CN117881406A - 低免疫原性rhd阴性原代t细胞 - Google Patents

低免疫原性rhd阴性原代t细胞 Download PDF

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CN117881406A CN202280049786.9A CN202280049786A CN117881406A CN 117881406 A CN117881406 A CN 117881406A CN 202280049786 A CN202280049786 A CN 202280049786A CN 117881406 A CN117881406 A CN 117881406A
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Abstract

本文公开了用于施用于患者的具有减少的RhD抗原表达的低免疫原性T细胞。在一些实施方案中，所述细胞由原代T细胞或其子代繁殖或衍生自诱导性多能干细胞(iPSC)。在一些实施方案中，所述细胞外源表达CD47蛋白并表现出MHC I类蛋白、MHC II类蛋白或两者的表达减少。在一些实施方案中，所述细胞外源表达一种或多种嵌合抗原受体。

Description

低免疫原性RHD阴性原代T细胞
相关申请的交叉引用
本申请根据35U.S.C.§119(e)要求提交于2021年5月19日的美国临时申请号63/190,685和提交于2021年10月14日的美国临时申请号63/255,803的优先权，所述申请的公开内容以引用方式整体并入本文。
背景技术
根据人体内每个红细胞表面是否存在抗原(ABO血型)，血液制品可以分成不同的组。A、B、AB和A1抗原是由红细胞糖蛋白上的寡糖序列决定的。血型抗原组中的基因提供了制造抗原蛋白的指令。血型抗原蛋白在红细胞的细胞膜内具有多种功能。这些蛋白质功能包括将其他蛋白质和分子转运进出细胞、维持细胞结构、附着至其他细胞和分子以及参与化学反应。
恒河猴因子(Rh)血型是继ABO血型系统之后第二重要的血型系统。Rh血型系统由49种限定的血型抗原组成，其中最重要的是D、C、c、E和e 5种抗原。个体的RhD状态通常在ABO型后用阳性或阴性后缀描述。术语“Rh因子”、“Rh阳性”、“RhD阳性”、“Rh阴性”和“RhD阴性”仅指RhD抗原。Rh抗原的抗体可参与溶血性输血反应，并且RhD和Rhc抗原的抗体给胎儿和新生儿带来重大的溶血病风险。ABO抗体在每个人的生命早期产生。然而，RhD-人体内的恒河猴抗体通常仅在人被致敏时才产生。举例来说，通过生下RhD+婴儿或通过接受RhD+输血可能发生这种情况。
A、B、H和Rh抗原是血液、组织和细胞移植供体与受体之间组织相容性的主要决定因素。ABO基因编码的糖基转移酶活性负责产生A、B、AB、O组织血型抗原，所述抗原展示在细胞表面上。A型个体编码ABO基因产物，具有产生α(1,3)N-乙酰半乳糖氨基转移酶活性的特异性并且B型个体具有产生α(1,3)半乳糖基转移酶活性的特异性。O型个体根本不产生功能性半乳糖基转移酶并且因此不产生任何修饰。AB型个体携带各一个拷贝，并产生两种类型的修饰。ABO基因的酶产物作为底物作用于H抗原，并且因此缺乏ABO活性的O型个体呈现未修饰的H抗原，并因此通常称为O(H)型。
H抗原本身是由FUT1基因编码的α(1,2)岩藻糖基转移酶的产物。在非常罕见的个体中，由于FUT1基因的破坏而完全丧失了H抗原，并且将不存在ABO产生A或B组织血型的底物。据说这些个体属于孟买(Bombay)组织血型。Rh抗原是由RHD基因编码的，并且RhD阴性个体携带RHD基因的缺失或破坏。
适用于治疗应用的细胞系的可获得性受到严重限制，并且通常，可获得的细胞系并非普遍与所有可能的受体组织相容。
仍然需要用于生成可用于细胞疗法的组织血型细胞的新型途径、组合物和方法。
发明内容
在一些实施方案中，本文提供了一种低免疫原性T细胞，其包含相对于未改变或未修饰的野生型细胞减少的恒河猴因子D(RhD)抗原和主要组织相容性复合物(MHC)I类和/或II类人白细胞抗原表达，以及编码CD47的第一外源多核苷酸，其中低免疫原性T细胞由原代T细胞或其子代繁殖，或衍生自诱导性多能干细胞(iPSC)或其子代。
在一些实施方案中，低免疫原性T细胞由原代T细胞或其子代繁殖，其中原代T细胞或其子代包含相对于未改变或未修饰的野生型细胞减少的RhD抗原和MHC I类和/或II类人白细胞抗原表达，以及编码CD47的第一外源多核苷酸。
在一些实施方案中，低免疫原性T细胞衍生自iPSC或其子代，其中iPSC或其子代包含相对于未改变或未修饰的野生型细胞减少的RhD抗原和MHC I类和/或II类人白细胞抗原表达，以及编码CD47的第一外源多核苷酸。
在一些实施方案中，本文提供了一种非活化T细胞，其包含相对于未改变或未修饰的野生型细胞减少的RhD抗原和MHC I类和/或II类人白细胞抗原表达，以及编码CD47的第一外源多核苷酸，其中非活化T细胞由原代T细胞或其子代繁殖，或衍生自iPSC或其子代。
在一些实施方案中，非活化T细胞由原代T细胞或其子代繁殖，其中原代T细胞或其子代包含相对于未改变或未修饰的野生型细胞减少的RhD抗原和MHC I类和/或II类人白细胞抗原表达，以及编码CD47的第一外源多核苷酸。
在一些实施方案中，非活化T细胞衍生自iPSC或其子代，其中iPSC或其子代包含相对于未改变或未修饰的野生型细胞减少的RhD抗原和MHC I类和/或II类人白细胞抗原表达，以及编码CD47的第一外源多核苷酸。
在一些实施方案中，非活化T细胞是非活化的低免疫原性细胞。
在一些实施方案中，本文提供了一种低免疫原性T细胞群，其包含相对于未改变或未修饰的野生型细胞减少的RhD抗原和MHC I类和/或II类人白细胞抗原表达，以及编码CD47的第一外源多核苷酸，其中低免疫原性T细胞群由原代T细胞或其子代繁殖，或衍生自iPSC或其子代。
在一些实施方案中，低免疫原性T细胞群由原代T细胞或其子代繁殖，其中原代T细胞或其子代包含相对于未改变或未修饰的野生型细胞减少的RhD抗原和MHC I类和/或II类人白细胞抗原表达，以及编码CD47的第一外源多核苷酸。
在一些实施方案中，低免疫原性T细胞群衍生自iPSC或其子代，其中iPSC或其子代包含相对于未改变或未修饰的野生型细胞减少的RhD抗原和MHC I类和/或II类人白细胞抗原表达，以及编码CD47的第一外源多核苷酸。
在一些实施方案中，低免疫原性T细胞、非活化T细胞或低免疫原性T细胞群不表达MHC I类和/或II类人白细胞抗原。
在一些实施方案中，低免疫原性T细胞、非活化T细胞或低免疫原性T细胞群包含相对于未改变或未修饰的野生型细胞减少的β-2-微球蛋白(B2M)和/或MHC II类反式激活因子(CIITA)表达。
在一些实施方案中，其中低免疫原性T细胞、非活化T细胞或低免疫原性T细胞群不表达B2M和/或CIITA。
在一些实施方案中，RhD抗原表达的减少是由RHD基因的敲除造成的。
在一些实施方案中，低免疫原性T细胞、非活化T细胞或低免疫原性T细胞群不表达RhD抗原。
在一些实施方案中，低免疫原性T细胞、非活化T细胞或低免疫原性T细胞群还包含相对于未改变或未修饰的野生型细胞减少的T细胞受体表达。
在一些实施方案中，低免疫原性T细胞、非活化T细胞或低免疫原性T细胞群不表达T细胞受体。
在一些实施方案中，低免疫原性T细胞、非活化T细胞或低免疫原性T细胞群包含减少的T细胞受体α恒定区(TRAC)和/或T细胞受体β恒定区(TRBC)表达。
在一些实施方案中，低免疫原性T细胞、非活化T细胞或低免疫原性T细胞群不表达TRAC和/或TRBC。
在一些实施方案中，低免疫原性T细胞、非活化T细胞或低免疫原性T细胞群还包含编码一种或多种嵌合抗原受体(CAR)的第二外源多核苷酸。
在一些实施方案中，一种或多种CAR选自由以下组成的组：CD19特异性CAR，使得细胞是CD19 CAR T细胞；CD20特异性CAR，使得细胞是CD20 CAR T细胞；CD22特异性CAR，使得细胞是CD22CAR T细胞；以及BCMA特异性CAR，使得细胞是BCMA CAR T细胞；或其组合。
在一些实施方案中，低免疫原性T细胞、非活化T细胞或低免疫原性T细胞群包含CD19特异性CAR和CD22特异性CAR，使得细胞是CD19/CD22 CAR T细胞。
在一些实施方案中，CD19特异性CAR和CD22特异性CAR由单一双顺反子多核苷酸编码。
在一些实施方案中，CD19特异性CAR和CD22特异性CAR由两种单独的多核苷酸编码。
在一些实施方案中，将第一和/或第二外源多核苷酸插入到细胞的至少一个等位基因的特定基因座中。
在一些实施方案中，特定基因座选自由以下组成的组：安全港基因座、RHD基因座、B2M基因座、CIITA基因座、TRAC基因座和TRB基因座。
在一些实施方案中，从供体受试者离体将编码CD47的多核苷酸引入低免疫原性T细胞、非活化T细胞或低免疫原性T细胞群中。
在一些实施方案中，使用慢病毒载体将编码CD47的多核苷酸引入低免疫原性T细胞、非活化T细胞或低免疫原性T细胞群中。
在一些实施方案中，在受体患者体内将编码CD47的多核苷酸引入低免疫原性T细胞、非活化T细胞或低免疫原性T细胞群中。
在一些实施方案中，通过使受体患者与包含慢病毒载体的组合物接触来将编码CD47的外源多核苷酸引入低免疫原性T细胞、非活化T细胞或低免疫原性T细胞群中，所述慢病毒载体包含(i)CD4结合剂或CD8结合剂，和(ii)编码CD47的多核苷酸，其中用慢病毒载体转导受体患者的低免疫原性T细胞、非活化T细胞或低免疫原性T细胞群。
在一些实施方案中，使用CRISPR/Cas基因编辑将编码CD47的多核苷酸引入低免疫原性T细胞、非活化T细胞或低免疫原性T细胞群中。
在一些实施方案中，CRISPR/Cas基因编辑从供体受试者离体进行。
在一些实施方案中，CRISPR/Cas基因编辑使用慢病毒载体进行。
在一些实施方案中，CRISPR/Cas基因编辑在受体患者体内进行。
在一些实施方案中，通过使受体患者与包含慢病毒载体的组合物接触来进行CRISPR/Cas基因编辑，所述慢病毒载体包含(i)CD4结合剂或CD8结合剂，(ii)编码CRISPR/Cas基因编辑组分的多核苷酸，以及(iii)编码CD47的多核苷酸，其中用慢病毒载体转导受体患者的低免疫原性T细胞、非活化T细胞或低免疫原性T细胞群。
在一些实施方案中，从供体受试者离体将一种或多种CAR引入低免疫原性T细胞、非活化T细胞或低免疫原性T细胞群中。
在一些实施方案中，使用慢病毒载体将一种或多种CAR引入低免疫原性T细胞、非活化T细胞或低免疫原性T细胞群中。
在一些实施方案中，在受体患者体内将一种或多种CAR引入低免疫原性T细胞、非活化T细胞或低免疫原性T细胞群中。
在一些实施方案中，通过使受体患者与包含慢病毒载体的组合物接触来将一种或多种CAR引入低免疫原性T细胞、非活化T细胞或低免疫原性T细胞群中，所述慢病毒载体包含(i)CD4结合剂或CD8结合剂，和(ii)编码一种或多种CAR的一种或多种多核苷酸，其中用慢病毒载体转导受体患者的低免疫原性T细胞、非活化T细胞或低免疫原性T细胞群。
在一些实施方案中，使用CRISPR/Cas基因编辑将一种或多种CAR引入低免疫原性T细胞、非活化T细胞或低免疫原性T细胞群中。
在一些实施方案中，CRISPR/Cas基因编辑从供体受试者离体进行。
在一些实施方案中，CRISPR/Cas基因编辑使用慢病毒载体进行。
在一些实施方案中，CRISPR/Cas基因编辑在受体患者体内进行。
在一些实施方案中，通过使受体患者与包含慢病毒载体的组合物接触来进行CRISPR/Cas基因编辑，所述慢病毒载体包含(i)CD4结合剂或CD8结合剂，(ii)编码CRISPR/Cas基因编辑组分的多核苷酸，以及(iii)编码一种或多种CAR的一种或多种多核苷酸，其中用慢病毒载体转导受体患者的低免疫原性T细胞、非活化T细胞或低免疫原性T细胞群。
在一些实施方案中，低免疫原性T细胞、非活化T细胞或低免疫原性T细胞群由原代T细胞或其子代繁殖，其中原代T细胞分离自恒河猴因子(Rh)阴性的供体受试者。
在一些实施方案中，低免疫原性T细胞、非活化T细胞或低免疫原性T细胞群衍生自iPSC或其子代，其中iPSC或其子代衍生自分离自RhD阴性的供体受试者的宿主细胞。
在一些实施方案中，低免疫原性T细胞、非活化T细胞或低免疫原性T细胞群由原代T细胞或其子代繁殖，其中原代T细胞或其子代分离自RhD阳性的供体受试者，并且被基因工程化为具有减少的RhD抗原表达。
在一些实施方案中，原代T细胞或其子代被基因工程化为不表达RhD抗原。
在一些实施方案中，低免疫原性T细胞、非活化T细胞或低免疫原性T细胞群衍生自iPSC或其子代，其中iPSC或其子代分离自RhD阳性的供体受试者，并且被基因工程化为具有减少的RhD抗原表达。
在一些实施方案中，iPSC或其子代被基因工程化为不表达RhD抗原。
在一些实施方案中，低免疫原性T细胞、非活化T细胞或低免疫原性T细胞群由原代T细胞库或其子代繁殖，其中原代T细胞库分离自一个或多个与受体患者不同的供体受试者，其中一个或多个供体受试者任选地包括一个或多个RhD阳性受试者、一个或多个RhD阴性受试者，或RhD阳性受试者和RhD阴性受试者的混合群体。
在一些实施方案中，低免疫原性T细胞、非活化T细胞或低免疫原性T细胞群衍生自iPSC库或其子代，其中iPSC库衍生自分离自一个或多个与受体患者不同的供体受试者的宿主细胞，其中一个或多个供体受试者任选地包括一个或多个RhD阳性受试者、一个或多个RhD阴性受试者，或RhD阳性受试者和RhD阴性受试者的混合群体。
在一些实施方案中，使用CRISPR/Cas基因编辑将低免疫原性T细胞、非活化T细胞或低免疫原性T细胞群基因工程化为具有减少的RhD抗原表达。
在一些实施方案中，CRISPR/Cas基因编辑从供体受试者离体进行。
在一些实施方案中，CRISPR/Cas基因编辑使用慢病毒载体进行。
在一些实施方案中，CRISPR/Cas基因编辑在受体患者体内进行。
在一些实施方案中，通过使受体患者与包含慢病毒载体的组合物接触来进行CRISPR/Cas基因编辑，所述慢病毒载体包含(i)CD4结合剂或CD8结合剂，和(ii)编码靶向RHD基因座的CRISPR/Cas基因编辑组分的多核苷酸，其中用慢病毒载体转导受体患者的低免疫原性T细胞、非活化T细胞或低免疫原性T细胞群。
在一些实施方案中，本文提供了一种药物组合物，其包含一种或多种本文提供的低免疫原性T细胞、非活化T细胞或低免疫原性T细胞群，以及药学上可接受的添加剂、载剂、稀释剂或赋形剂。
在一些实施方案中，组合物包含选自由低免疫原性T细胞群、非活化T细胞群、低免疫原性CD19 CAR T细胞群以及低免疫原性CD22CAR T细胞群组成的组的一种或多种细胞群，以及药学上可接受的添加剂、载剂、稀释剂或赋形剂。
在一些实施方案中，本文提供了本文提供的低免疫原性T细胞、非活化T细胞或低免疫原性T细胞群，或本文提供的药物组合物，其用于治疗患者的病症，其中患者是RhD致敏的。
在一些实施方案中，本文提供了本文提供的低免疫原性T细胞、非活化T细胞或低免疫原性T细胞群，或本文提供的药物组合物，其用于治疗患者的病症，其中患者不是RhD致敏的。
在一些实施方案中，本文提供了一种或多种修饰的T细胞群用于治疗受体患者的病症的用途，其中一种或多种修饰的T细胞群选自由以下组成的组：低免疫原性T细胞群、非活化T细胞群、低免疫原性CD19 CAR T细胞群以及低免疫原性CD22 CAR T细胞群，其中修饰的T细胞包含相对于未改变或未修饰的野生型细胞减少的RhD抗原和MHC I类和/或II类人白细胞抗原表达，以及编码CD47的第一外源多核苷酸，其中修饰的T细胞由原代T细胞或其子代繁殖，或衍生自iPSC或其子代。
在一些实施方案中，修饰的T细胞包含相对于未改变或未修饰的野生型细胞减少的RhD抗原和MHC I类和II类人白细胞抗原表达，以及编码CD47的第一外源多核苷酸，其中修饰的T细胞由原代T细胞或其子代繁殖，或衍生自iPSC或其子代。
在一些实施方案中，修饰的T细胞包含相对于未改变或未修饰的野生型细胞减少的RHD和B2M和/或CIITA表达，以及编码CD47的第一外源多核苷酸，其中修饰的T细胞由原代T细胞或其子代繁殖，或衍生自iPSC或其子代。
在一些实施方案中，修饰的T细胞包含相对于未改变或未修饰的野生型细胞减少的RHD和B2M以及CIITA表达，以及编码CD47的第一外源多核苷酸，其中修饰的T细胞由原代T细胞或其子代繁殖，或衍生自iPSC或其子代。
在一些实施方案中，修饰的T细胞不表达RhD抗原，不表达MHC I类和/或II类人白细胞抗原，并且包含编码CD47的第一外源多核苷酸，其中修饰的T细胞由原代T细胞或其子代繁殖，或衍生自iPSC或其子代。
在一些实施方案中，修饰的T细胞不表达RhD抗原，不表达MHC I类人白细胞抗原，不表达MHC II类人白细胞抗原，并且包含编码CD47的第一外源多核苷酸，其中修饰的T细胞由原代T细胞或其子代繁殖，或衍生自iPSC或其子代。
在一些实施方案中，修饰的T细胞不表达RHD，不表达B2M和/或CIITA，并且包含编码CD47的第一外源多核苷酸，其中修饰的T细胞由原代T细胞或其子代繁殖，或衍生自iPSC或其子代。
在一些实施方案中，修饰的T细胞不表达RHD，不表达B2M，不表达CIITA，并且包含编码CD47的第一外源多核苷酸，其中修饰的T细胞由原代T细胞或其子代繁殖，或衍生自iPSC或其子代。
在一些实施方案中，RhD抗原表达的减少或缺乏是由RHD基因的敲除造成的。
在一些实施方案中，修饰的T细胞还包含相对于未改变或未修饰的野生型细胞减少的T细胞受体表达。
在一些实施方案中，修饰的T细胞不表达T细胞受体。
在一些实施方案中，修饰的T细胞包含减少的TRAC和/或TRBC表达。
在一些实施方案中，修饰的T细胞不表达TRAC和/或TRBC。
在一些实施方案中，修饰的T细胞还包含编码一种或多种CAR的第二外源多核苷酸。
在一些实施方案中，一种或多种CAR选自由以下组成的组：CD19特异性CAR，使得细胞是CD19 CAR T细胞；CD20特异性CAR，使得细胞是CD20 CAR T细胞；CD22特异性CAR，使得细胞是CD22CAR T细胞；以及BCMA特异性CAR，使得细胞是BCMACAR T细胞；或其组合。
在一些实施方案中，低免疫原性T细胞、非活化T细胞或低免疫原性T细胞群包含CD19特异性CAR和CD22特异性CAR，使得细胞是CD19/CD22 CAR T细胞。
在一些实施方案中，CD19特异性CAR和CD22特异性CAR由单一双顺反子多核苷酸编码。
在一些实施方案中，CD19特异性CAR和CD22特异性CAR由两种单独的多核苷酸编码。
在一些实施方案中，将第一和/或第二外源多核苷酸插入到细胞的至少一个等位基因的特定基因座中。
在一些实施方案中，特定基因座选自由以下组成的组：安全港基因座、RHD基因座、B2M基因座、CIITA基因座、TRAC基因座和TRB基因座。
在一些实施方案中，从供体受试者离体将编码CD47的多核苷酸引入低免疫原性T细胞、非活化T细胞或低免疫原性T细胞群中。
在一些实施方案中，使用慢病毒载体将编码CD47的多核苷酸引入低免疫原性T细胞、非活化T细胞或低免疫原性T细胞群中。
在一些实施方案中，在受体患者体内将编码CD47的多核苷酸引入低免疫原性T细胞、非活化T细胞或低免疫原性T细胞群中。
在一些实施方案中，通过使受体患者与包含慢病毒载体的组合物接触来将编码CD47的外源多核苷酸引入低免疫原性T细胞、非活化T细胞或低免疫原性T细胞群中，所述慢病毒载体包含(i)CD4结合剂或CD8结合剂，和(ii)编码CD47的多核苷酸，其中用慢病毒载体转导受体患者的低免疫原性T细胞、非活化T细胞或低免疫原性T细胞群。
在一些实施方案中，使用CRISPR/Cas基因编辑将编码CD47的多核苷酸引入低免疫原性T细胞、非活化T细胞或低免疫原性T细胞群中。
在一些实施方案中，CRISPR/Cas基因编辑从供体受试者离体进行。
在一些实施方案中，CRISPR/Cas基因编辑使用慢病毒载体进行。
在一些实施方案中，CRISPR/Cas基因编辑在受体患者体内进行。
在一些实施方案中，通过使受体患者与包含慢病毒载体的组合物接触来进行CRISPR/Cas基因编辑，所述慢病毒载体包含(i)CD4结合剂或CD8结合剂，(ii)编码CRISPR/Cas基因编辑组分的多核苷酸，以及(iii)编码CD47的多核苷酸，其中用慢病毒载体转导受体患者的低免疫原性T细胞、非活化T细胞或低免疫原性T细胞群。
在一些实施方案中，从供体受试者离体将一种或多种CAR引入低免疫原性T细胞、非活化T细胞或低免疫原性T细胞群中。
在一些实施方案中，使用慢病毒载体将一种或多种CAR引入低免疫原性T细胞、非活化T细胞或低免疫原性T细胞群中。
在一些实施方案中，在受体患者体内将一种或多种CAR引入低免疫原性T细胞、非活化T细胞或低免疫原性T细胞群中。
在一些实施方案中，通过使受体患者与包含慢病毒载体的组合物接触来将一种或多种CAR引入低免疫原性T细胞、非活化T细胞或低免疫原性T细胞群中，所述慢病毒载体包含(i)CD4结合剂或CD8结合剂，和(ii)编码一种或多种CAR的一种或多种多核苷酸，其中用慢病毒载体转导受体患者的低免疫原性T细胞、非活化T细胞或低免疫原性T细胞群。
在一些实施方案中，使用CRISPR/Cas基因编辑将一种或多种CAR引入低免疫原性T细胞、非活化T细胞或低免疫原性T细胞群中。
在一些实施方案中，CRISPR/Cas基因编辑从供体受试者离体进行。
在一些实施方案中，CRISPR/Cas基因编辑使用慢病毒载体进行。
在一些实施方案中，CRISPR/Cas基因编辑在受体患者体内进行。
在一些实施方案中，通过使受体患者与包含慢病毒载体的组合物接触来进行CRISPR/Cas基因编辑，所述慢病毒载体包含(i)CD4结合剂或CD8结合剂，(ii)编码CRISPR/Cas基因编辑组分的多核苷酸，以及(iii)编码一种或多种CAR的一种或多种多核苷酸，其中用慢病毒载体转导受体患者的低免疫原性T细胞、非活化T细胞或低免疫原性T细胞群。
在一些实施方案中，修饰的T细胞由原代T细胞或其子代繁殖，其中原代T细胞分离自恒河猴因子(Rh)阴性的供体受试者。
在一些实施方案中，修饰的T细胞衍生自iPSC或其子代，其中iPSC或其子代衍生自分离自RhD阴性的供体受试者的宿主细胞。
在一些实施方案中，修饰的T细胞由原代T细胞或其子代繁殖，其中原代T细胞或其子代分离自RhD阳性的供体受试者，并且被基因工程化为具有减少的RhD抗原表达。
在一些实施方案中，原代T细胞或其子代被基因工程化为不表达RhD抗原。
在一些实施方案中，修饰的T细胞衍生自iPSC或其子代，其中iPSC或其子代分离自RhD阳性的供体受试者，并且被基因工程化为具有减少的RhD抗原表达。
在一些实施方案中，iPSC或其子代被基因工程化为不表达RhD抗原。
在一些实施方案中，修饰的T细胞由原代T细胞库或其子代繁殖，其中原代T细胞库分离自一个或多个与受体患者不同的供体受试者，其中一个或多个供体受试者任选地包括一个或多个RhD阳性受试者、一个或多个RhD阴性受试者，或RhD阳性受试者和RhD阴性受试者的混合群体。
在一些实施方案中，修饰的T细胞衍生自iPSC库或其子代，其中iPSC库衍生自分离自一个或多个与受体患者不同的供体受试者的宿主细胞，其中一个或多个供体受试者任选地包括一个或多个RhD阳性受试者、一个或多个RhD阴性受试者，或RhD阳性受试者和RhD阴性受试者的混合群体。
在一些实施方案中，使用CRISPR/Cas基因编辑将修饰的T细胞基因工程化为具有减少的RhD抗原表达。
在一些实施方案中，CRISPR/Cas基因编辑从供体受试者离体进行。
在一些实施方案中，CRISPR/Cas基因编辑使用慢病毒载体进行。
在一些实施方案中，CRISPR/Cas基因编辑在受体患者体内进行。
在一些实施方案中，通过使受体患者与包含慢病毒载体的组合物接触来进行CRISPR/Cas基因编辑，所述慢病毒载体包含(i)CD4结合剂或CD8结合剂，和(ii)编码靶向RHD基因座的CRISPR/Cas基因编辑组分的多核苷酸，其中用慢病毒载体转导修饰的T细胞。
在一些实施方案中，患者是RhD致敏的。
在一些实施方案中，患者不是RhD致敏的。
在一些实施方案中，本文提供了一种用于治疗受体患者的癌症或病症的方法，其包括向患者施用治疗有效量的一种或多种修饰的T细胞群，其中一种或多种修饰的T细胞群选自由以下组成的组：低免疫原性T细胞群、非活化T细胞群、低免疫原性CD19 CAR T细胞群以及低免疫原性CD22 CAR T细胞群，其中修饰的T细胞包含相对于未改变或未修饰的野生型细胞减少的RhD抗原和MHC I类和/或II类人白细胞抗原表达，以及编码CD47的第一外源多核苷酸，其中修饰的T细胞由原代T细胞或其子代繁殖，或衍生自iPSC或其子代。
在一些实施方案中，修饰的T细胞包含相对于未改变或未修饰的野生型细胞减少的RhD抗原和MHC I类和II类人白细胞抗原表达，以及编码CD47的第一外源多核苷酸，其中修饰的T细胞由原代T细胞或其子代繁殖，或衍生自iPSC或其子代。
在一些实施方案中，修饰的T细胞包含相对于未改变或未修饰的野生型细胞减少的RHD和B2M和/或CIITA表达，以及编码CD47的第一外源多核苷酸，其中修饰的T细胞由原代T细胞或其子代繁殖，或衍生自iPSC或其子代。
在一些实施方案中，修饰的T细胞包含相对于未改变或未修饰的野生型细胞减少的RHD和B2M以及CIITA表达，以及编码CD47的第一外源多核苷酸，其中修饰的T细胞由原代T细胞或其子代繁殖，或衍生自iPSC或其子代。
在一些实施方案中，修饰的T细胞不表达RhD抗原，不表达MHC I类和/或II类人白细胞抗原，并且包含编码CD47的第一外源多核苷酸，其中修饰的T细胞由原代T细胞或其子代繁殖，或衍生自iPSC或其子代。
在一些实施方案中，修饰的T细胞不表达RhD抗原，不表达MHC I类人白细胞抗原，不表达MHC II类人白细胞抗原，并且包含编码CD47的第一外源多核苷酸，其中修饰的T细胞由原代T细胞或其子代繁殖，或衍生自iPSC或其子代。
在一些实施方案中，修饰的T细胞不表达RHD，不表达B2M和/或CIITA，并且包含编码CD47的第一外源多核苷酸，其中修饰的T细胞由原代T细胞或其子代繁殖，或衍生自iPSC或其子代。
在一些实施方案中，修饰的T细胞不表达RHD，不表达B2M，不表达CIITA，并且包含编码CD47的第一外源多核苷酸，其中修饰的T细胞由原代T细胞或其子代繁殖，或衍生自iPSC或其子代。
在一些实施方案中，本文提供了一种用于扩增能够识别并杀伤患者体内的肿瘤细胞的T细胞的方法，其包括向患者施用治疗有效量的一种或多种修饰的T细胞群，其中一种或多种修饰的T细胞群选自由以下组成的组：低免疫原性T细胞群、非活化T细胞群、低免疫原性CD19 CAR T细胞群以及低免疫原性CD22 CAR T细胞群，其中修饰的T细胞包含相对于未改变或未修饰的野生型细胞减少的RhD抗原和MHC I类和/或II类人白细胞抗原表达，以及编码CD47的第一外源多核苷酸，其中修饰的T细胞由原代T细胞或其子代繁殖，或衍生自iPSC或其子代。
在一些实施方案中，修饰的T细胞包含相对于未改变或未修饰的野生型细胞减少的RhD抗原和MHC I类和II类人白细胞抗原表达，以及编码CD47的第一外源多核苷酸，其中修饰的T细胞由原代T细胞或其子代繁殖，或衍生自iPSC或其子代。
在一些实施方案中，修饰的T细胞包含相对于未改变或未修饰的野生型细胞减少的RHD和B2M和/或CIITA表达，以及编码CD47的第一外源多核苷酸，其中修饰的T细胞由原代T细胞或其子代繁殖，或衍生自iPSC或其子代。
在一些实施方案中，修饰的T细胞包含相对于未改变或未修饰的野生型细胞减少的RHD和B2M以及CIITA表达，以及编码CD47的第一外源多核苷酸，其中修饰的T细胞由原代T细胞或其子代繁殖，或衍生自iPSC或其子代。
在一些实施方案中，修饰的T细胞不表达RhD抗原，不表达MHC I类和/或II类人白细胞抗原，并且包含编码CD47的第一外源多核苷酸，其中修饰的T细胞由原代T细胞或其子代繁殖，或衍生自iPSC或其子代。
在一些实施方案中，修饰的T细胞不表达RhD抗原，不表达MHC I类人白细胞抗原，不表达MHC II类人白细胞抗原，并且包含编码CD47的第一外源多核苷酸，其中修饰的T细胞由原代T细胞或其子代繁殖，或衍生自iPSC或其子代。
在一些实施方案中，修饰的T细胞不表达RHD，不表达B2M和/或CIITA，并且包含编码CD47的第一外源多核苷酸，其中修饰的T细胞由原代T细胞或其子代繁殖，或衍生自iPSC或其子代。
在一些实施方案中，修饰的T细胞不表达RHD，不表达B2M，不表达CIITA，并且包含编码CD47的第一外源多核苷酸，其中修饰的T细胞由原代T细胞或其子代繁殖，或衍生自iPSC或其子代。
在一些实施方案中，RhD抗原表达的减少或缺乏是由RHD基因的敲除造成的。
在一些实施方案中，修饰的T细胞还包含相对于未改变或未修饰的野生型细胞减少的T细胞受体表达。
在一些实施方案中，修饰的T细胞不表达T细胞受体。
在一些实施方案中，修饰的T细胞包含减少的TRAC和/或TRBC表达。
在一些实施方案中，修饰的T细胞不表达TRAC和/或TRBC。
在一些实施方案中，修饰的T细胞还包含编码一种或多种CAR的第二外源多核苷酸。
在一些实施方案中，一种或多种CAR选自由以下组成的组：CD19特异性CAR，使得细胞是CD19 CAR T细胞；CD20特异性CAR，使得细胞是CD20 CAR T细胞；CD22特异性CAR，使得细胞是CD22CAR T细胞；以及BCMA特异性CAR，使得细胞是BCMA CAR T细胞；或其组合。
在一些实施方案中，低免疫原性T细胞、非活化T细胞或低免疫原性T细胞群包含CD19特异性CAR和CD22特异性CAR，使得细胞是CD19/CD22 CAR T细胞。
在一些实施方案中，CD19特异性CAR和CD22特异性CAR由单一双顺反子多核苷酸编码。
在一些实施方案中，CD19特异性CAR和CD22特异性CAR由两种单独的多核苷酸编码。
在一些实施方案中，将第一和/或第二外源多核苷酸插入到细胞的至少一个等位基因的特定基因座中。
在一些实施方案中，特定基因座选自由以下组成的组：安全港基因座、RHD基因座、B2M基因座、CIITA基因座、TRAC基因座和TRB基因座。
在一些实施方案中，从供体受试者离体将编码CD47的多核苷酸引入低免疫原性T细胞、非活化T细胞或低免疫原性T细胞群中。
在一些实施方案中，使用慢病毒载体将编码CD47的多核苷酸引入低免疫原性T细胞、非活化T细胞或低免疫原性T细胞群中。
在一些实施方案中，在受体患者体内将编码CD47的多核苷酸引入低免疫原性T细胞、非活化T细胞或低免疫原性T细胞群中。
在一些实施方案中，通过使受体患者与包含慢病毒载体的组合物接触来将编码CD47的外源多核苷酸引入低免疫原性T细胞、非活化T细胞或低免疫原性T细胞群中，所述慢病毒载体包含(i)CD4结合剂或CD8结合剂，和(ii)编码CD47的多核苷酸，其中用慢病毒载体转导受体患者的低免疫原性T细胞、非活化T细胞或低免疫原性T细胞群。
在一些实施方案中，使用CRISPR/Cas基因编辑将编码CD47的多核苷酸引入低免疫原性T细胞、非活化T细胞或低免疫原性T细胞群中。
在一些实施方案中，CRISPR/Cas基因编辑从供体受试者离体进行。
在一些实施方案中，CRISPR/Cas基因编辑在受体患者体内进行。
在一些实施方案中，通过使受体患者与包含慢病毒载体的组合物接触来进行CRISPR/Cas基因编辑，所述慢病毒载体包含(i)CD4结合剂或CD8结合剂，(ii)编码CRISPR/Cas基因编辑组分的多核苷酸，以及(iii)编码CD47的多核苷酸，其中用慢病毒载体转导受体患者的低免疫原性T细胞、非活化T细胞或低免疫原性T细胞群。
在一些实施方案中，其中从供体受试者离体将一种或多种CAR引入低免疫原性T细胞、非活化T细胞或低免疫原性T细胞群中。
在一些实施方案中，使用慢病毒载体将一种或多种CAR引入低免疫原性T细胞、非活化T细胞或低免疫原性T细胞群中。
在一些实施方案中，在受体患者体内将一种或多种CAR引入低免疫原性T细胞、非活化T细胞或低免疫原性T细胞群中。
在一些实施方案中，通过使受体患者与包含慢病毒载体的组合物接触来将一种或多种CAR引入低免疫原性T细胞、非活化T细胞或低免疫原性T细胞群中，所述慢病毒载体包含(i)CD4结合剂或CD8结合剂，和(ii)编码一种或多种CAR的一种或多种多核苷酸，其中用慢病毒载体转导受体患者的低免疫原性T细胞、非活化T细胞或低免疫原性T细胞群。
在一些实施方案中，使用CRISPR/Cas基因编辑将一种或多种CAR引入低免疫原性T细胞、非活化T细胞或低免疫原性T细胞群中。
在一些实施方案中，CRISPR/Cas基因编辑从供体受试者离体进行。
在一些实施方案中，CRISPR/Cas基因编辑使用慢病毒载体进行。
在一些实施方案中，CRISPR/Cas基因编辑在受体患者体内进行。
在一些实施方案中，通过使受体患者与包含慢病毒载体的组合物接触来进行CRISPR/Cas基因编辑，所述慢病毒载体包含(i)CD4结合剂或CD8结合剂，(ii)编码CRISPR/Cas基因编辑组分的多核苷酸，以及(iii)编码一种或多种CAR的一种或多种多核苷酸，其中用慢病毒载体转导受体患者的低免疫原性T细胞、非活化T细胞或低免疫原性T细胞群。
在一些实施方案中，修饰的T细胞由原代T细胞或其子代繁殖，其中原代T细胞分离自恒河猴因子(Rh)阴性的供体受试者。
在一些实施方案中，修饰的T细胞衍生自iPSC或其子代，其中iPSC或其子代衍生自分离自RhD阴性的供体受试者的宿主细胞。
在一些实施方案中，修饰的T细胞由原代T细胞或其子代繁殖，其中原代T细胞或其子代分离自RhD阳性的供体受试者，并且被基因工程化为具有减少的RhD抗原表达。
在一些实施方案中，原代T细胞或其子代被基因工程化为不表达RhD抗原。
在一些实施方案中，修饰的T细胞衍生自iPSC或其子代，其中iPSC或其子代分离自RhD阳性的供体受试者，并且被基因工程化为具有减少的RhD抗原表达。
在一些实施方案中，iPSC或其子代被基因工程化为不表达RhD抗原。
在一些实施方案中，修饰的T细胞由原代T细胞库或其子代繁殖，其中原代T细胞库分离自一个或多个与受体患者不同的供体受试者，其中一个或多个供体受试者任选地包括一个或多个RhD阳性受试者、一个或多个RhD阴性受试者，或RhD阳性受试者和RhD阴性受试者的混合群体。
在一些实施方案中，修饰的T细胞衍生自iPSC库或其子代，其中iPSC库衍生自分离自一个或多个与受体患者不同的供体受试者的宿主细胞，其中一个或多个供体受试者任选地包括一个或多个RhD阳性受试者、一个或多个RhD阴性受试者，或RhD阳性受试者和RhD阴性受试者的混合群体。
在一些实施方案中，使用CRISPR/Cas基因编辑将修饰的T细胞基因工程化为具有减少的RhD抗原表达。
在一些实施方案中，CRISPR/Cas基因编辑从供体受试者离体进行。
在一些实施方案中，CRISPR/Cas基因编辑使用慢病毒载体进行。
在一些实施方案中，CRISPR/Cas基因编辑在受体患者体内进行。
在一些实施方案中，通过使受体患者与包含慢病毒载体的组合物接触来进行CRISPR/Cas基因编辑，所述慢病毒载体包含(i)CD4结合剂或CD8结合剂，和(ii)编码靶向RHD基因座的CRISPR/Cas基因编辑组分的多核苷酸，其中用慢病毒载体转导细胞。
在一些实施方案中，患者是RhD致敏的。
在一些实施方案中，患者不是RhD致敏的。
在一些实施方案中，在施用后，一种或多种修饰的T细胞群在患者中引发水平降低的免疫激活或不引发免疫激活。
在一些实施方案中，在施用后，一种或多种修饰的T细胞群在患者中引发水平降低的全身性TH1激活或不引发全身性TH1激活。
在一些实施方案中，在施用后，一种或多种修饰的T细胞群在患者中引发水平降低的外周血单核细胞(PBMC)的免疫激活或不引发PBMC的免疫激活。
在一些实施方案中，在施用后，一种或多种修饰的T细胞群在患者中引发水平降低的针对低免疫原性T细胞的供体特异性IgG抗体或不引发供体特异性IgG抗体。
在一些实施方案中，在施用后，一种或多种修饰的T细胞群在患者中引发水平降低的针对低免疫原性T细胞的IgM和IgG抗体产生或不引发IgM和IgG抗体产生。
在一些实施方案中，在施用后，一种或多种修饰的T细胞群在患者中引发水平降低的对低免疫原性T细胞的细胞毒性T细胞杀伤或不引发细胞毒性T细胞杀伤。
在一些实施方案中，在施用低免疫原性T细胞群之前或之后至少3天或更长时间不向患者施用免疫阻抑剂。
在一些实施方案中，本文提供了一种对低免疫原性T细胞进行修饰，使得修饰的低免疫原性T细胞包含相对于未改变或未修饰的野生型细胞减少的RhD抗原表达的方法，所述方法包括使低免疫原性T细胞与包含慢病毒载体的组合物接触，所述慢病毒载体包含(i)CD4结合剂或CD8结合剂，和(ii)编码靶向RHD基因座的CRISPR/Cas基因编辑组分的多核苷酸，其中用慢病毒载体转导低免疫原性T细胞，低免疫原性T细胞由原代T细胞或其子代繁殖，或衍生自iPSC或其子代，并且低免疫原性T细胞包含相对于未改变或未修饰的野生型细胞减少的MHC I类和/或II类人白细胞抗原表达以及编码CD47的第一外源多核苷酸。
在一些实施方案中，慢病毒载体还包含(iii)编码一种或多种CAR的一种或多种多核苷酸。
在一些实施方案中，将编码一种或多种CAR的多核苷酸插入修饰的低免疫原性T细胞的RHD基因座中。
在一些实施方案中，低免疫原性T细胞的接触从供体受试者离体进行。
在一些实施方案中，低免疫原性T细胞的接触使用慢病毒载体进行。
在一些实施方案中，低免疫原性T细胞的接触在受体患者体内进行。
在一些实施方案中，受体患者患有疾病或病状。
附图说明
图1A描绘了测量与同种型对照相比，在解冻后，来自所分析的五个RhD+供体的CD3+T细胞的细胞表面上的RhD抗原水平(CD240D)的流式细胞术数据。
图1B描绘了测量与同种型对照相比，在用IL-2激活后，来自所分析的五个RhD+供体的CD3+T细胞的细胞表面上的RhD抗原水平(CD240D)的流式细胞术数据。
图1C描绘了测量与同种型对照相比，在解冻后，来自所分析的两个RhD-供体的CD3+T细胞的细胞表面上的RhD抗原水平(CD240D)的流式细胞术数据。
图2A示出描绘了使用实时细胞杀伤监测测定(例如，Xcelligence)评估在存在抗RhD抗体的情况下NK细胞对来自RhD+供体的T细胞的识别的图。
图2B示出描绘了使用实时细胞杀伤监测测定(例如，Xcelligence)评估在存在抗RhD抗体的情况下巨噬细胞对来自RhD+供体的T细胞的识别的图。
图2C示出描绘了使用实时细胞杀伤监测测定(例如，Xcelligence)评估在存在抗RhD抗体的情况下NK细胞(上图)和巨噬细胞(下图)对来自RhD-供体的T细胞的识别的图。
图3A示出描绘了使用实时细胞杀伤监测测定(例如，Xcelligence)评估在存在抗RhD抗体的情况下补体依赖性细胞毒性(CDC)对来自RhD+供体的T细胞的杀伤的图。
图3B示出描绘了使用实时细胞杀伤监测测定(例如，Xcelligence)评估在不存在抗RhD抗体的情况下(存活率对照)CDC对来自RhD+供体的T细胞的杀伤的图。
图3C示出描绘了使用实时细胞杀伤监测测定(例如，Xcelligence)评估在存在抗RhD抗体的情况下(上图)或在不存在抗RhD抗体的情况下(存活率对照；下图)CDC对来自RhD-供体的T细胞的杀伤的图。
图4A示出描绘了RhD-血清(顶行)、RhD+血清(中间行)或RhD-致敏血清(底行)中NK细胞(左列)、巨噬细胞(中间列)和CDC(右列)对来自第一供体(O型血；RhD+)的T细胞的杀伤的评估的图。
图4B示出描绘了RhD-血清(顶行)、RhD+血清(中间行)或RhD-致敏血清(底行)中NK细胞(左列)、巨噬细胞(中间列)和CDC(右列)对来自第二供体(O型血；RhD+)的T细胞的杀伤的评估的图。
图4C示出描绘了RhD-血清(顶行)、RhD+血清(中间行)或RhD-致敏血清(底行)中NK细胞(左列)、巨噬细胞(中间列)和CDC(右列)对来自第三供体(O型血；RhD+)的T细胞的杀伤的评估的图。
图4D示出描绘了RhD-血清(顶行)、RhD+血清(中间行)或RhD-致敏血清(底行)中NK细胞(左列)、巨噬细胞(中间列)和CDC(右列)对来自第四供体(O型血；RhD-)的T细胞的杀伤的评估的图。
具体实施方式
I.引言
本技术涉及包含减少的恒河猴因子D(RhD)抗原表达的低免疫原性T细胞和非活化T细胞、所述细胞的群、包含所述细胞的药物组合物，以及治疗病症和病状的方法，所述方法包括施用治疗有效量的细胞。
为了克服受体患者对由原代T细胞或其子代繁殖或衍生自诱导性多能干细胞(iPSC)或其子代的这些低免疫原性T细胞和非活化T细胞的免疫排斥问题，发明人已开发并在本文公开了用于生成和施用低免疫原性T细胞和非活化T细胞，使得它们在施用于受体患者后被保护免受适应性和先天免疫排斥的方法。有利地，本文公开的细胞不被受体患者的免疫系统排斥，无论受试者的基因构成如何。此类细胞在施用于受体患者后被保护免受适应性和先天免疫排斥。
在一些实施方案中，本文概述的低免疫原性T细胞和非活化T细胞不经受先天免疫细胞排斥。在一些情况下，低免疫原性T细胞和非活化T细胞对NK细胞介导的裂解不敏感。在一些情况下，低免疫原性T细胞和非活化T细胞对巨噬细胞吞噬不敏感。在一些实施方案中，低免疫原性T细胞和非活化T细胞可用作普遍相容的细胞或组织(例如，通用供体细胞或组织)的来源，所述细胞或组织被移植到受体患者中而几乎不需要免疫阻抑剂。此类低免疫原性T细胞和非活化T细胞在移植后保留细胞特异性特性和特征。
在一些实施方案中，本文提供了用于治疗病症的方法，其包括向RhD致敏患者受体施用逃避免疫排斥的细胞(例如，低免疫原性T细胞和非活化T细胞)。在一些情况下，当向RhD致敏的患者受体重复施用(例如，移植或植入)时，由本文概述的干细胞产生的分化细胞逃避免疫排斥。
在一些实施方案中，本文提供了用于治疗病症的方法，其包括向MHC错配的同种异体受体施用逃避免疫排斥的细胞(例如，低免疫原性T细胞和非活化T细胞)。在一些情况下，当向MHC错配的同种异体受体重复施用(例如，移植或植入)时，由本文概述的干细胞产生的分化细胞逃避免疫排斥。
