TW202102665A - 治療β-地中海貧血症之方法 - Google Patents

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Abstract

本文描述治療β-地中海貧血症之方法及組成物。

Description

治療β-地中海貧血症之方法
本發明是關於治療β-地中海貧血症之方法及基因療法。
β-地中海貧血症是一種遺傳性貧血症，特徵在於β-球蛋白鏈合成不存在或有缺陷(Higgs & Engel (2012)Lancet 379(9813):373-83)。這個缺陷導致球蛋白鏈生成失衡，以及血紅素(由兩個α-球蛋白鏈和兩個β-球蛋白鏈組成)減少。球蛋白鏈失衡的結果是，在紅血球(RBC)或RBC前驅細胞中形成不穩定的α-球蛋白鏈四聚體，並發生髓內破壞(intramedullary destruction)、細胞凋亡、無效的紅血球生成，鐵過負荷和嚴重貧血(Origa, R. (2017)Genet Med 19(6):609-619)。
地中海貧血症(β和α)在人類中是最常見的單基因疾病。它們分佈廣泛，但最常見於南亞、印度亞大陸，中東和地中海地區，與撒哈拉以南的非洲地區(Modellet al. (2008)J Cardiovasc Magn Reson . 10:42；Colahet al . (2010)Expert Rev Hematol 3(1):103-17)。據估計，全球人口約有1.5%是β地中海貧血症突變的攜帶者(例如，一個在IVS-I的核苷酸5處「IVS-I-5」的G-＞C突變；一個在IVS-II的核苷酸654處「IVS-II-654」的C＞T突變，其中每年約有60,000名有症狀者出生(Galanello & Origa (2010)Orphanet J Rare Dis . 5:11)。
β-地中海貧血症的臨床嚴重程度是由所產生的正常血紅素數量所決定，並定義出三種臨床和血液學病況，通常稱為輕度β-地中海貧血症，中度β-地中海貧血症和重度β-地中海貧血症。帶有β-地中海貧血症的患者少數有輕度貧血或無貧血，且通常是無症狀攜帶者。中度β-地中海貧血症患者有中重度貧血，而可能受惠於輸血以改善其生活品質，但稍後會出現輸血依賴型表型。重度β-地中海貧血症患者有嚴重的貧血，終生需要頻繁輸血。因為貧血導致的疾病包括生長停滯、骨骼畸形、肺高血壓、靜脈血栓栓塞、肝硬化、心臟衰竭、腿部潰瘍，和內分泌功能障礙(Vichinskyet al . (2005)Pediatrics . 116(6):e818-25)。儘管與輸血依賴型表型有關的β-球蛋白突變和遺傳疾病修飾因子有許多種組合，但該病況在本研究中統稱為輸血依賴型β-地中海貧血症(TDT)(Galanello＆Origa，同上)。
在過去的50年內，隨著認識到支持性照護計劃的好處，對TDT患者的健康結果已有所增進。支持性照護計畫由定期RBC輸血構成，從確定診斷和貧血發生就儘早開始。RBC輸血伴有定期鐵螯合療法，以在生命器官內減少因為輸血所致的鐵過負荷。這項支持性照護計畫明顯改善TDT的發病率，但即使有這樣的計劃，受治療患者仍有20%的預期壽命少於40年(Modellet al . (2008)J Cardiovasc Magn Reason 10:42)。此外，該計畫耗時且資源密集，其中在2011年，單單一名患者接受治療持續50年預估花費$1,971,380美元(Korenet al . (2014)Mediterr J Hematol Infect Dis 6(1):e2014012)。
目前，唯一被證明可治癒TDT的方法是同種異體造血幹細胞移植(HSCT)。同種異體HSCT有相當高的長期發病率風險(例如移植物抗宿主病[GVHD])，以及基於5年死亡率的10-15%死亡風險(Locatelliet al . (2013)Blood 122(6):1072-8；Baroncianiet al . (2016)Bone Marrow Transplant 51(4):536-41)。此外，已發表的報告顯示，鑑定出一個配對良好的不相關同種異種供體的概率會受到供體種族所影響；例如，非裔個體中，尋找到合適供體的概率估計只有19% (Gragertet al . (2014)N Engl J Med . 371(4):339-48)。因此，許多(如果不是大多數)受贈者將沒有同種異體HSCT的人類白血球抗原(HLA)配對供體，從而使這種可能的治療方法無從用起。
因此，仍然需要用於治療及/或預防TDT的組成物和方法。
本文揭示用於在有需要的個體體內治療及/或預防β-地中海貧血症的組成物和方法。本揭示內容提供用於基因體編輯及/或基因轉移的方法和組成物。本揭示內容還提供用於細胞療法的方法和組成物，其用於治療缺乏充分表現β球蛋白的個體(例如β0/β0或非β0/β0個體)。個體體內的異常β球蛋白表現可能是因為任何突變所引起，包括但不限於以下突變中的一或多者：IVS-I-5；IVS-II-654。在一些具體例中，本文揭示的方法及組成物用於治療輸血依賴型β-地中海貧血症(TDT)。本揭示內容提供了治療β-地中海貧血症個體的方法，該方法包含將已經使用工程改造核酸酶修飾的細胞投予給個體，其中該個體為待治療的。投予給患者的細胞可以是自體細胞(從患者分離，經遺傳修飾然後再輸注至患者)，或同種異體細胞(例如從健康患者分離並輸注至患者)。
如本文提供之改變血紅素表現的方法(包括用於治療TDT)，包括在個體體內導致相對於臨床實驗室血紅素分量(成人血紅素HbA，及胎兒血紅素HbF)之基線的變化，關於兩者的變化是以公克/dL血漿的變化和總Hb的HbF百分比變化來表示。在一些具體例中，使用本文揭示之治療方法可導致地中海貧血症相關疾病生物標記的變化。在一些具體例中，與地中海貧血症相關疾病生物標記的變化可包括，但不限於鐵代謝的變化及/或紅血球生成素，血紅素結合素(haptoglobin)和鐵調素(hepcidin)水平的變化。在一些具體例中，治療方法可導致患者之與基線輸血療法有關之鐵過負荷相關症狀的變化。鐵過負荷症狀的變化可能包括內分泌器官中由鐵沉積引起的內分泌功能障礙減輕。內分泌功能障礙可透過測量若干因素(含量及/或活性)來評估，這些因素包括但不限於：甲狀腺素、IGF-1、早晨皮質醇、促腎上腺皮質激素(ACTH)，HbA1C及/或維生素D。以上所有因素(包括HbA、HbF、紅血球生成素、血紅素結合素、鐵調素、甲狀腺素、IGF-1、皮質醇，ACTH和維生素D)均可透過標準臨床實驗室規程來進行測量。
在一些具體例中，本文所述用途和治療方法將在β-地中海貧血症(例如TDT)個體中導致對(使用)RBC輸血和輸注其它血液製品(包括，但不限於的血小板、靜脈內免疫球蛋白(IVIG)，血漿和顆粒球)的需求減少。在經本發明方法和組成物治療的個體體內，可針對該個體記下使用日誌來評估使用RBC和其他血液製品輸注的變化。在經本文揭示的組成物輸注後，該日誌可用於計算紅血球濃厚液(PRBC)的年化頻率(annualized frequency)和體積，並與個體在治療前的過往PRBC和其他血液製品使用進行比較。
在一些具體例中，如本文所述的治療方法導致肝臟疾病減少。肝臟疾病和肝腫大是TDT的常見合併症，原因是紅血球(RBC)破壞和髓外紅血球生成增加。紅血球生成速率加快會提高腸道中的飲食鐵吸收，從而導致類似於遺傳性血色素沉著症中所看到的慢性鐵過負荷狀態。在肝臟中，鐵沉積的變化可透過MRI進行評估，其中可使用標準方法來評估肝細胞和庫佛氏細胞中的鐵沉積，諸如基於R2F的FERRISCAN® (Resonance Health)技術(參見，例如St Pierreet al. (2013)Magn Reason Med 71(6):2215-23)。
在一些具體例中，本文所述的治療方法導致心臟異常減少。心臟異常(包括心臟衰竭和致命性心律不整)是TDT的主要併發症，也是常見的死因。終生輸血療法改善了心臟病理學；然而，TDT患者經常因為心肌鐵沉積而出現心臟血鐵黃素沉著症(Heet al . (2008)Magn Reason Med 60(5):1082-1089)。心臟異常的變化可以透過MRI進行評估，因為在標準的心肌T2*(T2星)磁共振技術中可以看到心肌中的鐵沉積和過負荷。
在一些具體例中，本文所述的治療方法導致骨質疏鬆症減少和骨折減少，這兩者是TDT的常見併發症(Vogiatziet al. (2009)J Bone Miner Res 24(3):543-57)。因為本文揭示之方法所致的骨礦物質密度變化，骨質疏鬆症和骨折風險的變化，可以使用標準DXA骨密度測定掃描來進行評估(雙能x射線吸收測量法DXA，參見例如Blake and Fogelman (2007)Postgrad Med J 83(982):509-517)。
在一些具體例中，就類紅血球前驅細胞的形態學及/類型而言，本文所述治療方法導致基線紅血球生成的變化(例如， 減少或增加)。TDT會造成嚴重的類紅血球過度增生，並伴有高度未成熟細胞和常常形態異常的類紅血球前驅細胞。本發明的方法和組成物可以導致出現較少的未成熟細胞及/或減少具有非典型形態的細胞的數量。可以透過標準骨髓抽吸術來評估紅血球生成的變化，而骨髓抽吸術是表徵造血作用的慣用臨床程序。
在一些具體例中，本文所述的治療方法導致F細胞的數目和百分比相對於基線改變。F細胞是含有可測得之HbF量的RBC。評估F細胞的變化作為治療方法的結果是可以透過本技藝中已知的方法來進行測量(參見，例如Woodet al. (1975)Blood 46(5):671)。在某些具體例中，相較於未受治療的個體，如本文所述受治療個體的F細胞數量及/或百分比增加。
本文揭示包含一或多個mRNA的組成物，該mRNA編碼一或多個切割內源性BCL11A序列(例如，內源性BCL11A增強子序列)的ZFN。在某些具體例中，該一或多個mRNA包含SB-mRENH1 mRNA及/或SB-mRENH2 mRNA (如SEQ ID NO：15和SEQ ID NO：16中所示)。還揭示了包含一或多個相同或不同mRNA的醫藥組成物，其包括包含SB-mRENH1和SB-mRENH2 mRNA的組成物。
還提供了包含一或多個mRNA的經分離細胞及經分離細胞群體及/或包含這些mRNA的一或多種醫藥組成物。也描述了包含經遺傳修飾細胞和其後代之細胞的組成物，包括但不限於經遺傳修飾細胞的後代。經遺傳修飾後代細胞可以藉由活體外方法(經遺傳修飾細胞的培養物)及/或活體內向個體投予經遺傳修飾細胞之後獲得。因此，經遺傳修飾後代細胞可包括經遺傳修飾細胞之完全分化或部分分化的後代。在某些具體例中，經遺傳修飾細胞組成物包含經遺傳修飾造血幹細胞(也稱為造血祖幹細胞(HPSC)或造血幹細胞/前驅細胞(HSC/PC))及/或自其繁衍或產生的經遺傳修飾細胞，與未經遺傳修飾細胞相比，包括細胞中的BCL11A序列經切割且血紅素(例如HbF及/或HbA)水平增加(例如3至4倍或更多)的經遺傳修飾細胞。本文所述的細胞群體及細胞組成物的經遺傳修飾細胞中的一些，全部或沒有一者可包含一或多個mRNA及/或包含這些mRNA的醫藥組成物。因此，本文描述了細胞，細胞群體和包含這些細胞的組成物，該等細胞，細胞群體和組成物包含經遺傳修飾細胞及其後代，該等經遺傳修飾細胞包含本文所述的mRNA。該等細胞，細胞群體和包含這些細胞與細胞群體的組成物可以包含自體細胞及/或同種異體細胞。還提供包含如本文所述之經遺傳修飾細胞(例如，與未修飾細胞相比，展現出球蛋白表現增加的類紅血球前驅細胞，諸如HPSC)的醫藥組成物。
進一步提供製造(做出)經遺傳修飾的經分離細胞(或細胞群體或包含經遺傳修飾細胞和其後代的組成物)的方法，包括製造經遺傳修飾細胞群體的方法，其中BCL11A序列(例如增強子序列)經遺傳修飾，以使得與未經修飾細胞相比，經遺傳修飾細胞中的血紅素(例如，HbF及/或HbA)水平增加(例如兩倍或更多倍)。在某些具體例中，該等方法包含將如本文所述之一或多個mRNA (或包含一或多個mRNA的醫藥組成物)投予給細胞(例如經由轉染)。該等細胞可以是自體的及/或同種異體的，並且可以是HSPC。在某些具體例中，該等方法進一步包含培養經遺傳修飾細胞，以產生包含展現出球蛋白生產增加之經遺傳修飾細胞(例如，HPSC細胞)及/或其經遺傳修飾細胞後代(例如，其他類紅血球前驅細胞及/或成熟類紅血球細胞，諸如RBC)群體的組成物。該等組成物可包含含有mRNA的經遺傳修飾細胞及/或衍生自不再包含mRNA但保有遺傳修飾(BCL11A特異性修飾)的此類細胞的經遺傳修飾細胞後代。還提供了包含經遺傳修飾細胞群體及/或其後代細胞的醫藥組成物。
因此，在一些具體例中，本文揭示的方法和組成物涉及用已經過離體(exo vivo)修飾的細胞來治療個體。在一些具體例中，從該名個體分離細胞、進行離體修飾，然後送回該個體。在其他具體例中，從健康供體分離細胞、進行離體修飾，然後用於治療個體。在進一步的具體例中，從健康供體分離的細胞被進一步離體修飾以除去自身標記(例如HLA複合物)，避免受到個體的細胞所排斥。在一些具體例中，分離的細胞是幹細胞。在進一步的具體例中，幹細胞是造血幹細胞/前驅(progenitor)細胞(例如CD34+ HSC/PC)。在一些具體例中，藉由用一或多劑顆粒球群落刺激因子(G-CSF)處理來動員每位個體體內的CD34 + HSC/PC。在一些具體例中，所使用的G-CSF的劑量為約10 μg/kg/天。在一些具體例中，將一或多劑G-CSF與一或多劑普樂沙福(plerixafor)組合。在一些具體例中，所使用的普樂沙福劑量為約240 μg/kg/天。在進一步的具體例中，藉由一或多回血球分離術收取受到動員的細胞。
可以藉由血球分離術從健康個體或β-地中海貧血症個體收集受到動員的人類CD34+ HSPC，並且在投予(轉染)如本文所述之一或多個mRNA (或包含一或多個mRNA的醫藥組成物)之前予以純化。在某些具體例中，用ZFN mRNA SB-mRENH1和SBmRENH2 (SEQ ID NO：15和SEQ ID NO：16)轉染經純化的HSPC。經轉染的經遺傳修飾CD34+ HSPC (「ST-400」)可以進行培養，收取及/或冷凍以供使用。在收取後，如本文所述包含經遺傳修飾細胞(如與其他遺傳基因座相比，至少50%，較佳至少70%或更多，甚至更佳至少75-80%或更多的細胞在mRNA投予之後受到遺傳修飾，較佳地在BCL11A增強子序列處經特異地修飾)(「ST-400」)的組成物可包括HSPC以及其後代細胞，例如分化成所有造血譜系的HSPC，包括類紅血球前驅細胞(CFU-E和BFU-E)、顆粒球/巨噬細胞前驅細胞(CFU-G/M/GM)和多潛能前驅細胞(CFU-GEMM)。在某些具體例中，細胞組成物(群體)的一些，沒有一者或全部經遺傳修飾細胞包含一或多個mRNA。
在本文所述的任一種方法或用途中，個體帶有經確診的β-地中海貧血症分子遺傳學；臨床經確診β-地中海貧血症(例如，TDT)；是β0 /β0 或非β0 /β0 ；及/或18歲和40歲之間臨床診斷為β-地中海貧血症(例如TDT)，其中前兩年期間以年化為基礎，每年≤8次有記載的PRBC輸血事件。在某些具體例中，經遺傳修飾CD34+ HSPC從得自個體的細胞產生(自體的)。在某些具體例中，使用G-CSF和普樂沙福處理在每名個體體內動員CD34+ HSPC。在動員後一或多天(例如3、4、5、6，7天或更多天)，藉由血球分離術從每名個體收集經動員的CD34+ HSPC，直至收集到足夠的細胞為止。在某些具體例中，收集至少約1×104 至1×107 (例如25×106 )個CD34+ HSPC/kg。如果需要的話，可以在第一回後的1、2、3週或更多週進行第二回動員(mobilization)和血球分離術。在某些具體例中，如所描述的，對收集的一部份細胞進行遺傳修飾，並且在指示對該名個體進行挽救治療的情況下，保留其餘部分(例如冷凍保存)。
在一些具體例中，從個體取出細胞(自體)，並用靶向牽涉到調節胎兒血紅素(HbF)產生的基因的核酸酶進行處理。在一些具體例中，該基因是HbF產生的抑制子。在一些具體例中，該基因是BCL11A基因。在一些具體例中，該核酸酶靶向並切割BCL11A基因的類紅血球特異性增強子區域。在一些具體例中，該核酸酶作為mRNA被遞送至細胞。在一些具體例中，類紅血球特異性增強子區域之切割會造成切割位點受到細胞修復機制的易錯修復，使得類紅血球轉錄因子GATA1的某個結合位點遭到破壞(參見Vierstraet al. (2015)Nat Methods 12(10):927-30；Canveret al. (2015)Nature 527(7577):192-7)。在一些具體例中，該核酸酶靶向BCL11A基因的類紅血球特異性增強子區域，使得其在造血幹細胞中不表現。被靶向的增強子區域可能在編碼區域之內或之外，包括但不限於內源性BCL11A之內含子2內+58，+55及/或+62區域(其是基於距離BCL11A轉錄起始位點的千鹼基距離來進行編號)，那些增強子區域的長度大約為350 (+55)；550 (+58)；以及350 (+62)個核苷酸。參見例如Baueret al . (2013)Science 343:253-25；美國專利第9,963,715號；第10,072,066號；與美國專利公開案第2015/0132269號和第2018/0362926號。在一些具體例中，在送回個體之前評估經修飾的HSC/PC。在一些具體例中，針對在BCL11A增強子區域中核酸酶誘導之突變的存在和類型來評估經修飾細胞。在一些具體例中，突變可以是核苷酸插入，核苷酸缺失或兩者(「插入缺失(indel)」)。在一些具體例中，透過核酸酶評估細胞的脫靶切割。在一些具體例中，在核酸酶切割後評估細胞的分子易位及/或核型分析細胞染色體。在一些具體例中，評估細胞的脫靶轉錄活性。在一些具體例中，評估細胞的內毒素負荷。在一些具體例中，可以針對一或多種上述特徵來評估細胞。
在一些具體例中，將經修飾CD34+ HSC/PC以使得HbF產生增加且β-地中海貧血症的臨床症狀減少的劑量送回個體。在一些具體例中，在輸注經修飾CD34+ HSC/PC前，以一或多種骨髓淨除式調理劑(myeloablative condition agent)處理個體。在一些具體例中，骨髓淨除劑是白消安(busulfan)。在進一步的具體例中，白消安與其他藥劑(諸如環磷醯胺)一起使用。
在一些具體例中，將劑量約3×106 個細胞/kg至約20×106 個細胞/kg (或其間的任何值)的經遺傳修飾細胞(例如經由靜脈內輸注)投予給個體。在一些具體例中，將細胞調配在含有10% DMSO的可輸注之(infusible)冷凍介質中。在一些具體例中，以約1×107 個細胞/mL的濃度用每袋約1.0-2.0×108 個細胞來調配。在本文所述的任一種方法中，可以將細胞劑量確定為總細胞劑量或CD34+細胞劑量，其可計算如下：CD34+劑量=[總細胞劑量] x [CD34+%]。參見，例如表B，其在第2列顯示總細胞劑量並在第3列顯示CD34+%。在一些具體例中，在輸注之後，針對植入經修飾細胞並且評估經修飾細胞群體的異質性來監控接受經修飾HSPC的個體。在一些具體例中，可以針對在BCL11A基因中存在插入缺失來分別評估周邊血液，骨髓及/或不同的細胞群。在一些具體例中，從經處理個體的細胞分離基因體DNA，並擴增包含BCL11A靶序列的區域。在進一步的具體例中，確定細胞群體內的經修飾細胞百分比，並在給藥後隨時間推移重新測試，以評估經修飾細胞群體與受治療個體的穩定性。
在一些具體例中，評估修飾數據以產生一個插入缺失概況。在進一步的具體例中，隨時間監控插入缺失概況，以確定任何一種特定細胞類型(插入缺失概況)異常過度生長群體的概率。
本文揭示用於治療帶有β-地中海貧血症之個體的組成物和方法，其包含已經經過兩個編碼鋅指核酸酶之半配偶體(又稱為「成對ZFN」或「左和右ZFN」)的多核苷酸處理的細胞。視情況，編碼核酸酶的多核苷酸進一步包含編碼小肽的序列(包括但不限於肽標籤與核定位序列)，及/或包含在一或多個DNA結合結構域區域(例如鋅指蛋白的骨架)中的突變，及/或一或多個在Fok I核酸酶切割結構域或切割半結構域中的突變。該等多核苷酸可視情況包含ARCA帽(美國專利第7,074,596號)。當這些多核苷酸組分單獨或以任何組合使用時(例如，諸如FLAG、NLS、WPRE，ARCA及/或聚A信號的肽序列，呈任何組合)，本發明的方法和組成物提供令人驚訝且出乎意料的人工核酸酶表現增加且效率增加(例如，與沒有本文所述序列/修飾的核酸酶相比，有2、3、4、5、6、10，20或更多倍切割)，及/或靶向特異性。在某些具體例中，本文所述為一種組成物，其包含在BCL11A基因座處受到如本文所述的mRNA特異性修飾的經遺傳修飾細胞，其包括其中小於10% (0至10%或其間的任何值)，較佳地小於5% (0至5%或其間的任何值)，甚至更佳小於1%細胞(0至1%或其間的任何值)，且甚至更佳小於0.5% (0至1%或其間的任何值)的經遺傳修飾細胞在BCL11A基因座以外包括由mRNA做出的遺傳修飾(但可包括額外的修飾，例如HLA標記的不活化)。在進一步的具體例中，編碼鋅指核酸酶的多核苷酸可以包含已知為SB63014的左ZFN (參見，美國專利第10,563,184號和美國專利公開案第2018/0087072號)，由mRNA SB-mRENH1所編碼。在一些具體例中，右ZFN是SB65722 (參見，美國專利第10,563,184號和美國專利公開案第2018/0087072號)，由mRNA SB-mRENH2所編碼。
本文還描述包含如本文所述之ZFN及/或多核苷酸(例如，mRNA)的宿主細胞，包括經分離的造血幹細胞(HSPC，例如CD34+)。可以從健康個體分離細胞，或者，替代地，是從有待治療病況(例如TDT)的個體中獲得，並使用標準技術純化的自體細胞。ZFN在切割後經由插入及/或缺失以遺傳的方式來修飾細胞。隨後，經擴增的(培養的)細胞可能不再包括ZFN (或編碼這些ZFN的多核苷酸)，而是在培養時保有遺傳修飾(例如，BCL11a中的插入及/或缺失)。在某些具體例中，遺傳修飾是在切割後由NHEJ做出的插入及/或缺失(「插入缺失」)。與未經處理的(未經遺傳修飾的)細胞相比，如本文所述之經遺傳細胞展現出不同比例的球蛋白(α-，β-和γ-球蛋白水平)。在某些具體例中，與未經處理的(未經轉染的)HSPC相比，γ-球蛋白與β-球蛋白的比率和γ-球蛋白與α-球蛋白的比率增加約2至5倍或更多，包括3至4倍。此外，本文所述之經遺傳修飾細胞分化成所有造血譜系，包括類紅血球前驅細胞(CFU-E和BFU-E)、顆粒球/巨噬細胞前驅細胞(CFU-G/M/GM)和多潛能前驅細胞(CFU-GEMM)，並展現出正常的核型與形態，這指出造血重建。
在某些態樣中，描述了使用如本文所述的經遺傳修飾細胞以供TDT的離體療法。在某些具體例中，經遺傳修飾細胞是獲自待治療的個體的自體細胞，然後如本文所述遺傳修飾這些細胞並投予給同一個體。可以在用G-CSF及/或普樂沙福處理的個體體內動員從個體獲得的細胞。參見圖5。在本文所述的任一種方法中，可動員任何數量的細胞，例如在個體體內約5x105 、約10x105 、約15x105 、約20x105 、約5x106 、約10×106 、約15×106 、約20×106 ，約25×106 個CD34+ HSPC/kg可被動員供用於遺傳修飾。如本文所述對自體細胞進行遺傳修飾，並根據標準技術將其冷凍保存(例如，使用控制速率的冷凍器)，每個等分試樣(例如，輸液袋)的總細胞計數為約1.0x108 至2.0x108 個細胞並可以在生產設施處儲存於氣相液態氮(＜-150℃)中，直到準備將其運送到臨床研究中心為止。
在本文所述的任一種方法中，個體可以在用經遺傳修飾細胞進行離體療法之前接受調理療法，例如使用有效劑量和方案經由靜脈內(IV)投予白消安。根據標準程序，例如，白消安以約0.5至5 mg/kg (或其間的任何值)給藥。在某些具體例中，個體將接受白消安的骨髓淨除式方案(約3.2 mg/kg/天；經由中央靜脈導管IV)持續至多4天(輸注前總劑量約12.8 mg/kg)，例如在第0天輸注經修飾HSPC之前第-6天至第-3天。根據研究中心實務或指南，IV白消安可以每日給藥一次(共4劑)或每6小時給藥一次(共16劑)。首次給藥後，將根據藥物動力學取樣和研究中心實務來調整IV白消安劑量，以達到曲線下面積(AUC)為4,000-5,000 mmol*min (每日給藥)或AUC為1,000-1,250 mmol*min (每6小時給藥)，總方案目標AUC為16,000-20,000 mmol*min。對於隨後的個體，可以修改IV白消安的藥物動力學目標。視情況，對治療性藥物進行監控以確定白消安在給藥4天後完全清除。
