CN117157096A - 用于调节car-t活性的方法和组合物 - Google Patents
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- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
本文公开了工程化细胞和/或低免疫原性细胞，包括工程化和/或低免疫原性干细胞、从其分化的工程化和/或低免疫原性细胞、工程化和/或低免疫原性CAR‑T细胞(原代或从工程化和/或低免疫原性干细胞分化)以及使用和生成它们的相关方法。本文提供了工程化和/或低免疫原性细胞，其表现出降低的MHC I类和/或MHC II类人白细胞抗原和T细胞受体的表达。在一些实施方案中，此类细胞还外源表达一种或多种致耐受因子，诸如CD47和一种或多种嵌合抗原受体(CAR)。
Description
相关申请的交叉引用
本申请根据美国法典第35条第119(e)款要求2020年12月31日提交的美国临时申请号63/133,171；2021年1月11日提交的63/136,172；2021年4月14日提交的63/175,003；2021年10月14日提交的63/255,795；和2021年12月10日提交的63/288,477的优先权，所述申请的公开内容通过引用整体并入本文。
发明内容
现成的CAR-T细胞和其他治疗细胞可以提供优于基于自体细胞的策略的优势，包括易于制造、质量控制以及避免恶性污染和T细胞功能障碍。然而，针对组织不相容性T细胞的强烈宿主抗移植物免疫反应阻止同种异体CAR-T细胞的扩增和持续存在，并降低这种途径的功效。
在动物模型和人类患者中都有大量证据表明，低免疫原性细胞移植是一种科学可行并且临床上有前途的治疗多种病症、病状和疾病的途径。
仍然需要用于产生避免被受体免疫系统检测的基于细胞的疗法的新途径、组合物和方法。
在一些实施方案中，本文提供了一种工程化细胞，其相对于野生型细胞或对照细胞包含降低的HLA-A、HLA-B、HLA-C、HLA-DP、HLA-DQ、HLA-DR、B2M、CIITA、TCR-α和/或TCR-β的表达，所述工程化细胞还包含一组外源多核苷酸，所述一组外源多核苷酸包含编码CD47的第一外源多核苷酸和编码嵌合抗原受体(CAR)的第二外源多核苷酸，其中第一和/或第二外源多核苷酸插入到细胞的至少一个等位基因的特定基因座中。在一些实施方案中，使用病毒转导(例如使用载体)将外源多核苷酸插入到细胞的至少一个等位基因中。在一些实施方案中，载体是携带外源多核苷酸的假型化、自灭活慢病毒载体。在一些实施方案中，载体是用水疱性口炎病毒糖蛋白(VSV-G)包膜假型化的自灭活慢病毒载体，并携带外源多核苷酸。在一些实施方案中，使用病毒转导将外源多核苷酸插入到细胞的至少一个等位基因中。在一些实施方案中，使用基于慢病毒的病毒载体将外源多核苷酸插入到细胞的至少一个等位基因中。
在一些实施方案中，特定基因座选自由以下组成的组：安全港或靶标基因座、B2M基因座、CIITA基因座、TRAC基因座和TRB基因座。在许多实施方案中，将编码CD47的第一外源多核苷酸插入到选自由以下组成的组的特定基因座中：安全港或靶标基因座、B2M基因座、CIITA基因座、TRAC基因座和TRB基因座。在一些实施方案中，将编码CAR的第二外源多核苷酸插入到选自由以下组成的组的特定基因座中：安全港或靶标基因座、B2M基因座、CIITA基因座、TRAC基因座和TRB基因座。在一些实施方案中，使用病毒转导(例如使用载体)将外源多核苷酸插入到细胞的至少一个等位基因中。在一些实施方案中，载体是携带外源多核苷酸的假型化、自灭活慢病毒载体。在一些实施方案中，载体是用水疱性口炎VSV-G包膜假型化的自灭活慢病毒载体，并携带外源多核苷酸。在一些实施方案中，使用病毒转导将外源多核苷酸插入到细胞的至少一个等位基因中。在一些实施方案中，使用基于慢病毒的病毒载体将外源多核苷酸插入到细胞的至少一个等位基因中。
在一些实施方案中，将编码CD47的第一外源多核苷酸和编码CAR的第二外源多核苷酸插入到不同的基因座中。在许多实施方案中，将编码CD47的第一外源多核苷酸和编码CAR的第二外源多核苷酸插入到相同的基因座中。在若干实施方案中，将编码CD47的第一外源多核苷酸和编码CAR的第二外源多核苷酸插入到B2M基因座中。在一些实施方案中，将编码CD47的第一外源多核苷酸和编码CAR的第二外源多核苷酸插入到CIITA基因座中。在许多实施方案中，将编码CD47的第一外源多核苷酸和编码CAR的第二外源多核苷酸插入到TRAC基因座中。在一些实施方案中，将编码CD47的第一外源多核苷酸和编码CAR的第二外源多核苷酸插入到TRB基因座中。在一些实施方案中，将编码CD47的第一外源多核苷酸和编码CAR的第二外源多核苷酸插入到安全港或靶标基因座中。在一些实施方案中，安全港或靶标基因座选自由以下组成的组：CCR5基因座、CXCR4基因座、PPP1R12C(也称为AAVS1)基因座、白蛋白基因座、SHS231基因座、CLYBL基因座、Rosa基因座(例如，ROSA26基因座)、F3基因座(也称为CD142)、MICA基因座、MICB基因座、LRP1基因座(也称为CD91基因座)、HMGB1基因座、ABO基因座、RHD基因座、FUT1基因座和KDM5D基因座。在各种实施方案中，安全港或靶标基因座选自由以下组成的组：AAVS1基因座、CCR5基因座和ROSA26基因座。在一些实施方案中，使用病毒转导(例如使用载体)将外源多核苷酸插入到细胞的至少一个等位基因中。在一些实施方案中，载体是携带外源多核苷酸的假型化、自灭活慢病毒载体。在一些实施方案中，载体是用水疱性口炎VSV-G包膜假型化的自灭活慢病毒载体，并携带外源多核苷酸。在一些实施方案中，使用病毒转导将外源多核苷酸插入到细胞的至少一个等位基因中。在一些实施方案中，使用基于慢病毒的病毒载体将外源多核苷酸插入到细胞的至少一个等位基因中。
在一些实施方案中，CAR选自由CD19特异性CAR和CD22特异性CAR组成的组。在一些实施方案中，CAR是双特异性CAR。在一些实施方案中，CAR是CD19特异性CAR。在一些实施方案中，CAR是CD22特异性CAR。在一些实施方案中，CAR是双特异性CAR。在一些实施方案中，CAR是CD19/CD22双特异性CAR。
在许多实施方案中，工程化细胞不表达HLA-A、HLA-B和/或HLA-C抗原。在一些实施方案中，工程化细胞不表达B2M。在其他实施方案中，工程化细胞不表达HLA-DP、HLA-DQ和/或HLA-DR抗原。在一些实施方案中，工程化细胞不表达CIITA。在一些实施方案中，工程化细胞选自由以下组成的组：多能干细胞、诱导性多能干细胞、从诱导性多能干细胞分化的T细胞、原代T细胞和来源于原代T细胞的细胞，并且工程化细胞不表达TCR-α和/或TCR-β。
在许多实施方案中，工程化细胞是多能干细胞。在一些实施方案中，工程化细胞是诱导性多能干细胞。
在一些实施方案中，工程化细胞是来源于诱导性多能干细胞的分化细胞。在各种实施方案中，分化细胞选自由NK细胞和T细胞组成的组。
在一些实施方案中，工程化细胞是来源于原代T细胞的细胞。在许多实施方案中，来源于原代T细胞的细胞来源于T细胞库，所述T细胞库包含来自不同于受体受试者的一个或多个供体受试者的原代T细胞。
在一些实施方案中，工程化细胞是来源于原代NK细胞的细胞。在许多实施方案中，来源于原代NK细胞的细胞来源于NK细胞库，所述NK细胞库包含来自不同于受体受试者的一个或多个供体受试者的原代NK细胞。
在一些实施方案中，工程化细胞保留多能性且/或保留分化潜能。
在许多实施方案中，在转移到第一受试者体内后，工程化细胞表现出选自由以下组成的组的一种或多种反应：(a)T细胞反应，(b)NK细胞反应，和(c)巨噬细胞反应，所述反应与转移到第二受试者体内后的野生型细胞相比有所降低。在一些情况下，第一受试者和第二受试者是不同的受试者。在一些情况下，巨噬细胞反应是吞噬。在各种实施方案中，与转移到受试者体内后的野生型细胞相比，工程化细胞在转移到受试者体内后表现出选自由以下组成的组的一项或多项：(a)受试者的TH1活化减少，(b)受试者的NK细胞杀伤减少，和(c)受试者的完整PBMC的杀伤减少。在许多实施方案中，与转移到受试者体内后的野生型细胞相比，工程化细胞在转移到受试者体内后引发选自由以下组成的组的一项或多项：(a)受试者的供体特异性抗体减少，(b)受试者的IgM或IgG抗体减少，和(c)受试者的补体依赖性细胞毒性(CDC)减少。
在一些实施方案中，工程化细胞选自由以下组成的组：多能干细胞、诱导性多能干细胞、从诱导性多能干细胞分化的T细胞、原代T细胞和来源于原代T细胞的细胞，并且工程化细胞是包含编码CD47的第一外源多核苷酸和/或编码CAR的第二外源多核苷酸的B2M插入缺失/插入缺失、CIITA插入缺失/插入缺失和/或TRAC插入缺失/插入缺失细胞。在一些实施方案中，使用病毒转导将第一和/或第二外源多核苷酸插入到T细胞的至少一个等位基因中。在一些实施方案中，使用基于慢病毒的病毒载体将第一和/或第二外源多核苷酸插入到T细胞的至少一个等位基因中。在一些实施方案中，工程化细胞选自由以下组成的组：多能干细胞、诱导性多能干细胞、从诱导性多能干细胞分化的T细胞、原代T细胞和来源于原代T细胞的细胞，并且工程化细胞是包含插入到TRAC基因座中的编码CD47的第一外源多核苷酸和/或编码CAR的第二外源多核苷酸的B2M插入缺失/插入缺失、CIITA插入缺失/插入缺失和/或TRAC插入缺失/插入缺失细胞。在许多实施方案中，工程化细胞选自由以下组成的组：多能干细胞、诱导性多能干细胞、从诱导性多能干细胞分化的T细胞、原代T细胞和来源于原代T细胞的细胞，并且工程化细胞是包含插入到TRAC基因座中的编码CD47的第一外源多核苷酸和编码CAR的第二外源多核苷酸的B2M插入缺失/插入缺失、CIITA插入缺失/插入缺失和/或TRAC插入缺失/插入缺失细胞。在许多实施方案中，工程化细胞选自由以下组成的组：多能干细胞、诱导性多能干细胞、从诱导性多能干细胞分化的T细胞、原代T细胞和来源于原代T细胞的细胞，并且工程化细胞是包含插入到TRB基因座中的编码CD47的第一外源多核苷酸和/或编码CAR的第二外源多核苷酸的B2M插入缺失/插入缺失、CIITA插入缺失/插入缺失和/或TRAC插入缺失/插入缺失细胞。在一些实施方案中，工程化细胞选自由以下组成的组：多能干细胞、诱导性多能干细胞、从诱导性多能干细胞分化的T细胞、原代T细胞和来源于原代T细胞的细胞，并且工程化细胞是包含插入到TRB基因座中的编码CD47的第一外源多核苷酸和编码CAR的第二外源多核苷酸的B2M插入缺失/插入缺失、CIITA插入缺失/插入缺失和/或TRAC插入缺失/插入缺失细胞。在多个实施方案中，工程化细胞选自由以下组成的组：多能干细胞、诱导性多能干细胞、从诱导性多能干细胞分化的T细胞、原代T细胞和来源于原代T细胞的细胞，并且工程化细胞是包含插入到B2M基因座中的编码CD47的第一外源多核苷酸和/或编码CAR的第二外源多核苷酸的B2M插入缺失/插入缺失、CIITA插入缺失/插入缺失和/或TRAC插入缺失/插λ缺失细胞。在许多实施方案中，工程化细胞选自由以下组成的组：多能干细胞、诱导性多能干细胞、从诱导性多能干细胞分化的T细胞、原代T细胞和来源于原代T细胞的细胞，并且工程化细胞是包含插入到B2M基因座中的编码CD47的第一外源多核苷酸和编码CAR的第二外源多核苷酸的B2M插入缺失/插入缺失、CIITA插入缺失/插入缺失和/或TRAC插入缺失/插入缺失细胞。在一些实施方案中，工程化细胞选自由以下组成的组：多能干细胞、诱导性多能干细胞、从诱导性多能干细胞分化的T细胞、原代T细胞和来源于原代T细胞的细胞，并且工程化细胞是包含插入到CIITA基因座中的编码CD47的第一外源多核苷酸和/或编码CAR的第二外源多核苷酸的B2M插入缺失/插入缺失、CIITA插入缺失/插入缺失和/或TRAC插入缺失/插入缺失细胞。在许多实施方案中，工程化细胞选自由以下组成的组：多能干细胞、诱导性多能干细胞、从诱导性多能干细胞分化的T细胞、原代T细胞和来源于原代T细胞的细胞，并且工程化细胞是包含插入到CIITA基因座中的编码CD47的第一外源多核苷酸和编码CAR的第二外源多核苷酸的B2M插入缺失/插入缺失、CIITA插入缺失/插入缺失和/或TRAC插入缺失/插入缺失细胞。在一些实施方案中，使用病毒转导(例如使用载体)将外源多核苷酸插入到细胞的至少一个等位基因中。在一些实施方案中，载体是携带外源多核苷酸的假型化、自灭活慢病毒载体。在一些实施方案中，载体是用水疱性口炎VSV-G包膜假型化的自灭活慢病毒载体，并携带外源多核苷酸。在一些实施方案中，使用病毒转导将外源多核苷酸插入到细胞的至少一个等位基因中。在一些实施方案中，使用基于慢病毒的病毒载体将外源多核苷酸插入到细胞的至少一个等位基因中。
在一些实施方案中，工程化细胞选自由以下组成的组：多能干细胞、诱导性多能干细胞、从诱导性多能干细胞分化的T细胞、原代T细胞和来源于原代T细胞的细胞，并且工程化细胞是包含插入到TRAC基因座中的编码CD47的第一外源多核苷酸和/或编码CAR的第二外源多核苷酸的B2M插入缺失/插入缺失、CIITA插入缺失/插入缺失和/或TRB插入缺失/插入缺失细胞。在许多实施方案中，工程化细胞选自由以下组成的组：多能干细胞、诱导性多能干细胞、从诱导性多能干细胞分化的T细胞、原代T细胞和来源于原代T细胞的细胞，并且工程化细胞是包含插入到TRAC基因座中的编码CD47的第一外源多核苷酸和编码CAR的第二外源多核苷酸的B2M插入缺失/插入缺失、CIITA插入缺失/插入缺失和/或TRB插入缺失/插入缺失细胞。在许多实施方案中，工程化细胞选自由以下组成的组：多能干细胞、诱导性多能干细胞、从诱导性多能干细胞分化的T细胞、原代T细胞和来源于原代T细胞的细胞，并且工程化细胞是包含插入到TRB基因座中的编码CD47的第一外源多核苷酸和/或编码CAR的第二外源多核苷酸的B2M插入缺失/插入缺失、CIITA插入缺失/插入缺失和/或TRB插入缺失/插入缺失细胞。在一些实施方案中，工程化细胞选自由以下组成的组：多能干细胞、诱导性多能干细胞、从诱导性多能干细胞分化的T细胞、原代T细胞和来源于原代T细胞的细胞，并且工程化细胞是包含插入到TRB基因座中的编码CD47的第一外源多核苷酸和编码CAR的第二外源多核苷酸的B2M插入缺失/插入缺失、CIITA插入缺失/插入缺失和/或TRB插入缺失/插入缺失细胞。在多个实施方案中，工程化细胞选自由以下组成的组：多能干细胞、诱导性多能干细胞、从诱导性多能干细胞分化的T细胞、原代T细胞和来源于原代T细胞的细胞，并且工程化细胞是包含插入到B2M基因座中的编码CD47的第一外源多核苷酸和/或编码CAR的第二外源多核苷酸的B2M插入缺失/插入缺失、CIITA插入缺失/插入缺失和/或TRB插入缺失/插入缺失细胞。在许多实施方案中，工程化细胞选自由以下组成的组：多能干细胞、诱导性多能干细胞、从诱导性多能干细胞分化的T细胞、原代T细胞和来源于原代T细胞的细胞，并且工程化细胞是包含插入到B2M基因座中的编码CD47的第一外源多核苷酸和编码CAR的第二外源多核苷酸的B2M插入缺失/插入缺失、CIITA插入缺失/插入缺失和/或TRB插入缺失/插入缺失细胞。在一些实施方案中，工程化细胞选自由以下组成的组：多能干细胞、诱导性多能干细胞、从诱导性多能干细胞分化的T细胞、原代T细胞和来源于原代T细胞的细胞，并且工程化细胞是包含插入到CIITA基因座中的编码CD47的第一外源多核苷酸和/或编码CAR的第二外源多核苷酸的B2M插入缺失/插入缺失、CIITA插入缺失/插入缺失和/或TRB插入缺失/插入缺失细胞。在许多实施方案中，工程化细胞选自由以下组成的组：多能干细胞、诱导性多能干细胞、从诱导性多能干细胞分化的T细胞、原代T细胞和来源于原代T细胞的细胞，并且工程化细胞是包含插入到CIITA基因座中的编码CD47的第一外源多核苷酸和编码CAR的第二外源多核苷酸的B2M插入缺失/插入缺失、CIITA插入缺失/插入缺失和/或TRB插入缺失/插入缺失细胞。在一些实施方案中，使用病毒转导(例如使用载体)将外源多核苷酸插入到细胞的至少一个等位基因中。在一些实施方案中，载体是携带外源多核苷酸的假型化、自灭活慢病毒载体。在一些实施方案中，载体是用水疱性口炎VSV-G包膜假型化的自灭活慢病毒载体，并携带外源多核苷酸。在一些实施方案中，使用病毒转导将外源多核苷酸插入到细胞的至少一个等位基因中。在一些实施方案中，使用基于慢病毒的病毒载体将外源多核苷酸插入到细胞的至少一个等位基因中。
在一些实施方案中，工程化细胞是包含插入到TRAC基因座中的编码CD47的第一外源多核苷酸和/或编码CAR的第二外源多核苷酸的B2M插入缺失/插入缺失、CIITA插入缺失/插入缺失、TRAC插入缺失/插入缺失和/或TRB插入缺失/插入缺失细胞。在许多实施方案中，工程化细胞是包含插入到TRAC基因座中的编码CD47的第一外源多核苷酸和编码CAR的第二外源多核苷酸的B2M插入缺失/插入缺失、CIITA插入缺失/插入缺失、TRAC插入缺失/插入缺失和/或TRB插入缺失/插入缺失细胞。在许多实施方案中，工程化细胞是包含插入到TRB基因座中的编码CD47的第一外源多核苷酸和/或编码CAR的第二外源多核苷酸的B2M插入缺失/插入缺失、CIITA插入缺失/插入缺失、TRAC插入缺失/插入缺失和/或TRB插入缺失/插入缺失细胞。在一些实施方案中，工程化细胞是包含插入到TRB基因座中的编码CD47的第一外源多核苷酸和编码CAR的第二外源多核苷酸的B2M插入缺失/插入缺失、CIITA插入缺失/插入缺失、TRAC插入缺失/插入缺失和/或TRB插入缺失/插λ缺失细胞。在多个实施方案中，工程化细胞是包含插入到B2M基因座中的编码CD47的第一外源多核苷酸和/或编码CAR的第二外源多核苷酸的B2M插入缺失/插入缺失、CIITA插入缺失/插入缺失、TRAC插入缺失/插入辨失和/或TRB插入缺失/插入缺失细胞。在许多实施方案中，工程化细胞是包含插入到B2M基因座中的编码CD47的第一外源多核苷酸和编码CAR的第二外源多核苷酸的B2M插入缺失/插入缺失、CIITA插入缺失/插入缺失、TRAC插入缺失/插入缺失和/或TRB插入缺失/缺失缺失细胞。在一些实施方案中，工程化细胞是包含插入到CIITA基因座中的编码CD47的第一外源多核苷酸和/或编码CAR的第二外源多核苷酸的B2M插入缺失/插入缺失、CIITA插入缺失/插入缺失、TRAC插入缺失/插入缺失和/或TRB插入缺失/插入缺失细胞。在许多实施方案中，工程化细胞是包含插入到CIITA基因座中的编码CD47的第一外源多核苷酸和编码CAR的第二外源多核苷酸的B2M插入缺失/插入缺失、CIITA插入缺失/插入缺失、TRAC插入缺失/插入缺失和/或TRB插入缺失/插入缺失细胞。在一些实施方案中，使用病毒转导(例如使用载体)将外源多核苷酸插入到细胞的至少一个等位基因中。在一些实施方案中，载体是携带外源多核苷酸的假型化、自灭活慢病毒载体。在一些实施方案中，载体是用水疱性口炎VSV-G包膜假型化的自灭活慢病毒载体，并携带外源多核苷酸。在一些实施方案中，使用病毒转导将外源多核苷酸插入到细胞的至少一个等位基因中。在一些实施方案中，使用基于慢病毒的病毒载体将外源多核苷酸插入到细胞的至少一个等位基因中。
在一些实施方案中，提供了一种工程化细胞，其相对于野生型细胞或对照细胞包含降低的HLA-A、HLA-B、HLA-C、HLA-DP、HLA-DQ、HLA-DR、B2M、CIITA、TCR-α和/或TCR-β的表达。
在一些实施方案中，工程化细胞不表达HLA-A、HLA-B和/或HLA-C抗原。在许多实施方案中，工程化细胞不表达CIITA。
在许多实施方案中，工程化细胞不表达HLA-DP、HLA-DQ和/或HLA-DR抗原。在一些实施方案中，工程化细胞不表达B2M。
在许多实施方案中，工程化细胞选自由以下组成的组：多能干细胞、诱导性多能干细胞、从诱导性多能干细胞分化的T细胞、原代T细胞和来源于原代T细胞的细胞，并且工程化细胞不表达TCR-α。在许多实施方案中，工程化细胞选自由以下组成的组：多能干细胞、诱导性多能干细胞、从诱导性多能干细胞分化的T细胞、原代T细胞和来源于原代T细胞的细胞，并且工程化细胞不表达TCR-β。
在各种实施方案中，工程化细胞相对于野生型细胞或对照细胞过表达CD47。
在一些实施方案中，工程化细胞是多能干细胞。在许多实施方案中，工程化细胞是诱导性多能干细胞。
在许多实施方案中，工程化细胞是来源于诱导性多能干细胞的分化细胞。在一些实施方案中，分化细胞选自由NK细胞和T细胞组成的组。
在许多实施方案中，工程化细胞是来源于原代T细胞的细胞。在若干实施方案中，来源于原代T细胞的细胞来源于T细胞库，所述T细胞库包含来自不同于受体受试者的一个或多个供体受试者的原代T细胞。
在各种实施方案中，工程化细胞保留多能性且/或保留分化潜能。
在一些实施方案中，在转移到受试者体内后，工程化细胞引发选自由以下组成的组的一种或多种反应：(a)T细胞反应，(b)NK细胞反应，和(c)巨噬细胞反应，所述反应与转移到第二受试者体内后的野生型细胞相比有所降低。在一些情况下，第一受试者和第二受试者是不同的受试者。在一些情况下，巨噬细胞反应是吞噬。
在各种实施方案中，与转移到受试者体内后的野生型细胞相比，工程化细胞在转移到受试者体内后表现出选自由以下组成的组的一项或多项：(a)受试者的TH1活化减少，(b)受试者的NK细胞杀伤减少，和(c)受试者的完整PBMC的杀伤减少。在许多实施方案中，与转移到受试者体内后的野生型细胞相比，工程化细胞在转移到受试者体内后引发选自由以下组成的组的一项或多项：(a)受试者的供体特异性抗体减少，(b)受试者的IgM或IgG抗体减少，和(c)受试者的补体依赖性细胞毒性(CDC)减少。
在一些实施方案中，工程化细胞是B2M插入缺失/插入缺失、CIITA插入缺失/插入缺失、TRAC插入缺失/插入缺失和/或TRB插入缺失/插入缺失细胞。在一些情况下，工程化细胞是B2M插入缺失/插入缺失、CIITA插入缺失/插入缺失、TRAC插入缺失/插入缺失和/或TRB插入缺失/插入缺失原代T细胞。在一些情况下，工程化细胞是从低免疫原性诱导性多能干细胞分化的B2M插入缺失/插入缺失、CIITA插入缺失/插入缺失、TRAC插入缺失/插入缺失和/或TRB插入缺失/插入缺失T细胞。在一些实施方案中，工程化细胞选自由以下组成的组：多能干细胞、诱导性多能干细胞、从诱导性多能干细胞分化的T细胞、原代T细胞和来源于原代T细胞的细胞，并且工程化细胞是B2M插入缺失/插入缺失、CIITA插入缺失/插入缺失、TRAC插入缺失/插入缺失细胞。在一些情况下，工程化细胞选自由以下组成的组：多能干细胞、诱导性多能干细胞、从诱导性多能干细胞分化的T细胞、原代T细胞和来源于原代T细胞的细胞，并且工程化细胞是B2M插入缺失/插入缺失、CIITA插入缺失/插入缺失、TRAC插入缺失/插入缺失原代T细胞。在一些实施方案中，工程化细胞选自由以下组成的组：多能干细胞、诱导性多能干细胞、从诱导性多能干细胞分化的T细胞、原代T细胞和来源于原代T细胞的细胞，并且工程化细胞是B2M插入缺失/插入缺失、CIITA插入缺失/插入缺失、TRB插入缺失/插入缺失细胞。在一些情况下，工程化细胞选自由以下组成的组：多能干细胞、诱导性多能干细胞、从诱导性多能干细胞分化的T细胞、原代T细胞和来源于原代T细胞的细胞，并且工程化细胞是B2M插入缺失/插入缺失、CIITA插入缺失/插入缺失、TRB插入缺失/插入缺失原代T细胞。在一些情况下，工程化细胞是从低免疫原性诱导性多能干细胞分化的B2M插入缺失/插入缺失、CIITA插入缺失/插入缺失和/或TRAC插入缺失/插入缺失T细胞。在一些实施方案中，工程化细胞是B2M插入缺失/插入缺失、CIITA插入缺失/插入缺失和/或TRB插入缺失/插入缺失细胞。在一些情况下，工程化细胞是B2M插入缺失/插入缺失、CIITA插入缺苯/插入缺失和/或TRB插入缺失/插入缺失原代T细胞。在一些情况下，工程化细胞是从低免疫原性诱导性多能干细胞分化的B2M插入缺失/插入缺失、CIITA插入缺失/插入缺失和/或TRB插入缺失/插入缺失T细胞。
在一些实施方案中，工程化细胞是低免疫原性细胞。
在一些实施方案中，提供了一种药物组合物，其包含本文所述的任何工程化细胞群和药学上可接受的添加剂、载剂、稀释剂或赋形剂。
在一些实施方案中，药学上可接受的添加剂、载剂、稀释剂或赋形剂包括选自由以下组成的组的一种或多种：Plasma-Lyte右旋糖、葡聚糖、氯化钠、人血清白蛋白(HSA)、二甲基亚砜(DMSO)及其组合。在一些实施方案中，药物组合物还包含药学上可接受的缓冲剂。在一些实施方案中，药学上可接受的缓冲剂是中性缓冲盐水或磷酸盐缓冲盐水。
在一些实施方案中，提供了一种药物组合物，其包含本文所述的任何工程化细胞群、浓度为约70-80％重量/重量的CSB的基础溶液，以及以下中的一种或多种：约20-30％重量/重量的PlasmaLyte-ATM、约0.3-5.3％重量/体积的人血清白蛋白(HSA)、约0-20％体积/体积的二甲亚砜(DMSO)和约100-400mM海藻糖。
在一些实施方案中，提供了一种药物组合物，其包含本文所述的任何工程化细胞群、浓度为约20-30％重量/重量的PlasmaLyte-ATM的基础溶液，以及以下中的一种或多种：约70-80％重量/重量的CSB、约0.3-5.3％重量/体积的人血清白蛋白(HSA)、约0-20％体积/体积的二甲亚砜(DMSO)和约100-400mM海藻糖。
在一些实施方案中，提供了一种药物组合物，其包含本文所述的任何工程化细胞群、约0.3-5.3％重量/体积的人血清白蛋白(HSA)，以及以下中的一种或多种：约70-80％重量/重量的CSB、约20-30％重量/重量的PlasmaLyte-ATM、约0-20％体积/体积的二甲亚砜(DMSO)和约100-400mM海藻糖。
在一些实施方案中，提供了一种药物组合物，其包含本文所述的任何工程化细胞群、约0-20％体积/体积的二甲亚砜(DMSO)，以及以下中的一种或多种：约70-80％重量/重量的CSB、约20-30％重量/重量的PlasmaLyte-ATM、约0.3-5.3％重量/体积的人血清白蛋白(HSA)和约100-400mM海藻糖。
在一些实施方案中，提供了一种药物组合物，其包含本文所述的任何工程化细胞群、约100-400mM海藻糖，以及以下中的一种或多种：约70-80％重量/重量的CSB、约20-30％重量/重量的PlasmaLyte-ATM、约0.3-5.3％重量/体积的人血清白蛋白(HSA)和约0-20％体积/体积的二甲亚砜(DMSO)。
在一些实施方案中，药物组合物包含约75％重量/重量的CSB。在一些实施方案中，药物组合物包含约25％重量/重量的PlasmaLyte-ATM。在一些实施方案中，药物组合物包含约0.3％重量/体积的HSA。在一些实施方案中，药物组合物包含约7.5％体积/体积的DMSO。
在一些实施方案中，提供了一种药物组合物，其包含本文所述的任何工程化细胞群、浓度为约75％重量/重量的CSB的基础溶液、约25％重量/重量的PlasmaLyte-ATM、约0.3％重量/体积的人血清白蛋白(HSA)和约7.5％体积/体积的二甲亚砜(DMSO)。
在一些实施方案中，工程化细胞群为至多约8.0x108个细胞。在许多实施方案中，工程化细胞群为至多约6.0x108个细胞。在其他实施方案中，工程化细胞群为约1.0x106至约2.5x108个细胞。在一些实施方案中，工程化细胞群为约2.0x106至约2.0x108个细胞。
在各种实施方案中，工程化细胞群的范围为约5ml至约80ml。在许多实施方案中，工程化细胞群的范围为约10ml至约70ml。在一些实施方案中，工程化细胞群的范围为约10ml至约50ml。
在一些实施方案中，组合物被配制用于以单剂量施用。在许多实施方案中，组合物被配制用于以至多三个剂量施用。
在一些实施方案中，组合物被配制用于向受试者施用单剂量，所述施用需要约60分钟或更短的持续时间。在许多实施方案中，组合物被配制用于向受试者施用单剂量，所述施用需要约30分钟或更短的持续时间。
在一些实施方案中，药物组合物的工程化细胞群或其后代在施用后10天后在受试者中表现出至少40％的存活率。在各种实施方案中，药物组合物的工程化细胞群或其后代在施用后约2周后在受试者中表现出至少80％的存活率。在若干实施方案中，药物组合物的工程化细胞群或其后代在施用后约3周后在受试者中表现出至少100％的存活率。在许多实施方案中，药物组合物的工程化细胞群或其后代在施用后约4周后在受试者中表现出至少150％的存活率。
在另一个实施方案中，提供了一种用于治疗受试者的疾病或病症的剂量方案，其包括施用药物组合物，所述药物组合物包含本文所述的任何工程化细胞群和药学上可接受的添加剂、载剂、稀释剂或赋形剂，其中所述药物组合物以约1-3个剂量施用。
在一些实施方案中，以约1-3个剂量施用的药物组合物为至多约6.0x108个细胞。在一些实施方案中，以约1-3个剂量施用的药物组合物为约0.6x106至约6.0xI08个细胞。在一些实施方案中，如果受试者的体重为50kg或更小，则以约1-3个剂量施用的药物组合物为约0.2x106至约5.0x106细胞/kg受试者体重。在一些实施方案中，如果受试者的体重大于50kg，则以约1-3个剂量施用的药物组合物为约0.1x108至约2.5x108个细胞。在一些实施方案中，以约1-3个剂量施用的药物组合物为约2.0x106细胞/kg受试者体重且至多约2.x108个细胞。
在一些实施方案中，向受试者施用单剂量需要约60分钟或更短的持续时间。在一些实施方案中，向受试者施用单剂量需要约30分钟或更短的持续时间。
在一些实施方案中，药学上可接受的添加剂、载剂、稀释剂或赋形剂包括选自由以下组成的组的一种或多种：Plasma-Lyte右旋糖、葡聚糖、氯化钠、人血清白蛋白(HSA)、二甲基亚砜(DMSO)及其组合。
在一些实施方案中，药物组合物还包含药学上可接受的缓冲剂。在一些实施方案中，药学上可接受的缓冲剂是中性缓冲盐水或磷酸盐缓冲盐水。
在一些实施方案中，在施用药物组合物后，细胞群或其后代在受试者中存在至多9个月。在一些实施方案中，在施用药物组合物后，细胞群或其后代在受试者中存在至少两年或更久。
在一些实施方案中，在施用药物组合物后，工程化细胞群或其后代在施用后约10天后在受试者中表现出至少40％的存活率。在一些实施方案中，在施用药物组合物后，工程化细胞群或其后代在施用后约2周后在受试者中表现出至少80％的存活率。在一些实施方案中，在施用药物组合物后，工程化细胞群或其后代在施用后约3周后在受试者中表现出至少100％的存活率。在一些实施方案中，在施用药物组合物后，工程化细胞群或其后代在施用后约4周后在受试者中表现出至少150％的存活率。
在一些实施方案中，向受试者施用2-3个剂量，使得每个剂量的施用间隔的范围为1至24小时。在一些实施方案中，向受试者施用2-3个剂量，使得每个剂量的施用间隔的范围为1至28天。在一些实施方案中，向受试者施用2-3个剂量，使得每个剂量的施用间隔的范围为1至6周。在一些实施方案中，向受试者施用2-3个剂量，使得每个剂量的施用间隔的范围为1至12个月或更久。
本文提供了一种用于治疗受试者的疾病或病症的剂量方案，其包括施用药物组合物，所述药物组合物包含(i)工程化细胞，其包含降低的HLA-A、HLA-B、HLA-C、HLA-DP、HLA-DQ、HLA-DR、B2M、CIITA、TCR-α和/或TCR-β的表达，所述工程化细胞还包含一组编码CD47和嵌合抗原受体(CAR)的外源多核苷酸。在一些实施方案中，使用病毒转导(例如使用载体)将外源多核苷酸组插入到T细胞的至少一个等位基因中。在一些实施方案中，载体是携带外源多核苷酸组的假型化、自灭活慢病毒载体。在一些实施方案中，载体是用水疱性口炎VSV-G包膜假型化的自灭活慢病毒载体，并携带外源多核苷酸组。在一些实施方案中，使用基于慢病毒的病毒载体将外源多核苷酸组插入到T细胞的至少一个等位基因中。在一些实施方案中，将外源多核苷酸组插入到细胞的至少一个等位基因的安全港或靶标基因座中；和(ii)药学上可接受的添加剂、载剂、稀释剂或赋形剂，其中药物组合物包含至多约6.0x108个细胞。在一些实施方案中，使用病毒转导(例如使用载体)将外源多核苷酸插入到细胞的至少一个等位基因中。在一些实施方案中，载体是携带外源多核苷酸的假型化、自灭活慢病毒载体。在一些实施方案中，载体是用水疱性口炎VSV-G包膜假型化的自灭活慢病毒载体，并携带外源多核苷酸。在一些实施方案中，使用病毒转导将外源多核苷酸插入到细胞的至少一个等位基因中。在一些实施方案中，使用基于慢病毒的病毒载体将外源多核苷酸插入到细胞的至少一个等位基因中。
本文提供了一种用于治疗受试者的疾病或病症的剂量方案，其包括施用药物组合物，所述药物组合物包含(i)工程化细胞，其包含降低为HLA-A、HLA-B、HLA-C、HLA-DP、HLA-DQ、HLA-DR、B2M、CIITA、TCR-α和/或TCR-β的表达，所述工程化细胞还包含一组编码CD47和嵌合抗原受体(CAR)的外源多核苷酸。在一些实施方案中，使用病毒转导将外源多核苷酸组插入到T细胞的至少一个等位基因中。在一些实施方案中，使用基于慢病毒的病毒载体将外源多核苷酸组插入到T细胞的至少一个等位基因中。在一些实施方案中，将外源多核苷酸组插入到细胞的至少一个等位基因的安全港或靶标基因座中；和(ii)药学上可接受的添加剂、载剂、稀释剂或赋形剂，其中药物组合物以1-3个剂量施用。在一些实施方案中，使用病毒转导(例如使用载体)将外源多核苷酸插入到细胞的至少一个等位基因中。在一些实施方案中，载体是携带外源多核苷酸的假型化、自灭活慢病毒载体。在一些实施方案中，载体是用水疱性口炎VSV-G包膜假型化的自灭活慢病毒载体，并携带外源多核苷酸。在一些实施方案中，使用病毒转导将外源多核苷酸插入到细胞的至少一个等位基因中。在一些实施方案中，使用基于慢病毒的病毒载体将外源多核苷酸插入到细胞的至少一个等位基因中。
本文提供了一种用于治疗受试者的疾病或病症的剂量方案，其包括施用药物组合物，所述药物组合物包含(i)工程化细胞，其包含降低的HLA-A、HLA-B、HLA-C、HLA-DP、HLA-DQ、HLA-DR、B2M、CIITA、TCR-β和/或TCR-β的表达，所述工程化细胞还包含一组编码CD47和嵌合抗原受体(CAR)的外源多核苷酸，其中将外源多核苷酸组插入到细胞的至少一个等位基因的安全港或靶标基因座中；和(ii)药学上可接受的添加剂、载剂、稀释剂或赋形剂，其中一剂药物组合物施用约60分钟或更短的持续时间。在一些实施方案中，使用病毒转导(例如使用载体)将外源多核苷酸插入到细胞的至少一个等位基因中。在一些实施方案中，载体是携带外源多核苷酸的假型化、自灭活慢病毒载体。在一些实施方案中，载体是用水疱性口炎VSV-G包膜假型化的自灭活慢病毒载体，并携带外源多核苷酸。在一些实施方案中，使用病毒转导将外源多核苷酸插入到细胞的至少一个等位基因中。在一些实施方案中，使用基于慢病毒的病毒载体将外源多核苷酸插入到细胞的至少一个等位基因中。
本文提供了一种用于治疗受试者的疾病或病症的剂量方案，其包括施用药物组合物，所述药物组合物包含(i)工程化细胞，其包含降低的HLA-A、HLA-B、HLA-C、HLA-DP、HLA-DQ、HLA-DR、B2M、CIITA、TCR-α和/或TCR-β的表达；和(ii)药学上可接受的添加剂、载剂、稀释剂或赋形剂，其中药物组合物包含至多约6.0x108个细胞。
本文提供了一种用于治疗受试者的疾病或病症的剂量方案，其包括施用药物组合物，所述药物组合物包含(i)工程化细胞，其包含降低的HLA-A、HLA-B、HLA-C、HLA-DP、HLA-DQ、HLA-DR、B2M、CIITA、TCR-α和/或TCR-β的表达；和(ii)药学上可接受的添加剂、载剂、稀释剂或赋形剂，其中药物组合物以1-3个剂量施用。
本文提供了一种用于治疗受试者的疾病或病症的剂量方案，其包括施用药物组合物，所述药物组合物包含(i)工程化细胞，其包含降低为HLA-A、HLA-B、HLA-C、HLA-DP、HLA-DQ、HLA-DR、B2M、CIITA、TCR-α和/或TCR-β的表达；和(ii)药学上可接受的添加剂、载剂、稀释剂或赋形剂，其中一剂药物组合物施用60分钟或更短的持续时间。
在一些实施方案中，提供了一种治疗受试者的癌症的方法，其包括向受试者施用本文所述的任何工程化细胞或本文所述的任何药物组合物或本文所述的任何剂量方案。在一些实施方案中，癌症是CD19+癌症。
在一些实施方案中，提供了一种在受试者中预防T细胞耗竭或治疗疾病的方法，其包括向受试者施用本文所述的任何工程化细胞，其中CAR是CD19/CD22双特异性CAR。
在一些实施方案中，本文提供了一种在受试者中预防T细胞耗竭或治疗疾病的方法，其包括：(i)在第一时间点，向受试者施用包含第一群体的本文所述的任何工程化细胞的第一剂量方案；和(ii)在第二时间点，向受试者施用包含第二群体的本文所述的任何工程化细胞的第二剂量方案，其中第一剂量方案和第二剂量方案不同。
在一些实施方案中，本文提供了一种在受试者中预防T细胞耗竭或治疗疾病的方法，其包括：(i)在第一时间点，向受试者施用包含第一群体的本文所述的任何工程化细胞的第一剂量方案；和(ii)在第二时间点，向受试者施用包含第二群体的本文所述的任何工程化细胞的第二剂量方案，其中第一群体的工程化细胞和第二群体的工程化细胞包含相同的嵌合抗原受体。
在一些实施方案中，本文提供了一种在受试者中预防T细胞耗竭或治疗疾病的方法，其包括：(i)在第一时间点，向受试者施用包含第一群体的本文所述的任何工程化细胞的第一剂量方案；和(ii)在第二时间点，向受试者施用包含第二群体的本文所述的任何工程化细胞的第二剂量方案，其中第一群体的工程化细胞和第二群体的工程化细胞包含不同的嵌合抗原受体。
在一些实施方案中，本文提供了一种在受试者中预防T细胞耗竭或治疗疾病的方法，其包括：(i)在第一时间点，向受试者施用包含第一群体的本文所述的任何工程化细胞的第一剂量方案；和(ii)在第二时间点，向受试者施用包含第二群体的本文所述的任何工程化细胞的第二剂量方案，其中第一群体的工程化细胞包含结合第一抗原的第一嵌合抗原受体，并且第二群体的工程化细胞包含结合第二抗原的第二嵌合抗原受体，并且其中第一抗原和第二抗原相同。
在一些实施方案中，本文提供了一种在受试者中预防T细胞耗竭或治疗疾病的方法，其包括：(i)在第一时间点，向受试者施用包含第一群体的本文所述的任何工程化细胞的第一剂量方案；和(ii)在第二时间点，向受试者施用包含第二群体的本文所述的任何工程化细胞的第二剂量方案，其中第一群体的工程化细胞包含结合第一抗原的第一嵌合抗原受体，并且第二群体的工程化细胞包含结合第二抗原的第二嵌合抗原受体，并且其中第一抗原和第二抗原不同。
本文提供了非活化T细胞，其相对于野生型T细胞包含降低的HLA-A、HLA-B、HLA-C、HLA-DP、HLA-DQ、HLA-DR、B2M、CIITA、TCR-α和/或TCR-β的表达，以及编码嵌合抗原受体(CAR)的第一外源多核苷酸。在一些实施方案中，使用病毒转导(例如使用载体)将外源多核苷酸插入到细胞的至少一个等位基因中。在一些实施方案中，载体是携带外源多核苷酸的假型化、自灭活慢病毒载体。在一些实施方案中，载体是用水疱性口炎VSV-G包膜假型化的自灭活慢病毒载体，并携带外源多核苷酸。在一些实施方案中，使用病毒转导将外源多核苷酸插入到细胞的至少一个等位基因中。在一些实施方案中，使用基于慢病毒的病毒载体将外源多核苷酸插入到细胞的至少一个等位基因中。
在一些实施方案中，非活化T细胞是原代T细胞。在其他实施方案中，非活化T细胞从本技术的工程化细胞分化。
在一些实施方案中，T细胞是CD8+T细胞。
在一些实施方案中，非活化T细胞未用抗CD3抗体、抗CD28抗体、T细胞活化细胞因子或可溶性T细胞共刺激分子处理。
在一些实施方案中，抗CD3抗体是OKT3。在一些实施方案中，抗CD28抗体是CD28.2。在一些实施方案中，T细胞活化细胞因子选自由IL-2、IL-7、IL-15和IL-21组成的T细胞活化细胞因子组。在一些实施方案中，可溶性T细胞共刺激分子选自由抗CD28抗体、抗CD80抗体、抗CD86抗体、抗CD137L抗体和抗ICOS-L抗体组成的可溶性T细胞共刺激分子组。
在一些实施方案中，非活化T细胞不表达活化标志物。
在一些实施方案中，非活化T细胞表达CD3和CD28，并且其中CD3和/或CD28是无活性的。
在一些实施方案中，第一外源多核苷酸由包含CD8结合剂的慢病毒载体携带。
在一些实施方案中，非活化T细胞还包含编码CD47的第二外源多核苷酸。
在一些实施方案中，将第一和/或第二外源多核苷酸插入到T细胞的至少一个等位基因的特定基因座中。在一些实施方案中，使用病毒转导将第一和/或第二外源多核苷酸插入到T细胞的至少一个等位基因中。在一些实施方案中，使用基于慢病毒的病毒载体将第一和/或第二外源多核苷酸插入到T细胞的至少一个等位基因中。在一些实施方案中，载体是携带第一和/或第二外源多核苷酸的假型化、自灭活慢病毒载体。在一些实施方案中，载体是用水疱性口炎VSV-G包膜假型化的自灭活慢病毒载体，并携带第一和/或第二外源多核苷酸。在一些实施方案中，特定基因座选自由以下组成的组：安全港或靶标基因座、B2M基因座、CIITA基因座、TRAC基因座和TRB基因座。在一些实施方案中，将编码CD47的第二外源多核苷酸插入到选自由以下组成的组的特定基因座中：安全港或靶标基因座、B2M基因座、CIITA基因座、TRAC基因座和TRB基因座。在一些实施方案中，将编码CAR的第一外源多核苷酸插入到选自由以下组成的组的特定基因座中：安全港或靶标基因座、B2M基因座、CIITA基因座、TRAC基因座和TRB基因座。在一些实施方案中，将编码CD47的第二外源多核苷酸和编码CAR的第一外源多核苷酸插入到不同的基因座中。在一些实施方案中，将编码CD47的第二外源多核苷酸和编码CAR的第一外源多核苷酸插入到相同的基因座中。在一些实施方案中，将编码CD47的第二外源多核苷酸和编码CAR的第一外源多核苷酸插入到B2M基因座中。在一些实施方案中，将编码CD47的第二外源多核苷酸和编码CAR的第一外源多核苷酸插入到CIITA基因座中。在一些实施方案中，将编码CD47的第二外源多核苷酸和编码CAR的第一外源多核苷酸插入到TRAC基因座中。在一些实施方案中，将编码CD47的第二外源多核苷酸和编码CAR的第一外源多核苷酸插入到TRB基因座中。在一些实施方案中，将编码CD47的第二外源多核苷酸和编码CAR的第一外源多核苷酸插入到安全港或靶标基因座中。在一些实施方案中，安全港或靶标基因座选自由以下组成的组：CCR5基因座、CXCR4基因座、PPP1R12C(也称为AAVS1)基因座、白蛋白基因座、SHS231基因座、CLYBL基因座、Rosa基因座(例如，ROSA26基因座)、F3基因座(也称为CD142)、MICA基因座、MICB基因座、LRP1基因座(也称为CD91基因座)、HMGB1基因座、ABO基因座、RHD基因座、FUT1基因座和KDM5D基因座。在一些实施方案中，安全港或靶标基因座选自由以下组成的组：AAVS1基因座、CCR5基因座和ROSA26基因座。在一些实施方案中，使用病毒转导(例如使用载体)将外源多核苷酸插入到细胞的至少一个等位基因中。在一些实施方案中，载体是携带外源多核苷酸的假型化、自灭活慢病毒载体。在一些实施方案中，载体是用水疱性口炎VSV-G包膜假型化的自灭活慢病毒载体，并携带外源多核苷酸。在一些实施方案中，使用病毒转导将外源多核苷酸插入到细胞的至少一个等位基因中。在一些实施方案中，使用基于慢病毒的病毒载体将外源多核苷酸插入到细胞的至少一个等位基因中。
在一些实施方案中，CAR选自由CD19特异性CAR和CD22特异性CAR组成的组。在一些实施方案中，CAR是双特异性CAR。在一些实施方案中，双特异性CAR是CD19/CD22双特异性CAR。
在一些实施方案中，非活化T细胞不表达HLA-A、HLA-B和/或HLA-C抗原。在一些实施方案中，非活化T细胞不表达B2M。在一些实施方案中，非活化T细胞不表达HLA-DP、HLA-DQ和/或HLA-DR抗原。在一些实施方案中，非活化T细胞不表达CIITA。在一些实施方案中，非活化T细胞不表达TCR-α和TCR-β。
在一些实施方案中，非活化T细胞是包含插入到TRAC基因座中的编码CD47的第二外源多核苷酸和/或编码CAR的第一外源多核苷酸的B2M插入缺失/插入缺失、CIITA插入缺失/插入缺失、TRAC插入缺失/插入缺失细胞。
在一些实施方案中，非活化T细胞是包含插入到TRAC基因座中的编码CD47的第二外源多核苷酸和编码CAR的第一外源多核苷酸的B2M插入缺失/插入缺失、CIITA插入缺失/插入缺失、TRAC插入缺失/插入缺失细胞。
在一些实施方案中，非活化T细胞是包含插入到TRB基因座中的编码CD47的第二外源多核苷酸和/或编码CAR的第一外源多核苷酸的B2M插入缺失/插入缺失、CIITA插入缺失/插入缺失、TRAC插入缺失/插入缺失细胞。
在一些实施方案中，非活化T细胞是包含插入到TRB基因座中的编码CD47的第二外源多核苷酸和编码CAR的第一外源多核苷酸的B2M插入缺失/插入缺失、CIITA插入缺失/插入缺失、TRAC插入缺失/插入缺失细胞。
在一些实施方案中，非活化T细胞是包含插入到B2M基因座中的编码CD47的第二外源多核苷酸和/或编码CAR的第一外源多核苷酸的B2M插入缺失/插入缺失、CIITA插入缺失/插入缺失、TRAC插入缺失/插入缺失细胞。
在一些实施方案中，非活化T细胞是包含插入到B2M基因座中的编码CD47的第二外源多核苷酸和编码CAR的第一外源多核苷酸的B2M插入缺失/插入缺失、CIITA插入缺失/插入缺失、TRAC插入缺失/插入缺失细胞。
在一些实施方案中，非活化T细胞是包含插入到CIITA基因座中的编码CD47的第二外源多核苷酸和/或编码CAR的第一外源多核苷酸的B2M插入缺失/插入缺失、CIITA插入缺失/插入缺失、TRAC插入缺失/插入缺失细胞。
在一些实施方案中，非活化T细胞是包含插入到CIITA基因座中的编码CD47的第二外源多核苷酸和编码CAR的第一外源多核苷酸的B2M插入缺失/插入缺失、CIITA插入缺失/插入缺失、TRAC插入缺失/插入缺失细胞。
在一些实施方案中，使用病毒转导(例如使用载体)将外源多核苷酸插入到细胞的至少一个等位基因中。在一些实施方案中，载体是携带外源多核苷酸的假型化、自灭活慢病毒载体。在一些实施方案中，载体是用水疱性口炎VSV-G包膜假型化的自灭活慢病毒载体，并携带外源多核苷酸。在一些实施方案中，使用病毒转导将外源多核苷酸插入到细胞的至少一个等位基因中。在一些实施方案中，使用基于慢病毒的病毒载体将外源多核苷酸插入到细胞的至少一个等位基因中。
本文提供了工程化T细胞，其相对于野生型T细胞包含降低的HLA-A、HLA-B、HLA-C、HLA-DP、HLA-DQ、HLA-DR、B2M、CIITA、TCR-α和/或TCR-β的表达，其中工程化T细胞还包含由慢病毒载体携带的编码嵌合抗原受体(CAR)的第一外源多核苷酸。本文提供了工程化T细胞，其相对于野生型T细胞包含降低的HLA-A、HLA-B、HLA-C、HLA-DP、HLA-DQ、HLA-DR、B2M、CIITA、TCR-α和/或TCR-β的表达，其中工程化T细胞还包含由包含CD8结合剂的慢病毒载体携带的编码嵌合抗原受体(CAR)的第一外源多核苷酸。在一些实施方案中，使用病毒转导(例如使用载体)将外源多核苷酸插入到细胞的至少一个等位基因中。在一些实施方案中，载体是携带外源多核苷酸的假型化、自灭活慢病毒载体。在一些实施方案中，载体是用水疱性口炎VSV-G包膜假型化的自灭活慢病毒载体，并携带外源多核苷酸。在一些实施方案中，使用病毒转导将外源多核苷酸插入到细胞的至少一个等位基因中。在一些实施方案中，使用基于慢病毒的病毒载体将外源多核苷酸插入到细胞的至少一个等位基因中。
在一些实施方案中，工程化T细胞是原代T细胞。在其他实施方案中，工程化T细胞从本技术的工程化细胞分化。在一些实施方案中，T细胞是CD8+T细胞。
在一些实施方案中，工程化T细胞未用抗CD3抗体、抗CD28抗体、T细胞活化细胞因子或可溶性T细胞共刺激分子处理。在一些实施方案中，抗CD3抗体是OKT3，其中抗CD28抗体是CD28.2，其中T细胞活化细胞因子选自由IL-2、IL-7、IL-15和IL-21组成的T细胞活化细胞因子组，并且其中可溶性T细胞共刺激分子选自由抗CD28抗体、抗CD80抗体、抗CD86抗体、抗CD137L抗体和抗ICOS-L抗体组成的可溶性T细胞共刺激分子组。
在一些实施方案中，工程化T细胞不表达活化标志物。在一些实施方案中，工程化T细胞表达CD3和CD28，并且其中CD3和/或CD28是无活性的。
在一些实施方案中，工程化T细胞还包含编码CD47的第二外源多核苷酸。在一些实施方案中，将第一和/或第二外源多核苷酸插入到T细胞的至少一个等位基因的特定基因座中。在一些实施方案中，特定基因座选自由以下组成的组：安全港或靶标基因座、B2M基因座、CIITA基因座、TRAC基因座和TRB基因座。在一些实施方案中，将编码CD47的第二外源多核苷酸插入到选自由以下组成的组的特定基因座中：安全港或靶标基因座、B2M基因座、CIITA基因座、TRAC基因座和TRB基因座。在一些实施方案中，将编码CAR的第一外源多核苷酸插入到选自由以下组成的组的特定基因座中：安全港或靶标基因座、B2M基因座、CIITA基因座、TRAC基因座和TRB基因座。在一些实施方案中，将编码CD47的第二外源多核苷酸和编码CAR的第一外源多核苷酸插入到不同的基因座中。在一些实施方案中，将编码CD47的第二外源多核苷酸和编码CAR的第一外源多核苷酸插入到相同的基因座中。在一些实施方案中，将编码CD47的第二外源多核苷酸和编码CAR的第一外源多核苷酸插入到B2M基因座、CIITA基因座、TRAC基因座、TRB基因座或安全港或靶标基因座中。在一些实施方案中，安全港或靶标基因座选自由以下组成的组：CCR5基因座、CXCR4基因座、PPP1R12C(也称为AAVS1)基因座、白蛋白基因座、SHS231基因座、CLYBL基因座、Rosa基因座(例如，ROSA26基因座)、F3基因座(也称为CD142)、MICA基因座、MICB基因座、LRP1基因座(也称为CD91基因座)、HMGB1基因座、ABO基因座、RHD基因座、FUT1基因座和KDM5D基因座。在一些实施方案中，安全港或靶标基因座选自由以下组成的组：AAVS1基因座、CCR5基因座和ROSA26基因座。在一些实施方案中，使用病毒转导(例如使用载体)将外源多核苷酸插入到细胞的至少一个等位基因中。在一些实施方案中，载体是携带外源多核苷酸的假型化、自灭活慢病毒载体。在一些实施方案中，载体是用水疱性口炎VSV-G包膜假型化的自灭活慢病毒载体，并携带外源多核苷酸。在一些实施方案中，使用病毒转导将外源多核苷酸插入到细胞的至少一个等位基因中。在一些实施方案中，使用基于慢病毒的病毒载体将外源多核苷酸插入到细胞的至少一个等位基因中。
在一些实施方案中，CAR选自由CD19特异性CAR和CD22特异性CAR组成的组。
在一些实施方案中，工程化T细胞不表达HLA-A、HLA-B和/或HLA-C抗原，其中工程化T细胞不表达B2M，其中工程化T细胞不表达HLA-DP、HLA-DQ和/或HLA-DR抗原，其中工程化T细胞不表达CIITA，且 /或其中工程化T细胞不表达TCR-α和TCR-β。
在一些实施方案中，工程化T细胞是包含插入到TRAC基因座、TRB基因座、B2M基因座或CIITA基因座中的编码CD47的第二外源多核苷酸和/或编码CAR的第一外源多核苷酸的B2M插入缺失/插入缺失、CIITA插入缺失/插入缺失、TRAC插入缺失/插入缺失细胞。在一些实施方案中，使用病毒转导(例如使用载体)将外源多核苷酸插入到细胞的至少一个等位基因中。在一些实施方案中，载体是携带外源多核苷酸的假型化、自灭活慢病毒载体。在一些实施方案中，载体是用水疱性口炎VSV-G包膜假型化的自灭活慢病毒载体，并携带外源多核苷酸。在一些实施方案中，使用病毒转导将外源多核苷酸插入到细胞的至少一个等位基因中。在一些实施方案中，使用基于慢病毒的病毒载体将外源多核苷酸插入到细胞的至少一个等位基因中。
在一些实施方案中，本技术的非活化T细胞和/或工程化T细胞在受试者中。在一些实施方案中，本技术的非活化T细胞和/或工程化T细胞在体外。
在一些实施方案中，本技术的非活化T细胞和/或工程化T细胞表达CD8结合剂。在一些实施方案中，CD8结合剂是抗CD8抗体。在一些实施方案中，抗CD8抗体选自由以下组成的组：小鼠抗CD8抗体、兔抗CD8抗体、人抗CD8抗体、人源化抗CD8抗体、骆驼科动物(例如美洲驼、羊驼、骆驼)抗CD8抗体及其片段。在一些实施方案中，其片段是scFV或VHH。在一些实施方案中，CD8结合剂结合CD8α链和/或CD8β链。
在一些实施方案中，CD8结合剂融合至掺入病毒包膜中的跨膜结构域。在一些实施方案中，慢病毒载体用病毒融合蛋白假型化。在一些实施方案中，病毒融合蛋白包含一种或多种修饰以降低与其天然受体的结合。
在一些实施方案中，病毒融合蛋白融合至CD8结合剂。在一些实施方案中，病毒融合蛋白包含融合至CD8结合剂的尼帕病毒F(Nipah virus F)糖蛋白和尼帕病毒G糖蛋白。在一些实施方案中，慢病毒载体不包含T细胞活化分子或T细胞共刺激分子。在一些实施方案中，慢病毒载体编码第一外源多核苷酸和/或第二外源多核苷酸。
在一些实施方案中，使用病毒转导(例如使用载体)将外源多核苷酸插入到细胞的至少一个等位基因中。在一些实施方案中，载体是携带外源多核苷酸的假型化、自灭活慢病毒载体。在一些实施方案中，载体是用水疱性口炎VSV-G包膜假型化的自灭活慢病毒载体，并携带外源多核苷酸。在一些实施方案中，使用病毒转导将外源多核苷酸插入到细胞的至少一个等位基因中。在一些实施方案中，使用基于慢病毒的病毒载体将外源多核苷酸插入到细胞的至少一个等位基因中。
在一些实施方案中，在转移到第一受试者体内后，非活化T细胞或工程化T细胞表现出选自由以下组成的组的一种或多种反应：(a)T细胞反应，(b)NK细胞反应，和(c)巨噬细胞反应，所述反应与转移到第二受试者体内后的野生型细胞相比有所降低。在一些实施方案中，第一受试者和第二受试者是不同的受试者。在一些实施方案中，巨噬细胞反应是吞噬。
在一些实施方案中，与转移到受试者体内后的野生型细胞相比，非活化T细胞或工程化T细胞在转移到受试者体内后表现出选自由以下组成的组的一项或多项：(a)受试者的TH1活化减少，(b)受试者的NK细胞杀伤减少，和(c)受试者的完整PBMC的杀伤减少。
在一些实施方案中，与转移到受试者体内后的野生型细胞相比，非活化T细胞或工程化T细胞在转移到受试者体内后引发选自由以下组成的组的一项或多项：(a)受试者的供体特异性抗体减少，(b)受试者的IgM或IgG抗体减少，和(c)受试者的补体依赖性细胞毒性(CDC)减少。
在一些实施方案中，在受试者体内用包含CD8结合剂的慢病毒载体转导非活化T细胞或工程化T细胞。在一些实施方案中，慢病毒载体携带编码CAR和/或CD47的基因。
本文提供了药物组合物，其包含本技术的非活化T细胞和/或工程化T细胞群和药学上可接受的添加剂、载剂、稀释剂或赋形剂。
本文提供了方法，其包括向受试者施用包含本技术的非活化T细胞和/或工程化T细胞群的组合物，或一种或多种本技术的药物组合物。
在一些实施方案中，在施用组合物之前、之后和/或同时不向受试者施用T细胞活化治疗。在一些实施方案中，T细胞活化治疗包括淋巴细胞清除。
本文提供了治疗罹患癌症的受试者的方法，其包括向受试者施用包含本技术的非活化T细胞和/或工程化T细胞群的组合物，或一种或多种本技术的药物组合物，其中在施用组合物之前、之后和/或同时不向受试者施用T细胞活化治疗。在一些实施方案中，T细胞活化治疗包括淋巴细胞清除。
本文提供了用于在有需要的受试者体内扩增能够识别并杀伤所述受试者的肿瘤细胞的T细胞的方法，其包括向受试者施用包含本技术的非活化T细胞和/或工程化T细胞群的组合物，或一种或多种本技术的药物组合物，其中在施用组合物之前、之后和/或同时不向受试者施用T细胞活化治疗。在一些实施方案中，T细胞活化治疗包括淋巴细胞清除。
本文提供了用于治疗受试者的疾病或病症的剂量方案，其包括施用包含本技术的非活化T细胞和/或工程化T细胞群的药物组合物，或一种或多种本技术的药物组合物，以及药学上可接受的添加剂、载剂、稀释剂或赋形剂，其中药物组合物以约1-3个剂量施用。
本文提供了一种工程化细胞，其相对于野生型细胞或对照细胞包含降低的HLA-A、HLA-B、HLA-C、HLA-DP、HLA-DQ、HLA-DR、B2M、CIITA、TCR-α和/或TCR-β的表达，所述工程化细胞还包含一组外源多核苷酸，所述一组外源多核苷酸包含编码CD47的第一外源多核苷酸和编码嵌合抗原受体(CAR)的第二外源多核苷酸，其中第一和/或第二外源多核苷酸插入到细胞的至少一个等位基因的特定基因座中。
在一些实施方案中，特定基因座选自由以下组成的组：安全港或靶标基因座、B2M基因座、CIITA基因座、TRAC基因座和TRB基因座。
在一些实施方案中，将编码CD47的第一外源多核苷酸插入到选自由以下组成的组的特定基因座中：安全港或靶标基因座、B2M基因座、CIITA基因座、TRAC基因座和TRB基因座。
在一些实施方案中，将编码CAR的第二外源多核苷酸插入到选自由以下组成的组的特定基因座中：安全港或靶标基因座、B2M基因座、CIITA基因座、TRAC基因座和TRB基因座。
在一些实施方案中，将编码CD47的第一外源多核苷酸和编码CAR的第二外源多核苷酸插入到不同的基因座中。
在一些实施方案中，将编码CD47的第一外源多核苷酸和编码CAR的第二外源多核苷酸插入到相同的基因座中。
在一些实施方案中，将编码CD47的第一外源多核苷酸和编码CAR的第二外源多核苷酸插入到B2M基因座中。
在一些实施方案中，将编码CD47的第一外源多核苷酸和编码CAR的第二外源多核苷酸插入到CIITA基因座中。
在一些实施方案中，将编码CD47的第一外源多核苷酸和编码CAR的第二外源多核苷酸插入到TRAC基因座中。
在一些实施方案中，将编码CD47的第一外源多核苷酸和编码CAR的第二外源多核苷酸插入到TRB基因座中。
在一些实施方案中，将编码CD47的第一外源多核苷酸和编码CAR的第二外源多核苷酸插入到安全港或靶标基因座中。
在一些实施方案中，安全港基因座选自由以下组成的组：CCR5基因座、PPP1R12C基因座、CLYBL基因座和Rosa基因座，并且靶标基因座选自由以下组成的组：CXCR4基因座、白蛋白基因座、SHS231基因座、F3(CD142)基因座、MICA基因座、MICB基因座、LRP1(CD91)基因座、HMGB1基因座、ABO基因座、RHD基因座、FUT1基因座和KDM5D基因座。
在一些实施方案中，CAR选自由CD19特异性CAR和CD22特异性CAR组成的组。
在一些实施方案中，CD19特异性CAR基本上等同于选自由以下组成的组的基于CAR-T细胞的疗法中的任一种的CD19特异性CAR：axicabtagene ciloleucel、lisocabtagene maraleucel、brexucabtagene autoleucel和tisagenlecleucel。
在一些实施方案中，CAR是双特异性CAR。
在一些实施方案中，CAR是CD19/CD22双特异性CAR。
在一些实施方案中，工程化细胞不表达HLA-A、HLA-B和/或HLA-C抗原。
在一些实施方案中，工程化细胞不表达B2M。
在一些实施方案中，工程化细胞不表达HLA-DP、HLA-DQ和/或HLA-DR抗原。
在一些实施方案中，工程化细胞不表达CIITA。
在一些实施方案中，工程化细胞选自由以下组成的组：多能干细胞、诱导性多能干细胞、从诱导性多能干细胞分化的T细胞、原代T细胞和来源于原代T细胞的细胞，并且工程化细胞不表达TCR-α和/或TCR-β。
在一些实施方案中，工程化细胞是多能干细胞。
在一些实施方案中，工程化细胞是诱导性多能干细胞。
在一些实施方案中，工程化细胞是来源于诱导性多能干细胞的分化细胞。
在一些实施方案中，分化细胞选自由NK细胞和T细胞组成的组。
在一些实施方案中，工程化细胞是来源于原代T细胞的细胞。
在一些实施方案中，来源于原代T细胞的细胞来源于T细胞库，所述T细胞库包含来自不同于受体受试者的一个或多个供体受试者的原代T细胞。
在一些实施方案中，工程化细胞保留多能性且/或保留分化潜能。
在一些实施方案中，在转移到第一受试者体内后，工程化细胞表现出选自由以下组成的组的一种或多种反应：(a)T细胞反应，(b)NK细胞反应，和(c)巨噬细胞反应，所述反应与转移到第二受试者体内后的野生型细胞相比有所降低。
在一些实施方案中，第一受试者和第二受试者是不同的受试者。
在一些实施方案中，巨噬细胞反应是吞噬。
在一些实施方案中，与转移到受试者体内后的野生型细胞相比，工程化细胞在转移到受试者体内后表现出选自由以下组成的组的一项或多项：(a)受试者的TH1活化减少，(b)受试者的NK细胞杀伤减少，和(c)受试者的完整PBMC的杀伤减少。
在一些实施方案中，与转移到受试者体内后的野生型细胞相比，工程化细胞在转移到受试者体内后引发选自由以下组成的组的一项或多项：(a)受试者的供体特异性抗体减少，(b)受试者的IgM或IgG抗体减少，和(c)受试者的补体依赖性细胞毒性(CDC)减少。
在一些实施方案中，工程化细胞选自由以下组成的组：多能干细胞、诱导性多能干细胞、从诱导性多能干细胞分化的T细胞、原代T细胞和来源于原代T细胞的细胞，并且工程化细胞是包含插入到TRAC基因座中的编码CD47的第一外源多核苷酸和/或编码CAR的第二外源多核苷酸的B2M插入缺失/插入缺失、CIITA插入缺失/插入缺失、TRAC插入缺失/插入缺失细胞。
在一些实施方案中，工程化细胞选自由以下组成的组：多能干细胞、诱导性多能干细胞、从诱导性多能干细胞分化的T细胞、原代T细胞和来源于原代T细胞的细胞，并且工程化细胞是包含插入到TRAC基因座中的编码CD47的第一外源多核苷酸和编码CAR的第二外源多核苷酸的B2M插入缺失/插入缺失、CIITA插入缺失/插入缺失、TRAC插入缺失/插入缺失细胞。
在一些实施方案中，工程化细胞选自由以下组成的组：多能干细胞、诱导性多能干细胞、从诱导性多能干细胞分化的T细胞、原代T细胞和来源于原代T细胞的细胞，并且工程化细胞是包含插入到TRB基因座中的编码CD47的第一外源多核苷酸和/或编码CAR的第二外源多核苷酸的B2M插入缺失/插入缺失、CIITA插入缺失/插入缺失、TRAC插入缺失/插入缺失细胞。
在一些实施方案中，工程化细胞选自由以下组成的组：多能干细胞、诱导性多能干细胞、从诱导性多能干细胞分化的T细胞、原代T细胞和来源于原代T细胞的细胞，并且工程化细胞是包含插入到TRB基因座中的编码CD47的第一外源多核苷酸和编码CAR的第二外源多核苷酸的B2M插入缺失/插入缺失、CIITA插入缺失/插入缺失、TRAC插入缺失/插入缺失细胞。
在一些实施方案中，工程化细胞选自由以下组成的组：多能干细胞、诱导性多能干细胞、从诱导性多能干细胞分化的T细胞、原代T细胞和来源于原代T细胞的细胞，并且工程化细胞是包含插入到B2M基因座中的编码CD47的第一外源多核苷酸和/或编码CAR的第二外源多核苷酸的B2M插入缺失/插入缺失、CIITA插入缺失/插入缺失、TRAC插入缺失/插入缺失细胞。
在一些实施方案中，工程化细胞选自由以下组成的组：多能干细胞、诱导性多能干细胞、从诱导性多能干细胞分化的T细胞、原代T细胞和来源于原代T细胞的细胞，并且工程化细胞是包含插入到B2M基因座中的编码CD47的第一外源多核苷酸和编码CAR的第二外源多核苷酸的B2M插入缺失/插入缺失、CIITA插入缺失/插入缺失、TRAC插入缺失/插入缺失细胞。
在一些实施方案中，工程化细胞选自由以下组成的组：多能干细胞、诱导性多能干细胞、从诱导性多能干细胞分化的T细胞、原代T细胞和来源于原代T细胞的细胞，并且工程化细胞是包含插入到CIITA基因座中的编码CD47的第一外源多核苷酸和/或编码CAR的第二外源多核苷酸的B2M插入缺失/插入缺失、CIITA插入缺失/插入缺失、TRAC插入缺失/插入缺失细胞。
在一些实施方案中，工程化细胞选自由以下组成的组：多能干细胞、诱导性多能干细胞、从诱导性多能干细胞分化的T细胞、原代T细胞和来源于原代T细胞的细胞，并且工程化细胞是包含插入到CIITA基因座中的编码CD47的第一外源多核苷酸和编码CAR的第二外源多核苷酸的B2M插入缺失/插入缺失、CIITA插入缺失/插入缺失、TRAC插入缺失/插入缺失细胞。
本文提供了一种工程化细胞，其相对于野生型细胞或对照细胞包含降低的HLA-A、HLA-B、HLA-C、HLA-DP、HLA-DQ、HLA-DR、B2M、CIITA、TCR-α和/或TCR-β的表达。
在一些实施方案中，工程化细胞不表达HLA-A、HLA-B和/或HLA-C抗原。
在一些实施方案中，工程化细胞不表达CIITA。
在一些实施方案中，工程化细胞不表达HLA-DP、HLA-DQ和/或HLA-DR抗原。
在一些实施方案中，工程化细胞不表达B2M。
在一些实施方案中，工程化细胞选自由以下组成的组：多能干细胞、诱导性多能干细胞、从诱导性多能干细胞分化的T细胞、原代T细胞和来源于原代T细胞的细胞，并且工程化细胞不表达TCR-α。
在一些实施方案中，工程化细胞选自由以下组成的组：多能干细胞、诱导性多能干细胞、从诱导性多能干细胞分化的T细胞、原代T细胞和来源于原代T细胞的细胞，并且工程化细胞不表达TCR-β。
在一些实施方案中，工程化细胞相对于野生型细胞或对照细胞过表达CD47。
在一些实施方案中，工程化细胞是多能干细胞。
在一些实施方案中，工程化细胞是诱导性多能干细胞。
在一些实施方案中，工程化细胞是来源于诱导性多能干细胞的分化细胞。
在一些实施方案中，分化细胞选自由NK细胞和T细胞组成的组。
在一些实施方案中，工程化细胞是来源于原代T细胞的细胞。
在一些实施方案中，来源于原代T细胞的细胞来源于T细胞库，所述T细胞库包含来自不同于受体受试者的一个或多个供体受试者的原代T细胞。
在一些实施方案中，工程化细胞保留多能性且/或保留分化潜能。
在一些实施方案中，在转移到第一受试者体内后，工程化细胞表现出选自由以下组成的组的一种或多种反应：(a)T细胞反应，(b)NK细胞反应，和(c)巨噬细胞反应，所述反应与转移到第二受试者体内后的野生型细胞相比有所降低。
在一些实施方案中，第一受试者和第二受试者是不同的受试者。
在一些实施方案中，巨噬细胞反应是吞噬。
在一些实施方案中，与转移到受试者体内后的野生型细胞相比，工程化细胞在转移到受试者体内后表现出选自由以下组成的组的一项或多项：(a)受试者的TH1活化减少，(b)受试者的NK细胞杀伤减少，和(c)受试者的完整PBMC的杀伤减少。
在一些实施方案中，与转移到受试者体内后的野生型细胞相比，工程化细胞在转移到受试者体内后引发选自由以下组成的组的一项或多项：(a)受试者的供体特异性抗体减少，(b)受试者的IgM或IgG抗体减少，和(c)受试者的补体依赖性细胞毒性(CDC)减少。
在一些实施方案中，工程化细胞选自由以下组成的组：多能干细胞、诱导性多能干细胞、从诱导性多能干细胞分化的T细胞、原代T细胞和来源于原代T细胞的细胞，并且工程化细胞是B2M插入缺失/插入缺失、CIITA插入缺失/插入缺失、TRAC插入缺失/插入缺失和/或TRB插入缺失/插入缺失细胞。
在一些实施方案中，工程化细胞是低免疫原性细胞。
在一些实施方案中，野生型细胞或对照细胞是起始材料。
在一些实施方案中，使用病毒转导将第一和/或第二外源多核苷酸插入到细胞的至少一个等位基因中。
在一些实施方案中，病毒转导经由基于慢病毒的病毒载体进行。
在一些实施方案中，基于慢病毒的病毒载体是携带第一和/或第二外源多核苷酸的假型化、自灭活慢病毒载体。
在一些实施方案中，基于慢病毒的病毒载体是用水疱性口炎VSV-G包膜假型化的自灭活慢病毒载体，并携带第一和/或第二外源多核苷酸。
本文提供了一种药物组合物，其包含如本文所述的工程化细胞群和药学上可接受的添加剂、载剂、稀释剂或赋形剂。
在一些实施方案中，药学上可接受的添加剂、载剂、稀释剂或赋形剂包括选自由以下组成的组的一种或多种：Plasma-Lyte右旋糖、葡聚糖、氯化钠、人血清白蛋白(HSA)、二甲基亚砜(DMSO)及其组合。
在组合物的一些实施方案中，组合物还包含药学上可接受的缓冲剂。
在一些实施方案中，药学上可接受的缓冲剂是中性缓冲盐水或磷酸盐缓冲盐水。
本文提供了一种药物组合物，其包含如本文所述的工程化细胞群、浓度为约70-80％重量/重量的CSB的基础溶液，以及以下中的一种或多种：约20-30％重量/重量的PlasmaLyte-ATM、约0.3-5.3％重量/体积的人血清白蛋白(HSA)、约0-20％体积/体积的二甲亚砜(DMSO)和约100-400mM海藻糖。
本文提供了一种药物组合物，其包含如本文所述的工程化细胞群、浓度为约20-30％重量/重量的PlasmaLyte-ATM的基础溶液，以及以下中的一种或多种：约70-80％重量/重量的CSB、约0.3-5.3％重量/体积的人血清白蛋白(HSA)、约0-20％体积/体积的二甲亚砜(DMSO)和约100-400mM海藻糖。
本文提供了一种药物组合物，其包含如本文所述的工程化细胞群、约0.3-5.3％重量/体积的人血清白蛋白(HSA)，以及以下中的一种或多种：约70-80％重量/重量的CSB、约20-30％重量/重量的PlasmaLyte-ATM、约0-20％体积/体积的二甲亚砜(DMSO)和约100-400mM海藻糖。
本文提供了一种药物组合物，其包含如本文所述的工程化细胞群、约0-20％体积/体积的二甲亚砜(DMSO)，以及以下中的一种或多种：约70-80％重量/重量的CSB、约20-30％重量/重量的PlasmaLyte-ATM、约0.3-5.3％重量/体积的人血清白蛋白(HSA)和约100-400mM海藻糖。
本文提供了一种药物组合物，其包含如本文所述的工程化细胞群、约100-400mM海藻糖，以及以下中的一种或多种：约70-80％重量/重量的CSB、约20-30％重量/重量的PlasmaLyte-ATM、约0.3-5.3％重量/体积的人血清白蛋白(HSA)和约0-20％体积/体积的二甲亚砜(DMSO)。
在一些实施方案中，药物组合物包含约75％重量/重量的CSB。
在一些实施方案中，药物组合物包含约25％重量/重量的PlasmaLyte-ATM。
在一些实施方案中，药物组合物包含约0.3％重量/体积的HSA。
在一些实施方案中，药物组合物包含约7.5％体积/体积的DMSO。
本文提供了一种药物组合物，其包含如本文所述的工程化细胞群、浓度为约75％重量/重量的CSB的基础溶液、约25％重量/重量的PlasmaLyte-ATM、约0.3％重量/体积的人血清白蛋白(HSA)和约7.5％体积/体积的二甲亚砜(DMSO)。
在一些实施方案中，工程化细胞群为至多约8.0x108个细胞。
在一些实施方案中，工程化细胞群为至多约6.0x108个细胞。
在一些实施方案中，工程化细胞群为约1.0x106至约2.5x108个细胞。
在一些实施方案中，工程化细胞群为约2.0x106至约2.0x108个细胞。
在一些实施方案中，工程化细胞群的范围为约5ml至约80ml。
在一些实施方案中，工程化细胞群的范围为约10ml至约70ml。
在一些实施方案中，工程化细胞群的范围为约10ml至约50ml。
在一些实施方案中，组合物被配制用于以单剂量施用。
在一些实施方案中，组合物被配制用于以至多三个剂量施用。
在一些实施方案中，组合物被配制用于向受试者施用单剂量，所述施用需要约60分钟或更短的持续时间。
在一些实施方案中，组合物被配制用于向受试者施用单剂量，所述施用需要约30分钟或更短的持续时间。
在一些实施方案中，药物组合物的工程化细胞群或其后代在施用后10天后在受试者中表现出至少40％的存活率。
在一些实施方案中，药物组合物的工程化细胞群或其后代在施用后约2周后在受试者中表现出至少80％的存活率。
在一些实施方案中，药物组合物的工程化细胞群或其后代在施用后约3周后在受试者中表现出至少100％的存活率。
在一些实施方案中，药物组合物的工程化细胞群或其后代在施用后约4周后在受试者中表现出至少150％的存活率。
本文提供了一种用于治疗受试者的疾病或病症的剂量方案，其包括施用药物组合物，所述药物组合物包含如本文所述的工程化细胞群和药学上可接受的添加剂、载剂、稀释剂或赋形剂，其中所述药物组合物以约1-3个剂量施用。
在一些实施方案中，以约1-3个剂量施用的药物组合物为至多约6.0x108个细胞。
在一些实施方案中，以约1-3个剂量施用的药物组合物为约0.6x106至约6.0x108个细胞。
在一些实施方案中，如果受试者的体重为50kg或更小，则以约1-3个剂量施用的药物组合物为约0.2x106至约5.0x106细胞/kg受试者体重。
在一些实施方案中，如果受试者的体重大于50kg，则以约1-3个剂量施用的药物组合物为约0.1x108至约2.5x108个细胞。
在一些实施方案中，以约1-3个剂量施用的药物组合物为约2.0x106细胞/kg受试者体重且至多约2.x108个细胞。
在一些实施方案中，向受试者施用单剂量需要约60分钟或更短的持续时间。
在一些实施方案中，向受试者施用单剂量需要约30分钟或更短的持续时间。
在一些实施方案中，药学上可接受的添加剂、载剂、稀释剂或赋形剂包括选自由以下组成的组的一种或多种：Plasma-Lyte右旋糖、葡聚糖、氯化钠、人血清白蛋白(HSA)、二甲基亚砜(DMSO)及其组合。
在一些实施方案中，药物组合物还包含药学上可接受的缓冲剂。
在一些实施方案中，药学上可接受的缓冲剂是中性缓冲盐水或磷酸盐缓冲盐水。
在一些实施方案中，在施用药物组合物后，细胞群或其后代在受试者中存在至多9个月。
在一些实施方案中，在施用药物组合物后，细胞群或其后代在受试者中存在至少两年或更久。
在一些实施方案中，在施用药物组合物后，工程化细胞群或其后代在施用后约10天后在受试者中表现出至少40％的存活率。
在一些实施方案中，在施用药物组合物后，工程化细胞群或其后代在施用后约2周后在受试者中表现出至少80％的存活率。
在一些实施方案中，在施用药物组合物后，工程化细胞群或其后代在施用后约3周后在受试者中表现出至少100％的存活率。
在一些实施方案中，在施用药物组合物后，工程化细胞群或其后代在施用后约4周后在受试者中表现出至少150％的存活率。
在一些实施方案中，向受试者施用2-3个剂量，使得每个剂量的施用间隔的范围为1至24小时。
在一些实施方案中，向受试者施用2-3个剂量，使得每个剂量的施用间隔的范围为1至28天。
在一些实施方案中，向受试者施用2-3个剂量，使得每个剂量的施用间隔的范围为1至6周。
在一些实施方案中，向受试者施用2-3个剂量，使得每个剂量的施用间隔的范围为1至12个月或更久。
本文提供了一种用于治疗受试者的疾病或病症的剂量方案，其包括施用药物组合物，所述药物组合物包含
(i)工程化细胞，其包含降低的HLA-A、HLA-B、HLA-C、HLA-DP、HLA-DQ、HLA-DR、B2M、CIITA、TCR-α和/或TCR-β的表达，所述工程化细胞还包含一组编码CD47和嵌合抗原受体(CAR)的外源多核苷酸，其中外源多核苷酸组插入到细胞的至少一个等位基因的安全港或靶标基因座中；和
(ii)药学上可接受的添加剂、载剂、稀释剂或赋形剂，
其中药物组合物包含至多约6.0x108个细胞。
本文提供了一种用于治疗受试者的疾病或病症的剂量方案，其包括施用药物组合物，所述药物组合物包含
(i)工程化细胞，其包含降低的HLA-A、HLA-B、HLA-C、HLA-DP、HLA-DQ、HLA-DR、B2M、CIITA、TCR-α和/或TCR-β的表达，所述工程化细胞还包含一组编码CD47和嵌合抗原受体(CAR)的外源多核苷酸，其中外源多核苷酸组插入到细胞的至少一个等位基因的安全港或靶标基因座中；和
(ii)药学上可接受的添加剂、载剂、稀释剂或赋形剂，
其中药物组合物以1-3个剂量施用。
本文提供了一种用于治疗受试者的疾病或病症的剂量方案，其包括施用药物组合物，所述药物组合物包含
工程化细胞，其包含降低的HLA-A、HLA-B、HLA-C、HLA-DP、HLA-DQ、HLA-DR、B2M、CIITA、TCR-α和/或TCR-β的表达，所述工程化细胞还包含一组编码CD47和嵌合抗原受体(CAR)的外源多核苷酸，其中外源多核苷酸组插入到细胞的至少一个等位基因的安全港或靶标基因座中；和
(ii)药学上可接受的添加剂、载剂、稀释剂或赋形剂，
其中一剂药物组合物施用约60分钟或更短的持续时间。
本文提供了一种用于治疗受试者的疾病或病症的剂量方案，其包括施用药物组合物，所述药物组合物包含
(i)工程化细胞，其包含降低的HLA-A、HLA-B、HLA-C、HLA-DP、HLA-DQ、HLA-DR、B2M、CIITA、TCR-α和/或TCR-β的表达；和
(ii)药学上可接受的添加剂、载剂、稀释剂或赋形剂，
其中药物组合物包含至多约6.0x108个细胞。
本文提供了一种用于治疗受试者的疾病或病症的剂量方案，其包括施用药物组合物，所述药物组合物包含
(i)工程化细胞，其包含降低的HLA-A、HLA-B、HLA-C、HLA-DP、HLA-DQ、HLA-DR、B2M、CIITA、TCR-α和/或TCR-β的表达；和