在一些实施方案中，本文提供了衍生自原代T细胞或其子代的低免疫原性的T细胞，以及衍生自iPSC或其子代的同样低免疫原性的细胞。在一些实施方案中，与未改变或未修饰的野生型免疫原性细胞相比，本文概述的此类低免疫原性T细胞和非活化T细胞具有降低的免疫原性(诸如，免疫原性低至少2.5％-99％)。在一些情况下，与未改变或未修饰的野生型T细胞相比，低免疫原性T细胞缺乏免疫原性。其衍生物或子代适合作为通用供体细胞移植或植入受体患者体内。在一些实施方案中，此类细胞对于受试者是非免疫原性的。
在一些实施方案中，本文公开的细胞在施用于受试者后未能引发全身性免疫反应。在一些情况下，细胞在施用于受试者后不引发外周血单核细胞和血清因子的免疫激活。在一些情况下，细胞不激活免疫系统。换句话说，本文所述的细胞表现出免疫逃避特性和性质。在一些实施方案中，本文所述的细胞表现出免疫豁免特性和性质。
令人惊讶的是，发现T细胞表达RhD抗原。此外，据发现，在存在抗RhD抗体的情况下，巨噬细胞和自然杀伤细胞识别并通过抗体依赖性细胞毒性(ADCC)杀伤RhD+T细胞，并且在存在抗RhD抗体的情况下通过补体依赖性细胞毒性(CDC)杀伤RhD+T细胞。这些令人惊讶的发现表明，低免疫原性供体T细胞或非活化供体T细胞的来源应是RhD-或被基因修饰为RhD-，以避免被受体的免疫系统(包括巨噬细胞和自然杀伤细胞)检测并消除。
II.定义
如本文所用，“免疫原性”是指允许物质在引入受试者(例如，人受试者)中时诱导可检测的免疫反应(体液或细胞)的性质。
如本文所用以表征细胞，术语“低免疫原性”通常是指这种细胞不太容易受到移植此类细胞的受试者的免疫排斥。例如，相对于未改变或未修饰的野生型细胞，这种低免疫原性T细胞可约2.5％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、97.5％、99％或更大可能不太容易受到移植此类细胞的受试者的免疫排斥。在一些实施方案中，使用基因组编辑技术调节MHC I和MHC II基因的表达，并且因此生成低免疫原性T细胞。在一些实施方案中，低免疫原性T细胞在MHC错配的同种异体受体中逃避免疫排斥。在一些情况下，当向MHC错配的同种异体受体施用(例如，移植或植入)时，由本文概述的低免疫原性干细胞产生的分化细胞逃避免疫排斥。在一些实施方案中，低免疫原性T细胞被保护免受T细胞介导的适应性免疫排斥和/或先天免疫细胞排斥。
在一些实施方案中，所描述的低免疫原性T细胞和非活化T细胞由原代T细胞或其子代繁殖。如本文所用，术语“由原代T细胞或其子代繁殖”涵盖从供体受试者分离的初始原代T细胞及其任何后续子代。如本文所用，术语“子代”涵盖例如第一代子代，即通过例如传统繁殖方法直接衍生自、获自、可获自或可衍生自初始原代T细胞的子代。术语“子代”还涵盖另外的世代，诸如第二代、第三代、第四代、第五代、第六代、第七代或更多代，即通过例如传统繁殖方法衍生自、获自、可获自或可衍生自前一代的细胞世代。术语“子代”还涵盖由于初始原代T细胞或其子代的修饰或改变而产生的修饰的细胞。
在一些实施方案中，所描述的低免疫原性T细胞和非活化T细胞衍生自iPSC或其子代。如本文所用，术语“衍生自iPSC或其子代”涵盖生成的初始iPSC及其任何后续子代。如本文所用，术语“子代”涵盖例如第一代子代，即通过例如传统繁殖方法直接衍生自、获自、可获自或可衍生自初始iPSC的子代。术语“子代”还涵盖另外的世代，诸如第二代、第三代、第四代、第五代、第六代、第七代或更多代，即通过例如传统繁殖方法衍生自、获自、可获自或可衍生自前一代的细胞世代。术语“子代”还涵盖由于初始iPSC或其子代的修饰或改变而产生的修饰的细胞。
细胞的低免疫原性可以通过评价细胞的免疫原性来确定，诸如细胞引发适应性和先天免疫反应的能力。这种免疫反应可以使用本领域技术人员认可的测定来测量。在一些实施方案中，免疫反应测定测量低免疫原性T细胞对T细胞增殖、T细胞激活、T细胞杀伤、NK细胞增殖、NK细胞激活和巨噬细胞活性的影响。在一些情况下，低免疫原性T细胞及其衍生物在施用于受试者后经历被T细胞和/或NK细胞杀伤的降低。在一些情况下，与未修饰的或野生型细胞相比，细胞及其衍生物显示出降低的巨噬细胞吞噬。在一些实施方案中，与相应的未修饰的野生型细胞相比，低免疫原性T细胞在受体受试者中引发降低或减弱的免疫反应。在一些实施方案中，低免疫原性T细胞是非免疫原性的或无法在受体受试者中引发免疫反应。
如本文所用的“多能干细胞”具有分化成三个胚层中的任一个的潜力：内胚层(例如，胃壁、胃肠道、肺等)、中胚层(例如，肌肉、骨骼、血液、泌尿生殖组织等)或外胚层(例如表皮组织和神经系统组织)。如本文所用的术语“多能干细胞”还涵盖“诱导性多能干细胞”或“iPSC”、“胚胎干细胞”或“ESC”，一类衍生自非多能细胞的多能干细胞。在一些实施方案中，多能干细胞由不是多能细胞的细胞产生或生成。换句话说，多能干细胞可以是非多能细胞的直接或间接子代。亲本细胞的实例包括已被重编程以通过各种方式诱导多能未分化表型的体细胞。这种“ESC”、“ESC”、“iPS”或“iPSC”细胞可以通过诱导某些调控基因的表达或通过某些蛋白质的外源应用而产生。用于诱导iPS细胞的方法是本领域已知的并且在下文进一步描述。(参见，例如，Zhou等人,Stem Cells 27(11):2667-74(2009)；Huangfu等人,Nature Biotechnol.26(7):795(2008)；Woltjen等人,Nature 458(7239):766-770(2009)；以及Zhou等人,Cell Stem Cell 8:381-384(2009)；其中的每一篇通过引用整体并入本文。)诱导性多能干细胞(iPSC)的生成在下文概述。如本文所用，“hiPSC”是人诱导性多能干细胞。
“HLA”或“人白细胞抗原”复合物是编码人主要组织相容性复合物(MHC)蛋白的基因复合物。构成HLA复合物的这些细胞表面蛋白负责调控对抗原的免疫反应。在人中，有两种MHC，即I类和II类，“HLA-I”和“HLA-II”。HLA-I包括三种蛋白质，即HLA-A、HLA-B和HLA-C，所述三种蛋白质呈递来自细胞内部的肽，并且由HLA-I复合物呈递的抗原吸引杀伤T细胞(也称为CD8+T细胞或细胞毒性T细胞)。HLA-I蛋白与β-2微球蛋白(B2M)相关。HLA-II包括五种蛋白质，即HLA-DP、HLA-DM、HLA-DOB、HLA-DQ和HLA-DR，所述五种蛋白质将来自细胞外部的抗原呈递至T淋巴细胞。这刺激CD4+细胞(也称为辅助T细胞)。应理解，“MHC”或“HLA”的使用并不意味着限制，因为它取决于基因是来自人(HLA)还是来自鼠(MHC)。因此，当涉及哺乳动物细胞时，这些术语在本文中可互换使用。
“恒河猴因子D抗原”或“Rh(D)抗原”或“RhD抗原”或“恒河猴D抗原”或“RhD抗原”或“RHD”及其变型是指由RHD基因编码的Rh抗原，其可存在于人红细胞的表面。那些红细胞具有这种抗原的个体通常被称为“RhD阳性”或“RhD+”或“Rh阳性”或“Rh+”，而那些红细胞不具有这种抗原的个体被称为“RhD阴性”或“RhD-”或“Rh阴性”或“Rh-”。
如本文所用，术语“逃避排斥”、“逃脱排斥”、“避开排斥”和类似术语可互换使用以指代根据本技术的经基因或其他方式修饰的膜产物和细胞，在与未根据本技术进行基因修饰的相应产物和细胞相比时，所述膜产物和细胞在移植到受试者中时更不易受到排斥。在一些实施方案中，在与ABO血型或Rh因子与受试者不匹配的相应细胞相比时，当移植到受试者中时，根据本技术的经基因修饰的产物和细胞更不易受到排斥。
本文中的“同种异体”意指产生免疫细胞反应的宿主生物体和细胞移植物的遗传差异性。
如本文所用，术语“植入(grafting)”、“施用(administering)”、“引入(introducing)”、“植入(implanting)”和“移植(transplanting)”以及其语法变型在将细胞(例如，本文所述的细胞)放置到受试者中的上下文中可互换使用，所述放置通过导致引入细胞至少部分地定位在期望部位的方法或途径实现。可以将细胞直接植入期望部位，或可替代地通过任何适当的途径施用，所述途径导致递送至受试者的期望位置，在所述位置中，植入的细胞或细胞组分中的至少一部分保持存活。在向受试者施用后细胞的存活期可以短至几小时(例如，二十四小时)至几天，甚至长达几年。在一些实施方案中，细胞还可以例如以胶囊形式施用(例如，注射)到期望部位以外的位置，诸如在脑中或皮下，以将植入的细胞维持在植入位置并且避免植入细胞的迁移。
如本文所用，术语“治疗(treating)”和“治疗(treatment)”包括向受试者施用有效量的本文所述的细胞，使得受试者的疾病的至少一种症状得到减轻或疾病得到改善，例如，有益的或期望的临床结果。出于该技术的目的，有益的或期望的临床结果包括但不限于一种或多种症状的减轻、疾病程度的减弱、疾病状态的稳定(即，不恶化)、疾病进展的延迟或减慢、疾病状态的改善或缓和以及缓解(无论是部分还是全部)，无论是可检测的还是不可检测的。治疗可以指与未接受治疗的预期存活相比延长存活。因此，本领域技术人员认识到，治疗可改善疾病状况，但可能不是疾病的完全治愈。在一些实施方案中，在治疗病状、疾病或病症后，病状、疾病或病症的一种或多种症状减轻至少5％、至少10％、至少20％、至少30％、至少40％或至少50％。
如本文所用，术语“有效量”意指足以显著且正面地改变待治疗的症状和/或病状(例如，提供正面临床反应)的药物组合物的量。用于药物组合物中的活性成分的有效量将随所治疗的具体病状、病状的严重程度、治疗的持续时间、并行疗法的性质、所采用的一种或多种特定活性成分、所使用的一种或多种特定药学上可接受的赋形剂和/或载剂，以及主治医师的知识和专业知识的类似因素而变化。
如本文所用，术语“药学上可接受的”是指在合理的医学判断范围内适合用于与人类和动物的组织接触，而没有过度的毒性、刺激、过敏反应或其他问题或并发症且具有合理的效益/风险比的赋形剂、组合物和/或剂型。
如本文所用的术语“癌症”被定义为细胞的过度增殖，其独特性状(例如，失去正常控制)导致不受调控的生长、缺乏分化、局部组织侵袭和转移。关于本发明的方法，癌症可以是任何癌症，包括以下癌症中的任一种：急性淋巴细胞癌、急性髓性白血病、腺泡状横纹肌肉瘤、膀胱癌、骨癌、脑癌、乳腺癌、肛门癌、肛管癌或肛门直肠癌、眼癌、肝内胆管癌、关节癌、颈癌、胆囊癌或胸膜癌、鼻癌、鼻腔癌或中耳癌、口腔癌、外阴癌、慢性淋巴细胞白血病、慢性髓性癌、结肠癌、食道癌、宫颈癌、纤维肉瘤、胃肠道类癌肿瘤、霍奇金淋巴瘤(Hodgkinlymphoma)、下咽癌、肾癌、喉癌、白血病、液体瘤、肝癌、肺癌、淋巴瘤、恶性间皮瘤、肥大细胞瘤、黑色素瘤、多发性骨髓瘤、鼻咽癌、非霍奇金淋巴瘤、卵巢癌、胰腺癌、腹膜癌、大网膜癌和肠系膜癌、咽癌、前列腺癌、直肠癌、肾癌、皮肤癌、小肠癌、软组织癌、实体瘤、胃癌、睾丸癌、甲状腺癌、输尿管癌和尿膀胱癌。如本文所用，除非另有明确说明，否则术语“肿瘤”是指恶性类型的细胞或组织的异常生长，并且不包括良性类型组织。
术语“慢性感染性疾病”是指由感染原引起的疾病，其中感染持续存在。这样的疾病可包括肝炎(甲型、乙型或丙型)、疱疹病毒(例如VZV、HSV-1、HSV-6、HSV-II、CMV和EBV)和HIV/AIDS。非病毒实例可包括慢性真菌病，诸如曲霉病(Aspergillosis)、念珠菌病(Candidiasis)、球孢子菌病(Coccidioidomycosis)，以及与隐球菌(Cryptococcus)相关的疾病和组织胞浆菌病(Histoplasmosis)。慢性细菌感染原的非限制性实例可以是肺炎衣原体(Chlamydia pneumoniae)、单核细胞增生性李斯特菌(Listeria monocytogene)和结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)。在一些实施方案中，病症是人免疫缺陷病毒(HIV)感染。在一些实施方案中，病症是获得性免疫缺陷综合征(AIDS)。
术语“自身免疫性疾病”是指受试者产生针对其自身组织的破坏性免疫反应的任何疾病或病症。自身免疫性病症几乎可以影响受试者(例如人)的每个器官系统，包括但不限于神经、胃肠道和内分泌系统疾病，以及皮肤和其他结缔组织、眼睛、血液和血管疾病。自身免疫性疾病的实例包括但不限于桥本甲状腺炎(Hashimoto's thyroiditis)、系统性红斑狼疮、干燥综合征(Sjogren's syndrome)、格雷夫斯病(Graves'disease)、硬皮病、类风湿性关节炎、多发性硬化症、重症肌无力和糖尿病。
在一些实施方案中，本技术设想了非致敏受试者的治疗。例如，针对本发明的治疗方法所设想的受试者对一种或多种同种异体抗原不敏感。在一些实施方案中，患者未因先前妊娠或先前同种异体移植(包括例如但不限于同种异体细胞移植、同种异体输血、同种异体组织移植和同种异体器官移植)而被致敏。在一些实施方案中，患者不敏感的一种或多种同种异体抗原包括RhD抗原，使得患者“不是RhD致敏的”。在一些实施方案中，患者未表现出对一种或多种同种异体抗原有反应性的记忆B细胞和/或记忆T细胞。在一些实施方案中，致敏可以包括对自体CAR T细胞的至少一部分(诸如由自体T细胞表达的CAR)敏感，并且在本方法中，患者不对此类自体CAR T细胞的任何部分敏感。
在一些实施方案中，本技术设想了致敏受试者的治疗。例如，针对本发明的治疗方法所设想的受试者对一种或多种同种异体抗原敏感。在一些实施方案中，患者因先前妊娠或先前同种异体移植(包括例如但不限于同种异体细胞移植、同种异体输血、同种异体组织移植和同种异体器官移植)而被致敏。在一些实施方案中，患者敏感的一种或多种同种异体抗原包括RhD抗原，使得患者是“RhD致敏的”。在一些实施方案中，患者表现出对一种或多种同种异体抗原有反应性的记忆B细胞和/或记忆T细胞。
在一些实施方案中，本技术设想了以技术人员可获得的任何方式改变靶多核苷酸序列，例如，利用TALEN系统或RNA引导的转座酶。应当理解，尽管本文详细描述了利用CRISPR/Cas(例如，Cas9和Cas12A)和TALEN的方法的实例，但本技术不限于这些方法/系统的使用。本文可以利用技术人员已知的降低或消除靶细胞中的表达的其他靶向例如B2M的方法。
与CRISPR-Cas组分结合并将它们靶向靶DNA内的特定位置的RNA分子在本文中被称为“指导RNA”、“gRNA”或“小指导RNA”，并且在本文中也可称为“靶向DNA的RNA”。指导RNA包含至少两个核苷酸区段：至少一个“DNA结合区段”和至少一个“多肽结合区段”。“区段”意指分子的一部分、节段或区域，例如，RNA分子的连续核苷酸链段。除非另有明确定义，否则“区段”的定义不限于特定数量的总碱基对。在一些实施方案中，靶向是通过gRNA的一部分与DNA杂交(例如，通过gRNA靶向结构域)和通过gRNA分子的一部分与RNA引导的核酸酶或其他效应分子结合(例如，至少通过gRNA tracr)来实现的。在一些实施方案中，gRNA分子由单个连续多核苷酸分子组成，在本文中称为“单指导RNA”或“sgRNA”等。在一些实施方案中，gRNA分子由单个连续多核苷酸分子组成，例如，在基于Cas12a的系统的情况下，在本文中称为“crRNA”。在其他实施方案中，gRNA分子包括多个，通常两个多核苷酸分子，所述多核苷酸分子本身能够缔合，通常通过杂交，在本文中称为“双指导RNA”或“dgRNA”等。gRNA分子在下文更详细地描述，并且通常包括靶向结构域和tracr。在其他实施方案中，靶向结构域和tracr设置在单个多核苷酸上。指导RNA可以作为分离的RNA分子引入靶细胞中，或使用含有编码指导RNA的DNA的表达载体引入细胞中。
如本文所用，术语“指导RNA靶标”包括本文所述的指导RNA靶标中的每一个和任一个的RNA序列以及其用于基因编辑的变体。在一些实施方案中，指导RNA靶标包括指导RNA结合的靶序列，从而允许对靶序列进行基因编辑。指导RNA靶标可以与靶序列相对应并且不包括PAM序列。
指导RNA的“DNA结合区段”(或“DNA靶向序列”)包含与靶DNA内的特定序列互补的核苷酸序列。
指导RNA可以包括一种或多种多肽结合序列/区段。指导RNA的多肽结合区段(或“蛋白质结合序列”)与Cas蛋白的RNA结合结构域相互作用。
如本文所用，术语“Cas9分子”是指衍生自II型CRISPR-Cas9系统的Cas9野生型蛋白、Cas9蛋白的修饰形式、Cas9蛋白的变体、Cas9直系同源物以及其组合。
如本文所用，术语“Cas12a分子”是指衍生自II型CRISPR-Cas12a系统的Cas12a野生型蛋白、Cas12a蛋白的修饰形式、Cas12a蛋白的变体、Cas12a直系同源物以及其组合。
术语“供体多核苷酸”、“供体模板”和“供体寡核苷酸”可互换使用，并且是指提供核酸序列的多核苷酸，所述核酸序列的至少一部分意欲整合到选定的核酸靶位点中。一般来说，供体多核苷酸是单链多核苷酸或双链多核苷酸。举例来说，工程化的II型CRISPR-Cas9系统可以与供体DNA模板组合使用，以修饰基因组DNA中的DNA靶序列，其中基因组DNA在DNA靶序列处被修饰以包含供体DNA模板的至少一部分。在一些实施方案中，载体包含供体多核苷酸。在其他实施方案中，供体多核苷酸是寡核苷酸。
如本文所用，术语“HDR”是指同源定向修复，如本文所用，是指使用同源核酸(例如，内源同源序列，例如，姐妹染色单体，或外源核酸，例如模板核酸)修复DNA损伤的过程。HDR通常在双链断裂处发生明显切除时起作用，形成DNA的至少一个单链部分。在正常细胞中，HDR通常涉及一系列步骤，诸如断裂的识别、断裂的稳定化、切除、单链DNA的稳定化、DNA交叉中间体的形成、交叉中间体的分离以及连接。在一些情况下，HDR需要核苷酸序列同源性并使用供体模板(例如，供体DNA模板)或供体寡核苷酸来修复发生双链断裂的序列(例如，DNA靶序列)。这导致遗传信息从例如供体模板DNA转移到DNA靶序列。如果供体模板DNA序列或寡核苷酸序列与DNA靶序列不同并且将供体模板DNA多核苷酸或寡核苷酸的一部分或全部并入DNA靶序列中，则HDR可能导致DNA靶序列的改变(例如，插入、缺失、突变)。在一些实施方案中，将整个供体模板DNA多核苷酸、供体模板DNA多核苷酸的一部分或供体多核苷酸的拷贝整合到DNA靶序列的位点处。
如本文所用，术语“非同源末端接合”或“NHEJ”是指连接介导的修复和/或非模板介导的修复。
本技术的方法可用于改变细胞中的靶多核苷酸序列。本技术设想了出于任何目的改变细胞中的靶多核苷酸序列。在一些实施方案中，改变细胞中的靶多核苷酸序列以产生突变细胞。如本文所用，“突变细胞”是指具有不同于其原始基因型的所得基因型的细胞。在一些情况下，“突变细胞”表现出突变表型，例如当使用CRISPR/Cas系统改变正常功能的基因时。在其他情况下，“突变细胞”表现出野生型表型，例如当CRISPR/Cas系统用于校正突变基因型时。在一些实施方案中，改变细胞中的靶多核苷酸序列以校正或修复遗传突变(例如，以恢复细胞的正常表型)。在一些实施方案中，改变细胞中的靶多核苷酸序列以诱导遗传突变(例如，以破坏基因或基因组元件的功能)。
在一些实施方案中，改变是插入缺失(indel)。如本文所用，“插入缺失”是指由插入、缺失或其组合产生的突变。如本领域技术人员将了解的，基因组序列的编码区中的插入缺失将导致移码突变，除非插入缺失的长度是三的倍数。在一些实施方案中，改变是点突变。如本文所用，“点突变”是指替换核苷酸中的一个的取代。CRISPR/Cas系统可以用于在靶多核苷酸序列中诱导任何长度的插入缺失或点突变。
如本文所用，“敲除”包括以干扰靶多核苷酸序列功能的方式使全部或部分靶多核苷酸序列缺失。例如，可以通过在靶多核苷酸序列的功能结构域(例如，DNA结合结构域)中的靶多核苷酸序列中诱导插入缺失来改变靶多核苷酸序列，从而实现敲除。本领域技术人员将容易理解如何使用CRISPR/Cas系统来基于本文所述的细节敲除靶多核苷酸序列或其部分。
在一些实施方案中，改变导致靶多核苷酸序列或其部分的敲除。使用CRISPR/Cas系统敲除靶多核苷酸序列或其部分可用于多种应用。例如，出于研究目的，敲除细胞中的靶多核苷酸序列可以在体外进行。对于离体目的，敲除细胞中的靶多核苷酸序列可以用于治疗或预防与靶多核苷酸序列的表达相关的病症(例如，通过离体敲除细胞中的突变等位基因并将那些包含所敲除的突变等位基因的细胞引入受试者体内)。对于体内目的，敲除细胞中的靶多核苷酸序列可以用于治疗或预防与靶多核苷酸序列的表达相关的病症(例如，通过敲除已移植到RhD阴性受体患者体内的细胞中的RHD表达)。
本文中的“敲入”意指向宿主细胞中添加遗传功能的过程。这导致敲入的基因产物(例如，RNA或编码的蛋白质)的水平增加。如本领域技术人员将理解的，这可以通过多种方式实现，包括将基因的一个或多个额外拷贝添加到宿主细胞中或改变内源基因的调控组分以增加蛋白质的表达。这可通过修饰启动子、添加不同的启动子、添加增强子或修饰其他基因表达序列来实现。
在一些实施方案中，改变导致相对于未改变或未修饰的野生型细胞减少的靶多核苷酸序列表达。
在细胞的上下文中，“野生型”或“wt”意指任何天然存在的细胞。然而，就低免疫原性T细胞而言，如本文所用，“野生型”还指可包含导致低免疫原性但未经历本技术的基因编辑程序以实现RhD抗原表达减少的低免疫原性T细胞。就iPSC或其子代而言，“野生型”还意指可包含导致多能性的核酸变化但未经历本技术的基因编辑程序以实现低免疫原性和/或RhD抗原表达减少的iPSC或其子代。就原代T细胞或其子代而言，“野生型”还意指可包含导致低免疫原性的核酸变化但未经历本技术的基因编辑程序以实现RhD抗原表达减少的原代T细胞或其子代。在一些实施方案中，“野生型”是指RhD阳性细胞。在一些实施方案中，“野生型”是指可包含导致低免疫原性的核酸变化但未经历所描述的基因编辑程序以实现RhD抗原表达减少的RhD阳性低免疫原性T细胞。在一些实施方案中，“野生型”是指可包含导致多能性的核酸变化但未经历本技术的基因编辑程序以实现低免疫原性和/或RhD抗原表达减少的RhD阳性iPSC细胞或其子代。在一些实施方案中，“野生型”是指可包含导致低免疫原性的核酸变化但未经历所描述的基因编辑程序以实现RhD抗原表达减少的RhD阳性原代T细胞或其子代。
术语“降低(decrease)”、“减少(reduced)”、“减少(reduction)”和降低(decrease)在本文中均一般性地用于意指降低统计上显著的量。然而，为免生疑问，“降低(decrease)”、“减少(reduced)”、“减少(reduction)”、“降低(decrease)”意指与参考水平相比降低至少10％，例如与参考水平相比降低至少约20％，或至少约30％，或至少约40％，或至少约50％，或至少约60％，或至少约70％，或至少约80％，或至少约90％或最多至并包括降低100％(即与参考样品相比不存在的水平)或介于10％-100％之间的任何降低。在一些实施方案中，靶多核苷酸序列的表达减少由编码序列(包括基因组DNA、mRNA等)向多肽或蛋白质的转录和/或翻译的减少造成。在一些实施方案中，编码序列的转录和/或翻译的减少是靶多核苷酸改变的结果，所述改变包括插入缺失、点突变、敲除或敲入。
术语“增加(increased)”、“增加(increase)”或“增强(enhance)”或“活化(activate)”在本文中均用于一般性地意指增加统计上显著的量；为避免任何疑问，术语“增加(increased)”、“增加(increase)”或“增强(enhance)”或“活化(activate)”意指与参考水平相比增加至少10％，例如与参考水平相比增加至少约20％，或至少约30％，或至少约40％，或至少约50％，或至少约60％，或至少约70％，或至少约80％，或至少约90％或最多至并包括增加100％或介于10％-100％之间的任何增加，或者与参考水平相比增加至少约2倍，或至少约3倍，或至少约4倍，或至少约5倍或至少约10倍，或介于2倍与10倍之间的任何增加或更多增加。
如本文所用，术语“外源”旨在意指参考分子或参考多肽被引入感兴趣的细胞中。例如，可以通过将编码核酸引入细胞的遗传物质中来引入多肽，诸如通过整合到染色体中或作为非染色体遗传物质，诸如质粒或表达载体。因此，当用于提及编码核酸的表达时，所述术语是指将编码核酸以可表达的形式引入到细胞中。
术语“内源”是指存在于细胞中的参考分子或多肽。类似地，当用于提及编码核酸的表达时，所述术语是指包含在细胞内并且不是外源引入的编码核酸的表达。
如本文所用的“安全港基因座”是指允许转基因或外源基因安全表达的基因座。示例性的“安全港”基因座包括但不限于CCR5基因、CXCR4基因、PPP1R12C(也称为AAVS1)基因、白蛋白基因、SHS231基因座、CLYBL基因、Rosa基因(例如，ROSA26)、F3基因(也称为CD142)、MICA基因、MICB基因、LRP1基因(也称为CD91)、HMGB1基因、ABO基因、RHD基因、FUT1基因和KDM5D基因(也称为HY)。可以将外源基因插入到B2M、CIITA、TRAC、TRBC、CCR5、F3(即，CD142)、MICA、MICB、LRP1、HMGB1、ABO、RHD、FUT1或KDM5D(即，HY)的CDS区中。可以将外源基因插入到PPP1R12C(即，AAVS1)或CCR5的内含子1或2中。可以将外源基因插入到CCR5的外显子1或2或3中。可以将外源基因插入到CLYBL的内含子2中。可以将外源基因插入到Ch-4:58,976,613(即，SHS231)中的500bp窗口中。可以将外源基因插入到上文提及的允许外源表达的安全港基因座的任何合适区域，包括例如安全港基因座中的内含子、外显子或编码序列区域中。
在两个或更多个核酸或多肽序列的上下文中，术语百分比“同一性”是指两个或更多个序列或子序列在比较和比对以获得最大对应关系时具有相同的核苷酸或氨基酸残基的指定百分比，如使用下述序列比较算法(例如，BLASTP和BLASTN或技术人员可用的其他算法)中的一种或通过目测所测量的。取决于应用，百分比“同一性”可以存在于被比较序列的区域内，例如，存在于功能结构域中，或者，可替代地，存在于要比较的两个序列的全长上。对于序列比较，通常一个序列充当与测试序列进行比较的参考序列。当使用序列比较算法时，将测试序列和参考序列输入计算机中，指定子序列坐标(如果需要的话)，并且指定序列算法程序参数。然后序列比较算法基于指定的程序参数来计算一个或多个测试序列相对于参考序列的百分比序列同一性。
可以例如通过Smith&Waterman,Adv.Appl.Math.2:482(1981)的局部同源算法、通过Needleman&Wunsch,J.Mol.Biol.48:443(1970)的同源比对算法、通过Pearson&Lipman,Proc.Nat’l.Acad.Sci.USA 85:2444(1988)的搜索相似性方法、通过这些算法的计算机实现(Wisconsin Genetics软件包,Genetics Computer Group,575Science Dr.,Madison,Wis.中的GAP、BESTFIT、FASTA和TFASTA)或通过目测(一般参见Ausubel等人，下文)进行序列的最佳比对以实现比较。
适用于确定百分比序列同一性和序列相似性的算法的一个实例是BLAST算法，所述算法描述于Altschul等人,J.Mol.Biol.215:403-410(1990)。用于执行BLAST分析的软件可通过美国国家生物技术信息中心(National Center for Biotechnology Information)公开获得。
术语“供体受试者”是指动物，例如，可以从其获得细胞的人。如本文中可互换使用的“非人动物”和“非人哺乳动物”包括哺乳动物，诸如大鼠、小鼠、兔、羊、猫、狗、牛、猪和非人灵长类动物。术语“供体受试者”还涵盖任何脊椎动物，包括但不限于哺乳动物、爬行动物、两栖动物和鱼类。然而，有利地，供体受试者是哺乳动物，诸如人或其他哺乳动物，诸如家养哺乳动物，例如狗、猫、马等，或生产哺乳动物，例如牛、羊、猪等。
术语“受体患者”是指动物，例如，向其提供使用如本文所述的细胞进行的治疗(包括预防性治疗)的人。对于指定动物(诸如人患者)特有的那些感染、病状或疾病状态的治疗，术语患者是指所述指定动物。术语“受体患者”还涵盖任何脊椎动物，包括但不限于哺乳动物、爬行动物、两栖动物和鱼类。然而，有利地，受体动物是哺乳动物，诸如人，或其他哺乳动物，诸如家养哺乳动物，例如狗、猫、马等，或生产哺乳动物，例如牛、羊、猪等。
应当注意，权利要求可被草拟为排除任何任选要素。因此，本声明旨在作为在引用权利要求要素时使用诸如“唯一”、“仅”等排他性术语或使用“否定”限制的先行基础。如本领域技术人员在阅读本公开后所显而易知的，在不背离本技术的范围或精神的情况下，本文描述和说明的各个实施方案中的每一个都具有易于与其他几个实施方案中的任一个的特征分离或组合的分立组分和特征。任何列举的方法都可按照列举的事件的顺序或按照逻辑上可能的任何其他顺序来进行。虽然与本文所述的那些方法和材料相似或等同的任何方法和材料也可用于实践或测试本技术，但是现在描述代表性的说明性方法和材料。
如本技术中所述，将采用以下术语，并且所述术语如下文所指出的那样进行定义。
在进一步描述本技术之前，应当理解，本技术不限于描述的一些实施方案，因此当然可发生变化。还应当理解，本文所用的术语仅用于描述一些实施方案的目的，并非旨在是限制性的，因为本技术的范围将仅受所附权利要求的限制。
除非另有定义，否则本文使用的所有技术和科学术语具有与本技术所属领域的普通技术人员通常所理解的相同含义。当提供值的范围时，应当理解，除非上下文另有明确规定，否则该范围的上下限与该规定范围中的任何其他规定值或居中值之间的直到下限单位十分之一的每个居中值都涵盖在本技术内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括在较小范围中，并且也涵盖在本技术内，从属于所述范围内的任何明确排除的极限值。在所述范围包括极限值中的一者或两者的情况下，不包括那些被包括的极限值中的一者或两者的范围也包括在本技术中。某些范围在本文中以术语“约”开头的数值呈现。术语“约”在本文中用于为其后面的确切数字以及接近或近似于所述术语后面的数字的数字提供字面支持。在确定数字是接近还是近似具体列举的数字时，接近或近似的未列举的数字可以是在所呈现的上下文中提供与具体列举的数字的实质等效的数字。
本说明书中引用的所有出版物、专利和专利申请都通过引用并入本文，其程度就如同每项单独的出版物、专利或专利申请被具体和单独地指示通过引用并入。此外，每项引用的出版物、专利或专利申请通过引用并入本文以公开和描述与引用的所述出版物相关的主题。对任何出版物的引用是针对其在申请日之前的公开内容，并且不应被解释为承认本文所述的本技术由于现有技术而无权先于所述出版物。此外，提供的公布日期可能与实际公布日期不同，这可能需要独立确认。
III.实施方案的详细描述
A.低免疫原性T细胞
在一些实施方案中，本文公开的本技术涉及由原代T细胞或其子代繁殖或衍生自诱导性多能干细胞(iPSC)或其子代的低免疫原性T细胞和非活化T细胞，其具有减少的RhD抗原和MHCI类和/或MHC II类人白细胞抗原表达或缺乏所述表达，并且过表达CD47。在一些实施方案中，相对于未改变或未修饰的野生型细胞，低免疫原性T细胞和非活化T细胞具有减少的RhD抗原和MHC I类和/或MHC II类人白细胞抗原表达，并且过表达CD47。在一些实施方案中，相对于未改变或未修饰的野生型细胞，低免疫原性T细胞和非活化T细胞具有减少的RhD抗原以及MHC I类和MHC II类人白细胞抗原表达，并且过表达CD47。在一些实施方案中，低免疫原性T细胞和非活化T细胞具有减少的RHD和B2M和/或CIITA表达，并且过表达CD47。在一些实施方案中，低免疫原性T细胞和非活化T细胞具有减少的RHD、B2M和CIITA表达，并且过表达CD47。在一些实施方案中，低免疫原性T细胞和非活化T细胞不表达RhD抗原，不表达MHC I类和/或II类人白细胞抗原，并且过表达CD47。在一些实施方案中，低免疫原性T细胞和非活化T细胞不表达RhD抗原，不表达MHC I类人白细胞抗原、不表达MHC II类人白细胞抗原，并且过表达CD47。在一些实施方案中，低免疫原性T细胞和非活化T细胞不表达RHD，不表达B2M和/或CIITA，并且过表达CD47。在一些实施方案中，低免疫原性T细胞和非活化T细胞不表达RHD，不表达B2M，不表达CIITA，并且过表达CD47。在一些实施方案中，相对于未改变或未修饰的野生型细胞，低免疫原性T细胞和非活化T细胞具有减少的T细胞受体表达。在一些实施方案中，低免疫原性T细胞和非活化T细胞不表达T细胞受体。在一些实施方案中，相对于未改变或未修饰的野生型细胞，低免疫原性T细胞和非活化T细胞具有减少的T细胞受体α恒定区(TRAC)和/或T细胞受体β恒定区(TRBC)表达。在一些实施方案中，低免疫原性T细胞和非活化T细胞不表达T细胞受体α恒定区(TRAC)和/或T细胞受体β恒定区(TRBC)。在一些实施方案中，低免疫原性T细胞和非活化T细胞包含编码一种或多种嵌合抗原受体(CAR)的第二外源多核苷酸。在一些实施方案中，一种或多种CAR包含与选自由CD19、CD20、CD22和BCMA或其组合组成的组的任一者结合的抗原结合结构域。在一些实施方案中，一种或多种CAR包含CD19特异性CAR，使得细胞是“CD19 CAR T细胞”。在一些实施方案中，一种或多种CAR包含CD22特异性CAR，使得细胞是“CD22 CAR T细胞”。
在一些实施方案中，低免疫原性T细胞和非活化T细胞过表达CD47和一种或多种嵌合抗原受体(CAR)，并且包括RHD和B2M基因的基因组修饰。在一些实施方案中，低免疫原性T细胞和非活化T细胞过表达CD47，并且包括RHD和CIITA基因的基因组修饰。在一些实施方案中，低免疫原性T细胞和非活化T细胞过表达CD47和一种或多种CAR，并且包括RHD和TRAC基因的基因组修饰。在一些实施方案中，低免疫原性T细胞和非活化T细胞过表达CD47和一种或多种CAR，并且包括RHD和TRB基因的基因组修饰。在一些实施方案中，低免疫原性T细胞和非活化T细胞过表达CD47和一种或多种CAR，包括RHD基因的基因组修饰，并且包括选自由B2M、CIITA、TRAC和TRB基因组成的组的一种或多种基因组修饰。在一些实施方案中，低免疫原性T细胞和非活化T细胞过表达CD47和一种或多种CAR，并且包括RHD、B2M、CIITA、TRAC和TRB基因的基因组修饰。在一些实施方案中，细胞是也表达CAR的RHD-/-、B2M-/-、CIITA-/-、TRAC-/-、CD47tg细胞。在一些实施方案中，低免疫原性T细胞和非活化T细胞是也表达CAR的RHD-/-、B2M-/-、CIITA-/-、TRB-/-、CD47tg细胞。在一些实施方案中，细胞是也表达CAR的B2M-/-、CIITA-/-、TRAC-/-、TRB-/-、CD47tg细胞。在一些实施方案中，细胞是也表达CAR的RHD插入缺失/插入缺失、B2M插入缺失/插入缺失、CIITA插入缺失/插入缺失、TRAC插入缺失/插入缺失、CD47tg细胞。在一些实施方案中，细胞是也表达CAR的RHD插入缺失/插入缺失、B2M插入缺失/插入缺失、CIITA插入缺失/插入缺失、TRB插入缺失/插入缺失、CD47tg细胞。在一些实施方案中，细胞是也表达CAR的RHD插入缺失/插入缺失、B2M插入缺失/插入缺失、CIITA插入缺失/插入缺失、TRAC插入缺失/插入缺失、TRB插入缺失/插入缺失、CD47tg细胞。
在一些实施方案中，低免疫原性T细胞和非活化T细胞是通过诱导性多能干细胞诸如低免疫原性诱导性多能干细胞的分化产生的。
在一些实施方案中，所描述的工程化或修饰的细胞是多能干细胞、诱导性多能干细胞、从此类多能干细胞和诱导性多能干细胞分化的T细胞，或原代T细胞。γδ原代T细胞的非限制性实例包括CD3+T细胞、CD4+T细胞、CD8+T细胞、初始T细胞、调控性T(Treg)细胞、非调控性T细胞、Th1细胞、Th2细胞、Th9细胞、Th17细胞、T滤泡辅助(Tfh)细胞、细胞毒性T淋巴细胞(CTL)、效应T(Teff)细胞、中央记忆T(Tcm)细胞、效应记忆T(Tem)细胞、表达CD45RA的效应记忆T细胞(TEMRA细胞)、组织驻留记忆(Trm)细胞、虚拟记忆T细胞、先天记忆T细胞、记忆干细胞(Tsc)、T细胞以及T细胞的任何其他亚型。在一些实施方案中，原代T细胞选自包括细胞毒性T细胞、辅助T细胞、记忆T细胞、调控性T细胞、肿瘤浸润淋巴细胞以及其组合的组。
在一些实施方案中，原代T细胞来自一个或多个供体受试者的原代T细胞库，所述供体受试者不同于受体患者(例如，被施用细胞的患者)。原代T细胞可获自1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、50、100个或更多个供体受试者并汇集在一起。原代T细胞可获自1个或多个、2个或更多个、3个或更多个、4个或更多个、5个或更多个、6个或更多个、7个或更多个、8个或更多个、9个或更多个、10个或更多个、20个或更多个、50个或更多个或100个或更多个供体受试者并且汇集在一起。在一些实施方案中，从一个或多个个体收获原代T细胞，并且在一些情况下，原代T细胞或原代T细胞库在体外培养。在一些实施方案中，原代T细胞或原代T细胞库被工程化以外源表达CD47，并且在体外培养。
在一些实施方案中，低免疫原性T细胞和非活化T细胞由原代T细胞库或其子代繁殖，其中原代T细胞库分离自一个或多个与受体患者不同的供体受试者，其中一个或多个供体受试者任选地包括一个或多个RhD阳性受试者、一个或多个RhD阴性受试者，或RhD阳性受试者和RhD阴性受试者的混合群体。
在一些实施方案中，低免疫原性T细胞和非活化T细胞衍生自iPSC库或其子代，其中iPSC库衍生自分离自一个或多个与受体患者不同的供体受试者的宿主细胞，其中一个或多个供体受试者任选地包括一个或多个RhD阳性受试者、一个或多个RhD阴性受试者，或RhD阳性受试者和RhD阴性受试者的混合群体。
本公开的示例性原代T细胞选自由以下组成的组：细胞毒性T细胞、辅助T细胞、记忆T细胞、调控性T细胞、组织浸润淋巴细胞以及其组合。在一些实施方案中，原代T细胞是修饰的原代T细胞。在一些情况下，修饰的T细胞包含引起细胞表达至少一种嵌合抗原受体的修饰，所述嵌合抗原受体与在以下细胞中的至少一种的表面上表达的感兴趣的抗原或表位特异性结合：损伤细胞、发育异常细胞、感染细胞、免疫原性细胞、发炎细胞、恶性细胞、化生细胞、突变细胞以及其组合。在其他情况下，修饰的T细胞包含引起细胞表达至少一种蛋白质的修饰，当细胞接近相邻细胞、组织或器官时，所述蛋白质在相邻细胞、组织或器官中调节感兴趣的生物学效应。对原代T细胞的有用修饰在US2016/0348073和WO2020/018620中详细描述，其公开内容整体并入本文。所提供的方法可用于灭活或消除细胞(诸如但不限于多能干细胞和原代T细胞)中的MHC I类表达和/或MHC II类表达。在一些实施方案中，利用罕见切割核酸内切酶(例如，CRISPR/Cas、TALEN、锌指核酸酶、大范围核酸酶和归巢核酸内切酶系统)的基因组编辑技术也用于减少或消除细胞中的关键免疫基因表达(例如，通过使关键免疫基因的基因组DNA缺失)。在某些实施方案中，基因组编辑技术或其他基因调节技术用于在人细胞中插入耐受诱导因子，使得它们和由其制备的分化细胞是低免疫原性T细胞。因此，低免疫原性T细胞具有减少或消除的MHC I表达和MHC II表达。在一些实施方案中，细胞在受体受试者中是非免疫原性的(例如，不诱导免疫反应)。
基因组编辑技术能够在期望的基因座位点处实现双链DNA断裂。这些受控的双链断裂促进特定基因座位点处的同源重组。所述过程集中于用识别和结合序列并诱导核酸分子内的双链断裂的核酸内切酶来靶向核酸分子的特定序列，诸如染色体。通过易错的非同源末端接合(NHEJ)或通过同源重组(HR)来修复双链断裂。
除非有明确相反的指示，否则一些实施方案的实践将采用化学、生物化学、有机化学、分子生物学、微生物学、重组DNA技术、遗传学、免疫学和细胞生物学的常规方法，所述方法在本领域的技术范围内，其中的许多方法出于说明目的在下文描述。此类技术在文献中充分解释。参见例如Sambrook等人,Molecular Cloning:ALaboratory Manual(第3版,2001)；Sambrook等人,Molecular Cloning:A Laboratory Manual(第2版,1989)；Maniatis等人,Molecular Cloning:A Laboratory Manual(1982)；Ausubel等人,CurrentProtocols in Molecular Biology(John Wiley and Sons,2008年7月更新)；ShortProtocols in Molecular Biology:A Compendium of Methods from Current Protocolsin Molecular Biology,Greene Pub.Associates and Wiley-Interscience；Glover,DNACloning:A Practical Approach,第I卷和第II卷(IRL Press,Oxford,1985)；Anand,Techniques for the Analysis of Complex Genomes,(Academic Press,New York,1992)；Transcription and Translation(B.Hames&S.Higgins编辑,1984)；Perbal,APractical Guide to Molecular Cloning(1984)；Harlow和Lane,Antibodies,(ColdSpring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.,1998)Current Protocolsin Immunology Q.E.Coligan、A.M.Kruisbeek、D.H.Margulies、E.M.Shevach和W.Strober编辑,1991)；Annual Review of Immunology；以及诸如Advances in Immunology的期刊上的专题论文。
