 있음을 용이하게 이해할 것이다. 예를 들어, 세포에서 변경하기 위한 바람직한 표적 폴리뉴클레오티드 서열은 질환 연관된 단일 폴리뉴클레오티드 다형성을 함유하는 게놈 서열에 상응하는 폴리뉴클레오티드 서열일 수 있다. 이러한 예에서, 본 개시내용의 CRISPR/Cas 시스템은 야생형 대립유전자로 대체함으로써 세포에서 질환 연관된 SNP를 교정하기 위해 사용될 수 있다. 다른 예로서, 병원체의 세포 내로의 진입 또는 증식을 담당하는 표적 유전자의 폴리뉴클레오티드 서열은 표적 유전자의 기능을 방해하여 병원체가 세포 내로 유입되거나 세포 안에서 증식하는 것을 방지하기 위한 결실 또는 삽입에 적합한 표적일 수 있다.
일부 실시양태에서, 표적 폴리뉴클레오티드 서열은 게놈 서열이다. 일부 실시양태에서, 표적 폴리뉴클레오티드 서열은 인간 게놈 서열이다. 일부 실시양태에서, 표적 폴리뉴클레오티드 서열은 포유동물 게놈 서열이다. 일부 실시양태에서, 표적 폴리뉴클레오티드 서열은 척추동물 게놈 서열이다.
일부 실시양태에서, 본 개시내용의 CRISPR/Cas 시스템은 Cas 단백질, 및 Cas 단백질을 표적 폴리뉴클레오티드 서열의 표적 모티프에 지시하고 이에 혼성화할 수 있는 하나 이상 내지 2 개의 리보핵산을 포함한다. 본원에 사용된 바와 같이, "단백질" 및 "폴리펩티드"는 펩티드 결합 (즉, 아미노산의 중합체)에 의해 접합된 일련의 아미노산 잔기를 지칭하기 위해 상호교환적으로 사용되며, 변형된 아미노산 (예컨대, 인산화, 당화, 글리코실화, 등) 및 아미노산 유사체를 포함한다. 예시적인 폴리펩티드 또는 단백질은 유전자 산물, 자연 발생 단백질, 상동체, 파라로그, 단편 및 위의 것의 다른 등가물, 변이체 및 유사체를 포함한다.
일부 실시양태에서, Cas 단백질은 하나 이상의 아미노산 치환 또는 변형을 포함한다. 일부 실시양태에서, 하나 이상의 아미노산 치환은 보존적 아미노산 치환을 포함한다. 일부 경우에, 치환 및/또는 변형은 단백질분해를 방지 또는 감소시키고/시키거나 세포에서 폴리펩티드의 반감기를 연장시킬 수 있다. 일부 실시양태에서, Cas 단백질은 펩티드 결합 대체 (예컨대, 우레아, 티오우레아, 카바메이트, 설포닐 우레아 등)를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, Cas 단백질은 자연 발생 아미노산을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, Cas 단백질은 대체 아미노산 (예컨대, D-아미노산, 베타-아미노산, 호모시스테인, 포스포세린 등)을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, Cas 단백질은 모이어티 (예컨대, PEG화, 글리코실화, 지질화, 아세틸화, 말단-캡핑 등)를 포함하는 변형을 포함할 수 있다.
일부 실시양태에서, Cas 단백질은 코어 Cas 단백질, 이의 아이소폼, 또는 임의의 Cas 단백질 또는 이의 아이소폼과 유사한 기능 또는 활성을 갖는 임의의 Cas-유사 단백질을 포함한다. 일부 실시양태에서, Cas 단백질은 코어 Cas 단백질을 포함한다. 예시적인 Cas 코어 단백질은 Cas1, Cas2, Cas3, Cas4, Cas5, Cas6, Cas7, Cas8 및 Cas9를 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 일부 실시양태에서, Cas 단백질은 유형 V Cas 단백질을 포함한다. 일부 실시양태에서, Cas 단백질은 대장균 서브타입 (CASS2로서 또한 알려짐)의 Cas 단백질을 포함한다. 대장균 서브타입의 예시적인 Cas 단백질은 Cse1, Cse2, Cse3, Cse4 및 Cas5e를 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 일부 실시양태에서, Cas 단백질은 Ypest 서브타입의 Cas 단백질 (CASS3으로서 또한 알려짐)을 포함한다. Ypest 서브타입의 예시적인 Cas 단백질은 Csy1, Csy2, Csy3 및 Csy4를 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 일부 실시양태에서, Cas 단백질은 Nmeni 서브타입의 Cas 단백질 (CASS4로서 또한 알려짐)을 포함한다. Nmeni 서브타입의 예시적인 Cas 단백질은 Csn1 및 Csn2를 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 일부 실시양태에서, Cas 단백질은 Dvulg 서브타입의 Cas 단백질 (CASS1로서 또한 알려짐)을 포함한다. Dvulg 서브타입의 예시적인 Cas 단백질은 Csd1, Csd2 및 Cas5d를 포함한다. 일부 실시양태에서, Cas 단백질은 Tneap 서브타입의 Cas 단백질 (CASS7로서 또한 알려짐)을 포함한다. Tneap 서브타입의 예시적인 Cas 단백질은 Cst1, Cst2, Cas5t를 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 일부 실시양태에서, Cas 단백질은 Hmari 서브타입의 Cas 단백질을 포함한다. Hmari 서브타입의 예시적인 Cas 단백질은 Csh1, Csh2 및 Cas5h를 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 일부 실시양태에서, Cas 단백질은 Apern 서브타입의 Cas 단백질 (CASS5로서 또한 알려짐)을 포함한다. Apern 서브타입의 예시적인 Cas 단백질은 Csa1, Csa2, Csa3, Csa4, Csa5 및 Cas5a를 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 일부 실시양태에서, Cas 단백질은 Mtube 서브타입의 Cas 단백질 (CASS6으로서 또한 알려짐)을 포함한다. Mtube 서브타입의 예시적인 Cas 단백질은 Csm1, Csm2, Csm3, Csm4 및 Csm5를 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 일부 실시양태에서, Cas 단백질은 RAMP 모듈 Cas 단백질을 포함한다. 예시적인 RAMP 모듈 Cas 단백질은 Cmr1, Cmr2, Cmr3, Cmr4, Cmr5 및 Cmr6을 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 예컨대, Klompe 등, Nature 571, 219-225 (2019); Strecker 등, Science 365, 48-53 (2019) 참고한다. Cas 단백질의 예는 Cas3, Cas8a, Cas5, Cas8b, Cas8c, Cas10d, Cse1, Cse2, Csy1, Csy2, Csy3, 및/또는 GSU0054를 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 일부 실시양태에서, Cas 단백질은 Cas3, Cas8a, Cas5, Cas8b, Cas8c, Cas10d, Cse1, Cse2, Csy1, Csy2, Csy3, 및/또는 GSU0054를 포함한다. Cas 단백질의 예는 Cas9, Csn2 및/또는 Cas4를 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 일부 실시양태에서, Cas 단백질은 Cas9, Csn2 및/또는 Cas4를 포함한다. 일부 실시양태에서, Cas 단백질의 예는 다음을 포함하나, 이에 제한되지 않는다: Cas10, Csm2, Cmr5, Cas10, Csx11, 및/또는 Csx10. 일부 실시양태에서, Cas 단백질은 Cas10, Csm2, Cmr5, Cas10, Csx11, 및/또는 Csx10을 포함한다. 일부 실시양태에서, Cas 단백질의 예는 Csf1을 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 일부 실시양태에서, Cas 단백질은 Csf1을 포함한다. 일부 실시양태에서, Cas 단백질의 예는 다음을 포함하나, 이에 제한되지 않는다: Cas12a, Cas12b, Cas12c, C2c4, C2c8, C2c5, C2c10, 및 C2c9; 뿐만 아니라 CasX (Cas12e) 및 CasY (Cas12d). 또한, 예컨대, Koonin 등, Curr Opin Microbiol. 2017; 37:67-78: "Diversity, classification and evolution of CRISPR-Cas systems." 참고한다. 일부 실시양태에서, Cas 단백질은 Cas12a, Cas12b, Cas12c, Cas12d, Cas12e, Cas12d, 및/또는 Cas12e를 포함한다. 일부 실시양태에서, Cas 단백질은 Cas13, Cas13a, C2c2, Cas13b, Cas13c, 및/또는 Cas13d를 포함한다. 일부 실시양태에서, CRISPR/Cas 시스템은 다음으로 이루어진 군으로부터 선택된 Cas 이펙터 단백질을 포함한다: a) Cas3, Cas8a, Cas5, Cas8b, Cas8c, Cas10d, Cse1, Cse2, Csy1, Csy2, Csy3, and GSU0054; b) Cas9, Csn2, 및 Cas4; c) Cas10, Csm2, Cmr5, Cas10, Csx11, 및 Csx10; d) Csf1; e) Cas12a, Cas12b, Cas12c, C2c4, C2c8, C2c5, C2c10, C2c9, CasX (Cas12e), 및 CasY (Cas12d); 및 f) Cas13, Cas13a, C2c2, Cas13b, Cas13c, 및 Cas13d.
일부 실시양태에서, Cas 단백질은 본원에 기재된 Cas 단백질 중 어느 하나 또는 이의 기능적 부분을 포함한다. 본원에 사용된 바와 같이, "기능적 부분"은 하나 이상의 리보핵산 (예컨대, 가이드 RNA (gRNA))과 복합체화하고 표적 폴리뉴클레오티드 서열을 절단하는 능력을 유지하는 펩티드의 부분을 지칭한다. 일부 실시양태에서, 기능적 부분은 DNA 결합 도메인, 하나 이상의 RNA 결합 도메인, 헬리카제 도메인 및 엔도뉴클레아제 도메인으로 이루어진 군으로부터 선택된 작동가능하게 연결된 Cas9 단백질 기능적 도메인의 조합을 포함한다. 일부 실시양태에서, 기능적 부분은 DNA 결합 도메인, 하나 이상의 RNA 결합 도메인, 헬리카제 도메인 및 엔도뉴클레아제 도메인으로 이루어진 군으로부터 선택된 작동가능하게 연결된 Cas12a (Cpf1로서 또한 알려짐) 단백질 기능적 도메인의 조합을 포함한다. 일부 실시양태에서, 기능적 도메인은 복합체를 형성한다. 일부 실시양태에서, Cas9 단백질의 기능적 부분은 RuvC-유사 도메인의 기능적 부분을 포함한다. 일부 실시양태에서, Cas9 단백질의 기능적 부분은 HNH 뉴클레아제 도메인의 기능적 부분을 포함한다. 일부 실시양태에서, Cas12a 단백질의 기능적 부분은 RuvC-유사 도메인의 기능적 부분을 포함한다.
일부 실시양태에서, 외인성 Cas 단백질은 폴리펩티드 형태로 세포 내로 도입될 수 있다. 특정 실시양태에서, Cas 단백질은 세포-투과 폴리펩티드 또는 세포-투과 펩티드에 컨쥬게이션되거나 융합될 수 있다. 본원에 사용된 바와 같이, "세포-투과 폴리펩티드" 및 "세포-투과 펩티드"는 각각 분자의 세포 내로의 흡수를 용이하게 하는 폴리펩티드 또는 펩티드를 지칭한다. 세포-투과 폴리펩티드는 검출가능한 표지를 함유할 수 있다.
많은 실시양태에서, Cas 단백질은 하전된 단백질 (예컨대, 양성, 음성 또는 전체 중성 전하를 운반하는 단백질)에 컨쥬게이션되거나 융합될 수 있다. 이러한 연결은 공유적일 수 있다. 일부 실시양태에서, Cas 단백질은 Cas 단백질이 세포에 투과하는 능력을 유의하게 증가시키기 위해 초양전하로 하전된 GFP에 융합될 수 있다 (Cronican 등 ACS Chem Biol. 2010; 5(8):747-52). 특정 실시양태에서, Cas 단백질은 단백질 전달 도메인 (PTD)에 융합되어, 세포 내로의 이의 진입을 용이하게 할 수 있다. 예시적인 PTD는 Tat, 올리고아르기닌 및 페네트라틴을 포함한다. 일부 실시양태에서, Cas9 단백질은 세포-투과 펩티드에 융합된 Cas9 폴리펩티드를 포함한다. 일부 실시양태에서, Cas9 단백질은 PTD에 융합된 Cas9 폴리펩티드를 포함한다. 일부 실시양태에서, Cas9 단백질은 tat 도메인에 융합된 Cas9 폴리펩티드를 포함한다. 일부 실시양태에서, Cas9 단백질은 올리고아르기닌 도메인에 융합된 Cas9 폴리펩티드를 포함한다. 일부 실시양태에서, Cas9 단백질은 페네트라틴 도메인에 융합된 Cas9 폴리펩티드를 포함한다. 일부 실시양태에서, Cas9 단백질은 초양전하로 하전된 GFP에 융합된 Cas9 폴리펩티드를 포함한다. 일부 실시양태에서, Cas12a 단백질은 세포-투과 펩티드에 융합된 Cas12a 폴리펩티드를 포함한다. 일부 실시양태에서, Cas12a 단백질은 PTD에 융합된 Cas12a 폴리펩티드를 포함한다. 일부 실시양태에서, Cas12a 단백질은 tat 도메인에 융합된 Cas12a 폴리펩티드를 포함한다. 일부 실시양태에서, Cas12a 단백질은 올리고아르기닌 도메인에 융합된 Cas12a 폴리펩티드를 포함한다. 일부 실시양태에서, Cas12a 단백질은 페네트라틴 도메인에 융합된 Cas12a 폴리펩티드를 포함한다. 일부 실시양태에서, Cas12a 단백질은 초양전하로 하전된 GFP에 융합된 Cas12a 폴리펩티드를 포함한다.
일부 실시양태에서, Cas 단백질은 Cas 단백질을 코딩하는 핵산의 형태로 표적 폴리뉴클레오티드 서열을 함유하는 세포 내로 도입될 수 있다. 핵산을 세포 내로 도입하는 과정은 임의의 적합한 기술에 의해 달성될 수 있다. 적합한 기술은 칼슘 포스페이트 또는 지질-매개된 형질주입, 전기천공법, 및 바이러스 벡터를 사용한 형질도입 또는 감염을 포함한다. 일부 실시양태에서, 핵산은 DNA를 포함한다. 일부 실시양태에서, 핵산은 본원에 기재된 바와 같은 변형된 DNA를 포함한다. 일부 실시양태에서, 핵산은 mRNA를 포함한다. 일부 실시양태에서, 핵산은 본원에 기재된 바와 같은 변형된 mRNA (예컨대, 합성, 변형된 mRNA)를 포함한다.
일부 실시양태에서, Cas 단백질은 1 내지 2 개의 리보핵산과 복합체화된다. 일부 실시양태에서, Cas 단백질은 2 개의 리보핵산과 복합체화된다. 일부 실시양태에서, Cas 단백질은 하나의 리보핵산과 복합체화된다. 일부 실시양태에서, Cas 단백질은 본원에 기재된 바와 같은 변형된 핵산 (예컨대, 합성, 변형된 mRNA)에 의해 코딩된다.
본 개시내용의 방법은 표적 폴리뉴클레오티드 서열의 표적 모티프에 Cas 단백질을 지시하고 이에 혼성화시킬 수 있는 임의의 리보핵산의 사용을 고려한다. 일부 실시양태에서, 리보핵산 중 하나 이상은 tracrRNA를 포함한다. 일부 실시양태에서, 리보핵산 중 하나 이상은 CRISPR RNA (crRNA)를 포함한다. 일부 실시양태에서, 단일 리보핵산은 Cas 단백질을 세포 내의 표적 폴리뉴클레오티드 서열의 표적 모티프에 지시하고 이에 혼성화시키는 가이드 RNA를 포함한다. 일부 실시양태에서, 하나 이상의 리보핵산은 Cas 단백질을 세포 내의 표적 폴리뉴클레오티드 서열의 표적 모티프에 지시하고 이에 혼성화시키는 가이드 RNA를 포함한다. 일부 실시양태에서, 1 내지 2 개의 리보핵산 둘 모두는 Cas 단백질을 세포 내의 표적 폴리뉴클레오티드 서열의 표적 모티프에 지시하고 이에 혼성화시키는 가이드 RNA를 포함한다. 본 개시내용의 리보핵산은 사용된 특정 CRISPR/Cas 시스템 및 표적 폴리뉴클레오티드의 서열에 따라 다양한 상이한 표적 모티프에 혼성화되도록 선택될 수 있으며, 이는 당업자에 의해 이해될 것이다. 1 내지 2 개의 리보핵산은 또한 표적 폴리뉴클레오티드 서열 이외의 핵산 서열과의 혼성화를 최소화하도록 선택될 수 있다. 일부 실시양태에서, 1 내지 2 개의 리보핵산은 세포 내의 모든 다른 게놈 뉴클레오티드 서열과 비교할 때 2 개 이상의 미스매치를 함유하는 표적 모티프에 혼성화된다. 일부 실시양태에서, 1 내지 2 개의 리보핵산은 세포 내의 모든 다른 게놈 뉴클레오티드 서열과 비교할 때 하나 이상의 미스매치를 함유하는 표적 모티프에 혼성화된다. 일부 실시양태에서, 1 내지 2 개의 리보핵산은 Cas 단백질에 의해 인식되는 데옥시리보핵산 모티프에 바로 인접한 표적 모티프에 혼성화되도록 설계된다. 일부 실시양태에서, 1 내지 2 개의 리보핵산 각각은 표적 모티프 사이에 위치한 돌연변이 대립유전자에 측접하는 Cas 단백질에 의해 인식되는 데옥시리보핵산 모티프에 바로 인접한 표적 모티프에 혼성화되도록 설계된다.
일부 실시양태에서, 1 내지 2 개의 리보핵산 각각은 Cas 단백질을 세포 내의 표적 폴리뉴클레오티드 서열의 표적 모티프에 지시하고 이에 혼성화시키는 가이드 RNA를 포함한다.
일부 실시양태에서, 1 또는 2 개의 리보핵산 (예컨대, 가이드 RNA)은 표적 폴리뉴클레오티드 서열의 동일한 가닥 상의 서열에 상보성이고/이거나 이에 혼성화된다. 일부 실시양태에서, 1 또는 2 개의 리보핵산 (예컨대, 가이드 RNA)은 표적 폴리뉴클레오티드 서열의 반대 가닥 상의 서열에 상보적이고/이거나 이에 혼성화된다. 일부 실시양태에서, 1 또는 2 개의 리보핵산 (예컨대, 가이드 RNA)은 표적 폴리뉴클레오티드 서열의 반대 가닥 상의 서열에 상보적이지 않고/않거나 이에 혼성화하지 않는다. 일부 실시양태에서, 1 또는 2 개의 리보핵산 (예컨대, 가이드 RNA)은 표적 폴리뉴클레오티드 서열의 중첩 표적 모티프에 상보적이고/이거나 이에 혼성화된다. 일부 실시양태에서, 1 또는 2 개의 리보핵산 (예컨대, 가이드 RNA)은 표적 폴리뉴클레오티드 서열의 오프셋 표적 모티프에 상보적이고/이거나 이에 혼성화된다.
일부 실시양태에서, Cas 단백질을 코딩하는 핵산 및 적어도 1 개 내지 2 개의 리보핵산을 코딩하는 핵산은 바이러스 형질도입 (예컨대, 렌티바이러스 형질도입)을 통해 세포 내로 도입된다. 일부 실시양태에서, Cas 단백질은 1-2 개의 리보핵산과 복합체화된다. 일부 실시양태에서, Cas 단백질은 2 개의 리보핵산과 복합체화된다. 일부 실시양태에서, Cas 단백질은 하나의 리보핵산과 복합체화된다. 일부 실시양태에서, Cas 단백질은 본원에 기재된 바와 같은 변형된 핵산 (예컨대, 합성, 변형된 mRNA)에 의해 코딩된다.
본원에 기재된 유전자의 CRISPR/Cas-기반 표적화에 유용한 예시적인 gRNA 서열은 표 15에 제공되어 있다. 서열은 2016 년 5 월 9 일자로 출원된 WO2016183041에서 찾아볼 수 있으며, 표, 부록 및 서열 목록을 포함하는 개시내용은 그 전체가 본원에 참고로 원용된다.
표 15. 유전자 표적화에 유용한 예시적인 gRNA 서열
본원에 기재된 유전자의 CRISPR/Cas-기반 표적화에 유용한 다른 예시적인 gRNA 서열은 2021 년 5 월 19 일자로 출원된 미국 가특허 출원 번호 63/190,685 및 2021 년 7 월 14 일자로 출원된 미국 가출원 번호 63/221,887에 제공되어 있으며, 표, 부록 및 서열 목록을 포함한 이의 개시내용은 그 전체가 참조로 본원에 원용된다.
일부 실시양태에서, 기술의 세포는 전사 활성화제-유사 이펙터 뉴클레아제 (TALEN) 방법론을 사용하여 제조된다.
"TALE-뉴클레아제" (TALEN)는 전형적으로 전사 활성화제 유사 이펙터 (TALE)로부터 유래된 핵산-결합 도메인, 및 핵산 표적 서열을 절단하기 위한 하나의 뉴클레아제 촉매 도메인으로 이루어진 융합 단백질을 의미한다. 예를 들어, I-TevI, ColE7, NucA 및 Fok-Ik와 같은 촉매 도메인은 바람직하게는 뉴클레아제 도메인이고, 보다 바람직하게는 엔도뉴클레아제 활성을 갖는 도메인이다. 다수의 실시양태에서, TALE 도메인은 예를 들어, I-CreI 및 I-OnuI 또는 이의 기능적 변이체와 같은 메가뉴클레아제에 융합될 수 있다. 보다 바람직한 실시양태에서, 상기 뉴클레아제는 단량체 TALE-뉴클레아제이다. 단량체 TALE-뉴클레아제는 WO2012138927에 기재된 I-TevI의 촉매 도메인과 조작된 TAL 반복부의 융합과 같은 특이적 인식 및 절단을 위한 이합체화를 필요로 하지 않는 TALE-뉴클레아제이다. 전사 활성화제 유사 이펙터 (TALE)는 크산토모나스 박테리아 종으로부터의 단백질로, 복수의 반복된 서열을 포함하며, 각각의 반복부는 핵산 표적화된 서열의 각각의 뉴클레오티드 염기에 특이적인 위치 12 및 13 (RVD)의 이중-잔기를 포함한다. 유사한 모듈 염기-당-염기 핵산 결합 특성 (MBBBD)을 갖는 결합 도메인은 또한 상이한 박테리아 종에서 출원인에 의해 최근에 발견된 새로운 모듈 단백질로부터 유래될 수 있다. 새로운 모듈 단백질은 TAL 반복부보다 더 많은 서열 변동성을 나타내는 이점을 갖는다. 바람직하게는, 상이한 뉴클레오티드의 인식과 연관된 RVD는 C를 인식하기 위한 HD, T를 인식하기 위한 NG, A를 인식하기 위한 NI, G 또는 A를 인식하기 위한 NN, A, C, G 또는 T를 인식하기 위한 NS, T를 인식하기 위한 HG, T를 인식하기 위한 IG, G를 인식하기 위한 NK, C를 인식하기 위한 HA, C를 인식하기 위한 ND, C를 인식하기 위한 HI, G를 인식하기 위한 HN, G를 인식하기 위한 NA, G 또는 A를 인식하기 위한 SN 및 T를 인식하기 위한 YG, A를 인식하기 위한 TL, A 또는 G를 인식하기 위한 VT, 및 A를 인식하는 SW이다. 다른 실시양태에서, 중요한 아미노산 12 및 13은 뉴클레오티드 A, T, C 및 G에 대한 이들의 특이성을 조정하고 특히 이 특이성을 향상시키기 위해 다른 아미노산 잔기로 돌연변이될 수 있다. TALEN 키트는 상업적으로 판매된다.
일부 실시양태에서, 세포는 징크 핑거 뉴클레아제 (ZFN)를 사용하여 조작된다. "징크 핑거 결합 단백질"은 아연 이온의 배위를 통한 단백질 구조의 안정화의 결과로서 바람직하게는 서열-특이적 방식으로 DNA, RNA 및/또는 단백질에 결합하는 단백질 또는 폴리펩티드이다. 용어 징크 핑거 결합 단백질은 종종 징크 핑거 단백질 또는 ZFP로서 약칭된다. 개별 DNA 결합 도메인은 전형적으로 "핑거"로서 지칭된다. ZFP는 하나 이상의 핑거, 전형적으로 2 개의 핑거, 3 개의 핑거, 또는 6 개의 핑거를 갖는다. 각각의 핑거는 2 내지 4 개의 DNA 염기쌍, 전형적으로 3 또는 4 개의 DNA의 염기쌍에 결합한다. ZFP는 표적 부위 또는 표적 절편이라고 하는 핵산 서열에 결합한다. 각각의 핑거는 전형적으로 대략 30 개의 아미노산, 아연-킬레이트, DNA-결합 서브도메인을 포함한다. 연구는 이 부류의 단일 징크 핑거가 단일 베타 회전의 2 개의 시스테인 잔기와 함께 아연과 배위된 2 개의 불변 히스티딘 잔기를 함유하는 알파 나선으로 이루어져 있음을 입증하였다 (예컨대, Berg & Shi, Science 271:1081-1085 (1996) 참고).
일부 실시양태에서, 본 개시내용의 세포는 귀소 엔도뉴클레아제를 사용하여 제조된다. 이러한 귀소 엔도뉴클레아제는 당업계에 잘 알려져 있다 (Stoddard 2005). 귀소 엔도뉴클레아제는 DNA 표적 서열을 인식하고 단일- 또는 이중-가닥 파손을 생성한다. 귀소 엔도뉴클레아제는 12 내지 45 염기쌍 (bp)의 길이의 범위, 일반적으로 14 내지 40 bp 길이의 범위인 DNA 표적 부위를 인식하며 매우 특이적이다. 기술에 따른 귀소 엔도뉴클레아제는 예를 들어, LAGLIDADG 엔도뉴클레아제, HNH 엔도뉴클레아제 또는 GIY-YIG 엔도뉴클레아제에 상응할 수 있다. 본 개시내용에 따른 바람직한 귀소 엔도뉴클레아제는 I-CreI 변이체일 수 있다.
일부 실시양태에서, 기술의 세포는 메가뉴클레아제를 사용하여 제조된다. 메가뉴클레아제는 정의상 큰 서열을 인식하는 서열-특이적 엔도뉴클레아제이다 (Chevalier, B. S. 및 B. L. Stoddard, Nucleic Acids Res., 2001, 29, 3757-3774). 이들은 살아 있는 세포에서 고유한 부위를 절단할 수 있어, 그에 따라 절단 부위 부근에서 유전자 표적화를 1000-배 이상 향상시킬 수 있다 (Puchta 등, Nucleic Acids Res., 1993, 21, 5034-5040; Rouet 등, Mol. Cell. Biol., 1994, 14, 8096-8106; Choulika 등, Mol. Cell. Biol., 1995, 15, 1968-1973; Puchta 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1996, 93, 5055-5060; Sargent 등, Mol. Cell. Biol., 1997, 17, 267-77; Donoho 등, Mol. Cell. Biol, 1998, 18, 4070-4078; Elliott 등, Mol. Cell. Biol., 1998, 18, 93-101; Cohen-Tannoudji 등, Mol. Cell. Biol., 1998, 18, 1444-1448).
일부 실시양태에서, 기술의 세포는 관용원성 인자와 같은 폴리펩티드의 발현을 녹다운 (예컨대, 감소, 제거 또는 억제)하기 위해 RNA 침묵 또는 RNA 간섭 (RNAi)을 사용하여 제조된다. 유용한 RNAi 방법은 합성 RNAi 분자, 짧은 간섭 RNA (siRNA), PIWI-상호작용 NRA (piRNA), 짧은 헤어핀 RNA (shRNA), 마이크로RNA (miRNA) 및 당업자가 인식하는 기타 일시적 녹다운 방법을 활용하는 방법을 포함한다. 서열 특이적 shRNA, siRNA, 및 miRNA 등을 포함하는 RNAi용 시약은 상업적으로 이용가능하다. 예를 들어, CIITA는 CIITA siRNA를 도입하거나 CIITA shRNA-발현 바이러스를 세포 내로 형질도입함으로써 만능 줄기 세포에서 녹다운될 수 있다. 일부 실시양태에서, RNA 간섭은 CIITA, B2M, NLRC5, TCR-알파 및 TCR-베타로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 발현을 감소시키거나 억제하기 위해 사용된다.
일부 실시양태에서, 본원에 제공된 세포는 하나 이상의 면역 인자 (표적 폴리펩티드 포함)의 발현을 감소시키도록 유전적으로 변형되어, 면역-특권 또는 저면역원성 세포를 생성한다. 특정 실시양태에서, 본원에 개시된 세포 (예컨대, 줄기 세포, 유도 만능 줄기 세포, 분화된 세포, 조혈 줄기 세포, 일차 T 세포 및 CAR-T 세포)는 하나 이상의 표적 폴리뉴클레오티드의 발현을 감소시키는 하나 이상의 유전자 변형을 포함한다. 이러한 표적 폴리뉴클레오티드 및 폴리펩티드의 비-제한적인 예는 CIITA, B2M, NLRC5, CTLA-4, PD-1, HLA-A, HLA-BM, HLA-C, RFX-ANK, NFY-A, RFX5, RFX-AP, NFY-B, NFY-C, IRF1 및 TAP1을 포함한다.
일부 실시양태에서, 유전자 변형은 CRISPR/Cas 시스템을 사용하여 발생한다. 하나 또는 복수의 표적 폴리뉴클레오티드의 발현을 조정함으로써 (예컨대, 감소 또는 결실시킴으로써), 이러한 세포는 수용자 대상체 내로 이식될 때 감소된 면역 활성화를 나타낸다. 일부 실시양태에서, 세포는 예컨대, 투여시 수용자 대상체 또는 환자에서 저면역원성인 것으로 간주된다.
I. 유전자 편집 시스템
일부 실시양태에서, 예를 들어, 징크 핑거 뉴클레아제 (ZFN), 전사 활성화제-유사 이펙터 뉴클레아제 (TALEN), 메가뉴클레아제, 트랜스포사제, 및 클러스터링된 규칙적으로 산재된 짧은 회문 반복부 (CRISPR)/Cas 시스템, 뿐만 아니라 당업계에 알려진 닉카제 시스템, 염기 편집 시스템, 프라임 편집 시스템 및 유전자 쓰기 시스템을 포함하여, 세포를 유전적으로 변형시켜 하나 이상의 유전자를 녹아웃, 녹다운 또는 달리 변형시키는 방법은 부위-지시된 뉴클레아제를 사용하는 단계를 포함한다.
i. ZFN
ZFN은 박테리아 FokI 제한 효소의 엔도뉴클레아제 도메인에 부착된 징크 핑거-함유 전사 인자로부터 적응된 부위-특이적 DNA 결합 도메인의 어레이를 포함하는 융합 단백질이다. ZFN은 하나 이상 (예컨대, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10 개 이상)의 DNA 결합 도메인 또는 징크 핑거 도메인을 가질 수 있다. 예컨대, Carroll 등, Genetics Society of America (2011) 188:773-782; Kim 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1996) 93:1156-1160 참고한다. 각각의 징크 핑거 도메인은 하나 이상의 아연 이온에 의해 안정화된 작은 단백질 구조 모티프이며, 일반적으로 3- 내지 4-bp DNA 서열을 인식한다. 따라서, 탠덤 도메인은 세포의 게놈 내에서 고유한 확장된 뉴클레오티드 서열에 잠재적으로 결합할 수 있다.
알려진 특이성의 다양한 징크 핑거를 조합하여, 약 6, 9, 12, 15 또는 18-bp 서열을 인식하는 멀티-핑거 폴리펩티드를 생산할 수 있다. 다양한 선택 및 모듈 조립 기술은 파지 디스플레이, 효모 1-하이브리드 시스템, 박테리아 1-하이브리드 및 2-하이브리드 시스템을 포함하는 특이적 서열, 및 포유동물 세포를 인식하는 징크 핑거 (및 이의 조합)를 생성하는 데 이용가능하다. 징크 핑거는 소정된 핵산 서열에 결합하도록 조작될 수 있다. 소정의 핵산 서열에 결합하도록 징크 핑거를 조작하는 기준은 당업계에 알려져 있다. 예컨대, Sera 등, Biochemistry (2002) 41:7074-7081; Liu 등, Bioinformatics (2008) 24:1850-1857 참고한다.
FokI 뉴클레아제 도메인 또는 다른 이합체 뉴클레아제 도메인을 함유하는 ZFN은 이합체로서 기능한다. 따라서, 비-회문 DNA 부위를 표적화하기 위해서는 한 쌍의 ZFN이 필요하다. 2 개의 개별 ZFN은 적절한 간격으로 떨어져 있는 이들의 뉴클레아제를 사용하여 DNA의 반대 가닥에 결합해야 한다. Bitinaite 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1998) 95:10570-10575 참고한다. 게놈의 특이적 부위를 절단하기 위해, 한 쌍의 ZFN은 부위에 측접하는 2 개의 서열을 인식하도록 설계되었으며, 하나는 정방향 가닥에 있고 다른 하나는 역방향 가닥에 있다. 부위의 둘 중 하나의 측면에 대한 ZFN의 결합시, 뉴클레아제 도메인이 부위에서 DNA를 이합체화하고 이를 절단하여, 5' 오버행을 갖는 DSB를 생성한다. 그런 다음, HDR을 활용하여, 상동성 아암에 측접하는 원하는 돌연변이를 함유하는 복구 주형의 도움으로 특이적 돌연변이를 도입할 수 있다. 복구 주형은 일반적으로 세포에 도입된 외인성 이중-가닥 DNA 벡터이다. Miller 등, Nat. Biotechnol. (2011) 29:143-148; Hockemeyer 등, Nat. Biotechnol. (2011) 29:731-734 참고한다.
ii. TALEN
TALEN은 표적 유전자를 편집하기 위해 사용될 수 있는 인공 뉴클레아제의 또 다른 예이다. TALEN은 TALE 반복부라고 하는 DNA 결합 도메인으로부터 유래되며, 이는 일반적으로 확장된 DNA 서열에 결합하고 이를 인식하는 10 내지 30 개의 반복부를 갖는 탠덤 어레이를 포함한다. 각각의 반복부는 33 내지 35 개의 아미노산 길이이며, 4 개의 DNA 염기쌍 중 하나에 대한 특이성을 부여하는 2 개의 인접한 아미노산 (반복부-가변 이중-잔기 또는 RVD라고 함)이 있다. 따라서, 표적 DNA 서열의 반복부 및 염기쌍 사이에는 일-대-일 상응이 있다.
TALEN은 하나 이상의 TALE DNA 결합 도메인 (예컨대, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 개 이상)을 뉴클레아제 도메인, 예를 들어, FokI 엔도뉴클레아제 도메인에 융합시킴으로써 인공적으로 생산된다. Zhang, Nature Biotech. (2011) 29:149-153 참고한다. FokI에 대한 여러 돌연변이가 TALEN에서 사용하기 위해 만들어졌으며; 예를 들어, 이들은 절단 특이성 또는 활성을 개선시킨다. Cermak 등, Nucl. Acids Res. (2011) 39:e82; Miller 등, Nature Biotech. (2011) 29:143-148; Hockemeyer 등, Nature Biotech. (2011) 29:731-734; Wood 등, Science (2011) 333:307; Doyon 등, Nature Methods (2010) 8:74-79; Szczepek 등, Nature Biotech (2007) 25:786-793; Guo 등, J. Mol. Biol. (2010) 200:96 참고한다. FokI 도메인은 적절한 배향 및 간격을 갖는 표적 게놈에서의 부위에 대해 고유한 DNA 결합 도메인을 포함하는 2 개의 작제물을 필요로 하는 이합체로서 기능한다. TALE DNA 결합 도메인 및 FokI 뉴클레아제 도메인 사이의 아미노산 잔기의 수, 및 2 개의 개별 TALEN 결합 부위 사이의 염기의 수 둘 모두는 높은 수준의 활성을 달성하기 위한 중요한 매개변수인 것으로 보인다. Miller 등, Nature Biotech. (2011) 29:143-148.
조작된 TALE 반복부를 뉴클레아제 도메인과 조합함으로써, 부위-특이적 뉴클레아제는 임의의 원하는 DNA 서열에 특이적으로 생산될 수 있다. ZFN과 유사하게, TALEN은 세포 내로 도입되어, 게놈에서의 원하는 표적 부위에서 DSB를 생성할 수 있으므로, 유사한 HDR-매개된 경로에서 유전자를 녹아웃하거나 돌연변이를 녹인하는 데 사용될 수 있다. Boch, Nature Biotech. (2011) 29:135-136; Boch 등, Science (2009) 326:1509-1512; Moscou 등, Science (2009) 326:3501 참고한다.
iii. 메가뉴클레아제
메가뉴클레아제는 큰 DNA 서열 (14 내지 40 개의 염기쌍)을 인식하고 절단하는 능력을 특징으로 하는 엔도뉴클레아제 패밀리의 효소이다. 메가뉴클레아제는 뉴클레아제 활성 및/또는 DNA 인식에 영향을 미치는 이들의 구조적 모티프에 기반하여 패밀리로 그룹화된다. 가장 광범위하고 가장 잘 알려진 메가뉴클레아제는 LAGLIDADG 패밀리의 단백질이며, 이는 보존된 아미노산 서열에서 명칭을 가져왔다. Chevalier 등, Nucleic Acids Res. (2001) 29(18): 3757-3774 참고한다. 한편, GIY-YIG 패밀리 구성원은 70-100 개의 잔기 길이인 GIY-YIG 모듈을 가지며 4 개의 불변 잔기를 포함하는 4 또는 5 개의 보존된 서열 모티프를 포함하며, 그 중 2 개는 활성에 필요하다. Van Roey 등, Nature Struct. Biol. (2002) 9:806-811 참고한다. His-Cys 패밀리 메가뉴클레아제는 수백 개의 아미노산 잔기를 포함하는 영역에 걸쳐 고도로 보존된 일련의 히스티딘 및 시스테인을 특징으로 한다. Chevalier 등, Nucleic Acids Res. (2001) 29(18):3757-3774 참고한다. NHN 패밀리의 구성원은 아스파라긴 잔기로 둘러싸인 2 쌍의 보존된 히스티딘을 함유하는 모티프에 의해 정의된다. Chevalier 등, Nucleic Acids Res. (2001) 29(18):3757-3774 참고한다.
높은 특이성 요건으로 인해 특정 표적 DNA 서열에 대한 자연 메가뉴클레아제를 식별할 가능성이 낮기 때문에, 고유한 서열을 인식하는 메가뉴클레아제 변이체를 생성하기 위해 돌연변이유발 및 고 처리량 스크리닝 방법을 포함한 다양한 방법이 사용되었다. 예컨대, 소정된 핵산 서열에 결합하기 위해 변경된 DNA-결합 특이성을 갖는 메가뉴클레아제를 조작하기 위한 전략은 당업계에 알려져 있다. 예컨대, Chevalier 등, Mol. Cell. (2002) 10:895-905; Epinat 등, Nucleic Acids Res (2003) 31:2952-2962; Silva 등, J Mol. Biol. (2006) 361:744-754; Seligman 등, Nucleic Acids Res (2002) 30:3870-3879; Sussman 등, J Mol Biol (2004) 342:31-41; Doyon 등, J Am Chem Soc (2006) 128:2477-2484; Chen 등, Protein Eng Des Sel (2009) 22:249-256; Arnould 등, J Mol Biol. (2006) 355:443-458; Smith 등, Nucleic Acids Res. (2006) 363(2):283-294 참고한다.