(ii)药学上可接受的添加剂、载剂、稀释剂或赋形剂，
其中药物组合物以1-3个剂量施用。
本文提供了一种用于治疗受试者的疾病或病症的剂量方案，其包括施用药物组合物，所述药物组合物包含
(i)工程化细胞，其包含降低的HLA-A、HLA-B、HLA-C、HLA-DP、HLA-DQ、HLA-DR、B2M、CIITA、TCR-α和/或TCR-β的表达；和
(ii)药学上可接受的添加剂、载剂、稀释剂或赋形剂，
其中一剂药物组合物施用60分钟或更短的持续时间。
本文提供了一种治疗受试者的癌症的方法，其包括向受试者施用如本文所述的工程化细胞、如本文所述的药物组合物或如本文所述的剂量方案。
在一些实施方案中，癌症是CD19+癌症。
本文提供了一种在受试者中预防T细胞耗竭的方法，其包括向受试者施用如本文所述的工程化细胞，其中CAR是CD19特异性CAR或CD22特异性CAR。
在一些实施方案中，CD19特异性CAR基本上等同于选自由以下组成的组的基于CAR-T细胞的疗法中的任一种的CD19特异性CAR：axicabtagene ciloleucel、lisocabtagene maraleucel、brexucabtagene autoleucel和tisagenlecleucel。
本文提供了一种在受试者中预防T细胞耗竭或治疗疾病的方法，其包括：
(i)在第一时间点，向受试者施用包含第一群体的如本文所述的工程化细胞的第一剂量方案；和
(ii)在第二时间点，向受试者施用包含第二群体的如本文所述的工程化细胞的第二剂量方案，
其中第一剂量方案和第二剂量方案不同。
一种在受试者中预防T细胞耗竭或治疗疾病的方法，其包括：
(i)在第一时间点，向受试者施用包含第一群体的如本文所述的工程化细胞的第一剂量方案；和
(ii)在第二时间点，向受试者施用包含第二群体的如本文所述的工程化细胞的第二剂量方案，
其中第一群体的工程化细胞和第二群体的工程化细胞包含相同的嵌合抗原受体。
本文提供了一种在受试者中预防T细胞耗竭或治疗疾病的方法，其包括：
(i)在第一时间点，向受试者施用包含第一群体的如本文所述的工程化细胞的第一剂量方案；和
(ii)在第二时间点，向受试者施用包含第二群体的如本文所述的工程化细胞的第二剂量方案，
其中第一群体的工程化细胞和第二群体的工程化细胞包含不同的嵌合抗原受体。
本文提供了一种在受试者中预防T细胞耗竭或治疗疾病的方法，其包括：
(i)在第一时间点，向受试者施用包含第一群体的如本文所述的工程化细胞的第一剂量方案；和
(ii)在第二时间点，向受试者施用包含第二群体的如本文所述的工程化细胞的第二剂量方案，
其中第一群体的工程化细胞包含结合第一抗原的第一嵌合抗原受体，并且第二群体的工程化细胞包含结合第二抗原的第二嵌合抗原受体，并且其中第一抗原和第二抗原相同。
本文提供了一种在受试者中预防T细胞耗竭或治疗疾病的方法，其包括：
(i)在第一时间点，向受试者施用包含第一群体的如本文所述的工程化细胞的第一剂量方案；和
(ii)在第二时间点，向受试者施用包含第二群体的如本文所述的工程化细胞的第二剂量方案，
其中第一群体的工程化细胞包含结合第一抗原的第一嵌合抗原受体，并且第二群体的工程化细胞包含结合第二抗原的第二嵌合抗原受体，并且其中第一抗原和第二抗原不同。
在一些实施方案中，工程化细胞是未活化的。
本文提供了一种非活化T细胞，其相对于野生型T细胞包含降低的HLA-A、HLA-B、HLA-C、HLA-DP、HLA-DQ、HLA-DR、B2M、CIITA、TCR-α和/或TCR-β的表达，以及编码嵌合抗原受体(CAR)的第一外源多核苷酸。
在一些实施方案中，非活化T细胞是原代T细胞。
在一些实施方案中，非活化T细胞从如本文所述的工程化细胞分化。
在一些实施方案中，T细胞是CD8+T细胞。
在一些实施方案中，非活化T细胞未用抗CD3抗体、抗CD28抗体、T细胞活化细胞因子或可溶性T细胞共刺激分子处理。
在一些实施方案中，抗CD3抗体是OKT3。
在一些实施方案中，抗CD28抗体是CD28.2。
在一些实施方案中，T细胞活化细胞因子选自由IL-2、IL-7、IL-15和IL-21组成的组。
在一些实施方案中，可溶性T细胞共刺激分子选自由抗CD28抗体、抗CD80抗体、抗CD86抗体、抗CD137L抗体和抗ICOS-L抗体组成的组。
在一些实施方案中，非活化T细胞不表达活化标志物。
在一些实施方案中，非活化T细胞表达CD3和CD28，并且其中CD3和/或CD28是无活性的。
在一些实施方案中，第一外源多核苷酸由包含CD8结合剂的慢病毒载体携带。
在一些实施方案中，非活化T细胞还包含编码CD47的第二外源多核苷酸。
在一些实施方案中，将第一和/或第二外源多核苷酸插入到T细胞的至少一个等位基因的特定基因座中。
在一些实施方案中，特定基因座选自由以下组成的组：安全港或靶标基因座、B2M基因座、CIITA基因座、TRAC基因座和TRB基因座。
在一些实施方案中，将编码CD47的第二外源多核苷酸插入到选自由以下组成的组的特定基因座中：安全港或靶标基因座、B2M基因座、CIITA基因座、TRAC基因座和TRB基因座。
在一些实施方案中，将编码CAR的第一外源多核苷酸插入到选自由以下组成的组的特定基因座中：安全港或靶标基因座、B2M基因座、CIITA基因座、TRAC基因座和TRB基因座。
在一些实施方案中，将编码CD47的第二外源多核苷酸和编码CAR的第一外源多核苷酸插入到不同的基因座中。
在一些实施方案中，将编码CD47的第二外源多核苷酸和编码CAR的第一外源多核苷酸插入到相同的基因座中。
在一些实施方案中，将编码CD47的第二外源多核苷酸和编码CAR的第一外源多核苷酸插入到B2M基因座中。
在一些实施方案中，将编码CD47的第二外源多核苷酸和编码CAR的第一外源多核苷酸插入到CIITA基因座中。
在一些实施方案中，将编码CD47的第二外源多核苷酸和编码CAR的第一外源多核苷酸插入到TCR基因座中。
在一些实施方案中，将编码CD47的第二外源多核苷酸和编码CAR的第一外源多核苷酸插入到TRAC基因座中。
在一些实施方案中，将编码CD47的第二外源多核苷酸和编码CAR的第一外源多核苷酸插入到TRB基因座中。
在一些实施方案中，将编码CD47的第二外源多核苷酸和编码CAR的第一外源多核苷酸插入到安全港或靶标基因座中。
在一些实施方案中，安全港或靶标基因座选自由以下组成的组：CCR5基因座、CXCR4基因座、PPP1R12C基因座、白蛋白基因座、SHS231基因座、CLYBL基因座、Rosa基因座、F3(CD142)基因座、MICA基因座、MICB基因座、LRP1(CD91)基因座、HMGB1基因座、ABO基因座、RHD基因座、FUT1基因座和KDM5D基因座。
在一些实施方案中，CAR选自由CD19特异性CAR和CD22特异性CAR组成的组。
在一些实施方案中，CD19特异性CAR基本上等同于选自由以下组成的组的基于CAR-T细胞的疗法中的任一种的CD19特异性CAR：axicabtagene ciloleucel、lisocabtagene maraleucel、brexucabtagene autoleucel和tisagenlecleucel。
在一些实施方案中，CAR是双特异性CAR。
在一些实施方案中，双特异性CAR是CD19/CD22双特异性CAR。
在一些实施方案中，非活化T细胞不表达HLA-A、HLA-B和/或HLA-C抗原。
在一些实施方案中，非活化T细胞不表达B2M。
在一些实施方案中，非活化T细胞不表达HLA-DP、HLA-DQ和/或HLA-DR抗原。
在一些实施方案中，非活化T细胞不表达CIITA。
在一些实施方案中，非活化T细胞不表达TCR-α和/或TCR-β。
在一些实施方案中，非活化T细胞是包含插入到TRAC基因座中的编码CD47的第二外源多核苷酸和/或编码CAR的第一外源多核苷酸的B2M插入缺失/插入缺失、CIITA插入缺失/插入缺失、TRAC插入缺失/插入缺失细胞。
在一些实施方案中，非活化T细胞是包含插入到TRAC基因座中的编码CD47的第二外源多核苷酸和编码CAR的第一外源多核苷酸的B2M插入缺失/插入缺失、CIITA插入缺失/插入缺失、TRAC插入缺失/插入缺失细胞。
在一些实施方案中，非活化T细胞是包含插入到TRB基因座中的编码CD47的第二外源多核苷酸和/或编码CAR的第一外源多核苷酸的B2M插入缺失/插入缺失、CIITA插入缺失/插入缺失、TRAC插入缺失/插入缺失细胞。
在一些实施方案中，非活化T细胞是包含插入到TRB基因座中的编码CD47的第二外源多核苷酸和编码CAR的第一外源多核苷酸的B2M插入缺失/插入缺失、CIITA插入缺失/插入缺失、TRAC插入缺失/插入缺失细胞。
在一些实施方案中，非活化T细胞是包含插入到B2M基因座中的编码CD47的第二外源多核苷酸和/或编码CAR的第一外源多核苷酸的B2M插入缺失/插入缺失、CIITA插入缺失/插入缺失、TRAC插入缺失/插入缺失细胞。
在一些实施方案中，非活化T细胞是包含插入到B2M基因座中的编码CD47的第二外源多核苷酸和编码CAR的第一外源多核苷酸的B2M插入缺失/插入缺失、CIITA插入缺失/插入缺失、TRAC插入缺失/插入缺失细胞。
在一些实施方案中，非活化T细胞是包含插入到CIITA基因座中的编码CD47的第二外源多核苷酸和/或编码CAR的第一外源多核苷酸的B2M插入缺失/插入缺失、CIITA插入缺失/插入缺失、TRAC插入缺失/插入缺失细胞。
在一些实施方案中，非活化T细胞是包含插入到CIITA基因座中的编码CD47的第二外源多核苷酸和编码CAR的第一外源多核苷酸的B2M插入缺失/插入缺失、CIITA插入缺失/插入缺失、TRAC插入缺失/插入缺失细胞。
本文提供了一种工程化T细胞，其相对于野生型T细胞包含降低的HLA-A、HLA-B、HLA-C、HLA-DP、HLA-DQ、HLA-DR、B2M、CIITA、TCR-α和/或TCR-β的表达，其中工程化T细胞还包含由包含CD8结合剂的慢病毒载体携带的编码嵌合抗原受体(CAR)的第一外源多核苷酸。
在一些实施方案中，工程化T细胞是原代T细胞。
在一些实施方案中，工程化T细胞从如本文所述的工程化细胞分化。
在一些实施方案中，T细胞是CD8+T细胞。
在一些实施方案中，工程化T细胞未用抗CD3抗体、抗CD28抗体、T细胞活化细胞因子或可溶性T细胞共刺激分子处理。
在一些实施方案中，抗CD3抗体是OKT3，其中抗CD28抗体是CD28.2，其中T细胞活化细胞因子选自由IL-2、IL-7、IL-15和IL-21组成的组，并且其中可溶性T细胞共刺激分子选自由抗CD28抗体、抗CD80抗体、抗CD86抗体、抗CD137L抗体和抗ICOS-L抗体组成的组。
在一些实施方案中，工程化T细胞不表达活化标志物。
在一些实施方案中，工程化T细胞表达CD3和CD28，并且其中CD3和/或CD28是无活性的。
在一些实施方案中，工程化T细胞还包含编码CD47的第二外源多核苷酸。
在一些实施方案中，将第一和/或第二外源多核苷酸插入到T细胞的至少一个等位基因的特定基因座中。
在一些实施方案中，特定基因座选自由以下组成的组：安全港或靶标基因座、B2M基因座、CIITA基因座、TRAC基因座和TRB基因座。
在一些实施方案中，将编码CD47的第二外源多核苷酸插入到选自由以下组成的组的特定基因座中：安全港或靶标基因座、B2M基因座、CIITA基因座、TRAC基因座和TRB基因座。
在一些实施方案中，将编码CAR的第一外源多核苷酸插入到选自由以下组成的组的特定基因座中：安全港或靶标基因座、B2M基因座、CIITA基因座、TRAC基因座和TRB基因座。
在一些实施方案中，将编码CD47的第二外源多核苷酸和编码CAR的第一外源多核苷酸插入到不同的基因座中。
在一些实施方案中，将编码CD47的第二外源多核苷酸和编码CAR的第一外源多核苷酸插入到相同的基因座中。
在一些实施方案中，将编码CD47的第二外源多核苷酸和编码CAR的第一外源多核苷酸插入到B2M基因座、CIITA基因座、TRAC基因座、TRB基因座或安全港或靶标基因座中。
在一些实施方案中，安全港或靶标基因座选自由以下组成的组：CCR5基因座、CXCR4基因座、PPP1R12C基因座、白蛋白基因座、SHS231基因座、CLYBL基因座、Rosa基因座、F3(CD142)基因座、MICA基因座、MICB基因座、LRP1(CD91)基因座、HMGB1基因座、ABO基因座、RHD基因座、FUT1基因座和KDM5D基因座。
在一些实施方案中，CAR选自由CD19特异性CAR和CD22特异性CAR组成的组。
在一些实施方案中，CD19特异性CAR基本上等同于选自由以下组成的组的基于CAR-T细胞的疗法中的任一种的CD19特异性CAR：axicabtagene ciloleucel、lisocabtagene maraleucel、brexucabtagene autoleucel和tisagenlecleucel。
在一些实施方案中，工程化T细胞不表达HLA-A、HLA-B和/或HLA-C抗原，其中工程化T细胞不表达B2M，其中工程化T细胞不表达HLA-DP、HLA-DQ和/或HLA-DR抗原，其中工程化T细胞不表达CIITA，且/或其中工程化T细胞不表达TCR-α和/或TCR-β。
在一些实施方案中，工程化T细胞是包含插入到TRAC基因座、TRB基因座、B2M基因座或CIITA基因座中的编码CD47的第二外源多核苷酸和/或编码CAR的第一外源多核苷酸的B2M插入缺失/插入缺失、CIITA插入缺失/插入缺失、TRAC插入缺失/插入缺失细胞。
在一些实施方案中，非活化T细胞如本文所述或者工程化T细胞如本文所述，其中非活化T细胞或工程化T细胞在受试者体内。
在一些实施方案中，非活化T细胞如本文所述或者工程化T细胞如本文所述，其中非活化T细胞或工程化T细胞在体外。
在一些实施方案中，非活化T细胞如本文所述或者工程化T细胞如本文所述，其中CD8结合剂是抗CD8抗体。
在一些实施方案中，非活化T细胞或工程化T细胞如本文所述，其中抗CD8抗体选自由以下组成的组：小鼠抗CD8抗体、兔抗CD8抗体、人抗CD8抗体、人源化抗CD8抗体、骆驼科动物抗CD8抗体及其片段。
在一些实施方案中，非活化T细胞或工程化T细胞如本文所述，其中其片段是scFV或VHH。
在一些实施方案中，非活化T细胞或工程化T细胞如本文所述，其中CD8结合剂结合CD8α链和/或CD8β链。
在一些实施方案中，非活化T细胞或工程化T细胞如本文所述，其中CD8结合剂融合至掺入病毒包膜中的跨膜结构域。
在一些实施方案中，非活化T细胞或工程化T细胞如本文所述，其中慢病毒载体用病毒融合蛋白假型化。
在一些实施方案中，非活化T细胞或工程化T细胞如本文所述，其中病毒融合蛋白包含一种或多种修饰以减少与其天然受体的结合。
在一些实施方案中，非活化T细胞或工程化T细胞如本文所述，其中病毒融合蛋白融合至CD8结合剂。
在一些实施方案中，非活化T细胞或工程化T细胞如本文所述，其中病毒融合蛋白包含融合至CD8结合剂的尼帕病毒F糖蛋白和尼帕病毒G糖蛋白。
在一些实施方案中，非活化T细胞或工程化T细胞如本文所述，其中慢病毒载体不包含T细胞活化分子或T细胞共刺激分子。
在一些实施方案中，非活化T细胞或工程化T细胞如本文所述，其中慢病毒载体编码第一外源多核苷酸和/或第二外源多核苷酸。
在一些实施方案中，非活化T细胞或工程化T细胞如本文所述，其中在转移到第一受试者体内后，非活化T细胞或工程化T细胞表现出选自由以下组成的组的一种或多种反应：(a)T细胞反应，(b)NK细胞反应，和(c)巨噬细胞反应，所述反应与转移到第二受试者体内后的野生型细胞相比有所降低。
在一些实施方案中，非活化T细胞或工程化T细胞如本文所述，其中第一受试者和第二受试者是不同的受试者。
在一些实施方案中，非活化T细胞或工程化T细胞如本文所述，其中巨噬细胞反应是吞噬。
在一些实施方案中，非活化T细胞或工程化T细胞如本文所述，其中与转移到受试者体内后的野生型细胞相比，非活化T细胞或工程化T细胞在转移到受试者体内后表现出选自由以下组成的组的一项或多项：(a)受试者的TH1活化减少，(b)受试者的NK细胞杀伤减少，和(c)受试者的完整PBMC的杀伤减少。
在一些实施方案中，非活化T细胞或工程化T细胞如本文所述，其中与转移到受试者体内后的野生型细胞相比，非活化T细胞或工程化T细胞在转移到受试者体内后引发选自由以下组成的组的一项或多项：(a)受试者的供体特异性抗体减少，(b)受试者的IgM或IgG抗体减少，和(c)受试者的补体依赖性细胞毒性(CDC)减少。
在一些实施方案中，非活化T细胞或工程化T细胞如本文所述，其中在受试者体内用包含CD8结合剂的慢病毒载体转导非活化T细胞或工程化T细胞。
在一些实施方案中，非活化T细胞或工程化T细胞如本文所述，其中慢病毒载体携带编码CAR和/或CD47的基因。
本文提供了一种药物组合物，其包含如本文所述的非活化T细胞或工程化T细胞群和药学上可接受的添加剂、载剂、稀释剂或赋形剂。
本文提供了一种方法，其包括向受试者施用包含如本文所述的非活化T细胞、如本文所述的工程化T细胞的组合物，或如本文所述的药物组合物。
在一些实施方案中，在施用组合物之前、之后和/或同时不向受试者施用T细胞活化治疗。
在一些实施方案中，T细胞活化治疗包括淋巴细胞清除。
本文提供了一种治疗罹患癌症的受试者的方法，其包括向受试者施用包含如本文所述的非活化T细胞、如本文所述的工程化T细胞的组合物，或如本文所述的药物组合物，其中在施用组合物之前、之后和/或同时不向受试者施用T细胞活化治疗。
在一些实施方案中，T细胞活化治疗包括淋巴细胞清除。
一种用于在有需要的受试者体内扩增能够识别并杀伤所述受试者的肿瘤细胞的T细胞的方法，其包括向受试者施用包含如本文所述的非活化T细胞、如本文所述的工程化T细胞的组合物，或如本文所述的药物组合物，其中在施用组合物之前、之后和/或同时不向受试者施用T细胞活化治疗。
在一些实施方案中，T细胞活化治疗包括淋巴细胞清除。
本文提供了一种用于治疗受试者的疾病或病症的剂量方案，其包括施用药物组合物，所述药物组合物包含如本文所述的非活化T细胞和/或如本文所述的工程化T细胞以及药学上可接受的添加剂、载剂、稀释剂或赋形剂，其中所述药物组合物以约1-3个剂量施用。
本公开涉及2020年12月31日提交的美国临时申请(代理人案卷号112864-5057-PR)以及Morrison和Foerester提交的在2021年1月11日提交的具有代理人案卷号18615-30046.00的美国临时申请，所述临时申请的内容特此通过引用整体并入。工程化和/或低免疫原性细胞、其生产方法及其使用方法的详细描述可见于2020年8月13日提交的美国临时申请号63/065,342、2015年5月9日提交的WO2016/183041、2018年1月14日提交的WO2018/132783、2019年7月17日提交的WO2020/018615、2019年7月17日提交的WO2020/018620、2020年2月16日提交的WO2020/168317，所述申请的包括实例、序列表和图片的公开内容通过引用整体并入本文。
附图说明
图1示出了本文所述的低免疫原性T细胞的特征。此类细胞是HLA-I和HLA-II敲除和CD47敲入细胞。
图2示出了不存在低免疫原性T细胞的NK细胞介导的杀伤。相比之下，用抗CD47抗体阻断CD47导致NK细胞介导的细胞杀伤。模拟T细胞未被同种异体NK细胞杀伤(如预期)。缺乏HLA-I/II的T细胞被NK细胞杀伤。HLA-I/II敲除和CD47敲入细胞未被NK细胞杀伤。用莫洛利单抗(magrolimab)(例如，抗CD47抗体)阻断CD47导致HLA-I/II敲除、CD47敲入细胞的杀伤，从而突出了CD47的保护作用。
图3示出了不存在低免疫原性T细胞的巨噬细胞介导的杀伤。对照T细胞未被同种异体巨噬细胞杀伤，而缺乏HLA-I/II的T细胞被巨噬细胞杀伤。HLA-I/II敲除和CD47敲入细胞未被巨噬细胞杀伤。用莫洛利单抗(例如，抗CD47抗体)阻断CD47导致HLA-I/II敲除、CD47敲入细胞的杀伤，从而突出了CD47的保护作用。
图4示出了CD19特异性CAR和CD47构建体在示例性低免疫原性CAR-T细胞中的表达。CD19特异性CAR-CD47 T细胞以高水平表达外源CD47。如本文所用，术语“CD19特异性CAR-CD47 T细胞”是指外源表达CD19特异性CAR和CD47的T细胞。
图5A和图5B描绘了示例性低免疫原性CAR-T细胞(CD19特异性CAR-CD47 T细胞)在体外以剂量依赖性方式对CD19+肿瘤细胞的杀伤。CD47过表达似乎不影响CD19特异性CAR活性。CD19特异性CAR-CD47 T细胞显示出与对照CD19特异性CAR-T细胞(“CAR低”(图5A)和“CAR高”(图5B)细胞)相似的杀伤。
图6A和图6B描绘了确认实时细胞分析数据的流式数据，其示出了示例性低免疫原性CAR-T细胞(例如，CD19特异性CAR-CD47 T细胞)(“CAR低”(图6A)和“CAR高”(图6B)细胞)在体外以剂量依赖的方式杀伤CD19+肿瘤细胞。在体外测定中，CD47过表达不改变CD19特异性CAR活性。
图7示出了通过FACS分选的示例性低免疫原性CAR-T细胞(CD19特异性CAR-CD47 T细胞)杀伤CD19+肿瘤细胞。靶细胞∶效应细胞比例为1∶3，并且使用实时定量微电子生物传感器系统(RTCA系统，Agilent)进行48小时的细胞分析并且通过流式细胞术对杀伤进行分析。数据显示，具有内源CD47表达的CD19特异性CAR-T细胞杀伤了肿瘤细胞。此外，具有外源CD47表达的CD19特异性CAR-T细胞杀伤了肿瘤细胞。对照T细胞(模拟T细胞)不杀伤肿瘤细胞。在体外测定中，CD47过表达似乎不影响CD19特异性CAR活性。
图8示出了本文所述的细胞的生长，特别是CD19特异性CAR-T细胞和CD19特异性CAR-CD47 T细胞的CD47依赖性和CD47非依赖性生长。
图9A至图9B示出了示例性低免疫原性CAR-T细胞在具有人CD19+肿瘤的小鼠模型中的功效。完整动物扫描示出了CD19特异性CAR-T细胞、CD19特异性CAR-CD47 T细胞和模拟T细胞对CD19+肿瘤细胞的影响。
图10示出了在各种效应物与Nalm6靶标比例下，示例性低免疫原性CAR-T细胞的功效。
图11描绘了在核转染以将基于CRISPR/Cas9的基因编辑系统引入到CD19特异性CAR-T细胞和CD19特异性CAR-CD47 T细胞中后四天，低免疫原性CD19特异性CAR-CD47 T细胞和对照T细胞(CD19特异性CAR-EGFRt T细胞和模拟T细胞)中的细胞活力以及TRAC、B2M和CIITA三重敲除的频率。
图12A和图12B示出了低免疫原性CD19特异性CAR-CD47 T细胞和对照T细胞(CD19特异性CAR-EGFRt T细胞、tisagenlecleucel生物类似物/替代细胞和模拟T细胞)中的示例性CD19特异性CAR的频率(图12A)和MFI(图12B)。
图13示出了低免疫原性CD19特异性CAR-CD47 T细胞和对照T细胞(CD19特异性CAR-EGFRt T细胞、tisagenlecleucel生物类似物/替代细胞、表达CD47的T细胞、和模拟T细胞)中的示例性CD19特异性CAR和CD47分子两者的频率。
图14描绘了活化后第8天低免疫原性CD19特异性CAR-CD47 T细胞和对照T细胞(CD19特异性CAR-EGFRt T细胞、tisagenlecleucel生物类似物/替代细胞、和模拟T细胞)中的载体拷贝数。
图15描绘了使用用流式细胞术估计每个细胞的抗体的方法(例如，QuantiBRITETM，BD Biosciences)，CD47分子在低免疫原性CD19特异性CAR-CD47 T细胞中的表达。在此测定中，外源CD47表达高于每个细胞200,000个分子。
图16A至图16D、图17A至图17D、图18A至图18C示出了TRAC、B2M和CIITA基因的三重基因灭活的存在以及CD47蛋白的过表达不影响本文所述的低免疫原性CD19特异性CAR-CD47 T细胞中的示例性CD19特异性CAR的活性。
图19至图22提供了本文所述的低免疫原性CD19特异性CAR-CD47 T细胞在具有CD19+肿瘤细胞的小鼠模型中的功效。完整动物扫描示出了此类低免疫原性CD19特异性CAR-T细胞杀伤肿瘤细胞。杀伤活性似乎呈剂量依赖性方式。
图23示出了在0至28天的范围内在不同的效应物：肿瘤细胞比例下，低免疫原性CD19特异性CAR-CD47 T细胞的功效。
图24示出了完整动物扫描图，其描绘了在27天的范围内低免疫原性CD19特异性CAR-CD47 T细胞对肿瘤细胞的杀伤。使用的效应物∶肿瘤细胞比例为7∶1。
图25示出了研究中使用的示例性测试细胞和对照细胞。示例性测试细胞包括低免疫原性CD19特异性CAR-CD47 T细胞，其具有B2M、CIITA和TRAC基因的基因组编辑，并且过表达CD47分子和CD19特异性嵌合抗原受体。对照细胞包括共表达CD47和EGFR的免疫原性CD19特异性CAR-T细胞以及tisagenlecleucel生物类似物或替代物。
图26和图27描绘了示例性低免疫原性CD19特异性CAR-CD47T细胞的FACS分析以及CD3、B2M、HLA-DR/HLA-DP/HLA-DQ和HLA-A/HLA-B/HLA-C表达的不存在。
图28示出了低免疫原性CD19特异性CAR-CD47 T细胞中CD47和CD19-CAR表达的FACS分析。
图29描绘了通过FACS和ICE确定的CD3、B2M、TRAC、HLA-DR/HLA-DP/HLA-DQ和HLA-A/HLA-B/HLA-C在低免疫原性CD19特异性CAR-CD47 T细胞、CD19特异性CAR-EGFRt T细胞和模拟T细胞中的表达。
图30示出了低免疫原性CD19特异性CAR-CD47 T细胞能够在体外与对照CD19特异性CAR-T细胞等同地杀伤肿瘤细胞。描绘了B细胞白血病杀伤动力学和B细胞白血病总杀伤。
图31提供了实施例3的实验途径的示意图，所述实验途径用于研究表达CD47转基因的TRAC、B2M和CIITA三重敲除CAR-T细胞(B2M-/-、CIITA-/-、TRAC-/-、CD47tg CD19特异性CAR-T细胞，其也被称为tKO/CD47 CAR-T细胞或HIP CD19-CAR-T细胞)的细胞因子非依赖性增殖。
图32A和图32B描绘了说明在补充有IL-2或未补充IL-2的培养基中培养的B2M-/-、CIITA-/-、TRAC-/-、CD47tg CD19特异性CAR-T细胞(tKO/CD47 CAR-T细胞或HIP CD19-CAR-T细胞)的增殖的图表。
图33提供了实施例4的实验途径的示意图。
图34示出了在异种移植小鼠中检测Nalm6-luc肿瘤细胞的体内生物发光图像。向小鼠施用tKO/CD47 CAR-T细胞(HIP CD19-CAR-T细胞)、对照CAR-T细胞(CD19-CAR-T细胞)、未编辑的T细胞或生理盐水。生物发光图像示出了研究第35天、第42天、第49天和第56天的肿瘤进展。
图35提供了代表在异种移植小鼠中检测到的Nalm6-luc肿瘤细胞的图表。带有Nalm6-luc的小鼠的图像示出了与对照CAR-T(CD19-CAR-T)治疗的小鼠、未编辑的T细胞治疗的小鼠和生理盐水治疗的小鼠相比，在tKO/CD47 CAR-T细胞(HIP CD19-CAR-T细胞)治疗的小鼠中的肿瘤生长延迟。
图36示出了用于生成表达CD19特异性CAR的B2M插入缺失/插入缺失、CIITA插入缺失/插入缺失、TRAC插入缺失/插入缺失、CD47tg T细胞的实验途径的示意图，所述细胞也被称为tKO/CD47 CAR-T细胞或HIP CD19-CAR-T细胞。此类细胞是CD47-CAR慢病毒转导和基因编辑的T细胞(底行；HIPCAR-T细胞)。所述图还示出了两种类型的对照细胞的生成：未转导且未编辑的细胞(顶行；未编辑的T细胞)和CAR-EGFRt慢病毒转导且未编辑的细胞(中间行；对照CAR-T细胞)。
图37示出了用于从收集自正常、健康的外周血的富集的白细胞去除术产品中分离CD8 T细胞和CD4 T细胞的说明性系列阳性免疫磁性细胞选择策略的流程图。
图38提供了表征根据图36中概述的方法产生的HIP CAR-T细胞(HIP CD19-CAR-T细胞)、对照CAR-T细胞(CD19-CAR-T细胞)和未编辑的T细胞的流式细胞术数据的表格。
图39A至图39D示出了实施例6的实验结果。图39A至图39B示出了Th1(IFNg)反应的Elispot分析，图39C至图39D示出了使用CD19-CAR-T细胞(图39C)或HIP CD19-CAR-T细胞(图39D)的杀伤测定的结果。
图40A和图40B示出了在表20中描述的示例性制剂中配制的HIP细胞的活力和杀伤效力。图40A示出了在制剂中制备的HIP细胞的冷冻前(空标记)或解冻后(实心标记)活力，而图40B示出了在制剂中制备的HIP细胞的NALM-6杀伤效力。
图41A至图41D示出了由Elispot确定的未分选和分选的T细胞的Th1(IFNg)反应。
图42A至图42J示出了实施例9中描述的研究的肿瘤负荷随时间的量化。
图43A至图43H示出了实施例9中描述的研究的血液中的HIP CD19-CAR-T细胞频率和CD47表达。具体而言，图43A至图43F示出了在中间采血和处死时评估的血液中HIP CD19-CAR-T细胞的频率，而图43G示出了在用5x106个HIP CD19-CAR-T细胞再次攻击的组和tKOCD19-CAR-T(HIP CD19-CAR-T)治疗的组中，在第108天的血液中的CD19-CAR-T细胞的CD47MFI。对CAR+细胞频率数据执行单因素方差分析和Tukey多重比较测试，并且对血液CD47MFI数据执行双因素方差分析和Bonferroni多重比较测试。
图44示出了实施例10中描述的研究的探索性自主生长测定细胞计数结果。
本公开的其他目的、优点和实施方案将从以下具体实施方式中显而易见。
具体实施方式
I.引言
本文描述了部分基于WO2018132783中所述的低免疫编辑平台的工程化或修饰的免疫逃避细胞(immune evasive cell)，包括但不限于人免疫逃避细胞。为了克服受试者对这些原代和/或干细胞衍生的移植物的免疫排斥问题，发明人已经开发并且在本文中描述了低免疫原性细胞(例如，低免疫原性多能细胞、来源于此类低免疫原性多能细胞的分化细胞、和原代细胞)，所述细胞代表任何可移植细胞类型的可行来源。此类细胞在向受体受试者施用后受到保护而免于适应性和/或先天免疫排斥。有利地，无论受试者的基因构成如何，本文公开的细胞均不会被受体受试者的免疫系统排斥，因为它们在向受体受试者施用后受到保护而免于适应性和先天免疫排斥。在一些实施方案中，工程化和/或低免疫原性细胞不表达主要组织相容性复合物(MHC)I类和II类抗原和/或T细胞受体。在某些实施方案中，工程化和/或低免疫原性细胞不表达MHC I和II抗原和/或T细胞受体，并且过表达CD47蛋白。在某些实施方案中，工程化和/或低免疫原性细胞(诸如工程化和/或低免疫原性T细胞)不表达MHC I和II抗原和/或T细胞受体，过表达CD47蛋白，并且表达外源CAR。
在一些实施方案中，本文概述的低免疫原性细胞不经受先天免疫细胞排斥。在一些情况下，低免疫原性细胞对NK细胞介导的裂解不敏感。在一些情况下，低免疫原性细胞对巨噬细胞吞噬不敏感。在一些实施方案中，低免疫原性细胞可用作普遍相容的细胞或组织(例如，通用供体细胞或组织)的来源，所述细胞或组织被移植到受体受试者中而几乎不需要免疫抑制剂。此类低免疫原性细胞在移植后保留细胞特异性特征和特性，包括例如多能性，以及能够植入和与对应的天然细胞类似地发挥作用。
本文公开的技术利用人类细胞中致耐受因子的表达和MHC I、MHC II和/或TCR表达的调节(例如，降低或消除)。在一些实施方案中，利用罕见切割核酸内切酶(rare-cutting endonuclease)(例如，CRISPR/Cas、TALEN、锌指核酸酶、大范围核酸酶和归巢核酸内切酶系统)的基因组编辑技术还可用于降低或消除细胞中涉及免疫反应的基因的表达(例如，通过缺失涉及免疫反应的基因的基因组DNA或通过将基因组DNA插入到此类基因中，使得基因表达受到影响)。在一些实施方案中，基因组编辑技术或其他基因调节技术用于在人细胞中插入耐受诱导(致耐受)因子，使细胞及其后代(包括由其制备的任何分化细胞)能够在植入到受体受试者后逃避免疫识别。因此，本文所述的细胞表现出影响MHC I、MHC II和/或TCR表达的一种或多种基因和因子的调节表达，并且逃避受体受试者免疫系统。
基因组编辑技术能够在期望的基因座位点处实现双链DNA断裂。这些受控的双链断裂促进特定基因座位点处的同源重组。此过程聚焦于用识别并且结合至核酸分子的特定序列并且在核酸分子内诱导双链断裂的核酸内切酶来靶向所述特定序列(诸如染色体)。通过易错的非同源末端连接(NHEJ)或通过同源重组(HR)来修复双链断裂。
除非另有明确相反的指示，否则多个实施方案的实践将采用化学、生物化学、有机化学、分子生物学、微生物学、重组DNA技术、遗传学、免疫学和细胞生物学的常规方法，所述方法在本领域的技术范围内，其中许多方法出于说明目的在下文中描述。此类技术在文献中充分解释。参见例如Sambrook等人，Molecular Cloning：A Laboratory Manual(第3版，2001)；Sambrook等人，Molecular Cloning：A Laboratory Manual(第2版，1989)；Maniatis等人，Molecular Cloning：A Laboratory Manual(1982)；Ausubel等人，CurrentProtocols in Molecular Biology(John Wiley and Sons，2008年7月更新)；ShortProtocols in Molecular Biology：A Compendium of Methods from Current Protocolsin Molecular Biology，Greene Pub.Associates and Wiley-Interscience；Glover，DNACloning：A Practical Approach，第I&II卷(IRL Press，Oxford，1985)；Anand，Techniquesfor the Analysis of Complex Genomes，(Academic Press，New York，1992)；Transcription and Translation(B.Hames&S.Higgins编辑，1984)；Perbal，A PracticalGuide to Molecular Cloning(1984)；Harlow和Lane，Antibodies，(Cold Spring HarborLaboratory Press，Cold Spring Harbor，N.Y.，1998)Current Protocols in ImmunologyQ.E.Coligan，A.M.Kruisbeek，D.H.Margulies，E.M.Shevach和W.Strober编辑，1991)；Annual Review of Immunology；以及诸如Advances in Immunology的期刊上的专题论文。
II.定义
如本公开中所述，将采用以下术语，并且所述术语如下所述定义。
术语“自身免疫性疾病”是指受试者产生针对其自身组织和/或细胞的免疫反应的任何疾病或病症。自身免疫性病症几乎可以影响受试者(例如人类)的每个器官系统，包括但不限于神经、胃肠道和内分泌系统疾病，以及皮肤和其他结缔组织、眼睛、血液和血管疾病。自身免疫性疾病的实例包括但不限于桥本甲状腺炎(Hashimoto′s thyroiditis)、系统性红斑狼疮、干燥综合征(Sjogren′s syndrome)、格雷夫斯病(Graves′disease)、硬皮病、类风湿性关节炎、多发性硬化症、重症肌无力和糖尿病。
如本文所用的术语“癌症”被定义为细胞的过度增殖，其独特特征(例如，失去正常控制)导致不受调控的生长、缺乏分化、局部组织侵袭和转移。关于本发明的方法，癌症可以是任何癌症，包括以下癌症中的任一种：急性淋巴细胞癌、急性髓性白血病、腺泡状横纹肌肉瘤、膀胱癌、骨癌、脑癌、乳腺癌、肛门癌、肛管癌或肛门直肠癌、眼癌、肝内胆管癌、关节癌、颈癌、胆囊癌或胸膜癌、鼻癌、鼻腔癌或中耳癌、口腔癌、外阴癌、慢性淋巴细胞白血病、慢性髓性白血病、结肠癌、食道癌、宫颈癌、纤维肉瘤、胃肠道类癌肿瘤、霍奇金淋巴瘤(Hodgkin lymphoma)、下咽癌、肾癌、喉癌、白血病、液体瘤、肝癌、肺癌、淋巴瘤、恶性间皮瘤、肥大细胞瘤、黑色素瘤、多发性骨髓瘤、鼻咽癌、非霍奇金淋巴瘤、卵巢癌、胰腺癌、腹膜、大网膜和肠系膜癌、咽癌、前列腺癌、直肠癌、肾癌、皮肤癌、小肠癌、软组织癌、实体瘤、胃癌、睾丸癌、甲状腺癌、输尿管癌和/或尿膀胱癌。如本文所用，除非另有明确说明，否则术语“肿瘤”是指恶性类型的细胞或组织的异常生长，并且不包括良性类型组织。
术语“慢性感染性疾病”是指由感染原引起的疾病，其中感染持续存在。这样的疾病可包括肝炎(甲型、乙型或丙型)、疱疹病毒(例如VZV、HSV-1、HSV-6、HSV-II、CMV和EBV)和HIV/AIDS。非病毒实例可包括慢性真菌病，诸如曲霉病(Aspergillosis)、念珠菌病(Candidiasis)、球孢子菌病(Coccidioidomycosis)、以及与隐球菌(Cryptococcus)相关的疾病和组织胞浆菌病(Histoplasmosis)。慢性细菌感染原的非限制性实例可以是肺炎衣原体(Chlamydia pneumoniae)、单核细胞增生性李斯特菌(Listeria monocytogene)和结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)。在一些实施方案中，病症是人类免疫缺陷病毒(HIV)感染。在一些实施方案中，病症是获得性免疫缺陷综合征(AIDS)。
如本文所用，“临床有效量”是指足以在疾病、病症或病状的治疗和/或管理中提供临床益处的量。在一些实施方案中，临床有效量是已显示对疾病、病症或病状的护理标准产生至少一个改进的临床终点的量。在一些实施方案中，临床有效量是例如在临床试验中已证明足以为治疗疾病、病症或病状提供统计上显著和有意义的有效性的量。在一些实施方案中，临床有效量也是治疗有效量。在一些实施方案中，临床有效量不是治疗有效量。
在一些实施方案中，本文所述的改变或修饰(包括例如遗传改变或修饰)导致靶标或选择的多核苷酸序列的表达降低。在一些实施方案中，本文所述的改变或修饰导致靶标或选择的多肽序列的表达降低。在一些实施方案中，本文所述的改变或修饰导致靶标或选择的多核苷酸序列的表达增加。在一些实施方案中，本文所述的改变或修饰导致靶标或选择的多肽序列的表达增加。
在另外的或替代的实施方案中，本公开考虑以技术人员可用的任何方式改变靶标多核苷酸序列，例如，利用TALEN系统或RNA引导的转座酶。应当理解，尽管本文详细描述了利用CRISPR/Cas(例如，Cas9和Cas12a)和TALEN的方法的实例，但本公开不限于这些方法/系统的使用。本文可以利用技术人员已知的降低或消除靶细胞中的表达的其他靶向例如B2M的方法。
术语“减少(decrease)”、“降低(reduced)”、“降低(reduction)”和“减少(decrease)”在本文中均一般用于意指减少统计上显著的量。然而，为避免疑问，减少(decrease)”、“降低(reduced)”、“降低(reduction)”、“减少(decrease)”意指与参考水平相比减少至少10％，例如与参考水平相比减少至少约20％、或至少约30％、或至少约40％、或至少约50％、或至少约60％、或至少约70％、或至少约80％、或至少约90％或至多并包括100％减少(即，与参考样品相比不存在的水平)或在10-100％之间的任何减少。在一些实施方案中，细胞经工程化以相对于未改变或未修饰的野生型细胞具有降低的一个或多个靶标的表达。
在一些实施方案中，所述的工程化和低免疫原性细胞来源于iPSC或其后代。如本文所用，术语“来源于iPSC或其后代”涵盖生成的初始iPSC及其任何后续后代。如本文所用，术语“后代”涵盖例如第一代后代，即通过例如传统繁殖方法直接来源于、获得自、可获得自或可来源于初始iPSC的后代。术语“后代”还涵盖另外的世代，诸如第二代、第三代、第四代、第五代、第六代、第七代或更多代，即通过例如传统繁殖方法来源于、获得自、可获得自或可来源于前一代的细胞世代。术语“后代”还涵盖由于初始iPSC或其后代的修饰或改变而产生的修饰的细胞。
术语“供体受试者”是指动物，例如，可以从其获得细胞的人。如本文中可互换使用的“非人动物”和“非人哺乳动物”包括哺乳动物，诸如大鼠、小鼠、兔、绵羊、猫、狗、牛、猪和非人类灵长类动物。术语“供体受试者”还涵盖任何脊椎动物，包括但不限于哺乳动物、爬行动物、两栖动物和鱼类。然而，有利地，供体受试者是哺乳动物，诸如人或其他哺乳动物(诸如家养哺乳动物，例如狗、猫、马等，或生产哺乳动物，例如牛、羊、猪等)。“供体受试者”还可以指代多于一个供体，例如一个或多个人或非人动物或非人哺乳动物。
术语“内源”是指天然存在于细胞中的参考分子或多肽。类似地，当用于提及编码核酸的表达时，所述术语是指天然包含在细胞内并且不是外源引入的编码核酸的表达。类似地，当用于提及启动子序列时，所述术语是指天然包含在细胞内并且不是外源引入的启动子序列。
如本文所用的术语“工程化细胞”是指已经通过人为干预以至少一些方式改变的细胞，所述人为干预包括例如通过遗传改变或修饰，使得工程化细胞不同于野生型细胞。
如本文所用，在表达的多核苷酸或多肽的上下文中，术语“外源”旨在意指将所提及的分子或所提及的多肽引入到感兴趣的细胞中。可以例如通过将编码核酸引入到细胞的遗传物质中(诸如通过整合到染色体中)或者作为非染色体遗传物质(诸如质粒或表达载体)来引入多肽。因此，当用于提及编码核酸的表达时，所述术语是指将编码核酸以可表达的形式引入到细胞中。可以使用病毒转导(例如使用载体)将外源多核苷酸插入到细胞的至少一个等位基因中。在一些实施方案中，载体是携带外源多核苷酸的假型化、自灭活慢病毒载体。在一些实施方案中，载体是用水疱性口炎VSV-G包膜假型化的自灭活慢病毒载体，并携带外源多核苷酸。在一些实施方案中，使用病毒转导将外源多核苷酸插入到细胞的至少一个等位基因中。在一些实施方案中，使用基于慢病毒的病毒载体将外源多核苷酸插入到细胞的至少一个等位基因中。在一些实施方案中，将外源多核苷酸插入到细胞的至少一个等位基因的安全港或靶标基因座中。
“外源”分子是细胞中通常不存在，但可以通过一种或多种遗传、生化或其他方法引入到细胞中的分子、构建体、因子等。“细胞中通常存在”是相对于细胞的特定发育阶段和环境条件确定的。因此，例如，仅在神经元胚胎发育期间存在的分子相对于成体神经元细胞是外源分子。外源分子可以包括例如功能失常的内源分子的功能型式或功能正常的内源分子的功能失常型式。
除其他外，外源分子或因子可以是诸如通过组合化学过程生成的小分子，或者可以是大分子，诸如蛋白质、核酸、碳水化合物、脂质、糖蛋白、脂蛋白、多糖、上述分子的任何修饰的衍生物或包含上述分子中的一种或多种的任何复合物。核酸包括DNA和RNA，可以是单链或双链的；可以是直链、支链或环状的；并且可以是任意长度。核酸包括那些能够形成双链体的核酸，以及形成三链体的核酸。参见例如美国专利号5，176,996和5,422,251。蛋白质包括但不限于DNA结合蛋白、转录因子、染色质重塑因子、甲基化DNA结合蛋白、聚合酶、甲基化酶、去甲基化酶、乙酰化酶、去乙酰化酶、激酶、磷酸酶、整合酶、重组酶、连接酶、拓扑异构酶、促旋酶和解旋酶。
外源分子或构建体可以是与内源分子相同类型的分子，例如外源蛋白质或核酸。在此类情况下，将外源分子以比细胞中内源分子更高的浓度引入到细胞中。在一些情况下，外源核酸可以包含感染病毒基因组、引入到细胞中的质粒或附加体或者细胞中通常不存在的染色体。用于将外源分子引入到细胞中的方法是本领域技术人员已知的并且包括但不限于脂质介导的转移(即，脂质体，包括中性和阳离子脂质)、电穿孔、直接注射、细胞融合、粒子轰击、磷酸钙共沉淀、DEAE-葡聚糖介导的转移和病毒载体介导的转移。
出于本公开的目的，“基因”包括编码基因产物的DNA区域，以及调控基因产物的产生的所有DNA区域，无论此类调控序列是否与编码和/或转录序列相邻。因此，基因包括但不一定限于启动子序列、终止子、翻译调控序列，诸如核糖体结合位点和内部核糖体进入位点、增强子、沉默子、绝缘子、边界元件、复制起点、基质附着位点及/或基因座控制区。
“基因表达”是指将包含在基因中的信息转化为基因产物。基因产物可以是基因的直接转录产物(例如，mRNA、tRNA、rRNA、反义RNA、核酶、结构RNA或任何其他类型的RNA)或通过mRNA翻译产生的蛋白质。基因产物还包括通过诸如加帽、聚腺苷酸化、甲基化和编辑的过程修饰的RNA，以及通过例如甲基化、乙酰化、磷酸化、泛素化、ADP-核糖基化、豆蔻酰化和/或糖基化修饰的蛋白质。
如本文所用的术语“遗传修饰”及其语法等同物可以指代核酸(例如生物体基因组内的核酸)的一种或多种改变。例如，遗传修饰可以指代基因或基因部分或其他核酸序列的改变、添加和/或缺失。遗传修饰的细胞还可以指代具有添加的、缺失的和/或改变的基因或基因部分的细胞。遗传修饰的细胞还可以指代添加了不是基因或基因部分的核酸序列的细胞。遗传修饰包括，例如，瞬时敲入或敲低机制，以及导致靶基因或基因部分或核酸序列的永久敲入、敲低或敲除的机制。遗传修饰包括，例如，瞬时敲入，以及导致核酸序列的永久敲入的机制。遗传修饰还包括，例如，降低或增加的转录、降低或增加的mRNA稳定性、降低或增加的翻译以及降低或增加的蛋白质稳定性。
如本文所用，术语“植入(grafting)”、“施用(administering)”、“引入(introducing)”、“植入(implanting)”和“移植(transplanting)”及其语法变体在将细胞(例如，本文所述的细胞)放置到受试者中的上下文中可互换使用，所述放置通过导致引入细胞定位或至少部分定位在期望部位或全身引入(例如，进入循环)的方法或途径进行。可以将细胞直接植入期望部位，或通过任何适当的途径施用，所述途径导致递送至受试者的期望部位，在所述位置中，植入的细胞或细胞组分中的至少一部分保持存活。在向受试者施用后细胞的生存期可以短至几小时(例如，二十四小时)至几天，甚至长达若干年。在一些实施方案中，细胞还可例如以胶囊形式施用(例如，注射)到期望部位以外的位置，诸如在脑中或皮下，以将植入的细胞维持在植入位置并且避免植入的细胞迁移。
“HLA”或“人白细胞抗原”复合物是在人体内编码MHC蛋白的基因复合物。构成HLA复合物的这些细胞表面蛋白负责调控对抗原的免疫反应。在人类中，有两种MHC，即I类和II类，“HLA-I”和“HLA-II”。HLA-I包括三种蛋白质，即HLA-A、HLA-B和HLA-C，所述三种蛋白质呈递来自细胞内的肽，并且由HLA-I复合物呈递的抗原吸引杀伤T细胞(也称为CD8+ T细胞或细胞毒性T细胞)。HLA-I蛋白与β-2微球蛋白(B2M)相关。HLA-II包括五种蛋白质，即HLA-DP、HLA-DM、HLA-DOB、HLA-DQ和HLA-DR，所述五种蛋白质将来自细胞外的抗原呈递至T淋巴细胞。这会刺激CD4+细胞(也称为辅助T细胞)。应当理解，“MHC”或“HLA”的使用并不意味着限制，因为它取决于基因是来自人(HLA)还是来自鼠(MHC)。因此，当它涉及哺乳动物细胞时，这些术语在本文中可互换使用。
如本文所用以表征细胞，术语“低免疫原性”一般意指这种细胞不太容易受到被移植此类细胞的受试者的先天或适应性免疫排斥，例如，细胞不太容易受到被移植此类细胞的受试者的同种异体排斥。例如，相对于不包含修饰的相同细胞类型的细胞，这种低免疫原性细胞可能约2.5％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、97.5％、99％或更不太容易受到被移植此类细胞的受试者的先天或适应性免疫排斥。在一些实施方案中，使用基因组编辑技术来调节MHC I和MHC II基因的表达，从而促进低免疫原性细胞的生成。在一些实施方案中，低免疫原性细胞在MHC错配的同种异体受体中逃避免疫排斥。在一些情况下，当向MHC错配的同种异体受体施用(例如，移植或植入)时，由本文概述的低免疫原性干细胞产生的分化细胞逃避免疫排斥。在一些实施方案中，低免疫原性细胞受到保护而免于T细胞介导的适应性免疫排斥和/或先天免疫细胞排斥。低免疫原性细胞、其生产方法及其使用方法的详细描述可见于2015年5月9日提交的WO2016183041；2018年1月14日提交的WO2018132783；2018年3月20日提交的WO2018176390；2019年7月17日提交的WO2020018615；2019年7月17日提交的WO2020018620；2020年7月31日提交的PCT/US2020/44635；2019年8月1日提交的US62/881,840；2019年8月23日提交的US62/891,180；2020年4月27日提交的US63/016,190；以及2020年7月15日提交的US63/052,360，包括实例、序列表和图片的公开内容通过引用整体并入本文。
细胞的低免疫原性可以通过评价细胞的免疫原性(诸如细胞引发适应性和先天免疫反应或避免引发此类适应性和先天免疫反应的能力)来确定。这种免疫反应可以使用本领域技术人员认可的测定来测量。在一些实施方案中，免疫反应测定测量低免疫原性细胞对T细胞增殖、T细胞活化、T细胞杀伤、供体特异性抗体生成、NK细胞增殖、NK细胞活化和巨噬细胞活性的影响。在一些情况下，低免疫原性细胞及其衍生物在向受试者施用后经历被T细胞和/或NK细胞杀伤的降低。在一些情况下，与未修饰或野生型细胞相比，细胞及其衍生物显示出降低的巨噬细胞吞噬。在一些实施方案中，与对应的未修饰的野生型细胞相比，低免疫原性细胞在受体受试者中引发降低或减弱的免疫反应。在一些实施方案中，低免疫原性细胞是非免疫原性的或不能在受体受试者中引发免疫反应。
在两个或更多个核酸或多肽序列的上下文中的术语百分比“同一性”是指两个或更多个序列或子序列在比较和比对以获得最大对应关系时具有相同的核苷酸或氨基酸残基的指定百分比，如使用下述序列比较算法(例如，BLASTP和BLASTN或技术人员可用的其他算法)中的一种或通过目测所测量的。根据应用，百分比“同一性”可以存在于被比较序列的区域中，例如，存在于功能结构域中，或者存在于两个待比较序列的全长中。对于序列比较，通常一个序列充当与测试序列进行比较的参考序列。当使用序列比较算法时，将测试序列和参考序列输入计算机中，指定子序列坐标(如果需要的话)，并且指定序列算法程序参数。然后序列比较算法基于指定的程序参数来计算测试序列相对于参考序列的百分比序列同一性。
可以例如通过以下算法进行序列的最佳比对以实现比较：Smith&Waterman，Adv.Appl.Math.2：482(1981)的局部同源性算法、Needleman&Wunsch，J.Mol.Biol.48：443(1970)的同源性比对算法、Pearson&Lipman，Proc.Nat′l.Acad.Sci.USA 85：2444(1988)的相似性搜索方法、这些算法的计算机化实现(威斯康星遗传软件包(Genetics ComputerGroup，575Science Dr.，Madison，Wis.)中的GAP、BESTFIT、FASTA和TFASTA)或目测(一般参见Ausubel等人，下文)。
适用于确定百分比序列同一性和序列相似性的算法的一个实例是BLAST算法，所述算法描述于Altschul等人，J.Mol.Biol.215：403-410(1990)。用于执行BLAST分析的软件可通过国家生物技术信息中心(National Center for Biotechnology Information)公开获得。
如本文所用的“免疫信号传导因子”在一些情况下是指活化免疫信号传导通路的分子、蛋白质、肽等。
如本文所用的“免疫抑制因子”或“免疫调控因子”或“致耐受因子”包括低免疫因子(hypoimmunity factor)、补体抑制剂、以及在施用、移植或植入后调节或影响细胞被宿主或受体受试者的免疫系统识别的能力的其他因子。这些可能与额外的基因修饰相组合。
术语“增加(increased)”、“增加(increase)”或“增强(enhance)”或“活化(activate)”在本文中均用于一般意指增加统计上显著的量；为避免任何疑问，术语“增加(increased)”、“增加(increase)”或“增强(enhance)”或“活化(activate)”意指与参考水平相比增加至少10％，例如与参考水平相比增加至少约20％、或至少约30％、或至少约40％、或至少约50％、或至少约60％、或至少约70％、或至少约80％、或至少约90％或至多并包括100％增加或在10％-100％之间的任何增加，或者与参考水平相比至少约2倍、或至少约3倍、或至少约4倍、或至少约5倍或至少约10倍增加，或在2倍与10倍之间的任何增加，或更多增加。在一些实施方案中，也称为基础水平的参考水平是0。
在一些实施方案中，改变是插入缺失。如本文所用，“插入缺失”是指由插入、缺失或其组合产生的突变。如本领域技术人员将理解的，除非插入缺失的长度是三的倍数，否则基因组序列的编码区中的插入缺失将导致移码突变。在一些实施方案中，改变是点突变。如本文所用，“点突变”是指替换一个核苷酸的取代。本公开的基因编辑(例如，CRISPR/Cas)系统可用于在靶多核苷酸序列中诱导任意长度的插入缺失或点突变。
如本文所用，“敲低”是指靶mRNA或对应靶蛋白的表达降低。通常相对于施用或表达不介导RNA表达水平降低的非对照分子(例如，非靶向对照shRNA、siRNA或miRNA)后存在的水平来报告敲低。在一些实施方案中，靶基因的敲低通过条件性或诱导型shRNA、条件性或诱导型siRNA、条件性或诱导型miRNA、或条件性或诱导型CRISPR干扰(CRISPRi)来实现。在一些实施方案中，靶基因的敲低通过基于蛋白质的方法来实现，诸如通过条件性或诱导型降解决定子(degron)方法。在一些实施方案中，靶基因的敲低通过遗传修饰(包括shRNA、siRNA、miRNA)或使用基因编辑系统(例如，CRISPR/Cas)来实现。
通常通过使用定量聚合酶链反应(qPCR)扩增测量mRNA水平或通过用蛋白质印迹法或酶联免疫吸附测定(ELISA)测量蛋白质水平来评估敲低。分析蛋白质水平提供mRNA切割以及翻译抑制的评估。用于测量敲低的另外技术包括RNA溶液杂交、核酸酶保护、Northern杂交、用微阵列监测基因表达、抗体结合、放射免疫测定和荧光活化细胞分析。基于本文所述的细节，本领域技术人员将容易理解如何使用本公开的基因编辑系统(例如，CRISPR/Cas)来敲除靶多核苷酸序列或其部分。
本文中的“敲入(knock in)”或“敲入(knock-in)”意指由将DNA序列插入到宿主细胞的染色体基因座中而引起的遗传修饰。这引起敲入基因、基因部分或核酸序列插入产物的表达的起始或水平增加，例如RNA转录物水平和/或编码蛋白质水平的增加。如本领域技术人员将理解的，这可以以若干种方式实现，包括将基因或其部分的一个或多个额外拷贝插入或添加到宿主细胞中、或改变内源基因的调控组分以增加蛋白质的表达、或插入期望其表达的特定核酸序列。这可通过修饰启动子、添加不同的启动子、添加增强子、添加其他调控元件或修饰其他基因表达序列来实现。
如本文所用，“敲除(knock out)”或“敲除(knock-out)”包括以干扰靶多核苷酸序列的翻译或功能的方式缺失全部或部分靶多核苷酸序列。例如，可以通过在靶多核苷酸序列中(包括靶多核苷酸序列的功能结构域(例如，DNA结合结构域)中)诱导插入或缺失(“插入缺失”)来改变靶多核苷酸序列，从而实现敲除。基于本文所述的细节，本领域技术人员将容易理解如何使用本公开的基因编辑系统(例如，CRISPR/Cas)来敲除靶多核苷酸序列或其部分。
在一些实施方案中，遗传修饰或改变导致靶多核苷酸序列或其部分的敲除或敲低。使用本公开的基因编辑系统(例如，CRISPR/Cas)敲除靶多核苷酸序列或其部分可用于多种应用。例如，出于研究目的，敲除细胞中的靶多核苷酸序列可以在体外执行。出于离体目的，敲除细胞中的靶多核苷酸序列可用于治疗或预防与靶多核苷酸序列的表达相关的病症(例如，通过离体敲除细胞中的突变体等位基因并且将包含敲除的突变体等位基因的这些细胞引入到受试者中)或用于改变细胞的基因型或表型。
基因表达的“调节”是指基因表达水平的变化。表达的调节可以包括但不限于基因活化和基因抑制。调节也可以是完全的，即其中基因表达完全灭活或活化至野生型水平或更高；或者它可以是部分的，其中基因表达部分降低或部分活化至野生型水平的一部分。
在另外的或替代的方面，本公开考虑以技术人员可用的任何方式改变靶多核苷酸序列，例如，利用核酸酶系统，诸如TAL效应物核酸酶(TALEN)或锌指核酸酶(ZFN)系统。应当理解，尽管本文详细描述了利用CRISPR/Cas(例如，Cas9和Cas12a)和TALEN的方法的实例，但本公开不限于这些方法/系统的使用。本文可以利用技术人员已知的降低或消除靶细胞中的表达的其他靶向方法。本文提供的方法可以用于改变细胞中的靶多核苷酸序列。本公开出于任何目的考虑了改变细胞中的靶多核苷酸序列。在一些实施方案中，改变细胞中的靶多核苷酸序列以产生突变体细胞。如本文所用，“突变体细胞”是指具有不同于其原始基因型的所得基因型的细胞。在一些情况下，“突变体细胞”表现出突变体表型，例如当使用本公开的基因表达系统(例如，CRISPR/Cas系统)改变正常功能的基因时。在其他情况下，“突变体细胞”表现出野生型表型，例如当使用本公开的基因表达系统(例如，CRISPR/Cas系统)来校正突变体基因型时。在一些实施方案中，改变细胞中的靶多核苷酸序列以校正或修复遗传突变(例如，以恢复细胞的正常表型)。在一些实施方案中，改变细胞中的靶多核苷酸序列以诱导遗传突变(例如，以破坏基因或基因组元件的功能)。
如本文所用的术语“天然细胞”是指未经其他方式修饰(例如，工程化)的细胞。在一些实施方案中，天然细胞是天然存在的野生型或对照细胞。
术语“有效地连接(operatively linked)”或“可操作地连接(operably linked)”关于两个或更多个组件(诸如序列元件)的并置可互换使用，其中组件被排列成使得两个组件都正常运行并且允许至少一个组件可以介导施加在至少一个其他组件上的功能的可能性。举例来说，如果转录调控序列(诸如启动子)响应于一种或多种转录调控因子的存在或不存在而控制编码序列的转录水平，则所述转录调控序列有效地连接至编码序列。转录调控序列通常以顺式方式与编码序列有效地连接，但不必与其直接相邻。例如，增强子是有效地连接至编码序列的转录调控序列，即使它们不连续。
如本文所用的“多能干细胞”具有分化成三个胚层中的任一个的潜力：内胚层(例如胃连接、胃肠道、肺等)、中胚层(例如肌肉、骨骼、血液、泌尿生殖组织等)或外胚层(例如表皮组织和神经系统组织)。如本文所用的术语“多能干细胞”还涵盖“诱导性多能干细胞”或“iPSC”，或一类来源于非多能细胞的多能干细胞。在一些实施方案中，多能干细胞由不是多能细胞的细胞产生或生成。换句话说，多能干细胞可以是非多能细胞的直接或间接后代。亲本细胞的实例包括已被重编程以通过各种方式诱导多能、未分化表型的体细胞。此类“iPS”或“iPSC”细胞可以通过诱导某些调控基因的表达或通过某些蛋白质的外源应用来产生。用于诱导iPS细胞的方法是本领域已知的并且在下文进一步描述。(参见例如Zhou等人，Stem Cells 27(11)：2667-74(2009)；Huangfu等人，Nature Biotechnol.26(7)：795(2008)；Woltjen等人，Nature 458(7239)：766-770(2009)；以及Zhou等人，Cell Stem Cell8：381-384(2009)；这些文献中的每一篇通过引用整体并入本文。)诱导性多能干细胞(iPSC)的生成在下文中概述。如本文所用，“hiPSC”是人诱导性多能干细胞。在一些实施方案中，如本文所用，“多能干细胞”还涵盖间充质干细胞(MSC)和/或胚胎干细胞(ESC)。
如本文所用，“启动子”、“启动子序列”或“启动子区”是指能够结合RNA聚合酶并参与启动下游编码或非编码序列转录的DNA调控区/序列。在一些实例中，启动子序列包括转录起始位点，并且向上游延伸以包括以高于背景的可检测水平启动转录所必需的最小数量的碱基或元件。在一些实施方案中，启动子序列包括转录起始位点，以及负责RNA聚合酶结合的蛋白质结合结构域。真核生物启动子将经常但不总是含有“TATA”盒和“CAT”盒。
在一些实施方案中，工程化和低免疫原性细胞从原代T细胞或其后代繁殖。如本文所用，术语“从原代T细胞或其后代繁殖”涵盖从供体受试者分离的初始原代T细胞及其任何后续后代。如本文所用，术语“后代”涵盖例如第一代后代，即通过例如传统繁殖方法直接来源于、获得自、可获得自或可来源于初始原代T细胞的后代。术语“后代”还涵盖另外的世代，诸如第二代、第三代、第四代、第五代、第六代、第七代或更多代，即通过例如传统繁殖方法来源于、获得自、可获得自或可来源于前一代的细胞世代。术语“后代”还涵盖由于初始原代T细胞或其后代的修饰或改变而产生的修饰的细胞。
术语“受体患者”是指动物，例如，向其提供用本文所述的细胞进行治疗(包括预防性治疗)的人。对于特定动物(诸如人类患者)特有的那些感染、病状或疾病状态的治疗，术语患者是指该特定动物。术语“受体患者”还涵盖任何脊椎动物，包括但不限于哺乳动物、爬行动物、两栖动物和鱼类。然而，有利地，受体动物是哺乳动物，诸如人类，或其他哺乳动物，诸如家养哺乳动物，例如狗、猫、马等，或生产哺乳动物，例如牛、羊、猪等。
如本文所用，术语“调控序列”、“调控元件”和“控制元件”是可互换的，并且是指待表达的多核苷酸靶标的上游(5′非编码序列)、内部或下游(3′非翻译序列)的多核苷酸序列。调控序列影响例如但不限于转录的时间、转录的量或水平、RNA处理或稳定性和/或相关结构核苷酸序列的翻译。调控序列可包括活化因子结合序列、增强子、内含子、聚腺苷酸化识别序列、启动子、阻遏物结合序列、茎环结构、翻译起始序列、翻译前导序列、转录终止序列、翻译终止序列、引物结合位点等。人们认识到，由于在大多数情况下调控序列的确切边界尚未完全界定，不同长度的核苷酸序列可具有相同的调控或启动子活性。
如本文所用的“安全港基因座”是指这样的基因座，其允许以使得新插入的遗传元件能够可预测地发挥作用的方式表达转基因或外源基因，并且也不会以对宿主细胞产生风险的方式引起宿主基因组的改变。示例性“安全港”基因座包括但不限于CCR5基因、PPP1R12C(也称为AAVS1)基因、CLYBL基因和/或Rosa基因(例如，ROSA26)。
如本文所用的“靶标基因座”是指允许表达转基因或外源基因的基因座。示例性“靶标基因座”包括但不限于CXCR4基因、白蛋白基因、SHS231基因座、F3基因(也称为CD142)、MICA基因、MICB基因、LRP1基因(也称为CD91)、HMGB1基因、ABO基因、RHD基因、FUT1基因和/或KDM5D基因(也称为HY)。编码外源基因的外源多核苷酸可以插入到B2M、CIITA、TRAC、TRBC、CCR5、F3(即，CD142)、MICA、MICB、LRP1、HMGB1、ABO、RHD、FUT1、KDM5D(即，HY)、PDGFRa、OLIG2和/或GFAP的CDS区中。可将编码外源基因的外源多核苷酸插入到PPP1R12C(即AAVS1)或CCR5的内含子1或2中。可将编码外源基因的外源多核苷酸插入到CCR5的外显子1或2或3中。可将编码外源基因的外源多核苷酸插入到CLYBL的内含子2中。可将编码外源基因的外源多核苷酸插入到Ch-4：58,976,613(即，SHS231)中的500bp窗口中。可将编码外源基因的外源多核苷酸插入到上文提及的允许表达外源基因的安全港或靶标基因座的任何合适区域，包括例如安全港或靶标基因座中的内含子、外显子或编码序列区域。
如本文所用，“靶标”可以指代通过本文所述的方法经受可调控的降低表达的基因、基因部分、基因组部分或蛋白质。
如本文所用，“治疗有效量”是指足以在疾病、病症或病状的治疗和/或管理中提供治疗益处的量。在一些实施方案中，治疗有效量是足以改善、缓和、稳定、逆转、减缓、减弱或延迟疾病、病症或病状的进展或疾病、病症或病状的症状或副作用的进展的量。在一些实施方案中，治疗有效量也是临床有效量。在其他实施方案中，治疗有效量不是临床有效量。
如本文所用，术语“治疗(treating)”和“治疗(treatment)”包括向受试者施用治疗或临床有效量的本文所述的细胞，使得受试者的疾病的至少一种症状得到减轻或疾病得到改善，例如，有益的或期望的治疗或临床结果。出于此技术的目的，有益的或期望的治疗或临床结果包括但不限于一种或多种症状的减轻、疾病程度的减轻、稳定(即，不恶化)的疾病状态、疾病进展的延迟或减缓、疾病状态的改善或缓和以及缓解(无论是部分的还是全部的)，无论是可检测的还是不可检测的。治疗可以指与未接受治疗的预期存活相比延长存活。因此，本领域技术人员认识到，治疗可改善疾病状况，但可能不是疾病的完全治愈。在一些实施方案中，在治疗病状、疾病或病症后，所述病状、疾病或病症的一种或多种症状减轻至少5％、至少10％、至少20％、至少30％、至少40％或至少50％。
出于此技术的目的，疾病治疗的有益的或期望的治疗或临床结果包括但不限于一种或多种症状的减轻、疾病程度的减轻、稳定(即，不恶化)的疾病状态、疾病进展的延迟或减缓、疾病状态的改善或缓和以及缓解(无论是部分的还是全部的)，无论是可检测的还是不可检测的。
“载体”或“构建体”能够将基因序列转移至靶细胞。通常，“载体构建体”、“表达载体”和“基因转移载体”意指能够指导感兴趣基因的表达并且可以将基因序列转移至靶细胞的任何核酸构建体。因此，所述术语包括克隆和表达媒介物以及整合载体。用于将载体或构建体引入到细胞中的方法是本领域技术人员已知的并且包括但不限于脂质介导的转移(即，脂质体，包括中性和阳离子脂质)、电穿孔、直接注射、细胞融合、粒子轰击、磷酸钙共沉淀、DEAE-葡聚糖介导的转移和/或病毒载体介导的转移。
在一些实施方案中，细胞经工程化以相对于未改变或未修饰的野生型细胞具有降低或增加的一个或多个靶标的表达。在一些实施方案中，细胞经工程化以相对于未改变或未修饰的野生型细胞具有组成型的降低或增加的一个或多个靶标的表达。在一些实施方案中，细胞经工程化以相对于未改变或未修饰的野生型细胞具有可调控的降低或增加的一个或多个靶标的表达。在一些实施方案中，细胞相对于野生型细胞或相同细胞类型的对照细胞包含增加的CD47表达。在细胞的上下文中，“野生型”或“wt”或“对照”意指任何天然存在的细胞。野生型或对照细胞的实例包括天然存在的原代细胞和T细胞。然而，举例来说，在工程化细胞的上下文中，如本文所用，“野生型”或“对照”还可意指工程化细胞，所述工程化细胞可能含有导致MHC I和/或II和/或T细胞受体表达降低的核酸变化，但未经过导致CD47蛋白过表达的基因编辑程序。例如，如本文所用，“野生型”或“对照”意指包含降低或敲除的B2M、CIITA和/或TRAC表达的工程化细胞。此外，如本文所用，“野生型”或“对照”意指包含降低或敲除的B2M、CIITA、TRAC和/或TRBC表达的工程化细胞。如本文所用，“野生型”或“对照”还意指工程化细胞，所述工程化细胞可能含有导致CD47蛋白过表达的核酸变化，但未经过导致MHC I和/或II和/或T细胞受体表达降低的基因编辑程序。在iPSC或其后代的上下文中，“野生型”或“对照”还意指iPSC或其后代，所述iPSC或其后代可含有导致多能性的核酸变化，但未经过本公开的实现MHC I和/或II和/或T细胞受体表达降低和/或CD47蛋白过表达的基因编辑程序。例如，如本文所用，“野生型”或“对照”意指包含降低或敲除的B2M、CIITA和/或TRAC表达的iPSC或其后代。此外，如本文所用，“野生型”或“对照”意指包含降低或敲除的B2M、CIITA、TRAC和/或TRBC表达的iPSC或其后代。在原代T细胞或其后代的上下文中，“野生型”或“对照”还意指原代T细胞或其后代，所述原代T细胞或其后代可能含有导致MHC I和/或II和/或T细胞受体表达降低的核酸变化，但未经过导致CD47蛋白过表达的基因编辑程序。例如，如本文所用，“野生型”或“对照”意指包含降低或敲除的B2M、CIITA和/或TRAC表达的原代T细胞或其后代。此外，如本文所用，“野生型”或“对照”意指包含降低或敲除的B2M、CIITA、TRAC和/或TRBC表达的原代T细胞或其后代。此外，在原代T细胞或其后代的上下文中，“野生型”或“对照”还意指原代T细胞或其后代，所述原代T细胞或其后代可能含有导致CD47蛋白过表达的核酸变化，但未经过导致MHC I和/或II和/或T细胞受体表达降低的基因编辑程序。在一些实施方案中，细胞经工程化以相对于不包含修饰的相同细胞类型的细胞具有可调控的降低或增加的一个或多个靶标的表达。在一些实施方案中，野生型细胞或对照细胞是起始材料。在一些实施方案中，起始材料是从供体收集的原代细胞。在一些实施方案中，起始材料是例如经由leukopak从供体收集的原代血细胞。例如，从供体获得的未修饰的T细胞是被认为是如本文所考虑的野生型或对照细胞的起始材料。在另一个实例中，iPSC细胞系起始材料是被认为是如本文所考虑的野生型或对照细胞的起始材料。在一些实施方案中，起始材料以其他方式被修饰或工程化以具有改变的一个或多个基因的表达以生成工程化细胞。
应当注意，权利要求可被草拟为排除任何任选要素。因此，本声明旨在作为在引用权利要求要素时使用诸如“唯一”、“仅”等排他性术语或使用“否定”限制的先行基础。如本领域技术人员在阅读本公开后将显而易见的，在不背离本公开的范围或精神的情况下，本文描述和说明的个别实施方案中的每一个都具有易于与其他若干个实施方案中的任一个的特征分离或组合的离散组分和特征。任何列举的方法可以按照列举的事件的顺序或按照逻辑上可能的任何其他顺序来进行。虽然与本文所述的那些方法和材料相似或相等的任何方法和材料也可用于实践或测试本公开，但是现在描述代表性说明性方法和材料。
除非另有定义，否则本文使用的所有技术和科学术语具有与本技术所属领域的普通技术人员通常所理解的相同含义。在提供值的范围的情况下，应当理解，在该范围的上限与下限之间的每个中介值(intervening value)(除非上下文另外清楚地指出，否则直到下限的单位的十分之一)以及该所述范围内的任何其他所述值或中介值都涵盖在本公开内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括在较小范围中，并且也涵盖在本公开内，属于所述范围内的任何明确排除的极限值。在所述范围包括极限值中的一个或两个的情况下，不包括那些被包括的极限值中的一个或两个的范围也包括在本公开中。某些范围在本文中以术语“约”开头的数值呈现。术语“约”在本文中用于为其后的确切数字以及接近或近似于所述术语后的数字的数字提供字面支持。在确定数字是接近还是近似具体列举的数字时，接近或近似的未列举的数字可以是在所呈现的上下文中提供与具体列举的数字的实质等效的数字。术语约在本文中用于意指值的正负百分之十(10％)。例如，“约100”是指90与110之间的任何数字。
本说明书中引用的所有出版物、专利和专利申请都通过引用并入本文，其程度就如每项单独的出版物、专利或专利申请被具体和单独地指示通过引用并入。此外，每项引用的出版物、专利或专利申请通过引用并入本文以公开和描述与引用的所述出版物相关的主题。对任何出版物的引用是针对其在申请日之前的公开内容，并且不应被解释为承认本文所述的本技术由于现有技术而无权先于这种出版物。此外，提供的公布日期可能与实际公布日期不同，这可能需要独立地确认。
在进一步描述本技术前，应当理解本技术不限于描述的特定实施方案，因此当然可发生变化。还应理解，本文所用的术语仅出于描述特定实施方案的目的，并且不意图是限制性的，因为本公开的范围将仅受所附权利要求书限制。还应理解，本文所用的标题不是限制性的并且仅旨在引导读者，但主题通常适用于本文公开的技术。
III.实施方案的详细描述
A.低免疫原性细胞
在一些实施方案中，本公开涉及多能干细胞(例如，多能干细胞和诱导性多能干细胞(iPSC))、来源于此类多能干细胞的分化细胞(诸如但不限于T细胞和NK细胞)和原代细胞(诸如但不限于原代T细胞和原代NK细胞)。在一些实施方案中，多能干细胞、来源于其的分化细胞(诸如T细胞和NK细胞)和原代细胞(诸如原代T细胞和原代NK细胞)经工程化以实现降低的MHC I类和/或MHC II类人白细胞抗原的表达或缺乏所述表达，并且在一些情况下，实现降低的T细胞受体(TCR)复合物的表达或缺乏所述表达。在一些实施方案中，除了降低的MHC I类和/或MHC II类人白细胞抗原的表达或缺乏所述表达之外，低免疫(HIP)T细胞和原代T细胞过表达CD47和嵌合抗原受体(CAR)，并且具有降低的T细胞受体(TCR)复合物的表达或缺乏所述表达。在一些实施方案中，CAR包含与选自由CD19、CD22、CD38、CD123、CD138和BCMA组成的组的任一个结合的抗原结合结构域。在一些实施方案中，CAR是CD19特异性CAR。在一些实施方案中，CAR是CD22特异性CAR。在一些情况下，CAR是CD38特异性CAR。在一些实施方案中，CAR是CD123特异性CAR。在一些实施方案中，CAR是CD138特异性CAR。在一些情况下，CAR是BCMA特异性CAR。在一些实施方案中，CAR是双特异性CAR。在一些实施方案中，双特异性CAR是CD19/CD22双特异性CAR。在一些实施方案中，双特异性CAR是BCMA/CD38双特异性CAR。在一些实施方案中，所述细胞表达CD19特异性CAR和不同的CAR，诸如但不限于CD22特异性CAR、CD38特异性CAR、CD123特异性CAR、CD138特异性CAR和BCMA特异性CAR。在一些实施方案中，所述细胞表达CD22特异性CAR和不同的CAR，诸如但不限于CD19特异性CAR、CD38特异性CAR、CD123特异性CAR、CD138特异性CAR和BCMA特异性CAR。在一些实施方案中，所述细胞表达CD38特异性CAR和不同的CAR，诸如但不限于CD22特异性CAR、CD18特异性CAR、CD123特异性CAR、CD138特异性CAR和BCMA特异性CAR。在一些实施方案中，所述细胞表达CD123特异性CAR和不同的CAR，诸如但不限于CD22特异性CAR、CD38特异性CAR、CD19特异性CAR、CD138特异性CAR和BCMA特异性CAR。在一些实施方案中，所述细胞表达CD138特异性CAR和不同的CAR，诸如但不限于CD22特异性CAR、CD38特异性CAR、CD123特异性CAR、CD19特异性CAR和BCMA特异性CAR。在一些实施方案中，所述细胞表达BCMA特异性CAR和不同的CAR，诸如但不限于CD22特异性CAR、CD38特异性CAR、CD123特异性CAR、CD138特异性CAR和CD19特异性CAR。在一些实施方案中，与野生型或对照细胞(包括未改变或未修饰的野生型细胞或对照细胞)相比，细胞被修饰或工程化。在一些实施方案中，野生型细胞或对照细胞是起始材料。在一些实施方案中，起始材料是从供体收集的原代细胞。在一些实施方案中，起始材料是例如经由leukopak从供体收集的原代血细胞。在一些实施方案中，起始材料以其他方式被修饰或工程化以具有改变的一个或多个基因的表达以生成工程化细胞。
在一些实施方案中，工程化和/或低免疫(HIP)T细胞和原代T细胞过表达CD47和嵌合抗原受体(CAR)，并且包括B2M基因的基因组修饰。在一些实施方案中，工程化和/或低免疫(HIP)T细胞和原代T细胞过表达CD47，并且包括CIITA基因的基因组修饰。在一些实施方案中，工程化和/或低免疫(HIP)T细胞和原代T细胞过表达CD47和CAR，并且包括TRAC基因的基因组修饰。在一些实施方案中，工程化和/或低免疫(HIP)T细胞和原代T细胞过表达CD47和CAR，并且包括TRB基因的基因组修饰。在一些实施方案中，工程化和/或低免疫(HIP)T细胞和原代T细胞过表达CD47和CAR，并且包括选自由B2M、CIITA、TRAC和TRB基因组成的组的一个或多个基因组修饰。在一些实施方案中，工程化和/或低免疫(HIP)T细胞和原代T细胞过表达CD47和CAR，并且包括B2M、CIITA、TRAC和TRB基因的基因组修饰。在一些实施方案中，细胞是也表达CAR的B2M-/-、CIITA-/-、TRAC-/-、CD47tg细胞。在一些实施方案中，工程化和/或低免疫(HIP)T细胞通过分化诱导性多能干细胞(诸如工程化和/或低免疫原性诱导性多能干细胞)产生。在一些实施方案中，与野生型或对照细胞(包括未改变或未修饰的野生型细胞或对照细胞)相比，细胞被修饰或工程化。在一些实施方案中，野生型细胞或对照细胞是起始材料。在一些实施方案中，起始材料是从供体收集的原代细胞。在一些实施方案中，起始材料是例如经由leukopak从供体收集的原代血细胞。在一些实施方案中，起始材料以其他方式被修饰或工程化以具有改变的一个或多个基因的表达以生成工程化细胞。