本文提供了包含一种或多种靶向多核苷酸序列的调控RHD、MHC I和/或MHC II表达的修饰的细胞。在一些实施方案中，细胞包含增加的CD47表达。在一些实施方案中，细胞包含外源或重组CD47多肽。在一些实施方案中，细胞还包括增加选自由以下组成的组的一者的表达的修饰：CD200、HLA-G、HLA-E、HLA-C、HLA-E重链、PD-L1、IDO1、CTLA4-Ig、IL-10、IL-35、FasL、Serpinb9、CCL21和Mfge8。在一些实施方案中，细胞还包含致耐受因子(例如，免疫调节分子)，所述致耐受因子选自由以下组成的组：DUX4、CD200、HLA-G、HLA-E、HLA-C、HLA-E重链、PD-L1、IDO1、CTLA4-Ig、IL-10、IL-35、FasL、Serpinb9、CCL21和Mfge8。
在一些实施方案中，细胞包含一种或多种靶向多核苷酸序列的调控RHD基因表达的基因组修饰。在一些实施方案中，基因编辑系统用于修饰一个或多个靶向多核苷酸序列。在一些实施方案中，靶向多核苷酸序列是RHD基因。在某些实施方案中，细胞的基因组已被改变而减少或缺失RHD基因表达的关键组分。
在许多实施方案中，原代T细胞或原代T细胞库被工程化为表达一种或多种嵌合抗原受体(CAR)。CAR可以是本领域技术人员已知的任一种。可用的CAR包括与选自包括CD19、CD20、CD22、CD38、CD123、CD138和BCMA的组的抗原结合的那些。在一些情况下，CAR与FDA批准的CAR-T细胞疗法中使用的那些CAR(诸如但不限于tisagenlecleucel和axicabtageneciloleucel中使用的那些)或正在临床试验中研究的其他CAR相同或等效。
在一些实施方案中，低免疫原性T细胞和非活化T细胞包含RHD基因的基因修饰。在一些实施方案中，基因修饰影响RHD基因的一个等位基因。在一些实施方案中，基因修饰影响RHD基因的两个等位基因。在一些实施方案中，基因修饰是RHD基因的插入、缺失或破坏。在一些实施方案中，基因修饰是RHD基因的纯合修饰。在一些实施方案中，基因修饰是RHD基因的杂合修饰。在一些实施方案中，通过靶向RHD基因座(例如，敲除RHD的表达)或通过靶向RHD表达的转录调控因子来干扰RHD表达。在一些实施方案中，RHD是细胞的“敲除”。具有敲除的RHD基因的细胞可表现出减少或消除的敲除基因表达。
使用罕见切割核酸内切酶(例如但不限于Cas9或Cas12a)的基因编辑用于靶向破坏编码组织相容性决定子的一种或多种基因，诸如但不限于RHD基因。
在一些情况下，RHD基因的靶向破坏靶向其编码外显子中的任一个。在一些实施方案中，基因的整个编码序列或其大部分被破坏或切除。在一些实施方案中，将通过CRISPR/Cas编辑实现的插入-缺失(插入缺失)引入细胞中以破坏RHD基因。
在一些实施方案中，使用RNA指导的DNA核酸酶靶向RHD基因的编码序列以引入RHD基因的有害变异并破坏RHD功能。在其他实施方案中，靶向RHD基因的非翻译区、内含子序列和/或外显子序列。
在一些实施方案中，RHD基因的有害变异包括插入缺失。在一些实施方案中，RHD基因的有害变异包括缺失。在一些实施方案中，RHD基因的有害变异包括插入。在一些实施方案中，RHD基因的有害变异包括移码突变。在一些实施方案中，RHD基因的有害变异包括取代。在一些实施方案中，RHD基因的有害变异包括点突变。在一些实施方案中，RHD基因的有害变异减少基因的表达。在一些实施方案中，RHD基因的有害变异包括功能丧失突变。
在一些实施方案中，低免疫原性T细胞和非活化T细胞是组织相容性细胞。在一些实施方案中，使用补体介导的细胞杀伤测定确定细胞的组织相容性。这种测定的非限制性实例是XCelligence SP平台(ACEA BioSciences)。
在一些实施方案中，细胞包括一个或多个靶向多核苷酸序列的调节MHC I和/或MHC II表达的基因组修饰。在一些实施方案中，基因编辑系统用于修饰一个或多个靶向多核苷酸序列。在一些实施方案中，靶向多核苷酸序列是选自由B2M和CIITA组成的组的一个或多个。在一些情况下，靶向多核苷酸序列是NLRC5。在某些实施方案中，细胞的基因组已被改变以减少或缺失HLA表达的关键组分。
减少MHC I和/或MHC II表达可以例如通过以下方式中的一种或多种来实现：(1)直接靶向多态HLA等位基因(HLA-A、HLA-B、HLA-C)和MHC-II基因；(2)去除B2M，这将阻止所有MHC-I分子的表面运输；以及/或者(3)缺失对HLA表达至关重要的MHC增强体组分，诸如LRC5、RFX-5、RFXANK、RFXAP、IRFl、NF-Y(包括NFY-A、NFY-B、NFY-C)和CIITA。
在某些实施方案中，HLA表达受到干扰。在一些实施方案中，通过靶向各个HLA(例如，敲除HLA-A、HLA-B和/或HLA-C的表达)、靶向HLA表达的转录调控因子(例如，敲除NLRC5、CIITA、RFX5、RFXAP、RFXANK、NFY-A、NFY-B、NFY-C和/或IRF-1的表达)、阻断MHC I类分子的表面运输(例如，敲除B2M和/或TAP1的表达)和/或用HLA-Razor靶向(参见例如WO2016183041)来干扰HLA表达。
在一些实施方案中，本文公开的细胞不表达与MHC-I和/或MHC-II相对应的一种或多种人白细胞抗原(例如，HLA-A、HLA-B和/或HLA-C)，并且因此被表征为低免疫原性。例如，在一些实施方案中，本文公开的细胞已被修饰，使得细胞或由其制备的分化细胞不表达以下MHC-I分子中的一种或多种或者表现出减少的以下MHC-I分子中的一种或多种的表达：HLA-A、HLA-B和HLA-C。在一些实施方案中，可将HLA-A、HLA-B和HLA-C中的一种或多种从细胞中“敲除”。具有敲除HLA-A基因、HLA-B基因和/或HLA-C基因的细胞可表现出每种敲除基因的表达的减少或消除。
在某些实施方案中，允许通过靶向HLA基因中的保守区域来同时缺失所有MHC I类等位基因的gRNA被鉴定为HLA Razor。在一些实施方案中，gRNA是CRISPR系统的一部分。在一些实施方案中，gRNA是TALEN系统的一部分。在一些实施方案中，靶向HLA中的经鉴定的保守区域的HLA Razor在WO2016183041中描述。在一些实施方案中，利用多个靶向经鉴定的保守区域的HLA Razor。一般认为，任何靶向HLA中的保守区域的指导物都可以充当HLARazor。
在一些实施方案中，本公开提供了一种细胞或其群体，其包含基因组，所述基因组中的基因已被编辑以缺失基因组DNA的连续链段，从而减少或消除MHC I类分子在细胞或其群体中的表面表达。在一些实施方案中，本公开提供了一种细胞或其群体，其包含基因组，所述基因组中的基因已被编辑以缺失基因组DNA的连续链段，从而减少或消除MHC II类分子在细胞或其群体中的表面表达。在一些实施方案中，本公开提供了一种细胞或其群体，其包含基因组，所述基因组中的一种或多种基因已被编辑以缺失基因组DNA的连续链段，从而减少或消除MHC I类和II类分子在细胞或其群体中的表面表达。
在某些实施方案中，MHC I或MHC II的表达通过靶向和缺失基因组DNA的连续链段来调节，从而减少或消除选自由B2M和CIITA组成的组的靶基因的表达。在其他情况下，靶基因是NLRC5。
在一些实施方案中，本文所述的细胞和方法包括基因组编辑人细胞以裂解CIITA基因序列以及编辑此类细胞的基因组以改变一种或多种另外的靶多核苷酸序列，诸如但不限于B2M和NLRC5。在一些实施方案中，本文所述的细胞和方法包括基因组编辑人细胞以裂解B2M基因序列以及编辑此类细胞的基因组以改变一种或多种另外的靶多核苷酸序列，诸如但不限于CIITA和NLRC5。在一些实施方案中，本文所述的细胞和方法包括基因组编辑人细胞以裂解NLRC5基因序列以及编辑此类细胞的基因组以改变一种或多种另外的靶多核苷酸序列，诸如但不限于B2M和CIITA。
B.药物组合物
本文提供了药物组合物，其包含本文所述的一种或多种低免疫原性T细胞或非活化T细胞，以及药学上可接受的添加剂、载剂、稀释剂或赋形剂。在一些实施方案中，组合物包含选自由低免疫原性T细胞群、非活化T细胞群、低免疫原性CD19 CAR T细胞群和低免疫原性CD22 CAR T细胞群、CD19/CD22 CAR T细胞群组成的组的一种或多种细胞群，以及药学上可接受的添加剂、载剂、稀释剂或赋形剂。在一些实施方案中，组合物包含一种或多种低免疫原性T细胞群，以及药学上可接受的添加剂、载剂、稀释剂或赋形剂。在一些实施方案中，组合物包含一种或多种非活化T细胞群，以及药学上可接受的添加剂、载剂、稀释剂或赋形剂。在一些实施方案中，组合物包含一种或多种低免疫原性CD19 CAR T细胞群，以及药学上可接受的添加剂、载剂、稀释剂或赋形剂。在一些实施方案中，组合物包含一种或多种低免疫原性CD22 CAR T细胞群，以及药学上可接受的添加剂、载剂、稀释剂或赋形剂。在一些实施方案中，组合物包含一种或多种低免疫原性CD19 CAR T细胞群和一种或多种低免疫原性CD22CAR T细胞群，以及药学上可接受的添加剂、载剂、稀释剂或赋形剂。在一些实施方案中，组合物包含一种或多种CD19/CD22 CAR T细胞群，以及药学上可接受的添加剂、载剂、稀释剂或赋形剂，其中CD19/CD22 CAR T细胞包含CD19 CAR和CD22 CAR。在一些实施方案中，组合物包含一种或多种CD19/CD22 CAR T细胞群，以及药学上可接受的添加剂、载剂、稀释剂或赋形剂，其中CD19/CD22 CAR T细胞包含CD19 CAR和CD22 CAR，其中CD19 CAR和CD22CAR由单一双顺反子多核苷酸编码。在一些实施方案中，组合物包含一种或多种CD19/CD22CAR T细胞群，以及药学上可接受的添加剂、载剂、稀释剂或赋形剂，其中CD19/CD22 CAR T细胞包含CD19 CAR和CD22 CAR，其中CD19 CAR和CD22 CAR由两种单独的多核苷酸编码。在一些实施方案中，组合物包含一种或多种CD19/CD22 CAR T细胞群，以及药学上可接受的添加剂、载剂、稀释剂或赋形剂，其中CD19/CD22 CAR T细胞包含CD19/CD22双特异性CAR。在一些实施方案中，组合物包含一种或多种CD19/CD22 CAR T细胞群，以及药学上可接受的添加剂、载剂、稀释剂或赋形剂，其中CD19/CD22CAR T细胞包含CD19/CD22二价CAR。
在一些实施方案中，本文提供的药物组合物还包含药学上可接受的载剂。可接受的载剂、赋形剂或稳定剂在采用的剂量和浓度下对受体是无毒的，并且包括缓冲剂诸如磷酸盐、柠檬酸盐和其他有机酸；抗氧化剂，包括抗坏血酸和甲硫氨酸；防腐剂(诸如十八烷基二甲基苄基氯化铵；氯化六甲双铵；苯扎氯铵；苄索氯铵；苯酚、丁基或苄基醇；对羟基苯甲酸烷基酯诸如对羟基苯甲酸甲酯或对羟基苯甲酸丙酯；儿茶酚；间苯二酚；环己醇；3-戊醇；以及间甲酚)；低分子量(小于约10个残基)的多肽；蛋白质，诸如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水性聚合物诸如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸诸如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、组氨酸、精氨酸或赖氨酸；单糖、二糖以及其他碳水化合物(包括葡萄糖、甘露糖或糊精)；螯合剂诸如EDTA；糖类诸如蔗糖、甘露醇、海藻糖或山梨醇；成盐抗衡离子诸如钠；金属络合物(例如Zn-蛋白质络合物)；和/或非离子型表面活性剂诸如TWEENTM、PLURONICSTM或聚乙二醇(PEG)。在一些实施方案中，药物组合物包含药学上可接受的缓冲剂(例如，中性缓冲盐水或磷酸盐缓冲盐水)。
C.衍生自T细胞的治疗性细胞
本文提供了逃避免疫识别的低免疫原性T细胞和非活化T细胞。在一些实施方案中，低免疫原性T细胞和非活化T细胞由T细胞(诸如原代T细胞)产生(例如，生成、培养、繁殖或衍生)。在一些情况下，从受试者或个体获得(例如，收获、提取、移除或取得)原代T细胞。在一些实施方案中，由T细胞库产生原代T细胞，使得T细胞来自一个或多个受试者(例如，一个或多个人，包括一个或多个健康的人)。在一些实施方案中，T细胞库来自1-100个、1-50个、1-20个、1-10个、1个或多个、2个或更多个、3个或更多个、4个或更多个、5个或更多个、10个或更多个、20个或更多个、30个或更多个、40个或更多个、50个或更多个或100个或更多个受试者。在一些实施方案中，供体受试者与患者(例如，被施用治疗性细胞的受体)不同。在一些实施方案中，T细胞库不包括来自患者的细胞。在一些实施方案中，从中获得T细胞库的一个或多个供体受试者与患者不同。在一些实施方案中，原代T细胞来自一个或多个供体受试者的原代T细胞库，所述供体受试者不同于受体受试者(例如，被施用细胞的患者)。原代T细胞可获自1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、50、100个或更多个供体受试者并汇集在一起。原代T细胞可获自1个或多个、2个或更多个、3个或更多个、4个或更多个、5个或更多个、6个或更多个、7个或更多个、8个或更多个、9个或更多个、10个或更多个、20个或更多个、50个或更多个或100个或更多个供体受试者并且汇集在一起。在一些实施方案中，从一个或多个个体收获原代T细胞，并且在一些情况下，原代T细胞或原代T细胞库在体外培养。在一些实施方案中，原代T细胞从一个或多个供体受试者中收获，其中一个或多个供体受试者任选地包括一个或多个RhD阳性受试者、一个或多个RhD阴性受试者，或RhD阳性受试者和RhD阴性受试者的混合群体。在一些实施方案中，原代T细胞或原代T细胞库被工程化以外源表达CD47，并且在体外培养。
在一些实施方案中，原代T细胞包括但不限于CD3+T细胞、CD4+T细胞、CD8+T细胞、初始T细胞、调控性T(Treg)细胞、非调控性T细胞、Th1细胞、Th2细胞、Th9细胞、Th17细胞、T滤泡辅助(Tfh)细胞、细胞毒性T淋巴细胞(CTL)、效应T(Teff)细胞、中央记忆T(Tcm)细胞、效应记忆T(Tem)细胞、表达CD45RA的效应记忆T细胞(TEMRA细胞)、组织驻留记忆(Trm)细胞、虚拟记忆T细胞、先天记忆T细胞、记忆干细胞(Tsc)、γδT细胞以及T细胞的任何其他亚型。
在一些实施方案中，原代T细胞和从这种原代T细胞繁殖、衍生或分化的任何细胞被修饰以表现出减少的RhD抗原表达。在一些实施方案中，原代T细胞和从这种原代T细胞分化的任何细胞被修饰以表现出减少的MHC I类人白细胞抗原表达。在其他实施方案中，原代T细胞和从这种多能干细胞分化的任何细胞被修饰以表现出减少的MHC II类人白细胞抗原表达。在一些实施方案中，原代T细胞和从这种多能干细胞分化的任何细胞被修饰以表现出减少的RhD抗原和MHC I类和II类人白细胞抗原表达。在一些实施方案中，原代T细胞和从这种多能干细胞分化的任何细胞被修饰以表现出减少的RhD抗原和MHC I类和/或II类人白细胞抗原表达并且表现出增加的CD47表达。在一些情况下，细胞通过携带一种或多种CD47转基因而过表达CD47。
在一些实施方案中，当施用于患者(例如，受体受试者)时，本文所述的方法中使用的细胞逃避免疫识别和反应。所述细胞可以在体外和体内逃避被免疫细胞杀伤。在一些实施方案中，细胞逃避被巨噬细胞和NK细胞杀伤。在一些实施方案中，细胞被免疫细胞或受试者的免疫系统忽略。换句话说，根据本文所述的方法施用的细胞不可被免疫系统的免疫细胞检测到。在一些实施方案中，细胞被遮蔽并因此避免免疫排斥。
确定低免疫原性T细胞或非活化T细胞是否逃避免疫识别的方法包括但不限于IFN-γElispot测定、小胶质细胞杀伤测定、细胞植入动物模型、细胞因子释放测定、ELISA、使用生物发光成像或铬释放测定或Xcelligence分析进行的杀伤测定、混合淋巴细胞反应、免疫荧光分析等。
本文概述的治疗性细胞可用于治疗病症，诸如但不限于癌症、遗传病症、慢性感染性疾病、自身免疫性病症、神经病症等。
D.衍生自多能干细胞的治疗性细胞
本文提供了逃避免疫识别的低免疫原性T细胞和非活化T细胞。在一些实施方案中，低免疫原性T细胞和非活化T细胞由低免疫诱导性多能干细胞产生(例如，生成、培养、繁殖或衍生)。
在一些实施方案中，诱导性多能干细胞由宿主细胞库产生，使得宿主细胞来自一个或多个受试者(例如，一个或多个人，包括一个或多个健康的人)。在一些实施方案中，宿主细胞库来自1-100个、1-50个、1-20个、1-10个、1个或多个、2个或更多个、3个或更多个、4个或更多个、5个或更多个、10个或更多个、20个或更多个、30个或更多个、40个或更多个、50个或更多个或100个或更多个受试者。在一些实施方案中，供体受试者与患者(例如，被施用治疗性细胞的受体)不同。在一些实施方案中，宿主细胞库不包括来自患者的细胞。在一些实施方案中，从中获得宿主细胞库的一个或多个供体受试者与患者不同。在一些实施方案中，诱导性多能干细胞由来自一个或多个供体受试者的原代宿主细胞库产生，所述供体受试者不同于受体受试者(例如，被施用细胞的患者)。宿主细胞库可以获自1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、50、100个或更多个供体受试者并汇集在一起。宿主细胞库可获自1个或多个、2个或更多个、3个或更多个、4个或更多个、5个或更多个、6个或更多个、7个或更多个、8个或更多个、9个或更多个、10个或更多个、20个或更多个、50个或更多个或100个或更多个供体受试者并且汇集在一起。在一些实施方案中，宿主细胞库来自一个或多个个体。在一些实施方案中，宿主细胞从一个或多个供体受试者中收获，其中一个或多个供体受试者任选地包括一个或多个RhD阳性受试者、一个或多个RhD阴性受试者，或RhD阳性受试者和RhD阴性受试者的混合群体。在一些实施方案中，诱导性多能干细胞被工程化以外源表达CD47，并且在体外培养。
在一些实施方案中，多能干细胞和从这种多能干细胞分化的任何细胞被修饰以表现出减少的RhD抗原表达。在一些实施方案中，多能干细胞和从这种多能干细胞分化的任何细胞被修饰以表现出减少的MHC I类人白细胞抗原表达。在其他实施方案中，多能干细胞和从这种多能干细胞分化的任何细胞被修饰以表现出减少的MHC II类人白细胞抗原表达。在一些实施方案中，多能干细胞和从这种多能干细胞分化的任何细胞被修饰以表现出减少的RhD抗原和MHC I类和II类人白细胞抗原表达。在一些实施方案中，多能干细胞和从这种多能干细胞分化的任何细胞被修饰以表现出减少的RhD抗原以及MHC I类和/或II类人白细胞抗原表达并且表现出增加的CD47表达。在一些情况下，细胞通过携带一种或多种CD47转基因而过表达CD47。
在一些实施方案中，当施用于患者(例如，受体受试者)时，本文所述的方法中使用的细胞逃避免疫识别和反应。所述细胞可以在体外和体内逃避被免疫细胞杀伤。在一些实施方案中，细胞逃避被巨噬细胞和NK细胞杀伤。在一些实施方案中，细胞被免疫细胞或受试者的免疫系统忽略。换句话说，根据本文所述的方法施用的细胞不可被免疫系统的免疫细胞检测到。在一些实施方案中，细胞被遮蔽并因此避免免疫排斥。
确定多能干细胞和从这种多能干细胞分化的任何细胞是否逃避免疫识别的方法包括但不限于IFN-γElispot测定、小胶质细胞杀伤测定、细胞植入动物模型、细胞因子释放测定、ELISA、使用生物发光成像或铬释放测定或Xcelligence分析进行的杀伤测定、混合淋巴细胞反应、免疫荧光分析等。
本文概述的治疗性细胞可用于治疗病症，诸如但不限于癌症、遗传病症、慢性感染性疾病、自身免疫性病症、神经病症等。
E.CD47
在一些实施方案中，本技术提供了一种细胞或其群体，其已经被修饰以表达致耐受因子(例如，免疫调节多肽)CD47。在一些实施方案中，本公开提供了一种用于改变细胞基因组以表达CD47的方法。在一些实施方案中，干细胞表达外源CD47。在一些情况下，细胞表达表达载体，所述表达载体包含编码人CD47多肽的核苷酸序列。在一些情况下，细胞表达编码人CD47多肽的核苷酸序列，使得将核苷酸序列插入到安全港基因座的至少一个等位基因中。在一些情况下，细胞表达编码人CD47多肽的核苷酸序列，使得将核苷酸序列插入到RHD基因座的至少一个等位基因中。在一些情况下，细胞表达编码人CD47多肽的核苷酸序列，使得将核苷酸序列插入到AAVS1基因座的至少一个等位基因中。在一些情况下，细胞表达编码人CD47多肽的核苷酸序列，使得将核苷酸序列插入到CCR5基因座的至少一个等位基因中。在一些情况下，细胞表达编码人CD47多肽的核苷酸序列，使得将核苷酸序列插入到安全港基因座的至少一个等位基因中，所述安全港基因座诸如但不限于CCR5基因座、CXCR4基因座、PPP1R12C基因座、白蛋白基因座、SHS231基因座、CLYBL基因座、Rosa基因座、F3(CD142)基因座、MICA基因座、MICB基因座、LRP1(CD91)基因座、HMGB1基因座、ABO基因座、RHD基因座、FUT1基因座和KDM5D基因座。在一些情况下，细胞表达编码人CD47多肽的核苷酸序列，使得将核苷酸序列插入到TRAC基因座的至少一个等位基因中。
CD47是一种白细胞表面抗原，并且在细胞粘附和整联蛋白调节中发挥作用。它在细胞表面上表达，并且向循环巨噬细胞发出不要吞噬细胞的信号。
在一些实施方案中，本文概述的细胞包含编码与NCBI参考序列号NP_001768.1和NP_942088.1中列出的氨基酸序列具有至少95％序列同一性(例如，95％、96％、97％、98％、99％或更多)的CD47多肽的核苷酸序列。在一些实施方案中，本文概述的细胞包含编码具有NCBI参考序列号NP_001768.1和NP_942088.1中列出的氨基酸序列的CD47多肽的核苷酸序列。在一些实施方案中，细胞包含与NCBI参考号NM_001777.3和NM_198793.2中列出的序列具有至少85％序列同一性(例如，85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多)的CD47核苷酸序列。在一些实施方案中，细胞包含NCBI参考序列号NM_001777.3和NM_198793.2中列出的CD47核苷酸序列。
在一些实施方案中，细胞包含与NCBI参考序列号NP_001768.1和NP_942088.1中列出的氨基酸序列具有至少95％序列同一性(例如，95％、96％、97％、98％、99％或更多)的CD47多肽。在一些实施方案中，本文概述的细胞包含具有NCBI参考序列号NP_001768.1和NP_942088.1中列出的氨基酸序列的CD47多肽。
在一些实施方案中，使用合适的基因编辑系统(例如，CRISPR/Cas系统或本文所述的任何基因编辑系统)来促进将编码CD47的多核苷酸插入到低免疫原性T细胞的基因组基因座中。在一些情况下，将编码CD47的多核苷酸插入到安全港基因座中，所述安全港基因座诸如但不限于AAVS1、CCR5、CLYBL、ROSA26、SHS231、F3(CD142)、MICA、MICB、LRP1(CD91)、HMGB1、ABO、RHD、FUT1或KDM5D基因座。在一些实施方案中，将编码CD47的多核苷酸插入到B2M基因座、CIITA基因座、TRAC基因座或TRB基因座中。在一些实施方案中，将编码CD47的多核苷酸插入到本文提供的表5中描绘的基因座中的任一个中。在某些实施方案中，编码CD47的多核苷酸可操作地连接至启动子。
在另一个实施方案中，使用细胞裂解物的蛋白质印迹来检测CD47蛋白表达，所述裂解物用针对CD47蛋白的抗体进行探测。在另一个实施方案中，逆转录酶聚合酶链式反应(RT-PCR)用于确认外源CD47 mRNA的存在。
F.RHD
在某些实施方案中，本文公开的本技术通过靶向和调节(例如，减少或消除)RHD基因的表达来调节(例如，减少或消除)RhD抗原的表达。在一些实施方案中，使用CRISPR/Cas系统进行调节。在一些实施方案中，细胞在受体受试者中具有降低的诱导免疫反应的能力。
在一些实施方案中，本技术的靶多核苷酸序列是RHD基因的变体。在一些实施方案中，靶多核苷酸序列是RHD基因的同源物。在一些实施方案中，靶多核苷酸序列是RHD基因的直系同源物。
在一些实施方案中，本文所述的细胞在编码RhD抗原蛋白的基因座处包含基因修饰。换句话说，细胞在RHD基因座处包含遗传修饰。在一些情况下，编码RhD抗原蛋白的核苷酸序列在参考序列号NM_001127691.2、NM_001282868.1、NM_001282869.1、NM_001282871.1或NM_016124.4，或在Genbank编号L08429中列出。在一些情况下，RHD基因座描述于NCBI基因ID编号6007中。在某些情况下，RhD抗原蛋白的氨基酸序列被描绘为NCBI GenBank编号AAA02679.1。RhD蛋白和基因座的另外描述可见于Uniprot编号Q02161、HGNC参考号10009和OMIM参考号111680。
在一些实施方案中，本文概述的低免疫原性T细胞和非活化T细胞包含靶向RHD基因的遗传修饰。在一些实施方案中，通过使用基因编辑工具(诸如但不限于CRISPR/Cas、TALE-核酸酶、锌指核酸酶、其他基于病毒的基因编辑系统或RNA干扰)对RHD基因进行基因编辑来产生靶向RHD基因的遗传修饰。在一些实施方案中，基因编辑靶向RHD基因的编码序列。在一些情况下，细胞不产生功能性RHD基因产物。在不存在RHD基因产物的情况下，细胞完全缺乏Rh血型抗原。
在一些实施方案中，Cas9或Cas12a编辑系统用于靶向RHD基因的序列以将插入或缺失引入基因中来破坏其功能，并且在一些情况下使其失活。在一些实施方案中，使用单一指导RNA。在一些实施方案中，使用双指导RNA。在一些实施方案中，使用表1A-1D的gRNA靶序列中的任一个。在一些情况下，使用表1A-1D的多于一个gRNA靶序列进行基因编辑。在一些实施方案中，Cas9编辑系统包括Cas9蛋白或其片段、tracrRNA和crRNA。在一些实施方案中，Cas12a编辑系统包括Cas12a蛋白或其片段和crRNA。
在一些实施方案中，在基因的任何编码序列中引入移码插入-缺失。在一些实施方案中，在基因的UTR、内含子或外显子内添加修饰以破坏RHD基因的功能。在一些实施方案中，使用包含表1A-1D的gRNA靶序列中的任一个或多个的CRISPR/Cas编辑。
在一些实施方案中，将修饰引入RHD基因中以使所述基因失活。在一些实施方案中，靶向诸如RHD基因的外显子1或外显子2的编码外显子。在一些实施方案中，靶向RHD基因的编码外显子4。在一些实施方案中，靶向RHD基因的编码外显子5。在一些实施方案中，靶向RHD基因的编码外显子6。在一些实施方案中，靶向RHD基因的编码外显子7。在一些实施方案中，靶向RHD基因的编码外显子8。在一些情况下，使用Cas编辑系统和靶向RHD基因的5’处序列的指导RNA靶序列以及靶向外显子(诸如但不限于外显子8)的指导RNA靶序列来产生缺失。在一些实施方案中，一种gRNA靶序列是表1A的RHD 5'UTR指导1，并且一种gRNA靶序列是表1的RHD外显子8指导1。在一些实施方案中，本文所述的细胞包含RHD基因的纯合修饰，从而使基因失活。
表1A.示例性RHD gRNA靶序列
表1B.示例性RHD gRNA靶序列
位置 链 序列 PAM 外显子
25306721 1 GATACCGTCGGAGCCGGCAA TGG 7
25306715 1 GTGCTTGATACCGTCGGAGC CGG 7
25306709 1 CTGCTGGTGCTTGATACCGT CGG 7
25307756 1 CTGCGGTTCCTACCGGTTCT TGG 8
25284622 -1 GTCTCCGGAAACTCGAGGTG AGG 2
25301582 -1 ACGGCATTCTTCCTTTCGAT TGG 5
25307749 1 GGAGGCGCTGCGGTTCCTAC CGG 8
25284627 -1 GCTGTGTCTCCGGAAACTCG AGG 2
25301628 1 CTATGCTGTAGCAGTCAGCG TGG 5
25303438 1 GCTGGGCTGATCTCCGTCGG GGG 6
25284629 1 GCTTCCTCACCTCGAGTTTC CGG 2
25301033 -1 TCCTCCGTTCCCTCGGGTAG AGG 4
25306657 1 GGGCTACAACTTCAGCTTGC TGG 7
25284606 1 CGTGATGGCGGCCATTGGCT TGG 2
25301613 -1 GCTGACTGCTACAGCATAGT AGG 5
25303436 1 TGGCTGGGCTGATCTCCGTC GGG 6
25301040 1 AAAGCCTCTACCCGAGGGAA CGG 4
25301582 1 TGCTGAGAAGTCCAATCGAA AGG 5
25306658 1 GGCTACAACTTCAGCTTGCT GGG 7
25284641 1 CGAGTTTCCGGAGACACAGC TGG 2
表1C.靶向编码外显子的示例性RHDgRNA靶序列
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表1D.RHD gRNA靶序列
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在一些实施方案中，gRNA靶序列针对RHD基因的外显子1或外显子2。在一些实施方案中，gRNA靶序列是表1的gRNA，其诱导移码突变以使外显子1或外显子2失活。
在一些实施方案中，RHD基因的表达因RHD基因的外显子2的TCATGG、GAGGTG、AACTCG、AGTTTC、TTGGCT或CACAGC内；外显子3的CCGTGA内；外显子4的GGGTAG或AGGGAA内；外显子5的TTCGAT、TCAGCG、CATAGT或ATCGAA内；外显子6的CGTCGG或TCCGTC内；外显子7的CGGCAA、CGGAGC、TACCGT、GCTTGC或CTTGCT内；或外显子8的GGTTCT或TCCTAC内的插入或缺失而部分或完全失活。
测试RHD基因是否已失活的测定是已知的并且在本文中描述。在一个实施方案中，通过PCR得到的RHD基因的遗传修饰和RHD抗原表达的减少可以通过FACS分析进行测定。在另一个实施方案中，使用细胞裂解物的蛋白质印迹来检测RhD蛋白表达，所述裂解物用RhD蛋白的抗体进行探测。在另一个实施方案中，逆转录酶聚合酶链式反应(RT-PCR)用于确认失活遗传修饰的存在。
G.CIITA
在一些实施方案中，本文公开的本技术通过靶向和调节(例如，减少或消除)II类反式激活因子(CIITA)的表达来调节(例如，减少或消除)MHC II基因的表达。在一些实施方案中，使用CRISPR/Cas系统进行调节。CIITA是LR或核苷酸结合结构域(NBD)富亮氨酸重复序列(LRR)蛋白家族的成员，并且通过与MHC增强体缔合来调控MHC II的转录。
在一些实施方案中，本技术的靶多核苷酸序列是CIITA的变体。在一些实施方案中，靶多核苷酸序列是CIITA的同源物。在一些实施方案中，靶多核苷酸序列是CIITA的直系同源物。
在一些实施方案中，减少或消除的CIITA表达减少或消除以下MHC II类中的一种或多种的表达：HLA-DP、HLA-DM、HLA-DOA、HLA-DOB、HLA-DQ和HLA-DR。
在一些实施方案中，本文概述的低免疫原性T细胞和非活化T细胞包含靶向CIITA基因的遗传修饰。在一些实施方案中，通过罕见切割核酸内切酶实现的靶向CIITA基因的遗传修饰包含Cas蛋白或编码Cas蛋白的多核苷酸，以及至少一种用于特异性靶向CIITA基因的指导核糖核酸序列。在一些实施方案中，用于特异性靶向CIITA基因的至少一个指导核糖核酸序列选自由WO2016183041(其通过引用并入本文)的表12的SEQ ID NO:5184-36352组成的组。在一些实施方案中，细胞在受体受试者中具有降低的诱导免疫反应的能力。
在一些实施方案中，低免疫原性T细胞和非活化T细胞包含CIITA基因的基因修饰。在一些实施方案中，基因修饰影响CIITA基因的一个等位基因。在一些实施方案中，基因修饰影响CIITA基因的两个等位基因。在一些实施方案中，基因修饰是CIITA基因的插入、缺失或破坏。在一些实施方案中，基因修饰是CIITA基因的纯合修饰。在一些实施方案中，基因修饰是CIITA基因的杂合修饰。
测试CIITA基因是否已失活的测定是已知的并且在本文描述。在一个实施方案中，通过PCR得到的CIITA基因的遗传修饰和HLA-II表达的减少可以通过FACS分析进行测定。在另一个实施方案中，使用细胞裂解物的蛋白质印迹检测CIITA蛋白表达，所述细胞裂解物用CIITA蛋白的抗体进行探测。在另一个实施方案中，逆转录酶聚合酶链式反应(RT-PCR)用于确认失活遗传修饰的存在。
H.B2M
在某些实施方案中，本文公开的本技术通过靶向和调节(例如，减少或消除)辅助链B2M的表达来调节(例如，减少或消除)MHC-I基因的表达。在一些实施方案中，使用CRISPR/Cas系统进行调节。通过调节(例如，减少或缺失)B2M的表达，MHC-I分子的表面运输被阻断并且细胞被赋予低免疫原性。在一些实施方案中，细胞在受体受试者中具有降低的诱导免疫反应的能力。
在一些实施方案中，本技术的靶多核苷酸序列是B2M的变体。在一些实施方案中，靶多核苷酸序列是B2M的同源物。在一些实施方案中，靶多核苷酸序列是B2M的直系同源物。
在一些实施方案中，降低或消除的B2M表达减少或消除以下MHC I分子中的一种或多种的表达：HLA-A、HLA-B和HLA-C。
在一些实施方案中，本文所述的细胞在编码B2M蛋白的基因座处包含基因修饰。换句话说，细胞在B2M基因座处包含遗传修饰。在一些情况下，编码B2M蛋白的核苷酸序列在参考序列号NM_004048.4和Genbank编号AB021288.1中列出。在一些情况下，B2M基因座在NCBI基因ID编号567中描述。在某些情况下，B2M的氨基酸序列被描绘为NCBI GenBank编号BAA35182.1。B2M蛋白和基因座的另外描述可见于Uniprot编号P61769、HGNC参考号914和OMIM参考号109700。
在一些实施方案中，本文概述的低免疫原性T细胞和非活化T细胞包含靶向B2M基因的遗传修饰。在一些实施方案中，通过罕见切割核酸内切酶实现的靶向B2M基因的遗传修饰包含Cas蛋白或编码Cas蛋白的多核苷酸，以及至少一种用于特异性靶向B2M基因的指导核糖核酸序列。在一些实施方案中，用于特异性靶向B2M基因的至少一个指导核糖核酸序列选自由WO2016183041(其通过引用并入本文)的表15的SEQ ID NO:81240-85644组成的组。
在一些实施方案中，低免疫原性T细胞和非活化T细胞包含B2M基因的基因修饰。在一些实施方案中，基因修饰影响B2M基因的一个等位基因。在一些实施方案中，基因修饰影响B2M基因的两个等位基因。在一些实施方案中，基因修饰是B2M基因的插入、缺失或破坏。在一些实施方案中，基因修饰是B2M基因的纯合修饰。在一些实施方案中，基因修饰是B2M基因的杂合修饰。
测试B2M基因是否已失活的测定是已知的并且在本文描述。在一个实施方案中，通过PCR得到的B2M基因的遗传修饰和HLA-I表达的减少可以通过FACS分析进行测定。在另一个实施方案中，使用细胞裂解物的蛋白质印迹检测B2M蛋白表达，所述细胞裂解物用B2M蛋白的抗体进行探测。在另一个实施方案中，逆转录酶聚合酶链式反应(RT-PCR)用于确认失活遗传修饰的存在。
I.另外的致耐受因子
在某些实施方案中，可以将一种或多种致耐受因子插入或重新插入到基因组编辑的细胞中以产生免疫豁免的通用供体细胞，诸如通用供体干细胞、通用供体T细胞或通用供体细胞。在某些实施方案中，本文公开的低免疫原性T细胞和非活化T细胞已被进一步修饰以表达一种或多种致耐受因子。示例性的致耐受因子包括但不限于以下中的一种或多种：DUX4、CD200、HLA-G、HLA-E、HLA-C、HLA-E重链、PD-L1、IDO1、CTLA4-Ig、IL-10、IL-35、FASL、Serpinb9、CCl21和Mfge8。在一些实施方案中，致耐受因子选自由以下组成的组：CD200、HLA-G、HLA-E、HLA-C、HLA-E重链、PD-L1、IDO1、CTLA4-Ig、IL-10、IL-35、FASL、Serpinb9、CCl21和Mfge8。在一些实施方案中，致耐受因子选自由以下组成的组：DUX4、HLA-C、HLA-E、HLA-F、HLA-G、PD-L1、CTLA-4-Ig、C1抑制剂和IL-35。在一些实施方案中，致耐受因子选自由以下组成的组：HLA-C、HLA-E、HLA-F、HLA-G、PD-L1、CTLA-4-Ig、C1抑制剂和IL-35。
在一些情况下，基因编辑系统(诸如CRISPR/Cas系统)用于促进将致耐受因子(诸如致耐受因子)插入到安全港基因座(诸如AAVS1基因座)中以主动抑制免疫排斥。在一些情况下，使用表达载体将致耐受因子插入到安全港基因座中。
在一些实施方案中，本公开提供了一种包含基因组的细胞(例如，低免疫原性T细胞、非活化T细胞及其衍生物)或其群体，其中细胞基因组已被修饰以表达CD47。在一些实施方案中，本公开提供了一种用于改变细胞基因组以表达CD47的方法。在一些实施方案中，至少一种核糖核酸或至少一对核糖核酸可用于促进将CD47插入到细胞系中。在一些实施方案中，至少一种核糖核酸或至少一对核糖核酸选自由WO2016183041(其通过引用并入本文)的表29的SEQ ID NO:200784-231885组成的组。
在一些实施方案中，本公开提供了一种包含基因组的细胞(例如，低免疫原性T细胞、非活化T细胞及其衍生物)或其群体，其中细胞基因组已被修饰以表达HLA-C。在一些实施方案中，本公开提供了一种用于改变细胞基因组以表达HLA-C的方法。在一些实施方案中，至少一种核糖核酸或至少一对核糖核酸可用于促进将HLA-C插入到细胞系中。在一些实施方案中，至少一种核糖核酸或至少一对核糖核酸选自由WO2016183041(其通过引用并入本文)的表10的SEQ ID NO:3278-5183组成的组。
在一些实施方案中，本公开提供了一种包含基因组的细胞(例如，低免疫原性T细胞、非活化T细胞及其衍生物)或其群体，其中细胞基因组已被修饰以表达HLA-E。在一些实施方案中，本公开提供了一种用于改变细胞基因组以表达HLA-E的方法。在一些实施方案中，至少一种核糖核酸或至少一对核糖核酸可用于促进将HLA-E插入到细胞系中。在一些实施方案中，至少一种核糖核酸或至少一对核糖核酸选自由WO2016183041(其通过引用并入本文)的表19的SEQ ID NO:189859-193183组成的组。
在一些实施方案中，本公开提供了一种包含基因组的细胞(例如，低免疫原性T细胞、非活化T细胞及其衍生物)或其群体，其中细胞基因组已被修饰以表达HLA-F。在一些实施方案中，本公开提供了一种用于改变细胞基因组以表达HLA-F的方法。在一些实施方案中，至少一种核糖核酸或至少一对核糖核酸可用于促进将HLA-F插入到细胞系中。在一些实施方案中，至少一种核糖核酸或至少一对核糖核酸选自由WO2016183041(其通过引用并入本文)的表45的SEQ ID NO:688808-399754组成的组。
在一些实施方案中，本公开提供了一种包含基因组的细胞(例如，低免疫原性T细胞、非活化T细胞及其衍生物)或其群体，其中细胞基因组已被修饰以表达HLA-G。在一些实施方案中，本公开提供了一种用于改变细胞基因组以表达HLA-G的方法。在一些实施方案中，至少一种核糖核酸或至少一对核糖核酸可用于促进将HLA-G插入到细胞系，例如干细胞系中。在一些实施方案中，至少一种核糖核酸或至少一对核糖核酸选自由WO2016183041(其通过引用并入本文)的表18的SEQ ID NO:188372-189858组成的组。
在一些实施方案中，本公开提供了一种包含基因组的细胞(例如，低免疫原性T细胞、非活化T细胞及其衍生物)或其群体，其中细胞基因组已被修饰以表达PD-L1。在一些实施方案中，本公开提供了一种用于改变细胞基因组以表达PD-L1的方法。在一些实施方案中，至少一种核糖核酸或至少一对核糖核酸可用于促进将PD-L1插入到细胞系，例如干细胞系中。在一些实施方案中，至少一种核糖核酸或至少一对核糖核酸选自由WO2016183041(其通过引用并入本文)的表21的SEQ ID NO:193184-200783组成的组。
在一些实施方案中，本公开提供了一种包含基因组的细胞(例如，低免疫原性T细胞、非活化T细胞及其衍生物)或其群体，其中细胞基因组已被修饰以表达CTLA4-Ig。在一些实施方案中，本公开提供了一种用于改变细胞基因组以表达CTLA4-Ig的方法。在一些实施方案中，至少一种核糖核酸或至少一对核糖核酸可用于促进将CTLA4-Ig插入到细胞系，例如干细胞系中。在一些实施方案中，至少一种核糖核酸或至少一对核糖核酸选自WO2016183041(包括序列表)中公开的任一种。
在一些实施方案中，本公开提供了一种包含基因组的细胞(例如，低免疫原性T细胞、非活化T细胞及其衍生物)或其群体，其中细胞基因组已被修饰以表达CI抑制剂。在一些实施方案中，本公开提供了一种用于改变细胞基因组以表达CI-抑制剂的方法。在一些实施方案中，至少一种核糖核酸或至少一对核糖核酸可用于促进将CI抑制剂插入到细胞系，例如干细胞系中。在一些实施方案中，至少一种核糖核酸或至少一对核糖核酸选自WO2016183041(包括序列表)中公开的任一种。
在一些实施方案中，本公开提供了一种包含基因组的细胞(例如，低免疫原性T细胞、非活化T细胞及其衍生物)或其群体，其中细胞基因组已被修饰以表达IL-35。在一些实施方案中，本公开提供了一种用于改变细胞基因组以表达IL-35的方法。在一些实施方案中，至少一种核糖核酸或至少一对核糖核酸可用于促进将IL-35插入到细胞系，例如干细胞系中。在一些实施方案中，至少一种核糖核酸或至少一对核糖核酸选自WO2016183041(包括序列表)中公开的任一种。
在一些实施方案中，使用表达载体在细胞中表达致耐受因子。例如，用于在细胞中表达CD47的表达载体包含编码CD47的多核苷酸序列。表达载体可以是诱导型表达载体。表达载体可以是病毒载体，诸如但不限于慢病毒载体。
