CN116568704A - 使用CD47-SIRPα阻断剂触发安全杀灭机制的方法 - Google Patents

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CN116568704A CN202180081954.8A CN202180081954A CN116568704A CN 116568704 A CN116568704 A CN 116568704A CN 202180081954 A CN202180081954 A CN 202180081954A CN 116568704 A CN116568704 A CN 116568704A
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Abstract

本公开提供了向有需要的受试者施用CD47‑SIRPα阻断剂的方法和组合物，其中先前已向所述受试者施用经工程化以表达外源CD47多肽的细胞群体。

Description

使用CD47-SIRPα阻断剂触发安全杀灭机制的方法
相关申请的交叉引用
本PCT申请要求2020年10月9日提交的美国临时专利申请第63/090,001号和2021年1月8日提交的美国临时专利申请第63/135,518号的优先权，所述专利申请两者都通过引用整体并入本文。
序列表
本申请含有序列表，所述序列表经由EFS-Web以ASCII格式提交并且通过引用整体并入本文。创建于2021年10月9日的ASCII副本被命名为2021-10-09Sana 8007.WO00sequence listing.txt并且大小为121KB。
再生医学(细胞疗法)涉及制备细胞并且将其递送至患者。这些细胞可为可分化成任何细胞类型的多能干细胞(PSC)、从这些PSC分化的细胞、或原代细胞。这些细胞可经工程化以含有一个或多个编码CD47的外源核酸、生物体内的宿主细胞上的跨膜蛋白和已知“自身”标志物、和任选地一个或多个其他蛋白。当CD47结合至循环免疫细胞上的一种跨膜受体蛋白，即信号调控蛋白α(SIRPα)，以便传递抑制性“别吃我”信号时，表达CD47的宿主细胞逃避患者免疫系统例如经由巨噬细胞和/或自然杀手细胞(NK)介导的死亡的排斥反应。此类工程化细胞的免疫抑制特性可使得其对于移植有所述细胞的患者而言是危险的，例如，当发生不受抑制的生长时，从而产生开发安全机制的需要，所述安全机制可通过作用于CD47-SIRPα轴或相互作用来调节经移植的细胞群体，例如，经由患者的先天免疫系统来消除经移植的细胞群体。
发明内容
本公开提供了用于调节先前施用于或移植至受试者中的细胞群体的方法和组合物，所述方法和组合物包括将CD47-SIRPα阻断剂施用于受试者，其中所述细胞群体含有一个或多个编码CD47和/或表达或过表达CD47的外源核酸。此CD47-SIRPα阻断剂包括结合至CD47或SIRPα，由此作用于、干扰、阻断和/或抑制CD47-SIRPα轴或相互作用的小分子、大分子、多肽、融合蛋白、双功能抗体、抗体或其组合。调节过表达CD47或另外表达外源CD47多肽的细胞群体包括在施用此类细胞的受试者中触发先天杀灭机制。先天杀灭机制可通过施用CD47-SIRPα阻断剂来触发并且可包括免疫细胞介导的细胞杀灭，例如NK介导的杀灭、巨噬细胞介导的杀灭、ADCC和/或CDC。
在一个方面，本文提供了一种包括向有需要的受试者施用CD47-SIRPα阻断剂的方法，其中先前已向所述受试者施用经工程化以表达外源CD47多肽的细胞群体。
在另一方面，本文提供了一种包括向有需要的受试者施用CD47-SIRPα阻断剂的方法，其中先前已向所述受试者施用经工程化以表达外源CD47多肽的T细胞群体。
在另一方面，本文提供了一种包括向有需要的受试者施用CD47-SIRPα阻断剂的方法，其中先前已向所述受试者施用T细胞群体，所述细胞(i)经工程化以表达外源CD47多肽和至少一个嵌合抗原受体(CAR)并且(ii)具有MHC I类HLA分子、MHC II类HLA分子、T细胞受体(TCR)α和/或TCRβ的减少的表达。
在另一方面，本文提供了一种包括向有需要的受试者施用CD47-SIRPα阻断剂的方法，其中先前已向所述受试者施用T细胞群体，所述细胞具有MHC I类HLA分子、MHC II类HLA分子和TCRα的减少的表达并且经工程化以表达外源CD47多肽和CD19嵌合抗原受体(CAR)。
在另一方面，本文提供了一种包括向有需要的受试者施用CD47-SIRPα阻断剂的方法，其中先前已向所述受试者施用经工程化以表达外源CD47多肽的胰岛细胞群体。
在另一方面，本文提供了一种包括向有需要的受试者施用CD47-SIRPα阻断剂的方法，其中先前已向所述受试者施用胰岛细胞群体，所述细胞(i)经工程化以表达外源CD47多肽并且(ii)具有MHC I类HLA和/或MHC II类HLA分子的减少的表达。
在另一方面，本文提供了一种包括向有需要的受试者施用CD47-SIRPα阻断剂的方法，其中先前已向所述受试者施用胰岛细胞群体，所述细胞(i)经工程化以表达外源CD47、CD46和CD59多肽并且(ii)具有MHC I类HLA和/或MHC II类HLA分子的减少的表达。
在另一方面，本文提供了一种减少受试者中的经工程化以表达外源CD47多肽的细胞群体的方法，所述方法包括：(a)向所述受试者施用第一剂量的CD47-SIRPα阻断剂；(b)测定在(a)中施用的所述第一剂量的CD47-SIRPα阻断剂的第一结果；(c)任选地基于(b)中的第一结果，施用第二剂量的CD47-SIRPα阻断剂；以及(d)任选地测定在(c)中施用的所述第二剂量的CD47-SIRPα阻断剂的第二结果。
在另一方面，本文提供了一种包括以下的方法：(a)量化受试者中的经工程化以表达外源CD47多肽的细胞群体；(b)测定有效减少所述细胞群体达至少20％的CD47-SIRPα阻断剂的第一剂量；以及(c)将所述第一剂量的CD47-SIRPα阻断剂施用于所述受试者。
在每个或任何上文或下文提及实施方案的一些实施方案中，所述T细胞为原代细胞。
在每个或任何上文或下文提及实施方案的一些实施方案中，所述T细胞为同种异体细胞。
在每个或任何上文或下文提及实施方案的一些实施方案中，所述T细胞是从iPSC分化。
在每个或任何上文或下文提及实施方案的一些实施方案中，所述T细胞进一步经工程化以表达嵌合抗原受体(CAR)。
在每个或任何上文或下文提及实施方案的一些实施方案中，所述CAR为选自由以下组成的组的CD19 CAR：tisagenlecleucel、lisocabtagene maraleucel、axicabtageneciloleucel和brexucabtagene autoleucel。
在每个或任何上文或下文提及实施方案的一些实施方案中，所述CAR为包含SEQID NO：117的氨基酸序列的CD19 CAR。
在每个或任何上文或下文提及实施方案的一些实施方案中，所述CD19 CAR由SEQID NO：116的核酸序列编码。
在每个或任何上文或下文提及实施方案的一些实施方案中，所述T细胞经工程化以表达至少一种选自由以下组成的组的额外因子：CD16、CD24、CD35、CD39、CD46、CD52、CD55、CD59、CD200、CCL22、CTLA4-Ig、C1抑制剂、FASL、IDO1、HLA-C、HLA-E、HLA-E重链、HLA-G、IL-10、IL-35、PD-1、PD-L1、Serpinb9、CCl21、Mfge8和其组合。
在每个或任何上文或下文提及实施方案的一些实施方案中，所述胰岛细胞经工程化以表达至少一种选自由以下组成的组的额外因子：CD16、CD24、CD35、CD39、CD46、CD52、CD55、CD59、CD200、CCL22、CTLA4-Ig、C1抑制剂、FASL、IDO1、HLA-C、HLA-E、HLA-E重链、HLA-G、IL-10、IL-35、PD-1、PD-L1、Serpinb9、CCl21、Mfge8和其组合。
如权利要求5、6或7中任一项所述的方法，其中所述胰岛细胞经工程化以具有CD142的减少的表达。
在每个或任何上文或下文提及实施方案的一些实施方案中，所述胰岛细胞为原代细胞。
在每个或任何上文或下文提及实施方案的一些实施方案中，所述胰岛细胞是从iPSC分化。
在每个或任何上文或下文提及实施方案的一些实施方案中，所述CAR和编码外源CD47多肽的基因在双顺反子载体中引入T细胞中。
在每个或任何上文或下文提及实施方案的一些实施方案中，所述双顺反子载体经由慢病毒引入T细胞中。
在每个或任何上文或下文提及实施方案的一些实施方案中，所述CAR和编码外源CD47多肽的基因是在单一启动子的控制下。
在每个或任何上文或下文提及实施方案的一些实施方案中，所述第一结果和第二结果独立地选自由以下组成的组：(i)约10％与100％之间的细胞数目的减少，(ii)约10％与100％之间的不良事件的减少，和(iii)(i)和(ii)的组合。
在每个或任何上文或下文提及实施方案的一些实施方案中，所述第一剂量和/或所述第二剂量按以下方式施用：(i)以0.05、0.1、0.3、1、3或10mg/kg；(ii)每12小时一次、每24小时一次、每36小时一次或每48小时一次；和/或(iii)持续1天至3周。
在每个或任何上文或下文提及实施方案的一些实施方案中，所述第一剂量与所述第二剂量是相同的。
在每个或任何上文或下文提及实施方案的一些实施方案中，所述细胞为原代细胞。
在每个或任何上文或下文提及实施方案的一些实施方案中，所述原代细胞为T细胞或胰岛细胞。
在每个或任何上文或下文提及实施方案的一些实施方案中，所述细胞是从iPSC分化。
在每个或任何上文或下文提及实施方案的一些实施方案中，所述分化细胞选自由以下组成的组：心脏细胞、神经细胞、内皮细胞、T细胞、胰岛细胞、视网膜色素上皮细胞、肝细胞、甲状腺细胞、皮肤细胞、血细胞、原代细胞和上皮细胞。
在每个或任何上文或下文提及实施方案的一些实施方案中，所述细胞经工程化以表达至少一种选自由以下组成的组的额外因子：CD16、CD24、CD35、CD39、CD46、CD52、CD55、CD59、CD200、CCL22、CTLA4-Ig、C1抑制剂、FASL、IDO1、HLA-C、HLA-E、HLA-E重链、HLA-G、IL-10、IL-35、PD-1、PD-L1、Serpinb9、CCl21、Mfge8和其组合。
在每个或任何上文或下文提及实施方案的一些实施方案中，所述T细胞经工程化以具有TCRα和/或TCRβ的减少的表达。
在每个或任何上文或下文提及实施方案的一些实施方案中，所述T细胞经工程化以具有细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4(CTLA4)和/或程序性细胞死亡(PD1)的减少的表达。
在每个或任何上文或下文提及实施方案的一些实施方案中，编码外源CD47多肽的基因经由同源引导修复(HDR)介导插入至细胞的基因组基因座中而引入细胞中。
在每个或任何上文或下文提及实施方案的一些实施方案中，所述基因组基因座选自由以下组成的组：B2M基因座、CIITA基因座、TRAC基因座、TRBC基因座和安全港基因座。
在每个或任何上文或下文提及实施方案的一些实施方案中，所述安全港基因座选自由以下组成的组：AAVS1、ABO、CCR5、CLYBL、CXCR4、F3、FUT1、HMGB1、KDMSD、LRP1、MICA、MICB、RHD、ROSA26和SHS231基因座。
在每个或任何上文或下文提及实施方案的一些实施方案中，所述CAR结合选自由以下组成的组的抗原：CD19、CD20、CD22、CD38、CD123、CD138、BCMA和其组合。
在每个或任何上文或下文提及实施方案的一些实施方案中，所述第一结果和/或第二结果是不良事件。
在每个或任何上文或下文提及实施方案的一些实施方案中，所述CD47-SIRPα阻断剂在向受试者施用细胞之后至少一天施用。
在每个或任何上文或下文提及实施方案的一些实施方案中，所述CD47-SIRPα阻断剂在向受试者施用细胞之后至少一周施用。
在每个或任何上文或下文提及实施方案的一些实施方案中，所述CD47-SIRPα阻断剂在向受试者施用细胞之后至少一个月施用。
在每个或任何上文或下文提及实施方案的一些实施方案中，所述CD47-SIRPα阻断剂在受试者经历与施用细胞相关的不良事件之后施用。
在每个或任何上文或下文提及实施方案的一些实施方案中，所述不良事件选自由以下组成的组：异常增生、转化、肿瘤形成、细胞因子释放综合征、移植物抗宿主疾病(GVHD)、免疫效应细胞相关神经中毒性综合征(ICANS)、炎症、感染、恶心、呕吐、出血、间质性肺炎、呼吸道疾病、黄疸、体重损失、腹泻、食欲不振、抽筋、腹部疼痛、肝静脉闭塞疾病(VOD)、移植失败、器官损伤、不育、激素变化、异常生长形成、白内障和移植后淋巴增殖病症(PTLD)。
在每个或任何上文或下文提及实施方案的一些实施方案中，所述CD47-SIRPα阻断剂包含CD47结合域。
在每个或任何上文或下文提及实施方案的一些实施方案中，所述CD47结合域包含信号调控蛋白α(SIRPα)或其片段。
在每个或任何上文或下文提及实施方案的一些实施方案中，所述CD47-SIRPα阻断剂包含免疫球蛋白G(IgG)Fc域。
在每个或任何上文或下文提及实施方案的一些实施方案中，所述IgG Fc域包含IgG1 Fc域。
在每个或任何上文或下文提及实施方案的一些实施方案中，所述IgG1 Fc域包含人类抗体的片段。
在每个或任何上文或下文提及实施方案的一些实施方案中，所述CD47-SIRPα阻断剂选自由TTI-621、TTI-622和ALX148组成的组。
在每个或任何上文或下文提及实施方案的一些实施方案中，所述IgG Fc域包含IgG4 Fc域。
在每个或任何上文或下文提及实施方案的一些实施方案中，所述CD47-SIRPα阻断剂为抗体。
在每个或任何上文或下文提及实施方案的一些实施方案中，所述抗体选自由以下组成的组：MIAP410、B6H12和麦格罗单抗(Magrolimab)。
在每个或任何上文或下文提及实施方案的一些实施方案中，所述CD47-SIRPα阻断剂以有效减少细胞群体的剂量施用。
在每个或任何上文或下文提及实施方案的一些实施方案中，所述细胞群体减少约10％至100％。
在每个或任何上文或下文提及实施方案的一些实施方案中，所述细胞群体得以消除。
在每个或任何上文或下文提及实施方案的一些实施方案中，所述细胞群体的减少经由免疫反应而发生。
在每个或任何上文或下文提及实施方案的一些实施方案中，所述免疫反应为细胞的NK细胞介导的细胞杀灭、巨噬细胞介导的细胞杀灭、补体依赖性细胞毒性(CDC)和/或抗体依赖性细胞毒性(ADCC)。
在每个或任何上文或下文提及实施方案的一些实施方案中，所述CD47-SIRPα阻断剂经静脉内、皮下、腹膜内、肌肉内或颅内施用于受试者。
在每个或任何上文或下文提及实施方案的一些实施方案中，所述CD47-SIRPα阻断剂以1-20天之间的时间间隔施用于受试者持续10天至6个月的时段。
在每个或任何上文或下文提及实施方案的一些实施方案中，所述CD47-SIRPα阻断剂按以下方式施用于受试者：(i)以0.05、0.1、0.3、1、3或10mg/kg的剂量；(ii)每12小时一次、每24小时一次、每36小时一次或每48小时一次；和/或(iii)持续1天至3周。
在每个或任何上文或下文提及实施方案的一些实施方案中，所述方法还包括将IL-2施用于受试者。
在每个或任何上文或下文提及实施方案的一些实施方案中，所述CD47-SIRPα阻断剂选自由以下组成的组：结合CD47的抗体或其片段、结合CD47的双特异性抗体、结合CD47的免疫细胞因子融合蛋白、含有CD47的融合蛋白、结合SIRPα的抗体或其片段、结合SIRPα的双特异性抗体、结合SIRPα的免疫细胞因子融合蛋白、含有SIRPα的融合蛋白和其组合。
在每个或任何上文或下文提及实施方案的一些实施方案中，结合CD47的抗体或其片段选自由以下组成的组：麦格罗单抗(Hu5F9-G4)、CC-90002、IBI-188、IBI-322、TG-1801(NI-1701)、ALX148、TJ011133、FA3M3、ZL1201、AK117、AO-176、SRF231、GenSci-059、C47B157、C47B161、C47B167、C47B222、C47B227、Vx-1004、HMBD004、SHR-1603、AMMS4-G4、RTX-CD47和IMC-002。
在每个或任何上文或下文提及实施方案的一些实施方案中，结合CD47的抗体或其片段选自由以下组成的组：针对CD47的单链Fv片段(scFv)、针对CD47的Fab、针对CD47的VHH纳米抗体、针对CD47的DARPin和其变体。
在每个或任何上文或下文提及实施方案的一些实施方案中，结合SIRPα的抗体或其片段选自由以下组成的组：ADU-1805、CC-95251、OSE-172(BI 765063)、KWAR23和P362。
在每个或任何上文或下文提及实施方案的一些实施方案中，结合SIRPα的抗体或其片段选自由以下组成的组：针对SIRPα的单链Fv片段(scFv)、针对SIRPα的Fab、针对SIRPα的VHH纳米抗体、针对SIRPα的DARPin和其变体。
在每个或任何上文或下文提及实施方案的一些实施方案中，所述含有SIRPα的融合蛋白包含连接至Fc域的SIRPα的CD47结合域。
在每个或任何上文或下文提及实施方案的一些实施方案中，所述Fc域包含选自由以下组成的组的Fc域或其一部分：IgG1、IgG2、IgG3和IgG4。
在每个或任何上文或下文提及实施方案的一些实施方案中，所述细胞具有MHC I类HLA和/或MHC II类HLA分子的减少的表达。
在每个或任何上文或下文提及实施方案的一些实施方案中，MHC I类和/或MHC II类表达得以敲除。
在每个或任何上文或下文提及实施方案的一些实施方案中，MHC I类HLA的减少表达由B2M的减少表达来介导并且MHC II类的减少表达由CIITA的减少表达来介导。
在每个或任何上文或下文提及实施方案的一些实施方案中，B2M和/或CIITA表达得以敲除。
在每个或任何上文或下文提及实施方案的一些实施方案中，外源CD47多肽包含SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：4的氨基酸序列。
附图说明
图1A至图1D描绘IL-2刺激NK细胞对于人类HIP (B2M-/-，CIITA-/-，CD47+)细胞(图1A)、人类dKO(B2M-/-，CIITA-/-)细胞(图1B)、用抗CD47 IgG1同型对照抗体治疗的人类HIP细胞(图1C)或用抗CD47抗体MIP410治疗的人类HIP细胞(图1D)的杀灭。
图2A至图2D描绘巨噬细胞对于人类HIP(B2M-/-，CIITA-/-，CD47+)细胞(图2A)、人类dKO(B2M-/-，CIITA-/-)细胞(图2B)、用抗CD47 IgG1同型对照抗体治疗的人类HIP细胞(图2C)或用抗CD47抗体MIP410治疗的人类HIP细胞(图2D)的杀灭。
图3A和图3B描绘在通过IgG1同型对照抗体(图3A)或抗CD47抗体MIP410(图3B)治疗之后，皮下注射至过继转移人类NK细胞的NSG小鼠中的人类HIP(B2M-/-、CIITA-/-、CD47+)细胞的生物发光测量结果。
图4A至图4J描绘在暴露于抗CD47抗体时，NK细胞和巨噬细胞诱导杀灭表达外源CD47和CD19特异性CAR构建体的人类HIP(例如，B2M-/-，CIITA-/-，TRAC-/-)CAR-T细胞(参见例如“HIP CAR-T，单一启动子CD47-CAR”)的实时细胞分析数据(参见例如图4A至图4E)。数据还示出NK细胞和巨噬细胞诱导杀灭表达CAR和EGFRt构建体的对照CAR-T细胞、基本上类似于tisagenlecleucel生物类似物或替代物的对照CAR-T细胞、和对照模拟T细胞的程度(图4E至图4J)。
图5A和图5B示出与人类模拟T细胞和人类HLA-I和HLA-II双重敲除CAR-T细胞(图5A)或低免疫原性人类HLA-I、HLA-II和TCR三重敲除CAR-T细胞(图5B)的混合物一起，将人类NK细胞和巨噬细胞过继转移至免疫缺陷NSG小鼠中之后的体内免疫逃避数据。
图6示出注射同种异体CAR-T细胞(例如，表达CAR-EGFRt构建体的CAR-T细胞(“CAR(EGFRt)”)和tisagenlecleucel生物类似物或替代物(“CAR(tisagenlecleucel)”)或低免疫原性人类HLA-I、HLA-II和TCR三重敲除CAR-T细胞(“HIP”)的人源化小鼠的样品中检测到的T细胞活化和供者特异性抗体结合的水平。
图7A和图7B示出在皮下移植HIP iPSC和过继转移NK细胞和巨噬细胞并且在第0天至第10天期间(D0-D10)施用100μg/ml抗CD47麦格罗单抗抗体后，人类HIP iPSC的体外细胞活力。
图8A和图8B示出在皮下移植HIP iPSC和过继转移NK细胞和施用IgG4同型对照后，NSG小鼠中的畸胎瘤形成(HIP iPSC存活)。
图9A和图9B示出在皮下移植HIP iPSC和过继转移NK细胞并且在第0天至第10天期间(D0-D10)施用抗CD47麦格罗单抗抗体后，人类HIP iPSC的体内细胞活力。
图10A和图10B示出在皮下移植HIP iPSC和过继转移NK细胞和巨噬细胞并且在第0天至第10天期间(D0-D10)施用100μg/ml抗CD47 MIAP410抗体后，人类HIP iPSC的体外细胞活力。
图11A和图11B示出在皮下移植HIP iPSC和过继转移NK细胞和施用IgG1同型对照后，NSG小鼠中的畸胎瘤形成(HIP iPSC存活)。
图12A和图12B示出在皮下移植HIP iPSC和过继转移NK细胞并且在第0天至第10天期间(D0-D10)施用抗CD47 MIAP410抗体后，人类HIP iPSC的体内细胞活力。
图13A和图13B示出在皮下移植15.5x104个人类iPSC和过继转移1x106个人类NK细胞并且在第0天、第1天和第3天施用抗CD47MIAP410抗体后，人类HIP iPSC的体内细胞活力。
图14A和图14B示出在皮下移植16.5x104个人类iPSC和过继转移1x106个人类NK细胞并且在第0天、第1天和第3天腹膜内施用抗CD47 MIAP410抗体后，人类HIP iPSC的体内细胞活力。
图15A和图15B示出在颅内移植5x104个人类iPSC和过继转移1x106个NK细胞并且在第0天、第1天和第3天施用IgG4同型对照后，NSG小鼠的大脑中的畸胎瘤形成(HIP iPSC存活)。
图16A和图16B示出在颅内移植5x104个人类iPSC和过继转移1x106个人类NK细胞并且在第0天、第1天和第3天腹膜内施用抗CD47 MIAP410抗体后，大脑中的人类HIP iPSC的体内细胞活力。
图17A和图17B示出在颅内移植5x104个人类iPSC和过继转移1x106个人类NK细胞并且在第0天、第1天和第3天腹膜内施用抗CD47 MIAP410抗体后，大脑中的人类HIP iPSC的体内细胞活力，其中血脑屏障通过甘露糖醇注射来打破。
图18A至图18F示出相对于以下各者的人类HIP iPSC的体外杀灭数据：NK细胞、ADCC NK细胞和CDC介导的杀灭(A)；在施用SIRPαIgG1Fc后，NK细胞、ADCC NK细胞和CDC介导的杀灭(B)；在施用SIRPαIgG4Fc后，NK细胞、ADCC NK细胞和CDC介导的杀灭(C)；ADCC巨噬细胞和巨噬细胞介导的杀灭(D)；在施用SIRPαIgG1Fc后，ADCC巨噬细胞和巨噬细胞介导的杀灭(E)；和在施用SIRPα IgG4Fc后，ADCC巨噬细胞和巨噬细胞介导的杀灭。
图19A和图19B示出在皮下移植人类iPSC和过继转移人类NK细胞并且在第0天、第1天和第3天施用SIRPα IgG1Fc后，人类HIP iPSC的体内细胞活力，其中在D20和D40执行人类HIP iPSC的再次注射，接着SIRPα IgG1Fc注射(持续3天)。
图20A和图20B示出在皮下移植人类iPSC和过继转移人类NK细胞并且在第0天、第1天和第3天施用SIRPα IgG4Fc后，人类HIP iPSC的体内细胞活力，其中在D20和D40执行人类HIP iPSC的再次注射，接着SIRPα IgG4Fc注射(持续3天)。
图21A和图21B示出在颅内移植人类iPSC和过继转移人类NK细胞和人类小神经胶质细胞并且在第0天、第1天和第3天施用IgG1同型对照后，NSG小鼠的大脑中的畸胎瘤形成(HIP iPSC存活)。
图22A和图22B示出在颅内移植人类iPSC和过继转移人类NK细胞和人类小神经胶质细胞并且在第0天、第1天和第3天施用SIRPα IgG1Fc后，人类HIP iPSC的体内细胞活力。
图23A和图23B示出在颅内移植人类iPSC和过继转移人类NK细胞和人类小神经胶质细胞并且在第0天、第1天和第3天腹膜内施用IgG1同型对照后，NSG小鼠的大脑中的畸胎瘤形成(HIP iPSC存活)。
图24A和图24B示出在颅内移植人类iPSC和过继转移人类NK细胞并且在第0天、第1天和第3天腹膜内施用SIRPα IgG1Fc后，大脑中的人类HIP iPSC的体内细胞活力，其中血脑屏障通过甘露糖醇注射来打破。
图25A和图25B示出在颅内移植人类iPSC和过继转移人类NK细胞和人类小神经胶质细胞并且在第0天、第1天和第3天施用IgG4同型对照后，NSG小鼠的大脑中的畸胎瘤形成(HIP iPSC存活)。
图26A和图26B示出在颅内移植人类iPSC和过继转移人类NK细胞并且在第0天、第1天和第3天腹膜内施用SIRPα IgG4Fc后，大脑中的人类HIP iPSC的体内细胞活力。
图27示出在将人类iPSC皮下注射至NSG小鼠中并且过继转移人类NK细胞和在D0、D1和D3以1mg皮下混入抗SIRPα后，人类HIP iPSC的细胞活力。在D20执行人类HIP iPSC的再次注射，将50，000个细胞(50k)皮下(注入左侧)，并且在D20(混入)、D21和D23，1mg B6H12。在D40执行人类HIP iPSC的再次注射，将50k皮下(注入胸部中间上部)，并且在D40(混入)、D41和D43，1mg B6H12。
图28A和图28B示出SIRPα IgG1Fc或SIRPα IgG4Fc体外的CD47阻断数据，并且研究对于NK细胞(A)和巨噬细胞(B)的效应。
图29A和图29B示出SIRPα IgG1Fc或SIRPα IgG4Fc体外的CD47阻断数据，并且研究对于CD19 HIP CAR和NK细胞(A)以及CD19 HIP CAR和巨噬细胞(B)的效应。
图30示出使用Nalm6肿瘤模型的NSG小鼠的研究。在具有和不具有静脉内融合蛋白的情况下，静脉内执行人类NK细胞和人类HIP CAR-T细胞的过继转移。在分选之前，将100U/ml IL-2解冻过夜，接着在分选之后和注射之前，100U/mlIL-2过夜。
图31示出使用Nalm6肿瘤模型的NSG小鼠的研究。在具有和不具有静脉内融合蛋白的情况下，静脉内执行人类NK细胞和人类HIP CAR-T细胞的过继转移。在分选之前，将100U/ml IL-2解冻过夜，接着在分选之后和注射之前，100U/ml IL-2过夜。当HIP CAR通过安全策略来消除时，Nalm-6肿瘤生长。
图32示出使用Nalm6肿瘤模型的NSG小鼠的研究。
图33和图34示出使用Nalm6肿瘤模型的NSG小鼠的研究，其中HIP CAR T细胞通过IgG1和IgG4抗CD47融合蛋白来消除，指示Nalm-6肿瘤的生长。
图35A和图35B示出在施用抗CD47 MIAP410抗体后，由于NK细胞介导的杀灭(A)和巨噬细胞介导的杀灭(B)导致的小鼠HIP原代胰岛的体外细胞活力。
图36示出胰岛小鼠研究模型。
图37A至图37C示出在肌肉内施用IgG1同型对照后，同种异体HIP胰岛和同种异体小鼠糖尿病缓解的细胞活力数据。
图38A至图38C示出在D7-D18肌肉内施用5mg MIAP410后，同种异体HIP胰岛和同种异体小鼠糖尿病缓解的细胞活力数据。
图39A至图39B示出在将人类HIP iPSC注射至具有过继转移人类NK细胞和人类巨噬细胞的NSG小鼠中，并且在具有或不具有体内IL-2刺激的情况下，施用具有Fc同型IgG1的MIAP410后，HIPiPSC的细胞活力。
图40A至图40B示出在将人类HIP iPSC注射至具有过继转移人类NK细胞和人类巨噬细胞的NSG小鼠中，并且施用高剂量具有Fc同型IgG1的MIAP410三次后，HIP iPSC的细胞活力。
图41示出用MIAP410局部皮下治疗或腹膜内治疗后，大脑中HIP iPSC的细胞活力。
图42A和图42B示出在皮下移植人类HIP iPSC和过继转移NK细胞和施用IgG1同型对照后，NSG小鼠中的畸胎瘤形成(HIP iPSC存活)。
图43A和图43B示出在皮下移植HIP iPSC和过继转移NK细胞和在第0天至第10天期间(D0-D10)，施用局部低剂量(LD；500μg)具有Fc同型IgG1的MIAP410，同时将IL-2施用于NK细胞供活化后，人类HIP iPSC的体内细胞活力。
图44A和图44B示出在皮下移植HIP iPSC和过继转移NK细胞和在第3天至第36天期间，施用局部低剂量(LD；500μg)具有Fc同型IgG1的MIAP410，同时将IL-2施用于NK细胞供活化后，人类HIP iPSC的体内细胞活力。
图45A和图45B示出在皮下移植HIP iPSC和过继转移NK细胞和在第11天至第36天期间，施用局部低剂量(LD；500μg)具有Fc同型IgG1的MIAP410，同时将IL-2施用于NK细胞供活化后，人类HIP iPSC的体内细胞活力。
图46A和图46B示出在皮下移植HIP iPSC和过继转移NK细胞并且在第0天至第10天期间(D0-D10)施用局部低剂量(LD；500μg)具有Fc同型IgG1的MIAP410后，人类HIP iPSC的体内细胞活力。
图47A和图47B示出在皮下移植HIP iPSC和过继转移NK细胞并且在第3天至第36天期间施用局部低剂量(LD；500μg)具有Fc同型IgG1的MIAP410后，人类HIP iPSC的体内细胞活力。
图48A和图48B示出在皮下移植HIP iPSC和过继转移NK细胞并且在第11天至第36天期间施用局部低剂量(LD；500μg)具有Fc同型IgG1的MIAP410后，人类HIP iPSC的体内细胞活力。
图49A和图49B示出在皮下移植HIP iPSC和过继转移NK细胞并且在D0、D1和D3施用局部高剂量(HD；1mg)具有Fc同型IgG1的MIAP410后，人类HIP iPSC的体内细胞活力。
图50A和图50B示出在皮下移植HIP iPSC和过继转移NK细胞并且在D11、D12和D14施用局部高剂量(HD；1mg)具有Fc同型IgG1的MIAP410后，人类HIP iPSC的体内细胞活力。
图51A和图51B示出在皮下移植HIP iPSC和过继转移NK细胞并且在D0、D1和D3腹膜内施用局部高剂量(HD；1mg)具有Fc同型IgG1的MIAP410后，人类HIP iPSC的体内细胞活力。
图52A和图52B示出在皮下移植HIP iPSC和过继转移NK细胞并且在D11、D12和D14腹膜内施用局部高剂量(HD；1mg)具有Fc同型IgG1的MIAP410后，人类HIP iPSC的体内细胞活力。
图53示出在将人类dKO(B2M-/CIITA-/-)细胞皮下注射至NSG小鼠中以及过继转移人类NK细胞后，人类iPSC的细胞活力。
图54示出在将人类dKO(B2M-/CIITA-/-)细胞皮下注射至NSG小鼠中以及过继转移人类NK细胞或人类小神经胶质细胞后，人类iPSC的细胞活力。
图55A和图55B示出在将人类dKO(B2M-/CIITA-/-)细胞皮下注射至NSG小鼠中，具有或不具有过继转移人类NK细胞的情况下，人类iPSC的细胞活力。
图56A和图56B示出将人类dKO(B2M-/CIITA-/-)细胞注射至NSG小鼠的大脑中，具有或不具有过继转移人类NK细胞的情况下，人类iPSC的细胞活力。
图57A和图57B示出在将人类dKO(B2M-/CIITA-/-)细胞注射至NSG小鼠的大脑中并且过继转移人类小神经胶质细胞后，人类iPSC的细胞活力。
图58示出与同种异体人类巨噬细胞或小神经胶质细胞共培养的人类wt、dKO(B2M-/-CIITA-/-)或HIP 1.0(B2M-/-CIITA-/-CD47 tg)的细胞活力数据。
图59示出与同种异体人类巨噬细胞或小神经胶质细胞共培养的人类dKO(B2M-/-CIITA-/-)细胞或与同种异体小鼠巨噬细胞或小神经胶质细胞共培养的小鼠dKO(B2M-/-CIITA-/-)细胞的细胞活力数据。
图60示出与异种(跨物种)小鼠巨噬细胞或小神经胶质细胞共培养的人类dKO(B2M-/-CIITA-/-)细胞或与异种人类巨噬细胞或小神经胶质细胞共培养的小鼠dKO(B2M-/-CIITA-/-)细胞的细胞活力数据。
图61A和图61B示出在将HIP iPSC颅内移植至NSG小鼠中以及过继转移NK细胞并且在D0、D1和D3施用高剂量(HD；1mg)Fc同型IgG1对照后，人类HIP iPSC的体内细胞活力。
图62A和图62B示出在将HIP iPSC颅内移植至NSG小鼠中以及过继转移NK细胞并且在D0、D1和D3施用高剂量(HD；1mg)MIAP410后，人类HIP iPSC的体内细胞活力。
图63A和图63B示出在将HIP iPSC颅内移植至NSG小鼠中以及过继转移NK细胞并且在D0、D1和D3施用高剂量(HD；1mg)MIAP410后，人类HIP iPSC的体内细胞活力，其中血脑屏障通过甘露糖醇注射来打破。
图64A和图64B示出在人类NK细胞(A)或人类巨噬细胞(B)存在下，施用100μg/ml具有小鼠IgG1 Fc域的B6H12抗CD47抗体后，人类HIP iPSC体外的细胞活力数据。
图65示出在皮下移植人类HIP iPSC并且过继转移人类NK细胞和施用B6H12后，人类HIP iPSC体内的细胞活力数据。
图66A和图66B示出在皮下移植HIP iPSC和过继转移NK细胞并且在D0-D40期间施用局部低剂量(LD；500μg)Fc同型IgG4对照后，人类HIP iPSC的体内细胞活力。
图67A和图67B示出在皮下移植HIP iPSC和过继转移NK细胞并且在D0-D96期间施用局部低剂量(LD；500μg)具有Fc同型IgG1的B6H12抗CD47抗体后，人类HIP iPSC的体内细胞活力。
图68A和图68B示出在皮下移植HIP iPSC和过继转移NK细胞并且在D3-D40期间施用局部低剂量(LD；500μg)具有Fc同型IgG1的B6H12抗CD47抗体后，人类HIP iPSC的体内细胞活力。
图69A和图69B示出在皮下移植HIP iPSC和过继转移NK细胞并且在D11-D44期间施用局部低剂量(LD；500μg)具有Fc同型IgG1的B6H12抗CD47抗体后，人类HIP iPSC的体内细胞活力。
图70A和图70B示出在皮下移植HIP iPSC和过继转移NK细胞并且在D0、D1和D3施用局部高剂量(HD；1mg)具有Fc同型IgG1的B6H12抗CD47抗体后，人类HIP iPSC的体内细胞活力。
图71A和图71B示出在皮下移植HIP iPSC和过继转移NK细胞并且在D3、D4和D6施用局部高剂量(HD；1mg)具有Fc同型IgG1的B6H12抗CD47抗体后，人类HIP iPSC的体内细胞活力。
图72A和图72B示出在皮下移植HIP iPSC和过继转移NK细胞并且在D11、D12和D14施用局部高剂量(HD；1mg)具有Fc同型IgG1的B6H12抗CD47抗体后，人类HIP iPSC的体内细胞活力。
图73A和图73B示出在皮下移植HIP iPSC和过继转移NK细胞并且在D0、D1和D3腹膜内施用局部高剂量(HD；1mg)具有Fc同型IgG1的B6H12抗CD47抗体后，人类HIP iPSC的体内细胞活力。
图74示出关于保护具有足够CD47水平的细胞以免NK细胞和巨噬细胞杀灭，小分子氟胞嘧啶和更昔洛韦分别对于胞嘧啶脱氨酶和HsVtk杀灭开关的效应的小分子体外研究。
图75示出小分子氟胞嘧啶和更昔洛韦分别对于胞嘧啶脱氨酶和HsVtk杀灭开关的效应的小分子体外研究的前药杀灭数据。
图76A和图76B示出人类HIP-CyD iPSC在NSG小鼠中形成畸胎瘤。
图77A和图77B示出在皮下注射至NSG小鼠中并且每日腹膜内施用氟胞嘧啶LD(200mg/kg)治疗后，人类HIP iPSC(CyD克隆2G11)的细胞活力数据，其中HIP-CyD iPSC的杀灭在16-44天内发生。
图78A和图78B示出在皮下注射至NSG小鼠中并且每日腹膜内施用氟胞嘧啶HD(500mg/kg)治疗后，人类HIP iPSC(CyD克隆2G11)的细胞活力数据，其中HIP-CyD iPSC的杀灭在16-32天内发生。
图79A和图79B示出在皮下注射至NSG小鼠中并且在第13天开始每日腹膜内施用氟胞嘧啶LD(200mg/kg)治疗后，人类HIP iPSC(CyD克隆2G11)的细胞活力数据，其中HIP-CyDiPSC的杀灭在开始施用后3-11天内发生。
图80A和图80B示出在皮下注射至NSG小鼠中并且在第13天开始每日腹膜内施用氟胞嘧啶HD(500mg/kg)治疗后，人类HIP iPSC(CyD克隆2G11)的细胞活力数据，其中HIP-CyDiPSC的杀灭在开始施用后3-11天内发生。
图81A至图81F示出在皮下注射至NSG小鼠中并且每日腹膜内施用氟胞嘧啶HD(500mg/kg)治疗后，人类HIP iPSC(克隆15；无杀灭开关)的细胞活力数据，其中尽管不存在杀灭开关，HIP-CyD iPSC存活受损(A和B)并且研究的扩展确认所述结果(C-F)。
图82A和图82B示出在皮下注射至NSG小鼠中后，人类HIP iPSC luc+(胞嘧啶脱氨酶克隆2-G11)的细胞活力数据。
图83A和图83B示出在皮下注射至NSG小鼠中并且施用盐水后，人类HIP iPSC(HSVTk克隆1-B10)的细胞活力数据。
图84A和图84B示出在皮下注射至NSG小鼠中并且每日腹膜内施用更昔洛韦LD(50mg/kg)治疗后，人类HIP iPSC(HSVTk克隆1-B10)的细胞活力数据，其中HIP-HsVtk iPSC的杀灭在12-24天内发生。
图85A和图85B示出在皮下注射至NSG小鼠中并且每日腹膜内施用更昔洛韦HD(75mg/kg)治疗后，人类HIP iPSC(HSVTk克隆1-B10)的细胞活力数据，其中HIP-HsVtk iPSC的杀灭在12-16天内发生。
图86A和图86B示出在皮下注射至NSG小鼠中并且在第13天开始每日腹膜内施用更昔洛韦LD(50mg/kg)治疗后，人类HIP iPSC(HSVTk克隆1-B10)的细胞活力数据，其中HIP-HsVtk iPSC的杀灭在开始施用后7天内发生。
图87A和图87B示出在皮下注射至NSG小鼠中并且在第13天开始每日腹膜内施用更昔洛韦HD(75mg/kg)治疗后，人类HIP iPSC(HSVTk克隆1-B10)的细胞活力数据，其中HIP-HsVtk iPSC的杀灭在开始施用后7天内发生。
图88A和图88B示出在皮下注射至NSG小鼠中并且在第0天开始每日腹膜内施用更昔洛韦HD(75mg/kg)治疗后，人类HIP iPSC(克隆15；无杀灭开关)的细胞活力数据，其中HIPiPSC的杀灭未发生。
图89A和图89B示出在皮下注射至NSG小鼠中后，人类HIP iPSC luc+(HSVtk克隆1-B10)的细胞活力数据。
具体实施方式
再生医学(细胞疗法)涉及制备细胞并且将其递送至患者。细胞疗法，即，将细胞移植至受试者中以替换或修复受损细胞，可在治疗以细胞、组织和/或器官的进行性恶化或不存在为特征的疾病方面极有用的。在一些实施方案中，细胞疗法旨在修复、替换、恢复和/或提供在其他情形下受损、功能异常或不存在的细胞。用于细胞疗法中的细胞可为例如可分化成任何细胞类型的多能干细胞(PSC)、从这些PSC分化的细胞、或原代细胞。用于细胞疗法中的细胞可经工程化以含有一个或多个编码致耐受性因子如CD47的外源核酸、生物体内的宿主细胞上的跨膜蛋白和已知“自身”标志物、和任选地一个或多个其他蛋白。当CD47结合至循环免疫细胞上的一种跨膜受体蛋白，即信号调控蛋白α(SIRPα)，以便传递抑制性“别吃我”信号时，表达CD47的宿主细胞逃避患者免疫系统例如经由巨噬细胞和/或自然杀手细胞(NK)介导的死亡的排斥反应。此类工程化细胞的免疫抑制特性可使得其对于移植有所述细胞的患者而言是危险的，例如，当发生不受抑制的生长时，从而产生开发安全机制的需要，所述安全机制可通过作用于CD47-SIRPα轴或相互作用来调节经移植的细胞群体，例如，经由患者先天免疫系统来消除经移植的细胞群体。本公开提供了用于通过将CD47-SIRPa阻断剂施用于受试者来调节先前施用于或移植至受试者中的细胞或细胞群体的方法和组合物，其中所述细胞或细胞群体含有一个或多个编码CD47的外源核酸和/或表达或过表达外源CD47多肽。CD47-SIRPα阻断剂可包括结合至CD47或SIRPα，由此作用于、干扰、阻断和/或抑制CD47-SIRPα轴或相互作用的小分子、大分子、多肽、融合蛋白、双功能抗体、抗体或其组合。这种相互作用触发针对先前施用细胞的先天杀灭机制，包括免疫细胞介导的细胞杀灭，例如NK介导的杀灭、巨噬细胞介导的杀灭、ADCC和/或CDC。以此方式，施用CD47-SIRPα阻断剂导致受试者中的先前施用细胞减少，并且在某些实施方案中完全消除。
I.定义
术语“抗体”用于指示，除了天然抗体、遗传工程化或另外经修饰形式的免疫球蛋白或其部分以外，包括嵌合抗体、人类抗体、人源化抗体或合成抗体。抗体可为单克隆或多克隆抗体。在抗体为免疫球蛋白分子的免疫原性活性部分的实施方案中，抗体可包括但不限于单链可变片段抗体(scFv)、二硫化物连接Fv、单域抗体(sdAb)、VHH抗体、抗原结合片段(Fab)、Fab′、F(ab′)2片段或双功能抗体。通过用短接头肽来连接免疫球蛋白的可变区重(VH)和轻(VL)链，scFv抗体衍生自抗体。scFv可包含Vh-V1或V1-Vh。类似地，二硫化物连接Fv抗体可通过使用域间二硫键来连接VH和VL而产生。另一方面，sdAb仅由重或轻链的可变区组成并且通常为抗体的最小抗原结合片段。VHH抗体为仅重链的抗原结合片段。双功能抗体为由通过小肽接头来非共价连接或彼此共价连接的VH和VL区域组成的scFv片段的二聚体。本文公开的抗体，包括包含免疫球蛋白分子的免疫原性活性部分的抗体，保持结合特异性抗原的能力。
本文使用的术语“安全开关”是指控制目标蛋白或基因的表达的系统，所述蛋白或基因在经下调或上调时，例如经由通过宿主的免疫系统来识别而导致细胞的清除或死亡。安全开关可被设计成或包括外源分子，所述分子经施用以预防或减轻不良临床事件。安全开关可通过在DNA、RNA和蛋白质层面上调控表达来工程化。安全开关可包括允许响应于不良事件来控制细胞活性的蛋白质或分子。在一些实施方案中，安全开关是指结合特异性细胞并且靶向其以实现细胞死亡或消除的因子(例如，蛋白质、分子等)。在一些情况下，安全开关为结合靶细胞表面上的靶蛋白，进而触发免疫反应的阻断剂。在一个实施方案中，安全开关为在不活动状态下表达的“杀灭开关”，并且在通过选择性、外部提供因子来活化开关后，对于表达安全开关的细胞而言是致死的。在一个实施方案中，安全开关基因相对于构建体中的目标基因是顺式作用的。安全开关的激活导致细胞经由细胞凋亡或坏死来仅杀灭自身或自身和相邻细胞。
如本文用于表征细胞，术语“低免疫原性”通常意指此细胞不太易于发生此类细胞植入或移植至其中的受试者的免疫排斥。例如，相对于未改变或未修饰野生型细胞，这种低免疫原性细胞可约2.5％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、97.5％、99％或更少易于发生此类细胞移植至其中的受试者的免疫排斥。在一些方面，基因组编辑技术用于调节MHC I和/或MHC II基因的表达，并且任选地表达致耐受性因子例如但不限于CD47，并且由此产生低免疫原性细胞。在一些实施方案中，低免疫原性细胞逃避MHC失配同种异体接受者中的免疫排斥。在一些情况下，在施用(例如，移植或嫁接)至MHC失配同种异体接受者时，由本文概述的低免疫原性干细胞产生的分化细胞逃避免疫排斥。在一些情况下，在施用(例如，移植或嫁接)至MHC失配同种异体接受者时，由本文概述的低免疫原性干细胞产生的低免疫原性或分化细胞逃避免疫排斥，并且免疫抑制水平低于非低免疫原性细胞所需要的水平。在一些实施方案中，保护低免疫原性细胞以免于适应性免疫排斥和/或先天免疫细胞排斥。
细胞的低免疫原性可通过评估细胞的免疫原性例如细胞引起适应性和先天免疫反应的能力来测定。此免疫反应可使用本领域技术人员公认的测定法来测量。在一些实施方案中，免疫反应测定法测量低免疫原性细胞对于T细胞增殖、T细胞活化、T细胞杀灭、NK细胞增殖、NK细胞活化和巨噬细胞活性的影响。在一些情况下，在施用于受试者后，低免疫原性细胞和其衍生物经历T细胞和/或NK细胞的减少的杀灭。在一些情况下，与未修饰或野生型细胞相比，细胞和其衍生物显示减少的巨噬细胞吞噬。在一些实施方案中，与对应未修饰野生型细胞相比，低免疫原性细胞在接受者受试者中引起减少或减弱的免疫反应。在一些实施方案中，低免疫原性细胞在接受者受试者中是非免疫原性的或未能引起免疫反应。
如本文使用的“免疫抑制因子”或“免疫调控因子”包括低免疫性因子和补体抑制剂。
在一些情况下，如本文使用的“免疫信号传导因子”是指激活免疫信号通路的分子、蛋白质、肽等。
如本文使用的“安全港基因座”是指允许转基因或外源基因的安全表达的基因座位。安全港或基因组安全港是基因组中的能够以一定方式容纳新遗传物质的整合的位点，所述方式允许新插入遗传元件：(i)可预测地起作用并且(ii)不导致对于宿主细胞或生物体构成风险的宿主基因组的变化。示例性“安全港”基因座包括CCR5基因、CXCR4基因、PPP1R12C(也称为AAVS1)基因、白蛋白基因和Rosa基因。
外源分子或构建体可为与内源性分子相同类型的分子，例如，外源蛋白或核酸。在此类情况下，外源分子以比细胞中的内源性分子更大的浓度引入细胞中。在一些情况下，外源核酸可包括引入细胞中的感染病毒基因组、质粒或游离基因，或不通常存在于细胞中的染色体。将外源分子引入细胞中的方法是本领域技术人员已知的，并且包括但不限于脂质介导转移(即，脂质体，包括中性和阳离子脂质)、电穿孔、直接注射、细胞融合、粒子轰击、磷酸钙共沉淀、DEAE-葡聚糖介导转移和病毒载体介导转移。
出于本公开的目的，“基因”包含编码基因产物的DNA区域，以及调控基因产物的产生的所有DNA区域，不论是否此类调控序列与编码和/或转录序列相邻。因此，基因包括但不一定限于启动子序列、终止子、翻译调控序列如核糖体结合位点和内部核糖体进入位点、增强子、沉默子、绝缘子、边界元件、复制起点、基质附着位点和基因座控制区。
“基因表达”是指包含于基因中的信息转化成基因产物。基因产物可为基因(例如，mRNA、tRNA、rRNA、反义RNA、核酶、结构RNA或任何其他类型的RNA)的直接转录产物或通过mRNA的翻译产生的蛋白质。基因产物还包括通过例如加帽、聚腺苷酸化、甲基化和编辑的过程来修饰的RNA，以及通过例如甲基化、乙酰化、磷酸化、泛素化、ADP-核糖基化、肉豆蔻化和糖基化来修饰的蛋白质。
“调节基因表达”是指基因的表达水平的变化。调节表达可包括但不限于基因活化和基因抑制。调节也可为完全的，即，其中基因表达完全失活或活化至野生型水平或以上；或者其可为部分的，其中基因表达部分减少，或部分活化至野生型水平的某个分率。
如本文使用，术语“减少表达”或“降低表达”是指与未修饰对应细胞或野生型细胞(例如，正常、健康或亲本细胞)相比，细胞表现出更低的基因或蛋白质的表达水平(例如，低至少约2％、5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％或95％的水平)。
如本文使用，术语“增强表达”或“增加表达”是指与未修饰对应细胞或野生型细胞(例如，正常、健康或亲本细胞)相比，细胞表现出更高的基因或蛋白质的表达水平(例如，高至少约2％、5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％或95％的水平)。
关于并列两个或更多个组件(例如序列元件)的术语“可操作连接”或“可操作地连接”可互换使用，其中组件被布置成使得两个组件正常地起作用并且允许至少一个组件可介导赋予至少另一组件的功能的可能性。以实例说明，如果响应于一个或多个转录调控因子的存在或不存在，转录调控序列控制编码序列的转录水平，则转录调控序列，例如启动子，可操作连接至编码序列。转录调控序列通常与编码序列可操作地顺式连接，但是不一定与其直接相邻。例如，增强子为可操作连接至编码序列的转录调控序列，虽然其并不邻接。
“载体”或“构建体”能够将基因序列转移至靶细胞。通常，“载体构建体”、“表达载体”和“基因转移载体”意指能够引导目标基因的表达并且可将基因序列转移至靶细胞的任何核酸构建体。因此，所述术语包含克隆、和表达媒介物，以及整合载体。将载体或构建体引入细胞中的方法是本领域技术人员已知的，并且包括但不限于脂质介导转移(即，脂质体，包括中性和阳离子脂质)、电穿孔、直接注射、细胞融合、粒子轰击、磷酸钙共沉淀、DEAE-葡聚糖介导转移和病毒载体介导转移。
如本文使用的“多能干细胞”或“原代细胞”具有分化成三个胚层中的任一者的潜力：内胚层(例如，胃壁、胃肠道、肺等)，中胚层(例如，肌肉、骨骼、血液、泌尿生殖系统组织等)或外胚层(例如，表皮组织和神经系统组织)。如本文使用的术语“多能干细胞”还涵盖“诱导多能干细胞”或“iPSC”，衍生自非多能细胞的多能干细胞类型。亲本细胞的实例包括已通过各种手段重新编程来诱导多能、未分化表型的体细胞。此类“iPS”或“iPSC”细胞可通过诱导某些调控基因的表达或通过外源应用某些蛋白质来产生。诱导iPS细胞的方法是此项技术中已知的并且进一步于下文描述。(参见例如Zhou等人，Stem Cells 27(11)：2667-74(2009)；Huangfu等人，Nature Biotechnol.26(7)：795(2008)；Woltjen等人，Nature 458(7239)：766-770(2009)；和Zhou等人，Cell Stem Cell 8：381-384(2009)；其中的每一者全部通过引用并入。)以下概述诱导多能干细胞(iPSC)的产生。如本文使用，“hiPSC”为人类诱导多能干细胞。
“HLA”或“人类白细胞抗原”复合物是编码人类中的主要组织相容性复合物(MHC)蛋白的基因复合物。构成HLA复合物的这些细胞表面蛋白负责调控对于抗原的免疫反应。在人类中，存在两种MHC，I类和II类，“HLA-I”和“HLA-II”。HLA-I包含三种蛋白，HLA-A、HLA-B和HLA-C，所述蛋白呈递来自细胞内部的肽，并且通过HLA-I复合物呈递的抗原吸引杀手T细胞(也称为CD8+T细胞或细胞毒性T细胞)。HLA-I蛋白与β-2微球蛋白(B2M)相关。HLA-II包括五种蛋白质，HLA-DP、HLA-DM、HLA-DOB、HLA-DQ和HLA-DR，所述蛋白质将来自细胞外部的抗原呈递至T淋巴细胞。此举刺激CD4+细胞(也称为T-辅助细胞)。应了解“MHC”或“HLA”的使用并不意在具有限制性，因为其取决于所述基因是来自人类(HLA)还是鼠科(MHC)。因此，由于其与哺乳动物细胞相关，因此这些术语可在本文中互换使用。
如应用于经分离细胞的术语“治疗(treat/treating/treatment)”包括使细胞经受任何种类的过程或条件或者对于细胞执行任何种类的处理或程序。如应用于受试者，所述术语是指将细胞或细胞群体施用于个体，其中靶多核苷酸序列(例如，B2M)根据本文描述的方法来离体改变。个体通常有病或受伤，或相对于群体的普通成员，处于患病的增加的风险中并且需要此关注、照顾或管理。
如本文使用，术语“治疗(treating/treatment)”是指向受试者施用有效量的具有根据本文描述的方法离体改变的靶多核苷酸序列的细胞以使得受试者具有疾病的至少一个症状的减少或疾病的改善，例如，有益或所需临床结果。出于本技术的目的，有益的或所需的临床结果包括但不限于一个或多个症状的减轻、疾病程度的减小、疾病状态的稳定(即不恶化)、疾病进程的推迟或减慢、疾病状态的改善或缓和，以及缓解(无论是部分缓解或是全部缓解)，无论是可检测或不可检测的。治疗可指与未接受治疗时期望的存活相比延长存活。因此，本领域技术人员认识到治疗可改善疾病状况，但是可能不完全治愈疾病。如本文使用，术语“治疗”包括预防。或者，如果疾病进展减少或暂停，则治疗是“有效的”。“治疗”还可意指与未接受治疗时期望的存活相比延长存活。需要治疗的人包括已经诊断患有与多核苷酸序列的表达相关的病症的人，以及归因于遗传易感性或其他因素而可能患上此病症的人。
“治疗”或“预防”疾病或病症意指延迟或预防此疾病或病症的发作、逆转、减轻、改善、抑制、减缓或停止进展、加重或恶化，与此疾病或病症相关的疾患的进展或严重程度。在一个实施方案中，疾病或病症的症状减轻至少5％、至少10％、至少20％、至少30％、至少40％或至少50％。
通过导致所引入细胞至少部分定位于所需位点的方法或途径，将细胞安置在受试者体内时，如本文使用，术语“施用”、“引入”和“移植”可互换使用，例如包含根据本公开的方法来改变的靶多核苷酸序列的本文所述细胞。细胞可直接植入所需位点，或替代地通过导致递送至受试者体内的所需位置的任何合适途径来施用，其中植入细胞的至少一部分或细胞的组分仍然是有活力的。施用于受试者之后的细胞生存时期可短至几小时，例如二十四小时，直至几天，直至长达几年。在一些情况下，细胞也可例如在胶囊中施用除了所需位点以外的位置，例如肝脏或皮下，以便将植入细胞保持于植入位置并且避免植入细胞的迁移。
在额外或替代方面，本技术涵盖以本领域技术人员可利用的任何方式来改变靶多核苷酸序列，例如，使用TALEN系统。应了解虽然使用CRISPR/Cas(例如，Cas9和Cpf1)和TALEN的方法的实例在本文中详细描述，但是所述技术不限于使用这些方法/系统。可在本文中利用本领域技术人员已知的靶向例如B2M，以便减少或消除靶细胞中的表达的其他方法。
本公开的方法可用于改变细胞中的靶多核苷酸序列。本公开涵盖出于任何目的来改变细胞中的靶多核苷酸序列。在一些实施方案中，细胞中的靶多核苷酸序列经改变以便产生突变细胞。如本文使用，“突变细胞”是指具有不同于其原始基因型的所得基因型的细胞。在一些情况下，“突变细胞”表现出突变体表型，例如当通常运作基因使用本公开的CRISPR/Cas系统来改变时。在其他情况下，“突变细胞”表现出野生型表型，例如当CRISPR/Cas系统用于校正突变体基因型时。在一些实施方案中，细胞中的靶多核苷酸序列经改变以便校正或修复遗传突变(例如，恢复细胞的正常表型)。在一些实施方案中，细胞中的靶多核苷酸序列经改变以便诱导遗传突变(例如，破坏基因或基因组元件的功能)。
在一些实施方案中，改变为插入/缺失。如本文使用，“插入/缺失”是指由插入、缺失或其组合产生的突变。如本领域技术人员了解，基因组序列的编码区域中的插入/缺失导致移码突变，除非插入/缺失的长度为三的倍数。在一些实施方案中，改变为点突变。如本文使用，“点突变”是指置换一个核苷酸的取代。CRISPR/Cas系统可用于在靶多核苷酸序列中诱导任何长度的插入/缺失或点突变。
如本文使用，“敲除”包括以干扰靶多核苷酸序列的功能的方式，使靶多核苷酸序列的全部或一部分缺失。例如，通过在靶多核苷酸序列的功能域(例如，DNA结合域)中，诱导靶多核苷酸序列中的插入/缺失，改变靶多核苷酸序列，可实现敲除。本领域技术人员容易认识到如何基于本文所述细节来使用CRISPR/Cas系统敲除靶多核苷酸序列或其一部分。
在一些实施方案中，改变导致敲除靶多核苷酸序列或其一部分。使用CRISPR/Cas系统来敲除靶多核苷酸序列或其一部分可适用于各种应用。例如，敲除细胞中的靶多核苷酸序列可在体外执行用于研究目的。对于离体目的，敲除细胞中的靶多核苷酸序列可适用于治疗或预防与靶多核苷酸序列的表达相关的病症(例如，通过离体敲除细胞中的突变体等位基因并且将包含敲除突变体等位基因的那些细胞引入受试者中)。
“敲入”在本文中意指向宿主细胞添加遗传功能的方法。在一些实施方案中，此举导致敲入基因产物，例如，RNA或编码蛋白的水平增加或降低。如本领域技术人员所了解，此举可以多种方式完成，包括向宿主细胞添加基因的一个或多个额外拷贝或改变内源性基因的调控组件，从而增加所产生蛋白的表达。此举可通过修饰启动子、添加不同启动子、添加增强子或修饰其他基因表达序列来完成。
在一些实施方案中，改变导致靶多核苷酸序列的表达减少。术语“降低(decrease)”、“减少(reduced/reduction)”都在本文中通常用于意指统计上显著量的降低。然而，为免生疑问，“降低(decrease)”、“减少(reduced/reduction)”意指如与参考水平相比，降低至少10％，例如如与参考水平相比，降低至少约20％，或至少约30％，或至少约40％，或至少约50％，或至少约60％，或至少约70％，或至少约80％，或至少约90％或降低多达并包括100％(即，如与参考样品相比，水平不存在)，或10-100％之间的任何降低。
术语“增加(increased/increase)”或“增强(enhance)”或“活化(activate)”都在本文中通常用于意指增加统计显著量；为免生任何疑问，术语“增加(increased/increase)”或“增强(enhance)”或“活化(activate)”意指如与参考水平相比，增加至少10％，例如如与参考水平相比，增加至少约20％，或至少约30％，或至少约40％，或至少约50％，或至少约60％，或至少约70％，或至少约80％，或至少约90％或增加多达并包括100％或10-100％之间的任何增加，或如与参考水平相比，至少约2倍，或至少约3倍，或至少约4倍，或至少约5倍或至少约10倍增加，或2倍和10倍之间或更大的任何增加。
如本文使用，术语“外源”旨在是指将所提及分子或所提及多肽引入目标细胞中。例如通过将编码核酸引入细胞的遗传物质中，可引入多肽，例如通过整合至染色体中或作为非染色体遗传物质例如质粒或表达载体。因此，关于编码核酸的表达所使用的所述术语是指将可表达形式的编码核酸引入细胞中。“外源”分子是通常不存在于细胞中，但是可通过一种或多种遗传、生物化学或其他方法来引入细胞中的分子、构建体、因子等。“正常存在于细胞中”相对于细胞的特定发育阶段和环境条件来决定。因此，例如，仅在神经元的胚胎发育期间存在的分子是相对于成年神经元细胞的外源分子。外源分子可包括例如不正常运作内源性分子的运作型式或正常运作内源性分子的不正常运作型式。
外源分子或因子可尤其为例如通过组合化学方法来产生的小分子，或大分子如蛋白质、核酸、碳水化合物、脂质、糖蛋白、脂蛋白、多糖、上述分子的任何经修饰衍生物、或包含以上分子中的一者或多者的任何复合物。核酸包括DNA和RNA，可为单链或双链；可为直链、支链或环形；并且可为任何长度。核酸包括能够形成双链体的核酸，以及形成三链体的核酸。参见例如美国专利第5,176,996号和第5,422,251号。蛋白质包括但不限于DNA结合蛋白、转录因子、染色质重塑因子、甲基化DNA结合蛋白、聚合酶、甲基化酶、脱甲基酶、乙酰化酶、脱乙酰酶、激酶、磷酸酶、整合酶、重组酶、连接酶、拓扑异构酶、回旋酶和解旋酶。
术语“内源性”是指所提及分子或多肽存在于细胞中。类似地，关于编码核酸的表达所使用的所述术语是指包含于细胞内并且并非外源引入的编码核酸的表达。
在两个或更多个核酸或多肽序列的情形中，术语“同一性”百分比是指当出于最大对应性进行比较和比对时，如使用以下描述的序列比较算法(例如，BLASTP和BLASTN或本领域技术人员可利用的其他算法)中的一者或通过目测所测量，两个或更多个序列或子序列具有指定百分比的相同核苷酸或氨基酸残基。取决于应用，“同一性”百分比可存在于所比较的序列的一个区域上，例如，一个功能域上，或替代地，存在于待比较的两个序列的全部长度上。关于序列比较，典型地，一个序列充当与测试序列进行比较的参考序列。当使用序列比较算法时，将测试序列和参照序列都输入计算机中，如果需要，则指定子序列坐标，接着指定序列算法程序参数。接着，序列比较算法是基于指定的程序参数计算测试序列相对于参照序列的序列同一性百分比。
用于比较的序列的最佳比对可例如通过Smith和Waterman，Adv.Appl.Math.，2：482(1981)的局部同源性算法、通过Needleman和Wunsch，J.Mol.Biol.，48：443(1970)的同源性比对算法、通过Pearson和Lipman，Proc.Nat′l.Acad.Sci.USA，85：2444(1988)的搜索相似性方法、通过这些算法(Wisconsin Genetics Software Package，Genetics ComputerGroup，575Science Dr.，Madison，Wis.中的GAP、BESTFIT、FASTA和TFASTA)的计算机化实现方式，或通过目测(参见通常Ausubel等人，下文)来进行。
适于确定序列同一性和序列相似性百分比的算法的一种实例为BLAST算法，其描述于Altschul等人，J.Mol.Biol.215：403-410(1990)中。用于执行BLAST分析的软件可经由国家生物技术信息中心(National Center for Biotechnology Information)公开获得。
术语“受试者”和“个体”在本文中可互换使用，并且是指动物例如人类，可从所述动物例如人类获得细胞和/或向所述动物例如人类提供使用如本文描述的细胞的治疗，包括预防性治疗。关于对于特定动物例如人类受试者具有特定性的感染、疾患或疾病状况的治疗，术语受试者是指该特定动物。如在本文中可互换使用的“非人类动物”和“非人类哺乳动物”包括哺乳动物如大鼠、小鼠、兔、绵羊、猫、犬、牛、猪和非人类灵长类动物。术语“受试者”也涵盖任何脊椎动物，包括但不限于哺乳动物、爬行动物、两栖动物和鱼类。然而，有利的是，受试者为哺乳动物如人类，或其他哺乳动物如驯化哺乳动物、例如狗、猫、马等，或生产型哺乳动物，例如奶牛、绵羊、猪等。
应注意，权利要求可经草拟而排除任何任选的要素。因此，对于与叙述权利要求要素有关所使用的例如“单独”、“只”等这样的排他性术语或所使用的“否定性”限制，这份说明书仅旨在充当一个先行基础。如本领域技术人员在阅读本公开后所显而易知，本文中描述和说明的每个个别实施方案具有可轻易地与任何其他几个实施方案的特征分离或组合的离散组件和特征，而不偏离本公开的范围或精神。所叙述的任何方法可以所叙述的事件顺序或在逻辑上可能的任何其他顺序来执行。虽然与本文中所述的那些方法和材料相似或相等的任何方法和材料也可用于实践或测试本技术，但是现在描述代表性的说明性方法和材料。
如本文描述的以下术语将予以使用，并且如以下指示来定义。
在更详细地描述本技术之前，应理解本技术不限于所描述的特定实施方案，因为此类实施方案当然可变化。还应理解，本文中使用的术语仅用于描述特定实施方案的目的，并且无意具有限制性，因为本技术的范围仅受所附权利要求限制。
除非另外定义，否则本文中使用的所有技术和科学术语都具有与本技术所属领域的普通技术人员通常理解相同的含义。当提供数值范围时，应了解在所述范围的上限与下限之间的每个间插值(精确到下限单位的十分之一)(除非上下文另外明确规定)以及在所述陈述范围内的任何其他陈述值或间插值都涵盖在本技术内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括于较小范围中，并且也涵盖于本技术中，所陈述范围中的任何极限可特别地加以排除。在所陈述范围包括极限的一者或两者时，排除那些包括的极限的任一者或两者的范围也可包括在本技术内。某些范围在本文中以前面有术语“约”的数值来提供。术语“约”在本文中用于对于其后接的确切数字，以及与所述术语后接的数字接近或近似的数字提供文字上的支持。在测定是否数字与特定叙述数字接近或近似时，接近或近似未叙述数字可为如下数字，在所呈现的上下文中，所述数字与特定叙述数字基本上相等。
在本说明书中提到的所有公开、专利和专利申请通过引用并入本文，其程度如同每个单独的公开、专利或专利申请明确地且单独地指出通过引用并入一样。此外，每个叙述公开、专利或专利申请通过引用并入本文以便公开并描述与所叙述的公开有关的主题物。任何公开的引用是针对其在本申请日期前的公开内容，并且不应被视为承认由于存在先前发明而使本文描述的技术无权享有所述公开的优先权。此外，所提供的公开日期可与实际公开日期有所不同，实际公开日期可能需要单独确认。
II.CD47、信号调控蛋白α(SIRPα)和免疫系统
本文提供了用于调节表达CD47并且先前施用于或移植至受试者中的细胞群体的方法和组合物，包括向所述受试者施用CD47-SIRPα阻断剂。
A.CD47-SIRPα轴/相互作用
分化簇47(CD47)是免疫球蛋白超家族中的高度糖基化、广泛表达的细胞表面蛋白。CD47在重要细胞功能如增殖、粘附、迁移、细胞凋亡和吞噬作用中发挥作用。CD47的分子结构包括胞外免疫球蛋白可变(IgV)样域、跨膜域和短的替代剪接胞质尾区。在一些实施方案中，CD47与信号调控蛋白α(SIRPα)反式相互作用并且在将颗粒细胞和T细胞募集至感染部位方面发挥作用。SIRPα编码在巨噬细胞和树突状细胞的表面上表达的Ig-超家族受体，其胞质区域含有免疫受体酪氨酸基抑制基序(ITIM)，所述基序可触发级联以便抑制吞噬作用。
CD47充当生物体内的宿主细胞上的“自身”标志物。在一些实施方案中，当表达时，CD47结合至循环免疫细胞的表面上的SIRPα以便传递抑制性“别吃我”信号。CD47-SIRPα结合导致SIRPα上的ITIM的磷酸化，从而触发一系列事件，所述事件可最终防止吞噬作用。靶细胞通过巨噬细胞的吞噬作用通过活化信号和抑制信号(SIRPα-CD47)的平衡来调控。这种平衡由于癌细胞而翻转，所述癌细胞利用“自身”信号并上调CD47表达以便逃避免疫监视和后续破坏。在一些实施方案中，CD47结合剂和/或SIRPα结合剂，即CD47-SIRPα阻断剂，阻断和/或干扰抑制性SIRPα-CD47信号，由此触发吞噬作用和/或其他免疫系统机制。
B.免疫系统介导的靶细胞杀灭
本文在某些实施方案中提供了通过向受试者施用一种或多种CD47-SIRPα阻断剂来触发针对先前施用于或移植至受试者中的细胞或细胞群体的先天杀灭机制的方法，其中所述细胞表达或过表达CD47。在某些这些实施方案中，表达或过表达CD47的细胞包含一个或多个编码CD47的外源核酸。所触发的先天杀灭机制可为一种或多种免疫细胞介导的杀灭机制，包括NK介导的杀灭、巨噬细胞介导的杀灭、ADC和/或CDCC。
本文在某些实施方案中提供了触发NK细胞介导的杀灭先前施用于或移植至受试者中并且表达或过表达CD47的细胞或细胞群体的方法，包括经工程化以表达或过表达CD47的细胞。
本文在某些实施方案中提供了触发巨噬细胞介导的杀灭先前施用于或移植至受试者中并且表达或过表达CD47的细胞或细胞群体的方法，包括经工程化以表达或过表达CD47的细胞。巨噬细胞为先天性免疫的重要组分，可经由吞噬作用来抑制肿瘤生长。SIRPα在包括巨噬细胞、颗粒细胞、单核细胞和树突状细胞的骨髓细胞的表面上表达。当巨噬细胞经由SIRPα来结合至靶细胞如癌细胞或其他外源细胞上的CD47时，巨噬细胞介导的靶细胞杀灭得以抑制。在一些实施方案中，SIRPα和/或CD47结合剂，即CD47-SIRPα阻断剂，阻断和/或干扰巨噬细胞介导吞噬作用的抑制，触发巨噬细胞介导的表达CD47的靶细胞杀灭。
本文在某些实施方案中提供了触发抗体依赖性细胞毒性(ADCC)介导的杀灭先前施用于或移植至受试者中并且表达或过表达CD47的细胞或细胞群体的方法，包括经工程化以表达或过表达CD47的细胞。一些免疫细胞介导抗体调理癌细胞的肿瘤细胞死亡的诱导，所述肿瘤细胞死亡是被称为ADCC的过程。一些免疫细胞赋有抑制受体，例如SIRPα，所述受体结合至例如癌细胞或其他外源细胞的靶细胞上的CD47，导致抑制免疫细胞介导的ADCC。在一些实施方案中，SIRPα和/或CD47结合剂，即CD47-SIRPα阻断剂，阻断和/或干扰免疫细胞介导ADCC的抑制，触发ADCC介导的表达CD47的靶细胞杀灭。ADCC可经由不同Fc受体的活化和通过不同Fc受体表达细胞如自然杀手(NK)细胞、巨噬细胞和嗜中性粒细胞来介导。在一些实施方案中，ADCC有效地通过包括IgG1和/或IgG4的CD47-SIRPα阻断剂来触发。
本文在某些实施方案中提供了触发补体依赖性细胞毒性(CDC)介导的杀灭先前施用于或移植至受试者中并表达或过表达CD47的细胞或细胞群体的方法，包括经工程化以表达或过表达CD47的细胞。在一些实施方案中，补体系统经由与靶细胞上的抗原如CD47复合的含有Fc域的抗体的结合来活化。C1q结合至抗体-抗原复合物中的抗体Fc域，触发其他补体蛋白的结合，最终导致形成一种或多种细胞裂解膜攻击复合物(MAC；membrane attackcomplex)，在靶细胞的膜中形成孔，导致细胞裂解/死亡。在一些实施方案中，CDC有效地通过包括IgG1的CD47-SIRPα阻断剂来触发。
在本文提供的方法的一些实施方案中，含有一个或多个编码CD47的核酸和/或表达或过表达CD47的细胞或细胞群体包含SEQ ID NO：1(NCBI Ref.No.NM_001777.4列出的核苷酸序列的编码序列(CDS))或SEQ ID NO：3(NCBI Ref.No.NM_198793.2列出的核苷酸序列的CDS)列出的核苷酸序列，或与SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：3至少80％同一(例如，至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一)的核苷酸序列。在某些这些实施方案中，编码CD47的核酸是外源的。在某些实施方案中，由细胞表达或过表达的CD47包含以下各者、由以下各者组成或基本上由以下各者组成：SEQID NO：2或SEQ ID NO：4列出的氨基酸序列，或与SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：4列出的氨基酸序列至少80％同一(例如，至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一)的氨基酸序列。在一些实施方案中，编码CD47的核苷酸序列经密码子优化以便在哺乳动物细胞，例如人类细胞中表达。在一些实施方案中，编码CD47的密码子优化核苷酸序列与SEQ ID NO：5列出的核苷酸序列至少80％同一(例如，至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一)。
表1.CD47的示例性序列
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C.使用工程化细胞上的CD47表达来逃避免疫系统
本文提供了外源表达CD47的工程化细胞和其使用方法。在一些实施方案中，此类CD47表达细胞施用于患者，并且在一些情况下，在施用CD47-SIRPα阻断剂之前施用。如了解，如上所述可抑制或阻断CD47和SIRPα的相互作用的任何剂可以任何组合用于充当本文所述逃避免疫识别的任何工程化细胞的安全开关。
在一些实施方案中，将可逃避免疫识别或反应(例如，表现出减少的免疫原性或低免疫原性)的外源表达CD47的细胞引入接受者受试者。逃避免疫识别可经由过表达一种或多种免疫抑制因子或分子来实现，包括致耐受性因子和补体抑制剂。在一些实施方案中，细胞还表现出MHC I或MHC II或两者(例如，HLA I和/或HLA II)的减少的表达。在许多实施方案中，细胞还表现出减少的表达或不表达T细胞受体(TCR)(例如，TCRα和/或TCRβ)。此类细胞和其产生方法的详细描述在本文中描述。
在一个实施方案中，免疫抑制因子的表达是基于调节免疫调控因子CD47的表达。CD47是先天免疫系统的组分，在一些方面，作为先天免疫系统的部分，充当“别吃我”信号以便阻断通过巨噬细胞的吞噬作用。可工程化以便由目标细胞来表达的可用免疫抑制因子包括但不限于CD47、CD27、CD35、CD46、CD55、CD59、CD200、DUX4、HLA-C、HLA-E、HLA-E重链、HLA-G、PD-L1、IDO1、CTLA4、C1-抑制剂、IL-10、IL-35、FASL、Serpin B9、CCL21、Mfge8、TGF-β、Cd73、Cd39、LAG3、IL1r2、Ackr2、Tnfrsf22、Tnfrsf23、Tnfrsf10、Dad1或IFNγRId39，包括在2018年6月12日提交的WO2018227286中描述的因子，所述文件的内容包括其中表1提供的序列，并且序列表通过引用整体并入本文。
在一些实施方案中，本文提供的工程化细胞包含外源表达CD47和一种或多种(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多种)选自包括以下各者的组的另外外源表达多肽：DUX4、PD-L1、CD24、CD46、CD55、CD59、CD200、HLA-G(H2-M3)、FASL(FASLG)、CCL21(Ccl21b)、Mfge8、Serpin B9(Spi6)和其任何组合。在一些实施方案中，工程化细胞包含外源表达CD47和DUX4。在一些实施方案中，工程化细胞包含外源表达CD47和PD-L1。在一些实施方案中，工程化细胞包含外源表达CD47和CD24。在一些实施方案中，工程化细胞包含外源表达CD47和CD46。在一些实施方案中，工程化细胞包含外源表达CD47和CD55。在一些实施方案中，工程化细胞包含外源表达CD47和CD59。在一些实施方案中，工程化细胞包含外源表达CD47和CD200。在一些实施方案中，工程化细胞包含外源表达CD47和HLA-G。在一些实施方案中，工程化细胞包含外源表达CD47和FASL。在一些实施方案中，工程化细胞包含外源表达CD47和CCL21。在一些实施方案中，工程化细胞包含外源表达CD47和Mfge8。在一些实施方案中，工程化细胞包含外源表达CD47和Serpin B9(Serpinb9)。在一些实施方案中，工程化细胞包含外源表达CD47、PD-L1、HLAG、CD200、FASL、CCL21、Mfge8和Serpin B9。
在一些实施方案中，本公开提供了产生经修饰以表达选自包括以下各者的组的免疫抑制因子中的一者或多者的细胞或其群体的方法：CD47、PD-L1、CD24、CD27、CD35、CD46、CD55、CD59、CD200、DUX4、HLA-C、HLA-E、HLA-E重链、HLA-G、IDO1、CTLA4、C1-抑制剂、IDO1、IL-10、IL-35、FASL、CCL21、Mfge8和Serpin B9。在某些实施方案中，本公开提供了经修饰以表达选自包括以下各者的组的免疫抑制因子中的一者或多者的细胞或其群体：CD47、PD-L1、CD24、CD27、CD35、CD46、CD55、CD59、CD200、DUX4、HLA-C、HLA-E、HLA-E重链、HLA-G、IDO1、CTLA4、C1-抑制剂、IDO1、IL-10、IL-35、FASL、CCL21、Mfge8和Serpin B9。在其他实施方案中，免疫抑制因子选自包括以下各者的组：B2M、CIITA、NLRC5、TAP1、HLA-A、HLA-B、HLA-C、RFX-ANK、NFY-A、RFX5、RFX-AP、HLA-G、HLA-E、NFY-B、PD-L1、NFY-C、IRF1、GITR、4-1BB、CD28、B7-1、CD47、B7-2、OX40、CD27、HVEM、SLAM、CD226、ICOS、LAG3、TIGIT、TIM3、CD160、BTLA、CD244、LFA-1、ST2、HLA-F、CD30、B7-H3、VISTA、TLT、PD-L2、CD58、CD2和HELIOS。
在一些实施方案中，免疫抑制因子整合至内源性基因座中以便保护所述因子或容纳所述因子的载体盒的表达。在一些实施方案中，免疫抑制因子被插入选自B2M基因座、CIITA基因座、TRAC基因座、TRBC基因座和安全港基因座的位点中。安全港基因座的非限制性实例包括但不限于AAVS1(也称为PPP1R12C)、ABO、CCR5、CLYBL、CXCR4、F3(也称为CD142)、FUT1、HMGB1、KDM5D、LRP1(也称为CD91)、MICA、MICB、RHD、ROSA26和SHS231基因座位。免疫抑制因子可插入安全港基因座的合适区域中，包括例如内含子、外显子和/或基因编码区域(也称为编码序列，或“CDS”)。在一些实施方案中，安全港基因座选自由以下组成的组：AAVS1基因座、CCR5基因座和CLYBL基因座。在一些实施方案中，插入发生于特定基因组基因座的一个等位基因中。在一些实施方案中，插入发生于特定基因组基因座的两个等位基因中。在这些实施方案中的任一者中，插入靶基因组基因座中的转基因的取向可与所述基因座中的基因的方向相同或相反。
本文提供了代表任何植入细胞类型的有活力来源的工程化细胞。经由表达一种或多种免疫抑制因子，在施用于接受者受试者后，可保护此类细胞以免适应性和先天免疫排斥反应。在一些实施方案中，本文概述的细胞不经受先天免疫细胞排斥。在一些情况下，细胞不易受NK细胞介导的裂解。在一些情况下，本文所述细胞不易受巨噬细胞吞噬。