在一些实施方案中，工程化和/或低免疫(HIP)T细胞和原代T细胞是也表达CAR的B2M-/-、CIITA-/-、TRB-/-、CD47tg细胞。在一些实施方案中，细胞是也表达CAR的B2M-/-、CIITA-/-、TRAC-/-、TRB-/-、CD47tg细胞。在某些实施方案中，细胞是也表达CAR的B2M插入缺失/插入缺失、CIITA插入缺失/插入缺失、TRAC插入缺失/插入缺失、CD47tg细胞。在某些实施方案中，细胞是也表达CAR的B2M插入缺失/插入缺失、CIITA插入缺失/插入缺失、TRB插入缺失/插入缺失、CD47tg细胞。在某些实施方案中，细胞是也表达CAR的B2M插入缺失/插入缺失、CIITA插入缺失/插入缺失、TRAC插入缺失/缺失缺失、TRB插入缺失/插入缺失、CD47tg细胞。在一些实施方案中，所述工程化或修饰的细胞是多能干细胞、诱导性多能干细胞、从此类多能干细胞和诱导性多能干细胞分化的NK细胞、从此类多能干细胞和诱导性多能干细胞分化的T细胞、或原代T细胞。原代T细胞的非限制性实例包括CD3+ T细胞、CD4+ T细胞、CD8+T细胞、未致敏T细胞、调控性T(Treg)细胞、非调控性T细胞、Th1细胞、Th2细胞、Th9细胞、Th17细胞、T滤泡辅助(Tfh)细胞、细胞毒性T淋巴细胞(CTL)、效应T(Teff)细胞、中央记忆T(Tcm)细胞、效应记忆T(Tem)细胞、表达CD45RA的效应记忆T细胞(TEMRA细胞)、组织驻留记忆(Trm)细胞、虚拟记忆T细胞、先天记忆T细胞、记忆干细胞(Tsc)、γδT细胞和T细胞的任何其他亚型。在一些实施方案中，原代T细胞选自包括细胞毒性T细胞、辅助T细胞、记忆T细胞、调控性T细胞、肿瘤浸润淋巴细胞及其组合的组。NK细胞和原代NK细胞的非限制性实例包括未成熟NK细胞和成熟NK细胞。在一些实施方案中，与野生型或对照细胞(包括未改变或未修饰的野生型细胞或对照细胞)相比，细胞被修饰或工程化。在一些实施方案中，野生型细胞或对照细胞是起始材料。在一些实施方案中，起始材料是从供体收集的原代细胞。在一些实施方案中，起始材料是例如经由leukopak从供体收集的原代血细胞。在一些实施方案中，起始材料以其他方式被修饰或工程化以具有改变的一个或多个基因的表达以生成工程化细胞。
在一些实施方案中，原代T细胞来自一个或多个供体受试者的原代T细胞库，所述供体受试者不同于受体受试者(例如，被施用细胞的患者)。原代T细胞可获自1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、50、100个或更多个供体受试者并汇集在一起。原代T细胞可获自1个或更多个、2个或更多个、3个或更多个、4个或更多个、5个或更多个、6个或更多个、7个或更多个、8个或更多个、9个或更多个、10个或更多个、20个或更多个、50个或更多个、或100个或更多个供体受试者并且汇集在一起。在一些实施方案中，从一个或多个个体收获原代T细胞，并且在一些情况下，原代T细胞或原代T细胞库在体外培养。在一些实施方案中，原代T细胞或原代T细胞库被工程化以外源表达CD47，并且在体外培养。
在某些实施方案中，原代T细胞或原代T细胞库被工程化以表达嵌合抗原受体(CAR)。CAR可以是本领域技术人员已知的任一种。可用的CAR包括与选自包括CD19、CD20、CD22、CD38、CD123、CD138和BCMA的组的抗原结合的那些。在一些情况下，CAR与FDA批准的CAR-T细胞疗法中使用的CAR(诸如但不限于tisagenlecleucel和axicabtageneciloleucel中使用的那些)或正在临床试验中研究的其他CAR相同或等效。
在一些实施方案中，原代T细胞或原代T细胞库被工程化以与未修饰的原代T细胞相比表现出降低的内源性T细胞受体的表达。在某些实施方案中，原代T细胞或原代T细胞库被工程化以与未修饰的原代T细胞相比表现出降低的CTLA-4、PD-1或CTLA-4和PD-1两者的表达。对包括T细胞的细胞进行遗传修饰的方法在例如WO2020/018620和WO2016/183041中详细描述，其公开内容通过引用整体并入本文，包括表格、附录、序列表和附图。
在一些实施方案中，CAR-T细胞包含CAR，所述CAR选自包括以下的组：(a)第一代CAR，其包含抗原结合结构域、跨膜结构域和信号传导结构域；(b)第二代CAR，其包含抗原结合结构域、跨膜结构域和至少两个信号传导结构域；(c)第三代CAR，其包含抗原结合结构域、跨膜结构域和至少三个信号传导结构域；(d)第四代CAR，其包含抗原结合结构域、跨膜结构域、三个或四个信号传导结构域，以及在CAR的成功信号传导后诱导细胞因子基因表达的结构域。
在一些实施方案中，CAR-T包含CAR，所述CAR包含抗原结合结构域、跨膜结构域和一个或多个信号传导结构域。在一些实施方案中，CAR还包含接头。在一些实施方案中，CAR包含CD19抗原结合结构域。在一些实施方案中，CAR包含CD28或CD8α跨膜结构域。在一些实施方案中，CAR包含CD8α信号肽。在一些实施方案中，CAR包含Whitlow接头GSTSGSGKPGSGEGSTKG(SEQ ID NO：15)。在一些实施方案中，CAR的抗原结合结构域选自包括但不限于以下的组：(a)靶向肿瘤细胞所特有的抗原的抗原结合结构域；(b)靶向T细胞所特有的抗原的抗原结合结构域；(c)靶向自身免疫性或炎性病症所特有的抗原的抗原结合结构域；(d)靶向衰老细胞所特有的抗原的抗原结合结构域；(e)靶向感染性疾病所特有的抗原的抗原结合结构域；和(f)与细胞的细胞表面抗原结合的抗原结合结构域。
在一些实施方案中，CAR还包含一个或多个接头。scFv的形式通常是由柔性肽序列或“接头”连接的两个可变结构域，方向为VH-接头-VL或VL-接头-VH。根据说明书，本领域技术人员已知的任何合适的接头都可以用于CAR。合适的接头的实例包括但不限于基于GS的接头序列和Whitlow接头GSTSGSGKPGSGEGSTKG(SEQ ID NO：15)。在一些实施方案中，接头是GS或gly-ser接头。示例性gly-ser多肽接头包含氨基酸序列Ser(Gly4Ser)n，以及(Gly4Ser)n和/或(Gly4Ser3)n。在一些实施方案中，n＝1。在一些实施方案中，n＝2。在一些实施方案中，n＝3，即Ser(Gly4Ser)3。在一些实施方案中，n＝4，即Ser(Gly4Ser)4。在一些实施方案中，n＝5。在一些实施方案中，n＝6。在一些实施方案中，n＝7。在一些实施方案中，n＝8。在一些实施方案中，n＝9。在一些实施方案中，n＝10。另一个示例性gly-ser多肽接头包含氨基酸序列Ser(Gly4Ser)n。在一些实施方案中，n＝1。在一些实施方案中，n＝2。在一些实施方案中，n＝3。在另一个实施方案中，n＝4。在一些实施方案中，n＝5。在一些实施方案中，n＝6。另一个示例性gly-ser多肽接头包含(Gly4Ser)n。在一些实施方案中，n＝1。在一些实施方案中，n＝2。在一些实施方案中，n＝3。在一些实施方案中，n＝4。在一些实施方案中，n＝5。在一些实施方案中，n＝6。另一个示例性gly-ser多肽接头包含(Gly3Ser)n。在一些实施方案中，n＝1。在一些实施方案中，n＝2。在一些实施方案中，n＝3。在一些实施方案中，n＝4。在另一个实施方案中，n＝5。在又另一个实施方案中，n＝6。另一个示例性gly-ser多肽接头包含(Gly4Ser3)n。在一些实施方案中，n＝1。在一些实施方案中，n＝2。在一些实施方案中，n＝3。在一些实施方案中，n＝4。在一些实施方案中，n＝5。在一些实施方案中，n＝6。另一个示例性gly-ser多肽接头包含(Gly3Ser)n。在一些实施方案中，n＝1。在一些实施方案中，n＝2。在一些实施方案中，n＝3。在一些实施方案中，n＝4。在另一个实施方案中，n＝5。在又另一个实施方案中，n＝6。
在一些实施方案中，抗原结合结构域选自包括以下的组：抗体、其抗原结合部分或片段、scFv和Fab。在一些实施方案中，抗原结合结构域与CD19、CD20、CD22、CD38、CD123、CD138或BCMA结合。在一些实施方案中，抗原结合结构域是抗CD19 scFv，诸如但不限于FMC63。
在一些实施方案中，跨膜结构域包括选自包括以下各者的跨膜区的组的跨膜结构域：TCRα、TCRβ、TCRζ、CD3ε、CD3γ、CD3δ、CD3ζ、CD4、CD5、CD8α、CD8β、CD9、CD16、CD28、CD45、CD22、CD33、CD34、CD37、CD40、CD40L/CD154、CD45、CD64、CD80、CD86、OX40/CD134、4-1BB/CD137、CD154、FcεRIγ、VEGFR2、FAS、FGFR2B及其功能变体。
在一些实施方案中，CAR的信号传导结构域包括共刺激结构域。例如，信号传导结构域可以含有共刺激结构域。或者，信号传导结构域可以含有一个或多个共刺激结构域。在某些实施方案中，信号传导结构域包括一个共刺激结构域。在其他实施方案中，信号传导结构域包括多个共刺激结构域。在一些情况下，当CAR包含两个或更多个共刺激结构域时，两个共刺激结构域不相同。在一些实施方案中，共刺激结构域包括两个不同的共刺激结构域。在一些实施方案中，所述一个共刺激结构域增强T细胞活化期间的细胞因子产生、CAR-T细胞增殖和/或CAR-T细胞持久性。在一些实施方案中，所述多个共刺激结构域增强T细胞活化期间的细胞因子产生、CAR-T细胞增殖和/或CAR-T细胞持久性。
如本文所述，第四代CAR可以含有抗原结合结构域、跨膜结构域、三个或四个信号传导结构域和在CAR的成功信号传导后诱导细胞因子基因表达的结构域。在一些情况下，细胞因子基因是低免疫原性细胞的内源或外源细胞因子基因。在一些情况下，细胞因子基因编码促炎细胞因子。在一些实施方案中，促炎细胞因子选自包括IL-1、IL-2、IL-9、IL-12、IL-18、TNF、IFN-γ及其功能片段的组。在一些实施方案中，在CAR的成功信号传导后诱导细胞因子基因表达的结构域包含转录因子或其功能结构域或片段。
在一些实施方案中，CAR包含CD3泽塔(CD3ζ)结构域或基于免疫受体酪氨酸的活化基序(ITAM)或其功能变体。在一些实施方案中，CAR包含(i)CD3ζ结构域或基于免疫受体酪氨酸的活化基序(ITAM)或其功能变体；和(ii)CD28结构域或4-1BB结构域或其功能变体。在其他实施方案中，CAR包含(i)CD3ζ结构域或基于免疫受体酪氨酸的活化基序(ITAM)或其功能变体；(ii)CD28结构域或其功能变体；和(iii)4-1BB结构域或CD134结构域或其功能变体。在某些实施方案中，CAR包含(i)CD3ζ结构域或基于免疫受体酪氨酸的活化基序(ITAM)或其功能变体；(ii)CD28结构域或其功能变体；(iii)4-1BB结构域或CD134结构域或其功能变体；和(iv)细胞因子或共刺激配体转基因。在一些实施方案中，CAR包含(i)抗CD19 scFv；(ii)CD8α铰链和跨膜结构域或其功能变体；(iii)4-1BB共刺激结构域或其功能变体；和(iv)CD3ζ信号传导结构域或其功能变体。
用于引入CAR构建体或产生CAR-T细胞的方法是本领域技术人员众所周知的。详细描述可见于例如Vormittag等人，Curr Opin Biotechnol，2018，53，162-181；和Eyquem等人，Nature，2017，543，113-117。
在一些实施方案中，来源于原代T细胞的细胞包含降低的内源性T细胞受体的表达，例如通过破坏内源性T细胞受体基因(例如，T细胞受体α恒定区(TRAC)或T细胞受体β恒定区(TRB))。在一些实施方案中，将编码如本文所公开的多肽(例如，嵌合抗原受体、CD47或本文公开的另一种致耐受因子)的外源核酸插入在破坏的T细胞受体基因处。在一些实施方案中，将编码多肽的外源核酸插入在TRAC或TRB基因座处。
在一些实施方案中，来源于原代T细胞的细胞包含降低的细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4(CTLA4)和/或程序性细胞死亡(PD1)的表达。降低或消除CTLA4、PD1以及CTLA4和PD1两者的表达的方法可以包括本领域技术人员认可的任何方法，诸如但不限于利用罕见切割核酸内切酶的遗传修饰技术和RNA沉默或RNA干扰技术。罕见切割核酸内切酶的非限制性实例包括任何Cas蛋白、TALEN、锌指核酸酶、大范围核酸酶和/或归巢核酸内切酶。在一些实施方案中，将编码如本文所公开的多肽(例如，嵌合抗原受体、CD47或本文公开的另一种致耐受因子)的外源核酸插入在CTLA4和/或PD1基因座处。在一些实施方案中，与野生型或对照细胞(包括未改变或未修饰的野生型细胞或对照细胞)相比，细胞被修饰或工程化。在一些实施方案中，野生型细胞或对照细胞是起始材料。在一些实施方案中，起始材料是从供体收集的原代细胞。在一些实施方案中，起始材料是例如经由leukopak从供体收集的原代血细胞。在一些实施方案中，起始材料以其他方式被修饰或工程化以具有改变的一个或多个基因的表达以生成工程化细胞。在一些实施方案中，使用病毒转导(例如使用载体)将外源多核苷酸插入到细胞的至少一个等位基因中。在一些实施方案中，载体是携带外源多核苷酸的假型化、自灭活慢病毒载体。在一些实施方案中，载体是用水疱性口炎VSV-G包膜假型化的自灭活慢病毒载体，并携带外源多核苷酸。在一些实施方案中，使用病毒转导将外源多核苷酸插入到细胞的至少一个等位基因中。在一些实施方案中，使用基于慢病毒的病毒载体将外源多核苷酸插入到细胞的至少一个等位基因中。
在一些实施方案中，将CD47转基因插入到细胞的预选基因座中。在一些实施方案中，将CD47转基因插入到细胞的随机基因座中。在一些实施方案中，将编码CAR的转基因插入到细胞的预选基因座中。在一些实施方案中，将编码CAR的转基因插入到细胞的随机基因座中。在某些实施方案中，将CD47转基因和编码CAR的转基因插入到细胞的预选基因座中。在一些实施方案中，经由病毒载体转导/整合将编码CAR的转基因插入到细胞的随机或预选基因座中，包括安全港基因座。在一些实施方案中，经由病毒载体转导/整合将CD47转基因和编码CAR的转基因插入到细胞的随机或预选基因座中，包括安全港基因座。在一些实施方案中，载体是用水疱性口炎VSV-G包膜假型化的自灭活慢病毒载体。在一些实施方案中，使用病毒转导将编码CAR的转基因插入到细胞的至少一个等位基因中。在一些实施方案中，使用基于慢病毒的病毒载体将外源多核苷酸插入到细胞的至少一个等位基因中。随机和/或预选基因座可以是安全港或靶标基因座。安全港基因座的非限制性实例包括但不限于CCR5基因座、PPP1R12C(也称为AAVS1)基因座和CLYBL基因座、Rosa基因座(例如，ROSA26基因座)。靶标基因座的非限制性实例包括但不限于CXCR4基因座、白蛋白基因座、SHS231基因座、F3基因座(也称为CD142)、MICA基因座、MICB基因座、LRP1基因座(也称为CD91基因座)、HMGB1基因座、ABO基因座、RHD基因座、FUT1基因座和KDM5D基因座。可将CD47转基因插入到PPP1R12C(即AAVS1)或CCR5的内含子1或2中。可将CD47转基因插入到CCR5的外显子1或2或3中。可将CD47转基因插入到CLYBL的内含子2中。可将CD47转基因插入到Ch-4：58,976,613(即，SHS231)中的500bp窗口中。可将CD47转基因插入到上文提及的允许表达外源多核苷酸的安全港或靶标基因座的任何合适区域，包括例如安全港或靶标基因座中的内含子、外显子或编码序列区域。在一些实施方案中，预选基因座选自由B2M基因座、CIITA基因座、TRAC基因座和TRB基因座组成的组。在一些实施方案中，预选基因座是B2M基因座。在一些实施方案中，预选基因座是CIITA基因座。在一些实施方案中，预选基因座是TRAC基因座。在一些实施方案中，预选基因座是TRB基因座。在一些实施方案中，使用病毒转导(例如使用载体)将外源多核苷酸插入到细胞的至少一个等位基因中。在一些实施方案中，载体是携带外源多核苷酸的假型化、自灭活慢病毒载体。在一些实施方案中，载体是用水疱性口炎VSV-G包膜假型化的自灭活慢病毒载体，并携带外源多核苷酸。在一些实施方案中，使用病毒转导将外源多核苷酸插入到细胞的至少一个等位基因中。在一些实施方案中，使用基于慢病毒的病毒载体将外源多核苷酸插入到细胞的至少一个等位基因中。
在一些实施方案中，将CD47转基因和编码CAR的转基因插入到相同基因座中。在一些实施方案中，将CD47转基因和编码CAR的转基因插入到不同基因座中。在许多情况下，将CD47转基因插入到安全港或靶标基因座中。在许多情况下，将编码CAR的转基因插入到安全港或靶标基因座中。在一些情况下，将CD47转基因插入到B2M基因座中。在一些情况下，将编码CAR的转基因插入到B2M基因座中。在某些情况下，将CD47转基因插入到CIITA基因座中。在某些情况下，将编码CAR的转基因插入到CIITA基因座中。在特定情况下，将CD47转基因插入到TRAC基因座中。在特定情况下，将编码CAR的转基因插入到TRAC基因座中。在许多其他情况下，将CD47转基因插入到TRB基因座中。在许多其他情况下，将编码CAR的转基因插入到TRB基因座中。在一些实施方案中，将CD47转基因和编码CAR的转基因插入到安全港或靶标基因座(例如，CCR5基因座、CXCR4基因座、PPP1R12C基因座、白蛋白基因座、SHS231基因座、CLYBL基因座、Rosa基因座、F3(CD142)基因座、MICA基因座、MICB基因座、LRP1(CD91)基因座、HMGB1基因座、ABO基因座、RHD基因座、FUT1基因座和KDM5D基因座)中。
在某些实施方案中，将CD47转基因和编码CAR的转基因插入到安全港或靶标基因座中。在某些实施方案中，CD47转基因和编码CAR的转基因受单个启动子控制，并且被插入到安全港或靶标基因座中。在某些实施方案中，CD47转基因和编码CAR的转基因受其自身的启动子控制，并且被插入到安全港或靶标基因座中。在某些实施方案中，将CD47转基因和编码CAR的转基因插入到TRAC基因座中。在某些实施方案中，CD47转基因和编码CAR的转基因受单个启动子控制，并且被插入到TRAC基因座中。在某些实施方案中，CD47转基因和编码CAR的转基因受其自身的启动子控制，并且被插入到TRAC基因座中。在一些实施方案中，将CD47转基因和编码CAR的转基因插入到TRB基因座中。在一些实施方案中，CD47转基因和编码CAR的转基因受单个启动子控制，并且被插入到TRB基因座中。在一些实施方案中，CD47转基因和编码CAR的转基因受其自身的启动子控制，并且被插入到TRB基因座中。在其他实施方案中，将CD47转基因和编码CAR的转基因插入到B2M基因座中。在其他实施方案中，CD47转基因和编码CAR的转基因受单个启动子控制，并且被插入到B2M基因座中。在其他实施方案中，CD47转基因和编码CAR的转基因受其自身的启动子控制，并且被插入到B2M基因座中。在各个实施方案中，将CD47转基因和编码CAR的转基因插入到CIITA基因座中。在各个实施方案中，CD47转基因和编码CAR的转基因受单个启动子控制，并且被插入到CIITA基因座中。在各个实施方案中，CD47转基因和编码CAR的转基因受其自身的启动子控制，并且被插入到CIITA基因座中。在一些情况下，控制所述任何转基因表达的启动子是组成型启动子。在其他情况下，所述任何转基因的启动子是诱导型启动子。在一些实施方案中，启动子是EF1α启动子。在一些实施方案中，启动子是CAG启动子。在一些实施方案中，CD47转基因和编码CAR的转基因均受组成型启动子控制。在一些实施方案中，CD47转基因和编码CAR的转基因均受诱导型启动子控制。在一些实施方案中，CD47转基因受组成型启动子控制，并且编码CAR的转基因受诱导型启动子控制。在一些实施方案中，CD47转基因受诱导型启动子控制，并且编码CAR的转基因受组成型启动子控制。在各个实施方案中，CD47转基因受EF1α启动子控制，并且编码CAR的转基因受EF1α启动子控制。在一些实施方案中，CD47转基因受CAG启动子控制，并且编码CAR的转基因受CAG启动子控制。在一些实施方案中，CD47转基因受CAG启动子控制，并且编码CAR的转基因受EF1α启动子控制。在一些实施方案中，CD47转基因受EF1α启动子控制，并且编码CAR的转基因受CAG启动子控制。在一些实施方案中，CD47转基因和编码CAR的转基因的表达受单个EF1α启动子控制。在一些实施方案中，CD47转基因和编码CAR的转基因的表达受单个CAG启动子控制。
在另一个实施方案中，本文公开的本公开涉及多能干细胞(例如，多能干细胞和诱导性多能干细胞(iPSC))、来源于此类多能干细胞的分化细胞(例如，低免疫(HIP)T细胞)和原代T细胞，其过表达CD47(诸如外源表达CD47蛋白)，具有降低的MHC I类和/或MHC II类人白细胞抗原的表达或缺乏所述表达，并且具有降低的T细胞受体(TCR)复合物的表达或缺乏所述表达。在一些实施方案中，低免疫(HIP)T细胞和原代T细胞过表达CD47(诸如外源表达CD47蛋白)，具有降低的MHC I类和/或MHC II类人白细胞抗原的表达或缺乏所述表达，并且具有降低的T细胞受体(TCR)复合物的表达或缺乏所述表达。
在一些实施方案中，多能干细胞(例如，多能干细胞和诱导性多能干细胞(iPSC))、来源于此类多能干细胞的分化细胞(例如，低免疫(HIP)T细胞)和原代T细胞过表达CD47并且包括B2M基因的基因组修饰。在一些实施方案中，多能干细胞、来源于此类多能干细胞的分化细胞和原代T细胞过表达CD47，并且包括CIITA基因的基因组修饰。在一些实施方案中，多能干细胞、从此类多能干细胞分化的T细胞和原代T细胞过表达CD47，并且包括TRAC基因的基因组修饰。在一些实施方案中，多能干细胞、从此类多能干细胞分化的T细胞和原代T细胞过表达CD47，并且包括TRB基因的基因组修饰。在一些实施方案中，多能干细胞、从此类多能干细胞分化的T细胞和原代T细胞过表达CD47，并且包括选自由B2M、CIITA、TRAC和TRB基因组成的组的一个或多个基因组修饰。在一些实施方案中，多能干细胞、从此类多能干细胞分化的T细胞和原代T细胞过表达CD47，并且包括B2M、CIITA和TRAC基因的基因组修饰。在一些实施方案中，多能干细胞、从此类多能干细胞分化的T细胞和原代T细胞过表达CD47，并且包括B2M、CIITA和TRB基因的基因组修饰。在一些实施方案中，多能干细胞、从此类多能干细胞分化的T细胞和原代T细胞过表达CD47，并且包括B2M、CIITA、TRAC和TRB基因的基因组修饰。在某些实施方案中，多能干细胞、来源于此类多能干细胞的分化细胞和原代T细胞是B2M-/-、CIITA-/-、TRAC-/-、CD47tg细胞。在某些实施方案中，细胞是B2M-/-、CIITA-/-、TRB-/-、CD47tg细胞。在某些实施方案中，细胞是B2M-/-、CIITA-/-、TRAC-/-、TRB-/-、CD47tg细胞。在一些实施方案中，细胞是B2M插入缺失/插入缺失、CIITA插入缺失/插入缺失、TRAC插入缺失/插入缺失、CD47tg细胞。在一些实施方案中，细胞是B2M插入缺失/插入缺失、CIITA插入缺失/插入缺失、TRB插入缺失/插入缺失、CD47tg细胞。在一些实施方案中，细胞是B2M插入缺失/插入缺失、CIITA插入缺失/插入缺失、TRAC插入缺失/插入缺失、TRB插入缺失/插入缺失、CD47tg细胞。在一些实施方案中，所述工程化或修饰的细胞是多能干细胞、从此类多能干细胞分化的T细胞或原代T细胞。原代T细胞的非限制性实例包括CD3+ T细胞、CD4+ T细胞、CD8+ T细胞、未致敏T细胞、调控性T(Treg)细胞、非调控性T细胞、Th1细胞、Th2细胞、Th9细胞、Th17细胞、T滤泡辅助(Tm)细胞、细胞毒性T淋巴细胞(CTL)、效应T(Teff)细胞、中央记忆T(Tcm)细胞、效应记忆T(Tem)细胞、表达CD45RA的效应记忆T细胞(TEMRA细胞)、组织驻留记忆(Trm)细胞、虚拟记忆T细胞、先天记忆T细胞、记忆干细胞(Tsc)、γδT细胞和T细胞的任何其他亚型。在一些实施方案中，与野生型或对照细胞(包括未改变或未修饰的野生型细胞或对照细胞)相比，细胞被修饰或工程化。在一些实施方案中，野生型细胞或对照细胞是起始材料。在一些实施方案中，起始材料是从供体收集的原代细胞。在一些实施方案中，起始材料是例如经由leukopak从供体收集的原代血细胞。在一些实施方案中，起始材料以其他方式被修饰或工程化以具有改变的一个或多个基因的表达以生成工程化细胞。
在一些实施方案中，将CD47转基因插入到细胞的预选基因座中。预选基因座可以是安全港或靶标基因座。安全港或靶标基因座的非限制性实例包括CCR5基因座、CXCR4基因座、PPP1R12C基因座、白蛋白基因座、SHS231基因座、CLYBL基因座、Rosa基因座、F3(CD142)基因座、MICA基因座、MICB基因座、LRP1(CD91)基因座、HMGB1基因座、ABO基因座、RHD基因座、FUT1基因座和KDM5D基因座。在一些实施方案中，预选基因座是TRAC基因座。在一些实施方案中，将CD47转基因插入到安全港或靶标基因座(例如，CCR5基因座、CXCR4基因座、PPP1R12C基因座、白蛋白基因座、SHS231基因座、CLYBL基因座、Rosa基因座、F3(CD142)基因座、MICA基因座、MICB基因座、LRP1(CD91)基因座、HMGB1基因座、ABO基因座、RHD基因座、FUT1基因座和KDM5D基因座)中。在某些实施方案中，将CD47转基因插入到B2M基因座中。在某些实施方案中，将CD47转基因插入到B2M基因座中。在某些实施方案中，将CD47转基因插入到TRAC基因座中。在某些实施方案中，将CD47转基因插入到TRB基因座中。在一些实施方案中，经由病毒载体转导/整合将CD47转基因插入到细胞的预选基因座中，包括安全港基因座。在一些实施方案中，载体是用水疱性口炎VSV-G包膜假型化的自灭活慢病毒载体。在一些实施方案中，使用病毒转导将CD47转基因插入到细胞的至少一个等位基因中。在一些实施方案中，使用基于慢病毒的病毒载体将外源多核苷酸插入到细胞的至少一个等位基因中。
在一些情况下，CD47转基因的表达受组成型启动子控制。在其他情况下，CD47转基因的表达受诱导型启动子控制。在一些实施方案中，启动子是EF1阿尔法(EF1α)启动子。在一些实施方案中，启动子是CAG启动子。
在又另一个实施方案中，本文公开的本公开涉及多能干细胞(例如，多能干细胞和诱导性多能干细胞(iPSC))、来源于此类多能干细胞的T细胞(例如，低免疫(HIP)T细胞)和原代T细胞，其具有降低的MHC I类和/或MHC II类人白细胞抗原的表达或缺乏所述表达，并且具有降低的T细胞受体(TCR)复合物的表达或缺乏所述表达。在一些实施方案中，细胞具有降低的MHC I类抗原、MHC II类抗原和TCR复合物的表达或缺乏所述表达。
在一些实施方案中，多能干细胞(例如，iPSC)、来源于此类多能干细胞的分化细胞(例如，从此类多能干细胞分化的T细胞)和原代T细胞包括B2M基因的基因组修饰。在一些实施方案中，多能干细胞(例如，iPSC)、来源于此类多能干细胞的分化细胞(例如，从此类多能干细胞分化的T细胞)和原代T细胞包括CIITA基因的基因组修饰。在一些实施方案中，多能干细胞(例如，iPSC)、从此类多能干细胞分化的T细胞和原代T细胞包括TRAC基因的基因组修饰。在一些实施方案中，多能干细胞(例如，iPSC)、从此类多能干细胞分化的T细胞和原代T细胞包括TRB基因的基因组修饰。在一些实施方案中，多能干细胞(例如，iPSC)、从此类多能干细胞分化的T细胞和原代T细胞包括选自由B2M、CIITA和TRAC基因组成的组的一个或多个基因组修饰。在一些实施方案中，多能干细胞(例如，iPSC)、从此类多能干细胞分化的T细胞和原代T细胞包括选自由B2M、CIITA和TRB基因组成的组的一个或多个基因组修饰。在一些实施方案中，多能干细胞(例如，iPSC)、从此类多能干细胞分化的T细胞和原代T细胞包括选自由B2M、CIITA、TRAC和TRB基因组成的组的一个或多个基因组修饰。在某些实施方案中，包括iPSC、从此类iPSC分化的T细胞和原代T细胞的细胞是B2M-/-、CIITA-/-、TRAC-/-细胞。在某些实施方案中，包括iPSC、从此类iPSC分化的T细胞和原代T细胞的细胞是B2M-/-、CIITA-/-、TRB-/-细胞。在一些实施方案中，包括iPSC、从此类iPSC分化的T细胞和原代T细胞的细胞是B2M插入缺失/插入缺失、CIITA插入缺失/插入缺失、TRAC插入缺失/插入缺失细胞。在一些实施方案中，包括iPSC、从此类iPSC分化的T细胞和原代T细胞的细胞是B2M插入缺失/插入缺失、CIITA插入缺失/插入缺失、TRB插入缺失/插入缺失细胞。在一些实施方案中，包括iPSC、从此类iPSC分化的T细胞和原代T细胞的细胞是B2M插入缺失/插入缺失、CIITA插入缺失/插入缺失、TRAC插入缺失/插入缺失、TRB插入缺失/插入缺失细胞。在一些实施方案中，所述修饰的细胞是多能干细胞、诱导性多能干细胞、从此类多能干细胞和诱导性多能干细胞分化的T细胞、或原代T细胞。原代T细胞的非限制性实例包括CD3+ T细胞、CD4+ T细胞、CD8+ T细胞、未致敏T细胞、调控性T(Treg)细胞、非调控性T细胞、Th1细胞、Th2细胞、Th9细胞、Th17细胞、T滤泡辅助(Tfh)细胞、细胞毒性T淋巴细胞(CTL)、效应T(Teff)细胞、中央记忆T(Tcm)细胞、效应记忆T(Tem)细胞、表达CD45RA的效应记忆T细胞(TEMRA细胞)、组织驻留记忆(Trm)细胞、虚拟记忆T细胞、先天记忆T细胞、记忆干细胞(Tsc)、γδT细胞和T细胞的任何其他亚型。在一些实施方案中，与野生型或对照细胞(包括未改变或未修饰的野生型细胞或对照细胞)相比，细胞被修饰或工程化。在一些实施方案中，野生型细胞或对照细胞是起始材料。在一些实施方案中，起始材料是从供体收集的原代细胞。在一些实施方案中，起始材料是例如经由leukopak从供体收集的原代血细胞。在一些实施方案中，起始材料以其他方式被修饰或工程化以具有改变的一个或多个基因的表达以生成工程化细胞。
本公开的细胞表现出降低的MHC I类抗原、MHC II类抗原和/或TCR复合物的表达或缺乏所述表达。降低MHC I和/或MHC II的表达可以例如通过以下方式中的一种或多种来实现：(1)直接靶向多态HLA等位基因(HLA-A、HLA-B、HLA-C)和MHC-II基因；(2)去除B2M，这将阻止所有MHC-I分子的表面运输；(3)去除CIITA，这将阻止所有MHC-II分子的表面运输；以及/或者(4)缺失对HLA表达至关重要的MHC增强体组分，诸如LRC5、RFX5、RFXANK、RFXAP、IRFl、NF-Y(包括NFY-A、NFY-B、NFY-C)和CIITA。
在一些实施方案中，HLA表达受以下干扰：靶向个别HLA(例如，敲除、敲低或降低HLA-A、HLA-B、HLA-C、HLA-DP、HLA-DQ和/或HLA-DR的表达)、靶向HLA表达的转录调控子(例如，敲除、敲低或降低NLRC5、CIITA、RFX5、RFXAP、RFXANK、NFY-A、NFY-B、NFY-C和/或IRF-1的表达)、阻断MHC I类分子的表面运输(例如，敲除、敲低或降低B2M和/或TAP1的表达)以及/或者用HLA-Razor靶向(参见例如WO2016183041)。
在一些实施方案中，本文公开的细胞(包括但不限于多能干细胞、诱导性多能干细胞、来源于此类干细胞的分化细胞和原代T细胞)不表达对应于MHC-I和/或MHC-II的一种或多种人白细胞抗原(例如，HLA-A、HLA-B、HLA-C、HLA-DP、HLA-DQ和/或HLA-DR)，因此表征为低免疫原性。例如，在某些实施方案中，所公开的多能干细胞和诱导性多能干细胞已经被修饰，使得干细胞或由其制备的分化干细胞不表达以下MHC-I分子中的一种或多种或者表现出降低的以下MHC-I分子中的一种或多种的表达：HLA-A、HLA-B和HLA-C。在一些实施方案中，HLA-A、HLA-B和HLA-C中的一种或多种可以从细胞“敲除”。具有敲除HLA-A基因、HLA-B基因和/或HLA-C基因的细胞可能表现出降低或消除的每个敲除基因的表达。
在一些实施方案中，允许通过靶向HLA基因中的保守区域来同时缺失所有MHC I类等位基因的指导RNA、shRNA、siRNA或miRNA被鉴定为HLA Razor。在一些实施方案中，gRNA是CRISPR系统的一部分。在替代实施方案中，gRNA是TALEN系统的一部分。在一些实施方案中，靶向HLA中已鉴定的保守区域的HLA Razor在WO2016183041中描述。在一些实施方案中，利用多个靶向已鉴定的保守区域的HLA Razor。通常应理解，靶向HLA中的保守区域的任何指导物、siRNA、shRNA或miRNA都可以充当HLA Razor。
所提供的方法可用于灭活或消除细胞(诸如但不限于多能干细胞、分化细胞和原代T细胞)中的MHC I类表达和/或MHC II类表达。在一些实施方案中，利用罕见切割核酸内切酶(例如，CRISPR/Cas、TALEN、锌指核酸酶、大范围核酸酶和归巢核酸内切酶系统)的基因组编辑技术还可用于降低或消除细胞中涉及免疫反应的基因的表达(例如，通过缺失涉及免疫反应的基因的基因组DNA或通过将基因组DNA插入到此类基因中，使得基因表达受到影响)。在某些实施方案中，基因组编辑技术或其他基因调节技术用于在人细胞中插入耐受诱导因子，使它们和由其制备的分化细胞是低免疫原性细胞。因此，低免疫原性细胞具有降低或消除的MHC I表达和MHC II表达。在一些实施方案中，细胞在受体受试者中是非免疫原性的(例如，不诱导先天和/或适应性免疫反应)。
在一些实施方案中，细胞包括修饰以增加CD47和选自由以下组成的组的一种或多种因子的表达：DUX4、CD24、CD27、CD35、CD46、CD55、CD59、CD200、HLA-C、HLA-E、HLA-E重链、HLA-G、PD-L1、IDO1、CTLA4-Ig、C1抑制剂、IL-10、IL-35、IL-39、FasL、CCL21、CCL22、Mfge8、CD16、CD52、H2-M3、CD16 Fc受体、IL15-RF和/或Serpinb9。
在一些实施方案中，细胞包含一个或多个靶多核苷酸序列的基因组修饰，所述修饰调控MHC I类分子、MHC II类分子或MHC I类和MHC II类分子的表达。在一些实施方案中，基因编辑系统用于修饰一个或多个靶多核苷酸序列。在一些实施方案中，靶向多核苷酸序列是选自包括B2M、CIITA和NLRC5的组的一个或多个。在一些实施方案中，细胞包含对B2M基因的遗传编辑修饰。在一些实施方案中，细胞包含对CIITA基因的遗传编辑修饰。在一些实施方案中，细胞包含对NLRC5基因的遗传编辑修饰。在一些实施方案中，细胞包含对B2M和CIITA基因的遗传编辑修饰。在一些实施方案中，细胞包含对B2M和NLRC5基因的遗传编辑修饰。在一些实施方案中，细胞包含对CIITA和NLRC5基因的遗传编辑修饰。在多个实施方案中，细胞包含对B2M、CIITA和NLRC5基因的遗传编辑修饰。在某些实施方案中，细胞的基因组已被改变以减少或缺失HLA表达的关键组分。在一些实施方案中，与野生型或对照细胞(包括未改变或未修饰的野生型细胞或对照细胞)相比，细胞被修饰或工程化。在一些实施方案中，野生型细胞或对照细胞是起始材料。在一些实施方案中，起始材料是从供体收集的原代细胞。在一些实施方案中，起始材料是例如经由leukopak从供体收集的原代血细胞。在一些实施方案中，起始材料以其他方式被修饰或工程化以具有改变的一个或多个基因的表达以生成工程化细胞。
在一些实施方案中，本公开提供了一种细胞(例如，干细胞、诱导性多能干细胞、分化细胞，诸如原代NK细胞、CAR-NK细胞、原代T细胞或CAR-T细胞)或其群体，其包含基因组，所述基因组中的基因已被编辑以缺失一段连续的基因组DNA，从而降低或消除MHC I类分子在细胞或其群体中的表面表达。在某些实施方案中，本公开提供了一种细胞(例如，干细胞、诱导性多能干细胞、分化细胞，诸如原代NK细胞、CAR-NK细胞、原代T细胞或CAR-T细胞)或其群体，其包含基因组，所述基因组中的基因已被编辑以缺失一段连续的基因组DNA，从而降低或消除MHC II类分子在细胞或其群体中的表面表达。在多个实施方案中，本公开提供了一种细胞(例如，干细胞、诱导性多能干细胞、分化细胞、造血干细胞、原代T细胞或CAR-T细胞)或其群体，其包含基因组，所述基因组中的一个或多个基因已被编辑以缺失一段连续的基因组DNA，从而降低或消除MHC I类和II类分子在细胞或其群体中的表面表达。
在某些实施方案中，通过靶向和缺失一段连续的基因组DNA来调节MHC I分子和/或MHC II分子的表达，从而降低或消除选自由B2M、CIITA和NLRC5组成的组的靶基因的表达。在一些实施方案中，本文描述了遗传编辑的细胞(例如，修饰的人细胞)，其包含外源CD47蛋白和灭活或修饰的CIITA基因序列，并且在一些情况下，包含灭活或修饰B2M基因序列的额外基因修饰。在一些实施方案中，本文描述了遗传编辑的细胞，其包含外源CD47蛋白和灭活或修饰的CIITA基因序列，并且在一些情况下，包含灭活或修饰NLRC5基因序列的额外基因修饰。在一些实施方案中，本文描述了遗传编辑的细胞，其包含外源CD47蛋白和灭活或修饰的B2M基因序列，并且在一些情况下，包含灭活或修饰NLRC5基因序列的额外基因修饰。在一些实施方案中，本文描述了遗传编辑的细胞，其包含外源CD47蛋白和灭活或修饰的B2M基因序列，并且在一些情况下，包含灭活或修饰CIITA基因序列和NLRC5基因序列的额外基因修饰。
本文提供了细胞，其表现出一个或多个靶向多核苷酸序列的修饰，所述修饰调控以下中的任一种的表达：(a)MHC I抗原，(b)MHC II抗原，(c)TCR复合物，(d)MHC I和II抗原两者，以及(e)MHC I和II抗原和TCR复合物。在某些实施方案中，修饰包括增加CD47的表达。在一些实施方案中，细胞包括外源或重组CD47多肽。在某些实施方案中，修饰包括嵌合抗原受体的表达。在一些实施方案中，细胞包含外源或重组嵌合抗原受体多肽。
在一些实施方案中，细胞包括一个或多个靶向多核苷酸序列的基因组修饰，所述修饰调控MHC I抗原、MHC II抗原和/或TCR复合物的表达。在一些实施方案中，基因编辑系统用于修饰一个或多个靶向多核苷酸序列。在一些实施方案中，多核苷酸序列靶向选自由B2M、CIITA、TRAC和TRB组成的组的一个或多个基因。在某些实施方案中，T细胞(例如，从低免疫原性iPSC分化的T细胞和原代T细胞)的基因组已被改变以减少或缺失HLA和TCR表达的关键组分，例如HLA-A抗原、HLA-B抗原、HLA-C抗原、HLA-DP抗原、HLA-DQ抗原、HLA-DR抗原、TCR-α和TCR-β。
在一些实施方案中，本公开提供了一种细胞或其群体，其包含基因组，所述基因组中的基因已被编辑以缺失一段连续的基因组DNA，从而降低或消除MHC I类分子在细胞或其群体中的表面表达。在某些实施方案中，本公开提供了一种细胞或其群体，其包含基因组，所述基因组中的基因已被编辑以缺失一段连续的基因组DNA，从而降低或消除MHC II类分子在细胞或其群体中的表面表达。在某些实施方案中，本公开提供了一种细胞或其群体，其包含基因组，所述基因组中的基因已被编辑以缺失一段连续的基因组DNA，从而降低或消除TCR分子在细胞或其群体中的表面表达。在多个实施方案中，本公开提供了一种细胞或其群体，其包含基因组，所述基因组中的一个或多个基因已被编辑以缺失一段连续的基因组DNA，从而降低或消除MHC I类和II类分子和TCR复合物分子在细胞或其群体中的表面表达。
在一些实施方案中，本文所述的细胞和方法包括基因组编辑人细胞以切割CIITA基因序列以及编辑此类细胞的基因组以改变一个或多个额外靶多核苷酸序列，诸如但不限于B2M、TRAC和TRB。在一些实施方案中，本文所述的细胞和方法包括基因组编辑人细胞以切割B2M基因序列以及编辑此类细胞的基因组以改变一个或多个额外靶多核苷酸序列，诸如但不限于CIITA、TRAC和TRB。在一些实施方案中，本文所述的细胞和方法包括基因组编辑人细胞以切割TRAC基因序列以及编辑此类细胞的基因组以改变一个或多个额外靶多核苷酸序列，诸如但不限于B2M、CIITA和TRB。在一些实施方案中，本文所述的细胞和方法包括基因组编辑人细胞以切割TRB基因序列以及编辑此类细胞的基因组以改变一个或多个额外靶多核苷酸序列，诸如但不限于B2M、CIITA和TRAC。
本文提供了低免疫原性干细胞，其相对于野生型干细胞包含降低的HLA-A、HLA-B、HLA-C、HLA-DP、HLA-DQ、HLA-DR、B2M、CIITA、TCR-α和TCR-β的表达，所述低免疫原性干细胞还包含一组外源多核苷酸，所述一组外源多核苷酸包含编码CD47的第一外源多核苷酸和编码嵌合抗原受体(CAR)的第二外源多核苷酸，其中第一和/或第二外源多核苷酸插入到细胞的至少一个等位基因的特定基因座中。本文还提供了低免疫原性原代T细胞(包括原代T细胞的任何亚型)，其相对于野生型原代T细胞包含降低的HLA-A、HLA-B、HLA-C、HLA-DP、HLA-DQ、HLA-DR、B2M、CIITA、TCR-α和TCR-β的表达，所述低免疫原性干细胞还包含一组外源多核苷酸，所述一组外源多核苷酸包含编码CD47的第一外源多核苷酸和编码嵌合抗原受体(CAR)的第二外源多核苷酸，其中第一和/或第二外源多核苷酸插入到细胞的至少一个等位基因的特定基因座中。本文另外提供了从低免疫原性诱导性多能干细胞分化的低免疫原性T细胞，其相对于野生型原代T细胞包含降低的HLA-A、HLA-B、HLA-C、HLA-DP、HLA-DQ、HLA-DR、B2M、CIITA、TCR-α和TCR-β的表达，所述低免疫原性干细胞还包含一组外源多核苷酸，所述一组外源多核苷酸包含编码CD47的第一外源多核苷酸和编码嵌合抗原受体(CAR)的第二外源多核苷酸，其中第一和/或第二外源多核苷酸插入到细胞的至少一个等位基因的特定基因座中。
在一些实施方案中，所述工程化细胞群在施用于受体患者后逃避NK细胞介导的细胞毒性。在一些实施方案中，工程化细胞群通过NK细胞的一个或多个亚群逃避NK细胞介导的细胞毒性。在一些实施方案中，工程化细胞群在施用于受体患者后受到保护而免于NK细胞(包括未成熟和/或成熟NK细胞)的细胞裂解。在一些实施方案中，工程化细胞群在施用于受体患者后逃避巨噬细胞吞噬。在一些实施方案中，工程化细胞群在施用于受体患者后不诱导对细胞的先天和/或适应性免疫反应。
在一些实施方案中，本文所述的细胞包含安全开关。本文所用的术语“安全开关”是指用于控制感兴趣基因或蛋白质的表达的系统，当所述感兴趣基因或蛋白质下调或上调时，导致例如通过宿主免疫系统的识别来产生细胞的清除或死亡。安全开关可以被设计成在发生不良临床事件时由外源分子触发。可以通过调控DNA、RNA和蛋白质水平的表达来设计安全开关。安全开关包括允许响应于不良事件而控制细胞活性的蛋白质或分子。在一个实施方案中，安全开关是“杀伤开关”，其以无活性状态表达，并且在通过选择性的外部提供的剂活化开关时对表达安全开关的细胞是致命的。在一个实施方案中，安全开关基因相对于构建体中的感兴趣基因是顺式作用的。安全开关的活化引起细胞通过凋亡或坏死单独杀伤自身或杀伤自身和邻近细胞。在一些实施方案中，本文所述的细胞(例如，干细胞、诱导性多能干细胞、造血干细胞、原代细胞或分化细胞，包括但不限于T细胞、CAR-T细胞、NK细胞和/或CAR-NK细胞)包含安全开关。
在一些实施方案中，安全开关包含抑制或阻断CD47与SIRPα的相互作用的治疗剂。在一些方面，CD47-SIRPα阻断剂是中和、阻断、拮抗或干扰CD47、SIRPα或两者的细胞表面表达的剂。在一些实施方案中，CD47-SIRPα阻断剂抑制或阻断CD47、SIRPα或两者的相互作用。在一些实施方案中，CD47-SIRPα阻断剂(例如，CD47-SIRPα阻断剂、抑制剂、还原剂、拮抗剂、中和剂或干扰剂)包括选自包括以下的组的剂：结合CD47的抗体或其片段、结合CD47的双特异性抗体、结合CD47的免疫细胞因子融合蛋白、含有CD47的融合蛋白、结合SIRPa的抗体或其片段、结合SIRPα的双特异性抗体、结合SIRPα的免疫细胞因子融合蛋白、含有SIRPα的融合蛋白及其组合。
在一些实施方案中，本文所述的细胞包含“自杀基因”(或“自杀开关”)。如果低免疫原性细胞以不期望的方式生长和分裂，则自杀基因会引起它们的死亡。自杀基因消融途径包括基因转移载体中的自杀基因，所述自杀基因编码仅在被特定化合物活化时才会导致细胞杀伤的蛋白质。自杀基因可以编码选择性地将无毒化合物转化成高毒性代谢物的酶。在一些实施方案中，本文所述的细胞(例如，干细胞、诱导性多能干细胞、造血干细胞、原代细胞或分化细胞，包括但不限于T细胞、CAR-T细胞、NK细胞和/或CAR-NK细胞)包含自杀基因。
在一些实施方案中，所述工程化细胞群在施用于受体受试者后引发降低水平的免疫活化或不引发免疫活化。在一些实施方案中，细胞在受体受试者中引发降低水平的全身性TH1活化或不引发全身性TH1活化。在一些实施方案中，细胞在受体受试者中引发降低水平的外周血单核细胞(PBMC)的免疫活化或不引发PBMC的免疫活化。在一些实施方案中，细胞在施用于受体受试者后引发降低水平的针对细胞的供体特异性IgG抗体或不引发所述供体特异性IgG抗体。在一些实施方案中，细胞在受体受试者中引发降低水平的针对细胞的IgM和IgG抗体产生或不引发所述IgM和IgG抗体产生。在一些实施方案中，细胞在施用于受体受试者后引发降低水平的细胞的细胞毒性T细胞杀伤。
B.CIITA
在一些实施方案中，本文公开的技术通过靶向和调节(例如，降低或消除)II类反式活化因子(CIITA)的表达来调节(例如，降低或消除)MHC II基因的表达。在一些实施方案中，使用CRISPR/Cas系统进行调节。CIITA是LR或核苷酸结合结构域(NBD)富亮氨酸重复序列(LRR)蛋白家族的成员，并且通过与MHC增强体缔合来调控MHC II的转录。
在一些实施方案中，本公开的靶多核苷酸序列是CIITA的变体。在一些实施方案中，靶多核苷酸序列是CIITA的同源物。在一些实施方案中，靶多核苷酸序列是CIITA的直向同源物。
在一些实施方案中，降低或消除的CIITA的表达降低或消除以下MHC II类中的一种或多种的表达：HLA-DP、HLA-DM、HLA-DOA、HLA-DOB、HLA-DQ和HLA-DR。
在一些实施方案中，本文所述的细胞在编码CIITA蛋白的基因座处包含基因修饰。换句话说，细胞在CIITA基因座处包含遗传修饰。在一些情况下，编码CIITA蛋白的核苷酸序列在RefSeq.No.NM_000246.4和NCBI Genbank No.U18259中列出。在一些情况下，CIITA基因座在NCBI Gene ID No.4261中描述。在某些情况下，CIITA的氨基酸序列被描绘为NCBIGenBank No.AAA88861.1。CIITA蛋白和基因座的额外描述可见于Uniprot No.P33076、HGNCRef.No.7067和OMIM Ref.No.600005。
在一些实施方案中，本文概述的低免疫原性细胞包含靶向CIITA基因的遗传修饰。在一些实施方案中，通过罕见切割核酸内切酶靶向CIITA基因的遗传修饰包括Cas蛋白或编码Cas蛋白的多核苷酸，以及用于特异性靶向CIITA基因的至少一个指导核糖核酸序列。在一些实施方案中，用于特异性靶向CIITA基因的至少一个指导核糖核酸序列选自由WO2016183041(其通过引用并入本文)的表12的SEQ ID NO：5184-36352组成的组。在一些实施方案中，细胞在受体受试者中诱导先天和/或适应性免疫反应的能力降低。在一些实施方案中，将编码如本文所公开的多肽(例如，嵌合抗原受体、CD47或本文公开的另一种致耐受因子)的外源核酸插入在CIITA基因处。
测试CIITA基因是否已灭活的测定是已知的并且在本文中描述。在一些实施方案中，通过PCR进行的CIITA基因的所得遗传修饰和HLA-II表达的降低可以通过FACS分析进行测定。在另一个实施方案中，使用细胞裂解物的蛋白质印迹来检测CIITA蛋白表达，所述裂解物用针对CIITA蛋白的抗体进行探测。在另一个实施方案中，逆转录酶聚合酶链反应(RT-PCR)用于确认灭活遗传修饰的存在。在一些实施方案中，使用病毒转导(例如使用载体)将外源多核苷酸插入到细胞的至少一个等位基因中。在一些实施方案中，载体是携带外源多核苷酸的假型化、自灭活慢病毒载体。在一些实施方案中，载体是用水疱性口炎VSV-G包膜假型化的自灭活慢病毒载体，并携带外源多核苷酸。在一些实施方案中，使用病毒转导将外源多核苷酸插入到细胞的至少一个等位基因中。在一些实施方案中，使用基于慢病毒的病毒载体将外源多核苷酸插入到细胞的至少一个等位基因中。
C.B2M
在一些实施方案中，本文公开的技术通过靶向和调节(例如，降低或消除)辅助链B2M的表达来调节(例如，降低或消除)MHC-I基因的表达。在一些实施方案中，使用CRISPR/Cas系统进行调节。通过调节(例如，降低或缺失)B2M的表达，MHC-I分子的表面运输被阻断并且细胞被赋予低免疫原性。在一些实施方案中，细胞在受体受试者中诱导先天和/或适应性免疫反应的能力降低。
在一些实施方案中，本公开的靶多核苷酸序列是B2M的变体。在一些实施方案中，靶多核苷酸序列是B2M的同源物。在一些实施方案中，靶多核苷酸序列是B2M的直向同源物。
在一些实施方案中，降低或消除的B2M的表达降低或消除以下MHC I分子中的一种或多种的表达：HLA-A、HLA-B和HLA-C。
在一些实施方案中，本文所述的细胞在编码B2M蛋白的基因座处包含基因修饰。换句话说，细胞在B2M基因座处包含遗传修饰。在一些情况下，编码B2M蛋白的核苷酸序列在RefSeq.No.NM_004048.4和Genbank No.AB021288.1中列出。在一些情况下，B2M基因座在NCBI Gene ID No.567中描述。在某些情况下，B2M的氨基酸序列被描绘为NCBI GenBankNo.BAA35182.1。B2M蛋白和基因座的额外描述可见于Uniprot No.P61769、HGNCRef.No.914和OMIM Ref.No.109700。
在一些实施方案中，本文概述的低免疫原性细胞包含靶向B2M基因的遗传修饰。在一些实施方案中，通过罕见切割核酸内切酶靶向B2M基因的遗传修饰包括Cas蛋白或编码Cas蛋白的多核苷酸，以及用于特异性靶向B2M基因的至少一个指导核糖核酸序列。在一些实施方案中，用于特异性靶向B2M基因的至少一个指导核糖核酸序列选自由WO2016183041(其通过引用并入本文)的表15的SEQ ID NO：81240-85644组成的组。在一些实施方案中，将编码如本文所公开的多肽(例如，嵌合抗原受体、CD47或本文公开的另一种致耐受因子)的外源核酸插入在B2M基因处。在一些实施方案中，使用病毒转导(例如使用载体)将外源多核苷酸插入到细胞的至少一个等位基因中。在一些实施方案中，载体是携带外源多核苷酸的假型化、自灭活慢病毒载体。在一些实施方案中，载体是用水疱性口炎VSV-G包膜假型化的自灭活慢病毒载体，并携带外源多核苷酸。在一些实施方案中，使用病毒转导将外源多核苷酸插入到细胞的至少一个等位基因中。在一些实施方案中，使用基于慢病毒的病毒载体将外源多核苷酸插入到细胞的至少一个等位基因中。
测试B2M基因是否已灭活的测定是已知的并且在本文中描述。在一些实施方案中，通过PCR进行的B2M基因的所得遗传修饰和HLA-I表达的降低可以通过FACS分析进行测定。在另一个实施方案中，使用细胞裂解物的蛋白质印迹来检测B2M蛋白表达，所述裂解物用针对B2M蛋白的抗体进行探测。在另一个实施方案中，逆转录酶聚合酶链反应(RT-PCR)用于确认灭活遗传修饰的存在。
D.NLRC5
在许多实施方案中，本文公开的技术通过靶向和调节(例如，降低或消除)含有5/NOD27/CLR1 6.1的NLR家族CARD结构域(NLRC5)的表达来调节(例如，降低或消除)MHC-I基因的表达。在一些实施方案中，使用CRISPR/Cas系统进行调节。NLRC5是MHC-I介导的免疫反应的关键调控子，并且与CIITA类似，NLRC5高度可被IFN-γ诱导并且可以易位到细胞核中。NLRC5活化MHC-I基因的启动子并且诱导MHC-I以及参与MHC-I抗原呈递的相关基因的转录。
在一些实施方案中，靶多核苷酸序列是NLRC5的变体。在一些实施方案中，靶多核苷酸序列是NLRC5的同源物。在一些实施方案中，靶多核苷酸序列是NLRC5的直向同源物。
在一些实施方案中，降低或消除的NLRC5的表达降低或消除以下MHC I分子中的一种或多种的表达：HLA-A、HLA-B和HLA-C。
在一些实施方案中，本文概述的细胞包含靶向NLRC5基因的遗传修饰。在一些实施方案中，通过罕见切割核酸内切酶靶向NLRC5基因的遗传修饰包括Cas蛋白或编码Cas蛋白的多核苷酸，以及用于特异性靶向NLRC5基因的至少一个指导核糖核酸序列。在一些实施方案中，用于特异性靶向NLRC5基因的至少一个指导核糖核酸序列选自由WO2016183041的附录3或表14的SEQ ID NO：36353-81239组成的组，所述公开内容通过引用整体并入本文。
测试NLRC5基因是否已灭活的测定是已知的并且在本文中描述。在一些实施方案中，通过PCR进行的NLRC5基因的所得遗传修饰和HLA-I表达的降低可以通过FACS分析进行测定。在另一个实施方案中，使用细胞裂解物的蛋白质印迹来检测NLRC5蛋白表达，所述裂解物用针对NLRC5蛋白的抗体进行探测。在另一个实施方案中，逆转录酶聚合酶链反应(RT-PCR)用于确认灭活遗传修饰的存在。
E.TRAC
在许多实施方案中，本文公开的技术通过靶向和调节(例如，降低或消除)T细胞受体α链恒定区的表达来调节(例如，降低或消除)TCR基因(包括TRAC基因)的表达。在一些实施方案中，使用CRISPR/Cas系统进行调节。通过调节(例如，降低或缺失)TRAC的表达，TCR分子的表面运输被阻断。在一些实施方案中，细胞在受体受试者中诱导先天和/或适应性免疫反应的能力也降低。
在一些实施方案中，本公开的靶多核苷酸序列是TRAC的变体。在一些实施方案中，靶多核苷酸序列是TRAC的同源物。在一些实施方案中，靶多核苷酸序列是TRAC的直向同源物。
在一些实施方案中，降低或消除的TRAC的表达降低或消除了TCR表面表达。
在一些实施方案中，细胞(诸如但不限于多能干细胞、诱导性多能干细胞、从诱导性多能干细胞分化的T细胞、原代T细胞和来源于原代T细胞的细胞)在编码TRAC蛋白的基因座处包含基因修饰。换句话说，细胞在TRAC基因座处包含遗传修饰。在一些情况下，编码TRAC蛋白的核苷酸序列在Genbank No.X02592.1中列出。在一些情况下，TRAC基因座在RefSeq.No.NG_001332.3和NCBI Gene ID No.28755中描述。在某些情况下，TRAC的氨基酸序列被描绘为Uniprot No.P01848。TRAC蛋白和基因座的额外描述可见于UniprotNo.P01848、HGNC Ref.No.12029和OMIM Ref.No.186880。
在一些实施方案中，本文概述的低免疫原性细胞包含靶向TRAC基因的遗传修饰。在一些实施方案中，通过罕见切割核酸内切酶靶向TRAC基因的遗传修饰包括Cas蛋白或编码Cas蛋白的多核苷酸，以及用于特异性靶向TRAC基因的至少一个指导核糖核酸序列。在一些实施方案中，用于特异性靶向TRAC基因的至少一个指导核糖核酸序列选自由US20160348073(其通过引用并入本文)的SEQ ID NO：532-609和9102-9797组成的组。
测试TRAC基因是否已灭活的测定是已知的并且在本文中描述。在一些实施方案中，通过PCR进行的TRAC基因的所得遗传修饰和TCR表达的降低可以通过FACS分析进行测定。在另一个实施方案中，使用细胞裂解物的蛋白质印迹来检测TRAC蛋白表达，所述裂解物用针对TRAC蛋白的抗体进行探测。在另一个实施方案中，逆转录酶聚合酶链反应(RT-PCR)用于确认灭活遗传修饰的存在。
F.TRB
在许多实施方案中，本文公开的技术通过靶向和调节(例如，降低或消除)T细胞受体β链恒定区的表达来调节(例如，降低或消除)TCR基因的表达，所述TCR基因包括编码T细胞抗原受体、β链的基因(例如，TRB、TRBC或TCRB基因)。在一些实施方案中，使用CRISPR/Cas系统进行调节。通过调节(例如，降低或缺失)TRB的表达，TCR分子的表面运输被阻断。在一些实施方案中，细胞在受体受试者中诱导先天和/或适应性免疫反应的能力也降低。
在一些实施方案中，本公开的靶多核苷酸序列是TRB的变体。在一些实施方案中，靶多核苷酸序列是TRB的同源物。在一些实施方案中，靶多核苷酸序列是TRB的直向同源物。
在一些实施方案中，降低或消除的TRB的表达降低或消除了TCR表面表达。
在一些实施方案中，细胞(诸如但不限于多能干细胞、诱导性多能干细胞、从诱导性多能干细胞分化的T细胞、原代T细胞和来源于原代T细胞的细胞)在编码TRB蛋白的基因座处包含基因修饰。换句话说，细胞在TRB基因座处包含遗传修饰。在一些情况下，编码TRB蛋白的核苷酸序列在UniProt No.P0DSE2中列出。在一些情况下，TRB基因座在RefSeq.No.NG_001333.2和NCBI Gene ID No.6957中描述。在某些情况下，TRB的氨基酸序列被描绘为Uniprot No.P01848。TRB蛋白和基因座的额外描述可见于GenBankNo.L36092.2、Uniprot No.P0DSE2和HGNC Ref.No.12155。
在一些实施方案中，本文概述的低免疫原性细胞包含靶向TRB基因的遗传修饰。在一些实施方案中，通过罕见切割核酸内切酶靶向TRB基因的遗传修饰包括Cas蛋白或编码Cas蛋白的多核苷酸，以及用于特异性靶向TRB基因的至少一个指导核糖核酸序列。在一些实施方案中，用于特异性靶向TRB基因的至少一个指导核糖核酸序列选自由US20160348073(其通过引用并入本文)的SEQ ID NO：610-765和9798-10532组成的组。
测试TRB基因是否已灭活的测定是已知的并且在本文中描述。在一些实施方案中，通过PCR进行的TRB基因的所得遗传修饰和TCR表达的降低可以通过FACS分析进行测定。在另一个实施方案中，使用细胞裂解物的蛋白质印迹来检测TRB蛋白表达，所述裂解物用针对TRB蛋白的抗体进行探测。在另一个实施方案中，逆转录酶聚合酶链反应(RT-PCR)用于确认灭活遗传修饰的存在。
G.CD142
在许多实施方案中，本文公开的技术调节(例如，降低或消除)CD142的表达，CD142也被称为组织因子、因子III和F3。在一些实施方案中，使用基因编辑系统(例如，CRISPR/Cas)进行调节。
在一些实施方案中，靶多核苷酸序列是CD142或CD142的变体。在一些实施方案中，靶多核苷酸序列是CD142的同源物。在一些实施方案中，靶多核苷酸序列是CD142的直向同源物。
在一些实施方案中，本文概述的细胞包含靶向CD142基因的遗传修饰。在一些实施方案中，通过罕见切割核酸内切酶靶向CD142基因的遗传修饰包括Cas蛋白或编码Cas蛋白的多核苷酸，以及用于特异性靶向CD142基因的至少一个指导核糖核酸(gRNA)序列。下文描述了可用于识别靶向CD142的gRNA序列的方法。
测试CD142基因是否已灭活的测定是已知的并且在本文中描述。在一些实施方案中，通过PCR进行的CD142基因的所得遗传修饰和CD142表达的降低可以通过FACS分析进行测定。在另一个实施方案中，使用细胞裂解物的蛋白质印迹来检测CD142蛋白表达，所述裂解物用针对CD142蛋白的抗体进行探测。在另一个实施方案中，逆转录酶聚合酶链反应(RT-PCR)用于确认灭活遗传修饰的存在。
关于人CD142的有用的基因组、多核苷酸和多肽信息提供于例如GeneCard标识符GC01M094530、HGNC No.3541、NCBI Gene ID 2152、NCBI RefSeq No.NM_001178096.1、NM_001993.4、NP_001171567.1和NP_001984.1、UniProt No.P13726等。
H.CTLA-4
在一些实施方案中，靶多核苷酸序列是CTLA-4或CTLA-4的变体。在一些实施方案中，靶多核苷酸序列是CTLA-4的同源物。在一些实施方案中，靶多核苷酸序列是CTLA-4的直向同源物。
在一些实施方案中，本文概述的细胞包含靶向CTLA-4基因的遗传修饰。在某些实施方案中，原代T细胞包含靶向CTLA-4基因的遗传修饰。遗传修饰可以降低T细胞(包括原代T细胞和CAR-T细胞)中CTLA-4多核苷酸和CTLA-4多肽的表达。在一些实施方案中，通过罕见切割核酸内切酶靶向CTLA-4基因的遗传修饰包括Cas蛋白或编码Cas蛋白的多核苷酸，以及用于特异性靶向CTLA-4基因的至少一个指导核糖核酸(gRNA)序列。下文描述了可用于识别靶向CTLA-4的gRNA序列的方法。
测试CTLA-4基因是否已灭活的测定是已知的并且在本文中描述。在一些实施方案中，通过PCR进行的CTLA-4基因的所得遗传修饰和CTLA-4表达的降低可以通过FACS分析进行测定。在另一个实施方案中，使用细胞裂解物的蛋白质印迹来检测CTLA-4蛋白表达，所述裂解物用针对CTLA-4蛋白的抗体进行探测。在另一个实施方案中，逆转录酶聚合酶链反应(RT-PCR)用于确认灭活遗传修饰的存在。
关于人CTLA-4的有用的基因组、多核苷酸和多肽信息提供于例如GeneCard标识符GC02P203867、HGNC No.2505、NCBI Gene ID 1493、NCBI RefSeq No.NM_005214.4、NM_001037631.2、NP_001032720.1和NP_005205.2、UniProt No.P16410等。
I.PD-1
在一些实施方案中，靶多核苷酸序列是PD-1或PD-1的变体。在一些实施方案中，靶多核苷酸序列是PD-1的同源物。在一些实施方案中，靶多核苷酸序列是PD-1的直向同源物。
在一些实施方案中，本文概述的细胞包含遗传修饰，所述遗传修饰靶向编码程序性细胞死亡蛋白1(PD-1)蛋白的基因或靶向PDCD1基因。在某些实施方案中，原代T细胞包含靶向PDCD1基因的遗传修饰。遗传修饰可以降低T细胞(包括原代T细胞和CAR-T细胞)中PD-1多核苷酸和PD-1多肽的表达。在一些实施方案中，通过罕见切割核酸内切酶靶向PDCD1基因的遗传修饰包括Cas蛋白或编码Cas蛋白的多核苷酸，以及用于特异性靶向PDCD1基因的至少一个指导核糖核酸(gRNA)序列。下文描述了可用于识别靶向PD-1的gRNA序列的方法。
测试PDCD1基因是否已灭活的测定是已知的并且在本文中描述。在一些实施方案中，通过PCR进行的PDCD1基因的所得遗传修饰和PD-1表达的降低可以通过FACS分析进行测定。在另一个实施方案中，使用细胞裂解物的蛋白质印迹来检测PD-1蛋白表达，所述裂解物用针对PD-1蛋白的抗体进行探测。在另一个实施方案中，逆转录酶聚合酶链反应(RT-PCR)用于确认灭活遗传修饰的存在。
关于人PD-1(包括PDCD1基因)的有用的基因组、多核苷酸和多肽信息提供于例如GeneCard标识符GC02M241849、HGNC No.8760、NCBI Gene ID 5133、Uniprot No.Q15116以及NCBI RefSeq No.NM_005018.2和NP_005009.2。
J.CD47
在一些实施方案中，本公开提供了一种细胞或其群体，其已经被修饰以表达致耐受因子(例如，免疫调节多肽)CD47。在一些实施方案中，本公开提供了一种用于改变细胞基因组以表达CD47的方法。在一些实施方案中，干细胞表达外源CD47。在一些情况下，细胞表达表达载体，所述表达载体包含编码人CD47多肽的核苷酸序列。在一些实施方案中，使用同源定向修复对细胞进行遗传修饰以包含编码CD47的整合外源多核苷酸。在一些情况下，细胞表达编码人CD47多肽的核苷酸序列，使得将核苷酸序列插入到安全港或靶标基因座的至少一个等位基因中。在一些情况下，细胞表达编码人CD47多肽的核苷酸序列，其中将核苷酸序列插入到AAVS1基因座的至少一个等位基因中。在一些情况下，细胞表达编码人CD47多肽的核苷酸序列，其中将核苷酸序列插入到CCR5基因座的至少一个等位基因中。在一些情况下，细胞表达编码人CD47多肽的核苷酸序列，其中将核苷酸序列插入到安全港或靶标基因座的至少一个等位基因中，所述安全港或靶标基因座诸如但不限于CCR5基因座、CXCR4基因座、PPP1R12C基因座、白蛋白基因座、SHS231基因座、CLYBL基因座、Rosa基因座、F3(CD142)基因座、MICA基因座、MICB基因座、LRP1(CD91)基因座、HMGB1基因座、ABO基因座、RHD基因座、FUT1基因座和KDM5D基因座。在一些情况下，细胞表达编码人CD47多肽的核苷酸序列，其中将核苷酸序列插入到TRAC基因座的至少一个等位基因中。
CD47是一种白细胞表面抗原，并且在细胞粘附和整联蛋白调节中发挥作用。它在细胞表面上表达，并且向循环巨噬细胞发出不要吞噬细胞的信号。
在一些实施方案中，本文概述的细胞包含编码与NCBI Ref.Sequence No.NP_001768.1和NP_942088.1中列出的氨基酸序列具有至少95％序列同一性(例如，95％、96％、97％、98％、99％或更多)的CD47多肽的核苷酸序列。在一些实施方案中，本文概述的细胞包含编码具有NCBI Ref.Sequence No.NP_001768.1和NP_942088.1中列出的氨基酸序列的CD47多肽的核苷酸序列。在一些实施方案中，细胞包含与NCBI Ref.No.NM_001777.3和NM_198793.2中列出的序列具有至少85％序列同一性(例如，85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多)的CD47核苷酸序列。在一些实施方案中，细胞包含NCBI Ref.Sequence No.NM_001777.3和NM_198793.2中列出的CD47核苷酸序列。在一些实施方案中，编码CD47多核苷酸的核苷酸序列是密码子优化序列。在一些实施方案中，编码CD47多核苷酸的核苷酸序列是人密码子优化序列。
在一些实施方案中，细胞包含与NCBI Ref.Sequence No.NP_001768.1和NP_942088.1中列出的氨基酸序列具有至少95％序列同一性(例如，95％、96％、97％、98％、99％或更多)的CD47多肽。在一些实施方案中，本文概述的细胞包含具有NCBIRef.Sequence No.NP_001768.1和NP_942088.1中列出的氨基酸序列的CD47多肽。
表1中提供了具有信号序列和不具有信号序列的人CD47的示例性氨基酸序列。
表1.人CD47的氨基酸序列
在一些实施方案中，细胞包含与SEQ ID NO：13的氨基酸序列具有至少95％序列同一性(例如，95％、96％、97％、98％、99％或更多)的CD47多肽。在一些实施方案中，细胞包含具有SEQ ID NO：13的氨基酸序列的CD47多肽。在一些实施方案中，细胞包含与SEQ ID NO：14的氨基酸序列具有至少95％序列同一性(例如，95％、96％、97％、98％、99％或更多)的CD47多肽。在一些实施方案中，细胞包含具有SEQ ID NO：14的氨基酸序列的CD47多肽。
在一些实施方案中，细胞包含编码与SEQ ID NO：13的氨基酸序列具有至少95％序列同一性(例如，95％、96％、97％、98％、99％或更多)的CD47多肽的核苷酸序列。在一些实施方案中，细胞包含编码具有SEQ ID NO：13的氨基酸序列的CD47多肽的核苷酸序列。在一些实施方案中，细胞包含编码与SEQ ID NO：14的氨基酸序列具有至少95％序列同一性(例如，95％、96％、97％、98％、99％或更多)的CD47多肽的核苷酸序列。在一些实施方案中，细胞包含编码具有SEQ ID NO：14的氨基酸序列的CD47多肽的核苷酸序列。在一些实施方案中，对核苷酸序列进行密码子优化以在特定细胞中表达。
在一些实施方案中，使用合适的基因编辑系统(例如，CRISPR/Cas系统或本文所述的任何基因编辑系统)来促进将编码CD47的多核苷酸插入到低免疫原性细胞的基因组基因座中。在一些情况下，将编码CD47的多核苷酸插入到安全港或靶标基因座中，诸如但不限于AAVS1、CCR5、CLYBL、ROSA26、SHS231、F3(CD142)、MICA、MICB、LRP1(CD91)、HMGB1、ABO、RHD、FUT1或KDM5D基因座。在一些实施方案中，将编码CD47的多核苷酸插入到B2M基因座、CIITA基因座、TRAC基因座或TRB基因座中。在一些实施方案中，将编码CD47的多核苷酸插入到本文提供的表15中描绘的基因座中的任一个中。在某些实施方案中，编码CD47的多核苷酸可操作地连接至启动子。
在一些实施方案中，使用病毒转导将编码CD47的多核苷酸插入到T细胞的至少一个等位基因中。在一些实施方案中，使用基于慢病毒的病毒载体将编码CD47的多核苷酸插入到T细胞的至少一个等位基因中。在一些实施方案中，基于慢病毒的病毒载体是携带编码CD47的多核苷酸的假型化、自灭活慢病毒载体。在一些实施方案中，基于慢病毒的病毒载体是用水疱性口炎VSV-G包膜假型化的自灭活慢病毒载体，并携带编码CD47的多核苷酸。
在另一个实施方案中，使用细胞裂解物的蛋白质印迹来检测CD47蛋白表达，所述裂解物用针对CD47蛋白的抗体进行探测。在另一个实施方案中，逆转录酶聚合酶链反应(RT-PCR)用于确认外源CD47 mRNA的存在。
K.CD24
在一些实施方案中，本公开提供了一种细胞或其群体，其已经被修饰以表达致耐受因子(例如，免疫调节多肽)CD24。在一些实施方案中，本公开提供了一种用于改变细胞基因组以表达CD24的方法。在一些实施方案中，干细胞表达外源CD24。在一些情况下，细胞表达表达载体，所述表达载体包含编码人CD24多肽的核苷酸序列。在一些实施方案中，使用病毒转导(例如使用载体)将外源多核苷酸插入到细胞的至少一个等位基因中。在一些实施方案中，载体是携带外源多核苷酸的假型化、自灭活慢病毒载体。在一些实施方案中，载体是用水疱性口炎VSV-G包膜假型化的自灭活慢病毒载体，并携带外源多核苷酸。在一些实施方案中，使用病毒转导将外源多核苷酸插入到细胞的至少一个等位基因中。在一些实施方案中，使用基于慢病毒的病毒载体将外源多核苷酸插入到细胞的至少一个等位基因中。
CD24也被称为热稳定抗原或小细胞肺癌簇4抗原，它是一种糖基化的糖基磷脂酰肌醇锚定表面蛋白(Pirruccello等人，J Immunol，1986，136，3779-3784；Chen等人，Glycobiology，2017，57，800-806)。它与先天免疫细胞上的Siglec-10结合。最近证明了经由Siglec-10的CD24充当先天免疫检查点(Barkal等人，Nature，2019，572，392-396)。
在一些实施方案中，本文概述的细胞包含编码与NCBI Ref.Sequence No.NP_001278666.1、NP_001278667.1、NP_001278668.1和NP_037362.1中列出的氨基酸序列具有至少95％序列同一性(例如，95％、96％、97％、98％、99％或更多)的CD24多肽的核苷酸序列。在一些实施方案中，本文概述的细胞包含编码具有NCBI Ref.Sequence No.NP_001278666.1、NP_001278667.1、NP_001278668.1和NP_037362.1中列出的氨基酸序列的CD24多肽的核苷酸序列。
在一些实施方案中，细胞包含与NCBI Ref.No.NM_00129737.1、NM_00129738.1、NM_001291739.1和NM_013230.3中列出的序列具有至少85％序列同一性(例如，85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多)的核苷酸序列。在一些实施方案中，细胞包含NCBI Ref.Sequence No.NM_00129737.1、NM_00129738.1、NM_001291739.1和NM_013230.3中列出的核苷酸序列。
在一些实施方案中，使用合适的基因编辑系统(例如，CRISPR/Cas系统或本文所述的任何基因编辑系统)来促进将编码CD24的多核苷酸插入到低免疫原性细胞的基因组基因座中。在一些情况下，将编码CD24的多核苷酸插入到安全港或靶标基因座中，诸如但不限于AAVS1、CCR5、CLYBL、ROSA26、SHS231、F3(CD142)、MICA、MICB、LRP1(CD91)、HMGB1、ABO、RHD、FUT1或KDM5D基因座。在一些实施方案中，将编码CD24的多核苷酸插入到B2M基因座、CIITA基因座、TRAC基因座或TRB基因座中。在一些实施方案中，将编码CD24的多核苷酸插入到本文提供的表15中描绘的基因座中的任一个中。在某些实施方案中，编码CD24的多核苷酸可操作地连接至启动子。
在另一个实施方案中，使用细胞裂解物的蛋白质印迹来检测CD24蛋白表达，所述裂解物用针对CD24蛋白的抗体进行探测。在另一个实施方案中，逆转录酶聚合酶链反应(RT-PCR)用于确认外源CD24 mRNA的存在。
在一些实施方案中，使用合适的基因编辑系统(例如，CRISPR/Cas系统或本文所述的任何基因编辑系统)来促进将编码CD24的多核苷酸插入到低免疫原性细胞的基因组基因座中。在一些情况下，将编码CD24的多核苷酸插入到安全港或靶标基因座中，诸如但不限于AAVS1、CCR5、CLYBL、ROSA26、SHS231、F3(也称为CD142)、MICA、MICB、LRP1(也称为CD91)、HMGB1、ABO、RHD、FUT1或KDM5D基因座。在一些实施方案中，将编码CD24的多核苷酸插入到B2M基因座、CIITA基因座、TRAC基因座或TRB基因座中。在一些实施方案中，将编码CD24的多核苷酸插入到本文提供的表15中描绘的基因座中的任一个中。在某些实施方案中，编码CD24的多核苷酸可操作地连接至启动子。
L.DUX4
在一些实施方案中，本公开提供了一种细胞(例如，干细胞、诱导性多能干细胞、分化细胞、造血干细胞、原代T细胞或CAR-T细胞)或其群体，其包含经修饰以增加致耐受因子或免疫抑制因子(诸如DUX4)的表达的基因组。在一些实施方案中，本公开提供了一种用于改变细胞基因组以提供增加的DUX4表达的方法，包括通过外源多核苷酸。在一些实施方案中，本公开提供了一种包含外源表达的DUX4蛋白的细胞或其群体。在一些实施方案中，增加的DUX4表达抑制、降低或消除以下MHC I分子中的一种或多种的表达：HLA-A、HLA-B和HLA-C。在一些实施方案中，使用病毒转导(例如使用载体)将外源多核苷酸插入到细胞的至少一个等位基因中。在一些实施方案中，载体是携带外源多核苷酸的假型化、自灭活慢病毒载体。在一些实施方案中，载体是用水疱性口炎VSV-G包膜假型化的自灭活慢病毒载体，并携带外源多核苷酸。在一些实施方案中，使用病毒转导将外源多核苷酸插入到细胞的至少一个等位基因中。在一些实施方案中，使用基于慢病毒的病毒载体将外源多核苷酸插入到细胞的至少一个等位基因中。
DUX4是一种转录因子，在胚胎组织和诱导性多能干细胞中具有活性，并且在正常、健康的体细胞组织中沉默(Feng等人，2015，ELife4；De Iaco等人，2017，Nat Genet，49，941-945；Hendrickson等人，2017，Nat Genet，49，925-934；Snider等人，2010，PLoS Genet，e1001181；Whiddon等人，2017，Nat Genet)。DUX4表达阻断IFN-γ介导的主要组织相容性复合物(MHC)I类基因表达(例如，B2M、HLA-A、HLA-B和HLA-C的表达)的诱导。DUX4表达与被MHCI类抑制的抗原呈递有关(Chew等人，Developmental Cell，2019，50，1-14)。DUX4在切割阶段基因表达(转录)程序中充当转录因子。其靶基因包括但不限于编码基因、非编码基因和重复元件。
DUX4有至少两种亚型，最长的亚型包括DUX4 C末端转录活化结构域。亚型通过可变剪接产生。参见，例如，Geng等人，2012，Dev Cell，22，38-51；Snider等人，2010，PLoSGenet，e1001181。DUX4的活性亚型包括其N末端DNA结合结构域和其C末端活化结构域。参见，例如，Choi等人，2016，Nucleic Acid Res，44，5161-5173。
