JP2024502630A - コンテキスト依存性二本鎖ｄｎａ特異的デアミナーゼ及びその使用 - Google Patents

コンテキスト依存性二本鎖ｄｎａ特異的デアミナーゼ及びその使用 Download PDF

Info

Publication number
JP2024502630A
JP2024502630A JP2023542485A JP2023542485A JP2024502630A JP 2024502630 A JP2024502630 A JP 2024502630A JP 2023542485 A JP2023542485 A JP 2023542485A JP 2023542485 A JP2023542485 A JP 2023542485A JP 2024502630 A JP2024502630 A JP 2024502630A
Authority
JP
Japan
Prior art keywords
seq
deaminase
base editor
amino acid
domain
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
JP2023542485A
Other languages
English (en)
Inventor
ファヒム ファルザドファルド，
ナバ ガラエイ，
ギヨン ジュン，
リアン リン，
ジョン ソク カン，
Original Assignee
マーチ セラピューティクス， インコーポレイテッド
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by マーチ セラピューティクス， インコーポレイテッド filed Critical マーチ セラピューティクス， インコーポレイテッド
Publication of JP2024502630A publication Critical patent/JP2024502630A/ja
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/78—Hydrolases (3) acting on carbon to nitrogen bonds other than peptide bonds (3.5)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
    • C12N15/102—Mutagenizing nucleic acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/80—Fusion polypeptide containing a DNA binding domain, e.g. Lacl or Tet-repressor

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Crystallography & Structural Chemistry (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

コンテキスト依存的様式で二本鎖ＤＮＡ中のシトシンヌクレオチドを脱アミノ化することができるデアミナーゼドメインが記載される。特定の標的配列を認識し、且つ／又はそれに結合する１つ以上のターゲティングドメイン（例えば、Ｃａｓ９、Ｃｐｆ１、ＺＦ、ＴＡＬＥ）と組み合わせて、そのデアミナーゼドメインを含有する非天然の又は操作された標的化塩基エディターも開示される。塩基エディターは、低いオフターゲット効果を伴って、細胞又は対象のゲノム内、例えばヒトミトコンドリアゲノム内での標的化部位の特異的且つ効率的な編集を促進する。デアミナーゼドメイン及び塩基エディターを使用する方法も提供される。