在一些方面，工程化细胞为多能干细胞、分化细胞或原代T细胞。在一些实施方案中，使用特定细胞类型的选定分化方案，分化细胞从多能干细胞产生。在一些实施方案中，原代T细胞选自包括以下各者的组：细胞毒性T细胞、辅助T细胞、记忆T细胞、调控T细胞、肿瘤浸润淋巴细胞和其组合。
在一些实施方案中，原代T细胞来自不同于接受者受试者(例如，施用细胞的患者)的一个或多个供者受试者的原代T细胞的池。原代T细胞可获自1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、50、100或更多个供者受试者并且任选地汇集在一起。在一些实施方案中，原代T细胞是从一个或多个个体收获，并且在一些情况下，原代T细胞或原代T细胞的池在体外培养。在一些实施方案中，原代T细胞或原代T细胞的池经工程化以便外源表达CD47并在体外培养。
在某些实施方案中，原代T细胞或原代T细胞的池经工程化以便表达嵌合抗原受体(CAR)。CAR(也称为嵌合免疫受体、嵌合T细胞受体或人工T细胞受体)是经工程化以便给予宿主细胞(例如，T细胞)靶向特定蛋白的新能力的受体蛋白。受体是嵌合的，因为其将抗原结合和T细胞活化功能两者组合至单一受体中。CAR可为本领域技术人员已知的任何CAR。可用CAR包括结合选自包括以下各者的组的抗原的CAR：CD19、CD22、CD38、CD123、CD138和BCMA。在一些情况下，CAR与用于FDA批准的CAR-T细胞疗法中的CAR相同或等同，例如但不限于，tisagenlecleucel和axicabtagene ciloleucel，或在临床试验中在调查下的CAR。在一些实施方案中，CAR为CD19特异性CAR。
在某些实施方案中，CAR可在N末端包含信号肽。信号肽的非限制性实例包括CD8α信号肽、IgK信号肽和颗粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子受体亚单位α(GMCSFR-α，也称为集落刺激因子2受体亚单位α(CSF2RA))信号肽和其变体，所述肽的氨基酸序列提供于下表2中。
表2.信号肽的示例性序列
在某些实施方案中，CAR的胞外结合域可包含对于一个靶抗原或多个靶抗原具有特异性的一个或多个抗体。抗体可为抗体片段，例如，scFv，或单域抗体片段，例如，VHH。在某些实施方案中，scFv可包含通过接头连接的抗体的重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)。VH和VL可以任一顺序连接，即，VH-接头-VL或VL-接头-VH。接头的非限制性实例包括Whitlow接头，(G4S)n(n可为正整数，例如，1、2、3、4、5、6等)接头和其变体。在某些实施方案中，抗原可为排他性地或优先表达于肿瘤细胞上的抗原，或自身免疫或炎症性疾病特有的抗原。示例性靶抗原包括但不限于CD5、CD19、CD20、CD22、CD23、CD30、CD70、Kappa、Lambda和B细胞成熟剂(BCMA)、G蛋白偶联受体家族C群组5成员D(GPRC5D)(与白血病相关)；CS1/SLAMF7、CD38、CD138、GPRC5D、TACI、和BCMA(与骨髓瘤相关)；GD2、HER2、EGFR、EGFRvIII、B7H3、PSMA、PSCA、CAIX、CD171、CEA、CSPG4、EPHA2、FAP、FRα、IL-13Rα、间皮素、MUC1、MUC16、和ROR1(与实体肿瘤相关)。在任何这些实施方案中，CAR的胞外结合域可经密码子优化以便在宿主细胞中表达或具有变体序列以便增加胞外结合域的功能。
在某些实施方案中，CAR可包含铰链域，也被称为间隔物。术语“铰链”和“间隔物”可在本公开中可互换使用。铰链域的非限制性实例包括CD8α铰链域、CD28铰链域、IgG4铰链域、IgG4铰链-CH2-CH3域和其变体，所述域的氨基酸序列提供于下表3中。
表3.铰链域的示例性序列
在某些实施方案中，CAR的跨膜域可包含T细胞受体的α、β或ζ链，CD28、CD3ε、CD45、CD4、CD5、CD8、CD9、CD16、CD22、CD33、CD37、CD64、CD80、CD86、CD134、CD137、CD154或其功能变体的跨膜区域，包括这些序列中的每一者的人类型式。在其他实施方案中，跨膜域可包含CD8α、CD8β、4-1BB/CD137、CD28、CD34、CD4、FcεRIγ、CD16、OX40/CD134、CD3ζ、CD3ε、CD3γ、CD3δ、TCRα、TCRβ、TCRζ、CD32、CD64、CD64、CD45、CD5、CD9、CD22、CD37、CD80、CD86、CD40、CD40L/CD154、VEGFR2、FAS和FGFR2B或其功能变体的跨膜区域，包括这些序列中的每一者的人类型式。表4提供了几个示例性跨膜域的氨基酸序列。
表4.跨膜域的示例性序列
在某些实施方案中，CAR的细胞内信号域和/或细胞内共刺激域可包含一个或多个选自以下各者的信号域：B7-1/CD80、B7-2/CD86、B7-H1/PD-L1、B7-H2、B7-H3、B7-H4、B7-H6、B7-H7、BTLA/CD272、CD28、CTLA-4、Gi24/VISTA/B7-H5、ICOS/CD278、PD-1、PD-L2/B7-DC、PDCD6、4-1BB/TNFSF9/CD137、4-1BB配体/TNFSF9、BAFF/BLvS/TNFSF13B、BAFF R/TNFRSF13C、CD27/TNFRSF7、CD27配体/TNFSF7、CD30/TNFRSF8、CD30配体/TNFSF8、CD40/TNFRSF5、CD40/TNFSF5、CD40配体/TNFSF5、DR3/TNFRSF25、GITR/TNFRSF18、GITR配体/TNFSF18、HVEM/TNFRSF14、LIGHT/TNFSF14、淋巴毒素-α/TNFβ、OX40/TNFRSF4、OX40配体/TNFSF4、RELT/TNFRSF19L、TACI/TNFRSF13B、TL1A/TNFSF15、TNFα、TNF RII/TNFRSF1B、2B4/CD244/SLAMF4、BLAME/SLAMF8、CD2、CD2F-10/SLAMF9、CD48/SLAMF2、CD58/LFA-3、CD84/SLAMF5、CD229/SLAMF3、CRACC/SLAMF7、NTB-A/SLAMF6、SLAM/CD150、CD2、CD7、CD53、CD82/Kai-1、CD90/Thyl、CD96、CD160、CD200、CD300a/LMIR1、HLA I类、HLA-DR、IKAROS、整联蛋白α4/CD49d、整联蛋白α4β1、整联蛋白α4β7/LPAM-1、LAG-3、TCL1A、TCL1B、CRTAM、DAP12、Dectin-1/CLEC7A、DPPIV/CD26、EphB6、TIM-1/KIM-1/HAVCR、TIM-4、TSLP、TSLPR、淋巴细胞功能相关抗原-1(LFA-1)、NKG2C、CD3ζ、免疫受体酪氨酸基活化基序(ITAM)、CD27、CD28、4-1BB、CD134/OX40、CD30、CD40、PD-1、ICOS、淋巴细胞功能相关抗原-1(LFA-1)、CD2、CD7、LIGHT、NKG2C、B7-H3、与CD83特异性结合的配体和其功能变体，包括这些序列中的每一者的人类型式。在一些实施方案中，细胞内信号域和/或细胞内共刺激域包含一个或多个选自以下各者的信号域：CD3ζ域、ITAM、CD28域、4-1BB域或其功能变体。表5提供几个示例性细胞内共刺激和/或信号域的氨基酸序列。在某些实施方案中，如在如下所述的tisagenlecleucel的情况下，SEQ ID NO：18的CD3ζ信号域可在氨基酸位置14(参见SEQ ID NO：115)处具有突变，例如，谷氨酰胺(Q)至赖氨酸(K)突变。
表5.细胞内共刺激和/或信号域的示例性序列
在某些实施方案中，使用载体将CAR插入T细胞或其他免疫细胞中。在某些这些实施方案中，载体含有单一表达盒用于表达CAR。在其他实施方案中，载体为含有两个或更多个表达盒的多顺反子载体，例如，双顺反子载体、三顺反子载体或四顺反子载体，其允许在宿主细胞中从一个mRNA转录物同时表达两个或更多个单独蛋白。在这些实施方案中，一个表达盒可表达CAR，而一个或多个额外表达盒可表达额外因子，包括例如CD47、CD16、CD24、CD35、CD39、CD46、CD52、CD55、CD59、CD200、CCL22、CTLA4-Ig、C1抑制剂、FASL、IDO1、HLA-C、HLA-E、HLA-E重链、HLA-G、IL-10、IL-35、PD-1、PD-L1、Serpinb9、CCl21、Mfge8。在某些实施方案中，两个或更多个表达盒在单一启动子控制下并且通过一个或多个裂解位点来彼此分隔以便实现从一个转录物共表达目标蛋白。在其他实施方案中，两个或更多个基因可在分开启动子的控制下。在某些实施方案中，多顺反子载体还可包含安全开关。多顺反子载体可为适合于将核苷酸序列引入宿主细胞中的任何类型的载体，包括例如质粒、腺病毒载体、逆转录病毒载体、慢病毒载体、噬菌体和基于同源介导修复(HDR)的供者载体。
在某些实施方案中，多顺反子载体的两个或更多个表达盒可通过一个或多个裂解位点来分隔。在一些实施方案中，一个或多个裂解位点包含一个或多个自身裂解位点。在一些实施方案中，自身裂解位点包含2A位点。2A肽是一种首先在小核糖核酸病毒中发现的18-22氨基酸长肽并且可在蛋白翻译期间诱导核糖体跳过，由此从同一mRNA转录物产生相等量的多个基因。通过在甘氨酸(G)与脯氨酸(P)残基之间，使得核糖体跳过C末端处的肽键合成，导致2A序列的末端与下游后续肽之间的分离，2A肽用于“裂解”mRNA转录物。存在通常用于分子生物学中的四种2A肽，T2A、P2A、E2A和F2A，所述肽的序列概述于表6中。甘氨酸-丝氨酸-甘氨酸(GSG)接头任选地添加至2A肽的N末端以便增加裂解效率。在本公开中，在序列周围使用“()”意指所包围的序列是任选的。
表6. 2A肽的序列
SEQ ID NO： 氨基酸序列 2A肽
85 (GSG)EGRGSLLTCGDVEENPGP T2A
86 (GSG)ATNFSLLKQAGDVEENPGP P2A
87 (GSG)QCTNYALLKLAGDVESNPGP E2A
88 (GSG)VKQTLNFDLLKLAGDVESNPGP F2A
在一些实施方案中，一个或多个裂解位点另外包含一个或多个蛋白酶位点。在多顺反子载体的5′至3′顺序中，一个或多个蛋白酶位点可在自身裂解位点(例如，2A位点)之前或之后。在翻译完整转录物之后或在翻译每个表达盒之后，蛋白酶位点可通过蛋白酶裂解以使得在翻译下一个表达盒之前，释放第一表达产物。在这些实施方案中，除了2A位点以外，尤其在5′至3′顺序中，在2A位点之前，具有蛋白酶位点可减少附接至目标表达蛋白的额外氨基酸残基的数目。在一些实施方案中，蛋白酶位点包含弗林蛋白酶位点，也称为成对碱性氨基酸裂解酶(PACE)位点。存在至少三个弗林蛋白酶裂解序列，FC1、FC2、和FC3，所述序列的氨基酸序列概述于表7中。类似于2A位点，可包括一个或多个任选的甘氨酸-丝氨酸-甘氨酸(GSG)序列以促进裂解效率。
表7.弗林蛋白酶位点的序列
SEQ ID NO： 氨基酸序列 弗林蛋白酶位点
89 RRRR(GSG) FC1
90 RKRR(GSG) FC2
91 RKRR(GSG)TPDPW(GSG) FC3
在一些实施方案中，一个或多个裂解位点包含一个或多个自身裂解位点、一个或多个蛋白酶位点和/或其任何组合。例如，裂解位点可仅包括2A位点。对于另一个实例，裂解位点可包括FC2或FC3位点，接着是2A位点。在这些实施方案中，一个或多个自身裂解位点可相同或不同。类似地，一个或多个蛋白酶位点可相同或不同。
在一些实施方案中，多顺反子载体包含驱动哺乳动物细胞中的组成性基因表达的启动子。那些常用启动子包括例如延长因子1α(EF1α)启动子、巨细胞病毒(CMV)即刻早期启动子(Greenaway等人，Gene 18：355-360(1982))、猿猴空泡病毒40(SV40)早期启动子(Fiers等人，Nature 273：113-120(1978))、脾病灶形成病毒(SFFV)启动子、磷酸甘油酸激酶(PGK)启动子(Adra等人，Gene 60(1)：65-74(1987))、人类β肌动蛋白启动子、聚泛素C基因(UBC)启动子和CAG启动子(Nitoshi等人，Gene 108：193-199(1991))。能够表达哺乳动物细胞(例如T细胞)中的CAR转基因的启动子的实例为EF1α启动子。天然EF1α启动子驱动延长因子-1复合物的α亚单位的表达，所述复合物负责酶促递送氨酰基tRNA至核糖体。EF1α启动子广泛用于哺乳动物表达质粒中并且已被证明有效驱动从克隆至慢病毒载体中的转基因的CAR表达。参见例如Milone等人，Mol.Ther.17(8)：1453-1464(2009)。
在其他实施方案中，多顺反子载体包含可诱导启动子。不同于组成性启动子，可诱导启动子可响应于某些刺激(例如，化学剂、温度、光)在启用与停用状态之间切换并且可以组织或细胞特异性方式来调控。常用可诱导启动子的非限制性实例包括四环素启用(Tet-On)系统和四环素停用(Tet-Off)系统，所述系统利用安置于最小启动子(例如，CMV启动子)上游的四环素反应元件(TRE)(Gossen和Bujard，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89(12)：5547-5551(1992))。TRE由19-核苷酸四环素操纵子(tetO)序列的7个重复序列制成并且可通过四环素抑制因子(tetR)来识别。在Tet-Off系统中，四环素控制的反式活化因子(tTA)通过将tetR与单纯性疱疹病毒的病毒颗粒蛋白16的活化域融合来发展。当不存在四环素或其类似物(例如强力霉素)时，tTA将结合TRE的tetO序列并驱动表达；当存在四环素时，rTA将结合至四环素并且不结合至TRE，导致基因表达减少。相反地，在Tet-On系统中，反向反式活化因子(rtTA)通过对于四环素依赖性抑制而言至关重要的氨基酸残基的诱变来产生，并且rtTA结合于TRE处并且在四环素或强力霉素存在下驱动基因表达(Gossen等人，Science268(5218)：1766-1769(1995))。可诱导启动子的其他实例包括例如AlcA、LexA和Cre。
在一些实施方案中，多顺反子载体包含在第一表达盒之前的Kozak共有序列。Kozak共有序列为核酸基序，所述基序在大多数真核mRNA转录物中充当蛋白质翻译启始位点并且介导核糖体组装和翻译启始。在一些实施方案中，Kozak共有序列包含以下或由以下组成：SEQ ID NO：92列出的序列，其中r为嘌呤(即a或g)：(gcc)gccrccatgg(SEQ ID NO：92)。
在一些实施方案中，多顺反子载体包含在第二表达盒之后的土拨鼠肝炎病毒(WHV)转录后调控元件(WPRE)。WPRE是在转录时产生增强表达的三级结构的DNA序列。WPRE序列通常用于增加通过病毒载体递送的基因的表达。在一些实施方案中，WPRE序列包含以下或由以下组成：SEQ ID NO：93列出的氨基酸序列或与SEQ ID NO：93列出的序列至少80％同一(例如，至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一)的氨基酸序列：
aatcaacctctggattacaaaatttgtgaaagattgactggtattcttaactatgttgctccttttacgctatgtggatacgctgctttaatgcctttgtatcatgctattgcttcccgtatggctttcattttctcctccttgtataaatcctggttgctgtctctttatgaggagttgtggcccgttgtcaggcaacgtggcgtggtgtgcactgtgtttgctgacgcaacccccactggttggggcattgccaccacctgtcagctcctttccgggactttcgctttccccctccctattgccacggcggaactcatcgccgcctgccttgcccgctgctggacaggggctcggctgttgggcactgacaattccgtggtgttgtcggggaaatcatcgtcctttccttggctgctcgcctgtgttgccacctggattctgcgcgggacgtccttctgctacgtcccttcggccctcaatccagcggaccttccttcccgcggcctgctgccggctctgcggcctcttccgcgtcttcgccttcgccctcagacgagtcggatctccctttgggccgcctccccgc(SEQ ID NO：93)。
在一些实施方案中，多顺反子载体包含侧接含有表达盒的片段的同源臂和/或用于定点插入(敲入)宿主细胞中的指定基因座中的启动子，例如，通过如所描述的基于同源引导修复(HDR)的方法。通常含有至少表达盒和任选地还含有启动子的待插入的多顺反子载体的片段通过直接在靶插入位点上游和下游的同源序列(即，左同源臂(LHA)和右同源臂(RHA))来侧接。同源臂针对靶基因组基因座来特别设计以便所述片段充当HDR的模板。每个同源臂的长度通常取决于所引入插入物的尺寸，并且更大插入物需要更长同源臂。
在某些实施方案中，表达外源CAR和外源CD47多肽的细胞或细胞群体从两个单独载体来表达CAR和CD47。在其他实施方案中，外源CAR和外源CD47多肽经由多顺反子载体来引入细胞或细胞群体中，例如，包含表达外源CAR的第一表达盒和表达外源CD47的第二表达盒的双顺反子载体。在某些这些实施方案中，多顺反子载体可包含表达一个或多个额外因子的一个或多个额外表达盒。在细胞或细胞群体包含编码外源CAR和外源CD47多肽的双顺反子载体的某些实施方案中，双顺反子载体经由慢病毒被引入一个或多个细胞中。
CD19 CAR
在一些实施方案中，CAR为CD19 CAR。在一些实施方案中，CD19 CAR可包含串联的信号肽、特异性结合CD19的胞外结合域、铰链域、跨膜域、细胞内共刺激域和/或细胞内信号域。
在一些实施方案中，CD19 CAR的信号肽包含CD8α信号肽。在一些实施方案中，CD8α信号肽包含以下或由以下组成：SEQ ID NO：6列出的氨基酸序列或与SEQ ID NO：6列出的氨基酸序列至少80％同一(例如，至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一)的氨基酸序列。在一些实施方案中，信号肽包含IgK信号肽。在一些实施方案中，IgK信号肽包含以下或由以下组成：SEQ ID NO：7列出的氨基酸序列或与SEQ ID NO：7列出的氨基酸序列至少80％同一(例如，至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一)的氨基酸序列。在一些实施方案中，信号肽包含GMCSFR-α或CSF2RA信号肽。在一些实施方案中，GMCSFR-α或CSF2RA信号肽包含以下或由以下组成：SEQ ID NO：8列出的氨基酸序列或与SEQ ID NO：8列出的氨基酸序列至少80％同一(例如，至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一)的氨基酸序列。
在一些实施方案中，CD19 CAR的胞外结合域对于CD19、例如人类CD19具有特异性。CD19 CAR的胞外结合域可经密码子优化以便在宿主细胞中表达或具有变体序列以便增加胞外结合域的功能。在一些实施方案中，胞外结合域包含免疫球蛋白分子的免疫原性活性部分，例如，scFv。
在一些实施方案中，CD19 CAR的胞外结合域包含衍生自FMC63单克隆抗体(FMC63)的scFv，其包含通过接头连接的FMC63的重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)。FMC63和衍生scFv描述于Nicholson等人，Mol.Immun.34(16-17)：1157-1165(1997)和PCT申请公开第WO2018/213337号，所述参考文献中的每一者的全部内容通过引用并入本文。在一些实施方案中，整个FMC63衍生scFv(也被称为FMC63 scFv)和其不同部分的氨基酸序列提供于下表8中。在一些实施方案中，CD19特异性scFv包含以下或由以下组成：SEQ ID NO：19、20或25列出的氨基酸序列，或与SEQ ID NO：19、20或25列出的氨基酸序列至少80％同一(例如，至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一)的氨基酸序列。在一些实施方案中，CD19特异性scFv可包含一个或多个具有SEQ ID NO：21-23和26-28列出的氨基酸序列的CDR。在一些实施方案中，CD19特异性scFv可包含一个或多个CDR具有SEQ ID NO：21-23列出的氨基酸序列的轻链。在一些实施方案中，CD19特异性scFv可包含一个或多个CDR具有SEQ ID NO：26-28列出的氨基酸序列的重链。在任何这些实施方案中，CD19特异性scFv可包含含有一个或多个氨基酸取代、或含有与鉴定的任何序列至少80％同一(例如，至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一)的序列的一个或多个CDR。在一些实施方案中，CD19 CAR的胞外结合域包含一个或多个如本文描述的CDR或由一个或多个如本文描述的CDR组成。
在一些实施方案中，连接scFv的VH和VL部分的接头是具有SEQ ID NO：24列出的氨基酸序列的Whitlow接头。在一些实施方案中，Whitlow接头可通过不同接头，例如，具有SEQID NO：30列出的氨基酸序列的3xG4S接头来代替，从而产生具有SEQ ID NO：29列出的氨基酸序列的不同FMC63衍生scFv。在某些这些实施方案中，CD19特异性scFv包含以下或由以下组成：SEQ ID NO：29列出的氨基酸序列或与SEQ ID NO：29列出的氨基酸序列至少80％同一(例如，至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一)的氨基酸序列。
表8.抗CD19 scFv和组分的示例性序列
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在一些实施方案中，CD19 CAR的胞外结合域衍生自对于CD19具有特异性的抗体，包括例如SJ25C1(Bejcek等人，Cancer Res.55：2346-2351(1995))、HD37(Pezutto等人，J.Immunol.138(9)：2793-2799(1987))、4G7(Meeker等人，Hybridoma 3：305-320(1984))、B43(Bejcek(1995))、BLY3(Bejcek(1995))、B4(Freedman等人，70：418-427(1987))、B4HB12b(Kansas和Tedder，J.Immunol.147：4094-4102(1991)；Yazawa等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 102：15178-15183(2005)；Herbst等人，J.Pharmacol.Exp.Ther.335：213-222(2010))、BU12(Callard等人，J.Immunology，148(10)：2983-2987(1992))和CLB-CD19(De Rie Cell.Immunol.118：368-381(1989))。在任何这些实施方案中，CD19 CAR的胞外结合域可包含以下或由以下组成：VH、VL和/或任何抗体的一个或多个CDR。
在一些实施方案中，CD19 CAR的铰链域包含CD8α铰链域，例如人类CD8α铰链域。在一些实施方案中，CD8α铰链域包含以下或由以下组成：SEQ ID NO：9列出的氨基酸序列或与SEQ ID NO：9列出的氨基酸序列至少80％同一(例如，至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一)的氨基酸序列。在一些实施方案中，铰链域包含CD28铰链域，例如人类CD28铰链域。在一些实施方案中，CD28铰链域包含以下或由以下组成：SEQ ID NO：10列出的氨基酸序列或与SEQ ID NO：10列出的氨基酸序列至少80％同一(例如，至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一)的氨基酸序列。在一些实施方案中，铰链域包含IgG4铰链域，例如人类IgG4铰链域。在一些实施方案中，IgG4铰链域包含以下或由以下组成：SEQ ID NO：11或SEQ ID NO：12列出的氨基酸序列，或与SEQ ID NO：11或SEQ ID NO：12列出的氨基酸序列至少80％同一(例如，至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一)的氨基酸序列。在一些实施方案中，铰链域包含IgG4铰链-Ch2-Ch3域，例如人类IgG4铰链-Ch2-Ch3域。在一些实施方案中，IgG4铰链-Ch2-Ch3域包含以下或由以下组成：SEQ ID NO：13列出的氨基酸序列或与SEQ ID NO：13列出的氨基酸序列至少80％同一(例如，至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一)的氨基酸序列。
在一些实施方案中，CD19 CAR的跨膜域包含CD8α跨膜域，例如人类CD8α跨膜域。在一些实施方案中，CD8α跨膜域包含以下或由以下组成：SEQ ID NO：14列出的氨基酸序列或与SEQ ID NO：14列出的氨基酸序列至少80％同一(例如，至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一)的氨基酸序列。在一些实施方案中，跨膜域包含CD28跨膜域，例如人类CD28跨膜域。在一些实施方案中，CD28跨膜域包含以下或由以下组成：SEQ ID NO：15列出的氨基酸序列或与SEQ ID NO：15列出的氨基酸序列至少80％同一(例如，至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一)的氨基酸序列。
在一些实施方案中，CD19 CAR的细胞内共刺激域包含4-1BB共刺激域。4-1BB，也称为CD137，向T细胞传送有效共刺激信号，促进分化并增强T淋巴细胞的长期存活。在一些实施方案中，4-1BB共刺激域为人类共刺激域。在一些实施方案中，4-1BB共刺激域包含以下或由以下组成：SEQ ID NO：16列出的氨基酸序列或与SEQ ID NO：16列出的氨基酸序列至少80％同一(例如，至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一)的氨基酸序列。在一些实施方案中，细胞内共刺激域包含CD28共刺激域。CD28为T细胞上的另一种共刺激分子。在一些实施方案中，CD28共刺激域为人类共刺激域。在一些实施方案中，CD28共刺激域包含以下或由以下组成：SEQ ID NO：17列出的氨基酸序列或与SEQ ID NO：17列出的氨基酸序列至少80％同一(例如，至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一)的氨基酸序列。在一些实施方案中，CD19 CAR的细胞内共刺激域包含如所描述的4-1BB共刺激域和CD28共刺激域。
在一些实施方案中，CD19 CAR的细胞内信号域包含CD3 zeta(ζ)信号域。CD3ζ与T细胞受体(TCR)缔合来产生信号并且含有免疫受体酪氨酸基活化基序(ITAM)。CD3ζ信号域是指来自ζ链的胞质域的氨基酸残基，所述残基足以在功能上传输T细胞活化必不可少的起始信号。在一些实施方案中，CD3ζ信号域是人类信号域。在一些实施方案中，CD3ζ信号域包含以下或由以下组成：SEQ ID NO：18列出的氨基酸序列或与SEQ ID NO：18列出的氨基酸序列至少80％同一(例如，至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一)的氨基酸序列。
在一些实施方案中，CD19 CAR包含具有SEQ ID NO：19或SEQ ID NO：29列出的序列的CD19特异性scFv、SEQ ID NO：11或SEQ ID NO：12的IgG4铰链域、SEQ ID NO：15的CD28跨膜域、SEQ ID NO：16的4-1BB共刺激域、SEQ ID NO：18的CD3ζ信号域和/或其变体(即，具有与所公开序列至少80％同一，例如，至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99同一的序列)。在任何这些实施方案中，CD19 CAR可另外包含如所描述的信号肽(例如，CD8α信号肽)。
在一些实施方案中，CD19 CAR包含具有SEQ ID NO：19或SEQ ID NO：29列出的序列的CD19特异性scFv、SEQ ID NO：10的CD28铰链域、SEQ ID NO：15的CD28跨膜域、SEQ ID NO：17的CD28共刺激域、SEQ ID NO：18的CD3ζ信号域和/或其变体(即，具有与所公开序列至少80％同一，例如，至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99同一的序列)。在任何这些实施方案中，CD19 CAR可另外包含如所描述的信号肽(例如，CD8α信号肽)。
在一些实施方案中，CD19 CAR通过SEQ ID NO：116列出的核苷酸序列或与SEQ IDNO：116列出的核苷酸序列至少80％同一(例如，至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一)的核苷酸序列来编码(参见表9)。所编码的CD19 CAR具有SEQ ID NO：117列出的对应氨基酸序列或与SEQ ID NO：117列出的氨基酸序列至少80％同一(例如，至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一)，具有以下组分：CD8α信号肽、FMC63 scFv(VL-Whitlow接头-VH)、CD8α铰链域、CD8α跨膜域、4-1BB共刺激域和CD3ζ信号域。
在一些实施方案中，CD19 CAR是商购实施方案的CD19 CAR，包括但不限于由T细胞表达和/或编码的CD19 CAR，包括tisagenlecleucel、lisocabtagene maraleucel、axicabtagene ciloleucel和brexucabtagene autoleucel。Tisagenlecleucel包含具有以下组分的CD19CAR：CD8α信号肽、FMC63 scFv(VL-3xG4S接头-VH)、CD8α铰链域、CD8α跨膜域、4-1BB共刺激域和CD3ζ信号域。tisagenlecleucel中的CD19 CAR的核苷酸和氨基酸序列提供于表9中，并且序列的注释提供于表10中。Lisocabtagene maraleucel包含具有以下组分的CD19CAR：GMCSFR-α或CSF2RA信号肽、FMC63 scFv(VL-Whitlow接头-VH)、IgG4铰链域、CD28跨膜域、4-1BB共刺激域和CD3ζ信号域。lisocabtagene maraleucel中的CD19 CAR的核苷酸和氨基酸序列提供于表9中，其中序列的注释提供于表11中。Axicabtagene ciloleucel或其部分。Axicabtagene ciloleucel包含具有以下组分的CD19CAR：GMCSFR-α或CSF2RA信号肽、FMC63 scFv(VL-Whitlow接头-VH)、CD28铰链域、CD28跨膜域、CD28共刺激域和CD3ζ信号域。axicabtagene ciloleucel中的CD19 CAR的核苷酸和氨基酸序列提供于表9中，其中序列的注释提供于表12中。Brexucabtagene autoleucel或其部分。Brexucabtageneautoleucel包含具有以下组分的CD19 CAR：GMCSFR-α信号肽、FMC63 scFv、CD28铰链域、CD28跨膜域、CD28共刺激域和CD3ζ信号域。
在一些实施方案中，CD19 CAR通过SEQ ID NO：31、33或35列出的核苷酸序列，或与SEQ ID NO：31、33或35列出的核苷酸序列至少80％同一(例如，至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一)的核苷酸序列来编码。所编码的CD19 CAR具有分别在SEQ ID NO：32、34或36列出的对应氨基酸序列，或分别与SEQ ID NO：32、34或36列出的氨基酸序列至少80％同一(例如，至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一)。
表9.CD19 CAR的示例性序列
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表10.tisagenlecleucel CD19 CAR序列的注释
表11.lisocabtagene maraleucel CD19 CAR序列的注释
表12.axicabtagene ciloleucel CD 19CAR序列的注释
CD20 CAR
在一些实施方案中，CAR为CD20 CAR。CD20是早在前B期即存在于B细胞表面上并且逐渐增加水平直到B细胞成熟为止的抗原，并且存在于大多数B细胞肿瘤的细胞上。CD20阳性细胞有时也发现于霍奇金疾病、骨髓瘤和胸腺瘤的病例中。在一些实施方案中，CD20CAR可包含串联的信号肽、特异性结合CD20的胞外结合域、铰链域、跨膜域、细胞内共刺激域和/或细胞内信号域。
在一些实施方案中，CD20 CAR的信号肽包含CD8α信号肽。在一些实施方案中，CD8α信号肽包含以下或由以下组成：SEQ ID NO：6列出的氨基酸序列或与SEQ ID NO：6列出的氨基酸序列至少80％同一(例如，至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一)的氨基酸序列。在一些实施方案中，信号肽包含IgK信号肽。在一些实施方案中，IgK信号肽包含以下或由以下组成：SEQ ID NO：7列出的氨基酸序列或与SEQ ID NO：7列出的氨基酸序列至少80％同一(例如，至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一)的氨基酸序列。在一些实施方案中，信号肽包含GMCSFR-α或CSF2RA信号肽。在一些实施方案中，GMCSFR-α或CSF2RA信号肽包含以下或由以下组成：SEQ ID NO：8列出的氨基酸序列或与SEQ ID NO：8列出的氨基酸序列至少80％同一(例如，至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一)的氨基酸序列。
在一些实施方案中，CD20 CAR的胞外结合域对于CD20，例如人类CD20具有特异性。CD20 CAR的胞外结合域可经密码子优化以便在宿主细胞中表达或具有变体序列以便增加胞外结合域的功能。在一些实施方案中，胞外结合域包含免疫球蛋白分子的免疫原性活性部分，例如，scFv。
在一些实施方案中，CD20 CAR的胞外结合域衍生自对于CD20具有特异性的抗体，包括例如Leu16、IF5、1.5.3、利妥昔单抗(rituximab)、阿托珠单抗(obinutuzumab)、替伊莫单抗(ibritumomab)、奥法木单抗(ofatumumab)、托西木单抗(tositumumab)、奥卓昔单抗(odronextamab)、维图珠单抗(veltuzumab)、乌利妥昔单抗(ublituximab)和奥瑞珠单抗(ocrelizumab)。在任何这些实施方案中，CD20 CAR的胞外结合域可包含以下或由以下组成：VH、VL和/或任何抗体的一个或多个CDR。
在一些实施方案中，CD20 CAR的胞外结合域包含衍生自Leu16单克隆抗体的scFv，其包含通过接头连接的Leu16的重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)。参见Wu等人，ProteinEngineering.14(12)：1025-1033(2001)。在一些实施方案中，接头为3xG4S接头。在其他实施方案中，接头为如本文描述的Whitlow接头。在一些实施方案中，整个Leu16衍生scFv(也被称为Leu16 scFv)的不同部分和其不同部分的氨基酸序列提供于下表13中。在一些实施方案中，CD20特异性scFv包含以下或由以下组成：SEQ ID NO：37、38或42列出的氨基酸序列，或与SEQ ID NO：37、38或42列出的氨基酸序列至少80％同一(例如，至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一)的氨基酸序列。在一些实施方案中，CD20特异性scFv可包含一个或多个具有SEQ ID NO：39-41、43和44列出的氨基酸序列的CDR。在一些实施方案中，CD20特异性scFv可包含一个或多个CDR具有SEQ ID NO：39-41列出的氨基酸序列的轻链。在一些实施方案中，CD20特异性scFv可包含一个或多个CDR具有SEQ ID NO：43-44列出的氨基酸序列的重链。在任何这些实施方案中，CD20特异性scFv可包含含有一个或多个氨基酸取代、或含有与鉴定的任何序列至少80％同一(例如，至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一)的序列的一个或多个CDR。在一些实施方案中，CD20 CAR的胞外结合域包含一个或多个如本文描述的CDR或由一个或多个如本文描述的CDR组成。
表13.抗CD20 scFv和组分的示例性序列
在一些实施方案中，CD20 CAR的铰链域包含CD8α铰链域，例如人类CD8α铰链域。在一些实施方案中，CD8α铰链域包含以下或由以下组成：SEQ ID NO：9列出的氨基酸序列或与SEQ ID NO：9列出的氨基酸序列至少80％同一(例如，至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一)的氨基酸序列。在一些实施方案中，铰链域包含CD28铰链域，例如人类CD28铰链域。在一些实施方案中，CD28铰链域包含以下或由以下组成：SEQ ID NO：10列出的氨基酸序列或与SEQ ID NO：10列出的氨基酸序列至少80％同一(例如，至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一)的氨基酸序列。在一些实施方案中，铰链域包含IgG4铰链域，例如人类IgG4铰链域。在一些实施方案中，IgG4铰链域包含以下或由以下组成：SEQ ID NO：11或SEQ ID NO：12列出的氨基酸序列，或与SEQ ID NO：11或SEQ ID NO：12列出的氨基酸序列至少80％同一(例如，至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一)的氨基酸序列。在一些实施方案中，铰链域包含IgG4铰链-Ch2-Ch3域，例如人类IgG4铰链-Ch2-Ch3域。在一些实施方案中，IgG4铰链-Ch2-Ch3域包含以下或由以下组成：SEQ ID NO：13列出的氨基酸序列或与SEQ ID NO：13列出的氨基酸序列至少80％同一(，例如，至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一)的氨基酸序列。
在一些实施方案中，CD20 CAR的跨膜域包含CD8α跨膜域，例如人类CD8α跨膜域。在一些实施方案中，CD8α跨膜域包含以下或由以下组成：SEQ ID NO：14列出的氨基酸序列或与SEQ ID NO：14列出的氨基酸序列至少80％同一(例如，至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一)的氨基酸序列。在一些实施方案中，跨膜域包含CD28跨膜域，例如人类CD28跨膜域。在一些实施方案中，CD28跨膜域包含以下或由以下组成：SEQ ID NO：15列出的氨基酸序列或与SEQ ID NO：15列出的氨基酸序列至少80％同一(例如，至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一)的氨基酸序列。
在一些实施方案中，CD20 CAR的细胞内共刺激域包含4-1BB共刺激域，例如人类4-1BB共刺激域。在一些实施方案中，4-1BB共刺激域包含以下或由以下组成：SEQ ID NO：16列出的氨基酸序列或与SEQ ID NO：16列出的氨基酸序列至少80％同一(例如，至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一)的氨基酸序列。在一些实施方案中，细胞内共刺激域包含CD28共刺激域，例如人类CD28共刺激域。在一些实施方案中，CD28共刺激域包含以下或由以下组成：SEQ ID NO：17列出的氨基酸序列或与SEQ ID NO：17列出的氨基酸序列至少80％同一(例如，至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一)的氨基酸序列。
在一些实施方案中，CD20 CAR的细胞内信号域包含CD3 zeta(ζ)信号域，例如人类CD3ζ信号域。在一些实施方案中，CD3ζ信号域包含以下或由以下组成：SEQ ID NO：18列出的氨基酸序列或与SEQ ID NO：18列出的氨基酸序列至少80％同一(例如，至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一)的氨基酸序列。
在一些实施方案中，CD20 CAR包含具有SEQ ID NO：37列出的序列的CD20特异性scFv、SEQ ID NO：9的CD8α铰链域、SEQ ID NO：14的CD8α跨膜域、SEQ ID NO：16的4-1BB共刺激域、SEQ ID NO：18的CD3ζ信号域和/或其变体(即，具有与所公开序列至少80％同一，例如，至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99同一的序列)。
在一些实施方案中，CD20 CAR包含具有SEQ ID NO：37列出的序列的CD20特异性scFv、SEQ ID NO：10的CD28铰链域、SEQ ID NO：14的CD8α跨膜域、SEQ ID NO：16的4-1BB共刺激域、SEQ ID NO：18的CD3ζ信号域和/或其变体(即，具有与所公开序列至少80％同一，例如，至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99同一的序列)。
在一些实施方案中，CD20 CAR包含具有SEQ ID NO：37列出的序列的CD20特异性scFv、SEQ ID NO：11或SEQ ID NO：12的IgG4铰链域、SEQ ID NO：14的CD8α跨膜域、SEQ IDNO：16的4-1BB共刺激域、SEQ ID NO：18的CD3ζ信号域和/或其变体(即，具有与所公开序列至少80％同一，例如，至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99同一的序列)。
在一些实施方案中，CD20 CAR包含具有SEQ ID NO：37列出的序列的CD20特异性scFv、SEQ ID NO：9的CD8α铰链域、SEQ ID NO：15的CD28跨膜域、SEQ ID NO：16的4-1BB共刺激域、SEQ ID NO：18的CD3ζ信号域和/或其变体(即，具有与所公开序列至少80％同一，例如，至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99同一的序列)。
在一些实施方案中，CD20 CAR包含具有SEQ ID NO：37列出的序列的CD20特异性scFv、SEQ ID NO：10的CD28铰链域、SEQ ID NO：15的CD28跨膜域、SEQ ID NO：16的4-1BB共刺激域、SEQ ID NO：18的CD3ζ信号域和/或其变体(即，具有与所公开序列至少80％同一，例如，至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99同一的序列)。
在一些实施方案中，CD20 CAR包含具有SEQ ID NO：37列出的序列的CD20特异性scFv、SEQ ID NO：11或SEQ ID NO：1的IgG4铰链域、SEQ ID NO：15的CD28跨膜域、SEQ IDNO：16的4-1BB共刺激域、SEQ ID NO：18的CD3ζ信号域和/或其变体(即，具有与所公开序列至少80％同一，例如，至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99同一的序列)。
CD22 CAR
在一些实施方案中，CAR为CD22 CAR。作为一种主要存在于成熟B细胞表面上的跨膜蛋白，CD22充当B细胞受体(BCR)信号传导的抑制性受体。CD22表达于60-70％的B细胞淋巴瘤和白血病(例如，B慢性淋巴细胞白血病、毛细胞白血病、急性淋巴细胞白血病(ALL)和伯基特氏淋巴瘤)中并且不存在于B细胞发育早期阶段中的细胞表面上或干细胞上。在一些实施方案中，CD22 CAR可包含串联的信号肽、特异性结合CD22的胞外结合域、铰链域、跨膜域、细胞内共刺激域和/或细胞内信号域。
在一些实施方案中，CD22 CAR的信号肽包含CD8α信号肽。在一些实施方案中，CD8α信号肽包含以下或由以下组成：SEQ ID NO：6列出的氨基酸序列或与SEQ ID NO：6列出的氨基酸序列至少80％同一(例如，至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一)的氨基酸序列。在一些实施方案中，信号肽包含IgK信号肽。在一些实施方案中，IgK信号肽包含以下或由以下组成：SEQ ID NO：7列出的氨基酸序列或与SEQ ID NO：7列出的氨基酸序列至少80％同一(例如，至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一)的氨基酸序列。在一些实施方案中，信号肽包含GMCSFR-α或CSF2RA信号肽。在一些实施方案中，GMCSFR-α或CSF2RA信号肽包含以下或由以下组成：SEQ ID NO：8列出的氨基酸序列或与SEQ ID NO：8列出的氨基酸序列至少80％同一(例如，至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一)的氨基酸序列。
在一些实施方案中，CD22 CAR的胞外结合域对于CD22，例如人类CD22具有特异性。CD22 CAR的胞外结合域可经密码子优化以便在宿主细胞中表达或具有变体序列以便增加胞外结合域的功能。在一些实施方案中，胞外结合域包含免疫球蛋白分子的免疫原性活性部分，例如，scFv。
在一些实施方案中，CD22 CAR的胞外结合域衍生自对于CD22具有特异性的抗体，包括例如SM03、奥英妥珠单抗(inotuzumab)、艾波妥珠单抗(epratuzumab)、莫西单抗(moxetumomab)和匹那珠单抗(moxetumomab)。在任何这些实施方案中，CD22 CAR的胞外结合域可包含以下或由以下组成：VH、VL和/或任何抗体的一个或多个CDR。
在一些实施方案中，CD22 CAR的胞外结合域包含衍生自m971单克隆抗体(m971)的scFv，其包含通过接头连接的m971的重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)。在一些实施方案中，接头为3xG4S接头。在其他实施方案中，可替代地使用Whitlow接头。在一些实施方案中，整个m971衍生scFv(也被称为m971 scFv)和其不同部分的氨基酸序列提供于下表14中。在一些实施方案中，CD22特异性scFv包含以下或由以下组成：SEQ ID NO：45、46或50列出的氨基酸序列，或与SEQ ID NO：45、46或50列出的氨基酸序列至少80％同一(例如，至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一)的氨基酸序列。在一些实施方案中，CD22特异性scFv可包含一个或多个具有SEQ ID NO：47-49和51-53列出的氨基酸序列的CDR。在一些实施方案中，CD22特异性scFv可包含一个或多个CDR具有SEQ ID NO：47-49列出的氨基酸序列的重链。在一些实施方案中，CD22特异性scFv可包含一个或多个CDR具有SEQ ID NO：51-53列出的氨基酸序列的轻链。在任何这些实施方案中，CD22特异性scFv可包含含有一个或多个氨基酸取代、或含有与鉴定的任何序列至少80％同一(例如，至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一)的序列的一个或多个CDR。在一些实施方案中，CD22 CAR的胞外结合域包含一个或多个如本文描述的CDR或由一个或多个如本文描述的CDR组成。
在一些实施方案中，CD22 CAR的胞外结合域包含衍生自m971-L7的scFv，与亲本抗体m971相比，所述m971-L7是具有显著改进的CD22结合亲和力的m971的亲和力成熟变体(改进约2nM至少于50pM)。在一些实施方案中，衍生自m971-L7的scFv包含通过3xG4S接头连接的m971-L7的VH和VL。在其他实施方案中，可替代地使用Whitlow接头。在一些实施方案中，整个m971-L7衍生scFv(也被称为m971-L7 scFv)和其不同部分的氨基酸序列提供于下表14中。在一些实施方案中，CD22特异性scFv包含以下或由以下组成：SEQ ID NO：54、55或59列出的氨基酸序列，或与SEQ ID NO：54、55或59列出的氨基酸序列至少80％同一(例如，至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一)的氨基酸序列。在一些实施方案中，CD22特异性scFv可包含一个或多个具有SEQ ID NO：56-58和60-62列出的氨基酸序列的CDR。在一些实施方案中，CD22特异性scFv可包含一个或多个CDR具有SEQ ID NO：56-58列出的氨基酸序列的重链。在一些实施方案中，CD22特异性scFv可包含一个或多个CDR具有SEQ ID NO：60-62列出的氨基酸序列的轻链。在任何这些实施方案中，CD22特异性scFv可包含含有一个或多个氨基酸取代、或含有与鉴定的任何序列至少80％同一(例如，至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一)的序列的一个或多个CDR。在一些实施方案中，CD22 CAR的胞外结合域包含一个或多个如本文描述的CDR或由一个或多个如本文描述的CDR组成。
表14.抗CD22 scFv和组分的示例性序列
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在一些实施方案中，CD22 CAR的胞外结合域包含免疫毒素HA22或BL22。免疫毒素BL22和HA22是包含融合至细菌毒素的对于CD22具有特异性的scFv的治疗剂，并且因此可结合至表达CD22的癌细胞的表面并且杀灭癌细胞。BL22包含融合至38-kDa截短形式的假单胞菌(Pseudomonas)外毒素A的抗CD22抗体RFB4的dsFv(Bang等人，Clin.Cancer Res.，11：1545-50(2005))。HA22(CAT8015，moxetumomab pasudotox)是突变的更高亲和力型式的BL22(Ho等人，J.Biol.Chem.，280(1)：607-17(2005))。对于CD22具有特异性的HA22和BL22的抗原结合域的合适序列公开于例如美国专利第7,541,034号；第7,355,012号；和第7,982,011号中，所述专利特此通过引用整体并入。
在一些实施方案中，CD22 CAR的铰链域包含CD8α铰链域，例如人类CD8α铰链域。在一些实施方案中，CD8α铰链域包含以下或由以下组成：SEQ ID NO：9列出的氨基酸序列或与SEQ ID NO：9列出的氨基酸序列至少80％同一(例如，至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一)的氨基酸序列。在一些实施方案中，铰链域包含CD28铰链域，例如人类CD28铰链域。在一些实施方案中，CD28铰链域包含以下或由以下组成：SEQ ID NO：10列出的氨基酸序列或与SEQ ID NO：10列出的氨基酸序列至少80％同一(例如，至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一)的氨基酸序列。在一些实施方案中，铰链域包含IgG4铰链域，例如人类IgG4铰链域。在一些实施方案中，IgG4铰链域包含以下或由以下组成：SEQ ID NO：11或SEQ ID NO：12列出的氨基酸序列，或与SEQ ID NO：11或SEQ ID NO：12列出的氨基酸序列至少80％同一(例如，至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一)的氨基酸序列。在一些实施方案中，铰链域包含IgG4铰链-Ch2-Ch3域，例如人类IgG4铰链-Ch2-Ch3域。在一些实施方案中，IgG4铰链-Ch2-Ch3域包含以下或由以下组成：SEQ ID NO：13列出的氨基酸序列或与SEQ ID NO：13列出的氨基酸序列至少80％同一(例如，至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一)的氨基酸序列。
在一些实施方案中，CD22 CAR的跨膜域包含CD8α跨膜域，例如人类CD8α跨膜域。在一些实施方案中，CD8α跨膜域包含以下或由以下组成：SEQ ID NO：14列出的氨基酸序列或与SEQ ID NO：14列出的氨基酸序列至少80％同一(例如，至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一)的氨基酸序列。在一些实施方案中，跨膜域包含CD28跨膜域，例如人类CD28跨膜域。在一些实施方案中，CD28跨膜域包含以下或由以下组成：SEQ ID NO：15列出的氨基酸序列或与SEQ ID NO：15列出的氨基酸序列至少80％同一(例如，至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一)的氨基酸序列。
在一些实施方案中，CD22 CAR的细胞内共刺激域包含4-1BB共刺激域，例如，人类4-1BB共刺激域。在一些实施方案中，4-1BB共刺激域包含以下或由以下组成：SEQ ID NO：16列出的氨基酸序列或与SEQ ID NO：16列出的氨基酸序列至少80％同一(例如，至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一)的氨基酸序列。在一些实施方案中，细胞内共刺激域包含CD28共刺激域，例如人类CD28共刺激域。在一些实施方案中，CD28共刺激域包含以下或由以下组成：SEQ ID NO：17列出的氨基酸序列或与SEQ ID NO：17列出的氨基酸序列至少80％同一(例如，至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一)的氨基酸序列。
在一些实施方案中，CD22 CAR的细胞内信号域包含CD3 zeta(ζ)信号域，例如人类CD3ζ信号域。在一些实施方案中，CD3ζ信号域包含以下或由以下组成：SEQ ID NO：18列出的氨基酸序列或与SEQ ID NO：18列出的氨基酸序列至少80％同一(例如，至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一)的氨基酸序列。
在一些实施方案中，CD22 CAR包含具有SEQ ID NO：45或SEQ ID NO：54列出的序列的CD22特异性scFv、SEQ ID NO：9的CD8α铰链域、SEQ ID NO：14的CD8α跨膜域、SEQ ID NO：16的4-1BB共刺激域、SEQ ID NO：18的CD3ζ信号域和/或其变体(即，具有与所公开序列至少80％同一，例如，至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99同一的序列)。
在一些实施方案中，CD22 CAR包含具有SEQ ID NO：45或SEQ ID NO：54列出的序列的CD22特异性scFv、SEQ ID NO：10的CD28铰链域、SEQ ID NO：14的CD8α跨膜域、SEQ ID NO：16的4-1BB共刺激域、SEQ ID NO：18的CD3ζ信号域和/或其变体(即，具有与所公开序列至少80％同一，例如，至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99同一的序列)。
在一些实施方案中，CD22 CAR包含具有SEQ ID NO：45或SEQ ID NO：54列出的序列的CD22特异性scFv、SEQ ID NO：11或SEQ ID NO：12的IgG4铰链域、SEQ ID NO：14的CD8α跨膜域、SEQ ID NO：16的4-1BB共刺激域、SEQ ID NO：18的CD3ζ信号域和/或其变体(即，具有与所公开序列至少80％同一，例如，至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99同一的序列)。
在一些实施方案中，CD22 CAR包含具有SEQ ID NO：45或SEQ ID NO：54列出的序列的CD22特异性scFv、SEQ ID NO：9的CD8α铰链域、SEQ ID NO：15的CD28跨膜域、SEQ ID NO：16的4-1BB共刺激域、SEQ ID NO：18的CD3ζ信号域和/或其变体(即，具有与所公开序列至少80％同一，例如，至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99同一的序列)。
在一些实施方案中，CD22 CAR包含具有SEQ ID NO：45或SEQ ID NO：54列出的序列的CD22特异性scFv、SEQ ID NO：10的CD28铰链域、SEQ ID NO：15的CD28跨膜域、SEQ ID NO：16的4-1BB共刺激域、SEQ ID NO：18的CD3ζ信号域和/或其变体(即，具有与所公开序列至少80％同一，例如，至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99同一的序列)。
在一些实施方案中，CD22 CAR包含具有SEQ ID NO：45或SEQ ID NO：54列出的序列的CD22特异性scFv、SEQ ID NO：11或SEQ ID NO：12的IgG4铰链域、SEQ ID NO：15的CD28跨膜域、SEQ ID NO：16的4-1BB共刺激域、SEQ ID NO：18的CD3ζ信号域和/或其变体(即，具有与所公开序列至少80％同一，例如，至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99同一的序列)。
BCMA CAR
在一些实施方案中，CAR为BCMACAR。BCMA是表达于B细胞谱系的细胞上的肿瘤坏死家族受体(TNFR)成员，其中在终末分化B细胞或成熟B淋巴细胞上的表达最高。BCMA涉及介导浆细胞的存活以便保持长期体液免疫。BCMA的表达最近与许多癌症相关，例如多发性骨髓瘤、霍奇金淋巴瘤和非霍奇金淋巴瘤、各种白血病、和胶质母细胞瘤。在一些实施方案中，BCMACAR可包含串联的信号肽、特异性结合BCMA的胞外结合域、铰链域、跨膜域、细胞内共刺激域、和/或细胞内信号域。
在一些实施方案中，BCMACAR的信号肽包含CD8α信号肽。在一些实施方案中，CD8α信号肽包含以下或由以下组成：SEQ ID NO：6列出的氨基酸序列或与SEQ ID NO：6列出的氨基酸序列至少80％同一(例如，至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一)的氨基酸序列。在一些实施方案中，信号肽包含IgK信号肽。在一些实施方案中，IgK信号肽包含以下或由以下组成：SEQ ID NO：7列出的氨基酸序列或与SEQ ID NO：7列出的氨基酸序列至少80％同一(例如，至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一)的氨基酸序列。在一些实施方案中，信号肽包含GMCSFR-α或CSF2RA信号肽。在一些实施方案中，GMCSFR-α或CSF2RA信号肽包含以下或由以下组成：SEQ ID NO：8列出的氨基酸序列或与SEQ ID NO：8列出的氨基酸序列至少80％同一(例如，至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一)的氨基酸序列。
在一些实施方案中，BCMA CAR的胞外结合域对于BCMA，例如人类BCMA具有特异性。BCMA CAR的胞外结合域可经密码子优化以便在宿主细胞中表达或具有变体序列以便增加胞外结合域的功能。
在一些实施方案中，胞外结合域包含免疫球蛋白分子的免疫原性活性部分，例如，scFv。在一些实施方案中，BCMA CAR的胞外结合域衍生自对于BCMA具有特异性的抗体，包括例如贝兰他单抗(belantamab)、厄拉那单抗(erlanatamab)、替尼单抗(teclistamab)、LCAR-B38M和西他他因(ciltacabtagene)。在任何这些实施方案中，BCMA CAR的胞外结合域可包含以下或由以下组成：VH、VL和/或任何抗体的一个或多个CDR。
在一些实施方案中，BCMA CAR的胞外结合域包含衍生自C11D5.3的scFv，C11D5.3是一种如Carpenter等人，C1in.Cancer Res.19(8)：2048-2060(2013)所描述的鼠科单克隆抗体。还参见PCT申请公开第WO2010/104949号。C11D5.3衍生scFv可包含通过Whitlow接头连接的C11D5.3的重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)，所述scFv的氨基酸序列提供于下表15中。在一些实施方案中，BCMA特异性胞外结合域包含以下或由以下组成：SEQ ID NO：63、64或68列出的氨基酸序列，或与SEQ ID NO：63、64或68列出的氨基酸序列至少80％同一(例如，至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一)的氨基酸序列。在一些实施方案中，BCMA特异性胞外结合域可包含一个或多个具有SEQ ID NO：65-67和69-71列出的氨基酸序列的CDR。在一些实施方案中，BCMA特异性胞外结合域可包含一个或多个CDR具有SEQ ID NO：65-67列出的氨基酸序列的轻链。在一些实施方案中，BCMA特异性胞外结合域可包含一个或多个CDR具有SEQ ID NO：69-71列出的氨基酸序列的重链。在任何这些实施方案中，BCMA特异性scFv可包含含有一个或多个氨基酸取代、或含有与鉴定的任何序列至少80％同一(例如，至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一)的序列的一个或多个CDR。在一些实施方案中，BCMA CAR的胞外结合域包含一个或多个如本文描述的CDR或由一个或多个如本文描述的CDR组成。
在一些实施方案中，BCMA CAR的胞外结合域包含衍生自另一种鼠科单克隆抗体C12A3.2的scFv，如Carpenter等人，Clin.Cancer Res.19(8)：2048-2060(2013)和PCT申请公开第WO2010/104949号所描述，所述scFv的氨基酸序列也提供于下表15中。在一些实施方案中，BCMA特异性胞外结合域包含以下或由以下组成：SEQ ID NO：72、73或77列出的氨基酸序列，或与SEQ ID NO：72、73或77列出的氨基酸序列至少80％同一(例如，至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一)的氨基酸序列。在一些实施方案中，BCMA特异性胞外结合域可包含一个或多个具有SEQ ID NO：74-76和78-80列出的氨基酸序列的CDR。在一些实施方案中，BCMA特异性胞外结合域可包含一个或多个CDR具有SEQ ID NO：74-76列出的氨基酸序列的轻链。在一些实施方案中，BCMA特异性胞外结合域可包含一个或多个CDR具有SEQ ID NO：78-80列出的氨基酸序列的重链。在任何这些实施方案中，BCMA特异性scFv可包含含有一个或多个氨基酸取代、或含有与鉴定的任何序列至少80％同一(例如，至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一)的序列的一个或多个CDR。在一些实施方案中，BCMACAR的胞外结合域包含一个或多个如本文描述的CDR或由一个或多个如本文描述的CDR组成。
在一些实施方案中，BCMA CAR的胞外结合域包含Friedman等人，Hum.GeneTher.29(5)：585-601(2018))中的被称为BB2121的对于人类BCMA具有较高特异性的鼠科单克隆抗体。还参见PCT申请公开第WO2012163805号。
在一些实施方案中，BCMA CAR的胞外结合域包含如Zhao等人，J.Hematol.Oncol.11(1)：141(2018)所描述的可结合至BCMA的两个表位的两个重链(VHH)的单一可变片段，也被称为LCAR-B38M。还参见PCT申请公开第WO2018/028647号。
在一些实施方案中，BCMA CAR的胞外结合域包含如Lam等人，Nat.Commun.11(1)：283(2020)所描述的完全人类重链可变域(FHVH)，也被称为FHVH33。还参见PCT申请公开第WO2019/006072号。FHVH33和其CDR的氨基酸序列提供于下表15中。在一些实施方案中，BCMA特异性胞外结合域包含以下或由以下组成：SEQ ID NO：81列出的氨基酸序列或与SEQ IDNO：81列出的氨基酸序列至少80％同一(例如，至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一)的氨基酸序列。在一些实施方案中，BCMA特异性胞外结合域可包含一个或多个具有SEQ ID NO：82-84列出的氨基酸序列的CDR。在任何这些实施方案中，BCMA特异性胞外结合域可包含含有一个或多个氨基酸取代、或含有与鉴定的任何序列至少80％同一(例如，至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一)的序列的一个或多个CDR。在一些实施方案中，BCMA CAR的胞外结合域包含一个或多个如本文描述的CDR或由一个或多个如本文描述的CDR组成。
在一些实施方案中，BCMA CAR的胞外结合域包含如美国专利第11，026，975B2号所描述的衍生自CT103A(或CAR0085)的scFv，所述scFv的氨基酸序列提供于下表15中。在一些实施方案中，BCMA特异性胞外结合域包含以下或由以下组成：SEQ ID NO：118、119或123列出的氨基酸序列，或与SEQ ID NO：118、119或123列出的氨基酸序列至少80％同一(例如，至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一)的氨基酸序列。在一些实施方案中，BCMA特异性胞外结合域可包含一个或多个具有SEQ ID NO：120-122和124-126列出的氨基酸序列的CDR。在一些实施方案中，BCMA特异性胞外结合域可包含一个或多个CDR具有SEQ ID NO：120-122列出的氨基酸序列的轻链。在一些实施方案中，BCMA特异性胞外结合域可包含一个或多个CDR具有SEQ ID NO：124-126列出的氨基酸序列的重链。在任何这些实施方案中，BCMA特异性scFv可包含含有一个或多个氨基酸取代、或含有与鉴定的任何序列至少80％同一(例如，至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一)的序列的一个或多个CDR。在一些实施方案中，BCMA CAR的胞外结合域包含一个或多个如本文描述的CDR或由一个或多个如本文描述的CDR组成。
另外，针对BCMA的CAR和结合剂描述于美国申请公开第2020/0246381 A1号和第2020/0339699 A1号中，所述公开中的每一者的整个内容通过引用并入本文。
表15.抗BCMA结合剂和组分的示例性序列
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在一些实施方案中，BCMA CAR的铰链域包含CD8α铰链域，例如人类CD8α铰链域。在一些实施方案中，CD8α铰链域包含以下或由以下组成：SEQ ID NO：9列出的氨基酸序列或与SEQ ID NO：9列出的氨基酸序列至少80％同一(例如，至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一)的氨基酸序列。在一些实施方案中，铰链域包含CD28铰链域，例如人类CD28铰链域。在一些实施方案中，CD28铰链域包含以下或由以下组成：SEQ ID NO：10列出的氨基酸序列或与SEQ ID NO：10列出的氨基酸序列至少80％同一(例如，至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一)的氨基酸序列。在一些实施方案中，铰链域包含IgG4铰链域，例如人类IgG4铰链域。在一些实施方案中，IgG4铰链域包含以下或由以下组成：SEQ ID NO：11或SEQ ID NO：12列出的氨基酸序列，或与SEQ ID NO：11或SEQ ID NO：12列出的氨基酸序列至少80％同一(例如，至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一)的氨基酸序列。在一些实施方案中，铰链域包含IgG4铰链-Ch2-Ch3域，例如人类IgG4铰链-Ch2-Ch3域。在一些实施方案中，IgG4铰链-Ch2-Ch3域包含以下或由以下组成：SEQ ID NO：13列出的氨基酸序列或与SEQ ID NO：13列出的氨基酸序列至少80％同一(例如，至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一)的氨基酸序列。
在一些实施方案中，BCMACAR的跨膜域包含CD8α跨膜域，例如人类CD8α跨膜域。在一些实施方案中，CD8α跨膜域包含以下或由以下组成：SEQ ID NO：14列出的氨基酸序列或与SEQ ID NO：14列出的氨基酸序列至少80％同一(例如，至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一)的氨基酸序列。在一些实施方案中，跨膜域包含CD28跨膜域，例如人类CD28跨膜域。在一些实施方案中，CD28跨膜域包含以下或由以下组成：SEQ ID NO：15列出的氨基酸序列或与SEQ ID NO：15列出的氨基酸序列至少80％同一(例如，至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一)的氨基酸序列。
在一些实施方案中，BCMA CAR的细胞内共刺激域包含4-1BB共刺激域，例如，人类4-1BB共刺激域。在一些实施方案中，4-1BB共刺激域包含以下或由以下组成：SEQ ID NO：16列出的氨基酸序列或与SEQ ID NO：16列出的氨基酸序列至少80％同一(例如，至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一)的氨基酸序列。在一些实施方案中，细胞内共刺激域包含CD28共刺激域，例如人类CD28共刺激域。在一些实施方案中，CD28共刺激域包含以下或由以下组成：SEQ ID NO：17列出的氨基酸序列或与SEQ ID NO：17列出的氨基酸序列至少80％同一(例如，至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一)的氨基酸序列。
在一些实施方案中，BCMA CAR的细胞内信号域包含CD3 zeta(ζ)信号域，例如人类CD3ζ信号域。在一些实施方案中，CD3ζ信号域包含以下或由以下组成：SEQ ID NO：18列出的氨基酸序列或与SEQ ID NO：18列出的氨基酸序列至少80％同一(例如，至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一)的氨基酸序列。
在一些实施方案中，BCMA CAR包含如所描述的任何BCMA特异性胞外结合域、SEQID NO：9的CD8α铰链域、SEQ ID NO：14的CD8α跨膜域、SEQ ID NO：16的4-1BB共刺激域、SEQID NO：18的CD3ζ信号域和/或其变体(即，具有与所公开序列至少80％同一，例如，至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99同一的序列)。在任何这些实施方案中，BCMA CAR可另外包含如所描述的信号肽(例如，CD8α信号肽)。
在一些实施方案中，BCMA CAR包含如所描述的任何BCMA特异性胞外结合域、SEQID NO：9的CD8α铰链域、SEQ ID NO：14的CD8α跨膜域、SEQ ID NO：17的CD28共刺激域、SEQID NO：18的CD3ζ信号域和/或其变体(即，具有与所公开序列至少80％同一，例如，至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99同一的序列)。在任何这些实施方案中，BCMA CAR可另外包含如所描述的信号肽。
在一些实施方案中，BCMA CAR通过SEQ ID NO：127列出的核苷酸序列或与SEQ IDNO：127列出的核苷酸序列至少80％同一(例如，至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一)的核苷酸序列来编码(参见表16)。所编码的BCMA CAR具有SEQ ID NO：128列出的对应氨基酸序列或与SEQ ID NO：128列出的氨基酸序列至少80％同一(例如，至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一)，具有以下组分：CD8α信号肽、CT 103A scFv(VL-Whitlow接头-VH)、CD8α铰链域、CD8α跨膜域、4-1BB共刺激域和CD3ζ信号域。
在一些实施方案中，BCMACAR是商购实施方案的BCMA CAR，包括例如idecabtagenevicleucel(ide-cel，也被称为bb2121)。Idecabtagene vicleucel包含具有以下组分的BCMA CAR：BB2121结合剂、CD8α铰链域、CD8α跨膜域、4-1BB共刺激域和CD3ζ信号域。
表16.BCMA CAR的示例性序列
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在一些实施方案中，原代T细胞或原代T细胞的池经工程化以便与未修饰原代T细胞相比，展现内源性T细胞受体的减少的表达。在某些实施方案中，原代T细胞或原代T细胞的池经工程化以便如与未修饰原代T细胞相比，展现CTLA4、PD1、或CTLA4和PD1两者的减少的表达。遗传修饰细胞(包括T细胞)的方法详细描述于例如WO2016183041中，公开内容通过引用整体并入本文，包括表格、附录、序列表和附图。