ZFN 및 TALEN과 마찬가지로, 메가뉴클레아제는 게놈 DNA에서 DSB를 생성할 수 있으며, 이는 예컨대, NHEJ를 통해 부적절하게 복구되는 경우 프레임-이동 돌연변이를 생성하여 세포에서 표적 유전자의 발현의 감소를 야기할 수 있다. 대안적으로, 외래 DNA는 메가뉴클레아제와 함께 세포 내로 도입될 수 있다. 외래 DNA의 서열 및 염색체 서열에 따라, 이 공정은 표적 유전자를 변형시키기 위해 사용될 수 있다. Silva 등, Current Gene Therapy (2011) 11:11-27 참고한다.
iv. 트랜스포사제
트랜스포사제는 트랜스포존의 단부에 결합하고 절단 및 붙여넣기 메커니즘 또는 복제적 전위 메커니즘에 의해 게놈의 다른 부분으로의 이동을 촉매하는 효소이다. 트랜스포사제를 CRISPER/Cas 시스템과 같은 다른 시스템에 연결함으로써, 게놈 DNA의 부위 특이적 삽입 또는 조작을 가능하게 하는 새로운 유전자 편집 도구를 개발할 수 있다. 촉매적으로 비활성인 Cas 이펙터 단백질 및 Tn7-유사 트랜스포존을 사용하는 트랜스포존을 사용하는 2 개의 알려진 DNA 통합 방법이 있다. 트랜스포사제-의존적 DNA 통합은 게놈에서 DSB를 유발하지 않아, 보다 안전하고 보다 구체적인 DNA 통합을 보장할 수 있다.
v. CRISPR/Cas 시스템
CRISPR 시스템은 획득된 면역의 형태를 제공하는 침입 파지 및 플라스미드에 대한 방어에 관여하는 시스템으로서 원래 원핵 유기체 (예컨대, 박테리아 및 고세균)에서 발견되었다. 이제, 이는 연구 및 임상 적용에서 널리 사용되는 유전자 편집 도구로서 채택 및 사용되었다.
CRISPR/Cas 시스템은 일반적으로 2 개 이상의 구성요소를 포함한다: 하나 이상의 가이드 RNA (gRNA) 및 Cas 단백질. Cas 단백질은 표적 부위 내로 DSB를 도입하는 뉴클레아제이다. CRISPR-Cas 시스템은 2 개의 주요 클래스로 나뉘며: 클래스 1 시스템은 다중 Cas 단백질의 복합체를 사용하여, 핵산을 분해하고; 클래스 2 시스템은 동일한 목적을 위해 단일 큰 Cas 단백질을 사용한다. 클래스 1은 유형 I, III 및 IV로 나뉘며; 클래스 2는 유형 II, V 및 VI로 나뉜다. 유전자 편집 적용에 적합한 상이한 Cas 단백질은 Cas3, Cas4, Cas5, Cas8a, Cas8b, Cas8c, Cas9, Cas10, Cas12, Cas12a (Cpf1), Cas12b (C2c1), Cas12c (C2c3), Cas12d (CasY), Cas12e (CasX), Cas12f (C2c10), Cas12g, Cas12h, Cas12i, Cas12k (C2c5), Cas13, Cas13a (C2c2), Cas13b, Cas13c, Cas13d, C2c4, C2c8, C2c9, Cmr5, Cse1, Cse2, Csf1, Csm2, Csn2, Csx10, Csx11, Csy1, Csy2, Csy3, 및 Mad7을 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 가장 널리 사용되는 Cas9는 본원에서 예시로서 설명된다. 이들 Cas 단백질은 상이한 공급원 종으로부터 기원할 수 있다. 예를 들어, Cas9는 S. 파이오게네스 또는 S. 아우레우스로부터 유래될 수 있다.
원래의 미생물 게놈에서, 유형 II CRISPR 시스템은 숙주 게놈 내의 어레이로서 코딩된 CRISPR 반복 서열 사이에 침입 DNA로부터의 서열을 통합한다. CRISPR 반복 어레이로부터의 전사물은 각각이 CRISPR 반복물의 일부뿐만 아니라 "프로토스페이서 (protospacer)" 서열로서 알려진 침입 DNA로부터 전사된 가변 서열을 보유하는 CRISPR RNA (crRNA)로 처리된다. 각각의 crRNA는 제2 트랜스활성화 CRISPR RNA (tracrRNA)와 혼성화하고, 이들 2 개의 RNA는 Cas9 뉴클레아제와 복합체를 형성한다. crRNA의 프로토스페이서-코딩된 부분은 Cas9 복합체가 "프로토스페이서 인접 모티프" (PAM)로서 알려진 짧은 서열에 인접하는 한, 상보적인 표적 DNA 서열을 절단하도록 지시된다.
이의 발견 이후, CRISPR 시스템은 박테리아로부터, 인간 세포를 포함하는 진핵 세포에 이르는 광범위한 세포 및 유기체에서 서열 특이적 DSB 및 표적화된 게놈 편집을 유도하도록 적응되었다. 유전자 편집 적용에서의 이의 사용에서, 인공적으로 설계된 합성 gRNA는 원래의 crRNA:tracrRNA 복합체를 대체하였다. 예를 들어, gRNA는 crRNA, 테트라루프 및 tracrRNA로 구성된 단일 가이드 RNA (sgRNA)일 수 있다. crRNA는 일반적으로 관심 표적 DNA를 인식하도록 사용자가 설계한 상보적 영역 (스페이서라고 또한 칭함, 일반적으로 약 20 개의 뉴클레오티드 길이)을 포함한다. tracrRNA 서열은 Cas 뉴클레아제 결합을 위한 스캐폴드 영역을 포함한다. crRNA 서열 및 tracrRNA 서열은 테트라루프에 의해 연결되고, 각각은 서로 혼성화하기 위한 짧은 반복 서열을 가지며, 따라서 키메라 sgRNA를 생성한다. gRNA에 존재하는 스페이서 또는 상보적 영역 서열을 간단히 변화시킴으로써 Cas 뉴클레아제의 게놈 표적을 변화시킬 수 있다. 상보적인 영역은 표준 RNA-DNA 상보적인 염기 쌍형성 규칙을 통해 Cas 뉴클레아제를 표적 DNA 부위로 지시할 것이다.
Cas 뉴클레아제가 기능하기 위해, 게놈 DNA에서 표적 서열의 바로 다운스트림에 PAM이 있어야 한다. Cas 단백질에 의한 PAM의 인식은 인접한 게놈 서열을 불안정화시켜, gRNA에 의한 서열의 조사(interrogation)를 허용하고 매칭 서열이 존재할 때 gRNA-DNA 쌍형성을 초래하는 것으로 생각된다. PAM의 특이적 서열은 Cas 유전자의 종에 따라 다르다. 예를 들어, S. 파이오게네스로부터 유래된 가장 일반적으로 사용되는 Cas9 뉴클레아제는 5'-NGG-3' 또는 덜 효율적인 속도로 5'-NAG-3'의 PAM 서열을 인식하며, 여기서 "N"은 임의의 뉴클레오티드일 수 있다. 대체 PAM을 포함하는 다른 Cas 뉴클레아제 변이체가 또한 특성화되었으며, 게놈 편집에 성공적으로 사용되었으며, 이는 아래 표 16에 요약되어 있다.
표 16. 예시적인 Cas 뉴클레아제 변이체 및 이들의 PAM 서열
일부 실시양태에서, Cas 뉴클레아제는 이들의 활성, 특이성, 인식 및/또는 다른 특질을 변경하기 위해 하나 이상의 돌연변이를 포함할 수 있다. 예를 들어, Cas 뉴클레아제는 오프-표적 효과를 완화시키기 위해 충실도를 변경하는 하나 이상의 돌연변이를 가질 수 있다 (예컨대, SpCas9의 eSpCas9, SpCas9-HF1, HypaSpCas9, HeFSpCas9 및 evoSpCas9 고-충실도 변이체). 다른 예로, Cas 뉴클레아제는 PAM 특이성을 변경하는 하나 이상의 돌연변이를 가질 수 있다. 6. 닉카제
Cas, 특히 Cas9의 뉴클레아제 도메인은 독립적으로 돌연변이되어 DNA "닉카제"로서 지칭되는 효소를 생성할 수 있다. 닉카제는 예를 들어, CRISPR/Cas9를 포함하여 일반 CRISPR/Cas 핵 시스템과 동일한 특이성을 갖는 단일-가닥 절단을 도입할 수 있다. 닉카제는 유전자 편집 시스템에서의 사용을 찾아볼 수 있는 이중-가닥 파손을 생성하기 위해 사용될 수 있다 (Mali 등, Nat Biotech, 31(9):833-838 (2013); Mali 등 Nature Methods, 10:957-963 (2013); Mali 등, Science, 339(6121):823-826 (2013)). 일부 경우에, 2 개의 Cas 닉카제가 사용될 때, 정밀한 유전자 통합 및 삽입에 대한 추가적인 제어를 허용하는 블런트 단부 대신 절단된 단부 각각에 긴 오버행이 생산된다 (Mali 등, Nat Biotech, 31(9):833-838 (2013); Mali 등 Nature Methods, 10:957-963 (2013); Mali 등, Science, 339(6121):823-826 (2013)). 두 닉킹 Cas 효소 모두는 이들의 표적 DNA에 효과적으로 닉킹을 해야 하기 때문에, 쌍형성된 닉카제는 이중-가닥-절단 Cas-기반 시스템과 비교하여 더 낮은 오프-표적 효과를 가질 수 있다 (Ran 등, Cell, 155(2):479-480(2013); Mali 등, Nat Biotech, 31(9):833-838 (2013); Mali 등 Nature Methods, 10:957-963 (2013); Mali 등, Science, 339(6121):823-826 (2013)).
S. 관용원성 인자 및/또는 키메라 항원 수용체의 재조합 발현의 방법
이러한 모든 기술에 대해, 잘 알려진 재조합 기술이 사용되어, 본원에 약술된 바와 같은 재조합 핵산을 생성한다. 특정 실시양태에서, 관용원성 인자 또는 키메라 항원 수용체를 코딩하는 재조합 핵산은 발현 작제물에서 하나 이상의 조절 뉴클레오티드 서열에 작동가능하게 연결될 수 있다. 조절 뉴클레오티드 서열은 일반적으로 치료될 숙주 세포 및 수용자 대상체에 대해 적절할 것이다. 다양한 숙주 세포에 대해 다수의 유형의 적절한 발현 벡터 및 적합한 조절 서열이 당업계에 알려져 있다. 전형적으로, 하나 이상의 조절 뉴클레오티드 서열은 프로모터 서열, 리더 또는 신호 서열, 리보솜 결합 부위, 전사 출발 및 종결 서열, 번역 출발 및 종결 서열, 및 인핸서 또는 활성화제 서열을 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 당업계에 알려진 바와 같은 구성적 또는 유도성 프로모터가 또한 고려된다. 프로모터는 자연 발생 프로모터, 하나 초과의 프로모터의 요소를 조합한 하이브리드 프로모터, 또는 합성 프로모터일 수 있다. 발현 작제물은 플라스미드와 같은 에피솜 상의 세포에 존재할 수 있거나, 발현 작제물은 유전자 유전자좌와 같은 염색체에 삽입될 수 있다. 일부 실시양태에서, 발현 벡터는 형질전환된 숙주 세포의 선택을 허용하는 선택가능한 마커 유전자를 포함한다. 일부 실시양태는 하나 이상의 조절 서열에 작동가능하게 연결된 변이체 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 발현 벡터를 포함한다. 본원에서 사용하기 위한 조절 서열은 프로모터, 인핸서 및 기타 발현 제어 요소를 포함한다. 일부 실시양태에서, 발현 벡터는 형질전환될 숙주 세포, 발현하고자 하는 특정 변이체 폴리펩티드, 벡터의 카피 수, 해당 카피 수를 제어하는 능력 및/또는 벡터에 의해 코딩된 임의의 다른 단백질, 예컨대, 항생제 마커의 발현의 선택을 위해 설계된다.
적합한 포유동물 프로모터의 예는 예를 들어, 다음의 유전자로부터의 프로모터를 포함한다: 신장 인자 1 알파 (EF1α) 프로모터, CAG 프로모터, 햄스터의 유비퀴틴/S27a 프로모터 (WO 97/15664), 시미안 액포화 바이러스 40 (SV40) 초기 프로모터, 아데노바이러스 주요 후기 프로모터, 마우스 메탈로티오네인-I 프로모터, 라우스 육종 바이러스 (RSV)의 긴 말단 반복 영역, 마우스 유방 종양 바이러스 프로모터 (MMTV), 몰로니 뮤린 백혈병 바이러스 긴 말단 반복 영역, 및 인간 사이토메갈로바이러스 (CMV)의 초기 프로모터. 다른 이종 포유동물 프로모터의 예는 액틴, 면역글로불린 또는 열 쇼크 프로모터(들)이다. 추가 실시양태에서, 포유동물 숙주 세포에서 사용하기 위한 프로모터는 폴리오마 바이러스, 계두 바이러스 (1989 년 7 월 5 일 공개된 UK 2,211,504), 소 유두종 바이러스, 조류 육종 바이러스, 사이토메갈로바이러스, 레트로바이러스, 간염-B 바이러스 및 시미안 바이러스 40 (SV40)과 같은 바이러스의 게놈으로부터 수득될 수 있다. 추가의 실시양태에서, 이종 포유동물 프로모터가 사용된다. 예는 액틴 프로모터, 면역글로불린 프로모터 및 열-충격 프로모터를 포함한다. SV40의 초기 및 후기 프로모터는 SV40 바이러스 복제 원점을 또한 함유하는 SV40 제한 단편으로서 편리하게 수득될 수 있다 (Fiers 등, Nature 273: 113-120 (1978)). 인간 사이토메갈로바이러스의 즉시 초기 프로모터는 HindIII 제한 효소 단편으로서 편리하게 수득된다 (Greenaway 등, Gene 18: 355-360 (1982)). 전술한 참조문헌은 그 전체가 참조로 원용된다.
일부 실시양태에서, 발현 벡터는 바이시스트론 또는 멀티시스트론 발현 벡터이다. 바이시스트론 또는 멀티시스트론 발현 벡터는 (1) 오픈 리딩 프레임 각각에 융합된 다중 프로모터; (2) 유전자 사이의 스플라이싱 신호의 삽입; (3) 발현이 단일 프로모터에 의해 구동되는 유전자의 융합; 및 (4) 유전자 사이의 단백질분해 절단 부위의 삽입 (자기-절단 펩티드) 또는 유전자 사이의 내부 리보솜 진입 부위 (IRES)의 삽입을 포함할 수 있다.
본원에 기재된 폴리뉴클레오티드를 세포에 도입하는 공정은 임의의 적합한 기술에 의해 달성될 수 있다. 적합한 기술은 칼슘 포스페이트 또는 지질-매개된 형질주입, 전기천공법, 푸소겐 및 바이러스 벡터를 사용한 형질도입 또는 감염을 포함한다. 일부 실시양태에서, 폴리뉴클레오티드는 바이러스 형질도입 (예컨대, AAV 형질도입, 렌티바이러스 형질도입)을 통해 세포 내로 도입되거나, 그렇지 않으면 바이러스 벡터 상에 전달된다 (예컨대, 융합원-매개된 전달). 일부 실시양태에서, 폴리뉴클레오티드는 조건부 또는 유도성 트랜스포사제, 조건부 또는 유도성 PiggyBac 트랜스포존, 조건부 또는 유도성 슬리핑 뷰티 (SB11) 트랜스포존, 조건부 또는 유도성 Mos1 트랜스포존, 및 조건부 또는 유도성 Tol2 트랜스포존으로 이루어진 군으로부터 선택된 푸소겐-매개된 전달 또는 트랜스포사제 시스템을 통해 세포 내로 도입된다.
일부 실시양태에서, 본원에 제공된 세포는 저면역원성 세포의 하나 이상의 게놈 유전자좌 내로 삽입된 하나 이상의 외인성 폴리뉴클레오티드를 포함하도록 유전적으로 변형된다. 일부 실시양태에서, 외인성 폴리뉴클레오티드는 관심 단백질, 예컨대, 키메라 항원 수용체를 코딩한다. 본원에 기재된 유전자 편집 방법 (예컨대, CRISPR/Cas 시스템)을 포함하는 저면역원성 세포의 게놈 유전자좌 내로 외인성 폴리뉴클레오티드를 삽입하기 위해 임의의 적합한 방법이 사용될 수 있다. 일부 실시양태에서, 외인성 폴리뉴클레오티드는 예를 들어, 벡터를 이용한 바이러스 형질도입을 사용하여 세포의 하나 이상의 대립유전자 내로 삽입된다. 일부 실시양태에서, 벡터는 외인성 폴리뉴클레오티드를 운반하는 슈도타이핑된 자기-비활성화 렌티바이러스 벡터이다. 일부 실시양태에서, 벡터는 수포성 구내염 VSV-G 외피로 슈도타이핑되고 외인성 폴리뉴클레오티드를 운반하는 자기-비활성화 렌티바이러스 벡터이다. 일부 실시양태에서, 외인성 폴리뉴클레오티드는 바이러스 형질도입을 사용하여 세포의 하나 이상의 대립유전자 내로 삽입된다. 일부 실시양태에서, 외인성 폴리뉴클레오티드는 렌티바이러스 기반 바이러스 벡터를 사용하여 세포의 하나 이상의 대립유전자 내로 삽입된다.
일반적으로 활성화 세포, 예컨대, 활성화 T 세포 (예컨대, CD8+ T 세포)를 포함하는 세포 내로 본원에 기재된 폴리뉴클레오티드를 도입하는 특정 방법과 달리, 폴리뉴클레오티드를 비-활성화된 T 세포 내로 도입하기 위해 적합한 기술이 활용될 수 있다. 적합한 기술은 비드에 결합될 수 있거나 결합되지 않을 수 있는, CD3, CD8 및/또는 CD28, 또는 이의 단편 또는 일부 (예컨대, scFv 및 VHH)에 결합하는 하나 이상의 항체를 이용한 CD8+ T 세포와 같은 T 세포의 활성화를 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 놀랍게도, T 세포 내로의 폴리뉴클레오티드의 푸소겐-매개된 도입은 하나 이상의 활성화 항체 또는 이의 단편 또는 일부 (예컨대, CD3, CD8, 및/또는 CD28)와 이전에 접촉되지 않은 비-활성화된 T 세포 (예컨대, CD8+ T 세포)에서 수행된다. 일부 실시양태에서, 폴리뉴클레오티드의 T 세포 내로의 푸소겐-매개된 도입은 (예컨대, T 세포가 대상체에 투여된 후에) 생체내에서 수행된다. 다른 실시양태에서, 폴리뉴클레오티드의 T 세포 내로의 푸소겐-매개된 도입은 (예컨대, T 세포가 대상체에 투여되기 전에) 생체외에서 수행된다.
본원은 야생형 T 세포에 비해 HLA-A, HLA-B, HLA-C, HLA-DP, HLA-DQ, HLA-DR, B2M, CIITA, TCR-알파, 및/또는 TCR-베타의 감소된 발현을 포함하는 비-활성화된 T 세포를 제공하며, 여기서 비-활성화된 T 세포는 키메라 항원 수용체 (CAR)를 코딩하는 제1 외인성 폴리뉴클레오티드를 추가로 포함한다.
일부 실시양태에서, 비-활성화된 T 세포는 항-CD3 항체, 항-CD28 항체, T 세포 활성화 사이토카인 또는 가용성 T 세포 공동자극 분자로 처리되지 않았다. 일부 실시양태에서, 비-활성화된 T 세포는 활성화 마커를 발현하지 않는다. 일부 실시양태에서, 비-활성화된 T 세포는 CD3 및 CD28을 발현하고, 여기서 CD3 및/또는 CD28은 비활성이다.
일부 실시양태에서, 항-CD3 항체는 OKT3이다. 일부 실시양태에서, 항-CD28 항체는 CD28.2이다. 일부 실시양태에서, T 세포 활성화 사이토카인은 IL-2, IL-7, IL-15 및 IL-21로 이루어진 T 세포 활성화 사이토카인의 군으로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, 가용성 T 세포 공동자극 분자는 항-CD28 항체, 항-CD80 항체, 항-CD86 항체, 항-CD137L 항체 및 항-ICOS-L 항체로 이루어진 가용성 T 세포 공동자극 분자의 군으로부터 선택된다.
일부 실시양태에서, 비-활성화된 T 세포는 일차 T 세포이다. 다른 실시양태에서, 비-활성화된 T 세포는 본 개시내용의 저면역원성 세포로부터 분화된다. 일부 실시양태에서, T 세포는 CD8+ T 세포이다.
일부 실시양태에서, CAR을 코딩하는 제1 외인성 폴리뉴클레오티드는 CD19-특이적 CAR 및 CD22-특이적 CAR로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일부 실시양태에서, 제1 및/또는 제2 외인성 폴리뉴클레오티드는 렌티바이러스 벡터를 포함하는 바이러스 벡터에 의해 운반된다. 일부 실시양태에서, 제1 및/또는 제2 외인성 폴리뉴클레오티드는 CD8 결합제를 포함하는 렌티바이러스 벡터에 의해 운반된다. 일부 실시양태에서, 제1 및/또는 제2 외인성 폴리뉴클레오티드는 조건부 또는 유도성 트랜스포사제, 조건부 또는 유도성 PiggyBac 트랜스포손, 조건부 또는 유도성 슬리핑 뷰티 (SB11) 트랜스포존, 조건부 또는 유도성 Mos1 트랜스포존, 및 조건부 또는 유도성 Tol2 트랜스포존으로 이루어진 군으로부터 선택된 트랜스포사제 시스템 또는 푸소겐-매개된 전달을 사용하여 세포 내로 도입된다.
일부 실시양태에서, 비-활성화된 T 세포는 CD47을 코딩하는 제2 외인성 폴리뉴클레오티드를 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 제1 및/또는 제2 외인성 폴리뉴클레오티드는 T 세포의 하나 이상의 대립유전자의 특이적 유전자좌 내로 삽입된다. 일부 실시양태에서, 특이적 유전자좌는 세이프 하버 또는 표적 유전자좌, 표적 유전자좌, B2M 유전자좌, CIITA 유전자좌, TRAC 유전자좌 및 TRB 유전자좌로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, CD47을 코딩하는 제2 외인성 폴리뉴클레오티드는 세이프 하버 또는 표적 유전자좌, 표적 유전자좌, B2M 유전자좌, CIITA 유전자좌, TRAC 유전자좌 및 TRB 유전자좌로 이루어진 군으로부터 선택된 특이적 유전자좌 내로 삽입된다. 일부 실시양태에서, CAR을 코딩하는 제1 외인성 폴리뉴클레오티드는 세이프 하버 또는 표적 유전자좌, 표적 유전자좌, B2M 유전자좌, CIITA 유전자좌, TRAC 유전자좌 및 TRB 유전자좌로 이루어진 군으로부터 선택된 특이적 유전자좌 내로 삽입된다. 일부 실시양태에서, CD47을 코딩하는 제2 외인성 폴리뉴클레오티드 및 CAR을 코딩하는 제1 외인성 폴리뉴클레오티드는 상이한 유전자좌 내로 삽입된다. 일부 실시양태에서, CD47을 코딩하는 제2 외인성 폴리뉴클레오티드 및 CAR을 코딩하는 제1 외인성 폴리뉴클레오티드는 동일한 유전자좌 내로 삽입된다. 일부 실시양태에서, CD47을 코딩하는 제2 외인성 폴리뉴클레오티드 및 CAR을 코딩하는 제1 외인성 폴리뉴클레오티드는 B2M 유전자좌 내로 삽입된다. 일부 실시양태에서, CD47을 코딩하는 제2 외인성 폴리뉴클레오티드 및 CAR을 코딩하는 제1 외인성 폴리뉴클레오티드는 CIITA 유전자좌 내로 삽입된다. 일부 실시양태에서, CD47을 코딩하는 제2 외인성 폴리뉴클레오티드 및 CAR을 코딩하는 제1 외인성 폴리뉴클레오티드는 TRAC 유전자좌 내로 삽입된다. 일부 실시양태에서, CD47을 코딩하는 제2 외인성 폴리뉴클레오티드 및 CAR을 코딩하는 제1 외인성 폴리뉴클레오티드는 TRB 유전자좌 내로 삽입된다. 일부 실시양태에서, CD47을 코딩하는 제2 외인성 폴리뉴클레오티드 및 CAR을 코딩하는 제1 외인성 폴리뉴클레오티드는 세이프 하버 또는 표적 유전자좌 내로 삽입된다. 일부 실시양태에서, 세이프 하버 또는 표적 유전자좌는 CCR5 유전자 유전자좌, CXCR4 유전자 유전자좌, PPP1R12C 유전자 유전자좌, 알부민 유전자 유전자좌, SHS231 유전자 유전자좌, CLYBL 유전자 유전자좌, Rosa 유전자 유전자좌, F3 (CD142) 유전자 유전자좌, MICA 유전자 유전자좌, MICB 유전자 유전자좌, LRP1 (CD91) 유전자 유전자좌, HMGB1 유전자 유전자좌, ABO 유전자 유전자좌, RHD 유전자 유전자좌, FUT1 유전자좌 및 KDM5D 유전자 유전자좌로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일부 실시양태에서, 비-활성화된 T 세포는 HLA-A, HLA-B 및/또는 HLA-C 항원을 발현하지 않는다. 일부 실시양태에서, 비-활성화된 T 세포는 B2M을 발현하지 않는다. 일부 실시양태에서, 비-활성화된 T 세포는 HLA-DP, HLA-DQ 및/또는 HLA-DR 항원을 발현하지 않는다. 일부 실시양태에서, 비-활성화된 T 세포는 CIITA를 발현하지 않는다. 일부 실시양태에서, 비-활성화된 T 세포는 TCR-알파를 발현하지 않는다. 일부 실시양태에서, 비-활성화된 T 세포는 TCR-베타를 발현하지 않는다. 일부 실시양태에서, 비-활성화된 T 세포는 TCR-알파 및 TCR-베타를 발현하지 않는다.
일부 실시양태에서, 비-활성화된 T 세포는 TRAC 유전자좌 내로 삽입된 CD47을 코딩하는 제2 외인성 폴리뉴클레오티드 및/또는 CAR을 코딩하는 제1 외인성 폴리뉴클레오티드를 포함하는 B2Mindel/indel, CIITAindel/indel, TRACindel/indel 세포이다. 일부 실시양태에서, 비-활성화된 T 세포는 TRAC 유전자좌 내로 삽입된 CD47을 코딩하는 제2 외인성 폴리뉴클레오티드 및 CAR을 코딩하는 제1 외인성 폴리뉴클레오티드를 포함하는 B2Mindel/indel, CIITAindel/indel, TRACindel/indel 세포이다. 일부 실시양태에서, 비-활성화된 T 세포는 TRB 유전자좌 내로 삽입된 CD47을 코딩하는 제2 외인성 폴리뉴클레오티드 및/또는 CAR을 코딩하는 제1 외인성 폴리뉴클레오티드를 포함하는 B2Mindel/indel, CIITAindel/indel, TRACindel/indel 세포이다. 일부 실시양태에서, 비-활성화된 T 세포는 TRB 유전자좌 내로 삽입된 CD47을 코딩하는 제2 외인성 폴리뉴클레오티드 및 CAR을 코딩하는 제1 외인성 폴리뉴클레오티드를 포함하는 B2Mindel/indel, CIITAindel/indel, TRACindel/indel 세포이다. 일부 실시양태에서, 비-활성화된 T 세포는 B2M 유전자좌 내로 삽입된 CD47을 코딩하는 제2 외인성 폴리뉴클레오티드 및/또는 CAR을 코딩하는 제1 외인성 폴리뉴클레오티드를 포함하는 B2Mindel/indel, CIITAindel/indel, TRACindel/indel 세포이다. 일부 실시양태에서, 비-활성화된 T 세포는 B2M 유전자좌 내로 삽입된 CD47을 코딩하는 제2 외인성 폴리뉴클레오티드 및 CAR을 코딩하는 제1 외인성 폴리뉴클레오티드를 포함하는 B2Mindel/indel, CIITAindel/indel, TRACindel/indel 세포이다. 일부 실시양태에서, 비-활성화된 T 세포는 CIITA 유전자좌 내로 삽입된 CD47을 코딩하는 제2 외인성 폴리뉴클레오티드 및/또는 CAR을 코딩하는 제1 외인성 폴리뉴클레오티드를 포함하는 B2Mindel/indel, CIITAindel/indel, TRACindel/indel 세포이다. 일부 실시양태에서, 비-활성화된 T 세포는 CIITA 유전자좌 내로 삽입된 CD47을 코딩하는 제2 외인성 폴리뉴클레오티드 및 CAR을 코딩하는 제1 외인성 폴리뉴클레오티드를 포함하는 B2Mindel/indel, CIITAindel/indel, TRACindel/indel 세포이다.
일부 실시양태에서, 비-활성화된 T 세포는 TRAC 유전자좌 내로 삽입된 CD47을 코딩하는 제2 외인성 폴리뉴클레오티드 및/또는 CAR을 코딩하는 제1 외인성 폴리뉴클레오티드를 포함하는 B2Mindel/indel, CIITAindel/indel, TRBindel/indel 세포이다. 일부 실시양태에서, 비-활성화된 T 세포는 TRAC 유전자좌 내로 삽입된 CD47을 코딩하는 제2 외인성 폴리뉴클레오티드 및 CAR을 코딩하는 제1 외인성 폴리뉴클레오티드를 포함하는 B2Mindel/indel, CIITAindel/indel, TRBindel/indel 세포이다. 일부 실시양태에서, 비-활성화된 T 세포는 TRB 유전자좌 내로 삽입된 CD47을 코딩하는 제2 외인성 폴리뉴클레오티드 및/또는 CAR을 코딩하는 제1 외인성 폴리뉴클레오티드를 포함하는 B2Mindel/indel, CIITAindel/indel, TRBindel/indel 세포이다. 일부 실시양태에서, 비-활성화된 T 세포는 TRB 유전자좌 내로 삽입된 CD47을 코딩하는 제2 외인성 폴리뉴클레오티드 및 CAR을 코딩하는 제1 외인성 폴리뉴클레오티드를 포함하는 B2Mindel/indel, CIITAindel/indel, TRBindel/indel 세포이다. 일부 실시양태에서, 비-활성화된 T 세포는 B2M 유전자좌 내로 삽입된 CD47을 코딩하는 제2 외인성 폴리뉴클레오티드 및/또는 CAR을 코딩하는 제1 외인성 폴리뉴클레오티드를 포함하는 B2Mindel/indel, CIITAindel/indel, TRBindel/indel 세포이다. 일부 실시양태에서, 비-활성화된 T 세포는 B2M 유전자좌 내로 삽입된 CD47을 코딩하는 제2 외인성 폴리뉴클레오티드 및 CAR을 코딩하는 제1 외인성 폴리뉴클레오티드를 포함하는 B2Mindel/indel, CIITAindel/indel, TRBindel/indel 세포이다. 일부 실시양태에서, 비-활성화된 T 세포는 CIITA 유전자좌 내로 삽입된 CD47을 코딩하는 제2 외인성 폴리뉴클레오티드 및/또는 CAR을 코딩하는 제1 외인성 폴리뉴클레오티드를 포함하는 B2M indel/indel , CIITAindel/indel, TRBindel/indel 세포이다. 일부 실시양태에서, 비-활성화된 T 세포는 CIITA 유전자좌 내로 삽입된 CD47을 코딩하는 제2 외인성 폴리뉴클레오티드 및 CAR을 코딩하는 제1 외인성 폴리뉴클레오티드를 포함하는 B2Mindel/indel, CIITAindel/indel, TRBindel/indel 세포이다.
본원은 야생형 T 세포에 비해 HLA-A, HLA-B, HLA-C, HLA-DP, HLA-DQ, HLA-DR, B2M, CIITA, TCR-알파, 및/또는 TCR-베타의 감소된 발현을 포함하는 조작된 T 세포를 제공하며, 여기서 조작된 T 세포는 렌티바이러스 벡터를 포함하는 바이러스 벡터에 의해 운반되는 키메라 항원 수용체 (CAR)를 코딩하는 제1 외인성 폴리뉴클레오티드를 추가로 포함한다. 본원은 야생형 T 세포에 비해 HLA-A, HLA-B, HLA-C, HLA-DP, HLA-DQ, HLA-DR, B2M, CIITA, TCR-알파 및/또는 TCR-베타의 감소된 발현을 포함하는 조작된 T 세포를 제공하며, 여기서 조작된 T 세포는 CD8 결합제를 포함하는 렌티바이러스 벡터에 의해 운반되는 키메라 항원 수용체 (CAR)를 코딩하는 제1 외인성 폴리뉴클레오티드를 추가로 포함한다.
일부 실시양태에서, 조작된 T 세포는 일차 T 세포이다. 다른 실시양태에서, 조작된 T 세포는 본 개시내용의 저면역원성 세포로부터 분화된다. 일부 실시양태에서, T 세포는 CD8+ T 세포이다. 일부 실시양태에서, T 세포는 CD4+ T 세포이다.
일부 실시양태에서, 조작된 T 세포는 활성화 마커를 발현하지 않는다. 일부 실시양태에서, 조작된 T 세포는 CD3 및 CD28을 발현하고, 여기서 CD3 및/또는 CD28은 비활성이다.
일부 실시양태에서, 조작된 T 세포는 항-CD3 항체, 항-CD28 항체, T 세포 활성화 사이토카인 또는 가용성 T 세포 공동자극 분자로 처리되지 않았다. 일부 실시양태에서, 항-CD3 항체는 OKT3이고, 여기서 항-CD28 항체는 CD28.2이고, 여기서 T 세포 활성화 사이토카인은 IL-2, IL-7, IL-15, 및 IL-21로 이루어진 T 세포 활성화 사이토카인의 군으로부터 선택되며, 여기서 가용성 T 세포 공동자극 분자는 항-CD28 항체, 항-CD80 항체, 항-CD86 항체, 항-CD137L 항체, 및 항-ICOS-L 항체로 이루어진 가용성 T 세포 공동자극 분자의 군으로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, 조작된 T 세포는 IL-2, IL-7, IL-15 및 IL-21로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 T 세포 활성화 사이토카인으로 처리되지 않았다. 일부 경우에, 사이토카인은 IL-2이다. 일부 실시양태에서, 하나 이상의 사이토카인은 IL-2, 및 IL-7, IL-15 및 IL-21로 이루어진 군으로부터 선택되는 또 다른 사이토카인이다.
일부 실시양태에서, 조작된 T 세포는 CD47을 코딩하는 제2 외인성 폴리뉴클레오티드를 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 제1 및/또는 제2 외인성 폴리뉴클레오티드는 T 세포의 하나 이상의 대립유전자의 특이적 유전자좌 내로 삽입된다. 일부 실시양태에서, 특이적 유전자좌는 세이프 하버 또는 표적 유전자좌, 표적 유전자좌, B2M 유전자좌, CIITA 유전자좌, TRAC 유전자좌 및 TRB 유전자좌로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, CD47을 코딩하는 제2 외인성 폴리뉴클레오티드는 세이프 하버 또는 표적 유전자좌, 표적 유전자좌, B2M 유전자좌, CIITA 유전자좌, TRAC 유전자좌 및 TRB 유전자좌로 이루어진 군으로부터 선택된 특이적 유전자좌 내로 삽입된다. 일부 실시양태에서, CAR을 코딩하는 제1 외인성 폴리뉴클레오티드는 세이프 하버 또는 표적 유전자좌, 표적 유전자좌, B2M 유전자좌, CIITA 유전자좌, TRAC 유전자좌 및 TRB 유전자좌로 이루어진 군으로부터 선택된 특이적 유전자좌 내로 삽입된다. 일부 실시양태에서, CD47을 코딩하는 제2 외인성 폴리뉴클레오티드 및 CAR을 코딩하는 제1 외인성 폴리뉴클레오티드는 상이한 유전자좌 내로 삽입된다. 일부 실시양태에서, CD47을 코딩하는 제2 외인성 폴리뉴클레오티드 및 CAR을 코딩하는 제1 외인성 폴리뉴클레오티드는 동일한 유전자좌 내로 삽입된다. 일부 실시양태에서, CD47을 코딩하는 제2 외인성 폴리뉴클레오티드 및 CAR을 코딩하는 제1 외인성 폴리뉴클레오티드는 B2M 유전자좌, CIITA 유전자좌, TRAC 유전자좌, TRB 유전자좌, 또는 세이프 하버 또는 표적 유전자좌 내로 삽입된다. 일부 실시양태에서, 세이프 하버 또는 표적 유전자좌는 CCR5 유전자 유전자좌, CXCR4 유전자 유전자좌, PPP1R12C 유전자 유전자좌, 알부민 유전자 유전자좌, SHS231 유전자 유전자좌, CLYBL 유전자 유전자좌, Rosa 유전자 유전자좌, F3 (CD142) 유전자 유전자좌, MICA 유전자 유전자좌, MICB 유전자 유전자좌, LRP1 (CD91) 유전자 유전자좌, HMGB1 유전자 유전자좌, ABO 유전자 유전자좌, RHD 유전자 유전자좌, FUT1 유전자좌 및 KDM5D 유전자 유전자좌로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일부 실시양태에서, CAR은 CD19-특이적 CAR 및 CD22-특이적 CAR로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, CAR은 CD19-특이적 CAR이다. 일부 실시양태에서, CAR은 CD22-특이적 CAR이다. 일부 실시양태에서, CAR은 CD19, CD22, CD38, CD123, CD138 및 BCMA로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나에 결합하는 항원 결합 도메인을 포함한다.
일부 실시양태에서, 조작된 T 세포는 HLA-A, HLA-B 및/또는 HLA-C 항원을 발현하지 않으며, 여기서 조작된 T 세포는 B2M을 발현하지 않고/않으며, 여기서 조작된 T 세포는 HLA-DP, HLA-DQ, 및/또는 HLA-DR 항원을 발현하지 않고/않으며, 여기서 조작된 T 세포는 CIITA를 발현하지 않고/않으며, 조작된 T 세포는 TCR-알파 및 TCR-베타를 발현하지 않는다.
일부 실시양태에서, 조작된 T 세포는 TRAC 유전자좌 내로, TRB 유전자좌 내로, B2M 유전자좌 내로 또는 CIITA 유전자좌 내로 삽입된 CD47을 코딩하는 제2 외인성 폴리뉴클레오티드 및/또는 CAR을 코딩하는 제1 외인성 폴리뉴클레오티드를 포함하는 B2Mindel/indel, CIITAindel/indel, TRACindel/indel 세포이다. 일부 실시양태에서, 조작된 T 세포는 TRAC 유전자좌 내로, TRB 유전자좌 내로, B2M 유전자좌 내로 또는 CIITA 유전자좌 내로 CD47을 코딩하는 제2 외인성 폴리뉴클레오티드 및/또는 CAR을 코딩하는 제1 외인성 폴리뉴클레오티드를 포함하는 B2Mindel/indel, CIITAindel/indel, TRACindel/indel 세포이다.