在一些实施方案中，本公开提供了一种包含基因组的细胞(例如，低免疫原性T细胞、非活化T细胞及其衍生物)或其群体，其中细胞基因组已被修饰以表达选自由以下组成的组的多肽中的任一种：HLA-A、HLA-B、HLA-C、RFX-ANK、CIITA、NFY-A、NLRC5、B2M、RFX5、RFX-AP、HLA-G、HLA-E、NFY-B、PD-L1、NFY-C、IRF1、TAP1、GITR、4-1BB、CD28、B7-1、CD47、B7-2、OX40、CD27、HVEM、SLAM、CD226、ICOS、LAG3、TIGIT、TIM3、CD160、BTLA、CD244、LFA-1、ST2、HLA-F、CD30、B7-H3、VISTA、TLT、PD-L2、CD58、CD2、HELIOS和IDO1。在一些实施方案中，本公开提供了一种用于改变细胞基因组以表达选自由以下组成的组的多肽中的任一种的方法：HLA-A、HLA-B、HLA-C、RFX-ANK、CIITA、NFY-A、NLRC5、B2M、RFX5、RFX-AP、HLA-G、HLA-E、NFY-B、PD-L1、NFY-C、IRF1、TAP1、GITR、4-1BB、CD28、B7-1、CD47、B7-2、OX40、CD27、HVEM、SLAM、CD226、ICOS、LAG3、TIGIT、TIM3、CD160、BTLA、CD244、LFA-1、ST2、HLA-F、CD30、B7-H3、VISTA、TLT、PD-L2、CD58、CD2、HELIOS和IDO1。在一些实施方案中，至少一种核糖核酸或至少一对核糖核酸可用于促进将选定多肽插入到细胞系，例如干细胞系中。在一些实施方案中，至少一种核糖核酸或至少一对核糖核酸选自WO2016183041的附录1-47和序列表中公开的任一种，所述公开通过引用并入本文。
J.嵌合抗原受体
本文提供了低免疫原性T细胞和非活化T细胞，包括从低免疫诱导性多能干细胞分化的低免疫原性T细胞和非活化T细胞以及衍生自原代T细胞的低免疫原性T细胞和非活化T细胞，其包含一种或多种嵌合抗原受体(CAR)。在一些实施方案中，CAR选自由第一代CAR、第二代CAR、第三代CAR和第四代CAR组成的组。
在一些实施方案中，本文所述的低免疫原性T细胞包含一种或多种多核苷酸，所述一种或多种多核苷酸编码包含抗原结合结构域的一种或多种嵌合抗原受体(CAR)。在一些实施方案中，本文所述的低免疫原性T细胞包含有包含抗原结合结构域的一种或多种嵌合抗原受体(CAR)。在一些实施方案中，多核苷酸是或包含有包含抗原结合结构域的一种或多种嵌合抗原受体(CAR)。在一些实施方案中，一种或多种CAR是或包括包含抗原结合结构域、跨膜结构域和至少一个信号传导结构域(例如，一个、两个或三个信号传导结构域)的第一代CAR。在一些实施方案中，一种或多种CAR是或包括包含抗原结合结构域、跨膜结构域和至少两个信号传导结构域的第二代CAR。在一些实施方案中，一种或多种CAR是或包括包含抗原结合结构域、跨膜结构域和至少三个信号传导结构域的第三代CAR。在一些实施方案中，一种或多种CAR是或包括包含抗原结合结构域、跨膜结构域、三个或四个信号传导结构域和在CAR成功信号传导后诱导细胞因子基因表达的结构域的第四代CAR。在一些实施方案中，抗原结合结构域是或包含抗体、抗体片段、scFv或Fab。
在一些情况下，细胞表达编码一种或多种CAR的一种或多种核苷酸序列，使得将核苷酸序列插入到安全港基因座的至少一个等位基因中。在一些情况下，细胞表达编码一种或多种CAR的一种或多种核苷酸序列，使得将一种或多种核苷酸序列插入到RHD基因座的至少一个等位基因中。在一些情况下，细胞表达编码一种或多种CAR的一种或多种核苷酸序列，使得将一种或多种核苷酸序列插入到AAVS1基因座的至少一个等位基因中。在一些情况下，细胞表达编码一种或多种CAR的一种或多种核苷酸序列，使得将一种或多种核苷酸序列插入到CCR5基因座的至少一个等位基因中。在一些情况下，细胞表达编码一种或多种CAR的一种或多种核苷酸序列，其中将一种或多种核苷酸序列插入到安全港基因座的至少一个等位基因中，所述安全港基因座诸如但不限于CCR5基因座、CXCR4基因座、PPP1R12C基因座、白蛋白基因座、SHS231基因座、CLYBL基因座、Rosa基因座、F3(CD142)基因座、MICA基因座、MICB基因座、LRP1(CD91)基因座、HMGB1基因座、ABO基因座、RHD基因座、FUT1基因座和KDM5D基因座。在一些情况下，细胞表达编码一种或多种CAR的一种或多种核苷酸序列，使得将一种或多种核苷酸序列插入到TRAC基因座的至少一个等位基因中。
在一些实施方案中，编码一种或多种CAR的一种或多种核苷酸序列通过慢病毒载体递送至细胞。在一些实施方案中，将编码一种或多种CAR的一种或多种核苷酸序列引入离体细胞。在一些实施方案中，将编码一种或多种CAR的一种或多种核苷酸序列引入体内细胞。在一些实施方案中，通过基于CRISPR/Cas的系统将编码一种或多种CAR的一种或多种核苷酸序列引入细胞的基因组中。在一些实施方案中，通过不基于CRISPR/Cas技术的基因表达系统将编码一种或多种CAR的一种或多种核苷酸序列引入细胞的基因组中。
1.抗原结合结构域(ABD)靶向赘生性细胞或癌细胞所特有的抗原
在一些实施方案中，抗原结合结构域(ABD)靶向赘生性细胞所特有的抗原。换句话说，抗原结合结构域靶向赘生性细胞或癌细胞表达的抗原。在一些实施方案中，ABD结合肿瘤相关抗原。在一些实施方案中，赘生性细胞所特有的抗原(例如，与赘生性细胞或癌细胞相关的抗原)或肿瘤相关抗原选自细胞表面受体、离子通道相关受体、酶联受体、G蛋白偶联受体、受体酪氨酸激酶、酪氨酸激酶相关受体、受体样酪氨酸磷酸酶、受体丝氨酸/苏氨酸激酶、受体鸟苷酸环化酶、组氨酸激酶相关受体、表皮生长因子受体(EGFR)(包括ErbB1/EGFR、ErbB2/HER2、ErbB3/HER3和ErbB4/HER4)、成纤维细胞生长因子受体(FGFR)(包括FGF1、FGF2、FGF3、FGF4、FGF5、FGF6、FGF7、FGF18和FGF21)、血管内皮生长因子受体(VEGFR)(包括VEGF-A、VEGF-B、VEGF-C、VEGF-D和PIGF)、RET受体和Eph受体家族(包括EphA1、EphA2、EphA3、EphA4、EphA5、EphA6、EphA7、EphA8、EphA9、EphA10、EphB1、EphB2、EphB3、EphB4和EphB6)、CXCR1、CXCR2、CXCR3、CXCR4、CXCR6、CCR1、CCR2、CCR3、CCR4、CCR5、CCR6、CCR8、CFTR、CIC-1、CIC-2、CIC-4、CIC-5、CIC-7、CIC-Ka、CIC-Kb、Bestrophin、TMEM16A、GABA受体、甘氨酸受体、ABC转运蛋白、NAV1.1、NAV1.2、NAV1.3、NAV1.4、NAV1.5、NAV1.6、NAV1.7、NAV1.8、NAV1.9、鞘氨醇-1-磷酸受体(S1P1R)、NMDA通道、跨膜蛋白、多跨跨膜蛋白、T细胞受体基序、T细胞α链、T细胞β链、T细胞γ链、T细胞δ链；CCR7；CD3；CD4；CD5；CD7；CD8；CD11b；CD11c；CD16；CD19；CD20；CD21；CD22；CD25；CD28；CD34；CD35；CD40；CD45RA；CD45RO；CD52；CD56；CD62L；CD68；CD80；CD95；CD117；CD127；CD133；CD137(4-1BB)；CD163；F4/80；IL-4Ra；Sca-1；CTLA-4；GITR；GARP；LAP；颗粒酶B；LFA-1；转铁蛋白受体；NKp46、穿孔素、CD4+；Th1；Th2；Th17；Th40；Th22；Th9；Tfh；典型Treg、FoxP3+；Tr1；Th3；Treg17；TREG；CDCP1、NT5E、EpCAM、CEA、gpA33、粘蛋白、TAG-72、碳酸酐酶IX、PSMA、叶酸结合蛋白、神经节苷脂(例如，CD2、CD3、GM2)、Lewis-γ2、VEGF、VEGFR 1/2/3、αVβ3、α5β1、ErbB1/EGFR、ErbB1/HER2、ErB3、c-MET、IGF1R、EphA3、TRAIL-R1、TRAIL-R2、RANKL、FAP、腱生蛋白、PDL-1、BAFF、HDAC、ABL、FLT3、KIT、MET、RET、IL-1β、ALK、RANKL、mTOR、CTLA4、IL-6、IL-6R、JAK3、BRAF、PTCH、Smoothened、PIGF、ANPEP、TIMP1、PLAUR、PTPRJ、LTBR或ANTXR1、叶酸受体α(FRa)、ERBB2(Her2/neu)、EphA2、IL-13Ra2、表皮生长因子受体(EGFR)、间皮素、TSHR、CD19、CD123、CD22、CD30、CD171、CS-1、CLL-1、CD33、EGFRvIII、GD2、GD3、BCMA、MUC16(CA125)、L1CAM、LeY、MSLN、IL13Rα1、L1-CAM、Tn Ag、前列腺特异性膜抗原(PSMA)、ROR1、FLT3、FAP、TAG72、CD38、CD44v6、CEA、EPCAM、B7H3、KIT、白介素-11受体a(IL-11Ra)、PSCA、PRSS21、VEGFR2、LewisY、CD24、血小板衍生生长因子受体β(PDGFR-β)、SSEA-4、CD20、MUC1、NCAM、前列腺酶(Prostase)、PAP、ELF2M、肝配蛋白(Ephrin)B2、IGF-1受体、CAIX、LMP2、gplOO、bcr-abl、酪氨酸酶、岩藻糖基GM1、sLe、GM3、TGS5、HMWMAA、o-乙酰基-GD2、叶酸受体β、TEM1/CD248、TEM7R、CLDN6、GPRC5D、CXORF61、CD97、CD179a、ALK、多唾液酸、PLACl、GloboH、NY-BR-1、UPK2、HAVCR1、ADRB3、PANX3、GPR20、LY6K、OR51E2、TARP、WT1、NY-ESO-1、LAGE-la、MAGE-A1、豆荚蛋白(legumain)、HPV E6、E7、ETV6-AML、精子蛋白17、XAGE1、Tie 2、MAD-CT-1、MAD-CT-2、主要组织相容性复合物I类相关基因蛋白(MR1)、尿激酶型纤溶酶原活化因子受体(uPAR)、Fos相关抗原1、p53、p53突变体、前列腺癌相关蛋白(prostein)、生存素、端粒酶、PCTA-1/半乳糖凝集素8、MelanA/MART1、Ras突变体、hTERT、肉瘤易位断裂点、ML-IAP、ERG(TMPRSS2 ETS融合基因)、NA17、PAX3、雄激素受体、细胞周期蛋白B1、MYCN、RhoC、TRP-2、CYPIB I、BORIS、SART3、PAX5、OY-TES1、LCK、AKAP-4、SSX2、RAGE-1、人端粒酶逆转录酶、RU1、RU2、肠羧基酯酶、mut hsp70-2、CD79a、CD79b、CD72、LAIR1、FCAR、LILRA2、CD300LF、CLEC12A、BST2、EMR2、LY75、GPC3、FCRL5、IGLL1、新抗原、CD133、CD15、CD184、CD24、CD56、CD26、CD29、CD44、HLA-A、HLA-B、HLA-C、(HLA-A、B、C)CD49f、CD151 CD340、CD200、tkrA、trkB或trkC，或其抗原片段或抗原部分。
2.ABD靶向T细胞所特有的抗原
在一些实施方案中，抗原结合结构域靶向T细胞所特有的抗原。在一些实施方案中，ABD结合与T细胞相关的抗原。在一些情况下，这种抗原由T细胞表达或者位于T细胞的表面上。在一些实施方案中，T细胞所特有的抗原或T细胞相关抗原选自T细胞所特有的细胞表面受体、膜转运蛋白(例如，主动或被动转运蛋白，诸如例如离子通道蛋白、成孔蛋白等)、跨膜受体、膜酶和/或细胞粘附蛋白。在一些实施方案中，T细胞所特有的抗原可以是G蛋白偶联受体、受体酪氨酸激酶、酪氨酸激酶相关受体、受体样酪氨酸磷酸酶、受体丝氨酸/苏氨酸激酶、受体鸟苷酸环化酶、组氨酸激酶相关受体、AKT1；AKT2；AKT3；ATF2；BCL10；CALM1；CD3D(CD3δ)；CD3E(CD3ε)；CD3G(CD3γ)；CD4；CD8；CD28；CD45；CD80(B7-1)；CD86(B7-2)；CD247(CD3ζ)；CTLA4(CD152)；ELK1；ERK1(MAPK3)；ERK2；FOS；FYN；GRAP2(GADS)；GRB2；HLA-DRA；HLA-DRB1；HLA-DRB3；HLA-DRB4；HLA-DRB5；HRAS；IKBKA(CHUK)；IKBKB；IKBKE；IKBKG(NEMO)；IL2；ITPR1；ITK；JUN；KRAS2；LAT；LCK；MAP2K1(MEK1)；MAP2K2(MEK2)；MAP2K3(MKK3)；MAP2K4(MKK4)；MAP2K6(MKK6)；MAP2K7(MKK7)；MAP3K1(MEKK1)；MAP3K3；MAP3K4；MAP3K5；MAP3K8；MAP3K14(NIK)；MAPK8(JNK1)；MAPK9(JNK2)；MAPK10(JNK3)；MAPK11(p38β)；MAPK12(p38γ)；MAPK13(p38δ)；MAPK14(p38α)；NCK；NFAT1；NFAT2；NFKB1；NFKB2；NFKBIA；NRAS；PAK1；PAK2；PAK3；PAK4；PIK3C2B；PIK3C3(VPS34)；PIK3CA；PIK3CB；PIK3CD；PIK3R1；PKCA；PKCB；PKCM；PKCQ；PLCY1；PRF1(穿孔素)；PTEN；RAC1；RAF1；RELA；SDF1；SHP2；SLP76；SOS；SRC；TBK1；TCRA；TEC；TRAF6；VAV1；VAV2；或ZAP70。
3.ABD靶向自身免疫性或炎性病症所特有的抗原
在一些实施方案中，抗原结合结构域靶向自身免疫性或炎性病症所特有的抗原。在一些实施方案中，ABD结合与自身免疫性或炎性病症相关的抗原。在一些情况下，抗原由与自身免疫性或炎性病症相关的细胞表达。在一些实施方案中，自身免疫性或炎性病症选自慢性移植物抗宿主病(GVHD)、狼疮、关节炎、免疫复合物肾小球性肾炎、古德巴斯捷氏综合征(goodpasture)、葡萄膜炎、肝炎、系统性硬化症或硬皮病、I型糖尿病、多发性硬化症、冷凝集素病、寻常性天疱疮(Pemphigus vulgaris)、格雷夫斯病、自身免疫性溶血性贫血、A型血友病、原发性干燥综合征(Primary Sjogren's Syndrome)、血栓性血小板减少性紫癜、视神经脊髓炎、埃文斯综合征(Evan's syndrome)、IgM介导的神经病变、冷球蛋白血症、皮肌炎、特发性血小板减少症、强直性脊柱炎、大疱性类天疱疮、获得性血管性水肿、慢性荨麻疹、抗磷脂脱髓鞘性多发性神经病变(antiphospholipid demyelinatingpolyneuropathy)和自身免疫性血小板减少症或中性粒细胞减少症或纯红细胞再生障碍，而同种免疫性疾病的示例性非限制性实例包括来自造血或实体器官移植、输血的同种致敏作用(参见，例如Blazar等人,2015,Am.J.Transplant,15(4):931-41)或异种致敏作用、孕期胎儿同种致敏作用、新生儿同种免疫性血小板减少症、新生儿溶血病、对外来抗原的致敏作用，诸如可在用酶或蛋白质替换疗法、血液制品和基因疗法治疗的遗传性或获得性缺陷病症的替换下发生。在一些实施方案中，自身免疫性或炎性病症所特有的抗原选自细胞表面受体、离子通道相关受体、酶联受体、G蛋白偶联受体、受体酪氨酸激酶、酪氨酸激酶相关受体、受体样酪氨酸磷酸酶、受体丝氨酸/苏氨酸激酶、受体鸟苷酸环化酶或组氨酸激酶相关受体。
在一些实施方案中，CAR的抗原结合结构域与在B细胞、浆细胞或浆母细胞上表达的配体结合。在一些实施方案中，CAR的抗原结合结构域与CD10、CD19、CD20、CD22、CD24、CD27、CD38、CD45R、CD138、CD319、BCMA、CD28、TNF、干扰素受体、GM-CSF、ZAP-70、LFA-1、CD3γ、CD5或CD2结合。参见US2003/0077249；WO 2017/058753；WO 2017/058850，其内容通过引用并入本文。
4.ABD靶向衰老细胞所特有的抗原
在一些实施方案中，抗原结合结构域靶向衰老细胞所特有的抗原，例如尿激酶型纤溶酶原活化因子受体(uPAR)。在一些实施方案中，ABD结合与衰老细胞相关的抗原。在一些情况下，抗原由衰老细胞表达。在一些实施方案中，CAR可用于治疗或预防以衰老细胞的异常积累为特征的病症，例如，肝和肺纤维化、动脉粥样硬化、糖尿病和骨关节炎。
5.ABD靶向感染性疾病所特有的抗原
在一些实施方案中，抗原结合结构域靶向感染性疾病所特有的抗原。在一些实施方案中，ABD结合与感染性疾病相关的抗原。在一些情况下，抗原由受感染性疾病影响的细胞表达。在一些实施方案中，其中感染性疾病选自HIV、乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、人疱疹病毒、人疱疹病毒8(HHV-8、卡波西肉瘤相关疱疹病毒(Kaposi sarcoma-associatedherpes virus，KSHV))、人嗜T淋巴细胞病毒1(HTLV-1)、默克尔细胞多瘤病毒(Merkel cellpolyomavirus，MCV)、猿猴病毒40(SV40)、爱泼斯坦-巴尔病毒(Epstein-Barr virus)、CMV、人乳头瘤病毒。在一些实施方案中，感染性疾病所特有的抗原选自细胞表面受体、离子通道相关受体、酶联受体、G蛋白偶联受体、受体酪氨酸激酶、酪氨酸激酶相关受体、受体样酪氨酸磷酸酶、受体丝氨酸/苏氨酸激酶、受体鸟苷酸环化酶、组氨酸激酶相关受体、HIV Env、gpl20或HIV-1Env上的CD4诱导的表位。
6.ABD与细胞的细胞表面抗原结合
在一些实施方案中，抗原结合结构域与细胞的细胞表面抗原结合。在一些实施方案中，细胞表面抗原是特定的或指定的细胞类型所特有的(例如，由其表达)。在一些实施方案中，细胞表面抗原是多于一种类型的细胞所特有的。
在一些实施方案中，CAR抗原结合结构域与T细胞所特有的细胞表面抗原(诸如T细胞上的细胞表面抗原)结合。在一些实施方案中，T细胞所特有的抗原可以是T细胞所特有的细胞表面受体、膜转运蛋白(例如，主动或被动转运蛋白，诸如例如离子通道蛋白、成孔蛋白等)、跨膜受体、膜酶和/或细胞粘附蛋白。在一些实施方案中，T细胞所特有的抗原可以是G蛋白偶联受体、受体酪氨酸激酶、酪氨酸激酶相关受体、受体样酪氨酸磷酸酶、受体丝氨酸/苏氨酸激酶、受体鸟苷酸环化酶或组氨酸激酶相关受体。
在一些实施方案中，CAR的抗原结合结构域与T细胞受体结合。在一些实施方案中，T细胞受体可以是AKT1；AKT2；AKT3；ATF2；BCL10；CALM1；CD3D(CD3δ)；CD3E(CD3ε)；CD3G(CD3γ)；CD4；CD8；CD28；CD45；CD80(B7-1)；CD86(B7-2)；CD247(CD3ζ)；CTLA4(CD152)；ELK1；ERK1(MAPK3)；ERK2；FOS；FYN；GRAP2(GADS)；GRB2；HLA-DRA；HLA-DRB1；HLA-DRB3；HLA-DRB4；HLA-DRB5；HRAS；IKBKA(CHUK)；IKBKB；IKBKE；IKBKG(NEMO)；IL2；ITPR1；ITK；JUN；KRAS2；LAT；LCK；MAP2K1(MEK1)；MAP2K2(MEK2)；MAP2K3(MKK3)；MAP2K4(MKK4)；MAP2K6(MKK6)；MAP2K7(MKK7)；MAP3K1(MEKK1)；MAP3K3；MAP3K4；MAP3K5；MAP3K8；MAP3K14(NIK)；MAPK8(JNK1)；MAPK9(JNK2)；MAPK10(JNK3)；MAPK11(p38β)；MAPK12(p38γ)；MAPK13(p38δ)；MAPK14(p38α)；NCK；NFAT1；NFAT2；NFKB1；NFKB2；NFKBIA；NRAS；PAK1；PAK2；PAK3；PAK4；PIK3C2B；PIK3C3(VPS34)；PIK3CA；PIK3CB；PIK3CD；PIK3R1；PKCA；PKCB；PKCM；PKCQ；PLCY1；PRF1(穿孔素)；PTEN；RAC1；RAF1；RELA；SDF1；SHP2；SLP76；SOS；SRC；TBK1；TCRA；TEC；TRAF6；VAV1；VAV2；或ZAP70。
7.跨膜结构域
在一些实施方案中，CAR跨膜结构域包含以下的至少一个跨膜区：T细胞受体的α、β或ζ链、CD28、CD3ε、CD45、CD4、CD5、CD8、CD9、CD16、CD22、CD33、CD37、CD64、CD80、CD86、CD134、CD137、CD154或其功能变体。在一些实施方案中，跨膜结构域包含以下的至少一个跨膜区：CD8α、CD8β、4-1BB/CD137、CD28、CD34、CD4、FcεRIγ、CD16、OX40/CD134、CD3ζ、CD3ε、CD3γ、CD3δ、TCRα、TCRβ、TCRζ、CD32、CD64、CD64、CD45、CD5、CD9、CD22、CD37、CD80、CD86、CD40、CD40L/CD154、VEGFR2、FAS和FGFR2B或其功能变体。抗原结合结构域结合
8.信号传导结构域或多个信号传导结构域
在一些实施方案中，本文所述的CAR包含选自以下中的一种或多种的一个或至少一个信号传导结构域：B7-1/CD80；B7-2/CD86；B7-H1/PD-L1；B7-H2；B7-H3；B7-H4；B7-H6；B7-H7；BTLA/CD272；CD28；CTLA4；Gi24/VISTA/B7-H5；ICOS/CD278；PD1；PD-L2/B7-DC；PDCD6)；4-1BB/TNFSF9/CD137；4-1BB配体/TNFSF9；BAFF/BLyS/TNFSF13B；BAFF R/TNFRSF13C；CD27/TNFRSF7；CD27配体/TNFSF7；CD30/TNFRSF8；CD30配体/TNFSF8；CD40/TNFRSF5；CD40/TNFSF5；CD40配体/TNFSF5；DR3/TNFRSF25；GITR/TNFRSF18；GITR配体/TNFSF18；HVEM/TNFRSF14；LIGHT/TNFSF14；淋巴毒素-α/TNF-β；OX40/TNFRSF4；OX40配体/TNFSF4；RELT/TNFRSF19L；TACI/TNFRSF13B；TL1A/TNFSF15；TNF-α；TNF RII/TNFRSF1B)；2B4/CD244/SLAMF4；BLAME/SLAMF8；CD2；CD2F-10/SLAMF9；CD48/SLAMF2；CD58/LFA-3；CD84/SLAMF5；CD229/SLAMF3；CRACC/SLAMF7；NTB-A/SLAMF6；SLAM/CD150)；CD2；CD7；CD53；CD82/Kai-1；CD90/Thy1；CD96；CD160；CD200；CD300a/LMIR1；HLA I类；HLA-DR；Ikaros；整联蛋白α4/CD49d；整联蛋白α4β1；整联蛋白α4β7/LPAM-1；LAG-3；TCL1A；TCL1B；CRTAM；DAP12；Dectin-1/CLEC7A；DPPIV/CD26；EphB6；TIM-1/KIM-1/HAVCR；TIM-4；TSLP；TSLP R；淋巴细胞功能相关抗原1(LFA-1)；NKG2C、CD3ζ结构域、基于免疫受体酪氨酸的活化基序(ITAM)、CD27、CD28、4-1BB、CD134/OX40、CD30、CD40、PD1、ICOS、淋巴细胞功能相关抗原1(LFA-1)、CD2、CD7、LIGHT、NKG2C、B7-H3、与CD83特异性结合的配体，或其功能片段。
在一些实施方案中，至少一个信号传导结构域包含CD3ζ结构域或基于免疫受体酪氨酸的活化基序(ITAM)或其功能变体。在其他实施方案中，至少一个信号传导结构域包含(i)CD3ζ结构域或基于免疫受体酪氨酸的活化基序(ITAM)或其功能变体；和(ii)CD28结构域或4-1BB结构域或其功能变体。在又其他实施方案中，至少一个信号传导结构域包含(i)CD3ζ结构域或基于免疫受体酪氨酸的活化基序(ITAM)或其功能变体；(ii)CD28结构域或其功能变体；以及(iii)4-1BB结构域或CD134结构域或其功能变体。在一些实施方案中，至少一个信号传导结构域包含(i)CD3ζ结构域或基于免疫受体酪氨酸的活化基序(ITAM)或其功能变体；(ii)CD28结构域或其功能变体；(iii)4-1BB结构域或CD134结构域或其功能变体；以及(iv)细胞因子或共刺激配体转基因。
在一些实施方案中，至少两个信号传导结构域包含CD3ζ结构域或基于免疫受体酪氨酸的活化基序(ITAM)或其功能变体。在其他实施方案中，至少两个信号传导结构域包含(i)CD3ζ结构域或基于免疫受体酪氨酸的活化基序(ITAM)或其功能变体；和(ii)CD28结构域或4-1BB结构域或其功能变体。在又其他实施方案中，至少一个信号传导结构域包含(i)CD3ζ结构域或基于免疫受体酪氨酸的活化基序(ITAM)或其功能变体；(ii)CD28结构域或其功能变体；以及(iii)4-1BB结构域或CD134结构域或其功能变体。在一些实施方案中，至少两个信号传导结构域包含(i)CD3ζ结构域或基于免疫受体酪氨酸的活化基序(ITAM)或其功能变体；(ii)CD28结构域或其功能变体；(iii)4-1BB结构域或CD134结构域或其功能变体；以及(iv)细胞因子或共刺激配体转基因。
在一些实施方案中，至少三个信号传导结构域包含CD3ζ结构域或基于免疫受体酪氨酸的活化基序(ITAM)或其功能变体。在其他实施方案中，至少三个信号传导结构域包含(i)CD3ζ结构域或基于免疫受体酪氨酸的活化基序(ITAM)或其功能变体；和(ii)CD28结构域或4-1BB结构域或其功能变体。在又其他实施方案中，至少三个信号传导结构域包含(i)CD3ζ结构域或基于免疫受体酪氨酸的活化基序(ITAM)或其功能变体；(ii)CD28结构域或其功能变体；以及(iii)4-1BB结构域或CD134结构域或其功能变体。在一些实施方案中，至少三个信号传导结构域包含(i)CD3ζ结构域或基于免疫受体酪氨酸的活化基序(ITAM)或其功能变体；(ii)CD28结构域或其功能变体；(iii)4-1BB结构域或CD134结构域或其功能变体；以及(iv)细胞因子或共刺激配体转基因。
在一些实施方案中，CAR包含CD3ζ结构域或基于免疫受体酪氨酸的活化基序(ITAM)或其功能变体。在一些实施方案中，CAR包含(i)CD3ζ结构域或基于免疫受体酪氨酸的活化基序(ITAM)或其功能变体；和(ii)CD28结构域或4-1BB结构域或其功能变体。
在一些实施方案中，CAR包含(i)CD3ζ结构域或基于免疫受体酪氨酸的活化基序(ITAM)或其功能变体；(ii)CD28结构域或其功能变体；以及(iii)4-1BB结构域或CD134结构域或其功能变体。
在一些实施方案中，CAR包含(i)CD3ζ结构域或基于免疫受体酪氨酸的活化基序(ITAM)或其功能变体；(ii)CD28结构域或4-1BB结构域或其功能变体，和/或(iii)4-1BB结构域或CD134结构域或其功能变体。
在一些实施方案中，CAR包含(i)CD3ζ结构域或基于免疫受体酪氨酸的活化基序(ITAM)或其功能变体；(ii)CD28结构域或其功能变体；(iii)4-1BB结构域或CD134结构域或其功能变体；以及(iv)细胞因子或共刺激配体转基因。
9.在CAR的成功信号传导后诱导细胞因子基因表达的结构域
在一些实施方案中，第一、第二、第三或第四代CAR还包含在CAR的成功信号传导后诱导细胞因子基因表达的结构域。在一些实施方案中，细胞因子基因对于包含CAR的靶细胞是内源的或外源的，所述CAR包含在CAR的成功信号传导后诱导细胞因子基因表达的结构域。在一些实施方案中，细胞因子基因编码促炎细胞因子。在一些实施方案中，细胞因子基因编码IL-1、IL-2、IL-9、IL-12、IL-18、TNF或IFN-γ或其功能片段。在一些实施方案中，在CAR的成功信号传导后诱导细胞因子基因表达的结构域是或包含转录因子或其功能结构域或片段。在一些实施方案中，在CAR的成功信号传导后诱导细胞因子基因表达的结构域是或包含转录因子或其功能结构域或片段。在一些实施方案中，转录因子或其功能结构域或片段是或包含活化T细胞的核因子(NFAT)、NF-kB或其功能结构域或片段。参见，例如，Zhang.C.等人,Engineering CAR T cells.Biomarker Research.5:22(2017)；WO2016126608；Sha,H.等人Chimaeric antigen receptor T-cell therapy for tumourimmunotherapy.Bioscience Reports Jan 27,2017,37(1)。
在一些实施方案中，CAR还包含一个或多个间隔子，例如，其中间隔子是抗原结合结构域与跨膜结构域之间的第一间隔子。在一些实施方案中，第一间隔子包括免疫球蛋白恒定区的至少一部分或其变体或修饰型式。在一些实施方案中，间隔子是跨膜结构域与信号传导结构域之间的第二间隔子。在一些实施方案中，第二间隔子是寡肽，例如，其中寡肽包含甘氨酸和丝氨酸残基，诸如但不限于甘氨酸-丝氨酸双联体。在一些实施方案中，CAR包含两个或更多个间隔子，例如，抗原结合结构域与跨膜结构域之间的间隔子以及跨膜结构域与信号传导结构域之间的间隔子。
在一些实施方案中，本文所述的细胞中的任一种包含编码CAR或第一代CAR的核酸。在一些实施方案中，第一代CAR包含抗原结合结构域、跨膜结构域和信号传导结构域。在一些实施方案中，信号传导结构域在T细胞活化期间介导下游信号传导。
在一些实施方案中，本文所述的细胞中的任一种包含编码CAR或第二代CAR的核酸。在一些实施方案中，第二代CAR包含抗原结合结构域、跨膜结构域和两个信号传导结构域。在一些实施方案中，信号传导结构域在T细胞活化期间介导下游信号传导。在一些实施方案中，信号传导结构域是共刺激结构域。在一些实施方案中，共刺激结构域在T细胞活化期间增强细胞因子产生、CAR T细胞增殖和/或CAR T细胞持久性。
在一些实施方案中，本文所述的细胞中的任一种包含编码CAR或第三代CAR的核酸。在一些实施方案中，第三代CAR包含抗原结合结构域、跨膜结构域和至少三个信号传导结构域。在一些实施方案中，信号传导结构域在T细胞活化期间介导下游信号传导。在一些实施方案中，信号传导结构域是共刺激结构域。在一些实施方案中，共刺激结构域在T细胞活化期间增强细胞因子产生、CAR T细胞增殖和或CAR T细胞持久性。在一些实施方案中，第三代CAR包含至少两个共刺激结构域。在一些实施方案中，至少两个共刺激结构域不相同。
在一些实施方案中，本文所述的细胞中的任一种包含编码CAR或第四代CAR的核酸。在一些实施方案中，第四代CAR包含抗原结合结构域、跨膜结构域和至少两个、三个或四个信号传导结构域。在一些实施方案中，信号传导结构域在T细胞活化期间介导下游信号传导。在一些实施方案中，信号传导结构域是共刺激结构域。在一些实施方案中，共刺激结构域在T细胞活化期间增强细胞因子产生、CAR T细胞增殖和或CAR T细胞持久性。
10.包含抗体或其抗原结合部分的ABD
在一些实施方案中，CAR抗原结合结构域是或包含抗体或其抗原结合部分。在一些实施方案中，CAR抗原结合结构域是或包含scFv或Fab。在一些实施方案中，CAR抗原结合结构域包含以下的scFv或Fab片段：T细胞α链抗体；T细胞β链抗体；T细胞γ链抗体；T细胞δ链抗体；CCR7抗体；CD3抗体；CD4抗体；CD5抗体；CD7抗体；CD8抗体；CD11b抗体；CD11c抗体；CD16抗体；CD19抗体；CD20抗体；CD21抗体；CD22抗体；CD25抗体；CD28抗体；CD34抗体；CD35抗体；CD40抗体；CD45RA抗体；CD45RO抗体；CD52抗体；CD56抗体；CD62L抗体；CD68抗体；CD80抗体；CD95抗体；CD117抗体；CD127抗体；CD133抗体；CD137(4-1BB)抗体；CD163抗体；F4/80抗体；IL-4Ra抗体；Sca-1抗体；CTLA4抗体；GITR抗体GARP抗体；LAP抗体；颗粒酶B抗体；LFA-1抗体；MR1抗体；uPAR抗体；或转铁蛋白受体抗体。
在一些实施方案中，CAR包含作为共刺激结构域的信号传导结构域。在一些实施方案中，CAR包含第二共刺激结构域。在一些实施方案中，CAR包含至少两个共刺激结构域。在一些实施方案中，CAR包含至少三个共刺激结构域。在一些实施方案中，CAR包含选自以下中的一种或多种的共刺激结构域：CD27、CD28、4-1BB、CD134/OX40、CD30、CD40、PD1、ICOS、淋巴细胞功能相关抗原1(LFA-1)、CD2、CD7、LIGHT、NKG2C、B7-H3、特异性结合CD83的配体。在一些实施方案中，当CAR包含两个或更多个共刺激结构域时，两个共刺激结构域不同。在一些实施方案中，当CAR包含两个或更多个共刺激结构域时，两个共刺激结构域相同。
除了本文所述的CAR之外，各种嵌合抗原受体和编码其的核苷酸序列是本领域已知的，并且将适合于如本文所述在体内和体外融合体递送和重编程靶细胞。参见，例如，WO2013040557；WO2012079000；WO2016030414；Smith T等人,NatureNanotechnology.2017.DOI:10.1038/NNANO.2017.57，其公开内容通过引用并入本文。
11.双特异性CAR
在某些实施方案中，至少一个抗原结合结构域选自由以下组成的组：抗体、其抗原结合部分、scFv和Fab。在一些实施方案中，CAR是包含结合两种不同抗原的两个抗原结合结构域的双特异性CAR。在一些实施方案中，至少一个抗原结合结构域结合选自由CD19、CD22和BCMA组成的组的抗原。在某些实施方案中，双特异性CAR与CD19和CD22结合。
在一些实施方案中，编码一种或多种CAR的多核苷酸由慢病毒载体携带。在一些实施方案中，一种或多种CAR选自由以下组成的组：CD19特异性CAR、CD20特异性CAR、CD22特异性CAR以及其组合。在一些实施方案中，编码一种或多种CAR的多核苷酸包含编码CD19特异性CAR和CD22特异性CAR两者的单一双顺反子多核苷酸。在一些实施方案中，细胞包含由一种多核苷酸编码的CD19特异性CAR和由另一种多核苷酸编码的CD22特异性CAR。在一些实施方案中，CAR是双特异性CAR。在一些实施方案中，双特异性CAR是CD19/CD20双特异性CAR。在一些实施方案中，双特异性CAR是CD19/CD22双特异性CAR。在一些实施方案中，CAR是二价CAR。在一些实施方案中，双特异性CAR是CD19/CD20二价CAR。在一些实施方案中，双特异性CAR是CD19/CD22二价CAR。
12.CAR
在某些实施方案中，细胞可包含编码CAR的外源基因。CAR(也称为嵌合免疫受体、嵌合T细胞受体或人工T细胞受体)是已经被工程化以给予宿主细胞(例如，T细胞)靶向特定蛋白质的新能力的受体蛋白。受体是嵌合的，因为它们将抗原结合和T细胞活化功能组合到单个受体中。本技术的多顺反子载体可用于在宿主细胞(例如，T细胞)中表达一种或多种CAR以用于针对各种靶抗原的基于细胞的疗法。由一个或多个表达盒表达的CAR可以是相同或不同的。在这些实施方案中，CAR可包含特异性结合靶抗原的细胞外结合结构域(也称为“结合物”)、跨膜结构域和细胞内信号传导结构域。在某些实施方案中，CAR还可包含一种或多种另外的元件，包括一种或多种信号肽、一种或多种细胞外铰链结构域和/或一种或多种细胞内共刺激结构域。结构域可以彼此直接相邻，或者可以存在连接结构域的一个或多个氨基酸。编码CAR的核苷酸序列可来源于哺乳动物序列，例如小鼠序列、灵长类动物序列、人序列或其组合。在编码CAR的核苷酸序列是非人类的情况下，CAR的序列可以是人源化的。编码CAR的核苷酸序列也可以是密码子优化的以在哺乳动物细胞(例如人细胞)中表达。在这些实施方案中的任一个中，编码CAR的核苷酸序列可与本文公开的核苷酸序列中的任一个具有至少80％同一性(例如，至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性)。序列变异可能是由密码子优化、人源化、基于限制酶的克隆疤痕和/或连接功能结构域的另外的氨基酸残基等造成的。
在某些实施方案中，CAR可在N末端包含信号肽。信号肽的非限制性实例包括CD8α信号肽、IgK信号肽和粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子受体亚基α(GMCSFR-α，也称为集落刺激因子2受体亚基α(CSF2RA))信号肽及其变体，所述信号肽的氨基酸序列在下表2中提供。
表2.信号肽的示例性序列
在某些实施方案中，CAR的细胞外结合结构域可包含对一种靶抗原或多种靶抗原具有特异性的一种或多种抗体。抗体可以是抗体片段，例如scFv，或单结构域抗体片段，例如VHH。在某些实施方案中，scFv可包含通过接头连接的抗体的重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)。VH和VL可以任一顺序连接，即VH-接头-VL或VL-接头-VH。接头的非限制性实例包括Whitlow接头、(G4S)n(n可以是正整数，例如，1、2、3、4、5、6等)接头及其变体。在某些实施方案中，抗原可以是唯一或优先在肿瘤细胞上表达的抗原，或者是自身免疫性或炎性疾病所特有的抗原。示例性靶抗原包括但不限于CD5、CD19、CD20、CD22、CD23、CD30、CD70、κ、λ和B细胞成熟剂(BCMA)、G蛋白偶联受体家族C 5组成员D(GPRC5D)(与白血病相关)；CS1/SLAMF7、CD38、CD138、GPRC5D、TACI和BCMA(与骨髓瘤相关)；GD2、HER2、EGFR、EGFRvIII、B7H3、PSMA、PSCA、CAIX、CD171、CEA、CSPG4、EPHA2、FAP、FRα、IL-13Rα、间皮素、MUC1、MUC16和ROR1(与实体瘤相关)。在这些实施方案中的任一个中，CAR的细胞外结合结构域可以针对在宿主细胞中的表达进行密码子优化，或具有变体序列以增加细胞外结合结构域的功能。
在某些实施方案中，CAR可包含铰链结构域，也称为间隔子。术语“铰链”和“间隔子”在本公开中可互换使用。铰链结构域的非限制性实例包括CD8α铰链结构域、CD28铰链结构域、IgG4铰链结构域、IgG4铰链-CH2-CH3结构域及其变体，所述铰链结构域的氨基酸序列在下表3中提供。
表3.铰链结构域的示例性序列
在某些实施方案中，CAR的跨膜结构域可包含以下的跨膜区：T细胞受体的α、β或ζ链、CD28、CD3ε、CD45、CD4、CD5、CD8、CD9、CD16、CD22、CD33、CD37、CD64、CD80、CD86、CD134、CD137、CD154或其功能变体，包括这些序列中每一个的人型式。在其他实施方案中，跨膜结构域可包含以下的跨膜区：CD8α、CD8β、4-1BB/CD137、CD28、CD34、CD4、FcεRIγ、CD16、OX40/CD134、CD3ζ、CD3ε、CD3γ、CD3δ、TCRα、TCRβ、TCRζ、CD32、CD64、CD64、CD45、CD5、CD9、CD22、CD37、CD80、CD86、CD40、CD40L/CD154、VEGFR2、FAS和FGFR2B或其功能变体，包括这些序列中每一个的人型式。表4提供了几个示例性跨膜结构域的氨基酸序列。
表4.跨膜结构域的示例性序列
在某些实施方案中，CAR的细胞内信号传导结构域和/或细胞内共刺激结构域可包含选自以下的一个或多个信号传导结构域：B7-1/CD80、B7-2/CD86、B7-H1/PD-L1、B7-H2、B7-H3、B7-H4、B7-H6、B7-H7、BTLA/CD272、CD28、CTLA4、Gi24/VISTA/B7-H5、ICOS/CD278、PD-1、PD-L2/B7-DC、PDCD6、4-1BB/TNFSF9/CD137、4-1BB配体/TNFSF9、BAFF/BLyS/TNFSF13B、BAFF R/TNFRSF13C、CD27/TNFRSF7、CD27配体/TNFSF7、CD30/TNFRSF8、CD30配体/TNFSF8、CD40/TNFRSF5、CD40/TNFSF5、CD40配体/TNFSF5、DR3/TNFRSF25、GITR/TNFRSF18、GITR配体/TNFSF18、HVEM/TNFRSF14、LIGHT/TNFSF14、淋巴毒素-α/TNFβ、OX40/TNFRSF4、OX40配体/TNFSF4、RELT/TNFRSF19L、TACI/TNFRSF13B、TL1A/TNFSF15、TNFα、TNF RII/TNFRSF1B、2B4/CD244/SLAMF4、BLAME/SLAMF8、CD2、CD2F-10/SLAMF9、CD48/SLAMF2、CD58/LFA-3、CD84/SLAMF5、CD229/SLAMF3、CRACC/SLAMF7、NTB-A/SLAMF6、SLAM/CD150、CD2、CD7、CD53、CD82/Kai-1、CD90/Thy1、CD96、CD160、CD200、CD300a/LMIR1、HLAI类、HLA-DR、Ikaros、整联蛋白α4/CD49d、整联蛋白α4β1、整联蛋白α4β7/LPAM-1、LAG-3、TCL1A、TCL1B、CRTAM、DAP12、Dectin-1/CLEC7A、DPPIV/CD26、EphB6、TIM-1/KIM-1/HAVCR、TIM-4、TSLP、TSLP R、淋巴细胞功能相关抗原1(LFA-1)、NKG2C、CD3ζ、基于免疫受体酪氨酸的活化基序(ITAM)、CD27、CD28、4-1BB、CD134/OX40、CD30、CD40、PD-1、ICOS、淋巴细胞功能相关抗原1(LFA-1)、CD2、CD7、LIGHT、NKG2C、B7-H3、与CD83特异性结合的配体以及其功能变体，包括这些序列中的每一个的人型式。在一些实施方案中，细胞内信号传导结构域和/或细胞内共刺激结构域包含选自CD3ζ结构域、ITAM、CD28结构域、4-1BB结构域或其功能变体的一个或多个信号传导结构域。表5提供了几个示例性细胞内共刺激和/或信号传导结构域的氨基酸序列。在某些实施方案中，如在下文所述的tisagenlecleucel的情况下，SEQ ID NO:18的CD3ζ信号传导结构域可在氨基酸位置14处具有突变，例如谷氨酰胺(Q)至赖氨酸(K)的突变(参见SEQ ID NO:115)。
表5.细胞内共刺激和/或信号传导结构域的示例性序列