已经证明了减少DUX4的CpG基序数量会减少DUX4转基因的沉默(Jagannathan等人，Human Molecular Genetics，2016，25(20)：4419-4431)。Jagannathan等人，同上中提供的核酸序列代表DUX4的密码子改变序列，其包含一个或多个碱基取代以降低CpG位点的总数，同时保留DUX4蛋白质序列。核酸序列可从Addgene目录号99281商购获得。
在许多实施方案中，可利用至少一种或多种多核苷酸来促进细胞(例如干细胞、诱导性多能干细胞、分化细胞、造血干细胞、原代T细胞或CAR-T细胞)外源表达DUX4。
在一些实施方案中，使用合适的基因编辑系统(例如，CRISPR/Cas系统或本文所述的任何基因编辑系统)来促进将编码DUX4的多核苷酸插入到低免疫原性细胞的基因组基因座中。在一些情况下，将编码DUX4的多核苷酸插入到安全港或靶标基因座中，诸如但不限于AAVS1、CCR5、CLYBL、ROSA26、SHS231、F3(CD142)、MICA、MICB、LRP1(CD91)、HMGB1、ABO、RHD、FUT1或KDM5D基因座。在一些实施方案中，将编码DUX4的多核苷酸插入到B2M基因座、CIITA基因座、TRAC基因座或TRB基因座中。在一些实施方案中，将编码DUX4的多核苷酸插入到本文提供的表15中描绘的基因座中的任一个中。在某些实施方案中，编码DUX4的多核苷酸可操作地连接至启动子。
在一些实施方案中，使用病毒转导将编码DUX4的多核苷酸插入到T细胞的至少一个等位基因中。在一些实施方案中，使用基于慢病毒的病毒载体将编码DUX4的多核苷酸插入到T细胞的至少一个等位基因中。在一些实施方案中，基于慢病毒的病毒载体是携带编码DUX4的多核苷酸的假型化、自灭活慢病毒载体。在一些实施方案中，基于慢病毒的病毒载体是用水疱性口炎VSV-G包膜假型化的自灭活慢病毒载体，并携带编码DUX4的多核苷酸。
在一些实施方案中，编码DUX4的多核苷酸序列包含有包含密码子改变的DUX4核苷酸序列的多核苷酸序列，所述密码子改变的DUX4核苷酸序列包含一个或多个碱基取代以降低CpG位点的总数，同时保留DUX4蛋白质序列。在一些实施方案中，编码DUX4的多核苷酸序列包含一个或多个碱基取代以降低与2020年7月31日提交的PCT/US2020/44635的SEQ IDNO：1具有至少85％(例如，85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)序列同一性的CpG位点的总数。在一些实施方案中，编码DUX4的多核苷酸序列是PCT/US2020/44635的SEQ ID NO：1。
在一些实施方案中，编码DUX4的多核苷酸序列是编码与选自包括以下的组的序列具有至少95％(例如，95％、96％、97％、98％、99％或100％)序列同一性的多肽序列的核苷酸序列：如PCT/US2020/44635中提供的SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ IDNO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：16、SEQ IDNO：17、SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：21、SEQ ID NO：22、SEQ IDNO：23、SEQ ID NO：24、SEQ ID NO：25、SEQ ID NO：26、SEQ ID NO：27、SEQ ID NO：28和SEQID NO：29。在一些实施方案中，编码DUX4的多核苷酸序列是编码选自包括以下的组的多肽序列的核苷酸序列：SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：21、SEQ ID NO：22、SEQ ID NO：23、SEQ IDNO：24、SEQ ID NO：25、SEQ ID NO：26、SEQ ID NO：27、SEQ ID NO：28和SEQ ID NO：29。如SEQID NO：2-29所示的氨基酸序列在PCT/US2020/44635的图1A至图1G中示出。
在一些情况下，DUX4多肽包含与GenBank登录号ACN62209.1中列出的序列具有至少95％序列同一性的氨基酸序列，或包含GenBank登录号ACN62209.1中列出的氨基酸序列。在一些情况下，DUX4多肽包含与NCBI RefSeq No.NP_001280727.1中列出的序列具有至少95％序列同一性的氨基酸序列，或包含NCBI RefSeq No.NP_001280727.1中列出的氨基酸序列。在一些情况下，DUX4多肽包含与GenBank登录号ACP30489.1中列出的序列具有至少95％序列同一性的氨基酸序列，或包含GenBank登录号ACP30489.1中列出的氨基酸序列。在一些情况下，DUX4多肽包含与UniProtNo.P0CJ85.1中列出的序列具有至少95％序列同一性的氨基酸序列，或包含UniProt No.P0CJ85.1中列出的氨基酸序列。在一些情况下，DUX4多肽包含与GenBank登录号AUA60622.1中列出的序列具有至少95％序列同一性的氨基酸序列，或包含GenBank登录号AUA60622.1中列出的氨基酸序列。在一些情况下，DUX4多肽包含与GenBank登录号ADK24683.1中列出的序列具有至少95％序列同一性的氨基酸序列，或包含GenBank登录号ADK24683.1中列出的氨基酸序列。在一些情况下，DUX4多肽包含与GenBank登录号ACN62210.1中列出的序列具有至少95％序列同一性的氨基酸序列，或包含GenBank登录号ACN62210.1中列出的氨基酸序列。在一些情况下，DUX4多肽包含与GenBank登录号ADK24706.1中列出的序列具有至少95％序列同一性的氨基酸序列，或包含GenBank登录号ADK24706.1中列出的氨基酸序列。在一些情况下，DUX4多肽包含与GenBank登录号ADK24685.1中列出的序列具有至少95％序列同一性的氨基酸序列，或包含GenBank登录号ADK24685.1中列出的氨基酸序列。在一些情况下，DUX4多肽包含与GenBank登录号ACP30488.1中列出的序列具有至少95％序列同一性的氨基酸序列，或包含GenBank登录号ACP30488.1中列出的氨基酸序列。在一些情况下，DUX4多肽包含与GenBank登录号ADK24687.1中列出的序列具有至少95％序列同一性的氨基酸序列，或包含GenBank登录号ADK24687.1中列出的氨基酸序列。在一些情况下，DUX4多肽包含与GenBank登录号ACP30487.1中列出的序列具有至少95％序列同一性的氨基酸序列，或包含GenBank登录号ACP30487.1中列出的氨基酸序列。在一些情况下，DUX4多肽包含与GenBank登录号ADK24717.1中列出的序列具有至少95％序列同一性的氨基酸序列，或包含GenBank登录号ADK24717.1中列出的氨基酸序列。在一些情况下，DUX4多肽包含与GenBank登录号ADK24690.1中列出的序列具有至少95％序列同一性的氨基酸序列，或包含GenBank登录号ADK24690.1中列出的氨基酸序列。在一些情况下，DUX4多肽包含与GenBank登录号ADK24689.1中列出的序列具有至少95％序列同一性的氨基酸序列，或包含GenBank登录号ADK24689.1中列出的氨基酸序列。在一些情况下，DUX4多肽包含与GenBank登录号ADK24692.1中列出的序列具有至少95％序列同一性的氨基酸序列，或包含GenBank登录号ADK24692.1中列出的氨基酸序列。在一些情况下，DUX4多肽包含与GenBank登录号ADK24693.1中列出的序列具有至少95％序列同一性的氨基酸序列，或包含GenBank登录号ADK24693.1中列出的氨基酸序列。在一些情况下，DUX4多肽包含与GenBank登录号ADK24712.1中列出的序列具有至少95％序列同一性的氨基酸序列，或包含GenBank登录号ADK24712.1中列出的氨基酸序列。在一些情况下，DUX4多肽包含与GenBank登录号ADK24691.1中列出的序列具有至少95％序列同一性的氨基酸序列，或包含GenBank登录号ADK24691.1中列出的氨基酸序列。在一些情况下，DUX4多肽包含与UniProt No.P0CJ87.1中列出的序列具有至少95％序列同一性的氨基酸序列，或包含UniProt No.P0CJ87.1中列出的氨基酸序列。在一些情况下，DUX4多肽包含与GenBank登录号ADK24714.1中列出的序列具有至少95％序列同一性的氨基酸序列，或包含GenBank登录号ADK24714.1中列出的氢基酸序列。在一些情况下，DUX4多肽包含与GenBank登录号ADK24684.1中列出的序列具有至少95％序列同一性的氨基酸序列，或包含GenBank登录号ADK24684.1中列出的氨基酸序列。在一些情况下，DUX4多肽包含与GenBank登录号ADK24695.1中列出的序列具有至少95％序列同一性的氨基酸序列，或包含GenBank登录号ADK24695.1中列出的氨基酸序列。在一些情况下，DUX4多肽包含与GenBank登录号ADK24699.1中列出的序列具有至少95％序列同一性的氨基酸序列，或包含GenBank登录号ADK24699.1中列出的氨基酸序列。在一些情况下，DUX4多肽包含与NCBI RefSeq No.NP_001768.1中列出的序列具有至少95％序列同一性的氨基酸序列，或包含NCBI RefSeq No.NP_001768中列出的氨基酸序列。在一些情况下，DUX4多肽包含与NCBI RefSeq No.NP 942088.1中列出的序列具有至少95％序列同一性的氨基酸序列，或包含NCBI RefSeq No.NP_942088.1中列出的氨基酸序列。在一些情况下，DUX4多肽包含与PCT/US2020/44635中提供的SEQ ID NO：28具有至少95％序列同一性的氨基酸序列，或包含PCT/US2020/44635中提供的SEQ ID NO：28的氨基酸序列。在一些情况下，DUX4多肽包含与PCT/US2020/44635中提供的SEQ ID NO：29具有至少95％序列同一性的氨基酸序列，或包含PCT/US2020/44635中提供的SEQ ID NO：29的氨基酸序列。
在其他实施方案中，使用表达载体来促进致耐受因子的表达。在一些实施方案中，表达载体包含编码DUX4的多核苷酸序列，所述编码DUX4的多核苷酸序列是密码子改变序列，其包含一个或多个碱基取代以降低CpG位点的总数，同时保留DUX4蛋白质序列。在一些情况下，DUX4的密码子改变序列包含PCT/US2020/44635的SEQ ID NO：1。在一些情况下，DUX4的密码子改变序列是PCT/US2020/44635的SEQ ID NO：1。在其他实施方案中，表达载体包含编码DUX4的多核苷酸序列，所述序列包含PCT/US2020/44635的SEQ ID NO：1。在一些实施方案中，表达载体包含编码DUX4多肽序列的多核苷酸序列，所述DUX4多肽序列与选自包括以下的组的序列具有至少95％的序列同一性：PCT/US2020/44635的SEQ ID NO：2、SEQ IDNO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：20、SEQ IDNO：21、SEQ ID NO：22、SEQ ID NO：23、SEQ ID NO：24、SEQ ID NO：25、SEQ ID NO：26、SEQ IDNO：27、SEQ ID NO：28和SEQ ID NO：29。在一些实施方案中，表达载体包含编码DUX4多肽序列的多核苷酸序列，所述DUX4多肽序列选自包括以下的组：PCT/US2020/44635的SEQ IDNO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：21、SEQ ID NO：22、SEQ ID NO：23、SEQ ID NO：24、SEQ ID NO：25、SEQ IDNO：26、SEQ ID NO：27、SEQ ID NO：28和SEQ ID NO：29。
可以使用已知技术(诸如Westem印迹、ELISA测定、FACS测定、免疫测定等)来测定DUX4表达的增加。
M.额外的致耐受因子
在许多实施方案中，可以将一种或多种致耐受因子插入或重新插入到基因组编辑的细胞中以产生免疫豁免的通用供体细胞，诸如通用供体干细胞、通用供体T细胞或通用供体细胞。在某些实施方案中，本文公开的低免疫原性细胞已被进一步修饰以表达一种或多种致耐受因子。示例性致耐受因子包括但不限于以下中的一种或多种：CD47、DUX4、CD24、CD27、CD35、CD46、CD55、CD59、CD200、HLA-C、HLA-E、HLA-E重链、HLA-G、PD-L1、IDO1、CTLA4-Ig、C1-抑制剂、IL-10、IL-35、FasL、CCL21、CCL22、Mfge8、CD16、CD52、H2-M3、CD16 Fc受体、IL15-RF和Serpinb9。在一些实施方案中，致耐受因子选自由以下组成的组：CD200、HLA-G、HLA-E、HLA-C、HLA-E重链、PD-L1、IDO1、CTLA4-Ig、IL-10、IL-35、FasL、Serpinb9、CCL21、CCL22和Mfge8。在一些实施方案中，致耐受因子选自由以下组成的组：DUX4、HLA-C、HLA-E、HLA-F、HLA-G、PD-L1、CTLA-4-Ig、C1-抑制剂和IL-35。在一些实施方案中，致耐受因子选自由以下组成的组：HLA-C、HLA-E、HLA-F、HLA-G、PD-L1、CTLA-4-Ig、C1-抑制剂和IL-35。在一些实施方案中，致耐受因子选自包括以下的组：CD47、DUX4、CD24、CD27、CD35、CD46、CD55、CD59、CD200、HLA-C、HLA-E、HLA-E重链、HLA-G、PD-L1、IDO1、CTLA4-Ig、C1-抑制剂、IL-10、IL-35、FasL、CCL21、CCL22、Mfge8、CD16、CD52、H2-M3、CD16 Fc受体、IL15-RF和Serpinb9。
在一些实施方案中，使用病毒转导将编码一种或多种致耐受因子的多核苷酸插入到T细胞的至少一个等位基因中。在一些实施方案中，使用基于慢病毒的病毒载体将编码一种或多种致耐受因子的多核苷酸插入到T细胞的至少一个等位基因中。在一些实施方案中，基于慢病毒的病毒载体是携带编码一种或多种致耐受因子的多核苷酸的假型化、自灭活慢病毒载体。在一些实施方案中，基于慢病毒的病毒载体是用水疱性口炎VSV-G包膜假型化的自灭活慢病毒载体，并携带编码一种或多种致耐受因子的多核苷酸。
关于人CD27(其也被称为CD27L受体、肿瘤坏死因子受体超家族成员7、TNFSF7、T细胞活化抗原S152、Tp55和T14)的有用的基因组、多核苷酸和多肽信息提供于例如GeneCard标识符GC12P008144、HGNC No.11922、NCBI Gene ID 939、Uniprot No.P26842以及NCBIRefSeq No.NM_001242.4和NP_001233.1。
关于人CD46的有用的基因组、多核苷酸和多肽信息提供于例如GeneCard标识符GC01P207752、HGNC No.6953、NCBI Gene ID 4179、Uniprot No.P15529以及NCBI RefSeqNo.NM_002389.4、NM_153826.3、NM_172350.2、NM_172351.2、NM_172352.2NP_758860.1、NM_172353.2、NM_172359.2、NM_172361.2、NP_002380.3、NP_722548.1、NP_758860.1、NP_758861.1、NP_758862.1、NP_758863.1、NP_758869.1和NP_758871.1。
关于人CD55(也称为补体衰变加速因子)的有用的基因组、多核苷酸和多肽信息提供于例如GeneCard标识符GC01P207321、HGNC No.2665、NCBI Gene ID 1604、UniprotNo.P08174以及NCBI RefSeq No.NM_000574.4、NM_001114752.2、NM_001300903.1、NM_001300904.1、NP_000565.1、NP_001108224.1、NP_001287832.1和NP_001287833.1。
关于人CD59的有用的基因组、多核苷酸和多肽信息提供于例如GeneCard标识符GC11M033704、HGNC No.1689，NCBI Gene ID 966、Uniprot No.P13987以及NCBI RefSeqNo.NP_000602.1、NM_000611.5、NP_001120695.1、NM_001127223.1、NP_001120697.1、NM_001127225.1、NP_001120698.1、NM_001127226.1、NP_001120699.1、NM_001127227.1、NP_976074.1、NM_203329.2、NP_976075.1、NM_203330.2、NP_976076.1和NM_203331.2。
关于人CD200的有用的基因组、多核苷酸和多肽信息提供于例如GeneCard标识符GC03P112332、HGNC No.7203、NCBI Gene ID 4345、Uniprot No.P41217以及NCBI RefSeqNo.NP_001004196.2、NM_001004196.3、NP_001305757.1、NM_001318828.1、NP_005935.4、NM_005944.6、XP_005247539.1和XM_005247482.2。
关于人HLA-C的有用的基因组、多核苷酸和多肽信息提供于例如GeneCard标识符GC06M031272、HGNC No.4933、NCBI Gene ID 3107、Uniprot No.P10321以及NCBI RefSeqNo.NP_002108.4和NM_002117.5。
关于人HLA-E的有用的基因组、多核苷酸和多肽信息提供于例如GeneCard标识符GC06P047281、HGNC No.4962、NCBI Gene ID 3133、Uniprot No.P13747以及NCBI RefSeqNo.NP_005507.3和NM_005516.5。
关于人HLA-G的有用的基因组、多核苷酸和多肽信息提供于例如GeneCard标识符GC06P047256、HGNC No.4964、NCBI Gene ID 3135、Uniprot No.P17693以及NCBI RefSeqNo.NP_002118.1和NM_002127.5。
关于人PD-L1或CD274的有用的基因组、多核苷酸和多肽信息提供于例如GeneCaurd标识符GC09P005450、HGNC No.17635、NCBI Gene ID 29126、Uniprot No.Q9NZQ7以及NCBI RefSeq No.NP_001254635.1、NM_001267706.1、NP_054862.1和NM_014143.3。
关于人ID01的有用的基因组、多核苷酸和多肽信息提供于例如GeneCard标识符GC08P039891、HGNC No.6059、NCBI Gene ID 3620、Uniprot No.P14902以及NCBI RefSeqNo.NP_002155.1和NM_002164.5。
关于人IL-10的有用的基因组、多核苷酸和多肽信息提供于例如GeneCard标识符GC01M206767、HGNC No.5962、NCBI Gene ID 3586、Uniprot No.P22301以及NCBI RefSeqNo.NP_000563.1和NM_000572.2。
关于人Fas配体(其也被称为FasL、FASLG、CD178、TNFSF6等)的有用的基因组、多核苷酸和多肽信息提供于例如GeneCard标识符GC01P172628、HGNC No.11936、NCBI Gene ID356、Uniprot No.P48023以及NCBI RefSeq No.NP_000630.1、NM_000639.2、NP_001289675.1和NM_001302746.1。
关于人CCL21的有用的基因组、多核苷酸和多肽信息提供于例如GeneCard标识符GC09M034709、HGNC No.10620、NCBI Gene ID 6366、Uniprot No.O00585以及NCBI RefSeqNo.NP_002980.1和NM_002989.3。
关于人CCL22的有用的基因组、多核苷酸和多肽信息提供于例如GeneCard标识符GC16P057359、HGNC No.10621、NCBI Gene ID 6367、Uniprot No.O00626以及NCBI RefSeqNo.NP_002981.2、NM_002990.4、XP_016879020.1和XM_017023531.1。
关于人Mfge8的有用的基因组、多核苷酸和多肽信息提供于例如GeneCard标识符GC 15M088898、HGNC No.7036、NCBI Gene ID 4240、Uniprot No.Q08431以及NCBI RefSeqNo.NP_001108086.1、NM_001114614.2、NP_001297248.1、NM_001310319.1、NP_001297249.1、NM_001310320.1、NP_001297250.1、NM_001310321.1、NP_005919.2和NM_005928.3。
关于人SerpinB9的有用的基因组、多核苷酸和多肽信息提供于例如GeneCard标识符GC06M002887、HGNC No.8955、NCBI Gene ID 5272、Uniprot No.P50453以及NCBI RefSeqNo.NP_004146.1、NM_004155.5、XP_005249241.1和XM_005249184.4。
用于调节基因和因子(蛋白质)表达的方法包括基因组编辑技术、RNA或蛋白质表达技术等。对于所有这些技术，使用众所周知的重组技术来产生如本文所概述的重组核酸。
在一些实施方案中，细胞(例如，干细胞、诱导性多能干细胞、分化细胞、造血干细胞、原代T细胞或CAR-T细胞)具有使B2M和CIITA基因灭活的遗传修饰，并且表达选自包括以下的组的多种外源多肽：CD47和DUX4、CD47和CD24、CD47和CD27、CD47和CD46、CD47和CD55、CD47和CD59、CD47和CD200、CD47和HLA-C、CD47和HLA-E、CD47和HLA-E重链、CD47和HLA-G、CD47和PD-L1、CD47和IDO1、CD47和CTLA4-Ig、CD47和C1-抑制剂、CD47和IL-10、CD47和IL-35、CD47和IL-39、CD47和FasL、CD47和CCL21、CD47和CCL22、CD47和Mfge8以及CD47和Serpinb9及其任何组合。在一些情况下，此类细胞还具有使CD142基因灭活的遗传修饰。
在一些情况下，基因编辑系统(诸如CRISPR/Cas系统)用于促进将致耐受因子(诸如致耐受因子)插入到安全港或靶标基因座(诸如AAVS1基因座)中以主动抑制免疫排斥反应。在一些情况下，使用表达载体将致耐受因子插入到安全港或靶标基因座中。在一些实施方案中，安全港或靶标基因座是AAVS1、CCR5、CLYBL、ROSA26、SHS231、F3(也称为CD142)、MICA、MICB、LRP1(也称为CD91)、HMGB1、ABO、RHD、FUT1或KDM5D基因座。
在一些实施方案中，通过表达含有以下的融合蛋白或蛋白质复合物来增加靶基因(例如，DUX4、CD47或另一种致耐受因子基因)的表达：(1)对外源靶基因(例如，DUX4、CD47或另一种致耐受因子基因)具有特异性的位点特异性结合结构域和(2)转录活化因子。
在一些实施方案中，调控因子由位点特异性DNA结合核酸分子(诸如指导RNA(gRNA))组成。在一些实施方案中，方法通过位点特异性DNA结合靶蛋白来实现，诸如通过锌指蛋白(ZFP)或含有ZFP的融合蛋白(其也被称为锌指核酸酶(ZFN))来实现。
在一些实施方案中，调控因子包含位点特异性结合结构域，诸如使用DNA结合蛋白或DNA结合核酸，其与靶向区域的基因特异性结合或杂交。在一些实施方案中，所提供的多核苷酸或多肽与位点特异性核酸酶(诸如修饰的核酸酶)偶联或复合。例如，在一些实施方案中，使用包含修饰的核酸酶的DNA靶向蛋白的融合物来实现施用，诸如使用大范围核酸酶或RNA指导的核酸酶，诸如成簇规律间隔短回文核酸(CRISPR)-Cas系统，诸如CRISPR-Cas9系统。在一些实施方案中，核酸酶经修饰以缺乏核酸酶活性。在一些实施方案中，修饰的核酸酶是催化死亡的dCas9。
在一些实施方案中，位点特异性结合结构域可来源于核酸酶。例如，归巢核酸内切酶和大范围核酸酶的识别序列，诸如I-SceI、I-CeuI、PI-PspI、PI-Sce、I-SceIV、I-CsmI、I-PanI、I-SceII、I-PpoI、I-SceIII、I-CreI、I-TevI、I-TevII和I-TevIII。另见美国专利号5,420,032；美国专利号6,833,252；Belfort等人，(1997)Nucleic Acids Res.25：3379-3388；Dujon等人，(1989)Gene 82∶115-118；Perler等人，(1994)Nucleic Acids Res.22，1125-1127；Jasin(1996)Trends Genet.12：224-228；Gimble等人，(1996)J.Mol.Biol.263：163-180；Argast等人，(1998)J.Mol.Biol.280：345-353和New England Biolabs目录。此外，可以对归巢核酸内切酶和大范围核酸酶的DNA结合特异性进行工程化以结合非天然靶位点。参见例如，Chevalier等人，(2002)Molec.Cell 10∶895-905；Epinat等人，(2003)NucleicAcids Res.31：2952-2962；Ashworth等人，(2006)Nature 441：656-659；Paques等人，(2007)Current Gene Therapy 7：49-66；美国专利公开号2007/0117128。
锌指、TALE和CRISPR系统结合结构域可以被“工程化”以结合预定的核苷酸序列，例如经由天然存在的锌指或TALE蛋白的识别螺旋区域的工程化(改变一个或多个氨基酸)。工程化DNA结合蛋白(锌指或TALE)是非天然存在的蛋白质。合理的设计标准包括应用取代规则和计算机化算法来处理存储现有ZFP和/或TALE设计和结合数据的信息的数据库中的信息。参见例如美国专利号6,140,081；6,453,242；和6,534,261；另见WO 98/53058；WO98/53059；WO 98/53060；WO 02/016536和WO 03/016496和美国公开号20110301073。
在一些实施方案中，位点特异性结合结构域包含一种或多种以序列特异性方式结合DNA的锌指蛋白(ZFP)或其结构域。ZFP或其结构域是通过一种或多种锌指以序列特异性方式结合DNA的较大蛋白质内的蛋白质或结构域，所述一种或多种锌指是其结构通过锌离子配位而稳定的结合结构域内的氨基酸序列区域。
在ZFP中，有靶向特定DNA序列的人工ZFP结构域，长度通常为9-18个核苷酸，由个别指组装生成。ZFP包括其中单个指结构域的长度为大约30个氨基酸并且含有α螺旋，并且具有两个、三个、四个、五个或六个指的ZFP，所述α螺旋含有两个不变的组氨酸残基，所述组氨酸残基通过锌与单个β转角的两个半胱氨酸配位。通常，ZFP的序列特异性可以通过在锌指识别螺旋上的四个螺旋位置(-1、2、3和6)处进行氨基酸取代来改变。因此，在一些实施方案中，ZFP或含有ZFP的分子是非天然存在的，例如，被工程化以与选择的靶位点结合。参见例如，Beerli等人(2002)Nature Biotechnol.20：135-141；Pabo等人(2001)Ann.Rev.Biochem.70：313-340；Isalan等人(2001)Nature Biotechnol.19：656-660；Segal等人(2001)Curr.Opin.Biotechnol.12：632-637；Choo等人(2000)Curr.Opin.Struct.Biol.10：411-416；美国公开号6,453,242；6,534,261；6,599,692；6,503,717；6,689,558；7,030,215；6,794,136；7,067,317；7,262,054；7,070,934；7,361,635；7,253,273；和美国专利公开号2005/0064474；2007/0218528；2005/0267061，所述文献通过引用整体并入本文。
许多基因特异性工程化锌指是可商购获得的。例如，Sangamo Biosciences(Richmond，CA，USA)与Sigma-Aldrich(St.Louis，MO，USA)合作开发了用于锌指构建的平台(CompoZr)，其允许研究人员绕过锌指构建与验证，并且为数千种蛋白质提供特异性靶向的锌指(Gaj等人，Trends in Biotechnology，2013，31(7)，397-405)。在一些实施方案中，使用或定制设计可商购获得的锌指。
在一些实施方案中，位点特异性结合结构域包含天然存在的或工程化的(非天然存在的)转录活化因子样蛋白(TAL)DNA结合结构域，诸如转录活化因子样蛋白效应物(TALE)蛋白中的所述结构域，参见例如美国专利公开号20110301073，其通过引用整体并入本文。
在一些实施方案中，位点特异性结合结构域来源于CRISPR/Cas系统。一般来讲，“CRISPR系统”统指参与表达CRISPR相关(“Cas”)基因或指导其活性的转录物和其他元件，包括编码Cas基因的序列、tracr(反式活化CRISPR)序列(例如，tracrRNA或活性部分tracrRNA)、tracr伴侣序列(在内源CRISPR系统的上下文中涵盖“直接重复序列”和tracrRNA加工的部分直接重复序列)、指导序列(在内源CRISPR系统的上下文中也被称为“间隔子”，或“靶向序列”)和/或来自CRISPR基因座的其他序列和转录物。
一般来讲，指导序列包括靶向结构域，所述靶向结构域包含与靶多核苷酸序列具有足够互补性以与靶序列杂交并且指导CRISPR复合物与靶序列的序列特异性结合的多核苷酸序列。在一些实施方案中，当使用合适的比对算法进行最佳比对时，指导序列与其对应靶序列之间的互补程度为约或大于约50％、60％、75％、80％、85％、90％、95％、97.5％、99％或更多。在一些实例中，gRNA的靶向结构域与靶核酸上的靶序列互补，例如至少80％、85％、90％、95％、98％或99％互补，例如完全互补。
在一些实施方案中，靶位点在靶基因的转录起始位点的上游。在一些实施方案中，靶位点与基因的转录起始位点相邻。在一些实施方案中，靶位点与基因转录起始位点下游的RNA聚合酶暂停位点相邻。
在一些实施方案中，靶向结构域被配置为靶向靶基因的启动子区域以促进转录起始、一种或多种转录增强子或活化因子和/或RNA聚合酶的结合。一种或多种gRNA可用于靶向基因的启动子区域。在一些实施方案中，可以靶向基因的一个或多个区域。在某些方面，靶位点位于基因转录起始位点(TSS)任一侧的600个碱基对内。
设计或鉴定作为或包含靶向基因的序列(包括外显子序列和调控区(包括启动子和活化因子)的序列)的gRNA序列在技术人员的水平内。用于CRISPR基因组编辑的全基因组gRNA数据库是公开可用的，其含有人类基因组或小鼠基因组中的基因的组成型外显子中的示例性单一指导RNA(sgRNA)靶序列(参见，例如，genescript.com/gRNA-database.html；另见Sanjana等人(2014)Nat.Methods，11：783-4；www.e-crisp.org/E-CRISP/；crispr.mit.edu/)。在一些实施方案中，gRNA序列是或包含与非靶基因具有最小脱靶结合的序列。
在一些实施方案中，调控因子还包含功能结构域，例如转录活化因子。
在一些实施方案中，转录活化因子是或含有一种或多种调控元件，诸如靶基因的一种或多种转录控制元件，由此识别如上文所提供的位点特异性结构域以驱动这种基因的表达。在一些实施方案中，转录活化因子驱动靶基因的表达。在一些情况下，转录活化因子可以是或含有异源反式活化结构域的全部或一部分。例如，在一些实施方案中，转录活化因子选自单纯疱疹衍生的反式活化结构域、Dnmt3a甲基转移酶结构域、p65、VP16和VP64。
在一些实施方案中，调控因子是锌指转录因子(ZF-TF)。在一些实施方案中，调控因子是VP64-p65-Rta(VPR)。
在某些实施方案中，调控因子还包含转录调控结构域。常见结构域包括，例如，转录因子结构域(活化因子、抑制因子、共活化因子、共抑制因子)、沉默子、癌基因(例如，myc、jun、fos、myb、max、mad、rel、ets、bcl、myb、mos家族成员等)；DNA修复酶及其相关因子和修饰因子；DNA重排酶及其相关因子和修饰因子；染色质相关蛋白及其修饰因子(例如，激酶、乙酰化酶和去乙酰化酶)；和DNA修饰酶(例如，甲基转移酶，诸如DNMT家族成员(例如，DNMT1、DNMT3A、DNMT3B、DNMT3L等、拓扑异构酶、解旋酶、连接酶、激酶、磷酸酶、聚合酶、核酸内切酶)及其相关因子和修饰因子。参见，例如，美国公开号2013/0253040，其通过引用整体并入本文。
用于实现活化的合适结构域包括HSV VP 16活化结构域(参见，例如，Hagmann等人，J.Virol.71，5952-5962(197))核激素受体(参见，例如，Torchia等人，Curr.Opin.Cell.Biol.10：373-383(1998))；核因子KB的p65亚基(Bitko&Bank，J.Virol.72：5610-5618(1998)和Doyle&Hunt，Neuroreport 8：2937-2942(1997))；Liu等人，Cancer Gene Ther.5：3-28(1998))或人工嵌合功能结构域，诸如VP64(Beerli等人，(1998)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 95：14623-33)、和降解决定子(Molinari等人，(1999)EMBO J.18，6439-6447)。额外的示例性活化结构域包括Oct 1、Oct-2A、Sp1、AP-2和CTF1(Seipel等人，EMBOJ.11，4961-4968(1992)以及p300、CBP、PCAF、SRC1 PvALF、AtHD2A和ERF-2。参见，例如，Robyr等人，(2000)Mol.Endocrinol.14：329-347；Collingwood等人，(1999)J.Mol.Endocrinol23∶255-275；Leo等人，(2000)Gene 245：1-11；Manteuffel-Cymborowska(1999)Acta Biochim.Pol.46∶77-89；McKenna等人，(1999)J.SteroidBiochem.Mol.Biol.69：3-12；Malik等人，(2000)Trends Biochem.Sci.25∶277-283；和Lemon等人，(1999)Curr.Opin.Genet.Dev.9：499-504。额外的示例性活化结构域包括但不限于OsGAI、HALF-1、Cl、AP1、ARF-5、-6、-1和-8、CPRF1、CPRF4、MYC-RP/GP和TRAB1，参见，例如，Ogawa等人，(2000)Gene 245：21-29；Okanami等人，(1996)Genes Cells 1：87-99；Goff等人，(1991)Genes Dev.5：298-309；Cho等人，(1999)P1ant Mol Biol40：419-429；U1mason等人，(1999)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 96：5844-5849；Sprenger-Haussels等人，(2000)Plant J.22：1-8；Gong等人，(1999)Plant Mol.Biol.41：33-44；和Hobo等人，(1999)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 96：15，348-15，353。
可用于制备遗传阻遏物的示例性阻遏结构域包括但不限于KRAB A/B、KOX、TGF-β-诱导型早期基因(TIEG)、v-erbA、SID、MBD2、MBD3、DNMT家族成员(例如，DNMT1、DNMT3A、DNMT3B、DNMT3L等)、Rb和MeCP2。参见，例如，Bird等人，(1999)Cell 99：451-454；Tyler等人，(1999)Cell 99：443-446；Knoepfler等人，(1999)Cell 99：447-450；和Robertson等人，(2000)Nature Genet.25：338-342。额外的示例性抑制结构域包括但不限于ROM2和AtHD2A。参见，例如，Chem等人，(1996)Plant Cell 8：305-321；和Wu等人，(2000)Plant J.22：19-27。
在一些情况下，所述结构域参与染色体的表观遗传调控。在一些实施方案中，所述结构域是组蛋白乙酰转移酶(HAT)，例如A型、核定位的，诸如MYST家族成员MOZ、Ybf2/Sas3、MOF和Tip60、GNAT家族成员Gcn5或pCAF、p300家族成员CBP、p300或Rttl09(Bemdsen和Denu(2008)Curr Opin Struct Biol 18(6)：682-689)。在其他情况下，所述结构域是组蛋白去乙酰化酶(HD AC)，诸如I类(HDAC-1、2、3和8)、II类(HDAC IIA(HDAC-4、5、7和9)、HD AC IIB(HDAC 6和10))、IV类(HDAC-11)、III类(也称为sirtuin(SIRT)；SIRT1-7)(参见Mottamal等人，(2015)Molecules 20(3)：3898-3941)。在一些实施方案中使用的另一个结构域是组蛋白磷酸化酶或激酶，其中实例包括MSK1、MSK2、ATR、ATM、DNA-PK、Bub1、VprBP、IKK-a、PKCpi、Dik/Zip、JAK2、PKC5、WSTF和CK2。在一些实施方案中，使用甲基化结构域并且其可以选自诸如Ezh2、PRMT1/6、PRMT5/7、PRMT 2/6、CARM1、set7/9、MLL、ALL-1、Suv 39h、G9a、SETDB1、Ezh2、Set2、Dotl、PRMT 1/6、PRMT 5/7、PR-Set7和Suv4-20h的组。参与苏木化和生物素化的结构域(Lys9、13、4、18和12)也可用于一些实施方案中(综述参见Kousarides(2007)Cell128：693-705)。
融合分子通过本领域技术人员众所周知的克隆和生化缀合方法构建。融合分子包含DNA结合结构域和功能结构域(例如，转录活化或抑制结构域)。融合分子还任选地包含核定位信号(例如，来自SV40培养基T抗原的信号)和表位标签(诸如，例如，FLAG和血凝素)。设计融合蛋白(和编码它们的核酸)，使得翻译阅读框保留在融合组分中。
一个方面的功能功能域(或其功能片段)的多肽组分与另一方面的非蛋白质DNA结合结构域(例如，抗生素、嵌入剂、小沟结合物、核酸)之间的融合体通过本领域技术人员已知的生化缀合方法来构建。参见，例如Pierce Chemical Company(Rockford，IL)目录。已经描述了用于进行小沟结合物与多肽之间的融合的方法和组合物。Mapp等人，(2000)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 97：3930-3935。同样，CRISPR/Cas TF以及包含与多肽组分功能结构域缔合的sgRNA核酸组分的核酸酶也是本领域技术人员已知的并在本文中详细描述。
在一些实施方案中，本公开提供了一种包含基因组的细胞(例如，原代T细胞和低免疫原性干细胞及其衍生物)或其群体，其中细胞基因组已被修饰以表达CD47。在一些实施方案中，本公开提供了一种用于改变细胞基因组以表达CD47的方法。在某些实施方案中，至少一种核糖核酸或至少一对核糖核酸可用于促进将CD47插入到细胞系中。在某些实施方案中，至少一种核糖核酸或至少一对核糖核酸选自由WO2016183041的表29的SEQ ID NO：200784-231885组成的组，所述文献通过引用并入本文。
在一些实施方案中，本公开提供了一种包含基因组的细胞(例如，原代T细胞和低免疫原性干细胞及其衍生物)或其群体，其中细胞基因组已被修饰以表达HLA-C。在一些实施方案中，本公开提供了一种用于改变细胞基因组以表达HLA-C的方法。在某些实施方案中，至少一种核糖核酸或至少一对核糖核酸可用于促进将HLA-C插入到细胞系中。在某些实施方案中，至少一种核糖核酸或至少一对核糖核酸选自由WO2016183041的表10的SEQ IDNO：3278-5183组成的组，所述文献通过引用并入本文。
在一些实施方案中，本公开提供了一种包含基因组的细胞(例如，原代T细胞和低免疫原性干细胞及其衍生物)或其群体，其中细胞基因组已被修饰以表达HLA-E。在一些实施方案中，本公开提供了一种用于改变细胞基因组以表达HLA-E的方法。在某些实施方案中，至少一种核糖核酸或至少一对核糖核酸可用于促进将HLA-E插入到细胞系中。在某些实施方案中，至少一种核糖核酸或至少一对核糖核酸选自由WO2016183041的表19的SEQ IDNO：189859-193183组成的组，所述文献通过引用并入本文。
在一些实施方案中，本公开提供了一种包含基因组的细胞(例如，原代T细胞和低免疫原性干细胞及其衍生物)或其群体，其中细胞基因组已被修饰以表达HLA-F。在一些实施方案中，本公开提供了一种用于改变细胞基因组以表达HLA-F的方法。在某些实施方案中，至少一种核糖核酸或至少一对核糖核酸可用于促进将HLA-F插入到细胞系中。在某些实施方案中，至少一种核糖核酸或至少一对核糖核酸选自由WO2016183041的表45的SEQ IDNO：688808-399754组成的组，所述文献通过引用并入本文。
在一些实施方案中，本公开提供了一种包含基因组的细胞(例如，原代T细胞和低免疫原性干细胞及其衍生物)或其群体，其中细胞基因组已被修饰以表达HLA-G。在一些实施方案中，本公开提供了一种用于改变细胞基因组以表达HLA-G的方法。在某些实施方案中，至少一种核糖核酸或至少一对核糖核酸可用于促进将HLA-G插入到干细胞系中。在某些实施方案中，至少一种核糖核酸或至少一对核糖核酸选自由WO2016183041的表18的SEQ IDNO：188372-189858组成的组，所述文献通过引用并入本文。
在一些实施方案中，本公开提供了一种包含基因组的细胞(例如，原代T细胞和低免疫原性干细胞及其衍生物)或其群体，其中细胞基因组已被修饰以表达PD-L1。在一些实施方案中，本公开提供了一种用于改变细胞基因组以表达PD-L1的方法。在某些实施方案中，至少一种核糖核酸或至少一对核糖核酸可用于促进将PD-L1插入到干细胞系中。在某些实施方案中，至少一种核糖核酸或至少一对核糖核酸选自由WO2016183041的表21的SEQ IDNO：193184-200783组成的组，所述文献通过引用并入本文。
在一些实施方案中，本公开提供了一种包含基因组的细胞(例如，原代T细胞和低免疫原性干细胞及其衍生物)或其群体，其中细胞基因组已被修饰以表达CTLA4-Ig。在一些实施方案中，本公开提供了一种用于改变细胞基因组以表达CTLA4-Ig的方法。在某些实施方案中，至少一种核糖核酸或至少一对核糖核酸可用于促进将CTLA4-Ig插入到干细胞系中。在某些实施方案中，至少一种核糖核酸或至少一对核糖核酸选自WO2016183041(包括序列表)中公开的任一种。
在一些实施方案中，本公开提供了一种包含基因组的细胞(例如，原代T细胞和低免疫原性干细胞及其衍生物)或其群体，其中细胞基因组已被修饰以表达CI-抑制剂。在一些实施方案中，本公开提供了一种用于改变细胞基因组以表达CI-抑制剂的方法。在某些实施方案中，至少一种核糖核酸或至少一对核糖核酸可用于促进将CI-抑制剂插入到干细胞系中。在某些实施方案中，至少一种核糖核酸或至少一对核糖核酸选自WO2016183041(包括序列表)中公开的任一种。
在一些实施方案中，本公开提供了一种包含基因组的细胞(例如，原代T细胞和低免疫原性干细胞及其衍生物)或其群体，其中细胞基因组已被修饰以表达IL-35。在一些实施方案中，本公开提供了一种用于改变细胞基因组以表达IL-35的方法。在某些实施方案中，至少一种核糖核酸或至少一对核糖核酸可用于促进将IL-35插入到干细胞系中。在某些实施方案中，至少一种核糖核酸或至少一对核糖核酸选自WO2016183041(包括序列表)中公开的任一种。
在一些实施方案中，使用表达载体在细胞中表达致耐受因子。在一些实施方案中，使用介导将致耐受因子序列整合到细胞基因组中的病毒表达载体将致耐受因子引入到细胞中。例如，用于在细胞中表达CD47的表达载体包含编码CD47的多核苷酸序列。表达载体可以是诱导型表达载体。表达载体可以是病毒载体，诸如但不限于慢病毒载体。在一些实施方案中，使用融合原介导的递送或选自由以下组成的组的转座酶系统将致耐受因子引入到细胞中：条件性或诱导型转座酶、条件性或诱导型PiggyBac转座子、条件性或诱导型睡美人(SB11)转座子、条件性或诱导型Mos1转座子和条件性或诱导型Tol2转座子。
在一些实施方案中，本公开提供了一种包含基因组的细胞(例如，原代T细胞和低免疫原性干细胞及其衍生物)或其群体，其中细胞基因组已被修饰以表达选自由以下组成的组的多肽中的任一种：HLA-A、HLA-B、HLA-C、RFX-ANK、CIITA、NFY-A、NLRC5、B2M、RFX5、RFX-AP、HLA-G、HLA-E、NFY-B、PD-L1、NFY-C、IRF1、TAP1、GITR、4-1BB、CD28、B7-1、CD47、B7-2、OX40、CD27、HVEM、SLAM、CD226、ICOS、LAG3、TIGIT、TIM3、CD160、BTLA、CD244、LFA-1、ST2、HLA-F、CD30、B7-H3、VISTA、TLT、PD-L2、CD58、CD2、HELIOS和IDO1。在一些实施方案中，本公开提供了一种用于改变细胞基因组以表达选自由以下组成的组的多肽中的任一种的方法：HLA-A、HLA-B、HLA-C、RFX-ANK、CIITA、NFY-A、NLRC5、B2M、RFX5、RFX-AP、HLA-G、HLA-E、NFY-B、PD-L1、NFY-C、IRF1、TAP1、GITR、4-1BB、CD28、B7-1、CD47、B7-2、OX40、CD27、HVEM、SLAM、CD226、ICOS、LAG3、TIGIT、TIM3、CD160、BTLA、CD244、LFA-1、ST2、HLA-F、CD30、B7-H3、VISTA、TLT、PD-L2、CD58、CD2、HELIOS和IDO1。在某些实施方案中，至少一种核糖核酸或至少一对核糖核酸可用于促进将所选多肽插入到干细胞系中。在某些实施方案中，至少一种核糖核酸或至少一对核糖核酸选自WO2016183041的附录1-47和序列表中公开的任一种，所述公开内容通过引用并入本文。
在一些实施方案中，使用合适的基因编辑系统(例如，CRISPR/Cas系统或本文所述的任何基因编辑系统)来促进将编码致耐受因子的多核苷酸插入到低免疫原性细胞的基因组基因座中。在一些情况下，将编码致耐受因子的多核苷酸插入到安全港或靶标基因座中，诸如但不限于AAVS1、CCR5、CLYBL、ROSA26、SHS231、F3(CD142)、MICA、MICB、LRP1(CD91)、HMGB1、ABO、RHD、FUT1或KDM5D基因座。在一些实施方案中，将编码致耐受因子的多核苷酸插入到B2M基因座、CIITA基因座、TRAC基因座或TRB基因座中。在一些实施方案中，将编码致耐受因子的多核苷酸插入到本文提供的表15中描绘的基因座中的任一个中。在某些实施方案中，编码致耐受因子的多核苷酸可操作地连接至启动子。
在一些实施方案中，细胞被工程化以相对于不包含修饰的相同细胞类型的细胞表达增加量的以下中的一种或多种：CD47、DUX4、CD24、CD27、CD35、CD46、CD55、CD59、CD200、HLA-C、HLA-E、HLA-E重链、HLA-G、PD-L1、IDO1、CTLA4-Ig、C1-抑制剂、IL-10、IL-35、FasL、CCL21、CCL22、Mfge8、CD16、CD52、H2-M3、CD16Fc受体、IL15-RF和/或Serpinb9。
N.嵌合抗原受体
本文提供了包含嵌合抗原受体(CAR)的低免疫原性细胞。在一些实施方案中，CAR与CD19结合。在一些实施方案中，CAR与CD22结合。在一些实施方案中，CAR与CD19结合。在一些实施方案中，CAR与CD19和CD22结合。在一些实施方案中，CAR选自由第一代CAR、第二代CAR、第三代CAR和第四代CAR组成的组。在一些实施方案中，CAR包括与单一靶抗原结合的单一结合结构域。在一些实施方案中，CAR包括与多于一种靶抗原(例如，2、3或更多种靶抗原)结合的单一结合结构域。在一些实施方案中，CAR包括两个结合结构域，使得每个结合结构域与不同的靶抗原结合。在一些实施方案中，CAR包括两个结合结构域，使得每个结合结构域与相同的靶抗原结合。包括CD19特异性、CD22特异性和CD19/CD22双特异性CAR的示例性CAR的详细描述可见于WO2012/079000、WO2016/149578和WO2020/014482，包括序列表和图片的公开内容通过引用整体并入本文。
在一些实施方案中，CD19特异性CAR包括抗CD19单链抗体片段(scFv)、跨膜结构域诸如来源于人CD8α的跨膜结构域、4-1BB(CD137)共刺激信号传导结构域和CD3ζ信号传导结构域。在一些实施方案中，CD22特异性CAR包括抗CD22 scFv、跨膜结构域诸如来源于人CD8α的跨膜结构域、4-1BB(CD137)共刺激信号传导结构域和CD3ζ信号传导结构域。在一些实施方案中，CD19/CD22双特异性CAR包括抗CD19 scFv、抗CD22 scFv、跨膜结构域诸如来源于人CD8α的跨膜结构域、4-1BB(CD137)共刺激信号传导结构域和CD3ζ信号传导结构域。
在一些实施方案中，CAR包含由T细胞携带的商业CAR构建体。基于商业CAR-T细胞的疗法的非限制性实例包括brexucabtagene autoleucelaxicabtageneciloleucel/>idecabtagene vicleucel/>lisocabtagenemaraleucel/>tisagenlecleucel/>来自CartesianTherapeutics的Descartes-08和Descartes-11、来自Novartis的CTL110、来自PoseidaTherapeutics的P-BMCA-101、来自Autolus Limited的AUTO4、来自Cellectis的UCARTCS、来自Precision Biosciences的PBCAR19B和PBCAR269A、来自Fate Therapeutics的FT819以及来自Clyad Oncology的CYAD-211。
在一些实施方案中，本文所述的低免疫原性细胞包含多核苷酸，所述多核苷酸编码包含抗原结合结构域的嵌合抗原受体(CAR)。在一些实施方案中，本文所述的低免疫原性细胞包含有包含抗原结合结构域的嵌合抗原受体(CAR)。在一些实施方案中，多核苷酸是或包含有包含抗原结合结构域的嵌合抗原受体(CAR)。在一些实施方案中，CAR是或包含有包含抗原结合结构域、跨膜结构域和至少一个信号传导结构域(例如，一个、两个或三个信号传导结构域)的第一代CAR。在一些实施方案中，CAR包含有包含抗原结合结构域、跨膜结构域和至少两个信号传导结构域的第二代CAR。在一些实施方案中，CAR包含有包含抗原结合结构域、跨膜结构域和至少三个信号传导结构域的第三代CAR。在一些实施方案中，第四代CAR包含抗原结合结构域、跨膜结构域、三个或四个信号传导结构域和在CAR的成功信号传导后诱导细胞因子基因表达的结构域。在一些实施方案中，抗原结合结构域是或包含抗体、抗体片段、scFv或Fab。
1.抗原结合结构域(ABD)靶向肿瘤或癌细胞所特有的抗原。
在一些实施方案中，抗原结合结构域(ABD)靶向肿瘤细胞所特有的抗原。换句话说，抗原结合结构域靶向被肿瘤或癌细胞表达的抗原。在一些实施方案中，ABD结合肿瘤相关抗原。在一些实施方案中，肿瘤细胞所特有的抗原(例如，与肿瘤或癌细胞相关的抗原)或肿瘤相关抗原选自细胞表面受体、离子通道相关受体、酶联受体、G蛋白偶联受体、受体酪氨酸激酶、酪氨酸激酶相关受体、受体样酪氨酸磷酸酶、受体丝氨酸/苏氨酸激酶、受体鸟苷酸环化酶、组氨酸激酶相关受体、表皮生长因子受体(EGFR)(包括ErbB1/EGFR、ErbB2/HER2、ErbB3/HER3和ErbB4/HER4)、成纤维细胞生长因子受体(FGFR)(包括FGF1、FGF2、FGF3、FGF4、FGF5、FGF6、FGF7、FGF18和FGF21)、血管内皮生长因子受体(VEGFR)(包括VEGF-A、VEGF-B、VEGF-C、VEGF-D和PIGF)、RET受体和Eph受体家族(包括EphA1、EphA2、EphA3、EphA4、EphA5、EphA6、EphA7、EphA8、EphA9、EphA10、EphB1、EphB2、EphB3、EphB4和EphB6)、CXCR1、CXCR2、CXCR3、CXCR4、CXCR6、CCR1、CCR2、CCR3、CCR4、CCR5、CCR6、CCR8、CFTR、CIC-1、CIC-2、CIC-4、CIC-5、CIC-7、CIC-Ka、CIC-Kb、Bestrophin、TMEM16A、GABA受体、甘氨酸受体、ABC转运蛋白、NAV1.1、NAV1.2、NAV1.3、NAV1.4、NAV1.5、NAV1.6、NAV1.7、NAV1.8、NAV1.9、1-磷酸鞘氨醇受体(S1P1R)、NMDA通道、跨膜蛋白、多跨膜蛋白、T细胞受体基序、T细胞α链、T细胞β链、T细胞γ链、T细胞δ链、CCR7、CD3、CD4、CD5、CD7、CD8、CD11b、CD11c、CD16、CD19、CD20、CD21、CD22、CD25、CD28、CD34、CD35、CD40、CD45RA、CD45RO、CD52、CD56、CD62L、CD68、CD80、CD95、CD117、CD127、CD133、CD137(4-1BB)、CD163、F4/80、IL-4Ra、Sca-1、CTLA-4、GITR、GARP、LAP、颗粒酶B、LFA-1、转铁蛋白受体、NKp46、穿孔素、CD4+、Th1、Th2、Th17、Th40、Th22、Th9、Tfh、典型Treg、FoxP3+、Tr1、Th3、Treg17、TREG；CDCP、NT5E、EpCAM、CEA、gpA33、粘蛋白、TAG-72、碳酸酐酶IX、PSMA、叶酸结合蛋白、神经节苷脂(例如，CD2、CD3、GM2)、Lewis-γ2、VEGF、VEGFR 1/2/3、αVβ3、α5β1、ErbB1/EGFR、ErbB1/HER2、ErB3、c-MET、IGF1R、EphA3、TRAIL-R1、TRAIL-R2、RANKL、FAP、腱生蛋白、PDL-1、BAFF、HDAC、ABL、FLT3、KIT、MET、RET、IL-1β、ALK、RANKL、mTOR、CTLA-4、IL-6、IL-6R、JAK3、BRAF、PTCH、Smoothened、PIGF、ANPEP、TIMP1、PLAUR、PTPRJ、LTBR、ANTXR1、叶酸受体α(FRa)、ERBB2(Her2/neu)、EphA2、IL-13Ra2、表皮生长因子受体(EGFR)、间皮素、TSHR、CD19、CD123、CD22、CD30、CD171、CS-1、CLL-1、CD33、EGFRvIII、GD2、GD3、BCMA、MUC16(CA125)、L1CAM、LeY、MSLN、IL13Rα1、L1-CAM、Tn Ag、前列腺特异性膜抗原(PSMA)、ROR1、FLT3、FAP、TAG72、CD38、CD44v6、CEA、EPCAM、B7H3、KIT、白介素-11受体a(IL-11Ra)、PSCA、PRSS21、VEGFR2、LewisY、CD24、血小板衍生生长因子-β(PDGFR-β)、SSEA-4、CD20、MUC1、NCAM、Prostase、PAP、ELF2M、Ephrin B2、IGF-1受体、CAIX、LMP2、gP100、bcr-ab1、酪氨酸酶、岩藻糖基GM1、sLe、GM3、TGS5、HMWMAA、o-乙酰基-GD2、叶酸受体β、TEM1/CD248、TEM7R、CLDN6、GPRC5D、CXORF61、CD97、CD179a、ALK、多唾液酸、PLACl、G1oboH、NY-BR-1、UPK2、HAVCR1、ADRB3、PANX3、GPR20、LY6K、OR51E2、TARP、WT1、NY-ESO-1、LAGE-1a、MAGE-A1、1egumain、HPV E6、E7、ETV6-AML、精子蛋白17、XAGE1、Tie 2、MAD-CT-1、MAD-CT-2、主要组织相容性I类相关基因蛋白(MR1)、尿激酶型纤溶酶原活化因子受体(uPAR)、Fos相关抗原1、p53、p53突变体、prostein、生存素、端粒酶、PCTA-1/半乳糖凝集素8、MelanA/MART1、Ras突变体、hTERT、肉瘤易位断裂点、ML-IAP、ERG(TMPRSS2 ETS融合基因)、NA17、PAX3、雄激素受体、细胞周期素B1、MYCN、RhoC、TRP-2、CYPIB I、BORIS、SART3、PAX5、OY-TES1、LCK、AKAP-4、SSX2、RAGE-1、人端粒酶逆转录酶、RU1、RU2、肠羧基酯酶、muthsp70-2、CD79a、CD79b、CD72、LAIR1、FCAR、LILRA2、CD300LF、CLEC12A、BST2、EMR2、LY75、GPC3、FCRL5、IGLL1、新抗原、CD133、CD15、CD184、CD24、CD56、CD26、CD29、CD44、HLA-A、HLA-B、HLA-C、(HLA-A、B、C)CD49f、CD151 CD340、CD200、tkrA、trkB或trkC或其抗原片段或抗原部分。
2.ABD靶向T细胞所特有的抗原
在一些实施方案中，抗原结合结构域靶向T细胞所特有的抗原。在一些实施方案中，ABD结合与T细胞相关的抗原。在一些情况下，这种抗原由T细胞表达或者位于T细胞的表面上。在一些实施方案中，T细胞所特有的抗原或T细胞相关抗原选自T细胞所特有的细胞表面受体、膜转运蛋白(例如，主动或被动转运蛋白，诸如例如离子通道蛋白、成孔蛋白等)、跨膜受体、膜酶和/或细胞粘附蛋白。在一些实施方案中，T细胞所特有的抗原可以是G蛋白偶联受体、受体酪氨酸激酶、酪氨酸激酶相关受体、受体样酪氨酸磷酸酶、受体丝氨酸/苏氨酸激酶、受体鸟苷酸环化酶、组氨酸激酶相关受体、AKT1、AKT2、AKT3、ATF2、BCL10、CALM1、CD3D(CD3δ)、CD3E(CD3ε)、CD3G(CD3γ)、CD4、CD8、CD28、CD45、CD80(B7-1)、CD86(B7-2)、CD247(CD3ζ)、CTLA-4(CD152)、ELK1、ERK1(MAPK3)、ERK2、FOS、FYN、GRAP2(GADS)、GRB2、HLA-DRA、HLA-DRB1、HLA-DRB3、HLA-DRB4、HLA-DRB5、HRAS、IKBKA(CHUK)、IKBKB、IKBKE、IKBKG(NEMO)、IL2、ITPR1、ITK、JUN、KRAS2、LAT、LCK、MAP2K1(MEK1)、MAP2K2(MEK2)、MAP2K3(MKK3)、MAP2K4(MKK4)、MAP2K6(MKK6)、MAP2K7(MKK7)、MAP3K1(MEKK1)、MAP3K3、MAP3K4、MAP3K5、MAP3K8、MAP3K14(NIK)、MAPK8(JNK1)、MAPK9(JNK2)、MAPK10(JNK3)、MAPK11(p38β)、MAPK12(p38γ)、MAPK13(p38δ)、MAPK14(p38α)、NCK、NFAT1、NFAT2、NFKB1、NFKB2、NFKBIA、NRAS、PAK1、PAK2、PAK3、PAK4、PIK3C2B、PIK3C3(VPS34)、PIK3CA、PIK3CB、PIK3CD、PIK3R1、PKCA、PKCB、PKCM、PKCQ、PLCY1、PRF1(穿孔素)、PTEN、RAC1、RAF1、RELA、SDF1、SHP2、SLP76、SOS、SRC、TBK1、TCRA、TEC、TRAF6、VAV1、VAV2或ZAP70。
3.ABD靶向自身免疫性或炎性病症所特有的抗原
在一些实施方案中，抗原结合结构域靶向自身免疫性或炎性病症所特有的抗原。在一些实施方案中，ABD结合与自身免疫性或炎性病症相关的抗原。在一些情况下，抗原由与自身免疫性或炎性病症相关的细胞表达。在一些实施方案中，自身免疫性或炎性病症选自慢性移植物抗宿主病(GVHD)、狼疮、关节炎、免疫复合物肾小球肾炎、古德巴斯捷氏综合征(goodpasture syndrome)、葡萄膜炎、肝炎、系统性硬化症或硬皮病、I型糖尿病、多发性硬化症、冷凝集素病、寻常性天疱疮(Pemphigus vulgaris)、格雷夫斯病、自身免疫性溶血性贫血、A型血友病、原发性干燥综合征(Primary Sjogren′s Syndrome)、血栓性血小板减少性紫癜、视神经脊髓炎、埃文斯综合征(Evan′s syndrome)、IgM介导的神经病变、冷球蛋白血症、皮肌炎、特发性血小板减少症、强直性脊柱炎、大疱性类天疱疮、获得性血管性水肿、慢性荨麻疹、抗磷脂脱髓鞘性多发性神经病变(antiphospholipid demyelinatingpolyneuropathy)和自身免疫性血小板减少症或中性粒细胞减少症或纯红细胞再生障碍，而同种免疫疾病的示例性非限制性实例包括来自造血或实体器官移植、输血的同种致敏作用(参见，例如Blazar等人，2015，Am.J.Transplant，15(4)：931-41)或异种致敏作用、孕期胎儿同种致敏作用、新生儿同种免疫性血小板减少症、新生儿溶血性疾病、对外来抗原的致敏作用，诸如可在用酶或蛋白质替换疗法、血液制品和基因疗法治疗的遗传性或获得性缺陷病症的替换下发生。在一些实施方案中，自身免疫性或炎性病症所特有的抗原选自细胞表面受体、离子通道相关受体、酶联受体、G蛋白偶联受体、受体酪氨酸激酶、酪氨酸激酶相关受体、受体样酪氨酸磷酸酶、受体丝氨酸/苏氨酸激酶、受体鸟苷酸环化酶或组氨酸激酶相关受体。
在一些实施方案中，CAR的抗原结合结构域与在B细胞、浆细胞或浆母细胞上表达的配体结合。在一些实施方案中，CAR的抗原结合结构域与CD10、CD19、CD20、CD22、CD24、CD27、CD38、CD45R、CD138、CD319、BCMA、CD28、TNF、干扰素受体、GM-CSF、ZAP-70、LFA-1、CD3γ、CD5或CD2结合。参见，例如，US 2003/0077249；WO 2017/058753；WO 2017/058850，其内容通过引用并入本文。
4.ABD靶向衰老细胞所特有的抗原
在一些实施方案中，抗原结合结构域靶向衰老细胞所特有的抗原，例如尿激酶型纤溶酶原活化因子受体(uPAR)。在一些实施方案中，ABD结合与衰老细胞相关的抗原。在一些情况下，抗原由衰老细胞表达。在一些实施方案中，CAR可用于治疗或预防以衰老细胞的异常积累为特征的病症，例如，肝和肺纤维化、动脉粥样硬化、糖尿病和骨关节炎。
5.ABD靶向感染性疾病所特有的抗原
在一些实施方案中，抗原结合结构域靶向感染性疾病所特有的抗原。在一些实施方案中，ABD结合与感染性疾病相关的抗原。在一些情况下，抗原由受感染性疾病影响的细胞表达。在一些实施方案中，其中感染性疾病选自HIV、乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、人疱疹病毒、人疱疹病毒8(HHV-8、卡波西肉瘤相关疱疹病毒(Kaposi sarcoma-associatedherpes virus，KSHV))、人嗜T淋巴细胞病毒1(HTLV-1)、默克尔细胞多瘤病毒(Merkel cellpolyomavirus，MCV)、猿猴病毒40(SV40)、爱泼斯坦巴尔病毒(Epstein-Barr virus)、CMV、人乳头瘤病毒。在一些实施方案中，感染性疾病所特有的抗原选自细胞表面受体、离子通道相关受体、酶联受体、G蛋白偶联受体、受体酪氨酸激酶、酪氨酸激酶相关受体、受体样酪氨酸磷酸酶、受体丝氨酸/苏氨酸激酶、受体鸟苷酸环化酶或组氨酸激酶相关受体、HIV Env、gpl20或HIV-1Env上的CD4诱导的表位。
6.ABD与细胞的细胞表面抗原结合
在一些实施方案中，抗原结合结构域与细胞的细胞表面抗原结合。在一些实施方案中，细胞表面抗原是特殊或特定的细胞类型所特有的(例如，由其表达)。在一些实施方案中，细胞表面抗原是多于一种类型的细胞所特有的。
在一些实施方案中，CAR抗原结合结构域与T细胞所特有的细胞表面抗原(诸如T细胞上的细胞表面抗原)结合。在一些实施方案中，T细胞所特有的抗原可以是T细胞所特有的细胞表面受体、膜转运蛋白(例如，主动或被动转运蛋白，诸如例如离子通道蛋白、成孔蛋白等)、跨膜受体、膜酶和/或细胞粘附蛋白。在一些实施方案中，T细胞所特有的抗原可以是G蛋白偶联受体、受体酪氨酸激酶、酪氨酸激酶相关受体、受体样酪氨酸磷酸酶、受体丝氨酸/苏氨酸激酶、受体鸟苷酸环化酶或组氨酸激酶相关受体。
在一些实施方案中，CAR的抗原结合结构域与T细胞受体结合。在一些实施方案中，T细胞受体可以是AKT1、AKT2、AKT3、ATF2、BCL10、CALM1、CD3D(CD3δ)、CD3E(CD3ε)、CD3G(CD3γ)、CD4、CD8、CD28、CD45、CD80(B7-1)、CD86(B7-2)、CD247(CD3ζ)、CTLA-4(CD152)、ELK1、ERK1(MAPK3)、ERK2、FOS、FYN、GRAP2(GADS)、GRB2、HLA-DRA、HLA-DRB1、HLA-DRB3、HLA-DRB4、HLA-DRB5、HRAS、IKBKA(CHUK)、IKBKB、IKBKE、IKBKG(NEMO)、IL2、ITPR1、ITK、JUN、KRAS2、LAT、LCK、MAP2K1(MEK1)、MAP2K2(MEK2)、MAP2K3(MKK3)、MAP2K4(MKK4)、MAP2K6(MKK6)、MAP2K7(MKK7)、MAP3K1(MEKK1)、MAP3K3、MAP3K4、MAP3K5、MAP3K8、MAP3K14(NIK)、MAPK8(JNK1)、MAPK9(JNK2)、MAPK10(JNK3)、MAPK11(p38β)、MAPK12(p38γ)、MAPK13(p38δ)、MAPK14(p38α)、NCK、NFAT1、NFAT2、NFKB1、NFKB2、NFKBIA、NRAS、PAK1、PAK2、PAK3、PAK4、PIK3C2B、PIK3C3(VPS34)、PIK3CA、PIK3CB、PIK3CD、PIK3R1、PKCA、PKCB、PKCM、PKCQ、PLCY1、PRF1(穿孔素)、PTEN、RAC1、RAF1、RELA、SDF1、SHP2、SLP76、SOS、SRC、TBK1、TCRA、TEC、TRAF6、VAV1、VAV2或ZAP70。
7.跨膜结构域
在一些实施方案中，CAR跨膜结构域包含以下的至少一个跨膜区：T细胞受体的α、β或ζ链、CD28、CD3ε、CD45、CD4、CD5、CD8、CD9、CD16、CD22、CD33、CD37、CD64、CD80、CD86、CD134、CD137、CD154或其功能变体。在一些实施方案中，所述跨膜结构域包含以下的至少一个跨膜区：CD8α、CD8β、4-1BB/CD137、CD28、CD34、CD4、FcεRIγ、CD16、OX40/CD134、CD3ζ、CD3ε、CD3γ、CD3δ、TCRα、TCRβ、TCRζ、CD32、CD64、CD64、CD45、CD5、CD9、CD22、CD37、CD80、CD86、CD40、CD40L/CD154、VEGFR2、FAS和FGFR2B或其功能变体。
8.信号传导结构域或多个信号传导结构域
在一些实施方案中，本文所述的CAR包含选自以下中的一种或多种的一个或至少一个信号传导结构域：B7-1/CD80；B7-2/CD86；B7-H1/PD-L 1；B7-H2；B7-H3；B7-H4；B7-H6；B7-H7；BTLA/CD272；CD28；CTLA-4；Gi24/VISTA/B7-H5；ICOS/CD278；PD-1；PD-L2/B7-DC；PDCD6)；4-1BB/TNFSF9/CD137；4-1BB配体/TNFSF9；BAFF/BLyS/TNFSF13B；BAFF R/TNFRSF13C；CD27/TNFRSF7；CD27配体/TNFSF7；CD30/TNFRSF8；CD30配体/TNFSF8；CD40/TNFRSF5；CD40/TNFSF5；CD40配体/TNFSF5；DR3/TNFRSF25；GITR/TNFRSF 18；GITR配体/TNFSF 18；HVEM/TNFRSF 14；LIGHT/TNFSF14；淋巴毒素-α/TNF-β；OX40/TNFRSF4；OX40配体/TNFSF4；RELT/TNFRSF19L；TACI/TNFRSF13B；TL1A/TNFSF15；TNF-α；TNF RII/TNFRSF 1B)；2B4/CD244/SLAMF4；BLAME/SLAMF8；CD2；CD2F-10/SLAMF9；CD48/SLAMF2；CD58/LFA-3；CD84/SLAMF5；CD229/SLAMF3；CRACC/SLAMF7；NTB-A/SLAMF6；SLAM/CD150)；CD2；CD7；CD53；CD82/Kai-1；CD90/Thy1；CD96；CD160；CD200；CD300a/LMIR1；HLA I类；HLA-DR；Ikaros；整联蛋白α4/CD49d；整联蛋白α4β1；整联蛋白α4β7/LPAM-1；LAG-3；TCL1A；TCL1B；CRTAM；DAP12；Dectin-1/CLEC7A；DPPIV/CD26；EphB6；TIM-1/KIM-1/HAVCR；TIM-4；TSLP；TSLP R；淋巴细胞功能相关抗原1(LFA-1)；NKG2C、CD3ζ结构域、基于免疫受体酪氨酸的活化基序(ITAM)、CD27、CD28、4-1BB、CD134/OX40、CD30、CD40、PD-1、ICOS、淋巴细胞功能相关抗原1(LFA-1)、CD2、CD7、LIGHT、NKG2C、B7-H3、特异性地结合CD83的配体、或其功能片段。
在一些实施方案中，至少一个信号传导结构域包含CD3ζ结构域或基于免疫受体酪氨酸的活化基序(ITAM)或其功能变体。在其他实施方案中，至少一个信号传导结构域包含(i)CD3ζ结构域或基于免疫受体酪氨酸的活化基序(ITAM)或其功能变体；和(ii)CD28结构域或4-1BB结构域或其功能变体。在又其他实施方案中，至少一个信号传导结构域包含(i)CD3ζ结构域或基于免疫受体酪氨酸的活化基序(ITAM)或其功能变体；(ii)CD28结构域或其功能变体；和(iii)4-1BB结构域或CD134结构域或其功能变体。在一些实施方案中，至少一个信号传导结构域包含(i)CD3ζ结构域或基于免疫受体酪氨酸的活化基序(ITAM)或其功能变体；(ii)CD28结构域或其功能变体；(iii)4-1BB结构域或CD134结构域或其功能变体；和(iv)细胞因子或共刺激配体转基因。
在一些实施方案中，至少两个信号传导结构域包含CD3ζ结构域或基于免疫受体酪氨酸的活化基序(ITAM)或其功能变体。在其他实施方案中，至少两个信号传导结构域包含(i)CD3ζ结构域或基于免疫受体酪氨酸的活化基序(ITAM)或其功能变体；和(ii)CD28结构域或4-1BB结构域或其功能变体。在又其他实施方案中，至少一个信号传导结构域包含(i)CD3ζ结构域或基于免疫受体酪氨酸的活化基序(ITAM)或其功能变体；(ii)CD28结构域或其功能变体；和(iii)4-1BB结构域或CD134结构域或其功能变体。在一些实施方案中，至少两个信号传导结构域包含(i)CD3ζ结构域或基于免疫受体酪氨酸的活化基序(ITAM)或其功能变体；(ii)CD28结构域或其功能变体；(iii)4-1BB结构域或CD134结构域或其功能变体；和(iv)细胞因子或共刺激配体转基因。
在一些实施方案中，至少三个信号传导结构域包含CD3ζ结构域或基于免疫受体酪氨酸的活化基序(ITAM)或其功能变体。在其他实施方案中，至少三个信号传导结构域包含(i)CD3ζ结构域或基于免疫受体酪氨酸的活化基序(ITAM)或其功能变体；和(ii)CD28结构域或4-1BB结构域或其功能变体。在又其他实施方案中，至少三个信号传导结构域包含(i)CD3ζ结构域或基于免疫受体酪氨酸的活化基序(ITAM)或其功能变体；(ii)CD28结构域或其功能变体；和(iii)4-1BB结构域或CD134结构域或其功能变体。在一些实施方案中，至少三个信号传导结构域包含(i)CD3ζ结构域或基于免疫受体酪氨酸的活化基序(ITAM)或其功能变体；(ii)CD28结构域或其功能变体；(iii)4-1BB结构域或CD134结构域或其功能变体；和(iv)细胞因子或共刺激配体转基因。
在一些实施方案中，CAR包含CD3ζ结构域或基于免疫受体酪氨酸的活化基序(ITAM)或其功能变体。在一些实施方案中，CAR包含(i)CD3ζ结构域或基于免疫受体酪氨酸的活化基序(ITAM)或其功能变体；和(ii)CD28结构域或4-1BB结构域或其功能变体。
在一些实施方案中，CAR包含(i)CD3ζ结构域或基于免疫受体酪氨酸的活化基序(ITAM)或其功能变体；(ii)CD28结构域或其功能变体；和(iii)4-1BB结构域或CD134结构域或其功能变体。
在一些实施方案中，CAR包含(i)CD3ζ结构域或基于免疫受体酪氨酸的活化基序(ITAM)或其功能变体；(ii)CD28结构域或4-1BB结构域或其功能变体，和/或(iii)4-1BB结构域或CD134结构域或其功能变体。
在一些实施方案中，CAR包含(i)CD3ζ结构域或基于免疫受体酪氨酸的活化基序(ITAM)或其功能变体；(ii)CD28结构域或其功能变体；(iii)4-1BB结构域或CD134结构域或其功能变体；和(iv)细胞因子或共刺激配体转基因。
9.在CAR的成功信号传导后诱导细胞因子基因表达的结构域
在一些实施方案中，第一、第二、第三或第四代CAR还包含在CAR的成功信号传导后诱导细胞因子基因表达的结构域。在一些实施方案中，细胞因子基因对于包含CAR的靶细胞是内源的或外源的，所述CAR包含在CAR的成功信号传导后诱导细胞因子基因表达的结构域。在一些实施方案中，细胞因子基因编码促炎细胞因子。在一些实施方案中，细胞因子基因编码IL-1、IL-2、IL-9、IL-12、IL-18、TNF或IFN-γ或其功能片段。在一些实施方案中，在CAR的成功信号传导后诱导细胞因子基因表达的结构域是或包含转录因子或其功能结构域或片段。在一些实施方案中，在CAR的成功信号传导后诱导细胞因子基因表达的结构域是或包含转录因子或其功能结构域或片段。在一些实施方案中，转录因子或其功能结构域或片段是或包含活化T细胞的核因子(NFAT)、NF-kB或其功能结构域或片段。参见，例如，Zhang.C.等人，Engineering CAR-T cells.Biomarker Research.5：22(2017)；WO2016126608；Sha，H.等人Chimaeric antigen receptor T-cell therapy for tumourimmunotherapy.Bioscience Reports Jan 27，2017，37(1)。
在一些实施方案中，CAR还包含一个或多个间隔子，例如，其中所述间隔子是抗原结合结构域与跨膜结构域之间的第一间隔子。在一些实施方案中，第一间隔子包括免疫球蛋白恒定区的至少一部分或其变体或修饰版本。在一些实施方案中，间隔子是跨膜结构域与信号传导结构域之间的第二间隔子。在一些实施方案中，第二间隔子是寡肽，例如，其中所述寡肽包含甘氨酸和丝氨酸残基，诸如但不限于甘氨酸-丝氨酸双联体。在一些实施方案中，CAR包含两个或更多个间隔子，例如，抗原结合结构域与跨膜结构域之间的间隔子以及跨膜结构域和信号传导结构域之间的间隔子。