在某些態樣中，離體療法包括解凍經遺傳修飾的冷凍HSPC，並且較佳地在解凍的約15至約45分鐘內將細胞輸注至個體。所投予的經修飾冷凍HSPC的體積是依據個體體重來決定。在輸注之前和之後監控生命徵象(血壓、溫度、心率，呼吸頻率和脈搏血氧飽和度)。在某些具體例中，個體是使用血液檢查以及HbF水平分析(HbF分量的基線水平(A和F，以g/dL計)來進行監控，而HbF百分比是基於首次投予IV白消安之日當天或之後基於最後評估，內分泌功能及/或進行MRI以評估鐵負荷來確定HbF百分比。在某些具體例中，離體療法於輸注約兩週至四週內在TDT個體體內導致嗜中性球和血小板回復至正常水平。HSPC輸注後，個體也可以接受PRBC輸注0次，1次或更多次。在某些具體例中，按照輸注經修飾HSPC之後的週數(例如2、3、4、5、6，7或更多週)，總血紅素含量在個體體內維持穩定或持續上升。
輸注後，可以在患者體內監控經修飾HSPC，以確定植入效率及/或修飾異質性。例如，這可以透過確定遺傳修飾(「插入缺失」)概況來完成。可以從周邊血液，骨髓抽吸物或其他組織樣品純化細胞樣品(較佳約5×104 至1×107 個細胞)，並進行基因體DNA分離以供評估。可以在各個時間點(包括大約6-9個月之時間)採集骨髓抽吸物或其他組織樣品。
在一些具體例中，與尚未經本文揭示之方法和組成物處理的個體相比，本文提供了減少，延遲及/或消除額外治療程序的治療方法，例如其中將有效量的經修飾HSC/PC投予給有需要的個體，其中該個體在治療後減少，延遲及/或消除了對額外治療程序的需要。在一些具體例中，額外治療程序可以包括，但不限於骨髓移植、PRBC及/或其他血液組分輸血，以及與鐵螯合療法有關的治療。
在一些具體例中，可用於本文揭示之組成物和方法中的ZFN (例如，ZFN，其為ZFN對(左和右)的成員是藉由兩個個別mRNA遞送)包括被稱為SB-mRENH1和SB-mRENH2的mRNA。在一些具體例中，經由電穿孔(例如向HSC/PC)遞送BCL11特異性對中的ZFN，例如其中一個AAV包含左ZFN (例如SB-mRENH1)而另一者包含右ZFN (例如SB-mRENH2)。
因此，本文描述用於改變血紅素表現以供治療及/或預防β-地中海貧血症(例如TDT)的方法。在某些具體例中，包含第一和第二(左和右)ZFN的ZFN對，即包含命名為63014之ZFP的六指ZFN (其包含表1中所示的識別螺旋區)(例如，由mRNA SB-mRENH1編碼)；和包含命名為65722之ZFP的5指ZFN(其包含表1中所示的識別螺旋區)(例如，由mRNA SB-mRENH2編碼)被用於改變個體之經分離細胞或細胞中的血紅素含量，包括用於治療TDT。ZFN對在人類基因體GRCh38/hg38裝配體中的位置chr2：60,495,250-60,495,290處結合至人類BCL11A基因的類紅血球特異性增強子中的33個鹼基對(合併的)靶位點。在某些具體例中，一個mRNA編碼該對的兩個ZFN。或者，採用各自編碼一對中的一個ZFN的個別mRNA。在某些具體例中，mRNA序列顯示在實例1中(SEQ ID NO：15和SEQ ID NO：16)。
視情況，編碼核酸酶的多核苷酸進一步包含編碼小肽(包括但不限於肽標籤和核定位序列)的序列，及/或包含在一或多個DNA結合結構域區域(例如鋅指蛋白的骨架)中的突變，及/或一或多個在Fok I核酸酶切割結構域或切割半結構域中的突變。當這些多核苷酸組分單獨或以任何組合使用時(例如，諸如FLAG、NLS、WPRE，ARCA及/或聚A信號的肽序列，呈任何組合)，本發明的方法和組成物提供令人驚訝且出乎意料的人工核酸酶表現增加且效率增加(例如，與沒有本文所述序列/修飾的核酸酶相比，有2、3、4、5、6、10，20或更多倍切割)，及/或靶向特異性。因此，依據某些具體例，本文所述細胞(細胞群體以及包含這些細胞與細胞群體的組成物)在BCL11A基因座處受到mRNA特異地遺傳修飾，其中小於10% (其間的任何值的0至10%)，較佳地小於5% (0至5%或其間的任何值)，甚至更佳小於1%細胞(0至1%或其間的任何值)，且甚至更佳小於0.5% (0至1%或其間的任何值)的經遺傳修飾細胞在BCL11A基因座以外包括由mRNA做出的遺傳修飾(但可包括額外的修飾，例如HLA標記的不活化)。在一些具體例中，核酸酶由mRNA編碼，且mRNA視情況包含用於增加轉錄和翻譯效率的要素。
本發明的方法和組成物還可包括在識別靶序列之核苷酸的殘基之外的DNA結合結構域內的一或多個胺基酸突變(例如，「ZFP骨架」的一或多個突變(在DNA識別螺旋區以外))，其可與DNA骨架上的磷酸根非特異地交互作用。因此，在一些具體例中，本文揭示之方法和組成物包括ZFP骨架中陽離子性胺基酸殘基的突變，其對於核苷酸標靶特異性不是必需的。在一些具體例中，ZFP骨架中的這些突變包含將陽離子性胺基酸殘基突變成中性或陰離子性胺基酸殘基。在一些具體例中，ZFP骨架中的這些突變包含將極性胺基酸殘基突變成中性或非極性胺基酸殘基。在一些具體例中，在相對於DNA結合螺旋的位置(-5)，(-9)及/或位置(-14)處做出突變。在一些具體例中，鋅指可在(-5)，(-9)及/或(-14)處包含一或多個突變。在一些具體例中，多指鋅指蛋白中的一或多個鋅指可包含(-5)，(-9)及/或(-14)中的突變。在一些具體例中，在(-5)，(-9)及/或(-14)處的胺基酸(例如精胺酸(R)或離胺酸(K))突變成丙胺酸(A)、白胺酸(L)、Ser (S)、Asp (N)、Glu(E)，Tyr (Y)及/或麩醯胺酸(Q)。參見，例如美國專利公開案第2018/0087072號。
在一些態樣中，本發明的方法和組成物包括使用編碼融合至真核轉基因序列之外源性肽序列的序列。在一些具體例中，外源性肽在轉譯後融合至蛋白質序列，而在其他具體例中，編碼外源性肽的序列在框內(3'及/或5')連接至編碼人工核酸酶的序列(例如，融合蛋白)。在較佳具體例中，使用編碼3個FLAG序列的序列(3x FLAG肽)(參見，美國專利案第6,379,903號)，其中胺基酸序列為N端DYKDHDG-DYKDHDI-DYKDDDDK(SEQ ID NO：1)。與不具有該肽序列的核酸酶相比，納入一或多個這樣的肽序列(例如3X FLAG)可使核酸酶(切割)活性增加2、3、4、5、6、7、8、9、10、11倍或更多倍。
在一些態樣中，編碼人工核酸酶的mRNA包含核定位肽序列(NLS)。在一些具體例中，NLS包含來自SV40病毒大T基因的序列PKKKRKV(SEQ ID NO ：2) (參見Kalderonet al. (1984)Nature 311(5981):33-8)。與不具有該肽序列的核酸酶相比，如本文所述納入一或多個NLS序列可使核酸酶(切割)活性增加2、3、4、5、6、7、8、9、10、11倍或更多倍。
在一些具體例中，本文揭示的方法和組成物包含例如經由周邊靜脈導管給予本發明組成物(例如，經修飾HSC/PC)。在一些具體例中，組成物被投予給個體，然後接著投予生理食鹽水(NS)或磷酸鹽緩衝食鹽水(PBS)。在一些具體例中，個體接受總劑量為約3.0×106 個細胞/kg與約20×106 個細胞/kg之間(或其間的任何值)的經修飾細胞。可使用範圍約3.0×106 至約20×106 個細胞/kg之間的任何劑量。
在一些具體例中，在接受總劑量約3.0×106 至約20×106 個細胞/kg之後，個體已延遲，減少或消除(例如)對於額外治療程序的需求。
在另一個態樣中，本文揭示一種於β-地中海貧血症個體體內，與用本發明方法及組成物治療之前的個體相比，在用該等方法及組成物治療之後減少、延遲或消除地中海貧血症相關疾病生物標記的方法。可以透過標準臨床實驗室規程來測量以測定地中海貧血症相關生物標記(包括HbA、HbF、紅血球生成素、血紅素結合素、鐵調素、甲狀腺素、IGF-1、皮質醇，ACTH和維生素D)，該方法包含，例如向該個體投予有效量之經修飾HSC/PC，其中該個體在治療後具有減少，延遲或消除的地中海貧血症相關疾病生物標記。在一些具體例中，在藉由本文揭示的方法治療之後，HbF水平增加約5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、100%、150%、200%、300%，400%或更多(或其間的任何值)。
在另一個態樣中，本文揭示一種於β-地中海貧血症個體體內，與未用本發明方法及組成物治療的個體相比，在用該等方法及組成物治療之後減少，延遲或消除使用PRBC輸血和其它血液製品輸注，包括但不限於血小板、靜脈內免疫球蛋白(IVIG)，血漿以及顆粒球。在一些具體例中，相較於接受治療之前的個體，在用本文揭示之方法治療的個體中，PRBC及/或其他血液製品的使用減少約10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%，100%或其間的任何值。在一些具體例中，消除了PRBC及/或其他血液製品輸注的使用。
在另一態樣中，本文揭示一種減少，延遲或消除β地中海貧血症個體體內與鐵過負荷有關之症狀的方法。在一些具體例中，與治療前的標記水平相比，在用本發明方法和組成物治療後，個體體內由於鐵沉積在內分泌器官中而引起內分泌功能障礙的標記(例如，甲狀腺標記、IGF-1、早晨皮質醇，HbA1C和維生素D)變得正常。在一些具體例中，與治療前的個體相比，在用本文揭示的方法和組成物治療的個體體內，肝臟和心臟中的鐵過負荷減少。鐵過負荷可透過標準MRI程序進行評估。在一些具體例中，與接受治療前的個體相比，在用本文揭示之方法治療的個體體內，透過MRI偵測到肝臟及/或心臟中的鐵過負荷降低約5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%，100%或其間的任何值。
在另一個態樣中，本文揭示一種減少，延遲或消除β-地中海貧血症個體體內與骨質疏鬆症及/或骨折相關之症狀的方法。在一些具體例中，與治療前的個體相比，在用本文揭示之方法及組成物治療的個體體內骨密度增加。在一些具體例中，與治療前的個體相比，在用本文揭示之方法和組成物治療的個體體內，骨質疏鬆症和骨折減少或消除。在一些具體例中，與接受治療前的個體相比，用本文揭示之方法治療的個體體內，骨質疏鬆症及/或骨折改善約5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%，100%或其間的任何值。
在另一個態樣中，本文揭示一種與治療前的TDT個體相比，在用本文揭示之方法及組成物治療之後，該個體體內減少，延遲或消除骨髓中的類紅血球過度增生，未成熟細胞和類紅血球前驅細胞。
在另一個態樣中，本文提供一種製品，其包含包裝(例如，袋子)，該包裝包含含有如本文所述經遺傳修飾的自體HSC/PC的組成物。該製品(例如袋子)可以被調配用於冷凍保存，例如在含有10% DMSO的CryoStor® CS-10冷凍介質(SigmaAldrich)中。每個袋子可以容納任何濃度的細胞。在某些具體例中，每個袋子含有濃度約1x107 個細胞/mL的每袋約1.0-2.0x108 個細胞。
在另一個態樣中，本文描述了監控如本文所述之經遺傳修飾細胞群體的修飾概況(例如，在切割後產生的插入及/或缺失的數量及/或類型，通常是由NHEJ切割的序列)的方法。監控可以在投予給個體之前及/或之後進行，以確定某一種類型的修飾(純系(clone))是否在群體中佔優勢，因為這種累積可能導致特定純系群體不樂見的增殖。在某些具體例中，使用標準技術(諸如定序或類似者)監控經遺傳修飾細胞群體的修飾類型(插入及/或缺失，也稱為「插入缺失/概況」)。在某些具體例中，在投予前分析細胞群體以確定修飾模式(插入缺失概況)的基線，然後在輸注後進行監控以確定植入細胞的插入缺失概況得以維持，這樣就不會出現某一個純系細胞群體異常生長。監控可以在輸注之前及/或之後隨時間進行(多次)。因此，本文所述的方法可進一步包含在輸注之前及/或之後監控經遺傳修飾細胞群體，以確定插入缺失概況隨時間推移而維持不變。
根據本文的說明，將理解到，本揭示內容含括多個具體例，這些具體例包括但不限於以下：
包含紅血球(RBC)前驅細胞的經遺傳修飾細胞，其包含SB-mRENH1 mRNA以及SB-mRENH2 mRNA，其中mRNA編碼ZFN對；以及在受到ZFN對切割後做出的基因體修飾，其中該修飾在內源性BCL11A增強子序列內，使得BCL11A基因在細胞中不活化。還包括其後代細胞。
一種在有需要的個體體內治療β-地中海貧血症(β-地中海貧血症)的離體方法，該方法包含：向該個體投予如本文所述具體例中任一者的組成物，以使在個體體內的胎兒血紅素(HbF)產生增加，且β-地中海貧血症的一或多種臨床症狀得以減少，改善或消除。
如本文所述前述具體例中任一者的離體方法，其中β-地中海貧血症是輸血依賴型β-地中海貧血症。
如本文所述前述具體例中任一者的離體方法，其中在個體體內達到了相對於臨床實驗室血紅素分量之基線的變化，關於該變化是以公克/dL血漿及/或總血紅素(Hb)的HbF百分比來表示。
如本文所述前述具體例中任一者的離體方法，其中血紅素分量是成人血紅素(HbA)及/或胎兒血紅素(HbF)。
如本文所述前述具體例中任一者的離體方法，其中該個體是β0 /β0 或β0 /β+ 。
如本文所述前述具體例中任一者的離體方法，其中地中海貧血症相關疾病生物標記的水平在治療後有所改變。
如本文所述前述具體例中任一者的離體方法，其中該等生物標記是鐵代謝的變化；及/或紅血球生成素，血紅素結合素及/或鐵調素(hepcidin)水平的變化。
如本文所述前述具體例中任一者的離體方法，其中與鐵過負荷有關或與基線輸血療法有關的臨床症狀獲得改善或消除。
如本文所述前述具體例中任一者的離體方法，其中藉由測定甲狀腺素、IGF-1、早晨皮質醇，促腎上腺皮質激素(ACTH)，HbA1C及/或維生素D水平的水平及/或活性來分析個體體內的分泌功能障礙減少。
如本文所述前述具體例中任一者的離體方法，其中減少或消除個體對RBC輸血和輸注血小板輸血、靜脈內免疫球蛋白(IVIG)輸血，血漿輸血及/或顆粒球輸血的需求。
如本文所述前述具體例中任一者的離體方法，其中在該個體體內減少或消除的臨床症狀是肝臟疾病。
如本文所述前述具體例中任一者的離體方法，其中在該個體體內減少或消除的臨床症狀是心臟異常。
如本文所述前述具體例中任一者的離體方法，其中在該個體體內減少或消除的臨床症狀是骨質疏鬆症及/或骨折。
如本文所述前述具體例中任一者的離體方法，其中在投予組成物後改變個體的基線紅血球生成。
如本文所述前述具體例中任一者的離體方法，其中在投予組成物後，個體體內的過度增生減少或消除。
如本文所述前述具體例中任一者的離體方法，其中在個體體內未成熟細胞及/或具有非典型形態之細胞的數量減少。
如本文所述前述具體例中任一者的離體方法，其中在投予組成物後，個體體內F細胞的數量和百分比改變。
如本文所述前述具體例中任一者的離體方法，其中經遺傳修飾細胞是自體的或同種異體的。
如本文所述前述具體例中任一者的離體方法，其中BCL11A經遺傳修飾的細胞進一步包含一或多個額外遺傳修飾。
如本文所述前述具體例中任一者的離體方法，其中經遺傳修飾細胞是同種異體細胞，並且該一或多種額外遺傳修飾包含一或多個自身標記或抗原的不活化。
如本文所述前述具體例中任一者的離體方法，其中經遺傳修飾細胞是從該個體分離的造血幹細胞。
如本文所述前述具體例中任一者的離體方法，其中造血幹細胞是CD34+造血幹細胞或前驅細胞(HSC/PC)，並且在分離之前，在藉由用一或多劑G-CSF及/或一劑或多劑普樂沙福(plerixafor)處理的個體體內動員CD34+ HSC/PC。
如本文所述前述具體例中任一者的離體方法，其中在個體體內動員至少25×106 個CD34+ HSPC/kg，並且藉由一或多回血球分離術來收取動員的細胞。
如本文所述前述具體例中任一者的離體方法，其進一步包含在向個體投予包含經遺傳修飾細胞的組成物之前，並評估該組成物的細胞在BCL11A內的插入及/或缺失。
如本文所述前述具體例中任一者的離體方法，其進一步包含在投予包含經遺傳修飾細胞的組成物之前，向個體投予一或多種骨髓淨除式調理劑一或多次。
如本文所述前述具體例中任一者的離體方法，其中該骨髓淨除劑包含白消安，而且進一步其中：靜脈內(IV)投予0.5至5 mg/kg白消安持續一或多次；IV投予的白消安為3.2 mg/kg/天；於第0天輸注包含經遺傳修飾細胞的組成物前，在第-6天至第-3天輸注之前，經由中央靜脈導管IV總劑量為12.8 mg/kg持續4天；或者每天一次或每6小時IV投予白消安。
如本文所述前述具體例中任一者的離體方法，其中投予給個體之經遺傳修飾細胞的劑量為3×106 個細胞/kg至20×106 個細胞/kg。
如本文所述前述具體例中任一者的離體方法，其中投予給個體之經遺傳修飾細胞係以約1×107 個細胞/mL的濃度用每袋約1.0-2.0×108 個細胞來調配。
如本文所述前述具體例中任一者的離體方法，其中經遺傳修飾的細胞在投予之前被冷凍保存，並在解凍約15分鐘內被投予給該個體。
如本文所述前述具體例中任一者的離體方法，其進一步包含在投予經遺傳修飾細胞之前，期間及/或之後監控個體的生命徵象。
如本文所述前述具體例中任一者的離體方法，其進一步包含在投予經遺傳修飾細胞之前評估個體的血紅素，嗜中性球及/或血小板水平，以確定個體體內的血紅素基線水平。
如本文所述前述具體例中任一者的離體方法，其中在投予經遺傳修飾細胞之後，個體體內的血紅素，嗜中性球及/或血小板水平與基線水平相比在投予之後增加或維持穩定持續數週或數月。
如本文所述前述具體例中任一者的離體方法，其中在投予經遺傳修飾細胞之前及/或之後，個體接受一或多次紅血球濃厚液(packed red blood cells; PRBC)輸血。
如本文所述前述具體例中任一者的離體方法，其中個體對額外療法(諸如骨髓移植，血液組分及/或鐵螯合療法PRBC輸血)的需求減少或消除。
如本文所述前述具體例中任一者的離體方法，其中在投予經遺傳修飾細胞1-20天內，對額外療法的需求減少或消除。
如本文所述前述具體例中任一者的離體方法，其中在投予後隨時間監控個體，以確定從週邊血液樣品，骨髓抽吸物或其他組織來源分離的細胞的插入缺失概況，與輸注細胞的插入缺失概況相比較來監控植入物在個體體內的穩定性。
如本文所述前述具體例中任一者的離體方法，其中在投予給個體之前監控細胞的插入缺失概況。
一種製品，其包含含有如請求項2之調配於CryoStor® CS-10冷凍介質中之組成物的包裝。
如本文所述前述具體例中任一者的製品，其中每袋包含濃度約1×107 個細胞/mL的每袋約1.0-2.0×108 個細胞。
鑑於整體揭示內容，這些和其他態樣對於習於技藝者來說將會是顯而易見的。
本文揭示基因體工程改造用的組成物及方法，以供調控BCL11A，γ球蛋白以及BLC11A和γ球蛋白表現的組合，並且供治療，預防或治療和預防血紅素病變。具體而言，經由利用包含具有識別螺旋區之ZFP的核酸酶(如表1中的單列所示)靶向，在HSC/PC中有效地達到破壞BCL11A的增強子，並導致隨後在後續紅血球生成期間於相對γ球蛋白表現方面的變化。BCL11A和γ球蛋白表現的這個調節特別適用於治療血紅素病變(例如β地中海貧血症，諸如TDT、鐮狀細胞病)，其中有β球蛋白表現不足或突變形式的β球蛋白。使用本文所述的方法和組成物，可以透過改變紅血球前驅細胞中的γ球蛋白表現來克服因為異常β球蛋白引起的併發症以及疾病相關後遺症。具體來說，本文所述的組成物和方法克服了與同種異體造血幹細胞移植(HSCT)有關的問題。這些問題包括受供體可用性限制以及同種異體移植後移植失敗和移植物抗宿主病的風險。
如本文所述，在造血幹細胞或前驅細胞中，高度準確基因編輯BCL11A之內含子類紅血球特異性的GATA結合區會導致胎兒血紅素(HbF)持續性高度表現，卻不會不利地影響正常多譜系造血作用。因此，經遺傳修飾細胞可用於離體治療血紅素病變，諸如TDT。胎兒血紅素(HbF)是於妊娠期間直至出生存在的主要血紅素。HbF是透過將兩個β樣球蛋白基因(Gγ-球蛋白和Aγ-球蛋白，統稱為γ-球蛋白)之一者的蛋白產物與α-球蛋白以四聚體(α2γ2)組合在而產生的。出生後HbF水平會隨著γ-球蛋白蛋白產生的下降而逐漸下降，約6-12個月大時被成年血紅素大幅取代，成年血紅素是由β-球蛋白和α-球蛋白的四聚體(α2β2)組成。伴隨HbF水平的同時下降，嬰兒中的TDT症狀在臨床上常常變得明顯。HbF通常僅在正常成人生理學發揮次要作用。但是，已發表的研究證實，先天性、獲得性和藥物誘導的HbF升高與TDT患者的發病率降低和臨床結局改善相關。例如，大型無偏差遺傳研究已鑑定出TDT疾病嚴重程度與定量性狀基因座(諸如BCL11A，其與HbF水平升高有關)之間的關聯性(Theinet al . (2009)Hum Mol Genet 18(R2):R216-23)，其中HbF水平通常與TDT症狀的減弱程度成正比(Musallamet al . (2012)Blood 119(2):364-7)。此外，還有在移植排斥的TDT患者中同種異體HSCT失敗的病例報告，偶然產生了持續性高HbF水平，在此之後，回報患者為輸血不依賴型(Fersteret al . (1995)Br. J Haematol 90(4):804-8；Paciaroni & Lucarelli (2012)Blood 119(4):1091-2)。HbF的產生因為羥基脲而增加(Walkeret al. (2011)Blood 118(20):5664-70)。然而，羥基脲在β-地中海貧血症僅有不同程度的效用，在中度β-地中海貧血症中比TDT功效更高(Characheet al . (1995)N Engl J Med 332(20):1317-22；Ansariet al . (2011)J Pediatr Hematol Oncol 33(5):339-43；Singeret al . (2008)Am J Hematol 83(11): 842-5)。此外，羥基脲的作用是舒緩的，但其使用需要定時監控血球減少症和其他毒性。
BCL11A是在發育和造血中扮演多種角色的轉錄因子。在細胞和動物模型中，全基因體關聯性和功能性追蹤研究已證明，BCL11A是HbF表現的重要緘默子(silencer)。在一項開創性研究中，在鐮狀細胞病(SCD)的轉基因人類化小鼠模型中，類紅血球特異性條件性基因剔除破壞BCL11A，導致血紅素轉換失敗，維持高水平的HbF並在與SCD相關的血液學和病理學特徵方面有顯著改善(Xuet al . (2011)Science 334(6058):993-6)。因此，抑制BCL11A似乎是治療人類β-球蛋白病症(諸如TDT和SCD)的一項潛在有效策略。然而，靶向BCL11A基因的治療方法有挑戰，因為BCL11A在發育和造血方面的重要作用(Brendelet al . (2016)J Clin Invest 126(10:3868-3878)。一個替代策略靶向類紅血球特異性增強子(ESE)要素，該要素位於BCL11A的第二個內含子中且在類紅血球細胞而非其他譜系中是BCL11A表現所必要的。增強子要素被發現含有一個與HbF水平較高有關的共同遺傳變異(Baueret al. (2013)Science 342(6155):253-7)。因此，假設對BCL11A基因的類紅血球特異性增強子進行修飾可以在類紅血球細胞中增強內源性HbF水平，卻不會對整體BCL11A功能產生有害影響(Hardison & Blobel (2013)Science 342(6155):206-7)。
在用經修飾HSPC治療後，個體的安全性最為重要。因此，在本文所述任一種方法中，可以在輸注之後監控經修飾HSPC，以評估經修飾細胞是否隨時間而保留在個體體內。另外，核酸酶切割後，NHEJ導致包括不同插入及/或缺失(又稱為插入缺失概況)的細胞群體。插入及/或缺失(插入缺失)可為任何長度，並且可以是插入和缺失的任何組合，包括但不限於缺失0至10 kb核苷酸；插入0至10 kb核苷酸；缺失0至10 kb核苷酸加上插入1至10 kb核苷酸；及/或缺失1至10 kb核苷酸加上插入0至10 kb核苷酸。患者間的插入缺失概況有很大的不同。例如，如圖7A至圖7C關於患者1、2和3所示，顯示了每名患者的10個最常見插入缺失的插入缺失概況，其中「I」是指插入；「D」是指缺失；第一個數字是指從參考鹼基對起插入缺失的起始位置(「*」是指側接插入缺失的核苷酸，可以與插入缺失的兩側對齊)；而冒號後面的數字是指插入或缺失的鹼基對的數目。如所示，最常見的插入缺失在1至28個核苷酸之間變化，並始於參考鹼基對的約50至70(在任一側)之間。此外，在所有患者中，「所有其他插入缺失」佔所評估插入缺失的40%以上。另外，如所示，插入缺失概況可隨時間改變。
本文還描述了監控經遺傳修飾HSPC以確定其插入缺失概況的方法。在某些具體例中，在輸注之前確定經離體遺傳修飾細胞的插入缺失概況，並在投予給個體後隨時間進行監控。這樣的監控確保了植入細胞中插入缺失的分佈模式得以維持，並且沒有一個純系細胞群體異常生長，這種現象也被稱為中樂透，其中一個純系群體的生長速度快於其他純系群體(參見，例如Heddle (1999)Mutagenesis 14(3):257-260)，這可能導致衍生自該經修飾HSPC之細胞類型相對於體內HSPC的正常細胞穩態而言不樂見的過度生長。可以使用任何標準技術進行插入缺失概況的監控，例如透過定序或其他方法。