在多顺反子载体编码两种或更多种CAR的某些实施方案中，如所述的那样，两种或更多种CAR可包含相同的功能结构域或一个或多个不同的功能结构域。例如，两种或更多种CAR可包含不同的信号肽、细胞外结合结构域、铰链结构域、跨膜结构域、共刺激结构域和/或细胞内信号传导结构域，以便最小化由于序列相似性引起的重组风险。或者，可替代地，两种或更多种CAR可包含相同的结构域。在使用一个或多个相同结构域和/或骨架的情况下，任选地在核苷酸序列水平上引入密码子分歧以最小化重组风险。
CD19 CAR
在一些实施方案中，CAR是CD19 CAR，并且在这些实施方案中，多顺反子载体包含表达盒，所述表达盒含有编码CD19 CAR的核苷酸序列。在一些实施方案中，CD19 CAR可包含串联的信号肽、特异性结合CD19的细胞外结合结构域、铰链结构域、跨膜结构域、细胞内共刺激结构域和/或细胞内信号传导结构域。
在一些实施方案中，CD19 CAR的信号肽包括CD8α信号肽。在一些实施方案中，CD8α信号肽包含SEQ ID NO:6中列出的氨基酸序列或由其组成，或者包含与SEQ ID NO:6中列出的氨基酸序列具有至少80％同一性(例如，至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性)的氨基酸序列或由其组成。在一些实施方案中，信号肽包括IgK信号肽。在一些实施方案中，IgK信号肽包含SEQ ID NO:7中列出的氨基酸序列或由其组成，或者包含与SEQ ID NO:7中列出的氨基酸序列具有至少80％同一性(例如，至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性)的氨基酸序列或由其组成。在一些实施方案中，信号肽包括GMCSFR-α或CSF2RA信号肽。在一些实施方案中，GMCSFR-α或CSF2RA信号肽包含SEQ ID NO:8中列出的氨基酸序列或由其组成，或者包含与SEQ ID NO:8中列出的氨基酸序列具有至少80％同一性(例如，至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性)的氨基酸序列或由其组成。
在一些实施方案中，CD19 CAR的细胞外结合结构域对CD19(例如人CD19)具有特异性。CD19 CAR的细胞外结合结构域可以针对在宿主细胞中的表达进行密码子优化，或可被密码子优化以具有变体序列以增加细胞外结合结构域的功能。在一些实施方案中，细胞外结合结构域包含免疫球蛋白分子的免疫原性活性部分，例如scFv。
在一些实施方案中，CD19 CAR的细胞外结合结构域包含衍生自FMC63单克隆抗体(FMC63)的scFv，其包含通过接头连接的FMC63的重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)。FMC63和衍生的scFv已经在Nicholson等人,Mol.Immun.34(16-17):1157-1165(1997)和PCT申请公布号WO2018/213337中描述，所述文献各自的全部内容通过引用并入本文。在一些实施方案中，完整的FMC63衍生的scFv(也称为FMC63 scFv)及其不同部分的氨基酸序列在下表6中提供。在一些实施方案中，CD19特异性scFv包含SEQ ID NO:19、20或25中列出的氨基酸序列或由其组成，或者包含与SEQ ID NO:19、20或25中列出的氨基酸序列具有至少80％同一性(例如，至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性)的氨基酸序列或由其组成。在一些实施方案中，CD19特异性scFv可包含一个或多个具有SEQ ID NO:21-23和26-28中列出的氨基酸序列的CDR。在一些实施方案中，CD19特异性scFv可包含具有一个或多个CDR的轻链，所述CDR具有SEQ ID NO:21-23中列出的氨基酸序列。在一些实施方案中，CD19特异性scFv可包含具有一个或多个CDR的重链，所述CDR具有SEQ ID NO:26-28中列出的氨基酸序列。在这些实施方案中的任一个中，CD19特异性scFv可包含一个或多个CDR，所述CDR包含一个或多个氨基酸取代或包含与所鉴定的任何序列具有至少80％同一性(例如，至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性)的序列。在一些实施方案中，CD19 CAR的细胞外结合结构域包含如本文所述的一个或多个CDR或由其组成。
在一些实施方案中，连接scFv的VH和VL部分的接头是具有SEQ ID NO:24中列出的氨基酸序列的Whitlow接头。在一些实施方案中，Whitlow接头可以被不同的接头替代，例如具有SEQ ID NO:30中列出的氨基酸序列的3xG4S接头，其产生不同的FMC63衍生的具有SEQID NO:29中列出的氨基酸序列的scFv。在这些实施方案中的某些中，CD19特异性scFv包含SEQ ID NO:29中列出的氨基酸序列或由其组成，或者包含与SEQ ID NO:29中列出的氨基酸序列具有至少80％同一性(例如，至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性)的氨基酸序列或由其组成。
表6.抗CD19 scFv和组分的示例性序列
在一些实施方案中，CD19 CAR的细胞外结合结构域来源于对CD19具有特异性的抗体，包括例如SJ25C1(Bejcek等人,Cancer Res.55:2346-2351(1995))、HD37(Pezutto等人,J.Immunol.138(9):2793-2799(1987))、4G7(Meeker等人,Hybridoma 3:305-320(1984))、B43(Bejcek(1995))、BLY3(Bejcek(1995))、B4(Freedman等人,70:418-427(1987))、B4HB12b(Kansas和Tedder,J.Immunol.147:4094-4102(1991)；Yazawa等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 102:15178-15183(2005)；Herbst等人,J.Pharmacol.Exp.Ther.335:213-222(2010))、BU12(Callard等人,J.Immunology,148(10):2983-2987(1992))和CLB-CD19(De Rie Cell.Immunol.118:368-381(1989))。在这些实施方案中的任一个中，CD19 CAR的细胞外结合结构域可包含任何抗体的VH、VL和/或一个或多个CDR或由其组成。
在一些实施方案中，CD19 CAR的铰链结构域包括CD8α铰链结构域，例如人CD8α铰链结构域。在一些实施方案中，CD8α铰链结构域包含SEQ ID NO:9中列出的氨基酸序列或由其组成，或者包含与SEQ ID NO:9中列出的氨基酸序列具有至少80％同一性(例如，至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性)的氨基酸序列或由其组成。在一些实施方案中，铰链结构域包括CD28铰链结构域，例如人CD28铰链结构域。在一些实施方案中，CD28铰链结构域包含SEQ ID NO:10中列出的氨基酸序列或由其组成，或者包含与SEQ ID NO:10中列出的氨基酸序列具有至少80％同一性(例如，至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性)的氨基酸序列或由其组成。在一些实施方案中，铰链结构域包括IgG4铰链结构域，例如人IgG4铰链结构域。在一些实施方案中，IgG4铰链结构域包含SEQ ID NO:11或SEQ ID NO:12中列出的氨基酸序列或由其组成，或者包含与SEQ ID NO:11或SEQ ID NO:12中列出的氨基酸序列具有至少80％同一性(例如，至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性)的氨基酸序列或由其组成。在一些实施方案中，铰链结构域包括IgG4铰链-Ch2-Ch3结构域，例如人IgG4铰链-Ch2-Ch3结构域。在一些实施方案中，IgG4铰链-Ch2-Ch3结构域包含SEQ ID NO:13中列出的氨基酸序列或由其组成，或者包含与SEQ ID NO:13中列出的氨基酸序列具有至少80％同一性(例如，至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性)的氨基酸序列或由其组成。
在一些实施方案中，CD19 CAR的跨膜结构域包括CD8α跨膜结构域，例如人CD8α跨膜结构域。在一些实施方案中，CD8α跨膜结构域包含SEQ ID NO:14中列出的氨基酸序列或由其组成，或者包含与SEQ ID NO:14中列出的氨基酸序列具有至少80％同一性(例如，至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性)的氨基酸序列或由其组成。在一些实施方案中，跨膜结构域包括CD28跨膜结构域，例如人CD28跨膜结构域。在一些实施方案中，CD28跨膜结构域包含SEQ ID NO:15中列出的氨基酸序列或由其组成，或者包含与SEQ ID NO:15中列出的氨基酸序列具有至少80％同一性(例如，至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性)的氨基酸序列或由其组成。
在一些实施方案中，CD19 CAR的细胞内共刺激结构域包括4-1BB共刺激结构域。4-1BB，也称为CD137，向T细胞传递有效的共刺激信号，从而促进分化并增强T淋巴细胞的长期存活。在一些实施方案中，4-1BB共刺激结构域是人的。在一些实施方案中，4-1BB共刺激结构域包含SEQ ID NO:16中列出的氨基酸序列或由其组成，或者包含与SEQ ID NO:16中列出的氨基酸序列具有至少80％同一性(例如，至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性)的氨基酸序列或由其组成。在一些实施方案中，细胞内共刺激结构域包括CD28共刺激结构域。CD28是T细胞上的另一种共刺激分子。在一些实施方案中，CD28共刺激结构域是人的。在一些实施方案中，CD28共刺激结构域包含SEQ ID NO:17中列出的氨基酸序列或由其组成，或者包含与SEQ ID NO:17中列出的氨基酸序列具有至少80％同一性(例如，至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性)的氨基酸序列或由其组成。在一些实施方案中，CD19 CAR的细胞内共刺激结构域包括如所述的4-1BB共刺激结构域和CD28共刺激结构域。
在一些实施方案中，CD19 CAR的细胞内信号传导结构域包括CD3泽塔(ζ)信号传导结构域。CD3ζ与T细胞受体(TCR)缔合以产生信号，并且含有基于免疫受体酪氨酸的活化基序(ITAM)。CD3ζ信号传导结构域是指来自ζ链的细胞质结构域的氨基酸残基，其足以功能性地传递T细胞活化所必需的初始信号。在一些实施方案中，CD3ζ信号传导结构域是人的。在一些实施方案中，CD3ζ信号传导结构域包含SEQ ID NO:18中列出的氨基酸序列或由其组成，或者包含与SEQ ID NO:18中列出的氨基酸序列具有至少80％同一性(例如，至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性)的氨基酸序列或由其组成。
在一些实施方案中，多顺反子载体包含表达盒，所述表达盒含有编码CD19 CAR的核苷酸序列，所述CD19 CAR包括例如包含以下的CD19 CAR：具有SEQ ID NO:19或SEQ IDNO:29中列出的序列的CD19特异性scFv、SEQ ID NO:9的CD8α铰链结构域、SEQ ID NO:14的CD8α跨膜结构域、SEQ ID NO:16的4-1BB共刺激结构域、SEQ ID NO:18的CD3ζ信号传导结构域和/或其变体(即，具有与所公开的序列具有至少80％同一性，例如至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99同一性的序列)。在这些实施方案中的任一个中，CD19 CAR可另外包含如所描述的信号肽(例如，CD8α信号肽)。
在一些实施方案中，多顺反子载体包含表达盒，所述表达盒含有编码CD19 CAR的核苷酸序列，所述CD19 CAR包括例如包含以下的CD19 CAR：具有SEQ ID NO:19或SEQ IDNO:29中列出的序列的CD19特异性scFv、SEQ ID NO:11或SEQ ID NO:12的IgG4铰链结构域、SEQ ID NO:15的CD28跨膜结构域、SEQ ID NO:16的4-1BB共刺激结构域、SEQ ID NO:18的CD3ζ信号传导结构域和/或其变体(即，具有与所公开的序列具有至少80％同一性，例如至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99同一性的序列)。在这些实施方案中的任一个中，CD19 CAR可另外包含如所描述的信号肽(例如，CD8α信号肽)。
在一些实施方案中，多顺反子载体包含表达盒，所述表达盒含有编码CD19 CAR的核苷酸序列，所述CD19 CAR包括例如包含以下的CD19 CAR：具有SEQ ID NO:19或SEQ IDNO:29中列出的序列的CD19特异性scFv、SEQ ID NO:10的CD28铰链结构域、SEQ ID NO:15的CD28跨膜结构域、SEQ ID NO:17的CD28共刺激结构域、SEQ ID NO:18的CD3ζ信号传导结构域和/或其变体(即，具有与所公开的序列具有至少80％同一性，例如至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99同一性的序列)。在这些实施方案中的任一个中，CD19 CAR可另外包含如所描述的信号肽(例如，CD8α信号肽)。
在一些实施方案中，多顺反子载体包含含有核苷酸序列的表达盒，所述核苷酸序列编码SEQ ID NO:116中列出的CD19 CAR或与SEQ ID NO:116中列出的核苷酸序列具有至少80％同一性(例如，至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性)(参见表7)。所编码的CD19 CAR具有SEQ ID NO:117中列出的对应氨基酸序列，或者与SEQ ID NO:117中列出的氨基酸序列具有至少80％同一性(例如，至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性)，具有以下组分：CD8α信号肽、FMC63 scFv(VL-Whitlow接头-VH)、CD8α铰链结构域、CD8α跨膜结构域、4-1BB共刺激结构域和CD3ζ信号传导结构域。
在一些实施方案中，多顺反子载体包含表达盒，所述表达盒含有编码CD19 CAR的可商购获得的实施方案的核苷酸序列。由T细胞表达和/或编码的CD19 CAR的可商购获得的实施方案的非限制性实例包括tisagenlecleucel、lisocabtagene maraleucel、axicabtagene ciloleucel和brexucabtagene autoleucel。
在一些实施方案中，多顺反子载体包含表达盒，所述表达盒含有编码tisagenlecleucel或其部分的核苷酸序列。tisagenlecleucel包含具有以下组分的CD19CAR：CD8α信号肽、FMC63 scFv(VL-3xG4S接头-VH)、CD8α铰链结构域、CD8α跨膜结构域、4-1BB共刺激结构域和CD3ζ信号传导结构域。tisagenlecleucel中的CD19 CAR的核苷酸和氨基酸序列在表7中提供，序列注释在表8中提供。
在一些实施方案中，多顺反子载体包含表达盒，所述表达盒含有编码lisocabtagene maraleucel或其部分的核苷酸序列。lisocabtagene maraleucel包含具有以下组分的CD19 CAR：GMCSFR-α或CSF2RA信号肽、FMC63 scFv(VL-Whitlow接头-VH)、IgG4铰链结构域、CD28跨膜结构域、4-1BB共刺激结构域和CD3ζ信号传导结构域。lisocabtagenemaraleucel中的CD19 CAR的核苷酸和氨基酸序列在表7中提供，序列注释在表9中提供。
在一些实施方案中，多顺反子载体包含表达盒，所述表达盒含有编码axicabtagene ciloleucel或其部分的核苷酸序列。axicabtagene ciloleucel包含具有以下组分的CD19 CAR：GMCSFR-α或CSF2RA信号肽、FMC63 scFv(VL-Whitlow接头-VH)、CD28铰链结构域、CD28跨膜结构域、CD28共刺激结构域和CD3ζ信号传导结构域。axicabtageneciloleucel中的CD19 CAR的核苷酸和氨基酸序列在表7中提供，序列注释在表10中提供。
在一些实施方案中，多顺反子载体包含表达盒，所述表达盒含有编码brexucabtagene autoleucel或其部分的核苷酸序列。brexucabtagene autoleucel包含具有以下组分的CD19 CAR：GMCSFR-α信号肽、FMC63 scFv、CD28铰链结构域、CD28跨膜结构域、CD28共刺激结构域和CD3ζ信号传导结构域。
在一些实施方案中，多顺反子载体包含含有核苷酸序列的表达盒，所述核苷酸序列编码SEQ ID NO:31、33或35中列出的CD19CAR或与SEQ ID NO:31、33或35中列出的核苷酸序列具有至少80％同一性(例如，至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性)。所编码的CD19 CAR具有SEQ ID NO:32、34或36中分别列出的对应氨基酸序列，或者与SEQ ID NO:32、34或36中分别列出的氨基酸序列具有至少80％同一性(例如，至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性)。
表7.CD19 CAR的示例性序列
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表8.tisagenlecleucel CD19 CAR序列的注释
表9.lisocabtagene maraleucel CD19 CAR序列的注释
表10.axicabtagene ciloleucel CD19 CAR序列的注释
在一些实施方案中，多顺反子载体包含含有核苷酸序列的表达盒，所述核苷酸序列编码SEQ ID NO:31、33或35中列出的CD19CAR或与SEQ ID NO:31、33或35中列出的核苷酸序列具有至少80％同一性(例如，至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性)。所编码的CD19 CAR具有SEQ ID NO:32、34或36中分别列出的对应氨基酸序列、与SEQ ID NO:32、34或36中分别列出的氨基酸序列具有至少80％同一性(例如，至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性)。
CD20 CAR
在一些实施方案中，CAR是CD20 CAR，并且在这些实施方案中，多顺反子载体包含表达盒，所述表达盒含有编码CD20 CAR的核苷酸序列。CD20是一种早在祖B细胞阶段在B细胞表面上存在的抗原，其水平逐渐增加直到B细胞成熟，其还存在于大多数B细胞赘生物的细胞上。有时在霍奇金病、骨髓瘤和胸腺瘤病例中也发现CD20阳性细胞。在一些实施方案中，CD20 CAR可包含串联的信号肽、特异性结合CD20的细胞外结合结构域、铰链结构域、跨膜结构域、细胞内共刺激结构域和/或细胞内信号传导结构域。
在一些实施方案中，CD20 CAR的信号肽包括CD8α信号肽。在一些实施方案中，CD8α信号肽包含SEQ ID NO:6中列出的氨基酸序列或由其组成，或者包含与SEQ ID NO:6中列出的氨基酸序列具有至少80％同一性(例如，至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性)的氨基酸序列或由其组成。在一些实施方案中，信号肽包括IgK信号肽。在一些实施方案中，IgK信号肽包含SEQ ID NO:7中列出的氨基酸序列或由其组成，或者包含与SEQ ID NO:7中列出的氨基酸序列具有至少80％同一性(例如，至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性)的氨基酸序列或由其组成。在一些实施方案中，信号肽包括GMCSFR-α或CSF2RA信号肽。在一些实施方案中，GMCSFR-α或CSF2RA信号肽包含SEQ ID NO:8中列出的氨基酸序列或由其组成，或者包含与SEQ ID NO:8中列出的氨基酸序列具有至少80％同一性(例如，至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性)的氨基酸序列或由其组成。
在一些实施方案中，CD20 CAR的细胞外结合结构域对CD20(例如人CD20)具有特异性。CD20 CAR的细胞外结合结构域可以针对在宿主细胞中的表达进行密码子优化，或可被密码子优化以具有变体序列以增加细胞外结合结构域的功能。在一些实施方案中，细胞外结合结构域包含免疫球蛋白分子的免疫原性活性部分，例如scFv。
在一些实施方案中，CD20 CAR的细胞外结合结构域来源于对CD20具有特异性的抗体，包括例如Leu16、IF5、1.5.3、利妥昔单抗(rituximab)、奥比妥珠单抗(obinutuzumab)、替伊莫单抗(ibritumomab)、奥法木单抗(ofatumumab)、托西莫单抗(tositumumab)、奥尼妥单抗(odronextamab)、维妥珠单抗(veltuzumab)、乌妥昔单抗(ublituximab)和奥克莱珠单抗(ocrelizumab)。在这些实施方案中的任一个中，CD20CAR的细胞外结合结构域可包含任何抗体的VH、VL和/或一个或多个CDR或由其组成。
在一些实施方案中，CD20 CAR的细胞外结合结构域包含衍生自Leu16单克隆抗体的scFv，其包含通过接头连接的Leu16的重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)。参见Wu等人,Protein Engineering.14(12):1025-1033(2001)。在一些实施方案中，接头是3xG4S接头。在其他实施方案中，接头是如本文所述的Whitlow接头。在一些实施方案中，完整的Leu16衍生的scFv(也称为Leu16 scFv)的不同部分及其不同部分的氨基酸序列在下表11中提供。在一些实施方案中，CD20特异性scFv包含SEQ ID NO:37、38或42中列出的氨基酸序列或由其组成，或者包含与SEQ ID NO:37、38或42中列出的氨基酸序列具有至少80％同一性(例如，至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性)的氨基酸序列或由其组成。在一些实施方案中，CD20特异性scFv可包含一个或多个具有SEQ ID NO:39-41、43和44中列出的氨基酸序列的CDR。在一些实施方案中，CD20特异性scFv可包含具有一个或多个CDR的轻链，所述CDR具有SEQ ID NO:39-41中列出的氨基酸序列。在一些实施方案中，CD20特异性scFv可包含具有一个或多个CDR的重链，所述CDR具有SEQ ID NO:43-44中列出的氨基酸序列。在这些实施方案中的任一个中，CD20特异性scFv可包含一个或多个CDR，所述CDR包含一个或多个氨基酸取代或包含与所鉴定的任何序列具有至少80％同一性(例如，至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性)的序列。在一些实施方案中，CD20 CAR的细胞外结合结构域包含如本文所述的一个或多个CDR或由其组成。
表11.抗CD20 scFv和组分的示例性序列
在一些实施方案中，CD20 CAR的铰链结构域包含CD8α铰链结构域，例如人CD8α铰链结构域。在一些实施方案中，CD8α铰链结构域包含SEQ ID NO:9中列出的氨基酸序列或由其组成，或者包含与SEQ ID NO:9中列出的氨基酸序列具有至少80％同一性(例如，至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性)的氨基酸序列或由其组成。在一些实施方案中，铰链结构域包括CD28铰链结构域，例如人CD28铰链结构域。在一些实施方案中，CD28铰链结构域包含SEQ ID NO:10中列出的氨基酸序列或由其组成，或者包含与SEQ ID NO:10中列出的氨基酸序列具有至少80％同一性(例如，至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性)的氨基酸序列或由其组成。在一些实施方案中，铰链结构域包括IgG4铰链结构域，例如人IgG4铰链结构域。在一些实施方案中，IgG4铰链结构域包含SEQ ID NO:11或SEQ ID NO:12中列出的氨基酸序列或由其组成，或者包含与SEQ ID NO:11或SEQ ID NO:12中列出的氨基酸序列具有至少80％同一性(例如，至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性)的氨基酸序列或由其组成。在一些实施方案中，铰链结构域包括IgG4铰链-Ch2-Ch3结构域，例如人IgG4铰链-Ch2-Ch3结构域。在一些实施方案中，IgG4铰链-Ch2-Ch3结构域包含SEQ ID NO:13中列出的氨基酸序列或由其组成，或者包含与SEQ ID NO:13中列出的氨基酸序列具有至少80％同一性(例如，至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性)的氨基酸序列或由其组成。
在一些实施方案中，CD20 CAR的跨膜结构域包括CD8α跨膜结构域，例如人CD8α跨膜结构域。在一些实施方案中，CD8α跨膜结构域包含SEQ ID NO:14中列出的氨基酸序列或由其组成，或者包含与SEQ ID NO:14中列出的氨基酸序列具有至少80％同一性(例如，至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性)的氨基酸序列或由其组成。在一些实施方案中，跨膜结构域包括CD28跨膜结构域，例如人CD28跨膜结构域。在一些实施方案中，CD28跨膜结构域包含SEQ ID NO:15中列出的氨基酸序列或由其组成，或者包含与SEQ ID NO:15中列出的氨基酸序列具有至少80％同一性(例如，至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性)的氨基酸序列或由其组成。
在一些实施方案中，CD20 CAR的细胞内共刺激结构域包括4-1BB共刺激结构域，例如人4-1BB共刺激结构域。在一些实施方案中，4-1BB共刺激结构域包含SEQ ID NO:16中列出的氨基酸序列或由其组成，或者包含与SEQ ID NO:16中列出的氨基酸序列具有至少80％同一性(例如，至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性)的氨基酸序列或由其组成。在一些实施方案中，细胞内共刺激结构域包括CD28共刺激结构域，例如人CD28共刺激结构域。在一些实施方案中，CD28共刺激结构域包含SEQ ID NO:17中列出的氨基酸序列或由其组成，或者包含与SEQ ID NO:17中列出的氨基酸序列具有至少80％同一性(例如，至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性)的氨基酸序列或由其组成。
在一些实施方案中，CD20 CAR的细胞内信号传导结构域包括CD3泽塔(ζ)信号传导结构域，例如人CD3ζ信号传导结构域。在一些实施方案中，CD3ζ信号传导结构域包含SEQ IDNO:18中列出的氨基酸序列或由其组成，或者包含与SEQ ID NO:18中列出的氨基酸序列具有至少80％同一性(例如，至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性)的氨基酸序列或由其组成。
在一些实施方案中，多顺反子载体包含表达盒，所述表达盒含有编码CD20 CAR的核苷酸序列，所述CD20 CAR包括例如包含以下的CD20 CAR：具有SEQ ID NO:37中列出的序列的CD20特异性scFv、SEQ ID NO:9的CD8α铰链结构域、SEQ ID NO:14的CD8α跨膜结构域、SEQ ID NO:16的4-1BB共刺激结构域、SEQ ID NO:18的CD3ζ信号传导结构域和/或其变体(即，具有与所公开的序列具有至少80％同一性，例如至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99同一性的序列)。
在一些实施方案中，多顺反子载体包含表达盒，所述表达盒含有编码CD20 CAR的核苷酸序列，所述CD20 CAR包括例如包含以下的CD20 CAR：具有SEQ ID NO:37中列出的序列的CD20特异性scFv、SEQ ID NO:10的CD28铰链结构域、SEQ ID NO:14的CD8α跨膜结构域、SEQ ID NO:16的4-1BB共刺激结构域、SEQ ID NO:18的CD3ζ信号传导结构域和/或其变体(即，具有与所公开的序列具有至少80％同一性，例如至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99同一性的序列)。
在一些实施方案中，多顺反子载体包含表达盒，所述表达盒含有编码CD20 CAR的核苷酸序列，所述CD20 CAR包括例如包含以下的CD20 CAR：具有SEQ ID NO:37中列出的序列的CD20特异性scFv、SEQ ID NO:11或SEQ ID NO:12的IgG4铰链结构域、SEQ ID NO:14的CD8α跨膜结构域、SEQ ID NO:16的4-1BB共刺激结构域、SEQ ID NO:18的CD3ζ信号传导结构域和/或其变体(即，具有与所公开的序列具有至少80％同一性，例如至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99同一性的序列)。
在一些实施方案中，多顺反子载体包含表达盒，所述表达盒含有编码CD20 CAR的核苷酸序列，所述CD20 CAR包括例如包含以下的CD20 CAR：具有SEQ ID NO:37中列出的序列的CD20特异性scFv、SEQ ID NO:9的CD8α铰链结构域、SEQ ID NO:15的CD28跨膜结构域、SEQ ID NO:16的4-1BB共刺激结构域、SEQ ID NO:18的CD3ζ信号传导结构域和/或其变体(即，具有与所公开的序列具有至少80％同一性，例如至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99同一性的序列)。
在一些实施方案中，多顺反子载体包含表达盒，所述表达盒含有编码CD20 CAR的核苷酸序列，所述CD20 CAR包括例如包含以下的CD20 CAR：具有SEQ ID NO:37中列出的序列的CD20特异性scFv、SEQ ID NO:10的CD28铰链结构域、SEQ ID NO:15的CD28跨膜结构域、SEQ ID NO:16的4-1BB共刺激结构域、SEQ ID NO:18的CD3ζ信号传导结构域和/或其变体(即，具有与所公开的序列具有至少80％同一性，例如至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99同一性的序列)。
在一些实施方案中，多顺反子载体包含表达盒，所述表达盒含有编码CD20 CAR的核苷酸序列，所述CD20 CAR包括例如包含以下的CD20 CAR：具有SEQ ID NO:37中列出的序列的CD20特异性scFv、SEQ ID NO:11或SEQ ID NO:1的IgG4铰链结构域、SEQ ID NO:15的CD28跨膜结构域、SEQ ID NO:16的4-1BB共刺激结构域、SEQ ID NO:18的CD3ζ信号传导结构域和/或其变体(即，具有与所公开的序列具有至少80％同一性，例如至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99同一性的序列)。
CD22 CAR
在一些实施方案中，CAR是CD22 CAR，并且在这些实施方案中，多顺反子载体包含表达盒，所述表达盒含有编码CD22 CAR的核苷酸序列。CD22是一种跨膜蛋白，其主要存在于成熟B细胞的表面上，充当B细胞受体(BCR)信号传导的抑制性受体。CD22在60％-70％的B细胞淋巴瘤和白血病(例如，慢性B淋巴细胞白血病、毛细胞白血病、急性淋巴细胞白血病(ALL)和伯基特淋巴瘤(Burkitt's lymphoma))中表达，并且在B细胞发育早期阶段的细胞表面或干细胞上不存在。在一些实施方案中，CD22 CAR可包含串联的信号肽、特异性结合CD22的细胞外结合结构域、铰链结构域、跨膜结构域、细胞内共刺激结构域和/或细胞内信号传导结构域。
在一些实施方案中，CD22 CAR的信号肽包括CD8α信号肽。在一些实施方案中，CD8α信号肽包含SEQ ID NO:6中列出的氨基酸序列或由其组成，或者包含与SEQ ID NO:6中列出的氨基酸序列具有至少80％同一性(例如，至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性)的氨基酸序列或由其组成。在一些实施方案中，信号肽包括IgK信号肽。在一些实施方案中，IgK信号肽包含SEQ ID NO:7中列出的氨基酸序列或由其组成，或者包含与SEQ ID NO:7中列出的氨基酸序列具有至少80％同一性(例如，至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性)的氨基酸序列或由其组成。在一些实施方案中，信号肽包括GMCSFR-α或CSF2RA信号肽。在一些实施方案中，GMCSFR-α或CSF2RA信号肽包含SEQ ID NO:8中列出的氨基酸序列或由其组成，或者包含与SEQ ID NO:8中列出的氨基酸序列具有至少80％同一性(例如，至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性)的氨基酸序列或由其组成。
在一些实施方案中，CD22 CAR的细胞外结合结构域对CD22(例如人CD22)具有特异性。CD22 CAR的细胞外结合结构域可以针对在宿主细胞中的表达进行密码子优化，或可被密码子优化以具有变体序列以增加细胞外结合结构域的功能。在一些实施方案中，细胞外结合结构域包含免疫球蛋白分子的免疫原性活性部分，例如scFv。
在一些实施方案中，CD22 CAR的细胞外结合结构域来源于对CD22具有特异性的抗体，包括例如SM03、奥英妥珠单抗(inotuzumab)、依帕珠单抗(epratuzumab)、莫塞妥莫单抗(moxetumomab)和匹那妥珠单抗(pinatuzumab)。在这些实施方案中的任一个中，CD22CAR的细胞外结合结构域可包含任何抗体的VH、VL和/或一个或多个CDR或由其组成。
在一些实施方案中，CD22 CAR的细胞外结合结构域包含衍生自m971单克隆抗体(m971)的scFv，其包含通过接头连接的m971的重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)。在一些实施方案中，接头是3xG4S接头。在其他实施方案中，可改用Whitlow接头。在一些实施方案中，完整的m971衍生的scFv(也称为m971 scFv)及其不同部分的氨基酸序列在下表12中提供。在一些实施方案中，CD22特异性scFv包含SEQ ID NO:45、46或50中列出的氨基酸序列或由其组成，或者包含与SEQ ID NO:45、46或50中列出的氨基酸序列具有至少80％同一性(例如，至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性)的氨基酸序列或由其组成。在一些实施方案中，CD22特异性scFv可包含一个或多个具有SEQ ID NO:47-49和51-53中列出的氨基酸序列的CDR。在一些实施方案中，CD22特异性scFv可包含具有一个或多个CDR的重链，所述CDR具有SEQ ID NO:47-49中列出的氨基酸序列。在一些实施方案中，CD22特异性scFv可包含具有一个或多个CDR的轻链，所述CDR具有SEQ ID NO:51-53中列出的氨基酸序列。在这些实施方案中的任一个中，CD22特异性scFv可包含一个或多个CDR，所述CDR包含一个或多个氨基酸取代或包含与所鉴定的任何序列具有至少80％同一性(例如，至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性)的序列。在一些实施方案中，CD22 CAR的细胞外结合结构域包含如本文所述的一个或多个CDR或由其组成。
在一些实施方案中，CD22 CAR的细胞外结合结构域包含衍生自m971-L7的scFv，m971-L7是m971的亲和力成熟变体，与亲本抗体m971相比具有显著改善的CD22结合亲和力(从约2nM改善至小于50pM)。在一些实施方案中，衍生自m971-L7的scFv包含通过3xG4S接头连接的m971-L7的VH和VL。在其他实施方案中，可改用Whitlow接头。在一些实施方案中，完整的m971-L7衍生的scFv(也称为m971-L7 scFv)及其不同部分的氨基酸序列在下表12中提供。在一些实施方案中，CD22特异性scFv包含SEQ ID NO:54、55或59中列出的氨基酸序列或由其组成，或者包含与SEQ ID NO:54、55或59中列出的氨基酸序列具有至少80％同一性(例如，至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性)的氨基酸序列或由其组成。在一些实施方案中，CD22特异性scFv可包含一个或多个具有SEQ ID NO:56-58和60-62中列出的氨基酸序列的CDR。在一些实施方案中，CD22特异性scFv可包含具有一个或多个CDR的重链，所述CDR具有SEQ ID NO:56-58中列出的氨基酸序列。在一些实施方案中，CD22特异性scFv可包含具有一个或多个CDR的轻链，所述CDR具有SEQ ID NO:60-62中列出的氨基酸序列。在这些实施方案中的任一个中，CD22特异性scFv可包含一个或多个CDR，所述CDR包含一个或多个氨基酸取代或包含与所鉴定的任何序列具有至少80％同一性(例如，至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性)的序列。在一些实施方案中，CD22 CAR的细胞外结合结构域包含如本文所述的一个或多个CDR或由其组成。
表12.抗CD22 scFv和组分的示例性序列
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在一些实施方案中，CD22 CAR的细胞外结合结构域包含免疫毒素HA22或BL22。免疫毒素BL22和HA22是治疗剂，其包含与细菌毒素融合的对CD22具有特异性的scFv，因此可以与表达CD22的癌细胞的表面结合并杀伤癌细胞。BL22包含抗CD22抗体RFB4的dsFv，其与假单胞菌(Pseudomonas)外毒素A的38-kDa截短形式融合(Bang等人,Clin.Cancer Res.,11:1545-50(2005))。HA22(CAT8015，莫塞妥莫单抗(moxetumomab pasudotox))是BL22的突变的、亲和力更高的型式(Ho等人,J.Biol.Chem.,280(1):607-17(2005))。对CD22具有特异性的HA22和BL22的抗原结合结构域的合适序列公开于例如美国专利号7,541,034；7,355,012；以及7,982,011，所述专利特此通过引用整体并入。
在一些实施方案中，CD22 CAR的铰链结构域包括CD8α铰链结构域，例如人CD8α铰链结构域。在一些实施方案中，CD8α铰链结构域包含SEQ ID NO:9中列出的氨基酸序列或由其组成，或者包含与SEQ ID NO:9中列出的氨基酸序列具有至少80％同一性(例如，至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性)的氨基酸序列或由其组成。在一些实施方案中，铰链结构域包括CD28铰链结构域，例如人CD28铰链结构域。在一些实施方案中，CD28铰链结构域包含SEQ ID NO:10中列出的氨基酸序列或由其组成，或者包含与SEQ ID NO:10中列出的氨基酸序列具有至少80％同一性(例如，至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性)的氨基酸序列或由其组成。在一些实施方案中，铰链结构域包括IgG4铰链结构域，例如人IgG4铰链结构域。在一些实施方案中，IgG4铰链结构域包含SEQ ID NO:11或SEQ ID NO:12中列出的氨基酸序列或由其组成，或者包含与SEQ ID NO:11或SEQ ID NO:12中列出的氨基酸序列具有至少80％同一性(例如，至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性)的氨基酸序列或由其组成。在一些实施方案中，铰链结构域包括IgG4铰链-Ch2-Ch3结构域，例如人IgG4铰链-Ch2-Ch3结构域。在一些实施方案中，IgG4铰链-Ch2-Ch3结构域包含SEQ ID NO:13中列出的氨基酸序列或由其组成，或者包含与SEQ ID NO:13中列出的氨基酸序列具有至少80％同一性(例如，至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性)的氨基酸序列或由其组成。
在一些实施方案中，CD22 CAR的跨膜结构域包括CD8α跨膜结构域，例如人CD8α跨膜结构域。在一些实施方案中，CD8α跨膜结构域包含SEQ ID NO:14中列出的氨基酸序列或由其组成，或者包含与SEQ ID NO:14中列出的氨基酸序列具有至少80％同一性(例如，至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性)的氨基酸序列或由其组成。在一些实施方案中，跨膜结构域包括CD28跨膜结构域，例如人CD28跨膜结构域。在一些实施方案中，CD28跨膜结构域包含SEQ ID NO:15中列出的氨基酸序列或由其组成，或者包含与SEQ ID NO:15中列出的氨基酸序列具有至少80％同一性(例如，至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性)的氨基酸序列或由其组成。
在一些实施方案中，CD22 CAR的细胞内共刺激结构域包括4-1BB共刺激结构域，例如人4-1BB共刺激结构域。在一些实施方案中，4-1BB共刺激结构域包含SEQ ID NO:16中列出的氨基酸序列或由其组成，或者包含与SEQ ID NO:16中列出的氨基酸序列具有至少80％同一性(例如，至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性)的氨基酸序列或由其组成。在一些实施方案中，细胞内共刺激结构域包括CD28共刺激结构域，例如人CD28共刺激结构域。在一些实施方案中，CD28共刺激结构域包含SEQ ID NO:17中列出的氨基酸序列或由其组成，或者包含与SEQ ID NO:17中列出的氨基酸序列具有至少80％同一性(例如，至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性)的氨基酸序列或由其组成。
在一些实施方案中，CD22 CAR的细胞内信号传导结构域包括CD3泽塔(ζ)信号传导结构域，例如人CD3ζ信号传导结构域。在一些实施方案中，CD3ζ信号传导结构域包含SEQ IDNO:18中列出的氨基酸序列或由其组成，或者包含与SEQ ID NO:18中列出的氨基酸序列具有至少80％同一性(例如，至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性)的氨基酸序列或由其组成。
在一些实施方案中，多顺反子载体包含表达盒，所述表达盒含有编码CD22 CAR的核苷酸序列，所述CD22 CAR包括例如包含以下的CD22 CAR：具有SEQ ID NO:45或SEQ IDNO:54中列出的序列的CD22特异性scFv、SEQ ID NO:9的CD8α铰链结构域、SEQ ID NO:14的CD8α跨膜结构域、SEQ ID NO:16的4-1BB共刺激结构域、SEQ ID NO:18的CD3ζ信号传导结构域和/或其变体(即，具有与所公开的序列具有至少80％同一性，例如至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99同一性的序列)。
在一些实施方案中，多顺反子载体包含表达盒，所述表达盒含有编码CD22 CAR的核苷酸序列，所述CD22 CAR包括例如包含以下的CD22 CAR：具有SEQ ID NO:45或SEQ IDNO:54中列出的序列的CD22特异性scFv、SEQ ID NO:10的CD28铰链结构域、SEQ ID NO:14的CD8α跨膜结构域、SEQ ID NO:16的4-1BB共刺激结构域、SEQ ID NO:18的CD3ζ信号传导结构域和/或其变体(即，具有与所公开的序列具有至少80％同一性，例如至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99同一性的序列)。
在一些实施方案中，多顺反子载体包含表达盒，所述表达盒含有编码CD22 CAR的核苷酸序列，所述CD22 CAR包括例如包含以下的CD22 CAR：具有SEQ ID NO:45或SEQ IDNO:54中列出的序列的CD22特异性scFv、SEQ ID NO:11或SEQ ID NO:12的IgG4铰链结构域、SEQ ID NO:14的CD8α跨膜结构域、SEQ ID NO:16的4-1BB共刺激结构域、SEQ ID NO:18的CD3ζ信号传导结构域和/或其变体(即，具有与所公开的序列具有至少80％同一性，例如至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99同一性的序列)。
在一些实施方案中，多顺反子载体包含表达盒，所述表达盒含有编码CD22 CAR的核苷酸序列，所述CD22 CAR包括例如包含以下的CD22 CAR：具有SEQ ID NO:45或SEQ IDNO:54中列出的序列的CD22特异性scFv、SEQ ID NO:9的CD8α铰链结构域、SEQ ID NO:15的CD28跨膜结构域、SEQ ID NO:16的4-1BB共刺激结构域、SEQ ID NO:18的CD3ζ信号传导结构域和/或其变体(即，具有与所公开的序列具有至少80％同一性，例如至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99同一性的序列)。
在一些实施方案中，多顺反子载体包含表达盒，所述表达盒含有编码CD22 CAR的核苷酸序列，所述CD22 CAR包括例如包含以下的CD22 CAR：具有SEQ ID NO:45或SEQ IDNO:54中列出的序列的CD22特异性scFv、SEQ ID NO:10的CD28铰链结构域、SEQ ID NO:15的CD28跨膜结构域、SEQ ID NO:16的4-1BB共刺激结构域、SEQ ID NO:18的CD3ζ信号传导结构域和/或其变体(即，具有与所公开的序列具有至少80％同一性，例如至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99同一性的序列)。
在一些实施方案中，多顺反子载体包含表达盒，所述表达盒含有编码CD22 CAR的核苷酸序列，所述CD22 CAR包括例如包含以下的CD22 CAR：具有SEQ ID NO:45或SEQ IDNO:54中列出的序列的CD22特异性scFv、SEQ ID NO:11或SEQ ID NO:12的IgG4铰链结构域、SEQ ID NO:15的CD28跨膜结构域、SEQ ID NO:16的4-1BB共刺激结构域、SEQ ID NO:18的CD3ζ信号传导结构域和/或其变体(即，具有与所公开的序列具有至少80％同一性，例如至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99同一性的序列)。
BCMACAR
在一些实施方案中，CAR是BCMA CAR，并且在这些实施方案中，多顺反子载体包含表达盒，所述表达盒含有编码BCMA CAR的核苷酸序列。BCMA是在B细胞谱系的细胞上表达的肿瘤坏死家族受体(TNFR)成员，在终末分化B细胞或成熟B淋巴细胞上表达最高。BCMA参与介导浆细胞的存活以维持长期体液免疫。最近已将BCMA的表达与许多癌症联系起来，诸如多发性骨髓瘤、霍奇金淋巴瘤和非霍奇金淋巴瘤、各种白血病和胶质母细胞瘤。在一些实施方案中，BCMACAR可包含串联的信号肽、特异性结合BCMA的细胞外结合结构域、铰链结构域、跨膜结构域、细胞内共刺激结构域和/或细胞内信号传导结构域。
在一些实施方案中，BCMACAR的信号肽包括CD8α信号肽。在一些实施方案中，CD8α信号肽包含SEQ ID NO:6中列出的氨基酸序列或由其组成，或者包含与SEQ ID NO:6中列出的氨基酸序列具有至少80％同一性(例如，至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性)的氨基酸序列或由其组成。在一些实施方案中，信号肽包括IgK信号肽。在一些实施方案中，IgK信号肽包含SEQ ID NO:7中列出的氨基酸序列或由其组成，或者包含与SEQ ID NO:7中列出的氨基酸序列具有至少80％同一性(例如，至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性)的氨基酸序列或由其组成。在一些实施方案中，信号肽包括GMCSFR-α或CSF2RA信号肽。在一些实施方案中，GMCSFR-α或CSF2RA信号肽包含SEQ ID NO:8中列出的氨基酸序列或由其组成，或者包含与SEQ ID NO:8中列出的氨基酸序列具有至少80％同一性(例如，至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性)的氨基酸序列或由其组成。
在一些实施方案中，BCMA CAR的细胞外结合结构域对BCMA(例如人BCMA)具有特异性。BCMACAR的细胞外结合结构域可以针对在宿主细胞中的表达进行密码子优化，或可被密码子优化以具有变体序列以增加细胞外结合结构域的功能。
在一些实施方案中，细胞外结合结构域包含免疫球蛋白分子的免疫原性活性部分，例如scFv。在一些实施方案中，BCMA CAR的细胞外结合结构域来源于对BCMA具有特异性的抗体，包括例如贝兰他单抗(belantamab)、埃纳妥单抗(erlanatamab)、特立妥单抗(teclistamab)、LCAR-B38M和ciltacabtagene。在这些实施方案中的任一个中，BCMA CAR的细胞外结合结构域可包含任何抗体的VH、VL和/或一个或多个CDR或由其组成。
在一些实施方案中，BCMA CAR的细胞外结合结构域包含衍生自C11D5.3的scFv，C11D5.3是一种如Carpenter等人,Clin.Cancer Res.19(8):2048-2060(2013)中所述的鼠单克隆抗体。另外参见PCT申请公布号WO2010/104949。C11D5.3衍生的scFv可以包含通过Whitlow接头连接的C11D5.3的重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)，其氨基酸序列在表13中提供。在一些实施方案中，BCMA特异性细胞外结合结构域包含SEQ ID NO:63、64或68中列出的氨基酸序列或由其组成，或者包含与SEQ ID NO:63、64或68中列出的氨基酸序列具有至少80％同一性(例如，至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性)的氨基酸序列或由其组成。在一些实施方案中，BCMA特异性细胞外结合结构域可包含一个或多个具有SEQ ID NO:65-67和69-71中列出的氨基酸序列的CDR。在一些实施方案中，BCMA特异性细胞外结合结构域可包含具有一个或多个CDR的轻链，所述CDR具有SEQ ID NO:65-67中列出的氨基酸序列。在一些实施方案中，BCMA特异性细胞外结合结构域可包含具有一个或多个CDR的重链，所述CDR具有SEQ ID NO:69-71中列出的氨基酸序列。在这些实施方案中的任一个中，BCMA特异性scFv可包含一个或多个CDR，所述CDR包含一个或多个氨基酸取代或包含与所鉴定的任何序列具有至少80％同一性(例如，至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性)的序列。在一些实施方案中，BCMACAR的细胞外结合结构域包含如本文所述的一个或多个CDR或由其组成。
在一些实施方案中，BCMA CAR的细胞外结合结构域包含衍生自另一种鼠单克隆抗体C12A3.2的scFv，如Carpenter等人,Clin.Cancer Res.19(8):2048-2060(2013)和PCT申请公布号WO2010/104949中所述，所述scFv的氨基酸序列也在下表13中提供。在一些实施方案中，BCMA特异性细胞外结合结构域包含SEQ ID NO:72、73或77中列出的氨基酸序列或由其组成，或者包含与SEQ ID NO:72、73或77中列出的氨基酸序列具有至少80％同一性(例如，至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性)的氨基酸序列或由其组成。在一些实施方案中，BCMA特异性细胞外结合结构域可包含一个或多个具有SEQ ID NO:74-76和78-80中列出的氨基酸序列的CDR。在一些实施方案中，BCMA特异性细胞外结合结构域可包含具有一个或多个CDR的轻链，所述CDR具有SEQ ID NO:74-76中列出的氨基酸序列。在一些实施方案中，BCMA特异性细胞外结合结构域可包含具有一个或多个CDR的重链，所述CDR具有SEQ ID NO:78-80中列出的氨基酸序列。在这些实施方案中的任一个中，BCMA特异性scFv可包含一个或多个CDR，所述CDR包含一个或多个氨基酸取代或包含与所鉴定的任何序列具有至少80％同一性(例如，至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性)的序列。在一些实施方案中，BCMA CAR的细胞外结合结构域包含如本文所述的一个或多个CDR或由其组成。
在一些实施方案中，BCMA CAR的细胞外结合结构域包含对人BCMA具有高特异性的鼠单克隆抗体，其在Friedman等人,Hum.Gene Ther.29(5):585-601(2018))中被称为BB2121。另外参见PCT申请公布号WO2012163805。
在一些实施方案中，BCMACAR的细胞外结合结构域包含两条重链的单一可变片段(VHH)，其可以如Zhao等人,J.Hematol.Oncol.11(1):141(2018)中所述与BCMA的两个表位结合，也被称为LCAR-B38M。另外参见PCT申请公布号WO2018/028647。
在一些实施方案中，BCMA CAR的细胞外结合结构域包含如Lam等人,Nat.Commun.11(1):283(2020)中所述的完全人重链可变结构域(FHVH)，其也被称为FHVH33。另外参见PCT申请公布号WO2019/006072。FHVH33及其CDR的氨基酸序列在下表13中提供。在一些实施方案中，BCMA特异性细胞外结合结构域包含SEQ ID NO:81中列出的氨基酸序列或由其组成，或者包含与SEQ ID NO:81中列出的氨基酸序列具有至少80％同一性(例如，至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性)的氨基酸序列或由其组成。在一些实施方案中，BCMA特异性细胞外结合结构域可包含一个或多个具有SEQ ID NO:82-84中列出的氨基酸序列的CDR。在这些实施方案中的任一个中，BCMA特异性细胞外结合结构域可包含一个或多个CDR，所述CDR包含一个或多个氨基酸取代或包含与所鉴定的任何序列具有至少80％同一性(例如，至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性)的序列。在一些实施方案中，BCMA CAR的细胞外结合结构域包含如本文所述的一个或多个CDR或由其组成。
在一些实施方案中，BCMACAR的细胞外结合结构域包含衍生自如美国专利号11,026,975B2中所述的CT103A(或CAR0085)的scFv，其氨基酸序列在下表13中提供。在一些实施方案中，BCMA特异性细胞外结合结构域包含SEQ ID NO:118、119或123中列出的氨基酸序列或由其组成，或者包含与SEQ ID NO:118、119或123中列出的氨基酸序列具有至少80％同一性(例如，至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性)的氨基酸序列或由其组成。在一些实施方案中，BCMA特异性细胞外结合结构域可包含一个或多个具有SEQ ID NO:120-122和124-126中列出的氨基酸序列的CDR。在一些实施方案中，BCMA特异性细胞外结合结构域可包含具有一个或多个CDR的轻链，所述CDR具有SEQ ID NO:120-122中列出的氨基酸序列。在一些实施方案中，BCMA特异性细胞外结合结构域可包含具有一个或多个CDR的重链，所述CDR具有SEQ ID NO:124-126中列出的氨基酸序列。在这些实施方案中的任一个中，BCMA特异性scFv可包含一个或多个CDR，所述CDR包含一个或多个氨基酸取代或包含与所鉴定的任何序列具有至少80％同一性(例如，至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性)的序列。在一些实施方案中，BCMACAR的细胞外结合结构域包含如本文所述的一个或多个CDR或由其组成。
此外，针对BCMA的CAR和结合物已在美国申请公布号2020/0246381A1和2020/0339699A1中有所描述，其各自的全部内容通过引用并入本文。
表13.抗BCMA结合物和组分的示例性序列
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在一些实施方案中，BCMACAR的铰链结构域包括CD8α铰链结构域，例如人CD8α铰链结构域。在一些实施方案中，CD8α铰链结构域包含SEQ ID NO:9中列出的氨基酸序列或由其组成，或者包含与SEQ ID NO:9中列出的氨基酸序列具有至少80％同一性(例如，至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性)的氨基酸序列或由其组成。在一些实施方案中，铰链结构域包括CD28铰链结构域，例如人CD28铰链结构域。在一些实施方案中，CD28铰链结构域包含SEQ ID NO:10中列出的氨基酸序列或由其组成，或者包含与SEQ ID NO:10中列出的氨基酸序列具有至少80％同一性(例如，至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性)的氨基酸序列或由其组成。在一些实施方案中，铰链结构域包括IgG4铰链结构域，例如人IgG4铰链结构域。在一些实施方案中，IgG4铰链结构域包含SEQ ID NO:11或SEQ ID NO:12中列出的氨基酸序列或由其组成，或者包含与SEQ ID NO:11或SEQ ID NO:12中列出的氨基酸序列具有至少80％同一性(例如，至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性)的氨基酸序列或由其组成。在一些实施方案中，铰链结构域包括IgG4铰链-Ch2-Ch3结构域，例如人IgG4铰链-Ch2-Ch3结构域。在一些实施方案中，IgG4铰链-Ch2-Ch3结构域包含SEQ ID NO:13中列出的氨基酸序列或由其组成，或者包含与SEQ ID NO:13中列出的氨基酸序列具有至少80％同一性(例如，至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性)的氨基酸序列或由其组成。
在一些实施方案中，BCMACAR的跨膜结构域包括CD8α跨膜结构域，例如人CD8α跨膜结构域。在一些实施方案中，CD8α跨膜结构域包含SEQ ID NO:14中列出的氨基酸序列或由其组成，或者包含与SEQ ID NO:14中列出的氨基酸序列具有至少80％同一性(例如，至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性)的氨基酸序列或由其组成。在一些实施方案中，跨膜结构域包括CD28跨膜结构域，例如人CD28跨膜结构域。在一些实施方案中，CD28跨膜结构域包含SEQ ID NO:15中列出的氨基酸序列或由其组成，或者包含与SEQ ID NO:15中列出的氨基酸序列具有至少80％同一性(例如，至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性)的氨基酸序列或由其组成。
在一些实施方案中，BCMACAR的细胞内共刺激结构域包括4-1BB共刺激结构域，例如人4-1BB共刺激结构域。在一些实施方案中，4-1BB共刺激结构域包含SEQ ID NO:16中列出的氨基酸序列或由其组成，或者包含与SEQ ID NO:16中列出的氨基酸序列具有至少80％同一性(例如，至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性)的氨基酸序列或由其组成。在一些实施方案中，细胞内共刺激结构域包括CD28共刺激结构域，例如人CD28共刺激结构域。在一些实施方案中，CD28共刺激结构域包含SEQ ID NO:17中列出的氨基酸序列或由其组成，或者包含与SEQ ID NO:17中列出的氨基酸序列具有至少80％同一性(例如，至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性)的氨基酸序列或由其组成。
在一些实施方案中，BCMACAR的细胞内信号传导结构域包括CD3泽塔(ζ)信号传导结构域，例如人CD3ζ信号传导结构域。在一些实施方案中，CD3ζ信号传导结构域包含SEQ IDNO:18中列出的氨基酸序列或由其组成，或者包含与SEQ ID NO:18中列出的氨基酸序列具有至少80％同一性(例如，至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性)的氨基酸序列或由其组成。
在一些实施方案中，多顺反子载体包含表达盒，所述表达盒含有编码BCMA CAR的核苷酸序列，所述BCMA CAR包括例如包含以下的BCMACAR：如所描述的任何BCMA特异性细胞外结合结构域、SEQ ID NO:9的CD8α铰链结构域、SEQ ID NO:14的CD8α跨膜结构域、SEQ IDNO:16的4-1BB共刺激结构域、SEQ ID NO:18的CD3ζ信号传导结构域和/或其变体(即，具有与所公开的序列具有至少80％同一性，例如至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99同一性的序列)。在这些实施方案中的任一个中，BCMACAR可另外包含如所描述的信号肽(例如，CD8α信号肽)。
在一些实施方案中，多顺反子载体包含表达盒，所述表达盒含有编码BCMA CAR的核苷酸序列，所述BCMA CAR包括例如包含以下的BCMA CAR：如所描述的任何BCMA特异性细胞外结合结构域、SEQ ID NO:9的CD8α铰链结构域、SEQ ID NO:14的CD8α跨膜结构域、SEQID NO:17的CD28共刺激结构域、SEQ ID NO:18的CD3ζ信号传导结构域和/或其变体(即，具有与所公开的序列具有至少80％同一性，例如至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99同一性的序列)。在这些实施方案中的任一个中，BCMACAR可另外包含如所描述的信号肽。
在一些实施方案中，多顺反子载体包含含有核苷酸序列的表达盒，所述核苷酸序列编码SEQ ID NO:127中列出的BCMA CAR或与SEQ ID NO:127中列出的核苷酸序列具有至少80％同一性(例如，至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性)(参见表14)。所编码的BCMA CAR具有SEQ ID NO:128中列出的对应氨基酸序列，或者与SEQ ID NO:128中列出的氨基酸序列具有至少80％同一性(例如，至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性)，具有以下组分：CD8α信号肽、CT103A scFv(VL-Whitlow接头-VH)、CD8α铰链结构域、CD8α跨膜结构域、4-1BB共刺激结构域和CD3ζ信号传导结构域。
在一些实施方案中，多顺反子载体包含表达盒，所述表达盒含有编码BCMA CAR的可商购获得的实施方案的核苷酸序列，所述可商购获得的实施方案包括例如idecabtagenevicleucel(ide-cel，也称为bb2121)。在一些实施方案中，多顺反子载体包含表达盒，所述表达盒含有编码idecabtagene vicleucel或其部分的核苷酸序列。idecabtagenevicleucel包含具有以下组分的BCMACAR：BB2121结合物、CD8α铰链结构域、CD8α跨膜结构域、4-1BB共刺激结构域和CD3ζ信号传导结构域。
表14.BCMACAR的示例性序列
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K.致耐受因子的过表达
对于所有这些技术，使用众所周知的重组技术来产生如本文所概述的重组核酸。在某些实施方案中，编码致耐受因子的重组核酸可以与表达构建体中的一个或多个调控核苷酸序列可操作地连接。调控核苷酸序列将通常适用于待治疗的宿主细胞和受体受试者。对于多种宿主细胞，多种类型的适当的表达载体和合适的调控序列是本领域已知的。通常，一种或多种调控核苷酸序列可以包括但不限于启动子序列、前导或信号序列、核糖体结合位点、转录起始和终止序列、翻译起始和终止序列以及增强子或激活子序列。还设想了本领域已知的组成型或诱导型启动子。启动子可以是天然存在的启动子，或结合了多于一个启动子的元件的杂合启动子。表达构建体可存在于细胞中的附加体(诸如质粒)上，或者表达构建体可插入染色体中。在一个特定实施方案中，表达载体包括选择性标志基因以允许选择转化的宿主细胞。某些实施方案包括包含编码变体多肽的核苷酸序列的表达载体，所述变体多肽与至少一个调控序列可操作地连接。本文使用的调控序列包括启动子、增强子和其他表达控制元件。在某些实施方案中，表达载体被设计用于选择要转化的宿主细胞、期望表达的特定变体多肽、载体的拷贝数、控制所述拷贝数的能力或表达由载体编码的任何其他蛋白质，诸如抗生素标志物。
合适的哺乳动物启动子的实例包括例如来自以下基因的启动子：仓鼠泛素/S27a启动子(WO 97/15664)、猿猴空泡形成病毒40(SV40)早期启动子、腺病毒主要晚期启动子、小鼠金属硫蛋白-I启动子、劳斯肉瘤病毒(RSV)长末端重复区、小鼠乳腺肿瘤病毒启动子(MMTV)、莫洛尼鼠白血病病毒长末端重复区和人巨细胞病毒(CMV)早期启动子。其他异源哺乳动物启动子的实例是肌动蛋白、免疫球蛋白或一种或多种热休克启动子。在另外的实施方案中，用于哺乳动物宿主细胞的启动子可以从病毒的基因组获得，所述病毒诸如多瘤病毒、禽痘病毒(1989年7月5日公布的UK 2,211,504)、牛乳头瘤病毒、禽肉瘤病毒、巨细胞病毒、逆转录病毒、乙型肝炎病毒和猿猴病毒40(SV40)。在其他实施方案中，使用异源哺乳动物启动子。实例包括肌动蛋白启动子、免疫球蛋白启动子和热休克启动子。SV40的早期和晚期启动子作为同样含有SV40病毒复制起点的SV40限制性片段方便地获得(Fiers等人,Nature 273:113-120(1978))。人巨细胞病毒的立即早期启动子作为HindIII E限制性片段方便地获得(Greenaway等人,Gene 18:355-360(1982))。前述参考文献通过引用整体并入。
将本文所述的多核苷酸引入细胞中的过程可以通过任何合适的技术来实现。合适的技术包括磷酸钙或脂质介导的转染、电穿孔和使用病毒载体进行的转导或感染。在一些实施方案中，通过病毒转导(例如，慢病毒转导)将多核苷酸引入细胞中。
一旦改变，本文所述的任何分子的表达的存在就可以使用已知技术来测定，诸如蛋白质印迹、ELISA测定、FACS测定等。
在一些实施方案中，本技术提供了包含“自杀基因”或“自杀开关”的低免疫原性T细胞。并入这些以起到“安全开关”的作用，如果低免疫原性T细胞以不希望的方式生长和分裂，所述安全开关就可导致它们死亡。“自杀基因”消融途径包括基因转移载体中的自杀基因，所述自杀基因编码仅在被特定化合物激活时才导致细胞杀伤的蛋白质。自杀基因可编码选择性地将无毒化合物转化成高毒性代谢物的酶。结果是特异性消除表达酶的细胞。在一些实施方案中，自杀基因是疱疹病毒胸苷激酶(HSV-tk)基因并且触发剂是更昔洛韦(ganciclovir)。在其他实施方案中，自杀基因是大肠杆菌(Escherichia coli)胞嘧啶脱氨酶(EC-CD)基因并且触发剂是5-氟胞嘧啶(5-FC)(Barese等人,Mol.Therap.20(10):1932-1943(2012)；Xu等人,Cell Res.8:73-8(1998)；两者均以引用方式整体并入本文。)
在其他实施方案中，自杀基因是诱导型半胱天冬酶蛋白。诱导型半胱天冬酶蛋白包括能够诱导细胞凋亡的半胱天冬酶蛋白的至少一部分。在优选实施方案中，诱导型半胱天冬酶蛋白是iCasp9。它包括具有F36V突变的人FK506结合蛋白FKBP12的序列，它通过一系列氨基酸连接至编码人半胱天冬酶9的基因。FKBP12-F36V以高亲和力与小分子二聚剂AP1903结合。因此，iCasp9的自杀功能是通过二聚化化学诱导剂(CID)的施用触发的。在一些实施方案中，CID是小分子药物API 903。二聚化引起细胞凋亡的快速诱导。(参见WO2011146862；Stasi等人,N.Engl.J.Med 365；18(2011)；Tey等人,Biol.Blood MarrowTransplant.13:913-924(2007)，这些文献中的每一个均以引用方式整体并入。)
L.遗传修饰方法
将本文所述的多核苷酸引入细胞中的过程可以通过任何合适的技术来实现。合适的技术包括磷酸钙或脂质介导的转染、电穿孔、融合剂(fusogen)和使用病毒载体进行的转导或感染。在一些实施方案中，通过病毒转导(例如，慢病毒转导)或者以其他方式在病毒载体上递送(例如，融合剂介导的递送)将多核苷酸引入到细胞中。本文所述的多核苷酸可以在体外、从供体受试者离体或在受体患者体内引入到细胞中。
与通常涉及活化细胞(诸如活化T细胞(例如，CD8+T细胞))的将本文所述的多核苷酸引入到细胞中的某些方法不同，可以利用合适的技术将多核苷酸引入到非活化T细胞中。合适的技术包括但不限于用一种或多种结合CD3、CD8和/或CD28的抗体或其可以或不可以结合珠粒的片段或部分(例如，scFv和VHH)来活化T细胞(诸如CD8+T细胞)。其他合适的技术包括但不限于融合剂介导的在非活化T细胞(例如，CD8+T细胞)中将多核苷酸引入到T细胞中，所述细胞先前未接触过一种或多种活化抗体或其片段或部分(例如，CD3、CD8和/或CD28)。在一些实施方案中，融合剂介导的将多核苷酸引入到T细胞中是在患者体内进行的(例如，在T细胞已经被施用于受体患者之后)。在其他实施方案中，融合剂介导的将多核苷酸引入到T细胞中是在受试者体内进行的(例如，在将细胞从供体受试者中分离之前)。
在一些实施方案中，将罕见切割核酸内切酶以编码罕见切割核酸内切酶的核酸的形式引入到含有靶多核苷酸序列的细胞中。将核酸引入细胞中的过程可以通过任何合适的技术来实现。合适的技术包括磷酸钙或脂质介导的转染、电穿孔和使用病毒载体进行的转导或感染。在一些实施方案中，核酸包含DNA。在一些实施方案中，核酸包含如本文所述的修饰DNA。在一些实施方案中，核酸包含mRNA。在一些实施方案中，核酸包含如本文所述的修饰mRNA(例如，合成的修饰mRNA)。
本技术设想了利用CRISPR/Cas系统以技术人员可获得的任何方式改变靶多核苷酸序列。可以使用能够改变细胞中的靶多核苷酸序列的任何CRISPR/Cas系统。此类CRISPR-Cas系统可以采用多种Cas蛋白(Haft等人PLoS Comput Biol.2005；1(6)e60)。此类Cas蛋白的允许CRISPR/Cas系统改变细胞中的靶多核苷酸序列的分子机制包括RNA结合蛋白、核酸内切酶和核酸外切酶、解旋酶和聚合酶。在一些实施方案中，CRISPR/Cas系统是I型CRISPR系统。在一些实施方案中，CRISPR/Cas系统是II型CRISPR系统。在一些实施方案中，CRISPR/Cas系统是V型CRISPR系统。
CRISPR/Cas系统可以用于改变细胞中的任何靶多核苷酸序列。本领域技术人员将容易理解，在任何特定细胞中待改变的期望的靶多核苷酸序列可对应于基因组序列的表达与病症相关或以其他方式促进病原体进入细胞中的任何基因组序列。例如，细胞中待改变的期望的靶多核苷酸序列可以是对应于含有疾病相关单多核苷酸多态性的基因组序列的多核苷酸序列。在这样的实例中，CRISPR/Cas系统可以用于通过用野生型等位基因替代细胞中的疾病相关SNP来对其进行纠正。作为另一个实例，负责使病原体进入细胞中或在其中增殖的靶基因的多核苷酸序列可以是合适的靶标，所述靶标用于缺失或插入以破坏靶基因的功能，从而防止病原体进入细胞或在细胞内部增殖。
在一些实施方案中，靶多核苷酸序列是基因组序列。在一些实施方案中，靶多核苷酸序列是人基因组序列。在一些实施方案中，靶多核苷酸序列是哺乳动物基因组序列。在一些实施方案中，靶多核苷酸序列是脊椎动物基因组序列。
在一些实施方案中，CRISPR/Cas系统包括Cas蛋白和能够将Cas蛋白引导到靶多核苷酸序列的靶基序并与其杂交的至少一种至两种核糖核酸。如本文所用，“蛋白质”和“多肽”可互换使用，是指通过肽键接合的一系列氨基酸残基(即，氨基酸的聚合物)，并且包括修饰的氨基酸(例如，磷酸化、糖化、糖基化等)和氨基酸类似物。示例性多肽或蛋白质包括基因产物、天然存在的蛋白质、上述各项的同源物、旁系同源物、片段以及其他等效物、变体和类似物。
在一些实施方案中，Cas蛋白包含一个或多个氨基酸取代或修饰。在一些实施方案中，一个或多个氨基酸取代包括保守氨基酸取代。在一些情况下，取代和/或修饰可以防止或减少蛋白水解降解和/或延长多肽在细胞中的半衰期。在一些实施方案中，Cas蛋白可以包含肽键替换(例如，脲、硫脲、氨基甲酸酯、磺酰脲等)。在一些实施方案中，Cas蛋白可以包含天然存在的氨基酸。在一些实施方案中，Cas蛋白可以包含替代氨基酸(例如，D-氨基酸、β-氨基酸、同型半胱氨酸、磷酸丝氨酸等)。在一些实施方案中，Cas蛋白可以包含修饰以包括部分(例如，聚乙二醇化、糖基化、脂化、乙酰化、封端等)。
在一些实施方案中，Cas蛋白包含核心Cas蛋白。示例性Cas核心蛋白包括但不限于Cas1、Cas2、Cas3、Cas4、Cas5、Cas6、Cas7、Cas8、Cas9和Cas12a。在一些实施方案中，Cas蛋白包含大肠杆菌亚型的Cas蛋白(也称为CASS2)。大肠杆菌亚型的示例性Cas蛋白包括但不限于Cse1、Cse2、Cse3、Cse4和Cas5e。在一些实施方案中，Cas蛋白包含Ypest亚型的Cas蛋白(也称为CASS3)。Ypest亚型的示例性Cas蛋白包括但不限于Csy1、Csy2、Csy3和Csy4。在一些实施方案中，Cas蛋白包含Nmeni亚型的Cas蛋白(也称为CASS4)。Nmeni亚型的示例性Cas蛋白包括但不限于Csn1和Csn2。在一些实施方案中，Cas蛋白包含Dvulg亚型的Cas蛋白(也称为CASS1)。Dvulg亚型的示例性Cas蛋白包括Csd1、Csd2和Cas5d。在一些实施方案中，Cas蛋白包含Tneap亚型的Cas蛋白(也称为CASS7)。Tneap亚型的示例性Cas蛋白包括但不限于Cst1、Cst2、Cas5t。在一些实施方案中，Cas蛋白包含Hmari亚型的Cas蛋白。Hmari亚型的示例性Cas蛋白包括但不限于Csh1、Csh2和Cas5h。在一些实施方案中，Cas蛋白包含Apern亚型的Cas蛋白(也称为CASS5)。Apern亚型的示例性Cas蛋白包括但不限于Csa1、Csa2、Csa3、Csa4、Csa5和Cas5a。在一些实施方案中，Cas蛋白包含Mtube亚型的Cas蛋白(也称为CASS6)。Mtube亚型的示例性Cas蛋白包括但不限于Csm1、Csm2、Csm3、Csm4和Csm5。在一些实施方案中，Cas蛋白包括RAMP模块Cas蛋白。示例性RAMP模块Cas蛋白包括但不限于Cmr1、Cmr2、Cmr3、Cmr4、Cmr5和Cmr6。参见，例如，Klompe等人,Nature 571,219–225(2019)；Strecker等人,Science 365,48–53(2019)。
在一些实施方案中，Cas蛋白包括本文所述的Cas蛋白中的任一种或其功能部分。如本文所用，“功能部分”是指肽的一部分，其保留其与至少一种核糖核酸(例如，指导RNA(gRNA))复合并裂解靶多核苷酸序列的能力。在一些实施方案中，功能部分包含可操作地连接的Cas9蛋白功能结构域的组合，所述Cas9蛋白功能结构域选自由DNA结合结构域、至少一个RNA结合结构域、解旋酶结构域和核酸内切酶结构域组成的组。在一些实施方案中，功能部分包含可操作地连接的Cas12a(也称为Cpf1)蛋白功能结构域的组合，所述Cas12a蛋白功能结构域选自由DNA结合结构域、至少一个RNA结合结构域、解旋酶结构域和核酸内切酶结构域组成的组。在一些实施方案中，功能结构域形成复合物。在一些实施方案中，Cas9蛋白的功能部分包含RuvC样结构域的功能部分。在一些实施方案中，Cas9蛋白的功能部分包含HNH核酸酶结构域的功能部分。在一些实施方案中，Cas12a蛋白的功能部分包含RuvC样结构域的功能部分。
在一些实施方案中，可以将外源Cas蛋白以多肽形式引入到细胞中。在某些实施方案中，可以将Cas蛋白缀合或融合至细胞穿透多肽或细胞穿透肽。如本文所用，“细胞穿透多肽”和“细胞穿透肽”分别是指促进分子摄取到细胞中的多肽或肽。细胞穿透多肽可以含有可检测标记。
在某些实施方案中，可以将Cas蛋白缀合或融合至带电蛋白(例如，携带正电荷、负电荷或总体中性电荷的蛋白)。这种连接可以是共价的。在一些实施方案中，可以将Cas蛋白融合至超正电荷GFP以显著增加Cas蛋白穿透细胞的能力(Cronican等人ACS ChemBiol.2010；5(8):747-52)。在某些实施方案中，可以将Cas蛋白融合至蛋白转导结构域(PTD)以促进其进入细胞。示例性PTD包括Tat、寡聚精氨酸和穿透素(penetratin)。在一些实施方案中，Cas9蛋白包含融合至细胞穿透肽的Cas9多肽。在一些实施方案中，Cas9蛋白包含融合至PTD的Cas9多肽。在一些实施方案中，Cas9蛋白包含融合至tat结构域的Cas9多肽。在一些实施方案中，Cas9蛋白包含融合至寡聚精氨酸结构域的Cas9多肽。在一些实施方案中，Cas9蛋白包含融合至穿透素结构域的Cas9多肽。在一些实施方案中，Cas9蛋白包含融合至超正电荷GFP的Cas9多肽。在一些实施方案中，Cas12a蛋白包含融合至细胞穿透肽的Cas12a多肽。在一些实施方案中，Cas12a蛋白包含融合至PTD的Cas12a多肽。在一些实施方案中，Cas12a蛋白包含融合至tat结构域的Cas12a多肽。在一些实施方案中，Cas12a蛋白包含融合至寡聚精氨酸结构域的Cas12a多肽。在一些实施方案中，Cas12a蛋白包含融合至穿透素结构域的Cas12a多肽。在一些实施方案中，Cas12a蛋白包含融合至超正电荷GFP的Cas12a多肽。
在一些实施方案中，可以将Cas蛋白以编码Cas蛋白的核酸的形式引入到含有靶多核苷酸序列的细胞中。将核酸引入细胞中的过程可以通过任何合适的技术来实现。合适的技术包括磷酸钙或脂质介导的转染、电穿孔、病毒转导(例如，慢病毒转导)或以其他方式在病毒载体上递送(例如，融合剂介导的递送)。在一些实施方案中，核酸包含DNA。在一些实施方案中，核酸包含如本文所述的修饰DNA。在一些实施方案中，核酸包含mRNA。在一些实施方案中，核酸包含如本文所述的修饰mRNA(例如，合成的修饰mRNA)。
在一些实施方案中，Cas蛋白与一种至两种核糖核酸复合。在一些实施方案中，Cas蛋白与两种核糖核酸复合。在一些实施方案中，Cas蛋白与一种核糖核酸复合。在一些实施方案中，Cas蛋白由如本文所述的修饰核酸(例如，合成的修饰mRNA)编码。
本技术的方法设想了使用能够将Cas蛋白引导至靶多核苷酸序列的靶基序并与其杂交的任何核糖核酸。在一些实施方案中，至少一种核糖核酸包含tracrRNA。在一些实施方案中，至少一种核糖核酸包含CRISPR RNA(crRNA)。在一些实施方案中，单个核糖核酸包含将Cas蛋白引导至细胞中的靶多核苷酸序列的靶基序并与其杂交的指导RNA。在一些实施方案中，至少一种核糖核酸包含将Cas蛋白引导至细胞中的靶多核苷酸序列的靶基序并与其杂交的指导RNA。在一些实施方案中，一种至两种核糖核酸均包含将Cas蛋白引导至细胞中的靶多核苷酸序列的靶基序并与其杂交的指导RNA。如本领域技术人员将理解的，可以选择核糖核酸与多种不同的靶基序杂交，这取决于采用的具体CRISPR/Cas系统和靶多核苷酸的序列。还可以选择一种至两种核糖核酸以最大程度地减少与除靶多核苷酸序列之外的核酸序列的杂交。在一些实施方案中，当与细胞中的所有其他基因组核苷酸序列相比时，一种至两种核糖核酸与含有至少两个错配的靶基序杂交。在一些实施方案中，当与细胞中的所有其他基因组核苷酸序列相比时，一种至两种核糖核酸与含有至少一个错配的靶基序杂交。在一些实施方案中，一种至两种核糖核酸被设计成与紧邻被Cas蛋白识别的脱氧核糖核酸基序的靶基序杂交。在一些实施方案中，一种至两种核糖核酸中的每一种被设计成与紧邻被Cas蛋白识别的脱氧核糖核酸基序的靶基序杂交，所述脱氧核糖核酸基序侧接位于靶基序之间的突变等位基因。
在一些实施方案中，一种至两种核糖核酸中的每一种包含将Cas蛋白引导至细胞中的靶多核苷酸序列的靶基序并与其杂交的指导RNA。
在一些实施方案中，一种或两种核糖核酸(例如，指导RNA)与靶多核苷酸序列的同一链上的序列互补和/或杂交。在一些实施方案中，一种或两种核糖核酸(例如，指导RNA)与靶多核苷酸序列的相反链上的序列互补和/或杂交。在一些实施方案中，一种或两种核糖核酸(例如，指导RNA)不与靶多核苷酸序列的相反链上的序列互补和/或杂交。在一些实施方案中，一种或两种核糖核酸(例如，指导RNA)与靶多核苷酸序列的重叠靶基序互补和/或杂交。在一些实施方案中，一种或两种核糖核酸(例如，指导RNA)与靶多核苷酸序列的偏移靶基序互补和/或杂交。
在一些实施方案中，通过病毒转导(例如，慢病毒转导)将编码Cas蛋白的核酸和编码至少一种至两种核糖核酸的核酸引入到细胞中。在一些实施方案中，Cas蛋白与1-2种核糖核酸复合。在一些实施方案中，Cas蛋白与两种核糖核酸复合。在一些实施方案中，Cas蛋白与一种核糖核酸复合。在一些实施方案中，Cas蛋白由如本文所述的修饰核酸(例如，合成的修饰mRNA)编码。
可用于本文所述的基于CRISPR/Cas的基因靶向的示例性gRNA序列在表1A-D和表15中提供。表15的序列可见于2016年5月9日提交的WO2016183041，包括表、附录和序列表的公开内容通过引用整体并入本文。
表15.可用于靶向基因的示例性gRNA序列
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在一些实施方案中，本技术的细胞使用转录激活因子样效应物核酸酶(TALEN)方法来制备。
“TALE核酸酶”(TALEN)意指由通常来源于转录激活因子样效应物(TALE)的核酸结合结构域和用以切割核酸靶序列的一个核酸酶催化结构域组成的融合蛋白。催化结构域优选地是核酸酶结构域，并且更优选地是具有核酸内切酶活性的结构域，例如I-TevI、ColE7、NucA和Fok-I。在一个具体实施方案中，可以将TALE结构域与大范围核酸酶例如I-CreI和I-OnuI或其功能变体融合。在更优选的实施方案中，所述核酸酶是单体TALE核酸酶。单体TALE核酸酶是不需要二聚化来进行特异性识别和切割的TALE核酸酶，诸如在WO2012138927中描述的工程化的TAL重复序列与I-TevI的催化结构域的融合体。转录激活因子样效应物(TALE)是来自细菌物种黄单胞菌属(Xanthomonas)的蛋白质，包含多个重复序列，每个重复包含位置12和13中对核酸靶向序列的每个核苷酸碱基具有特异性的二残基(RVD)。具有相似模块化逐碱基核酸结合性质(MBBBD)的结合结构域也可以来源于申请人最近在不同细菌物种中发现的新模块化蛋白。新模块化蛋白具有表现出比TAL重复更多的序列可变性的优势。优选地，与不同核苷酸的识别相关的RVD是用于识别C的HD；用于识别T的NG；用于识别A的NI；用于识别G或A的NN；用于识别A、C、G或T的NS；用于识别T的HG；用于识别T的IG；用于识别G的NK；用于识别C的HA；用于识别C的ND；用于识别C的HI；用于识别G的HN；用于识别G的NA；用于识别G或A的SN和用于识别T的YG；用于识别A的TL；用于识别A或G的VT和用于识别A的SW。在另一个实施方案中，关键氨基酸12和13可以向其他氨基酸残基突变，以调节其对核苷酸A、T、C和G的特异性，特别是增强这种特异性。TALEN试剂盒在商业上出售。
在一些实施方案中，使用锌指核酸酶(ZFN)对细胞进行操纵。“锌指结合蛋白”是优选以序列特异性方式结合DNA、RNA和/或蛋白质的蛋白质或多肽，这是通过锌离子的配位稳定蛋白质结构的结果。术语锌指结合蛋白通常缩写为锌指蛋白或ZFP。个别DNA结合结构域通常称为“指”。ZFP至少有一个指，通常是两个指、三个指或六个指。每个指结合两个至四个DNA碱基对，通常是三个或四个DNA碱基对。ZFP与被称为靶位点或靶区段的核酸序列结合。每个指通常包含一个大约30个氨基酸的锌螯合DNA结合亚结构域。研究表明，这类单个锌指由含有与锌配位的两个不变组氨酸残基的α螺旋以及单个β转角的两个半胱氨酸残基组成(参见，例如，Berg和Shi,Science271:1081-1085(1996))。
在一些实施方案中，使用归巢核酸内切酶制备细胞。此类归巢核酸内切酶是本领域熟知的(Stoddard 2005)。归巢核酸内切酶识别DNA靶序列并产生单链或双链断裂。归巢核酸内切酶具有高度特异性，识别长度范围为12个至45个碱基对(bp)、通常长度范围为14bp至40bp的DNA靶位点。归巢核酸内切酶可以例如对应于LAGLIDADG核酸内切酶、HNH核酸内切酶或GIY-YIG核酸内切酶。优选的归巢核酸内切酶可以是I-CreI变体。
在一些实施方案中，使用大范围核酸酶制备细胞。按照定义，大范围核酸酶是识别大序列的序列特异性核酸内切酶(Chevalier,B.S.和B.L.Stoddard,Nucleic Acids Res.,2001,29,3757-3774)。它们可以切割活细胞中的独特位点，从而将切割位点附近的基因靶向增强1000倍或更多(Puchta等人,Nucleic Acids Res.,1993,21,5034-5040；Rouet等人,Mol.Cell.Biol.,1994,14,8096-8106；Choulika等人,Mol.Cell.Biol.,1995,15,1968-1973；Puchta等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,1996,93,5055-5060；Sargent等人,Mol.Cell.Biol.,1997,17,267-77；Donoho等人,Mol.Cell.Biol,1998,18,4070-4078；Elliott等人,Mol.Cell.Biol.,1998,18,93-101；Cohen-Tannoudji等人,Mol.Cell.Biol.,1998,18,1444-1448)。
在一些实施方案中，使用RNA沉默或RNA干扰(RNAi)敲低(例如，降低、消除或抑制)多肽(诸如致耐受因子)的表达来制备细胞。可用的RNAi方法包括利用合成RNAi分子、短干扰RNA(siRNA)、PIWI相互作用NRA(piRNA)、短发夹RNA (shRNA)、微小RNA(miRNA)和本领域技术人员认可的其他瞬时敲低方法的那些方法。包括序列特异性shRNA、siRNA、miRNA等的用于RNAi的试剂是可商购获得的。例如，通过将CIITAsiRNA引入细胞中或将表达CIITAshRNA的病毒转导到细胞中，可以在多能干细胞中敲低CIITA。在一些实施方案中，采用RNA干扰来降低或抑制选自由CIITA、B2M和NLRC5组成的组的至少一者的表达。
在一些实施方案中，使用CRISPR/Cas系统制备细胞，其中通过病毒转导(例如，慢病毒转导)将编码Cas蛋白的核酸和编码至少一种至两种核糖核酸的核酸引入到细胞中。
在一些实施方案中，慢病毒载体包含一种或多种融合剂。在一些实施方案中，融合剂促进慢病毒载体与膜的融合。在一些实施方案中，膜是浆细胞膜。在一些实施方案中，包含融合剂的慢病毒载体将膜整合到靶细胞的脂质双层中。在一些实施方案中，慢病毒载体中可以包含一种或多种本文所述的融合剂。在一些实施方案中，融合剂是蛋白质融合剂，例如哺乳动物蛋白或哺乳动物蛋白的同源物(例如，具有50％、60％、70％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更大同一性)、非哺乳动物蛋白(诸如病毒蛋白或病毒蛋白的同源物)(例如，具有50％、60％、70％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更大同一性)、天然蛋白或天然蛋白的衍生物、合成蛋白、其片段、其变体、包含一种或多种融合剂或片段的蛋白融合体以及其任何组合。
在一些实施方案中，融合剂导致慢病毒载体中的脂质与靶细胞中的脂质之间的混合。在一些实施方案中，融合剂导致在病毒载体内部与靶细胞的胞质溶胶之间形成一个或多个孔。
在一些实施方案中，融合剂可以包括哺乳动物蛋白。哺乳动物融合剂的实例可包括但不限于SNARE家族蛋白(诸如vSNARE和tSNARE)、合胞素蛋白(诸如合胞素-1(DOI:10.1128/JVI.76.13.6442–6452.2002)和合胞素-2)、成肌蛋白(myomaker)(biorxiv.org/content/early/2017/04/02/123158,doi.org/10.1101/123158, doi: 10.1096/fj.201600945R,doi:10.1038/nature12343) 、 myomixer(www.nature.com/nature/journal/v499/n7458/full/nature12343.html,doi:10.1038/nature12343)、myomerger(science.sciencemag.org/content/early/2017/04/05/science.aam9361,DOI:10.1126/science.aam9361)、FGFRL1(成纤维细胞生长因子受体样1)、Minion(doi.org/10.1101/122697)、甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)的同种型(例如，如US 6,099,857A中所公开)、间隙连接蛋白诸如联接蛋白43、联接蛋白40、联接蛋白45、联接蛋白32或联接蛋白37(例如，如US2007/0224176中所公开的)、Hap2、能够诱导异源细胞之间的合胞体形成的任何蛋白质(参见表2)、具有融合剂性质的任何蛋白质、其同源物，其片段、其变体，以及包含一种或多种蛋白质或其片段的蛋白融合体。在一些实施方案中，融合剂由在人基因组中发现的人内源性逆转录病毒元件(hERV)编码。在US 6,099,857A和US 2007/0224176中公开了另外的示例性融合剂，所述专利的全部内容据此通过引用并入。
在一些实施方案中，融合剂可包括非哺乳动物蛋白，例如病毒蛋白。在一些实施方案中，病毒融合剂是I类病毒膜融合蛋白、II类病毒膜蛋白、III类病毒膜融合蛋白、病毒膜糖蛋白或其他病毒融合蛋白，或其同源物、其片段、其变体，或包含一种或多种蛋白质或其片段的蛋白融合体。
在一些实施方案中，I类病毒膜融合蛋白包括但不限于杆状病毒F蛋白，例如核型多角体病毒(NPV)属的F蛋白，例如甜菜夜蛾MNPV(SeMNPV)F蛋白和舞毒蛾MNPV(LdMNPV)以及副粘病毒F蛋白。
在一些实施方案中，II类病毒膜蛋白包括但不限于蜱骨脑炎E(TBEV E)、塞姆利基森林病毒E1/E2。
在一些实施方案中，III类病毒膜融合蛋白包括但不限于弹状病毒G(例如，水疱性口炎病毒(VSV-G)的融合蛋白G、科卡尔(Cocal)病毒G蛋白)、疱疹病毒糖蛋白B(例如，单纯疱疹病毒1(HSV-1)gB))、爱泼斯坦-巴尔病毒糖蛋白B(EBV gB)、托高土病毒G、杆状病毒gp64(例如，苜蓿银纹夜蛾(Autographa California)多粒包埋型NPV(AcMNPV)gp64)和玻那症病毒(Borna disease virus，BDV)糖蛋白(BDV G)。
其他病毒融合剂的实例，例如膜糖蛋白和病毒融合蛋白，包括但不限于：病毒合胞体蛋白，诸如流感血凝素(HA)或突变体或其融合蛋白；1型人免疫缺陷病毒包膜蛋白(HIV-1ENV)、来自形成淋巴细胞合胞体的HIV结合LFA-1的gp120、HIV gp41、HIV gp160或HIV反式转录激活因子(TAT)；病毒糖蛋白VSV-G、来自弹状病毒科水泡性口炎病毒的病毒糖蛋白；水痘-带状疱疹病毒(VZV)的糖蛋白gB和gH-gL；鼠白血病病毒(MLV)-10A1；长臂猿白血病病毒糖蛋白(GaLV)；狂犬病病毒、莫科拉病毒、水泡性口炎病毒和披膜病毒中的G型糖蛋白；鼠肝炎病毒JHM表面投影蛋白；猪呼吸道冠状病毒刺突和膜糖蛋白；禽传染性支气管炎刺突糖蛋白及其前体；牛肠道冠状病毒刺突蛋白；麻疹病毒属(例如，麻疹病毒(MeV)、犬瘟热病毒、鲸类动物麻疹病毒、小反刍兽疫病毒、海豹瘟热病毒、牛瘟病毒)的F和H、HN或G基因；新城疫病毒、人副流感病毒3、猿猴病毒41、仙台病毒和人呼吸道合胞病毒；人疱疹病毒1和猿猴水痘病毒的gH，伴有伴侣蛋白gL；人、牛和猕猴疱疹病毒gB；弗瑞德鼠白血病病毒和梅森-菲舍猴病毒的包膜糖蛋白；腮腺炎病毒血凝素神经氨酸酶和糖蛋白F1和F2；来自委内瑞拉马脑脊髓炎的膜糖蛋白；副粘病毒F蛋白；SIV gp160蛋白；埃博拉病毒G蛋白；或仙台病毒融合蛋白，或其同源物、其片段、其变体，以及包含一种或多种蛋白质或其片段的蛋白融合体。
非哺乳动物融合剂包括病毒融合剂、其同源物、其片段，以及包含一种或多种蛋白质或其片段的融合蛋白。病毒融合剂包括I类融合剂、II类融合剂、III类融合剂和IV类融合剂。在实施方案中，I类融合剂诸如人免疫缺陷病毒(HIV)gp41，具有特征性融合后构象，其具有带有中央卷曲螺旋结构的α-螺旋发夹的特征三聚体。I类病毒融合蛋白包括具有中心融合后六螺旋束的蛋白质。I类病毒融合蛋白包括流感HA、副流感F、HIV Env、埃博拉GP、来自正粘病毒的血凝素、来自副粘病毒(例如麻疹(Katoh等人BMC Biotechnology 2010,10:37))的F蛋白、来自逆转录病毒的ENV蛋白，以及丝状病毒和冠状病毒的融合剂。在实施方案中，II类病毒融合剂诸如登革热E糖蛋白，具有形成延长的胞外域的β-折叠的结构特征，所述胞外域重折叠产生发夹三聚体。在实施方案中，II类病毒融合剂缺乏中央卷曲螺旋。II类病毒融合剂可在甲病毒(例如，E1蛋白)和黄病毒(例如，E糖蛋白)中发现。II类病毒融合剂包括来自塞姆利基森林病毒、辛比斯病毒、风疹病毒和登革热病毒的融合剂。在实施方案中，III类病毒融合剂诸如水疱性口炎病毒G糖蛋白组合了在I类和II类中发现的结构特征。在实施方案中，III类病毒融合剂包含α螺旋(例如，与I类病毒融合剂一样，形成六螺旋束以回折蛋白质)和在其末端具有两亲融合肽的β折叠，使人想起II类病毒融合剂。III类病毒融合剂可以在弹状病毒和疱疹病毒中发现。在实施方案中，IV类病毒融合剂是融合相关的小跨膜(FAST)蛋白(doi:10.1038/sj.emboj.7600767,Nesbitt,Rae L.,"TargetedIntracellular Therapeutic Delivery Using Liposomes Formulated withMultifunctional FAST proteins"(2012)。Electronic Thesis and DissertationRepository.论文388)，其由无包膜呼肠孤病毒编码。在实施方案中，IV类病毒融合剂足够小，以至于它们不形成发夹(doi:10.1146/annurev-cellbio-101512-122422,doi:10.1016/j.devcel.2007.12.008)。
在一些实施方案中，本文公开的慢病毒载体包括一种或多种CD8结合剂。例如，CD8结合剂可与蛋白融合剂或病毒包膜蛋白融合或掺入其中。在另一个实施方案中，可通过与跨膜结构域融合而将CD8结合剂掺入病毒包膜中。
示例性CD8结合剂包括与CD8α和CD8β中的一种或多种结合的抗体及其片段(例如scFv、VHH)。此类抗体可衍生自任何物种，并且可以是例如小鼠、兔、人、人源化或骆驼抗体。示例性抗体包括WO2014025828、WO2014164553、WO2020069433、WO2015184203、US20160176969、WO2017134306、WO2019032661、WO2020257412、WO2018170096、WO2020060924、US10730944、US20200172620中公开的那些，以及非人抗体OKT8；RPA-T8、12.C7(Novus)；17D8、3B5、LT8、RIV11、SP16、YTC182.20、MEM-31、MEM-87、RAVB3、C8/144B(Thermo Fisher)；2ST8.5H7、Bu88、3C39、Hit8a、SPM548、CA-8、SK1、RPA-T8(GeneTex)；UCHT4(Absolute Antibody)；BW135/80(Miltenyi)；G42-8(BD Biosciences)；C8/1779R、mAB 104(Enzo Life Sciences)；B-Z31(Sapphire North America)；32-M4、5F10、MCD8、UCH-T4、5F2(Santa Cruz)；D8A8Y、RPA-T8(Cell Signaling Technology)。其他示例性结合剂包括经设计的锚蛋白重复蛋白(DARPins)和基于纤连蛋白III型(Fn3)支架的结合剂。
在一些实施方案中，本文公开的慢病毒载体包括一种或多种CD4结合剂。例如，CD4结合剂可与蛋白融合剂或病毒包膜蛋白融合或掺入其中。在另一个实施方案中，可通过与跨膜结构域融合而将CD4结合剂掺入病毒包膜中。可以使用本领域技术人员根据本公开已知的任何CD4结合剂。
在一些实施方案中，通过融合剂介导的递送将外源多核苷酸，例如表达CD47的多核苷酸、表达一种或多种CAR的多核苷酸和/或编码Cas蛋白的多核苷酸以及编码至少一种至两种核糖核酸的核酸引入细胞中。在一些实施方案中，融合剂介导的递送在受体患者体内进行。在一些实施方案中，融合剂介导的递送包括使受体患者与包含慢病毒载体的组合物接触，所述慢病毒载体包含(i)CD8结合剂，(ii)编码CRISPR/Cas基因编辑组分的多核苷酸，以及(iii)编码CD47的多核苷酸，其中用慢病毒载体转导受体患者的低免疫原性T细胞、非活化T细胞或低免疫原性T细胞群。在一些实施方案中，融合剂介导的递送包括使受体患者与包含慢病毒载体的组合物接触，所述慢病毒载体包含(i)CD8结合剂，(ii)编码CRISPR/Cas基因编辑组分的多核苷酸，以及(iii)编码一种或多种CAR的一种或多种多核苷酸，其中用慢病毒载体转导受体患者的低免疫原性T细胞、非活化T细胞或低免疫原性T细胞群。在一些实施方案中，融合剂介导的递送包括使受体患者与包含慢病毒载体的组合物接触，所述慢病毒载体包含(i)CD8结合剂，和(ii)编码靶向RHD基因座的CRISPR/Cas基因编辑组分的多核苷酸，其中用慢病毒载体转导受体患者的低免疫原性T细胞、非活化T细胞或低免疫原性T细胞群。在一些实施方案中，融合剂介导的递送包括使受体患者与包含慢病毒载体的组合物接触，所述慢病毒载体包含(i)CD8结合剂，(ii)编码靶向RHD基因座的CRISPR/Cas基因编辑组分的多核苷酸，以及(iii)编码一种或多种CAR的一种或多种多核苷酸，其中用慢病毒载体转导受体患者的低免疫原性T细胞、非活化T细胞或低免疫原性T细胞群。在一些实施方案中，将编码一种或多种CAR的一种或多种多核苷酸插入CRISPR/Cas靶向的RHD基因座中。
M.用于施用低免疫原性T细胞的方法
如本文进一步详细描述的，本文提供了用于治疗已接受同种异体移植的患者或者在怀孕或曾怀孕的患者(例如，正在孕期进行同种异体免疫或已在孕期进行过同种异体免疫)或对同种异体抗原敏感的患者，诸如已接受同种异体移植的患者或者在怀孕或曾怀孕的患者的方法。在一些实施方案中，同种异体移植包括但不限于同种异体细胞移植、同种异体输血、同种异体组织移植或同种异体器官移植。在一些实施方案中，患者对RhD抗原敏感。对RhD抗原敏感的患者的实例包括例如具有RhD阳性胎儿的RhD阴性母亲和RhD阳性细胞疗法的RhD阴性受体患者。
治疗此类患者的方法通常是通过施用细胞，特别是低免疫原性T细胞实现的。应当理解，对于本文所述的与细胞和/或疗法的时间安排相关的所有多个实施方案，细胞的施用是通过导致所引入的细胞至少部分定位于期望部位的方法或途径来完成的。可以将细胞直接植入期望部位，或可替代地通过任何适当的途径施用，所述途径导致递送至受试者的期望位置，在所述位置中，植入的细胞或细胞组分中的至少一部分保持存活。在一些实施方案中，施用细胞以治疗疾病或病症，诸如可以通过细胞疗法减轻的任何疾病、病症、病状或其症状。
在一些实施方案中，在患者被致敏或表现出致敏特性或特征之后施用细胞群至少1周(例如，1周、2周、3周、4周、5周、6周、7周、8周、9周、10周、11周、12周、13周、14周、15周、16周、17周、18周、19周、20周或更长时间)或更长时间。在一些实施方案中，在患者已接受同种异体移植、曾怀孕(例如，正在孕期进行同种异体免疫或已在孕期进行过同种异体免疫)或被致敏或表现出致敏特性或特征之后施用细胞群至少1个月(例如，1个月、2个月、3个月、4个月、5个月、6个月、7个月、8个月、9个月、10个月、11个月、12个月、13个月、14个月、15个月、16个月、17个月、18个月、19个月、20个月或更长时间)或更长时间。
在一些实施方案中，施用的低免疫原性T细胞群在患者中引发降低或较低水平的免疫激活。在一些情况下，与施用免疫原性细胞产生的免疫激活水平相比，所述细胞引发的免疫激活水平低至少5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％。在一些实施方案中，施用的低免疫原性T细胞群无法在患者中引发免疫激活。
在一些实施方案中，施用的低免疫原性T细胞群在患者中引发降低或较低水平的全身性TH1激活。在一些情况下，与施用免疫原性细胞产生的全身性TH1激活水平相比，所述细胞引发的全身性TH1激活水平低至少5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％。在一些实施方案中，施用的低免疫原性T细胞群无法在患者中引发全身性TH1激活。
在一些实施方案中，施用的低免疫原性T细胞群在患者中引发降低或较低水平的外周血单核细胞(PBMC)的免疫激活。在一些情况下，与施用免疫原性细胞产生的PBMC的免疫激活水平相比，所述细胞引发的PBMC的免疫激活水平低至少5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％。在一些实施方案中，施用的低免疫原性T细胞群无法在患者中引发PBMC的免疫激活。
在一些实施方案中，施用的低免疫原性T细胞群在患者中引发降低或较低水平的供体特异性IgG抗体。在一些情况下，与施用免疫原性细胞产生的供体特异性IgG抗体水平相比，所述细胞引发的供体特异性IgG抗体水平低至少5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％。在一些实施方案中，施用的低免疫原性T细胞群无法在患者中引发供体特异性IgG抗体。
在一些实施方案中，施用的低免疫原性T细胞群在患者中引发降低或较低水平的IgM和IgG抗体产生。在一些情况下，与施用免疫原性细胞产生的IgM和IgG抗体产生水平相比，所述细胞引发的IgM和IgG抗体产生水平低至少5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％。在一些实施方案中，施用的低免疫原性T细胞群无法在患者中引发IgM和IgG抗体产生。
在一些实施方案中，施用的低免疫原性T细胞群在患者中引发降低或较低水平的细胞毒性T细胞杀伤。在一些情况下，与施用免疫原性细胞产生的细胞毒性T细胞杀伤水平相比，所述细胞引发的细胞毒性T细胞杀伤水平低至少5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％。在一些实施方案中，施用的低免疫原性T细胞群无法在患者中引发细胞毒性T细胞杀伤。
如上文所论述，本文提供了在某些实施方案中可以施用于对同种异体抗原诸如RhD和/或人白细胞抗原敏感的患者的细胞。在一些实施方案中，患者在怀孕或曾怀孕，例如，在孕期进行同种异体免疫(例如，胎儿和新生儿溶血病(HDFN)、新生儿同种免疫性中性粒细胞减少症(NAN)或胎儿和新生儿同种免疫性血小板减少症(FNAIT))。换句话说，患者患有或曾患有与孕期同种异体免疫相关的病症或病状，诸如但不限于胎儿和新生儿溶血病(HDFN)、新生儿同种免疫性中性粒细胞减少症(NAN)以及胎儿和新生儿同种免疫性血小板减少症(FNAIT)。在一些实施方案中，患者已接受同种异体移植，诸如但不限于同种异体细胞移植、同种异体输血、同种异体组织移植或同种异体器官移植。在一些实施方案中，患者表现出针对同种异体抗原的记忆B细胞。在一些实施方案中，患者表现出针对同种异体抗原的记忆T细胞。此类患者可以表现出针对同种异体抗原的记忆B细胞和记忆T细胞。
在施用所述细胞后，患者不表现出全身免疫反应，或者表现出与对非低免疫原性的细胞的反应相比水平降低的全身免疫反应。在一些实施方案中，患者不表现出适应性免疫反应，或者表现出与对非低免疫原性的细胞的反应相比水平降低的适应性免疫反应。在一些实施方案中，患者不表现出先天免疫反应，或者表现出与对非低免疫原性的细胞的反应相比水平降低的先天免疫反应。在一些实施方案中，患者不表现出T细胞反应，或者表现出与对非低免疫原性的细胞的反应相比水平降低的T细胞反应。在一些实施方案中，患者不表现出B细胞反应，或者表现出与对非低免疫原性的细胞的反应相比水平降低的B细胞反应。
如本文进一步详细描述的，本文提供了包含外源CD47多肽和减少的RhD抗原和MHCI类人白细胞抗原表达的低免疫原性T细胞群、包含外源CD47多肽和减少的RhD抗原和MHCII类人白细胞抗原表达的低免疫原性T细胞群，以及包含外源CD47多肽和减少的RhD抗原和MHC I类和II类人白细胞抗原表达的低免疫原性T细胞群。
本文提供了用于治疗患有病状、病症或病症的患者的方法，其包括向受试者(例如人患者)施用低免疫原性T细胞群(例如，由原代T细胞或其子代繁殖的低免疫原性T细胞和非活化T细胞，或衍生自诱导性多能干细胞(iPSC)或其子代的低免疫原性T细胞和非活化T细胞)。例如，向患者施用低免疫原性原代T细胞群，诸如但不限于CD3+T细胞、CD4+T细胞、CD8+T细胞、天然T细胞、调控性T(Treg)细胞、非调控性T细胞、Th1细胞、Th2细胞、Th9细胞、Th17细胞、T滤泡辅助(Tfh)细胞、细胞毒性T淋巴细胞(CTL)、效应T(Teff)细胞、中央记忆T(Tcm)细胞、效应记忆T(Tem)细胞、表达CD45RA的效应记忆T细胞(TEMRA细胞)、组织驻留记忆(Trm)细胞、虚拟记忆T细胞、先天记忆T细胞、记忆干细胞(Tsc)、γδT细胞以及T细胞的任何其他亚型，以治疗病状、病症或病症。在一些实施方案中，在施用低免疫原性T细胞群之前，不向患者施用免疫阻抑剂和/或免疫调节剂(诸如但不限于淋巴细胞耗竭剂)。在一些实施方案中，在施用细胞前至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14天或更多天施用免疫阻抑剂和/或免疫调节剂。在一些实施方案中，在施用细胞前至少1周、2周、3周、4周、5周、6周、7周、8周、9周、10周或更多周施用免疫阻抑剂和/或免疫调节剂。在多个实施方案中，在施用细胞后不向患者施用免疫阻抑剂和/或免疫调节剂，或者在施用细胞后至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14天或更多天施用免疫阻抑剂和/或免疫调节剂。在一些实施方案中，在施用细胞后至少1周、2周、3周、4周、5周、6周、7周、8周、9周、10周或更多周施用免疫阻抑剂和/或免疫调节剂。在一些实施方案中，其中免疫阻抑剂和/或免疫调节剂在施用细胞之前或之后向患者施用，施用的剂量低于具有RhD抗原、MHC I和/或MHC II表达且无外源CD47表达的细胞所需的剂量。
免疫阻抑剂和/或免疫调节剂(诸如但不限于淋巴细胞耗竭剂)的非限制性实例包括环孢菌素(cyclosporine)、硫唑嘌呤(azathioprine)、霉酚酸(mycophenolic acid)、霉酚酸酯(mycophenolate mofetil)、皮质类固醇诸如泼尼松(prednisone)、甲氨蝶呤、金盐、柳氮磺胺吡啶(sulfasalazine)、抗疟药、布喹那(brequinar)、来氟米特(leflunomide)、咪唑立宾(mizoribine)、15-脱氧精胍菌素(15-deoxyspergualine)、6-巯基嘌呤、环磷酰胺、雷帕霉素(rapamycin)、他克莫司(tacrolimus)(FK-506)、OKT3、抗胸腺细胞球蛋白、胸腺五肽、胸腺肽-α和类似的剂。在一些实施方案中，免疫阻抑剂和/或免疫调节剂选自由以下组成的免疫阻抑抗体组：与IL-2受体的p75结合的抗体、与例如MHC、CD2、CD3、CD4、CD7、CD28、B7、CD40、CD45、IFN-γ、TNF-α、IL-4、IL-5、IL-6R、IL-6、IGF、IGFR1、IL-7、IL-8、IL-10、CD11a或CD58结合的抗体，以及与其任何配体结合的抗体。在一些实施方案中，这种免疫阻抑剂和/或免疫调节剂可选自可溶性IL-15R、IL-10、B7分子(例如，B7-1、B7-2、其变体，以及其片段)、ICOS和OX40、负性T细胞调控子的抑制剂(诸如针对CTLA-4的抗体)和类似的剂。
在一些实施方案中，其中免疫阻抑剂和/或免疫调节剂在施用细胞之前或之后向患者施用，施用的剂量低于具有RhD抗原表达、MHC I和/或MHC II表达、TCR表达且无外源CD47表达的细胞所需的剂量。在一些实施方案中，其中免疫阻抑剂和/或免疫调节剂在第一次施用细胞之前或之后向患者施用，施用的剂量低于具有RhD抗原表达、MHC I和MHC II表达、TCR表达且无外源CD47表达的细胞所需的剂量。
对于治疗应用，根据所公开的方法制备的细胞通常可以以包含等渗赋形剂的药物组合物的形式提供，并且在对人体施用足够无菌的条件下制备。对于细胞组合物的药物制剂的一般原则，参见“Cell Therapy:Stem Cell Transplantation,Gene Therapy,andCellular Immunotherapy,”Morstyn和Sheridan编辑,Cambridge University Press,1996；和“Hematopoietic Stem Cell Therapy,”E.D.Ball、J.Lister和P.Law,ChurchillLivingstone,2000。可以将细胞包装在适合分配或临床使用的装置或容器中。
N.低免疫原性多能干细胞的生成
本技术提供了产生衍生自多能细胞的低免疫原性T细胞和非活化T细胞的方法。在一些实施方案中，所述方法包括生成多能干细胞。小鼠和人多能干细胞(通常称为iPSC；对于鼠细胞为miPSC或对于人细胞为hiPSC)的生成通常是本领域已知的。如本领域技术人员将理解的，有多种不同的用于生成iPCS的方法。最初的诱导是使用四种转录因子Oct3/4、Sox2、c-Myc和Klf4的病毒引入在小鼠胚胎或成人成纤维细胞中进行的；参见Takahashi和Yamanaka Cell 126:663-676(2006)，所述文献特此通过引用整体并入，特别是其中概述的技术。从那时起，已经开发了许多方法；参见Seki等人,World J.Stem Cells7(1):116-125(2015)进行回顾，以及Lakshmipathy和Vermuri编辑,Methods in Molecular Biology:Pluripotent Stem Cells,Methods and Protocols,Springer 2013，这两篇文献均特此通过引用明确地整体并入，特别是用于生成hiPSC的方法(参见例如后一篇参考文献的第3章)。
通常，iPSC通过在宿主细胞中瞬时表达一种或多种重编程因子”来生成，所述重编程因子通常使用附加型载体引入。在这些条件下，少量的细胞被诱导成为iPSC(一般来说，这一步的效率很低，因为没有使用选择性标志物)。一旦细胞被“重编程”并成为多能细胞，它们就失去附加型载体并使用内源基因产生因子。
如本领域技术人员还应理解的，可以使用或被使用的重编程因子的数量可以变化。通常，当使用较少的重编程因子时，细胞转化为多能状态的效率下降，“多能性”也下降，例如，较少的重编程因子可能导致细胞不是完全多能的，而是可能只能够分化成较少的细胞类型。
在一些实施方案中，使用单个重编程因子OCT4。在其他实施方案中，使用两个重编程因子OCT4和KLF4。在其他实施方案中，使用三个重编程因子OCT4、KLF4和SOX2。在其他实施方案中，使用四个重编程因子OCT4、KLF4、SOX2和c-Myc。在其他实施方案中，可以使用选自SOKMNLT；SOX2、OCT4(POU5F1)、KLF4、MYC、NANOG、LIN28和SV40L T抗原的5、6或7个重编程因子。一般来讲，这些重编程因子基因是在附加型载体上提供的，所述附加型载体诸如是本领域已知的和可商购获得的。
一般来讲，如本领域已知的，iPSC通过瞬时表达如本文所述的重编程因子由非多能细胞(诸如但不限于血细胞、成纤维细胞等)制备。
O.低免疫原性表型的测定
一旦已经生成低免疫原性T细胞，就可如WO2016183041和WO2018132783中所述测定它们的低免疫原性。
在一些实施方案中，使用如WO2018132783的图13和图15中例示的多种技术测定低免疫原性。这些技术包括移植到同种异体宿主中和监测逃脱宿主免疫系统的低免疫原性多能细胞生长(例如畸胎瘤)。在一些情况下，低免疫原性多能细胞衍生物被转导以表达荧光素酶，然后可以使用生物发光成像进行跟踪。类似地，测试宿主动物对此类细胞的T细胞和/或B细胞反应，以确认所述细胞不在宿主动物中引起免疫反应。通过Elispot、ELISA、FACS、PCR或质谱流式细胞术(CYTOF)评估T细胞反应。使用FACS或Luminex来评估B细胞反应或抗体反应。另外或可替代地，可测定细胞避免先天免疫反应(例如，NK细胞杀伤)的能力，如WO2018132783的图14和图15中一般性地所示。
在一些实施方案中，使用本领域技术人员认可的T细胞免疫测定(诸如T细胞增殖测定、T细胞活化测定和T细胞杀伤测定)来评价细胞的免疫原性。在一些情况下，T细胞增殖测定包括用干扰素-γ预处理细胞并将细胞与标记的T细胞共培养，并且在预先选择的时间量后测定T细胞群(或增殖的T细胞群)的存在。在一些情况下，T细胞活化测定包括将T细胞与本文概述的细胞共培养并确定T细胞中T细胞活化标志物的表达水平。
可以进行体内测定以评估本文概述的细胞的免疫原性。在一些实施方案中，使用同种异体人源化免疫缺陷小鼠模型确定低免疫原性T细胞的存活率和免疫原性。在一些情况下，将低免疫原性T细胞移植到同种异体人源化NSG-SGM3小鼠中并测定细胞排斥、细胞存活率和畸胎瘤形成。在一些情况下，植入的低免疫原性T细胞或其分化细胞在小鼠模型中展现出长期存活。
用于确定免疫原性(包括细胞的低免疫原性)的另外的技术描述于例如Deuse等人,Nature Biotechnology,2019,37,252-258和Han等人,Proc Natl Acad Sci USA,2019,116(21),10441-10446，包括附图、附图说明和方法描述的公开内容通过引用整体并入本文。
如本领域技术人员将理解的，细胞中RhD抗原水平的成功降低可以使用本领域已知的技术并且如下文所述进行测量；例如，使用结合RhD抗原的标记抗体(例如使用可商购获得的RhD抗体)进行的蛋白质印迹和FACS技术、RT-PCR技术等。
另外，可以对细胞进行测试，以确认RhD抗原不在细胞表面上表达。再次，这种测定如本领域已知的那样进行并且通常使用基于与人RhD抗原结合的商业抗体的蛋白质印迹或FACS分析进行。
可以使用本领域已知并且如下文所述的技术(例如，使用结合HLA复合物的标记抗体(例如，使用与人主要组织相容性HLAI类抗原的α链结合的可商购获得的HLA-A、B、C抗体)的FACS技术)来测量多能细胞中MHC I功能(当细胞衍生自人细胞时为HLAI)的成功降低。
另外，可以对细胞进行测试，以确认HLAI复合物不在细胞表面上表达。这可使用如上文所讨论的一种或多种HLA细胞表面组分的抗体通过FACS分析来测定。
可以使用本领域已知的技术(诸如使用蛋白质的抗体进行的蛋白质印迹、FACS技术、RT-PCR技术等)来测量多能细胞或其衍生物中MHC II功能(当细胞衍生自人细胞时为HLAII)的成功降低。
另外，可以对细胞进行测试，以确认HLAII复合物不在细胞表面上表达。再次，这种测定如本领域已知的那样进行(例如参见WO2018132783的图21)并且通常使用基于与人HLAII类HLA-DR、DP和大多数DQ抗原结合的商业抗体的蛋白质印迹或FACS分析进行。
除了减少RhD、HLAI和II(或MHC I和II)之外，本技术的低免疫原性T细胞和非活化T细胞对巨噬细胞吞噬作用和NK细胞杀伤的易感性也降低。所得的低免疫原性T细胞“逃脱”免疫巨噬细胞和先天途径。可以使用本领域已知的标准技术，诸如下文描述的那些，测试细胞以确认补体依赖性细胞毒性(CDC)和抗体依赖性细胞毒性(ADCC)的降低。
P.从低免疫原性多能细胞分化的低免疫原性T细胞的施用
本技术提供了HIP细胞，所述HIP细胞分化成不同的细胞类型以便后续移植到受体受试者体内。可以如本领域已知的那样，通常通过评价细胞特异性标志物的存在来测定分化。如本领域技术人员将理解的，可以使用本领域已知的技术移植分化的低免疫原性多能细胞衍生物，这取决于细胞类型和这些细胞的最终用途。在一些实施方案中，T淋巴细胞(T细胞)衍生自本文所述的低免疫原性诱导性多能干(HIP)细胞。在一些实施方案中，衍生自HIP细胞的T细胞作为CD4+和CD8+细胞的混合物施用。在一些实施方案中，所施用的衍生自HIP细胞的T细胞是CD4+细胞。在一些实施方案中，所施用的衍生自HIP细胞的T细胞是CD8+细胞。在一些实施方案中，衍生自HIP细胞的T细胞作为非活化T细胞施用。
在本文提供，T淋巴细胞(T细胞)衍生自所述的低免疫原性诱导性多能干(HIP)细胞。用于从多能干细胞(例如，iPSC)生成T细胞(包括CAR T细胞)的方法在例如Iriguchi等人,Nature Communications 12,430(2021)；Themeli等人,Cell Stem Cell,16(4):357-366(2015)；Themeli等人,Nature Biotechnology 31:928-933(2013)中有所描述。
在一些实施方案中，低免疫原性诱导性多能干细胞衍生的T细胞包括一种或多种嵌合抗原受体(CAR)。任何合适的CAR可以包含在低免疫原性诱导性多能干细胞衍生的T细胞中，包括本文所述的CAR。在一些实施方案中，低免疫原性诱导性多能干细胞衍生的T细胞包括编码一种或多种CAR的一种或多种多核苷酸。可以使用任何合适的方法将一种或多种CAR插入到低免疫原性T细胞的基因组基因座中，所述方法包括本文所述的基因编辑方法(例如，CRISPR/Cas系统)。
本文提供的HIP衍生的T细胞可用于治疗合适的癌症，包括但不限于B细胞急性成淋巴细胞性白血病(B-ALL)、弥漫性大B细胞淋巴瘤、肝癌、胰腺癌、乳腺癌、卵巢癌、结直肠癌、肺癌、非小细胞肺癌、急性髓性淋巴细胞白血病、多发性骨髓瘤、胃癌、胃腺癌、胰腺癌、胶质母细胞瘤、神经母细胞瘤、肺鳞状细胞癌、肝细胞癌和膀胱癌。
IV.实施例
实施例1：T细胞上的RhD表达
为了确定RhD抗原是否在T细胞上表达，对来自五名RhD+人供体的T细胞进行CD3表达分选以生成CD3+群，并使用标准技术分析CD3+T细胞的RhD抗原表达。在解冻后或用IL-2激活后通过流式细胞术(使用标准方法)对T细胞进行分析。来自两名RhD-供体的CD3+T细胞用作对照。
将细胞用抗Fc受体抗体封闭，并用抗CD3抗体以及与同种型对照浓度匹配的抗RhD抗体(CD240D)染色。如图1A和1B所示，RhD抗原在来自RhD+供体的T细胞上表达，并且在用IL-2激活后表达不受影响。在用IL-2激活之前或之后，RhD抗原在来自RhD-供体的T细胞上不表达(图1C)。
鉴于RhD抗原在包括活化T细胞的T细胞上表达这一令人惊讶的发现，对其表达的功能相关性进行了分析。
ADCC(抗体依赖性细胞毒性)
使用Xcelligence细胞杀伤测定确定在存在Roledumab(一种与RhD结合的单克隆IgG1型抗体)的情况下，巨噬细胞或自然杀伤(NK)细胞是否识别并杀伤RhD+T细胞。
如图2A-2C所示，在存在Roledumab的情况下，RhD+T细胞被NK细胞(图2A)或巨噬细胞(图2B)通过ADCC杀伤，并且在存在抗RhD抗体的情况下不存在RhD-T细胞的杀伤(图2C)。
CDC(补体依赖性细胞毒性)
使用Xcelligence细胞杀伤测定确定在存在Roledumab的情况下，RhD+T细胞是否会触发CDC。
如图3A-3C所示，在存在Roledumab的情况下，通过CDC杀伤RhD+T细胞，并且在存在抗RhD抗体的情况下不存在RhD-T细胞的杀伤。
实施例2：RhD致敏患者
如实施例1中所述，从RhD+和RhD-供体制备T细胞。如实施例1中所述，使用来自RhD+、RhD-和RhD-致敏志愿者的血清进行ADCC和CDC测定，以分析RhD致敏对RhD阴性受体的影响。
然后分析了RhD致敏对RhD阴性受体的影响。分析对RhD敏感的RhD阴性志愿者的血清通过CDC和ADCC对RhD+T细胞(O型血)的杀伤。如图4A-C所示，RhD阳性或阴性血清没有杀伤RhD+T细胞，但是当RhD阴性志愿者先前被致敏时，存在RhD+T细胞的杀伤。来自未致敏的RhD阴性志愿者的血清用作对照。如图4D所示，在对照的情况下，当供体细胞为RhD阴性时，即使在先前被致敏的RhD阴性志愿者的情况下，也不存在被RhD阳性或阴性血清杀伤。
所有标题和章节名称仅用于清晰和参考目的，并且不应视为以任何方式进行限制。例如，本领域技术人员将理解根据本文所述的本技术的精神和范围适当地组合来自不同标题和章节的各个方面的有用性。
本文引用的所有参考文献特此通过引用并且出于所有目的整体并入本文，其程度就如同每项单独的出版物或专利或专利申请被具体和单独地指示出于所有目的通过引用整体并入。
如本领域的技术人员将显而易见的，可以在不脱离本申请的精神和范围下对本申请进行许多修改和变化。本文所述的特定实施方案和实施例只是为了举例而提供，并且本申请只受随附权利要求的条款以及权利要求所授权的等效物的完整范围限制。

Claims (188)

1.一种低免疫原性T细胞，其包含相对于未改变或未修饰的野生型细胞减少的恒河猴因子D(RhD)抗原和主要组织相容性复合物(MHC)I类和/或II类人白细胞抗原表达，以及编码CD47的第一外源多核苷酸，其中所述低免疫原性T细胞由原代T细胞或其子代繁殖，或衍生自诱导性多能干细胞(iPSC)或其子代。
2.如权利要求1所述的低免疫原性T细胞，其中所述低免疫原性T细胞由原代T细胞或其子代繁殖，其中所述原代T细胞或其子代包含相对于未改变或未修饰的野生型细胞减少的RhD抗原和MHC I类和/或II类人白细胞抗原表达，以及编码CD47的第一外源多核苷酸。
3.如权利要求1所述的低免疫原性T细胞，其中所述低免疫原性T细胞衍生自iPSC或其子代，其中所述iPSC或其子代包含相对于未改变或未修饰的野生型细胞减少的RhD抗原和MHC I类和/或II类人白细胞抗原表达，以及编码CD47的第一外源多核苷酸。
4.一种非活化T细胞，其包含相对于未改变或未修饰的野生型细胞减少的RhD抗原和MHC I类和/或II类人白细胞抗原表达，以及编码CD47的第一外源多核苷酸，其中所述非活化T细胞由原代T细胞或其子代繁殖，或衍生自iPSC或其子代。
5.如权利要求4所述的非活化T细胞，其中所述非活化T细胞由原代T细胞或其子代繁殖，其中所述原代T细胞或其子代包含相对于未改变或未修饰的野生型细胞减少的RhD抗原和MHC I类和/或II类人白细胞抗原表达，以及编码CD47的第一外源多核苷酸。
6.如权利要求4所述的非活化T细胞，其中所述非活化T细胞衍生自iPSC或其子代，其中所述iPSC或其子代包含相对于未改变或未修饰的野生型细胞减少的RhD抗原和MHC I类和/或II类人白细胞抗原表达，以及编码CD47的第一外源多核苷酸。
7.如权利要求4-6中任一项所述的非活化T细胞，其中所述非活化T细胞是非活化的低免疫原性细胞。
8.一种低免疫原性T细胞群，其包含相对于未改变或未修饰的野生型细胞减少的RhD抗原和MHC I类和/或II类人白细胞抗原表达，以及编码CD47的第一外源多核苷酸，其中所述低免疫原性T细胞群由原代T细胞或其子代繁殖，或衍生自iPSC或其子代。
9.如权利要求8所述的低免疫原性T细胞群，其中所述低免疫原性T细胞群由原代T细胞或其子代繁殖，其中所述原代T细胞或其子代包含相对于未改变或未修饰的野生型细胞减少的RhD抗原和MHC I类和/或II类人白细胞抗原表达，以及编码CD47的第一外源多核苷酸。
10.如权利要求8所述的低免疫原性T细胞群，其中所述低免疫原性T细胞群衍生自iPSC或其子代，其中所述iPSC或其子代包含相对于未改变或未修饰的野生型细胞减少的RhD抗原和MHC I类和/或II类人白细胞抗原表达，以及编码CD47的第一外源多核苷酸。
11.如权利要求3-10中任一项所述的低免疫原性T细胞、非活化T细胞或低免疫原性T细胞群，其中所述低免疫原性T细胞、非活化T细胞或低免疫原性T细胞群不表达MHC I类和/或II类人白细胞抗原。
12.如权利要求1-11中任一项所述的低免疫原性T细胞、非活化T细胞或低免疫原性T细胞群，其中所述低免疫原性T细胞、非活化T细胞或低免疫原性T细胞群包含相对于未改变或未修饰的野生型细胞减少的β-2-微球蛋白(B2M)和/或MHC II类反式激活因子(CIITA)表达。
13.如权利要求12所述的低免疫原性T细胞、非活化T细胞或低免疫原性T细胞群，其中所述低免疫原性T细胞、非活化T细胞或低免疫原性T细胞群不表达B2M和/或CIITA。
14.如权利要求1-13中任一项所述的低免疫原性T细胞、非活化T细胞或低免疫原性T细胞群，其中RhD抗原表达的减少是由RHD基因的敲除造成的。
15.如权利要求1-14中任一项所述的低免疫原性T细胞、非活化T细胞或低免疫原性T细胞群，其中所述低免疫原性T细胞、非活化T细胞或低免疫原性T细胞群不表达RhD抗原。
16.如权利要求1-15中任一项所述的低免疫原性T细胞、非活化T细胞或低免疫原性T细胞群，其还包含相对于未改变或未修饰的野生型细胞减少的T细胞受体表达。
17.如权利要求16所述的低免疫原性T细胞、非活化T细胞或低免疫原性T细胞群，其中所述低免疫原性T细胞、非活化T细胞或低免疫原性T细胞群不表达T细胞受体。
18.如权利要求16或17所述的低免疫原性T细胞、非活化T细胞或低免疫原性T细胞群，其中所述低免疫原性T细胞、非活化T细胞或低免疫原性T细胞群包含减少的T细胞受体α恒定区(TRAC)和/或T细胞受体β恒定区(TRBC)表达。
19.如权利要求18所述的低免疫原性T细胞、非活化T细胞或低免疫原性T细胞群，其中所述低免疫原性T细胞、非活化T细胞或低免疫原性T细胞群不表达TRAC和/或TRBC。
20.如权利要求1-19中任一项所述的低免疫原性T细胞、非活化T细胞或低免疫原性T细胞群，其还包含编码一种或多种嵌合抗原受体(CAR)的第二外源多核苷酸。
21.如权利要求20所述的低免疫原性T细胞、非活化T细胞或低免疫原性T细胞群，其中所述一种或多种CAR选自由以下组成的组：CD19特异性CAR，使得所述细胞是CD19 CAR T细胞；CD20特异性CAR，使得所述细胞是CD20 CAR T细胞；CD22特异性CAR，使得所述细胞是CD22 CAR T细胞；以及BCMA特异性CAR，使得所述细胞是BCMA CAR T细胞；或其组合。
22.如权利要求21所述的低免疫原性T细胞、非活化T细胞或低免疫原性T细胞群，其中所述低免疫原性T细胞、非活化T细胞或低免疫原性T细胞群包含CD19特异性CAR和CD22特异性CAR，使得所述细胞是CD19/CD22 CAR T细胞。
23.如权利要求22所述的低免疫原性T细胞、非活化T细胞或低免疫原性T细胞群，其中所述CD19特异性CAR和所述CD22特异性CAR由单一双顺反子多核苷酸编码。
24.如权利要求22所述的低免疫原性T细胞、非活化T细胞或低免疫原性T细胞群，其中所述CD19特异性CAR和所述CD22特异性CAR由两种单独的多核苷酸编码。
25.如权利要求1-24中任一项所述的低免疫原性T细胞、非活化T细胞或低免疫原性T细胞群，其中将所述第一和/或第二外源多核苷酸插入到所述细胞的至少一个等位基因的特定基因座中。
26.如权利要求25所述的低免疫原性T细胞、非活化T细胞或低免疫原性T细胞群，其中所述特定基因座选自由以下组成的组：安全港基因座、RHD基因座、B2M基因座、CIITA基因座、TRAC基因座和TRB基因座。
27.如权利要求1-26中任一项所述的低免疫原性T细胞、非活化T细胞或低免疫原性T细胞群，其中从供体受试者离体将编码CD47的所述多核苷酸引入所述低免疫原性T细胞、非活化T细胞或低免疫原性T细胞群中。
28.如权利要求27所述的低免疫原性T细胞、非活化T细胞或低免疫原性T细胞群，其中使用慢病毒载体将编码CD47的所述多核苷酸引入所述低免疫原性T细胞、非活化T细胞或低免疫原性T细胞群中。
29.如权利要求1-26中任一项所述的低免疫原性T细胞、非活化T细胞或低免疫原性T细胞群，其中在所述受体患者体内将编码CD47的所述多核苷酸引入所述低免疫原性T细胞、非活化T细胞或低免疫原性T细胞群中。
30.如权利要求29所述的低免疫原性T细胞、非活化T细胞或低免疫原性T细胞群，其中通过使所述受体患者与包含慢病毒载体的组合物接触来将编码CD47的所述外源多核苷酸引入所述低免疫原性T细胞、非活化T细胞或低免疫原性T细胞群中，所述慢病毒载体包含(i)CD4结合剂或CD8结合剂，和(ii)编码CD47的多核苷酸，其中用所述慢病毒载体转导所述受体患者的所述低免疫原性T细胞、非活化T细胞或低免疫原性T细胞群。
31.如权利要求1-26中任一项所述的低免疫原性T细胞、非活化T细胞或低免疫原性T细胞群，其中使用CRISPR/Cas基因编辑将编码CD47的所述多核苷酸引入所述低免疫原性T细胞、非活化T细胞或低免疫原性T细胞群中。
32.如权利要求31所述的低免疫原性T细胞、非活化T细胞或低免疫原性T细胞群，其中所述CRISPR/Cas基因编辑从供体受试者离体进行。
33.如权利要求32所述的低免疫原性T细胞、非活化T细胞或低免疫原性T细胞群，其中所述CRISPR/Cas基因编辑使用慢病毒载体进行。
34.如权利要求31所述的低免疫原性T细胞、非活化T细胞或低免疫原性T细胞群，其中所述CRISPR/Cas基因编辑在所述受体患者体内进行。
35.如权利要求34所述的低免疫原性T细胞、非活化T细胞或低免疫原性T细胞群，其中通过使所述受体患者与包含慢病毒载体的组合物接触来进行所述CRISPR/Cas基因编辑，所述慢病毒载体包含(i)CD4结合剂或CD8结合剂，(ii)编码CRISPR/Cas基因编辑组分的多核苷酸，以及(iii)编码CD47的多核苷酸，其中用所述慢病毒载体转导所述受体患者的所述低免疫原性T细胞、非活化T细胞或低免疫原性T细胞群。
36.如权利要求20-35中任一项所述的低免疫原性T细胞、非活化T细胞或低免疫原性T细胞群，其中从供体受试者离体将所述一种或多种CAR引入所述低免疫原性T细胞、非活化T细胞或低免疫原性T细胞群中。
37.如权利要求36所述的低免疫原性T细胞、非活化T细胞或低免疫原性T细胞群，其中使用慢病毒载体将所述一种或多种CAR引入所述低免疫原性T细胞、非活化T细胞或低免疫原性T细胞群中。
38.如权利要求20-35中任一项所述的低免疫原性T细胞、非活化T细胞或低免疫原性T细胞群，其中在所述受体患者体内将所述一种或多种CAR引入所述低免疫原性T细胞、非活化T细胞或低免疫原性T细胞群中。
39.如权利要求38所述的低免疫原性T细胞、非活化T细胞或低免疫原性T细胞群，其中通过使所述受体患者与包含慢病毒载体的组合物接触来将所述一种或多种CAR引入所述低免疫原性T细胞、非活化T细胞或低免疫原性T细胞群中，所述慢病毒载体包含(i)CD4结合剂或CD8结合剂，和(ii)编码所述一种或多种CAR的一种或多种多核苷酸，其中用所述慢病毒载体转导所述受体患者的所述低免疫原性T细胞、非活化T细胞或低免疫原性T细胞群。
40.如权利要求20-35中任一项所述的低免疫原性T细胞、非活化T细胞或低免疫原性T细胞群，其中使用CRISPR/Cas基因编辑将所述一种或多种CAR引入所述低免疫原性T细胞、非活化T细胞或低免疫原性T细胞群中。
41.如权利要求40所述的低免疫原性T细胞、非活化T细胞或低免疫原性T细胞群，其中所述CRISPR/Cas基因编辑从供体受试者离体进行。
42.如权利要求41所述的低免疫原性T细胞、非活化T细胞或低免疫原性T细胞群，其中所述CRISPR/Cas基因编辑使用慢病毒载体进行。
43.如权利要求42所述的低免疫原性T细胞、非活化T细胞或低免疫原性T细胞群，其中所述CRISPR/Cas基因编辑在所述受体患者体内进行。
44.如权利要求43所述的低免疫原性T细胞、非活化T细胞或低免疫原性T细胞群，其中通过使所述受体患者与包含慢病毒载体的组合物接触来进行所述CRISPR/Cas基因编辑，所述慢病毒载体包含(i)CD4结合剂或CD8结合剂，(ii)编码CRISPR/Cas基因编辑组分的多核苷酸，以及(iii)编码所述一种或多种CAR的一种或多种多核苷酸，其中用所述慢病毒载体转导所述受体患者的所述低免疫原性T细胞、非活化T细胞或低免疫原性T细胞群。
45.如权利要求1-44中任一项所述的低免疫原性T细胞、非活化T细胞或低免疫原性T细胞群，其中所述低免疫原性T细胞、非活化T细胞或低免疫原性T细胞群由原代T细胞或其子代繁殖，其中所述原代T细胞分离自恒河猴因子(Rh)阴性的供体受试者。
46.如权利要求1-44中任一项所述的低免疫原性T细胞、非活化T细胞或低免疫原性T细胞群，其中所述低免疫原性T细胞、非活化T细胞或低免疫原性T细胞群衍生自iPSC或其子代，其中所述iPSC或其子代衍生自分离自RhD阴性的供体受试者的宿主细胞。
47.如权利要求1-44中任一项所述的低免疫原性T细胞、非活化T细胞或低免疫原性T细胞群，其中所述低免疫原性T细胞、非活化T细胞或低免疫原性T细胞群由原代T细胞或其子代繁殖，其中所述原代T细胞或其子代分离自RhD阳性的供体受试者，并且被基因工程化为具有减少的RhD抗原表达。
48.如权利要求47所述的低免疫原性T细胞、非活化T细胞或低免疫原性T细胞群，其中所述原代T细胞或其子代被基因工程化为不表达RhD抗原。
49.如权利要求1-44中任一项所述的低免疫原性T细胞、非活化T细胞或低免疫原性T细胞群，其中所述低免疫原性T细胞、非活化T细胞或低免疫原性T细胞群衍生自iPSC或其子代，其中所述iPSC或其子代分离自RhD阳性的供体受试者，并且被基因工程化为具有减少的RhD抗原表达。
50.如权利要求49所述的低免疫原性T细胞、非活化T细胞或低免疫原性T细胞群，其中所述iPSC或其子代被基因工程化为不表达RhD抗原。
51.如权利要求1-50中任一项所述的低免疫原性T细胞、非活化T细胞或低免疫原性T细胞群，其中所述低免疫原性T细胞、非活化T细胞或低免疫原性T细胞群由原代T细胞库或其子代繁殖，其中所述原代T细胞库分离自一个或多个与所述受体患者不同的供体受试者，其中所述一个或多个供体受试者任选地包括一个或多个RhD阳性受试者、一个或多个RhD阴性受试者，或RhD阳性受试者和RhD阴性受试者的混合群体。
52.如权利要求1-50中任一项所述的低免疫原性T细胞、非活化T细胞或低免疫原性T细胞群，其中所述低免疫原性T细胞、非活化T细胞或低免疫原性T细胞群衍生自iPSC库或其子代，其中所述iPSC库衍生自分离自一个或多个与所述受体患者不同的供体受试者的宿主细胞，其中所述一个或多个供体受试者任选地包括一个或多个RhD阳性受试者、一个或多个RhD阴性受试者，或RhD阳性受试者和RhD阴性受试者的混合群体。
53.如权利要求1-52中任一项所述的低免疫原性T细胞、非活化T细胞或低免疫原性T细胞群，其中使用CRISPR/Cas基因编辑将所述低免疫原性T细胞、非活化T细胞或低免疫原性T细胞群基因工程化为具有减少的RhD抗原表达。
54.如权利要求53所述的低免疫原性T细胞、非活化T细胞或低免疫原性T细胞群，其中所述CRISPR/Cas基因编辑从供体受试者离体进行。
55.如权利要求54所述的低免疫原性T细胞、非活化T细胞或低免疫原性T细胞群，其中所述CRISPR/Cas基因编辑使用慢病毒载体进行。
56.如权利要求53所述的低免疫原性T细胞、非活化T细胞或低免疫原性T细胞群，其中所述CRISPR/Cas基因编辑在所述受体患者体内进行。
57.如权利要求56所述的低免疫原性T细胞、非活化T细胞或低免疫原性T细胞群，其中通过使所述受体患者与包含慢病毒载体的组合物接触来进行所述CRISPR/Cas基因编辑，所述慢病毒载体包含(i)CD4结合剂或CD8结合剂，和(ii)编码靶向所述RHD基因座的CRISPR/Cas基因编辑组分的多核苷酸，其中用所述慢病毒载体转导所述受体患者的所述低免疫原性T细胞、非活化T细胞或低免疫原性T细胞群。
58.一种药物组合物，其包含一种或多种如权利要求1-57中任一项所述的低免疫原性T细胞、非活化T细胞或低免疫原性T细胞群，以及药学上可接受的添加剂、载剂、稀释剂或赋形剂。
59.如权利要求58所述的药物组合物，其中所述组合物包含选自由低免疫原性T细胞群、非活化T细胞群、低免疫原性CD19 CAR T细胞群以及低免疫原性CD22 CAR T细胞群组成的组的一种或多种细胞群，以及药学上可接受的添加剂、载剂、稀释剂或赋形剂。
60.如权利要求1-57中任一项所述的低免疫原性T细胞、非活化T细胞或低免疫原性T细胞群，或如权利要求58或59所述的药物组合物，其用于治疗患者的病症，其中所述患者是RhD致敏的。
61.如权利要求1-57中任一项所述的低免疫原性T细胞、非活化T细胞或低免疫原性T细胞群，或如权利要求58或59所述的药物组合物，其用于治疗患者的病症，其中所述患者不是RhD致敏的。
62.一种或多种修饰的T细胞群用于治疗受体患者的病症的用途，其中所述一种或多种修饰的T细胞群选自由以下组成的组：低免疫原性T细胞群、非活化T细胞群、低免疫原性CD19 CAR T细胞群以及低免疫原性CD22 CAR T细胞群，其中所述修饰的T细胞包含相对于未改变或未修饰的野生型细胞减少的RhD抗原和MHC I类和/或II类人白细胞抗原表达，以及编码CD47的第一外源多核苷酸，其中所述修饰的T细胞由原代T细胞或其子代繁殖，或衍生自iPSC或其子代。
63.如权利要求62所述的用途，其中所述修饰的T细胞包含相对于未改变或未修饰的野生型细胞减少的RhD抗原和MHC I类和II类人白细胞抗原表达，以及编码CD47的第一外源多核苷酸，其中所述修饰的T细胞由原代T细胞或其子代繁殖，或衍生自iPSC或其子代。
64.如权利要求62或63所述的用途，其中所述修饰的T细胞包含相对于未改变或未修饰的野生型细胞减少的RHD和B2M和/或CIITA表达，以及编码CD47的第一外源多核苷酸，其中所述修饰的T细胞由原代T细胞或其子代繁殖，或衍生自iPSC或其子代。
65.如权利要求64所述的用途，其中所述修饰的T细胞包含相对于未改变或未修饰的野生型细胞减少的RHD和B2M以及CIITA表达，以及编码CD47的第一外源多核苷酸，其中所述修饰的T细胞由原代T细胞或其子代繁殖，或衍生自iPSC或其子代。
66.如权利要求62-65中任一项所述的用途，其中所述修饰的T细胞不表达RhD抗原，不表达MHC I类和/或II类人白细胞抗原，并且包含编码CD47的第一外源多核苷酸，其中所述修饰的T细胞由原代T细胞或其子代繁殖，或衍生自iPSC或其子代。
67.如权利要求66所述的用途，其中所述修饰的T细胞不表达RhD抗原，不表达MHC I类人白细胞抗原，不表达MHC II类人白细胞抗原，并且包含编码CD47的第一外源多核苷酸，其中所述修饰的T细胞由原代T细胞或其子代繁殖，或衍生自iPSC或其子代。
68.如权利要求65或66所述的用途，其中所述修饰的T细胞不表达RHD，不表达B2M和/或CIITA，并且包含编码CD47的第一外源多核苷酸，其中所述修饰的T细胞由原代T细胞或其子代繁殖，或衍生自iPSC或其子代。
69.如权利要求68所述的用途，其中所述修饰的T细胞不表达RHD，不表达B2M，不表达CIITA，并且包含编码CD47的第一外源多核苷酸，其中所述修饰的T细胞由原代T细胞或其子代繁殖，或衍生自iPSC或其子代。
70.如权利要求62-69中任一项所述的用途，其中RhD抗原表达的减少或缺乏是由RHD基因的敲除造成的。
71.如权利要求62-70中任一项所述的用途，其中所述修饰的T细胞还包含相对于未改变或未修饰的野生型细胞减少的T细胞受体表达。
72.如权利要求71所述的用途，其中所述修饰的T细胞不表达T细胞受体。
73.如权利要求71或72所述的用途，其中所述修饰的T细胞包含减少的TRAC和/或TRBC表达。
74.如权利要求73所述的用途，其中所述修饰的T细胞不表达TRAC和/或TRBC。
75.如权利要求62-74中任一项所述的用途，其中所述修饰的T细胞还包含编码一种或多种CAR的第二外源多核苷酸。
76.如权利要求75所述的用途，其中所述一种或多种CAR选自由以下组成的组：CD19特异性CAR，使得所述细胞是CD19 CAR T细胞；CD20特异性CAR，使得所述细胞是CD20 CAR T细胞；CD22特异性CAR，使得所述细胞是CD22 CAR T细胞；以及BCMA特异性CAR，使得所述细胞是BCMA CAR T细胞；或其组合。
77.如权利要求76所述的用途，其中所述低免疫原性T细胞、非活化T细胞或低免疫原性T细胞群包含CD19特异性CAR和CD22特异性CAR，使得所述细胞是CD19/CD22 CAR T细胞。
78.如权利要求77所述的用途，其中所述CD19特异性CAR和所述CD22特异性CAR由单一双顺反子多核苷酸编码。
79.如权利要求77所述的用途，其中所述CD19特异性CAR和所述CD22特异性CAR由两种单独的多核苷酸编码。
80.如权利要求62-79中任一项所述的用途，其中将所述第一和/或第二外源多核苷酸插入到所述细胞的至少一个等位基因的特定基因座中。
81.如权利要求80所述的用途，其中所述特定基因座选自由以下组成的组：安全港基因座、RHD基因座、B2M基因座、CIITA基因座、TRAC基因座和TRB基因座。
82.如权利要求62-81中任一项所述的用途，其中从供体受试者离体将编码CD47的所述多核苷酸引入所述低免疫原性T细胞、非活化T细胞或低免疫原性T细胞群中。
83.如权利要求82所述的用途，其中使用慢病毒载体将编码CD47的所述多核苷酸引入所述低免疫原性T细胞、非活化T细胞或低免疫原性T细胞群中。
84.如权利要求62-81中任一项所述的用途，其中在所述受体患者体内将编码CD47的所述多核苷酸引入所述低免疫原性T细胞、非活化T细胞或低免疫原性T细胞群中。
85.如权利要求84所述的用途，其中通过使所述受体患者与包含慢病毒载体的组合物接触来将编码CD47的所述外源多核苷酸引入所述低免疫原性T细胞、非活化T细胞或低免疫原性T细胞群中，所述慢病毒载体包含(i)CD4结合剂或CD8结合剂，和(ii)编码CD47的多核苷酸，其中用所述慢病毒载体转导所述受体患者的所述低免疫原性T细胞、非活化T细胞或低免疫原性T细胞群。
86.如权利要求62-85中任一项所述的用途，其中使用CRISPR/Cas基因编辑将编码CD47的所述多核苷酸引入所述低免疫原性T细胞、非活化T细胞或低免疫原性T细胞群中。
87.如权利要求86所述的用途，其中所述CRISPR/Cas基因编辑从供体受试者离体进行。
88.如权利要求87所述的用途，其中所述CRISPR/Cas基因编辑使用慢病毒载体进行。
89.如权利要求86所述的用途，其中所述CRISPR/Cas基因编辑在所述受体患者体内进行。
90.如权利要求89所述的用途，其中通过使所述受体患者与包含慢病毒载体的组合物接触来进行所述CRISPR/Cas基因编辑，所述慢病毒载体包含(i)CD4结合剂或CD8结合剂，(ii)编码CRISPR/Cas基因编辑组分的多核苷酸，以及(iii)编码CD47的多核苷酸，其中用所述慢病毒载体转导所述受体患者的所述低免疫原性T细胞、非活化T细胞或低免疫原性T细胞群。
91.如权利要求75-90中任一项所述的用途，其中从供体受试者离体将所述一种或多种CAR引入所述低免疫原性T细胞、非活化T细胞或低免疫原性T细胞群中。
92.如权利要求91所述的用途，其中使用慢病毒载体将所述一种或多种CAR引入所述低免疫原性T细胞、非活化T细胞或低免疫原性T细胞群中。
93.如权利要求75-90中任一项所述的用途，其中在所述受体患者体内将所述一种或多种CAR引入所述低免疫原性T细胞、非活化T细胞或低免疫原性T细胞群中。
94.如权利要求93所述的用途，其中通过使所述受体患者与包含慢病毒载体的组合物接触来将所述一种或多种CAR引入所述低免疫原性T细胞、非活化T细胞或低免疫原性T细胞群中，所述慢病毒载体包含(i)CD4结合剂或CD8结合剂，和(ii)编码所述一种或多种CAR的一种或多种多核苷酸，其中用所述慢病毒载体转导所述受体患者的所述低免疫原性T细胞、非活化T细胞或低免疫原性T细胞群。
95.如权利要求75-90中任一项所述的用途，其中使用CRISPR/Cas基因编辑将所述一种或多种CAR引入所述低免疫原性T细胞、非活化T细胞或低免疫原性T细胞群中。
96.如权利要求95所述的用途，其中所述CRISPR/Cas基因编辑从供体受试者离体进行。
97.如权利要求96所述的用途，其中所述CRISPR/Cas基因编辑使用慢病毒载体进行。
98.如权利要求95所述的用途，其中所述CRISPR/Cas基因编辑在所述受体患者体内进行。
99.如权利要求98所述的用途，其中通过使所述受体患者与包含慢病毒载体的组合物接触来进行所述CRISPR/Cas基因编辑，所述慢病毒载体包含(i)CD4结合剂或CD8结合剂，(ii)编码CRISPR/Cas基因编辑组分的多核苷酸，以及(iii)编码所述一种或多种CAR的一种或多种多核苷酸，其中用所述慢病毒载体转导所述受体患者的所述低免疫原性T细胞、非活化T细胞或低免疫原性T细胞群。
100.如权利要求62-99中任一项所述的用途，其中所述修饰的T细胞由原代T细胞或其子代繁殖，其中所述原代T细胞分离自恒河猴因子(Rh)阴性的供体受试者。
101.如权利要求62-99中任一项所述的用途，其中所述修饰的T细胞衍生自iPSC或其子代，其中所述iPSC或其子代衍生自分离自RhD阴性的供体受试者的宿主细胞。
102.如权利要求62-99中任一项所述的用途，其中所述修饰的T细胞由原代T细胞或其子代繁殖，其中所述原代T细胞或其子代分离自RhD阳性的供体受试者，并且被基因工程化为具有减少的RhD抗原表达。
103.如权利要求102所述的用途，其中所述原代T细胞或其子代被基因工程化为不表达RhD抗原。
104.如权利要求62-99中任一项所述的用途，其中所述修饰的T细胞衍生自iPSC或其子代，其中所述iPSC或其子代分离自RhD阳性的供体受试者，并且被基因工程化为具有减少的RhD抗原表达。
105.如权利要求104所述的用途，其中所述iPSC或其子代被基因工程化为不表达RhD抗原。
106.如权利要求62-105中任一项所述的用途，其中所述修饰的T细胞由原代T细胞库或其子代繁殖，其中所述原代T细胞库分离自一个或多个与所述受体患者不同的供体受试者，其中所述一个或多个供体受试者任选地包括一个或多个RhD阳性受试者、一个或多个RhD阴性受试者，或RhD阳性受试者和RhD阴性受试者的混合群体。
107.如权利要求62-105中任一项所述的用途，其中所述修饰的T细胞衍生自iPSC库或其子代，其中所述iPSC库衍生自分离自一个或多个与所述受体患者不同的供体受试者的宿主细胞，其中所述一个或多个供体受试者任选地包括一个或多个RhD阳性受试者、一个或多个RhD阴性受试者，或RhD阳性受试者和RhD阴性受试者的混合群体。
108.如权利要求62-107中任一项所述的用途，其中使用CRISPR/Cas基因编辑将所述修饰的T细胞基因工程化为具有减少的RhD抗原表达。
109.如权利要求108所述的用途，其中所述CRISPR/Cas基因编辑从供体受试者离体进行。
110.如权利要求109所述的用途，其中所述CRISPR/Cas基因编辑使用慢病毒载体进行。
111.如权利要求108所述的用途，其中所述CRISPR/Cas基因编辑在所述受体患者体内进行。
112.如权利要求111所述的用途，其中通过使所述受体患者与包含慢病毒载体的组合物接触来进行所述CRISPR/Cas基因编辑，所述慢病毒载体包含(i)CD4结合剂或CD8结合剂，和(ii)编码靶向所述RHD基因座的CRISPR/Cas基因编辑组分的多核苷酸，其中用所述慢病毒载体转导所述修饰的T细胞。
113.如权利要求62-112中任一项所述的用途，其中所述患者是RhD致敏的。
114.如权利要求62-112中任一项所述的用途，其中所述患者不是RhD致敏的。
115.一种用于治疗受体患者的癌症或病症的方法，其包括向所述患者施用治疗有效量的一种或多种修饰的T细胞群，其中所述一种或多种修饰的T细胞群选自由以下组成的组：低免疫原性T细胞群、非活化T细胞群、低免疫原性CD19 CAR T细胞群以及低免疫原性CD22CAR T细胞群，其中所述修饰的T细胞包含相对于未改变或未修饰的野生型细胞减少的RhD抗原和MHC I类和/或II类人白细胞抗原表达，以及编码CD47的第一外源多核苷酸，其中所述修饰的T细胞由原代T细胞或其子代繁殖，或衍生自iPSC或其子代。
116.如权利要求115所述的方法，其中所述修饰的T细胞包含相对于未改变或未修饰的野生型细胞减少的RhD抗原和MHC I类和II类人白细胞抗原表达，以及编码CD47的第一外源多核苷酸，其中所述修饰的T细胞由原代T细胞或其子代繁殖，或衍生自iPSC或其子代。
117.如权利要求115或116所述的方法，其中所述修饰的T细胞包含相对于未改变或未修饰的野生型细胞减少的RHD和B2M和/或CIITA表达，以及编码CD47的第一外源多核苷酸，其中所述修饰的T细胞由原代T细胞或其子代繁殖，或衍生自iPSC或其子代。
118.如权利要求117所述的方法，其中所述修饰的T细胞包含相对于未改变或未修饰的野生型细胞减少的RHD和B2M以及CIITA表达，以及编码CD47的第一外源多核苷酸，其中所述修饰的T细胞由原代T细胞或其子代繁殖，或衍生自iPSC或其子代。
119.如权利要求115-118中任一项所述的方法，其中所述修饰的T细胞不表达RhD抗原，不表达MHC I类和/或II类人白细胞抗原，并且包含编码CD47的第一外源多核苷酸，其中所述修饰的T细胞由原代T细胞或其子代繁殖，或衍生自iPSC或其子代。
120.如权利要求119所述的方法，其中所述修饰的T细胞不表达RhD抗原，不表达MHC I类人白细胞抗原，不表达MHC II类人白细胞抗原，并且包含编码CD47的第一外源多核苷酸，其中所述修饰的T细胞由原代T细胞或其子代繁殖，或衍生自iPSC或其子代。
121.如权利要求119或120所述的方法，其中所述修饰的T细胞不表达RHD，不表达B2M和/或CIITA，并且包含编码CD47的第一外源多核苷酸，其中所述修饰的T细胞由原代T细胞或其子代繁殖，或衍生自iPSC或其子代。
122.如权利要求121所述的方法，其中所述修饰的T细胞不表达RHD，不表达B2M，不表达CIITA，并且包含编码CD47的第一外源多核苷酸，其中所述修饰的T细胞由原代T细胞或其子代繁殖，或衍生自iPSC或其子代。
123.一种用于扩增能够识别并杀伤患者体内的肿瘤细胞的T细胞的方法，其包括向所述患者施用治疗有效量的一种或多种修饰的T细胞群，其中所述一种或多种修饰的T细胞群选自由以下组成的组：低免疫原性T细胞群、非活化T细胞群、低免疫原性CD19 CAR T细胞群以及低免疫原性CD22 CAR T细胞群，其中所述修饰的T细胞包含相对于未改变或未修饰的野生型细胞减少的RhD抗原和MHC I类和/或II类人白细胞抗原表达，以及编码CD47的第一外源多核苷酸，其中所述修饰的T细胞由原代T细胞或其子代繁殖，或衍生自iPSC或其子代。
124.如权利要求123所述的方法，其中所述修饰的T细胞包含相对于未改变或未修饰的野生型细胞减少的RhD抗原和MHC I类和II类人白细胞抗原表达，以及编码CD47的第一外源多核苷酸，其中所述修饰的T细胞由原代T细胞或其子代繁殖，或衍生自iPSC或其子代。
125.如权利要求123或124所述的方法，其中所述修饰的T细胞包含相对于未改变或未修饰的野生型细胞减少的RHD和B2M和/或CIITA表达，以及编码CD47的第一外源多核苷酸，其中所述修饰的T细胞由原代T细胞或其子代繁殖，或衍生自iPSC或其子代。
126.如权利要求125所述的方法，其中所述修饰的T细胞包含相对于未改变或未修饰的野生型细胞减少的RHD和B2M以及CIITA表达，以及编码CD47的第一外源多核苷酸，其中所述修饰的T细胞由原代T细胞或其子代繁殖，或衍生自iPSC或其子代。
127.如权利要求123-126中任一项所述的方法，其中所述修饰的T细胞不表达RhD抗原，不表达MHC I类和/或II类人白细胞抗原，并且包含编码CD47的第一外源多核苷酸，其中所述修饰的T细胞由原代T细胞或其子代繁殖，或衍生自iPSC或其子代。
128.如权利要求127所述的方法，其中所述修饰的T细胞不表达RhD抗原，不表达MHC I类人白细胞抗原，不表达MHC II类人白细胞抗原，并且包含编码CD47的第一外源多核苷酸，其中所述修饰的T细胞由原代T细胞或其子代繁殖，或衍生自iPSC或其子代。
129.如权利要求127或128所述的方法，其中所述修饰的T细胞不表达RHD，不表达B2M和/或CIITA，并且包含编码CD47的第一外源多核苷酸，其中所述修饰的T细胞由原代T细胞或其子代繁殖，或衍生自iPSC或其子代。
130.如权利要求129所述的方法，其中所述修饰的T细胞不表达RHD，不表达B2M，不表达CIITA，并且包含编码CD47的第一外源多核苷酸，其中所述修饰的T细胞由原代T细胞或其子代繁殖，或衍生自iPSC或其子代。
131.如权利要求115-130中任一项所述的方法，其中RhD抗原表达的减少或缺乏是由RHD基因的敲除造成的。
132.如权利要求115-131中任一项所述的方法，其中所述修饰的T细胞还包含相对于未改变或未修饰的野生型细胞减少的T细胞受体表达。
133.如权利要求132所述的方法，其中所述修饰的T细胞不表达T细胞受体。
134.如权利要求132或133所述的方法，其中所述修饰的T细胞包含减少的TRAC和/或TRBC表达。
135.如权利要求134所述的方法，其中所述修饰的T细胞不表达TRAC和/或TRBC。
136.如权利要求115-135中任一项所述的方法，其中所述修饰的T细胞还包含编码一种或多种CAR的第二外源多核苷酸。
137.如权利要求136所述的方法，其中所述一种或多种CAR选自由以下组成的组：CD19特异性CAR，使得所述细胞是CD19 CAR T细胞；CD20特异性CAR，使得所述细胞是CD20 CAR T细胞；CD22特异性CAR，使得所述细胞是CD22 CAR T细胞；以及BCMA特异性CAR，使得所述细胞是BCMA CAR T细胞；或其组合。
138.如权利要求137所述的方法，其中所述低免疫原性T细胞、非活化T细胞或低免疫原性T细胞群包含CD19特异性CAR和CD22特异性CAR，使得所述细胞是CD19/CD22 CAR T细胞。
139.如权利要求138所述的方法，其中所述CD19特异性CAR和所述CD22特异性CAR由单一双顺反子多核苷酸编码。
140.如权利要求138所述的方法，其中所述CD19特异性CAR和所述CD22特异性CAR由两种单独的多核苷酸编码。
141.如权利要求115-140中任一项所述的方法，其中将所述第一和/或第二外源多核苷酸插入到所述细胞的至少一个等位基因的特定基因座中。
142.如权利要求141所述的方法，其中所述特定基因座选自由以下组成的组：安全港基因座、RHD基因座、B2M基因座、CIITA基因座、TRAC基因座和TRB基因座。
143.如权利要求115-142中任一项所述的方法，其中从供体受试者离体将编码CD47的所述多核苷酸引入所述低免疫原性T细胞、非活化T细胞或低免疫原性T细胞群中。
144.如权利要求143所述的方法，其中使用慢病毒载体将编码CD47的所述多核苷酸引入所述低免疫原性T细胞、非活化T细胞或低免疫原性T细胞群中。
145.如权利要求115-142中任一项所述的方法，其中在所述受体患者体内将编码CD47的所述多核苷酸引入所述低免疫原性T细胞、非活化T细胞或低免疫原性T细胞群中。
146.如权利要求145所述的方法，其中通过使所述受体患者与包含慢病毒载体的组合物接触来将编码CD47的所述外源多核苷酸引入所述低免疫原性T细胞、非活化T细胞或低免疫原性T细胞群中，所述慢病毒载体包含(i)CD4结合剂或CD8结合剂，和(ii)编码CD47的多核苷酸，其中用所述慢病毒载体转导所述受体患者的所述低免疫原性T细胞、非活化T细胞或低免疫原性T细胞群。
147.如权利要求115-146中任一项所述的方法，其中使用CRISPR/Cas基因编辑将编码CD47的所述多核苷酸引入所述低免疫原性T细胞、非活化T细胞或低免疫原性T细胞群中。
148.如权利要求147所述的方法，其中所述CRISPR/Cas基因编辑从供体受试者离体进行。
149.如权利要求147所述的方法，其中所述CRISPR/Cas基因编辑在所述受体患者体内进行。
150.如权利要求149所述的方法，其中通过使所述受体患者与包含慢病毒载体的组合物接触来进行所述CRISPR/Cas基因编辑，所述慢病毒载体包含(i)CD4结合剂或CD8结合剂，(ii)编码CRISPR/Cas基因编辑组分的多核苷酸，以及(iii)编码CD47的多核苷酸，其中用所述慢病毒载体转导所述受体患者的所述低免疫原性T细胞、非活化T细胞或低免疫原性T细胞群。
151.如权利要求136-150中任一项所述的方法，其中从供体受试者离体将所述一种或多种CAR引入所述低免疫原性T细胞、非活化T细胞或低免疫原性T细胞群中。
152.如权利要求151所述的方法，其中使用慢病毒载体将所述一种或多种CAR引入所述低免疫原性T细胞、非活化T细胞或低免疫原性T细胞群中。
153.如权利要求136-150中任一项所述的方法，其中在所述受体患者体内将所述一种或多种CAR引入所述低免疫原性T细胞、非活化T细胞或低免疫原性T细胞群中。
154.如权利要求153所述的方法，其中通过使所述受体患者与包含慢病毒载体的组合物接触来将所述一种或多种CAR引入所述低免疫原性T细胞、非活化T细胞或低免疫原性T细胞群中，所述慢病毒载体包含(i)CD4结合剂或CD8结合剂，和(ii)编码所述一种或多种CAR的一种或多种多核苷酸，其中用所述慢病毒载体转导所述受体患者的所述低免疫原性T细胞、非活化T细胞或低免疫原性T细胞群。
155.如权利要求136-150中任一项所述的方法，其中使用CRISPR/Cas基因编辑将所述一种或多种CAR引入所述低免疫原性T细胞、非活化T细胞或低免疫原性T细胞群中。
156.如权利要求155所述的方法，其中所述CRISPR/Cas基因编辑从供体受试者离体进行。
157.如权利要求156所述的方法，其中所述CRISPR/Cas基因编辑使用慢病毒载体进行。
158.如权利要求155所述的方法，其中所述CRISPR/Cas基因编辑在所述受体患者体内进行。
159.如权利要求158所述的方法，其中通过使所述受体患者与包含慢病毒载体的组合物接触来进行所述CRISPR/Cas基因编辑，所述慢病毒载体包含(i)CD4结合剂或CD8结合剂，(ii)编码CRISPR/Cas基因编辑组分的多核苷酸，以及(iii)编码所述一种或多种CAR的一种或多种多核苷酸，其中用所述慢病毒载体转导所述受体患者的所述低免疫原性T细胞、非活化T细胞或低免疫原性T细胞群。
160.如权利要求115-159中任一项所述的方法，其中所述修饰的T细胞由原代T细胞或其子代繁殖，其中所述原代T细胞分离自恒河猴因子(Rh)阴性的供体受试者。
161.如权利要求115-159中任一项所述的方法，其中所述修饰的T细胞衍生自iPSC或其子代，其中所述iPSC或其子代衍生自分离自RhD阴性的供体受试者的宿主细胞。
162.如权利要求115-159中任一项所述的方法，其中所述修饰的T细胞由原代T细胞或其子代繁殖，其中所述原代T细胞或其子代分离自RhD阳性的供体受试者，并且被基因工程化为具有减少的RhD抗原表达。
163.如权利要求162所述的方法，其中所述原代T细胞或其子代被基因工程化为不表达RhD抗原。
164.如权利要求115-159中任一项所述的方法，其中所述修饰的T细胞衍生自iPSC或其子代，其中所述iPSC或其子代分离自RhD阳性的供体受试者，并且被基因工程化为具有减少的RhD抗原表达。
165.如权利要求164所述的方法，其中所述iPSC或其子代被基因工程化为不表达RhD抗原。
166.如权利要求115-165中任一项所述的方法，其中所述修饰的T细胞由原代T细胞库或其子代繁殖，其中所述原代T细胞库分离自一个或多个与所述受体患者不同的供体受试者，其中所述一个或多个供体受试者任选地包括一个或多个RhD阳性受试者、一个或多个RhD阴性受试者，或RhD阳性受试者和RhD阴性受试者的混合群体。
167.如权利要求115-165中任一项所述的方法，其中所述修饰的T细胞衍生自iPSC库或其子代，其中所述iPSC库衍生自分离自一个或多个与所述受体患者不同的供体受试者的宿主细胞，其中所述一个或多个供体受试者任选地包括一个或多个RhD阳性受试者、一个或多个RhD阴性受试者，或RhD阳性受试者和RhD阴性受试者的混合群体。
168.如权利要求115-167中任一项所述的方法，其中使用CRISPR/Cas基因编辑将所述修饰的T细胞基因工程化为具有减少的RhD抗原表达。
169.如权利要求168所述的方法，其中所述CRISPR/Cas基因编辑从供体受试者离体进行。
170.如权利要求169所述的方法，其中所述CRISPR/Cas基因编辑使用慢病毒载体进行。
171.如权利要求168所述的方法，其中所述CRISPR/Cas基因编辑在所述受体患者体内进行。
172.如权利要求171所述的方法，其中通过使所述受体患者与包含慢病毒载体的组合物接触来进行所述CRISPR/Cas基因编辑，所述慢病毒载体包含(i)CD4结合剂或CD8结合剂，和(ii)编码靶向所述RHD基因座的CRISPR/Cas基因编辑组分的多核苷酸，其中用所述慢病毒载体转导所述细胞。
173.如权利要求115-172中任一项所述的方法，其中所述患者是RhD致敏的。
174.如权利要求115-172中任一项所述的方法，其中所述患者不是RhD致敏的。
175.如权利要求115-174中任一项所述的方法，其中在施用后，所述一种或多种修饰的T细胞群在所述患者中引发水平降低的免疫激活或不引发免疫激活。
176.如权利要求115-175中任一项所述的方法，其中在施用后，所述一种或多种修饰的T细胞群在所述患者中引发水平降低的全身性TH1激活或不引发全身性TH1激活。
177.如权利要求115-176中任一项所述的方法，其中在施用后，所述一种或多种修饰的T细胞群在所述患者中引发水平降低的外周血单核细胞(PBMC)的免疫激活或不引发PBMC的免疫激活。
178.如权利要求115-177中任一项所述的方法，其中在施用后，所述一种或多种修饰的T细胞群在所述患者中引发水平降低的针对所述低免疫原性T细胞的供体特异性IgG抗体或不引发供体特异性IgG抗体。
179.如权利要求115-178中任一项所述的方法，其中在施用后，所述一种或多种修饰的T细胞群在所述患者中引发水平降低的针对所述低免疫原性T细胞的IgM和IgG抗体产生或不引发IgM和IgG抗体产生。
180.如权利要求115-179中任一项所述的方法，其中在施用后，所述一种或多种修饰的T细胞群在所述患者中引发水平降低的对所述低免疫原性T细胞的细胞毒性T细胞杀伤或不引发细胞毒性T细胞杀伤。
181.如权利要求115-180中任一项所述的方法，其中在施用所述低免疫原性T细胞群之前或之后至少3天或更长时间不向所述患者施用免疫阻抑剂。
182.一种对低免疫原性T细胞进行修饰，使得所修饰的低免疫原性T细胞包含相对于未改变或未修饰的野生型细胞减少的RhD抗原表达的方法，所述方法包括使低免疫原性T细胞与包含慢病毒载体的组合物接触，所述慢病毒载体包含(i)CD4结合剂或CD8结合剂，和(ii)编码靶向RHD基因座的CRISPR/Cas基因编辑组分的多核苷酸，其中用所述慢病毒载体转导所述低免疫原性T细胞，所述低免疫原性T细胞由原代T细胞或其子代繁殖，或衍生自iPSC或其子代，并且所述低免疫原性T细胞包含相对于未改变或未修饰的野生型细胞减少的MHC I类和/或II类人白细胞抗原表达以及编码CD47的第一外源多核苷酸。
183.如权利要求182所述的方法，其中所述慢病毒载体还包含(iii)编码一种或多种CAR的一种或多种多核苷酸。
184.如权利要求183所述的方法，其中将编码所述一种或多种CAR的所述多核苷酸插入到所述修饰的低免疫原性T细胞的所述RHD基因座中。
185.如权利要求184所述的方法，其中所述低免疫原性T细胞的所述接触从供体受试者离体进行。
186.如权利要求185所述的方法，其中所述低免疫原性T细胞的所述接触使用慢病毒载体进行。
187.如权利要求184所述的方法，其中所述低免疫原性T细胞的所述接触在受体患者体内进行。
188.如权利要求182-187中任一项所述的方法，其中所述受体患者患有疾病或病状。
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