Description

関連出願の相互参照
本出願は、その内容が全体として参照により組み込まれる、２０２１年１月１２日に出願された米国特許出願第６３／１３６，５２４号明細書の利益及びそれに対する優先権を主張する。
配列表の参照
２０２２年１月１２日に作成され、サイズが３７４，３８４バイトである「ＭＩＬＡ１００＿ＳＴ２５．ｔｘｔ」という名称のテキストファイルとして、２０２２年１月１２日に提出された配列表は、３７Ｃ．Ｆ．Ｒ．§１．５２（ｅ）（５）に準拠して参照により本明細書に組み込まれる。
開示される本発明は、概して、核酸のターゲティング及び編集、特に目的の標的配列におけるプログラム可能な脱アミノ化のための組成物及び方法に関する。
核酸配列の標的化編集、例えば標的化切断又はゲノムＤＮＡへの特異的修飾の標的化導入は、遺伝子機能の研究にとって非常に有望な手法であり、ヒト遺伝病の新しい治療法を提供する可能性も有する。操作されたジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）及びＣＲＩＳＲＰＲ－Ｃａｓシステムを含む現在のゲノムエンジニアリングツールは、ゲノム中の配列特異的なＤＮＡ切断を実施する。このプログラム可能な切断は、非相同末端結合（ＮＨＥＪ）を介した切断部位のＤＮＡの突然変異又は相同組換え修復（ＨＤＲ）を介した切断部位周囲のＤＮＡの置換を達成し得る。しかし、これらの技術の欠点は、それらが典型的にはわずかな遺伝子編集効率のみをもたらし、さらに所望の改変と競合する可能性がある不要な遺伝子改変を招くことである。
多くの遺伝性疾患は、原則として、ゲノム中の特定の位置に特定のヌクレオチド変化（例えば、ある疾患に関連する遺伝子の特定のコドンにおけるＣからＴへの変化）をもたらすことによって治療することができるため、塩基エディターは、二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）切断の導入を必要とすることなく、そのような精密遺伝子編集を達成するプログラム可能な方法として企図されてきた。以前に記載されている（シチジン又はアデノシン）デアミナーゼは、一本鎖核酸に作用するため、それらを塩基編集に使用するには、例えば、Ｃａｓ９システム又は同様のＲＮＡ誘導酵素による二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）の巻き戻しを必要とする。従って、既存の塩基エディターは、Ｃａｓ９又は他のＲＮＡ誘導酵素に融合したＤＮＡ修飾ドメイン（即ちｓｓＤＮＡ特異的デアミナーゼドメイン）を使用する。そのガイドＲＮＡを有するＣａｓ９酵素とゲノム標的との結合により、一本鎖ＤＮＡ領域を露出させるＲループが生成されるため、塩基エディターは、露出したｓｓＤＮＡ領域によって画定される小さいウィンドウ内で塩基を修飾する。シチジンデアミナーゼを使用する塩基エディターは、Ｃ→Ｔ変異を可能にし（Ｋｏｍｏｒ，Ａ．，ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ５３３，４２０－４２４（２０１６））、アデノシンデアミナーゼに融合した塩基エディターは、Ａ→Ｇ変異を可能にした（Ｇａｕｄｅｌｌｉ，Ｎ．，ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ５５１，４６４－４７１（２０１７））。しかし、ｓｓＤＮＡをその基質として厳密に要求するため、ｓｓＤＮＡ特異的デアミナーゼをジンクフィンガー及びＴＡＬＥなどのｄｓＤＮＡ特異的ＤＮＡ結合ドメインと組み合わせて使用しようとする取り組みは、効率的な塩基エディターをもたらしていない。
近年、ミトコンドリアゲノム編集を可能にする二本鎖ＤＮＡ活性を有するシチジンデアミナーゼが報告された（Ｍｏｋ ＢＹ．，ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，５８３（７８１７）：６３１－６３７（２０２０）；国際公開第２０２１／１５５０６５Ａ１号パンフレット）。ＤｄｄＡと命名されたこのシチジンデアミナーゼは、二本鎖ＤＮＡ上にＣ→Ｕ変換を生成し、次にこれが細胞修復及び複製機構によってＣ→Ｔに変換される。しかし、ＤｄｄＡは、厳密なコンテキスト特異性を備え、チミンの前にあるデオキシシチジンのみを編集することができる（従ってＴＣをＴＴに変換する）ため、その適用可能性を非常に狭い配列コンテキストに制限する。従って、多くの進歩がなされたにもかかわらず、特にＲＮＡ誘導エディターによる編集に適していないミトコンドリアなどの細胞小器官において、現在の塩基編集能力を拡大するための組成物、システム及び方法が依然として必要とされている。
国際公開第２０２１／１５５０６５号
Ｋｏｍｏｒ，Ａ．，ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ５３３，４２０－４２４（２０１６） Ｇａｕｄｅｌｌｉ，Ｎ．，ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ５５１，４６４－４７１（２０１７） Ｍｏｋ ＢＹ．，ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，５８３（７８１７）：６３１－６３７（２０２０）
従って、本発明の目的は、核酸編集のための組成物及び方法を提供することである。
本発明の目的は、ＤＮＡの巻き戻し又はその機能のための任意の補助核酸部分（例えば、ガイドＲＮＡ）への依存を必要とすることなく、ｄｓＤＮＡの塩基編集を可能にする組成物及び方法を提供することである。
本発明の目的は、任意の所与の配列コンテキスト（例えば、ＮＡＣＮ、ＮＣＣＮ、ＮＧＣＮ、ＮＴＣＮ）において、高効率でｄｓＤＮＡ中のシチジンの所望の修飾（例えば、塩基編集）の導入を可能にする組成物及び方法を提供することである。
本発明の目的は、最小限のオフターゲット活性で核酸塩基編集を可能にする組成物及び方法を提供することである。
本発明の別の目的は、向上した精度で核酸塩基編集を可能にする組成物及び方法を提供することである。
本発明の別の目的は、オンターゲット編集を最大化すると共に、バイスタンダーオフターゲットを最小化するために、塩基エディターの活性ウィンドウの調整を可能にする組成物及び方法を提供することである。
本発明の別の目的は、広範囲の標的核酸にわたって核酸塩基編集を可能にする組成物及び方法を提供することである。
本発明の別の目的は、ヒト（核又はミトコンドリア）ゲノム中の任意の部位における核酸塩基編集のための組成物及び方法を提供することである。
本発明の別の目的は、多様性生成及びエピジェネティックシーケンシングなどの適用のためのインビトロでのｄｓＤＮＡの核酸編集のための組成物及び方法を提供することである。
本明細書に含まれる文献、行為、材料、装置、物品などに関するいかなる議論も、これらのいずれか又は全てが先行技術基準の一部をなすこと、又は本出願の各請求項の優先日より前に存在したため、本開示に関連する分野で共通の一般的知識であったことの承認として見なされるべきではない。
本明細書全体を通して、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」という語又は「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」若しくは「含んでいる」などの変形は、記載される要素、整数若しくはステップ又は要素、整数若しくはステップの群を含むことを意味すると理解されるが、他のいかなる要素、整数若しくはステップ又は要素、整数若しくはステップの群の除外を意味するものではない。
二本鎖ＤＮＡ中のシトシンを脱アミノ化することができるデアミナーゼドメインが発見されている。開示されるデアミナーゼドメインのいくつかは、より配列特異的であるが、他のものは、以前に特性決定されたデアミナーゼよりも広い範囲の標的配列を編集することができる（即ちより広範なコンテキスト特異性を有する）。これら及び他の特徴に基づいて、デアミナーゼは、以前に特性決定されたｄｓＤＮＡ特異的デアミナーゼと比較して、オフターゲット編集の低減を示し、且つ／又はより広いコンテキストで編集を導入することを可能にすると考えられる。デアミナーゼドメインを使用して、細胞又は対象のゲノム内の単一の標的部位を編集することを含む、核酸をターゲティング及び編集するための試薬、組成物、キット及び方法が提供される。
特に、二本鎖ＤＮＡを脱アミノ化することができる単離されたデアミナーゼドメインが開示される。デアミナーゼドメインは、標的ヌクレオチド配列を含まない二本鎖ＤＮＡ上のデアミナーゼドメインのデアミナーゼ活性と比較して、標的ヌクレオチド配列を含む二本鎖ＤＮＡに対してより大きいデアミナーゼ活性を有し得る。典型的には、標的ヌクレオチド配列は、それぞれ個別に完全に又は部分的に規定され、且つ互いに固定された順序関係にある２つ以上の標的ヌクレオチドを含む。一部の形態では、標的ヌクレオチド配列は、２つ以上の標的ヌクレオチドを含み、標的ヌクレオチドは、それぞれ個別に完全に又は部分的に規定され、且つ互いに固定された順序関係にある。
一部の形態では、デアミナーゼのコンテキスト特異性は、確率シーケンスロゴとして表すことができ、この場合、デアミナーゼにより特定の閾値（例えば、２５％又は５０％）で編集される標的ヌクレオチドのコンテキストの不均質性は、アラインメントされた配列の群により表される。アラインメントは、所与の位置に存在する文字のスタックとして表され、アラインメントに観察される各核酸の頻度は、スタック内の各文字の高さによって表される。
好ましい形態では、デアミナーゼドメインは、バークホルデリア・セノセパシア（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｃｅｎｏｃｅｐａｃｉａ）のＤｄｄＡのデアミナーゼドメインではない。一部の形態では、デアミナーゼドメインは、バークホルデリア・セノセパシア（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｃｅｎｏｃｅｐａｃｉａ）由来のＤｄｄＡのホモログのデアミナーゼドメインではない。一部の形態では、デアミナーゼドメインは、バークホルデリア属（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ）由来のＤｄｄＡのデアミナーゼドメインではない。
一部の形態では、デアミナーゼドメインを２つの部分に分割することができ、それにより、デアミナーゼドメインは、２つの部分を近接させるか又は互いに結合させたときにのみ標的ヌクレオチド配列を脱アミノ化することができる。これは、ターゲティングドメインがデアミナーゼ部分を標的配列付近に近接させる場合を除いて、デアミナーゼ活性を防止するのに役立つ。一部の形態では、スプリットデアミナーゼドメインの各部分は、インタクトなデアミナーゼドメインの５０％超を含み、その結果、結合された部分は、デアミナーゼドメインの少なくともいくつかの部分の２つのコピーを含む。一部の形態では、スプリットデアミナーゼドメインの各部分は、インタクトなデアミナーゼドメインの少なくとも５５％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％又は９５％超を含む。他の形態では、スプリットデアミナーゼドメインの各部分は、インタクトなデアミナーゼドメインの正確に５０％を含み、その結果、２つの部分の組合せは、デアミナーゼドメインの構造成分の正確に１００％を提供する。典型的には、スプリットデアミナーゼドメインの２つの部分は、１つ以上のアクセサリードメインによって互いに近接される。
一部の形態では、デアミナーゼドメインは、シトシンヌクレオチドを脱アミノ化することができる（本明細書では「シトシンデアミナーゼ」と呼ぶ）。シトシンヌクレオチドを脱アミノ化することができる例示的な標的ヌクレオチド配列としては、いずれかの所与のコンテキストにおけるＡＣ、ＣＣ、ＧＣ、ＴＣが挙げられるが、これらに限定されない。標的ヌクレオチド配列は、頻度シーケンスロゴ分析により、優勢配列として有用に示すことができる。上記の一部の形態では、３’末端Ｃは、脱アミノ化される。例示的なシトシンデアミナーゼとしては、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号９、配列番号１１、配列番号１４、配列番号１５及び配列番号１６のいずれか１つのアミノ酸配列を有するデアミナーゼドメインが挙げられる。
一部の形態では、デアミナーゼドメインは、アデニンヌクレオチドを脱アミノ化することができる（本明細書では「アデノシンデアミナーゼ」と呼ばれる）。
一部の形態では、デアミナーゼドメインは、配列番号１のアミノ酸配列又は配列番号１に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％若しくは９９％の配列同一性を有するアミノ酸或いはその断片を有するＢＥ＿Ｒ１＿１１を含む。一部の形態では、デアミナーゼドメインは、配列番号２のアミノ酸配列又は配列番号２に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％若しくは９９％の配列同一性を有するアミノ酸或いはその断片を有するＢＥ＿Ｒ１＿１２を含む。一部の形態では、デアミナーゼドメインは、配列番号３のアミノ酸配列又は配列番号３に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％若しくは９９％の配列同一性を有するアミノ酸或いはその断片を有するＢＥ＿Ｒ１＿２８を含む。
塩基エディター標的配列に特異的に結合するデアミナーゼドメイン及びターゲティングドメインなどの標的化塩基エディターも記載される。例示的なターゲティングドメインとしては、ＴＡＬＥ、ＢＡＴ、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９、Ｃｆｐ１及びジンクフィンガーが挙げられる。
一部の形態では、標的化塩基エディター標的配列は、デアミナーゼドメインの標的ヌクレオチド配列の実体の２０ヌクレオチド以内の標的核酸中に存在するように選択され、標的ヌクレオチド配列の実体は、標的化塩基エディターによって塩基編集されるように選択される。一部の形態では、標的化塩基エディターによって塩基編集されるように選択される標的ヌクレオチド配列の実体の３０ヌクレオチド以内の塩基エディター標的配列は、標的ヌクレオチド配列の任意の実体の２０ヌクレオチド以内にある標的核酸における唯一の塩基エディター標的配列である。一部の形態では、標的核酸における標的ヌクレオチド配列の実体は、標的ヌクレオチド配列の実体の２０ヌクレオチド以内の標的核酸中の塩基エディター標的配列の２０ヌクレオチド以内のデアミナーゼドメインの標的ヌクレオチド配列の唯一の実体である。
以上のいずれでも、塩基エディター標的配列は、ミトコンドリアＤＮＡ、葉緑体ＤＮＡ若しくは色素体ＤＮＡ又はゲノムを有するいずれかの他の膜性細胞小器官中に存在し得る。塩基エディターを使用して、試験管内の例えば合成又は天然ＤＮＡに対してインビトロで作用させることもできる。
一部の形態では、塩基エディターは、２つの部分を含み、それにより、第１の部分は、第１のスプリットデアミナーゼドメインを含み、及び第２の部分は、第２のスプリットデアミナーゼドメインを含む。一部の形態では、第１の部分は、配列番号１２２～１８１のいずれか１つのアミノ酸配列を含むスプリットデアミナーゼドメインを含み、及び第２の部分は、配列番号１２７～１８１のいずれか１つのアミノ酸配列を含むスプリットデアミナーゼドメインを含み、第１及び第２のスプリットデアミナーゼドメインは、単独では不活性であるが、一緒に近接されると脱アミノ化が可能である。一部の形態では、第１のスプリットデアミナーゼドメインは、配列番号１２２～１２６のいずれか１つのアミノ酸配列を含む。他の形態では、第１及び第２のスプリットデアミナーゼドメインの両方は、野生型デアミナーゼドメイン活性部位を含む。
特定の形態では、第１及び第２のスプリットデアミナーゼドメインは、ＢＥ＿Ｒ１＿１１の断片又は変異体をそれぞれ含む。例えば、一部の形態では、第１のスプリットデアミナーゼドメインは、配列番号１２２、又は１２７～１３５、又は１５０のいずれか１つを含み、及び第２のスプリットデアミナーゼドメインは、配列番号１２７～１３５又は１５０のいずれか１つを含む。一部の形態では、第１のスプリットデアミナーゼドメインは、配列番号１２２を含み、及び第２のスプリットデアミナーゼドメインは、配列番号１２７～１３４又は１５０のいずれか１つを含む。特定の形態では、第１のスプリットデアミナーゼドメインは、配列番号１２９を含み、及び第２のスプリットデアミナーゼドメインは、配列番号１５０を含む。
特定の形態では、第１及び第２のスプリットデアミナーゼドメインは、ＢＥ＿Ｒ１＿１２の断片又は変異体をそれぞれ含む。例えば、一部の形態では、第１のスプリットデアミナーゼドメインは、配列番号１２４、又は１３６～１４０、又は１５６～１６７のいずれか１つを含み、及び第２のスプリットデアミナーゼドメインは、配列番号１３６～１４０又は１５６～１６７のいずれか１つを含む。一部の形態では、第１のスプリットデアミナーゼドメインは、配列番号１２４を含み、及び第２のスプリットデアミナーゼドメインは、配列番号１５６～１６６のいずれか１つを含む。特定の形態では、第１のスプリットデアミナーゼドメインは、配列番号１３７を含み、及び第２のスプリットデアミナーゼドメインは、配列番号１４２を含む。別の形態では、第１のスプリットデアミナーゼドメインは、配列番号１３９を含み、及び第２のスプリットデアミナーゼドメインは、配列番号１４４を含む。
特定の形態では、第１及び第２のスプリットデアミナーゼドメインは、ＢＥ＿Ｒ１＿４１の断片又は変異体をそれぞれ含む。例えば、一部の形態では、第１のスプリットデアミナーゼドメインは、配列番号１６８～１７１のいずれか１つを含み、及び第２のスプリットデアミナーゼドメインは、配列番号１７２～１７５のいずれか１つを含む。特定の形態では、第１のスプリットデアミナーゼドメインは、配列番号１６８を含み、及び第２のスプリットデアミナーゼドメインは、配列番号１７３を含む。別の形態では、第１のスプリットデアミナーゼドメインは、配列番号１７１を含み、及び第２のスプリットデアミナーゼドメインは、配列番号１７５を含む。他の形態では、第１のスプリットデアミナーゼドメインは、配列番号１７１を含み、及び第２のスプリットデアミナーゼドメインは、配列番号１７３を含む。
特定の形態では、第１及び第２のスプリットデアミナーゼドメインは、ＢＥ＿Ｒ１＿２８の断片又は変異体をそれぞれ含む。例えば、一部の形態では、第１のスプリットデアミナーゼドメインは、配列番号１２３、又は１４６～１４９、又は１５１～１５５のいずれか１つを含み、及び第２のスプリットデアミナーゼドメインは、配列番号１４６～１４９又は１５１～１５５のいずれか１つを含む。特定の形態では、第１のスプリットデアミナーゼドメインは、配列番号１２３を含み、及び第２のスプリットデアミナーゼドメインは、配列番号１４９又は１５１～１５３のいずれか１つを含む。
特定の形態では、第１及び第２スプリットデアミナーゼドメインは、ＢＥ＿Ｒ４＿２１の断片又は変異体をそれぞれ含む。例えば、一部の形態では、第１のスプリットデアミナーゼドメインは、配列番号１２５又は１７６～１７７のいずれか１つを含み、及び第２のスプリットデアミナーゼドメインは、配列番号１７６～１７７のいずれか１つを含む。特定の形態では、第１のスプリットデアミナーゼドメインは、配列番号１２５を含み、及び第２のスプリットデアミナーゼドメインは、配列番号１７７を含む。他の形態では、第１のスプリットデアミナーゼドメインは、配列番号１７６を含み、及び第２のスプリットデアミナーゼドメインは、配列番号１７７を含む。
特定の形態では、第１及び第２スプリットデアミナーゼドメインは、ＢＥ＿Ｒ２＿１１の断片又は変異体をそれぞれ含む。例えば、一部の形態では、第１のスプリットデアミナーゼドメインは、配列番号１２６又は１８０～１８１のいずれか１つを含み、及び第２のスプリットデアミナーゼドメインは、配列番号１８０～１８１のいずれか１つを含む。特定の形態では、第１のスプリットデアミナーゼドメインは、配列番号１２５を含み、及び第２のスプリットデアミナーゼドメインは、配列番号１８０～１８１のいずれか１つを含む。別の形態では、第１のスプリットデアミナーゼドメインは、配列番号１８０を含み、及び第２のスプリットデアミナーゼドメインは、配列番号１８１を含む。
他のデアミナーゼを類似の方法で分割して、類似の結果を得ることができる。さらに、他のスプリット及び編集を使用して、デアミナーゼ部分が接近するまでそれらを不活性に保持するという目的を達成することもできる。
一部の形態では、第１の部分若しくは第２の部分又は第１の部分及び第２の部分の両方は、ＴＡＬＥ、ＢＡＴ、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９、Ｃｆｐ１又はジンクフィンガーから選択されるプログラマブルＤＮＡ結合ドメインを含む。
例えば、一部の形態では、１つのプログラマブルＤＮＡ結合ドメインは、左側ＴＡＬＥ及び右側ＴＡＬＥからなる群から選択されるＴＡＬＥである。「左」及び「右」という用語の使用は、あくまで便宜上の目的で使用され、ＤＮＡ結合ドメインが標的配列のいずれの側に結合するかを意味するものではない。さらに、異なるクラスのＤＮＡ結合ドメイン（例えば、ＴＡＬＥ及びＺＦ、ＺＦ及びＴＡＬＥ、ＢＡＴ及びＴＡＬＥ、ｄＣａｓ９及びＴＡＬＥ）を一緒に使用することができる。例示的な形態では、１つのプログラマブルＤＮＡ結合ドメインは、配列番号９０、９２、９５、９７～１０６のいずれか１つのアミノ酸配列を含む左側ＴＡＬＥである。別の例示的な形態では、１つのプログラマブルＤＮＡ結合ドメインは、配列番号９１、９３～９４、９６、１０８～１１３のいずれか１つのアミノ酸配列を含む右側ＴＡＬＥである。一部の形態では、１つ以上のプログラマブルＤＮＡ結合ドメインは、配列番号９５～９６のいずれか１つを含むアミノ酸配列を有する、ミトコンドリアｍＮＤ１ ＤＮＡに結合するＴＡＬＥである。従って、特定の形態では、１つのプログラマブルＤＮＡ結合ドメインは、配列番号９６を含むアミノ酸配列を有する、ミトコンドリアｍＮＤ１ ＤＮＡに結合する右側ＴＡＬＥである。別の特定の形態では、１つのプログラマブルＤＮＡ結合ドメインは、配列番号９５を含むアミノ酸配列を有する、ミトコンドリアｈＮＤ１ ＤＮＡに結合する左側ＴＡＬＥである。一部の形態では、１つ以上のプログラマブルＤＮＡ結合ドメインは、配列番号９９～１０６又は１０８～１１３のいずれか１つを含むアミノ酸配列を有する、ミトコンドリアｍＣＯＸ１ ＤＮＡに結合するＴＡＬＥである。例えば、一部の形態では、１つのプログラマブルＤＮＡ結合ドメインは、配列番号１０８～１１３のいずれかを含むアミノ酸配列を有する、ミトコンドリアｍＣＯＸ１ ＤＮＡに結合する右側ＴＡＬＥである。一部の形態では、１つのプログラマブルＤＮＡ結合ドメインは、配列番号９０～１０６のいずれかを含むアミノ酸配列を有する、ミトコンドリアｍＣＯＸ１ ＤＮＡに結合する左側ＴＡＬＥである。他の形態では、１つ以上のプログラマブルＤＮＡ結合ドメインは、配列番号９８を含むアミノ酸配列を有する、ｈ１２ ＤＮＡに結合するＴＡＬＥである。他の形態では、１つのプログラマブルＤＮＡ結合ドメインは、配列番号１１４を含むアミノ酸配列を有する、ＮＴ（Ｇ）Ｎ末端ドメインを有するＴＡＬＥである。一部の形態では、１つのプログラマブルＤＮＡ結合ドメインは、配列番号１１５を含むアミノ酸配列を有する、ＮＴ（ｂｎ）Ｎ末端ドメインを有するＴＡＬＥである。他の形態では、１つ以上のプログラマブルＤＮＡ結合ドメインは、配列番号９２～９４のいずれか１つを含むアミノ酸配列を有する、ミトコンドリアＮＤ６ ＤＮＡに結合するＴＡＬＥである。一部の形態では、１つのプログラマブルＤＮＡ結合ドメインは、配列番号９３～９４のいずれか１つを含むアミノ酸配列を有する、ミトコンドリアＮＤ６ ＤＮＡに結合する右側ＴＡＬＥである。一部の形態では、１つのプログラマブルＤＮＡ結合ドメインは、配列番号９２を含むアミノ酸配列を有する、ミトコンドリアｍＮＤ６ ＤＮＡに結合する左側ＴＡＬＥである。他の形態では、１つ以上のプログラマブルＤＮＡ結合ドメインは、配列番号９０～９１のいずれか１つを含むアミノ酸配列を有する、ミトコンドリアｈＮＤ ＤＮＡに結合するＴＡＬＥである。例えば、一部の形態では、１つのプログラマブルＤＮＡ結合ドメインは、配列番号９０を含むアミノ酸配列を有する、ミトコンドリアｈＮＤ ＤＮＡに結合する右側ＴＡＬＥである。一部の形態では、１つのプログラマブルＤＮＡ結合ドメインは、配列番号９１を含むアミノ酸配列を有する、ミトコンドリアｈＮＤ ＤＮＡに結合する左側ＴＡＬＥである。他の形態では、１つのプログラマブルＤＮＡ結合ドメインは、配列番号９７を含むアミノ酸配列を有する、ｈ１１ ＤＮＡに結合するＴＡＬＥである。プログラマブルＤＮＡ結合ドメインは、任意の所望の標的配列を標的とするように設計することができる。
一部の形態では、第１及び第２の部分の一方又は両方は、独立して、ジンクフィンガープログラマブルＤＮＡ結合ドメインを含む。例えば、一部の形態では、１つのプログラマブルＤＮＡ結合ドメインは、左側ジンクフィンガー及び右側ジンクフィンガーから選択されるジンクフィンガーである。例示的な形態では、１つのプログラマブルＤＮＡ結合ドメインは、配列番号８２～８９のいずれか１つを含むアミノ酸配列を有する、ミトコンドリアｍＣＯＸ１ ＤＮＡに結合するジンクフィンガーである。一部の形態では、１つのプログラマブルＤＮＡ結合ドメインは、配列番号８２～８６又は８７～８９のいずれか１つのアミノ酸配列を有する、ミトコンドリアｍＣＯＸ１ ＤＮＡに結合する右側ジンクフィンガーである。一部の形態では、１つのプログラマブルＤＮＡ結合ドメインは、配列番号８２～８６のいずれか１つを含むアミノ酸配列を有する、ミトコンドリアｍＣＯＸ１ ＤＮＡに結合する左側ジンクフィンガーである。他の形態では、１つのプログラマブルＤＮＡ結合ドメインは、配列番号７４～８１のいずれか１つを含むアミノ酸配列を有する、ｈＮＤ ＤＮＡに結合するジンクフィンガーである。例えば、一部の形態では、１つのプログラマブルＤＮＡ結合ドメインは、配列番号７８～８１のいずれか１つのアミノ酸配列を有する、ｈＮＤ ＤＮＡに結合する右側ジンクフィンガーである。一部の形態では、１つのプログラマブルＤＮＡ結合ドメインは、配列番号７４～７７のいずれか１つを含むアミノ酸配列を有する、ｈＮＤ ＤＮＡに結合する左側ジンクフィンガーである。
一部の形態では、第１及び第２の部分の一方又は両方は、独立して、ＢＡＴプログラマブルＤＮＡ結合ドメインを含む。例えば、一部の形態では、１つのプログラマブルＤＮＡ結合ドメインは、左側ＢＡＴ及び右側ＢＡＴからなる群から選択されるＢＡＴである。一部の形態では、１つのプログラマブルＤＮＡ結合ドメインは、配列番号１１８～１１９のいずれか１つを含むアミノ酸配列を有する、ｍＣＯＸ１ ＤＮＡに結合するＢＡＴである。一部の形態では、１つのプログラマブルＤＮＡ結合ドメインは、配列番号１１９のいずれか１つのアミノ酸配列を有する、ｍＣＯＸ１ ＤＮＡに結合する右側ＢＡＴである。一部の形態では、１つのプログラマブルＤＮＡ結合ドメインは、配列番号１１８のいずれか１つを含むアミノ酸配列を有する、ｍＣＯＸ１ ＤＮＡに結合する左側ＢＡＴである。一部の形態では、１つのプログラマブルＤＮＡ結合ドメインは、配列番号１２０～１２１のいずれか１つを含むアミノ酸配列を有する、ＮＤ６ ＤＮＡに結合するＢＡＴである。一部の形態では、１つのプログラマブルＤＮＡ結合ドメインは、配列番号１２１のいずれか１つのアミノ酸配列を有する、ｈＮＤ ＤＮＡに結合する右側ＢＡＴである。一部の形態では、１つのプログラマブルＤＮＡ結合ドメインは、配列番号１２０のいずれか１つを含むアミノ酸配列を有する、ｈＮＤ ＤＮＡに結合する左側ＢＡＴである。
例示的な形態では、標的化ＤＮＡエディターの第１の部分は、配列番号１２０のアミノ酸配列を含む第１のスプリットデアミナーゼドメインと、左側ＴＡＬＥプログラマブルＤＮＡ結合ドメインとを含み；それにより、第２の部分は、配列番号１５６、１５８、１６０又は１６４のいずれか１つのアミノ酸配列を含む第２のスプリットデアミナーゼドメインと、右側ＴＡＬＥプログラマブルＤＮＡ結合ドメインとを含む。
例示的な形態では、標的化ＤＮＡエディターの第１の部分は、配列番号１６９のアミノ酸配列を含む第１のスプリットデアミナーゼドメインと、左側ＴＡＬＥプログラマブルＤＮＡ結合ドメインとを含み；それにより、第２の部分は、配列番号１７３又は１７５のいずれか１つのアミノ酸配列を含む第２のスプリットデアミナーゼドメインと、右側ＴＡＬＥプログラマブルＤＮＡ結合ドメインとを含む。
例示的な形態では、標的化ＤＮＡエディターの第１の部分は、配列番号１７１のアミノ酸配列を含む第１のスプリットデアミナーゼドメインと、左側ＴＡＬＥプログラマブルＤＮＡ結合ドメインとを含み；それにより、第２の部分は、配列番号１７５のいずれか１つのアミノ酸配列を含む第２のスプリットデアミナーゼドメインと、右側ＴＡＬＥプログラマブルＤＮＡ結合ドメインとを含む。
例示的な形態では、標的化ＤＮＡエディターの第１の部分は、配列番号１６９のアミノ酸配列を含む第１のスプリットデアミナーゼドメインのアミノ酸配列を含む第１のスプリットデアミナーゼドメインと、左側ＢＡＴプログラマブルＤＮＡ結合ドメインとを含み；それにより、第２の部分は、配列番号１７３又は１７５のいずれか１つのアミノ酸配列を含む第２のスプリットデアミナーゼドメインと、右側ＴＡＬＥプログラマブルＤＮＡ結合ドメインとを含む。
例示的な形態では、標的化ＤＮＡエディターの第１の部分は、配列番号１６９のアミノ酸配列を含む第１のスプリットデアミナーゼドメインを含む第１のスプリットデアミナーゼドメインと、第１のコイルドコイルドメインと、任意選択で、左側ＴＡＬＥプログラマブルＤＮＡ結合ドメインとを含み、それにより、第２の部分は、（ｄ）配列番号１７３又は１７５のいずれか１つのアミノ酸配列を含む第２のスプリットデアミナーゼドメインと、第２のコイルドコイルドメインと、任意選択で、右側ＴＡＬＥプログラマブルＤＮＡ結合ドメインとを含み、それにより、第１及び第２のコイルドコイルドメインは、第１及び第２の部分の結合時に一緒に相互作用する。
一部の形態では、第１及び第２の部分は、ＴＡＬＥ、ＢＡＴ、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９、Ｃｆｐ１及びジンクフィンガーからなる群から独立して選択されるプログラマブルＤＮＡ結合ドメインをそれぞれ含む。一部の形態では、第１の部分は、ＴＡＬＥであり、及び第２の部分は、ＴＡＬＥであるか、又は第１の部分は、ＴＡＬＥであり、及び第２の部分は、ＢＡＴであるか、又は第１の部分は、ＴＡＬＥであり、及び第２の部分は、ジンクフィンガーであるか、又は第１の部分は、ＴＡＬＥであり、及び第２の部分は、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９であるか、又は第１の部分は、ＴＡＬＥであり、及び第２の部分は、Ｃｆｐ１であるか、又は第１の部分は、ＢＡＴであり、及び第２の部分は、ＴＡＬＥであるか、又は第１の部分は、ＢＡＴであり、及び第２の部分は、ＢＡＴであるか、又は第１の部分は、ＢＡＴであり、及び第２の部分は、ジンクフィンガーであるか、又は第１の部分は、ＢＡＴであり、及び第２の部分は、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９であるか、又は第１の部分は、ＢＡＴであり、及び第２の部分は、Ｃｆｐ１であるか、又は第１の部分は、ジンクフィンガーであり、及び第２の部分は、ＴＡＬＥであるか、又は第１の部分は、ジンクフィンガーであり、及び第２の部分は、ＢＡＴであるか、又は第１の部分は、ジンクフィンガーであり、及び第２の部分は、ジンクフィンガーであるか、又は第１の部分は、ジンクフィンガーであり、及び第２の部分は、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９であるか、又は第１の部分は、ジンクフィンガーであり、及び第２の部分は、Ｃｆｐ１であるか、又は第１の部分は、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９であり、及び第２の部分は、ＴＡＬＥであるか、又は第１の部分は、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９であり、及び第２の部分は、ＢＡＴであるか、又は第１の部分は、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９であり、及び第２の部分は、ジンクフィンガーであるか、又は第１の部分は、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９であり、及び第２の部分は、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９であるか、又は第１の部分は、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９であり、及び第２の部分は、Ｃｆｐ１であるか、又は第１の部分は、Ｃｆｐ１であり、及び第２の部分は、ＴＡＬＥであるか、又は第１の部分は、Ｃｆｐ１であり、及び第２の部分は、ＢＡＴであるか、又は第１の部分は、Ｃｆｐ１であり、及び第２の部分は、ジンクフィンガーであるか、又は第１の部分は、Ｃｆｐ１であり、及び第２の部分は、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９であるか、又は第１の部分は、Ｃｆｐ１であり、及び第２の部分は、Ｃｆｐ１である。
一部の形態では、標的化塩基エディターの第１及び第２の部分の一方又は両方は、少なくとも１つのリンカーを含む。一部の形態では、第１及び第２の部分の一方又は両方は、少なくとも１つのリンカーを含み、それにより、リンカーは、プログラマブルＤＮＡ結合ドメインとスプリットデアミナーゼドメインとの間に位置する。一部の形態では、第１及び第２の部分の両方は、プログラマブルＤＮＡ結合ドメインとスプリットデアミナーゼドメインとの間にリンカーを含む。例示的なリンカーは、２～２００アミノ酸長である。例えば、一部の形態では、リンカーは、２～１６アミノ酸長である。
特定の形態では、リンカーは、ＧＳ、ＧＳＧ、ＧＳＳ又は配列番号２３～２７若しくは３０のいずれかのアミノ酸配列を含む。リンカーは、従来技術で公知であるいずれかの形態のリジッド又はフレキシブルリンカーでもあり得る（例えば、下記ウェブサイトを参照されたい：ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｐｍｃ／ａｒｔｉｃｌｅｓ／ＰＭＣ３７２６５４０／）。
塩基エディターは、標的ＤＮＡ鎖上のプログラマブル結合ドメイン結合部位から所望の数の塩基対内に標的核酸を配置するように構成することができる。一部の形態では、塩基エディターは、標的核酸が標的ＤＮＡ鎖上のプログラマブル結合ドメイン結合部位から９～１１塩基対になるように構成される。一部の形態では、標的ＤＮＡ鎖上の２つのプログラマブル結合ドメインの２つの結合部位間の距離は、１２～２２塩基対である。他の形態では、標的ＤＮＡ鎖上の２つのプログラマブル結合ドメインの２つの結合部位間の距離は、１４～１９塩基対である。
典型的には、塩基エディターの第１及び第２の部分の少なくとも一方は、細胞ターゲティング部分を含む。一般に、第１及び第２の部分の両方は、細胞ターゲティング部分、例えば同じ細胞ターゲティング部分を含む。例示的な細胞ターゲティング部分としては、ミトコンドリアターゲティング配列（ＭＴＳ）及び核局在化配列（ＮＬＳ）がある。例示的なＮＬＳとしては、配列番号３４～３９のいずれか１つのアミノ酸配列を含む。例示的なＭＴＳは、配列番号２２、６９、７１、１８２又は１８３のいずれか１つのアミノ酸配列を含む。
一部の形態では、標的化塩基エディターの第１及び第２の部分の少なくとも一方は、塩基除去修復阻害剤を含む。一部の形態では、塩基除去修復阻害剤は、哺乳類の核又はミトコンドリアＤＮＡグリコシラーゼ阻害剤、例えばウラシルグリコシラーゼ阻害剤である。例示的な塩基除去修復阻害剤は、配列番号２１又は７０のいずれか１つを含むアミノ酸配列を有する。
開示されるデアミナーゼドメイン及び塩基エディターを使用する方法も提供される。一部の形態では、塩基エディターを用いて、標的核酸の塩基編集を行うことができる。例えば、標的核酸と標的化塩基エディターとを接触させるステップを含む方法が開示され、標的核酸は、二本鎖ＤＮＡであり、それにより、上記の標的ヌクレオチド配列の実体は、標的化塩基エディターによって脱アミノ化される。典型的には、標的ヌクレオチド配列中の脱アミノ化ヌクレオチドは、チミン又はグアニンヌクレオチドに変換される。この変換は、標的ヌクレオチド配列の塩基編集を完了させる。
本方法の一部の形態では、標的核酸は、ミトコンドリアＤＮＡである。ヌクレオチドが脱アミノ化され得る例示的な標的ヌクレオチド配列としては、限定されないが、ＡＣ、ＣＣ、ＧＣ及びＴＣが挙げられる。一部の形態では、標的ヌクレオチド配列の最後のＣは、標的化塩基エディターによって脱アミノ化される。一部の形態では、ミトコンドリアＤＮＡにおける標的ヌクレオチド配列の実体は、ミトコンドリアＤＮＡ配列中に含まれる。塩基編集は、標的ヌクレオチド配列の実体が例えば塩基エディター標的ＤＮＡ結合配列の１～２５塩基（両端の値を含む）である場合に達成され得る。一部の形態では、標的ヌクレオチド配列の実体が塩基エディター標的ＤＮＡ結合配列の１５～２０塩基（両端の値を含む）である場合、最適な塩基編集が達成される。一部の形態では、ＤＮＡ標的領域内の塩基編集の活性ウィンドウは、リンカードメインの長さ、剛性若しくは柔軟性を変更するか、又はＤＮＡ結合ドメインの特異性若しくはタイプを変更するか、又は塩基エディターの２つの部分の一方若しくは両方でのスプリットデアミナーゼドメインの一方若しくは両方における分割部位を変更するか、又はデアミナーゼのタイプを変更するか、又はＤＮＡ結合部位間の距離を変更することによって増減される。例えば、一部の形態では、ＤＮＡ標的領域内の塩基編集の活性ウィンドウは、塩基エディターの２つの部分の一方又は両方におけるリンカードメインの長さを増加させることによって拡張される。他の形態では、ＤＮＡ標的領域内の塩基編集の活性ウィンドウは、塩基エディターの２つの部分の一方又は両方におけるリンカードメインの長さを増加させることによって縮小される。一部の形態では、ＤＮＡ標的領域内の塩基編集の活性ウィンドウは、塩基エディターの２つの部分の一方又は両方におけるリンカードメインの長さを減少させることによって拡張される。他の形態では、ＤＮＡ標的領域内の塩基編集の活性ウィンドウは、塩基エディターの２つの部分の一方又は両方におけるリンカードメインの長さを減少させることによって縮小される。一部の形態では、ＤＮＡ標的領域内の塩基編集の活性ウィンドウは、塩基エディターの２つの部分の一方又は両方におけるＤＮＡ結合ドメインの特異性又はタイプを変更することによって拡張される。他の形態では、ＤＮＡ標的領域内の塩基編集の活性ウィンドウは、塩基エディターの２つの部分の一方又は両方におけるＤＮＡ結合ドメインの特異性又はタイプを変更することによって縮小される。
一部の形態では、ＤＮＡ標的領域内の塩基編集の活性ウィンドウは、塩基エディターの２つの部分の各々におけるスプリットデアミナーゼドメインの一方又は両方の分割部位を変更することによって拡張される。他の形態では、ＤＮＡ標的領域内の塩基編集の活性ウィンドウは、塩基エディターの２つの部分の各々におけるスプリットデアミナーゼドメインの一方又は両方の分割部位を変更することによって縮小される。
標的核酸は、細胞内にあり得る。このように、本方法の一部の形態では、標的核酸と標的化塩基エディターとを接触させるステップは、細胞内への標的化塩基エディターの進入を促進することによって達成される。一部の形態では、細胞は、動物内にある。従って、本方法の一部の形態では、標的核酸と標的化塩基エディターとを接触させるステップは、標的化塩基エディターを動物に投与することによって達成される。
酵素的方法により、標的核酸中の修飾された（例えば、メチル化された）ヌクレオチドを同定する方法も記載される。具体的には、１つ以上の標的核酸と、シチジンの異なる修飾に対して活性が異なる１つ以上のデアミナーゼドメインとを接触させるステップと、続いて、標的核酸を配列決定するステップとを含む方法が開示される。例えば、一部の形態では、１つ以上のデアミナーゼドメインは、１つ以上の未修飾シトシン（Ｃ）、メチル化シトシン（ｍＣ）若しくはｈｍＣ、ｆＣ及びｃａＣなどの酸化ｍＣ塩基又はそれらの組合せの１つ以上に対して集合的又は個別に活性である。従って、一部の形態では、本方法は、１つ以上の標的核酸と、１つ以上の未修飾（Ｃ）、メチル化（ｍＣ）又は酸化ｍＣ塩基（例えば、ｈｍＣ、ｆＣ及びｃａＣ）などのシチジンの様々な修飾に対して活性が異なる１つ以上のデアミナーゼドメインとを接触させるステップと、続いて、標的核酸を配列決定するステップとを含む。
好ましくは、標的核酸は、二本鎖シトシンメチル化ＤＮＡであり、デアミナーゼドメインは、二本鎖ＤＮＡを脱アミノ化することができる。シトシンメチル化ＤＮＡとは、１つ、数個、多数又はほとんどのシトシンがメチル化されたＤＮＡを指す。ゲノムＤＮＡなどの天然ＤＮＡは、メチル化されたシトシンの一部のみを有する。例示的な二本鎖シトシンメチル化ＤＮＡとしては、植物ゲノムＤＮＡ、動物ゲノムＤＮＡ及びヒトゲノムＤＮＡなどのゲノムＤＮＡがある。一部の形態では、デアミナーゼドメインは、実質的に標的核酸中の非メチル化シトシンヌクレオチドのみを脱アミノ化する。一部の形態では、標的核酸中の非メチル化シトシンヌクレオチドの実質的に全ては、デアミナーゼドメインによって脱アミノ化されるが、修飾シチジンは、改変されない（又は未修飾塩基よりもはるかに少ない程度に改変される）。好ましくは、デアミナーゼドメインは、標的核酸中の非メチル化シトシンヌクレオチドの９０％以上を脱アミノ化する。一部の形態では、デアミナーゼドメインは、標的核酸中の実質的に非メチル化シトシンヌクレオチドのみを集合的に脱アミノ化する。一部の形態では、標的核酸中の非メチル化シトシンヌクレオチドの実質的に全ては、デアミナーゼドメインによって集合的に脱アミノ化されるが、修飾シチジンは、改変されない（又は未修飾塩基よりもはるかに少ない程度に改変される）。好ましくは、デアミナーゼドメインは、標的核酸中の非メチル化シトシンヌクレオチドの９０％以上を集合的に脱アミノ化する。脱アミノ化された標的核酸を配列決定することにより、標的核酸中のメチル化シトシンヌクレオチドが同定される（即ち、これらは、デアミナーゼによって編集されないシチジンである）。
生細胞の内部又は外部いずれかの標的核酸のプールで配列多様性を生成する方法も提供される。例えば、本明細書に開示されるデアミナーゼを使用して、非標的化塩基編集によってＤＮＡ配列のプールにランダムな非標的化変異を導入することができる。例示的な方法は、標的核酸のデアミナーゼドメインと標的核酸の複数のコピーとを、標的核酸の１コピー当たり平均０．１～５．０ヌクレオチドの脱アミノ化をもたらす時間にわたって且つそのような条件下で接触させることを含む。好ましくは、標的核酸は、二本鎖ＤＮＡであり、デアミナーゼドメインは、二本鎖ＤＮＡを脱アミノ化することができる。
一部の形態では、標的核酸のコピーは、インビトロである。一部の形態では、標的核酸のコピー中の脱アミノ化ヌクレオチドは、インビトロ反応を介してチミン又はグアニンヌクレオチドに変換される。一部の形態では、この方法は、脱アミノ化ヌクレオチドを標準的な対応物に、例えばｄＵからｄＴ及びｄＩからｄＡに変換することをさらに含み、その後、限定されないが、ｍＲＮＡディスプレイ、リボソームディスプレイ又はＳＥＬＥＸなどの選択手順が続く。一部の形態では、変換は、ＰＣＲ増幅によって行われる。他の形態では、多様化されたＤＮＡは、インビボ選択及び指向性進化適用のための細胞に形質変換される。ＤＮＡ多様性生成のための方法は、とりわけ、多様化しようとする断片が、容易にＰＣＲ増幅できるサイズよりもはるかに大きい場合、ランダム化ＤＮＡを作製するためのエラープローンＰＣＲに代わる手段を提供する。
一部の形態では、標的核酸のコピー中の脱アミノ化ヌクレオチドがチミン又はグアニンヌクレオチドに変換されると、変換は、標的核酸のコピーの一部又は全ての１つ以上の塩基編集を完了する。一部の形態では、標的核酸のコピー中の脱アミノ化ヌクレオチドは、細胞内で標的核酸のコピーをインキュベートすることによってチミン又はグアニンヌクレオチドに変換される。例えば、標的核酸のコピーは、細胞内にあり得、細胞内へのデアミナーゼドメインの進入を促進することにより、デアミナーゼドメインと標的核酸のコピーとを接触させる。
対象の細胞中のミトコンドリアＤＮＡ内の１つ以上の核酸を編集することにより、対象のミトコンドリア遺伝病を治療又は予防する方法も記載される。一部の形態では、この方法は、デアミナーゼドメインと、標的ヌクレオチド（又は標的ヌクレオチド近傍の配列）と相互作用するＤＮＡ相互作用ドメインとを含む標的化シトシンデアミナーゼ塩基エディターを細胞に導入し、ミトコンドリアＤＮＡ中の標的核酸は、標的化塩基エディターによって脱アミノ化される。一部の形態では、ＤＮＡ相互作用ドメインは、その標的部位と相互作用するＤＮＡ結合ドメイン又は転写因子、即ちプロモーター又は複製起点と相互作用し、且つｄｓＤＮＡ上の特定の領域に沿ってデアミナーゼを運搬するＲＮＡ又はＤＮＡポリメラーゼである。一部の形態では、標的ヌクレオチド配列中の脱アミノ化ヌクレオチドは、チミン又はグアニンヌクレオチドに変換される。典型的には、これらの方法は、ミトコンドリアＤＮＡを非病原性形態に編集する。一部の形態では、脱アミノ化ヌクレオチドは、ｍ．５８３Ｇ＞Ａ、ｍ．６１６Ｔ＞Ｃ、ｍ．１６０６Ｇ＞Ａ、ｍ．１６４４Ｇ＞Ａ、ｍ．３２５８Ｔ＞Ｃ、ｍ．３２７１Ｔ＞Ｃ、ｍ．３４６０Ｇ＞Ａ、ｍ．４２９８Ｇ＞Ａ、ｍ．５７２８Ｔ＞Ｃ、ｍ．５６５０Ｇ＞Ａ、ｍ．３２４３Ａ＞Ｇ、ｍ．８３４４Ａ＞Ｇ、ｍ．１４４５９Ｇ＞Ａ、ｍ．１１７７８Ｇ＞Ａ、ｍ．１４４８４Ｔ＞Ｃ、ｍ．８９９３Ｔ＞Ｃ、ｍ．１４４８４Ｔ＞Ｃ、ｍ．３４６０Ｇ＞Ａ及びｍ．１５５５Ａ＞Ｇから選択される位置にある。一部の形態では、細胞は、線維芽細胞、リンパ球、膵臓細胞、筋細胞、神経細胞及び幹細胞からなる群から選択される。
一部の形態では、細胞は、動物内にあり、デアミナーゼドメインと標的核酸のコピーとを接触させるステップは、デアミナーゼドメインを動物に投与することによって達成される。一部の形態では、標的核酸のコピーが細胞内にある場合、デアミナーゼドメインは、細胞内のトランスジェニック発現構築物（例えば、発現ベクター）によってコードされ得る。このような形態では、デアミナーゼドメインと標的核酸のコピーとを接触させるステップは、スタンドアローン型酵素或いはＤＮＡ結合ドメイン、転写因子又はＤＮＡ若しくはＲＮＡポリメラーゼ（例えば、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼなど）などの他のタンパク質ドメインとの融合としてデアミナーゼドメインを細胞内で一過性発現させることによって達成される。
標的化塩基エディターを含むか又は発現するベクターも提供される。例示的なベクターとして、改変アデノウイルス（ＡＡＶ）ベクター又はレンチウイルスベクターが挙げられる。一部の形態では、標的化塩基エディターは、ベクター内にカプセル化される。一部の形態では、デアミナーゼドメインは、ベクター内に標的化塩基エディターを含む。
開示される方法のさらなる利点は、以下の説明に一部が記載され、説明から部分的に理解されるか、又は開示される方法及び組成物の実施によって知ることができる。開示される方法及び組成物の利点は、添付の特許請求の範囲で特に指摘される要素及び組合せによって実現及び達成されるであろう。以上の概要及び以下の詳細な説明の両方が例示的且つ説明的なものにすぎず、特許請求される本発明を限定するものではないことを理解されたい。
添付の図面は、開示される方法及び組成物のいくつかの実施形態を示し、この説明と共に開示の方法及び組成物の原理を説明するのに役立つ。
図１は、推定デアミナーゼドメインを生成して、実験的に評価及び特性評価し、二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）に対して活性のデアミナーゼを同定し、それらの編集コンテキスト特異性を決定するための段階的システムの概略図であり；ｐｆａｍデータベースにおけるシチジンデアミナーゼ様（ＣＤＡ）スーパーファミリーの各デアミナーゼタンパク質ファミリーからの複数のドメインは、無細胞インビトロ転写／翻訳（上から下に、ＤＮＡ配列は、ＡＴＣＣＧＡＴＣＡＧＡＧＣＴ（配列番号２８７）、５’－ＡＴＴＴＧＡＴＴＡＧＡＧＴＴ－３’（配列番号２８９）及び３’－ＴＡＧＧＣＴＡＧＴＴＴＴＧＡ－５’（配列番号２９０）を含む）によって合成及び発現され、次にｓｓＤＮＡ及びｄｓＤＮＡ基質を用いるアッセイにより特性決定して、次世代シーケンシング（ＮＧＳ）技術を用いて鎖バイアス及び配列特異性を決定する。これらは、例示的な配列にすぎない。脱アミノ化アッセイに用いた実際の基質についての配列を図２に示す。ＮＧＳアッセイに使用される実際の基質は、配列番号７３：ＴＡＡＴＡＡＴＴＡＴＡＴＴＡＴＴＡＴＴＴＴＡＡＡＴＴＡＡＴＴＡＴＴＴＡＡＣＣＧＴＧＧＴＧＣＧＣＧＧＧＧＴＣＧＣＣＣＡＧＣＡＡＴＡＧＴＡＴＡＧＧＴＴＧＴＣＧＡＧＴＡＴＧＡＡＧＧＧＴＣＴＡＡＡＡＧＡＴＴＴＴＡＡＧＡＣＡＣＣＴＴＡＣＧＧＡＣＧＡＡＧＡＧＴＴＴＣＴＣＴＣＴＴＡＧＴＣＣＣＣＴＧＡＴＣＴＧＣＡＧＡＡＣＣＣＡＧＧＡＴＡＴＣＡＡＧＣＡＣＡＴＴＴＣＡＣＴＴＣＡＣＧＴＧＴＴＴＴＧＡＴＧＡＡＡＣＴＡＴＡＣＡＴＣＡＣＣＣＧＣＧＣＣＡＣＡＧＧＣＧＣＴＧＴＧＣＧＧＴＴＴＡＴＡＡＴＡＴＡＴＴＡＴＡＡＴＴＴＡＴＡＴＴＴＡＴＡＴＴＡＡＡＴＴ（配列番号７３）である。 図２Ａ～２Ｃは、脱アミノ化アッセイにおける二本鎖（図２Ａ、２Ｂ）又は一本鎖（図２Ｃ）ＦＡＭ標識ＤＮＡ基質に対するデアミナーゼドメインの活性を示すゲル電気泳動画像である。 図２Ａ～２Ｃは、脱アミノ化アッセイにおける二本鎖（図２Ａ、２Ｂ）又は一本鎖（図２Ｃ）ＦＡＭ標識ＤＮＡ基質に対するデアミナーゼドメインの活性を示すゲル電気泳動画像である。 図２Ｄは、それぞれデアミナーゼドメインＢＥ＿Ｒ１＿１１、ＢＥ＿Ｒ１＿１２、ＢＥ＿Ｒ１＿２８及びＢＥ＿Ｒ１＿４１の各々のそれぞれ非存在（－）又は存在（＋）下で二本鎖ＤＮＡ基質に対する表示デアミナーゼドメインの活性を示すゲル電気泳動画像であり、レーン１～６の各々は、以下の配列：（１）Ａ［１５］ＴＧＣＧＣＣＡ［１５］（配列番号２６８）、（２）Ａ［１５］ＡＣＡ［１５］（配列番号２６９）、（３）Ａ［１５］ＣＣＡ［１５］（配列番号２７０）、（４）Ａ［１５］ＧＣＡ［１５］（配列番号２７１）、（５）Ａ［１５］ＴＣＡ［１５］（配列番号２７２）、（６）Ａ［１５］ＡＣＧＣＣＴＣＡ［１５］（配列番号２７３）（ｓｓＤＮＡ基質配列）を含む。二本鎖ＤＮＡ基質の場合、相補鎖は、所与の基質にアニーリングされた。 図３Ａ～３Ｂは、ＤＮＡ脱アミノ化アッセイについてのＮＧＳ（図３Ａ）及びサンガー（Ｓａｎｇｅｒ）シーケンシング（図３Ｂ；上から下に、配列：ＡＴＧＡＡＴＣＧＧＣＣＡＡＣＧＣＧＣＧＧＧＧＡＧＡＧＧＣＧＧＴＴＴＧＣＧＴＡＴＴＧＧＧＣＧＣＣＡＧＧＧＴＧＧＴＴＴ（配列番号２９）、及びＡＴＧＡＡＴＣＧＧＴＣＡＡＴＧＣＧＴＧＧＧＧＡＧＡＧＧＴＧＧＴＴＴＧＴＧＴＡＴＴＧＧＧＴＧＣＣＡＧＧＧＴＧＧＴＴＴ（配列番号２９２）に対するデアミナーゼ活性を示す）結果を示す画像である。これらの図は、ｄｓＤＮＡに対するｄｓＣＤＡ処理の結果を示すデータの一部の例を明らかにする。 図３Ａ～３Ｂは、ＤＮＡ脱アミノ化アッセイについてのＮＧＳ（図３Ａ）及びサンガー（Ｓａｎｇｅｒ）シーケンシング（図３Ｂ；上から下に、配列：ＡＴＧＡＡＴＣＧＧＣＣＡＡＣＧＣＧＣＧＧＧＧＡＧＡＧＧＣＧＧＴＴＴＧＣＧＴＡＴＴＧＧＧＣＧＣＣＡＧＧＧＴＧＧＴＴＴ（配列番号２９）、及びＡＴＧＡＡＴＣＧＧＴＣＡＡＴＧＣＧＴＧＧＧＧＡＧＡＧＧＴＧＧＴＴＴＧＴＧＴＡＴＴＧＧＧＴＧＣＣＡＧＧＧＴＧＧＴＴＴ（配列番号２９２）に対するデアミナーゼ活性を示す）結果を示す画像である。これらの図は、ｄｓＤＮＡに対するｄｓＣＤＡ処理の結果を示すデータの一部の例を明らかにする。 図４Ａ～４Ｂは、それぞれ編集閾値レベル５０％（図４Ａ）及び２５％（図４Ｂ）での編集効率に基づく表示デアミナーゼと一緒にインキュベートされたｄｓＤＮＡ基質中の変異シトシンにフランキングする領域の確率シーケンスロゴである。図４Ａは、（上の列）いかなるコンテキストでもシチジンを編集することができるコンテキスト非依存性デアミナーゼ（混合型特異性を有する）（ＮＣＮ）の例と、（下２列）シチジンの前にある特定の配列に対して特異的である識別コンテキスト依存性デアミナーゼの例とを示す。 図５は、単独であるか又は結合されたかのいずれかのスプリットデアミナーゼのデアミナーゼ活性を示す。ＤＮＡ基質に対するＢＥ１１、ＢＥ１２及びＢＥ２８デアミナーゼドメインの様々なＮ及びＣ末端半分の活性は、それぞれデアミナーゼの各種について、対照並びにｒＮ末端断片（Ｎ１、Ｎ２、Ｎ３、Ｎ４、Ｎ５）及び５つのＣ末端断片（Ｃ１、Ｃ２、Ｃ３、Ｃ４、Ｃ５）の各々を単独及び組み合わせて比較するゲル電気泳動画像により示し；塩基エディターのＮ及びＣ末端部分の図は、試験した塩基エディター内のＮ又はＣ末端デアミナーゼ（Ｄｅａｍ＿Ｎ／Ｄｅａｍ＿Ｃ）の相対立体配置を示す。 図６は、ｄｓＤＮＡに対して活性又は不活性であるＭａｆＢ１９－ｄｅａｍファミリーのメンバーの配列アラインメントロゴを、このデアミナーゼファミリーのｄｓＤＮＡ特異的メンバーに存在するシグネチャモチーフと一緒に示し、このモチーフは、上記のファミリーの追加のｄｓＤＮＡ特異的デアミナーゼを同定するためのシグネチャとして使用することができる。 図７は、ＭａｆＢ１９－ｄｅａｍファミリー内の明瞭な枝を示し、そこに、上記のファミリーの同定されたｄｓＤＮＡ特異的デアミナーゼのほとんどが位置する。 図８は、ｄｓＤＮＡに対して活性又は不活性であるＳＣＰ１２０１－ｄｅａｍファミリーのメンバーの配列アラインメントロゴを、このデアミナーゼファミリーのｄｓＤＮＡ特異的メンバーに存在するシグネチャモチーフと一緒に示し、このモチーフは、上記のファミリーの追加のｄｓＤＮＡ特異的デアミナーゼを同定するためのシグネチャとして使用することができる。 図９は、塩基エディターの迅速な試験のためのインビトロシステムの概略図である。塩基エディターは、デザイナーＴＡＬＥの下流にあるデアミナーゼドメインをクローニングすることによって作製される。カセット全体をＴ７プロモーターの下流にクローニングし、インビトロ翻訳（ＩＶＴ）反応のテンプレートとして使用する。標的（目的のＤＮＡ結合ドメイン、例えば、デザイナーＴＡＬＥの結合部位をコードする）をプラスミド上にクローニングし、次にこれをＩＶＴ反応におけるｄｓＤＮＡ基質として使用した。ＩＶＴシステム中に発現させると、塩基エディタータンパク質（例えば、ＴＡＬＥ－デアミナーゼ融合タンパク質）が基質プラスミド上のその標的に結合し、標的プラスミドに編集を導入する。次に、基質プラスミドをＰＣＲ増幅し、編集の位置／頻度をシーケンシング又はＴ７エンドヌクレアーゼアッセイのいずれかによって決定する。 図１０Ａ～１０Ｃは、それぞれＢＥＲ１＿１１、ＢＥ＿Ｒ１＿１２、ＢＥ＿Ｒ１＿２８又はＢＥ＿Ｒ１＿４１と一緒インキュベートされた、様々なｄｓＤＮＡ基質ＡＣＡＣＡＣＡＣＡＣＡＣＡＣＡＣ（配列番号１９１）（図１０Ａ）、ＡＣＧＴＧＴＡＣＡＣＧＴＡＣＧＴ（配列番号１９２）、ＧＣＧＣＧＣＧＣＧＣＧＣＧＣＧＣＧ（配列番号（配列番号１９４）（図１０Ｂ）又はＴＣＧＡＧＡＴＣＴＣＧＡＴＣＧＡ（配列番号１９５）、ＴＣＴＣＴＣＴＣＴＣＴＣＴＣＴＣ（配列番号１９６）及びＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣ（配列番号１９７）（図１０Ｃ）において標的化シトシンにフランキングする領域のＮＧＳシーケンシングから得られた確率シーケンスロゴ結果である。 図１０Ａ～１０Ｃは、それぞれＢＥＲ１＿１１、ＢＥ＿Ｒ１＿１２、ＢＥ＿Ｒ１＿２８又はＢＥ＿Ｒ１＿４１と一緒インキュベートされた、様々なｄｓＤＮＡ基質ＡＣＡＣＡＣＡＣＡＣＡＣＡＣＡＣ（配列番号１９１）（図１０Ａ）、ＡＣＧＴＧＴＡＣＡＣＧＴＡＣＧＴ（配列番号１９２）、ＧＣＧＣＧＣＧＣＧＣＧＣＧＣＧＣＧ（配列番号（配列番号１９４）（図１０Ｂ）又はＴＣＧＡＧＡＴＣＴＣＧＡＴＣＧＡ（配列番号１９５）、ＴＣＴＣＴＣＴＣＴＣＴＣＴＣＴＣ（配列番号１９６）及びＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣ（配列番号１９７）（図１０Ｃ）において標的化シトシンにフランキングする領域のＮＧＳシーケンシングから得られた確率シーケンスロゴ結果である。 図１１Ａ～１１Ｂは、（図１１Ａ）図９のスキームの修飾に基づいて、デザイナーＴＡＬＥ（ＴＡＬＥ＿左及びＴＡＬＥ＿右と呼ばれる）の下流にデアミナーゼ分割ドメインをクローニングするためのインビトロシステムの概略を示す図であり；（図１１Ｂ）ＢＥ＿Ｒ１＿１２に基づく異なるスプリット塩基エディター設計戦略であり、以下を示す：ＢＥ＿Ｒ１＿１２（ｗｔ）、不活性な「不活性型」タンパク質における変異活性部位配列（ＨＡＥからＨＡＡ）並びに３つの異なる短縮型タンパク質２０、４０及び６０。ＴＡＬＥ左（Ｌ）及び右（Ｒ）ドメインの付加を含むドメイン構成、さらに結果として得られる結合した機能性塩基エディターも示され、これは、ＴＡＬＥ Ｌ及びＲ結合ドメインを用いて標的ＤＮＡで共局在する。 図１１Ａ～１１Ｂは、（図１１Ａ）図９のスキームの修飾に基づいて、デザイナーＴＡＬＥ（ＴＡＬＥ＿左及びＴＡＬＥ＿右と呼ばれる）の下流にデアミナーゼ分割ドメインをクローニングするためのインビトロシステムの概略を示す図であり；（図１１Ｂ）ＢＥ＿Ｒ１＿１２に基づく異なるスプリット塩基エディター設計戦略であり、以下を示す：ＢＥ＿Ｒ１＿１２（ｗｔ）、不活性な「不活性型」タンパク質における変異活性部位配列（ＨＡＥからＨＡＡ）並びに３つの異なる短縮型タンパク質２０、４０及び６０。ＴＡＬＥ左（Ｌ）及び右（Ｒ）ドメインの付加を含むドメイン構成、さらに結果として得られる結合した機能性塩基エディターも示され、これは、ＴＡＬＥ Ｌ及びＲ結合ドメインを用いて標的ＤＮＡで共局在する。 図１２は、ＴＡＬＥ＿Ｒのみ（対照）並びにそれぞれＴＡＬＥ＿Ｌのみ（対照）又はＴＡＬＥ＿Ｌ及び不活性な「不活性型」ＢＥ＿Ｒ１＿１２タンパク質における変異活性部位配列（ＨＡＥからＨＡＡ）と組み合わせた、ＴＡＬＥ＿Ｒ＿ＢＥ＿Ｒ１＿１２（短縮型２０、４０又は６０）を含む図１１に記載した異なる塩基エディター設計の各々について、標的（ポリシトシン）ＤＮＡ基質に対する塩基エディターデアミナーゼ活性の結果を示す図である。編集済塩基（ＣからＴ）は、各構築物ペアについて示されるシーケンシングデータ、それぞれＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣ（配列番号１９７）、ＣＣＣＣＣＣＣＴＴＴＴＴＴＣＣＣ（配列番号１９８）、ＣＣＣＣＣＣＴＴＴＴＴＴＴＣＣＣ（配列番号１９９）に表示される。部分的編集は、サンガークロマトグラムで混合型ピークとして示される。このような場合、ベースコーリングソフトウェアは、コンセンサス塩基として主要ピークを要求するが、実際には、その位置は、塩基の混合物を含む。 図１３は、多様な異なる標的ＤＮＡ基質：ＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣ（配列番号１９７）、ＡＣＡＣＡＣＡＣＡＣＡＣＡＣＡＣ（配列番号１９１）、ＡＣＧＴＡＣＧＴＡＣＧＴＡＣＧＴ（配列番号２００）、ＣＣＧＧＣＣＧＧＣＣＧＧＣＣＧＧ（配列番号２０１）及びＧＣＧＣＧＣＧＣＧＣＧＣＧＣＧＣ（配列番号２０２）、ＣＴＣＴＣＴＣＴＣＴＣＴＣＴＣＴ（配列番号２０３）又はＴＣＧＡＴＣＧＡＴＣＧＡＴＣＧＡ（配列番号２０４）に対する塩基エディターデアミナーゼ活性の結果並びにＴＡＬＥ＿Ｌと組み合わせた塩基エディターＴＡＬＥ＿Ｒ＿ＢＥ＿Ｒ１＿１２（短縮型３０）及び不活性な「不活性型」ＢＥ＿Ｒ１＿１２タンパク質における変異活性部位配列（ＨＡＥからＨＡＡ）の配列コンテキストを示す図である。編集済塩基（ＣからＴ）は、各基質について示されるシーケンシングデータに表示され、ＣＣＣＣＣＣＣＴＴＴＴＴＴＣＣＣ（配列番号２０５）、ＡＣＡＣＡＣＡＣＡＴＡＣＡＣＡＣ（配列番号１９１）、ＡＣＧＴＧＴＡＴＡＴＧＴＡＣＧＴ（配列番号１９２）、ＡＣＧＴＧＴＡＴＡＴＧＴＡＣＧＴ（配列番号２０６）、ＧＣＧＣＧＣＧＣＧＴＧＣＧＣＧＣ（配列番号２０７）、ＴＣＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＣＴＣ（配列番号２０８）、ＴＣＧＡＧＡＴＣＴＣＧＡＴＣＧＡ（配列番号１９５）又はＴＣＧＡＧＡＴＣＴＴＧＡＴＣＧＡ（配列番号２０９）をそれぞれ含む。部分的編集は、サンガークロマトグラムの混合型ピークとして示される。このような場合、ベースコーリングソフトウェアは、コンセンサス塩基として主要ピークを要求するが、実際には、その位置は、塩基の混合物を含む。 図１４は、塩基エディターの活性の編集ウィンドウを識別して、最適化する実験を示す図である。この図は、設計戦略並びにＴＡＬＥ Ｌ及びＲ結合ドメインを用いて標的ＤＮＡで共局在化する、結合された機能性塩基エディター並びに位置Ｇ４３又はＧ１０８（ＨＶＥ結合部位の両側に位置する）でｗｔ ＢＥ＿Ｒ１＿４１を分割し、次いでデアミナーゼドメイン全体を４つの方法の各々で再結合することによって得られる４つの異なる切断変異体を含む、ＢＥ＿Ｒ１＿４１に基づく４つの異なる塩基エディターの各々について、標的（ポリシトシン）ＤＮＡ基質ＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣ（配列番号１９７）に対する塩基エディターデアミナーゼ活性の結果を示す。編集済塩基（ＣからＴ）は、各基質について示されるシーケンシングデータに表示され、ＣＣＣＣＣＣＴＴＴＴＴＴＣＣＣＣ（配列番号２１０）、ＣＣＣＣＣＣＴＴＴＴＴＴＴＣＣＣ（配列番号１９９）、ＣＣＣＣＣＣＣＴＴＴＴＴＴＴＴＣ（配列番号２１１）をそれぞれ含む。対応する活性の位置ウィンドウが描かれ、各設計について定量化される。 図１５は、ＴＡＬＥ Ｌ及びＲドメインを用いて、２つの活性部位を有するＧ１０８（Ｎ）及びＧ４３（Ｃ）で切断されたＢＥ＿Ｒ１＿４１を再結合することにより形成された塩基エディター並びにＴＡＬＥ Ｌ及びＲドメインを用いて、１つの活性部位を有するＧ１０８（Ｎ）及びＧ１０８（Ｃ）で切断されたＢＥ＿Ｒ１＿４１を再結合して形成することにより形成された塩基エディターについて、それぞれ様々な異なる標的ＤＮＡ基質：ＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣ（配列番号１９７）、ＡＣＡＣＡＣＡＣＡＣＡＣＡＣＡＣ（配列番号１９１）、ＡＣＧＴＡＣＧＴＡＣＧＴＡＣＧＴ（配列番号２００）、ＣＣＧＧＣＣＧＧＣＣＧＧＣＣＧＧ（配列番号２０１）及びＧＣＧＣＧＣＧＣＧＣＧＣＧＣＧＣ（配列番号２０２）、ＴＣＴＣＴＣＴＣＴＣＴＣＴＣＴＣ（配列番号１９６）、ＧＡＧＡＧＡＧＡＧＡＧＡＧＡＧＡ（配列番号２１２）又はＴＣＧＡＴＣＧＡＴＣＧＡＴＣＧＡ（配列番号２０４）に対する塩基エディターデアミナーゼ活性の結果を示す図である。編集済塩基（ＣからＴ）は、各基質について示されるシーケンシングデータに表示され、ＣＣＣＣＣＣＣＴＴＴＴＴＣＣＣＣ（配列番号２１３）、ＣＣＣＣＣＣＣＣＣＴＴＴＴＣＣ（配列番号２１４）、ＡＣＡＣＡＣＡＣＡＴＡＣＡＣＡ（配列番号２１５）、ＡＣＧＴＧＴＡＴＡＴＧＴＡＣＧＴ（配列番号２０６）、ＣＣＧＧＣＣＧＧＴＴＧＧＣＣＧＧ（配列番号２１６）、ＴＣＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＣＴＣ（配列番号２１７）、ＴＣＴＣＴＣＴＣＴＴＴＣＴＣＴＣ（配列番号２１８）、ＧＡＧＡＡＡＡＡＡＡＡＡＧＡＧＡ（配列番号２１９）若しくはＴＣＧＡＧＡＴＣＴＴＧＡＴＣＧＡ（配列番号２０９）又はＴＣＧＡＧＡＴＴＴＴＧＡＴＣＧＡ（配列番号２２０）をそれぞれ含む。 図１６Ａ～１６Ｃは、陰性対照（エディターなし）並びにＴＡＬＥ Ｌ及びＲドメインを用いて、２つの活性部位を有するＧ１０８（Ｎ）及びＧ４３（Ｃ）で切断されたＢＥ＿Ｒ１＿４１を再結合することにより形成された塩基エディター、さらにＴＡＬＥ Ｌ及びＲドメインを用いて、１つの活性部位を有するＧ１０８（Ｎ）及びＧ１０８（Ｃ）で切断されたＢＥ＿Ｒ１＿４１を再結合して形成することにより形成された塩基エディターの各々について、それぞれ以下の３つ：ＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣ（配列番号１９７）、ＡＣＧＴＡＣＧＴＡＣＧＴＡＣＧＴ（配列番号２００）、ＴＣＴＣＴＣＴＣＴＣＴＣＴＣＴＣ（配列番号１９６）（図１６Ａ）及び以下の２つ：ＧＡＧＡＧＡＧＡＧＡＧＡＧＡＧＡ（配列番号２１２）、ＴＣＧＡＴＣＧＡＴＣＧＡＴＣＧＡ（配列番号２０４）（図１６Ｂ）並びに以下の３つ：ＣＣＧＧＣＣＧＧＣＣＧＧＣＣＧＧ（配列番号２０１）、ＡＣＡＣＡＣＡＣＡＴＡＣＡＣＡＣ（配列番号１９１）又はＧＣＧＣＧＣＧＣＧＣＧＣＧＣＧＣ（配列番号２０２）（図１６Ｃ）の異なるＤＮＡ基質の各々に対する塩基エディターデアミナーゼ活性の結果を示す図である。各基質についてそれぞれ示されるシーケンシングデータに編集済塩基（ＣからＴ）が表示される。対応する活性の位置ウィンドウが描かれ、各設計について定量化される。 図１６Ａ～１６Ｃは、陰性対照（エディターなし）並びにＴＡＬＥ Ｌ及びＲドメインを用いて、２つの活性部位を有するＧ１０８（Ｎ）及びＧ４３（Ｃ）で切断されたＢＥ＿Ｒ１＿４１を再結合することにより形成された塩基エディター、さらにＴＡＬＥ Ｌ及びＲドメインを用いて、１つの活性部位を有するＧ１０８（Ｎ）及びＧ１０８（Ｃ）で切断されたＢＥ＿Ｒ１＿４１を再結合して形成することにより形成された塩基エディターの各々について、それぞれ以下の３つ：ＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣ（配列番号１９７）、ＡＣＧＴＡＣＧＴＡＣＧＴＡＣＧＴ（配列番号２００）、ＴＣＴＣＴＣＴＣＴＣＴＣＴＣＴＣ（配列番号１９６）（図１６Ａ）及び以下の２つ：ＧＡＧＡＧＡＧＡＧＡＧＡＧＡＧＡ（配列番号２１２）、ＴＣＧＡＴＣＧＡＴＣＧＡＴＣＧＡ（配列番号２０４）（図１６Ｂ）並びに以下の３つ：ＣＣＧＧＣＣＧＧＣＣＧＧＣＣＧＧ（配列番号２０１）、ＡＣＡＣＡＣＡＣＡＴＡＣＡＣＡＣ（配列番号１９１）又はＧＣＧＣＧＣＧＣＧＣＧＣＧＣＧＣ（配列番号２０２）（図１６Ｃ）の異なるＤＮＡ基質の各々に対する塩基エディターデアミナーゼ活性の結果を示す図である。各基質についてそれぞれ示されるシーケンシングデータに編集済塩基（ＣからＴ）が表示される。対応する活性の位置ウィンドウが描かれ、各設計について定量化される。 図１６Ａ～１６Ｃは、陰性対照（エディターなし）並びにＴＡＬＥ Ｌ及びＲドメインを用いて、２つの活性部位を有するＧ１０８（Ｎ）及びＧ４３（Ｃ）で切断されたＢＥ＿Ｒ１＿４１を再結合することにより形成された塩基エディター、さらにＴＡＬＥ Ｌ及びＲドメインを用いて、１つの活性部位を有するＧ１０８（Ｎ）及びＧ１０８（Ｃ）で切断されたＢＥ＿Ｒ１＿４１を再結合して形成することにより形成された塩基エディターの各々について、それぞれ以下の３つ：ＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣ（配列番号１９７）、ＡＣＧＴＡＣＧＴＡＣＧＴＡＣＧＴ（配列番号２００）、ＴＣＴＣＴＣＴＣＴＣＴＣＴＣＴＣ（配列番号１９６）（図１６Ａ）及び以下の２つ：ＧＡＧＡＧＡＧＡＧＡＧＡＧＡＧＡ（配列番号２１２）、ＴＣＧＡＴＣＧＡＴＣＧＡＴＣＧＡ（配列番号２０４）（図１６Ｂ）並びに以下の３つ：ＣＣＧＧＣＣＧＧＣＣＧＧＣＣＧＧ（配列番号２０１）、ＡＣＡＣＡＣＡＣＡＴＡＣＡＣＡＣ（配列番号１９１）又はＧＣＧＣＧＣＧＣＧＣＧＣＧＣＧＣ（配列番号２０２）（図１６Ｃ）の異なるＤＮＡ基質の各々に対する塩基エディターデアミナーゼ活性の結果を示す図である。各基質についてそれぞれ示されるシーケンシングデータに編集済塩基（ＣからＴ）が表示される。対応する活性の位置ウィンドウが描かれ、各設計について定量化される。 図１７Ａ～１７Ｂは、標的領域上の正鎖及び逆鎖に対するスプリットデアミナーゼ塩基エディター及び活性ウィンドウの位置の予測モデル（図１７Ａ）並びにそのモデルを確認するデータ（図１７Ｂ）を示す。図１７Ｂは、Ｇ１０８（Ｎ）及びＧ１０８（Ｃ）で切断されたＢＥ＿Ｒ１＿４１を再結合することにより形成された塩基エディターのデアミナーゼ分割半分（１つの活性部位を有する）をＴＡＬＥ Ｌ及びＲ結合ドメインと交換して、ポリＣ又はポリＧ ＤＮＡ基質：ＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣ（配列番号１９７）及びＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧ（配列番号２２１）に対する編集効率及び活性ウィンドウの位置を評価するアッセイの結果を示す図である。編集済塩基（ＣからＴ又はＧからＡ）は、各基質について示されるシーケンシングデータに表示され、ＣＣＣＣＣＣＣＣＴＴＴＴＴＴＴＣ（配列番号１９７）、ＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣＴＣＣ（配列番号２２２）及びＧＧＡＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧ（配列番号２２３）をそれぞれ含む。 図１７Ａ～１７Ｂは、標的領域上の正鎖及び逆鎖に対するスプリットデアミナーゼ塩基エディター及び活性ウィンドウの位置の予測モデル（図１７Ａ）並びにそのモデルを確認するデータ（図１７Ｂ）を示す。図１７Ｂは、Ｇ１０８（Ｎ）及びＧ１０８（Ｃ）で切断されたＢＥ＿Ｒ１＿４１を再結合することにより形成された塩基エディターのデアミナーゼ分割半分（１つの活性部位を有する）をＴＡＬＥ Ｌ及びＲ結合ドメインと交換して、ポリＣ又はポリＧ ＤＮＡ基質：ＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣ（配列番号１９７）及びＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧ（配列番号２２１）に対する編集効率及び活性ウィンドウの位置を評価するアッセイの結果を示す図である。編集済塩基（ＣからＴ又はＧからＡ）は、各基質について示されるシーケンシングデータに表示され、ＣＣＣＣＣＣＣＣＴＴＴＴＴＴＴＣ（配列番号１９７）、ＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣＴＣＣ（配列番号２２２）及びＧＧＡＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧ（配列番号２２３）をそれぞれ含む。 図１８は、ＴＡＬＥ Ｌ及びＲドメインを用いて、２つの活性部位を有するＧ１０８（Ｎ）及びＧ４３（Ｃ）で切断されたＢＥ＿Ｒ１＿４１を再結合することにより形成される塩基エディター並びにＴＡＬＥ Ｌドメイン及びＲドメインを用いて、１つの活性部位を有するＧ１０８（Ｎ）及びＧ１０８（Ｃ）で切断されたＢＥ＿Ｒ１＿４１を再結合することにより形成される塩基エディターについて、標的ＤＮＡ基質に対する推定塩基エディター活性ウィンドウを示す図であり、上記のＴＡＬＥ Ｌドメイン及びＲドメインは、それぞれＤＮＡ配列ＴＣＴＡＧＣＣＴＡＧＣＣＧＴＴＴＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＡＧＧＧＴＧＡＧＣＡＴＣＡＡＡＣＴＣＡ（配列番号２２４）に結合する。デアミナーゼの性質に基づくらせん状ＤＮＡ変化との相互作用の関数として示される対応する活性の位置ウィンドウは、周期的及び非対称的な活性ウィンドウを示す。活性ウィンドウの区間及び位置は、本文に記載されるように、位置分割設計（即ち２つのデアミナーゼ半分の各々の分割／切断部位の位置）、リンカーのタイプ、ＤＮＡ結合ドメインなどの複数の要因に依存する。 図１９は、各々ＴＡＬＥ Ｌ及びＲドメインを用いて、ＢＥ＿Ｒ４＿７、ＢＥ＿Ｒ４＿１２、ＢＥ＿Ｒ４＿１３、ＢＥ＿Ｒ４＿１７、ＢＥ＿Ｒ４＿１８、ＢＥ＿Ｒ４＿１９、ＢＥ＿Ｒ４＿２０及びＢＥ＿Ｒ４＿２１を再結合することにより形成される塩基エディターの各々について、ポリＣ標的ＤＮＡ基質ＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣ（配列番号１９７）に対する塩基エディターデアミナーゼ活性の結果を示す図である。編集済塩基（ＣからＴ）は、それぞれ各基質について示されるシーケンシングデータに表示される。対応する活性の位置ウィンドウが描かれ、各設計について定量化される。 図２０は、ＴＡＬＥ Ｌ及びＲドメインを用いて、２つの活性部位を有するＧ１０８（Ｎ）及びＧ４３（Ｃ）で切断されたＢＥ＿Ｒ１＿４１を再結合することにより形成された塩基エディターについて、異なる長さの様々な標的ＤＮＡ基質（それぞれＣＣＣＣＣ（配列番号２２５）、ＣＣＣＣＣＣ（配列番号２２６）、ＣＣＣＣＣＣＣ（配列番号２２７）、ＣＣＣＣＣＣＣＣ（配列番号２２８）、ＣＣＣＣＣＣＣＣＣ（配列番号２２９）、ＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣ（配列番号２３０）、ＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣ（配列番号２３１）、ＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣ（配列番号２３２）、ＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣ（配列番号２３３）、ＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣ（配列番号２３４）、ＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣ（配列番号２３５）、ＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣ（配列番号２３６）、ＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣ（配列番号２３７）、ＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣ（配列番号２３８）、ＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣ（配列番号２３９）、ＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣ（配列番号２４０）の配列を有するポリＣ５～ＰｏｌｙＣ２０）に対する推定塩基エディターデアミナーゼ活性を示す図である。編集済塩基（ＣからＴ）は、各基質について示されるシーケンシングデータに表示され、ＣＣＣＣＣＣＴＴＴＴＴＣＣＣ（配列番号２４１）、ＣＣＣＣＣＣＣＴＴＴＴＴＣＣＣＣ（配列番号２４２）、ＣＣＣＣＣＣＣＣＴＴＴＴＴＣＣＣＣ（配列番号２４３）、ＣＣＣＣＣＣＣＣＴＴＴＴＴＴＴＣＣＣＣ（配列番号２４４）、ＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣＴＴＴＣＣＣＣＣＣ（配列番号２４５）をそれぞれ含む。対応する活性の位置ウィンドウが描かれ、各設計について定量化される。 図２１Ａ～２１Ｂは、ＴＡＬＥ Ｌ及びＲドメイン、又はＢＡＴ＿Ｌ及びＴＡＬＥ＿Ｒドメイン、又はＴＡＬＥ＿Ｌ及びＢＡＴ＿Ｒ結合ドメインのいずれかを用いて、２つの活性部位を有するＧ１０８（Ｎ）及びＧ４３（Ｃ）で切断されたＢＥ＿Ｒ１＿４１を再結合することにより形成された塩基エディターについて、それぞれ様々な標的ＤＮＡ基質に対する推定塩基エディターデアミナーゼ活性を示す。図２１Ａは、異なる長さの様々な標的ＤＮＡ基質（ＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣ（配列番号２３０）、ＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣ（配列番号２３２）、ＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣ（配列番号２３４）、ＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣ（配列番号２３５）、ＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣ（配列番号２３６）、ＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣ（配列番号２３８）をそれぞれ含み、ＣＣＣＣＣＣＴＴＴＴＴＣＣＣ（配列番号２４１）、ＣＣＣＣＣＣＣＴＴＴＴＴＣＣＣＣ（配列番号２４２）、ＣＣＣＣＣＣＴＴＴＴＴＣＣＣＣ（配列番号２４６）、ＣＣＣＣＣＣＣＣＣＴＴＴＣＣＣ（配列番号２４７）、ＣＣＣＣＣＣＣＣＣＴＴＴＣＣＣＣ（配列番号２４８）、ＣＣＣＣＣＣＣＣＣＴＴＴＴＴＣＣＣＣ（配列番号２４９）、ＣＣＣＣＣＣＣＣＣＴＴＴＴＣＣＣＣＣ（配列番号２５０）をそれぞれ含むポリＣ１０～ＰｏｌｙＣ１８）に対する前述した塩基エディターの効果を示す。図２１Ｂは、ポリＣ１６基質に対する上記の塩基エディターデアミナーゼの効果を示し、これは、ＤＮＡ結合ドメインの性質が塩基エディターの活性ウィンドウ及び編集効率に影響を与えることを立証する。編集済塩基（ＣからＴ）は、各基質について示されるシーケンシングデータに表示され、ＣＣＣＣＣＣＴＴＴＴＴＣＣＣＣ（配列番号２４６）、ＣＣＣＣＣＣＣＣＣＴＴＴＣＣＣ（配列番号２４７）及びＣＣＣＣＣＣＣＴＴＴＣＣＣＣＣＣ（配列番号２５１）をそれぞれ含む。対応する活性の位置ウィンドウが描かれ、各設計について定量化される。 図２１Ａ～２１Ｂは、ＴＡＬＥ Ｌ及びＲドメイン、又はＢＡＴ＿Ｌ及びＴＡＬＥ＿Ｒドメイン、又はＴＡＬＥ＿Ｌ及びＢＡＴ＿Ｒ結合ドメインのいずれかを用いて、２つの活性部位を有するＧ１０８（Ｎ）及びＧ４３（Ｃ）で切断されたＢＥ＿Ｒ１＿４１を再結合することにより形成された塩基エディターについて、それぞれ様々な標的ＤＮＡ基質に対する推定塩基エディターデアミナーゼ活性を示す。図２１Ａは、異なる長さの様々な標的ＤＮＡ基質（ＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣ（配列番号２３０）、ＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣ（配列番号２３２）、ＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣ（配列番号２３４）、ＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣ（配列番号２３５）、ＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣ（配列番号２３６）、ＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣ（配列番号２３８）をそれぞれ含み、ＣＣＣＣＣＣＴＴＴＴＴＣＣＣ（配列番号２４１）、ＣＣＣＣＣＣＣＴＴＴＴＴＣＣＣＣ（配列番号２４２）、ＣＣＣＣＣＣＴＴＴＴＴＣＣＣＣ（配列番号２４６）、ＣＣＣＣＣＣＣＣＣＴＴＴＣＣＣ（配列番号２４７）、ＣＣＣＣＣＣＣＣＣＴＴＴＣＣＣＣ（配列番号２４８）、ＣＣＣＣＣＣＣＣＣＴＴＴＴＴＣＣＣＣ（配列番号２４９）、ＣＣＣＣＣＣＣＣＣＴＴＴＴＣＣＣＣＣ（配列番号２５０）をそれぞれ含むポリＣ１０～ＰｏｌｙＣ１８）に対する前述した塩基エディターの効果を示す。図２１Ｂは、ポリＣ１６基質に対する上記の塩基エディターデアミナーゼの効果を示し、これは、ＤＮＡ結合ドメインの性質が塩基エディターの活性ウィンドウ及び編集効率に影響を与えることを立証する。編集済塩基（ＣからＴ）は、各基質について示されるシーケンシングデータに表示され、ＣＣＣＣＣＣＴＴＴＴＴＣＣＣＣ（配列番号２４６）、ＣＣＣＣＣＣＣＣＣＴＴＴＣＣＣ（配列番号２４７）及びＣＣＣＣＣＣＣＴＴＴＣＣＣＣＣＣ（配列番号２５１）をそれぞれ含む。対応する活性の位置ウィンドウが描かれ、各設計について定量化される。 図２２は、ＢＥ＿Ｒ１＿４１に基づき、異なるスプリット塩基エディターの設計戦略を示す図であり、柔軟性及び活性ウィンドウサイズを増強するために、各々がＴＡＬＥ左（Ｌ）及び右（Ｒ）ドメイン並びにコイルドコイル（「コイル」）ドメインが付加されたＢＥ＿Ｒ１＿４１（Ｎ又はＣ）断片を含むドメイン構成を示す。編集（ＣからＴ）を示すＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣ（配列番号２３６）基質からの編集済塩基は、各基質についてそれぞれ示されるシーケンシングデータに表示され、ＣＣＣＣＣＣＴＴＴＴＴＴＴＣＣＣ（配列番号２５２）、ＣＣＣＣＣＣＣＴＴＴＴＴＴＴＴＣ（配列番号２５３）及びＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＣＣＣＣ配列番号２５４）をそれぞれ含む。 図２３Ａ～２３Ｂは、標的塩基の最適位置を示すデータを示す。図２３Ａは、５つの異なる標的ＤＮＡ基質の各々に対する、ＴＡＬＥ＿Ｒ＿ＢＥ＿Ｒ１＿１２（短縮型６０）と組み合わせた塩基エディターＴＡＬＥ＿Ｌ＿「不活性型」ｄＢＥ＿Ｒ１＿１２の塩基エディターデアミナーゼ活性の結果を示す図であり、上記の基質は、病原性ミトコンドリア変異である、マウスミトコンドリアにおけるｍＣｏｘ１ Ｖ４２１Ａ（Ｃ６５８９のＴへの変換に相当）の修正にそれぞれ対応し、ＴＡＬＥ結合部位に対するＣ６５８９の単一塩基シフトを有し、ＧＴＡＧＧＡＧＣＡＡＣＡＴＡＡ（配列番号２５５）、ＣＧＴＡＧＧＡＧＣＡＡＣＡＴＡ（配列番号２５６）、ＴＣＧＴＡＧＧＡＧＣＡＡＣＡＴ（配列番号２５７）、ＴＴＣＧＴＡＧＧＡＧＣＡＡＣＡ（配列番号２５８）、ＡＴＴＣＧＴＡＧＧＡＧＣＡＡＣ（配列番号２５９）をそれぞれ含む。編集済塩基（ＣからＴ）は、各基質について示されるシーケンシングデータに表示され、それぞれＴＣＧＴＡＧＧＡＧＴＡＡＡＣＡＴ（配列番号２６０）を含む。対応する活性の位置ウィンドウが描かれ、各設計について定量化される。編集済塩基（Ｃ６５８９ ＣからＴ）は、このＣ残基が左側ＴＡＬＥ結合部位から１０ｂｐ（二重らせんの１ターンに相当）離れている場合に存在する。図２３Ｂは、Ｃ６５８９（距離＝８～１２）及びＣ６５９３（距離＝１２～１６）におけるＣヌクレオチド各々の左側ＴＡＬＥ結合部位から標的ｄＣまでの距離にわたるｄＣ－ｄＴ編集効率のグラフである。この例では、Ｃ６５８９が標的塩基であり、Ｃ６５９３がバイスタンダー塩基である。この手法（標的ウィンドウを１度に１ｂｐスライドさせる）を使用して、標的塩基の編集効率を最大化すると共に、任意の所与の標的関するバイスタンダー塩基の編集を最小化することができる。 図２３Ａ～２３Ｂは、標的塩基の最適位置を示すデータを示す。図２３Ａは、５つの異なる標的ＤＮＡ基質の各々に対する、ＴＡＬＥ＿Ｒ＿ＢＥ＿Ｒ１＿１２（短縮型６０）と組み合わせた塩基エディターＴＡＬＥ＿Ｌ＿「不活性型」ｄＢＥ＿Ｒ１＿１２の塩基エディターデアミナーゼ活性の結果を示す図であり、上記の基質は、病原性ミトコンドリア変異である、マウスミトコンドリアにおけるｍＣｏｘ１ Ｖ４２１Ａ（Ｃ６５８９のＴへの変換に相当）の修正にそれぞれ対応し、ＴＡＬＥ結合部位に対するＣ６５８９の単一塩基シフトを有し、ＧＴＡＧＧＡＧＣＡＡＣＡＴＡＡ（配列番号２５５）、ＣＧＴＡＧＧＡＧＣＡＡＣＡＴＡ（配列番号２５６）、ＴＣＧＴＡＧＧＡＧＣＡＡＣＡＴ（配列番号２５７）、ＴＴＣＧＴＡＧＧＡＧＣＡＡＣＡ（配列番号２５８）、ＡＴＴＣＧＴＡＧＧＡＧＣＡＡＣ（配列番号２５９）をそれぞれ含む。編集済塩基（ＣからＴ）は、各基質について示されるシーケンシングデータに表示され、それぞれＴＣＧＴＡＧＧＡＧＴＡＡＡＣＡＴ（配列番号２６０）を含む。対応する活性の位置ウィンドウが描かれ、各設計について定量化される。編集済塩基（Ｃ６５８９ ＣからＴ）は、このＣ残基が左側ＴＡＬＥ結合部位から１０ｂｐ（二重らせんの１ターンに相当）離れている場合に存在する。図２３Ｂは、Ｃ６５８９（距離＝８～１２）及びＣ６５９３（距離＝１２～１６）におけるＣヌクレオチド各々の左側ＴＡＬＥ結合部位から標的ｄＣまでの距離にわたるｄＣ－ｄＴ編集効率のグラフである。この例では、Ｃ６５８９が標的塩基であり、Ｃ６５９３がバイスタンダー塩基である。この手法（標的ウィンドウを１度に１ｂｐスライドさせる）を使用して、標的塩基の編集効率を最大化すると共に、任意の所与の標的関するバイスタンダー塩基の編集を最小化することができる。 図２４は、図１０～２３に示すデータに従って決定された活性ウィンドウの長さと位置及び異なるスプリット塩基エディターの設計ルールに影響を与える要因を要約した図である。２部スプリット塩基エディターの各部分が二本鎖標的ＤＮＡの各対向鎖上に示され、各核酸がＸとして示されている。スプリット塩基エディターの各部分は、ＤＮＡ結合ドメインと、リンカーを介して連結されたデアミナーゼＮ又はＣドメインとを含む（Ｎドメインが５’ＤＮＡ鎖に結合し、Ｃドメインが３’ＤＮＡ鎖に結合して示されている）。図示される例では、ＤＮＡ結合ドメイン認識部位同士の距離は、合計１９残基であると示され、デアミナーゼ活性ウィンドウは、３つの核酸のオーバーラップを有する各鎖上の７つの核酸を含む（矢印で示す）。 図２５Ａ～２５Ｂは、（図２５Ａ）スプリットＢＥ１２塩基エディターの２つの部分の各々のドメイン構成の概略図を示し、ＭＴＳターゲティング配列を含むスプリットデアミナーゼ（「不活性型」ｄＢＥ＿１２－Ｎ－ＴＡＬＥ＿Ｌ；及びＢＥ＿１２－Ｃ－ＴＡＬＥ＿Ｒ）の各々は、ＵＧＩ（ミトコンドリアウラシルＤＮＡグリコシラーゼの活性を制限するため）及びＧＦＰ（左側ＴＡＬＥ融合物の場合）又はｍＫａｔｅ（右ＴＡＬＥ融合物の場合）に融合され、その結果、ＴＡＬＥ Ｌ及びＲ結合ドメインを用いて標的ミトコンドリアＤＮＡ（ｈＮＤ１遺伝子）に共局在する結合された機能性塩基エディターが得られ；並びに（図２５Ｂ）ＨＥＫ２９３Ｔ細胞株における異なるＢＥ＿１２に基づくデアミナーゼ切断変異体で共トランスフェクトされたＢＥ＿１２－不活性型を用いたｈＮＤ１遺伝子座での塩基編集の結果を示す顕微鏡写真であり、編集されたサンプルにおけるＴ７エンドヌクレアーゼによる予想切断産物の位置が矢印で示される。 図２５Ａ～２５Ｂは、（図２５Ａ）スプリットＢＥ１２塩基エディターの２つの部分の各々のドメイン構成の概略図を示し、ＭＴＳターゲティング配列を含むスプリットデアミナーゼ（「不活性型」ｄＢＥ＿１２－Ｎ－ＴＡＬＥ＿Ｌ；及びＢＥ＿１２－Ｃ－ＴＡＬＥ＿Ｒ）の各々は、ＵＧＩ（ミトコンドリアウラシルＤＮＡグリコシラーゼの活性を制限するため）及びＧＦＰ（左側ＴＡＬＥ融合物の場合）又はｍＫａｔｅ（右ＴＡＬＥ融合物の場合）に融合され、その結果、ＴＡＬＥ Ｌ及びＲ結合ドメインを用いて標的ミトコンドリアＤＮＡ（ｈＮＤ１遺伝子）に共局在する結合された機能性塩基エディターが得られ；並びに（図２５Ｂ）ＨＥＫ２９３Ｔ細胞株における異なるＢＥ＿１２に基づくデアミナーゼ切断変異体で共トランスフェクトされたＢＥ＿１２－不活性型を用いたｈＮＤ１遺伝子座での塩基編集の結果を示す顕微鏡写真であり、編集されたサンプルにおけるＴ７エンドヌクレアーゼによる予想切断産物の位置が矢印で示される。 図２６は、ＢＥ１２又はＢＥ４１に基づくスプリット塩基エディターのドメイン構成の概略図であり、スプリットデアミナーゼの各々は、ＴＡＬＥ＿Ｌ及びＴＡＬＥ＿Ｒ ＤＮＡ結合ドメイン、それぞれＧ１０８（Ｎ）及びＧ４３（Ｃ）で切断された不活性型ｄＢＥ１２又はＢＥ４１のいずれかに対するＵＧＩ（ミトコンドリアウラシルＤＮＡグリコシラーゼの活性を制限するため）及びＧＦＰ（左側ＴＡＬＥ若しくはＢＡＴ融合物の場合）又はｍＫａｔｅ（右ＴＡＬＥ若しくはＢＡＴ融合物の場合）に融合されたＭＴＳターゲティング配列を含む。標的遺伝子座（ｈＮＤ１）（ＡＣＴＣＡＡＴＣＣＴＣＴＧＡＴＣ（配列番号２６１））における編集済塩基（ＣからＴ）は、各基質についてそれぞれ示されるシーケンシングデータに表示される。 図２７Ａ～２７Ｂは、（図２７Ａ）ミトコンドリアｈＮＤ１遺伝子をターゲティングする４つのスプリットＢＥ４１塩基エディターの各々のドメイン構成の概略図を示し、スプリットデアミナーゼは、ＴＡＬＥ ＤＮＡ結合ドメイン（ＴＡＬＥ＿Ｌ－ＢＥ＿４１－Ｎ（１）；及びＴＡＬＥ＿Ｒ－ＢＥ＿４１－Ｃ（２））又はＢＡＴ結合ドメイン（ＢＡＴ＿Ｌ－ＢＥ＿４１－Ｎ（３）；及びＢＡＴ＿Ｒ－ＢＥ＿４１－Ｃ（４））のいずれかをそれぞれ含み、それらの各々は、ＵＧＩ（ミトコンドリアウラシルＤＮＡグリコシラーゼの活性を制限するため）及びＧＦＰ（左側ＴＡＬＥ又はＢＡＴ融合物の場合）又はｍＫａｔｅ（右ＴＡＬＥ又はＢＡＴ融合物の場合）に融合したＭＴＳターゲティング配列を含み；並びに（図２７Ｂ）ＨＥＫ２９３Ｔ細胞株における図２７Ａに示したＮ－（（１）又は（２））とＣ－（（１）又は（２））構築物の異なる組合せの結果を示す顕微鏡写真であり、編集されたサンプルにおけるＴ７エンドヌクレアーゼによる予想切断産物の位置が矢印で示される。 図２８Ａ～２８Ｂは、（図２８Ａ）スプリットＢＥ４１塩基エディターの２つの部分のドメイン構成の概略図を示し、スプリットデアミナーゼの各々は、左側ＴＡＬＥ ＤＮＡ結合ドメイン（ＴＡＬＥ＿Ｌ－ＢＥ＿４１－Ｎ）又は右側ジンクフィンガー（ＺＦ＿Ｒ２）のいずれかを含み、その各々は、ＵＧＩ（ミトコンドリアウラシルＤＮＡグリコシラーゼの活性を制限するため）及びＧＦＰ（左側のＴＡＬＥ又はＢＡＴ融合の場合）又はｍＫａｔｅ（右側のＴＡＬＥ又はＢＡＴ融合の場合）に融合したＭＴＳターゲティング配列を含み；並びに（図２８Ｂ）標的化ＤＮＡ（ＡＣＴＣＡＡＴＣＣＴＣＴＧＡＴＣ（配列番号２６１））中の編集済塩基（ＣからＴ）は、シーケンシングデータに表示され、処理ＤＮＡサンプル及び対照ＤＮＡサンプルについて示され、対応する活性の位置ウィンドウが各設計についてそれぞれ描かれ、定量化される。 図２９Ａ～２９Ｂは、２つの単一ＡＡＶ塩基エディター設計のドメイン構成の概略図を示し、これは、ＭＴＳターゲティング配列、Ｐ２Ａに融合し、且つＵＧＩ（ミトコンドリアウラシルＤＮＡグリコシラーゼの活性を制限するため）に融合したＭＴＳ－ＢＥ＿４１－Ｎ、ＧＦＰと直接融合したジンクフィンガー左側（ＺＦ＿Ｌ）ＤＮＡ結合ドメイン、即ちＢＥ＿４１－Ｃ；ＧＦＰに融合した右側ＺＦ；又はＭＴＳターゲティング配列及びＵＧＩに融合した（ミトコンドリアウラシルＤＮＡグリコシラーゼの活性を制限するため）ＭＴＳ－ＢＥ＿４１－Ｎと直接融合したＴＡＡ＿ＩＲＥＳに融合したジンクフィンガー左側（ＺＦ＿Ｌ）ＤＮＡ結合ドメイン、即ちＢＥ＿４１－Ｃ、ＧＦＰに融合した右側ＺＦを含む（図２９Ａ）。Ａに図示される構築物を保有するＡＡＶ粒子の様々なＭＯＩでのＴ７エンドヌクレアーゼアッセイの結果が示されている（図２９Ｂ）。 マウスＮＩＨ３Ｔ３細胞株におけるｍＮＤ１遺伝子座を編集するために使用されるスプリットＢＥ４１に基づく塩基エディターのドメイン構成の概略図であり、これは、ＭＴＳターゲティング配列、ＵＧＩ及びＧＦＰに融合したＧ１０８で切断されたＢＥ＿４１－ＮＴＡＬＥに融合したＴＡＬＥ左側ＤＮＡ結合ドメイン；並びにＭＴＳターゲティング配列、ＵＧＩ及びｍＫａｔｅに融合したＧ４３で切断されたＢＥ＿４１－Ｃに融合したＴＡＬＥ右側ＤＮＡ結合ドメインを含む。 図３１Ａ～３１Ｂは、ＮＧＳに基づいて決定された編集効率及びオフターゲット（図３１Ａ）並びに塩基エディター処理サンプル対陰性対照配列ＣＡＴＴＡＧＴＡＧＡＡＣＧＣＡ（配列番号２６２）における標的遺伝子座のサンガークロマトグラム（図３１Ｂ）を示す。位置Ｇ２８２０で配列ＣＡＴＴＡＧＴＡＡＡＡＣＧＣＡ（配列番号２６３）において編集された（ＧからＡ）核酸塩基が表示される。 図３１Ａ～３１Ｂは、ＮＧＳに基づいて決定された編集効率及びオフターゲット（図３１Ａ）並びに塩基エディター処理サンプル対陰性対照配列ＣＡＴＴＡＧＴＡＧＡＡＣＧＣＡ（配列番号２６２）における標的遺伝子座のサンガークロマトグラム（図３１Ｂ）を示す。位置Ｇ２８２０で配列ＣＡＴＴＡＧＴＡＡＡＡＣＧＣＡ（配列番号２６３）において編集された（ＧからＡ）核酸塩基が表示される。 図３２Ａ～３２Ｄは、異なるｄｓＤＮＡ特異的デアミナーゼ（ｄｓＣＤＡ）がシチジン修飾に対して異なる活性を有することを示す。図３２Ａは、シトシン（Ｃ）、５－メチルシトシン（５ｍＣ）、５－ヒドロキシメチルシトシン（５ｈｍＣ）、５－ホルミルシトシン（５ｆＣ）及び５－カルボキシルシトシン（５ｃａＣ）の構造の概略図である。図３２Ｂ～３２Ｄは、メチル化を含まないＤＮＡ基質（図３２Ｂ）、５－メチルシトシン（５ｍＣ）（図３２Ｃ）及び５－ヒドロキシメチルシトシン（５ｈｍＣ）（図３２Ｃ）に対してそれぞれデアミナーゼＢＥ＿Ｒ１＿１１、ＢＥ＿Ｒ１＿１２、ＢＥ＿Ｒ１＿２８、ＢＥ＿Ｒ１＿４１、ＢＥ＿Ｒ２＿１１、ＢＥ＿Ｒ２＿１９、ＢＥ＿Ｒ２＿２８、ＢＥ＿Ｒ２＿３１及びＤｄｄＡの各々を用いたデアミナーゼアッセイの顕微鏡写真である。 図３３Ａ～３３Ｂは、ＢａｍＨ１メチラーゼを用いたメチル化（シトシンをメチル化５ｍＣに変換する）によってシトシンを保護するためのアッセイを示す。図３３Ａは、ＭＴａｓｅなし（対照）、ＢＡＭＨＩ ＭＴａｓｅ又はＣｐＧ ＭＴａｓｅのいずれかでｄｓＤＮＡ基質を前処理し、次にｄｓ－デアミナーゼを添加した後、シーケンシングするためのアッセイの概略図であり、それにより、未修飾シトシンは、ウラシルに脱アミノ化され、Ｔとして検出され、修飾シトシンは、脱アミノ化されない。図３３Ｂは、未処理（ＭＴａｓｅなし）又は（ＢａｍＨ１ ＭＴａｓｅ）で処理し、その後、脱アミノ化及び配列決定した基質ＤＮＡの確率シーケンスロゴを示す。 図３４Ａ～３４Ｃは、それぞれ５ｃａＣ、５ｆＣ、５ｈｍＣ若しくは５ｍＣを含むように修飾されたＤＮＡ基質：ＧＴＡＣＡＣＣＡＴＣＣＧＴＣＣＣ（配列番号２７４）及びＧＴＧＴＴＣＴＣＴＡＴＴＴＣＡＣ（配列番号２７５）に対するＢＥ＿Ｒ１＿１１デアミナーゼ（図３４Ａ）、ＢＥ＿Ｒ１＿２８デアミナーゼ（図３４Ｂ）又はＢＥ＿Ｒ１＿４１デアミナーゼ（図３４Ｃ）の活性を示すシーケンシングクロマトグラムである。ＧＴＧＴＴＣＴＣＴＡＴＴＴＣＡＣ（配列番号２７５） 図３４Ａ～３４Ｃは、それぞれ５ｃａＣ、５ｆＣ、５ｈｍＣ若しくは５ｍＣを含むように修飾されたＤＮＡ基質：ＧＴＡＣＡＣＣＡＴＣＣＧＴＣＣＣ（配列番号２７４）及びＧＴＧＴＴＣＴＣＴＡＴＴＴＣＡＣ（配列番号２７５）に対するＢＥ＿Ｒ１＿１１デアミナーゼ（図３４Ａ）、ＢＥ＿Ｒ１＿２８デアミナーゼ（図３４Ｂ）又はＢＥ＿Ｒ１＿４１デアミナーゼ（図３４Ｃ）の活性を示すシーケンシングクロマトグラムである。ＧＴＧＴＴＣＴＣＴＡＴＴＴＣＡＣ（配列番号２７５） 図３４Ａ～３４Ｃは、それぞれ５ｃａＣ、５ｆＣ、５ｈｍＣ若しくは５ｍＣを含むように修飾されたＤＮＡ基質：ＧＴＡＣＡＣＣＡＴＣＣＧＴＣＣＣ（配列番号２７４）及びＧＴＧＴＴＣＴＣＴＡＴＴＴＣＡＣ（配列番号２７５）に対するＢＥ＿Ｒ１＿１１デアミナーゼ（図３４Ａ）、ＢＥ＿Ｒ１＿２８デアミナーゼ（図３４Ｂ）又はＢＥ＿Ｒ１＿４１デアミナーゼ（図３４Ｃ）の活性を示すシーケンシングクロマトグラムである。ＧＴＧＴＴＣＴＣＴＡＴＴＴＣＡＣ（配列番号２７５） 図３５は、５位にメチルシトシン、１０位にヒドロキシメチルシトシンを含む配列ＣＣＧＴＣＧＧＡＣＣＧＣ（配列番号２７８）を有するＤＮＡ基質に対するＴｅｔ２酸化酵素及びＢＧＴグルコシル化酵素の活性を示す概略図であり、上記の配列は、５位にカルボキシルシトシン及び１０位にグルコシル－メチルシトシンをそれぞれ含むＣＣＧＴＣＧＧＡＣＣＧＣ（配列番号２７９）に変換される。 図３６は、５ｍＣ、５ｈｍＣ、５ｆＣ及び５ｃａＣを含むＤＮＡ基質ＧＴＡＣＡＣＣＡＴＣＣＧＴＣＣＣ（配列番号２７４）に対する、単独（ＢＥ１２／ＢＥ４１）又は酸化及びグルコシル化後（ＢＥ１２＋ＴＥＴ２－ＢＧＴ／ＢＥ４１＋ＴＥＴ２－ＢＧＴ）のＢＥ＿Ｒ１＿１２及びＢＥ＿Ｒ１＿４１デアミナーゼの活性差をそれぞれ１時間（ｔ１）及び２時間（ｔ２）インキュベーションの各時点で示すシーケンシングクロマトグラムを示す。ＴＥＴ２及びＢＧＴによる酸化及びグルコシル化がない場合、ＧＴＡＣＡＣＣＡＴＣＣＧＴＣＣＣ（配列番号２７４）におけるＢＥ＿Ｒ１＿４１による５ｍＣからＴへの脱アミノ化により、ＧＴＡＣＡＣＣＡＴＴＴＧＴＣＣＣ（配列番号２７６）が得られ；ＢＥ＿Ｒ１＿４１による５ｈｍＣからＴへの脱アミノ化により、ＧＴＡＣＡＣＣＡＴＴＴＧＴＣＣＣ（配列番号２７６）及びＧＴＡＣＡＣＣＡＴＴＴＧＴＣＣ（配列番号２７７）がそれぞれ得られた。この図は、ＢＥ４１のようにｍＣ又はｈｍＣに対して活性なデアミナーゼの場合、ＴＥＴ２＋ＢＧＴ処理を使用して、メチル化ＤＮＡを脱アミノ化から保護することができることを示す。ＢＥ１２のような一部のデアミナーゼは、通常のコンテキストでは編集することができるが、本質的に修飾ＤＮＡに対して活性が低いため、最初のＴＥＴ２＋ＢＧＴ処理を必要とせずに使用することができる。 図３７は、基質ＤＮＡ：ＣＴＡＡＣＴＴＡＣＣＡＴＧＡＴＴＡＡＴＴＴＡＡＧＡＡＴＴＣＴＣＡＴＣＧＴＣＡ（配列番号２８０）に対する１つ以上のデアミナーゼの活性を示す概略図であり、これによりそれぞれ３つの異なる脱アミノ化産物ＴＴＡＡＴＴＴＡＣＴＡＴＧＡＴＴＡＡＴＴＴＡＡＧＡＡＴＴＣＴＴＡＴＴＧＴＴＡ（配列番号２８１）、ＣＴＡＡＴＴＴＡＣＣＡＴＡＡＴＴＡＡＴＴＴＡＡＧＡＡＴＴＣＴＴＡＴＣＧＴＴＡ（配列番号２８２）及びＣＴＡＡＣＴＴＡＴＣＡＴＡＡＴＴＡＡＴＴＴＡＡＡＡＡＴＴＣＴＴＡＴＣＧＴＣＡ（配列番号２８３）が得られる。 図３８Ａ～３８Ｂは、ＤＮＡ基質に対するＢＥ＿Ｒ１＿１２デアミナーゼのデアミナーゼ活性から得られた頻度シーケンスロゴ（図３８Ａ）及びＮＧＳのアラインメント配列（図３８Ｂ）を示す。 図３８Ａ～３８Ｂは、ＤＮＡ基質に対するＢＥ＿Ｒ１＿１２デアミナーゼのデアミナーゼ活性から得られた頻度シーケンスロゴ（図３８Ａ）及びＮＧＳのアラインメント配列（図３８Ｂ）を示す。 図３９は、ＧＡＴＴＧＡＡＴＧＧＴＡＣＴＧＡＴＴＡＧＡＴＴＴＴＴＡＡＧＡＧＴＡＧＣＡＧＴ（配列番号２８５）に脱アミノ化されるＤＮＡ基質：ＧＡＴＴＧＡＡＴＧＧＴＡＣＴＧＡＴＣＡＧＡＴＣＣＴＣＡＡＧＡＧＴＡＧＣＡＧＴ（配列番号２８４）上のＴ７プロモーター及びターミネーターによって規定されるウィンドウ内に多様性を導入するための、ターゲティングドメインとしてＴ７ＲＮＡポリメラーゼ（Ｔ７ ＲＮＡＰ）に結合した塩基エディター（ＢＥ）を示す概略図である。この図は、エピジェネティックシーケンシング法の概念／ワークフローを示す。 図４０は、ｄＣａｓ９結合部位に結合した塩基エディター（スプリットＢＥ４１）であり、ｄＣａｓ９／ｇＲＮＡは、Ｔ７プロモーター領域下流の二本鎖ＤＮＡ上のポリメラーゼのロードブロックとして役立ち；スプリットＢＥ４１の一方の半分は、Ｔ７ポリメラーゼに融合して示され、別の半分は、自由浮遊酵素として示されている。 図４１は、スプリットデアミナーゼの異なる形態を示す図である。
開示される方法及び組成物は、特定の実施形態及びそれに含まれる実施例の以下の詳細な説明並びに図面及びそれらの前述及び後述の説明を参照することにより、より容易に理解することができる。
現在のゲノム編集技術は、遺伝子修正に対する最初のステップとして、標的遺伝子座に二本鎖（ｄｓ）ＤＮＡ切断を導入する。ほとんどの遺伝病は点突然変異から発生するが、ＤＮＡ切断とそれに続く固定点突然変異への組換えに依存するアプローチは非効率的であり、典型的には、ｄｓＤＮＡ切断に対する細胞応答から標的遺伝子座に多量のランダムな挿入及び欠失（インデル）を誘導する。ほとんどの既知の遺伝病の場合、病気の根本的な原因に対処するために、遺伝子の推計学的な破壊ではなく、むしろ標的遺伝子座の点突然変異の修正が必要とされる。
塩基編集は、ｄｓＤＮＡ骨格切断又はドナーテンプレートを必要とせずに、プログラム可能な方法で、１つの標的ＤＮＡ塩基を別の標的ＤＮＡ塩基に直接、不可逆的に変換することを可能にするゲノム編集への最新アプローチである。既存の塩基編集アプローチは、主として、ＲＮＡ誘導ＤＮＡ結合ドメイン（例えば、ｄＣａｓ９又はｎＣａｓ９）に融合させたｓｓＤＮＡ特異的ＤＮＡデアミナーゼ（例えば、ＡＰＯＢＥＣ又はＡＩＤ）を利用する。標的遺伝子座におけるガイドＲＮＡ／Ｃａｓ９によるＲループ形成は、ｓｓＤＮＡデアミナーゼ酵素の基質として機能するｓｓＤＮＡ領域を露出させる。ＲＮＡ誘導タンパク質を用いた塩基編集は強力ではあるが、固有の制限を有する。例えば、現時点では、ガイドＲＮＡ又は他の核酸をミトコンドリアルーメンに送達する効率的な方法がないため、それは、ミトコンドリアゲノム（又は葉緑体及び色素体などのゲノムを含む他の膜性細胞小器官）を編集するために使用することができない。
ｓｓＤＮＡ特異的デアミナーゼをジンクフィンガー及びＴＡＬＥなどのｄｓＤＮＡ結合ドメインに融合させても、主に、ｓｓＤＮＡ特異的デアミナーゼは、ｄｓＤＮＡに対してほとんど又は全く活性がないため、効率的な塩基エディターが達成されていない。この制限に対処するために、ツリーオブライフ（ｔｒｅｅ ｏｆ ｌｉｆｅ）が調べられ、ｄｓＤＮＡに対して活性があり、且つ様々な配列コンテキストでｄｓＤＮＡを編集することができるデアミナーゼが見出された。このように、デアミナーゼは、以前よりもはるかに広範なコンテキストでｄｓＤＮＡを編集することができ、且つ以前の特性決定デアミナーゼよりもオフターゲット編集を低減する。実施例に示すように、これらのデアミナーゼは、以前に特性決定されたほとんど全てのデアミナーゼ（ＤｄｄＡを除く）の場合のように一本鎖ＤＮＡのみならず、二本鎖及び一本鎖ＤＮＡ基質に対して活性である。
シトシンデアミナーゼが開示される。プログラム可能なターゲティングドメイン（例えば、ＤＮＡ結合ドメイン）と連結又は関連するこのようなデアミナーゼを含む塩基エディターも提供される。デアミナーゼ及びその塩基エディターは、インビトロ（例えば、試験管内）及びインビボ（例えば、生存細胞内）の両方でＤＮＡの正確な編集を可能にする。塩基エディターは、ヒトの疾患に関連する様々な点突然変異を効率的に修正することができる。このようなカスタム設計された塩基エディターは、ゲノムに標的化（部位特異的）塩基編集を導入するための一般的且つ効率的な方法を提供し、標的化遺伝子修正又はゲノム編集をヒト細胞で実行可能な選択肢にする。それらのタンパク質単独の性質及び一切の核酸部分（例えば、ガイドＲＮＡ）の要件がないことから、ミトコンドリアゲノム、葉緑体及び他の色素体の編集など、標的ＤＮＡの位置への核酸の送達が困難な場合、記載される塩基エディターを有効に使用することができる。
開示される方法及び組成物のさらなる利点は、以下の説明に一部が詳述され、且つ説明から部分的に理解されるか、又は開示される方法及び組成物の実施によって知ることができるであろう。開示される方法及び組成物の利点は、添付の特許請求の範囲に特に指摘された要素及び組み合わせによって実現及び達成されるであろう。以上の概略的な説明及び以下の詳細な説明の両方が例示的且つ説明的なものであり、特許請求の範囲の発明を限定するものではないことを理解されたい。
開示される方法及び組成物は、別に指定されない限り、特定の合成方法、特定の分析技術又は特定の試薬に限定されず、従って変化し得ることを理解すべきである。本明細書で使用される用語は、特定の実施形態を説明することを目的するにすぎず、限定することを意図しないことも理解されたい。
Ｉ．定義
用語「デアミナーゼ」又は「デアミナーゼドメイン」は、脱アミノ化反応を触媒するポリペプチド、タンパク質又は酵素を指す。デアミナーゼは、デアミナーゼの配列特異性に基づいて、ＤＮＡ中のアデニン（Ａ）又はシトシン（Ｃ）を非標化様式で脱アミノ化することができる。ｄｓＤＮＡ特異的デアミナーゼは、二本鎖ＤＮＡに対して脱アミノ化反応を行うことができ、ｓｓＤＮＡ特異的デアミナーゼは、基質としての一本鎖ＤＮＡに厳密に作用する。
用語「塩基エディター（ＢＥ）」は、デアミナーゼドメイン及び１つ以上の機能性ドメインを含む組成物を指す。デアミナーゼドメインと機能性ドメインは、リンカーを介して融合又は共役することができる。従って、一部の形態では、塩基エディターは、融合タンパク質である。塩基エディターは、標的核酸（例えば、ＤＮＡ又はＲＮＡ）中の標的ヌクレオチド配列内の塩基（例えば、Ａ又はＣ）に改変を加えることができる。一部の形態では、塩基エディターは、二本鎖ＤＮＡ分子などの核酸内の塩基を脱アミノ化することができる。好ましくは、塩基エディターは、ＤＮＡ中のアデニン（Ａ）又はシトシン（Ｃ）を標的様式化で脱アミノ化することができる。
用語「リンカー」は、結合（例えば、共有結合）、化学基又は２つの分子若しくは部分、例えば融合タンパク質の２つのドメイン、例えば、アデノシン又はシトシンデアミナーゼドメインとターゲティングドメイン（例えば、ＤＮＡ結合タンパク質又はドメイン）を連結する分子を指す。典型的には、リンカーは、２つの基、分子若しくは他の部分間又はそれらにフランキングして位置し、且つ共有結合を介して互いに連結され、従って両方を連結する。一部の形態では、リンカーは、アミノ酸又は複数のアミノ酸（例えば、ペプチド）である。一部の形態では、リンカーは、有機分子、基、ポリマー又は化学的部分である。
用語「（突然）変異」は、所与の参照配列からの改変をもたらす配列の変化を指す。変異には、配列、例えば、核酸若しくはアミノ酸配列内の残基の、別の残基による置換又は配列内の１つ若しくは複数の残基の欠失若しくは挿入が含まれる。一部の形態では、変異は、本来の残基、続いて配列内の上記の残基の位置、さらに新たに置換された残基のアイデンティティー（例えば、Ｄ１０Ａ）を明示することによって記述される。一部の形態では、突然変異は、配列内の残基の位置、元の残基、続いて新たに置換された残基のアイデンティティー（例えば、５６５０Ｇ＞Ａ）を明示することによって記述される。変異は、対象の観察可能な特徴（表現型）に識別可能な変化をもたらす場合もあれば又はもたらさない場合もある。
「標的核酸」という用語は、デアミナーゼドメイン又は塩基エディターによって認識及び／又は脱アミノ化され得る標的ヌクレオチド配列を含む核酸分子を指す。標的核酸は、限定するものではないが、生存細胞の内部又は外部いずれかの染色体ＤＮＡ、ミトコンドリアＤＮＡ、ＲＮＡ、プラスミド、発現ベクターなどであり得る。
「標的ヌクレオチド配列」という用語は、異なるヌクレオチド配列においてヌクレオチドよりもデアミナーゼドメインにより優先的に脱アミノ化されるヌクレオチドを含むヌクレオチド配列を指す。標的ヌクレオチド配列の特定の実体を、脱アミノ化のためにターゲティングすることができる。標的ヌクレオチド配列は、２つ以上のヌクレオチド（例えば、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ、１０又はそれを超える）を含むことができる。標的ヌクレオチドと呼ばれる標的ヌクレオチド配列中の２つ以上のヌクレオチドは、その標的配列を脱アミノ化するデアミナーゼドメインの標的特異性を規定する。一部の形態では、標的ヌクレオチド配列中の２つ以上の標的ヌクレオチドは、それぞれ個別に完全に又は部分的に規定され、且つ互いに固定された順序関係にある。一般に、「標的ヌクレオチド配列」内の特定のヌクレオチドは、デアミナーゼドメインによって脱アミノ化される。例えば、例示的な標的ヌクレオチド配列ＣＮＡＣでは、標的ヌクレオチド配列の最後のＣは、デアミナーゼドメイン（例えば、シトシンデアミナーゼ）によって脱アミノ化され得る。脱アミノ化のために選択されるこのヌクレオチドを「標的ヌクレオチド」と呼ぶことができる。
「塩基エディター標的配列」という用語は、標的化塩基エディターによって認識されて、結合される標的核酸分子内の配列を指す。一般に、塩基エディター標的配列は、標的化塩基エディターによって脱アミノ化された標的ヌクレオチド配列と区別され、且つ／又はそれと重複しない。従って、塩基エディター標的配列は、標的化塩基エディターによって結合されると、核酸分子内の標的ヌクレオチド配列の実体の近傍に標的化塩基エディターを配置する核酸配列を包含する。塩基エディター標的配列と標的ヌクレオチド配列の実体とのこのコロケーションは、標的ヌクレオチド配列の実体の優先的且つ特異的な脱アミノ化を促進する。典型的には、標的化塩基エディターに関連するＤＮＡ結合ドメインなどのターゲティングドメインは、塩基エディター標的配列を認識して結合する。
「二本鎖ＤＮＡ上のデアミナーゼ活性」は、全て標的ヌクレオチド配列を含む１つ以上の二本鎖ＤＮＡセグメントの集団に対するデアミナーゼのデアミナーゼ活性を指す。二本鎖ＤＮＡ上のデアミナーゼ活性は、二本鎖ＤＮＡを巻き戻すために、ガイドＲＮＡなどの補助因子の活性を必要としない。従って、この活性は、ＲＮＡ誘導ＤＮＡ結合ドメイン（即ちｄＣａｓ９及びガイドＲＮＡ）などの補助因子の存在下でのみｄｓＤＮＡにアクセスして、これを脱アミノ化することができるＡＰＯＢＥＣ及びＡＩＤなどのｓｓＤＮＡ特異的デアミナーゼのデアミナーゼ活性と異なる。
ヌクレオチド配列（標的ヌクレオチド配列など）中のヌクレオチドは、そのヌクレオチドが１つの特定のヌクレオチド（例えば、Ｃ）でなければならない場合、「完全に規定」される。ヌクレオチド配列（標的ヌクレオチド配列など）中のヌクレオチドは、そのヌクレオチドが、２つ以上の特定のヌクレオチド（例えば、Ｃ又はＡ）であり得るが、任意のヌクレオチド（即ちＮであってはならない）ではあり得ない場合、「部分的に規定される」。ヌクレオチド配列中のヌクレオチド（標的ヌクレオチド配列など）は、そのヌクレオチドが任意のヌクレオチド（即ちＮ）であり得る場合、「規定されていない」。