일부 실시양태에서, 본 개시내용의 비-활성화된 T 세포 및/또는 조작된 T 세포는 대상체에 있다. 다른 실시양태에서, 본 개시내용의 비-활성화된 T 세포 및/또는 조작된 T 세포는 생체외에 있다.
일부 실시양태에서, 본 개시내용의 비-활성화된 T 세포 및/또는 조작된 T 세포는 CD8 결합제를 발현한다. 일부 실시양태에서, CD8 결합제는 항-CD8 항체이다. 일부 실시양태에서, 항-CD8 항체는 마우스 항-CD8 항체, 토끼 항-CD8 항체, 인간 항-CD8 항체, 인간화된 항-CD8 항체, 낙타류 (예컨대, 라마, 알파카, 낙타) 항-CD8 항체 및 이의 단편으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, 이의 단편은 scFv 또는 VHH이다. 일부 실시양태에서, CD8 결합제는 CD8 알파 쇄 및/또는 CD8 베타 쇄에 결합한다.
일부 실시양태에서, CD8 결합제는 바이러스 외피에 혼입된 막관통 도메인에 융합된다. 일부 실시양태에서, 렌티바이러스 벡터는 바이러스 융합 단백질로 슈도타이핑된다. 일부 실시양태에서, 바이러스 융합 단백질은 이의 천연 수용체에 대한 결합을 감소시키기 위한 하나 이상의 변형을 포함한다.
일부 실시양태에서, 바이러스 융합 단백질은 CD8 결합제에 융합된다. 일부 실시양태에서, 바이러스 융합 단백질은 CD8 결합제에 융합된 니파 바이러스 F 당단백질 및 니파 바이러스 G 당단백질을 포함한다. 일부 실시양태에서, 렌티바이러스 벡터는 T 세포 활성화 분자 또는 T 세포 공동자극 분자를 포함하지 않는다. 일부 실시양태에서, 렌티바이러스 벡터는 제1 외인성 폴리뉴클레오티드 및/또는 제2 외인성 폴리뉴클레오티드를 코딩한다.
일부 실시양태에서, 제1 대상체 내로 전달된 후, 비-활성화된 T 세포 또는 조작된 T 세포는 제2 대상체 내로 전달된 후의 야생형 세포와 비교하여 감소된 (a) T 세포 반응, (b) NK 세포 반응 및 (c) 대식세포 반응으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 반응을 나타낸다. 일부 실시양태에서, 제1 대상체 및 제2 대상체는 상이한 대상체이다. 일부 실시양태에서, 대식세포 반응은 탐식이다.
일부 실시양태에서, 대상체 내로 전달된 후, 비-활성화된 T 세포 또는 조작된 T 세포는 대상체 내로 전달된 후의 야생형 세포와 비교하여, (a) 대상체에서 감소된 TH1 활성화, (b) 대상체에서 감소된 NK 세포 살해 및 (c) 대상체에서 전체 PBMC에 의한 감소된 살해로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상을 나타낸다.
일부 실시양태에서, 대상체 내로 전달된 후, 비-활성화된 T 세포 또는 조작된 T 세포는 대상체 내로 전달된 후의 야생형 세포와 비교하여, (a) 대상체에서 감소된 공여자 특이적 항체, (b) 대상체에서 감소된 IgM 또는 IgG 항체, 및 (c) 대상체에서 감소된 보체-의존성 세포독성 (CDC)으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상을 이끌어낸다.
일부 실시양태에서, 비-활성화된 T 세포 또는 조작된 T 세포는 대상체 내에서 CD8 결합제를 포함하는 렌티바이러스 벡터로 형질도입된다. 일부 실시양태에서, 렌티바이러스 벡터는 CAR 및/또는 CD47을 코딩하는 유전자를 운반한다.
일부 실시양태에서, CAR 및/또는 CD47을 코딩하는 유전자는 푸소젠-매개된 전달, 트랜스포사제, PiggyBac 트랜스포존, 슬리핑 뷰티 (SB11) 트랜스포존, Mos1 트랜스포존 및 Tol2 트랜스포손으로 이루어진 군으로부터 선택된 트랜스포사제 시스템, 또는 렌티바이러스 벡터를 포함하는 바이러스 벡터을 사용하여 세포 내로 도입된다.
본원은 본 개시내용의 비-활성화된 T 세포 및/또는 조작된 T 세포의 집단 및 약학적으로 허용가능한 첨가제, 담체, 희석제 또는 부형제를 포함하는 약학 조성물을 제공한다.
본원은 본 개시내용의 비-활성화된 T 세포 및/또는 조작된 T 세포의 집단을 포함하는 조성물, 또는 본 개시내용의 하나 이상의 약학 조성물을 대상체에 투여하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다.
일부 실시양태에서, 대상체에 조성물의 투여 전, 후 및/또는 이와 동시에 T 세포 활성화 치료가 투여되지 않는다. 일부 실시양태에서, T 세포 활성화 치료는 림프구고갈을 포함한다.
본원은 본 개시내용의 비-활성화된 T 세포 및/또는 조작된 T 세포의 집단을 포함하는 조성물, 또는 본 개시내용의 하나 이상의 약학 조성물을 대상체에 투여하는 단계를 포함하는 암을 앓고 있는 대상체를 치료하는 방법을 제공하며, 여기서 대상체에 조성물의 투여 전, 후 및/또는 이와 동시에 T 세포 활성화 치료가 투여되지 않는다. 일부 실시양태에서, T 세포 활성화 치료는 림프구고갈을 포함한다.
본원은 본 개시내용의 비-활성화된 T 세포 및/또는 조작된 T 세포의 집단을 포함하는 조성물, 또는 본 개시내용의 하나 이상의 약학 조성물을 대상체에 투여하는 단계를 포함하는, 대상체 내에서 T 세포의 확장을 필요로 하는 대상체의 종양 세포를 인식하고 살해시킬 수 있는 T 세포를 확장하는 방법을 제공하며, 대상체에 조성물의 투여 전, 후 및/또는 이와 동시에 T 세포 활성화 치료가 투여되지 않는다. 일부 실시양태에서, T 세포 활성화 치료는 림프구고갈을 포함한다.
본원은 본 개시내용의 비-활성화된 T 세포 및/또는 조작된 T 세포의 집단을 포함하는 약학 조성물, 또는 본 개시내용의 하나 이상의 약학 조성물, 및 약학적으로 허용가능한 첨가제, 담체, 희석제 또는 부형제의 투여를 포함하는 대상체에서 병태, 질환 또는 장애를 치료하기 위한 투여량 양생법을 제공하며, 여기서 약학 조성물은 약 1-3 회의 치료적 유효 용량으로 투여된다. 본원은 본 개시내용의 비-활성화된 T 세포 및/또는 조작된 T 세포의 집단을 포함하는 약학 조성물, 또는 본 개시내용의 하나 이상의 약학 조성물, 및 약학적으로 허용가능한 첨가제, 담체, 희석제 또는 부형제의 투여를 포함하는 대상체에서 병태, 질환 또는 장애를 치료하기 위한 투여량 양생법을 제공하며, 여기서 약학 조성물은 약 1-3 회의 임상적 유효 용량으로 투여된다.
일단 변경되면, 본원에 기재된 분자 중 임의의 것의 발현의 존재는 알려진 기술, 예컨대, 웨스턴 블롯, ELISA 검정, FACS 검정, 기타 면역검정, 및 역전사 효소 중합효소 연쇄 반응 (RT-PCR) 등을 사용하여 검정될 수 있다.
T. 유도 만능 줄기 세포의 생성
기술은 저면역원성 만능 세포를 생산하는 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 방법은 만능 줄기 세포를 생성하는 것을 포함한다. 마우스 및 인간 만능 줄기 세포 (일반적으로 iPSC; 뮤린 세포의 경우 miPSC 또는 인간 세포의 경우 hiPSC로서 지칭됨)의 생성은 일반적으로 당업계에 알려져 있다. 당업자에 의해 인식될 것인 바와 같이, iPCS의 생성을 위한 다양한 상이한 방법이 있다. 최초의 유도는 4 개의 전사 인자, Oct3/4, Sox2, c-Myc 및 Klf4의 바이러스 도입을 사용하여 마우스 배아 또는 성체 섬유아세포로부터 이루어졌으며; 그 안에 약술된 기술에 대해 구체적으로 그리고 그 전체가 참조로 본원에 원용되는, Takahashi and Yamanaka Cell 126:663-676 (2006)을 참고한다. 그 이후로, 다수의 방법이 개발되었으며; 검토를 대해 Seki 등, World J. Stem Cells 7(1): 116-125 (2015), 및 Lakshmipathy and Vermuri, editors, Methods in Molecular Biology: Pluripotent Stem Cells, Methods and Protocols, Springer 2013을 참고하며, 이들 둘 모두는 특히 hiPSC를 생성하는 방법 (예를 들어, 후자 참조의 3장 참고)에 대해 그리고 그 전체가 참조로 명백하게 본원에 원용된다.
일반적으로, iPSC는 일반적으로 에피솜 벡터를 사용하여 도입되는 숙주 세포에서 하나 이상의 재프로그래밍 인자"의 일시적인 발현에 의해 생성된다. 이러한 조건 하에서, 소량의 세포가 유도되어, iPSC가 된다 (일반적으로, 선택 마커가 사용되지 않기 때문에 이 단계의 효율성은 낮다). 일단 세포가 "재프로그래밍"되고 만능이 되면, 이들은 에피솜 벡터(들)를 상실하고, 내인성 유전자를 사용하여 인자를 생산한다.
또한 당업자에 의해 인식되는 바와 같이, 사용될 수 있거나 사용되는 재프로그래밍 인자의 수는 다양할 수 있다. 일반적으로, 더 적은 재프로그래밍 인자가 사용되는 경우, "다능성" 뿐만 아니라 세포의 만능 상태로의 형질전환의 효율이 감소하며, 예컨대, 더 적은 재프로그래밍 인자는 완전히 만능이 아니지만 더 적은 세포 유형으로만 분화할 수 있는 세포를 초래할 수 있다.
일부 실시양태에서, 단일 재프로그래밍 인자 OCT4가 사용된다. 다른 실시양태에서, 2 개의 재프로그래밍 인자, OCT4 및 KLF4가 사용된다. 다른 실시양태에서, 3 개의 재프로그래밍 인자, OCT4, KLF4 및 SOX2가 사용된다. 다른 실시양태에서, 4 개의 재프로그래밍 인자, OCT4, KLF4, SOX2 및 c-Myc가 사용된다. 다른 실시양태에서, 5, 6 또는 7 개의 재프로그래밍 인자가 SOKMNLT; SOX2, OCT4 (POU5F1), KLF4, MYC, NANOG, LIN28 및 SV40L T 항원으로부터 선택되어 사용될 수 있다. 일반적으로, 이들 재프로그래밍 인자 유전자는 당업계에 알려지고 상업적으로 이용가능한 것과 같은 에피솜 벡터 상에 제공된다.
일반적으로, 당업계에 알려진 바와 같이, iPSC는 본원에 기재된 바와 같은 재프로그래밍 인자를 일시적으로 발현시킴으로써 비-만능 세포, 예컨대, 비제한적으로 혈액 세포, 섬유아세포 등으로부터 제조된다.
U. 저면역원성 표현형 및 다능성의 보유에 대한 검정
일단 저면역원성 세포가 생성되면, 이들은 WO2016183041 및 WO2018132783에 기재된 바와 같이 이들의 저면역원성 및/또는 다능성의 보유에 대해 검정될 수 있다.
일부 실시양태에서, 저면역원성은 WO2018132783의 도 13 및 도 15에 예시된 바와 같은 다수의 기술을 사용하여 검정된다. 이들 기술은 동종이계 숙주 내로의 이식 및 숙주 면역계를 회피하는 저면역성 만능 세포 성장 (예컨대, 기형종)에 대한 모니터링을 포함한다. 일부 경우에, 저면역원성 만능 세포 유도체가 형질도입되어, 루시퍼라제를 발현하고, 이어서 생물발광 이미징을 사용할 수 있다. 유사하게, 이러한 세포에 대한 숙주 동물의 T 세포 및/또는 B 세포 반응을 테스트하여, 세포가 숙주 동물에서 면역 반응을 유발하지 않는지를 확인한다. T 세포 반응은 Elispot, ELISA, FACS, PCR 또는 질량 세포측정법 (CYTOF)에 의해 평가될 수 있다. B 세포 반응 또는 항체 반응은 FACS 또는 Luminex를 사용하여 평가된다. 추가적으로 또는 대안적으로, 세포는 WO2018132783의 도 14 및 15에 일반적으로 도시된 바와 같이 선천적 면역 반응, 예컨대, NK 세포 살해를 피하는 이들의 능력에 대해 검정될 수 있다.
일부 실시양태에서, 세포의 면역원성은 T 세포 면역검정, 예컨대, T 세포 증식 검정, T 세포 활성화 검정, 및 당업자에 의해 인식되는 T 세포 살해 검정을 사용하여 평가된다. 일부 경우에, T 세포 증식 검정은 세포를 인터페론-감마로 전처리하고 세포를 표지된 T 세포와 공동배양하고 미리선택된 시간 후에 T 세포 집단 (또는 증식하는 T 세포 집단)의 존재를 검정하는 것을 포함한다. 일부 경우에, T 세포 활성화 검정은 T 세포를 본원에 약술된 세포와 공동배양하고 T 세포에서 T 세포 활성화 마커의 발현 수준을 측정하는 것을 포함한다.
생체내 검정은 본원에 약술된 세포의 면역원성을 평가하기 위해 수행될 수 있다. 일부 실시양태에서, 저면역원성 세포의 생존 및 면역원성은 동종이계 인간화된 면역결핍 마우스 모델을 사용하여 결정된다. 일부 예에서, 저면역원성 만능 줄기 세포는 동종이계 인간화된 NSG-SGM3 마우스 내로 이식되고, 세포 거부, 세포 생존 및 기형종 형성에 대해 검정된다. 일부 경우에, 이식된 저면역원성 만능 줄기 세포 또는 이의 분화된 세포는 마우스 모델에서 장기간 생존을 나타낸다.
세포의 저면역원성을 포함하여 면역원성을 결정하기 위한 추가적인 기술은 예를 들어, Deuse 등, Nature Biotechnology, 2019, 37, 252-258 및 Han 등, Proc Natl Acad Sci USA, 2019, 116(21), 10441-10446에 기재되어 있으며, 도면, 도면 범례 및 방법의 설명을 포함하는 개시내용은 그 전체가 참조로 본원에 원용된다.
유사하게, 다능성의 보유는 다수의 방식으로 테스트된다. 일부 실시양태에서, 다능성은 본원에 일반적으로 기재되고 WO2018132783의 도 29에 도시된 바와 같은 특정 다능성-특이적 인자의 발현에 의해 검정된다. 추가적으로 또는 대안적으로, 만능 세포는 다능성의 표시로서 하나 이상의 세포 유형으로 분화된다.
당업자에게 인식될 것인 바와 같이, 만능 세포에서 MHC I 기능 (세포가 인간 세포로부터 유래된 경우 HLA I)의 성공적인 감소는 당업계에 알려진 기술; 예를 들어, 인간 주요 조직적합성 HLA 클래스 I 항원의 알파 쇄에 결합하는 상업적으로 이용가능한 HLA-A, HLA-B 및 HLA-C 항체를 사용한; 예를 들어, HLA 복합체에 결합하는 표지된 항체를 사용하는 FACS 기술을 사용하여 하기 기재된 바와 같이 측정될 수 있다.
추가로, HLA I 복합체가 세포 표면에서 발현되지 않는다는 것을 확인하기 위해 세포를 테스트할 수 있다. 이는 위에 논의된 바와 같이 하나 이상의 HLA 세포 표면 구성요소에 대한 항체를 사용하는 FACS 분석에 의해 검정될 수 있다.
만능 세포 또는 이들의 유도체에서 MHC II 기능 (세포가 인간 세포로부터 유래된 경우 HLA II)의 성공적인 감소는 단백질에 대한 항체를 사용하는 웨스턴 블롯팅, FACS 기술, RT-PCR 기술 등과 같은 당업계에 알려진 기술을 사용하여 측정될 수 있다.
추가로, HLA II 복합체가 세포 표면 상에 발현되지 않는다는 것을 확인하기 위해 세포를 테스트할 수 있다. 다시, 이 검정은 당업계에 알려진 바와 같이 수행되며 (예를 들어, WO2018132783의 도 21 참고), 일반적으로 인간 HLA 클래스 II HLA-DR, DP 및 대부분의 DQ 항원에 대해 결합하는 상업적인 항체에 기반한 웨스턴 블롯 또는 FACS 분석을 사용하여 수행된다.
HLA I 및 II (또는 MHC I 및 II)의 감소 이외에, 기술의 저면역원성 세포는 대식세포 식균작용 및 NK 세포 살해에 대한 감소된 감수성을 갖는다. 생성된 저면역원성 세포는 TCR 복합체의 감소 또는 결여 및 하나 이상의 CD47 트랜스진의 발현으로 인해 면역 대식세포 및 선천적 경로를 "탈출"한다.
V. 외인성 폴리뉴클레오티드
일부 실시양태에서, 본원에 제공된 저면역원성 세포는 저면역원성 세포의 하나 이상의 게놈 유전자좌 내로 삽입된 하나 이상의 외인성 폴리뉴클레오티드를 포함하도록 유전적으로 변형된다. 일부 실시양태에서, 외인성 폴리뉴클레오티드는 관심 단백질, 예를 들어, 키메라 항원 수용체를 코딩한다. 본원에 기재된 유전자 편집 방법 (예컨대, CRISPR/Cas 시스템)을 포함하는 저면역원성 세포의 게놈 유전자좌 내로 외인성 폴리뉴클레오티드를 삽입하기 위해 임의의 적합한 방법이 사용될 수 있다. 일부 실시양태에서, 하나 이상의 외인성 폴리뉴클레오티드는 예를 들어, 벡터를 이용한 바이러스 형질도입을 사용하여 세포의 하나 이상의 대립유전자 내로 삽입된다. 일부 실시양태에서, 벡터는 하나 이상의 외인성 폴리뉴클레오티드를 운반하는 슈도타이핑된 자기-비활성화 렌티바이러스 벡터이다. 일부 실시양태에서, 벡터는 수포성 구내염 VSV-G 외피로 슈도타이핑되고 하나 이상의 외인성 폴리뉴클레오티드를 운반하는 자기-비활성화 렌티바이러스 벡터이다. 일부 실시양태에서, 하나 이상의 외인성 폴리뉴클레오티드는 바이러스 형질도입을 사용하여 세포의 하나 이상의 대립유전자 내로 삽입된다. 일부 실시양태에서, 하나 이상의 외인성 폴리뉴클레오티드는 렌티바이러스 기반 바이러스 벡터를 사용하여 세포의 하나 이상의 대립유전자 내로 삽입된다.
외인성 폴리뉴클레오티드는 저면역원성 세포의 임의의 적합한 게놈 유전자좌 내로 삽입될 수 있다. 일부 실시양태에서, 외인성 폴리뉴클레오티드는 본원에 기재된 바와 같이 세이프 하버 또는 표적 유전자좌 내로 삽입된다. 적합한 세이프 하버 및 표적 유전자좌는 CCR5 유전자, CXCR4 유전자, PPP1R12C (AAVS1로서 또한 알려짐) 유전자, 알부민 유전자, SHS231 유전자좌, CLYBL 유전자, Rosa 유전자 (예컨대, ROSA26), F3 유전자 (CD142로서 또한 알려짐), MICA 유전자, MICB 유전자, LRP1 유전자 (CD91로서 또한 알려짐), HMGB1 유전자, ABO 유전자, RHD 유전자, FUT1 유전자, PDGFRa 유전자, OLIG2 유전자, GFAP 유전자 및 KDM5D 유전자 (HY로서 또한 알려짐)를 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 일부 실시양태에서, 외인성 폴리뉴클레오티드는 세이프 하버 또는 표적 유전자 유전자좌의 인트론, 엑손 또는 코딩 서열 영역에 관심이 있다. 일부 실시양태에서, 외인성 폴리뉴클레오티드는 내인성 유전자 내로 삽입되며, 여기서 삽입은 내인성 유전자의 침묵 또는 감소된 발현을 유발한다. 일부 실시양태에서, 폴리뉴클레오티드는 B2M, CIITA, TRAC, TRB, PD-1 또는 CTLA-4 유전자 유전자좌에 삽입된다. 외인성 폴리뉴클레오티드의 삽입을 위한 예시적인 게놈 유전자좌는 표 17에 묘사되어 있다.
표 17: 외인성 폴리뉴클레오티드의 삽입을 위한 예시적인 게놈 유전자좌
표 18: Cas9 가이드 RNA의 비-제한적인 예
Cas9 가이드의 경우, 모든 Cas9 가이드에 대한 스페이서 서열은 예를 들어, 표 18에 나열된 것들을 포함하여 본원에 기재된 것들 중 임의의 것일 수 있다는 설명과 함께 표 19에 제공되어 있으며, 20nt 가이드 서열은 고유한 가이드 서열에 상응한다.
표 19: Cas9 가이드 RNA
일부 실시양태에서, 외인성 폴리뉴클레오티드를 포함하는 저면역원성 세포는 예를 들어, 본원에 기재된 바와 같은 저면역원성 유도 만능 세포 (HIP)로부터 유래된다. 이러한 저면역원성 세포는 예를 들어, T 세포 및 NK 세포를 포함한다. 일부 실시양태에서, 외인성 폴리뉴클레오티드를 포함하는 저면역원성 세포는 T 세포 (예컨대, 일차 T 세포) 또는 NK 세포이다.
일부 실시양태에서, 외인성 폴리뉴클레오티드는 외인성 CD47 폴리펩티드 (예컨대, 인간 CD47 폴리펩티드)를 코딩하고, 외인성 폴리펩티드는 유전자 요법 벡터를 사용하여 세포의 게놈 내로 삽입된다. 일부 실시양태에서, 외인성 폴리뉴클레오티드는 외인성 CD47 폴리펩티드 (예컨대, 인간 CD47 폴리펩티드)를 코딩하고, 외인성 폴리펩티드는 본원에 개시된 바와 같은 세이프 하버 또는 표적 유전자 유전자좌 또는 세이프 하버 또는 표적 부위, 또는 내인성 유전자의 침묵 또는 감소된 발현을 유발하는 게놈 유전자좌 내로 삽입된다. 일부 실시양태에서, 폴리뉴클레오티드는 B2M, CIITA, TRAC, TRB, PD1 또는 CTLA4 유전자 유전자좌 내로 삽입된다.
일부 실시양태에서, 외인성 폴리뉴클레오티드를 포함하는 저면역원성 세포는 일차 T 세포 또는 저면역원성 만능 세포 (예컨대, 저면역원성 iPSC)로부터 유래된 T 세포이다. 예시적인 실시양태에서, 외인성 폴리뉴클레오티드는 키메라 항원 수용체 (예컨대, 본원에 기재된 CAR 중 임의의 것)이다. 일부 실시양태에서, 외인성 폴리뉴클레오티드는 저면역원성 세포에서 외인성 폴리뉴클레오티드의 발현을 위한 프로모터에 작동가능하게 연결된다.
W. 약학적으로 허용가능한 담체
일부 실시양태에서, 본원에 제공된 약학 조성물은 약학적으로 허용가능한 담체를 추가로 포함한다. 허용가능한 담체, 부형제 또는 안정화제는 사용된 투여량 및 농도에서 수용자에게 무독성이며, 완충액, 예컨대, 포스페이트, 시트레이트, 및 기타 유기산; 아스코르브산 및 메티오닌을 포함하는 항산화제; 보존제 (예컨대, 옥타데실디메틸벤질 암모늄 클로라이드; 헥사메토늄 클로라이드; 벤잘코늄 클로라이드, 벤제토늄 클로라이드; 페놀, 부틸 또는 벤질 알콜; 알킬 파라벤, 예컨대, 메틸 또는 프로필 파라벤; 카테콜; 레조르시놀; 사이클로헥산올; 3-펜탄올 및 m-크레졸); 저분자량 (약 10 개 미만의 잔기) 폴리펩티드; 단백질, 예컨대, 혈청 알부민, 젤라틴 또는 면역글로불린; 친수성 중합체, 예컨대, 폴리비닐피롤리돈; 아미노산, 예컨대, 글리신, 글루타민, 아스파라긴, 히스티딘, 아르기닌 또는 리신; 글루코스, 만노스 또는 덱스트린을 포함하는 단당류, 이당류 및 기타 탄수화물; 킬레이팅제, 예컨대, EDTA; 당, 예컨대, 수크로스, 만니톨, 트레할로스 또는 소르비톨; 염-형성 카운터-이온, 예컨대, 소듐; 금속 복합체 (예컨대, Zn-단백질 복합체); 염, 예컨대, 소듐 클로라이드; 및/또는 비-이온성 계면활성제, 예컨대, 폴리소르베이트 (TWEEN™), 폴록사머 (PLURONICS™) 또는 폴리에틸렌 글리콜 (PEG)을 포함한다. 일부 실시양태에서, 약학 조성물은 약학적으로 허용가능한 완충액 (예컨대, 중성 완충 식염수 또는 포스페이트 완충된 식염수)를 포함한다.
일부 실시양태에서, 약학 조성물은 락테이트화된 CryoStor®, 링거 용액, PlasmaLyte-A™, 이스코브의 변형된 둘베코의 배지, Normosol-R™, Veen-D™, Polysal® 및 행크의 균형잡힌 염 용액 (페놀 레드를 함유하지 않음)으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 전해질 기반 용액을 포함한다. 이들 염기 용액은 세포외 포유동물의 생리학적 유체의 조성과 거의 유사하다.
일부 실시양태에서, 약학 조성물은 아라비노갈락탄, 글리세롤, 폴리비닐피롤리돈 (PVP), 덱스트로스, 덱스트란, 트레할로스, 수크로스, 라피노스, 하이드록시에틸 전분 (HES), 프로필렌 글리콜, 인간 혈청 알부민 (HSA) 및 디메틸설폭사이드 (DMSO)로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 동결보호제를 포함한다. 일부 실시양태에서, 약학적으로 허용가능한 완충액은 중성 완충 식염수 또는 포스페이트 완충된 식염수이다. 일부 실시양태에서, 본원에서 제공된 약학 조성물은 CryoStor® CSB, Plasma-Lyte-A™, HSA, DMSO 및 트레할로스 중 하나 이상을 포함한다.
CryoStor®는 아폽토시스를 최소화하고, 허혈/재관류 손상을 최소화하고, 가장 많은 수의 생존가능한 기능적 세포의 해동-후 회복을 최대화하기 위해 삼투/항종양제, 자유 라디칼 스캐빈저 및 에너지원을 함유하는 세포내-유사 최적화된 용액이다. CryoStor®는 혈청 및 단백질이 없으며 비-면역원성이다. CryoStor®는 USPgrade 이상의 원료로부터 cGMP-제조된다. CryoStor®는 0%, 2%, 5% 또는 10% DMSO로 미리-제형화된 용액의 패밀리이다. CryoStor® CSB는 DMSO가 없는 CryoStor®의 버전이다. 일부 실시양태에서, 약학 조성물은 약 0-100%, 5-95%, 10-90%, 15-85%, 20-80%, 30-80%, 40-80%, 50-80%, 60-80%, 70-80%, 25-75%, 30-70%, 35-65%, 40-60%, 또는 45-55% w/w 농도의 CryoStor® CSB의 염기 용액을 포함한다. 일부 실시양태에서, 약학 조성물은 약 0%, 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 100% w/w의 농도에서 CryoStor® CSB의 염기 용액을 포함한다.
PlasmaLyte-A™는 비-중합체성 혈장 확장제이며, 배양 배지에서 발견되는 것들과 유사한 필수 염 및 영양소를 함유하지만, 인간 주입용으로 승인되지 않은 조직 배양 배지에서 발견되는 추가적인 구성성분, 예컨대, 페놀 레드를 함유하지 않거나, U.S.P. 등급에서 이용가능하지 않다. PlasmaLyte-A™은 약 140 mEq/리터의 소듐 (Na), 약 5 mEq/리터의 포타슘 (K), 약 3 mEq/리터의 마그네슘 (Mg), 약 98 mEq/리터의 클로라이드 (Cl), 약 27 mEq/리터의 아세테이트, 및 약 23 mEq/리터의 글루코네이트를 함유한다. (PlasmaLyte-A™는 Baxter, Hyland Division, Glendale Calif., 제품 번호 2B2543으로부터 상업적으로 이용가능함). 일부 실시양태에서, 약학 조성물은 약 0-100%, 5-95%, 10-90%, 15-85%, 15-80%, 15-75%, 15-70%, 15-65%, 15-60%, 15-55%, 15-50%, 15-45%, 15-40%, 15-35%, 15-30%, 15-25%, 20-80%, 20-75%, 20-70%, 20-65%, 20-60%, 20-55%, 20-50%, 20-45%, 20-40%, 20-35%, 20-30%, 25-75%, 30-70%, 35-65%, 40-60%, 또는 45-55% w/w 농도의 PlasmaLyte-A™의 염기 용액을 포함한다. 일부 실시양태에서, 약학 조성물은 약 0%, 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 100% w/w 농도의 PlasmaLyte-A™의 기본 용액을 포함한다.
일부 실시양태에서, 약학 조성물은 약 0-10%, 0.3-9.3%, 0.3-8.3%, 0.3-7.3%, 0.3-6.3%, 0.3-5.3%, 0.3-4.3%, 0.3-3.3%, 0.3-2.3%, 0.3-1.3%, 0.6-8.3%, 0.9-7.3%, 1.2-6.3%, 1.5-5.3%, 1.8-4.3% 또는 2.1-3.3% w/v의 농도로 인간 혈청 알부민 (HSA)을 포함한다. 일부 실시양태에서, 약학 조성물은 약 0%, 0.3%, 0.6%, 0.9%, 1.2%, 1.5%, 1.8%, 2.1%, 2.4%, 2.7%, 3.0%, 3.3%, 3.6%, 3.9%, 4.3%, 4.6%, 4.9%, 5.3%, 5.6%, 5.9%, 6.3%, 6.6%, 6.9%, 7.3%, 7.6%, 7.9%, 8.3%, 8.6%, 8.9%, 9.3%, 9.6%, 9.9% 또는 10% w/v의 농도로 HSA를 포함한다.
일부 실시양태에서, 약학 조성물은 약 0-10%, 0.5-9.5%, 1-9%, 1.5-8.5%, 2-8%, 3-8%, 4-8%, 5-8%, 6-8%, 7-8%, 2.5-7.5%, 3-7%, 3.5-6.5%, 4-6%, 또는 4.5-5.5% v/v의 농도로 디메틸설폭사이드 (DMSO)를 포함한다. 일부 실시양태에서, 약학 조성물은 약 0%, 0.25%, 0.5%, 0.75%, 1.0%, 1.25%, 1.5%, 1.75%, 2.0%, 2.25%, 2.5%, 2.75%, 3.0%, 3.25%, 3.5%, 3.75%, 4.0%, 4.25%, 4.5%, 4.75%, 5.0%, 5.25%, 5.5%, 5.75%, 6.0%, 6.25%, 6.5%, 6.75%, 7.0%, 7.25%, 7.5%, 7.75%, 8.0%, 8.25%, 8.5%, 8.75%, 9.0%, 9.25%, 9.5%, 9.75%, 또는 10.0% v/v의 농도로 HSA를 포함한다.
일부 실시양태에서, 약학 조성물은 약 0-500 mM, 50-450 mM, 100-400 mM, 150-350 mM, 또는 200-300 mM의 농도로 트레할로스를 포함한다. 일부 실시양태에서, 약학 조성물은 약 0 mM, 10 mM, 20 mM, 30 mM, 40 mM, 50 mM, 60 mM, 70 mM, 80 mM, 90 mM, 100 mM, 125 mM, 150 mM, 175 mM, 200 mM, 225 mM, 250 mM, 275 mM, 300 mM, 325 mM, 350 mM, 375 mM, 400 mM, 425 mM, 450 mM, 475 mM 또는 500 mM의 농도로 트레할로스를 포함한다.
예시적인 약학 조성물 성분은 표 20에 도시되어 있다.
표 20. 예시적인 약학 조성물 구성요소.
* PlasmaLyte 외에 추가적인 HSA.
일부 실시양태에서, 약학 조성물은 본원에 기재된 저면역원성 세포, 및 31.25% (v/v) Plasma-Lyte A, 31.25% (v/v)의 5% 덱스트로스/0.45% 소듐 클로라이드, 10% 덱스트란 40 (LMD)/5% 덱스트로스, 20% (v/v)의 25% 인간 혈청 알부민 (HSA) 및 7.5% (v/v) 디메틸설폭사이드 (DMSO)를 포함하는 약학적으로 허용가능한 담체를 포함한다.
X. 제형 및 투여량 양생법
본원에 기재된 임의의 치료적 유효량의 세포는 치료될 적응증에 따라, 약학 조성물에 포함될 수 있다. 세포의 비-제한적인 예는 일차 T 세포, 저면역원성 유도 만능 줄기 세포로부터 분화된 T 세포, 및 본원에 기재된 저면역원성 유도 만능 줄기 세포로부터 분화된 기타 세포를 포함한다. 일부 실시양태에서, 약학 조성물은 약 1 x 102, 5 x 102, 1 x 103, 5 x 103, 1 x 104, 5 x 104, 1 x 105, 5 x 105, 1 x 106, 5 x 106, 1 x 107, 5 x 107, 1 x 108, 5 x 108, 1 x 109, 5 x 109, 1 x 1010 또는 5 x 1010 개 이상의 세포를 포함한다. 일부 실시양태에서, 약학 조성물은 최대 약 1 x 102, 5 x 102, 1 x 103, 5 x 103, 1 x 104, 5 x 104, 1 x 105, 5 x 105, 1 x 106, 5 x 106, 1 x 107, 5 x 107, 1 x 108, 5 x 108, 1 x 109, 5 x 109, 1 x 1010 또는 5 x 1010 개의 세포를 포함한다. 일부 실시양태에서, 약학 조성물은 최대 약 6.0 x 108 개의 세포를 포함한다. 일부 실시양태에서, 약학 조성물은 최대 약 8.0 x 108 개의 세포를 포함한다. 일부 실시양태에서, 약학 조성물은 약 1 x 102-5 x 102, 5 x 102-1 x 103, 1 x 103-5 x 103, 5 x 103-1 x 104, 1 x 104-5 x 104, 5 x 104-1 x 105, 1 x 105-5 x 105, 5 x 105-1 x 106, 1 x 106-5 x 106, 5 x 106-1 x 107, 1 x 107-5 x 107, 5 x 107-1 x 108, 1 x 108-5 x 108, 5 x 108-1 x 109, 1 x 109-5 x 109, 5 x 109-1 x 1010 또는 1 x 1010 - 5 x 1010 개 이상의 세포를 포함한다. 예시적인 실시양태에서, 약학 조성물은 약 1.0 x 106 내지 약 2.5 x 108 개의 세포를 포함한다. 특정 실시양태에서, 약학 조성물은 약 2.0 x 106 내지 약 2.0 x 108 개의 세포, 예컨대, 비제한적으로 일차 T 세포, 저면역원성 유도 만능 줄기 세포로부터 분화된 T 세포를 포함한다.
일부 실시양태에서, 약학 조성물은 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 250, 300, 350, 400 또는 500 ml 이상의 부피를 갖는다. 예시적인 실시양태에서, 약학 조성물은 최대 약 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 250, 300, 350, 400 또는 500 ml의 부피를 갖는다. 예시적인 실시양태에서, 약학 조성물은 약 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 250, 300, 350, 400 또는 500 ml의 부피를 갖는다. 일부 실시양태에서, 약학 조성물은 약 1-50 ml, 50-100 ml, 100-150 ml, 150-200 ml, 200-250 ml, 250-300 ml, 300-350 ml, 350-400 ml, 400-450 ml 또는 450-500 ml의 부피를 갖는다. 일부 실시양태에서, 약학 조성물은 약 1-50 ml, 50-100 ml, 100-150 ml, 150-200 ml, 200-250 ml, 250-300 ml, 300-350 ml, 350-400 ml, 400-450 ml 또는 450-500 ml의 부피를 갖는다. 일부 실시양태에서, 약학 조성물은 약 1-10 ml, 10-20 ml, 20-30 ml, 30-40 ml, 40-50 ml, 50-60 ml, 60-70 ml, 70-80 ml, 70-80 ml, 80-90 ml 또는 90-100 ml의 부피를 갖는다. 일부 실시양태에서, 약학 조성물은 약 5 ml 내지 약 80 ml의 범위인 부피를 갖는다. 예시적인 실시양태에서, 약학 조성물은 약 10 ml 내지 약 70 ml의 범위인 부피를 갖는다. 특정 실시양태에서, 약학 조성물은 약 10 ml 내지 약 50 ml의 범위인 부피를 갖는다.
구체적인 양/투여량 양생법은 개체의 체중, 성별, 연령 및 건강; 제형, 생화학적 성질, 생체활성, 생체이용률 및 세포의 부작용 및 완전한 치료적 양생법에서 세포의 수 및 아이덴티티에 따라 달라질 것이다.
일부 실시양태에서, 약학 조성물의 치료적 유효 용량 또는 임상적 유효 용량은 약 10 ml 내지 50 ml의 부피에서 약 1.0 x 105 내지 약 2.5 x 108 개의 세포를 포함하고, 약학 조성물은 단일 치료적 유효 용량 또는 임상적 유효 용량으로서 투여된다. 일부 경우에, 치료적 유효 용량 또는 임상적 유효 용량은 약 10 ml 내지 50 ml의 부피로 본원에 기재된 약 1.0 x 105 내지 약 2.5 x 108 개의 일차 T 세포를 포함한다. 일부 경우에, 치료적 유효 용량 또는 임상적 유효 용량은 약 10 ml 내지 50 ml의 부피로 위에 기재된 약 1.0 x 105 내지 약 2.5 x 108 개의 일차 T 세포를 포함한다. 다양한 경우에, 치료적 유효 용량 또는 임상적 유효 용량은 약 10 ml 내지 50 ml의 부피로 본원에 기재된 저면역원성 유도 만능 줄기 세포로부터 분화된 약 1.0 x 105 내지 약 2.5 x 108 개의 T 세포를 포함한다. 일부 실시양태에서, 치료적 유효 용량 또는 임상적 유효 용량은 약 10 ml 내지 50 ml의 부피로 1.0 x 105, 1.1 x 105, 1.2 x 105, 1.3 x 105, 1.4 x 105, 1.5 x 105, 1.6 x 105, 1.7 x 105, 1.8 x 105, 1.9 x 105, 2.0 x 105, 2.1 x 105, 2.2 x 105, 2.3 x 105, 2.4 x 105, 2.5 x 105, 1.0 x 106, 1.1 x 106, 1.2 x 106, 1.3 x 106, 1.4 x 106, 1.5 x 106, 1.6 x 106, 1.7 x 106, 1.8 x 106, 1.9 x 106, 2.0 x 106, 2.1 x 106, 2.2 x 106, 2.3 x 106, 2.4 x 106, 2.5 x 106, 1.0 x 107, 1.1 x 107, 1.2 x 107, 1.3 x 107, 1.4 x 107, 1.5 x 107, 1.6 x 107, 1.7 x 107, 1.8 x 107, 1.9 x 107, 2.0 x 107, 2.1 x 107, 2.2 x 107, 2.3 x 107, 2.4 x 107, 2.5 x 107, 1.0 x 108, 1.1 x 108, 1.2 x 108, 1.3 x 108, 1.4 x 108, 1.5 x 108, 1.6 x 108, 1.7 x 108, 1.8 x 108, 1.9 x 108, 2.0 x 108, 2.1 x 108, 2.2 x 108, 2.3 x 108, 2.4 x 108, 또는 2.5 x 108 개의 본원에 기재된 저면역원성 유도 만능 줄기 세포로부터 분화된 T 세포이다. 다른 경우에, 치료적 유효 용량 또는 임상적 유효 용량은 약 1.0 x 105 미만 내지 약 2.5 x 108 개 범위의, 저면역원성 유도 만능 줄기 세포로부터 분화된 T 세포 또는 일차 T 세포를 포함하는 T 세포이다. 또 다른 경우에, 치료적 유효 용량 또는 임상적 유효 용량은 약 1.0 x 105 초과 내지 약 2.5 x 108 개 범위의 저면역원성 유도 만능 줄기 세포로부터 분화된 T 세포 및 일차 T 세포를 포함하는 T 세포이다.