因此，本文提供經遺傳修飾細胞(例如紅血球(RBC)前驅細胞，諸如CD34+造血幹細胞或類紅血球前驅細胞)，其包含(ⅰ) SB-mRENH1 mRNA和SB-mRENH2 mRNA (如SEQ ID NO：15和SEQ ID NO：16中所示)，該等mRNA編碼ZFN對；以及(ⅱ)透過ZFN切割之後作出的基因體修飾，其中該修飾是在內源性BCL11A增強子序列內，使得BCL11A基因在細胞中不活化。還提供了包含這些經遺傳修飾細胞的細胞群體；自其衍生的經基因修飾細胞；包含經遺傳修飾細胞以及自其衍生之細胞的細胞群；以及包含經遺傳修飾細胞及/或自其衍生之細胞的組成物。本文所述的細胞、細胞群體，和組成物可以是(來自個體的)自體細胞及/或同種異體細胞。此外，經遺傳修飾細胞可以包括一或多個額外遺傳修飾，包括但不限於其中一或多種自身標記或抗原不活化(基因剔除)的細胞。
也提供使用這些細胞群體及/或組成物的離體細胞療法，例如，藉由向個體投予如本文所述包含經遺傳修飾細胞(及/或自其衍生之細胞)的組成物來治療患有β-地中海貧血症(β-地中海貧血症)的個體的離體方法，使得個體體內的胎兒血紅素(HbF)產生(例如β0 /β0 或β0 /β+ )增加，且β-地中海貧血症的一或多種臨床症狀(例如， 輸血依賴型β-地中海貧血症)得以減少，改善或消除。在某些具體例中，在個體體內達到相對於臨床實驗室血紅素分量(成人和胎人血紅素)基線的變化(以公克/dL血漿為單位及/或總血紅素(Hb)的HbF百分比)。在其他具體例中，在治療(投予經遺傳修飾細胞)後，改變了地中海貧血症相關疾病生物標記水平(例如鐵代謝的改變；及/或紅血球生成素，血紅素結合素及/或鐵調素水平的改變)。可以減少，改善或消除的臨床症狀包括但不限於：與鐵過負荷有關或基線輸血療法有關的臨床症狀(例如，透過確定甲狀腺素、IGF-1、早晨皮質醇，促腎上腺皮質激素(ACTH)，HbA1C及/或維生素D水平的水平及/或活性來分析個體的內分泌功能障礙的減少)；對RBC輸注和輸注血小板輸血、靜脈內免疫球蛋白(IVIG)輸血、血漿輸血，及/或顆粒球輸注的需求；肝臟疾病；心臟異常；骨質疏鬆症及/或骨折。如本文所述的離體方法還可在投予組成物後在個體體內導致基線紅血球生成方面的改變，包括但不限於減少或消除過度增生；減少未成熟及/或具有非典型形態的細胞的數量；及/或個體體內F細胞的數量和百分比的變化(修飾)。
在本文所述任一種方法中，經遺傳修飾細胞是從個體分離的造血幹細胞(例如CD34+ HSC/PC)，視情況其中在分離之前於每位個體體內藉由用一或多劑G-CSF及/或一或多劑普樂沙福處理來動員CD34+ HSPC/PC (例如至少25 x 106 個CD34+ HSPC/kg)，並且藉由一或多回血球分離術來收取經動員細胞。此外，可以評估包含經遺傳修飾細胞的組成物在BCL11A (中靶修飾)及/或其他非BCL11A區域(脫靶修飾)內的插入及/或缺失。投予包含經遺傳修飾細胞的組成物之前，個體可以用(投予)一或多種骨髓淨除式調理劑處理一或多次，例如，投予白消安：以0.5至5 mg/kg靜脈內(IV)持續一或多次；以3.2 mg/kg/天IV；於第0天輸注包含經遺傳修飾細胞的組成物前，在第-6天至第-3天輸注前，經由中央靜脈導管IV總劑量為12.8 mg/kg持續4天；或者每天一次或每6小時IV。可以使用任何劑量的經遺傳修飾細胞，例如，3 x 106 個細胞/kg和20 x 106 個細胞/kg之間(例如，以約1×107 個細胞/mL的濃度用每袋約1.0-2.0×108 個細胞來調配細胞)。可以在投予之前將經遺傳修飾細胞冷凍保存，並且可以在解凍後的任何時間，包括但不限於解凍的約15分鐘至約45分鐘內。該等方法可以進一步包含在投予經遺傳修飾細胞之前，期間及/或之後監控個體的生命徵象；及/或在投予經遺傳修飾細胞之前評估個體的血紅素，嗜中性球及/或血小板水平，以確定個體的血紅素基線水平。在某些具體例中，與投予後數週或數月的基線水平相比，個體在投予經遺傳修飾細胞後的血紅素，嗜中性球及/或血小板水平增加或維持穩定。視情況，個體可以在投予經遺傳修飾細胞之前及/或之後接受一或多次PRBC輸血。在本文所述任一種方法中，在將組成物投予給個體後，在例如大約1到30天或更多天內(包括1-20天)，減少或消除了個體對其他療法(諸如骨髓移植、血液組分，鐵螯合及/或PRBC輸血療法)的需求。還可以在投予之前及/和之後監控細胞和個體，例如以確定從周邊血液樣品，骨髓抽吸物或其他組織來源中分離而來之細胞的插入缺失概況而與輸注細胞的插入缺失概況相比較，以便監控植入物在個體體內的穩定性。一般性
除非另有說明，否則實施本文揭示的方法，以及組成物的製備和使用採用分子生物學、生物化學、染色質結構和分析、計算化學、細胞培養，重組DNA和習於技藝者所知之相關領域中的常規技術。這些技術在文獻中已得到充分解釋。參見例如，Sambrooket al. MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, Second edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989 and Third edition, 2001；Ausubelet al. , CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, John Wiley & Sons, New York, 1987 and periodic updates;  the series METHODS IN ENZYMOLOGY, Academic Press, San Diego；Wolffe, CHROMATIN STRUCTURE AND FUNCTION, Third edition, Academic Press, San Diego, 1998；METHODS IN ENZYMOLOGY, Vol. 304, “Chromatin” (P.M. Wassarman and A. P. Wolffe, eds.), Academic Press, San Diego, 1999；以及METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY, Vol. 119, “Chromatin Protocols” (P.B. Becker, ed.) Humana Press, Totowa, 1999。定義
術語「核酸」、「多核苷酸」和「寡核苷酸」可交替使用，並且是指線性或環狀構型，以及單股或雙股形式的去氧核糖核苷酸或核糖核苷酸聚合物。出於本揭示內容的目的，這些術語不應解釋為對聚合物長度的限制。該等術語可涵蓋天然核苷酸的已知類似物，以及在鹼基，糖及/或磷酸酯部分(例如，硫代磷酸酯骨架)中經修飾的核苷酸。通常，特定核苷酸的類似物具有相同的鹼基配對特異性；亦即A的類似物將與T鹼基配對。
術語「多肽」、「肽」和「蛋白質」可交替使用，是指胺基酸殘基的聚合物。該術語還適用於其中一或多個胺基酸為對應天然胺基酸之化學類似物或經修飾衍生物的胺基酸聚合物。
「結合」是指巨分子之間(例如，蛋白質與核酸之間)的序列特異性，非共價交互作用。並非結合交互作用的所有組分都是序列特異性所必要的(例如，與DNA骨架中的磷酸根殘基接觸)，只要整個交互作用具有序列特異性即可。這種交互作用的特徵通常在於解離常數(Kd )為10-6 M-1 或更低。「親和力」是指結合強度：結合親和力的增加與較低的Kd 相關聯。
「結合蛋白」是一種蛋白質，其能夠非共價結合至另一個分子。結合蛋白可以結合至例如DNA分子(DNA結合蛋白)，RNA分子(RNA結合蛋白)及/或蛋白質分子(蛋白質結合蛋白)。在蛋白質結合蛋白的情況下，它可以結合至自身(形成同二聚體，同三聚體等)及/或可以結合不同蛋白質的一個或多個分子。結合蛋白可以具有超過一種的結合活性。例如，鋅指蛋白具有DNA結合，RNA結合和蛋白質結合活性。
「鋅指(zinc finger)DNA結合蛋白」(或結合結構域)是一種蛋白質，或一個較大蛋白質內的結構域，其透過一個或多個鋅指以序列特異性的方式結合DNA，它們是結合結構域中的胺基酸序列區域，其結構是透過鋅離子的配位得以穩定。術語｢鋅指DNA結合蛋白｣通常縮寫為鋅指蛋白或ZFP。術語「鋅指核酸酶」包括一個ZFN以及一對ZFN (該對中的成員稱為「左與右」或「第一與第二」或「一對」)，其二聚化以切割標靶基因。
「TALE DNA結合結構域」或「TALE」是包含一或多個TALE重複序列結構域/單元的多肽。重複序列結構域參與TALE與其同源標靶DNA序列的結合。單個「重複單元」(也稱為「重複序列」)的長度通常為33-35個胺基酸，並且與天然TALE蛋白內的其他TALE重複序列具有至少一些序列同源性。參見，例如美國專利第8,586,526號和第9,458,205號。術語「TALEN」包括一個TALEN以及一對TALEN (該對中的成員稱為「左與右」或「第一與第二」或「一對」)，其二聚化以切割標靶基因。鋅指和TALE結合結構域可以例如經由工程改造天然鋅指或TALE蛋白的識別螺旋區(改變一或多個胺基酸)，而被「改造」成結合至預定核苷酸序列。因此，經工程改造的DNA結合蛋白(鋅指或TALE)是非天然的蛋白質。用於工程改造DNA結合蛋白的方法的非限制性實例是設計和選擇。經設計的DNA結合蛋白是自然界中不存在的蛋白質，其設計/組成主要來自合理標準。設計的合理標準包括應用替換規則和計算機演算法，以供處理數據庫中儲存現有ZFP及/或TALE設計的資訊以及結合數據的資訊。參見，例如，美國專利第8,568,526號；第6,140,​​081號；第6,453,242號；和第6,534,261號；也參見國際專利公開案第WO 98/53058號；第WO 98/53059號；第WO 98/53060號；第WO 02/016536號；和第WO 03/016496號。
「選定」的鋅指蛋白或TALE本質上是其主要從實驗過程(諸如噬菌體展示，交互作用捕獲或雜交篩選)生產未發現到的蛋白質。參見例如，美國專利案第8,586,526號；第5,789,538號；第5,925,523號；第6,007,988號；第6,013,453號；第6,200,759號；和國際專利公開案第WO 95/19431號；第WO 96/06166號；第WO 98/53057號；第WO 98/54311號；第WO 00/27878號；第WO 01/60970號；第WO 01/88197號和第WO 02/099084號。
「重組」是指兩個多核苷酸之間交換遺傳資訊的過程。出於本揭示內容之目的，「同源重組(HR)」是指這種交換的特殊形式，其發生在例如經由同源性定點修復機制在細胞中修復雙股斷裂期間。這個過程需要核苷酸序列同源性，使用「供體」分子對「標靶」分子(即經歷雙股斷裂的分子)進行模板修復，因此被稱為「非交叉基因轉換」或「短道基因轉換」，因為它導致遺傳資訊從供體轉移到標靶。在不希望受到任何特定理論囿限的情況下，這種轉移可能涉及在斷裂標靶和供體之間形成的異源雙股DNA的錯配校正，及/或「合成依賴型股貼合」，其中供體被用於重新合成，將成為標靶及/或相關過程一部分的遺傳資訊。這種特化HR通常導致標靶分子序列的改變，使得供體多核苷酸的部分或全部序列被併入到標靶多核苷酸中。
在本揭示內容的方法中，如本文所述的一或多個靶向核酸酶在預定位點處的表靶序列(例如， 細胞染色質)中產生雙股斷裂，並且可將與斷裂區域中之核苷酸序列具有同源性的「供體」多核苷酸引入細胞。已經顯示雙股斷裂的存在促進供體序列併入。供體序列可以是物理併入的，或者供體多核苷酸用作修復斷裂的模板經由同源重組，在供體進入細胞染色質之時引入全部或部分核苷酸序列。因此，可以改變細胞染色質中的第一序列，並且在某些具體例中，可以將其轉換成供體多核苷酸中存在的序列。因此，使用術語「替換(replace或replacement)」可以理解為表示一個核苷酸序列被另一個核苷酸序列替換(即，替換在資訊股中的序列)，並且不一定需要在物理或化學上用另一個核苷酸置換一個多核苷酸。
在本文所述任一種方法中，其他鋅指或TALEN蛋白對可以用於細胞內的其他標靶位點的額外雙股切割。
在細胞染色質的感興趣區域中靶向重組及/或替換及/或改變序列的方法的某些具體例中，透過與外源性「供體」核苷酸序列的同源重組來改變染色體序列。如果存在與斷裂區域同源的序列，則透過在細胞染色質中存在雙股斷裂來刺激這種同源重組。
在本文所述任一種方法中，第一核苷酸序列(「供體序列」)可含有與感興趣區域中的基因體序列同源但不相同的序列，從而刺激同源重組以在感興趣區域中插入非一致序列。因此，在某些具體例中，與感興趣區域中的序列同源的部分供體序列與被置換的基因體序列表現出約80至99% (或其間的任何整數)序列同一性。在其他具體例中，供體和基因體序列之間的同源性高於99%，例如，如果超過100個連續鹼基對的供體和基因體序列之間只有1個核苷酸不同。在某些情況下，供體序列的非同源部分可含有不存在於感興趣區域中的序列，從而將新的序列引入感興趣區域。在這些情況下，非同源序列通常側接與感興趣區域中的序列同源或相同的50-1,000個鹼基對(或其間的任何整數值)或大於1,000個鹼基對中任一數值的序列。在其他具體例中，供體序列與第一序列非同源，並且透過非同源重組機制被插入到基因體中。
本文所述任一種方法可藉由靶向合併破壞感興趣基因表現的供體序列而用於在細胞中部分或完全不活化一或多個標靶序列。還提供了具有部分或完全不活化基因的細胞株。
此外，如本文所述的靶向合併方法也可用於併入一或多個外源性序列。外源性核酸序列可包含例如一或多個基因或cDNA分子，或任何類型的編碼或非編碼序列，以及一或多個控制要素(例如，啟動子)。另外，外源性核酸序列可以產生一或多個RNA分子(例如，小髮夾RNA (shRNA)、抑制性RNA (RNAi)、微RNA (miRNA)等)。
「切割」是指DNA分子的共價骨架斷裂。切割可透過多種方法引發，包括但不限於磷酸二酯鍵的酶促水解或化學水解。單股切割和雙股切割都是可行的，並且是由於兩個不同的單股切割事件的結果，可能發生雙股切割。DNA切割可導致產生鈍端或交錯端。在某些具體例中，融合多肽用於靶向雙股DNA切割。
「切割半結構域」是指一種多肽序列，其與第二多肽(相同或不同)接合形成具有切割活性(較佳雙股切割活性)的複合物。術語「第一和第二切割半結構域」；「+和-切割半結構域」與「右和左切割半結構域」可以交替使用，是指二聚化的切割半結構域。
「經工程改造的切割半結構域」是一個已被修飾，以便與另一個切割半結構域(例如，另一個經工程改造的切割半結構域)形成絕對異二聚體的切割半結構域。參見，美國專利第7,888,121號；第7,914,796號；第8,034,598號；和第8,823,618號，其以整體引用的方式併入本文。
術語「序列」是指任何長度的核苷酸序列，可以是DNA或RNA；可以是線性，環狀或分支的，且可以是單股或雙股的。術語「供體序列」是指插入基因體中的核苷酸序列。供體序列可以具有任何長度，例如長度在2至10,000個核苷酸之間(或其間或以上的任何整數值)，較佳地長度在約100至1,000個核苷酸之間(或其間的任何整數)，更佳地長度在約200至500個核苷酸之間。
「疾病相關基因」是指是在單基因疾病中以某種方式缺損的基因。單基因疾病的非限制性實例包括重度聯合免疫缺乏症、囊腫纖維化、溶胞體貯積症(例如，高歇氏病(Gaucher’s)、Hurler氏病、亨特氏病(Hunter’s)、Fabry氏病、尼曼-匹克二氏病(Neimann-Pick)、泰-沙二氏病(Tay-Sach’s)等等)、鐮狀細胞貧血症，和地中海貧血症。
「血腦障壁」是一種高度選擇性滲透屏障，分隔循環血液與中樞神經系統的腦部。血腦障壁是由腦部內皮細胞形成，這些腦部內皮細胞通過CNS血管中的緊密接合而相互連接，從而限制了血液溶質通過。長期以來，人們一直認為血腦障壁可以阻止大分子療法的吸收，並可以阻止大多數小分子療法的吸收(Pardridge (2005)NeuroRx 2(1): 3-14)。
「染色質」是包含細胞基因體的核蛋白結構。細胞染色質包含核酸(主要是DNA)和蛋白質，蛋白質包括組蛋白和非組蛋白染色體蛋白質。大多數真核細胞染色質以核小體的形式存在，其中核小體核心包含約150個鹼基對的DNA，DNA與八聚體締合，該八聚體包含組蛋白H2A、H2B，H3和H4中每一種各兩個；以及連接子DNA(長度可變，取決於生物體)在核小體核心之間延伸。組蛋白H1分子通常與連接子DNA締合。出於本揭示內容之目的，術語「染色質」是指涵蓋原核和真核的所有類型細胞核蛋白。細胞染色質包括染色體和游離型染色質。
「染色體」是染色體複合物，包含細胞的全部或部分基因體。細胞的基因體通常以其核型為特徵，核型是構成細胞基因體的所有染色體的集合。細胞的基因體可以包含一或多個染色體。
「游離基因體」是一種複製核酸，核蛋白複合物或其它含有核酸不是細胞的染色體核型一部分的結構。游離基因體的實例包括質體和某些病毒基因體。
「標靶位點」或「標靶序列」是核酸序列，其定義了核酸的一部分，其為結合分子將結合的部分，提供有關於結合存在的充分條件。
「外源性」分子是一種在細胞中並非正常存在的，但可以透過一或多種遺傳，生物化學或其它方法引入細胞中的分子。「在細胞中正常存在」是就細胞的特定發育階段和環境條件來決定。因此，例如，僅在肌肉的胚胎發育期間存在的分子相對於成年肌肉細胞是外源性分子。類似地，相對於非熱休克細胞，由熱休克誘導的分子是外源性分子。外源性分子可包含例如功能失常的內源性分子的具功能形式或功能正常的內源性分子的功能失調形式。
外源性分子尤其可以是諸如藉由組合化學過程產生的小分子，或者是諸如蛋白質、核酸、碳水化合物、脂質、糖蛋白、脂蛋白、多醣、上述分子的任何經修飾衍生物，或包含一或多種上述分子的任何複合物的巨分子。核酸包括DNA和RNA，可以是單股或雙股；可以是線性，分支或環狀；並且可具任何長度。核酸包括那些能夠形成雙螺旋體者，以及形成三螺旋體者。參見，例如美國專利第5,176,996號和第5,422,251號。蛋白質包括但不限於DNA結合蛋白、轉錄因子、染色質重塑因子、甲基化DNA結合蛋白、聚合酶、甲基化酶、去甲基化酶、乙醯化酶、去乙醯化酶、激酶、磷酸酶、整合酶、重組酶、連接酶、拓樸異構酶，旋轉酶和解旋酶。
外源性分子可以是與內源性分子相同類型的分子，例如外源性蛋白質或核酸。例如，外源性核酸可包含感染性病毒基因體、被引入細胞中的質體或游離基因體，或細胞中通常不存在的染色體。將外源性分子引入細胞的方法是習於技藝者已知的彼等，並且包括，但不限於脂質介導的轉移(即，脂質體，包括中性和陽離子脂質)、電穿孔、直接注射、細胞融合、粒子轟擊(bombardment)、磷酸鈣共沉澱，DEAE-葡聚醣媒介的轉移和病毒載體媒介的轉移。外源性分子也可以是與內源性分子相同類型的分子，但其來源不同於細胞來源。例如，可以將人類核酸序列引入最初源自小鼠或倉鼠的細胞株。
相對而言，「內源性」分子是一種在特定環境條件下在特定發育階段時通常存在於特定細胞中的分子。例如，內源性核酸可包含染色體、粒線體，葉綠體或其他胞器的基因體，或天然存在的游離型(episomal)核酸。其他內源性分子可以包括蛋白質，例如轉錄因子和酶。
「融合」分子是其中兩個或更多個次單位分子(較佳地共價)連接在一起的分子。次單位分子可以是相同化學類型的分子，也可以是不同化學類型的分子。融合分子的實例包括，但不限於融合蛋白(例如，蛋白DNA結合結構域與切割結構域之間的融合)、與切割結構域可操作地締合之多核苷酸DNA結合結構域之間的融合(例如sgRNA)，以及融合核酸(例如，編碼融合蛋白的核酸)。
融合蛋白在細胞中的表現可以由將融合蛋白遞送至細胞或透過將編碼融合蛋白的多核苷酸遞送至細胞而產生，其中轉錄多核苷酸，並轉譯轉錄本以產生融合蛋白。反式剪接，多肽切割和多肽連接也可能涉及蛋白質在細胞中的表現。用於將多核苷酸和多肽遞送至細胞的方法在本揭示內容的他處提出。
「基因」出於本揭示內容之目的，包括編碼基因產物的DNA區域(見下文)，以及調節基因產物產生的所有DNA區域，無論此類調節序列與編碼及/或轉錄序列是否相鄰。因此，基因包括，但不限於啟動子序列、終止子，轉譯調節序列(諸如核醣體結合位點和內部核醣體進入位點)、增強子、緘默子、絕緣子、邊界要素、複製起點，基質附著位點和基因座控制區域。
「基因表現」是指將基因中包含的資訊轉換成基因產物。基因產物可以是基因的直接轉錄產物(例如，mRNA、tRNA、rRNA、反義RNA、核酶、結構RNA或任何其他類型的RNA)，或藉由mRNA轉譯產生的蛋白質。基因產物還包括藉由諸如加帽(capping)、聚腺苷酸化，甲基化和編輯的過程修飾的RNA，以及藉由例如甲基化、乙醯基化、磷酸化、泛素化、ADP-核糖基化，肉荳蔻化和糖基化修飾的蛋白質。
基因表現的「調控」是指基因活性的變化。表現的調控可包括，但不限於基因活化和基因壓抑。基因體編輯(例如， 切割、改變、不活化、隨機突變)可用於調控表現。基因不活化是指與不包刮如本文所述的ZFP或TALEN的細胞相比，基因表現的任何降低。因此，基因不活化可以是部分或完全的。
「感興趣區域」是細胞染色質的任何區域，諸如，例如基因內或相鄰的非編碼序列，在其中期望結合外源性分子。結合可以出於靶向DNA切割及/或靶向重組為目的。例如，感興趣區域可以存在於染色體、游離基因體、胞器基因體(例如粒線體，葉綠體)或感染性病毒基因體中。感興趣區域可以在基因的編碼區域內、在轉錄非編碼區域內(諸如，例如前導序列，尾部序列或內含子)，或在非轉錄區域內(在編碼區域的上游或下游)。感興趣區域的長度可以小至單個核苷酸對，或多至2,000個核苷酸對，或者任何整數核苷酸對。
「真核」細胞包括但不限於，真菌細胞(諸如酵母)、植物細胞、動物細胞，哺乳動物細胞和人類細胞(例如，幹細胞或前驅細胞)。術語「幹細胞」或「前驅細胞」是指多能(pluripotent)和多能(multipotent)幹細胞，包括但不限於造血幹細胞，也稱為造血先驅細胞(HPSC)或造血幹細胞/前驅細胞(HSC)/PC)。
「紅血球」(RBC)或紅血球是衍生自造血幹細胞的最終分化細胞。它們缺乏核酸酶和大部分細胞胞器。RBC含有血紅素，將氧從肺部攜帶到周邊組織。實際上，單獨一個RBC中有33%是血紅素。它們還將代謝期間由細胞產生的二氧化碳帶出組織，並返回肺部以在呼氣時釋放。RBC會對血液缺氧做出反應而在骨髓中生成，而這是由腎臟釋放紅血球生成素(EPO)媒介的。EPO導致前紅血球母細胞的數量增加，並縮短了RBC完全成熟所需的時間。大約120天後，因為RBC不包含細胞核或任何其他再生能力，細胞會在肝臟，脾臟和淋巴結中被巨噬細胞的吞噬活動(〜90%)或藉由在血漿中的溶血作用(〜10%)而從循環中被移除。巨噬細胞吞噬後，由於溶酶體酶的作用，RBC的化學組分在巨噬細胞的液泡內分解。
「分泌組織」是那些在動物體內將產物從單個細胞分泌到某些類型的管腔中的組織，這些管腔通常源自上皮。定位於胃腸道的分泌組織實例包括襯於腸，胰臟和膽囊的細胞。其他分泌組織包括肝臟，與眼睛相關的組織和黏膜，諸如唾液腺、乳腺、前列腺，腦下腺和內分泌系統的其他成員。另外，分泌組織包括能夠分泌的組織類型的單個細胞。
關於兩個或更多個組分(例如序列要素)的並置，術語「可操作連接」和「可操作地連接(operatively linked)」(或「可操作地連接(operably linked)」)可交替使用，其中該等組件被排列成使得這兩個組分正常地發揮作用，並允許至少一個組分能夠媒介被施加在該等組分之至少一者上的功能。舉例來說，如果轉錄調節序列對一或多個轉錄調節因子的存在或不存在做出反應來控制編碼序列的轉錄程度，則轉錄調節序列(例如啟動子)為可操作地連接至編碼序列。轉錄調節序列通常與編碼序列以順式的方式可操作地連接，但是不必然直接相鄰。例如，增強子是與編碼序列可操作地連接的轉錄調節序列，即使它們不是相鄰的。
關於融合多肽，術語「可操作地連接」可以指，也就是如果沒有這樣連接的話，每個組分在與另一個組分的連接時執行相同的功能。例如，對於其中ZFP或TALE DNA結合結構域與活化結構域融合的融合多肽來說，如果在融合多肽中，ZFP或TALE DNA結合結構域部分和活化結構域是可操作連接，則ZFP或TALE DNA結合域部分能夠結合其標靶位點及/或其結合位點，而活化結構域則能夠上調基因表現。當融合多肽的ZFP或TALE DNA結合結構域融合至切割結構域，如果在融合多肽中，ZFP或TALE DNA結合結構域和切割結構域是可操作連接，則ZFP或TALE DNA-結合結構域部分能夠結合其標靶位點及/或其結合位點，而切割結構域能夠在標靶位點附近切割DNA。
「功能性」蛋白質，多肽或核酸包括提供與野生型蛋白質、多肽或核酸相同功能的任何蛋白質，多肽或核酸。蛋白質，多肽或核酸的「功能性片段」是蛋白質，多肽或核酸，其序列與全長蛋白質，多肽或核酸的序列不同，但仍保有與全長蛋白質，多肽或核酸相同的功能。功能性片段可具有與對應天然分子相比更多，更少或相同數目的殘基，及/或可含有一或多個胺基酸或核苷酸取代。用以確定核酸功能(例如，編碼功能，與另一個核酸雜交的能力)的方法是本技藝中周知的。類似地，用以確定蛋白質功能的方法是周知的。例如，可以透過例如濾膜結合、電泳遷移率改變或免疫沉澱分析來確定多肽的DNA結合功能。DNA切割可以透過凝膠電泳來進行分析。參見Ausubel et al.，同上。一個蛋白質與另一個蛋白質交互作用的能力可以例如透過遺傳和生物化學的共免疫沉澱，雙雜交分析或互補來確定。參見，例如Fields et al. (1989) Nature 340:245-246；美國專利第5,585,245號與國際專利公開案第WO 98/44350號。
「載體」能將基因序列轉移到標靶細胞。通常，「載體構建體」、「表現載體」和「基因轉移載體」是指能夠引導感興趣基因表現並且可以將基因序列轉移至標靶細胞的任何核酸構建體。因此，該術語包括選殖和表現載體(vehicle)，以及整合載體。
「報導基因」或「報導序列」是指產生一種容易測定的蛋白產物的任何序列，較佳地儘管不必以常規分析來測定。合適的報導基因包括，但不限於編碼媒介抗生素抗性(例如胺芐青黴素抗性、新黴素抗性、G418抗性、嘌呤黴素抗性)之蛋白質的序列，編碼有色或螢光或發光蛋白(例如綠色螢光蛋白，增強型綠色螢光蛋白、紅色螢光蛋白、螢光素酶)的序列，和媒介增強細胞生長及/或基因擴增的蛋白質(例如，二氫葉酸還原酶)。表位標籤包括例如FLAG、His、myc、Tap，HA或任何可檢測的胺基酸序列的一或多個複本。「表現標籤」包括編碼可以可操作地連接至所需基因序列以監控感興趣基因表現的報導子的序列。
術語「個體」和「患者」可交替使用，並且指哺乳動物(諸如人類個體和非人類靈長類動物)，以及實驗動物(諸如兔、狗、貓、大鼠、小鼠，和其他動物)。因此，術語「個體」或「患者」在此用於表示任何哺乳動物個體或患者，以將本發明之經改變細胞及/或由本發明經改變細胞產生的蛋白質投予至其。本發明的個體包括那些患有β-地中海貧血症的個體。
通常，個體是有資格接受β-地中海貧血症治療的個體。出於本文之目的，這種符合資格的個體是正在經歷，已經經歷或可能經歷一或多種β-地中海貧血症的徵象，症狀或其他適應症的個體；已被診斷患有β-地中海貧血症(例如是否新近診斷及/或有發生β-地中海貧血症風險)的個體。患有β-地中海貧血症或有罹患β-地中海貧血症風險者可視情況被鑑定為經篩選在其血液或血漿中有異常低水平血紅素者。
如本文所用，「治療(treatment或treating)」是一種用於獲得有益或期望結果(包括臨床結果)的方法。出於本發明之目的，有益或期望的臨床結果包括但不限於以下一或多者：減少由疾病引起的一或多種症狀、減少疾病的程度、穩定疾病(例如，預防或延緩疾病的惡化)、延遲或減緩疾病的進展、改善疾病狀態，減少治療該疾病所需的一或多種其他藥物的劑量及/或提高生活品質。
如本文所用，「延遲」或「減緩」β-地中海貧血症的進展表示預防、推遲、阻礙、減緩、延緩，穩定及/或推延疾病的發展。取決於疾病的病史及/或要被治療的個體，該延遲可以具有不同的時間長度。
如本文所用，「在開始治療之時」是指在第一次暴露於β-地中海貧血症治療組成物(諸如本發明的組成物)之時或之前的時間段。在一些具體例中，「在開始治療之時」是在β-地中海貧血症藥物之前約一年、九個月、六個月、三個月，第二個月或一個月中的任一者。在一些具體例中，「在開始治療之時」是正好在第一次暴露於β-地中海貧血症治療組成物之前。
如本文所用，「基於」包括(1)評估，測定或測量如本文所述的個體特徵(並且較佳地選出適於接受治療的個體；以及(2)如本文所述投予治療。
β-地中海貧血症的「症狀」是任何現象或在結構，功能或感覺上偏離個體所體驗到者，並表示β-地中海貧血症。
「輸血依賴型β-地中海貧血症」(TDT)個體需要定期輸注(輸血) PRBC和其他血液製品，以維持血紅素水平＞ 9至10 g/dL。TDT是一種嚴重的，進行性β-地中海貧血症，與一般群體相比，特徵在於具有嚴重貧血症、終身依賴輸血、不可避免的鐵過負荷，嚴重的合併症和壽命較短。TDT患者需要終生支持性照護，並定期輸血(通常每2至5週進行一次輸血)，以減輕貧血症並實現生存。治療水平(包括減少或消除對輸血之需求的水平)可以高於2-10 g/dL或更高(包括2、3、5、6、7、8、9、10或更高g/dL)，視情況對於輸血非依賴性至少約5 至7或更高g/dL。
長期(chronic)輸血導致不可避免的鐵過負荷，其可對重要器官造成重大損害。因此，患有TDT的患者需要持續並嚴格地監控鐵負擔，並且必須定期服用藥物以移除多餘的鐵，一個被稱為鐵螯合的過程。
術語「支持性手術」是指可以對個體執行以減輕可能與疾病有關的症狀的手術程序。
如本文所用，關於輔助療法的術語「免疫抑制劑」是指發揮抑制或掩蔽本文所治療之哺乳動物免疫系統的作用的物質。這可能包括抑制細胞介素產生，下調或抑制自身抗原表現或掩蔽MHC抗原的物質。這類試劑的實例包括2-胺基-6-芳基-5-經取代的嘧啶(參見，美國專利案第4,665,077號)；非類固醇消炎藥(NSAIDUA)；更昔洛韋(ganciclovir)、他克莫司(tacrolimus)、糖皮質素(諸如皮質醇或醛固酮)、消炎劑(諸如環加氧酶抑制劑、5-脂氧合酶抑制劑，或白三烯受體拮抗劑)；嘌呤拮抗劑，諸如硫唑嘌呤或黴酚酸酯(MMF)；烷基化劑，例如環磷醯胺；溴隱鹼(bromocryptine)；達那唑(danazol)；二胺苯碸(dapsone)；戊二醛(其掩蔽MHC抗原，如在美國專利第4,120,649號中所述)；MHC抗原和MHC片段的抗個體基因型抗體；環孢菌素A；類固醇，諸如皮質類固醇或糖皮質類固醇或糖皮質素類似物(例如，普賴鬆(prednisone)、甲基培尼皮質醇(methylprednisolone)和地塞米松(dexamethasone))；二氫葉酸還原酶抑制劑，例如甲胺蝶呤(口服或皮下)；羥基氯喹(hydroxycloroquine)；柳氮磺吡啶(sulfasalazine)；來氟米特(leflunomide)；細胞介素或細胞介素受體拮抗劑，包括抗干擾素-α，-β或-γ抗體，抗腫瘤壞死因子-α抗體(英夫利昔單抗(infliximab)或阿達木單抗(adalimumab))、抗TNF-α免疫曙紅(immunoahesin)(依那西普(etanercept))、抗腫瘤壞死因子-β抗體，抗介白素-2抗體和抗IL-2受體抗體；抗LFA-1抗體，包括抗CD11a和抗CD18抗體；抗L3T4抗體；異源性抗淋巴球球蛋白；泛-T抗體，較佳抗CD3或抗CD4/CD4a抗體；含有LFA-3結合結構域的可溶性肽(國際專利公開案第WO 90/08187號，於7/26/90公開)；鏈激酶；TGF-β；鏈黴烯酶(streptodornase)；來自宿主的RNA或DNA；FK506；RS-61443；去氧精胍菌素(deoxyspergualin)；雷帕黴素(rapamycin)；T細胞受體(Cohen et al.，美國專利第5,114,721號)；T細胞受體片段(Offner et al. (1991) Science 251:430-432；國際專利公開案第WO 90/11294號；Janeway (1989) Nature 341:482；與國際專利公開案第WO 91/01133號)；T細胞受體抗體，諸如T10B9。
「皮質類固醇」是指數種合成或天然物質中任一者，其具有類固醇之模擬或增強天然皮質類固醇之作用的通用化學結構。合成皮質類固醇的實例包括普賴鬆、培尼皮質醇(包括甲基培尼皮質醇)、地塞米松，糖皮質素和倍他米松。
「鐵螯合」是從體內移除過量鐵的一種療法。輸血中提供的每單位血液包含約250毫克的鐵，身體無法排洩，只有少量(約1 mg)會在皮膚和汗液中流失。過量鐵被困在重要器官的組織中，如腦下腺前葉、心臟、肝臟，胰臟和關節。當鐵達到毒性水平時，損害可能導致疾病(例如糖尿病、肝硬化、骨關節炎、心臟病和激素失衡)。這些激素失衡可導致甲狀腺功能低下、性腺功能低下、不孕、陽痿和不育)。如果不解決，過量的鐵會導致器官完全衰竭並死亡。鐵還原用螯合療法來實現，這是利用鐵螯合劑(諸如去鐵胺(品牌名稱Desferal或Jadenu®)或去鐵斯若(deferasirox)(品牌名稱Exjade®)在藥理上移除鐵。
「仿單(package insert)」用於指通常包括在治療產品的商業包裝中的說明書，其含有關於適應症、用法、劑量、投予、禁忌症，其他與包裝產品組合的治療產品，及/或有關使用此類治療產品的警語等資訊。
「標籤」在本文中用於指通常包括與醫藥調配物(包括容器，諸如小瓶)和仿單的商業包裝，以及其他類型包裝一起納入的資訊。
應當理解，本文所述各種具體例的一個，一些或全部性質可以組合以形成本發明的其他具體例。本發明的這些和其他態樣對於習於技藝者來說將變得顯而易見。核酸酶
本文所述方法可利用一或多種核酸酶以供靶向性剔除BCL11A類紅血球增強子。核酸酶的非限制性實例包括ZFN、TALEN、歸巢核酸內切酶，CRISPR/Cas及/或Ttago引導RNA，其可用於在活體內切割攜帶轉基因的供體分子；和用以切割細胞基因體的核酸酶，使得轉基因以靶向方式併入到基因體。參見，例如美國專利第10,435,677號；第10,072,066號；第9,957,501號；第9,963,715號；第9,650,648號；和美國專利公開案第2019/0177709號；第2018/0111975號；與第2015/0132269號。在某些具體例中，一或多種核酸酶是天然的。在其他具體例中，一或多種核酸酶是非天然的，即在DNA結合分子(也稱為DNA結合結構域)及/或切割結構域中經工程改造。例如，可以改變天然核酸酶的DNA結合結構域以結合至選定標靶位點(例如，經工程改造以結合至選定標靶位點的ZFP，TALE，及/或CRISPR/Cas的sgRNA)。在其他具體例中，核酸酶包含異源性DNA結合結構域和切割結構域(例如鋅指核酸酶；TAL效應子結構域DNA結合蛋白；具有異源性切割結構域的巨核酸酶DNA結合結構域)。在其他具體例中，核酸酶包含CRISPR/Cas的Ttago系統。A.   DNA 結合結構域
在某些具體例中，本文所述的組成物和方法採用巨核酸酶(歸巢核酸內切酶)DNA結合結構域，以結合至供體分子及/或結合至細胞基因體中感興趣的區域。天然巨核酸酶識別15-40個鹼基對的切割位點，通常分為四個家族：LAGLIDADG家族(SEQ ID NO：17)、GIY-YIG家族，His-Cyst盒家族和HNH家族。例示性歸巢核酸內切酶包括I-Sce I，I-Ceu I、PI-Psp I、PI-Sce 、I-Sce IV、I-Csm I，I-Pan I、I-Sce II、I-Ppo I、I-Sce III、I-Cre I、I-Tev I、I-Tev II和I-Tev III。它們的識別序列是已知的。亦參見美國專利第5,420,032號；美國專利第6,833,252號；Belfortet al . (1997)Nucleic Acids Res . 25:3379-3388；Dujonet al . (1989)Gene 82:115-118；Perleret al . (1994)Nucleic Acids Res. 22:1125-1127；Jasin (1996)Trends Genet . 12:224-228；Gimbleet al . (1996) J. Mol. Biol . 263:163-180；Argastet al . (1998)J. Mol. Biol . 280:345-353和新英格蘭生物實驗室目錄。
在某些具體例中，本文所述的方法和組成物利用核酸酶，其包含經工程改造的(非天然)歸巢核酸內切酶(巨核酸酶)。歸巢核酸內切酶和巨核酸酶的識別序列，諸如I-SceI、I-CeuI、PI-PspI、PI-Sce、I-SceIV、I-CsmI、I-PanI、I-SceII、I-PpoI、I-SceIII、I-CreI、I-TevI，I-TevII以及I-TevIII為已知的。亦參見美國專利第5,420,032號；美國專利第6,833,252號；Belfort et al. (1997) Nucleic Acids Res. 25:3379-3388；Dujon et al. (1989) Gene 82:115-118；Perler et al. (1994) Nucleic Acids Res. 22:1125-1127；Jasin (1996) Trends Genet. 12:224-228；Gimble et al. (1996) J. Mol. Biol. 263:163-180；Argast et al. (1998) J. Mol. Biol. 280:345-353和新英格蘭生物實驗室目錄。另外，歸巢核酸內切酶和巨核酸酶的DNA結合特異性可以經工程改造以結合非天然標靶位點。參見，例如Chevalier et al. (2002) Molec. Cell 10:895-905；Epinat et al. (2003) Nucleic Acids Res. 31:2952-2962；Ashworth et al. (2006) Nature 441:656-659；Paques et al. (2007) Current Gene Therapy 7:49-66；美國專利公開案第2007/0117128號。歸巢核酸內切酶和巨核酸酶的DNA結合結構域可在在核酸酶中以一個整體被改變(即，使得該核酸酶包括同源切割結構域)，或者可融合至異源性切割結構域。
在其他具體例中，用於本文所述方法和組成物中的一或多種核酸酶的DNA結合結構域包含天然或經工程改造的(非天然) TAL效應子DNA結合結構域。參見例如美國專利第8,586,526號，其以全文引用的方式併入。已知黃單胞菌屬(the genus Xanthomonas)的植物致病菌在重要的農作物中引起許多疾病。黃單胞菌的致病性取決於保守第III型分泌(T3S)系統，該系統將超過25種不同效應子蛋白注入植物細胞中。這些注射蛋白質為轉錄活化因子樣(TAL)效應子，其模擬植物轉錄活化因子並操縱植物轉錄體(參見Kay et al. (2007) Science 318:648-651)。這些蛋白質含有DNA結合結構域和轉錄活化結構域。Xanthomonas campestgris pv Vesicatoria最為充分特徵鑑定的TAL效應子之一為AvrBs3。(參見Bonas et al. (1989) Mol Gen Genet 218: 127-136以及國際專利公開案第WO 2010/079430號)。TAL效應子含有一個串聯重複序列的集中結構域，每個重複序列含有約34個胺基酸，這是這些蛋白質的DNA結合特異性的關鍵。此外，它們含有核定位序列和酸性轉錄活化結構域(關於綜述參見Schornack et al. (2006) J Plant Physiol 163(3): 256-272)。再者，在植物病原菌青枯雷爾氏菌(Ralstonia solanacearum)中，兩個基因(稱為brg11和hpx17)已經被發現與青枯雷爾氏菌生物變型1菌株GMI1000和在生物變型4菌株RS1000的黃單胞菌AvrBs3科同源(參見，Heuer et al. (2007) Appl and Envir Micro 73(13):4379-4384)。這些基因在核苷酸序列上彼此具有98.9%的同一性，但在hpx17的重複結構域中缺失了1,575 bp。然而，兩種基因產物與黃單胞菌的AvrBs3家族蛋白具有少於40%的序列同一性。參見例如美國專利第8,586,526號，其以整體引用的方式併入。
這些TAL效應子的特異性取決於在串聯重複序列中所發現到的序列。重複序列包含約102 bp且重複序列彼此通常為91-100%同源性(Bonas et al.，同上)。重複序列的多態性通常位於位置12和13處，且在位置12和13處的高度變異二殘基(RVD)的特性與TAL效應子之標靶序列中的連續核苷酸特性間似乎有一比一對應性(參見Moscou and Bogdanove (2009) Science 326:1501與Boch et al. (2009) Science 326:1509-1512)。在實驗上，已確定了這些TAL效應子的DNA識別的天然密碼子，使得位置12和13處的HD序列導致結合至胞嘧啶(C)、NG結合至T、NI結合至A、C、G或T，NN結合至A或G，而ING結合至T。這些DNA結合重複序列已被組裝成具有新的重複序列組合和數量的蛋白質，以做出能夠與新序列交互作用並活化在植物細胞中的非內源性報導基因表現的人工轉錄因子(Boch et al.，同上)。經工程改造的TAL蛋白已與FokI切割半結構域連接，以產生TAL效應子結構域核酸酶融合(TALEN)，其在酵母報導分析(基於質體的標靶)中展現出活性。參見，例如美國專利第8,586,526號；Christian et al. (2010) Genetics epub 10.1534/genetics.110.120717)。
在某些具體例中，用於細胞基因體的活體內切割及/或靶向切割的一或多種核酸酶的DNA結合結構域包含鋅指蛋白。較佳地，鋅指蛋白是非天然的，因為其被工程改造成結合至選定的標靶位點。參見例如Beerli et al. (2002) Nature Biotechnol. 20:135-141；Pabo et al. (2001) Ann. Rev. Biochem. 70:313-340；Isalan et al. (2001) Nature Biotechnol. 19:656-660；Segal et al. (2001) Curr. Opin. Biotechnol. 12:632-637；Choo et al. (2000) Curr. Opin. Struct. Biol. 10:411-416；美國專利第6,453,242號；第6,534,261號；第6,599,692號；第6,503,717號；第6,689,558號；第7,030,215號；第6,794,136號；第7,067,317號；第7,262,054號；第7,070,934號；第7,361,635號；第7,253,273號；與美國專利公開案第2005/0064474號；第2007/0218528號；及第2005/0267061號，其以整體引用的方式併入本文。
與天然的鋅指蛋白相比，經工程改造的鋅指結合結構域可以具有新的結合特異性。工程改造方法包括但不限於合理設計和各類型選擇。合理的設計包括，例如使用包含三聯體(或四聯體)核苷酸序列和單個鋅指胺基酸序列的數據庫，其中每個三聯體或四聯體核苷酸序列與結合特定三聯體或四聯體序列的鋅指的一或多個胺基酸序列有關。參見，例如共同擁有的美國專利第6,453,242號和第6,534,261號，其以整體引用的方式併入本文。
在美國專利第5,789,538號；第5,925,523號；第6,007,988號；第6,013,453號；第6,410,248號；第6,140,466號；第6,200,759號；和第6,242,568號；以及國際專利公開案第WO 98/37186號；第WO 98/53057號；第WO 00/27878號；與第WO 01/88197號中揭示了例示性選擇方法，包括噬菌體展示和雙雜交系統。另外，例如在共同擁有的國際專利公開案第WO 02/077227號中已描述了增強鋅指結合域的結合特異性。
此外，如在這些和其他參考文獻中所揭示，鋅指結構域及/或多指鋅指蛋白可以使用任何合適連接子序列(包括例如，長度為5個或更多個胺基酸的連接子)連接在一起。關於例示性連接子序列，亦參見美國專利第8,772,453號；第6,479,626號；第6,903,185號；和第7,153,949號。本文所述的蛋白質可以包括蛋白質的單獨鋅指間之合適連接子的任何組合。
選擇標靶位點；用於設計和構建融合蛋白(和編碼其的多核苷酸)的ZFP和方法是習於技藝者已知的，並且詳述於下列中：美國專利第6,140,081號；第5,789,538號；第6,453,242號；第6,534,261號；第5,925,523號；第6,007,988號；第6,013,453號；和第6,200,759號；國際專利公開案第WO 95/19431號；第WO 96/06166號；第WO 98/53057號；第WO 98/54311號；第WO 00/27878號；第WO 01/60970號；第WO 01/88197號；第WO 02/099084號；第WO 98/53058號；第WO 98/53059號；第WO 98/53060號；第WO 02/016536號；與第WO 03/016496號。
另外，如在這些和其他參考文獻中所揭示，鋅指結構域及/或多指鋅指蛋白可以使用任何合適連接子序列(包括例如，長度為5個或更多個胺基酸的連接子)連接在一起。關於長度為6個或更多個胺基酸的例示性連接子序列，亦參見美國專利第6,479,626號；第6,903,185號；和第7,153,949號。本文所述的蛋白質可以包括蛋白質的單獨鋅指間之合適連接子的任何組合。
鋅指核酸酶可包含一個ZFN對(包含左和右ZFN)，其中每個ZFN對包含核酸酶(切割結構域)和一個靶向BCL11A的ZFP。參見，例如，美國專利第9,963,715號；第9,650,648號；美國專利公開案第2015/0132269號和第2018/0111975號。在某些具體例中，與任何其他基因座(脫靶)相比及/或與其他BCL11A靶向核酸酶相比(例如，沒有對骨架修飾的ZFN，該修飾描述於美國專利第10,563,184號)相比，mRNA的ZFN對特異地修飾BCL11A(例如，+58增強子區域)。因此，使用本文所述的mRNA產生的細胞在BCL11A基因座處經特異地修飾，包括其中少於10%(其間的任何值的0至10%)，較佳少於5% (0至5%或其間的任何值)，甚至更佳小於1% (0至1%或其間的任何值)且甚至更佳地小於0.5% (0至1%或其間的任何值)的經遺傳修飾細胞包括BCL11A基因座外由mRNA所做出的遺傳修飾。參見例如美國專利第10,563,184號。這些細胞可能包含其他修飾，例如HLA基因不活化。
在某些具體例中，核酸酶的DNA結合結構域是CRISPR/Cas核酸酶系統的一部分，包括例如單一引導RNA (sgRNA)。參見，例如美國專利第8,697,359號和美國專利公開案第2015/0056705號。CRISPR (規律間隔成簇短回文重複序列)基因座(編碼該系統的RNA組分)，以及Cas (CRISPR相關)基因座(其編碼蛋白質)(Jansen et al. (2002) Mol. Microbiol. 43:1565-1575；Makarova et al. (2002) Nucleic Acids Res. 30:482-496；Makarova et al. (2006) Biol. Direct 1:7；Haft et al. (2005) PLoS Comput. Biol. 1:e600)構成CRISPR/Cas核酸酶系統的基因序列。微生物宿主中的CRISPR基因座包含CRISPR相關(Cas)基因以及能夠程式化CRISPR媒介之核酸切割特異性的非編碼RNA要素的組合。
第II型CRISPR是特徵鑑定最為充分的系統之一，並以四個連續步驟進行靶向DNA雙股斷裂。首先，從CRISPR基因座轉錄兩個非編碼RNA，即前-crRNA陣列和tracrRNA。其次，tracrRNA與前-crRNA的重複序列區域雜交，並媒介前-crRNA加工成含有單個間隔子序列的成熟crRNA。第三，成熟的crRNA：tracrRNA複合物經由crRNA上的間隔子和標靶DNA上與原間隔子相鄰基序(PAM)相鄰的原間隔子之間的華生-克立克鹼基配對將Cas9引導至標靶DNA，PAM為標靶識別的額外要件。最後，Cas9媒介標靶DNA的切割，從而在原間隔子內產生一個雙股斷裂。CRISPR/Cas系統的活性包括三個步驟：(i)將外來DNA序列插入CRISPR陣列中，以防止將來的攻擊，在稱為「適應」的過程中；(ii)相關蛋白的表現以及陣列的表現和加工處理；接著(iii) 使用外來核酸進行RNA媒介的干擾。因此，在細菌細胞中，一些所謂的「Cas」蛋白參與CRISPR/Cas系統的天然功能，並在諸如插入外來DNA等功能中發揮作用。
在一些具體例中，使用了CRISPR-Cpf1系統。已在法蘭西斯桿菌屬(Francisella spp)中鑑定CRISPR-Cpf1系統，其為第2類CRISPR-Cas系統，在人類細胞中媒介強大的DNA干擾。雖然在功能上是保守的，但Cpf1和Cas9在許多方面(包括在其引導RNA和受質特異性)不同(參見，Fagerlund et al. (2015) Genom Bio 16:251)。Cas9和Cpf1蛋白之間的主要區別在於Cpf1不利用tracrRNA，因此僅需要crRNA。FnCpf1 crRNA長度為42-44個核苷酸(19個核苷酸重複序列和23–25個核苷酸間隔子)，並含有一個單獨莖環，可以耐受保留二級結構的序列變化。此外，Cpf1 crRNA明顯短於Cas9所需的〜100個核苷酸工程改造的sgRNA，且FnCpfl的PAM要求是置換股上的5'-TTN-3'和5'-CTA-3'。儘管Cas9和Cpf1都在標靶DNA中產生雙股斷裂，但是Cas9使用其RuvC-和HNH樣結構域在引導RNA的種子序列內產生鈍端切口，而Cpf1使用RuvC樣結構域在種子外產生交錯切口。由於Cpf1遠離關鍵種子區域產生交錯切口，NHEJ將不會破壞標靶位點，故確保Cpf1可以繼續切割同一位點，直到發生所需的HDR重組事件為止。因此，在本文所述的方法和組成物中，應理解，術語「Cas」包括Cas9和Cfp1蛋白。因此，如本文所用，「CRISPR/Cas系統」是指CRISPR/Cas及/或CRISPR/Cfp1系統，包括核酸酶，切口酶及/或轉錄因子系統。
在一些具體例中，可以使用其他Cas蛋白。一些例示性Cas蛋白包括Cas9、Cpf1(也稱為Cas12a)、C2c1、C2c2 (也稱為Cas13a)、C2c3、Cas1、Cas2、Cas4，CasX和CasY；並且包括其工程改造和天然變體(Burstein et al. (2017) Nature 542:237-241)，例如HF1/spCas9 (Kleinstiver et al. (2016) Nature 529: 490-495；Cebrian-Serrano and Davies (2017) Mamm Genome (2017) 28(7):247-261)；拆分Cas9系統(Zetsche et al. (2015) Nat Biotechnol 33(2):139-142)；基於內含肽-外顯肽系統的反式剪接Cas9 (Troung et al. (2015) Nucl Acid Res 43(13):6450-8)；mini-SaCas9 (Ma et al. (2018) ACS Synth Biol 7(4):978-985)。因此，在本文所述的方法和組成物中，應理解術語「Cas」包括所有Cas變體蛋白，天然的和經工程改造的。
在某些具體例中，Cas蛋白可以是天然的Cas蛋白的「功能衍生物」。天然序列多肽的「功能衍生物」是具有與原有序列多肽共有的定性生物學特性的化合物。「功能衍生物」包括但不限於原有序列的片段和原有序列多肽的衍生物及其片段，只要它們具有與對應原有序列多肽共有的生物學活性即可。本文預想的生物學活性是功能衍生物將DNA受質水解成片段的能力。術語「衍生物」涵蓋多肽的胺基酸序列變體，共價修飾及其融合體。Cas多肽或其片段的合適衍生物包括，但不限於Cas蛋白或其片段的突變體、融合體、共價修飾。包括Cas蛋白或其片段，以及Cas蛋白或其片段之衍生物的Cas蛋白可以從細胞獲得或透過化學方法合成或透過這兩種程序的組合而獲得。該細胞可以是天然產生Cas蛋白的細胞，或者是天然產生Cas蛋白並經遺傳工程改造以產生表現水平較高的內源性Cas蛋白或由外源引入核酸產生Cas蛋白的細胞，其編碼與內源性Cas相同或不同的Cas。在某些情況下，細胞不會自然產生Cas蛋白，而是經過遺傳工程改造成產生Cas蛋白。除了Cas蛋白以外及/或取代Cas蛋白，可用之RNA引導核酸酶的其他非限制性實例包括第2類CRISPR蛋白，諸如Cpf1。參見，例如Zetsche et al. (2015) Cell 163:1-13。
在一些具體例中，DNA結合結構域是TtAgo系統的一部分(參見，Swarts et al. (2014) Nature 507(7491):258-261；Swarts et al. (2012) PLoS One 7(4):e35888與Sheng et al. (2014) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 111(2):652-657)。在真核生物中，基因緘默化是由Argonaute (Ago)蛋白家族所媒介。在這個範例中，Ago結合至小(19-31個核苷酸) RNA。這個蛋白質-RNA緘默化複合物經由小RNA與標靶之間的華生-克立克鹼基配對來識別標靶RNA，並以核酸內切酶切割標靶RNA (Vogel (2014) Science 344:972-973)。相對來說，原核生物Ago蛋白結合至小單股DNA片段，並可能發揮偵測和移除外來(通常是病毒)DNA的作用(Yuan et al. (2005) Mol. Cell 19:405；Olovnikov et al. (2013) Mol. Cell 51:594；Swarts et al.，同上)。例示性原核生物Ago蛋白包括來自Aquifex aeolicus、球形紅細菌(Rhodobacter sphaeroides)和Thermus thermophilus的Ago蛋白。
特徵被鑑定最為充分的原核生物Ago蛋白之一是來是T. thermophiles (TtAgo；Swarts et al.，同上)者。TtAgo與具有5'磷酸根基團的15個核苷酸或13-25個核苷酸的單股DNA片段締合。這個「引導DNA」受到TtAgo結合，以在第三方DNA分子中引導蛋白質-DNA複合物結合至華生-克立克互補DNA序列。一旦這些引導DNA中的序列資訊允許鑑定標靶DNA，則TtAgo引導DNA複合物就會切割標靶DNA。當與標靶DNA結合時，TtAgo-引導DNA複合物的結構也支持這種機制(Sheng et al.，同上)。來自球形紅細菌的Ago (RsAgo)具有相似的性質(Olovnikov et al.，同上)。
可以將任意DNA序列的外源性引導DNA裝載到TtAgo蛋白上(Swarts et al.，同上)。由於TtAgo切割的特異性是由引導DNA指引的，與外源性之由研究人員指定的引導DNA形成的TtAgo-DNA複合物將引導靶向DNA切割的TtAgo到研究人員指定的互補標靶DNA。以此方式，可以在DNA中產生靶向的雙股斷裂。使用TtAgo-引導DNA系統(或來自其他生物的異種同源Ago-引導DNA系統)可以在細胞內靶向切割基因體DNA。這種切割可以是單股或雙股的。為了切割哺乳動物基因體DNA，較佳使用為了在哺乳動物細胞中表現而優化的TtAgo密碼子形式。另外，可能更佳用活體外形成的TtAgo-DNA複合物處理細胞，其中TtAgo蛋白與細胞穿透肽融合。另外，可能更佳使用經誘變而改變的一種TtAgo蛋白形式，以在37℃下具有改善的活性。使用在本技藝中關於利用DNA斷裂的標準技術，TtAgo-RNA媒介的DNA切割可被用於影響全部結果，包括基因剔除、靶向基因添加、基因修正、靶向基因缺失。
因此，核酸酶包含DNA結合結構域，其中特異地結合至希望將供體(轉基因)插入其中的任何基因中的標靶位點。
在某些具體例中，DNA結合結構域結合至白蛋白，例如命名為SBS-47171和SBS-47898的ZFP的DNA結合結構域。參見，例如美國專利公開案第2015/0159172號。B. 切割結構域
任何合適的切割結構域可與DNA結合結構域締合(例如， 可操作地連接)以形成核酸酶。例如，ZFP DNA結合結構域已融合至核酸酶結構域而形成ZFN，ZFN是一種功能性實體，其能夠透過其工程改造的(ZFP) DNA結合結構域識別其預期的核酸標靶，並導致DNA在ZFP結合位點附近經由核酸酶活化被切開。參見，例如Kim et al. (1996)Proc Natl Acad Sci USA 93(3):1156-1160。最近，ZFN已用於多種不同生物的基因體修飾。參見，例如美國專利公開案第2003/0232410號；第2005/0208489號；第2005/0026157號；第2005/0064474號；第2006/0188987號；第2006/0063231號；和國際專利公開案第WO 07/014275號。同樣，TALE DNA結合結構域已與核酸酶結構域融合而形成TALEN。參見，例如美國專利第8,586,526號。還描述過包含結合至DNA並與切割結構域(例如Cas結構域)締合以誘導靶向切割的單一引導RNA(sgRNA)的CRISPR/Cas核酸酶系統。參見，例如美國專利第8,697,359號和第8,932,814號，及美國專利公開案第2015/0056705號。
如上所述，切割結構域可以與DNA結合結構域為異源的，例如鋅指DNA結合結構域和來自核酸酶的切割結構域，或TALEN DNA結合結構域和來自核酸酶的切割結構域；sgRNA DNA結合結構域和來自核酸酶的切割結構域(CRISPR/Cas)；及/或來自不同核酸酶的巨核酸酶DNA結合結構域和切割結構域。異源性切割結構域可獲自任何核酸內切酶或核酸外切酶。可以從其衍生切割結構域的例示性核酸內切酶包括，但不限於限制性核酸內切酶和歸巢核酸內切酶。參見，例如2002-2003目錄，新英格蘭生物實驗室，Beverly, MA；以及Belfort et al. (1997) Nucleic Acids Res. 25:3379-3388。切割DNA的其他酶是已知的(例如，S1核酸酶；綠豆核酸酶；胰臟DNase I；微球菌核酸酶；酵母HO核酸內切酶；還參見Linn et al. (eds.) Nucleases, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1993)。這些酶中的一或多者(或其功能片段)可以用作切割結構域和切割半結構域的來源。
類似地，切割半結構域可衍生自如上文所述的任何核酸酶或其部分，就切割活性來說其需要二聚化。通常，如果融合蛋白包含切割半結構域，則需要兩個融合蛋白進行切割。或者，可以使用包含兩個切割半結構域的單一蛋白質。兩個切割半結構域可以衍生自相同核酸內切酶(或其功能片段)，或者每個切割半結構域可衍生自不同核酸內切酶(或其功能片段)。另外，兩個融合蛋白的標靶位點較佳地相對於彼此配置，使得兩個融合蛋白與它們各自標靶位點的結合令切割半結構域彼此在空間方向上以允許切割半結構域形成功能性切割結構域(例如藉由二聚化)的方式形成。因此，在某些具體例中，標靶位點的鄰近邊緣被5-8個核苷酸或15-18個核苷酸隔開。但是，任何整數個核苷酸或核苷酸對都可以插入兩個標靶位點之間(例如2至50個核苷酸對或更多)。通常，切割位點位於標靶位點之間。
限制性核酸內切酶(限制酶)存在於許多物種中，且能夠特異性結合至DNA (在識別位點處)，並能夠在結合位點處或結合位點附近切割DNA。某些限制酶(例如第IIS型)在從識別位點移除的位點處切割DNA，並具有可分離的結合結構域和切割結構域。例如，第IIS型酶FokI在一股上距其識別位點9個核苷酸處和另一股距其識別位點13個核苷酸處催化DNA的雙股切割。參見，例如美國專利第5,356,802號；第5,436,150號和第5,487,994號；以及Li et al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:4275-4279；Li et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:2764-2768；Kim et al. (1994a) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:883-887；Kim et al. (1994b) J. Biol. Chem. 269:31,978-31,982。因而，在一個具體例中，融合蛋白包含來自至少一種第IIS型限制酶的切割結構域(或切割半結構域)，及一或多個可被工程改造或可不被工程改造的鋅指結合結構域。
其切割結構域可與結合結構域分離的例示性第IIS型限制酶為FokI。這個特定的酶作為二聚體時具有活性。Bitinaite et al. (1998) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95:10,570-10,575。因此，出於本揭示內容之目的，在所揭示的融合蛋白中使用的FokI酶部分被認為是切割半結構域。是以，對於使用鋅指-FokI融合體的靶向雙股切割及/或靶向置換細胞序列，可以使用各自包含FokI切割半結構域的兩個融合蛋白來重建催化活性切割結構域。或者，也可以使用含有鋅指結合結構域和兩個FokI切割半結構域的單個多肽分子。使用鋅指-FokI融合物進行靶向切割和靶向序列改變的參數提供於本揭示內容的他處。
切割結構域或切割半結構域可以是蛋白質的任何部分，其保有切割活性，或保留多聚化(例如，二聚化)的能力以形成功能性切割結構域。
例示性第IIS型限制酶描述於美國專利第7,888,121號中，其以整體併入本文。其他限制酶也含有可分離的結合結構域和切割結構域，並為本揭示內容所預見。參見，例如Roberts et al. (2003) Nucleic Acids Res. 31:418-420。
在某些具體例中，切割結構域包含最小化或防止同二聚化的一或多個經工程改造切割半結構域(也稱為二聚化結構域突變體)，例如，在美國專利第8,772,453號；第8,623,618號；第8,409,861號；第8,034,598號；第7,914,796號；與第7,888,121號中所述，其整體內容全部以引用的方式併入本文。在FokI之位置446、447、479、483、484、486、487、490、491、496、498、499、500、531、534、537和538處的胺基酸殘基都是影響FokI切割半結構域二聚化的目標。
形成必要異二聚體的FokI的例示性工程改造切割半結構域包括一對，其中第一切割半結構域包括在FokI的位置490和538處的胺基酸殘基突變，而第二切割半結構域包括在位置486和499處的胺基酸殘基突變。
因此，在一個具體例中，在490處用Lys (K)取代Glu (E)的突變；在538處用Lys (K)取代Iso (I)的突變；在486處用Glu (E)取代Gln (Q)的突變；及在位置499處用Lys (K)取代Iso (I)的突變。具體而言，本文所述之經工程改造的切割半結構域是經由在一個切割半結構域的位置490(E→K)與538(I→K)突變，以產生稱為「E490K:I538K」的工程改造切割半結構域；以及經由在另一個切割半結構域的位置486(Q→E)與499(I→L)突變，以產生稱為「Q486E:I499L」的工程改造切割半結構域。本文所述的工程改造切割半結構域是必要異二聚體突變體，其中異常切割被最小化或被消除。美國專利第7,914,796號和第8,034,598號，其揭示內容以整體引用的方式併入本文。在某些具體例中，經工程改造切割半結構域包含在位置486、499和496處的突變(相對於野生型Fok I編號)，例如在位置486處用Glu (E)殘基取代野生型Gln (Q)殘基的突變、在位置499處用Leu (L)殘基取代的野生型Iso (I)殘基的突變，以及在位置496處用Asp (D)或Glu (E)殘基取代野生型Asn (N)的突變(也分別稱為「ELD」和「ELE」結構域)。在其他具體例中，經工程改造切割半結構域包含在位置490、538和537處的突變(相對於野生型FokI編號)，例如在位置490處用Lys (K)殘基取代野生型Glu (E)殘基、在位置538處用Lys (K)殘基取代野生型Iso (I)殘基，以及在位置537處用Lys (K)殘基或Arg (R)殘基取代野生型His (H)殘基(分別也稱為「KKK」和「KKR」結構域)。在其他具體例中，經工程改造切割半結構域包含在位置490和537處的突變(相對於野生型FokI編號)，例如在位置490處用Lys (K)殘基取代野生型Glu (E)，以及在位置537處用Lys (K)殘基或Arg (R)殘基取代野生型His (H)殘基(也分別稱為「KIK」和「KIR」結構域)。參見例如美國專利第8,772,453號。在其它具體例中，經工程改造切割半結構域包括所述「Sharkey」及/或「Sharkey突變」(參見，Guo et al. (2010) J. Mol. Biol. 400(1):96-107)。
本文所述的經工程改造切割半結構域可以使用任何合適的方法來製備，例如藉由野生型切割半結構域的定點誘變(FokI)，如美國專利第7,888,121號；第7,914,796號；第8,034,598號；和第8,623,618號中所述。
或者，核酸酶可以使用所謂的「分裂酶」技術在活體內被組裝於核酸標靶位點處(參見，例如，美國專利公開案第2009/0068164號)。此類分裂酶的組分可以在單獨的表現構建體上表現，或者可以連接在一個開放閱讀框中，在該閱讀框中，各個成分是分開的，例如藉由自切割2A肽或IRES序列。組分可以是單獨的鋅指結合結構域或巨核酸酶核酸結合結構域的結構域。
核酸酶可在使用前進行活性篩選，例如在美國專利第8,563,314號中所述的基於酵母的染色體系統中。核酸酶的表現可以受到組成型啟動子或誘導型啟動子控制，例如在棉子糖及/或半乳糖存在下被活化(去抑制)並在葡萄糖存在下被抑制的半乳糖激酶啟動子。
Cas9相關的CRISPR/Cas系統包含兩個RNA非編碼組分：一個tracrRNA和一個前-crRNA陣列，該陣列含有被相同的直接重複序列(DR)分隔開的核酸酶引導序列(間隔子)。要使用CRISPR/CAS系統來完成基因體工程改造，這些RNA的兩種功能必須存在(參見，Cong et al. (2013) Sciencexpress 1/10.1126/science 1231143)。在一些具體例中，tracrRNA和前-crRNA是經由個別的表現構建體或以個別的RNA提供。在其他具體例中，構建嵌合RNA，其中將經工程改造的成熟crRNA (賦予標靶特異性)融合至tracrRNA (提供與Cas9的交互作用)，以產生嵌合crRNA-tracrRNA雜交體(也稱為單一引導RNA)。(參見，JJinek et al. (2012) Science 337:816-821、Jinek et al. (2013) eLife 2:e00471和Cong，同上)。
本文所述的核酸酶可以在標靶位點中做出一或多個雙股及/或單股切割。在某些具體例中，核酸酶包含催化不活化的切割結構域(例如，FokI及/或Cas蛋白)。參見，例如美國專利第9,200,266號；第8,703,489號和Guillinger et al. (2014) Nature Biotech. 32(6):577-582。在催化上不活化的切割結構域可以與催化活化結構域組合，用作切口酶以形成單股切割。因此，可以組合使用兩種切口酶以在特定區域中做出雙股切口。其他切口酶在本技藝中也是已知的，例如McCaffery et al. (2016) Nucleic Acids Res. 44(2):e11. doi: 10.1093/nar/gkv878. Epub 2015 Oct 19。
因此，可以使用包含DNA結合結構域和切割結構域的任何核酸酶。在某些具體例中，核酸酶包含由第一和第二ZFN (也稱為左ZFN和右ZFN)組成的ZFN，例如包含第一ZFN以及第二ZFN的ZFN，該第一ZFN包含命名為SBS- 63014的ZFP和切割結構域，該第二ZFN包含命名為SBS-65722的ZFP和切割結構域。在某些具體例中，ZFN的左和右(第一和第二) ZFN被攜帶在同一個載體上，而在其他具體例中，ZFN的成對組分被攜帶在不同載體上，例如兩個mRNA載體，如實例1中所示，一個命名為SB-mRENH1 mRNA (編碼包含ZFP的ZFN的mRNA，該ZFP命名為63014)，另一個命名為SB-mRENH2 mRNA (編碼包含ZFP的ZFN的mRNA，該ZFP命名為65722)。標靶位點
如上所詳述，可以對DNA結構域進行工程改造，使其結合至基因座中的任何選定序列，例如白蛋白或其他安全停泊基因。與天然DNA結合結構域相比，經工程改造的DNA結合結構域可以具有新的結合特異性。工程改造方法包括但不限於合理設計和各種類型的選擇。合理的設計包括，例如使用包含三聯體(或四聯體)核苷酸序列和單獨(例如鋅指)胺基酸序列的數據庫，其中每個三聯體或四聯體核苷酸序列與結合特定三聯體或四聯體序列之DNA結合結構域的一或多個胺基酸序列締合。參見，例如共同擁有的美國專利第6,453,242號和第6,534,261號，其以整體引用的方式併入本文。也可以執行TAL-效應子結構域的合理設計。參見例如美國專利公開案第2011/0301073號。
適用於DNA結合結構域的例示性選擇方法包括噬菌體展示和雙雜交系統，揭示於美國專利第5,789,538號；第5,925,523號；第6,007,988號；第6,013,453號；第6,410,248號；第6,140,466號；第6,200,759號；與第6,242,568號；以及國際專利公開案第WO 98/37186​號​；第WO 98/53057號；第WO 00/27878號；和第WO 01/88197號和GB 2,338,237。
選擇標靶位點；核酸酶與用於設計和構建融合蛋白(以及編碼其的多核苷酸)的方法是習於技藝者已知的，並且詳述於以下中：美國專利公開案第2005/0064474號和第2006/0188987號，其以全文引用的方式併入本文。
另外，如在這些和其他參考文獻中所揭示，DNA結合結構域(例如多指鋅指蛋白)可以使用任何合適連接子序列(包括例如，長度為5個或更多個胺基酸的連接子)連接在一起。關於長度為6個或更多個胺基酸的例示性連接子序列，參見例如美國專利第6,479,626號；第6,903,185號；和第7,153,949號。本文所述的蛋白質可以包括蛋白質的個別DNA結合結構域之間的合適連接子的任何組合。亦參見美國專利第8,586,526號。
在某些具體例中，用於DNA結合結構域的標靶位點在BCL11A基因內。參見，例如美國專利第10,563,184號；第9,963,715號；第9,650,648號；美國專利公開案第2015/0132269號；第2018/0111975號；和第2019/0177709號。本發明的組成物 / 系統
本文描述經修飾的自體HSC/PC，其被遞送到個體以實施依據某些具體例的方法。編碼右與左ZFN配偶體的兩個mRNA被遞送到收取的HSC/PC，其靶向BCL11a類紅血球增強子序列。在某些具體例中，mRNA包括SB-mRENH1和SB-mRENH2。在本文所述任一種方法中，藉由在分離之前用一或多劑G-CSF及/或一或多劑普樂沙福處理個體而在個體體內進行動員後，收取(例如，血球分離術) CD34 + HSC/PC和受動員的細胞。在某些具體例中，在整個或每回血球分離術中收取至少約25×106 個CD34+ HSPC/kg，並且可以培養任何時間長度。培養所得到的經遺傳修飾細胞及其後代將包括特定BCL11A遺傳修飾(例如，少於1%的細胞具有脫靶(非BCL11A)修飾)，但不一定是mRNA。
包含BCL11剔除的細胞被輸注到個體。可在特定BCL11A經遺傳修飾的細胞中進行額外修飾，例如HLA基因不活化。細胞
本文還提供了經遺傳修飾的細胞，例如HSC/PC，其包含BCL11A類紅血球增強子的靶向剔除。藉由用編碼左與右ZFN配偶體的mRNA處理收取的HSC/PC來產生基因剔除，其中在轉譯後將產生活性ZFN。ZFN切割BCL11A類紅血球增強子，使得DNA中出現雙股斷裂。細胞機制使用易錯非同源末端連接(NHEJ)來修復雙股斷裂，這會導致切割位點周圍核苷酸的插入與缺失(插入缺失)。
自體(例如個體衍生的)和同種異體(健康供體衍生的) HSC/PC都可以用於實施該方法。
如本文所述的細胞可用於細胞療法中，以治療及/或預防患有β-地中海貧血症的個體的病症。在經修飾幹細胞的情況下，於輸注入個體後，這些前驅細胞在活體內分化成表現功能蛋白的細胞(來自插入的供體)。
還提供了包含如本文所述之細胞的醫藥組成物。另外，可以在投予給個體之前將細胞冷凍保存。
本文所述的細胞群體(和組成物)包含在BCL11A基因座處經特異性遺傳修飾的細胞，包括經遺傳修飾的細胞群體，其中小於10% (其間的任何值的0至10%)，較佳小於5% (0至5%或其間的任何值)，甚至更佳小於1%的細胞(0至1%或其間的任何值)，以及更佳小於0.5% (0至1%或其間的任何值)的細胞包括在BCL11A基因座以外的遺傳修飾(但可能包括其他修飾，例如HLA標記的不活化)。遞送
核酸酶、編碼這些核酸酶的多核苷酸，供體多核苷酸以及包含本文所述蛋白質及/或多核苷酸的組成物的離體(ex vivo )遞送可以藉由任何合適的方式被遞送至收取的HSC/PC。
如本文中所述遞送核酸酶的方法描述於例如美國專利第6,453,242號；第6,503,717號；第6,534,261號；第6,599,692號；第6,607,882號；第6,689,558號；第6,824,978號；第6,933,113號；第6,979,539號；第7,013,219號；和第7,163,824號，其全部揭示內容以整體引用的方式併入本文。
如本文所述的核酸酶及/或供體構建體也可以使用含有編碼鋅指，TAL效應子結構域及/或Cas蛋白中之一或多者的序列的載體來遞送。可以使用任何載體系統，包括但不限於質體載體、逆轉錄病毒載體、慢病毒載體、腺病毒載體、痘病毒載體；皰疹病毒載體和腺相關病毒載體等。也參見美國專利第6,534,261號；第6,607,882號；第6,824,978號；第6,933,113號；第6,979,539號；第7,013,219號；與第7,163,824號，其以整體引用的方式併入本文。
習用的基於病毒和非病毒的基因轉移方法可以用於將編碼核酸酶與供體構建體的核酸引入細胞(例如，哺乳動物細胞)和標靶組織。非病毒載體遞送系統包括DNA質體、裸核酸，以及與遞送載體(諸如脂質體或泊洛沙姆)複合的核酸。病毒載體遞送系統包括DNA和RNA病毒，它們在遞送至細胞後具有游離型基因體或併入基因體。關於基因治療程序的綜述，參見Anderson (1992) Science 256:808-813；Nabel & Felgner (1993) TIBTECH 11:211-217；Mitani & Caskey (1993) TIBTECH 11:162-166；Dillon (1993) TIBTECH 11:167-175；Miller (1992) Nature 357:455-460；Van Brunt (1988) Biotechnology 6(10):1149-1154；Vigne (1995) Restorative Neurology and Neuroscience 8:35-36；Kremer & Perricaudet (1995) British Medical Bulletin 51(1):31-44；Haddada et al., in Current Topics in Microbiology and Immunology Doerfler and Böhm (eds.) (1995)；以及Yu et al. (1994) Gene Therapy 1:13-26。
非病毒遞送核酸的方法包括電穿孔、脂質轉染、顯微注射、生物槍、病毒體、脂質體、免疫脂質體、聚陽離子或脂質：核酸接合物、裸DNA、人工病毒體，與增強DNA吸收的試劑。也可以使用音波穿孔用於遞送核酸，其使用例如Sonitron 2000系統(Rich-Mar)。
其他例示性核酸遞送系統包括由下列提供者：Amaxa Biosystems (Cologne, Germany)、Maxcyte, Inc. (Rockville, Maryland)、BTX Molecular Delivery Systems (Holliston, MA)與Copernicus Therapeutics Inc, (參見，例如美國專利第6,008,336號)。脂質轉染描述於，例如美國專利第5,049,386號；第4,946,787號；與第4,897,355號)以及商業上販售的脂質轉染試劑(例如TransfectamTM 與LipofectinTM )。適於多核苷酸的有效率受體識別脂質轉染的陽離子和中性脂質包括Felgner的那些，國際專利公開案第WO 91/17424號、第WO 91/16024號。
脂質：核酸複合物的製備，包括靶向脂質體(諸如免疫脂質複合物)是習於技藝者周知的(參見，例如Crystal (1995) Science 270:404-410；Blaese et al. (1995) Cancer Gene Ther. 2:291-297；Behr et al. (1994) Bioconjugate Chem. 5:382-389；Remy et al. (1994) Bioconjugate Chem. 5:647-654；Gao et al. (1995) Gene Therapy 2:710-722；Ahmad et al. (1992) Cancer Res. 52:4817-4820；美國專利第4,186,183號；第4,217,344號；第4,235,871號；第4,261,975號；第4,485,054號；第4,501,728號；第4,774,085號；第4,837,028號；與第4,946,787號)。
遞送的其他方法包括使用將待遞送的核酸打包到EnGeneIC遞送載體(EDV)中。使用雙特異性抗體將這些EDV特異性地遞送至標靶組織，其中抗體的一個臂對標靶組織具有特異性，而另一個臂對EDV具有特異性。抗體將EDV帶到標靶細胞表面，然後藉由內吞作用將EDV帶入細胞。一旦在細胞中，內容物便被釋放(參見，MacDiarmid et al. (2009) Nature Biotechnology 27(7):643)。
使用以RNA或DNA病毒為主的系統以供遞送編碼經工程改造ZFP之核酸係利用高度進化過程，以便在體內將病毒靶向特定細胞並將病毒有效負載(payload)運輸至細胞核。病毒載體可用於在活體外處理細胞，並將經修飾的細胞投予給個體(離體)。用於遞送ZFP之基於病毒的習知系統包括但不限於用於基因轉移的逆轉錄病毒、慢病毒、腺病毒、腺相關病毒，牛痘病毒和單純皰疹病毒載體。用逆轉錄病毒，慢病毒和腺相關病毒基因轉移方法可以併入宿主基因體中，通常會導致被插入的轉基因長期表現。另外，已經在許多不同的細胞類型和標靶組織中測到了高轉導效率。
重組腺相關病毒載體(rAAV)是一種基於有缺陷但非致病性小病毒腺相關病毒第2型的有前途替代性基因遞送系統。所有載體均衍生自僅保有側接轉基因表現匣的AAV 145 bp反向末端重複序列的質體。由於併入到經轉導細胞的基因體中，有效率的基因轉移和穩定的轉基因遞送是這個載體系統的關鍵特徵。(Wagner et al. (1998) Lancet 351(9117):1702-3；Kearns et al. (1996) Gene Ther. 9:748-55)。也可以根據本發明來使用其他AAV血清型，包括作為非限制性實例，AAV1、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV8、AAV 8.2，AAV9 和AAV rh10與假型AAV(諸如AAV2/8，AAV2/5和AAV2/6)。在一些具體例中，使用能夠穿過血腦障壁的AAV血清型。
複製缺陷型重組腺病毒載體(Ad)可在高力價(titer)下生產並容易感染許多不同的細胞類型。大多數腺病毒載體經過工程改造，以使得轉基因取代Ad E1a，E1b及/或E3基因；隨後複製缺陷型載體在人類293細胞中增殖，從而提供反式缺失的基因功能。Ad載體可以在活體內轉導多種類型的組織，包括非分裂的已分化細胞，諸如在肝臟，腎臟和肌肉中發現的細胞。習用Ad載體的承載能力大。在臨床試驗中使用Ad載體的實例包括多核苷酸療法，用於肌肉內注射進行抗腫瘤免疫(Sterman et al. (1998) Hum. Gene Ther. 7:1083-9)。在臨床試驗中使用腺病毒載體進行基因轉移的其他實例包括Rosenecker et al. (1996) Infection 24(1):5-10；Sterman et al. (1998) Hum. Gene Ther. 9(7):1083-1089；Welsh et al. (1995) Hum. Gene Ther. 2:205-18；Alvarez et al. (1997) Hum. Gene Ther. 5:597-613；Topf et al. (1998) Gene Ther. 5:507-513；Sterman et al. (1998) Hum. Gene Ther. 7:1083-1089。
打包細胞用於形成能夠感染宿主細胞的病毒顆粒。這樣的細胞包括打包腺病毒的293細胞，和打包逆轉錄病毒的ψ2細胞或PA317細胞。基因治療中使用的病毒載體通常由生產者細胞株產生，該生產者細胞株係將核酸載體打包到病毒顆粒中。載體通常含有打包和隨後併入宿主(如果適用的話)所需的最小病毒序列，其他病毒序列被編碼要表現的蛋白質的表現匣所取代。缺失的病毒功能由打包細胞株以反式提供。例如，用於基因治療的AAV載體通常僅具有來自AAV基因體的反向末端重複(ITR)序列，其是打包和併入到宿主基因體中所需要的。病毒DNA打包在細胞株中，該細胞株含有編碼其他AAV基因(即rep和cap)但缺少ITR序列的輔助質體。該細胞株還被作為輔助的腺病毒感染。輔助病毒可促進AAV載體複製並由輔助質體表現AAV基因。由於缺少ITR序列，因此沒有大量輔助質體被打包。可以透過例如腺病毒比AAV對熱處理更敏感來減少腺病毒的污染。
包含本文所述的經遺傳修飾細胞的組成物可以以任何合適的方式被遞送至個體，包括藉由輸注。在投予包括經遺傳修飾細胞的組成物之前，個體可以用(施用)一或多種骨髓淨除式調理劑處理一或多次，例如，投予白消安：以0.5至5 mg/kg靜脈內(IV)持續一或多次；以約3.2 mg/kg/天IV；於第0天輸注包含經遺傳修飾細胞的組成物前，在第-6天至第-3天輸注前，經由中央靜脈導管IV總劑量為約12.8 mg/kg持續4天；或者每天一次或每6小時IV。
可以使用任何劑量的經遺傳修飾細胞，例如，在約3 x 106 個細胞/kg和約20 x 106 個細胞/kg之間(例如，以約1×107 個細胞/mL的濃度用每袋約1.0-2.0×108 個細胞來調配細胞)。
醫藥上可接受的載體部分取決於所投予的特定組成物以及用於投予該組成物的特定方法。因此，如下述有多種醫藥組成物的合適調配物(參見，例如Remington’s Pharmaceutical Sciences, 17th ed., 1989)。
用於離體和活體內投予的調配物包括呈液體或乳化液體的懸浮液。通常將活性成分與醫藥上可接受的並且與活性成分相容的賦形劑混合。合適的賦形劑包括例如水、食鹽水、右旋糖、甘油，乙醇或類似物，及其組合。另外，該組成物可以包含少量的輔助物質，例如潤濕劑或乳化劑、pH緩衝劑，穩定劑或增強醫藥組成物有效性的其他試劑。應用
本發明之方法預想治療及/或預防β-地中海貧血症。治療可以包含在細胞中剔除BCL11A增強子序列，以阻斷BCL11A蛋白的表現。已知BCL11a蛋白會抑制胎兒球蛋白的表現，因此剔除BCL11A會導致缺乏HbF基因的抑制。本發明的方法和組成物也可用於需要在造血幹細胞中剔除BCL11A類紅血球增強子的任何情況下，以使衍生自這些細胞的成熟細胞(例如RBC)含有治療性剔除。這些幹細胞可以在活體外或活體內分化，並且可以衍生自可用於所有個體的通用供體類型的細胞。另外，細胞可以包含跨膜蛋白以在體內運輸細胞。治療還可以包括使用含有治療性轉基因的個體細胞，其中該等細胞離體發育然後被引回至個體。例如，可以經由自體骨髓移植將含有BCL11A類紅血球增強子剔除的HSC/PC插入個體。
因此，這個技術可以用於個體在其B球蛋白基因有突變或其表現有缺陷的情況下。編碼血紅素鏈之序列中的遺傳缺陷可能導致一群稱為血紅素病變的疾病，其包括鐮狀細胞貧血症和β地中海貧血症。在輕度地中海貧血症中，β球蛋白對偶基因中只有一者帶有突變。個體將患有小紅血球性貧血症，且檢測通常涉及低於正常平均的紅血球體積(＜80fL)。帶有輕度地中海貧血症的個體的對偶基因是β+/β或β0/β (其中「β+」是指允許形成一定數量的β鏈的對偶基因，「β」是指野生型β球蛋白對偶基因，而「β0」是指與β-球蛋白表現完全不存在相關的β球蛋白突變)。中度地中海貧血症個體通常可以過正常生活，但有時需要輸血，尤其是在生病或懷孕時，取決於其貧血症的嚴重程度。這些患者的對偶基因可能是β+/β+或β0/β+。當兩個對偶基因都有地中海貧血症突變(β0/β0)時，發生重度地中海貧血症。這是嚴重小紅血球性貧血症和低色素性貧血症。未經治療會導致貧血症，脾腫大和嚴重骨骼畸形，並在20歲之前進展至死亡。治療由定期輸血；用於脾腫大的脾切除術，和輸血引起的鐵過負荷的螯合組成。如果可以找到合適的供體，那麼骨髓移植也可以用於治療重度地中海貧血症的人，但是這種程序可能會有很大的風險。在大多數患有血紅素病變的患者中，仍然存在編碼γ球蛋白的基因，但由於分娩前後發生正常的基因抑制，因此表現相對較低。
在一些應用中，本文提供一種在β-地中海貧血症(例如，重度β-地中海貧血症(TDT)或輕度β-地中海貧血症)的人類個體體內，與未用本發明的方法和組成物治療的個體相比，改善或維持(減緩下降)與地中海貧血症相關疾病生物標記的方法。在其他應用中，本文提供了一種在β地中海貧血症的個體體內，與用本發明的方法和組成物治療之前的個體相比，降低對PRBC或其他血液製品輸注的需求(劑量水平或頻率)的方法。在另一態樣中，本文提供一種在β-地中海貧血症患者體內，減少因為長期血液製品輸注而發生鐵過負荷的方法。
因此，本文提供藉由向有需要的個體投予(例如藉由輸注)其中BCL11A在細胞中不活化之經遺傳修飾細胞，而在該個體體內治療β-地中海貧血症(例如，TDT)的方法，使得個體的HbF產生增加且β-地中海貧血症的一或多種臨床症狀減少。經處理的TDT個體可以展現出下列一或多者：(1)相對臨床實驗室血紅素分量(成人血紅素HbA，與胎兒血紅素HbF)的基線的變化，單位為公克/dL血漿及/或總Hb的HbF百分比；(2)地中海貧血症相關的疾病生物標記(諸如鐵代謝的生物標記)；及/或紅血球生成素，紅血球結合素及/或鐵調素的水平的變化(例如，達到或接近正常水平)；(3)在個體體內減輕或消除與基線輸血療法有關之鐵過負荷相關症狀，視情況其中藉由測量個體的甲狀腺素、IGF-1、早晨皮質醇、促腎上腺皮質激素(ACTH)、HbA1C、維生素D、HbA、HbF、紅血球生成素、紅血球結合素、鐵調素、甲狀腺素、IGF-1、皮質醇，ACTH及/或維生素D的水平及/或活性來分析內分泌功能障礙的減少；(4)減少或消除對血液製品輸注的需求，血液製品輸注包括PRBC輸血、血小板輸注、IVIG，血漿輸血及/或顆粒球輸血；(5)減少或消除肝臟疾病；(6)減少或消除心臟異常；(7)減少及/或消除骨質疏鬆症及/或骨折及/或骨礦物質密度相對於基線的變化；(8)減少或消除非典型形態(例如，過度增生)及/或未成熟類紅血球細胞的數量；及/或(9)在F細胞的數量和百分比方面相對於基線(治療前水平)的變化。
卡諾夫斯基日常活動功能量表(Karnofsky Performance Scale)是一種廣為接受用於評估患者功能障礙的簡單工具。使用卡諾夫斯基日常活動功能量表定義評分標準對指定訪視的每名個體進行評估和評分。篩選訪視時，卡諾夫斯基日常活動功能量表≤60沒有資格參加此項研究。評估相對於基線的變化。
經遺傳修飾的細胞可以是幹細胞(例如，CD34+ HSC/PC，ST-400)，並且可以是自體的或同種異體的(例如，從健康供體分離)，並且同種異體細胞可以被進一步修飾(例如，除了BCL11A不活化以外)，例如，從同種異體細胞移除一或多個自身抗原(例如，HLA複合物)。參見，例如，美國專利第8,945,868號；第10,072,062號；美國專利公開案第2018/0362926號。在離體修飾之前，藉由用一或多劑G-CSF及/或一或多劑普樂沙福處理個體，可以在個體體內動員自體細胞，並藉由一或多回血球分離術來收集受動員的細胞。視情況地，在個體體內動員至少約25 ×106 CD34+ HSPC/kg。該等細胞可以經遺傳修飾以使用一或多種核酸酶來不活化BCL11A，例如其中核酸酶以如本文揭示的mRNA引入細胞(SEQ ID NO：15和SEQ ID NO：16)。在離體遺傳修飾之後，可以評估細胞在BCL11A中的插入及/或缺失。
待治療的個體還可以在投予經遺傳修飾細胞之前(例如治療前10至1天)經一或多個骨髓淨除劑預處理，例如以介於0.5至5 mg/kg (或其間的任何值)靜脈內(IV)投予白消安持續一或多次；以約3.2 mg/kg/天IV投予白消安；於第0天輸注經修飾HSPC前，在第-6天至第-3天輸注前，經由中央靜脈導管IV總劑量為約12.8 mg/kg持續4天；或者每天一次(例如4劑)或每6小時(總共16劑) IV投予白消安。可以使用任何劑量的經修飾細胞，包括但不限於約3 x 106 個細胞/kg和約20 x 106 個細胞/kg之間，視情況其中將細胞調配於含有10% DMSO的難溶性冷凍介質中。可以在任何合適的容器或包裝中(例如在輸液袋中)調配細胞(例如，以約1×107 個細胞/mL的濃度包含每袋約1.0-2.0×108 個細胞)。
如本文所用，應用於一個或多個感興趣值的術語「大約」或「約」是指類似於所述參考值之值。在某些具體例中，除非另有說明或從上下文中可以明顯看出，否則該術語指的是在任一方向上(大於或小於)落入所述參考值之10%、9%、8%、7%、6%、5%、4%、3%、2%、1%或更少範圍內的值。
以下實例是關於本揭示內容的例示性具體例，其中核酸酶包含鋅指核酸酶(ZFN)或TALEN。將理解的是，這僅出於例示為目的，並且可以使用其他核酸酶或核酸酶系統，例如具有經工程改造DNA結合結構域的歸巢核酸內切酶(巨核酸酶)及/或天然經工程改造歸巢核酸內切酶(巨核酸酶) DNA結合結構域和異源性切割結構域及/或包含工程改造的單一引導RNACRISPR/Cas系統的融合體。實例 實例 1 ： ZFN 設計
ZFN對是由6指ZFN (由mRNA SB-mRENH1編碼)和5指ZFN (由mRNA SB-mRENH2編碼)組成，其結合至人類BCL11A基因的類紅血球特異性增強子的33個鹼基對(合併的)標靶位點，該標靶位點是在人類基因體GRCh38/hg38裝配體中的位置chr2:60,495,250-60,495,290處。如下製備ZFN和編碼它們的多核苷酸：在活體外藉由技藝中已知的方法製造SB-mRENH1與SB-mRENH2 mRNA。mRNA包含編碼ZFN配偶體的序列，並且還包含諸如核定位序列和肽的部分。表1顯示與每個配偶體ZFN締合的螺旋(參見美國專利第10,563184號；美國專利公開案第2018/0087072號)： 表1：ZFN設計
SBS # (標靶位點，5’-3’) 設計 [螺旋序列，SEQ ID]     連接子  
[指骨架的突變] Fok突變體  
　 F1 F2 F3 F4 F5 F6    
63014 aaAGCAACtGTTAGCTTGCACtagacta (SEQ ID NO:3) DQSNLRA(SEQ ID NO:5) RNFSLTM(SEQ ID NO:6) STGNLTN (SEQ ID NO:7) TSGSLTR(SEQ ID NO:8) DQSNLRA(SEQ ID NO:5) AQCCLFH(SEQ ID NO:9)   L7c5  
Qm5 無 Qm5 無 Qm5 無   ELD  
65722 caCAGGCTCCAGGAAGGgtttggcctct (SEQ ID NO:4) RNDHRTT (SEQ ID NO:10) QKAHLIR(SEQ ID NO:11) QKGTLGE (SEQ ID NO:12) RGRDLSR (SEQ ID NO:13) RRDNLHS (SEQ ID NO:14) N/A   L0
  Qm5 Qm5 無 Qm5 無 N/A KKR K525S
SB-mRENH1 mRNA的完整核苷酸序列(1725個核苷酸)顯示於下： 5’gggagacaagcuuugaauuacaagcuugcuuguucuuuuugcagaagcucagaauaaacgcucaacuuuggcagaucgaauucgccauggacuacaaagaccaugacggugauuauaaagaucaugacaucgauuacaaggaugacgaugacaagauggcccccaagaagaagaggaaggucggcauccacgggguacccgccgcuauggcugagaggcccuuccagugucgaaucugcaugcagaacuucagugaccaguccaaccugcgcgcccacauccgcacccacaccggcgagaagccuuuugccugugacauuugugggaggaaauuugcccgcaacuucucccugaccaugcauaccaagauacacacgggcagccaaaagcccuuccagugucgaaucugcaugcagaacuucaguuccaccggcaaccugaccaaccacauccgcacccacaccggcgagaagccuuuugccugugacauuugugggaggaaauuugccaccuccggcucccugacccgccauaccaagauacacacgcacccgcgcgccccgaucccgaagcccuuccagugucgaaucugcaugcagaacuucagugaccaguccaaccugcgcgcccacauccgcacccacaccggcgagaagccuuuugccugugacauuugugggaggaaauuugccgcccaguguugucuguuccaccauaccaagauacaccugcggggauccaucagcagagccagaccacugaacccgcacccggagcuggaggagaagaaguccgagcugcggcacaagcugaaguacgugccccacgaguacaucgagcugaucgagaucgccaggaacagcacccaggaccgcauccuggagaugaaggugauggaguucuucaugaagguguacggcuacaggggaaagcaccugggcggaagcagaaagccugacggcgccaucuauacagugggcagccccaucgauuacggcgugaucguggacacaaaggccuacagcggcggcuacaaucugccuaucggccaggccgacgagauggagagauacguggaggagaaccagacccgggauaagcaccucaaccccaacgagugguggaagguguacccuagcagcgugaccgaguucaaguuccuguucgugagcggccacuucaagggcaacuacaaggcccagcugaccaggcugaaccacaucaccaacugcaauggcgccgugcugagcguggaggagcugcugaucggcggcgagaugaucaaagccggcacccugacacuggaggaggugcggcgcaaguucaacaacggcgagaucaacuucagaucuugauaacucgagucuagaagcucgcuuucuugcuguccaauuucuauuaaagguuccuuuguucccuaaguccaacuacuaaacugggggauauuaugaagggccuugagcaucuggauucugccuaauaaaaaacauuuauuuucauugcugcgcuagaagcucgcuuucuugcuguccaauuucuauuaaagguuccuuuguucccuaaguccaacuacuaaacugggggauauuaugaagggccuugagcaucuggauucugccuaauaaaaaacauuuauuuucauugcugcgggacauucuuaauuaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaacuag (SEQ ID NO:15)
此外，SB-mRENH2 mRNA的完整核苷酸序列(1680個核苷酸)顯示於下： 5’gggagacaagcuugaauacaagcuugcuuguucuuuuugcagaagcucagaauaaacgcucaacuuuggcagaucgaauucgccuagagaucuggcggcggagagggcagaggaagucuucuaaccugcggugacguggaggagaaucccggcccuaggaccauggacuacaaagaccaugacggugauuauaaagaucaugacaucgauuacaaggaugacgaugacaagauggcccccaagaagaagaggaaggucggcauucaugggguacccgccgcuauggcugagaggcccuuccagugucgaaucugcaugcagaaguuugcccgcaacgaccaccgcaccacccauaccaagauacacacgggcgagaagcccuuccagugucgaaucugcaugcagaacuucagucagaaggcccaccugauccgccacauccgcacccacaccggcgagaagccuuuugccugugacauuugugggaggaaauuugcccagaagggcacccugggcgagcauaccaagauacacacgggaucucagaagcccuuccagugucgaaucugcaugcagaacuucagucgcggccgcgaccugucccgccacauccgcacccacaccggcgagaagccuuuugccugugacauuugugggaggaaauuugcccgccgcgacaaccugcacucccauaccaagauacaccugcggggaucccagcuggugaagagcgagcuggaggagaagaaguccgagcugcggcacaagcugaaguacgugccccacgaguacaucgagcugaucgagaucgccaggaacagcacccaggaccgcauccuggagaugaaggugauggaguucuucaugaagguguacggcuacaggggaaagcaccugggcggaagcagaaagccugacggcgccaucuauacagugggcagccccaucgauuacggcgugaucguggacacaaaggccuacagcggcggcuacaaucugccuaucggccaggccgacgagaugcagagauacgugaaggagaaccagacccggaauaagcacaucaaccccaacgagugguggaagguguacccuagcagcgugaccgaguucaaguuccuguucgugagcggccacuucagcggcaacuacaaggcccagcugaccaggcugaaccgcaaaaccaacugcaauggcgccgugcugagcguggaggagcugcugaucggcggcgagaugaucaaagccggcacccugacacuggaggaggugcggcgcaaguucaacaacggcgagaucaacuucugauaacucgagucuagaagcucgcuuucuugcuguccaauuucuauuaaagguuccuuuguucccuaaguccaacuacuaaacugggggauauuaugaagggccuugagcaucuggauucugccuaauaaaaaacauuuauuuucauugcugcgcuagaagcucgcuuucuugcuguccaauuucuauuaaagguuccuuuguucccuaaguccaacuacuaaacugggggauauuaugaagggccuugagcaucuggauucugccuaauaaaaaacauuuauuuucauugcugcgggacauucuuaauuaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaacuag (SEQ ID NO:16)。實例 2 ：細胞修飾方法開發
活體外研究：藉由血球分離術從健康個體中收集被動員的人類CD34+ HSPC，並予以純化。用ZFN mRNA SB-mRENH1和SBmRENH2轉染經純化的HSPC。來自相同個體的未轉染CD34+ HSPC用作對照。轉染後48小時，收取經轉染CD34+ HSPC (「ST-400」)並冷凍以用於活體外研究。
為了分析ZFN媒介基因編輯BCL11A基因的人類類紅血球特異性增強子的效果，將來自上文的經修飾細胞置於稱為「cRBC匯集分化(cRBC pooled differentiation)」(Giarratana et al. (2011) Blood 118(19):5071)的活體外紅血球生成模型中，其必須在具有前類紅血球細胞介素的3步驟液體培養物中歷時培養21天。BCL11A增強子基因修飾是在ST-400中藉由MiSeq深度定序，於轉染後2天、在活體外分化開始之時與活體外分化第14天、大部分類紅血球細胞去核之前所收取的DNA樣品中進行測定。在臨床材料產生期間所預期的範圍內，經轉染細胞中BCL11A增強子基因座的修飾包括約75%插入缺失。在未轉染的對照HSPC中，基因修飾水平≤0.2%。
在類紅血球分化過程中監控細胞生長(擴增)。在第21天確認去核，其為類紅血球成熟的一種量度。經轉染HSPC的擴增範圍是約2500-至9000倍，比未經轉染HSPC低約2倍，反映出轉染程序對早期細胞生長的影響。在經轉染和未經轉染的細胞之間，去核細胞的百分比沒有差異(在兩種情況下均約為59-62%)。
在第21天(類紅血球分化終點)所分離的蛋白質樣品的逆相UPLC用於測量經轉染HSPC的類紅血球後代中的α-，β-和γ-球蛋白水平。
如圖2中所示，與未經轉染HSPC相比，γ球蛋白與β-球蛋白和γ-球蛋白與α-球蛋白的比率在ST400類紅血球後代中增加大約3至4倍。這個調查結果證明一個結果，靶向基因修飾會導致γ-球蛋白蛋白升高，其在TDT患者類紅血球細胞中增加HbF水平。在γ-球蛋白水平方面所觀察到的增加類似於那些靶向BCL11A的其他方法所公開者(Wilber et al. (2011) Blood 117(10):2817-26)和那些在帶有BCL11A單倍體不足的患者中所偵測到的(Basak et al. (2015) J Clin Invest 125(6):2363-8；Funnell et al. (2015) Blood 126(1):89-93)。
為了評估經修飾HSPC的功能潛力(評估為增殖和分化成造血譜系)，在CFU分析中使用由固定數目的輸入細胞所形成的群落數目和形態。衍生自相同個體的未經轉染CD34+ HSPC用作陰性對照。使用標準程序進行CFU分析。簡言之，將每個具有100或300個細胞的培養物以三重複鋪在6孔盤中，並培育持續14天，在這個時間點對培養物的群落計數和群落類型進行評分。解凍後的生存力是相同的(在經轉染HSPC中約72%至83%；在未經轉染HSPC中約96%)。經轉染HSPC的舖盤效力百分比範圍為15.7%至45.7%，相比之下，未經轉染HSPC為37.3%至75.0%。ST-400的鋪盤效率在使用經基因修飾細胞的其他研究所報導的範圍內(Dever et al. (2016) Nature 539(7629):384-389；Wu et al. (2001) Gene Ther 8(5):384-90)，並且由於電穿孔和基因修飾的影響，與未經轉染HSPC相比效率較低。
如表2中所示，經修飾HSPC分化成所有造血譜系，包括類紅血球前驅細胞(CFU-E和BFU-E)、顆粒球/巨噬細胞前驅細胞(CFU-G/M/GM)和多能前驅細胞(CFU-GEMM)。衍生自經修飾HSPC之CFU-E百分比類似於彼等未經轉染HSPC，而CFU-G/M/GM和CFU-GEMM的百分比僅有最小程度差異。因此，用ZFN mRNA SB-mRENH1和SB- mRENH2轉染和遺傳修飾對經修飾HSPC分化潛能的影響很小或沒有影響。 表2：CD34+ HSPC的造血分化
批號 電穿孔條件 細胞/孔 平均CFU 平均總CFU
E G/M/GM GEMM
PB-MR-003 mRENHI/mRENH2 100 16.3 17.7 0.0 34.0
未經轉染 100 25.3 45.3 4.3 75.0
PB-MR-004 mRENHI/mRENH2 100 10.0 35.7 0.0 45.7
未經轉染 100 10.7 45.0 1.0 56.7
PB-MR-006 mRENHI/mRENH2 300 17.7 29.3 0.6 47.7
未經轉染 100 20.7 32.0 1.0 53.7
PB-CH-002 mRENHI/mRENH2 300 12.7 38.3 0.0 51.0
未經轉染 100 9.0 27.0 1.3 37.3
PB-CH-003 mRENHI/mRENH2 300 17.3 28.7 1.0 47.0
未經轉染 100 19.7 40.3 0.6 60.7
經 ST-400- 轉染的纖維母細胞在軟瓊脂中的群落形成： 為了評估轉形/致瘤潛力，在軟瓊脂轉形分析中評估用ZFN mRNA SB-mRENH1-和SB-mRENH2轉染的人類WI-38纖維母細胞的錨定非依賴型生長。在經遺傳修飾的WI-38細胞中，測得的基因修飾水平為〜73%插入缺失，而相較於在未經轉染WI-38細胞中則為〜0.3%。在任何時間點均未觀察到經轉染和未經轉染的WI-38細胞的錨定非依賴型生長。結果顯示，用ZFN mRNA SB-mRENH1和SB-mRENH2轉染，並在WI-38細胞中的BCL11A 基因的類紅血球特異性增強子處所產生的ZFN媒介破壞，並不會促進致瘤性。
經修飾 CD34+ HSPC 的核型分析 (karyotyping) ： 用經修飾HSPC進行核型分析。ZFN被設計成在指定的標靶基因座處誘導基因體中的DSB。鑑於其作用機制，ZFN的脫靶活性可能會導致計劃外的遺傳變化。目視檢查單個細胞中攤開的染色體(核型分析)可以提供遺傳整體性的全局視圖，並偵測遺傳異常，包括更有針對性的其他檢測可能漏掉的大規模結構或數值染色體變化。
為了評估總體染色體形態，對衍生自3名健康個體的經修飾HSPC進行了核型分析。來自相同個體的未經轉染CD34+ HSPC用作對照。MiSeq深度定序顯示，在經轉染HSPC中，BCL11A基因的類紅血球特異性增強子處的基因修飾為77%至79%插入缺失，而未經轉染HSPC中相比為＜0.1%插入缺失。核型分析顯示，所有細胞都是人類來源的，沒有一個細胞具有明顯的染色體異常。經修飾HSPC的細胞遺傳學分析顯示，沒有與處理相關的總體結構或數值染色體異常。
經修飾HSPC中的雙股斷裂：在p53結合蛋白1 (53BP1)分析中測試經修飾HSPC，以藉由免疫組織化學來評估ZFN活性在7天內的持續時間和特異性。轉染後第1天和第2天評估基因修飾水平。53BP1在它們發生後的24小時內被募集到DSB的位點，並經由NHEJ參與DSB修復，這是ZFN誘導的DSB修復的主要途徑。使用針對53BP1的抗體，利用免疫螢光顯微鏡，修復位點顯現為固定細胞核內染色強烈且明顯有別的焦點。使用這個方法對DSB進行評估，可提供淨ZFN作用的無偏差時間量度(中靶和脫靶兩者)。評估了經修飾HSPC中的DSB，而結果指出當53BP1免疫染色水平降低時，基因修飾水平仍維持著高，證實53BP1信號的下降不是因為經轉染細胞隨時間流失所致(圖3A至圖3C)。轉染後1-2天發現到最高水平的53BP1焦點/細胞。此外，約50%的細胞在轉染後1天顯示1個53BP1焦點/細胞(1個DSB/細胞)，在轉染後7天則為約8%細胞(與未經轉染細胞所看到的背景水平相似)。轉染後第1天和第2天，BCL11A增強子標靶處的基因修飾為73.5%和78.5%。
在經修飾HSPC中的易位分析。用經修飾HSPC進行了分子易位分析，以評估可能的易位事件。量化發生在中靶基因座(BCL11A增強子)和所有已知的脫靶切割位點之間的易位事件頻率(先前鑑定出19個)。經由基於MiSeq的候選脫靶位點標準深度定序而鑑定了其中的十二個，並產生了範圍約0.01%至約0.1%的插入缺失水平。經由使用超深度定序NextSeq平台過抽樣來對較小的基因座組進行更深入的評估，從而鑑定出其餘七個位點，並產生了範圍約0.001%至約0.01%的較低插入缺失率。這是一種高度靈敏的方法，可以偵測接近105個查詢基因體之一的易位事件頻率；它用於查詢BCL11A類紅血球增強子中預期的切割標靶與每個先前鑑定出的脫靶位點之間是否有相互易位和水平。
因此，ST-400 ZFN對就BCL11A基因的類紅血球特異性增強子來說具有高度特異性，並且具有可偵測到的脫靶活性量最少。特別是，MiSeq深度DNA定序顯示脫靶切割的水平非常低，為0.15%或更低，而NextSeq分析顯示脫靶切割的水平極低，少於0.01%。相比之下，BCL11A基因的靶向類紅血球特異性增強子的插入缺失水平範圍約79%至86%。這些全基因體分析指出，BCL11A中靶基因座處的插入缺失水平超過所有鑑定出的脫靶位點處的修飾水平合計超過300倍。此外，生物資訊學分析與鑑定出脫靶基因座的文獻回顧顯示，並沒有對涉及關鍵造血功能的基因編碼區域進行修飾的證據，未導致已知與人類造血惡性病相關的修飾。
ST-400 ZFN對在類紅血球後代中的脫靶轉錄效用：為了評估優化的ST-400 ZFN對的脫靶轉錄活性，使用MiSeq深度定序分析BCLA11A基因兩側的11個基因的表現概況。在第14天從經轉染CD34+ HSPC收集RNA，與對照相比，BCL11A基因的類紅血球特異性增強子處的基因修飾水平在此時間點被量化為＞50%。經轉染CD34+ HSPC中的γ-球蛋白mRNA水平增加約2倍(相對於18s RNA標準化)，反映出BCL11A表現降低是由於BCL11A基因的類紅血球特異性增強子中的GATA1結合位點之中靶清除所致。相反地，在BCL11A基因兩側的11個基因的表現水平與對照細胞中11個基因的表現水平相似。受到GATA1調節的其他4個基因(KLF1、SCL4A1，ZFPM1和ALAS2)的表現水平也未受到影響。這些結果證實，ZFN mRNA SB-mRENH1和SB-mRENH2的活性僅限於抑制BCL11A基因轉錄及其下游效用。
用於偵測易位事件的方法，是一種用於DNA定量的標準TaqMan分析的修改形式(Holland et al. (1991) Proc Natl Acad Sci U.S.A. 8(16):7276-7280)，其中聚合酶鏈反應(PCR)與探針結合進行，該探針在貼合至DNA並隨後被DNA聚合酶降解後會釋放出螢光團。在完整的探針中，螢光團信號經由與共價附接的抑制劑交互作用而受到壓抑。該探針被設計成貼合在PCR引子擴增的區域內。因此，偵測到的螢光信號與樣品中存在的擴增子數量成正比。TaqMan引子的長度設計成20個鹼基，可產生橫跨約200個鹼基對(bp)的擴增子。合成引子並使用標準去鹽法予以純化。螢光探針的長度設計成橫跨20 bp，且GC含量為60%。該探針含有5' HEX報導染料、3'愛荷華黑FQ抑制劑，和額外內部「ZEN」抑制劑，以進一步減少背景信號。探針經HPLC純化。
由於在原有人類基因體中未發現有疑問的易位序列，因此需要針對19個脫靶基因座中的每一者來設計含括預測的易位接合的合成DNA片段，以產生標準曲線並評估分析靈敏度。這些試劑以及對應引子和探針試劑的示意圖提供在圖4中。要注意的是，在疑似污染的情況下，BCL11A和脫靶衍生片段之間的每個陽性對照模板中均插入了一個獨特的21 bp序列，以能夠基於序列識別出真正的易位產物。以gBlock的形式購買合成雙股DNA片段，其中DNA片段的長度在287到434 bp範圍之間。在圖4中，上圖描繪了含括BCL11A增強子中靶位點(綠色)和脫靶位點(橙色)的染色體區段。下圖描繪了用於偵測對應易位產物的陽性對照試劑(gBlock)。還顯示了TaqMan分析中使用的近似引子和探針位置。每個gBlock中的孤立(maroon)區段是插入到每個對照試劑中的獨特序列，以將其與真正的易位產物加以區別，並允許監控潛在的交叉污染。在片段的BCL11A區域中探測到產物1 gBlock。在片段的脫靶區域中探測到產物2 gBlock。
針對每個有疑義易位(產物1或產物2，參見圖4)，在來自未經轉染細胞之CD34+基因體DNA (gDNA)的100,000個單倍體基因體中，產生包含10000、1000、100、10、3、1，0.1或0.01個合成gBlock DNA複本的標準曲線。預期標準曲線上最低的兩個點(0.1和0.01個複本)會產生陰性訊號，並產生這些訊號以提供對對照DNA定量和分析穩健性的進一步驗證。納入三個複本點，以提供更高的分辨率和該分析預期的偵測極限範圍內的其他數據點。用QIAGEN DNeasy血液和組織套組(QIAGEN)的AE緩衝液(10 mM Tris-Cl和0.5 mM EDTA pH 9.0)(含有5 ng/uL K562細胞的gDNA)做為載劑進行十倍稀釋，然後轉移到含有100,000個CD34+ gDNA基因體的管內。
按照製造商的方案使用Bio-Rad ddPCR 2x Supermix (Bio-Rad；Hercules, CA)來製備反應，其中含有PCR緩衝液，dNTP和DNA聚合酶。生成用於標準曲線的DNA模板(gBlock)。NTC (無模板對照)樣品缺少加入gBlock，但包括來自未經轉染CD34+細胞的330 ng之gDNA。每個反應含有0.5 μM引子和0.25 μM探針。從三批ST-400中每一批的基因體DNA使用QIAGEN DNeasy血液和組織套組純化。針對每個測試樣品，將來自指定批次的100,000個單倍體基因體(330 ng) DNA添加到每個反應中，以匹配用於生成標準曲線的條件。所有樣品和標準品均進行三次。根據製造商的說明書，TaqMan分析是在Bio-Rad CFX 96即時PCR偵測系統上進行。使用的PCR程式如下：95℃持續10分鐘，然後進行94℃持續30秒和59℃持續1分鐘的50個循環。
進行TaqMan分析來檢驗經ZFN處理的CD34+細胞的基因體DNA，以尋找BCL11A中靶位點與經由MiSeq分析鑑定的12個脫靶基因座之間易位的證據。為此，使用臨床條件進行RNA轉染和表現，用ST-400 ZFN處理受動員周邊血液中的CD34 +細胞。兩天後，分離出gDNA並提交相互易位評估(產物1和產物2)。結果總結在表3中，揭示了七個脫靶位點的易位訊號非常低，頻率範圍為每104 至106 個單倍體基因體有一次易位。其餘位點顯示沒有易位的證據。 表3：偵測到的易位
脫靶位點 平均易位水平   每 100,000 個單倍體基因體的易位，依據 CMC 批號  
(每100,000個單倍體基因體)   產物1 產物2 基因座ID
名稱 (OT#) 位置 產物1 產物 2 PB-MR-006 PB-CH-001 PB-CH-002 PB-MR-006 PB-CH-001 PB-CH-002  
OT1 chr8 119856440 2.22 0.99 2.17 0.67 3.83 1. 1.47 0.5 NIFMAEVG
OT10 chr2 23702834 3.59 7.01 6.73 2.07 1.97 3.57 8.43 9.03 RFGIYSHZ
OT3 chr6 89888012 0.14 0.31 0. 0.42 0. 0.43 0. 0.5 FYQYHJIS
OT6 chr10 132654832 0.4 1.49 0. 0. 1.2 1.67 0. 2.8 ALVTVCYL
OT2 chr1 21635648 0.12 0. 0. 0. 0.37 0. 0. 0. PEBPWNNJ
OT4 chrX 66004390 0.08 0. 0. 0.23 0. 0. 0. 0. MKRBBTRS
OT12 chr19 51327822 0. 0.39 0. 0. 0. 1.17 0. 0. YJJYYWPK
OT8 chr8 94988044 0. 0. 0. 0. 0. 0. 0. 0. CSRBEMTR
OT7 chr7 131503656 0. 0. 0. 0. 0. 0. 0. 0. LSKZRNJH
OT9 chr20 37707466 0. 0. 0. 0. 0. 0. 0. 0. MDRSNDIS
OT11 chr16 2122340 0. 0. 0. 0. 0. 0. 0. 0. FYTLXRTA
OT5 chr3 49724756 0. 0. 0. 0. 0. 0. 0. 0. TNJMZKZS
實例 3 ：經修飾 HSPC 的臨床研究
在人類中進行了一項研究以測試使用經修飾HSPC治療TDT的安全性。另外，對經修飾HSPC的功效估算進行評估。探索性目的也包括評估在用經修飾細胞處理之後，於BCL11A的類紅血球特異性增強子處評估基因修飾特性(%和耐久性)，以及估算經修飾細胞在與β-地中海貧血症和HSCT相關的生物化學、成象、功能，以及骨髓上的影響。
研究納入標準包括六名受試者(β0 /β0 或非β0 /β0 )，年齡介於18與40歲，在研究篩選之前兩年內臨床診斷為TDT，以年化基礎每年有≤8次有紀錄的PRBC輸血事件。還需要確認β-地中海貧血症的分子遺傳學診斷。受試者包括願意使用節育措施的男性和女性。
研究受試者的關鍵排除標準包括：先前有自體或同種異體人類幹細胞移植或實體器官移植的歷史；與氧親和力臨床上顯著改變有關的γ-球蛋白對偶基因變體(實例包括，但不限於Hb F-Poole、Hb F-M Osaka、Hb F-La Grange、Hb F-Cincinnati和大缺失，諸如γβ-地中海貧血症或εγδβ-地中海貧血症)；血球分離術的醫學禁忌症；大規模脾腫大和嗜中性球絕對計數(ANC) ≤1,000/μL；如藉由血清肌酸酐≥ 2.0 mg/dL定義的腎功能障礙；基於肝臟生檢，在過去12個月或篩選時有橋狀纖維化、肝硬化，或活動性肝炎；在過去30天內用違禁藥物治療；具有臨床意義的活躍細菌、病毒，真菌或寄生蟲感染；基於篩選實驗室檢驗，診斷為HIV，或HBV或HCV活性感染的證據；卡諾夫斯基日常活動功能量表≤60；經校正DLCO ≤ 50%預測的或臨床顯著限制性；基於篩選肺功能測試(PFT)的肺臟疾病；充血性心臟衰竭(NYHA第III或IV級)；不穩定心絞痛，失控性心律不整或左心室射血分數(LVEF)＜40%、根據篩選時ECG的QTcF＞ 500 msec、根據篩選時MRI的心臟T2 * MRI ＜10 msec；重大出血病史；目前診斷為失控癲癇；過去5年有活動性惡性病病史(允許非黑色素瘤皮膚癌或原位子宮頸癌)；在研究候選者中，沒有陰性檢查結果的任何血液學惡性病病史，或癌症易感症候群的家族史；有可能干擾研究順從性的活躍酒精或物質濫用的病史；不順從治療的歷史；目前正在參加使用研究藥物的另一項臨床試驗，或在篩選訪視前90天內或小於研究產品的5個半衰期內參加此樣的一項試驗；使用基因療法的先前治療；對白消安或研究藥物賦形劑(人類血清白蛋白，DMSO和聚葡糖40)有過敏或過敏反應；或任何其他可能使受試者不適合加入研究的原因。研究設計
對帶有輸血依賴型β-地中海貧血症(TDT)的受試者進行研究。完成登記後，符合資格的受試者接受血球分離術以便收集自體CD34+ HSPC。藉由用ZFN mRNA SB-mRENH1和SB-mRENH2轉染來離體處理CD34+ HSPC，以製造研究藥物。在輸注經修飾HSPC之前，受試者接受靜脈內(IV)白消安的調理療法。使用G-CSF和普樂沙福處理而在每位受試者體內動員CD34+ HSPC。在動員第5天和第6天(如果需要確保挽救治療，則在+/-第7天)藉由血球分離術從每位受試者收集受動員的CD34+ HSPC。在G-CSF (在動員第1-6天)和普樂沙福(在動員第4、5與6天)投予之後，每名受試者體內的CD34+ HSPC受到動員(參見圖5)。連續兩天(例如， 第5天和第6天)藉由血球分離術從每位受試者收集被動員的CD34+ HSPC， 並在第三天(例如，為了確保挽救治療的第7天)收集未受操縱的備用移植物，目標是25 x 106 CD34+ HSPC/kg總量，儘管可以接受較小的產量。如果需要的話，≥2週後進行第二次動員和第二回血球分離術。
每名受試者所收集的細胞被分成2個部分，一部分用於經修飾HSPC藥物製造，而另一個部分待用於在指示為挽救治療的事件時。
挽救治療部包含最少2.5×106 CD34+ HSPC/公斤。挽救治療部分以未經修飾的形式被冷凍保存並儲存在該研究中心，以供在延遲造血重建或發育不全與移植失敗的情況下可用。如果第一回血球分離術沒有動員經修飾HSPC藥物製造和挽救治療所需的最小數量CD34+ HSPC，則可以重複動員程序。第二次血球分離術的時間點選擇是根據研究人員的決定，基於受試者的臨床狀態，但在不早於最初血球分離術後的2週(≥2週)。
在挽救治療的調動和儲存之後，受試者的其餘受動員和收取細胞是透過快遞員發送到GMP製造設施。篩選出CD34+細胞，接著執行用ZFN mRNA SB-mRENH1和SB-mRENH2轉染以破壞BCL11A基因的類紅血球特異性增強子，以產生經修飾HSPC研究藥物。經修飾HSPC進行冷凍保存和儲存，直到所有的臨床方案部門加入並完成納入基線訪視程序，與受試者準備好輸注。使用控制速率冷凍器，將經修飾HSPC冷凍保存在50mL CryoMACS®冷凍袋(填充約10至20 mL的體積；總細胞計數約1.0×108 至2.0×108 個細胞)。如果細胞產量超過單個袋子的容量，則使用多個冷凍袋子。輸液袋在生產設施處儲存在氣相液態氮(＜-150℃)中，直到準備好運送到臨床研究中心為止。
在釋出經修飾HSPC供臨床使用之後，受試者被接納到醫院在專門移植單位中開始IV白消安。受試者接受白消安骨髓淨除方案(3.2 mg/kg/天；經由中央靜脈導管IV)持續4天(總劑量為12.8 mg/kg，這被認為是用於自體移植的標準照護)，在於第0天輸注經修飾HSPC之前第-6天至第-3天。根據研究中心實務或指南，IV白消安可以每天給藥一次(共4劑)或每6小時給藥(共16劑)。第一劑後，基於藥物動力學採樣和研究中心實務來調整IV白消安的劑量，以每天給藥的曲線下面積(AUC)為4,000-5,000 mmol*min，或每6小時給藥的AUC為1,000-1,250 mmol*min為目標，總方案目標AUC為16,000-20,000 mmol*min。在與安全監控委員會(SMC)討論後，可以根據先前受試者的經驗修改後續受試者的IV白消安藥物動力學目標。監控治療藥物，以確定白消安在給藥4天後不需要清除，而是可以根據研究中心實務在研究人員的決定下來實施(參見圖5)。
經修飾HSPC輸注：用靜脈內白消安進行骨髓淨除性調理後(總方案目標暴露=16,000至20,000 μmol*min，如基於藥物動力學採樣所確認及/或調整)，患者經由中央靜脈導管輸液接受了解凍的CD34+ HSPC(「ST-400」)產品(圖5)。將冷凍的經修飾HSPC解凍並輸注，使得解凍和輸注的整個過程在約15分鐘內結束。冷凍的經修飾HSPC體積是根據受試者的體重來決定。在輸注之前和之後監控生命徵象(血壓、體溫、心率，呼吸頻率和脈搏血氧飽和度)。
在投予研究藥物後，監控受試者來進行常規實驗室作業。此外，也將完成任何不良事件的評估，並且針對基因修飾來分析血球。還將評估HbF水平、分析內分泌功能，並進行MRI以評估鐵負荷。將評估造血重建的動力學和成功、調理後的住院持續時間、篩檢造血惡性病的可能發展、依據簡短表格健康狀況調查(SF-36調查)的生活品質、由卡諾夫斯基日常活動功能量表的整體功能、血球分離術程序的效率，ST-400產品的插入缺失%與ST-400輸注後在骨髓和血液中偵測到的插入缺失%之間的差異。
AE是在人類中與使用藥物相關的任何不樂見醫學事件，無論是否被認為與藥物有關。AE可以包括在這個研究期間發生或嚴重程度增加的任何下列事件：在本質、嚴重程度，或頻率方面相比於基線狀態(即，篩選前)有惡化的任何徵象、症狀或身體檢查結果，無論是否被認為與正在研究的條件相關或不相關；任何臨床顯著實驗室異常或需要用藥或住院的實驗室異常。異常實驗室結果將基於不良事件一般術語標準(CTCAE)5.0標準來分級，第1級或第2級臨床實驗室異常只有當它被研究人員認為是臨床上顯著時應回報為AE，如果與已在CRF所回報的診斷不相關的話(與使用治療有關的所有事件，包括那些因為過量、濫用、撤回現象、對治療敏感性或毒性、伴隨疾病，損傷或意外而發生者)，則表示嚴重程度相對於基線有增加的第3級和第4級臨床實驗室異常應回報為AE。
SAE是導致以下結果中任一者的任何AE：死亡，危及生命的威脅事件(即，使受試者處於立即性死亡風險中的事件)；但是，這不包括以下事件：如果事件以更嚴重的形式發生，則可能導致死亡、住院病患住院或住院延長、持續或嚴重喪失能力或嚴重破壞正常生活功能的能力、暴露受試者之後代的先天性異常/出生缺陷，或醫學上重要的事件。
繼發性和探索性事件的評估：在第一次投予IV白消安的日期當天或之前，將基於在最後一次評估來決定HbF分量的基線水平(A與F，以g/dL表示)，和HbF百分比。HbF水平和相對於基線的變化將透過研究訪視進行彙總。
基線頻率和PRBC輸血的體積是以篩選之前2年期間為基準。輸血的頻率和體積是按照研究期和整體予以年化，並且將描述性地與基線值相比。
輸注後監控經修飾HSPC異質性：輸注後，可在患者體內監控經修飾HSPC，以確定植入效率和修飾異質性，如藉由插入缺失概況所評估。可以從周邊血液，骨髓抽吸物或其他組織樣品中純化受試者細胞樣品(較佳約5×104 至1×107 個細胞)，並進行基因體DNA分離。然後藉由PCR在標準條件下擴增切割位點周圍區域。接著進行第二輪PCR以添加銜接子(adapter)，從而可以使用MiSeq (Illumina)分析反應。將來自受試者細胞的定序數據與標準曲線進行比較，以確定插入缺失百分比。
規程指示，患者2和3不能開始化療調節，直到前一個患者證明有嗜中性球和血小板植入；在患者3成功植入之後，患者4-6可開始進行化療調理。監控患者的安全性和功效。這項研究涵蓋追蹤持續3年，之後提議患者參加長期安全性隨訪研究。
依據不良事件(AE)和嚴重AE (SAE)的發生率來評估安全性和耐受性。造血重建的成功和動力學是藉由嗜中性球(ANC≥500個細胞/μL)和血小板(≥20,000個細胞/μL，不受輸血支援)移植來評估。隨著時間推移在分子水平上追踪中靶插入/缺失模式，以監督新出現的造血純系。ST-400輸注後，監控患者的造血細胞內中靶插入缺失的存在、胎兒血紅素水平以及輸血需求；移植後血紅素的輸注閾值是遵照臨床中心的標準實務(患者1和2：＜8 g/dL；患者3：＜7 g/dL)。結果
迄今，已經為6位患者中的5位製造了自體ST-400產品，其中3位已經接受ST-400 (表A)。這些患者的安全性和功效數據；不良事件、胎兒血紅素產生、插入缺失標記和PRBC輸血需求將隨著時間而形成，可能持續12個月或更久。 表A：患者人口統計以及疾病特徵
患者 同意時的年齡 ( 歲 ) 基因型 登記前的年化 PRBC 事件 時間 輸注後
1 36 β0 β0 27 39週
2 30 βᐩ (嚴重IVS-I-5: G＞C) βᐩ (嚴重IVS-I-5: G＞C) 18 26週
3 23 β0 β+ (嚴重IVS-II-654 C＞T) 15 12週
4 18 βWT (αα) β0 (αααα) 13 輸注前
5 35 β0 β+ (嚴重IVS-I-110 G＞A) 15 輸注前
β0 ，不存在β-球蛋白產生：βᐩ，β-球蛋白產生減少；βWT ，野生型(正常β-球蛋白產生)；PRBC，紅血球濃厚液輸血。
在第1/2期研究中，第一例經ST-400治療的患者(患者1)具有最嚴重的輸血依賴型β-地中海貧血症(β0/β0)。在研究中進行治療之前的兩年內，這名患者每隔一週接受紅血球濃厚液(PRBC)輸血。在ST-400輸注期間，患者1經歷了短暫的過敏反應，認為與產品中存在的冷凍保護劑有關。此後，移植後的臨床過程是平淡的，且患者分別在輸注兩週和四週內表現出嗜中性球和血小板恢復。
患者1在經修飾HSPC輸注後兩週接受了PRBC輸注，並且在隨後的6週期間不再需要PRBC輸注。用經修飾HSPC輸注後七週之時，總血紅素水平保持穩定在大約9 g/dL，且胎兒血紅素水平持續上升(總血紅素從在輸注時的約1%至31% (參見圖6A和圖6B))。在循環白血球中已經偵測到插入缺失(在標靶DNA序列處做出的插入或缺失)，指出成功編輯BCL11A基因並破壞BCL11A類紅血球特異性增強子，其欲上調紅血球中的內源性胎兒血紅素產生。
在患者1中證實了嗜中性球和血小板移植之後，患者2和3如上所述進行治療。患者1、2和3均有嚴重的β地中海貧血症基因型：β0/β0，嚴重β+ IVS-I-5 (G＞C)突變(患者1和3)的同型合子；或β0/β+基因型，具有嚴重IVS-II-654 (C ＞T)突變(患者2)。
患者1和患者2經歷了迅速的造血重建。患者1的胎兒血紅素(HbF)分量增加，這有助於穩定總血紅素。無PRBC輸血持續總計6週後，患者1接著需要間歇性輸血。病人2在輸注後90天觀察到HbF水平升高。就患者1和2來說，循環白血球中存在有中靶插入和缺失(indel)。患者3剛完成ST-400製造，將在輸注後測定HbF水平。
患者1在ST-400輸注期間經歷過敏反應的嚴重不良事件(SAE)，研究人員認為該事件與產品有關。該事件已利用治療獲得解決。未回報有其他與ST-400相關的SAE。沒有觀察到純系造血作用。
隨著時間推移(例如12個月或更多個月)進行定期隨訪(評估造血重建、胎兒血紅素水平、循環白血球中的插入缺失等)，因未經修飾幹細胞重新住入骨髓內並驅動造血，患者體內的HbF水平升高且對輸血的需求減少或消除。動員與血球分離術結果
每日血球分離術之前，週邊血液CD34+計數於25至118個細胞/μL間變化。由於在第一批ST-400中的細胞劑量與CFU效力低，患者1經歷2回動員與血球分離術。從第一回開始將備用移植物冷凍保存。患者2、3、4和5分別經歷一回動員和血球分離術，從中製造出其ST-400批次，並冷凍保存備用移植物。產品特徵與造血重建
ST-400產品中的中靶插入缺失範圍為23-80%，如下文表B中所示。 表B：ST-400產品特徵與造血重建
患者 細胞劑量 (10 6 /kg) CD34+ (%) CFU 劑量 (10 5 /kg) 中靶插入缺失 a (%) 嗜中性球植入 b 天數 血小板植入 c 天數
1d 5.9 91 6.2 23e 14 25
2d 4.5 87 4.0 73 15 22
3f 11.4 90 14.8 54 22 35
4 5.4 86 7.6 80 輸注前 輸注前
5 9.5 98 10.5 76 輸注前 輸注前
a 帶有插入缺失的所有BCL11A ESE對偶基因百分比；這不等於帶有至少一個經編輯BCL11A ESE對偶基因的所有細胞百分比。b 嗜中性球植入定義為在頭一個連續3天時，發生患者的嗜中性球計數≥500個細胞/µL。c 血小板植入定義為在橫跨最少3天之頭一個3次連續測量時(在前7天沒有血小板輸注)，發生患者的血小板計數為≥20,000細胞/µL。d 患者1和2從第+5天至嗜中性球植入按照中心的標準操作程序接受G-CSF。e 患者1經歷了2回血球分離術和ST-400製造；未顯示批次的中靶插入缺失百分比為26%。所有其他患者僅經歷了一回血球分離術和製造。f 患者3從第+21天至嗜中性球植入按照中心的標準操作程序接受G-CSF。
如所示，在患者1中看到最低的插入缺失值，在兩個分開製造的批次中，其編輯效率接近25%。在臨床規模上使用相同的製程，有效率地編輯了來自12位健康供體的CD34+細胞：中位中靶插入缺失，71%；範圍，59%至83%。ST-400有核活細胞的劑量為4.5-11.4 x 106 個細胞/kg。患者在14-22天內證明有嗜中性球植入，並在22-35天內證明有血小板植入。安全性
在3位給藥的患者中，依據插入缺失概況分析隨著時間監控中靶插入缺失模式，未觀察到新出現的純系造血。參見圖7A至7C。
透過在患者1體內於第9個月的觀察結果；患者2於第6個月的觀察結果；以及患者3於第56天的觀察結果，在任何時間點，獨特插入缺失的最大頻率分別為偵測到所有插入缺失的16%，16%和14%。
表C中顯示了受治療患者所回報的嚴重不良事件(SAE)。 表C：嚴重不良事件
患者 嚴重不良事件 與 ST-400 有關
1 過敏反應a 有關
2 無 -
3 肺炎b 無關
4 無 -
5 無 -
a 發生在輸注ST-400期間，並利用醫療處置迅速解決；被認為與DMSO冷凍保護劑有關。b 肺炎發生在血球分離術程序和開始化療調理之間的時間期。
如所示，回報僅有一種歸因於ST-400藥物產品的SAE；這個過敏反應的SAE發生在ST-400輸注期間，且在輸注結束時獲得解決，並被認為與產品冷凍保護劑DMSO有關。
此外，回報的AE與動員、血球分離術和骨髓淨除性白消安調理的已知毒性相符。輸注之後的變化
如上所述，在ST-400移植後，於所有3名患者中的胎兒血紅素水平與基線相比有增加(圖8)，其中患者1和3顯示出比患者2誘導更多，這與患者2接受細胞劑量和CFU效力最低的ST-400產品相符。
在患者1中，插入缺失在週邊白血球中一直持續到第9個月，且在第90天未區分骨髓細胞顯示出6%插入缺失。在最初的6週無輸血期後，這名患者已恢復間歇性PRBC輸血，在植入起約8個月時，計畫的年化PRBC單位輸血減少33%。
在患者2中，插入缺失一直在週邊白血球中直至第6個月，並且第90天未區分骨髓細胞顯示出32%插入缺失。該患者正在接受間歇性PRBC輸血。
在患者3中，插入缺失一直在週邊白血球中直到第56天。尚不能在第90天時評估骨髓抽吸物樣品。在最初的7週無輸血期後，患者從輸注後62天開始接受了兩次PRBC輸血。患者 1 至 3 的概述
下文彙總患者1至3的治療和結果。就每個患者來說，CD34+細胞劑量計算如下：CD34+劑量= [總細胞劑量] x [CD34 +%]。參見，例如表B，在第2列顯示總細胞劑量，而在第3列顯示CD34+%。 患者1
患者1具有β0/β0基因型，TDT最為嚴重的形式，並且在加入研究之前具有27次年化紅血球濃厚液(PRBC)事件。由於在第一回中達到的細胞劑量低且效力低，患者經歷了第二回動員和血球分離術。在兩個ST-400批次中，編輯效率為約25%，低於其他加入這個研究的患者，還有以臨床規模製造的12個試驗運行批次(中值編輯效率71%)。
經輸注ST-400產物中的中靶插入缺失為23%，且CD34+細胞劑量為5.4×106 個細胞/kg。在90天時，插入缺失存在於未區分骨髓細胞中，並一直持續在週邊白血球中到第9個月。在ST-400輸注後，於第56天胎兒血紅素水平增加至約2.7 g/dL，在第39週時0.9 g/dL與基線相比仍維持升高，這是ASH數據截止時的最新測量值。在最初的6週無輸血持續時間後，患者恢復了間歇性PRBC輸血，自植入以來，輸血的年化PRBC單位整體減少了33%。 患者2
患者2是嚴重β+ IVS-I-5 (G＞C)突變的同型合子，並且在加入研究之前有18次年化PRBC事件。ST-400產品中的中靶插入缺失為73%，CD34+細胞劑量為3.9 x 106 個細胞/kg，這在5名入選患者所製造的ST-400批次中最低的。在90天時，插入缺失存在於未區分骨髓細胞中，並一直存在於週邊白血球中直到第6個月。ST-400輸注後，胎兒血紅素水平與基線相比有所增加，但為＜1 g/dL直到26週，是迄今為止在三名接受治療的患者中觀察到誘導水平中最低的。該患者目前正在接受間歇性PRBC輸血。 患者3
患者3具有β0/β+基因型，其包括嚴重IVS-II-654(C＞ T)突變，並且在加入研究之前具有15次年度化PRBC事件。ST-400產品中的中靶插入缺失率為54%，CD34+細胞劑量為10.3 x 106 個細胞/kg。在ASH的數據截止時，插入缺失一直存在於週邊白血球中直到第56天。ST-400輸注後，胎兒血紅素水平與基線相比有所增加，並且在第90天最新測量值2.8 g/dL以來持續上升。在最初的7週無輸血期後，患者於輸注後62天開始接受兩次PRBC輸血。
這些研究以及對其他患者和患者1-3的進一步研究證明，如本文所述，在投予(輸注)經遺傳修飾細胞(ST-400)之後，實現了TDT的治療，包括免除了對額外療法(諸如PRBC)的需求。
本文中提及的所有專利，專利申請案和出版物均以全文引用的方式併入。
儘管出於清楚理解之目的，藉由例示和實例詳細提供了揭示內容，但是對於那些習於技藝者來說顯而易見的是，在不偏離本揭示內容的精神或範疇的情況下，可以進行各種改變和修改。因此，前面說明和實例不應解釋為限制性的。
無
圖1是低、升高和高的胎兒血紅素水平對包含成人血紅素突變(例如鐮狀細胞病或β-地中海貧血症)的受試者之影響的圖示(改編自Hardison & Blobel (2013)Science 342(6155):206-7)。最左邊(「低胎兒血紅素」)顯示的是帶有成人血紅素突變和野生型ESE BCL11A的受試者，在這種情況下，該名受試者的胎兒血紅素水平正常(低)，從而導致受試者體內的疾病症狀。在中間(「升高之胎兒血紅素」)，受試者具有成人血紅素突變，還在其BCL11A基因具有突變，使得BCL11A 表現減少但並未消除，導致胎兒球蛋白水平升高。由於胎兒球蛋白「取代」了一些成人球蛋白功能，該名受試者經歷了一些疾病改善。在最右邊(「高胎兒血紅素」)，受試者具有成人球蛋白突變但在BCL11A增強子中有缺失，使得該名個體展現出完全胎兒球蛋白表現。由於BCL11A完全不活化，這名受試者的症狀改善甚至更大。
圖2描繪了從健康志願者(PB-MR-003和PB-MR-004)收取並受到SB-mRENH1和SB-mRENH2修飾的CD34+ HSC/PC中的胎兒(也稱為伽瑪球蛋白或γ球蛋白)水平。描繪在指定條件下，γ-球蛋白(Aγ-球蛋白和Gγ-球蛋白峰值的總和)與α-球蛋白的比率以及γ-球蛋白與β-樣球蛋白(Aγ、Gγ，β和δ-球蛋白峰值的總和)的比率，如由UPLC分析經修飾HSPC從第21天類紅血球分化起的蛋白質樣品所測定。電穿孔後48小時，收取細胞並冷凍。將細胞解凍，且用於研究活體外紅血球生成和球蛋白產生。如所示，與未經轉染細胞相比，經處理HSC/PC的類紅血球後代中γ-球蛋白與β-球蛋白的比率以及γ-球蛋白與α-球蛋白的比率增加了約3至4倍(蛋白質數據也受到γ-球蛋白mRNA水平的測定所支持)。在每組中，左方的槓表示γ-球蛋白/α-球蛋白的比率，而右方的槓表示γ-球蛋白/總β-樣球蛋白的比率。
圖3A至圖3C描繪了顯示在經修飾HSPC中，雙鏈斷裂的頻率和時間過程的圖。圖3A顯示轉染後7天內(「dpt」) 53BP1焦點/細胞的數量的時間進程(平均值±SD 53BP1+焦點/細胞)。圖3B和圖3C顯示了轉染後第1天(圖3B)和第7天(圖3C)具有不同數量(1-5+個)之53BP1焦點/細胞的總細胞百分比。* P ＜0.05 vs.對照
圖4是用於偵測染色體易位之探針組的圖示。上方描繪了含括BCL11A增強子中靶位點(實線)和脫靶位點(陰影線)的染色體區段。下方畫出了用於偵測對應易位產物的陽性對照試劑(gBlock)。還顯示了TaqMan分析中使用的引子和探針大略位置。每個gBlock中的方格區段是被插入到每個對照試劑中的獨特序列，以將其與真正的易位產物區分開，並允許監控潛在的交叉污染。在片段的BCL11A區域中探測到產物1 gBlock。在片段的脫靶區域中探測到產物2 gBlock。
圖5是描繪使用經遺傳修飾HSPC (也稱為「ST-400」)的治療規程的示意圖。「G-CSF」是指顆粒球群落刺激因子；「HSPC」是指造血幹前驅細胞；「IV」是指靜脈內；「RBC」是指紅血球；而「ZFN」是指鋅指核酸酶。
圖6A與圖6B是描繪如本文所述(參見例如圖5)在用經修飾HSPC (「ST-400」)治療的患者體內，總血紅素和胎兒血紅素的圖。圖6A顯示在指定研究天數的血紅素F水平(血紅素的%)。圖6B顯示在指定研究天數的血紅素水平(g/dL)。箭頭顯示患者何時接受PRBC輸血。在第0天投予經修飾HSPC。數據證明，輸注後50天，該名患者的胎兒血紅素增加至接近總血紅素的31%。數據還證明，儘管患者在治療前一貫每兩週接受PRBC持續兩年，但在ST-400輸注後的第10天到50天之間，患者不需要任何PRBC。
圖7A至圖7C描繪藉由有核血球(骨髓抽吸液，循環白血球或周邊血液單核細胞，若可用的話)的次世代定序所偵測到的10個最常見插入缺失(插入及/或缺失)，依據每位患者在每個時間點來顯示。圖7A顯示患者1；圖7B顯示患者2；圖7C顯示患者3。隨著時間推移，就新出現造血群落來說未觀察到令人擔憂的現象。Indel命名慣例：「I」是指插入；「D」是指缺失；第一個數字是指從參考鹼基對開始插入缺失的起始處(「*」是指位於插入缺失兩側的核苷酸，且可以與插入缺失任一側對齊)；而冒號之後的數字是指被插入或缺失的鹼基對數。如所指出的，患者2的56天數據不可用(圖7B)。
圖8描繪在用ST-400治療後的指定時間，患者1、2和3中的HbF水平。在每個圖中還針對各個患者顯示出導致β地中海貧血症的基因型。
無
Figure 12_A0101_SEQ_0001
Figure 12_A0101_SEQ_0002
Figure 12_A0101_SEQ_0003
Figure 12_A0101_SEQ_0004
Figure 12_A0101_SEQ_0005
Figure 12_A0101_SEQ_0006

Claims (41)

  1. 一種包含紅血球(RBC)前驅細胞之經遺傳修飾細胞，該前驅細胞包含SB-mRENH1 mRNA以及SB-mRENH2 mRNA，其中mRNA編碼ZFN對；以及 在受到該ZFN對切割後做出的基因體修飾，其中該修飾係在內源性BCL11A增強子序列內，使得BCL11A基因在細胞中不活化。
  2. 一種組成物，其包含如請求項1之經遺傳修飾細胞及其後代細胞。
  3. 一種在有需要的個體體內治療β-地中海貧血症(β-地中海貧血症)的離體方法，該方法包含： 向該個體投予如請求項2的組成物，以使在個體體內的胎兒血紅素(HbF)產生增加，且β-地中海貧血症的一或多種臨床症狀得以減少，改善或消除。
  4. 如請求項3之離體方法，其中β-地中海貧血症是輸血依賴型β-地中海貧血症。
  5. 如請求項3或4之離體方法，其中在個體體內達到了相對於臨床實驗室血紅素分量之基線的變化，關於該變化是以公克/dL血漿及/或總血紅素(Hb)的HbF百分比來表示。
  6. 如請求項3至5中任一項之離體方法，其中血紅素分量是成人血紅素(HbA)及/或胎兒血紅素(HbF)。
  7. 如請求項3至6中任一項之離體方法，其中該個體是β0 /β0 或β0 /β+ 。
  8. 如請求項3至7中任一項之離體方法，其中地中海貧血症相關疾病生物標記的水平在治療後有所改變。
  9. 如請求項8之離體方法，其中該等生物標記是鐵代謝的變化；及/或紅血球生成素，血紅素結合素及/或鐵調素水平的變化。
  10. 如請求項3至9中任一項之離體方法，其中與鐵過負荷有關或與基線輸血療法有關的臨床症狀獲得改善或消除。
  11. 如請求項10之離體方法，其中藉由測定甲狀腺素、IGF-1、早晨皮質醇、促腎上腺皮質激素(ACTH)、HbA1C的水平及/或活性及/或維生素D水平來分析個體體內的分泌功能障礙減少。
  12. 如請求項3至11中任一項之離體方法，其中減少或消除個體對RBC輸血和輸注血小板輸血、靜脈內免疫球蛋白(IVIG)輸血，血漿輸血及/或顆粒球輸血的需求。
  13. 如請求項3至12中任一項之離體方法，其中在該個體體內減少或消除的臨床症狀是肝臟疾病。
  14. 如請求項3至13中任一項之離體方法，其中在該個體體內減少或消除的臨床症狀是心臟異常。
  15. 如請求項3至14中任一項之離體方法，其中在該個體體內減少或消除的臨床症狀是骨質疏鬆症及/或骨折。
  16. 如請求項3至15中任一項之離體方法，其中在投予組成物後改變個體的基線紅血球生成。
  17. 如請求項16之離體方法，其中在投予組成物後，個體體內的過度增生減少或消除。
  18. 如請求項16或17之離體方法，其中在個體體內未成熟細胞及/或具有非典型形態之細胞的數量減少。
  19. 如請求項3至18中任一項之離體方法，其中在投予組成物後，個體體內F細胞的數量和百分比改變。
  20. 如請求項3至19中任一項之離體方法，其中經遺傳修飾細胞是自體的或同種異體的。
  21. 如請求項3至20中任一項之離體方法，其中BCL11A經遺傳修飾的細胞進一步包含一或多個額外遺傳修飾。
  22. 如請求項21之離體方法，其中經遺傳修飾細胞是同種異體細胞，並且該一或多種額外遺傳修飾包含一或多個自身標記或抗原的不活化。
  23. 如請求項3至22中任一項之離體方法，其中經遺傳修飾細胞是從該個體分離的造血幹細胞。
  24. 如請求項23之離體方法，其中造血幹細胞是CD34+造血幹細胞或前驅細胞(HSC/PC)，並且在分離之前，在藉由用一或多劑G-CSF及/或一劑或多劑普樂沙福處理的個體體內動員CD34+ HSC/PC。
  25. 如請求項24之離體方法，其中在個體體內動員至少25×106 個CD34+ HSPC/kg，並且藉由一或多回血球分離術來收取動員的細胞。
  26. 如請求項3至25中任一項之離體方法，其進一步包含在向個體投予包含經遺傳修飾細胞的組成物之前，並評估該組成物的細胞在BCL11A內的插入及/或缺失。
  27. 如請求項3至26中任一項之離體方法，其進一步包含在投予包含經遺傳修飾細胞的組成物之前，向個體投予一或多種骨髓淨除式調理劑一或多次。
  28. 如請求項27之離體方法，其中該骨髓淨除劑包含白消安(busulfan)而且進一步其中： 靜脈內(IV)投予0.5至5 mg/kg白消安持續一或多次； IV投予白消安為3.2 mg/kg/天； 於第0天輸注包含經遺傳修飾細胞的組成物前，在第-6天至第-3天輸注之前，經由中央靜脈導管IV總劑量為12.8 mg/kg持續4天；或者 每天一次或每6小時IV投予白消安。
  29. 如請求項3至28中任一項之離體方法，其中投予給個體之經遺傳修飾細胞的劑量為3×106 個細胞/kg至20×106 個細胞/kg。
  30. 如請求項3至29中任一項之離體方法，其中投予給個體之經遺傳修飾細胞以約1×107 個細胞/mL的濃度用每袋約1.0-2.0×108 個細胞來調配。
  31. 如請求項3至30中任一項之離體方法，其中經遺傳修飾的細胞在投予之前被冷凍保存，並在解凍15分鐘內被投予給該個體。
  32. 如請求項3至31中任一項之離體方法，其進一步包含在投予經遺傳修飾細胞之前，期間及/或之後監控個體的生命徵象。
  33. 如請求項3至32中任一項之離體方法，其進一步包含在投予經遺傳修飾細胞之前評估個體的血紅素，嗜中性球及/或血小板水平，以確定個體體內的血紅素基線水平。
  34. 如請求項33之離體方法，其中在投予經遺傳修飾細胞之後，個體體內的血紅素，嗜中性球及/或血小板水平與基線水平相比在投予之後增加或維持穩定持續數週或數月。
  35. 如請求項3至34中任一項之離體方法，其中在投予經遺傳修飾細胞之前及/或之後，個體接受一或多次紅血球濃厚液(PRBC)輸血。
  36. 如請求項3至35中任一項之離體方法，其中個體對額外療法(諸如骨髓移植，血液組分及/或鐵螯合療法PRBC輸血)的需求減少或消除。
  37. 如請求項36之離體方法，其中在投予經遺傳修飾細胞1-20天內，對額外療法的需求減少或消除。
  38. 如請求項3至37中任一項之離體方法，其中在投予後隨時間監控個體，以確定從週邊血液樣品，骨髓抽吸物或其他組織來源分離的細胞的插入缺失概況，與輸注細胞的插入缺失概況相比較來監控植入物在個體體內的穩定性。
  39. 如請求項38之離體方法，其中在投予給個體之前監控細胞的插入缺失概況。
  40. 一種製品，其包含含有如請求項2之調配於CryoStor® CS-10冷凍介質中之組成物的包裝。
  41. 如請求項40之製品，其中每袋以約1×107 個細胞/mL的濃度包含每袋約1.0-2.0×108 個細胞。
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