「互いに固定された順序関係にある」ヌクレオチド配列中のヌクレオチドの群は、ヌクレオチド配列の各実体に対して、ヌクレオチド配列上で同じ順序にあり、同じ数のヌクレオチドによって互いに隔てられているようなヌクレオチドを指す。間隔をあける場合、これは、ヌクレオチド配列の所与の実体におけるヌクレオチドが、全て互いに等間隔である（例えば、全てが互いの間に１つのヌクレオチドを有する）ことを意味しないか又は必要としない。むしろ、これは、ヌクレオチド配列の各実体におけるヌクレオチドが、ヌクレオチド配列の全ての実体と同じヌクレオチドの間隔を有することを意味する。例えば、標的塩基配列（Ｃ／Ｔ）ＮＡＣを考慮されたい。このヌクレオチド配列では、第１ヌクレオチドは、部分的に規定され、第２ヌクレオチドは、規定されず、第３及び第４ヌクレオチドは、完全に規定される。従って、これは、完全に又は部分的に規定された３つのヌクレオチドを含むヌクレオチド配列を表す。間隔に関して、（Ｃ／Ｔ）ヌクレオチドは、それとＡヌクレオチドとの間に１つのヌクレオチドを有し、それとＣヌクレオチドとの間に２つのヌクレオチドを有し；Ａヌクレオチドは、それとＣヌクレオチドとの間にヌクレオチドを含まない。この同じ間隔が、この標的ヌクレオチド配列の各実体に存在することになる。ヌクレオチドの順序に関して、（Ｃ／Ｔ）、Ａ及びＣは、上記の標的ヌクレオチド配列の各実体において同じ順序で出現することになる。
ポリペプチドに関して「単離された」又は「精製された」とは、ポリペプチドが、天然に通常見出される細胞成分（例えば、他のポリペプチド、脂質、炭水化物及び核酸）からある程度分離されることを意味する。精製されたポリペプチドは、非還元ポリアクリルアミドゲル上に単一の主要なバンドを生成することができる。精製されたポリペプチドは、少なくとも約７５％純粋（例えば、少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％又は１００％純粋）であり得る。精製ポリペプチドは、例えば、天然源からの抽出、化学合成又は宿主細胞若しくはトランスジェニック植物における組換え生産によって取得することができ、例えば、アフィニティークロマトグラフィー、免疫沈降、サイズ排除クロマトグラフィー及びイオン交換クロマトグラフィーを用いて精製することができる。精製の程度は、限定するものではないが、カラムクロマトグラフィーを含む任意の適切な方法を用いて測定することができる。
「導入する」とは、接触させることを指す。「接触」又は「接触させること」とは、少なくとも２つの要素間の即時近接又は結合の状態を可能にするか又は促進することを意味する。例えば、塩基エディター、ベクター又は他の薬剤を細胞に導入することは、細胞と塩基エディター、ベクター又は薬剤との間の接触を提供することである。この用語は、任意の適切な製剤中で、任意の適切な手段により、例えば、トランスフェクション、エレクトロポレーション、形質導入、遺伝子銃、ナノ粒子送達などを介して、接触させた塩基エディター、ベクター又は薬剤の細胞内部への浸透を包含する。
用語「発現」は、プロモーターによって駆動される特定のヌクレオチド配列の転写及び／又は翻訳を包含する。「発現ベクター」又は「発現カセット」は、発現させようとするヌクレオチド配列に作動可能に連結された発現制御配列を有する組換えポリヌクレオチドを含むベクターを指す。発現ベクターは、発現に十分なシス作用要素を含み；発現のための他の要素は、宿主細胞によって又はインビトロ発現系内に供給され得る。発現ベクターは、当技術分野で公知のもの全てを含み、例えば コスミド、プラスミド（例えば、裸又はリポソーム中に含まれる）、ファージミド、ＢＡＣ、ＹＡＣ及び組換えポリヌクレオチドを組み込んだウイルスベクター（例えば、レンチウイルス、レトロウイルス、アデノウイルス及びアデノ随伴ウイルスに由来するベクター）が挙げられる。
「作動可能に連結された」又は「作動可能に連結された」という用語は、要素（例えば、調節配列及び異種核酸配列）間の機能的連結を指し、それらがそれらの意図された様式で機能する（例えば、異種核酸配列の発現をもたらす）ことを可能にする。この用語は、そのような配列の転写又は翻訳に影響を与えるように核酸で転写される調節領域及び配列の配置を包含する。例えば、コード配列をプロモーターの制御下に置くために、ポリペプチドの翻訳リーディングフレームの翻訳開始部位は、典型的に、プロモーターの１～約５０ヌクレオチド下流に位置する。しかし、プロモーターは、翻訳開始部位の約５，０００ヌクレオチド上流又は転写開始部位の約２，０００ヌクレオチド上流に配置され得る。プロモーターは、典型的に、少なくともコア（基底）プロモーターを含む。タンパク質に作動可能に連結された細胞小器官局在配列は、連結されたタンパク質が特定の細胞小器官に局在するように指令する。
用語「核局在化配列」又は「ＮＬＳ」は、例えば、核輸送により、細胞核へのペプチド又はタンパク質の移入を促進するアミノ酸配列を指す。核局在化配列は、当技術分野で公知であり、当業者に明らかであろう。例えば、ＮＬＳ配列は、国際ＰＣＴ出願番号ＰＣＴ／欧州特許出願公開第２０００／０１１６９０号明細書に記載されており、その内容は、例示的な核局在化配列の開示内容について参照により本明細書に組み込まれる。
本明細書で使用される用語「有効量」は、所望の生物学的応答を誘発するのに十分である生物学的に活性な薬剤の量を指す。例えば、一部の形態では、有効量の塩基エディターは、標的ヌクレオチド配列の編集を誘導するのに十分な塩基エディターの量を指し得る。当業者には理解されるように、薬剤、例えば、デアミナーゼドメイン又は塩基エディターの有効量は、様々な要因、例えば、所望の生物学的応答、例えば、編集しようとする特定の対立遺伝子、ゲノム又は標的部位、ターゲティングされる細胞若しくは組織及び使用される薬剤に応じて変動し得る。
用語「核酸」及び「核酸分子」は、核酸塩基及び酸部分を含む分子、例えば、ヌクレオシド、ヌクレオチド又はヌクレオチドのポリマーを指す。典型的には、高分子核酸、例えば、３個以上のヌクレオチドを含む核酸分子は、直鎖状分子であり、そこで、隣接するヌクレオチドは、ホスホジエステル結合を介して互いに連結される。一部の形態では、「核酸」は、個々の核酸残基（例えば、ヌクレオチド及び／又はヌクレオシド）を指す。一部の形態では、「核酸」は、３つ以上の個別のヌクレオチド残基を含むオリゴヌクレオチド鎖を指す。本明細書で使用される場合、用語「オリゴヌクレオチド」及び「ポリヌクレオチド」は、互換的に使用されて、ヌクレオチドのポリマー（例えば、少なくとも３つのヌクレオチドの配列）を意味し得る。核酸は、ＲＮＡ並びに一本鎖及び／又は二本鎖ＤＮＡを包含する。核酸は、例えば、ゲノム、転写産物、ｍＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｓｎＲＮＡ、プラスミド、コスミド、染色体、染色分体又は他の天然に存在する核酸分子に関連して天然に存在することができる。一方で、核酸分子は、非天然に存在する分子、例えば組換えＤＮＡ若しくはＲＮＡ、人工染色体、操作ゲノム又はそれらの断片或いは合成ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッドであり得るか、又は非天然のヌクレオチド若しくはヌクレオシドを含む。さらに、用語「核酸」、「ＤＮＡ」、「ＲＮＡ」及び／又は類似の用語は、核酸類似体、例えばホスホジエステル骨格以外を有する類似体を含む。核酸は、天然源から精製し、組換え発現系を用いて製造し、任意選択で精製し、化学合成することなどができる。適切な場合、例えば化学合成された分子の場合、核酸は、化学的に修飾された塩基又は糖及び骨格修飾を有する類似体などのヌクレオシド類似体を含むことができる。核酸配列は、特に指示がない限り、５’～３’方向に表示される。一部の形態では、核酸は、天然ヌクレオシド（例えば、アデノシン、チミジン、グアノシン、シチジン、ウリジン、デオキシアデノシン、デオキシチミジン、デオキシグアノシン及びデオキシシチジン）；ヌクレオシド類似体（例えば、２－アミノアデノシン、２－チオチミジン、イノシン、ピロロ－ピリミジン、３－メチルアデノシン、５－メチルシチジン、２－アミノアデノシン、Ｃ５－ブロモウリジン、Ｃ５－フルオロウリジン、Ｃ５－ヨードウリジン、Ｃ５－プロピニル－ウリジン、Ｃ５－プロピニル－シチジン、Ｃ５－メチルシチジン、２－アミノアデノシン、７－デアザアデノシン、７－デアザグアノシン、８－オキソアデノシン、８－オキソグアノシン、Ｏ（６）－メチルグアニン及び２－チオシチジン）；化学的に修飾された塩基；生物学的に修飾された塩基（例えば、メチル化塩基）；インターカレートされた塩基；修飾糖（例えば、２’－フルオロリボース、リボース、２’－デオキシリボース、アラビノース及びヘキソース）；並びに／又は修飾されたリン酸基（例えば、ホスホロチオエート及び５’－Ｎ－ホスホロアミダイト結合）であるか又はそれらを含む。
用語「ペプチド」は、互いに化学的に結合したアミノ酸から構成される化合物のクラスを指す。一般に、アミノ酸は、アミド結合（ＣＯＮＨ）を介して化学的に結合する。しかし、アミノ酸は、当技術分野で公知の他の化学結合によって互いに結合することができる。例えば、アミノ酸はアミン結合によって結合することができる。本明細書で使用されるペプチドとしては、ポリペプチドなど、アミノ酸並びに大及び小ペプチドのオリゴマーを含む。従って、用語「タンパク質」、「ペプチド」及び「ポリペプチド」は、本明細書で互換的に使用される。タンパク質、ペプチド又はポリペプチドは、任意のサイズ、構造又は機能のものであり得る。タンパク質、ペプチド又はポリペプチドは、単一分子でもあり得るか又は多分子複合体であり得る。タンパク質、ペプチド又はポリペプチドは、天然に存在するタンパク質又はペプチドの断片にすぎない。タンパク質、ペプチド又はポリペプチドは、天然に存在する、組換え若しくは合成又はそれらの任意の組合せであり得る。
用語「パーセント（％）配列同一性」は、最大パーセント配列同一性を達成するために、配列をアラインメントし、必要に応じて、ギャップを導入した後、参照核酸配列中のヌクレオチド又はアミノ酸と同一である候補配列中のヌクレオチド又はアミノ酸のパーセンテージを表す。配列同一性パーセントの決定を目的とするアラインメントは、当業者の技術の範囲内にある様々な方法で、例えば、ＢＬＡＳＴ、ＢＬＡＳＴ－２、ＡＬＩＧＮ、ＡＬＩＧＮ－２又はＭｅｇａｌｉｇｎ（ＤＮＡＳＴＡＲ）ソフトウェアなどの一般に利用可能なコンピューターソフトウェアを使用して、達成することができる。アラインメントを測定するための適切なパラメーターは、比較対象の配列の全長にわたって最大のアラインメントを達成するのに必要な任意のアルゴリズムを含む公知の方法により決定することができる。
「同一性」は、Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ｌｅｓｋ，Ａ．Ｍ．，Ｅｄ．，Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９８８；Ｂｉｏｃｏｍｐｕｔｉｎｇ：Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ ａｎｄ Ｇｅｎｏｍｅ Ｐｒｏｊｅｃｔｓ，Ｓｍｉｔｈ，Ｄ．Ｗ．，Ｅｄ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９９３；Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｄａｔａ，Ｐａｒｔ Ｉ，Ｇｒｉｆｆｉｎ，Ａ． Ｍ．，ａｎｄ Ｇｒｉｆｆｉｎ，Ｈ．Ｇ．，Ｅｄｓ．，Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｊｅｒｓｅｙ，１９９４；Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，ｖｏｎ Ｈｅｉｎｊｅ，Ｇ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，１９８７；及びＳｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｐｒｉｍｅｒ，Ｇｒｉｂｓｋｏｖ，Ｍ．ａｎｄ Ｄｅｖｅｒｅｕｘ，Ｊ．，Ｅｄｓ．，Ｍ Ｓｔｏｃｋｔｏｎ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９９１；及びＣａｒｉｌｌｏ，Ｈ．，ａｎｄ Ｌｉｐｍａｎ，Ｄ．，ＳＩＡＭ Ｊ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｍａｔｈ．，４８：１０７３（１９８８）に記載されるものを含むが、これらに限定されない公知の方法によって容易に計算することができる。同一性を決定するための好ましい方法は、試験された配列間で最大の一致が得られるように設計される。同一性及び類似性を決定する方法は、一般に利用可能なコンピュータプログラムで体系化される。２つの配列間の同一性パーセントは、Ｎｅｅｄｅｌｍａｎ ａｎｄ Ｗｕｎｓｃｈ（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，４８：４４３－４５３，９７０）アルゴリズム（例えば、ＮＢＬＡＳＴ及びＸＢＬＡＳＴ）を組み込んだ解析ソフトウェア（即ちＧｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ，Ｍａｄｉｓｏｎ Ｗｉｓ．のＳｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｐａｃｋａｇｅ）を用いて決定することができる。一部の形態では、デフォルトパラメータを使用して、本開示のポリヌクレオチド又はポリペプチドの同一性を決定することができる。
一部の形態では、所与の核酸又はアミノ酸配列Ｄへの、その配列との若しくはその配列に対する所与の核酸又はアミノ酸配列Ｃの％配列同一性（代わりに所与の配列Ｄへの、その配列との若しくはその配列に対する特定の％配列同一性を有するか又は含む所与の配列Ｃと表すこともできる）は、
分数Ｗ／Ｚの１００倍
のように計算され、式中、Ｗは、Ｃ及びＤのそのプログラムのアラインメントにおいて、配列アラインメントプログラムにより同一のマッチとしてスコアリングされるヌクレオチド又はアミノ酸の数であり、Ｚは、Ｄ中のヌクレオチド又はアミノ酸の総数である。配列Ｃの長さが配列Ｄの長さと等しくない場合、ＣからＤの％配列同一性は、ＤからＣの％配列同一性と等しくないことは理解されるであろう。
本明細書で使用される場合、用語「対象」は、任意の個体、生物又は実体を意味する。対象は、脊椎動物、例えば、哺乳動物であり得る。従って、対象は、ヒト又は動物、例えばマウス、ラット、ウサギ、ヤギ、ブタ、線虫、チンパンジー若しくはウマであり得る。この用語は、特定の年齢又は性別を示すものではない。従って、男性若しくは女性にかかわらず、成人及び新生児の対象、さらに胎児も包含されることを意図する。対象は、健康であるか、又は疾患、障害若しくは状態に罹患しているか若しくはそれに罹患しやすい。患者とは、疾患又は障害に罹患している対象を指す。「患者」という用語は、ヒト及び獣医学的対象を含む。
本明細書における値の範囲の列挙は、本明細書に別段の指示がない限り、範囲内に入る別個の値各々を個別に指す簡潔な方法として使用されることを意図するにすぎず、別個の値の各々は、あたかも本明細書に個別に列挙されたのと同じように本明細書に組み込まれる。
核酸シーケンスロゴに関連して使用される「ビット」という用語は、所与の核酸シーケンスロゴ内の核酸に対応する文字の高さの尺度である。核酸シーケンスロゴは、その配列内の各位置における核酸に対応する文字のスタックを含む。文字の相対的なサイズは、多数のアラインメントされた核酸配列における対応する核酸の頻度を示す。文字の全高は、位置の情報内容をビット単位で表す。
「約」という用語の使用は、約＋／－１０％の範囲で、記載される値より上又は下いずれかの値を表すことを意図するものであり；他の形態では、値は、約＋／－５％の範囲で、記載の値より上又は下いずれかの値の範囲にある可能性があり；他の形態では、値は、約＋／－２％の範囲で、記載された値より上又は下いずれかの値の範囲にある可能性があり；他の形態では、値は、約＋／－１％の範囲で、記載の値より上又は下いずれかの値の範囲にあり得る。先行する範囲は、文脈から明確にされることが意図され、それ以上の限定は含意されない。
ＩＩ．組成物
核酸をターゲティング及び編集するための試薬及び組成物が開示される。このような試薬及び組成物は、一本鎖及び／又は二本鎖ＤＮＡ中の標的ヌクレオチドを脱アミノ化することができるシトシンデアミナーゼドメインを含む。特定の標的配列を認識し、且つ／又はそれに結合するＣａｓ９、Ｃｐｆ１、ＺＦ、ＴＡＬＥなどの１つ以上のターゲティングドメインと組み合わせて、そのようなデアミナーゼドメインを含有する非天然の又は操作されたＤＮＡ塩基エディターも開示される。塩基エディターは、低いオフターゲット効果を伴って、細胞又は対象のゲノム内、例えばヒトミトコンドリアゲノム内での標的化部位の特異的且つ効率的な編集を促進する。
二本鎖ＤＮＡデアミナーゼ活性を有する非天然のポリペプチドである１つ以上の機能性デアミナーゼタンパク質を含む組成物が記載される。一般に、組成物は、二本鎖ＤＮＡデアミナーゼ活性を付与する１つ以上の最小ドメインを含む。例示的なタンパク質ドメインは、配列番号１～１６、１８～１９若しくは４０～６７のいずれかのアミノ酸配列又は配列番号１～１６、１８～１９若しくは４０～６７のいずれかに対して少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列の対応領域に対応する。
一部の形態では、組成物は、機能性デアミナーゼドメイン内の切断部位でデアミナーゼタンパク質を切断することによって得られる機能性二本鎖ＤＮＡデアミナーゼタンパク質の非天然由来ポリペプチド断片を含む。例えば、一部の形態では、断片はＮ末端断片に対応し、断片は、切断された機能性デアミナーゼドメインのＮ末端部分を含む。他の形態では、断片は、Ｃ末端断片に対応し、断片は、切断された機能性デアミナーゼドメインのＣ末端部分を含む。デアミナーゼ活性は、Ｎ末端断片をＣ末端断片と共局在させるか、又はＣ末端断片をＮ末端断片と共局在させると回復される。
第１及び第２モノマーを有するヘテロ二量体を含む塩基エディターも記載され、第１モノマーは、第１のプログラマブルＤＮＡ結合タンパク質と、切断された二本鎖ＤＮＡデアミナーゼのＮ末端又はＣ末端断片を含み、及び第２モノマーは、第２のプログラマブルＤＮＡ結合タンパク質と、切断された二本鎖ＤＮＡデアミナーゼのＮ末端又はＣ末端断片を含む。典型的には、第１及び第２モノマーの二量体化は、機能性二本鎖ＤＮＡデアミナーゼタンパク質及び機能性二本鎖ＤＮＡデアミナーゼ活性を再形成する。一部の形態では、第１及び／又は第２のプログラマブルＤＮＡ結合タンパク質は、同じである。他の形態では、第１及び／又は第２のプログラマブルＤＮＡ結合タンパク質は、異なる。例示的な第１及び／又は第２のプログラマブルＤＮＡ結合タンパク質は、Ｃａｓドメイン（例えば、Ｃａｓ９）、ニッカーゼ、ジンクフィンガータンパク質、ＴＡＬＥタンパク質及びＴＡＬＥ様タンパク質を含む。従って、一部の形態では、塩基エディターは、第１及び第２のモノマーを有するヘテロ二量体を含み、その際、第１のモノマーは、Ｃａｓドメイン、ニッカーゼ、ジンクフィンガータンパク質又はＴＡＬＥタンパク質；及び切断された二本鎖ＤＮＡデアミナーゼのＮ末端又はＣ末端断片を含み、及び第２のモノマーは、Ｃａｓドメイン、ニッカーゼ、ジンクフィンガータンパク質又はＴＡＬＥタンパク質；並びに切断された二本鎖ＤＮＡデアミナーゼの第２のプログラマブルＤＮＡ結合タンパク質及びＮ末端又はＣ末端断片を含み、それにより、第１及び第２モノマーの二量体化は、二本鎖ＤＮＡデアミナーゼ活性を回復させる。例示的なＣａｓドメインとしては、Ｃａｓ９、Ｃａｓｌ２ｅ、Ｃａｓｌ２ｄ、Ｃａｓｌ２ａ、Ｃａｓｌ２ｂｌ、Ｃａｓ１３ａ、Ｃａｓｌ２ｃ及びアルゴノートが挙げられる。
一部の形態では、塩基エディターは、リンカーを含む。リンカーは、より高い効率又は拡張された若しくはより狭い活性ウィンドウに適応するように、設計パラメーターに基づいてリジッド又はフレキシブルにすることができる。例えば、一部の形態では、第１のモノマーは、第１のプログラマブルＤＮＡ結合タンパク質を、切断された二本鎖ＤＮＡデアミナーゼのＮ末端又はＣ末端断片と連結するリンカーを含む。一部の形態では、第２のモノマーは、第１のプログラマブルＤＮＡ結合タンパク質を、切断された二本鎖ＤＮＡデアミナーゼのＮ末端又はＣ末端断片と連結するリンカーを含む。例示的なリンカーは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９又は５０アミノ酸を含む。好ましいリンカーとしては、２～１０個のアミノ酸が挙げられる。
一部の形態では、塩基エディターは、１つ以上のウラシルグリコシラーゼ阻害剤（ＵＧＩ）ドメイン及び／又は１つ以上のターゲティング配列を含む。例示的なターゲティング配列としては、核局在化配列（ＮＬＳ）、ミトコンドリアターゲティング配列（ＭＴＳ）が挙げられる。
例示的なＭＴＳ配列としては、ＳＯＤ２配列及びＣＯＸ８配列が挙げられる。
従って、特定の形態では、塩基エディターは、以下の構造：
［Ａ］－［プログラマブルＤＮＡ結合タンパク質］－［切断された二本鎖ＤＮＡデアミナーゼのＮ末端若しくはＣ末端断片］－［Ｂ］；又は
［Ａ］－［切断された二本鎖ＤＮＡデアミナーゼのＮ末端若しくはＣ末端断片］［プログラマブルＤＮＡ結合タンパク質］－［Ｂ］
の１つを有する第１及び／又は第２のモノマーを含み、
「［Ａ］」及び／又は「［Ｂ］」は、任意の１つ以上の追加の機能性ドメインを表し、「］－［」は、任意のリンカーである。
例示的な形態では、塩基エディターは以下の構造：
［ＳＯＤ２］－［ＵＧＩ］（１－２）－［ｍｉｔｏＴＡＬＥ］－［切断された二本鎖ＤＮＡデアミナーゼのＮ末端又はＣ末端断片］－［ＵＧＩ］（１－２）
を有する。
一部の形態では、第１及び第２のモノマーは、標的部位の片側で第１及び第２のヌクレオチド配列にそれぞれ結合する。例示的な標的部位は、塩基エディターによって脱アミノ化される標的塩基を含む。一部の形態では、標的塩基は、Ｃである。例えば、一部の形態では、Ｃは、５’－ＴＣ－３’配列コンテキスト内にある。他の形態では、Ｃは、５’－ＴＣＣ－３’配列コンテキスト内にある。典型的には、ヌクレオチド配列は、塩基エディターによって脱アミノ化される標的塩基と同じ鎖上にそれぞれ存在する。特定の形態では、第１及び第２のヌクレオチド配列は、塩基エディターによって脱アミノ化される標的塩基を含む鎖と同じ鎖上にそれぞれある。別の形態では、第１及び第２のヌクレオチド配列は、塩基エディターによって脱アミノ化される標的塩基を含む鎖とは反対側の鎖上にそれぞれある。一部の形態では、第１及び第２のヌクレオチド配列は、対向する鎖上にある。
１つ以上のガイドＲＮＡを含む塩基エディターも記載される。例えば、一部の形態では、第１及び／又は第２のプログラマブルＤＮＡ結合タンパク質は、核酸プログラマブルＤＮＡ結合タンパク質であり、１つ以上のガイドＲＮＡは、塩基エディターを指令して、第１又は第２のヌクレオチド配列の標的部位に結合させる。塩基エディターの第１又は第２のモノマーをコードする単離核酸も記載される。塩基エディターの第１又は第２のモノマーをコードする単離核酸を含むベクターも記載される。塩基エディターの第１又は第２のモノマーをコードする単離された核酸を含有するベクターを含む細胞も記載される。
Ａ．デアミナーゼドメイン
デアミナーゼ、デアミナーゼドメイン及びそのようなデアミナーゼドメインを含むポリペプチドが開示される。「デアミナーゼ」又は「デアミナーゼドメイン」は、ポリペプチドタンパク質又は脱アミノ化反応を触媒する酵素を指す。脱アミノ化反応は、限定するものではないが、窒素塩基（例えば、シトシン、アデニン）などの分子からのアミノ基の除去を含む。一部の形態では、窒素塩基は、ヌクレオシド、ヌクレオチド又は核酸の一部である。従って、開示されるデアミナーゼは、遊離塩基、遊離ヌクレオシド、遊離ヌクレオチド及び／又はポリヌクレオチドの脱アミノ化を触媒することができる。一部の形態では、デアミナーゼドメインは、リボ核酸（ＲＮＡ）又はデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）基質中の窒素塩基を脱アミノ化することができる。一部の形態では、デアミナーゼドメインは、ＲＮＡ及びＤＮＡの両方の脱アミノ化を触媒する。ＲＮＡ又はＤＮＡ基質は、一本鎖（ｓｓ）又は二本鎖（ｄｓ）であり得る。一部の形態では、デアミナーゼドメインは、ｓｓＤＮＡ又はｄｓＤＮＡの脱アミノ化を触媒する。一部の形態では、デアミナーゼドメインは、ｓｓＤＮＡ及びｄｓＤＮＡの両方の脱アミノ化を触媒する。
本明細書中で提供されるデアミナーゼドメインは、任意の生物由来であり得る。従って、デアミナーゼドメインは、原核生物又は真核生物由来であり得る。一部の形態では、デアミナーゼは、脊椎動物デアミナーゼ又は無脊椎動物デアミナーゼである。一部の形態では、デアミナーゼドメインは、ヒト、チンパンジー、ゴリラ、サル、ウシ、イヌ、ラット、マウス、魚類、ハエ、蠕虫、真菌、細菌、ウイルス又はバクテリオファージデアミナーゼドメインである。
好ましい形態では、デアミナーゼドメインを取得することができる生物として、限定されないが、以下が挙げられる：スケルマネラ・スティビイレジスタンス（Ｓｋｅｒｍａｎｅｌｌａ ｓｔｉｂｉｉｒｅｓｉｓｔｅｎｓ）、エリスランテ・グッタタ（Ｅｒｙｔｈｒａｎｔｈｅ ｇｕｔｔａｔａ）、シトラス・シネンシス（Ｃｉｔｒｕｓ ｓｉｎｅｎｓｉｓ）、ヒドロカルボニファガ・ダチンゲンシス（Ｈｙｄｒｏｃａｒｂｏｎｉｐｈａｇａ ｄａｑｉｎｇｅｎｓｉｓ）、チエゲモステリウム・ラクテウム（Ｔｉｅｇｈｅｍｏｓｔｅｌｉｕｍ ｌａｃｔｅｕｍ）、サプロレグニア・パラシチカ（Ｓａｐｒｏｌｅｇｎｉａ ｐａｒａｓｉｔｉｃａ）、ビトレラ・ブラシカフォルミス（Ｖｉｔｒｅｌｌａ ｂｒａｓｓｉｃａｆｏｒｍｉｓ）、リーシュマニア・インファンタム（Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ ｉｎｆａｎｔｕｍ）、シモンシエラ・ムエレリ（Ｓｉｍｏｎｓｉｅｌｌａ ｍｕｅｌｌｅｒｉ）、クロストリジウム・バクテリウム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａｌｅｓ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、キブデロスポランギウム・アリダム（Ｋｉｂｄｅｌｏｓｐｏｒａｎｇｉｕｍ ａｒｉｄｕｍ）、デスモスポラ・アクティバ（Ｄｅｓｍｏｓｐｏｒａ ａｃｔｉｖａ）、ナイセリア・ゴノロエア（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ）、バチルス・アサヒ（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｓａｈｉｉ）、サエジア・サンギニス（Ｓａｅｚｉａ ｓａｎｇｕｉｎｉｓ）、炭疽菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｎｔｈｒａｃｉｓ）、ハンガテイクロストリジウム・クラリフラバム（Ｈｕｎｇａｔｅｉｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｃｌａｒｉｆｌａｖｕｍ）、ルミノコッカス属（Ｒｕｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．）ＣＡＧ：５６３、クロストリジウム・ディスポリカム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｄｉｓｐｏｒｉｃｕｍ）、ウメザワエア・タンジェリナ（Ｕｍｅｚａｗａｅａ ｔａｎｇｅｒｉｎａ）、コンキフォルミビウス・スティーダエ（Ｃｏｎｃｈｉｆｏｒｍｉｂｉｕｓ ｓｔｅｅｄａｅ）、ストレプトマイセス・セリカラー（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ）、ストレプトマイセス科細菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｔａｃｅａｅ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ）ＭＰ１１３－０５、ベルコシスポラ属（Ｖｅｒｒｕｃｏｓｉｓｐｏｒａ ｓｐ．）ＬＨＷ６３０１４、ビブリオ・アエロゲネス（Ｖｉｂｒｉｏ ａｅｒｏｇｅｎｅｓ）、フザリウム・オキシスポラム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ）、バーティシリウム・ロンギスポラム（Ｖｅｒｔｉｃｉｌｌｉｕｍ ｌｏｎｇｉｓｐｏｒｕｍ）、コンドロマイセス・クロカツス（Ｃｈｏｎｄｒｏｍｙｃｅｓ ｃｒｏｃａｔｕｓ）、キタサトスポラ・アウレオファシエンス（Ｋｉｔａｓａｔｏｓｐｏｒａ ａｕｒｅｏｆａｃｉｅｎｓ）、コレトトリクム・オーキドフィラム（Ｃｏｌｌｅｔｏｔｒｉｃｈｕｍ ｏｒｃｈｉｄｏｐｈｉｌｕｍ）、ノノムラエア・ソラニ（Ｎｏｎｏｍｕｒａｅａ ｓｏｌａｎｉ）、アキマリナ・スポンギアエ（Ａｑｕｉｍａｒｉｎａ ｓｐｏｎｇｉａｅ）、ディポドミス・オルディ（Ｄｉｐｏｄｏｍｙｓ ｏｒｄｉｉ）、パタジオエナス・ファシアタ・モニリス（Ｐａｔａｇｉｏｅｎａｓ ｆａｓｃｉａｔａ ｍｏｎｉｌｉｓ）、ストレプトマイセス・フェオルテイグリセウス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｐｈａｅｏｌｕｔｅｉｇｒｉｓｅｕｓ）、イクタルス・プンクタトゥス（Ｉｃｔａｌｕｒｕｓ ｐｕｎｃｔａｔｕｓ）、コリネスポラ・カッシコラ（Ｃｏｒｙｎｅｓｐｏｒａ ｃａｓｓｉｉｃｏｌａ）、プラティステルノン・メガセファラム（Ｐｌａｔｙｓｔｅｒｎｏｎ ｍｅｇａｃｅｐｈａｌｕｍ）、ストレプトマイセス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｓｐ．）ＡＣ１－４２Ｗ、ギメシア・マリス（Ｇｉｍｅｓｉａ ｍａｒｉｓ）、バークホルデリア・グルマエ（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｇｌｕｍａｅ）、ナカムレラ・マルチパルティタ（Ｎａｋａｍｕｒｅｌｌａ ｍｕｌｔｉｐａｒｔｉｔａ）、スタッケブランティア・ナッサウエンシス（Ｓｔａｃｋｅｂｒａｎｄｔｉａ ｎａｓｓａｕｅｎｓｉｓ）、キタサトスポラ・セタエ（Ｋｉｔａｓａｔｏｓｐｏｒａ ｓｅｔａｅ）、アスペルギルス・カワチイ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｋａｗａｃｈｉｉ）、ストレプトマイセス・ツルギディスカベス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｔｕｒｇｉｄｉｓｃａｂｉｅｓ）、アノリス・カロリンシス（Ａｎｏｌｉｓ ｃａｒｏｌｉｎｅｎｓｉｓ）、セラチア・ルビダエ（Ｓｅｒｒａｔｉａ ｒｕｂｉｄａｅａ）、ルミニクロストリジウム・セルロリチカム（Ｒｕｍｉｎｉｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｃｅｌｌｕｌｏｌｙｔｉｃｕｍ）、アロアクチノシンネマ・イラニカム（Ａｌｌｏａｃｔｉｎｏｓｙｎｎｅｍａ ｉｒａｎｉｃｕｍ）、フォトラブドゥス・ラウモンディ（Ｐｈｏｔｏｒｈａｂｄｕｓ ｌａｕｍｏｎｄｉｉ）、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）、黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）、チフス菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉ）、シュワネラ・プトレファシエンス（Ｓｈｅｗａｎｅｌｌａ ｐｕｔｒｅｆａｃｉｅｎｓ）、インフルエンザ菌（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ，）、カウロバクター・クレセントス（Ｃａｕｌｏｂａｃｔｅｒ ｃｒｅｓｃｅｎｔｕｓ）、枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）及びカエノラブディティス・エレガンス（Ｃａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ ｅｌｅｇａｎｓ）。
一部の形態では、デアミナーゼドメインを取得することができる生物として、限定されないが、以下が挙げられる：スケルマネラ属種（Ｓｋｅｒｍａｎｅｌｌａ ｓｐ．）、エリスランテ属種（Ｅｒｙｔｈｒａｎｔｈｅ ｓｐ．）、シトラス属種（Ｃｉｔｒｕｓ ｓｐ．）、ヒドロカルボニファガ属種（Ｈｙｄｒｏｃａｒｂｏｎｉｐｈａｇａ ｓｐ．）、チエゲモステリウム属（Ｔｉｅｇｈｅｍｏｓｔｅｌｉｕｍ ｓｐ．）、サプロレグニア属種（Ｓａｐｒｏｌｅｇｎｉａ ｓｐ．）、ビトレラ属種（Ｖｉｔｒｅｌｌａ ｓｐ．）、リーシュマニア属種（Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ ｓｐ．）、シモンシエラ属種（Ｓｉｍｏｎｓｉｅｌｌａ ｓｐ．）、クロストリジウム属（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａｌｅｓ ｓｐ．）、キブデロスポランギウム属（Ｋｉｂｄｅｌｏｓｐｏｒａｎｇｉｕｍ ｓｐ．）、デスモスポラ種（Ｄｅｓｍｏｓｐｏｒａ ｓｐ．）、ナイセリア属種（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｓｐ．）、バチルス属種（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．）、サエジア属種（Ｓａｅｚｉａ ｓｐ．）、バチルス属種（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．）、ハンガテイクロストリジウム属種（Ｈｕｎｇａｔｅｉｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｓｐ．）、ルミノコッカス属種（Ｒｕｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．）、クロストリジウム属種（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｓｐ．）、ウメザワエア属種（Ｕｍｅｚａｗａｅａ ｓｐ．）、コンキフォルミビウス属種（Ｃｏｎｃｈｉｆｏｒｍｉｂｉｕｓ ｓｐ．）、ストレプトマイセス属種（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｓｐ．）、ストレプトマイセス科種（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｔａｃｅａｅ ｓｐ．）、ベルコシスポラ属種（Ｖｅｒｒｕｃｏｓｉｓｐｏｒａ ｓｐ．）、ビブリオ属種（Ｖｉｂｒｉｏ ｓｐ．）、フザリウム属種（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｓｐ．）、バーティシリウム属種（Ｖｅｒｔｉｃｉｌｌｉｕｍ ｓｐ．）、コンドロマイセス属種（Ｃｈｏｎｄｒｏｍｙｃｅｓ ｓｐ．）、キタサトスポラ属種（Ｋｉｔａｓａｔｏｓｐｏｒａ ｓｐ．）、コレトトリクム属種（Ｃｏｌｌｅｔｏｔｒｉｃｈｕｍ ｓｐ．）、ノノムラエア属（Ｎｏｎｏｍｕｒａｅａ ｓｐ．）、アキマリーナ属種（Ａｑｕｉｍａｒｉｎａ ｓｐ．）、ディポドミス属種（Ｄｉｐｏｄｏｍｙｓ ｓｐ．）、パタジオエナス属種（Ｐａｔａｇｉｏｅｎａｓ ｓｐ．）、イクタルス属種（Ｉｃｔａｌｕｒｕｓ ｓｐ．）、コリネスポラ属種（Ｃｏｒｙｎｅｓｐｏｒａ ｓｐ．）、プラティステルノン属種（Ｐｌａｔｙｓｔｅｒｎｏｎ ｓｐ．）、ストレプトマイセス属種（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｓｐ．）、ギメシア属種（Ｇｉｍｅｓｉａ ｓｐ．）、バークホルデリア属種（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｓｐ．）、ナカムレラ属種（Ｎａｋａｍｕｒｅｌｌａ ｓｐ．）、スタッケブランティア属種（Ｓｔａｃｋｅｂｒａｎｄｔｉａ ｓｐ．）、キタサトスポラ属種（Ｋｉｔａｓａｔｏｓｐｏｒａ ｓｐ．）、アスペルギルス属種（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｓｐ．）、アノリス属種（Ａｎｏｌｉｓ ｓｐ．）、セラチア属種（Ｓｅｒｒａｔｉａ ｓｐ．）、ルミニクロストリジウム属（Ｒｕｍｉｎｉｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｓｐ．）、アロアクチノシンネマ属種（Ａｌｌｏａｃｔｉｎｏｓｙｎｎｅｍａ ｓｐ．）、フォトラブドゥス属種（Ｐｈｏｔｏｒｈａｂｄｕｓ ｓｐ．）、エシェリヒア属種（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｓｐ．）、ブドウ球菌属種（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．）、サルモネラ属種（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｓｐ．）、シュワネラ属種（Ｓｈｅｗａｎｅｌｌａ ｓｐ．）、ヘモフィルス属種（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｓｐ．）、カウロバクター属種（Ｃａｕｌｏｂａｃｔｅｒ ｓｐ．）、バチルス属種（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．）及びカエノラブディティス属種（Ｃａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ ｓｐ．）。
開示されるデアミナーゼ又はデアミナーゼドメインは、任意の公知のデアミナーゼクラン（ｃｌａｎ）又はファミリーに属し得る。例えば、その全体が参照により本明細書に援用されるＩｙｅｒ ＬＭ，ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，３９（２２）：９４７３－９７（２０１１）を参照されたい。例示的なデアミナーゼクランとして、限定されないが、以下が挙げられる：ＣＤＤ／ＣＤＡシチジンデアミナーゼ、ブラストサイジンＳ－デアミナーゼ（ＢＳＤ）、植物Ｄｅｓ／Ｃｄａ、ＬｍｊＦ３６．５９４０様、ＰＩＴＧ＿０６５９９様、ＤＹＷ様、ＢＵＲＰＳ６６８＿１１２２、Ｐｐｕｔ＿２６１３、ＳＣＰ１．２０１、ＹｗｑＪ、ＭａｆＢ１９、ＴａｄＡ－Ｔａｄ２（ＡＤＡＴ２）、Ｂｄ３６１４、Ｔａｄ１、ＲｉｂＤ様（ジアミノ－ヒドロキシ－ホスホリボシルアミノピリミジンデアミナーゼ）、グアニンデアミナーゼ、ｄＣＭＰデアミナーゼ及びＣｏｍＥ、ＡＩＤ／ＡＰＯＢＥＣ、ＺＫ２８７．１、Ｂ３ｇｐ４５、ＸＯＯ＿２８９７並びにＯＴＴ＿１５０８（Ｉｙｅｒ ＬＭらの表１を参照されたい）。好ましい形態では、デアミナーゼ又はデアミナーゼドメインは、シチジンデアミナーゼ様（ＣＤＡ）、ＭａｆＢ１９様デアミナーゼ、ＳＣＰ１２０１－ｄｅａｍ、ＳＮＡＤ１、ＳＮＡＤ２、ＳＮＡＤ４、ＣＭＰ／ｄＣＭＰ、Ｐｐｕｔ２６１３－ｄｅａｍ、ＬｍｊＦ３６５９４０－ｄｅａｍ、ＬｏｘＩ＿Ｎ、ＤＡＡＤ、ＤＹＷ、ＹｗｑＪ－デアミナーゼ又はＳＵＫＨ－４ファミリーに由来する。
ＣＤＡクランは、アデノシン、シトシン、グアニン及びシチジンに作用する遊離ヌクレオチドと核酸デアミナーゼの両方を含み、総称してデアミナーゼスーパーファミリーとして知られている。保存されたフォールドは、２１３４オーダーの３つのらせんと４つのストランドを有する３層のα／β／α構造からなる（Ｌｉａｗ ＳＨ，ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．，２７９：３５４７９－３５４８５（２００４）；Ｉｙｅｒ ＬＭ，ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，３９（２２）：９４７３－９７（２０１１））。このスーパーファミリーは、らせん（らせん４）の存在に基づいて２つの主要な部分にさらに区分され、上記のらせんは、その存在下で末端鎖（鎖４及び５）を互いに平行にするか又は非存在下で逆平行にする。デアミナーゼの活性部位は、保存されたらせん２及び３間に亜鉛イオンを配位する３つの残基で構成される。残基は、通常、らせん２及び３の最初にある［ＨＣＤ］ｘＥ及びＣｘｘＣモチーフとして見出される。亜鉛イオンは水分子を活性化し、水分子はアミン基に結合する炭素原子と四面体中間体を形成する。これに続いて、塩基の脱アミノ化が起こる。ＭａｆＢ１９様デアミナーゼファミリーは、ナイセリア（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ）ＭａｆＢ１９によってプロトタイピングされた核酸／ヌクレオチドデアミナーゼスーパーファミリーのメンバーである。このファミリーのメンバーは、細菌の幅広い系統発生範囲に存在し、細菌多型毒素系の毒素として機能すると予測される。ＳＣＰ１．２０１様デアミナーゼは、ストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）ＳＣＰ１．２０１によってプロトタイピングされた核酸／ヌクレオチドデアミナーゼスーパーファミリーのメンバーである。このファミリーのメンバーは、細菌多型毒素系の毒素として機能すると予測される。
デアミナーゼ又はデアミナーゼドメインは、細菌など、前述のいずれかを含む生物由来の天然デアミナーゼの変異体であり得る。一部の形態では、デアミナーゼ又はデアミナーゼドメインは、天然には存在しない。例えば、一部の形態では、デアミナーゼ又はデアミナーゼドメインは、天然に存在するデアミナーゼドメインに対して少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％又は少なくとも９９．５％の配列同一性を示す。
デアミナーゼ又はデアミナーゼドメインのサイズは変動し得る。一部の形態では、デアミナーゼ又はデアミナーゼドメインは、約５０～２５０、５０～２００、５０～１５０、５０～１００、１００～２５０、１００～２００、１００～１５０、１００～１２０、１２０～１６０、１２０～１４０、１４０～１６０、１５０～２５０、１５０～２００、２００～２５０又は２００～２２０アミノ酸長である。一部の形態では、デアミナーゼ又はデアミナーゼドメインは、約４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、２１０、２２０、２３０、２４０又は２５０アミノ酸長である。
一部の形態では、開示されるデアミナーゼ又はデアミナーゼドメインは、２つ以上の別個の部分（例えば、２、３、４又は５）に分割することができる。このような形態では、スプリットデアミナーゼドメインは、小成分が結合されて（例えば、共発現若しくは共導入された）、且つ／又は一緒に近接された（例えば、ＤＮＡ標的ドメインにより）場合にのみ、基質を脱アミノ化することができる。例えば、実施例１は、単一のデアミナーゼドメインをＮ末端部分とＣ末端部分に分離することができ、それらの結合時にデアミナーゼ活性を示すことを実証する。当業者であれば、デアミナーゼドメインを異なる位置で分割することができることを理解し、その相補的成分の結合時にデアミナーゼ活性を保持する目的で、単一のデアミナーゼドメインをどこで分割するべきかを決定することができるであろう。
一部の形態では、デアミナーゼドメインは、シトシンデアミナーゼ（本明細書ではシチジンデアミナーゼとも呼ばれる）であり、これは、シチジン又はシトシンの加水分解脱アミノ化を触媒する。一部の形態では、シトシンデアミナーゼは、シチジン又はデオキシシチジンのウリジン又はデオキシウリジンの加水分解脱アミノ化をそれぞれ触媒する。一部の形態では、シトシンデアミナーゼドメインは、シトシンのウラシルへの加水分解脱アミノ化を触媒する。
一部の形態では、デアミナーゼドメインは、アデノシンデアミナーゼ（本明細書ではアデニンデアミナーゼとも称される）であり、これは、アデニン又はアデノシンの加水分解脱アミノ化を触媒する。一部の形態では、アデノシンデアミナーゼは、アデノシン又はデオキシアデノシンのイノシン又はデオキシイノシンへの加水分解脱アミノ化をそれぞれ触媒する。
特定の形態では、単離されたデアミナーゼドメインが開示され、デアミナーゼドメインは、二本鎖ＤＮＡを脱アミノ化することができる。デアミナーゼドメインは、標的ヌクレオチド配列を含まない二本鎖ＤＮＡ上のデアミナーゼドメインのデアミナーゼ活性と比較して、標的ヌクレオチド配列を含む二本鎖ＤＮＡ上で、より大きいデアミナーゼ活性を有することができる。好ましくは、標的ヌクレオチド配列は、２つ以上の標的ヌクレオチド（例えば、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ、１０又はそれを超える）を含み、標的ヌクレオチドは、それぞれ個別に完全に又は部分的に規定され、且つ互いに固定された順序関係にある。一部の形態では、標的ヌクレオチド配列は、３つ以上の標的ヌクレオチドを含む。一部の形態では、標的ヌクレオチド配列は、４つ以上の標的ヌクレオチドを含む。一部の形態では、標的ヌクレオチド配列は、５つ以上の標的ヌクレオチドを含む。このような形態では、標的ヌクレオチドは、それぞれ個別に完全に又は部分的に規定され、且つ互いに固定された順序関係にある。好ましくは、デアミナーゼドメインは、バークホルデリア・セノセパシア（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｃｅｎｏｃｅｐａｃｉａ）由来のＤｄｄＡのデアミナーゼドメインではない（Ｍｏｋ ＢＹ．，ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，５８３（７８１７）：６３１－６３７（２０２０）を参照されたい）。
デアミナーゼドメインは、標的ヌクレオチド配列を含む核酸基質（例えば、ｓｓＤＮＡ、ｄｓＤＮＡ、ＲＮＡ）の脱アミノ化で広範な編集効率を示すことができる。一部の形態では、標的ヌクレオチドを含む核酸基質の編集効率は、少なくとも１％、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、 少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％又は少なくとも９５％である。一部の形態では、標的ヌクレオチドを含む核酸基質の編集効率は、少なくとも１％である。一部の形態では、標的ヌクレオチドを含む核酸基質の編集効率は、少なくとも１０％である。一部の形態では、標的ヌクレオチドを含む核酸基質の編集効率は、少なくとも２５％である。一部の形態では、標的ヌクレオチドを含む核酸基質の編集効率は、少なくとも５０％である。
一部の形態では、デアミナーゼドメインによって認識及び／又は脱アミノ化される標的ヌクレオチド配列を、シーケンスロゴとして表すことができる。シーケンスロゴは、アミノ酸又は核酸の複数の配列アラインメントをグラフとして表したものである。例えば、図４Ａ～４Ｃを参照されたい。各ロゴは、シンボルのスタックを含み、１スタックは、シーケンス内の各位置を示す。スタックの全高は、その位置での配列保存性を示し、スタック内のシンボルの高さは、その位置における各アミノ酸又は核酸の相対頻度を示す。各スタック内で、文字は相対頻度により順序付けられ、スタックの全高は、その位置の情報量（ビット）によって決定される（Ｄｅｙ，ＫＫ．，ｅｔ ａｌ．，ＢＭＣ Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ．１９，４７３（２０１８）；Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ ＴＤ．，ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，１８（２０）：６０９７－１００（１９９０）を参照されたい）。
標的ヌクレオチドは、規定された編集閾値でのデアミナーゼ確率シーケンスロゴによって規定されるコンテキスト特異性をそれぞれ示すことができる。標的ヌクレオチドの直前の残基は、最も重要な特異性規定残基であるため、有意な特異性は、ＡＣＮ、ＣＣＮ、ＧＣＮ、ＴＣＮである。このような特異性は、オフターゲット編集を低減するのに有意であり得る。しかし、広範な特異性のデアミナーゼは、より多様な標的の編集を可能にし、オフターゲット編集は、本明細書に記載される他の特徴及び設計によって制限され得る。
デアミナーゼ特異性の例として、ＢＥ＿１１＿Ｒ１は、全てのＴＣ、ＡＣ及びＣＣコンテキストをほぼ等しい確率で編集することができるが、ＧＣコンテキストでは活性が低い。同じデアミナーゼの場合、標的ヌクレオチド後の位置は、ほぼ等しい確率で任意のヌクレオチドであり得る。そのため、図４に示すロゴに基づくＢＥ＿Ｒ１＿１１に適した（最も可能性の高い）部位はＴＣＡであるが、他の部位も非常に可能性が高い。ＢＥ＿Ｒ２＿１７のように、特異性の狭いデアミナーゼの場合、最も可能性の高い（観察された）編集部位は、ＴＣＴ、ＴＣＧ及びＴＣＡである（これは、本発明者らの基質中の６４の考えられる３ヌクレオチドの組合せ全てのうち、これらの３つの組合せが、少なくとも５０％の効率でこのデアミナーゼによって編集された主な組合せであったことを意味する）。
当業者は、任意の開示されるデアミナーゼドメインについてのシーケンスロゴを取得するための適切な方法を容易に決定することができる。非限定的な例を実施例１に記載する。手短には、一部の形態では、様々な配列コンテキストで、目的のデアミナーゼドメインを、標的ヌクレオチド（例えば、シトシンデアミナーゼドメインの場合にはＣ、アデノシンデアミナーゼドメインの場合にはＡ）を含む異なる核酸基質（即ち異なる配列を有する）と一緒にインキュベートすることができる。次に、基質を配列決定する。次に、標的ヌクレオチドの編集（脱アミノ化）から生じた配列変異体を同定し、これらの配列変異体の複数の配列アラインメントからシーケンスロゴを生成することができる。シーケンスロゴを生成するための様々なツールが当技術分野で利用可能である。非限定的な例としては、Ｓｅｑ２Ｌｏｇｏ（ウェブサイト：ｃｂｓ．ｄｔｕ．ｄｋ／ｂｉｏｔｏｏｌｓ／Ｓｅｑ２Ｌｏｇｏ／）、ＷｅｂＬｏｇｏ（インターネットサイト：ｗｅｂｌｏｇｏ．ｂｅｒｋｅｌｅｙ．ｅｄｕ／ｌｏｇｏ．ｃｇｉ）及びＷｅｂｌｏｇｏ（Ｃｒｏｏｋｓ ＧＥ，ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１４：１１８８－１１９０（２００４））が挙げられる。一部の形態では、シーケンスロゴは、１％、１０％、２５％又は５０％などの異なるレベルの編集（脱アミノ化）効率に対して決定することができる（例えば、図４Ａ～４Ｃを参照されたい）。
従って、一部の形態では、開示されるデアミナーゼドメインは、シーケンスロゴとして表される標的ヌクレオチド配列を含む核酸基質に対してデアミナーゼ活性を有する。一部の形態では、標的ヌクレオチド配列（シーケンスロゴ）中の標的ヌクレオチドは、各々約０．１～２．０ビット（両端の値を含む）を含む。例えば、一部の形態では、標的ヌクレオチド配列（シーケンスロゴ）中の標的ヌクレオチドは、約０．１、約０．２、約０．２５、約０．３、約０．４、約０．５、約０．６、約０．７、約０．７５、約０．８、約０．９、約１．０、約１．１、約１．２、約１．２５、約１．３、約１．４、約１．５、約１．６、約１．７、約１．７５、約１．８、約１．９又は約２．０ビットをそれぞれ呈示する。
一部の形態では、標的ヌクレオチド配列（シーケンスロゴ）中の標的ヌクレオチドは、標的ヌクレオチド配列の約１％～約９０％が編集されたとき、各々約０．１～約２．０ビットを呈示する。例えば、一部の形態では、標的ヌクレオチド配列の１％以上が編集されると、標的ヌクレオチドは各々少なくとも０．１ビットを呈示する。一部の形態では、標的ヌクレオチド配列の１０％以上が編集されると、標的ヌクレオチドは各々少なくとも０．１ビットを呈示する。一部の形態では、標的ヌクレオチド配列の２５％以上が編集されると、標的ヌクレオチドは各々少なくとも０．１ビットを呈示する。一部の形態では、標的ヌクレオチド配列の５０％以上が編集されると、標的ヌクレオチドは各々少なくとも０．１ビットを呈示する。
一部の形態では、標的ヌクレオチド配列の１％以上が編集されると、標的ヌクレオチドは各々少なくとも０．２５ビットを呈示する。一部の形態では、標的ヌクレオチド配列の１０％以上が編集されると、標的ヌクレオチドは各々少なくとも０．２５ビットを呈示する。一部の形態では、標的ヌクレオチド配列の２５％以上が編集されると、標的ヌクレオチドは各々少なくとも０．２５ビットを呈示する。一部の形態では、標的ヌクレオチド配列の５０％以上が編集されると、標的ヌクレオチドは各々少なくとも０．２５ビットを呈示する。一部の形態では、標的ヌクレオチド配列の１％以上が編集されると、標的ヌクレオチドは各々少なくとも０．５ビットを呈示する。一部の形態では、標的ヌクレオチド配列の１０％以上が編集されると、標的ヌクレオチドは各々少なくとも０．５ビットを呈示する。一部の形態では、標的ヌクレオチド配列の２５％以上が編集されると、標的ヌクレオチドは各々少なくとも０．５ビットを呈示する。一部の形態では、標的塩基配列の５０％以上が編集されると、標的ヌクレオチドは各々少なくとも０．５ビットを呈示する。
特定の形態では、単離されたデアミナーゼドメインは、シトシン含有ヌクレオチド（シトシンデアミナーゼと呼ばれる）を脱アミノ化することができる。シトシンデアミナーゼによって脱アミノ化することができる例示的な標的ヌクレオチド配列としては、ＡＣ、ＣＣ、ＧＣ及びＴＣが挙げられるが、これらに限定されない。一部の形態では、シトシンデアミナーゼによって脱アミノ化され得る標的ヌクレオチド配列は、限定されないが、Ａｃ、Ｃｃ、Ｇｃ及びＴｃを含み、Ｎは、独立して、任意のヌクレオチドを表し、脱アミノ化されるシトシン含有ヌクレオチドは、小文字である。
１．例示的なシトシンデアミナーゼドメイン
様々な形態では、ｄｓＤＮＡ塩基エディター（例えば、ＤＮＡｂｐｓ及びＣＤＡ）を含むｄｓＤＮＡ塩基エディター又はポリペプチドは、シトシンデアミナーゼ（ＣＤＡ）又はその不活性若しくは短縮断片を含むように操作され得る。開示される組成物及び方法に従って使用することができる例示的なシトシンデアミナーゼのアミノ酸配列を以下に記載する。
様々な形態では、ＣＤＡタンパク質は、ＢＥ１１（Ｕｎｉｐｒｏｔ ＩＤ番号：Ａ０Ａ１Ｙ５Ｙ１Ｍ１＿ＫＩＢＡＲの成分）であり、これは、以下のアミノ酸配列：
Figure 2024502630000001
 （配列番号１）又は配列番号１のＣＤＡと少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％若しくは１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列或いはその断片を有する。
様々な形態では、ＣＤＡタンパク質は、ＢＥ１２（Ｕｎｉｐｒｏｔ ＩＤ Ｎｏ．：Ａ０Ａ２Ｔ４Ｚ６Ｌ８＿９ＢＡＣＬ）であり、これは、以下のアミノ酸配列：
Figure 2024502630000002
 （配列番号２）又は配列番号２のＣＤＡと少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％若しくは１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列或いはその断片を有する。
様々な形態では、ＣＤＡタンパク質は、ＢＥ２８（Ｕｎｉｐｒｏｔ ＩＤ番号：Ａ０Ａ０Ｋ１ＥＫＶ１＿ＣＨＯＣＯの成分）であり、これは、以下のアミノ酸配列：
Figure 2024502630000003
 （配列番号３）又は配列番号３のＣＤＡと少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％若しくは１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列或いはその断片を有する。
様々な形態では、ＣＤＡタンパク質は、ＢＥ＿Ｒ１＿４１（Ｕｎｉｐｒｏｔ ＩＤ番号：Ｃ５ＡＬＭ７＿ＢＵＲＧＢの成分）であり、これは、以下のアミノ酸配列：
Figure 2024502630000004
 （配列番号４）又は配列番号４のＣＤＡと少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％若しくは１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列或いはその断片を有する。
一部の形態では、ＣＤＡタンパク質は、ＢＥ＿Ｒ２＿７（Ｕｎｉｐｒｏｔ ＩＤ番号：Ａ０Ａ１Ｕ７ＩＳＥ２＿９ＣＹＡＮの成分）であり、これは、以下のアミノ酸配列：
ＭＰＰＡＧＳＥＴＤＫＳＴＩＡＫＬＥＩＳＧＱＮＦＦＧＩＮＳＧＳＮＰＮＰＲＱＩＴＦＮＶＮＰＩＴＫＴＨＡＥＡＤＡＦＱＱＡＡＤＶＧＩＲＧＧＫＡＲＬＩＶＤＲＤＬＣＡＡＣＧＩＲＧＧＶＮＳＭＡＷＱＬＧＩＥＥＬＥＩＩＴＰＳＶＳＫＴＩＡＶＫＰＰＮＲＲＲＱ
（配列番号８）又は配列番号８のＣＤＡと少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％若しくは１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列或いはその断片を有する。
一部の形態では、ＣＤＡタンパク質は、ＢＥ＿Ｒ２＿１１（Ｕｎｉｐｒｏｔ ＩＤ番号：Ａ０Ａ２Ｔ４Ｚ７Ｐ２＿９ＢＡＣＬの成分）であり、これは、以下のアミノ酸配列：
Figure 2024502630000005
 （配列番号９）又は配列番号９のＣＤＡと少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％若しくは１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列或いはその断片を有する。
一部の形態では、ＣＤＡタンパク質は、ＢＥ＿Ｒ２＿１７（Ｕｎｉｐｒｏｔ ＩＤ番号：Ｄ２ＺＹ３３＿ＮＥＩＭＵの成分）であり、これは、以下のアミノ酸配列：
Figure 2024502630000006
 （配列番号１０）又は配列番号１０のＣＤＡと少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％若しくは１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列或いはその断片を有する。
一部の形態では、ＣＤＡタンパク質は、ＢＥ＿Ｒ２＿１８（Ｕｎｉｐｒｏｔ ＩＤ番号：Ａ０Ａ０Ａ８Ｋ６Ｆ０＿９ＲＨＩＺの成分）であり、これは、以下のアミノ酸配列：
Figure 2024502630000007
 （配列番号１１）又は配列番号１１のＣＤＡと少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％若しくは１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列或いはその断片を有する。
一部の形態では、ＣＤＡタンパク質は、ＢＥ＿Ｒ２＿２９（Ｕｎｉｐｒｏｔ ＩＤ番号：Ｄ２ＱＹＦ９＿ＰＩＲＳＤの成分）であり、これは、以下のアミノ酸配列：
Figure 2024502630000008
 （配列番号１４）又は配列番号１４のＣＤＡと少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％若しくは１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列或いはその断片を有する。
一部の形態では、ＣＤＡタンパク質は、ＢＥ＿Ｒ２＿３１（Ｕｎｉｐｒｏｔ ＩＤ番号：Ｇ８ＳＩ５６＿ＡＣＴＳ５の成分）であり、これは、以下のアミノ酸配列：
Figure 2024502630000009
 （配列番号１５）又は配列番号１５のＣＤＡと少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％若しくは１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列或いはその断片を有する。
一部の形態では、ＣＤＡタンパク質は、ＢＥ＿Ｒ２＿４８（Ｕｎｉｐｒｏｔ ＩＤ番号：Ａ０Ａ２Ｔ４Ｚ６Ｌ８＿９ＢＡＣＬの成分）であり、これは、以下のアミノ酸配列：
Figure 2024502630000010
 （配列番号１６）又は配列番号１６のＣＤＡと少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％若しくは１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列或いはその断片を有する。
一部の形態では、ＣＤＡタンパク質は、ＢＥ＿Ｒ１＿１０（Ｕｎｉｐｒｏｔ ＩＤ番号：Ａ０Ａ３Ｐ２ＡＬＺ１＿９ＦＩＲＭの成分）であり、これは、以下のアミノ酸配列：
Figure 2024502630000011
 （配列番号４０）又は配列番号４０のＣＤＡと少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％若しくは１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列或いはその断片を有する。
一部の形態では、ＣＤＡタンパク質は、ＢＥ＿Ｒ１＿１５（Ｕｎｉｐｒｏｔ ＩＤ番号：Ａ０Ａ４３３ＳＥＵ４＿９ＢＵＲＫの成分）であり、これは、以下のアミノ酸配列：
Figure 2024502630000012
 （配列番号４１）又は配列番号４１のＣＤＡと少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％若しくは１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列或いはその断片を有する。
一部の形態では、ＣＤＡタンパク質は、ＢＥ＿Ｒ１＿２１（Ｕｎｉｐｒｏｔ ＩＤ番号：Ａ０Ａ３Ｐ２Ａ０Ｌ６＿９ＮＥＩＳの成分）であり、これは、以下のアミノ酸配列：
Figure 2024502630000013
 （配列番号４２）又は配列番号４２のＣＤＡと少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％若しくは１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列或いはその断片を有する。
一部の形態では、ＣＤＡタンパク質は、ＢＥ＿Ｒ２＿１（Ｕｎｉｐｒｏｔ ＩＤ番号：Ａ０Ａ０Ｆ６Ｗ２９９＿９ＤＥＬＴの成分）であり、これは、以下のアミノ酸配列：
Figure 2024502630000014
 （配列番号４３）又は配列番号４３のＣＤＡと少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％若しくは１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列或いはその断片を有する。
一部の形態では、ＣＤＡタンパク質は、ＢＥ＿Ｒ２＿３（Ｕｎｉｐｒｏｔ ＩＤ番号：Ａ０Ａ０Ｎ９ＨＸＷ６＿９ＰＳＥＵの成分）であり、これは、以下のアミノ酸配列：
Figure 2024502630000015
 （配列番号４４）又は配列番号４４のＣＤＡと少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％若しくは１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列或いはその断片を有する。
一部の形態では、ＣＤＡタンパク質は、ＢＥ＿Ｒ２＿１９（Ｕｎｉｐｒｏｔ ＩＤ番号：Ａ０Ａ１Ｉ４Ｂ７Ｘ１＿９ＰＳＥＵの成分）であり、これは、以下のアミノ酸配列：
Figure 2024502630000016
 （配列番号４５）又は配列番号４５のＣＤＡと少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％若しくは１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列或いはその断片を有する。
一部の形態では、ＣＤＡタンパク質は、ＢＥ＿Ｒ２＿２０（Ｕｎｉｐｒｏｔ ＩＤ番号：Ａ０Ａ１Ｍ７ＤＴ３７＿９ＦＩＲＭの成分）であり、これは、以下のアミノ酸配列：
Figure 2024502630000017
 （配列番号４６）又は配列番号４６のＣＤＡと少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％若しくは１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列或いはその断片を有する。
一部の形態では、ＣＤＡタンパク質は、ＢＥ＿Ｒ２＿２１（Ｕｎｉｐｒｏｔ ＩＤ番号：Ａ０Ａ１Ｎ６ＭＱＹ７＿９ＧＡＭＭの成分）であり、これは、以下のアミノ酸配列：
Figure 2024502630000018
 （配列番号４７）又は配列番号４７のＣＤＡと少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％若しくは１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列或いはその断片を有する。
一部の形態では、ＣＤＡタンパク質は、ＢＥ＿Ｒ２＿２８（Ｕｎｉｐｒｏｔ ＩＤ番号：Ｂ９ＪＧＭ２＿ＡＧＲＲＫの成分）であり、これは、以下のアミノ酸配列：
Figure 2024502630000019
 （配列番号４８）又は配列番号４８のＣＤＡと少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％若しくは１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列或いはその断片を有する。
一部の形態では、ＣＤＡタンパク質は、ＢＥ＿Ｒ４＿４（Ｕｎｉｐｒｏｔ ＩＤ番号：Ｂ９ＪＧＭ２＿ＡＧＲＲＫの成分）であり、これは、以下のアミノ酸配列：
Figure 2024502630000020
 （配列番号４９）又は配列番号４０のＣＤＡと少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％若しくは１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列或いはその断片を有する。
一部の形態では、ＣＤＡタンパク質は、ＢＥ＿Ｒ４＿６（Ｕｎｉｐｒｏｔ ＩＤ番号：Ａ０Ａ７Ｇ９ＦＺＹ２＿９ＦＩＲＭの成分）であり、これは、以下のアミノ酸配列：
Figure 2024502630000021
 （配列番号５０）又は配列番号５０のＣＤＡと少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％若しくは１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列或いはその断片を有する。
一部の形態では、ＣＤＡタンパク質は、ＢＥ＿Ｒ４＿７（Ｕｎｉｐｒｏｔ ＩＤ番号：Ａ０Ａ７Ｘ７ＸＹＩ６＿ＣＬＯＳＰの断片）であり、これは、以下のアミノ酸配列：
Figure 2024502630000022
 （配列番号５１）又は配列番号５１のＣＤＡと少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％若しくは１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列或いはその断片を有する。
一部の形態では、ＣＤＡタンパク質は、ＢＥ＿Ｒ４＿１０（Ｕｎｉｐｒｏｔ ＩＤ番号：ＭＢＲ１６１５９５５．１の成分）であり、これは、以下のアミノ酸配列：
ＥＬＰＰＹＤＧＫＴＴＹＧＶＬＩＬＤＤＧＫＱＹＳＦＮＳＧＫＰＡＰＩＹＲＮＹＩＰＡＳＨＶＥＧＫＡＡＩＹＭＲＥＮＫＩＱＳＧＴＶＹＨＮＮＴＤＧＴＣＰＹＣＤＫＭＬＰＴＬＬＥＫＤＳＴＬＫＶＶＰＰＱＮＡＴＳＳＫＫＧＷＩＴＮＥＫＩＹＩＧＮＤＫＩＰＫＴ
（配列番号５２）又は配列番号５２のＣＤＡと少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％若しくは１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列或いはその断片を有する。
一部の形態では、ＣＤＡタンパク質は、ＢＥ＿Ｒ４＿１２（Ｕｎｉｐｒｏｔ ＩＤ番号：ＭＧＹＰ０００６０５８２８５２９の成分）であり、これは、以下のアミノ酸配列：
Figure 2024502630000023
 （配列番号５３）又は配列番号５３のＣＤＡと少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％若しくは１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列或いはその断片を有する。
一部の形態では、ＣＤＡタンパク質は、ＢＥ＿Ｒ４＿１３（Ｕｎｉｐｒｏｔ ＩＤ番号：ＷＰ＿０２１７９８７４２の成分）であり、これは、以下のアミノ酸配列：
Figure 2024502630000024
 （配列番号５４）又は配列番号５４のＣＤＡと少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％若しくは１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列或いはその断片を有する。
一部の形態では、ＣＤＡタンパク質は、ＢＥ＿Ｒ４＿１４（Ｕｎｉｐｒｏｔ ＩＤ番号：ＷＰ＿０５９９８８４８７の成分）であり、これは、以下のアミノ酸配列：
Figure 2024502630000025
 （配列番号５５）又は配列番号５５のＣＤＡと少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％若しくは１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列或いはその断片を有する。
一部の形態では、ＣＤＡタンパク質は、ＢＥ＿Ｒ４＿１５（Ｕｎｉｐｒｏｔ ＩＤ番号：ＷＰ＿０８２５０７１５４の成分）であり、これは、以下のアミノ酸配列：
Figure 2024502630000026
 （配列番号５６）又は配列番号５６のＣＤＡと少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％若しくは１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列或いはその断片を有する。
一部の形態では、ＣＤＡタンパク質は、ＢＥ＿Ｒ４＿１６（Ｕｎｉｐｒｏｔ ＩＤ番号：ＷＰ＿１１２２１０９０６の成分）であり、これは、以下のアミノ酸配列：
Figure 2024502630000027
 （配列番号５７）又は配列番号５７のＣＤＡと少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％若しくは１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列或いはその断片を有する。
一部の形態では、ＣＤＡタンパク質は、ＢＥ＿Ｒ４＿１７（Ｕｎｉｐｒｏｔ ＩＤ番号：ＷＰ＿１３３１８６１４７の成分）であり、これは、以下のアミノ酸配列：
Figure 2024502630000028
 （配列番号５８）又は配列番号５８のＣＤＡと少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％若しくは１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列或いはその断片を有する。
一部の形態では、ＣＤＡタンパク質は、ＢＥ＿Ｒ４＿１８（Ｕｎｉｐｒｏｔ ＩＤ番号：ＷＰ＿１５７８６９２６９の成分）であり、これは、以下のアミノ酸配列：
Figure 2024502630000029
 （配列番号５９）又は配列番号５９のＣＤＡと少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％若しくは１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列或いはその断片を有する。
一部の形態では、ＣＤＡタンパク質は、ＢＥ＿Ｒ４＿１９（Ｕｎｉｐｒｏｔ ＩＤ番号：ＷＰ＿１６５９４６２８９の成分）であり、これは、以下のアミノ酸配列：
Figure 2024502630000030
 （配列番号６０）又は配列番号６０のＣＤＡと少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％若しくは１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列或いはその断片を有する。
一部の形態では、ＣＤＡタンパク質は、ＢＥ＿Ｒ４＿２０（Ｕｎｉｐｒｏｔ ＩＤ番号：ＷＰ＿１７４４２２２６７の成分）であり、これは、以下のアミノ酸配列：
Figure 2024502630000031
 （配列番号６１）又は配列番号６１のＣＤＡと少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％若しくは１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列或いはその断片を有する。
一部の形態では、ＣＤＡタンパク質は、ＢＥ＿Ｒ４＿２１（Ｕｎｉｐｒｏｔ ＩＤ番号：ＷＰ＿１８９５９４２９３の成分）であり、これは、以下のアミノ酸配列：
Figure 2024502630000032
 （配列番号６２）又は配列番号６２のＣＤＡと少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％若しくは１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列或いはその断片を有する。
一部の形態では、ＣＤＡタンパク質は、ＢＥ＿Ｒ４＿２２（Ｕｎｉｐｒｏｔ ＩＤ番号：ＭＧＹＰ０００４９８４４３２６７の成分）であり、これは、以下のアミノ酸配列：
Figure 2024502630000033
 （配列番号６３）又は配列番号６３のＣＤＡと少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％若しくは１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列或いはその断片を有する。
一部の形態では、ＣＤＡタンパク質は、ＢＥ＿Ｒ４＿２３（Ｕｎｉｐｒｏｔ ＩＤ番号：ＷＰ＿１９５４４１５６４の成分）であり、これは、以下のアミノ酸配列：
Figure 2024502630000034
 （配列番号６４）又は配列番号６４のＣＤＡと少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％若しくは１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列或いはその断片を有する。
一部の形態では、ＣＤＡタンパク質は、ＢＥ＿Ｒ４＿２４（Ｕｎｉｐｒｏｔ ＩＤ番号：ＷＰ＿２１１２３２０６１の成分）であり、これは、以下のアミノ酸配列：
Figure 2024502630000035
 （配列番号６５）又は配列番号６５のＣＤＡと少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％若しくは１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列或いはその断片を有する。
一部の形態では、ＣＤＡタンパク質は、ＢＥ＿Ｒ４＿２５（Ｕｎｉｐｒｏｔ ＩＤ番号：ＭＧＹＰ０００４０２８８３１７９の成分）であり、これは、以下のアミノ酸配列：
Figure 2024502630000036
 （配列番号６６）又は配列番号６６のＣＤＡと少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％若しくは１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列或いはその断片を有する。
一部の形態では、ＣＤＡタンパク質は、ＢＥ＿Ｒ４＿２６（Ｕｎｉｐｒｏｔ ＩＤ番号：ＭＧＹＰ０００１８６３４０４７５の成分）であり、これは、以下のアミノ酸配列：
Figure 2024502630000037
 （配列番号６７）又は配列番号６７のＣＤＡと少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％若しくは１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列或いはその断片を有する。
一部の形態では、ＣＤＡタンパク質は、以下のアミノ酸配列：
Figure 2024502630000038
 （配列番号６８）の１つ以上の断片又は配列番号６８のＣＤＡと少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％若しくは１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列或いはその断片を有する。
ＭａｆＢ１９デアミナーゼドメイン
一部の形態では、デアミナーゼドメインは、ＭａｆＢ１９デアミナーゼドメインである。ＭａｆＢ１９デアミナーゼファミリーの活性及び不活性メンバーの配列アラインメントを用いて、ＭａｆＢ１９デアミナーゼファミリー中のｄｓＤＮＡ特異的デアミナーゼのシグネチャモチーフを同定した。ＭａｆＢ１９デアミナーゼファミリー中のｄｓＤＮＡ特異的ＣＤＡ中に存在する具体的なシグネチャモチーフは、以下を含む：（Ｍ／Ｌ）Ｐモチーフ；Ｔ（Ｖ／Ｉ／Ｌ／Ａ）Ａ（Ｒ／Ｋ／Ｖ）モチーフ；（Ｙ／Ｆ／Ｗ）Ｇ（Ｖ／Ｈ／Ｉ／Ｒ／Ｋ）Ｎモチーフ；ＨＡＥ＝＞活性部位モチーフ；ｄｓＤＮＡに対して活性であるＭａｆＢ１９－ｄｅａｍファミリーのほぼ全メンバーに存在するＶＤ（Ｒ／Ｋ）モチーフ；並びにＣＸＸＣモチーフ（標準ＣＸＸＣジンク結合モチーフ）。従って、一部の形態では、ＭａｆＢ１９デアミナーゼファミリーと関連するデアミナーゼドメインは、（Ｍ／Ｌ）Ｐモチーフ；Ｔ（Ｖ／Ｉ／Ｌ／Ａ）Ａ（Ｒ／Ｋ／Ｖ）モチーフ；（Ｙ／Ｆ／Ｗ）Ｇ（Ｖ／Ｈ／Ｉ／Ｒ／Ｋ）Ｎモチーフ；ＨＡ活性部位モチーフ；ＶＤ（Ｒ／Ｋ）モチーフ及び標準ＣＸＸＣジンク結合モチーフを含む。
ＳＣＰ１２０１デアミナーゼドメイン
一部の形態では、デアミナーゼドメインは、ＳＣＰ１２０１デアミナーゼファミリーデアミナーゼドメインである。ＳＣＰ１２０１デアミナーゼファミリーの活性及び不活性メンバーの配列アラインメントを用いて、ＳＣＰ１２０１デアミナーゼファミリー中のｄｓＤＮＡ特異的デアミナーゼのシグネチャモチーフを同定した。ＳＣＰ１２０１デアミナーゼファミリーのｄｓＤＮＡ特異的ＣＤＡ中に存在する具体的なシグネチャモチーフは、以下を含む：Ｌ（Ｐ／Ｌ）モチーフ；（Ｙ／Ｆ／Ｅ／Ｑ）（Ｄ／Ｅ／Ｎ）Ｇ（Ｋ／Ｒ／Ｄ）（Ｔ／Ｋ／Ｎ）ＴＸＧ（Ｖ／Ｌ／Ｔ）（Ｌ／Ｍ／Ｆ）モチーフ；（Ｐ／Ｓ／Ｔ）（Ｎ／Ｇ／Ｅ／Ｑ）Ｙモチーフ；（Ｇ／Ｓ）ＨＶＥ（Ｇ／Ａ／Ｑ）－Ｇ又はＳ後に保存された活性部位モチーフ（ＨＶＥ）が位置し、これに（Ｇ／Ａ／Ｑ）が続く；ＨＮＮモチーフ（又は程度は低いが、（Ｈ／Ｉ）（Ｎ／Ｄ）（Ｎ／Ｈ））、Ｇ（Ｔ／Ｉ）Ｃ（Ｇ／Ｐ／Ｎ／Ｈ）（Ｙ／Ｆ）Ｃモチーフ－Ｇ（Ｔ／Ｉ）後に標準ＣＸＸＣジンク結合モチーフ；（Ｔ／Ａ）ＬＬ（Ｐ／Ｅ）モチーフ；Ｌ（Ｅ／Ｄ／Ｒ／Ｋ）Ｖ（Ｖ／Ｉ）ＰＰモチーフ及びＧ（Ｎ／Ｄ）ＸＸＸＰＫモチーフ。Ｃｘ（Ｙ／Ｆ）Ｃは、ＳＣＰ１２０１デアミナーゼのｄｓＤＮＡ特異的デアミナーゼで主要なモチーフである。ＢＥ＿Ｒ１＿２８を除いて、このファミリーの全ての活性メンバーは、厳密に、ジンク結合モチーフ中の２つのＣ残基間に２つのアミノ酸を有する。このファミリーの不活性メンバーは全て、２つのＣ残基間に３つ以上のアミノ酸を有する。このファミリーの活性メンバーでは、Ｇ（Ｔ／Ｉ）モチーフ後にジンク結合モチーフが位置する。従って、一部の形態では、ＳＣＰ１２０１デアミナーゼファミリーに関連するデアミナーゼドメインは、Ｌ（Ｐ／Ｌ）モチーフ；（Ｙ／Ｆ／Ｅ／Ｑ）（Ｄ／Ｅ／Ｎ）Ｇ（Ｋ／Ｒ／Ｄ）（Ｔ／Ｋ／Ｎ）ＴＸＧ（Ｖ／Ｌ／Ｔ）（Ｌ／Ｍ／Ｆ）モチーフ；（Ｐ／Ｓ／Ｔ）（Ｎ／Ｇ／Ｅ／Ｑ）Ｙモチーフ；（Ｇ／Ｓ）ＨＶＥ（Ｇ／Ａ／Ｑ）；ＨＮＮモチーフ（又は程度は低いが、（Ｈ／Ｉ）（Ｎ／Ｄ）（Ｎ／Ｈ））；Ｇ（Ｔ／Ｉ）Ｃ（Ｇ／Ｐ／Ｎ／Ｈ）（Ｙ／Ｆ）Ｃモチーフ；（Ｔ／Ａ）ＬＬ（Ｐ／Ｅ）モチーフ；Ｌ（Ｅ／Ｄ／Ｒ／Ｋ）Ｖ（Ｖ／Ｉ）ＰＰモチーフ及びＧ（Ｎ／Ｄ）ＸＸＸＰＫモチーフを含む１つ以上の構造的特徴を含む。
特定の形態では、単離されたデアミナーゼドメインは、アデニン含有ヌクレオチドを脱アミノ化することができる（アデノシンデアミナーゼと呼ばれる）。一部の形態では、タンパク質、ポリペプチド又はタンパク質若しくはポリペプチドの１つ以上の機能性ドメインであり、これは、アデニン（又はある分子のアデニン部分）をヒポキサンチン（又はある分子のヒポキサンチン部分）に変換する加水分解脱アミノ化反応を触媒することができる。アデニン含有ヌクレオチドは、アデノシン（Ａ）であり得、ヒポキサンチン含有分子は、イノシン（Ｉ）であり得る。アデニン含有分子は、ＤＮＡ又はＲＮＡであり得る。
さらに別の好適なデアミナーゼドメイン及びその配列は、本開示に基づいて当業者に明らかであろう。例えば、配列番号１～１６のいずれか１つ又は本明細書に開示されるアクセッション番号のいずれかの配列をクエリ配列として使用して、相同体及び他の関連タンパク質、ポリペプチド又はそのドメインを同定することができる。このような相同体及び他の関連タンパク質、ポリペプチド又はそのドメインは、ＲＮＡ若しくはＤＮＡ基質に対してデアミナーゼ活性を示し得ることから、開示される組成物及び方法に従って使用することができると考慮される。
一部の形態では、好適なデアミナーゼドメイン（例えば、アデノシンデアミナーゼ又はシトシンデアミナーゼ）は、本明細書に開示されるＵｎｉｐｒｏｔアクセッション番号、例えば、配列番号１～１６（及びそれらのアミノ酸配列をコードする核酸配列を含む）のいずれかと少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％又は少なくとも９９％の配列同一性を有する。好ましくは、配列同一性は、クエリ配列の長さの少なくとも５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％にわたる。従って、一部の形態では、単離されたシトシンデアミナーゼは、配列番号１～１６のいずれかの配列（及びそのアミノ酸配列が提供される核酸配列を含む）と少なくとも５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の配列同一性を有する。
本明細書に開示されるデアミナーゼのいずれかに対して１つ以上の変異（例えば、保存的又は非保存的変異）を含むシトシン又はアデノシンデアミナーゼ変異体も開示されることは理解すべきである。例えば、構造データに基づくか又は一連の直接進化アプローチ（ランダム突然変異誘発及び選択／スクリーニング）のいずれかによる、デアミナーゼの特定の領域における１つ以上のアミノ酸残基の標的変異により、他のシトシン又はアデノシンデアミナーゼ変異体を、本明細書に開示されるものから進化させ得ることも企図される。従って、１つ以上の変異を、開示されるデアミナーゼドメインのいずれかに導入することができる。一部の形態では、そのような変異は、基質結合を改変し、結合基質の立体構造を改変し、デアミナーゼ活性部位への基質の到達可能性を改変し、標的ヌクレオチド（例えば、Ｃ若しくはＡ）のデアミナーゼ活性部位への非最適提示に対する耐性を改変し、且つ／又は標的ヌクレオチド配列特異性（認識）及び／若しくは編集効率を改変することができる。一部の形態では、好適なシトシン若しくはアデノシンデアミナーゼは、配列番号１～２０、４０～６８に記載されるアミノ酸配列のいずれか１つ又は他に本明細書に記載されるデアミナーゼのいずれかと比較して、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２１、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０又はそれを超える変異を有するアミノ酸配列を含む。一部の形態では、シトシン又はアデノシンデアミナーゼは、配列番号１～１６又は４０～６８に記載のアミノ酸配列のいずれか１つと比較して、少なくとも５、少なくとも１０、少なくとも１５、少なくとも２０、少なくとも２５、少なくとも３０、少なくとも３５、少なくとも４０、少なくとも４５、少なくとも５０、少なくとも６０、少なくとも７０、少なくとも８０、少なくとも９０又は少なくとも１００個の同一の連続したアミノ酸残基を有するアミノ酸配列を含む。
Ｂ．塩基エディター
デアミナーゼドメイン及び１つ以上の機能性ドメインを含む塩基エディターも開示される。一部の形態では、塩基エディターは、「スプリット」デアミナーゼ、例えば、２つ以上の別個の断片に切断されるデアミナーゼを含む。分割断片の各々は、典型的に、デアミナーゼ活性がなく、例えば、共局在化による、２つ以上の断片の再会合により、デアミナーゼ活性が回復又は増強されるようにする。従って、一部の形態では、塩基エディターは、スプリット塩基エディターである。典型的には、スプリット塩基エディターは、１つ又は複数の機能性ドメインの特異的相互作用に依存して、核酸内の特定の位置で、デアミナーゼドメインを共局在化し、デアミナーゼ活性を再形成する。機能性ドメインは、ポリペプチド若しくはタンパク質又はその一部或いは塩基エディターに所望の特性又は機能を付与する任意の部分であり得る。所望の特性又は機能は、例えば、細胞小器官への局在化、酵素活性、タンパク質相互作用、エピトープタグ付け又はＤＮＡ及び／若しくはＲＮＡ結合であり得る。一部の形態では、塩基エディターは、（１）プログラマブルＤＮＡ結合ドメインと；（２）デアミナーゼドメイン及び任意選択でＤＮＡ結合ドメインとデアミナーゼドメインとの間の１つ以上のリンカー並びに／又はターゲティングモチーフなどの１つ以上の追加の機能性ドメインを含む。一部の形態では、デアミナーゼドメインは、スプリットデアミナーゼドメイン、即ち不活性デアミナーゼドメイン又はその断片である。典型的には、２つ以上のスプリットデアミナーゼドメインの共局在化（例えば、プログラマブルＤＮＡ結合ドメインによって決定される標的ＤＮＡ鎖上の会合による）は、２つ以上のスプリットデアミナーゼドメインの１つ以上におけるデアミナーゼ活性を活性化する。
１．スプリットデアミナーゼドメイン
一部の形態では、本組成物は、機能性デアミナーゼドメイン内の切断部位でデアミナーゼタンパク質を切断することによって得られる機能性二本鎖ＤＮＡデアミナーゼタンパク質の非天然由来ポリペプチド断片を含む。例えば、一部の形態では、断片は、Ｎ末端断片に対応し、断片は、切断された機能性デアミナーゼドメインのＮ末端部分を含む。他の形態では、断片は、Ｃ末端断片に対応し、断片は切断された機能性デアミナーゼドメインのＣ末端部分を含む。デアミナーゼ活性は、Ｎ末端断片をＣ末端断片と共局在させるとき又はＣ末端断片をＮ末端断片と共局在させるときに回復される。スプリットデアミナーゼの異なる形態及び立体配置の例を図４１に示す。
第１及び第２のモノマーを有するヘテロダイマーを含む塩基エディターも記載され、第１のモノマーは、第１のプログラマブルＤＮＡ結合タンパク質と、切断された二本鎖ＤＮＡデアミナーゼのＮ末端又はＣ末端断片を含み、及び第２のモノマーは、第２のプログラマブルＤＮＡ結合タンパク質と、切断された二本鎖ＤＮＡデアミナーゼのＮ末端又はＣ末端断片を含む。典型的には、第１及び第２のモノマーの二量体化は、機能性二本鎖ＤＮＡデアミナーゼタンパク質及び機能性二本鎖ＤＮＡデアミナーゼ活性を再形成する。
ｉ．例示的なスプリットデアミナーゼドメイン
デアミナーゼ活性を欠いた例示的なスプリットデアミナーゼドメインが記載される。典型的には、スプリットデアミナーゼドメインは、デアミナーゼドメインへの１つ以上の変異の導入によって不活性化される。変異は、デアミナーゼドメイン内の所定の位置における１つ以上のアミノ酸の特異的欠失、置換及び付加が含まれる。一部の形態では、スプリットデアミナーゼドメインは、配列番号１～１７、４０～６８のいずれか１つのアミノ酸配列を有するデアミナーゼドメインのいずれかにおける所与の位置にある１つ以上のアミノ酸の１つ以上の特異的欠失、置換又は付加を含む。
ａ．不活性デアミナーゼドメイン
一部の形態では、スプリットデアミナーゼは、デアミナーゼタンパク質の不活性形態である。例えば、一部の形態では、スプリットデアミナーゼは、デアミナーゼドメインの「不活性型」又は完全に不活性な変異体である。好ましい形態では、不活性型デアミナーゼドメインは、ＤＮＡ結合領域に１つ以上の変異体を有するデアミナーゼタンパク質である。典型的には、同じタイプの１つ以上のインタクトな、短縮又は切断されたデアミナーゼドメイン断片を有する不活性デアミナーゼドメインが共局在して、短縮又は切断された断片の欠損構造成分を付与することにより、短縮又は切断されたデアミナーゼドメイン断片の活性を再形成することができる。この手法は、ある分割部位でデアミナーゼを切断することが適切ではないと考えられる場合、その活性のために二量体化（又は多量体化）を必要とするスプリットデアミナーゼを作製するのに特に有用である。
一部の形態では、不活性型デアミナーゼドメインは、ＢＥ＿Ｒ１＿１１（ＢＥ＿Ｒ１＿１１＿不活性型）をベースとし、これは、以下のアミノ酸配列：
Figure 2024502630000039
 （配列番号１２２）又は配列番号１２２に対して少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％若しくは少なくとも９９％の配列同一性を有するアミノ酸或いはその断片を有する。
一部の形態では、不活性型デアミナーゼドメインは、ＢＥ＿Ｒ１＿２８（ＢＥ＿Ｒ１＿２８＿不活性型）をベースとし、これは、以下のアミノ酸配列：
Figure 2024502630000040
 （配列番号１２３）又は配列番号１２３に対して少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％若しくは少なくとも９９％の配列同一性を有するアミノ酸或いはその断片を有する。
一部の形態では、不活性型デアミナーゼドメインは、ＢＥ＿Ｒ１＿１２（ＢＥ＿Ｒ１＿１２＿不活性型）をベースとし、これは、以下のアミノ酸配列：
Figure 2024502630000041
 （配列番号１２４）又は配列番号１２４に対して少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％若しくは少なくとも９９％の配列同一性を有するアミノ酸或いはその断片を有する。
一部の形態では、不活性型デアミナーゼドメインは、ＢＥ＿Ｒ４＿２１（ＢＥ＿Ｒ４＿２１＿不活性型）をベースとし、これは、以下のアミノ酸配列：
Figure 2024502630000042
 （配列番号１２５）又は配列番号１２５に対して少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％若しくは少なくとも９９％の配列同一性を有するアミノ酸或いはその断片を有する。
一部の形態では、不活性型デアミナーゼドメインは、ＢＥ＿Ｒ２＿１１（ＢＥ＿Ｒ２＿１１＿不活性型）をベースとし、これは、以下のアミノ酸配列：
Figure 2024502630000043
 （配列番号１２６）又は配列番号１２６に対して少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％若しくは少なくとも９９％の配列同一性を有するアミノ酸或いはその断片を有する。
ｂ．短縮又は切断スプリットデアミナーゼドメイン
一部の形態では、スプリットデアミナーゼは、デアミナーゼタンパク質の短縮又は切断された形態である。スプリットタンパク質は、再形成時に１つ以上（２×）の活性部位が、標的上に存在するように、設計することができる。例えば、一部の形態では、スプリットデアミナーゼは、デアミナーゼドメインの完全に不活性な短縮又は切断された断片である。好ましい形態では、短縮又は切断デアミナーゼドメインは、デアミナーゼドメインのアミノ（ＮＨ）若しくはカルボキシル（ＣＯＯＨ）末端領域又はアミノ（ＮＨ）及びカルボキシル（ＣＯＯＨ）末端領域の両方から１つ以上のアミノ酸が除去されたデアミナーゼタンパク質である。
一部の形態では、デアミナーゼタンパク質の短縮又は切断形態は、アミノ（ＮＨ）末端若しくはカルボキシル（ＣＯＯＨ）末端又はアミノ（ＮＨ）末端及びカルボキシル（ＣＯＯＨ）末端の両方からカウントされる特定の数の連続したアミノ酸残基が欠如した短縮又は切断デアミナーゼタンパク質である。例えば、一部の形態では、デアミナーゼタンパク質の短縮又は切断形態は、アミノ（ＮＨ）末端若しくはカルボキシル（ＣＯＯＨ）末端又はアミノ（ＮＨ）末端及びカルボキシル（ＣＯＯＨ）末端の両方からカウントされる５個の連続したアミノ酸残基又は１０、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５若しくは１００個の連続したアミノ酸残基が欠如した（Δ）短縮又は切断デアミナーゼタンパク質である。
（１）スプリットＢＥ＿Ｒ１＿１１デアミナーゼタンパク質
一部の形態では、デアミナーゼタンパク質の短縮又は切断形態は、ＢＥ＿Ｒ１＿１１デアミナーゼタンパク質の短縮又は切断形態である。
ＢＥ＿Ｒ１＿１１の切断アミノ（ＮＨ）断片
一部の形態では、デアミナーゼタンパク質の短縮又は切断形態は、アミノ（ＮＨ）末端に対応するＢＥ＿Ｒ１＿１１デアミナーゼタンパク質の断片を得るために特定のアミノ酸残基で切断された短縮又は切断ＢＥ＿Ｒ１＿１１デアミナーゼタンパク質である。一部の形態では、デアミナーゼタンパク質の短縮又は切断形態は、Ｇｌｙ３０、又はＧｌｙ４１、又はＳｅｒ７０、又はＧｌｙ９０、又はＧｌｙ１００のいずれかを含む位置での切除から生じるアミノ（ＮＨ）末端のアミノ酸残基を含む、切断されたＢＥ＿Ｒ１＿１１デアミナーゼタンパク質断片である。
一部の形態では、デアミナーゼタンパク質の切断形態は、アミノ酸Ｇｌｙ３０（ＢＥ＿Ｒ１＿１１＿Ｎ＿Ｇ３０）で切断されたＢＥ＿Ｒ１＿１１デアミナーゼタンパク質の切断形態であり、これは、以下のアミノ酸配列：
ＴＫＳＡＮＳＧＧＡＡＫＤＬＡＫＹＲＥＲＱＧＭＰＲＡＧＳＡＤＤＡＨＴＡＡＲＬＤＶＧ（配列番号１２７）又は配列番号１２７に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％若しくは９９％の配列同一性を有するアミノ酸或いはその断片を有する。
一部の形態では、デアミナーゼタンパク質の切断形態は、アミノ酸Ｇｌｙ４１（ＢＥ＿Ｒ１＿１１＿Ｎ＿Ｇ４１）で切断されたＢＥ＿Ｒ１＿１１デアミナーゼタンパク質の切断形態であり、これは、以下のアミノ酸配列：
ＴＫＳＡＮＳＧＧＡＡＫＤＬＡＫＹＲＥＲＱＧＭＰＲＡＧＳＡＤＤＡＨＴＡＡＲＬＤＶＧＧＲＳＦＹＧＨＮＡＨＧ（配列番号１２８）又は配列番号１２８に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％若しくは９９％の配列同一性を有するアミノ酸或いはその断片を有する。
一部の形態では、デアミナーゼタンパク質の切断形態は、アミノ酸Ｓｅｒ７０（ＢＥ＿Ｒ１＿１１＿Ｎ＿Ｓ７０）で切断されたＢＥ＿Ｒ１＿１１デアミナーゼタンパク質の切断形態であり、これは、以下のアミノ酸配列：
ＴＫＳＡＮＳＧＧＡＡＫＤＬＡＫＹＲＥＲＱＧＭＰＲＡＧＳＡＤＤＡＨＴＡＡＲＬＤＶＧＧＲＳＦＹＧＨＮＡＨＧＲＮＩＤＩＫＶＮＡＱＴＫＴＨＡＥＡＤＶＦＱＱＡＫＮＡＫＶＳ（配列番号１２９）又は配列番号１２９に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％若しくは９９％の配列同一性を有するアミノ酸或いはその断片を有する。
一部の形態では、デアミナーゼタンパク質の切断形態は、アミノ酸Ｇｌｙ９０（ＢＥ＿Ｒ１＿１１＿Ｎ＿Ｇ９０）で切断されたＢＥ＿Ｒ１＿１１デアミナーゼタンパク質の切断形態であり、これは、以下のアミノ酸配列：
ＴＫＳＡＮＳＧＧＡＡＫＤＬＡＫＹＲＥＲＱＧＭＰＲＡＧＳＡＤＤＡＨＴＡＡＲＬＤＶＧＧＲＳＦＹＧＨＮＡＨＧＲＮＩＤＩＫＶＮＡＱＴＫＴＨＡＥＡＤＶＦＱＱＡＫＮＡＫＶＳＡＤＲＡＴＬＨＶＤＲＤＬＣＤＡＣＧＩＫ（配列番号１３０）又は配列番号１３０に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％若しくは９９％の配列同一性を有するアミノ酸或いはその断片を有する。
一部の形態では、デアミナーゼタンパク質の切断形態は、アミノ酸Ｇｌｙ１００（ＢＥ＿Ｒ１＿１１＿Ｎ＿Ｇ１００）で切断されたＢＥ＿Ｒ１＿１１デアミナーゼタンパク質の切断形態であり、これは、以下のアミノ酸配列：
ＴＫＳＡＮＳＧＧＡＡＫＤＬＡＫＹＲＥＲＱＧＭＰＲＡＧＳＡＤＤＡＨＴＡＡＲＬＤＶＧＧＲＳＦＹＧＨＮＡＨＧＲＮＩＤＩＫＶＮＡＱＴＫＴＨＡＥＡＤＶＦＱＱＡＫＮＡＫＶＳＡＤＲＡＴＬＨＶＤＲＤＬＣＤＡＣＧＩＫＧＧＶＧＳＬＭＲＧＶＧ（配列番号１３１）又は配列番号１３１に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％若しくは９９％の配列同一性を有するアミノ酸或いはその断片を有する。
ＢＥ＿Ｒ１＿１１の切断カルボキシル（ＣＯＯＨ）断片
一部の形態では、デアミナーゼタンパク質の短縮又は切断形態は、カルボキシル（ＣＯＯＨ）末端に対応するＢＥ＿Ｒ１＿１１デアミナーゼタンパク質の断片を得るために特定のアミノ酸残基で切断された短縮又は切断ＢＥ＿Ｒ１＿１１デアミナーゼタンパク質である。一部の形態では、デアミナーゼタンパク質の短縮又は切断形態は、Ｇｌｙ３０、又はＧｌｙ４１、又はＳｅｒ７０、又はＧｌｙ９０、又はＧｌｙ１００のいずれかを含む位置での切断から生じるカルボキシル（ＣＯＯＨ）末端のアミノ酸残基を含む、切断されたＢＥ＿Ｒ１＿１１デアミナーゼタンパク質断片である。
一部の形態では、デアミナーゼタンパク質の短縮又は切断形態は、アミノ（ＮＨ）末端のアミノ酸残基が欠如した切断ＢＥ＿Ｒ１＿１１デアミナーゼタンパク質である。
一部の形態では、デアミナーゼタンパク質の短縮又は切断形態は、アミノ酸Ｇｌｙ３０（ＢＥ＿Ｒ１＿１１＿Ｃ＿Ｇ３０）で切断されたＢＥ＿Ｒ１＿１１デアミナーゼタンパク質の切断形態であり、これは、以下のアミノ酸配列：
ＧＲＳＦＹＧＨＮＡＨＧＲＮＩＤＩＫＶＮＡＱＴＫＴＨＡＥＡＤＶＦＱＱＡＫＮＡＫＶＳＡＤＲＡＴＬＨＶＤＲＤＬＣＤＡＣＧＩＫＧＧＶＧＳＬＭＲＧＶＧＩＳＲＬＴＶＮＳＰＳＧＲＦＥＩＴＡＳＲＰＳＶＰＲＲＩＮＧ（配列番号１３２）又は配列番号１３２に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％若しくは９９％の配列同一性を有するアミノ酸或いはその断片を有する。
一部の形態では、デアミナーゼタンパク質の短縮又は切断形態は、アミノ酸Ｇｌｙ４１（ＢＥ＿Ｒ１＿１１＿Ｃ＿Ｇ４１）で切断されたＢＥ＿Ｒ１＿１１デアミナーゼタンパク質の短縮又は切断形態であり、これは、以下のアミノ酸配列：
ＲＮＩＤＩＫＶＮＡＱＴＫＴＨＡＥＡＤＶＦＱＱＡＫＮＡＫＶＳＡＤＲＡＴＬＨＶＤＲＤＬＣＤＡＣＧＩＫＧＧＶＧＳＬＭＲＧＶＧＩＳＲＬＴＶＮＳＰＳＧＲＦＥＩＴＡＳＲＰＳＶＰＲＲＩＮＧ（配列番号１３３）又は配列番号１３３に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％若しくは９９％の配列同一性を有するアミノ酸或いはその断片を有する。
一部の形態では、デアミナーゼタンパク質の切断形態は、アミノ酸Ｓｅｒ７０（ＢＥ＿Ｒ１＿１１＿Ｃ＿Ｓ７０）で切断されたＢＥ＿Ｒ１＿１１デアミナーゼタンパク質の切断形態であり、これは、以下のアミノ酸配列：
ＡＤＲＡＴＬＨＶＤＲＤＬＣＤＡＣＧＩＫＧＧＶＧＳＬＭＲＧＶＧＩＳＲＬＴＶＮＳＰＳＧＲＦＥＩＴＡＳＲＰＳＶＰＲＲＩＮＧ（配列番号１５０）又は配列番号１５０に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％若しくは９９％の配列同一性を有するアミノ酸或いはその断片を有する。
一部の形態では、デアミナーゼタンパク質の切断形態は、アミノ酸Ｇｌｙ９０（ＢＥ＿Ｒ１＿１１＿Ｃ＿Ｇ９０）で切断されたＢＥ＿Ｒ１＿１１デアミナーゼタンパク質の切断形態であり、これは、以下のアミノ酸配列：
ＧＧＶＧＳＬＭＲＧＶＧＩＳＲＬＴＶＮＳＰＳＧＲＦＥＩＴＡＳＲＰＳＶＰＲＲＩＮＧ（配列番号１３４）又は配列番号１３４に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％若しくは９９％の配列同一性を有するアミノ酸或いはその断片を有する。
一部の形態では、デアミナーゼタンパク質の切断形態は、アミノ酸Ｇｌｙ１００（ＢＥ＿Ｒ１＿１１＿Ｃ＿Ｇ１００）で切断されたＢＥ＿Ｒ１＿１１デアミナーゼタンパク質の切断形態であり、これは、以下のアミノ酸配列：
ＩＳＲＬＴＶＮＳＰＳＧＲＦＥＩＴＡＳＲＰＳＶＰＲＲＩＮＧ（配列番号１３５）又は配列番号１３５に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％若しくは９９％の配列同一性を有するアミノ酸或いはその断片を有する。
スプリットＢＥ＿Ｒ１＿１１デアミナーゼタンパク質の結合
一部の形態では、デアミナーゼタンパク質の短縮又は切断形態は、デアミナーゼ機能のみが欠如している。一部の形態では、ＢＥ＿Ｒ１＿１１デアミナーゼタンパク質の短縮又は切断形態の２つ以上の結合により、デアミナーゼ機能が再形成される。例えば、一部の形態では、アミノ（ＮＨ）末端から１つ以上のアミノ酸残基が欠如したＢＥ＿Ｒ１＿１１デアミナーゼタンパク質の１つの短縮又は切断形態又は完全ＢＥ＿Ｒ１＿１１デアミナーゼドメインのカルボキシル（ＣＯＯＨ）末端からの断片を組み合わせると、カルボキシル（ＣＯＯＨ）末端から１つ以上のアミノ酸残基が欠如したＢＥ＿Ｒ１＿１１デアミナーゼタンパク質の１つ以上の短縮若しくは切断形態又は完全ＢＥ＿Ｒ１＿１１デアミナーゼドメインのアミノ（ＮＨ）末端からの断片との結合若しくは共局在化時に機能性になる。例えば、一部の形態では、塩基エディターは、配列番号１２７～１３１のいずれか１つのアミノ酸配列を有するスプリットＢＥ＿Ｒ１＿１１デアミナーゼドメインを含み、この場合、塩基エディターは、配列番号１３２～１３５のアミノ酸配列を有する別のスプリットＢＥ＿Ｒ１＿１１デアミナーゼドメインとの共局在化又は結合時或いは配列番号１２２のアミノ酸配列又は配列番号１２２に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％若しくは９９％の配列同一性を有するアミノ酸を有するＢＥ＿Ｒ１＿１１デアミナーゼドメインの「不活性型」形態と一緒に、再形成されたデアミナーゼ活性を有する。
（２）スプリットＢＥ＿Ｒ１＿１２デアミナーゼタンパク質
一部の形態では、デアミナーゼタンパク質の短縮又は切断形態は、ＢＥ＿Ｒ１＿１２デアミナーゼタンパク質の短縮又は切断形態である。
ＢＥ＿Ｒ１＿１２の切断アミノ（ＮＨ）断片
一部の形態では、デアミナーゼタンパク質の短縮又は切断形態は、短縮又は切断されたＢＥ＿Ｒ１＿１２デアミナーゼタンパク質断片であり、Ｇｌｙ３１、又はＧｌｙ４０、又はＧｌｙ８５、Ｇｌｙ１１０、又はＧｌｙ１４０のいずれかを含む位置での切断から生じる（ＮＨ）末端のアミノ酸残基を含む。
一部の形態では、デアミナーゼタンパク質の切断形態は、アミノ酸Ｇｌｙ３１（ＢＥ＿Ｒ１＿１２＿Ｎ＿Ｇ３１）で切断されたＢＥ＿Ｒ１＿１２デアミナーゼタンパク質の切断形態であり、これは、以下のアミノ酸配列：
ＦＳＫＡＥＳＧＹＩＥＩＱＲＦＲＲＩＬＮＭＰＲＹＳＬＴＮＧＲＴＧ（配列番号１３６）又は配列番号１３６に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％若しくは９９％の配列同一性を有するアミノ酸或いはその断片を有する。
一部の形態では、デアミナーゼタンパク質の切断形態は、アミノ酸Ｇｌｙ４０（ＢＥ＿Ｒ１＿１２＿Ｎ＿Ｇ４０）で切断されたＢＥ＿Ｒ１＿１２デアミナーゼタンパク質の切断形態であり、これは、以下のアミノ酸配列：
ＦＳＫＡＥＳＧＹＩＥＩＱＲＦＲＲＩＬＮＭＰＲＹＳＬＴＮＧＲＴＧＴＶＡＲＶＥＶＮＧ（配列番号１３７）又は配列番号１３７に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％若しくは９９％の配列同一性を有するアミノ酸或いはその断片を有する。
一部の形態では、デアミナーゼタンパク質の切断形態は、アミノ酸Ｇｌｙ ８５（ＢＥ＿Ｒ１＿１２＿Ｎ＿Ｇ８５）で切断されたＢＥ＿Ｒ１＿１２デアミナーゼタンパク質の切断形態であり、これは、以下のアミノ酸配列：
ＦＳＫＡＥＳＧＹＩＥＩＩＱＲＦＲＲＩＬＮＭＰＲＹＳＬＴＮＧＲＴＧＴＶＡＲＶＥＶＮＧＲＲＩＦＧＶＮＴＳＬＩＫＮＳＫＹＡＰＲＤＭＤＬＲＲＲＷＬＲＥＶＮＷＶＰＰＫＫＮＫＰＮＨＬＧ（配列番号１３８）又は配列番号１３８に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％若しくは９９％の配列同一性を有するアミノ酸或いはその断片を有する。
一部の形態では、デアミナーゼタンパク質の切断形態は、アミノ酸Ｇｌｙ１１０（ＢＥ＿Ｒ１＿１２＿Ｎ＿Ｇ１１０）で切断されたＢＥ＿Ｒ１＿１２デアミナーゼタンパク質の切断形態であり、これは、以下のアミノ酸配列：
ＦＳＫＡＥＳＧＹＩＥＩＩＱＲＦＲＲＩＬＮＭＰＲＹＳＬＴＮＧＲＴＧＴＶＡＲＶＥＶＮＧＲＲＩＦＧＶＮＴＳＬＩＫＮＳＫＹＡＰＲＤＭＤＬＲＲＲＷＬＲＥＶＮＷＶＰＰＫＫＮＫＰＮＨＬＧＨＡＱＳＬＳＨＡＥＳＨＡＬＩＲＡＹＥＲＭＥＲＬＧＧ（配列番号１３９）又は配列番号１３９に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％若しくは９９％の配列同一性を有するアミノ酸或いはその断片を有する。
一部の形態では、デアミナーゼタンパク質の切断形態は、アミノ酸Ｇｌｙ１４０（ＢＥ＿Ｒ１＿１２＿Ｎ＿Ｇ１４０）で切断されたＢＥ＿Ｒ１＿１２デアミナーゼタンパク質の切断形態であり、これは、以下のアミノ酸配列：
Figure 2024502630000044
 （配列番号１４０）又は配列番号１４０に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％若しくは９９％の配列同一性を有するアミノ酸或いはその断片を有する。
ＢＥ＿Ｒ１＿１２の切断カルボキシル（ＣＯＯＨ）断片
一部の形態では、デアミナーゼタンパク質の切断形態は、Ｇｌｙ３１、又はＧｌｙ４０、又はＧｌｙ８５、Ｇｌｙ１１０、又はＧｌｙ１４０のいずれかを含む位置での切断から生じるカルボキシル（ＣＯＯＨ）末端のアミノ酸残基を含む、切断ＢＥ＿Ｒ１＿１２デアミナーゼタンパク質断片である。
一部の形態では、デアミナーゼタンパク質の切断形態は、アミノ酸Ｇｌｙ３１（ＢＥ＿Ｒ１＿１２＿Ｃ＿Ｇ３１）で切断されたＢＥ＿Ｒ１＿１２デアミナーゼタンパク質の切断形態であり、これは、以下のアミノ酸配列：
Figure 2024502630000045
 （配列番号１４１）又は配列番号１４１に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％若しくは９９％の配列同一性を有するアミノ酸或いはその断片を有する。
一部の形態では、デアミナーゼタンパク質の切断形態は、アミノ酸Ｇｌｙ４０（ＢＥ＿Ｒ１＿１２＿Ｃ＿Ｇ４０）で切断されたＢＥ＿Ｒ１＿１２デアミナーゼタンパク質の切断形態であり、これは、以下のアミノ酸配列：
ＲＲＩＦＧＶＮＴＳＬＩＫＮＳＫＹＡＰＲＤＭＤＬＲＲＲＷＬＲＥＶＮＷＶＰＰＫＫＮＫＰＮＨＬＧＨＡＱＳＬＳＨＡＥＳＨＡＬＩＲＡＹＥＲＭＥＲＬＧＧＱＬＰＫＫＬＴＭＶＶＤＲＰＴＣＮＩＣＲＧＥＭＰＡＬＬＫＲＬＧＩＥＥＬＴＩＹＳＧＧＲＤＡＩＩＩＫＡＩＫ（配列番号１４２）又は配列番号１４２に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％若しくは９９％の配列同一性を有するアミノ酸或いはその断片を有する。
一部の形態では、デアミナーゼタンパク質の切断形態は、アミノ酸Ｇｌｙ ８５（ＢＥ＿Ｒ１＿１２＿Ｃ＿Ｇ８５）で切断されたＢＥ＿Ｒ１＿１２デアミナーゼタンパク質の切断形態であり、これは、以下のアミノ酸配列：
ＨＡＱＳＬＳＨＡＥＳＨＡＬＩＲＡＹＥＲＭＥＲＬＧＧＱＬＰＫＫＬＴＭＶＶＤＲＰＴＣＮＩＣＲＧＥＭＰＡＬＬＫＲＬＧＩＥＥＬＴＩＹＳＧＧＲＤＡＩＩＩＫＡＩＫ（配列番号１４３）又は配列番号１４３に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％若しくは９９％の配列同一性を有するアミノ酸或いはその断片を有する。
一部の形態では、デアミナーゼタンパク質の切断形態は、アミノ酸Ｇｌｙ１１０（ＢＥ＿Ｒ１＿１２＿Ｃ＿Ｇ１１０）で切断されたＢＥ＿Ｒ１＿１２デアミナーゼタンパク質の切断形態であり、これは、以下のアミノ酸配列：
ＱＬＰＫＫＬＴＭＶＶＤＲＰＴＣＮＩＣＲＧＥＭＰＡＬＬＫＲＬＧＩＥＥＬＴＩＹＳＧＧＲＤＡＩＩＩＫＡＩＫ（配列番号１４４）又は配列番号１４４に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％若しくは９９％の配列同一性を有するアミノ酸或いはその断片を有する。
一部の形態では、デアミナーゼタンパク質の切断形態は、アミノ酸Ｇｌｙ１４０（ＢＥ＿Ｒ１＿１２＿Ｃ＿Ｇ１４０）で切断されたＢＥ＿Ｒ１＿１２デアミナーゼタンパク質の切断形態であり、これは、以下のアミノ酸配列：
ＩＥＥＬＴＩＹＳＧＧＲＤＡＩＩＩＫＡＩＫ（配列番号１４５）又は配列番号１４５に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％若しくは９９％の配列同一性を有するアミノ酸或いはその断片を有する。
ＢＥ＿Ｒ１＿１２の短縮断片
一部の形態では、デアミナーゼタンパク質の短縮又は切断形態は、アミノ（ＮＨ）末端から数えて特定の数の連続したアミノ酸残基が欠如した（例えば、インタクトなカルボキシル（ＣＯＯＨ）末端を得るために）短縮又は切断ＢＥ＿Ｒ１＿２８デアミナーゼタンパク質である。例えば、一部の形態では、デアミナーゼタンパク質の短縮又は切断形態は、アミノ（ＮＨ）末端から数えて５個の連続したアミノ酸残基又は１０、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５若しくは１００個の連続したアミノ酸残基が欠如した（Δ）短縮又は切断ＢＥ＿Ｒ１＿２８デアミナーゼタンパク質である。
一部の形態では、デアミナーゼタンパク質の短縮形態は、アミノ（ＮＨ）末端から２０個の連続したアミノ酸残基が欠如した（Δ）短縮ＢＥ＿Ｒ１＿１２デアミナーゼタンパク質（ＢＥ＿Ｒ１＿１２＿Ｃ＿Δ２０）であり、これは、以下のアミノ酸配列：
Figure 2024502630000046
 （配列番号１５６）又は配列番号１５６に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％若しくは９９％の配列同一性を有するアミノ酸或いはその断片を有する。
一部の形態では、デアミナーゼタンパク質の短縮形態は、アミノ（ＮＨ）末端から２５個の連続したアミノ酸残基が欠如した（Δ）短縮ＢＥ＿Ｒ１＿１２デアミナーゼタンパク質（ＢＥ＿Ｒ１＿１２＿Ｃ＿Δ２５）であり、これは、以下のアミノ酸配列：
Figure 2024502630000047
 （配列番号１５７）又は配列番号１５７に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％若しくは９９％の配列同一性を有するアミノ酸或いはその断片を有する。
一部の形態では、デアミナーゼタンパク質の短縮形態は、カルボキシル（ＣＯＯＨ）末端から３０個の連続したアミノ酸残基が欠如した（Δ）短縮ＢＥ＿Ｒ１＿１２デアミナーゼタンパク質（ＢＥ＿Ｒ１＿１２＿Ｃ＿Δ３０）であり、これは、以下のアミノ酸配列：
Figure 2024502630000048
 （配列番号１５８）又は配列番号１５８に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％若しくは９９％の配列同一性を有するアミノ酸或いはその断片を有する。
一部の形態では、デアミナーゼタンパク質の短縮形態は、アミノ（ＮＨ）末端から３５個の連続したアミノ酸残基が欠如した（Δ）短縮ＢＥ＿Ｒ１＿１２デアミナーゼタンパク質（ＢＥ＿Ｒ１＿１２＿Ｃ＿Δ３５）であり、これは、以下のアミノ酸配列：
Figure 2024502630000049
 （配列番号１５９）又は配列番号１５９に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％若しくは９９％の配列同一性を有するアミノ酸或いはその断片を有する。
一部の形態では、デアミナーゼタンパク質の短縮形態は、アミノ（ＮＨ）末端から４０個の連続したアミノ酸残基が欠如した（Δ）短縮ＢＥ＿Ｒ１＿１２デアミナーゼタンパク質（ＢＥ＿Ｒ１＿１２＿Ｃ＿Δ４０）であり、これは、以下のアミノ酸配列：
ＲＲＩＦＧＶＮＴＳＬＩＫＮＳＫＹＡＰＲＤＭＤＬＲＲＲＷＬＲＥＶＮＷＶＰＰＫＫＮＫＰＮＨＬＧＨＡＱＳＬＳＨＡＥＳＨＡＬＩＲＡＹＥＲＭＥＲＬＧＧＱＬＰＫＫＬＴＭＶＶＤＲＰＴＣＮＩＣＲＧＥＭＰＡＬＬＫＲＬＧＩＥＥＬＴＩＹＳＧＧＲＤＡＩＩＩＫＡＩＫ（配列番号１６０）又は配列番号１６０に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％若しくは９９％の配列同一性を有するアミノ酸或いはその断片を有する。
一部の形態では、デアミナーゼタンパク質の短縮形態は、アミノ（ＮＨ）末端から４５個の連続したアミノ酸残基が欠如した（Δ）短縮ＢＥ＿Ｒ１＿１２デアミナーゼタンパク質（ＢＥ＿Ｒ１＿１２＿Ｃ＿Δ４５）であり、これは、以下のアミノ酸配列：
ＶＮＴＳＬＩＫＮＳＫＹＡＰＲＤＭＤＬＲＲＲＷＬＲＥＶＮＷＶＰＰＫＫＮＫＰＮＨＬＧＨＡＱＳＬＳＨＡＥＳＨＡＬＩＲＡＹＥＲＭＥＲＬＧＧＱＬＰＫＫＬＴＭＶＶＤＲＰＴＣＮＩＣＲＧＥＭＰＡＬＬＫＲＬＧＩＥＥＬＴＩＹＳＧＧＲＤＡＩＩＩＫＡＩＫ（配列番号１６１）又は配列番号１６１に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％若しくは９９％の配列同一性を有するアミノ酸或いはその断片を有する。
一部の形態では、デアミナーゼタンパク質の短縮形態は、アミノ（ＮＨ）末端から５０個の連続したアミノ酸残基が欠如した（Δ）短縮ＢＥ＿Ｒ１＿１２デアミナーゼタンパク質（ＢＥ＿Ｒ１＿１２＿Ｃ＿Δ５０）であり、これは、以下のアミノ酸配列：
ＩＫＮＳＫＹＡＰＲＤＭＤＬＲＲＲＷＬＲＥＶＮＷＶＰＰＫＫＮＫＰＮＨＬＧＨＡＱＳＬＳＨＡＥＳＨＡＬＩＲＡＹＥＲＭＥＲＬＧＧＱＬＰＫＫＬＴＭＶＶＤＲＰＴＣＮＩＣＲＧＥＭＰＡＬＬＫＲＬＧＩＥＥＬＴＩＹＳＧＧＲＤＡＩＩＩＫＡＩＫ（配列番号１６２）又は配列番号１６２に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％若しくは９９％の配列同一性を有するアミノ酸或いはその断片を有する。
一部の形態では、デアミナーゼタンパク質の短縮形態は、アミノ（ＮＨ）末端から５５個の連続したアミノ酸残基が欠如した（Δ）短縮ＢＥ＿Ｒ１＿１２デアミナーゼタンパク質（ＢＥ＿Ｒ１＿１２＿Ｃ＿Δ５５）であり、これは、以下のアミノ酸配列：
ＹＡＰＲＤＭＤＬＲＲＲＷＬＲＥＶＮＷＶＰＰＫＫＮＫＰＮＨＬＧＨＡＱＳＬＳＨＡＥＳＨＡＬＩＲＡＹＥＲＭＥＲＬＧＧＱＬＰＫＫＬＴＭＶＶＤＲＰＴＣＮＩＣＲＧＥＭＰＡＬＬＫＲＬＧＩＥＥＬＴＩＹＳＧＧＲＤＡＩＩＩＫＡＩＫ（配列番号１６３）又は配列番号１６３に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％若しくは９９％の配列同一性を有するアミノ酸或いはその断片を有する。
一部の形態では、デアミナーゼタンパク質の短縮形態は、アミノ（ＮＨ）末端から６０個の連続したアミノ酸残基が欠如した（Δ）短縮ＢＥ＿Ｒ１＿１２デアミナーゼタンパク質（ＢＥ＿Ｒ１＿１２＿Ｃ＿Δ６０）であり、これは、以下のアミノ酸配列：
ＭＤＬＲＲＲＷＬＲＥＶＮＷＶＰＰＫＫＮＫＰＮＨＬＧＨＡＱＳＬＳＨＡＥＳＨＡＬＩＲＡＹＥＲＭＥＲＬＧＧＱＬＰＫＫＬＴＭＶＶＤＲＰＴＣＮＩＣＲＧＥＭＰＡＬＬＫＲＬＧＩＥＥＬＴＩＹＳＧＧＲＤＡＩＩＩＫＡＩＫ（配列番号１６４）又は配列番号１６４に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％若しくは９９％の配列同一性を有するアミノ酸或いはその断片を有する。
一部の形態では、デアミナーゼタンパク質の短縮形態は、アミノ（ＮＨ）末端から７０個の連続したアミノ酸残基が欠如した（Δ）短縮ＢＥ＿Ｒ１＿１２デアミナーゼタンパク質（ＢＥ＿Ｒ１＿１２＿Ｃ＿Δ７０）であり、これは、以下のアミノ酸配列：
ＶＮＷＶＰＰＫＫＮＫＰＮＨＬＧＨＡＱＳＬＳＨＡＥＳＨＡＬＩＲＡＹＥＲＭＥＲＬＧＧＱＬＰＫＫＬＴＭＶＶＤＲＰＴＣＮＩＣＲＧＥＭＰＡＬＬＫＲＬＧＩＥＥＬＴＩＹＳＧＧＲＤＡＩＩＩＫＡＩＫ（配列番号１６５）又は配列番号１６５に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％若しくは９９％の配列同一性を有するアミノ酸或いはその断片を有する。
一部の形態では、デアミナーゼタンパク質の短縮形態は、アミノ（ＮＨ）末端から７５個の連続したアミノ酸残基が欠如した（Δ）短縮ＢＥ＿Ｒ１＿１２デアミナーゼタンパク質（ＢＥ＿Ｒ１＿１２＿Ｃ＿Δ７５）であり、これは、以下のアミノ酸配列：
ＰＫＫＮＫＰＮＨＬＧＨＡＱＳＬＳＨＡＥＳＨＡＬＩＲＡＹＥＲＭＥＲＬＧＧＱＬＰＫＫＬＴＭＶＶＤＲＰＴＣＮＩＣＲＧＥＭＰＡＬＬＫＲＬＧＩＥＥＬＴＩＹＳＧＧＲＤＡＩＩＩＫＡＩＫ（配列番号１６６）又は配列番号１６６に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％若しくは９９％の配列同一性を有するアミノ酸或いはその断片を有する。
一部の形態では、デアミナーゼタンパク質の短縮形態は、アミノ（ＮＨ）末端から１００個の連続したアミノ酸残基が欠如した（Δ）短縮ＢＥ＿Ｒ１＿１２デアミナーゼタンパク質（ＢＥ＿Ｒ１＿１２＿Ｃ＿Δ１００）であり、これは、以下のアミノ酸配列：
ＨＡＬＩＲＡＹＥＲＭＥＲＬＧＧＱＬＰＫＫＬＴＭＶＶＤＲＰＴＣＮＩＣＲＧＥＭＰＡＬＬＫＲＬＧＩＥＥＬＴＩＹＳＧＧＲＤＡＩＩＩＫＡＩＫ（配列番号１６７）又は配列番号１６７に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％若しくは９９％の配列同一性を有するアミノ酸或いはその断片を有する。
スプリットＢＥ＿Ｒ１＿１２デアミナーゼタンパク質の結合
一部の形態では、トＢＥ＿Ｒ１＿１２デアミナーゼタンパク質の短縮又は切断形態は、デアミナーゼ機能のみが欠如している。一部の形態では、ＢＥ＿Ｒ１＿１２デアミナーゼタンパク質の短縮又は切断形態の２つ以上の結合により、デアミナーゼ機能が再形成される。例えば、一部の形態では、アミノ（ＮＨ）末端から１つ以上のアミノ酸残基が欠如したＢＥ＿Ｒ１＿１２デアミナーゼタンパク質の１つの短縮又は切断形態又は完全ＢＥ＿Ｒ１＿１２デアミナーゼドメインのカルボキシル（ＣＯＯＨ）末端からの断片を組み合わせると、カルボキシル（ＣＯＯＨ）末端から１つ以上のアミノ酸残基が欠如したＢＥ＿Ｒ１＿１２デアミナーゼタンパク質の１つ以上の短縮若しくは切断形態又は完全ＢＥ＿Ｒ１＿１２デアミナーゼドメインのアミノ（ＮＨ）末端からの断片との結合又は共局在化時に機能性になる。例えば、一部の形態では、塩基エディターは、配列番号１４１～１４５のいずれか１つのアミノ酸配列を有するスプリットＢＥ＿Ｒ１＿１２デアミナーゼドメインを含み、この場合、塩基エディターは、配列番号１３６～１４０のアミノ酸配列のいずれか１つのアミノ酸配列を有する別のスプリットＢＥ＿Ｒ１＿１２デアミナーゼドメインとの共局在化又は結合時或いは配列番号１２４のアミノ酸配列又は配列番号１２４に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％若しくは９９％の配列同一性を有するアミノ酸を有するＢＥ＿Ｒ１＿１２デアミナーゼドメインの「不活性型」形態と一緒に、再形成されたデアミナーゼ活性を有する。
一部の形態では、塩基エディターは、配列番号１４６～１６７のいずれか１つのアミノ酸配列を有するスプリットＢＥ＿Ｒ１＿１２デアミナーゼドメインを含み、この場合、塩基エディターは、配列番号１３６～１４０のいずれかのアミノ酸配列を有する別のスプリットＢＥ＿Ｒ１＿１２デアミナーゼドメインとの共局在化又は結合時或いは配列番号１２４のアミノ酸配列又は配列番号１２４に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％若しくは９９％の配列同一性を有するアミノ酸を有するＢＥ＿Ｒ１＿１２デアミナーゼドメインの「不活性型」形態と一緒に、再形成されたデアミナーゼ活性を有する。
（３）スプリットＢＥ＿Ｒ１＿２８デアミナーゼタンパク質
一部の形態では、デアミナーゼタンパク質の短縮又は切断形態は、ＢＥ＿Ｒ１＿２８デアミナーゼタンパク質の短縮又は切断形態である。
ＢＥ＿Ｒ１＿２８の切断アミノ（ＮＨ）断片
一部の形態では、デアミナーゼタンパク質の短縮又は切断形態は、Ｇｌｙ３３、又はＧｌｙ５１、又はＬｙｓ７１、Ｇｌｙ１０１、又はＧｌｙ１２６のいずれかを含む位置での切断から生じる（ＮＨ）末端のアミノ酸残基を含む、短縮又は切断ＢＥ＿Ｒ１＿２８デアミナーゼタンパク質断片である。
一部の形態では、デアミナーゼタンパク質の切断形態は、アミノ酸Ｇｌｙ３３で切断されたＢＥ＿Ｒ１＿１２デアミナーゼタンパク質の切断形態（ＢＥ＿Ｒ１＿２８＿Ｎ＿Ｇ３３）であり、これは、以下のアミノ酸配列：
ＧＶＧＧＡＩＴＡＴＶＧＳＴＡＧＡＡＧＲＡＡＡＲＡＰＳＬＰＡＹＡＧＧ（配列番号１４６）又は配列番号１４６に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％若しくは９９％の配列同一性を有するアミノ酸或いはその断片を有する。
一部の形態では、デアミナーゼタンパク質の切断形態は、アミノ酸Ｇｌｙ５１で切断されたＢＥ＿Ｒ１＿２８デアミナーゼタンパク質の切断形態（ＢＥ＿Ｒ１＿２８＿Ｎ＿Ｇ５１）であり、これは、以下のアミノ酸配列：
ＧＶＧＧＡＩＴＡＴＶＧＳＴＡＧＡＡＧＲＡＡＡＲＡＰＳＬＰＡＹＡＧＧＫＴＳＧＶＬＲＴＴＡＧＤＴＡＬＬＳＧ（配列番号１４７）又は配列番号１４７に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％若しくは９９％の配列同一性を有するアミノ酸或いはその断片を有する。
一部の形態では、デアミナーゼタンパク質の切断形態は、アミノ酸Ｌｙｓ７１で切断されたＢＥ＿Ｒ１＿２８デアミナーゼタンパク質の切断形態（ＢＥ＿Ｒ１＿２８＿Ｎ＿Ｋ７１）であり、これは、以下のアミノ酸配列：
ＧＶＧＧＡＩＴＡＴＶＧＳＴＡＧＡＡＧＲＡＡＡＲＡＰＳＬＰＡＹＡＧＧＫＴＳＧＶＬＲＴＴＡＧＤＴＡＬＬＳＧＹＫＧＰＳＡＳＭＰＲＧＴＰＧＭＮＧＲＩＫ（配列番号１４８）又は配列番号１４８に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％若しくは９９％の配列同一性を有するアミノ酸或いはその断片を有する。
一部の形態では、デアミナーゼタンパク質の切断形態は、アミノ酸Ｇｌｙ１０１で切断されたＢＥ＿Ｒ１＿２８デアミナーゼタンパク質の切断形態（ＢＥ＿Ｒ１＿２８＿Ｎ＿Ｇ１０１）であり、これは、以下のアミノ酸配列：
ＧＶＧＧＡＩＴＡＴＶＧＳＴＡＧＡＡＧＲＡＡＡＲＡＰＳＬＰＡＹＡＧＧＫＴＳＧＶＬＲＴＴＡＧＤＴＡＬＬＳＧＹＫＧＰＳＡＳＭＰＲＧＴＰＧＭＮＧＲＩＫＳＨＶＥＡＨＡＡＡＶＭＲＥＱＧＭＫＥＧＴＬＹＩＮＲＶＰＣＳＧ（配列番号１４９）又は配列番号１４９に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％若しくは９９％の配列同一性を有するアミノ酸或いはその断片を有する。
ＢＥ＿Ｒ１＿２８の切断カルボキシル（ＣＯＯＨ）断片
一部の形態では、デアミナーゼタンパク質の短縮又は切断形態は、Ｇｌｙ３３、又はＧｌｙ５１、又はＬｙｓ７１、Ｇｌｙ１０１、又はＧｌｙ１２６のいずれかを含む位置での切断から生じるカルボキシル（ＣＯＯＨ）末端のアミノ酸残基を含む、短縮又は切断ＢＥ＿Ｒ１＿２８デアミナーゼタンパク質断片である。
一部の形態では、デアミナーゼタンパク質の切断形態は、アミノ酸Ｇｌｙ３３末端で切断されたＢＥ＿Ｒ１＿２８デアミナーゼタンパク質の切断形態（ＢＥ＿Ｒ１＿２８＿Ｃ＿Ｇ３３）であり、これは、以下のアミノ酸配列：
ＫＴＳＧＶＬＲＴＴＡＧＤＴＡＬＬＳＧＹＫＧＰＳＡＳＭＰＲＧＴＰＧＭＮＧＲＩＫＳＨＶＥＡＨＡＡＡＶＭＲＥＱＧＭＫＥＧＴＬＹＩＮＲＶＰＣＳＧＡＴＧＣＤＡＭＬＰＲＭＬＰＰＤＡＨＬＲＶＶＧＰＮＧＹＤＱＶＦＶＧＬ（配列番号１５１）又は配列番号１５１に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％若しくは９９％の配列同一性を有するアミノ酸或いはその断片を有する。
一部の形態では、デアミナーゼタンパク質の切断形態は、アミノ酸Ｇｌｙ５１で切断されたＢＥ＿Ｒ１＿２８デアミナーゼタンパク質の切断形態（ＢＥ＿Ｒ１＿２８＿Ｃ＿Ｇ５１）であり、これは、以下のアミノ酸配列：ＹＫＧＰＳＡＳＭＰＲＧＴＰＧＭＮＧＲＩＫＳＨＶＥＡＨＡＡＡＶＭＲＥＱＧＭＫＥＧＴＬＹＩＮＲＶＰＣＳＧＡＴＧＣＤＡＭＬＰＲＭＬＰＰＤＡＨＬＲＶＶＧＰＮＧＹＤＱＶＦＶＧＬ（配列番号１５２）又は配列番号１５２に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％若しくは９９％の配列同一性を有するアミノ酸或いはその断片を有する。
一部の形態では、デアミナーゼタンパク質の切断形態は、アミノ酸Ｌｙｓ７１で切断されたＢＥ＿Ｒ１＿２８デアミナーゼタンパク質の切断形態（ＢＥ＿Ｒ１＿２８＿Ｃ＿Ｋ７１）であり、これは、以下のアミノ酸配列：
ＳＨＶＥＡＨＡＡＡＶＭＲＥＱＧＭＫＥＧＴＬＹＩＮＲＶＰＣＳＧＡＴＧＣＤＡＭＬＰＲＭＬＰＰＤＡＨＬＲＶＶＧＰＮＧＹＤＱＶＦＶＧＬ（配列番号１５３）又は配列番号１５３に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％若しくは９９％の配列同一性を有するアミノ酸或いはその断片を有する。
一部の形態では、デアミナーゼタンパク質の切断形態は、アミノ酸Ｇｌｙ１０１で切断されたＢＥ＿Ｒ１＿２８デアミナーゼタンパク質の切断形態（ＢＥ＿Ｒ１＿２８＿Ｃ＿Ｇ１０１）であり、これは、以下のアミノ酸配列：
ＡＴＧＣＤＡＭＬＰＲＭＬＰＰＤＡＨＬＲＶＶＧＰＮＧＹＤＱＶＦＶＧＬ（配列番号１５４）又は配列番号１５４に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％若しくは９９％の配列同一性を有するアミノ酸或いはその断片を有する。
一部の形態では、デアミナーゼタンパク質の切断形態は、アミノ酸Ｇｌｙ１２６で切断されたＢＥ＿Ｒ１＿２８デアミナーゼタンパク質の切断形態（ＢＥ＿Ｒ１＿２８＿Ｃ＿Ｇ１２６）であり、これは、以下のアミノ酸配列：
ＹＤＱＶＦＶＧＬ（配列番号１５５）又は配列番号１５５に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％若しくは９９％の配列同一性を有するアミノ酸或いはその断片を有する。
スプリットＢＥ＿Ｒ１＿２８デアミナーゼタンパク質の結合
一部の形態では、ＢＥ＿Ｒ１＿２８デアミナーゼタンパク質の短縮又は切断形態は、デアミナーゼ機能のみが欠如している。一部の形態では、ＢＥ＿Ｒ１＿２８デアミナーゼタンパク質の短縮又は切断形態の２つ以上の結合により、デアミナーゼ機能が再形成される。例えば、一部の形態では、アミノ（ＮＨ）末端から１つ以上のアミノ酸残基が欠如したＢＥ＿Ｒ１＿２８デアミナーゼタンパク質の１つの短縮又は切断形態又は完全ＢＥ＿Ｒ１＿２８デアミナーゼドメインのカルボキシル（ＣＯＯＨ）末端からの断片を組み合わせると、カルボキシル（ＣＯＯＨ）末端から１つ以上のアミノ酸残基が欠如したＢＥ＿Ｒ１＿２８デアミナーゼタンパク質の１つ以上の短縮若しくは切断形態又は完全ＢＥ＿Ｒ１＿２８デアミナーゼドメインのアミノ（ＮＨ）末端からの断片との結合又は共局在化時に機能性になる。例えば、一部の形態では、塩基エディターは、配列番号１５１～１５５のいずれか１つのアミノ酸配列を有するスプリットＢＥ＿Ｒ１＿２８デアミナーゼドメインを含み、この場合、塩基エディターは、配列番号１４６～１４９のいずれか１つのアミノ酸配列を有する別のスプリットＢＥ＿Ｒ１＿２８デアミナーゼドメインとの共局在化又は結合時或いは配列番号１２３のアミノ酸配列又は配列番号１２３に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％若しくは９９％の配列同一性を有するアミノ酸を有するＢＥ＿Ｒ１＿１２デアミナーゼドメインの「不活性型」形態と一緒に、再形成されたデアミナーゼ活性を有する。
（４）スプリットＢＥ＿Ｒ１＿４１デアミナーゼタンパク質
一部の形態では、デアミナーゼタンパク質の短縮又は切断形態は、ＢＥ＿Ｒ１＿４１デアミナーゼタンパク質の短縮又は切断形態である。
ＢＥ＿Ｒ１＿４１の切断アミノ（ＮＨ）断片
一部の形態では、デアミナーゼタンパク質の短縮又は切断形態は、Ｇｌｙ３３、又はＧｌｙ４３、又はＧｌｙ６９、又はＧｌｙ１０８のいずれかを含む位置での切断から生じるアミノ（ＮＨ）末端のアミノ酸残基を含む、切断されたＢＥ＿Ｒ１＿４１デアミナーゼタンパク質断片である。
一部の形態では、デアミナーゼタンパク質の切断形態は、アミノ酸Ｇｌｙ３３で切断されたＢＥ＿Ｒ１＿４１デアミナーゼタンパク質の切断形態（ＢＥ＿Ｒ１＿４１＿Ｎ＿Ｇ３３）であり、これは、以下のアミノ酸配列：
ＧＳＹＴＬＧＳＹＱＩＳＡＰＱＬＰＡＹＮＧＱＴＶＧＴＦＹＹＶＮＧＡＧ（配列番号１６８）又は配列番号１６８に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％若しくは９９％の配列同一性を有するアミノ酸或いはその断片を有する。
一部の形態では、デアミナーゼタンパク質の短縮又は切断形態は、アミノ酸Ｇｌｙ４３で切断されたＢＥ＿Ｒ１＿４１デアミナーゼタンパク質の短縮又は切断形態（ＢＥ＿Ｒ１＿４１＿Ｎ＿Ｇ４３）であり、これは、以下のアミノ酸配列：
ＧＳＹＴＬＧＳＹＱＩＳＡＰＱＬＰＡＹＮＧＱＴＶＧＴＦＹＹＶＮＧＡＧＧＬＥＳＲＴＦＳＳＧ（配列番号１６９）又は配列番号１６９に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％若しくは９９％の配列同一性を有するアミノ酸或いはその断片を有する。
一部の形態では、デアミナーゼタンパク質の切断形態は、アミノ酸Ｇｌｙ６９で切断されたＢＥ＿Ｒ１＿４１デアミナーゼタンパク質の切断形態（ＢＥ＿Ｒ１＿４１＿Ｎ＿Ｇ６９）であり、これは、以下のアミノ酸配列：
ＧＳＹＴＬＧＳＹＱＩＳＡＰＱＬＰＡＹＮＧＱＴＶＧＴＦＹＹＶＮＧＡＧＧＬＥＳＲＴＦＳＳＧＧＰＴＰＹＰＮＹＡＮＡＧＨＶＥＧＱＳＡＬＦＭＲＤＮＧ（配列番号１７０）又は配列番号１７０に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％若しくは９９％の配列同一性を有するアミノ酸或いはその断片を有する。
一部の形態では、デアミナーゼタンパク質の切断形態は、アミノ酸Ｇｌｙ１０８で切断されたＢＥ＿Ｒ１＿４１デアミナーゼタンパク質の切断形態（ＢＥ＿Ｒ１＿４１＿Ｎ＿Ｇ１０８）であり、これは、以下のアミノ酸配列：
ＧＳＹＴＬＧＳＹＱＩＳＡＰＱＬＰＡＹＮＧＱＴＶＧＴＦＹＹＶＮＧＡＧＧＬＥＳＲＴＦＳＳＧＧＰＴＰＹＰＮＹＡＮＡＧＨＶＥＧＱＳＡＬＦＭＲＤＮＧＩＳＤＧＬＶＦＨＮＮＰＥＧＴＣＧＦＣＶＮＭＴＥＴＬＬＰＥＮＳＫＬＴＶＶＰＰＥＧ（配列番号１７１）又は配列番号１７１に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％若しくは９９％の配列同一性を有するアミノ酸或いはその断片を有する。
ＢＥ＿Ｒ１＿４１の切断カルボキシル（ＣＯＯＨ）断片
一部の形態では、デアミナーゼタンパク質の短縮又は切断形態は、Ｇｌｙ３３、又はＧｌｙ４３、又はＧｌｙ６９、又はＧｌｙ１０８のいずれかを含む位置での切断から生じるアミノ（ＣＯＯＨ）末端のアミノ酸残基を含む、切断されたＢＥ＿Ｒ１＿４１デアミナーゼタンパク質断片である。
一部の形態では、デアミナーゼタンパク質の切断形態は、アミノ酸Ｇｌｙ３３末端で切断されたＢＥ＿Ｒ１＿４１デアミナーゼタンパク質の切断形態（ＢＥ＿Ｒ１＿４１＿Ｃ＿Ｇ３３）であり、これは、以下のアミノ酸配列：
ＧＬＥＳＲＴＦＳＳＧＧＰＴＰＹＰＮＹＡＮＡＧＨＶＥＧＱＳＡＬＦＭＲＤＮＧＩＳＤＧＬＶＦＨＮＮＰＥＧＴＣＧＦＣＶＮＭＴＥＴＬＬＰＥＮＳＫＬＴＶＶＰＰＥＧＡＩＰＶＫＲＧＡＴＧＥＴＲＴＦＴＧＮＳＫＳＰＫＳＰＶＫＧＥＣ（配列番号１７２）又は配列番号１７２に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％若しくは９９％の配列同一性を有するアミノ酸或いはその断片を有する。
一部の形態では、デアミナーゼタンパク質の切断形態は、アミノ酸Ｇｌｙ４３で切断されたＢＥ＿Ｒ１＿４１デアミナーゼタンパク質の切断形態（ＢＥ＿Ｒ１＿４１＿Ｃ＿Ｇ４３）であり、これは、以下のアミノ酸配列：
ＧＰＴＰＹＰＮＹＡＮＡＧＨＶＥＧＱＳＡＬＦＭＲＤＮＧＩＳＤＧＬＶＦＨＮＮＰＥＧＴＣＧＦＣＶＮＭＴＥＴＬＬＰＥＮＳＫＬＴＶＶＰＰＥＧＡＩＰＶＫＲＧＡＴＧＥＴＲＴＦＴＧＮＳＫＳＰＫＳＰＶＫＧＥＣ（配列番号１７３）又は配列番号１７３に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％若しくは９９％の配列同一性を有するアミノ酸或いはその断片を有する。
一部の形態では、デアミナーゼタンパク質の切断形態は、アミノ酸Ｌｙｓ７１で切断されたＢＥ＿Ｒ１＿４１デアミナーゼタンパク質の切断形態（ＢＥ＿Ｒ１＿４１＿Ｃ＿Ｇ６９）であり、これは、以下のアミノ酸配列：
ＤＮＧＩＳＤＧＬＶＦＨＮＮＰＥＧＴＣＧＦＣＶＮＭＴＥＴＬＬＰＥＮＳＫＬＴＶＶＰＰＥＧＡＩＰＶＫＲＧＡＴＧＥＴＲＴＦＴＧＮＳＫＳＰＫＳＰＶＫＧＥＣ（配列番号１７４）又は配列番号１７４に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％若しくは９９％の配列同一性を有するアミノ酸或いはその断片を有する。
一部の形態では、デアミナーゼタンパク質の切断形態は、アミノ酸Ｇｌｙ１０８で切断されたＢＥ＿Ｒ１＿４１デアミナーゼタンパク質の切断形態（ＢＥ＿Ｒ１＿２８＿Ｃ＿Ｇ１０８）であり、これは、以下のアミノ酸配列：
ＡＩＰＶＫＲＧＡＴＧＥＴＲＴＦＴＧＮＳＫＳＰＫＳＰＶＫＧＥＣ（配列番号１７５）又は配列番号１７５に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％若しくは９９％の配列同一性を有するアミノ酸或いはその断片を有する。
スプリットＢＥ＿Ｒ１＿４１デアミナーゼタンパク質の結合
一部の形態では、ＢＥ＿Ｒ１＿４１デアミナーゼタンパク質の短縮又は切断形態は、デアミナーゼ機能のみが欠如している。一部の形態では、ＢＥ＿Ｒ１＿４１デアミナーゼタンパク質の短縮又は切断形態の２つ以上の結合により、デアミナーゼ機能が再形成される。例えば、一部の形態では、アミノ（ＮＨ）末端から１つ以上のアミノ酸残基が欠如したＢＥ＿Ｒ１＿４１デアミナーゼタンパク質の１つの短縮若しくは切断形態又は完全ＢＥ＿Ｒ１＿４１デアミナーゼドメインのカルボキシル（ＣＯＯＨ）末端からの断片を組み合わせると、カルボキシル（ＣＯＯＨ）末端から１つ以上のアミノ酸残基が欠如したＢＥ＿Ｒ１＿４１デアミナーゼタンパク質の１つ以上の短縮若しくは切断形態又は完全ＢＥ＿Ｒ１＿４１デアミナーゼドメインのアミノ（ＮＨ）末端からの断片との結合又は共局在化時に機能性になる。例えば、一部の形態では、塩基エディターは、配列番号１６８～１７２のいずれか１つのアミノ酸配列を有するスプリットＢＥ＿Ｒ１＿４１デアミナーゼドメインを含み、この場合、塩基エディターは、配列番号１７３～１７５のアミノ酸配列を有する別のスプリットＢＥ＿Ｒ１＿４１デアミナーゼドメインとの共局在化又は結合時或いは配列番号１２３のアミノ酸配列又は配列番号１２３に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％若しくは９９％の配列同一性を有するアミノ酸を有するＢＥ＿Ｒ１＿１２デアミナーゼドメインの「不活性型」形態と一緒に、再形成されたデアミナーゼ活性を有する。
（５）スプリットＢＥ＿Ｒ４＿２１デアミナーゼタンパク質
一部の形態では、デアミナーゼタンパク質の短縮又は切断形態は、ＢＥ＿Ｒ４＿２１デアミナーゼタンパク質の短縮又は切断形態である。
ＢＥ＿Ｒ４＿２１の切断アミノ（ＮＨ）断片
一部の形態では、デアミナーゼタンパク質の短縮又は切断形態は、Ｓｅｒ６２又はＧｌｙ１２７のいずれかを含む位置での切断から生じるアミノ（ＮＨ）末端のアミノ酸残基を含む、切断されたＢＥ＿Ｒ４＿２１デアミナーゼタンパク質断片である。
一部の形態では、デアミナーゼタンパク質の切断形態は、アミノ酸Ｓｅｒ６２で切断されたＢＥ＿Ｒ４＿２１デアミナーゼタンパク質の切断形態（ＢＥ＿Ｒ４＿２１＿Ｎ＿Ｓ６２）であり、これは、以下のアミノ酸配列：
ＧＧＳＡＶＶＧＡＧＶＶＡＴＧＡＫＡＶＴＴＧＫＳＬＳＥＳＱＡＴＬＳＶＡＱＲＬＬＡＴＩＧＥＥＧＫＴＡＧＶＬＥＬＤＧＥＬＩＰＬＶＳ（配列番号１７６）又は配列番号１７６に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％若しくは９９％の配列同一性を有するアミノ酸或いはその断片を有する。
一部の形態では、デアミナーゼタンパク質の短縮又は切断形態は、アミノ酸Ｇｌｙ１２７で切断されたＢＥ＿Ｒ４＿２１デアミナーゼタンパク質の短縮又は切断形態（ＢＥ＿Ｒ４＿２１＿Ｎ＿Ｇ１２７）であり、これは、以下のアミノ酸配列：
Figure 2024502630000050
 （配列番号１７７）又は配列番号１７７に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％若しくは９９％の配列同一性を有するアミノ酸或いはその断片を有する。
ＢＥ＿Ｒ４＿２１の切断カルボキシル（ＣＯＯＨ）断片
一部の形態では、デアミナーゼタンパク質の短縮又は切断形態は、Ｓｅｒ６２又はＧｌｙ１２７のいずれかを含む位置での切断から生じる（ＣＯＯＨ）末端のアミノ酸残基を含む、短縮又は切断されたＢＥ＿Ｒ４＿２１デアミナーゼタンパク質断片である。
一部の形態では、デアミナーゼタンパク質の切断形態は、アミノ酸Ｓｅｒ６２で切断されたＢＥ＿Ｒ４＿２１デアミナーゼタンパク質の切断形態（ＢＥ＿Ｒ４＿２１＿Ｃ＿Ｓ６２）であり、これは、以下のアミノ酸配列：
ＧＫＳＳＬＰＮＹＡＡＳＧＨＶＥＧＱＡＡＬＩＭＲＤＲＧＡＴＳＧＲＬＬＩＤＮＰＳＧＩＣＧＹＣＫＳＱＶＡＴＬＬＰＥＮＡＴＬＱＶＧＴＰＬＧＴＶＴＰＳＳＲＷＳＡＳＲＴＦＴＧＮＤＲＤＰＫＰＷＰＲ（配列番号１７８）又は配列番号１７８に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％若しくは９９％の配列同一性を有するアミノ酸或いはその断片を有する。
一部の形態では、デアミナーゼタンパク質の切断形態は、アミノ酸Ｇｌｙ１２７で切断されたＢＥ＿Ｒ４＿２１デアミナーゼタンパク質の切断形態（ＢＥ＿Ｒ４＿２１＿Ｃ＿Ｇ１２７）であり、これは、以下のアミノ酸配列：
ＴＶＴＰＳＳＲＷＳＡＳＲＴＦＴＧＮＤＲＤＰＫＰＷＰＲ（配列番号１７９）又は配列番号１７９に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％若しくは９９％の配列同一性を有するアミノ酸或いはその断片を有する。
スプリットＢＥ＿Ｒ４＿２１デアミナーゼタンパク質の結合
一部の形態では、ＢＥ＿Ｒ４＿２１デアミナーゼタンパク質の短縮又は切断形態は、デアミナーゼ機能のみが欠如している。一部の形態では、ＢＥ＿Ｒ４＿２１デアミナーゼタンパク質の短縮又は切断形態の２つ以上の結合により、デアミナーゼ機能が再形成される。例えば、一部の形態では、アミノ（ＮＨ）末端から１つ以上のアミノ酸残基が欠如したＢＥ＿Ｒ４＿２１デアミナーゼタンパク質の１つの短縮若しくは切断形態又は完全ＢＥ＿Ｒ４＿２１デアミナーゼドメインのカルボキシル（ＣＯＯＨ）末端からの断片を組み合わせると、カルボキシル（ＣＯＯＨ）末端から１つ以上のアミノ酸残基が欠如したＢＥ＿Ｒ４＿２１デアミナーゼタンパク質の１つ以上の短縮若しくは切断形態又は完全ＢＥ＿Ｒ４＿２１デアミナーゼドメインのアミノ（ＮＨ）末端からの断片との結合又は共局在化時に機能性になる。例えば、一部の形態では、塩基エディターは、配列番号１７６～１７７のいずれか１つのアミノ酸配列を有するスプリットＢＥ＿Ｒ４＿２１デアミナーゼドメインを含み、この場合、塩基エディターは、配列番号１７８～１７９のいずれか１つのアミノ酸配列を有する別のスプリットＢＥ＿Ｒ４＿２１デアミナーゼドメインとの共局在化又は結合時或いは配列番号１２５のアミノ酸配列又は配列番号１２５に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％若しくは９９％の配列同一性を有するアミノ酸を有するＢＥ＿Ｒ４＿２１デアミナーゼドメインの「不活性型」形態と一緒に、再形成されたデアミナーゼ活性を有する。
（６）スプリットＢＥ＿Ｒ２＿１１デアミナーゼタンパク質
一部の形態では、デアミナーゼタンパク質の短縮又は切断形態は、ＢＥ＿Ｒ２＿１１デアミナーゼタンパク質の短縮又は切断形態である。
ＢＥ＿Ｒ２＿１１の短縮断片
一部の形態では、デアミナーゼタンパク質の短縮又は切断形態は、アミノ（ＮＨ）末端からの５４又は３９個の連続したアミノ酸残基の切断から生じるアミノ酸残基を含む、ＢＥ＿Ｒ２＿１１デアミナーゼタンパク質の断片である。
一部の形態では、デアミナーゼタンパク質の切断形態は、アミノ（ＮＨ）末端からの５４残基の除去から生じるＢＥ＿Ｒ２＿１１デアミナーゼタンパク質の短縮形態（ＢＥ＿Ｒ２＿１１＿Ｎ＿Δ５４）であり、これは、以下のアミノ酸配列：
ＨＹＤＫＶＲＫＥＬＧＴＳＡＥＶＰＧＨＡＥＧＶＡＦＮＫＡＹＱＶＲＫＮＴＧＴＫＧＧＮＡＶＬＹＶＤＫＩＰＣＶＭＣＫＰＧＩＡＴＬＭＲＳＡＫＶＤＨＬＤＬＨＹＬＱＤＧＫＭＨＨＶＱＹＶＲＮＰＤＴＤＡＶＹＮＰＦＳＧＫＷＴＫＰＳＫＫＫ（配列番号１８０）又は配列番号１８０に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％若しくは９９％の配列同一性を有するアミノ酸或いはその断片を有する。
一部の形態では、デアミナーゼタンパク質の切断形態は、アミノ（ＮＨ）末端からの３９残基の除去から生じるＢＥ＿Ｒ２＿１１デアミナーゼタンパク質の短縮形態（ＢＥ＿Ｒ２＿１１＿Ｎ＿Δ３９）であり、これは、以下のアミノ酸配列：
Figure 2024502630000051
 （配列番号１８１）又は配列番号１８１に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％若しくは９９％の配列同一性を有するアミノ酸或いはその断片を有する。
スプリットＢＥ＿Ｒ２＿１１デアミナーゼタンパク質の結合
一部の形態では、ＢＥ＿Ｒ２＿１１デアミナーゼタンパク質の短縮又は切断形態は、デアミナーゼ機能のみが欠如している。一部の形態では、ＢＥ＿Ｒ２＿１１デアミナーゼタンパク質の短縮又は切断形態の２つ以上の結合により、デアミナーゼ機能が再形成される。例えば、一部の形態では、アミノ（ＮＨ）末端から１つ以上のアミノ酸残基が欠如したＢＥ＿Ｒ２＿１１デアミナーゼタンパク質の１つの短縮若しくは切断形態又は完全ＢＥ＿Ｒ２＿１１デアミナーゼドメインのカルボキシル（ＣＯＯＨ）末端からの断片を組み合わせると、カルボキシル（ＣＯＯＨ）末端から１つ以上のアミノ酸残基が欠如したＢＥ＿Ｒ２＿１１デアミナーゼタンパク質の１つ以上の短縮若しくは切断形態又は完全ＢＥ＿Ｒ２＿１１デアミナーゼドメインのアミノ（ＮＨ）末端からの断片との結合又は共局在化時に機能性になる。例えば、一部の形態では、塩基エディターは、配列番号１８０又は１８１のアミノ酸配列を有するスプリットＢＥ＿Ｒ２＿１１デアミナーゼドメインを含み、この場合、塩基エディターは、配列番号１８０～１８１のアミノ酸配列を有する別のスプリットＢＥ＿Ｒ２＿１１デアミナーゼドメインとの共局在化又は結合時或いは配列番号１２６のアミノ酸配列又は配列番号１２６に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％若しくは９９％の配列同一性を有するアミノ酸を有するＢＥ＿Ｒ２＿１１デアミナーゼドメインの「不活性型」形態と一緒に、再形成されたデアミナーゼ活性を有する。
２．機能性ドメイン
典型的に、塩基エディターは１つ以上の機能性ドメインを含む。機能性ドメインは、プログラマブルＤＮＡ結合ドメイン／ターゲティングドメイン、ヌクレアーゼ及び他のドメインを含む。一部の形態では、機能性ドメインは、ターゲティングドメインである。一部の形態では、ターゲティングドメインは、核酸中の特定の標的配列（例えば、ＤＮＡ又はＲＮＡ配列）を認識し、且つ／又はそれに結合することができる。従って、一部の形態では、ターゲティングドメインは、ＴＡＬＥ、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９、Ｃｆｐ１又はジンクフィンガーなどのＤＮＡ及び／又はＲＮＡ結合タンパク質又はドメインである。従って、一部の形態では、塩基エディターは、デアミナーゼドメインと、１つ以上のターゲティングドメイン（例えば、ＤＮＡ結合タンパク質又はドメイン）を含む標的化塩基エディターであり、各ターゲティングドメインは、標的配列に特異的に結合する。
塩基エディターは、所望の活性（例えば、デアミナーゼ活性）を保持する限り、任意の数の機能性ドメインを含むことができる。例えば、塩基エディターは、１～５つの範囲の機能性ドメインを含むことができる。一部の形態では、塩基エディターは、１、２、３、４、５つ又はそれを超える機能性（例えば、ターゲティング）ドメインを含む。一部の形態では、塩基エディターは、デアミナーゼドメインと、１つの機能性ドメインを含む。一部の形態では、塩基エディターは、デアミナーゼドメインと、２つの機能性ドメインを含む。一部の形態では、塩基エディターは、デアミナーゼドメインと、３つの機能性ドメインを含む。一部の形態では、標的塩基エディターは、デアミナーゼドメインと、１つのターゲティングドメインを含む。一部の形態では、標的塩基エディターは、デアミナーゼドメインと、２つのターゲティングドメインを含む。一部の形態では、標的塩基エディターは、デアミナーゼドメインと、３つのターゲティングドメインを含む。
１つ以上の機能性ドメインとデアミナーゼドメインを、塩基エディター内で任意の方向に配置することができる。例えば、デアミナーゼドメインは、塩基エディターのＮ末端又はＣ末端に存在し得る。一部の形態では、塩基エディターは、以下の構成／構造：
ＮＨ２［デアミナーゼドメイン］－［機能性ドメイン］ＣＯＯＨ；又は
ＮＨ２［機能性ドメイン］－［デアミナーゼドメイン］ＣＯＯＨ
に従い、ＮＨ２は、塩基エディターのＮ末端であり、ＣＯＯＨは、塩基エディターのＣ末端である。好ましくは、機能性ドメインはターゲティングドメインである。一部の形態では、上記の一般的なアーキテクチャで使用される「－」は、任意選択のリンカーの存在を示す。
一部の形態では、本明細書に開示される塩基エディターは、リンカーを含まない。一部の形態では、リンカーは、塩基エディター内の１つ以上のドメイン又はタンパク質間（例えば、デアミナーゼドメインと、第１の機能性（例えば、ターゲティング）ドメイン及び／又は第２の機能性ドメインとの間）に存在する。一部の形態では、デアミナーゼドメインと機能性（例えば、ターゲティング）ドメインは、当技術分野で公知の任意の適切なリンカー、例えば、「リンカー」と題されるサブセクションで以下に提供されるリンカーのいずれかを介して融合される。一部の形態では、塩基エディターを形成する様々なドメイン又は成分は、約１～２００アミノ酸（両端の値を含む）を含むリンカーを介して融合される。一部の形態では、リンカーは、１～５、１～１０、１～２０、１～３０、１～４０、１～５０、１～６０、１～８０、１～１００、１～１５０、１～２００、５～１０、５～２０、５～３０、５～４０、５～６０、５～８０、５～１００、５～１５０、５～２００、１０～２０、１０～３０、１０～４０、１０～５０、１０～６０、１０～８０、１０～１００、１０～１５０、１０～２００、２０～３０、２０～４０、２０～５０、２０～６０、２０～８０、２０～１００、２０～１５０、２０～２００、３０～４０、３０～５０、３０～６０、３０～８０、３０～１００、３０～１５０、３０～２００、４０～５０、４０～６０、４０～８０、４０～１００、４０～１５０、４０～２００、５０～６０、５０～８０、５０～１００、５０～１５０、５０～２００、６０～８０、６０～１００、６０～１５０、６０～２００、８０～１００、８０～１５０、８０～２００、１００～１５０、１００～２００又は１５０～２００アミノ酸を含む。
特定の形態では、本明細書に開示されるデアミナーゼドメイン及びターゲティングドメインのいずれかを含むターゲティング塩基エディターが開示され、ターゲティングドメインは、塩基エディター標的配列に特異的に結合する。好ましくは、ターゲティングドメインは、ＴＡＬＥ、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓエフェクタータンパク質（例えば、Ｃａｓ９、Ｃｆｐ１）又はジンクフィンガータンパク質若しくはドメインであるか又はそれを含む。例えば、ターゲティングドメインがＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓエフェクタータンパク質（例えば、Ｃａｓ９、Ｃｆｐ１）であるか又はそれを含む場合、塩基エディター標的配列は、プロトスペーサー配列と同じであるか又はそれを含むことができる。
塩基エディター標的配列は、標的核酸中で、標的ヌクレオチド配列の脱アミノ化を支持するデアミナーゼドメインの標的ヌクレオチド配列の任意の距離内に存在することができる。開示される標的化塩基エディターのための好ましい設計原理は、脱アミノ化が意図される標的核酸中の標的ヌクレオチド配列の実体に近接した標的核酸にターゲティングドメインが結合するように、塩基エディター標的配列（及びターゲティングドメイン）並びにデアミナーゼドメインとターゲティングドメインの連結を選択することである。この近接性は、所与の標的塩基エディター及び標的核酸について、デアミナーゼドメインが、標的核酸中の標的ヌクレオチド配列の目的とする実体を脱アミノ化することができるようにすべきである。例えば、塩基エディター標的配列は、標的核酸中で、デアミナーゼドメインの標的ヌクレオチド配列の実体の１～１００、２０～８０、４０～６０、１０～５０、２０～４０、１～１０、１～２０、１０～２０又は５～１０ヌクレオチド内に存在することができる。一部の形態では、塩基エディター標的配列は、標的核酸中で、デアミナーゼドメインの標的ヌクレオチド配列の実体の１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３０～３５、３５～４０、４０～４５、４５～５０、５０～６０、６０～７０、７０～８０、８０～９０又は９０～１００ヌクレオチド内に存在する。好ましい形態では、塩基エディター標的配列は、標的核酸中で、デアミナーゼドメインの標的ヌクレオチド配列の実体の２０ヌクレオチド以内に存在するように選択される。好ましくは、標的ヌクレオチド配列の実体は、標的塩基エディターによって塩基編集されるように選択される。
一部の形態では、標的ヌクレオチド配列の実体は、標的核酸における標的ヌクレオチド配列の唯一の実体である。場合によっては、標的ヌクレオチド配列の複数（例えば、２つ、３つ、４つ、５つ又はそれを超える）の実体が標的核酸中に存在する。従って、一部の形態では、標的化塩基エディターによって塩基編集されるように選択される標的ヌクレオチドの複数の実体の特定の実体は、標的化塩基エディター標的配列からの距離に基づいて記述又は指定することができる（例えば、標的塩基エディター標的配列から指定された距離内にある唯一の実体として）。
例えば、一部の形態では、塩基編集されるように選択される（標的核酸中の）標的ヌクレオチド配列の実体は、塩基エディター標的配列の１～１００、２０～８０、４０～６０、１０～５０、２０～４０、１～１０、１～２０、１０～２０又は５～１０ヌクレオチド内のデアミナーゼドメインの標的ヌクレオチド配列の唯一の実体である。一部の形態では、塩基編集されるように選択される（標的核酸中の）標的ヌクレオチド配列の実体は、塩基エディター標的配列の１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３０～３５、３５～４０、４０～４５、４５～５０、５０～６０、６０～７０、７０～８０、８０～９０又は９０～１００ヌクレオチド内のデアミナーゼドメインの標的ヌクレオチド配列の唯一の実体である。一部の形態では、塩基編集されるように選択される（標的核酸中の）標的ヌクレオチド配列の実体は、塩基エディター標的配列の２０ヌクレオチド以内のデアミナーゼドメインの標的ヌクレオチド配列の唯一の実体である。
しかし、この「唯一の実体」の距離とは独立して、塩基編集されるように選択される（標的核酸中の）標的ヌクレオチド配列の実体は、選択される塩基エディター標的配列から任意の距離であり得る（それが、指定された「唯一の実体」の距離以下である限り）。例えば、塩基編集されるように選択される（標的核酸中の）標的ヌクレオチド配列の実体は、塩基エディター標的配列の２０ヌクレオチド以内にあるデアミナーゼドメインの標的ヌクレオチド配列の唯一の実体であり得るが、塩基編集されるように選択される標的ヌクレオチド配列のこの実体は、それ自体が、塩基エディター標的配列の２０ヌクレオチド以内である。より一般的には、一部の形態では、塩基編集されるように選択される（標的核酸中の）標的ヌクレオチド配列の実体は、塩基エディター標的配列の１～１００、２０～８０、４０～６０、１０～５０、２０～４０、１～１０、１～２０、１０～２０又は５～１０ヌクレオチド以内にあるデアミナーゼドメインの標的ヌクレオチド配列の唯一の実体であり得るが、塩基編集されるように選択される標的ヌクレオチド配列のこの実体は、それ自体が、塩基エディター標的配列の１～１００、２０～８０、４０～６０、１０～５０、２０～４０、１～１０、１～２０、１０～２０又は５～１０ヌクレオチド以内にある。従って、一部の形態では、塩基編集されるように選択される（標的核酸中の）標的ヌクレオチド配列の実体は、塩基エディター標的配列の２０ヌクレオチド以内にあるデアミナーゼドメインの標的ヌクレオチド配列の唯一の実体であり得るが、塩基編集されるように選択される標的ヌクレオチド配列のこの実体は、それ自体が、塩基エディター標的配列の２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３、２又は１ヌクレオチド以内にある。
一部の形態では、塩基エディター標的配列の複数（例えば、２つ、３つ、４つ、５つ又はそれを超える）の実体が標的核酸中に存在する。従って、一部の形態では、選択される塩基エディター標的配列は、標的化塩基エディターによって塩基編集されるように選択される標的ヌクレオチド配列の実体からの距離に基づいて、記述又は指定することができる（例えば、塩基編集されるように選択される標的ヌクレオチド配列の実体から指定距離内にある標的核酸中の唯一の塩基エディター標的配列として）。例えば、一部の形態では、（標的核酸中）塩基編集されるように選択される標的ヌクレオチド配列の１～１００、２０～８０、４０～６０、１０～５０、２０～４０、１～１０、１～２０、１０～２０又は５～１０ヌクレオチド内にある塩基エディター標的配列は、塩基編集されるように選択される標的ヌクレオチド配列の１～１００、２０～８０、４０～６０、１０～５０、２０～４０、１～１０、１～２０、１０～２０又は５～１０ヌクレオチド以内にある標的核酸の唯一の塩基エディター標的配列である。一部の形態では、（標的核酸中）塩基編集されるように選択される標的ヌクレオチド配列の１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３０～３５、３５～４０、４０～４５、４５～５０、５０～６０、６０～７０、７０～８０、８０～９０又は９０～１００ヌクレオチド以内にある塩基エディター標的配列は、標的核酸において、塩基編集されるように選択される標的ヌクレオチド配列の１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３０～３５、３５～４０、４０～４５、４５～５０、５０～６０、６０～７０、７０～８０、８０～９０又は９０～１００ヌクレオチド以内にある唯一の塩基エディター標的配列である。一部の形態では、塩基編集されるように選択される（標的核酸中）標的ヌクレオチド配列の２０ヌクレオチド以内の塩基エディター標的配列は、標的核酸中で、塩基編集されるように選択される標的ヌクレオチド配列の２０ヌクレオチド以内にある唯一の塩基エディター標的配列である。
一部の形態では、（標的核酸中）塩基編集されるように選択される標的ヌクレオチド配列の１～１００、２０～８０、４０～６０、１０～５０、２０～４０、１～１０、１～２０、１０～２０又は５～１０ヌクレオチド以内にある塩基エディター標的配列は、標的核酸中において、標的ヌクレオチド配列の任意の実体の１～１００、２０～８０、４０～６０、１０～５０、２０～４０、１～１０、１～２０、１０～２０又は５～１０ヌクレオチド以内にある唯一の塩基エディター標的配列である。一部の形態では、（標的核酸中）塩基編集されるように選択される標的ヌクレオチド配列の１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３０～３５、３５～４０、４０～４５、４５～５０、５０～６０、６０～７０、７０～８０、８０～９０又は９０～１００ヌクレオチド以内にある塩基エディター標的配列は、標的核酸中で、標的ヌクレオチド配列の任意の実体の１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３０～３５、３５～４０、４０～４５、４５～５０、５０～６０、６０～７０、７０～８０、８０～９０又は９０～１００ヌクレオチド以内にある唯一の塩基エディター標的配列である。一部の形態では、（標的核酸中）塩基編集されるように選択される標的ヌクレオチド配列の２０ヌクレオチド以内にある塩基エディター標的配列は、標的核酸中で、標的ヌクレオチド配列の任意の実体の２０ヌクレオチド以内にある唯一の塩基エディター標的配列である。
一部の形態では、標的核酸中で（例えば、標的化塩基エディターによって塩基編集されるように選択される）標的ヌクレオチド配列の実体は、標的核酸中で、標的ヌクレオチド配列の実体の２０ヌクレオチド以内の塩基エディターの２０ヌクレオチド以内にあるデアミナーゼドメインの標的ヌクレオチド配列の唯一の実体である。一部の形態では、標的核酸中で（例えば、標的塩基エディターにより塩基編集されるように選択される）標的ヌクレオチド配列の実体は、標的核酸中で、標的ヌクレオチド配列の実体の１～１００、２０～８０、４０～６０、１０～５０、２０～４０、１～１０、１～２０、１０～２０又は５～１０ヌクレオチド以内の塩基エディター標的配列の１～１００、２０～８０、４０～６０、１０～５０、２０～４０、１～１０、１～２０、１０～２０又は５～１０ヌクレオチド以内にあるデアミナーゼドメインの標的ヌクレオチド配列の唯一の実体である。一部の形態では、標的核酸中で（例えば、標的塩基エディターによって塩基編集されるように選択される）標的ヌクレオチド配列の実体は、標的核酸中で、標的ヌクレオチド配列の実体の１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３０～３５、３５～４０、４０～４５、４５～５０、５０～６０、６０～７０、７０～８０、８０～９０又は９０～１００ヌクレオチド以内の塩基エディター標的配列の１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３０～３５、３５～４０、４０～４５、４５～５０、５０～６０、６０～７０、７０～８０、８０～９０又は９０～１００ヌクレオチド以内にあるデアミナーゼドメインの標的ヌクレオチド配列の唯一の実体である。
以上のいずれでも、塩基エディター標的配列は、核ＤＮＡ又はミトコンドリアＤＮＡであり得る。いくつかの好ましい形態では、塩基エディター標的配列は、ミトコンドリアＤＮＡ中に存在する。
ｉ．プログラマブルＤＮＡ結合タンパク質
一部の形態では、塩基エディターは、少なくとも１つのプログラマブルＤＮＡ結合タンパク質を含む。一部の形態では、塩基エディターは、単一のプログラマブルＤＮＡ結合タンパク質を含む。例えば、一部の形態では、塩基エディターは、第１及び第２のプログラマブルＤＮＡ結合タンパク質を含む。一部の形態では、第１及び／又は第２のプログラマブルＤＮＡ結合タンパク質は、同じである。他の形態では、第１及び／又は第２のプログラマブルＤＮＡ結合タンパク質は、異なる。例示的な第１及び／又は第２のプログラマブルＤＮＡ結合タンパク質は、Ｃａｓドメイン（例えば、Ｃａｓ９）、ニッカーゼ、ジンクフィンガータンパク質及びＴＡＬＥタンパク質を含む。従って、一部の形態では、塩基エディターは、第１及び第２のモノマーを有するヘテロ二量体を含み、第１のモノマーは、Ｃａｓドメイン、ニッカーゼ、ジンクフィンガータンパク質又はＴＡＬＥタンパク質；及び切断された二本鎖ＤＮＡデアミナーゼのＮ末端若しくはＣ末端断片を含み、及び第２のモノマーは、Ｃａｓドメイン、ニッカーゼ、ジンクフィンガータンパク質又はＴＡＬＥタンパク質；並びに切断された二本鎖ＤＮＡデアミナーゼの第２のプログラマブルＤＮＡ結合タンパク質及びＮ末端若しくはＣ末端断片を含み、それにより第１及び第２のモノマーの二量体化が二本鎖ＤＮＡデアミナーゼ活性を再形成する。例示的なＣａｓドメインは、Ｃａｓ９、Ｃａｓｌ２ｅ、Ｃａｓｌ２ｄ、Ｃａｓｌ２ａ、Ｃａｓｌ２ｂｌ、Ｃａｓ１３ａ、Ｃａｓｌ２ｃ及びアルゴノートを含む。
ｉｉ．例示的な機能性ドメイン
一部の形態では、塩基エディターは、プログラマブルＤＮＡ結合タンパク質などのプログラマブルＤＮＡ結合因子である１つ以上の機能性ドメインを含む。「プログラマブルＤＮＡ結合タンパク質」、「ｐＤＮＡ結合タンパク質」、「ｐＤＮＡ結合タンパク質ドメイン」又は「ｐＤＮＡｂｐ」という用語は、特定の標的ＤＮＡヌクレオチド配列（例えば、ゲノムの遺伝子座）に局在し、それと結合する任意のタンパク質を指す。この用語は、ＲＮＡプログラム可能なタンパク質を包含し、これは、そのタンパク質に関連する１つ以上の核酸分子（又はその一部若しくは領域）に相補的な特定の標的ヌクレオチド配列（例えば、ＤＮＡ配列）に局在するようにタンパク質を指令するか、又はそうでなければプログラムする１つ以上の核酸分子（即ち例えばＣａｓシステムの場合にはガイドＲＮＡを含む）と会合する（例えば、複合体を形成する）。この用語は、アミノ酸プログラム可能な方法でヌクレオチド配列に直接結合するタンパク質、例えばジンクフィンガータンパク質及びＴＡＬＥタンパク質も包含する。例示的なＲＮＡプログラマブルタンパク質は、天然に存在するか非天然である（例えば、操作又は改変された）かにかかわらず、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９タンパク質並びにＣａｓ９均等物、ホモログ、オルソログ又はパラログであり、ＣＲＩＳＰＲシステム（ＩＩ、Ｖ、ＶＩ型）のいずれかのタイプからのＣａｓ９均等物を含み得、そうしたものとして、Ｃｐｆｌ（Ｖ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステム）、Ｃ２ｃｌ（Ｖ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステム）、Ｃ２ｃ２（ＶＩ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステム）、Ｃ２ｃ３（Ｖ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステム）、ｄＣａｓ９、ＧｅｏＣａｓ９、ＣｊＣａｓ９、Ｃａｓ１２ａ、Ｃａｓｌ２ｂ、Ｃａｓ１２ｃ、Ｃａｓｌ２ｄ、Ｃａｓ１２ｇ、Ｃａｓ１２ｈ、Ｃａｓ１２ｉ、Ｃａｓ１３ｄ、Ｃａｓ１４、アルゴノート及びｎＣａｓ９が挙げられる。さらに別のＣａｓ均等物は、Ｍａｋａｒｏｖａ ｅｔ ａｌ．，“Ｃ２ｃ２ ｉｓ ａ ｓｉｎｇｌｅ－ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ ｐｒｏｇｒａｍｍａｂｌｅ ＲＮＡｇｕｉｄｅｄ ＲＮＡ－ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ＣＲＩＳＰＲ ｅｆｆｅｃｔｏｒ，”Ｓｃｉｅｎｃｅ ２０１６；３５３（６２９９）に記載されており、その内容は、参照により本明細書に組み込まれる。
ａ．ジンクフィンガー
一部の形態では、標的塩基エディターは、１つ以上のターゲティングドメインとして、１つ以上のジンクフィンガータンパク質又はジンクフィンガーＤＮＡ結合ドメインを含む。デアミナーゼドメインとジンクフィンガードメインを組み合わせたカスタム設計の塩基エディターは、標的化（部位特異的）塩基編集をゲノムに導入するための一般的且つ効率的な方法を提供する。
ジンクフィンガーは、ＤＮＡに結合することができるタンパク質ドメインの大きいスーパーファミリーの一部である。ジンクフィンガーは、真核生物に存在する最も一般的なＤＮＡ結合モチーフの１つである。酵母ゲノムによってコードされる５００のジンクフィンガータンパク質があること並びに恐らく全哺乳類遺伝子の１％がジンクフィンガー含有タンパク質をコードすることが推定される。ジンクフィンガーは、２本の逆平行β鎖とαらせんからなる。亜鉛イオンは、このドメインタイプの安定性にとって非常に重要である－金属イオンの非存在下では、ドメインは、疎水性コアを有するには小さすぎるため、アンフォールドする。個別のフィンガーの構造は、それぞれ高度に保存され、約３０アミノ酸残基からなり、これらは、ββαフォールドとして構築され、亜鉛イオンによって互いに保持される。αらせんは、フィンガーのＣ末端部分で発生し、βシートは、Ｎ末端部分で発生する。
ジンクフィンガータンパク質は、亜鉛配位に利用可能なシステイン残基及びヒスチジン残基の数及び位置に従って分類される。アフリカツメガエル（Ｘｅｎｏｐｕｓ）転写因子ＩＩＩＡに代表されるＣＣＨＨクラスが最大である。これらのタンパク質は、タンデムリピートに２本以上のフィンガーを含む。対照的に、ステロイド受容体は、４つ（Ｃ４）及び５つ（Ｃ５）のシステインを有する２種類の亜鉛配位構造を形成するシステイン残基のみを含む。ジンクフィンガーの別のクラスは、ＣＣＨＣフィンガーを含む。ショウジョウバエ属（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）並びに哺乳類及びレトロウイルスタンパク質に見出だされるＣＣＨＣフィンガーは、コンセンサス配列Ｃ－Ｎ２－Ｃ－Ｎ４－Ｈ－Ｎ４－Ｃ（配列番号２８）を示す。Ｃ－Ｎ５－Ｃ－Ｎ１２－Ｈ－Ｎ４－Ｃ（配列番号２９）型のＣＣＨＣフィンガーの立体配置は、神経ジンクフィンガー因子／ミエリン転写因子ファミリーに認められる。最後に、ＧＡＬ４及びＣＨＡ４などのいくつかの酵母転写因子は、２つの亜鉛イオンを配位する非定型Ｃ６ジンクフィンガー構造を含む。ジンクフィンガーは、通常、１タンパク質当たり複数のコピー（最大３７）で存在する。これらのコピーは、タンデムアレイで編成して、単一のクラスター若しくは複数のクラスターを形成することもできるか、又はタンパク質全体に分散させることができる。
各ジンクフィンガーモチーフは、典型的には、３塩基対配列を認識して結合すると考えられ、そのため、より多くのジンクフィンガーを含むタンパク質はより長い配列をターゲティングし、従って標的部位に対するより大きい特異性及び親和性を有する。一部の形態では、個々のジンクフィンガードメインは、３ｂｐサブサイトに結合し、フィンガーのアレイは、伸長された９又は１２ｂｐ配列標的に結合することができる。
原則として、目的の任意のゲノム位置をターゲティングするように設計することができるジンクフィンガーＤＮＡ結合ドメインは、Ｃｙｓ２Ｈｉｓ２ジンクフィンガーのタンデムアレイであり得るが、その各々は、一般に、標的ＤＮＡ配列中の３～４個のヌクレオチドを認識する。Ｃｙｓ２Ｈｉｓ２ドメインは、以下の一般的な構造を有する：Ｐｈｅ（時としてＴｙｒ）－Ｃｙｓ－（２～４アミノ酸）－Ｃｙｓ－（３アミノ酸）－Ｐｈｅ（時としてＴｙｒ）－（５アミノ酸）－Ｌｅｕ－（２アミノ酸）－Ｈｉｓ－（３アミノ酸）－Ｈｉｓ。複数の（数は変動する：発表された研究では１モノマー当たり３～６本のフィンガーが使用される）フィンガーを互いに連結することにより、ＺＦＮペアは、１８～３６ヌクレオチド長のゲノム配列に結合するように設計することができる。ジンクフィンガータンパク質は、亜鉛に結合して、ＤＮＡ二重らせんの主溝に結合する構造ドメインを形成する。各ＤＮＡ結合フィンガーの重要なアミノ酸の変化は、結合親和性及び特異性に寄与する。
公開された文献は、多くの異なる一般的に入手可能なジンクフィンガー操作方法について記載しており、これらは、大きく２つの概括的カテゴリに分類することができる：（１）特定のＤＮＡ配列に結合するタンパク質を設計するために、事前に特性決定された特異性を備える個別のフィンガーを互いに連結するモジュラーアセンブリ方法、又は（２）複数の大きいランダム化ライブラリーを必要とする選択に基づく方法（例えば、ファージディスプレイを用いたランダム化ジンクフィンガーのライブラリーからの望ましい変異体の選択により、ＤＮＡ特異的結合ドメインを生成することができる）。
操作方法は、合理的設計及び様々なタイプの経験的選択方法を含むが、これらに限定されない。合理的設計は、例えば、トリプレット（又はクワドラプレット）ヌクレオチド配列及び個別のジンクフィンガーアミノ酸配列を含むデータベースの使用を含み、この場合、各トリプレット又はクワドラプレットヌクレオチド配列は、特定のトリプレット又はクワドラプレット配列に結合するジンクフィンガーの１つ以上のアミノ酸配列と関連する。例えば、米国特許第６，１４０，０８１号明細書；同第６，４５３，２４２号明細書；同第６，５３４，２６１号明細書；同第６，６１０，５１２号明細書；同第６，７４６，８３８号明細書；同第６，８６６，９９７号明細書；同第７，０６７，６１７号明細書；米国特許出願公開第２００２／０１６５３５６号明細書；同第２００４／０１９７８９２号明細書；同第２００７／０１５４９８９号明細書；同第２００７／０２１３２６９号明細書；並びに国際公開第９８／５３０５９号パンフレット及び同第２００３／０１６４９６号パンフレットを参照されたい。
多くの研究により、高品質のマルチフィンガードメインを構築するための重要な要件は、より長いアレイ内の個別のフィンガードメインのコンテキスト依存性活性を考慮することであることが明らかにされている。マルチフィンガードメインを構築するためのＯｌｉｇｏｍｅｒｉｚｅｄ Ｐｏｏｌ ＥＮｇｉｎｅｅｒｉｎｇ（ＯＰＥＮ）法は、個々のジンクフィンガーのコンテキスト依存性活性に取り組むが、頑健でもあり、且つ前述の方法より実施が比較的容易である。その全体が参照により本明細書に援用される国際公開第２００９／１４６１７９号パンフレットを参照されたい。ＯＰＥＮはスケーラブルであり、これを使用して、同時に極めて多数の異なる標的部位に対して高品質のマルチフィンガードメインを生成することができる。ＯＰＥＮは、様々なＤＮＡ配列を結合するように設計されたジンクフィンガープールの大規模なアーカイブの構築により可能になる。現在まで、ＯＰＥＮは、細菌細胞ベースのアッセイで良好に機能する５００を超える異なる標的部位のマルチフィンガードメインを生成するために使用されている。
典型的に、切断ドメインに連結したジンクフィンガータンパク質由来のＤＮＡ結合ドメインを含むジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）（ＩＩＳ型酵素Ｆｏｋｌなど）は、非相同末端結合（ＮＨＥＪ）により修復される二本鎖ＤＮＡ切断を介して標的化（部位特異的）ＤＮＡ変異（例えば欠失）を誘導するために使用される。本明細書に開示される標的化塩基エディターは、切断ドメインの代わりにデアミナーゼドメインが使用され、ＤＮＡ切断と比較してＤＮＡの標的化塩基編集を達成することを除いて、類似の様式で使用することができる。従って、１つ以上のジンクフィンガータンパク質又はＤＮＡ結合ドメインを含む塩基エディターを操作するための方法は明らかであり、ＺＦＮを製造するための当技術分野に公知のものから改変することができる。
ＺＦＮは、二量体として機能し、非特異的切断ドメインを含む各モノマーは、目的の標的ＤＮＡ配列に結合するように操作された人工ジンクフィンガーのアレイに融合される。従って、一部の形態では、開示される標的化塩基エディターは、デアミナーゼドメインの標的ヌクレオチド配列と（例えば、上流及び下流で）フランキングする塩基エディター標的配列に結合する二量体としても機能し得る。これは、（塩基エディターの）デアミナーゼドメインが２つの異なる部分に分割される場合に特に有用である。従って、一部の形態では、デアミナーゼドメインのＮ末端部分は、第１のジンクフィンガードメインに連結されるのに対して、デアミナーゼドメインのＣ末端部分は、第２のジンクフィンガードメインに連結される。２つのジンクフィンガードメイン及び／又はジンクフィンガードメインによって結合された塩基エディター標的配列は、同じであり得るが、同じである必要はない。ジンクフィンガードメインは、２つのジンクフィンガーデアミナーゼドメイン分子が標的核酸上で最適な間隔をあけて二量体化されるように設計及び選択される。一部の形態では、このようなスプリット標的化塩基エディターは、小成分が結合され（例えば、共発現又は共導入され）、二量体化されるときに限り、標的ヌクレオチド配列を脱アミノ化することができる。
ジンクフィンガーは、構造的に多様であり、ＤＮＡ又はＲＮＡ結合からタンパク質間相互作用及び膜結合まで、非常に多様な機能を示す。ＵｎｉＰｒｏｔＫＢには４０種以上のジンクフィンガーがアノテーションされている。最も頻繁に使用されるのは、Ｃ２Ｈ２タイプ、ＣＣＨＣタイプ、ＰＨＤタイプ及びＲｉｎｇタイプである。例としては、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢアクセッション番号Ｑ７Ｚ１４２、Ｐ５５１９７、Ｑ９Ｐ２Ｒ３、Ｑ９Ｐ２Ｇ１、Ｑ９Ｐ２Ｓ６、Ｑ８ＩＵＨ５、Ｐ１９８１１、Ｑ９２７９３、Ｐ３６４０６、０９５０８１及びＱ９ＵＬＶ３が挙げられる。
一部の形態では、ジンクフィンガータンパク質は、アミノ酸配列：
Figure 2024502630000052
 （配列番号７２）又は配列番号７２に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％若しくは９９％の配列同一性を有するアミノ酸或いはその断片を有する（Ｑ７Ｚ１４２－１）である。
ミトコンドリアｈＮＤ ＤＮＡ領域を認識するジンクフィンガー
一部の形態では、ジンクフィンガータンパク質は、左側（Ｌ）ジンクフィンガー（ＺＦ）タンパク質である。一部の形態では、左側ジンクフィンガータンパク質は、ｈＮＤ１ ＤＮＡ配列を認識するＺＦである。一部の形態では、ｈＮＤ１ ＤＮＡ配列を認識する左側ジンクフィンガータンパク質は、アミノ酸配列：
ＭＥＰＧＥＫＰＹＫＣＰＥＣＧＫＳＦＳＴＳＧＳＬＶＲＨＱＲＴＨＴＧＥＫＰＹＫＣＰＥＣＧＫＳＦＳＤＣＲＤＬＡＲＨＱＲＴＨＴＧＥＫＰＹＫＣＰＥＣＧＫＳＦＳＱＮＳＴＬＴＥＨＱＲＴＨＴＧＥＫＰＹＫＣＰＥＣＧＫＳＦＳＥＲＳＨＬＲＥＨＱＲＴＨＴＧＫＫＴＳ（配列番号７４）又は配列番号７４に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％若しくは９９％の配列同一性を有するアミノ酸或いはその断片を有する（ＺＦ＿ｈＮＤ－Ｌ１）である。
一部の形態では、ｈＮＤ１ ＤＮＡ配列を認識する左側ジンクフィンガータンパク質は、アミノ酸配列：
Figure 2024502630000053
 （配列番号７５）又は配列番号７５に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％若しくは９９％の配列同一性を有するアミノ酸或いはその断片を有する（ＺＦ＿ｈＮＤ－Ｌ２）である。
一部の形態では、ｈＮＤ１ ＤＮＡ配列を認識する左側ジンクフィンガータンパク質は、アミノ酸配列：
ＭＥＰＧＥＫＰＹＫＣＰＥＣＧＫＳＦＳＤＰＧＨＬＶＲＨＱＲＴＨＴＧＥＫＰＹＫＣＰＥＣＧＫＳＦＳＱＮＳＴＬＴＥＨＱＲＴＨＴＧＥＫＰＹＫＣＰＥＣＧＫＳＦＳＲＳＤＫＬＴＥＨＱＲＴＨＴＧＥＫＰＹＫＣＰＥＣＧＫＳＦＳＱＲＡＮＬＲＡＨＱＲＴＨＴＧＫＫＴＳ（配列番号７６）又は配列番号７６に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％若しくは９９％の配列同一性を有するアミノ酸或いはその断片を有する（ＺＦ＿ｈＮＤ－Ｌ３）である。
一部の形態では、ｈＮＤ１ ＤＮＡ配列を認識する左側ジンクフィンガータンパク質は、アミノ酸配列：
Figure 2024502630000054
 （配列番号７７）又は配列番号７７に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％若しくは９９％の配列同一性を有するアミノ酸或いはその断片を有する（ＺＦ＿ｈＮＤ－Ｌ４）である。
一部の形態では、ジンクフィンガータンパク質は、右側（Ｒ）ジンクフィンガー（ＺＦ）タンパク質である。一部の形態では、右側ジンクフィンガータンパク質は、ｈＮＤ１ ＤＮＡ配列を認識するＺＦである。一部の形態では、ｈＮＤ１ ＤＮＡ配列を認識する右側ジンクフィンガータンパク質は、
ＭＥＰＧＥＫＰＹＫＣＰＥＣＧＫＳＦＳＴＫＮＳＬＴＥＨＱＲＴＨＴＧＥＫＰＹＫＣＰＥＣＧＫＳＦＳＳＫＫＡＬＴＥＨＱＲＴＨＴＧＥＫＰＹＫＣＰＥＣＧＫＳＦＳＴＳＧＥＬＶＲＨＱＲＴＨＴＧＥＫＰＹＫＣＰＥＣＧＫＳＦＳＴＳＧＮＬＶＲＨＱＲＴＨＴＧＫＫＴＳ（配列番号７８）又は配列番号７８に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％若しくは９９％の配列同一性を有するアミノ酸或いはその断片である。
一部の形態では、ｈＮＤ１ ＤＮＡ配列を認識する右側ジンクフィンガータンパク質は、アミノ酸配列：
Figure 2024502630000055
 （配列番号７９）又は配列番号７９に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％若しくは９９％の配列同一性を有するアミノ酸或いはその断片を有する（ＺＦ＿ｈＮＤ－Ｒ２）である。
一部の形態では、ｈＮＤ１ ＤＮＡ配列を認識する右側ジンクフィンガータンパク質は、アミノ酸配列：
ＭＥＰＧＥＫＰＹＫＣＰＥＣＧＫＳＦＳＴＳＧＮＬＴＥＨＱＲＴＨＴＧＥＫＰＹＫＣＰＥＣＧＫＳＦＳＲＳＤＮＬＶＲＨＱＲＴＨＴＧＥＫＰＹＫＣＰＥＣＧＫＳＦＳＴＳＧＨＬＶＲＨＱＲＴＨＴＧＥＫＰＹＫＣＰＥＣＧＫＳＦＳＲＡＤＮＬＴＥＨＱＲＴＨＴＧＫＫＴＳ（配列番号８０）又は配列番号８０に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％若しくは９９％の配列同一性を有するアミノ酸或いはその断片を有する（ＺＦ＿ｈＮＤ－Ｒ３）である。
一部の形態では、ｈＮＤ１ ＤＮＡ配列を認識する右側ジンクフィンガータンパク質は、アミノ酸配列：
Figure 2024502630000056
 （配列番号８１）又は配列番号８１に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％又は９９％の配列同一性を有するアミノ酸或いはその断片を有する（ＺＦ＿ｈＮＤ－Ｒ４）である。
ミトコンドリアｍＣＯＸ１ ＤＮＡ領域を認識するジンクフィンガー
一部の形態では、左側ジンクフィンガータンパク質は、ｍＣＯＸ ＤＮＡ配列を認識するＺＦである。一部の形態では、ｍＣＯＸ ＤＮＡ配列を認識する左側ジンクフィンガータンパク質は、アミノ酸配列：
Figure 2024502630000057
 （配列番号８２）又は配列番号８２に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％若しくは９９％の配列同一性を有するアミノ酸或いはその断片を有する（ＺＦ＿ｍＣＯＸ１－Ｌ１）である。
一部の形態では、左側ジンクフィンガータンパク質は、ｍＣＯＸ１ ＤＮＡ配列を認識するＺＦである。一部の形態では、ｍＣＯＸ１ ＤＮＡ配列を認識する左側ジンクフィンガータンパク質は、アミノ酸配列：
Figure 2024502630000058
 （配列番号８３）又は配列番号８３に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％又は９９％の配列同一性を有するアミノ酸或いはその断片を有する（ＺＦ＿ｍＣＯＸ１－Ｌ２）である。
一部の形態では、ｍＣＯＸ１ ＤＮＡ配列を認識する左側ジンクフィンガータンパク質は、アミノ酸配列：
Figure 2024502630000059
 （配列番号８４）又は配列番号８４に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％若しくは９９％の配列同一性を有するアミノ酸或いはその断片を有する（ＺＦ＿ｍＣＯＸ１－Ｌ３）である。
一部の形態では、ｍＣＯＸ１ ＤＮＡ配列を認識する左側ジンクフィンガータンパク質は、アミノ酸配列：
Figure 2024502630000060
 （配列番号８５）又は配列番号８５に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％又は９９％の配列同一性を有するアミノ酸或いはその断片を有する（ＺＦ＿ｍＣＯＸ１－Ｌ４）である。
一部の形態では、ｍＣＯＸ１ ＤＮＡ配列を認識する左側ジンクフィンガータンパク質は、アミノ酸配列：
Figure 2024502630000061
 （配列番号８６）又は配列番号８６に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％若しくは９９％の配列同一性を有するアミノ酸或いはその断片を有する（ＺＦ＿ｍＣＯＸ１－Ｌ５）である。
一部の形態では、ｍＣＯＸ１ ＤＮＡ配列を認識する右側ジンクフィンガータンパク質は、アミノ酸配列：
Figure 2024502630000062
 （配列番号８７）又は配列番号８７に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％又は９９％の配列同一性を有するアミノ酸或いはその断片を有する（ＺＦ＿ｍＣＯＸ１－Ｒ１）である。
一部の形態では、ｍＣＯＸ１ ＤＮＡ配列を認識する右側ジンクフィンガータンパク質は、アミノ酸配列：
Figure 2024502630000063
 （配列番号８８）又は配列番号８８に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％若しくは９９％の配列同一性を有するアミノ酸或いはその断片を有する（ＺＦ＿ｍＣＯＸ１－Ｒ２）である。
一部の形態では、ｍＣＯＸ１ ＤＮＡ配列を認識する右側ジンクフィンガータンパク質は、アミノ酸配列：
Figure 2024502630000064
 （配列番号８９）又は配列番号８９に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％若しくは９９％の配列同一性を有するアミノ酸或いはその断片を有する（ＺＦ＿ｍＣＯＸ１－Ｒ３）である。
ｂ．転写活性化因子様（ＴＡＬ）エフェクター
一部の形態では、標的塩基エディターは、１つ以上のターゲティングドメインとして１つ以上の転写活性化因子様（ＴＡＬ）エフェクターを含む。デアミナーゼドメインとＴＡＬエフェクターを組み合わせたカスタム設計の塩基エディターは、標的化（部位特異的）塩基編集をゲノムに導入するための一般的且つ効率的な方法を提供する。
ＴＡＬエフェクターは、病原体によって植物細胞に注入される植物病原菌のタンパク質であり、そこで、それらのタンパク質は、核に移動し、特定の植物遺伝子をオンにする転写因子として機能する。転写活性化因子様エフェクター（ＴＡＬＥ）のモジュラーＤＮＡ認識ドメインは、キサントモナス属（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ）の病原性細菌によってコードされる天然の転写因子に初めて発見され、近年ではラルストニア・ソラナケアルム（Ｒａｌｓｔｏｎｉａ ｓｏｌａｎａｃｅａｒｕｍ）で見い出された。キサントモナス属（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ）ＴＡＬＥは、ゲノム工学分野で最も広く使用されている。ＴＡＬエフェクターの一次アミノ酸配列は、それが結合するヌクレオチド配列を指令する。このように、標的部位は、ＴＡＬエフェクターについて予測することができ、ＴＡＬエフェクターは、本明細書に記載されるような塩基エディター標的配列などの特定のヌクレオチド配列に結合させる目的で操作及び作製することもできる。
ＴＡＬエフェクターＤＮＡ結合ドメイン内の各モジュールには、「リピート可変二残基」（ＲＶＤ）と呼ばれる、位置１２及び１３の二残基を介して単一ヌクレオチドとの相互作用を媒介する、典型的には３４残基の保存区間を含む。異なる特異性を持つモジュールは、ジンクフィンガーアレイの生成に対して主な制限を呈示するコンテキスト依存性の課題を発生することなく、適合したアレイに融合することができる。従って、この単純な「１つのモジュールから１ヌクレオチド」サイファー（Ｃｙｐｈｅｒ）は、新規の特異性を備えるＴＡＬＥの作製を迅速且つ安価にする。
ＴＡＬエフェクターＤＮＡ結合ドメインは、各々約３４残基長のアミノ酸リピートのタンデム配列である。これらのリピートは、互いに非常に類似しており；典型的には、それらは、主に２つの位置（アミノ酸１２及び１３、リピート可変残基又はＲＶＤと呼ばれる）で異なる。各ＲＶＤは、４つの可能なヌクレオチドの１つに対する優先的な結合を指定し、各ＴＡＬＥリピートが単一の塩基対に結合することを意味するが、ＮＮ ＲＶＤは、グアニン以外に、アデニンに結合することがわかっている。ＲＶＤ及びそれらの対応する標的ヌクレオチドの非限定的な例を以下の表１に示す。国際公開第２０１０／０７９４３０号パンフレット（その全体が参照により本明細書に援用される）も参照されたい。
Figure 2024502630000065
天然のＴＡＬＥには、それらの標的部位の先頭にＴが存在するという厳密な要件（Ｔ０ルール）、即ちＴＡＬＥ Ｎ末端ドメインによって指令される特異性がある。この特異性を緩くする操作ＴＡＬＥ Ｎ末端ドメインが記載されており、これは、他のヌクレオチドで開始するターゲティング配列を可能にする（Ｌａｍｂ，Ｂ．Ｍ．，Ｍｅｒｃｅｒ，Ａ．Ｃ．，＆Ｂａｒｂａｓ ＩＩＩ，Ｃ．Ｆ．（２０１３）．Ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ＴＡＬＥ Ｎ－ｔｅｒｍｉｎａｌ ｄｏｍａｉｎ ｆｏｒ ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ ｏｆ ａｌｌ ５’ｂａｓｅｓ．Ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄｓ ｒｅｓｅａｒｃｈ，４１（２１），９７７９－９７８５）。
ＴＡＬエフェクターＤＮＡ結合は、ジンクフィンガータンパク質のものよりも機構的によく理解されていないが、それらの一見単純なコードは、プログラム可能な部位特異的ＤＮＡ結合に有益である。ＴＡＬＥは、比較的長い標的配列（これまでに報告された最短のものは、１モノマー当たり１３ヌクレオチドに結合する）を有するため、結合部位間のスペーサーの長さに関してＺＦＮほど厳密ではない要件も有すると思われる。単量体及び二量体ＴＡＬＥＮは、１０超、１４超、２０超又は２４超のリピートを含み得る。
特定の核酸に結合するようにＴＡＬを操作する方法は、Ｃｅｒｍａｋ，ｅｔ ａｌ，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１－１１（２０１１）に記載されている。米国特許出願公開第２０１１／０１４５９４０号明細書は、ＴＡＬエフェクター及びそれらを使用してＤＮＡを修飾する方法を開示している。Ｍｉｌｌｅｒ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ２９：１４３（２０１１）は、ＴＡＬ切断変異体をＦｏｋｌヌクレアーゼの触媒ドメインに連結することにより、部位特異的ヌクレアーゼ構造のための転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）を作製したことを報告している。得られたＴＡＬＥＮは、不死化ヒト細胞で遺伝子改変を誘導することが明らかにされた。ＴＡＬＥ結合ドメインに関する一般的な設計原理は、例えば、国際公開第２０１１／０７２２４６号パンフレットに見出すことができ、これらは、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
配列特異的ＴＡＬＥは、予め選択された標的核酸（例えば、染色体又はミトコンドリアＤＮＡ上に存在する）内の特定の配列を認識することができる。従って、一部の形態では、標的ヌクレオチド配列をＴＡＬＥ認識部位について調べることができ、特定のＴＡＬＥを標的配列に基づいて選択することができる。他の形態では、ＴＡＬＥは、特定の配列をターゲティングするように操作することができる。組み合わせて、塩基エディター標的配列に結合する複数のＤＮＡ結合リピートを含む配列特異的ＴＡＬエフェクターを設計することができる。本明細書に記載されるように、ＴＡＬエフェクターは、それらがＤＮＡと相互作用する特異性を決定する多数の不完全なリピートを含む。各リピートは、リピートの残基１２及び１３における特定のジアミノ酸配列に応じて、単一の塩基に結合する。従って、（例えば、当技術分野で公知の標準的な技術を使用して）ＴＡＬエフェクター内のリピートを操作することにより、特定のＤＮＡ部位をターゲティングすることができる。
ＺＦＮと同様に、一部のＴＡＬＥＮは、二量体としてのみ機能するエンドヌクレアーゼ（例えば、Ｆｏｋｌ）を含み、これを十分に利用して、ＴＡＬエフェクターの標的特異性を高めることができる。例えば、場合によっては、各Ｆｏｋｌｅモノマーを異なるＤＮＡ標的配列を認識するＴＡＬエフェクター配列に融合することができ、２つの認識部位が近接している場合にのみ、不活性モノマーが一緒になって機能性ＴＡＬＥＮを生成することができる。本明細書に開示される標的塩基エディターは、エンドヌクレアーゼ（例えば、Ｆｏｋｌ）の代わりにデアミナーゼドメインが使用され、ＤＮＡ切断と比較してＤＮＡの標的塩基編集をもたらすことを除けば、類似の方法で使用することができる。このように、１つ以上のＴＡＬエフェクターを含む塩基エディターを操作するための方法は明らかであり、ＴＡＬＥＮを製造するための当技術分野で公知のものから改変することができる。
前述のように、ジンクフィンガーが、塩基エディターのターゲティングドメインとして使用される場合、ターゲティングドメインとしてＴＡＬエフェクターを含む、開示される標的化塩基エディターも、一部の形態では、二量体として機能することができる。このように、一部の形態では、開示される標的塩基エディターは、デアミナーゼドメインの標的ヌクレオチド配列と（例えば、上流及び下流で）フランキングする塩基エディター標的配列に結合する二量体として機能することができる。これは、（塩基エディターの）デアミナーゼドメインが２つの個別の部分に分割される場合に特に有用である。従って、一部の形態では、デアミナーゼドメインのＮ末端部分は、第１のＴＡＬエフェクターに連結されるのに対して、デアミナーゼドメインのＣ末端部分は、第２のＴＡＬエフェクターに連結される。２つのＴＡＬエフェクター及び／又はＴＡＬエフェクターによって結合された塩基エディター標的配列は、同じであり得るが、同じである必要はない。ＴＡＬエフェクターは、２つのＴＡＬＥ－デアミナーゼドメイン分子が標的核酸上で最適に配置されて二量体化するように設計及び選択することができる。一部の形態では、そのようなスプリット標的塩基エディターは、小成分が結合して（例えば、共発現又は共導入されて）及び二量体化するときに限り、標的ヌクレオチド配列を脱アミノ化することができる。
一部の形態では、ＴＡＬＥタンパク質は、左側（Ｌ）ＴＡＬＥタンパク質又は右側（Ｒ）ＴＡＬＥタンパク質である。一部の形態では、ＴＡＬＥタンパク質は、ｈＮＤ１ ＤＮＡ配列を認識するＴＡＬＥである。
ｈＮＤ ＤＮＡ領域を認識するＴＡＬＥ
一部の形態では、ｈＮＤ１ ＤＮＡ配列を認識する左側ＴＡＬＥタンパク質は、アミノ酸配列：
Figure 2024502630000066
 （配列番号９０）又は配列番号９０に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％若しくは９９％の配列同一性を有するアミノ酸或いはその断片を有する（ＴＡＬＥ＿ｈＮＤ－Ｌ１）である。
一部の形態では、ｈＮＤ１ ＤＮＡ配列を認識する右側ＴＡＬＥタンパク質は、アミノ酸配列：
Figure 2024502630000067
 （配列番号９１）又は配列番号９１に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％若しくは９９％の配列同一性を有するアミノ酸或いはその断片を有する（ＴＡＬＥ＿ｈＮＤ－Ｒ１）である。
一部の形態では、ＴＡＬＥタンパク質は、ｍＮＤ６ ＤＮＡ配列を認識するＴＡＬＥである。一部の形態では、ｍＮＤ６ ＤＮＡ配列を認識する左側ＴＡＬＥタンパク質は、アミノ酸配列：
Figure 2024502630000068
 （配列番号９２）又は配列番号９２に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％若しくは９９％の配列同一性を有するアミノ酸或いはその断片を有する（ＴＡＬＥ＿ｍＮＤ６－Ｌ１）である。
一部の形態では、ｍＮＤ６ ＤＮＡ配列を認識する右側ＴＡＬＥタンパク質は、アミノ酸配列：
Figure 2024502630000069
 （配列番号９３）又は配列番号９３に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％若しくは９９％の配列同一性を有するアミノ酸或いはその断片を有する（ＴＡＬＥ＿ｍＮＤ６－Ｒ１）である。
一部の形態では、ｍＮＤ６ ＤＮＡ配列を認識する右側ＴＡＬＥタンパク質は、アミノ酸配列：
Figure 2024502630000070
 （配列番号９４）又は配列番号９４に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％若しくは９９％の配列同一性を有するアミノ酸或いはその断片を有する（ＴＡＬＥ＿ｍＮＤ－Ｒ２）である。
一部の形態では、ＴＡＬＥタンパク質は、ｍＮＤ１ ＤＮＡ配列を認識するＴＡＬＥである。一部の形態では、ｍＮＤ１ ＤＮＡ配列を認識する左側ＴＡＬＥタンパク質は、アミノ酸配列：
Figure 2024502630000071
 （配列番号９５）又は配列番号９５に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％若しくは９９％の配列同一性を有するアミノ酸或いはその断片を有する（ＴＡＬＥ＿ｍＮＤ１－Ｌ１）である。
一部の形態では、ｍＮＤ１ ＤＮＡ配列を認識する左側ＴＡＬＥタンパク質は、アミノ酸配列：
Figure 2024502630000072
 （配列番号９６）又は配列番号９６に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％若しくは９９％の配列同一性を有するアミノ酸或いはその断片を有する（ＴＡＬＥ＿ｍＮＤ１－Ｌ２）である。
一部の形態では、ＴＡＬＥタンパク質は、ｈ１１ ＤＮＡ配列を認識するＴＡＬＥである。一部の形態では、ｈ１１ ＤＮＡ配列を認識するＴＡＬＥタンパク質は、アミノ酸配列：
Figure 2024502630000073
 （配列番号９７）又は配列番号９７に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％若しくは９９％の配列同一性を有するアミノ酸或いはその断片を有する（ＴＡＬＥ＿ｈ１１）である。
一部の形態では、ＴＡＬＥタンパク質は、ｈ１２ ＤＮＡ配列を認識するＴＡＬＥである。一部の形態では、ｈ１２ ＤＮＡ配列を認識するＴＡＬＥタンパク質は、アミノ酸配列：
Figure 2024502630000074
 （配列番号９８）又は配列番号９８に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％若しくは９９％の配列同一性を有するアミノ酸或いはその断片を有する（ＴＡＬＥ＿ｈ１２）である。
一部の形態では、ＴＡＬＥタンパク質は、ｍＣＯＸ１ ＤＮＡ配列を認識するＴＡＬＥである。一部の形態では、ｍＣＯＸ１ ＤＮＡ配列を認識する左側ＴＡＬＥタンパク質は、アミノ酸配列：
Figure 2024502630000075
 （配列番号９９）又は配列番号９９に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％若しくは９９％の配列同一性を有するアミノ酸或いはその断片を有する（ＴＡＬＥ＿ｍＣＯＸ１－Ｌ１）である。
一部の形態では、ｍＣＯＸ１ ＤＮＡ配列を認識する左側ＴＡＬＥタンパク質は、アミノ酸配列：
Figure 2024502630000076
 （配列番号１００）又は配列番号１００に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％若しくは９９％の配列同一性を有するアミノ酸或いはその断片を有する（ＴＡＬＥ＿ｍＣＯＸ１－Ｌ２）である。
一部の形態では、ｍＣＯＸ１ ＤＮＡ配列を認識する左側ＴＡＬＥタンパク質は、アミノ酸配列：
Figure 2024502630000077
 （配列番号１０１）又は配列番号１０１に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％若しくは９９％の配列同一性を有するアミノ酸或いはその断片を有する（ＴＡＬＥ＿ｍＣＯＸ１－Ｌ３）である。
一部の形態では、ｍＣＯＸ１ ＤＮＡ配列を認識する左側ＴＡＬＥタンパク質は、アミノ酸配列：
Figure 2024502630000078
 （配列番号１０２）又は配列番号１０２に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％若しくは９９％の配列同一性を有するアミノ酸或いはその断片を有する（ＴＡＬＥ＿ｍＣＯＸ１－Ｌ４）である。
一部の形態では、ｍＣＯＸ１ ＤＮＡ配列を認識する左側ＴＡＬＥタンパク質は、アミノ酸配列：
Figure 2024502630000079
 （配列番号１０３）又は配列番号１０３に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％若しくは９９％の配列同一性を有するアミノ酸或いはその断片を有する（ＴＡＬＥ＿ｍＣＯＸ１－Ｌ５）である。
一部の形態では、ｍＣＯＸ１ ＤＮＡ配列を認識する左側ＴＡＬＥタンパク質は、アミノ酸配列：
Figure 2024502630000080
 （配列番号１０４）又は配列番号１０４に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％若しくは９９％の配列同一性を有するアミノ酸或いはその断片を有する（ＴＡＬＥ＿ｍＣＯＸ１－Ｌ６）である。
一部の形態では、ｍＣＯＸ１ ＤＮＡ配列を認識する左側ＴＡＬＥタンパク質は、アミノ酸配列：
Figure 2024502630000081
 （配列番号１０５）又は配列番号１０５に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％若しくは９９％の配列同一性を有するアミノ酸或いはその断片を有する（ＴＡＬＥ＿ｍＣＯＸ１－Ｌ７）である。
一部の形態では、ｍＣＯＸ１ ＤＮＡ配列を認識する左側ＴＡＬＥタンパク質は、アミノ酸配列：
Figure 2024502630000082
 （配列番号１０６）又は配列番号１０６に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％若しくは９９％の配列同一性を有するアミノ酸或いはその断片を有する（ＴＡＬＥ＿ｍＣＯＸ１－Ｌ７）である。
一部の形態では、ｍＣＯＸ１ ＤＮＡ配列を認識する右側ＴＡＬＥタンパク質は、アミノ酸配列：
Figure 2024502630000083
 （配列番号１０８）又は配列番号１０８に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％若しくは９９％の配列同一性を有するアミノ酸或いはその断片を有する（ＴＡＬＥ＿ｍＣＯＸ１－Ｒ１）である。
一部の形態では、ｍＣＯＸ１ ＤＮＡ配列を認識する右側ＴＡＬＥタンパク質は、アミノ酸配列：
Figure 2024502630000084
 （配列番号１０９）又は配列番号１０９に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％若しくは９９％の配列同一性を有するアミノ酸或いはその断片を有する（ＴＡＬＥ＿ｍＣＯＸ１－Ｒ２）である。
一部の形態では、ｍＣＯＸ１ ＤＮＡ配列を認識する右側ＴＡＬＥタンパク質は、アミノ酸配列：
Figure 2024502630000085
 （配列番号１１０）又は配列番号１１０に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％若しくは９９％の配列同一性を有するアミノ酸或いはその断片を有する（ＴＡＬＥ＿ｍＣＯＸ１－Ｒ３）である。
一部の形態では、ｍＣＯＸ１ ＤＮＡ配列を認識する右側ＴＡＬＥタンパク質は、アミノ酸配列：
Figure 2024502630000086
 （配列番号１１１）又は配列番号１１１に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％若しくは９９％の配列同一性を有するアミノ酸或いはその断片を有する（ＴＡＬＥ＿ｍＣＯＸ１－Ｒ４）である。
一部の形態では、ｍＣＯＸ１ ＤＮＡ配列を認識する右側ＴＡＬＥタンパク質は、アミノ酸配列：
Figure 2024502630000087
 （配列番号１１２）又は配列番号１１２に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％若しくは９９％の配列同一性を有するアミノ酸或いはその断片を有する（ＴＡＬＥ＿ｍＣＯＸ１－Ｒ５）である。
一部の形態では、ｍＣＯＸ１ ＤＮＡ配列を認識する右側ＴＡＬＥタンパク質は、アミノ酸配列：
Figure 2024502630000088
 （配列番号１１３）又は配列番号１１３に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％若しくは９９％の配列同一性を有するアミノ酸或いはその断片を有する（ＴＡＬＥ＿ｍＣＯＸ１－Ｒ６）である。
一部の形態では、ＴＡＬＥタンパク質は、ＮＴ（Ｇ）ＤＮＡ配列を認識し（ＴＡＬＥ＿ＮＴ（Ｇ））、アミノ酸配列：
Figure 2024502630000089
 （配列番号１１４）又は配列番号１１４に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％若しくは９９％の配列同一性を有するアミノ酸或いはその断片を有する。
一部の形態では、ＴＡＬＥタンパク質は、ＮＴ（ｂＮ）ＤＮＡ配列を認識し（ＴＡＬＥ＿ＮＴ（ｂＮ））、アミノ酸配列：
Figure 2024502630000090
 （配列番号１１５）又は配列番号１１５に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％若しくは９９％の配列同一性を有するアミノ酸或いはその断片を有する。
ｃ．ＢＡＴタンパク質
一部の形態では、ＤＮＡ結合タンパク質は、ＴＡＬＥ様（例えば、ＢＡＴ）タンパク質である。ＴＡＬＥと異なり、天然のＢＡＴは、Ｔ０ルールに従わず、そのＮ末端ドメインで、緩い特異性を有するため、任意の出発ヌクレオチドを有する標的に結合するようにそれらを設計することができる。一部の形態では、ＢＡＴタンパク質は、左側ＢＡＴタンパク質又は右側ＢＡＴタンパク質である。一部の形態では、ＢＡＴタンパク質は、ｈＮＤ１ ＤＮＡ配列を認識する左側ＢＡＴタンパク質である。一部の形態では、ｈＮＤ１ ＤＮＡ配列を認識する左側ＢＡＴタンパク質は、アミノ酸配列：
Figure 2024502630000091
 （配列番号１１６）又は配列番号１０６に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％若しくは９９％の配列同一性を有するアミノ酸或いはその断片を有する（ＢＡＴ＿ｈＮＤ１－Ｌ）である。
一部の形態では、ＢＡＴタンパク質は、ｈＮＤ１ ＤＮＡ配列を認識する右側ＢＡＴタンパク質である。一部の形態では、ｈＮＤ１ ＤＮＡ配列を認識する右側ＢＡＴタンパク質は、アミノ酸配列：
Figure 2024502630000092
 （配列番号１１７）又は配列番号１１７に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％若しくは９９％の配列同一性を有するアミノ酸或いはその断片を有する（ＢＡＴ＿ｈＮＤ１－Ｒ）である。
一部の形態では、ＢＡＴタンパク質は、ｍＣＯＸ１ ＤＮＡ配列を認識する左側ＢＡＴタンパク質である。一部の形態では、ｍＣＯＸ１ ＤＮＡ配列を認識する左側ＢＡＴタンパク質は、アミノ酸配列：
Figure 2024502630000093
 （配列番号１１８）又は配列番号１１８に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％若しくは９９％の配列同一性を有するアミノ酸或いはその断片を有する（ＢＡＴ＿ｍＣＯＸ１－Ｌ）である。
一部の形態では、ＢＡＴタンパク質は、ｍＣＯＸ１ ＤＮＡ配列を認識する右側ＢＡＴタンパク質である。一部の形態では、ｍＣＯＸ１ ＤＮＡ配列を認識する右側ＢＡＴタンパク質は、アミノ酸配列：
Figure 2024502630000094
 （配列番号１１９）又は配列番号１１９に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％若しくは９９％の配列同一性を有するアミノ酸或いはその断片を有する（ＢＡＴ＿ｍＣＯＸ１－Ｒ）である。
一部の形態では、ＢＡＴタンパク質は、ｍＮＤ６ ＤＮＡ配列を認識する左側ＢＡＴタンパク質である。一部の形態では、ｍＮＤ６ ＤＮＡ配列を認識する左側ＢＡＴタンパク質は、アミノ酸配列：
Figure 2024502630000095
 （配列番号１２０）又は配列番号１２０に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％若しくは９９％の配列同一性を有するアミノ酸或いはその断片を有する（ＢＡＴ＿ｍＮＤ６－Ｌ）である。
一部の形態では、ＢＡＴタンパク質は、ｍＮＤ６ ＤＮＡ配列を認識する右側ＢＡＴタンパク質である。一部の形態では、ｍＮＤ６ ＤＮＡ配列を認識する右側ＢＡＴタンパク質は、アミノ酸配列：
Figure 2024502630000096
 （配列番号１２１）又は配列番号１２１に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％若しくは９９％の配列同一性を有するアミノ酸或いはその断片を有する（ＢＡＴ＿ｍＮＤ６－Ｒ）である。
ｄ．ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓエフェクタータンパク質
一部の形態では、標的塩基エディターは、１つ以上のターゲティングドメインとして１つ以上のＣｒｉｓｐｒ－Ｃａｓエフェクタータンパク質を含む。ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムの利点は、特定の配列をターゲティングするために、カスタマイズされたタンパク質の生成を必要とするのではなく、ガイド分子によって単一のＣａｓタンパク質をプログラムして、特定の核酸標的を認識することができる点である。換言すれば、Ｃｒｉｓｐｒ－Ｃａｓエフェクタータンパク質は、前記ガイド分子を用いて、目的の特定の核酸標的遺伝子座に動員することができる。
好ましくは、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓエフェクタータンパク質は、実質的に全てのＤＮＡ切断活性が欠如していると考えられる（例えば、変異酵素のＤＮＡ切断活性が、非変異型の酵素のＤＮＡ切断活性の約２５％、１０％、５％、１％、０．１％、０．０１％以下である場合）。一例は、変異型のＤＮＡ切断活性が、非変異型と比較してゼロ又は無視できる場合であり得る。このような形態では、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓタンパク質は、一般的なＤＮＡ結合タンパク質として使用される。
ＣＲＩＳＰＲ（クラスター化した規則的な配置の短い回文反復）は、塩基配列の複数の短い直接的な反復を含むＤＮＡ遺伝子座の頭字語である。原核生物のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムは、真核生物で使用される遺伝子編集（特定の遺伝子のサイレンシング、増強又は変更）としての使用のために改変される（例えば、Ｃｏｎｇ、Ｓｃｉｅｎｃｅ，１５：３３９（６１２１）：８１９－８２３（２０１３）及びＪｉｎｅｋ，ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，３３７（６０９６）：８１６－２１（２０１２）を参照されたい）。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムを用いたゲノム編集に使用される組成物を調製する方法は、国際公開第２０１３／１７６７７２号パンフレット及び同第２０１４／０１８４２３号パンフレットに詳細に記載されており、これらはその全体が参照により本明細書に具体的に組み込まれる。
本明細書で使用される場合、用語「Ｃａｓ」は、一般に、ＣＲＩＳＰＲ Ｃａｓシステム又は複合体のエフェクタータンパク質を指す。用語「Ｃａｓ」は、別段明らかでない限り、「ＣＲＩＳＰＲ」タンパク質、「ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓタンパク質」、「ＣＲＩＳＰＲエフェクター」、「ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓエフェクター」、「ＣＲＩＳＰＲ酵素」、「ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ酵素」などの用語と互換可能に使用され得る。一般に、「ＣＲＩＳＰＲシステム」は、ＣＲＩＳＰＲ関連（「Ｃａｓ」）遺伝子の発現又はその活性の指令に関与する転写物及び他の要素を集合的に指し、Ｃａｓ遺伝子をコードする配列、ｔｒａｃｒ（トランス活性化ＣＲＩＳＰＲ）配列（例えば、ｔｒａｃｒＲＮＡ又は活性部分ｔｒａｃｒＲＮＡ）、ｔｒａｃｒメイト配列（「直列反復配列」及び内因性ＣＲＩＳＰＲシステムに関連するｔｒａｃｒＲＮＡプロセス部分直列反復配列を含む）、ガイド配列（内因性ＣＲＩＳＰＲシステムに関連する「スペーサー」とも呼ばれる）又はＣＲＩＳＰＲ遺伝子座からの他の配列及び転写物を含む。ガイド配列に作動可能に連結された１つ以上のｔｒａｃｒメイト配列（例えば、直列反復配列－スペーサー－直列反復配列）は、ヌクレアーゼによるプロセシング前のｐｒｅ－ｃｒＲＮＡ（ｐｒｅ－ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ）又はヌクレアーゼによるプロセシング後のｃｒＲＮＡと呼ぶこともできる。
一部の形態では、Ｃｏｎｇ，Ｓｃｉｅｎｃｅ，１５：３３９（６１２１）：８１９－８２３（２０１３）及びＪｉｎｅｋ，ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，３３７（６０９６）：８１６－２１（２０１２）に記載されるように、ｔｒａｃｒＲＮＡとｃｒＲＮＡが連結され、キメラｃｒＲＮＡ－ｔｒａｃｒＲＮＡハイブリッドを形成するが、この場合、成熟したｃｒＲＮＡが合成ステムループを介して部分的なｔｒａｃｒＲＮＡに融合され、天然のｃｒＲＮＡ：ｔｒａｃｒＲＮＡ二重鎖を模倣する。単一の融合ｃｒＲＮＡ－ｔｒａｃｒＲＮＡ構築物は、ガイドＲＮＡ若しくはｇＲＮＡ（又はシングルガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ））と呼ぶこともできる。ｓｇＲＮＡ内で、ｃｒＲＮＡ部分は、「標的配列」として識別でき、ｔｒａｃｒＲＮＡは、「スカフォールド」と呼ばれることが多い。
ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓエフェクタータンパク質は、ＩＩ型、Ｖ型又はＶＩ型Ｃａｓエフェクタータンパク質であり得るが、限定されない。
ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓエフェクタータンパク質の非限定的な例としては、Ｃａｓｌ、ＣａｓｌＢ、Ｃａｓ２、Ｃａｓ３、Ｃａｓ４、Ｃａｓ５、Ｃａｓ６、Ｃａｓ７、Ｃａｓ８、Ｃａｓ９（Ｃｓｎｌ及びＣｓｘｌ２としても知られる）、ＣａｓｌＯ、Ｃｓｙｌ、Ｃｓｙ２、Ｃｓｙ３、Ｃｓｅｌ、Ｃｓｅ２、Ｃｓｃｌ、Ｃｓｃ２、Ｃｓａ５、Ｃｓｎ２、Ｃｓｍ２、Ｃｓｍ３、Ｃｓｍ４、Ｃｓｍ５、Ｃｓｍ６、Ｃｍｒｌ、Ｃｍｒ３、Ｃｍｒ４、Ｃｍｒ５、Ｃｍｒ６、Ｃｓｂｌ、Ｃｓｂ２、Ｃｓｂ３、Ｃｓｘｌ７、Ｃｓｘｌ４、ＣｓｘｌＯ、Ｃｓｘｌ６、ＣｓａＸ、Ｃｓｘ３、Ｃｓｘｌ、Ｃｓｘｌ５、Ｃｓｆｌ、Ｃｓｆ２、Ｃｓｆ３、Ｃｓｆ４、それらのホモログ又はそれらの修飾バージョンが挙げられる。一部の形態では、修飾されないＣＲＩＳＰＲ酵素は、ＤＮＡ切断活性を有する。好ましくは、Ｃｒｉｓｐｒ－Ｃａｓエフェクタータンパク質は、変異型ＣＲＩＳＰＲ酵素が標的配列を含む標的ポリヌクレオチドの一方又は両方の鎖を切断する能力を欠失するように、対応する野生型酵素に対して変異される。
（１）Ｃａｓ９
一部の形態では、ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ酵素は、国際公開第２０１４／０９３５９５号パンフレットに開示されるようなＣａｓ９酵素である。一部の形態では、Ｃａｓ９酵素は、肺炎レンサ球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、化膿レンサ球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）又はＳ．サーモフィルス（Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）Ｃａｓ９であり、これらの生物に由来する変異Ｃａｓ９を含み得る。酵素は、Ｃａｓ９ホモログ又はオルソログであり得る。別のオルソログとしては、例えば、コリネバクター・ジプテリアエ（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒ ｄｉｐｔｈｅｒｉａｅ）、ユーバクテリウム・ベントリオサム（Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｖｅｎｔｒｉｏｓｕｍ）、ストレプトコッカス・パストゥリアヌス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐａｓｔｅｕｒｉａｎｕｓ）、ラクトバチルス・ファルシミニス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｆａｒｃｉｍｉｎｉｓ）、スフェロアケタ・グロバス（Ｓｐｈａｅｒｏａｃｈａｅｔａ ｇｌｏｂｕｓ）、アゾスピリルム（Ａｚｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ）Ｂ５１０、グルコナセトバクター・ジアゾトロフィカス（Ｇｌｕｃｏｎａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｄｉａｚｏｔｒｏｐｈｉｃｕｓ）、ナイセリア・シネリアル（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｃｉｎｅｒｅａｌ）、ゼブリア・インテスチナリス（Ｒｏｓｅｂｕｒｉａ ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌｉｓ）、パルビバキュラム・ラバメンティボランス（Ｐａｒｖｉｂａｃｕｌｕｍ ｌａｖａｍｅｎｔｉｖｏｒａｎｓ）、黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）、ニトラチフラクター・サルスギニス（Ｎｉｔｒａｔｉｆｒａｃｔｏｒ ｓａｌｓｕｇｉｎｉｓ）ＤＳＭ １６５１１、カンプリオバクター・ラリ（Ｃａｍｐｌｙｏｂａｃｔｅｒ ｌａｒｉ）ＣＦ８９－１２及びストレプトコッカス・サーモフィルス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）ＬＭＤ－９由来のＣａｓ９酵素が挙げられる。
一部の形態では、Ｃａｓ９エフェクタータンパク質及びそのオルソログは、機能増強のために修飾することができる。例えば、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９システムの標的特異性の向上は、複数の手法によって達成することができ、そうした手法は、限定されないが、最適活性を有するガイドＲＮＡの設計及び調製するステップと、特定の長さのＣａｓ９酵素を選択するステップと、それをコードする核酸分子を切断して、Ｃａｓ９酵素を切断し、それをコードする核酸分子を切断することにより、対応する野生型Ｃａｓ９酵素よりもその長さを短くするステップと、キメラＣａｓ９酵素を生成するステップとを含み、上記のキメラＣａｓ９酵素では、適合させた特異性を有するキメラ酵素に到達するように、酵素の様々な部分が様々なオルソログ間で交換されるか又は取替えられる。
Ｃａｓ９酵素は、１つ以上の変異を含み得、且つ機能性ドメインとの融合を伴って若しくは伴わずに、又は機能性ドメインに作動可能に連結されるか若しくは連結されない一般的なＤＮＡ結合タンパク質として使用され得る。変異は、人為的に導入された変異であり得、触媒ドメイン中に１つ以上の変異を含み得るが、これらに限定されない。Ｃａｓ９酵素に関する触媒ドメインの例として、限定されないが、ＲｕｖＣ Ｉ、ＲｕｖＣ ＩＩ、ＲｕｖＣ ＩＩＩ及びＨＮＨドメインが挙げられる。好適な変異の好ましい例は、Ｃａｓ９のＮ末端ＲｕｖＣ Ｉドメインにおける触媒残基又は内部ＨＮＨドメインにおける触媒残基である。一部の形態では、Ｃａｓ９は、化膿レンサ球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９（ＳｐＣａｓ９）である（又はそれに由来する）。このような形態では、好ましい変異は、ＳｐＣａｓ９の位置１０、７６２、８４０、８５４、８６３及び／又は９８６のいずれか若しくは全て又はＳｐＣａｓ９の位置番号付けに準拠して、他のＣａｓ９オルソログにおける対応する位置にある（これは、例えば、標準的な配列比較ツール、例えば、Ｌａｓｅｒｇｅｎｅ １０スイートによるＣｌｕｓｔａｌＷ又はＭｅｇＡｌｉｇｎによって確認され得る）。とりわけ、ＳｐＣａｓ９における以下の変異：Ｄ１０Ａ、Ｅ７６２Ａ、Ｈ８４０Ａ、Ｎ８５４Ａ、Ｎ８６３Ａ及び／若しくはＤ９８６Ａのいずれか又は全てが好ましく；さらに、置換アミノ酸のいずれかに対する保存的置換も考慮される。他のＣａｓ９オルソログにおけるＳｐＣａｓ９の位置番号付けに準拠して、対応する位置での同じ変異（又はこれらの変異の保存的置換）も好ましい。特に、ＳｐＣａｓ９におけるＤ１０及びＨ８４０が好ましい。しかし、他のＣａｓ９では、ＳｐＣａｓ９ Ｄ１０及びＨ８４０に対応する残基も好ましい。これらは、単独で変異した場合にニッカーゼ活性を付与し、両方の変異が存在する場合、Ｃａｓ９は、一般的なＤＮＡ結合に有用な触媒としてヌル変異体に変換されるために有利である。
一部の形態例では、Ｃａｓ９タンパク質は、誘導性二量体を含むか若しくは誘導性ヘテロ二量体を含むか、又はほぼそれからなるか若しくはそれからなる。一部の形態では、誘導性ヘテロ二量体の第１の半分又は第１の位置又は第１の断片は、ＦＫＢＰ又は任意選択でＦＫＢＰ１２であるか、又はそれを含むか、又はそれからなるか、又はほぼそれからなる。誘導性ＣＲＩＳＰＲ Ｃａｓシステムの一部の形態では、誘導性ヘテロ二量体の第２の半分又は第２の位置又は第２の断片は、ＦＲＢであるか、又はそれを含むか、又はそれからなるか、又はほぼそれからなる。第１のＣＲＩＳＰＲ酵素融合構築物の構成は、Ｎ’末端Ｃａｓ９部分－ＦＲＢ－ＮＥＳを含むか、又はそれからなるか、又はほぼそれからなり得る。第１のＣＲＩＳＰＲ酵素融合構築物の構成は、ＮＥＳ－Ｎ’末端Ｃａｓ９部分－ＦＲＢ－ＮＥＳを含むか、又はそれからなるか、又はほぼそれからもなり得る。第２のＣＲＩＳＰＲ酵素融合構築物の構成は、Ｃ’末端Ｃａｓ９部分－ＦＫＢＰ－ＮＬＳを含むか、又はほぼそれからなるか、又はそれからなり得る。第２のＣＲＩＳＰＲ酵素融合構築物の構成は、ＮＬＳ－Ｃ’末端Ｃａｓ９部分－ＦＫＢＰ－ＮＬＳを含むか、又はそれからなるか、又はほぼそれからなり得る。Ｃａｓ９部分を誘導性二量体の半分又は部分又は断片から隔てるリンカーが存在し得る。誘導物質エネルギー源は、ラパマイシンを含むか、又はほぼそれからなるか、又はそれからなり得る。誘導性二量体は、誘導性ホモ二量体であり得る。一部の形態では、誘導性ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムにおいて、ＣＲＩＳＰＲ酵素は、Ｃａｓ９、例えばＳｐＣａｓ９又はＳａＣａｓ９である。誘導性ＣＲＩＳＰＲ Ｃａｓシステムの一部の形態では、Ｃａｓ９は、ＳｐＣａｓ９に従って又はＳｐＣａｓ９に関連して、以下の分割点のいずれか１つで２つの部分に分割される：２０２Ａ／２０３Ｓ間の分割位置；２５５Ｆ／２５６Ｄ間の分割位置；３１０Ｅ／３１１Ｉ間の分割位置；５３４Ｒ／５３５Ｋ間の分割位置；５７２Ｅ／５７３Ｃ間の分割位置；７１３Ｓ／７１４Ｇ間の分割位置；１００３Ｌ／１０４Ｅ間の分割位置；１０５４Ｇ／１０５５Ｅ間の分割位置；１１１４Ｎ／１１１５Ｓ間の分割位置；１１５２Ｋ／１１５３Ｓ間の分割位置；１２４５Ｋ／１２４６Ｇ間の分割位置；又は１０９８と１０９９との間の分割。
一部の形態では、キメラＣａｓ９タンパク質が使用される。キメラＣａｓ９タンパク質は、異なるＣａｓ９オルソログに由来する断片を含むタンパク質である。例えば、第１のＣａｓ９オルソログのＮ末端を第２のＣａｓ９オルソログのＣ末端と融合させて、得られるＣａｓ９キメラタンパク質を生成し得る。これらのキメラＣａｓ９タンパク質は、キメラタンパク質が生成された個々のＣａｓ９酵素のいずれかの本来の特異性又は効率よりも高い特異性若しくはより高い効率を有し得る。これらのキメラタンパク質は、１つ以上の変異も含み得るか、又は１つ以上の機能性ドメインに連結され得る。
異なるＰＡＭ特異性を有するＣａｓ９タンパク質も好適である。典型的には、化膿レンサ球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）由来のＣａｓ９（ｓｐＣａｓ９）などのＣａｓ９タンパク質は、特定の核酸領域に結合するために標準的なＮＧＧ ＰＡＭ配列を必要とする。一部の形態では、塩基エディターは、例えば、標的塩基が、ＰＡＭの約１５塩基上流にある４塩基領域（例えば、「脱アミノ化ウィンドウ」）内に配置される正確な位置に配置する必要がある場合がある。その全内容が参照により本明細書に組み込まれるＫｏｍｏｒ，Ａ．Ｃ．，ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ５３３，４２０－４２４（２０１６）を参照されたい。従って、一部の形態では、塩基エディターは、標準的な（例えば、ＮＧＧ）ＰＡＭ配列を含まないヌクレオチド配列と結合することができるＣａｓ９タンパク質を含み得る。非標準的なＰＡＭ配列に結合するＣａｓ９ドメインは、当技術分野で記載されており、当業者に明らかであろう。例えば、非標準的なＰＡＭ配列に結合するＣａｓ９ドメインは、Ｋｌｅｉｎｓｔｉｖｅｒ，ＢＰ．，ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ５２３，４８１－４８５（２０１５）；Ｋｌｅｉｎｓｔｉｖｅｒ，ＢＰ．，ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ３３，１２９３－１２９８（２０１５）に記載されており；各々の全内容は、参照により本明細書に組み込まれる。
好ましい形態では、ＣＲＩＳＰＲ酵素は、不活性型Ｃａｓ（ｄＣａｓ）であり、これは、ヌクレアーゼ活性が低下したＣＲＩＳＰＲ酵素である。例えば、ヌクレアーゼ活性は、変異が一切ないＣＲＩＳＰＲ酵素と比較して、少なくとも９７％又は１００％（即ち３％以下及び有利には０％のヌクレアーゼ活性）減少させることができる。一部の形態では、ｄＣａｓは、不活性型Ｃａｓ９（ｄＣａｓ９）であり得る。一部の形態では、ｄＣａｓ９は、少なくとも１つの変異又は２つ以上の変異を含むことができる。一部の形態では、少なくとも１つの変異は、位置Ｈ８４０（又は任意の対応するオルソログにおける対応する位置）にあり得る。一部の形態では、２つ以上の変異は、ＳｐＣａｓ９タンパク質による位置Ｄ１０、Ｅ７６２、Ｈ８４０、Ｎ８５４、Ｎ８６３若しくはＤ９８６の２つ以上（又は任意の対応するオルソログにおける対応する位置）、ＳａＣａｓ９タンパク質による位置Ｎ５８０（又は任意の対応するオルソログにおける対応する位置）に変異を含み得る。
（２）Ｃａｓ１２ａ（Ｃｐｆ１）
一部の形態では、ＣＲＩＳＰＲエフェクターは、クラス２、Ｖ型ＣＲＩＳＰＲエフェクターである。一部の形態では、ＣＲＩＳＰＲエフェクターは、クラス２、Ｖ－Ａ型；クラス２、Ｖ－Ｂ型；クラス２、Ｖ－Ｃ型；クラス２、Ｖ－Ｕ型；；クラス２、Ｖ－Ｕ１型；クラス２、Ｖ－Ｕ２型；クラス２、Ｖ－Ｕ３型；クラス２、Ｖ－Ｕ４型；又はクラス２、Ｖ－Ｕ５型ＣＲＩＳＰＲエフェクターである。
一部の形態では、ＣＲＩＳＰＲエフェクターは、Ｃａｓ１２ａ（Ｃｐｆ１）である。Ｃａｓ１２ｓエフェクタータンパク質としては、レンサ球菌属（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）、カンピロバクター属（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ）、ニトラチフラクター属（Ｎｉｔｒａｔｉｆｒａｃｔｏｒ）、ブドウ球菌属（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）、パービバキュラム属（Ｐａｒｖｉｂａｃｕｌｕｍ）、ロゼブリア属（Ｒｏｓｅｂｕｒｉａ）、ナイセリア属（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ）、グルコナセトバクター属（Ｇｌｕｃｏｎａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ）、アゾスピリルム属（Ａｚｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ）、スフェロケタ属（Ｓｐｈａｅｒｏｃｈａｅｔａ）、ラクトバシラス属（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、ユーバクテリウム属（Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、コリネバクター属（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒ）、カルノバクテリウム属（Ｃａｒｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、ロドバクター属（Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ）、リステリア属（Ｌｉｓｔｅｒｉａ）、パルディバクター属（Ｐａｌｕｄｉｂａｃｔｅｒ）、クロストリジウム属（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）、ラクノスピラ科（Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ）、クロストリジアリジウム属（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａｒｉｄｉｕｍ）、レプトトリキア属（Ｌｅｐｔｏｔｒｉｃｈｉａ）、フランシセラ属（Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ）、レジオネラ属（Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ）、アリシクロバチルス属（Ａｌｉｃｙｃｌｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、メタノメチオフィラス属（Ｍｅｔｈａｎｏｍｅｔｈｙｏｐｈｉｌｕｓ）、ポルフィロモナス属（Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ）、プレボテラ属（Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ）、バクテロイデス門（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｔｅｓ）、ヘルココッカス属（Ｈｅｌｃｏｃｏｃｃｕｓ）、レプトスピラ属（Ｌｅｔｏｓｐｉｒａ）、デスルホビブリオ属（Ｄｅｓｕｌｆｏｖｉｂｒｉｏ）、デスルホナトロヌム属（Ｄｅｓｕｌｆｏｎａｔｒｏｎｕｍ）、オピツツス科（Ｏｐｉｔｕｔａｃｅａｅ）、ツベリバチルス属（Ｔｕｂｅｒｉｂａｃｉｌｌｕｓ）、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、ブレビバチルス属（Ｂｒｅｖｉｂａｃｉｌｕｓ）、メチロバクテリウム属（Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）又はアシダミノコッカス属（Ａｃｉｄａｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ）を含む属の生物由来のエフェクタータンパク質が挙げられる。
一部の形態では、エフェクタータンパク質（例えば、Ｃｐｆ１）は、Ｓ．ミュータンス（Ｓ．ｍｕｔａｎｓ）、Ｓ．アガラクティエ（Ｓ．ａｇａｌａｃｔｉａｅ）、Ｓ．エクイシミリス（Ｓ．ｅｑｕｉｓｉｍｉｌｉｓ）、Ｓ．サングイニス（Ｓ．ｓａｎｇｕｉｎｉｓ）、肺炎レンサ球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａ）；Ｃ．ジェジュニ（Ｃ．ｊｅｊｕｎｉ）、Ｃ．コリ（Ｃ．ｃｏｌｉ）；Ｎ．サルスギニス（Ｎ．ｓａｌｓｕｇｉｎｉｓ）、Ｎ．テルガルカス（Ｎ．ｔｅｒｇａｒｃｕｓ）；Ｓ．アウリクラリス（Ｓ．ａｕｒｉｃｕｌａｒｉｓ）、Ｓ．カルノスス（Ｓ．ｃａｒｎｏｓｕｓ）；Ｎ．メニンギティディス（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｅｓ）、淋菌（Ｎ．ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ）；リステリア菌（Ｌ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）、Ｌ．イバノビイ（Ｌ．ｉｖａｎｏｖｉｉ）；ボツリヌス菌（Ｃ．ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ）、Ｃ．ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）、破傷風菌（Ｃ．ｔｅｔａｎｉ）、Ｃ．ソルデリイ（Ｃ．ｓｏｒｄｅｌｌｉｉ）由来の生物のエフェクタータンパク質（例えば、Ｃｐｆ１）を含む。
エフェクタータンパク質は、第１エフェクタータンパク質（例えば、Ｃｐｆ１）オルソログ由来の第１の断片と、第２のエフェクター（例えば、Ｃｐｆ１）タンパク質オルソログ由来の第２の断片とを含むキメラエフェクタータンパク質を含み得、第１及び第２のエフェクタータンパク質オルソログは、異なる。Ｃｐｆ１エフェクタータンパク質は、修飾され得、例えば操作された又は非天然のエフェクタータンパク質又はＣｐｆ１であり得る。一部の形態では、修飾は、エフェクタータンパク質の１つ以上のアミノ酸残基の突然変異を含み得る。１つ又は複数の変異は、エフェクタータンパク質の１つ以上の触媒活性ドメインにあり得る。エフェクタータンパク質は、前記１つ以上の変異のないエフェクタータンパク質と比較して、ヌクレアーゼ活性が低減しているか又は消失している可能性がある。好ましい形態では、１つ以上の変異は、２つの変異を含み得る。エフェクタータンパク質は、目的の標的遺伝子座における一方若しくは他方のＤＮＡ又はＲＮＡ鎖の切断を指令しない場合がある。好ましい形態では、Ｃｐｆ１エフェクタータンパク質は、ＦｎＣｐｆ１エフェクタータンパク質である。好ましい形態では、１つ以上の修飾又は変異アミノ酸残基は、ＦｎＣｐｆ１エフェクタータンパク質のアミノ酸位置番号付けに準拠して、Ｄ９１７Ａ、Ｅ１００６Ａ又はＤ１２５５Ａである。さらに好ましい形態では、１つ以上の変異アミノ酸残基は、ＡｓＣｐｆ１におけるアミノ酸位置を基準として、Ｄ９０８Ａ、Ｅ９９３Ａ及びＤ１２６３Ａであるか、又はＬｂＣｐｆ１中のアミノ酸位置を基準として、ＬｂＤ８３２Ａ、Ｅ９２５Ａ、Ｄ９４７Ａ及びＤ１１８０Ａである。
一部の形態では、２つ以上の突然変異の１つ以上の突然変異は、ＲｕｖＣドメインなどのエフェクタータンパク質の触媒活性ドメインに存在することができる。一部の形態では、ＲｕｖＣドメインは、ＲｕｖＣＩ、ＲｕｖＣＩＩ若しくはＲｕｖＣＩＩＩドメイン又はＲｕｖＣＩＩ、ＲｕｖＣＩＩ若しくはＲｕｖＣＩＩＩドメインに対して相同的な触媒活性ドメインを含み得る。本明細書に開示される組成物を使用して送達することができる別のＣａｓ１２ａ酵素は、国際公開第２０１６／２０５７１１号パンフレット、同第２０１７／１０６６５７号パンフレット及び同第２０１７／１７２６８２号パンフレットに論じられている。
一部の形態では、プロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）又はＰＡＭ様モチーフは、目的の標的遺伝子座へのエフェクタータンパク質複合体の結合を指令する。一部の形態では、ＰＡＭは、５’ＴＴＮであり、Ｎは、Ａ／Ｃ／Ｇ又はＴであり、エフェクタータンパク質は、ＦｎＣｐｆ１ｐである。一部の形態では、ＰＡＭは、５’ＴＴＴＶであり、Ｖは、Ａ／Ｃ又はＧであり、エフェクタータンパク質は、ＡｓＣｐｆ１、ＬｂＣｐｆ１又はＰａＣｐｆ１ｐである。一部の形態では、ＰＡＭは、５’ＴＴＮであり、Ｎは、Ａ／Ｃ／Ｇ又はＴであり、エフェクタータンパク質は、ＦｎＣｐｆ１ｐであり、ＰＡＭは、プロトスペーサーの５’末端の上流に位置する。一部の形態では、ＰＡＭは、５’ＣＴＡであり、エフェクタータンパク質は、ＦｎＣｐｆ１ｐであり、ＰＡＭは、プロトスペーサー又は標的遺伝子座の５’末端の上流に位置する。
ｅ．塩基除去修復阻害剤
一部の形態では、標的化塩基エディターは、塩基除去修復（ＢＥＲ）阻害剤をさらに含む。塩基除去修復は、ＤＮＡらせん構造を有意に歪めない小さい塩基損傷を修正する。このような損傷は、通常、脱アミノ化、酸化又はメチル化によって起こる。ＢＥＲは、核内、さらにミトコンドリア内でも起こり、主として異なるアイソフォームのタンパク質又は遺伝的に遠いタンパク質を使用する。ＢＥＲは、ＤＮＡグリコシラーゼによって開始され、これは、損傷した塩基を認識して、除去するが、脱塩基部位が残り、これは、ショートパッチ修復又はロングパッチ修復によってさらにプロセシングされる。少なくとも１１の異なる哺乳類ＤＮＡグリコシラーゼが知られており、各々がいくつかの関連する損傷を認識するが、これらは、多くの場合、特異性にある程度の重複を有する。
開示されるデアミナーゼ又は塩基エディターによる標的ヌクレオチドの脱アミノ化によって生じるミスマッチ（例えば、Ｉ：Ｔ；Ｕ：Ｇ）の存在に対するＤＮＡ修復（例えば、ＢＥＲ）応答は、細胞内で所望の塩基編集を完了する効率の低下を招き得る。従って、ＢＥＲの阻害剤は、ＤＮＡを元の状態に戻し得る望ましくないＢＥＲ活性を阻害又は低減することができる。
例えば、アデニンの脱アミノ化は、ヒポキサンチン（本明細書では、ヒポキサンチンから形成されるヌクレオシドであるイノシンを「Ｉ」と表す）の形成をもたらす。Ｉ：Ｔ対合の存在に対するＢＥＲ応答は、細胞の塩基編集効率の低下の原因となり得る。アルキルアデニンＤＮＡグリコシラーゼ（ＤＮＡ－３－メチルアデニングリコシラーゼ、３－アルキルアデニンＤＮＡグリコシラーゼ又はＮ－メチルプリンＤＮＡグリコシラーゼとしても知られる）は、細胞内のＤＮＡからのヒポキサンチンの除去を触媒し、それにより塩基除去修復を開始し、Ｉ：Ｔ対をＡ：Ｔ対に戻す可能性がある。
従って、一部の形態では、ＢＥＲ阻害剤は、アルキルアデニンＤＮＡグリコシラーゼ（例えば、ヒトアルキルアデニンＤＮＡグリコシラーゼ）の阻害剤である。一部の形態では、ＢＥＲ阻害剤は、ポリペプチド阻害剤である。一部の形態では、ＢＥＲ阻害剤は、ヒポキサンチン（例えば、ＤＮＡ中）に結合するタンパク質である。一部の形態では、ＢＥＲ阻害剤は、触媒として不活性なアルキルアデニンＤＮＡグリコシラーゼタンパク質又はその結合ドメインである。一部の形態では、ＢＥＲ阻害剤は、触媒として不活性なアルキルアデニンＤＮＡグリコシラーゼタンパク質又はその結合ドメインであり、これは、ＤＮＡからヒポキサンチンを切除しない。アルキルアデニンＤＮＡグリコシラーゼ塩基除去修復酵素を阻害する（例えば立体的に遮断する）ことができる他のタンパク質も好適である。さらに、塩基除去修復を阻止又は阻害する任意のタンパク質も有用である。
シトシンの脱アミノ化は、ウラシル（「Ｕ」）の形成を招く。Ｕ：Ｇ対合の存在に対するＢＥＲ応答は、細胞の塩基編集効率の低下の原因となり得る。少なくとも４つの異なるヒトＤＮＡグリコシラーゼがウラシルを除去して、塩基除去修復を開始し、Ｕ：Ｇ対をＣ：Ｇ対に戻す可能性がある。ウラシル－ＤＮＡグリコシラーゼ（ＵＤＧ）と呼ばれるこれらの酵素は、ＵＮＧ、ＳＭＵＧ１、ＴＤＧ及びＭＢＤ４を含む。
従って、一部の形態では、ＢＥＲ阻害剤は、ウラシルグリコシラーゼ阻害剤（「ＵＧＩ」）である。好ましくは、ＵＧＩは、上に列挙したもののようなウラシル－ＤＮＡグリコシラーゼ塩基除去修復酵素を阻害することができるペプチド又はタンパク質である。本明細書で使用される用語「ウラシルグリコシラーゼ阻害剤」又は「ＵＧＩ」は、ウラシル－ＤＮＡグリコシラーゼ塩基除去修復酵素を阻害することができるタンパク質を指す。一部の形態では、ＵＧＩドメインは、野生型ＵＧＩ又は配列番号２１に記載されるようなＵＧＩを含む。一部の形態では、本明細書に提供されるＵＧＩタンパク質は、ＵＧＩの断片及びＵＧＩ又はＵＧＩ断片に相同的なタンパク質を含む。例えば、一部の形態では、ＵＧＩドメインは、配列番号２１に記載されるアミノ酸配列の断片を含む。一部の形態では、ＵＧＩは、以下のアミノ酸配列又はその断片を含む：ＭＴＮＬＳＤＩＩＥＫＥＴＧＫＱＬＶＩＱＥＳＩＬＭＬＰＥＥＶＥＥＶＩＧＮＫＰＥＳＤＩＬＶＨＴＡＹＤＥＳＴＤＥＮＶＭＬＬＴＳＤＡＰＥＹＫＰＷＡＬＶＩＱＤＳＮＧＥＮＫＩＫＭＬ（配列番号２１）。一部の形態では、ＵＧＩは、配列番号２１に記載されるアミノ酸配列と少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％又は少なくとも９９．５％同一であるアミノ酸配列を含む。一部の形態では、ＵＧＩは、一本鎖ＤＮＡに結合するタンパク質（例えば、エルウィニア・タスマニエンシス（Ｅｒｗｉｎｉａ ｔａｓｍａｎｉｅｎｓｉｓ）一本鎖結合タンパク質）である。一部の形態では、ＵＧＩ阻害剤は、ウラシルに結合するタンパク質である（例えば、ＤＮＡ中のウラシル）。一部の形態では、ウラシルグリコシラーゼ阻害剤は、触媒として不活性なウラシルＤＮＡ－グリコシラーゼ（例えば、ＤＮＡからウラシルを切除ないＵＤＧ）である。他の好適なＵＧＩは、当技術分野で公知であり、例えばＷａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６４：１１６３－１１７１（１９８９）；Ｌｕｎｄｑｕｉｓｔ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２：２１４０８－２１４１９（１９９７）；Ｒａｖｉｓｈａｎｋａｒ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２６：４８８０－４８８７（１９９８）；Ｐｕｔｎａｍ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２８７：３３１－３４６（１９９９）及び米国特許出願公開第２０１９／００９３０９９号明細書に記載されているものがあり、これらの文献各々の全内容は、参照により本明細書に組み込まれる。従って、一部の形態では、塩基エディターは、
ＴＮＬＳＤＩＩＥＫＥＴＧＫＱＬＶＩＱＥＳＩＬＭＬＰＥＥＶＥＥＶＩＧＮＫＰＥＳＤＩＬＶＨＴＡＹＤＥＳＴＤＥＮＶＭＬＬＴＳＤＡＰＥＹＫＰＷＡＬＶＩＱＤＳＮＧＥＮＫＩＫＭＬ（配列番号７０）
の標準的なＵＧＩアミノ酸配列を含む。
特定の理論に縛られることは望まないが、塩基除去修復は、編集済鎖を結合し、編集済塩基をブロックし、アルキルアデニンＤＮＡグリコシラーゼを阻害し、ウラシルＤＮＡグリコシラーゼを阻害し、塩基除去修復を阻害し、編集済塩基を保護し、且つ／又は非編集鎖の修正を促進する分子によって阻害され得る。ＢＥＲ阻害剤の使用は、ＡからＧの塩基編集又はＣからＴの塩基編集を実施することができるデアミナーゼ又はその塩基エディターの編集効率を高めることができると考えられる。
一部の形態では、さらにＢＥＲ阻害剤を含む塩基エディターは、以下のアーキテクチャ／構造：
ＮＨ２［デアミナーゼドメイン］－［機能性ドメイン］－［ＢＥＲ阻害剤］ＣＯＯＨ；
ＮＨ２［デアミナーゼドメイン］－［ＢＥＲ阻害剤］－［機能性ドメイン］ＣＯＯＨ；
ＮＨ２［ＢＥＲ阻害剤］－［デアミナーゼドメイン］－［機能性ドメイン］ＣＯＯＨ；
ＮＨ２［ＢＥＲ阻害剤］－［機能性ドメイン］－［デアミナーゼドメイン］ＣＯＯＨ、
ＮＨ２［機能性ドメイン］－［デアミナーゼドメイン］－［ＢＥＲ阻害剤］ＣＯＯＨ、
ＮＨ２［機能性ドメイン］－［ＢＥＲ阻害剤］－［デアミナーゼドメイン］ＣＯＯＨ
に従い、ＮＨ２は、塩基エディターのＮ末端であり、ＣＯＯＨは、塩基エディターのＣ末端であり、「－」は、任意選択のリンカーの存在を示す。好ましくは、機能性ドメインは、ターゲティングドメイン、例えばジンクフィンガー、ＴＡＬエフェクター若しくはＣｒｉｓｐｒ－ＣａｓエフェクターなどのＤＮＡ結合タンパク質又はドメインである。
４．リンカー
リンカーを用いて、本明細書に記載されるドメインのいずれかを融合又は結合することができる。一般に、このようなリンカーには、ドメイン間の最小距離又は他の空間的関係を連結するか、又は維持する以外の特異的生物学的活性はない。しかし、特定の形態では、リンカーは、リンカー及び／又はリンカーのフォールディング、柔軟性、正味電荷若しくは疎水性などの連結成分の何らかの特性に影響を与えるように選択され得る。特定の形態では、塩基エディターは、デアミナーゼドメイン及び機能性（例えば、ターゲティング）ドメインを、各ドメインがその必要な機能的特性を保持することを確実にするのに十分な距離だけ隔てるために１つ以上のリンカーを含む。
典型的には、リンカーは、２つの基、分子又は他の部分間に位置するか又はそれらとフランキングし、各々と共有結合を介して連結され、このようにして両方を連結する。リンカーは、共有結合と同様に単純であり得るか、又は多数の原子長さの高分子リンカーであり得る。リンカーは、アミノ酸又は複数のアミノ酸（例えば、ペプチド又はタンパク質）であり得る。好ましい形態では、リンカーは、アミノ酸を含有する。一部の形態では、リンカーは、好ましくは、ペプチドである。好ましいペプチドリンカー配列は、柔軟な伸長された立体構造を採用し、規則的な二次構造を形成する傾向を示さない。好ましくは、リンカーは、アミノ酸を含む。フレキシブルリンカーの典型的なアミノ酸としては、Ｇｌｙ（Ｇ）、Ａｓｎ（Ｎ）及びＳｅｒ（Ｓ）がある。従って、特定の形態では、リンカーは、Ｇｌｙ（Ｇ）、Ａｓｎ（Ｎ）及びＳｅｒ（Ｓ）アミノ酸の１つ以上の組合せを含む。Ｔｈｒ（Ｔ）及びＡｌａ（Ａ）などの他の類似の中性アミノ酸もリンカー配列に使用され得る。
一部の形態では、リンカーは、２～２００アミノ酸長、例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３０～３５、３５～４０、４０～４５、４５～５０、５０～６０、６０～７０、７０～８０、８０～９０、９０～１００、１００～１５０又は１５０～２００アミノ酸長であり得る。上記のより長い又は短いリンカーも好適である。適切な長さを付与するために、ＧＳ、ＧＧＳ、ＧＧＧＳ（配列番号２３）又はＧＳＧなどのＧｌｙＳｅｒリンカーを、３、４、５、６、７、９、１２回又はそれを超えて反復して使用することができる。好適なリンカーとしては、（ＧＧＧＳ）ｎ（配列番号２３）、（ＳＧＧＳ）ｎ（配列番号２４）、（ＧＧＧＧＳ）ｎ（配列番号２５）、（ＥＡＡＡＫ）ｎ（配列番号２６）、（Ｇ）ｎ、（ＧＧＳ）ｎ、ＳＧＳＥＴＰＧＴＳＥＳＡＴＰＥＳ（配列番号２７；ＸＴＥＮリンカーと呼ばれる）及び（ＸＰ）ｎ又はこれらのいずれかの組合せが挙げられ、式中、ｎは、独立して、１～３０の整数であり、Ｘは、任意のアミノ酸である。一部の形態では、ｎは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４又は１５である。一部の形態では、Ｎ末端及びＣ末端ＮＬＳは、リンカー（例えば、ＰＫＫＫＲＫＶＥＡＳＳＰＫＫＲＫＶＥＡＳ；配列番号３０）としても機能し得る。
他の形態では、リンカーはペプチド様ではない。リンカーは、有機分子、基、ポリマー又は化学的部分であり得る。特定の形態では、リンカーは、共有結合（例えば、炭素－炭素結合、ジスルフィド結合、炭素－ヘテロ原子結合など）である。一部の形態では、リンカーはアミド結合の炭素－窒素結合である。一部の形態では、リンカーは、環状又は非環状、置換若しくは非置換、分岐若しくは非分岐脂肪族又はヘテロ脂肪族リンカーである。一部の形態では、リンカーは、ポリマー（例えば、ポリエチレン、ポリエチレングリコール、ポリアミド、ポリエステルなど）である。一部の形態では、リンカーは、アミノアルカン酸のモノマー、二量体又はポリマーを含む。一部の形態では、リンカーは、アミノアルカン酸（例えば、グリシン、エタン酸、アラニン、β－アラニン、３－アミノプロパン酸、４－アミノブタン酸、５－ペンタン酸など）を含む。一部の形態では、リンカーは、アミノヘキサン酸（Ａｈｘ）のモノマー、二量体又はポリマーを含む。一部の形態では、リンカーは、炭素環部分（例えば、シクロペンタン、シクロヘキサン）、ポリエチレングリコール部分（ＰＥＧ）又はアリール若しくはヘテロアリール部分に基づく。一部の形態では、リンカーは、フェニル環に基づく。リンカーは、ペプチドからリンカーへの求核剤（例えば、チオール、アミノ）の付着を容易にするための官能化部分を含み得る。任意の求電子剤をリンカーの一部として使用することができる。例示的な求電子剤としては、限定するものではないが、活性化エステル、活性化アミド、マイケルアクセプター、ハロゲン化アルキル、ハロゲン化アリール、ハロゲン化アシル及びイソチオシアネートが挙げられる。
例示的なリンカーは、Ｍａｒａｔｅａ ｅｔ ａｌ．（１９８５），Ｇｅｎｅ ４０：３９－４６；Ｍｕｒｐｈｙ ｅｔ ａｌ．（１９８６）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８３：８２５８－６２；米国特許第４，９３５，２３３号明細書；及び同第４，７５１，１８０号明細書にも開示されている。
ｉ．コイルドコイルリンカー
一部の形態では、デアミナーゼ、スプリットデアミナーゼドメイン、塩基エディター、ターゲティングドメイン又は他の開示されるドメイン、タンパク質若しくはポリペプチドは、リンカーに融合又は作動可能に連結することができ、こうしたリンカーとして、限定されないが、コイルドコイル立体配置を有するタンパク質がある。
一部の形態では、コイルドコイルリンカーは、別のコイルドコイルリンカーと対合する配列を有する。例えば、一部の形態では、２つ以上の異なるコイルドコイルリンカーが共局在化して、標的ＤＮＡ鎖上の塩基エディターの位置を制限及び誘導することができる、より剛性の立体構造をもたらす。例えば、一部の形態では、塩基エディターは、第１のコイルドコイルリンカーに結合したスプリットデアミナーゼタンパク質ドメインと、第２のコイルドコイルリンカーに結合した第２のスプリットデアミナーゼドメインとを含む。コイルドコイルドメインの共局在化は、標的ＤＮＡ鎖上の共局在デアミナーゼドメインの位置を誘導するために、より剛性のリンカーを付与する。一部の形態では、第１のコイルドコイルリンカーは、アミノ酸配列：
ＧＧＧＳＧＧＳＧＥＩＡＡＬＥＡＫＮＡＡＬＫＡＥＩＡＡＬＥＡＫＩＡＡＬＫＡＧＹ（配列番号１８４）を含む。他の形態では、コイルドコイルは、配列番号１８４に対して約５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％又は９５％同一であるアミノ酸配列を含む。
一部の形態では、第２のコイルドコイルリンカーは、アミノ酸配列：
ＧＧＳＧＧＳＹＫＩＡＡＬＫＡＥＮＡＡＬＥＡＫＩＡＡＬＫＡＥＩＡＡＬＥＡＧＣ（配列番号１８５）を含む。他の形態では、コイルドコイルは、配列番号１８５に対して約５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％又は９５％同一であるアミノ酸配列を含む。
典型的には、第１のコイルドコイルリンカーは、共局在化時に第２のコイルドコイルリンカーと対合する。
５．他のドメイン及び修飾
デアミナーゼ、塩基エディター、ターゲティングドメイン又は他の開示されるドメイン、タンパク質若しくはポリペプチドは、様々な方法で修飾され得る。一部の形態では、修飾は、タンパク質若しくはペプチドをより安定に（例えば、インビボでの分解に対して抵抗性に）するか、又は細胞若しくは細胞内コンパートメントに浸透する能力を高めるか、或いは当業者に理解されるように他の望ましい特性にすることができる。このような修飾として、限定されないが、化学修飾、Ｎ末端修飾、Ｃ末端修飾、ペプチド結合修飾、骨格修飾、残基修飾、Ｄ－アミノ酸若しくは非天然アミノ酸又はその他が挙げられる。一部の形態では、１つ以上の修飾を同時に使用し得る。好ましい形態では、デアミナーゼ、塩基エディター、ターゲティングドメイン又は他の開示されるドメイン、タンパク質又はポリペプチドは、タンパク質分解に対して安定化される。例えば、ペプチドの安定性及び活性は、Ｎ－メチル化又はＣ－メチル化でペプチド結合の一部を保護することによって改善され得る。アミド化のような修飾は、ペプチダーゼに対するペプチドの安定性も高めると考えられる。
修飾は、機能性の改変をもたらす場合と、もたらさない場合がある。例として、とりわけ、デアミナーゼ又は塩基エディターに関して、機能性の改変をもたらさない修飾には、例えば、特定の宿主への発現のためのコドン最適化又はデアミナーゼ若しくは塩基エディターへの特定のマーカー若しくはエピトープタグ（例えば、可視化及び／又は単離若しくは精製用）の付与がある。
一部の形態では、デアミナーゼ、塩基エディター、ターゲティングドメイン又は他の開示されるドメイン、タンパク質若しくはポリペプチドをドメインに融合又は作動可能に連結させることができ、こうしたドメインとして、限定されないが、転写活性化因子、転写抑制因子、リコンビナーゼ、トランスポザーゼ、ヒストンリモデラー、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ、クリプトクロム、光誘導性／制御可能ドメイン又は化学的に誘導可能／制御可能なドメインが挙げられる。
ｉ．核局在化配列
一部の形態では、デアミナーゼ、塩基エディター、ターゲティングドメイン又は他の開示されるドメイン、タンパク質若しくはポリペプチドは、１つ以上（例えば、２つ以上、３つ以上又は４つ以上）の核局在化配列（ＮＬＳ）を含むか又はそれと結合し得る。任意の好都合なＮＬＳを使用することができる。例としては、クラス１及びクラス２の「単節型ＮＬＳ」並びにクラス３～５のＮＬＳが挙げられる（Ｋｏｓｕｇｉ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．２８４（１）：４７８－４８５（２００９））。場合によっては、ＮＬＳは、式：（Ｋ／Ｒ）（Ｋ／Ｒ）Ｘ１０～１２（Ｋ／Ｒ）３～５を有する。場合によっては、ＮＬＳは、式：Ｋ：（Ｋ／Ｒ）Ｘ：（Ｋ／Ｒ）（配列番号３１）を有する。ＮＬＳは、デアミナーゼ、塩基エディター、ターゲティングドメイン又は他の開示されるドメイン、タンパク質又はポリペプチドのＮ末端又はＣ末端に配置することができる。場合によっては、ＮＬＳをＮ末端に配置することが有利である。
使用できるＮＬＳの例としては、Ｔ－ａｇＮＬＳ（ＰＫＫＫＲＫＶ；配列番号３２）、Ｔ－Ａｇ由来ＮＬＳ（ＰＫＫＫＲＫＶＥＤＰＹＣ－ＳＶ４０；配列番号３３）、ＮＬＳ ＳＶ４０（ＰＫＫＫＲＫＶＧＰＫＫＫＲＫＶＧＰＫＫＫＲＫＶＧＰＫＫＫＲＫＶＧＣ；配列番号３４）、システイン－ＴＡＴのＣＹＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲ－Ｎ末端システイン（配列番号３５）、ＣＳＩＰＰＥＶＫＦＮＫＰＦＶＹＬＩ（配列番号３６）、ＤＲＱＩＫＩＷＦＱＮＲＲＭＫＶＶＫＫ（配列番号３７）、ＳＶ４０Ｔ－Ａｇ由来ＮＬＳの（配列番号３８）のＰＫＫＫＲＫＶＥＤＰＹＣ－Ｃ末端システイン及びｃＭｙｃ ＮＬＳ（ＰＡＡＫＲＶＫＬＤ；配列番号３９）が挙げられる。他の有用なＮＬＳは、Ｋｏｓｕｇｉ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．２８４（１）：４７８－４８５（２００９）に記載されている。
ｉｉ．ミトコンドリア局在化配列
デアミナーゼ、塩基エディター、ターゲティングドメイン又は他の開示されるドメイン、タンパク質若しくはポリペプチドは、１つ以上（例えば、２つ以上、３つ以上又は４つ以上）のミトコンドリアターゲティング配列（ＭＴＳ）又はミトコンドリアターゲティング配列（ＭＴＳ）を含むか又はそれに結合し得る。任意の好都合なミトコンドリア局在化配列を使用することができる。ミトコンドリア局在化配列の例としては、ＰＥＤＥＩＷＬＰＥＰＥＳＶＤＶＰＡＫＰＩＳＴＳＳＭＭＭ（配列番号２２）、ＳＤＨＢのミトコンドリア局在化配列、モノ／ジ／トリフェニルホスホニウム又は他のホスホニウムは、ＶＡＭＰ１Ａ、ＶＡＭＰ１Ｂ、ＤＧＡＴ２の６７Ｎ末端アミノ酸及びＢａｘの２０Ｎ末端アミノ酸である。ＭＴＳは、デアミナーゼ、塩基エディター、ターゲティングドメイン又は他の開示されるドメイン、タンパク質若しくはポリペプチドのＮ末端又はＣ末端に配置することができる。
ａ．Ｃｏｘ８由来のＭＴＳ
一部の形態では、ミトコンドリア標的化配列（ＭＴＳ）は、Ｃｏｘ８に由来する。一部の形態では、ミトコンドリア局在化配列は、Ｃｏｘ８、即ちミトコンドリアシトクロムｃオキシダーゼサブユニットＶＩＩＩに由来する。一部の形態では、ＣＯＸ８に由来するミトコンドリア局在化配列は、アミノ酸配列：ＭＳＶＬＴＰＬＬＬＲＧＬＴＧＳＡＲＲＬＰＶＰＲＡＫＩＨＳＬ（配列番号６９）を含む。他の形態では、ＣＯＸ８に由来するミトコンドリア局在化配列は、配列番号６９に対して約５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％又は９５％の同一性であるアミノ酸配列を含む。
他の形態では、Ｃｏｘ８に由来するミトコンドリア局在化配列は、アミノ酸配列：ＳＶＬＴＰＬＬＬＲＳＬＴＧＳＡＲＲＬＭＶＰＲＡＱＶＨＳＫ（配列番号１８３）を含む。他の形態では、Ｃｏｘ８に由来するミトコンドリア局在化配列は、配列番号１８３に対して約５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％又は９５％同一性であるアミノ酸配列を含む。
ｂ．ＳＯＤ２由来のＭＴＳ
一部の形態では、ミトコンドリア標的化配列（ＭＴＳ）は、ＳＯＤ２に由来する。一部の形態では、ＳＯＤ２由来のミトコンドリア局在化配列は、アミノ酸配列：ＭＬＳＲＡＶＣＧＴＳＲＱＬＡＰＶＬＧＹＬＧＳＲＱＫＨＳＬＰＤ（配列番号７１）を含む。他の形態では、ＳＯＤ２由来のミトコンドリア局在化配列は、配列番号７１に対して約５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％又は９５％同一であるアミノ酸配列を含む。他の形態では、ＳＯＤ２由来のミトコンドリア局在化配列は、アミノ酸配列：ＬＣＲＡＡＣＳＴＧＲＲＬＧＰＶＡＧＡＡＧＳＲＨＫＨＳＬＰＤ（配列番号１８２）を含む。他の形態では、ＳＯＤ２由来のミトコンドリア局在化配列は、配列番号１８２に対して約５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％又は９５％同一性であるアミノ酸配列を含む。
ｃ．Ｉ－Ｔｅｖ Ｉヌクレアーゼ
一部の形態では、塩基エディターは、１つ以上のヌクレアーゼ、例えば、ホーミングエンドヌクレアーゼＩ－Ｔｅｖ酵素由来の小さい配列許容性モノマーヌクレアーゼドメインを含む（Ｉ－ＴｅｖＩ酵素；Ｋｌｅｉｎｓｔｉｖｅｒ，ｅｔ ａｌ．，Ｇ３ Ｇｅｎｅｓ｜Ｇｅｎｏｍｅｓ｜Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，Ｖｏｌｕｍｅ ４，Ｉｓｓｕｅ ６，１ Ｊｕｎｅ ２０１４，Ｐａｇｅｓ １１５５－１１６５，ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１５３４／ｇ３．１１４．０１１４４５）。Ｉ－ＴｅｖＩヌクレアーゼドメインのさらに別の特異性は、必要な切断モチーフが無差別ＤＮＡ結合から生じる部位の近傍に見つからない可能性があるため、オフターゲット部位での切断を低減する可能性を有する。一部の形態では、Ｉ－Ｔｅｖ Ｉヌクレアーゼは、ミトコンドリア修復システムを誤誘導し、修復を望ましい結果（即ち編集された標的）に向けるためのニッカーゼとして使用することができる。
一部の形態では、標的化塩基エディターは、１つ以上のＩ－ＴＥＶＩドメインを含む。一部の形態では、Ｉ－ＴＥＶＩドメインは、以下のアミノ酸配列：
Figure 2024502630000097
 （配列番号１８６）又は配列番号１８６に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％若しくは９９％の配列同一性を有するアミノ酸或いはその断片を有する。
ｄ．２Ａ自己切断ペプチド
一部の形態では、標的塩基エディターは、２Ａペプチドモチーフをさらに含む。２Ａ自己切断ペプチド又は２Ａペプチドは、１８～２２個のａａ長ペプチドのクラスであり、これは、細胞内のタンパク質の翻訳中にリボソームスキッピングを誘導し得る。これらのペプチドは、ＤｘＥｘＮＰＧＰのコア配列モチーフを共有し、極めて多様なウイルスファミリーに認められる。それらは、リボソームがペプチド結合を作るのを失敗させることによってポリタンパク質の生成を助ける。
２Ａペプチドのメンバーは、それらが最初に記載されたウイルスにちなんで命名されている。例えば、最初に記載された２ＡペプチドであるＦ２Ａは、口蹄疫ウイルス（Ｆｏｏｔ－ａｎｄ－ｍｏｕｔｈ ｄｉｓｅａｓｅ ｖｉｒｕｓ）に由来する。「２Ａ」という名称自体は、このウイルスの遺伝子番号付けスキームに由来する。塩基エディターに使用される例示的な２Ａペプチドとしては、Ｐ２Ａ、Ｅ２Ａ、Ｆ２Ａ及びＴ２Ａが挙げられる。一部の形態では、２Ａペプチドは、アミノ酸配列：ＡＴＮＦＳＬＬＫＱＡＧＤＶＥＥＮＰＧＰ（配列番号１８７）又は配列番号１８７に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％若しくは９９％の配列同一性を有するアミノ酸或いはその断片を有する。
ｅ．ＩＲＥＳ
一部の形態では、標的化塩基エディターは、ＩＲＥＳモチーフをさらに含む。内部リボソーム進入部位（略してＩＲＥＳ）は、タンパク質合成のより大きいプロセスの一部として、キャップ非依存的方法で翻訳開始を可能にするＲＮＡエレメントである。真核生物の翻訳では、開始複合体のアセンブリには５’キャップ認識が必要であるため、開始は、典型的に、ｍＲＮＡ分子の５’末端で起こる。ＩＲＥＳエレメントの位置は、５’ＵＴＲであることが多いが、ｍＲＮＡの他の場所にも起こり得る。ＩＲＥＳを使用して、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）にｄｓＤＮＡ特異的デアミナーゼをクローニングする際に、Ｐ２Ａペプチドの場合に観察される毒性を回避しながら、意図した真核細胞において規定の終止コドンを有するポリシストロン性タンパク質を発現させることができる。ＩＲＥＳ設計を使用して、単一のＡＡＶ塩基エディター（ＤＮＡ結合ドメインとしてＺＦを使用）を作製し、その場合、必要な全ての成分が単一のＡＡＶベクターにパッケージ化され、次にこのベクターが使用されて、ヒト細胞株のミトコンドリアゲノムを問題なく編集する。
一部の形態では、スプリットデアミナーゼドメイン又は塩基エディターがウイルスベクターなどのベクターを介して送達される場合、塩基エディターは、１つ以上のＩＲＥＳドメインを含む。一部の形態では、ＩＲＥＳドメインは、核酸配列：
Figure 2024502630000098
 （配列番号１８８）又は配列番号１８８に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％若しくは９９％の配列同一性を有する核酸或いはその断片を有する。
ｆ．ＣＢｈプロモーター
一部の形態では、標的化塩基エディターは、組換えアデノ随伴ウイルス媒介遺伝子発現のためのプロモーターをさらに含む。一部の形態では、プロモーター配列はＣＢｈプロモーターである。
一部の形態では、ＣＢｈプロモーターは核酸配列：
Figure 2024502630000099
 （配列番号１８９）又は配列番号１８９に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％若しくは９９％の配列同一性を有する核酸或いはその断片を有する。
ｇ．ポリアデニル化モチーフ
一部の形態では、標的塩基エディターは、組換えアデノ随伴ウイルス媒介遺伝子発現のためのポリアデニル化モチーフをさらに含む。例示的なポリアデニル化モチーフとしては、ＳＶ４０、ｈＧＨ、ＢＧＨ及びｒｂＧｌｏｂ由来のものが挙げられる。一部の形態では、ポリアデニル化モチーフは、ＢＧＨ由来であり、核酸配列：
Figure 2024502630000100
 （配列番号１９０）又は配列番号１９０に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％若しくは９９％の配列同一性を有する核酸或いはその断片を有する。
６．例示的な塩基エディター立体配置
一部の形態では、標的化塩基エディターは、第１及び第２の部分を含み、第１の部分は、
（ａ）配列番号１２０のアミノ酸配列を含む第１のスプリットデアミナーゼドメインと、
（ｂ）左側ＴＡＬＥプログラマブルＤＮＡ結合ドメインと
を含み；
第２の部分は、
（ｃ）配列番号１５６、１５８、１６０又は１６４のいずれか１つのアミノ酸配列を含む第２のスプリットデアミナーゼドメインと、
（ｄ）右側ＴＡＬＥプログラマブルＤＮＡ結合ドメインと
を含む。
一部の形態では、標的化塩基エディターは、第１及び第２の部分を含み、第１の部分は、
（ａ）配列番号１６９のアミノ酸配列を含む第１のスプリットデアミナーゼドメインと、
（ｂ）左側ＴＡＬＥプログラマブルＤＮＡ結合ドメインと
を含み；
第２の部分は、
（ｃ）配列番号１７３又は１７５のいずれか１つのアミノ酸配列を含む第２のスプリットデアミナーゼドメインと、
（ｄ）右側ＴＡＬＥプログラマブルＤＮＡ結合ドメインと
を含む。
一部の形態では、標的化塩基エディターは、第１及び第２の部分を含み、第１の部分は、
（ａ）配列番号１７１のアミノ酸配列を含む第１のスプリットデアミナーゼドメインと、
（ｂ）左側ＴＡＬＥプログラマブルＤＮＡ結合ドメインと
を含み；
第２の部分は、
（ｃ）配列番号１７５のいずれか１つのアミノ酸配列を含む第２のスプリットデアミナーゼドメインと、
（ｄ）右側ＴＡＬＥプログラマブルＤＮＡ結合ドメインと
を含む。
一部の形態では、標的化塩基エディターは、第１及び第２の部分を含み、第１の部分は、
（ａ）配列番号１６９のアミノ酸配列を含む第１のスプリットデアミナーゼドメインと、
（ｂ）左側ＢＡＴプログラマブルＤＮＡ結合ドメインと
を含み；
第２の部分は、
（ｃ）配列番号１７３又は１７５のいずれか１つのアミノ酸配列を含む第２のスプリットデアミナーゼドメインと、
（ｄ）右側ＴＡＬＥプログラマブルＤＮＡ結合ドメインと
を含む。
一部の形態では、標的化塩基エディターは、第１及び第２の部分を含み、第１の部分は、
（ａ）配列番号１６９のアミノ酸配列を含む第１のスプリットデアミナーゼドメインと、
（ｂ）第１のコイルドコイルドメインと、
（ｃ）任意選択で、左側ＴＡＬＥプログラマブルＤＮＡ結合ドメインを含み；
第２の部分は、
（ｄ）配列番号１７３又は１７５のいずれか１つのアミノ酸配列を含む第２のスプリットデアミナーゼドメインと、
（ｅ）第２のコイルドコイルドメインと、
（ｆ）任意選択で、右側ＴＡＬＥプログラマブルＤＮＡ結合ドメインと
を含み、第１及び第２のコイルドコイルドメインは、第１及び第２の部分の結合時に互いに相互作用する。
標的化塩基エディターを含むか又はそれを発現するベクターも記載される。
一部の形態では、ベクターは、改変アデノウイルス（ＡＡＶ）ベクター又はレンチウイルスベクターである。典型的には、標的化塩基エディターは、ベクター内に封カプセル化される。
７．例示的な塩基エディター配列
例示的な形態では、塩基エディターは、第１及び第２の部分を含むＢＥ＿Ｒ１＿１２デアミナーゼドメインに基づく。例示的な形態では、塩基エディターは、不活性型又は不活性スプリットデアミナーゼドメインＢＥ＿Ｒ１＿１２を有する第１の部分と、短縮型スプリットＢＥ＿Ｒ１＿１２デアミナーゼドメインを有する第２の部分を含む。
例示的な形態では、塩基エディターは、
ｐＣＢｈ－コザック開始コドン－ｍＣｏｘ８ＭＴＳ－リンカー－ＴＡＬＥ＿Ｒ＿ｍＣｏｘ１－リンカー－ｄＢＥ＿Ｒ１＿１２－リンカー－ＵＧＩ－ｂＧＨ ポリＡ
のように構成される第１の部分を含む。
例示的な形態では、ＢＥ＿Ｒ１＿１２塩基エディターの第１の部分は、核酸配列：
Figure 2024502630000101
Figure 2024502630000102
Figure 2024502630000103
 （配列番号２６４）
を有する。
例示的な形態では、ＢＥ＿Ｒ１＿１２塩基エディターの第１の部分は、
Figure 2024502630000104
 （配列番号２６５）
のアミノ酸配列を有する融合タンパク質である。
例示的な形態では、塩基エディターは、
ｐＣＢｈ－コザック開始コドン－ｍＣｏｘ８ＭＴＳ－リンカー－ＢＡＴ＿Ｒ＿ｍＣｏｘ１－リンカー－ＢＥ＿Ｒ１＿１２（Δ６０）－リンカー－ＵＧＩ－ポリＡ
のように構成される第２の部分を含む。
例示的な形態では、ＢＥ＿Ｒ１＿１２塩基エディターの第２の部分は、核酸配列：
Figure 2024502630000105
Figure 2024502630000106
Figure 2024502630000107
 （配列番号２６６）
を有する。
例示的な形態では、ＢＥ＿Ｒ１＿１２塩基エディターの第２の部分は、アミノ酸配列：
Figure 2024502630000108
 （配列番号２６７）
を有する融合タンパク質である。
ＩＩＩ．方法
開示の組成物及び試薬（デアミナーゼドメイン、塩基エディターなどを含む）並びにそれらの使用に関連する様々な方法が本明細書に開示される。例えば、ゲノム修飾を実施する方法、標的核酸を脱アミノ化する方法、インビトロ又はインビボで核酸（塩基）編集を実施する方法、標的核酸中のメチル化ヌクレオチドを同定する方法及び標的核酸のプールにおける配列多様性を生成する方法が開示される。
Ａ．核酸編集
配列特異的ＤＮＡデアミナーゼ及び標的塩基エディターが開示され、これは、インビトロ（例えば、試験管内）及びインビボ（例えば、生存細胞中）の両方でＤＮＡの正確な又は非標的化編集を可能にする。一本鎖ＤＮＡ上でのみ活性であることが知られている以前に特性決定されたＤＮＡデアミナーゼ（Ｉｙｅｒ ＬＭ．，ｅｔ ａｌ．，ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ３９，９４７３－９４９７（２０１１））の大部分と異なり、本明細書に開示されるデアミナーゼは、二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）に対して活性であり、様々な程度の配列特異性を有する。例えば、デアミナーゼと標的化塩基エディターは、特定のコンテキストではｄｓＤＮＡを脱アミノ化することができるが、他のコンテキストではできない。こうした特徴により、ＤＮＡデアミナーゼ及び標的化塩基エディターは、ｓｓＤＮＡ特異的デアミナーゼを使用する塩基エディターよりも、特定の用途について有用となる。例えば、開示のｄｓＤＮＡ特異的デアミナーゼを利用して、その機能のために追加のＲＮＡ又はＤＮＡ部分を必要としないタンパク質単独塩基エディターが作製される（例えば、デアミナーゼを、タンパク質のみのターゲティングドメインの配列に融合させることによって）。これらのタンパク質のみのエディターは、核酸送達が効率的ではない細胞コンパートメント（例えば、ミトコンドリア及び葉緑体）内に位置するＤＮＡ種を編集するのに特に有用であるため、これらの細胞小器官のゲノムを編集するためにＲＮＡ誘導塩基エディターを適用する上での主要な制約の１つを回避する。さらに、それらの配列特異性のために、開示される塩基エディターは、所与の標的部位の近傍におけるバイスタンダーヌクレオチドに変異を導入することなく、ヌクレオチド分解能を伴う正確なゲノム編集を達成することができる。既存の塩基エディターは、ヌクレオチド分解能特異性を欠き、編集ウィンドウ内でバイスタンダー塩基に望ましくない変異を導入し得るが、配列特異的ＤＮＡデアミナーゼを備える開示の塩基エディターは、デアミナーゼドメインを起源とする追加の層の特異性を有する。これは、ヒトの遺伝病及び他のバイオテクノロジーの応用に取り組む上で広範な有用性がある。例えば、プログラマブルＤＮＡ結合ドメイン（例えば、Ｃａｓ９、Ｃｆｐ１、ＴＡＬＥ、ジンクフィンガー（ＺＦ）など）に融合された所望の特異性を有するデアミナーゼドメインを含む、開示される標的塩基エディターは、配列特異的塩基編集を実施するために使用することができ、その特異性は、ＤＮＡ結合ドメイン並びにデアミナーゼドメインの両方の特異性に影響され、規定され得る。
さらなる例として、一部の形態では、Ｃａｓ９（又は別のＤＮＡ結合タンパク質）に係留すると、アデノシンデアミナーゼは目的の遺伝子に局在し、ＤＮＡ基質でＡからＧへの変異を触媒する。この塩基エディターを用いて、ＡからＧへの復帰を必要とする疾患関連遺伝子の一塩基多型（ＳＮＰ）をターゲティングして、復帰させることができる。この塩基エディターを用いて、ＴからＣへの復帰を必要とする疾患関連遺伝子のＳＮＰをターゲティングして、Ｔの反対側のＡをＧに変異させることにより復帰させることもできる。その後、Ｔは、例えば、塩基除去修復機構により、Ｃで置換されるか、又はＤＮＡ複製後のラウンドで変更され得る。
このように、核酸編集を行う方法が開示される。一部の形態では、この方法は、標的核酸と標的塩基エディターとを接触させるステップを含み、それにより、標的核酸内の標的ヌクレオチド配列の１つ以上の実体は、標的化塩基エディターによって脱アミノ化される。一部の形態では、標的核酸は、一本鎖ＤＮＡ又は二本鎖ＤＮＡである。好ましくは、標的核酸は、二本鎖ＤＮＡである。
好ましくは、標的ヌクレオチド配列中の標的ヌクレオチドが脱アミノ化される。「脱アミノ化される」とは、標的ヌクレオチド中の塩基（例えば、Ａ、Ｃ）からアミノ基を除去することを意味する。好ましくは、除去は、加水分解脱アミノ化を介して開示のデアミナーゼによって触媒される。本方法の一部の形態では、標的ヌクレオチド配列中の脱アミノ化ヌクレオチドは、それぞれＴ及びＧとして表されるチミン又はグアニンヌクレオチドに変換される。一部の形態では、ＣはＴに変換される。一部の形態では、ＡはＧに変換される。典型的には、そのような変換は、標的ヌクレオチド配列の塩基編集を完了する。「塩基編集」とは、任意選択で中間体を介したあるヌクレオチドの別のヌクレオチドへの完全な変換を指す。例えば、アデノシンデアミナーゼ又はその塩基エディターによるアデニン（Ａ）の脱アミノ化は、ヒポキサンチン（Ｉ）の形成をもたらし、これは、好ましくは、シトシン（Ｃ）と塩基対合する。ＤＮＡ修復及び／又は複製機構は、ＩからＧを修復し、この修復は、塩基編集を完了する。このようにして、塩基編集は、Ａ・Ｔ塩基対をＧ・Ｃに変更する。
同様に、シトシンデアミナーゼ又はその塩基エディターによるシトシン（Ｃ）の脱アミノ化は、ウラシル（Ｕ）の形成をもたらし、これは、好ましくはアデノシン（Ａ）と塩基対合する。ＤＮＡ修復及び／又は複製機構は、その後、ＵからＴを修復し、この修復によって塩基編集が完了する。このようにして、塩基編集は、Ｃ・Ｇ塩基対をＴ・Ａに変更することができる。
適切なデアミナーゼ又はその塩基エディターが選択される限り、あらゆる標的ヌクレオチド配列を脱アミノ化することができる。一部の形態では、標的ヌクレオチド配列は、ＡＣ、ＣＣ、ＧＣ、ＴＣである。前述の例示的な標的ヌクレオチド配列のいずれかにおいて、一部の形態では、標的ヌクレオチド配列の最後のＣは、そのデアミナーゼ又は標的化塩基エディターによって脱アミノ化される。
一部の形態では、意図された標的ヌクレオチド配列は、少なくとも１％、２％、３％、４％、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％又は５０％の効率で編集される。一部の形態では、本方法により、１９％、１８％、１６％、１４％、１２％、１０％、８％、６％、４％、２％、１％、０．５％、０．２％未満又は０．１％未満のインデル形成が起こる。一部の形態では、標的ヌクレオチドでの意図される生成物と意図されない生成物の比は、少なくとも２：１、５：１、１０：１、２０：１、３０：１、４０：１、５０：１、６０：１、７０：１、８０：１、９０：１、１００：１若しくは２００：１又はそれを超える。一部の形態では、意図される点突然変異とインデル形成の比は、１：１、１０：１、５０：１、１００：１、５００：１若しくは１０００：１又はそれを超える。
一部の形態では、標的核酸は、核（例えば、染色体）ＤＮＡである。一部の形態では、標的核酸は、細胞小器官ゲノム（ミトコンドリア、葉緑体又は色素体）である。一部の形態では、標的核酸は、精製若しくは未精製のゲノムＤＮＡ、プラスミド、ＰＣＲ産物のいずれかの形態又は合成ＤＮＡの何らかの形態で、細胞の外部にある。
ミトコンドリアゲノム工学
一部の形態では、標的核酸は、ミトコンドリアＤＮＡである。従って、一部の形態では、塩基エディター標的配列の指定された距離（例えば、２０ヌクレオチド）以内にあるミトコンドリアＤＮＡ中の標的ヌクレオチド配列の実体は、ミトコンドリアＤＮＡ配列に含まれる。
デアミナーゼ及びその塩基エディターを含む、開示される試薬及び組成物を使用して、ミトコンドリアゲノムを操作することができる。これを用いて、ミトコンドリア遺伝病をモデル化する（即ちミトコンドリアゲノムに病原性突然変異を導入する）か、又はミトコンドリア遺伝病に関連する病原性変異体を修正することができる。ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）をミトコンドリアに送達する効率的なメカニズムがないために、ＲＮＡ誘導ゲノム編集アプローチは、ミトコンドリアゲノムの操作のための使用に成功していない（Ｇａｍｍａｇｅ ＰＡ．，ｅｔ ａｌ．，Ｔｒｅｎｄｓ Ｇｅｎｅｔ．，３４（２）：１０１－１１０（２０１８））。ｓｓＤＮＡ特異的デアミナーゼに融合したＴＡＬＥ及びＺＦなどのタンパク質のみのＤＮＡ結合ドメインは、Ｃａｓ９と異なり、ＤＮＡに結合したとき、ｓｓＤＮＡ領域を露出しないため、ミトコンドリアＤＮＡ中の標的配列を効率的に編集することができない。近年、ヒト細胞培養物中でミトコンドリアゲノム工学を達成するために、ｄｓＤＮＡ特異的シチジンデアミナーゼ（ＤｄｄＡ）がＴＡＬＥに融合された（Ｍｏｋ ｅｔ ａｌ．，２０２０）。しかし、このデアミナーゼのコンテキスト依存性のために、ＴＣからＴＴへの変異のみを導入することができ、これは、ＭＩＴＯＭＡＰデータベースで確認された病原性変異の４／９３に相当する。これに対して、開示されるデアミナーゼ及びその塩基エディターは、配列特異性を拡大し、集合的に、任意の配列コンテキスト（ＡＣ、ＣＣ、ＧＣ及びＴＣ）でシチジンを編集することができ、これにより、既存のツールでは対処することができないミトコンドリア遺伝子変異の７９／９３の修正を可能にする。
従って、核酸編集の方法の一部の形態では、標的核酸は、細胞中（例えば、ミトコンドリア中）にある。一部の形態では、この方法は、標的化塩基エディターの細胞への進入を促進することにより、標的核酸及び標的化塩基エディターを接触させるステップを含む。「進入を促進すること」は、標的化塩基エディターをセルと接触させることを含み、その際、標的化塩基エディターは、セルに進入することができるように作製又は構成される。一部の形態では、細胞は、対象（例えば、動物）に存在する。従って、一部の形態では、標的核酸と標的化塩基エディターとを接触させるステップは、標的塩基エディターを対象（例えば、動物）に投与することによって達成される。
標的シトシン又はアデノシンデアミナーゼ塩基エディターを細胞に導入することにより、ミトコンドリアゲノム工学をインビボで実施する方法も開示され、ミトコンドリアＤＮＡ中の標的ヌクレオチド配列は、標的化塩基エディターによって脱アミノ化される。一部の形態では、細胞は、対象（例えば、動物）内に存在する。
一部の形態では、ミトコンドリアＤＮＡにおける標的ヌクレオチド又は標的ヌクレオチド配列の編集は、ミトコンドリアにおける変異（例えば、病原性又は疾患関連変異）の修正をもたらす。病原性又は疾患関連ミトコンドリア変異は、当技術分野で公知であり、そのうちのいくつかは、ヒトミトコンドリアＤＮＡ変異のデータベースであるＭＩＴＯＭＡＰデータベース（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｍｉｔｏｍａｐ．ｏｒｇ／）にカタログ化されている。表２は、病原性ミトコンドリア変異の非限定的なリストを提供する。
Figure 2024502630000109
Figure 2024502630000110
Figure 2024502630000111
Figure 2024502630000112
Figure 2024502630000113
一部の形態では、開示の標的塩基エディターによって脱アミノ化された標的ヌクレオチドは、表２に列挙される変異から選択される。一部の形態では、開示の標的塩基エディターによって脱アミノ化された標的ヌクレオチドは、ｍ．５８３Ｇ＞Ａ、ｍ．６１６Ｔ＞Ｃ、ｍ．１６０６Ｇ＞Ａ、ｍ．１６４４Ｇ＞Ａ、ｍ．３２５８Ｔ＞Ｃ、ｍ．３２７１Ｔ＞Ｃ、ｍ．３４６０Ｇ＞Ａ、ｍ．４２９８Ｇ＞Ａ、ｍ．５７２８Ｔ＞Ｃ、ｍ．５６５０Ｇ＞Ａ、ｍ．３２４３Ａ＞Ｇ、ｍ．８３４４Ａ＞Ｇ、ｍ．１４４５９Ｇ＞Ａ、ｍ．１１７７８Ｇ＞Ａ、ｍ．１４４８４Ｔ＞Ｃ、ｍ．８９９３Ｔ＞Ｃ、ｍ．１４４８４Ｔ＞Ｃ、ｍ．３４６０Ｇ＞Ａ、ａｄ ｍ．１５５５Ａ＞Ｇから選択される。最も好ましいのは、ｍ．３２４３Ａ＞Ｇ、ｍ．８３４４Ａ＞Ｇ、ｍ．１４４５９Ｇ＞Ａ、ｍ．１１７７８Ｇ＞Ａ、ｍ．１４４８４Ｔ＞Ｃ、ｍ．８９９３Ｔ＞Ｃ、ｍ．１４４８４Ｔ＞Ｃ、ｍ．３４６０Ｇ＞Ａ及びｍ．１５５５Ａ＞Ｇである。
このように、基本的な変異を修正することにより、ミトコンドリア遺伝子疾患に対処する方法が開示される。この方法は、標的化シトシン又はアデノシンデアミナーゼ塩基エディターを細胞に導入するステップを含み、ミトコンドリアＤＮＡ中の標的ヌクレオチド配列は、標的化塩基エディターによって脱アミノ化される。一部の形態では、標的ヌクレオチド配列中の脱アミノ化ヌクレオチドは、チミン又はグアニンヌクレオチドに変換される。この変換により、標的ヌクレオチド配列の塩基編集が完了する。塩基編集により、病原性又はミトコンドリア病に関連する変異が修正され、その変異をミトコンドリア核酸のＷＴ又は非病原性形態に復帰させる。任意の好適な患者由来細胞を使用し得、そうした細胞として、限定されないが、線維芽細胞、リンパ球、膵臓細胞、筋細胞、神経細胞及びｉＰＳ細胞などの幹細胞が挙げられる。一部の形態では、細胞は、対象（例えば、動物又はヒト）内にあり；従ってそれにより塩基エディターを用いて病原性突然変異及び基礎疾患状態を修正することができる。ミトコンドリアゲノムに正確な編集を導入するための信頼できる技術が全くないことを考慮すると、ミトコンドリア遺伝病の細胞又は動物モデルを作製することは困難であった。ミトコンドリア病を治療するための病原性ミトコンドリア変異体の修正（即ち遺伝子療法適用）以外にも、開示される塩基エディターは、ミトコンドリア遺伝病のための細胞又は動物モデルを作製する方法にも使用することができる。このような方法は、これらの遺伝病並びにミトコンドリア生理学及び遺伝的ヘテロプラスミーの順遺伝学研究を可能にする。さらに、開示の塩基エディターは、癌、代謝障害及び老化などの複雑な疾患の順遺伝学研究も可能にし、これら及び類似の非遺伝的に定義された疾患におけるミトコンドリアコード遺伝子及び突然変異の役割を解明するのに役立ち得る。
このように、ミトコンドリア遺伝病の細胞モデルを作製する方法が開示される。この方法は、標的化シトシン又はアデノシンデアミナーゼ塩基エディターを細胞に導入することを含み、その際、ミトコンドリアＤＮＡ中の標的ヌクレオチド配列は、標的化塩基エディターによって脱アミノ化される。一部の形態では、標的ヌクレオチド配列中の脱アミノ化ヌクレオチドは、チミン又はグアニンヌクレオチドに変換される。変換により、標的ヌクレオチド配列の塩基編集が完了する。塩基編集により、以前の野生型又は非変異標的ミトコンドリア核酸に病原性又はミトコンドリア病関連突然変異の導入が起こる。限定されないが、線維芽細胞、リンパ球、膵臓細胞、筋細胞、神経細胞及びｉＰＳ細胞などの幹細胞を含むあらゆる好適な細胞が使用され得る。一部の形態では、細胞は、対象（例えば、動物）に存在し；従って、それによりミトコンドリア病の動物モデルを作製することができる。
疾患モデリングのための病原性突然変異を生成するために塩基編集を受けることができる例示的な野生型ミトコンドリアＤＮＡ標的ヌクレオチド配列は、表２から選択することができ、限定されないが、ＣＡＣｃＣＴＣ、ＧＡＧａＣＡＡ、ＣＡＧａＧＣＣ、ＴＣＧｃＡＴＡ、ＧＴＣａＧＡＧ、ＴＡＡｃＡＡＣ、ＡＧＴａＡＡＴ、ＴＡＧａＣＡＡ、ＣＡＣｃＧＣＴ及びＡＧＡａＣＣＡを含み、病原性変異を生成するために編集される標的ヌクレオチドは、小文字である。
核酸編集の方法に使用される様々な試薬及び組成物は、当技術分野で公知の様々な手段によって細胞又は対象に導入することができる。例えば、デアミナーゼ、標的化塩基エディター又は他の試薬は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、タンパク質の組合せ又はそれらの組合せなどの様々な形態で送達することができる。例えば、塩基エディターは、ＤＮＡコードポリヌクレオチド若しくはＲＮＡコードポリヌクレオチド又はタンパク質として送達され得る。塩基エディターがターゲティングドメインとしてＣｒｉｓｐｒ－Ｃａｓエフェクタータンパク質を含む場合、適切なガイドＲＮＡ又はｃｒＲＮＡをＤＮＡコードポリヌクレオチド又はＲＮＡとして送達し得る。混合式の送達を含む考えられるあらゆる組合せが構想される。
一部の形態では、本方法は、１つ以上のポリヌクレオチド、例えば、１つ以上のベクター、１つ以上のその転写産物及び／又はそれから転写されるタンパク質を宿主細胞に送達するステップを含む。核酸編集試薬を細胞に導入又は導入するための好適なベクターとして、限定されないが、例えばバクテリオファージ、バキュロウイルス、レトロウイルス（レンチウイルスなど）、アデノウイルス、ポックスウイルス、エプスタイン・バーウイルス（Ｅｐｓｔｅｉｎ－Ｂａｒｒ ｖｉｒｕｓｅｓ）及びアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）に由来するプラスミド及びウイルスベクターが挙げられる。ウイルスベクターは、ＤＮＡウイルス（例えば、ｄｓＤＮＡ若しくはｓｓＤＮＡウイルス）又はＲＮＡウイルス（例えば、ｓｓＲＮＡウイルス）であり得るか、或いはウイルス様粒子（ＶＬＰ）であり得る。多数のベクター及び発現系は、Ａｄｄｇｅｎｅ、Ｎｏｖａｇｅｎ（Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ（Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ，ＣＡ）、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ（Ｌａ Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）及びインビトロｇｅｎ／Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）を含む販売業者から市販されている。有利なベクターは、レンチウイルス及びアデノ随伴ウイルスを含み、そのようなベクターのサブタイプを、特定のタイプの細胞をターゲティングするために選択することもできる。
核酸編集試薬（例えば、塩基エディター）は、様々なウイルス又は非ウイルス技術によって細胞に導入することができる。試薬は、ウイルスベクター（例えば、レンチウイルス、アデノウイルス、ポックスウイルス、エプスタイン・バーウイルス（Ｅｐｓｔｅｉｎ－Ｂａｒｒ ｖｉｒｕｓｅｓ）、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、ウイルス様粒子（ＶＬＰ）などのレトロウイルス）で提供することができる。物理的及び／又は化学的方法などの非ウイルスアプローチも使用することができ、そうしたものとして、限定されないが、カチオン性リポソーム及びポリマー、エキソソーム、ＤＮＡナノクルー、遺伝子銃、マイクロインジェクション、エレクトロポレーション、ヌクレオフェクション、パーティクルガン、超音波の使用、マグネトフェクション及び細胞透過性ペプチドとの共役が挙げられる。このような方法は、例えば、Ｎａｙｅｒｏｓｓａｄａｔ Ｎ．，ｅｔ ａｌ．，Ａｄｖ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｒｅｓ．，１：２７ （２０１２）及びＬｉｎｏ ＣＡ， ｅｔ ａｌ．， Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖ．，２５（１）：１２３４－１２５７（２０１８）に記載されている。当業者は、それぞれの利点及び欠点に関連しで当技術分野で公知の送達方法に基づいて、最適な方法を決定することができるであろう。
一部の形態では、デアミナーゼ又はその塩基エディターは、デアミナーゼ又は塩基エディターをコードするｍＲＮＡを介して細胞に導入することができる。ｍＲＮＡは、Ｎ６－メチルアデノシン（ｍ６Ａ）、５－メチルシトシン（ｍ５Ｃ）、シュードウリジン（ψ）、Ｎ１－メチルプシュードウリジン（ｍｅ１ψ）及び５－メトキシウリジン（５ｍｏＵ）；５’キャップ；ポリ（Ａ）テール；１つ以上の核局在化シグナル；又はそれらの組合せなどの修飾を含有し得る。ｍＲＮＡは、真核細胞での発現のために最適化されたコドンであり、エレクトロポレーション、トランスフェクション及び／又はナノ粒子媒介による送達を介して細胞に導入することができる。デアミナーゼ又は塩基エディターは、ＲＮＡ誘導エンドヌクレアーゼをコードするウイルスベクターを介して或いはデアミナーゼ若しくは塩基エディタータンパク質の直接エレクトロポレーション又は塩基エディタータンパク質－ＲＮＡ複合体を介して導入することもできる。
核酸編集試薬は、それぞれ個別に組成物に含有させ、個々に又は集合的に細胞に導入することができる。代わりに、これらの成分は、細胞への導入のための単一の組成物で提供することができる。
Ｂ．修飾ヌクレオチドの同定
標的核酸中のヌクレオチド修飾の存在及び／又は位置（即ちエピジェネティックマーク）を同定するための方法も提供される。
エピジェネティックシーケンシングは、典型的に、ＤＮＡシーケンシングによりゲノム内のヌクレオチドに対する修飾を同定及び局在化するために使用される。様々な修飾が存在するが、最も一般的であり且つ重要なものは、５－メチルシトシン（５－ｍＣ）及び５－ヒドロキシメチルシトシン（５－ｈｍＣ）である。これらのエピジェネティック修飾を同定するために使用される主な技術は、バイサルファイトシーケンシング法である（Ｒａｉｂｅｒ ＥＡ．，ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｃｈｅｍ １，００６９（２０１７））。このアプローチでは、抽出されたゲノムを化学薬品亜硫酸水素塩で処理し、これにより、全ての未修飾シトシンをウラシルに変換する。シーケンシング中、これらは「Ｔ」として読み取られる。この技術は広く採用されているが、この方法により、使用されるＤＮＡ分子の９９％が化学的に破壊される。さらに、未修飾ＣからＵへの変換は全て、塩基の分布を歪めることから、シーケンスエラーが発生する。さらに、変換率が１００％ではないため、修飾シトシンの誤同定が起こる可能性がある。ニューイングランドバイオラボ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）（ＮＥＢ）によって新たに開発されたアプローチは、亜硫酸水素塩の過酷な化学処理の代わりに、ＡＰＯＢＥＣ：シトシンをウラシルに同様に変換するｓｓＤＮＡ特異的酵素を使用する（ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｎｅｂ．ｃｏｍ／ｔｏｏｌｓ－ａｎｄ－ｒｅｓｏｕｒｃｅｓ／ｆｅａｔｕｒｅ－ａｒｔｉｃｌｅｓ／ｅｎｚｙｍａｔｉｃ－ｍｅｔｈｙｌ－ｓｅｑ－ｔｈｅ－ｎｅｘｔ－ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ－ｏｆ－ｍｅｔｈｙｌｏｍｅ－ａｎａｌｙｓｉｓ）。しかし、ＡＰＯＢＥＣは、５ｍＣ及び５ｈｍＣも脱アミノ化するため、シトシンとその修飾形態の識別を不可能にする。この方法では、５ｍＣ及び５ｈｍＣを検出するために、ＴＥＴ２及び酸化促進剤も使用し、これにより、５ｍＣ及び５ｈｍＣをＡＰＯＢＥＣの基質ではない形態に酵素的に修飾する。ＴＥＴ２酵素は、５ｍＣを５ｃａＣに変換し、酸化促進剤が５ｈｍＣを５ｇｈｍＣに変換する。最終的に、シトシンは、チミンとして配列決定され、５ｍＣ及び５ｈｍＣはシトシンとして配列決定され、それによって元の５ｍＣ及び５ｈｍＣ配列情報の完全性を保護する。これは改善であるが、それでも塩基の分布を歪ませ、標準的なゲノム配列決定を困難にする。ＴＥＴ２と酸化エンハンサーを使用する必要があり、ＡＰＯＢＥＣの基質としてｓｓＤＮＡ形態のＤＮＡが存在するため、このプロセスは制限され、複雑で非効率的になる。
バイサルファイトシーケンシングの大幅な改善は、近年開発されたＴＥＴ支援ピリジンボランシーケンシング（ＴＡＰＳ）である（Ｌｉｕ Ｙ．，ｅｔ ａｌ．Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ３７，４２４－４２９（２０１９））。この方法は、酵素的処理と化学的処理を組み合わせて、５－ｍＣ及び５－ｈｍＣをＵに変換する。ＴＡＰＳは、バイサルファイトシーケンシングよりも過酷ではなく、歪んだ塩基分布から生じるシーケンシングアーティファクトを軽減する。但し、その主な制約は、５－ｈｍＣから５－ｍＣを識別することができないことである。
開示されるデアミナーゼ及びその塩基エディターは、ｄｓＤＮＡに対して活性であり、ＤＮＡでのメチル化（５ｍＣ及び５ｈｍＣ）又は他の修飾を検出する（又は検出するように進化させる）ことができるため、既存のエピジェネティックシーケンシングワークフローを大幅に促進及び改善し、シーケンシングによるメチル化を超えたエピジェネティックマークを検出するための新たな道の領域を切り開く。エピジェネティックマーカーの同定は、癌及び他の多くの疾患の検出を含む様々なＲ＆Ｄ及び診断用途に使用することができ、ゲノムデータに追加の情報層を付与し得る。
このように、エピジェネティックマークの存在及び／又は位置を決定するための方法が提供される。一部の形態では、本方法は、ＤＮＡ中の修飾ヌクレオチド（例えば、５ｍＣ及び５ｈｍＣ）の存在及び／又は位置を決定するステップを含む。例示的な方法は、標的核酸とデアミナーゼドメインとを接触させるステップを含み、標的核酸は、二本鎖シトシンメチル化ＤＮＡであり、標的核酸を配列決定して、標的核酸中のメチル化シトシンヌクレオチドを同定する。好ましくは、デアミナーゼドメインは、二本鎖ＤＮＡを脱アミノ化することができ、非メチル化シチジン及び様々な形態のシチジン修飾（例えば、ｍＣ及びｈｍＣ）に対して異なる活性（例えば、異なる脱アミノ化速度）を有する。一部の形態では、デアミナーゼドメイン及び標的核酸は、デアミナーゼドメインが標的核酸を脱アミノするのに好適な期間及び条件下で、インキュベートされる。一部の形態では、デアミナーゼドメインは、実質的に標的核酸中の非メチル化シトシンヌクレオチドのみを脱アミノ化する。一部の形態では、ＤＮＡ基質上のメチル化ヌクレオチドは、メチル化シチジンと非メチル化シチジンのより良好な識別を可能にするために、ｄｓＣＤＡで処理する前に、ＴＥＴ２及びＢＧＴ酵素処理（従来技術で公知の方法による）を用いて、最初に酸化形態（例えばｃａＣ及びｆＣ）に変換される。一部の形態では、標的核酸中の実質的に全て（又は大部分）の非メチル化シトシンヌクレオチドが、デアミナーゼドメインによって脱アミノ化される。脱アミノ化された標的核酸を配列決定すると、標的核酸中のメチル化シトシンヌクレオチドが同定される（それらはシトシンとして配列決定される）。加えて、標的核酸中の未修飾シトシンは、それらがチミンとして配列決定されることから、同定することができる。核酸を配列決定するための適切な方法は、当技術分野で公知である。標的化シーケンシング、全ゲノムシーケンシング又は全エクソームシーケンシングを含む様々なタイプのシーケンシングを実施することができる。核酸サンプルのシングルエンド又はペアエンドシーケンシングを実施し得る。
適切なシーケンシング方法として、限定されないが、以下が挙げられる：サンガーシーケンシングハイスループットシーケンシング、パイロシーケンシング、合成によるシーケンシング、単一分子シーケンシング、ナノポアシーケンシング（例えば、ＭｉｎＩＯＮ）、半導体シーケンシング、ライゲーションによるシーケンシング、ハイブリダイゼーションによるシーケンシング、デジタル遺伝子発現（Ｈｅｌｉｃｏｓ）、次世代シーケンシング（例えば、Ｒｏｃｈｅ ４５４、ＨｉＳｅｑ２０００などのＳｏｌｅｘａプラットフォーム、ＳＯＬｉＤなど）、合成による単一分子シーケンシング（ＳＭＳＳ）（Ｈｅｌｉｃｏｓ）、超並列シーケンシング、クローン単一分子アレイ（Ｓｏｌｅｘａ）、単一分子リアルタイムシーケンシング（ＳＭＲＴ）、ショットガンシーケンシング、マキシムギルバートシーケンシング、プライマーウォーキング、ＰａｃＢｉｏ、ＳＯＬｉＤ、Ｉｏｎ Ｔｏｒｒｅｎｔ又はナノポアプラットフォームを用いたシーケンシング並びに当技術分野で公知の任意の他のシーケンシング方法。
一部の形態では、デアミナーゼドメインは、標的核酸中の非メチル化シトシンヌクレオチドの少なくとも５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は９９．５％を脱アミノ化する。一部の形態では、デアミナーゼドメインは、標的核酸中の非メチル化シトシンヌクレオチドの５０～１００％、５０～９０％、５０～８０％、６０～１００％、６０～９０％、６０～８０％、７０～１００％、７０～９０％、７０～８０％、８０～１００％、８０～９５％、８０～９０％、９０～１００％、９０～９５％、９５～１００％又は９５～９９．５％の非メチル化シトシンヌクレオチドを脱アミノ化する。好ましくは、デアミナーゼドメインは、標的核酸中の非メチル化シトシンヌクレオチドの９０％以上（例えば、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％又はそれを超える）を脱アミノ化する。
一部の形態では、デアミナーゼは、ｄｓＤＮＡ特異的シトシンデアミナーゼであり、好ましくは、実質的に非配列特異的シトシンデアミナーゼである。例えば、デアミナーゼドメインは、特定の標的ヌクレオチド配列の脱アミノ化を優先し得るが、これに限定されるわけではない。一部の形態では、ｄｓＤＮＡ特異的デアミナーゼの混合物を使用して、任意の個々のデアミナーゼによって課される配列バイアスを最小限に抑え、それらの配列コンテキストとは独立して非メチル化シトシンを脱アミノ化することができる。
異なるｄｓＤＮＡ特異的デアミナーゼ（ｄｓＣＤＡ）は、シチジン及びその様々な修飾（即ちエピジェネティックマーク、５ｍＣ、５ｈｍＣ、５ｆＣ、５ｃａＣ）に対して異なる活性を示す。この特徴を利用して、様々なエピジェネティックマーク（シチジン修飾）を示差的にマーキングし、次にこれをシーケンシング法により読み取ることができる。この方法は、バイサルファイトシーケンシングに代わる酵素的代替手段を提供し、ＤＮＡのバイサルファイト処理に関連する欠点と技術的制約に対処し、品質の優れた結果の生成を最小化する。実施例に記載されるように、デアミナーゼは非メチル化シチジン［（ｍ）Ｃ］に対してより活性であるが、メチル化シチジン（５ｍＣ及び５ｈｍＣ）に対してはそうではないことが明らかにされている。加えて、編集効率（ＣからＴ変換）は、非メチル化ｄＣ残基で高く、これは、ｄｓＣＤＡが、非メチル化ＤＮＡ及びメチル化ＤＮＡに対して差別的に作用することを示唆するものである。５ｈｍＣと５ｍＣは、グルコシル化及び酸化によって保護される場合、脱アミノ化に対してより耐性であることが判明した。
Ｃ．配列多様性の生成
ランダム突然変異誘発は、遺伝子及びタンパク質の機能を探究するために、密接に関連する変異体の配列多様性及びライブラリーを生成する一連の技術を包含する。これらの方法のうち、一般的であるのは、エラープローンＰＣＲ（Ｗｉｌｓｏｎ ＤＳ ａｎｄ Ｋｅｅｆｅ ＡＤ，２００１；ＰＭＩＤ：１８２６５２７５）であり、この方法では、エラープローンポリメラーゼ又は別の突然変異誘発因子の酵素を用いて、目的の遺伝子を多様化／増幅し、遺伝子の機能に影響を及ぼし得るランダムな突然変異を導入する。その有用性にもかかわらず、エラープローンＰＣＲは、それが生成できる突然変異の種類に偏りがある。別の手法は、ＤＮＡシャッフリング（Ｊｏｅｒｎ ＪＭ（２００３）ＤＮＡ Ｓｈｕｆｆｌｉｎｇ．Ｉｎ：Ａｒｎｏｌｄ Ｆ．Ｈ．，Ｇｅｏｒｇｉｏｕ Ｇ．（ｅｄｓ）．Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（商標），ｖｏｌ ２３１．Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ．インターネットサイト：ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１３８５／１－５９２５９－３９５－Ｘ：８５）であり、この場合、２つの類似した遺伝子間の短い配列をランダムにシャッフルして、変異遺伝子のライブラリーを生成する。このアプローチの主な制約は、２つの遺伝子が有意な配列類似性を有するという要件である。別の手法では、トランスポザーゼを使用して、ＤＮＡの短いセグメントを遺伝子にランダムに挿入する（Ｃａｒｔｍａｎ ＳＴ ａｎｄ Ｍｉｎｔｏｎ ＮＰ，Ａｐｐｌ Ｅｎｖｉｒｏｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，７６（４）：１１０３－９（２０１０））。あまり一般に使用されてはいないが、トランポサーゼベースの手法は、挿入部位の要件という欠点がある。最後に、ランダム変異は、主にグアノシンヌクレオチドの修飾を実施するエチルメタンスルホン酸（ＥＭＳ）などの化学物質を用して使用することができる。化学的突然変異誘発手法は、多くの場合、インビボＤＮＡ修復機構を必要とし、グアノシンに対する修飾のみを行うため、生成することができる配列の多様性が制限される。
開示されるｄｓＤＮＡ特異的デアミナーゼを使用して、目的のＤＮＡ分子に調整可能な効率でランダム変異を導入することができ、従って、様々な遺伝的にコードされた生体分子（例えば、抗体、アプタマーなど）を最適化するための指向性進化ワークフローを促進及び合理化することができる。このように、ＤＮＡ配列のプールをランダムに変異させる方法が提供される。標的核酸のプールで配列多様性を生成するための方法も提供される。このような方法では、デアミナーゼは、好ましくは、実質的に非配列特異的デアミナーゼ又は最小限のコンテキスト依存性で標的配列を集合的に編集することができる配列特異的デアミナーゼの混合物である。例えば、デアミナーゼドメインは、限定されないが、特定の標的ヌクレオチド配列の脱アミノ化を選好し得るか、又は個別の特異性を有する複数のデアミナーゼが同時に使用される。
一部の形態では、このような方法は、デアミナーゼドメインと標的核酸の複数のコピーとを、標的核酸の脱アミノ化をもたらす時間にわたって且つそのような条件下で接触させるステップを含む。一部の形態では、本方法は、標的核酸の１コピー当たり平均０．１～５．０ヌクレオチドの脱アミノ化に影響を及ぼす。一部の形態では、本方法は、標的核酸の１コピー当たり平均約０．１、０．５、１．０、１．５、２．０、２．５、３．０、３．５、４．０、４．５又は５．０ヌクレオチドの脱アミノ化に影響を及ぼす。好ましくは、標的核酸は、二本鎖ＤＮＡであり、デアミナーゼドメインは、二本鎖ＤＮＡを脱アミノ化することができる。
一部の形態では、標的核酸のコピーは、インビトロである。従って、標的核酸のコピー中の脱アミノ化ヌクレオチドは、インビトロ反応を介してチミン又はグアニンヌクレオチドに変換され得る。
一部の形態では、本方法は、標的核酸の脱アミノ化コピーを選択又はスクリーニング手順に供するステップをさらに含み、それは、インビボ又はインビトロで実施され得る。選択法又はスクリーニング法は、標的核酸のライブラリーに特定の選択圧を加えることにより、不要な変異体を直接排除する。適切な選択手順として、限定されないが、ｍＲＮＡディスプレイ、リボソームディスプレイ及びＳＥＬＥＸ（インビトロ）又はインビボ細胞ベースの選択方法（後者は、細胞に導入する前に、多様なＤＮＡ断片を適切なベクターにクローニングする必要がある）が挙げられる。
一部の形態では、標的核酸のコピー中の脱アミノ化ヌクレオチドは、チミン又はグアニンヌクレオチドに変換され、この変換は、標的核酸のコピーの一部又は全ての１つ以上の塩基編集を完了する。
一部の形態では、標的核酸のコピー中の脱アミノ化ヌクレオチドは、細胞中の標的核酸のコピーをインキュベートすることにより、チミン又はグアニンヌクレオチドに変換され得る。従って、一部の形態では、標的核酸のコピーは、細胞内にあり、細胞へのデアミナーゼドメインの進入を促進すること（例えば、ｍＲＮＡ又はタンパク質のエレクトロポレーション、発現ベクターによるトランスフェクション、形質転換など）により、デアミナーゼドメインと標的核酸のコピーとを接触させる。
一部の形態では、デアミナーゼドメインは、単離されたデアミナーゼドメインである。一部の形態では、デアミナーゼドメインは、ターゲティングドメイン（例えば、ＤＮＡ結合ドメイン、転写因子、ＤＮＡ又はＲＮＡポリメラーゼ（例えば、ヒト細胞におけるＴ７ ＲＮＡポリメラーゼなどの直交ＲＮＡポリメラーゼ）、他の複製及び転写アクセサリー因子など）に融合され、その結果、デアミナーゼドメインは、ターゲティングドメインによって占有されるＤＮＡ配列上のターゲティングドメイン（例えば、ＤＮＡ結合ドメイン標的部位、転写因子標的部位、ＤＮＡポリメラーゼ融合の場合には全ゲノム、ＲＮＡポリメラーゼ融合により転写されるプロモーター及び遺伝子など）と優先的に共局在する。この手法を用いて、ｄｓＤＮＡ特異的デアミナーゼを転写因子又は他の目的のＤＮＡ相互作用ドメインに融合させ、融合物を細胞に導入することにより、転写因子又は他のＤＮＡ相互作用タンパク質の結合部位をハイスループットで（ＣｈＩＰ－Ｓｅｑの代替として）同定することができ、目的のドメインとＤＮＡとの相互作用は、ＣからＴへの変異としてデアミナーゼにより一意にマーキングされ、次にこれを、全ゲノムシーケンシングによって検出することができる。
他の形態では、このアプローチは、例えば、デアミナーゼドメインをＤＮＡ相互作用ドメインに融合させることにより、細胞内部の目的の遺伝子座を高効率で連続的に多様化するために使用することができる。ＤＮＡ相互作用ドメインの選択は、変異がゲノム全体に生成される（例えば、デアミナーゼドメインが、融合されたＤＮＡポリメラーゼであるか、又はＤＮＡポリメラーゼに対するアクセサリータンパク質を使用することができる）ように実施することができる。代わりに、ゲノム又はプラスミドの規定セグメントのみをターゲティングすることもできる（例えば、デアミナーゼドメインは、ＲＮＡポリメラーゼに融合されて、そのポリメラーゼのプロモーターによって規定される領域をターゲティングする。デアミナーゼは、Ｔ７プロモーターを天然にコードしない宿主において、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼなどの直交ＤＮＡポリメラーゼに融合させることができる。目的のＤＮＡセグメントをＴ７の前に配置し、所与の宿主で発現させて、ゲノムの残りを多様化させずに、目的のセグメントを連続的に多様化することができる。このような連続的なインビボ多様化戦略は、細胞バーコード適用の目的とする形質の漸進的進化に使用することができる。ｓｓＤＮＡ特異的デアミナーゼとは対照的に、ｄｓＤＮＡ特異的デアミナーゼを使用すると、これらの適用での編集効率が向上する。例えば、ｓｓＤＮＡ特異的デアミナーゼに融合したＴ７ ＲＮＡポリメラーゼは、以前に記載されているが、恐らく、転写中に一過性に生成されるｓｓＤＮＡ基質（即ち転写バブル）がポリメラーゼ内に埋め込まれて、ｓｓＤＮＡ特異的デアミナーゼに容易にアクセスできないために、そうした設計の編集の効率は、選択を適用することなく、＜１％に制限されている（ウェブページ：ｎａｔｕｒｅ．ｃｏｍ／ａｒｔｉｃｌｅｓ／ｓ４１４６７－０２１－２１８７６－ｚ及びインターネットサイト：ｐｕｂｓ．ａｃｓ．ｏｒｇ／ｄｏｉ／１０．１０２１／ｊａｃｓ．８ｂ０４００１を参照されたい）。ｄｓＤＮＡ特異的デアミナーゼは、ポリメラーゼがその転写カセットに沿って通過する際に、それらの好ましい基質（ｄｓＤＮＡ）に容易にアクセスできるため、露出したｓｓＮＤＡにのみ作用することができるｓｓＤＮＡ特異的デアミナーゼよりも高い編集効率を達成するが、これは、漸進的インビボ進化及び細胞バーコーディング適用に望ましい機能である。
一部の形態では、細胞は、動物内にある。従って、一部の形態では、デアミナーゼドメインを動物に投与して、それを標的核酸のコピーと接触させる。
一部の形態では、標的核酸のコピーが細胞中にある場合、デアミナーゼドメインは、細胞中の発現ベクターによってコードされる。従って、一部の形態では、細胞中でデアミナーゼドメインを（例えば、一過性に）発現させることにより、デアミナーゼドメインを標的核酸のコピーと接触させる。
例示的な方法では、目的のｄｓＤＮＡ（例えば、目的のタンパク質をコードする遺伝子）をｄｓＤＮＡ特異的デアミナーゼで処理して、目的の遺伝子の変異体のライブラリーを作製した後、これを様々な指向性進化戦略（例えば、リボソームディスプレイ）又は他の選択／スクリーニングに基づく方法に供することができる。実施例に記載されるように、ＣからＴ編集がｇＲＮＡ結合部位の上流で観察され、これは、規定標的領域における標的化編集の成功を実証するものである。
ＩＶ．キット
開示される試薬、材料及び組成物並びに他の材料は、開示される方法を実施又は実施を補助するのに有用なキットとして任意の好適な組み合わせで一緒に包装することができる。所与のキット内の構成要素が、開示される方法で一緒に使用するために設計及び改変される場合に有用である。
一部の形態では、キットは、例えば、デアミナーゼドメイン又は塩基エディターをコードするヌクレオチド配列を含む１つ以上の核酸構築物を含むことができる。キットは、このようなポリヌクレオチドを含む発現ベクターを含み得る。他の形態では、キットは、適切な緩衝液中のデアミナーゼタンパク質又はその塩基エディターを含み得る。キットは、追加的又は代替的に、デアミナーゼドメイン又はその塩基エディターを発現する細胞を含むことができる。
一部の形態では、キットは、脱アミノ化アッセイを実施し、且つ／又は遺伝子発現を解析するための試薬を含む。例えば、キットは、ＰＣＲ試薬、シーケンシング試薬、フローサイトメトリー試薬、プライマー及びこれらの組合せを含むことができる。好ましくは、キットは、説明資料を含む。説明資料は、刊行物、記録、図又はキットの組成物及び方法の有用性を伝えるために使用することができる任意の他の表現媒体を含むことができる。例えば、説明資料は、キット構成要素を使用する方法、例えば、インビトロ又はインビボで標的化核酸編集を実施する方法に関する指示を提供し得る。
Ｖ．デアミナーゼ酵素ドメインを同定し、特性決定する方法
二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）に対して活性であるデアミナーゼドメインを同定し、それらの編集コンテキスト特異性を決定する方法も記載される。これらの方法は、ゲノミクス及びメタゲノミクスデータベースで利用可能なデアミナーゼドメインを体系的に特性決定する。一部の形態では、本方法は、１つ以上のデアミナーゼタンパク質ファミリーから１つ以上の代表的なデアミナーゼドメインを同定する１つ以上のステップを含む。一部の形態では、これらの方法は、１つ以上のゲノミクス及びメタゲノミクスデータベース内のシチジンデアミナーゼ様（ＣＤＡ）スーパーファミリーにおけるデアミナーゼドメインを同定する。例示的なゲノミクス及びメタゲノミクスデータベースには、ワールドワイドウェブ：ａ／／ｐｆａｍ．ｘｆａｍ．ｏｒｇ／ｃｌａｎ／ＣＤＡで利用可能なインターネットリソースｐｆａｍデータベースが含まれる。ｐｆａｍデータベース内のタンパク質機能は、一般に計算処理上アノテーションが付けられている。データベースで同定された遺伝子ドメインは、例えば、市販の遺伝子合成サービスを用いて合成される。
上記の方法は、例えば、インビトロ転写／翻訳系を用いて、遺伝子を発現させるための１つ以上のステップを含む。本方法は、合成され、発現されたデアミナーゼドメインの活性を特性決定するステップを含む。典型的には、これら方法は、デアミナーゼを特性決定する１つ以上のステップ、例えば、１つ以上のアッセイを用いてｓｓＤＮＡ及びｄｓＤＮＡ基質に対するそれらの鎖バイアス及び配列特異性機能を決定するためのステップを含む。例示的なアッセイは、ＤＮＡシーケンシング及び／又は脱アミノ化アッセイを含む。例示的なシーケンシングアッセイは、以下を含む：（ｉ）インビトロ翻訳によって所与のＣＤＡドメインを発現するステップ；（ｉｉ）ｄｓＤＮＡプラスミドをインビトロ翻訳反応に付加するステップ；続いて（ｉｉｉ）デアミナーゼ活性に対して好適な条件下で一定期間インキュベートするステップ；並びに（ｉｖ）得られたＤＮＡ産物の配列分析を行い、デアミナーゼ活性を決定するステップ。例示的な条件は、以下を含む：３７℃の温度で２時間のインキュベーション；９５℃に短時間加熱による反応の不活性化；例えば、ＰＣＲによる残留ＤＮＡ産物の増幅；ＤＮＡの完全性を特定するためのシーケンシング。例示的なシーケンシング技術としては、次世代シーケンシング（ＮＧＳ）及びサンガーシーケンシングがある。上記の方法により活性デアミナーゼドメインを同定する形態では、本方法は、同一又は異なるゲノミクス及びメタゲノミクスデータベース内のタンパク質遺伝子の遺伝的に関連するサブファミリー中で類似のデアミナーゼドメインを同定するための１つ以上のステップを含む。例えば、一部の形態では、これらの方法は、１つ又は複数のｄｓＣＤＡの同定に到った最初のスクリーニングで活性ｄｓＤＮＡ特異的ＣＤＡを含有することが判明したサブファミリーでスクリーニングを反復する。この方法は、同定されたｄｓＣＤＡに存在し、非活性ｄｓＣＤＡに存在しないシグネチャモチーフを同定するステップも含む。これらのシグネチャモチーフを使用して、データベース内の追加のｄｓＤＮＡを識別することができる。
同様の手法を使用して、ゲノム及びメタゲノムデータベースから他のＲＮＡ及びＤＮＡ修飾／プロセシング酵素を迅速に特性決定することができる。
開示される組成物及び方法は、以下の番号付きパラグラフを通してさらに理解することができる。
１．単離されたデアミナーゼドメインであって、二本鎖ＤＮＡを脱アミノ化することができ、標的ヌクレオチド配列を含まない二本鎖ＤＮＡに対するデアミナーゼドメインのデアミナーゼ活性と比較して、標的ヌクレオチド配列を含む二本鎖ＤＮＡに対してより大きいデアミナーゼ活性を有し、
標的ヌクレオチドは、それぞれ個別に完全に又は部分的に規定され、且つ互いに固定された順序関係にあり、
デアミナーゼドメインは、バークホルデリア・セノセパシア（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｃｅｎｏｃｅｐａｃｉａ）由来のＤｄｄＡのデアミナーゼドメインではない、単離されたデアミナーゼドメイン。
２．標的ヌクレオチド配列は、２つ以上の標的ヌクレオチドを含み、
標的ヌクレオチドは、それぞれ個別に完全に又は部分的に規定され、且つ互いに固定された順序関係にある、パラグラフ１に記載のデアミナーゼドメイン。
３．標的ヌクレオチドは、ＧＣ、ＡＣ又はＣＣである、パラグラフ１又は２に記載のデアミナーゼ。
４．２つの部分を含み、
２つの部分が一緒に結合されるときにのみ脱アミノ化が可能である、パラグラフ１～３のいずれか１つに記載のデアミナーゼドメイン。
５．シトシンヌクレオチドを脱アミノ化することができる、パラグラフ１～４のいずれか１つに記載のデアミナーゼドメイン。
６．標的ヌクレオチドは、ＡＣである、パラグラフ１～５のいずれか１つに記載のデアミナーゼドメイン。
７．標的ヌクレオチドは、ＣＣである、パラグラフ１～５のいずれか１つに記載のデアミナーゼドメイン。
８．標的ヌクレオチドは、ＧＣである、パラグラフ１～５のいずれか１つに記載のデアミナーゼドメイン。
９．標的ヌクレオチドは、ＴＣである、パラグラフ１又は４に記載のデアミナーゼドメイン。
１０．配列番号１～４、９、１１、１４～１６若しくは４０～６７のいずれか１つのアミノ酸配列又はその断片若しくは変異体を含む、パラグラフ１～９のいずれか１つに記載のデアミナーゼドメイン。
１１．配列番号４のアミノ酸配列又は配列番号４に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％若しくは９９％の配列同一性を有するアミノ酸或いはその断片を有するＢＥ＿Ｒ１＿４１を含む、パラグラフ１０に記載のデアミナーゼドメイン。
１２．配列番号１のアミノ酸配列又は配列番号１に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％若しくは９９％の配列同一性を有するアミノ酸或いはその断片を有するＢＥ＿Ｒ１＿１１を含む、パラグラフ１１に記載のデアミナーゼドメイン。
１３．配列番号２のアミノ酸配列又は配列番号２に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％若しくは９９％の配列同一性を有するアミノ酸或いはその断片を有するＢＥ＿Ｒ１＿１２を含む、パラグラフ１１に記載のデアミナーゼドメイン。
１４．配列番号３のアミノ酸配列又は配列番号３に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％若しくは９９％の配列同一性を有するアミノ酸或いはその断片を有するＢＥ＿Ｒ１＿２８を含む、パラグラフ１１に記載のデアミナーゼドメイン。
１５．パラグラフ１～１４のいずれか１つに記載のデアミナーゼドメイン及びターゲティングドメインを含む標的化塩基エディターであって、ターゲティングドメインは、塩基エディター標的配列に特異的に結合する、標的化塩基エディター。
１６．ターゲティングドメインは、ＴＡＬＥ、ＢＡＴ、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９、Ｃｆｐ１又はジンクフィンガーを含む、パラグラフ１５に記載の標的化塩基エディター。
１７．塩基エディター標的配列は、デアミナーゼドメインの標的ヌクレオチド配列の実体の２０ヌクレオチド以内の標的核酸中に存在するように選択され、
標的ヌクレオチド配列の実体は、標的化塩基エディターによって塩基編集されるように選択される、パラグラフ１５又は１６に記載の標的化塩基エディター。
１８．標的化塩基エディターによって塩基編集されるように選択される標的ヌクレオチド配列の実体の２０ヌクレオチド以内の塩基エディター標的配列は、標的ヌクレオチド配列の任意の実体の２０ヌクレオチド以内にある標的核酸中の唯一の塩基エディター標的配列である、パラグラフ１７に記載の標的化塩基エディター。
１９．標的核酸中の標的ヌクレオチド配列の実体は、標的ヌクレオチド配列の実体の２０ヌクレオチド以内の標的核酸中の塩基エディター標的配列の２０ヌクレオチド以内のデアミナーゼドメインの標的ヌクレオチド配列の唯一の実体である、パラグラフ１７又は１８に記載の標的化塩基エディター。
２０．塩基エディター標的配列は、ミトコンドリアＤＮＡ、又は葉緑体ＤＮＡ、又は色素体ＤＮＡ中に存在する、パラグラフ１５～１９のいずれか１つに記載の標的化塩基エディター。
２１．２つの部分を含み、
第１の部分は、第１のスプリットデアミナーゼドメインを含み、第２の部分は、第２のスプリットデアミナーゼドメインを含む、パラグラフ１５～２０のいずれか１つに記載の標的化塩基エディター。
２２．第１の部分は、配列番号１２２～１８１のいずれか１つのアミノ酸配列を含むスプリットデアミナーゼドメインを含み、
第２の部分は、配列番号１２７～１８１のいずれか１つのアミノ酸配列を含むスプリットデアミナーゼドメインを含み、
第１及び第２のスプリットデアミナーゼドメインは、単独では不活性であるが、一緒に近接されると脱アミノ化が可能である、パラグラフ２１に記載の標的化塩基エディター。
２３．第１のスプリットデアミナーゼドメインは、配列番号１２２～１２６のいずれか１つのアミノ酸配列を含む、パラグラフ２１～２２のいずれか１つに記載の標的化塩基エディター。
２４．第１及び第２のスプリットデアミナーゼドメインの両方は、野生型デアミナーゼドメイン活性部位を含む、パラグラフ２１～２２のいずれか１つに記載の標的化塩基エディター。
２５．第１及び第２のスプリットデアミナーゼドメインは、ＢＥ＿Ｒ１＿１１の断片又は変異体をそれぞれ含む、パラグラフ２１～２４のいずれか１つに記載の標的化塩基エディター。
２６．第１のスプリットデアミナーゼドメインは、配列番号１２２、又は１２７～１３５、又は１５０のいずれか１つを含み、
第２のスプリットデアミナーゼドメインは、配列番号１２７～１３５又は１５０のいずれか１つを含む、パラグラフ２５に記載の標的化塩基エディター。
２７．第１のスプリットデアミナーゼドメインは、配列番号１２２を含み、
第２のスプリットデアミナーゼドメインは、配列番号１２７～１３４又は１５０のいずれか１つを含む、パラグラフ２５に記載の標的化塩基エディター。
２８．第１のスプリットデアミナーゼドメインは、配列番号１２９を含み、
第２のスプリットデアミナーゼドメインは、配列番号１５０を含む、パラグラフ２５に記載の標的化塩基エディター。
２９．第１及び第２のスプリットデアミナーゼドメインは、ＢＥ＿Ｒ１＿１２の断片又は変異体をそれぞれ含む、パラグラフ２１～２４のいずれか１つに記載の標的化塩基エディター。
３０．第１のスプリットデアミナーゼドメインは、配列番号１２４、又は１３６～１４０、又は１５６～１６７のいずれか１つを含み、
第２のスプリットデアミナーゼドメインは、配列番号１３６～１４０又は１５６～１６７のいずれか１つを含む、パラグラフ２９に記載の標的化塩基エディター。
３１．第１のスプリットデアミナーゼドメインは、配列番号１２４を含み、第２のスプリットデアミナーゼドメインは、配列番号１５６～１６６のいずれか１つを含む、パラグラフ２９又は３０に記載の標的化塩基エディター。
３２．第１のスプリットデアミナーゼドメインは、配列番号１３７を含み、
第２のスプリットデアミナーゼドメインは、配列番号１４２を含む、パラグラフ２９又は３０に記載の標的化塩基エディター。
３３．第１のスプリットデアミナーゼドメインは、配列番号１３９を含み、
第２のスプリットデアミナーゼドメインは、配列番号１４４を含む、パラグラフ２９又は３０に記載の標的化塩基エディター。
３４．第１及び第２のスプリットデアミナーゼドメインは、ＢＥ＿Ｒ１＿４１の断片又は変異体をそれぞれ含む、パラグラフ２２に記載の標的化塩基エディター。
３５．第１のスプリットデアミナーゼドメインは、配列番号１６８～１７１のいずれか１つを含み、
第２のスプリットデアミナーゼドメインは、配列番号１７２～１７５のいずれか１つを含む、パラグラフ３４に記載の標的化塩基エディター。
３６．第１のスプリットデアミナーゼドメインは、配列番号１６８を含み、
第２のスプリットデアミナーゼドメインは、配列番号１７３を含む、パラグラフ３４～３５に記載の標的化塩基エディター。
３７．第１のスプリットデアミナーゼドメインは、配列番号１７１を含み、
第２のスプリットデアミナーゼドメインは、配列番号１７５を含む、パラグラフ３４～３５に記載の標的化塩基エディター。
３８．第１のスプリットデアミナーゼドメインは、配列番号１７１を含み、
第２のスプリットデアミナーゼドメインは、配列番号１７３を含む、パラグラフ３４に記載の標的化塩基エディター。
３９．第１及び第２のスプリットデアミナーゼドメインは、ＢＥ＿Ｒ１＿２８の断片又は変異体をそれぞれ含む、パラグラフ２１～２４のいずれか１つに記載の標的化塩基エディター。
４０．第１のスプリットデアミナーゼドメインは、配列番号１２３、又は１４６～１４９、又は１５１～１５５のいずれか１つを含み、
第２のスプリットデアミナーゼドメインは、配列番号１４６～１４９又は１５１～１５５のいずれか１つを含む、パラグラフ３９に記載の標的化塩基エディター。
４１．第１のスプリットデアミナーゼドメインは、配列番号１２３を含み、
第２のスプリットデアミナーゼドメインは、配列番号１４９又は１５１～１５３のいずれか１つを含む、パラグラフ３９又は４０に記載の標的化塩基エディター。
４２．第１及び第２のスプリットデアミナーゼドメインは、ＢＥ＿Ｒ４＿２１の断片又は変異体をそれぞれ含む、パラグラフ２１～２４のいずれか１つに記載の標的化塩基エディター。
４３．第１のスプリットデアミナーゼドメインは、配列番号１２５又は１７６～１７７のいずれか１つを含み、
第２のスプリットデアミナーゼドメインは、配列番号１７６～１７７のいずれか１つを含む、パラグラフ４２に記載の標的化塩基エディター。
４４．第１のスプリットデアミナーゼドメインは、配列番号１２５を含み、
第２のスプリットデアミナーゼドメインは、配列番号１７７を含む、パラグラフ４２に記載の標的化塩基エディター。
４５．第１のスプリットデアミナーゼドメインは、配列番号１７６を含み、
第２のスプリットデアミナーゼドメインは、配列番号１７７を含む、パラグラフ４２に記載の標的化塩基エディター。
４６．第１及び第２のスプリットデアミナーゼドメインは、ＢＥ＿Ｒ２＿１１の断片又は変異体をそれぞれ含む、パラグラフ２１～２４のいずれか１つに記載の標的化塩基エディター。
４７．第１のスプリットデアミナーゼドメインは、配列番号１２６又は１８０～１８１のいずれか１つを含み、
第２のスプリットデアミナーゼドメインは、配列番号１８０～１８１のいずれか１つを含む、パラグラフ４６に記載の標的化塩基エディター。
４８．第１のスプリットデアミナーゼドメインは、配列番号１２５を含み、
第２のスプリットデアミナーゼドメインは、配列番号１８０～１８１のいずれか１つを含む、パラグラフ４２に記載の標的化塩基エディター。
４９．第１のスプリットデアミナーゼドメインは、配列番号１８０を含み、
第２のスプリットデアミナーゼドメインは、配列番号１８１を含む、パラグラフ４２に記載の標的化塩基エディター。
５０．第１の部分若しくは第２の部分又は第１及び第２の部分の両方は、ＴＡＬＥ、ＢＡＴ、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９、Ｃｆｐ１又はジンクフィンガーからなる群から選択されるプログラマブルＤＮＡ結合ドメインを含む、パラグラフ２２～４９のいずれか１つに記載の標的化塩基エディター。
５１．１つのプログラマブルＤＮＡ結合ドメインは、左側ＴＡＬＥ及び右側ＴＡＬＥからなる群から選択されるＴＡＬＥである、パラグラフ５０に記載の標的化塩基エディター。
５２．１つのプログラマブルＤＮＡ結合ドメインは、配列番号９０、９２、９５、９７～１０６のいずれか１つのアミノ酸配列を含む左側ＴＡＬＥである、パラグラフ５０又は５１に記載の標的化塩基エディター。
５３．１つのプログラマブルＤＮＡ結合ドメインは、配列番号９１、９３～９４、９６、１０８～１１３のいずれか１つのアミノ酸配列を含む右側ＴＡＬＥである、パラグラフ５０～５２のいずれか１つに記載の標的化塩基エディター。
５４．１つ以上のプログラマブルＤＮＡ結合ドメインは、配列番号９５～９６のいずれか１つを含むアミノ酸配列を有する、ミトコンドリアｍＮＤ１ ＤＮＡに結合するＴＡＬＥである、パラグラフ５０～５３のいずれか１つに記載の標的化塩基エディター。
５５．１つのプログラマブルＤＮＡ結合ドメインは、配列番号９６を含むアミノ酸配列を有する、ミトコンドリアｍＮＤ１ ＤＮＡに結合する右側ＴＡＬＥである、パラグラフ５０～５４のいずれか１つに記載の標的化塩基エディター。
５６．１つのプログラマブルＤＮＡ結合ドメインは、配列番号９５を含むアミノ酸配列を有する、ミトコンドリアｈＮＤ１ ＤＮＡに結合する左側ＴＡＬＥである、パラグラフ５４又は５５に記載の標的化塩基エディター。
５７．１つ以上のプログラマブルＤＮＡ結合ドメインは、配列番号９９～１０６又は１０８～１１３のいずれか１つを含むアミノ酸配列を有する、ミトコンドリアｍＣＯＸ１ ＤＮＡに結合するＴＡＬＥである、パラグラフ５１に記載の標的化塩基エディター。
５８．１つのプログラマブルＤＮＡ結合ドメインは、配列番号１０８～１１３のいずれか１つを含むアミノ酸配列を有する、ミトコンドリアｍＣＯＸ１ ＤＮＡに結合する右側ＴＡＬＥである、パラグラフ５７に記載の標的化塩基エディター。
５９．１つのプログラマブルＤＮＡ結合ドメインは、配列番号９０～１０６のいずれかを含むアミノ酸配列を有する、ミトコンドリアｍＣＯＸ１ ＤＮＡに結合する左側ＴＡＬＥである、パラグラフ５７又は５８のいずれか１つに記載の標的化塩基エディター。
６０．１つ以上のプログラマブルＤＮＡ結合ドメインは、配列番号９８を含むアミノ酸配列を有する、ｈ１２ ＤＮＡに結合するＴＡＬＥである、パラグラフ５０に記載の標的化塩基エディター。
６１．１つのプログラマブルＤＮＡ結合ドメインは、配列番号１１４を含むアミノ酸配列を有する、ＮＴ（Ｇ）Ｎ末端ドメインを有するＴＡＬＥである、パラグラフ５０に記載の標的化塩基エディター。
６２．１つのプログラマブルＤＮＡ結合ドメインは、配列番号１１５を含むアミノ酸配列を有する、ＮＴ（ｂｎ）Ｎ末端ドメインを有するＴＡＬＥである、パラグラフ５０に記載の標的化塩基エディター。
６３．１つ以上のプログラマブルＤＮＡ結合ドメインは、配列番号９２～９４のいずれか１つを含むアミノ酸配列を有する、ミトコンドリアＮＤ６ ＤＮＡに結合するＴＡＬＥである、パラグラフ５１に記載の標的化塩基エディター。
６４．１つのプログラマブルＤＮＡ結合ドメインは、配列番号９３～９４のいずれか１つを含むアミノ酸配列を有する、ミトコンドリアＮＤ６ ＤＮＡに結合する右側ＴＡＬＥである、パラグラフ６３に記載の標的化塩基エディター。
６５．１つのプログラマブルＤＮＡ結合ドメインは、配列番号９２を含むアミノ酸配列を有する、ミトコンドリアｍＮＤ６ ＤＮＡに結合する左側ＴＡＬＥである、パラグラフ６３又は６４に記載の標的化塩基エディター。
６６．１つ以上のプログラマブルＤＮＡ結合ドメインは、配列番号９０～９１のいずれか１つを含むアミノ酸配列を有する、ミトコンドリアｈＮＤ ＤＮＡに結合するＴＡＬＥである、パラグラフ５１に記載の標的化塩基エディター。
６７．１つのプログラマブルＤＮＡ結合ドメインは、配列番号９０を含むアミノ酸配列を有する、ミトコンドリアｈＮＤ ＤＮＡに結合する右側ＴＡＬＥである、パラグラフ６６に記載の標的化塩基エディター。
６８．１つのプログラマブルＤＮＡ結合ドメインは、配列番号９１を含むアミノ酸配列を有する、ミトコンドリアｈＮＤ ＤＮＡに結合する左側ＴＡＬＥである、パラグラフ６６又は６７に記載の標的化塩基エディター。
６９．１つのプログラマブルＤＮＡ結合ドメインは、配列番号９７を含むアミノ酸配列を有する、ｈ１１ ＤＮＡに結合するＴＡＬＥである、パラグラフ５０に記載の標的化塩基エディター。
７０．第１及び第２の部分の一方又は両方は、独立して、ジンクフィンガープログラマブルＤＮＡ結合ドメインを含む、パラグラフ５０～６９のいずれか１つに記載の標的化塩基エディター。
７１．１つのプログラマブルＤＮＡ結合ドメインは、左側ジンクフィンガー及び右側ジンクフィンガーからなる群から選択されるジンクフィンガーである、パラグラフ５０～７０のいずれか１つに記載の標的化塩基エディター。
７２．１つのプログラマブルＤＮＡ結合ドメインは、配列番号８２～８９のいずれか１つを含むアミノ酸配列を有する、ｍＣＯＸ１ ＤＮＡに結合するジンクフィンガーである、パラグラフ５０若しくは５７又は７０～７１のいずれか１つに記載の標的化塩基エディター。
７３．１つのプログラマブルＤＮＡ結合ドメインは、配列番号８２～８６又は８７～８９のいずれか１つのアミノ酸配列を有する、ｍＣＯＸ１ ＤＮＡに結合する右側ジンクフィンガーである、パラグラフ５０又は７０～７２のいずれか１つに記載の標的化塩基エディター。
７４．１つのプログラマブルＤＮＡ結合ドメインは、配列番号８２～８６のいずれか１つを含むアミノ酸配列を有する、ｍＣＯＸ１ ＤＮＡに結合する左側ジンクフィンガーである、パラグラフ５０又は７０～７３のいずれか１つに記載の標的化塩基エディター。
７５．１つのプログラマブルＤＮＡ結合ドメインは、配列番号７４～８１のいずれか１つを含むアミノ酸配列を有する、ｈＮＤ ＤＮＡに結合するジンクフィンガーである、パラグラフ５０若しくは６６又は７０～７１のいずれか１つに記載の標的化塩基エディター。
７６．１つのプログラマブルＤＮＡ結合ドメインは、配列番号７８～８１のいずれか１つのアミノ酸配列を有する、ｈＮＤ ＤＮＡに結合する右側ジンクフィンガーである、パラグラフ５０若しくは７０又は７４～７５のいずれか１つに記載の標的化塩基エディター。
７７．１つのプログラマブルＤＮＡ結合ドメインは、配列番号７４～７７のいずれか１つを含むアミノ酸配列を有する、ｈＮＤ ＤＮＡに結合する左側ジンクフィンガーである、パラグラフ５０若しくは７０又は７４～７６のいずれか１つに記載の標的化塩基エディター。
７８．第１及び第２の部分の一方又は両方は、独立して、ＢＡＴプログラマブルＤＮＡ結合ドメインを含む、パラグラフ５０～７７のいずれか１つに記載の標的化塩基エディター。
７９．１つのプログラマブルＤＮＡ結合ドメインは、左側ＢＡＴ及び右側ＢＡＴからなる群から選択されるＢＡＴである、パラグラフ５０～７８のいずれか１つに記載の標的化塩基エディター。
８０．１つのプログラマブルＤＮＡ結合ドメインは、配列番号１１８～１１９のいずれか１つを含むアミノ酸配列を有する、ｍＣＯＸ１ ＤＮＡに結合するＢＡＴである、パラグラフ５０、又は５７、又は７２のいずれか１つに記載の標的化塩基エディター。
８１．１つのプログラマブルＤＮＡ結合ドメインは、配列番号１１９のいずれか１つのアミノ酸配列を有する、ｍＣＯＸ１ ＤＮＡに結合する右側ＢＡＴである、パラグラフ５０、又は５７、又は７０、又は７２、又は８０のいずれか１つに記載の標的化塩基エディター。
８２．１つのプログラマブルＤＮＡ結合ドメインは、配列番号１１８のいずれか１つを含むアミノ酸配列を有する、ｍＣＯＸ１ ＤＮＡに結合する左側ＢＡＴである、パラグラフ５０、又は５７、又は７０、又は７２、又は８０～８１のいずれか１つに記載の標的化塩基エディター。
８３．１つのプログラマブルＤＮＡ結合ドメインは、配列番号１２０～１２１のいずれか１つを含むアミノ酸配列を有する、ＮＤ６ ＤＮＡに結合するＢＡＴである、パラグラフ５０、又は７０、又は６３、又は７８～７９のいずれか１つに記載の標的化塩基エディター。
８４．１つのプログラマブルＤＮＡ結合ドメインは、配列番号１２１のいずれか１つのアミノ酸配列を有する、ｈＮＤ ＤＮＡに結合する右側ＢＡＴである、パラグラフ５０、又は７０、又は６３、又は７８～７９、又は８３のいずれか１つに記載の標的化塩基エディター。
８５．１つのプログラマブルＤＮＡ結合ドメインは、配列番号１２０のいずれか１つを含むアミノ酸配列を有する、ｈＮＤ ＤＮＡに結合する左側ＢＡＴである、パラグラフ５０、又は７０、又は６３、又は７８～７９、又は８３～８４のいずれか１つに記載の標的化塩基エディター。
８６．第１の部分は、
（ａ）配列番号１２０のアミノ酸配列を含む第１のスプリットデアミナーゼドメインと、
（ｂ）左側ＴＡＬＥプログラマブルＤＮＡ結合ドメインと
を含み；
第２の部分は、
（ｃ）配列番号１５６、１５８、１６０又は１６４のいずれか１つのアミノ酸配列を含む第２のスプリットデアミナーゼドメインと、
（ｄ）右側ＴＡＬＥプログラマブルＤＮＡ結合ドメインと
を含む、パラグラフ２１～２２のいずれか１つに記載の標的化塩基エディター。
８７．第１の部分は、
（ａ）配列番号１６９のアミノ酸配列を含む第１のスプリットデアミナーゼドメインと、
（ｂ）左側ＴＡＬＥプログラマブルＤＮＡ結合ドメインと
を含み；
第２の部分は、
（ｃ）配列番号１７３又は１７５のいずれか１つのアミノ酸配列を含む第２のスプリットデアミナーゼドメインと、
（ｄ）右側ＴＡＬＥプログラマブルＤＮＡ結合ドメインと
を含む、パラグラフ２１～２２のいずれか１つに記載の標的化塩基エディター。
８８．第１の部分は、
（ａ）配列番号１７１のアミノ酸配列を含む第１のスプリットデアミナーゼドメインと、
（ｂ）左側ＴＡＬＥプログラマブルＤＮＡ結合ドメインと
を含み；
第２の部分は、
（ｃ）配列番号１７５のいずれか１つのアミノ酸配列を含む第２のスプリットデアミナーゼドメインと、
（ｄ）右側ＴＡＬＥプログラマブルＤＮＡ結合ドメインと
を含む、パラグラフ２１～２２のいずれか１つに記載の標的化塩基エディター。
８９．第１の部分は、
（ａ）配列番号１６９のアミノ酸配列を含む第１のスプリットデアミナーゼドメインと、
（ｂ）左側ＢＡＴプログラマブルＤＮＡ結合ドメインと
を含み；
第２の部分は、
（ｃ）配列番号１７３又は１７５のいずれか１つのアミノ酸配列を含む第２のスプリットデアミナーゼドメインと、
（ｄ）右側ＴＡＬＥプログラマブルＤＮＡ結合ドメインと
を含む、パラグラフ２１～２２のいずれか１つに記載の標的化塩基エディター。
９０．第１の部分は、
（ａ）配列番号１６９のアミノ酸配列を含む第１のスプリットデアミナーゼドメインと、
（ｂ）第１のコイルドコイルドメインと、
（ｃ）任意選択で、左側ＴＡＬＥプログラマブルＤＮＡ結合ドメインと
を含み；
第２の部分は、
（ｄ）配列番号１７３又は１７５のいずれか１つのアミノ酸配列を含む第２のスプリットデアミナーゼドメインと、
（ｅ）第２のコイルドコイルドメインと、
（ｆ）任意選択で、右側ＴＡＬＥプログラマブルＤＮＡ結合ドメインと
を含み、第１及び第２のコイルドコイルドメインは、第１及び第２の部分の結合時に一緒に相互作用する、パラグラフ２１～２２のいずれか１つに記載の標的化塩基エディター。
９１．第１及び第２の部分の一方又は両方は、少なくとも１つのリンカーを含む、パラグラフ２２～９１のいずれか１つに記載の標的化塩基エディター。
９２．第１及び第２の部分の一方又は両方は、少なくとも１つのリンカーを含み、
リンカーは、プログラマブルＤＮＡ結合ドメインとスプリットデアミナーゼドメインとの間に位置する、パラグラフ５０～９０のいずれか１つに記載の標的化塩基エディター。
９３．第１及び第２の部分の両方は、プログラマブルＤＮＡ結合ドメインとスプリットデアミナーゼドメインとの間にリンカーを含む、パラグラフ９２のいずれか１つに記載の標的化塩基エディター。
９４．リンカーは、２～２００アミノ酸長である、パラグラフ９１～９３のいずれか１つに記載の標的化塩基エディター。
９５．リンカーは、２～１６アミノ酸長である、パラグラフ９４のいずれか１つに記載の標的化塩基エディター。
９６．リンカーは、ＧＳ、ＧＳＧ、ＧＳＳ又は配列番号２３～２７若しくは３０のいずれかのアミノ酸配列を含む、パラグラフ９１～９５のいずれか１つに記載の標的化塩基エディター。
９７．標的核酸が標的ＤＮＡ鎖上のプログラマブル結合ドメイン結合部位から９～１１塩基対であるように構成される、パラグラフ５０～９６のいずれか１つに記載の標的化塩基エディター。
９８．標的ＤＮＡ鎖上の２つのプログラマブル結合ドメインの２つの結合部位間の距離は、１２～２２塩基対である、パラグラフ５０～９７のいずれか１つに記載の標的化塩基エディター。
９９．標的ＤＮＡ鎖上の２つのプログラマブル結合ドメインの２つの結合部位間の距離は、１４～１９塩基対である、パラグラフ９８に記載の標的化塩基エディター。
１００．第１及び第２の部分の少なくとも一方は、細胞ターゲティング部分を含む、パラグラフ２２～９９のいずれか１つに記載の標的化塩基エディター。
１０１．第１及び第２の部分の両方は、細胞ターゲティング部分を含む、パラグラフ１００に記載の標的化塩基エディター。
１０２．第１及び第２の部分の両方は、同じ細胞ターゲティング部分を含む、パラグラフ１０１に記載の標的化塩基エディター。
１０３．細胞ターゲティング部分は、ミトコンドリアターゲティング配列（ＭＴＳ）及び核局在化配列（ＮＬＳ）からなる群から選択される、パラグラフ１００～１０２のいずれか１つに記載の標的化塩基エディター。
１０４．ＮＬＳは、配列番号３４～３９のいずれか１つのアミノ酸配列を含む、パラグラフ１０３に記載の標的化塩基エディター。
１０５．ＭＴＳは、配列番号２２、６９、７１、１８２又は１８３のいずれか１つのアミノ酸配列を含む、パラグラフ１０４に記載の標的化塩基エディター。
１０６．第１及び第２の部分の少なくとも一方は、塩基除去修復阻害剤を含む、パラグラフ２２～１０５のいずれか１つに記載の標的化塩基エディター。
１０７．塩基除去修復阻害剤は、哺乳類ＤＮＡグリコシラーゼ阻害剤である、パラグラフ１０６に記載の標的化塩基エディター。
１０８．塩基除去修復阻害剤は、ウラシルグリコシラーゼ阻害剤である、パラグラフ１０６又は１０７に記載の標的化塩基エディター。
１０９．塩基除去修復阻害剤は、配列番号２１又は７０のいずれか１つを含むアミノ酸配列を有する、パラグラフ１０６～１０８のいずれか１つに記載の標的化塩基エディター。
１１０．標的核酸と、パラグラフ１７～１０９のいずれか１つに記載の標的化塩基エディターとを接触させるステップを含む方法であって、標的核酸は、二本鎖ＤＮＡであり、それにより、標的ヌクレオチド配列の実体は、標的化塩基エディターによって脱アミノ化される、方法。
１１１．標的ヌクレオチド配列中の脱アミノ化ヌクレオチドは、チミン又はグアニンヌクレオチドに変換され、変換は、標的ヌクレオチド配列の塩基編集を完了させる、パラグラフ１１０に記載の方法。
１１２．標的核酸は、ミトコンドリアＤＮＡである、パラグラフ１１０又は１１１に記載の方法。
１１３．標的ヌクレオチド配列は、ＡＣである、パラグラフ１１０～１１２のいずれか１つに記載の方法。
１１４．標的ヌクレオチド配列は、ＣＣである、パラグラフ１１０～１１２のいずれか１つに記載の方法。
１１５．標的ヌクレオチド配列は、ＧＣである、パラグラフ１１０～１１２のいずれか１つに記載の方法。
１１６．標的ヌクレオチド配列は、ＴＣである、パラグラフ１１０～１１２のいずれか１つに記載の方法。
１１７．標的ヌクレオチド配列中の最後のＣは、標的化塩基エディターによって脱アミノ化される、パラグラフ１１０～１１６のいずれか１つに記載の方法。
１１８．標的ＤＮＡ中の標的ヌクレオチド配列の実体は、塩基エディター標的配列の２０ヌクレオチド以内にある、パラグラフ１１０～１１７のいずれか１つに記載の方法。
１１９．標的核酸は、細胞内にあり、標的核酸と標的化塩基エディターとを接触させるステップは、細胞内への標的化塩基エディターの進入を促進することによって達成される、パラグラフ１１０～１１８のいずれか１つに記載の方法。
１２０．標的核酸は、動物内にあり、標的核酸と標的化塩基エディターとを接触させるステップは、標的化塩基エディターを動物に投与することによって達成される、パラグラフ１１９に記載の方法。
１２１．標的核酸と、１つ以上のデアミナーゼドメインとを接触させるステップであって、標的核酸は、二本鎖シトシン－メチル化ＤＮＡであり、デアミナーゼドメインは、二本鎖ＤＮＡを脱アミノ化することができ、デアミナーゼドメインは、実質的に標的核酸中の非メチル化シトシンヌクレオチドのみを脱アミノ化し、
標的核酸中の非メチル化シトシンヌクレオチドの実質的に全ては、デアミナーゼドメインにより脱アミノ化される、ステップと；
脱アミノ化標的核酸を配列決定するステップであって、それにより、標的核酸中のメチル化シトシンヌクレオチドは、同定される、ステップと
を含む方法。
１２２．デアミナーゼドメインは、標的核酸中の非メチル化シトシンヌクレオチドの９０％以上を脱アミノ化する、パラグラフ１２１に記載の方法。
１２３．デアミナーゼドメインと標的核酸の複数のコピーとを、標的核酸の１コピー当たり平均０．１～５．０ヌクレオチドの脱アミノ化をもたらす時間にわたって且つそのような条件下で接触させるステップを含む方法であって、標的核酸は、二本鎖ＤＮＡであり、デアミナーゼドメインは、二本鎖ＤＮＡを脱アミノ化することができる、方法。
１２４．標的核酸のコピーは、インビトロである、パラグラフ１２３に記載の方法。
１２５．標的核酸のコピー中の脱アミノ化ヌクレオチドは、インビトロ反応を介してチミン又はグアニンヌクレオチドに変換される、パラグラフ１２４に記載の方法。
１２６．標的核酸の脱アミノ化コピーを選択手順に付すステップをさらに含む、パラグラフ１２１～１２５のいずれか１つに記載の方法。
１２７．選択手順は、ｍＲＮＡディスプレイ、リボソームディスプレイ若しくはＳＥＬＥＸ又は細胞ベースの選択アッセイを含む、パラグラフ１２６に記載の方法。
１２８．標的核酸のコピー中の脱アミノ化ヌクレオチドは、チミン又はグアニンヌクレオチドに変換され、変換は、標的核酸のコピーの一部又は全ての１つ以上の塩基編集を完了させる、パラグラフ１２５～１２７のいずれか１つに記載の方法。
１２９．標的核酸のコピー中の脱アミノ化ヌクレオチドは、細胞内で標的核酸のコピーをインキュベートし、その後、ＤＮＡ複製／増幅ステップを行うことによってチミン又はグアニンヌクレオチドに変換される、パラグラフ１２３に記載の方法。
１３０．標的核酸のコピーは、細胞内にあり、デアミナーゼドメインと標的核酸のコピーとを接触させるステップは、細胞内へのデアミナーゼドメインの進入を促進することによって達成される、パラグラフ１２３に記載の方法。
１３１．細胞は、動物内にあり、デアミナーゼドメインと標的核酸のコピーとを接触させるステップは、デアミナーゼドメインを動物に投与することによって達成される、パラグラフ１３０に記載の方法。
１３２．標的核酸のコピーは、細胞内にあり、デアミナーゼドメインは、細胞内のトランスジェニック発現構築物によってコードされ、デアミナーゼドメインと標的核酸のコピーとを接触させるステップは、デアミナーゼドメインを細胞内で一過性発現させることによって達成される、パラグラフ１３０に記載の方法。
１３３．対象の細胞内のミトコンドリアＤＮＡ中の１つ以上の核酸を編集することにより、対象のミトコンドリア遺伝病を治療又は予防する方法であって、
パラグラフ１～１１０のいずれか１つに記載の標的化シトシンデアミナーゼ塩基エディターを細胞に導入するステップ
を含み、ミトコンドリアＤＮＡ中の標的核酸は、標的化塩基エディターによって脱アミノ化される、方法。
１３４．標的ヌクレオチド配列中の脱アミノ化ヌクレオチドは、チミン又はグアニンヌクレオチドに変換される、パラグラフ１３３に記載の方法。
１３５．ミトコンドリアＤＮＡ中の１つ以上の核酸は、非病原性形態に編集される、パラグラフ１３３～１３４のいずれか１つに記載の方法。
１３６．脱アミノ化ヌクレオチドは、ｍ．５８３Ｇ＞Ａ、ｍ．６１６Ｔ＞Ｃ、ｍ．１６０６Ｇ＞Ａ、ｍ．１６４４Ｇ＞Ａ、ｍ．３２５８Ｔ＞Ｃ、ｍ．３２７１Ｔ＞Ｃ、ｍ．３４６０Ｇ＞Ａ、ｍ．４２９８Ｇ＞Ａ、ｍ．５７２８Ｔ＞Ｃ、ｍ．５６５０Ｇ＞Ａ、ｍ．３２４３Ａ＞Ｇ、ｍ．８３４４Ａ＞Ｇ、ｍ．１４４５９Ｇ＞Ａ、ｍ．１１７７８Ｇ＞Ａ、ｍ．１４４８４Ｔ＞Ｃ、ｍ．８９９３Ｔ＞Ｃ、ｍ．１４４８４Ｔ＞Ｃ、ｍ．３４６０Ｇ＞Ａ及びｍ．１５５５Ａ＞Ｇから選択される位置にある、パラグラフ１３３～１３５のいずれか１つに記載の方法。
１３７．細胞は、線維芽細胞、リンパ球、膵臓細胞、筋細胞、神経細胞及び幹細胞からなる群から選択される、パラグラフ１３３～１３６のいずれか１つに記載の方法。
１３８．パラグラフ２２～１１０のいずれか１つに記載の標的化塩基エディターを含むか又はそれを発現するベクター。
１３９．改変アデノウイルス（ＡＡＶ）ベクター、レンチウイルスベクター又はウイルス様粒子（ＶＬＰ）である、パラグラフ１３８に記載のベクター。
１４０．標的化塩基エディターは、ベクター内に封入される、パラグラフ１３８又は１３９に記載のベクター。
１４１．デアミナーゼドメインは、ベクター内の標的化塩基エディターを含む、パラグラフ１２０又は１２９～１３７のいずれか１つに記載の方法。
１４２．第１及び第２の部分は、ＴＡＬＥ、ＢＡＴ、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９、Ｃｆｐ１及びジンクフィンガーからなる群から独立して選択されるプログラマブルＤＮＡ結合ドメインをそれぞれ含む、パラグラフ２２～４９のいずれか１つに記載の標的化塩基エディター。
１４３．第１の部分は、ＴＡＬＥであり、及び第２の部分は、ＴＡＬＥであるか、又は第１の部分は、ＴＡＬＥであり、及び第２の部分は、ＢＡＴであるか、又は第１の部分は、ＴＡＬＥであり、及び第２の部分は、ジンクフィンガーであるか、又は第１の部分は、ＴＡＬＥであり、及び第２の部分は、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９であるか、又は第１の部分は、ＴＡＬＥであり、及び第２の部分は、Ｃｆｐ１であるか、又は第１の部分は、ＢＡＴであり、及び第２の部分は、ＴＡＬＥであるか、又は第１の部分は、ＢＡＴであり、及び第２の部分は、ＢＡＴであるか、又は第１の部分は、ＢＡＴであり、及び第２の部分は、ジンクフィンガーであるか、又は第１の部分は、ＢＡＴであり、及び第２の部分は、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９であるか、又は第１の部分は、ＢＡＴであり、及び第２の部分は、Ｃｆｐ１であるか、又は第１の部分は、ジンクフィンガーであり、及び第２の部分は、ＴＡＬＥであるか、又は第１の部分は、ジンクフィンガーであり、及び第２の部分は、ＢＡＴであるか、又は第１の部分は、ジンクフィンガーであり、及び第２の部分は、ジンクフィンガーであるか、又は第１の部分は、ジンクフィンガーであり、及び第２の部分は、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９であるか、又は第１の部分は、ジンクフィンガーであり、及び第２の部分は、Ｃｆｐ１であるか、又は第１の部分は、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９であり、及び第２の部分は、ＴＡＬＥであるか、又は第１の部分は、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９であり、及び第２の部分は、ＢＡＴであるか、又は第１の部分は、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９であり、及び第２の部分は、ジンクフィンガーであるか、又は第１の部分は、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９であり、及び第２の部分は、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９であるか、又は第１の部分は、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９であり、及び第２の部分は、Ｃｆｐ１であるか、又は第１の部分は、Ｃｆｐ１であり、及び第２の部分は、ＴＡＬＥであるか、又は第１の部分は、Ｃｆｐ１であり、及び第２の部分は、ＢＡＴであるか、又は第１の部分は、Ｃｆｐ１であり、及び第２の部分は、ジンクフィンガーであるか、又は第１の部分は、Ｃｆｐ１であり、及び第２の部分は、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９であるか、又は第１の部分は、Ｃｆｐ１であり、及び第２の部分は、Ｃｆｐ１である、パラグラフ５０／１４２に記載の標的化塩基エディター。
１４４．ミトコンドリア中のミトコンドリアＤＮＡ又は葉緑体中の葉緑体ＤＮＡにおける１つ以上の核酸を編集する方法であって、
パラグラフ１～１１０のいずれか１つに記載の標的化シトシンデアミナーゼ塩基エディターをミトコンドリア又は葉緑体に導入するステップ
を含み、ミトコンドリア又は葉緑体ＤＮＡ中の標的核酸は、標的化塩基エディターによって脱アミノ化される、方法。
１４５．ミトコンドリア又は葉緑体は、インビトロである、パラグラフ１４４に記載の方法。
１４６．標的ヌクレオチドは、規定の編集閾値でのデアミナーゼ確率シーケンスロゴによって規定されるコンテキスト特異性をそれぞれ呈示する、パラグラフ１又は２に記載のデアミナーゼドメイン。
本発明は、以下の非限定的な例を参照することによってさらに理解されるであろう。
以下の実施例は、本明細書で特許請求される化合物、組成物、物品、装置及び／又は方法がどのように作製及び評価されるかについての完全な開示及び説明を当業者に提供するために提示されるものであり、これらは、あくまで例示的であることが意図され、本開示を限定することを意図するものではない。
実施例１：ｓｓＤＮＡ及び／又はｄｓＤＮＡに対して活性なシトシンデアミナーゼドメインの生成及び同定
材料及び方法
ゲノミクス及びメタゲノミクスデータベースで利用可能な様々な推定デアミナーゼドメインの体系的な特性決定を実施して、デアミナーゼタンパク質及び塩基エディターの活性を評価した。ｐｆａｍデータベース（ｈｔｔｐｓ：／／ｐｆａｍ．ｘｆａｍ．ｏｒｇ／ｃｌａｎ／ＣＤＡ、このデータベースにおけるタンパク質機能は、一般に、計算によりアノテーションが付けられている）で入手可能なシチジンデアミナーゼ様（ＣＤＡ）クランの各デアミナーゼタンパク質ファミリーからの複数の代表的なドメインを選択した。これらのタンパク質ドメインをコードする配列は、市販の合成リソースを使用して合成され、無細胞インビトロ転写／翻訳システムを使用して発現された。一般に、スクリーニングによって同定されたドメイン／ポリペプチドは、天然タンパク質の一部であるが、単離されたデアミナーゼドメインに対応する配列のみ、ＧＢＬＯＣＫ（商標）遺伝子断片合成システム（ＩＤＴ）を用いて合成された。ｄｓＤＮＡ特異的デアミナーゼは、ゲノム全体に不要な突然変異を導入する可能性があるため、細胞内で発現すると有毒であることが判明したことから、合成インビトロシステムは、これらの酵素の活性を評価するのに効果的であることがわかった。このシステムは、通常、生細胞という状況下で評価される塩基エディター活性の効率的なインビトロ評価を可能にした。続いて、ｓｓＤＮＡ及びｄｓＤＮＡ基質上のデアミナーゼドメインの活性を様々なアッセイ（ＤＮＡシーケンシング又は脱アミノ化アッセイ）を用いて評価し、それらの鎖バイアス及び配列特異性を決定した。この方法の概要を図１に示す。
シーケンシングアッセイのために、ｄｓＤＮＡプラスミドを、所定のＣＤＡドメインを発現するインビトロ翻訳反応物に添加し、３７℃で２時間インキュベートした。二本鎖ＤＮＡ基質（プラスミド又はＰＣＲアンプリコン）をインビトロ翻訳（ＩＶＴ）発現タンパク質と一緒にインキュベートすると、高レベルの脱アミノ化（ＣからＴ又はＧからＡ）変異を同定することができるが、これは、ＰＣＲ増幅（Ｑ５Ｕ又はＫａｐａ Ｕ＋ポリメラーゼなどのｄＵ許容ポリメラーゼを用いて）並びにそれに続く増幅ＤＮＡのＮＧＳハイスループットシーケンシング又はサンガーシーケンシングによって検出することができる。続いて、サンプルを９５℃で短時間加熱することによって反応物を不活性化し、基質をＰＣＲ増幅し、配列決定した（ＮＧＳ又はサンガーシーケンシングのいずれかを用いて）。スクリーニングの追加ラウンド（Ｒ２～Ｒ４）を、最初のラウンドで活性ｄｓＤＮＡ特異的ＣＤＡ（ＭａｆＢ１９及びＳＣＰ１２０１デアミナーゼ）を含むことが判明したサブファミリーで実施し、これにより、追加のｄｓＣＤＡの同定が達成された。
デアミナーゼアッセイの場合、脱アミノ化のためのＵＳＥＲ（ウラシル特異的切除試薬）酵素ベースのアッセイを使用して、基質に対する様々なデアミナーゼドメインの活性を試験した。このアッセイは、シトシン標的残基の脱アミノ化が標的シトシンのウラシルへの変換をもたらすという原理に基づいて機能する。ＵＳＥＲ酵素は、ウラシル塩基を切除し、その位置でＤＮＡ骨格を切断して、ＤＮＡ基質を２つのより短い断片にカットする。ＤＮＡ基質は、一端を色素、例えば、ＦＡＭ標識で標識することができる。鎖の脱アミノ化、切除及び切断時に基質を電気泳動に付すことができ、基質及びそれから放出された任意の断片を、標識の検出により視覚化することができる。ｄｓＤＮＡ基質（Ａ（１５）ＸＡ（１５））が基質として使用され、ここで、Ｘは、基質として示される配列の１つである（例えば、ＡＣと呼ばれる基質は、［Ａ（１５）］ＡＣ［Ａ（１５）］に対応する）。
様々な状況下でｄＣを含有するＦＡＭ標識ｓｓＤＮＡ又はｄｓＤＮＡ基質を使用した。インビトロ翻訳ドメインとのインキュベーション後、ＵＳＥＲ酵素を添加して、脱アミノ化基質を切断した。基質切断は、変性ＴＢＥ－尿素ゲル上で反応を実行することによって分析した。
同定されたｄｓＤＮＡ特異的デアミナーゼのコンテキスト特異性をフリーフローティング形態で体系的に決定するために、ＩＶＴシステム中の考えられるトリプレットヌクレオチド（ＮＮＮ）を全てコードする合成基質に対する活性を検査し、それらの活性をイルミナシーケンシングによって読み取った。ＮＧＳデータから編集頻度＞５０％の部位（シチジンに対応する）を同定し、編集したシチジンにフランキングするヌクレオチドを抽出し、各デアミナーゼの編集コンテキストを表すシーケンスロゴを作成した。この実験で使用したｄｓＤＮＡ基質の配列は、以下の通りであった。
Figure 2024502630000114
 （配列番号７３）
基質には、ＮＧＳライブラリー調製のための下流増幅を容易にするために、ＡＴ単独のアダプターが付加された。
結果
ｓｓＤＮＡ及びｄｓＤＮＡに対するデアミナーゼドメインの活性を脱アミノ化アッセイによって検出した。最初のスクリーニングでは、５５の異なるデアミナーゼをコードする遺伝子をインビトロで発現させ、ｓｓＤＮＡ及びｄｓＤＮＡ基質（Ａ（１５）ＡＣＣＧＣＴＣＡ（１５）；配列番号３９）に対するそれらの活性を決定した（表３）。電気泳動後に観察された切断事象は、表示される基質に対する指定デアミナーゼの活性を示す（図２Ａ～２Ｃ）。デアミナーゼＢＥ１１（配列番号１）、ＢＥ１２（配列番号２）、ＢＥ２８（配列番号３）及びＢＥ４１（配列番号４）は、ｄｓＤＮＡ及びｓｓＤＮＡの両方に対して活性であったのに対して、ＢＥ４７（配列番号５）、ＢＥ５４（配列番号６）、ＢＥ５５（配列番号７）は、ｓｓＤＮＡに対して活性であったことが観察された（図２Ａ、２Ｃ）。
これらの結果に触発されて、上で同定された活性のｄｓＤＮＡ特異的デアミナーゼが属するタンパク質ファミリー（具体的には、ＭａｆＢ１９－ｄｅａｍ及びＳＣＰ１２０１－ｄｅａｍファミリー）から追加のデアミナーゼドメインをさらにスクリーニングした。第２のスクリーニングでは、デアミナーゼアッセイにより追加のデアミナーゼドメインの活性を決定したが、これらのドメインは、ｄｓＤＮＡに対して高い活性のもの：ＢＥ＿Ｒ２＿１８（配列番号１１）、ＢＥ＿Ｒ２＿２７、ＢＥ＿Ｒ２＿２９（配列番号１４）、ＢＥ＿Ｒ２＿３１（配列番号１５）及びＢＥ＿Ｒ２＿４８（配列番号１６）；ＢＥ＿Ｒ２＿１１（配列番号９）、１９（配列番号４５）、２８（配列番号４８）を含んだが、ＢＥ＿Ｒ２＿７（配列番号８）、ＢＥ＿Ｒ２＿１７（配列番号１０）及びＢＥ＿Ｒ２＿２６（配列番号１２）は、ｄｓＤＮＡに対してより低い活性を示した（図２Ｂ）。これにより、ｄｓＤＮＡに対して活性である追加のデアミナーゼドメインが同定され、これらは、ｄｓＤＮＡに対して高い活性を示した。潜在的なｄｓＤＮＡ特異的デアミナーゼのスクリーニングの追加ラウンドを実施した（ラウンドＲ３及びＲ４）。同定されたドメインの生化学的特性評価の結果及び配列の詳細を表３に要約する。
次に、同定されたｄｓＤＮＡ特異的デアミナーゼドメインがある程度の配列特異性を有するかどうかを調べた。デアミナーゼアッセイでは、ｄｓＤＮＡ基質（Ａ（１５）ＸＡ（１５））を含む様々なコンテキストでｄＣを含む異なる基質として使用し、ここで、Ｘは、基質として示された配列の１つである（例えば、ＡＣと呼ばれる基質は、［Ａ（１５）］ＡＣ［Ａ（１５）］に対応する）。使用したｄｓＤＮＡ基質は、以下を含んだ：
１．ＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＴＧＣＧＣＣＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡ（配列番号２６８）
２．ＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＣＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡ（配列番号２６９）
３．ＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＣＣＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡ（配列番号２７０）
４．ＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＧＣＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡ（配列番号２７１）
５．ＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＴＣＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡ（配列番号２７２）
６．ＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＣＣＣＣＴＣＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡ（配列番号２７３）。
唯一の既知のｄｓＤＮＡ特異的デアミナーゼ（ｄｄｄＡ、近年記載された細菌毒素由来のデアミナーゼ）を陽性対照として使用した。
異なるデアミナーゼドメインは、様々な基質上で異なるレベルの活性を示し、酵素がある程度の配列特異性を有することを示す（図２Ｄ）。これらの結果（図２Ｄ）に基づいて、単離されたデアミナーゼに対して以下のような配列特異性又は選好が観察された：
ＢＥ＿Ｒ１＿１１：ＴＣ特異的。それより程度は低いが、ＡＣ及びＧＣ特異的
ＢＥ＿Ｒ１＿１２：ＡＣ及びＧＣ特異的。それより程度は低いが、ＣＣ特異的
ＢＥ＿Ｒ１＿２８：ＴＣ特異的（コンテキスト特異性は、ＢＥ＿Ｒ１＿１１及びＢＥ＿Ｒ１＿４１よりも厳密である）
ＢＥ＿Ｒ１＿４１：ＴＣ特異的。それより程度は低いが、ＡＣ及びＣＣ特異的。
次に、シーケンシングによりＤＮＡ脱アミノ化事象をアッセイした。シーケンシングの結果、デアミナーゼは、ｄｓＤＮＡに対して非常に活性が高く、ある程度の配列特異性を有し、これらの酵素は、さまざまなコンテキストでのｄＣを様々な効率で脱アミノ化することが実証された（図３Ａ～３Ｂ）。
ＮＧＳデータを使用して、同定されたｄｓＤＮＡ特異的デアミナーゼの配列特異性を決定した。手短には、ｄｓＤＮＡプラスミド基質をインビトロ翻訳デアミナーゼと一緒にインキュベートした。続いて、基質をＰＣＲ増幅し、イルミナ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）アダプターとバーコードを第２ラウンドのＰＣＲで追加した。表示される編集頻度を有するＳＮＰ変異体を同定し、各レベルの編集効率（２５％又は５０％編集部位）についてシーケンス頻度ロゴを決定した（図４Ａ～４Ｂ）。これらの結果は、同定されたデアミナーゼが、明確な基質特異性を有し、任意のコンテキスト（ＮＣＮ）下の任意のシチジンを集合的に編集できることを示している。標的配列の状況に応じて、比較的緩い配列特異性又は厳格な配列特異性を有するデアミナーゼを、同定されたデアミナーゼパネルから選択することができる。
ｄｓＤＮＡに対する活性のために、同定されたデアミナーゼは、それらの活性がある程度含有されない場合、生存細胞で発現したときに毒性となり得る。天然系では、これらのタンパク質の活性は、転写レベル若しくは翻訳レベルにおいて又は特定の細胞コンパートメントへの隔離若しくは阻害タンパク質の共発現によって（毒素－抗毒素系の場合など）含有される。毒性タンパク質を不活性な半分に分割することは、ＦｏｋＩ（エンドヌクレアーゼ）及びＤｄｄＡ（ＤＮＡデアミナーゼ）などの毒性タンパク質を発現するために以前から使用されている。共発現すると、不活性な半分はタンパク質の活性形態を再形成することができる。２つの半分の局在化を制御することにより、タンパク質の完全に機能する形態が所望のコンパートメント／位置（例えば、所望のＤＮＡ配列）のみで再形成され、ゲノムの残りの部分に対する毒性タンパク質のオフターゲット活性が最小化されることを確実にすることができる。
これを念頭に置いて、同定されたデアミナーゼの分割バージョンは、細胞に毒性を付与することなくそれらをインビボ適用に使用するために作製された。同定されたデアミナーゼは、（タンパク質の様々なＮ末端及びＣ末端半分を作製するために）それらのコード遺伝子に沿って異なる位置で分割され、（個別の半分として又は相補的な半分が結合されたとき）それらの活性をデアミナーゼアッセイで評価した。図５に示すように、いくつかの分割形態は、それらの相補的な半分（ＢＥ１１：Ｎ３＋Ｃ３、ＢＥ１２：Ｎ２＋Ｃ２、ＢＥ１２：Ｎ４＋Ｃ４）と混合すると活性を示した。
ｄｓＤＮＡ活性を有する同定されたシチジンデアミナーゼドメイン（「ｄｓＣＤＡ」とも呼ばれる）の配列にわたって比較ゲノミクスを実施した。同定されたデアミナーゼの大部分は、ＣＤＡクラン内の２つの主要なファミリー（ＭａｆＢ１９及びＳＣＰ１２０１）に属していた。図７Ａは、ｄｓＣＤＡに対して活性であるＭａｆＢ１９ファミリーのメンバー、ｄｓＤＮＡに対して不活性であるメンバー並びにＭａｆＢ１９ファミリー全体について同定された配列アラインメントロゴ及びシグネチャモチーフを示す。
特定の保存された残基（即ちシグネチャモチーフ）は、実験により試験したＭａｆＢ１９－ｄｅａｍファミリーのｄｓＤＮＡ特異的ＣＤＡに存在したが、このファミリーの不活性メンバーには存在しなかった。これらのシグネチャを使用して、このファミリーの追加メンバー、活性メンバーを予測及び同定することができ、それらは以下を含む：
（Ｍ／Ｌ）Ｐモチーフ
Ｔ（Ｖ／Ｉ／Ｌ／Ａ）Ａ（Ｒ／Ｋ／Ｖ）モチーフ
（Ｙ／Ｆ／Ｗ）Ｇ（Ｖ／Ｈ／Ｉ／Ｒ／Ｋ）Ｎモチーフ
ＨＡＥ＝＞活性部位モチーフ
ＶＤ（Ｒ／Ｋ）モチーフ＝＞ｄｓＤＮＡに対して活性であるＭａｆＢ１９－ｄｅａｍファミリーのほぼ全てのメンバーに存在
ＣＸＸＣモチーフ＝＞標準的なＣＸＸＣ亜鉛結合モチーフ。
同定されたシグネチャモチーフを使用して、このファミリー内の追加のｄｓＤＮＡ特異的デアミナーゼを同定することができる。
ＭａｆＢ１９－ｄｅａｍファミリー内で、このファミリーで同定されたｄｓＤＮＡ特異的デアミナーゼの大部分が位置する枝が見出された（図７Ｂ）。明瞭な枝がこのファミリーの他のデアミナーゼから分岐している（アラインメントツリールート及び他の枝の大部分からの大きい進化距離により示される）。
ＳＣＰ１２０１－ｄｅａｍタンパク質ファミリーについても同様の分析を行った（図８）。実験により試験したＳＣＰ１２０１－ｄｅａｍファミリーのｄｓＤＮＡ特異的ＣＤＡに存在する特定のシグネチャモチーフは以下の通りである：
Ｌ（Ｐ／Ｌ）モチーフ；
（Ｙ／Ｆ／Ｅ／Ｑ）（Ｄ／Ｅ／Ｎ）Ｇ（Ｋ／Ｒ／Ｄ）（Ｔ／Ｋ／Ｎ）ＴＸＧ（Ｖ／Ｌ／Ｔ）（Ｌ／Ｍ／Ｆ）モチーフ；
（Ｐ／Ｓ／Ｔ）（Ｎ／Ｇ／Ｅ／Ｑ）Ｙモチーフ；
（Ｇ／Ｓ）ＨＶＥ（Ｇ／Ａ／Ｑ）＝＞Ｇ又はＳ後、保存された活性部位モチーフ（ＨＶＥ）、続いて（Ｇ／Ａ／Ｑ）；
ＨＮＮモチーフ（又は程度は低いが、（Ｈ／Ｉ）（Ｎ／Ｄ）（Ｎ／Ｈ））；
Ｇ（Ｔ／Ｉ）Ｃ（Ｇ／Ｐ／Ｎ／Ｈ）（Ｙ／Ｆ）Ｃモチーフ＝＞Ｇ（Ｔ／Ｉ）後、標準的なＣＸＸＣ亜鉛結合モチーフ。
Ｃｘ（Ｙ／Ｆ）Ｃは、このファミリーのｄｓＤＮＡ特異的デアミナーゼで一般的なモチーフである。ＢＥ＿Ｒ１＿２８を除いて、このファミリーの全ての活性メンバーは、亜鉛結合モチーフの２つのＣ残基間に厳密に２つのアミノ酸を有する。このファミリーの不活性メンバーは全て、２つのＣ残基間に２つ以上のアミノ酸残基を有する。Ｇ（Ｔ／Ｉ）モチーフ後、このファミリーの活性メンバーの亜鉛結合モチーフが位置する。
（Ｔ／Ａ）ＬＬ（Ｐ／Ｅ）モチーフ；
Ｌ（Ｅ／Ｄ／Ｒ／Ｋ）Ｖ（Ｖ／Ｉ）ＰＰモチーフ；及び
Ｇ（Ｎ／Ｄ）ＸＸＸＰＫモチーフ。
同定されたシグネチャモチーフは、各ファミリー内の追加のｄｓＤＮＡ特異的デアミナーゼを同定するために使用することができる。
ｄｓＤＮＡ／デアミナーゼ相互作用をさらに特性決定するために、ｄｓＤＮＡに結合したデアミナーゼの予測構造モデルを計算した。
ｄｓＤＮＡにドッキングしたＢＥ１２の予測構造は、ＭａｆＢ１９－ｄｅａｍファミリーの代表例として計算した。ＭａｆＢ１９－ｄｅａｍファミリーのシグネチャ残基に対応する位置を決定した。デアミナーゼは、ＤＮＡの副溝及び主溝の両方と相互作用することにより、ｄｓＤＮＡに結合すると思われる。保存された／シグネチャモチーフは、酵素活性部位（ＨＡＥ）とＤＮＡ結合部位の周囲にクラスターを形成する。シグネチャモチーフ（特にＶＤＲ及びＧ（Ｖ／Ｈ／Ｉ／Ｒ／Ｋ）Ｎモチーフ）は、デアミナーゼとｄｓＤＮＡとの相互作用を安定化させると考えられる。ＶＤＲモチーフ中のＲ残基は、ｄｓＤＮＡ骨格と直接相互作用することから、突起又は塩基フリップアウト機構のいずれかによって二本鎖ＤＮＡの巻戻しに関与し得る）。
ｄｓＤＮＡにドッキングされたＢＥ４１の予測構造も、ＳＣＰ１２０１－ｄｅａｍファミリーの代表例として計算した。ＳＣＰ１２０１－ｄｅａｍファミリーのシグネチャ残基に対応する位置を決定した。デアミナーゼは、ＤＮＡの副溝及び主溝の両方と相互作用することによってｄｓＤＮＡに結合すると思われる。保存された／シグネチャモチーフは、酵素活性部位（ＨＡＥ）とＤＮＡ結合部位の周囲にクラスター形成する。シグネチャモチーフ（特に、（Ｙ／Ｆ／Ｅ／Ｑ）（Ｄ／Ｅ／Ｎ）Ｇ（Ｋ／Ｑ／Ｔ）（Ｔ／Ｋ）ＴＸＧ（Ｖ／Ｌ／Ｔ）（Ｌ／Ｍ／Ｆ）、（Ｐ／Ｓ／Ｔ）（Ｎ／Ｇ／Ｅ／Ｑ）Ｙ、ＳＧ及びＨＮＮモチーフは、デアミナーゼとｄｓＤＮＡとの相互作用を安定化させると思われる）。
Figure 2024502630000115
Figure 2024502630000116
Figure 2024502630000117
実施例２：ミトコンドリアゲノム工学のためのタンパク質単独塩基エディターの作製及び同定
ミトコンドリアゲノムの変異によって引き起こされるミトコンドリア遺伝病は、これらの変異の正確な編集を可能にする技術がないために、現時点で治療不能である深刻なヒト疾患の１クラスである。これらの変異の大部分（確認された９３の病原性変異のうちの７８）は一点突然変異の形態であり、塩基編集によって修正される可能性はあるが、ミトコンドリアへの核酸送達の効率的な機構がないため、ＣＲＩＳＰＲに基づくような既存のＲＮＡ誘導技術はミトコンドリアによく適用されていない。ＣＲＩＳＰＲ及び編集のためにＤＮＡ（例えば、テンプレート）又はＲＮＡ（例えば、ガイドＲＮＡ）部分に依存する編集システムの使用における主な制約は、これらの部分を、ミトコンドリア二重膜を介してミトコンドリアルーメン中にシャトルするのに使用することができる機構がないことである。ＲＮＡ誘導システム（ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９など）を用いてミトコンドリアゲノムの編集に成功したことを主張する報告があるが、それらは依然として議論の的となっており、再現性がない。これらの研究のほとんどで提供されたエビデンスは、編集の直接的な証拠（編集された遺伝子座の配列決定）を示すのではなく、間接的（ｑＰＣＲなど）なものである。
（主にＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９のようなＲＮＡ誘導タンパク質に依存する）正確なゲノムエディターがない場合、プログラム可能なタンパク質のみのヌクレアーゼ（ミトコンドリアジンクフィンガーヌクレアーゼ（ｍｉｔｏＺＦＮ）、ミトコンドリアＴＡＬＥ－ヌクレアーゼ（ｍｉｔｏＴＡＬＥＮ）及びミトコンドリア制限酵素（ｍｉｔｏＲＥ））を活用して、細胞培養／患者由来サンプル／動物モデルにおけるミトコンドリアゲノムヘテロプラスミーのレベルをシフトさせた。これらの手法は全て、（スプリット）ヌクレアーゼとプログラマブルＤＮＡ結合ドメインの融合に依存する。ＤＮＡ結合ドメイン（ＺＦ、ＴＡＬＥ、ＲＥ）は、ミトコンドリアゲノムの変異コピー（ＷＴコピーではない）に高い親和性で結合することができるように設計されるため、ミトコンドリアゲノムの変異コピーに優先的に結合して、それを切断し、このようにして、ヘテロプラスミーを所望の（ｗｔ）対立遺伝子にシフトさせる。この手法は、有意なレベルのヘテロプラスミー（ｗｔ及び変異対立遺伝子の両方がかなりの量で存在する）を有する疾患にのみ適用可能であり、現在、疾患に対処するのにあまり効果的ではない。
ｄｓＤＮＡに対する活性のために、完全長ｄｓＤＮＡ特異的デアミンは、細胞内で発現すると有毒である（ゲノム全域に全体的な突然変異を導入する恐れがある）。毒性を管理するために、近年の研究では、ＴＡＬＥＮ及びＺＦＮ並びに他の毒性ドメインにおけるＦｏｋＩヌクレアーゼの場合に以前に使用された戦略、即ち毒性タンパク質を２つに分割する戦略が使用された。次に、デアミナーゼの半分を、ミトコンドリアターゲティングペプチド及びＵＧＩ（修復機構をブロックする）を付加したＴＡＬＥドメインにそれぞれ融合させた。
ＴＡＬＥＮアプローチと同様に、ＴＡＬＥ結合部位は標的部位の両側に設計された。それらの標的に結合すると、それらは、２つのデアミナーゼの半分を一緒にして、デアミナーゼ結合部位の近傍のシチジンを脱アミノ化することができる機能性シチジンデアミナーゼを形成する。
しかし、Ｍｏｋらによって記述されたｄｓＤＮＡ特異的ＤｄｄＡに基づく近年のアプローチの主な制約は、その狭いコンテキスト特異性である。ＤｄｄＡのコンテキスト特異性（Ｍｏｋらの論文の上方のシーケンスロゴに示されるように、ＴＣコンテキストでのみシチジンを編集することができる）のため、公開された塩基エディターは、ヒトで確認された病原性突然変異の４／９３を占めるチミンの前に位置するシチジンのみを編集することができる。
ｄｓＤＮＡ特異的デアミナーゼのパネルを活用することにより、あらゆるコンテキスト（ＮＣＮ：ＡＣＮ、ＣＣＮ、ＧＣＮ、ＴＣＮ）下のシチジンを高効率で編集することができる一連のタンパク質単独塩基エディターが開発された。さらに、標的領域に対するデアミナーゼの活性ウィンドウの調整を可能にすると共に、インビトロ及びインビボで異なるｄｓＤＮＡ基質（核又はミトコンドリアゲノム）を効率的に操作すると共に、正確に編集するための原理を使用した操作ルールが開発された。ミトコンドリアへのガイドＲＮＡの送達のためのＣＲＩＳＰＲに基づく方法の制約並びにｄｄｄＡに基づくアプローチの限定的なコンテキスト特異性のために、本明細書に記載される塩基エディターは、より広い配列コンテキストにおける塩基編集を可能にすることから、ミトコンドリアゲノム工学適用並びに他の膜性細胞小器官における塩基編集に特に適している。
ｄｓＤＮＡ特異的シチジンデアミナーゼをプログラマブルＤＮＡ結合ドメインに融合させることによるｄｓＤＮＡの部位特異的脱アミノ化
遺伝子編集実験は、通常、細胞内で実施されるが、これは、実験のラウンド毎に数日から数週間を要し得る。この時間を短縮し、且つ塩基エディターの使用から生じ得る毒性の問題を回避するために、最初の実験では、インビトロ転写／翻訳（ＩＶＴ）システム（以前には新規ｄｓＤＮＡ特異的デアミナーゼの同定に使用されていた）に基づくインビトロシステムをセットアップして、遺伝子エディターと塩基エディターの性能をインビトロで迅速に検査した（図９）。
手短には、塩基エディターは、デザイナーＴＡＬＥ下流のデアミナーゼドメインをクローニングすることによって作製した。カセット全体をＴ７プロモーターの下流にクローニングし、ＩＶＴ反応の鋳型として使用した。（目的のＤＮＡ結合ドメイン、例えば、デザイナーＴＡＬＥに対する結合部位をコードする）標的をプラスミドにクローニングした後、これをＩＶＴ反応のｄｓＤＮＡ基質として使用した。ＩＶＴシステムで発現すると、塩基エディタータンパク質（例えば、ＴＡＬＥデアミナーゼ融合物）が基質プラスミド上のその標的に結合し、標的プラスミドに編集を導入する。次に、基質プラスミドをＰＣＲ増幅し、編集の位置／頻度をシーケンシング又はＴ７エンドヌクレアーゼアッセイのいずれかによって決定した。
同定されたｄｓＤＮＡ特異的デアミナーゼのサブセットに対するＴＡＬＥ完全長デアミナーゼ融合物の活性を、異なる配列コンテキストを有する異なる基質で試験した。デアミナーゼは、考えられる全てのジヌクレオチドコンテキスト（ＡＣ、ＣＣ、ＧＣ、ＴＣ）に対して活性であり、異なる融合物は、異なる基質に対して異なる活性ウィンドウ及び編集効率を示した（図１０Ａ～１０Ｂ）。
興味深いことに、編集ウィンドウ内で１０ｂｐ周期が観察された。編集は、一部の基質（例えば、ポリＣ又はポリＴＣ）で他の基質よりも顕著であった。最適な編集ウィンドウは、定期的に発生する（１つの二重らせんターンに対応する１０ｂｐ周期で）。これは、デアミナーゼが二重らせんの片側にのみアクセスできることを示唆している。周期的ウィンドウは、これらのデアミナーゼの活性が高すぎるか、又はＴＡＬＥとデアミナーゼコア間のリンカーが柔軟すぎるため、ＴＡＬＥ＿ＢＥ＿Ｒ１＿１１及びＴＡＬＥ＿ＢＥ＿Ｒ１＿１２ではあまり顕著ではない。これは、デアミナーゼがＤＮＡの副溝及び主溝の両方と相互作用することを予測する構造予測モデルと一致し、これを支持するものである。ＴＡＬＥと融合すると、デアミナーゼの移動は片側から制限されるため、デアミナーゼは、二重らせんの片側へのアクセスが、反対側よりも良好になる。
ＤＮＡに結合したＴＡＬＥ－デアミナーゼ融合の予測モデル（ｄｓＤＮＡ特異的ＣＤＡの例としてＢＥ＿Ｒ１＿４１を使用）を計算した。このモデルは、デアミナーゼが、ＴＡＬＥに融合すると、二重らせんの片側に優先的にアクセスできることを示した。ＤＮＡの主溝及び副溝と相互作用するための要件により、これらの実験で観察される活性の約１０ｂｐ周期ウィンドウが要求される。
スプリット塩基エディター設計
遺伝子編集実験は、通常、細胞内で実施されるが、これは、実験のラウンド毎に数日から数週間を要し得る。この時間を短縮し、且つ塩基エディターの使用から生じ得る毒性の問題を回避するために、最初の実験では、インビトロ転写／翻訳（ＩＶＴ）システム（以前には新規ｄｓＤＮＡ特異的デアミナーゼの同定に使用されていた）に基づくインビトロシステムをセットアップして、遺伝子エディターと塩基エディターの性能をインビトロで迅速に検査した。デザイナーＴＡＬＥ下流のデアミナーゼドメインをクローニングすることにより、半分の塩基エディター（ＴＡＬＥ＿Ｌｅｆｔ及びＴＡＬＥ＿Ｒｉｇｈｔと呼ばれる）を作製した。カセット全体をＴ７プロモーターの下流にクローニングし、ＩＶＴ反応の鋳型として使用した。（目的のＤＮＡ結合ドメイン、例えば、デザイナーＴＡＬＥに対する結合部位をコードする）標的をプラスミドにクローニングした後、これをＩＶＴ反応のｄｓＤＮＡ基質として使用した。ＩＶＴシステムで発現すると、塩基エディタータンパク質（例えば、ＴＡＬＥデアミナーゼ融合物）が基質プラスミド上のその標的に結合し、標的プラスミドに編集を導入する。次に、基質プラスミドをＰＣＲ増幅し、シーケンシング又はＴ７エンドヌクレアーゼアッセイのいずれかによって編集の位置／頻度を決定した。
同定されたデアミナーゼの構造データがない場合、スプリットデアミナーゼタンパク質は、ＳＰＥＬＬウェブツールを使用して設計したが、これは、アセンブリ時に機能性タンパク質をもたらす可能性があるタンパク質の位置を予測する。ＶＴシステムで予測されたスプリット半分を共発現した後、脱アミノ化アッセイを行うことによってスプリット形態を試験した。ＢＥ＿Ｒ１＿１１（Ｎ３＋Ｃ３）及びＢＥ＿Ｒ１＿１２（Ｎ２＋Ｃ２及びＮ４＋Ｃ４）を含むいくつかの設計では、ある程度の活性が示された（スプリット半分のいずれかを個別に発現させた場合、活性は全く検出されなかった）。しかし、これらのスプリット変異体の活性は、完全長デアミナーゼよりも有意に低く、ＴＡＬＥ ＤＮＡ結合ドメインと融合したとき、標的領域の有意な編集をもたらさなかった（図５）。
ＭａｆＢ１９－ｄｅａｍファミリーのスプリットデアミナーゼＴＡＬＥ融合物を生成する最初の試みは、これらのデアミナーゼの活性に対する他の要件の可能性を示唆し、スプリットタンパク質を作製するための代替アプローチを見出す動機付けとなった。スプリットタンパク質の設計に際して、目標は、タンパク質がその位置で２つの半分に分割されると、それらの半分のタンパク質は活性を保持しないが、特定の条件下で２つの半分が一緒になると活性が再形成される、目的のタンパク質内の位置を見出すことである。既存のツールを使用する構造データを持たずにスプリットＣＤＡタンパク質を設計する最初の試みは失敗し、タンパク質の構造に関する予備知識なしに、分割タンパク質を作製するための新規且つより普遍的なアプローチが模索された。従来行われていたようにタンパク質をＮ－ｔｅｒとＣ－ｔｅｒの半分に分割するのではなく、完全長タンパク質の不活性（不活性型）コピーを、それ自体では活性を保持しないタンパク質の切断コピーで補完するアプローチを考案した。酵素活性は、酵素の不活性型コピーと酵素の切断コピーが共局在化すると再形成される。共局在化は、例えば、ＤＮＡ分子上に並置結合部位を有するＤＮＡ結合ドメインに２つの部分を融合させることによって達成することができる。
ＢＥ＿Ｒ１＿１２は、初期研究（完全長デアミナーゼとして発現すると強い活性を示した）のために使用し、この条件付きタンパク質共局在化及び活性化の概念を実証するために、ＴＡＬＥ ＤＮＡ結合ドメインに融合させた。
まず、保存されたグルタミン酸（ＡＰＯＢＥＣ及びＡＩＤなどの既知シチジンデアミナーゼとの相同性に基づいて酵素の活性部位であると予測されるＨＡＥモチーフ中のＥ残基）をアラニンに変異させることによって「不活性型」（不活性）ＢＥ＿Ｒ１＿１２（不活性型ＢＥ１２又はｄＢＥ１２）タンパク質を作製した。
デアミナーゼの不活性型コピーを、基質プラスミド中の標的領域の左側に結合するＴＡＬＥ＿Ｌｅｆｔ（ＴＡＬＥ＿Ｌ）ドメインと融合させた。完全長活性ＢＥ＿Ｒ１＿１２も、５アミノ酸毎にＮ－ｔｅｒから順次切断した（切断ドメインは依然としてＨＡＥ活性部位を保持していた）。切断ドメインを、結合部位を挟んで標的領域の反対側に結合するＴＡＬＥ＿Ｒｉｇｈｔ（ＴＡＬＥ＿Ｒ）ドメインＴＡＬＥ＿Ｌと融合させた。２つのＴＡＬＥ－デアミナーゼ融合物半分をＩＶＴシステム内で個別に又は結合させて試験した。スプリットタンパク質設計の従来の手法と異なり、この新しい手法は、タンパク質構造に関する情報を必要とせず、単量体形態ではなく二量体形態で活性になる機能性スプリットタンパク質の作製を可能にし得る（図１１）。
スプリットＴＡＬＥ－ＢＥ＿Ｒ１＿１２塩基エディターを、ＴＡＬＥ結合部位にフランキングするポリＣ含有基質を処理しながらインキュベートし、塩基編集の結果をサンガーシーケンシングによって読み取った。ＴＡＬＥ＿Ｒ＿切断＿ＢＥ１２融合物及びＴＡＬＥ－不活性型＿ＢＥ１２融合物は、ｄｓＤＮＡ ｐｏｌｙＣ含有基質に対して不活性である。しかし、ＴＡＬＥ＿Ｒ＿切断＿ＢＥ１２とＴＡＬＥ＿Ｌ＿不活性型＿ＢＥ１２の両方を添加すると、ＴＡＬＥ結合部位の近傍でデアミナーゼ活性が再形成され、標的領域のシチジンの効率的な編集を可能にする（図１２～１３）。ＴＣコンテキストでのみシチジンを効率的に編集できるｄｄｄＡと異なり、分割ＢＥ１２塩基エディターは、考えられるあらゆるコンテキスト（ＡＣ、ＣＣ、ＧＣ、ＴＣ）を効率的に編集することができるため、コンテキスト非依存性塩基エディターとして機能する。この設計では、活性の最大ウィンドウは、標的領域の中央に向かっている。
実施例３：別の分割塩基エディター構造（１×活性部位ではなく２×デアミナーゼ活性部位を有する高効率スプリット塩基エディターを作製する）
活性部位の１コピーではなく、活性部位の２コピーを標的領域に局在化させ、より高いオンターゲット活性をもたらす、スプリット塩基エディター作製のための別の手法が考案された。これを達成するために、単一の分割部位を用いるのではなく、２つの異なる分割部位をデアミナーゼ活性部位の両側に使用した。分割部位は、個別の断片のいずれも酵素活性を引き起こさないように選択されるが、ＴＡＬＥが標的に結合したとき、上記の部位がＴＡＬＥと融合して、標的領域に局在化すると、互いに補完し合うことができる。各分割部位の大きい方の断片を使用すると、この手法では、従来の手法の１×ではなく、標的上の活性部位（ＨＶＥ）の２×コピーを付与することができるため、より高い編集活性をもたらす。
ＢＥ４１の切断（スプリット）断片
この手法は、ＢＥ４１（ＳＣＰ１２０１－ｄｅａｍファミリーに属するタンパク質及びｄｄｄＡのホモログであり、それらのタンパク質構造及び分割部位は以前に同定された）のスプリット断片を作製することによって実証された。相同性に基づいて、ＢＥ４１中の位置Ｇ４３及びＧ１０８が潜在的な分割部位として同定された。次に、Ｎ－ｔｅｒ及びＣ－ｔｅｒ断片をＴＡＬＥ＿Ｒ及びＴＡＬＥ＿Ｌ ＤＮＡ結合ドメインに融合させ、ＩＶＴシステム内でそれらを個別に又は組み合わせて（Ｎ－ｔｅｒ＋Ｃ－ｔｅｒ断片）発現させた。ＴＡＬＥ結合部位によりフランキングされた１６ｂｐのポリＣを含むプラスミドを基質として使用した（ポリＣ基質の標的領域全体の全ての位置が編集され得ることから、標的領域全体の編集活性／効率をより良好に定量化及び視覚化することを可能にする）。興味深いことに、分割部位の位置は、塩基エディターの活性ウィンドウ（編集される標的領域内の位置で、サンガークロマトグラムの上部に赤い曲線で示される）に影響を与えた。Ｃ＿Ｇ４３断片を含む組合せに対する活性ウィンドウは、１６ｂｐ標的領域の６～１３位であったが、Ｃ＿Ｇ１０８断片を使用した場合、活性ウィンドウは、８～１５位であった。Ｃ＿Ｇ１０８対Ｃ＿Ｇ４３の組合せにおける活性ウィンドウの２ｂｐｓのシフトは、Ｃ＿Ｇ１０８断片内のＣ＿ｔｅｒ断片の長さが短い（従って柔軟性が低い）ためであると考えられる。この特徴を用いて、このクラスの塩基エディターの活性を調整することができる。この実験は、デアミナーゼ内の分割部位の位置が塩基エディターの活性ウィンドウに影響を与え、このクラスの塩基エディターの活性ウィンドウを調整するために活用できることを示している。デアミナーゼタンパク質のさらに別の分割部位の設計は、必要に応じて塩基エディターの活性ウィンドウをさらに調整するのに役立ち得る（図１４）。
ＢＥ４１＿Ｎ＿Ｇ１０８＋ＢＥ４１＿Ｃ＿４３の組合せ（２×活性部位分割設計）
ＢＥ４１＿Ｎ＿Ｇ１０８＋ＢＥ４１＿Ｃ＿４３の組合せ（２×活性部位分割設計）により、ＢＥ４１＿Ｎ＿Ｇ１０８＋ＢＥ４１＿Ｃ＿Ｇ１０８よりも高い編集効率が得られる。１×活性部位の組合せは、ＴＣコンテキスト及びＣＣコンテキストに対して活性であるが、ＡＣ又はＧＣコンテキストに対しては活性ではない。２×活性部位を有する設計は、ＴＣ及びＣＣコンテキストに対して比較的活性であり、ＡＣコンテキストに対しても、ある程度活性であり、ＧＣコンテキストでもわずかに活性である。最大活性は活性ウィンドウの中央で観察される。２×活性部位設計の場合、最大活性は、位置９～１１（１６ｂｐ標的領域）で観察され、中心からの距離だけ低下する。１×活性部位設計の最大活性は、位置１１～１３（１６ｂｐ標的領域）で観察され、距離だけ低下する。赤い星印は、編集部位の位置を示す。星印に対応する位置におけるピークの相対的高さは、編集効率（順鎖上のＣからＴへの変換（図示）又はＧからＡへの変換（逆相補鎖上のＣからＴへの変換））を示す（図１５）。
２×活性部位ＢＥ４１塩基エディター設計
２×活性部位ＢＥ４１塩基エディター設計は、１×ＢＥ４１塩基エディターよりも高い活性を示す。両方のＢＥ４１塩基エディター構造が、対応する活性ウィンドウ内にあるＣＣコンテキスト及びＴＣコンテキストでの編集に優れている。ＢＥ４１は、ポリＴＣコンテキストよりもポリＣを選好する。１×活性部位ＢＥ４１塩基エディターは、ＡＣコンテキストに対して困難を有する。
ＢＥ４１塩基エディターは、逆鎖上のシチジンを脱アミノ化することができ、ＰＣＲ増幅後に順鎖上にＧからＡ変異をもたらす。逆鎖上の活性ウィンドウは、順鎖上のウィンドウの反対側にある。
あらゆるコンテキストでシチジンを編集することができるＢＥ１２塩基エディターと異なり、ＢＥ４１塩基エディターは、ＧＣコンテキスト下でのシトシンの編集に困難を有し、程度は低いが、ＡＣコンテキストでも同様である。これらのコンテキストでは、活性の最大ウィンドウに対応する位置で、ある程度の編集が観察される（２×活性部位設計の場合には左側ＴＡＬＥから１０ｂｐ、１×活性部位設計の場合には左側ＴＡＬＥから１２ｂｐ離れている）。（図１６Ａ～Ｃ）。
実施例４：活性の塩基エディターウィンドウ：活性ウィンドウに影響を与える要因とその調整方法
デアミナーゼスプリット半分を交換すると、編集効率に影響するが、活性ウィンドウの位置は大きく変わらないと判定された。標的領域におけるＤＮＡの方向性が重要であることが証明された。
ＴＡＬＥ＿ＲｉｇｈｔとＴＡＬＥ＿Ｌｅｆｔとの間でデアミナーゼ半分を交換しても、活性ウィンドウの位置は変わらない。即ち、この特定のデアミナーゼ（ＢＥ４１）の場合、デアミナーゼスプリット半分の配向とは独立に、標的領域内の順鎖の右側（左側ではない）のシトシンが優先的に編集される。活性ウィンドウに近い方の結合部位（この場合には右のＴＡＬＥ）を有するＴＡＬＥと、より小さい断片を融合させると、恐らく活性ウィンドウに対する大小の断片のより良好な空間調節のために、より高い効率が得られる。これは、意外な観察結果であるが、デアミナーゼは、ＤＮＡの副溝と主溝の両方を介して、ｄｓＤＮＡと相互作用し、結合するという発見によって説明することができる。この結合要件は、脱アミノ化活性に必要であり、塩基エディターの活性ウィンドウを制限する。ｄｓＤＮＡらせんの各ターンは１０ｂｐであるため、この実験で使用した１６ｂｐの標的領域内では、結合のために、１対の副溝ペアと主溝のみがデアミナーゼにアクセス可能であり、従って、順鎖のターンの半分のみがデアミナーゼ結合要件を満たし、効果的に脱アミノ化される。
スプリット塩基エディターの構造モデリング
計算構造モデルを計算して、再形成されたスプリットＴＡＬＥ－ＢＥ４１とＤＮＡ二重らせんとの結合をモデル化した（図１７Ａ）。このモデルは、逆鎖上のシチジンもデアミナーゼにアクセス可能であり、脱アミノ化を受けるはずであると予測し、これは、ＰｏｌｙＣの代わりにＰｏｌｙＧ基質を使用することにより、正しいと確認された。ＰｏｌｙＣの代わりにＰｏｌｙＧ基質を用いた場合、標的領域の第１の半分の位置が脱アミノ化され（逆鎖上のＣｓ）、提案されたモデルがさらに確認された（図１７Ｂ）。
これらの知見は、ｄｓＤＮＡ特異的デアミナーゼを利用するこのクラスの塩基エディターが、順鎖及び逆鎖に不斉相を伴う周期的な活性ウィンドウを有することを示唆している。
このモデルによれば、ＤＮＡのアクセス可能な側に対するデアミナーゼ活性部位の位置（即ち標的領域内のＤＮＡのアクセス可能な副溝及び主溝）は、活性ウィンドウの位置に影響を与えるであろう。分割部位の位置は、ＤＮＡに対する活性部位の相対位置に影響を与える。データは、リンカーの柔軟性及び長さを変更すると、ＤＮＡのアクセス可能な側に関して酵素活性部位の位置に影響を与える可能性があり、従って、編集ウィンドウと効率に影響を与え得ることを示した。従って、デアミナーゼの本体自体がリンカーとして作用するため、ｄｓＤＮＡへのデアミナーゼのアクセスしやすさに影響を与える可能性がある。これらの知見は、活性ウィンドウを調整すると共に、このクラスの塩基エディターによるバイスタンダー残基の変異を最小化する上で有用性が高い。
塩基エディターの活性の調整ウィンドウ
計算モデル及びデータに基づくスプリットＢＥ４１塩基エディターの活性ウィンドウを（図１８）に示す。ＤＮＡの各鎖の活性ウィンドウに対応するＴＡＬＥ結合部位及び位置が示される。活性ウィンドウは、デアミナーゼの性質、分割部位の位置、使用されるリンカーの種類などに基づいて変化し得る。しかし、デアミナーゼ結合がＤＮＡの副溝及び主溝との相互作用を必要とする場合、周期的及び非対称的な活性ウィンドウが予想される。
異なるｄｓＣＤＡを用いて作製された塩基エディターは、所与の基質に対して異なる活性ウィンドウ及び編集効率を示し（図１９）、さらに異なるデアミナーゼが異なる活性ウィンドウを有することを示している。
ＤＮＡ結合ドメイン間の距離の影響
効率的な編集を確実にするためには、ＤＮＡ結合部位間の最適な距離が必要とされる。スプリットＢＥ４１デアミナーゼの場合、この距離は、１４～１９塩基対である。標的領域（２つのＤＮＡ結合部位間の距離）が、＜１４ｂｐの場合、デアミナーゼは、標的領域によく収って、正しい配向でＤＮＡの副溝及び主溝にアクセスするのに十分なスペースがない。一方、標的領域が、＞１９ｂｐの場合、恐らく２つのデアミナーゼ間の距離が遠くなりすぎるために、編集効率が低下し、それらの相互作用（従って編集効率）は、ｄｓＤＮＡの分子運動及び他の因子に依存的になる。ＤＮＡ結合部位間の最適な距離は、２つのデアミナーゼ半分が効率的に相互作用することができる最適距離を表す。この最適距離は、デアミナーゼ及びＤＮＡ結合ドメインの性質、それらのドメインを結合するリンカー及びデアミナーゼドメイン内の分割部位の位置によって変動する（図２０）。
実施例５：ＤＮＡ結合ドメイン／リンカーの性質は、活性の塩基エディターウィンドウに影響を与える
モデルをさらに確認するために、ＴＡＬＥ ＤＮＡ結合ドメインを、同じＤＮＡ配列にターゲティングさせたＢＡＴ ＤＮＡ結合ドメイン（ＴＡＬＥと同じＤＮＡ結合コードを有する近年記載されたＴＡＬＥ様ＤＮＡ結合ドメイン）で置換した。ＢＡＴリピートは、ＴＡＬＥと同じＲＤＶコード（Ａ：ＮＩ、Ｃ：ＨＤ、Ｇ：ＮＮ、Ｔ：ＮＧ）を使用するが、ＴＡＬＥ及びＢＡＴのＮ末端とＣ末端は異なる。Ｔ０ルール（ＴＡＬＥ結合部位は、厳密にＴで開始しなければならない）に従うＴＡＬＥと異なり、ＢＡＴ Ｎ末端ドメインは、結合に対してより柔軟であり、ＢＡＴ結合部位は、４つのヌクレオチドのいずれかによって開始することができる。ＢＡＴのＣ末端は、ＴＡＬＥと非相同的であり、より短い（この実験で用いるＴＡＬＥの４１ａａに対して、ＢＡＴａでは３０ａａ）。
ＴＡＬＥドメインの１つを同義のＢＡＴで置換すると、活性ウィンドウが短くなり、活性ウィンドウは、ＴＡＬＥドメインの方にシフトした（図２７Ａ～Ｂ）。活性ウィンドウが短いということは、ＢＡＴ Ｃ－ｔｅｒの柔軟性が低く、且つ／又はその長さが短いため、活性デアミナーゼが、二重らせん上で、より短い期間で再形成されることを示唆している。両ＴＡＬＥドメインを同義のＢＡＴで置換すると、恐らくＢＡＴの短いＣ－ｔｅｒドメインが、デアミナーゼ半分の相互作用を可能にするのに十分な長さ／柔軟性ではなかったため、塩基編集活性が完全に無効になった。ＢＡＴ－ＴＡＬＥ対の活性は、ＨＥＫ２９３細胞で構築物を発現させ、Ｔ７エンドヌクレアーゼアッセイによる編集の結果を評価することによってさらに検証した（図２７Ｂ）。
この実験では、２つの主要な点を実証した：
ｉ）ＢＡＴ（及び恐らく他のＴＡＬＥ様タンパク質）は、このクラスの塩基エディターでＴＡＬＥの代替物として使用することができること；並びに
ｉｉ）活性ウィンドウは、デアミナーゼドメインに融合したＤＮＡ結合ドメインのタイプに依存し、デアミナーゼ半分とＤＮＡ結合ドメインとの間のリンカーの配列／長さを変更することによって調整され得ること。
デアミナーゼドメインのＣ末端ドメインは、その柔軟性及び長さがデアミナーゼ半分同士及びＤＮＡとの相互作用に寄与するため、リンカーの一部と見なすべきである。この識見は、塩基エディターの活性ウィンドウを調整すると共に、標的領域におけるバイスタンダーＣ残基の変異を回避するために、ウィンドウの範囲を狭めるのに有用である。
ＴＡＬＥ／ＢＡＴ ＤＮＡ結合ドメインペアを有するＤＮＡ結合部位間の距離の影響
ＤＮＡ結合ドメインの性質は、塩基エディターの活性ウィンドウに影響を与える。ＢＥ４１の場合、左及び右ＤＮＡ結合ドメインの両方としてＴＡＬＥを使用すれば、効率的な編集で、より広い活性ウィンドウが達成される：
左側ＴＡＬＥを同義のＢＡＴドメインで置換すると、より狭い活性ウィンドウで、効率的な編集を達成した；
右側ＴＡＬＥをＢＡＴで置換すると、活性ウィンドウが小さくなったが、これは、編集効率が低下するという代償を伴なった。
これらのデータは、ＤＮＡ結合ドメインの性質（即ちＤＮＡ結合ドメイン及びデアミナーゼリンカー、例えばＤＮＡ結合ドメインのＣ－ｔｅｒドメインの性質）が、このクラスの塩基エディターの設計における重要な要素であり、恐らく活性デアミナーゼが効果的に再形成され得る標的領域内の区域を制限することにより、活性ウィンドウ及び編集効率に影響を与えることを示している。この機能は、このクラスの塩基エディターにおける重要な設計要素であり、要件（病原性突然変異の修正など）に基づいて、より広い又はより狭い活性ウィンドウを達成すると共に、編集効率を調節するように調整することができる１つのパラメーターである。編集ウィンドウの調整は、標的領域内のオフターゲット（バイスタンダーＣ残基）を回避するために重要である。（図２１Ｂ）
実施例６：デアミナーゼの移動の弛緩による塩基エディターの活性ウィンドウを拡大
ＤＮＡ結合ドメインによって柔軟性の欠如が起こると、活性デアミナーゼの再形成及びＤＮＡ二重らせんへのデアミナーゼのアクセスが制限されるかどうかを評価した。潜在的に、相互作用の弛緩は、ＤＮＡへのデアミナーゼのアクセスを促進し、活性ウィンドウを拡張する可能性がある。
この仮説を検証するために、ＴＡＬＥ融合物を含むか又は含まないスプリットデアミナーゼの末端に相補的なコイルドコイルドメインを付加し、これらの修飾塩基エディターの活性を検査した。図２２に示すように、コイルドコイルの存在下でＴＡＬＥの１つを置換又は除去すると、活性ウィンドウが拡張されたが、これは、結合したＤＮＡ結合ドメインを除去することによってデアミナーゼ半分の１つを弛緩すると、デアミナーゼの活性ウィンドウが、除去されたＴＡＬＥ方向に向かって拡張するのを助け得る（即ち右側ＴＡＬＥを除去すると、活性ウィンドウの右側への拡張を招き、左側ＴＡＬＥを除去すると、活性ウィンドウが左側への拡張を招く）ことを実証するものである。
両方のＴＡＬＥを同時に除去すると、予想された通り、特異性の喪失により、編集は、検出限界未満まで下降した。これらの結果は、編集ウィンドウが、ＴＡＬＥによってデアミナーゼ半分に課せられた制限により制約されることを実証する。
実施例７：塩基エディターの活性ウィンドウの移動による、オンターゲット活性の調整及びバイスタンダーオフターゲットの最小化
塩基編集により変異を導入する際、多くの場合、標的化Ｃ残基の編集効率を最大化しながら、標的領域近傍のバイスタンダーＣｓの変異を最小化することが望まれる。
Ｍｔ－ＣＢＥ塩基エディターの活性ウィンドウを規定するルールを見出した後、病原性ミトコンドリア変異の修正に対応する変異（Ｃ６５８９からＴ変換に対応する、マウスミトコンドリアのｍＣｏｘ１ Ｖ４２１Ａ）を設置することができる塩基エディター（バイスタンダーＣ残基（Ｃ６５９３）のオフターゲット変異を最小化する）を設計した。
この目的のために、１ｂｐシフトを用いて、ｍＣｏｘ１標的領域をコードする複数のプラスミド基質を調製した。Ｃ６５８９残基はＧ残基（ＧＣコンテキスト）の前に位置するため、ＧＣコンテキスト内でシチジンを編集することが以前に実証されているＢＥ１２塩基エディターを選択した（注：ｄｄｄＡは、ＧＣ含有基質に対して活性がない）。２つの非可変結合部位内の標的領域をスライドさせることにより、異なるＤＮＡ配列に結合する新しい塩基エディターの作製を必要とすることなく、塩基エディターの活性ウィンドウ内の標的塩基の位置を評価及び最適化した。図２３Ａ～２３Ｂに示すように、Ｃ６５８９の標的編集の最大値は、このＣ残基が左側ＴＡＬＥ結合部位から１０ｂｐ（二重らせんの１ターンに相当）離れているときに発生するが、これは、上記の塩基エディターアーキテクチャでは、デアミナーゼがこの位置でｄｓＤＮＡに良好なアクセスを有することを示している。標的残基が両方向で１０位から離れると、活性が下降するが、標的残基が右側に移動すると下降が急激になる。Ｃ６５９３の場合にも同様の傾向が観察され、この残基が標的ウィンドウ内の１４位を通過すると、脱アミノ化活性は検出限界を下回る。
データ：
ｉ）病原性変異に関連するＧＣコンテキスト内のＣ残基の効率的且つ標的化された編集を実証し；
ｉｉ）ＢＥ１２塩基エディターの活性ウィンドウと、その活性ウィンドウを調整する方法を記述すると共に；
ｉｉｉ）病原性Ｃ６５９３変異を編集するための塩基編集アーキテクチャを提供し、標的塩基を左側ＴＡＬＥ結合部位から１０塩基対離して配置することにより、オフターゲットの最小化をもたらす。
同様の標的スライディングアプローチは、複数のＤＮＡ結合ドメイン及び塩基エディターの作製を必要とすることなく、他の塩基エディターの編集効率を最適化し、他の塩基エディターのバイスタンダーオフターゲットを最小化することができる。
概要：塩基エディター設計
塩基エディターの活性ウィンドウ及び編集効率に影響を与える様々なパラメーターは、以下の通りである。
１．ＤＮＡ結合ドメインの性質
異なるタイプのプログラム可能なｄｓＤＮＡ特異的ＤＮＡ結合ドメイン（ＴＡＬＥ、ＺＦ及びＢＡＴを含む）を使用して、これらの塩基エディターを作製する際の特異性を提供できることが証明されている。
ＤＮＡ結合ドメインの性質は、活性ウィンドウの位置及び範囲に影響を及ぼすことも証明されている。ｄｓＤＮＡ特異的デアミナーゼには現在、いくつかの固有の制限があること（例えば、ＺＦは、全ての可能な標的に対して設計することはできず、ＴＡＬＥ及びＺＦ、さらに恐らくＢＡＴも、他の標的よりもいくつかの標的に結合するなど）を考慮すると、任意の所与の標的について、塩基エディターの性能を最適化するために、デアミナーゼの性質に関していくつかの最適化が必要となり得る。
２．ｄｓＤＮＡ特異的デアミナーゼの性質
使用されるデアミナーゼドメインの性質は、シチジン塩基が編集され得る配列コンテキストに影響を及ぼす。以前公開されたｄｄｄＡデアミナーゼデータは、ｄｄｄＡデアミナーゼがＴＣコンテキスト内でのみＣｓを編集できることを示している（Ｍｏｋ ｅｔ ａｌ．）。
ここに提示されるデータは、様々なコンテキスト内でシチジンを編集することができる様々なデアミナーゼを特性決定する。このデアミナーゼのパネルを集合的に使用して、考えられるあらゆるコンテキスト（ＡＣ、ＣＣ、ＧＣ、ＴＣ）でシチジンを編集することができる。所与の標的に対して最大のオンターゲット編集と最小のオフターゲット編集を可能にするデアミナーゼを選択することができる。デアミナーゼの性質は、順鎖又は逆鎖のいずれに対する活性ウィンドウの位置及び区間にも影響を与えることが実証されている。
３．分割部位の位置／性質
データは、分割部位の位置が、順方向と逆方向の両方に対する塩基エディターの活性ウィンドウ（の位置及び範囲）に影響を与えることを示している。異なる分割位置を使用して、デアミナーゼの活性ウィンドウを調整することができる。分割塩基エディターを作製するための２つの設計が考案され、提供される：
ｉ．最初の設計戦略は、デアミナーゼの「不活性型」／不活性な、完全長コピーを一方のＤＮＡ結合ドメインと融合させ、ＤＮＡ結合ドメインの他方のコピーのインタクトな活性部位とデアミナーゼの短縮型コピーを融合させる（概念実証としてＢＥ１２を使用した）ステップを含む。デアミナーゼの２つのコピー（不活性型又は短縮型）のいずれも活性ではない（個別に又はＤＮＡ結合ドメインへの融合物として）。しかし、それらが標的ＤＮＡ上で一緒にされると、それらは互いに補完し合い、デアミナーゼ活性を再形成することができる（この一般的な設計は、それらの構造についての知識がなくても、分割バージョンを他の酵素にするためにも使用することができる）。この設計では、酵素の不活性型コピー（不活性化された活性部位を含む）は、酵素の短縮型コピー（機能性活性部位を有するが、１つ以上の必要な構造要素を欠いている）の構造要素を補完する。この手法は、その活性のために二量体化を必要とする分割タンパク質の製造にも使用することができる。
ｉｉ．第２の設計戦略は、単一タンパク質の２つの別々の分割部位から得られた、より大きい断片を含む（ＢＥ４１は、概念実証として使用した）。２つの断片（即ちＮ及びＣ末端で切断された重複断片）のいずれも個別に活性ではないが、ＤＮＡ結合ドメインによってそれらが標的にもたらされると酵素活性を再形成する。この設計では、各断片は、他方の断片に欠けている構造モチーフを補完し、標的上に共局在化された２つの活性部位が存在することから、より高い酵素活性が達成される。
前述した手法（ｉ）及び（ｉｉ）は、構造データに依存せず、タンパク質構造へのアクセスなしに適用することができ、それらの活性のために二量体又は多量体形成を必要とする分割タンパク質の製造を可能にし得る。これらは、タンパク質が単一の部位で、重複しないＮ末端及びＣ末端に分割される従来の手法とは対照的である。従来の手法でスプリットタンパク質を設計するためには、多くの場合、構造データが必要とされる。さらに重要なことに、タンパク質の１コピーのみを標的に対して有効に再形成することができるため、二量体化又は多量体化を必要とするタンパク質は、従来の手法を用いて分割バージョンにすることができない。
４．リンカーの性質
リンカーの長さ及び性質は、二重らせんに沿ってデアミナーゼ活性を再形成することができるｄｓＤＮＡ上の領域を許可／制限することにより、活性ウィンドウの位置及び範囲に影響を与え得ることが実証されている。
ＤＮＡ結合ドメイン及びデアミナーゼドメイン中に存在する可能性があり、リンカーに隣接して結合する非必須配列は、リンカーの延長として考慮されるべきであることに留意すべきである。例えば、天然に存在するＴＡＬＥ及びＴＡＬＥ様タンパク質は、それらの結合親和性に影響を与えることなく、それらのＣ－ｔｅｒドメインにおける切断を許容することができる。ＤＮＡ結合ドメイン又はデアミナーゼドメインの本体の一部である非必須アミノ酸は、リンカーの延長と見なすべきであり、それらの組成（長さ／柔軟性）は、編集効率及び塩基エディターの活性ウィンドウの調整のために調整することができるパラメーターとして機能し得る。
５．ＤＮＡ結合ドメイン間の距離
標的領域上の活性ウィンドウの位置に影響を与える別のパラメーターは、ＤＮＡ結合因子を分離する距離である。最適な活性を達成するために、２つの結合部位間の距離が特定の範囲内にある必要があることが実証されている：距離が短すぎると、恐らくｄｓＤＮＡへのデアミナーゼ半分が立体的に妨害されるため、最小限の編集が起こるか又は編集が全く起こらず；一方、距離が遠すぎると、デアミナーゼ半分の効率的な濃度が低下し、デアミナーゼ半分の相互作用の効率が低下する。
検証した塩基エディターデザインの場合、活性の最適なウィンドウは、１４～２０ｂｐであることが判明した。異なるタイプのＤＮＡ結合ドメイン／デアミナーゼ／リンカーを使用すると、最適な距離がわずかに異なる可能性がある。この範囲を下回ると、デアミナーゼのｄｓＤＮＡへのアクセスが立体的に妨害されるため、効率的な編集を達成するには、最低１ターンのｄｓＤＮＡ（１０ｂｐ）の距離が必要になると考えられる（図２４）。
実施例８：Ｍｔ－ＣＢＥ塩基エディターを用いたミトコンドリアゲノムの編集
スプリットＢＥ１２塩基エディターの活性を実証するために、ミトコンドリアｈＮＤ１遺伝子を標的とするＴＡＬＥスプリットデアミナーゼ融合物をＵＧＩ（ミトコンドリアウラシルＤＮＡグリコシラーゼの活性を制限するため）及びＧＦＰ（左側ＴＡＬＥ融合物の場合）及びｍＫａｔｅ（右ＴＡＬＥ融合物の場合）と融合させ、構築物をＨＥＫ２９３Ｔ細胞株に同時トランスフェクトした。細胞を３日後に回収し、編集結果をＴ７エンドヌクレアーゼアッセイによって評価した（図２５Ａ～２５Ｂ）。
スプリットＢＥ１２対ＢＥ４１塩基エディターの活性ウィンドウを、ＨＥＫ２９３ミトコンドリアのｈＮＤ１標的の編集について比較した。ＢＥ１２エディターは、より狭い活性ウィンドウを示すのに対して、ＢＥ４１エディターは、より効率的な編集及びより広い活性ウィンドウをもたらす。両方の塩基エディターの活性ウィンドウは、インビトロ実験で観察された編集ウィンドウと一致する。ＢＥ１２エディターの活性ウィンドウが狭いことを考慮すると、このエディターは、バイスタンダーオフターゲット編集の最小化が要望される場合に適している（図２６）。
実施例９：代替ＤＮＡ結合ドメイン（ＴＡＬＥ、ＢＡＴ、ＺＦ）の使用
ジンクフィンガー（ＺＦ）、ＴＡＬＥ及びＴＡＬＥ様（ＢＡＴ）タンパク質を含むいくつかの代替ＤＮＡ結合因子を、Ｍｔ－ＣＢＥを用いた塩基編集での使用について評価した。
ジンクフィンガー
ジンクフィンガー（ＺＦ）をＤＮＡ結合因子として評価した。各ＺＦリピートは、ＴＡＬＥ及びＴＡＬＥ様タンパク質の場合には１リピート当たり１ヌクレオチドであるのに対して、３ヌクレオチド（トリプレット）を認識する（リピートが少ないほど、細胞中で安定している可能性がある）。ＺＦは、ＴＡＬＥ及びＴＡＬＥ様よりも小さい（２つのＺＦ－ＢＥをベクター内に収めることができる）ため、ＡＡＶによる遺伝子送達の候補として適しているが、ＺＦは、特定の所与の標的に対して設計することはできない（考えられる６４のトリプレットヌクレオチドがあるが、それらのうちの約５０のみを既存のＺＦによりターゲティングすることができる）。
ＴＡＬＥ及びＴＡＬＥ様タンパク質
ＴＡＬＥ及びＴＡＬＥ様タンパク質も評価した。これらは、ＴＡＬＥと同じ二ヌクレオチド結合コードを有する反復ＤＮＡ／ＲＮＡ結合ドメイン（その多くは、依然として特徴付けられていない）である：
ＴＡＬＥ（Ｔ０ルール。天然のＮ－ｔｅｒドメインを有するＴＡＬＥは、効率的な結合のために結合部位の先頭にＴを必要とする。ＴＡＬＥ Ｎ－ｔｅｒの変異型は、他のヌクレオチドに対して緩い特異性を有するように進化している）；
ＲｉｐＴＡＬ（Ｇ０ルール。結合部位の最初の塩基は、Ｇでなければならない）；
ＢＡＴ（緩い結合。結合部位は、任意のヌクレオチドで開始することができる）；
ＭｏｒＴＬ（同定されたメタゲノム配列）；
他の多くの特徴付けられていないＴＡＬＥ様タンパク質がゲノミクスデータベースに存在する；
通常、リピートは、交換可能である（１つ又はいくつかのＴＡＬＥリピートをＴＡＬＥ様リピートで置換することができ、それらは同じ標的に結合する）。
ＢＡＴ
ＢＡＴは、ミトコンドリアで機能性であり、塩基エディターの設計のための代替ＤＮＡ結合ドメインとして使用することができる。前述のように、ＢＡＴを使用すると、塩基エディターの活性ウィンドウを調整し、バイスタンダーオフターゲットを最小化することができる。さらに、ＢＡＴの結合特異性は、ＴＡＬＥ及びＺＦよりも緩い。ＢＡＴは、結合部位の先頭にＴを厳密に必要とするＴＡＬＥと異なり（Ｔ０ルール）、より緩いＮ末端結合特異性を有し、Ｔ０ルールに従わない。
ＢＡＴの結合部位は、Ｔだけでなく、任意のヌクレオチドから開始することができる。ジンクフィンガーは、配列のサブセットのみをターゲティングすることができる（全トリプレットヌクレオチドがＺＦリピートの標的になるわけではない）。ＢＡＴは、その緩い特異性と、ＴＡＬＥのように単純な同義コードにより、塩基エディターの設計のために注目される代替ＤＮＡ結合ドメインを提供する。
実施例１０：ｄｓＤＮＡ塩基編集によりターゲティングすることができる配列の範囲の拡大：ＴＡＬＥ Ｎ末端、ＢＡＴ及びＺＦの操作
塩基エディターを設計する場合、ＤＮＡ結合部位と標的塩基の近接性が、塩基エディターの活性ウィンドウ内（例えば、１６ｂｐの標的領域で左側ＴＡＬＥ結合部位から約１０ｂｐ離れ、右側ＴＡＬＥ結合部位から約６ｂｐ離れている）内にあるという要件は、ＤＮＡ結合部位の位置に追加の制約を課す。例えば、ＢＥ１２塩基エディターで最大の塩基編集を達成するためには、左側結合ドメイン間の距離を９～１１ｂｐにすべきである。さらに、ジンクフィンガー及びＴＡＬＥなどのプログラマブルＤＮＡ結合ドメインには、特定の塩基をターゲティングすることを困難にし得るいくつかの固有の制限がある。ＺＦの場合、約１５／６４のトリプレットヌクレオチドにはそれらを認識できるＺＦリピートがないため、配列のサブセットをターゲティングさせることはできない。これらの１５ヌクレオチドリピートのいずれかが、潜在的な結合部位の近傍に存在すると、ＺＦを設計することはできない。一方、Ｔ０ルールと、結合部位の最初の数ｂｐの性質を含む他のいくつかの要因は、ＴＡＬＥによる効率的な結合にとって重要であり、所与の標的全てについては満たされない可能性がある要件である。
これらの制限は、ｍ６５８９Ｃ＞Ｔ変異を導入する塩基エディターを設計する上で課題となった。この標的塩基を取り巻く配列コンテキストを考慮すると、高い結合スコアを提供するＺＦ又はＴＡＬＥを設計することはできなかった。それでも尚、低スコアのＺＦ及びＴＡＬＥを用いる一連の塩基エディターを実験的に設計及び検証したが、恐らくＤＮＡ結合ドメインの結合親和性が低いために、標的塩基の高い編集効率は観察されなかった。好適なコンテキスト（例えば、天然ＴＡＬＥドメインの場合、標的塩基からの最適な距離にＴ０が存在する）を欠く標的に対する塩基編集は、２つの並行手法によって達成された：
１）Ｎ末端に変異の弛緩を伴うＴＡＬＥの使用；及び
２）ＢＡＴの使用。
第１の手法では、Ｎ末端に変異の弛緩を有するＴＡＬＥを用い、Ｔ０特異性を緩めて、Ｔ以外のヌクレオチドで開始する結合部位のターゲティングを可能にするＴＡＬＥのＮ末端変異を事前に同定した（以下の表４を参照されたい）。これらの変異の弛緩をＴＡＬＥタンパク質に組み込むことで、より高い結合スコアを有するＴＡＬＥを設計することができ（矢印は、結合部位の位置を示す）、これを標的ヌクレオチドの編集に使用した（図２３Ａ～２３Ｂ）。
Figure 2024502630000118
ＴＡＬＥの代わりにＢＡＴを使用する第２の手法では、ＴＡＬＥと異なり、ＢＡＴは、その標的部位の出発ヌクレオチドに明らかな制限がないことが予備研究で明らかにされた。この緩和された特異性は、それらが標的とすることができるＤＮＡ配列の範囲を大幅に拡大する。第２のアプローチとして、比較的高い結合スコアを有するＢＡＴを設計し、Ｃ６５８９Ｔ変異をインストールすることができた（図２７Ａ～２７Ｂ）。
さらに、本発明者らは、ＴＡＬＥの代わりに、ＺＦをＤＮＡ結合ドメインとして使用できることを実証した（図２８）。ＤＮＡ結合ドメインのタイプを変更すると、塩基エディターの活性ウィンドウが変化するが、これは、ＤＮＡ結合ドメインとそのＣ末端がデアミナーゼドメインを制限し得ることをさらに示唆している。この知見を利用して、これらのデアミナーゼの活性ウィンドウを調整し、バイスタンダーオフターゲットを低減することができる。サイズが小さいため、ＺＦベースのエディターは、ＡＡＶ送達に魅力的である。
実施例１１：ＺＦ結合ドメインを用いた単一のＡＡＶ塩基エディター設計
ＴＡＬＥとＢＡＴは比較的大きいタンパク質であるため、これらのドメインをＤＮＡ結合ドメインとして使用する場合、スプリット塩基エディターの２つの半分の一方のみが単一のアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター内に収まる。これに対して、ＺＦは比較的小さいＤＮＡ結合ドメインであることから、塩基エディターの両半分を単一のＡＡＶ内に収めることが可能である（そのＬＴＲリピート間に約４．５ｋｂのカーゴを収容することができる）。
スプリットＺＦ－デアミナーゼの両半分を単一のＡＡＶに収容するための２つの異なる手法を検証した：
１）Ｐ２Ａペプチド（翻訳スキップを経て、真核生物における同じ転写産物からの複数のタンパク質のポリシストロン発現を可能にする）；及び
２）内部開始部位として機能し、哺乳類細胞における転写物のバイシストロン発現を可能にする、内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）。
複数回の試みにもかかわらず、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）でＰ２Ａ構築物をクローニングすることは、不可能であり（得られた全てのコロニーには、タンパク質を非機能性にする不活性化変異（フレームシフト又は終止コドン）が含まれていた）、これは、フレーム内スプリットデアミナーゼの基本的／潜在性発現でさえ細胞に有毒であることを示唆している。
この設計では、デアミナーゼのＮ－ｔｅｒ及びＣ－ｔｅｒが単一のポリペプチドに翻訳されることから、発現すると、細胞に対して毒性の機能性ｄｓＤＮＡ特異的デアミナーゼを自発的に再形成することができる。
これに対して、ＩＲＥＳ設計では、２つの分割された半分は、２つの別々のポリペプチド鎖として発現され、それらが結合するＤＮＡ結合ドメインによって規定される標的領域の近傍でのみ機能性デアミナーゼを共局在及び再形成することができる（翻訳終結を確実にするためにＩＲＥＳの前に終止コドン（ＴＡＡ）がある）。この構築物をクローニングして、配列検証し、哺乳類細胞のミトコンドリアにおけるその活性を確認することができた。ＩＲＥＳベクターをＨＥＫ２９３ ＡＡＶｐｒｏ細胞株（Ｔｅｋｎｏｖａ）を用いてＡＡＶ２キャプシドにパッケージングし、ウイルス粒子を使用して、表示されるＭＯＩでＨＥＫ２９３細胞を形質導入した。細胞を２週間後に回収し、ｈＮＤ１遺伝子座の編集をＴ７エンドヌクレアーゼアッセイによって評価した。（図２９Ａ～２９Ｂ）
実施例１２：マウスＮＩＨ３Ｔ３及びＥＳ細胞株におけるミトコンドリアゲノムの編集
マウスＮＩＨ３Ｔ３細胞株における塩基編集は、ＮＩＨ３Ｔ３細胞におけるｍＮＤ１遺伝子座を編集することにより実施した。スプリットＢＥ４１塩基エディターの半分をコードするベクターは、選択なしで、トランスフェクション又は形質導入（ＡＡＶ２キャプシド）のいずれかでＮＩＨ３Ｔ３に送達された。Ｔ７エンドヌクレアーゼアッセイを用いて、編集の結果を検出した。編集は、Ｔ７エンドヌクレアーゼアッセイによってトランスフェクションされた細胞でのトランスフェクションから５日後に検出された。ＡＡＶ形質導入の場合、Ｔ７エンドヌクレアーゼアッセイにより形質導入の２週間後に編集が検出された。観察されたＮＩＨ３Ｔ３細胞株への送達効率は＜２０％であり、これは、大部分が、ＨＥＫ細胞と比較して比較的低い見かけ編集効率を占める。
マウスＮＩＨ３Ｔ３細胞株における塩基編集の実証に成功すると、これらの編集のマウスＥＳ細胞への導入がさらに実証された。（図３０）
マウスＥＳ細胞への病原性ＮＤ１ Ｅ２４Ｋ変異（ｍ．２８２０Ｇ＞Ａ）の導入
実験計画：
ピューロマイシン選択マーカーを有するスプリットデアミナーゼ構築物（ＴＡＬＥ－ＢＥ－左及びＴＡＬＥ－ＢＥ－右ターゲティングマウスＮＤ１遺伝子）をエレクトロポレーションによりＣ５７ＢＬ／６Ｊ胚性幹（ＥＳ）細胞に送達した。
形質移入体をピューロマイシンの存在下で１週間にわたって選択した後、クローン集団を採取して、９６ウェルプレートの個々のウェルに移し、それらの全ＤＮＡを抽出した。
遺伝子特異的プライマーを用いて標的領域を増幅し、イルミナ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）アダプターを第２ラウンドのＰＣＲによってアンプリコンに添加した。アンプリコンは、イルミナＭｉＳｅｑ（２×１００ｂｐペアエンド）によって配列決定した。リードを逆多重化し、ペアリードをマージした後、Ｇｅｎｅｉｏｕｓ Ｐｒｉｍｅの変異／ＳＮＰ分析モジュールによって分析した。
陰性（ＧＦＰ処理）対照では、ＮＧＳによって検出限界（０．１％）を超える変異は検出されなかった。
塩基エディター構築物で処理した細胞では、オンターゲット編集（ｍ．２８２０Ｇ＞Ａ）を有する対立遺伝子が主な変異体（５６．４３％）を構成した。非常に低いレベル（０．１２％）のバイスタンダー変異（ｍ．２８１７Ｇ＞Ａ）も検出された。検出限界を超えるインデル（挿入／欠失）は検出されなかった（図３１Ａ～３１Ｂ）。
概要：ゲノム工学適用のための塩基エディター
このデータは、バイスタンダー編集をほとんど伴わずに、コンテキスト特異的編集を可能にするゲノム工学のための頑健なシステムを確立し、これを使用して、ミトコンドリアゲノムと核ゲノムの両方を編集することができる。
ミトコンドリアゲノム編集は、癌、老化及び他の遺伝病で多くの意味を有する。ミトコンドリアゲノムの操作並びに順遺伝学研究の実施を可能にする遺伝子ツールがない場合、ゲノム編集のために記載されたシステムにより、これまで相関研究に限定されていた遺伝病の理解を深めることができる。開示される塩基エディターは、これらの疾患におけるミトコンドリアの作用を明解に見抜くと共に、適切な治療法を開発するために、順遺伝学によるミトコンドリア変異の作用の研究を促進する。
類似の手法を使用して、天然の多様性をマイニングするか、又はｄｓＤＮＡに対して活性であるアデノシンデアミナーゼ（ＡＤＡ）を進化させることにより、二本鎖ＤＮＡ特異的アデノシンデアミナーゼ（ｄｓＡＤＡ）を開発することができる。このようなｄｓＡＤＡは、ｄｓＣＤＡによるＣからＴ（及びＡからＧ）変異を含むデータで実証されているものと類似するＡからＧ（及びＴからＣ）塩基編集を可能にし得る。塩基編集ｖｉａｄｓＡＤＡは、対処可能な変異の数を３８／９３から７８／９３に増加して、ミトコンドリアのさらに４０の病原性変異に対処する可能性がある。
塩基エディターユーティリティは、ミトコンドリア又は核ゲノムに限定されず、細胞の内部及び外部の両方並びに膜性細胞小器官内（例えば、葉緑体及び色素体）内の他のｄｓＤＮＡ部分を編集するために使用することができる。
ＤＮＡ結合ドメインとしてのＲＮＡ誘導ヌクレアーゼ（ＴＡＬＥ又はＺＦに代わり）の使用：核ゲノム工学適用の場合、ＴＡＬＥ及びＺＦの代わりに、ＲＮＡ誘導タンパク質（例えば、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９）をＤＮＡ結合タンパク質として使用することができる。ｄｓＣＤＡのコンテキスト特異性は、バイスタンダー変異を制限することができ、これは、デアミナーゼドメインとしてｓｓＤＮＡ特異的ＣＤＡ（例えば、ＡＰＯＢＥＣなど）（既存のＣＲＩＳＰＲベースの塩基編集技術で使用されている）を使用するよりも有利となり得る。
動物モデルの作製：ミトコンドリア遺伝病の動物モデルの作製：ミトコンドリアゲノムに正確な編集を導入するための信頼できる技術がないため、ミトコンドリア遺伝病の動物モデルを作製することは不可能ではないにしても非常に困難であった。塩基エディターは、遺伝病の修正を促進するだけでなく、動物モデルの作製にも使用することができる。これにより、これらの遺伝病の順遺伝学研究並びにミトコンドリア生理学、さらにミトコンドリア遺伝子工学技術の不足のために更新が不可能であった遺伝子ヘテロプラスミーの研究が可能となるであろう。
植物（及びそれ自体のゲノムをコードする他の細胞小器官）におけるミトコンドリアと葉緑体の操作：それ自体のゲノム（葉緑体及び他の色素体など）で他の膜性細胞小器官を操作するためのＣＲＩＳＰＲの使用は、ミトコンドリアの編集と同じ課題に直面している。タンパク質のみのエディター（ｄｓＤＮＡ特異的デアミナーゼに融合したプログラマブルＤＮＡ結合ドメインを使用して、これらの細胞小器官ゲノムを編集することができる（例えば、作物を改良するか、又は雄性不稔性のような特定の遺伝病に対してそれらを免疫性にするために）。
代謝障害、癌及び老化又はバイオテクノロジー適用の研究のための機能性遺伝子スクリーニング（例えば、エタノール耐性の操作、又は酵母の好気性発酵の改善、又は作物の改良）：ミトコンドリアゲノムを選択的に変異誘発する方法がないため、ミトコンドリアゲノムに機能性遺伝子スクリーニング戦略を適用することは不可能であった。同定されたデアミナーゼを目的の細胞（例えば、哺乳動物細胞、酵母細胞など）のミトコンドリアで一過性に発現させ、それらの細胞のミトコンドリアに遺伝的多様性を導入することができる。次に、これらの細胞を選択圧又は機能的スクリーニングスキーム（例えば、癌マーカー若しくは老化マーカーのより速い増殖若しくは存在又はエタノールに対する耐性について選択する）に供して、それらの疾患又はプロセスに関与する遺伝的変異体を同定することができる。
実施例１３：酵素エピジェネティックシーケンシング
異なるｄｓＤＮＡ特異的デアミナーゼ（ｄｓＣＤＡ）は、５ｍＣ、５ｈｍＣ、５ｆＣ、５ｃａＣなどのエピジェネティックマーカーを含むシチジン及びその様々な修飾に対して異なる活性を示すことが証明されている（図３２Ａ）。この特徴を利用して、様々なエピジェネティックシチジン修飾を示差的にマーキングすることができ、次にこれをシーケンシング方法により読み取ることができる。
方法
この方法は、バイサルファイトシーケンシングに代わる酵素的方法を提供し、ＤＮＡのバイサルファイト処理に関連する欠点及び技術的制限に対処し、それにより、優れた品質の結果の生成を最小化する。
脱アミノ化アッセイ
ｄｓＤＮＡ特異的デアミナーゼの活性を、非メチル化及びメチル化シチジン（５ｍＣ及び５ｈｍＣ）に対して脱アミノ化アッセイにより試験した。相補配列にアニーリングした［Ａ１５］ＴＣ［Ａ１５］（配列番号２７２）、［Ａ１５］Ｔ（５ｍＣ）［Ａ１５］及び［Ａ１５］Ｔ（５ｈｍＣ）［Ａ１５］を基質として処理した。
修飾ヌクレオチドに対するｄｓＣＤＡ活性を評価するアッセイ
メチルシチジン（５ｍＣ）に対するｄｓＣＤＡの活性を評価するために、ＢａｍＨ１メチルトランスフェラーゼ（部位特異的ＭＴａｓｅ）及びＣｐＧメチルトランスフェラーゼ（ＣｐＧ配列でＤＮＡをメチル化する）を用いて、約１ｋｂのＰＣＲ断片をメチル化し、基質として使用した。完全長の単離されたｄｓＤＮＡ特異的デアミナーゼドメイン（ｄｓＣＤＡ）をＩＶＴシステムで２時間発現させた。発現したｄｓＣＤＡを基質と一緒に１時間インキュベートした後、反応中の基質をＰＣＲ増幅し、編集頻度をサンガー及びＮＧＳシーケンシングにより評価した（図３３Ａ）。
修飾ヌクレオチドに対する様々なｄｓＣＤＡ活性を評価するアッセイ
デアミナーゼアッセイは、ＧＴＡＣＡＣＣＡＴＣＣＧＴＣＣＣ（配列番号２７４）及びＧＴＧＴＴＣＴＣＴＡＴＴＴＣＡＣ（配列番号２７４）を含む２つのＤＮＡ基質の各々を用いて実施され、各々５ｃａＣ、５ｆＣ、５ｈｍＣ又は５ｍＣのいずれかを含むように修飾され、それぞれＢＥ＿Ｒ１＿１１、ＢＥ＿Ｒ１＿２８及びＢＥ＿Ｒ１＿４１を含む３つのｄｓＤＮＡデアミナーゼの各々を用いて、２４時間にわたり行った。サンプルは、１５分、４５分、２時間及び２４時間のインキュベーション後に配列決定した。
酵素酸化及びグルコシル化
ＧＴＡＣＡＣＣＡＴＣＣＧＴＣＣＣ（配列番号２７４）及びＧＴＧＴＴＣＴＣＴＡＴＴＣＡＣ（配列番号２７５）を含むＤＮＡ基質を、ＴＥＴ２酵素を用いた処理により酸化し、ＢＧＴ酵素を用いた処理によりグルコシル化した後、ＢＥ＿Ｒ１＿１２又はＢＥ＿Ｒ１＿４１デアミナーゼと一緒に１時間又は２時間インキュベートし、脱アミノ化の有効性を評価した。
結果
脱アミノ化アッセイでは、デアミナーゼは、非メチル化シチジン［（ｍ）Ｃ］に対してはより活性が高い（図３２Ｂ）が、メチル化シチジン（５ｍＣ及び５ｈｍＣ）に対しては活性ではない（図３２Ｃ～Ｄ）ことが実証された。
ＤＮＡ修飾を同定するためのアッセイは、非メチル化ｄＣ残基に対して編集効率（ＣからＴ変換）が高いことを示し、ＢａｍＨ１メチルトランスフェラーゼ、続いてＢＥ＿Ｒ１＿１２で基質を処理したサンプルのＮＧＳ結果についての頻度シーケンスロゴに示されるように、ｄｓＣＤＡが非メチル化及びメチル化ＤＮＡに異なる作用をすることを示唆している（図３３Ｂ）。
各ＤＮＡ基質（配列番号２７４及び２７５）を用いたデアミナーゼアッセイの結果をそれぞれＢＥ＿Ｒ１＿１１（図３４Ａ）、ＢＥ＿Ｒ１＿２８（図３４Ｂ）及びＢＥ＿Ｒ１＿４１（図３４Ｃ）について示す。
酸化及びグルコシル化は、ＧＴＡＣＡＣＣＡＴＴＴＧＴＣＣＣ（配列番号２７６）をもたらしたＧＴＡＣＡＣＣＡＴＣＣＧＴＣＣＣ（配列番号２７４）のＢＥ＿Ｒ１＿４１による５ｍＣのＴへの脱アミノ化及びＧＴＡＣＡＣＣＡＴＴＴＧＴＣＣＣ（配列番号２７６）をもたらしたＢＥ＿Ｒ１＿４１による５ｍＣのＴへの脱アミノ化並びにＴＥＴ２及びＢＧＴによる酸化及びグルコシル化の非存在下のＧＴＡＣＡＣＣＡＴＴＴＧＴＴＣＣ（配列番号２７７）によって示されるように、デアミナーゼ保護を増強した（図３６を参照されたい）。
バイサルファイトはＤＮＡに損傷を与え、ＤＮＡを断片化する。ｓｓＤＮＡデアミナーゼは、ＤＮＡ変性を必要とし、それを損傷に曝露する。従って、ｄｓＤＮＡデアミナーゼは、修飾されたシトシンが脱アミノ化されず、シーケンシング中にシトシンとして出現するため、より良い解決策を提供する。未修飾シトシンは脱アミノ化され、シーケンシング中にウラシルとして出現する。
ＤＮＡは、バイサルファイト又はｄｓＣＤＡで処理することにより修飾することができ、続いて、ＰＣＲ増幅及び配列決定された。
実施例１４：ＤＮＡにおける多様性の生成
ＤＮＡに多様性を導入する方法が確立されている。
方法
目的のｄｓＤＮＡ（例えば、目的のタンパク質をコードする遺伝子）に多様性を生成するために、ｄｓＤＮＡをｄｓＤＮＡ特異的デアミナーゼで処理して、目的の遺伝子の変異体のライブラリーを作製した。次に、ライブラリーを、様々な指向性進化戦略（例えば、リボソームディスプレイなど）又は他の選択／スクリーニングに基づく方法に付す。多様性生成は、インビトロ（例えば、デアミナーゼタンパク質を目的のＤＮＡ基質と接触させることによって）又はインビボでデアミナーゼドメインを単離ドメイン又はアドレッシングドメイン（例えば、ＤＮＡ結合ドメイン、ＲＮＡポリメラーゼドメイン、転写因子若しくは他のＤＮＡ相互作用ドメイン）との融合物としてのいずれかで導入することにより実施することができる。
代表的な例では、基質ＤＮＡ：ＣＴＡＡＣＴＴＡＣＣＡＴＧＡＴＴＡＡＴＴＴＡＡＧＡＡＴＴＣＴＣＡＴＣＧＴＣＡ（配列番号２８０）に対する１つ以上のデアミナーゼの活性により、３つの異なる脱アミノ化産物：ＴＴＡＡＴＴＴＡＣＴＡＴＧＡＴＴＡＡＴＴＴＡＡＧＡＡＴＴＣＴＴＡＴＴＧＴＴＡ（配列番号２８１）、ＣＴＡＡＴＴＴＡＣＣＡＴＡＡＴＴＡＡＴＴＴＡＡＧＡＡＴＴＣＴＴＡＴＣＧＴＴＡ（配列番号２８２）及びＣＴＡＡＣＴＴＡＴＣＡＴＡＡＴＴＡＡＴＴＴＡＡＡＡＡＴＴＣＴＴＡＴＣＧＴＣＡ（配列番号２８３）がそれぞれ得られる（図３７Ａ～Ｂ）。
結果
インビトロ多様性の生成：ＤＮＡ基質に対するＢＥ＿Ｒ１＿１２デアミナーゼのデアミナーゼ活性から生じるＰＣＲ断片の頻度シーケンスロゴとＮＧＳリードを図３９Ａ～３９Ｂに示し、デアミナーゼ活性二本鎖ＤＮＡ基質の結果として生成された異なる配列のライブラリー内の異なる位置でのＣからＴ及びＧからＡの様々な脱アミノ化を示す。手短には、単離されたＢＥ＿Ｒ１＿１２をＩＶＴシステムにおいて３７℃で２時間発現させ、次に発現したデアミナーゼをｄｓＤＮＡ基質と一緒に１時間インキュベートした。編集／多様化された基質をＮＧＳによって評価した。このアプローチは、目的のＤＮＡの変異体ライブラリーを作製するためのエラープローンＰＣＲに代わるものとして役立ち得る。
インビボ多様性生成アッセイ：完全長デアミナーゼは、インビトロ多様性生成に使用することができる；但し、インビボ適用の場合には毒性を引き起こす恐れがある。この制限を回避するために、分割手法を使用した。ＢＥ４１（ＢＥ４１＿Ｇ１０８＿Ｃ）の分割された半分の一方をＴ７ＲＮＡポリメラーゼ（ターゲティングドメインとして機能）に融合させた。他方の半分（ＢＥ４１＿Ｇ１０８＿Ｎ）は自由浮遊酵素として発現された。Ｔ７プロモーターを標的配列の上流に付加し、それをＢＥ４１＿Ｇ１０８＿Ｃ－Ｔ７融合物及びＢＥ４１＿Ｇ１０８＿Ｎタンパク質と一緒にインキュベートした（図４０）。ＣＲＩＳＰＲｉ（即ちｇＲＮＡ／ｄＣａｓ９）を用いて、標的に対するＴ７ ＲＮＡポリメラーゼの進行を阻止し、Ｔ７プロモーターの下流における多様性生成の境界を定めると同時に、標的領域上のデアミナーゼの滞留時間を増加させた。この手法は、目的とする形質の継続的なインビボ進化と細胞バーコーディングのために、生存細胞内の規定領域での効率的な多様性生成のために使用することができる。後者のクラスのデアミナーゼのｓｓＤＮＡ基質は一過性に（転写バブル内で）生成され、大部分がポリメラーゼタンパク質と一緒に残留し、従ってデアミナーゼにアクセス不可能であるため、ｄｓＤＮＡに対する開示デアミナーゼの活性は、ｓｓＤＮＡ特異的デアミナーゼに基づく前述の適用と比較して上記の適用に有利であろう。
他のＤＮＡ相互作用ドメインは、類似の方法でＤＮＡターゲティングドメインとして使用することができる。一部の形態では、同様の手法を使用して、従来のＣｈＩＰ－Ｓｅｑのハイスループット代替物として、目的のＤＮＡ相互作用タンパク質（例えば、転写因子）のゲノム全体の標的部位を同定することができる。この目的のために、ｄｓＤＮＡ特異的デアミナーゼドメイン（全長又は分割形態のいずれか）を目的のＤＮＡ結合ドメインに融合させ、融合タンパク質を目的の細胞（通常は目的のＤＮＡ相互作用タンパク質の天然細胞型）に発現させる。次に、ＤＮＡ相互作用ドメインのフットプリント（即ち結合部位）は、細胞の全ゲノムを配列決定し、増大した（ＣからＴ）変異を有するゲノムのセグメントを探すことによって同定することができる。
インビボアッセイでは、ｇＲＮＡ／ｄＣａｓ９を使用して、標的上のＴ７ポリメラーゼの進行を阻止し、標的領域（Ｔ７プロモーターとｇＲＮＡ結合部位によって規定される）上のデアミナーゼの滞留時間を増加させ、基質配列の多様性を生じさせた。
開示される方法及び組成物は、これらが変動し得ると記載される特定の方法、プロトコル及び試薬に限定されないことが理解される。本明細書で使用される用語は、あくまで特定の実施形態を説明することを目的とし、添付の特許請求の範囲によってのみ限定される本発明の範囲を限定することを意図しないことも理解されたい。
開示されるのは、開示の方法及び組成物のために使用することができるか、それと一緒に使用することができるか、その調製に使用することができるか、又は開示の方法及び組成物の生成物である材料、組成物及び成分である。これら及び他の材料は、本明細書に開示され、これらの材料の組合せ、サブセット、相互作用、群などが開示されるとき、様々な個別の及び集合的な組合せ及び並び換えの具体的な参照は、明示的に開示されない場合もあるが、各々が本明細書で具体的に企図及び記載されることが理解される。例えば、１ステップが開示され、議論され、そのステップを含む多数の構成要素に加えることができる多数の修正が議論される場合、ステップの全ての組合せ及び並び換え並びに可能な修飾は、特に反対に示されない限り、具体的に企図される。従って、分子Ａ、Ｂ及びＣのクラス並びに分子Ｄ、Ｅ及びＦのクラス及び組合せ分子の例が開示される場合、Ａ～Ｄが開示され、その際、各々が個別に列挙されなくても、各々が個別に及び集合的に企図される。従って、この例では、組合せＡ～Ｅ、Ａ～Ｆ、Ｂ～Ｄ、Ｂ～Ｅ、Ｂ～Ｆ、Ｃ～Ｄ、Ｃ～Ｅ及びＣ～Ｆの各々が具体的に企図され、Ａ、Ｂ及びＣ；Ｄ、Ｅ及びＦ；並びに例の組合せＡ～Ｄの開示から開示されると考慮すべきである。同様に、これらの任意のサブセット又は組合せも具体的に企図され、開示される。従って、例えば、Ａ～Ｅ、Ｂ～Ｆ及びＣ～Ｅの亜群が具体的に企図され、Ａ、Ｂ及びＣ；Ｄ、Ｅ及びＦ；並びに例の組合せＡ～Ｄの開示から開示されると考えるべきである。さらに、前述のように企図及び開示される材料、組成物、成分などは、そのような材料の任意の群、亜群、リスト、セットなどから具体的且つ独立して包含又は除外することもできる。これらの概念は、開示される組成物を作製し、使用するアルゴリズム又は方法のステップを含むが、これらに限定されない本出願の全ての態様に適用される。従って、実施され得る様々な追加ステップがある場合、これらの追加のステップの各々は、開示される方法の任意の特定の実施形態又は実施形態の組合せで実行することができ、そのような組合せの各々が具体的に企図され、開示されると考慮すべきであることが理解される。
本明細書及び添付の特許請求の範囲で使用されるように、単数形「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」及び「その」は、文脈から明確に別の解釈が要求されない限り、複数形の参照を含むことに留意しなければならない。
本明細書の記載及び特許請求の範囲全体を通して、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」という語並びに「含んでいる」及び「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」などの語の変形は、「含むが、限定されない」を意味し、例えば他の添加物、成分、整数又はステップを排除することを意図されない。
「任意選択の」又は「任意選択で」とは、次に説明する事象、状況若しくは材料が発生若しくは存在する可能性があるか、又はそれらが発生若しくは存在しない可能性があることと、説明には、事象、状況又は材料が発生又は存在する実体と、それが発生又は存在しない実体とが含まれることとを意味する。
文脈から明らかに別の解釈が指示されない限り、「することができる」という語の使用は、言及される対象又は条件の選択肢又は能力を示す。一般に、こうした「することができる」の使用は、選択肢又は能力を明確に記述するが、選択肢又は能力が、言及される対象又は条件の他の形態又は実施形態に存在しないことがある可能性も残すことを意味する。文脈から明確に別段の解釈が指示されない限り、「であり得る」という語の使用は、言及される対象又は条件の選択肢又は能力を示す。一般に、こうした「であり得る」の使用は、選択肢又は能力を明確に記述するが、選択肢又は能力が、言及される対象又は条件の他の形態又は実施形態に存在しないことがある可能性も残すことを意味する。文脈から明らかに別の解釈が指示されない限り、本明細書における「であり得る」の使用は、対象又は条件の不明又は疑わしい特徴を指すものではない。
範囲は、本明細書では、「約」１つの特定の値から及び／又は「約」別の特定の値までとして表すことができる。そのような範囲が表現されるとき、文脈から特に別の解釈が指示されない限り、１つの特定の値及び／又は他の特定の値から他の特定の値までの範囲も具体的に企図され、開示されると考えられる。同様に、値が近似として表現されるとき、先行する「約」の使用により、特定の値は、文脈から特に別の解釈が指示されない限り、開示されたと見なされるべき別の具体的に企図される実施形態を形成することが理解されるであろう。さらに、各範囲の終点は、文脈から特に別の解釈が要求されない限り、他の終点と関係して且つ他の終点とは独立しての両方で重要であることが理解されるであろう。明示的に開示された範囲内に含まれる値の個別の値及び値の部分範囲の全ても具体的に企図され、文脈から特に別の解釈が指示されない限り、開示されたと見なされるべきであることを理解されたい。最後に、全ての範囲は、列挙された範囲を範囲として且つ第１の終点から第２の終点までの個々の数の集合として指すことを理解されたい。後者の場合、個々の数のいずれも、範囲が指す量、値又は特徴の１つの形態として選択され得ることを理解されたい。このように、１つの範囲は、その範囲が指す量、値又は特徴として選択することができるその集合の単一メンバー（即ち単一の数）からの第１の終点（それを含む）から第２の終点（それを含む）までの数又は値の集合を表す。上記は、特に、これらの実施形態の一部又は全てが明示的に開示されるか否かにかかわらずに適用される。
他に定義されない限り、本明細書で使用される全ての技術用語及び科学用語は、開示される方法及び組成物が属する技術分野の当業者によって一般的に理解されるのと同じ意味を有する。本明細書に記載のものと類似の又は均等な任意の方法及び材料を本方法及び組成物の実施又は試験に使用することができるが、特に有用な方法、装置及び材料は、記載される通りである。本明細書で引用される刊行物及びそれらが引用される資料は、参照により本明細書に具体的に組み込まれる。本明細書のいかなる内容も、本発明が先行発明によりそのような開示に先行する権利がないことの承認として解釈されるべきではない。参照物が先行技術を構成することを承認するものではない。参考文献の議論は、著者が主張することを記述するものであり、本出願人は、引用された文献の正確性及び妥当性に異議を唱える権利を留保する。多くの刊行物が本明細書で参照されるが、そのような参照物は、これらの文献のいずれも当技術分野で共通の一般的な知識の一部を形成することを認めるものではないことが明確に理解されるであろう。
材料、組成、成分、ステップ、技術などの説明は、多くの選択肢及び代替形態を含み得るが、これは、そのような選択肢及び代替形態が互いに均等であるか又はとりわけ明らかな代替形態であると解釈されるべきではなく、その承認でもない。
本明細書に開示される全ての組成物は、本明細書で具体的に開示されることを意図され、そのように考慮されるべきである。さらに、本開示で特定することができるあらゆる亜群は、本明細書で具体的に開示されることを意図され、そのように考慮されるべきである。結果として、任意の組成物又は組成物の亜群は、使用のために具体的に含まれるか若しくは使用から除外されるか、又は組成物のリストに含まれるか若しくは除外され得ることを特に企図される。例えば、デアミナーゼ又はデアミナーゼドメインの任意の群又は集合としては、バークホルデリア・セノセパシア（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｃｅｎｏｃｅｐａｃｉａ）由来のＤｄｄＡ、コンドロマイセス・クロカツス（Ｃｈｏｎｄｒｏｍｙｃｅｓ ｃｒｏｃａｔｕｓ）由来のＵｎｉｐｒｏｔ ＩＤ番号：Ａ０Ａ０Ｋ１ＥＫＶ１＿ＣＨＯＣＯのデアミナーゼドメイン、バークホルデリア・グルマエ（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｇｌｕｍａｅ （ＢＧＲ１株）由来のＵｎｉｐｒｏｔ ＩＤ番号：Ｃ５ＡＬＭ７＿ＢＵＲＧＢ又はこれらの任意の組合せが挙げられる。
当業者は、本明細書に記載の方法及び組成物の特定の実施形態に対する多くの均等物を認識するか、又は常用的な実験のみを用いて確認することができるであろう。このような均等物は、以下の特許請求の範囲に包含されることが意図される。

Claims (146)

  1. 単離されたデアミナーゼドメインであって、二本鎖ＤＮＡを脱アミノ化することができ、標的ヌクレオチド配列を含まない二本鎖ＤＮＡに対する前記デアミナーゼドメインのデアミナーゼ活性と比較して、前記標的ヌクレオチド配列を含む二本鎖ＤＮＡに対してより大きいデアミナーゼ活性を有し、
    標的ヌクレオチドは、それぞれ個別に完全に又は部分的に規定され、且つ互いに固定された順序関係にあり、
    前記デアミナーゼドメインは、バークホルデリア・セノセパシア（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｃｅｎｏｃｅｐａｃｉａ）由来のＤｄｄＡのデアミナーゼドメインではない、単離されたデアミナーゼドメイン。
  2. 前記標的ヌクレオチド配列は、２つ以上の標的ヌクレオチドを含み、
    前記標的ヌクレオチドは、それぞれ個別に完全に又は部分的に規定され、且つ互いに固定された順序関係にある、請求項１に記載のデアミナーゼドメイン。
  3. 前記標的ヌクレオチドは、ＧＣ、ＡＣ又はＣＣである、請求項１又は２に記載のデアミナーゼドメイン。
  4. ２つの部分を含み、
    前記２つの部分が一緒に結合されるときにのみ脱アミノ化が可能である、請求項１～３のいずれか一項に記載のデアミナーゼドメイン。
  5. シトシンヌクレオチドを脱アミノ化することができる、請求項１～４のいずれか一項に記載のデアミナーゼドメイン。
  6. 前記標的ヌクレオチド配列は、ＡＣである、請求項１～５のいずれか一項に記載のデアミナーゼドメイン。
  7. 前記標的ヌクレオチド配列は、ＣＣである、請求項１～５のいずれか一項に記載のデアミナーゼドメイン。
  8. 前記標的ヌクレオチド配列は、ＧＣである、請求項１～５のいずれか一項に記載のデアミナーゼドメイン。
  9. 前記標的ヌクレオチド配列は、ＴＣである、請求項１又は４に記載のデアミナーゼドメイン。
  10. 配列番号１～４、９、１１、１４～１６若しくは４０～６７のいずれか１つのアミノ酸配列又はその断片若しくは変異体を含む、請求項１～９のいずれか一項に記載のデアミナーゼドメイン。
  11. 配列番号４のアミノ酸配列又は配列番号４に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％若しくは９９％の配列同一性を有するアミノ酸或いはその断片を有するＢＥ＿Ｒ１＿４１を含む、請求項１０に記載のデアミナーゼドメイン。
  12. 配列番号１のアミノ酸配列又は配列番号１に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％若しくは９９％の配列同一性を有するアミノ酸或いはその断片を有するＢＥ＿Ｒ１＿１１を含む、請求項１１に記載のデアミナーゼドメイン。
  13. 配列番号２のアミノ酸配列又は配列番号２に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％若しくは９９％の配列同一性を有するアミノ酸或いはその断片を有するＢＥ＿Ｒ１＿１２を含む、請求項１１に記載のデアミナーゼドメイン。
  14. 配列番号３のアミノ酸配列又は配列番号３に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％若しくは９９％の配列同一性を有するアミノ酸或いはその断片を有するＢＥ＿Ｒ１＿２８を含む、請求項１１に記載のデアミナーゼドメイン。
  15. 請求項１～１４のいずれか一項に記載のデアミナーゼドメイン及びターゲティングドメインを含む標的化塩基エディターであって、前記ターゲティングドメインは、塩基エディター標的配列に特異的に結合する、標的化塩基エディター。
  16. 前記ターゲティングドメインは、ＴＡＬＥ、ＢＡＴ、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９、Ｃｆｐ１又はジンクフィンガーを含む、請求項１５に記載の標的化塩基エディター。
  17. 前記塩基エディター標的配列は、前記デアミナーゼドメインの前記標的ヌクレオチド配列の実体の２０ヌクレオチド以内の標的核酸中に存在するように選択され、
    前記標的ヌクレオチド配列の前記実体は、前記標的化塩基エディターによって塩基編集されるように選択される、請求項１５又は１６に記載の標的化塩基エディター。
  18. 前記標的化塩基エディターによって塩基編集されるように選択される前記標的ヌクレオチド配列の前記実体の２０ヌクレオチド以内の前記塩基エディター標的配列は、標的ヌクレオチド配列の任意の実体の２０ヌクレオチド以内にある前記標的核酸中の唯一の塩基エディター標的配列である、請求項１７に記載の標的化塩基エディター。
  19. 前記標的核酸中の前記標的ヌクレオチド配列の前記実体は、前記標的ヌクレオチド配列の前記実体の２０ヌクレオチド以内の前記標的核酸中の前記塩基エディター標的配列の２０ヌクレオチド以内の前記デアミナーゼドメインの前記標的ヌクレオチド配列の唯一の実体である、請求項１７又は１８に記載の標的化塩基エディター。
  20. 前記塩基エディター標的配列は、ミトコンドリアＤＮＡ、又は葉緑体ＤＮＡ、又は色素体ＤＮＡ中に存在する、請求項１５～１９のいずれか一項に記載の標的化塩基エディター。
  21. ２つの部分を含み、
    第１の部分は、第１のスプリットデアミナーゼドメインを含み、第２の部分は、第２のスプリットデアミナーゼドメインを含む、請求項１５～２０のいずれか一項に記載の標的化塩基エディター。
  22. 前記第１の部分は、配列番号１２２～１８１のいずれか１つのアミノ酸配列を含むスプリットデアミナーゼドメインを含み、
    前記第２の部分は、配列番号１２７～１８１のいずれか１つのアミノ酸配列を含むスプリットデアミナーゼドメインを含み、
    前記第１及び第２のスプリットデアミナーゼドメインは、単独では不活性であるが、一緒に近接されると脱アミノ化が可能である、請求項２１に記載の標的化塩基エディター。
  23. 前記第１のスプリットデアミナーゼドメインは、配列番号１２２～１２６のいずれか１つのアミノ酸配列を含む、請求項２１又は２２に記載の標的化塩基エディター。
  24. 前記第１及び第２のスプリットデアミナーゼドメインの両方は、野生型デアミナーゼドメイン活性部位を含む、請求項２１又は２２に記載の標的化塩基エディター。
  25. 前記第１及び第２のスプリットデアミナーゼドメインは、ＢＥ＿Ｒ１＿１１の断片又は変異体をそれぞれ含む、請求項２１～２４のいずれか一項に記載の標的化塩基エディター。
  26. 前記第１のスプリットデアミナーゼドメインは、配列番号１２２、又は１２７～１３５、又は１５０のいずれか１つを含み、
    前記第２のスプリットデアミナーゼドメインは、配列番号１２７～１３５又は１５０のいずれか１つを含む、請求項２５に記載の標的化塩基エディター。
  27. 前記第１のスプリットデアミナーゼドメインは、配列番号１２２を含み、
    前記第２のスプリットデアミナーゼドメインは、配列番号１２７～１３４又は１５０のいずれか１つを含む、請求項２５に記載の標的化塩基エディター。
  28. 前記第１のスプリットデアミナーゼドメインは、配列番号１２９を含み、
    前記第２のスプリットデアミナーゼドメインは、配列番号１５０を含む、請求項２５に記載の標的化塩基エディター。
  29. 前記第１及び第２のスプリットデアミナーゼドメインは、ＢＥ＿Ｒ１＿１２の断片又は変異体をそれぞれ含む、請求項２１～２４のいずれか一項に記載の標的化塩基エディター。
  30. 前記第１のスプリットデアミナーゼドメインは、配列番号１２４、又は１３６～１４０、又は１５６～１６７のいずれか１つを含み、
    前記第２のスプリットデアミナーゼドメインは、配列番号１３６～１４０又は１５６～１６７のいずれか１つを含む、請求項２９に記載の標的化塩基エディター。
  31. 前記第１のスプリットデアミナーゼドメインは、配列番号１２４を含み、前記第２のスプリットデアミナーゼドメインは、配列番号１５６～１６６のいずれか１つを含む、請求項２９又は３０に記載の標的化塩基エディター。
  32. 前記第１のスプリットデアミナーゼドメインは、配列番号１３７を含み、
    前記第２のスプリットデアミナーゼドメインは、配列番号１４２を含む、請求項２９又は３０に記載の標的化塩基エディター。
  33. 前記第１のスプリットデアミナーゼドメインは、配列番号１３９を含み、
    前記第２のスプリットデアミナーゼドメインは、配列番号１４４を含む、請求項２９又は３０に記載の標的化塩基エディター。
  34. 前記第１及び第２のスプリットデアミナーゼドメインは、ＢＥ＿Ｒ１＿４１の断片又は変異体をそれぞれ含む、請求項２２に記載の標的化塩基エディター。
  35. 前記第１のスプリットデアミナーゼドメインは、配列番号１６８～１７１のいずれか１つを含み、
    前記第２のスプリットデアミナーゼドメインは、配列番号１７２～１７５のいずれか１つを含む、請求項３４に記載の標的化塩基エディター。
  36. 前記第１のスプリットデアミナーゼドメインは、配列番号１６８を含み、
    前記第２のスプリットデアミナーゼドメインは、配列番号１７３を含む、請求項３４又は３５に記載の標的化塩基エディター。
  37. 前記第１のスプリットデアミナーゼドメインは、配列番号１７１を含み、
    前記第２のスプリットデアミナーゼドメインは、配列番号１７５を含む、請求項３４又は３５に記載の標的化塩基エディター。
  38. 前記第１のスプリットデアミナーゼドメインは、配列番号１７１を含み、
    前記第２のスプリットデアミナーゼドメインは、配列番号１７３を含む、請求項３４に記載の標的化塩基エディター。
  39. 前記第１及び第２のスプリットデアミナーゼドメインは、ＢＥ＿Ｒ１＿２８の断片又は変異体をそれぞれ含む、請求項２１～２４のいずれか一項に記載の標的化塩基エディター。
  40. 前記第１のスプリットデアミナーゼドメインは、配列番号１２３、又は１４６～１４９、又は１５１～１５５のいずれか１つを含み、
    前記第２のスプリットデアミナーゼドメインは、配列番号１４６～１４９又は１５１～１５５のいずれか１つを含む、請求項３９に記載の標的化塩基エディター。
  41. 前記第１のスプリットデアミナーゼドメインは、配列番号１２３を含み、
    前記第２のスプリットデアミナーゼドメインは、配列番号１４９又は１５１～１５３のいずれか１つを含む、請求項３９又は４０に記載の標的化塩基エディター。
  42. 前記第１及び第２のスプリットデアミナーゼドメインは、ＢＥ＿Ｒ４＿２１の断片又は変異体をそれぞれ含む、請求項２１～２４のいずれか一項に記載の標的化塩基エディター。
  43. 前記第１のスプリットデアミナーゼドメインは、配列番号１２５又は１７６～１７７のいずれか１つを含み、
    前記第２のスプリットデアミナーゼドメインは、配列番号１７６～１７７のいずれか１つを含む、請求項４２に記載の標的化塩基エディター。
  44. 前記第１のスプリットデアミナーゼドメインは、配列番号１２５を含み、
    前記第２のスプリットデアミナーゼドメインは、配列番号１７７を含む、請求項４２に記載の標的化塩基エディター。
  45. 前記第１のスプリットデアミナーゼドメインは、配列番号１７６を含み、
    前記第２のスプリットデアミナーゼドメインは、配列番号１７７を含む、請求項４２に記載の標的化塩基エディター。
  46. 前記第１及び第２のスプリットデアミナーゼドメインは、ＢＥ＿Ｒ２＿１１の断片又は変異体をそれぞれ含む、請求項２１～２４のいずれか一項に記載の標的化塩基エディター。
  47. 前記第１のスプリットデアミナーゼドメインは、配列番号１２６又は１８０～１８１のいずれか１つを含み、
    前記第２のスプリットデアミナーゼドメインは、配列番号１８０～１８１のいずれか１つを含む、請求項４６に記載の標的化塩基エディター。
  48. 前記第１のスプリットデアミナーゼドメインは、配列番号１２５を含み、
    前記第２のスプリットデアミナーゼドメインは、配列番号１８０～１８１のいずれか１つを含む、請求項４２に記載の標的化塩基エディター。
  49. 前記第１のスプリットデアミナーゼドメインは、配列番号１８０を含み、
    前記第２のスプリットデアミナーゼドメインは、配列番号１８１を含む、請求項４２に記載の標的化塩基エディター。
  50. 前記第１の部分若しくは前記第２の部分又は前記第１及び第２の部分の両方は、ＴＡＬＥ、ＢＡＴ、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９、Ｃｆｐ１又はジンクフィンガーからなる群から選択されるプログラマブルＤＮＡ結合ドメインを含む、請求項２２～４９のいずれか一項に記載の標的化塩基エディター。
  51. １つのプログラマブルＤＮＡ結合ドメインは、左側ＴＡＬＥ及び右側ＴＡＬＥからなる群から選択されるＴＡＬＥである、請求項５０に記載の標的化塩基エディター。
  52. １つのプログラマブルＤＮＡ結合ドメインは、配列番号９０、９２、９５、９７～１０６のいずれか１つのアミノ酸配列を含む左側ＴＡＬＥである、請求項５０又は５１に記載の標的化塩基エディター。
  53. １つのプログラマブルＤＮＡ結合ドメインは、配列番号９１、９３～９４、９６、１０８～１１３のいずれか１つのアミノ酸配列を含む右側ＴＡＬＥである、請求項５０～５２のいずれか一項に記載の標的化塩基エディター。
  54. １つ以上のプログラマブルＤＮＡ結合ドメインは、配列番号９５～９６のいずれか１つを含むアミノ酸配列を有する、ミトコンドリアｍＮＤ１ ＤＮＡに結合するＴＡＬＥである、請求項５０～５３のいずれか一項に記載の標的化塩基エディター。
  55. １つのプログラマブルＤＮＡ結合ドメインは、配列番号９６を含むアミノ酸配列を有する、ミトコンドリアｍＮＤ１ ＤＮＡに結合する右側ＴＡＬＥである、請求項５０～５４のいずれか一項に記載の標的化塩基エディター。
  56. １つのプログラマブルＤＮＡ結合ドメインは、配列番号９５を含むアミノ酸配列を有する、ミトコンドリアｈＮＤ１ ＤＮＡに結合する左側ＴＡＬＥである、請求項５４又は５５に記載の標的化塩基エディター。
  57. １つ以上のプログラマブルＤＮＡ結合ドメインは、配列番号９９～１０６又は１０８～１１３のいずれか１つを含むアミノ酸配列を有する、ミトコンドリアｍＣＯＸ１ ＤＮＡに結合するＴＡＬＥである、請求項５１に記載の標的化塩基エディター。
  58. １つのプログラマブルＤＮＡ結合ドメインは、配列番号１０８～１１３のいずれか１つを含むアミノ酸配列を有する、ミトコンドリアｍＣＯＸ１ ＤＮＡに結合する右側ＴＡＬＥである、請求項５７に記載の標的化塩基エディター。
  59. １つのプログラマブルＤＮＡ結合ドメインは、配列番号９０～１０６のいずれか１つを含むアミノ酸配列を有する、ミトコンドリアｍＣＯＸ１ ＤＮＡに結合する左側ＴＡＬＥである、請求項５７又は５８に記載の標的化塩基エディター。
  60. １つ以上のプログラマブルＤＮＡ結合ドメインは、配列番号９８を含むアミノ酸配列を有する、ｈ１２ ＤＮＡに結合するＴＡＬＥである、請求項５０に記載の標的化塩基エディター。
  61. １つのプログラマブルＤＮＡ結合ドメインは、配列番号１１４を含むアミノ酸配列を有する、ＮＴ（Ｇ）Ｎ末端ドメインを有するＴＡＬＥである、請求項５０に記載の標的化塩基エディター。
  62. １つのプログラマブルＤＮＡ結合ドメインは、配列番号１１５を含むアミノ酸配列を有する、ＮＴ（ｂｎ）Ｎ末端ドメインを有するＴＡＬＥである、請求項５０に記載の標的化塩基エディター。
  63. １つ以上のプログラマブルＤＮＡ結合ドメインは、配列番号９２～９４のいずれか１つを含むアミノ酸配列を有する、ミトコンドリアＮＤ６ ＤＮＡに結合するＴＡＬＥである、請求項５１に記載の標的化塩基エディター。
  64. １つのプログラマブルＤＮＡ結合ドメインは、配列番号９３～９４のいずれか１つを含むアミノ酸配列を有する、ミトコンドリアＮＤ６ ＤＮＡに結合する右側ＴＡＬＥである、請求項６３に記載の標的化塩基エディター。
  65. １つのプログラマブルＤＮＡ結合ドメインは、配列番号９２を含むアミノ酸配列を有する、ミトコンドリアｍＮＤ６ ＤＮＡに結合する左側ＴＡＬＥである、請求項６３又は６４に記載の標的化塩基エディター。
  66. １つ以上のプログラマブルＤＮＡ結合ドメインは、配列番号９０～９１のいずれか１つを含むアミノ酸配列を有する、ミトコンドリアｈＮＤ ＤＮＡに結合するＴＡＬＥである、請求項５１に記載の標的化塩基エディター。
  67. １つのプログラマブルＤＮＡ結合ドメインは、配列番号９０を含むアミノ酸配列を有する、ミトコンドリアｈＮＤ ＤＮＡに結合する右側ＴＡＬＥである、請求項６６に記載の標的化塩基エディター。
  68. １つのプログラマブルＤＮＡ結合ドメインは、配列番号９１を含むアミノ酸配列を有する、ミトコンドリアｈＮＤ ＤＮＡに結合する左側ＴＡＬＥである、請求項６６又は６７に記載の標的化塩基エディター。
  69. １つのプログラマブルＤＮＡ結合ドメインは、配列番号９７を含むアミノ酸配列を有する、ｈ１１ ＤＮＡに結合するＴＡＬＥである、請求項５０に記載の標的化塩基エディター。
  70. 前記第１及び第２の部分の一方又は両方は、独立して、ジンクフィンガープログラマブルＤＮＡ結合ドメインを含む、請求項５０～６９のいずれか一項に記載の標的化塩基エディター。
  71. １つのプログラマブルＤＮＡ結合ドメインは、左側ジンクフィンガー及び右側ジンクフィンガーからなる群から選択されるジンクフィンガーである、請求項５０～７０のいずれか一項に記載の標的化塩基エディター。
  72. １つのプログラマブルＤＮＡ結合ドメインは、配列番号８２～８９のいずれか１つを含むアミノ酸配列を有する、ｍＣＯＸ１ ＤＮＡに結合するジンクフィンガーである、請求項５０若しくは５７又は７０若しくは７１のいずれか一項に記載の標的化塩基エディター。
  73. １つのプログラマブルＤＮＡ結合ドメインは、配列番号８２～８６又は８７～８９のいずれか１つのアミノ酸配列を有する、ｍＣＯＸ１ ＤＮＡに結合する右側ジンクフィンガーである、請求項５０又は７０～７２のいずれか一項に記載の標的化塩基エディター。
  74. １つのプログラマブルＤＮＡ結合ドメインは、配列番号８２～８６のいずれか１つを含むアミノ酸配列を有する、ｍＣＯＸ１ ＤＮＡに結合する左側ジンクフィンガーである、請求項５０又は７０～７３のいずれか一項に記載の標的化塩基エディター。
  75. １つのプログラマブルＤＮＡ結合ドメインは、配列番号７４～８１のいずれか１つを含むアミノ酸配列を有する、ｈＮＤ ＤＮＡに結合するジンクフィンガーである、請求項５０若しくは６６又は７０若しくは７１のいずれか一項に記載の標的化塩基エディター。
  76. １つのプログラマブルＤＮＡ結合ドメインは、配列番号７８～８１のいずれか１つのアミノ酸配列を有する、ｈＮＤ ＤＮＡに結合する右側ジンクフィンガーである、請求項５０若しくは７０又は７４若しくは７５のいずれか一項に記載の標的化塩基エディター。
  77. １つのプログラマブルＤＮＡ結合ドメインは、配列番号７４～７７のいずれか１つを含むアミノ酸配列を有する、ｈＮＤ ＤＮＡに結合する左側ジンクフィンガーである、請求項５０若しくは７０又は７４～７６のいずれか一項に記載の標的化塩基エディター。
  78. 前記第１及び第２の部分の一方又は両方は、独立して、ＢＡＴプログラマブルＤＮＡ結合ドメインを含む、請求項５０～７７のいずれか一項に記載の標的化塩基エディター。
  79. １つのプログラマブルＤＮＡ結合ドメインは、左側ＢＡＴ及び右側ＢＡＴからなる群から選択されるＢＡＴである、請求項５０～７８のいずれか一項に記載の標的化塩基エディター。
  80. １つのプログラマブルＤＮＡ結合ドメインは、配列番号１１８～１１９のいずれか１つを含むアミノ酸配列を有する、ｍＣＯＸ１ ＤＮＡに結合するＢＡＴである、請求項５０、又は５７、又は７２のいずれか一項に記載の標的化塩基エディター。
  81. １つのプログラマブルＤＮＡ結合ドメインは、配列番号１１９のいずれか１つのアミノ酸配列を有する、ｍＣＯＸ１ ＤＮＡに結合する右側ＢＡＴである、請求項５０、又は５７、又は７０、又は７２、又は８０のいずれか一項に記載の標的化塩基エディター。
  82. １つのプログラマブルＤＮＡ結合ドメインは、配列番号１１８のいずれか１つを含むアミノ酸配列を有する、ｍＣＯＸ１ ＤＮＡに結合する左側ＢＡＴである、請求項５０、若しくは５７、若しくは７０、若しくは７２又は８０若しくは８１のいずれか一項に記載の標的化塩基エディター。
  83. １つのプログラマブルＤＮＡ結合ドメインは、配列番号１２０～１２１のいずれか１つを含むアミノ酸配列を有する、ＮＤ６ ＤＮＡに結合するＢＡＴである、請求項５０、若しくは７０、若しくは６３又は７８若しくは７９のいずれか一項に記載の標的化塩基エディター。
  84. １つのプログラマブルＤＮＡ結合ドメインは、配列番号１２１のいずれか１つのアミノ酸配列を有する、ｈＮＤ ＤＮＡに結合する右側ＢＡＴである、請求項５０、又は７０、又は６３或いは７８若しくは７９又は８３のいずれか一項に記載の標的化塩基エディター。
  85. １つのプログラマブルＤＮＡ結合ドメインは、配列番号１２０のいずれか１つを含むアミノ酸配列を有する、ｈＮＤ ＤＮＡに結合する左側ＢＡＴである、請求項５０、又は７０、又は６３或いは７８若しくは７９又は８３若しくは８４のいずれか一項に記載の標的化塩基エディター。
  86. 前記第１の部分は、
    （ａ）配列番号１２０のアミノ酸配列を含む第１のスプリットデアミナーゼドメインと、
    （ｂ）左側ＴＡＬＥプログラマブルＤＮＡ結合ドメインと
    を含み；
    前記第２の部分は、
    （ｃ）配列番号１５６、１５８、１６０又は１６４のいずれか１つのアミノ酸配列を含む第２のスプリットデアミナーゼドメインと、
    （ｄ）右側ＴＡＬＥプログラマブルＤＮＡ結合ドメインと
    を含む、請求項２１又は２２に記載の標的化塩基エディター。
  87. 前記第１の部分は、
    （ａ）配列番号１６９のアミノ酸配列を含む第１のスプリットデアミナーゼドメインと、
    （ｂ）左側ＴＡＬＥプログラマブルＤＮＡ結合ドメインと
    を含み；
    前記第２の部分は、
    （ｃ）配列番号１７３又は１７５のいずれか１つのアミノ酸配列を含む第２のスプリットデアミナーゼドメインと、
    （ｄ）右側ＴＡＬＥプログラマブルＤＮＡ結合ドメインと
    を含む、請求項２１又は２２に記載の標的化塩基エディター。
  88. 前記第１の部分は、
    （ａ）配列番号１７１のアミノ酸配列を含む第１のスプリットデアミナーゼドメインと、
    （ｂ）左側ＴＡＬＥプログラマブルＤＮＡ結合ドメインと
    を含み；
    前記第２の部分は、
    （ｃ）配列番号１７５のいずれか１つのアミノ酸配列を含む第２のスプリットデアミナーゼドメインと、
    （ｄ）右側ＴＡＬＥプログラマブルＤＮＡ結合ドメインと
    を含む、請求項２１又は２２に記載の標的化塩基エディター。
  89. 前記第１の部分は、
    （ａ）配列番号１６９のアミノ酸配列を含む第１のスプリットデアミナーゼドメインと、
    （ｂ）左側ＢＡＴプログラマブルＤＮＡ結合ドメインと
    を含み；
    前記第２の部分は、
    （ｃ）配列番号１７３又は１７５のいずれか１つのアミノ酸配列を含む第２のスプリットデアミナーゼドメインと、
    （ｄ）右側ＴＡＬＥプログラマブルＤＮＡ結合ドメインと
    を含む、請求項２１又は２２に記載の標的化塩基エディター。
  90. 前記第１の部分は、
    （ａ）配列番号１６９のアミノ酸配列を含む第１のスプリットデアミナーゼドメインと、
    （ｂ）第１のコイルドコイルドメインと、
    （ｃ）任意選択で、左側ＴＡＬＥプログラマブルＤＮＡ結合ドメインと
    を含み；
    前記第２の部分は、
    （ｄ）配列番号１７３又は１７５のいずれか１つのアミノ酸配列を含む第２のスプリットデアミナーゼドメインと、
    （ｅ）第２のコイルドコイルドメインと、
    （ｆ）任意選択で、右側ＴＡＬＥプログラマブルＤＮＡ結合ドメインと
    を含み、前記第１及び第２のコイルドコイルドメインは、前記第１及び第２の部分の結合時に一緒に相互作用する、請求項２１又は２２に記載の標的化塩基エディター。
  91. 前記第１及び第２の部分の一方又は両方は、少なくとも１つのリンカーを含む、請求項２２～９１のいずれか一項に記載の標的化塩基エディター。
  92. 前記第１及び第２の部分の一方又は両方は、少なくとも１つのリンカーを含み、
    前記リンカーは、前記プログラマブルＤＮＡ結合ドメインと前記スプリットデアミナーゼドメインとの間に位置する、請求項５０～９０のいずれか一項に記載の標的化塩基エディター。
  93. 前記第１及び第２の部分の両方は、前記プログラマブルＤＮＡ結合ドメインと前記スプリットデアミナーゼドメインとの間にリンカーを含む、請求項９２に記載の標的化塩基エディター。
  94. 前記リンカーは、２～２００アミノ酸長である、請求項９１～９３のいずれか一項に記載の標的化塩基エディター。
  95. 前記リンカーは、２～１６アミノ酸長である、請求項９４に記載の標的化塩基エディター。
  96. 前記リンカーは、ＧＳ、ＧＳＧ、ＧＳＳ又は配列番号２３～２７若しくは３０のいずれかのアミノ酸配列を含む、請求項９１～９５のいずれか一項に記載の標的化塩基エディター。
  97. 前記標的核酸が標的ＤＮＡ鎖上のプログラマブル結合ドメイン結合部位から９～１１塩基対であるように構成される、請求項５０～９６のいずれか一項に記載の標的化塩基エディター。
  98. 標的ＤＮＡ鎖上の２つのプログラマブル結合ドメインの２つの結合部位間の距離は、１２～２２塩基対である、請求項５０～９７のいずれか一項に記載の標的化塩基エディター。
  99. 標的ＤＮＡ鎖上の２つのプログラマブル結合ドメインの２つの結合部位間の距離は、１４～１９塩基対である、請求項９８に記載の標的化塩基エディター。
  100. 前記第１及び第２の部分の少なくとも一方は、細胞ターゲティング部分を含む、請求項２２～９９のいずれか一項に記載の標的化塩基エディター。
  101. 前記第１及び第２の部分の両方は、細胞ターゲティング部分を含む、請求項１００に記載の標的化塩基エディター。
  102. 前記第１及び第２の部分の両方は、同じ細胞ターゲティング部分を含む、請求項１０１に記載の標的化塩基エディター。
  103. 細胞ターゲティング部分は、ミトコンドリアターゲティング配列（ＭＴＳ）及び核局在化配列（ＮＬＳ）からなる群から選択される、請求項１００～１０２のいずれか一項に記載の標的化塩基エディター。
  104. 前記ＮＬＳは、配列番号３４～３９のいずれか１つのアミノ酸配列を含む、請求項１０３に記載の標的化塩基エディター。
  105. 前記ＭＴＳは、配列番号２２、６９、７１、１８２又は１８３のいずれか１つのアミノ酸配列を含む、請求項１０４に記載の標的化塩基エディター。
  106. 前記第１及び第２の部分の少なくとも一方は、塩基除去修復阻害剤を含む、請求項２２～１０５のいずれか一項に記載の標的化塩基エディター。
  107. 前記塩基除去修復阻害剤は、哺乳類ＤＮＡグリコシラーゼ阻害剤である、請求項１０６に記載の標的化塩基エディター。
  108. 前記塩基除去修復阻害剤は、ウラシルグリコシラーゼ阻害剤である、請求項１０６又は１０７に記載の標的化塩基エディター。
  109. 前記塩基除去修復阻害剤は、配列番号２１又は７０のいずれか１つを含むアミノ酸配列を有する、請求項１０６～１０８のいずれか一項に記載の標的化塩基エディター。
  110. 標的核酸と、請求項１７～１０９のいずれか一項に記載の標的化塩基エディターとを接触させるステップを含む方法であって、前記標的核酸は、二本鎖ＤＮＡであり、それにより、前記標的ヌクレオチド配列の前記実体は、前記標的化塩基エディターによって脱アミノ化される、方法。
  111. 前記標的ヌクレオチド配列中の前記脱アミノ化ヌクレオチドは、チミン又はグアニンヌクレオチドに変換され、前記変換は、前記標的ヌクレオチド配列の塩基編集を完了させる、請求項１１０に記載の方法。
  112. 前記標的核酸は、ミトコンドリアＤＮＡである、請求項１１０又は１１１に記載の方法。
  113. 前記標的ヌクレオチド配列は、ＡＣである、請求項１１０～１１２のいずれか一項に記載の方法。
  114. 前記標的ヌクレオチド配列は、ＣＣである、請求項１１０～１１２のいずれか一項に記載の方法。
  115. 前記標的ヌクレオチド配列は、ＧＣである、請求項１１０～１１２のいずれか一項に記載の方法。
  116. 前記標的ヌクレオチド配列は、ＴＣである、請求項１１０～１１２のいずれか一項に記載の方法。
  117. 前記標的ヌクレオチド配列中の最後のＣは、前記標的化塩基エディターによって脱アミノ化される、請求項１１０～１１６のいずれか一項に記載の方法。
  118. 前記標的ＤＮＡ中の前記標的ヌクレオチド配列の前記実体は、前記塩基エディター標的配列の２０ヌクレオチド以内にある、請求項１１０～１１７のいずれか一項に記載の方法。
  119. 前記標的核酸は、細胞内にあり、前記標的核酸と前記標的化塩基エディターとを接触させるステップは、前記細胞内への前記標的化塩基エディターの進入を促進することによって達成される、請求項１１０～１１８のいずれか一項に記載の方法。
  120. 前記細胞は、動物内にあり、前記標的核酸と前記標的化塩基エディターとを接触させるステップは、前記標的化塩基エディターを前記動物に投与することによって達成される、請求項１１９に記載の方法。
  121. 標的核酸と、１つ以上のデアミナーゼドメインとを接触させるステップであって、前記標的核酸は、二本鎖シトシン－メチル化ＤＮＡであり、前記デアミナーゼドメインは、二本鎖ＤＮＡを脱アミノ化することができ、前記デアミナーゼドメインは、実質的に前記標的核酸中の非メチル化シトシンヌクレオチドのみを脱アミノ化し、
    前記標的核酸中の前記非メチル化シトシンヌクレオチドの実質的に全ては、前記デアミナーゼドメインによって脱アミノ化される、ステップと；
    前記脱アミノ化標的核酸を配列決定するステップであって、それにより、前記標的核酸中のメチル化シトシンヌクレオチドは、同定される、ステップと
    を含む方法。
  122. 前記デアミナーゼドメインは、前記標的核酸中の前記非メチル化シトシンヌクレオチドの９０％以上を脱アミノ化する、請求項１２１に記載の方法。
  123. デアミナーゼドメインと標的核酸の複数のコピーとを、前記標的核酸の１コピー当たり平均０．１～５．０ヌクレオチドの脱アミノ化をもたらす時間にわたって且つそのような条件下で接触させるステップを含む方法であって、前記標的核酸は、二本鎖ＤＮＡであり、前記デアミナーゼドメインは、二本鎖ＤＮＡを脱アミノ化することができる、方法。
  124. 前記標的核酸の前記コピーは、インビトロである、請求項１２３に記載の方法。
  125. 前記標的核酸の前記コピー中の前記脱アミノ化ヌクレオチドは、インビトロ反応を介してチミン又はグアニンヌクレオチドに変換される、請求項１２４に記載の方法。
  126. 前記標的核酸の前記脱アミノ化コピーを選択手順に付すステップをさらに含む、請求項１２１～１２５のいずれか一項に記載の方法。
  127. 前記選択手順は、ｍＲＮＡディスプレイ、リボソームディスプレイ若しくはＳＥＬＥＸ又は細胞ベースの選択アッセイを含む、請求項１２６に記載の方法。
  128. 前記標的核酸の前記コピー中の前記脱アミノ化ヌクレオチドは、チミン又はグアニンヌクレオチドに変換され、前記変換は、標的核酸の前記コピーの一部又は全ての１つ以上の塩基編集を完了させる、請求項１２５～１２７のいずれか一項に記載の方法。
  129. 前記標的核酸の前記コピー中の前記脱アミノ化ヌクレオチドは、細胞内で前記標的核酸の前記コピーをインキュベートし、その後、ＤＮＡ複製／増幅ステップを行うことによってチミン又はグアニンヌクレオチドに変換される、請求項１２３に記載の方法。
  130. 前記標的核酸の前記コピーは、細胞内にあり、前記デアミナーゼドメインと標的核酸の前記コピーとを接触させるステップは、前記細胞内への前記デアミナーゼドメインの進入を促進することによって達成される、請求項１２３に記載の方法。
  131. 前記細胞は、動物内にあり、前記デアミナーゼドメインと標的核酸の前記コピーとを接触させるステップは、前記デアミナーゼドメインを前記動物に投与することによって達成される、請求項１３０に記載の方法。
  132. 前記標的核酸の前記コピーは、細胞内にあり、前記デアミナーゼドメインは、前記細胞内のトランスジェニック発現構築物によってコードされ、前記デアミナーゼドメインと標的核酸の前記コピーとを接触させるステップは、前記デアミナーゼドメインを前記細胞内で一過性発現させることによって達成される、請求項１３０に記載の方法。
  133. 対象の細胞内のミトコンドリアＤＮＡ中の１つ以上の核酸を編集することにより、前記対象のミトコンドリア遺伝病を治療又は予防する方法であって、
    請求項１～１１０のいずれか一項に記載の標的化シトシンデアミナーゼ塩基エディターを前記細胞に導入するステップ
    を含み、ミトコンドリアＤＮＡ中の標的核酸は、前記標的化塩基エディターによって脱アミノ化される、方法。
  134. 前記標的ヌクレオチド配列中の前記脱アミノ化ヌクレオチドは、チミン又はグアニンヌクレオチドに変換される、請求項１３３に記載の方法。
  135. 前記ミトコンドリアＤＮＡ中の１つ以上の核酸は、非病原性形態に編集される、請求項１３３又は１３４に記載の方法。
  136. 前記脱アミノ化ヌクレオチドは、ｍ．５８３Ｇ＞Ａ、ｍ．６１６Ｔ＞Ｃ、ｍ．１６０６Ｇ＞Ａ、ｍ．１６４４Ｇ＞Ａ、ｍ．３２５８Ｔ＞Ｃ、ｍ．３２７１Ｔ＞Ｃ、ｍ．３４６０Ｇ＞Ａ、ｍ．４２９８Ｇ＞Ａ、ｍ．５７２８Ｔ＞Ｃ、ｍ．５６５０Ｇ＞Ａ、ｍ．３２４３Ａ＞Ｇ、ｍ．８３４４Ａ＞Ｇ、ｍ．１４４５９Ｇ＞Ａ、ｍ．１１７７８Ｇ＞Ａ、ｍ．１４４８４Ｔ＞Ｃ、ｍ．８９９３Ｔ＞Ｃ、ｍ．１４４８４Ｔ＞Ｃ、ｍ．３４６０Ｇ＞Ａ及びｍ．１５５５Ａ＞Ｇから選択される位置にある、請求項１３３～１３５のいずれか一項に記載の方法。
  137. 前記細胞は、線維芽細胞、リンパ球、膵臓細胞、筋細胞、神経細胞及び幹細胞からなる群から選択される、請求項１３３～１３６のいずれか一項に記載の方法。
  138. 請求項２２～１１０のいずれか一項に記載の標的化塩基エディターを含むか又はそれを発現するベクター。
  139. 改変アデノウイルス（ＡＡＶ）ベクター、レンチウイルスベクター又はウイルス様粒子（ＶＬＰ）である、請求項１３８に記載のベクター。
  140. 前記標的化塩基エディターは、前記ベクター内に封入される、請求項１３８又は１３９に記載のベクター。
  141. 前記デアミナーゼドメインは、ベクター内の標的化塩基エディターを含む、請求項１２０又は１２９～１３７のいずれか一項に記載の方法。
  142. 前記第１及び第２の部分は、ＴＡＬＥ、ＢＡＴ、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９、Ｃｆｐ１及びジンクフィンガーからなる群から独立して選択されるプログラマブルＤＮＡ結合ドメインをそれぞれ含む、請求項２２～４９のいずれか一項に記載の標的化塩基エディター。
  143. 前記第１の部分は、ＴＡＬＥであり、及び前記第２の部分は、ＴＡＬＥであるか、前記第１の部分は、ＴＡＬＥであり、及び前記第２の部分は、ＢＡＴであるか、前記第１の部分は、ＴＡＬＥであり、及び前記第２の部分は、ジンクフィンガーであるか、前記第１の部分は、ＴＡＬＥであり、及び前記第２の部分は、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９であるか、前記第１の部分は、ＴＡＬＥであり、及び前記第２の部分は、Ｃｆｐ１であるか、前記第１の部分は、ＢＡＴであり、及び前記第２の部分は、ＴＡＬＥであるか、前記第１の部分は、ＢＡＴであり、及び前記第２の部分は、ＢＡＴであるか、前記第１の部分は、ＢＡＴであり、及び前記第２の部分は、ジンクフィンガーであるか、前記第１の部分は、ＢＡＴであり、及び前記第２の部分は、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９であるか、前記第１の部分は、ＢＡＴであり、及び前記第２の部分は、Ｃｆｐ１であるか、前記第１の部分は、ジンクフィンガーであり、及び前記第２の部分は、ＴＡＬＥであるか、前記第１の部分は、ジンクフィンガーであり、及び前記第２の部分は、ＢＡＴであるか、前記第１の部分は、ジンクフィンガーであり、及び前記第２の部分は、ジンクフィンガーであるか、前記第１の部分は、ジンクフィンガーであり、及び前記第２の部分は、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９であるか、前記第１の部分は、ジンクフィンガーであり、及び前記第２の部分は、Ｃｆｐ１であるか、前記第１の部分は、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９であり、及び前記第２の部分は、ＴＡＬＥであるか、前記第１の部分は、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９であり、及び前記第２の部分は、ＢＡＴであるか、前記第１の部分は、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９であり、及び前記第２の部分は、ジンクフィンガーであるか、前記第１の部分は、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９であり、及び前記第２の部分は、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９であるか、前記第１の部分は、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９であり、及び前記第２の部分は、Ｃｆｐ１であるか、前記第１の部分は、Ｃｆｐ１であり、及び前記第２の部分は、ＴＡＬＥであるか、前記第１の部分は、Ｃｆｐ１であり、及び前記第２の部分は、ＢＡＴであるか、前記第１の部分は、Ｃｆｐ１であり、及び前記第２の部分は、ジンクフィンガーであるか、前記第１の部分は、Ｃｆｐ１であり、及び前記第２の部分は、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９であるか、又は前記第１の部分は、Ｃｆｐ１であり、及び前記第２の部分は、Ｃｆｐ１である、請求項５０／１４２に記載の標的化塩基エディター。
  144. ミトコンドリア中のミトコンドリアＤＮＡ又は葉緑体中の葉緑体ＤＮＡにおける１つ以上の核酸を編集する方法であって、
    請求項１～１１０のいずれか一項に記載の標的化シトシンデアミナーゼ塩基エディターを前記ミトコンドリア又は前記葉緑体に導入するステップ
    を含み、ミトコンドリア又は葉緑体ＤＮＡ中の標的核酸は、前記標的化塩基エディターによって脱アミノ化される、方法。
  145. 前記ミトコンドリア又は前記葉緑体は、インビトロである、請求項１４４に記載の方法。
  146. 前記標的ヌクレオチドは、規定の編集閾値でのデアミナーゼ確率シーケンスロゴによって規定されるコンテキスト特異性をそれぞれ呈示する、請求項１又は２に記載のデアミナーゼドメイン。
JP2023542485A 2021-01-12 2022-01-12 コンテキスト依存性二本鎖ｄｎａ特異的デアミナーゼ及びその使用 Pending JP2024502630A (ja)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US202163136524P 2021-01-12 2021-01-12
US63/136,524 2021-01-12
PCT/US2022/012204 WO2022155265A2 (en) 2021-01-12 2022-01-12 Context-dependent, double-stranded dna-specific deaminases and uses thereof

Publications (1)

Publication Number Publication Date
JP2024502630A true JP2024502630A (ja) 2024-01-22

Family

ID=80168318

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2023542485A Pending JP2024502630A (ja) 2021-01-12 2022-01-12 コンテキスト依存性二本鎖ｄｎａ特異的デアミナーゼ及びその使用

Country Status (7)

Country Link
EP (1) EP4277989A2 (ja)
JP (1) JP2024502630A (ja)
KR (1) KR20230142500A (ja)
CN (1) CN117321197A (ja)
AU (1) AU2022207981A1 (ja)
CA (1) CA3207102A1 (ja)
WO (1) WO2022155265A2 (ja)

Families Citing this family (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2021536229A (ja) 2018-08-23 2021-12-27 サンガモ セラピューティクス， インコーポレイテッド 操作された標的特異的な塩基エディター
WO2023122722A1 (en) * 2021-12-22 2023-06-29 Sangamo Therapeutics, Inc. Novel zinc finger fusion proteins for nucleobase editing
WO2024065721A1 (en) * 2022-09-30 2024-04-04 Peking University Methods of determining genome-wide dna binding protein binding sites by footprinting with double stranded dna deaminase
CN117106758B (zh) * 2023-08-25 2024-05-17 南京医科大学 一种特异在DNA的gC基序上实现C/G到T/A编辑的RiCBE系统

Family Cites Families (25)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4751180A (en) 1985-03-28 1988-06-14 Chiron Corporation Expression using fused genes providing for protein product
US4935233A (en) 1985-12-02 1990-06-19 G. D. Searle And Company Covalently linked polypeptide cell modulators
GB9710807D0 (en) 1997-05-23 1997-07-23 Medical Res Council Nucleic acid binding proteins
GB9710809D0 (en) 1997-05-23 1997-07-23 Medical Res Council Nucleic acid binding proteins
US6140081A (en) 1998-10-16 2000-10-31 The Scripps Research Institute Zinc finger binding domains for GNN
US6534261B1 (en) 1999-01-12 2003-03-18 Sangamo Biosciences, Inc. Regulation of endogenous gene expression in cells using zinc finger proteins
US6453242B1 (en) 1999-01-12 2002-09-17 Sangamo Biosciences, Inc. Selection of sites for targeting by zinc finger proteins and methods of designing zinc finger proteins to bind to preselected sites
US7067617B2 (en) 2001-02-21 2006-06-27 The Scripps Research Institute Zinc finger binding domains for nucleotide sequence ANN
US20040197892A1 (en) 2001-04-04 2004-10-07 Michael Moore Composition binding polypeptides
JP2005500061A (ja) 2001-08-20 2005-01-06 ザ スクリップス リサーチ インスティテュート Ｃｎｎについての亜鉛フィンガー結合ドメイン
JP2009520463A (ja) 2005-11-28 2009-05-28 ザ スクリプス リサーチ インスティテュート Ｔｎｎのための亜鉛フィンガー結合ドメイン
WO2007081647A2 (en) 2006-01-03 2007-07-19 The Scripps Research Institute Zinc finger domains specifically binding agc
WO2009146179A1 (en) 2008-04-15 2009-12-03 University Of Iowa Research Foundation Zinc finger nuclease for the cftr gene and methods of use thereof
EP2206723A1 (en) 2009-01-12 2010-07-14 Bonas, Ulla Modular DNA-binding domains
AU2010327998B2 (en) 2009-12-10 2015-11-12 Iowa State University Research Foundation, Inc. TAL effector-mediated DNA modification
MX362866B (es) 2012-05-25 2019-02-20 Univ California Metodos y composiciones para la modificacion de adn objetivo dirigida por arn y para la modulacion de la transcripcion dirigida por arn.
EP3808844A1 (en) 2012-07-25 2021-04-21 The Broad Institute, Inc. Inducible dna binding proteins and genome perturbation tools and applications thereof
US20140189896A1 (en) 2012-12-12 2014-07-03 Feng Zhang Crispr-cas component systems, methods and compositions for sequence manipulation
US9790490B2 (en) 2015-06-18 2017-10-17 The Broad Institute Inc. CRISPR enzymes and systems
EP4269577A3 (en) * 2015-10-23 2024-01-17 President and Fellows of Harvard College Nucleobase editors and uses thereof
US20190233814A1 (en) 2015-12-18 2019-08-01 The Broad Institute, Inc. Novel crispr enzymes and systems
CN108884785B (zh) 2016-03-28 2022-03-15 沃尔布罗有限责任公司 用于发动机暖机的燃料供应系统
SG11201900907YA (en) 2016-08-03 2019-02-27 Harvard College Adenosine nucleobase editors and uses thereof
CN110914426A (zh) * 2017-03-23 2020-03-24 哈佛大学的校长及成员们 包含核酸可编程dna结合蛋白的核碱基编辑器
CA3166153A1 (en) 2020-01-28 2021-08-05 The Broad Institute, Inc. Base editors, compositions, and methods for modifying the mitochondrial genome

Also Published As

Publication number Publication date
CN117321197A (zh) 2023-12-29
KR20230142500A (ko) 2023-10-11
WO2022155265A2 (en) 2022-07-21
WO2022155265A3 (en) 2022-08-25
AU2022207981A1 (en) 2023-07-27
CA3207102A1 (en) 2022-07-21
EP4277989A2 (en) 2023-11-22

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US11098326B2 (en) Using RNA-guided FokI nucleases (RFNs) to increase specificity for RNA-guided genome editing
US11319532B2 (en) High efficiency base editors comprising Gam
US10392616B2 (en) CRISPR RNA targeting enzymes and systems and uses thereof
US20230021641A1 (en) Cas9 variants having non-canonical pam specificities and uses thereof
JP2024502630A (ja) コンテキスト依存性二本鎖ｄｎａ特異的デアミナーゼ及びその使用
JP2023525304A (ja) 標的二本鎖ヌクレオチド配列の両鎖同時編集のための方法および組成物
US10011850B2 (en) Using RNA-guided FokI Nucleases (RFNs) to increase specificity for RNA-Guided Genome Editing
CA3130488A1 (en) Methods and compositions for editing nucleotide sequences
EP3658573A1 (en) Methods and compositions for evolving base editors using phage-assisted continuous evolution (pace)
JPWO2020191243A5 (ja)
JPWO2020191234A5 (ja)
JPWO2020191233A5 (ja)
WO2022261509A1 (en) Improved cytosine to guanine base editors
CA3234217A1 (en) Base editing enzymes
CA3227004A1 (en) Improved prime editors and methods of use
Pedrazzoli Expanding the CRISPR-Cas9 toolbox for genome editing
Kim Base Editing: A New Approach to Genome Editing
WO2024086845A2 (en) Engineered casphi2 nucleases
WO2023023519A1 (en) Crispr-associated transposons and uses thereof
CA3163369A1 (en) Variant cas9