在一些实施方案中，在本文所述工程化细胞施用于接受者受试者或患者之后，细胞在接受者体内经历不适当的扩增或增殖；存在于接受者身体中的不适当位置；或经历恶性转化。在某些实施方案中，此类工程化细胞在接受者中诱导细胞因子释放综合征、诱导神经中毒性；或诱导毒性如中靶偏离肿瘤毒性。并且此后，向接受者受试者施用阻断、中和、失活、干扰CD47和SIRPα结合、信号传导、活性和功能的因子。
不希望受理论束缚，据认为工程化细胞的修饰使其“隐藏”以逃避负责清除感染、恶性或非自身细胞的接受者免疫系统的效应细胞。“隐藏”细胞以逃避免疫系统允许特定细胞，例如同种异体细胞在身体中的存在和持久性。在一些情况下，本文所述工程化细胞可能在接受者中不再为治疗上有效的或者可诱导非所需不良效应。不良事件的非限制性实例包括异常增生、转化、肿瘤形成、细胞因子释放综合征、GVHD、免疫效应细胞相关神经中毒性综合征(ICANS)、炎症、感染、恶心、呕吐、出血、间质性肺炎、呼吸道疾病、黄疸、体重损失、腹泻、食欲不振、抽筋、腹部疼痛、肝静脉闭塞疾病(VOD)、移植失败、器官损伤、不育、激素变化、异常生长形成、白内障和移植后淋巴增殖病症(PTLD)等。因此，控制工程化细胞在接受者身体中的存在的能力对于安全是至关紧要的。因此，“揭露”细胞起安全开关的作用并且可通过阻断或中和免疫抑制因子如CD47的功能来实现。
在一些实施方案中，在使细胞与CD47-SIRPα阻断剂接触后，细胞通过接受者的免疫系统识别。在一些实施方案中，工程化细胞表达免疫抑制因子CD47以使得所述细胞为低免疫原性的或者具有减少的免疫原性直到一种或多种CD47-SIRPα阻断剂施用于接受者为止。在CD47-SIRPα阻断剂存在下，细胞经揭露并且通过免疫细胞识别以便定为细胞死亡或清除的目标。
1.修饰MHC I类和/或MHC II类复合物的表达
本文提供了细胞，所述细胞包含外源CD47蛋白和调控MHC I人类白细胞抗原和/或MHC II人类白细胞抗原的表达的一个或多个靶向多核苷酸序列的修饰。在一些实施方案中，MHC I人类白细胞抗原或MHC II人类白细胞抗原的表达得以调节。在一些实施方案中，MHC I人类白细胞抗原和MHC II人类白细胞抗原的表达得以调节。在一些实施方案中，细胞经遗传修饰以便使MHC I类复合物的表达减少或失效、使MHC II类复合物的表达减少或失效、防止通过接受者受试者的CD8 T细胞的直接识别和/或逃避通过接受者受试者的NK细胞识别。在一些实施方案中，细胞展现减少的免疫原性。遗传修饰细胞的详细说明发现于例如WO2016183041中，公开内容整体并入本文，包括序列表、表格和附图。
在一些实施方案中，工程化细胞包含调控MHC I蛋白和MHC II蛋白的表达的一个或多个靶向多核苷酸序列的基因组修饰。在某些实施方案中，细胞包含调控MHC I蛋白或MHC II蛋白的表达的一个或多个靶向多核苷酸序列的基因组修饰。在一些方面，遗传编辑系统用于修饰一个或多个靶向多核苷酸序列。在一些实施方案中，靶向多核苷酸序列是选自包括B2M、CIITA和NLRC5的组中的一者或多者。在某些实施方案中，细胞的基因组经改变以使HLA表达的关键组分减少或缺失。在一些实施方案中，遗传修饰包含失活突变(例如，缺失、添加或取代)。
在一些实施方案中，工程化细胞包含选自来自包括以下各者的组的一者或多者的基因中的遗传修饰：B2M、CIITA、NLRC5、B7-1、B7-2、B7-H3、CD27、CD28、CD47、GITR、HLA-A、HLA-B、HLA-C、HLA-E、HLA-F、HLA-G、IRF1、NFY-A、NFY-B、PD-L1、PD-L2、NFY-C、OX40、RFX5、RFX-ANK、RFX-AP、TAP1、HVEM、SLAM、LFA-1、ST2、CD2、CD30、CD58、CD74、CD160、CD226、CD244、4-1BB、BTLA、ICOS、LAG3、HELIOS、TIGIT、TIM3、TLT、VISTA和NKG2D的配体。在一些实施方案中，NKG2D的配体选自包括以下各者的组中的一者或多者：MICA、MICB、Raetl e、Raetl g、Raetl I、Ulbpl、Ulbp2和Ulbp3。
在一些方面，本公开提供了包含基因组的细胞或其群体，其中基因经编辑以便使基因组DNA的连续链段缺失，由此减少或消除细胞或其群体中的MHC I类分子的表面表达。在某些方面，本公开提供了包含基因组的细胞或其群体，其中基因经编辑以便使基因组DNA的连续链段缺失，由此减少或消除细胞或其群体中的MHC II类分子的表面表达。在特定方面，本公开提供了包含基因组的细胞或其群体，其中一个或多个基因经编辑以便使基因组DNA的连续链段缺失，由此减少或消除细胞或其群体中的MHC I类和/或MHC II类分子的表面表达。
在某些实施方案中，MHC I或MHC II分子的表达通过靶向和缺失基因组DNA的连续链段来调节，由此减少或消除选自包括但不限于B2M、CIITA和NLRC5的组的靶基因的表达。
在一些实施方案中，本文描述的细胞和方法包括基因组学编辑人类细胞以便裂解CIITA基因序列以及编辑此类细胞的基因组以便改变一个或多个额外靶多核苷酸序列例如但不限于B2M和NLRC5。在一些实施方案中，本文描述的细胞和方法包括基因组学编辑人类细胞以便裂解B2M基因序列以及编辑此类细胞的基因组以便改变一个或多个额外靶多核苷酸序列例如但不限于CIITA和NLRC5。在一些实施方案中，本文描述的细胞和方法包括基因组学编辑人类细胞以便裂解NLRC5基因序列以及编辑此类细胞的基因组以便改变一个或多个额外靶多核苷酸序列例如但不限于B2M和CIITA。
i.CIITA
在一些方面，本文公开的本技术通过靶向和调节(例如，减少、降低或消除)II类反式活化因子(CIITA)表达来调节(例如，减少、降低或消除)MHC II基因的表达。在一些方面，调节使用CRISPR/Cas系统来发生。CIITA是LR或核苷酸结合域(NBD)富含亮氨酸重复序列(LRR)蛋白家族的成员并且通过与MHC增强体关联来调控MHC II的转录。
在一些实施方案中，本文所述靶多核苷酸序列是CIITA的变体。在一些实施方案中，靶多核苷酸序列是CIITA的同源物。在一些实施方案中，靶多核苷酸序列是CIITA的异种同源物。
在一些方面，减少或消除CIITA的表达减少或消除以下MHC II分子中的一者或多者的表达：HLA-DP、HLA-DM、HLA-DOA、HLA-DOB、HLA-DQ和HLA-DR。
在一些实施方案中，本文概述的低免疫原性细胞包含靶向CIITA基因的遗传修饰。在一些实施方案中，通过稀少切割核酸内切酶来靶向CIITA基因的遗传修饰包含Cas蛋白或编码Cas蛋白的多核苷酸和至少一个特异性靶向CIITA基因的引导核糖核酸序列。在一些实施方案中，至少一个用于特异性靶向CIITA基因的引导核糖核酸序列选自包括WO2016/183041的表12的SEQ ID NO：5184-36352的组。在一些实施方案中，细胞具有诱导接受者受试者中的免疫反应的减少的能力。
测试是否CIITA基因失活的测定法是已知的并且在本文中描述。在一个实施方案中，通过PCR导致的CIITA基因的遗传修饰和HLA-II表达的减少可通过FACS分析来测定。在另一个实施方案中，CIITA蛋白表达是使用以CIITA蛋白的抗体来探测的细胞裂解物的蛋白质印迹法(Western blot)来检测。在另一个实施方案中，反转录酶聚合酶链反应(RT-PCR)用于确认失活遗传修饰的存在。
ii.B2M
在某些实施方案中，所描述的本公开方法通过靶向和调节(例如，减少、降低或消除)附属链B2M的表达来调节(例如，减少、降低或消除)MHC-I基因的表达。在一些方面，调节使用CRISPR/Cas系统来发生。通过调节(例如，减少、降低或缺失)B2M的表达，MHC-I分子的表面转运得以阻断并且细胞呈现低免疫原性。在一些实施方案中，细胞具有诱导接受者受试者中的免疫反应的减少的能力。
在一些实施方案中，本文所公开的靶多核苷酸序列是B2M的变体。在一些实施方案中，靶多核苷酸序列是B2M的同源物。在一些实施方案中，靶多核苷酸序列是B2M的异种同源物。
在一些方面，降低或消除B2M的表达减少或消除以下MHC I分子中的一者或多者的表达：HLA-A、HLA-B和HLA-C。
在一些实施方案中，本文概述的低免疫原性细胞包含靶向B2M基因的遗传修饰。在一些实施方案中，通过稀少切割核酸内切酶来靶向B2M基因的遗传修饰包含Cas蛋白或编码Cas蛋白的多核苷酸、和至少一个特异性靶向B2M基因的引导核糖核酸序列。在一些实施方案中，至少一个用于特异性靶向B2M基因的引导核糖核酸序列选自包括WO2016/183041的表15的SEQ ID NO：81240-85644的组。
测试是否B2M基因失活的测定法是已知的并且在本文中描述。在一个实施方案中，通过PCR导致的B2M基因的遗传修饰和HLA-II表达的减少可通过FACS分析来测定。在另一个实施方案中，B2M蛋白表达使用以B2M蛋白的抗体来探测的细胞裂解物的蛋白质印迹法来检测。在另一个实施方案中，反转录酶聚合酶链反应(RT-PCR)用于确认失活遗传修饰的存在。
iii.NLRC5
在某些方面，本文公开的方法通过靶向和调节(例如，减少、降低或消除)含有5/NOD27/CLR16.1的NLR家族，CARD域(NLRC5)的表达来调节(例如，减少、降低或消除)MHC-I基因的表达。在一些方面，调节使用CRISPR/Cas系统来发生。NLRC5是MHC-I介导免疫反应的关键调控因子并且类似于CIITA，NLRC5是可通过IFN-γ来高度诱导的并且可转运至细胞核中。NLRC5活化MHC-I基因的启动子并且诱导MHC-I以及涉及MHC-I抗原呈递的相关基因的转录。
在一些实施方案中，本文所述靶多核苷酸序列是NLRC5的变体。在一些实施方案中，靶多核苷酸序列是NLRC5的同源物。在一些实施方案中，靶多核苷酸序列是NLRC5的异种同源物。
在一些方面，降低或消除NLRC5的表达减少或消除以下MHC I分子中的一者或多者的表达：HLA-A、HLA-B和HLA-C。
在一些实施方案中，本文概述的低免疫原性细胞包含靶向NLRC5基因的遗传修饰。在一些实施方案中，通过稀少切割核酸内切酶来靶向NLRC5基因的遗传修饰包含Cas蛋白或编码Cas蛋白的多核苷酸、和至少一个特异性靶向NLRC5基因的引导核糖核酸序列。在一些实施方案中，至少一个用于特异性靶向NLRC5基因的引导核糖核酸序列选自包括WO2016/183041的表14的SEQ ID NO：36353-81239的组。在一些实施方案中，细胞具有诱导接受者受试者中的免疫反应的减少的能力。
测试是否NLRC5基因失活的测定法是已知的并且在本文中描述。在一个实施方案中，通过PCR导致的NLRC5基因的遗传修饰和HLA-I表达的减少可通过FACS分析来测定。在另一个实施方案中，NLRC5蛋白表达使用以NLRC5蛋白的抗体来探测的细胞裂解物的蛋白质印迹法来检测。在另一个实施方案中，反转录酶聚合酶链反应(RT-PCR)用于确认失活遗传修饰的存在。
在一些实施方案中，所描述细胞包括调节表达选自包括以下各者的组的一者的修饰：CD24、CD27、CD200、HLA-C、HLA-E、HLA-E重链、HLA-G、PD-L1、IDO1、CTLA4-Ig、C1-抑制剂、IL-10、IL-35、FASL、Serpinb9、CCL21和Mfge8。在某些情况下，细胞过表达一个或多个选自包括以下各者的组的基因或蛋白：CD24、CD27、CD200、HLA-C、HLA-E、HLA-E重链、HLA-G、PD-L1、IDO1、CTLA4-Ig、C1-抑制剂、IL-10、IL-35、FASL、Serpinb9、CCL21和Mfge8。在某些情况下，细胞经修饰以便展现一个或多个选自包括以下各者的组的基因或蛋白质的减少的表达：CD24、CD27、CD200、HLA-C、HLA-E、HLA-E重链、HLA-G、PD-L1、IDO1、CTLA4-Ig、C1-抑制剂、IL-10、IL-35、FASL、Serpinb9、CCL21和Mfge8。
在一些实施方案中，所描述细胞包含外源表达的CD47多肽和减少表达的MHC I类分子。在一些实施方案中，所描述细胞包含外源表达的CD47多肽和减少表达的MHC II类分子。在一些实施方案中，所描述细胞包含外源表达的CD47多肽和减少表达的MHC I类和MHCI类分子。
在一些实施方案中，所描述细胞包含外源表达的CD47多肽和减少表达的B2M。在某些实施方案中，所描述细胞包含外源表达的CD47多肽和减少表达的CIITA。在其他实施方案中，所描述细胞包含外源表达的CD47多肽和减少表达的B2M和CIITA。
在一些实施方案中，所描述细胞包含外源表达的CD47多肽和一种或多种选自包括以下各者的组的额外外源表达多肽：CD24、CD46、CD55、CD59、CD200、PD-L1、IDO1、HLA-G、FasL、CCL21、Mfge8、Serpin B9和其任何组合。在一些实施方案中，所描述细胞包含外源表达的CD47多肽；一种或多种选自包括以下各者的组的额外外源表达多肽：CD24、CD46、CD55、CD59、CD200、PD-L1、IDO1、HLA-G、FasL、CCL21、Mfge8、Serpin B9和其任何组合；以及减少表达的MHC I类分子。在一些实施方案中，所描述细胞包含外源表达的CD47多肽；一种或多种选自包括以下各者的组的额外外源表达多肽：CD24、CD46、CD55、CD59、CD200、PD-L1、IDO1、HLA-G、FasL、CCL21、Mfge8、Serpin B9和其任何组合；以及减少表达的MHC II类分子。在一些实施方案中，所描述细胞包含外源表达的CD47多肽；一种或多种选自包括以下各者的组的额外外源表达多肽：CD24、CD46、CD55、CD59、CD200、PD-L1、IDO1、HLA-G、FasL、CCL21、Mfge8、Serpin B9和其任何组合；以及减少表达的MHC I类和MHC II类分子。
在一些实施方案中，所描述细胞包含外源表达的CD47多肽；一种或多种选自包括以下各者的组的额外外源表达多肽：CD24、CD46、CD55、CD59、CD200、PD-L1、IDO1、HLA-G、FasL、CCL21、Mfge8、Serpin B9和其任何组合；以及减少表达的B2M。在一些实施方案中，所描述细胞包含外源表达的CD47多肽；一种或多种选自包括以下各者的组的额外外源表达多肽：CD24、CD46、CD55、CD59、CD200、PD-L1、IDO1、HLA-G、FasL、CCL21、Mfge8、Serpin B9和其任何组合；以及减少表达的CIITA。在一些实施方案中，所描述细胞包含外源表达的CD47多肽；一种或多种选自包括以下各者的组的额外外源表达多肽：CD24、CD46、CD55、CD59、CD200、PD-L1、IDO1、HLA-G、FasL、CCL21、Mfge8、Serpin B9和其任何组合；以及减少表达的NLRC5。在一些实施方案中，所描述细胞包含外源表达的CD47多肽；一种或多种选自包括以下各者的组的额外外源表达多肽：CD24、CD46、CD55、CD59、CD200、PD-L1、IDO1、HLA-G、FasL、CCL21、Mfge8、Serpin B9和其任何组合；以及减少表达的包括以下各者的组中的任一者：(a)B2M和CIITA；(b)B2M和NLRC5；(c)CIITA和NLRC5；以及(d)B2M、CIITA和NLRC5。
2.修饰TCR复合物的表达
本文提供了细胞，所述细胞包含外源CD47蛋白和调控TCR复合物的表达的一个或多个靶向多核苷酸序列的修饰。在一些实施方案中，TCRα蛋白或TCRβ蛋白的表达得以调节。在一些实施方案中，TCRα蛋白和TCRβ蛋白的表达得以调节。在一些实施方案中，细胞经遗传修饰以便使一个或多个TCR复合物的表达减少或失效、使TCRα的表达减少或失效、使TCRβ的表达减少或失效和/或减少免疫原性。遗传修饰细胞的详细说明发现于例如WO2016183041中，所述文献的公开内容整体并入本文，包括序列表、表格和附图。
在一些实施方案中，工程化细胞包含调控TCRα蛋白和TCRβ蛋白的表达的一个或多个靶向多核苷酸序列的基因组修饰。在某些实施方案中，细胞包含调控TCRα蛋白或TCRβ蛋白的表达的一个或多个靶向多核苷酸序列的基因组修饰。在一些方面，遗传编辑系统用于修饰一个或多个靶向多核苷酸序列。在一些实施方案中，靶向多核苷酸序列是选自包括TRAC和TRB的组中的一者或多者。在某些实施方案中，细胞的基因组经改变以便使TCR表达的关键组分减少或缺失以使得一个或多个TCR复合物的表面表达得以改变。在一些实施方案中，遗传修饰包含失活突变(例如，缺失、添加或取代)。
i.TRAC
在某些实施方案中，本文公开的技术通过靶向和调节(例如，减少或消除)T细胞受体α链的恒定区的表达来调节(例如，减少或消除)TCR基因，包括TRAC基因的表达。在一些方面，调节使用CRISPR/Cas系统来发生。在根据本文公开的技术来调节的细胞中，通过调节(例如，减少或缺失)TRAC的表达，TCR分子的表面转运得以阻断。在一些实施方案中，其基因组经工程化以调节TCR基因(包括TRAC基因)的表达的细胞也具有诱导接受者受试者中的免疫反应的减少的能力。在一些实施方案中，在TRAC基因表达经调节的细胞中，一个或多个TCR复合物的表达得以改变。
在一些实施方案中，本文所述靶多核苷酸序列是TRAC的变体。在一些实施方案中，靶多核苷酸序列是TRAC的同源物。在一些实施方案中，靶多核苷酸序列是TRAC的异种同源物。
在一些方面，减少或消除TRAC的表达减少或消除TCR表面表达。因此，与未修饰细胞中的表达相比，一个或多个TCR复合物的表达降低。
在一些实施方案中，本文所述细胞包含编码TRAC蛋白的基因座位处的基因修饰。换言之，细胞包含TRAC基因座处的遗传修饰。在一些情况下，编码TRAC蛋白的核苷酸序列在Genbank No.X02592.1中列出。在一些情况下，TRAC基因座位在RefSeq.No.NG_001332.3和NCBI基因ID No.28755中描述。在某些情况下，TRAC的氨基酸序列描述为UniprotNo.P01848。TRAC蛋白和基因座位的额外描述可发现于UniprotNo.P01848、HGNCRef.No.12029和OMIM Ref.No.186880中。
在一些实施方案中，本文概述的低免疫原性细胞包含靶向TRAC基因的遗传修饰。在一些实施方案中，通过稀少切割核酸内切酶来靶向TRAC基因的遗传修饰包含Cas蛋白或编码Cas蛋白的多核苷酸、和至少一个特异性靶向TRAC基因的引导核糖核酸序列。在一些实施方案中，至少一个用于特异性靶向TRAC基因的引导核糖核酸序列选自由US20160348073的SEQ ID NO：532-609和9102-9797组成的组，所述文献通过引用并入本文。
测试是否TRAC基因失活的测定法是已知的并且在本文中描述。在一个实施方案中，通过PCR导致的TRAC基因的遗传修饰和HLA-II表达的减少可通过FACS分析来测定。在另一个实施方案中，TCRα蛋白表达使用以TCRα蛋白的抗体来探测的细胞裂解物的蛋白质印迹法来检测。在另一个实施方案中，反转录酶聚合酶链反应(RT-PCR)用于确认失活遗传修饰的存在。
ii.TRB
在某些实施方案中，本文公开技术通过靶向和调节(例如，减少或消除)T细胞受体β链的恒定区的表达来调节(例如，减少或消除)TCR基因的表达，包括编码T细胞抗原受体，β链(例如，TRB或TCRB基因)的基因。在一些方面，调节使用CRISPR/Cas系统来发生。在根据本文公开的技术来调节的细胞中，通过调节(例如，减少或缺失)TRB的表达，TCR分子的表面转运得以阻断。在一些实施方案中，其基因组经工程化以调节TCR基因(包括TRB基因)的表达的细胞也具有诱导接受者受试者中的免疫反应的减少的能力。在一些实施方案中，在TRB基因经调节的细胞中，一个或多个TCR复合物的表达得以改变。
在一些实施方案中，本文所述靶多核苷酸序列是TRB的变体。在一些实施方案中，靶多核苷酸序列是TRB的同源物。在一些实施方案中，靶多核苷酸序列是TRB的异种同源物。
在一些方面，减少或消除TRB的表达减少或消除TCR表面表达。因此，与未修饰细胞中的表述相比，一个或多个TCR复合物的表达降低。
在一些实施方案中，本文所述细胞包含编码TRB蛋白的基因座位处的基因修饰。换言之，细胞包含TRB基因座处的遗传修饰。在一些情况下，编码TRB蛋白的核苷酸序列在UniProt No.P0DSE2中列出。在一些情况下，TRB基因座位描述于RefSeq.No.NG_001333.2和NCBI基因ID No.6957中。在某些情况下，TRB的氨基酸序列描述为Uniprot No.P01848。TRB蛋白和基因座位的额外描述可发现于GenBank No.L36092.2、Uniprot No.P0DSE2和HGNCRef.No.12155中。
在一些实施方案中，本文概述的低免疫原性细胞包含靶向TRB基因的遗传修饰。在一些实施方案中，通过稀少切割核酸内切酶来靶向TRB基因的遗传修饰包含Cas蛋白或编码Cas蛋白的多核苷酸、和至少一个特异性靶向TRB基因的引导核糖核酸序列。在一些实施方案中，至少一个用于特异性靶向TRB基因的引导核糖核酸序列选自由US20160348073的SEQID NO：610-765和9798-10532组成的组，所述文献通过引用并入本文。
测试是否TRB基因失活的测定法是已知的并且在本文中描述。在一个实施方案中，通过PCR导致的TRB基因的遗传修饰和HLA-II表达的减少可通过FACS分析来测定。在另一个实施方案中，TCRβ蛋白表达使用以TCRβ蛋白的抗体来探测的细胞裂解物的蛋白质印迹法来检测。在另一个实施方案中，反转录酶聚合酶链反应(RT-PCR)用于确认失活遗传修饰的存在。
本文提供了经工程化以便与对应野生型或未修饰细胞相比，减少MHC I类和/或MHC II类人类白细胞抗原的表达或不存在表达，减少TCR复合物的表达或不存在表达，和增加CD47的表达的细胞。在一些实施方案中，工程化细胞也表达嵌合抗原受体(CAR)。在一些情况下，CAR是CD19特异性CAR。在一些实施方案中，CD19特异性CAR表现出与tisagenlecleucel或其生物类似物或替代物的细胞中表达的CAR基本上类似的结构和/或功能。在一些方面，细胞包括一个或多个选自由B2M、CIITA、TRAC和TRB基因组成的组的基因中的遗传修饰。在一些实施方案中，将遗传修饰引入B2M和CIITA基因中。在一些实施方案中，将遗传修饰引入B2M、CIITA和TRAC基因中。在一些实施方案中，将遗传修饰引入B2M、CIITA和TRB基因中。在一些实施方案中，将遗传修饰引入B2M、CIITA、TRAC和TRB基因中。在一些实施方案中，细胞为B2M-/-、CIITA-/-、TRAC-/-细胞。在一些实施方案中，细胞为B2M-/-、CIITA-/-、TRB-/-细胞。在一些实施方案中，细胞为B2M-/-、CIITA-/-、TRAC-/-、TRB-/-细胞。
在许多方面，细胞包括一个或多个选自由B2M、CIITA、TRAC和TRB基因组成的组的基因中的遗传修饰并且过表达CD47。在一些实施方案中，细胞过表达CD47并且带有引入B2M和CIITA基因中的遗传修饰。在一些实施方案中，细胞过表达CD47并且带有引入B2M、CIITA和TRAC基因中的遗传修饰。在一些实施方案中，细胞过表达CD47并且带有引入B2M、CIITA和TRB基因中的遗传修饰。在一些实施方案中，细胞过表达CD47并且带有引入B2M、CIITA、TRAC和TRB基因中的遗传修饰。在一些实施方案中，细胞为B2M-/-、CIITA-/-、TRAC-/-、CD47tg细胞。在一些实施方案中，细胞为B2M-/-、CIITA-/-、TRB-/-、CDB7tg细胞。在一些实施方案中，细胞为B2M-/-、CIITA-/-、TRAC-/-、TRB-/-、CD47tg细胞。在一些实施方案中，通过所描述细胞来表达外源CD47通过组成性启动子或可诱导启动子来控制。
在许多方面，细胞包括一个或多个选自由B2M、CIITA、TRAC和TRB基因组成的组的基因中的遗传修饰并且过表达CD47和CAR。在一些实施方案中，细胞过表达CD47和CAR，并且带有引入B2M和CIITA基因中的遗传修饰。在一些实施方案中，细胞过表达CD47和CAR，并且带有引入B2M、CIITA和TRAC基因中的遗传修饰。在一些实施方案中，细胞过表达CD47和CAR，并且带有引入B2M、CIITA和TRB基因中的遗传修饰。在一些实施方案中，细胞过表达CD47和CAR，并且带有引入B2M、CIITA、TRAC和TRB基因中的遗传修饰。在一些实施方案中，细胞是也表达嵌合抗原受体的B2M-/-、CIITA-/-、TRAC-/-、CD47tg细胞。在一些实施方案中，细胞是也表达嵌合抗原受体的B2M-/-、CIITA-/-、TRB-/-、CD47tg细胞。在一些实施方案中，细胞是也表达嵌合抗原受体的B2M-/-、CIITA-/-、TRAC-/-、TRB-/-、CD47tg细胞。
在一些实施方案中，CAR的表达通过组成性启动子或可诱导启动子来控制。在一些实施方案中，通过所描述细胞来表达外源CD47通过组成性启动子或可诱导启动子来控制。在某些实施方案中，CAR和CD47的表达通过单一启动子来控制。在许多实施方案中，CAR和CD47的表达通过两个启动子来控制。在一些实施方案中，CAR的表达通过第一启动子来控制并且CD47通过第二启动子来控制，以使得第一启动子和第二启动子是相同类型的启动子。在其他情况下，第一启动子和第二启动子是不同类型的启动子。在一些情况下，通过细胞的CAR的表达水平比CD47的表达更高(例如，高5％、10％、25％、50％、75％、100％、200％、300％或更多)。在一些情况下，通过细胞的CD47(例如，外源CD47)的表达水平比CAR的表达更高(例如，高5％、10％、25％、50％、75％、100％、200％、300％或更多)。在许多情况中，CAR和外源CD47的表达水平基本上相同。
III.原代细胞：产生、工程化、分化、移植
本文提供了用于调节含有一个或多个编码CD47的核酸和任选地其他蛋白的细胞，包括原代细胞和非原代细胞的群体的方法和组合物，包括向受试者施用CD47-SIRPα阻断剂，其中细胞群体先前施用于或移植至受试者中。在一些实施方案中，原代细胞包含可分化成其他非原代细胞类型的细胞。在一些实施方案中，原代细胞为多能细胞。在一些实施方案中，原代细胞包含多能干细胞。在一些实施方案中，原代细胞为人类原代细胞。在一些实施方案中，人类原代细胞为人类多能干细胞(hPSC)。在一些实施方案中，非原代细胞为人类非原代细胞。
包括多能干细胞、分化细胞、原代细胞和原代T细胞的治疗细胞可经工程化以便表达免疫调控蛋白并且逃避接受者免疫系统的排斥。并且因此，此类细胞对于同种异体细胞疗法有很大的希望。在一些方面，本技术的细胞包含用于抑制对于植入细胞的接受者免疫反应的免疫抑制(例如，免疫原性)因子。在一些实施方案中，将CD47-SIRPα阻断剂施用于接受者促进这些细胞和其衍生物(例如，子代细胞)的吞噬作用、细胞清除和/或细胞死亡。在一些方面，CD47-SIRPα阻断剂是中和、阻断、拮抗或干扰CD47、SIRPα或两者的细胞表面表达的因子。在一些实施方案中，CD47-SIRPα阻断剂抑制或阻断CD47、SIRPα或两者的相互作用。此类CD47-SIRPα阻断剂可用作调节所施用或植入细胞的活性的安全开关，由此改进这些基于细胞疗法的安全性。
本文提供了使用CD47-SIRPα阻断剂来减少表达CD47的细胞(例如，施用或引入患者的CD47表达细胞)的数目的方法。还提供了表达CD47的细胞和其衍生物(例如，多能干细胞、诱导多能干细胞、来自多能干细胞的分化细胞、原代T细胞和其子代)。在一些实施方案中，细胞包含外源表达的CD47。在一些实施方案中，将本文所述工程化细胞施用于接受者受试者，并且然后在将CD47-SIRPα阻断剂施用于受试者后，那些工程化细胞被定为接受者受试者免疫系统的细胞死亡和/或细胞清除的目标。
在一些实施方案中，在向接受者受试者施用CD47-SIRPα阻断剂之后，本文概述的细胞经受先天免疫细胞排斥。在一些情况下，在施用CD47-SIRPα阻断剂之前，表达免疫抑制因子(例如，CD47)的细胞不易受NK细胞介导的裂解。在一些情况下，在施用CD47-SIRPα阻断剂之前，细胞不易受巨噬细胞吞噬。在一些实施方案中，所述细胞可用作可在需要极少直至不需要免疫抑制剂的情况下，移植至接受者受试者中的普遍相容细胞或组织(例如，普遍供者细胞或组织)的来源。此类细胞在移植后保持特定细胞特性和特征。
在一些实施方案中，本文提供了在MHC失配同种异体接受者中逃避免疫排斥的细胞和/或其分化衍生物。在一些情况下，表达CD47的细胞和其子代，包括表达CD47的植入细胞和任何子代(例如，细胞的直接或间接子代)可逃避接受者受试者的免疫识别。在一些实施方案中，细胞和/或衍生自此类细胞的分化细胞是低免疫原性的。因此，细胞和其子代可逃避免疫识别并且不引起接受者受试者中的免疫反应。在一些实施方案中，从本文概述的干细胞产生的分化细胞在施用(例如，移植或嫁接)MHC失配同种异体接受者时逃避免疫排斥。在一些实施方案中，细胞和/或衍生自此类细胞的分化细胞是低免疫原性的。
A.产生原代和/或分化细胞
本公开提供了产生包含外源表达CD47的工程化细胞的方法。在一些实施方案中，所述细胞包括多能干细胞、诱导多能干细胞、分化细胞和衍生自原代T细胞的细胞。在一些实施方案中，分化细胞包括选自由以下组成的组的细胞类型：心脏细胞、神经细胞、内皮细胞、T细胞、胰岛细胞、视网膜色素上皮细胞、肝细胞、甲状腺细胞、皮肤细胞、血细胞和上皮细胞。在一些实施方案中，工程化细胞或其子代是身体的任何器官或组织的细胞，包括但不限于心脏、大脑、皮肤、眼睛、胰腺、膀胱、脾脏、肝脏、肺、肾脏、甲状腺、心血管系统、呼吸系统、神经系统和免疫系统。在一些实施方案中，多能干细胞使用特异性分化条件来分化成身体的任何器官或组织的细胞。
在一些实施方案中，本文描述的方法包含使用本领域技术人员已知的方法来产生的原代细胞。在一些实施方案中，本文所述方法包含使用本领域技术人员已知的方法来产生的多能干细胞。小鼠和人类诱导多能干细胞(通常被称为iPSC；鼠科细胞的miPSC或人类细胞的hiPSC)的产生通常在此项技术中是已知的。如本领域技术人员了解，存在产生iPSC的各种不同方法。使用四种转录因子Oct3/4、Sox2、c-Myc和K1f4的病毒引入，进行来自小鼠胚胎或成人纤维母细胞的最初诱导；参见Takahashi和Yamanaka，Cell，126：663-676(2006)，所述文献全部并且尤其针对其中概述的技术通过引用并入本文。此后，已开发许多方法；参见Seki等人，World J.Stem Cells 7(1)：116-125(2015)的评述，以及Lakshmipathy和Vermuri编，Methods in Molecular Biology：Pluripotent Stem Cells，Methods and Protocols，Springer 2013，两种文献全部并且尤其针对产生hiPSC的方法(参见例如后一参考文献的第3章)通过引用明确并入本文。
总体上，iPSC通过通常使用游离基因载体来引入的一种或多种“重新编程因子”在宿主细胞中的瞬时表达来产生。在这些条件下，少量细胞经诱导成为iPSC(通常，此步骤的效率较低，因为未使用选择标志物)。一旦细胞经“重新编程”，并且成为多能细胞，其失去游离基因载体并且使用内源性基因来产生所述因子。
也如本领域技术人员了解，可使用或经使用的许多重新编程因子可变化。通常，当使用较少重新编程因子时，细胞转化至多能状态的效率以及“多能性”降低，例如，较少重新编程因子可导致细胞并非完全多能的，但是可能只能够分化成较少细胞类型。
在一些实施方案中，使用单一重新编程因子OCT4。在其他实施方案中，使用两个重新编程因子OCT4和KLF4。在其他实施方案中，使用三个重新编程因子OCT4、KLF4和SOX2。在其他实施方案中，使用四个重新编程因子OCT4、KLF4、SOX2和c-Myc。在其他实施方案中，可使用5、6或7个选自SOKMNLT；SOX2、OCT4(POU5F1)、KLF4、MYC、NANOG、LIN28、和SV40L T抗原的重新编程因子。通常，这些重新编程因子基因提供于例如在此项技术中已知并且可购得的游离基因载体上。
通常，如在此项技术中已知，通过如本文描述瞬时表达重新编程因子，iPSC从非多能细胞例如但不限于血细胞、纤维母细胞等产生。
一旦产生低免疫原性多能干细胞，其可保持如已知用于保持iPSC的未分化状态。例如，细胞可使用防止分化和保持多能性的培养基来在Matrigel上培养。另外，其可在保持多能性的条件下，处于培养基中。
B.原代和/或分化细胞的工程化
所提供的方法可用于使例如但不限于多能干细胞、其分化细胞、原代T细胞等的细胞中的一个或多个基因失活或消除。在一些实施方案中，工程化细胞包含减少或消除MHC I类复合物的任何组分和/或MHC I类复合物的任何组分的表面表达的遗传修饰。在一些实施方案中，工程化细胞包含编码B2M的基因的遗传修饰。在一些实施方案中，工程化细胞包含编码CIITA的基因的遗传修饰。在一些实施方案中，工程化细胞包含编码NLRC5的基因的遗传修饰。在一些实施方案中，工程化细胞包含编码细胞毒性T-淋巴细胞相关蛋白4(CTLA4)的基因的遗传修饰。在一些实施方案中，工程化细胞包含编码程序性细胞死亡1(PD1)的基因的遗传修饰。遗传修饰T细胞的详细说明发现于例如WO2016160721中，公开内容全部并入本文，包括序列表、表格和附图。
在一些实施方案中，使用稀少切割核酸内切酶(例如，CRISPR/Cas、TALEN、锌指核酸酶、兆碱基大范围核酸酶和归巢核酸内切酶系统)的基因组编辑技术也用于减少或消除人类干细胞中的关键免疫基因的表达(例如，通过使关键免疫基因的基因组DNA缺失)。在某些实施方案中，基因组编辑技术或其他基因调节技术用于将耐受性诱导因子插入人类细胞中，使得其和由此制备的分化细胞成为低免疫原性(或减少免疫原性)细胞。因此，低免疫原性细胞具有减少或消除的MHC I和/或MHC II表达。在一些实施方案中，细胞在接受者受试者中为非免疫原性的(例如，不诱导免疫反应)。在某些实施方案中，细胞在接受者受试者中具有减少的免疫原性(例如，降低诱导免疫反应的可能性)。
基因组编辑技术实现所需基因座位点处的双链DNA断裂。这些受控双链断裂促进特定基因座位点处的同源重组。此方法着重于使用核酸内切酶来靶向例如染色体的核酸分子的特定序列，所述核酸内切酶识别并结合至序列并且诱导核酸分子中的双链断裂。双链断裂通过易于出错的非同源末端连接(NHEJ)或同源重组(HR)来修复。
除非特别指出相反的情况，特定实施方案的实践使用本领域技术人员技能内的化学、生物化学、有机化学、分子生物学、微生物学、重组DNA技术、遗传学、免疫学和细胞生物学的常规方法，许多方法出于说明目的于下文描述。此类技术在文献中有充分说明。参见例如Sambrook等人，Molecular Cloning：A Laboratory Manual(第3版，2001)；Sambrook等人，Molecular Cloning：A Laboratory Manual(第2版，1989)；Maniatis等人，MolecularCloning：A Laboratory Manual(1982)；Ausubel等人，Current Protocols in MolecularBiology(John Wiley and Sons，2008年7月更新)；Shorr Protocols in MolecularBiology：A Compendium of Methods from Current Protocols in Molecular Biology，Greene Pub.Associates and Wiley-Interscience；Glover，DNA Cloning：A PracticalApproach，第I和II卷(IRL Press，Oxfird，1985)；Anand，Techniques for the Analysisof Complex Genomes，(Academic Press，New York，1992)；Transcription andTranslation(B.Hames和S.Higgins编，1984)；Perbal，A Practical Guide to MolecularCloning(1984)；Harlow和Lane，Antibodies，(Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，N.Y.，1998)Current Protocols in Immunology Q.E.Coligan，A.M.Kruisbeek，D.H.Margulies，E.M.Shevach和W.Strober编，1991)；Annual Review ofImmunology；以及例如Advances in Immunology的期刊中的专著。
在一些实施方案中，稀少切割内切核酸酶以编码稀少切割内切核酸酶的核酸形式来引入含有靶多核苷酸序列的细胞中。将核酸引入细胞中的方法可通过任何合适技术实现。合适技术包括磷酸钙或脂质介导转染、电穿孔、和使用病毒载体的转导或感染。在一些实施方案中，核酸包含DNA。在一些实施方案中，核酸包含如本文描述的经修饰DNA。在一些实施方案中，核酸包含mRNA。在一些实施方案中，核酸包含如本文描述的经修饰mRNA(例如，合成、修饰mRNA)。
本公开涵盖以本领域技术人员使用CRISPR/Cas系统可利用的任何方式来改变靶多核苷酸序列。可使用能够改变细胞中的靶多核苷酸序列的任何CRISPR/Cas系统。此类CRISPR-Cas系统可使用各种Cas蛋白(Haft等人.PLoS Comput Biol.；2005；1(6)e60)。允许CRISPR/Cas系统改变细胞中的靶多核苷酸序列的此类Cas蛋白的分子机制包括RNA结合蛋白、核酸内切酶和核酸外切酶、解旋酶和聚合酶。在一些实施方案中，CRISPR/Cas系统是CRISPR I型系统。在一些实施方案中，CRISPR/Cas系统是CRISPR II型系统。在一些实施方案中，CRISPR/Cas系统是CRISPR V型系统。
CRISPR/Cas系统通常包含至少两个组分：一个或多个引导RNA(gRNA)和Cas蛋白。Cas蛋白是将DSB引入靶位点中的核酸酶。CRISPR-Cas系统分成两个主要类别：类别1系统使用多个Cas蛋白的复合物来使核酸降解；类别2系统使用单一大Cas蛋白用于相同目的。类别1划分成类型I、III和IV；类别2划分成类型II、V和VI。适于基因编辑应用的不同Cas蛋白包括但不限于Cas3、Cas4、Cas5、Cas8a、Cas8b、Cas8c、Cas9、Cas10、Cas12、Cas12a(Cpf1)、Cas12b(C2c1)、Cas12c(C2c3)、Cas12d(CasY)、Cas12e(CasX)、Cas12f(C2c10)、Cas12g、Cas12h、Cas12i、Cas12k(C2c5)、Cas13、Cas13a(C2c2)、Cas13b、Cas13c、Cas13d、C2c4、C2c8、C2c9、Cmr5、Cse1、Cse2、Csf1、Csm2、Csn2、Csx10、Csx11、Csy1、Csy2、Csy3和Mad7。参见例如Jinek等人，Science(2012)337(6096)：816-821；Dang等人，Genome Biology(2015)16：280；Ran等人，Nature(2015)520：186-191；Zetsche等人，Cell(2015)163：759-771；Strecker等人，Nature Comm.(2019)10：212；Yan等人，Science(2019)363：88-91。最广泛使用的Cas9是II型Cas蛋白并且本文描述为说明性的。这些Cas蛋白可来源于不同源物种。例如，Cas9可衍生自化脓性链球菌(S.pyogenes)或金黄色葡萄球菌(S.aureus)。
在原始微生物基因组中，II型CRISPR系统将侵入DNA的序列并入被编码为宿主基因组内的阵列的CRISPR重复序列之间。来自CRISPR重复阵列的转录物被处理成CRISPR RNA(crRNA)，各自容纳从侵入DNA转录的可变序列，被称为“原型间隔物”序列，以及CRISPR重复序列的一部分。每个crRNA与第二反式活化CRISPR RNA(tracrRNA)杂交，并且这两个RNA与Cas9核酸酶形成复合物。crRNA的原型间隔物编码部分引导Cas9复合物裂解互补靶DNA序列，条件是它们与被称为“原型间隔物相邻基序”(PAM)的短序列相邻。
虽然前述描述着重于Cas9核酸酶，应了解存在利用gRNA的其他RNA引导核酸酶，所述核酸酶在某些方面不同于迄今为止所描述的那些核酸酶。例如，Cpf1(来自普雷沃氏菌和弗朗西斯氏菌1的CRISPR；也称为Cas12a)是仅需要crRNA并且不需要tracrRNA来起作用的RNA引导核酸酶。
自从其发现以来，CRISPR系统经调适以便在从细菌至包括人类细胞的真核细胞的广泛范围的细胞和生物体中诱导序列特异性DSB和靶向基因组编辑。在其基因编辑应用中的用途中，人工设计、合成的gRNA已代替原始crRNA：tracrRNA复合物，包括在某些实施方案中经由单一gRNA。例如，gRNA可为由crRNA、四环和tracrRNA组成的单一引导RNA(sgRNA)。crRNA通常包含经使用者设计以便识别目标靶DNA的互补区域(也被称为间隔物，通常约20个核苷酸长度)。tracrRNA序列包含用于Cas核酸酶结合的支架区域。crRNA序列和tracrRNA序列通过四环来连接并且各自具有短重复序列以便彼此杂交，由此产生嵌合sgRNA。可通过仅改变存在于gRNA中的间隔物或互补区域序列来改变Cas核酸酶的基因组靶标。互补区域经由标准RNA-DNA互补碱基配对规则来将Cas核酸酶引导至靶DNA位点。
为了使Cas核酸酶发挥作用，必须在基因组DNA中的靶序列直接下游存在PAM。通过Cas蛋白来识别PAM被视为使相邻基因组序列去稳定，允许通过gRNA来讯问所述序列并且当存在匹配序列时，导致gRNA-DNA配对。PAM的特异性序列取决于Cas基因的种类而变化。例如，衍生自化脓性链球菌的最常用Cas9核酸酶识别5′-NGG-3′的PAM序列或在不太有效速率下，识别5′-NAG-3′，其中“N”可为任何核苷酸。具有替代PAM的其他Cas核酸酶变体也得以表征并且成功用于基因组编辑，所述变体概述于下表17中。
表17.示例性Cas核酸酶变体和其PAM序列
r＝a或g；y＝c或t；w＝a或t；v＝a或c或g；n＝任何碱基
在一些实施方案中，Cas核酸酶可包含一个或多个突变以便改变其活性、特异性、识别和/或其他特性。例如，Cas核酸酶可具有一个或多个突变，所述突变改变其减轻脱靶效应的保真性(例如，SpCas9的eSpCas9、SpCas9-HF1、HypaSpCas9、HeFSpCas9和evoSpCas9高保真变体)。对于另一个实例，Cas核酸酶可具有改变其PAM特异性的一个或多个突变。
在一些实施方案中，提供了具有通过如所描述的任何基因编辑系统来修饰的基因组基因座的宿主细胞或其组合物。在一些实施方案中，遗传修饰是通过使用选自由以下组成的组的定点核酸酶：Cas3、Cas4、Cas5、Cas8a、Cas8b、Cas8c、Cas9、Cas10、Cas12、Cas12a(Cpf1)、Cas12b(C2c1)、Cas12c(C2c3)、Cas12d(CasY)、Cas12e(CasX)、Cas12f(C2c10)、Cas12g、Cas12h、Cas12i、Cas12k(C2c5)、Cas13、Cas13a(C2c2)、Cas13b、Cas13c、Cas13d、C2c4、C2c8、C2c9、Cmr5、Cse1、Cse2、Csfl、Csm2、Csn2、Csx10、Csx11、Csy1、Csy2、Csy3、Mad7、锌指核酸酶(ZFN)、转录活化子样效应核酸酶(TALEN)、兆碱基大范围核酸酶和CRISPR相关转座酶。在某些这些实施方案中，经修饰的基因组基因座为B2M基因座、CIITA基因座、TRAC基因座、TRBC基因座或安全港基因座。安全港基因座的非限制性实例包括但不限于AAVS1、ABO、CCR5、CLYBL、CXCR4、F3、FUT1、HMGB1、KDM5D、LRP1、MICA、MICB、RHD、ROSA26和SHS231基因座位。
用于CRISPR编辑中的gRNA包含crRNA序列，所述序列进而包含识别并结合目标互补靶DNA的互补区域(也被称为间隔物)。间隔物或互补区域的长度通常在15与30个核苷酸之间，通常约20个核苷酸长度，但是基于特定CRISPR/Cas系统的要求来变化。在某些实施方案中，间隔物或互补区域与靶DNA序列完全互补。在其他实施方案中，间隔物与靶DNA序列部分互补，例如至少80％、85％、90％、95％、98％或99％互补。
在某些实施方案中，本文提供的gRNA还包含tracrRNA序列，所述序列包含结合至核酸酶的支架区域。tracrRNA的长度和/或序列可取决于用于编辑的特定核酸酶而变化。在某些实施方案中，通过gRNA的核酸酶结合不需要tracrRNA序列。在其中gRNA包含tracrRNA的实施方案中，crRNA序列还可包含用于与tracrRNA的互补序列杂交的重复区域。
在一些实施方案中，本文提供的gRNA包含呈两个单独分子的两个或更多个gRNA分子，例如，crRNA和tracrRNA。在其他实施方案中，gRNA为单一引导RNA(sgRNA)，包括在单一RNA分子上包含crRNA和tracrRNA的sgRNA。在某些这些实施方案中，crRNA和tracrRNA通过间插四环来连接。
在一些实施方案中，一个gRNA可与用于目标基因座位的靶向编辑的定点核酸酶结合使用。在其他实施方案中，靶向同一目标基因座位的两个或更多个gRNA可与定点核酸酶结合使用。
在一些实施方案中，与同时需要crRNA和tracrRNA的各种常见Cas核酸酶，包括Cas9和Cas12b(C2c1)一起使用的示例性gRNA(例如，sgRNA)提供于表18中。参见例如Jinek等人，Science(2012)337(6096)：816-821；Dang等人，Genome Biology(2015)16：280；Ran等人，Nature(2015)520：186-191；Strecker等人，Nature Comm.(2019)10：212。对于每个示例性gRNA，示出gRNA的不同部分的序列，包括互补区域或间隔物、crRNA重复区域、四环和tracrRNA。在一些实施方案中，gRNA包含SEQ ID NO：94-97列出的核苷酸序列的全部或部分。在一些实施方案中，gRNA包含SEQ ID NO：98-101列出的核苷酸序列的全部或部分。在一些实施方案中，gRNA包含SEQ ID NO：102-105列出的核苷酸序列的全部或部分。在一些实施方案中，gRNA包含SEQ ID NO：106-109列出的核苷酸序列的全部或部分。
在一些实施方案中，gRNA包含crRNA重复区域，所述重复区域包含SEQ ID NO：95、SEQ ID NO：99、SEQ ID NO：103或SEQ ID NO：108列出的核苷酸序列、由所述核苷酸序列组成、或基本上由所述核苷酸序列组成。在一些实施方案中，gRNA包含四环，所述四环包含SEQID NO：96或SEQ ID NO：107列出的核苷酸序列、由所述核苷酸序列组成、或基本上由所述核苷酸序列组成。在一些实施方案中，gRNA包含tracrRNA，所述tracrRNA包含SEQ ID NO：97、SEQ ID NO：101、SEQ ID NO：105或SEQ ID NO：106列出的核苷酸序列、由所述核苷酸序列组成、或基本上由所述核苷酸序列组成。
表18.CRISPR/Cas的示例性gRNA结构和序列
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s＝c或g；n＝任何碱基
在一些实施方案中，gRNA包含对于目标靶基因座位具有特异性的互补区域，例如，B2M基因座、CIITA基因座、TRAC基因座、TRBC基因座、或选自由以下组成的组的安全港基因座：AAVS1、ABO、CCR5、CLYBL、CXCR4、F3、FUT1、HMGB1、KDM5D、LRP1、MICA、MICB、RHD、ROSA26和SHS231基因座位。互补区域可结合靶基因座位的任何区域中的序列，包括例如CDS、外显子、内含子、横跨外显子的一部分和相邻内含子的一部分的序列、或调控区域(例如，启动子、增强子)。当靶序列为CDS、外显子、内含子、或横跨外显子和内含子的部分的序列时，CDS、外显子、内含子、或外显子/内含子边界可根据靶基因的任何接合变体来定义。在一些实施方案中，通过gRNA来靶向的基因组基因座位在如所描述的任何基因座或其区域的4000bp、3500bp、3000bp、2500bp、2000bp、1500bp、1000bp或500bp内。本文进一步提供包含一种或多种本文提供的gRNA和Cas蛋白或编码Cas蛋白的核苷酸序列的组合物。在某些这些实施方案中，一种或多种gRNA和编码Cas蛋白的核苷酸序列包含于载体，例如病毒载体中。
在一些实施方案中，gRNA在本文中用于定点插入包含识别AAVS1中的靶序列的互补区域的转基因。在某些这些实施方案中，靶序列位于AAVS1的内含子1中。AAVS1位于染色体19：55，090，918-55，117，637反向链处，并且AAVS1内含子1(基于转录物ENSG00000125503)位于染色体19：55，117，222-55，112，796反向链处。在某些实施方案中，gRNA靶向位于染色体19：55，117，222-55，112，796的任何位置处的位点的4000bp内、3500bp内、3000bp内、2500bp内、2000bp内、1500bp内、1000bp内或500bp内的基因组基因座。在某些实施方案中，gRNA靶向位于染色体19：55，115，674的4000bp内、3500bp内、3000bp内、2500bp内、2000bp内、1500bp内、1000bp内或500bp内的基因组基因座。在某些实施方案中，gRNA被配置为在染色体19：55，115，674处，或在染色体19：55，115，674的5、10、15、20、30、40或50个核苷酸内的位置处产生切割位点。在某些实施方案中，gRNA是在Li等人，Nat.Methods 16：866-869(2019)中所描述的GET000046，也称为“sgAAVS1-1”。这种gRNA包含互补区域，所述互补区域包含SEQ ID NO：110列出的核酸序列、由所述序列组成、或基本上由所述序列组成并且靶向AAVS1(也称为PPP1R12C)的内含子1。
在一些实施方案中，gRNA在本文中用于定点插入包含识别CLYBL中的靶序列的互补区域的转基因。在某些这些实施方案中，靶序列位于CLYBL的内含子2中。CLYBL位于染色体13：99，606，669-99，897，134前向链处，并且CLYBL内含子2(基于转录物ENST00000376355.7)位于染色体13：99，773，011-99，858，860前向链处。在某些实施方案中，gRNA靶向位于染色体13：99，773，011-99，858，860的任何位置处的位点的4000bp内、3500bp内、3000bp内、2500bp内、2000bp内、1500bp内、1000bp内或500bp内的基因组基因座。在某些实施方案中，gRNA靶向位于染色体13：99，822，980的4000bp内、3500bp内、3000bp内、2500bp内、2000bp内、1500bp内、1000bp内或500bp内的基因组基因座。在某些实施方案中，gRNA被配置为在染色体13：99，822，980处，或在染色体13：99，822，980的5、10、15、20、30、40或50个核苷酸内的位置处产生切割位点。在某些实施方案中，gRNA为包含互补区域的GET000047，所述互补区域包含SEQ D NO：111列出的核酸序列、由所述序列组成、或基本上由所述序列组成并且靶向CLYBL的内含子2。靶位点类似于如Cerbini等人，PLoS One，10(1)：e0116032(2015)所描述的TALEN的靶位点。
在一些实施方案中，gRNA在本文中用于定点插入包含识别CCR5中的靶序列的互补区域的转基因。在某些这些实施方案中，靶序列位于CCR5的外显子3中。CCR5位于染色体3：46，370，854-46，376，206前向链处，并且CCR5外显子3(基于转录物ENST00000292303.4)位于染色体3：46，372，892-46，376，206前向链处。在某些实施方案中，gRNA靶向位于染色体3：46，372，892-46，376，206的任何位置处的位点的4000bp内、3500bp内、3000bp内、2500bp内、2000bp内、1500bp内、1000bp内或500bp内的基因组基因座。在某些实施方案中，gRNA靶向位于染色体3：46，373，180的4000bp内、3500bp内、3000bp内、2500bp内、2000bp内、1500bp内、1000bp内或500bp内的基因组基因座。在某些实施方案中，gRNA被配置为在染色体3：46，373，180处，或在染色体3：46，373，180的5、10、15、20、30、40或50个核苷酸内的位置处产生切割位点。在某些实施方案中，gRNA为在Mandal等人，Cell Stem Cell 15：643-652(2014)中所描述的GET000048，也称为”crCCR5_D”。这种gRNA包含互补区域，所述互补区域包含SEQID NO：112列出的核酸序列、由所述序列组成、或基本上由所述序列组成并且靶向CCR5的外显子3(在Ensembl基因组数据库中替代地标注为外显子2)。参见Gomez-Ospina等人，Nat.Comm.10(1)：4045(2019)。
在本文使用的gRNA的某些实施方案中，表19列出的互补区域序列中的一个或多个胸腺嘧啶被尿嘧啶取代。
表19.示例性gRNA互补区域序列
SEQ ID NO： 核酸序列(5′→3′) 描述
110 accccacagtggggccacta GET000046引导
111 tgttggaaggatgaggaaat GET000047引导
112 tcactatgctgccgcccagt GET000048引导
在一些实施方案中，提供了鉴定用于如所描述的定点基因编辑方法中的新基因座和/或gRNA序列的方法。例如，对于CRISPR/Cas系统，当特定基因座(例如，安全港基因座)的现有gRNA已知时，通过针对通常在整个基因组中约每100个碱基对(bp)出现的PAM序列，扫描基因座的任一侧上的侧接区域，“尺蠖蠕动”方法可用于鉴定用于靶向插入转基因的额外基因座。PAM序列取决于所使用的特定Cas核酸酶，因为不同核酸酶通常具有不同的对应PAM序列。基因座的任一侧上的侧接区域可为约500至4000bp长，例如，约500bp、约1000bp、约1500bp、约2000bp、约2500bp、约3000bp、约3500bp、或约4000bp长。当在搜寻范围内鉴定PAM序列时，可根据所述基因座的序列来设计新引导以便用于定点插入转基因。虽然CRISPR/Cas系统描述为说明性的，但是如所描述的任何基因编辑方法可用于鉴定新基因座的这种方法中，包括使用ZFN、TALEN、兆碱基大范围核酸酶和转座酶的方法。
在一些实施方案中，gRNA的活性、稳定性和/或其他特性可经由并入化学和/或序列修饰来改变。作为一个实例，瞬时表达或递送的核酸可易于通过例如细胞核酸酶来降解。因此，本文所述gRNA可含有一个或多个向核酸酶引入稳定性的经修饰核苷或核苷酸。虽然不受特定理论束缚，但是据认为本文所述某些经修饰gRNA在引入细胞、特别是本技术的细胞的群体中时可表现出减少的先天免疫反应。如本文使用，术语“先天性免疫反应”包括对外源核酸，包括单链核酸(通常来源于病毒或细菌)的细胞反应，所述反应涉及诱导细胞因子表达和释放(特别是干扰素)以及细胞死亡。改进稳定性、增加核酸酶抗性和/或减少免疫反应的gRNA的其他常见化学修饰包括2′-O-甲基修饰、2′-氟修饰、2′-O-甲基硫代磷酸酯键修饰和2′-O-甲基3′硫代PACE修饰。
一种常见3′端修饰是添加包含一个或多个(并且通常5-200个)腺嘌呤(A)残基的聚腺苷酸束。聚腺苷酸束可包含于编码gRNA的核酸序列中或可在化学合成期间，或在使用聚腺苷酸聚合酶(例如，大肠杆菌聚(A)聚合酶)体外转录之后添加至gRNA。体内聚腺苷酸束可经由使用聚腺苷酸化信号来添加至从DNA载体转录的序列。此类信号的实例提供于Maeder中。其他合适的gRNA修饰包括不限于美国专利申请第US 2017/0073674 A1号和国际公开第WO 2017/165862 A1号所描述的修饰，所述文献中的每一者的整个内容通过引用并入本文。
CRISPR/Cas系统可用于改变细胞中的任何靶多核苷酸序列。本领域技术人员容易认识到任何特定细胞中的待改变的理想靶多核苷酸序列可对应于基因组序列的表达与病症相关或另外促进病原体进入细胞中的任何基因组序列。例如，细胞中的待改变的理想靶多核苷酸序列可为与含有疾病相关单一多核苷酸多态性的基因组序列对应的多核苷酸序列。在此实例中，CRISPR/Cas系统可用于通过将疾病相关SNP用野生型等位基因来置换而校正细胞中的疾病相关SNP。作为另一个实例，负责病原体进入细胞或增殖的靶基因的多核苷酸序列可为缺失或插入的合适靶标以破坏靶基因的功能，从而防止病原体进入细胞或在细胞内部增殖。
在一些实施方案中，靶多核苷酸序列是基因组序列。在一些实施方案中，靶多核苷酸序列是人类基因组序列。在一些实施方案中，靶多核苷酸序列是哺乳动物基因组序列。在一些实施方案中，靶多核苷酸序列是脊椎动物基因组序列。
在一些实施方案中，CRISPR/Cas系统包括Cas蛋白和至少一个至两个能够将Cas蛋白引导至靶多核苷酸序列的靶基序并且杂交至所述基序的核糖核酸。如本文使用，“蛋白质”和“多肽”可互换使用以指代通过肽键连接的一系列氨基酸残基(即，氨基酸的聚合物)并且包括经修饰氨基酸(例如，磷酸化、糖化、糖基化等)和氨基酸类似物。示例性多肽或蛋白质包括基因产物、天然存在的蛋白、同源物、旁系同源物、片段和上述的其他等效物、变体和类似物。
在一些实施方案中，Cas蛋白包含一个或多个氨基酸取代或修饰。在一些实施方案中，一个或多个氨基酸取代包含保守氨基酸取代。在一些情况下，取代和/或修饰可预防或减少蛋白分解降解且/或延长细胞中的多肽的半衰期。在一些实施方案中，Cas蛋白可包含肽键置换(例如，脲、硫脲、氨基甲酸酯、磺酰基脲等)。在一些实施方案中，Cas蛋白可包含天然存在的氨基酸。在一些实施方案中，Cas蛋白可包含替代氨基酸(例如，D-氨基酸、β-氨基酸、高半胱氨酸、磷酸丝氨酸等)。在一些实施方案中，Cas蛋白可包含修饰以便包括部分(例如，聚乙二醇化、糖基化、脂化、乙酰化、末端加帽等)。
在一些实施方案中，Cas蛋白包含核心Cas蛋白。示例性Cas核心蛋白包括但不限于Cas1、Cas2、Cas3、Cas4、Cas5、Cas6、Cas7、Cas8和Cas9。在一些实施方案中，Cas蛋白包含大肠杆菌亚型的Cas蛋白(也称为CASS2)。大肠杆菌亚型的示例性Cas蛋白包括但不限于Cse1、Cse2、Cse3、Cse4和Cas5e。在一些实施方案中，Cas蛋白包含Ypest亚型的Cas蛋白(也称为CASS3)。Ypest亚型的示例性Cas蛋白包括但不限于Csy1、Csy2、Csy3和Csy4。在一些实施方案中，Cas蛋白包含Nmeni亚型的Cas蛋白(也称为CASS4)。Nmeni亚型的示例性Cas蛋白包括但不限于Csn1和Csn2。在一些实施方案中，Cas蛋白包含Dvulg亚型的Cas蛋白(也称为CASS1)。Dvulg亚型的示例性Cas蛋白包括Csd1、Csd2和Cas5d。在一些实施方案中，Cas蛋白包含Tneap亚型的Cas蛋白(也称为CASS7)。Tneap亚型的示例性Cas蛋白包括但不限于Cst1、Cst2、Cas5t。在一些实施方案中，Cas蛋白包含Hmari亚型的Cas蛋白。Hmari亚型的示例性Cas蛋白包括但不限于Csh1、Csh2和Cas5h。在一些实施方案中，Cas蛋白包含Apem亚型的Cas蛋白(也称为CASS5)。Apem亚型的示例性Cas蛋白包括但不限于Csa1、Csa2、Csa3、Csa4、Csa5和Cas5a。在一些实施方案中，Cas蛋白包含Mtube亚型的Cas蛋白(也称为CASS6)。Mtube亚型的示例性Cas蛋白包括但不限于Csm1、Csm2、Csm3、Csm4和Csm5。在一些实施方案中，Cas蛋白包含RAMP模块Cas蛋白。示例性RAMP模块Cas蛋白包括但不限于Cmr1、Cmr2、Cmr3、Cmr4、Cmr5和Cmr6。
在一些实施方案中，Cas蛋白包含本文所述Cas蛋白或其功能部分中的任一者。如本文使用，“功能部分”或“功能片段”是指肽或蛋白因子的一部分，所述部分保留其与至少一个核糖核酸(例如，引导RNA(gRNA))复合并且裂解靶多核苷酸序列的能力。在一些实施方案中，功能部分包含选自包括以下各者的组的可操作连接的Cas9蛋白功能域的组合：DNA结合域、至少一个RNA结合域、解旋酶域和核酸内切酶域。在一些实施方案中，功能部分包含选自包括以下各者的组的可操作连接的Cpf1蛋白功能域的组合：DNA结合域、至少一个RNA结合域、解旋酶域和核酸内切酶域。在一些实施方案中，功能域形成复合物。在一些实施方案中，Cas9蛋白的功能部分包含RuvC样域的功能部分。在一些实施方案中，Cas9蛋白的功能部分包含HNH核酸酶域的功能部分。在一些实施方案中，Cpf1蛋白的功能部分包含RuvC样域的功能部分。
在一些实施方案中，外源Cas蛋白可以多肽形式来引入细胞中。在某些实施方案中，Cas蛋白可缀合至或融合至细胞穿透多肽或细胞穿透肽。如本文使用，“细胞穿透多肽”和“细胞穿透肽”分别是指促进分子吸收至细胞中的多肽或肽。细胞穿透多肽可含有可检测标签。
在某些实施方案中，Cas蛋白可缀合至或融合至带电荷的蛋白(例如，其带有正、负或总体中性电荷)。此键可为共价的。在一些实施方案中，Cas蛋白可融合至带超级正电荷的GFP以便显著增加Cas蛋白穿透细胞的能力(Cronican等人，ACS Chem Biol.；2010；5(8)：747-52)。在某些实施方案中，Cas蛋白可融合至蛋白转导域(PTD)以便促进其进入细胞中。示例性PTD包括Tat、低聚精氨酸和渗透素。在一些实施方案中，Cas9蛋白包含融合至细胞穿透肽的Cas9多肽。在一些实施方案中，Cas9蛋白包含融合至PTD的Cas9多肽。在一些实施方案中，Cas9蛋白包含融合至tat域的Cas9多肽。在一些实施方案中，Cas9蛋白包含融合至低聚精氨酸域的Cas9多肽。在一些实施方案中，Cas9蛋白包含融合至渗透素域的Cas9多肽。在一些实施方案中，Cas9蛋白包含融合至带超级正电荷的GFP的Cas9多肽。
在一些实施方案中，Cas多肽包含Cpf1(Cas12a)蛋白或其变体。在一些实施方案中，Cpf1(Cas12a)蛋白包含融合至细胞穿透肽的Cpf1多肽。在一些实施方案中，Cpf1蛋白包含融合至PTD的Cpf1多肽。在一些实施方案中，Cpf1蛋白包含融合至tat域的Cpf1多肽。在一些实施方案中，Cpf1蛋白包含融合至低聚精氨酸域的Cpf1多肽。在一些实施方案中，Cpf1蛋白包含融合至渗透素域的Cpf1多肽。在一些实施方案中，Cpfl蛋白包含融合至带超级正电荷的GFP的Cpf1多肽。Cpf1蛋白的详细说明可发现于例如Safari等人，Cell&Bioscience，2019；9，36；doi.org/10.1186/s13578-019-0298-7中。
在一些实施方案中，Cas蛋白可以编码Cas蛋白的核酸形式来引入含有靶多核苷酸序列的细胞中。将核酸引入细胞中的方法可通过任何合适技术实现。合适技术包括磷酸钙或脂质介导转染、电穿孔、和使用病毒载体的转导或感染。在一些实施方案中，核酸包含DNA。在一些实施方案中，核酸包含如本文描述的经修饰DNA。在一些实施方案中，核酸包含mRNA。在一些实施方案中，核酸包含如本文描述的经修饰mRNA(例如，合成、修饰mRNA)。
在一些实施方案中，Cas蛋白与一个至两个核糖核酸复合。在一些实施方案中，Cas蛋白与两个核糖核酸复合。在一些实施方案中，Cas蛋白与一个核糖核酸复合。在一些实施方案中，Cas蛋白通过如本文描述的经修饰核酸(例如，合成、修饰mRNA)来编码。
本公开的方法涵盖能够将Cas蛋白引导至靶多核苷酸序列的靶基序并且杂交至所述基序的任何核糖核酸的用途。在一些实施方案中，核糖核酸中的至少一者包含tracrRNA。在一些实施方案中，核糖核酸中的至少一者包含CRISPR RNA(crRNA)。在一些实施方案中，单一核糖核酸包含将Cas蛋白引导至细胞中的靶多核苷酸序列的靶基序并且杂交至所述靶基序的引导RNA。在一些实施方案中，核糖核酸中的至少一者包含将Cas蛋白引导至细胞中的靶多核苷酸序列的靶基序并且杂交至所述靶基序的引导RNA。在一些实施方案中，一个至两个核糖核酸中的两者包含将Cas蛋白引导至细胞中的靶多核苷酸序列的靶基序并且杂交至所述靶基序的引导RNA。本公开的核糖核酸可经选择以杂交至各种不同靶基序，这取决于所使用的特定CRISPR/Cas系统、和靶多核苷酸的序列，如本领域技术人员了解。一个至两个核糖核酸还可经选择以最大限度地减少与除了靶多核苷酸序列以外的核酸序列的杂交。在一些实施方案中，一个至两个核糖核酸杂交至靶基序，所述靶基序在与细胞中的所有其他基因组核苷酸序列比较时含有至少两个失配。在一些实施方案中，一个至两个核糖核酸杂交至靶基序，所述靶基序在与细胞中的所有其他基因组核苷酸序列比较时含有至少一个失配。在一些实施方案中，一个至两个核糖核酸经设计以杂交至与通过Cas蛋白识别的脱氧核糖核酸基序直接相邻的靶基序。在一些实施方案中，一个至两个核糖核酸中的每一者经设计以杂交至与通过Cas蛋白识别的脱氧核糖核酸基序直接相邻的靶基序，所述基序侧接位于靶基序之间的突变体等位基因。
在一些实施方案中，一个至两个核糖核酸中的每一者包含将Cas蛋白引导至细胞中的靶多核苷酸序列的靶基序并且杂交至所述靶基序的引导RNA。
在一些实施方案中，一个或两个核糖核酸(例如，引导RNA)与靶多核苷酸序列的同一链上的序列互补和/或杂交。在一些实施方案中，一个或两个核糖核酸(例如，引导RNA)与靶多核苷酸序列的相反链上的序列互补和/或杂交。在一些实施方案中，一个或两个核糖核酸(例如，引导RNA)与靶多核苷酸序列的相反链上的序列不互补和/或不杂交。在一些实施方案中，一个或两个核糖核酸(例如，引导RNA)与靶多核苷酸序列的重叠靶基序互补和/或杂交。在一些实施方案中，一个或两个核糖核酸(例如，引导RNA)与靶多核苷酸序列的偏移靶基序互补和/或杂交。
在一些实施方案中，编码Cas蛋白的核酸和编码至少一个至两个核糖核酸的核酸经由病毒转导(例如，慢病毒转导)来引入细胞中。在一些实施方案中，Cas蛋白与1-2个核糖核酸复合。在一些实施方案中，Cas蛋白与两个核糖核酸复合。在一些实施方案中，Cas蛋白与一个核糖核酸复合。在一些实施方案中，Cas蛋白通过如本文描述的经修饰核酸(例如，合成、修饰mRNA)来编码。
适用于基于CRISPR/Cas的靶向输送本文所述基因的示例性gRNA序列提供于下表20中。所述序列可见于2016年5月9日提交的WO2016/183041中，包括表格、附录和序列表的公开内容通过引用整体并入本文。
表20.适用于靶向基因的示例性gRNA序列
在一些实施方案中，所描述的细胞使用转录活化因子样效应核酸(TALEN)方法来产生。
“TALE-核酸酶”(TALEN)意指含有通常衍生自转录活化因子样效应物(TALE)的核酸结合域和裂解核酸靶序列的一个核酸酶催化域的融合蛋白。催化域优选为核酸酶域并且更优选具有核酸内切酶活性的域，如例如I-TevI、ColE7、NucA和Fok-I。在一个特定实施方案中，TALE域可融合至兆碱基大范围核酸酶如例如I-CreI和I-OnuI或其功能变体。在一个更优选实施方案中，所述核酸酶是单体TALE-核酸酶。单体TALE-核酸酶是不需要二聚化以便特异性识别和裂解的TALE-核酸酶，例如在WO2012138927中描述的工程化TAL重复序列与I-TevI的催化域的融合物。转录活化因子样效应物(TALE)是来自细菌物种黄单孢菌属的包含多个重复序列的蛋白，每个重复序列包含在位置12和13中的二残基(RVD)，所述二残基对于核酸靶向序列的每个核苷酸碱基具有特异性。具有类似模块化碱基对碱基核酸结合性质的结合域(MBBBD)也可衍生自最近由申请者在不同细菌物种中发现的新模块化蛋白。新模块化蛋白具有比TAL重复序列显示更大序列可变性的优点。优选地，与识别不同核苷酸相关的RVD是用于识别C的HD，用于识别T的NG，用于识别A的NI，用于识别G或A的NN，用于识别A、C、G或T的NS，用于识别T的HG，用于识别T的IG，用于识别G的NK，用于识别C的HA，用于识别C的ND，用于识别C的HI，用于识别G的HN，用于识别G的NA，用于识别G或A的SN和用于识别T的YG，用于识别A的TL，用于识别A或G的VT和用于识别A的SW。在另一个实施方案中，关键氨基酸12和13可突变成其他氨基酸残基以便调节其对于核苷酸A、T、C和G的特异性并且尤其增强这种特异性。TALEN试剂盒是商业上出售的。
在一些实施方案中，细胞使用锌指核酸酶(ZFN)来处理。“锌指结合蛋白”是由于经由锌离子的配位使蛋白结构稳定化而优选以序列特异性方式结合DNA、RNA和/或蛋白质的蛋白或多肽。术语锌指结合蛋白经常缩写为锌指蛋白或ZFP。个别DNA结合域通常被称为“指状物”。ZFP具有最少一个指状物、通常两个指状物、三个指状物、或六个指状物。每个指状物结合两个至四个DNA碱基对，通常三个或四个DNA碱基对。ZFP结合至被称为靶位点或靶区段的核酸序列。每个指状物通常包含大约30个氨基酸、锌螯合、DNA结合子区域。研究证明此类别的单一锌指由含有与锌配位的两个不变组氨酸残基的α螺旋以及单一β转角的两个半胱氨酸残基组成(参见例如Berg和Shi，Science 271：1081-1085(1996))。
在一些实施方案中，所公开的细胞使用归巢核酸内切酶来产生。此类归巢核酸内切酶是此项技术熟知的(B.L.Stoddard，QRev Biophys，2005；38(1)：49-952005)。归巢核酸内切酶识别DNA靶序列并且产生单链或双链断裂。归巢核酸内切酶含有高度特异性、识别DNA靶位点，长度在12至45个碱基对(bp)范围内，通常长度在14至40个bp范围内。归巢核酸内切酶可例如对应于LAGLIDADG核酸内切酶、HNH核酸内切酶或GIY-YIG核酸内切酶。根据本公开的优选归巢核酸内切酶可为I-CreI变体。
在一些实施方案中，所描述的细胞使用兆碱基大范围核酸酶来产生。兆碱基大范围核酸酶按照定义为识别较大序列的序列特异性核酸内切酶(Chevalier，B.S.和B.L.Stoddard，Nucleic Acids Res.，2001，29，3757-3774)。它们可裂解活细胞中的独特位点，由此在裂解位点附近增强基因靶向1000倍或更多(Puchta等人，Nucleic Acids Res.，1993，21，5034-5040；Rouet等人，Mol.Cell.Biol.，1994，14，8096-8106；Choulika等人，Mol.Cell.Biol.，1995，15，1968-1973；Puchta等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，1996，93，5055-5060；Sargent等人，Mol.Cell.Biol.，1997，17，267-77；Donoho等人，Mol.Cell.Biol，1998，18，4070-4078；Elliott等人，Mol.Cell.Biol.，1998，18，93-10 1；Cohen-Tannoudji等人，Mol.Cell.Biol.，1998，18，1444-1448)。
在一些实施方案中，本文所述细胞使用RNA缄默或RNA干扰(RNAi)来产生以便敲低(例如，减少、消除或抑制)多肽如免疫抑制因子、致耐受性因子等的表达。可用RNAi方法包括利用合成RNAi分子、短干扰RNA(siRNA)、PIWI-相互作用NRA(piRNA)、短发夹RNA(shRNA)、微小RNA(miRNA)的方法，和本领域技术人员公认的其他瞬时敲低方法。用于包括序列特异性shRNA、siRNA、miRNA等的RNAi的试剂是可购得的。例如，通过引入CIITA siRNA或将CIITAshRNA表达病毒转导至细胞中，CIITA可在多能干细胞中敲低。在一些实施方案中，RNA干扰用于减少或抑制选自包括CIITA、B2M和NLRC5的组中的至少一者的表达。
1.示例性表达构建体
为了将外源基因转移至目标细胞中，使用熟知重组技术来产生如本文概述的重组核酸。适用于在靶细胞中外源表达多肽的许多载体是可利用的。载体可为游离基因，例如质粒、病毒衍生载体如巨细胞病毒、腺病毒等，或者可经由同源重组或随机整合来整合至靶细胞基因组中，例如逆转录病毒衍生载体如MMLV、HIV-1、ALV等。在干细胞的一些实施方案中，慢病毒载体是优选的。
在某些实施方案中，编码免疫抑制因子的重组核酸可操作地连接至表达构建体中的一个或多个调控核苷酸序列。调控核苷酸序列通常适合于待治疗的宿主细胞和受试者。各种宿主细胞的许多类型的适当表达载体和合适调控序列在此项技术中是已知的。通常，一个或多个调控核苷酸序列可包括但不限于启动子序列、前导或信号序列、核糖体结合位点、转录开始和终止序列、翻译开始和终止序列、和增强子或活化子序列。还涵盖如在此项技术中已知的组成性或可诱导启动子。启动子可为天然存在的启动子，或组合一个以上启动子的要素的杂合启动子。表达构建体可在游离基因如质粒上存在于细胞中，或者表达构建体可插入染色体中。在一个特定实施方案中，表达载体包含允许选择转化宿主细胞的可选择标记基因。某些实施方案包括包含可操作地连接至至少一个调控序列的编码变体多肽的核苷酸序列的表达载体。在本文中使用的调控序列包括启动子、增强子和其他表达控制元件。在某些实施方案中，表达载体针对待转化的宿主细胞、需要表达的特定变体多肽、载体的拷贝数、控制所述拷贝数的能力、或通过载体编码的任何其他蛋白如抗生素标志物的表达的选择来设计。
合适的哺乳动物启动子的实例包括例如以下基因的启动子：仓鼠的泛素/S27a启动子(WO 97/15664)、猿猴空泡病毒40(SV40)早期启动子、腺病毒主要晚期启动子、小鼠金属硫蛋白-I启动子、劳斯肉瘤病毒(RSV)的长末端重复区域、小鼠乳瘤病毒启动子(MMTV)、莫罗尼鼠科白血病病毒长末端重复区域和人类巨细胞病毒(CMV)的早期启动子。其他异源哺乳动物启动子的实例为肌动蛋白、免疫球蛋白或热休克启动子。在另外的实施方案中，用于哺乳动物宿主细胞中的启动子可获自病毒如多形瘤病毒、鸡痘病毒(1989年7月5日公布的UK 2,211,504)、牛乳头瘤病毒、鸟类肉瘤病毒、巨细胞病毒、逆转录病毒、乙型肝炎病毒和猿猴病毒40(SV40)的基因组。在其他实施方案中，使用异源哺乳动物启动子。实例包括肌动蛋白启动子、免疫球蛋白启动子和热休克启动子。SV40的早期和晚期启动子便利地作为还含有SV40病毒复制起点的SV40限制片段获得(Fiers等人，Nature，273：113-120(1978))。人类巨细胞病毒的即刻早期启动子便利地作为HindIII限制酶片段获得(Greenaway等人，Gene，18：355-360(1982))。前述参考通过引用整体并入。
将本文所述多核苷酸引入细胞中的方法可通过任何合适技术实现。合适技术包括磷酸钙或脂质介导转染、电穿孔、和使用病毒载体的转导或感染。在一些实施方案中，多核苷酸经由病毒转导(例如，慢病毒转导)来引入细胞中。
一旦改变，本文所述任何分子的表达的存在可使用已知技术如蛋白质印迹法、ELISA测定法、FACS测定法等来测定。
2.低免疫细胞
本文提供了低免疫细胞，包括低免疫干细胞、从那些干细胞分化的细胞、或原代细胞(在本文中统称为“HIP细胞”)，所述细胞经工程化以便在作为同种异体细胞疗法的部分，施用于接受者受试者后，表达免疫调控蛋白并且逃避接受者宿主的免疫系统的排斥。在施用于接受者受试者后，引入安全开关来调节此类细胞的活性是改进这些细胞疗法的安全性的重要技术。
HIP细胞的关键特征是其表达用于抑制植入细胞群体的宿主细胞免疫反应的免疫抑制因子。在一些实施方案中，引入接受者受试者的细胞的低免疫性经由过表达包括例如CD47的低免疫性因子的免疫抑制分子、和补体抑制剂，伴随着抑制或遗传破坏HLA-I和HLA-II基因座来实现。这些修饰使细胞隐藏以避免负责清除受感染、恶性或非自身细胞的接受者免疫系统的效应细胞，例如T细胞、B细胞、NK细胞和巨噬细胞。隐藏细胞以逃避免疫系统允许同种异体细胞在身体中的存在和持久性。工程化细胞从身体中的受控去除对于患者安全而言是至关紧要的并且可通过揭露来自免疫系统的细胞来实现。揭露充当安全开关并且可经由阻断和/或干扰CD47-SIRPα轴或相互作用来实现。
C.低免疫原性表型和保持多能性的测定法
一旦产生低免疫原性细胞或逃避免疫识别的细胞，可针对其免疫原性和/或保持多能性来对其进行测定，如WO2016183041、WO2018132783和WO2018175390所描述。