일부 실시양태에서, 약학 조성물은 50 kg 이하의 대상체에 대한 체중 kg당 약 1.0 x 105 내지 약 1.0 x 107 개의 세포 (예컨대, 일차 T 세포 및 저면역원성 유도 만능 줄기 세포로부터 분화된 T 세포)의 단일 치료적 유효 용량 또는 임상적 유효 용량으로서 투여된다. 일부 실시양태에서, 약학 조성물은 50 kg 이하의 대상체에 대한 체중 kg당 약 0.5 x 105 내지 약 1.0 x 107, 약 1.0 x 105 내지 약 1.0 x 107, 약 1.0 x 105 내지 약 1.0 x 107, 약 5.0 x 105 내지 약 1 x 107, 약 1.0 x 106 내지 약 1 x 107, 약 5.0 x 106 내지 약 1.0 x 107, 약 1.0 x 105 내지 약 5.0 x 106, 약 1.0 x 105 내지 약 1.0 x 106, 약 1.0 x 105 내지 약 5.0 x 105, 약 1.0 x 105 내지 약 5.0 x 106, 약 2.0 x 105 내지 약 5.0 x 106, 약 3.0 x 105 내지 약 5.0 x 106, 약 4.0 x 105 내지 약 5.0 x 106, 약 5.0 x 105 내지 약 5.0 x 106, 약 6.0 x 105 내지 약 5.0 x 106, 약 7.0 x 105 내지 약 5.0 x 106, 약 8.0 x 105 내지 약 5.0 x 106, 또는 약 9.0 x 105 내지 약 5.0 x 106 개의 세포의 단일 치료적 유효 용량 또는 임상적 유효 용량으로서 투여된다. 일부 실시양태에서, 치료적 유효 용량 또는 임상적 유효 용량은 50 kg 이하의 대상체에 대한 체중 kg당 0.5 x 105, 0.6 x 105, 0.7 x 105, 0.8 x 105, 0.9 x 105, 1.0 x 105, 1.1 x 105, 1.2 x 105, 1.3 x 105, 1.4 x 105, 1.5 x 105, 1.6 x 105, 1.7 x 105, 1.8 x 105, 1.9 x 105, 2.0 x 105, 2.1 x 105, 2.2 x 105, 2.3 x 105, 2.4 x 105, 2.5 x 105, 2.6 x 105, 2.7 x 105, 2.8 x 105, 2.9 x 105, 3.0 x 105, 3.1 x 105, 3.2 x 105, 3.3 x 105, 3.4 x 105, 3.5 x 105, 3.6 x 105, 3.7 x 105, 3.8 x 105, 3.9 x 105, 4.0 x 105, 4.1 x 105, 4.2 x 105, 4.3 x 105, 4.4 x 105, 4.5 x 105, 4.6 x 105, 4.7 x 105, 4.8 x 105, 4.9 x 105, 5.0 x 105, 0.5 x 106, 0.6 x 106, 0.7 x 106, 0.8 x 106, 0.9 x 106, 1.0 x 106, 1.1 x 106, 1.2 x 106, 1.3 x 106, 1.4 x 106, 1.5 x 106, 1.6 x 106, 1.7 x 106, 1.8 x 106, 1.9 x 106, 2.0 x 106, 2.1 x 106, 2.2 x 106, 2.3 x 106, 2.4 x 106, 2.5 x 106, 2.6 x 106, 2.7 x 106, 2.8 x 106, 2.9 x 106, 3.0 x 106, 3.1 x 106, 3.2 x 106, 3.3 x 106, 3.4 x 106, 3.5 x 106, 3.6 x 106, 3.7 x 106, 3.8 x 106, 3.9 x 106, 4.0 x 106, 4.1 x 106, 4.2 x 106, 4.3 x 106, 4.4 x 106, 4.5 x 106, 4.6 x 106, 4.7 x 106, 4.8 x 106, 4.9 x 106, 5.0 x 106, 5.1 x 106, 5.2 x 106, 5.3 x 106, 5.4 x 106, 5.5 x 106, 5.6 x 106, 5.7 x 106, 5.8 x 106, 5.9 x 106, 6.0 x 106, 6.1 x 106, 6.2 x 106, 6.3 x 106, 6.4 x 106, 6.5 x 106, 6.6 x 106, 6.7 x 106, 6.8 x 106, 6.9 x 106, 7.0 x 106, 7.1 x 106, 7.2 x 106, 7.3 x 106, 7.4 x 106, 7.5 x 106, 7.6 x 106, 7.7 x 106, 7.8 x 106, 7.9 x 106, 8.0 x 106, 8.1 x 106, 8.2 x 106, 8.3 x 106, 8.4 x 106, 8.5 x 106, 8.6 x 106, 8.7 x 106, 8.8 x 106, 8.9 x 106, 9.0 x 106, 9.1 x 106, 9.2 x 106, 9.3 x 106, 9.4 x 106, 9.5 x 106, 9.6 x 106, 9.7 x 106, 9.8 x 106, 9.9 x 106, 0.5 x 107, 0.6 x 107, 0.7 x 107, 0.8 x 107, 0.9 x 107, 또는 1.0 x 107 개의 세포이다. 일부 실시양태에서, 치료적 유효 용량 또는 임상적 유효 용량은 50 kg 이하의 대상체에 대한 체중 kg당 약 0.2 x 106 내지 약 5.0 x 106 개의 세포이다. 특정 실시양태에서, 치료적 유효량 또는 임상적 유효량은 50 kg 이하의 대상체에 대한 체중 kg당 약 0.2 x 106 미만 내지 약 5.0 x 106 개의 세포 범위이다. 또는 임상적 유효 용량 예시적인 실시양태에서, 단일 치료적 유효 용량 또는 임상적 유효 용량은 약 10 ml 내지 50 ml의 부피이다. 일부 실시양태에서, 치료적 유효 용량 또는 임상적 유효 용량은 정맥내로 투여된다.
예시적인 실시양태에서, 세포는 50 kg 초과의 대상체에 대해 약 1.0 x 106 내지 약 5.0 x 108 개의 세포 (예컨대, 일차 T 세포 및 저면역원성 유도 만능 줄기 세포로부터 분화된 T 세포)의 단일 치료적 유효 용량으로 투여된다. 일부 실시양태에서, 약학 조성물은 50 kg 이하의 대상체에 대해 체중 kg당 약 0.5 x 106 내지 약 1.0 x 109, 약 1.0 x 106 내지 약 1.0 x 109, 약 1.0 x 106 내지 약 1.0 x 109, 약 5.0 x 106 내지 약 1.0 x 109, 약 1.0 x 107 내지 약 1.0 x 109, 약 5.0 x 107 내지 약 1.0 x 109, 약 1.0 x 106 내지 약 5.0 x 107, 약 1.0 x 106 내지 약 1.0 x 107, 약 1.0 x 106 내지 약 5.0 x 107, 약 1.0 x 107 내지 약 5.0 x 108, 약 2.0 x 107 내지 약 5.0 x 108, 약 3.0 x 107 내지 약 5.0 x 108, 약 4.0 x 107 내지 약 5.0 x 108, 약 5.0 x 107 내지 약 5.0 x 108, 약 6.0 x 107 내지 약 5.0 x 108, 약 7.0 x 107 내지 약 5.0 x 108, 약 8.0 x 107 내지 약 5.0 x 108, 또는 약 9.0 x 107 내지 약 5.0 x 108 개의 세포의 단일 치료적 유효 용량 또는 임상적 유효 용량으로서 투여된다. 일부 실시양태에서, 치료적 유효 용량 또는 임상적 유효 용량은 50 kg 이하의 대상체에 대해 체중 kg당 1.0 x 106, 1.1 x 106, 1.2 x 106, 1.3 x 106, 1.4 x 106, 1.5 x 106, 1.6 x 106, 1.7 x 106, 1.8 x 106, 1.9 x 106, 2.0 x 106, 2.1 x 106, 2.2 x 106, 2.3 x 106, 2.4 x 106, 2.5 x 106, 2.6 x 106, 2.7 x 106, 2.8 x 106, 2.9 x 106, 3.0 x 106, 3.1 x 106, 3.2 x 106, 3.3 x 106, 3.4 x 106, 3.5 x 106, 3.6 x 106, 3.7 x 106, 3.8 x 106, 3.9 x 106, 4.0 x 106, 4.1 x 106, 4.2 x 106, 4.3 x 106, 4.4 x 106, 4.5 x 106, 4.6 x 106, 4.7 x 106, 4.8 x 106, 4.9 x 106, 5.0 x 106, 5.1 x 106, 5.2 x 106, 5.3 x 106, 5.4 x 106, 5.5 x 106, 5.6 x 106, 5.7 x 106, 5.8 x 106, 5.9 x 106, 6.0 x 106, 6.1 x 106, 6.2 x 106, 6.3 x 106, 6.4 x 106, 6.5 x 106, 6.6 x 106, 6.7 x 106, 6.8 x 106, 6.9 x 106, 7.0 x 106, 7.1 x 106, 7.2 x 106, 7.3 x 106, 7.4 x 106, 7.5 x 106, 7.6 x 106, 7.7 x 106, 7.8 x 106, 7.9 x 106, 8.0 x 106, 8.1 x 106, 8.2 x 106, 8.3 x 106, 8.4 x 106, 8.5 x 106, 8.6 x 106, 8.7 x 106, 8.8 x 106, 8.9 x 106, 9.0 x 106, 9.1 x 106, 9.2 x 106, 9.3 x 106, 9.4 x 106, 9.5 x 106, 9.6 x 106, 9.7 x 106, 9.8 x 106, 9.9 x 106, 1.0 x 107, 1.1 x 107, 1.2 x 107, 1.3 x 107, 1.4 x 107, 1.5 x 107, 1.6 x 107, 1.7 x 107, 1.8 x 107, 1.9 x 107, 2.0 x 107, 2.1 x 107, 2.2 x 107, 2.3 x 107, 2.4 x 107, 2.5 x 107, 2.6 x 107, 2.7 x 107, 2.8 x 107, 2.9 x 107, 3.0 x 107, 3.1 x 107, 3.2 x 107, 3.3 x 107, 3.4 x 107, 3.5 x 107, 3.6 x 107, 3.7 x 107, 3.8 x 107, 3.9 x 107, 4.0 x 107, 4.1 x 107, 4.2 x 107, 4.3 x 107, 4.4 x 107, 4.5 x 107, 4.6 x 107, 4.7 x 107, 4.8 x 107, 4.9 x 107, 5.0 x 107, 5.1 x 107, 5.2 x 107, 5.3 x 107, 5.4 x 107, 5.5 x 107, 5.6 x 107, 5.7 x 107, 5.8 x 107, 5.9 x 107, 6.0 x 107, 6.1 x 107, 6.2 x 107, 6.3 x 107, 6.4 x 107, 6.5 x 107, 6.6 x 107, 6.7 x 107, 6.8 x 107, 6.9 x 107, 7.0 x 107, 7.1 x 107, 7.2 x 107, 7.3 x 107, 7.4 x 107, 7.5 x 107, 7.6 x 107, 7.7 x 107, 7.8 x 107, 7.9 x 107, 8.0 x 107, 8.1 x 107, 8.2 x 107, 8.3 x 107, 8.4 x 107, 8.5 x 107, 8.6 x 107, 8.7 x 107, 8.8 x 107, 8.9 x 107, 9.0 x 107, 9.1 x 107, 9.2 x 107, 9.3 x 107, 9.4 x 107, 9.5 x 107, 9.6 x 107, 9.7 x 107, 9.8 x 107, 9.9 x 107, 1.0 x 108, 1.1 x 108, 1.2 x 108, 1.3 x 108, 1.4 x 108, 1.5 x 108, 1.6 x 108, 1.7 x 108, 1.8 x 108, 1.9 x 108, 2.0 x 108, 2.1 x 108, 2.2 x 108, 2.3 x 108, 2.4 x 108, 2.5 x 108, 2.6 x 108, 2.7 x 108, 2.8 x 108, 2.9 x 108, 3.0 x 108, 3.1 x 108, 3.2 x 108, 3.3 x 108, 3.4 x 108, 3.5 x 108, 3.6 x 108, 3.7 x 108, 3.8 x 108, 3.9 x 108, 4.0 x 108, 4.1 x 108, 4.2 x 108, 4.3 x 108, 4.4 x 108, 4.5 x 108, 4.6 x 108, 4.7 x 108, 4.8 x 108, 4.9 x 108, 또는 5.0 x 108 개의 세포이다. 특정 실시양태에서, 세포는 50 kg 초과의 대상체에 대해 약 1.0 x 107 내지 약 2.5 x 108 개의 세포의 단일 치료적 유효 용량 또는 임상적 유효 용량으로 투여된다. 일부 실시양태에서, 세포는 50 kg 초과의 대상체에 대해 약 1.0 x 107 개 미만 내지 약 2.5 x 108 개의 세포 범위의 단일 치료적 유효 용량 또는 임상적 유효 용량으로 투여된다. 일부 실시양태에서, 세포는 50 kg 초과의 대상체에 대해 약 1.0 x 107 개 초과 내지 약 2.5 x 108 개의 세포 범위의 단일 치료적 유효 용량 또는 임상적 유효 용량으로 투여된다. 일부 실시양태에서, 용량은 정맥내로 투여된다. 예시적인 실시양태에서, 단일 치료적 유효 용량 또는 임상적 유효 용량은 약 10 ml 내지 50 ml의 부피이다. 일부 실시양태에서, 치료적 유효 용량 또는 임상적 유효 용량은 정맥내로 투여된다.
예시적인 실시양태에서, 치료적 유효 용량 또는 임상적 유효 용량은 분당 약 1 내지 50 ml, 분당 1 내지 40 ml, 분당 1 내지 30 ml, 분당 1 내지 20 ml, 분당 10 내지 20 ml, 분당 10 내지 30 ml, 분당 10 내지 40 ml, 분당 10 내지 50 ml, 분당 20 내지 50 ml, 분당 30 내지 50 ml, 분당 40 내지 50 ml의 속도로 정맥내 투여된다. 다수의 실시양태에서, 약학 조성물은 정맥내 투여를 위해 하나 이상의 주입 백에 저장된다. 일부 실시양태에서, 용량은 10 분, 15 분, 20 분, 25 분, 30 분, 35 분, 40 분, 45 분, 50 분, 55 분, 60 분, 70 분, 80 분, 90 분, 120 분, 150 분, 180 분, 240 분 또는 300 분 이하에 완전히 투여된다.
일부 실시양태에서, 약학 조성물의 단일 치료적 유효 용량 또는 임상적 유효 용량이 단일 주입 백에 존재한다. 다른 실시양태에서, 약학 조성물의 단일 치료적 유효 용량 또는 임상적 유효 용량은 2, 3, 4 또는 5 개의 개별 주입 백으로 분할된다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 세포는 2, 3, 4, 5 또는 6 회 이상의 용량과 같은 복수의 용량으로 투여되며, 여기서 복수의 용량은 함께 치료적 유효 용량 또는 임상적 유효 용량 양생법을 구성한다. 일부 실시양태에서, 복수의 용량의 각각의 용량은 1 내지 24 시간 간격 범위로 대상체에 투여된다. 일부 경우에, 후속적 용량은 초기 또는 선행 용량 후에 약 1 시간 내지 약 24 시간 (예컨대, 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23 또는 약 24 시간) 투여된다. 일부 실시양태에서, 복수의 용량 중 각각의 용량은 약 1 일 내지 28 일 간격 범위로 대상체에 투여된다. 일부 경우에, 후속적 용량은 초기 또는 선행 용량 후에 약 1 일 내지 약 28 일 (예컨대, 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 또는 약 28 일)에 투여된다. 특정 실시양태에서, 복수의 용량 중 각각의 용량은 1 주 내지 약 6 주 간격 범위로 대상체에 투여된다. 특정 경우에, 후속적 용량은 초기 또는 선행 용량 후에 약 1 주 내지 약 6 주 (예컨대, 약 1, 2, 3, 4, 5 또는 6 주)에 투여된다. 몇몇 실시양태에서, 복수의 용량 중 각각의 용량은 약 1 개월 내지 약 12 개월 간격 범위로 대상체에 투여된다. 여러 경우에, 후속적 용량은 초기 또는 선행 용량 후에 약 1 개월 내지 약 12 개월 (예컨대, 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 또는 12 개월)에 투여된다.
일부 실시양태에서, 대상체에 제1 시점에서 제1 투여량 양생법을 투여한 다음, 후속적으로 제2 시점에서 제2 투여량 양생법을 투여한다. 일부 실시양태에서, 제1 투여량 양생법은 제2 투여량 양생법과 동일하다. 다른 실시양태에서, 제1 투여량 양생법은 제2 투여량 양생법과 상이하다. 일부 경우에, 제1 투여량 양생법 및 제2 투여량 양생법에서의 세포의 수는 동일하다. 일부 경우에, 제1 투여량 양생법 및 제2 투여량 양생법에서의 세포의 수가 상이하다. 일부 경우에, 제1 투여량 양생법 및 제2 투여량 양생법의 투약의 횟수가 동일하다. 일부 경우에, 제1 투여량 양생법 및 제2 투여량 양생법의 투약의 횟수가 상이하다.
일부 실시양태에서, 제1 투여량 양생법은 제1 CAR을 발현하는 저면역 (HIP) T 세포 또는 일차 T 세포를 포함하고, 제2 투여량 양생법은 제1 CAR 및 제2 CAR이 상이하도록 제2 CAR을 발현하는 저면역 (HIP) T 세포 또는 일차 T 세포를 포함한다. 예를 들어, 제1 CAR 및 제2 CAR은 상이한 표적 항원에 결합한다. 일부 경우에, 제1 CAR은 항원에 결합하는 scFv를 포함하고, 제2 CAR은 상이한 항원에 결합하는 scFv를 포함한다. 일부 실시양태에서, 제1 투여량 양생법은 제1 CAR을 발현하는 저면역 (HIP) T 세포 또는 일차 T 세포를 포함하고, 제2 투여량 양생법은 제1 CAR 및 제2 CAR이 동일하도록 제2 CAR을 발현하는 저면역 (HIP) T 세포 또는 일차 T 세포를 포함한다. 제1 투여량 양생법은 제2 투여량 양생법으로부터 적어도 1 개월, 2 개월, 3 개월, 4 개월, 5 개월, 6 개월, 7 개월, 8 개월, 9 개월, 10 개월, 11 개월, 12 개월, 1-3 개월, 1-6 개월, 4-6 개월, 3-9 개월, 3-12 개월, 또는 그 초과 개월 간격으로 대상체에 투여될 수 있다. 일부 실시양태에서, 대상체에 질환 (예컨대, 암)의 과정 동안 복수의 투여량 양생법을 투여하고, 투여량 양생법 중 2 개 이상은 본원에 기재된 동일한 유형의 저면역 (HIP) T 세포 또는 일차 T 세포를 포함한다. 다른 실시양태에서, 복수의 투여량 양생법 중 2 개 이상은 본원에 기재된 상이한 유형의 저면역 (HIP) T 세포 또는 일차 T 세포를 포함한다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 CD19 특이적 (CD19) CAR-T 세포는 약 50 x 106 내지 약 110 x 106 (예컨대, 50 x 106, 51 x 106, 52 x 106, 53 x 106, 54 x 106, 55 x 106, 56 x 106, 57 x 106, 58 x 106, 59 x 106, 60 x 106, 61 x 106, 62 x 106, 63 x 106, 64 x 106, 65 x 106, 66 x 106, 67 x 106, 68 x 106, 69 x 106, 70 x 106, 71 x 106, 72 x 106, 73 x 106, 74 x 106, 75 x 106, 76 x 106, 77 x 106, 78 x 106, 79 x 106, 80 x 106, 81 x 106, 82 x 106, 83 x 106, 84 x 106, 85 x 106, 86 x 106, 87 x 106, 88 x 106, 89 x 106, 90 x 106, 91 x 106, 92 x 106, 93 x 106, 94 x 106, 95 x 106, 96 x 106, 97 x 106, 98 x 106, 99 x 106, 100 x 106, 101 x 106, 102 x 106, 103 x 106, 104 x 106, 105 x 106, 106 x 106, 107 x 106, 108 x 106, 109 x 106, 또는 110 x 106)의 용량의 생존가능한 CD19 특이적 CAR-T 세포가 대상체에 투여된다. 일부 실시양태에서, 용량은 생존가능한 CD19 특이적 CAR-T 세포의 치료적 유효량이다. 다른 실시양태에서, 용량은 생존가능한 CD19 특이적 CAR-T 세포의 임상적 유효량이다. 일부 실시양태에서, 생존가능한 CD19 특이적 CAR-T 세포는 CD19 특이적 CAR 발현 CD4+ T 세포 및 CD19 특이적 CAR 발현 CD8+ T 세포를 약 1:1의ㅣ 비로 포함한다. 일부 실시양태에서, 세포의 CD19 특이적 CAR은 리소카브타진 마라류셀 (BREYANZI®), 이의 구조적 등가물 또는 이의 기능적 등가물이다.
일부 실시양태에서, 대상체에 약 50 x 106 내지 약 110 x 106 (예컨대, 50 x 106, 51 x 106, 52 x 106, 53 x 106, 54 x 106, 55 x 106, 56 x 106, 57 x 106, 58 x 106, 59 x 106, 60 x 106, 61 x 106, 62 x 106, 63 x 106, 64 x 106, 65 x 106, 66 x 106, 67 x 106, 68 x 106, 69 x 106, 70 x 106, 71 x 106, 72 x 106, 73 x 106, 74 x 106, 75 x 106, 76 x 106, 77 x 106, 78 x 106, 79 x 106, 80 x 106, 81 x 106, 82 x 106, 83 x 106, 84 x 106, 85 x 106, 86 x 106, 87 x 106, 88 x 106, 89 x 106, 90 x 106, 91 x 106, 92 x 106, 93 x 106, 94 x 106, 95 x 106, 96 x 106, 97 x 106, 98 x 106, 99 x 106, 100 x 106, 101 x 106, 102 x 106, 103 x 106, 104 x 106, 105 x 106, 106 x 106, 107 x 106, 108 x 106, 109 x 106, 또는 110 x 106) 개의 본원에 기재된 생존가능한 CD19 특이적 CAR-T 세포가 투여된다. 일부 실시양태에서, 용량은 생존 가능한 CD19 특이적 CAR-T 세포의 치료적 유효량이다. 다른 실시양태에서, 용량은 생존가능한 CD19 특이적 CAR-T 세포의 임상적 유효량이다. 일부 경우에, 생존가능한 CD19 특이적 CAR-T 세포의 50%는 CD19 특이적 CAR 발현 CD4+ T 세포이고, CD19 특이적 CAR-T 세포의 50%는 CD19 특이적 CAR 발현 CD8+ T 세포이다. 일부 실시양태에서, 세포의 CD19 특이적 CAR은 리소카브타진 마라류셀 (BREYANZI®), 이의 구조적 등가물 또는 이의 기능적 등가물이다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 CD19 특이적 CAR-T 세포는 체중 kg당 약 2 x 106 개의 용량으로 대상체에 투여된다. 일부 실시양태에서, 투여되는 최대 용량은 약 2 x 108 개의 생존가능한 CD19 특이적 CAR-T 세포이다. 일부 실시양태에서, 용량은 생존가능한 CD19 특이적 CAR-T 세포의 치료적 유효량이다. 다른 실시양태에서, 용량은 생존가능한 CD19 특이적 CAR-T 세포의 임상적 유효량이다. 일부 실시양태에서, 세포의 CD19 특이적 CAR은 악시카브타진 실로류셀 (YESCARTA®), 이의 구조적 등가물 또는 이의 기능적 등가물과 동일한 CD19 특이적 CAR이다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 CD19 특이적 CAR-T 세포는 체중 kg당 약 2 x 106 개의 용량으로 대상체에 투여된다. 일부 실시양태에서, 약 2 x 108 개의 생존가능한 CD19 특이적 CAR-T 세포의 최대 용량이 체중 약 100 kg 이상의 환자에 투여된다. 일부 실시양태에서, 용량은 생존가능한 CD19 특이적 CAR-T 세포의 치료적 유효량이다. 다른 실시양태에서, 용량은 생존가능한 CD19 특이적 CAR-T 세포의 임상적 유효량이다. 일부 실시양태에서, 세포의 CD19 특이적 CAR은 브렉수카브타진 오토류셀 (TECARTUS®), 이의 구조적 등가물 또는 이의 기능적 등가물과 동일한 CD19 특이적 CAR이다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 CD19 특이적 CAR-T 세포는 최대 약 2 x 108 개의 생존가능한 CD19 특이적 CAR-T 세포의 용량으로 대상체에 투여된다. 일부 실시양태에서, 대상체에 약 50 kg 이하의 체중을 갖는 대상체에 대해 체중 kg당 약 0.2 x 106 내지 약 5.0 x 106 (예컨대, 약 0.2 x 106, 0.4 x 106, 0.5 x 106, 0.6 x 106, 0.8 x 106, 0.9 x 106, 1.0 x 106, 1.2 x 106, 1.4 x 106, 1.5 x 106, 1.6 x 106, 1.8 x 106, 1.9 x 106, 2.0 x 106, 2.2 x 106, 2.4 x 106, 2.5 x 106, 2.6 x 106, 2.8 x 106, 2.9 x 106, 3.0 x 106, 3.2 x 106, 3.4 x 106, 3.5 x 106, 3.6 x 106, 3.8 x 106, 3.9 x 106, 4.0 x 106, 4.2 x 106, 4.4 x 106, 4.5 x 106, 4.6 x 106, 4.8 x 106, 4.9 x 106, 또는 5.0 x 106) 개의 생존가능한 CD19 특이적 CAR-T 세포가 투여된다. 일부 실시양태에서, 대상체에 약 50 kg 초과의 체중을 갖는 대상체에 대해 약 0.1 x 108 내지 약 2.5 x 108 (예컨대, 약 0.1 x 106, 0.2 x 106, 0.4 x 106, 0.5 x 106, 0.6 x 106, 0.8 x 106, 0.9 x 106, 1.0 x 106, 1.2 x 106, 1.4 x 106, 1.5 x 106, 1.6 x 106, 1.8 x 106, 1.9 x 106, 2.0 x 106, 2.2 x 106, 2.4 x 106, 또는 2.5 x 106) 개의 생존가능한 CD19 특이적 CAR-T 세포가 투여된다. 일부 실시양태에서, 대상체에 약 0.6 x 108 내지 약 6.0 x 108 (예컨대, 약 0.6 x 108, 0.8 x 108, 0.9 x 108, 1.0 x 108, 1.2 x 108, 1.4 x 108, 1.5 x 108, 1.6 x 108, 1.8 x 108, 1.9 x 108, 2.0 x 108, 2.2 x 108, 2.4 x 108, 2.5 x 108, 2.6 x 108, 2.8 x 108, 2.9 x 108, 3.0 x 108, 3.2 x 108, 3.4 x 108, 3.5 x 108, 3.6 x 108, 3.8 x 108, 3.9 x 108, 4.0 x 108, 4.2 x 108, 4.4 x 108, 4.5 x 108, 4.6 x 108, 4.8 x 108, 4.9 x 108, 5.0 x 108, 5.2 x 108, 5.4 x 108, 5.5 x 108, 5.6 x 108, 5.8 x 108, 5.9 x 108, 또는 6.0 x 108) 개의 생존가능한 CD19 특이적 CAR-T 세포가 투여된다. 일부 실시양태에서, 용량은 생존가능한 CD19 특이적 CAR-T 세포의 치료적 유효량이다. 다른 실시양태에서, 용량은 생존가능한 CD19 특이적 CAR-T 세포의 임상적 유효량이다. 일부 실시양태에서, 세포의 CD19 특이적 CAR은 티사젠렉류셀 (KYMRIAH®), 이의 구조적 등가물 또는 이의 기능적 등가물과 동일한 CD19 특이적 CAR이다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 CD19 특이적 CAR-T 세포 중 임의의 것의 단일 용량은 약 50 x 106 내지 약 110 x 106 (예컨대, 50 x 106, 51 x 106, 52 x 106, 53 x 106, 54 x 106, 55 x 106, 56 x 106, 57 x 106, 58 x 106, 59 x 106, 60 x 106, 61 x 106, 62 x 106, 63 x 106, 64 x 106, 65 x 106, 66 x 106, 67 x 106, 68 x 106, 69 x 106, 70 x 106, 71 x 106, 72 x 106, 73 x 106, 74 x 106, 75 x 106, 76 x 106, 77 x 106, 78 x 106, 79 x 106, 80 x 106, 81 x 106, 82 x 106, 83 x 106, 84 x 106, 85 x 106, 86 x 106, 87 x 106, 88 x 106, 89 x 106, 90 x 106, 91 x 106, 92 x 106, 93 x 106, 94 x 106, 95 x 106, 96 x 106, 97 x 106, 98 x 106, 99 x 106, 100 x 106, 101 x 106, 102 x 106, 103 x 106, 104 x 106, 105 x 106, 106 x 106, 107 x 106, 108 x 106, 109 x 106, 또는 110 x 106) 개의 생존가능한 CD19 특이적 CAR-T 세포를 포함한다. 일부 실시양태에서, 용량은 생존가능한 CD19 특이적 CAR-T 세포의 치료적 유효량이다. 다른 실시양태에서, 용량은 생존가능한 CD19 특이적 CAR-T 세포의 임상적 유효량이다. 일부 실시양태에서, 생존가능한 CD19 특이적 CAR-T 세포는 CD19 특이적 CAR 발현 CD4+ T 세포, 및 CD19 특이적 CAR 발현 CD8+ T 세포를 약 1:1의 비로 포함한다. 일부 실시양태에서, CD19 특이적 CAR은 리소카브타진 마라류셀 (BREYANZI®), 이의 구조적 등가물 또는 이의 기능적 등가물과 동일한 CD19 특이적 CAR이다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 CD19 특이적 CAR-T 세포 중 임의의 것의 단일 용량은 약 2 x 108 개의 생존가능한 CD19 특이적 CAR-T 세포를 포함한다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 CD19 특이적 CAR-T 세포 중 임의의 것의 단일 주입 백은 약 68 mL의 세포 현탁액에 약 2 x 108 개의 생존가능한 CD19 특이적 CAR-T 세포를 포함한다. 일부 실시양태에서, CD19 특이적 CAR은 악시카브타진 실로류셀 (YESCARTA®), 이의 구조적 등가물 또는 이의 기능적 등가물과 동일한 CD19 특이적 CAR이다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 CD19 특이적 CAR-T 세포 중 임의의 것의 단일 용량은 약 2 x 108 개의 생존가능한 CD19 특이적 CAR-T 세포를 포함한다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 CD19 특이적 CAR-T 세포 중 임의의 것의 단일 주입 백은 약 68 mL의 세포 현탁액에 약 2 x 108 개의 생존가능한 CD19 특이적 CAR-T 세포를 포함한다. 일부 실시양태에서, CD19 특이적 CAR은 브렉수카브타진 오토루셀 (TECARTUS®), 이의 구조적 등가물 또는 이의 기능적 등가물과 동일한 CD19 특이적 CAR이다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 CD19 특이적 CAR-T 세포 중 임의의 것의 단일 용량은 50 kg 이하의 체중을 갖는 대상체에 대한 체중의 kg당 약 0.2 x 106 내지 약 5.0 x 106 (예컨대, 약 0.2 x 106, 0.3 x 106, 0.4 x 106, 0.5 x 106, 0.6 x 106, 0.7 x 106, 0.8 x 106, 0.9 x 106, 1.0 x 106, 1.1 x 106, 1.2 x 106, 1.3 x 106, 1.4 x 106, 1.5 x 106, 1.6 x 106, 1.7 x 106, 1.8 x 106, 1.9 x 106, 2.0 x 106, 2.1 x 106,2.2 x 106, 2.3 x 106, 2.4 x 106, 2.5 x 106, 2.6 x 106, 2.7 x 106, 2.8 x 106, 2.9 x 106, 3.0 x 106, 3.1 x 106, 3.2 x 106, 3.3 x 106, 3.4 x 106, 3.5 x 106, 3.6 x 106, 3.7 x 106, 3.8 x 106, 3.9 x 106, 4.0 x 106, 4.1 x 106, 4.2 x 106, 4.3 x 106, 4.4 x 106, 4.5 x 106, 4.6 x 106, 4.7 x 106, 4.8 x 106, 4.9 x 106, 또는 5.0 x 106) 개의 생존가능한 CD19 특이적 CAR-T 세포를 포함한다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 CD19 특이적 CAR-T 세포 중 임의의 것의 단일 용량은 50 kg 초과의 체중을 갖는 대상체에 대한 체중의 kg당 약 0.1 x 108 내지 약 2.5 x 108 (예컨대, 약 0.1 x 106, 0.2 x 106, 0.3 x 106, 0.4 x 106, 0.5 x 106, 0.6 x 106, 0.7 x 106, 0.8 x 106, 0.9 x 106, 1.0 x 106, 1.1 x 106, 1.2 x 106, 1.3 x 106, 1.4 x 106, 1.5 x 106, 1.6 x 106, 1.7 x 106, 1.8 x 106, 1.9 x 106, 2.0 x 106, 2.1 x 106, 2.2 x 106, 2.3 x 106, 2.4 x 106, 또는 2.5 x 106) 개의 생존가능한 CD19 특이적 CAR-T 세포를 포함한다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 CD19 특이적 CAR-T 세포 중 임의의 것의 단일 용량은 약 0.6 x 108 내지 약 6.0 x 108 (예컨대, 약 0.6 x 108, 0.7 x 108, 0.8 x 108, 0.9 x 108, 1.0 x 108, 1.1 x 108,1.2 x 108, 1.3 x 108, 1.4 x 108, 1.5 x 108, 1.6 x 108, 1.7 x 108, 1.8 x 108, 1.9 x 108, 2.0 x 108, 2.1 x 108, 2.2 x 108, 2.3 x 108, 2.4 x 108, 2.5 x 108, 2.6 x 108, 2.7 x 108, 2.8 x 108, 2.9 x 108, 3.0 x 108, 3.1 x 108, 3.2 x 108, 3.3 x 108, 3.4 x 108, 3.5 x 108, 3.6 x 108, 3.7 x 108, 3.8 x 108, 3.9 x 108, 4.0 x 108, 4.1 x 108, 4.2 x 108, 4.3 x 108, 4.4 x 108, 4.5 x 108, 4.6 x 108, 4.7 x 108, 4.8 x 108, 4.9 x 108, 5.0 x 108, 5.1 x 108, 5.2 x 108, 5.3 x 108, 5.4 x 108, 5.5 x 108, 5.6 x 108, 5.7 x 108, 5.8 x 108, 5.9 x 108, 또는 6.0 x 108) 개의 생존가능한 CD19 특이적 CAR-T 세포를 포함한다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 CD19 특이적 CAR-T 세포 중 임의의 것의 단일 주입 백은 약 10 mL 내지 약 50 mL의 세포 현탁액에서 약 0.6 x 108 내지 약 6.0 x 108 (예컨대, 약 0.6 x 108, 0.7 x 108, 0.8 x 108, 0.9 x 108, 1.0 x 108, 1.1 x 108, 1.2 x 108, 1.3 x 108, 1.4 x 108, 1.5 x 108, 1.6 x 108, 1.7 x 108, 1.8 x 108, 1.9 x 108, 2.0 x 108, 2.1 x 108, 2.2 x 108, 2.3 x 108, 2.4 x 108, 2.5 x 108, 2.6 x 108, 2.7 x 108, 2.8 x 108, 2.9 x 108, 3.0 x 108, 3.1 x 108, 3.2 x 108, 3.3 x 108, 3.4 x 108, 3.5 x 108, 3.6 x 108, 3.7 x 108, 3.8 x 108, 3.9 x 108, 4.0 x 108, 4.1 x 108, 4.2 x 108, 4.3 x 108, 4.4 x 108, 4.5 x 108, 4.6 x 108, 4.7 x 108, 4.8 x 108, 4.9 x 108, 5.0 x 108, 5.1 x 108, 5.2 x 108, 5.3 x 108, 5.4 x 108, 5.5 x 108, 5.6 x 108, 5.7 x 108, 5.8 x 108, 5.9 x 108, 또는 6.0 x 108) 개의 생존가능한 CD19 특이적 CAR-T 세포를 포함한다. 일부 실시양태에서, 용량은 생존가능한 CD19 특이적 CAR-T 세포의 치료적 유효량이다. 다른 실시양태에서, 용량은 생존가능한 CD19 특이적 CAR-T 세포의 임상적 유효량이다. 일부 실시양태에서, 세포의 CD19 특이적 CAR은 티사젠렉류셀 (KYMRIAH®), 이의 구조적 등가물 또는 이의 기능적 등가물과 동일한 CD19 특이적 CAR이다.
Y. T 세포를 포함하는 저면역원성 세포를 투여하는 방법
본원에 더 상세히 기재된 바와 같이, 본원은 저면역원성 세포, 특히 저면역원성 T 세포의 투여를 통해 병태, 장애 또는 장애를 갖는 환자를 치료하는 방법을 제공한다. 인식될 것인 바와 같이, 요법의 시기 및/또는 조합과 관련하여 본원에 기재된 모든 다중 실시양태에 대해, 세포의 투여는 원하는 부위에서 도입된 세포의 적어도 부분적인 국소화를 초래하는 방법 또는 경로에 의해 달성된다. 세포는 원하는 부위에 직접 주입, 이식 또는 이식될 수 있거나, 대안적으로 이식된 세포 또는 세포의 구성요소의 적어도 일부가 생존가능하게 남아있는 대상체에서의 원하는 위치에 대한 전달을 초래하는 임의의 적절한 경로에 의해 투여될 수 있다.
