KR20210146986A - 베타-지중해빈혈의 치료 방법 - Google Patents

베타-지중해빈혈의 치료 방법 Download PDF

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4세 웨스턴 피 밀러
존 토마로
사가르 에이 바이댜
마크 월터스
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상가모 테라퓨틱스, 인코포레이티드
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Abstract

베타-지중해빈혈을 치료하기 위한 방법 및 조성물이 본원에 기재되어 있다.

Description

베타-지중해빈혈의 치료 방법
관련 출원에 대한 상호 참조
본 출원은 2019년 4월 2일자로 출원된 미국 가출원 제62/828,182호; 2019년 11월 5일자로 출원된 미국 가출원 제62/930,846호; 및 2019년 12월 6일자로 출원된 미국 가출원 제62/944,626호의 이익을 주장하며, 이들의 개시 내용은 그 전체가 참조로서 본원에 포함된다.
서열 목록
본 출원은 ASCII 형식으로 전자적으로 제출된 서열 목록을 포함하며, 그 전체 내용이 본원에 참조로서 포함된다. 2020년 1월 10일자로 생성된 상기 ASCII 카피는 명칭이 8328-0194_40_SL.txt이며, 크기가 8,701 바이트이다.
기술분야
본 발명은 β-지중해빈혈을 치료하는 방법, 및 유전자 요법에 관한 것이다.
β-지중해빈혈은 β-글로빈 사슬 합성이 없거나 결핍된 것을 특징으로 하는 유전성 빈혈이다(문헌[Higgs & Engel (2012) Lancet 379(9813):373-83]). 결핍은 글로빈 사슬 생성의 불균형과 헤모글로빈(2개의 α-글로빈 사슬과 2개의 β-글로빈 사슬로 구성됨)의 감소를 초래한다. 글로빈 사슬 불균형의 결과로, 적혈구(RBC) 또는 적혈구 전구체에서 불안정한 α-글로빈 사슬 사량체가 형성되고, 골수내 파괴, 세포사멸, 비효율적인 적혈구생성, 철분 과부하 및 심한 빈혈이 발생한다(문헌[Origa, R. (2017) Genet Med 19(6):609-619]).
지중해빈혈(β 및 α)은 인간에서 가장 흔한 단일유전자 질환이다. 이들은 전 세계적으로 분포하지만, 남아시아, 인도 아대륙, 중동 및 지중해 지역, 사하라 사막 이남의 아프리카에서 가장 흔하다(문헌[Modell et al. (2008) J Cardiovasc Magn Reson. 10:42]; 문헌[Colah et al. (2010) Expert Rev Hematol 3(1):103-17]). 전 세계 인구의 약 1.5%가 β-지중해빈혈 돌연변이(예를 들어, IVS-I의 뉴클레오타이드 5 "IVS-I-5"에서 G->C 돌연변이; IVS-II의 뉴클레오타이드 654 "IVS-II-654'에서 C>T 돌연변이)의 보균자인 것으로 추정되며, 매년 약 60,000명의 증상이 있는 개체가 태어난다(문헌[Galanello & Origa (2010) Orphanet J Rare Dis. 5:11]).
β-지중해빈혈의 임상적 중증도는 생성된 정상 헤모글로빈의 양에 의해 결정되고, 고전적으로 경증성 β-지중해빈혈, 중간형 β-지중해빈혈, 및 중증성 β-지중해빈혈로 지칭되는, 3가지 임상 및 혈액학적 상태를 정의한다. 경증성 β-지중해빈혈 환자들은 경미하거나, 빈혈이 없으며, 일반적으로 무증상 보균자이다. 중간형 β-지중해빈혈 환자들은 중등도의 중증 빈혈을 가지고 있으며, 삶의 질을 향상시키기 위해 수혈의 혜택을 받을 수 있지만 나중에는 종종 수혈-의존적 표현형이 발생한다. 중증성 β-지중해빈혈 환자들은 빈혈이 심하며, 평생 수혈을 자주 받아야 한다. 빈혈로 인한 이환에는 성장 장애, 골격 기형, 폐 고혈압, 정맥 혈전색전증, 간경변, 심부전, 다리 궤양 및 내분비 기능장애가 포함된다(문헌[Vichinsky et al. (2005) Pediatrics. 116(6):e818-25]). 수혈-의존성 표현형과 관련된 β-글로빈 돌연변이 및 유전 질환 변형체의 많은 조합이 있지만, 이 연구에서는 집합적으로 이 병태를 수혈-의존성 β-지중해빈혈(TDT)이라고 한다(문헌[Galanello & Origa], 상동).
지지 치료 프로그램의 이점이 인식됨에 따라 지난 50년 동안 TDT 환자에 대한 건강 결과의 개선이 일어났다. 이 프로그램은 진단이 확정되고 빈혈이 발생하는 즉시 시작되는 정기적인 적혈구 수혈로 구성된다. 적혈구 수혈은 수혈로 인해 발생하는 중요한 장기의 철분 과부하를 줄이기 위해 정기적인 철분 킬레이트화 요법을 동반한다. 이 지지 치료 프로그램은 TDT의 이환율을 상당히 개선하지만, 이 프로그램을 사용하더라도 치료를 받은 환자의 20%는 기대 수명이 40세 미만이다(문헌[Modell et al. (2008) J Cardiovasc Magn Reason 10:42]). 또한, 이 프로그램은 2011년에 50년 동안 한 명의 환자를 치료하는 데 $1,971,380 USD의 비용이 들 것으로 추정되는 시간-소모적이고 자원-집약적이다(문헌[Koren et al. (2014) Mediterr J Hematol Infect Dis 6(1):e2014012]).
현재, TDT에 대해 입증된 유일한 치료법은 동종 조혈모세포 이식(HSCT)이다. 동종 HSCT는 만성 이환율(예를 들어, 이식편대숙주병[GVHD])의 실질적 위험과 5년 사망률을 기준으로 하여 10~15%의 사망 위험을 수반한다(문헌[Locatelli et al. (2013) Blood 122(6):1072-8]; 문헌[Baronciani et al. (2016) Bone Marrow Transplant 51(4):536-41]). 또한, 공개된 보고서에 따르면 혈연이 아니면서 잘 부합하는 동종 공여자를 식별할 확률은 수혜자의 인종에 의해 영향을 받으며; 예를 들어, 아프리카 혈통의 개인 중 적합한 공여자를 찾을 확률은 19%에 불과한 것으로 추정된다(문헌[Gragert et al. (2014) N Engl J Med. 371(4):339-48]). 따라서, 대부분은 아니지만 많은 수혜자들은 동종 HSCT에 대한 인간 백혈구 항원(HLA)-일치 공여자가 부족하여 이 잠재적인 치료를 사용할 수 없게 된다.
따라서, TDT를 치료 및/또는 예방하기 위한 조성물 및 방법이 여전히 필요하다.
본원은 치료를 필요로 하는 대상체에서 β-지중해빈혈을 치료 및/또는 예방하기 위한 조성물 및 방법을 개시한다. 본 개시 내용은 게놈 편집 및/또는 유전자 전달을 위한 방법 및 조성물을 제공한다. 본 개시 내용은 또한 베타 글로빈의 충분한 발현이 결여된 대상체(예를 들어, β0/β0 또는 비-β0/β0 대상체)의 치료를 위한 세포 요법을 위한 방법 및 조성물을 제공한다. 대상체에서 비정상적인 베타 글로빈 발현은 하기 돌연변이 중 하나 이상을 포함하지만, 이에 제한되지 않는 임의의 돌연변이에 의해 야기될 수 있다: IVS-I-5; IVS-II-654. 일부 구현예에서, 본원에 개시된 방법 및 조성물은 수혈-의존성 β-지중해빈혈(TDT)을 치료하는 데 사용된다. 본 개시 내용은 조작된 뉴클레아제를 사용하여 변형된 세포를 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는 β-지중해빈혈이 있는 대상체를 치료하는 방법을 제공하며, 여기서 대상체는 치료된다. 환자에게 투여되는 세포는 자가(환자로부터 단리되고, 유전적으로 변형된 후 환자에게 재주입됨) 또는 예를 들어, 건강한 환자로부터 단리되어 환자에게 주입된 동종 세포일 수 있다.
본원에 제공된 바와 같이, TDT의 치료에 사용하기 위한 것을 포함하여, 헤모글로빈의 발현을 변경하는 방법에는 그램/dL 혈장의 변화와 대상체의 총 Hb 중 HbF 백분율의 관점에서 임상 실험실 헤모글로빈 분획(성인 헤모글로빈, HbA 및 태아 헤모글로빈, HbF)의 기준선으로부터의 변화를 초래하는 방법이 포함된다. 일부 구현예에서, 본원에 개시된 치료 방법의 사용은 지중해빈혈-관련 질환 바이오마커의 변화를 초래할 수 있다. 일부 구현예에서, 지중해빈혈-관련 질환 바이오마커의 변화는 철분 대사의 변화 및/또는 에리트로포이에틴, 합토글로빈 및 헵시딘 수준의 변화를 포함할 수 있지만, 이에 제한되지 않는다. 일부 구현예에서, 치료 방법은 기준선 수혈 요법과 관련된 철분 과부하와 관련된 환자의 증상의 변화를 초래할 수 있다. 철분 과부하 증상의 변화에는 내분비 기관의 철분 침착으로 인한 내분비 기능장애의 감소가 포함될 수 있다. 내분비 기능장애는 갑상선 호르몬, IGF-1, 모닝 코티솔, 부신피질자극 호르몬(ACTH), HbA1C, 및/또는 비타민 D와 같은 인자(수준 및/또는 활성)를 측정하여 평가될 수 있으며, 이에 제한되지 않는다. HbA, HbF, 에리트로포이에틴, 합토글로빈, 헵시딘, 갑상선 호르몬, IGF-1, 코티솔, ACTH 및 비타민 D를 포함한 위의 모든 인자들의 결정은 표준 임상 실험실 프로토콜에 의해 측정될 수 있다.
일부 구현예에서, 본원에 기재된 치료의 용도 및 방법은 RBC 수혈 및, 혈소판, 정맥내 면역글로빈(IVIG), β-지중해빈혈이 있는 대상체(예를 들어, TDT)의 혈장 및 과립구를 포함하지만, 이에 제한되지 않는 다른 혈액 제제의 주입(사용)의 필요성을 감소시킬 것이다. 본 발명의 방법 및 조성물로 치료된 대상체에서 RBC 및 기타 혈액 제제 주입의 사용 변화는 대상체에 대한 사용 로그를 유지함으로써 평가될 수 있다. 로그는 본원에 개시된 조성물을 주입한 후 패킹된 적혈구(PRBC)의 연간 빈도 및 부피를 계산하고 치료 전 대상의 과거 PRBC 및 기타 혈액 제제 사용과 비교하는 데 사용될 수 있다.
일부 구현예에서, 본원에 기재된 바와 같은 치료 방법은 간 질환의 감소를 초래한다. 간 질환과 간비대는 적혈구(RBC) 파괴 증가와 골수외 적혈구생성으로 인한 TDT의 흔한 동반-질환이다. 적혈구생성의 가속화된 속도는 장에서 식이 철분 흡수를 향상시켜, 유전성 혈색소 침착증에서 나타나는 것과 유사한 철분 과부하의 만성 상태를 초래한다. 간에서의 철분 침착의 변화는 간세포 및 쿠퍼 세포의 철분 침착이 R2 기반 FERRISCAN®(Resonance Health) 기술과 같은 표준 방법을 사용하여 평가될 수 있는 MRI로 평가할 수 있다(예를 들어, 문헌[St Pierre et al. (2013) Magn Reason Med 71(6):2215-23] 참조).
일부 구현예에서, 본원에 기재된 바와 같은 치료 방법은 심장 이상의 감소를 초래한다. 심부전 및 치명적인 부정맥을 포함한 심장 이상은 TDT의 주요 합병증이자 빈번한 사망 원인이다. 평생 수혈 요법은 심장 병리를 개선하지만, TDT 환자는 심근의 철분 침착으로 인해 종종 심장 혈색소증을 발생시킨다(문헌[He et al. (2008) Magn Reason Med 60(5):1082-1089] 참조). 심근의 철분 침착 및 과부하는 표준 심근 T2*(T2 스타) 자기 공명 기술로 볼 수 있으므로, 심장 이상의 변화는 MRI로 평가될 수 있다.
일부 구현예에서, 본원에 기재된 바와 같은 치료 방법은 TDT의 일반적인 합병증인 골다공증 및 골절의 감소를 초래한다(문헌[Vogiatzi et al. (2009) J Bone Miner Res 24(3):543-57]). 본원에 개시된 방법의 결과로서 골밀도, 골다공증 및 골절 위험의 변화는 표준 DXA 골밀도 스캔(이중 에너지 x 선 흡수계 DXA, 예를 들어 문헌[Blake and Fogelman (2007) Postgrad Med J 83(982):509-517] 참조)을 사용하여 평가될 수 있다.
일부 구현예에서, 본원에 기재된 치료 방법은 적혈구 전구 세포의 형태 및/또는 유형의 관점에서 기준선 적혈구생성의 변화(예를 들어, 감소 또는 증가)를 초래한다. TDT는 고도의 미성숙 세포 및 종종 기괴한 형태의 적혈구 전구체를 갖는 극심한 적혈구 증식증을 유발한다. 본 발명의 방법 및 조성물은 더 적은 미성숙 세포의 존재를 야기할 수 있고/있거나 비-전형적인 형태를 갖는 세포의 수를 감소시킬 수 있다. 적혈구생성의 변화는 조혈을 특성화하기 위한 일상적인 임상 절차인 표준 골수 흡인으로 평가될 수 있다.
일부 구현예에서, 본원에 기재된 치료 방법은 F 세포의 수 및 백분율에서 기준선으로부터의 변화를 초래한다. F 세포는 측정 가능한 양의 HbF를 함유하는 적혈구이다. 치료 방법의 결과로서 F 세포의 변화에 대한 평가는 당업계에 공지된 방법에 의해 측정될 수 있다(예를 들어, 문헌[Wood et al. (1975) Blood 46(5):671] 참조). 특정 구현예에서, F 세포의 수 및/또는 백분율은 치료되지 않은 대상체와 비교하여, 본원에 기재된 바와 같이 치료된 대상체에서 증가된다.
내인성 BCL11A 서열(예를 들어, 내인성 BCL11A 인핸서 서열)을 절단하는 하나 이상의 ZFN을 암호화하는 하나 이상의 mRNA를 포함하는 조성물이 본원에 개시된다. 특정 구현예에서, 하나 이상의 mRNA는 SB-mRENH1 mRNA 및/또는 SB-mRENH2 mRNA(서열 번호: 15 및 서열 번호: 16에 개시된 바와 같음)를 포함한다. 또한, SB-mRENH1 및 SB-mRENH2 mRNA를 포함하는 조성물을 포함하여, 동일하거나 상이한 mRNA 중 하나 이상을 포함하는 약제학적 조성물이 개시된다.
하나 이상의 mRNA 및/또는 이들 mRNA를 포함하는 하나 이상의 약제학적 조성물을 포함하는 단리된 세포 및 단리된 세포 집단이 또한 제공된다. 또한, 유전적으로 변형된 세포, 및 유전적으로 변형된 세포의 자손을 포함하지만, 이에 제한되지 않는 그로부터 유래된 세포를 포함하는 조성물이 기재되어 있다. 유전적으로 변형된 자손 세포는 시험관 내 방법(유전적으로 변형된 세포의 배양)에 의해, 및/또는 대상체에 유전적으로 변형된 세포를 투여한 후 생체 내에서 수득될 수 있다. 따라서, 유전적으로 변형된 자손 세포는 유전적으로 변형된 세포로부터 유래된 완전히 또는 부분적으로 분화된 자손을 포함할 수 있다. 특정 구현예에서, 유전적으로 변형된 세포 조성물은 BCL11A 서열이 절단되고 세포 내의 헤모글로빈(예를 들어, HbF 및/또는 HbA) 수준이 유전적으로 변형되지 않은 세포와 비교하여 증가(예를 들어, 3 내지 4배 이상)된 유전적으로 변형된 세포를 포함하는, 유전적으로 변형된 조혈모세포(또한, 조혈모 전구 세포(HPSC) 또는 조혈모세포/전구 세포(HSC/PC)로도 지칭됨) 및/또는 이로부터 유래된, 또는 생성된(배양된) 유전적으로 변형된 세포를 포함한다. 본원에 기재된 세포 집단 및 세포의 조성물의 유전적으로 변형된 세포의 일부, 전부가 하나 이상의 mRNA 및/또는 이들 mRNA를 포함하는 약제학적 조성물을 포함할 수 있거나, 본원에 기재된 세포 집단 및 세포의 조성물의 유전적으로 변형된 세포의 어느 것도 하나 이상의 mRNA 및/또는 이들 mRNA를 포함하는 약제학적 조성물을 포함하지 않을 수 있다. 따라서, 세포, 세포 집단 및 이들 세포를 포함하는 조성물이 본원에 기재되며, 이들 세포, 세포 집단 및 조성물은 본원에 기재된 mRNA를 포함하는 유전적으로 변형된 세포 및 이로부터 유래된 세포를 포함한다. 세포, 세포 집단, 및 이들 세포 및 세포 집단을 포함하는 조성물은 자가 및/또는 동종 세포를 포함할 수 있다. 본원에 기재된 바와 같이, 유전적으로 변형된 세포(예를 들어, 변형되지 않은 세포와 비교하여 증가된 글로빈 발현을 나타내는 HPSC와 같은 적혈구계 전구 세포)를 포함하는 약제학적 조성물이 또한 제공된다.
유전적으로 변형된 세포 내 헤모글로빈(예를 들어, HbF 및/또는 HbA) 수준이 비변형된 세포와 비교하여(예를 들어, 2배 이상) 증가되도록 BCL11A 서열(예를 들어, 인핸서 서열)이 유전적으로 변형된 세포의 유전적으로 변형된 집단을 제조하는 방법을 포함하여, 유전적으로 변형된 단리된 세포(또는 유전적으로 변형된 세포 및 이로부터 유래된 세포를 포함하는 세포 집단 또는 조성물)을 제조(생성)하는 방법들이 또한 제공된다. 특정 구현예에서, 방법은 본원에 기재된 바와 같은 하나 이상의 mRNA(또는 하나 이상의 mRNA를 포함하는 약제학적 조성물)를 세포에 (예를 들어, 형질감염을 통해) 투여하는 단계를 포함한다. 세포는 자가 및/또는 동종일 수 있고, HSPC일 수 있다. 특정 구현예에서, 방법은 유전적으로 변형된 세포를 배양하여, 증가된 글로빈 생산을 나타내는, 유전적으로 변형된 세포(예를 들어, HPSC 세포) 및/또는 그로부터 유래된 유전적으로 변형된 세포(예를 들어, 다른 적혈구 전구 세포 및/또는 성숙한 적혈구, 예컨대 RBC)의 집단을 포함하는 조성물을 생성하는 단계를 추가로 포함한다. 조성물은 mRNA를 포함하는 유전적으로 변형된 세포 및/또는 더 이상 mRNA를 포함하지 않지만 유전적 변형(BCL11A-특이적 변형)을 유지하는 이러한 세포로부터 유래된 유전적으로 변형된 세포를 포함할 수 있다. 유전적으로 변형된 세포 집단 및/또는 이로부터 유래된 세포를 포함하는 약제학적 조성물이 또한 제공된다.
따라서, 일부 구현예에서, 본원에 개시된 방법 및 조성물은 생체 외에서 변형된 세포로 대상체를 치료하는 것에 관한 것이다. 일부 구현예에서, 세포는 대상체로부터 단리되고, 생체 외에서 변형된 다음, 대상체에게 반환된다. 다른 구현예에서, 세포는 건강한 공여자로부터 단리되고, 생체 외에서 변형된 다음, 대상체를 치료하는데 사용된다. 추가 구현예에서, 건강한 공여자로부터 단리된 세포는 자가-마커(예를 들어, HLA 복합체)를 제거하여 대상체에 의한 세포의 거부를 피하기 위해 생체 외에서 추가로 변형된다. 일부 구현예에서, 단리된 세포는 줄기 세포이다. 추가 구현예에서, 줄기 세포는 조혈모 세포/전구 세포(예를 들어, CD34+ HSC/PC)이다. 일부 구현예에서, CD34+ HSC/PC는 과립구 콜로니-자극 인자(G-CSF)의 1회 이상의 용량으로의 치료에 의해 각 대상체에서 동원된다. 일부 구현예에서, 사용된 G-CSF의 용량은 약 10 μg/kg/일이다. 일부 구현예에서, G-CSF의 1회 이상의 용량은 플레릭사포(plerixafor)의 1회 이상의 용량과 조합된다. 일부 구현예에서, 사용된 플레릭사포의 용량은 약 240 μg/kg/일이다. 추가 구현예에서, 동원된 세포는 하나 이상의 성분채집 주기에 의해 수확된다.
동원된 인간 CD34+ HSPC는 건강한 또는 베타-지중해빈혈 환자로부터 성분채집에 의해 수집될 수 있고, 본원에 기재된 바와 같은 하나 이상의 mRNA(또는 하나 이상의 mRNA를 포함하는 약제학적 조성물)의 투여(형질감염) 전에 정제될 수 있다. 특정 구현예에서, 정제된 HSPC는 ZFN mRNAs SB-mRENH1 및 SBmRENH2(서열 번호: 15 및 서열 번호: 16)로 형질감염된다. 형질감염된 유전적으로 변형된 CD34+ HSPC("ST-400")는 사용을 위해 배양, 수확 및/또는 동결될 수 있다. 수확 후, 본 명세서에 기재된 바와 같은 유전적으로 변형된 세포를 포함하는 조성물(세포의 적어도 50%, 바람직하게는 적어도 70% 이상, 훨씬 더 바람직하게는 적어도 75~80% 또는 그 이상이 mRNA 투여 후 유전적으로 변형되고, 바람직하게는 다른 유전적 유전자좌와 비교하여 BCL11A 인핸서 서열에서 특이적으로 변형됨)("ST-400")은 HSPC 및 그로부터 유래된 세포, 예를 들어 적혈구 전구 세포(CFU-E 및 BFU-E), 과립구/대식세포 전구체(CFU-G/M/GM), 및 다중-전위 전구체(CFU-GEMM)를 포함한 모든 조혈 계통으로 분화된 HSPC를 포함할 수 있다. 특정 구현예에서, 세포의 조성(집단)의 유전적으로 변형된 세포의 일부, 또는 전부가 하나 이상의 mRNA를 포함하거나, 세포의 조성(집단)의 유전적으로 변형된 세포의 어느 것도 하나 이상의 mRNA를 포함하지 않는다.
본원에 기재된 임의의 방법 또는 용도에서, 대상체는 β-지중해빈혈의 확인된 분자 유전 진단을 가지며; β-지중해빈혈(예를 들어, TDT)의 확인된 임상 진단은; β0/β0 또는 비-β0/β0이며/이거나, 18세에서 40세 사이에 임상 진단을 받은 β-베타 지중해빈혈(예를 들어, TDT)로 이전 2년 기간에 연간 기준으로 연간 8건 이하의 문서화된 PRBC 수혈 사례가 있다. 특정 구현예에서, 유전적으로 변형된 CD34+ HSPC는 대상체(자가 유래)로부터 수득된 세포로부터 생성된다. 특정 구현예에서, CD34+ HSPC는 G-CSF 및 플레릭사포를 사용한 치료를 사용하여 각 대상체에서 동원된다. 동원된 CD34+ HSPC는 성분채집에 의한 동원 후 1일 이상(예를 들어, 3, 4, 5, 6, 7일 이상), 예를 들어 충분한 세포가 수집될 때까지 연속 2일 이상 각 대상체로부터 수집된다. 특정 구현예에서, 적어도 약 1 x 104 내지 1 x 107(예를 들어, 25 x 106) CD34+ HSPCs/kg이 수집된다. 필요한 경우, 첫 번째 주기 후 1, 2, 3주 또는 그 이상 후에 두 번째 동원 및 성분채집 주기가 수행될 수 있다. 특정 구현예에서, 수집된 세포의 일부는 본원에 기재된 바와 같은 유전적 변형의 대상이 되고, 나머지는 대상체에 대한 구조 치료가 지시되는 경우 유지(예를 들어, 냉동보존)된다.
일부 구현예에서, 세포는 대상체(자가조직)로부터 제거되고, 태아 헤모글로빈(HbF) 생산의 조절에 관여하는 유전자를 표적으로 하는 뉴클레아제로 치료된다. 일부 구현예에서, 유전자는 HbF 생산의 억제인자이다. 일부 구현예에서, 유전자는 BCL11A 유전자이다. 일부 구현예에서, 뉴클레아제는 BCL11A 유전자의 적혈구계-특이적 인핸서 영역을 표적으로 하고 절단한다. 일부 구현예에서, 뉴클레아제는 mRNA로서 세포에 전달된다. 일부 구현예에서, 적혈구계-특이적 인핸서 영역의 절단은 적혈구계 전사 인자 GATA1에 대한 결합 부위가 파괴되도록 세포 복구 기구에 의한 절단 부위의 에러-프론(error-prone) 복구를 초래한다(문헌[Vierstra et al. (2015) Nat Methods 12(10):927-30]; 문헌[Canver et al. (2015) Nature 527(7577):192-7] 참조). 일부 구현예에서, 뉴클레아제는 조혈모 세포에서 발현되지 않도록 BCL11A 유전자의 적혈구계-특이적 인핸서 영역을 표적화한다. 표적화된 인핸서 영역은 BCL11A의 전사 시작 부위로부터 킬로베이스 단위의 거리에 따라 넘버링된 내인성 BCL11A의 인트론 2 내의 +58, +55 및/또는 +62 영역을 포함하지만 이에 제한되지 않는 암호화 영역 내부 또는 외부에 있을 수 있으며, 인핸서 영역은 대략 350 (+55); 550 (+58); 및 350 (+62)개의 뉴클레오타이드 길이이다. 예를 들어, 문헌[Bauer et al. (2013) Science 343:253-257]; 미국 특허 제9,963,715호; 제10,072,066호; 및 미국 특허 공개 번호 제2015/0132269호 및 제2018/0362926호를 참조한다. 일부 구현예에서, 변형된 HSC/PC는 대상체로 되돌아가기 전에 평가된다. 일부 구현예에서, 변형된 세포는 BCL11A 인핸서 영역에서 뉴클레아제-유도 돌연변이의 존재 및 유형에 대해 평가된다. 일부 구현예에서, 돌연변이는 뉴클레오타이드의 삽입, 뉴클레오타이드의 결실 또는 둘 다("인델")일 수 있다. 일부 구현예에서, 세포는 뉴클레아제에 의한 표적외 절단에 대해 평가된다. 일부 구현예에서, 세포는 뉴클레아제 절단 후 세포 염색체의 분자 전위 및/또는 핵형에 대해 평가된다. 일부 구현예에서, 세포는 표적외 전사 활성에 대해 평가된다. 일부 구현예에서, 세포는 내독소 부하에 대해 평가된다. 일부 구현예에서, 세포는 상기 특성 중 하나 이상에 대해 평가될 수 있다.
일부 구현예에서, 변형된 CD34+ HSC/PC는 HbF 생산이 증가되고 β-지중해빈혈의 임상 증상이 감소되도록 하는 용량으로 대상체에게 되돌아간다. 일부 구현예에서, 대상체는 변형된 CD34+ HSC/PC를 주입하기 전에 하나 이상의 골수절제 병태 제제로 치료된다. 일부 구현예에서, 근육연화제는 부설판이다. 추가 구현예에서, 부술판은 사이클로포스파미드와 같은 다른 작용제와 함께 사용된다.
일부 구현예에서, 유전적으로 변형된 세포의 약 3 x 106개 세포/kg 내지 약 20 x 106개 세포/kg(또는 이들 사이의 임의의 값)의 용량이 (예를 들어, 정맥내 주입을 통해) 대상체에게 투여된다. 일부 구현예에서, 세포는 10% DMSO를 함유하는 불용성 저온배지에서 제형화된다. 일부 구현예에서, 세포는 대략 1 x 107 세포/mL의 농도에서 백(bag) 당 1.0~2.0 x 108 세포/mL로 제형화된다. 본원에 기재된 임의의 방법에서, 세포 투여량은 총 세포 투여량으로서 또는 CD34+ 세포 투여량으로서 결정될 수 있으며, 이는 하기와 같이 계산될 수 있다: CD34+ 투여량 = [총 세포 투여량] x [CD34+ %]. 예를 들어, 컬럼 2의 총 세포 투여량 및 컬럼 3의 CD34+%를 나타내는 표 B를 참조한다. 일부 구현예에서, 변형된 HSPC를 투여받은 대상체는 변형된 세포의 생착에 대해, 그리고 변형된 세포 집단의 이종성을 평가하기 위해 주입 후 모니터링된다. 일부 구현예에서, 말초 혈액, 골수 및/또는 상이한 세포 집단은 BCL11A 유전자에서 인델의 존재에 대해 개별적으로 평가될 수 있다. 일부 구현예에서, 치료되는 대상체로부터 단리된 세포로부터의 게놈 DNA가 단리되고, BCL11A 표적 서열을 포함하는 영역이 증폭된다. 추가 구현예에서, 세포 집단 내의 변형된 세포 퍼센트를 결정하고, 투여 후 시간 경과에 따라 재시험하여 치료된 대상체에 대한 변형된 세포 집단의 안정성을 평가한다.
일부 구현예에서, 변형 데이터를 평가하여 인델 프로파일을 생성한다. 추가 구현예에서, 인델 프로파일은 임의의 하나의 특정 세포 유형(인델 프로파일)이 집단을 비정상적으로 과성장할 가능성을 결정하기 위해 시간 경과에 따라 모니터링된다.
아연 핑거 뉴클레아제의 파트너 절반("짝지어진 ZFN" 또는 "왼쪽 및 오른쪽 ZFN"으로도 지칭됨)을 암호화하는 2개의 폴리뉴클레오타이드로 처리된 세포를 포함하는 β-지중해빈혈 환자를 치료하기 위한 조성물 및 방법이 본원에 개시되어 있다. 선택적으로, 뉴클레아제-암호화 폴리뉴클레오타이드는 작은 펩타이드를 암호화하는 서열(펩타이드 태그 및 핵 국소화 서열을 포함하지만, 이에 제한되지 않음)을 추가로 포함하고/하거나, 하나 이상의 DNA 결합 도메인 영역(예를 들어, 아연 핑거 단백질의 백본)에 돌연변이 및/또는 FokI 뉴클레아제 절단 도메인 또는 절단 절반 도메인에 하나 이상의 돌연변이를 포함한다. 폴리뉴클레오타이드는 선택적으로 ARCA 캡을 포함할 수 있다(미국 특허 제7,074,596호). 이들 폴리뉴클레오타이드 성분이 개별적으로 또는 임의의 조합으로 사용되는 경우(예를 들어, FLAG, NLS, WPRE, ARCA 및/또는 임의의 조합의 폴리 A 신호와 같은 펩타이드 서열), 본 발명의 방법 및 조성물은 증가된 효율(예를 들어, 본원에 기재된 서열/변형이 없는 뉴클레아제와 비교하여 2, 3, 4, 5, 6, 10, 20배 또는 그 초과의 절단) 및/또는 표적화 특이성을 갖는 인공 뉴클레아제의 발현의 놀랍고 예상치 못한 증가를 제공한다. 특정 구현예에서, 유전적으로 변형된 세포의 10% 미만(0 내지 10% 또는 이들 사이의 임의의 값), 바람직하게는 5% 미만(0 내지 5% 또는 이들 사이의 임의의 값), 훨씬 더 바람직하게는 1% 미만의 세포(0 내지 1% 또는 이들 사이의 임의의 값), 더욱 더 바람직하게는 0.5% 미만(0 내지 1% 또는 이들 사이의 임의의 값)가 BCL11A 유전자좌 외부의 mRNA(들)에 의해 이루어진 유전적 변형을 포함하는(그러나 HLA 마커의 불활성화와 같은 추가 변형을 포함할 수 있음) 것들을 비롯한, 본원에 기재된 바와 같이 mRNA(들)에 의해 BCL11A 유전자좌에서 특이적으로 변형된 유전적으로 변형된 세포를 포함하는 조성물이 본원에 기재된다. 추가 구현예에서, 아연 핑거 뉴클레아제를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드는 mRNA SB-mRENH1에 의해 암호화되는 SB63014로 알려진 좌측 ZFN(미국 특허 제10,563,184호 및 미국 특허 공개 번호 제2018/0087072호 참조)을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 우측 ZFN은 mRNA SB-mRENH2에 의해 암호화되는 SB65722(미국 특허 제10,563,184호 및 미국 특허 공개 번호 제2018/0087072호 참조)이다.
또한, 본 명세서에 기재된 바와 같은 ZFN 및/또는 폴리뉴클레오타이드(예를 들면, mRNA)를 포함하는 단리된 조혈모세포(HSPC, 예컨대 CD34+)를 비롯한 숙주 세포가 본원에 기재된다. 세포는 건강한 대상체로부터 단리될 수 있거나, 대안적으로 치료될 병태(예를 들어, TDT)가 있는 대상체로부터 수득되고, 표준 기술을 사용하여 정제되는 자가 세포이다. ZFN은 절단 후 삽입 및/또는 결실을 통해 세포를 유전적으로 변형시킨다. 결과적으로, 확장된(배양된) 세포는 더 이상 ZFN(또는 이러한 ZFN을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드)을 포함하지 않을 수 있지만, 배양에서 유전적 변형(예를 들어, BCL11a 내 삽입 및/또는 결실)을 유지할 수 있다. 특정 구현예에서, 유전적 변형은 절단 후 NHEJ에 의해 만들어진 삽입 및/또는 결실("인델")이다. 본원에 기재된 바와 같은 유전적으로 변형된 세포는 미처리(비-유전적으로 변형된) 세포와 비교하여 상이한 비율의 글로빈(α-, β- 및 γ-글로빈 수준)을 나타낸다. 특정 구현예에서, γ-글로빈 대 β-글로빈 및 γ-글로빈 대 α-글로빈의 비율은 미처리(형질감염되지 않은) HSPC와 비교하여 3 내지 4배를 포함하여, 약 2 내지 5배 또는 그 이상 증가한다. 또한, 본원에 기재된 유전적으로 변형된 세포는 적혈구 전구 세포(CFU-E 및 BFU-E), 과립구/대식세포 전구 세포(CFU-G/M/GM) 및 다중-전위 전구 세포(CFU-GEMM)를 포함한 모든 조혈 계통으로 분화하며, 조혈의 재구성을 나타내는 정상 핵형 및 형태를 나타낸다.