在一些实施方案中，本文所述的细胞中的任一种包含编码CAR或第一代CAR的核酸。在一些实施方案中，第一代CAR包含抗原结合结构域、跨膜结构域和信号传导结构域。在一些实施方案中，信号传导结构域在T细胞活化期间介导下游信号传导。
在一些实施方案中，本文所述的细胞中的任一种包含编码CAR或第二代CAR的核酸。在一些实施方案中，第二代CAR包含抗原结合结构域、跨膜结构域和两个信号传导结构域。在一些实施方案中，信号传导结构域在T细胞活化期间介导下游信号传导。在一些实施方案中，信号传导结构域是共刺激结构域。在一些实施方案中，共刺激结构域在T细胞活化期间增强细胞因子产生、CAR-T细胞增殖和/或CAR-T细胞持久性。
在一些实施方案中，本文所述的细胞中的任一种包含编码CAR或第三代CAR的核酸。在一些实施方案中，第三代CAR包含抗原结合结构域、跨膜结构域和至少三个信号传导结构域。在一些实施方案中，信号传导结构域在T细胞活化期间介导下游信号传导。在一些实施方案中，信号传导结构域是共刺激结构域。在一些实施方案中，共刺激结构域在T细胞活化期间增强细胞因子产生、CAR-T细胞增殖和或CAR-T细胞持久性。在一些实施方案中，第三代CAR包含至少两个共刺激结构域。在一些实施方案中，至少两个共刺激结构域不相同。
在一些实施方案中，本文所述的细胞中的任一种包含编码CAR或第四代CAR的核酸。在一些实施方案中，第四代CAR包含抗原结合结构域、跨膜结构域和至少两个、三个或四个信号传导结构域。在一些实施方案中，信号传导结构域在T细胞活化期间介导下游信号传导。在一些实施方案中，信号传导结构域是共刺激结构域。在一些实施方案中，共刺激结构域在T细胞活化期间增强细胞因子产生、CAR-T细胞增殖和或CAR-T细胞持久性。
10.包含抗体或其抗原结合部分的ABD
在一些实施方案中，CAR抗原结合结构域是或包含抗体或其抗原结合部分。在一些实施方案中，CAR抗原结合结构域是或包含scFv或Fab。在一些实施方案中，CAR抗原结合结构域包含以下的scFv或Fab片段：CD19抗体；CD22抗体；T细胞α链抗体；T细胞β链抗体；T细胞γ链抗体；T细胞δ链抗体；CCR7抗体；CD3抗体；CD4抗体；CD5抗体；CD7抗体；CD8抗体；CD11b抗体；CD11c抗体；CD16抗体；CD20抗体；CD21抗体；CD25抗体；CD28抗体；CD34抗体；CD35抗体；CD40抗体；CD45RA抗体；CD45RO抗体；CD52抗体；CD56抗体；CD62L抗体；CD68抗体；CD80抗体；CD95抗体；CD117抗体；CD127抗体；CD133抗体；CD137(4-1BB)抗体；CD163抗体；F4/80抗体；IL-4Ra抗体；Sca-1抗体；CTLA-4抗体；GITR抗体GARP抗体；LAP抗体；颗粒酶B抗体；LFA-1抗体；MR1抗体；uPAR抗体；或转铁蛋白受体抗体。
在一些实施方案中，CAR包含作为共刺激结构域的信号传导结构域。在一些实施方案中，CAR包含第二共刺激结构域。在一些实施方案中，CAR包含至少两个共刺激结构域。在一些实施方案中，CAR包含至少三个共刺激结构域。在一些实施方案中，CAR包含共刺激结构域，所述共刺激结构域选自以下中的一种或多种：CD27、CD28、4-1BB、CD134/OX40、CD30、CD40、PD-1、ICOS、淋巴细胞功能相关抗原1(LFA-1)、CD2、CD7、LIGHT、NKG2C、B7-H3、特异性结合CD83的配体。在一些实施方案中，当CAR包含两个或更多个共刺激结构域时，两个共刺激结构域不同。在一些实施方案中，当CAR包含两个或更多个共刺激结构域时，两个共刺激结构域相同。
除了本文所述的CAR之外，各种嵌合抗原受体和编码其的核苷酸序列是本领域已知的，并且将适合于如本文所述在体内和体外融合体递送和重编程靶细胞。参见，例如，WO2013040557；WO2012079000；WO2016030414；Smith T等人，NatureNanotechnology.2017.DOI：10.1038/NNANO.2017.57，其公开内容通过引用并入本文。
11.CAR的额外说明
在某些实施方案中，细胞可包含编码CAR的外源多核苷酸。CAR(也称为嵌合免疫受体、嵌合T细胞受体或人工T细胞受体)是已经被工程化以给予宿主细胞(例如，T细胞)靶向特定蛋白质的新能力的受体蛋白。所述受体是嵌合的，因为它们将抗原结合和T细胞活化功能组合到单个受体中。本公开的多顺反子载体可用于在宿主细胞(例如，T细胞)中表达一种或多种CAR以用于针对各种靶抗原的基于细胞的疗法。由一个或多个表达盒表达的CAR可以相同或不同。在这些实施方案中，CAR可包含特异性结合靶抗原的细胞外结合结构域(也称为“结合物”)、跨膜结构域和细胞内信号传导结构域。在某些实施方案中，CAR还可包含一种或多种额外的元件，包括一种或多种信号肽、一种或多种细胞外铰链结构域和/或一种或多种细胞内共刺激结构域。结构域可以彼此直接相邻，或者可以存在连接所述结构域的一个或多个氨基酸。编码CAR的核苷酸序列可来源于哺乳动物序列，例如小鼠序列、灵长类动物序列、人序列或其组合。在编码CAR的核苷酸序列是非人类的情况下，CAR的序列可以是人源化的。编码CAR的核苷酸序列也可以是密码子优化的以在哺乳动物细胞(例如人细胞)中表达。在这些实施方案的任一个中，编码CAR的核苷酸序列可以与本文公开的核苷酸序列具有至少80％同一性(例如，至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性)。序列变异可能是由于密码子优化、人源化、基于限制酶的克隆疤痕和/或连接功能结构域的额外氨基酸残基等。
在某些实施方案中，CAR可在N末端包含信号肽。信号肽的非限制性实例包括CD8α信号肽、IgK信号肽和粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子受体亚基α(GMCSFR-α，也称为集落刺激因子2受体亚基α(CSF2RA))信号肽及其变体，所述信号肽的氨基酸序列在下表2中提供。
表2.信号肽的示例性序列
在某些实施方案中，CAR的细胞外结合结构域可包含对一种靶抗原或多种靶抗原具有特异性的一种或多种抗体。抗体可以是抗体片段，例如scFv，或单结构域抗体片段，例如VHH。在某些实施方案中，scFv可包含通过接头连接的抗体的重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)。VH和VL可以任一顺序连接，即VH-接头-VL或VL-接头-VH。接头的非限制性实例包括Whitlow接头、(G4S)n(n可以是正整数，例如，1、2、3、4、5、6等)接头及其变体。在某些实施方案中，抗原可以是唯一或优先在肿瘤细胞上表达的抗原，或者是自身免疫性或炎性疾病所特有的抗原。示例性靶抗原包括但不限于CD5、CD19、CD20、CD22、CD23、CD30、CD70、κ、λ和B细胞成熟剂(BCMA)、G蛋白偶联受体家族C 5组成员D(GPRC5D)(与白血病相关)；CS1/SLAMF7、CD38、CD138、GPRC5D、TACI和BCMA(与骨髓瘤相关)；GD2、HER2、EGFR、EGFRvIII、B7H3、PSMA、PSCA、CAIX、CD171、CEA、CSPG4、EPHA2、FAP、FRα、IL-13Rα、间皮素、MUC1、MUC16和ROR1(与实体瘤相关)。在这些实施方案中的任一个中，CAR的细胞外结合结构域可以针对在宿主细胞中的表达进行密码子优化，或具有变体序列以增加细胞外结合结构域的功能。
在某些实施方案中，CAR可包含铰链结构域，也称为间隔子。术语“铰链”和“间隔子”在本公开中可互换使用。铰链结构域的非限制性实例包括CD8α铰链结构域、CD28铰链结构域、IgG4铰链结构域、IgG4铰链-CH2-CH3结构域及其变体，所述铰链结构域的氨基酸序列在下表3中提供。
表3.铰链结构域的示例性序列
在某些实施方案中，CAR的跨膜结构域可包含以下的跨膜区：T细胞受体的α、β或ζ链、CD28、CD3ε、CD45、CD4、CD5、CD8、CD9、CD16、CD22、CD33、CD37、CD64、CD80、CD86、CD134、CD137、CD154或其功能变体，包括这些序列中每一个的人版本。在其他实施方案中，跨膜结构域可包含以下的跨膜区：CD8α、CD8β、4-1BB/CD137、CD28、CD34、CD4、FcεRIγ、CD16、OX40/CD134、CD3ζ、CD3ε、CD3γ、CD3δ、TCRα、TCRβ、TCRζ、CD32、CD64、CD64、CD45、CD5、CD9、CD22、CD37、CD80、CD86、CD40、CD40L/CD154、VEGFR2、FAS和FGFR2B或其功能变体，包括这些序列中每一个的人版本。表4提供了一些示例性跨膜结构域的氨基酸序列。
表4.跨膜结构域的示例性序列
在某些实施方案中，CAR的细胞内信号传导结构域和/或细胞内共刺激结构域可包含选自以下的一个或多个信号传导结构域：B7-1/CD80、B7-2/CD86、B7-H1/PD-L1、B7-H2、B7-H3、B7-H4、B7-H6、B7-H7、BTLA/CD272、CD28、CTLA-4、Gi24/VISTA/B7-H5、ICOS/CD278、PD-1、PD-L2/B7-DC、PDCD6、4-1BB/TNFSF9/CD137、4-1BB配体/TNFSF9、BAFF/BLyS/TNFSF13B、BAFFR/TNFRSF13C、CD27/TNFRSF7、CD27配体/TNFSF7、CD30/TNFRSF8、CD30配体/TNFSF8、CD40/TNFRSF5、CD40/TNFSF5、CD40配体/TNFSF5、DR3/TNFRSF25、GITR/TNFRSF18、GITR配体/TNFSF18、HVEM/TNFRSF14、LIGHT/TNFSF14、淋巴毒素-α/TNFβ、OX40/TNFRSF4、OX40配体/TNFSF4、RELT/TNFRSF19L、TACI/TNFRSF13B、TL1A/TNFSF15、TNFα、TNFRII/TNFRSF1B、2B4/CD244/SLAMF4、BLAME/SLAMF8、CD2、CD2F-10/SLAMF9、CD48/SLAMF2、CD58/LFA-3、CD84/SLAMF5、CD229/SLAMF3、CRACC/SLAMF7、NTB-A/SLAMF6、SLAM/CD150、CD2、CD7、CD53、CD82/Kai-1、CD90/Thy1、CD96、CD160、CD200、CD300a/LMIR1、HLAI类、HLA-DR、Ikaros、整联蛋白α4/CD49d、整联蛋白α4β1、整联蛋白α4β7/LPAM-1、LAG-3、TCL1A、TCL1B、CRTAM、DAP12、Dectin-1/CLEC7A、DPPIV/CD26、EphB6、TIM-1/KIM-1/HAVCR、TIM-4、TSLP、TSLPR、淋巴细胞功能相关抗原1(LFA-1)、NKG2C、CD3ζ、基于免疫受体酪氨酸的活化基序(ITAM)、CD27、CD28、4-1BB、CD134/OX40、CD30、CD40、PD-1、ICOS、淋巴细胞功能相关抗原1(LFA-1)、CD2、CD7、LIGHT、NKG2C、B7-H3、特异性结合CD83的配体及其功能变体，包括这些序列中每一个的人版本。在一些实施方案中，细胞内信号传导结构域和/或细胞内共刺激结构域包含选自CD3ζ结构域、ITAM、CD28结构域、4-1BB结构域或其功能变体的一个或多个信号传导结构域。表5提供了一些示例性细胞内共刺激和/或信号传导结构域的氨基酸序列。在某些实施方案中，如在下文所述的tisagenlecleucel的情况下，SEQ ID NO：18的CD3ζ信号传导结构域可在氨基酸位置14处具有突变，例如谷氨酰胺(Q)至赖氨酸(K)的突变(参见SEQ ID NO：115)。
表5.细胞内共刺激和/或信号传导结构域的示例性序列
在多顺反子载体编码两个或更多个CAR的某些实施方案中，如所述的那样，所述两个或更多个CAR可包含相同的功能结构域或一个或多个不同的功能结构域。例如，两个或更多个CAR可包含不同的信号肽、细胞外结合结构域、铰链结构域、跨膜结构域、共刺激结构域和/或细胞内信号传导结构域，以便最大程度的降低由于序列相似性引起的重组风险。或者，替代地，两个或更多个CAR可包含相同的结构域。在使用相同结构域和/或骨架的情况下，任选地在核苷酸序列水平引入密码子分歧以最小化重组的风险。
CD19 CAR
在一些实施方案中，CAR是CD19 CAR(“CD19-CAR”)，并且在这些实施方案中，多顺反子载体包含表达盒，所述表达盒含有编码CD19 CAR的核苷酸序列。在一些实施方案中，CD19 CAR可包含串联的信号肽、特异性结合CD19的细胞外结合结构域、铰链结构域、跨膜结构域、细胞内共刺激结构域和/或细胞内信号传导结构域。
在一些实施方案中，CD19 CAR的信号肽包括CD8α信号肽。在一些实施方案中，CD8α信号肽包含SEQ ID NO：6中列出的氨基酸序列或由其组成，或者包含与SEQ ID NO：6中列出的氨基酸序列具有至少80％同一性(例如，至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性)的氨基酸序列或由其组成。在一些实施方案中，信号肽包括IgK信号肽。在一些实施方案中，IgK信号肽包含SEQ ID NO：7中列出的氨基酸序列或由其组成，或者包含与SEQ ID NO：7中列出的氨基酸序列具有至少80％同一性(例如，至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性)的氨基酸序列或由其组成。在一些实施方案中，信号肽包括GMCSFR-α或CSF2RA信号肽。在一些实施方案中，GMCSFR-α或CSF2RA信号肽包含SEQ ID NO：8中列出的氨基酸序列或由其组成，或者包含与SEQ ID NO：8中列出的氨基酸序列具有至少80％同一性(例如，至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性)的氨基酸序列或由其组成。
在一些实施方案中，CD19 CAR的细胞外结合结构域对CD19(例如人CD19)具有特异性。CD19 CAR的细胞外结合结构域可以针对在宿主细胞中的表达进行密码子优化，或可被密码子优化以具有变体序列以增加细胞外结合结构域的功能。在一些实施方案中，细胞外结合结构域包含免疫球蛋白分子的免疫原性活性部分，例如scFv。
在一些实施方案中，CD19 CAR的细胞外结合结构域包含来源于FMC63单克隆抗体(FMC63)的scFv，其包含通过接头连接的FMC63的重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)。FMC63和衍生的scFv已经在Nicholson等人，Mol.Immun.34(16-17)：1157-1165(1997)和PCT申请公开号WO2018/213337中描述，所述文献各自的全部内容通过引用并入本文。在一些实施方案中，完整FMC63衍生的scFv(也称为FMC63 scFv)及其不同部分的氨基酸序列在下表6中提供。在一些实施方案中，CD19特异性scFv包含SEQ ID NO：19、20或25中列出的氨基酸序列或由其组成，或者包含与SEQ ID NO：19、20或25中列出的氨基酸序列具有至少80％同一性(例如，至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性)的氨基酸序列或由其组成。在一些实施方案中，CD19特异性scFv可包含一个或多个具有SEQ ID NO：21-23和26-28中列出的氨基酸序列的CDR。在一些实施方案中，CD19特异性scFv可包含具有一个或多个CDR的轻链，所述CDR具有SEQ ID NO：21-23中列出的氨基酸序列。在一些实施方案中，CD19特异性scFv可包含具有一个或多个CDR的重链，所述CDR具有SEQ ID NO：26-28中列出的氨基酸序列。在这些实施方案中的任一个中，CD19特异性scFv可包含一个或多个CDR，所述CDR包含一个或多个氨基酸取代或包含与所鉴定的任何序列具有至少80％同一性(例如，至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性)的序列。在一些实施方案中，CD19 CAR的细胞外结合结构域包含如本文所述的一个或多个CDR或由其组成。
在一些实施方案中，连接scFv的VH和VL部分的接头是具有SEQ ID NO：24中列出的氨基酸序列的Whitlow接头。在一些实施方案中，Whitlow接头可以被不同的接头替代，例如具有SEQ ID NO：30中列出的氨基酸序列的3xG4S接头，其产生不同的FMC63衍生的具有SEQID NO：29中列出的氨基酸序列的scFv。在这些实施方案中的某些中，CDl9特异性scFv包含SEQ ID NO：29中列出的氨基酸序列或由其组成，或者包含与SEQ ID NO：29中列出的氨基酸序列具有至少80％同一性(例如，至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性)的氨基酸序列或由其组成。
表6.抗CD19 scFv和组分的示例性序列
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在一些实施方案中，CD19 CAR的细胞外结合结构域来源于对CD19具有特异性的抗体，包括例如SJ25C1(Bejcek等人，Cancer Res.55：2346-2351(1995))、HD37(Pezutto等人，J.Immunol.138(9)：2793-2799(1987))、4G7(Meeker等人，Hybridoma 3：305-320(1984))、B43(Bejcek(1995))、BLY3(Bejcek(1995))、B4(Freedman等人，70：418-427(1987))、B4HB12b(Kansas&Tedder，J.Immunol.147：4094-4102(1991)；Yazawa等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 102：15178-15183(2005)；Herbst等人，J.Pharmacol.Exp.Ther.335：213-222(2010))、BU12(Callard等人，J.Immunology，148(10)：2983-2987(1992))和CLB-CD19(De Rie Cell.Immunol.118：368-381(1989))。在这些实施方案中的任一个中，CD19 CAR的细胞外结合结构域可包含任何抗体的VH、VL和/或一个或多个CDR或由其组成。
在一些实施方案中，CD19 CAR的铰链结构域包含CD8α铰链结构域，例如人CD8α铰链结构域。在一些实施方案中，CD8α铰链结构域包含SEQ ID NO：9中列出的氨基酸序列或由其组成，或者包含与SEQ ID NO：9中列出的氨基酸序列具有至少80％同一性(例如，至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性)的氨基酸序列或由其组成。在一些实施方案中，铰链结构域包括CD28铰链结构域，例如人CD28铰链结构域。在一些实施方案中，CD28铰链结构域包含SEQ ID NO：10中列出的氨基酸序列或由其组成，或者包含与SEQ ID NO：10中列出的氨基酸序列具有至少80％同一性(例如，至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性)的氨基酸序列或由其组成。在一些实施方案中，铰链结构域包括IgG4铰链结构域，例如人IgG4铰链结构域。在一些实施方案中，IgG4铰链结构域包含SEQ ID NO：11或SEQ ID NO：12中列出的氨基酸序列或由其组成，或者包含与SEQ ID NO：11或SEQ ID NO：12中列出的氨基酸序列具有至少80％同一性(例如，至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性)的氨基酸序列或由其组成。在一些实施方案中，铰链结构域包括IgG4铰链-Ch2-Ch3结构域，例如人IgG4铰链-Ch2-Ch3结构域。在一些实施方案中，IgG4铰链-Ch2-Ch3结构域包含SEQ ID NO：13中列出的氨基酸序列或由其组成，或者包含与SEQ ID NO：13中列出的氨基酸序列具有至少80％同一性(例如，至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性)的氨基酸序列或由其组成。
在一些实施方案中，CD19 CAR的跨膜结构域包含CD8α跨膜结构域，例如人CD8α跨膜结构域。在一些实施方案中，CD8α跨膜结构域包含SEQ ID NO：14中列出的氨基酸序列或由其组成，或者包含与SEQ ID NO：14中列出的氨基酸序列具有至少80％同一性(例如，至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性)的氨基酸序列或由其组成。在一些实施方案中，跨膜结构域包括CD28跨膜结构域，例如人CD28跨膜结构域。在一些实施方案中，CD28跨膜结构域包含SEQ ID NO：15中列出的氨基酸序列或由其组成，或者包含与SEQ ID NO：15中列出的氨基酸序列具有至少80％同一性(例如，至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性)的氨基酸序列或由其组成。
在一些实施方案中，CD19 CAR的细胞内共刺激结构域包括4-1BB共刺激结构域。4-1BB也被称为CD137，向T细胞传递有效的共刺激信号，从而促进分化并增强T淋巴细胞的长期存活。在一些实施方案中，4-1BB共刺激结构域是人类的。在一些实施方案中，4-1BB共刺激结构域包含SEQ ID NO：16中列出的氨基酸序列或由其组成，或者包含与SEQ ID NO：16中列出的氨基酸序列具有至少80％同一性(例如，至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性)的氨基酸序列或由其组成。在一些实施方案中，细胞内共刺激结构域包括CD28共刺激结构域。CD28是T细胞上的另一种共刺激分子。在一些实施方案中，CD28共刺激结构域是人类的。在一些实施方案中，CD28共刺激结构域包含SEQ ID NO：17中列出的氨基酸序列或由其组成，或者包含与SEQ ID NO：17中列出的氨基酸序列具有至少80％同一性(例如，至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性)的氨基酸序列或由其组成。在一些实施方案中，CD19 CAR的细胞内共刺激结构域包括如所述的4-1BB共刺激结构域和CD28共刺激结构域。
在一些实施方案中，CD19 CAR的细胞内信号传导结构域包括CD3泽塔(ζ)信号传导结构域。CD3ζ与T细胞受体(TCR)缔合以产生信号，并且含有基于免疫受体酪氨酸的活化基序(ITAM)。CD3ζ信号传导结构域是指来自ζ链的细胞质结构域的氨基酸残基，其足以功能性地传递T细胞活化所必需的初始信号。在一些实施方案中，CD3ζ信号传导结构域是人类的。在一些实施方案中，CD3ζ信号传导结构域包含SEQ ID NO：18中列出的氨基酸序列或由其组成，或者包含与SEQ ID NO：18中列出的氨基酸序列具有至少80％同一性(例如，至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性)的氨基酸序列或由其组成。
在一些实施方案中，多顺反子载体包含表达盒，所述表达盒含有编码CD19 CAR的核苷酸序列，所述CD19 CAR包括例如包含以下的CD19 CAR：具有SEQ ID NO：19或SEQ IDNO：29中列出的序列的CD19特异性scFv、SEQ ID NO：9的CD8α铰链结构域、SEQ ID NO：14的CD8α跨膜结构域、SEQ ID NO：16的4-1BB共刺激结构域、SEQ ID NO：18的CD3ζ信号传导结构域和/或其变体(即，具有与所公开的序列具有至少80％同一性，例如至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99同一性的序列)。在这些实施方案中的任一个中，CD19 CAR可额外包含如所述的信号肽(例如，CD8α信号肽)。
在一些实施方案中，多顺反子载体包含表达盒，所述表达盒含有编码CD19 CAR的核苷酸序列，所述CD19 CAR包括例如包含以下的CD19 CAR：具有SEQ ID NO：19或SEQ IDNO：29中列出的序列的CD19特异性scFv、SEQ ID NO：11或SEQ ID NO：12的IgG4铰链结构域、SEQ ID NO：15的CD28跨膜结构域、SEQ ID NO：16的4-1BB共刺激结构域、SEQ ID NO：18的CD3ζ信号传导结构域和/或其变体(即，具有与所公开的序列具有至少80％同一性，例如至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99同一性的序列)。在这些实施方案中的任一个中，CD19 CAR可额外包含如所述的信号肽(例如，CD8α信号肽)。
在一些实施方案中，多顺反子载体包含表达盒，所述表达盒含有编码CD19 CAR的核苷酸序列，所述CD19 CAR包括例如包含以下的CD19 CAR：具有SEQ ID NO：19或SEQ IDNc：29中列出的序列的CD19特异性scFv、SEQ ID NO：10的CD28铰链结构域、SEQ ID NO：15的CD28跨膜结构域、SEQ ID NO：17的CD28共刺激结构域、SEQ ID NO：18的CD3ζ信号传导结构域和/或其变体(即，具有与所公开的序列具有至少80％同一性，例如至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99同一性的序列)。在这些实施方案中的任一个中，CD19 CAR可额外包含如所述的信号肽(例如，CD8α信号肽)。
在一些实施方案中，多顺反子载体包含含有核苷酸序列的表达盒，所述核苷酸序列编码SEQ ID NO：116中列出的CD19 CAR或与SEQ ID NO：116中列出的核苷酸序列具有至少80％同一性(例如，至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性)(参见表7)。编码的CD19 CAR具有SEQ ID NO：117中列出的对应氨基酸序列，或者与SEQ ID NO：117中列出的氨基酸序列具有至少80％同一性(例如，至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性)，具有以下组分：CD8α信号肽、FMC63 scFv(VL-Whitlow接头-VH)、CD8α铰链结构域、CD8α跨膜结构域、4-1BB共刺激结构域和CD3ζ信号传导结构域。
在一些实施方案中，多顺反子载体包含表达盒，所述表达盒含有编码CD19 CAR的可商购获得的实施方案的核苷酸序列。由T细胞表达和/或编码的CD19 CAR的可商购获得的实施方案的非限制性实例包括tisagenlecleucel、lisocabtagene maraleucel、axicabtagene ciloleucel和brexucabtagene autoleucel。
在一些实施方案中，多顺反子载体包含表达盒，所述表达盒含有编码tisagenlecleucel或其部分的核苷酸序列。Tisagenlecleucel包含具有以下组分的CD19CAR：CD8α信号肽、FMC63 scFv(VL-3xG4S接头-VH)、CD8α铰链结构域、CD8α跨膜结构域、4-1BB共刺激结构域和CD3ζ信号传导结构域。Tisagenlecleucel中的CD19 CAR的核苷酸和氨基酸序列在表7中提供，序列注释在表8中提供。
在一些实施方案中，多顺反子载体包含表达盒，所述表达盒含有编码lisocabtagene maraleucel或其部分的核苷酸序列。Lisocabtagene maraleucel包含具有以下组分的CD19 CAR：GMCSFR-α或CSF2RA信号肽、FMC63 scFv(VL-Whitlow接头-VH)、IgG4铰链结构域、CD28跨膜结构域、4-1BB共刺激结构域和CD3ζ信号传导结构域。Lisocabtagenemaraleucel中的CD19 CAR的核苷酸和氨基酸序列在表7中提供，序列注释在表9中提供。
在一些实施方案中，多顺反子载体包含表达盒，所述表达盒含有编码axicabtagene ciloleucel或其部分的核苷酸序列。Axicabtagene ciloleucel包含具有以下组分的CD19 CAR：GMCSFR-α或CSF2RA信号肽、FMC63 scFv(VL-Whitlow接头-Vii)、CD28铰链结构域、CD28跨膜结构域、CD28共刺激结构域和CD3ζ信号传导结构域。Axicabtageneciloleucel中的CD19 CAR的核苷酸和氨基酸序列在表7中提供，序列注释在表10中提供。
在一些实施方案中，多顺反子载体包含表达盒，所述表达盒含有编码brexucabtagene autoleucel或其部分的核苷酸序列。Brexucabtagene autoleucel包含具有以下组分的CD19 CAR：GMCSFR-α信号肽、FMC63 scFv、CD28铰链结构域、CD28跨膜结构域、CD28共刺激结构域和CD3ζ信号传导结构域。
在一些实施方案中，多顺反子载体包含含有核苷酸序列的表达盒，所述核苷酸序列编码SEQ ID NO：31、33或35中列出的CD19 CAR或与SEQ ID NO：31、33或35中列出的核苷酸序列具有至少80％同一性(例如，至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性)。编码的CD19 CAR具有SEQ ID NO：32、34或36中分别列出的对应氨基酸序列，或者与SEQ ID NO：32、34或36中分别列出的氨基酸序列具有至少80％同一性(例如，至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性)。
表7.CD19 CAR的示例性序列
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表8.tisagenlecleucel CD19 CAR序列的注释
表9.lisocabtagene maraleucel CD19 CAR序列的注释
表10.axicabtagene ciloleucel CD19 CAR序列的注释
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在一些实施方案中，多顺反子载体包含含有核苷酸序列的表达盒，所述核苷酸序列编码SEQ ID NO：31、33或35中列出的CD19 CAR或与SEQ ID NO：31、33或35中列出的核苷酸序列具有至少80％同一性(例如，至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性)。编码的CD19 CAR具有SEQ ID NO：32、34或36中分别列出的对应氨基酸序列、与SEQ ID NO：32、34或36中分别列出的氨基酸序列具有至少80％同一性(例如，至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性)。
CD20 CAR
在一些实施方案中，CAR是CD20 CAR(“CD20-CAR”)，并且在这些实施方案中，多顺反子载体包含表达盒，所述表达盒含有编码CD20 CAR的核苷酸序列。CD20是一种早在祖B细胞阶段在B细胞表面上发现的抗原，其水平逐渐增加直至B细胞成熟，其还在大多数B细胞肿瘤的细胞上发现。有时在霍奇金病、骨髓瘤和胸腺瘤病例中也发现CD20阳性细胞。在一些实施方案中，CD20 CAR可包含串联的信号肽、特异性结合CD20的细胞外结合结构域、铰链结构域、跨膜结构域、细胞内共刺激结构域和/或细胞内信号传导结构域。
在一些实施方案中，CD20 CAR的信号肽包括CD8α信号肽。在一些实施方案中，CD8α信号肽包含SEQ ID NO：6中列出的氨基酸序列或由其组成，或者包含与SEQ ID NO：6中列出的氨基酸序列具有至少80％同一性(例如，至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性)的氨基酸序列或由其组成。在一些实施方案中，信号肽包括IgK信号肽。在一些实施方案中，IgK信号肽包含SEQ ID NO：7中列出的氨基酸序列或由其组成，或者包含与SEQ ID NO：7中列出的氨基酸序列具有至少80％同一性(例如，至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性)的氨基酸序列或由其组成。在一些实施方案中，信号肽包括GMCSFR-α或CSF2RA信号肽。在一些实施方案中，GMCSFR-α或CSF2RA信号肽包含SEQ ID NO：8中列出的氨基酸序列或由其组成，或者包含与SEQ ID NO：8中列出的氨基酸序列具有至少80％同一性(例如，至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性)的氨基酸序列或由其组成。
在一些实施方案中，CD20 CAR的细胞外结合结构域对CD20(例如人CD20)具有特异性。CD20 CAR的细胞外结合结构域可以针对在宿主细胞中的表达进行密码子优化，或可被密码子优化以具有变体序列以增加细胞外结合结构域的功能。在一些实施方案中，细胞外结合结构域包含免疫球蛋白分子的免疫原性活性部分，例如scFv。
在一些实施方案中，CD20 CAR的细胞外结合结构域来源于对CD20具有特异性的抗体，包括例如Leu16、IF5、1.5.3、利妥昔单抗(rituximab)、奥比妥珠单抗(obinutuzumab)、替伊莫单抗(ibritumomab)、奥法木单抗(ofatumumab)、托西莫单抗(tositumumab)、奥尼妥单抗(odronextamab)、维妥珠单抗(veltuzumab)、乌妥昔单抗(ublituximab)和奥克莱珠单抗(ocrelizumab)。在这些实施方案中的任一个中，CD20CAR的细胞外结合结构域可包含任何抗体的VH、VL和/或一个或多个CDR或由其组成。
在一些实施方案中，CD20 CAR的细胞外结合结构域包含来源于Leu16单克隆抗体的scFv，其包含通过接头连接的Leu16的重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)。参见Wu等人，Protein Engineering.14(12)：1025-1033(2001)。在一些实施方案中，接头是3xG4S接头。在其他实施方案中，接头是如本文所述的Whitlow接头。在一些实施方案中，完整Leu16衍生的scFv(也称为Leu16 scFv)的不同部分及其不同部分的氨基酸序列在下表11中提供。在一些实施方案中，CD20特异性scFv包含SEQ ID NO：37、38或42中列出的氨基酸序列或由其组成，或者包含与SEQ ID NO：37、38或42中列出的氨基酸序列具有至少80％同一性(例如，至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性)的氨基酸序列或由其组成。在一些实施方案中，CD20特异性scFv可包含一个或多个具有SEQ ID NO：39-41、43和44中列出的氨基酸序列的CDR。在一些实施方案中，CD20特异性scFv可包含具有一个或多个CDR的轻链，所述CDR具有SEQ ID NO：39-41中列出的氨基酸序列。在一些实施方案中，CD20特异性scFv可包含具有一个或多个CDR的重链，所述CDR具有SEQ ID NO：43-44中列出的氨基酸序列。在这些实施方案中的任一个中，CD20特异性scFv可包含一个或多个CDR，所述CDR包含一个或多个氨基酸取代或包含与所鉴定的任何序列具有至少80％同一性(例如，至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性)的序列。在一些实施方案中，CD20 CAR的细胞外结合结构域包含如本文所述的一个或多个CDR或由其组成。
表11.抗CD20 scFv和组分的示例性序列
在一些实施方案中，CD20 CAR的铰链结构域包含CD8α铰链结构域，例如人CD8α铰链结构域。在一些实施方案中，CD8α铰链结构域包含SEQ ID NO：9中列出的氨基酸序列或由其组成，或者包含与SEQ ID NO：9中列出的氨基酸序列具有至少80％同一性(例如，至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性)的氨基酸序列或由其组成。在一些实施方案中，铰链结构域包括CD28铰链结构域，例如人CD28铰链结构域。在一些实施方案中，CD28铰链结构域包含SEQ ID NO：10中列出的氨基酸序列或由其组成，或者包含与SEQ ID NO：10中列出的氨基酸序列具有至少80％同一性(例如，至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性)的氨基酸序列或由其组成。在一些实施方案中，铰链结构域包括IgG4铰链结构域，例如人IgG4铰链结构域。在一些实施方案中，IgG4铰链结构域包含SEQ ID NO：11或SEQ ID NO：12中列出的氨基酸序列或由其组成，或者包含与SEQ ID NO：11或SEQ ID NO：12中列出的氨基酸序列具有至少80％同一性(例如，至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性)的氨基酸序列或由其组成。在一些实施方案中，铰链结构域包括IgG4铰链-Ch2-Ch3结构域，例如人IgG4铰链-Ch2-Ch3结构域。在一些实施方案中，IgG4铰链-Ch2-Ch3结构域包含SEQ ID NO：13中列出的氨基酸序列或由其组成，或者包含与SEQ ID NO：13中列出的氨基酸序列具有至少80％同一性(例如，至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性)的氨基酸序列或由其组成。
在一些实施方案中，CD20 CAR的跨膜结构域包含CD8α跨膜结构域，例如人CD8α跨膜结构域。在一些实施方案中，CD8α跨膜结构域包含SEQ ID NO：14中列出的氨基酸序列或由其组成，或者包含与SEQ ID NO：14中列出的氨基酸序列具有至少80％同一性(例如，至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性)的氨基酸序列或由其组成。在一些实施方案中，跨膜结构域包括CD28跨膜结构域，例如人CD28跨膜结构域。在一些实施方案中，CD28跨膜结构域包含SEQ ID NO：15中列出的氨基酸序列或由其组成，或者包含与SEQ ID NO：15中列出的氨基酸序列具有至少80％同一性(例如，至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性)的氨基酸序列或由其组成。
在一些实施方案中，CD20 CAR的细胞内共刺激结构域包含4-1BB共刺激结构域，例如人4-1BB共刺激结构域。在一些实施方案中，4-1BB共刺激结构域包含SEQ ID NO：16中列出的氨基酸序列或由其组成，或者包含与SEQ ID NO：16中列出的氨基酸序列具有至少80％同一性(例如，至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性)的氨基酸序列或由其组成。在一些实施方案中，细胞内共刺激结构域包含CD28共刺激结构域，例如人CD28共刺激结构域。在一些实施方案中，CD28共刺激结构域包含SEQ ID NO：17中列出的氨基酸序列或由其组成，或者包含与SEQ ID NO：17中列出的氨基酸序列具有至少80％同一性(例如，至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性)的氨基酸序列或由其组成。
在一些实施方案中，CD20 CAR的细胞内信号传导结构域包含CD3泽塔(ζ)信号传导结构域，例如人CD3ζ信号传导结构域。在一些实施方案中，CD3ζ信号传导结构域包含SEQ IDNO：18中列出的氨基酸序列或由其组成，或者包含与SEQ ID NO：18中列出的氨基酸序列具有至少80％同一性(例如，至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性)的氨基酸序列或由其组成。
在一些实施方案中，多顺反子载体包含表达盒，所述表达盒含有编码CD20 CAR的核苷酸序列，所述CD20 CAR包括例如包含以下的CD20 CAR：具有SEQ ID NO：37中列出的序列的CD20特异性scFv、SEQ ID NO：9的CD8α铰链结构域、SEQ ID NO：14的CD8α跨膜结构域、SEQ ID NO：16的4-1BB共刺激结构域、SEQ ID NO：18的CD3ζ信号传导结构域和/或其变体(即，具有与所公开的序列具有至少80％同一性，例如至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99同一性的序列)。
在一些实施方案中，多顺反子载体包含表达盒，所述表达盒含有编码CD20 CAR的核苷酸序列，所述CD20 CAR包括例如包含以下的CD20 CAR：具有SEQ ID NO：37中列出的序列的CD20特异性scFv、SEQ ID NO：10的CD28铰链结构域、SEQ ID NO：14的CD8α跨膜结构域、SEQ ID NO：16的4-1BB共刺激结构域、SEQ ID NO：18的CD3ζ信号传导结构域和/或其变体(即，具有与所公开的序列具有至少80％同一性，例如至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99同一性的序列)。
在一些实施方案中，多顺反子载体包含表达盒，所述表达盒含有编码CD20 CAR的核苷酸序列，所述CD20 CAR包括例如包含以下的CD20 CAR：具有SEQ ID NO：37中列出的序列的CD20特异性scFv、SEQ ID NO：11或SEQ ID NO：12的IgG4铰链结构域、SEQ ID NO：14的CD8α跨膜结构域、SEQ ID NO：16的4-1BB共刺激结构域、SEQ ID NO：18的CD3ζ信号传导结构域和/或其变体(即，具有与所公开的序列具有至少80％同一性，例如至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99同一性的序列)。
在一些实施方案中，多顺反子载体包含表达盒，所述表达盒含有编码CD20 CAR的核苷酸序列，所述CD20 CAR包括例如包含以下的CD20 CAR：具有SEQ ID NO：37中列出的序列的CD20特异性scFv、SEQ ID NO：9的CD8α铰链结构域、SEQ ID NO：15的CD28跨膜结构域、SEQ ID NO：16的4-1BB共刺激结构域、SEQ ID NO：18的CD3ζ信号传导结构域和/或其变体(即，具有与所公开的序列具有至少80％同一性，例如至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99同一性的序列)。
在一些实施方案中，多顺反子载体包含表达盒，所述表达盒含有编码CD20 CAR的核苷酸序列，所述CD20 CAR包括例如包含以下的CD20 CAR：具有SEQ ID NO：37中列出的序列的CD20特异性scFv、SEQ ID NO：10的CD28铰链结构域、SEQ ID NO：15的CD28跨膜结构域、SEQ ID NO：16的4-1BB共刺激结构域、SEQ ID NO：18的CD3ζ信号传导结构域和/或其变体(即，具有与所公开的序列具有至少80％同一性，例如至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99同一性的序列)。
在一些实施方案中，多顺反子载体包含表达盒，所述表达盒含有编码CD20 CAR的核苷酸序列，所述CD20 CAR包括例如包含以下的CD20 CAR：具有SEQ ID NO：37中列出的序列的CD20特异性scFv、SEQ ID NO：11或SEQ ID NO：1的IgG4铰链结构域、SEQ ID NO：15的CD28跨膜结构域、SEQ ID NO：16的4-1BB共刺激结构域、SEQ ID NO：18的CD3ζ信号传导结构域和/或其变体(即，具有与所公开的序列具有至少80％同一性，例如至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99同一性的序列)。
CD22 CAR
在一些实施方案中，CAR是CD22 CAR(“CD22-CAR”)，并且在这些实施方案中，多顺反子载体包含表达盒，所述表达盒含有编码CD22 CAR的核苷酸序列。CD22是一种跨膜蛋白，其主要存在于成熟B细胞的表面上，充当B细胞受体(BCR)信号传导的抑制性受体。CD22在60-70％的B细胞淋巴瘤和白血病(例如，慢性B淋巴细胞白血病、毛细胞白血病、急性淋巴细胞白血病(ALL)和伯基特淋巴瘤(Burkitt′s lymphoma))中表达，并且在B细胞发育早期阶段的细胞表面或干细胞上不存在。在一些实施方案中，CD22 CAR可包含串联的信号肽、特异性结合CD22的细胞外结合结构域、铰链结构域、跨膜结构域、细胞内共刺激结构域和/或细胞内信号传导结构域。
在一些实施方案中，CD22 CAR的信号肽包括CD8α信号肽。在一些实施方案中，CD8α信号肽包含SEQ ID NO：6中列出的氨基酸序列或由其组成，或者包含与SEQ ID NO：6中列出的氨基酸序列具有至少80％同一性(例如，至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性)的氨基酸序列或由其组成。在一些实施方案中，信号肽包括IgK信号肽。在一些实施方案中，IgK信号肽包含SEQ ID NO：7中列出的氨基酸序列或由其组成，或者包含与SEQ ID NO：7中列出的氨基酸序列具有至少80％同一性(例如，至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性)的氨基酸序列或由其组成。在一些实施方案中，信号肽包括GMCSFR-α或CSF2RA信号肽。在一些实施方案中，GMCSFR-α或CSF2RA信号肽包含SEQ ID NO：8中列出的氨基酸序列或由其组成，或者包含与SEQ ID NO：8中列出的氨基酸序列具有至少80％同一性(例如，至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性)的氨基酸序列或由其组成。
在一些实施方案中，CD22 CAR的细胞外结合结构域对CD22(例如人CD22)具有特异性。CD22 CAR的细胞外结合结构域可以针对在宿主细胞中的表达进行密码子优化，或可被密码子优化以具有变体序列以增加细胞外结合结构域的功能。在一些实施方案中，细胞外结合结构域包含免疫球蛋白分子的免疫原性活性部分，例如scFv。
在一些实施方案中，CD22 CAR的细胞外结合结构域来源于对CD22具有特异性的抗体，包括例如SM03、奥英妥珠单抗(inotuzumab)、依帕珠单抗(epratuzumab)、莫塞妥莫单抗(moxetumomab)和匹那妥珠单抗(pinatuzumab)。在这些实施方案中的任一个中，CD22CAR的细胞外结合结构域可包含任何抗体的VH、VL和/或一个或多个CDR或由其组成。
在一些实施方案中，CD22 CAR的细胞外结合结构域包含来源于m971单克隆抗体(m971)的scFv，其包含通过接头连接的m971的重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)。在一些实施方案中，接头是3xG4S接头。在其他实施方案中，可改用Whitlow接头。在一些实施方案中，完整m971衍生的scFv(也称为m971 scFv)及其不同部分的氨基酸序列在下表12中提供。在一些实施方案中，CD22特异性scFv包含SEQ ID NO：45、46或50中列出的氨基酸序列或由其组成，或者包含与SEQ ID NO：45、46或50中列出的氨基酸序列具有至少80％同一性(例如，至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性)的氨基酸序列或由其组成。在一些实施方案中，CD22特异性scFv可包含一个或多个具有SEQ ID NO：47-49和51-53中列出的氨基酸序列的CDR。在一些实施方案中，CD22特异性scFv可包含具有一个或多个CDR的重链，所述CDR具有SEQ ID NO：47-49中列出的氨基酸序列。在一些实施方案中，CD22特异性scFv可包含具有一个或多个CDR的轻链，所述CDR具有SEQ ID NO：51-53中列出的氨基酸序列。在这些实施方案中的任一个中，CD22特异性scFv可包含一个或多个CDR，所述CDR包含一个或多个氨基酸取代或包含与所鉴定的任何序列具有至少80％同一性(例如，至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性)的序列。在一些实施方案中，CD22 CAR的细胞外结合结构域包含如本文所述的一个或多个CDR或由其组成。
在一些实施方案中，CD22 CAR的细胞外结合结构域包含来源于m971-L7的scFv，m971-L7是m971的亲和力成熟变体，与亲本抗体m971相比具有显著改善的CD22结合亲和力(从约2nM改善至小于50pM)。在一些实施方案中，来源于m971-L7的scFv包含通过3xG4S接头连接的m971-L7的VH和VL。在其他实施方案中，可改用Whitlow接头。在一些实施方案中，完整m971-L7衍生的scFv(也称为m971-L7scFv)及其不同部分的氨基酸序列在下表12中提供。在一些实施方案中，CD22特异性scFv包含SEQ ID NO：54、55或59中列出的氨基酸序列或由其组成，或者包含与SEQ ID NO：54、55或59中列出的氨基酸序列具有至少80％同一性(例如，至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性)的氨基酸序列或由其组成。在一些实施方案中，CD22特异性scFv可包含一个或多个具有SEQ ID NO：56-58和60-62中列出的氨基酸序列的CDR。在一些实施方案中，CD22特异性scFv可包含具有一个或多个CDR的重链，所述CDR具有SEQ ID NO：56-58中列出的氨基酸序列。在一些实施方案中，CD22特异性scFv可包含具有一个或多个CDR的轻链，所述CDR具有SEQ ID NO：60-62中列出的氨基酸序列。在这些实施方案中的任一个中，CD22特异性scFv可包含一个或多个CDR，所述CDR包含一个或多个氨基酸取代或包含与所鉴定的任何序列具有至少80％同一性(例如，至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性)的序列。在一些实施方案中，CD22 CAR的细胞外结合结构域包含如本文所述的一个或多个CDR或由其组成。
表12.抗CD22 scFv和组分的示例性序列
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在一些实施方案中，CD22 CAR的细胞外结合结构域包含免疫毒素HA22或BL22。免疫毒素BL22和HA22是治疗剂，其包含与细菌毒素融合的对CD22具有特异性的scFv，因此可以与表达CD22的癌细胞的表面结合并杀伤癌细胞。BL22包含抗CD22抗体RFB4的dsFv，其与假单胞菌(Pseudomonas)外毒素A的38-kDa截短形式融合(Bang等人，Clin.Cancer Res.，11：1545-50(2005))。HA22(CAT8015，莫塞妥莫单抗(moxetumomab pasudotox))是BL22的突变的、亲和力更高的版本(Ho等人，J.Biol.Chem.，280(1)：607-17(2005))。对CD22具有特异性的HA22和BL22的抗原结合结构域的合适序列公开于例如美国专利号7,541,034；7,355,012；和7,982,011，其特此通过引用整体并入。
在一些实施方案中，CD22 CAR的铰链结构域包含CD8α铰链结构域，例如人CD8α铰链结构域。在一些实施方案中，CD8α铰链结构域包含SEQ ID NO：9中列出的氨基酸序列或由其组成，或者包含与SEQ ID NO：9中列出的氨基酸序列具有至少80％同一性(例如，至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性)的氨基酸序列或由其组成。在一些实施方案中，铰链结构域包括CD28铰链结构域，例如人CD28铰链结构域。在一些实施方案中，CD28铰链结构域包含SEQ ID NO：10中列出的氨基酸序列或由其组成，或者包含与SEQ ID NO：10中列出的氨基酸序列具有至少80％同一性(例如，至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性)的氨基酸序列或由其组成。在一些实施方案中，铰链结构域包括IgG4铰链结构域，例如人IgG4铰链结构域。在一些实施方案中，IgG4铰链结构域包含SEQ ID NO：11或SEQ ID NO：12中列出的氨基酸序列或由其组成，或者包含与SEQ ID NO：11或SEQ ID NO：12中列出的氨基酸序列具有至少80％同一性(例如，至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性)的氨基酸序列或由其组成。在一些实施方案中，铰链结构域包括IgG4铰链-Ch2-Ch3结构域，例如人IgG4铰链-Ch2-Ch3结构域。在一些实施方案中，IgG4铰链-Ch2-Ch3结构域包含SEQ ID NO：13中列出的氨基酸序列或由其组成，或者包含与SEQ ID NO：13中列出的氨基酸序列具有至少80％同一性(例如，至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性)的氨基酸序列或由其组成。
在一些实施方案中，CD22 CAR的跨膜结构域包含CD8α跨膜结构域，例如人CD8α跨膜结构域。在一些实施方案中，CD8α跨膜结构域包含SEQ ID NO：14中列出的氨基酸序列或由其组成，或者包含与SEQ ID NO：14中列出的氨基酸序列具有至少80％同一性(例如，至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性)的氨基酸序列或由其组成。在一些实施方案中，跨膜结构域包括CD28跨膜结构域，例如人CD28跨膜结构域。在一些实施方案中，CD28跨膜结构域包含SEQ ID NO：15中列出的氨基酸序列或由其组成，或者包含与SEQ ID NO：15中列出的氨基酸序列具有至少80％同一性(例如，至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性)的氨基酸序列或由其组成。
在一些实施方案中，CD22 CAR的细胞内共刺激结构域包含4-1BB共刺激结构域，例如人4-1BB共刺激结构域。在一些实施方案中，4-1BB共刺激结构域包含SEQ ID NO：16中列出的氨基酸序列或由其组成，或者包含与SEQ ID NO：16中列出的氨基酸序列具有至少80％同一性(例如，至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性)的氨基酸序列或由其组成。在一些实施方案中，细胞内共刺激结构域包含CD28共刺激结构域，例如人CD28共刺激结构域。在一些实施方案中，CD28共刺激结构域包含SEQ ID NO：17中列出的氨基酸序列或由其组成，或者包含与SEQ ID NO：17中列出的氨基酸序列具有至少80％同一性(例如，至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性)的氨基酸序列或由其组成。
在一些实施方案中，CD22 CAR的细胞内信号传导结构域包含CD3泽塔(ζ)信号传导结构域，例如人CD3ζ信号传导结构域。在一些实施方案中，CD3ζ信号传导结构域包含SEQ IDNO：18中列出的氨基酸序列或由其组成，或者包含与SEQ ID NO：18中列出的氨基酸序列具有至少80％同一性(例如，至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性)的氨基酸序列或由其组成。
在一些实施方案中，多顺反子载体包含表达盒，所述表达盒含有编码CD22 CAR的核苷酸序列，所述CD22 CAR包括例如包含以下的CD22 CAR：具有SEQ ID NO：45或SEQ IDNO：54中列出的序列的CD22特异性scFv、SEQ ID NO：9的CD8α铰链结构域、SEQ ID NO：14的CD8α跨膜结构域、SEQ ID NO：16的4-1BB共刺激结构域、SEQ ID NO：18的CD3ζ信号传导结构域和/或其变体(即，具有与所公开的序列具有至少80％同一性，例如至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99同一性的序列)。
在一些实施方案中，多顺反子载体包含表达盒，所述表达盒含有编码CD22 CAR的核苷酸序列，所述CD22 CAR包括例如包含以下的CD22 CAR：具有SEQ ID NO：45或SEQ IDNO：54中列出的序列的CD22特异性scFv、SEQ ID NO：10的CD28铰链结构域、SEQ ID NO：14的CD8α跨膜结构域、SEQ ID NO：16的4-1BB共刺激结构域、SEQ ID NO：18的CD3ζ信号传导结构域和/或其变体(即，具有与所公开的序列具有至少80％同一性，例如至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99同一性的序列)。
在一些实施方案中，多顺反子载体包含表达盒，所述表达盒含有编码CD22 CAR的核苷酸序列，所述CD22 CAR包括例如包含以下的CD22 CAR：具有SEQ ID NO：45或SEQ IDNO：54中列出的序列的CD22特异性scFv、SEQ ID NO：11或SEQ ID NO：12的IgG4铰链结构域、SEQ ID NO：14的CD8α跨膜结构域、SEQ ID NO：16的4-1BB共刺激结构域、SEQ ID NO：18的CD3ζ信号传导结构域和/或其变体(即，具有与所公开的序列具有至少80％同一性，例如至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99同一性的序列)。
在一些实施方案中，多顺反子载体包含表达盒，所述表达盒含有编码CD22 CAR的核苷酸序列，所述CD22 CAR包括例如包含以下的CD22 CAR：具有SEQ ID NO：45或SEQ IDNO：54中列出的序列的CD22特异性scFv、SEQ ID NO：9的CD8α铰链结构域、SEQ ID NO：15的CD28跨膜结构域、SEQ ID NO：16的4-1BB共刺激结构域、SEQ ID NO：18的CD3ζ信号传导结构域和/或其变体(即，具有与所公开的序列具有至少80％同一性，例如至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99同一性的序列)。
在一些实施方案中，多顺反子载体包含表达盒，所述表达盒含有编码CD22 CAR的核苷酸序列，所述CD22 CAR包括例如包含以下的CD22 CAR：具有SEQ ID NO：45或SEQ IDNO：54中列出的序列的CD22特异性scFv、SEQ ID NO：10的CD28铰链结构域、SEQ ID NO：15的CD28跨膜结构域、SEQ ID NO：16的4-1BB共刺激结构域、SEQ ID NO：18的CD3ζ信号传导结构域和/或其变体(即，具有与所公开的序列具有至少80％同一性，例如至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99同一性的序列)。
在一些实施方案中，多顺反子载体包含表达盒，所述表达盒含有编码CD22 CAR的核苷酸序列，所述CD22 CAR包括例如包含以下的CD22 CAR：具有SEQ ID NO：45或SEQ IDNO：54中列出的序列的CD22特异性scFv、SEQ ID NO：11或SEQ ID NO：12的IgG4铰链结构域、SEQ ID NO：15的CD28跨膜结构域、SEQ ID NO：16的4-1BB共刺激结构域、SEQ ID NO：18的CD3ζ信号传导结构域和/或其变体(即，具有与所公开的序列具有至少80％同一性，例如至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99同一性的序列)。
BCMA CAR
在一些实施方案中，CAR是BCMA CAR(“BCMA-CAR”)，并且在这些实施例中，多顺反子载体包含表达盒，所述表达盒含有编码BCMA CAR的核苷酸序列。BCMA是在B细胞谱系的细胞上表达的肿瘤坏死家族受体(TNFR)成员，在终末分化B细胞或成熟B淋巴细胞上表达最高。BCMA参与介导浆细胞的存活以维持长期体液免疫。BCMA的表达最近与许多癌症有关，诸如多发性骨髓瘤、霍奇金淋巴瘤和非霍奇金淋巴瘤、各种白血病和胶质母细胞瘤。在一些实施方案中，BCMA CAR可包含串联的信号肽、特异性结合BCMA的细胞外结合结构域、铰链结构域、跨膜结构域、细胞内共刺激结构域和/或细胞内信号传导结构域。
在一些实施方案中，BCMA CAR的信号肽包括CD8α信号肽。在一些实施方案中，CD8α信号肽包含SEQ ID NO：6中列出的氨基酸序列或由其组成，或者包含与SEQ ID NO：6中列出的氨基酸序列具有至少80％同一性(例如，至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性)的氨基酸序列或由其组成。在一些实施方案中，信号肽包括IgK信号肽。在一些实施方案中，IgK信号肽包含SEQ ID NO：7中列出的氨基酸序列或由其组成，或者包含与SEQ ID NO：7中列出的氨基酸序列具有至少80％同一性(例如，至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性)的氨基酸序列或由其组成。在一些实施方案中，信号肽包括GMCSFR-α或CSF2RA信号肽。在一些实施方案中，GMCSFR-α或CSF2RA信号肽包含SEQ ID NO：8中列出的氨基酸序列或由其组成，或者包含与SEQ ID NO：8中列出的氨基酸序列具有至少80％同一性(例如，至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性)的氨基酸序列或由其组成。
在一些实施方案中，BCMA CAR的细胞外结合结构域对BCMA(例如人BCMA)具有特异性。BCMA CAR的细胞外结合结构域可以针对在宿主细胞中的表达进行密码子优化，或可被密码子优化以具有变体序列以增加细胞外结合结构域的功能。
在一些实施方案中，细胞外结合结构域包含免疫球蛋白分子的免疫原性活性部分，例如scFv。在一些实施方案中，BCMA CAR的细胞外结合结构域来源于对BCMA具有特异性的抗体，包括例如贝兰他单抗(belantamab)、埃纳妥单抗(erlanatamab)、特立妥单抗(teclistamab)、LCAR-B38M和ciltacabtagene。在这些实施方案中的任一个中，BCMA CAR的细胞外结合结构域可包含任何抗体的VH、VL和/或一个或多个CDR或由其组成。
在一些实施方案中，BCMA CAR的细胞外结合结构域包含来源于C11D5.3的scFv，C11D5.3是一种如Carpenter等人，Clin.Cancer Res.19(8)：2048-2060(2013)中所述的鼠单克隆抗体。另见PCT申请公开号WO2010/104949。C1 1D5.3衍生的scFv可以包含通过Whitlow接头连接的C11D5.3的重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)，其氨基酸序列在表13中提供。在一些实施方案中，BCMA特异性细胞外结合结构域包含SEQ ID NO：63、64或68中列出的氨基酸序列或由其组成，或者包含与SEQ ID NO：63、64或68中列出的氨基酸序列具有至少80％同一性(例如，至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性)的氨基酸序列或由其组成。在一些实施方案中，BCMA特异性细胞外结合结构域可包含一个或多个具有SEQ ID NO：65-67和69-71中列出的氨基酸序列的CDR。在一些实施方案中，BCMA特异性细胞外结合结构域可包含具有一个或多个CDR的轻链，所述CDR具有SEQ ID NO：65-67中列出的氨基酸序列。在一些实施方案中，BCMA特异性细胞外结合结构域可包含具有一个或多个CDR的重链，所述CDR具有SEQ ID NO：69-71中列出的氨基酸序列。在这些实施方案中的任一个中，BCMA特异性scFv可包含一个或多个CDR，所述CDR包含一个或多个氨基酸取代或包含与所鉴定的任何序列具有至少80％同一性(例如，至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性)的序列。在一些实施方案中，BCMA CAR的细胞外结合结构域包含如本文所述的一个或多个CDR或由其组成。
在一些实施方案中，BCMA CAR的细胞外结合结构域包含来源于另一种鼠单克隆抗体C12A3.2的scFv，如Carpenter等人，Clin.Cancer Res.19(8)：2048-2060(2013)和PCT申请公开号WO2010/104949中所述，所述scFv的氨基酸序列也在下表13中提供。在一些实施方案中，BCMA特异性细胞外结合结构域包含SEQ ID NO：72、73或77中列出的氨基酸序列或由其组成，或者包含与SEQ ID NO：72、73或77中列出的氨基酸序列具有至少80％同一性(例如，至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性)的氨基酸序列或由其组成。在一些实施方案中，BCMA特异性细胞外结合结构域可包含一个或多个具有SEQ ID NO：74-76和78-80中列出的氨基酸序列的CDR。在一些实施方案中，BCMA特异性细胞外结合结构域可包含具有一个或多个CDR的轻链，所述CDR具有SEQ ID NO：74-76中列出的氨基酸序列。在一些实施方案中，BCMA特异性细胞外结合结构域可包含具有一个或多个CDR的重链，所述CDR具有SEQ ID NO：78-80中列出的氨基酸序列。在这些实施方案中的任一个中，BCMA特异性scFv可包含一个或多个CDR，所述CDR包含一个或多个氨基酸取代或包含与所鉴定的任何序列具有至少80％同一性(例如，至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性)的序列。在一些实施方案中，BCMA CAR的细胞外结合结构域包含如本文所述的一个或多个CDR或由其组成。
在一些实施方案中，BCMA CAR的细胞外结合结构域包含对人BCMA具有高特异性的鼠单克隆抗体，其在Friedman等人，Hum.Gene Ther.29(5)：585-601(2018))中被称为BB2121。另见PCT申请公开号WO2012163805。
在一些实施方案中，BCMA CAR的细胞外结合结构域包含两条重链的单一可变片段(VHH)，其可以如Zhao等人，J.Hematol.Oncol.11(1)：141(2018)中所述与BCMA的两个表位结合，也被称为LCAR-B38M。另见PCT申请公开号WO2018/028647。
在一些实施方案中，BCMA CAR的细胞外结合结构域包含如Lam等人，Nat.Commun.11(1)：283(2020)中所述的全人重链可变结构域(FHVH)，其也被称为FHVH33。另见PCT申请公开号WO2019/006072。FHVH33及其CDR的氨基酸序列在下表13中提供。在一些实施方案中，BCMA特异性细胞外结合结构域包含SEQ ID NO：81中列出的氨基酸序列或由其组成，或者包含与SEQ ID NO：81中列出的氨基酸序列具有至少80％同一性(例如，至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性)的氨基酸序列或由其组成。在一些实施方案中，BCMA特异性细胞外结合结构域可包含一个或多个具有SEQ ID NO：82-84中列出的氨基酸序列的CDR。在这些实施方案中的任一个中，BCMA特异性细胞外结合结构域可包含一个或多个CDR，所述CDR包含一个或多个氨基酸取代或包含与所鉴定的任何序列具有至少80％同一性(例如，至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性)的序列。在一些实施方案中，BCMA CAR的细胞外结合结构域包含如本文所述的一个或多个CDR或由其组成。
在一些实施方案中，BCMA CAR的细胞外结合结构域包含来源于如美国专利号11，026，975B2中所述的CT103A(或CAR0085)的scFv，其氨基酸序列在下表13中提供。在一些实施方案中，BCMA特异性细胞外结合结构域包含SEQ ID NO：118、119或123中列出的氨基酸序列或由其组成，或者包含与SEQ ID NO：118、119或123中列出的氨基酸序列具有至少80％同一性(例如，至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性)的氨基酸序列或由其组成。在一些实施方案中，BCMA特异性细胞外结合结构域可包含一个或多个具有SEQ ID NO：120-122和124-126中列出的氨基酸序列的CDR。在一些实施方案中，BCMA特异性细胞外结合结构域可包含具有一个或多个CDR的轻链，所述CDR具有SEQ ID NO：120-122中列出的氨基酸序列。在一些实施方案中，BCMA特异性细胞外结合结构域可包含具有一个或多个CDR的重链，所述CDR具有SEQ ID NO：124-126中列出的氨基酸序列。在这些实施方案中的任一个中，BCMA特异性scFv可包含一个或多个CDR，所述CDR包含一个或多个氨基酸取代或包含与所鉴定的任何序列具有至少80％同一性(例如，至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性)的序列。在一些实施方案中，BCMA CAR的细胞外结合结构域包含如本文所述的一个或多个CDR或由其组成。
此外，针对BCMA的CAR和结合物已在美国申请公开号2020/0246381A1和2020/0339699A1中描述，其各自的全部内容通过引用并入本文。
表13.抗BCMA结合物和组分的示例性序列
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在一些实施方案中，BCMA CAR的铰链结构域包含CD8α铰链结构域，例如人CD8α铰链结构域。在一些实施方案中，CD8α铰链结构域包含SEQ ID NO：9中列出的氨基酸序列或由其组成，或者包含与SEQ ID NO：9中列出的氨基酸序列具有至少80％同一性(例如，至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性)的氨基酸序列或由其组成。在一些实施方案中，铰链结构域包括CD28铰链结构域，例如人CD28铰链结构域。在一些实施方案中，CD28铰链结构域包含SEQ ID NO：10中列出的氨基酸序列或由其组成，或者包含与SEQ ID NO：10中列出的氨基酸序列具有至少80％同一性(例如，至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性)的氨基酸序列或由其组成。在一些实施方案中，铰链结构域包括IgG4铰链结构域，例如人IgG4铰链结构域。在一些实施方案中，IgG4铰链结构域包含SEQ ID NO：11或SEQ ID NO：12中列出的氨基酸序列或由其组成，或者包含与SEQ ID NO：11或SEQ ID NO：12中列出的氨基酸序列具有至少80％同一性(例如，至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性)的氨基酸序列或由其组成。在一些实施方案中，铰链结构域包括IgG4铰链-Ch2-Ch3结构域，例如人IgG4铰链-Ch2-Ch3结构域。在一些实施方案中，IgG4铰链-Ch2-Ch3结构域包含SEQ ID NO：13中列出的氨基酸序列或由其组成，或者包含与SEQ ID NO：13中列出的氨基酸序列具有至少80％同一性(例如，至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性)的氨基酸序列或由其组成。
在一些实施方案中，BCMA CAR的跨膜结构域包含CD8α跨膜结构域，例如人CD8α跨膜结构域。在一些实施方案中，CD8α跨膜结构域包含SEQ ID NO：14中列出的氨基酸序列或由其组成，或者包含与SEQ ID NO：14中列出的氨基酸序列具有至少80％同一性(例如，至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性)的氨基酸序列或由其组成。在一些实施方案中，跨膜结构域包括CD28跨膜结构域，例如人CD28跨膜结构域。在一些实施方案中，CD28跨膜结构域包含SEQ ID NO：15中列出的氨基酸序列或由其组成，或者包含与SEQ ID NO：15中列出的氨基酸序列具有至少80％同一性(例如，至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性)的氨基酸序列或由其组成。
在一些实施方案中，BCMA CAR的细胞内共刺激结构域包含4-1BB共刺激结构域，例如人4-1BB共刺激结构域。在一些实施方案中，4-1BB共刺激结构域包含SEQ ID NO：16中列出的氨基酸序列或由其组成，或者包含与SEQ ID NO：16中列出的氨基酸序列具有至少80％同一性(例如，至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性)的氨基酸序列或由其组成。在一些实施方案中，细胞内共刺激结构域包含CD28共刺激结构域，例如人CD28共刺激结构域。在一些实施方案中，CD28共刺激结构域包含SEQ ID NO：17中列出的氨基酸序列或由其组成，或者包含与SEQ ID NO：17中列出的氨基酸序列具有至少80％同一性(例如，至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性)的氨基酸序列或由其组成。
在一些实施方案中，BCMA CAR的细胞内信号传导结构域包含CD3泽塔(ζ)信号传导结构域，例如人CD3ζ信号传导结构域。在一些实施方案中，CD3ζ信号传导结构域包含SEQ IDNO：18中列出的氨基酸序列或由其组成，或者包含与SEQ ID NO：18中列出的氨基酸序列具有至少80％同一性(例如，至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性)的氨基酸序列或由其组成。
在一些实施方案中，多顺反子载体包含表达盒，所述表达盒含有编码BCMA CAR的核苷酸序列，所述BCMA CAR包括例如包含以下的BCMA CAR：如所述的任何BCMA特异性细胞外结合结构域、SEQ ID NO：9的CD8α铰链结构域、SEQ ID NO：14的CD8α跨膜结构域、SEQ IDNO：16的4-1BB共刺激结构域、SEQ ID NO：18的CD3ζ信号传导结构域和/或其变体(即，具有与所公开的序列具有至少80％同一性，例如至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99同一性的序列)。在这些实施方案中的任一个中，BCMACAR可额外包含如所述的信号肽(例如，CD8α信号肽)。