본원은 대상체, 예컨대, 인간 환자에 대한 저면역원성 세포 (예컨대, 일차 T 세포, 저면역원성 유도 만능 줄기 세포로부터 분화된 T 세포, 또는 본원에 기재된 저면역원성 유도 만능 줄기 세포로부터 분화된 다른 T 세포)의 집단의 투여를 포함하는 병태, 장애 또는 장애를 갖는 환자를 치료하기 위한 방법을 제공한다. 예를 들어, 저면역원성 일차 T 세포, 예컨대, 비제한적으로 CD3+ T 세포, CD4+ T 세포, CD8+ T 세포, 나이브 T 세포, 조절 T (Treg) 세포, 비-조절 T 세포, Th1 세포, Th2 세포, Th9 세포, Th17 세포, T-여포 헬퍼 (Tfh) 세포, 세포독성 T 림프구 (CTL), 이펙터 T (Teff) 세포, 중앙 기억 T (Tcm) 세포, 이펙터 기억 T (Tem) 세포, CD45RA를 발현하는 이펙터 기억 T 세포 (TEMRA 세포), 조직-상주 기억 (Trm) 세포, 가상 기억 T 세포, 선천적 기억 T 세포, 기억 줄기 세포 (Tsc), γδ T 세포, 및 T 세포의 임의의 다른 서브타입의 집단은 병태, 장애 또는 장애를 치료하기 위해 환자에 투여된다. 일부 실시양태에서, 면역억압제 및/또는 면역조정제 (예컨대, 비제한적으로 림프구 고갈제)는 저면역원성 세포의 집단의 투여 전에 환자에 투여되지 않는다. 일부 실시양태에서, 면역억압제 및/또는 면역조정제는 세포의 투여 전에 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 일 또는 그 초과로 투여된다. 일부 실시양태에서, 면역억압제 및/또는 면역조정제는 세포의 투여 전에 적어도 1 주, 2 주, 3 주, 4 주, 5 주, 6 주, 7 주, 8 주, 9 주 또는 10 주 이상 투여된다. 다수의 실시양태에서, 면역억압제 및/또는 면역조정제는 세포의 투여 후에 환자에 투여되지 않거나, 세포의 투여 후에 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13 또는 14 일 이상 투여된다. 일부 실시양태에서, 면역억압제 및/또는 면역조정제는 세포의 투여 후에 적어도 1 주, 2 주, 3 주, 4 주, 5 주, 6 주, 7 주, 8 주, 9 주 또는 10 주 이상 투여된다. 면역억압제 및/또는 면역조정제가 세포의 투여 전에 또는 후에 환자에 투여되는 일부 실시양태에서, 투여는 MHC I 및/또는 MHC II 발현을 갖고 CD47의 외인성 발현이 없는 세포에 필요할 것보다 더 낮은 투여량이다.
면역억압제 및/또는 면역조정제 (예컨대, 비제한적으로 림프구고갈제)의 비-제한적인 예는 사이클로스포린, 아자티오프린, 마이코페놀산, 마이코페놀레이트 모페틸, 코르티코스테로이드, 예컨대, 프레드니손, 메토트렉세이트, 골드 염, 설파살라진, 항말라리아제, 브레퀴나르, 레플루노마이드, 미조리빈, 15-데옥시스페르구알린, 6-머캅토푸린, 사이클로포스파미드, 라파마이신, 타크롤리무스 (FK-506), OKT3, 항-흉선세포 글로불린, 티모펜틴, 티모신-α 및 유사한 약제를 포함한다. 일부 실시양태에서, 면역억압제 및/또는 면역조정제는 IL-2 수용체의 p75에 결합하는 항체, 예를 들어, MHC, CD2, CD3, CD4, CD7, CD28, B7, CD40, CD45, IFN-감마, TNF-알파, IL-4, IL-5, IL-6R, IL-6, IGF, IGFR1, IL-7, IL-8, IL-10, CD11a, 또는 CD58에 결합하는 항체, 및 이들의 리간드 중 임의의 것에 결합하는 항체로 이루어진 면역억압 항체의 군으로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, 이러한 면역억압제 및/또는 면역조정제는 가용성 IL-15R, IL-10, B7 분자 (예컨대, B7-1, B7-2, 이의 변이체 및 이의 단편), ICOS 및 OX40, 음성 T 세포 조절인자의 억제제 (예컨대, CTLA-4에 대한 항체) 및 유사한 약제로부터 선택될 수 있다.
일부 실시양태에서, 면역억압제 및/또는 면역조정제가 세포의 투여 전에 또는 후에 환자에 투여되는 경우, 투여는 MHC I 및/또는 MHC II 발현, TCR 발현을 갖고 CD47의 외인성 발현이 없는 세포에 대해 요구될 것인 것보다 더 낮은 투여량이다. 일부 실시양태에서, 면역억압제 및/또는 면역조정제가 세포의 제1 투여 전후에 환자에 투여되는 경우, 투여는 MHC I 및 MHC II 발현, TCR 발현을 갖고 CD47의 외인성 발현이 없는 세포에 대해 요구될 것인 것보다 더 낮은 투여량이다.
일부 실시양태에서, 기재된 세포는 CD94, KIR2DL4, PD-1, 억제성 NK 세포 수용체, 및 활성화 NK 수용체로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 수용체에 결합하고/하거나 이와 상호작용하는 치료제와 공동-투여된다. 일부 예에서, 치료제는 NK 세포의 하나 이상의 하위집단을 포함하는 NK 세포의 표면 상의 수용체에 결합한다. 일부 실시양태에서, 치료제는 항체 및 이의 단편 및 변이체, 항체 모방체, 소분자, 차단 펩티드 및 수용체 길항제로 이루어진 군으로부터 선택된다.
치료적 적용을 위해, 개시된 방법에 따라 제조된 세포는 전형적으로 등장성 부형제를 포함하는 약학 조성물의 형태로 공급될 수 있고, 인간 투여를 위해 충분히 멸균된 조건 하에서 제조된다. 세포 조성물의 의학적 제형의 일반 원리에 대해서는 "Cell Therapy: Stem Cell Transplantation, Gene Therapy, and Cellular Immunotherapy," by Morstyn & Sheridan eds, Cambridge University Press, 1996; 및 "Hematopoietic Stem Cell Therapy," E. D. Ball, J. Lister & P. Law, Churchill Livingstone, 2000을 참고한다. 세포는 유통 또는 임상적 용도에 적합한 장치 또는 용기에 패키징될 수 있다.
IV. 실시예
실시예 1: TRAC, B2M 및 CIITA 삼중 녹아웃, CD47 트랜스제닉 CAR-T 세포 (tKO/CD47 CAR-T 세포)의 생성
본원은 TRAC, B2M 및 CIITA 삼중 녹아웃, CD47 트랜스제닉 CAR-T 세포 (HIP CD19-CAR-T 세포)를 생산하기 위한 예시적인 방법을 설명한다. CD19-특이적 키메라 항원 수용체 (CD19-CAR)를 렌티바이러스 발현 기술을 사용하여 T 세포에 도입하였고, TRAC, B2M 및 CIITA 유전자를 CRISPR/Cas9 기술을 사용하여 비활성화시켰다.
렌티바이러스 벡터의 생산: 현탁 배양물에서 성장한 HEK293LX를 각각 대조군 CAR 또는 테스트 CAR을 보유하는 바이러스 발현 및 전달 벡터를 함유하는 표준 화학적 형질주입 복합체를 사용하여 형질주입시켰다. 세포 배양물을 수확하고, 형질주입 후 정화한 다음, 농축을 위해 원심분리하였다. 렌티바이러스 펠릿을 최종 농축물로 재현탁시켰다.
인간 pan T 세포 (CD3-양성 T 세포 포함)의 배양, 형질도입 및 뉴클레오펙션: Pan T 세포를 해동하고, 같은 날 활성화시켰다. 활성화 후, 렌티바이러스 농축물을 표준 배양 플레이트에서 T 세포와 혼합하였다. 특히, T 세포를 렌티바이러스 농축물을 함유하는 배지와 혼합한 다음, 스핀펙션하였다. 동일한 조건의 세포를 비-처리된 배양 플레이트에 접종하여 풀링하였다. 구체적으로, T 세포는 (1) CD47 트랜스진만을 함유하는 대조군 작제물, (2) CD19-CAR을 함유하는 대조군 작제물, 또는 (3) CD47 트랜스진 및 CD19-CAR 둘 모두를 함유하는 작제물 ("CAR-CD47"로서 또한 지칭됨)로 형질도입하였다. 형질도입 후, 모든 형질도입된 T 세포를 수집하고, Cas9 리보핵단백질 (RNP)의 뉴클레오펙션을 위한 준비로 펠릿화하여, TRAC, B2M 및 CIITA 삼중 녹아웃 세포를 생성하였다. 각각의 표적 유전자좌에 대한 RNP를, 특정 sgRNA:Cas9 비로 개별적으로 복합체화한 후, 백만 개의 세포당 구체적인 양으로 3 개의 RNP를 혼합하였다. RNP 혼합물을 용액에 희석하고, 세포 펠릿과 혼합하고, 특이적인 조건 하에서 뉴클레오펙션하였다. 뉴클레오펙션된 세포를 씨딩하고, 배양한 다음, 동결보존 배지에서 활성화-후 동결보존하였다. 자세한 내용은 표 21을 참고한다.
표 21. 테스트 재료의 요약
약어: HLA, 인간 백혈구 항원; TCR, T 세포 수용체; wt, 야생형; -, 음성; ++, 과발현; +, 양성
실시예 2: 동종이계 요법을 위한 면역 인식을 회피하기 위한 저면역원성 CAR-T 세포의 생성
기성품 CAR-T 세포는 제조의 용이성, 품질 관리, 및 악성 오염 및 T 세포 기능장애의 회피를 포함하여 자가유래 전략에 비해 이점을 제공할 수 있다. 그러나, 조직부적격 T 세포에 대한 격렬한 숙주-대-이식편 면역 반응은 동종이계 CAR-T 세포의 확장 및 지속을 방지하고, 이 접근법의 효험을 완화시킨다.
본원은 WO2018132783에 기재된 저면역 편집 플랫폼에 부분적으로 기반한 조작된 또는 변형된 인간 면역 회피 CAR-T 세포를 설명한다. 발명자들은 인간 백혈구 항원 (HLA) 클래스 I 및 II 유전자가 비활성화되고 CD47이 과-발현될 때 T 세포가 이들의 면역원성을 상실하고 이식편-대-숙주 질환의 위험이 TCR 녹아웃을 통해 제어될 수 있다는 발견을 이용하였다. 추가적으로, 이식편-대-숙주 질환의 위험을 제어하기 위해 TCR 녹아웃을 수행하였다.
이 실시예는 생체외 종양 효험 실험에서 대조군 CD19-특이적 CAR-T 세포와 비교하여 저면역원성 CD19-특이적 CAR-T 세포 및 이러한 세포의 활성에 대한 외인성 CD47 발현의 효과를 설명한다. 실험에서는, 표적 세포로서 CD19+ 종양 세포를 사용하였고, 이펙터 세포로서 테스트 및 대조군 CAR-T 세포와 같은 CAR-T 세포를 사용하였다.
연구에서, 테스트 저면역원성 CAR-T 세포는 (a) B2M, CIITA 및 TRAC 유전자의 게놈 편집 및 (b) CD19-특이적 CAR을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 및 CD47을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 함유하는 트랜스진을 포함하였다. 일부 경우에, 대조군 CAR-T 세포는 CD19-특이적 CAR을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하였다. 특정 경우에, 대조군 CAR-T 세포는 티사젠렉류셀 또는 이의 바이오시밀러/대용물과 동일한 CAR 작제물을 발현하는 T 세포를 포함하였다.
동종이계 인간화된 마우스에 이식되었을 때, 저면역원성 HLA-I/II-음성, TCR-음성, CD47-양성, CD19-특이적 CAR-T 세포는 동일한 인간 공여자로부터 생성된 CD19-특이적 CAR-T 세포와 비교하여 T 및 B 세포에 의한 면역 인식을 회피하였다. 선천적 면역 세포 검정은 CD47 과발현이 생체외 및 생체내에서 선천적 면역 세포 살해로부터 MHC-I/II 결핍 CAR-T 세포를 보호한다는 것을 보여주었다. CD47 발현 수준을, 보호를 위한 역치 수준을 이해하기 위해 세포당 항체의 유세포 측정 추정을 위한 방법을 사용하여 분석하였다. 본원에 기재된 전략을 저면역원성 CAR-T 세포에 대한 안전 전략으로서 추가적으로 사용할 수 있다.
단리된 CD47 과발현 또는 3 개의 모든 저면역 편집 또는 녹아웃 (B2M/CIITA/TRAC)은 CAR-T 세포의 세포독성 잠재력에 대해 임의의 효과도 나타내지 않았다. 저면역원성 CD19-특이적 CAR-T 세포 (예컨대, B2M-/-, CIITA-/-, TRAC-/- CD19-특이적 CAR-CD47 T 세포)는 종양 세포:CAR-T 세포 비의 범위에 걸쳐 생체외 CD19+ 종양 모델뿐만 아니라 NSG 마우스에서 이들의 항종양 활성을 유지하였다. 저면역 유전자 편집 (예컨대, B2M/CIITA/TRAC 유전자 비활성화)의 도입이 면역원성 CAR-T 세포와 비교하여 이들의 사이토카인 독립적 성장을 변화시킨 것으로 보이지 않는다. 이러한 발견은 저면역원성 CD19-특이적 CAR-T 세포가 장기간의 세포독성 항-종양 능력을 가진 동종이계 수용자에서 기능적으로 면역 회피적임을 보여주고, 암 환자에게 보편적인 면역치료적 옵션을 제공할 수 있음을 시사한다.
요약하면, 이 실시예 및 상응하는 도면은 CD19-특이적 CAR 활성 (예컨대, 삼중 TRAC, B2M, CIITA 녹아웃 및 CD19-특이적 CAR 및 CD47 단백질 과발현 둘 모두)을 갖는 저면역원성 T 세포를 제공한다. 이러한 저면역원성 CAR-T 세포는 생체외 검정에서 입증된 바와 같이 선천적 면역 세포 살해로부터 보호된다. 단일 EF1α 프로모터의 제어 하에서 CD19-특이적 CAR 및 CD47을 함유하는 작제물 (CAR-CD47 작제물)을 외인성으로 발현하는 T 세포는 생체외 및 생체내 검정에서 나타난 바와 같이 다른 비슷한 CD19-특이적 CAR-T 세포와 유사한 활성을 나타냈다. 또한, T-림프아구성 세포주 (Mo) 세포에서 CAR-CD47 작제물의 발현은 사이토카인 독립적 성장을 보였다. 생체외 및 생체내 실험에서 나타난 바와 같이, 본원에 기재된 저면역원성 CAR-T 세포는 거부되지 않았다. 저면역원성 CAR-T 세포는 또한 생체외 및 생체내 검정 둘 모두에서 비슷한 면역원성 CAR-T 세포와 유사한 종양 살해 활성을 보였다. 실험 데이터는 도 1-30에 제공된다.
실시예 3: TRAC, B2M 및 CIITA 삼중 녹아웃 CAR-T 세포의 사이토카인-독립적 증식의 부재
-1 일차에, 세포를 IL-2가 보충된 배양 배지에 재현탁시켰다. 당업자에게 알려진 표준 프로토콜을 사용하여 생 세포 및 사멸 세포를 검출하기 위해 세포를 세포 생존력 염료로 염색하였다. 그런 다음, 염색된 세포를 소정된 농도로 플레이팅하고, 37℃; 밤새 5% CO2에서 항온처리하였다. 0 일차에, 세포를 염색한 후, 카운팅하였다. 세포를 IL-2가 없는 배양 배지에서 미리-선택된 농도로 재현탁시켰다. 세포를 2 개의 분취량으로 분할하였다 - 샘플 #1에는 IL-2가 보충되었고, 샘플 #2에는 IL-2가 보충되지 않았다. 샘플 #1에는 IL-2가 보충된 배지가 공급되고 샘플 #2에는 IL-2 보충이 없는 배지가 공급되도록 2 개의 샘플을 3 일마다 공급하였다. 19 일차에 두 샘플 모두를 IL-2가 보충된 배지에서 배양하였다. 22 일차에, 샘플을 세포 생존력 염료로 염색하였다. 세포를 카운팅하고, 표준 셀로미터를 사용하여 생존력을 평가하여, 생 세포 및 사멸 세포의 수를 결정하였다. 도 31은 실험적 접근법의 개략도를 제공한다.
결과는 샘플 #1 세포 (IL-2가 보충됨)가 증식하고 샘플 #2 세포 (IL-2가 보충되지 않음)가 증식하지 않았음을 보여준다 (도 32a 및 도 32b).
실시예 4: 이종이식 마우스 모델에서 Nalm6 종양 세포의 tKO/CD47 CAR-T 세포 매개된 세포독성
종양 세포에 대한 본 개시내용의 저면역원성 CAR-T 세포 (HLA-/TCR-/CD47tg CD19-특이적 CAR-T 세포, tKO/CD47 CAR-T 세포로서 또는 HIP CD19-CAR-T 세포로서 또한 지칭됨)의 세포독성을 평가하기 위해, Nalm6-luc 백혈병 종양 세포로 이종이식된 NSG 마우스를 사용하였다. 연구에 사용된 실험적 접근법은 도 33에 제공된다.
Nalm6-luc 세포는 원래 남성 급성 B 림프아구성 백혈병 (B-ALL) 환자로부터 유래되었고, 루시퍼라제 및 G418 저항성 유전자를 안정하게 발현하도록 변형되었다. 세포를 반-현탁 배양 조건 하에서 배양하고, 2-3 일마다 계대하였다. 생체내 주사를 위해, 대수 성장기에 있는 동안 세포를 수집하고, 수용자 NSG 마우스에 투여하기 전에 표준 완충액으로 세척하였다.
tKO/CD47 CAR-T (HIP CD19-CAR-T) 세포를 해동하고, 표준 T 세포 배양 조건을 사용하여 배양하였다. 생존력 및 CD19-특이적 CAR 발현 빈도의 해동-후 유동 분석을 위해 세포의 분취량을 비축하였다. 생존력 및 CAR 발현은 유세포 분석법을 사용하여 측정하였다. CAR-T 세포의 투약을, 세포의 생존력 및 CAR 발현의 빈도에 기반하여 계산하였다.
-3 일차에, NSG 마우스에 Nalm6-luc 세포를 정맥내 (iv) 주사하였다. Nalm6 종양으로 챌린지된 마우스를 4 개의 처리군으로 나누었다. 종양 부담을 tKO/CD47 CAR-T (HIP CD19-CAR-T) 세포를 투여한 마우스에서 시간 경과에 따라 측정하고, 대조군 CAR-T 세포, 미편집된 T 세포 또는 식염수를 투여한 마우스와 비교하였다.
0 일차에, 마우스의 제1 그룹에 tKO/CD47 CAR-T (HIP CD19-CAR-T) 세포를 3 개의 상이한 용량 - 1x106 개의 tKO/CD47 CAR-T (HIP CD19-CAR-T) 세포의 용량 #1, 3x106 개의 tKO/CD47 CAR-T (HIP CD19-CAR-T) 세포의 용량 #2 및 5x106 개의 tKO/CD47 CAR-T (HIP CD19-CAR-T) 세포의 용량 #3로 iv 주사하였다. 마우스의 제2 그룹에 대조군 CAR-T 세포를 3 개의 상이한 용량 - 1x106 개의 대조군 CAR-T 세포의 용량 #1, 3x106 개의 대조군 CAR-T 세포의 용량 #2 및 5x106 개의 대조군 CAR-T 세포의 용량 #3로 iv 주사하였다. 마우스의 제3 그룹에 5x106 개의 미편집된 T 세포를 iv 주사하였다. 마지막으로, 마우스의 제4 그룹에 식염수를 iv 주사하였다.
종양 세포를 검출하기 위한 생체내 이미징을 연구 과정에 걸쳐 매주, 예컨대, 7, 14, 21, 28 일차 등에 수행하였다. 연구의 엔드포인트에서, 마우스로부터의 조직 샘플을 수집할 것이고, 샘플은 비제한적으로 사이토카인 분석 및 바이러스 카피 수 (VCN)와 같은 분석을 거치게 될 것이다.
CAR-T 세포 요법 후 수득된 Nalm6-보유 마우스의 이미지는 대조군 CAR-T 처리된 마우스, 미편집된 T 세포-처리된 마우스 및 식염수-처리된 마우스와 비교할 때 tKO/CD47 CAR-T (HIP CD19-CAR-T) 세포-처리된 마우스에서 지연된 종양 성장을 나타냈다 (도 34 및 35).
실시예 5: 동종이계 세포 요법을 위한 저면역원성 CAR-T 세포의 생산 방법
이 실시예는 35 세 미만이고 O+ 혈액형을 가졌던 건강한 여성 공여자로부터 수득된 단핵 세포 및 혈장(류코팩)으로부터 저면역원성 CAR-T 세포 (B2Mindel/indel, CIITAindel/indel, TRACindel/indel, CD19-특이적 CAR-T 세포를 발현하는 CD47tg T 세포, tKO/CD47 CD19-CAR-T (HIP CD19-CAR-T) 세포로서 또한 지칭됨)를 생성하는 방법을 설명한다. 건강한 공여자로부터의 CD4+ 및 CD8+ T 세포를, CD47 트랜스진 및 CD19-특이적 CAR을 운반하는 렌티바이러스로 CD4+ 및 CD8+ T 세포의 렌티바이러스 형질도입 전에 단리하고, 분리하고, 활성화하였다. 그런 다음, 형질도입된 세포를 CRISPR/Cas9를 통해 B2M, CIITA 및 TRAC 유전자를 비활성화하도록 유전적으로 변형시켜, tKO/CD47 CD19-CAR-T 세포 (HIP CD19-CAR-T)를 생산하였다.
CD4+ 및 CD8+ T 세포의 단리
공여자의 단핵 세포/혈장으로부터 CD4+ 및 CD8+ T 세포를 단리하기 위해, CD8+ T 세포 및 CD4+ T 세포를 단리하기 위해 일련의 양성 면역자기 세포 선택 전략을 활용하였다. CD8+ T 세포를 동결보존 배지로 제형화하고, 동결보존 바이알에 분취하고, 제어된-속도 냉동고를 사용하여 냉동시켰다. 별도로, CD4+ T 세포를 동결보존 배지로 제형화하고, 동결보존 바이알에 분취하고, 제어된-속도 냉동고를 사용하여 냉동시켰다.
CD4+ 및 CD8+ T 세포의 활성화
CD4+ 및 CD8+ 세포의 냉동된 분취량을 해동하고, CD3/CD28 비드를 사용하여 활성화하고, 세포 성장 및 확장을 위한 조건 하에서 배양하였다. 간략하게, CD4+ 및 CD8+ T 세포를 약 3:1의 비드:세포 비로 CD3/CD28 (항-CD3/항-CD28) 비드와 조합하였다. 세포 및 비드 혼합물을 약 1:1의 CD4:CD8 비로 시딩하고, IL-2를 함유하는 배양 배지에서 밤새 배양하였다. 설명된 공정은 활성화 0 일차를 구성하였다.
렌티바이러스 벡터 생산
렌티바이러스 생산을 위한 HEK293-유래된 세포를 제조자의 조건에 따라 배양하였다. 0 일차 (형질주입일)에, 렌티바이러스 패키징 플라스미드 및 미리-선택된 발현 벡터를 함유하는 형질주입 혼합물로 세포를 형질주입시켰다. 형질주입 후 1 일차에, 세포를 소듐 부티레이트와 같은 첨가제에 노출시켜, 바이러스 단백질 생산을 개선시켰다. 형질주입 후 1 일차에, 바이러스 상층액을 수집하고, 정화한 다음, 초고속 원심분리로 농축하였다. 생성된 바이러스 펠릿을 단리하고, 표준 바이러스 제형 완충액에 재현탁시켰다.
CD4+ 및 CD8+ T 세포의 렌티바이러스 형질도입
0 일차에, CD4+ 및 CD8+ 세포의 냉동된 분취량을 해동하고, CD3/CD28 비드를 사용하여 활성화하고, 세포 성장 및 확장을 위한 조건 하에서 배양하였다. 간략하게, CD4+ 및 CD8+ T 세포를 약 3:1의 비드:세포 비로 CD3/CD28 (항-CD3/항-CD28) 비드와 조합하고, 약 1:1의 CD4:CD8 비로 시딩하고, 사이토카인이 없는 배양 배지에서 밤새 배양하였다. 활성화 후 당일 (활성화-후 1 일차)에, 활성화된 CD4+ 및 CD8+ T 세포를 렌티바이러스 형질도입을 위해 준비하였고, 3 개의 실험군으로 나누었다. 미형질도입된 대조군 T 세포 ("미편집된 대조군")로 간주되는 그룹 1 세포를 표준 T 세포 배양 조건 하에서 증식되도록 허용하였고, 렌티바이러스 벡터로 형질도입시키지 않았다. 형질도입된 대조군 CD19-CAR-EGFRt T 세포 ("대조군 CAR-T")로 간주되는 그룹 2 세포를, CD19-특이적 CAR 및 절삭된 EGFR을 코딩하는 렌티바이러스 벡터로 형질도입시켰다. 형질도입된 저면역원성 CD19-CAR-T 세포 ("HIP CAR-T")로 간주되는 그룹 3 세포를, CD47 트랜스진 및 CD19-특이적 CAR 둘 모두에 대한 바이시스트론 발현 카세트를 코딩하는 렌티바이러스 벡터로 형질도입시켰다. 그룹 2 및 그룹 3 세포의 경우, 기능적 역가로부터 계산된 바와 같이 약 10의 MOI에서 세포를 이들 각각의 농축된 렌티바이러스 입자에 노출시켰다. 세포를 표준 스핀펙션 프로토콜을 사용하여 형질도입하고, 항온처리기에서 약 2 일 동안 회복되도록 하였다.
회복 후 및 활성화-후 3 일차에, 형질도입된 세포 (그룹 2 및 3 세포) 및 대조군 세포 (그룹 1 세포)를 개별적으로 수확하고, CD3/CD28 비드 제거 방법을 적용하였다. 각각의 그룹으로부터의 생성된 세포를 세척하고, IL-2를 함유하는 배양 배지에 재현탁시켰다.
유전자 편집 렌티바이러스 형질도입된 CD4+ 및 CD8+ T 세포
TRAC, B2M 및 CIITA 유전자에 대한 리보핵단백질 (RNP)을 조립하여, sgRNA를 재조합 Cas9와 미리복합체화하였다. 간략하게, 합성 변형된 sgRNA를 SPyFi Cas9와 Cas9가 과량인 비로 혼합하였다. Cas9와 함께 TRAC, CIITA 및 B2M을 표적화하는 gRNA의 이원 복합체 형성을 당업자가 인식하는 표준 프로토콜에 따라 수행하였다. TRAC-RNP:B2M-RNP:CIITA-RNP의 1:1.5:2 비로 삼중 녹-아웃 뉴클레오펙션을 위해 RNP를 조합하고, 그룹 3 세포로 뉴클레오펙션하였다. 세포를 항온처리기에서 약 2 일 동안 회복되도록 하였다.
그룹 3의 세포뿐만 아니라 그룹 1 및 2의 세포를 당업계에 알려진 표준 프로토콜을 사용하여 배양하고 유지하였다.
HIP CAR-T 세포로부터의 CD3+ T 세포의 고갈
활성화-후 8 일차에, 당업자에게 알려진 표준 음성 선택 방법을 사용하여 CD3 양성 세포의 그룹 3 "HIP CAR-T" 세포를 고갈시켰다.
수집된 CD3-음성 HIP CAR-T 세포를 재현탁하고, IL-2가 보충된 배양 배지에서 배양하였다. 동결보존을 위해, 세포를 카운팅하고, 동결보존 제형에서 미리-선택된 농도로 현탁시켰다. 장기 보관을 위해 세포를 액체 질소에 보관하였다.
CD3-고갈된 HIP CAR-T 세포의 특성화
활성화-후 10 일차에, 표준 프로토콜을 사용한 유세포 분석법 분석을 위해 실험 그룹 1, 2 및 3으로부터의 세포를 제조하여, 세포 생존력 및 CD3, CD4, CD8a, HLA-ABC, HLA-DR/DP/DQ, CD19-CAR 및 CD47을 포함하는 세포 마커의 발현을 결정하였다. 도 38은 기재된 방법으로부터 생산된 HIP CAR-T 세포, 대조군 CAR-T 세포 및 미편집된 T 세포에 대한 유세포 분석법 결과의 표를 제공한다.
결과
데이터는 HIP CAR-T 세포가 대조군 CAR-T 세포 및 미편집된 T 세포와 비교하여 유의하게 더 높은 백분율의 CD47 양성 세포, CD47 양성 및 CAR 양성 세포, CD3 음성 세포, HLA-ABC 음성 세포, HLA-DR/DP/DQ 음성 세포, 및 삼중 녹아웃 세포를 포함하였음을 보여준다. HIP CAR-T 세포는 유사한 백분율의 CD4+ T 세포 및 CD8+ T 세포를 함유하였다. 실시예는 동종이계 CAR-T 요법에 유용한 저면역원성 CD19-특이적 CAR-T 세포를 생성하기 위한 예시적인 방법을 설명한다.
실시예 6: 인간화 마우스에서 HIP CAR-T 세포에 의한 적응성 면역 회피
인간화된 NSG-SGM3 마우스를 CDC 살해 검정을 위한 수용자로서 사용하였다. 동물을 무작위로 실험군에 배정하였다. 1 x 106 개의 CD19-CAR-T 세포를 꼬리 정맥에 정맥 주사하고, 주사 7 일 후에 혈청을 수집하였다.
CDC 살해 검정을 XCelligence MP 플랫폼 (Agilent Technologies, Santa Clara, CA)에서 수행하였다. 96-웰 E-플레이트 (Agilent Technologies)를 종양 코팅 용액 (Agilent Technologies)으로 코팅하고, 4 x 104 개의 표적 CD19-CAR-T 세포 또는 HIP CD19-CAR-T 세포를 인간 IL-2를 포함하는 100 μl Optimizer 배지 (보충제 포함, Thermo Fisher)에 플레이팅하였다. 세포 지수가 0.7에 도달한 후, 50 μl 혈청 샘플을 50 μl 인간 보체 (Quidel, San Diego, CA)와 혼합하고, 표적 세포에 첨가하였다. 살해 대조군으로서, 세포를 2% TritonX100으로 처리하였다 (데이터는 도시되지 않음). 데이터를 RTCA 소프트웨어 (Agilent Technologies)로 표준화하고 분석하였다.
도 39a-b에 도시된 바와 같이, 비-저면역 편집된 CD19-CAR-T 세포 (CAR을 발현하도록 조작되었지만 B2M, CIITA 또는 CD47 트랜스진에 대한 임의의 변형이 결여된 T 세포)의 동종이계 인간화된 마우스로의 이식은 유의한 T 세포 활성화를 초래한 반면에, 저면역 CD19-CAR-T 세포 (CAR 및 CD47 트랜스진을 발현하도록 조작되고 B2M 및 CIITA의 감소된 발현을 위해 조작된 T 세포)는 면역 인식을 회피하였다 (p<0.0001).
도 39c-d에 도시된 바와 같이, 저면역 CD19-CAR-T 세포는 CAR 민감화 후에도 동종이계 인간화된 마우스 수용자에서 기능적으로 면역 회피성이었다. 이러한 데이터는 저면역 CD19-CAR-T 세포가 감작된 환자 및 재투약 전략에 사용될 수 있음을 시사한다.
실시예 7: 예시적인 HIP CD19-CAR-T 세포의 생성
HIP CD19-CAR-T 세포를, 정제된 CD8+ 및 CD4+ T 세포의 게놈 변형을 위한 2 개의 개별 단계를 포함하는 엑스 비보 공정을 통해 제조하였다: 항-CD19 키메라 항원 수용체 (CD19-CAR) 및 CD47 유전자의 트랜스진 발현을 가능하게 하는 렌티바이러스 형질도입 단계, 및 Cas 효소가 녹아웃을 위한 3 개의 유전자좌 (TRAC, B2M 및 CIITA)를 표적화하는 데 사용되는 게놈 편집 단계. 렌티바이러스 벡터를 VSV-G로 슈도타이핑하고, CD19-CAR 및 CD47 유전자 둘 모두를 함유하는 바이시스트론 트랜스진을 운반하였다. 게놈 편집 단계에서 사용되는 시약은 Cas nuclease 또는 Cas 단백질을 코딩하는 mRNA, 및 위에 기재된 유전자좌 중 하나를 각각 표적화하는 3 개의 단일 가이드 RNA (sgRNA)를 포함한다. (i) 숙주 선천적 면역을 차단하기 위한 CD47 과발현; (ii) 숙주 적응성 면역을 방지하기 위한 MHC 클래스 I 및 클래스 II HLA의 발현 감소 및 (iii) 이식편-대-숙주 반응을 방지하기 위한 T 세포 수용체 (TCR)의 발현 감소를 통해, CD19-발현 종양 세포의 지속가능한 살해를 매개하면서 숙주의 면역계를 회피하도록 HIP CD19-CAR-T 세포를 설계하였다. 이전에 기재된 실험은 이러한 세포가 면역계로부터 숨을 수 있고 면역 거부를 피할 수 있음을 입증하였다. 예컨대, 그 전문이 본원에 참조로 원용되는, 2021 년 8 월 12 일자로 출원된 PCT/US21/45822, 및 WO2021222285를 참고한다.
HIP CD19-CAR-T 세포를 사용한 생체외 및 생체내 연구 둘 모두는 CD19-CAR-T 세포와 유사한 CD19+ 종양 세포 (NALM-6)를 표적화하고 살해시키는 의도된 약리학적 활성을 입증하였다 (CD19-CAR을 발현하지만 저면역 편집은 없는 렌티바이러스 벡터를 이용한 형질도입). HIP CD19-CAR-T 세포에는 삼중 녹아웃 (tKO) CD19-CAR-T 세포와 유사한 이식편-대-숙주 반응이 결여되어 있으며, 표준 또는 tKO CD19-CAR-T 세포와 비교할 때 선천적 및 적응성 숙주 면역계 반응을 고유하게 회피한다. 예컨대, 2021 년 8 월 12 일자로 출원된 PCT/US21/45822, 및 WO2021222285, 및 도 39 및 41을 참고한다.
실시예 8: HIP CD19-CAR-T 세포 살해의 생체외 평가
이 생체외 연구의 목적은 본원에 기재된 HIP CD19-CAR-T 세포의 살해 활성을 테스트하는 것이었다.
이 연구에 사용된 세포는 (iHIP CD19-CAR-T 세포, (ii) CD19-CAR-T 세포, 및 (iii) 동일한 공여자로부터의 미편집된 T 세포를 포함하였다. 살해 활성을 평가하기 위해, CD19-CAR-T 및 HIP CD19-CAR-T 세포를 해동하고, 밤새 휴지시키고, CD19-CAR 빈도에 대해 유세포 분석법에 의해 평가하였다. CD19-CAR-T 및 HIP CD19-CAR-T 세포를 NALM-6 세포 (셀 트레이스 바이올렛, CTV로 표지된 표적 세포)와 함께 상이한 이펙터 대 표적 비 (범위 3:1 내지 1:243, 3-배 희석 시리즈)로 18 시간 동안 공동-배양하였다. 미편집된 T 세포를, 각각의 조건에서 동일한 총 T 세포의 수를 유지하기 위해 각각의 E:T 비에 대해 첨가하였다. 미편집된 T 세포 및 NALM 6 세포 (CTV-표지됨)의 공동-배양을 사용하여, 세포 살해를 정규화하였다.
CD19-CAR-T 세포 및 HIP CD19-CAR-T 세포는 CD19-CAR을 발현하는 유사한 백분율 (75%)의 생존가능한 세포를 가졌다 (데이터는 도시되지 않음). CD19+ NALM-6 종양 표적 세포와의 공동-배양물에서일 때, CD19-CAR-T 및 HIP CD19-CAR-T 세포 둘 모두는 유효 용량 50% (ED50)의 1:20 이펙터 대 표적 비 (E:T)로 용량-관련된 활성을 나타냈다 (데이터는 도시되지 않음). 이러한 결과는 HIP CD19-CAR-T 세포가 CD19-CAR의 유사한 발현을 갖고 CD19-CAR-T 세포와 유사한 활성을 나타냄을 나타낸다.
실시예 9: 암컷 NSG 마우스를 보유하는 NALM-6-Luc 종양에서 HIP CAR-T 세포의 항-종양 활성의 단일 정맥내 용량 108-일 연구
이 연구의 목적은 B-세포 악성종양의 CD19+ NALM 6-루시퍼라제 종양 NSG 마우스 모델에서 Cas9 유전자-편집된 HIP CD19-CAR-T 세포의 항-종양 활성을 입증하는 것이었다.
표 22는 장기간 CD19-CAR-T 세포 활성의 수준을 평가하기 위해 60 일차에 종양 재-챌린지를 포함하였던 이러한 용량-범위 종적 연구를 요약한 것이다.
표 22. 연구 그룹
모든 그룹에 대해 n=8. NA는 재-챌린지되지 않았던 동물, 또는 지정된 출혈의 시기에 살아 있지 않았던 동물을 지정한다. 희생의 시간은 마우스마다 달랐다.
암컷 NSG 마우스 (n=8/그룹)에 1x106 개의 NALM-6-Luc 종양 세포를 -3 일차에 정맥내로 이식하였다. 총 T 세포 수 (CD19-CAR+ 세포 수/% 생존가능한, CD19-CAR+ 세포의 의도된 수)를 계산하기 위해, T 세포에 대한 생존력 및 CD19-CAR 발현을 평가하였다. 미편집된 T 세포를, 생존가능한 세포의 빈도를 기준으로 계산하였다. 0 일차에, CD19-CAR-T 세포를 마우스에 투여하였다. 그룹 A 및 G의 동물 (각각 5x106 개의 HIP CD19-CAR-T 세포/마우스 및 5x106 개의 tKO CD19-CAR-T 세포/마우스)을 60 일차에 1x106 개의 NALM-6-Luc 세포의 추가적인 정맥내 주사로 재-챌린지하였다. 나이브 NSG 마우스의 새로운 코호트 (그룹 J)에 1x106 개의 NALM-6-Luc 세포를 정맥내로 주사하여, 미처리된 대조군으로서 사용하였다.
면역표현형을 단리된 PBMC, 비장 및 골수 T 세포 집단에 대해 수행하였다. 생물발광 이미징 (BLI)을 매주 기준으로 종양 부담을 모니터링하기 위해 수행하였다. 조직병리학을 부검에서 수집된 조직에 대해 수행하였고, 조직학적 변화를 이식편-대-숙주 반응 (GvHR)의 중증도, 종양 부담 및/또는 기타 현미경적 변화에 대해 주관적으로 스코어링하였다.
유세포 분석법 데이터에 대한 통계 분석을, 일원 또는 이원 분산 분석 (ANOVA)으로 수행하였고, 기울기에 대한 무작위 효과가 있는 무작위 계수 모델을 BLI 데이터 및 재-챌린지된 마우스에 사용하였다.