특정 양태에서, TDT에 대한 생체 외 요법은 본원에 기재된 바와 같은 유전적으로 변형된 세포를 사용하여 기재된다. 특정 구현예에서, 유전적으로 변형된 세포는 치료될 대상체로부터 수득된 자가 세포이고, 이 세포는 이어서 본원에 기재된 바와 같이 유전적으로 변형되고 동일한 대상체에게 다시 투여된다. 대상체로부터 얻은 세포는 G-CSF 및/또는 플레릭사포를 사용한 치료를 사용하여 대상체에서 동원될 수 있다. 도 5를 참조한다. 본원에 기재된 임의의 방법에서, 임의의 양의 세포가 동원될 수 있으며, 예를 들어 유전자 변형을 위한 약 5 x 105, 약 10 x 105, 약 15 x 105, 약 20 x 105, 약 5 x 106, 약 10 x 106, 약 15 x 106, 약 20 x 106, 약 25 x 106 CD34+ HSPCs/kg이 대상체에서 동원된다. 자가 세포는 본 명세서에 기재된 바와 같이 유전적으로 변형되고, 대략 1.0 x 108 내지 2.0 x 108 세포의 총 세포 수를 갖는 각각의 분취액(예를 들어, 주입 백)으로 표준 기술에 따라 (예를 들어, 제어된 속도 냉동기를 사용하여) 동결보존되고 임상 연구 센터로 배송될 준비가 될 때까지 제조 시설에서 증기상 액체 질소(< -150℃)에 보관될 수 있다.
본원에 기재된 임의의 방법에서, 대상체는 예를 들어 효과적인 용량 및 요법을 사용하여 부술판의 정맥내(IV) 투여를 통해 유전적으로 변형된 세포를 사용한 생체 외 요법 전에 컨디셔닝 요법을 받을 수 있다. 표준 절차에 따르면, 예를 들어 부술판은 약 0.5 내지 5 mg/kg(또는 그 사이의 임의의 값)으로 투여된다. 특정 구현예에서, 대상체는 0일째에 변형된 HSPC 주입 전, 최대 4일 동안(주입 전 약 12.8 mg/kg의 총 용량), 예를 들어 -6 내지 -3일째에 부술판(약 3.2 mg/kg/일; 중심 정맥 카테터를 통한 IV)의 골수파괴 요법을 받을 것이다. IV 부술판은 연구 센터 관행 또는 지침에 따라 1일 1회(총 4회 투여) 또는 6시간마다(총 16회 투여) 투여될 수 있다. 첫 번째 투여 후, IV 부술판 용량은 약동학 샘플링 및 연구 센터 관행에 따라 조정되어 일일 용량의 경우 4,000~5,000 mmol*분의 곡선아래면적(AUC) 또는 16,000~20,000 mmol*분의 AUC 총 요법 목표의 경우 6시간 투여마다 1,000~1,250 mmol*분의 AUC를 목표로 한다. IV 부술판 약동학 표적화는 후속 대상체에 대해 변형될 수 있다. 선택적으로, 투여 4일이 완료된 후 부술판의 제거를 결정하기 위해 치료 약물 모니터링이 수행된다.
특정 양태에서, 생체 외 요법은 동결된 유전자 변형 HSPC를 해동하는 단계 및 바람직하게는 해동 후 약 15 내지 약 45분 이내에 대상체에 세포를 주입하는 단계를 포함한다. 투여되는 동결 변형 HSPC의 부피는 대상체의 체중에 의해 결정된다. 바이탈 징후(혈압, 체온, 심박수, 호흡수 및 맥박 산소측정기)는 주입 전과 주입 후에 모니터링된다. 특정 구현예에서, 대상체는 혈액 검사 뿐만 아니라 HbF 수준의 분석(HbF 분획의 기준선 수준(g/dL 단위의 A 및 F) 및 퍼센트 HbF는 IV 부술판의 첫 번째 투여 당일 전에 또는 마지막 평가에 기초하여 결정됨), 내분비 기능 및/또는 철분 부하를 평가하기 위한 MRI 수행을 사용하여 모니터링된다. 특정 구현예에서, 생체 외 요법은 주입 후 약 2 내지 4주 이내에 TDT 대상체에서 정상 수준 이내로 호중구 및 혈소판 회복을 초래한다. 대상체는 또한 HSPC 주입 후 0, 1 또는 그 이상 PRBC 수혈을 받을 수 있다. 특정 구현예에서, 변형된 HSPC를 주입한 후 몇 주(예를 들어, 2, 3, 4, 5, 6, 7 또는 그 이상)까지, 총 헤모글로빈 수치는 대상체에서 안정적으로 유지되거나 계속 상승한다.
주입 후, 변형된 HSPC는 이식 효율 및/또는 변형 이종성을 결정하기 위해 환자에서 모니터링될 수 있다. 이것은 예를 들어 유전자 변형("인델") 프로파일을 결정하여 수행될 수 있다. 세포 샘플은 말초 혈액, 골수 흡인물 또는 기타 조직 샘플(바람직하게는 약 5 x 104 내지 1 x 107 세포)로부터 정제될 수 있고, 평가를 위해 게놈 DNA 단리 대상이 될 수 있다. 골수 흡인물 또는 기타 조직 샘플은 약 6~9개월 사이를 포함하여 다양한 시점에서 채취될 수 있다.
일부 구현예에서, 본원에 개시된 바와 같은 방법 및 조성물로 치료되지 않은 대상체와 비교하여, 추가 치료 절차를 감소, 지연 및/또는 제거하는 치료 방법이 본원에 제공되며, 예를 들어 유효량의 변형된 HSC/PC가 치료를 필요로 하는 대상체에게 투여되고, 여기서 대상체는 치료 후 추가 치료 절차에 대한 필요성이 감소, 지연 및/또는 제거된다. 일부 구현예에서, 추가 치료 절차는 골수 이식, PRBC 및/또는 기타 혈액 성분 수혈, 및 철분 킬레이트화 요법과 관련된 치료를 포함할 수 있지만, 이에 제한되지 않는다.
일부 구현예에서, 본원에 개시된 조성물 및 방법에 유용한 ZFN(예를 들어, ZFN 쌍(좌측 및 우측) ZFN의 구성원이 2개의 개별 mRNA에 의해 전달되는 ZFN)은 SB-mRENH1 및 SB-mRENH2로 지칭되는 mRNA를 포함한다. 일부 구현예에서, BCL11A-특이적 쌍의 ZFN은 예를 들어 전기천공을 통해 (예를 들어, HSC/PC로) 전달되며, 여기서 하나의 AAV는 좌측 ZFN(예를 들어, SB-mRENH1)을 포함하고, 또다른 AAV는 우측 ZFN(예를 들어, SB-mRENH2)을 포함한다.
따라서, 본원에서는 β-지중해빈혈(예를 들어, TDT)의 치료 및/또는 예방을 위해 헤모글로빈 발현을 변경하는 방법을 설명한다. 특정 구현예에서, 제1 및 제2(좌측 및 우측) ZFN, 즉 표 1에 나타낸 바와 같은 인지 나선 영역(예를 들어, mRNA SB-mRENH1에 의해 암호화됨)을 포함하는 63014로 지정된 ZFP를 포함하는 6-핑거 ZFN 및 표 1에 나타낸 바와 같은 인지 나선 영역을 포함하는 65722로 지정된 ZFP를 포함하는 5-핑거 ZFN(예를 들어, mRNA SB-mRENH2에 의해 암호화됨)을 포함하는 ZFN 쌍은 TDT 치료를 포함하는, 대상체의 단리된 세포 또는 세포내 헤모글로빈 수치를 변경하기 위해 사용된다. ZFN 쌍은 인간 게놈의 GRCh38/hg38 어셈블리에서 위치 chr2:60,495,250-60,495,290의 인간 BCL11A 유전자의 적혈구-특이적 인핸서의 33개 염기 쌍(결합된) 표적 부위에 결합한다. 특정 구현예에서, 하나의 mRNA는 쌍의 ZFN 둘 다를 암호화한다. 대안적으로, 각각이 쌍의 하나의 ZFN을 암호화하는 별도의 mRNA가 사용된다. 특정 구현예에서, mRNA 서열은 실시예 1(서열 번호: 15 및 서열 번호: 16)에 제시되어 있다.
선택적으로, 뉴클레아제-암호화 폴리뉴클레오타이드는 작은 펩타이드를 암호화하는 서열(펩타이드 태그 및 핵 국소화 서열을 포함하지만, 이에 제한되지 않음)을 추가로 포함하고/하거나, 하나 이상의 DNA 결합 도메인 영역(예를 들어, 아연 핑거 단백질의 백본 또는 TALE)에 돌연변이 및/또는 FokI 뉴클레아제 절단 도메인 또는 절단 절반 도메인에 하나 이상의 돌연변이를 포함한다. 이들 폴리뉴클레오타이드 성분이 개별적으로 또는 임의의 조합으로 사용되는 경우(예를 들어, FLAG, NLS, WPRE 및/또는 임의의 조합의 폴리 A 신호와 같은 펩타이드 서열), 본 발명의 방법 및 조성물은 증가된 효율(예를 들어, 본원에 기재된 서열/변형이 없는 뉴클레아제와 비교하여 2, 3, 4, 5, 6, 10, 20배 또는 그 초과의 절단) 및/또는 표적화 특이성을 갖는 인공 뉴클레아제의 발현의 놀랍고 예상치 못한 증가를 제공한다. 따라서, 특정 구현예에 따르면, 본원에 기재된 세포(세포의 집단 및 이들 세포 및 세포의 집단을 포함하는 조성물)는 유전적으로 변형된 세포 집단(및 이들 세포를 포함하는 조성물)을 포함하는 BCL11A 유전자좌에서 mRNA(들)에 의해 특이적으로 유전적으로 변형되며, 유전적으로 변형된 세포의 10% 미만(0 내지 10% 또는 이들 사이의 임의의 값), 바람직하게는 5% 미만(0 내지 5% 또는 이들 사이의 임의의 값), 훨씬 더 바람직하게는 1% 미만의 세포(0 내지 1% 또는 이들 사이의 임의의 값), 및 더욱 더 바람직하게는 0.5% 미만(0 내지 1% 또는 이들 사이의 임의의 값)는 BCL11A 유전자좌 외부의 mRNA(들)에 의해 이루어진 유전적 변형을 포함한다(그러나 HLA 마커의 불활성화와 같은 추가 변형을 포함할 수 있음). 일부 구현예에서, 뉴클레아제는 mRNA에 의해 암호화되고, mRNA는 선택적으로 전사 및 번역 효율을 증가시키기 위한 요소를 포함한다.
본 발명의 방법 및 조성물은 또한 DNA 백본의 인산염과 비특이적으로 상호 작용할 수 있는 표적 서열의 뉴클레오타이드를 인식하는 잔기 외부의 DNA 결합 도메인 내의 하나 이상의 아미노산에 대한 돌연변이(예를 들어, 'ZFP 백본'에 대한 하나 이상의 돌연변이(DNA 인식 나선 영역 외부))를 포함한다. 따라서, 일부 구현예에서, 본원에 개시된 방법 및 조성물은 뉴클레오타이드 표적 특이성에 필요하지 않은 ZFP 백본 내의 양이온성 아미노산 잔기의 돌연변이를 포함한다. 일부 구현예에서, ZFP 백본에서의 이러한 돌연변이는 양이온성 아미노산 잔기를 중성 또는 음이온성 아미노산 잔기로 돌연변이시키는 것을 포함한다. 일부 구현예에서, ZFP 백본에서의 이러한 돌연변이는 극성 아미노산 잔기를 중성 또는 비극성 아미노산 잔기로 돌연변이시키는 것을 포함한다. 일부 구현예에서, DNA 결합 나선에 대한 위치 (-5), (-9) 및/또는 위치 (-14)에서 돌연변이가 생성된다. 일부 구현예에서, 아연 핑거는 (-5), (-9) 및/또는 (-14)에서 하나 이상의 돌연변이를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 다중-핑거 아연 핑거 단백질에서 하나 이상의 아연 핑거는 (-5), (-9) 및/또는 (-14)에 돌연변이를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, (-5), (-9) 및/또는 (-14)에서의 아미노산(예를 들어, 아르기닌(R) 또는 라이신(K))은 알라닌(A), 류신(L), Ser(S), Asp(N), Glu(E), Tyr(Y) 및/또는 글루타민(Q)으로 돌연변이된다. 예를 들어, 미국 특허 공개 번호 제2018/0087072호를 참조한다.
일부 양태에서, 본 발명의 방법 및 조성물은 진핵생물 이식유전자 서열에 융합된 외인성 펩타이드 서열을 암호화하는 서열의 사용을 포함한다. 일부 구현예에서, 외인성 펩타이드는 단백질 서열에 번역 후 융합되고, 다른 구현예에서, 외인성 펩타이드를 암호화하는 서열은 프레임(3' 및/또는 5')에서 인조 뉴클레아제(예를 들어, 융합 단백질)를 암호화하는 서열에 결합된다. 바람직한 구현예에서, 3개의 FLAG 서열(3x FLAG 펩타이드)을 암호화하는 서열이 사용되며(미국 특허 제6,379,903호 참조), 여기서 아미노산 서열은 N-말단 DYKDHDG-DYKDHDI-DYKDDDDK (서열 번호: 1)이다. 하나 이상의 이러한 펩타이드 서열(예를 들어, 3X FLAG)의 포함은 펩타이드 서열 없는 뉴클레아제에 비해 뉴클레아제(절단) 활성을 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11배 또는 그 이상 증가시킬 수 있다.
일부 양태에서, 인조 뉴클레아제를 암호화하는 mRNA는 핵 국소화 펩타이드 서열(NLS)을 포함한다. 일부 구현예에서, NLS는 SV40 바이러스 대형 T 유전자로부터의 서열 PKKKRKV (서열 번호: 2)를 포함한다(문헌[Kalderon et al. (1984) Nature 311(5981):33-8] 참조). 본원에 기재된 바와 같은 하나 이상의 NLS 서열의 포함은 펩타이드 서열 없는 뉴클레아제에 비해 뉴클레아제(절단) 활성을 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11배 또는 그 이상 증가시킬 수 있다.
일부 구현예에서, 본원에 개시된 방법 및 조성물은 예를 들어 말초 정맥 카테터를 통한 본 발명의 조성물 (예를 들어, 변형된 HSC/PC)의 투여를 포함한다. 일부 구현예에서, 조성물은 대상체에게 투여된 후 생리 식염수(NS) 또는 인산염 완충 식염수(PBS)가 투여된다. 일부 구현예에서, 대상체는 약 3.0 x 106 세포/kg 내지 약 20 x 106 세포/kg(또는 그 사이의 임의의 값)의 변형된 세포의 총 용량을 받는다. 약 3.0 x 106 내지 약 20 x 106 세포/kg 범위의 임의의 용량이 사용될 수 있다.
일부 구현예에서, 대상체는 예를 들어 약 3.0 x 106 내지 약 20 x 106 세포/kg의 총 용량을 받은 후 추가 치료 절차에 대한 필요성이 지연, 감소 또는 제거되었다.
또 다른 양태에서, 본 발명의 방법 및 조성물로 치료하기 전의 대상체와 비교하여 β-지중해빈혈을 갖는 대상체에서 방법 및 조성물로 치료한 후 지중해빈혈-관련 질병 바이오마커를 감소, 지연 또는 제거하는 방법이 본원에 개시된다. HbA, HbF, 에리트로포이에틴, 합토글로빈, 헵시딘, 갑상선 호르몬, IGF-1, 코르티솔, ACTH 및 비타민 D를 포함하는 지중해빈혈-관련 바이오마커의 결정은 표준 임상 실험실 프로토콜에 의해 측정될 수 있으며, 이 방법은 예를 들어, 유효량의 변형된 HSC/PC를 대상체에게 투여하여, 치료 후 대상체의 지중해빈혈-관련 질병 바이오마커가 감소, 지연 또는 제거되는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, HbF의 수준은 본원에 개시된 방법에 의한 치료 후 약 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 150%, 200%, 300%, 400% 이상(또는 그 사이의 임의의 값) 증가한다.
또 다른 양태에서, 본 발명의 방법 및 조성물로 치료되지 않은 대상체와 비교하여 β-지중해빈혈을 갖는 대상체에서 방법 및 조성물로 치료한 후 혈소판, 정맥내 면역글로빈(IVIG), 혈장 및 과립구를 포함하지만, 이에 제한되지 않는 다른 혈액 제제의 주입 및 PRBC 수혈의 사용을 감소, 지연 또는 제외시키는 방법이 본원에 개시된다. 일부 구현예에서, PRBC 및/또는 기타 혈액 제제의 사용은 치료를 받기 전의 대상체와 비교하여 본원에 개시된 방법으로 치료된 대상체에서 약 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100% 또는 그 사이의 임의의 값만큼 감소된다. 일부 구현예에서, PRBC 및/또는 기타 혈액 제제 주입의 사용이 제외된다.
또 다른 양태에서, β-지중해빈혈을 갖는 대상체에서 철분 과부하와 관련된 증상을 감소, 지연 또는 제거하는 방법이 본원에 개시된다. 일부 구현예에서, 내분비 기관에서의 철분 침착의 결과로서 내분비 기능장애의 마커(예를 들어, 갑상선 마커, IGF-1, 모닝 코르티솔, HbA1C 및 비타민 D)는 치료 전 마커 수준과 비교하여, 본 발명의 방법 및 조성물로 치료한 후 대상체에서 정상화된다. 일부 구현예에서, 간 및 심장의 철분 과부하는 치료 전 대상체와 비교하여 본원에 개시된 방법 및 조성물로 치료한 후 대상체에서 감소된다. 철분 과부하는 표준 MRI 절차로 평가될 수 있다. 일부 구현예에서, MRI에 의해 탐지된 간 및/또는 심장에서의 철분 과부하는 치료를 받기 전의 대상체와 비교하여 본원에 개시된 방법으로 치료된 대상체에서 약 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100% 또는 그 사이의 임의의 값만큼 감소된다.
또 다른 양태에서, β-지중해빈혈을 갖는 대상체에서 골다공증 및/또는 골절과 관련된 증상을 감소, 지연 또는 제거하는 방법이 본원에 개시된다. 일부 구현예에서, 골밀도는 치료 전 대상체와 비교하여 본원에 개시된 방법 및 조성물로 치료된 대상체에서 증가된다. 일부 구현예에서, 골다공증 및 골절은 치료 전의 대상체와 비교하여 본원에 개시된 방법 및 조성물로 치료된 대상체에서 감소되거나 제거된다. 일부 구현예에서, 골다공증 및/또는 골절은 치료를 받기 전의 대상체와 비교하여 본원에 개시된 방법으로 치료된 대상체에서 약 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100% 또는 그 사이의 임의의 값만큼 개선된다.
또 다른 양태에서, 치료 전 대상체와 비교하여, 본원에 개시된 방법 및 조성물로 치료한 후 대상체에서 TDT, 골수 내 미성숙 세포 및 적혈구계 전구체의 수준을 갖는 대상체에서 적혈구 증식증을 감소, 지연 또는 제거하는 방법이 본원에 개시된다.
또 다른 양태에서, 본원에 기재된 바와 같은 유전적으로 변형된 자가 HSC/PC를 포함하는 조성물을 포함하는 패키지(예를 들어, 백)를 포함하는 제조 물품이 본원에 제공된다. 제조 물품(예를 들어, 백)은 예를 들어 10% DMSO를 함유하는 CryoStor® CS-10 냉동매질(cryomedia)(SigmaAldrich)에서 냉동 보관을 위해 제형화될 수 있다. 각 백에는 임의의 농도의 세포가 함유될 수 있다. 특정 구현예에서, 각 백에는 대략 1 x 107 세포/mL의 농도에서 백당 대략 1.0~2.0 x 108 세포가 함유된다.
추가의 양태에서, 본원에 기재된 바와 같은 유전적으로 변형된 세포 집단의 변형 프로파일(예를 들어, 전형적으로, 절단된 서열의 NHEJ에 의해 절단된 후 생성된 삽입 및/또는 결실의 수 및/또는 유형)을 모니터링하는 방법이 본원에 기재되어 있다. 이러한 잭팟은 특정 클론 집단의 원치 않는 증식을 초래할 수 있기 때문에, 모니터링은 한 유형의 변형(클론)이 집단에서 우세한지 여부를 결정하기 위해 대상체에 투여하기 전 및/또는 후에 수행될 수 있다. 특정 구현예에서, 유전적으로 변형된 세포의 집단은 시퀀싱 등과 같은 표준 기술을 사용하여 변형 유형(삽입 및/또는 결실, "인델/프로파일"로도 지칭됨)에 대해 모니터링된다. 특정 구현예에서, 세포 집단은 변형 패턴(인델 프로파일)의 기준선을 결정하기 위해 투여 전에 분석되고, 이후 주입 후 모니터링하여 하나의 클론 세포 집단의 비정상적인 파생물이 되지 않도록 이식된 세포의 인델 프로파일이 유지되고 있는지를 결정한다. 모니터링은 주입 전 및/또는 후에 시간에 걸쳐(여러 번) 수행될 수 있다. 따라서, 본원에 기재된 방법은 인델 프로파일이 시간 경과에 따라 동일하게 유지되는지를 결정하기 위해 주입 전 및/또는 후에 유전적으로 변형된 세포의 집단을 모니터링하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
본 명세서의 설명으로부터, 본 개시 내용은 하기를 포함하지만 이에 제한되지 않는 다수의 구현예를 포함한다는 것이 이해될 것이다:
mRNA가 ZFN 쌍을 암호화하는, SB-mRENH1 mRNA 및 SB-mRENH2 mRNA를 포함하는 적혈구(RBC) 전구체 세포; 및 ZFN 쌍에 의한 절단 후에 이루어진 게놈 변형을 포함하는 유전적으로 변형된 세포로서, 상기 변형은 BCL11A 유전자가 세포에서 불활성화되도록 내인성 BCL11A 인핸서 서열 내에 있다. 또한 그로부터 유래된 세포도 포함된다.
치료를 필요로 하는 대상체에서 베타-지중해빈혈(β-지중해빈혈)을 치료하는 생체 외 방법으로서, 상기 방법은: 대상체 내 태아 헤모글로빈(HbF) 생산이 증가하고 β-지중해빈혈의 하나 이상의 임상 증상이 감소, 개선 또는 제거되도록 본원에 기재된 구현예들 중 어느 하나에 따른 조성물을 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다.
본원에 기재된 임의의 선행하는 구현예에 따른 생체 외 방법으로서, 상기 베타-지중해빈혈이 수혈-의존성 β-지중해빈혈이다.
본원에 기재된 임의의 선행하는 구현예에 따른 생체 외 방법으로서, 총 헤모글로빈(Hb)의 그램/dL 혈장 및/또는 퍼센트 HbF에서 임상 실험실 헤모글로빈 분획의 기준선으로부터의 변화가 대상체에서 달성된다.
본원에 기재된 임의의 선행하는 구현예에 따른 생체 외 방법으로서, 헤모글로빈 인자가 성인 헤모글로빈(HbA) 및/또는 태아 헤모글로빈(HbF)이다.
본원에 기재된 임의의 선행하는 구현예에 따른 생체 외 방법으로서, 대상체는 β0/β0 또는 β0/β+이다.
본원에 기재된 임의의 선행하는 구현예에 따른 생체 외 방법으로서, 지중해빈혈-관련 질병 바이오마커의 수준이 치료 후에 변경된다.
본원에 기재된 임의의 선행하는 구현예에 따른 생체 외 방법으로서, 바이오마커가 철분 대사의 변화; 및/또는 에리트로포이에틴, 합토글로빈 및/또는 헵시딘 수준의 변화이다.
본원에 기재된 임의의 선행하는 구현예에 따른 생체 외 방법으로서, 철분 과부하와 관련되거나 기준선 수혈 요법과 관련된 임상 증상이 개선되거나 제거된다.
본원에 기재된 임의의 선행하는 구현예에 따른 생체 외 방법으로서, 대상체에서 내분비 기능장애의 감소는 갑상선 호르몬, IGF-1, 모닝 코르티솔, 부신피질자극 호르몬(ACTH), HbA1C 및/또는 비타민 D 수준의 수준 및/또는 활성을 결정함으로써 분석된다.
본원에 기재된 임의의 선행하는 구현예에 따른 생체 외 방법으로서, 대상체에서 RBC 수혈 및 주입 혈소판 수혈, 정맥내 면역글로빈(IVIG) 수혈, 혈장 수혈 및/또는 과립구 수혈에 대한 필요성이 감소 또는 제거된다.
본원에 기재된 임의의 선행하는 구현예에 따른 생체 외 방법으로서, 대상체에서 감소 또는 제거된 임상 증상이 간 질환이다.
본원에 기재된 임의의 선행하는 구현예에 따른 생체 외 방법으로서, 대상체에서 감소되거나 제거된 임상 증상이 심장 이상이다.
본원에 기재된 임의의 선행하는 구현예에 따른 생체 외 방법으로서, 대상체에서 감소되거나 제거된 임상 증상이 골다공증 및/또는 골절이다.
본원에 기재된 임의의 선행하는 구현예에 따른 생체 외 방법으로서, 기준선 적혈구생성이 조성물의 투여 후 대상체에서 변화된다.
본원에 기재된 임의의 선행하는 구현예에 따른 생체 외 방법으로서, 조성물의 투여 후 대상체에서 증식이 감소되거나 제거된다.
본원에 기재된 임의의 선행하는 구현예에 따른 생체 외 방법으로서, 미성숙 및/또는 비-전형적인 형태를 갖는 세포의 수가 대상체에서 감소된다.
본원에 기재된 임의의 선행하는 구현예에 따른 생체 외 방법으로서, 대상체에서 F 세포의 수 및 퍼센트가 조성물의 투여 후에 변형된다.
본원에 기재된 임의의 선행하는 구현예에 따른 생체 외 방법으로서, 유전적으로 변형된 세포가 자가 또는 동종이다.
본원에 기재된 임의의 선행하는 구현예에 따른 생체 외 방법으로서, BCL11A-유전적으로 변형된 세포가 하나 이상의 추가의 유전적 변형을 추가로 포함한다.
본원에 기재된 임의의 선행하는 구현예에 따른 생체 외 방법으로서, 유전적으로 변형된 세포가 동종 세포이고, 하나 이상의 추가적인 유전적 변형이 하나 이상의 자가-마커 또는 항원의 불활성화를 포함한다.
본원에 기재된 임의의 선행하는 구현예에 따른 생체 외 방법으로서, 유전적으로 변형된 세포가 대상체로부터 단리된 조혈모 세포이다.
본원에 기재된 임의의 선행하는 구현예에 따른 생체 외 방법으로서, 조혈모 세포가 CD34+ 조혈 줄기 또는 전구체 세포(HSC/PC)이고, CD34+ HSC/PC는 단리 전에 하나 또는 그 이상의 용량의 G-CSF 및/또는 하나 또는 그 이상의 용량의 플레릭사포에 의한 치료로 각 대상체에서 동원된다.
본원에 기재된 임의의 선행하는 구현예에 따른 생체 외 방법으로서, 적어도 25 x 106 CD34+ HSPC/kg이 각 대상체에서 동원되고, 상기 동원된 세포는 하나 이상의 성분채집 주기에 의해 수확된다.
본원에 기재된 임의의 선행하는 구현예에 따른 생체 외 방법으로서, 유전적으로 변형된 세포를 포함하는 조성물을 대상체에게 투여하기 전에 BCL11A 내의 삽입 및/또는 결실에 대해 조성물의 세포를 평가하는 단계를 추가로 포함한다.
본원에 기재된 임의의 선행하는 구현예에 따른 생체 외 방법으로서, 유전적으로 변형된 세포를 포함하는 조성물을 투여하기 전에 대상체에게 하나 이상의 골수절제 병태 작용제를 1회 이상 투여하는 단계를 추가로 포함한다.
본원에 기재된 임의의 선행하는 구현예에 따른 생체 외 방법으로서, 상기 골수절제 작용제는 부술판을 포함하고, 추가로: 부술판의 정맥내(IV) 투여는 1회 이상 동안 0.5 내지 5 mg/kg이고; 부술판의 IV 투여는 3.2 mg/kg/일이고; 0일에 유전적으로 변형된 세포를 포함하는 조성물의 주입 전 -6 내지 -3일에 주입 전 12.8 mg/kg의 총 용량을 4일 동안 중심 정맥 카테터를 통한 IV; 또는 부술판의 IV 투여는 1일 1회 또는 6시간마다이다.
본원에 기재된 임의의 선행하는 구현예에 따른 생체 외 방법으로서, 대상체에게 투여되는 유전적으로 변형된 세포의 용량이 약 3 x 106 세포/kg 내지 약 20 x 106 세포/kg이다.
본원에 기재된 임의의 선행하는 구현예에 따른 생체 외 방법으로서, 대상체에게 투여된 유전적으로 변형된 세포가 대략 1 x 107 세포/mL의 농도에서 백당 대략 1.0~2.0 x 108 세포로 제형화된다.
본원에 기재된 임의의 선행하는 구현예에 따른 생체 외 방법으로서, 유전적으로 변형된 세포는 투여 전에 동결보존되고, 해동 후 약 15분 이내에 대상체에게 투여된다.
본원에 기재된 임의의 선행하는 구현예에 따른 생체 외 방법으로서, 유전적으로 변형된 세포의 투여 전, 투여 중 및/또는 투여 후에 대상체의 바이탈 징후를 모니터링하는 단계를 추가로 포함한다.
본원에 기재된 임의의 선행하는 구현예에 따른 생체 외 방법으로서, 유전적으로 변형된 세포를 투여하기 전에 대상체에서 헤모글로빈, 호중구 및/또는 혈소판 수준을 평가하여 대상체 내 헤모글로빈의 기준선 수준을 결정하는 단계를 추가로 포함한다.
본원에 기재된 임의의 선행하는 구현예에 따른 생체 외 방법으로서, 유전적으로 변형된 세포의 투여 후 대상체 내 헤모글로빈, 호중구 및/또는 혈소판 수준이 투여 후 몇 주 또는 몇 개월 동안 기준선 수준과 비교하여 증가하거나 안정하게 유지된다.
본원에 기재된 임의의 선행하는 구현예에 따른 생체 외 방법으로서, 대상체는 유전적으로 변형된 세포의 투여 전 및/또는 후에 하나 이상의 패킹된 적혈구(PRBC) 수혈을 받는다.
본원에 기재된 임의의 선행하는 구현예에 따른 생체 외 방법으로서, 대상체에서 골수 이식, 혈액 성분 및/또는 철분 킬레이트 요법 PRBC 수혈과 같은 추가 요법에 대한 필요성이 감소되거나 제거된다.
본원에 기재된 임의의 선행하는 구현예에 따른 생체 외 방법으로서, 추가 요법에 대한 필요성이 유전적으로 변형된 세포의 투여 후 1~20일 이내에 감소되거나 제거된다.
본원에 기재된 임의의 선행하는 구현예에 따른 생체 외 방법으로서, 대상체는 대상체 내 이식편의 안정성을 모니터링하기 위해 주입된 세포의 인델 프로파일과 비교하여, 투여 후 시간 경과에 따라 모니터링되어 말초 혈액 샘플, 골수 흡인물 또는 다른 조직 공급원으로부터 단리된 세포의 인델 프로파일을 결정한다.
본원에 기재된 임의의 선행하는 구현예에 따른 생체 외 방법으로서, 세포의 인델 프로파일은 대상체에 투여되기 전에 모니터링된다.
CryoStor® CS-10 냉동매질에서 제형화된 제2항에 따른 조성물을 포함하는 패키지를 포함하는 제조 물품.
본원에 기재된 임의의 선행하는 구현예에 따른 제조 물품으로서, 각 백은 대략 1 x 107 세포/mL의 농도로 백당 대략 1.0~2.0 x 108 세포를 함유한다.
상기 및 다른 양태들은 전반적으로 본 개시 내용에 비추어 당업자에게 용이하게 명백할 것이다.
도 1은 성인 헤모글로빈 돌연변이(예를 들어, 겸상적혈구병 또는 β-지중해빈혈)를 포함하는 대상체에 대한 태아 헤모글로빈 수치의 저농도, 상승농도 및 고농도 효과에 대한 예시(문헌[Hardison & Blobel (2013) Science 342(6155):206-7]에서 발췌됨)이다. 맨 왼쪽("낮은 태아 헤모글로빈:")은 성인 헤모글로빈과 야생형 ESE BCL11A에 돌연변이가 있는 대상체이며, 이 경우 대상체는 태아 헤모글로빈 수치가 정상(낮음)이어서 대상체에 질환 증상을 초래한다. 중간("상승된 태아 헤모글로빈")에서, 대상체는 성인 헤모글로빈 돌연변이를 갖고 있지만, BCL11A 발현이 감소하지만 제거되지 않도록 하는 BCL11A 유전자 돌연변이가 있어 태아 글로빈 수준이 상승한다. 대상체는 일부 성인 글로빈 기능을 "대체"하는 태아 글로빈으로 인해 일부 질환 개선을 경험한다. 맨 오른쪽("높은 태아 헤모글로빈)에서, 대상체는 성인 글로빈 돌연변이를 가지고 있지만 BCL11A 인핸서가 결실되어, 대상체가 태아 글로빈의 완전한 발현을 나타낸다. 이 대상체는 완전한 BCL11A 불활성화로 인해 훨씬 더 큰 증상 개선을 경험할 것이다.