在一些实施方案中，多顺反子载体包含表达盒，所述表达盒含有编码BCMA CAR的核苷酸序列，所述BCMA CAR包括例如包含以下的BCMA CAR：如所述的任何BCMA特异性细胞外结合结构域、SEQ ID NO：9的CD8α铰链结构域、SEQ ID NO：14的CD8α跨膜结构域、SEQ IDNO：17的CD28共刺激结构域、SEQ ID NO：18的CD3ζ信号传导结构域和/或其变体(即，具有与所公开的序列具有至少80％同一性，例如至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99同一性的序列)。在这些实施方案中的任一个中，BCMACAR可额外包含如所述的信号肽。
在一些实施方案中，多顺反子载体包含含有核苷酸序列的表达盒，所述核苷酸序列编码SEQ ID NO：127中列出的BCMA CAR或与SEQ ID NO：127中列出的核苷酸序列具有至少80％同一性(例如，至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性)(参见表14)。编码的BCMA CAR具有SEQ ID NO：128中列出的对应氨基酸序列，或者与SEQ ID NO：128中列出的氨基酸序列具有至少80％同一性(例如，至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性)，具有以下组分：CD8α信号肽、CT103A scFv(VL-Whitlow接头-VH)、CD8α铰链结构域、CD8α跨膜结构域、4-1BB共刺激结构域和CD3ζ信号传导结构域。
在一些实施方案中，多顺反子载体包含表达盒，所述表达盒含有编码BCMA CAR的可商购获得的实施方案的核苷酸序列，所述BCMA CAR包括例如idecabtagene vicleucel(ide-cel，也称为bb2121)。在一些实施方案中，多顺反子载体包含表达盒，所述表达盒含有编码idecabtagene vicleucel或其部分的核苷酸序列。Idecabtagene vicleucel包含具有以下组分的BCMA CAR：BB2121结合物、CD8α铰链结构域、CD8α跨膜结构域、4-1BB共刺激结构域和CD3ζ信号传导结构域。
表14.BCMA CAR的示例性序列
O.低免疫原性细胞的特征
在一些实施方案中，低免疫原性干细胞群与对照干细胞(例如，野生型干细胞或免疫原性干细胞)相比保留多能性。在一些实施方案中，低免疫原性干细胞群与对照干细胞(例如，野生型干细胞或免疫原性干细胞)相比保留分化潜能。
在一些实施方案中，施用的低免疫原性细胞(诸如低免疫原性CAR-T细胞)群在受试者或患者中引发降低或较低水平的免疫活化。在一些情况下，与施用免疫原性细胞产生的免疫活化水平相比，所述低免疫原性细胞引发的免疫活化水平低至少5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％。在一些实施方案中，施用的低免疫原性细胞群无法在受试者或患者中引发免疫活化。
在一些实施方案中，施用的低免疫原性细胞(诸如低免疫原性CAR-T细胞)群在受试者或患者中引发降低或较低水平的T细胞反应。在一些情况下，与施用免疫原性细胞产生的T细胞反应水平相比，所述低免疫原性细胞引发的T细胞反应水平低至少5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％。在一些实施方案中，施用的低免疫原性细胞群无法在受试者或患者中引发对细胞的T细胞反应。
在一些实施方案中，施用的低免疫原性细胞(诸如低免疫原性CAR-T细胞)群在受试者或患者中引发降低或较低水平的NK细胞反应。在一些情况下，与施用免疫原性细胞产生的NK细胞反应水平相比，所述低免疫原性细胞引发的NK细胞反应水平低至少5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％。在一些实施方案中，施用的低免疫原性细胞群无法在受试者或患者中引发对细胞的NK细胞反应。
在一些实施方案中，施用的低免疫原性细胞(诸如低免疫原性CAR-T细胞)群在受试者或患者中引发降低或较低水平的巨噬细胞吞噬。在一些情况下，与施用免疫原性细胞产生的巨噬细胞吞噬水平相比，所述低免疫原性细胞引发的NK细胞反应水平低至少5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％。在一些实施方案中，施用的低免疫原性细胞群无法在受试者或患者中引发细胞的巨噬细胞吞噬。
在一些实施方案中，施用的低免疫原性细胞(诸如低免疫原性CAR-T细胞)群在受试者或患者中引发降低或较低水平的全身性TH1活化。在一些情况下，与施用免疫原性细胞产生的全身性TH1活化水平相比，所述低免疫原性细胞引发的全身性TH1活化水平低至少5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％。在一些实施方案中，施用的低免疫原性细胞群无法在受试者或患者中引发全身性TH1活化。
在一些实施方案中，施用的低免疫原性细胞(诸如低免疫原性CAR-T细胞)群在受试者或患者中引发降低或较低水平的NK细胞杀伤。在一些情况下，与施用免疫原性细胞产生的NK细胞杀伤水平相比，所述低免疫原性细胞引发的NK细胞杀伤水平低至少5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％。在一些实施方案中，施用的低免疫原性细胞群无法在受试者或患者中引发NK细胞杀伤。
在一些实施方案中，施用的低免疫原性细胞(诸如低免疫原性CAR-T细胞)群在受试者或患者中引发降低或较低水平的外周血单核细胞(PBMC)的免疫活化。在一些情况下，与施用免疫原性细胞产生的PBMC的免疫活化水平相比，所述低免疫原性细胞引发的PBMC的免疫活化水平低至少5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％。在一些实施方案中，施用的低免疫原性细胞群无法在受试者或患者中引发PBMC的免疫活化。
在一些实施方案中，施用的低免疫原性细胞(诸如低免疫原性CAR-T细胞)群在受试者或患者中引发降低或较低水平的供体特异性IgG抗体。在一些情况下，与施用免疫原性细胞产生的供体特异性IgG抗体水平相比，所述低免疫原性细胞引发的供体特异性IgG抗体水平低至少5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％。在一些实施方案中，施用的低免疫原性细胞群无法在受试者或患者中引发供体特异性IgG抗体。
在一些实施方案中，施用的低免疫原性细胞(诸如低免疫原性CAR-T细胞)群在受试者或患者中引发降低或较低水平的供体特异性IgM抗体。在一些情况下，与施用免疫原性细胞产生的供体特异性IgM抗体水平相比，所述低免疫原性细胞引发的供体特异性IgM抗体水平低至少5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％。在一些实施方案中，施用的低免疫原性细胞群无法在受试者或患者中引发供体特异性IgM抗体。
在一些实施方案中，施用的低免疫原性细胞(诸如低免疫原性CAR-T细胞)群在受试者或患者中引发降低或较低水平的IgM和IgG抗体产生。在一些情况下，与施用免疫原性细胞产生的IgM和IgG抗体产生水平相比，所述低免疫原性细胞引发的IgM和IgG抗体产生水平低至少5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％。在一些实施方案中，施用的低免疫原性细胞群无法在受试者或患者中引发IgM和IgG抗体产生。
在一些实施方案中，施用的低免疫原性细胞(诸如低免疫原性CAR-T细胞)群在受试者或患者中引发降低或较低水平的细胞毒性T细胞杀伤。在一些情况下，与施用免疫原性细胞产生的细胞毒性T细胞杀伤水平相比，所述低免疫原性细胞引发的细胞毒性T细胞杀伤水平低至少5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％。在一些实施方案中，施用的低免疫原性细胞群无法在受试者或患者中引发细胞毒性T细胞杀伤。
在一些实施方案中，施用的低免疫原性细胞(诸如低免疫原性CAR-T细胞)群在受试者或患者中引发降低或较低水平的补体依赖性细胞毒性(CDC)。在一些情况下，与施用免疫原性细胞产生的CDC水平相比，所述低免疫原性细胞引发的CDC水平低至少5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％。在一些实施方案中，施用的低免疫原性细胞群无法在受试者或患者中引发CDC。
P.来自原代T细胞的治疗性细胞
本文提供低免疫原性细胞，包括但不限于逃避免疫识别的原代T细胞。在一些实施方案中，低免疫原性细胞由T细胞(诸如原代T细胞)产生(例如，生成、培养或衍生)。在一些情况下，从受试者或个体获得(例如，收获、提取、去除或取得)原代T细胞。在一些实施方案中，由T细胞库产生原代T细胞，使得T细胞来自一个或多个受试者(例如，一个或多个人类，包括一个或多个健康人类)。在一些实施方案中，原代T细胞库来自1-100个、1-50个、1-20个、1-10个、1或更多个、2或更多个、3或更多个、4或更多个、5或更多个、10或更多个、20或更多个、30或更多个、40或更多个、50或更多个、或100或更多个受试者。在一些实施方案中，供体受试者与患者(例如，施用治疗性细胞的受体)不同。在一些实施方案中，T细胞库不包括来自患者的细胞。在一些实施方案中，从中获得T细胞库的一个或多个供体受试者与患者不同。
在一些实施方案中，低免疫原性细胞不活化患者(例如，施用后的受体)中的先天和/或适应性免疫反应。提供了通过向有需要的受试者(例如，受体)或患者施用低免疫原性细胞群来治疗病症的方法。在一些实施方案中，本文所述的低免疫原性细胞包含经工程化(例如，修饰)以表达嵌合抗原受体的T细胞，所述嵌合抗原受体包括但不限于本文所述的嵌合抗原受体。在一些情况下，T细胞是来自一个或多个个体的原代T细胞群或亚群。在一些实施方案中，本文描述的T细胞诸如工程化或修饰的T细胞包含降低的内源性T细胞受体的表达。
在一些实施方案中，本公开涉及低免疫原性原代T细胞，其过表达CD47和CAR，并且具有降低的MHC I类和/或MHC II类人白细胞抗原的表达或缺乏所述表达，并且具有降低的TCR复合物分子的表达或缺乏所述表达。本文概述的细胞过表达CD47和CAR并且逃避免疫识别。在一些实施方案中，原代T细胞表现出降低的MHC I类抗原、MHC II类抗原和/或TCR复合分子的水平或活性。在某些实施方案中，原代T细胞过表达CD47和CAR，并且在B2M基因中具有基因组修饰。在一些实施方案中，T细胞过表达CD47和CAR，并且在CIITA基因中具有基因组修饰。在一些实施方案中，原代T细胞过表达CD47和CAR，并且在TRAC基因中具有基因组修饰。在一些实施方案中，原代T细胞过表达CD47和CAR，并且在TRB基因中具有基因组修饰。在一些实施方案中，T细胞过表达CD47和CAR，并且在以下基因中的一种或多种中具有基因组修饰：B2M、CIITA、TRAC和TRB基因。
本公开的示例性T细胞选自由以下组成的组：细胞毒性T细胞、辅助T细胞、记忆T细胞、中央记忆T细胞、效应记忆T细胞、效应记忆RA T细胞、调控性T细胞、组织浸润淋巴细胞及其组合。在某些实施方案中，T细胞表达CCR7、CD27、CD28和CD45RA。在一些实施方案中，中央T细胞表达CCR7、CD27、CD28和CD45RO。在其他实施方案中，效应记忆T细胞表达PD-1、CD27、CD28和CD45RO。在其他实施方案中，效应记忆RA T细胞表达PD-1、CD57和CD45RA。
在一些实施方案中，T细胞是修饰的(例如，工程化的)T细胞。在一些情况下，修饰的T细胞包含引起细胞表达至少一种嵌合抗原受体的修饰，所述嵌合抗原受体与以下细胞中的至少一种的表面上表达的感兴趣的抗原或表位结合：受损细胞、发育异常细胞、感染细胞、免疫原性细胞、发炎细胞、恶性细胞、化生细胞、突变体细胞及其组合。在其他情况下，修饰的T细胞包含引起细胞表达至少一种蛋白质的修饰，当细胞接近相邻细胞、组织或器官时，所述蛋白质在相邻细胞、组织或器官中调节感兴趣的生物学效应。对原代T细胞的有用修饰在US2016/0348073和WO2020/018620中详细描述，所述文献的公开内容整体并入本文。
在一些实施方案中，本文所述的低免疫原性细胞包含经工程化(例如，修饰)以表达嵌合抗原受体的T细胞，所述嵌合抗原受体包括但不限于本文所述的嵌合抗原受体。在一些情况下，T细胞是来自一个或多个个体的原代T细胞群或亚群。在一些实施方案中，本文所述的T细胞诸如工程化或修饰的T细胞包括降低的内源性T细胞受体的表达。在一些实施方案中，本文所述的T细胞诸如工程化或修饰的T细胞包括降低的细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4(CTLA-4)的表达。在其他实施方案中，本文所述的T细胞诸如工程化或修饰的T细胞包括降低的程序性细胞死亡(PD-1)的表达。在某些实施方案中，本文所述的T细胞诸如工程化或修饰的T细胞包括降低的CTLA-4和PD-1的表达。降低或消除CTLA-4、PD-1以及CTLA-4和PD-1两者的表达的方法可以包括本领域技术人员认可的任何方法，诸如但不限于利用罕见切割核酸内切酶的遗传修饰技术和RNA沉默或RNA干扰技术。罕见切割核酸内切酶的非限制性实例包括任何Cas蛋白、TALEN、锌指核酸酶、大范围核酸酶和归巢核酸内切酶。在一些实施方案中，将编码如本文所公开的多肽(例如，嵌合抗原受体、CD47或本文公开的另一种致耐受因子)的外源核酸插入在CTLA-4和/或PD-1基因座处。在一些实施方案中，使用病毒转导(例如使用载体)将外源多核苷酸插入到细胞的至少一个等位基因中。在一些实施方案中，载体是携带外源多核苷酸的假型化、自灭活慢病毒载体。在一些实施方案中，载体是用水疱性口炎VSV-G包膜假型化的自灭活慢病毒载体，并携带外源多核苷酸。在一些实施方案中，使用病毒转导将外源多核苷酸插入到细胞的至少一个等位基因中。在一些实施方案中，使用基于慢病毒的病毒载体将外源多核苷酸插入到细胞的至少一个等位基因中。
在一些实施方案中，本文所述的T细胞诸如工程化或修饰的T细胞包括增强的PD-L1表达。
在一些实施方案中，低免疫原性T细胞包括编码CAR的多核苷酸，其中将所述多核苷酸插入到基因组基因座中。在一些实施方案中，将编码CAR的多核苷酸随机整合到细胞的基因组中。在一些实施方案中，经由病毒载体转导将编码CAR的多核苷酸随机整合到细胞的基因组中。在一些实施方案中，经由慢病毒载体转导将编码CAR的多核苷酸随机整合到细胞的基因组中。在一些实施方案中，将多核苷酸插入到安全港或靶标基因座中，诸如但不限于AAVS1、CCR5、CLYBL、ROSA26、SHS231、F3(也称为CD142)、MICA、MICB、LRP1(也称为CD91)、HMGB1、ABO、RHD、FUT1或KDM5D基因座。在一些实施方案中，将多核苷酸插入到B2M、CIITA、TRAC、TRB、PD-1或CTLA-4基因中。
在一些实施方案中，低免疫原性T细胞包括编码CAR的多核苷酸，使用表达载体在细胞中表达所述CAR。在一些实施方案中，使用介导将CAR序列整合到细胞基因组中的病毒表达载体将CAR引入到细胞中。例如，用于在细胞中表达CAR的表达载体包含编码所述CAR的多核苷酸序列。表达载体可以是诱导型表达载体。表达载体可以是病毒载体，诸如但不限于慢病毒载体。
本文提供的低免疫原性T细胞可用于治疗合适的癌症，包括但不限于B细胞急性淋巴细胞白血病(B-ALL)、弥漫性大B细胞淋巴瘤、肝癌、胰腺癌、乳腺癌、卵巢癌、结直肠癌、肺癌、非小细胞肺癌、急性髓性淋巴细胞白血病、多发性骨髓瘤、胃癌、胃腺癌、胰腺癌、胶质母细胞瘤、神经母细胞瘤、肺鳞状细胞癌、肝细胞癌和膀胱癌。
Q.从低免疫原性多能干细胞分化的治疗性细胞
本文提供低免疫原性细胞，其包括来源于多能干细胞的逃避免疫识别的细胞。在一些实施方案中，细胞不活化患者或受试者(例如，施用后的受体)中的先天和/或适应性免疫反应。提供了治疗病症的方法，其包括向有需要的受体受试者重复给药低免疫原性细胞群。
在一些实施方案中，多能干细胞和从这种多能干细胞分化的任何细胞被修饰以表现出降低的MHC I类人白细胞抗原的表达。在其他实施方案中，多能干细胞和从这种多能干细胞分化的任何细胞被修饰以表现出降低的MHC II类人白细胞抗原的表达。在某些实施方案中，多能干细胞和从这种多能干细胞分化的任何细胞被修饰以表现出降低的TCR复合物的表达。在一些实施方案中，多能干细胞和从这种多能干细胞分化的任何细胞被修饰以表现出降低的MHC I类和II类人白细胞抗原的表达。在一些实施方案中，多能干细胞和从这种多能干细胞分化的任何细胞被修饰以表现出降低的MHC I类和II类人白细胞抗原以及TCR复合物的表达。
在一些实施方案中，多能干细胞和从这种多能干细胞分化的任何细胞被修饰以表现出降低的MHC I类和/或II类人白细胞抗原的表达并且表现出增加的CD47表达。在一些情况下，细胞通过具有一个或多个CD47转基因而过表达CD47。在一些实施方案中，多能干细胞和从这种多能干细胞分化的任何细胞被修饰以表现出降低的MHC I类和II类人白细胞抗原的表达并且表现出增加的CD47表达。在一些实施方案中，多能干细胞和从这种多能干细胞分化的任何细胞被修饰以表现出降低的MHC I类和II类人白细胞抗原以及TCR复合物的表达，并且表现出增加的CD47表达。
在一些实施方案中，多能干细胞和从这种多能干细胞分化的任何细胞被修饰以表现出降低的MHC I类和/或II类人白细胞抗原的表达，表现出增加的CD47表达，并且外源表达嵌合抗原受体。在一些情况下，细胞通过具有一个或多个CD47转基因而过表达CD47多肽。在一些情况下，细胞通过具有一个或多个CAR转基因而过表达CAR多肽。在一些实施方案中，多能干细胞和从这种多能干细胞分化的任何细胞被修饰以表现出降低的MHC I类和II类人白细胞抗原的表达，表现出增加的CD47表达，并且外源表达嵌合抗原受体。在一些实施方案中，多能干细胞和从这种多能干细胞分化的任何细胞被修饰以表现出降低的MHC I类和II类人白细胞抗原以及TCR复合物的表达，表现出增加的CD47表达，并且外源表达嵌合抗原受体。
此类多能干细胞是低免疫原性干细胞。此类分化的细胞是低免疫原性细胞。
本文所述的任何多能干细胞都可以分化成生物体和组织的任何细胞。在一些实施方案中，细胞表现出降低的MHC I类和/或II类人白细胞抗原的表达和降低的TCR复合物的表达。在一些情况下，与相同细胞类型的未修饰或野生型细胞相比，MHC I类和/或II类人白细胞抗原的表达降低。在一些情况下，与相同细胞类型的未修饰或野生型细胞相比，TCR复合物的表达降低。在一些实施方案中，细胞表现出增加的CD47表达。在一些情况下，与相同细胞类型的未修饰或野生型细胞相比，本公开涵盖的细胞中的CD47的表达增加。在一些实施方案中，细胞表现出外源CAR表达。本文描述了用于降低MHC I类和/或II类人白细胞抗原和TCR复合物的水平并增加CD47和CAR的表达的方法。
在一些实施方案中，当施用于患者(例如，受体受试者)时，本文所述方法中使用的细胞逃避免疫识别和反应。所述细胞可以逃避免疫细胞在体外和体内的杀伤。在一些实施方案中，细胞逃避巨噬细胞和NK细胞的杀伤。在一些实施方案中，细胞被免疫细胞或受试者的免疫系统忽略。换句话说，根据本文所述的方法施用的细胞不可被免疫系统的免疫细胞检测到。在一些实施方案中，细胞被遮蔽并因此避免免疫排斥。
确定多能干细胞和从这种多能干细胞分化的任何细胞是否逃避免疫识别的方法包括但不限于IFN-γElispot测定、小胶质细胞杀伤测定、细胞植入动物模型、细胞因子释放测定、ELISA、使用生物发光成像或铬释放测定或用于细胞分析的实时定量微电子生物传感器系统(RTCA系统，Agilent)进行的杀伤测定、混合淋巴细胞反应、免疫荧光分析等。
本文概述的治疗性细胞可用于治疗病症，诸如但不限于癌症、遗传疾病、慢性感染性病、自身免疫性疾病、神经病症等。
1.从低免疫原性多能细胞分化的T淋巴细胞
本文提供的T淋巴细胞(T细胞，包括原代T细胞)来源于本文所述的HIP细胞(例如，低免疫原性iPSC)。用于从多能干细胞(例如，iPSC)生成T细胞(包括CAR-T细胞)的方法在例如Iriguchi等人，Nature Communications 12，430(2021)；Themeli等人，Cell Stem Cell，16(4)：357-366(2015)；Themeli等人，Nature Biotechnology 31：928-933(2013)中描述。
T淋巴细胞衍生的低免疫原性细胞包括但不限于逃避免疫识别的原代T细胞。在一些实施方案中，低免疫原性细胞由T细胞(诸如原代T细胞)产生(例如，生成、培养或衍生)。在一些情况下，从受试者或个体获得(例如，收获、提取、去除或取得)原代T细胞。在一些实施方案中，由T细胞库产生原代T细胞，使得T细胞来自一个或多个受试者(例如，一个或多个人类，包括一个或多个健康人类)。在一些实施方案中，原代T细胞库来自1-100个、1-50个、1-20个、1-10个、1或更多个、2或更多个、3或更多个、4或更多个、5或更多个、10或更多个、20或更多个、30或更多个、40或更多个、50或更多个、或100或更多个受试者。在一些实施方案中，供体受试者与患者(例如，施用治疗性细胞的受体)不同。在一些实施方案中，T细胞库不包括来自患者的细胞。在一些实施方案中，从中获得T细胞库的一个或多个供体受试者与患者不同。
在一些实施方案中，低免疫原性细胞不活化患者(例如，施用后的受体)中的免疫反应。提供了通过向有需要的受试者(例如，受体)或患者施用低免疫原性细胞群来治疗病症的方法。在一些实施方案中，本文所述的低免疫原性细胞包含经工程化(例如，修饰)以表达嵌合抗原受体的T细胞，所述嵌合抗原受体包括但不限于本文所述的嵌合抗原受体。在一些情况下，T细胞是来自一个或多个个体的原代T细胞群或亚群。在一些实施方案中，本文描述的T细胞诸如工程化或修饰的T细胞包含降低的内源性T细胞受体的表达。
在一些实施方案中，HIP衍生的T细胞包括嵌合抗原受体(CAR)。任何合适的CAR都可以包括在hyHIP衍生的T细胞中，包括本文所述的CAR。在一些实施方案中，低免疫原性诱导性多能干细胞衍生的T细胞包括编码CAR的多核苷酸，其中将所述多核苷酸插入到基因组基因座中。在一些实施方案中，将多核苷酸插入到安全港或靶标基因座中。在一些实施方案中，将多核苷酸插入到B2M、CIITA、TRAC、TRB、PD-1或CTLA-4基因中。可以使用任何合适的方法将CAR插入到低免疫原性细胞的基因组基因座中，所述方法包括本文所述的基因编辑方法(例如，CRISPR/Cas系统)。
本文提供的HIP衍生的T细胞可用于治疗合适的癌症，包括但不限于B细胞急性淋巴细胞白血病(B-ALL)、弥漫性大B细胞淋巴瘤、肝癌、胰腺癌、乳腺癌、卵巢癌、结直肠癌、肺癌、非小细胞肺癌、急性髓性淋巴细胞白血病、多发性骨髓瘤、胃癌、胃腺癌、胰腺癌、胶质母细胞瘤、神经母细胞瘤、肺鳞状细胞癌、肝细胞癌和膀胱癌。
2.来源于低免疫原性多能细胞的NK细胞
本文提供的自然杀伤(NK)细胞来源于本文所述的HIP细胞(例如，低免疫原性iPSC)。
NK细胞(也定义为“大颗粒淋巴细胞”)代表一种从普通淋巴祖细胞(也产生B淋巴细胞和T淋巴细胞)分化的细胞谱系。与T细胞不同，NK细胞在质膜上不天然包含CD3。重要的是，NK细胞不表达TCR，并且通常也缺乏其他抗原特异性细胞表面受体(以及TCR和CD3，它们也不表达免疫球蛋白B细胞受体，而是通常表达CD16和CD56)。NK细胞的细胞毒性活性不需要致敏作用，但可通过使用多种细胞因子(包括IL-2)的活化而增强。NK细胞通常被认为缺乏抗原受体介导的信号传导所必需的适当或完整的信号传导通路，因此不被认为能够进行抗原受体依赖性信号传导、活化和扩增。NK细胞具有细胞毒性，并且平衡活化性和抑制性受体信号传导以调节其细胞毒性活性。例如，表达CD16的NK细胞可结合与感染细胞结合的抗体的Fc结构域，从而导致NK细胞活化。相比之下，针对表达高水平MHC I类蛋白的细胞的活性降低。在与靶细胞接触时，NK细胞释放蛋白质(诸如穿孔素)和酶(诸如蛋白酶(颗粒酶))。穿孔素可以在靶细胞的细胞膜上形成孔，从而诱导细胞凋亡或细胞裂解。
有许多技术可以用于从多能干细胞(例如iPSC)生成NK细胞，包括CAR-NK细胞；参见，例如Zhu等人，Methods Mol Biol.2019；2048：107-119；Knorr等人，Stem CellsTranslMed.20132(4)：274-83.doi：10.5966/sctm.2012-0084；Zeng等人，Stem CellReports.2017 Dec 12；9(6)：1796-1812；Ni等人，Methods Mol Biol.2013；1029：33-41；Bernareggi等人，Exp Hematol.201971：13-23；Shankar等人，Stem Cell Res Ther.2020；11(1)：234，所述文献全部通过引用整体并入本文，特别是用于分化的方法和试剂。可以如本领域已知的那样，通常通过评价NK细胞相关和/或特异性标记物的存在来测定分化，所述标志物包括但不限于CD56、KIRs、CD16、NKp44、NKp46、NKG2D、TRAIL、CD122、CD27、CD244、NK1.1、NKG2A/C、NCR1、Ly49、CD49b、CD11b、KLRG1、CD43、CD62L和/或CD226。
在一些实施方案中，低免疫原性多能细胞分化成肝细胞以解决肝细胞功能丧失或肝硬化。有许多技术可以用于使HIP细胞分化为肝细胞；参见例如Pettinato等人，doi：10.1038/spre32888、Snykers等人，Methods Mol Biol.，2011 698：305-314、Si-Tayeb等人，Hepatology，2010，51：297-305和Asgari等人，Stem Cell Rev.，2013，9(4)：493-504，所有这些文献都通过引用整体并入本文，特别是用于分化的方法和试剂。可以如本领域已知的那样，通常通过评价肝细胞相关和/或特异性标志物的存在来测定分化，所述标志物包括但不限于白蛋白、甲胎蛋白和纤维蛋白原。还可以在功能上(诸如氨的代谢、LDL储存和摄取、ICG摄取和释放以及糖原储存)测量分化。
在一些实施方案中，NK细胞不活化患者(例如，施用后的受体)中的先天和/或适应性免疫反应。提供了通过向有需要的受试者(例如，受体)或患者施用NK细胞群来治疗病症的方法。在一些实施方案中，本文所述的NK细胞包含经工程化(例如，修饰)以表达嵌合抗原受体的NK细胞，所述嵌合抗原受体包括但不限于本文所述的嵌合抗原受体。任何合适的CAR都可以包括在NK细胞中，包括本文所述的CAR。在一些实施方案中，NK细胞包括编码CAR的多核苷酸，其中将所述多核苷酸插入到基因组基因座中。在一些实施方案中，将多核苷酸插入到安全港或靶标基因座中。在一些实施方案中，将多核苷酸插入到B2M、CIITA、PD1或CTLA4基因中。可以使用任何合适的方法将CAR插入到NK细胞的基因组基因座中，所述方法包括本文所述的基因编辑方法(例如，CRISPR/Cas系统)。
R.遗传修饰方法
在一些实施方案中，本文的载体是能够转移或转运另一核酸分子(包括转移或转运到细胞或细胞基因组中)的核酸分子。被转移的核酸通常与载体核酸分子连接，例如插入到载体核酸分子中。载体可包括在细胞中指导自主复制的序列，或者可包括足以允许整合到宿主细胞DNA中的序列。有用的载体包括例如质粒(例如，DNA质粒或RNA质粒)、转座子、粘粒、细菌人工染色体和病毒载体。有用的病毒载体包括例如复制缺陷逆转录病毒和慢病毒。非病毒载体可能需要递送媒介物以促进核酸分子进入到细胞中。
病毒载体可包含核酸分子，其包括病毒衍生的核酸元件，所述核酸元件通常促进核酸分子转移或整合到细胞基因组中或者转移或整合到介导核酸转移的病毒颗粒中。病毒颗粒通常将包括各种病毒组分，并且有时除了核酸外还包括宿主细胞组分。病毒载体可以包含例如能够将核酸转移到细胞中或转移到被转移的核酸中的病毒或病毒颗粒(例如，作为裸DNA)。病毒载体和转移质粒可以包含主要来源于病毒的结构和/或功能遗传元件。逆转录病毒载体可包含病毒载体或质粒，其含有主要来源于逆转录病毒的结构和功能遗传元件或其部分。
在本文所述的一些载体中，与对应的野生型病毒相比，有助于复制或复制所必需的一个或多个蛋白质编码区的至少一部分可能不存在。这使得病毒载体复制有缺陷。在一些实施方案中，载体能够转导靶非分裂宿主细胞和/或将其基因组整合到宿主基因组中。
在一些实施方案中，逆转录病毒核酸包含以下中的一种或多种(例如，全部)：5′启动子(例如，用于控制整个包装的RNA的表达)、5′LTR(例如，其包括R(聚腺苷酸化尾信号)和/或包括引物活化信号的U5)、引物结合位点、psi包装信号、用于核输出的RRE元件、直接位于转基因上游以控制转基因表达的启动子、转基因(或其他外源药剂元件)、多嘌呤区和3′LTR(例如，其包括突变的U3、R和U5)。在一些实施方案中，逆转录病毒核酸还包含cPPT、WPRE和/或绝缘子元件中的一种或多种。
逆转录病毒通常通过将其基因组RNA逆转录成线性双链DNA拷贝并随后将其基因组DNA共价整合到宿主基因组中来复制。野生型逆转录病毒基因组的结构通常包含5′长末端重复序列(LTR)和3′LTR，在它们之间或之内有能够使基因组被包装的包装信号、引物结合位点、实现整合到宿主细胞基因组中的整合位点以及编码促进病毒颗粒组装的包装组分的gag、pol和env基因。更复杂的逆转录病毒具有额外的特征，诸如HIV中的rev和RRE序列，其使得整合的原病毒的RNA转录物能够从感染靶细胞的细胞核有效输出到细胞质。在原病毒中，病毒基因在两个末端侧接被称为长末端重复序列(LTR)的区域。LTR参与原病毒整合和转录。LTR也充当增强子-启动子序列，并且可以控制病毒基因的表达。逆转录病毒RNA的衣壳化是通过位于病毒基因组的5’端的psi序列发生的。
LTR本身通常是相似的(例如相同的)序列，其可以分成三个元件，称为U3、R和U5。U3来源于对RNA的3′末端独特的序列。R来源于在RNA两个末端重复的序列，并且U5来源于对RNA的5′末端独特的序列。这三种元件的尺寸在不同的逆转录病毒中可以有相当大的变化。
对于病毒基因组，转录起始位点通常位于一个LTR中的U3与R之间的边界处，而poly(A)添加(终止)位点位于另一个LTR中的R与U5之间的边界处。U3含有原病毒的大部分转录控制元件，其包括对细胞和在一些情况下对病毒转录活化因子蛋白作出反应的启动子和多个增强子序列。一些逆转录病毒包含编码参与调控基因表达的蛋白质的以下基因中的任一种或多种：tot、rev、tax和rex。
关于结构基因gag、pol和env本身，gag编码病毒的内部结构蛋白。Gag蛋白被蛋白水解加工为成熟蛋白MA(基质)、CA(衣壳)和NC(核衣壳)。pol基因编码逆转录酶(RT)，它含有介导基因组复制的DNA聚合酶、相关RNA酶H和整合酶(IN)。env基因编码病毒体的表面(SU)糖蛋白和跨膜(TM)蛋白，它们形成与细胞受体蛋白特异性相互作用的复合物。这种相互作用例如通过病毒膜与细胞膜的融合来促进感染。
在复制缺陷型逆转录病毒载体基因组中，gag、pol和env可能缺失或无功能。RNA两个末端的R区是典型的重复序列。U5和U3分别代表RNA基因组5′末端和3′末端的独特序列。逆转录病毒还可含有编码除gag、pol和env以外的蛋白质的额外基因。额外基因的实例包括(在HIV中)vif、vpr、vpx、vpu、tat、rev和nef中的一种或多种。EIAV具有(尤其)额外基因S2。
适用于特定的实施方案的说明性逆转录病毒包括但不限于：莫洛尼鼠白血病病毒(M-MuLV)、莫洛尼鼠肉瘤病毒(MoMSV)、哈维鼠肉瘤病毒(HaMuSV)、鼠乳腺肿瘤病毒(MuMTV)、长臂猿白血病病毒(GaLV)、猫白血病病毒(FLV)、泡沫病毒(spumavirus)、弗瑞德鼠(Friend murine)白血病病毒、鼠干细胞病毒(MSCV)和劳斯肉瘤病毒(RSV))和慢病毒。
在一些实施方案中，逆转录病毒是γ逆转录病毒。在一些实施方案中，逆转录病毒是ε逆转录病毒。在一些实施方案中，逆转录病毒是α逆转录病毒。在一些实施方案中，逆转录病毒是β逆转录病毒。在一些实施方案中，逆转录病毒是δ逆转录病毒。在一些实施方案中，逆转录病毒是泡沫逆转录病毒。在一些实施方案中，逆转录病毒是内源性逆转录病毒。在一些实施方案中，逆转录病毒是慢病毒。
在一些实施方案中，逆转录病毒或慢病毒载体还包含一个或多个绝缘子元件，例如本文所述的绝缘子元件。在各种实施方案中，载体包含与编码外源性剂的多核苷酸可操作地连接的启动子。载体可以具有一个或多个LTR，其中任一个LTR包含一个或多个修饰，诸如一个或多个核苷酸取代、添加或缺失。载体还可包含一个或多个增加转导效率的辅助元件(例如，cPPT/FLAP)、病毒包装(例如，Psi(Y)包装信号，RRE)和/或增加外源基因表达的其他元件(例如，聚(A)序列)，并且可任选地包含WPRE或HPRE。在一些实施方案中，慢病毒核酸例如从5′至3′包含以下中的一种或多种(例如全部)：启动子(例如CMV)、R序列(例如包含TAR)、U5序列(例如用于整合)、PBS序列(例如用于逆转录)、DIS序列(例如用于基因组二聚化)、psi包装信号、部分gag序列、RRE序列(例如用于核输出)、cPPT序列(例如用于核输入)、驱动外源性剂表达的启动子、编码外源性剂的基因、WPRE序列(例如，用于有效的转基因表达)、PPT序列(例如，用于逆转录)、R序列(例如，用于聚腺苷酸化和终止)和U5信号(例如，用于整合)。
说明性慢病毒包括但不限于：HIV(人免疫缺陷病毒；包括HIV 1型和HIV 2型)；维士那-梅地病毒(VMV)病毒；山羊关节炎-脑炎病毒(CAEV)；马传染性贫血病毒(EIAV)；猫免疫缺陷病毒(FIV)；牛免疫缺陷病毒(BIV)；和猿猴免疫缺陷病毒(SIV)。在一些实施方案中，使用基于HIV的载体骨架(即HIV顺式作用序列元件)。慢病毒载体可包含含有结构和功能遗传元件或其部分的病毒载体或质粒，包括主要来源于慢病毒的LTR。
在实施方案中，慢病毒载体(例如，慢病毒表达载体)可包含慢病毒转移质粒(例如，作为裸DNA)或感染性慢病毒颗粒。关于诸如克隆位点、启动子、调控元件、异源核酸等的元件，应当理解这些元件的序列可以在慢病毒颗粒中以RNA形式存在，并且可以在DNA质粒中以DNA形式存在。
在实施方案中，慢病毒载体是具有足够的逆转录病毒遗传信息以允许在包装组分的存在下将RNA基因组包装到能够感染靶细胞的病毒颗粒中的载体。靶细胞的感染可以包括逆转录和整合到靶细胞基因组中。RLV通常携带非病毒编码序列，所述序列将由载体递送至靶细胞。在实施方案中，RLV不能在靶细胞内独立复制产生感染性逆转录病毒颗粒。通常，RLV缺乏功能性gag-pol和/或env基因和/或参与复制的其他基因。载体可以被配置为分裂内含子载体，例如，如PCT专利申请WO 99/15683中所述，所述申请通过引用整体并入本文。
在一些实施方案中，慢病毒载体包含最小的病毒基因组，例如，病毒载体已被操纵以去除非必需元件并保留必需元件，以便提供感染、转导和递送感兴趣的核苷酸序列至靶宿主细胞所需的功能，例如，如WO 98/17815中所述，所述专利通过引用整体并入本文。
最小慢病毒基因组可包含例如(5′)R-U5-一个或多个第一核苷酸序列-U3-R(3′)。然而，用于在源细胞中产生慢病毒基因组的质粒载体也可以包括可操作地连接至慢病毒基因组上以指导基因组在源细胞中的转录的转录调控控制序列。这些调控序列可包含与转录的逆转录病毒序列缔合的天然序列，例如5′U3区，或者它们可以包含异源启动子，诸如另一种病毒启动子，例如CMV启动子。一些慢病毒基因组包含促进有效病毒产生的额外序列。例如，在HIV的情况下，可包括rev和RRE序列。
在一些实施方案中，将罕见切割核酸内切酶以编码罕见切割核酸内切酶的核酸的形式引入到含有靶多核苷酸序列的细胞中。将核酸引入细胞中的过程可以通过任何合适的技术来实现。合适的技术包括磷酸钙或脂质介导的转染、电穿孔和使用病毒载体进行的转导或感染。在一些实施方案中，核酸包含DNA。在一些实施方案中，核酸包含如本文所述的修饰的DNA。在一些实施方案中，核酸包含mRNA。在一些实施方案中，核酸包含如本文所述的修饰的mRNA(例如，合成的修饰mRNA)。
本公开考虑以本领域技术人员可用的任何方式利用本公开的基因编辑系统(例如，CRISPR/Cas)来改变靶多核苷酸序列。可以使用能够改变细胞中的靶多核苷酸序列的任何CRISPR/Cas系统。此类CRISPR-Cas系统可以采用多种Cas蛋白(Haft等人PLoS ComputBiol.2005；1(6)e60)。此类Cas蛋白的允许CRISPR/Cas系统改变细胞中的靶多核苷酸序列的分子机制包括RNA结合蛋白、核酸内切酶和外切酶、解旋酶和聚合酶。在一些实施方案中，CRISPR/Cas系统是I型CRISPR系统。在一些实施方案中，CRISPR/Cas系统是II型CRISPR系统。在一些实施方案中，CRISPR/Cas系统是V型CRISPR系统。
本公开的CRISPR/Cas系统可用于改变细胞中的任何靶多核苷酸序列。本领域技术人员将容易理解，在任何特定细胞中待改变的期望的靶多核苷酸序列可以对应于基因组序列的表达与病症相关或以其他方式促进病原体进入细胞的任何基因组序列。例如，在细胞中改变的期望的靶多核苷酸序列可以是对应于含有疾病相关单多核苷酸多态性的基因组序列的多核苷酸序列。在此类实例中，本公开的CRISPR/Cas系统可用于通过用野生型等位基因替换细胞中的疾病相关SNP来校正所述疾病相关SNP。作为另一个实例，负责使病原体进入或增殖到细胞中的靶基因的多核苷酸序列可能是合适的靶标，所述靶标用于缺失或插入以破坏靶基因的功能，从而防止病原体进入细胞或在细胞内增殖。
在一些实施方案中，靶多核苷酸序列是基因组序列。在一些实施方案中，靶多核苷酸序列是人基因组序列。在一些实施方案中，靶多核苷酸序列是哺乳动物基因组序列。在一些实施方案中，靶多核苷酸序列是脊椎动物基因组序列。
在一些实施方案中，本公开的CRISPR/Cas系统包括Cas蛋白和能够将Cas蛋白引导至靶多核苷酸序列的靶基序并与其杂交的至少一种至两种核糖核酸。如本文所用，“蛋白质”和“多肽”可互换使用以指代通过肽键连接的一系列氨基酸残基(即，氨基酸的聚合物)，并且包括修饰的氨基酸(例如，磷酸化、糖化、糖基化等)和氨基酸类似物。示例性多肽或蛋白质包括基因产物、天然存在的蛋白质、上述项的同源物、旁系同源物、片段以及其他等效物、变体和类似物。
在一些实施方案中，Cas蛋白包含一个或多个氨基酸取代或修饰。在一些实施方案中，一个或多个氨基酸取代包括保守氨基酸取代。在一些情况下，取代和/或修饰可以防止或减少蛋白水解降解和/或延长多肽在细胞中的半衰期。在一些实施方案中，Cas蛋白可以包含肽键替换(例如，脲、硫脲、氨基甲酸酯、磺酰脲等)。在一些实施方案中，Cas蛋白可以包含天然存在的氨基酸。在一些实施方案中，Cas蛋白可以包含替代氨基酸(例如，D-氨基酸、β-氨基酸、同型半胱氨酸、磷酸丝氨酸等)。在一些实施方案中，Cas蛋白可以包含修饰以包括部分(例如，聚乙二醇化、糖基化、脂化、乙酰化、封端等)。
在一些实施方案中，Cas蛋白包含核心Cas蛋白、其同种型、或具有与任何Cas蛋白或其同种型类似的功能或活性的任何Cas样蛋白。在一些实施方案中，Cas蛋白包含核心Cas蛋白。示例性Cas核心蛋白包括但不限于Cas1、Cas2、Cas3、Cas4、Cas5、Cas6、Cas7、Cas8和Cas9。在一些实施方案中，Cas蛋白包含V型Cas蛋白。在一些实施方案中，Cas蛋白包含大肠杆菌(E.coli)亚型的Cas蛋白(也称为CASS2)。大肠杆菌亚型的示例性Cas蛋白包括但不限于Cse1、Cse2、Cse3、Cse4和Cas5e。在一些实施方案中，Cas蛋白包含Ypest亚型的Cas蛋白(也称为CASS3)。Ypest亚型的示例性Cas蛋白包括但不限于Csy1、Csy2、Csy3和Csy4。在一些实施方案中，Cas蛋白包含Nmeni亚型的Cas蛋白(也称为CASS4)。Nmeni亚型的示例性Cas蛋白包括但不限于Csn1和Csn2。在一些实施方案中，Cas蛋白包含Dvulg亚型的Cas蛋白(也称为CASS1)。Dvulg亚型的示例性Cas蛋白包括Csd1、Csd2和Cas5d。在一些实施方案中，Cas蛋白包含Tneap亚型的Cas蛋白(也称为CASS7)。Tneap亚型的示例性Cas蛋白包括但不限于Cst1、Cst2、Cas5t。在一些实施方案中，Cas蛋白包含Hmari亚型的Cas蛋白。Hmari亚型的示例性Cas蛋白包括但不限于Csh1、Csh2和Cas5h。在一些实施方案中，Cas蛋白包含Apern亚型的Cas蛋白(也称为CASS5)。Apern亚型的示例性Cas蛋白包括但不限于Csa1、Csa2、Csa3、Csa4、Csa5和Cas5a。在一些实施方案中，Cas蛋白包含Mtube亚型的Cas蛋白(也称为CASS6)。Mtube亚型的示例性Cas蛋白包括但不限于Csm1、Csm2、Csm3、Csm4和Csm5。在一些实施方案中，Cas蛋白包括RAMP模块Cas蛋白。示例性RAMP模块Cas蛋白包括但不限于Cmr1、Cmr2、Cmr3、Cmr4、Cmr5和Cmr6。参见，例如，Klompe等人，Nature 571，219-225(2019)；Strecker等人，Science 365，48-53(2019)。Cas蛋白的实例包括但不限于：Cas3、Cas8a、Cas5、Cas8b、Cas8c、Cas10d、Cse1、Cse2、Csy1、Csy2、Csy3和/或GSU0054。在一些实施方案中，Cas蛋白包括Cas3、Cas8a、Cas5、Cas8b、Cas8c、Cas10d、Cse1、Cse2、Csy1、Csy2、Csy3和/或GSU0054。Cas蛋白的实例包括但不限于：Cas9、Csn2和/或Cas4。在一些实施方案中，Cas蛋白包括Cas9、Csn2和/或Cas4。在一些实施方案中，Cas蛋白的实例包括但不限于：Cas10、Csm2、Cmr5、Cas10、Csx11和/或Csx10。在一些实施方案中，Cas蛋白包括Cas10、Csm2、Cmr5、Cas10、Csx11和/或Csx10。在一些实施方案中，Cas蛋白的实例包括但不限于：Csf1。在一些实施方案中，Cas蛋白包括Csf1。在一些实施方案中，Cas蛋白的实例包括但不限于：Cas12a、Cas12b、Cas12c、C2c4、C2c8、C2c5、C2c10和C2c9；以及CasX(Cas12e)和CasY(Cas12d)。另见，例如，Koonin等人，Curr Opin Microbiol.2017；37：67-78：“Diversity，classification andevolution of CRISPR-Cas systems”。在一些实施方案中，Cas蛋白包括Cas12a、Cas12b、Cas12c、Cas12d、Cas12e、Cas12d和/或Cas12e。在一些实施方案中，Cas蛋白包括Cas13、Cas13a、C2c2、Cas13b、Cas13c和/或Cas13d。在一些实施方案中，CRISPR/Cas系统包含选自由以下组成的组的Cas效应蛋白：a) Cas3、Cas8a、Cas5、Cas8b、Cas8c、Cas10d、Cse1、Cse2、Csyl、Csy2、Csy3和GSU0054；b)Cas9、Csn2和Cas4；c)Cas10、Csm2、Cmr5、Cas10、Csx11和Csx10；d)Csf1；e)Cas12a、Cas12b、Cas12c、C2c4、C2c8、C2c5、C2c10、C2c9、CasX(Cas12e)和CasY(Cas12d)；和f)Cas13、Cas13a、C2c2、Cas13b、Cas13c和Cas13d。
在一些实施方案中，Cas蛋白包括本文所述的Cas蛋白中的任一种或其功能部分。如本文所用，“功能部分”是指肽的一部分，其保留其与至少一种核糖核酸(例如，指导RNA(gRNA))复合并且切割靶多核苷酸序列的能力。在一些实施方案中，功能部分包含可操作地连接的Cas9蛋白功能结构域的组合，所述Cas9蛋白功能结构域选自由DNA结合结构域、至少一个RNA结合结构域、解旋酶结构域和核酸内切酶结构域组成的组。在一些实施方案中，功能部分包含可操作地连接的Cas12a(也称为Cpf1)蛋白功能结构域的组合，所述Cas12a蛋白功能结构域选自由DNA结合结构域、至少一个RNA结合结构域、解旋酶结构域和核酸内切酶结构域组成的组。在一些实施方案中，功能结构域形成复合物。在一些实施方案中，Cas9蛋白的功能部分包含RuvC样结构域的功能部分。在一些实施方案中，Cas9蛋白的功能部分包含HNH核酸酶结构域的功能部分。在一些实施方案中，Cas12a蛋白的功能部分包含RuvC样结构域的功能部分。
在一些实施方案中，可以将外源Cas蛋白以多肽形式引入到细胞中。在某些实施方案中，可以将Cas蛋白缀合或融合至细胞穿透多肽或细胞穿透肽。如本文所用，“细胞穿透多肽”和“细胞穿透肽”分别指代促进分子摄取到细胞中的多肽或肽。细胞穿透多肽可以含有可检测标记。
在许多实施方案中，可以将Cas蛋白缀合或融合至带电蛋白(例如，其携带正电荷、负电荷或整体中性电荷)。这种连接可以是共价的。在一些实施方案中，可以将Cas蛋白融合至超正电荷GFP以显著增加Cas蛋白穿透细胞的能力(Cronican等人ACS Chem Biol.2010；5(8)：747-52)。在某些实施方案中，可以将Cas蛋白融合至蛋白转导结构域(PTD)以促进其进入细胞。示例性PTD包括Tat、寡精氨酸和穿透肽。在一些实施方案中，Cas9蛋白包含融合至细胞穿透肽的Cas9多肽。在一些实施方案中，Cas9蛋白包含融合至PTD的Cas9多肽。在一些实施方案中，Cas9蛋白包含融合至tat结构域的Cas9多肽。在一些实施方案中，Cas9蛋白包含融合至寡精氨酸结构域的Cas9多肽。在一些实施方案中，Cas9蛋白包含融合至穿透肽结构域的Cas9多肽。在一些实施方案中，Cas9蛋白包含融合至超正电荷GFP的Cas9多肽。在一些实施方案中，Cas12a蛋白包含融合至细胞穿透肽的Cas12a多肽。在一些实施方案中，Cas12a蛋白包含融合至PTD的Cas12a多肽。在一些实施方案中，Cas12a蛋白包含融合至tat结构域的Cas12a多肽。在一些实施方案中，Cas12a蛋白包含融合至寡精氨酸结构域的Cas12a多肽。在一些实施方案中，Cas12a蛋白包含融合至穿透肽结构域的Cas12a多肽。在一些实施方案中，Cas12a蛋白包含融合至超正电荷GFP的Cas12a多肽。
在一些实施方案中，可以将Cas蛋白以编码Cas蛋白的核酸的形式引入到含有靶多核苷酸序列的细胞中。将核酸引入细胞中的过程可以通过任何合适的技术来实现。合适的技术包括磷酸钙或脂质介导的转染、电穿孔和使用病毒载体进行的转导或感染。在一些实施方案中，核酸包含DNA。在一些实施方案中，核酸包含如本文所述的修饰的DNA。在一些实施方案中，核酸包含mRNA。在一些实施方案中，核酸包含如本文所述的修饰的mRNA(例如，合成的修饰mRNA)。
在一些实施方案中，Cas蛋白与一种至两种核糖核酸复合。在一些实施方案中，Cas蛋白与两种核糖核酸复合。在一些实施方案中，Cas蛋白与一种核糖核酸复合。在一些实施方案中，Cas蛋白由如本文所述的修饰的核酸(例如，合成的修饰mRNA)编码。
本公开的方法考虑使用能够将Cas蛋白引导至靶多核苷酸序列的靶基序并与其杂交的任何核糖核酸。在一些实施方案中，至少一种核糖核酸包含tracrRNA。在一些实施方案中，至少一种核糖核酸包含CRISPR RNA(crRNA)。在一些实施方案中，单个核糖核酸包含将Cas蛋白引导至细胞中的靶多核苷酸序列的靶基序并与其杂交的指导RNA。在一些实施方案中，至少一种核糖核酸包含将Cas蛋白引导至细胞中的靶多核苷酸序列的靶基序并与其杂交的指导RNA。在一些实施方案中，一种至两种核糖核酸均包含将Cas蛋白引导至细胞中的靶多核苷酸序列的靶基序并与其杂交的指导RNA。如本领域技术人员将理解的，可以选择本公开的核糖核酸与多种不同的靶基序杂交，这取决于采用的特定CRISPR/Cas系统和靶多核苷酸的序列。还可以选择一种至两种核糖核酸以最大程度的减少与除靶多核苷酸序列之外的核酸序列的杂交。在一些实施方案中，当与细胞中的所有其他基因组核苷酸序列相比时，一种至两种核糖核酸与含有至少两个错配的靶基序杂交。在一些实施方案中，当与细胞中的所有其他基因组核苷酸序列相比时，一种至两种核糖核酸与含有至少一个错配的靶基序杂交。在一些实施方案中，一种至两种核糖核酸被设计成与紧邻被Cas蛋白识别的脱氧核糖核酸基序的靶基序杂交。在一些实施方案中，一种至两种核糖核酸中的每一种被设计成与紧邻被Cas蛋白识别的脱氧核糖核酸基序的靶基序杂交，所述脱氧核糖核酸基序侧接位于靶基序之间的突变体等位基因。
在一些实施方案中，一种至两种核糖核酸中的每一种包含将Cas蛋白引导至细胞中的靶多核苷酸序列的靶基序并与其杂交的指导RNA。
在一些实施方案中，一种或两种核糖核酸(例如，指导RNA)与靶多核苷酸序列的同一链上的序列互补和/或杂交。在一些实施方案中，一种或两种核糖核酸(例如，指导RNA)与靶多核苷酸序列的相反链上的序列互补和/或杂交。在一些实施方案中，一种或两种核糖核酸(例如，指导RNA)不与靶多核苷酸序列的相反链上的序列互补和/或杂交。在一些实施方案中，一种或两种核糖核酸(例如，指导RNA)与靶多核苷酸序列的重叠靶基序互补和/或杂交。在一些实施方案中，一种或两种核糖核酸(例如，指导RNA)与靶多核苷酸序列的偏移靶基序互补和/或杂交。
在一些实施方案中，经由病毒转导(例如，慢病毒转导)将编码Cas蛋白的核酸和编码至少一种至两种核糖核酸的核酸引入到细胞中。在一些实施方案中，Cas蛋白与1-2种核糖核酸复合。在一些实施方案中，Cas蛋白与两种核糖核酸复合。在一些实施方案中，Cas蛋白与一种核糖核酸复合。在一些实施方案中，Cas蛋白由如本文所述的修饰的核酸(例如，合成的修饰mRNA)编码。
可用于本文所述的基于CRISPR/Cas的基因靶向的示例性gRNA序列在表15中提供。所述序列可见于2016年5月9日提交的WO2016183041，包括表、附录和序列表的公开内容通过引用整体并入本文。
表15.可用于靶向基因的示例性gRNA序列
可用于本文所述的基于CRISPR/Cas的基因靶向的其他示例性gRNA序列在2021年5月19日提交的美国临时专利申请号63/190,685和2021年7月14日提交的美国临时专利申请号63/221,887中提供，包括表、附录和序列表的公开内容通过引用整体并入本文。
在一些实施方案中，本技术的细胞使用转录活化因子样效应物核酸酶(TALEN)方法来制备。
“TALE核酸酶”(TALEN)意指由通常来源于转录活化因子样效应物(TALE)的核酸结合结构域和一个核酸酶催化结构域组成的用以切割核酸靶序列的融合蛋白。催化结构域优选地是核酸酶结构域，并且更优选地是具有核酸内切酶活性的结构域，例如I-TevI、ColE7、NucA和Fok-I。在多个实施方案中，可以将TALE结构域融合至大范围核酸酶，例如I-CreI和I-Onul或其功能变体。在更优选的实施方案中，所述核酸酶是单体TALE核酸酶。单体TALE核酸酶是不需要二聚化来进行特异性识别和切割的TALE核酸酶，诸如在WO2012138927中描述的工程化TAL重复序列与I-TevI的催化结构域的融合物。转录活化因子样效应物(TALE)是来自细菌物种黄单胞菌属(Xanthomonas)的蛋白质，其包含多个重复序列，每个重复序列包含对核酸靶向序列的每个核苷酸碱基具有特异性的位置12和13中的二残基(RVD)。具有相似模块化逐碱基核酸结合性质(MBBBD)的结合结构域也可以来源于申请人最近在不同细菌物种中发现的新模块化蛋白。新模块化蛋白具有比TAL重复序列显示更多序列可变性的优势。优选地，与识别不同核苷酸相关的RVD是用于识别C的HD；用于识别T的NG；用于识别A的NI；用于识别G或A的NN；用于识别A、C、G或T的NS；用于识别T的HG；用于识别T的IG；用于识别G的NK；用于识别C的HA；用于识别C的ND；用于识别C的HI；用于识别G的HN；用于识别G的NA；用于识别G或A的SN；和用于识别T的YG；用于识别A的TL；用于识别A或G的VT；以及用于识别A的SW。在另一个实施方案中，关键氨基酸12和13可以向其他氨基酸残基突变，以便调节其对核苷酸A、T、C和G的特异性，特别是增强这种特异性。TALEN套件在商业上出售。
在一些实施方案中，使用锌指核酸酶(ZFN)对细胞进行操作。“锌指结合蛋白”是一种由于通过锌离子的配位稳定蛋白质结构而优选地以序列特异性方式结合DNA、RNA和/或蛋白质的蛋白质或多肽。术语锌指结合蛋白通常缩写为锌指蛋白或ZFP。单个DNA结合结构域通常被称为“指”。ZFP具有至少一个指，通常具有两个指、三个指或六个指。每个指结合两个至四个DNA碱基对，通常是三个或四个DNA碱基对。ZFP与被称为靶位点或靶区段的核酸序列结合。每个指通常包含大约30个氨基酸的锌螯合DNA结合亚结构域。研究表明，这类单个锌指由含有与锌配位的两个不变组氨酸残基的α螺旋以及单个β转角的两个半胱氨酸残基组成(参见，例如，Berg&Shi，Science 271：1081-1085(1996))。
在一些实施方案中，本公开的细胞使用归巢核酸内切酶来制备。此类归巢核酸内切酶是本领域众所周知的(Stoddard 2005)。归巢核酸内切酶识别DNA靶序列并生成单链或双链断裂。归巢核酸内切酶具有高度特异性，识别长度范围为12个至45个碱基对(bp)、通常长度范围为14bp至40bp的DNA靶位点。根据本技术的归巢核酸内切酶可例如对应于LAGLIDADG核酸内切酶、HNH核酸内切酶或GIY-YIG核酸内切酶。根据本公开的优选归巢核酸内切酶可以是I-CreI变体。
在一些实施方案中，本技术的细胞使用大范围核酸酶来制备。按照定义，大范围核酸酶是识别大序列的序列特异性核酸内切酶(Chevalier，B.S.和B.L.Stoddard，NucleicAcids Res.，2001，29，3757-3774)。它们可以切割活细胞中的独特位点，从而将切割位点附近的基因靶向增强1000倍或更多(Puchta等人，Nucleic Acids Res.，1993，21，5034-5040；Rouet等人，Mol.Cell.Biol.，1994，14，8096-8106；Choulika等人，Mol.Cell.Biol.，1995，15，1968-1973；Puchta等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，1996，93，5055-5060；Sargent等人，Mol.Cell.Biol.，1997，17，267-77；Donoho等人，Mol.Cell.Biol，1998，18，4070-4078；Elliott等人，Mol.Cell.Biol.，1998，18，93-101；Cohen-Tannoudji等人，Mol.Cell.Biol.，1998，18，1444-1448)。
在一些实施方案中，使用RNA沉默或RNA干扰(RNAi)敲低(例如，降低、消除或抑制)多肽(诸如致耐受因子)的表达以制备本技术的细胞。可用的RNAi方法包括利用合成RNAi分子、短干扰RNA(siRNA)、PIWI相互作用NRA(piRNA)、短发夹RNA(shRNA)、微小RNA(miRNA)的方法以及本领域技术人员认可的其他瞬时敲低方法。包括序列特异性shRNA、siRNA、miRNA等的用于RNAi的试剂是可商购获得的。例如，通过将CIITA siRNA引入到细胞中或将表达CIITA shRNA的病毒转导到细胞中，可以在多能干细胞中敲低CIITA。在一些实施方案中，采用RNA干扰来降低或抑制选自由CIITA、B2M、NLRC5、TCR-α和TCR-β组成的组的至少一种的表达。
在一些实施方案中，本文提供的细胞经遗传修饰以降低一种或多种免疫因子(包括靶多肽)的表达以产生免疫豁免或低免疫原性细胞。在某些实施方案中，本文公开的细胞(例如，干细胞、诱导性多能干细胞、分化细胞、造血干细胞、原代T细胞和CAR-T细胞)包含一种或多种遗传修饰以降低一种或多种靶多核苷酸的表达。此类靶多核苷酸和多肽的非限制性实例包括CIITA、B2M、NLRC5、CTLA-4、PD-1、HLA-A、HLA-BM、HLA-C、RFX-ANK、NFY-A、RFX5、RFX-AP、NFY-B、NFY-C、IRF1和TAP1。
在一些实施方案中，使用CRISPR/Cas系统进行遗传修饰。通过调节(例如，降低或缺失)一个或多个靶多核苷酸的表达，此类细胞在植入到受体受试者中时表现出降低的免疫活化。在一些实施方案中，细胞被认为是低免疫原性的，例如，在施用时在受体受试者或患者中。
I.基因编辑系统
在一些实施方案中，用于遗传修饰细胞以敲除、敲低或以其他方式修饰一个或多个基因的方法包括使用定点核酸酶，包括例如锌指核酸酶(ZFN)、转录活化因子样效应物核酸酶(TALEN)、大范围核酸酶、转座酶和成簇规律间隔短回文重复序列(CRISPR)/Cas系统，以及本领域已知的切口酶系统、碱基编辑系统、引物编辑系统和基因编写系统。
i.ZFN
ZFN是包含一系列位点特异性DNA结合结构域的融合蛋白，所述结构域改编自附接至细菌FokI限制酶的核酸内切酶结构域的含锌指转录因子。ZFN可具有一个或多个(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个或更多个)DNA结合结构域或锌指结构域。参见，例如，Carroll等人，Genetics Societof America(2011)188：773-782；Kim等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1996)93：1156-1160。每个锌指结构域都是被一个或多个锌离子稳定的小蛋白质结构基序，并且通常识别3至4bp的DNA序列。因此，串联结构域可以潜在地与细胞基因组中独特的延伸核苷酸序列结合。
可以组合特异性已知的各种锌指以产生识别约6、9、12、15或18bp序列的多指多肽。各种选择和模块化组装技术可用于生成识别特定序列的锌指(及其组合)，包括噬菌体展示、酵母单杂交系统、细菌单杂交和双杂交系统以及哺乳动物细胞。可以对锌指进行工程化以结合预定的核酸序列。工程化锌指以结合预定核酸序列的标准是本领域已知的。参见，例如，Sera等人，Biochemistry(2002)41：7074-7081；Liu等人，Bioinformatics(2008)24：1850-1857。
含有FokI核酸酶结构域或其他二聚核酸酶结构域的ZFN用作二聚体。因此，需要一对ZFN来靶向非回文DNA位点。两个单独的ZFN必须通过适当间隔开的核酸酶结合DNA的相反链。参见Bitinaite等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1998)95：10570-10575。为了切割基因组中的特定位点，设计了一对ZFN以识别侧接所述位点的两个序列，一个在正向链上，而另一个在反向链上。当ZFN在所述位点的任一侧结合后，核酸酶结构域二聚化并且切割所述位点处的DNA，从而生成具有5′突出端的DSB。然后可以借助含有被同源臂侧接的期望突变的修复模板，利用HDR来引入特定突变。修复模板通常是引入到细胞中的外源双链DNA载体。参见Miller等人，Nat.Biotechnol.(2011)29：143-148；Hockemeyer等人，Nat.Biotechnol.(2011)29：731-734。
ii.TALEN
TALEN是可以用于编辑靶基因的人工核酸酶的另一个实例。TALEN来源于被称为TALE重复序列的DNA结合结构域，它通常包含具有10至30个重复序列的串联阵列，所述重复序列结合并识别延伸的DNA序列。每个重复序列长度为33至35个氨基酸，两个相邻的氨基酸(称为重复可变双残基或RVD)赋予四个DNA碱基对之一的特异性。因此，重复序列与靶DNA序列中的碱基对之间存在一一对应关系。
通过将一个或多个TALE DNA结合结构域(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个或更多个)融合至核酸酶结构域(例如FokI核酸内切酶结构域)而人工产生TALEN。参见Zhang，Nature Biotech.(2011)29：149-153。为了在TALEN中使用，已经对FokI进行了若干种突变；例如，这些改善了切割特异性或活性。参见Cermak等人，Nucl.Acids Res.(2011)39：e82；Miller等人，Nature Biotech.(2011)29：143-148；Hockemeyer等人，Nature Biotech.(2011)29：731-734；Wood等人，Science(2011)333：307；Doyon等人，Nature Methods(2010)8：74-79；Szczepek等人，Nature Biotech(2007)25：786-793；Guo等人，J.Mol.Biol.(2010)200：96。FokI结构域用作二聚体，需要具有独特的DNA结合结构域的两个构建体，用于靶基因组中的具有正确的方向和间距的位点。TALE DNA结合结构域与FokI核酸酶结构域之间的氨基酸残基数量以及两个单独的TALEN结合位点之间的碱基数量似乎都是实现高水平活性的重要参数。Miller等人，Nature Biotech.(2011)29：143-148。
通过将工程化TALE重复序列与核酸酶结构域相组合，可以产生对任何期望的DNA序列具有特异性的位点特异性核酸酶。与ZFN类似，可以将TALEN引入到细胞中以在基因组中的期望靶位点生成DSB，因此TALEN可以用于以类似的HDR介导的途径敲除基因或敲入突变。参见Boch，Nature Biotech.(2011)29：135-136；Boch等人，Science(2009)326：1509-1512；Moscou等人，Science(2009)326：3501。
iii.大范围核酸酶
大范围核酸酶是内切核酸酶家族中的酶，其特征在于它们能够识别并切割大DNA序列(14至40个碱基对)。基于大范围核酸酶的影响核酸酶活性和/或DNA识别的结构基序，将大范围核酸酶分为多个家族。最广泛和最有名的大范围核酸酶是LAGLIDADG家族中的蛋白质，其名称来源于保守的氨基酸序列。参见Chevalier等人，Nucleic Acids Res.(2001)29(18)：3757-3774。另一方面，GIY-YIG家族成员具有GIY-YIG模块，其长度为70-100个残基，并且包括具有四个不变残基的四个或五个保守序列基序，其中两个是活性所需的。参见Van Roey等人，Nature Struct.Biol.(2002)9：806-811。His-Cys家族大范围核酸酶的特征在于在涵盖数百个氨基酸残基的区域中的一系列高度保守的组氨酸和半胱氨酸。参见Chevalier等人，Nucleic Acids Res.(2001)29(18)：3757-3774。NHN家族的成员由含有被天冬酰胺残基包围的两对保守组氨酸的基序定义。参见Chevalier等人，Nucleic AcidsRes.(2001)29(18)：3757-3774。
由于高特异性要求，鉴定特定靶DNA序列的天然大范围核酸酶的机会较低，因此已使用各种方法(包括诱变和高通量筛选方法)来创建识别独特序列的大范围核酸酶变体。用于对具有改变的DNA结合特异性的大范围核酸酶进行工程化(例如以结合预定核酸序列)的策略是本领域已知的。参见，例如，Chevalier等人，Mol.Cell.(2002)10：895-905；Epinat等人，Nucleic Acids Res(2003)31：2952-2962；Silva等人，J Mol.Biol.(2006)361：744-754；Seligman等人，Nucleic Acids Res (2002)30：3870-3879；Sussman等人，J Mol Biol(2004)342：31-41；Doyon等人，J Am Chem Soc(2006)128：2477-2484；Chen等人，ProteinEng Des Sel(2009)22：249-256；Amould等人，J Mol Biol.(2006)355∶443-458；Smith等人，Nucleic Acids Res.(2006)363(2)：283-294。
与ZFN和TALEN一样，大范围核酸酶可以在基因组DNA中产生DSB，如果修复不当(例如，经由NHEJ)，它可以产生移码突变，从而导致靶基因在细胞中的表达降低。或者，可以将外来DNA与大范围核酸酶一起引入到细胞中。根据外来DNA的序列和染色体序列，此过程可用于修饰靶基因。参见Silva等人，Current Gene Therapy (2011)11：11-27。
iv.转座酶
转座酶是结合转座子的末端并且通过剪切和粘贴机制或复制性转座机制催化其移动到基因组另一部分的酶。通过将转座酶连接至其他系统(诸如CRISPER/Cas系统)，可以开发新的基因编辑工具以实现基因组DNA的位点特异性插入或操作。有两种已知的使用转座子的DNA整合方法，其使用催化无活性的Cas效应蛋白和Tn7样转座子。转座酶依赖性DNA整合不在基因组中引发DSB，这可以保证更安全和更具特异性的DNA整合。
v.CRISPR/Cas系统
CRISPR系统作为提供一种获得性免疫的参与防御入侵噬菌体和质粒的系统最初在原核生物(例如，细菌和古细菌)中发现。现在它已被改编并用作研究和临床应用中流行的基因编辑工具。
CRISPR/Cas系统通常包含至少两种组件：一个或多个指导RNA(gRNA)和Cas蛋白。Cas蛋白是一种将DSB引入到靶位点中的核酸酶。CRISPR-Cas系统有两大类：1类系统使用多种Cas蛋白的复合物来降解核酸；2类系统使用单个大Cas蛋白来达到相同目的。1类分为I、III和IV型；2类分为II、V和VI型。适用于基因编辑应用的不同Cas蛋白包括但不限于Cas3、Cas4、Cas5、Cas8a、Cas8b、Cas8c、Cas9、Cas10、Cas12、Cas12a(Cpf1)、Cas12b(C2c1)、Cas12c(C2c3)、Cas12d(CasY)、Cas12e(CasX)、Cas12f(C2c10)、Cas12g、Cas12h、Cas12i、Cas12k(C2c5)、Cas13、Cas13a(C2c2)、Cas13b、Cas13c、Cas13d、C2c4、C2c8、C2c9、Cmr5、Cse1、Cse2、Csf1、Csm2、Csn2、Csx10、Csx11、Csyl、Csy2、Csy3和Mad7。最广泛使用的Cas9在本文中被描述为说明性的。这些Cas蛋白可来源于不同的来源物种。例如，Cas9可以来源于化脓性链球菌(S.pyogenes)或金黄色葡萄球菌(S.aureus)。
在原始微生物基因组中，II型CRISPR系统将来自入侵DNA的序列掺入到宿主基因组内编码为阵列的CRISPR重复序列之间。来自CRISPR重复序列阵列的转录物被加工成CRISPR RNA(crRNA)，每个都具有从入侵DNA转录的可变序列(称为“原间隔”序列)，以及CRISPR重复序列的一部分。每个crRNA与第二反式活化CRISPR RNA(tracrRNA)杂交，并且这两个RNA与Cas9核酸酶形成复合物。crRNA的原间隔编码部分指导Cas9复合物切割互补的靶DNA序列，前提条件是它们与被称为“原间隔相邻基序”(PAM)的短序列相邻。
自发现以来，CRISPR系统已被改编用于在从细菌到真核细胞(包括人类细胞)的广泛细胞和生物体中诱导序列特异性DSB和靶向基因组编辑。在基因编辑应用的用途中，人工设计的合成gRNA已经替代了原始的crRNA：tracrRNA复合物。例如，gRNA可以是由crRNA、四环和tracrRNA构成的单一指导RNA(sgRNA)。crRNA通常包含互补区域(也称为间隔子，长度通常为约20个核苷酸)，其经过用户设计以识别感兴趣的靶DNA。tracrRNA序列包含用于Cas核酸酶结合的支架区域。crRNA序列和tracrRNA序列通过四环连接，每个都具有用于彼此杂交的短重复序列，因此生成嵌合sgRNA。可以通过简单地改变gRNA中存在的间隔子或互补区域序列来改变Cas核酸酶的基因组靶标。互补区域将通过标准的RNA-DNA互补碱基配对规则将Cas核酸酶引导至靶DNA位点。
为了使Cas核酸酶发挥作用，紧邻基因组DNA中的靶序列的下游必须有PAM的存在。Cas蛋白对PAM的识别被认为会破坏相邻基因组序列的稳定性，从而允许gRNA询问序列并且在存在匹配序列时导致gRNA-DNA配对。PAM的特定序列因Cas基因的种类而异。例如，最常用的来源于化脓性链球菌的Cas9核酸酶识别5′-NGG-3′的PAM序列，或者以较低的效率识别5′-NAG-3′，其中“N”可以是任何核苷酸。具有替代PAM的其他Cas核酸酶变体也已经表征并成功用于基因组编辑，所述变体总结在下表16中。
表16.示例性Cas核酸酶变体及其PAM序列
R＝A或G；Y＝C或T；W＝A或T；V＝A或C或G；N＝任何碱基
在一些实施方案中，Cas核酸酶可包含一个或多个突变以改变它们的活性、特异性、识别和/或其他特征。例如，Cas核酸酶可具有一个或多个突变，所述突变改变其保真度以减轻脱靶效应(例如，SpCas9的eSpCas9、SpCas9-HF 1、HypaSpCas9、HeFSpCas9和evoSpCas9高保真变体)。再例如，Cas核酸酶可具有一个或多个改变其PAM特异性的突变。6.切口酶
Cas(特别是Cas9)的核酸酶结构域，核酸酶可以独立突变以生成被称为DNA“切口酶”的酶。切口酶能够通过与常规CRISPR/Cas核酸酶系统(包括例如CRISPR/Cas9)相同的特异性引入单链切割。切口酶可用于生成可用于基因编辑系统的双链断裂(Mali等人，NatBiotech，31(9)：833-838(2013)；Mali等人Nature Methods，10：957-963(2013)；Mali等人，Science，339(6121)：823-826(2013))。在一些情况下，当使用两种Cas切口酶时，在每个切割末端上会产生长突出端而不是平末端，这允许对精确基因整合和插入进行额外控制(Mali等人，Nat Biotech，31(9)：833-838(2013)；Mali等人Nature Methods，10：957-963(2013)；Mali等人，Science，339(6121)：823-826(2013))。由于两种切口Cas酶必须有效地切割其靶DNA，因此与基于双链切割Cas的系统相比，配对的切口酶可以具有更低的脱靶效应(Ran等人，Cell，155(2)：479-480(2013)；Mali等人，Nat Biotech，31(9)：833-838(2013)；Mali等人Nature Methods，10：957-963(2013)；Mali等人，Science，339(6121)：823-826(2013))。
S.致耐受因子和/或嵌合抗原受体的重组表达方法
对于所有这些技术，使用众所周知的重组技术来生成如本文所概述的重组核酸。在某些实施方案中，编码致耐受因子或嵌合抗原受体的重组核酸可与表达构建体中的一个或多个调控核苷酸序列可操作地连接。调控核苷酸序列通常适用于待治疗的宿主细胞和受体受试者。对于多种宿主细胞，多种类型的适当的表达载体和合适的调控序列是本领域已知的。通常，一种或多种调控核苷酸序列可包括但不限于启动子序列、前导或信号序列、核糖体结合位点、转录起始和终止序列、翻译起始和终止序列以及增强子或活化因子序列。还考虑了本领域已知的组成型或诱导型启动子。启动子可以是天然存在的启动子、组合了超过一个启动子的元件的杂合启动子、或合成启动子。表达构建体可存在于细胞中的附加体(诸如质粒)上，或者表达构建体可插入到染色体中，诸如基因座中。在一些实施方案中，表达载体包括可选择的标记基因以允许选择转化的宿主细胞。一些实施方案包括这样的表达载体，其包含编码变体多肽的核苷酸序列，所述核苷酸序列与至少一个调控序列可操作地连接。本文使用的调控序列包括启动子、增强子和其他表达控制元件。在一些实施方案中，表达载体被设计用于选择待转化的宿主细胞、期望表达的特定变体多肽、载体的拷贝数、控制该拷贝数的能力和/或载体编码的任何其他蛋白质(诸如抗生素标志物)的表达。
合适的哺乳动物启动子的实例包括例如来自以下基因的启动子：延伸因子1α(EF1α)启动子、CAG启动子、仓鼠的泛素/S27a启动子(WO 97/15664)、猿猴空泡病毒40(SV40)早期启动子、腺病毒主要晚期启动子、小鼠金属硫蛋白-I启动子、劳斯肉瘤病毒(RSV)的长末端重复区、小鼠乳腺肿瘤病毒启动子(MMTV)、莫洛尼氏鼠白血病病毒长末端重复区和人巨细胞病毒(CMV)早期启动子。其他异源哺乳动物启动子的实例是肌动蛋白、免疫球蛋白或热休克启动子。在额外的实施方案中，用于哺乳动物宿主细胞的启动子可以从病毒的基因组获得，所述病毒诸如多瘤病毒、禽痘病毒(1989年7月5日公开的UK 2,211,504)、牛乳头瘤病毒、禽肉瘤病毒、巨细胞病毒、逆转录病毒、乙型肝炎病毒和猿猴病毒40(SV40)。在其他实施方案中，使用异源哺乳动物启动子。实例包括肌动蛋白启动子、免疫球蛋白启动子和热休克启动子。SV40的早期和晚期启动子作为同样含有SV40病毒复制起点的SV40限制性片段方便地获得(Fiers等人，Nature 273：113-120(1978))。人巨细胞病毒的即刻早期启动子作为HindIII限制酶片段方便地获得(Greenaway等人，Gene 18：355-360(1982))。前述参考文献通过引用整体并入。
在一些实施方案中，表达载体是双顺反子或多顺反子表达载体。双顺反子或多顺反子表达载体可包括(1)与每个开放阅读框融合的多个启动子；(2)基因之间的剪接信号的插入；(3)表达受单个启动子驱动的基因的融合；和(4)基因之间的蛋白水解切割位点(自切割肽)的插入或基因之间的内部核糖体进入位点(IRES)的插入。
将本文所述的多核苷酸引入到细胞中的过程可以通过任何合适的技术来实现。合适的技术包括磷酸钙或脂质介导的转染、电穿孔、融合原和使用病毒载体进行的转导或感染。在一些实施方案中，经由病毒转导(例如，AAV转导、慢病毒转导)或者以其他方式在病毒载体上递送(例如，融合原介导的递送)，将多核苷酸引入到细胞中。在一些实施方案中，经由融合原介导的递送或选自由以下组成的组的转座酶系统将多核苷酸引入到细胞中：条件性或诱导型转座酶、条件性或诱导型PiggyBac转座子、条件性或诱导型睡美人(SB11)转座子、条件性或诱导型Mos1转座子和条件性或诱导型Tol2转座子。
在一些实施方案中，本文提供的细胞经遗传修饰以包括插入到低免疫原性细胞的一个或多个基因组基因座中的一种或多种外源多核苷酸。在一些实施方案中，外源多核苷酸编码感兴趣的蛋白质，例如嵌合抗原受体。可以使用任何合适的方法将外源多核苷酸插入到低免疫原性细胞的基因组基因座中，所述方法包括本文所述的基因编辑方法(例如，CRISPR/Cas系统)。在一些实施方案中，使用病毒转导(例如使用载体)将外源多核苷酸插入到细胞的至少一个等位基因中。在一些实施方案中，载体是携带外源多核苷酸的假型化、自灭活慢病毒载体。在一些实施方案中，载体是用水疱性口炎VSV-G包膜假型化的自灭活慢病毒载体，并携带外源多核苷酸。在一些实施方案中，使用病毒转导将外源多核苷酸插入到细胞的至少一个等位基因中。在一些实施方案中，使用基于慢病毒的病毒载体将外源多核苷酸插入到细胞的至少一个等位基因中。
与通常涉及活化细胞(诸如活化T细胞(例如，CD8+T细胞))的将本文所述的多核苷酸引入到细胞中的某些方法不同，可以利用合适的技术将多核苷酸引入到非活化T细胞中。合适的技术包括但不限于用一种或多种结合CD3、CD8和/或CD28的抗体或其可以或不可以结合珠子的片段或部分(例如，scFv和VHH)来活化T细胞(CD8+T细胞)。令人惊讶的是，融合原介导的将多核苷酸引入到T细胞中是在非活化T细胞(例如，CD8+T细胞)中执行的，所述细胞先前未接触过一种或多种活化抗体或其片段或部分(例如，CD3、CD8和/或CD28)。在一些实施方案中，融合原介导的将多核苷酸引入到T细胞中是在体内进行的(例如，在T细胞已经被施用于受试者之后)。在其他实施方案中，融合原介导的将多核苷酸引入到T细胞中是在体外进行的(例如，在T细胞被施用于受试者之前)。
本文提供了非活化T细胞，其相对于野生型T细胞包含降低的HLA-A、HLA-B、HLA-C、HLA-DP、HLA-DQ、HLA-DR、B2M、CIITA、TCR-α和/或TCR-β的表达，其中非活化T细胞还包含编码嵌合抗原受体(CAR)的第一外源多核苷酸。