在一些实施方案中，低免疫原性使用如WO2018132783的图13和图15示例的许多技术来测定。这些技术包括移植至同种异体或异种宿主中并且监测逃避宿主免疫系统的低免疫原性多能细胞生长(例如畸胎瘤)。在一些情况下，低免疫原性细胞衍生物经转导来表达荧光素酶并且可然后使用生物发光成像来跟踪。类似地，宿主动物对于此类细胞的T细胞和/或B细胞反应经测试以便确认细胞不导致宿主动物的免疫反应。T细胞功能通过Elispot、ELISA、FACS、PCR或大量细胞计数法(CYTOF)来评定。B细胞反应或抗体反应使用FACS或Luminex来评定。另外或替代地，细胞可针对其避免先天免疫反应例如NK细胞杀灭的能力来进行测定，如通常在WO2018132783的图14和图15中示出。
在一些实施方案中，细胞的免疫原性使用本领域技术人员公认的T细胞免疫测定法如T细胞增殖测定法、T细胞活化测定法和T细胞杀灭测定法来评估。在一些情况下，T细胞增殖测定法包括用干扰素-γ预处理细胞并且将细胞与经标记T细胞共培养并且在预先选定的时间量之后，测定T细胞群体(或增殖T细胞群体)的存在。在一些情况下，T细胞活化测定法包括将T细胞与本文概述的细胞共培养并且测定T细胞中的T细胞活化标志物的表达水平。
可执行体内测定法以便评估本文概述的细胞的免疫原性。在一些实施方案中，细胞的存活和免疫原性使用同种异体人源化免疫缺陷小鼠模型来测定。在一些情况下，将低免疫原性多能干细胞移植至同种异体人源化NSG-SGM3小鼠中并且测定细胞排斥、细胞存活和畸胎瘤形成。在一些情况下，经移植的低免疫原性多能干细胞或其分化细胞在小鼠模型中展示长期存活。
测定细胞的免疫原性(包括低免疫原性)的额外技术描述于例如Deuse等人，Nature Biotechnology，2019，37，252-258和Han等人，Proc Natl Acad Sci USA，2019，116(21)，10441-10446中，包括附图、图例、和方法的描述的公开内容通过引用整体并入本文。
类似地，多能性的保持以许多方法来测试。在一个实施方案中，多能性通过某些多能性特异性因子的表达来测定，如通常本文描述并且在WO2018132783的图29中示出。另外或替代地，多能细胞分化成一种或多种细胞类型，作为多能性的指示。
如本领域技术人员了解，多能细胞中的MHC I功能(当细胞衍生自人类细胞时为HLA I)的成功减少可使用在此项技术中已知并且如下所述的技术来测量；例如，使用结合HLA复合物的经标记抗体的FACS技术；例如，使用结合至人类主要组织相容性HLA I类抗原的α链的商购HLA-A、B、C抗体。
另外，可测试细胞以便确认HLA I复合物不在细胞表面上表达。这可使用如以上论述的一种或多种HLA细胞表面组分的抗体的FACS分析来测定。
多能细胞或其衍生物中的MHC II功能(当细胞衍生自人类细胞时为HLA II)的成功减少可使用在此项技术中已知的技术例如使用蛋白的抗体的蛋白质印迹法、FACS技术、RT-PCR技术等来测量。
另外，可测试细胞以便确认HLA II复合物不在细胞表面上表达。另外，这种测定法如在此项技术中已知(参见例如WO2018132783的图21)来进行并且通常使用蛋白质印迹法或FACS分析、基于结合至人类HLA II类HLA-DR、DP和大多数DQ抗原的市售抗体来进行。
除了减少HLA I和II(或MHC I和II)以外，所公开的细胞可具有对于巨噬细胞吞噬作用和NK细胞杀灭的减少的敏感性。据认为(不希望受理论束缚)所得细胞逃避免疫巨噬细胞和先天途径是归因于一个或多个CD47转基因的表达。
D.干细胞的分化
本公开提供了可分化成不同细胞类型以便接着移植至受试者中的多能细胞。如本领域技术人员了解，分化方法取决于使用已知技术的所需细胞类型。细胞可在悬浮液中分化，然后置于凝胶基质形式，例如matrigel、明胶、或纤维蛋白/凝血酶形式以便促进细胞存活。在一些情况下，分化如在此项技术中已知来测定，通常通过评估细胞特异性标志物的存在。
在一些实施方案中，多能细胞分化成肝细胞以便解决肝细胞功能损失或肝硬化。许多技术可用于使低免疫原性多能细胞分化成肝细胞；参见例如Pettinato等人，doi：10.1038/spre32888，Snykers等人，Methods Mol Biol 698：305-314(2011)，Si-Tayeb等人，Hepatology51：297-305(2010)和Asgari等人，Stem Cell Rev(：493-504(2013)，所述文献都全部并且尤其针对分化方法和试剂来明确通过引用并入本文。分化如在此项技术中已知来测定，通常通过评估相关肝细胞和/或特异性标志物的存在，包括但不限于白蛋白、甲胎蛋白和纤维蛋白原。分化也可在功能上测量，例如氨的新陈代谢、LDL储存和吸收、ICG吸收和释放以及糖原储存。
在一些实施方案中，多能细胞分化成β样细胞或胰岛类器官供移植以便解决I型糖尿病(T1DM)。细胞系统是解决T1DM的有希望的方法，参见例如Ellis等人，doi/10.1038/nrgastro.2017.93，所述文献通过引用并入本文。另外，Pagliuca等人报告β细胞从人类iPSC成功分化(参见doi/10.106/j.cell.2014.09.040，全部并且尤其针对其中概述的从人类多能干细胞大规模产生功能性人类β细胞的方法和试剂通过引用并入本文)。此外，Vegas等人示出从人类多能干细胞产生人类β细胞，接着囊封以避免宿主的免疫排斥；(doi：10.1038/nm.4030，全部并且尤其针对其中概述的从人类多能干细胞大规模产生功能性人类β细胞的方法和试剂通过引用并入本文)。
分化如在此项技术中已知来测定，通常通过评估相关β细胞或特异性标志物的存在，包括但不限于胰岛素。分化也可在功能上测量，例如测量葡萄糖代谢，通常参见Muraro等人，doi：10.1016/j.cels.2016.09.002，全部并且尤其针对其中概述的生物标志物通过引用并入本文。
在一些实施方案中，多能细胞分化成视网膜色素上皮细胞(RPE)以便解决威胁视力的眼睛疾病。使用Kamao等人，Stem Cell Reports2014：2：205-18概述的技术，人类多能干细胞分化成RPE细胞，所述文献全部并且尤其针对其中概述的关于分化技术和试剂的方法和试剂通过引用并入本文；还参见Mandai等人，doi：10.1056/NEJMoa1608368，所述文献也针对产生RPE细胞薄层并且移植至患者中的技术而全部并入。
分化可如在此项技术中已知来测定，通常通过评估相关RPE和/或特异性标志物的存在或通过在功能上测量。参见例如Kamao等人，doi：10.1016/j.stemcr.2013.12.007，所述文献全部并且尤其针对结果部分的第一段落中概述的标志物通过引用并入本文。
在一些实施方案中，多能细胞分化成心肌细胞以便解决心血管疾病。hiPSC分化成心肌细胞的技术在此项技术中是已知的并且在实例中论述。分化可如在此项技术中已知来测定，通常通过评估相关心肌细胞或特异性标志物的存在或通过在功能上测量；参见例如Loh等人，doi：10.1016/j.cell.2016.06.001，所述文献全部并且尤其针对分化干细胞(包括心肌细胞)的方法来通过引用并入本文。
在一些实施方案中，多能细胞分化成内皮集落形成细胞(ECFC)以形成新血管以便解决周围动脉疾病。分化内皮细胞的技术是已知的。参见例如Prasain等人，doi：10.1038/nbt.3048，所述文献全部并且尤其针对从人类多能干细胞产生内皮细胞的方法和试剂，并且还针对移植技术通过引用并入。分化可如在此项技术中已知来测定，通常通过评估相关内皮细胞或特异性标志物的存在或通过在功能上测量。
在一些实施方案中，多能细胞分化成甲状腺祖细胞和甲状腺滤泡性类器官，所述类器官可分泌甲状腺激素以便解决自身免疫性甲状腺炎。分化甲状腺细胞的技术在此项技术中是已知的。参见例如Kurmann等人，doi：10.106/j.stem.2015.09.004，全部并且尤其针对从人类多能干细胞产生甲状腺细胞的方法和试剂，并且也针对移植技术据此明确通过引用并入。分化可如在此项技术中已知来测定，通常通过评估相关甲状腺细胞或特异性标志物的存在或通过在功能上测量。
分化多能细胞的方法的额外描述可发现于例如Deuse等人，NatureBiotechnology，2019，37，252-258和Han等人，Proc Natl Acad Sci USA，2019，116(21)，10441-10446中。
E.施用/移植原代细胞和/或衍生自原代细胞的细胞
在一些实施方案中，原代细胞或其非原代细胞衍生物使用在此项技术中已知的取决于细胞类型和这些细胞的最终用途两者而定的技术来移植或植入。通常，本公开的细胞可静脉内或通过注射来施用于患者中的特定位置处。当移植于特定位置处时，细胞可悬浮于凝胶基质中以便防止分散。在一些实施方案中，向接受细胞的患者施用免疫抑制剂。在其他实施方案中，不向接受细胞的患者施用免疫抑制剂。
在一些实施方案中，本文提供了一种治疗需要细胞疗法的患者的方法，包括施用包含从包含外源免疫抑制因子的工程化干细胞产生的分化细胞的细胞群体。在可用实施方案中，本文提供了一种治疗需要细胞疗法的患者的方法，包括施用包含从包含外源人类CD47的干细胞产生的分化细胞的细胞群体。总体上，工程化细胞的安全和有效量例如是在患者中引起所需治疗效果，同时最大限度地减少非所需不良效应的量。在另外的实施方案中，向患者施用本文所述的任何CD47-SIRPα阻断剂，并且由此最大限度地减少来自所施用工程化细胞的非所需不良效应。
在一些实施方案中，本文提供了一种治疗需要细胞疗法的患者的方法，包括施用原代T细胞群体，其包含表达外源免疫信号传导因子的原代T细胞。在可用实施方案中，本文提供了一种治疗需要细胞疗法的患者的方法，包括施用原代T细胞群体，其包含表达外源人类CD47的原代T细胞。在一些实施方案中，向患者施用本文所述的任何CD47-SIRPα阻断剂。
在一些实施方案中，当施用于患者的细胞在接受者中经历不适合扩增或增殖时，施用CD47-SIRPα阻断剂。在一些实施方案中，当施用于患者的细胞存在于接受者身体中的不适当位置中时，施用CD47-SIRPα阻断剂。在一些实施方案中，当施用于患者的细胞经历恶性转化时，施用CD47-SIRPα阻断剂。在一些实施方案中，当施用于患者的细胞诱导细胞因子释放综合征时，施用CD47-SIRPα阻断剂。在一些实施方案中，当施用于患者的细胞诱导神经中毒性时，施用CD47-SIRPα阻断剂。在一些实施方案中，当施用于患者的细胞诱导毒性如中靶偏离肿瘤毒性时，施用CD47-SIRPα阻断剂。
在一个方面，所描述的方法包括向有需要的接受者受试者施用一个或多个剂量的CD47工程化细胞群体(例如，外源表达CD47的细胞群体)，并且然后施用CD47-SIRPα阻断剂。在一些实施方案中，接受者受试者接受1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多剂量的细胞群体。在一些实施方案中，患者接受初始剂量的CD47工程化细胞群体，然后向患者施用CD47-SIRPα阻断剂。在特定实施方案中，向患者施用初始剂量的CD47工程化细胞群体，然后施用CD47-SIRPα阻断剂，然后施用后续CD47工程化细胞群体。在某些实施方案中，向患者施用初始剂量的CD47工程化细胞群体，然后第一次施用CD47-SIRPα阻断剂，然后施用后续CD47工程化细胞群体，然后第二次施用CD47-SIRPα阻断剂。CD47工程化细胞群体的初始剂量包括一次或多次(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多次)输注或注射细胞。CD47工程化细胞群体的后续剂量包括一次或多次(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多次)输注或注射细胞。
在另一方面，所述方法包括执行包含治疗周期的治疗方案，所述治疗周期包括施用工程化细胞群体，然后施用CD47-SIRPα阻断剂。在一些实施方案中，治疗方案包含一个或多个(例如，1、2、3、4、或更多个)治疗周期以使得每个治疗周期包括施用工程化细胞群体，然后施用CD47-SIRPα阻断剂。在一些实施方案中，向接受者受试者施用工程化细胞群体的步骤包括施用1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多个剂量的细胞群体。在一些实施方案中，在接受CD47-SIRPα阻断剂之前，向接受者受试者施用1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多个剂量的细胞群体。
在一些实施方案中，本文所述方法包括施用CD47工程化细胞群体，然后在间隔时间段之后，施用CD47-SIRPα阻断剂。在一些情况下，间隔时间段为至少1周或更长。在一些情况下，间隔时间段为至少1个月或更长。在一些情况下，如果接受者受试者表现出通过所施用细胞诱导的不良效应，则间隔时间段结束。在一些实施方案中，如果所施用细胞在接受者中经历不适当扩增或增殖，则间隔时间段结束。在某些实施方案中，如果所施用细胞存在于接受者身体中的不适当位置中，则间隔时间段结束。在特定实施方案中，如果所施用细胞经历恶性转化，则间隔时间段结束。在一些实施方案中，如果所施用细胞诱导细胞因子释放综合征，则间隔时间段结束。在其他实施方案中，如果所施用细胞诱导神经中毒性，则间隔时间段结束。在特定实施方案中，如果所施用细胞诱导毒性例如中靶偏离肿瘤毒性，则间隔时间段结束。
在一些实施方案中，所述方法包括CD47-SIRPα阻断剂疗法的多个周期。在一些情况下，治疗方案包括施用一个或多个剂量的CD47-SIRPα阻断剂以使得所施用细胞和其衍生物(例如，接受者受试者中的所施用细胞和由此类细胞产生的任何细胞)的量减少至少10％(例如，10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更大)。在一些实施方案中，施用CD47-SIRPα阻断剂以使得基本上所有施用细胞经历细胞死亡和/或细胞清除(例如，吞噬作用)。
IV.CD47-SIRPα阻断剂
引入安全开关改进细胞疗法的安全性，例如涉及包含CD47的工程化细胞的疗法。本文描述了用于减少植入接受者受试者中的此类细胞中的CD47的免疫逃避效应的方法。在一些实施方案中，接受者受试者用抑制或阻断CD47和SIRPα相互作用的治疗剂来治疗。在一些实施方案中，CD47-SIRPα阻断剂(例如，CD47-SIRPα阻断、抑制、减少、拮抗、中和或干扰剂)包含选自包括以下各者的组的剂：结合CD47的抗体或其片段、结合CD47的双特异性抗体、结合CD47的免疫细胞因子融合蛋白、含有CD47的融合蛋白、结合SIRPα的抗体或其片段、结合SIRPα的双特异性抗体、结合SIRPα的免疫细胞因子融合蛋白、含有SIRPα的融合蛋白和其组合。在本公开的一个方面，本文提供了一种包括向先前施用包含外源表达CD47蛋白的细胞的患者施用CD47-SIRPα阻断剂的方法。因此，不希望受理论束缚，据认为细胞可不再逃避免疫识别并且由此被患者的免疫细胞识别并且被定为细胞死亡和/或细胞清除的目标。在一些情况下，患者的先天免疫细胞经活化或调动以便减少先前施用细胞和其衍生物(例如，子代)的数目。
本文所述任何CD47-SIRPα阻断剂可用于治疗患有对于细胞疗法作出响应的疾患或疾病的患者。例如，此疾患或疾病可通过存在可通过包含健康细胞的治疗性干预措施来置换的不健康细胞或组织(例如，患病细胞或组织)来表征，包括未处于患病状态中的细胞。在一些实施方案中，向患有疾患或疾病的患者施用预期改善疾患或疾病的一个或多个症状的细胞疗法。任何CD47-SIRPα阻断剂可用于治疗、减少或改善不良效应，所述不良效应在施用包含外源表达CD47多肽的细胞群体之后发生。在一些实施方案中，所述剂用于控制患者中的细胞疗法的效应，调节患者中的细胞疗法的活性，或减少患者中的包含外源表达CD47多肽的细胞的数目。
在一些方面，CD47-SIRPα阻断剂在接受者患者中减少外源表达CD47多肽的细胞的数目，包括但不限于也外源表达一种或多种嵌合抗原受体的细胞。在一些实施方案中，CD47-SIRPα阻断剂降低患者中的CD47表达细胞的数目，而与通过此类细胞的CAR表达水平无关。在一些情况下，与例如但不限于tisagenlecleucel生物类似物、tisagenlecleucel替代物等的对照CAR-T细胞的水平相比，通过所述细胞的CAR表达水平更少(例如，少1％、5％、10％、15％、20％、25％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％或99％)。在某些情况下，与例如但不限于tisagenlecleucel生物类似物、tisagenlecleucel替代物等的对照CAR-T细胞的水平相比，通过所述细胞的CAR表达水平更大(例如，大1％、5％、10％、15％、20％、25％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、100％、150％、200％、300％或更高百分比)。
A.CD47结合阻断剂
在本文提供的方法的一些实施方案中，CD47-SIRPα阻断剂为结合CD47的剂。所述剂可为CD47阻断、中和、拮抗或干扰剂。在一些实施方案中，CD47-SIRPα阻断剂选自包括以下各者的组：结合CD47的抗体或其片段、结合CD47的双特异性抗体和结合CD47的免疫细胞因子融合蛋白。
结合CD47的可用抗体或其片段可选自包括以下各者的组：麦格罗单抗((Hu5F9-G4))(Forty Seven，Inc.；Gilead Sciences，Inc.)、乌拉瑞单抗(urabrelimab)、CC-90002(Celgene；Bristol-Myers Squibb)、IBI-188(Innovent Biologics)、IBI-322(InnoventBiologics)、TG-1801(TG Therapeutics；也称为NI-1701，Novimmune SA)、ALX148(ALXOncology)、TJ011133(也称为TJC4，I-Mab Biopharma)、FA3M3、ZL-1201(Zai Lab Co.，Ltd)、AK117(Akesbio Australia Pty，Ltd.)、AO-176(Arch Onco1ogy)、SRF231(SurfaceOncology)、GenSci-059(GeneScience)、C47B157(Janssen Research and Development)、C47B161(Janssen Research and Development)、C47B167(Janssen Research andDevelopment)、C47B222(Janssen Research and Development)、C47B227(JanssenResearchand Development)、Vx-1004(Corvus Pharmaceuticals)、HMBD004(HummingbirdBioscience Pte Ltd)、SHR-1603(Hengrui)、AMMS4-G4(Beijing Institute ofBiotechnology)、RTX-CD47(University of Groningen)和IMC-002.(Samsung Biologics；ImmuneOncia Therapeutics)。在一些实施方案中，抗体或其片段不与选自包括以下各者的组的抗体竞争CD47结合：麦格罗单抗、乌拉瑞单抗、CC-90002、IBI-188、IBI-322、TG-1801(NI-1701)、ALX148、TJ011133、FA3M3、ZL1201、AK117、AO-176、SRF231、GenSci-059、C47B157、C47B161、C47B167、C47B222、C47B227、Vx-1004、HMBD004、SHR-1603、AMMS4-G4、RTX-CD47和IMC-002。在一些实施方案中，抗体或其片段与选自以下各者的抗体竞争CD47结合：麦格罗单抗、乌拉瑞单抗、CC-90002、IBI-188、IBI-322、TG-1801(NI-1701)、ALX148、TJ011133、FA3M3、ZL1201、AK117、AO-176、SRF231、GenSci-059、C47B157、C47B161、C47B167、C47B222、C47B227、Vx-1004、HMBD004、SHR-1603、AMMS4-G4、RTX-CD47和IMC-002。在一些实施方案中，结合CD47的抗体或其片段选自包括以下各者的组：针对CD47的单链Fv片段(scFv)、针对CD47的Fab、针对CD47的VHH纳米抗体、针对CD47的DARPin和其变体。在一些实施方案中，针对CD47的scFv、针对CD47的Fab和其变体是基于选自包括以下各者的组的任何抗体的抗原结合域：麦格罗单抗、乌拉瑞单抗、CC-90002、IBI-188、IBI-322、TG-1801(NI-1701)、ALX148、TJ011133、FA3M3、ZL1201、AK117、AO-176、SRF231、GenSci-059、C47B157、C47B161、C47B167、C47B222、C47B227、Vx-1004、HMBD004、SHR-1603、AMMS4-G4、RTX-CD47和IMC-002。
结合CD47的可用双特异性抗体包含结合CD47的第一抗原结合域和结合选自包括CD19、CD20、CD22、CD24、CD25、CD30、CD33、CD38、CD44、CD52、CD56、CD70、CD96、CD97、CD99、CD123、CD279(PD-1)、EGFR、HER2、CD117、c-Met、PTHR2、HAVCR2(TIM3)的组的抗原，和在癌细胞上表达的抗原的第二抗原结合域。
在一些实施方案中，CD47-SIRPα阻断剂是包含细胞因子和结合CD47的抗原结合域、抗体或其片段的免疫细胞因子融合蛋白。
示例性CD47结合分子(例如，识别或结合CD47的抗原结合域、抗体、纳米抗体、双功能抗体、抗体模拟物蛋白(例如，DARPin)、和其片段)的详细描述，包括重链、轻链、VH区域、VL区域、CDR和框架区的序列，可见于例如WO2009091601；WO2011143624；WO2013119714；WO201414947；WO2014149477；WO2015138600；WO2016033201；WO2017049251；Pietsch等人，Blood Cancer J，2017，7(2)，e536；van Brommel等人，2018，7(2)，e1386361；Yu等人，Biochimie，2018，151，54-66；和Andrechak等人，Phil Trans R Soc，2019，374，20180217中；例如序列表、说明书和附图的公开内容全部并入本文中。
B.SIRPα结合阻断剂
在一些实施方案中，施用于接受者受试者的CD47-SIRPα阻断剂是结合SIRPα的剂。所述剂可为SIRPα阻断、中和、拮抗或灭活剂。在一些实施方案中，CD47-SIRPα阻断剂选自包括但不限于以下各者的组：结合SIRPα的抗体或其片段、结合SIRPα的双特异性抗体、和结合SIRPα的免疫细胞因子融合蛋白。
结合SIRPα的可用抗体或其片段可选自包括但不限于以下各者的组：ADU-1805(Aduro Biotech Holdings)、OSE-172(OSE Immunotherapeutics；也称为BI 765063，Boehringer Ingelheim)、CC-95251(Celgene；Bristol-Myers Squibb)、KWAR23(LelandStanford Junior University)和P362(Leland Stanford Junior University)。在一些实施方案中，抗体或其片段不与选自包括以下各者的组的抗体竞争SIRPα结合：ADU-1805、CC-95251、OSE-172(BI 765063)、KWAR23和P362。在一些实施方案中，抗体或其片段与选自包括以下各者的组的抗体竞争SIRPα结合：ADU-1805、CC-95251、OSE-172(BI 765063)、KWAR23和P362。
在一些实施方案中，结合SIRPα的抗体或其片段选自包括以下各者的组：针对SIRPα的单链Fv片段(scFv)、针对SIRPα的Fab、针对SIRPα的VHH纳米抗体、针对SIRPα的DARPin和其变体。在一些实施方案中，针对SIRPα的scFv、针对SIRPα的Fab和其变体是基于选自包括以下各者的组的任何抗体的抗原结合域：ADU-1805、CC-95251、OSE-172(BI 765063)、KWAR23和P362。
在一些实施方案中，结合SIRPα的双特异性抗体和结合选自包括CD19、CD20、CD22、CD24、CD25、CD30、CD33、CD38、CD44、CD52、CD56、CD70、CD96、CD97、CD99、CD123、CD279(PD-1)、EGFR、HER2、CD117、C-Met、PTHR2、HAVCR2(TIM3)的组的抗原，和在癌细胞上表达的抗原的抗原结合域。在一些情况下，双特异性抗体结合SIRPα和肿瘤相关抗原。在一些情况下，双特异性抗体结合SIRPα和在免疫细胞表面上表达的抗原。
在一些实施方案中，CD47-SIRPα阻断剂是免疫细胞因子融合蛋白，所述蛋白包含细胞因子和结合SIRPα的抗原结合域、抗体或其片段。
示例性SIRPα结合分子(例如，识别或结合SIRPα的抗原结合域、抗体、纳米抗体、双功能抗体、抗体模拟物蛋白(例如，DARPin)、和其片段)的详细描述，包括重链、轻链、VH区域、VL区域、CDR和框架区的序列，可见于例如WO2019226973；WO2018190719；WO2018057669；WO2017178653；WO2016205042；WO2016033201；WO2016022971；WO2015138600；和WO2013109752中；包括序列表、说明书和附图的公开内容整体并入本文。
C.含有CD47和/或SIRPα的融合蛋白
如本文描述，CD47-SIRPα阻断剂可包含结合SIRPα的含有CD47的融合蛋白。在一些实施方案中，结合SIRPα的此含有CD47的融合蛋白是施用于接受者受试者的剂。在一些实施方案中，含有CD47的融合蛋白包含结合SIRPα的CD47胞外域或其变体。在一些实施方案中，融合蛋白包含Fc区域。示例性CD47融合蛋白的详细描述，包括序列，可见于例如US20100239579中，包括序列表、说明书和附图的公开内容整体并入本文。
在一些实施方案中，CD47-SIRPα阻断剂可包含结合CD47的含有SIRPα的融合蛋白。SIRPα的序列在SEQ ID NO：129(UniProt P78324)中列出。总体上，含有SIRPα的融合蛋白包含SIRPα的域，所述域包括以下中任一者：(a)人类SIRPα的免疫球蛋白样域(例如，含有SIRP的IgV域的膜远侧(D1)环，(b)含有IgC域的第一膜近侧环，和(c)含有IgC域的第二膜近侧环)。在一些情况下，SIRPα域结合CD47。在一些实施方案中，含有SIRPα的融合蛋白包含结合CD47的SIRPα胞外域或其变体。在一些实施方案中，融合蛋白包含Fc区域，包括但不限于人类IgG1 Fc区域(例如，UniProtKB/Swiss-Prot P01857，SEQ ID NO：130)或IgG4 Fc区域(例如，UniProt P01861，SEQ ID NO：131；GenBank CAC20457.1，SEQ ID NO：132)。任选地，Fc区域可包含一个或多个取代。在一些实施方案中，含有SIRPα的融合蛋白选自包括以下各者的组：TTI-621(Trillium Therapeutics)、TTI-622(Trillium Therapeutics)和ALX148(ALXOncology)。TTI-621(SEQ ID NO：133)是由融合至人类IgG1 Fc区域的人类SIRPα的N末端V域组成的融合蛋白(Petrova等人，Clin Cancer Res 23(4)：1068-1079(2017))，而TTI-622(SEQ ID NO：134)是具有单一取代的由融合至人类IgG4 Fc区域的人类SIRPα的N末端V域组成的融合蛋白。
表21.SIRPα、IgG1/IgG4和CD47融合蛋白的示例性序列
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TTI-621、TTI-622和其他相关融合蛋白公开于PCT公开第WO14/94122号中，关于所述蛋白的内容特此通过引用并入本文。AL148是由融合至经修饰人类IgG1 Fc域的SIRPα的N末端D1域组成的融合蛋白(Kauder等人，PLoS One(13(8)：e0201832(2018))。示例性SIRPα融合蛋白(包括序列)的详细描述可见于例如PCT公开第WO14/94122号；第WO16/23040号；第WO17/27422号；第WO17/177333号；和第WO18/176132号中，包括序列表、说明书和附图的公开内容特此整体并入本文。
含有SIRPα的融合蛋白，包括TTI-621，经开发用于单独或与其他癌症治疗药物组合来治疗癌症，例如血液科恶性肿瘤。评估在患有复发/难治性血液科恶性肿瘤和选定实体肿瘤的患者中静脉内TTI-621施用的剂量和安全性(NCT02663518)的1期试验发现TTI-621良好耐受并且作为单一疗法和与其他癌症治疗剂组合均展示活性(Ansell等人，ClinCancer Res 27(8)：2190-2199(2021))。在初始递增阶段中，受试者接受0.05、0.1、0.3、1、3和10mg/kg的剂量的TTI-621以便评估安全性和最大耐受剂量(MTD)。在扩展阶段中，受试者接受作为单一疗法的0.2mg/kg或与利妥昔单抗或纳武单抗(nivolumab)组合的0.1mg/kg的MTD。
V.CD47-SIRPα阻断剂和相关方法的用途
本文公开了使用CD47-SIRPα阻断剂来减少或消除经工程化来表达致耐受性因子如CD47的细胞群体的方法和组合物，其中细胞群体先前施用于受试者。在一些实施方案中，细胞群体进一步经工程化以表达至少一种CAR。在一些实施方案中，细胞群体进一步经工程化以表达额外因子。在一些实施方案中，细胞群体进一步楷工程化以表达至少一种CAR和额外因子。在一些实施方案中，细胞为原代细胞。在一些实施方案中，细胞为T细胞。在一些实施方案中，T细胞从多能细胞如经诱导多能细胞(iPSC)分化。在一些实施方案中，T细胞为原代T细胞。在一些实施方案中，T细胞为同种异体T细胞。在一些实施方案中，细胞为胰岛细胞。在一些实施方案中，胰岛细胞从多能细胞如iPSC分化。在一些实施方案中，胰岛细胞为原代胰岛细胞。在一些实施方案中，胰岛细胞为同种异体胰岛细胞。
在一些实施方案中，本文公开的方法包括向有需要的受试者施用CD47-SIRPα阻断剂，其中先前已向所述受试者施用经工程化以表达外源CD47多肽的细胞群体。在一些实施方案中，细胞是从iPSC分化。在一些实施方案中，细胞为分化细胞。在一些实施方案中，分化细胞选自由以下组成的组：心脏细胞、神经细胞、内皮细胞、T细胞、胰岛细胞、视网膜色素上皮细胞、肝细胞、甲状腺细胞、皮肤细胞、血细胞、原代细胞和上皮细胞。在一些实施方案中，细胞为原代细胞。在一些实施方案中，原代细胞为T细胞或胰岛细胞。在一些实施方案中，原代细胞为T细胞。在一些实施方案中，原代细胞为胰岛细胞。在一些实施方案中，细胞经工程化以表达至少一种选自由以下组成的组的额外因子：CD16、CD24、CD35、CD39、CD46、CD52、CD55、CD59、CD200、CCL22、CTLA4-Ig、C1抑制剂、FASL、IDO1、HLA-C、HLA-E、HLA-E重链、HLA-G、IL-10、IL-35、PD-1、PD-L1、Serpinb9、CCl21、Mfge8和其组合。
在一些实施方案中，额外因子为CD16。在一些实施方案中，额外因子为CD24。在一些实施方案中，额外因子为CD35。在一些实施方案中，额外因子为CD39。在一些实施方案中，额外因子为CD46。在一些实施方案中，额外因子为CD52。在一些实施方案中，额外因子为CD55。在一些实施方案中，额外因子为CD59。在一些实施方案中，额外因子为CD200。在一些实施方案中，额外因子为CCL22。在一些实施方案中，额外因子为CTLA4-Ig。在一些实施方案中，额外因子为C1抑制剂。在一些实施方案中，额外因子为FASL。在一些实施方案中，额外因子为IDO1。在一些实施方案中，额外因子为HLA-C。在一些实施方案中，额外因子为HLA-E。在一些实施方案中，额外因子为HLA-E重链。在一些实施方案中，额外因子为HLA-G。在一些实施方案中，额外因子为IL-10。在一些实施方案中，额外因子为IL-35。在一些实施方案中，额外因子为PD-1。在一些实施方案中，额外因子为PD-L1。在一些实施方案中，额外因子为Serpinb9。在一些实施方案中，额外因子为CCl21。在一些实施方案中，额外因子为Mfge8。在一些实施方案中，细胞具有MHC I类HLA和/或MHC II类HLA分子的减少的表达。
在一些实施方案中，本文公开的方法包括向有需要的受试者施用CD47-SIRPα阻断剂，其中先前已向所述受试者施用经工程化以表达外源CD47多肽的T细胞群体。在一些实施方案中，细胞具有MHC I类HLA和/或MHC II类HLA分子的减少的表达。在一些实施方案中，本文公开的方法包括向有需要的受试者施用CD47-SIRPα阻断剂，其中先前已向所述受试者施用T细胞群体，所述细胞(i)经工程化以表达外源CD47多肽和至少一个嵌合抗原受体(CAR)并且(ii)具有MHC I类HLA分子、MHCII类HLA分子、T细胞受体(TCR)α、和/或TCR β的减少的表达。在一些实施方案中，本文公开的方法包括向有需要的受试者施用CD47-SIRPα阻断剂，其中先前已向所述受试者施用T细胞群体，所述细胞具有MHC I类HLA分子、MHC II类HLA分子和TCRα的减少的表达并且经工程化以表达外源CD47多肽和CD19嵌合抗原受体(CAR)。在一些实施方案中，本文公开的方法包括向有需要的受试者施用CD47-SIRPα阻断剂，其中先前已向所述受试者施用T细胞群体，所述细胞具有MHC I类HLA分子、MHC II类HLA分子和TCRβ的减少的表达并且经工程化以表达外源CD47多肽和CD19嵌合抗原受体(CAR)。在一些实施方案中，CAR结合选自由以下组成的组的抗原：CD19、CD20、CD22、CD38、CD123、CD138、BCMA和其组合。在一些实施方案中，MHC I类和/或MHC II类表达得以敲除。在一些实施方案中，MHCI类HLA的减少表达由B2M的减少表达来介导并且MHC II类的减少表达由CIITA的减少表达来介导。在一些实施方案中，B2M和/或CIITA表达得以敲除。在一些实施方案中，CAR结合CD19抗原并且为CD19 CAR。在一些实施方案中，CAR结合CD20抗原并且为CD20 CAR。在一些实施方案中，CAR结合CD22抗原并且为CD22 CAR。在一些实施方案中，CAR结合CD38抗原并且为CD38 CAR。在一些实施方案中，CAR结合CD123抗原并且为CD123 CAR。在一些实施方案中，CAR结合CD138抗原并且为CD138 CAR。在一些实施方案中，CAR结合BCMA抗原并且为BCMACAR。
在一些实施方案中，T细胞为原代细胞。在一些实施方案中，T细胞为同种异体细胞。在一些实施方案中，T细胞是从iPSC分化。在一些实施方案中，T细胞经工程化以具有TCRα和/或TCRβ的减少的表达。在一些实施方案中，T细胞经工程化以具有细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4(CTLA4)和/或程序性细胞死亡(PD1)的减少的表达。
在一些实施方案中，本文公开的方法包括向有需要的受试者施用CD47-SIRPα阻断剂，其中先前已向所述受试者施用经工程化以表达外源CD47多肽的T细胞群体。在一些实施方案中，T细胞进一步经工程化以表达嵌合抗原受体(CAR)。在一些实施方案中，CAR为选自由以下组成的组的CD19 CAR：tisagenlecleucel、lisocabtagene maraleucel、axicabtagene ciloleucel和brexucabtagene autoleucel。在一些实施方案中，CD19 CAR为tisagenlecleucel。在一些实施方案中，CD19 CAR为lisocabtagene。在一些实施方案中，CD19 CAR为maraleucel。在一些实施方案中，CD19 CAR为axicabtagene。在一些实施方案中，CD19 CAR为ciloleucel。在一些实施方案中，CD19 CAR为brexucabtagene autoleucel。在一些实施方案中，CAR为包含SEQ ID NO：117的氨基酸序列的CD19 CAR。在一些实施方案中，CD19 CAR由SEQ ID NO：116的核酸序列编码。在一些实施方案中，T细胞经工程化以表达至少一种选自由以下组成的组的额外因子：CD16、CD24、CD35、CD39、CD46、CD52、CD55、CD59、CD200、CCL22、CTLA4-Ig、C1抑制剂、FASL、IDO1、HLA-C、HLA-E、HLA-E重链、HLA-G、IL-10、IL-35、PD-1、PD-L1、Serpinb9、CCl21、Mfge8和其组合。在一些实施方案中，额外因子为CD16。在一些实施方案中，额外因子为CD24。在一些实施方案中，额外因子为CD35。在一些实施方案中，额外因子为CD39。在一些实施方案中，额外因子为CD46。在一些实施方案中，额外因子为CD52。在一些实施方案中，额外因子为CD55。在一些实施方案中，额外因子为CD59。在一些实施方案中，额外因子为CD200。在一些实施方案中，额外因子为CCL22。在一些实施方案中，额外因子为CTLA4-Ig。在一些实施方案中，额外因子为C1抑制剂。在一些实施方案中，额外因子为FASL。在一些实施方案中，额外因子为IDO1。在一些实施方案中，额外因子为HLA-C。在一些实施方案中，额外因子为HLA-E。在一些实施方案中，额外因子为HLA-E重链。在一些实施方案中，额外因子为HLA-G。在一些实施方案中，额外因子为IL-10。在一些实施方案中，额外因子为IL-35。在一些实施方案中，额外因子为PD-1。在一些实施方案中，额外因子为PD-L1。在一些实施方案中，额外因子为Serpinb9。在一些实施方案中，额外因子为CC121。在一些实施方案中，额外因子为Mfge8。在一些实施方案中，CAR和编码外源CD47多肽的基因在双顺反子载体中引入T细胞中。在一些实施方案中，双顺反子载体经由慢病毒来引入T细胞中。在一些实施方案中，CAR和编码外源CD47多肽的基因在单一启动子的控制下。
在一些实施方案中，本文公开的方法是一种减少受试者中的经工程化以表达外源CD47多肽的细胞群体的方法，所述方法包括：(a)向所述受试者施用第一剂量的CD47-SIRPα阻断剂；(b)测定在(a)中施用的第一剂量的CD47-SIRPα阻断剂的第一结果；(c)任选地基于(b)中的第一结果，施用第二剂量的CD47-SIRPα阻断剂；以及(d)任选地测定在(c)中施用的第二剂量的CD47-SIRPα阻断剂的第二结果。在一些实施方案中，细胞是从iPSC分化。在一些实施方案中，细胞为分化细胞。在一些实施方案中，分化细胞选自由以下组成的组：心脏细胞、神经细胞、内皮细胞、T细胞、胰岛细胞、视网膜色素上皮细胞、肝细胞、甲状腺细胞、皮肤细胞、血细胞、原代细胞和上皮细胞。在一些实施方案中，细胞为原代细胞。在一些实施方案中，原代细胞为T细胞或胰岛细胞。在一些实施方案中，原代细胞为T细胞。在一些实施方案中，原代细胞为胰岛细胞。在一些实施方案中，细胞经工程化以表达至少一种选自由以下组成的组的额外因子：CD16、CD24、CD35、CD39、CD46、CD52、CD55、CD59、CD200、CCL22、CTLA4-Ig、C1抑制剂、FASL、IDO1、HLA-C、HLA-E、HLA-E重链、HLA-G、IL-10、IL-35、PD-1、PD-L1、Serpinb9、CCl21、Mfge8和其组合。在一些实施方案中，额外因子为CD16。在一些实施方案中，额外因子为CD24。在一些实施方案中，额外因子为CD35。在一些实施方案中，额外因子为CD39。在一些实施方案中，额外因子为CD46。在一些实施方案中，额外因子为CD52。在一些实施方案中，额外因子为CD55。在一些实施方案中，额外因子为CD59。在一些实施方案中，额外因子为CD200。在一些实施方案中，额外因子为CCL22。在一些实施方案中，额外因子为CTLA4-Ig。在一些实施方案中，额外因子为C1抑制剂。在一些实施方案中，额外因子为FASL。在一些实施方案中，额外因子为IDO1。在一些实施方案中，额外因子为HLA-C。在一些实施方案中，额外因子为HLA-E。在一些实施方案中，额外因子为HLA-E重链。在一些实施方案中，额外因子为HLA-G。在一些实施方案中，额外因子为IL-10。在一些实施方案中，额外因子为IL-35。在一些实施方案中，额外因子为PD-1。在一些实施方案中，额外因子为PD-L1。在一些实施方案中，额外因子为Serpinb9。在一些实施方案中，额外因子为CCl21。在一些实施方案中，额外因子为Mfge8。在一些实施方案中，细胞具有MHC I类HLA和/或MHC II类HLA分子的减少的表达。在一些实施方案中，MHC I类和/或MHC II类表达得以敲除。在一些实施方案中，MHC I类HLA的减少表达由B2M的减少表达来介导并且MHC II类的减少表达由CIITA的减少表达来介导。在一些实施方案中，B2M和/或CIITA表达得以敲除。
在一些实施方案中，本文公开的方法是一种减少受试者中的经工程化以表达外源CD47多肽的细胞群体的方法，所述方法包括：(a)向所述受试者施用第一剂量的CD47-SIRPα阻断剂；(b)测定在(a)中施用的第一剂量的CD47-SIRPα阻断剂的第一结果；(c)任选地基于(b)中的第一结果，施用第二剂量的CD47-SIRPα阻断剂；以及(d)任选地测定在(c)中施用的第二剂量的CD47-SIRPα阻断剂的第二结果。在一些实施方案中，第一结果和第二结果独立地选自由以下组成的组：(i)约10％与100％之间的细胞数目的减少，(ii)约10％与100％之间的不良事件的减少，和(iii)(i)和(ii)的组合。在一些实施方案中，第一结果和/或第二结果为不良事件。在一些实施方案中，所述不良事件选自由以下组成的组：异常增生、转化、肿瘤形成、细胞因子释放综合征、移植物抗宿主疾病(GVHD)、免疫效应细胞相关神经中毒性综合征(ICANS)、炎症、感染、恶心、呕吐、出血、间质性肺炎、呼吸道疾病、黄疸、体重损失、腹泻、食欲不振、抽筋、腹部疼痛、肝静脉闭塞疾病(VOD)、移植失败、器官损伤、不育、激素变化、异常生长形成、白内障和移植后淋巴增殖病症(PTLD)。在一些实施方案中，不良事件为异常增生。在一些实施方案中，不良事件为转化。在一些实施方案中，不良事件为肿瘤形成。在一些实施方案中，不良事件为细胞因子释放综合征。在一些实施方案中，不良事件为移植物抗宿主疾病(GVHD)。在一些实施方案中，不良事件为免疫效应细胞相关神经中毒性综合征(ICANS)。在一些实施方案中，不良事件为炎症。在一些实施方案中，不良事件为感染。在一些实施方案中，不良事件为恶心。在一些实施方案中，不良事件为呕吐。在一些实施方案中，不良事件为出血。在一些实施方案中，不良事件为间质性肺炎。在一些实施方案中，不良事件为呼吸道疾病。在一些实施方案中，不良事件为黄疸。在一些实施方案中，不良事件为体重损失。在一些实施方案中，不良事件为腹泻。在一些实施方案中，不良事件为食欲不振。在一些实施方案中，不良事件为抽筋。在一些实施方案中，不良事件为腹部疼痛。在一些实施方案中，不良事件为肝静脉闭塞疾病(VOD)。在一些实施方案中，不良事件为移植失败。在一些实施方案中，不良事件为器官损伤。在一些实施方案中，不良事件为不育。在一些实施方案中，不良事件为激素变化。在一些实施方案中，不良事件为异常生长形成。在一些实施方案中，不良事件为白内障。在一些实施方案中，不良事件为移植后淋巴增殖病症(PTLD)。
在一些实施方案中，本文公开的方法是一种减少受试者中的经工程化以表达外源CD47多肽的细胞群体的方法，所述方法包括：(a)向所述受试者施用第一剂量的CD47-SIRPα阻断剂；(b)测定在(a)中施用的第一剂量的CD47-SIRPα阻断剂的第一结果；(c)任选地基于(b)中的第一结果，施用第二剂量的CD47-SIRPα阻断剂；以及(d)任选地测定在(c)中施用的第二剂量的CD47-SIRPα阻断剂的第二结果。在一些实施方案中，第一结果包括约10％与约15％之间的细胞数目的减少。在一些实施方案中，第一结果包括约15％与约20％之间的细胞数目的减少。在一些实施方案中，第一结果包括约20％与约25％之间的细胞数目的减少。在一些实施方案中，第一结果包括约25％与约30％之间的细胞数目的减少。在一些实施方案中，第一结果包括约30％与约35％之间的细胞数目的减少。在一些实施方案中，第一结果包括约35％与约40％之间的细胞数目的减少。在一些实施方案中，第一结果包括约40％与约45％之间的细胞数目的减少。在一些实施方案中，第一结果包括约45％与约50％之间的细胞数目的减少。在一些实施方案中，第一结果包括约50％与约55％之间的细胞数目的减少。在一些实施方案中，第一结果包括约55％与约60％之间的细胞数目的减少。在一些实施方案中，第一结果包括约60％与约65％之间的细胞数目的减少。在一些实施方案中，第一结果包括约65％与约70％之间的细胞数目的减少。在一些实施方案中，第一结果包括约70％与约75％之间的细胞数目的减少。在一些实施方案中，第一结果包括约75％与约80％之间的细胞数目的减少。在一些实施方案中，第一结果包括约80％与约85％之间的细胞数目的减少。在一些实施方案中，第一结果包括约85％与约90％之间的细胞数目的减少。在一些实施方案中，第一结果包括约90％与约95％之间的细胞数目的减少。在一些实施方案中，第一结果包括约95％与约100％之间的细胞数目的减少。
在一些实施方案中，本文公开的方法是一种减少受试者中的经工程化以表达外源CD47多肽的细胞群体的方法，所述方法包括：(a)向所述受试者施用第一剂量的CD47-SIRPα阻断剂；(b)测定在(a)中施用的第一剂量的CD47-SIRPα阻断剂的第一结果；(c)任选地基于(b)中的第一结果，施用第二剂量的CD47-SIRPα阻断剂；以及(d)任选地测定在(c)中施用的第二剂量的CD47-SIRPα阻断剂的第二结果。在一些实施方案中，第一结果包含约10％与约15％之间的不良事件的减少。在一些实施方案中，第一结果包含约15％与约20％之间的不良事件的减少。在一些实施方案中，第一结果包含约20％与约25％之间的不良事件的减少。在一些实施方案中，第一结果包含约25％与约30％之间的不良事件的减少。在一些实施方案中，第一结果包含约30％与约35％之间的不良事件的减少。在一些实施方案中，第一结果包含约35％与约40％之间的不良事件的减少。在一些实施方案中，第一结果包含约40％与约45％之间的不良事件的减少。在一些实施方案中，第一结果包含约45％与约50％之间的不良事件的减少。在一些实施方案中，第一结果包含约50％与约55％之间的不良事件的减少。在一些实施方案中，第一结果包含约55％与约60％之间的不良事件的减少。在一些实施方案中，第一结果包含约60％与约65％之间的不良事件的减少。在一些实施方案中，第一结果包含约65％与约70％之间的不良事件的减少。在一些实施方案中，第一结果包含约70％与约75％之间的不良事件的减少。在一些实施方案中，第一结果包含约75％与约80％之间的不良事件的减少。在一些实施方案中，第一结果包含约80％与约85％之间的不良事件的减少。在一些实施方案中，第一结果包含约85％与约90％之间的不良事件的减少。在一些实施方案中，第一结果包含约90％与约95％之间的不良事件的减少。在一些实施方案中，第一结果包含约95％与约100％之间的不良事件的减少。
在一些实施方案中，本文公开的方法是一种减少受试者中的经工程化以表达外源CD47多肽的细胞群体的方法，所述方法包括：(a)向所述受试者施用第一剂量的CD47-SIRPα阻断剂；(b)测定在(a)中施用的第一剂量的CD47-SIRPα阻断剂的第一结果；(c)任选地基于(b)中的第一结果，施用第二剂量的CD47-SIRPα阻断剂；以及(d)任选地测定在(c)中施用的第二剂量的CD47-SIRPα阻断剂的第二结果。在一些实施方案中，第二结果包括约10％与约15％之间的细胞数目的减少。在一些实施方案中，第二结果包括约15％与约20％之间的细胞数目的减少。在一些实施方案中，第二结果包括约20％与约25％之间的细胞数目的减少。在一些实施方案中，第二结果包括约25％与约30％之间的细胞数目的减少。在一些实施方案中，第二结果包括约30％与约35％之间的细胞数目的减少。在一些实施方案中，第二结果包括约35％与约40％之间的细胞数目的减少。在一些实施方案中，第二结果包括约40％与约45％之间的细胞数目的减少。在一些实施方案中，第二结果包括约45％与约50％之间的细胞数目的减少。在一些实施方案中，第二结果包括约50％与约55％之间的细胞数目的减少。在一些实施方案中，第二结果包括约55％与约60％之间的细胞数目的减少。在一些实施方案中，第二结果包括约60％与约65％之间的细胞数目的减少。在一些实施方案中，第二结果包括约65％与约70％之间的细胞数目的减少。在一些实施方案中，第二结果包括约70％与约75％之间的细胞数目的减少。在一些实施方案中，第二结果包括约75％与约80％之间的细胞数目的减少。在一些实施方案中，第二结果包括约80％与约85％之间的细胞数目的减少。在一些实施方案中，第二结果包括约85％与约90％之间的细胞数目的减少。在一些实施方案中，第二结果包括约90％与约95％之间的细胞数目的减少。在一些实施方案中，第二结果包括约95％与约100％之间的细胞数目的减少。
在一些实施方案中，本文公开的方法是一种减少受试者中的经工程化以表达外源CD47多肽的细胞群体的方法，所述方法包括：(a)向所述受试者施用第一剂量的CD47-SIRPα阻断剂；(b)测定在(a)中施用的第一剂量的CD47-SIRPα阻断剂的第一结果；(c)任选地基于(b)中的第一结果，施用第二剂量的CD47-SIRPα阻断剂；以及(d)任选地测定在(c)中施用的第二剂量的CD47-SIRPα阻断剂的第二结果。在一些实施方案中，第二结果包含约10％与约15％之间的不良事件的减少。在一些实施方案中，第二结果包含约15％与约20％之间的不良事件的减少。在一些实施方案中，第二结果包含约20％与约25％之间的不良事件的减少。在一些实施方案中，第二结果包含约25％与约30％之间的不良事件的减少。在一些实施方案中，第二结果包含约30％与约35％之间的不良事件的减少。在一些实施方案中，第二结果包含约35％与约40％之间的不良事件的减少。在一些实施方案中，第二结果包含约40％与约45％之间的不良事件的减少。在一些实施方案中，第二结果包含约45％与约50％之间的不良事件的减少。在一些实施方案中，第二结果包含约50％与约55％之间的不良事件的减少。在一些实施方案中，第二结果包含约55％与约60％之间的不良事件的减少。在一些实施方案中，第二结果包含约60％与约65％之间的不良事件的减少。在一些实施方案中，第二结果包含约65％与约70％之间的不良事件的减少。在一些实施方案中，第二结果包含约70％与约75％之间的不良事件的减少。在一些实施方案中，第二结果包含约75％与约80％之间的不良事件的减少。在一些实施方案中，第二结果包含约80％与约85％之间的不良事件的减少。在一些实施方案中，第二结果包含约85％与约90％之间的不良事件的减少。在一些实施方案中，第二结果包含约90％与约95％之间的不良事件的减少。在一些实施方案中，第二结果包含约95％与约100％之间的不良事件的减少。
在一些实施方案中，本文公开的方法包括：(a)量化受试者中的经工程化以表达外源CD47多肽的细胞群体；(b)测定有效减少细胞群体至少20％的CD47-SIRPα阻断剂的第一剂量；以及(c)将第一剂量的CD47-SIRPα阻断剂施用于受试者。在一些实施方案中，细胞是从iPSC分化。在一些实施方案中，细胞为分化细胞。在一些实施方案中，分化细胞选自由以下组成的组：心脏细胞、神经细胞、内皮细胞、T细胞、胰岛细胞、视网膜色素上皮细胞、肝细胞、甲状腺细胞、皮肤细胞、血细胞、原代细胞和上皮细胞。在一些实施方案中，细胞为原代细胞。在一些实施方案中，原代细胞为T细胞或胰岛细胞。在一些实施方案中，原代细胞为T细胞。在一些实施方案中，原代细胞为胰岛细胞。在一些实施方案中，细胞经工程化以表达至少一种选自由以下组成的组的额外因子：CD16、CD24、CD35、CD39、CD46、CD52、CD55、CD59、CD200、CCL22、CTLA4-Ig、C1抑制剂、FASL、IDO1、HLA-C、HLA-E、HLA-E重链、HLA-G、IL-10、IL-35、PD-1、PD-L1、Serpinb9、CCl21、Mfge8和其组合。在一些实施方案中，额外因子为CD16。在一些实施方案中，额外因子为CD24。在一些实施方案中，额外因子为CD35。在一些实施方案中，额外因子为CD39。在一些实施方案中，额外因子为CD46。在一些实施方案中，额外因子为CD52。在一些实施方案中，额外因子为CD55。在一些实施方案中，额外因子为CD59。在一些实施方案中，额外因子为CD200。在一些实施方案中，额外因子为CCL22。在一些实施方案中，额外因子为CTLA4-Ig。在一些实施方案中，额外因子为C1抑制剂。在一些实施方案中，额外因子为FASL。在一些实施方案中，额外因子为IDO1。在一些实施方案中，额外因子为HLA-C。在一些实施方案中，额外因子为HLA-E。在一些实施方案中，额外因子为HLA-E重链。在一些实施方案中，额外因子为HLA-G。在一些实施方案中，额外因子为IL-10。在一些实施方案中，额外因子为IL-35。在一些实施方案中，额外因子为PD-1。在一些实施方案中，额外因子为PD-L1。在一些实施方案中，额外因子为Serpinb9。在一些实施方案中，额外因子为CCl21。在一些实施方案中，额外因子为Mfge8。在一些实施方案中，细胞具有MHC I类HLA和/或MHC II类HLA分子的减少的表达。在一些实施方案中，MHC I类和/或MHC II类表达得以敲除。在一些实施方案中，MHC I类HLA的减少表达由B2M的减少表达来介导并且MHC II类的减少表达由CIITA的减少表达来介导。在一些实施方案中，B2M和/或CIITA表达得以敲除。
在一些实施方案中，本文公开的方法包括：(a)量化受试者中的经工程化以表达外源CD47多肽的细胞群体；(b)测定有效减少细胞群体至少20％的CD47-SIRPα阻断剂的第一剂量；以及(c)将第一剂量的CD47-SIRPα阻断剂施用于受试者。在一些实施方案中，第一剂量有效减少细胞群体约20％与约30％之间。在一些实施方案中，第一剂量有效减少细胞群体约30％与约40％之间。在一些实施方案中，第一剂量有效减少细胞群体约40％与约50％之间。在一些实施方案中，第一剂量有效减少细胞群体约50％与约60％之间。在一些实施方案中，第一剂量有效减少细胞群体约60％与约70％之间。在一些实施方案中，第一剂量有效减少细胞群体约70％与约80％之间。在一些实施方案中，第一剂量有效减少细胞群体约80％与约90％之间。在一些实施方案中，第一剂量有效减少细胞群体约90％与约100％之间。
在一些实施方案中，本文公开的方法包括：(a)量化受试者中的经工程化以表达外源CD47多肽的细胞群体；(b)测定有效减少细胞群体至少20％的CD47-SIRPα阻断剂的第一剂量；以及(c)将第一剂量的CD47-SIRPα阻断剂施用于受试者。在一些实施方案中，第一剂量和/或第二剂量按以下方式施用：(i)以0.05、0.1、0.3、1、3或10mg/kg；(ii)每12小时一次、每24小时一次、每36小时一次或每48小时一次；和/或(iii)1天与3周之间。在一些实施方案中，第一剂量和第二剂量是相同的。在一些实施方案中，第一剂量和/或第二剂量以0.05mg/kg施用。在一些实施方案中，第一剂量和/或第二剂量以0.1mg/kg施用。在一些实施方案中，第一剂量和/或第二剂量以0.3mg/kg施用。在一些实施方案中，第一剂量和/或第二剂量以1mg/kg施用。在一些实施方案中，第一剂量和/或第二剂量以3mg/kg施用。在一些实施方案中，第一剂量和/或第二剂量以10mg/kg施用。在一些实施方案中，第一剂量和/或第二剂量以约0.01mg/kg与约20mg/kg之间施用。在一些实施方案中，第一剂量和/或第二剂量以约0.01mg/kg与约0.05mg/kg之间施用。在一些实施方案中，第一剂量和/或第二剂量以约0.05mg/kg与约0.1mg/kg之间施用。在一些实施方案中，第一剂量和/或第二剂量以约0.1mg/kg与约0.5mg/kg之间施用。在一些实施方案中，第一剂量和/或第二剂量以约0.5mg/kg与约1mg/kg之间施用。在一些实施方案中，第一剂量和/或第二剂量以约1mg/kg与约5mg/kg之间施用。在一些实施方案中，第一剂量和/或第二剂量以约5mg/kg与约10mg/kg之间施用。在一些实施方案中，第一剂量和/或第二剂量以约10mg/kg与约15mg/kg之间施用。在一些实施方案中，第一剂量和/或第二剂量以约15mg/kg与约20mg/kg之间施用。
在一些实施方案中，本文公开的方法包括：(a)量化受试者中的经工程化以表达外源CD47多肽的细胞群体；(b)测定有效减少细胞群体至少20％的CD47-SIRPα阻断剂的第一剂量；以及(c)将第一剂量的CD47-SIRPα阻断剂施用于受试者。在一些实施方案中，第一剂量和/或第二剂量每6小时施用一次。在一些实施方案中，第一剂量和/或第二剂量每12小时施用一次。在一些实施方案中，第一剂量和/或第二剂量每18小时施用一次。在一些实施方案中，第一剂量和/或第二剂量每24小时施用一次。在一些实施方案中，第一剂量和/或第二剂量每36小时施用一次。在一些实施方案中，第一剂量和/或第二剂量每48小时施用一次。在一些实施方案中，第一剂量和/或第二剂量每3天施用一次。在一些实施方案中，第一剂量和/或第二剂量每4天施用一次。在一些实施方案中，第一剂量和/或第二剂量每5天施用一次。在一些实施方案中，第一剂量和/或第二剂量每6天施用一次。在一些实施方案中，第一剂量和/或第二剂量每7天施用一次。在一些实施方案中，第一剂量和/或第二剂量每2周施用一次。在一些实施方案中，第一剂量和/或第二剂量每4周施用一次。在一些实施方案中，第一剂量和/或第二剂量每6周施用一次。在一些实施方案中，第一剂量和/或第二剂量每8周施用一次。在一些实施方案中，第一剂量和/或第二剂量每3个月施用一次。在一些实施方案中，第一剂量和/或第二剂量每4个月施用一次。在一些实施方案中，第一剂量和/或第二剂量每5个月施用一次。在一些实施方案中，第一剂量和/或第二剂量每6个月施用一次。在一些实施方案中，第一剂量和/或第二剂量每约6个月与约12个月之间施用一次。在一些实施方案中，第一剂量和/或第二剂量每18个月施用一次。在一些实施方案中，第一剂量和/或第二剂量每24个月施用一次。在一些实施方案中，第一剂量和/或第二剂量每3年施用一次。在一些实施方案中，第一剂量和/或第二剂量每4年施用一次。在一些实施方案中，第一剂量和/或第二剂量每5年施用一次。
在一些实施方案中，本文公开的方法包括：(a)量化受试者中的经工程化以表达外源CD47多肽的细胞群体；(b)测定有效减少细胞群体至少20％的CD47-SIRPα阻断剂的第一剂量；以及(c)将第一剂量的CD47-SIRPα阻断剂施用于受试者。在一些实施方案中，施用第一剂量和/或第二剂量持续约1天与约50年之间。在一些实施方案中，施用第一剂量和/或第二剂量持续约1天与约1周之间。在一些实施方案中，施用第一剂量和/或第二剂量持续约1周与约2周之间。在一些实施方案中，施用第一剂量和/或第二剂量持续约2周与约3周之间。在一些实施方案中，施用第一剂量和/或第二剂量持续约3周与约1个月之间。在一些实施方案中，施用第一剂量和/或第二剂量持续约1个月与约2个月之间。在一些实施方案中，施用第一剂量和/或第二剂量持续约2个月与约3个月之间。在一些实施方案中，施用第一剂量和/或第二剂量持续约3个月与约4个月之间。在一些实施方案中，施用第一剂量和/或第二剂量持续约4个月与约5个月之间。在一些实施方案中，施用第一剂量和/或第二剂量持续约5个月与约6个月之间。在一些实施方案中，施用第一剂量和/或第二剂量持续约6个月与约1年之间。在一些实施方案中，施用第一剂量和/或第二剂量持续约1年与约2年之间。在一些实施方案中，施用第一剂量和/或第二剂量持续约2年与约3年之间。在一些实施方案中，施用第一剂量和/或第二剂量持续约3年与约4年之间。在一些实施方案中，施用第一剂量和/或第二剂量持续约4年与约5年之间。在一些实施方案中，施用第一剂量和/或第二剂量持续约5年与约10年之间。在一些实施方案中，施用第一剂量和/或第二剂量持续约10年与约15年之间。在一些实施方案中，施用第一剂量和/或第二剂量持续约15年与约20年之间。在一些实施方案中，施用第一剂量和/或第二剂量持续约20年与约30年之间。在一些实施方案中，施用第一剂量和/或第二剂量持续约30年与约40年之间。在一些实施方案中，施用第一剂量和/或第二剂量持续约40年与约50年之间。在一些实施方案中，施用第一剂量和/或第二剂量持续受试者的一生。
在一些实施方案中，本文公开的方法包括向有需要的受试者施用CD47-SIRPα阻断剂，其中先前已向所述受试者施用经工程化以表达外源CD47多肽的胰岛细胞群体。在一些实施方案中，本文公开的方法包括向有需要的受试者施用CD47-SIRPα阻断剂，其中先前已向所述受试者施用胰岛细胞群体，所述细胞(i)经工程化以表达外源CD47多肽并且(ii)具有MHC I类HLA和/或MHC II类HLA分子的减少的表达。在一些实施方案中，本文公开的方法包括向有需要的受试者施用CD47-SIRPα阻断剂，其中先前已向所述受试者施用胰岛细胞群体，所述细胞(i)经工程化以表达外源CD47、CD46和CD59多肽并且(ii)具有MHC I类HLA和/或MHC II类HLA分子的减少的表达。在一些实施方案中，MHC I类和/或MHC II类表达得以敲除。在一些实施方案中，MHC I类HLA的减少表达由B2M的减少表达来介导并且MHC II类的减少表达由CIITA的减少表达来介导。在一些实施方案中，B2M和/或CIITA表达得以敲除。在一些实施方案中，胰岛细胞经工程化以具有CD142的减少的表达。在一些实施方案中，胰岛细胞为原代细胞。在一些实施方案中，胰岛细胞是从iPSC分化。
在一些实施方案中，本文公开的方法包括向有需要的受试者施用CD47-SIRPα阻断剂，其中先前已向所述受试者施用经工程化以表达外源CD47多肽的胰岛细胞群体。在一些实施方案中，胰岛细胞经工程化以表达至少一种选自由以下组成的组的额外因子：CD16、CD24、CD35、CD39、CD46、CD52、CD55、CD59、CD200、CCL22、CTLA4-Ig、C1抑制剂、FASL、IDO1、HLA-C、HLA-E、HLA-E重链、HLA-G、IL-10、IL-35、PD-1、PD-L1、Serpinb9、CCl21、Mfge8和其组合。在一些实施方案中，额外因子为CD16。在一些实施方案中，额外因子为CD24。在一些实施方案中，额外因子为CD35。在一些实施方案中，额外因子为CD39。在一些实施方案中，额外因子为CD46。在一些实施方案中，额外因子为CD52。在一些实施方案中，额外因子为CD55。在一些实施方案中，额外因子为CD59。在一些实施方案中，额外因子为CD200。在一些实施方案中，额外因子为CCL22。在一些实施方案中，额外因子为CTLA4-Ig。在一些实施方案中，额外因子为C1抑制剂。在一些实施方案中，额外因子为FASL。在一些实施方案中，额外因子为IDO1。在一些实施方案中，额外因子为HLA-C。在一些实施方案中，额外因子为HLA-E。在一些实施方案中，额外因子为HLA-E重链。在一些实施方案中，额外因子为HLA-G。在一些实施方案中，额外因子为IL-10。在一些实施方案中，额外因子为IL-35。在一些实施方案中，额外因子为PD-1。在一些实施方案中，额外因子为PD-L1。在一些实施方案中，额外因子为Serpinb9。在一些实施方案中，额外因子为CCl21。在一些实施方案中，额外因子为Mfge8。
在一些实施方案中，本文公开的方法包括向有需要的受试者施用CD47-SIRPα阻断剂，其中先前已向所述受试者施用经工程化以表达外源CD47多肽的细胞群体。在一些实施方案中，编码外源CD47多肽的基因经由同源引导修复(HDR)介导插入细胞的基因组基因座中来引入细胞中。在一些实施方案中，基因组基因座选自由以下组成的组：B2M基因座、CIITA基因座、TRAC基因座、TRBC基因座和安全港基因座。在一些实施方案中，基因组基因座为B2M基因座。在一些实施方案中，基因组基因座为CIITA基因座。在一些实施方案中，基因组基因座为TRAC基因座。在一些实施方案中，基因组基因座为TRBC基因座。在一些实施方案中，基因组基因座为安全港基因座。在一些实施方案中，安全港基因座选自由以下组成的组：AAVS1、ABO、CCR5、CLYBL、CXCR4、F3、FUT1、HMGB1、KDM5D、LRP1、MICA、MICB、RHD、ROSA26和SHS231基因座。在一些实施方案中，安全港基因座为AAVS1基因座。在一些实施方案中，安全港基因座为ABO基因座。在一些实施方案中，安全港基因座为CCR5基因座。在一些实施方案中，安全港基因座为CLYBL基因座。在一些实施方案中，安全港基因座为CXCR4基因座。在一些实施方案中，安全港基因座为F3基因座。在一些实施方案中，安全港基因座为FUT1基因座。在一些实施方案中，安全港基因座为HMGB1基因座。在一些实施方案中，安全港基因座为KDM5D基因座。在一些实施方案中，安全港基因座为LRP1基因座。在一些实施方案中，安全港基因座为MICA基因座。在一些实施方案中，安全港基因座为MICB基因座。在一些实施方案中，安全港基因座为RHD基因座。在一些实施方案中，安全港基因座为ROSA26基因座。在一些实施方案中，安全港基因座为SHS231基因座。在一些实施方案中，细胞具有MHC I类HLA和/或MHC II类HLA分子的减少的表达。在一些实施方案中，MHC I类和/或MHC II类表达得以敲除。在一些实施方案中，MHC I类HLA的减少表达由B2M的减少表达来介导并且MHC II类的减少表达由CIITA的减少表达来介导。在一些实施方案中，B2M和/或CIITA表达得以敲除。
在一些实施方案中，本文公开的方法包括向有需要的受试者施用CD47-SIRPα阻断剂，其中先前已向所述受试者施用经工程化以表达外源CD47多肽的细胞群体。在一些实施方案中，CD47-SIRPα阻断剂在向受试者施用细胞之后至少一天施用。在一些实施方案中，CD47-SIRPα阻断剂在向受试者施用细胞之后至少两天施用。在一些实施方案中，CD47-SIRPα阻断剂在向受试者施用细胞之后至少三天施用。在一些实施方案中，CD47-SIRPα阻断剂在向受试者施用细胞之后至少四天施用。在一些实施方案中，CD47-SIRPα阻断剂在向受试者施用细胞之后至少五天施用。在一些实施方案中，CD47-SIRPα阻断剂在向受试者施用细胞之后至少六天施用。在一些实施方案中，CD47-SIRPα阻断剂在向受试者施用细胞之后至少一周施用。在一些实施方案中，CD47-SIRPα阻断剂在向受试者施用细胞之后至少两周施用。在一些实施方案中，CD47-SIRPα阻断剂在向受试者施用细胞之后至少三周施用。在一些实施方案中，CD47-SIRPα阻断剂在向受试者施用细胞之后至少一个月施用。在一些实施方案中，CD47-SIRPα阻断剂在向受试者施用细胞之后至少两个月施用。在一些实施方案中，CD47-SIRPα阻断剂在向受试者施用细胞之后至少三个月施用。在一些实施方案中，CD47-SIRPα阻断剂在向受试者施用细胞之后至少四个月施用。在一些实施方案中，CD47-SIRPα阻断剂在向受试者施用细胞之后至少五个月施用。在一些实施方案中，CD47-SIRPα阻断剂在向受试者施用细胞之后至少六个月施用。在一些实施方案中，CD47-SIRPα阻断剂在向受试者施用细胞之后至少1年施用。
在一些实施方案中，本文公开的方法包括向有需要的受试者施用CD47-SIRPα阻断剂，其中先前已向所述受试者施用经工程化以表达外源CD47多肽的细胞群体。在一些实施方案中，CD47-SIRPα阻断剂在受试者经历与施用细胞相关的不良事件之后施用。在一些实施方案中，不良事件选自由以下组成的组：异常增生、转化、肿瘤形成、细胞因子释放综合征、移植物抗宿主疾病(GVHD)、免疫效应细胞相关神经中毒性综合征(ICANS)、炎症、感染、恶心、呕吐、出血、间质性肺炎、呼吸道疾病、黄疸、体重损失、腹泻、食欲不振、抽筋、腹部疼痛、肝静脉闭塞疾病(VOD)、移植失败、器官损伤、不育、激素变化、异常生长形成、白内障和移植后淋巴增殖病症(PTLD)。在一些实施方案中，不良事件为异常增生。在一些实施方案中，不良事件为转化。在一些实施方案中，不良事件为肿瘤形成。在一些实施方案中，不良事件为细胞因子释放综合征。在一些实施方案中，不良事件为移植物抗宿主疾病(GVHD)。在一些实施方案中，不良事件为免疫效应细胞相关神经中毒性综合征(ICANS)。在一些实施方案中，不良事件为炎症。在一些实施方案中，不良事件为感染。在一些实施方案中，不良事件为恶心。在一些实施方案中，不良事件为呕吐。在一些实施方案中，不良事件为出血。在一些实施方案中，不良事件为间质性肺炎。在一些实施方案中，不良事件为呼吸道疾病。在一些实施方案中，不良事件为黄疸。在一些实施方案中，不良事件为体重损失。在一些实施方案中，不良事件为腹泻。在一些实施方案中，不良事件为食欲不振。在一些实施方案中，不良事件为抽筋。在一些实施方案中，不良事件为腹部疼痛。在一些实施方案中，不良事件为肝静脉闭塞疾病(VOD)。在一些实施方案中，不良事件为移植失败。在一些实施方案中，不良事件为器官损伤。在一些实施方案中，不良事件为不育。在一些实施方案中，不良事件为激素变化。在一些实施方案中，不良事件为异常生长形成。在一些实施方案中，不良事件为白内障。在一些实施方案中，不良事件为移植后淋巴增殖病症(PTLD)。
在一些实施方案中，本文公开的方法包括向有需要的受试者施用CD47-SIRPα阻断剂，其中先前已向所述受试者施用经工程化以表达外源CD47多肽的细胞群体。在一些实施方案中，CD47-SIRPα阻断剂包含CD47结合域。在一些实施方案中，CD47结合域包含信号调控蛋白α(SIRPα)或其片段。在一些实施方案中，CD47-SIRPα阻断剂包含免疫球蛋白G(IgG)Fc域。在一些实施方案中，IgG Fc域包含IgG1 Fc域。在一些实施方案中，IgG1 Fc域包含人类抗体的片段。在一些实施方案中，CD47-SIRPα阻断剂选自由TTI-621、TTI-622和ALX148组成的组。在一些实施方案中，CD47-SIRPα阻断剂为TTI-621、TTI-622和ALX148。在一些实施方案中，CD47-SIRPα阻断剂为TTI-622。在一些实施方案中，CD47-SIRPα阻断剂为ALX148。在一些实施方案中，IgG Fc域包含IgG4 Fc域。在一些实施方案中，CD47-SIRPα阻断剂为抗体。在一些实施方案中，抗体选自由以下组成的组：MIAP410、B6H12和麦格罗单抗。在一些实施方案中，抗体为MIAP410。在一些实施方案中，抗体为B6H12。在一些实施方案中，抗体为麦格罗单抗。
在一些实施方案中，本文公开的方法包括向有需要的受试者施用CD47-SIRPα阻断剂，其中先前已向所述受试者施用经工程化以表达外源CD47多肽的细胞群体。在一些实施方案中，CD47-SIRPα阻断剂以有效减少细胞群体的剂量施用。在一些实施方案中，细胞群体减少约10％与100％之间。在一些实施方案中，细胞群体减少约10％与约20％之间。在一些实施方案中，细胞群体减少约20％与约30％之间。在一些实施方案中，细胞群体减少约30％与约40％之间。在一些实施方案中，细胞群体减少约40％与约50％之间。在一些实施方案中，细胞群体减少约50％与约60％之间。在一些实施方案中，细胞群体减少约60％与约70％之间。在一些实施方案中，细胞群体减少约70％与约80％之间。在一些实施方案中，细胞群体减少约80％与约90％之间。在一些实施方案中，细胞群体减少约90％与约100％之间。在一些实施方案中，细胞群体得以消除。在一些实施方案中，细胞群体的减少经由免疫反应而发生。在一些实施方案中，免疫反应为细胞的NK细胞介导的细胞杀灭、巨噬细胞介导的细胞杀灭、补体依赖性细胞毒性(CDC)和/或抗体依赖性细胞毒性(ADCC)。在一些实施方案中，免疫反应为细胞的NK细胞介导的细胞杀灭。在一些实施方案中，免疫反应为细胞的巨噬细胞介导的细胞杀灭。在一些实施方案中，免疫反应为细胞的补体依赖性细胞毒性(CDC)。在一些实施方案中，免疫反应为细胞的抗体依赖性细胞毒性(ADCC)。
在一些实施方案中，本文公开的方法包括向有需要的受试者施用CD47-SIRPα阻断剂，其中先前已向所述受试者施用经工程化以表达外源CD47多肽的细胞群体。在一些实施方案中，CD47-SIRPα阻断剂经静脉内、皮下、腹膜内、肌肉内或颅内施用于受试者。在一些实施方案中，CD47-SIRPα阻断剂经静脉内施用于受试者。在一些实施方案中，CD47-SIRPa阻断剂经皮下施用于受试者。在一些实施方案中，CD47-SIRPa阻断剂经腹膜内施用于受试者。在一些实施方案中，CD47-SIRPα阻断剂经肌肉内施用于受试者。在一些实施方案中，CD47-SIRPα阻断剂经颅内施用于受试者。
在一些实施方案中，本文公开的方法包括向有需要的受试者施用CD47-SIRPα阻断剂，其中先前已向所述受试者施用经工程化以表达外源CD47多肽的细胞群体。在一些实施方案中，CD47-SIRPα阻断剂以1-20天之间的时间间隔施用于受试者持续10天与6个月之间的时段。在一些实施方案中，CD47-SIRPα阻断剂以1-2天之间的时间间隔施用于受试者持续10天与6个月之间的时段。CD47-SIRPα阻断剂以2-3天之间的时间间隔施用于受试者持续10天与6个月之间的时段。CD47-SIRPα阻断剂以3-4天之间的时间间隔施用于受试者持续10天与6个月之间的时段。CD47-SIRPα阻断剂以4-5天之间的时间间隔施用于受试者持续10天与6个月之间的时段。CD47-SIRPα阻断剂以5-6天之间的时间间隔施用于受试者持续10天与6个月之间的时段。CD47-SIRPα阻断剂以6-7天之间的时间间隔施用于受试者持续10天与6个月之间的时段。CD47-SIRPα阻断剂以7-10天之间的时间间隔施用于受试者持续10天与6个月之间的时段。CD47-SIRPα阻断剂以10-15天之间的时间间隔施用于受试者持续10天与6个月之间的时段。CD47-SIRPα阻断剂以15-20天之间的时间间隔施用于受试者持续10天与6个月之间的时段。
在一些实施方案中，本文公开的方法包括向有需要的受试者施用CD47-SIRPα阻断剂，其中先前已向所述受试者施用经工程化以表达外源CD47多肽的细胞群体。在一些实施方案中，CD47-SIRPα阻断剂以1-10天之间的时间间隔施用于受试者持续10-15天之间的时段。在一些实施方案中，CD47-SIRPα阻断剂以1-15天之间的时间间隔施用于受试者持续15-20天之间的时段。在一些实施方案中，CD47-SIRPα阻断剂以1-20天之间的时间间隔施用于受试者持续20-25天之间的时段。在一些实施方案中，CD47-SIRPα阻断剂以1-20天之间的时间间隔施用于受试者持续25-30天之间的时段。在一些实施方案中，CD47-SIRPα阻断剂以1-20天之间的时间间隔施用于受试者持续1-2个月之间的时段。在一些实施方案中，CD47-SIRPα阻断剂以1-20天之间的时间间隔施用于受试者持续2-3个月之间的时段。在一些实施方案中，CD47-SIRPα阻断剂以1-20天之间的时间间隔施用于受试者持续3-4个月之间的时段。在一些实施方案中，CD47-SIRPα阻断剂以1-20天之间的时间间隔施用于受试者持续4-5个月之间的时段。在一些实施方案中，CD47-SIRPα阻断剂以1-20天之间的时间间隔施用于受试者持续5-6个月之间的时段。