도 2는 건강한 지원자(PB-MR-003 및 PB-MR-004)로부터 수확되고 SB-mRENH1 및 SB-mRENH2에 의해 변형된 CD34+ HSC/PC의 태아(감마 글로빈 또는 γ 글로빈으로도 지칭됨) 수준을 도시한다. 변형된 HSPC의 적혈구 분화 21일째부터의 단백질 샘플의 UPLC 분석에 의해 결정된 바와 같은, γ-글로빈(Aγ-글로빈 및 Gγ-글로빈 피크의 합) 대 α-글로빈 및 γ-글로빈 대 β-유사-글로빈의 비율(Aγ, Gγ, β 및 δ-글로빈 피크의 합)의 비율은 표시된 조건에서 도시된다. 전기천공 48시간 후, 세포가 수확되고 동결되었다. 세포가 해동되고 시험관 내 적혈구생성 및 글로빈 생산을 연구하는 데 사용했다. 도시된 바와 같이, γ-글로빈 대 β-글로빈 및 γ-글로빈 대 α-글로빈의 비율은 형질감염되지 않은 세포와 비교하여 처리된 HSC/PC의 적혈구계 자손에서 대략 3~4배 증가하였다(단백질 데이터 또한 γ-글로빈 mRNA 수준의 측정에 의해 뒷받침되었다). 각 그룹에서, 왼쪽 막대는 γ-글로빈/α-글로빈의 비율을 나타내고, 오른쪽 막대는 γ-글로빈/총 β-유사-글로빈의 비율을 나타낸다.
도 3a 내지 도 3c는 변형된 HSPC에서 이중 가닥 파손의 빈도 및 시간 경과를 나타내는 그래프를 도시한다. 도 3a는 형질감염 후 7일 동안 53BP1 병소/세포의 수의 시간 경과("dpt")를 나타낸다(평균 ± SD 53BP1+병소/세포). 도 3b 및 도 3c는 형질감염 후 1일(도 3b) 및 7일(도 3c)에 53BP1 병소/세포의 다양한 수(1 내지 5+)를 갖는 전체 세포의 퍼센트를 나타낸다. * P < 0.05 대 대조군.
도 4는 염색체 전위를 검출하기 위해 사용되는 프로브 세트의 예시이다. 상단 패널은 BCL11A 인핸서 표적내 부위(빗금없는 부분) 및 표적외 부위(빗금친 부분)를 포함하는 염색체 세그먼트를 나타낸다. 하단 패널은 해당 전위 생성물의 검출을 위한 양성 대조군 시약(gBlocks)을 스케치한다. 또한 TaqMan 분석에 사용된 대략적인 프라이머 및 프로브 위치도 도시된다. 각 gBlock 내의 체크무늬 세그먼트는 각 대조군 시약에 삽입된 고유한 서열로, 이를 실제 전위 생성물과 구별하고 잠재적인 교차-오염을 모니터링할 수 있다. 생성물 1 gBlocks는 단편의 BCL11A 영역에서 프로브되었다. 생성물 2 gBlocks는 단편의 표적외 영역에서 프로브되었다.
도 5는 유전적으로 변형된 HSPC("ST-400"이라고도 함)를 사용한 치료 프로토콜을 나타내는 개략도이다. "G-CSF"는 과립구 콜로니-자극 인자를 의미하고; "HSPC"는 조혈모 전구 세포를 의미하고; "IV"는 정맥내를 의미하고; "RBC"는 적혈구를 의미하고; "ZFN"은 아연 핑거 뉴클레아제를 의미한다.
도 6a 및 도 6b는 본 명세서에 기재된 바와 같은 변형된 HSPC("ST-400")로 치료받은 환자의 총 헤모글로빈 및 태아 헤모글로빈을 도시하는 그래프이다(예를 들어, 도 5 참조). 도 6a는 표시된 연구일에서의 헤모글로빈 F 수준(헤모글로빈의 %)을 나타낸다. 도 6b는 표시된 연구일에 헤모글로빈 수치(g/dL)를 나타낸다. 화살표는 환자가 PRBC 수혈을 받은 시점을 나타낸다. 변형된 HSPC는 0일에 투여되었다. 데이터에 따르면 환자는 주입 후 50일에 태아 헤모글로빈이 총 헤모글로빈의 거의 31%로 증가했다. 데이터는 또한 환자가 치료 전 2년 동안 전형적으로 2주마다 PRBC를 받았지만 환자는 ST-400 주입 후 10일에서 50일 사이에 PRBC가 필요하지 않았다는 것을 보여준다.
도 7a 내지 도 7c는 유핵 혈액 세포(가능한 경우, 골수 흡인물, 순환 백혈구 또는 말초 혈액 단핵 세포)의 차세대 시퀀싱에 의해 검출된 10개의 가장 빈번한 인델(삽입 및/또는 결실)이 각 시점에서 환자당 표시됨을 도시한다. 도 7a는 환자 1을 나타내고; 도 7b는 환자 2를 나타내고; 도 7c는 환자 3을 나타낸다. 시간이 지남에 따라 조혈 클론성에 대한 우려되는 우세한 우성은 관찰되지 않았다. 인델 명명 규칙: "I"는 삽입을 나타내고; "D"는 결실을 나타내고; 첫 번째 숫자는 참조 염기쌍에서 인델의 시작을 나타내고("*"는 인델 측면에 있는 뉴클레오타이드를 나타내며, 인델의 양쪽에 정렬될 수 있음); 콜론 다음의 숫자는 삽입되거나 결실된 염기쌍의 수를 나타낸다. 언급된 바와 같이, 56일째 데이터는 환자 2에 대해 이용가능하지 않다(도 7b).
도 8은 ST-400으로 치료한 후 표시된 시간에 환자 1, 2 및 3의 HbF 수준을 도시한다. 각 환자에 대한 베타 지중해빈혈의 원인이 되는 유전자형도 각 그래프에 도시된다.
BCL11A, 감마 글로빈, 및 BLC11A와 감마 글로빈 발현의 조합의 조절 및 혈색소병증의 치료, 예방 또는 치료 및 예방을 위한 게놈 조작을 위한 조성물 및 방법이 본원에 개시된다. 특히, 표 1의 단일 행에 나타낸 바와 같이 인식 나선 영역을 갖는 ZFP를 포함하는 뉴클레아제로 표적화함으로써, BCL11A의 인핸서의 파괴가 HSC/PC에서 효율적으로 달성되고 후속 적혈구생성 동안 상대적인 감마 글로빈 발현의 변화를 초래한다. BCL11A 및 감마 글로빈 발현의 이러한 조절은 베타 글로빈 발현 또는 돌연변이된 형태의 베타-글로빈 발현이 불충분한 혈색소병증(예를 들어, TDT와 같은 베타 지중해빈혈, 겸상 적혈구 질환)의 치료에 특히 유용하다. 본원에 기재된 방법 및 조성물을 사용하여, 비정상적인 베타 글로빈에 의해 야기되는 합병증 및 질환 관련 후유증은 적혈구 전구체 세포에서 감마 글로빈의 발현의 변경에 의해 극복될 수 있다. 특히, 본 명세서에 기재된 조성물 및 방법은 동종 조혈모 세포 이식(HSCT)과 관련된 문제를 극복한다. 이러한 문제에는 공여자 가용성 및 동종 이식 후 이식편 실패 및 이식편 대 숙주 질환의 위험에 의해 제한되는 것이 포함된다.
본 명세서에 기재된 바와 같이 조혈 줄기 또는 전구 세포에서 BCL11A의 인트론 적혈구-특이적 인핸서내 GATA-결합 영역의 고정밀 유전자 편집은 정상적인 다중-계통 조혈에 악영향을 미치지 않으면서 태아 헤모글로빈(HbF)의 지속적으로 높은 발현을 초래한다. 이와 같이, 유전적으로 변형된 세포는 TDT와 같은 혈색소병증의 생체 외 치료에 사용될 수 있다. 태아 헤모글로빈(HbF)은 임신 중 태어날 때까지 존재하는 주요 헤모글로빈이다. HbF는 집합적으로 γ-글로빈으로 알려져 있는, 2개의 β-유사 글로빈 유전자인 Gγ-글로빈과 Aγ-글로빈 중 하나의 단백질 생성물과 사량체(α2γ2)인 α-글로빈 단백질을 결합하여 생성된다. HbF 수치는 γ-글로빈 단백질 생산이 감소함에 따라 출생 후 점진적으로 감소하고, 약 6~12개월령은 β-글로빈과 α-글로빈 단백질의 사량체(α2β2)로 구성된 성인 헤모글로빈으로 대부분 대체된다. HbF 수치의 이러한 감소와 함께 TDT의 증상은 유아에서 임상적으로 자주 나타난다. HbF는 일반적으로 정상적인 성인 생리학에서 작은 역할만 한다. 그러나 발표된 연구에 따르면 HbF의 선천적, 후천적 및 약물-유발 증가는 TDT 환자의 이환율 감소 및 임상 결과 개선과 관련이 있는 것으로 입증되었다. 예를 들어, 편향되지 않은 대규모 유전 연구는 HbF 수준의 증가와 관련된 BCL11A와 같은 정량적 형질 유전자좌와 TDT 질환 중증도 사이의 연관성을 확인했으며(문헌[Thein et al. (2009) Hum Mol Genet 18(R2):R216-23]),여기서 HbF의 수준은 종종 TDT 증상의 약화 정도에 비례한다(문헌[Musallam et al. (2012) Blood 119(2):364-7]). 또한, 이식 거부가 있는 TDT 환자에서 동종 HSCT에 실패한 사례 보고가 우연히 지속적으로 높은 HbF 수치를 초래했으며 그 후 환자는 수혈에 의존하지 않는 것으로 보고되었다(문헌[Ferster et al. (1995) Br. J Haematol 90(4):804-8]; 문헌[Paciaroni & Lucarelli (2012) Blood 119(4):1091-2]). HbF 생산은 하이드록시우레아에 의해 증가된다(문헌[Walker et al. (2011) Blood 118(20):5664-70]). 그러나, 하이드록시우레아는 β-지중해빈혈에서 가변적으로만 효과가 있었고, 중간성 β-지중해빈혈에서는 TDT보다 더 큰 효능을 보였다(문헌[Charache et al. (1995) N Engl J Med 332(20):1317-22]; 문헌[Ansari et al. (2011) J Pediatr Hematol Oncol 33(5):339-43]; 문헌[Singer et al. (2008) Am J Hematol 83(11): 842-5]). 또한, 하이드록시우레아의 효과는 완화적이며, 사용 시 혈구감소증 및 기타 독성에 대한 정기적인 모니터링이 필요하다.
BCL11A는 발달 및 조혈에서 많은 역할을 하는 전사 인자이다. 세포 및 동물 모델에서 게놈 전반에 걸친 연관성 및 기능적 추적 연구에 따르면, BCL11A가 HbF 발현의 중요한 사일런서임을 보여주었다. 획기적인 연구에서, 겸상 적혈구 질환(SCD)의 형질전환 인간화 마우스 모델에서 적혈구-특이적 조건부 녹아웃에 의한 BCL11A의 파괴는 헤모글로빈 전환의 실패, 높은 수준의 HbF 유지, 및 SCD와 관련된 혈액학적 및 병리학적 특성에서의 상당한 개선으로 이어진다(문헌[Xu et al. (2011) Science 334(6058):993-6]). 따라서, BCL11A의 억제는 인간의 TDT 및 SCD와 같은 β-글로빈 장애를 치료하기 위한 잠재적으로 효과적인 전략인 것으로 보인다. 그러나, 치료적 접근을 위해 BCL11A 유전자를 표적으로 하는 것은 발달 및 조혈에서 BCL11A의 중요한 역할로 인해 문제를 제기한다(문헌[Brendel et al. (2016) J Clin Invest 126(10:3868-3878]). 대체 전략은 BCL11A의 두 번째 인트론에 위치하며 적혈구계 세포에서는 BCL11A 발현에 필요하지만 다른 계통에서는 필요하지 않는, 적혈구-특이적 인핸서(ESE) 요소를 표적으로 한다. 인핸서 요소는 더 높은 HbF 수준과 관련된 일반적인 유전적 변이를 포함하는 것으로 밝혀졌다(문헌[Bauer et al. (2013) Science 342(6155):253-7]). 따라서, BCL11A 유전자의 이 적혈구-특이적 인핸서의 변형은 전반적인 BCL11A 기능에 대한 해로운 영향 없이 적혈구 세포의 내인성 HbF 수준을 높일 수 있다고 가정한다(문헌[Hardison & Blobel (2013) Science 342(6155):206-7]).
변형된 HSPC로 치료한 후 대상체의 안전이 가장 중요하다. 따라서, 본원에 기재된 임의의 방법에서, 변형된 세포가 시간 경과에 따라 대상체에서 유지되는지 여부를 평가하기 위해 주입 후 변형된 HSPC를 모니터링할 수 있다. 또한, 뉴클레아제 절단 후 NHEJ는 인델 프로파일이라고도 하는 다양한 상이한 삽입 및/또는 결실을 포함하는 세포 집단을 생성한다. 삽입 및/또는 결실(인델)은 임의의 길이일 수 있고, 결실된 0 내지 10 kb 뉴클레오타이드; 삽입된 0 내지 10 kb 뉴클레오타이드; 결실된 0 내지 10 kb 뉴클레오타이드 및 삽입된 1 내지 10 kb 뉴클레오타이드; 및/또는 결실된 1 내지 10 kb 뉴클레오타이드 및 삽입된 0 내지 10 kb 뉴클레오타이드를 포함하지만, 이에 제한되지 않는 삽입 및 결실의 임의의 조합일 수 있다. 인델 프로파일은 환자마다 크게 다를 수 있다. 예를 들어, 환자 1, 2 및 3에 대하여 도 7a 내지 도 7c에 도시된 바와 같이, 10개의 가장 일반적인 인델에 대한 인델 프로파일이 각 환자에 대해 표시되며, "I"는 삽입을 나타내고; "D"는 결실을 나타내고; 첫 번째 숫자는 참조 염기쌍에서 인델의 시작을 나타내고("*"는 인델 측면에 있는 뉴클레오타이드를 나타내며, 인델의 양쪽에 정렬될 수 있음); 콜론 다음의 숫자는 삽입되거나 결실된 염기쌍의 수를 나타낸다. 도시된 바와 같이, 가장 일반적인 인델은 1개에서 28개 뉴클레오타이드까지 다양하며, 참조 염기쌍의 대략 50개에서 70개(양쪽 모두)에서 시작되었다. 또한, 모든 환자에서 "다른 모든 인델"은 평가된 인델의 40% 초과를 차지했다. 또한, 표시된 대로 인델 프로파일은 시간이 지남에 따라 변경될 수 있다.
또한, 유전적으로 변형된 HSPC를 모니터링하여 이들의 인델 프로파일을 결정하는 방법이 본원에 기재되어 있다. 특정 구현예에서, 생체 외 유전적으로 변형된 세포의 인델 프로파일은 주입 전에 결정되고, 대상체에 투여된 후 시간 경과에 따라 모니터링된다. 이러한 모니터링은 이식된 세포내 인델의 분포 패턴이 유지되고, 한 클론 집단이 나머지 클론 집단보다 빠르게 성장하는 잭팟(jackpotting)으로도 알려진 현상인, 세포의 한 클론 집단의 비정상적 파생물이 없음을 확인하며(예를 들어, 문헌[Heddle (1999) Mutagenesis 14(3):257-260] 참조), 이는 신체 내 HSPC의 정상적인 세포 항상성과 관련하여 변형된 HSPC로부터 유래된 세포 유형의 원치 않는 과성장을 초래할 수 있다. 인델 프로파일의 모니터링은 임의의 표준 기술, 예를 들어 시퀀싱 또는 기타 방법을 사용하여 수행될 수 있다.
따라서, (i) mRNA가 ZFN 쌍을 암호화하는, SB-mRENH1 mRNA 및 SB-mRENH2 mRNA(서열 번호: 15 및 서열 번호: 16에 도시된 바와 같음); 및 (ii) ZFN 쌍에 의한 절단 후에 이루어진 게놈 변형을 포함하는 유전적으로 변형된 세포(예를 들어, CD34+ 조혈모 세포 또는 적혈구 전구체 세포와 같은 적혈구(RBC) 전구체 세포)가 본원에 제공되며, 상기 변형은 BCL11A 유전자가 세포에서 불활성화되도록 내인성 BCL11A 인핸서 서열 내에 있다. 또한, 이들 유전적으로 변형된 세포를 포함하는 세포 집단; 그로부터 유래된 유전적으로 변형된 세포; 유전적으로 변형된 세포 및 그로부터 유래된 세포를 포함하는 세포 집단; 및 유전적으로 변형된 세포 및/또는 이로부터 유래된 세포를 포함하는 조성물이 본원에 제공된다. 본 명세서에 기재된 세포, 세포 집단, 및 조성물은 자가(대상체로부터) 및/또는 동종 세포일 수 있다. 더욱이, 유전적으로 변형된 세포는 하나 이상의 자가-마커 또는 항원이 불활성화(녹아웃)된 세포를 포함하지만, 이에 제한되지 않는 하나 이상의 추가 유전적 변형을 포함할 수 있다.
이들 세포 집단 및/또는 조성물을 사용하는 생체 외 세포 요법, 예를 들어 본원에 기재된 유전적으로 변형된 세포(및/또는 그로부터 유래된 세포)를 포함하는 조성물을 대상체에게 투여하여, 대상체에서 태아 헤모글로빈(HbF) 생산(예를 들어, β0/β0 또는 β0/β+)이 증가하고 β-지중해빈혈(예를 들어, 수혈-의존성 β-지중해빈혈)의 하나 이상의 임상 증상이 감소, 개선 또는 제거되도록 함으로써 베타-지중해빈혈(β-지중해빈혈)을 갖는 대상체를 치료하는 생체 외 방법이 또한 제공된다. 특정 구현예에서, 총 헤모글로빈(Hb)의 그램/dL 혈장 및/또는 퍼센트 HbF에서 임상 실험실 헤모글로빈 분획(성인 또는 태아 헤모글로빈)의 기준선으로부터의 변화가 대상체에서 달성된다. 다른 구현예에서, 지중해빈혈-관련 질환 바이오마커의 수준(예를 들어, 철분 대사의 변화; 및/또는 에리트로포이에틴, 합토글로빈 및/또는 헵시딘 수준의 변화)은 치료(유전적으로 변형된 세포의 투여) 후에 변경된다. 감소, 개선 또는 제거될 수 있는 임상 증상은 하기를 포함하지만, 이에 제한되지는 않는다: 철분 과부하와 관련된, 또는 기준선 수혈 요법과 관련된 임상 증상(예를 들어, 갑상선 호르몬, IGF-1, 모닝 코르티솔, 부신피질자극 호르몬(ACTH), HbA1C 및/또는 비타민 D 수치의 수준 및/또는 활성을 결정함으로써 분석된 대상체에서 내분비 기능장애의 감소); RBC 수혈 및 주입 혈소판 수혈, 정맥내 면역글로빈(IVIG) 수혈, 혈장 수혈 및/또는 과립구 수혈의 필요성; 간 질환; 심장 이상; 골다공증; 및/또는 골절. 본원에 기재된 바와 같은 생체 외 방법은 또한 과형성의 감소 또는 제거; 미성숙 및/또는 비-전형적 형태를 갖는 세포의 수 감소; 및/또는 대상체에서 F 세포의 수 및 퍼센트의 변화(변형)을 포함하지만, 이에 제한되지 않는, 조성물 투여 후 대상체에서의 기준선 적혈구생성의 변화를 초래할 수 있다.
본원에 기재된 임의의 방법에서 유전적으로 변형된 세포는 대상체로부터 단리된 조혈모 세포(예를 들어, CD34+ HSC/PC)이며, 여기서 선택적으로 CD34+ HSC/PC는 (예를 들어, 적어도 25 x 106 CD34+ HSPCs/kg) 단리 전에 하나 이상의 용량의 G-CSF 및/또는 하나 이상의 용량의 플레릭사포에 의한 치료로 각 대상체에서 동원되며, 동원된 세포는 하나 이상의 성분채집 주기에 의해 수확된다. 또한, 유전적으로 변형된 세포를 포함하는 조성물은 BCL11A(표적내 변형) 및/또는 다른 비-BCL11A 영역(표적외 변형) 내의 삽입 및/또는 결실에 대해 평가될 수 있다. 유전적으로 변형된 세포를 포함하는 조성물을 투여하기 전에, 대상체는 하나 이상의 골수억제성 병태 작용제로 1회 이상 치료(투여)될 수 있으며, 예를 들어 부술판은 0.5 내지 5 mg/kg에서 1회 이상 정맥내(IV); 3.2 mg/kg/일에서 IV; 0일에 유전적으로 변형된 세포를 포함하는 조성물의 주입 전 -6 내지 -3일에 주입 전 12.8 mg/kg의 총 용량을 4일 동안 중심 정맥 카테터를 통한 IV; 또는 매일 1회 또는 6시간마다 IV로 투여된다. 유전적으로 변형된 세포의 임의의 용량, 예를 들어 3 x 106 세포/kg 내지 20 x 106 세포/kg 사이이 사용될 수 있다(예를 들어, 세포가 1 x 107 세포/mL의 농도로 백 당 대략 1.0-2.0 x 108 세포와 제형화됨). 유전적으로 변형된 세포는 투여 전에 동결보존될 수 있고, 해동 후 약 15분 내지 약 45분 이내를 포함하지만, 이에 제한되지 않는, 해동 후 임의의 시점에 있을 수 있다. 방법은 유전적으로 변형된 세포의 투여 전, 투여 중 및/또는 투여 후에 대상체의 바이탈 징후를 모니터링하는 단계; 및/또는 대상체에서 헤모글로빈의 기준선 수준을 결정하기 위해 유전적으로 변형된 세포를 투여하기 전에 대상체에서 헤모글로빈, 호중구 및/또는 혈소판 수준을 평가하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 특정 구현예에서, 유전적으로 변형된 세포의 투여 후 대상체 내 헤모글로빈, 호중구 및/또는 혈소판 수준이 투여 후 몇 주 또는 몇 개월 동안 기준선 수준과 비교하여 증가하거나 안정하게 유지된다. 선택적으로, 대상체는 유전적으로 변형된 세포의 투여 전 및/또는 투여 후에 하나 이상의 PRBC 수혈을 받을 수 있다. 본원에 기재된 임의의 방법에서, 대상체에게 조성물을 투여한 후, 대상체에서 골수 이식, 혈액 성분, 철분 킬레이트화 및/또는 요법 PRBC 수혈과 같은 추가 요법에 대한 필요성이 예를 들어 1~20일을 포함하여 약 1 내지 30일 또는 그 이상 내에 감소되거나 제거된다. 대상체에서 이식편의 안정성을 모니터링하기 위해, 세포 및 대상체는 또한 예를 들어 주입된 세포의 인델 프로파일과 비교하여 말초 혈액 샘플, 골수 흡인물, 또는 기타 조직 공급원으로부터 단리된 세포의 인델 프로파일을 결정하기 위해 투여 전 및/또는 후에 모니터링될 수 있다.
일반 사항
본 명세서에 개시된 조성물의 제조 및 사용뿐만 아니라 방법의 실행은 달리 지시되지 않는 한, 분자 생물학, 생화학, 염색질 구조 및 분석, 컴퓨터 화학, 세포 배양, 재조합 DNA 및 관련 분야의 통상적인 기술을 기술의 범위 내에서 사용한다. 이러한 기술들은 문헌에 완전히 설명되어 있다. 예를 들어, 문헌[Sambrook et al. MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, Second edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989 and Third edition, 2001]; 문헌[Ausubel et al., CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, John Wiley & Sons, New York, 1987] 및 주기적 업데이트; 시리즈 [METHODS IN ENZYMOLOGY, Academic Press, San Diego; Wolffe, CHROMATIN STRUCTURE AND FUNCTION, Third edition, Academic Press, San Diego, 1998]; [METHODS IN ENZYMOLOGY, Vol. 304, "Chromatin" (P.M. Wassarman and A. P. Wolffe, eds.), Academic Press, San Diego, 1999]; 및 [METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY, Vol. 119, "Chromatin Protocols" (P.B. Becker, ed.) Humana Press, Totowa, 1999]를 참고한다.
정의
용어 "핵산", "폴리뉴클레오타이드" 및 "올리고뉴클레오타이드"는 상호교환적으로 사용되며, 선형 또는 원형 형태, 및 단일- 또는 이중-가닥 형태의 데옥시리보뉴클레오타이드 또는 리보뉴클레오타이드 중합체를 지칭한다. 본 개시 내용의 목적을 위해, 이들 용어는 중합체의 길이와 관련하여 제한하는 것으로 해석되어서는 안 된다. 이 용어는 천연 뉴클레오타이드의 공지된 유사체 뿐만 아니라 염기, 당 및/또는 포스페이트 모이어티(예를 들어, 포스포로티오에이트 백본)에서 변형된 뉴클레오타이드를 포함할 수 있다. 일반적으로, 특정 뉴클레오타이드의 유사체는 동일한 염기쌍 특이성을 가지고 있으며; 즉, A의 유사체는 T와 염기쌍을 이룰 것이다.
용어 "폴리펩타이드", "펩타이드" 및 "단백질"은 아미노산 잔기의 중합체를 지칭하기 위해 상호교환적으로 사용된다. 상기 용어는 또한 하나 이상의 아미노산이 상응하는 자연-발생 아미노산의 화학적 유사체 또는 변형된 유도체인 아미노산 중합체에 적용된다.
"결합"은 거대분자들 사이(예를 들어, 단백질과 핵산 사이) 서열-특이적, 비공유 상호작용을 지칭한다. 전반적으로 상호작용이 서열-특이적인 한, 결합 상호작용의 모든 구성요소가 서열-특이적일 필요는 없다(예를 들어, DNA 백본에서 포스페이트 잔기와의 접촉). 이러한 상호작용은 일반적으로 10-6　M-1 이하의 해리 상수(Kd)를 특징으로 한다. "친화도"는 결합의 강도를 나타내며: 증가된 결합 친화도는 더 낮은 Kd와 상관관계가 있다.
"결합 단백질"은 또 다른 분자에 비공유적으로 결합할 수 있는 단백질이다. 결합 단백질은 예를 들어 DNA 분자(DNA-결합 단백질), RNA 분자(RNA-결합 단백질) 및/또는 단백질 분자(단백질-결합 단백질)에 결합할 수 있다. 단백질-결합 단백질의 경우, 그것은 (동종이량체, 동종삼량체 등을 형성하기 위해) 그 자체에 결합할 수 있고/있거나, 상이한 단백질 또는 단백질들의 하나 이상의 분자에 결합할 수 있다. 결합 단백질은 하나 초과의 유형의 결합 활성을 가질 수 있다. 예를 들어, 아연 핑거 단백질은 DNA-결합, RNA-결합 및 단백질-결합 활성을 가지고 있다.
"아연 핑거 DNA 결합 단백질"(또는 결합 도메인)은 하나 이상의 아연 핑거를 통해 서열-특이적 방식으로 DNA에 결합하는 단백질, 또는 더 큰 단백질 내의 도메인이며, 이는 아연 이온의 배위를 통해 구조가 안정화된 결합 도메인 내의 아미노산 서열의 영역이다. 아연 핑거 DNA 결합 단백질이라는 용어는 종종 아연 핑거 단백질 또는 ZFP로 축약된다. 용어 "아연 핑거 뉴클레아제"는 표적 유전자를 절단하도록 이량체화하는 ZFN 쌍 (쌍의 구성원은 "왼쪽 및 오른쪽" 또는 "첫 번째 및 두 번째" 또는 "쌍"으로 지칭됨) 뿐만 아니라 하나의 ZFN을 포함한다.
"TALE DNA 결합 도메인" 또는 "TALE"은 하나 이상의 TALE 반복 도메인/단위를 포함하는 폴리펩타이드이다. 반복 도메인은 TALE의 그의 동족 표적 DNA 서열에 대한 결합에 관여한다. 단일 "반복 단위"("반복"이라고도 함)는 전형적으로 길이가 33~35개 아미노산이고, 자연 발생 TALE 단백질 내에서 다른 TALE 반복 서열과 적어도 일부 서열 상동성을 나타낸다. 예를 들어, 미국 특허 제8,586,526호 및 제9,458,205호를 참고한다. 용어 "TALEN"은 표적 유전자를 절단하도록 이량체화하는 1개의 TALEN 뿐만 아니라 한 쌍의 TALEN(쌍의 구성원은 "좌측 및 우측" 또는 "제1 및 제2" 또는 "쌍"으로 지칭됨)을 포함한다. 아연 핑거 및 TALE 결합 도메인은 예를 들어 자연 발생 아연 핑거 또는 TALE 단백질의 인식 나선 영역의 조작(하나 이상의 아미노산 변경)을 통해 미리 결정된 뉴클레오타이드 서열에 결합하도록 "조작"될 수 있다. 따라서, 조작된 DNA 결합 단백질(아연 핑거 또는 TALE)은 자연적으로 발생하지 않는 단백질이다. DNA-결합 단백질을 조작하는 방법의 비제한적인 예는 설계 및 선택이다. 설계된 DNA 결합 단백질은 설계/조성이 주로 합리적인 기준에서 나오는 자연에서 발생하지 않는 단백질이다. 합리적 설계 기준에는 기존 ZFP 및/또는 TALE 설계 정보 및 결합 데이터를 저장하는 데이터베이스의 정보 처리를 위한 대체 규칙 및 컴퓨터 알고리즘의 적용이 포함된다. 예를 들어, 미국 특허 제8,568,526호; 제6,140,081호; 제6,453,242호; 및 제6,534,261호를 참조하고; 또한, 국제 특허 출원 공개 WO　98/53058; WO　98/53059; WO　98/53060; WO　02/016536; 및 WO　03/016496을 참조한다.
"선택된" 아연 핑거 단백질 또는 TALE은 파지 디스플레이, 상호작용 트랩 또는 하이브리드 선택과 같은 경험적 과정에서 주로 생산되는 자연에서 발견되지 않는 단백질이다. 예를 들어, 미국 특허 제8,586,526호;　제5,789,538호; 제5,925,523호; 제6,007,988호; 제6,013,453호; 제6,200,759호; 및 국제 특허 출원 공개 WO　95/19431; WO　96/06166; WO　98/53057; WO　98/54311; WO　00/27878; WO　01/60970; WO　01/88197 및 WO　02/099084를 참조한다.
"재조합"은 2개의 폴리뉴클레오타이드 간의 유전 정보 교환 과정을 지칭한다. 본 개시 내용의 목적을 위해, "상동 재조합(HR)"은 예를 들어 상동성-지향 복구 메카니즘을 통한 세포의 이중-가닥 파단의 복구 동안 발생하는 이러한 교환의 특수화된 형태를 지칭한다. 이 과정은 뉴클레오타이드 서열 상동성을 필요로 하고, "표적" 분자(즉, 이중-가닥 파단을 경험한 분자)의 주형 복구를 위해 "공여체" 분자를 사용하며, 유전 정보가 공여자로부터 표적으로 전달되기 때문에 "비-교차 유전자 전환" 또는 "쇼트 트랙 유전자 전환"으로 다양하게 알려져 있다. 특정 이론에 얽매이지 않고, 그러한 전달은 파손된 표적과 공여자 사이에 형성되는 이종이중체 DNA의 불일치 교정 및/또는 공여자가 표적 및/또는 관련 프로세스의 일부가 될 유전 정보를 재합성하는데 사용되는 "합성-의존성 가닥 어닐링"을 포함할 수 있다. 이러한 특수화된 HR은 종종 공여체 폴리뉴클레오타이드의 서열의 일부 또는 전부가 표적 폴리뉴클레오타이드에 통합되도록 표적 분자의 서열의 변경을 초래한다.
본 개시 내용의 방법에서, 본원에 기재된 바와 같은 하나 이상의 표적화된 뉴클레아제는 미리 결정된 부위에서 표적 서열(예를 들어, 세포 염색질)의 이중-가닥 파단을 형성하고, 파손 영역의 뉴클레오타이드 서열에 대하여 상동성을 갖는 "공여자" 폴리뉴클레오타이드가 세포 내로 도입될 수 있다. 이중-가닥 파손의 존재는 공여자 서열의 통합을 용이하게 하는 것으로 나타났다. 공여자 서열은 물리적으로 통합될 수 있거나, 대안적으로 공여자 폴리뉴클레오타이드는 상동 재조합을 통한 파단 복구를 위한 주형으로서 사용되어, 공여자에서와 같이 뉴클레오타이드 서열의 전부 또는 일부가 세포 염색질 내로 도입되게 한다. 따라서, 세포 염색질의 첫 번째 서열은 변경될 수 있고, 특정 구현예에서는 공여자 폴리뉴클레오타이드에 존재하는 서열로 전환될 수 있다. 따라서, "대체하다" 또는 "대체"라는 용어의 사용은 하나의 뉴클레오타이드 서열을 또 다른 것으로 대체하는 것으로 이해될 수 있으며(즉, 정보 의미에서 서열의 대체), 하나의 폴리뉴클레오타이드가 또 다른 폴리뉴클레오타이드로 물리적 또는 화학적으로 대체되는 것을 반드시 필요로 하진 않는다.
본원에 기재된 임의의 방법에서, 아연-핑거 또는 TALEN 단백질의 추가 쌍은 세포 내의 추가 표적 부위의 추가 이중-가닥 절단을 위해 사용될 수 있다.
세포 염색질에서 관심 영역의 서열의 표적화된 재조합 및/또는 대체 및/또는 변경을 위한 방법의 특정 구현예에서, 염색체 서열은 외인성 "공여체" 뉴클레오타이드 서열과의 상동 재조합에 의해 변경된다. 이러한 상동 재조합은 파단 영역에 대하여 상동인 서열이 존재하는 경우 세포 염색질의 이중-가닥 파단의 존재에 의해 자극된다.
본원에 기재된 임의의 방법에서, 제1 뉴클레오타이드 서열("공여자 서열")은 관심 영역의 게놈 서열과 상동하지만 동일하지 않은 서열을 함유할 수 있으며, 이로써 상동 재조합을 자극하여 관심 영역에 비-동일 서열을 삽입하게 된다. 따라서, 특정 구현예에서, 관심 영역의 서열과 상동성인 공여자 서열의 부분은 대체되는 게놈 서열에 대해 약 80 내지 99%(또는 그 사이의 임의의 정수)의 서열 동일성을 나타낸다. 다른 구현예에서, 공여자와 게놈 서열 사이의 상동성은 예를 들어 공여자와 100개 초과의 연속 염기쌍의 게놈 서열 사이에서 단 1개의 뉴클레오타이드가 상이한 경우, 99% 초과이다. 특정 경우에, 공여자 서열의 비-상동성 부분은 관심 영역에 존재하지 않는 서열을 함유할 수 있어, 새로운 서열이 관심 영역에 도입된다. 이러한 경우에, 비-상동성 서열은 일반적으로 관심 영역의 서열과 상동성이거나 동일한 50~1,000개 염기쌍(또는 이들 사이의 임의의 정수 값)의 서열 또는 1,000개를 초과하는 임의의 수의 염기쌍의 서열에 의해 플랭킹된다. 다른 구현예에서, 공여자 서열은 제1 서열과 비-상동이고, 비-상동 재조합 메카니즘에 의해 게놈 내로 삽입된다.
본원에 기재된 임의의 방법은 관심 유전자(들)의 발현을 방해하는 공여자 서열의 표적화된 통합에 의해 세포에서 하나 이상의 표적 서열의 부분적 또는 완전한 불활성화를 위해 사용될 수 있다. 부분적으로 또는 완전히 불활성화된 유전자를 갖는 세포주가 또한 제공된다.
또한, 본원에 기재된 표적화된 통합 방법은 또한 하나 이상의 외인성 서열을 통합하는데 사용될 수 있다. 외인성 핵산 서열은 예를 들어, 하나 이상의 유전자 또는 cDNA 분자, 또는 임의의 유형의 암호화 또는 비-암호화 서열, 뿐만 아니라 하나 이상의 제어 요소(예를 들어, 프로모터)를 포함할 수 있다. 또한, 외인성 핵산 서열은 하나 이상의 RNA 분자(예를 들어, 작은 헤어핀 RNA(shRNA), 억제 RNA(RNAis), 마이크로RNA(miRNA) 등)를 생성할 수 있다.
"절단"은 DNA 분자의 공유 백본의 파단을 지칭한다. 절단은 포스포디에스테르 결합의 효소적 또는 화학적 가수분해를 포함하지만, 이에 제한되지 않는 다양한 방법에 의해 개시될 수 있다. 단일-가닥 절단 및 이중-가닥 절단이 모두 가능하며, 이중-가닥 절단은 2개의 별개의 단일-가닥 절단 이벤트의 결과로 발생할 수 있다. DNA 절단으로 인해 끝이 무딘 단부 또는 엇갈린 단부가 생성될 수 있다. 특정 구현예에서, 융합 폴리펩타이드는 표적화된 이중-가닥 DNA 절단에 사용된다.
"절단 반-도메인"은 제2 폴리펩타이드(동일하거나 상이한)와 함께 절단 활성(바람직하게는 이중-가닥 절단 활성)을 갖는 복합체를 형성하는 폴리펩타이드 서열이다. 용어 "제1 및 제2 절단 반-도메인"; "+ 및 - 절단 반-도메인" 및 "오른쪽 및 왼쪽 절단 반-도메인"은 이량체화하는 절단 반-도메인의 쌍을 나타내기 위해 상호교환적으로 사용된다.
"조작된 절단 반-도메인"은 다른 절단 반-도메인(예를 들어, 또 다른 조작된 절단 반-도메인)과 절대 이종이량체를 형성하도록 변형된 절단 반-도메인이다. 미국 특허 제7,888,121호; 제7,914,796호; 제8,034,598호; 및 제8,823,618호에 기술되어 있으며, 그 전체 내용이 참조로서 본원에 포함된다.
용어 "서열"은 DNA 또는 RNA일 수 있는 임의의 길이의 뉴클레오타이드 서열을 지칭하고; 선형, 원형 또는 분지형일 수 있으며, 단일-가닥 또는 이중-가닥일 수 있다. 용어 "공여자 서열"은 게놈에 삽입되는 뉴클레오타이드 서열을 지칭한다. 공여자 서열은 임의의 길이, 예를 들어 2 내지 10,000개의 뉴클레오타이드 길이(또는 그 사이 또는 그 초과의 임의의 정수 값), 바람직하게는 약 100 내지 1,000개의 뉴클레오타이드 길이(또는 그 사이의 임의의 정수), 더욱 바람직하게는 약 200 내지 500개의 뉴클레오타이드 길이일 수 있다.
"질환 관련 유전자"는 단일 유전자 질환에서 어떤 방식으로든 결함이 있는 유전자이다. 단일 유전자 질환의 비제한적인 예는 중증 복합 면역결핍증, 낭포성 섬유증, 리소좀 축적 질환(예를 들어, 고셔병, 헐러병, 헌터병, 파브리병, 니만-픽(Neimann-Pick), 테이삭병 등), 겸상 적혈구 빈혈 및 지중해빈혈을 포함한다.
"혈액 뇌 장벽"은 중추 신경계의 뇌로부터 순환 혈액을 분리하는 고도로 선택적인 투과성 장벽이다. 혈액 뇌 장벽은 혈액 용질의 통과를 제한하는 CNS 혈관의 밀착 접합에 의해 연결된 뇌 내피 세포에 의해 형성된다. 혈액 뇌 장벽은 큰 분자 치료제의 흡수를 방지하고 대부분의 소분자 치료제의 흡수를 방지하는 것으로 오랫동안 생각되어 왔다(문헌[Pardridge (2005) NeuroRx 2(1): 3-14]).
"염색질"은 세포 게놈을 포함하는 핵단백질 구조이다. 세포 염색질은 핵산, 주로 DNA, 및 히스톤 및 비-히스톤 염색체 단백질을 포함한 단백질을 포함한다. 대부분의 진핵 세포 염색질은 뉴클레오솜 형태로 존재하며, 여기서 뉴클레오솜 코어는 히스톤 H2A, H2B, H3 및 H4 각각을 2개 포함하는 팔량체와 관련된 대략 150개 염기쌍의 DNA를 포함하고; 링커 DNA(유기체에 따라 길이가 가변적임)는 뉴클레오솜 코어 사이에서 확장된다. 히스톤 H1 분자는 일반적으로 링커 DNA와 연관되어 있다. 본 개시 내용의 목적을 위해, 용어 "염색질"은 원핵생물 및 진핵생물 모두의 모든 유형의 세포 핵단백질을 포괄하는 의미이다. 세포 염색질은 염색체와 에피솜 염색질을 모두 포함한다.
"염색체"는 세포 게놈의 전부 또는 일부를 포함하는 염색질 복합체이다. 세포의 게놈은 종종 세포의 게놈을 포함하는 모든 염색체의 집합인 핵형에 의해 특징지어진다. 세포의 게놈은 하나 이상의 염색체를 포함할 수 있다.
"에피솜"은 복제 핵산, 핵단백질 복합체 또는 세포의 염색체 핵형의 일부가 아닌 핵산을 포함하는 다른 구조이다. 에피솜의 예에는 플라스미드 및 특정 바이러스 게놈이 포함된다.
"표적 부위" 또는 "표적 서열"은 결합을 위한 충분한 조건이 존재한다면, 결합 분자가 결합할 핵산의 일부를 정의하는 핵산 서열이다.
"외인성" 분자는 정상적으로 세포에 존재하지 않지만 하나 이상의 유전적, 생화학적 또는 기타 방법에 의해 세포 내로 도입될 수 있는 분자이다. "세포 내 정상적인 존재"는 세포의 특정 발달 단계 및 환경 조건과 관련하여 결정된다. 따라서, 예를 들어 근육의 배아 발달 동안에만 존재하는 분자는 성인 근육 세포에 대한 외인성 분자이다. 이와 유사하게, 열충격에 의해 유도된 분자는 열충격을 받지 않은 세포에 대한 외인성 분자이다. 외인성 분자는, 예를 들어, 오작동하는 내인성 분자의 기능 버전 또는 정상적으로 기능하는 내인성 분자의 오작동 버전을 포함할 수 있다.
외인성 분자는 무엇보다도 조합 화학 공정에 의해 생성되는 것과 같은 소분자, 또는 단백질, 핵산, 탄수화물, 지질, 당단백질, 지단백질, 다당류, 상기 분자의 임의의 변형된 유도체, 또는 상기 분자 중 하나 이상을 포함하는 임의의 복합체와 같은 거대분자일 수 있다. 핵산에는 DNA 및 RNA가 포함되며, 단일- 또는 이중-가닥일 수 있으며; 선형, 분지형 또는 원형일 수 있고; 길이에 관계없이 가능하다. 핵산에는 이중체를 형성할 수 있는 것 뿐만 아니라 삼중체-형성 핵산이 포함된다. 예를 들어, 미국 특허 제5,176,996호 및 제5,422,251호를 참고한다. 단백질은 DNA-결합 단백질, 전사 인자, 염색질 리모델링 인자, 메틸화된 DNA 결합 단백질, 폴리머라제, 메틸라제, 데메틸라제, 아세틸라제, 데아세틸라제, 키나제, 포스파타제, 인테그라제, 재조합효소, 리가제, 토포이소머라제, 자이라제 및 헬리카제를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.
외인성 분자는 내인성 분자와 동일한 유형의 분자, 예를 들어 외인성 단백질 또는 핵산일 수 있다. 예를 들어, 외인성 핵산은 감염 바이러스 게놈, 세포 내로 도입된 플라스미드 또는 에피솜, 또는 세포에 정상적으로 존재하지 않는 염색체를 포함할 수 있다. 외인성 분자를 세포 내로 도입하는 방법은 당업자에게 알려져 있으며, 지질-매개 전달(즉, 중성 및 양이온성 지질을 포함하는 리포솜), 전기천공, 직접 주사, 세포 융합, 입자 충격, 인산칼슘 공침, DEAE-덱스트란-매개 전달 및 바이러스 벡터-매개 전달을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 외인성 분자는 또한 내인성 분자와 동일한 유형의 분자일 수 있지만, 세포가 유도된 것과 다른 종에서 유도된다. 예를 들어, 인간 핵산 서열은 원래 마우스 또는 햄스터로부터 유래된 세포주에 도입될 수 있다.
대조적으로, "내인성" 분자는 특정 환경 조건 하에 특정 발달 단계에서 특정 세포에 정상적으로 존재하는 분자이다. 예를 들어, 내인성 핵산은 염색체, 미토콘드리아의 게놈, 엽록체 또는 기타 소기관, 또는 자연-발생 에피솜 핵산을 포함할 수 있다. 추가적인 내인성 분자는 단백질, 예를 들어 전사 인자 및 효소를 포함할 수 있다.
"융합" 분자는 2개 이상의 서브유닛 분자가 바람직하게는 공유적으로 연결된 분자이다. 서브유닛 분자는 동일한 화학적 유형의 분자이거나, 다른 화학적 유형의 분자일 수 있다. 융합 분자의 예에는 융합 단백질(예를 들어, 단백질 DNA-결합 도메인과 절단 도메인 사이의 융합), 절단 도메인과 작동적으로 연관된 폴리뉴클레오타이드 DNA-결합 도메인(예를 들어, sgRNA) 사이의 융합, 및 융합 핵산(예를 들어, 융합 단백질을 암호화하는 핵산)을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.
세포에서 융합 단백질의 발현은 융합 단백질의 세포로의 전달 또는 융합 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드의 세포로의 전달에 의해 야기될 수 있으며, 여기서 폴리뉴클레오타이드는 전사되고, 그 전사체는 번역되어, 융합 단백질을 생성한다. 트랜스-스플라이싱(trans-splicing), 폴리펩타이드 절단 및 폴리펩타이드 결찰은 또한 세포내 단백질의 발현에 관여할 수 있다. 세포로의 폴리뉴클레오타이드 및 폴리펩타이드 전달 방법은 본 개시 내용의 다른 곳에 제시되어 있다.
본 개시 내용의 목적을 위한 "유전자"는 유전자 생성물을 암호화하는 DNA 영역(하기 참조), 뿐만 아니라 유전자 생성물의 생산을 조절하는 모든 DNA 영역을 포함하며, 반드시 상기 조절 서열은 암호화 및/또는 전사된 서열에 인접해 있다. 따라서, 유전자는 프로모터 서열, 종결인자, 번역 조절 서열, 예컨대 리보솜 결합 부위 및 내부 리보솜 진입 부위, 인핸서, 사일런서, 절연체, 경계 요소, 복제 기점, 기질 부착 부위 및 유전자좌 제어 영역을 포함하지만, 반드시 이에 제한되는 것은 아니다.
"유전자 발현"은 유전자에 포함된 정보가 유전자 생성물로 전환되는 것을 의미한다. 유전자 생성물은 유전자의 직접적인 전사 생성물(예를 들어, mRNA, tRNA, rRNA, 안티센스 RNA, 리보자임, 구조적 RNA 또는 기타 유형의 RNA) 또는 mRNA의 번역에 의해 생성된 단백질일 수 있다. 유전자 생성물은 또한 캡핑, 폴리아데닐화, 메틸화 및 편집과 같은 과정에 의해 변형된 RNA, 및 예를 들어 메틸화, 아세틸화, 인산화, 유비퀴틴화, ADP-리보실화, 미리스틸화 및 글리코실화에 의해 변형된 단백질을 포함한다.
유전자 발현의 "조절"은 유전자 활성의 변화를 의미한다. 발현 조절은 유전자 활성화 및 유전자 억제를 포함할 수 있지만, 이에 제한되지 않는다. 게놈 편집(예를 들어, 절단, 변경, 불활성화, 무작위 돌연변이)을 사용하여 발현을 조절할 수 있다. 유전자 불활성화는 본원에 기재된 ZFP 또는 TALEN을 포함하지 않는 세포와 비교하여 유전자 발현의 임의의 감소를 지칭한다. 따라서, 유전자 불활성화는 부분적이거나 완전할 수 있다.
"관심 영역"은 외인성 분자에 결합하는 것이 바람직한, 세포 염색질의 임의의 영역, 예컨대 예를 들어, 유전자 또는 유전자 내 또는 유전자에 인접한 비-암호화 서열이다. 결합은 표적화된 DNA 절단 및/또는 표적화된 재조합을 위한 것일 수 있다. 관심 영역은 예를 들어, 염색체, 에피솜, 소기관 게놈(예를 들어, 미토콘드리아, 엽록체), 또는 감염 바이러스 게놈에 존재할 수 있다. 관심 영역은 유전자의 암호화 영역 내에, 예를 들어 리더 서열, 트레일러 서열 또는 인트론과 같은 전사된 비암호화 영역 내에, 또는 암호화 영역의 상류 또는 하류에 있는 비-전사 영역 내에 있을 수 있다. 관심 영역은 단일 뉴클레오타이드 쌍만큼 작거나 길이가 최대 2,000개 뉴클레오타이드 쌍이거나, 뉴클레오타이드 쌍의 임의의 정수 값일 수 있다.
"진핵생물" 세포는 진균 세포(예컨대, 효모), 식물 세포, 동물 세포, 포유동물 세포 및 인간 세포(예를 들어, 줄기 세포 또는 전구체 세포)를 포함하지만, 이에 제한되지는 않는다. 용어 "줄기 세포" 또는 "전구체 세포"는 조혈 전구 줄기세포(HPSC) 또는 조혈모 세포/전구 세포(HSC/PC)라고도 하는, 조혈모 세포를 포함하지만, 이에 제한되지 않는 다능 및 다능성 줄기 세포를 의미한다.
"적혈구"(RBC) 또는 적혈구는 조혈모 세포로부터 유래된 말단 분화 세포이다. 그들은 뉴클레아제와 대부분의 세포 소기관이 없다. 적혈구에는 폐에서 말초 조직으로 산소를 운반하는 헤모글로빈이 포함되어 있다. 사실, 개별 적혈구의 33%는 헤모글로빈이다. 그들은 또한 신진대사 동안 세포에 의해 생성된 CO2를 조직 밖으로 운반하고, 숨을 내쉴 때 방출하기 위해 폐로 다시 운반한다. 적혈구는 신장에서 에리트로포이에틴(EPO)의 방출에 의해 매개되는 혈액 저산소증에 대한 반응으로 골수에서 생성된다. EPO는 전적혈구의 수를 증가시키고, 완전한 RBC 성숙에 필요한 시간을 단축시킨다. 대략 120일 후, 적혈구는 핵이나 임의의 다른 재생 능력을 포함하지 않기 때문에 간, 비장 및 림프절에서 대식세포의 식세포 활동(~90%) 또는 혈장에서 용혈(~10%)에 의해 순환으로부터 세포가 제거된다. 대식세포가 삼켜진 후, 적혈구의 화학 성분은 리소좀 효소의 작용으로 인해 대식세포의 액포 내에서 분해된다.
"분비 조직"은 개별 세포로부터, 전형적으로 상피로부터 유래되는 일부 유형의 내강으로 생성물을 분비하는 동물의 조직이다. 위장관에 국한된 분비 조직의 예로는 장, 췌장 및 담낭을 둘러싸고 있는 세포가 포함된다. 다른 분비 조직에는 간, 눈과 관련된 조직, 및 타액선, 유선, 전립선, 뇌하수체 및 기타 내분비계 구성원과 같은 점막이 있다. 또한, 분비 조직은 분비할 수 있는 조직 유형의 개별 세포를 포함한다.
"작동 가능한 연결" 및 "작동적으로 연결된"(또는 "작동 가능하게 연결된")이라는 용어는 2개 이상의 구성요소(예컨대 서열 요소)의 병치와 관련하여 상호교환적으로 사용되며, 여기서 구성요소는 두 구성요소 모두 정상적으로 기능하고 구성요소 중 적어도 하나가 다른 구성요소들 중 적어도 하나에 작용하는 기능을 중재할 수 있는 가능성을 허용한다. 예로서, 전사 조절 서열이 하나 이상의 전사 조절 인자의 존재 또는 부재에 대한 반응으로 암호화 서열의 전사 수준을 제어하는 경우, 프로모터와 같은 전사 조절 서열은 암호화 서열에 작동가능하게 연결된다. 전사 조절 서열은 일반적으로 암호화 서열과 시스에서 작동가능하게 연결되지만, 이에 직접 인접할 필요는 없다. 예를 들어, 인핸서는 인접하지 않더라도 암호화 서열에 작동 가능하게 연결된 전사 조절 서열이다.
융합 폴리펩타이드와 관련하여, "작동가능하게 연결된"이라는 용어는 각각의 구성요소가 다른 구성요소에 대한 연결에서 그렇게 연결되지 않은 경우와 동일한 기능을 수행한다는 사실을 지칭할 수 있다. 예를 들어, ZFP 또는 TALE DNA-결합 도메인이 활성화 도메인에 융합된 융합 폴리펩타이드와 관련하여, 융합 폴리펩타이드에서 ZFP 또는 TALE DNA-결합 도메인 부분이 그의 표적 부위 및/또는 그의 결합 부위에 결합할 수 있는 반면, 활성화 도메인이 유전자 발현을 상향-조절할 수 있는 경우, ZFP 또는 TALE DNA-결합 도메인과 활성화 도메인은 작동적 연결상태에 있다. ZFP 또는 TALE DNA-결합 도메인이 절단 도메인에 융합된 융합 폴리펩타이드의 경우, 융합 폴리펩타이드에서 ZFP 또는 TALE DNA-결합 도메인 부분이 그의 표적 부위 및/또는 그의 결합 부위에 결합할 수 있는 반면, 절단 도메인이 표적 부위 부근에서 DNA를 절단할 수 있는 경우, ZFP 또는 TALE DNA-결합 도메인과 절단 도메인은 작동적 연결상태에 있다.
"기능성" 단백질, 폴리펩타이드 또는 핵산은 야생형 단백질, 폴리펩타이드 또는 핵산과 동일한 기능을 제공하는 임의의 단백질, 폴리펩타이드 또는 핵산을 포함한다. 단백질, 폴리펩타이드 또는 핵산의 "기능적 단편"은 서열이 전장 단백질, 폴리펩타이드 또는 핵산과 동일하지 않지만 전장 단백질, 폴리펩타이드 또는 핵산과 동일한 기능을 유지하는 단백질, 폴리펩타이드 또는 핵산이다. 기능적 단편은 상응하는 천연 분자와 더 많거나 더 적거나 동일한 수의 잔기를 가질 수 있고/있거나 하나 이상의 아미노산 또는 뉴클레오타이드 치환을 함유할 수 있다. 핵산의 기능(예를 들어, 암호화 기능, 또 다른 핵산에 혼성화하는 능력)을 결정하는 방법은 당업계에 잘 알려져 있다. 유사하게, 단백질 기능을 결정하는 방법은 잘 알려져 있다. 예를 들어, 폴리펩타이드의 DNA-결합 기능은 예를 들어 필터-결합, 전기영동 이동성-이동, 또는 면역침전 분석에 의해 결정될 수 있다. DNA 절단은 겔 전기영동으로 분석할 수 있다. Ausubel 등의 상기를 참고한다. 다른 단백질과 상호작용하는 단백질의 능력은, 예를 들어 유전 및 생화학적 동시-면역침전, 2-하이브리드 검정 또는 보완에 의해 결정될 수 있다. 예를 들어, 문헌[Fields et al. (1989) Nature 340:245-246]; 미국 특허 제5,585,245호 및 국제 특허 공개 번호 WO 98/44350을 참고한다.
"벡터"는 유전자 서열을 표적 세포로 전달할 수 있다. 전형적으로, "벡터 작제물", "발현 벡터" 및 "유전자 전달 벡터"는 관심 유전자의 발현을 지시할 수 있고, 유전자 서열을 표적 세포로 전달할 수 있는 임의의 핵산 작제물을 의미한다. 따라서, 상기 용어는 클로닝 및 발현 비히클, 뿐만 아니라 통합 벡터를 포함한다.
"리포터 유전자" 또는 "리포터 서열"은 바람직하게는 일상적인 분석에서 반드시는 아니지만, 용이하게 측정되는 단백질 생성물을 생성하는 임의의 서열을 지칭한다. 적합한 리포터 유전자에는 항생제 내성(예를 들어, 암피실린 내성, 네오마이신 내성, G418 내성, 퓨로마이신 내성)을 매개하는 단백질을 암호화하는 서열, 유색 또는 형광 또는 발광 단백질(예를 들어, 녹색 형광 단백질, 강화된 녹색 형광 단백질, 적색 형광 단백질, 루시퍼라제)을 암호화하는 서열, 및 강화된 세포 성장 및/또는 유전자 증폭을 매개하는 단백질(예를 들어, 디하이드로폴레이트 환원효소)이 포함되지만, 이에 제한되지 않는다. 에피토프 태그는 예를 들어 FLAG, His, myc, Tap, HA 또는 임의의 검출 가능한 아미노산 서열의 하나 이상의 사본을 포함한다. "발현 태그"는 관심 유전자의 발현을 모니터링하기 위해 원하는 유전자 서열에 작동가능하게 연결될 수 있는 리포터를 암호화하는 서열을 포함한다.
"대상체" 및 "환자"라는 용어는 상호교환적으로 사용되며, 인간 대상체 및 비-인간 영장류와 같은 포유동물뿐만 아니라 토끼, 개, 고양이, 래트, 마우스 및 기타 동물과 같은 실험 동물을 지칭한다. 따라서, 본원에 사용된 용어 "대상체" 또는 "환자"는 본 발명의 변경된 세포 및/또는 본 발명의 변경된 세포에 의해 생성된 단백질이 투여될 수 있는 임의의 포유동물 대상체 또는 환자를 의미한다. 본 발명의 대상체는 β-지중해빈혈 장애가 있는 대상체를 포함한다.
일반적으로, 대상체 또는 대상체는 β-지중해빈혈 치료에 적격이다. 본 명세서의 목적을 위해, 그러한 적격한 대상체 또는 대상체는 β-지중해빈혈의 하나 이상의 징후, 증상 또는 기타 지표를 경험하거나, 경험했거나, 경험할 가능성이 있는 사람이고; 예를 들어 새로 진단되었는지 여부와 관계없이 β-지중해빈혈로 진단받았고/거나 β-지중해빈혈이 발생할 위험이 있다. β-지중해빈혈을 앓고 있거나 앓을 위험이 있는 사람은 혈액 또는 혈장에서 비정상적으로 낮은 수준의 헤모글로빈에 대해 선별검사를 받은 사람으로 선택적으로 식별될 수 있다.
본원에 사용된 "치료(treatment/treating)"는 임상 결과를 포함하는, 유익한 또는 원하는 결과를 얻기 위한 접근법이다. 본 발명의 목적을 위해, 유익하거나 원하는 임상 결과는 하기의 것 중 하나 이상에 포함되지만, 이들에 제한되지 않는다: 질환으로 인한 하나 이상의 증상 감소, 질환의 정도 경감, 질환 안정화(예를 들어, 질환의 예방 또는 악화 지연), 질환의 진행 지연 또는 감속, 질환 상태 개선, 질환 치료에 필요한 하나 이상의 다른 약제의 투여량 감소, 및/또는 삶의 질 증가.
본 명세서에 사용된 바와 같이, β-지중해빈혈의 진행을 "지연" 또는 "감속시키는 것"은 질환의 발달을 예방, 지연, 방해, 감속, 지체, 안정화 및/또는 연기하는 것을 의미한다. 이 지연은 질환의 병력 및/또는 치료를 받는 개인에 따라 다양한 시간 길이가 될 수 있다.
본원에 사용된 "치료 시작 시점"은 본 발명의 조성물과 같은 β-지중해빈혈 치료 조성물에 대한 최초 노출 시 또는 그 이전의 기간을 지칭한다. 일부 구현예에서, "치료 시작 시점"은 β-지중해빈혈 약물 투여 전 약 1년, 9개월, 6개월, 3개월, 2개월, 또는 1개월 중 어느 하나이다. 일부 구현예에서, "치료 시작 시점"은 β-지중해빈혈 치료 조성물에 대한 최초 노출과 동시 발생 직전이다.
본원에 사용된 "~에 기초한"은 (1) 본원에 기재된 바와 같은 대상체 특성을 평가, 결정 또는 측정하는 것(및 바람직하게는 치료를 받기에 적합한 대상체를 선택하는 것; 및 (2) 본원에 기재된 바와 같은 치료(들)을 투여하는 것을 포함한다.
β-지중해빈혈의 "증상"은 β-지중해빈혈을 나타내는 대상체에 의해 경험되는 구조, 기능 또는 감각의 정상으로부터의 임의의 현상 또는 이탈이다.
"수혈 의존성 β-지중해빈혈"(TDT) 대상체는 9 내지 10 g/dL 초과의 헤모글로빈 수치를 유지하기 위해 PRBC 및 기타 혈액 제제의 정기적인 주입(수혈)을 필요로 한다. TDT는 중증 빈혈, 평생 수혈 의존, 불가피한 철분 과부하, 심각한 동반 질환 및 일반 인구에 비해 짧은 수명을 특징으로 하는 중증 진행형 β-지중해빈혈이다. TDT 환자는 빈혈을 완화하고 생존을 가능하게 하기 위해 전형적으로 2~5주마다 정기적으로 수혈을 받는 평생 지지 치료가 필요하다. 수혈의 필요성을 감소시키거나 제거하는 수준을 포함한 치료 수준은 2~10 g/dL 이상(2, 3, 5, 6, 7, 8, 9, 10 g/dL 이상 포함), 선택적으로 수혈 독립을 위해 적어도 약 5 내지 7 g/dL 이상일 수 있다.
만성 수혈은 피할 수 없는 철분 과부하로 이어져, 중요한 장기에 심각한 손상을 줄 수 있다. 따라서, TDT 환자는 철분 부하를 지속적이고 엄격하게 모니터링해야 하며, 철분 킬레이트화라고 하는 과정인 과잉 철분 제거를 위해 정기적으로 약제를 복용해야 한다.
"지지 수술"이라는 용어는 질환과 관련될 수 있는 증상을 완화시키기 위해 대상체에 대해 수행될 수 있는 수술 절차를 지칭한다.
부가 요법을 위해 본원에 사용된 용어 "면역억제제"는 본원에서 치료받는 포유동물의 면역계를 억제하거나 차폐하는 작용을 하는 물질을 지칭한다. 이는 사이토카인 생성을 억제하거나, 자가-항원 발현을 하향-조절하거나 억제하거나, MHC 항원을 차폐하는 물질을 포함한다. 이러한 작용제의 예는 2-아미노-6-아릴-5-치환 피리미딘(미국 특허 제4,665,077호 참조); 비스테로이드성 항염증제(NSAIDUA); 간시클로비르, 타크롤리무스, 글루코코르티코이드, 예컨대 코르티솔 또는 알도스테론, 항염증제, 예컨대 사이클로옥시게나제 억제제, 5-리폭시게나제 억제제 또는 류코트리엔 수용체 길항제; 퓨린 길항제, 예컨대 아자티오프린 또는 미코페놀레이트 모페틸(MMF); 알킬화제, 예컨대 사이클로포스파미드; 브로모크립틴; 다나졸; 답손; 글루타르알데히드(미국 특허 제4,120,649호에 기술된 바와 같이 MHC 항원을 차폐함); MHC 항원 및 MHC 단편에 대한 항-이디오타입 항체; 사이클로스포린 A; 스테로이드, 예컨대 코르티코스테로이드 또는 글루코코르티코스테로이드 또는 글루코코르티코이드 유사체, 예를 들어 프레드니손, 메틸프레드니솔론 및 덱사메타손; 디하이드로폴레이트 환원효소 억제제, 예컨대 메토트렉세이트(경구 또는 피하); 하이드록시클로로퀸; 설파살라진; 레플루노마이드; 항-인터페론-알파, -베타 또는 -감마 항체, 항-종양 괴사 인자-알파 항체(인플릭시맙 또는 아달리무맙), 항-TNF-알파 면역아헤신(에타너셉트), 항종양 괴사 인자- 베타 항체, 항-인터류킨-2 항체 및 항-IL-2 수용체 항체를 포함한 사이토카인 또는 사이토카인 수용체 길항제; 항-CD11a 및 항-CD18 항체를 포함하는 항-LFA-1 항체; 항-L3T4 항체; 이종 항-림프구 글로불린; 팬(pan)-T 항체, 바람직하게는 항-CD3 또는 항-CD4/CD4a 항체; LFA-3 결합 도메인을 함유하는 가용성 펩타이드(국제 특허 공개 번호 WO 90/08187(7/26/90 공개)); 스트렙토키나제; TGF-베타; 스트렙토도나제; 숙주로부터의 RNA 또는 DNA; FK506; RS-61443; 데옥시스페구알린; 라파마이신; T-세포 수용체(Cohen et al., 미국 특허 제5,114,721호); T-세포 수용체 단편(문헌[Offner et al. (1991) Science 251:430-432]; 국제 특허 공개 번호 WO 90/11294; 문헌[Janeway(1989) Nature 341:482]; 및 국제 특허 공개 번호 WO 91/01133); 및 T 세포 수용체 항체, 예컨대 T10B9를 포함한다.
"코르티코스테로이드"는 자연 발생 코르티코스테로이드의 효과를 모방하거나 증대시키는 스테로이드의 일반적인 화학 구조를 갖는 여러 합성 또는 자연 발생 물질 중 어느 하나를 의미한다. 합성 코르티코스테로이드의 예에는 프레드니손, 프레드니솔론(메틸프레드니솔론 포함), 덱사메타손, 글루코코르티코이드 및 베타메타손이 포함된다.
"철분 킬레이트화"는 신체에서 과도한 철분을 제거하기 위한 치료법의 한 유형이다. 수혈 시 제공되는 혈액의 각 단위는 약 250 mg의 철분을 포함하며, 신체는 피부와 땀으로 손실되는 소량(약 1 mg)을 제외하고는 철분을 배설할 수 없다. 과도한 철분은 뇌하수체 전엽, 심장, 간, 췌장 및 관절과 같은 중요한 기관의 조직에 갇혀 있다. 철분이 독성 수준에 도달하면 손상이 당뇨병, 간경변, 골관절염, 심장마비, 호르몬 불균형과 같은 질환을 유발할 수 있다. 갑상선 기능 저하증, 성선 기능 저하증, 불임, 발기 부전 및 불임증은 이러한 호르몬 불균형으로 인해 발생할 수 있다. 해결하지 않으면, 과도한 철분은 완전한 장기 부전 및 사망을 초래할 수 있다. 철분 감소는 데스페리옥사민(desferrioxamine)(상품명 Desferal 또는 Jadenu®) 또는 데페라시록스(deferasirox)(상품명 Exjade®)와 같은 철분-킬레이트제를 사용하여 약리학적으로 철분을 제거하는 킬레이트화 요법으로 달성된다.
"패키지 삽입물"은 치료용 제품의 상업적인 포장 내의 관례상 포함된 설명을 지칭하는 데 사용되며, 이 설명은 적응증, 용법, 투여량, 투여, 금기사항, 포장된 제품과 조합될 기타 치료용 제품 및/또는 그러한 치료용 제품의 이용에 관련된 경고에 관한 정보를 포함한다.
"라벨"은 바이알 및 패키지 삽입물과 같은 용기, 뿐만 아니라 다른 유형의 포장을 포함하는 약제학적 제형의 상업적 패키지에 관례상 포함된 정보를 지칭하기 위해 본 명세서에서 사용된다.
본 명세서에 기재된 다양한 구현예의 특성 중 하나, 일부, 또는 전부는 조합되어 본 발명의 다른 구현예를 형성할 수 있음이 이해되어야 한다. 본 발명의 이러한 양태 및 다른 양태는 당업자에게 명확해질 것이다.
뉴클레아제
본원에 기재된 방법은 BCL11A 적혈구 인핸서의 표적화된 녹아웃을 위해 하나 이상의 뉴클레아제를 사용할 수 있다. 뉴클레아제의 비제한적인 예는 ZFN, TALEN, 귀소 엔도뉴클레아제, CRISPR/Cas 및/또는 Ttago 가이드 RNA를 포함하며, 이는 세포 게놈의 절단을 위한 뉴클레아제와 이식유전자가 표적화된 방식으로 게놈에 통합되도록 이식유전자를 운반하는 공여자 분자의 생체 내 절단에 사용가능하다. 예를 들어, 미국 특허 제10,435,677호; 제10,072,066호; 제9,957,501호; 제9,963,715호; 제9,650,648호; 및 미국 특허 공개 번호 제2019/0177709호; 제2018/0111975호; 및 제2015/0132269호를 참고한다. 특정 구현예에서, 하나 이상의 뉴클레아제는 자연적으로 발생한다. 다른 구현예에서, 뉴클레아제 중 하나 이상은 비-자연 발생이며, 즉 DNA-결합 분자(DNA-결합 도메인으로도 지칭됨) 및/또는 절단 도메인에서 조작된다. 예를 들어, 자연-발생 뉴클레아제의 DNA-결합 도메인은 선택된 표적 부위(예를 들어, 선택된 표적 부위에 결합하도록 조작된 CRISPR/Cas의 ZFP, TALE 및/또는 sgRNA)에 결합하도록 변경될 수 있다. 다른 구현예에서, 뉴클레아제는 이종 DNA-결합 및 절단 도메인(예를 들어, 아연 핑거 뉴클레아제; TAL-효과기 도메인 DNA 결합 단백질; 이종 절단 도메인을 갖는 메가뉴클레아제 DNA-결합 도메인)을 포함한다. 다른 구현예에서, 뉴클레아제는 Ttago 시스템의 CRISPR/Cas와 같은 시스템을 포함한다.
A. DNA-결합 도메인
특정 구현예에서, 본원에 기재된 조성물 및 방법은 공여자 분자에 대한 결합 및/또는 세포 게놈의 관심 영역에 대한 결합을 위해 메가뉴클레아제(귀소 엔도뉴클레아제) DNA-결합 도메인을 사용한다. 자연-발생 메가뉴클레아제는 15~40개의 염기쌍 절단 부위를 인식하고, 일반적으로: LAGLIDADG 계열(서열 번호: 17), GIY-YIG 계열, His-Cyst 박스 계열 및 HNH 계열의 4가지 계열로 분류된다. 예시적인 귀소 엔도뉴클레아제는 I-SceI, I-CeuI, PI-PspI, PI-Sce, I-SceIV, I-CsmI, I-PanI, I-SceII, I-PpoI, I-SceIII, I-CreI, I-TevI, I-TevII 및 I-TevIII을 포함한다. 그들의 인식 서열은 공지되어 있다. 또한, 미국 특허 제5,420,032호; 미국 특허 제6,833,252호; 문헌[Belfort et al. (1997) Nucleic Acids Res. 25:3379-3388]; 문헌[Dujon et al. (1989) Gene 82:115-118]; 문헌[Perler et al. (1994) Nucleic Acids Res. 22:1125-1127]; 문헌[Jasin (1996) Trends Genet. 12:224-228]; 문헌[Gimble et al. (1996) J. Mol. Biol. 263:163-180]; 문헌[Argast et al. (1998) J. Mol. Biol. 280:345-353] 및 New England Biolabs 카탈로그를 참고한다.
특정 구현예에서, 본원에 기재된 방법 및 조성물은 조작된(비-천연 발생) 귀소 엔도뉴클레아제(메가뉴클레아제)를 포함하는 뉴클레아제를 사용한다. 귀소 엔도뉴클레아제 및 메가뉴클레아제, 예컨대 I-SceI, I-CeuI, PI-PspI, PI-Sce, I-SceIV, I-CsmI, I-PanI, I-SceII, I-PpoI, I-SceIII, I-CreI, I-TevI, I-TevII 및 I-TevIII의 인식 서열은 공지되어 있다. 또한, 미국 특허 제5,420,032호; 미국 특허 제6,833,252호; 문헌[Belfort et al. (1997) Nucleic Acids Res. 25:3379-3388]; 문헌[Dujon et al. (1989) Gene 82:115-118]; 문헌[Perler et al. (1994) Nucleic Acids Res. 22:1125 1127]; 문헌[Jasin (1996) Trends Genet. 12:224-228]; 문헌[Gimble et al. (1996) J. Mol. Biol. 263:163-180]; 문헌[Argast et al. (1998) J. Mol. Biol. 280:345-353] 및 New England Biolabs 카탈로그를 참고한다. 또한, 귀소 엔도뉴클레아제 및 메가뉴클레아제의 DNA-결합 특이성은 비-자연 표적 부위에 결합하도록 조작될 수 있다. 예를 들어, 문헌[Chevalier et al. (2002) Molec. Cell 10:895-905]; 문헌[Epinat et al. (2003) Nucleic Acids Res. 31:2952-2962]; 문헌[Ashworth et al. (2006) Nature 441:656-659]; 문헌[Paques et al. (2007) Current Gene Therapy 7:49-66]; 미국 특허 공개 번호 제2007/0117128호를 참조한다. 귀소 엔도뉴클레아제 및 메가뉴클레아제의 DNA-결합 도메인은 전체적으로 뉴클레아제의 맥락에서 변경될 수 있거나(즉, 뉴클레아제가 동족 절단 도메인을 포함하도록) 또는 이종 절단 도메인에 융합될 수 있다.
다른 구현예에서, 본원에 기재된 방법 및 조성물에 사용된 하나 이상의 뉴클레아제의 DNA-결합 도메인은 자연 발생 또는 조작된 (비-자연 발생) TAL 효과기 DNA 결합 도메인을 포함한다. 미국 특허 제8,586,526호를 참조하며, 본 명세서에 그 전문이 참조에 의해 포함된다. 크산토모나스 속의 식물 병원성 박테리아는 중요한 작물에 많은 질병을 일으키는 것으로 알려져 있다. 크산토모나스의 병원성은 식물 세포에 25개 초과의 서로 다른 효과기 단백질을 주입하는 보존형 III 분비(T3S) 시스템에 따라 달라진다. 이러한 주입된 단백질 중에는 식물 전사 활성제를 모방하고 식물 전사체를 조작하는 전사 활성제-유사(TAL) 효과기가 있다(문헌[Kay et al. (2007) Science 318:648-651] 참조). 이 단백질은 DNA 결합 도메인과 전사 활성화 도메인을 포함한다. 가장 잘 특성화된 TAL-효과기 중 하나는 크산토모나스 캠페스트그리스 pv. 베시카토리아(Xanthomonas campestgris pv. Vesicatoria)의 AvrBs3이다. (문헌[Bonas et al. (1989) Mol Gen Genet 218: 127-136] 및 국제 특허 공개 번호 WO 2010/079430 참조). TAL-효과기는 탠덤 반복의 중앙집중식 도메인을 포함하며, 각 반복은 이들 단백질의 DNA 결합 특이성의 핵심인 대략 34개의 아미노산을 포함한다. 또한, 이들은 핵 국소화 서열 및 산성 전사 활성화 도메인을 함유한다(검토를 위해 문헌[Schornack et al. (2006) J Plant Physiol 163(3): 256-272]를 참조함). 또한, 식물병원성 박테리아인 랄스토니아 솔라나세아룸(Ralstonia solanacearum)에서 R. solanacearum 비오바(biovar) 1 균주 GMI1000 및 비오바 4 균주 RS1000에서 크산토모나스(Xanthomonas)의 AvrBs3 계열과 상동인, brg11 및 hpx17로 지정된 두개의 유전자가 발견되었다(문헌[Heuer et al. (2007) Appl and Envir Micro 73(13):4379-4384] 참조). 이들 유전자는 뉴클레오타이드 서열이 98.9% 동일하지만, hpx17의 반복 도메인에서 1,575 bp가 결실되어 서로 다르다. 그러나, 두 유전자 생성물은 크산토모나스(Xanthomonas)의 AvrBs3 계열 단백질과 40% 미만의 서열 동일성을 갖는다. 미국 특허 제8,586,526호를 참조하며, 본 명세서에 그 전문이 참조에 의해 포함된다.
이들 TAL 효과기의 특이성은 탠덤 반복에서 발견되는 서열에 의존한다. 반복되는 서열은 대략 102 bp를 포함하고, 반복은 전형적으로 서로 91~100% 상동이다(Bonas et al., 상동). 반복체의 다형성은 일반적으로 위치 12와 13에 있으며, 위치 12와 13의 초가변 이잔기(RVD)의 동일성과 TAL-효과기의 표적 서열의 인접 뉴클레오타이드의 동일성 사이에 일대일 대응 관계가 있는 것으로 보인다(문헌[Moscou and Bogdanove (2009) Science 326:1501] 및 문헌[Boch et al. (2009) Science 326:1509-1512] 참조). 실험적으로, 이러한 TAL-효과기의 DNA 인식을 위한 자연 코드는 위치 12 및 13의 HD 서열이 시토신(C)에 결합시키고, NG가 T에 결합하고, NI가 A, C, G 또는 T에 결합하고, NN은 A 또는 G에 결합하고, ING는 T에 결합하도록 결정되었다. 이러한 DNA 결합 반복은 새로운 조합과 반복 수를 가진 단백질로 조립되어, 새로운 서열과 상호 작용하고 식물 세포의 비내인성 리포터 유전자의 발현을 활성화할 수 있는 인공 전사 인자를 만든다(Boch et al., 상동). 조작된 TAL 단백질은 FokI 절단 절반 도메인에 연결되어 효모 리포터 분석(플라스미드-기반 표적)에서 활성을 나타내는 TAL 이펙터 도메인 뉴클레아제 융합(TALEN)을 생성한다. 예를 들어, 미국 특허 제8,586,526호; 문헌[Christian et al. (2010) Genetics epub 10.1534/genetics.110.120717]을 참조한다.
특정 구현예에서, 세포 게놈의 생체 내 절단 및/또는 표적화된 절단에 사용되는 하나 이상의 뉴클레아제의 DNA 결합 도메인은 아연 핑거 단백질을 포함한다. 바람직하게는, 아연 핑거 단백질은 선택된 표적 부위에 결합하도록 조작된다는 점에서 비자연적으로 발생한다. 예를 들어, 문헌[Beerli et al. (2002) Nature Biotechnol. 20:135-141]; 문헌[Pabo et al. (2001) Ann. Rev. Biochem. 70:313-340]; 문헌[Isalan et al. (2001) Nature Biotechnol. 19:656-660]; 문헌[Segal et al. (2001) Curr. Opin. Biotechnol. 12:632-637]; 문헌[Choo et al. (2000) Curr. Opin. Struct. Biol. 10:411-416]; 미국 특허 제6,453,242호; 제6,534,261호; 제6,599,692호; 제6,503,717호; 제6,689,558호; 제7,030,215호; 제6,794,136호; 제7,067,317호; 제7,262,054호; 제7,070,934호; 제7,361,635호; 제7,253,273호; 및 미국 특허 공개 번호 제2005/0064474호; 제2007/0218528호; 및 제2005/0267061호를 참조하며, 이들은 그 전체 내용이 본원에 참조로서 포함된다.
조작된 아연 핑거 결합 도메인은 자연-발생 아연 핑거 단백질과 비교하여 신규한 결합 특이성을 가질 수 있다. 조작 방법에는 합리적인 설계 및 다양한 유형의 선택이 포함되지만, 이에 제한되지는 않는다. 합리적인 설계에는 예를 들어 삼중항(또는 사중항) 뉴클레오타이드 서열 및 개별 아연 핑거 아미노산 서열을 포함하는 데이터베이스 사용이 포함되며, 여기서 각각의 삼중항 또는 사중항 뉴클레오타이드 서열은 특정 삼중항 또는 사중항 서열에 결합하는 아연 핑거의 하나 이상의 아미노산 서열과 연관된다. 공동 소유의 미국 특허 제6,453,242호 및 제6,534,261호를 참조하며, 이들은 그 전체 내용이 참조로서 본원에 포함된다.
파지 디스플레이 및 2-하이브리드 시스템을 포함하는 예시적인 선택 방법은 미국 특허 제5,789,538호; 제5,925,523호; 제6,007,988호; 제6,013,453호; 제6,410,248호; 제6,140,466호; 제6,200,759호; 및 제6,242,568호; 뿐만 아니라 국제 특허 공개 번호 WO　98/37186; WO　98/53057; WO　00/27878; 및 WO　01/88197에 개시되어 있다. 또한, 아연 핑거 결합 도메인에 대한 결합 특이성의 향상은 예를 들어 공동 소유의 국제 특허 공개 번호 WO 02/077227에 기재되어 있다.
또한, 이들 및 다른 참고문헌에 개시된 바와 같이, 아연 핑거 도메인 및/또는 다중-핑거 아연 핑거 단백질은 예를 들어 5개 이상의 아미노산 길이의 링커를 포함하는 임의의 적합한 링커 서열을 사용하여 함께 연결될 수 있다. 또한, 예시적인 링커 서열에 대해서는 미국 특허 제8,772,453호; 제6,479,626호; 제6,903,185호; 및 제7,153,949호를 참조한다. 본원에 기재된 단백질은 단백질의 개별 아연 핑거 사이에 적합한 링커의 임의의 조합을 포함할 수 있다.
표적 부위의 선택; ZFP 및 융합 단백질(및 이를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드)의 설계 및 구성을 위한 방법은 당업자에게 공지되어 있으며, 미국 특허 제6,140,081호; 제5,789,538호; 제6,453,242호; 제6,534,261호; 제5,925,523호; 제6,007,988호; 제6,013,453호; 및 제6,200,759호; 국제 특허 공개 번호 WO　95/19431; WO　96/06166; WO　98/53057; WO　98/54311; WO　00/27878; WO　01/60970; WO　01/88197; WO　02/099084; WO　98/53058; WO　98/53059; WO　98/53060; WO　02/016536; 및 WO　03/016496에 상세히 기재되어 있다.
또한, 이들 및 다른 참고문헌에 개시된 바와 같이, 아연 핑거 도메인 및/또는 다중-핑거 아연 핑거 단백질은 예를 들어 5개 이상의 아미노산 길이의 링커를 포함하는 임의의 적합한 링커 서열을 사용하여 함께 연결될 수 있다. 또한, 길이가 6개 이상의 아미노산인 예시적인 링커 서열에 대해서는 미국 특허 제6,479,626호; 제6,903,185호; 및 제7,153,949호를 참조한다. 본원에 기재된 단백질은 단백질의 개별 아연 핑거 사이에 적합한 링커의 임의의 조합을 포함할 수 있다.
아연 핑거 뉴클레아제는 각각의 ZFN 쌍이 뉴클레아제(절단 도메인) 및 BCL11A를 표적으로 하는 ZFP를 포함하는 ZFN 쌍(좌측 및 우측 ZFN 포함)을 포함할 수 있다. 예를 들어, 미국 특허 제9,963,715호; 제9,650,648호; 미국 특허 공개 번호 제2015/0132269호 및 제2018/0111975호를 참조한다. 특정 구현예에서, mRNA의 ZFN 쌍은 임의의 다른 유전자좌(비표적)와 비교하여, 및/또는 다른 BCL11A 표적화된 뉴클레아제와 비교하여, BCL11A(예를 들어, +58 인핸서 영역)를 특이적으로 변형시킨다(예를 들어, 백본에 대한 변형이 없는 ZFN, 상기 변형은 미국 특허 제10,563,184호에 기술되어 있음). 따라서, 유전적으로 변형된 세포의 10% 미만(그 사이의 임의의 값의 0 내지 10%), 바람직하게는 5% 미만(0 내지 5% 또는 이들 사이의 임의의 값), 훨씬 더 바람직하게는 세포의 1% 미만(0 내지 1% 또는 그 사이의 임의의 값) 및 훨씬 더 바람직하게는 0.5% 미만(0 내지 1% 또는 그 사이의 임의의 값)은 BCL11A 유전자좌 외부의 mRNA(들)에 의해 형성된 유전적 변형을 포함하는 것들을 비롯하여, 본원에 기재된 mRNA를 사용하여 생성된 세포는 BCL11A 유전자좌에 의해 특이적으로 변형된다. 예를 들어, 미국 특허 제10,563,184호를 참조한다. 이러한 세포는 HLA 유전자의 추가 변형, 예를 들어 불활성화를 포함할 수 있다.
특정 구현예에서, 뉴클레아제의 DNA-결합 도메인은 예를 들어 단일 가이드 RNA(sgRNA)를 포함하는 CRISPR/Cas 뉴클레아제 시스템의 일부이다. 예를 들어, 미국 특허 제8,697,359호 및 미국 특허 공개 번호 제2015/0056705호를 참조한다. 시스템의 RNA 성분을 암호화하는 CRISPR(클러스터된 규칙적으로 간격을 두고 있는 짧은 회문 반복) 유전자좌 및 단백질을 암호화하는 Cas(CRISPR-연관) 유전자좌(문헌[Jansen et al. (2002) Mol. Microbiol. 43:1565-1575]; 문헌[Makarova et al. (2002) Nucleic Acids Res. 30:482-496]; 문헌[Makarova et al. (2006) Biol. Direct 1:7]; 문헌[Haft et al. (2005) PLoS Comput. Biol. 1:e60])는 CRISPR/Cas 뉴클레아제 시스템의 유전자 서열을 구성한다. 미생물 숙주의 CRISPR 유전자좌는 CRISPR-매개 핵산 절단의 특이성을 프로그래밍할 수 있는 비-암호화 RNA 요소 뿐만 아니라 CRISPR-연관(Cas) 유전자의 조합을 포함한다.
유형 II CRISPR은 가장 잘 특성화된 시스템 중 하나이며, 4개의 순차적 단계에서 표적화된 DNA 이중-가닥 파단을 수행한다. 먼저, 2개의 비-암호화 RNA인 pre-crRNA 어레이와 tracrRNA가 CRISPR 유전자좌에서 전사된다. 둘째, tracrRNA는 pre-crRNA의 반복 영역에 혼성화하고, pre-crRNA를 개별 스페이서 서열을 포함하는 성숙한 crRNA로 처리하는 것을 매개한다. 셋째, 성숙한 crRNA:tracrRNA 복합체는 crRNA의 스페이서와, 표적 인식을 위한 추가 요건인 프로토스페이서 인접 모티프(PAM) 옆에 있는 표적 DNA의 프로토스페이서 사이의 왓슨-크릭(Watson-Crick) 염기쌍을 통해 Cas9를 표적 DNA로 안내한다. 마지막으로, Cas9는 표적 DNA의 절단을 매개하여 프로토스페이서 내에서 이중-가닥 파단을 생성한다. CRISPR/Cas 시스템의 활성은 3단계로 구성된다: (i) '적응'이라고 하는 과정에서 CRISPR 어레이에 외래 DNA 서열을 삽입하여, 미래의 공격 방지, (ii) 관련 단백질의 발현 뿐만 아니라 어레이의 발현 및 처리, 이어서 (iii) 외래 핵산과의 RNA-매개 간섭. 따라서, 박테리아 세포에서는 소위 'Cas' 단백질 중 몇 가지가 CRISPR/Cas 시스템의 자연적 기능에 관여하고, 외래 DNA 삽입 등과 같은 기능을 수행한다.
일부 구현예에서, CRISPR-Cpf1 시스템이 사용된다. Francisella spp.에서 확인된 CRISPR-Cpf1 시스템은 인간 세포에서 강력한 DNA 간섭을 매개하는 클래스 2 CRISPR-Cas 시스템이다. 기능적으로 보존되었지만 Cpf1 및 Cas9는 그들의 가이드 RNA 및 기질 특이성을 비롯한 여러 측면에서 다르다(문헌[Fagerlund et al. (2015) Genom Bio 16:251] 참조). Cas9와 Cpf1 단백질의 주요 차이점은 Cpf1이 tracrRNA를 사용하지 않으므로 crRNA만 필요하다는 것이다. FnCpf1 crRNA는 42~44개의 뉴클레오타이드 길이(19-뉴클레오타이드 반복 및 23~25-뉴클레오타이드 스페이서)이며, 이차 구조를 유지하는 서열 변경을 허용하는 단일 스템-루프를 포함한다. 또한, Cpf1 crRNA는 Cas9에 필요한 약 100개 뉴클레오타이드 조작된 sgRNA보다 훨씬 짧고, FnCpfl에 대한 PAM 요건은 치환된 가닥의 5'-TTN-3' 및 5'-CTA-3'이다. Cas9와 Cpf1 모두 표적 DNA에서 이중 가닥 파단을 만들지만, Cas9는 가이드 RNA의 시드 서열 내에서 그의 RuvC- 및 HNH-유사 도메인을 사용하여 무딘-말단 절단을 만드는 반면, Cpf1은 RuvC-유사 도메인을 사용하여 시드의 바깥쪽에 엇갈린 절단을 생성한다. Cpf1은 임계 시드 영역에서 엇갈린 절단을 만들기 때문에, NHEJ는 표적 부위를 방해하지 않을 것이므로 원하는 HDR 재조합 이벤트가 발생할 때까지 Cpf1이 동일한 부위를 계속 절단할 수 있다. 따라서, 본원에 기재된 방법 및 조성물에서, 용어 "Cas"는 Cas9 및 Cfp1 단백질 둘 다를 포함하는 것으로 이해된다. 따라서, 본원에 사용된 "CRISPR/Cas 시스템"은 뉴클레아제, 닉카제 및/또는 전사 인자 시스템 둘 다를 포함하는 CRISPR/Cas 및/또는 CRISPR/Cfp1 시스템 둘 다를 지칭한다.
일부 구현예에서, 다른 Cas 단백질이 사용될 수 있다. 일부 예시적인 Cas 단백질은 Cas9, Cpf1(Cas12a로도 알려짐), C2c1, C2c2(Cas13a로도 알려짐), C2c3, Cas1, Cas2, Cas4, CasX 및 CasY를 포함하고; 이의 조작된 및 천연 변이체(문헌[Burstein et al. (2017) Nature 542:237-241]) 예를 들어 HF1/spCas9(문헌[Kleinstiver et al. (2016) Nature 529: 490-495]; 문헌[Cebrian-Serrano and Davies (2017) Mamm Genome (2017) 28(7):247-261]); 분할 Cas9 시스템(문헌[Zetsche et al. (2015) Nat Biotechnol 33(2):139-142]), 인테인-엑스테인 시스템에 기반한 트랜스-접합 Cas9(문헌[Troung et al. (2015) Nucl Acid Res 43(13):6450-8]); 미니-SaCas9(문헌[Ma et al. (2018) ACS Synth Biol 7(4):978-985])를 포함한다. 따라서, 본원에 기재된 방법 및 조성물에서, 용어 "Cas"는 천연 및 조작된 모든 Cas 변이체 단백질을 포함하는 것으로 이해된다.
일부 구현예에서, Cas 단백질은 천연 발생 Cas 단백질의 "기능적 유도체"일 수 있다. 천연 서열 폴리펩타이드의 "기능적 유도체"는 천연 서열 폴리펩타이드와 공통되는 질적 생물학적 특성을 갖는 화합물이다. "기능적 유도체"는 천연 서열의 단편 및 천연 서열 폴리펩타이드의 유도체 및 이의 단편을 포함하지만 이에 제한되지 않으며, 단, 이들이 상응하는 천연 서열 폴리펩타이드와 공통적인 생물학적 활성을 갖는다. 본원에서 고려되는 생물학적 활성은 DNA 기질을 단편으로 가수분해하는 기능적 유도체의 능력이다. 용어 "유도체"는 폴리펩타이드의 아미노산 서열 변이체, 공유 변형 및 이들의 융합을 모두 포함한다. Cas 폴리펩타이드 또는 이의 단편의 적합한 유도체는 Cas 단백질 또는 이의 단편의 돌연변이, 융합, 공유 변형을 포함하지만, 이에 제한되지는 않는다. Cas 단백질 또는 이의 단편뿐만 아니라 Cas 단백질의 유도체 또는 이의 단편을 포함하는 Cas 단백질은 세포로부터 얻어질 수 있거나 화학적으로 합성되거나 이들 두 절차의 조합에 의해 합성될 수 있다. 세포는 Cas 단백질을 자연적으로 생산하는 세포, 또는 Cas 단백질을 자연적으로 생산하고 더 높은 발현 수준에서 내인성 Cas 단백질을 생산하거나 외인성으로 도입된 핵산으로부터 Cas 단백질을 생산하도록 유전적으로 조작된 세포일 수 있으며, 이 핵산은 내인성 Cas와 같거나 다른 Cas를 암호화한다. 어떤 경우에는, 세포가 자연적으로 Cas 단백질을 생산하지 않고 Cas 단백질을 생산하도록 유전적으로 조작된다. Cas 단백질에 추가로 및/또는 대신에 사용될 수 있는 RNA 가이드 뉴클레아제의 추가의 비제한적인 예는 Cpf1과 같은 클래스 2 CRISPR 단백질을 포함한다. 예를 들어, 문헌[Zetsche et al. (2015) Cell 163:1-13]을 참조한다.
일부 구현예에서, DNA 결합 도메인은 TtAgo 시스템의 일부이다(문헌[Swarts et al. (2014) Nature 507(7491):258-261]; 문헌[Swarts et al. (2012) PLoS One 7(4):e35888] 및 문헌[Sheng et al. (2014) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 111(2):652-657] 참조). 진핵생물에서, 유전자 사일런싱은 단백질의 아르고노트(Ago) 계열에 의해 매개된다. 이 패러다임에서, Ago는 작은(19~31 뉴클레오타이드) RNA에 결합된다. 이 단백질-RNA 사일런싱 복합체는 작은 RNA와 표적 사이의 왓슨-크릭 염기쌍을 통해 표적 RNA를 인식하고, 표적 RNA를 세포내핵분해로 절단한다(문헌[Vogel (2014) Science 344:972-973]). 대조적으로, 원핵생물 Ago 단백질은 작은 단일-가닥 DNA 단편에 결합하고, 외래(종종 바이러스) DNA를 검출하고 제거하는 기능을 할 가능성이 높다(문헌[Yuan et al. (2005) Mol. Cell 19:405]; 문헌[Olovnikov et al. (2013) Mol. Cell 51:594]; 문헌[Swarts et al., 상동). 예시적인 원핵생물 Ago 단백질은 아퀴펙스 아이올리쿠스(Aquifex aeolicus), 로도박터 스페로이데스(Rhodobacter sphaeroides) 및 테르무스 써모필루스(Thermus thermophilus) 유래의 단백질을 포함한다.
가장 잘 특성화된 원핵생물 Ago 단백질 중 하나는 T. 써모필루스로부터의 단백질이다(TtAgo; Swarts et al., 상동). TtAgo는 15개의 뉴클레오타이드 또는 13~25개의 뉴클레오타이드 단일-가닥 DNA 단편과 5' 포스페이트 그룹과 결합한다. TtAgo에 의해 결합된 이 "가이드 DNA"는 단백질-DNA 복합체가 제3자 DNA 분자에서 왓슨-크릭 상보적 DNA 서열에 결합하도록 지시하는 역할을 한다. 이들 가이드 DNA의 서열 정보가 표적 DNA의 식별을 허용하면, TtAgo-가이드 DNA 복합체가 표적 DNA를 절단한다. 이러한 메커니즘은 또한 표적 DNA에 결합된 TtAgo-가이드 DNA 복합체의 구조에 의해 지지된다(Sheng et al., 상동). 로도박터 스페로이데스(RsAgo)로부터의 Ago는 유사한 특성을 갖는다(Olovnikov et al., 상동).
임의의 DNA 서열의 외인성 가이드 DNA는 TtAgo 단백질에 로딩될 수 있다(Swarts et al., 상동.). TtAgo 절단의 특이성은 가이드 DNA에 의해 지시되기 때문에, 외인성 조사자-지정 가이드 DNA로 형성된 TtAgo-DNA 복합체는 따라서 TtAgo 표적 DNA 절단을 상보적인 조사자-지정 표적 DNA로 지시할 것이다. 이런 식으로, DNA에 표적 이중-가닥 파단을 생성할 수 있다. TtAgo-가이드 DNA 시스템(또는 다른 유기체의 이종상동성 Ago-가이드 DNA 시스템)을 사용하면, 세포 내에서 게놈 DNA의 표적 절단이 가능하다. 이러한 절단은 단일 또는 이중-가닥일 수 있다. 포유동물 게놈 DNA의 절단을 위해, 포유동물 세포에서의 발현에 최적화된 버전의 TtAgo 코돈을 사용하는 것이 바람직할 것이다. 또한, TtAgo 단백질이 세포-투과성 펩타이드에 융합된 시험관 내에서 형성된 TtAgo-DNA 복합체로 세포를 처리하는 것이 바람직할 수 있다. 또한, 돌연변이생성을 통해 섭씨 37도에서 개선된 활성을 갖도록 변경된 TtAgo 단백질 버전을 사용하는 것이 바람직할 수 있다. TtAgo-RNA-매개 DNA 절단은 DNA 파단의 이용을 위한 당업계의 표준 기술을 사용한, 유전자 녹아웃, 표적화된 유전자 추가, 유전자 교정, 표적화된 유전자 결실을 포함하는 결과의 파노플라이에 영향을 미치기 위해 사용될 수 있다.
따라서, 뉴클레아제는 공여자(이식유전자)를 삽입하고자 하는 임의의 유전자의 표적 부위에 특이적으로 결합하는 DNA-결합 도메인을 포함한다.
특정 구현예에서, DNA-결합 도메인은 알부민, 예를 들어 SBS-47171 및 SBS-47898로 명명된 ZFP의 DNA-결합 도메인에 결합한다. 예를 들어, 미국 특허 공개 번호 제2015/0159172호를 참조한다.
B. 절단 도메인
임의의 적합한 절단 도메인은 뉴클레아제를 형성하기 위해 DNA-결합 도메인에 결합(예를 들어, 작동가능하게 연결)될 수 있다. 예를 들어, ZFP DNA-결합 도메인은 뉴클레아제 도메인에 융합되어 ZFN을 생성하며, 상기 ZFN은 조작된 (ZFP) DNA 결합 도메인을 통해 의도한 핵산 표적을 인식하고 뉴클레아제 활성을 통해 ZFP 결합 부위 근처에서 DNA를 절단할 수 있는 기능적 실체이다. 예를 들어, 문헌[Kim et al. (1996) Proc Natl Acad Sci USA 93(3):1156-1160]을 참조한다. 보다 최근에, ZFN은 다양한 유기체에서 게놈 변형에 사용되었다. 예를 들어, 미국 특허 공개 번호 제2003/0232410호; 제2005/0208489호; 제2005/0026157호; 제2005/0064474호; 제2006/0188987호; 제2006/0063231호; 및 국제 특허 공개 번호 WO 07/014275를 참조한다. 마찬가지로, TALE DNA-결합 도메인은 뉴클레아제 도메인에 융합되어 TALEN을 생성하였다. 예를 들어, 미국 특허 제8,586,526호를 참조한다. DNA에 결합하고 절단 도메인(예를 들어, Cas 도메인)과 연합하여 표적화된 절단을 유도하는 단일 가이드 RNA(sgRNA)를 포함하는 CRISPR/Cas 뉴클레아제 시스템이 또한 설명되었다. 예를 들어, 미국 특허 제8,697,359호 및 제8,932,814호 및 미국 특허 공개 번호 제2015/0056705호를 참조한다.
상기 언급된 바와 같이, 절단 도메인은 DNA-결합 도메인, 예를 들어 아연 핑거 DNA-결합 도메인 및 뉴클레아제 또는 TALEN DNA-결합 도메인으로부터의 절단 도메인 및 뉴클레아제로부터의 절단 도메인; sgRNA DNA-결합 도메인 및 뉴클레아제(CRISPR/Cas)로부터의 절단 도메인; 및/또는 상이한 뉴클레아제로부터의 메가뉴클레아제 DNA-결합 도메인 및 절단 도메인에 이종성일 수 있다. 이종성 절단 도메인은 임의의 엔도뉴클레아제 또는 엑소뉴클레아제로부터 얻을 수 있다. 절단 도메인이 유래될 수 있는 예시적인 엔도뉴클레아제는 제한 엔도뉴클레아제 및 귀소 엔도뉴클레아제를 포함하지만, 이에 제한되지는 않는다. 예를 들어, [2002-2003 Catalogue, New England Biolabs, Beverly, MA; and Belfort et al. (1997) Nucleic Acids Res. 25:3379-3388]을 참조한다. DNA를 절단하는 추가 효소가 알려져 있다(예를 들어, S1 뉴클레아제; 녹두 뉴클레아제; 췌장 DNase I; 미세구균 뉴클레아제; 효모 HO 엔도뉴클레아제; 또한 문헌[Linn et al. (eds.) Nucleases, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1993] 참조). 이들 효소(또는 이의 기능적 단편) 중 하나 이상은 절단 도메인 및 절단 반-도메인의 공급원으로서 사용될 수 있다.
유사하게, 절단 반-도메인은 절단 활성을 위한 이량체화를 필요로 하는, 상기 기재된 바와 같이 임의의 뉴클레아제 또는 그의 부분으로부터 유래될 수 있다. 일반적으로, 융합 단백질이 절단 반-도메인을 포함하는 경우 절단을 위해 2개의 융합 단백질이 필요하다. 대안적으로, 2개의 절단 반-도메인을 포함하는 단일 단백질이 사용될 수 있다. 2개의 절단 반-도메인은 동일한 엔도뉴클레아제(또는 이의 기능적 단편)로부터 유래될 수 있거나, 각각의 절단 반-도메인은 상이한 엔도뉴클레아제(또는 이의 기능적 단편)로부터 유래될 수 있다. 또한, 2개의 융합 단백질에 대한 표적 부위는 바람직하게는 2개의 융합 단백질이 그들의 각각의 표적 부위에 결합하여 절단 반-도메인이 서로에 대해 공간 배향을 허용하도록 배치되도록 서로에 대해 배치되어, 절단 반-도메인이 예를 들어, 이량체화에 의해 기능적 절단 도메인을 형성하도록 한다. 따라서, 특정 구현예에서, 표적 부위의 가까운 가장자리는 5~8개 뉴클레오타이드 또는 15~18개 뉴클레오타이드에 의해 분리된다. 그러나, 임의의 정수 갯수의 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 쌍이 2개의 표적 부위 사이에 개재할 수 있다(예를 들어, 2 내지 50개 뉴클레오타이드 쌍 또는 그 이상). 일반적으로, 절단 부위는 표적 부위 사이에 있다.
제한 엔도뉴클레아제(제한 효소)는 많은 종에 존재하고, (인식 부위에서) DNA에 서열-특이적 결합할 수 있고, 결합 부위 또는 그 부근에서 DNA를 절단할 수 있다. 특정 제한 효소(예를 들어, 유형 IIS)는 인식 부위로부터 제거된 부위에서 DNA를 절단하고, 분리 가능한 결합 및 절단 도메인을 갖는다. 예를 들어, 유형 IIS 효소 FokI는 한 가닥의 인식 부위로부터 9개의 뉴클레오타이드에서, 그리고 다른 가닥의 인식 부위로부터 13개의 뉴클레오타이드에서 DNA의 이중-가닥 절단을 촉매한다. 예를 들어, 미국 특허 제5,356,802호; 제5,436,150호 및 제5,487,994호; 뿐만 아니라 문헌[Li et al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:4275-4279]; 문헌[Li et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:2764-2768]; 문헌[Kim et al. (1994a) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:883-887]; 문헌[Kim et al. (1994b) J. Biol. Chem. 269:31,978-31,982]을 참조한다. 따라서, 한 구현예에서, 융합 단백질은 조작되거나 조작되지 않을 수 있는 적어도 하나의 유형 IIS 제한 효소 및 하나 이상의 아연 핑거 결합 도메인으로부터의 절단 도메인(또는 절단 반-도메인)을 포함한다.
절단 도메인이 결합 도메인으로부터 분리가능한, 예시적인 유형 IIS 제한 효소는 FokI이다. 이러한 특정 효소는 이량체로서 활성이다. 문헌[Bitinaite et al. (1998) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95:10,570-10,575]. 따라서, 본 개시 내용의 목적을 위해, 개시된 융합 단백질에 사용된 FokI 효소의 부분은 절단 반-도메인으로 간주된다. 따라서, 표적화된 이중-가닥 절단 및/또는 아연 핑거-FokI 융합을 사용한 세포 서열의 표적화된 대체를 위해, 각각 FokI 절단 반-도메인을 포함하는 2개의 융합 단백질을 사용하여 촉매 활성 절단 도메인을 재구성할 수 있다. 대안적으로, 아연 핑거 결합 도메인 및 2개의 FokI 절단 반-도메인을 함유하는 단일 폴리펩타이드 분자가 또한 사용될 수 있다. 아연 핑거-FokI 융합을 사용한 표적화된 절단 및 표적화된 서열 변경에 대한 파라미터는 본 개시 내용의 다른 곳에서 제공된다.
절단 도메인 또는 절단 반-도메인은 절단 활성을 유지하거나, 기능적 절단 도메인을 형성하기 위해 다량체화(예를 들어, 이량체화)하는 능력을 보유하는 단백질의 임의의 부분일 수 있다.
예시적인 유형 IIS 제한 효소는 그 전체 내용이 본원에 포함되는 미국 특허 제7,888,121호에 기재되어 있다. 추가 제한 효소는 또한 분리가능한 결합 및 절단 도메인을 함유하고, 이들은 본 개시 내용에 의해 고려된다. 예를 들어, 문헌[Roberts et al. (2003) Nucleic Acids Res. 31:418-420]을 참조한다.
특정 구현예에서, 절단 도메인은 예를 들어 미국 특허 제8,772,453호; 제8,623,618호; 제8,409,861호; 제8,034,598호; 제7,914,796호; 및 제7,888,121호에 기재된 바와 같이 동종이량체화를 최소화하거나 방지하는 하나 이상의 조작된 절단 반-도메인(이량체화 도메인 돌연변이체로도 지칭됨)을 포함하며, 이들 모두의 개시 내용은 그 전체가 참조로서 본원에 포함된다. FokI의 위치 446, 447, 479, 483, 484, 486, 487, 490, 491, 496, 498, 499, 500, 531, 534, 537, 및 538에서의 아미노산 잔기는 모두 FokI 절단 반-도메인의 이량체화에 영향을 주는 표적이다.
절대적 이종이량체를 형성하는 FokI의 예시적인 조작된 절단 반-도메인은 제1 절단 반-도메인이 FokI의 위치 490 및 538에 있는 아미노산 잔기에서의 돌연변이를 포함하고, 제2 절단 반-도메인이 아미노산 잔기 486 및 499에서의 돌연변이를 포함하는 쌍을 포함한다.
따라서, 한 구현예에서, 490에서의 돌연변이는 Glu(E)를 Lys(K)로 대체하고; 538에서의 돌연변이는 Iso(I)를 Lys(K)로 대체하고; 486에서의 돌연변이는 Gln(Q)을 Glu(E) 잔기로 대체하고; 위치 499에서의 돌연변이는 Iso(I)를 Lys(K)로 대체한다. 구체적으로, 본원에 기술된 조작된 절단 반-도메인은 "E490K:I538K"로 명명된 조작된 절단 반-도메인을 생성하기 위해 하나의 절단 반-도메인에서 위치 490(E→K) 및 538(I→K)을 돌연변이시켜, 그리고 또 다른 절단 반-도메인에서 위치 486(Q→E) 및 499(I→L)를 돌연변이시켜, "Q486E:I499L"로 명명된 조작된 절단 반-도메인을 생성하였다. 본원에 기재된 조작된 절단 반-도메인은 비정상적인 절단이 최소화되거나 폐지된 절대 이종이량체 돌연변이체이다. 미국 특허 제7,914,796호 및 제8,034,598호에 개시되어 있으며, 이들의 개시 내용은 그 전체가 참조로서 포함된다. 특정 구현예에서, 조작된 절단 반-도메인은 위치 486, 499 및 496에서의 돌연변이(야생형 FokI에 대해 넘버링됨), 예를 들어 위치 486에서 야생형 Gln(Q) 잔기를 Glu(E)로 대체하고, 위치 499에서 야생형 Iso(I) 잔기를 Leu(L) 잔기로 대체하고, 위치 496에서 야생형 Asn(N) 잔기를 Asp(D) 또는 Glu(E) 잔기(각각 "ELD" 및 "ELE" 도메인이라고도 함)로 대체하는 돌연변이를 포함한다. 다른 구현예에서, 조작된 절단 반-도메인은 위치 490, 538 및 537에서의 돌연변이(야생형 FokI에 대해 넘버링됨), 예를 들어 위치 490에서 야생형 Glu(E) 잔기를 Lys(K) 잔기로 대체하고, 위치 538에서 야생형 Iso(I) 잔기를 Lys(K) 잔기로 대체하고, 위치 537에서 야생형 His(H) 잔기를 Lys(K) 잔기 또는 Arg(R) 잔기(각각 "KKK" 및 "KKR" 도메인이라고도 함)로 대체하는 돌연변이를 포함한다. 다른 구현예에서, 조작된 절단 반-도메인은 위치 490 및 537에서의 돌연변이(야생형 FokI에 대해 넘버링됨), 예를 들어 위치 490에서 야생형 Glu(E) 잔기를 Lys(K) 잔기로 대체하고, 위치 537에서 야생형 His(H) 잔기를 Lys(K) 잔기 또는 Arg(R) 잔기(각각 "KIK" 및 "KIR" 도메인이라고도 함)로 대체하는 돌연변이를 포함한다. 예를 들어, 미국 특허 제8,772,453호를 참조한다. 다른 구현예에서, 조작된 절단 반 도메인은 "샤키(Sharkey)" 및/또는 "샤키 돌연변이"를 포함한다(문헌[Guo et al. (2010) J. Mol. Biol. 400(1):96-107] 참조).
본원에 기재된 조작된 절단 반-도메인은 임의의 적합한 방법을 사용하여, 예를 들어 미국 특허 제7,888,121호; 제7,914,796호; 제8,034,598호; 및 제8,623,618호에 기재된 바와 같은 야생형 절단 반-도메인(FokI)의 부위-지정 돌연변이유발에 의해 제조될 수 있다.
대안적으로, 뉴클레아제는 소위 "분할-효소" 기술을 사용하여 핵산 표적 부위에서 생체 내 조립될 수 있다(예를 들어, 미국 특허 공개 번호 제2009/0068164호 참조). 이러한 분할 효소의 성분은 별개의 발현 작제물 상에서 발현될 수 있거나, 개별 성분이 예를 들어 자가-절단 2A 펩타이드 또는 IRES 서열에 의해 분리되는 하나의 오픈 리딩 프레임에서 연결될 수 있다. 성분들은 개별 아연 핑거 결합 도메인 또는 메가뉴클레아제 핵산 결합 도메인의 도메인일 수 있다.
뉴클레아제는 예를 들어 미국 특허 제8,563,314호에 기재된 바와 같이 효모-기반 염색체 시스템에서 사용 전에 활성에 대해 스크리닝될 수 있다. 뉴클레아제의 발현은 구성적 프로모터 또는 유도성 프로모터, 예를 들어 라피노스 및/또는 갈락토스의 존재 하에 활성화(탈억제)되고 글루코스의 존재 하에 억제되는 갈락토키나제 프로모터의 제어 하에 있을 수 있다.
Cas9 관련 CRISPR/Cas 시스템은 2개의 RNA 비-암호화 성분: tracrRNA 및 동일한 직접 반복부(DR)에 의해 이격된 뉴클레아제 가이드 서열(스페이서)을 함유하는 프리-crRNA 어레이를 포함한다. CRISPR/Cas 시스템을 사용하여 게놈 엔지니어링을 수행하려면 이러한 RNA의 두 기능이 모두 존재해야 한다(문헌[Cong et al. (2013) Sciencexpress 1/10.1126/science 1231143] 참조). 일부 구현예에서, tracrRNA 및 pre-crRNA는 별도의 발현 작제물을 통해 또는 별도의 RNA로서 공급된다. 다른 구현예에서, 조작된 성숙한 crRNA(표적 특이성 부여)가 tracrRNA(Cas9와의 상호작용 공급)에 융합된 키메라 RNA가 작제되어, 키메라 cr-RNA-tracrRNA 하이브리드(단일 가이드 RNA로도 지칭됨)를 생성한다. (문헌[Jinek et al. (2012) Science 337:816-821], 문헌[Jinek et al. (2013) eLife 2:e00471] 및 Cong, 상동 참조).
본원에 기재된 바와 같은 뉴클레아제(들)는 표적 부위에서 하나 이상의 이중-가닥 및/또는 단일-가닥 절단부를 만들 수 있다. 특정 구현예에서, 뉴클레아제는 촉매적으로 불활성인 절단 도메인(예를 들어, FokI 및/또는 Cas 단백질)을 포함한다. 예를 들어, 미국 특허 제9,200,266호; 제8,703,489호 및 문헌[Guillinger et al. (2014) Nature Biotech. 32(6):577-582]을 참조한다. 촉매적으로 불활성인 절단 도메인은 촉매적으로 활성인 도메인과 조합하여 단일-가닥 절단을 만드는 닉카제(nickase)로 작용할 수 있다. 따라서, 2개의 닉카제는 특정 영역에서 이중-가닥 절단을 만들기 위해 조합하여 사용될 수 있다. 추가적인 닉카제가 또한 당업계, 예를 들어, 문헌[McCaffery et al. (2016) Nucleic Acids Res. 44(2):e11. doi: 10.1093/nar/gkv878. Epub 2015 Oct 19]에 공지되어 있다.
따라서, DNA-결합 도메인 및 절단 도메인을 포함하는 임의의 뉴클레아제가 사용될 수 있다. 특정 구현예에서, 뉴클레아제는 제1 및 제2(좌측 및 우측 ZFN으로도 지칭됨)로 구성된 ZFN, 예를 들어 SBS-63014로 지정된 ZFP 및 절단 도메인을 포함하는 제1 ZFN 및 SBS-65722로 지정된 ZFP 및 절단 도메인을 포함하는 제2 ZFN을 포함하는 ZFN을 포함한다. 특정 구현예에서, ZFN의 왼쪽 및 오른쪽(첫 번째 및 두 번째) ZFN은 동일한 벡터에 전달되고, 다른 구현예에서, ZFN의 쌍을 이루는 성분은 상이한 벡터, 예를 들어 실시예 1에 나타낸 바와 같은 2개의 mRNA 벡터, 하나의 지정된 SB-mRENH1 mRNA(63014로 지정된 ZFP를 포함하는 ZFN을 암호화하는 mRNA) 및 다른 지정된 SB-mRENH2 mRNA(65722로 지정된 ZFP를 포함하는 ZFN을 암호화하는 mRNA)에 전달된다.
표적 부위
위에서 상세히 설명된 바와 같이, DNA 도메인은 유전자좌에서 선택된 임의의 서열, 예를 들어 알부민 또는 다른 안전-하버 유전자에 결합하도록 조작될 수 있다. 조작된 DNA-결합 도메인은 자연-발생 DNA-결합 단백질과 비교하여 신규한 결합 특이성을 가질 수 있다. 조작 방법에는 합리적인 설계 및 다양한 유형의 선택이 포함되지만, 이에 제한되지는 않는다. 합리적인 설계에는 예를 들어 삼중항(또는 사중항) 뉴클레오타이드 서열 및 개별 (예를 들어, 아연 핑거) 아미노산 서열을 포함하는 데이터베이스 사용이 포함되며, 여기서 각각의 삼중항 또는 사중항 뉴클레오타이드 서열은 특정 삼중항 또는 사중항 서열에 결합하는 DNA 결합 도메인의 하나 이상의 아미노산 서열과 연관된다. 공동 소유의 미국 특허 제6,453,242호 및 제6,534,261호를 참조하며, 이들은 그 전체 내용이 참조로서 본원에 포함된다. TAL-효과기 도메인의 합리적인 설계도 수행될 수 있다. 예를 들어, 미국 특허 공개 번호 제2011/0301073호를 참조한다.
파지 디스플레이 및 2-하이브리드 시스템을 포함하는 DNA-결합 도메인에 적용 가능한 예시적인 선택 방법은 미국 특허 제5,789,538호; 제5,925,523호; 제6,007,988호; 제6,013,453호; 제6,410,248호; 제6,140,466호; 제6,200,759호; 및 제6,242,568호; 뿐만 아니라 국제 특허 공개 번호 WO　98/37186; WO　98/53057; WO　00/27878; and WO　01/88197 및 GB 2,338,237에 개시되어 있다.
표적 부위의 선택; 뉴클레아제 및 융합 단백질(및 이를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드)의 설계 및 구성을 위한 방법은 당업자에게 공지되어 있으며, 미국 특허 공개 번호 제2005/0064474호 및 제2006/0188987호에 상세히 기재되어 있으며, 이는 그 전체 내용이 참조로서 본원에 포함된다.
또한, 이들 및 다른 참고문헌에 개시된 바와 같이, DNA-결합 도메인(예를 들어, 다중-핑거 아연 핑거 단백질)은 예를 들어 5개 이상의 아미노산의 링커를 포함하는 임의의 적합한 링커 서열을 사용하여 함께 연결될 수 있다. 예를 들어, 길이가 6개 이상의 아미노산인 예시적인 링커 서열에 대해서는 미국 특허 제6,479,626호; 제6,903,185호; 및 제7,153,949호를 참조한다. 본원에 기재된 단백질은 단백질의 개별 DNA-결합 도메인 사이에 적합한 링커의 임의의 조합을 포함할 수 있다. 또한, 미국 특허 제8,586,526호를 참조한다.
특정 구현예에서, DNA-결합 도메인(들)에 대한 표적 부위(들)는 BCL11A 유전자 내에 있다. 예를 들어, 미국 특허 제10,563,184호; 제9,963,715호; 제9,650,648호; 미국 특허 공개 번호 제2015/0132269호; 제2018/0111975호; 및 제2019/0177709호를 참고한다.
발명의 조성물/시스템
특정 구현예에 따른 방법을 실시하기 위해 대상체에게 전달되는 변형된 자가 HSC/PC가 본원에 기재되어 있다. 오른쪽 및 왼쪽 ZFN 파트너를 암호화하는 2개의 mRNA는 BCL11a 적혈구계 인핸서 서열을 표적으로 하는 수확된 HSC/PC로 전달된다. 특정 구현예에서, mRNA는 SB-mRENH1 및 SB-mRENH2를 포함한다. 본원에 기재된 임의의 방법에서, CD34+ HSC/PC는 단리 전에 하나 이상의 용량의 G-CSF 및/또는 하나 이상의 용량의 플레릭사포 및 동원된 세포로 대상체를 치료함으로써 대상체에서 동원 후 수확(예를 들어, 성분채집)된다. 특정 구현예에서, 적어도 약 25 x 106개의 CD34+ HSPC/kg이 전체 또는 성분채집 주기당 수확되고, 임의의 시간 길이 동안 배양될 수 있다. 생성된 유전적으로 변형된 세포는 배양될 수 있고, 그의 후손은 특정 BCL11A 유전적 변형을 포함할 것이지만(예를 들어, 표적외(비-BCL11A) 변형을 갖는 세포의 1% 미만), 반드시 mRNA(들)를 포함할 필요는 없다.
그런 다음, BCL11A 녹아웃을 포함하는 세포가 대상체에 주입된다. HLA 유전자의 추가 변형, 예를 들어 불활성화는 특정 BCL11A 유전적으로 변형된 세포에서 이루어질 수 있다.
세포
BCL11A 적혈구계 인핸서의 표적화된 녹아웃을 포함하는 유전적으로 변형된 세포, 예를 들어 HSC/PC가 또한 본원에서 제공된다. 번역될 때 활성 ZFN을 생성할 오른쪽 및 왼쪽 ZFN 파트너를 암호화하는 mRNA로 수확된 HSC/PC를 처리하여 녹아웃이 생성된다. ZFN은 BCL11A 적혈구계 인핸서를 절단하여, DNA의 이중 가닥 파단이 발생한다. 세포 기구는 오류가 발생하기 쉬운 비-상동 말단 연결(NHEJ)을 사용하여 이중 가닥 파단을 복구하여, 절단 부위 주위에 뉴클레오타이드의 삽입 및 결실(인델)을 초래한다.
자가(예를 들어, 대상체-유래) 및 동종(건강한 공여자 유래) HSC/PC는 모두 방법의 수행에 사용될 수 있다.
본원에 기재된 바와 같은 세포는 장애를 갖는 대상체에서 β-지중해빈혈 질환을 치료 및/또는 예방하기 위한 세포 요법에서 유용하다. 변형된 줄기세포의 경우, 대상체에 주입한 후, 이들 전구체의 (삽입된 공여자로부터의) 기능성 단백질을 발현하는 세포로의 생체 내 분화도 일어난다.
본원에 기재된 바와 같은 세포를 포함하는 약제학적 조성물이 또한 제공된다. 또한, 세포는 대상체에 투여하기 전에 동결보존될 수 있다.
본원에 기재된 세포 집단(및 조성물)은 세포의 10% 미만(0 내지 10% 또는 이들 사이의 임의의 값), 바람직하게는 5% 미만(0 내지 5% 또는 이들 사이의 임의의 값), 훨씬 더 바람직하게는 1% 미만의 세포(0 내지 1% 또는 이들 사이의 임의의 값), 및 더욱 더 바람직하게는 0.5% 미만(0 내지 1% 또는 이들 사이의 임의의 값)이 BCL11A 유전자좌 외부의 유전적 변형을 포함하는 유전적 변형된 세포 집단을 포함하는, BCL11A 유전자좌에서 특이적으로 유전적으로 변형된 세포를 포함한다(그러나 HLA 마커의 불활성화와 같은 추가 변형을 포함할 수 있음).
전달
뉴클레아제, 이들 뉴클레아제를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드, 공여자 폴리뉴클레오타이드 및 본원에 기재된 단백질 및/또는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 조성물의 생체 외 전달은 임의의 적합한 수단에 의해 수확된 HSC/PC에 전달될 수 있다.
본원에 기재된 바와 같은 뉴클레아제를 전달하는 방법은 예를 들어, 미국 특허 제6,453,242호; 제6,503,717호; 제6,534,261호; 제6,599,692호; 제6,607,882호; 제6,689,558호; 제6,824,978호; 제6,933,113호; 제6,979,539호; 제7,013,219호; 및 제7,163,824호에 기술되어 있으며, 이들 모두의 개시 내용은 그 전체가 참조로서 본원에 포함된다.
본원에 기재된 바와 같은 뉴클레아제 및/또는 공여자 작제물은 또한 아연 핑거, TAL-효과기 도메인 및/또는 Cas 단백질(들) 중 하나 이상을 암호화하는 서열을 함유하는 벡터를 사용하여 전달될 수 있다. 플라스미드 벡터, 레트로바이러스 벡터, 렌티바이러스 벡터, 아데노바이러스 벡터, 폭스바이러스 벡터; 헤르페스바이러스 벡터 및 아데노-연관 바이러스 벡터 등을 포함하지만, 이에 제한되지 않는 임의의 벡터 시스템들이 사용될 수 있다. 또한, 미국 특허 제6,534,261호; 제6,607,882호; 제6,824,978호; 제6,933,113호; 제6,979,539호; 제7,013,219호; 및 제7,163,824호를 참조하며, 그 전체 내용이 참조로서 본원에 포함된다.
통상적인 바이러스 및 비-바이러스 기반 유전자 전달 방법을 사용하여 뉴클레아제 및 공여자 작제물을 암호화하는 핵산을 세포(예를 들어, 포유동물 세포) 및 표적 조직에 도입할 수 있다. 비바이러스 벡터 전달 시스템은 DNA 플라스미드, 네이키드 핵산, 및 리포솜 또는 폴록사머와 같은 전달 비히클과 복합된 핵산을 포함한다. 바이러스 벡터 전달 시스템은 세포로 전달된 후 에피솜 또는 통합된 게놈이 있는 DNA 및 RNA 바이러스를 포함한다. 유전자 요법 절차의 검토에 대해서는, 문헌[Anderson (1992) Science 256:808-813]; 문헌[Nabel & Felgner (1993) TIBTECH 11:211-217]; 문헌[Mitani & Caskey (1993) TIBTECH 11:162-166]; 문헌[Dillon (1993) TIBTECH 11:167-175]; 문헌[Miller (1992) Nature 357:455-460]; 문헌[Van Brunt (1988) Biotechnology 6(10):1149-1154]; 문헌[Vigne (1995) Restorative Neurology and Neuroscience 8:35-36]; 문헌[Kremer & Perricaudet (1995) British Medical Bulletin 51(1):31-44]; 문헌[Haddada et al., in Current Topics in Microbiology and Immunology Doerfler and B
Figure pct00001
hm (eds.) (1995)]; 및 문헌[Yu et al. (1994) Gene Therapy 1:13-26]을 참고한다.
핵산의 비-바이러스 전달 방법은 전기천공, 리포펙션, 마이크로인젝션, 바이올리스틱스(biolistics), 비로솜, 리포솜, 면역리포솜, 다중양이온 또는 지질:핵산 컨쥬게이트, 네이키드 DNA, 인공 비리온, 및 DNA의 흡수 증강 작용제를 포함한다. 예를 들어 Sonitron 2000 시스템(Rich-Mar)을 사용하는 소노포레이션은 핵산 전달에도 사용할 수 있다.
추가의 예시적인 핵산 전달 시스템은 Amaxa Biosystems(Cologne, Germany), Maxcyte, Inc.(Rockville, Maryland), BTX 분자 전달 시스템(Holliston, MA) 및 Copernicus Therapeutics Inc(예를 들어, 미국 특허 제6,008,336호 참조)에 의해 제공된 것들을 포함한다. 리포펙션은 예를 들어 미국 특허 제5,049,386호, 제4,946,787호 및 제4,897,355호)에 기재되어 있고, 리포펙션 시약은 상업적으로 판매되고 있다(예를 들어, Transfectam™ 및 Lipofectin™). 폴리뉴클레오티드의 효율적인 수용체-인지 리포펙션에 적합한 양이온성 지질 및 중성 지질은 Felgner, 국제 특허 공개 번호 WO 91/17424; WO 91/16024의 것들을 포함한다.
면역지질 복합체와 같은 표적 리포솜을 포함하는, 지질:핵산 복합체의 제조는 당업자에게 널리 공지되어 있다(예를 들어, 문헌[Crystal (1995) Science 270:404-410]; 문헌[Blaese et al. (1995) Cancer Gene Ther. 2:291-297]; 문헌[Behr et al. (1994) Bioconjugate Chem. 5:382-389]; 문헌[Remy et al. (1994) Bioconjugate Chem. 5:647-654]; 문헌[Gao et al. (1995) Gene Therapy 2:710-722]; 문헌[Ahmad et al. (1992) Cancer Res. 52:4817-4820]; 미국 특허 제4,186,183호; 제4,217,344호; 제4,235,871호; 제4,261,975호; 제4,485,054호; 제4,501,728호; 제4,774,085호; 제4,837,028호; 및 제4,946,787호 참조).
추가적인 전달 방법에는 EnGeneIC 전달 비히클(EDV)에 전달될 핵산을 패키징하는 것을 사용하는 방법이 포함된다. 이러한 EDV는 항체의 한 팔이 표적 조직에 대해 특이성을 갖고 다른 팔이 EDV에 대해 특이성을 갖는 이중특이성 항체를 사용하여 표적 조직에 특이적으로 전달된다. 항체는 EDV를 표적 세포 표면으로 가져온 다음, 세포내이입에 의해 EDV를 세포 내로 가져온다. 일단 세포에 들어가면, 내용물이 방출된다(문헌[MacDiarmid et al. (2009) Nature Biotechnology 27(7):643] 참조).
조작된 ZFP를 암호화하는 핵산의 전달을 위한 RNA 또는 DNA 바이러스 기반 시스템의 사용은 바이러스를 신체의 특정 세포로 표적화하고 바이러스 페이로드를 핵으로 트래피킹하기 위한 고도로 진화된 프로세스를 이용한다. 바이러스 벡터는 시험관 내에서 세포를 치료하는 데 사용될 수 있으며, 변형된 세포가 대상체에 투여된다(생체 외). ZFP의 전달을 위한 기존의 바이러스 기반 시스템은 유전자 전달을 위한 레트로바이러스, 렌티바이러스, 아데노바이러스, 아데노-연관, 백시니아 및 단순 포진 바이러스 벡터를 포함되지만, 이에 제한되지 않는다. 숙주 게놈의 통합은 레트로바이러스, 렌티바이러스 및 아데노-연관 바이러스 유전자 전달 방법으로 가능하며, 종종 삽입된 이식유전자의 장기간 발현을 초래한다. 또한, 다양한 세포 유형과 표적 조직에서 높은 형질도입 효율이 측정되었다.
재조합 아데노-연관 바이러스 벡터(rAAV)는 결함이 있고 비병원성인 파보바이러스 아데노-연관 유형 2 바이러스를 기반으로 하는 유망한 대체 유전자 전달 시스템이다. 모든 벡터는 이식유전자 발현 카세트 옆에 있는 AAV 145 bp 역 말단 반복부만 보유하는 플라스미드에서 유래된다. 형질도입된 세포의 게놈으로의 통합으로 인한 효율적인 유전자 전달 및 안정적인 이식유전자 전달은 이 벡터 시스템의 핵심 기능이다. (문헌[Dennis et al. (1998) Lancet 351(9117):1702-3]; 문헌[Kearns et al. (1996) Gene Ther. 9:748-55]). 비제한적인 예로서, AAV1, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV8, AAV 8.2, AAV9 및 AAV rh10 및 유상유형 AAV, 예컨대 AAV2/8, AAV2/5 및 AAV2/6을 포함하는 다른 AAV 혈청형이 본 발명에 따라 또한 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, 혈액 뇌 장벽을 통과할 수 있는 AAV 혈청형이 사용된다.
복제-결핍 재조합 아데노바이러스 벡터(Ad)는 높은 역가로 생산될 수 있고, 다수의 상이한 세포 유형을 쉽게 감염시킬 수 있다. 대부분의 아데노바이러스 벡터는 이식유전자가 Ad E1a, E1b 및/또는 E3 유전자를 대체하도록 조작되며; 후속적으로 복제 결함 벡터는 트랜스로 결실된 유전자 기능을 공급하는 인간 293 세포에서 증식된다. Ad 벡터는 간, 신장 및 근육에서 발견되는 것과 같은 비-분할, 분화된 세포를 포함하여 생체 내에서 여러 유형의 조직을 형질도입할 수 있다. 기존의 Ad 벡터는 전달 용량이 크다. 임상 시험에서 Ad 벡터의 사용의 예는 근육내 주사로 항종양 면역화를 위한 폴리뉴클레오타이드 요법을 포함한다(문헌[Sterman et al. (1998) Hum. Gene Ther. 7:1083-9]). 임상 시험에서 유전자 전달을 위한 아데노바이러스 벡터의 사용에 대한 추가 예는 문헌[Rosenecker et al. (1996) Infection 24(1):5-10]; 문헌[Sterman et al. (1998) Hum. Gene Ther. 9(7):1083-1089]; 문헌[Welsh et al. (1995) Hum. Gene Ther. 2:205-18]; 문헌[Alvarez et al. (1997) Hum. Gene Ther. 5:597-613]; 문헌[Topf et al. (1998) Gene Ther. 5:507-513]; 문헌[Sterman et al. (1998) Hum. Gene Ther. 7:1083-1089]을 참조한다.
패키징 세포는 숙주 세포를 감염시킬 수 있는 바이러스 입자를 형성하는 데 사용된다. 이러한 세포에는 아데노바이러스를 패키징하는 293 세포와 레트로바이러스를 패키징하는 ψ2 세포 또는 PA317 세포가 포함된다. 유전자 치료에 사용되는 바이러스 벡터는 일반적으로 핵산 벡터를 바이러스 입자로 패키징하는 생산자 세포주에 의해 생성된다. 벡터는 전형적으로 패키징 및 숙주로의 후속 통합(해당되는 경우)에 필요한 최소 바이러스 서열을 함유하며, 다른 바이러스 서열은 발현될 단백질을 암호화하는 발현 카세트로 대체된다. 누락된 바이러스 기능은 패키징 세포주에 의해 트랜스로 공급된다. 예를 들어, 유전자 치료에 사용되는 AAV 벡터는 전형적으로 패키징 및 숙주 게놈으로의 통합에 필요한 AAV 게놈의 역 말단 반복부(ITR) 서열만을 보유한다. 바이러스 DNA는 다른 AAV 유전자, 즉 rep 및 cap을 암호화하는 헬퍼 플라스미드를 함유하지만, ITR 서열이 없는 세포주에 패키징되어 있다. 세포주는 또한 헬퍼로서 아데노바이러스에 의해 감염된다. 헬퍼 바이러스는 AAV 벡터의 복제 및 헬퍼 플라스미드로부터 AAV 유전자의 발현을 촉진한다. 헬퍼 플라스미드는 ITR 서열의 부족으로 인해 상당한 양으로 패키징되지 않는다. 아데노바이러스에 의한 오염은 예를 들어 아데노바이러스가 AAV보다 더 민감한 열처리에 의해 감소될 수 있다.
본원에 기재된 바와 같은 유전적으로 변형된 세포를 포함하는 조성물은 주입을 비롯한 임의의 적합한 방식으로 대상체에게 전달될 수 있다. 유전적으로 변형된 세포를 포함하는 조성물을 투여하기 전에, 대상체는 하나 이상의 골수억제성 병태 작용제로 1회 이상 치료(투여)될 수 있으며, 예를 들어 부술판이: 0.5 내지 5 mg/kg에서 1회 이상 정맥내(IV); 약 3.2 mg/kg/일에서 IV; 0일에 유전적으로 변형된 세포를 포함하는 조성물의 주입 전 -6 내지 -3일에 주입 전 약 12.8 mg/kg의 총 용량을 4일 동안 중심 정맥 카테터를 통한 IV; 또는 매일 1회 또는 6시간마다 IV로 투여된다.
유전적으로 변형된 세포의 임의의 용량, 예를 들어 약 3 x 106 세포/kg 내지 약 20 x 106 세포/kg이 사용될 수 있다(예를 들어, 세포가 1 x 107 세포/mL의 농도로 백 당 대략 1.0-2.0 x 108 세포와 제형화됨).
약제학적으로 허용되는 담체는 투여되는 특정 조성물뿐만 아니라 조성물을 투여하는 데 사용되는 특정 방법에 의해 부분적으로 결정된다. 따라서, 하기에 기술된 바와 같이 이용 가능한 다양한 적합한 약제학적 조성물 제형이 존재한다(예를 들어, Remington's Pharmaceutical Sciences, 17th ed., 1989 참조).
생체 외 및 생체 내 투여 둘 모두를 위한 제형은 액체 또는 유화 액체 중의 현탁액을 포함한다. 활성 성분은 종종 약제학적으로 허용되고 활성 성분과 상용성인 부형제와 혼합된다. 적합한 부형제는 예를 들어 물, 식염수, 덱스트로스, 글리세롤, 에탄올 등, 및 이들의 조합을 포함한다. 또한, 조성물은 습윤제 또는 유화제, pH 완충제, 안정화제 또는 약제학적 조성물의 효과를 향상시키는 기타 시약과 같은 보조 물질을 소량 함유할 수 있다.
용도
본 발명의 방법은 β-지중해빈혈의 치료 및/또는 예방을 고려한다. 치료는 세포에서 BCL11A 인핸서 서열의 녹아웃을 포함하여 BCL11A 단백질의 발현을 차단할 수 있다. BCL11a 단백질은 태아 글로빈의 발현을 억제하는 것으로 알려져 있으므로, BCL11A가 녹아웃되면 HbF 유전자의 억제가 부족하게 될 것이다. 본 발명의 방법 및 조성물은 또한 조혈모 세포에서 BCL11A 적혈구계 인핸서를 녹아웃시켜 이들 세포로부터 유래된 성숙한 세포(예를 들어, RBC)가 치료적 녹아웃을 함유하도록 하는 것이 바람직한 임의의 상황에서 사용될 수 있다. 이러한 줄기 세포는 시험관 내 또는 생체 내에서 분화될 수 있으며, 모든 대상체에 사용할 수 있는 보편적인 공여자 유형의 세포에서 유래할 수 있다. 추가로, 세포는 신체의 세포를 이동시키는 막횡단 단백질을 함유할 수 있다. 치료는 또한 세포가 생체 외에서 발달된 다음 대상체로 다시 도입되는 치료적 이식유전자를 함유하는 대상체 세포의 사용을 포함할 수 있다. 예를 들어, BCL11A 적혈구 인핸서 녹아웃을 함유하는 HSC/PC는 자가 골수 이식을 통해 대상체에 삽입될 수 있다.
따라서, 이 기술은 대상체의 B-글로빈 유전자에 돌연변이가 있거나 그의 발현이 결핍된 상태에서 사용될 수 있다. 헤모글로빈 사슬을 암호화하는 서열의 유전적 결함은 겸상 적혈구 빈혈 및 베타 지중해빈혈을 포함하는 혈색소병증으로 알려진 질환 그룹의 원인이 될 수 있다. 소아 지중해빈혈(thalassemia minor)에서는 β 글로빈 대립유전자 중 하나만 돌연변이가 있다. 개인은 소구성 빈혈을 앓게 되며, 일반적으로 검출 시 정상 평균 입자 부피(<80fL)보다 낮다. 소아 지중해빈혈이 있는 대상체의 대립유전자는 β+/β 또는 β0/β이다(여기서, 'β+'는 β 사슬 형성이 어느 정도 일어나도록 하는 대립유전자를 의미하고, 'β'는 야생형 β 글로빈 대립유전자를 의미하고, 'β0'는 베타-글로빈 발현의 완전한 부재와 관련된 β 글로빈 돌연변이를 의미한다). 지중해빈혈 중형 대상체는 종종 정상적인 생활을 할 수 있지만, 빈혈의 중증도에 따라 특히 질환이나 임신 중일 때 가끔 수혈이 필요할 수 있다. 이 환자의 대립유전자는 β+/β+ 또는 β0/β+일 수 있다. 주요 지중해빈혈은 두 대립유전자에 지중해빈혈 돌연변이(β0/β0)가 있을 때 발생한다. 이것은 심각한 소구성 및 저색소성 빈혈이다. 치료하지 않으면, 빈혈, 비장 비대 및 심각한 뼈 기형을 유발하고, 20세 이전에 사망한다. 치료는 주기적인 수혈; 비장 비대에 대한 비장절제술 및 수혈로 인한 철분 과부하의 킬레이트화로 이루어진다. 골수 이식은 적당한 공여자를 식별할 수 있는 경우 심각한 지중해빈혈 환자의 치료에도 사용되지만, 이 절차는 상당한 위험을 초래할 수 있다. 혈색소병증 환자의 대부분은 감마 글로빈을 암호화하는 유전자가 남아있으나, 분만시 정상적인 유전자 억제가 일어나 발현이 상대적으로 낮다.
일부 용도에서, β-지중해빈혈(예를 들어, 주요 β-지중해빈혈증(TDT) 또는 소아 β-지중해빈혈증)을 갖는 인간 대상체에서 지중해빈혈-관련 질환 바이오마커의 개선 또는 유지(감소를 늦추는) 방법이 본 발명의 방법 및 조성물로 처리되지 않은 대상체와 비교하여 본원에 제공된다. 다른 용도에서, 본 발명의 방법 및 조성물로 치료하기 전의 대상체와 비교하여 β 지중해빈혈을 갖는 대상체에서 PRBC 또는 기타 혈액 제품 주입에 대한 필요성(용량 수준 또는 빈도)을 감소시키는 방법이 본원에 제공된다. 또 다른 양태에서, 만성 혈액 제제 주입으로부터 발생하는 β-지중해빈혈 환자에서 철분 과부하를 감소시키는 방법이 본원에 제공된다.
따라서, 대상체의 HbF 생산이 증가하고 β-지중해빈혈의 하나 이상의 임상 증상이 감소하도록, BCL11A가 세포에서 불활성화된 유전적으로 변형된 세포를 대상체에게 투여함으로써(예를 들어, 주입에 의해) 치료를 필요로 하는 대상체에서 베타-지중해빈혈(예를 들어, TDT)을 치료하는 방법이 본원에 제공된다. 치료를 받는 TDT를 가진 대상체는 하기 중 하나 이상을 나타낼 수 있다: (1) 총 Hb의 그램/dL 혈장 및/또는 백분율 HbF에서 임상 실험실 헤모글로빈 분획(성인 헤모글로빈, HbA 및 태아 헤모글로빈, HbF)의 기준선으로부터의 변화; (2) 철분 대사의 바이오마커와 같은 지중해빈혈-관련 질환 바이오마커의 변경(예를 들어, 정상 수준으로 또는 거의 정상 수준으로); 및/또는 에리트로포이에틴, 합토글로빈 및/또는 헵시딘의 수준; (3) 기준선 수혈 요법과 관련된 철분 과부하와 관련된 대상체에서 증상의 감소 또는 제거, 선택적으로 내분비 기능장애의 감소는 갑상선 호르몬, IGF-1, 모닝 코르티솔, 부신피질자극 호르몬(ACTH), HbA1C, 비타민 D, HbA, HbF, 에리트로포이에틴, 합토글로빈, 헵시딘, 갑상선 호르몬, IGF-1, 코르티솔, ACTH 및/또는 대상체에서 비타민 D의 수준 및/또는 활성을 측정함으로써 검정되며; (4) PRBC 수혈, 혈소판 주입, IVIG, 혈장 수혈 및/또는 과립구 수혈을 포함한 혈액 제제 주입의 필요성 감소 또는 제거; (5) 간 질환의 감소 또는 제거; (6) 심장 이상의 감소 또는 제거; (7) 골다공증 및/또는 골절의 감소 및/또는 제거 및/또는 골밀도의 기준선으로부터의 변화; (8) 비정형 형태(예를 들어, 증식증) 및/또는 미성숙 적혈구계 세포 수의 감소 또는 제거; 및/또는 (9) F 세포의 수 및 백분율의 기준선(처리전 수준)으로부터의 변화.
카르노프스키 수행 척도(Karnofsky Performance Scale)는 환자의 기능장애를 평가하기 위한 간단하고 널리 사용되는 도구이다. 각 대상체는 카르노프스키 수행 상태 척도 정의 평가 기준을 사용하여 지정된 방문에서 평가되고 채점된다. 스크리닝 방문 시 카르노프스키 수행 척도 점수가 ≤60인 대상체는 이 연구에 참여할 자격이 없다. 기준선으로부터의 변화가 평가될 것이다.
유전적으로 변형된 세포는 줄기 세포(예를 들어, CD34+ HSC/PC, ST-400)일 수 있고, 자가 또는 동종(예를 들어, 건강한 공여자로부터 단리됨)일 수 있고, 동종 세포는 추가로 변형될 수 있고(예를 들어, BCL11A 불활성화에 대해 추가로), 예를 들어 동종 세포로부터 하나 이상의 자가-항원(예를 들어, HLA 복합체)을 제거한다. 예를 들어, 미국 특허 제8,945,868호; 제10,072,062호 및 미국 특허 공개 번호 제2018/0362926호를 참조한다. 자가 세포는 하나 이상의 용량의 G-CSF 및/또는 하나 이상의 용량의 플레릭사포로 대상체를 치료함으로써 생체 외 변형 전에 대상체에서 동원될 수 있고, 동원된 세포는 하나 이상의 성분채집 주기에 의해 수확된다. 선택적으로, 적어도 약 25 x 106 CD34+ HSPCs/kg이 대상체에서 동원된다. 세포는 하나 이상의 뉴클레아제를 사용하여 BCL11A를 불활성화하도록 유전적으로 변형될 수 있으며, 예를 들어 여기서 뉴클레아제는 본원에 개시된 mRNA(서열 번호: 15 및 서열 번호: 16)로서 세포 내로 도입된다. 생체 외 유전자 변형 후, 세포는 BCL11A 내의 삽입 및/또는 결실에 대해 평가될 수 있다.
치료될 대상체는 또한 예를 들어 부술판의 정맥내(IV) 투여를 통해 유전적으로 변형된 세포의 투여 전에(예를 들어, 치료 10 내지 1일 전에) 하나 이상의 골수억제제로 사전 치료될 수 있으며, 1회 이상 동안 약 0.5 내지 5 mg/kg(또는 그 사이의 임의의 값)이고; 부술판의 IV 투여는 약 3.2 mg/kg/일이고; 0일에 변형된 HSPC의 주입 전 -6 내지 -3일에 주입 전 약 12.8 mg/kg의 총 용량으로 4일 동안 중심 정맥 카테터를 통한 IV; 또는 부술판의 IV 투여는 1일 1회(예를 들어, 4회 용량) 또는 6시간마다(총 16회 용량)이다. 약 3 x 106개 세포/kg 내지 약 20 x 106개 세포/kg을 포함하지만, 이에 제한되지 않는 임의의 용량의 유전적으로 변형된 세포가 사용될 수 있으며, 선택적으로 세포는 10% DMSO를 함유하는 불용성 저온배지에서 제형화된다. 세포는 임의의 적합한 용기 또는 포장, 예를 들어 주입 백(예를 들어, 대략 1 x 107 세포/mL의 농도에서 백 당 약 1.0- 2.0 x 108 세포 포함)으로 제형화될 수 있다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, 하나 이상의 관심 값에 적용되는 용어 "대략" 또는 "약"은 언급된 기준 값과 유사한 값을 지칭한다. 특정 구현예에서, 이 용어는 달리 명시되거나 문맥에서 달리 명백하지 않는 한 명시된 기준 값의 (보다 크거나 보다 작음) 어느 한 방향으로 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1%, 또는 그 미만에 속하는 값의 범위를 지칭한다.
하기 실시예는 뉴클레아제가 아연 핑거 뉴클레아제(ZFN) 또는 TALEN을 포함하는 본 개시 내용의 예시적인 구현예에 관한 것이다. 이것은 단지 예시를 위한 것이며, 다른 뉴클레아제 또는 뉴클레아제 시스템, 예를 들어 조작된 DNA-결합 도메인을 갖는 귀소 엔도뉴클레아제(메가뉴클레아제) 및/또는 조작된 귀소 엔도뉴클레아제(메가뉴클레아제) DNA-결합 도메인 및 이종 절단 도메인 및/또는 조작된 단일 가이드 RNA를 포함하는 CRISPR/Cas 시스템의 자연 발생 융합이 사용될 수 있음이 이해될 것이다.
실시예
실시예 1: ZFN 설계
ZFN 쌍은 인간 게놈의 GRCh38/hg38 어셈블리에서 위치 chr2:60,495,250-60,495,290의 인간 BCL11A 유전자의 적혈구-특이적 인핸서의 33개 염기 쌍(결합된) 표적 부위에 결합하는 6-핑거 ZFN(mRNA SB-mRENH1에 의해 암호화됨) 및 5-핑거 ZFN(mRNA SB-mRENH2에 의해 암호화됨)으로 구성된다. ZFN 및 이를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드의 제조는 하기와 같다: SB-mRENH1 및 SB-mRENH2 mRNA는 당업계에 공지된 방법에 의해 시험관 내에서 생성된다. mRNA는 ZFN 파트너를 암호화하는 서열을 포함하고, 또한 핵 국소화 서열 및 펩타이드와 같은 특징을 포함한다. 표 1은 각 파트너 ZFN과 관련된 나선을 보여준다(미국 특허 제10,563,184호; 미국 특허 공개 번호 제2018/0087072호 참조):
[표 1]
Figure pct00002
SB-mRENH1 mRNA (1725개 뉴클레오타이드)에 대한 완전한 뉴클레오타이드 서열은 하기에 제시되어 있다:
Figure pct00003
또한, SB-mRENH2 mRNA에 대한 완전한 뉴클레오타이드 서열은 하기에 제시되어 있다(1680개 뉴클레오타이드):
Figure pct00004
실시예 2: 세포 변형 방법 개발
시험관 내 연구: 동원된 인간 CD34+ HSPC를 건강한 대상체로부터 성분채집에 의해 수집하고 정제하였다. 정제된 HSPC를 ZFN mRNA SB-mRENH1 및 SBmRENH2로 형질감염시켰다. 동일한 대상체로부터의 형질감염되지 않은 CD34+ HSPC가 대조군으로 사용되었다. 형질감염 48시간 후에, 형질감염된 CD34+ HSPC("ST-400")를 시험관 내 연구에서 사용하기 위해 수확하고 동결시켰다.
BCL11A 유전자의 인간 적혈구-특이적 인핸서의 ZFN-매개 유전자 편집의 효과를 분석하기 위해, 위에서 변형된 세포를 "cRBC 풀링된 분화"로 알려진 시험관 내 적혈구생성 모델에 배치하였으며(문헌[Giarratana et al. (2011) Blood 118(19):5071]), 이는 전-적혈구계 사이토카인을 사용한 3단계 액체 배양에서 21일 동안 배양을 수반한다. BCL11A 인핸서 유전자 변형은 형질감염 2일 후 채취한 DNA 샘플에서, 시험관 내 분화 시작 시 및 시험관 내 분화 14일째에, 많은 부분의 적혈구 세포의 핵 제거전에, MiSeq 딥 시퀀싱에 의해 ST-400에서 측정하였다. 형질감염된 세포에서 BCL11A 인핸서 유전자좌의 변형은 약 75%의 인델을 포함했으며, 이는 임상 물질 생산 동안 예상되는 범위 내이다. 유전자 변형 수준은 형질감염되지 않은 대조군 HSPC에서 ≤0.2%였다.
적혈구 분화 과정에 걸쳐 세포 성장(확장)을 모니터링하였다. 적혈구 성숙의 척도인 핵 제거는 21일째에 결정되었다. 형질감염된 HSPC의 확장은 약 2500~9000배 범위였으며, 형질감염되지 않은 HSPC에서보다 약 2배 낮았으며, 이는 초기 세포 성장에 대한 형질감염 절차의 영향을 반영한다. 제핵 세포의 퍼센트는 형질감염된 세포와 형질감염되지 않은 세포 간에 차이가 없었다(두 경우 모두에서 약 59~62% 범위).
21일째(적혈구 분화의 종말점)에 분리된 단백질 샘플의 역상 UPLC를 사용하여 형질감염된 HSPC의 적혈구계 자손에서 α-, β- 및 γ-글로빈 수준을 측정하였다.
도 2에 도시된 바와 같이, γ-글로빈 대 β-글로빈 및 γ-글로빈 대 α-글로빈의 비율은 형질감염되지 않은 HSPC에 비해 ST-400의 적혈구계 자손에서 약 3~4배 증가하였다. 이 발견은 표적화된 유전자 변형의 결과가 γ-글로빈 단백질의 상승을 초래하며, 이는 TDT 환자의 적혈구계 세포에서 HbF 수준을 증가시켜야 함을 입증한다. 관찰된 γ-글로빈 수준의 증가는 BCL11A를 표적으로 하는 다른 방법에 대해 공개된 것과 유사하고(문헌[Wilber et al. (2011) Blood 117(10):2817-26]), BCL11A 반수체부족 환자에서 검출된 것과 유사하다(문헌[Basak et al. (2015) J Clin Invest 125(6):2363-8]; 문헌[Funnell et al. (2015) Blood 126(1):89-93]).
변형된 HSPC(조혈 계통으로의 증식 및 분화로 평가됨)의 기능적 잠재력의 평가를 위해, CFU 검정에서 고정된 수의 입력 세포에 의해 형성된 콜로니의 수 및 형태를 사용하였다. 동일한 대상체로부터 유래된 형질감염되지 않은 CD34+ HSPC가 음성 대조군으로 사용되었다. CFU 분석은 표준 절차를 사용하여 수행되었다. 간단히 말해서, 각각 100개 또는 300개 세포의 3중 배양물을 6-웰 플레이트에 플레이팅하고, 14일 동안 인큐베이션했으며, 이 시점에서 배양물은 콜로니 수 및 콜로니 유형에 대해 점수를 매겼다. 해동 후 생존율은 동등했다(형질감염된 HSPC에서 약 72% 내지 83%; 형질감염되지 않은 HSPC에서 약 96%). 형질감염된 HSPC의 퍼센트 플레이팅 효능은 형질감염되지 않은 HSPC의 경우 37.3%에서 75.0%에 비해 15.7%에서 45.7%의 범위였다. ST-400의 플레이팅 효율은 유전자-변형 세포에 대한 다른 연구에서 보고된 범위 내에 있으며(문헌[Dever et al. (2016) Nature 539(7629):384-389]; 문헌[Wu et al. (2001) Gene Ther 8(5):384-90]), 형질감염되지 않은 HSPC에 비해 낮은 효율은 전기천공 및 유전자 변형의 영향으로 인한 것 같다.
표 2에 나타낸 바와 같이, 변형된 HSPC는 적혈구 전구 세포(CFU-E 및 BFU-E), 과립구/대식세포 전구 세포(CFU-G/M/GM) 및 다중-전위 전구 세포(CFU-GEMM)를 포함한 모든 조혈 계통으로 분화한다. 변형된 HSPC에서 파생된 CFU-E의 백분율은 형질감염되지 않은 HSPC의 백분율과 유사했으며, CFU-G/M/GM 및 CFU-GEMM의 백분율은 최소한으로만 상이했다. 따라서, ZFN mRNA SB-mRENH1 및 SB-mRENH2를 사용한 형질감염 및 유전적 변형은 변형된 HSPC의 분화 가능성에 최소한의 영향을 미치거나 전혀 영향을 미치지 않는다.
[표 2]
Figure pct00005
ST-400-형질감염된 섬유아세포에 의한 연질 한천에서의 콜로니 형성: 형질전환/종양형성 가능성의 평가를 위해, ZFN mRNA SB-mRENH1- 및 SB-mRENH2로 형질감염된 인간 WI-38 섬유아세포의 고정-독립적 성장을 연질 한천 형질전환 분석에서 평가하였다. 유전자 변형 수준은 형질전환되지 않은 WI-38 세포에서 약 0.3%에 비해 유전적으로 변형된 WI-38 세포에서 약 73% 인델에서 측정하였다. 형질감염된, 및 형질감염되지 않은 WI-38 세포의 고정-독립적 성장은 어느 시점에서도 관찰되지 않았다. 결과는 ZFN mRNA SB-mRENH1 및 SB-mRENH2로의 형질감염 및 WI-38 세포에서 BCL11A 유전자의 적혈구계-특이적 인핸서에서의 ZFN-매개 파괴가 종양 형성을 촉진하지 않았음을 보여준다.
변형된 CD34+HSPC의 핵형 분석: 변형된 HSPC로 핵형 분석을 수행하였다. ZFN은 지정된 표적 유전자좌에서 게놈의 DSB를 유도하도록 설계되었다. 그들의 작용 기전을 고려할 때 ZFN의 표적 외 활동은 계획되지 않은 유전적 변화를 초래할 수 있다. 개별 세포에서 퍼진 염색체의 육안 검사(핵형 분석)는 유전적 무결성에 대한 전체적인 관점을 제공하고, 더 표적화된 다른 검사에서 놓칠 수 있는 대규모 구조적 또는 수치적 염색체 변화를 포함한 유전적 이상을 감지할 수 있다.
전체 염색체 형태를 평가하기 위해, 3명의 건강한 대상체로부터 유래된 변형된 HSPC가 핵형 분석을 받았다. 동일한 대상체로부터의 형질감염되지 않은 CD34+ HSPC가 대조군으로 사용되었다. MiSeq 딥 시퀀싱은 BCL11A 유전자의 적혈구-특이적 인핸서에서의 유전자 변형이 형질감염되지 않은 HSPC의 0.1% 미만 인델과 비교하여 형질감염된 HSPC의 77%로부터 79% 인델까지임을 보여주었다. 핵형 분석은 모든 세포가 인간 기원이고 어느 것도 심한 염색체 이상을 가지고 있지 않다는 것을 보여주었다. 변형된 HSPC의 세포유전학적 분석은 치료와 관련된 전체적인 구조적 또는 수치적 염색체 이상을 나타내지 않았다.
변형된 HSPC의 이중 가닥 파단: 변형된 HSPC를 p53-결합 단백질 1(53BP1) 검정에서 시험하여, 면역조직화학에 의해 7일에 걸쳐 ZFN 활성의 지속시간 및 특이성을 평가하였다. 유전자 변형 수준을 형질감염 후 1일 및 2일에 평가하였다. 53BP1은 DSB가 발생한 후 24시간 이내에 DSB의 부위로 모집되고, ZFN-유도 DSB의 복구를 위한 주요 경로인 NHEJ를 통한 DSB 복구에 관여한다. 복구 부위는 53BP1에 대한 항체가 있는 면역형광 현미경을 사용하여 고정된 세포의 핵 내에서 강렬하게 염색되고 뚜렷한 초점으로 시각화된다. 이 방법을 사용하여 DSB를 평가하면 순 ZFN 활동(표적내 및 표적외 모두)에 대한 공정한 시간 측정값을 제공한다. 변형된 HSPC에서 DSB를 평가하였고, 결과는 53BP1 면역염색 수준이 감소함에 따라 유전자 변형 수준이 높게 유지되었음을 나타내며, 이는 53BP1 신호의 감소가 시간 경과에 따른 형질감염된 세포의 손실로 인한 것이 아님을 입증한다(도 3a 내지 도 3c). 53BP1 병소/세포의 최고 수준은 형질감염 1~2일 후에 발견되었다. 또한, 형질감염 1일 후 세포의 약 50%가, 그리고 형질감염 7일 후 세포의 약 8%가 1 53BP1 병소/세포(1 DSB/세포)를 나타냈다(형질감염되지 않은 세포에서 보이는 배경 수준과 유사). BCL11A 인핸서 표적에서의 유전자 변형은 형질감염 후 1일 및 2일에 73.5% 및 78.5%였다.
변형된 HSPC에서 전위 분석. 분자 전위 분석은 변형된 HSPC로 수행하여, 잠재적 전위 이벤트를 평가하였다. 표적내 유전자좌(BCL11A 인핸서)와 표적외 절단의 모든 알려진 부위(이전에 확인된 19개) 사이에서 발생하는 전위 이벤트의 빈도를 정량화했다. 이들 중 12개는 후보 표적외 부위의 표준 MiSeq-기반 딥 시퀀싱을 통해 식별되었으며, 약 0.01% 내지 약 0.1% 범위의 인델 수준을 산출했다. 나머지 7개 부위는 울트라 딥 시퀀싱 NextSeq 플랫폼을 사용한 오버샘플링을 통해 더 작은 유전자좌 패널에 대한 보다 집중적인 평가를 통해 식별되었으며, 약 0.001% 내지 약 0.01%의 낮은 범위에서 인델률을 산출했다. 이것은 매우 민감한 접근 방식이며, 쿼리된 게놈 105개 중 1개에 근접하는 빈도로 전위 이벤트를 감지할 수 있으며; BCL11A 적혈구 인핸서의 의도된 절단 표적과 이전에 식별된 각각의 표적외 부위 사이의 상호 전위의 존재 및 수준을 쿼리하는 데 사용하였다.
따라서, ST-400 ZFN 쌍은 BCL11A 유전자의 적혈구-특이적 인핸서에 대해 고도로 특이적이며, 검출가능한 표적외 활성의 최소량만을 갖는다. 특히, MiSeq 딥 DNA 시퀀싱은 0.15% 이하의 매우 낮은 표적외 절단 수준을 보였고, NextSeq 분석은 0.01% 미만의 매우 낮은 수준의 표적외 절단을 나타냈다. 이에 비해, BCL11A 유전자의 표적화된 적혈구-특이적 인핸서에서의 인델 수준은 약 79 내지 86% 범위였다. 이러한 게놈 전체 분석은 BCL11A 표적내 유전자좌의 인델 수준이 확인된 모든 표적외 부위에서 변형 수준을 더한 것을 300배 넘게 초과함을 나타낸다. 또한, 확인된 표적외 유전자좌에 대한 문헌 검토와 함께 생물정보학 분석을 수행한 결과, 중요한 조혈 기능에 관여하는 유전자의 암호화 영역에 대한 변형의 증거가 나타나지 않았으며, 표적외 이벤트는 인간에서 조혈 악성 종양과 관련된 것으로 알려진 변형을 일으키지 않았다.
적혈구 자손에서 ST-400 ZFN 쌍에 의한 표적외 전사 효과: 최적화된 ST-400 ZFN 쌍의 표적외 전사 활성을 평가하기 위해, BCLA11A 유전자 측면에 있는 11개 유전자의 발현 프로파일을 MiSeq 딥 시퀀싱을 사용하여 분석하였다. RNA는 14일째에 형질감염된 CD34+ HSPC로부터 수집되었으며, 이때 BCL11A 유전자의 적혈구-특이적 인핸서에서의 유전자 변형 수준은 대조군과 비교하여 >50%로 정량화되었다. 형질감염된 CD34+ HSPC에서 γ-글로빈 mRNA의 수준은 약 2배 증가했으며(18s RNA로 정규화됨), 이는 BCL11A 유전자의 적혈구-특이적 인핸서에서 GATA1 결합 부위의 표적내 제거로 인한 감소된 BCL11A 발현을 반영하였다. 대조적으로, BCL11A 유전자 측면에 있는 11개 유전자의 발현 수준은 대조군 세포의 11개 유전자의 발현 수준과 유사하였다. GATA1(KLF1, SCL4A1, ZFPM1 및 ALAS2)에 의해 조절되는 4개의 다른 유전자의 발현 수준도 영향을 받지 않았다. 이러한 결과는 ZFN mRNA SB-mRENH1 및 SB-mRENH2의 활성이 BCL11A 유전자 전사의 억제 및 이에 따른 다운스트림 효과로 제한됨을 보여준다.
전위 이벤트를 감지하기 위해 사용된 방법은 DNA 정량화를 위한 표준 TaqMan 분석법의 적응이었으며(문헌[Holland et al. (1991) Proc Natl Acad Sci U.S.A. 8(16):7276-7280]), 상기 중합효소 연쇄반응(PCR)은 DNA에 어닐링 및 DNA 중합효소에 의한 후속 분해 시 형광단을 방출하는 프로브와 함께 수행된다. 손상되지 않은 프로브에서 형광단 신호는 공유 결합된 소광제와의 상호 작용을 통해 억제된다. 프로브는 PCR 프라이머에 의해 증폭되는 영역 내부를 어닐링하도록 설계되었다. 따라서 감지된 형광 신호는 샘플에 존재하는 앰플리콘의 양에 비례한다. TaqMan 프라이머는 20개 염기 길이로 설계되었으며, 약 200개 염기쌍(bp)에 걸쳐 있는 앰플리콘을 생성한다. 프라이머를 합성하고, 표준 탈염을 사용하여 정제했다. 형광 프로브는 20 bp에 걸쳐 있고, 60% GC 함량을 갖도록 설계되었다. 프로브에는 5' HEX 리포터 염료, 3' Iowa Black FQ 소광제 및 추가 내부 "ZEN" 소광제가 포함되어 배경 신호를 추가로 감소시켰다. 프로브를 HPLC 정제하였다.
쿼리된 전위 서열이 천연 인간 게놈에서 발견되지 않기 때문에, 표준 곡선을 생성하고 검정 감도를 평가하기 위해 예측된 전위 접합을 포함하는 합성 DNA 단편이 19개의 표적외 유전자좌 각각에 대해 설계될 필요가 있었다. 상응하는 프라이머 및 프로브 시약과 함께 이들 시약의 개략도가 도 4에 제공된다. BCL11A와 표적외 유래 세그먼트 사이의 각 양성 대조군 주형 내에 고유한 21 bp 서열이 삽입되어, 오염이 의심되는 경우 선의의 전위 생성물에서 시퀀싱-기반 식별을 가능하게 한다. 합성 이중-가닥 DNA 단편은 DNA 단편의 길이가 287에서 434bp 범위인 gBlocks로 구입했다. 도 4에서, 상단 패널은 BCL11A 인핸서 표적내 부위(녹색) 및 표적외 부위(오렌지색)를 포함하는 염색체 세그먼트를 나타낸다. 하단 패널은 해당 전위 생성물의 검출을 위한 양성 대조군 시약(gBlocks)을 스케치한다. 또한 TaqMan 분석에 사용된 대략적인 프라이머 및 프로브 위치도 도시된다. 각 gBlock 내의 마룬 세그먼트는 각 대조군 시약에 삽입된 고유한 서열로, 이를 실제 전위 생성물과 구별하고 잠재적인 교차-오염을 모니터링할 수 있다. 생성물 1 gBlocks는 단편의 BCL11A 영역에서 프로브되었다. 생성물 2 gBlocks는 단편의 표적외 영역에서 프로브되었다.
각각의 쿼리된 전위(생성물 1 또는 생성물 2, 도 4 참조)에 대해, 형질감염되지 않은 세포로부터의 CD34+ 게놈 DNA(gDNA)의 100,000 반수체 게놈의 맥락에서 10000, 1000, 100, 10, 3, 1, 0.1, 또는 0.01개의 합성 gBlock DNA 복제본을 포함하는 표준 곡선이 생성되었다. 표준 곡선에서 가장 낮은 두 지점(0.1 및 0.01 복제본)은 음성 신호를 생성할 것으로 예상되었으며, 대조군 DNA 정량 및 분석 견고성에 대한 추가 검증을 제공하기 위해 생성되었다. 이 분석에 대한 예상 검출 한계 범위에서 더 높은 해상도와 추가 데이터 포인트를 제공하기 위해 3-복제본 포인트가 포함되었다. 100,000개의 CD34+ gDNA 게놈을 함유하는 튜브로 옮기기 전에 담체로서 K562 세포로부터의 gDNA 5 ng/uL를 함유하는 QIAGEN DNeasy 혈액 및 조직 키트(QIAGEN)의 AE 완충액(10 mM Tris-Cl 및 0.5 mM EDTA pH 9.0)에서 10배 희석하였다.
제조사의 프로토콜에 따라 PCR 완충액, dNTP 및 DNA 중합효소를 함유하는 Bio-Rad ddPCR 2x Supermix(Bio-Rad; Hercules, CA)를 사용하여 반응을 제조하였다. 표준 곡선(gBlocks)에 대한 DNA 주형이 생성되었다. NTC(주형 대조군 없음) 샘플에는 추가된 gBlock이 없었지만, 형질감염되지 않은 CD34+ 세포로부터의 330 ng의 gDNA가 포함되었다. 각 반응은 0.5 μM 프라이머와 0.25 μM 프로브를 포함했다. QIAGEN DNeasy 혈액 및 조직 키트를 사용하여 ST-400의 3개 로트 각각의 게놈 DNA를 정제했다. 각 테스트 샘플에 대해, 표시된 로트로부터의 DNA 100,000개 반수체 게놈(330 ng)을 각 반응에 추가하여, 표준 곡선을 생성하는 데 사용된 조건과 일치시켰다. 모든 샘플 및 표준은 3회 실행하였다. TaqMan 검정은 제조사의 지침에 따라 Bio-Rad CFX 96 실시간 PCR 검출 시스템에서 실행하였다. 사용된 PCR 프로그램은 하기와 같다: 95℃에서 10분, 이후 94℃에서 30초, 59℃에서 1분을 50회 반복했다.
MiSeq 분석을 통해 확인된 BCL11A 표적내 부위와 표적외 12개 유전자좌 사이의 전위의 증거에 대해 ZFN-처리된 CD34+ 세포로부터의 게놈 DNA를 조사하기 위해 TaqMan 검정을 수행하였다. 이를 달성하기 위해, RNA 형질감염 및 발현을 위한 임상 조건을 사용하여 동원된 말초 혈액의 CD34+ 세포를 ST-400 ZFN으로 처리하였다. 2일 후, gDNA를 단리하고 상호 전위 평가를 위해 제출했다(생성물 1 및 생성물 2). 표 3에 요약된 결과는 104개 내지 106개 반수체 게놈마다 1개 전위 범위의 빈도를 갖는, 7개의 표적외 부위에 대해 매우 낮은 전위 신호를 나타냈다. 나머지 부위는 전위의 증거를 보여주지 않았다.
[표 3]
Figure pct00006
실시예 3: 변형된 HSPC의 임상 연구
TDT를 치료하기 위해 변형된 HSPC를 사용하는 안전성을 시험하기 위한 연구가 인간에서 수행되었다. 또한, 변형된 HSPC의 효능에 대한 평가를 평가하였다. 탐색 목적은 또한 변형된 세포로 처리한 후 BCL11A 유전자의 적혈구-특이적 인핸서에서 유전자 변형 특성(% 및 내구성)을 평가하고, β-지중해빈혈 및 HSCT와 관련된 생화학적, 영상화, 기능적 및 골수 평가에 변형된 세포가 미치는 영향 평가를 포함했다.
연구에 대한 포함 기준은 연구를 위한 선별 전 2년 동안 연간 기준으로 1년에 8회 이하의 문서화된 PRBC 수혈 이벤트를 갖는 TDT의 임상 진단을 받은 18세 내지 40세 사이의 6명의 대상체(β0/β0 또는 비- β0/β0)를 포함하였다. 또한, β-지중해빈혈의 확인된 분자 유전 진단이 필요했다. 대상체에는 피임법을 사용하려는 남성과 여성이 포함되었다.
연구에서 대상체에 대한 주요 배제 기준은 하기를 포함하였다: 자가 또는 동종 인간 줄기 세포 이식 또는 고형 장기 이식의 이전 병력; 임상적으로 유의하게 변경된 산소 친화도와 관련된 γ-글로빈 대립유전자 변이체(예를 들어, Hb F-Poole, Hb F-M Osaka, Hb F-La Grange, Hb F-Cincinnati 및 대형 결실, 예컨대 γβ-지중해빈혈 또는 εγδβ-지중해빈혈을 포함하지만, 이에 제한되지 않음); 성분채집에 대한 의학적 금기사항; 거대 비장비대 및 절대 호중구 수(ANC) ≤1,000/μL; 혈청 크레아티닌 ≥2.0 mg/dL로 정의되는 신장 기능장애; 이전 12개월 또는 스크리닝에서 얻은 간 생검에 기초한 가교 섬유증, 간경변 또는 활동성 간염; 지난 30일 동안 금지된 약물 치료; 임상적으로 유의한 활성 박테리아, 바이러스, 진균 또는 기생충 감염; 선별 검사실 검사에 근거한 HIV 또는 활동성 HBV 또는 HCV 감염의 증거 진단; 카르노프스키(Karnofsky) 성능 척도 ≤60; 예측 또는 임상적으로 유의한 제한의 수정된 DLCO ≤50%; 스크리닝 폐 기능 검사(PFT)에 기초한 폐 질환; 울혈성 심부전(NYHA 클래스 III 또는 IV); 불안정 협심증, 조절되지 않는 부정맥 또는 좌심실 박출률(LVEF) <40%., 스크리닝 ECG를 기반으로 한 QTcF >500 msec, 스크리닝 MRI를 기반으로 한 심장 T2* MRI <10 msec; 심각한 출혈 장애의 병력; 통제되지 않는 발작의 현재 진단; 지난 5년 동안 활동성 악성종양의 이력(비흑색종 피부암 또는 제자리 자궁경부암 허용); 혈액 악성종양의 임의의 병력, 또는 연구 후보자에서 음성 검사 결과가 없는 암 소인 증후군의 가족력; 연구 순응을 방해할 수 있는 활성 알코올 또는 약물 남용의 이력; 치료 불순응의 이력; 현재 연구용 연구 약물을 사용하는 다른 임상 시험에 참여 중이거나, 스크리닝 방문 전 연구용 제품의 90일 이내 또는 5개 미만의 반감기 이내에 이러한 시험에 참여함; 유전자 요법을 사용한 이전 치료; 부술판 또는 연구 약물 부형제(인간 혈청 알부민, DMSO 및 Dextran 40)에 대한 알레르기 또는 과민증; 또는 대상체를 연구 참여에 부적합하게 만드는 임의의 기타 이유.
연구 설계
연구는 수혈-의존성 β-지중해빈혈(TDT)이 있는 대상체에 대해 수행되었다. 등록 시, 적격 대상체는 자가 CD34+ HSPC를 수집하기 위해 성분채집을 받는다. CD34+ HSPC를 ZFN mRNA SB-mRENH1 및 SB-mRENH2로 형질감염시켜 생체 외 처리하여 연구 약물을 제조하였다. 대상체는 변형된 HSPC를 주입하기 전에 정맥내(IV) 부술판으로 컨디셔닝 요법을 받는다. CD34+ HSPC는 G-CSF 및 플레릭사포를 사용한 치료를 사용하여 각 대상체에서 동원되었다. 성분채집에 의한 동원의 5일 및 6일(구조 치료를 확보하기 위해 필요한 경우 +/- 7일)에 각각의 대상체로부터 동원된 CD34+ HSPC를 수집하였다. CD34+ HSPC는 G-CSF(동원 1~6일째) 및 플레릭사포(동원 4일, 5일 및 6일째) 투여 후 각 대상체에서 동원되었다(도 5 참조). 동원된 CD34+ HSPC를 연속 2일(예를 들어, 5일 및 6일)에 성분채집에 의해 각 대상체로부터 수집하고, 3일째(예를 들어, 구조 치료를 확보하기 위한 7일)에 총 25 x 106 CD34+ HSPC/kg의 표적을 사용하여 조작되지 않은 백업 이식편을 수집했지만, 더 적은 수율도 허용된다. 필요한 경우, 2주 이상 후에 두 번째 동원 및 성분채집 주기가 수행되었다.
각 대상체의 수집된 세포를 2개의 부분으로 나누었는데, 한 부분은 변형된 HSPC 약물 제조를 위한 부분이고, 다른 부분은 구조 치료가 지시되는 경우 따로 보관되어 있다.
구조 치료 부분은 최소 2.5 x 106 CD34+ HSPC/kg을 포함한다. 구조 치료 부분은 변형되지 않은 상태로 동결보존되었고, 조혈 재구성이 지연되거나 무형성이 있는 이식편 실패의 경우에 이용 가능하도록 연구 장소에 보관되었다. 첫 번째 성분채집 주기가 변형된 HSPC 약물 제조 및 구조 치료에 필요한 최소 수의 CD34+ HSPC를 동원하지 않은 경우, 동원 절차를 반복할 수 있다. 두 번째 성분채집 시기의 선택은 대상체의 임상 상태에 따라 조사자의 재량에 있었지만, 초기 성분채집 후 2주(≥2주)보다 빠르지 않았다.
구조 치료의 제거 및 보관 후, 대상체의 동원 및 수확된 세포의 나머지를 택배로 GMP 제조 시설로 보냈다. CD34+ 세포 선택 후 ZFN mRNA SB-mRENH1 및 SB-mRENH2로 형질감염시켜 BCL11A 유전자의 적혈구-특이적 인핸서를 파괴하여 변형된 HSPC 연구 약물을 생성했다. 변형된 HSPC는 기준선 방문 절차까지(기준선 방문 절차 포함) 모든 임상 프로토콜 세그먼트가 완료되고 대상체가 주입 준비가 될 때까지 동결보존 및 저장되었다. 변형된 HSPC는 제어 속도 냉동기를 사용하여 50 mL CryoMACS® 냉동 백(충전 부피 약 10~20 mL, 총 세포 수 약 1.0 x 108~2.0 x 108개)에 동결 보존되었다. 세포 수율이 단일 백의 용량을 초과하는 경우 여러 냉동 백을 사용했다. 주입 백은 임상 연구 센터로 배송될 준비가 될 때까지 제조 시설에서 증기상 액체 질소(< -150℃)에 보관되었다.
임상 사용을 위해 변형된 HSPC를 방출한 후, 대상체는 전용 이식 유닛에서 IV 부술판을 시작하기 위해 병원에 입원했다. 대상체들은 0일째에 변형된 HSPC 주입 전, -6일 내지 -3일째에 4일 동안(총 용량 12.8 mg/kg, 자가 이식 치료의 표준으로 간주됨) 부술판(3.2 mg/kg/일; 중심 정맥 카테터를 통한 IV)의 골수 파괴 요법을 받았다. IV 부술판은 연구 센터 관행 또는 지침에 따라 1일 1회(총 4회 투여) 또는 6시간마다(총 16회 투여) 투여될 수 있다. 첫 번째 투여 후, IV 부술판 용량은 약동학 샘플링 및 연구 센터 관행에 따라 조정되어 일일 용량의 경우 4,000~5,000 mmol*분의 곡선아래면적(AUC) 또는 16,000~20,000 mmol*분의 AUC 총 요법 목표의 경우 6시간 투여마다 1,000~1,250 mmol*분의 AUC를 목표로 한다. IV 부술판 약동학 표적화는 안전성 모니터링 위원회(SMC)와 논의한 후 이전 대상체에 대한 경험을 기반으로 후속 대상체에 대해 변형될 수 있다. 투여 4일 후 부술판의 제거를 결정하기 위한 치료 약물 모니터링은 요구되지 않았지만, 연구 센터 관행에 따라 조사자의 재량에 따라 수행될 수 있다(도 5 참조).
변형된 HSPC 주입: 정맥 내 부술판을 사용한 골수파괴 컨디셔닝(총 요법 표적화 노출 = 약동학 샘플링에 기초하여 확인 및/또는 조정된 바와 같이 16,000 내지 20,000 μmol*분) 후, 환자는 중심 정맥 카테터 주입에 의한 해동된 CD34+ HSPC("ST-400") 제품을 제공받았다(도 5). 동결된 변형 HSPC를 해동 및 주입하여, 해동 및 주입의 전체 과정이 약 15분 이내에 완료되도록 하였다. 동결 변형 HSPC의 부피는 대상체의 체중에 의해 결정되었다. 바이탈 징후(혈압, 체온, 심박수, 호흡수 및 맥박 산소측정기)는 주입 전과 주입 후에 모니터링되었다.
일단 연구 약물이 제공되면, 대상체는 일상적인 실험실 작업에 대해 모니터링되었다. 또한, 임의의 유해 사례에 대한 평가가 수행될 것이며, 유전자 변형에 대해 혈액 세포를 분석하였다. HbF 수치도 평가하고, 내분비 기능을 분석하고, MRI를 수행하여, 철분 부하를 평가할 것이다. 조혈 재구성의 역학 및 성공, 컨디셔닝 후 입원 기간, 혈액 악성종양의 잠재적 발달에 대한 선별, Short Form Health Status Survey(SF-36 Survey)에 의한 삶의 질, 카르노프스키 성능 척도에 의한 전반적인 기능, 성분채집 절차의 효율, ST-400 제품의 % 인델과 ST-400 주입 후 골수 및 혈액에서 검출된 인델 간의 차이가 평가될 것이다.
AE는 약물과 관련된 것으로 간주되는지 여부에 관계없이 인간에서 약물의 사용과 관련된 임의의 부적절한 의학적 발생이다. AE는 이 연구 동안 중증도가 증가하거나 발생하는 하기 사례들 중 하나를 포함할 수 있다: 연구 중인 병태, 임상적으로 유의한 실험실 이상 또는 약물이나 입원이 필요한 실험실 이상과 관련이 있거나 관련이 없는 것으로 생각되는, 기준선 상태(즉, 스크리닝 전)와 비교하여 특성, 중증도 또는 빈도가 악화되는 임의의 징후, 증상 또는 신체 검사 소견. 비정상적인 실험실 결과는 유해 사례에 대한 공통 용어 기준(Common Terminology Criteria for Adverse Events, CTCAE) 5.0 기준에 따라 등급이 매겨지며, 등급 1 또는 2의 임상 실험실 이상은 조사자가 임상적으로 유의하다고 간주하는 경우에만 AE로 보고되어야 하며, 기준선으로부터의 중증도의 증가를 나타내는 등급 3 및 4의 임상 실험실 이상이 CRF에 이미 보고된 진단과 관련이 없는 경우 AE로 보고되어야 하며, 과다 복용, 남용, 금단 현상, 치료에 대한 민감성 또는 독성, 동시 질병, 부상 또는 사고의 결과로 발생하는 것을 포함하여 치료 사용과 관련된 모든 사례들이다.
SAE는 하기 결과 중 임의의 것을 초래하는 임의의 AE이다: 사망, 생명을 위협하는 사례(즉, 대상체를 즉각적인 사망 위험에 놓이는 사례); 그러나 더 심각한 형태로 발생했다면 사망, 입원 환자 입원 또는 기존 입원의 연장, 지속적이거나 심각한 무능력 또는 정상적인 생활 기능 수행 능력의 상당한 장애, 노출된 대상체의 자손의 선천적 기형/선천적 결함, 또는 의학적으로 중요한 사례를 유발할 수 있는 사례는 여기에 포함되지 않는다.
2차 및 탐색적 사례의 평가: HbF 분획의 기준선 수준(g/dL 단위의 A 및 F) 및 퍼센트 HbF는 IV 부술판의 첫 번째 투여 당일 또는 그 이전의 마지막 평가에 기초하여 결정될 것이다. HbF 수준 및 기준선으로부터의 변화는 연구 방문에 의해 요약될 것이다.
PRBC 수혈의 기준선 빈도 및 양은 스크리닝 전 2년 기간을 기준으로 한다. 수혈의 빈도와 양은 연구 기간 및 전체에 따라 연간화되고, 기준선 값과 기술적으로 비교된다.
주입 후 변형된 HSPC 이종성 모니터링: 주입 후, 변형된 HSPC는 인델 프로파일에 의해 평가된 바와 같이 이식 효율 및 변형 이종성을 결정하기 위해 환자에서 모니터링될 수 있다. 대상체 세포 샘플은 말초 혈액, 골수 흡인물 또는 기타 조직 샘플(바람직하게 약 5 x 104 내지 1 x 107 세포)로부터 정제될 수 있고, 게놈 DNA 단리 대상이 될 수 있다. 절단 부위 주변 영역은 표준 조건에서 PCR에 의해 증폭된다. 그런 다음 MiSeq(Illumina)를 사용하여 반응을 분석할 수 있도록 두 번째 PCR 라운드를 수행하여 어댑터를 추가한다. 대상체 세포로부터의 시퀀싱 데이터를 표준 곡선과 비교하여 퍼센트 인델을 결정한다.
프로토콜은 환자 2 및 3이 이전 환자가 호중구 및 혈소판 이식을 나타낼 때까지 화학요법 컨디셔닝을 시작할 수 없다고 지시했으며; 환자 3의 성공적인 이식 후 환자 4~6은 화학요법 컨디셔닝을 시작할 수 있었다. 환자는 안전성과 효능에 대해 모니터링되었다. 이 연구는 3년 동안의 추적 관찰을 포함하며, 그 후 환자는 장기 안전성 추적 연구에 참여할 수 있다.
안전성 및 내약성은 유해 사례(AE) 및 심각한 AE(SAE)의 발생률에 의해 평가되었다. 조혈 재구성의 성공 및 동역학은 호중구(ANC ≥500 세포/μL) 및 혈소판(≥20,000 세포/μL 수혈 미지원) 이식에 의해 평가되었다. 새로운 조혈 클론을 감시하기 위해 시간이 지남에 따라 분자 수준에서 표적내 인델 패턴을 추적했다. ST-400 주입 후 조혈 세포, 태아 헤모글로빈 수치 및 수혈 요건에 대한 표적 인델의 존재에 대해 환자를 모니터링하고: 이식 후 헤모글로빈 수혈 역치는 임상 현장의 표준 관행에 따라 결정되었다(환자 1 및 2: <8 g/dL; 환자 3: <7 g/dL).
결과
현재까지 자가 ST-400 제품은 6명의 환자 중 5명을 위해 제조되었으며, 그 중 3명은 ST-400을 투여받았다(표 A). 안전성 및 유효성 데이터; 이들 환자들에 대한 유해 사례, 태아 헤모글로빈 생성, 인델 표시 및 PRBC 수혈 요건은 시간이 지남에 따라, 잠재적으로 12개월 이상 동안 발전할 것이다.
[표 A]
Figure pct00007
1/2상 연구에서 ST-400으로 치료된 첫 번째 환자(환자 1)는 가장 중증인 형태의 수혈-의존성 베타 지중해빈혈(β0/β0)을 갖는다. 연구에서 치료를 받기 2년 전에, 이 환자는 격주로 패키징된 적혈구(PRBC) 수혈을 받았다. ST-400 주입 동안, 환자 1은 제품에 존재하는 동결보호제와 관련된 것으로 간주되는 일시적인 알레르기 반응을 경험했다. 그 후, 이식 후 임상 과정은 일상적이었고, 환자는 주입 후 각각 2주 및 4주 이내에 호중구 및 혈소판 회복을 보였다.
환자 1은 변형된 HSPC 주입 2주 후에 PRBC 수혈을 받았고, 다음 6주 동안 추가 PRBC 주입이 필요하지 않았다. 변형된 HSPC 주입 후 7주째에, 총 헤모글로빈 수치는 약 9 g/dL에서 안정적으로 유지되었고, 태아 헤모글로빈 수치는 계속 증가한다(주입 시점에 총 헤모글로빈의 약 1%에서 31%로 증가한다(도 6a 및 도 6b 참조). 인델(DNA의 표적 서열에서 생성된 삽입 또는 결실)이 순환하는 백혈구에서 검출되었으며, 이는 BCL11A 유전자의 성공적인 편집 및 BCL11A 적혈구계 특이적 인핸서의 파괴를 나타내며, 이는 적혈구에서 내인성 태아 헤모글로빈 생산을 상향 조절한다.
환자 1에서 호중구 및 혈소판 이식이 입증된 후, 환자 2 및 3도 상기 기재된 바와 같이 치료하였다. 환자 1, 2 및 3은 모두 중증의 베타 지중해빈혈 유전자형을 가지고 있다: 중증 β+ IVS-I-5 (G>C) 돌연변이에 대하여 동형 접합성인 β0/β0, (환자 1 및 3) 또는 중증 IVS-II-654 (C>T) 돌연변이를 포함하는 β0/β+ 유전자형(환자 2).
환자 1 및 환자 2는 신속한 조혈 재구성을 경험하였다. 환자 1은 안정적인 총 헤모글로빈에 기여하는 태아 헤모글로빈(HbF) 분획이 증가했다. 총 6주 동안 PRBC 수혈을 받지 않은 환자 1은 이후 간헐적 수혈이 필요했다. 환자 2는 주입 후 90일 동안 관찰된 HbF 수치 상승을 보였다. 환자 1과 2의 경우 순환하는 백혈구에 표적 삽입 및 결실(인델)이 존재했다. 환자 3은 ST-400 제조를 막 완료했으며, HbF 수준은 주입 후 결정될 것이다.
환자 1은 조사자가 제품과 관련된 것으로 간주하는, ST-400 주입 동안 과민증의 중증의 유해 사례(SAE)를 경험했다. 이 사례는 치료로 해결되었다. ST-400과 관련된 다른 SAE는 보고되지 않았다. 클론 조혈은 관찰되지 않았다.
변형된 줄기 세포가 골수를 다시 채우고 조혈을 유도함에 따라 정기적인 추적 관찰(조혈 재구성, 태아 헤모글로빈 수치, 순환 백혈구의 인델 등 평가)이 시간 경과에 따라(예를 들어, 12개월 이상) 수행되고, HbF 수준이 증가하고 환자의 수혈 필요성이 감소하거나 제거된다.
동원 및 성분채집 결과
일일 성분채집 전 말초 혈액 CD34+ 수는 25에서 118 세포/μL까지 다양했다. 환자 1은 첫 번째 ST-400 로트에서 낮은 세포 용량과 CFU 효능으로 인해 2주기의 동원 및 성분채집을 받았다. 백업 이식편은 첫 번째 주기부터 동결보존되었다. 환자 2, 3, 4 및 5는 한 주기의 동원 및 성분채집을 받았으며, 이로부터 이들의 ST-400 로트를 제조하고 백업 이식편을 동결 보존하였다.
제품 특성 및 조혈 재구성
ST-400 제품의 표적내 인델은 하기 표 B에 나타낸 바와 같이 23~80% 범위였다.
[표 B]
Figure pct00008
도시된 바와 같이, 가장 낮은 인델 값은 환자 1에서 나타났으며, 그에 대한 편집 효율은 2개의 별도로 제조된 로트에서 거의 25%였다. 임상 규모에서 동일한 제조 공정을 사용하여, 12명의 건강한 공여자로부터의 CD34+ 세포를 효율적으로 편집했다: 중앙값 표적 인델, 71%; 범위, 59%~83%. ST-400 생존 유핵 세포 용량은 4.5~11.4 x 106 세포/kg이었다. 환자는 14~22일 내에 호중구 이식을, 22~35일 내에 혈소판 이식을 나타냈다.
안전성
3명의 투여된 환자에서 인델 프로파일링에 의한 시간 경과에 따른 표적내 인델 패턴 모니터링에 의해 새로운 클론 조혈이 관찰되지 않았다. 도 7a 내지 도 7c를 참고한다.
9개월째에 환자 1; 6개월째의 환자 2) 및 56일째의 환자 3에서의 관찰을 통해, 임의의 시점에서 고유한 인델의 최대 빈도는 각각 검출된 모든 인델의 16%, 16% 및 14%였다.
보고된 심각한 유해 사례(SAE)는 치료된 환자에 대해 표 C에 제시되어 있다.
[표 C]
Figure pct00009
나타낸 바와 같이, ST-400 약물 제품에 기인한 단 하나의 SAE가 보고되었고; 과민성의 이 SAE는 ST-400 주입 중에 발생했으며, 주입이 끝날 때 해결되었으며, 제품 동결보호제, DMSO와 관련된 것으로 간주되었다.
그 이외에는, 보고된 AE는 동원, 성분채집 및 골수제거 부술판 컨디셔닝의 알려진 독성과 일치했다.
주입후 변화
상기 기재된 바와 같이, ST-400 이식 후, 태아 헤모글로빈 수치는 모든 3명의 환자에서 기준선과 비교하여 증가하였고(도 8), 환자 1 및 3은 환자 2보다 더 큰 유도를 나타내며, 이는 환자 2가 가장 낮은 세포 투여량과 CFU 효능을 갖는 ST-400 제품을 받았다는 사실과 일치한다.
환자 1에서, 인델은 9개월까지 말초 백혈구에서 지속되었고, 90일째 비분획 골수 세포는 6% 인델을 나타냈다. 6주의 초기 무수혈 기간 후, 이 환자는 간헐적 PRBC 수혈을 재개했으며, 이식 후 약 8개월에 수혈된 예상 연간 PRBC 단위가 33% 감소했다.
환자 2에서, 인델은 6개월까지 말초 백혈구에서 지속되었고, 90일째 비분획 골수 세포는 32% 인델을 나타냈다. 환자는 간헐적 PRBC 수혈을 받고 있다.
환자 3에서, 인델이 56일까지 말초 백혈구에서 지속되었다. 90일에 골수 흡인 샘플의 평가는 아직 이용 가능하지 않다. 7주의 초기 무수혈 기간 이후, 환자는 주입 후 62일째부터 시작하여 2회의 PRBC 수혈을 받았다.
환자 1~3의 요약
환자 1 내지 3의 치료 및 결과는 하기에 요약되어 있다. 각 환자에 대해, CD34+ 세포 용량은 하기와 같이 계산되었다: CD34+ 투여량 = [총 세포 투여량] x [CD34+ %]. 예를 들어, 컬럼 2의 총 세포 투여량 및 컬럼 3의 CD34+%를 나타내는 표 B를 참조한다.
환자 1
환자 1은 TDT의 가장 중증의 형태인 β0/β0 유전자형을 갖고, 연구에 등록하기 전에 27번의 연간 패키징된 적혈구(PRBC) 사례를 가졌다. 환자는 첫 번째 주기에서 달성된 낮은 세포 용량과 효능으로 인해 두 번째 주기의 동원 및 성분채집을 받았다. 두 ST-400 로트에서, 편집 효율은 약 25%로 연구에 등록한 다른 환자 및 임상 규모로 제조된 12개의 시험-실행 로트(71% 중간 편집 효율)보다 낮았다.
주입된 ST-400 제품의 표적내 인델은 23%였고, CD34+ 세포 용량은 5.4 x 106 세포/kg이었다. 인델은 90일째에 미분획 골수 세포에 존재했고, 9개월째까지 말초 백혈구에서 지속되었다. ST-400 주입 후, 태아 헤모글로빈 수치는 56일째에 약 2.7 g/dL로 증가했으며, ASH 데이터 컷 당시 가장 최근 측정인 39주차에 0.9 g/dL의 기준선과 비교하여 상승된 상태를 유지했다. 초기 6주의 무수혈 기간 후, 환자는 간헐적 PRBC 수혈을 재개했으며, 이식 이후 수혈된 연간 PRBC 단위는 전체적으로 33% 감소했다.
환자 2
환자 2는 중증의 β+ IVS-I-5(G>C) 돌연변이에 대해 동형접합성이고, 연구에 등록하기 전에 18번의 연간 PRBC 사례를 가졌다. ST-400 제품의 표적내 인델은 73%였으며, CD34+ 세포 용량은 3.9 x 106 세포/kg으로, 5명의 등록된 환자를 위해 제조된 ST-400 로트 전체에서 가장 낮았다. 인델은 90일째에 미분획 골수 세포에 존재했고, 6개월째까지 말초 백혈구에서 지속되었다. ST-400 주입 후 태아 헤모글로빈 수치는 기준선과 비교하여 증가했지만 26주까지 <1 g/dL이었으며, 현재까지 치료된 3명의 환자에서 가장 낮은 유도 수준이 관찰되었다. 환자는 현재 간헐적 PRBC 수혈을 받고 있다.
환자 3
환자 3은 중증의 IVS-II-654(C>T) 돌연변이를 포함하는 β0/β+ 유전자형을 갖고, 연구에 등록하기 전에 15회의 연간 PRBC 사례를 가졌다. ST-400 제품의 표적내 인델은 54%였고, CD34+ 세포 용량은 10.3 x 106 세포/kg이었다. ASH 데이터 컷 당시에, 인델은 56일까지 말초 백혈구에서 지속되었다. ST-400 주입 후, 태아 헤모글로빈 수치는 기준선과 비교하여 증가했으며, 90일째에 최근 측정치 2.8 g/dL로써 계속 상승하고 있었다. 7주의 초기 무수혈 기간 이후, 환자는 주입 후 62일째에 시작되는 2회의 PRBC 수혈을 받았다.
추가 환자 및 환자 1~3에 대한 이들 연구 및 추가 연구는 PRBC와 같은 추가 요법의 필요성을 제거하는 것을 포함하는 TDT의 치료가 본원에 기재된 바와 같이 유전적으로 변형된 세포(ST-400)의 투여(주입) 후에 달성된다는 것을 입증한다.
본원에 기재된 모든 특허, 특허 출원, 및 공보들은 이들의 전체내용이 참조로서 본원에 포함된다.
비록 본 개시 내용이 이해의 명확성을 목적으로 설명 및 예시로서 일부 상세히 기재되어 있지만, 당업자에게는 본 개시 내용의 사상 또는 범주로부터 벗어나지 않고 다양한 수정 및 변경이 이루어질 수 있다는 것이 명백할 것이다. 따라서, 상기 설명 및 실시예는 제한적인 것으로 간주되어서는 안된다.
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Claims (41)

  1. 유전적으로 변형된 세포로서,
    mRNA가 ZFN 쌍을 암호화하는, SB-mRENH1 mRNA 및 SB-mRENH2 mRNA를 포함하는 적혈구(RBC) 전구체 세포; 및
    ZFN 쌍에 의한 절단 후에 이루어진 게놈 변형
    을 포함하며, 상기 변형은 BCL11A 유전자가 세포에서 불활성화되도록 내인성 BCL11A 인핸서 서열 내에 있는, 유전적으로 변형된 세포.
  2. 제1항의 유전적으로 변형된 세포 및 이로부터 유래된 세포를 포함하는 조성물.
  3. 치료를 필요로 하는 대상체에서 베타-지중해빈혈(β-지중해빈혈)을 치료하는 생체 외 방법으로서, 상기 방법은:
    대상체 내 태아 헤모글로빈(HbF) 생산이 증가하고 β-지중해빈혈의 하나 이상의 임상 증상이 감소, 개선 또는 제거되도록 제2항에 따른 조성물을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 생체 외 방법.
  4. 제3항에 있어서,
    상기 베타-지중해빈혈이 수혈-의존성 β-지중해빈혈인, 생체 외 방법.
  5. 제3항 또는 제4항에 있어서,
    총 헤모글로빈(Hb)의 그램/dL 혈장 및/또는 퍼센트 HbF에서 임상 실험실 헤모글로빈 분획의 기준선으로부터의 변화가 대상체에서 달성되는, 생체 외 방법.
  6. 제3항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 헤모글로빈 인자가 성인 헤모글로빈(HbA) 및/또는 태아 헤모글로빈(HbF)인, 생체 외 방법.
  7. 제3항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 대상체는 β0/β0 또는 β0/β+인, 생체 외 방법.
  8. 제3항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 지중해빈혈-관련 질병 바이오마커의 수준이 치료 후에 변경되는, 생체 외 방법.
  9. 제8항에 있어서,
    상기 바이오마커가 철분 대사의 변화; 및/또는 에리트로포이에틴, 합토글로빈 및/또는 헵시딘 수준의 변화인, 생체 외 방법.
  10. 제3항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서,
    철분 과부하와 관련되거나 기준선 수혈 요법과 관련된 임상 증상이 개선되거나 제거되는, 생체 외 방법.
  11. 제10항에 있어서,
    대상체에서 내분비 기능장애의 감소는 갑상선 호르몬, IGF-1, 모닝 코르티솔, 부신피질자극 호르몬(ACTH), HbA1C 및/또는 비타민 D 수준의 수준 및/또는 활성을 결정함으로써 분석되는, 생체 외 방법.
  12. 제3항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서,
    대상체에서 RBC 수혈 및 주입 혈소판 수혈, 정맥내 면역글로빈(IVIG) 수혈, 혈장 수혈 및/또는 과립구 수혈에 대한 필요성이 감소 또는 제거되는, 생체 외 방법.
  13. 제3항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서,
    대상체에서 감소 또는 제거된 임상 증상이 간 질환인, 생체 외 방법.
  14. 제3항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서,
    대상체에서 감소되거나 제거된 임상 증상이 심장 이상인, 생체 외 방법.
  15. 제3항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서,
    대상체에서 감소되거나 제거된 임상 증상이 골다공증 및/또는 골절인, 생체 외 방법.
  16. 제3항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서,
    기준선 적혈구생성이 조성물의 투여 후 대상체에서 변화되는, 생체 외 방법.
  17. 제16항에 있어서,
    조성물의 투여 후 대상체에서 증식이 감소되거나 제거되는, 생체 외 방법.
  18. 제16항 또는 제17항에 있어서,
    미성숙 및/또는 비-전형적인 형태를 갖는 세포의 수가 대상체에서 감소되는, 생체 외 방법.
  19. 제3항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서,
    대상체에서 F 세포의 수 및 퍼센트가 조성물의 투여 후에 변형되는, 생체 외 방법.
  20. 제3항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서,
    유전적으로 변형된 세포가 자가 또는 동종인, 생체 외 방법.
  21. 제3항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서,
    BCL11A-유전적으로 변형된 세포가 하나 이상의 추가의 유전적 변형을 추가로 포함하는, 생체 외 방법.
  22. 제21항에 있어서,
    유전적으로 변형된 세포가 동종 세포이고, 하나 이상의 추가적인 유전적 변형이 하나 이상의 자가-마커 또는 항원의 불활성화를 포함하는, 생체 외 방법.
  23. 제3항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서,
    유전적으로 변형된 세포가 대상체로부터 단리된 조혈모 세포인, 생체 외 방법.
  24. 제23항에 있어서,
    조혈모 세포가 CD34+ 조혈 줄기 또는 전구체 세포(HSC/PC)이고, CD34+ HSC/PC는 단리 전에 하나 이상의 용량의 G-CSF 및/또는 하나 이상의 용량의 플레릭사포에 의한 치료로 각 대상체에서 동원되는, 생체 외 방법.
  25. 제24항에 있어서,
    적어도 25 x 106 CD34+ HSPC/kg이 대상체에서 동원되고, 상기 동원된 세포는 하나 이상의 성분채집 주기에 의해 수확되는, 생체 외 방법.
  26. 제3항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서,
    유전적으로 변형된 세포를 포함하는 조성물을 대상체에게 투여하기 전에, BCL11A 내의 삽입 및/또는 결실에 대해 조성물의 세포를 평가하는 단계를 추가로 포함하는, 생체 외 방법.
  27. 제3항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서,
    유전적으로 변형된 세포를 포함하는 조성물을 투여하기 전에 대상체에게 하나 이상의 골수절제 병태 작용제를 1회 이상 투여하는 단계를 추가로 포함하는, 생체 외 방법.
  28. 제27항에 있어서,
    상기 골수절제 작용제는 부술판을 포함하고, 추가로:
    부술판의 정맥내(IV) 투여는 1회 이상 동안 0.5 내지 5 mg/kg이고;
    부술판의 IV 투여는 3.2 mg/kg/일이고,
    0일에 유전적으로 변형된 세포를 포함하는 조성물의 주입 전 -6 내지 -3일에 주입 전 12.8 mg/kg의 총 용량을 4일 동안 중심 정맥 카테터를 통한 IV; 또는
    부술판의 IV 투여는 1일 1회 또는 6시간마다인, 생체 외 방법.
  29. 제3항 내지 제28항 중 어느 한 항에 있어서,
    대상체에게 투여되는 유전적으로 변형된 세포의 용량이 3 x 106 세포/kg 내지 20 x 106 세포/kg인, 생체 외 방법.
  30. 제3항 내지 제29항 중 어느 한 항에 있어서,
    대상체에게 투여된 유전적으로 변형된 세포가 대략 1 x 107 세포/mL의 농도에서 백(bag) 당 대략 1.0~2.0 x 108 세포로 제형화되는, 생체 외 방법.
  31. 제3항 내지 제30항 중 어느 한 항에 있어서,
    유전적으로 변형된 세포는 투여 전에 동결보존되고, 해동 후 15분 이내에 대상체에게 투여되는, 생체 외 방법.
  32. 제3항 내지 제31항 중 어느 한 항에 있어서,
    유전적으로 변형된 세포의 투여 전, 투여 중 및/또는 투여 후에 대상체의 바이탈 징후를 모니터링하는 단계를 추가로 포함하는, 생체 외 방법.
  33. 제3항 내지 제32항 중 어느 한 항에 있어서,
    유전적으로 변형된 세포를 투여하기 전에 대상체에서 헤모글로빈, 호중구 및/또는 혈소판 수준을 평가하여 대상체 내 헤모글로빈의 기준선 수준을 결정하는 단계를 추가로 포함하는, 생체 외 방법.
  34. 제33항에 있어서,
    유전적으로 변형된 세포의 투여 후 대상체 내 헤모글로빈, 호중구 및/또는 혈소판 수준이 투여 후 몇 주 또는 몇 개월 동안 기준선 수준과 비교하여 증가하거나 안정하게 유지되는, 생체 외 방법.
  35. 제3항 내지 제34항 중 어느 한 항에 있어서,
    대상체는 유전적으로 변형된 세포의 투여 전 및/또는 후에 하나 이상의 패킹된 적혈구(PRBC) 수혈을 받는, 생체 외 방법.
  36. 제3항 내지 제35항 중 어느 한 항에 있어서,
    대상체에서 골수 이식, 혈액 성분 및/또는 철분 킬레이트 요법 PRBC 수혈과 같은 추가 요법에 대한 필요성이 감소되거나 제거되는, 생체 외 방법.
  37. 제36항에 있어서,
    추가 요법에 대한 필요성이 유전적으로 변형된 세포의 투여 후 1~20일 이내에 감소되거나 제거되는, 생체 외 방법.
  38. 제3항 내지 제37항 중 어느 한 항에 있어서,
    대상체는 대상체 내 이식편의 안정성을 모니터링하기 위해 주입된 세포의 인델 프로파일과 비교하여, 투여 후 시간 경과에 따라 모니터링되어 말초 혈액 샘플, 골수 흡인물 또는 다른 조직 공급원으로부터 단리된 세포의 인델 프로파일을 결정하는, 생체 외 방법.
  39. 제38항에 있어서,
    세포의 인델 프로파일은 대상체에 투여되기 전에 모니터링되는, 생체 외 방법.
  40. CryoStor® CS-10 냉동매질에서 제형화된 제2항에 따른 조성물을 포함하는 패키지를 포함하는 제조 물품.
  41. 제40항에 있어서,
    각 백은 대략 1 x 107 세포/mL의 농도로 백당 대략 1.0~2.0 x 108 세포를 함유하는, 제조 물품.
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