在一些实施方案中，非活化T细胞未用抗CD3抗体、抗CD28抗体、T细胞活化细胞因子或可溶性T细胞共刺激分子处理。在一些实施方案中，非活化T细胞不表达活化标志物。在一些实施方案中，非活化T细胞表达CD3和CD28，并且其中CD3和/或CD28是无活性的。
在一些实施方案中，抗CD3抗体是OKT3。在一些实施方案中，抗CD28抗体是CD28.2。在一些实施方案中，T细胞活化细胞因子选自由IL-2、IL-7、IL-15和IL-21组成的T细胞活化细胞因子组。在一些实施方案中，可溶性T细胞共刺激分子选自由抗CD28抗体、抗CD80抗体、抗CD86抗体、抗CD137L抗体和抗ICOS-L抗体组成的可溶性T细胞共刺激分子组。
在一些实施方案中，非活化T细胞是原代T细胞。在其他实施方案中，非活化T细胞从本公开的低免疫原性细胞分化。在一些实施方案中，T细胞是CD8+T细胞。
在一些实施方案中，第一外源多核苷酸编码选自由CD19特异性CAR和CD22特异性CAR组成的组的CAR。
在一些实施方案中，第一和/或第二外源多核苷酸由病毒载体(包括慢病毒载体)携带。在一些实施方案中，第一和/或第二外源多核苷酸由包含CD8结合剂的慢病毒载体携带。在一些实施方案中，使用融合原介导的递送或选自由以下组成的组的转座酶系统将第一和/或第二外源多核苷酸引入到细胞中：条件性或诱导型转座酶、条件性或诱导型PiggyBac转座子、条件性或诱导型睡美人(SB11)转座子、条件性或诱导型Mos1转座子和条件性或诱导型Tol2转座子。
在一些实施方案中，非活化T细胞还包含编码CD47的第二外源多核苷酸。在一些实施方案中，将第一和/或第二外源多核苷酸插入到T细胞的至少一个等位基因的特定基因座中。在一些实施方案中，特定基因座选自由以下组成的组：安全港或靶标基因座、靶标基因座、B2M基因座、CIITA基因座、TRAC基因座和TRB基因座。在一些实施方案中，将编码CD47的第二外源多核苷酸插入到选自由以下组成的组的特定基因座中：安全港或靶标基因座、靶标基因座、B2M基因座、CIITA基因座、TRAC基因座和TRB基因座。在一些实施方案中，将编码CAR的第一外源多核苷酸插入到选自由以下组成的组的特定基因座中：安全港或靶标基因座、靶标基因座、B2M基因座、CIITA基因座、TRAC基因座和TRB基因座。在一些实施方案中，将编码CD47的第二外源多核苷酸和编码CAR的第一外源多核苷酸插入到不同的基因座中。在一些实施方案中，将编码CD47的第二外源多核苷酸和编码CAR的第一外源多核苷酸插入到相同的基因座中。在一些实施方案中，将编码CD47的第二外源多核苷酸和编码CAR的第一外源多核苷酸插入到B2M基因座中。在一些实施方案中，将编码CD47的第二外源多核苷酸和编码CAR的第一外源多核苷酸插入到CIITA基因座中。在一些实施方案中，将编码CD47的第二外源多核苷酸和编码CAR的第一外源多核苷酸插入到TRAC基因座中。在一些实施方案中，将编码CD47的第二外源多核苷酸和编码CAR的第一外源多核苷酸插入到TRB基因座中。在一些实施方案中，将编码CD47的第二外源多核苷酸和编码CAR的第一外源多核苷酸插入到安全港或靶标基因座中。在一些实施方案中，安全港或靶标基因座选自由以下组成的组：CCR5基因座、CXCR4基因座、PPP1R12C基因座、白蛋白基因座、SHS231基因座、CLYBL基因座、Rosa基因座、F3(CD142)基因座、MICA基因座、MICB基因座、LRP1(CD91)基因座、HMGB1基因座、ABO基因座、RHD基因座、FUT1基因座和KDM5D基因座。
在一些实施方案中，非活化T细胞不表达HLA-A、HLA-B和/或HLA-C抗原。在一些实施方案中，非活化T细胞不表达B2M。在一些实施方案中，非活化T细胞不表达HLA-DP、HLA-DQ和/或HLA-DR抗原。在一些实施方案中，非活化T细胞不表达CIITA。在一些实施方案中，非活化T细胞不表达TCR-α。在一些实施方案中，非活化T细胞不表达TCR-β。在一些实施方案中，非活化T细胞不表达TCR-α和TCR-β。
在一些实施方案中，非活化T细胞是包含插入到TRAC基因座中的编码CD47的第二外源多核苷酸和/或编码CAR的第一外源多核苷酸的B2M插入缺失/插入缺失、CIITA插入缺失/插入缺失、TRAC插入缺失/插入缺失细胞。在一些实施方案中，非活化T细胞是包含插入到TRAC基因座中的编码CD47的第二外源多核苷酸和编码CAR的第一外源多核苷酸的B2M插入缺失/插入缺失、CIITA插入缺失/插入缺失、TRAC插入缺失/插入缺失细胞。在一些实施方案中，非活化T细胞是包含插入到TRB基因座中的编码CD47的第二外源多核苷酸和/或编码CAR的第一外源多核苷酸的B2M插入缺失/插入缺失、CIITA插入缺失/插入缺失、TRAC插入缺失/插入缺失细胞。在一些实施方案中，非活化T细胞是包含插入到TRB基因座中的编码CD47的第二外源多核苷酸和编码CAR的第一外源多核苷酸的B2M插入缺失/插入缺失、CIITA插入缺失/插入缺失、TRAC插入缺失/插入缺失细胞。在一些实施方案中，非活化T细胞是包含插入到B2M基因座中的编码CD47的第二外源多核苷酸和/或编码CAR的第一外源多核苷酸的B2M插入缺失/插入缺失、CIITA插入缺失/插入缺失、TRAC插入缺失/插入缺失细胞。在一些实施方案中，非活化T细胞是包含插入到B2M基因座中的编码CD47的第二外源多核苷酸和编码CAR的第一外源多核苷酸的B2M插入缺失/插入缺失、CIITA插入缺失/插入缺失、TRAC插入缺失/插入缺失细胞。在一些实施方案中，非活化T细胞是包含插入到CIITA基因座中的编码CD47的第二外源多核苷酸和/或编码CAR的第一外源多核苷酸的B2M插入缺失/插入缺失、CIITA插入缺失/插入缺失、TRAC插入缺失/插入缺失细胞。在一些实施方案中，非活化T细胞是包含插入到CIITA基因座中的编码CD47的第二外源多核苷酸和编码CAR的第一外源多核苷酸的B2M插入缺失/插入缺失、CIITA插入缺失/插入缺失、TRAC插入缺失/插入缺失细胞。
在一些实施方案中，非活化T细胞是包含插入到TRAC基因座中的编码CD47的第二外源多核苷酸和/或编码CAR的第一外源多核苷酸的B2M插入缺失/插入缺失、CIITA插入缺失/插入缺失、TRB插入缺失/插入缺失细胞。在一些实施方案中，非活化T细胞是包含插入到TRAC基因座中的编码CD47的第二外源多核苷酸和编码CAR的第一外源多核苷酸的B2M插入缺失/插入缺失、CIITA插入缺失/插入缺失、TRB插入缺失/插入缺失细胞。在一些实施方案中，非活化T细胞是包含插入到TRB基因座中的编码CD47的第二外源多核苷酸和/或编码CAR的第一外源多核苷酸的B2M插入缺失/插入缺失、CIITA插入缺失/插入缺失、TRB插入缺失/插入缺失细胞。在一些实施方案中，非活化T细胞是包含插入到TRB基因座中的编码CD47的第二外源多核苷酸和编码CAR的第一外源多核苷酸的B2M插入缺失/插入缺失、CIITA插入缺失/插入缺失、TRB插入缺失/插入缺失细胞。在一些实施方案中，非活化T细胞是包含插入到B2M基因座中的编码CD47的第二外源多核苷酸和/或编码CAR的第一外源多核苷酸的B2M插入缺失/插入缺失、CIITA插入缺失/插入缺失、TRB插入缺失/插入缺失细胞。在一些实施方案中，非活化T细胞是包含插入到B2M基因座中的编码CD47的第二外源多核苷酸和编码CAR的第一外源多核苷酸的B2M插入缺失/插入缺失、CIITA插入缺失/插入缺失、TRB插入缺失/插入缺失细胞。在一些实施方案中，非活化T细胞是包含插入到CIITA基因座中的编码CD47的第二外源多核苷酸和/或编码CAR的第一外源多核苷酸的B2M插入缺失/插入缺失、CIITA插入缺失/插入缺失、TRB插入缺失/插入缺失细胞。在一些实施方案中，非活化T细胞是包含插入到CIITA基因座中的编码CD47的第二外源多核苷酸和编码CAR的第一外源多核苷酸的B2M插入缺失/插入缺失、CIITA插入缺失/插入缺失、TRB插入缺失/插入缺失细胞。
本文提供了工程化T细胞，其相对于野生型T细胞包含降低的HLA-A、HLA-B、HLA-C、HLA-DP、HLA-DQ、HLA-DR、B2M、CIITA、TCR-α和/或TCR-β的表达，其中工程化T细胞还包含由病毒载体(包括慢病毒载体)携带的编码嵌合抗原受体(CAR)的第一外源多核苷酸。本文提供了工程化T细胞，其相对于野生型T细胞包含降低的HLA-A、HLA-B、HLA-C、HLA-DP、HLA-DQ、HLA-DR、B2M、CIITA、TCR-α和/或TCR-β的表达，其中工程化T细胞还包含由包含CD8结合剂的慢病毒载体携带的编码嵌合抗原受体(CAR)的第一外源多核苷酸。
在一些实施方案中，工程化T细胞是原代T细胞。在其他实施方案中，工程化T细胞从本公开的低免疫原性细胞分化。在一些实施方案中，T细胞是CD8+T细胞。在一些实施方案中，T细胞是CD4+T细胞。
在一些实施方案中，工程化T细胞不表达活化标志物。在一些实施方案中，工程化T细胞表达CD3和CD28，并且其中CD3和/或CD28是无活性的。
在一些实施方案中，工程化T细胞未用抗CD3抗体、抗CD28抗体、T细胞活化细胞因子或可溶性T细胞共刺激分子处理。在一些实施方案中，抗CD3抗体是OKT3，其中抗CD28抗体是CD28.2，其中T细胞活化细胞因子选自由IL-2、IL-7、IL-15和IL-21组成的T细胞活化细胞因子组，并且其中可溶性T细胞共刺激分子选自由抗CD28抗体、抗CD80抗体、抗CD86抗体、抗CD137L抗体和抗ICOS-L抗体组成的可溶性T细胞共刺激分子组。在一些实施方案中，工程化T细胞尚未用选自由IL-2、IL-7、IL-15和IL-21组成的组的一种或多种T细胞活化细胞因子处理。在一些情况下，细胞因子是IL-2。在一些实施方案中，一种或多种细胞因子是IL-2，并且另一种选自由IL-7、IL-15和IL-21组成的组。
在一些实施方案中，工程化T细胞还包含编码CD47的第二外源多核苷酸。在一些实施方案中，将第一和/或第二外源多核苷酸插入到T细胞的至少一个等位基因的特定基因座中。在一些实施方案中，特定基因座选自由以下组成的组：安全港或靶标基因座、靶标基因座、B2M基因座、CIITA基因座、TRAC基因座和TRB基因座。在一些实施方案中，将编码CD47的第二外源多核苷酸插入到选自由以下组成的组的特定基因座中：安全港或靶标基因座、靶标基因座、B2M基因座、CIITA基因座、TRAC基因座和TRB基因座。在一些实施方案中，将编码CAR的第一外源多核苷酸插入到选自由以下组成的组的特定基因座中：安全港或靶标基因座、靶标基因座、B2M基因座、CIITA基因座、TRAC基因座和TRB基因座。在一些实施方案中，将编码CD47的第二外源多核苷酸和编码CAR的第一外源多核苷酸插入到不同的基因座中。在一些实施方案中，将编码CD47的第二外源多核苷酸和编码CAR的第一外源多核苷酸插入到相同的基因座中。在一些实施方案中，将编码CD47的第二外源多核苷酸和编码CAR的第一外源多核苷酸插入到B2M基因座、CIITA基因座、TRAC基因座、TRB基因座或安全港或靶标基因座中。在一些实施方案中，安全港或靶标基因座选自由以下组成的组：CCR5基因座、CXCR4基因座、PPP1R12C基因座、白蛋白基因座、SHS231基因座、CLYBL基因座、Rosa基因座、F3(CD142)基因座、MICA基因座、MICB基因座、LRP1(CD91)基因座、HMGB1基因座、ABO基因座、RHD基因座、FUTI基因座和KDMSD基因座。
在一些实施方案中，CAR选自由CD19特异性CAR和CD22特异性CAR组成的组。在一些实施方案中，CAR是CD19特异性CAR。在一些实施方案中，CAR是CD22特异性CAR。在一些实施方案中，CAR包含与选自由CDI9、CD22、CD38、CD123、CD138和BCMA组成的组的任一个结合的抗原结合结构域。
在一些实施方案中，工程化T细胞不表达HLA-A、HLA-B和/或HLA-C抗原，其中工程化T细胞不表达B2M，其中工程化T细胞不表达HLA-DP、HLA-DQ和/或HLA-DR抗原，其中工程化T细胞不表达CIITA，且/或其中工程化T细胞不表达TCR-α和TCR-β。
在一些实施方案中，工程化T细胞是包含插入到TRAC基因座、TRB基因座、B2M基因座或CIITA基因座中的编码CD47的第二外源多核苷酸和/或编码CAR的第一外源多核苷酸的B2M插入缺失/插入缺失、CIITA插入缺失/插入缺失、TRAC插入缺失/插入缺失细胞。在一些实施方案中，工程化T细胞是包含插入到TRAC基因座、TRB基因座、B2M基因座或CIITA基因座中的编码CD47的第二外源多核苷酸和/或编码CAR的第一外源多核苷酸的B2M插入缺失/插入缺失、CIITA插入缺失/插入缺失、TRB插入缺失/插入缺失细胞。
在一些实施方案中，本公开的非活化T细胞和/或工程化T细胞在受试者中。在其他实施方案中，本公开的非活化T细胞和/或工程化T细胞在体外。
在一些实施方案中，本公开的非活化T细胞和/或工程化T细胞表达CD8结合剂。在一些实施方案中，CD8结合剂是抗CD8抗体。在一些实施方案中，抗CD8抗体选自由以下组成的组：小鼠抗CD8抗体、兔抗CD8抗体、人抗CD8抗体、人源化抗CD8抗体、骆驼科动物(例如美洲驼、羊驼、骆驼)抗CD8抗体及其片段。在一些实施方案中，其片段是scFv或VHH。在一些实施方案中，CD8结合剂结合CD8α链和/或CD8β链。
在一些实施方案中，CD8结合剂融合至掺入病毒包膜中的跨膜结构域。在一些实施方案中，慢病毒载体用病毒融合蛋白假型化。在一些实施方案中，病毒融合蛋白包含一种或多种修饰以降低与其天然受体的结合。
在一些实施方案中，病毒融合蛋白融合至CD8结合剂。在一些实施方案中，病毒融合蛋白包含融合至CD8结合剂的尼帕病毒F糖蛋白和尼帕病毒G糖蛋白。在一些实施方案中，慢病毒载体不包含T细胞活化分子或T细胞共刺激分子。在一些实施方案中，慢病毒载体编码第一外源多核苷酸和/或第二外源多核苷酸。
在一些实施方案中，在转移到第一受试者体内后，非活化T细胞或工程化T细胞表现出选自由以下组成的组的一种或多种反应：(a)T细胞反应，(b)NK细胞反应，和(c)巨噬细胞反应，所述反应与转移到第二受试者体内后的野生型细胞相比有所降低。在一些实施方案中，第一受试者和第二受试者是不同的受试者。在一些实施方案中，巨噬细胞反应是吞噬。
在一些实施方案中，与转移到受试者体内后的野生型细胞相比，非活化T细胞或工程化T细胞在转移到受试者体内后表现出选自由以下组成的组的一项或多项：(a)受试者的TH1活化减少，(b)受试者的NK细胞杀伤减少，和(c)受试者的完整PBMC的杀伤减少。
在一些实施方案中，与转移到受试者体内后的野生型细胞相比，非活化T细胞或工程化T细胞在转移到受试者体内后引发选自由以下组成的组的一项或多项：(a)受试者的供体特异性抗体减少，(b)受试者的IgM或IgG抗体减少，和(c)受试者的补体依赖性细胞毒性(CDC)减少。
在一些实施方案中，在受试者体内用包含CD8结合剂的慢病毒载体转导非活化T细胞或工程化T细胞。在一些实施方案中，慢病毒载体携带编码CAR和/或CD47的基因。
在一些实施方案中，使用融合原介导的递送、选自由以下组成的组的转座酶系统或病毒载体(包括慢病毒载体)将编码CAR和/或CD47的基因引入到细胞中：转座酶、PiggyBac转座子、睡美人(SB11)转座子、Mos1转座子和Tol2转座子。
本文提供药物组合物，其包含本公开的非活化T细胞和/或工程化T细胞群和药学上可接受的添加剂、载剂、稀释剂或赋形剂。
本文提供的方法包括向受试者施用包含本公开的非活化T细胞和/或工程化T细胞群的组合物，或一种或多种本公开的药物组合物。
在一些实施方案中，在施用组合物之前、之后和/或同时不向受试者施用T细胞活化治疗。在一些实施方案中，T细胞活化治疗包括淋巴细胞清除。
本文提供了治疗罹患癌症的受试者的方法，其包括向受试者施用包含本公开的非活化T细胞和/或工程化T细胞群的组合物，或一种或多种本公开的药物组合物，其中在施用组合物之前、之后和/或同时不向受试者施用T细胞活化治疗。在一些实施方案中，T细胞活化治疗包括淋巴细胞清除。
本文提供了用于在有需要的受试者体内扩增能够识别并杀伤所述受试者的肿瘤细胞的T细胞的方法，其包括向受试者施用包含本公开的非活化T细胞和/或工程化T细胞群的组合物，或一种或多种本公开的药物组合物，其中在施用组合物之前、之后和/或同时不向受试者施用T细胞活化治疗。在一些实施方案中，T细胞活化治疗包括淋巴细胞清除。
本文提供了用于治疗受试者的病状、疾病或病症的剂量方案，其包括施用包含本公开的非活化T细胞和/或工程化T细胞群的组合物，或一种或多种本公开的药物组合物，以及药学上可接受的添加剂、载剂、稀释剂或赋形剂，其中药物组合物以约1-3个治疗有效剂量施用。本文提供了用于治疗受试者的病状、疾病或病症的剂量方案，其包括施用包含本公开的非活化T细胞和/或工程化T细胞群的组合物，或一种或多种本公开的药物组合物，以及药学上可接受的添加剂、载剂、稀释剂或赋形剂，其中药物组合物以约1-3个临床有效剂量施用。
一旦改变，本文所述的任何分子的表达的存在可以使用已知技术来测定，诸如蛋白质印迹、ELISA测定、FACS测定、其他免疫测定、逆转录酶聚合酶链反应(RT-PCR)等。
T.诱导性多能干细胞的生成
本技术提供了产生低免疫原性多能细胞的方法。在一些实施方案中，方法包括生成多能干细胞。小鼠和人多能干细胞(通常称为iPSC；对于鼠细胞为miPSC或对于人细胞为hiPSC)的生成通常是本领域已知的。如本领域技术人员将理解的，有多种不同的方法用于生成iPCS。最初的诱导是使用四种转录因子Oct3/4、Sox2、c-Myc和Klf4的病毒引入在小鼠胚胎或成年成纤维细胞中进行的；参见Takahashi和Yamanaka Cell 126：663-676(2006)，所述文献特此通过引用整体并入，特别是其中概述的技术。从那时起，已经开发了许多方法；参见Seki等人，World J.Stem Cells 7(1)：116-125(2015)进行回顾，以及Lakshmipathy和Vermuri编辑，Methods in Molecular Biology：Pluripotent StemCells，Methods and Protocols，Springer 2013，所述文献特此通过引用明确地整体并入，特别是用于生成hiPSC的方法(参见例如后一篇参考文献的第3章)。
通常，iPSC通过在宿主细胞中瞬时表达一种或多种重编程因子来生成，所述重编程因子通常使用附加型载体引入。在这些条件下，少量的细胞被诱导成为iPSC(一般来讲，这一步的效率很低，因为没有使用选择标志物)。一旦细胞被“重编程”并成为多能细胞，它们就会失去附加型载体并使用内源基因产生因子。
如本领域技术人员还理解的，可以使用或被使用的重编程因子的数量可以变化。通常，当使用较少的重编程因子时，细胞转化为多能状态的效率下降，“多能性”也下降，例如，较少的重编程因子可能导致细胞不是完全多能的，而是可能只能够分化成较少的细胞类型。
在一些实施方案中，使用单个重编程因子OCT4。在其他实施方案中，使用两个重编程因子OCT4和KLF4。在其他实施方案中，使用三个重编程因子OCT4、KLF4和SOX2。在其他实施方案中，使用四个重编程因子OCT4、KLF4、SOX2和c-Myc。在其他实施方案中，可以使用选自SOKMNLT；SOX2、OCT4(POU5F1)、KLF4、MYC、NANOG、LIN28和SV40L T抗原的5、6或7个重编程因子。一般来讲，这些重编程因子基因是在附加型载体上提供的，诸如是本领域已知的和可商购获得的。
一般来讲，如本领域已知的，iPSC通过瞬时表达如本文所述的重编程因子由非多能细胞(诸如但不限于血细胞、成纤维细胞等)制成。
U.低免疫原性表型和多能性保留的测定
一旦已经生成低免疫原性细胞，就可如WO2016183041和WO2018132783中所述测定它们的低免疫原性和/或多能性保留。
在一些实施方案中，使用如WO2018132783的图13和图15中例示的多种技术测定低免疫原性。这些技术包括移植到同种异体宿主中和监测逃脱宿主免疫系统的低免疫原性多能细胞生长(例如畸胎瘤)。在一些情况下，低免疫原性多能细胞衍生物被转导以表达荧光素酶，然后可以使用生物发光成像进行跟踪。类似地，测试宿主动物对此类细胞的T细胞和/或B细胞反应，以确认所述细胞不在宿主动物中引起免疫反应。通过Elispot、ELISA、FACS、PCR或质谱流式细胞术(CYTOF)评估T细胞反应。使用FACS或Luminex来评估B细胞反应或抗体反应。另外或另选地，可测定细胞避免先天免疫反应(例如，NK细胞杀伤)的能力，如WO2018132783的图14和图15中通常所示。
在一些实施方案中，使用本领域技术人员认可的T细胞免疫测定(诸如T细胞增殖测定、T细胞活化测定和T细胞杀伤测定)来评价细胞的免疫原性。在一些情况下，T细胞增殖测定包括用干扰素-γ预处理细胞并将细胞与标记的T细胞共培养，并且在预先选择的时间量后测定T细胞群(或增殖的T细胞群)的存在。在一些情况下，T细胞活化测定包括将T细胞与本文概述的细胞共培养，并且确定T细胞中T细胞活化标志物的表达水平。
可以执行体内测定以评估本文概述的细胞的免疫原性。在一些实施方案中，使用同种异体人源化免疫缺陷小鼠模型来确定低免疫原性细胞的存活率和免疫原性。在一些情况下，将低免疫原性多能干细胞移植到同种异体人源化NSG-SGM3小鼠中并测定细胞排斥、细胞存活率和畸胎瘤形成。在一些情况下，植入的低免疫原性多能干细胞或其分化细胞在小鼠模型中展现出长期存活。
用于确定免疫原性(包括细胞的低免疫原性)的额外技术描述于例如Deuse等人，Nature Biotechnology，2019，37，252-258和Han等人，Proc Natl Acad Sci USA，2019，116(21)，10441-10446，包括附图、附图说明和方法描述的公开内容通过引用整体并入本文。
类似地，以多种方式测试多能性保留。在一些实施方案中，通过某些多能性特异性因子的表达来测定多能性，如本文一般描述和WO2018132783的图29所示。另外或替代地，将多能细胞分化成一种或多种细胞类型作为多能性的指示。
如本领域技术人员将理解的，多能细胞中MHC I功能(当细胞来源于人类细胞时为HLA I)的成功降低可以使用本领域已知并且如下文所述的技术来测量；例如，使用与HLA复合物结合的标记抗体的FACS技术；例如，使用与人主要组织相容性HLA I类抗原的α链结合的可商购获得的HLA-A、HLA-B和HLA-C抗体。
另外，可以对细胞进行测试，以确认HLA I复合物不在细胞表面上表达。这可使用如上文所讨论的一种或多种HLA细胞表面组分的抗体通过FACS分析来测定。
可以使用本领域已知的技术(诸如使用蛋白质的抗体的蛋白质印迹、FACS技术、RT-PCR技术等)来测量多能细胞或其衍生物中的MHC II功能(当细胞来源于人细胞时为HLAII)的成功降低。
另外，可以对细胞进行测试，以确认HLA II复合物不在细胞表面上表达。再次，这种测定如本领域已知的那样进行(例如参见WO2018132783的图21)并且通常使用基于与人类HLA II类HLA-DR、DP和大多数DQ抗原结合的商业抗体的蛋白质印迹或FACS分析进行。
除了减少HLA I和II(或MHC I和II)之外，本技术的低免疫原性细胞对巨噬细胞吞噬作用和NK细胞杀伤的易感性降低。由于TCR复合物的减少或缺乏以及一种或多种CD47转基因的表达，所得的低免疫原性细胞“逃脱”免疫巨噬细胞和先天途径。
V.外源多核苷酸
在一些实施方案中，本文提供的低免疫原性细胞经遗传修饰以包括插入到低免疫原性细胞的一个或多个基因组基因座中的一种或多种外源多核苷酸。在一些实施方案中，外源多核苷酸编码感兴趣的蛋白质，例如嵌合抗原受体。可以使用任何合适的方法将外源多核苷酸插入到低免疫原性细胞的基因组基因座中，所述方法包括本文所述的基因编辑方法(例如，CRISPR/Cas系统)。在一些实施方案中，使用病毒转导(例如使用载体)将一个或多个外源多核苷酸插入到细胞的至少一个等位基因中。在一些实施方案中，载体是携带一个或多个外源多核苷酸的假型化、自灭活慢病毒载体。在一些实施方案中，载体是用水疱性口炎VSV-G包膜假型化的自灭活慢病毒载体，并携带一个或多个外源多核苷酸。在一些实施方案中，使用病毒转导将一个或多个外源多核苷酸插入到细胞的至少一个等位基因中。在一些实施方案中，使用基于慢病毒的病毒载体将一个或多个外源多核苷酸插入到细胞的至少一个等位基因中。
可以将外源多核苷酸插入低免疫原性细胞的任何合适的基因组基因座中。在一些实施方案中，将外源多核苷酸插入到如本文所述的安全港或靶标基因座中。合适的安全港和靶标基因座包括但不限于CCR5基因、CXCR4基因、PPP1R12C(也称为AAVS1)基因、白蛋白基因、SHS231基因座、CLYBL基因、Rosa基因(例如，ROSA26)、F3基因(也称为CD142)、MICA基因、MICB基因、LRP1基因(也称为CD91)、HMGB1基因、ABO基因、RHD基因、FUT1基因、PDGFRa基因、OLIG2基因、GFAP基因和KDM5D基因(也称为HY)。在一些实施方案中，将外源多核苷酸插入到安全港或靶标基因座的内含子、外显子或编码序列区域中。在一些实施方案中，将外源多核苷酸插入到内源基因中，其中插入导致内源基因的沉默或表达降低。在一些实施方案中，将多核苷酸插入到B2M、CIITA、TRAC、TRB、PD-1或CTLA-4基因座中。用于插入外源多核苷酸的示例性基因组基因座在表17中描述。
表17：用于插入外源多核苷酸的示例性基因组基因座
表18：Cas9指导RNA的非限制性实例
对于Cas9指导，表19中提供了所有Cas9指导的间隔序列，其中描述了20nt指导序列对应于独特的指导序列，并且Cas9指导可以是本文描述的那些中的任一种，包括例如表18中列出的那些。
表19：Cas9指导RNA
在一些实施方案中，包括外源多核苷酸的低免疫原性细胞来源于低免疫原性诱导性多能细胞(HIP)，例如，如本文所述。此类低免疫原性细胞包括例如T细胞和NK细胞。在一些实施方案中，包括外源多核苷酸的低免疫原性细胞是T细胞(例如，原代T细胞)或NK细胞。
在一些实施方案中，外源多核苷酸编码外源CD47多肽(例如，人CD47多肽)，并且使用基因治疗载体将外源多肽插入到细胞的基因组中。在一些实施方案中，外源多核苷酸编码外源CD47多肽(例如，人CD47多肽)，并且将外源多肽插入到如本文所公开的安全港或靶标基因座或安全港或靶位点中，或插入到引起内源基因的沉默或表达降低的基因组基因座中。在一些实施方案中，将多核苷酸插入到B2M、CIITA、TRAC、TRB、PD1或CTLA4基因座中。
在一些实施方案中，包括外源多核苷酸的低免疫原性细胞是原代T细胞或来源于低免疫原性多能细胞(例如，低免疫原性iPSC)的T细胞。在示例性实施方案中，外源多核苷酸是嵌合抗原受体(例如，本文所述的任何CAR)。在一些实施方案中，外源多核苷酸可操作地连接至用于在低免疫原性细胞中表达外源多核苷酸的启动子。
W.药学上可接受的载剂
在一些实施方案中，本文提供的药物组合物还包括药学上可接受的载剂。可接受的载剂、赋形剂或稳定剂在采用的剂量和浓度下对受体是无毒的，并且包括缓冲剂，诸如磷酸盐、柠檬酸盐和其他有机酸；抗氧化剂(包括抗坏血酸和甲硫氨酸)；防腐剂(诸如十八烷基二甲基苄基氯化铵；氯化六烃季铵；氯化苯甲烃铵、氯化苄乙氧铵；苯酚、丁醇或苄醇；对羟基苯甲酸烷基酯，诸如对羟基苯甲酸甲酯或对羟基苯甲酸丙酯；儿茶酚；间苯二酚；环己醇；3-戊醇；及间甲酚)；低分子量(小于约10个残基)的多肽；蛋白质，诸如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白等；亲水性聚合物，诸如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，诸如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、组氨酸、精氨酸或赖氨酸；单糖、二糖及其他碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合剂，诸如EDTA；糖，诸如蔗糖、甘露醇、海藻糖或山梨糖醇；成盐抗衡离子，诸如钠；金属络合物(例如，Zn-蛋白络合物)；盐，诸如氯化钠；和/或非离子表面活性剂，诸如聚山梨醇酯(TWEENTM)、泊洛沙姆(PLURONICSTM)或聚乙二醇(PEG)。在一些实施方案中，药物组合物包括药学上可接受的缓冲剂(例如，中性缓冲盐水或磷酸盐缓冲盐水)。
在一些实施方案中，药物组合物包括选自由以下组成的组的一种或多种电解质基础溶液：乳酸林格氏溶液(Ringer′s solution)、PlasmaLyte-ATM、Iscove的改进Dulbecco培养基、Normosol-RTM、Veen-DTM、/>和Hank平衡盐溶液(不含酚红)。这些基础溶液非常接近哺乳动物细胞外生理液体的组成。
在一些实施方案中，药物组合物包括一种或多种选自由以下组成的组的冷冻保护剂：阿拉伯半乳聚糖、甘油、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、右旋糖、葡聚糖、海藻糖、蔗糖、棉子糖、羟乙基淀粉(HES)、丙二醇、人血清白蛋白(HSA)和二甲基亚砜(DMSO)。在一些实施方案中，药学上可接受的缓冲剂是中性缓冲盐水或磷酸盐缓冲盐水。在一些实施方案中，本文提供的药物组合物包括CSB、Plasma-Lyte-ATM、HSA、DMSO和海藻糖中的一种或多种。
是一种细胞内样的优化溶液，其含有渗透剂(osmotic agent)/渗透压剂(oncotic agent)、自由基清除剂和能量源以最大程度地减少细胞凋亡、最大程度地减少局部缺血/再灌注损伤并最大限度地提高最大数量的活的功能细胞的解冻后恢复。/>不含血清和蛋白质，并且无免疫原性。/>由USP级或更高级的原料遵循cGMP制造。是用0％、2％、5％或10％DMSO预先配制的一系列溶液。/>CSB是/>的无DMSO版本。在一些实施方案中，药物组合物包括浓度为约0-100％、5-95％、10-90％、15-85％、20-80％、30-80％、40-80％、50-80％、60-80％、70-80％、25-75％、30-70％、35-65％、40-60％或45-55％重量/重量的/>CSB的基础溶液。在一些实施方案中，药物组合物包括浓度为约0％、5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或100％重量/重量的/>CSB的基础溶液。
PlasmaLyte-ATM是一种非聚合血浆增容剂，并且含有与培养基中发现的那些相似的必需盐和营养物质，但不含有组织培养基中发现的未批准用于人体输注或在U.S.P.等级中不可用的额外成分(例如，酚红)。PlasmaLyte-ATM含有约140mEq/L的钠(Na)、约5mEq/L的钾(K)、约3mEq/L的镁(Mg)、约98mEq/L的氯(Cl)、约27mEq/L的乙酸盐和约23mEq/L的葡糖酸盐。(PlasmaLyte-ATM可从Baxter，Hyland Division，Glendale Calif.商购获得，产品号为2B2543)。在一些实施方案中，药物组合物包括浓度为约0-100％、5-95％、10-90％、15-85％、15-80％、15-75％、15-70％、15-65％、15-60％、15-55％、15-50％、15-45％、15-40％、15-35％、15-30％、15-25％、20-80％、20-75％、20-70％、20-65％、20-60％、20-55％、20-50％、20-45％、20-40％、20-35％、20-30％、25-75％、30-70％、35-65％、40-60％或45-55％重量/重量的PlasmaLyte-ATM基础溶液。在一些实施方案中，药物组合物包括浓度为约0％、5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或100％重量/重量的PlasmaLyte-ATM基础溶液。
在一些实施方案中，药物组合物包括浓度为约0-10％、0.3-9.3％、0.3-8.3％、0.3-7.3％、0.3-6.3％、0.3-5.3％、0.3-4.3％、0.3-3.3％、0.3-2.3％、0.3-1.3％、0.6-8.3％、0.9-7.3％、1.2-6.3％、1.5-5.3％、1.8-4.3％或2.1-3.3％重量/体积的人血清白蛋白(HSA)。在一些实施方案中，药物组合物包括浓度为约0％、O.3％、0.6％、0.9％、1.2％、1.5％、1.8％、2.1％、2.4％、2.7％、3.0％、3.3％、3.6％、3.9％、4.3％、4.6％、4.9％、5.3％、5.6％、5.9％、6.3％、6.6％、6.9％、7.3％、7.6％、7.9％、8.3％、8.6％、8.9％、9.3％、9.6％、9.9％或10％重量/体积的HSA。
在一些实施方案中，药物组合物包括浓度为约0-10％、0.5-9.5％、1-9％、1.5-8.5％、2-8％、3-8％、4-8％、5-8％、6-8％、7-8％、2.5-7.5％、3-7％、3.5-6.5％、4-6％或4.5-5.5％体积/体积的二甲基亚砜(DMSO)。在一些实施方案中，药物组合物包括浓度为约0％、0.25％、0.5％、0.75％、1.0％，1.25％、1.5％、1.75％、2.0％、2.25％、2.5％、2.75％、3.0％、3.25％、3.5％、3.75％、4.0％、4.25％、4.5％、4.75％、5.0％、5.25％、5.5％、5.75％、6.0％、6.25％、6.5％、6.75％、7.0％、7.25％、7.5％、7.75％、8.0％、8.25％、8.5％、8.75％、9.0％、9.25％、9.5％、9.75％或10.0％体积/体积的HSA。
在一些实施方案中，药物组合物包括浓度为约0-500mM、50-450mM、100-400mM、150-350mM或200-300mM的海藻糖。在一些实施方案中，药物组合物包括浓度为约0 mM、10mM、20mM、30mM、40mM、50mM、60mM、70mM、80mM、90mM、100mM、125mM、150mM、175mM、200mM、225mM、250mM、275mM、300mM、325mM、350mM、375mM、400mM、425mM、450mM、475mM或500mM的海藻糖。
示例性药物组合物组分在表20中示出。
表20.示例性药物组合物组分。
*除PlasmaLyte之外的额外HSA。
在一些实施方案中，药物组合物包含本文所述的低免疫原性细胞和药学上可接受的载剂，所述载剂包含31.25％(体积/体积)Plasma-LyteA、31.25％(体积/体积)的5％右旋糖/0.45％氯化钠、10％葡聚糖40(LMD)/5％右旋糖、20％(体积/体积)的25％人血清白蛋白(HSA)和7.5％(体积/体积)二甲基亚砜(DMSO)。
X.制剂和剂量方案
任何治疗有效量的本文所述的细胞都可以包括在药物组合物中，这取决于所治疗的适应症。细胞的非限制性实例包括原代T细胞、从低免疫原性诱导性多能干细胞分化的T细胞以及本文所述的从低免疫原性诱导性多能干细胞分化的其他细胞。在一些实施方案中，药物组合物包括至少约1x102、5x102、1x103、5x103、1x104、5x104、1x105、5x105、1x106、5x106、1x107、5x107、1x108、5x108、1x109、5x109、1x1010或5x1010个细胞。在一些实施方案中，药物组合物包括至多约1x102、5x102、1x103、5x103、1x104、5x104、1x105、5x105、1x106、5x106、1x107、5x107、1x108、5x108、1x109、5x109、1x1010或5x1010个细胞。在一些实施方案中，药物组合物包括至多约6.0x108个细胞。在一些实施方案中，药物组合物包括至多约8.0x108个细胞。在一些实施方案中，药物组合物包括至少约1x102-5x102、5x102-1x103、1x103-5x103、5x103-1x104、1x104-5x104、5x104-1x105、1x105-5x105、5x105-1x106、1x106-5x106、5x106-1x107、1x107-5x107、5x107-1x108、1x108-5x108、5x108-1x109、1x109-5x109、5x109-1x1010或1x1010-5x1010个细胞。在示例性实施方案中，药物组合物包括约1.0x106至约2.5x108个细胞。在某些实施方案中，药物组合物包括约2.0x106至约2.0x108个细胞，诸如但不限于原代T细胞、从低免疫原性诱导性多能干细胞分化的T细胞。
在一些实施方案中，药物组合物具有至少5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、250、300、350、400或500ml的体积。在示例性实施方案中，药物组合物具有至多约5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、250、300、350、400或500ml的体积。在示例性实施方案中，药物组合物具有约5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、250、300、350、400或500ml的体积。在一些实施方案中，药物组合物具有约1-50ml、50-100ml、100-150ml、150-200ml、200-250ml、250-300ml、300-350ml、350-400ml、400-450ml或450-500ml的体积。在一些实施方案中，药物组合物具有约1-50ml、50-100ml、100-150ml、150-200ml、200-250ml、250-300ml、300-350ml、350-400ml、400-450ml或450-500ml的体积。在一些实施方案中，药物组合物具有约1-10ml、10-20ml、20-30ml、30-40ml、40-50ml、50-60ml、60-70ml、70-80ml、70-80ml、80-90ml或90-100ml的体积。在一些实施方案中，药物组合物具有范围为约5ml至约80ml的体积。在示例性实施方案中，药物组合物具有范围为约10ml至约70ml的体积。在某些实施方案中，药物组合物具有范围为约10ml至约50ml的体积。
具体的量/剂量方案将因以下因素而异：个体的体重、性别、年龄和健康状况；制剂、生化性质、生物活性、生物利用度和细胞的副作用以及完整治疗方案中细胞的数量和特性。
在一些实施方案中，治疗有效剂量或临床有效剂量的药物组合物包括体积为约10ml至50ml的约1.0x105至约2.5x108个细胞，并且药物组合物作为单一治疗有效剂量或临床有效剂量施用。在一些情况下，治疗有效剂量或临床有效剂量包括体积为约10ml至50ml的约1.0x105至约2.5x108个本文所述的原代T细胞。在一些情况下，治疗有效剂量或临床有效剂量包括体积为约10ml至50ml的约1.0x105至约2.5x108个上文已经描述的原代T细胞。在各种情况下，治疗有效剂量或临床有效剂量包括体积为约10ml至50ml的约1.0x105至约2.5x108个本文所述的从低免疫原性诱导性多能干细胞分化的T细胞。在一些实施方案中，治疗有效剂量或临床有效剂量是体积为约10ml至50ml的1.Ox105、1.1x105、1.2x105、1.3x105、1.4x105、1.5x105、1.6x105、1.7x105、1.8x105、1.9x105、2.0x105、2.1x105、2.2x105、2.3x105、2.4x105、2.5x105、1.0x106、1.1x106、1.2x106、1.3x106、1.4x106、1.5x106、1.6x106、1.7x106、1.8x106、1.9x106、2.0x106、2.1x106、2.2x106、2.3x106、2.4x106、2.5x106、1.0x107、1.1x107、1.2x107、1.3x107、1.4x107、1.5x107、1.6x107、1.7x107、1.8x107、1.9x107、2.0x107、2.1x107、2.2x107、2.3x107、2.4x107、2.5x107、1.0x108、1.1x108、1.2x108、1.3x108、1.4x10o、1.5x108、1.6x10o、1.7x108、1.8x108、1.9x108、2.0x108、2.1x108、2.2x10o、2.3x108、2.4x108或2.5x108个本文所述的从低免疫原性诱导性多能干细胞分化的T细胞。在其他情况下，治疗有效剂量或临床有效剂量的范围低于约1.0x105至约2.5x108个T细胞，包括原代T细胞或从低免疫原性诱导性多能干细胞分化的T细胞。在又其他情况下，治疗有效剂量或临床有效剂量的范围高于约1.0x105至约2.5x108个T细胞，包括原代T细胞和从低免疫原性诱导性多能干细胞分化的T细胞。
在一些实施方案中，药物组合物作为单一治疗有效剂量或临床有效剂量施用，所述剂量对于50kg或更轻的受试者为约1.0x105至约1.0x107个细胞(诸如原代T细胞和从低免疫原性诱导性多能干细胞分化的T细胞)/kg体重。在一些实施方案中，药物组合物作为单一治疗有效剂量或临床有效剂量施用，所述剂量对于50kg或更轻的受试者为约0.5x105至约1.0x107、约1.0x105至约1.0x107、约1.0x105至约1.0x107、约5.0x105至约1x107、约1.0x106至约1x107、约5.0x106至约1.0x107、约1.0x105至约5.0x106、约1.0x105至约1.0x106、约1.0x105至约5.0x105、约1.0x105至约5.0x106、约2.0x105至约5.0x106、约3.0x105至约5.0x106、约4.0x105至约5.0x106、约5.0x105至约5.0x106、约6.0x105至约5.0x106、约7.0x105至约5.0x106、约8.0x105至约5.0x106或约9.0x105至约5.0x106个细胞/kg体重。在一些实施方案中，对于50kg或更轻的受试者，治疗有效剂量或临床有效剂量为0.5x105、0.6x105、0.7x105、0.8x105、0.9x105、1.0x105、1.1x105、1.2x105、1.3x105、1.4x105、1.5x105、1.6x105、1.7x105、1.8x105、1.9x105、2.0x105、2.1x105、2.2x105、2.3x105、2.4x105、2.5x105、2.6x105、2.7x105、2.8x105、2.9x105、3.0x105、3.1x105、3.2x105、3.3x105、3.4x105、3.5x105、3.6x105、3.7x105、3.8x105、3.9x105、4.0x105、4.1x105、4.2x105、4.3x105、4.4x105、4.5x105、4.6x105、4.7x105、4.8x105、4.9x105、5.0x105、0.5x106、0.6x106、0.7x106、0.8x106、0.9x106、1.0x106、1.1x106、1.2x106、1.3x106、1.4x106、1.5x106、1.6x106、1.7x106、1.8x106、1.9x106、2.0x106、2.1x106、2.2x106、2.3x106、2.4x106、2.5x106、2.6x106、2.7x106、2.8x106、2.9x106、3.0x106、3.1x106、3.2x106、3.3x106、3.4x106、3.5x106、3.6x106、3.7x106、3.8x106、3.9x106、4.0x106、4.1x106、4.2x106、4.3x106、4.4x106、4.5x106、4.6x106、4.7x106、4.8x106、4.9x106、5.0x106、5.1x106、5.2x106、5.3x106、5.4x106、5.5x106、5.6x106、5.7x106、5.8x106、5.9x106、6.0x106、6.1x106、6.2x106、6.3x106、6.4x106、6.5x106、6.6x106、6.7x106、6.8x106、6.9x106、7.0x106、7.1x106、7.2x106、7.3x106、7.4x106、7.5x106、7.6x106、7.7x106、7.8x106、7.9x106、8.0x106、8.1x106、8.2x106、8.3x106、8.4x106、8.5x106、8.6x106、8.7x106、8.8x106、8.9x106、9.0x106、9.1x106、9.2x106、9.3x106、9.4x106、9.5x106、9.6x106、9.7x106、9.8x106、9.9x106、0.5x107、0.6x107、0.7x107、0.8x107、0.9x107或1.0x107个细胞/kg体重。在一些实施方案中，对于50kg或更轻的受试者，治疗有效剂量或临床有效剂量为约0.2x106至约5.0x106个细胞/kg体重。在某些实施方案中，对于50kg或更轻的受试者，治疗有效剂量或临床有效剂量的范围低于约0.2x106至约5.0x106个细胞/kg体重。或临床有效剂量在示例性实施方案中，单一治疗有效剂量或临床有效剂量的体积为约10ml至50ml。在一些实施方案中，治疗有效剂量或临床有效剂量静脉内施用。
在示例性实施方案中，细胞以单一治疗有效剂量施用，所述剂量对于超过50kg的受试者为约1.0x106至约5.0x108个细胞(诸如原代T细胞和从低免疫原性诱导性多能干细胞分化的T细胞)。在一些实施方案中，药物组合物作为单一治疗有效剂量或临床有效剂量施用，所述剂量对于50kg或更轻的受试者为约0.5x106至约1.0x109、约1.0x106至约1.0x109、约1.0x106至约1.0x109、约5.0x106至约1.0x109、约1.0x107至约1.0x109、约5.0x107至约1.0x109、约1.0x106至约5.0x107、约1.0x106至约1.0x107、约1.0x106至约5.0x107、约1.0x107至约5.0x108、约2.0x107至约5.0x108、约3.0x107至约5.0x108、约4.0x107至约5.0x108、约5.0x107至约5.0x108、约6.0x107至约5.0x108、约7.0x107至约5.0x108、约8.0x107至约5.0x108或约9.0x107至约5.0x108个细胞/kg体重。在一些实施方案中，对于50kg或更轻的受试者，治疗有效剂量或临床有效剂量为1.0x106、1.1x106、1.2x106、1.3x106、1.4x106、1.5x106、1.6x106、1.7x106、1.8x106、1.9x106、2.0x106、2.1x106、2.2x106、2.3x106、2.4x106、2.5x106、2.6x106、2.7x106、2.8x106、2.9x106、3.0x106、3.1x106、3.2x106、3.3x106、3.4x106、3.5x106、3.6x106、3.7x106、3.8x106、3.9x106、4.0x106、4.1x106、4.2x106、4.3x106、4.4x106、4.5x106、4.6x106、4.7x106、4.8x106、4.9x106、5.0x106、5.1x106、5.2x106、5.3x106、5.4x106、5.5x106、5.6x106、5.7x106、5.8x106、5.9x106、6.0x106、6.1x106、6.2x106、6.3x106、6.4x106、6.5x106、6.6x106、6.7x106、6.8x106、6.9x106、7.0x106、7.1x106、7.2x106、7.3x106、7.4x106、7.5x106、7.6x106、7.7x106、7.8x106、7.9x106、8.0x106、8.1x106、8.2x106、8.3x106、8.4x106、8.5x106、8.6x106、8.7x106、8.8x106、8.9x106、9.0x106、9.1x106、9.2x106、9.3x106、9.4x106、9.5x106、9.6x106、9.7x106、9.8x106、9.9x106、1.0x107、1.1x107、1.2x107、1.3x107、1.4x107、1.5x107、1.6x107、1.7x107、1.8x107、1.9x107、2.0x107、2.1x107、2.2x107、2.3x107、2.4x107、2.5x107、2.6x107、2.7x107、2.8x107、2.9x107、3.0x107、3.1x107、3.2x107、3.3x107、3.4x107、3.5x107、3.6x107、3.7x107、3.8x107、3.9x107、4.0x107、4.1x107、4.2x107、4.3x107、4.4x107、4.5x107、4.6x107、4.7x107、4.8x107、4.9x107、5.0x107、5.1x107、5.2x107、5.3x107、5.4x107、5.5x107、5.6x107、5.7x107、5.8x107、5.9x107、6.0x107、6.1x107、6.2x107、6.3x107、6.4x107、6.5x107、6.6x107、6.7x107、6.8x107、6.9x107、7.0x107、7.1x107、7.2x107、7.3x107、7.4x107、7.5x107、7.6x107、7.7x107、7.8x107、7.9x107、8.0x107、8.1x107、8.2x107、8.3x107、8.4x107、8.5x107、8.6x107、8.7x107、8.8x107、8.9x107、9.0x107、9.1x107、9.2x107、9.3x107、9.4x107、9.5x107、9.6x107、9.7x107、9.8x107、9.9x107、1.0x108、1.1x108、1.2x108、1.3x108、1.4x108、1.5x108、1.6x108、1.7x108、1.8x108、1.9x108、2.0x108、2.1x108、2.2x108、2.3x108、2.4x108、2.5x108、2.6x108、2.7x108、2.8x108、2.9x108、3.0x108、3.1x108、3.2x108、3.3x108、3.4x108、3.5x108、3.6x108、3.7x108、3.8x108、3.9x108、4.0x108、4.1x108、4.2x108、4.3x108、4.4x108、4.5x108、4.6x108、4.7x108、4.8x108、4.9x108或5.0x108细胞/kg体重。在某些实施方案中，细胞以单一治疗有效剂量或临床有效剂量施用，所述剂量对于超过50kg的受试者为约1.0x107至约2.5x108个细胞。在一些实施方案中，细胞以单一治疗有效剂量或临床有效剂量施用，对于超过50kg的受试者，所述剂量的范围小于约1.0x107至约2.5x108个细胞。在一些实施方案中，细胞以单一治疗有效剂量或临床有效剂量施用，对于超过50kg的受试者，所述剂量的范围高于约1.0x107至约2.5x108个细胞。在一些实施方案中，剂量静脉内施用。在示例性实施方案中，单一治疗有效剂量或临床有效剂量的体积为约10ml至50ml。在一些实施方案中，治疗有效剂量或临床有效剂量静脉内施用。
在示例性实施方案中，治疗有效剂量或临床有效剂量以约每分钟1至50ml、每分钟1至40ml、每分钟1至30ml、每分钟1至20ml、每分钟10至20ml、每分钟10至30ml、每分钟10至40ml、每分钟10至50ml、每分钟20至50ml、每分钟30至50ml、每分钟40至50ml的速率静脉内施用。在多个实施方案中，药物组合物储存在一个或多个输液袋中用于静脉内施用。在一些实施方案中，剂量以不超过10分钟、15分钟、20分钟、25分钟、30分钟、35分钟、40分钟、45分钟、50分钟、55分钟、60分钟、70分钟、80分钟、90分钟、120分钟、150分钟、180分钟、240分钟或300分钟完全施用。
在一些实施方案中，单一治疗有效剂量或临床有效剂量的药物组合物存在于单个输液袋中。在其他实施方案中，将单一治疗有效剂量或临床有效剂量的药物组合物分成2、3、4或5个单独的输液袋。
在一些实施方案中，本文所述的细胞以多个剂量(诸如2、3、4、5、6或更多个剂量)施用，其中多个剂量一起构成治疗有效剂量或临床有效剂量方案。在一些实施方案中，多个剂量中的每个剂量以间隔1至24小时的范围施用于受试者。在一些情况下，后续剂量在初始剂量或先前剂量后约1小时至约24小时(例如，约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23或约24小时)施用。在一些实施方案中，多个剂量中的每个剂量以间隔约1天至28天的范围施用于受试者。在一些情况下，后续剂量在初始剂量或先前剂量后约1天至约28天(例如，约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27或约28天)施用。在某些实施方案中，多个剂量中的每个剂量以间隔1周至约6周的范围施用于受试者。在某些情况下，后续剂量在初始剂量或先前剂量后约1周至约6周(例如，约1、2、3、4、5或6周)施用。在若干实施方案中，多个剂量中的每个剂量以间隔约1个月至约12个月的范围施用于受试者。在若干种情况下，后续剂量在初始剂量或先前剂量后约1个月至约12个月(例如，约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12个月)施用。
在一些实施方案中，在第一时间点向受试者施用第一剂量方案，然后随后在第二时间点向受试者施用第二剂量方案。在一些实施方案中，第一剂量方案与第二剂量方案相同。在其他实施方案中，第一剂量方案与第二剂量方案不同。在一些情况下，第一剂量方案和第二剂量方案中的细胞数量相同。在一些情况下，第一剂量方案和第二剂量方案中的细胞数量不同。在一些情况下，第一剂量方案和第二剂量方案的剂量数相同。在一些情况下，第一剂量方案和第二剂量方案的剂量数不同。
在一些实施方案中，第一剂量方案包括表达第一CAR的低免疫(HIP)T细胞或原代T细胞，并且第二剂量方案包括表达第二CAR的低免疫(HIP)T细胞或原代T细胞，使得第一CAR和第二CAR不同。例如，第一CAR和第二CAR结合不同的靶抗原。在一些情况下，第一CAR包括结合抗原的scFv，而第二CAR包括结合不同抗原的scFv。在一些实施方案中，第一剂量方案包括表达第一CAR的低免疫(HIP)T细胞或原代T细胞，并且第二剂量方案包括表达第二CAR的低免疫(HIP)T细胞或原代T细胞，使得第一CAR和第二CAR相同。第一剂量方案可以与第二剂量方案间隔至少1个月、2个月、3个月、4个月、5个月、6个月、7个月、8个月、9个月、10个月、11个月、12个月、1-3个月、1-6个月、4-6个月、3-9个月、3-12个月或更多个月施用于受试者。在一些实施方案中，在疾病(例如，癌症)过程期间向受试者施用多个剂量方案，并且所述剂量方案中的至少两个包含相同类型的本文所述的低免疫(HIP)T细胞或原代T细胞。在其他实施方案中，多个剂量方案中的至少两个包含不同类型的本文所述的低免疫(HIP)T细胞或原代T细胞。
在一些实施方案中，本文所述的CD19特异性(CD19)CAR-T细胞以约50x106至约110x106(例如，50x106、51x106、52x106、53x106、54x106、55x106、56x106、57x106、58x106、59x106、60x106、61x106、62x106、63x106、64x106、65x106、66x106、67x106、68x106、69x106、70x106、71x106、72x106、73x106、74x106、75x106、76x106、77x106、78x106、79x106、80x106、81x106、82x106、83x106、84x106、85x106、86x106、87x106、88x106、89x106、90x106、91x106、92x106、93x106、94x106、95x106、96x106、97x106、98x106、99x106、100x106、101x106、102x106、103x106、104x106、105x106、106x106、107x106、108x106、109x106或110x106)个活CD19特异性CAR-T细胞的剂量施用于受试者。在一些实施方案中，剂量是活CD19特异性CAR-T细胞的治疗有效量。在其他实施方案中，剂量是活CD19特异性CAR-T细胞的临床有效量。在一些实施方案中，活CD19特异性CAR-T细胞包括表达CD19特异性CAR的CD4+T细胞和表达CD19特异性CAR的CD8+T细胞，其比例为约1：1。在一些实施方案中，细胞的CD19特异性CAR是lisocabtagenemaraleucel其结构等同物或其功能等同物。
在一些实施方案中，向受试者施用约50x106至约110x106(例如，50x106、51x106、52x106、53x106、54x106、55x106、56x106、57x106、58x106、59x106、60x106、61x106、62x106、63x106、64x106、65x106、66x106、67x106、68x106、69x106、70x106、71x106、72x106、73x106、74x106、75x106、76x106、77x106、78x106、79x106、80x106、81x106、82x106、83x106、84x106、85x106、86x106、87x106、88x106、89x106、90x106、91x106、92x106、93x106、94x106、95x106、96x106、97x106、98x106、99x106、100x106、101x106、102x106、103x106、104x106、105x106、106x106、107x106、108x106、109x106或110x106)个本文所述的活CD19特异性CAR-T细胞。在一些实施方案中，剂量是活CD19特异性CAR-T细胞的治疗有效量。在其他实施方案中，剂量是活CD19特异性CAR-T细胞的临床有效量。在一些情况下，50％的活CD19特异性CAR-T细胞是表达CD19特异性CAR的CD4+ T细胞，并且50％的活CD19特异性CAR-T细胞是表达CD19特异性CAR的CD8+T细胞。在一些实施方案中，细胞的CD19特异性CAR是lisocabtagene maraleucel其结构等同物或其功能等同物。
在一些实施方案中，本文所述的CD19特异性CAR-T细胞以约2x106个/kg体重的剂量施用于受试者。在一些实施方案中，施用的最大剂量是约2x108个活CD19特异性CAR-T细胞。在一些实施方案中，剂量是活CD19特异性CAR-T细胞的治疗有效量。在其他实施方案中，剂量是活CD19特异性CAR-T细胞的临床有效量。在一些实施方案中，细胞的CD19特异性CAR是与axicabtagene ciloleucel相同的CD19特异性CAR、其结构等同物或其功能等同物。
在一些实施方案中，本文所述的CD19特异性CAR-T细胞以约2x106个/kg体重的剂量施用于受试者。在一些实施方案中，将最大剂量的约2x108个活CD19特异性CAR-T细胞施用于体重约100kg和更重的患者。在一些实施方案中，剂量是活CD19特异性CAR-T细胞的治疗有效量。在其他实施方案中，剂量是活CD19特异性CAR-T细胞的临床有效量。在一些实施方案中，细胞的CD19特异性CAR是与brexucabtagene autoleucel相同的CD19特异性CAR、其结构等同物或其功能等同物。
在一些实施方案中，本文所述的CD19特异性CAR-T细胞以至多约2x108个活CD19特异性CAR-T细胞的剂量施用于受试者。在一些实施方案中，对于体重约50kg或更轻的受试者，向受试者施用约0.2x106至约5.0x106(例如，约0.2x106、0.4x106、0.5x106、0.6x106、0.8x106、0.9x106、1.0x106、1.2x106、1.4x106、1.5x106、1.6x106、1.8x106、1.9x106、2.0x106、2.2x106、2.4x106、2.5x106、2.6x106、2.8x106、2.9x106、3.0x106、3.2x106、3.4x106、3.5x106、3.6x106、3.8x106、3.9x106、4.0x106、4.2x106、4.4x106、4.5x106、4.6x106、4.8x106、4.9x106或5.0x106)个活CD19特异性CAR-T细胞/kg体重。在一些实施方案中，对于体重大于约50kg的受试者，向受试者施用约0.1x108至约2.5x108(例如，约0.1x106、0.2x106、0.4x106、0.5x106、0.6x106、0.8x106、0.9x106、1.0x106、1.2x106、1.4x106、1.5x106、1.6x106、1.8x106、1.9x106、2.0x106、2.2x106、2.4x106或2.5x106)个活CD19特异性CAR-T细胞。在一些实施方案中，向受试者施用约0.6x108至约6.0x108(例如，约0.6x108、0.8x108、0.9x108、1.0x108、1.2x108、1.4x108、1.5x108、1.6x108、1.8x108、1.9x108、2.0x108、2.2x108、2.4x108、2.5x108、2.6x108、2.8x108、2.9x108、3.0x108、3.2x108、3.4x108、3.5x108、3.6x108、3.8x108、3.9x108、4.0x108、4.2x108、4.4x108、4.5x108、4.6x108、4.8x108、4.9x108、5.0x108、5.2x108、5.4x108、5.5x108、5.6x108、5.8x108、5.9x108或6.0x108)个活CD19特异性CAR-T细胞。在一些实施方案中，剂量是活CD19特异性CAR-T细胞的治疗有效量。在其他实施方案中，剂量是活CD19特异性CAR-T细胞的临床有效量。在一些实施方案中，细胞的CD19特异性CAR是与tisagenlecleucel相同的CD19特异性CAR、其结构等同物或其功能等同物。
在一些实施方案中，单剂量的本文所述的任何CD19特异性CAR-T细胞包括约50x106至约110x106(例如，50x106、51x106、52x106、53x106、54x106、55x106、56x106、57x106、58x106、59x106、60x106、61x106、62x106、63x106、64x106、65x106、66x106、67x106、68x106、69x106、70x106、71x106、72x106、73x106、74x106、75x106、76x106、77x106、78x106、79x106、80x106、81x106、82x106、83x106、84x106、85x106、86x106、87x106、88x106、89x106、90x106、91x106、92x106、93x106、94x106、95x106、96x106、97x106、98x106、99x106、100x106、101x106、102x106、103x106、104x106、105x106、106x106、107x106、108x106、109x106或110x106)个活CD19特异性CAR-T细胞。在一些实施方案中，剂量是活CD19特异性CAR-T细胞的治疗有效量。在其他实施方案中，剂量是活CD19特异性CAR-T细胞的临床有效量。在一些实施方案中，活CD19特异性CAR-T细胞包括表达CD19特异性CAR的CD4+T细胞和表达CD19特异性CAR的CD8+T细胞，其比例为约1：1。在一些实施方案中，CD19特异性CAR是与lisocabtagene maraleucel相同的CD19特异性CAR、其结构等同物或其功能等同物。
在一些实施方案中，单剂量的本文所述的任何CD19特异性CAR-T细胞包括约2x108个活CD19特异性CAR-T细胞。在一些实施方案中，本文描述的任何CD19特异性CAR-T细胞的单个输液袋包括约68mL的细胞悬浮液中的约2x108个活CD19特异性CAR-T细胞。在一些实施方案中，CD19特异性CAR是与axicabtagene ciloleucel相同的CD19特异性CAR、其结构等同物或其功能等同物。
在一些实施方案中，单剂量的本文所述的任何CD19特异性CAR-T细胞包括约2x108个活CD19特异性CAR-T细胞。在一些实施方案中，本文描述的任何CD19特异性CAR-T细胞的单个输液袋包括约68mL的细胞悬浮液中的约2x108个活CD19特异性CAR-T细胞。在一些实施方案中，CD19特异性CAR是与brexucabtagene autoleucel相同的CD19特异性CAR、其结构等同物或其功能等同物。
在一些实施方案中，对于体重50kg或更轻的受试者，单剂量的本文所述的任何CD19特异性CAR-T细胞包括约0.2x106至约5.0x106(例如，约0.2x106、0.3x106、0.4x106、0.5x106、0.6x106、0.7x106、0.8x106、0.9x106、1.0x106、1.1x106、1.2x106、1.3x106、1.4x106、1.5x106、1.6x106、1.7x106、1.8x106、1.9x106、2.0x106、2.1x106，2.2x106、2.3x106、2.4x106、2.5x106、2.6x106、2.7x106、2.8x106、2.9x106、3.0x106、3.1x106、3.2x106、3.3x106、3.4x106、3.5x106、3.6x106、3.7x106、3.8x106、3.9x106、4.0x106、4.1x106、4.2x106、4.3x106、4.4x106、4.5x106、4.6x106、4.7x106、4.8x106、4.9x106或5.0x106)个活CD19特异性CAR-T细胞/kg体重。在一些实施方案中，对于体重大于50kg的受试者，单剂量的本文所述的任何CD19特异性CAR-T细胞包括约0.1x108至约2.5x108(例如，约0.1x106、0.2x106、0.3x106、0.4x106、0.5x106、0.6x106、0.7x106、0.8x106、0.9x106、1.0x106、1.1x106、1.2x106、1.3x106、1.4x106、1.5x106、1.6x106、1.7x106、1.8x106、1.9x106、2.0x106、2.1x106、2.2x106、2.3x106、2.4x106或2.5x106)个活CD19特异性CAR-T细胞。在一些实施方案中，单剂量的本文所述的任何CD19特异性CAR-T细胞包括约0.6x108至约6.0x108(例如，约0.6x108、0.7x108、0.8x108、0.9x108、1.0x108、1.1x108，1.2x108、1.3x108、1.4x108、1.5x108、1.6x108、1.7x108、1.8x108、1.9x108、2.0x108、2.1x108、2.2x108、2.3x108、2.4x108、2.5x108、2.6x108、2.7x108、2.8x108、2.9x108、3.0x108、3.1x108、3.2x108、3.3x108、3.4x108、3.5x108、3.6x108、3.7x108、3.8x108、3.9x108、4.0x108、4.1x108、4.2x108、4.3x108、4.4x108、4.5x108、4.6x108、4.7x108、4.8x108、4.9x108、5.0x108、5.1x108、5.2x108、5.3x108、5.4x108、5.5x108、5.6x108、5.7x108、5.8x108、5.9x108或6.0x108)个活CD19特异性CAR-T细胞。在一些实施方案中，本文所述的任何CD19特异性CAR-T细胞的输液袋包括约10mL至约50mL的细胞悬浮液中的约0.6x108至约6.0x108(例如，约0.6x108、0.7x108、0.8x108、0.9x108、1.0x108、1.1x108、1.2x108、1.3x108、1.4x108、1.5x108、1.6x108、1.7x108、1.8x108、1.9x108、2.0x108、2.1x108、2.2x108、2.3x108、2.4x108、2.5x108、2.6x108、2.7x108、2.8x108、2.9x108、3.0x108、3.1x108、3.2x108、3.3x108、3.4x108、3.5x108、3.6x108、3.7x108、3.8x108、3.9x108、4.0x108、4.1x108、4.2x108、4.3x108、4.4x108、4.5x108、4.6x108、4.7x108、4.8x108、4.9x108、5.0x108、5.1x108、5.2x108、5.3x108、5.4x108、5.5x108、5.6x108、5.7x108、5.8x108、5.9x108或6.0x108)个活CD19特异性CAR-T细胞。在一些实施方案中，剂量是活CD19特异性CAR-T细胞的治疗有效量。在其他实施方案中，剂量是活CD19特异性CAR-T细胞的临床有效量。在一些实施方案中，细胞的CD19特异性CAR是与tisagenlecleucel相同的CD19特异性CAR、其结构等同物或其功能等同物。
Y.用于施用低免疫原性细胞(包括T细胞)的方法
如本文进一步详细描述的，本文提供了通过施用低免疫原性细胞(特别是低免疫原性T细胞)来治疗患有病状、病症或病症的患者的方法。应当理解，对于本文所述的与疗法的时间安排和/或组合相关的所有多个实施方案，细胞的施用是通过导致所引入的细胞至少部分定位于期望部位的方法或途径来完成的。可以将细胞直接输注、植入或移植到期望的部位，或通过任何适当的途径施用，所述途径导致递送至受试者的期望位置，植入的细胞或细胞组分中的至少一部分在所述位置中保持活性。
本文提供了用于治疗患有病状、病症或病症的患者的方法，包括向受试者(例如人类患者)施用低免疫原性细胞群(例如，原代T细胞、从低免疫原性诱导性多能干细胞分化的T细胞，或从本文所述低免疫原性诱导性多能干细胞分化的其他细胞)。例如，向患者施用低免疫原性原代T细胞群，诸如但不限于CD3+T细胞、CD4+T细胞、CD8+T细胞、未致敏T细胞、调控性T(Treg)细胞、非调控性T细胞、Th1细胞、Th2细胞、Th9细胞、Th17细胞、T滤泡辅助(Tfh)细胞、细胞毒性T淋巴细胞(CTL)、效应T(Teff)细胞、中央记忆T(Tcm)细胞、效应记忆T(Tem)细胞、表达CD45RA的效应记忆T细胞(TEMRA细胞)、组织驻留记忆(Trm)细胞、虚拟记忆T细胞、先天记忆T细胞、记忆干细胞(Tsc)、γδT细胞和T细胞的任何其他亚型，以治疗病状、病症或病症。在一些实施方案中，在施用低免疫原性细胞群之前，不向患者施用免疫抑制剂和/或免疫调节剂(诸如但不限于淋巴细胞清除剂)。在一些实施方案中，在施用细胞前至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14天或更多天施用免疫抑制剂和/或免疫调节剂。在一些实施方案中，在施用细胞前至少1周、2周、3周、4周、5周、6周、7周、8周、9周、10周或更多周施用免疫抑制剂和/或免疫调节剂。在多个实施方案中，在施用细胞后不向患者施用免疫抑制剂和/或免疫调节剂，或者在施用细胞后至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14天施用免疫抑制剂和/或免疫调节剂。在一些实施方案中，在施用细胞后至少1周、2周、3周、4周、5周、6周、7周、8周、9周、10周或更多周施用免疫抑制剂和/或免疫调节剂。在一些实施方案中，其中免疫抑制剂和/或免疫调节剂在施用细胞之前或之后向患者施用，施用的剂量低于具有MHC I和/或MHC II表达且无外源CD47表达的细胞所需的剂量。
免疫抑制剂和/或免疫调节剂(诸如但不限于淋巴细胞耗竭剂)的非限制性实例包括环孢菌素(cyclosporine)、硫唑嘌呤(azathioprine)、麦考酚酸(mycophenolic acid)、霉酚酸酯(mycophenolate mofetil)、皮质类固醇，诸如泼尼松(prednisone)、甲氨蝶呤、金盐、柳氮磺胺吡啶(sulfasalazine)、抗疟药、布喹那(brequinar)、来氟米特(1eflunomide)、咪唑立宾(mizoribine)、15-脱氧精胍菌素、6-巯基嘌呤、环磷酰胺、雷帕霉素(rapamycin)、他克莫司(tacrolimus)(FK-506)、OKT3、抗胸腺细胞球蛋白、胸腺五肽、胸腺肽-α和类似剂。在一些实施方案中，免疫抑制剂和/或免疫调节剂选自由以下组成的免疫抑制抗体组：与IL-2受体的p75结合的抗体、与例如MHC、CD2、CD3、CD4、CD7、CD28、B7、CD40、CD45、IFN-γ、TNF-α、IL-4、IL-5、IL-6R、IL-6、IGF、IGFR1、IL-7、IL-8、IL-10、CD11a或CD58结合的抗体、以及与其任何配体结合的抗体。在一些实施方案中，这种免疫抑制剂和/或免疫调节剂可选自可溶性IL-15R、IL-10、B7分子(例如，B7-1、B7-2、其变体及其片段)、ICOS和OX40、负性T细胞调控子的抑制剂(诸如针对CTLA-4的抗体)和相似的剂。
在一些实施方案中，其中免疫抑制剂和/或免疫调节剂在施用细胞之前或之后向患者施用，施用的剂量低于具有MHC I和/或MHC II表达、TCR表达且无外源CD47表达的细胞所需的剂量。在一些实施方案中，其中免疫抑制剂和/或免疫调节剂在第一次施用细胞之前或之后向患者施用，施用的剂量低于具有MHC I和MHC II表达、TCR表达且无外源CD47表达的细胞所需的剂量。
在一些实施方案中，将所述细胞与治疗剂共同施用，所述治疗剂与选自由以下组成的组的一种或多种受体结合和/或相互作用：CD94、KIR2DL4、PD-1、抑制性NK细胞受体和活化NK受体。在一些情况下，治疗剂与NK细胞(包括NK细胞的一个或多个亚群)表面的受体结合。在一些实施方案中，治疗剂选自由以下组成的组：抗体及其片段和变体、抗体模拟物、小分子、阻断肽和受体拮抗剂。
对于治疗应用，根据所公开的方法制备的细胞通常可以以包含等渗赋形剂的药物组合物的形式提供，并且在对人体施用足够无菌的条件下制备。对于细胞组合物的药物制剂的一般原则，参见″Cell Therapy：Stem Cell Transplantation，Gene Therapy，andCellular Immunotherapy，″Morstyn&Sheridan编辑，Cambridge University Press，1996；和″Hematopoietic Stem Cell Therapy，″E.D.Ball，J.Lister&P.Law，ChurchillLivingstone，2000。可以将细胞包装在适合分配或临床使用的装置或容器中。
IV.实施例
实施例1：TRAC、B2M和CIITA三重敲除的CD47转基因CAR-T细胞(tKO/CD47 CAR-T细
胞)的生成
本文描述了用于产生TRAC、B2M和CIITA三重敲除的CD47转基因CAR-T细胞(HIPCD19-CAR-T细胞)的示例性方法。使用慢病毒表达技术将CD19特异性嵌合抗原受体(CD19-CAR)引入到T细胞中，并且使用CRISPR/Cas9技术将TRAC、B2M和CIITA基因灭活。
慢病毒载体的产生：使用标准化学转染复合物来转染悬浮培养物中生长的HEK293LX，所述复合物含有分别具有对照CAR或测试CAR的病毒表达和转移载体。在转染后收获并澄清细胞培养物，然后离心浓缩。将慢病毒颗粒重新悬浮成最终浓缩物。
人泛T细胞(包括CD3阳性T细胞)的培养、转导和核转染：泛T细胞在同一天解冻并活化。活化后，将慢病毒浓缩物与T细胞在标准培养板中混合。具体来讲，将T细胞与含有慢病毒浓缩物的培养基混合，然后进行旋转感染。将相同条件的细胞在接种于未处理的培养板上时汇集。具体而言，T细胞用以下中的任一种转染：(1)仅含有CD47转基因的对照构建体，(2)含有CD19-CAR的对照构建体，或(3)含有CD47转基因和CD19-CAR两者的构建体(也称为“CAR-CD47”)。转导后，收集并沉淀所有转导的T细胞，以准备对Cas9核糖核蛋白(RNP)进行核转染，以生成TRAC、B2M和CIITA三重敲除细胞。每个靶标基因座的RNP以特定的sgRNA：Cas9比例单独复合，然后以每百万个细胞的特定量混合三种RNP。RNP混合物在溶液中稀释，与细胞沉淀混合，并且在特定条件下进行核转染。对核转染细胞进行接种和培养，然后在活化后在冷冻保存培养基中冷冻保存。有关更多信息，请参见表21。