결과 - 종양 부담. 식염수-처리된 동물을 종양 부담으로 인한 빈사 상태로 인해 21 일차에 안락사시켰다 (도 42). 2 마리의 미편집된 T 세포-처리된 마우스는 종양 성장이 감소하였지만, 나머지 미편집된 T 세포-처리된 마우스에서 종양이 발달하였고 35 일차에 희생시켰다. 1x106 개의 CD19-CAR-T 세포/마우스 그룹에서 8 마리의 마우스 중 2 마리가 종양 성장을 보였고, 35 일차에 희생시켰고; 1x106 개의 CD19-CAR-T 그룹의 나머지 6 마리 마우스를 GvHR로 인해 42 일차에 희생시켰다. 1x106 개의 HIP CD19-CAR-T 세포로 처리된 동물은 21 일차부터 시작하여 종양 성장을 보였다. 3x106 개의 HIP CD19-CAR-T 세포를 투약한 마우스 및 5x106 개의 HIP CD19-CAR-T 또는 tKO CD19-CAR-T 세포를 투약한 마우스는 NALM-6-Luc 재챌린지 후까지 종양이 없었다 (60 일차 (도 42)).
중요하게도, HIP CD19-CAR-T 또는 tKO CD19-CAR-T 처리된 동물이 GvHR의 증상을 갖지 않았던 반면, 5x106 및 3x106 개의 CD19-CAR-T 처리군의 모든 마우스는 유의한 체중 손실, 털 손실 및/또는 구부러진 자세를 포함하는 GvHR 증상이 발달하였다.
60 일차에, 5x106 개의 HIP CD19-CAR-T 및 5x106 개의 tKO CD19-CAR-T-처리된 그룹을 1x106 개의 NALM-6-Luc 세포로 재-챌린지하였다. 1x106 개의 NALM-6-Luc 세포를 주사하고 식염수로 처리한 나이브 NSG 마우스의 새로운 코호트를 연구에 추가하여, 대조군으로 사용하였다. NALM-6-Luc 세포로 재-챌린지된 5x106 개의 HIP CD19-CAR-T 및 tKO CD19-CAR-T 동물은 48-일 기간에 걸쳐 식염수-처리된 마우스와 비교하여 유사하고 유의하게 개선된 종양 억압을 나타냈다 (도 42). 연구는 모든 재-챌린지된 마우스가 종양 재기(resurgence)를 보인 108 일차에 종결하였다.
결과 - CD19-CAR-T 및 CD47 발현 수준. CD19-CAR+ 세포의 빈도를 42 일차 및 108 일차 사이의 중간 출혈과 희생 시간에 수집된 혈액으로부터 평가하였다 (도 43). 임의의 그룹에 대해서도 희생 시간이 미리-결정되지 않았기 때문에, 모든 시점에서 일대일 비교가 불가능하였다. 42 일차 및 66 일차 사이에 모든 저면역 및 tKO CD19-CAR-T 처리된 마우스, 및 1x106 개의 CD19-CAR-T 처리된 마우스의 혈액에서 CD19-CAR+ 세포 빈도의 유의한 감소가 있었다 (5x106 개의 HIP CD19-CAR-T 처리된 p<0.0001, 3x106 개의 HIP CD19-CAR-T 처리된 p<0.0001, 1x106 개의 HIP CD19-CAR-T 처리된 p=0.0015; 5x106 개의 tKO CD19-CAR-T 처리된 p<0.0001; 1x106 개의 CD19-CAR-T 처리된 p=0.0410). 재-챌린지된 5x106 개의 HIP CD19-CAR-T 처리된 그룹은 66 일차 및 108 일차 사이에 CD19-CAR+ 세포에서 유의한 증가를 가졌던 반면 (p<0.0001), 재-챌린지된 5x106 개의 tKO CD19-CAR-T 처리된 그룹은 그룹은 그렇지 않았다 (p=0.4694).
CD47MFI는 108 일차에 tKO CD19-CAR-T 세포보다 HIP CD19-CAR-T 세포에서 유의하게 더 높았다 (p<0.0001)(도 43). CD47MFI는 충분한 당일 출혈 또는 희생의 결여로 인해 저면역 대 CD19-CAR-T 세포 사이에서 비교할 수 없었다.
결과. 폐, 간 및 피부에 대해 조직병리학적 분석을 수행하였다. CD19-CAR-T 세포 또는 미편집된 CD19-CAR-T 세포를 투여한 마우스에서 간, 폐 및 피부에서의 혈관주위, 세기관지주위 및 부속기주위 단핵 (림프구 및 대식세포) 침윤물을 특징으로 하는 GvHR이 관찰되었다. GvHR은 HIP CD19-CAR-T 또는 tKO CD19-CAR-T를 임의의 용량으로 투여한 마우스에서 분명하지 않았다. 간 굴모양혈관(sinusoid) 및/또는 폐의 폐포 중격 내의 종양 (NALM-6) 세포의 침윤물이 가장 낮은 (1x106) 용량의 HIP CD19-CAR-T 세포를 투여한 마우스 및 모든 재-챌린지된 마우스에서 관찰되었다. 미편집된 CD19-CAR-T 세포를 투여한 2 마리의 마우스는 간에서 동시에 NALM-6 종양 세포 및 GvHR의 침윤을 가졌다. 5x106 개의 HIP CD19-CAR-T 세포, 1x106 개의 CD19-CAR-T 세포 또는 5x106 개의 tKO CD19-CAR-T 세포로 처리한 여러 마우스로부터의 복부 종괴는 정상적인 난소 아키텍쳐를 대체한 NALM-6 종양 세포에 상응한다.
결론. CD19+ NALM-6-Luc 종양 세포가 이식된 NSG 마우스에 대한 HIP CD19-CAR-T 세포의 투여는 108-일 연구 기간에 걸쳐 GvHR의 증거 없이 전신 종양 부담의 용량-의존적 감소를 초래하였다. 3x106 및 5x106 용량의 CD19-CAR-T 세포는 또한 감소된 종양 부담을 가졌지만, 또한 조직병리학적 분석에 의해 확인된 바와 같이 GvHR을 발달시켰다. CD19-CAR-T 처리된 동물에서 GvHR의 높은 발생률은 저면역 또는 tKO CD19-CAR-T 세포에서 발생하지 않았던 TCR 및 MHC 시그널링으로 인한 것일 가능성이 있다. 추가로, 5x106 개의 HIP CD19-CAR-T 및 5x106 개의 tKO CD19-CAR-T 세포/마우스 처리는 식염수 처리된 대조군과 비교하여 종양 세포로 재-챌린지되었을 때 비슷한 종양 부담 감소뿐만 아니라 유의하고 유사한 억압을 초래하였다. 연구 종결시, CD19-CAR+ 세포는 재-챌린지된 동물에서 여전히 검출가능하였고, CD47 발현은 tKO CD19-CAR-T 세포와 비교하여 HIP CD19-CAR-T 세포에서 유의하게 더 높았다.
실시예 10: HIP CD19-CAR-T 세포의 생체외 사이토카인-비의존적 증식
이 연구의 목적은 HIP CD19-CAR-T 세포가 잠재적 발암성 형질전환의 지표로서 IL2의 부재 하에 증식할 수 있는 능력을 가지고 있는지 여부를 결정하는 것이었다.
IL2의 존재 하에 배양된 CD19-CAR-T (대조군) 및 HIP CD19-CAR-T 세포는 0 일차와 비교하여 유사하게 증가된 세포 카운트를 나타냈고, 이는 비슷한 세포 증식을 시사한다. IL2의 부재 하에 배양된 CD19-CAR-T 세포 및 HIP CD19-CAR-T 세포는 비슷하였고 증식의 최소 증거, 감소된 생존 (감소된 세포 카운트) 및 결과적으로 12 일차까지 생존가능한 세포가 존재하지 않음을 나타냈다 (도 44).
HIP CD19-CAR-T 세포는 IL2의 부재 하에 증식을 나타내지 않았으며, 이는 게놈 변형이 잠재적 발암성 형질전환을 초래하지 않는다는 것을 시사한다. 추가로, HIP CD19-CAR-T 세포는 IL2의 존재 또는 부재 하에 CD19-CAR-T 세포와 비교할 때 유사한 행동을 보였다.
모든 제목 및 섹션 지정은 명확성 및 참조 목적으로만 사용되며, 임의의 방식으로든 제한하는 것으로 간주되지 않는다. 예를 들어, 당업자는 본원에 기재된 기술의 사상 및 범주에 따라 적절하게 상이한 제목 및 섹션으로부터의 다양한 실시양태를 조합하는 유용성을 인식할 것이다.
본원에 인용된 모든 참조문헌은 각각의 개별 공개물 또는 특허 또는 특허 출원이 모든 목적을 위해 그 전체가 참조로 원용될 것으로 구체적이고 개별적으로 표시된 것과 동일한 정도로 모든 목적을 위해 그 전체가 참조로 본원에 원용된다.
당업자에게 명백할 것인 바와 같이, 본 출원의 사상 및 범주를 벗어나지 않으면서 본 출원의 많은 변형 및 변동이 이루어질 수 있다. 본원에 기재된 구체적인 실시양태 및 실시예는 단지 예로서 제공되며, 출원은 첨부된 청구범위의 용어와 청구범위가 부여하는 등가물의 전체 범주에 의해서만 제한된다.
SEQUENCE LISTING
<110> Sana Biotechnology, Inc.
<120> METHODS AND COMPOSITIONS FOR MODULATING CAR-T ACTIVITY
<130> 122864-01-5058-WO
<150> PCT/US21/65157
<151> 2021-12-23
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<151> 2021-04-14
<150> 63/255,795
<151> 2021-10-14
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<160> 110
<170> PatentIn version 3.5
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cuggaugucg gaggaguacg 20
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acaguguaga cuugauugac 20
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1 5 10 15
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20
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Met Leu Leu Leu Val Thr Ser Leu Leu Leu Cys Glu Leu Pro His Pro
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Ala Phe Leu Leu Ile Pro
20
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Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp
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Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Ser Cys Pro
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Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe
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Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr
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Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val
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Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val
50 55 60
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65 70 75 80
Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu
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Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro
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Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala
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Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr
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Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu
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Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser
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Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser
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Leu Ser Leu Gly Lys
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Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys
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Phe Trp Val Leu Val Val Val Gly Gly Val Leu Ala Cys Tyr Ser Leu
1 5 10 15
Leu Val Thr Val Ala Phe Ile Ile Phe Trp Val
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Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu
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<223> Synthetic costimulatory domain
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Arg Ser Lys Arg Ser Arg Leu Leu His Ser Asp Tyr Met Asn Met Thr
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Pro Arg Arg Pro Gly Pro Thr Arg Lys His Tyr Gln Pro Tyr Ala Pro
20 25 30
Pro Arg Asp Phe Ala Ala Tyr Arg Ser
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Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly
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Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr
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Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys
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Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg
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Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala
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Asp Arg Val Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Lys Tyr
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gly Thr Val Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr His Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Asn Leu Glu Gln
65 70 75 80
Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Gly Asn Thr Leu Pro Tyr
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Thr Gly Ser Thr Ser Gly
100 105 110
Ser Gly Lys Pro Gly Ser Gly Glu Gly Ser Thr Lys Gly Glu Val Lys
115 120 125
Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Ala Pro Ser Gln Ser Leu Ser
130 135 140
Val Thr Cys Thr Val Ser Gly Val Ser Leu Pro Asp Tyr Gly Val Ser
145 150 155 160
Trp Ile Arg Gln Pro Pro Arg Lys Gly Leu Glu Trp Leu Gly Val Ile
165 170 175
Trp Gly Ser Glu Thr Thr Tyr Tyr Asn Ser Ala Leu Lys Ser Arg Leu
180 185 190
Thr Ile Ile Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gln Val Phe Leu Lys Met Asn
195 200 205
Ser Leu Gln Thr Asp Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys Ala Lys His Tyr
210 215 220
Tyr Tyr Gly Gly Ser Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser
225 230 235 240
Val Thr Val Ser Ser
245
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<213> Artificial Sequence
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<223> Synthetic amino acid
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Asp Ile Gln Met Thr Gln Thr Thr Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Lys Tyr
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gly Thr Val Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr His Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Asn Leu Glu Gln
65 70 75 80
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Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Thr
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<223> Synthetic amino acid
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<213> Artificial Sequence
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1
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Lys Gly
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<220>
<223> Synthetic amino acid
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1 5 10 15
Ser Leu Ser Val Thr Cys Thr Val Ser Gly Val Ser Leu Pro Asp Tyr
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Gly Val Ile Trp Gly Ser Glu Thr Thr Tyr Tyr Asn Ser Ala Leu Lys
50 55 60
Ser Arg Leu Thr Ile Ile Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gln Val Phe Leu
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Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser
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<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic amino acid
<400> 29
Asp Ile Gln Met Thr Gln Thr Thr Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Lys Tyr
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gly Thr Val Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr His Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Asn Leu Glu Gln
65 70 75 80
Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Gly Asn Thr Leu Pro Tyr
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Thr Gly Gly Gly Gly Ser
100 105 110
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Lys Leu Gln Glu
115 120 125
Ser Gly Pro Gly Leu Val Ala Pro Ser Gln Ser Leu Ser Val Thr Cys
130 135 140
Thr Val Ser Gly Val Ser Leu Pro Asp Tyr Gly Val Ser Trp Ile Arg
145 150 155 160
Gln Pro Pro Arg Lys Gly Leu Glu Trp Leu Gly Val Ile Trp Gly Ser
165 170 175
Glu Thr Thr Tyr Tyr Asn Ser Ala Leu Lys Ser Arg Leu Thr Ile Ile
180 185 190
Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gln Val Phe Leu Lys Met Asn Ser Leu Gln
195 200 205
Thr Asp Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys Ala Lys His Tyr Tyr Tyr Gly
210 215 220
Gly Ser Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val
225 230 235 240
Ser Ser
<210> 30
<211> 15
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic amino acid linker
<400> 30
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
1 5 10 15
<210> 31
<211> 1458
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic nucleotide sequence
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ggggggacca agctggagat cacaggtggc ggtggctcgg gcggtggtgg gtcgggtggc 420
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ctgtccgtca catgcactgt ctcaggggtc tcattacccg actatggtgt aagctggatt 540
cgccagcctc cacgaaaggg tctggagtgg ctgggagtaa tatggggtag tgaaaccaca 600
tactataatt cagctctcaa atccagactg accatcatca aggacaactc caagagccaa 660
gttttcttaa aaatgaacag tctgcaaact gatgacacag ccatttacta ctgtgccaaa 720
cattattact acggtggtag ctatgctatg gactactggg gccaaggaac ctcagtcacc 780
gtctcctcaa ccacgacgcc agcgccgcga ccaccaacac cggcgcccac catcgcgtcg 840
cagcccctgt ccctgcgccc agaggcgtgc cggccagcgg cggggggcgc agtgcacacg 900
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gtccttctcc tgtcactggt tatcaccctt tactgcaaac ggggcagaaa gaaactcctg 1020
tatatattca aacaaccatt tatgagacca gtacaaacta ctcaagagga agatggctgt 1080
agctgccgat ttccagaaga agaagaagga ggatgtgaac tgagagtgaa gttcagcagg 1140
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<210> 32
<211> 486
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic amino acid
<400> 32
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35 40 45
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Leu Ser Val Thr Cys Thr Val Ser Gly Val Ser Leu Pro Asp Tyr Gly
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Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp
290 295 300
Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly
305 310 315 320
Val Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys Lys Arg Gly Arg
325 330 335
Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro Val Gln
340 345 350
Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu
355 360 365
Glu Gly Gly Cys Glu Leu Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala
370 375 380
Pro Ala Tyr Lys Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu
385 390 395 400
Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp
405 410 415
Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu
420 425 430
Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile
435 440 445
Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr
450 455 460
Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met
465 470 475 480
Gln Ala Leu Pro Pro Arg
485
<210> 33
<211> 1383
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic nucleotide sequence
<400> 33
atgctgctgc tggtgaccag cctgctgctg tgcgagctgc cccaccccgc ctttctgctg 60
atccccgaca tccagatgac ccagaccacc tccagcctga gcgccagcct gggcgaccgg 120
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cccagccggt ttagcggcag cggctccggc accgactaca gcctgaccat ctccaacctg 300
gaacaggaag atatcgccac ctacttttgc cagcagggca acacactgcc ctacaccttt 360
ggcggcggaa caaagctgga aatcaccggc agcacctccg gcagcggcaa gcctggcagc 420
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cccagccaga gcctgagcgt gacctgcacc gtgagcggcg tgagcctgcc cgactacggc 540
gtgagctgga tccggcagcc ccccaggaag ggcctggaat ggctgggcgt gatctggggc 600
agcgagacca cctactacaa cagcgccctg aagagccggc tgaccatcat caaggacaac 660
agcaagagcc aggtgttcct gaagatgaac agcctgcaga ccgacgacac cgccatctac 720
tactgcgcca agcactacta ctacggcggc agctacgcca tggactactg gggccagggc 780
accagcgtga ccgtgagcag cgaatctaag tacggaccgc cctgcccccc ttgccctatg 840
ttctgggtgc tggtggtggt cggaggcgtg ctggcctgct acagcctgct ggtcaccgtg 900
gccttcatca tcttttgggt gaaacggggc agaaagaaac tcctgtatat attcaaacaa 960
ccatttatga gaccagtaca aactactcaa gaggaagatg gctgtagctg ccgatttcca 1020
gaagaagaag aaggaggatg tgaactgcgg gtgaagttca gcagaagcgc cgacgcccct 1080
gcctaccagc agggccagaa tcagctgtac aacgagctga acctgggcag aagggaagag 1140
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ggcctgtcca ccgccaccaa ggatacctac gacgccctgc acatgcaggc cctgccccca 1380
agg 1383
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<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic amino acid
<400> 34
Met Leu Leu Leu Val Thr Ser Leu Leu Leu Cys Glu Leu Pro His Pro
1 5 10 15
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Leu Ser Ala Ser Leu Gly Asp Arg Val Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser
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Gln Asp Ile Ser Lys Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gly
50 55 60
Thr Val Lys Leu Leu Ile Tyr His Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val
65 70 75 80
Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser Leu Thr
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Ile Ser Asn Leu Glu Gln Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln
100 105 110
Gly Asn Thr Leu Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile
115 120 125
Thr Gly Ser Thr Ser Gly Ser Gly Lys Pro Gly Ser Gly Glu Gly Ser
130 135 140
Thr Lys Gly Glu Val Lys Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Ala
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Pro Ser Gln Ser Leu Ser Val Thr Cys Thr Val Ser Gly Val Ser Leu
165 170 175
Pro Asp Tyr Gly Val Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Arg Lys Gly Leu
180 185 190
Glu Trp Leu Gly Val Ile Trp Gly Ser Glu Thr Thr Tyr Tyr Asn Ser
195 200 205
Ala Leu Lys Ser Arg Leu Thr Ile Ile Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gln
210 215 220
Val Phe Leu Lys Met Asn Ser Leu Gln Thr Asp Asp Thr Ala Ile Tyr
225 230 235 240
Tyr Cys Ala Lys His Tyr Tyr Tyr Gly Gly Ser Tyr Ala Met Asp Tyr
245 250 255
Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser Glu Ser Lys Tyr Gly
260 265 270
Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Met Phe Trp Val Leu Val Val Val Gly
275 280 285
Gly Val Leu Ala Cys Tyr Ser Leu Leu Val Thr Val Ala Phe Ile Ile
290 295 300
Phe Trp Val Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln
305 310 315 320
Pro Phe Met Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser
325 330 335
Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu Arg Val Lys
340 345 350
Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln
355 360 365
Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu
370 375 380
Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg
385 390 395 400
Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met
405 410 415
Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly
420 425 430
Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp
435 440 445
Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg
450 455 460
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic nucleotide sequence
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ggcgagggat ccaccaaggg cgaggtgaaa ctgcaggagt caggacctgg cctggtggcg 480
ccctcacaga gcctgtccgt cacatgcact gtctcagggg tctcattacc cgactatggt 540
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agtgaaacca catactataa ttcagctctc aaatccagac tgaccatcat caaggacaac 660
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tactgtgcca aacattatta ctacggtggt agctatgcta tggactactg gggtcaagga 780
acctcagtca ccgtctcctc agcggccgca attgaagtta tgtatcctcc tccttaccta 840
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<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic amino acid
<400> 36
Met Leu Leu Leu Val Thr Ser Leu Leu Leu Cys Glu Leu Pro His Pro
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Leu Ser Ala Ser Leu Gly Asp Arg Val Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser
35 40 45
Gln Asp Ile Ser Lys Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gly
50 55 60
Thr Val Lys Leu Leu Ile Tyr His Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val
65 70 75 80
Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser Leu Thr
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Ile Ser Asn Leu Glu Gln Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln
100 105 110
Gly Asn Thr Leu Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile
115 120 125
Thr Gly Ser Thr Ser Gly Ser Gly Lys Pro Gly Ser Gly Glu Gly Ser
130 135 140
Thr Lys Gly Glu Val Lys Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Ala
145 150 155 160
Pro Ser Gln Ser Leu Ser Val Thr Cys Thr Val Ser Gly Val Ser Leu
165 170 175
Pro Asp Tyr Gly Val Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Arg Lys Gly Leu
180 185 190
Glu Trp Leu Gly Val Ile Trp Gly Ser Glu Thr Thr Tyr Tyr Asn Ser
195 200 205
Ala Leu Lys Ser Arg Leu Thr Ile Ile Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gln
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Tyr Cys Ala Lys His Tyr Tyr Tyr Gly Gly Ser Tyr Ala Met Asp Tyr
245 250 255
Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser Ala Ala Ala Ile Glu
260 265 270
Val Met Tyr Pro Pro Pro Tyr Leu Asp Asn Glu Lys Ser Asn Gly Thr
275 280 285
Ile Ile His Val Lys Gly Lys His Leu Cys Pro Ser Pro Leu Phe Pro
290 295 300
Gly Pro Ser Lys Pro Phe Trp Val Leu Val Val Val Gly Gly Val Leu
305 310 315 320
Ala Cys Tyr Ser Leu Leu Val Thr Val Ala Phe Ile Ile Phe Trp Val
325 330 335
Arg Ser Lys Arg Ser Arg Leu Leu His Ser Asp Tyr Met Asn Met Thr
340 345 350
Pro Arg Arg Pro Gly Pro Thr Arg Lys His Tyr Gln Pro Tyr Ala Pro
355 360 365
Pro Arg Asp Phe Ala Ala Tyr Arg Ser Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser
370 375 380
Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu
385 390 395 400
Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg
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Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln
420 425 430
Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr
435 440 445
Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp
450 455 460
Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala
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<220>
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<223> Synthetic amino acid
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<400> 42
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<220>
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<400> 44
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Gly
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Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Gln Met Thr
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<400> 49
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<213> Artificial Sequence
<220>
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<400> 51
Gln Thr Ile Trp Ser Tyr
1 5
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<220>
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<400> 52
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1
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<212> PRT
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<220>
<223> Synthetic amino acid
<400> 53
Gln Gln Ser Tyr Ser Ile Pro Gln Thr
1 5
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<211> 246
<212> PRT
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<220>
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<400> 54
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Gln Arg Pro Gly Glu Ala Pro Asn Leu Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Ser
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<223> Synthetic amino acid
<400> 55
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<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic amino acid
<400> 56
Gly Asp Ser Val Ser Ser Asn Ser Val Ala
1 5 10
<210> 57
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic amino acid
<400> 57
Thr Tyr Tyr Arg Ser Thr Trp Tyr Asn
1 5
<210> 58
<211> 14
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic amino acid
<400> 58
Ala Arg Glu Val Thr Gly Asp Leu Glu Asp Ala Phe Asp Ile
1 5 10
<210> 59
<211> 107
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic amino acid
<400> 59
Asp Ile Gln Met Ile Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Thr Ile Trp Ser Tyr
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Arg Gln Arg Pro Gly Glu Ala Pro Asn Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Arg Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ala
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr Ser Ile Pro Gln
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 60
<211> 6
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic amino acid
<400> 60
Gln Thr Ile Trp Ser Tyr
1 5
<210> 61
<211> 3
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic amino acid
<400> 61
Ala Ala Ser
1
<210> 62
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic amino acid
<400> 62
Gln Gln Ser Tyr Ser Ile Pro Gln Thr
1 5
<210> 63
<211> 246
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic amino acid
<400> 63
Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala Met Ser Leu Gly
1 5 10 15
Lys Arg Ala Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Glu Ser Val Ser Val Ile
20 25 30
Gly Ala His Leu Ile His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro
35 40 45
Lys Leu Leu Ile Tyr Leu Ala Ser Asn Leu Glu Thr Gly Val Pro Ala
50 55 60
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Asp
65 70 75 80
Pro Val Glu Glu Asp Asp Val Ala Ile Tyr Ser Cys Leu Gln Ser Arg
85 90 95
Ile Phe Pro Arg Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Gly
100 105 110
Ser Thr Ser Gly Ser Gly Lys Pro Gly Ser Gly Glu Gly Ser Thr Lys
115 120 125
Gly Gln Ile Gln Leu Val Gln Ser Gly Pro Glu Leu Lys Lys Pro Gly
130 135 140
Glu Thr Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp
145 150 155 160
Tyr Ser Ile Asn Trp Val Lys Arg Ala Pro Gly Lys Gly Leu Lys Trp
165 170 175
Met Gly Trp Ile Asn Thr Glu Thr Arg Glu Pro Ala Tyr Ala Tyr Asp
180 185 190
Phe Arg Gly Arg Phe Ala Phe Ser Leu Glu Thr Ser Ala Ser Thr Ala
195 200 205
Tyr Leu Gln Ile Asn Asn Leu Lys Tyr Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Phe
210 215 220
Cys Ala Leu Asp Tyr Ser Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
225 230 235 240
Ser Val Thr Val Ser Ser
245
<210> 64
<211> 111
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic amino acid
<400> 64
Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala Met Ser Leu Gly
1 5 10 15
Lys Arg Ala Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Glu Ser Val Ser Val Ile
20 25 30
Gly Ala His Leu Ile His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro
35 40 45
Lys Leu Leu Ile Tyr Leu Ala Ser Asn Leu Glu Thr Gly Val Pro Ala
50 55 60
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Asp
65 70 75 80
Pro Val Glu Glu Asp Asp Val Ala Ile Tyr Ser Cys Leu Gln Ser Arg
85 90 95
Ile Phe Pro Arg Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 65
<211> 15
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic amino acid
<400> 65
Arg Ala Ser Glu Ser Val Ser Val Ile Gly Ala His Leu Ile His
1 5 10 15
<210> 66
<211> 7
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic amino acid
<400> 66
Leu Ala Ser Asn Leu Glu Thr
1 5
<210> 67
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic amino acid
<400> 67
Leu Gln Ser Arg Ile Phe Pro Arg Thr
1 5
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<211> 117
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic amino acid
<400> 68
Gln Ile Gln Leu Val Gln Ser Gly Pro Glu Leu Lys Lys Pro Gly Glu
1 5 10 15
Thr Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr
20 25 30
Ser Ile Asn Trp Val Lys Arg Ala Pro Gly Lys Gly Leu Lys Trp Met
35 40 45
Gly Trp Ile Asn Thr Glu Thr Arg Glu Pro Ala Tyr Ala Tyr Asp Phe
50 55 60
Arg Gly Arg Phe Ala Phe Ser Leu Glu Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Ile Asn Asn Leu Lys Tyr Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys
85 90 95
Ala Leu Asp Tyr Ser Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser
100 105 110
Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 69
<211> 5
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic amino acid
<400> 69
Asp Tyr Ser Ile Asn
1 5
<210> 70
<211> 17
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic amino acid
<400> 70
Trp Ile Asn Thr Glu Thr Arg Glu Pro Ala Tyr Ala Tyr Asp Phe Arg
1 5 10 15
Gly
<210> 71
<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic amino acid
<400> 71
Asp Tyr Ser Tyr Ala Met Asp Tyr
1 5
<210> 72
<211> 246
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic amino acid
<400> 72
Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Pro Ser Leu Ala Met Ser Leu Gly
1 5 10 15
Lys Arg Ala Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Glu Ser Val Thr Ile Leu
20 25 30
Gly Ser His Leu Ile Tyr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro
35 40 45
Thr Leu Leu Ile Gln Leu Ala Ser Asn Val Gln Thr Gly Val Pro Ala
50 55 60
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Arg Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Asp
65 70 75 80
Pro Val Glu Glu Asp Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Leu Gln Ser Arg
85 90 95
Thr Ile Pro Arg Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Gly
100 105 110
Ser Thr Ser Gly Ser Gly Lys Pro Gly Ser Gly Glu Gly Ser Thr Lys
115 120 125
Gly Gln Ile Gln Leu Val Gln Ser Gly Pro Glu Leu Lys Lys Pro Gly
130 135 140
Glu Thr Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Arg His
145 150 155 160
Tyr Ser Met Asn Trp Val Lys Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Lys Trp
165 170 175
Met Gly Arg Ile Asn Thr Glu Ser Gly Val Pro Ile Tyr Ala Asp Asp
180 185 190
Phe Lys Gly Arg Phe Ala Phe Ser Val Glu Thr Ser Ala Ser Thr Ala
195 200 205
Tyr Leu Val Ile Asn Asn Leu Lys Asp Glu Asp Thr Ala Ser Tyr Phe
210 215 220
Cys Ser Asn Asp Tyr Leu Tyr Ser Leu Asp Phe Trp Gly Gln Gly Thr
225 230 235 240
Ala Leu Thr Val Ser Ser
245
<210> 73
<211> 111
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic amino acid
<400> 73
Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Pro Ser Leu Ala Met Ser Leu Gly
1 5 10 15
Lys Arg Ala Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Glu Ser Val Thr Ile Leu
20 25 30
Gly Ser His Leu Ile Tyr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro
35 40 45
Thr Leu Leu Ile Gln Leu Ala Ser Asn Val Gln Thr Gly Val Pro Ala
50 55 60
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Arg Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Asp
65 70 75 80
Pro Val Glu Glu Asp Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Leu Gln Ser Arg
85 90 95
Thr Ile Pro Arg Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 74
<211> 15
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic amino acid
<400> 74
Arg Ala Ser Glu Ser Val Thr Ile Leu Gly Ser His Leu Ile Tyr
1 5 10 15
<210> 75
<211> 7
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic amino acid
<400> 75
Leu Ala Ser Asn Val Gln Thr
1 5
<210> 76
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic amino acid
<400> 76
Leu Gln Ser Arg Thr Ile Pro Arg Thr
1 5
<210> 77
<211> 117
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic amino acid
<400> 77
Gln Ile Gln Leu Val Gln Ser Gly Pro Glu Leu Lys Lys Pro Gly Glu
1 5 10 15
Thr Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Arg His Tyr
20 25 30
Ser Met Asn Trp Val Lys Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Lys Trp Met
35 40 45
Gly Arg Ile Asn Thr Glu Ser Gly Val Pro Ile Tyr Ala Asp Asp Phe
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Ala Phe Ser Val Glu Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Val Ile Asn Asn Leu Lys Asp Glu Asp Thr Ala Ser Tyr Phe Cys
85 90 95
Ser Asn Asp Tyr Leu Tyr Ser Leu Asp Phe Trp Gly Gln Gly Thr Ala
100 105 110
Leu Thr Val Ser Ser
115
<210> 78
<211> 5
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic amino acid
<400> 78
His Tyr Ser Met Asn
1 5
<210> 79
<211> 17
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic amino acid
<400> 79
Arg Ile Asn Thr Glu Ser Gly Val Pro Ile Tyr Ala Asp Asp Phe Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 80
<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic amino acid
<400> 80
Asp Tyr Leu Tyr Ser Leu Asp Phe
1 5
<210> 81
<211> 121
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic amino acid
<400> 81
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ser Ile Ser Gly Ser Gly Asp Tyr Ile Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Ile Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Glu Gly Thr Gly Ala Asn Ser Ser Leu Ala Asp Tyr Arg Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 82
<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic amino acid
<400> 82
Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr Ala
1 5
<210> 83
<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic amino acid
<400> 83
Ile Ser Gly Ser Gly Asp Tyr Ile
1 5
<210> 84
<211> 14
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic amino acid
<400> 84
Ala Lys Glu Gly Thr Gly Ala Asn Ser Ser Leu Ala Asp Tyr
1 5 10
<210> 85
<211> 42
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic hinge domain
<400> 85
Ala Ala Ala Ile Glu Val Met Tyr Pro Pro Pro Tyr Leu Asp Asn Glu
1 5 10 15
Lys Ser Asn Gly Thr Ile Ile His Val Lys Gly Lys His Leu Cys Pro
20 25 30
Ser Pro Leu Phe Pro Gly Pro Ser Lys Pro
35 40
<210> 86
<211> 28
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic transmembrane domain
<400> 86
Met Phe Trp Val Leu Val Val Val Gly Gly Val Leu Ala Cys Tyr Ser
1 5 10 15
Leu Leu Val Thr Val Ala Phe Ile Ile Phe Trp Val
20 25
<210> 87
<211> 112
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic signaling domain
<400> 87
Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Lys Gln Gly
1 5 10 15
Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr
20 25 30
Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys
35 40 45
Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys
50 55 60
Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg
65 70 75 80
Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala
85 90 95
Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg
100 105 110
<210> 88
<211> 1467
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic nucleotide sequence
<400> 88
atggccttac cagtgaccgc cttgctcctg ccgctggcct tgctgctcca cgccgccagg 60
ccggacatcc agatgacaca gactacatcc tccctgtctg cctctctggg agacagagtc 120
accatcagtt gcagggcaag tcaggacatt agtaaatatt taaattggta tcagcagaaa 180
ccagatggaa ctgttaaact cctgatctac catacatcaa gattacactc aggagtccca 240
tcaaggttca gtggcagtgg gtctggaaca gattattctc tcaccattag caacctggag 300
caagaagata ttgccactta cttttgccaa cagggtaata cgcttccgta cacgttcgga 360
ggggggacca agctggagat cacaggctcc acctctggat ccggcaagcc cggatctggc 420
gagggatcca ccaagggcga ggtgaaactg caggagtcag gacctggcct ggtggcgccc 480
tcacagagcc tgtccgtcac atgcactgtc tcaggggtct cattacccga ctatggtgta 540
agctggattc gccagcctcc acgaaagggt ctggagtggc tgggagtaat atggggtagt 600
gaaaccacat actataattc agctctcaaa tccagactga ccatcatcaa ggacaactcc 660
aagagccaag ttttcttaaa aatgaacagt ctgcaaactg atgacacagc catttactac 720
tgtgccaaac attattacta cggtggtagc tatgctatgg actactgggg ccaaggaacc 780
tcagtcaccg tctcctcaac cacgacgcca gcgccgcgac caccaacacc ggcgcccacc 840
atcgcgtcgc agcccctgtc cctgcgccca gaggcgtgcc ggccagcggc ggggggcgca 900
gtgcacacga gggggctgga cttcgcctgt gatatctaca tctgggcgcc cttggccggg 960
acttgtgggg tccttctcct gtcactggtt atcacccttt actgcaaacg gggcagaaag 1020
aaactcctgt atatattcaa acaaccattt atgagaccag tacaaactac tcaagaggaa 1080
gatggctgta gctgccgatt tccagaagaa gaagaaggag gatgtgaact gagagtgaag 1140
ttcagcagga gcgcagacgc ccccgcgtac cagcagggcc agaaccagct ctataacgag 1200
ctcaatctag gacgaagaga ggagtacgat gttttggaca agagacgtgg ccgggaccct 1260
gagatggggg gaaagccgag aaggaagaac cctcaggaag gcctgtacaa tgaactgcag 1320
aaagataaga tggcggaggc ctacagtgag attgggatga aaggcgagcg ccggaggggc 1380
aaggggcacg atggccttta ccagggtctc agtacagcca ccaaggacac ctacgacgcc 1440
cttcacatgc aggccctgcc ccctcgc 1467
<210> 89
<211> 489
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic amino acid
<400> 89
Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu
1 5 10 15
His Ala Ala Arg Pro Asp Ile Gln Met Thr Gln Thr Thr Ser Ser Leu
20 25 30
Ser Ala Ser Leu Gly Asp Arg Val Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Gln
35 40 45
Asp Ile Ser Lys Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gly Thr
50 55 60
Val Lys Leu Leu Ile Tyr His Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro
65 70 75 80
Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser Leu Thr Ile
85 90 95
Ser Asn Leu Glu Gln Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Gly
100 105 110
Asn Thr Leu Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Thr
115 120 125
Gly Ser Thr Ser Gly Ser Gly Lys Pro Gly Ser Gly Glu Gly Ser Thr
130 135 140
Lys Gly Glu Val Lys Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Ala Pro
145 150 155 160
Ser Gln Ser Leu Ser Val Thr Cys Thr Val Ser Gly Val Ser Leu Pro
165 170 175
Asp Tyr Gly Val Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Arg Lys Gly Leu Glu
180 185 190
Trp Leu Gly Val Ile Trp Gly Ser Glu Thr Thr Tyr Tyr Asn Ser Ala
195 200 205
Leu Lys Ser Arg Leu Thr Ile Ile Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gln Val
210 215 220
Phe Leu Lys Met Asn Ser Leu Gln Thr Asp Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr
225 230 235 240
Cys Ala Lys His Tyr Tyr Tyr Gly Gly Ser Tyr Ala Met Asp Tyr Trp
245 250 255
Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser Thr Thr Thr Pro Ala Pro
260 265 270
Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu
275 280 285
Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg
290 295 300
Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly
305 310 315 320
Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys Lys
325 330 335
Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met Arg
340 345 350
Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe Pro
355 360 365
Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser
370 375 380
Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu
385 390 395 400
Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg
405 410 415
Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln
420 425 430
Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr
435 440 445
Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp
450 455 460
Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala
465 470 475 480
Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg
485
<210> 90
<211> 243
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic amino acid
<400> 90
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Tyr
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Lys Tyr Asp Leu Leu Thr
85 90 95
Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Gly Ser Thr Ser Gly Ser
100 105 110
Gly Lys Pro Gly Ser Gly Glu Gly Ser Thr Lys Gly Gln Leu Gln Leu
115 120 125
Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu Thr Leu Ser Leu
130 135 140
Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Ile Ser Ser Ser Ser Tyr Tyr Trp
145 150 155 160
Gly Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile Gly Ser
165 170 175
Ile Ser Tyr Ser Gly Ser Thr Tyr Tyr Asn Pro Ser Leu Lys Ser Arg
180 185 190
Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu Lys Leu
195 200 205
Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Asp
210 215 220
Arg Gly Asp Thr Ile Leu Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Met Val Thr
225 230 235 240
Val Ser Ser
<210> 91
<211> 106
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic amino acid
<400> 91
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Tyr
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Lys Tyr Asp Leu Leu Thr
85 90 95
Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 92
<211> 6
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic amino acid
<400> 92
Gln Ser Ile Ser Ser Tyr
1 5
<210> 93
<211> 3
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic amino acid
<400> 93
Ala Ala Ser
1
<210> 94
<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic amino acid
<400> 94
Gln Gln Lys Tyr Asp Leu Leu Thr
1 5
<210> 95
<211> 119
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic amino acid
<400> 95
Gln Leu Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Ile Ser Ser Ser
20 25 30
Ser Tyr Tyr Trp Gly Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu
35 40 45
Trp Ile Gly Ser Ile Ser Tyr Ser Gly Ser Thr Tyr Tyr Asn Pro Ser
50 55 60
Leu Lys Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe
65 70 75 80
Ser Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr
85 90 95
Cys Ala Arg Asp Arg Gly Asp Thr Ile Leu Asp Val Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Met Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 96
<211> 10
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic amino acid
<400> 96
Gly Gly Ser Ile Ser Ser Ser Ser Tyr Tyr
1 5 10
<210> 97
<211> 7
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic amino acid
<400> 97
Ile Ser Tyr Ser Gly Ser Thr
1 5
<210> 98
<211> 11
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic amino acid
<400> 98
Ala Arg Asp Arg Gly Asp Thr Ile Leu Asp Val
1 5 10
<210> 99
<211> 1503
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic nucleotide sequence
<400> 99
atggccttac cagtgaccgc cttgctcctg ccgctggcct tgctgctcca cgccgccagg 60
ccggacatcc agatgaccca gtctccatcc tccctgtctg catctgtagg agacagagtc 120
accatcactt gccgggcaag tcagagcatt agcagctatt taaattggta tcagcagaaa 180
ccagggaaag cccctaagct cctgatctat gctgcatcca gtttgcaaag tggggtccca 240
tcaaggttca gtggcagtgg atctgggaca gatttcactc tcaccatcag cagtctgcaa 300
cctgaagatt ttgcaactta ctactgtcag caaaaatacg acctcctcac ttttggcgga 360
gggaccaagg ttgagatcaa aggcagcacc agcggctccg gcaagcctgg ctctggcgag 420
ggcagcacaa agggacagct gcagctgcag gagtcgggcc caggactggt gaagccttcg 480
gagaccctgt ccctcacctg cactgtctct ggtggctcca tcagcagtag tagttactac 540
tggggctgga tccgccagcc cccagggaag gggctggagt ggattgggag tatctcctat 600
agtgggagca cctactacaa cccgtccctc aagagtcgag tcaccatatc cgtagacacg 660
tccaagaacc agttctccct gaagctgagt tctgtgaccg ccgcagacac ggcggtgtac 720
tactgcgcca gagatcgtgg agacaccata ctagacgtat ggggtcaggg tacaatggtc 780
accgtcagct cattcgtgcc cgtgttcctg cccgccaaac ctaccaccac ccctgcccct 840
agacctccca ccccagcccc aacaatcgcc agccagcctc tgtctctgcg gcccgaagcc 900
tgtagacctg ctgccggcgg agccgtgcac accagaggcc tggacttcgc ctgcgacatc 960
tacatctggg cccctctggc cggcacctgt ggcgtgctgc tgctgagcct ggtgatcacc 1020
ctgtactgca accaccggaa caaacggggc agaaagaaac tcctgtatat attcaaacaa 1080
ccatttatga gaccagtaca aactactcaa gaggaagatg gctgtagctg ccgatttcca 1140
gaagaagaag aaggaggatg tgaactgaga gtgaagttca gcagatccgc cgacgcccct 1200
gcctaccagc agggacagaa ccagctgtac aacgagctga acctgggcag acgggaagag 1260
tacgacgtgc tggacaagcg gagaggccgg gaccccgaga tgggcggaaa gcccagacgg 1320
aagaaccccc aggaaggcct gtataacgaa ctgcagaaag acaagatggc cgaggcctac 1380
agcgagatcg gcatgaaggg cgagcggagg cgcggcaagg gccacgatgg cctgtaccag 1440
ggcctgagca ccgccaccaa ggacacctac gacgccctgc acatgcaggc cctgcccccc 1500
aga 1503
<210> 100
<211> 501
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic amino acid
<400> 100
Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu
1 5 10 15
His Ala Ala Arg Pro Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu
20 25 30
Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln
35 40 45
Ser Ile Ser Ser Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala
50 55 60
Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro
65 70 75 80
Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile
85 90 95
Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Lys
100 105 110
Tyr Asp Leu Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Gly
115 120 125
Ser Thr Ser Gly Ser Gly Lys Pro Gly Ser Gly Glu Gly Ser Thr Lys
130 135 140
Gly Gln Leu Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser
145 150 155 160
Glu Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Ile Ser Ser
165 170 175
Ser Ser Tyr Tyr Trp Gly Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu
180 185 190
Glu Trp Ile Gly Ser Ile Ser Tyr Ser Gly Ser Thr Tyr Tyr Asn Pro
195 200 205
Ser Leu Lys Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln
210 215 220
Phe Ser Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr
225 230 235 240
Tyr Cys Ala Arg Asp Arg Gly Asp Thr Ile Leu Asp Val Trp Gly Gln
245 250 255
Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser Phe Val Pro Val Phe Leu Pro Ala
260 265 270
Lys Pro Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr
275 280 285
Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala
290 295 300
Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp Ile
305 310 315 320
Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser
325 330 335
Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys Asn His Arg Asn Lys Arg Gly Arg Lys
340 345 350
Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro Val Gln Thr
355 360 365
Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu
370 375 380
Gly Gly Cys Glu Leu Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro
385 390 395 400
Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly
405 410 415
Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro
420 425 430
Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr
435 440 445
Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly
450 455 460
Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln
465 470 475 480
Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln
485 490 495
Ala Leu Pro Pro Arg
500
<210> 101
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic guide sequence
<400> 101
gauauuggca uaagccuccc 20
<210> 102
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic guide sequence
<400> 102
agagucucuc agcugguaca 20
<210> 103
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic guide sequence
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(20)
<223> n is a, c, g, or u
<400> 103
nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 20
<210> 104
<211> 12
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic guide sequence
<400> 104
guuuuagagc ua 12
<210> 105
<211> 4
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic guide sequence
<400> 105
gaaa 4
<210> 106
<211> 63
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic guide sequence
<400> 106
uagcaaguua aaauaaggcu aguccguuau caacuugaaa aaguggcacc gagucggugc 60
uuu 63
<210> 107
<211> 99
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic guide sequence
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(20)
<223> n is a, c, g, or u
<400> 107
nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60
cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuu 99
<210> 108
<211> 305
<212> PRT
<213> Human adenovirus type 47
<400> 108
Gln Leu Leu Phe Asn Lys Thr Lys Ser Val Glu Phe Thr Phe Cys Asn
1 5 10 15
Asp Thr Val Val Ile Pro Cys Phe Val Thr Asn Met Glu Ala Gln Asn
20 25 30
Thr Thr Glu Val Tyr Val Lys Trp Lys Phe Lys Gly Arg Asp Ile Tyr
35 40 45
Thr Phe Asp Gly Ala Leu Asn Lys Ser Thr Val Pro Thr Asp Phe Ser
50 55 60
Ser Ala Lys Ile Glu Val Ser Gln Leu Leu Lys Gly Asp Ala Ser Leu
65 70 75 80
Lys Met Asp Lys Ser Asp Ala Val Ser His Thr Gly Asn Tyr Thr Cys
85 90 95
Glu Val Thr Glu Leu Thr Arg Glu Gly Glu Thr Ile Ile Glu Leu Lys
100 105 110
Tyr Arg Val Val Ser Trp Phe Ser Pro Asn Glu Asn Ile Leu Ile Val
115 120 125
Ile Phe Pro Ile Phe Ala Ile Leu Leu Phe Trp Gly Gln Phe Gly Ile
130 135 140
Lys Thr Leu Lys Tyr Arg Ser Gly Gly Met Asp Glu Lys Thr Ile Ala
145 150 155 160
Leu Leu Val Ala Gly Leu Val Ile Thr Val Ile Val Ile Val Gly Ala
165 170 175
Ile Leu Phe Val Pro Gly Glu Tyr Ser Leu Lys Asn Ala Thr Gly Leu
180 185 190
Gly Leu Ile Val Thr Ser Thr Gly Ile Leu Ile Leu Leu His Tyr Tyr
195 200 205
Val Phe Ser Thr Ala Ile Gly Leu Thr Ser Phe Val Ile Ala Ile Leu
210 215 220
Val Ile Gln Val Ile Ala Tyr Ile Leu Ala Val Val Gly Leu Ser Leu
225 230 235 240
Cys Ile Ala Ala Cys Ile Pro Met His Gly Pro Leu Leu Ile Ser Gly
245 250 255
Leu Ser Ile Leu Ala Leu Ala Gln Leu Leu Gly Leu Val Tyr Met Lys
260 265 270
Phe Val Ala Ser Asn Gln Lys Thr Ile Gln Pro Pro Arg Lys Ala Val
275 280 285
Glu Glu Pro Leu Asn Ala Phe Lys Glu Ser Lys Gly Met Met Asn Asp
290 295 300
Glu
305
<210> 109
<211> 323
<212> PRT
<213> Human adenovirus type 47
<400> 109
Met Trp Pro Leu Val Ala Ala Leu Leu Leu Gly Ser Ala Cys Cys Gly
1 5 10 15
Ser Ala Gln Leu Leu Phe Asn Lys Thr Lys Ser Val Glu Phe Thr Phe
20 25 30
Cys Asn Asp Thr Val Val Ile Pro Cys Phe Val Thr Asn Met Glu Ala
35 40 45
Gln Asn Thr Thr Glu Val Tyr Val Lys Trp Lys Phe Lys Gly Arg Asp
50 55 60
Ile Tyr Thr Phe Asp Gly Ala Leu Asn Lys Ser Thr Val Pro Thr Asp
65 70 75 80
Phe Ser Ser Ala Lys Ile Glu Val Ser Gln Leu Leu Lys Gly Asp Ala
85 90 95
Ser Leu Lys Met Asp Lys Ser Asp Ala Val Ser His Thr Gly Asn Tyr
100 105 110
Thr Cys Glu Val Thr Glu Leu Thr Arg Glu Gly Glu Thr Ile Ile Glu
115 120 125
Leu Lys Tyr Arg Val Val Ser Trp Phe Ser Pro Asn Glu Asn Ile Leu
130 135 140
Ile Val Ile Phe Pro Ile Phe Ala Ile Leu Leu Phe Trp Gly Gln Phe
145 150 155 160
Gly Ile Lys Thr Leu Lys Tyr Arg Ser Gly Gly Met Asp Glu Lys Thr
165 170 175
Ile Ala Leu Leu Val Ala Gly Leu Val Ile Thr Val Ile Val Ile Val
180 185 190
Gly Ala Ile Leu Phe Val Pro Gly Glu Tyr Ser Leu Lys Asn Ala Thr
195 200 205
Gly Leu Gly Leu Ile Val Thr Ser Thr Gly Ile Leu Ile Leu Leu His
210 215 220
Tyr Tyr Val Phe Ser Thr Ala Ile Gly Leu Thr Ser Phe Val Ile Ala
225 230 235 240
Ile Leu Val Ile Gln Val Ile Ala Tyr Ile Leu Ala Val Val Gly Leu
245 250 255
Ser Leu Cys Ile Ala Ala Cys Ile Pro Met His Gly Pro Leu Leu Ile
260 265 270
Ser Gly Leu Ser Ile Leu Ala Leu Ala Gln Leu Leu Gly Leu Val Tyr
275 280 285
Met Lys Phe Val Ala Ser Asn Gln Lys Thr Ile Gln Pro Pro Arg Lys
290 295 300
Ala Val Glu Glu Pro Leu Asn Ala Phe Lys Glu Ser Lys Gly Met Met
305 310 315 320
Asn Asp Glu
<210> 110
<211> 18
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic amino acid linker
<400> 110
Gly Ser Thr Ser Gly Ser Gly Lys Pro Gly Ser Gly Glu Gly Ser Thr
1 5 10 15
Lys Gly
Claims (227)
- 야생형 세포 또는 대조군 세포에 비해 HLA-A, HLA-B, HLA-C, HLA-DP, HLA-DQ, HLA-DR, B2M, CIITA, TCR-알파 및/또는 TCR-베타의 감소된 발현을 포함하는 조작된 세포로서,
상기 조작된 세포는 CD47을 코딩하는 제1 외인성 폴리뉴클레오티드 및 키메라 항원 수용체 (CAR)를 코딩하는 제2 외인성 폴리뉴클레오티드를 포함하는 외인성 폴리뉴클레오티드의 세트를 추가로 포함하며, 여기서 제1 및/또는 제2 외인성 폴리뉴클레오티드는 세포의 하나 이상의 대립 유전자의 특이적 유전자좌 내로 삽입되는, 조작된 세포. - 제1항에 있어서,
상기 특이적 유전자좌가 세이프 하버 또는 표적 유전자좌, B2M 유전자좌, CIITA 유전자좌, TRAC 유전자좌 및 TRB 유전자좌로 이루어진 군으로부터 선택되는, 조작된 세포. - 제2항에 있어서,
상기 CD47을 코딩하는 제1 외인성 폴리뉴클레오티드가 세이프 하버 또는 표적 유전자좌, B2M 유전자좌, CIITA 유전자좌, TRAC 유전자좌 및 TRB 유전자좌로 이루어진 군으로부터 선택된 특이적 유전자좌 내로 삽입되는, 조작된 세포. - 제2항 또는 제3항에 있어서,
상기 CAR을 코딩하는 제2 외인성 폴리뉴클레오티드가 세이프 하버 또는 표적 유전자좌, B2M 유전자좌, CIITA 유전자좌, TRAC 유전자좌 및 TRB 유전자좌로 이루어진 군으로부터 선택된 특이적 유전자좌 내로 삽입되는, 조작된 세포. - 제2항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 CD47을 코딩하는 제1 외인성 폴리뉴클레오티드 및 CAR을 코딩하는 제2 외인성 폴리뉴클레오티드가 상이한 유전자좌 내로 삽입되는, 조작된 세포. - 제2항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 CD47을 코딩하는 제1 외인성 폴리뉴클레오티드 및 CAR을 코딩하는 제2 외인성 폴리뉴클레오티드가 동일한 유전자좌 내로 삽입되는, 조작된 세포. - 제2항 내지 제4항 또는 제6항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 CD47을 코딩하는 제1 외인성 폴리뉴클레오티드 및 CAR을 코딩하는 제2 외인성 폴리뉴클레오티드가 B2M 유전자좌 내로 삽입되는, 조작된 세포. - 제2항 내지 제4항 또는 제6항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 CD47을 코딩하는 제1 외인성 폴리뉴클레오티드 및 CAR을 코딩하는 제2 외인성 폴리뉴클레오티드가 CIITA 유전자좌 내로 삽입되는, 조작된 세포. - 제2항 내지 제4항 또는 제6항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 CD47을 코딩하는 제1 외인성 폴리뉴클레오티드 및 CAR을 코딩하는 제2 외인성 폴리뉴클레오티드가 TRAC 유전자좌 내로 삽입되는, 조작된 세포. - 제2항 내지 제4항 또는 제6항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 CD47을 코딩하는 제1 외인성 폴리뉴클레오티드 및 CAR을 코딩하는 제2 외인성 폴리뉴클레오티드가 TRB 유전자좌 내로 삽입되는, 조작된 세포. - 제2항 내지 제4항 또는 제6항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 CD47을 코딩하는 제1 외인성 폴리뉴클레오티드 및 CAR을 코딩하는 제2 외인성 폴리뉴클레오티드가 세이프 하버 또는 표적 유전자좌 내로 삽입되는, 조작된 세포. - 제2항 내지 제6항 또는 제11항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 세이프 하버 유전자좌가 CCR5 유전자 유전자좌, PPP1R12C 유전자 유전자좌, CLYBL 유전자 유전자좌 및 Rosa 유전자 유전자좌로 이루어진 군으로부터 선택되고, 상기 표적 유전자좌가 CXCR4 유전자 유전자좌, 알부민 유전자 유전자좌, SHS231 유전자 유전자좌, F3 (CD142) 유전자 유전자좌, MICA 유전자 유전자좌, MICB 유전자 유전자좌, LRP1 (CD91) 유전자 유전자좌, HMGB1 유전자 유전자좌, ABO 유전자 유전자좌, ad RHD 유전자 유전자좌, FUT1 유전자좌 및 KDM5D 유전자 유전자좌로 이루어진 군으로부터 선택되는, 조작된 세포. - 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 CAR이 CD19-특이적 CAR 및 CD22-특이적 CAR로 이루어진 군으로부터 선택되는, 조작된 세포. - 제13항에 있어서,
상기 CD19-특이적 CAR이 악시카브타진 실로류셀, 리소카브타진 마라류셀, 브렉수카브타진 오토류셀 및 티사젠렉류셀로 이루어진 군으로부터 선택된 CAR-T 세포 기반 요법 중 어느 하나의 CD19-특이적 CAR과 실질적으로 동등한, 조작된 세포. - 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 CAR이 이중특이적 CAR인, 조작된 세포. - 제14항에 있어서,
상기 CAR이 CD19/CD22-이중특이적 CAR인, 조작된 세포. - 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 조작된 세포가 HLA-A, HLA-B 및/또는 HLA-C 항원을 발현하지 않는 것인, 조작된 세포. - 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 조작된 세포가 B2M을 발현하지 않는 것인, 조작된 세포. - 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 조작된 세포가 HLA-DP, HLA-DQ 및/또는 HLA-DR 항원을 발현하지 않는 것인, 조작된 세포. - 제1항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 조작된 세포가 CIITA를 발현하지 않는 것인, 조작된 세포. - 제1항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 조작된 세포가 만능 줄기 세포, 유도 만능 줄기 세포, 유도 만능 줄기 세포로부터 분화된 T 세포, 일차 T 세포, 및 일차 T 세포로부터 유래된 세포로 이루어진 군으로부터 선택되고, 상기 조작된 세포가 TCR-알파 및/또는 TCR-베타를 발현하지 않는 것인, 조작된 세포. - 제1항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 조작된 세포가 만능 줄기 세포인 것인, 조작된 세포. - 제1항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 조작된 세포가 유도 만능 줄기 세포인 것인, 조작된 세포. - 제1항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 조작된 세포가 유도 만능 줄기 세포로부터 유래된 분화된 세포인 것인, 조작된 세포. - 제24항에 있어서,
상기 분화된 세포가 NK 세포 및 T 세포로 이루어진 군으로부터 선택되는, 조작된 세포. - 제1항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 조작된 세포가 일차 T 세포로부터 유래된 세포인 것인, 조작된 세포. - 제26항에 있어서,
상기 일차 T 세포로부터 유래된 세포가 수용자 대상체와 상이한 1 명 이상의 공여자 대상체로부터의 일차 T 세포를 포함하는 T 세포의 풀로부터 유래되는, 조작된 세포. - 제1항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 조작된 세포가 다능성을 유지하고/하거나 분화 잠재력을 유지하는 것인, 조작된 세포. - 제1항 내지 제28항 중 어느 한 항에 있어서,
제1 대상체 내로 전달된 후, 상기 조작된 세포가 제2 대상체 내로 전달된 후에 야생형 세포와 비교하여 감소되는, (a) T 세포 반응, (b) NK 세포 반응 및 (c) 대식세포 반응으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 반응을 나타내는 것인, 조작된 세포. - 제1항 내지 제29항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 제1 대상체 및 제2 대상체가 상이한 대상체인, 조작된 세포. - 제29항 또는 제30항에 있어서,
상기 대식세포 반응이 탐식(engulfment)인, 조작된 세포. - 제1항 내지 제31항 중 어느 한 항에 있어서,
대상체 내로 전달된 후, 상기 조작된 세포가 대상체 내로 전달된 후에 야생형 세포와 비교하여, (a) 대상체 내의 감소된 TH1 활성화, (b) 대상체 내의 감소된 NK 세포 살해 및 (c) 대상체 내의 전체 PBMC에 의한 감소된 살해로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상을 나타내는 것인, 조작된 세포. - 제1항 내지 제32항 중 어느 한 항에 있어서,
대상체 내로 전달된 후, 상기 조작된 세포가 대상체 내로 전달된 후에 야생형 세포와 비교하여, (a) 대상체 내의 감소된 공여자 특이적 항체, (b) 대상체 내의 감소된 IgM 또는 IgG 항체, 및 (c) 대상체 내의 감소된 보체-의존적 세포독성 (CDC)으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상을 이끌어내는 것인, 조작된 세포. - 제1항 내지 제33항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 조작된 세포가 만능 줄기 세포, 유도 만능 줄기 세포, 유도 만능 줄기 세포로부터 분화된 T 세포, 일차 T 세포, 및 일차 T 세포로부터 유래된 세포로 이루어진 군으로부터 선택되고, 상기 조작된 세포가 TRAC 유전자좌 내로 삽입된, CD47을 코딩하는 제1 외인성 폴리뉴클레오티드 및/또는 CAR을 코딩하는 제2 외인성 폴리뉴클레오티드를 포함하는 B2Mindel/indel, CIITAindel/indel, TRACindel/indel 세포인 것인, 조작된 세포. - 제1항 내지 제34항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 조작된 세포가 만능 줄기 세포, 유도 만능 줄기 세포, 유도 만능 줄기 세포로부터 분화된 T 세포, 일차 T 세포, 및 일차 T 세포로부터 유래된 세포로 이루어진 군으로부터 선택되고, 상기 조작된 세포가 TRAC 유전자좌 내로 삽입된, CD47을 코딩하는 제1 외인성 폴리뉴클레오티드 및 CAR을 코딩하는 제2 외인성 폴리뉴클레오티드를 포함하는 B2Mindel/indel, CIITAindel/indel, TRACindel/indel 세포인 것인, 조작된 세포. - 제1항 내지 제33항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 조작된 세포가 만능 줄기 세포, 유도 만능 줄기 세포, 유도 만능 줄기 세포로부터 분화된 T 세포, 일차 T 세포, 및 일차 T 세포로부터 유래된 세포로 이루어진 군으로부터 선택되고, 상기 조작된 세포가 TRB 유전자좌 내로 삽입된, CD47을 코딩하는 제1 외인성 폴리뉴클레오티드 및/또는 CAR을 코딩하는 제2 외인성 폴리뉴클레오티드를 포함하는 B2Mindel/indel, CIITAindel/indel, TRACindel/indel 세포인 것인, 조작된 세포. - 제1항 내지 제33항 또는 제36항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 조작된 세포가 만능 줄기 세포, 유도 만능 줄기 세포, 유도 만능 줄기 세포로부터 분화된 T 세포, 일차 T 세포, 및 일차 T 세포로부터 유래된 세포로 이루어진 군으로부터 선택되고, 상기 조작된 세포가 TRB 유전자좌 내로 삽입된, CD47을 코딩하는 제1 외인성 폴리뉴클레오티드 및 CAR을 코딩하는 제2 외인성 폴리뉴클레오티드를 포함하는 B2Mindel/indel, CIITAindel/indel, TRACindel/indel 세포인 것인, 조작된 세포. - 제1항 내지 제33항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 조작된 세포가 만능 줄기 세포, 유도 만능 줄기 세포, 유도 만능 줄기 세포로부터 분화된 T 세포, 일차 T 세포, 및 일차 T 세포로부터 유래된 세포로 이루어진 군으로부터 선택되고, 상기 조작된 세포가 B2M 유전자좌 내로 삽입된, CD47을 코딩하는 제1 외인성 폴리뉴클레오티드 및/또는 CAR을 코딩하는 제2 외인성 폴리뉴클레오티드를 포함하는 B2Mindel/indel, CIITAindel/indel, TRACindel/indel 세포인 것인, 조작된 세포. - 제1항 내지 제33항 또는 제38항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 조작된 세포가 만능 줄기 세포, 유도 만능 줄기 세포, 유도 만능 줄기 세포로부터 분화된 T 세포, 일차 T 세포, 및 일차 T 세포로부터 유래된 세포로 이루어진 군으로부터 선택되고, 상기 조작된 세포가 B2M 유전자좌 내로 삽입된, CD47을 코딩하는 제1 외인성 폴리뉴클레오티드 및 CAR을 코딩하는 제2 외인성 폴리뉴클레오티드를 포함하는 B2Mindel/indel, CIITAindel/indel, TRACindel/indel 세포인 것인, 조작된 세포. - 제1항 내지 제33항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 조작된 세포가 만능 줄기 세포, 유도 만능 줄기 세포, 유도 만능 줄기 세포로부터 분화된 T 세포, 일차 T 세포, 및 일차 T 세포로부터 유래된 세포로 이루어진 군으로부터 선택되고, 상기 조작된 세포가 CIITA 유전자좌 내로 삽입된, CD47을 코딩하는 제1 외인성 폴리뉴클레오티드 및/또는 CAR을 코딩하는 제2 외인성 폴리뉴클레오티드를 포함하는 B2Mindel/indel, CIITAindel/indel, TRACindel/indel 세포인 것인, 조작된 세포. - 제1항 내지 제33항 또는 제40항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 조작된 세포가 만능 줄기 세포, 유도 만능 줄기 세포, 유도 만능 줄기 세포로부터 분화된 T 세포, 일차 T 세포, 및 일차 T 세포로부터 유래된 세포로 이루어진 군으로부터 선택되고, 상기 조작된 세포가 CIITA 유전자좌 내로 삽입된, CD47을 코딩하는 제1 외인성 폴리뉴클레오티드 및 CAR을 코딩하는 제2 외인성 폴리뉴클레오티드를 포함하는 B2Mindel/indel, CIITAindel/indel, TRACindel/indel 세포인 것인, 조작된 세포. - 야생형 세포 또는 대조군 세포에 비해, HLA-A, HLA-B, HLA-C, HLA-DP, HLA-DQ, HLA-DR, B2M, CIITA, TCR-알파 및/또는 TCR-베타의 감소된 발현을 포함하는 조작된 세포.
- 제42항에 있어서,
상기 조작된 세포가 HLA-A, HLA-B 및/또는 HLA-C 항원을 발현하지 않는 것인, 조작된 세포. - 제42항 또는 제43항에 있어서,
상기 조작된 세포가 CIITA를 발현하지 않는 것인, 조작된 세포. - 제42항 내지 제44항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 조작된 세포가 HLA-DP, HLA-DQ 및/또는 HLA-DR 항원을 발현하지 않는 것인, 조작된 세포. - 제42항 내지 제45항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 조작된 세포가 B2M을 발현하지 않는 것인, 조작된 세포. - 제42항 내지 제46항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 조작된 세포가 만능 줄기 세포, 유도 만능 줄기 세포, 유도 만능 줄기 세포로부터 분화된 T 세포, 일차 T 세포, 및 일차 T 세포로부터 유래된 세포로 이루어진 군으로부터 선택되고, 상기 조작된 세포가 TCR-알파를 발현하지 않는 것인, 조작된 세포. - 제42항 내지 제47항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 조작된 세포가 만능 줄기 세포, 유도 만능 줄기 세포, 유도 만능 줄기 세포로부터 분화된 T 세포, 일차 T 세포, 및 일차 T 세포로부터 유래된 세포로 이루어진 군으로부터 선택되고, 상기 조작된 세포가 TCR-베타를 발현하지 않는 것인, 조작된 세포. - 제42항 내지 제48항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 조작된 세포가 야생형 세포 또는 대조군 세포에 비해 CD47을 과발현하는 것인, 조작된 세포. - 제42항 내지 제49항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 조작된 세포가 만능 줄기 세포인 것인, 조작된 세포. - 제42항 내지 제50항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 조작된 세포가 유도 만능 줄기 세포인 것인, 조작된 세포. - 제42항 내지 제49항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 조작된 세포가 유도 만능 줄기 세포로부터 유래된 분화된 세포인 것인, 조작된 세포. - 제52항에 있어서,
상기 분화된 세포가 NK 세포 및 T 세포로 이루어진 군으로부터 선택되는, 조작된 세포. - 제42항 내지 제51항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 조작된 세포가 일차 T 세포로부터 유래된 세포인 것인, 조작된 세포. - 제54항에 있어서,
상기 일차 T 세포로부터 유래된 세포가 수용자 대상체와 상이한 하나 이상의 공여자 대상체로부터의 일차 T 세포를 포함하는 T 세포의 풀로부터 유래되는, 조작된 세포. - 제42항 내지 제51항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 조작된 세포가 다능성을 유지하고/하거나 분화 잠재력을 유지하는 것인, 조작된 세포. - 제42항 내지 제56항 중 어느 한 항에 있어서,
제1 대상체 내로 전달된 후, 상기 조작된 세포가 제2 대상체 내로 전달된 후에 야생형 세포와 비교하여 감소되는, (a) T 세포 반응, (b) NK 세포 반응 및 (c) 대식세포 반응으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 반응을 나타내는, 조작된 세포. - 제57항에 있어서,
상기 제1 대상체 및 제2 대상체가 상이한 대상체인, 조작된 세포. - 제57항 또는 제58항에 있어서,
상기 대식세포 반응이 탐식인, 조작된 세포. - 제42항 내지 제59항 중 어느 한 항에 있어서,
대상체 내로 전달된 후, 상기 조작된 세포가 대상체 내로 전달된 후에 야생형 세포와 비교하여, (a) 대상체 내의 감소된 TH1 활성화, (b) 대상체 내의 감소된 NK 세포 살해 및 (c) 대상체 내의 전체 PBMC에 의한 감소된 살해로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상을 나타내는 것인, 조작된 세포. - 제42항 내지 제60항 중 어느 한 항에 있어서,
대상체 내로 전달된 후, 상기 조작된 세포가 대상체 내로 전달된 후에 야생형 세포와 비교하여, (a) 대상체 내의 감소된 공여자-특이적 항체, (b) 대상체 내의 감소된 IgM 또는 IgG 항체, 및 (c) 대상체 내의 감소된 보체-의존적 세포독성 (CDC)으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상을 이끌어내는 것인, 조작된 세포. - 제42항 내지 제61항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 조작된 세포가 만능 줄기 세포, 유도 만능 줄기 세포, 유도 만능 줄기 세포로부터 분화된 T 세포, 일차 T 세포, 및 일차 T 세포로부터 유래된 세포로 이루어진 군으로부터 선택되고, 상기 조작된 세포가 B2Mindel/indel, CIITAindel/indel, TRACindel/indel 및/또는 TRBindel/indel 세포인 것인, 조작된 세포. - 제1항 내지 제62항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 조작된 세포가 저면역원성 세포인 것인, 조작된 세포. - 제1항 내지 제63항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 야생형 세포 또는 대조군 세포가 출발 재료인, 조작된 세포. - 제1항 내지 제64항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 제1 및/또는 제2 외인성 폴리뉴클레오티드가 바이러스 형질도입을 사용하여 세포의 하나 이상의 대립유전자 내로 삽입되는, 조작된 세포. - 제65항에 있어서,
상기 바이러스 형질도입이 렌티바이러스 기반 바이러스 벡터를 통한 것인, 조작된 세포. - 제66항에 있어서,
상기 렌티바이러스 기반 바이러스 벡터가 제1 및/또는 제2 외인성 폴리뉴클레오티드를 운반하는 슈도타이핑된 자기-비활성화 렌티바이러스 벡터인, 조작된 세포. - 제66항 또는 제67항에 있어서,
상기 렌티바이러스 기반 바이러스 벡터가 수포성 구내염 VSV-G 외피로 슈도타이핑된 자기-비활성화 렌티바이러스 벡터이고, 이는 제1 및/또는 제2 외인성 폴리뉴클레오티드를 운반하는, 조작된 세포. - 제1항 내지 제68항 중 어느 한 항의 조작된 세포의 집단 및 약학적으로 허용가능한 첨가제, 담체, 희석제 또는 부형제를 포함하는, 약학 조성물.
- 제69항에 있어서,
상기 약학적으로 허용가능한 첨가제, 담체, 희석제 또는 부형제가 Plasma-Lyte A®, 덱스트로스, 덱스트란, 소듐 클로라이드, 인간 혈청 알부민 (HSA), 디메틸설폭사이드 (DMSO) 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상을 포함하는, 약학 조성물. - 제69항 또는 제70항에 있어서,
약학적으로 허용가능한 완충액을 추가로 포함하는, 약학 조성물. - 제71항에 있어서,
상기 약학적으로 허용가능한 완충액이 중성 완충 식염수 또는 포스페이트 완충된 식염수인, 약학 조성물. - 제1항 내지 제68항 중 어느 한 항의 조작된 세포의 집단, 약 70-80% w/w의 농도의 CryoStor® CSB의 염기 용액, 및 약 20-30% w/w PlasmaLyte-A™, 약 0.3-5.3% w/v 인간 혈청 알부민 (HSA), 약 0-20% v/v 디메틸설폭사이드 (DMSO) 및 약 100-400 mM 트레할로스 중 하나 이상을 포함하는, 약학 조성물.
- 제1항 내지 제68항 중 어느 한 항의 조작된 세포의 집단, 약 20-30% w/w의 농도의 PlasmaLyte-A™의 염기 용액, 및 약 70-80% w/w CryoStor® CSB, 약 0.3-5.3% w/v 인간 혈청 알부민 (HSA), 약 0-20% v/v 디메틸설폭사이드 (DMSO) 및 약 100-400 mM 트레할로스 중 하나 이상을 포함하는, 약학 조성물.
- 제1항 내지 제68항 중 어느 한 항의 조작된 세포의 집단, 약 0.3-5.3% w/v 인간 혈청 알부민 (HSA), 및 약 70-80% w/w CryoStor® CSB, 약 20-30% w/w PlasmaLyte-A™, 약 0-20% v/v 디메틸설폭사이드 (DMSO) 및 약 100-400 mM 트레할로스 중 하나 이상을 포함하는, 약학 조성물.
- 제1항 내지 제68항 중 어느 한 항의 조작된 세포의 집단, 약 0-20% v/v 디메틸설폭사이드 (DMSO), 및 약 70-80% w/w CryoStor® CSB, 약 20-30% w/w PlasmaLyte-A™, 약 0.3-5.3% w/v 인간 혈청 알부민 (HSA) 및 약 100-400 mM 트레할로스 중 하나 이상을 포함하는, 약학 조성물.
- 제1항 내지 제68항 중 어느 한 항의 조작된 세포의 집단, 약 100-400 mM 트레할로스, 및 약 70-80% w/w CryoStor® CSB, 약 20-30% w/w PlasmaLyte-A™, 약 0.3-5.3% w/v 인간 혈청 알부민 (HSA) 및 약 0-20% v/v 디메틸설폭사이드 (DMSO) 중 하나 이상을 포함하는, 약학 조성물.
- 제69항 내지 제77항 중 어느 한 항에 있어서,
약 75% w/w의 CryoStor® CSB를 포함하는, 약학 조성물. - 제69항 내지 제78항 중 어느 한 항에 있어서,
약 25% w/w의 PlasmaLyte-A™을 포함하는, 약학 조성물. - 제69항 내지 제79항 중 어느 한 항에 있어서,
약 0.3% w/v의 HSA를 포함하는, 약학 조성물. - 제69항 내지 제81항 중 어느 한 항에 있어서,
약 7.5% v/v의 DMSO를 포함하는, 약학 조성물. - 제1항 내지 제68항 중 어느 한 항의 조작된 세포의 집단, 약 75% w/w의 농도의 CryoStor® CSB의 염기 용액, 약 25% w/w PlasmaLyte-A™, 약 0.3% w/v 인간 혈청 알부민 (HSA) 및 약 7.5% v/v 디메틸설폭사이드 (DMSO)를 포함하는, 약학 조성물.
- 제69항 내지 제82항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 조작된 세포의 집단이 최대 약 8.0 x 108 개의 세포인, 약학 조성물. - 제69항 내지 제83항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 조작된 세포의 집단이 최대 약 6.0 x 108 개의 세포인, 약학 조성물. - 제69항 내지 제84항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 조작된 세포의 집단이 약 1.0 x 106 내지 약 2.5 x 108 개의 세포인, 약학 조성물. - 제69항 내지 제85항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 조작된 세포의 집단이 약 2.0 x 106 내지 약 2.0 x 108 개의 세포인, 약학 조성물. - 제69항 내지 제86항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 조작된 세포의 집단이 약 5 ml 내지 약 80 ml 범위인, 약학 조성물. - 제69항 내지 제87항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 조작된 세포의 집단이 약 10 ml 내지 약 70 ml 범위인, 약학 조성물. - 제69항 내지 제88항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 조작된 세포의 집단이 약 10 ml 내지 약 50 ml 범위인, 약학 조성물. - 제69항 내지 제89항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 조성물이 단일 용량으로 투여하기 위해 제형화되는, 약학 조성물. - 제69항 내지 제89항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 조성물이 최대 3 회 용량의 투여를 위해 제형화되는, 약학 조성물. - 제69항 내지 제91항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 조성물은 대상체에게 약 60 분 이하의 지속기간이 걸리는 단일 용량의 투여를 위해 제형화되는 것인, 조성물. - 제69항 내지 제91항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 조성물이 대상체에게 약 30 분 이하의 지속기간이 걸리는 단일 용량의 투여를 위해 제형화되는 것인, 조성물. - 제69항 내지 제93항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 약학 조성물의 조작된 세포 또는 이의 자손의 집단이 투여 후 10 일 후에 대상체에서 적어도 40%의 생존을 나타내는, 약학 조성물. - 제69항 내지 제94항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 약학 조성물의 조작된 세포 또는 이의 자손의 집단이 투여 후 약 2 주 후에 대상체에서 적어도 80%의 생존을 나타내는, 약학 조성물. - 제69항 내지 제95항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 약학 조성물의 조작된 세포 또는 이의 자손의 집단이 투여 후 약 3 주 후에 대상체에서 적어도 100%의 생존을 나타내는, 약학 조성물. - 제69항 내지 제96항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 약학 조성물의 조작된 세포 또는 이의 자손의 집단이 투여 후 약 4 주 후에 대상체에서 적어도 150%의 생존을 나타내는, 약학 조성물. - 대상체에서 질환 또는 장애를 치료하기 위한 투여량 양생법으로서, 제1항 내지 제68항 중 어느 한 항의 조작된 세포의 집단, 및 약학적으로 허용가능한 첨가제, 담체, 희석제 또는 부형제를 포함하는 약학 조성물의 투여를 포함하며, 상기 약학 조성물은 약 1-3 회 용량으로 투여되는, 투여량 양생법.
- 제98항에 있어서,
상기 투여된 약학 조성물이 약 1-3 회 용량의 최대 약 6.0 x 108 개의 세포인, 투여량 양생법. - 제98항 또는 제99항에 있어서,
상기 투여된 약학 조성물이 약 1-3 회 용량의 약 0.6 x 106 내지 약 6.0 x 108 개의 세포인, 투여량 양생법. - 제98항 또는 제99항에 있어서,
상기 투여된 약학 조성물이 대상체가 50 kg 이하의 체중을 갖는 경우, 약 1-3 회 용량의 대상체의 체중 kg당 약 0.2 x 106 내지 약 5.0 x 106 개의 세포인, 투여량 양생법. - 제98항 또는 제99항에 있어서,
상기 투여된 약학 조성물이 대상체가 50 kg 초과의 체중을 갖는 경우, 약 1-3 회 용량의 약 0.1 x 108 내지 약 2.5 x 108 개의 세포인, 투여량 양생법. - 제98항 또는 제99항에 있어서,
상기 투여된 약학 조성물이 대상체의 체중 kg당 약 2.0 x 106 개의 세포, 및 약 1-3 회 용량의 최대 약 2.x 108 개의 세포인, 투여량 양생법. - 제98항 내지 제103항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 대상체에 대한 단일 용량의 투여가 약 60 분 이하의 지속시간이 걸리는, 투여량 양생법. - 제98항 내지 제104항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 대상체에 대한 단일 용량의 투여가 약 30 분 이하의 지속시간이 걸리는, 투여량 양생법. - 제98항 내지 제105항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 약학적으로 허용가능한 첨가제, 담체, 희석제 또는 부형제가 Plasma-Lyte A®, 덱스트로스, 덱스트란, 소듐 클로라이드, 인간 혈청 알부민 (HSA), 디메틸설폭사이드 (DMSO) 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상을 포함하는, 투여량 양생법. - 제98항 내지 제106항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 약학 조성물이 약학적으로 허용가능한 완충액을 추가로 포함하는, 투여량 양생법. - 제107항에 있어서,
상기 약학적으로 허용가능한 완충액이 중성 완충 식염수 또는 포스페이트 완충된 식염수인, 투여량 양생법. - 제98항 내지 제108항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 약학 조성물의 투여 후, 세포 또는 이의 자손의 집단이 최대 9 개월까지 대상체에 존재하는, 투여량 양생법. - 제98항 내지 제109항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 약학 조성물의 투여 후, 세포 또는 이의 자손의 집단이 적어도 2 년 이상 대상체에 존재하는, 투여량 양생법. - 제98항 내지 제110항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 약학 조성물의 투여 후, 조작된 세포 또는 이의 자손의 집단이 투여 후 약 10 일 후에 대상체에서 40% 이상의 생존을 나타내는, 투여량 양생법. - 제98항 내지 제111항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 약학 조성물의 투여 후, 조작된 세포 또는 이의 자손의 집단이 투여 후 약 2 주 후에 대상체에서 80% 이상의 생존을 나타내는, 투여량 양생법. - 제98항 내지 제112항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 약학 조성물의 투여 후, 조작된 세포 또는 이의 자손의 집단이 투여 후 약 3 주 후에 대상체에서 100% 이상의 생존을 나타내는, 투여량 양생법. - 제98항 내지 제113항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 약학 조성물의 투여 후, 조작된 세포 또는 이의 자손의 집단이 투여 후 약 4 주 후에 대상체에서 150% 이상의 생존을 나타내는, 투여량 양생법. - 제98항 내지 제114항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 각각의 용량이 1 내지 24 시간 범위의 간격으로 투여되도록 대상체에 대한 2-3 회 용량의 투여가 발생하는, 투여량 양생법. - 제98항 내지 제114항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 각각의 용량이 1 내지 28 일 범위의 간격으로 투여되도록 대상체에 대한 2-3 회 용량의 투여가 발생하는, 투여량 양생법. - 제98항 내지 제114항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 각각의 용량이 1 내지 6 주 범위의 간격으로 투여되도록 대상체에 대한 2-3 회 용량의 투여가 발생하는, 투여량 양생법. - 제98항 내지 제114항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 각각의 용량이 1 내지 12 개월 이상 범위의 간격으로 투여되도록 대상체에 대한 2-3 회 용량의 투여가 발생하는, 투여량 양생법. - 대상체에서 질환 또는 장애를 치료하기 위한 투여량 양생법으로서,
(i) HLA-A, HLA-B, HLA-C, HLA-DP, HLA-DQ, HLA-DR, B2M, CIITA, TCR-알파 및/또는 TCR-베타의 감소된 발현을 포함하는 조작된 세포로서, 상기 조작된 세포는 CD47 및 키메라 항원 수용체 (CAR)를 코딩하는 외인성 폴리뉴클레오티드의 세트를 추가로 포함하고, 상기 외인성 폴리뉴클레오티드의 세트는 세포의 하나 이상의 대립유전자의 세이프 하버 또는 표적 유전자좌 내로 삽입되는, 조작된 세포; 및
(ii) 약학적으로 허용가능한 첨가제, 담체, 희석제 또는 부형제
를 포함하는 약학 조성물을 투여하는 단계를 포함하며,
상기 약학 조성물은 최대 약 6.0 x 108 개의 세포를 포함하는, 투여량 양생법. - 대상체에서 질환 또는 장애를 치료하기 위한 투여량 양생법으로서,
(i) HLA-A, HLA-B, HLA-C, HLA-DP, HLA-DQ, HLA-DR, B2M, CIITA, TCR-알파 및/또는 TCR-베타의 감소된 발현을 포함하는 조작된 세포로서, 상기 조작된 세포는 CD47 및 키메라 항원 수용체 (CAR)를 코딩하는 외인성 폴리뉴클레오티드의 세트를 추가로 포함하고, 여기서 외인성 폴리뉴클레오티드의 세트는 세포의 하나 이상의 대립유전자의 세이프 하버 또는 표적 유전자좌 내로 삽입되는, 조작된 세포; 및
(ii) 약학적으로 허용가능한 첨가제, 담체, 희석제 또는 부형제
를 포함하는 약학 조성물을 투여하는 단계를 포함하며,
상기 약학 조성물은 1-3 회 용량으로 투여되는, 투여량 양생법. - 대상체에서 질환 또는 장애를 치료하기 위한 투여량 양생법으로서,
(i) HLA-A, HLA-B, HLA-C, HLA-DP, HLA-DQ, HLA-DR, B2M, CIITA, TCR-알파 및/또는 TCR-베타의 감소된 발현을 포함하는 조작된 세포로서, 상기 조작된 세포는 CD47 및 키메라 항원 수용체 (CAR)를 코딩하는 외인성 폴리뉴클레오티드의 세트를 추가로 포함하고, 여기서 외인성 폴리뉴클레오티드의 세트는 세포의 하나 이상의 대립유전자의 세이프 하버 또는 표적 유전자좌 내로 삽입되는, 조작된 세포; 및
(ii) 약학적으로 허용가능한 첨가제, 담체, 희석제 또는 부형제
를 포함하는 약학 조성물을 투여하는 단계를 포함하며,
상기 약학 조성물의 용량은 약 60 분 이하의 시간의 지속기간 동안 투여되는, 투여량 양생법. - 대상체에서 질환 또는 장애를 치료하기 위한 투여량 양생법으로서,
(i) HLA-A, HLA-B, HLA-C, HLA-DP, HLA-DQ, HLA-DR, B2M, CIITA, TCR-알파 및/또는 TCR-베타의 감소된 발현을 포함하는 조작된 세포; 및
(ii) 약학적으로 허용가능한 첨가제, 담체, 희석제 또는 부형제
를 포함하는 약학 조성물을 투여하는 단계를 포함하며,
여기서 약학 조성물은 최대 약 6.0 x 108 개의 세포를 포함하는, 투여량 양생법. - 대상체에서 질환 또는 장애를 치료하기 위한 투여량 양생법으로서,
(i) HLA-A, HLA-B, HLA-C, HLA-DP, HLA-DQ, HLA-DR, B2M, CIITA, TCR-알파 및/또는 TCR-베타의 감소된 발현을 포함하는 조작된 세포; 및
(ii) 약학적으로 허용가능한 첨가제, 담체, 희석제 또는 부형제
를 포함하는 약학 조성물을 투여하는 단계를 포함하며,
여기서 약학 조성물은 1-3 회 용량으로 투여되는, 투여량 양생법. - 대상체에서 질환 또는 장애를 치료하기 위한 투여량 양생법으로서,
(i) HLA-A, HLA-B, HLA-C, HLA-DP, HLA-DQ, HLA-DR, B2M, CIITA, TCR-알파 및/또는 TCR-베타의 감소된 발현을 포함하는 조작된 세포; 및
(ii) 약학적으로 허용가능한 첨가제, 담체, 희석제 또는 부형제
를 포함하는 약학 조성물을 투여하는 단계를 포함하며,
여기서 약학 조성물의 용량은 60 분 이하의 지속기간 동안 투여되는, 투여량 양생법. - 대상체에 대한 제1항 내지 제68항 중 어느 한 항의 조작된 세포, 제69항 내지 제97항 중 어느 한 항의 약학 조성물, 또는 제98항 내지 제124항 중 어느 한 항의 투여량 양생법의 투여를 포함하는, 대상체에서 암을 치료하는 방법.
- 제125항에 있어서,
상기 암이 CD19+ 암인 것인, 방법. - 대상체에서 T 세포 고갈을 예방하는 방법으로서, 대상체에게 제1항 내지 제68항 중 어느 한 항의 조작된 세포를 투여하는 것을 포함하며, 상기 CAR은 CD19-특이적 CAR 또는 CD22-특이적 CAR인, 방법.
- 제127항에 있어서,
상기 CD19-특이적 CAR이 악시카브타진 실로류셀, 리소카브타진 마라류셀, 브렉수카브타진 오토류셀 및 티사젠렉류셀로 이루어진 군으로부터 선택된 CAR-T 세포 기반 요법 중 어느 하나의 CD19-특이적 CAR과 실질적으로 동등한 것인, 방법. - 대상체에서 T 세포 고갈을 방지하거나 질환을 치료하는 방법으로서,
(i) 제1 시점에서 대상체에 대한 제1항 내지 제68항 중 어느 한 항의 조작된 세포의 제1 집단을 포함하는 제1 투여량 양생법의 투여, 및
(ii) 제2 시점에서 대상체에 대한 제1항 내지 제68항 중 어느 한 항의 조작된 세포의 제2 집단을 포함하는 제2 투여량 양생법의 투여를 포함하며,
여기서 제1 투여량 양생법 및 제2 투여량 양생법은 상이한 것인, 방법. - 대상체에서 T 세포 고갈을 방지하거나 질환을 치료하는 방법으로서,
(i) 제1 시점에서 대상체에 대한 제1항 내지 제68항 중 어느 한 항의 조작된 세포의 제1 집단을 포함하는 제1 투여량 양생법의 투여, 및
(ii) 제2 시점에서 대상체에 대한 제1항 내지 제68항 중 어느 한 항의 조작된 세포의 제2 집단을 포함하는 제2 투여량 양생법의 투여를 포함하며,
여기서 조작된 세포의 제1 집단 및 조작된 세포의 제2 집단 둘 모두는 동일한 키메라 항원 수용체를 포함하는 것인, 방법. - 대상체에서 T 세포 고갈을 방지하거나 질환을 치료하는 방법으로서,
(i) 제1 시점에서 대상체에 대한 제1항 내지 제68항 중 어느 한 항의 조작된 세포의 제1 집단을 포함하는 제1 투여량 양생법의 투여, 및
(ii) 제2 시점에서 대상체에 대한 제1항 내지 제68항 중 어느 한 항의 조작된 세포의 제2 집단을 포함하는 제2 투여량 양생법의 투여를 포함하며,
여기서 조작된 세포의 제1 집단 및 조작된 세포의 제2 집단 둘 모두는 상이한 키메라 항원 수용체를 포함하는 것인, 방법. - 대상체에서 T 세포 고갈을 방지하거나 질환을 치료하는 방법으로서,
(i) 제1 시점에서 대상체에 대한 제1항 내지 제68항 중 어느 한 항의 조작된 세포의 제1 집단을 포함하는 제1 투여량 양생법의 투여, 및
(ii) 제2 시점에서 대상체에 대한 제1항 내지 제68항 중 어느 한 항의 조작된 세포의 제2 집단을 포함하는 제2 투여량 양생법의 투여를 포함하며,
여기서 제1 집단의 조작된 세포는 제1 항원에 결합하는 제1 키메라 항원 수용체를 포함하고, 제2 집단의 조작된 세포는 제2 항원에 결합하는 제2 키메라 항원 수용체를 포함하며, 여기서 제1 항원 및 제2 항원은 동일한 것인, 방법. - 대상체에서 T 세포 고갈을 방지하거나 질환을 치료하는 방법으로서,
(i) 제1 시점에서 대상체에 대한 제1항 내지 제68항 중 어느 한 항의 조작된 세포의 제1 집단을 포함하는 제1 투여량 양생법의 투여, 및
(ii) 제2 시점에서 대상체에 대한 제1항 내지 제68항 중 어느 한 항의 조작된 세포의 제2 집단을 포함하는 제2 투여량 양생법의 투여를 포함하며,
여기서 제1 집단의 조작된 세포는 제1 항원에 결합하는 제1 키메라 항원 수용체를 포함하고, 제2 집단의 조작된 세포는 제2 항원에 결합하는 제2 키메라 항원 수용체를 포함하며, 여기서 제1 항원 및 제2 항원은 상이한 것인, 방법. - 제1항 내지 제68항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 조작된 세포가 활성화되지 않은 것인, 조작된 세포. - 야생형 T 세포에 비해 HLA-A, HLA-B, HLA-C, HLA-DP, HLA-DQ, HLA-DR, B2M, CIITA, TCR-알파 및/또는 TCR-베타의 감소된 발현 및 키메라 항원 수용체 (CAR)를 코딩하는 제1 외인성 폴리뉴클레오티드를 포함하는 비-활성화된 T 세포.
- 제135항에 있어서,
상기 비-활성화된 T 세포가 일차 T 세포인 것인, 비-활성화된 T 세포. - 제135항에 있어서,
상기 비-활성화된 T 세포가 제1항 내지 제68항 중 어느 한 항의 조작된 세포로부터 분화된 것인, 비-활성화된 T 세포. - 제135항 내지 제137항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 T 세포가 CD8+ T 세포인, 비-활성화된 T 세포. - 제135항 내지 제138항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 비-활성화된 T 세포가 항-CD3 항체, 항-CD28 항체, T 세포 활성화 사이토카인 또는 가용성 T 세포 공동자극 분자로 처리되지 않았던 것인, 비-활성화된 T 세포. - 제139항에 있어서,
상기 항-CD3 항체가 OKT3인, 비-활성화된 T 세포. - 제139항에 있어서,
상기 항-CD28 항체가 CD28.2인, 비-활성화된 T 세포. - 제139항에 있어서,
상기 T 세포 활성화 사이토카인이 IL-2, IL-7, IL-15 및 IL-21로 이루어진 군으로부터 선택되는, 비-활성화된 T 세포. - 제139항에 있어서,
상기 가용성 T 세포 공동자극 분자가 항-CD28 항체, 항-CD80 항체, 항-CD86 항체, 항-CD137L 항체, 및 항-ICOS-L 항체로 이루어진 군으로부터 선택되는, 비-활성화된 T 세포. - 제135항 내지 제149항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 비-활성화된 T 세포가 활성화 마커를 발현하지 않는 것인, 비-활성화된 T 세포. - 제135항 내지 제144항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 비-활성화된 T 세포가 CD3 및 CD28을 발현하고, 상기 CD3 및/또는 CD28이 비활성인, 비-활성화된 T 세포. - 제135항 내지 제145항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 제1 외인성 폴리뉴클레오티드가 CD8 결합제를 포함하는 렌티바이러스 벡터에 의해 운반되는, 비-활성화된 T 세포. - 제135항 내지 제146항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 비-활성화된 T 세포가 CD47을 코딩하는 제2 외인성 폴리뉴클레오티드를 추가로 포함하는 것인, 비-활성화된 T 세포. - 제135항 내지 제147항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 제1 및/또는 제2 외인성 폴리뉴클레오티드가 T 세포의 하나 이상의 대립유전자의 특이적 유전자좌 내로 삽입되는, 비-활성화된 T 세포. - 제148항에 있어서,
상기 특이적 유전자좌가 세이프 하버 또는 표적 유전자좌, B2M 유전자좌, CIITA 유전자좌, TRAC 유전자좌 및 TRB 유전자좌로 이루어진 군으로부터 선택되는, 비-활성화된 T 세포. - 제135항 내지 제149항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 CD47을 코딩하는 제2 외인성 폴리뉴클레오티드가 세이프 하버 또는 표적 유전자좌, B2M 유전자좌, CIITA 유전자좌, TRAC 유전자좌 및 TRB 유전자좌로 이루어진 군으로부터 선택된 특이적 유전자좌 내로 삽입되는, 비-활성화된 T 세포. - 제135항 내지 제150항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 CAR을 코딩하는 제1 외인성 폴리뉴클레오티드가 세이프 하버 또는 표적 유전자좌, B2M 유전자좌, CIITA 유전자좌, TRAC 유전자좌 및 TRB 유전자좌로 이루어진 군으로부터 선택된 특이적 유전자좌 내로 삽입되는, 비-활성화된 T 세포. - 제135항 내지 제151항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 CD47을 코딩하는 제2 외인성 폴리뉴클레오티드 및 CAR을 코딩하는 제1 외인성 폴리뉴클레오티드가 상이한 유전자좌 내로 삽입되는, 비-활성화된 T 세포. - 제135항 내지 제151항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 CD47을 코딩하는 제2 외인성 폴리뉴클레오티드 및 CAR을 코딩하는 제1 외인성 폴리뉴클레오티드가 동일한 유전자좌 내로 삽입되는, 비-활성화된 T 세포. - 제135항 내지 제151항 및 제153항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 CD47을 코딩하는 제2 외인성 폴리뉴클레오티드 및 CAR을 코딩하는 제1 외인성 폴리뉴클레오티드가 B2M 유전자좌 내로 삽입되는, 비-활성화된 T 세포. - 제135항 내지 제151항 및 제153항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 CD47을 코딩하는 제2 외인성 폴리뉴클레오티드 및 CAR을 코딩하는 제1 외인성 폴리뉴클레오티드가 CIITA 유전자좌 내로 삽입되는, 비-활성화된 T 세포. - 제135항 내지 제151항 및 제153항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 CD47을 코딩하는 제2 외인성 폴리뉴클레오티드 및 CAR을 코딩하는 제1 외인성 폴리뉴클레오티드가 TCR 유전자 유전자좌 내로 삽입되는, 비-활성화된 T 세포. - 제135항 내지 제151항 및 제153항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 CD47을 코딩하는 제2 외인성 폴리뉴클레오티드 및 CAR을 코딩하는 제1 외인성 폴리뉴클레오티드가 TRAC 유전자좌 내로 삽입되는, 비-활성화된 T 세포. - 제135항 내지 제151항 및 제153항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 CD47을 코딩하는 제2 외인성 폴리뉴클레오티드 및 CAR을 코딩하는 제1 외인성 폴리뉴클레오티드가 TRB 유전자좌 내로 삽입되는, 비-활성화된 T 세포. - 제135항 내지 제151항 및 제153항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 CD47을 코딩하는 제2 외인성 폴리뉴클레오티드 및 CAR을 코딩하는 제1 외인성 폴리뉴클레오티드가 세이프 하버 또는 표적 유전자좌 내로 삽입되는, 비-활성화된 T 세포. - 제135항 내지 제151항, 제153항 및 제159항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 세이프 하버 또는 표적 유전자좌가 CCR5 유전자 유전자좌, CXCR4 유전자 유전자좌, PPP1R12C 유전자 유전자좌, 알부민 유전자 유전자좌, SHS231 유전자 유전자좌, CLYBL 유전자 유전자좌, Rosa 유전자 유전자좌, F3 (CD142) 유전자 유전자좌, MICA 유전자 유전자좌, MICB 유전자 유전자좌, LRP1 (CD91) 유전자 유전자좌, HMGB1 유전자 유전자좌, ABO 유전자 유전자좌, RHD 유전자 유전자좌, FUT1 유전자좌 및 KDM5D 유전자 유전자좌로 이루어진 군으로부터 선택되는, 비-활성화된 T 세포. - 제135항 내지 제160항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 CAR이 CD19-특이적 CAR 및 CD22-특이적 CAR로 이루어진 군으로부터 선택되는, 비-활성화된 T 세포. - 제161항에 있어서,
상기 CD19-특이적 CAR이 악시카브타진 실로류셀, 리소카브타진 마라류셀, 브렉수카브타진 오토류셀 및 티사젠렉류셀로 이루어진 군으로부터 선택된 CAR-T 세포 기반 요법 중 어느 하나의 CD19-특이적 CAR과 실질적으로 동등한, 비-활성화된 T 세포. - 제135항 내지 제160항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 CAR이 이중특이적 CAR인, 비-활성화된 T 세포. - 제162항에 있어서,
상기 이중특이적 CAR이 CD19/CD22 이중특이적 CAR인, 비-활성화된 T 세포. - 제135항 내지 제164항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 비-활성화된 T 세포가 HLA-A, HLA-B 및/또는 HLA-C 항원을 발현하지 않는 것인, 비-활성화된 T 세포. - 제135항 내지 제165항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 비-활성화된 T 세포가 B2M을 발현하지 않는 것인, 비-활성화된 T 세포. - 제135항 내지 제166항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 비-활성화된 T 세포가 HLA-DP, HLA-DQ 및/또는 HLA-DR 항원을 발현하지 않는 것인, 비-활성화된 T 세포. - 제135항 내지 제167항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 비-활성화된 T 세포가 CIITA를 발현하지 않는 것인, 비-활성화된 T 세포. - 제135항 내지 제168항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 비-활성화된 T 세포가 TCR-알파 및/또는 TCR-베타를 발현하지 않는 것인, 비-활성화된 T 세포. - 제135항 내지 제169항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 비-활성화된 T 세포가 TRAC 유전자좌 내로 삽입된, CD47을 코딩하는 제2 외인성 폴리뉴클레오티드 및/또는 CAR을 코딩하는 제1 외인성 폴리뉴클레오티드를 포함하는 B2Mindel/indel, CIITAindel/indel, TRACindel/indel 세포인 것인, 비-활성화된 T 세포. - 제135항 내지 제169항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 비-활성화된 T 세포가 TRAC 유전자좌 내로 삽입된, CD47을 코딩하는 제2 외인성 폴리뉴클레오티드 및 CAR을 코딩하는 제1 외인성 폴리뉴클레오티드를 포함하는 B2Mindel/indel, CIITAindel/indel, TRACindel/indel 세포인 것인, 비-활성화된 T 세포. - 제135항 내지 제169항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 비-활성화된 T 세포가 TRB 유전자좌 내로 삽입된, CD47을 코딩하는 제2 외인성 폴리뉴클레오티드 및/또는 CAR을 코딩하는 제1 외인성 폴리뉴클레오티드를 포함하는 B2Mindel/indel, CIITAindel/indel, TRACindel/indel 세포인 것인, 비-활성화된 T 세포. - 제135항 내지 제169항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 비-활성화된 T 세포가 TRB 유전자좌 내로 삽입된, CD47을 코딩하는 제2 외인성 폴리뉴클레오티드 및 CAR을 코딩하는 제1 외인성 폴리뉴클레오티드를 포함하는 B2Mindel/indel, CIITAindel/indel, TRACindel/indel 세포인 것인, 비-활성화된 T 세포. - 제135항 내지 제169항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 비-활성화된 T 세포가 B2M 유전자좌 내로 삽입된, CD47을 코딩하는 제2 외인성 폴리뉴클레오티드 및/또는 CAR을 코딩하는 제1 외인성 폴리뉴클레오티드를 포함하는 B2Mindel/indel, CIITAindel/indel, TRACindel/indel 세포인 것인, 비-활성화된 T 세포. - 제135항 내지 제169항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 비-활성화된 T 세포가 B2M 유전자좌 내로 삽입된, CD47을 코딩하는 제2 외인성 폴리뉴클레오티드 및 CAR을 코딩하는 제1 외인성 폴리뉴클레오티드를 포함하는 B2Mindel/indel, CIITAindel/indel, TRACindel/indel 세포인 것인, 비-활성화된 T 세포. - 제135항 내지 제169항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 비-활성화된 T 세포가 CIITA 유전자좌 내로 삽입된, CD47을 코딩하는 제2 외인성 폴리뉴클레오티드 및/또는 CAR을 코딩하는 제1 외인성 폴리뉴클레오티드를 포함하는 B2Mindel/indel, CIITAindel/indel, TRACindel/indel 세포인 것인, 비-활성화된 T 세포. - 제135항 내지 제169항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 비-활성화된 T 세포가 CIITA 유전자좌 내로 삽입된, CD47을 코딩하는 제2 외인성 폴리뉴클레오티드 및 CAR을 코딩하는 제1 외인성 폴리뉴클레오티드를 포함하는 B2Mindel/indel, CIITAindel/indel, TRACindel/indel 세포인 것인, 비-활성화된 T 세포. - 야생형 T 세포에 비해, HLA-A, HLA-B, HLA-C, HLA-DP, HLA-DQ, HLA-DR, B2M, CIITA, TCR-알파 및/또는 TCR-베타의 감소된 발현을 포함하는 조작된 T 세포로서, 상기 조작된 T 세포는 CD8 결합제를 포함하는 렌티바이러스 벡터에 의해 운반되는 키메라 항원 수용체 (CAR)를 코딩하는 제1 외인성 폴리뉴클레오티드를 추가로 포함하는, 조작된 T 세포.
- 제178항에 있어서,
상기 조작된 T 세포가 일차 T 세포인 것인, 조작된 T 세포. - 제178항에 있어서,
상기 조작된 T 세포가 제1항 내지 제68항 중 어느 한 항의 조작된 세포로부터 분화된 것인, 조작된 T 세포. - 제178항 내지 제180항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 T 세포가 CD8+ T 세포인 것인, T 세포. - 제178항 내지 제181항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 조작된 T 세포가 항-CD3 항체, 항-CD28 항체, T 세포 활성화 사이토카인 또는 가용성 T 세포 공동자극 분자로 처리되지 않았던 것인, 조작된 T 세포. - 제182항에 있어서,
상기 항-CD3 항체가 OKT3이고, 항-CD28 항체가 CD28.2이고, T 세포 활성화 사이토카인이 IL-2, IL-7, IL-15 및 IL-21로 이루어진 군으로부터 선택되고, 가용성 T 세포 공동자극 분자가 항-CD28 항체, 항-CD80 항체, 항-CD86 항체, 항-CD137L 항체 및 항-ICOS-L 항체로 이루어진 군으로부터 선택되는, 조작된 T 세포. - 제178항 내지 제183항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 조작된 T 세포가 활성화 마커를 발현하지 않는 것인, 조작된 T 세포. - 제178항 내지 제184항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 조작된 T 세포가 CD3 및 CD28을 발현하고, 상기 CD3 및/또는 CD28이 비활성인, 조작된 T 세포. - 제178항 내지 제185항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 조작된 T 세포가 CD47을 코딩하는 제2 외인성 폴리뉴클레오티드를 추가로 포함하는 것인, 조작된 T 세포. - 제178항 내지 제186항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 제1 및/또는 제2 외인성 폴리뉴클레오티드가 T 세포의 하나 이상의 대립유전자의 특이적 유전자좌 내로 삽입되는, 조작된 T 세포. - 제187항에 있어서,
상기 특이적 유전자좌가 세이프 하버 또는 표적 유전자좌, B2M 유전자좌, CIITA 유전자좌, TRAC 유전자좌 및 TRB 유전자좌로 이루어진 군으로부터 선택되는, 조작된 T 세포. - 제178항 내지 제188항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 CD47을 코딩하는 제2 외인성 폴리뉴클레오티드가 세이프 하버 또는 표적 유전자좌, B2M 유전자좌, CIITA 유전자좌, TRAC 유전자좌 및 TRB 유전자좌로 이루어진 군으로부터 선택된 특이적 유전자좌 내로 삽입되는, 조작된 T 세포. - 제178항 내지 제189항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 CAR을 코딩하는 제1 외인성 폴리뉴클레오티드가 세이프 하버 또는 표적 유전자좌, B2M 유전자좌, CIITA 유전자좌, TRAC 유전자좌 및 TRB 유전자좌로 이루어진 군으로부터 선택된 특이적 유전자좌 내로 삽입되는, 조작된 T 세포. - 제178항 내지 제190항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 CD47을 코딩하는 제2 외인성 폴리뉴클레오티드 및 CAR을 코딩하는 제1 외인성 폴리뉴클레오티드가 상이한 유전자좌 내로 삽입되는, 조작된 T 세포. - 제178항 내지 제190항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 CD47을 코딩하는 제2 외인성 폴리뉴클레오티드 및 CAR을 코딩하는 제1 외인성 폴리뉴클레오티드가 동일한 유전자좌 내로 삽입되는, 조작된 T 세포. - 제178항 내지 제190항 및 제192항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 CD47을 코딩하는 제2 외인성 폴리뉴클레오티드 및 CAR을 코딩하는 제1 외인성 폴리뉴클레오티드가 B2M 유전자좌, CIITA 유전자좌, TRAC 유전자좌, TRB 유전자좌, 또는 세이프 하버 또는 표적 유전자좌 내로 삽입되는, 조작된 T 세포. - 제193항에 있어서,
상기 세이프 하버 또는 표적 유전자좌가 CCR5 유전자 유전자좌, CXCR4 유전자 유전자좌, PPP1R12C 유전자 유전자좌, 알부민 유전자 유전자좌, SHS231 유전자 유전자좌, CLYBL 유전자 유전자좌, Rosa 유전자 유전자좌, F3 (CD142) 유전자 유전자좌, MICA 유전자 유전자좌, MICB 유전자 유전자좌, LRP1 (CD91) 유전자 유전자좌, HMGB1 유전자 유전자좌, ABO 유전자 유전자좌, RHD 유전자 유전자좌, FUT1 유전자좌 및 KDM5D 유전자 유전자좌로 이루어진 군으로부터 선택되는, 조작된 T 세포. - 제178항 내지 제194항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 CAR이 CD19-특이적 CAR 및 CD22-특이적 CAR로 이루어진 군으로부터 선택되는, 조작된 T 세포. - 제195항에 있어서,
상기 CD19-특이적 CAR이 악시카브타진 실로류셀, 리소카브타진 마라류셀, 브렉수카브타진 오토류셀 및 티사젠렉류셀로 이루어진 군으로부터 선택된 CAR-T 세포 기반 요법 중 어느 하나의 CD19-특이적 CAR과 실질적으로 동등한, 조작된 T 세포. - 제178항 내지 제195항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 조작된 T 세포가 HLA-A, HLA-B, 및/또는 HLA-C 항원을 발현하지 않고/않거나, 상기 조작된 T 세포가 B2M을 발현하지 않고/않거나, 상기 조작된 T 세포가 HLA-DP, HLA-DQ 및/또는 HLA-DR 항원을 발현하지 않고/않거나, 상기 조작된 T 세포가 CIITA를 발현하지 않고/않거나, 상기 조작된 T 세포가 TCR-알파 및/또는 TCR-베타를 발현하지 않는 것인, 조작된 T 세포. - 제178항 내지 제197항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 조작된 T 세포가 TRAC 유전자좌, TRB 유전자좌, B2M 유전자좌 또는 CIITA 유전자좌 내로 삽입된, CD47을 코딩하는 제2 외인성 폴리뉴클레오티드 및/또는 CAR을 코딩하는 제1 외인성 폴리뉴클레오티드를 포함하는 B2Mindel/indel, CIITAindel/indel, TRACindel/indel 세포인 것인, 조작된 T 세포. - 제135항 내지 제177항 중 어느 한 항, 또는 제178항 내지 제198항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 비-활성화된 T 세포 또는 조작된 T 세포가 대상체에 있는 것인, 비-활성화된 T 세포 또는 조작된 T 세포. - 제135항 내지 제177항 중 어느 한 항, 또는 제178항 내지 제198항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 비-활성화된 T 세포 또는 조작된 T 세포가 생체 외에 있는 것인, 비-활성화된 T 세포 또는 조작된 T 세포. - 제146항 내지 제177항, 제199항 및 제200항 중 어느 한 항, 또는 제178항 내지 제200항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 CD8 결합제가 항-CD8 항체인, 비-활성화된 T 세포 또는 조작된 T 세포. - 제201항에 있어서,
상기 항-CD8 항체가 마우스 항-CD8 항체, 토끼 항-CD8 항체, 인간 항-CD8 항체, 인간화된 항-CD8 항체, 낙타류 항-CD8 항체 및 이의 단편으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 비-활성화된 T 세포 또는 조작된 T 세포. - 제202항에 있어서,
상기 이의 단편이 scFV 또는 VHH인, 비-활성화된 T 세포 또는 조작된 T 세포. - 제146항 내지 제177항 및 제199항 내지 제203항 중 어느 한 항, 또는 제178항 내지 제203항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 CD8 결합제가 CD8 알파 쇄 및/또는 CD8 베타 쇄에 결합하는, 비-활성화된 T 세포 또는 조작된 T 세포. - 제146항 내지 제177항 및 제199항 내지 제204항 중 어느 한 항, 또는 제178항 내지 제204항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 CD8 결합제가 바이러스 외피에 혼입된 막관통 도메인에 융합되는 것인, 비-활성화된 T 세포 또는 조작된 T 세포. - 제146항 내지 제177항 및 제199항 내지 제205항 중 어느 한 항, 또는 제178항 내지 제205항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 렌티바이러스 벡터가 바이러스 융합 단백질로 슈도타이핑되는, 비-활성화된 T 세포 또는 조작된 T 세포. - 제206항에 있어서,
상기 바이러스 융합 단백질이 이의 천연 수용체에 대한 결합을 감소시키기 위한 하나 이상의 변형을 포함하는, 비-활성화된 T 세포 또는 조작된 T 세포. - 제206항 또는 제207항에 있어서,
상기 바이러스 융합 단백질이 CD8 결합제에 융합되는, 비-활성화된 T 세포 또는 조작된 T 세포. - 제206항 내지 제208항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 바이러스 융합 단백질이 CD8 결합제에 융합된 니파 바이러스 F 당단백질 및 니파 바이러스 G 당단백질을 포함하는, 비-활성화된 T 세포 또는 조작된 T 세포. - 제146항 내지 제177항 및 제199항 내지 제209항 중 어느 한 항, 또는 제178항 내지 제209항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 렌티바이러스 벡터가 T 세포 활성화 분자 또는 T 세포 공동자극 분자를 포함하지 않는, 비-활성화된 T 세포 또는 조작된 T 세포. - 제135항 내지 제177항 및 제199항 내지 제210항 중 어느 한 항, 또는 제178항 내지 제210항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 렌티바이러스 벡터가 제1 외인성 폴리뉴클레오티드 및/또는 제2 외인성 폴리뉴클레오티드를 코딩하는, 비-활성화된 T 세포 또는 조작된 T 세포. - 제135항 내지 제177항 및 제199항 내지 제210항 중 어느 한 항, 또는 제178항 내지 제210항 중 어느 한 항에 있어서,
제1 대상체 내로 전달된 후, 상기 비-활성화된 T 세포 또는 조작된 T 세포가 제2 대상체 내로 전달된 후에 야생형 세포와 비교하여 감소되는, (a) T 세포 반응, (b) NK 세포 반응 및 (c) 대식세포 반응으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 반응을 나타내는 것인, 비-활성화된 T 세포 또는 조작된 T 세포. - 제212항에 있어서,
상기 제1 대상체 및 제2 대상체가 상이한 대상체인, 비-활성화된 T 세포 또는 조작된 T 세포. - 제212항 또는 제213항에 있어서,
상기 대식세포 반응이 탐식인, 비-활성화된 T 세포 또는 조작된 T 세포. - 제135항 내지 제177항 및 제199항 내지 제214항 중 어느 한 항, 또는 제178항 내지 제214항 중 어느 한 항에 있어서,
대상체 내로 전달된 후, 상기 비-활성화된 T 세포 또는 조작된 T 세포가 대상체 내로 전달된 후에 야생형 세포와 비교하여, (a) 대상체 내의 감소된 TH1 활성화, (b) 대상체 내의 감소된 NK 세포 살해, 및 (c) 대상체 내의 전체 PBMC에 의한 감소된 살해로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상을 나타내는 것인, 비-활성화된 T 세포 또는 조작된 T 세포. - 제135항 내지 제177항 및 제199항 내지 제215항 중 어느 한 항, 또는 제178항 내지 제215항 중 어느 한 항에 있어서,
대상체 내로 전달된 후, 상기 비-활성화된 T 세포 또는 조작된 T 세포가 대상체 내로 전달된 후에 야생형 세포와 비교하여, (a) 대상체 내의 감소된 공여자 특이적 항체, (b) 대상체 내의 감소된 IgM 또는 IgG 항체, 및 (c) 대상체 내의 감소된 보체-의존적 세포독성 (CDC)으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상을 이끌어내는 것인, 비-활성화된 T 세포 또는 조작된 T 세포. - 제135항 내지 제177항 및 제199항 내지 제216항 중 어느 한 항, 또는 제178항 내지 제216항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 비-활성화된 T 세포 또는 조작된 T 세포가 대상체 내에 CD8 결합제를 포함하는 렌티바이러스 벡터로 형질도입되는 것인, 비-활성화된 T 세포 또는 조작된 T 세포. - 제135항 내지 제177항 및 제199항 내지 제217항 중 어느 한 항, 또는 제178항 내지 제217항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 렌티바이러스 벡터가 CAR 및/또는 CD47을 코딩하는 유전자를 운반하는, 비-활성화된 T 세포 또는 조작된 T 세포. - 제135항 내지 제177항 및 제199항 내지 제218항 중 어느 한 항의 비-활성화된 T 세포 또는 제178항 내지 제218항 중 어느 한 항의 조작된 T 세포의 집단 및 약학적으로 허용가능한 첨가제, 담체, 희석제 또는 부형제를 포함하는 약학 조성물.
- 제135항 내지 제177항 및 제199항 내지 제218항 중 어느 한 항의 비-활성화된 T 세포, 제178항 내지 제218항 중 어느 한 항의 조작된 T 세포, 또는 제219항의 약학 조성물을 포함하는 조성물을 대상체에 투여하는 단계를 포함하는 방법.
- 제220항에 있어서,
상기 대상체에 조성물의 투여 전, 후 및/또는 이와 동시에 T 세포 활성화 치료가 투여되지 않는 것인, 방법. - 제220항 또는 제221항에 있어서,
상기 T 세포 활성화 치료가 림프구고갈을 포함하는 것인, 방법. - 제135항 내지 제177항 및 제199항 내지 제218항 중 어느 한 항의 비-활성화된 T 세포, 제178항 내지 제218항 중 어느 한 항의 조작된 T 세포, 또는 제219항의 약학 조성물을 포함하는 조성물을 대상체에 투여하는 단계를 포함하는, 암을 앓고 있는 대상체를 치료하는 방법으로서,
상기 대상체에 조성물의 투여 전, 후 및/또는 이와 동시에 T 세포 활성화 치료가 투여되지 않는 것인, 방법. - 제223항에 있어서,
상기 T 세포 활성화 치료가 림프구고갈을 포함하는 것인, 방법. - 제135항 내지 제177항 및 제199항 내지 제218항 중 어느 한 항의 비-활성화된 T 세포, 제178항 내지 제218항 중 어느 한 항의 조작된 T 세포, 또는 제219항의 약학 조성물을 포함하는 조성물을 대상체에 투여하는 단계를 포함하는, 대상체 내에서, 치료를 필요로 하는 대상체 내의 종양 세포를 인식하고 이를 살해시킬 수 있는 T 세포를 확장시키는 방법으로서,
상기 대상체에 조성물의 투여 전, 후 및/또는 이와 동시에 T 세포 활성화 치료가 투여되지 않는 것인, 방법. - 제225항에 있어서,
상기 T 세포 활성화 치료가 림프구고갈을 포함하는 것인, 방법. - 제135항 내지 제177항 및 제199항 내지 제218항 중 어느 한 항의 비-활성화된 T 세포 및/또는 제178항 내지 제218항 중 어느 한 항의 조작된 T 세포, 및 약학적으로 허용가능한 첨가제, 담체, 희석제 또는 부형제를 포함하는 조성물을 대상체의 집단을 포함하는 약학 조성물의 투여를 포함하는, 대상체에서 질환 또는 장애를 치료하기 위한 투여량 양생법으로서,
상기 약학 조성물은 약 1-3 회 용량으로 투여되는, 투여량 양생법.
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