在一些实施方案中，本文公开的方法包括向有需要的受试者施用CD47-SIRPα阻断剂，其中先前已向所述受试者施用经工程化以表达外源CD47多肽的细胞群体。在一些实施方案中，CD47-SIRPα阻断剂按以下方式施用于受试者：(i)以0.05、0.1、0.3、1、3或10mg/kg；(ii)每12小时一次、每24小时一次、每36小时一次或每48小时一次；和/或(iii)1天与3周之间。在一些实施方案中，CD47-SIRPα阻断剂以0.05mg/kg施用。在一些实施方案中，CD47-SIRPα阻断剂以0.1mg/kg施用于受试者。在一些实施方案中，CD47-SIRPα阻断剂以0.3mg/kg施用于受试者。在一些实施方案中，CD47-SIRPα阻断剂以1mg/kg施用于受试者。在一些实施方案中，CD47-SIRPα阻断剂以3mg/kg施用于受试者。在一些实施方案中，CD47-SIRPα阻断剂以10mg/kg施用于受试者。在一些实施方案中，CD47-SIRPα阻断剂以约0.01mg/kg与约20mg/kg之间施用于受试者。在一些实施方案中，CD47-SIRPα阻断剂以约0.01mg/kg与约0.05mg/kg之间施用于受试者。在一些实施方案中，CD47-SIRPa阻断剂以约0.05mg/kg与约0.1mg/kg之间施用于受试者。在一些实施方案中，CD47-SIRPα阻断剂以约0.1mg/kg与约0.5mg/kg之间施用于受试者。在一些实施方案中，CD47-SIRPα阻断剂以约0.5mg/kg与约1mg/kg之间施用于受试者。在一些实施方案中，CD47-SIRPα阻断剂以约1mg/kg与约5mg/kg之间施用于受试者。在一些实施方案中，CD47-SIRPα阻断剂以约5mg/kg与约10mg/kg之间施用于受试者。在一些实施方案中，CD47-SIRPα阻断剂以约10mg/kg与约15mg/kg之间施用于受试者。在一些实施方案中，CD47-SIRPα阻断剂以约15mg/kg与约20mg/kg之间施用于受试者。
在一些实施方案中，本文公开的方法包括向有需要的受试者施用CD47-SIRPα阻断剂，其中先前已向所述受试者施用经工程化以表达外源CD47多肽的细胞群体。在一些实施方案中，CD47-SIRPα阻断剂每6小时施用于受试者一次。在一些实施方案中，CD47-SIRPα阻断剂每12小时施用于受试者一次。在一些实施方案中，CD47-SIRPα阻断剂每18小时施用于受试者一次。在一些实施方案中，CD47-SIRPα阻断剂每24小时施用于受试者一次。在一些实施方案中，CD47-SIRPα阻断剂每36小时施用于受试者一次。在一些实施方案中，CD47-SIRPα阻断剂每48小时施用于受试者一次。在一些实施方案中，CD47-SIRPα阻断剂每3天施用于受试者一次。在一些实施方案中，CD47-SIRPα阻断剂每4天施用于受试者一次。在一些实施方案中，CD47-SIRPα阻断剂每5天施用于受试者一次。在一些实施方案中，CD47-SIRPα阻断剂每6天施用于受试者一次。在一些实施方案中，CD47-SIRPα阻断剂每7天施用于受试者一次。在一些实施方案中，CD47-SIRPα阻断剂每2周施用于受试者一次。在一些实施方案中，CD47-SIRPα阻断剂每4周施用于受试者一次。在一些实施方案中，CD47-SIRPα阻断剂每6周施用于受试者一次。在一些实施方案中，CD47-SIRPα阻断剂每8周施用于受试者一次。在一些实施方案中，CD47-SIRPα阻断剂每3个月施用于受试者一次。在一些实施方案中，CD47-SIRPα阻断剂每4个月施用于受试者一次。在一些实施方案中，CD47-SIRPα阻断剂每5个月施用于受试者一次。在一些实施方案中，CD47-SIRPα阻断剂每6个月施用于受试者一次。在一些实施方案中，CD47-SIRPα阻断剂每约6个月与约12个月之间施用于受试者一次。在一些实施方案中，CD47-SIRPα阻断剂每18个月施用于受试者一次。在一些实施方案中，CD47-SIRPα阻断剂每24个月施用于受试者一次。在一些实施方案中，CD47-SIRPα阻断剂每3年施用于受试者一次。在一些实施方案中，CD47-SIRPα阻断剂每4年施用于受试者一次。在一些实施方案中，CD47-SIRPα阻断剂每5年施用于受试者一次。
在一些实施方案中，本文公开的方法包括向有需要的受试者施用CD47-SIRPα阻断剂，其中先前已向所述受试者施用经工程化以表达外源CD47多肽的细胞群体。在一些实施方案中，CD47-SIRPa阻断剂施用于受试者持续约1天与约50年之间。在一些实施方案中，CD47-SIRPα阻断剂施用于受试者持续约1天与约1周之间。在一些实施方案中，CD47-SIRPα阻断剂施用于受试者持续约1周与约2周之间。在一些实施方案中，CD47-SIRPα阻断剂施用于受试者持续约2周与约3周之间。在一些实施方案中，CD47-SIRPα阻断剂施用于受试者持续约3周与约1个月之间。在一些实施方案中，CD47-SIRPα阻断剂施用于受试者持续约1个月与约2个月之间。在一些实施方案中，CD47-SIRPα阻断剂施用于受试者持续约2个月与约3个月之间。在一些实施方案中，CD47-SIRPα阻断剂施用于受试者持续约3个月与约4个月之间。在一些实施方案中，CD47-SIRPα阻断剂施用于受试者持续约4个月与约5个月之间。在一些实施方案中，CD47-SIRPα阻断剂施用于受试者持续约5个月与约6个月之间。在一些实施方案中，CD47-SIRPα阻断剂施用于受试者持续约6个月与约1年之间。在一些实施方案中，CD47-SIRPα阻断剂施用于受试者持续约1年与约2年之间。在一些实施方案中，CD47-SIRPα阻断剂施用于受试者持续约2年与约3年之间。在一些实施方案中，CD47-SIRPα阻断剂施用于受试者持续约3年与约4年之间。在一些实施方案中，CD47-SIRPα阻断剂施用于受试者持续约4年与约5年之间。在一些实施方案中，CD47-SIRPα阻断剂施用于受试者持续约5年与约10年之间。在一些实施方案中，CD47-SIRPα阻断剂施用于受试者持续约10年与约15年之间。在一些实施方案中，CD47-SIRPα阻断剂施用于受试者持续约15年与约20年之间。在一些实施方案中，CD47-SIRPα阻断剂施用于受试者持续约20年与约30年之间。在一些实施方案中，CD47-SIRPα阻断剂施用于受试者持续约30年与约40年之间。在一些实施方案中，CD47-SIRPα阻断剂施用于受试者持续约40年与约50年之间。在一些实施方案中，向受试者施用CD47-SIRPα阻断剂持续受试者的一生。
在一些实施方案中，本文公开的方法包括向有需要的受试者施用CD47-SIRPα阻断剂，其中先前已向所述受试者施用经工程化以表达外源CD47多肽的细胞群体。在一些实施方案中，本文公开的方法还包括将IL-2施用于受试者。
在一些实施方案中，本文公开的方法包括向有需要的受试者施用CD47-SIRPα阻断剂，其中先前已向所述受试者施用经工程化以表达外源CD47多肽的细胞群体。在一些实施方案中，CD47-SIRPα阻断剂选自由以下组成的组：结合CD47的抗体或其片段、结合CD47的双特异性抗体、结合CD47的免疫细胞因子融合蛋白、含有CD47的融合蛋白、结合SIRPα的抗体或其片段、结合SIRPα的双特异性抗体、结合SIRPα的免疫细胞因子融合蛋白、含有SIRPα的融合蛋白和其组合。在一些实施方案中，CD47-SIRPα阻断剂为结合CD47的抗体或其片段。在一些实施方案中，CD47-SIRPα阻断剂为结合CD47的双特异性抗体。在一些实施方案中，CD47-SIRPα阻断剂为结合CD47的免疫细胞因子融合蛋白。在一些实施方案中，CD47-SIRPα阻断剂为含有CD47的融合蛋白。在一些实施方案中，CD47-SIRPα阻断剂为结合SIRPα的抗体或其片段。在一些实施方案中，CD47-SIRPα阻断剂为结合SIRPα的双特异性抗体。在一些实施方案中，CD47-SIRPα阻断剂为结合SIRPα的免疫细胞因子融合蛋白。在一些实施方案中，CD47-SIRPα阻断剂为含有SIRPα的融合蛋白。
在一些实施方案中，本文公开的方法包括向有需要的受试者施用CD47-SIRPα阻断剂，其中先前已向所述受试者施用经工程化以表达外源CD47多肽的细胞群体。在一些实施方案中，CD47-SIRPα阻断剂选自由以下组成的组：结合CD47的抗体或其片段、结合CD47的双特异性抗体、结合CD47的免疫细胞因子融合蛋白、含有CD47的融合蛋白、结合SIRPα的抗体或其片段、结合SIRPα的双特异性抗体、结合SIRPα的免疫细胞因子融合蛋白、含有SIRPα的融合蛋白和其组合。在一些实施方案中，结合CD47的抗体或其片段选自由以下组成的组：麦格罗单抗(Hu5F9-G4)、CC-90002、IBI-188、IBI-322、TG-1801(NI-1701)、ALX148、TJ011133、FA3M3、ZL1201、AK117、AO-176、SRF231、GenSci-059、C47B157、C47B161、C47B167、C47B222、C47B227、Vx-1004、HMBD004、SHR-1603、AMMS4-G4、RTX-CD47和IMC-002。在一些实施方案中，结合CD47的抗体或其片段为麦格罗单抗(Hu5F9-G4)。在一些实施方案中，结合CD47的抗体或其片段为CC-90002。在一些实施方案中，结合CD47的抗体或其片段为IBI-188。在一些实施方案中，结合CD47的抗体或其片段为IBI-322。在一些实施方案中，结合CD47的抗体或其片段为TG-1801(NI-1701)。在一些实施方案中，结合CD47的抗体或其片段为ALX148。在一些实施方案中，结合CD47的抗体或其片段为TJ011133。在一些实施方案中，结合CD47的抗体或其片段为FA3M3。在一些实施方案中，结合CD47的抗体或其片段为ZL1201。在一些实施方案中，结合CD47的抗体或其片段为AK117。在一些实施方案中，结合CD47的抗体或其片段为AO-176。在一些实施方案中，结合CD47的抗体或其片段为SRF231。在一些实施方案中，结合CD47的抗体或其片段为GenSci-059。在一些实施方案中，结合CD47的抗体或其片段为C47B157。在一些实施方案中，结合CD47的抗体或其片段为C47B161。在一些实施方案中，结合CD47的抗体或其片段为C47B167。在一些实施方案中，结合CD47的抗体或其片段为C47B222。在一些实施方案中，结合CD47的抗体或其片段为C47B227。在一些实施方案中，结合CD47的抗体或其片段为Vx-1004。在一些实施方案中，结合CD47的抗体或其片段为HMBD004。在一些实施方案中，结合CD47的抗体或其片段为SHR-1603。在一些实施方案中，结合CD47的抗体或其片段为AMMS4-G4。在一些实施方案中，结合CD47的抗体或其片段为RTX-CD47。在一些实施方案中，结合CD47的抗体或其片段为IMC-002。
在一些实施方案中，本文公开的方法包括向有需要的受试者施用CD47-SIRPα阻断剂，其中先前已向所述受试者施用经工程化以表达外源CD47多肽的细胞群体。在一些实施方案中，CD47-SIRPα阻断剂选自由以下组成的组：结合CD47的抗体或其片段、结合CD47的双特异性抗体、结合CD47的免疫细胞因子融合蛋白、含有CD47的融合蛋白、结合SIRPα的抗体或其片段、结合SIRPα的双特异性抗体、结合SIRPα的免疫细胞因子融合蛋白、含有SIRPαα的融合蛋白和其组合。在一些实施方案中，结合CD47的抗体或其片段选自由以下组成的组：针对CD47的单链Fv片段(scFv)、针对CD47的Fab、针对CD47的VHH纳米抗体、针对CD47的DARPin和其变体。在一些实施方案中，结合CD47的抗体或其片段为针对CD47的单链Fv片段(scFv)和其变体。在一些实施方案中，结合CD47的抗体或其片段为针对CD47的Fab和其变体。在一些实施方案中，结合CD47的抗体或其片段为针对CD47的VHH纳米抗体和其变体。在一些实施方案中，结合CD47的抗体或其片段为针对CD47的DARPin和其变体。
在一些实施方案中，本文公开的方法包括向有需要的受试者施用CD47-SIRPα阻断剂，其中先前已向所述受试者施用经工程化以表达外源CD47多肽的细胞群体。在一些实施方案中，CD47-SIRPα阻断剂选自由以下组成的组：结合CD47的抗体或其片段、结合CD47的双特异性抗体、结合CD47的免疫细胞因子融合蛋白、含有CD47的融合蛋白、结合SIRPα的抗体或其片段、结合SIRPα的双特异性抗体、结合SIRPα的免疫细胞因子融合蛋白、含有SIRPα的融合蛋白和其组合。在一些实施方案中，结合SIRPα的抗体或其片段选自由以下组成的组：ADU-1805、CC-95251、OSE-172(BI 765063)、KWAR23和P362。在一些实施方案中，结合SIRPα的抗体或其片段为ADU-1805。在一些实施方案中，结合SIRPα的抗体或其片段为CC-95251。在一些实施方案中，结合SIRPα的抗体或其片段为OSE-172(BI 765063)。在一些实施方案中，结合SIRPα的抗体或其片段为KWAR23。在一些实施方案中，结合SIRPα的抗体或其片段为P362。
在一些实施方案中，本文公开的方法包括向有需要的受试者施用CD47-SIRPα阻断剂，其中先前已向所述受试者施用经工程化以表达外源CD47多肽的细胞群体。在一些实施方案中，CD47-SIRPa阻断剂选自由以下组成的组：结合CD47的抗体或其片段、结合CD47的双特异性抗体、结合CD47的免疫细胞因子融合蛋白、含有CD47的融合蛋白、结合SIRPα的抗体或其片段、结合SIRPα的双特异性抗体、结合SIRPα的免疫细胞因子融合蛋白、含有SIRPα的融合蛋白和其组合。在一些实施方案中，结合SIRPα的抗体或其片段选自由以下组成的组：针对SIRPα的单链Fv片段(scFv)、针对SIRPα的Fab、针对SIRPα的VHH纳米抗体、针对SIRPα的DARPin和其变体。在一些实施方案中，结合SIRPα的抗体或其片段为针对SIRPα的单链Fv片段(scFv)和其变体。在一些实施方案中，结合SIRPα的抗体或其片段为针对SIRPα的Fab和其变体。在一些实施方案中，结合SIRPα的抗体或其片段为针对SIRPα的VHH纳米抗体和其变体。在一些实施方案中，结合SIRPα的抗体或其片段为针对SIRPα的DARPin和其变体。
在一些实施方案中，本文公开的方法包括向有需要的受试者施用CD47-SIRPα阻断剂，其中先前已向所述受试者施用经工程化以表达外源CD47多肽的细胞群体。在一些实施方案中，CD47-SIRPα阻断剂选自由以下组成的组：结合CD47的抗体或其片段、结合CD47的双特异性抗体、结合CD47的免疫细胞因子融合蛋白、含有CD47的融合蛋白、结合SIRPα的抗体或其片段、结合SIRPα的双特异性抗体、结合SIRPα的免疫细胞因子融合蛋白、含有SIRPα的融合蛋白和其组合。在一些实施方案中，含有SIRPα的融合蛋白包含连接至Fc域的SIRPα的CD47结合域。在一些实施方案中，Fc域包含选自由以下组成的组的Fc域或其一部分：IgG1、IgG2、IgG3和IgG4。在一些实施方案中，Fc域包含作为IgG1的Fc域或其一部分。在一些实施方案中，Fc域包含作为IgG2的Fc域或其一部分。在一些实施方案中，Fc域包含作为IgG3的Fc域或其一部分。在一些实施方案中，Fc域包含作为IgG4的Fc域或其一部分。
在一些实施方案中，本文公开的方法包括向有需要的受试者施用CD47-SIRPα阻断剂，其中先前已向所述受试者施用经工程化以表达外源CD47多肽的细胞群体。在一些实施方案中，外源CD47多肽包含SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：4的氨基酸序列。在一些实施方案中，外源CD47多肽包含SEQ ID NO：2的氨基酸序列。在一些实施方案中，外源CD47多肽包含SEQID NO：4的氨基酸序列。在一些实施方案中，外源CD47多肽包含与内源CD47多肽的氨基酸序列相同的氨基酸序列。在一些实施方案中，外源CD47多肽包含与内源CD47多肽的氨基酸序列类似的氨基酸序列。在一些实施方案中，外源CD47多肽包含与内源CD47多肽的氨基酸序列不同的氨基酸序列。
实施方案
实施方案1.一种方法，所述方法包括向先前施用包含外源表达CD47多肽的细胞群体的患者施用CD47-信号调控蛋白α(SIRPα)阻断剂。
实施方案2.如以上或以下实施方案中任一项所述的方法，其中所述CD47-SIRPα阻断剂选自由以下组成的组：结合CD47的抗体或其片段、结合CD47的双特异性抗体、结合CD47的免疫细胞因子融合蛋白、含有CD47的融合蛋白、结合SIRPα的抗体或其片段、结合SIRPα的双特异性抗体、结合SIRPα的免疫细胞因子融合蛋白、含有SIRPα的融合蛋白和其组合。
实施方案3.如以上或以下实施方案中任一项所述的方法，其中所述结合CD47的抗体或其片段选自由以下组成的组：麦格罗单抗(Hu5F9-G4)、CC-90002、IBI-188、IBI-322、TG-1801(NI-1701)、ALX148、TJ011133、FA3M3、ZL1201、AK117、AO-176、SRF231、GenSci-059、C47B157、C47B161、C47B167、C47B222、C47B227、Vx-1004、HMBD004、SHR-1603、AMMS4-G4、RTX-CD47和IMC-002。
实施方案4.如以上或以下实施方案中任一项所述的方法，其中所述结合CD47的抗体或其片段选自由以下组成的组：针对CD47的单链Fv片段(scFv)、针对CD47的Fab、针对CD47的VHH纳米抗体、针对CD47的DARPin和其变体。
实施方案5.如以上或以下实施方案中任一项所述的方法，其中所述结合SIRPα的抗体或其片段选自由以下组成的组：ADU-1805、CC-95251、OSE-172(BI 765063)、KWAR23和P362。
实施方案6.如以上或以下实施方案中任一项所述的方法，其中所述结合SIRPα的抗体或其片段选自由以下组成的组：针对SIRPα的单链Fv片段(scFv)、针对SIRPα的Fab、针对SIRPα的VHH纳米抗体、针对SIRPα的DARPin和其变体。
实施方案7.如以上或以下实施方案中任一项所述的方法，其中含有SIRPα的融合蛋白包含连接至Fc域的SIRPα的CD47结合域。
实施方案8.如以上或以下实施方案中任一项所述的方法，其中所述Fc域包含选自由以下组成的组的Fc域或其一部分：IgG1、IgG2、IgG3和IgG4。
实施方案9.如以上或以下实施方案中任一项所述的方法，其中施用所述CD47-SIRPα阻断剂减少了所述患者中仍然有活力的细胞群体的量。
实施方案10.如以上或以下实施方案中任一项所述的方法，其中施用所述CD47-SIRPα阻断剂减少了所述患者中的外源表达CD47肽的细胞的数目。
实施方案11.如以上或以下实施方案中任一项所述的方法，其中在所述患者施用所述细胞群体之后经历不良事件后，施用所述CD47-SIRPα阻断剂。
实施方案12.如以上或以下实施方案中任一项所述的方法，其中所述不良事件选自由以下组成的组：异常增生、转化、肿瘤形成、细胞因子释放综合征、移植物抗宿主疾病(GVHD)和免疫效应细胞相关神经中毒性综合征(ICANS)。
实施方案13.如以上或以下实施方案中任一项所述的方法，其中在施用所述细胞群体之后至少1周或更长时间，施用所述CD47-SIRPα阻断剂。
实施方案14.如以上或以下实施方案中任一项所述的方法，其中在施用所述细胞群体之后至少1个月或更长时间，施用所述CD47-SIRPα阻断剂。
实施方案15.如以上或以下实施方案中任一项所述的方法，其中所述细胞还包含减少表达的MHC I类和/或MHC II人类白细胞抗原。
实施方案16.如以上或以下实施方案中任一项所述的方法，其中所述细胞还包含减少表达的一种或多种TCR复合物。
实施方案17.如以上或以下实施方案中任一项所述的方法，其中所述细胞还包含一个或多个转基因，其中所述转基因编码选自由以下组成的组的外源表达多肽：CD24、CD46、CD55、CD59、CD200、DUX4、PD-L1、IDO1、HLA-G、CCL21、Mfge8和Serpin B9。
实施方案18.如以上或以下实施方案中任一项所述的方法，其中所述细胞包含外源表达CD47多肽和一种或多种选自由以下组成的组的额外外源表达多肽：CD24、CD46、CD55、CD59、DUX4、PD-L1、IDO1、HLA-G、CD200、FasL、CCL21、Mfge8、Serpin B9和其任何组合。
实施方案19.如以上或以下实施方案中任一项所述的方法，其中所述细胞包含外源表达CD47多肽和减少表达水平的B2M和/或CIITA。
实施方案20.如以上或以下实施方案中任一项所述的方法，其中所述细胞包含外源表达CD47多肽并且还包含减少表达水平的B2M和CIITA。
实施方案21.如以上或以下实施方案中任一项所述的方法，其中所述细胞包含外源表达的CD47多肽、减少表达水平的B2M和/或CIITA、和一种或多种选自以下各者的组的额外外源表达多肽：CD24、CD46、CD55、CD59、CD200、DUX4、PD-L1、HLA-G、IDO1、FasL、CCL21、Mfge8、Serpin B9和其任何组合。
实施方案22.如以上或以下实施方案中任一项所述的方法，其中所述细胞包含外源表达的CD47多肽、减少表达水平的B2M和CIITA、和一种或多种选自以下各者的组的额外外源表达多肽：CD24、CD46、CD55、CD59、CD200、DUX4、PD-L1、HLA-G、IDO1、FasL、CCL21、Mfge8、Serpin B9和其任何组合。
实施方案23.如以上或以下实施方案中任一项所述的方法，其中所述细胞还包含减少表达水平的TCRα、TCRβ或两者。
实施方案24.如以上或以下实施方案中任一项所述的方法，其中所述细胞为衍生自多能干细胞的分化细胞。
实施方案25.如以上或以下实施方案中任一项所述的方法，其中所述多能干细胞包括经诱导的多能干细胞。
实施方案26.如以上或以下实施方案中任一项所述的方法，其中所述分化细胞选自由以下组成的组：心脏细胞、神经细胞、内皮细胞、T细胞、胰岛细胞、视网膜色素上皮细胞、肝细胞、甲状腺细胞、皮肤细胞、血细胞和上皮细胞。
实施方案27.如以上或以下实施方案中任一项所述的方法，其中所述细胞包括衍生自原代T细胞的细胞。
实施方案28.如以上或以下实施方案中任一项所述的方法，其中所述衍生自原代T细胞的细胞衍生自原代T细胞的池，所述原代T细胞包括来自不同于所述患者的一个或多个(例如，两个或更多个、三个或更多个、四个或更多个、五个或更多个、十个或更多个、二十个或更多个、五十个或更多个、或一百个或更多个)受试者的原代T细胞。
实施方案29.如以上或以下实施方案中任一项所述的方法，其中所述衍生自原代T细胞的细胞包含嵌合抗原受体(CAR)。
实施方案30.如以上或以下实施方案中任一项所述的方法，其中所述CAR和所述外源表达CD47多肽在单一启动子控制下表达。
实施方案31.如以上或以下实施方案中任一项所述的方法，其中所述CAR结合选自由以下组成的组的抗原：CD19、CD22、CD38、CD123、CD138和BCMA。
实施方案32.如以上或以下实施方案中任一项所述的方法，其中所述衍生自原代T细胞的细胞包含减少表达的内源性T细胞受体。
实施方案33.如以上或以下实施方案中任一项所述的方法，其中所述衍生自原代T细胞的细胞包含减少表达的细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4(CTLA4)和/或程序性细胞死亡(PD1)。
实施方案34.一种方法，所述方法包括：(a)向患者施用一定量的包含外源表达CD47的细胞群体；以及(b)向患者施用一定量的有效减少患者中的细胞和其衍生物的数目的CD47-SIRPα阻断剂。
实施方案35.如以上或以下实施方案中任一项所述的方法，其中所述细胞还包含减少表达的MHC I类和/或MHC II类人类白细胞抗原。
实施方案36.如以上或以下实施方案中任一项所述的方法，其中所述细胞包含减少表达的MHC I类和MHC II类人类白细胞抗原。
实施方案37.如以上或以下实施方案中任一项所述的方法，其中所述细胞还包含减少表达的一种或多种TCR复合物。
实施方案38.如以上或以下实施方案中任一项所述的方法，其中所述细胞包含外源表达CD47多肽和一种或多种选自由以下组成的组的额外外源表达多肽：CD24、CD46、CD55、CD59、CD200、DUX4、PD-L1、IDO1、HLA-G、FasL、CCL21、Mfge8、Serpin B9和其任何组合。
实施方案39.如以上或以下实施方案中任一项所述的方法，其中所述细胞还包含一个或多个转基因，其中所述转基因编码选自由以下组成的组的外源表达多肽：CD24、CD46、CD55、CD59、CD200、DUX4、PD-L1、IDO1、HLA-G、FasL、CCL21、Mfge8和Serpin B9。
实施方案40.如以上或以下实施方案中任一项所述的方法，其中所述细胞包含外源表达CD47多肽和减少表达水平的B2M和/或CIITA。
实施方案41.如以上或以下实施方案中任一项所述的方法，其中所述细胞包含外源表达CD47多肽和减少表达水平的B2M和CIITA。
实施方案42.如以上或以下实施方案中任一项所述的方法，其中所述细胞包含外源表达的CD47多肽、减少表达水平的B2M和/或CIITA、和一种或多种选自以下各者的组的额外外源表达多肽：CD24、CD46、CD55、CD59、CD200、DUX4、PD-L1、IDO1、HLA-G、FasL、CCL21、Mfge8、Serpin B9和其任何组合。
实施方案43.如以上或以下实施方案中任一项所述的方法，其中所述细胞包含外源表达的CD47多肽、减少表达水平的B2M和CIITA、和一种或多种选自以下各者的组的额外外源表达多肽：CD24、CD46、CD55、CD59、CD200、DUX4、PD-L1、IDO1、HLA-G、FasL、CCL21、Mfge8、Serpin B9和其任何组合。
实施方案44.如以上或以下实施方案中任一项所述的方法，其中所述细胞还包含减少表达水平的TCRα、TCRβ或两者。
实施方案45.如以上或以下实施方案中任一项所述的方法，其中所述细胞为衍生自多能干细胞的分化细胞。
实施方案46.如以上或以下实施方案中任一项所述的方法，其中所述多能干细胞包含经诱导的多能干细胞。
实施方案47.如以上或以下实施方案中任一项所述的方法，其中所述分化细胞选自由以下组成的组：心脏细胞、神经细胞、内皮细胞、T细胞、胰岛细胞、视网膜色素上皮细胞、肝细胞、甲状腺细胞、皮肤细胞、血细胞和上皮细胞。
实施方案48.如以上或以下实施方案中任一项所述的方法，其中所述细胞包含衍生自原代T细胞的细胞。
实施方案49.如以上或以下实施方案中任一项所述的方法，其中所述衍生自原代T细胞的细胞衍生自原代T细胞的池，所述原代T细胞包括来自不同于所述患者的一个或多个(例如，两个或更多个、三个或更多个、四个或更多个、五个或更多个、十个或更多个、二十个或更多个、五十个或更多个、或一百个或更多个)受试者的原代T细胞。
实施方案50.如以上或以下实施方案中任一项所述的方法，其中所述衍生自原代T细胞的细胞包含嵌合抗原受体(CAR)。
实施方案51.如以上或以下实施方案中任一项所述的方法，其中所述CAR和所述外源表达CD47多肽在单一启动子控制下表达。
实施方案52.如以上或以下实施方案中任一项所述的方法，其中所述CAR结合选自由以下组成的组的抗原：CD19、CD22、CD38、CD123、CD138和BCMA。
实施方案53.如以上或以下实施方案中任一项所述的方法，其中所述衍生自原代T细胞的细胞包含减少表达的内源性T细胞受体。
实施方案54.如以上或以下实施方案中任一项所述的方法，其中所述衍生自原代T细胞的细胞包含减少表达的细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4(CTLA4)和/或程序性细胞死亡(PD1)。
实施方案55.如以上或以下实施方案中任一项所述的方法，其中所述CD47-SIRPα阻断剂选自由以下组成的组：结合CD47的抗体或其片段、结合CD47的双特异性抗体、结合CD47的免疫细胞因子融合蛋白、含有CD47的融合蛋白、结合SIRPα的抗体或其片段、结合SIRPα的双特异性抗体、结合SIRPα的免疫细胞因子融合蛋白、含有SIRPα的融合蛋白和其组合。
实施方案56.如以上或以下实施方案中任一项所述的方法，其中所述结合CD47的抗体或其片段选自由以下组成的组：麦格罗单抗(Hu5F9-G4)、CC-90002、IBI-188、IBI-322、TG-1801(NI-1701)、ALX148、TJ011133、FA3M3、ZL1201、AK117、AO-176、SRF231、GenSci-059、C47B157、C47B161、C47B167、C47B222、C47B227、Vx-1004、HMBD004、SHR-1603、AMMS4-G4、RTX-CD47和IMC-002。
实施方案57.如以上或以下实施方案中任一项所述的方法，其中所述结合CD47的抗体或其片段选自由以下组成的组：针对CD47的单链Fv片段(scFv)、针对CD47的Fab、针对CD47的VHH纳米抗体、针对CD47的DARPin和其变体。
实施方案58.如以上或以下实施方案中任一项所述的方法，其中所述结合SIRPα的抗体或其片段选自由以下组成的组：ADU-1805、CC-95251、OSE-172(BI 765063)、KWAR23和P362。
实施方案59.如以上或以下实施方案中任一项所述的方法，其中所述结合SIRPα的抗体或其片段选自由以下组成的组：针对SIRPα的单链Fv片段(scFv)、针对SIRPα的Fab、针对SIRPα的VHH纳米抗体、针对SIRPα的DARPin和其变体。
实施方案60.如以上或以下实施方案中任一项所述的方法，其中所述含有SIRPα的融合蛋白包含连接至Fc域的SIRPα的CD47结合域。
实施方案61.如以上或以下实施方案中任一项所述的方法，其中所述Fc域包含选自由以下组成的组的Fc域或其一部分：IgG1、IgG2、IgG3和IgG4。
实施方案62.如以上或以下实施方案中任一项所述的方法，其中在所述患者施用细胞群体之后经历不良事件时，施用所述CD47-SIRPα阻断剂。
实施方案63.如以上或以下实施方案中任一项所述的方法，其中所述不良事件选自由以下组成的组：异常增生、转化、肿瘤形成、细胞因子释放综合征、移植物抗宿主疾病(GVHD)、免疫效应细胞相关神经中毒性综合征(ICANS)。
实施方案64.如以上或以下实施方案中任一项所述的方法，其中在施用所述细胞群体之后至少1周或更长时间，施用所述CD47-SIRPα阻断剂。
实施方案65.如以上或以下实施方案中任一项所述的方法，其中在施用所述细胞群体之后至少1个月或更长时间，施用所述CD47-SIRPα阻断剂。
实施方案66.一种方法，所述方法包括：(a)向患者施用细胞群体，其中所述细胞包含外源表达CD47多肽；以及(b)在步骤(a)之后的时间间隔期之后，向患者施用CD47-SIRPα阻断剂，其中所述时间间隔期包括至少1周或更长时间。
实施方案67.如以上或以下实施方案中任一项所述的方法，其中所述细胞包含减少表达的MHC I类和/或MHC II类人类白细胞抗原。
实施方案68.如以上或以下实施方案中任一项所述的方法，其中所述细胞包含减少表达的MHC I类和MHC II类人类白细胞抗原。
实施方案69.如以上或以下实施方案中任一项所述的方法，其中所述细胞还包含减少表达的一种或多种TCR复合物。
实施方案70.如以上或以下实施方案中任一项所述的方法，其中所述细胞包含外源表达CD47多肽和一种或多种选自由以下组成的组的额外外源表达多肽：CD24、CD46、CD55、CD59、CD200、DUX4、PD-L1、IDO1、HLA-G、FasL、CCL21、Mfge8、Serpin B9和其任何组合。
实施方案71.如以上或以下实施方案中任一项所述的方法，其中所述细胞还包含一个或多个转基因，其中所述转基因编码选自由以下组成的组的外源表达多肽：CD24、CD46、CD55、CD59、CD200、DUX4、PD-L1、IDO1、HLA-G、FasL、CCL21、Mfge8和Serpin B9。
实施方案72.如以上或以下实施方案中任一项所述的方法，其中所述细胞表达外源CD47多肽并且还包含减少表达水平的B2M和/或CIITA。
实施方案73.如以上或以下实施方案中任一项所述的方法，其中所述细胞表达外源CD47多肽并且还包含减少表达水平的B2M和CIITA。
实施方案74.如以上或以下实施方案中任一项所述的方法，其中所述细胞包含外源表达的CD47多肽、减少表达水平的B2M和/或CIITA、和一种或多种选自以下各者的组的额外外源表达多肽：CD24、CD46、CD55、CD59、CD200、DUX4、PD-L1、IDO1、HLA-G、FasL、CCL21、Mfge8、Serpin B9和其任何组合。
实施方案75.如以上或以下实施方案中任一项所述的方法，其中所述细胞包含外源表达的CD47多肽、减少表达水平的B2M和CIITA、和一种或多种选自以下各者的组的额外外源表达多肽：CD24、CD46、CD55、CD59、CD200、DUX4、PD-L1、IDO1、HLA-G、FasL、CCL21、Mfge8、Serpin B9和其任何组合。
实施方案76.如以上或以下实施方案中任一项所述的方法，其中所述细胞还包含减少表达水平的TCRα、TCRβ或两者。
实施方案77.如以上或以下实施方案中任一项所述的方法，其中所述细胞包括衍生自多能干细胞的分化细胞。
实施方案78.如以上或以下实施方案中任一项所述的方法，其中所述多能干细胞包括经诱导的多能干细胞。
实施方案79.如以上或以下实施方案中任一项所述的方法，其中所述分化细胞选自由以下组成的组：心脏细胞、神经细胞、内皮细胞、T细胞、胰岛细胞、视网膜色素上皮细胞、肝细胞、甲状腺细胞、皮肤细胞、血细胞和上皮细胞。
实施方案80.如以上或以下实施方案中任一项所述的方法，其中所述细胞包括衍生自原代T细胞的细胞。
实施方案81.如以上或以下实施方案中任一项所述的方法，其中所述衍生自原代T细胞的细胞衍生自原代T细胞的池，所述原代T细胞包括来自不同于所述患者的一个或多个(例如，两个或更多个、三个或更多个、四个或更多个、五个或更多个、十个或更多个、二十个或更多个、五十个或更多个、或一百个或更多个)受试者的原代T细胞。
实施方案82.如以上或以下实施方案中任一项所述的方法，其中所述衍生自原代T细胞的细胞包含嵌合抗原受体(CAR)。
实施方案83.如以上或以下实施方案中任一项所述的方法，其中所述CAR和所述外源表达CD47多肽在单一启动子控制下表达。
实施方案84.如以上或以下实施方案中任一项所述的方法，其中所述CAR结合选自由以下组成的组的抗原：CD19、CD22、CD38、CD123、CD138和BCMA。
实施方案85.如以上或以下实施方案中任一项所述的方法，其中所述衍生自原代T细胞的细胞包含减少表达的内源性T细胞受体。
实施方案86.如以上或以下实施方案中任一项所述的方法，其中所述衍生自原代T细胞的细胞包含减少表达的细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4(CTLA4)和/或程序性细胞死亡(PD1)。
实施方案87.如以上或以下实施方案中任一项所述的方法，其中所述时间间隔期包括至少1个月或更长时间。
实施方案88.如以上或以下实施方案中任一项所述的方法，其中所述CD47-SIRPα阻断剂选自由以下组成的组：结合CD47的抗体或其片段、结合CD47的双特异性抗体、结合CD47的免疫细胞因子融合蛋白、含有CD47的融合蛋白、结合SIRPα的抗体或其片段、结合SIRPα的双特异性抗体、结合SIRPα的免疫细胞因子融合蛋白、含有SIRPα的融合蛋白和其组合。
实施方案89.如以上或以下实施方案中任一项所述的方法，其中所述结合CD47的抗体或其片段选自由以下组成的组：麦格罗单抗(Hu5F9-G4)、CC-90002、IBI-188、IBI-322、TG-1801(NI-1701)、ALX148、TJ011133、FA3M3、ZL1201、AK117、AO-176、SRF231、GenSci-059、C47B157、C47B161、C47B167、C47B222、C47B227、Vx-1004、HMBD004、SHR-1603、AMMS4-G4、RTX-CD47和IMC-002。
实施方案90.如以上或以下实施方案中任一项所述的方法，其中所述结合CD47的抗体或其片段选自由以下组成的组：针对CD47的单链Fv片段(scFv)、针对CD47的Fab、针对CD47的VHH纳米抗体、针对CD47的DARPin和其变体。
实施方案91.如以上或以下实施方案中任一项所述的方法，其中所述结合SIRPα的抗体或其片段选自由以下组成的组：ADU-1805、CC-95251、OSE-172(BI 765063)、KWAR23和P362。
实施方案92.如以上或以下实施方案中任一项所述的方法，其中所述结合SIRPα的抗体或其片段选自由以下组成的组：针对SIRPα的单链Fv片段(scFv)、针对SIRPα的Fab、针对SIRPα的VHH纳米抗体、针对SIRPα的DARPin和其变体。
实施方案93.如以上或以下实施方案中任一项所述的方法，其中所述含有SIRPα的融合蛋白包含连接至Fc域的SIRPα的CD47结合域。
实施方案94.如以上或以下实施方案中任一项所述的方法，其中所述Fc域包含选自由以下组成的组的Fc域或其一部分：IgG1、IgG2、IgG3和IgG4。
实施方案95.如以上或以下实施方案中任一项所述的方法，其中步骤(b)减少了所述患者中仍然有活力的细胞群体的量。
实施方案96.如以上或以下实施方案中任一项所述的方法，其中步骤(b)减少了所述患者中的外源表达CD47肽的细胞的数目。
实施方案97.如以上或以下实施方案中任一项所述的方法，所述方法还包括在步骤(b)之后，施用第二细胞群体。
实施方案98.一种调节患者中的细胞疗法的活性的方法，其中所述患者已接受至少一个剂量的治疗有效的包含外源表达CD47多肽的细胞群体，所述方法包括以有效调节所述细胞群体活性的量向所述患者施用CD47-SIRPα阻断剂。
实施方案99.如以上或以下实施方案中任一项所述的方法，其中所述CD47-SIRPα阻断剂选自由以下组成的组：结合CD47的抗体或其片段、结合CD47的双特异性抗体、结合CD47的免疫细胞因子融合蛋白、含有CD47的融合蛋白、结合SIRPα的抗体或其片段、结合SIRPα的双特异性抗体、结合SIRPα的免疫细胞因子融合蛋白、含有SIRPα的融合蛋白和其组合。
实施方案100.如以上或以下实施方案中任一项所述的方法，其中所述结合CD47的抗体或其片段选自由以下组成的组：麦格罗单抗(Hu5F9-G4)、CC-90002、IBI-188、IBI-322、TG-1801(NI-1701)、ALX148、TJ011133、FA3M3、ZL1201、AK117、AO-176、SRF231、GenSci-059、C47B157、C47B161、C47B167、C47B222、C47B227、Vx-1004、HMBD004、SHR-1603、AMMS4-G4、RTX-CD47和IMC-002。
实施方案101.如以上或以下实施方案中任一项所述的方法，其中所述结合CD47的抗体或其片段选自由以下组成的组：针对CD47的单链Fv片段(scFv)、针对CD47的Fab、针对CD47的VHH纳米抗体、针对CD47的DARPin和其变体。
实施方案102.如以上或以下实施方案中任一项所述的方法，其中所述结合SIRPα的抗体或其片段选自由以下组成的组：ADU-1805、CC-95251、OSE-172(BI 765063)、KWAR23和P362。
实施方案103.如以上或以下实施方案中任一项所述的方法，其中所述结合SIRPα的抗体或其片段选自由以下组成的组：针对SIRPα的单链Fv片段(scFv)、针对SIRPα的Fab、针对SIRPα的VHH纳米抗体、针对SIRPα的DARPin和其变体。
实施方案104.如以上或以下实施方案中任一项所述的方法，其中所述含有SIRPα的融合蛋白包含连接至Fc域的SIRPα的CD47结合域。
实施方案105.如以上或以下实施方案中任一项所述的方法，其中所述Fc域包含选自由以下组成的组的Fc域或其一部分：IgG1、IgG2、IgG3和IgG4。
实施方案106.如以上或以下实施方案中任一项所述的方法，其中所述细胞包含减少表达的MHC I类和/或MHC II类人类白细胞抗原。
实施方案107.如以上或以下实施方案中任一项所述的方法，其中所述细胞包含减少表达的MHC I类和MHC II类人类白细胞抗原。
实施方案108.如以上或以下实施方案中任一项所述的方法，其中所述细胞还包含减少表达的一种或多种TCR复合物。
实施方案109.如以上或以下实施方案中任一项所述的方法，其中所述细胞包含外源表达CD47多肽和一种或多种选自由以下组成的组的额外外源表达多肽：CD24、CD46、CD55、CD59、CD200、DUX4、PD-L1、IDO1、HLA-G、FasL、CCL21、Mfge8、Serpin B9和其任何组合。
实施方案110.如以上或以下实施方案中任一项所述的方法，其中所述细胞还包含一个或多个转基因，其中所述转基因编码选自由以下组成的组的外源表达多肽：CD24、CD46、CD55、CD59、CD200、DUX4、PD-L1、IDO1、HLA-G、FasL、CCL21、Mfge8和Serpin B9。
实施方案111.如以上或以下实施方案中任一项所述的方法，其中所述细胞包含外源表达CD47多肽和减少表达水平的B2M和/或CIITA。
实施方案112.如以上或以下实施方案中任一项所述的方法，其中所述细胞包含外源表达CD47多肽和减少表达水平的B2M和CIITA。
实施方案113.如以上或以下实施方案中任一项所述的方法，其中所述细胞包含外源表达的CD47多肽、减少表达水平的B2M和/或CIITA、和一种或多种选自以下各者的组的额外外源表达多肽：CD24、CD46、CD55、CD59、CD200、DUX4、PD-L1、IDO1、HLA-G、FasL、CCL21、Mfge8、Serpin B9和其任何组合。
实施方案114.如以上或以下实施方案中任一项所述的方法，其中所述细胞包含外源表达的CD47多肽、减少表达水平的B2M和CIITA、和一种或多种选自以下各者的组的额外外源表达多肽：CD24、CD46、CD55、CD59、CD200、DUX4、PD-L1、IDO1、HLA-G、FasL、CCL21、Mfge8、Serpin B9和其任何组合。
实施方案115.如以上或以下实施方案中任一项所述的方法，其中所述细胞还包含减少表达水平的TCRα、TCRβ或两者。
实施方案116.如以上或以下实施方案中任一项所述的方法，其中治疗有效细胞群体的至少一个剂量包括所述群体的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多个剂量。
实施方案117.如以上或以下实施方案中任一项所述的方法，其中调节包括降低所述患者中的治疗有效细胞群体的数目。
实施方案118.如以上或以下实施方案中任一项所述的方法，其中所述细胞包括衍生自多能干细胞的分化细胞。
实施方案119.如以上或以下实施方案中任一项所述的方法，其中所述多能干细胞包括经诱导的多能干细胞。
实施方案120.如以上或以下实施方案中任一项所述的方法，其中所述分化细胞选自由以下组成的组：心脏细胞、神经细胞、内皮细胞、T细胞、胰岛细胞、视网膜色素上皮细胞、肝细胞、甲状腺细胞、皮肤细胞、血细胞和上皮细胞。
实施方案121.如以上或以下实施方案中任一项所述的方法，其中所述细胞包括衍生自原代T细胞的细胞。
实施方案122.如以上或以下实施方案中任一项所述的方法，其中所述衍生自原代T细胞的细胞衍生自原代T细胞的池，所述原代T细胞包括来自不同于所述患者的一个或多个(例如，两个或更多个、三个或更多个、四个或更多个、五个或更多个、十个或更多个、二十个或更多个、五十个或更多个、或一百个或更多个)受试者的原代T细胞。
实施方案123.如以上或以下实施方案中任一项所述的方法，其中所述衍生自原代T细胞的细胞包含嵌合抗原受体(CAR)。
实施方案124.如以上或以下实施方案中任一项所述的方法，其中所述CAR和所述外源表达CD47多肽在单一启动子控制下表达。
实施方案125.如以上或以下实施方案中任一项所述的方法，其中所述CAR结合选自由以下组成的组的抗原：CD19、CD22、CD38、CD123、CD138和BCMA。
实施方案126.如以上或以下实施方案中任一项所述的方法，其中所述衍生自原代T细胞的细胞包含减少表达的内源性T细胞受体。
实施方案127.如以上或以下实施方案中任一项所述的方法，其中所述衍生自原代T细胞的细胞包含减少表达的细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4(CTLA4)和/或程序性细胞死亡(PD1)。
实施方案128.如以上或以下实施方案中任一项所述的方法，其中所述患者中的细胞群体的活性包括细胞的不当活性。
实施方案129.如以上或以下实施方案中任一项所述的方法，其中所述不当活性选自由以下组成的组：异常增生、转化、肿瘤形成、细胞因子释放综合征、移植物抗宿主疾病(GVHD)和免疫效应细胞相关神经中毒性综合征(ICANS)。
实施方案130.一种控制患者中的细胞疗法效应的方法，所述方法包括：(a)向所述患者施用包含细胞群体的组合物，其中所述细胞包含外源表达CD47多肽；(b)在步骤(a)之后的时间间隔后，以有效诱导针对在步骤(a)中施用的细胞群体的免疫反应的量，进一步向所述患者施用CD47-SIRPα阻断剂，由此控制所述患者中的细胞群体效应。
实施方案131.如以上或以下实施方案中任一项所述的方法，其中所述细胞包含减少表达的MHC I类和/或MHC II类人类白细胞抗原。
实施方案132.如以上或以下实施方案中任一项所述的方法，其中所述细胞包含减少表达的MHC I类和MHC II类人类白细胞抗原。
实施方案133.如以上或以下实施方案中任一项所述的方法，其中所述细胞还包含减少表达的一种或多种TCR复合物。
实施方案134.如以上或以下实施方案中任一项所述的方法，其中所述细胞包含外源表达CD47多肽和一种或多种选自由以下组成的组的额外外源表达多肽：CD24、CD46、CD55、CD59、CD200、DUX4、PD-L1、IDO1、HLA-G、FasL、CCL21、Mfge8、Serpin B9和其任何组合。
实施方案135.如以上或以下实施方案中任一项所述的方法，其中所述细胞还包含一个或多个转基因，其中所述转基因编码选自由以下组成的组的外源表达多肽：CD24、CD46、CD55、CD59、CD200、DUX4、PD-L1、IDO1、HLA-G、FasL、CCL21、Mfge8和Serpin B9。
实施方案136.如以上或以下实施方案中任一项所述的方法，其中所述细胞包含外源表达CD47多肽和减少表达水平的B2M和/或CIITA。
实施方案137.如以上或以下实施方案中任一项所述的方法，其中所述细胞包含外源表达CD47多肽和减少表达水平的B2M和CIITA。
实施方案138.如以上或以下实施方案中任一项所述的方法，其中所述细胞包含外源表达的CD47多肽、减少表达水平的B2M和/或CIITA、和一种或多种选自以下各者的组的额外外源表达多肽：CD24、CD46、CD55、CD59、CD200、DUX4、PD-L1、IDO1、HLA-G、FasL、CCL21、Mfge8、Serpin B9和其任何组合。
实施方案139.如以上或以下实施方案中任一项所述的方法，其中所述细胞包含外源表达的CD47多肽、减少表达水平的B2M和CIITA、和一种或多种选自以下各者的组的额外外源表达多肽：CD24、CD46、CD55、CD59、CD200、DUX4、PD-L1、IDO1、HLA-G、FasL、CCL21、Mfge8、Serpin B9和其任何组合。
实施方案140.如以上或以下实施方案中任一项所述的方法，其中所述细胞还包含减少表达水平的TCRα、TCRβ或两者。
实施方案141.如以上或以下实施方案中任一项所述的方法，其中所述细胞包括衍生自多能干细胞的分化细胞。
实施方案142.如以上或以下实施方案中任一项所述的方法，其中所述多能干细胞包括经诱导的多能干细胞。
实施方案143.如以上或以下实施方案中任一项所述的方法，其中所述分化细胞选自由以下组成的组：心脏细胞、神经细胞、内皮细胞、T细胞、胰岛细胞、视网膜色素上皮细胞、肝细胞、甲状腺细胞、皮肤细胞、血细胞和上皮细胞。
实施方案144.如以上或以下实施方案中任一项所述的方法，其中所述细胞包括衍生自原代T细胞的细胞。
实施方案145.如以上或以下实施方案中任一项所述的方法，其中所述衍生自原代T细胞的细胞衍生自原代T细胞的池，所述原代T细胞包括来自不同于所述患者的一个或多个(例如，两个或更多个、三个或更多个、四个或更多个、五个或更多个、十个或更多个、二十个或更多个、五十个或更多个、或一百个或更多个)受试者的原代T细胞。
实施方案146.如以上或以下实施方案中任一项所述的方法，其中所述衍生自原代T细胞的细胞包含嵌合抗原受体(CAR)。
实施方案147.如以上或以下实施方案中任一项所述的方法，其中所述CAR和所述外源表达CD47多肽在单一启动子控制下表达。
实施方案148.如以上或以下实施方案中任一项所述的方法，其中所述CAR结合选自由以下组成的组的抗原：CD19、CD22、CD38、CD123、CD138和BCMA。
实施方案149.如以上或以下实施方案中任一项所述的方法，其中所述衍生自原代T细胞的细胞包含减少表达的内源性T细胞受体。
实施方案150.如以上或以下实施方案中任一项所述的方法，其中所述衍生自原代T细胞的细胞包含减少表达的细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4(CTLA4)和/或程序性细胞死亡(PD1)。
实施方案151.如以上或以下实施方案中任一项所述的方法，其中所述时间间隔包括至少1周或更长时间。
实施方案152.如以上或以下实施方案中任一项所述的方法，其中所述时间间隔包括至少1个月或更长时间。
实施方案153.如以上或以下实施方案中任一项所述的方法，其中所述CD47-SIRPα阻断剂选自由以下组成的组：结合CD47的抗体或其片段、结合CD47的双特异性抗体、结合CD47的免疫细胞因子融合蛋白、含有CD47的融合蛋白、结合SIRPα的抗体或其片段、结合SIRPα的双特异性抗体、结合SIRPα的免疫细胞因子融合蛋白、含有SIRPα的融合蛋白和其组合。
实施方案154.如以上或以下实施方案中任一项所述的方法，其中所述结合CD47的抗体或其片段选自由以下组成的组：麦格罗单抗(Hu5F9-G4)、CC-90002、IBI-188、IBI-322、TG-1801(NI-1701)、ALX148、TJ011133、FA3M3、ZL1201、AK117、AO-176、SRF231、GenSci-059、C47B157、C47B161、C47B167、C47B222、C47B227、Vx-1004、HMBD004、SHR-1603、AMMS4-G4、RTX-CD47和IMC-002。
实施方案155.如以上或以下实施方案中任一项所述的方法，其中所述结合CD47的抗体或其片段选自由以下组成的组：针对CD47的单链Fv片段(scFv)、针对CD47的Fab、针对CD47的VHH纳米抗体、针对CD47的DARPin和其变体。
实施方案156.如以上或以下实施方案中任一项所述的方法，其中所述结合SIRPα的抗体或其片段选自由以下组成的组：ADU-1805、CC-95251、OSE-172(BI 765063)、KWAR23和P362。
实施方案157.如以上或以下实施方案中任一项所述的方法，其中所述结合SIRPα的抗体或其片段选自由以下组成的组：针对SIRPα的单链Fv片段(scFv)、针对SIRPα的Fab、针对SIRPα的VHH纳米抗体、针对SIRPα的DARPin和其变体。
实施方案158.如以上或以下实施方案中任一项所述的方法，其中所述含有SIRPα的融合蛋白包含连接至Fc域的SIRPα的CD47结合域。
实施方案159.如以上或以下实施方案中任一项所述的方法，其中所述Fc域包含选自由以下组成的组的Fc域或其一部分：IgG1、IgG2、IgG3和IgG4。
实施方案160.如以上或以下实施方案中任一项所述的方法，其中在在施用步骤(b)之前，步骤(a)重复至少1-10次。
实施方案161.如以上或以下实施方案中任一项所述的方法，其中所述患者中的细胞群体效应包括细胞的不良效应或不当效应。
实施方案162.如以上或以下实施方案中任一项所述的方法，其中所述不良效应选自由以下组成的组：异常增生、转化、肿瘤形成、细胞因子释放综合征、移植物抗宿主疾病(GVHD)、免疫效应细胞相关神经中毒性综合征(ICANS)。
实施方案163.一种控制患者中的细胞疗法效应的方法，所述方法包括向先前施用包含外源表达CD47多肽的细胞的患者施用CD47-SIRPα阻断剂。
实施方案164.如以上或以下实施方案中任一项所述的方法，其中所述细胞包含减少表达的MHC I类和/或MHC II类人类白细胞抗原。
实施方案165.如以上或以下实施方案中任一项所述的方法，其中所述细胞包含减少表达的MHC I类和MHC II类人类白细胞抗原。
实施方案166.如以上或以下实施方案中任一项所述的方法，其中所述细胞还包含减少表达的一种或多种TCR复合物。
实施方案167.如以上或以下实施方案中任一项所述的方法，其中所述细胞包含外源表达CD47多肽和一种或多种选自由以下组成的组的额外外源表达多肽：CD24、CD46、CD55、CD59、CD200、DUX4、PD-L1、IDO1、HLA-G、FasL、CCL21、Mfge8、Serpin B9和其任何组合。
实施方案168.如以上或以下实施方案中任一项所述的方法，其中所述细胞还包含一个或多个转基因，其中所述转基因编码选自由以下组成的组的外源表达多肽：CD24、CD46、CD55、CD59、CD200、DUX4、PD-L1、IDO1、HLA-G、FasL、CCL21、Mfge8和Serpin B9。
实施方案169.如以上或以下实施方案中任一项所述的方法，其中所述细胞包含外源表达CD47多肽和减少表达水平的B2M和/或CIITA。
实施方案170.如以上或以下实施方案中任一项所述的方法，其中所述细胞包含外源表达CD47多肽和减少表达水平的B2M和CIITA。
实施方案171.如以上或以下实施方案中任一项所述的方法，其中所述细胞包含外源表达的CD47多肽、减少表达水平的B2M和/或CIITA、和一种或多种选自以下各者的组的额外外源表达多肽：CD24、CD46、CD55、CD59、CD200、DUX4、PD-L1、IDO1、HLA-G、FasL、CCL21、Mfge8、Serpin B9和其任何组合。
实施方案172.如以上或以下实施方案中任一项所述的方法，其中所述细胞包含外源表达的CD47多肽、减少表达水平的B2M和CIITA、和一种或多种选自以下各者的组的额外外源表达多肽：CD24、CD46、CD55、CD59、CD200、DUX4、PD-L1、IDO1、HLA-G、FasL、CCL21、Mfge8、Serpin B9和其任何组合。
实施方案173.如以上或以下实施方案中任一项所述的方法，其中所述细胞还包含减少表达水平的TCRα、TCRβ或两者。
实施方案174.如以上或以下实施方案中任一项所述的方法，其中所述细胞包括衍生自多能干细胞的分化细胞。
实施方案175.如以上或以下实施方案中任一项所述的方法，其中所述多能干细胞包括经诱导的多能干细胞。
实施方案176.如以上或以下实施方案中任一项所述的方法，其中所述分化细胞选自由以下组成的组：心脏细胞、神经细胞、内皮细胞、T细胞、胰岛细胞、视网膜色素上皮细胞、肝细胞、甲状腺细胞、皮肤细胞、血细胞和上皮细胞。
实施方案177.如以上或以下实施方案中任一项所述的方法，其中所述细胞包括衍生自原代T细胞的细胞。
实施方案178.如以上或以下实施方案中任一项所述的方法，其中所述衍生自原代T细胞的细胞衍生自原代T细胞的池，所述原代T细胞包括来自不同于所述患者的一个或多个(例如，两个或更多个、三个或更多个、四个或更多个、五个或更多个、十个或更多个、二十个或更多个、五十个或更多个、或一百个或更多个)受试者的原代T细胞。
实施方案179.如以上或以下实施方案中任一项所述的方法，其中所述衍生自原代T细胞的细胞包含嵌合抗原受体(CAR)。
实施方案180.如以上或以下实施方案中任一项所述的方法，其中所述CAR和所述外源表达CD47多肽在单一启动子控制下表达。
实施方案181.如以上或以下实施方案中任一项所述的方法，其中所述CAR结合选自由以下组成的组的抗原：CD19、CD22、CD38、CD123、CD138和BCMA。
实施方案182.如以上或以下实施方案中任一项所述的方法，其中所述衍生自原代T细胞的细胞包含减少表达的内源性T细胞受体。
实施方案183.如以上或以下实施方案中任一项所述的方法，其中所述衍生自原代T细胞的细胞包括减少表达的细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4(CTLA4)和/或程序性细胞死亡(PD1)。
实施方案184.如以上或以下实施方案中任一项所述的方法，其中所述CD47-SIRPα阻断剂选自由以下组成的组：结合CD47的抗体或其片段、结合CD47的双特异性抗体、结合CD47的免疫细胞因子融合蛋白、含有CD47的融合蛋白、结合SIRPα的抗体或其片段、结合SIRPα的双特异性抗体、结合SIRPα的免疫细胞因子融合蛋白、含有SIRPα的融合蛋白和其组合。
实施方案185.如以上或以下实施方案中任一项所述的方法，其中所述结合CD47的抗体或其片段选自由以下组成的组：麦格罗单抗(Hu5F9-G4)、CC-90002、IBI-188、IBI-322、TG-1801(NI-1701)、ALX148、TJ011133、FA3M3、ZL1201、AK117、AO-176、SRF231、GenSci-059、C47B157、C47B161、C47B167、C47B222、C47B227、Vx-1004、HMBD004、SHR-1603、AMMS4-G4、RTX-CD47和IMC-002。
实施方案186.如以上或以下实施方案中任一项所述的方法，其中所述结合CD47的抗体或其片段选自由以下组成的组：针对CD47的单链Fv片段(scFv)、针对CD47的Fab、针对CD47的VHH纳米抗体、针对CD47的DARPin和其变体。
实施方案187.如以上或以下实施方案中任一项所述的方法，其中所述结合SIRPα的抗体或其片段选自由以下组成的组：ADU-1805、CC-95251、OSE-172(BI 765063)、KWAR23和P362。
实施方案188.如以上或以下实施方案中任一项所述的方法，其中所述结合SIRPα的抗体或其片段选自由以下组成的组：针对SIRPα的单链Fv片段(scFv)、针对SIRPα的Fab、针对SIRPα的VHH纳米抗体、针对SIRPα的DARPin和其变体。
实施方案189.如以上或以下实施方案中任一项所述的方法，其中所述含有SIRPα的融合蛋白包含连接至Fc域的SIRPα的CD47结合域。
实施方案190.如以上或以下实施方案中任一项所述的方法，其中所述Fc域包含选自由以下组成的组的Fc域或其一部分：IgG1、IgG2、IgG3和IgG4。
实施方案191.如以上或以下实施方案中任一项所述的方法，其中先前施用细胞的效应包括所述患者中的不良效应或不当效应。
实施方案192.如以上或以下实施方案中任一项所述的方法，其中所述不良效应选自由以下组成的组：异常增生、转化、肿瘤形成、细胞因子释放综合征、移植物抗宿主疾病(GVHD)和免疫效应细胞相关神经中毒性综合征(ICANS)。
实施方案193.一种用于治疗不良效应的CD47-SIRPα阻断剂，所述不良效应在施用包含外源表达CD47多肽的细胞群体之后发生。
实施方案194.一种用于治疗不良效应的CD47-SIRPα阻断剂，所述不良效应在施用包含外源表达CD47多肽和减少表达的MHC I类和MHC II人类白细胞抗原的细胞群体之后发生。
实施方案195.一种用于治疗不良效应的CD47-SIRPα阻断剂，所述不良效应在施用包含外源表达CD47多肽和减少表达的MHC I类和MHC II人类白细胞抗原和一种或多种TCR复合物的细胞群体之后发生。
实施方案196.CD47-SIRPα阻断剂在制造供在有需要的患者中进行细胞疗法的药物中的用途，其中已向所述患者施用包含外源表达CD47多肽的细胞。
实施方案197.CD47-SIRPα阻断剂在制造供在有需要的患者中进行细胞疗法的药物中的用途，其中已向所述患者施用包含外源表达CD47多肽和减少表达的MHC I类和MHCII人类白细胞抗原的细胞。
实施方案198.CD47-SIRPα阻断剂在制造供在有需要的患者中进行细胞疗法的药物中的用途，其中已向患者施用包含外源表达CD47多肽和减少表达的MHC I类和MHC II人类白细胞抗原和一种或多种TCR复合物的细胞。
实施方案199.CD47-SIRPα阻断剂在制造供调节患者中的细胞疗法活性的药物中的用途，其中所述患者已接受至少一个剂量的治疗有效的包含外源表达CD47多肽的细胞群体。
实施方案200.CD47-SIRPα阻断剂在制造供调节患者中的细胞疗法活性的药物中的用途，其中所述患者已接受至少一个剂量的治疗有效的包含外源表达CD47多肽和减少表达的MHC I类和MHC II人类白细胞抗原的细胞群体。
实施方案201.CD47-SIRPα阻断剂在制造供调节患者中的细胞疗法活性的药物中的用途，其中所述患者已接受至少一个剂量的治疗有效的包含外源表达CD47多肽和减少表达的MHC I类和MHC II人类白细胞抗原和一种或多种TCR复合物的细胞群体。
实施方案202.CD47-SIRPα阻断剂在制造供控制患者中的细胞疗法效应的药物中的用途，其中已向所述患者施用包含外源表达CD47多肽的细胞。
实施方案203.如以上或以下实施方案中任一项所述的CD47-SIRPα阻断剂或用途，其中所述CD47-SIRPα阻断剂选自由以下组成的组：结合CD47的抗体或其片段、结合CD47的双特异性抗体、结合CD47的免疫细胞因子融合蛋白、含有CD47的融合蛋白、结合SIRPα的抗体或其片段、结合SIRPα的双特异性抗体、结合SIRPα的免疫细胞因子融合蛋白、含有SIRPα的融合蛋白和其组合。
实施方案204.如以上或以下实施方案中任一项所述的CD47-SIRPα阻断剂或用途，其中所述结合CD47的抗体或其片段选自由以下组成的组：麦格罗单抗(Hu5F9-G4)、CC-90002、IBI-188、IBI-322、TG-1801(NI-1701)、ALX148、TJ011133、FA3M3、ZL1201、AK117、AO-176、SRF231、GenSci-059、C47B157、C47B161、C47B167、C47B222、C47B227、Vx-1004、HMBD004、SHR-1603、AMMS4-G4、RTX-CD47和IMC-002。
实施方案205.如以上或以下实施方案中任一项所述的CD47-SIRPα阻断剂或用途，其中所述结合CD47的抗体或其片段选自由以下组成的组：针对CD47的单链Fv片段(scFv)、针对CD47的Fab、针对CD47的VHH纳米抗体、针对CD47的DARPin和其变体。
实施方案206.如以上或以下实施方案中任一项所述的CD47-SIRPα阻断剂或用途，其中所述结合SIRPα的抗体或其片段选自由以下组成的组：ADU-1805、CC-95251、OSE-172(BI 765063)、KWAR23和P362。
实施方案207.如以上或以下实施方案中任一项所述的CD47-SIRPα阻断剂或用途，其中所述结合SIRPα的抗体或其片段选自由以下组成的组：针对SIRPα的单链Fv片段(scFv)、针对SIRPα的Fab、针对SIRPα的VHH纳米抗体、针对SIRPα的DARPin和其变体。
实施方案208.如以上或以下实施方案中任一项所述的CD47-SIRPα阻断剂或用途，其中所述含有SIRPα的融合蛋白包含连接至Fc域的SIRPα的CD47结合域。
实施方案209.如以上或以下实施方案中任一项所述的CD47-SIRPα阻断剂或用途，其中所述Fc域包含选自由以下组成的组的Fc域或其一部分：IgG1、IgG2、IgG3和IgG4。
实施方案210.如以上或以下实施方案中任一项所述的CD47-SIRPα阻断剂或用途，其中所述细胞还包含减少表达的MHC I类和/或MHC II类人类白细胞抗原。
实施方案211.如以上或以下实施方案中任一项所述的CD47-SIRPα阻断剂或用途，其中所述细胞包含减少表达的MHC I类和MHC II类人类白细胞抗原。
实施方案212.如以上或以下实施方案中任一项所述的CD47-SIRPα阻断剂或用途，其中所述细胞包含外源表达CD47多肽和一种或多种选自由以下组成的组的额外外源表达多肽：CD24、CD46、CD55、CD59、CD200、DUX4、PD-L1、IDO1、HLA-G、FasL、CCL21、Mfge8、SerpinB9和其任何组合。
实施方案213.如以上或以下实施方案中任一项所述的CD47-SIRPα阻断剂或用途，其中所述细胞还包含一个或多个转基因，其中所述转基因编码选自由以下组成的组的外源表达多肽：CD24、CD46、CD55、CD59、CD200、DUX4、PD-L1、IDO1、HLA-G、FasL、CCL21、Mfge8和Serpin B9。
实施方案214.如以上或以下实施方案中任一项所述的CD47-SIRPα阻断剂或用途，其中所述细胞包含外源表达CD47多肽和减少表达水平的B2M和/或CIITA。
实施方案215.如以上或以下实施方案中任一项所述的CD47-SIRPα阻断剂或用途，其中所述细胞包含外源表达CD47多肽和减少表达水平的B2M和CIITA。
实施方案216.如以上或以下实施方案中任一项所述的CD47-SIRPα阻断剂或用途，其中所述细胞包含外源表达CD47多肽和减少表达水平的B2M和CIITA。
实施方案217.如以上或以下实施方案中任一项所述的CD47-SIRPα阻断剂或用途，其中所述细胞包含外源表达的CD47多肽、减少表达水平的B2M和/或CIITA、和一种或多种选自以下各者的组的额外外源表达多肽：CD24、CD46、CD55、CD59、CD200、DUX4、PD-L1、IDO1、HLA-G、FasL、CCL21、Mfge8、Serpin B9和其任何组合。
实施方案218.如以上或以下实施方案中任一项所述的CD47-SIRPa阻断剂或用途，其中所述细胞包含外源表达的CD47多肽、减少表达水平的B2M和CIITA、和一种或多种选自以下各者的组的额外外源表达多肽：CD24、CD46、CD55、CD59、CD200、DUX4、PD-L1、IDO1、HLA-G、FasL、CCL21、Mfge8、Serpin B9和其任何组合。
实施方案219.如以上或以下实施方案中任一项所述的CD47-SIRPα阻断剂或用途，其中所述细胞还包含减少表达水平的TCRα、TCRp或两者。
实施方案220.如以上或以下实施方案中任一项所述的CD47-SIRPα阻断剂或用途，其中所述细胞是衍生自多能干细胞的分化细胞。
实施方案221.如以上或以下实施方案中任一项所述的CD47-SIRPα阻断剂或用途，其中所述多能干细胞包括经诱导的多能干细胞。
实施方案222.如以上或以下实施方案中任一项所述的CD47-SIRPα阻断剂或用途，其中所述分化细胞选自由以下组成的组：心脏细胞、神经细胞、内皮细胞、T细胞、胰岛细胞、视网膜色素上皮细胞、肝细胞、甲状腺细胞、皮肤细胞、血细胞和上皮细胞。
实施方案223.如以上或以下实施方案中任一项所述的CD47-SIRPα阻断剂或用途，其中所述细胞包括衍生自原代T细胞的细胞。
实施方案224.如以上或以下实施方案中任一项所述的CD47-SIRPα阻断剂或用途，其中所述衍生自原代T细胞的细胞衍生自原代T细胞的池，所述原代T细胞包括来自不同于所述患者的一个或多个(例如，两个或更多个、三个或更多个、四个或更多个、五个或更多个、十个或更多个、二十个或更多个、五十个或更多个、或一百个或更多个)受试者的原代T细胞。
实施方案225.如以上或以下实施方案中任一项所述的CD47-SIRPα阻断剂或用途，其中所述衍生自原代T细胞的细胞包含嵌合抗原受体(CAR)。
实施方案226.如以上或以下实施方案中任一项所述的CD47-SIRPα阻断剂或用途，其中所述CAR和所述外源表达CD47多肽在单一启动子控制下表达。
实施方案227.如以上或以下实施方案中任一项所述的CD47-SIRPα阻断剂或用途，其中所述CAR结合选自由以下组成的组的抗原：CD19、CD22、CD38、CD123、CD138和BCMA。
实施方案228.如以上或以下实施方案中任一项所述的CD47-SIRPα阻断剂或用途，其中所述衍生自原代T细胞的细胞包含减少表达的内源性T细胞受体。
实施方案229.如以上或以下实施方案中任一项所述的CD47-SIRPα阻断剂或用途，其中所述衍生自原代T细胞的细胞包括减少表达的细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4(CTLA4)和/或程序性细胞死亡(PD1)。
实施方案230.一种用于治疗不良效应的CD47-SIRPα阻断剂，所述不良效应在施用包含外源表达CD47多肽和减少表达的B2M、CIITA和TCRα的细胞群体之后发生。
实施方案231.一种用于治疗不良效应的CD47-SIRPα阻断剂，所述不良效应在施用包含外源表达CD47多肽和减少表达的B2M、CIITA和TCRβ的细胞群体之后发生。
实施方案232.CD47-SIRPα阻断剂在制造供在有需要的患者中进行细胞疗法的药物中的用途，其中已向所述患者施用包含外源表达CD47多肽和减少表达的B2M、CIITA和TCRα的细胞。
实施方案233.CD47-SIRPα阻断剂在制造供在有需要的患者中进行细胞疗法的药物中的用途，其中已向所述患者施用包含外源表达CD47多肽和减少表达的B2M、CIITA和TCRβ的细胞。
实施方案234.CD47-SIRPα阻断剂在制造供调节患者中的细胞疗法活性的药物中的用途，其中所述患者已接受至少一个剂量的治疗有效的包含外源表达CD47多肽和减少表达的B2M、CIITA和TCRα的细胞群体。
实施方案235.CD47-SIRPα阻断剂在制造供调节患者中的细胞疗法活性的药物中的用途，其中所述患者已接受至少一个剂量的治疗有效的包含外源表达CD47多肽和减少表达的B2M、CIITA和TCRβ的细胞群体。
实施例
实施例1.体外CD47阻断
CD47阻断剂(在本文中也称为CD47-SIRPa阻断剂)消除CD47对于NK细胞和巨噬细胞杀灭的抑制效应的能力在XCELLIGENCE MP平台(ACEA BioSciences)上测定。将96孔E板(ACEA BioSciences)以胶原蛋白(Sigma-Aldrich)涂布并且将4×105个人类HIP(B2M-/-、CIITA-/-、CD47+)或双重敲除(B2M-/-、CIITA-/-)细胞涂铺于100μL细胞特异性培养基中。将人类细胞涂铺并且一天后用100ug/ml抗CD47抗体MIP410(BioXCell，Lebanon，NH)或IgG1同型对照(BioXCell)处理。细胞指数值达到0.7后，在使用或不使用1ng/ml人类IL-2(PeproTech)的情况下，以1∶1的E∶T比率添加人类NK细胞或人类巨噬细胞(Lonza)。作为杀灭对照，细胞用2％TRITON X100处理。未观察到经刺激或未刺激NK细胞(图1A)或巨噬细胞(图2A)对于表达CD47的HIP细胞的杀灭，而双重敲除细胞通过NK细胞(图1B)和巨噬细胞(图2B)两者快速杀灭。相比之下，用抗CD47抗体治疗的HIP细胞被NK细胞(图1D)和巨噬细胞(图2D)快速杀灭，而在IgG1同型对照处理后，未见杀灭(图1C和图2C)。此实施例证明CD47阻断消除CD47针对NK细胞和巨噬细胞杀灭的保护效应。
实施例2.体内CD47阻断
NSG小鼠具有功能性巨噬细胞，但是缺少其他免疫细胞。因此将1百万人类NK细胞i.v.转移至NSG小鼠中并且同时将5万人类HIP(B2M-/-、CIITA-/-、CD47+)iPSC皮下注射至同一小鼠中。每日s.c.注射(n＝5)500ug/kg抗CD47抗体(MIP410；BioXCell)。对照小鼠接受IgG1同型对照(BioXCell)(n＝3)。对于生物发光成像(BLI)，将D-萤火虫荧光素钾盐(375mg/kg；Biosynth)溶解在PBS(pH 7.4)(Gibco，Invitrogen)中并且腹膜内注射(每只小鼠250μL)至麻醉小鼠中。动物使用AMI成像器(Spectral Instruments)成像。目标区域(ROI)生物发光以最大光子/秒/平方厘米/球面度(p s-1cm-2sr-1)为单位来定量。来自ROI的最大信号使用Living Image软件(MediaCybemetics)来测量。小鼠在第0天、第2天和每第4天监测直到信号达到背景或畸胎瘤达到＞2000mm3体积为止。施用IgG1同型对照抗体的小鼠中的HIP iPSC的生物发光在25天过程中增加，指示iPSC的存活(图3A)。相反，在施用抗CD47抗体后，HIP iPSC的生物发光快速降低，到第4天降至背景以下(图3B)。此实施例展示CD47阻断可诱导表达CD47的低免疫细胞的杀灭。
实施例3.产生低免疫原性CAR-T细胞来逃避免疫识别以用于同种异体疗法
A.摘要
现成CAR-T细胞可提供超过自体策略的优势，包括制造简易、质量控制和避免恶性污染和T细胞功能障碍。然而，针对组织不相容T细胞的剧烈宿主抗移植物免疫反应阻止同种异体CAR-T细胞的扩增和持久性并且减轻此方法的功效。本文描述了使用新颖低免疫编辑平台来工程化并产生人类免疫逃避CAR-T细胞的方法。所述系统部分地基于以下发现：当人类白细胞抗原(HLA)I类和II类基因失活并且CD47过表达时，T细胞失去其免疫原性。另外，已发现TCR敲除可用于控制移植物抗宿主疾病的风险。
此实施例描述低免疫原性CD19特异性CAR-T细胞(在本文中也称为HIP CD19CAR-T细胞)，以及在体外肿瘤功效实验中，与对照CD19特异性CAR-T细胞相比，外源CD47表达对于此类细胞的活性的效应。在实验中，CD19+肿瘤细胞用作靶细胞并且HIP CD19CAR-T细胞(例如测试和对照CAR-T细胞)用作效应细胞。在所描述实验中，HIP CD19CAR-T细胞(也被称为“HIP CAR-T细胞”)是含有以下各者的T细胞：(a)B2M、CIITA和TRAC基因的基因组编辑和(b)带有编码CD19特异性CAR的多核苷酸和编码CD47的多核苷酸的转基因。此类HIP CD19CAR-T细胞也被称为B2M-/-、CIITA-/-、TRAC-/-、CD19特异性CAR-CD47 T细胞。另外，在实验中，对照CAR-T细胞包括(a)表达编码CD19特异性CAR的多核苷酸的免疫原性T细胞，包括表达与tisagenlecleucel或其生物类似物/替代物相同CAR构建体的T细胞，(b)表达编码CD19特异性CAR和EGFRt的多核苷酸的免疫原性T细胞，和(c)模拟转染T细胞，即模拟转染的T细胞。
当移植至同种异体人源化小鼠中时，与从相同人类供者产生的免疫原性CD19阳性CAR-T细胞相比，HIP CD19CAR-T细胞(例如，B2M-/-、CIITA-/-、TRAC-/-、CD19特异性CAR-CD47T细胞)逃避T和B细胞的免疫识别。先天免疫细胞(例如，NK细胞或巨噬细胞)测定法显示在体外和体内，CD47过表达保护HIP CD1 9CAR-T细胞免于先天免疫细胞杀灭。通过使用每个细胞结合的抗体的流式细胞计数估计方法，分析CD47表达水平以便评估临界保护水平。针对CD47的阻断抗体使得HIP CD19CAR-T细胞易被巨噬细胞和NK细胞杀灭，证实CD47过表达对于逃避先天免疫清除的重要性。因此，使用针对CD47的阻断抗体预期为提供本文所述HIPCD19CAR-T细胞的安全开关的策略。
经分离的CD47过表达和使B2M、CIITA和TRAC基因失活的遗传修饰均不显示对于CAR-T细胞的细胞毒性潜力的任何效应。在一系列肿瘤细胞：HIP CD19CAR-T细胞比率下，HIP CD19CAR-T细胞(例如，B2M-/-、CIITA-/-、TRAC-/-、CD19特异性CAR-CD47 T细胞)在体外CD19+肿瘤模型中以及在免疫缺陷NSG小鼠中保持其抗肿瘤活性。如与免疫原性CAR-T细胞相比，引入低免疫基因编辑(例如，B2M/CIITA/TRAC基因失活)似乎不改变其与细胞因子无关的生长。这些发现结果显示在同种异体接受者中，HIP CD19CAR-T细胞在功能上为免疫逃避的，具有延长的细胞毒性抗肿瘤能力。因此，结果表明HIP CD19CAR-T细胞可为癌症患者提供普遍免疫治疗选项。
B.-方法
产生CAR-CD47工程化全T细胞：将全T细胞解冻并且在补充有IL-2的标准T细胞培养基中培养过夜。将有活力的T细胞计数并且以1∶1的珠粒：细胞比率用CD3/CD28珠粒来活化。在鱼精蛋白硫酸盐存在下，以100的MOI，使用CD19特异性CAR和CD47表达慢病毒(例如，在单一启动子控制下表达CD19特异性CAR和CD47转基因的慢病毒)来执行T细胞转导以便产生CD47工程化全T细胞。另外，产生模拟转染全T细胞，其中将T细胞模拟转染。细胞在补充有IL-2的标准T细胞培养基中扩增并且在标准冷冻培养基中冷冻以供稍后使用。
产生B2M/CIITA双重敲除全T细胞和B2M/CIITA双重敲除/CAR-CD47工程化全T细 胞：将冷冻模拟转染T细胞，即模拟转染的T细胞，和CD47工程化T细胞解冻并培养过夜，然后用CD3/CD28珠粒将细胞重新活化。在约第4天后，将珠粒从细胞去除。含有Cas9和靶向B2M和CIITA的引导RNA的核糖核蛋白(RNP)复合物根据标准方案来形成。在使用标准细胞电穿孔装置来电穿孔之前，将T细胞重新悬浮于核转染缓冲液中并添加至RNP复合物。电穿孔后，细胞在补充有IL-2的标准T细胞培养基中回收。编辑效率通过CD47、HLA-ABC和HLA-DR的FACS分析来评定。
与细胞因子无关的生长测定法：工程化T细胞在使用之前在1xPBS中洗涤两次并且在用于测定法中之前，重新悬浮于标准T细胞培养基中过夜。在第1天，将细胞重新悬浮于用或不用IL-2补充的标准培养基中。其后，活细胞每周通过锥虫蓝排除来计数两次。在整个测定法中，细胞浓度使用IL-2补充培养基来调整。
NK细胞培养：在细胞用于测定法中之前，在标准NK细胞培养基(例如，RPMI 1640加上10％热灭活FCS和1％青霉素/链霉素)中，人类原代NK细胞用人类IL-2刺激。
巨噬细胞培养：通过Ficoll分离，将PBMC从新鲜血液中分离并且重新悬浮于标准巨噬细胞培养基(例如，具有10％热灭活FCS和1％青霉素/链霉素的RPMI 1640)中。将细胞涂铺并在人类M-CSF中培养。每隔一天更换培养基。从第6天开始，将人类IL-2添加至培养基中约24小时，然后将细胞用于实验测定法中。
CD19+肿瘤培养物：在用于实验测定法中之前，将CD19+肿瘤细胞在标准细胞培养基(例如，具有10％热灭活FCS和1％青霉素/链霉素的RPMI 1640)中培养。
使用实时细胞分析系统的先天杀灭：NK细胞杀灭测定法和巨噬细胞吞噬测定法在实时细胞分析仪器(例如，平台，Agilent)上执行。简言之，将T细胞涂铺于CD19+肿瘤细胞特异性培养基中。在细胞指数值达到0.7后，以1∶1的E∶T比率，添加人类NK细胞或人类巨噬细胞，其中人类IL-2用于NK细胞并且没有IL-2用于巨噬细胞。一些孔用人类CD47阻断抗体或人类EGFR抗体(例如，西妥昔单抗(cetuximab))预处理并且在实时分析测定法过程期间再次处理。将数据标准化并用实时细胞分析仪器软件来分析。
约48小时后，将T细胞收集并用活/死亡细胞活力染色测定法的组分来染色。简言之，根据制造商的方案，将细胞用钙黄绿素AM和乙锭同二聚体-1染色。通过流式细胞术执行分析并且结果表示为死亡细胞的百分比。
使用实时细胞分析系统的体外CD19+肿瘤细胞杀灭：体外CD19+肿瘤细胞杀灭测定法在实时细胞分析仪器(例如，平台，Agilent)上执行。简言之，将T细胞涂铺于CD19+肿瘤细胞特异性培养基中。在细胞指数值达到0.7后，以0.125∶1、0.25∶1、0.5∶1、1∶1、3∶1或7∶1的E∶T比率，将人类NK细胞或人类巨噬细胞添加至标准T细胞培养基中。将数据标准化并用实时细胞分析仪器软件来分析。
具有过继转移的体内细胞毒性测定法：(1)未修饰T细胞和修饰B2M-/-CIITA-/-T细胞或(2)未修饰T细胞和修饰B2M-/-CIITA-/-CD47tgT细胞混合并且使用多色细胞标记试剂盒，用不同荧光团染料来染色。将细胞稀释于盐水和人类IL-2中。然后，细胞与人类原代NK细胞或人类巨噬细胞组合并且i.p.注射至免疫缺陷NSG小鼠中。人类原代NK细胞在注射之前用人类IL-2体外预处理。注射后大约48小时，腹膜细胞从实验小鼠收集并通过流式细胞术来分析。比较未修饰T细胞与修饰T细胞之间的比率。结果在图5A至图5B中示出。过继转移数据显示带有失活HLA-I/II基因的CAR-T细胞在体内通过NK细胞和巨噬细胞杀灭。但是，带有失活HLA-I/II和TCR基因与过表达CD47的CAR-T细胞不被先天免疫细胞杀灭。
酶联免疫吸收斑点ELISpot测定法：将低免疫原性CAR-T细胞或同种异体CAR-T细胞注射至每组n＝3的NSG-SGM3人源化小鼠中。在细胞注射后大约6天，接受者脾细胞从脾脏分离并且用作应答细胞。供者T细胞经丝裂霉素处理并且用作刺激细胞。将刺激细胞与接受者应答T细胞一起温育48小时并且IFN-γ斑点频率使用ELISpot板读取器来计数。结果在图6中示出。低免疫原性CAR-T细胞不诱导T细胞活化，然而，在人源化小鼠中检测到活化T细胞同种异体CAR-T细胞。
供者特异性抗体测定法：通过加热至56℃大约30min，将来自接受者小鼠(例如，注射低免疫原性CAR-T细胞或同种异体CAR-T细胞的NSG-SGM3人源化小鼠)的血清去补体。相等量的血清和细胞悬浮液在4℃下温育大约45min。细胞用FITC缀合山羊抗人类IgM标记并通过流式细胞术来分析。结果在图6中示出。低免疫原性CAR-T细胞不诱导供者特异性抗体结合，但是检测到针对同种异体CAR-T细胞的IgM结合。
C.结果
由于人类白细胞抗原(HLA)I类和II和TCR基因灭活(例如，敲除B2M、CIITA和TRAC基因)和CD47过表达，本文所述低免疫原性T细胞似乎缺少免疫原性。此类低免疫T细胞经工程化以便表达CD19特异性CAR分子。如与对应免疫原性CAR-T细胞相比，引入低免疫基因编辑不改变细胞的与细胞因子无关的生长。
此外，暴露于针对CD47的阻断抗体(例如，麦格罗单抗)使得低免疫原性CAR-T细胞(例如，B2M-/-、CIITA-/-、TRAC-/-、CD19特异性CAR-CD47 T细胞)易被巨噬细胞和NK细胞杀灭，证实CD47过表达对于逃避先天免疫清除的重要性。参见例如图4A至图4J和图5A至图5B。数据显示CD19特异性CAR和CD47构建体在实验细胞中以低或高水平表达。此外，此类构建体在单一启动子(例如，单一组成性活性启动子)控制下表达。结果显示低免疫原性CAR-T细胞在体外测定法中未被先天免疫细胞杀灭。相比之下，通过麦格罗单抗来阻断CD47诱导在体外由先天免疫细胞杀灭低免疫原性CD19特异性CAR-T细胞。如预期，未检测到通过先天免疫细胞杀灭对照CAR-T细胞(例如表达CAR-EGFRt构建体或tisagenlecleucel生物类似物或替代物的T细胞)。先天细胞杀灭表达CAR-EGFRt构建体的对照CAR-T细胞使用针对EGFR的阻断抗体(例如，西妥昔单抗)来诱导。数据还显示在不存在或存在麦格罗单抗或西妥昔单抗的情况下，模拟转染T细胞，即通过模拟转染的T细胞，不被NK细胞和巨噬细胞杀灭。
总之，用CD47抗体治疗可用作消除本文所述低免疫原性CAR-T细胞的低免疫原性特性的安全策略，由此允许接受者受试者的身体去除所述细胞。
实施例4.施用CD47-SIRPα阻断剂导致在体外和体内杀灭低免疫细胞
在体外和体内使用低免疫(B2M-/-、CIITA-/-和CD47tg+)细胞的安全机制研究使用本文所述方案来进行。
A.安全机制研究方案
1.细胞植入
皮下。在可拆卸腔室中，健康雄性NSG小鼠经由异氟烷吸入麻醉来麻醉。将麻醉小鼠从腔室移出并置于背卧位中。注射位点(右腹股沟区域)用70％EtOH喷雾。邻近腹股沟区，将细胞皮下注射。
脑部。预定手术之前24至48小时，通过MediGel(Clear H2O，Portland，ME)向动物提供卡洛芬(5毫克/千克/天)。计算量是基于标准摄取。向各个MediGel(三氯蔗糖)杯子中，添加1.5mg卡洛芬。或者，在开始手术之前，每12小时施用丁丙诺啡(0.05-0.1mg/Kg IM或IP)BID持续三天或施用丁丙诺啡SR(0.5-1.0mg/Kg SC)一次。丁丙诺啡SR或丁丙诺啡不在手术后联合MediGel使用。
在手术当天，将动物经由异氟烷吸入来麻醉并保持(分别3％和1.5％)。将头顶部修剪并用氯己定洗涤并用70％EtOH擦拭。将动物置于立体定位装置中。切开经过头皮中线的切口，所述切口足够长以便容易地暴露从前囟至人字缝尖的中缝。
在预定坐标(如通过Allen Brain Atlas或George Paxinos的Mouse Brain Atlas来鉴定)处，钻穿头骨而不穿透硬脑膜。使用Hamilton注射器和针，将微型打孔转换成微型输注泵。将针“降下”至到达大脑目标区所需要的深度并且输注可注射物(1μl-5μl盐水中的分化干细胞)。使用可吸收缝线，将切口闭合，并且小鼠在加温垫上恢复。动物保持于MediGel(具有卡洛芬的三氯蔗糖凝胶)上3天。
2.生物发光成像(BLI)
小鼠经由异氟烷吸入麻醉来麻醉并且腹膜内(IP)注射250μl荧光素(45.45mg/ml)。然后小鼠在鼻吸中定位于生物发光腔室中(在1.5％下以500ml氧/min来保持麻醉)。将小鼠成像180秒。围绕目标区域(ROI)绘制圆圈，给出发射光的光子/秒读数。
3.抗体(Ab)给药
IP给药。通过刺穿皮肤和肌肉层，将抗体(100ul)从腹面注射至腹腔中。
SC给药。小鼠经由异氟烷吸入麻醉来麻醉并置于背卧位中。注射位点(右腹股沟区域)用70％EtOH喷雾并且将抗体(100ul)注射至植入细胞区域中。
IV给药。小鼠在热灯下加温并且将抗体注射至扩张侧静脉中。
B.人类iPSC：体外和体内的麦格罗单抗
如图7A至图7B示出，当添加抗CD47麦格罗单抗抗体时，发生通过NK细胞和巨噬细胞杀灭人类HIP iPSC。将人类HIP iPSC皮下注射至具有过继转移的人类NK细胞的NSG小鼠中。使用局部同型对照(小鼠IgG4)并且在第0天至第10天(D0-D10)期间执行治疗。如图8A至图8B示出，在具有过继转移的NK细胞的NSG小鼠中，人类HIP iPSC形成畸胎瘤。用IgG4同型对照治疗不影响HIP存活。
将5x104个人类HIP iPSC皮下注射至具有过继转移的1x106个人类NK细胞的NSG小鼠中。使用局部同型对照(小鼠IgG4)并且在第0天至第10天(D0-D10)期间执行治疗。如图9A至图9B示出，体内阻断CD47导致杀灭HIP iPSC。在D10后，麦格罗单抗治疗停止。在6个月随访期间检查时，iPSC未重新出现。
C.人类iPSC：体外和体内MIAP410
在体外人类免疫细胞中观察到通过抗CD47抗体MIAP410的CD47阻断。如图10A至图10B示出，当添加抗CD47 MIAP410抗体时，观察到人类NK细胞和人类巨噬细胞杀灭人类HIPiPSC。
体内观察到通过抗CD47抗体MIAP410的CD47阻断。将2.5x104个人类HIP iPSC皮下注射至具有过继转移的1x106个人类NK细胞的NSG小鼠中。使用局部同型对照(小鼠IgG1)并且在第0天至第10天(D0-D10)期间执行治疗。如图11A至图11B示出，在具有过继转移的NK细胞的NSG小鼠中，人类iPSC形成畸胎瘤。用IgG1同型对照治疗不影响HIP存活。
将1.5x104个人类HIP iPSC皮下注射至具有过继转移的1x106个人类NK细胞的NSG小鼠中。将IL-2腹膜内(i.p.)施用于NK细胞供活化。在DO-D10期间，执行局部抗CD47低剂量(LD)(500ug)治疗。如图12A至图12B示出，体内阻断CD47导致杀灭HIP iPSC。在D10后，抗CD47治疗停止。在6个月随访期间检查时，iPSC未重新出现。
将15.5x104个人类HIP iPSC皮下注射至具有过继转移的1x106个人类NK细胞(未通过IL-2活化)的NSG小鼠中。高剂量(HD；1mg)的局部抗CD47 MIAP410治疗在D0、D1和D3执行。如图13A至图13B示出，体内阻断CD47导致杀灭HIP iPSC。给予抗CD47治疗3次(D0、D1、D3)。在6个月随访期间检查时，iPSC未在任何小鼠中重新出现。
将16.5x104个人类HIP iPSC皮下注射至具有过继转移的1x106个人类NK细胞(未通过IL-2活化)的NSG小鼠中。在D0、D1、D3腹膜内执行抗CD47 HD(1mg)治疗。如图14A至图14B示出，体内阻断CD47导致杀灭HIP iPSC。腹膜内给予抗CD47治疗3次(D0、D1、D3)。在6个月随访期间检查时，iPSC未在任何小鼠中重新出现。
在体内在大脑中观察到通过抗CD47抗体MIAP410的CD47阻断。将5x104个人类HIPiPSC颅内注射至具有过继转移的1x106个人类NK细胞的NSG小鼠中。如图15A至图15B示出，在具有过继转移的NK细胞的NSG小鼠中，人类iPSC形成畸胎瘤。用IgG4同型对照颅内治疗不影响HIP存活。在D0、D1和D3执行局部IgG4同型对照HD(1mg)治疗。
将5x104个人类HIP iPSC颅内注射至具有过继转移的1x106个人类NK细胞的NSG小鼠中。在D0、D1、D3执行局部抗CD47 HD(1mg)治疗。如图16A至图16B示出，CD47的颅内阻断导致大脑中的HIP iPSC的杀灭。三次后，抗CD47治疗停止。当小鼠在40天随访期间检查时，iPSC未重新出现。
将5x104个人类HIP iPSC颅内注射至具有过继转移的1x106个人类NK细胞的NSG小鼠中。在D0、D1和D3腹膜内执行抗CD47 HD(1mg)治疗，其中血脑屏障通过甘露糖醇注射来打破。如图17A至图17B示出，CD47的颅内阻断导致杀灭大脑中的HIP iPSC。三次后，抗CD47治疗(i.p.)停止。当在40天随访期间检查时，在5只小鼠中的4只中，iPSC未重新出现。
D.人类iPSC：体外和体内SIRPαIgG1Fc或IGG4Fc(融合蛋白)
在体外研究SIRPαFc融合蛋白对于人类iPSC的效应。相对于通过NK细胞、ADCC NK细胞和CDC介导的杀灭来研究对于HIP CD19CAR-T细胞的效应(图18A)。相对于通过NK细胞、ADCC NK细胞和CDC介导的杀灭来研究SIRPα IgG1Fc对于HIP细胞的效应(图18B)。相对于通过NK细胞、ADCC NK细胞和CDC介导的杀灭来研究SIRPαIgG4Fc(包括dKO杀灭对照)对于HIP细胞的效应(图18C)。相对于通过巨噬细胞和ADCC巨噬细胞介导的杀灭来研究对于HIP细胞的效应(图18D)。相对于通过巨噬细胞和ADCC巨噬细胞介导的杀灭来研究SIRPα IgGIFc对于HIP细胞的效应(图18E)。相对于通过巨噬细胞和ADCC巨噬细胞介导的杀灭来研究SIRPαIgG4Fc(包括dKO杀灭对照)对于HIP细胞的效应(图18F)。如预期，观察到IgG4介导通过阻断CD47来实现的杀灭。此外，观察到IgG1另外诱导CDC和ADCC。
在体内观察到通过SIRPαIgG1Fc的CD47阻断和ADCC。将人类HIP iPSC皮下注射至具有过继转移的人类NK细胞的NSG小鼠中。在D0、D1、D3执行局部SIRPαIgGIFc(1mg)治疗。在D20和D40，执行人类HIP iPSC的再次注射，接着进行SIRPαIgGIFc注射(持续3天)。如图19A至图19B示出，用SIRPα IgG1 Fc治疗在所有小鼠中重复地导致杀灭HIP iPSC。执行随访6个月。
在体内观察到通过SIRPαIgG4Fc的CD47阻断。将人类HIP iPSC皮下注射至具有过继转移的人类NK细胞的NSG小鼠中。在D0、D1、D3执行局部SIRPα IgG4Fc(1mg)治疗。在D20和D40，执行人类HIP iPSC的再次注射，接着进行SIRPαIgG4Fc注射(持续3天)(图20A至图20B)。
在体内观察到通过SIRPαIgG1Fc的CD47阻断和ADCC。将人类HIP iPSC颅内注射至具有过继转移的人类NK细胞和人类小神经胶质细胞的NSG小鼠中。在D0、D1、D3执行局部IgG1同型对照(1mg)治疗。如图21A至图21B示出，在具有过继转移的NK细胞和小神经胶质细胞的NSG小鼠中，人类HIP iPSC形成畸胎瘤。用IgG1同型对照治疗不影响HIP存活。
在体内观察到通过SIRPαIgG1Fc的CD47阻断和ADCC。将人类HIP iPSC颅内注射至具有过继转移的人类NK细胞和小神经胶质细胞的NSG小鼠中。在D0、D1、D3执行局部SIRPαIgG1Fc(1mg)治疗。如图22A至图22B示出，颅内SIRPαIgG1Fc导致杀灭大脑中的HIP iPSC。
在体内观察到通过SIRPαIgG1Fc的CD47阻断和ADCC。将人类HIP iPSC颅内注射至具有过继转移的人类NK细胞和人类小神经胶质细胞的NSG小鼠中。在D0、D1、D3腹膜内执行IgG1同型对照(1mg)治疗。如图23A至图23B示出，在具有过继转移的NK细胞和小神经胶质细胞的NSG小鼠中，人类HIP iPSC形成畸胎瘤。用IgG1同型对照腹膜内治疗不影响HIP存活。
在体内观察到通过SIRPαIgG1Fc的CD47阻断和ADCC。将人类HIP iPSC颅内注射至具有过继转移的人类NK细胞和小神经胶质细胞的NSG小鼠中。SIRPαIgG1Fc(1mg)治疗在D0、D1、D3执行并且腹膜内施用，其中通过甘露糖醇来打破血脑屏障。如图24A至图24B示出，在5只小鼠中的1只中，全身SIRPαIgG1Fc诱导杀灭大脑中的HIP iPSC。与局部施用相比，腹膜内应用似乎不太有效。
在体内观察到通过SIRPα IgG4Fc的CD47阻断。将人类HIP iPSC颅内注射至具有过继转移的人类NK细胞和人类小神经胶质细胞的NSG小鼠中。在D0、D1、D3执行局部IgG4同型对照(1mg)治疗。如图25A至图25B示出，在具有过继转移的NK细胞和小神经胶质细胞的NSG小鼠中，人类HIP iPSC形成畸胎瘤。用IgG4同型对照治疗不影响HIP存活。由于在D16和D20的畸胎瘤尺寸/症状，将小鼠安乐死。
在体内观察到通过SIRPα IgG4Fc的CD47阻断。将人类HIP iPSC颅内注射至具有过继转移的人类NK细胞和小神经胶质细胞的NSG小鼠中。在D0、D1、D3执行局部SIRPα IgG4Fc(1mg)治疗。如图26A至图26B示出，在5只小鼠中的1只中，颅内SIRPα IgG4Fc治疗导致杀灭大脑中的HIP iPSC。IgG1Fc似乎更有效。
将人类HIP iPSC皮下注射至NSG小鼠中，并且过继转移人类NK细胞和在D0、D1和D3以1mg皮下混入抗SIRPα。在D20执行人类HIP iPSC的再次注射，将50,000个细胞(50k)皮下(注入左侧)，并且在D20(混入)、D21和D23，1mg B6H12。在D40执行人类HIP iPSC的再次注射，将50k皮下(注入胸部中间上部)，并且在D40(混入)、D41和D43，1mg B6H12(图27)。
E.人类CD19Car T：体外和体内SIRPαIgG1Fc或IgG4Fc(融合蛋白)
功能端点为：(a)通过NK细胞或巨噬细胞的T细胞杀灭；以及(b)通过抗CD47抗体(麦格罗单抗/IgG1融合蛋白/IgG4融合蛋白)诱导HIP T细胞杀灭，确认CD47防止NK细胞/巨噬细胞杀灭的相关性。体外读出使用Xcelligence来执行。
表22.细胞类型和群组
1 HIP-CAR
2 EGFRt CAR
3 EGFRt CAR+tKO*
4 模拟转染T细胞(即模拟转染的T细胞)
*确认CD47防止NK细胞/巨噬细胞杀灭的相关性
在体外观察到通过SIRPαIgG1Fc或SIRPαIgG4Fc的CD47阻断。研究对于NK细胞(图28A)、巨噬细胞(图28B)、CD19 HIP CAR和NK细胞(图29A)、和CD19 HIP CAR和巨噬细胞(图29B)的效应。
使用Nalm6肿瘤模型来研究NSG小鼠。在具有和不具有静脉内融合蛋白的情况下，静脉内执行人类NK细胞和人类HIP CAR-T细胞的过继转移。在分选之前，将100U/mlIL-2解冻过夜，接着在分选之后和注射之前，100U/mlIL-2过夜(图30)。当HIP CAR通过安全策略来消除时，Nalm-6肿瘤生长(图31)。
如图32示出，(a)用模拟转染T细胞，即模拟转染的T细胞来治疗的小鼠显现肿瘤；(b)用HIP CAR T细胞治疗的小鼠显示肿瘤清除；并且(c)由于CD47阻断，IgG1和IgG4融合蛋白治疗导致杀灭HIP CAR T细胞并且因此肿瘤生长似乎与模拟转染T细胞群相当。HIP CART细胞通过IgG1和IgG4抗CD47融合蛋白来消除，指示Nalm-6肿瘤生长(图33和图34)。
F.小鼠原代HIP胰岛：体外和体内MIAP410
在体外小鼠HIP原代胰岛中观察到通过抗CD47抗体MIAP410的阻断。如图35A示出，NK细胞杀灭由MIAP410导致。如图35B示出，观察到巨噬细胞杀灭。
在体内在小鼠HIP原代胰岛中观察到通过MIAP410的阻断。1只小鼠对应于约150个胰岛簇。1个胰岛对应于约1500个细胞。在移植期间，每只小鼠(18g-20g)使用300个簇，即，肌肉内(i.m.)约450,000个细胞(450k)。
表23.HIP胰岛细胞研究
*HIP胰岛来自B2M-/-小鼠；CD47通过慢病毒递送
在小鼠细胞中使用STZ诱导糖尿病。6天后，将同种异体HIP胰岛细胞(MHC单倍型：H2b；对于luc和CD47(CAG启动子)为MOI 20)注射/移植至小鼠中。(图36)。在同种异体Balb/C小鼠中，使用原代胰岛移植来执行安全策略研究。如图37A至图37C示出，同种异体HIP胰岛存活并且治愈同种异体小鼠中的糖尿病。当使用5mg肌肉内IgG1同型对照时，未观察到HIP胰岛的杀灭。如图38A至图38C示出，在D7-D18肌肉内注射5mg的MIAP410时，HIP胰岛在同种异体小鼠中存活并且治愈糖尿病。当使用抗CD47(“安全策略”)时，将HIP胰岛杀灭并且小鼠再次变成糖尿病性的。
实施例5.在体内具有过继转移人类NK细胞的人类细胞中，施用具有小鼠IgG1 Fc域的MIAP410抗CD47抗体阻断CD47
遵循如实施例4中的方案。
A.无IL-2依赖性
如图39A至图39B示出，在将人类HIP iPSC注射至具有过继转移人类NK细胞和人类巨噬细胞的NSG小鼠中时，在具有或不具有体内IL-2刺激的情况下，施用具有Fc同型IgG1的MIAP410导致通过先天细胞的时间依赖性杀灭，可能经由NSG巨噬细胞的活化。
B.结果变化取决于何时开始治疗
如图40A至图40B示出，在第0天(D0)开始的局部皮下更高剂量(HD；三次)的MIAP410似乎比在第11天开始治疗更有效。腹膜内剂量与D0而非D11的局部剂量一样有效。
C.大脑中的局部治疗
如图41示出，大脑中的局部治疗与局部皮下治疗一样有效。当血脑屏障被打破，允许MIAP410更容易接近时，腹膜内治疗似乎是有效的。
D.在体内阻断CD47，同时施用IL-2导致杀灭HIP iPSC
如图42A至图42B示出，在具有过继转移NK细胞的NSG小鼠中，人类HIP iPSC形成畸胎瘤。当将人类HIP iPSC皮下注射至具有过继转移的人类NK细胞的NSG小鼠中时，施用Fc同型IgG1对照不影响HIP存活。
如图43A至图43B示出，当将人类HIP iPSC皮下注射至具有过继转移的人类NK细胞的NSG小鼠中时，局部LD 500μg施用具有Fc同型IgG1的MIAP410同时将IL-2施用于NK细胞供活化导致杀灭HIP iPSC。在D0-D10期间，发生MIAP410抗体治疗并且第10天(D10)后停止。在治疗后6个月执行随访时，未观察到iPSC重新出现。
如图44A至图44B示出，将人类HIP iPSC皮下注射至具有过继转移的人类NK细胞的NSG小鼠中，并且局部施用具有Fc同型IgG1的MIAP410(LD 500μg)，同时将IL-2施用于NK细胞供活化。MIAP410抗体治疗在第3天(D3)开始并且在D3-D36期间发生。对于小鼠的子集，重新治疗在D80开始。在开始治疗后6个月执行随访时，观察到在1只小鼠中，iPSC得以消除，同时在4只小鼠中，畸胎瘤显现，并且在1只小鼠中，重新治疗消除iPSC。
如图45A至图45B示出，将人类HIP iPSC皮下注射至具有过继转移的人类NK细胞的NSG小鼠中，并且局部施用具有Fc同型IgG1的MIAP410(LD 500g)，同时将IL-2施用于NK细胞供活化。MIAP410抗体治疗在第11天(D11)开始并且在D11-D36期间发生。在开始治疗后6个月执行随访时，观察到在1只小鼠中，iPSC得以消除，同时在4只小鼠中，畸胎瘤显现。
E.在体内阻断CD47，同时不施用IL-2导致杀灭HIP iPSC
如图46A至图46B示出，当将人类HIP iPSC皮下注射至具有过继转移的人类NK细胞的NSG小鼠中时，局部LD 500μg施用具有Fc同型IgG1的MIAP410导致杀灭HIP iPSC。MIAP410抗体治疗在第0天(D0)开始并且在D0-D10期间发生，在D16后治疗停止。在开始治疗后6个月执行随访时，未观察到iPSC在4只小鼠中重新出现，而畸胎瘤在1只小鼠中显现，所述小鼠是荧光素酶-的。
如图47A至图47B示出，当将人类HIP iPSC皮下注射至具有过继转移的人类NK细胞的NSG小鼠中时，局部LD 500μg施用具有Fc同型IgG1的MIAP410导致杀灭HIP iPSC。MIAP410抗体治疗在第3天(D3)开始并且在D3-D11期间发生，在D11后治疗停止。在开始治疗后6个月执行随访时，未观察到iPSC在任何小鼠中重新出现。
如图48A至图48B示出，将人类HIP iPSC皮下注射至具有过继转移的人类NK细胞的NSG小鼠中，并且局部施用具有Fc同型IgG1的MIAP410(LD 500μg)。MIAP410抗体治疗在第11天(D11)开始并且在D11-D36期间发生，在D36后治疗停止。在开始治疗后6个月执行随访时，观察到在1只小鼠中，iPSC得以消除，同时在3只小鼠中，畸胎瘤显现。
如图49A至图49B示出，当将人类HIP iPSC皮下注射至具有过继转移的人类NK细胞的NSG小鼠中时，局部HD 1mg施用具有Fc同型IgG1的MIAP410导致杀灭HIP iPSC。MIAP410抗体治疗在D0、D1和D3发生。在开始治疗后120天执行随访时，未观察到iPSC在任何小鼠中重新出现。
如图50A至图50B示出，将人类HIP iPSC皮下注射至具有过继转移的人类NK细胞的NSG小鼠中，并且局部施用具有Fc同型IgG1的MIAP410(HD 1mg)。MIAP410抗体治疗在D11、D12和D14发生。在开始治疗后44天执行随访时，观察到iPSC未在3只小鼠中重新出现并且畸胎瘤在2只小鼠中显现。
如图51A至图51B示出，当将人类HIP iPSC皮下注射至具有过继转移的人类NK细胞的NSG小鼠中时，腹膜内HD 1mg施用具有Fc同型IgG1的MIAP410导致杀灭HIP iPSC。MIAP410抗体治疗在D0、D1和D3发生。在开始治疗后100天执行随访时，未观察到iPSC在任何小鼠中重新出现。
如图52A至图52B示出，将人类HIP iPSC皮下注射至具有过继转移的人类NK细胞的NSG小鼠中，并且腹膜内施用具有Fc同型IgG1的MIAP410(HD 1mg)。MIAP410抗体治疗在D11、D12和D14发生。在开始治疗后44天执行随访时，观察到iPSC未在1只小鼠中重新出现并且畸胎瘤在6只小鼠中显现。
实施例6.在体内具有或不具有过继转移人类NK细胞/小神经胶质细胞的小鼠中，在用具有IgG1 Fc域的MIAP410抗CD47抗体治疗后，人类低免疫细胞的杀灭在小鼠身体与大脑之间是不同的
遵循如实施例4中描述的方案。
如图53示出，在将人类dKO(B2M-/CIITA-/-)细胞皮下注射至NSG小鼠中时，在过继转移人类NK细胞时，人类iPSC被人类NK细胞杀灭，同时在未过继转移NK细胞时，人类iPSC被NSG巨噬细胞杀灭。后者大概是归因于巨噬细胞的“缺失自身的异种感测”。
如图54示出，在将人类dKO(B2M-/CIITA-/-)细胞注射至NSG小鼠的大脑中时，在过继转移人类NK细胞或人类小神经胶质细胞时，人类iPSC被杀灭。然而，在人类NK细胞或人类小神经胶质细胞的过继转移未发生时，人类iPSC不被NSG小神经胶质细胞单独杀灭。后者大概是归因于不存在小神经胶质细胞的“缺失自身的异种感测”。
A.大脑中的缺失自身感测取决于同种异体小神经胶质细胞
如图55A至图55B示出，将5x104个人类dKO(B2M-/-CIITA-/-)细胞皮下注射至具有或不具有过继转移人类NK细胞的NSG小鼠中。当过继转移人类NK细胞时，人类dKO iPSC被皮下杀灭。当未转移人类NK细胞时，人类dKO iPSC被NSG巨噬细胞杀灭，大概是经由“缺失自身的异种感测”。
如图56A至图56B示出，将5x104个人类dKO(B2M-/-CIITA-/-)细胞注射至具有或不具有过继转移人类NK细胞的NSG小鼠的大脑中。当过继转移人类NK细胞时，人类dKO iPSC在大脑中被杀灭，但是当未转移人类NK细胞时，不被NSG小神经胶质细胞杀灭。
如图57A至图57B示出，在将5x104个人类dKO(B2M-/-CIITA-/-)细胞注射至具有过继转移人类小神经胶质细胞的NSG小鼠的大脑中时，人类dKO iPSC在大脑中被杀灭，大概是经由“缺失自身”的同种异体感测。
实施例7.CD47保护小鼠大脑中的人类低免疫细胞免于小神经胶质细胞介导的杀灭
遵循如实施例4中描述的方案。
如图58示出，在人类wt、dKO(B2M-/-CIITA-/-)或HIP 1.0(B2M-/-CIITA-/-CD47tg)与同种异体人类巨噬细胞或小神经胶质细胞共培养时，CD47保护dKO细胞免于巨噬细胞杀灭以及小神经胶质细胞杀灭两者。
A.dKO细胞的小神经胶质细胞和巨噬细胞杀灭中的差异
如图59示出，当人类dKO(B2M-/-CIITA-/-)细胞与同种异体人类巨噬细胞或小神经胶质细胞共培养或小鼠dKO(B2M-/-CIITA-/-)细胞与同种异体小鼠巨噬细胞或小神经胶质细胞共培养时，同种异体巨噬细胞和小神经胶质细胞感测到缺失自身并且杀灭dKO细胞。
如图60示出，在人类dKO(B2M-/-CIITA-/-)细胞与异种(跨物种)小鼠巨噬细胞或小神经胶质细胞共培养或小鼠dKO(B2M-/-CIITA-/-)细胞与异种人类巨噬细胞或小神经胶质细胞共培养时，异种巨噬细胞和小神经胶质细胞未感测到缺失自身并且因此不杀灭dKO细胞。
B.给药研究
如图61A至图61B示出，当将人类HIP iPSC颅内注射至具有过继转移人类NK细胞的NSG小鼠中时，在D0、D1和D3局部IgG1同型对照的局部HD(小鼠IgG1；1mg)施用不影响HIP存活。
如图62A至图62B示出，当将人类HIP iPSC颅内注射至具有过继转移人类NK细胞的NSG小鼠中时，在D0、D1和D3局部HD(1mg)施用MIAP410导致杀灭大脑中的HIP iPSC。40天随访时，未观察到iPSC重新出现。
如图63A至图63B示出，当将人类HIP iPSC颅内注射至具有过继转移人类NK细胞的NSG小鼠中时，在血脑屏障通过甘露糖醇注射来打破的情况下，在D0、D1和D3腹膜内HD(1mg)施用MIAP410导致杀灭大脑中的HIP iPSC。40天随访时，在5只小鼠中的4只中，未观察到iPSC重新出现。
实施例8.施用具有小鼠IgG1 Fc域的B6H12抗CD47抗体在体外和/或体内阻断人类低免疫细胞中的CD47
遵循如实施例4中的方案。
在体外在人类NK细胞和/或巨噬细胞存在下，施用具有小鼠IgG1 Fc域的B6H12抗CD47抗体阻断人类低免疫细胞中的CD47。图64A(人类HIP iPSC和人类NK细胞)和图64B(人类HIP iPSC和人类巨噬细胞)示出体外施用100μg/ml抗CD47抗体B6H12以便靶向人类HIPiPSC导致被人类NK细胞和人类巨噬细胞杀灭。
在体内具有过继转移人类NK细胞的人类低免疫细胞中，施用具有小鼠IgG1 Fc域的B6H12抗CD47抗体阻断CD47。如图65示出，三次1mg的皮下更高剂量(HD)似乎比连续施用LD(500μg)的B6H12抗CD47抗体更有效。腹膜内剂量似乎是无效的。
A.结果变化取决于何时开始治疗
如图66A至图66B示出，在具有过继转移NK细胞的NSG小鼠中，人类HIP iPSC形成畸胎瘤。当将人类HIP iPSC皮下注射至具有过继转移的人类NK细胞的NSG小鼠中，在D0-D40期间局部LD(500μg)施用Fc同型IgG4对照不影响HIP存活。
如图67A至图67B示出，将人类HIP iPSC皮下注射至具有过继转移的人类NK细胞的NSG小鼠中，并且局部施用具有Fc同型IgG1的B6H12抗CD47抗体(LD 500μg)。B6H12抗体治疗在D0-D96期间发生。在治疗后6个月执行随访时，观察到在2只小鼠中，iPSC得以消除并且在3只小鼠中，畸胎瘤显现。
如图68A至图68B示出，将人类HIP iPSC皮下注射至具有过继转移的人类NK细胞的NSG小鼠中，并且局部施用具有Fc同型IgG1的B6H12(LD 500μg)。B6H12抗体治疗在D3-D40期间发生。在开始治疗40天后随访时，在所有4只小鼠中，观察到畸胎瘤显现。
如图69A至图69B示出，将人类HIP iPSC皮下注射至具有过继转移的人类NK细胞的NSG小鼠中，并且局部施用具有Fc同型IgG1的B6H12(LD 500μg)。B6H12抗体治疗在D11-D44期间发生。在开始治疗160天后随访时，在所有5只小鼠中的4只中，观察到畸胎瘤显现。
如图70A至图70B出，当将人类HIP iPSC皮下注射至具有过继转移的人类NK细胞的NSG小鼠中时，局部HD 1mg施用具有Fc同型IgG1的B6H12导致杀灭HIP iPSC。B6H12抗体治疗在D0、D1和D3执行三次。在开始治疗120天后随访时，未观察到iPSC在任何小鼠中重新出现。
如图71A至图71B示出，当将人类HIP iPSC皮下注射至具有过继转移的人类NK细胞的NSG小鼠中时，局部HD 1mg施用具有Fc同型IgG1的B6H12导致杀灭HIP iPSC。B6H12抗体治疗在D3、D4和D6执行三次。在开始治疗100天后随访时，未观察到iPSC在任何小鼠中重新出现。
如图72A至图72B示出，当将人类HIP iPSC皮下注射至具有过继转移的人类NK细胞的NSG小鼠中时，局部HD 1mg施用具有Fc同型IgG1的B6H12导致杀灭HIP iPSC。B6H12抗体治疗在D11、D12和D14执行三次。在开始治疗40天后随访时，未观察到iPSC在任何小鼠中重新出现。
如图73A至图73B示出，将人类HIP iPSC皮下注射至具有过继转移的人类NK细胞的NSG小鼠中，并且腹膜内(HD 1mg)施用具有Fc同型IgG1的B6H12在D0、D1和D3执行三次。在开始治疗120天后随访时，在所有4只小鼠中，观察到畸胎瘤显现。
实施例9.施用氟胞嘧啶和/或更昔洛韦导致体外和/或体内低免疫细胞的杀灭
遵循如实施例4中的方案。
A.体外的小分子氟胞嘧啶和更昔洛韦
在体外研究小分子氟胞嘧啶和更昔洛韦分别对于胞嘧啶脱氨酶和HsVtk杀灭开关的效应。观察到所有测试克隆具有足够CD47水平以便防止NK细胞和巨噬细胞杀灭(图74)。也获得前药杀灭数据(图75)。
B.体内的小分子氟胞嘧啶
在体内研究小分子氟胞嘧啶对于胞嘧啶脱氨酶杀灭开关的效应。将人类HIP iPSC(CyD克隆2G11)皮下注射至第5组NSG小鼠中。盐水用作对照。如图76A至图76B示出，在NSG小鼠(盐水对照)中，人类HIP-CyD iPSC形成畸胎瘤。第5组小鼠治疗如下：稀MG，S.C.中的hiPSC HIP CyD克隆2G11，未治疗(盐水，IP，D0)。
将人类HIP iPSC(CyD克隆2G11)皮下注射至第1组NSG小鼠中。每日腹膜内施用氟胞嘧啶LD(200mg/kg)治疗。如图77A至图77B示出，给予氟胞嘧啶LD导致在16-44天内杀灭HIP-CyD iPSC。第1组小鼠治疗如下：稀MG，S.C中的1x106 hiPSC HIP CyD克隆2G11；治疗＝200毫克/千克/天氟胞嘧啶，IP(D0)。
将人类HIP iPSC(CyD克隆2G11)皮下注射至第2组NSG小鼠中。每日腹膜内施用氟胞嘧啶HD(500mg/kg)治疗。如图78A至图78B示出，在44天随访的情况下，给予氟胞嘧啶HD导致在16-32天内杀灭HIP-CyD iPSC。如与LD相比，未观察到HD的主要益处。第2组小鼠治疗如下：稀MG，S.C.中的1x106 hiPSC HIP CyD克隆2G11；治疗为500毫克/千克/天氟胞嘧啶，IP(D0)。
将人类HIP iPSC(CyD克隆2G11)皮下注射至第3组NSG小鼠中。氟胞嘧啶LD(200mg/kg)治疗在第13天开始，然后每日腹膜内施用。如图79A至图79B示出，给予氟胞嘧啶LD导致在开始治疗后3-11天内杀灭HIP-CyD iPSC。在40D随访期间检查小鼠。第3组小鼠治疗如下：稀MG，S.C.中的1x106 hiPSC HIP CyD克隆2G11；治疗为200毫克/千克/天氟胞嘧啶，IP(DS13)。
将人类HIP iPSC(CyD克隆2G11)皮下注射至第4组NSG小鼠中。在第13天开始，每日腹膜内施用氟胞嘧啶HD(500mg/kg)治疗。如图80A至图80B示出，给予氟胞嘧啶HD导致在开始治疗后3-11天内杀灭HIP-CyD iPSC。在40D随访期间检查小鼠。与LD相比，未观察到HD的益处。第4组小鼠治疗如下：稀MG，S.C.中的1x106hiPSC HIP CyD克隆2G11；治疗为500毫克/千克/天氟胞嘧啶，IP(D13)。
将人类HIP iPSC(克隆15；没有杀灭开关)皮下注射至第6组NSG小鼠中。每日腹膜内施用氟胞嘧啶HD(500mg/kg)治疗。如图81A至图81B示出，虽然细胞没有杀灭开关，但是人类HIP iPSC存活似乎被氟胞嘧啶HD削弱。将所述组扩展以便数据验证(图81C至图81D和图81E至图81F)。第6组小鼠治疗如下：稀MG，S.C.中的1x106hiPSC HIP克隆15；治疗为500毫克/千克/天氟胞嘧啶，IP(D0)。
将1x106个人类HIP iPSC luc+(胞嘧啶脱氨酶克隆2-G1 1)皮下注射至NSG小鼠中。对于此对照组未执行治疗。如图82A至图82B示出，观察到胞嘧啶脱氨酶基因编辑不影响在NSG小鼠中存活的iPSC。
C.体内的小分子更昔洛韦
在体内研究小分子更昔洛韦对于HsVtk杀灭开关的效应。将人类HIP iPSC(HSVTk克隆1-B10)皮下注射至第5组NSG小鼠中。对照组接受盐水治疗。如图83A至图83B示出，人类HIP-HsVtk iPSC存活似乎在NSG小鼠中削弱，或许是归因于杀灭开关编辑。第5组小鼠治疗如下：稀MG，S.C.中的1x106 hiPSC HIP HSVtk克隆1-B10luc+；未治疗(盐水，IP，D0)。
将人类HIP iPSC(HSVTk克隆1-B10)皮下注射至第1组NSG小鼠中。更昔洛韦LD(50mg/kg)治疗每日腹膜内执行。如图84A至图84B示出，给予更昔洛韦LD导致在12-24天内杀灭HIP-HsVtk iPSC。在44D随访期间检查小鼠。第1组小鼠治疗如下：稀MG，S.C.中的1x106hiPSC HIP HSVtk克隆1-B10 luc+；治疗为50毫克/千克/天更昔洛韦，IP(D0)。
将人类HIP iPSC(HSVTk克隆1-B10)皮下注射至第2组NSG小鼠中。每日腹膜内施用更昔洛韦HD(75mg/kg)治疗。如图85A至图85B示出，给予更昔洛韦HD导致在12-16天内杀灭HIP-HsVtk iPSC。在40d随访期间检查小鼠。HD似乎在很小的程度上有益。第2组小鼠治疗如下：稀MG，S.C.中的1x106 hiPSC HIP HSVtk克隆1-B10luc+；治疗为75毫克/千克/天更昔洛韦，IP(D0)。
将人类HIP iPSC(HsVTk克隆1-B10)皮下注射至第3组NSG小鼠中。在第13天开始，每日腹膜内施用更昔洛韦LD(50mg/kg)治疗。如图86A至图86B示出，给予更昔洛韦LD导致在开始治疗7天内杀灭HIP-HsVtk iPSC。在40d随访期间检查小鼠。第3组小鼠治疗如下：稀MG，S.C.中的1x106 hiPSC HIP HSVtk克隆1-B10 luc+；治疗为50毫克/千克/天更昔洛韦，IP(D13)。
将人类HIP iPSC(HSVTk克隆1-B10)皮下注射至第4组NSG小鼠中。在第13天开始，每日腹膜内施用更昔洛韦HD(75mg/kg)治疗。如图87A至图87B示出，给予更昔洛韦HD导致在开始治疗后7天内杀灭HIP-HsVtk iPSC。在40d随访期间检查小鼠。与LD相比，未观察到HD的明显益处。第4组小鼠治疗如下：稀MG，S.C.中的1x106hiPSC HIP HSVtk克隆1-B10 luc+；治疗为75毫克/千克/天更昔洛韦，IP(D13)。
将人类HIP iPSC(克隆15；没有杀灭开关)皮下注射至第6组NSG小鼠中。在第0天开始，每日腹膜内施用更昔洛韦HD(75mg/kg)治疗。如图88A至图88B示出，更昔洛韦HD治疗似乎对于没有杀灭开关的HIP iPSC没有影响。第6组小鼠治疗如下：稀MG，S.C.中的1x106hiPSC HIP克隆15luc+；治疗为75毫克/千克/天更昔洛韦，IP(D0)。
将1x106个人类HIP iPSC luc+(HSVtk克隆1-B10)皮下注射至NSG小鼠中。未施用治疗(初步研究)。如图89A至图89B示出，对于对照组，HSVtk编辑似乎不影响NSG小鼠中的iPSC存活。
结论
本技术的实施方案的以上详细说明不旨在为详尽的或将本技术限制于以上公开的精确形式。虽然本技术的具体实施方案和实施例如上出于示例性目的来描述，但是在相关领域的技术人员辨识的技术的范围内，各种等同修改是可能的。例如，虽然步骤以给定顺序来呈现，但是替代实施方案可以不同顺序来执行步骤。本文所述的各种实施方案也可组合以提供其他实施方案。
根据前述，应认识到本技术的具体实施方案已在本文中出于说明目的来描述，但是熟知组件和功能未详细示出或描述以避免不必要地混淆本技术的实施方案的描述。当上下文允许时，单数或复数术语也可分别包括复数或单数术语。此外，虽然与本技术的一些实施方案相关的优势已在那些实施方案的情形中描述，但是其他实施方案也可表现出此类优势，并且并非所有实施方案都必需表现出此类优势以落在本技术的范围内。因此，本公开和相关技术可涵盖未在本文中明确示出或描述的其他实施方案。
序列表
<110> 萨那生物技术公司(Sana Biotechnology, Inc.)
施雷普费尔·索尼娅(Schrepfer, Sonja)
<120> 使用CD47-SIRPα阻断剂触发安全杀灭机制的方法
<130> 142598-8007.WO00 (SNA.P2057W01)
<150> US 63/090,001
<151> 2020-10-09
<150> US 63/135,518
<151> 2021-01-08
<160> 134
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 972
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 1
atgtggcccc tggtagcggc gctgttgctg ggctcggcgt gctgcggatc agctcagcta 60
ctatttaata aaacaaaatc tgtagaattc acgttttgta atgacactgt cgtcattcca 120
tgctttgtta ctaatatgga ggcacaaaac actactgaag tatacgtaaa gtggaaattt 180
aaaggaagag atatttacac ctttgatgga gctctaaaca agtccactgt ccccactgac 240
tttagtagtg caaaaattga agtctcacaa ttactaaaag gagatgcctc tttgaagatg 300
gataagagtg atgctgtctc acacacagga aactacactt gtgaagtaac agaattaacc 360
agagaaggtg aaacgatcat cgagctaaaa tatcgtgttg tttcatggtt ttctccaaat 420
gaaaatattc ttattgttat tttcccaatt tttgctatac tcctgttctg gggacagttt 480
ggtattaaaa cacttaaata tagatccggt ggtatggatg agaaaacaat tgctttactt 540
gttgctggac tagtgatcac tgtcattgtc attgttggag ccattctttt cgtcccaggt 600
gaatattcat taaagaatgc tactggcctt ggtttaattg tgacttctac agggatatta 660
atattacttc actactatgt gtttagtaca gcgattggat taacctcctt cgtcattgcc 720
atattggtta ttcaggtgat agcctatatc ctcgctgtgg ttggactgag tctctgtatt 780
gcggcgtgta taccaatgca tggccctctt ctgatttcag gtttgagtat cttagctcta 840
gcacaattac ttggactagt ttatatgaaa tttgtggctt ccaatcagaa gactatacaa 900
cctcctagga aagctgtaga ggaacccctt aatgcattca aagaatcaaa aggaatgatg 960
aatgatgaat aa 972
<210> 2
<211> 323
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 2
Met Trp Pro Leu Val Ala Ala Leu Leu Leu Gly Ser Ala Cys Cys Gly
1 5 10 15
Ser Ala Gln Leu Leu Phe Asn Lys Thr Lys Ser Val Glu Phe Thr Phe
20 25 30
Cys Asn Asp Thr Val Val Ile Pro Cys Phe Val Thr Asn Met Glu Ala
35 40 45
Gln Asn Thr Thr Glu Val Tyr Val Lys Trp Lys Phe Lys Gly Arg Asp
50 55 60
Ile Tyr Thr Phe Asp Gly Ala Leu Asn Lys Ser Thr Val Pro Thr Asp
65 70 75 80
Phe Ser Ser Ala Lys Ile Glu Val Ser Gln Leu Leu Lys Gly Asp Ala
85 90 95
Ser Leu Lys Met Asp Lys Ser Asp Ala Val Ser His Thr Gly Asn Tyr
100 105 110
Thr Cys Glu Val Thr Glu Leu Thr Arg Glu Gly Glu Thr Ile Ile Glu
115 120 125
Leu Lys Tyr Arg Val Val Ser Trp Phe Ser Pro Asn Glu Asn Ile Leu
130 135 140
Ile Val Ile Phe Pro Ile Phe Ala Ile Leu Leu Phe Trp Gly Gln Phe
145 150 155 160
Gly Ile Lys Thr Leu Lys Tyr Arg Ser Gly Gly Met Asp Glu Lys Thr
165 170 175
Ile Ala Leu Leu Val Ala Gly Leu Val Ile Thr Val Ile Val Ile Val
180 185 190
Gly Ala Ile Leu Phe Val Pro Gly Glu Tyr Ser Leu Lys Asn Ala Thr
195 200 205
Gly Leu Gly Leu Ile Val Thr Ser Thr Gly Ile Leu Ile Leu Leu His
210 215 220
Tyr Tyr Val Phe Ser Thr Ala Ile Gly Leu Thr Ser Phe Val Ile Ala
225 230 235 240
Ile Leu Val Ile Gln Val Ile Ala Tyr Ile Leu Ala Val Val Gly Leu
245 250 255
Ser Leu Cys Ile Ala Ala Cys Ile Pro Met His Gly Pro Leu Leu Ile
260 265 270
Ser Gly Leu Ser Ile Leu Ala Leu Ala Gln Leu Leu Gly Leu Val Tyr
275 280 285
Met Lys Phe Val Ala Ser Asn Gln Lys Thr Ile Gln Pro Pro Arg Lys
290 295 300
Ala Val Glu Glu Pro Leu Asn Ala Phe Lys Glu Ser Lys Gly Met Met
305 310 315 320
Asn Asp Glu
<210> 3
<211> 918
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 3
atgtggcccc tggtagcggc gctgttgctg ggctcggcgt gctgcggatc agctcagcta 60
ctatttaata aaacaaaatc tgtagaattc acgttttgta atgacactgt cgtcattcca 120
tgctttgtta ctaatatgga ggcacaaaac actactgaag tatacgtaaa gtggaaattt 180
aaaggaagag atatttacac ctttgatgga gctctaaaca agtccactgt ccccactgac 240
tttagtagtg caaaaattga agtctcacaa ttactaaaag gagatgcctc tttgaagatg 300
gataagagtg atgctgtctc acacacagga aactacactt gtgaagtaac agaattaacc 360
agagaaggtg aaacgatcat cgagctaaaa tatcgtgttg tttcatggtt ttctccaaat 420
gaaaatattc ttattgttat tttcccaatt tttgctatac tcctgttctg gggacagttt 480
ggtattaaaa cacttaaata tagatccggt ggtatggatg agaaaacaat tgctttactt 540
gttgctggac tagtgatcac tgtcattgtc attgttggag ccattctttt cgtcccaggt 600
gaatattcat taaagaatgc tactggcctt ggtttaattg tgacttctac agggatatta 660
atattacttc actactatgt gtttagtaca gcgattggat taacctcctt cgtcattgcc 720
atattggtta ttcaggtgat agcctatatc ctcgctgtgg ttggactgag tctctgtatt 780
gcggcgtgta taccaatgca tggccctctt ctgatttcag gtttgagtat cttagctcta 840
gcacaattac ttggactagt ttatatgaaa tttgtggctt ccaatcagaa gactatacaa 900
cctcctagga ataactga 918
<210> 4
<211> 305
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 4
Met Trp Pro Leu Val Ala Ala Leu Leu Leu Gly Ser Ala Cys Cys Gly
1 5 10 15
Ser Ala Gln Leu Leu Phe Asn Lys Thr Lys Ser Val Glu Phe Thr Phe
20 25 30
Cys Asn Asp Thr Val Val Ile Pro Cys Phe Val Thr Asn Met Glu Ala
35 40 45
Gln Asn Thr Thr Glu Val Tyr Val Lys Trp Lys Phe Lys Gly Arg Asp
50 55 60
Ile Tyr Thr Phe Asp Gly Ala Leu Asn Lys Ser Thr Val Pro Thr Asp
65 70 75 80
Phe Ser Ser Ala Lys Ile Glu Val Ser Gln Leu Leu Lys Gly Asp Ala
85 90 95
Ser Leu Lys Met Asp Lys Ser Asp Ala Val Ser His Thr Gly Asn Tyr
100 105 110
Thr Cys Glu Val Thr Glu Leu Thr Arg Glu Gly Glu Thr Ile Ile Glu
115 120 125
Leu Lys Tyr Arg Val Val Ser Trp Phe Ser Pro Asn Glu Asn Ile Leu
130 135 140
Ile Val Ile Phe Pro Ile Phe Ala Ile Leu Leu Phe Trp Gly Gln Phe
145 150 155 160
Gly Ile Lys Thr Leu Lys Tyr Arg Ser Gly Gly Met Asp Glu Lys Thr
165 170 175
Ile Ala Leu Leu Val Ala Gly Leu Val Ile Thr Val Ile Val Ile Val
180 185 190
Gly Ala Ile Leu Phe Val Pro Gly Glu Tyr Ser Leu Lys Asn Ala Thr
195 200 205
Gly Leu Gly Leu Ile Val Thr Ser Thr Gly Ile Leu Ile Leu Leu His
210 215 220
Tyr Tyr Val Phe Ser Thr Ala Ile Gly Leu Thr Ser Phe Val Ile Ala
225 230 235 240
Ile Leu Val Ile Gln Val Ile Ala Tyr Ile Leu Ala Val Val Gly Leu
245 250 255
Ser Leu Cys Ile Ala Ala Cys Ile Pro Met His Gly Pro Leu Leu Ile
260 265 270
Ser Gly Leu Ser Ile Leu Ala Leu Ala Gln Leu Leu Gly Leu Val Tyr
275 280 285
Met Lys Phe Val Ala Ser Asn Gln Lys Thr Ile Gln Pro Pro Arg Asn
290 295 300
Asn
305
<210> 5
<211> 969
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 密码子优化的CD47 CDS
<400> 5
atgtggcccc tggtcgccgc cctgttgctg ggctcggcat gctgcggatc agctcagcta 60
ctgtttaata aaacaaaatc tgtagaattc acgttttgta acgacactgt cgtgatccca 120
tgctttgtta ctaatatgga ggcacaaaac accactgaag tgtacgtgaa gtggaaattc 180
aaaggcagag acatttacac ctttgacggc gccctcaaca agtccaccgt gcccactgac 240
tttagtagcg caaaaattga ggtcagccaa ttactaaaag gagatgcctc tttgaagatg 300
gacaagagcg atgctgtcag ccacacaggg aactacactt gtgaagtaac agagttaacc 360
cgcgaaggtg aaacgatcat cgagctgaag tatcgagtgg tgtcctggtt ttctccgaac 420
gagaatatcc ttatcgtaat tttcccaatt ttcgctatcc tcctgttctg gggccagttt 480
ggtatcaaga cactcaaata tcggtccggt gggatggatg agaagacaat tgccctgctt 540
gttgctggac tcgtgatcac cgtcatcgtg attgttgggg ccatcctttt cgtcccaggg 600
gagtacagcc tgaagaatgc tacgggcctg ggattaattg tgacctctac agggatactc 660
atcctgcttc actactatgt gttcagtacc gcgattggac tgacctcctt cgtcattgcc 720
atattggtga ttcaggtgat agcctacatc ctcgccgtgg ttggcctgag tctctgtatc 780
gcggcgtgca tacccatgca tggccctctt ctgatttcag ggttgagtat cctcgcacta 840
gcacagttgc tgggactggt ttatatgaaa tttgtggcct ccaaccagaa gactatacag 900
cctcctagga aggctgtaga ggagcccctg aatgcattca aggaatcaaa aggcatgatg 960
aatgatgaa 969
<210> 6
<211> 21
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> CD8a信号肽
<400> 6
Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu
1 5 10 15
His Ala Ala Arg Pro
20
<210> 7
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> IgK信号肽
<400> 7
Met Glu Thr Asp Thr Leu Leu Leu Trp Val Leu Leu Leu Trp Val Pro
1 5 10 15
Gly Ser Thr Gly
20
<210> 8
<211> 22
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> GMCSFR-? (CSF2RA)信号肽
<400> 8
Met Leu Leu Leu Val Thr Ser Leu Leu Leu Cys Glu Leu Pro His Pro
1 5 10 15
Ala Phe Leu Leu Ile Pro
20
<210> 9
<211> 45
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> CD8a铰链域
<400> 9
Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala
1 5 10 15
Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly
20 25 30
Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp
35 40 45
<210> 10
<211> 39
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> CD28铰链域
<400> 10
Ile Glu Val Met Tyr Pro Pro Pro Tyr Leu Asp Asn Glu Lys Ser Asn
1 5 10 15
Gly Thr Ile Ile His Val Lys Gly Lys His Leu Cys Pro Ser Pro Leu
20 25 30
Phe Pro Gly Pro Ser Lys Pro
35
<210> 11
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> IgG4铰链域
<400> 11
Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro
1 5 10
<210> 12
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> IgG4铰链域
<400> 12
Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Ser Cys Pro
1 5 10
<210> 13
<211> 229
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> IgG4铰链-CH2-CH3域
<400> 13
Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe
1 5 10 15
Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr
20 25 30
Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val
35 40 45
Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val
50 55 60
Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser
65 70 75 80
Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu
85 90 95
Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser
100 105 110
Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro
115 120 125
Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln
130 135 140
Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala
145 150 155 160
Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr
165 170 175
Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu
180 185 190
Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser
195 200 205
Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser
210 215 220
Leu Ser Leu Gly Lys
225
<210> 14
<211> 24
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> CD8a跨膜域
<400> 14
Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu
1 5 10 15
Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys
20
<210> 15
<211> 27
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> CD28跨膜域
<400> 15
Phe Trp Val Leu Val Val Val Gly Gly Val Leu Ala Cys Tyr Ser Leu
1 5 10 15
Leu Val Thr Val Ala Phe Ile Ile Phe Trp Val
20 25
<210> 16
<211> 42
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 4-1BB共刺激域
<400> 16
Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met
1 5 10 15
Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe
20 25 30
Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu
35 40
<210> 17
<211> 41
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> CD28共刺激域
<400> 17
Arg Ser Lys Arg Ser Arg Leu Leu His Ser Asp Tyr Met Asn Met Thr
1 5 10 15
Pro Arg Arg Pro Gly Pro Thr Arg Lys His Tyr Gln Pro Tyr Ala Pro
20 25 30
Pro Arg Asp Phe Ala Ala Tyr Arg Ser
35 40
<210> 18
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> CD3z信号域
<400> 18
Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly
1 5 10 15
Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr
20 25 30
Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys
35 40 45
Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys
50 55 60
Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg
65 70 75 80
Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala
85 90 95
Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg
100 105 110
<210> 19
<211> 245
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 抗CD19 FMC63 scFv完整序列，具有Whitlow接头
<400> 19
Asp Ile Gln Met Thr Gln Thr Thr Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Lys Tyr
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gly Thr Val Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr His Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Asn Leu Glu Gln
65 70 75 80
Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Gly Asn Thr Leu Pro Tyr
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Thr Gly Ser Thr Ser Gly
100 105 110
Ser Gly Lys Pro Gly Ser Gly Glu Gly Ser Thr Lys Gly Glu Val Lys
115 120 125
Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Ala Pro Ser Gln Ser Leu Ser
130 135 140
Val Thr Cys Thr Val Ser Gly Val Ser Leu Pro Asp Tyr Gly Val Ser
145 150 155 160
Trp Ile Arg Gln Pro Pro Arg Lys Gly Leu Glu Trp Leu Gly Val Ile
165 170 175
Trp Gly Ser Glu Thr Thr Tyr Tyr Asn Ser Ala Leu Lys Ser Arg Leu
180 185 190
Thr Ile Ile Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gln Val Phe Leu Lys Met Asn
195 200 205
Ser Leu Gln Thr Asp Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys Ala Lys His Tyr
210 215 220
Tyr Tyr Gly Gly Ser Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser
225 230 235 240
Val Thr Val Ser Ser
245
<210> 20
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 抗CD19 FMC63 scFv轻链可变区
<400> 20
Asp Ile Gln Met Thr Gln Thr Thr Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Lys Tyr
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gly Thr Val Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr His Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Asn Leu Glu Gln
65 70 75 80
Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Gly Asn Thr Leu Pro Tyr
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Thr
100 105
<210> 21
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 抗CD19 FMC63 scFv轻链CDR1
<400> 21
Gln Asp Ile Ser Lys Tyr
1 5
<210> 22
<211> 3
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 抗CD19 FMC63 scFv轻链CDR2
<400> 22
His Thr Ser
1
<210> 23
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 抗CD19 FMC63 scFv轻链CDR3
<400> 23
Gln Gln Gly Asn Thr Leu Pro Tyr Thr
1 5
<210> 24
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> Whitlow接头
<400> 24
Gly Ser Thr Ser Gly Ser Gly Lys Pro Gly Ser Gly Glu Gly Ser Thr
1 5 10 15
Lys Gly
<210> 25
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 抗CD19 FMC63 scFv重链可变区
<400> 25
Glu Val Lys Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Ala Pro Ser Gln
1 5 10 15
Ser Leu Ser Val Thr Cys Thr Val Ser Gly Val Ser Leu Pro Asp Tyr
20 25 30
Gly Val Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Arg Lys Gly Leu Glu Trp Leu
35 40 45
Gly Val Ile Trp Gly Ser Glu Thr Thr Tyr Tyr Asn Ser Ala Leu Lys
50 55 60
Ser Arg Leu Thr Ile Ile Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gln Val Phe Leu
65 70 75 80
Lys Met Asn Ser Leu Gln Thr Asp Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Lys His Tyr Tyr Tyr Gly Gly Ser Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 26
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 抗CD19 FMC63 scFv重链CDR1
<400> 26
Gly Val Ser Leu Pro Asp Tyr Gly
1 5
<210> 27
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 抗CD19 FMC63 scFv重链CDR2
<400> 27
Ile Trp Gly Ser Glu Thr Thr
1 5
<210> 28
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 抗CD19 FMC63 scFv重链CDR3
<400> 28
Ala Lys His Tyr Tyr Tyr Gly Gly Ser Tyr Ala Met Asp Tyr
1 5 10
<210> 29
<211> 242
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 抗CD19 FMC63 scFv完整序列，具有3xG4S接头
<400> 29
Asp Ile Gln Met Thr Gln Thr Thr Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Lys Tyr
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gly Thr Val Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr His Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Asn Leu Glu Gln
65 70 75 80
Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Gly Asn Thr Leu Pro Tyr
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Thr Gly Gly Gly Gly Ser
100 105 110
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Lys Leu Gln Glu
115 120 125
Ser Gly Pro Gly Leu Val Ala Pro Ser Gln Ser Leu Ser Val Thr Cys
130 135 140
Thr Val Ser Gly Val Ser Leu Pro Asp Tyr Gly Val Ser Trp Ile Arg
145 150 155 160
Gln Pro Pro Arg Lys Gly Leu Glu Trp Leu Gly Val Ile Trp Gly Ser
165 170 175
Glu Thr Thr Tyr Tyr Asn Ser Ala Leu Lys Ser Arg Leu Thr Ile Ile
180 185 190
Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gln Val Phe Leu Lys Met Asn Ser Leu Gln
195 200 205
Thr Asp Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys Ala Lys His Tyr Tyr Tyr Gly
210 215 220
Gly Ser Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val
225 230 235 240
Ser Ser
<210> 30
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 3xG4S接头
<400> 30
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
1 5 10 15
<210> 31
<211> 1458
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> Tisagenlecleucel CD19 CAR
<400> 31
atggccttac cagtgaccgc cttgctcctg ccgctggcct tgctgctcca cgccgccagg 60
ccggacatcc agatgacaca gactacatcc tccctgtctg cctctctggg agacagagtc 120
accatcagtt gcagggcaag tcaggacatt agtaaatatt taaattggta tcagcagaaa 180
ccagatggaa ctgttaaact cctgatctac catacatcaa gattacactc aggagtccca 240
tcaaggttca gtggcagtgg gtctggaaca gattattctc tcaccattag caacctggag 300
caagaagata ttgccactta cttttgccaa cagggtaata cgcttccgta cacgttcgga 360
ggggggacca agctggagat cacaggtggc ggtggctcgg gcggtggtgg gtcgggtggc 420
ggcggatctg aggtgaaact gcaggagtca ggacctggcc tggtggcgcc ctcacagagc 480
ctgtccgtca catgcactgt ctcaggggtc tcattacccg actatggtgt aagctggatt 540
cgccagcctc cacgaaaggg tctggagtgg ctgggagtaa tatggggtag tgaaaccaca 600
tactataatt cagctctcaa atccagactg accatcatca aggacaactc caagagccaa 660
gttttcttaa aaatgaacag tctgcaaact gatgacacag ccatttacta ctgtgccaaa 720
cattattact acggtggtag ctatgctatg gactactggg gccaaggaac ctcagtcacc 780
gtctcctcaa ccacgacgcc agcgccgcga ccaccaacac cggcgcccac catcgcgtcg 840
cagcccctgt ccctgcgccc agaggcgtgc cggccagcgg cggggggcgc agtgcacacg 900
agggggctgg acttcgcctg tgatatctac atctgggcgc ccttggccgg gacttgtggg 960
gtccttctcc tgtcactggt tatcaccctt tactgcaaac ggggcagaaa gaaactcctg 1020
tatatattca aacaaccatt tatgagacca gtacaaacta ctcaagagga agatggctgt 1080
agctgccgat ttccagaaga agaagaagga ggatgtgaac tgagagtgaa gttcagcagg 1140
agcgcagacg cccccgcgta caagcagggc cagaaccagc tctataacga gctcaatcta 1200
ggacgaagag aggagtacga tgttttggac aagagacgtg gccgggaccc tgagatgggg 1260
ggaaagccga gaaggaagaa ccctcaggaa ggcctgtaca atgaactgca gaaagataag 1320
atggcggagg cctacagtga gattgggatg aaaggcgagc gccggagggg caaggggcac 1380
gatggccttt accagggtct cagtacagcc accaaggaca cctacgacgc ccttcacatg 1440
caggccctgc cccctcgc 1458
<210> 32
<211> 486
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> Tisagenlecleucel CD19 CAR
<400> 32
Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu
1 5 10 15
His Ala Ala Arg Pro Asp Ile Gln Met Thr Gln Thr Thr Ser Ser Leu
20 25 30
Ser Ala Ser Leu Gly Asp Arg Val Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Gln
35 40 45
Asp Ile Ser Lys Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gly Thr
50 55 60
Val Lys Leu Leu Ile Tyr His Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro
65 70 75 80
Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser Leu Thr Ile
85 90 95
Ser Asn Leu Glu Gln Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Gly
100 105 110
Asn Thr Leu Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Thr
115 120 125
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu
130 135 140
Val Lys Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Ala Pro Ser Gln Ser
145 150 155 160
Leu Ser Val Thr Cys Thr Val Ser Gly Val Ser Leu Pro Asp Tyr Gly
165 170 175
Val Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Arg Lys Gly Leu Glu Trp Leu Gly
180 185 190
Val Ile Trp Gly Ser Glu Thr Thr Tyr Tyr Asn Ser Ala Leu Lys Ser
195 200 205
Arg Leu Thr Ile Ile Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gln Val Phe Leu Lys
210 215 220
Met Asn Ser Leu Gln Thr Asp Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys Ala Lys
225 230 235 240
His Tyr Tyr Tyr Gly Gly Ser Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
245 250 255
Thr Ser Val Thr Val Ser Ser Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro
260 265 270
Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu
275 280 285
Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp
290 295 300
Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly
305 310 315 320
Val Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys Lys Arg Gly Arg
325 330 335
Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro Val Gln
340 345 350
Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu
355 360 365
Glu Gly Gly Cys Glu Leu Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala
370 375 380
Pro Ala Tyr Lys Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu
385 390 395 400
Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp
405 410 415
Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu
420 425 430
Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile
435 440 445
Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr
450 455 460
Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met
465 470 475 480
Gln Ala Leu Pro Pro Arg
485
<210> 33
<211> 1383
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> Lisocabtagene maraleucel CD19 CAR
<400> 33
atgctgctgc tggtgaccag cctgctgctg tgcgagctgc cccaccccgc ctttctgctg 60
atccccgaca tccagatgac ccagaccacc tccagcctga gcgccagcct gggcgaccgg 120
gtgaccatca gctgccgggc cagccaggac atcagcaagt acctgaactg gtatcagcag 180
aagcccgacg gcaccgtcaa gctgctgatc taccacacca gccggctgca cagcggcgtg 240
cccagccggt ttagcggcag cggctccggc accgactaca gcctgaccat ctccaacctg 300
gaacaggaag atatcgccac ctacttttgc cagcagggca acacactgcc ctacaccttt 360
ggcggcggaa caaagctgga aatcaccggc agcacctccg gcagcggcaa gcctggcagc 420
ggcgagggca gcaccaaggg cgaggtgaag ctgcaggaaa gcggccctgg cctggtggcc 480
cccagccaga gcctgagcgt gacctgcacc gtgagcggcg tgagcctgcc cgactacggc 540
gtgagctgga tccggcagcc ccccaggaag ggcctggaat ggctgggcgt gatctggggc 600
agcgagacca cctactacaa cagcgccctg aagagccggc tgaccatcat caaggacaac 660
agcaagagcc aggtgttcct gaagatgaac agcctgcaga ccgacgacac cgccatctac 720
tactgcgcca agcactacta ctacggcggc agctacgcca tggactactg gggccagggc 780
accagcgtga ccgtgagcag cgaatctaag tacggaccgc cctgcccccc ttgccctatg 840
ttctgggtgc tggtggtggt cggaggcgtg ctggcctgct acagcctgct ggtcaccgtg 900
gccttcatca tcttttgggt gaaacggggc agaaagaaac tcctgtatat attcaaacaa 960
ccatttatga gaccagtaca aactactcaa gaggaagatg gctgtagctg ccgatttcca 1020
gaagaagaag aaggaggatg tgaactgcgg gtgaagttca gcagaagcgc cgacgcccct 1080
gcctaccagc agggccagaa tcagctgtac aacgagctga acctgggcag aagggaagag 1140
tacgacgtcc tggataagcg gagaggccgg gaccctgaga tgggcggcaa gcctcggcgg 1200
aagaaccccc aggaaggcct gtataacgaa ctgcagaaag acaagatggc cgaggcctac 1260
agcgagatcg gcatgaaggg cgagcggagg cggggcaagg gccacgacgg cctgtatcag 1320
ggcctgtcca ccgccaccaa ggatacctac gacgccctgc acatgcaggc cctgccccca 1380
agg 1383
<210> 34
<211> 461
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> Lisocabtagene maraleucel CD19 CAR
<400> 34
Met Leu Leu Leu Val Thr Ser Leu Leu Leu Cys Glu Leu Pro His Pro
1 5 10 15
Ala Phe Leu Leu Ile Pro Asp Ile Gln Met Thr Gln Thr Thr Ser Ser
20 25 30
Leu Ser Ala Ser Leu Gly Asp Arg Val Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser
35 40 45
Gln Asp Ile Ser Lys Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gly
50 55 60
Thr Val Lys Leu Leu Ile Tyr His Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val
65 70 75 80
Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser Leu Thr
85 90 95
Ile Ser Asn Leu Glu Gln Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln
100 105 110
Gly Asn Thr Leu Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile
115 120 125
Thr Gly Ser Thr Ser Gly Ser Gly Lys Pro Gly Ser Gly Glu Gly Ser
130 135 140
Thr Lys Gly Glu Val Lys Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Ala
145 150 155 160
Pro Ser Gln Ser Leu Ser Val Thr Cys Thr Val Ser Gly Val Ser Leu
165 170 175
Pro Asp Tyr Gly Val Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Arg Lys Gly Leu
180 185 190
Glu Trp Leu Gly Val Ile Trp Gly Ser Glu Thr Thr Tyr Tyr Asn Ser
195 200 205
Ala Leu Lys Ser Arg Leu Thr Ile Ile Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gln
210 215 220
Val Phe Leu Lys Met Asn Ser Leu Gln Thr Asp Asp Thr Ala Ile Tyr
225 230 235 240
Tyr Cys Ala Lys His Tyr Tyr Tyr Gly Gly Ser Tyr Ala Met Asp Tyr
245 250 255
Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser Glu Ser Lys Tyr Gly
260 265 270
Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Met Phe Trp Val Leu Val Val Val Gly
275 280 285
Gly Val Leu Ala Cys Tyr Ser Leu Leu Val Thr Val Ala Phe Ile Ile
290 295 300
Phe Trp Val Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln
305 310 315 320
Pro Phe Met Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser
325 330 335
Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu Arg Val Lys
340 345 350
Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln
355 360 365
Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu
370 375 380
Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg
385 390 395 400
Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met
405 410 415
Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly
420 425 430
Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp
435 440 445
Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg
450 455 460
<210> 35
<211> 1467
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> Axicabtagene ciloleucel CD19 CAR
<400> 35
atgcttctcc tggtgacaag ccttctgctc tgtgagttac cacacccagc attcctcctg 60
atcccagaca tccagatgac acagactaca tcctccctgt ctgcctctct gggagacaga 120
gtcaccatca gttgcagggc aagtcaggac attagtaaat atttaaattg gtatcagcag 180
aaaccagatg gaactgttaa actcctgatc taccatacat caagattaca ctcaggagtc 240
ccatcaaggt tcagtggcag tgggtctgga acagattatt ctctcaccat tagcaacctg 300
gagcaagaag atattgccac ttacttttgc caacagggta atacgcttcc gtacacgttc 360
ggagggggga ctaagttgga aataacaggc tccacctctg gatccggcaa gcccggatct 420
ggcgagggat ccaccaaggg cgaggtgaaa ctgcaggagt caggacctgg cctggtggcg 480
ccctcacaga gcctgtccgt cacatgcact gtctcagggg tctcattacc cgactatggt 540
gtaagctgga ttcgccagcc tccacgaaag ggtctggagt ggctgggagt aatatggggt 600
agtgaaacca catactataa ttcagctctc aaatccagac tgaccatcat caaggacaac 660
tccaagagcc aagttttctt aaaaatgaac agtctgcaaa ctgatgacac agccatttac 720
tactgtgcca aacattatta ctacggtggt agctatgcta tggactactg gggtcaagga 780
acctcagtca ccgtctcctc agcggccgca attgaagtta tgtatcctcc tccttaccta 840
gacaatgaga agagcaatgg aaccattatc catgtgaaag ggaaacacct ttgtccaagt 900
cccctatttc ccggaccttc taagcccttt tgggtgctgg tggtggttgg gggagtcctg 960
gcttgctata gcttgctagt aacagtggcc tttattattt tctgggtgag gagtaagagg 1020
agcaggctcc tgcacagtga ctacatgaac atgactcccc gccgccccgg gcccacccgc 1080
aagcattacc agccctatgc cccaccacgc gacttcgcag cctatcgctc cagagtgaag 1140
ttcagcagga gcgcagacgc ccccgcgtac cagcagggcc agaaccagct ctataacgag 1200
ctcaatctag gacgaagaga ggagtacgat gttttggaca agagacgtgg ccgggaccct 1260
gagatggggg gaaagccgag aaggaagaac cctcaggaag gcctgtacaa tgaactgcag 1320
aaagataaga tggcggaggc ctacagtgag attgggatga aaggcgagcg ccggaggggc 1380
aaggggcacg atggccttta ccagggtctc agtacagcca ccaaggacac ctacgacgcc 1440
cttcacatgc aggccctgcc ccctcgc 1467
<210> 36
<211> 489
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> Axicabtagene ciloleucel CD19 CAR
<400> 36
Met Leu Leu Leu Val Thr Ser Leu Leu Leu Cys Glu Leu Pro His Pro
1 5 10 15
Ala Phe Leu Leu Ile Pro Asp Ile Gln Met Thr Gln Thr Thr Ser Ser
20 25 30
Leu Ser Ala Ser Leu Gly Asp Arg Val Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser
35 40 45
Gln Asp Ile Ser Lys Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gly
50 55 60
Thr Val Lys Leu Leu Ile Tyr His Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val
65 70 75 80
Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser Leu Thr
85 90 95
Ile Ser Asn Leu Glu Gln Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln
100 105 110
Gly Asn Thr Leu Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile
115 120 125
Thr Gly Ser Thr Ser Gly Ser Gly Lys Pro Gly Ser Gly Glu Gly Ser
130 135 140
Thr Lys Gly Glu Val Lys Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Ala
145 150 155 160
Pro Ser Gln Ser Leu Ser Val Thr Cys Thr Val Ser Gly Val Ser Leu
165 170 175
Pro Asp Tyr Gly Val Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Arg Lys Gly Leu
180 185 190
Glu Trp Leu Gly Val Ile Trp Gly Ser Glu Thr Thr Tyr Tyr Asn Ser
195 200 205
Ala Leu Lys Ser Arg Leu Thr Ile Ile Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gln
210 215 220
Val Phe Leu Lys Met Asn Ser Leu Gln Thr Asp Asp Thr Ala Ile Tyr
225 230 235 240
Tyr Cys Ala Lys His Tyr Tyr Tyr Gly Gly Ser Tyr Ala Met Asp Tyr
245 250 255
Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser Ala Ala Ala Ile Glu
260 265 270
Val Met Tyr Pro Pro Pro Tyr Leu Asp Asn Glu Lys Ser Asn Gly Thr
275 280 285
Ile Ile His Val Lys Gly Lys His Leu Cys Pro Ser Pro Leu Phe Pro
290 295 300
Gly Pro Ser Lys Pro Phe Trp Val Leu Val Val Val Gly Gly Val Leu
305 310 315 320
Ala Cys Tyr Ser Leu Leu Val Thr Val Ala Phe Ile Ile Phe Trp Val
325 330 335
Arg Ser Lys Arg Ser Arg Leu Leu His Ser Asp Tyr Met Asn Met Thr
340 345 350
Pro Arg Arg Pro Gly Pro Thr Arg Lys His Tyr Gln Pro Tyr Ala Pro
355 360 365
Pro Arg Asp Phe Ala Ala Tyr Arg Ser Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser
370 375 380
Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu
385 390 395 400
Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg
405 410 415
Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln
420 425 430
Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr
435 440 445
Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp
450 455 460
Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala
465 470 475 480
Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg
485
<210> 37
<211> 246
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 抗CD20 Leu16 scFv完整序列，具有Whitlow接头
<400> 37
Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile Leu Ser Ala Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Asn Tyr Met
20 25 30
Asp Trp Tyr Gln Lys Lys Pro Gly Ser Ser Pro Lys Pro Trp Ile Tyr
35 40 45
Ala Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu
65 70 75 80
Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Phe Asn Pro Pro Thr
85 90 95
Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Gly Ser Thr Ser Gly Ser
100 105 110
Gly Lys Pro Gly Ser Gly Glu Gly Ser Thr Lys Gly Glu Val Gln Leu
115 120 125
Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala Ser Val Lys Met
130 135 140
Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr Asn Met His Trp
145 150 155 160
Val Lys Gln Thr Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile Gly Ala Ile Tyr
165 170 175
Pro Gly Asn Gly Asp Thr Ser Tyr Asn Gln Lys Phe Lys Gly Lys Ala
180 185 190
Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr Met Gln Leu Ser
195 200 205
Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Asp Tyr Tyr Cys Ala Arg Ser Asn
210 215 220
Tyr Tyr Gly Ser Ser Tyr Trp Phe Phe Asp Val Trp Gly Ala Gly Thr
225 230 235 240
Thr Val Thr Val Ser Ser
245
<210> 38
<211> 106
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 抗CD20 Leu16 scFv轻链可变区
<400> 38
Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile Leu Ser Ala Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Asn Tyr Met
20 25 30
Asp Trp Tyr Gln Lys Lys Pro Gly Ser Ser Pro Lys Pro Trp Ile Tyr
35 40 45
Ala Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu
65 70 75 80
Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Phe Asn Pro Pro Thr
85 90 95
Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 39
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 抗CD20 Leu16 scFv轻链CDR1
<400> 39
Arg Ala Ser Ser Ser Val Asn Tyr Met Asp
1 5 10
<210> 40
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 抗CD20 Leu16 scFv轻链CDR2
<400> 40
Ala Thr Ser Asn Leu Ala Ser
1 5
<210> 41
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 抗CD20 Leu16 scFv轻链CDR3
<400> 41
Gln Gln Trp Ser Phe Asn Pro Pro Thr
1 5
<210> 42
<211> 122
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 抗CD20 Leu16 scFv重链
<400> 42
Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
Asn Met His Trp Val Lys Gln Thr Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Ala Ile Tyr Pro Gly Asn Gly Asp Thr Ser Tyr Asn Gln Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Asp Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Ser Asn Tyr Tyr Gly Ser Ser Tyr Trp Phe Phe Asp Val Trp
100 105 110
Gly Ala Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 43
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 抗CD20 Leu16 scFv重链CDR1
<400> 43
Ser Tyr Asn Met His
1 5
<210> 44
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 抗CD20 Leu16 scFv重链CDR2
<400> 44
Ala Ile Tyr Pro Gly Asn Gly Asp Thr Ser Tyr Asn Gln Lys Phe Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 45
<211> 246
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 抗CD22 m971 scFv完整序列，具有3xG4S接头
<400> 45
Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Ile Ser Gly Asp Ser Val Ser Ser Asn
20 25 30
Ser Ala Ala Trp Asn Trp Ile Arg Gln Ser Pro Ser Arg Gly Leu Glu
35 40 45
Trp Leu Gly Arg Thr Tyr Tyr Arg Ser Lys Trp Tyr Asn Asp Tyr Ala
50 55 60
Val Ser Val Lys Ser Arg Ile Thr Ile Asn Pro Asp Thr Ser Lys Asn
65 70 75 80
Gln Phe Ser Leu Gln Leu Asn Ser Val Thr Pro Glu Asp Thr Ala Val
85 90 95
Tyr Tyr Cys Ala Arg Glu Val Thr Gly Asp Leu Glu Asp Ala Phe Asp
100 105 110
Ile Trp Gly Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly
115 120 125
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Gln Met Thr
130 135 140
Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile
145 150 155 160
Thr Cys Arg Ala Ser Gln Thr Ile Trp Ser Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln
165 170 175
Gln Arg Pro Gly Lys Ala Pro Asn Leu Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Ser
180 185 190
Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Arg Gly Ser Gly Thr
195 200 205
Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Phe Ala Thr
210 215 220
Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr Ser Ile Pro Gln Thr Phe Gly Gln Gly
225 230 235 240
Thr Lys Leu Glu Ile Lys
245
<210> 46
<211> 124
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 抗CD22 m971 scFv重链可变区
<400> 46
Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Ile Ser Gly Asp Ser Val Ser Ser Asn
20 25 30
Ser Ala Ala Trp Asn Trp Ile Arg Gln Ser Pro Ser Arg Gly Leu Glu
35 40 45
Trp Leu Gly Arg Thr Tyr Tyr Arg Ser Lys Trp Tyr Asn Asp Tyr Ala
50 55 60
Val Ser Val Lys Ser Arg Ile Thr Ile Asn Pro Asp Thr Ser Lys Asn
65 70 75 80
Gln Phe Ser Leu Gln Leu Asn Ser Val Thr Pro Glu Asp Thr Ala Val
85 90 95
Tyr Tyr Cys Ala Arg Glu Val Thr Gly Asp Leu Glu Asp Ala Phe Asp
100 105 110
Ile Trp Gly Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 47
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 抗CD22 m971 scFv重链CDR1
<400> 47
Gly Asp Ser Val Ser Ser Asn Ser Ala Ala
1 5 10
<210> 48
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 抗CD22 m971 scFv重链CDR2
<400> 48
Thr Tyr Tyr Arg Ser Lys Trp Tyr Asn
1 5
<210> 49
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 抗CD22 m971 scFv重链CDR3
<400> 49
Ala Arg Glu Val Thr Gly Asp Leu Glu Asp Ala Phe Asp Ile
1 5 10
<210> 50
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 抗CD22 m971 scFv轻链
<400> 50
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Thr Ile Trp Ser Tyr
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Arg Pro Gly Lys Ala Pro Asn Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Arg Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ala
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr Ser Ile Pro Gln
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 51
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 抗CD22 m971 scFv轻链CDR1
<400> 51
Gln Thr Ile Trp Ser Tyr
1 5
<210> 52
<211> 3
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 抗CD22 m971 scFv轻链CDR2
<400> 52
Ala Ala Ser
1
<210> 53
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 抗CD22 m971 scFv轻链CDR3
<400> 53
Gln Gln Ser Tyr Ser Ile Pro Gln Thr
1 5
<210> 54
<211> 246
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 抗CD22 m971-L7 scFv完整序列，具有3xG4S接头
<400> 54
Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Gly Met Val Lys Pro Ser Gln
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Ile Ser Gly Asp Ser Val Ser Ser Asn
20 25 30
Ser Val Ala Trp Asn Trp Ile Arg Gln Ser Pro Ser Arg Gly Leu Glu
35 40 45
Trp Leu Gly Arg Thr Tyr Tyr Arg Ser Thr Trp Tyr Asn Asp Tyr Ala
50 55 60
Val Ser Met Lys Ser Arg Ile Thr Ile Asn Pro Asp Thr Asn Lys Asn
65 70 75 80
Gln Phe Ser Leu Gln Leu Asn Ser Val Thr Pro Glu Asp Thr Ala Val
85 90 95
Tyr Tyr Cys Ala Arg Glu Val Thr Gly Asp Leu Glu Asp Ala Phe Asp
100 105 110
Ile Trp Gly Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly
115 120 125
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Gln Met Ile
130 135 140
Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile
145 150 155 160
Thr Cys Arg Ala Ser Gln Thr Ile Trp Ser Tyr Leu Asn Trp Tyr Arg
165 170 175
Gln Arg Pro Gly Glu Ala Pro Asn Leu Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Ser
180 185 190
Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Arg Gly Ser Gly Thr
195 200 205
Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Phe Ala Thr
210 215 220
Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr Ser Ile Pro Gln Thr Phe Gly Gln Gly
225 230 235 240
Thr Lys Leu Glu Ile Lys
245
<210> 55
<211> 124
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 抗CD22 m971-L7 scFv重链可变区
<400> 55
Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Gly Met Val Lys Pro Ser Gln
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Ile Ser Gly Asp Ser Val Ser Ser Asn
20 25 30
Ser Val Ala Trp Asn Trp Ile Arg Gln Ser Pro Ser Arg Gly Leu Glu
35 40 45
Trp Leu Gly Arg Thr Tyr Tyr Arg Ser Thr Trp Tyr Asn Asp Tyr Ala
50 55 60
Val Ser Met Lys Ser Arg Ile Thr Ile Asn Pro Asp Thr Asn Lys Asn
65 70 75 80
Gln Phe Ser Leu Gln Leu Asn Ser Val Thr Pro Glu Asp Thr Ala Val
85 90 95
Tyr Tyr Cys Ala Arg Glu Val Thr Gly Asp Leu Glu Asp Ala Phe Asp
100 105 110
Ile Trp Gly Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 56
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 抗CD22 m971-L7 scFv重链CDR1
<400> 56
Gly Asp Ser Val Ser Ser Asn Ser Val Ala
1 5 10
<210> 57
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 抗CD22 m971-L7 scFv重链CDR2
<400> 57
Thr Tyr Tyr Arg Ser Thr Trp Tyr Asn
1 5
<210> 58
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 抗CD22 m971-L7 scFv重链CDR3
<400> 58
Ala Arg Glu Val Thr Gly Asp Leu Glu Asp Ala Phe Asp Ile
1 5 10
<210> 59
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 抗CD22 m971-L7 scFv轻链可变区
<400> 59
Asp Ile Gln Met Ile Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Thr Ile Trp Ser Tyr
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Arg Gln Arg Pro Gly Glu Ala Pro Asn Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Arg Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ala
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr Ser Ile Pro Gln
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 60
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 抗CD22 m971-L7 scFv轻链CDR1
<400> 60
Gln Thr Ile Trp Ser Tyr
1 5
<210> 61
<211> 3
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 抗CD22 m971-L7 scFv轻链CDR2
<400> 61
Ala Ala Ser
1
<210> 62
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 抗CD22 m971-L7 scFv轻链CDR3
<400> 62
Gln Gln Ser Tyr Ser Ile Pro Gln Thr
1 5
<210> 63
<211> 246
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 抗BCMA C11D5.3 scFv完整序列，具有Whitlow接头
<400> 63
Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala Met Ser Leu Gly
1 5 10 15
Lys Arg Ala Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Glu Ser Val Ser Val Ile
20 25 30
Gly Ala His Leu Ile His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro
35 40 45
Lys Leu Leu Ile Tyr Leu Ala Ser Asn Leu Glu Thr Gly Val Pro Ala
50 55 60
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Asp
65 70 75 80
Pro Val Glu Glu Asp Asp Val Ala Ile Tyr Ser Cys Leu Gln Ser Arg
85 90 95
Ile Phe Pro Arg Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Gly
100 105 110
Ser Thr Ser Gly Ser Gly Lys Pro Gly Ser Gly Glu Gly Ser Thr Lys
115 120 125
Gly Gln Ile Gln Leu Val Gln Ser Gly Pro Glu Leu Lys Lys Pro Gly
130 135 140
Glu Thr Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp
145 150 155 160
Tyr Ser Ile Asn Trp Val Lys Arg Ala Pro Gly Lys Gly Leu Lys Trp
165 170 175
Met Gly Trp Ile Asn Thr Glu Thr Arg Glu Pro Ala Tyr Ala Tyr Asp
180 185 190
Phe Arg Gly Arg Phe Ala Phe Ser Leu Glu Thr Ser Ala Ser Thr Ala
195 200 205
Tyr Leu Gln Ile Asn Asn Leu Lys Tyr Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Phe
210 215 220
Cys Ala Leu Asp Tyr Ser Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
225 230 235 240
Ser Val Thr Val Ser Ser
245
<210> 64
<211> 111
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 抗BCMA C11D5.3 scFv轻链可变区
<400> 64
Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala Met Ser Leu Gly
1 5 10 15
Lys Arg Ala Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Glu Ser Val Ser Val Ile
20 25 30
Gly Ala His Leu Ile His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro
35 40 45
Lys Leu Leu Ile Tyr Leu Ala Ser Asn Leu Glu Thr Gly Val Pro Ala
50 55 60
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Asp
65 70 75 80
Pro Val Glu Glu Asp Asp Val Ala Ile Tyr Ser Cys Leu Gln Ser Arg
85 90 95
Ile Phe Pro Arg Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 65
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 抗BCMA C11D5.3 scFv轻链CDR1
<400> 65
Arg Ala Ser Glu Ser Val Ser Val Ile Gly Ala His Leu Ile His
1 5 10 15
<210> 66
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 抗BCMA C11D5.3 scFv轻链CDR2
<400> 66
Leu Ala Ser Asn Leu Glu Thr
1 5
<210> 67
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 抗BCMA C11D5.3 scFv轻链CDR3
<400> 67
Leu Gln Ser Arg Ile Phe Pro Arg Thr
1 5
<210> 68
<211> 117
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 抗BCMA C11D5.3 scFv重链可变区
<400> 68
Gln Ile Gln Leu Val Gln Ser Gly Pro Glu Leu Lys Lys Pro Gly Glu
1 5 10 15
Thr Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr
20 25 30
Ser Ile Asn Trp Val Lys Arg Ala Pro Gly Lys Gly Leu Lys Trp Met
35 40 45
Gly Trp Ile Asn Thr Glu Thr Arg Glu Pro Ala Tyr Ala Tyr Asp Phe
50 55 60
Arg Gly Arg Phe Ala Phe Ser Leu Glu Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Ile Asn Asn Leu Lys Tyr Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys
85 90 95
Ala Leu Asp Tyr Ser Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser
100 105 110
Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 69
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 抗BCMA C11D5.3 scFv重链CDR1
<400> 69
Asp Tyr Ser Ile Asn
1 5
<210> 70
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 抗BCMA C11D5.3 scFv重链CDR2
<400> 70
Trp Ile Asn Thr Glu Thr Arg Glu Pro Ala Tyr Ala Tyr Asp Phe Arg
1 5 10 15
Gly
<210> 71
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 抗BCMA C11D5.3 scFv重链CDR3
<400> 71
Asp Tyr Ser Tyr Ala Met Asp Tyr
1 5
<210> 72
<211> 246
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 抗BCMA C12A3.2 scFv完整序列，具有Whitlow接头
<400> 72
Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Pro Ser Leu Ala Met Ser Leu Gly
1 5 10 15
Lys Arg Ala Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Glu Ser Val Thr Ile Leu
20 25 30
Gly Ser His Leu Ile Tyr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro
35 40 45
Thr Leu Leu Ile Gln Leu Ala Ser Asn Val Gln Thr Gly Val Pro Ala
50 55 60
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Arg Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Asp
65 70 75 80
Pro Val Glu Glu Asp Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Leu Gln Ser Arg
85 90 95
Thr Ile Pro Arg Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Gly
100 105 110
Ser Thr Ser Gly Ser Gly Lys Pro Gly Ser Gly Glu Gly Ser Thr Lys
115 120 125
Gly Gln Ile Gln Leu Val Gln Ser Gly Pro Glu Leu Lys Lys Pro Gly
130 135 140
Glu Thr Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Arg His
145 150 155 160
Tyr Ser Met Asn Trp Val Lys Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Lys Trp
165 170 175
Met Gly Arg Ile Asn Thr Glu Ser Gly Val Pro Ile Tyr Ala Asp Asp
180 185 190
Phe Lys Gly Arg Phe Ala Phe Ser Val Glu Thr Ser Ala Ser Thr Ala
195 200 205
Tyr Leu Val Ile Asn Asn Leu Lys Asp Glu Asp Thr Ala Ser Tyr Phe
210 215 220
Cys Ser Asn Asp Tyr Leu Tyr Ser Leu Asp Phe Trp Gly Gln Gly Thr
225 230 235 240
Ala Leu Thr Val Ser Ser
245
<210> 73
<211> 111
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 抗BCMA C12A3.2 scFv轻链可变区
<400> 73
Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Pro Ser Leu Ala Met Ser Leu Gly
1 5 10 15
Lys Arg Ala Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Glu Ser Val Thr Ile Leu
20 25 30
Gly Ser His Leu Ile Tyr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro
35 40 45
Thr Leu Leu Ile Gln Leu Ala Ser Asn Val Gln Thr Gly Val Pro Ala
50 55 60
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Arg Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Asp
65 70 75 80
Pro Val Glu Glu Asp Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Leu Gln Ser Arg
85 90 95
Thr Ile Pro Arg Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 74
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 抗BCMA C12A3.2 scFv轻链CDR1
<400> 74
Arg Ala Ser Glu Ser Val Thr Ile Leu Gly Ser His Leu Ile Tyr
1 5 10 15
<210> 75
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 抗BCMA C12A3.2 scFv轻链CDR2
<400> 75
Leu Ala Ser Asn Val Gln Thr
1 5
<210> 76
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 抗BCMA C12A3.2 scFv轻链CDR3
<400> 76
Leu Gln Ser Arg Thr Ile Pro Arg Thr
1 5
<210> 77
<211> 117
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 抗BCMA C12A3.2 scFv重链可变区
<400> 77
Gln Ile Gln Leu Val Gln Ser Gly Pro Glu Leu Lys Lys Pro Gly Glu
1 5 10 15
Thr Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Arg His Tyr
20 25 30
Ser Met Asn Trp Val Lys Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Lys Trp Met
35 40 45
Gly Arg Ile Asn Thr Glu Ser Gly Val Pro Ile Tyr Ala Asp Asp Phe
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Ala Phe Ser Val Glu Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Val Ile Asn Asn Leu Lys Asp Glu Asp Thr Ala Ser Tyr Phe Cys
85 90 95
Ser Asn Asp Tyr Leu Tyr Ser Leu Asp Phe Trp Gly Gln Gly Thr Ala
100 105 110
Leu Thr Val Ser Ser
115
<210> 78
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 抗BCMA C12A3.2 scFv重链CDR1
<400> 78
His Tyr Ser Met Asn
1 5
<210> 79
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 抗BCMA C12A3.2 scFv重链CDR2
<400> 79
Arg Ile Asn Thr Glu Ser Gly Val Pro Ile Tyr Ala Asp Asp Phe Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 80
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 抗BCMA C12A3.2 scFv重链CDR3
<400> 80
Asp Tyr Leu Tyr Ser Leu Asp Phe
1 5
<210> 81
<211> 121
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 抗BCMA FHVH33完整序列
<400> 81
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ser Ile Ser Gly Ser Gly Asp Tyr Ile Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Ile Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Glu Gly Thr Gly Ala Asn Ser Ser Leu Ala Asp Tyr Arg Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 82
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 抗BCMA FHVH33 CDR1
<400> 82
Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr Ala
1 5
<210> 83
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 抗BCMA FHVH33 CDR2
<400> 83
Ile Ser Gly Ser Gly Asp Tyr Ile
1 5
<210> 84
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 抗BCMA FHVH33 CDR3
<400> 84
Ala Lys Glu Gly Thr Gly Ala Asn Ser Ser Leu Ala Asp Tyr
1 5 10
<210> 85
<211> 21
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> T2A肽
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(3)
<223> GSG接头是任选的
<400> 85
Gly Ser Gly Glu Gly Arg Gly Ser Leu Leu Thr Cys Gly Asp Val Glu
1 5 10 15
Glu Asn Pro Gly Pro
20
<210> 86
<211> 22
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> P2A肽
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(3)
<223> GSG接头是任选的
<400> 86
Gly Ser Gly Ala Thr Asn Phe Ser Leu Leu Lys Gln Ala Gly Asp Val
1 5 10 15
Glu Glu Asn Pro Gly Pro
20
<210> 87
<211> 23
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> E2A肽
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(3)
<223> GSG接头是任选的
<400> 87
Gly Ser Gly Gln Cys Thr Asn Tyr Ala Leu Leu Lys Leu Ala Gly Asp
1 5 10 15
Val Glu Ser Asn Pro Gly Pro
20
<210> 88
<211> 25
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> F2A肽
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(3)
<223> GSG接头是任选的
<400> 88
Gly Ser Gly Val Lys Gln Thr Leu Asn Phe Asp Leu Leu Lys Leu Ala
1 5 10 15
Gly Asp Val Glu Ser Asn Pro Gly Pro
20 25
<210> 89
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> FC1弗林蛋白酶位点
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (5)..(7)
<223> GSG是任选的
<400> 89
Arg Arg Arg Arg Gly Ser Gly
1 5
<210> 90
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> FC2弗林蛋白酶位点
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (5)..(7)
<223> GSG是任选的
<400> 90
Arg Lys Arg Arg Gly Ser Gly
1 5
<210> 91
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> FC3弗林蛋白酶位点
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (5)..(7)
<223> GSG是任选的
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (13)..(15)
<223> GSG是任选的
<400> 91
Arg Lys Arg Arg Gly Ser Gly Thr Pro Asp Pro Trp Gly Ser Gly
1 5 10 15
<210> 92
<211> 13
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> Kozak共有序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (7)..(7)
<223> r是a或g
<400> 92
gccgccrcca tgg 13
<210> 93
<211> 589
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> WPRE序列
<400> 93
aatcaacctc tggattacaa aatttgtgaa agattgactg gtattcttaa ctatgttgct 60
ccttttacgc tatgtggata cgctgcttta atgcctttgt atcatgctat tgcttcccgt 120
atggctttca ttttctcctc cttgtataaa tcctggttgc tgtctcttta tgaggagttg 180
tggcccgttg tcaggcaacg tggcgtggtg tgcactgtgt ttgctgacgc aacccccact 240
ggttggggca ttgccaccac ctgtcagctc ctttccggga ctttcgcttt ccccctccct 300
attgccacgg cggaactcat cgccgcctgc cttgcccgct gctggacagg ggctcggctg 360
ttgggcactg acaattccgt ggtgttgtcg gggaaatcat cgtcctttcc ttggctgctc 420
gcctgtgttg ccacctggat tctgcgcggg acgtccttct gctacgtccc ttcggccctc 480
aatccagcgg accttccttc ccgcggcctg ctgccggctc tgcggcctct tccgcgtctt 540
cgccttcgcc ctcagacgag tcggatctcc ctttgggccg cctccccgc 589
<210> 94
<211> 20
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 示例性spCas9 1互补区(间隔物)
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(20)
<223> n在每次出现时是任何核苷酸
<400> 94
nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 20
<210> 95
<211> 12
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 示例性spCas9 1 crRNA重复区
<400> 95
guuuuagagc ua 12
<210> 96
<211> 4
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 示例性spCas9 1四环
<400> 96
gaaa 4
<210> 97
<211> 66
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 示例性spCas9 1 tracrRNA
<400> 97
uagcaaguua aaauaaggcu aguccguuau caacuugaaa aaguggcacc gagucggugc 60
uuuuuu 66
<210> 98
<211> 20
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 示例性spCas9 2互补区(间隔物)
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(20)
<223> n在每次出现时是任何核苷酸
<400> 98
nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 20
<210> 99
<211> 17
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 示例性spCas9 2 crRNA重复区
<220>
<221> misc_feature
<222> (5)..(5)
<223> s是c或g
<400> 99
guuusagagc uaugcug 17
<210> 100
<211> 4
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 示例性spCas9 2四环
<400> 100
gaaa 4
<210> 101
<211> 71
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 示例性spCas9 2 tracrRNA
<220>
<221> misc_feature
<222> (15)..(15)
<223> s是c或g
<400> 101
cagcauagca aguusaaaua aggcuagucc guuaucaacu ugaaaaagug gcaccgaguc 60
ggugcuuuuu u 71
<210> 102
<211> 20
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 示例性saCas9互补区(间隔物)
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(20)
<223> n在每次出现时是任何核苷酸
<400> 102
nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 20
<210> 103
<211> 14
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 示例性saCas9 crRNA重复区
<400> 103
guuuuaguac ucug 14
<210> 104
<211> 4
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 示例性saCas9四环
<400> 104
gaaa 4
<210> 105
<211> 64
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 示例性saCas9 tracrRNA
<400> 105
cagaaucuac uaaaacaagg caaaaugccg uguuuaucuc gucaacuugu uggcgagauu 60
uuuu 64
<210> 106
<211> 88
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 示例性AkCas12b tracrRNA
<400> 106
gucgucuaua ggacggcgag gacaacggga agugccaaug ugcucuuucc aagagcaaac 60
accccguugg cuucaagaug accgcucg 88
<210> 107
<211> 4
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 示例性AkCas12b四环
<400> 107
aaaa 4
<210> 108
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 示例性AkCas12b crRNA重复区
<400> 108
cgagcggucu gagaaguggc acu 23
<210> 109
<211> 20
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 示例性AkCas12b互补区(间隔物)
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(20)
<223> n在每次出现时是任何核苷酸
<400> 109
nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 20
<210> 110
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> GET000046引导
<400> 110
accccacagt ggggccacta 20
<210> 111
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> GET000047引导
<400> 111
tgttggaagg atgaggaaat 20
<210> 112
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> GET000048引导
<400> 112
tcactatgct gccgcccagt 20
<210> 113
<211> 42
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> CD28铰链域
<400> 113
Ala Ala Ala Ile Glu Val Met Tyr Pro Pro Pro Tyr Leu Asp Asn Glu
1 5 10 15
Lys Ser Asn Gly Thr Ile Ile His Val Lys Gly Lys His Leu Cys Pro
20 25 30
Ser Pro Leu Phe Pro Gly Pro Ser Lys Pro
35 40
<210> 114
<211> 28
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> CD28跨膜域
<400> 114
Met Phe Trp Val Leu Val Val Val Gly Gly Val Leu Ala Cys Tyr Ser
1 5 10 15
Leu Leu Val Thr Val Ala Phe Ile Ile Phe Trp Val
20 25
<210> 115
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 在位置14处具有Q至K突变的CD3z信号域
<400> 115
Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Lys Gln Gly
1 5 10 15
Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr
20 25 30
Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys
35 40 45
Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys
50 55 60
Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg
65 70 75 80
Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala
85 90 95
Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg
100 105 110
<210> 116
<211> 1467
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 示例性CD19 CAR
<400> 116
atggccttac cagtgaccgc cttgctcctg ccgctggcct tgctgctcca cgccgccagg 60
ccggacatcc agatgacaca gactacatcc tccctgtctg cctctctggg agacagagtc 120
accatcagtt gcagggcaag tcaggacatt agtaaatatt taaattggta tcagcagaaa 180
ccagatggaa ctgttaaact cctgatctac catacatcaa gattacactc aggagtccca 240
tcaaggttca gtggcagtgg gtctggaaca gattattctc tcaccattag caacctggag 300
caagaagata ttgccactta cttttgccaa cagggtaata cgcttccgta cacgttcgga 360
ggggggacca agctggagat cacaggctcc acctctggat ccggcaagcc cggatctggc 420
gagggatcca ccaagggcga ggtgaaactg caggagtcag gacctggcct ggtggcgccc 480
tcacagagcc tgtccgtcac atgcactgtc tcaggggtct cattacccga ctatggtgta 540
agctggattc gccagcctcc acgaaagggt ctggagtggc tgggagtaat atggggtagt 600
gaaaccacat actataattc agctctcaaa tccagactga ccatcatcaa ggacaactcc 660
aagagccaag ttttcttaaa aatgaacagt ctgcaaactg atgacacagc catttactac 720
tgtgccaaac attattacta cggtggtagc tatgctatgg actactgggg ccaaggaacc 780
tcagtcaccg tctcctcaac cacgacgcca gcgccgcgac caccaacacc ggcgcccacc 840
atcgcgtcgc agcccctgtc cctgcgccca gaggcgtgcc ggccagcggc ggggggcgca 900
gtgcacacga gggggctgga cttcgcctgt gatatctaca tctgggcgcc cttggccggg 960
acttgtgggg tccttctcct gtcactggtt atcacccttt actgcaaacg gggcagaaag 1020
aaactcctgt atatattcaa acaaccattt atgagaccag tacaaactac tcaagaggaa 1080
gatggctgta gctgccgatt tccagaagaa gaagaaggag gatgtgaact gagagtgaag 1140
ttcagcagga gcgcagacgc ccccgcgtac cagcagggcc agaaccagct ctataacgag 1200
ctcaatctag gacgaagaga ggagtacgat gttttggaca agagacgtgg ccgggaccct 1260
gagatggggg gaaagccgag aaggaagaac cctcaggaag gcctgtacaa tgaactgcag 1320
aaagataaga tggcggaggc ctacagtgag attgggatga aaggcgagcg ccggaggggc 1380
aaggggcacg atggccttta ccagggtctc agtacagcca ccaaggacac ctacgacgcc 1440
cttcacatgc aggccctgcc ccctcgc 1467
<210> 117
<211> 489
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 示例性CD19 CAR
<400> 117
Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu
1 5 10 15
His Ala Ala Arg Pro Asp Ile Gln Met Thr Gln Thr Thr Ser Ser Leu
20 25 30
Ser Ala Ser Leu Gly Asp Arg Val Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Gln
35 40 45
Asp Ile Ser Lys Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gly Thr
50 55 60
Val Lys Leu Leu Ile Tyr His Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro
65 70 75 80
Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser Leu Thr Ile
85 90 95
Ser Asn Leu Glu Gln Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Gly
100 105 110
Asn Thr Leu Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Thr
115 120 125
Gly Ser Thr Ser Gly Ser Gly Lys Pro Gly Ser Gly Glu Gly Ser Thr
130 135 140
Lys Gly Glu Val Lys Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Ala Pro
145 150 155 160
Ser Gln Ser Leu Ser Val Thr Cys Thr Val Ser Gly Val Ser Leu Pro
165 170 175
Asp Tyr Gly Val Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Arg Lys Gly Leu Glu
180 185 190
Trp Leu Gly Val Ile Trp Gly Ser Glu Thr Thr Tyr Tyr Asn Ser Ala
195 200 205
Leu Lys Ser Arg Leu Thr Ile Ile Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gln Val
210 215 220
Phe Leu Lys Met Asn Ser Leu Gln Thr Asp Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr
225 230 235 240
Cys Ala Lys His Tyr Tyr Tyr Gly Gly Ser Tyr Ala Met Asp Tyr Trp
245 250 255
Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser Thr Thr Thr Pro Ala Pro
260 265 270
Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu
275 280 285
Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg
290 295 300
Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly
305 310 315 320
Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys Lys
325 330 335
Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met Arg
340 345 350
Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe Pro
355 360 365
Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser
370 375 380
Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu
385 390 395 400
Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg
405 410 415
Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln
420 425 430
Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr
435 440 445
Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp
450 455 460
Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala
465 470 475 480
Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg
485
<210> 118
<211> 243
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 抗BCMA CT103A scFv完整序列，具有Whitlow接头
<400> 118
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Tyr
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Lys Tyr Asp Leu Leu Thr
85 90 95
Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Gly Ser Thr Ser Gly Ser
100 105 110
Gly Lys Pro Gly Ser Gly Glu Gly Ser Thr Lys Gly Gln Leu Gln Leu
115 120 125
Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu Thr Leu Ser Leu
130 135 140
Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Ile Ser Ser Ser Ser Tyr Tyr Trp
145 150 155 160
Gly Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile Gly Ser
165 170 175
Ile Ser Tyr Ser Gly Ser Thr Tyr Tyr Asn Pro Ser Leu Lys Ser Arg
180 185 190
Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu Lys Leu
195 200 205
Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Asp
210 215 220
Arg Gly Asp Thr Ile Leu Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Met Val Thr
225 230 235 240
Val Ser Ser
<210> 119
<211> 106
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 抗BCMA CT103A scFv轻链可变区
<400> 119
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Tyr
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Lys Tyr Asp Leu Leu Thr
85 90 95
Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 120
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 抗BCMA CT103A scFv轻链CDR1
<400> 120
Gln Ser Ile Ser Ser Tyr
1 5
<210> 121
<211> 3
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 抗BCMA CT103A scFv轻链CDR2
<400> 121
Ala Ala Ser
1
<210> 122
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 抗BCMA CT103A scFv轻链CDR3
<400> 122
Gln Gln Lys Tyr Asp Leu Leu Thr
1 5
<210> 123
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 抗BCMA CT103A scFv重链可变区
<400> 123
Gln Leu Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Ile Ser Ser Ser
20 25 30
Ser Tyr Tyr Trp Gly Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu
35 40 45
Trp Ile Gly Ser Ile Ser Tyr Ser Gly Ser Thr Tyr Tyr Asn Pro Ser
50 55 60
Leu Lys Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe
65 70 75 80
Ser Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr
85 90 95
Cys Ala Arg Asp Arg Gly Asp Thr Ile Leu Asp Val Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Met Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 124
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 抗BCMA CT103A scFv重链CDR1
<400> 124
Gly Gly Ser Ile Ser Ser Ser Ser Tyr Tyr
1 5 10
<210> 125
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 抗BCMA CT103A scFv重链CDR2
<400> 125
Ile Ser Tyr Ser Gly Ser Thr
1 5
<210> 126
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 抗BCMA CT103A scFv重链CDR3
<400> 126
Ala Arg Asp Arg Gly Asp Thr Ile Leu Asp Val
1 5 10
<210> 127
<211> 1503
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 示例性BCMA CAR
<400> 127
atggccttac cagtgaccgc cttgctcctg ccgctggcct tgctgctcca cgccgccagg 60
ccggacatcc agatgaccca gtctccatcc tccctgtctg catctgtagg agacagagtc 120
accatcactt gccgggcaag tcagagcatt agcagctatt taaattggta tcagcagaaa 180
ccagggaaag cccctaagct cctgatctat gctgcatcca gtttgcaaag tggggtccca 240
tcaaggttca gtggcagtgg atctgggaca gatttcactc tcaccatcag cagtctgcaa 300
cctgaagatt ttgcaactta ctactgtcag caaaaatacg acctcctcac ttttggcgga 360
gggaccaagg ttgagatcaa aggcagcacc agcggctccg gcaagcctgg ctctggcgag 420
ggcagcacaa agggacagct gcagctgcag gagtcgggcc caggactggt gaagccttcg 480
gagaccctgt ccctcacctg cactgtctct ggtggctcca tcagcagtag tagttactac 540
tggggctgga tccgccagcc cccagggaag gggctggagt ggattgggag tatctcctat 600
agtgggagca cctactacaa cccgtccctc aagagtcgag tcaccatatc cgtagacacg 660
tccaagaacc agttctccct gaagctgagt tctgtgaccg ccgcagacac ggcggtgtac 720
tactgcgcca gagatcgtgg agacaccata ctagacgtat ggggtcaggg tacaatggtc 780
accgtcagct cattcgtgcc cgtgttcctg cccgccaaac ctaccaccac ccctgcccct 840
agacctccca ccccagcccc aacaatcgcc agccagcctc tgtctctgcg gcccgaagcc 900
tgtagacctg ctgccggcgg agccgtgcac accagaggcc tggacttcgc ctgcgacatc 960
tacatctggg cccctctggc cggcacctgt ggcgtgctgc tgctgagcct ggtgatcacc 1020
ctgtactgca accaccggaa caaacggggc agaaagaaac tcctgtatat attcaaacaa 1080
ccatttatga gaccagtaca aactactcaa gaggaagatg gctgtagctg ccgatttcca 1140
gaagaagaag aaggaggatg tgaactgaga gtgaagttca gcagatccgc cgacgcccct 1200
gcctaccagc agggacagaa ccagctgtac aacgagctga acctgggcag acgggaagag 1260
tacgacgtgc tggacaagcg gagaggccgg gaccccgaga tgggcggaaa gcccagacgg 1320
aagaaccccc aggaaggcct gtataacgaa ctgcagaaag acaagatggc cgaggcctac 1380
agcgagatcg gcatgaaggg cgagcggagg cgcggcaagg gccacgatgg cctgtaccag 1440
ggcctgagca ccgccaccaa ggacacctac gacgccctgc acatgcaggc cctgcccccc 1500
aga 1503
<210> 128
<211> 501
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 示例性BCMA CAR
<400> 128
Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu
1 5 10 15
His Ala Ala Arg Pro Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu
20 25 30
Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln
35 40 45
Ser Ile Ser Ser Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala
50 55 60
Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro
65 70 75 80
Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile
85 90 95
Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Lys
100 105 110
Tyr Asp Leu Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Gly
115 120 125
Ser Thr Ser Gly Ser Gly Lys Pro Gly Ser Gly Glu Gly Ser Thr Lys
130 135 140
Gly Gln Leu Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser
145 150 155 160
Glu Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Ile Ser Ser
165 170 175
Ser Ser Tyr Tyr Trp Gly Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu
180 185 190
Glu Trp Ile Gly Ser Ile Ser Tyr Ser Gly Ser Thr Tyr Tyr Asn Pro
195 200 205
Ser Leu Lys Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln
210 215 220
Phe Ser Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr
225 230 235 240
Tyr Cys Ala Arg Asp Arg Gly Asp Thr Ile Leu Asp Val Trp Gly Gln
245 250 255
Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser Phe Val Pro Val Phe Leu Pro Ala
260 265 270
Lys Pro Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr
275 280 285
Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala
290 295 300
Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp Ile
305 310 315 320
Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser
325 330 335
Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys Asn His Arg Asn Lys Arg Gly Arg Lys
340 345 350
Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro Val Gln Thr
355 360 365
Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu
370 375 380
Gly Gly Cys Glu Leu Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro
385 390 395 400
Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly
405 410 415
Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro
420 425 430
Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr
435 440 445
Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly
450 455 460
Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln
465 470 475 480
Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln
485 490 495
Ala Leu Pro Pro Arg
500
<210> 129
<211> 507
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (32)..(137)
<223> N末端V域
<400> 129
Met Glu Pro Ala Gly Pro Ala Pro Gly Arg Leu Gly Pro Leu Leu Cys
1 5 10 15
Leu Leu Leu Ala Ala Ser Cys Ala Trp Ser Gly Val Ala Gly Glu Glu
20 25 30
Glu Leu Gln Val Ile Gln Pro Asp Lys Ser Val Ser Val Ala Ala Gly
35 40 45
Glu Ser Ala Ile Leu His Cys Thr Val Thr Ser Leu Ile Pro Val Gly
50 55 60
Pro Ile Gln Trp Phe Arg Gly Ala Gly Pro Ala Arg Glu Leu Ile Tyr
65 70 75 80
Asn Gln Lys Glu Gly His Phe Pro Arg Val Thr Thr Val Ser Glu Ser
85 90 95
Thr Lys Arg Glu Asn Met Asp Phe Ser Ile Ser Ile Ser Asn Ile Thr
100 105 110
Pro Ala Asp Ala Gly Thr Tyr Tyr Cys Val Lys Phe Arg Lys Gly Ser
115 120 125
Pro Asp Thr Glu Phe Lys Ser Gly Ala Gly Thr Glu Leu Ser Val Arg
130 135 140
Ala Lys Pro Ser Ala Pro Val Val Ser Gly Pro Ala Ala Arg Ala Thr
145 150 155 160
Pro Gln His Thr Val Ser Phe Thr Cys Glu Ser His Gly Phe Ser Pro
165 170 175
Arg Asp Ile Thr Leu Lys Trp Phe Lys Asn Gly Asn Glu Leu Ser Asp
180 185 190
Phe Gln Thr Asn Val Asp Pro Val Gly Glu Ser Val Ser Tyr Ser Ile
195 200 205
His Ser Thr Ala Lys Val Val Leu Thr Arg Glu Asp Val His Ser Gln
210 215 220
Val Ile Cys Glu Val Ala His Val Thr Leu Gln Gly Asp Pro Leu Arg
225 230 235 240
Gly Thr Ala Asn Leu Ser Glu Thr Ile Arg Val Pro Pro Thr Leu Glu
245 250 255
Val Thr Gln Gln Pro Val Arg Ala Glu Asn Gln Val Asn Val Thr Cys
260 265 270
Gln Val Arg Lys Phe Tyr Pro Gln Arg Leu Gln Leu Thr Trp Leu Glu
275 280 285
Asn Gly Asn Val Ser Arg Thr Glu Thr Ala Ser Thr Val Thr Glu Asn
290 295 300
Lys Asp Gly Thr Tyr Asn Trp Met Ser Trp Leu Leu Val Asn Val Ser
305 310 315 320
Ala His Arg Asp Asp Val Lys Leu Thr Cys Gln Val Glu His Asp Gly
325 330 335
Gln Pro Ala Val Ser Lys Ser His Asp Leu Lys Val Ser Ala His Pro
340 345 350
Lys Glu Gln Gly Ser Asn Thr Ala Ala Glu Asn Thr Gly Ser Asn Glu
355 360 365
Arg Asn Ile Tyr Ile Val Val Gly Val Val Cys Thr Leu Leu Val Ala
370 375 380
Leu Leu Met Ala Ala Leu Tyr Leu Val Arg Ile Arg Gln Lys Lys Ala
385 390 395 400
Gln Gly Ser Thr Ser Ser Thr Arg Leu His Glu Pro Glu Lys Asn Ala
405 410 415
Arg Glu Ile Thr Gln Val Gln Ser Leu Asp Thr Asn Asp Ile Thr Tyr
420 425 430
Ala Asp Leu Asn Leu Pro Lys Gly Lys Lys Pro Ala Pro Gln Ala Ala
435 440 445
Glu Pro Asn Asn His Thr Glu Tyr Ala Ser Ile Gln Thr Ser Pro Gln
450 455 460
Pro Ala Ser Glu Asp Thr Leu Thr Tyr Ala Asp Leu Asp Met Val His
465 470 475 480
Leu Asn Arg Thr Pro Lys Gln Pro Ala Pro Lys Pro Glu Pro Ser Phe
485 490 495
Ser Glu Tyr Ala Ser Val Gln Val Pro Arg Lys
500 505
<210> 130
<211> 330
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (104)..(330)
<223> Fc区
<400> 130
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys
1 5 10 15
Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr
65 70 75 80
Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys
100 105 110
Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro
115 120 125
Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys
130 135 140
Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp
145 150 155 160
Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu
165 170 175
Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu
180 185 190
His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn
195 200 205
Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly
210 215 220
Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu
225 230 235 240
Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr
245 250 255
Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn
260 265 270
Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe
275 280 285
Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn
290 295 300
Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr
305 310 315 320
Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
325 330
<210> 131
<211> 327
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (99)..(327)
<223> Fc域
<400> 131
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg
1 5 10 15
Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr
65 70 75 80
Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Ser Cys Pro Ala Pro
100 105 110
Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys
115 120 125
Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val
130 135 140
Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp
145 150 155 160
Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe
165 170 175
Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp
180 185 190
Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu
195 200 205
Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg
210 215 220
Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys
225 230 235 240
Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp
245 250 255
Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys
260 265 270
Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser
275 280 285
Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser
290 295 300
Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser
305 310 315 320
Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys
325
<210> 132
<211> 327
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (99)..(327)
<223> Fc域
<400> 132
Ala Ser Phe Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Val Pro Cys Ser Arg
1 5 10 15
Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Cys Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr
65 70 75 80
Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Ser Cys Pro Ala Pro
100 105 110
Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys
115 120 125
Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val
130 135 140
Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp
145 150 155 160
Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe
165 170 175
Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Arg Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp
180 185 190
Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu
195 200 205
Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg
210 215 220
Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys
225 230 235 240
Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp
245 250 255
Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asp Asn Tyr Lys
260 265 270
Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser
275 280 285
Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser
290 295 300
Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser
305 310 315 320
Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
325
<210> 133
<211> 345
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> TTI-621
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(118)
<223> SIRPa组分
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (119)..(345)
<223> IgG1 Fc组分
<400> 133
Glu Glu Glu Leu Gln Val Ile Gln Pro Asp Lys Ser Val Ser Val Ala
1 5 10 15
Ala Gly Glu Ser Ala Ile Leu His Cys Thr Val Thr Ser Leu Ile Pro
20 25 30
Val Gly Pro Ile Gln Trp Phe Arg Gly Ala Gly Pro Ala Arg Glu Leu
35 40 45
Ile Tyr Asn Gln Lys Glu Gly His Phe Pro Arg Val Thr Thr Val Ser
50 55 60
Glu Ser Thr Lys Arg Glu Asn Met Asp Phe Ser Ile Ser Ile Ser Asn
65 70 75 80
Ile Thr Pro Ala Asp Ala Gly Thr Tyr Tyr Cys Val Lys Phe Arg Lys
85 90 95
Gly Ser Pro Asp Thr Glu Phe Lys Ser Gly Ala Gly Thr Glu Leu Ser
100 105 110
Val Arg Ala Lys Pro Ser Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro
115 120 125
Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys
130 135 140
Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val
145 150 155 160
Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr
165 170 175
Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu
180 185 190
Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His
195 200 205
Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys
210 215 220
Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln
225 230 235 240
Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu
245 250 255
Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro
260 265 270
Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn
275 280 285
Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu
290 295 300
Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val
305 310 315 320
Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln
325 330 335
Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
340 345
<210> 134
<211> 347
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> TTI-622
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(118)
<223> SIRPa组分
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (119)..(347)
<223> IgG4 Fc组分
<400> 134
Glu Glu Glu Leu Gln Val Ile Gln Pro Asp Lys Ser Val Ser Val Ala
1 5 10 15
Ala Gly Glu Ser Ala Ile Leu His Cys Thr Val Thr Ser Leu Ile Pro
20 25 30
Val Gly Pro Ile Gln Trp Phe Arg Gly Ala Gly Pro Ala Arg Glu Leu
35 40 45
Ile Tyr Asn Gln Lys Glu Gly His Phe Pro Arg Val Thr Thr Val Ser
50 55 60
Glu Ser Thr Lys Arg Glu Asn Met Asp Phe Ser Ile Ser Ile Ser Asn
65 70 75 80
Ile Thr Pro Ala Asp Ala Gly Thr Tyr Tyr Cys Val Lys Phe Arg Lys
85 90 95
Gly Ser Pro Asp Thr Glu Phe Lys Ser Gly Ala Gly Thr Glu Leu Ser
100 105 110
Val Arg Ala Lys Pro Ser Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro
115 120 125
Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro
130 135 140
Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr
145 150 155 160
Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn
165 170 175
Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg
180 185 190
Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val
195 200 205
Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser
210 215 220
Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys
225 230 235 240
Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu
245 250 255
Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe
260 265 270
Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu
275 280 285
Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe
290 295 300
Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly
305 310 315 320
Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr
325 330 335
Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys
340 345

Claims (74)

1.一种包括向有需要的受试者施用CD47-SIRPα阻断剂的方法，其中先前已向所述受试者施用经工程化以表达外源CD47多肽的细胞群体。
2.一种包括向有需要的受试者施用CD47-SIRPα阻断剂的方法，其中先前已向所述受试者施用经工程化以表达外源CD47多肽的T细胞群体。
3.一种包括向有需要的受试者施用CD47-SIRPα阻断剂的方法，其中先前已向所述受试者施用T细胞群体，所述细胞(i)经工程化以表达外源CD47多肽和至少一个嵌合抗原受体(CAR)并且(ii)具有MHC I类HLA分子、MHC II类HLA分子、T细胞受体(TCR)α和/或TCRβ的减少的表达。
4.一种包括向有需要的受试者施用CD47-SIRPα阻断剂的方法，其中先前已向所述受试者施用T细胞群体，所述细胞具有MHC I类HLA分子、MHC II类HLA分子和TCRα的减少的表达并且经工程化以表达外源CD47多肽和CD19嵌合抗原受体(CAR)。
5.一种包括向有需要的受试者施用CD47-SIRPα阻断剂的方法，其中先前已向所述受试者施用经工程化以表达外源CD47多肽的胰岛细胞群体。
6.一种包括向有需要的受试者施用CD47-SIRPα阻断剂的方法，其中先前已向所述受试者施用胰岛细胞群体，所述细胞(i)经工程化以表达外源CD47多肽并且(ii)具有MHC I类HLA和/或MHC II类HLA分子的减少的表达。
7.一种包括向有需要的受试者施用CD47-SIRPα阻断剂的方法，其中先前已向所述受试者施用胰岛细胞群体，所述细胞(i)经工程化以表达外源CD47、CD46和CD59多肽并且(ii)具有MHC I类HLA和/或MHC II类HLA分子的减少的表达。
8.一种减少受试者中的经工程化以表达外源CD47多肽的细胞群体的方法，所述方法包括：
(a)向所述受试者施用第一剂量的CD47-SIRPα阻断剂；
(b)测定在(a)中施用的所述第一剂量的所述CD47-SIRPα阻断剂的第一结果；
(c)任选地基于(b)中的所述第一结果，施用第二剂量的所述CD47-SIRPα阻断剂；以及
(d)任选地测定在(c)中施用的所述第二剂量的所述CD47-SIRPα阻断剂的第二结果。
9.一种方法，所述方法包括：
(a)量化受试者中的经工程化以表达外源CD47多肽的细胞群体；
(b)测定有效减少所述细胞群体至少20％的CD47-SIRPα阻断剂的第一剂量；以及
(c)将所述第一剂量的所述CD47-SIRPα阻断剂施用于所述受试者。
10.如权利要求2、3或4中任一项所述的方法，其中所述T细胞为原代细胞。
11.如权利要求2、3或4中任一项所述的方法，其中所述T细胞为同种异体细胞。
12.如权利要求2、3或4中任一项所述的方法，其中所述T细胞是从iPSC分化。
13.如权利要求2所述的方法，其中所述T细胞进一步经工程化以表达嵌合抗原受体(CAR)。
14.如权利要求3、4或13中任一项所述的方法，其中所述CAR为选自由以下组成的组的CD19 CAR：tisagenlecleucel、lisocabtagene maraleucel、axicabtagene ciloleucel和brexucabtagene autoleucel。
15.如权利要求3、4或13中任一项所述的方法，其中所述CAR为包含SEQ ID NO：117的氨基酸序列的CD19 CAR。
16.如权利要求15所述的方法，其中所述CD19 CAR由SEQ ID NO：116的核酸序列编码。
17.如权利要求2、3或4中任一项所述的方法，其中所述T细胞经工程化以表达至少一种选自由以下组成的组的额外因子：CD16、CD24、CD35、CD39、CD46、CD52、CD55、CD59、CD200、CCL22、CTLA4-Ig、C1抑制剂、FASL、IDO1、HLA-C、HLA-E、HLA-E重链、HLA-G、IL-10、IL-35、PD-1、PD-L1、Serpinb9、CCl21、Mfge8和其组合。
18.如权利要求5、6或7中任一项所述的方法，其中所述胰岛细胞经工程化以表达至少一种选自由以下组成的组的额外因子：CD16、CD24、CD35、CD39、CD46、CD52、CD55、CD59、CD200、CCL22、CTLA4-Ig、C1抑制剂、FASL、IDO1、HLA-C、HLA-E、HLA-E重链、HLA-G、IL-10、IL-35、PD-1、PD-L1、Serpinb9、CCl21、Mfge8和其组合。
19.如权利要求5、6或7中任一项所述的方法，其中所述胰岛细胞经工程化以具有CD142的减少的表达。
20.如权利要求5、6或7中任一项所述的方法，其中所述胰岛细胞为原代细胞。
21.如权利要求5、6或7中任一项所述的方法，其中所述胰岛细胞是从iPSC分化。
22.如权利要求3、4或13中任一项所述的方法，其中所述CAR和编码所述外源CD47多肽的基因在双顺反子载体中引入所述T细胞中。
23.如权利要求22所述的方法，其中所述双顺反子载体经由慢病毒来引入所述T细胞中。
24.如权利要求23所述的方法，其中所述CAR和编码所述外源CD47多肽的所述基因在单一启动子的控制下。
25.如权利要求8所述的方法，其中所述第一结果和所述第二结果独立地选自由以下组成的组：(i)约10％与100％之间的细胞数目的减少，(ii)约10％与100％之间的不良事件的减少，和(iii)(i)和(ii)的组合。
26.如权利要求8或9所述的方法，其中所述第一剂量和/或所述第二剂量按以下方式施用：
(i)以0.05、0.1、0.3、1、3或10mg/kg；
(ii)每12小时一次、每24小时一次、每36小时一次或每48小时一次；和/或
(iii)持续1天与3周之间。
27.如权利要求26所述的方法，其中所述第一剂量和所述第二剂量是相同的。
28.如权利要求1、8或9中任一项所述的方法，其中所述细胞为原代细胞。
29.如权利要求28所述的方法，其中所述原代细胞为T细胞或胰岛细胞。
30.如权利要求1、8或9中任一项所述的方法，其中所述细胞是从iPSC分化。
31.如权利要求12、21或30中任一项所述的方法，其中所述分化细胞选自由以下组成的组：心脏细胞、神经细胞、内皮细胞、T细胞、胰岛细胞、视网膜色素上皮细胞、肝细胞、甲状腺细胞、皮肤细胞、血细胞、原代细胞和上皮细胞。
32.如权利要求1、8或9中任一项所述的方法，其中所述细胞经工程化以表达至少一种选自由以下组成的组的额外因子：CD16、CD24、CD35、CD39、CD46、CD52、CD55、CD59、CD200、CCL22、CTLA4-Ig、C1抑制剂、FASL、IDO1、HLA-C、HLA-E、HLA-E重链、HLA-G、IL-10、IL-35、PD-1、PD-L1、Serpinb9、CCl21、Mfge8和其组合。
33.如权利要求2、3、4或29中任一项所述的方法，其中所述T细胞经工程化以具有TCRα和/或TCRβ的减少的表达。
34.如权利要求2、3、4或29中任一项所述的方法，其中所述T细胞经工程化以具有细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4(CTLA4)和/或程序性细胞死亡(PD1)的减少的表达。
35.如权利要求1-9中任一项所述的方法，其中编码所述外源CD47多肽的基因经由同源引导修复(HDR)介导插入所述细胞的基因组基因座中来引入所述细胞中。
36.如权利要求35所述的方法，其中所述基因组基因座选自由以下组成的组：B2M基因座、CIITA基因座、TRAC基因座、TRBC基因座和安全港基因座。
37.如权利要求36所述的方法，其中所述安全港基因座选自由以下组成的组：AAVS1、ABO、CCR5、CLYBL、CXCR4、F3、FUT1、HMGB1、KDM5D、LRP1、MICA、MICB、RHD、ROSA26和SHS231基因座。
38.如权利要求3、4或13中任一项所述的方法，其中所述CAR结合选自由以下组成的组的抗原：CD19、CD20、CD22、CD38、CD123、CD138、BCMA和其组合。
39.如权利要求8所述的方法，其中所述第一结果和/或所述第二结果是不良事件。
40.如权利要求1-7中任一项所述的方法，其中所述CD47-SIRPα阻断剂在向所述受试者施用所述细胞之后至少一天施用。
41.如权利要求1-7中任一项所述的方法，其中所述CD47-SIRPα阻断剂在向所述受试者施用所述细胞之后至少一周施用。
42.如权利要求1-7中任一项所述的方法，其中所述CD47-SIRPα阻断剂在向所述受试者施用所述细胞之后至少一个月施用。
43.如权利要求1-7中任一项所述的方法，其中所述CD47-SIRPα阻断剂在所述受试者经历与所施用细胞相关的不良事件之后施用。
44.如权利要求39或43所述的方法，其中所述不良事件选自由以下组成的组：异常增生、转化、肿瘤形成、细胞因子释放综合征、移植物抗宿主疾病(GVHD)、免疫效应细胞相关神经中毒性综合征(ICANS)、炎症、感染、恶心、呕吐、出血、间质性肺炎、呼吸道疾病、黄疸、体重损失、腹泻、食欲不振、抽筋、腹部疼痛、肝静脉闭塞疾病(VOD)、移植失败、器官损伤、不育、激素变化、异常生长形成、白内障和移植后淋巴增殖病症(PTLD)。
45.如权利要求1-9中任一项所述的方法，其中所述CD47-SIRPα阻断剂包含CD47结合域。
46.如权利要求45所述的方法，其中所述CD47结合域包含信号调控蛋白α(SIRPα)或其片段。
47.如权利要求1-9中任一项所述的方法，其中所述CD47-SIRPα阻断剂包含免疫球蛋白G(IgG)Fc域。
48.如权利要求47所述的方法，其中所述IgG Fc域包含IgG1 Fc域。
49.如权利要求48所述的方法，其中所述IgG1 Fc域包含人类抗体的片段。
50.如权利要求1-9中任一项所述的方法，其中所述CD47-SIRPα阻断剂选自由TTI-621、TTI-622和ALX148组成的组。
51.如权利要求47所述的方法，其中所述IgG Fc域包含IgG4 Fc域。
52.如权利要求1-9中任一项所述的方法，其中所述CD47-SIRPα阻断剂为抗体。
53.如权利要求52所述的方法，其中所述抗体选自由以下组成的组：MIAP410、B6H12和麦格罗单抗。
54.如权利要求1-7中任一项所述的方法，其中所述CD47-SIRPα阻断剂以有效减少所述细胞群体的剂量施用。
55.如权利要求54所述的方法，其中所述细胞群体减少约10％与约100％之间。
56.如权利要求54所述的方法，其中所述细胞群体得以消除。
57.如权利要求54所述的方法，其中所述细胞群体的减少经由免疫反应而发生。
58.如权利要求57所述的方法，其中所述免疫反应为所述细胞的NK细胞介导的细胞杀灭、巨噬细胞介导的细胞杀灭、补体依赖性细胞毒性(CDC)和/或抗体依赖性细胞毒性(ADCC)。
59.如权利要求1-9中任一项所述的方法，其中所述CD47-SIRPα阻断剂经静脉内、皮下、腹膜内、肌肉内或颅内施用于所述受试者。
60.如权利要求59所述的方法，其中所述CD47-SIRPα阻断剂以1-20天之间的时间间隔施用于所述受试者持续10天与6个月之间的时段。
61.如权利要求60所述的方法，其中所述CD47-SIRPα阻断剂按以下方式施用于所述受试者：
(i)以0.05、0.1、0.3、1、3或10mg/kg的剂量；
(ii)每12小时一次、每24小时一次、每36小时一次或每48小时一次；和/或
(ii)持续1天与3周之间。
62.如权利要求1-9中任一项所述的方法，所述方法还包括将IL-2施用于所述受试者。
63.如权利要求1-9中任一项所述的方法，其中所述CD47-SIRPα阻断剂选自由以下组成的组：结合CD47的抗体或其片段、结合CD47的双特异性抗体、结合CD47的免疫细胞因子融合蛋白、含有CD47的融合蛋白、结合SIRPα的抗体或其片段、结合SIRPα的双特异性抗体、结合SIRPα的免疫细胞因子融合蛋白、含有SIRPα的融合蛋白和其组合。
64.如权利要求63所述的方法，其中所述结合CD47的抗体或其片段选自由以下组成的组：麦格罗单抗(Hu5F9-G4)、CC-90002、IBI-188、IBI-322、TG-1801(NI-1701)、ALX148、TJ011133、FA3M3、ZL1201、AK117、AO-176、SRF231、GenSci-059、C47B157、C47B161、C47B167、C47B222、C47B227、Vx-1004、HMBD004、SHR-1603、AMMS4-G4、RTX-CD47和IMC-002。
65.如权利要求63所述的方法，其中所述结合CD47的抗体或其片段选自由以下组成的组：针对CD47的单链Fv片段(scFv)、针对CD47的Fab、针对CD47的VHH纳米抗体、针对CD47的DARPin和其变体。
66.如权利要求63所述的方法，其中所述结合SIRPα的抗体或其片段选自由以下组成的组：ADU-1805、CC-95251、OSE-172(BI 765063)、KWAR23和P362。
67.如权利要求63所述的方法，其中所述结合SIRPα的抗体或其片段选自由以下组成的组：针对SIRPα的单链Fv片段(scFv)、针对SIRPα的Fab、针对SIRPα的VHH纳米抗体、针对SIRPα的DARPin和其变体。
68.如权利要求63所述的方法，其中所述含有SIRPα的融合蛋白包含连接至Fc域的SIRPα的CD47结合域。
69.如权利要求68所述的方法，其中所述Fc域包含选自由以下组成的组的Fc域或其一部分：IgG1、IgG2、IgG3和IgG4。
70.如权利要求1、2、5、8或9中任一项所述的方法，其中所述细胞具有MHC I类HLA和/或MHC II类HLA分子的减少的表达。
71.如权利要求3、4、6、7或70中任一项所述的方法，其中MHC I类和/或MHC II类表达得以敲除。
72.如权利要求3、4、6、7或70中任一项所述的方法，其中MHC I类HLA的减少表达由B2M的减少表达来介导并且MHC II类的减少表达由CIITA的减少表达来介导。
73.如权利要求71所述的方法，其中B2M和/或CIITA表达得以敲除。
74.如权利要求1-9中任一项所述的方法，其中所述外源CD47多肽包含SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：4的氨基酸序列。
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