表21.测试材料汇总
缩写：HLA，人白细胞抗原；TCR，T细胞受体；wt，野生型；-，阴性；++，过表达；+，阳性
实施例2：创建低免疫原性CAR-T细胞以逃避同种异体疗法的免疫识别
现成的CAR-T细胞可以提供优于自体策略的优势，包括易于制造、质量控制以及避免恶性污染和T细胞功能障碍。然而，针对组织不相容性T细胞的强烈宿主抗移植物免疫反应阻止同种异体CAR-T细胞的扩增和持续存在，并降低这种途径的功效。
本文描述了工程化或修饰的人免疫逃避CAR-T细胞，其部分基于WO2018132783中所述的低免疫编辑平台。发明人利用了以下发现：当人白细胞抗原(HLA)I类和II类基因灭活并且CD47过表达时，T细胞失去其免疫原性，并且可以经由TCR敲除来控制移植物抗宿主病的风险。此外，还执行了TCR敲除以控制移植物抗宿主病的风险。
本实施例描述了在体外肿瘤功效实验中，与对照CD19特异性CAR-T细胞相比，低免疫原性CD19特异性CAR-T细胞以及外源CD47表达对此类细胞的活性的影响。在实验中，CD19+肿瘤细胞用作靶细胞，并且CAR-T细胞(诸如测试和对照CAR-T细胞)用作效应细胞。
在研究中，测试低免疫原性CAR-T细胞包括(a)B2M、CIITA和TRAC基因的基因组编辑，和(b)含有编码CD19特异性CAR的多核苷酸和编码CD47的多核苷酸的转基因。在一些情况下，对照CAR-T细胞包括编码CD19特异性CAR的多核苷酸。在某些情况下，对照CAR-T细胞包括表达与tisagenlecleucel或其生物类似物/替代物相同的CAR构建体的T细胞。
当移植到同种异体人源化小鼠中时，与从同一人类供体生成的CD19特异性CAR-T细胞相比，低免疫原性HLA-I/II阴性、TCR阴性、CD47阳性、CD19特异性CAR-T细胞逃避T细胞和B细胞的免疫识别。先天免疫细胞测定显示，CD47过表达保护MHC-I/II缺陷型CAR-T细胞在体外和体内免受先天免疫细胞杀伤。使用用流式细胞术估计每个细胞的抗体的方法，分析CD47表达水平，以了解保护的阈值水平。本文所述的策略还可以用作低免疫原性CAR-T细胞的安全策略。
分离的CD47过表达和所有三种低免疫编辑或敲除(B2M/CIITA/TRAC)均未显示对CAR-T细胞的细胞毒性潜力有任何影响。在一定范围的肿瘤细胞：CAR-T细胞比例下，低免疫原性CD19特异性CAR-T细胞(例如，B2M-/-、CIITA-/-、TRAC-/-CD19特异性CAR-CD47 T细胞)在体外CD19+肿瘤模型以及NSG小鼠中保留其抗肿瘤活性。与免疫原性CAR-T细胞相比，似乎低免疫基因编辑(例如，B2M/CIITA/TRAC基因灭活)的引入并未改变它们的细胞因子非依赖性生长。这些发现显示，低免疫原性CD19特异性CAR-T细胞在同种异体受体中具有功能性免疫逃避作用，且细胞毒性抗肿瘤能力延长，并且表明它们可以为癌症患者提供通用的免疫治疗选择。
总之，本实施例和对应图片中提供了具有CD19特异性CAR活性的低免疫原性T细胞(例如，三重TRAC、B2M、CIITA敲除以及CD19特异性CAR和CD47蛋白过表达)。如体外测定中所证明的，此类低免疫原性CAR-T细胞受到保护而免于先天免疫细胞杀伤。在单个EF1α启动子的控制下外源表达含有CD19特异性CAR和CD47的构建体(CAR-CD47构建体)的T细胞显示出与其他可比较的CD19特异性CAR-T细胞相似的活性，如体外和体内测定所示。此外，CAR-CD47构建体在T淋巴母细胞系(Mo)细胞中的表达显示出细胞因子非依赖性生长。如体外和体内实验所示，本文所述的低免疫原性CAR-T细胞未被排斥。在体外和体内测定中，低免疫原性CAR-T细胞还显示出与可比较的免疫原性CAR-T细胞相似的肿瘤杀伤活性。实验数据在图1至图30中提供。
实施例3：TRAC、B2M和CIITA三重敲除CAR-T细胞不存在细胞因子非依赖性增殖
在第-1天，将细胞重悬在补充有IL-2的培养基中。使用本领域技术人员已知的标准方案，用细胞活力染料对细胞进行染色以检测活细胞和死细胞。染色的细胞以预定浓度铺板，并且在37℃；5％CO2下孵育过夜。在第0天，对细胞进行染色，然后计数。将细胞以预选浓度重悬在不含IL-2的培养基中。将细胞分成两个等分试样-样品#1补充了IL-2，而样品#2未补充IL-2。两份样品每三天补料一次，使得样品#1被补料补充有IL-2的培养基，而样品#2被补料未补充IL-2的培养基。在第19天，将两份样品在补充有IL-2的培养基中培养。在第22天，使用细胞活力染料对样品进行染色。使用标准细胞计数仪对细胞进行计数并评价活力以确定活细胞和死细胞的数量。图31提供了实验途径的示意图。
结果显示，样品#1细胞(补充有IL-2)增殖，而样品#2细胞(未补充IL-2)不增殖(图32A和图32B)。
实施例4：Nalm6肿瘤细胞在异种移植小鼠模型中的tKO/CD47CAR-T细胞介导的细
胞毒性
使用异种移植Nalm6-1uc白血病肿瘤细胞的NSG小鼠来评价本公开的低免疫原性CAR-T细胞(HLA-/TCR-/CD47tg CD19-特异性CAR-T细胞，也称为tKO/CD47 CAR-T细胞或HIPCD19-CAR-T细胞)针对肿瘤细胞的细胞毒性。研究中使用的实验途径在图33中提供。
Nalm6-luc细胞最初来源于男性急性B淋巴细胞白血病(B-ALL)患者，并且其已被修饰以稳定表达荧光素酶和G418抗性基因。在半悬浮培养条件下培养细胞，每2-3天传代一次。对于体内注射，收集处于对数生长期的细胞并且在标准缓冲液中洗涤，然后向受体NSG小鼠施用。
将tKO/CD47 CAR-T(HIP CD 19-CAR-T)细胞解冻，并且使用标准T细胞培养条件进行培养。保留细胞的等分试样用于活力和CD19特异性CAR表达频率的解冻后流动分析。使用流式细胞术确定活力和CAR表达。CAR-T细胞的剂量基于细胞的活力和CAR表达的频率进行计算。
在第-3天，对NSG小鼠静脉内(iv)注射Nalm6-luc细胞。将使用Nalm6肿瘤攻击的小鼠分成四个治疗组。随着时间的推移，在施用tKO/CD47 CAR-T(HIP CD19-CAR-T)细胞的小鼠中确定肿瘤负荷，并且与施用对照CAR-T细胞、未编辑的T细胞或生理盐水的小鼠进行比较。
在第0天，对第一组小鼠iv注射三种不同剂量的tKO/CD47 CAR-T(HIP CD19-CAR-T)细胞-剂量#1为1x106个tKO/CD47 CAR-T细胞(HIP CD19-CAR-T)、剂量#2为3x106个tKO/CD47 CAR-T(HIP CD19-CAR-T)细胞，并且剂量#3为5x106个tKO/CD47 CAR-T(HIP CD19-CAR-T)细胞。对第二组小鼠iv注射三种不同剂量的对照CAR-T细胞-剂量#1为1x106个对照CAR-T细胞，剂量#2为3x106个对照CAR-T细胞，并且剂量#3为5x106个对照CAR-T细胞。对第三组小鼠iv注射5x106个未编辑的T细胞。最后，对第四组小鼠iv注射生理盐水。
在研究过程中，每周(诸如在第7、14、21、28天等)执行体内成像以检测肿瘤细胞。在研究终点时，将收集小鼠的组织样品并对样品进行分析，诸如但不限于细胞因子分析和病毒拷贝数(VCN)。
CAR-T细胞疗法后获得的带有Nalm6的小鼠的图像显示，与对照CAR-T治疗的小鼠、未编辑的T细胞治疗的小鼠和生理盐水治疗的小鼠相比，tKO/CD47 CAR-T(HIP CD19-CAR-T)细胞治疗的小鼠的肿瘤生长延迟(图34和图35)。
实施例5：用于产生用于同种异体细胞疗法的低免疫原性CAR-T细胞的方法
本实施例描述了一种由单核细胞和血浆(leukopak)生成低免疫原性CAR-T细胞(B2M插入缺失/插入缺失、CIITA插入缺失/插入缺失、TRAC插入缺失/插入缺失CD47tg T细胞，其表达CD19特异性CAR-T细胞，也称为tKO/CD47CD19-CAR-T(HIP CD19-CAR-T)细胞)的方法，所述单核细胞和血浆来自小于35岁并且具有O+血型的健康女性供体。从健康供体分离CD4+和CD8+T细胞分离、将它们分开并活化，然后使用携带CD47转基因和CD19特异性CAR的慢病毒对CD4+和CD8+ T细胞进行慢病毒转导。然后经由CRISPR/Cas9对转导的细胞进行遗传修饰以将B2M、CIITA和TRAC基因灭活，从而产生tKO/CD47 CD19-CAR-T细胞(HIP CD19-CAR-T)。
CD4+和CD8+ T细胞的分离
为了从供体的单核细胞/血浆中分离CD4+和CD8+ T细胞，利用了一系列阳性免疫磁性细胞选择策略来分离CD8+T细胞和CD4+ T细胞。CD8+ T细胞用冷冻保存培养基配制，在冷冻保存小瓶中等分，并且使用控速冷冻机进行冷冻。单独地，CD4+ T细胞用冷冻保存培养基配制，在冷冻保存小瓶中等分，并且使用控速冷冻机进行冷冻。
CD4+和CD8+ T细胞的活化
将CD4+和CD8+细胞的冷冻的等分试样解冻，使用CD3/CD28珠活化，并且在用于细胞生长和扩增的条件下培养。简而言之，CD4+和CD8+ T细胞与CD3/CD28(抗CD3/抗CD28)珠以约3∶1的珠∶细胞比例组合。细胞和珠混合物以约1∶1的CD4∶CD8比例接种，并且在含有IL-2的培养基中培养过夜。所述过程构成活化的第0天。
慢病毒载体生产
根据制造商的条件来培养用于慢病毒生产的HEK293衍生细胞。在第0天(转染日)，用含有慢病毒包装质粒和预选表达载体的转染混合物转染细胞。在转染后第1天，将细胞暴露于添加剂(诸如丁酸钠)中以改善病毒蛋白生产。在转染后第1天，收集病毒上清液，澄清，然后通过超高速离心进行浓缩。将所得病毒沉淀分离并重悬在标准病毒制剂缓冲液中。
CD4+和CD8+ T细胞的慢病毒转导
在第0天，将CD4+和CD8+细胞的冷冻的等分试样解冻，使用CD3/CD28珠活化，并且在用于细胞生长和扩增的条件下培养。简而言之，CD4+和CD8+ T细胞与CD3/CD28(抗CD3/抗CD28)珠以约3∶1的珠∶细胞比例组合，以约1∶1的CD4∶CD8比例接种，并且在不含细胞因子的培养基中培养过夜。在活化后的那一天(活化后第1天)，活化的CD4+和CD8+T细胞已准备用于慢病毒转导，并且被分为三个实验组。第1组细胞被认为是未转导的对照T细胞(“未编辑的对照”)，允许其在标准T细胞培养条件下增殖，并且不用慢病毒载体进行转导。第2组细胞被认为是转导的对照CD19-CAR-EGFRt T细胞(“对照CAR-T”)，用编码CD19特异性CAR和截短的EGFR的慢病毒载体进行转导。第3组细胞被认为是转导的低免疫原性CD19-CAR-T细胞(“HIP CAR-T”)，用编码CD47转基因和CD19特异性CAR两者的双顺反子表达盒的慢病毒载体进行转导。对于第2组和第3组细胞，细胞以约10的MOI(根据功能滴度计算)暴露于它们各自的浓缩慢病毒颗粒。使用标准旋转感染方案对细胞进行转染，并允许细胞在孵育箱中恢复约2天。
恢复后并且在活化后第3天，分别收获转导的细胞(第2组和第3组细胞)和对照细胞(第1组细胞)，并进行CD3/CD28珠去除方法。将来自每组的所得细胞洗涤并重悬在含有IL-2的培养基中。
基因编辑慢病毒转导的CD4+和CD8+ T细胞
组装TRAC、B2M和CIITA基因的核糖核蛋白(RNP)，使得sgRNA与重组Cas9预复合。简而言之，将合成修饰的sgRNA与SPyFi Cas9以一定比例混合，使得Cas9过量。靶向TRAC、CIITA和B2M的gRNA与Cas9的二元复合物形成根据本领域技术人员认可的标准方案来进行。RNP以1∶1.5∶2的TRAC-RNP∶B2M-RNP∶CIITA-RNP比例组合用于三重敲除核转染，并且核转染到第3组细胞中。允许细胞在孵育箱中恢复约2天。
第3组的细胞以及第1组和第2组的细胞使用本领域已知的标准方案进行培养和维持。
从HIP CAR-T细胞中耗尽CD3+ T细胞
在活化后第8天，使用本领域技术人员已知的标准阴性选择方法耗尽第3组“HIPCAR-T”细胞的CD3阳性细胞。
将收集的CD3阴性HIP CAR-T细胞重悬在补充有IL-2的培养基中并培养。对于冷冻保存，对细胞进行计数并且以预先选择的浓度将细胞悬浮在冷冻保存制剂中。将细胞储存在液氮中以长期储存。
CD3耗尽的HIP CAR-T细胞的表征
在活化后第10天，使用标准方案制备来自实验组1、2和3的细胞用于流式细胞术分析，以确定细胞活力和细胞标志物的表达，所述标志物包括CD3、CD4、CD8a、HLA-ABC、HLA-DR/DP/DQ、CD19-CAR和CD47。图38提供了由所述方法产生的HIP CAR-T细胞、对照CAR-T细胞和未编辑的T细胞的流式细胞术结果的表格。
结果
数据显示，与对照CAR-T细胞和未编辑的T细胞相比，HIP CAR-T细胞包括显著更高百分比的CD47阳性细胞、CD47阳性和CAR阳性细胞、CD3阴性细胞、HLA-ABC阴性细胞、HLA-DR/DP/DQ阴性细胞和三重敲除细胞。HIP CAR-T细胞含有相似百分比的CD4+ T细胞和CD8+T细胞。本实施例描述了一种用于生成低免疫原性CD19特异性CAR-T细胞的说明性方法，所述细胞可用于同种异体CAR-T疗法。
实施例6：HIP CAR-T细胞在人源化小鼠中的适应性免疫逃避
人源化NSG-SGM3小鼠用作CDC杀伤测定的受体。将动物随机分配到实验组。将1x106个CD19-CAR-T细胞静脉内注射到尾静脉中，并且在注射后7天收集血清。
CDC杀伤测定在XCelligence MP平台(Agilent Technologies，Santa Clara，CA)上执行。用肿瘤涂覆溶液(Agilent Technologies)涂覆96孔E板(Agilent Technologies)，并且将4×104个靶CD19-CAR-T细胞或HIP CD19-CAR-T细胞铺板在含有人IL-2的100μlOptimizer培养基(包括补充剂，Thermo Fisher)中。在细胞指数达到0.7后，将50μl血清样品与50μl人补体(Quidel，San Diego，CA)混合并添加至靶细胞。作为杀伤对照，细胞用2％TritonX100处理(数据未显示)。使用RTCA软件(Agilent Technologies)对数据进行归一化和分析。
如图39A至图39B所示，将非低免疫编辑的CD19-CAR-T细胞(经工程化以表达CAR但缺乏对B2M、CIITA或CD47转基因的任何修饰的T细胞)移植到同种异体人源化小鼠中导致显著的T细胞活化，而低免疫CD19-CAR-T细胞(经工程化以表达CAR和CD47转基因并且经工程化以降低B2M和CIITA的表达的T细胞)逃避免疫识别(p＜0.0001)。
如图39C至图39D所示，即使在CAR敏化后，低免疫CD19-CAR-T细胞在同种异体人源化小鼠受体中也具有功能性免疫逃避作用。这些数据表明，低免疫CD19-CAR-T细胞可以用于敏化的患者和重新给药策略。
实施例7：示例性HIP CD19-CAR-T细胞的生成
HIP CD19-CAR-T细胞经由离体过程来制造，所述过程包括对纯化的CD8+和CD4+ T细胞进行基因组修饰的两个单独步骤：实现抗CD19嵌合抗原受体(CD19-CAR)和CD47基因的转基因表达的慢病毒转导步骤，以及其中Cas酶用于靶向三个基因座以进行敲除(TRAC、B2M和CIITA)的基因组编辑步骤。慢病毒载体用VSV-G假型化，并携带含有CD19-CAR和CD47基因两者的双顺反子转基因。基因组编辑步骤中使用的试剂包含编码Cas核酸酶或Cas蛋白的mRNA以及三种单一指导RNA(sgRNA)，所述单一指导RNA中的每一种都靶向上述基因座之一。通过(i)阻断宿主先天免疫的CD47过表达；(ii)防止宿主适应性免疫的降低的MHC I类和II类HLA的表达和(iii)防止移植物抗宿主反应的降低的T细胞受体(TCR)的表达，将HIPCD19-CAR-T细胞设计为逃避宿主的免疫系统，同时介导表达CD19的肿瘤细胞的持久杀伤。先前描述的实验证明，这些细胞能够躲避免疫系统并避免免疫排斥。参见，例如，2021年8月12日提交的PCT/US21/45822和WO2021222285，其通过引用整体并入本文。
使用HIP CD19-CAR-T细胞的体外和体内研究都证明了靶向和杀伤CD19+肿瘤细胞(NALM-6)的预期药理活性与CD19-CAR-T细胞相似(用慢病毒载体转导以表达CD19-CAR，但没有低免疫编辑)。HIP CD19-CAR-T细胞缺乏与三重敲除(tKO)CD19-CAR-T细胞相似的移植物抗宿主反应，并且与标准或tKO CD19-CAR-T细胞相比，独特地逃避先天和适应性宿主免疫系统反应。参见，例如，2021年8月12日提交的PCT/US21/45822和WO2021222285以及图39和图41。
实施例8：HIP CD19-CAR-T细胞杀伤的体外评估
本体外研究的目的是测试本文所述的HIP CD19-CAR-T细胞的杀伤活性。
本研究中使用的细胞包括(i)HIP CD19-CAR-T细胞，(ii)CD19-CAR-T细胞，和(iii)来自同一供体的未编辑的T细胞。为了评价杀伤活性，将CD19-CAR-T和HIP CD19-CAR-T细胞解冻、静置过夜，并通过流式细胞术评估CD19-CAR频率。CD19-CAR-T和HIP CD19-CAR-T细胞以不同的效应物与靶标比例(范围为3∶1至1∶243，3倍稀释系列)与NALM-6细胞(用Cell Trace Violet，CTV标记的靶细胞)共培养18小时。将未编辑的T细胞添加至每个E∶T比，以在每个条件下保持相同的T细胞总数。未编辑的T细胞和NALM-6细胞(CTV标记的)的共培养用于将细胞杀伤归一化。
CD19-CAR-T细胞和HIP CD19-CAR-T细胞具有相似百分比(75％)的表达CD19-CAR的活细胞(数据未显示)。当与CD19+NALM-6肿瘤靶细胞共培养时，CD19-CAR-T和HIP CD19-CAR-T细胞两者均显示出剂量相关活性，其中半数有效浓度(ED5o)为1∶20的效应物与靶标目标比例(E：T)(数据未显示)。这些发现表明HIP CD19-CAR-T细胞具有相似的CD19-CAR表达，并且证明了与CD19-CAR-T细胞相似的活性。
实施例9：HIP CAR-T细胞在带有NALM-6-Luc肿瘤的雌性NSG小鼠中的抗肿瘤活性的单次静脉内剂量108天研究
本研究的目的是证明Cas9基因编辑的HIP CD19-CAR-T细胞在CD19+NALM-6-荧光素酶肿瘤NSG小鼠B细胞恶性肿瘤模型中的抗肿瘤活性。
表22总结了本剂量范围纵向研究，所述研究包括在第60天用肿瘤再次攻击以评价长期CD19-CAR-T细胞活性水平。
表22.研究组
每组的n＝8。NA表示未再次攻击的动物，或在指定采血时不存活的动物。处死的时间因小鼠而异。
在第-3天，雌性NSG小鼠(n＝8只/组)静脉内植入1×106个NALM-6-Luc肿瘤细胞。评价T细胞上的活力和CD19-CAR表达以计算总T细胞数(CD19-CAR+细胞数的预期数量/％存活的CD19-CAR+细胞)。未编辑的T细胞基于活细胞的频率来计算。在第0天，向小鼠施用CD19-CAR-T细胞。在第60天，使用额外静脉内注射1×106个NALM-6-Luc细胞来再次攻击A组和G组(分别为5×106HIP CD19-CAR-T细胞/小鼠和5×106tKO CD19-CAR-T细胞/小鼠)中的动物。一组新的幼稚NSG小鼠(J组)静脉内注射1×106个NALM-6-Luc细胞以用作未治疗的对照。
对分离的PBMC、脾脏和骨髓T细胞群执行免疫表型分析。执行生物发光成像(BLI)以每周监测肿瘤负荷。对尸检时收集的组织执行组织病理学检查，并且根据移植物抗宿主反应(GvHR)的严重程度、肿瘤负荷和/或其他微观变化对组织学变化进行主观评分。
使用单因素或双因素方差分析(ANOVA)对流式细胞术数据执行统计分析，并且对斜率具有随机效应的随机系数模型用于BLI数据和再次攻击的小鼠。
结果-肿瘤负荷。由于肿瘤负荷引起的垂死，生理盐水治疗的动物在第21天被安乐死(图42)。尽管两只未编辑的T细胞治疗的小鼠具有降低的肿瘤生长，但剩余的未编辑的T细胞治疗小鼠发展肿瘤并且在第35天被处死。1×106个CD19-CAR-T细胞/小鼠组中的八只小鼠中的两只具有肿瘤生长并且在第35天被处死；1×106个CD19-CAR-T组中剩余的6只小鼠由于GvHR在第42天被处死。用1×106个HIP CD19-CAR-T细胞治疗的动物从第21天开始显示出肿瘤生长。给药3×106个HIP CD19-CAR-T细胞的小鼠和给药5×106个HIP CD19-CAR-T细胞或tKO CD19-CAR-T细胞的小鼠在NALM-6-Luc再次攻击之前都没有肿瘤(第60天(图42))。
重要的是，HIP CD19-CAR-T或tKO CD19-CAR-T治疗的动物都没有GvHR症状，而5×106个和3×106个CD19-CAR-T治疗组中的每只小鼠都发展出GvHR症状，所述症状包括显著的体重减轻、皮毛脱落和/或驼背姿势。
在第60天，5×106个HIP CD19-CAR-T和5×106个tKO CD19-CAR-T治疗的组用1×106个NALM-6-Luc细胞再次攻击。将注射1×106个NALM-6-Luc细胞并且用生理盐水治疗的一组新的幼稚NSG小鼠添加至研究以用作对照。在48天期间，与生理盐水治疗的小鼠相比，使用NALM-6-Luc细胞再次攻击的5×106个HIP CD19-CAR-T和tKO CD19-CAR-T动物显示出相似的、显著改善的肿瘤抑制(图42)。本研究在第108天终止，此时所有再次攻击的小鼠都有肿瘤复发。
结果-CD19-CAR-T和CD47表达水平。从在第42天与第108天之间的中间采血时和处死时收集的血液评价CD19-CAR+细胞的频率(图43)。由于没有为任何组预先确定处死时间，因此不可能在每个时间点进行头对头比较。在第42天与第66天之间，在所有低免疫和tKOCD19-CAR-T治疗的小鼠的血液中，并且在1×106个CD19-CAR-T治疗的小鼠中，存在CD19-CAR+细胞频率的显著降低(5×106个HIP CD19-CAR-T治疗的p＜0.0001，3×106个HIP CD19-CAR-T治疗的p＜0.0001，1×106个HIP CD19-CAR-T治疗的p＝0.0015；5×106个tKO CD19-CAR-T治疗的p＜0.0001；1×106个CD19-CAR-T治疗的p＝0.0410)。再次攻击的5×106个HIPCD19-CAR-T治疗的组在第66天与第108天之间具有CD19-CAR+细胞的显著增加(p＜0.0001)，而再次攻击的5×106个tKO CD19-CAR-T治疗的组不具有(p＝0.4694)。
在第108天，HIP CD19-CAR-T细胞上的CD47MFI显著高于tKO CD19-CAR-T细胞(p＜0.0001)(图43)。由于缺乏足够的同一天出血或处死，无法在低免疫细胞与CD19-CAR-T细胞之间比较CD47MFI。
结果。对肺、肝和皮肤执行组织病理学分析。在施用CD19-CAR-T细胞或未编辑的CD19-CAR-T细胞的小鼠中观察到以血管周围、细支气管周围和附件周围单核细胞(淋巴细胞和巨噬细胞)浸润肝脏、肺部和皮肤为特征的GvHR。在以任何剂量施用HIP CD19-CAR-T或tKO CD19-CAR-T的小鼠中，GvHR不明显。在施用最低(1×106个)剂量的HIP CD19-CAR-T细胞的小鼠和所有再次攻击的小鼠中，观察到肝窦和/或肺部的肺泡隔内的肿瘤(NALM-6)细胞浸润。施用未编辑的CD19-CAR-T细胞的两只小鼠在肝脏中同时具有NALM-6肿瘤细胞浸润和GvHR。使用5×106个HIP CD19-CAR-T细胞、1×106个CD19-CAR-T细胞或5×106个tKOCD19-CAR-T细胞治疗的若干只小鼠的腹部肿块对应于替代了正常卵巢结构的NALM-6肿瘤细胞。
结论。在108天的研究期间，向植入CD19+NALM-6-Luc肿瘤细胞的NSG小鼠施用HIPCD19-CAR-T细胞导致全身肿瘤负荷的剂量依赖性降低而没有GvHR的证据。3×106个和5×106个的剂量的CD19-CAR-T细胞也降低了肿瘤负荷，但组织病理学分析也证实发展了GvHR。GvHR在CD19-CAR-T治疗的动物中的高发病率可能是由于TCR和MHC信号传导，这在低免疫或tKO CD19-CAR-T细胞中没有发生。此外，与生理盐水治疗的对照相比，5×106个HIP CD19-CAR-T细胞/小鼠和5×106个tKO CD19-CAR-T细胞/小鼠的治疗导致相当的肿瘤负荷减少，以及在再次攻击时显著和相似的抑制。在研究结束时，CD19-CAR+细胞在再次攻击的动物中仍可检测到，并且与tKO CD19-CAR-T细胞相比，HIP CD19-CAR-T细胞上的CD47表达显著更高。
实施例10：HIP CD19-CAR-T细胞的体外细胞因子非依赖性增殖
本研究的目的是确定HIP CD19-CAR-T细胞是否具有在IL2不存在的情况下增殖的能力，作为潜在致癌转化的指标。
与第0天相比，在IL2的存在下培养的CD19-CAR-T细胞(对照)和HIP CD19-CAR-T细胞显示出相似的细胞计数增加，表明细胞增殖相当。在IL2不存在的情况下培养的CD19-CAR-T细胞和HIP CD19-CAR-T细胞是相当的，并显示出极少的增殖迹象、存活率降低(细胞计数减少)，并且最终在第12天时不存在活细胞(图44)。
HIP CD19-CAR-T细胞在IL2不存在的情况下未表现出增殖，表明基因组修饰不导致潜在的致癌转化。此外，与存在或不存在IL2的情况下的CD19-CAR-T细胞相比，HIP CD19-CAR-T细胞表现出相似的行为。
所有标题和章节名称仅出于清晰和参考目的，并且不应视为以任何方式进行限制。例如，本领域技术人员将理解，根据本文所述的技术的精神和范围适当地组合来自不同标题和章节的各个实施方案的有用性。
本文引用的所有参考文献特此通过引用并且出于所有目的整体并入本文，其程度就如每项单独的出版物或专利或专利申请被具体和单独地指示出于所有目的通过引用整体并入。
可以在不背离本申请的精神和范围的情况下对本申请进行许多修改和变化，这对本领域技术人员而言将是显而易见的。本文所述的具体实施方案和实施例仅作为实例提供，并且本申请仅受所附权利要求的条款以及权利要求所享有的等同物的全部范围的限制。
Claims (227)
1.一种工程化细胞，其相对于野生型细胞或对照细胞包含降低的HLA-A、HLA-B、HLA-C、HLA-DP、HLA-DQ、HLA-DR、B2M、CIITA、TCR-α和/或TCR-β的表达，所述工程化细胞还包含一组外源多核苷酸，所述一组外源多核苷酸包含编码CD47的第一外源多核苷酸和编码嵌合抗原受体(CAR)的第二外源多核苷酸，其中所述第一和/或第二外源多核苷酸插入到所述细胞的至少一个等位基因的特定基因座中。
2.如权利要求1所述的工程化细胞，其中所述特定基因座选自由以下组成的组：安全港或靶标基因座、B2M基因座、CIITA基因座、TRAC基因座和TRB基因座。
3.如权利要求2所述的工程化细胞，其中将所述编码CD47的第一外源多核苷酸插入到选自由以下组成的组的特定基因座中：安全港或靶标基因座、B2M基因座、CIITA基因座、TRAC基因座和TRB基因座。
4.如权利要求2或3所述的工程化细胞，其中将所述编码CAR的第二外源多核苷酸插入到选自由以下组成的组的特定基因座中：安全港或靶标基因座、B2M基因座、CIITA基因座、TRAC基因座和TRB基因座。
5.如权利要求2-4中任一项所述的工程化细胞，其中将所述编码CD47的第一外源多核苷酸和所述编码CAR的第二外源多核苷酸插入到不同的基因座中。
6.如权利要求2-4中任一项所述的工程化细胞，其中将所述编码CD47的第一外源多核苷酸和所述编码CAR的第二外源多核苷酸插入到相同的基因座中。
7.如权利要求2-4或6中任一项所述的工程化细胞，其中将所述编码CD47的第一外源多核苷酸和所述编码CAR的第二外源多核苷酸插入到所述B2M基因座中。
8.如权利要求2-4或6中任一项所述的工程化细胞，其中将所述编码CD47的第一外源多核苷酸和所述编码CAR的第二外源多核苷酸插入到所述CIITA基因座中。
9.如权利要求2-4或6中任一项所述的工程化细胞，其中将所述编码CD47的第一外源多核苷酸和所述编码CAR的第二外源多核苷酸插入到所述TRAC基因座中。
10.如权利要求2-4或6中任一项所述的工程化细胞，其中将所述编码CD47的第一外源多核苷酸和所述编码CAR的第二外源多核苷酸插入到所述TRB基因座中。
11.如权利要求2-4或6中任一项所述的工程化细胞，其中将所述编码CD47的第一外源多核苷酸和所述编码CAR的第二外源多核苷酸插入到所述安全港或靶标基因座中。
12.如权利要求2-6或11中任一项所述的工程化细胞，其中所述安全港基因座选自由以下组成的组：CCR5基因座、PPP1R12C基因座、CLYBL基因座和Rosa基因座，并且所述靶标基因座选自由以下组成的组：CXCR4基因座、白蛋白基因座、SHS231基因座、F3(CD142)基因座、MICA基因座、MICB基因座、LRP1(CD91)基因座、HMGB1基因座、ABO基因座、RHD基因座、FUT1基因座和KDM5D基因座。
13.如权利要求1-12中任一项所述的工程化细胞，其中所述CAR选自由CD19特异性CAR和CD22特异性CAR组成的组。
14.如权利要求13所述的工程化细胞，其中所述CD19特异性CAR基本上等同于选自由以下组成的组的基于CAR-T细胞的疗法中的任一种的CD19特异性CAR：axicabtageneciloleucel、lisocabtagene maraleucel、brexucabtagene autoleucel和tisagenlecleucel。
15.如权利要求1-12中任一项所述的工程化细胞，其中所述CAR是双特异性CAR。
16.如权利要求14所述的工程化细胞，其中所述CAR是CD 19/CD22双特异性CAR。
17.如权利要求1-16中任一项所述的工程化细胞，其中所述工程化细胞不表达HLA-A、HLA-B和/或HLA-C抗原。
18.如权利要求1-17中任一项所述的工程化细胞，其中所述工程化细胞不表达B2M。
19.如权利要求1-18中任一项所述的工程化细胞，其中所述工程化细胞不表达HLA-DP、HLA-DQ和/或HLA-DR抗原。
20.如权利要求1-19中任一项所述的工程化细胞，其中所述工程化细胞不表达CIITA。
21.如权利要求1-20中任一项所述的工程化细胞，其中所述工程化细胞选自由以下组成的组：多能干细胞、诱导性多能干细胞、从诱导性多能干细胞分化的T细胞、原代T细胞和来源于原代T细胞的细胞，并且所述工程化细胞不表达TCR-α和/或TCR-β。
22.如权利要求1-21中任一项所述的工程化细胞，其中所述工程化细胞是多能干细胞。
23.如权利要求1-21中任一项所述的工程化细胞，其中所述工程化细胞是诱导性多能干细胞。
24.如权利要求1-21中任一项所述的工程化细胞，其中所述工程化细胞是来源于诱导性多能干细胞的分化细胞。
25.如权利要求24所述的工程化细胞，其中所述分化细胞选自由NK细胞和T细胞组成的组。
26.如权利要求1-21中任一项所述的工程化细胞，其中所述工程化细胞是来源于原代T细胞的细胞。
27.如权利要求26所述的工程化细胞，其中所述来源于原代T细胞的细胞来源于T细胞库，所述T细胞库包含来自不同于受体受试者的一个或多个供体受试者的原代T细胞。
28.如权利要求1-23中任一项所述的工程化细胞，其中所述工程化细胞保留多能性且/或保留分化潜能。
29.如权利要求1-28中任一项所述的工程化细胞，其中在转移到第一受试者体内后，所述工程化细胞表现出选自由以下组成的组的一种或多种反应：(a)T细胞反应，(b)NK细胞反应，和(c)巨噬细胞反应，所述反应与转移到第二受试者体内后的野生型细胞相比有所降低。
30.如权利要求1-29中任一项所述的工程化细胞，其中所述第一受试者和所述第二受试者是不同的受试者。
31.如权利要求29或30所述的工程化细胞，其中所述巨噬细胞反应是吞噬。
32.如权利要求1-31中任一项所述的工程化细胞，其中与转移到受试者体内后的野生型细胞相比，所述工程化细胞在转移到所述受试者体内后表现出选自由以下组成的组的一项或多项：(a)所述受试者的TH1活化减少，(b)所述受试者的NK细胞杀伤减少，和(c)所述受试者的完整PBMC的杀伤减少。
33.如权利要求1-32中任一项所述的工程化细胞，其中与转移到受试者体内后的野生型细胞相比，所述工程化细胞在转移到所述受试者体内后引发选自由以下组成的组的一项或多项：(a)所述受试者的供体特异性抗体减少，(b)所述受试者的IgM或IgG抗体减少，和(c)所述受试者的补体依赖性细胞毒性(CDC)减少。
34.如权利要求1-33中任一项所述的工程化细胞，其中所述工程化细胞选自由以下组成的组：多能干细胞、诱导性多能干细胞、从诱导性多能干细胞分化的T细胞、原代T细胞和来源于原代T细胞的细胞，并且所述工程化细胞是包含插入到所述TRAC基因座中的所述编码CD47的第一外源多核苷酸和/或所述编码CAR的第二外源多核苷酸的B2M插入缺失/插入缺失、CIITA插入缺失/插入缺失、TRAC插入缺失/插入缺失细胞。
35.如权利要求1-34中任一项所述的工程化细胞，其中所述工程化细胞选自由以下组成的组：多能干细胞、诱导性多能干细胞、从诱导性多能干细胞分化的T细胞、原代T细胞和来源于原代T细胞的细胞，并且所述工程化细胞是包含插入到所述TRAC基因座中的所述编码CD47的第一外源多核苷酸和所述编码CAR的第二外源多核苷酸的B2M插入缺失/插入缺失、CIITA插入缺失/插入缺失、TRAC插入缺失/插入缺失细胞。
36.如权利要求1-33中任一项所述的工程化细胞，其中所述工程化细胞选自由以下组成的组：多能干细胞、诱导性多能干细胞、从诱导性多能干细胞分化的T细胞、原代T细胞和来源于原代T细胞的细胞，并且所述工程化细胞是包含插入到所述TRB基因座中的所述编码CD47的第一外源多核苷酸和/或所述编码CAR的第二外源多核苷酸的B2M插入缺失/插入缺失、CIITA插入缺失/插入缺失、TRAC插入缺失/插入缺失细胞。
37.如权利要求1-33或36中任一项所述的工程化细胞，其中所述工程化细胞选自由以下组成的组：多能干细胞、诱导性多能干细胞、从诱导性多能干细胞分化的T细胞、原代T细胞和来源于原代T细胞的细胞，并且所述工程化细胞是包含插入到所述TRB基因座中的所述编码CD47的第一外源多核苷酸和所述编码CAR的第二外源多核苷酸的B2M插入缺失/插入缺失、CIITA插入缺失/插入缺失、TRAC插入缺失/插入缺失细胞。
38.如权利要求1-33中任一项所述的工程化细胞，其中所述工程化细胞选自由以下组成的组：多能干细胞、诱导性多能干细胞、从诱导性多能干细胞分化的T细胞、原代T细胞和来源于原代T细胞的细胞，并且所述工程化细胞是包含插入到所述B2M基因座中的所述编码CD47的第一外源多核苷酸和/或所述编码CAR的第二外源多核苷酸的B2M插入缺失/插入缺失、CIITA插入缺失/插入缺失、TRAC插入缺失/插入缺失细胞。
39.如权利要求1-33或38中任一项所述的工程化细胞，其中所述工程化细胞选自由以下组成的组：多能干细胞、诱导性多能干细胞、从诱导性多能干细胞分化的T细胞、原代T细胞和来源于原代T细胞的细胞，并且所述工程化细胞是包含插入到B2M基因座中的所述编码CD47的第一外源多核苷酸和所述编码CAR的第二外源多核苷酸的B2M插入缺失/插入缺失、CIITA插入缺失/插入缺失、TRAC插入缺失/插入缺失细胞。
40.如权利要求1-33中任一项所述的工程化细胞，其中所述工程化细胞选自由以下组成的组：多能干细胞、诱导性多能干细胞、从诱导性多能干细胞分化的T细胞、原代T细胞和来源于原代T细胞的细胞，并且所述工程化细胞是包含插入到所述CIITA基因座中的所述编码CD47的第一外源多核苷酸和/或所述编码CAR的第二外源多核苷酸的B2M插入缺失/插入缺失、CIITA插入缺失/插入缺失、TRAC插入缺失/插入缺失细胞。
41.如权利要求1-33或40中任一项所述的工程化细胞，其中所述工程化细胞选自由以下组成的组：多能干细胞、诱导性多能干细胞、从诱导性多能干细胞分化的T细胞、原代T细胞和来源于原代T细胞的细胞，并且所述工程化细胞是包含插入到CIITA基因座中的所述编码CD47的第一外源多核苷酸和所述编码CAR的第二外源多核苷酸的B2M插入缺失/插入缺失、CIITA插入缺失/插入缺失、TRAC插入缺失/插入缺失细胞。
42.一种工程化细胞，其相对于野生型细胞或对照细胞包含降低的HLA-A、HLA-B、HLA-C、HLA-DP、HLA-DQ、HLA-DR、B2M、CIITA、TCR-α和/或TCR-β的表达。
43.如权利要求42所述的工程化细胞，其中所述工程化细胞不表达HLA-A、HLA-B和/或HLA-C抗原。
44.如权利要求42或43所述的工程化细胞，其中所述工程化细胞不表达CIITA。
45.如权利要求42-44中任一项所述的工程化细胞，其中所述工程化细胞不表达HLA-DP、HLA-DQ和/或HLA-DR抗原。
46.如权利要求42-45中任一项所述的工程化细胞，其中所述工程化细胞不表达B2M。
47.如权利要求42-46中任一项所述的工程化细胞，其中所述工程化细胞选自由以下组成的组：多能干细胞、诱导性多能干细胞、从诱导性多能干细胞分化的T细胞、原代T细胞和来源于原代T细胞的细胞，并且所述工程化细胞不表达TCR-α。
48.如权利要求42-47中任一项所述的工程化细胞，其中所述工程化细胞选自由以下组成的组：多能干细胞、诱导性多能干细胞、从诱导性多能干细胞分化的T细胞、原代T细胞和来源于原代T细胞的细胞，并且所述工程化细胞不表达TCR-β。
49.如权利要求42-48中任一项所述的工程化细胞，其中所述工程化细胞相对于野生型细胞或对照细胞过表达CD47。
50.如权利要求42-49中任一项所述的工程化细胞，其中所述工程化细胞是多能干细胞。
51.如权利要求42-50中任一项所述的工程化细胞，其中所述工程化细胞是诱导性多能干细胞。
52.如权利要求42-49中任一项所述的工程化细胞，其中所述工程化细胞是来源于诱导性多能干细胞的分化细胞。
53.如权利要求52所述的工程化细胞，其中所述分化细胞选自由NK细胞和T细胞组成的组。
54.如权利要求42-51中任一项所述的工程化细胞，其中所述工程化细胞是来源于原代T细胞的细胞。
55.如权利要求54所述的工程化细胞，其中所述来源于原代T细胞的细胞来源于T细胞库，所述T细胞库包含来自不同于受体受试者的一个或多个供体受试者的原代T细胞。
56.如权利要求42-51中任一项所述的工程化细胞，其中所述工程化细胞保留多能性且/或保留分化潜能。
57.如权利要求42-56中任一项所述的工程化细胞，其中在转移到第一受试者体内后，所述工程化细胞表现出选自由以下组成的组的一种或多种反应：(a)T细胞反应，(b)NK细胞反应，和(c)巨噬细胞反应，所述反应与转移到第二受试者体内后的野生型细胞相比有所降低。
58.如权利要求57所述的工程化细胞，其中所述第一受试者和所述第二受试者是不同的受试者。
59.如权利要求57或58所述的工程化细胞，其中所述巨噬细胞反应是吞噬。
60.如权利要求42-59中任一项所述的工程化细胞，其中与转移到受试者体内后的野生型细胞相比，所述工程化细胞在转移到所述受试者体内后表现出选自由以下组成的组的一项或多项：(a)所述受试者的TH1活化减少，(b)所述受试者的NK细胞杀伤减少，和(c)所述受试者的完整PBMC的杀伤减少。
61.如权利要求42-60中任一项所述的工程化细胞，其中与转移到受试者体内后的野生型细胞相比，所述工程化细胞在转移到所述受试者体内后引发选自由以下组成的组的一项或多项：(a)所述受试者的供体特异性抗体减少，(b)所述受试者的IgM或IgG抗体减少，和(c)所述受试者的补体依赖性细胞毒性(CDC)减少。
62.如权利要求42-61中任一项所述的工程化细胞，其中所述工程化细胞选自由以下组成的组：多能干细胞、诱导性多能干细胞、从诱导性多能干细胞分化的T细胞、原代T细胞和来源于原代T细胞的细胞，并且所述工程化细胞是B2M插入缺失/插入缺失、CIITA插入缺失/插入缺失、TRAC插入缺失/插入缺失和/或TRB插入缺失/插入缺失细胞。
63.如权利要求1-62中任一项所述的工程化细胞，其中所述工程化细胞是低免疫原性细胞。
64.如权利要求1-63中任一项所述的工程化细胞，其中所述野生型细胞或对照细胞是起始材料。
65.如权利要求1-64中任一项所述的工程化细胞，其中使用病毒转导将所述第一和/或第二外源多核苷酸插入到所述细胞的至少一个等位基因中。
66.如权利要求65所述的工程化细胞，其中所述病毒转导经由基于慢病毒的病毒载体进行。
67.如权利要求66所述的工程化细胞，其中所述基于慢病毒的病毒载体是携带所述第一和/或第二外源多核苷酸的假型化、自灭活慢病毒载体。
68.如权利要求66或67所述的工程化细胞，其中所述基于慢病毒的病毒载体是用水疱性口炎VSV-G包膜假型化的自灭活慢病毒载体，并且携带所述第一和/或第二外源多核苷酸。
69.一种药物组合物，其包含如权利要求1-68中任一项所述的工程化细胞群和药学上可接受的添加剂、载剂、稀释剂或赋形剂。
70.如权利要求69所述的药物组合物，其中所述药学上可接受的添加剂、载剂、稀释剂或赋形剂包括选自由以下组成的组的一种或多种：Plasma-Lyte右旋糖、葡聚糖、氯化钠、人血清白蛋白(HSA)、二甲基亚砜(DMSO)及其组合。
71.如权利要求69或70所述的药物组合物，其还包含药学上可接受的缓冲剂。
72.如权利要求71所述的药物组合物，其中所述药学上可接受的缓冲剂是中性缓冲盐水或磷酸盐缓冲盐水。
73.一种药物组合物，其包含如权利要求1-68中任一项所述的工程化细胞群、浓度为约70-80％重量/重量的CSB的基础溶液，以及以下中的一种或多种：约20-30％重量/重量的PlasmaLyte-ATM、约0.3-5.3％重量/体积的人血清白蛋白(HSA)、约0-20％体积/体积的二甲亚砜(DMSO)和约100-400mM海藻糖。
74.一种药物组合物，其包含如权利要求1-68中任一项所述的工程化细胞群、浓度为约20-30％重量/重量的PlasmaLyte-ATM的基础溶液，以及以下中的一种或多种：约70-80％重量/重量的CSB、约0.3-5.3％重量/体积的人血清白蛋白(HSA)、约0-20％体积/体积的二甲亚砜(DMSO)和约100-400mM海藻糖。
75.一种药物组合物，其包含如权利要求1-68中任一项所述的工程化细胞群、约0.3-5.3％重量/体积的人血清白蛋白(HSA)，以及以下中的一种或多种：约70-80％重量/重量的CSB、约20-30％重量/重量的PlasmaLyte-ATM、约0-20％体积/体积的二甲亚砜(DMSO)和约100-400mM海藻糖。
76.一种药物组合物，其包含如权利要求1-68中任一项所述的工程化细胞群、约0-20％体积/体积的二甲亚砜(DMSO)，以及以下中的一种或多种：约70-80％重量/重量的CSB、约20-30％重量/重量的PlasmaLyte-ATM、约0.3-5.3％重量/体积的人血清白蛋白(HSA)和约100-400mM海藻糖。
77.一种药物组合物，其包含如权利要求1-68中任一项所述的工程化细胞群、约100-400mM海藻糖，以及以下中的一种或多种：约70-80％重量/重量的CSB、约20-30％重量/重量的PlasmaLyte-ATM、约0.3-5.3％重量/体积的人血清白蛋白(HSA)和约0-20％体积/体积的二甲亚砜(DMSO)。
78.如权利要求69-77中任一项所述的药物组合物，其包含约75％重量/重量的CSB。
79.如权利要求69-78中任一项所述的药物组合物，其包含约25％重量/重量的PlasmaLyte-ATM。
80.如权利要求69-79中任一项所述的药物组合物，其包含约0.3％重量/体积的HSA。
81.如权利要求69-81中任一项所述的药物组合物，其包含约7.5％体积/体积的DMSO。
82.一种药物组合物，其包含如权利要求1-68中任一项所述的工程化细胞群、浓度为约75％重量/重量的CSB的基础溶液、约25％重量/重量的PlasmaLyte-ATM、约0.3％重量/体积的人血清白蛋白(HSA)和约7.5％体积/体积的二甲亚砜(DMSO)。
83.如权利要求69-82中任一项所述的药物组合物，其中所述工程化细胞群为至多约8.0x108个细胞。
84.如权利要求69-83中任一项所述的药物组合物，其中所述工程化细胞群为至多约6.0x108个细胞。
85.如权利要求69-84中任一项所述的药物组合物，其中所述工程化细胞群为约1.0x106至约2.5x108个细胞。
86.如权利要求69-85中任一项所述的药物组合物，其中所述工程化细胞群为约2.0x106至约2.0x108个细胞。
87.如权利要求69-86中任一项所述的药物组合物，其中所述工程化细胞群的范围为约5ml至约80ml。
88.如权利要求69-87中任一项所述的药物组合物，其中所述工程化细胞群的范围为约10ml至约70ml。
89.如权利要求69-88中任一项所述的药物组合物，其中所述工程化细胞群的范围为约10m1至约50ml。
90.如权利要求69-89中任一项所述的药物组合物，其中所述组合物被配制用于以单剂量施用。
91.如权利要求69-89中任一项所述的药物组合物，其中所述组合物被配制用于以至多三个剂量施用。
92.如权利要求69-91中任一项所述的药物组合物，其中所述组合物被配制用于向受试者施用单剂量，所述施用需要约60分钟或更短的持续时间。
93.如权利要求69-91中任一项所述的药物组合物，其中所述组合物被配制用于向受试者施用单剂量，所述施用需要约30分钟或更短的持续时间。
94.如权利要求69-93中任一项所述的药物组合物，其中所述药物组合物的工程化细胞群或其后代在施用后10天后在受试者中表现出至少40％的存活率。
95.如权利要求69-94中任一项所述的药物组合物，其中所述药物组合物的工程化细胞群或其后代在施用后约2周后在受试者中表现出至少80％的存活率。
96.如权利要求69-95中任一项所述的药物组合物，其中所述药物组合物的工程化细胞群或其后代在施用后约3周后在受试者中表现出至少100％的存活率。
97.如权利要求69-96中任一项所述的药物组合物，其中所述药物组合物的工程化细胞群或其后代在施用后约4周后在受试者中表现出至少150％的存活率。
98.一种用于治疗受试者的疾病或病症的剂量方案，其包括施用药物组合物，所述药物组合物包含如权利要求1-68中任一项所述的工程化细胞群和药学上可接受的添加剂、载剂、稀释剂或赋形剂，其中所述药物组合物以约1-3个剂量施用。
99.如权利要求98所述的剂量方案，其中以约1-3个剂量施用的所述药物组合物为至多约6.0x108个细胞。
100.如权利要求98或99所述的剂量方案，其中以约1-3个剂量施用的所述药物组合物为约0.6x106至约6.0x108个细胞。
101.如权利要求98或99所述的剂量方案，其中如果所述受试者的体重为50kg或更小，则以约1-3个剂量施用的所述药物组合物为约0.2x106至约5.0x106细胞/kg所述受试者体重。
102.如权利要求98或99所述的剂量方案，其中如果所述受试者的体重大于50kg，则以约1-3个剂量施用的所述药物组合物为约0.1x108至约2.5x108个细胞。
103.如权利要求98或99所述的剂量方案，其中以约1-3个剂量施用的所述药物组合物为约2.0x106细胞/kg所述受试者体重且至多约2.x108个细胞。
104.如权利要求98-103中任一项所述的剂量方案，其中向所述受试者施用单剂量需要约60分钟或更短的持续时间。
105.如权利要求98-104中任一项所述的剂量方案，其中向所述受试者施用单剂量需要约30分钟或更短的持续时间。
106.如权利要求98-105中任一项所述的剂量方案，其中所述药学上可接受的添加剂、载剂、稀释剂或赋形剂包括选自由以下组成的组的一种或多种：Plasma-Lyte右旋糖、葡聚糖、氯化钠、人血清白蛋白(HSA)、二甲基亚砜(DMSO)及其组合。
107.如权利要求98-106中任一项所述的剂量方案，其中所述药物组合物还包含药学上可接受的缓冲剂。
108.如权利要求107所述的剂量方案，其中所述药学上可接受的缓冲剂是中性缓冲盐水或磷酸盐缓冲盐水。
109.如权利要求98-108中任一项所述的剂量方案，其中在施用所述药物组合物后，所述细胞群或其后代在所述受试者中存在至多9个月。
110.如权利要求98-109中任一项所述的剂量方案，其中在施用所述药物组合物后，所述细胞群或其后代在所述受试者中存在至少2年或更久。
111.如权利要求98-110中任一项所述的剂量方案，其中在施用所述药物组合物后，所述工程化细胞群或其后代在施用后约10天后在受试者中表现出至少40％的存活率。
112.如权利要求98-111中任一项所述的剂量方案，其中在施用所述药物组合物后，所述工程化细胞群或其后代在施用后约2周后在受试者中表现出至少80％的存活率。
113.如权利要求98-112中任一项所述的剂量方案，其中在施用所述药物组合物后，所述工程化细胞群或其后代在施用后约3周后在受试者中表现出至少100％的存活率。
114.如权利要求98-113中任一项所述的剂量方案，其中在施用所述药物组合物后，所述工程化细胞群或其后代在施用后约4周后在受试者中表现出至少150％的存活率。
115.如权利要求98-114中任一项所述的剂量方案，其中向所述受试者施用2-3个剂量，使得每个剂量的施用间隔的范围为1至24小时。
116.如权利要求98-114中任一项所述的剂量方案，其中向所述受试者施用2-3个剂量，使得每个剂量的施用间隔的范围为1至28天。
117.如权利要求98-114中任一项所述的剂量方案，其中向所述受试者施用2-3个剂量，使得每个剂量的施用间隔的范围为1至6周。
118.如权利要求98-114中任一项所述的剂量方案，其中向所述受试者施用2-3个剂量，使得每个剂量的施用间隔的范围为1至12个月或更久。
119.一种用于治疗受试者的疾病或病症的剂量方案，其包括施用药物组合物，所述药物组合物包含
(i)工程化细胞，其包含降低的HLA-A、HLA-B、HLA-C、HLA-DP、HLA-DQ、HLA-DR、B2M、CIITA、TCR-α和/或TCR-β的表达，所述工程化细胞还包含一组编码CD47和嵌合抗原受体(CAR)的外源多核苷酸，其中所述外源多核苷酸组插入到所述细胞的至少一个等位基因的安全港或靶标基因座中；和
(ii)药学上可接受的添加剂、载剂、稀释剂或赋形剂，
其中所述药物组合物包含至多约6.0x108个细胞。
120.一种用于治疗受试者的疾病或病症的剂量方案，其包括施用药物组合物，所述药物组合物包含
(i)工程化细胞，其包含降低的HLA-A、HLA-B、HLA-C、HLA-DP、HLA-DQ、HLA-DR、B2M、CIITA、TCR-α和/或TCR-β的表达，所述工程化细胞还包含一组编码CD47和嵌合抗原受体(CAR)的外源多核苷酸，其中所述外源多核苷酸组插入到所述细胞的至少一个等位基因的安全港或靶标基因座中；和
(ii)药学上可接受的添加剂、载剂、稀释剂或赋形剂，
其中所述药物组合物以1-3个剂量施用。
121.一种用于治疗受试者的疾病或病症的剂量方案，其包括施用药物组合物，所述药物组合物包含
(i)工程化细胞，其包含降低的HLA-A、HLA-B、HLA-C、HLA-DP、HLA-DQ、HLA-DR、B2M、CIITA、TCR-α和/或TCR-β的表达，所述工程化细胞还包含一组编码CD47和嵌合抗原受体(CAR)的外源多核苷酸，其中所述外源多核苷酸组插入到所述细胞的至少一个等位基因的安全港或靶标基因座中；和
(ii)药学上可接受的添加剂、载剂、稀释剂或赋形剂，
其中一剂所述药物组合物施用约60分钟或更短的持续时间。
122.一种用于治疗受试者的疾病或病症的剂量方案，其包括施用药物组合物，所述药物组合物包含
(i)工程化细胞，其包含降低的HLA-A、HLA-B、HLA-C、HLA-DP、HLA-DQ、HLA-DR、B2M、CIITA、TCR-α和/或TCR-β的表达；和
(ii)药学上可接受的添加剂、载剂、稀释剂或赋形剂，
其中所述药物组合物包含至多约6.0x108个细胞。
123.一种用于治疗受试者的疾病或病症的剂量方案，其包括施用药物组合物，所述药物组合物包含
(i)工程化细胞，其包含降低的HLA-A、HLA-B、HLA-C、HLA-DP、HLA-DQ、HLA-DR、B2M、CIITA、TCR-α和/或TCR-β的表达；和
(ii)药学上可接受的添加剂、载剂、稀释剂或赋形剂，
其中所述药物组合物以1-3个剂量施用。
124.一种用于治疗受试者的疾病或病症的剂量方案，其包括施用药物组合物，所述药物组合物包含
(i)工程化细胞，其包含降低的HLA-A、HLA-B、HLA-C、HLA-DP、HLA-DQ、HLA-DR、B2M、CIITA、TCR-α和/或TCR-β的表达；和
(ii)药学上可接受的添加剂、载剂、稀释剂或赋形剂，
其中一剂所述药物组合物施用60分钟或更短的持续时间。
125.一种治疗受试者的癌症的方法，其包括向所述受试者施用如权利要求1-68中任一项所述的工程化细胞、如权利要求69-97中任一项所述的药物组合物或如权利要求98-124中任一项所述的剂量方案。
126.如权利要求125所述的方法，其中所述癌症是CD19+癌症。
127.一种在受试者中预防T细胞耗竭的方法，其包括向所述受试者施用如权利要求1-68中任一项所述的工程化细胞，其中所述CAR是CD19特异性CAR或CD22特异性CAR。
128.如权利要求127所述的方法，其中所述CD19特异性CAR基本上等同于选自由以下组成的组的基于CAR-T细胞的疗法中的任一种的CD 19特异性CAR：axicabtageneciloleucel、lisocabtagene maraleucel、brexucabtagene autoleucel和tisagenlecleucel。
129.一种在受试者中预防T细胞耗竭或治疗疾病的方法，其包括：
(i)在第一时间点，向所述受试者施用包含第一群体的如权利要求1-68中任一项所述的工程化细胞的第一剂量方案；和
(ii)在第二时间点，向所述受试者施用包含第二群体的如权利要求1-68中任一项所述的工程化细胞的第二剂量方案，
其中所述第一剂量方案和所述第二剂量方案不同。
130.一种在受试者中预防T细胞耗竭或治疗疾病的方法，其包括：
(i)在第一时间点，向所述受试者施用包含第一群体的如权利要求1-68中任一项所述的工程化细胞的第一剂量方案；和
(ii)在第二时间点，向所述受试者施用包含第二群体的如权利要求1-68中任一项所述的工程化细胞的第二剂量方案，
其中所述第一群体的工程化细胞和所述第二群体的工程化细胞包含相同的嵌合抗原受体。
131.一种在受试者中预防T细胞耗竭或治疗疾病的方法，其包括：
(i)在第一时间点，向所述受试者施用包含第一群体的如权利要求1-68中任一项所述的工程化细胞的第一剂量方案；和
(ii)在第二时间点，向所述受试者施用包含第二群体的如权利要求1-68中任一项所述的工程化细胞的第二剂量方案，
其中所述第一群体的工程化细胞和所述第二群体的工程化细胞包含不同的嵌合抗原受体。
132.一种在受试者中预防T细胞耗竭或治疗疾病的方法，其包括：
(i)在第一时间点，向所述受试者施用包含第一群体的如权利要求1-68中任一项所述的工程化细胞的第一剂量方案；和
(ii)在第二时间点，向所述受试者施用包含第二群体的如权利要求1-68中任一项所述的工程化细胞的第二剂量方案，
其中所述第一群体的工程化细胞包含结合第一抗原的第一嵌合抗原受体并且所述第二群体的工程化细胞包含结合第二抗原的第二嵌合抗原受体，并且其中所述第一抗原和所述第二抗原相同。
133.一种在受试者中预防T细胞耗竭或治疗疾病的方法，其包括：
(i)在第一时间点，向所述受试者施用包含第一群体的如权利要求1-68中任一项所述的工程化细胞的第一剂量方案；和
(ii)在第二时间点，向所述受试者施用包含第二群体的如权利要求1-68中任一项所述的工程化细胞的第二剂量方案，
其中所述第一群体的工程化细胞包含结合第一抗原的第一嵌合抗原受体并且所述第二群体的工程化细胞包含结合第二抗原的第二嵌合抗原受体，并且其中所述第一抗原和所述第二抗原不同。
134.如权利要求1-68中任一项所述的工程化细胞，其中所述工程化细胞是未活化的。
135.一种非活化T细胞，其相对于野生型T细胞包含降低的HLA-A、HLA-B、HLA-C、HLA-DP、HLA-DQ、HLA-DR、B2M、CIITA、TCR-α和/或TCR-β的表达，以及编码嵌合抗原受体(CAR)的第一外源多核苷酸。
136.如权利要求135所述的非活化T细胞，其中所述非活化T细胞是原代T细胞。
137.如权利要求135所述的非活化T细胞，其中所述非活化T细胞从如权利要求1-68中任一项所述的工程化细胞分化。
138.如权利要求135-137中任一项所述的非活化T细胞，其中所述T细胞是CD8+T细胞。
139.如权利要求135-138中任一项所述的非活化T细胞，其中所述非活化T细胞未用抗CD3抗体、抗CD28抗体、T细胞活化细胞因子或可溶性T细胞共刺激分子处理。
140.如权利要求139所述的非活化T细胞，其中所述抗CD3抗体是OKT3。
141.如权利要求139所述的非活化T细胞，其中所述抗CD28抗体是CD28.2。
142.如权利要求139所述的非活化T细胞，其中所述T细胞活化细胞因子选自由IL-2、IL-7、IL-15和IL-21组成的组。
143.如权利要求139所述的非活化T细胞，其中所述可溶性T细胞共刺激分子选自由抗CD28抗体、抗CD80抗体、抗CD86抗体、抗CD137L抗体和抗ICOS-L抗体组成的组。
144.如权利要求135-149中任一项所述的非活化T细胞，其中所述非活化T细胞不表达活化标志物。
145.如权利要求135-144中任一项所述的非活化T细胞，其中所述非活化T细胞表达CD3和CD28，并且其中所述CD3和/或CD28是无活性的。
146.如权利要求135-145中任一项所述的非活化T细胞，其中所述第一外源多核苷酸由包含CD8结合剂的慢病毒载体携带。
147.如权利要求135-146中任一项所述的非活化T细胞，其中所述非活化T细胞还包含编码CD47的第二外源多核苷酸。
148.如权利要求135-147中任一项所述的非活化T细胞，其中将所述第一和/或第二外源多核苷酸插入到所述T细胞的至少一个等位基因的特定基因座中。
149.如权利要求148所述的非活化T细胞，其中所述特定基因座选自由以下组成的组：安全港或靶标基因座、B2M基因座、CIITA基因座、TRAC基因座和TRB基因座。
150.如权利要求135-149中任一项所述的非活化T细胞，其中将所述编码CD47的第二外源多核苷酸插入到选自由以下组成的组的特定基因座中：安全港或靶标基因座、B2M基因座、CIITA基因座、TRAC基因座和TRB基因座。
151.如权利要求135-150中任一项所述的非活化T细胞，其中将所述编码CAR的第一外源多核苷酸插入到选自由以下组成的组的特定基因座中：安全港或靶标基因座、B2M基因座、CIITA基因座、TRAC基因座和TRB基因座。
152.如权利要求135-151中任一项所述的非活化T细胞，其中将所述编码CD47的第二外源多核苷酸和所述编码CAR的第一外源多核苷酸插入到不同基因座中。
153.如权利要求135-151中任一项所述的非活化T细胞，其中将所述编码CD47的第二外源多核苷酸和所述编码CAR的第一外源多核苷酸插入到相同基因座中。
154.如权利要求135-151和153中任一项所述的非活化T细胞，其中将所述编码CD47的第二外源多核苷酸和所述编码CAR的第一外源多核苷酸插入到所述B2M基因座中。
155.如权利要求135-151和153中任一项所述的非活化T细胞，其中将所述编码CD47的第二外源多核苷酸和所述编码CAR的第一外源多核苷酸插入到所述CIITA基因座中。
156.如权利要求135-151和153中任一项所述的非活化T细胞，其中将所述编码CD47的第二外源多核苷酸和所述编码CAR的第一外源多核苷酸插入到TCR基因座中。
157.如权利要求135-151和153中任一项所述的非活化T细胞，其中将所述编码CD47的第二外源多核苷酸和所述编码CAR的第一外源多核苷酸插入到所述TRAC基因座中。
158.如权利要求135-151和153中任一项所述的非活化T细胞，其中将所述编码CD47的第二外源多核苷酸和所述编码CAR的第一外源多核苷酸插入到所述TRB基因座中。
159.如权利要求135-151和153中任一项所述的非活化T细胞，其中将所述编码CD47的第二外源多核苷酸和所述编码CAR的第一外源多核苷酸插入到所述安全港或靶标基因座中。
160.如权利要求135-151、153和159中任一项所述的非活化T细胞，其中所述安全港或靶标基因座选自由以下组成的组：CCR5基因座、CXCR4基因座、PPP1R12C基因座、白蛋白基因座、SHS231基因座、CLYBL基因座、Rosa基因座、F3(CD142)基因座、MICA基因座、MICB基因座、LRP1(CD91)基因座、HMGB1基因座、ABO基因座、RHD基因座、FUT1基因座和KDM5D基因座。
161.如权利要求135-160中任一项所述的非活化T细胞，其中所述CAR选自由CD19特异性CAR和CD22特异性CAR组成的组。
162.如权利要求161所述的非活化T细胞，其中所述CD19特异性CAR基本上等同于选自由以下组成的组的基于CAR-T细胞的疗法中的任一种的CD19特异性CAR：aXicabtageneciloleucel、lisocabtagene maraleucel、brexucabtagene autoleucel和tisagenlecleucel。
163.如权利要求135-160中任一项所述的非活化T细胞，其中所述CAR是双特异性CAR。
164.如权利要求162所述的非活化T细胞，其中所述双特异性CAR是CD19/CD22双特异性CAR。
165.如权利要求135-164中任一项所述的非活化T细胞，其中所述非活化T细胞不表达HLA-A、HLA-B和/或HLA-C抗原。
166.如权利要求135-165中任一项所述的非活化T细胞，其中所述非活化T细胞不表达B2M。
167.如权利要求135-166中任一项所述的非活化T细胞，其中所述非活化T细胞不表达HLA-DP、HLA-DQ和/或HLA-DR抗原。
168.如权利要求135-167中任一项所述的非活化T细胞，其中所述非活化T细胞不表达CIITA。
169.如权利要求135-168中任一项所述的非活化T细胞，其中所述非活化T细胞不表达TCR-α和/或TCR-β。
170.如权利要求135-169中任一项所述的非活化T细胞，其中所述非活化T细胞是包含插入到所述TRAC基因座中的所述编码CD47的第二外源多核苷酸和/或所述编码CAR的第一外源多核苷酸的B2M插入缺失/插入缺失、CIITA插入缺失/插入缺失、TRAC插入缺失/插入缺失细胞。
171.如权利要求135-169中任一项所述的非活化T细胞，其中所述非活化T细胞是包含插入到所述TRAC基因座中的所述编码CD47的第二外源多核苷酸和所述编码CAR的第一外源多核苷酸的B2M插入缺失/插入缺失、CIITA插入缺失/插入缺失、TRAC插入缺失/插入缺失细胞。
172.如权利要求135-169中任一项所述的非活化T细胞，其中所述非活化T细胞是包含插入到所述TRB基因座中的所述编码CD47的第二外源多核苷酸和/或所述编码CAR的第一外源多核苷酸的B2M插入缺失/插入缺失、CIITA插入缺失/插入缺失、TRAC插入缺失/插入缺失细胞。
173.如权利要求135-169中任一项所述的非活化T细胞，其中所述非活化T细胞是包含插入到所述TRB基因座中的所述编码CD47的第二外源多核苷酸和所述编码CAR的第一外源多核苷酸的B2M插入缺失/插入缺失、CIITA插入缺失/插入缺失、TRAC插入缺失/插入缺失细胞。
174.如权利要求135-169中任一项所述的非活化T细胞，其中所述非活化T细胞是包含插入到所述B2M基因座中的所述编码CD47的第二外源多核苷酸和/或所述编码CAR的第一外源多核苷酸的B2M插入缺失/插入缺失、CIITA插入缺失/插入缺失、TRAC插入缺失/插入缺失细胞。
175.如权利要求135-169中任一项所述的非活化T细胞，其中所述非活化T细胞是包含插入到B2M基因座中的所述编码CD47的第二外源多核苷酸和所述编码CAR的第一外源多核苷酸的B2M插入缺失/插入缺失、CIITA插入缺失/插入缺失、TRAC插入缺失/插入缺失细胞。
176.如权利要求135-169中任一项所述的非活化T细胞，其中所述非活化T细胞是包含插入到所述CIITA基因座中的所述编码CD47的第二外源多核苷酸和/或所述编码CAR的第一外源多核苷酸的B2M插入缺失/插入缺失、CIITA插入缺失/插入缺失、TRAC插入缺失/插入缺失细胞。
177.如权利要求135-169中任一项所述的非活化T细胞，其中所述非活化T细胞是包含插入到CIITA基因座中的所述编码CD47的第二外源多核苷酸和所述编码CAR的第一外源多核苷酸的B2M插入缺失/插入缺失、CIITA插入缺失/插入缺失、TRAC插入缺失/插入缺失细胞。
178.一种工程化T细胞，其相对于野生型T细胞包含降低的HLA-A、HLA-B、HLA-C、HLA-DP、HLA-DQ、HLA-DR、B2M、CIITA、TCR-α和/或TCR-β的表达，其中所述工程化T细胞还包含由包含CD8结合剂的慢病毒载体携带的编码嵌合抗原受体(CAR)的第一外源多核苷酸。
179.如权利要求178所述的工程化T细胞，其中所述工程化T细胞是原代T细胞。
180.如权利要求178所述的工程化T细胞，其中所述工程化T细胞从如权利要求1-68中任一项所述的工程化细胞分化。
181.如权利要求178-180中任一项所述的工程化T细胞，其中所述T细胞是CD8+T细胞。
182.如权利要求178-181中任一项所述的工程化T细胞，其中所述工程化T细胞未用抗CD3抗体、抗CD28抗体、T细胞活化细胞因子或可溶性T细胞共刺激分子处理。
183.如权利要求182所述的工程化T细胞，其中所述抗CD3抗体是OKT3，其中所述抗CD28抗体是CD28.2，其中所述T细胞活化细胞因子选自由IL-2、IL-7、IL-15和IL-21组成的组，并且其中所述可溶性T细胞共刺激分子选自由抗CD28抗体、抗CD80抗体、抗CD86抗体、抗CD137L抗体和抗ICOS-L抗体组成的组。
184.如权利要求178-183中任一项所述的工程化T细胞，其中所述工程化T细胞不表达活化标志物。
185.如权利要求178-184中任一项所述的工程化T细胞，其中所述工程化T细胞表达CD3和CD28，并且其中所述CD3和/或CD28是无活性的。
186.如权利要求178-185中任一项所述的工程化T细胞，其中所述工程化T细胞还包含编码CD47的第二外源多核苷酸。
187.如权利要求178-186中任一项所述的工程化T细胞，其中将所述第一和/或第二外源多核苷酸插入到所述T细胞的至少一个等位基因的特定基因座中。
188.如权利要求187所述的工程化T细胞，其中所述特定基因座选自由以下组成的组：安全港或靶标基因座、B2M基因座、CIITA基因座、TRAC基因座和TRB基因座。
189.如权利要求178-188中任一项所述的工程化T细胞，其中将所述编码CD47的第二外源多核苷酸插入到选自由以下组成的组的特定基因座中：安全港或靶标基因座、B2M基因座、CIITA基因座、TRAC基因座和TRB基因座。
190.如权利要求178-189中任一项所述的工程化T细胞，其中将所述编码CAR的第一外源多核苷酸插入到选自由以下组成的组的特定基因座中：安全港或靶标基因座、B2M基因座、CIITA基因座、TRAC基因座和TRB基因座。
191.如权利要求178-190中任一项所述的工程化T细胞，其中将所述编码CD47的第二外源多核苷酸和所述编码CAR的第一外源多核苷酸插入到不同基因座中。
192.如权利要求178-190中任一项所述的工程化T细胞，其中将所述编码CD47的第二外源多核苷酸和所述编码CAR的第一外源多核苷酸插入到相同基因座中。
193.如权利要求178-190和192中任一项所述的工程化T细胞，其中将所述编码CD47的第二外源多核苷酸和所述编码CAR的第一外源多核苷酸插入到B2M基因座、CIITA基因座、TRAC基因座、TRB基因座、或安全港或靶标基因座中。
194.如权利要求193所述的工程化T细胞，其中所述安全港或靶标基因座选自由以下组成的组：CCR5基因座、CXCR4基因座、PPP1R12C基因座、白蛋白基因座、SHS231基因座、CLYBL基因座、Rosa基因座、F3(CD142)基因座、MICA基因座、MICB基因座、LRP1(CD91)基因座、HMGB1基因座、ABO基因座、RHD基因座、FUT1基因座和KDM5D基因座。
195.如权利要求178-194中任一项所述的工程化T细胞，其中所述CAR选自由CD19特异性CAR和CD22特异性CAR组成的组。
196.如权利要求195所述的工程化T细胞，其中所述CD19特异性CAR基本上等同于选自由以下组成的组的基于CAR-T细胞的疗法中的任一种的CD19特异性CAR：aXicabtageneciloleucel、lisocabtagene maraleucel、brexucabtagene autoleucel和tisagenlecleucel。
197.如权利要求178-195中任一项所述的工程化T细胞，其中所述工程化T细胞不表达HLA-A、HLA-B和/或HLA-C抗原，其中所述工程化T细胞不表达B2M，其中所述工程化T细胞不表达HLA-DP、HLA-DQ和/或HLA-DR抗原，其中所述工程化T细胞不表达CIITA，且/或其中所述工程化T细胞不表达TCR-α和/或TCR-β。
198.如权利要求178-197中任一项所述的工程化T细胞，其中所述工程化T细胞是包含插入到所述TRAC基因座、所述TRB基因座、所述B2M基因座或所述CIITA基因座中的所述编码CD47的第二外源多核苷酸和/或所述编码CAR的第一外源多核苷酸的B2M插入缺失/插入缺失、CIITA插入缺失/插入缺失、TRAC插入缺失/插入缺失细胞。
199.如权利要求135-177中任一项所述的非活化T细胞或如权利要求178-198中任一项所述的工程化T细胞，其中所述非活化T细胞或工程化T细胞在受试者体内。
200.如权利要求135-177中任一项所述的非活化T细胞或如权利要求178-198中任一项所述的工程化T细胞，其中所述非活化T细胞或工程化T细胞在体外。
201.如权利要求146-177、199和200中任一项所述的非活化T细胞或如权利要求178-200中任一项所述的工程化T细胞，其中所述CD8结合剂是抗CD8抗体。
202.如权利要求201所述的非活化T细胞或工程化T细胞，其中所述抗CD8抗体选自由以下组成的组：小鼠抗CD8抗体、兔抗CD8抗体、人抗CD8抗体、人源化抗CD8抗体、骆驼科动物抗CD8抗体及其片段。
203.如权利要求202所述的非活化T细胞或工程化T细胞，其中所述其片段是scFV或VHH。
204.如权利要求146-177和199-203中任一项所述的非活化T细胞或如权利要求178-203中任一项所述的工程化T细胞，其中所述CD8结合剂与CD8α链和/或CD8β链结合。
205.如权利要求146-177和199-204中任一项所述的非活化T细胞或如权利要求178-204中任一项所述的工程化T细胞，其中所述CD8结合剂与掺入病毒包膜中的跨膜结构域融合。
206.如权利要求146-177和199-205中任一项所述的非活化T细胞或如权利要求178-205中任一项所述的工程化T细胞，其中所述慢病毒载体用病毒融合蛋白假型化。
207.如权利要求206所述的非活化T细胞或工程化T细胞，其中所述病毒融合蛋白包含一种或多种修饰以减少与其天然受体的结合。
208.如权利要求206或207所述的非活化T细胞或工程化T细胞，其中所述病毒融合蛋白与所述CD8结合剂融合。
209.如权利要求206-208中任一项所述的非活化T细胞或工程化T细胞，其中所述病毒融合蛋白包含融合至所述CD8结合剂的尼帕病毒F糖蛋白和尼帕病毒G糖蛋白。
210.如权利要求146-177和199-209中任一项所述的非活化T细胞或如权利要求178-209中任一项所述的工程化T细胞，其中所述慢病毒载体不包含T细胞活化分子或T细胞共刺激分子。
211.如权利要求135-177和199-210中任一项所述的非活化T细胞或如权利要求178-210中任一项所述的工程化T细胞，其中所述慢病毒载体编码所述第一外源多核苷酸和/或所述第二外源多核苷酸。
212.如权利要求135-177和199-210中任一项所述的非活化T细胞或如权利要求178-210中任一项所述的工程化T细胞，其中在转移到第一受试者体内后，所述非活化T细胞或所述工程化T细胞表现出选自由以下组成的组的一种或多种反应：(a)T细胞反应，(b)NK细胞反应，和(c)巨噬细胞反应，所述反应与转移到第二受试者体内后的野生型细胞相比有所降低。
213.如权利要求212所述的非活化T细胞或工程化T细胞，其中所述第一受试者和所述第二受试者是不同的受试者。
214.如权利要求212或213所述的非活化T细胞或工程化T细胞，其中所述巨噬细胞反应是吞噬。
215.如权利要求135-177和199-214中任一项所述的非活化T细胞或如权利要求178-214中任一项所述的工程化T细胞，其中与转移到受试者体内后的野生型细胞相比，所述非活化T细胞或所述工程化T细胞在转移到所述受试者体内后表现出选自由以下组成的组的一项或多项：(a)所述受试者的TH1活化减少，(b)所述受试者的NK细胞杀伤减少，和(c)所述受试者的完整PBMC的杀伤减少。
216.如权利要求135-177和199-215中任一项所述的非活化T细胞或如权利要求178-215中任一项所述的工程化T细胞，其中与转移到受试者体内后的野生型细胞相比，所述非活化T细胞或所述工程化T细胞在转移到所述受试者体内后引发选自由以下组成的组的一项或多项：(a)所述受试者的供体特异性抗体减少，(b)所述受试者的IgM或IgG抗体减少，和(c)所述受试者的补体依赖性细胞毒性(CDC)减少。
217.如权利要求135-177和199-216中任一项所述的非活化T细胞或如权利要求178-216中任一项所述的工程化T细胞，其中所述非活化T细胞或所述工程化T细胞在所述受试者体内用包含CD8结合剂的慢病毒载体转导。
218.如权利要求135-177和199-217中任一项所述的非活化T细胞或如权利要求178-217中任一项所述的工程化T细胞，其中所述慢病毒载体携带编码所述CAR和/或CD47的基因。
219.一种药物组合物，其包含如权利要求135-177和199-218中任一项所述的非活化T细胞群或如权利要求178-218中任一项所述的工程化T细胞群以及药学上可接受的添加剂、载剂、稀释剂或赋形剂。
220.一种方法，其包括向受试者施用组合物，所述组合物包含如权利要求135-177和199-218中任一项所述的非活化T细胞、如权利要求178-218中任一项所述的工程化T细胞或如权利要求219所述的药物组合物。
221.如权利要求220所述的方法，其中在施用所述组合物之前、之后和/或同时不向所述受试者施用T细胞活化治疗。
222.如权利要求220或权利要求221所述的方法，其中所述T细胞活化治疗包括淋巴细胞清除。
223.一种治疗罹患癌症的受试者的方法，其包括向受试者施用组合物，所述组合物包含如权利要求135-177和199-218中任一项所述的非活化T细胞、如权利要求178-218中任一项所述的工程化T细胞或如权利要求219所述的药物组合物，其中在施用所述组合物之前、之后和/或同时不向所述受试者施用T细胞活化治疗。
224.如权利要求223所述的方法，其中所述T细胞活化治疗包括淋巴细胞清除。
225.一种用于在有需要的受试者体内扩增能够识别并杀伤所述受试者的肿瘤细胞的T细胞的方法，其包括向受试者施用组合物，所述组合物包含如权利要求135-177和199-218中任一项所述的非活化T细胞、如权利要求178-218中任一项所述的工程化T细胞或如权利要求219所述的药物组合物，其中在施用所述组合物之前、之后和/或同时不向所述受试者施用T细胞活化治疗。
226.如权利要求225所述的方法，其中所述T细胞活化治疗包括淋巴细胞清除。
227.一种用于治疗受试者的疾病或病症的剂量方案，其包括施用药物组合物，所述药物组合物包含如权利要求135-177和199-218中任一项所述的非活化T细胞和/或如权利要求178-218中任一项所述的工程化T细胞以及药学上可接受的添加剂、载剂、稀释剂或赋形剂，其中所述药物组合物以约1-3个剂量施用。
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination |