JP2022519949A - ベータ－サラセミアの治療のための方法 - Google Patents

ベータ－サラセミアの治療のための方法 Download PDF

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Abstract

ベータ－サラセミアを治療するための方法および組成物が、本明細書で説明される。【選択図】図２

Description

関連出願の相互参照
本出願は、２０１９年４月２日に出願した米国特許仮出願第６２／８２８，１８２号；２０１９年１１月５日に出願した米国特許仮出願第６２／９３０，８４６号；および２０１９年１２月６日に出願した米国特許仮出願第６２／９４４，６２６号の利益を主張するものであり、当該出願の開示は、それらの全体を参照によって本明細書に組み入れる。
配列表
本出願は、ＡＳＣＩＩ形式で電子的に提出し、その全体を参照によって本明細書に組み入れる配列表を含有する。２０２０年１月１０日に作出された前記ＡＳＣＩＩ複製物は、８３２８－０１９４＿４０＿ＳＬ．ｔｘｔと命名され、８，７０１バイトのサイズである。
本発明は、β－サラセミアを治療するための方法、および遺伝子療法に関する。
β－サラセミアは、β－グロビン鎖合成の非存在または欠損によって特徴付けられる遺伝性貧血である（非特許文献１）。欠損は、グロビン鎖産生における不均衡、およびヘモグロビン（２つのα－グロビンおよび２つのβ－グロビン鎖からなる）の低減を引き起こす。グロビン鎖不均衡の結果として、赤血球（ＲＢＣ：ｒｅｄ ｂｌｏｏｄ ｃｅｌｌ）またはＲＢＣ前駆体において不安定なα－グロビン鎖四量体が形成し、髄内破壊、アポトーシス、無効な赤血球生成、鉄過剰および重大な貧血が起こる（非特許文献２）。
サラセミア（βおよびα）は、男性において最も多い一遺伝子性疾患である。サラセミアは世界中に分布しているが、南アジア、インド亜大陸、中東および地中海地方、ならびにサブサハラアフリカに最も多い（非特許文献３；非特許文献４）。世界人口の約１．５％が、β－サラセミア変異（例えば、ＩＶＳ－Ｉのヌクレオチド５「ＩＶＳ－Ｉ－５」のＧ－＞Ｃ変異；ＩＶＳ－ＩＩのヌクレオチド６５４「ＩＶＳ－ＩＩ－６５４」のＣ＞Ｔ変異）のキャリアであり、約６０，０００人の症候性個体が毎年出生している（非特許文献５）と見積もられている。
β－サラセミアの臨床重症度は、産生される正常ヘモグロビンの量によって決定され、古典的に、軽症型β－サラセミア、中間型β－サラセミアおよび重症型β－サラセミアと呼ばれる３つの臨床的かつ血液学的状態を規定する。軽症型β－サラセミアを有する患者は、軽度の貧血を有するか、または貧血を有さず、通常無症候性キャリアである。中間型β－サラセミアを有する患者は、中程度に重度の貧血を有し、輸血からの恩恵によりクオリティ・オブ・ライフを改善することができるが、晩年には多くの場合、輸血依存性表現型を発症する。重症型β－サラセミアを有する患者は、重度の貧血を有し、生涯、頻繁な輸血を必要とする。貧血から生ずる病的状態には、成長障害、骨格変形、肺高血圧症、静脈血栓塞栓症、肝硬変、心不全、下腿潰瘍および内分泌機能異常が含まれる（非特許文献６）。β－グロビン変異と、輸血依存性表現型に関連する遺伝病モディファイヤーとの多くの組合せがあるが、集合的にこの状態は、本研究において輸血依存性β－サラセミア（ＴＤＴ：ｔｒａｎｓｆｕｓｉｏｎ－ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ β－ｔｈａｌａｓｓｅｍｉａ）と呼ばれる（非特許文献５）。
ＴＤＴを有する患者についての健康結果は、支持療法プログラムの利益が認識されてきたので、過去５０年にわたり改善されてきている。プログラムは、診断が確立し、貧血を発症するとすぐに開始される定期的なＲＢＣ輸血からなる。ＲＢＣ輸血は、定期的な鉄キレート療法を伴って、輸血によって引き起こされる生体器官における鉄過剰を低減する。この支持療法プログラムは、ＴＤＴの病的状態を顕著に改善するが、しかしながら、このプログラムを用いた場合でさえも、治療された患者のうちの２０％は、平均余命４０年未満である（非特許文献３）。加えて、このプログラムは、時間がかかり、資源集約的であり、１人の患者についての５０年間の治療は、２０１１年に１，９７１，３８０ドル（ＵＳＤ）かかると見積もられた（非特許文献７）。
現在、ＴＤＴについて唯一証明された治療法は、同種造血幹細胞移植（ＨＳＣＴ：ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ）である。同種ＨＳＣＴは、慢性病的状態（例えば、移植片対宿主病［ＧＶＨＤ：ｇｒａｆｔ－ｖｅｒｓｕｓ－ｈｏｓｔ ｄｉｓｅａｓｅ］）の実質的なリスク、および５年死亡率に基づく１０～１５％の死亡リスクを有する（非特許文献８；非特許文献９）。加えて、発行されている報告書では、十分に適合する、血縁でない同種ドナーを特定する可能性は、レシピエントの民族性によって影響されることが示されており；例えば、アフリカ系の個人では、好適なドナーを発見する可能性は、１９％のみであると見積もられている（非特許文献１０）。したがって、ほとんどではないが、多くのレシピエントは、同種ＨＳＣＴのためのヒト白血球抗原（ＨＬＡ：ｈｕｍａｎ ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ ａｎｔｉｇｅｎ）適合ドナーを欠き、そのため、この潜在的な治療的処置は利用不可能である。
ＨｉｇｇｓおよびＥｎｇｅｌ（２０１２）Ｌａｎｃｅｔ ３７９（９８１３）：３７３～８３頁 Ｏｒｉｇａ，Ｒ．（２０１７）Ｇｅｎｅｔ Ｍｅｄ １９（６）：６０９～６１９頁 Ｍｏｄｅｌｌら、（２００８）Ｊ Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ Ｍａｇｎ Ｒｅｓｏｎ．１０：４２ Ｃｏｌａｈら、（２０１０）Ｅｘｐｅｒｔ Ｒｅｖ Ｈｅｍａｔｏｌ ３（１）：１０３～１７頁 ＧａｌａｎｅｌｌｏおよびＯｒｉｇａ（２０１０）Ｏｒｐｈａｎｅｔ Ｊ Ｒａｒｅ Ｄｉｓ．５：１１ Ｖｉｃｈｉｎｓｋｙら、（２００５）Ｐｅｄｉａｔｒｉｃｓ．１１６（６）：ｅ８１８～２５頁 Ｋｏｒｅｎら、（２０１４）Ｍｅｄｉｔｅｒｒ Ｊ Ｈｅｍａｔｏｌ Ｉｎｆｅｃｔ Ｄｉｓ ６（１）：ｅ２０１４０１２ Ｌｏｃａｔｅｌｌｉら、（２０１３）Ｂｌｏｏｄ １２２（６）：１０７２～８頁 Ｂａｒｏｎｃｉａｎｉら、（２０１６）Ｂｏｎｅ Ｍａｒｒｏｗ Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ ５１（４）：５３６～４１頁 Ｇｒａｇｅｒｔら、（２０１４）Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ．３７１（４）：３３９～４８頁
したがって、ＴＤＴを治療および／または予防するための組成物および方法についての要求が存続している。
治療および予防を必要とする対象においてβ－サラセミアを治療および／または予防するための組成物および方法が、本明細書で開示される。本開示は、ゲノム編集および／または遺伝子移行のための方法および組成物を提供する。また、本開示は、ベータグロビンの十分な発現を欠く対象（例えば、β０／β０または非β０／β０対象）の治療のための細胞療法のための方法および組成物を提供する。対象における異常なベータグロビン発現は、非限定的に、以下の変異：ＩＶＳ－Ｉ－５；ＩＶＳ－ＩＩ－６５４のうちの１つまたはそれ以上を含む、任意の変異によって引き起こされる場合がある。一部の実施形態では、本明細書で開示される方法および組成物は、輸血依存性β－サラセミア（ＴＤＴ）を治療するために使用される。本開示は、操作されたヌクレアーゼを使用して改変した細胞を、対象に投与することを含む、β－サラセミアを有する対象を治療する方法であって、対象が治療される、方法を提供する。患者に投与される細胞は、自家細胞（患者から単離され、遺伝子改変され、その後、患者に再輸注される）または例えば、健康な患者から単離され、患者に輸注される同種細胞であり得る。
本明細書で提供される、ＴＤＴの治療における使用のための方法を含む、ヘモグロビンの発現を変更する方法は、対象におけるグラム／血漿ｄＬ、および全Ｈｂ中のＨｂＦパーセントの両方の変化について、臨床検査ヘモグロビン画分（成人ヘモグロビン、ＨｂＡおよび胎児ヘモグロビン、ＨｂＦ）のベースラインからの変化をもたらす方法を含む。一部の実施形態では、本明細書で開示される治療方法の使用は、サラセミア関連疾患バイオマーカーの変化をもたらすことができる。一部の実施形態では、サラセミア関連疾患バイオマーカーにおける変化は、鉄代謝における変化ならびに／またはエリスロポエチン、ハプトグロビンおよびヘプシジンレベルのレベルにおける変化を含み得るが、これらに限定されない。一部の実施形態では、治療方法は、ベースライン輸血療法に伴う鉄過剰に関連する患者の症状における変化をもたらすことができる。鉄過剰症状における変化は、内分泌器官における鉄沈着によって引き起こされる内分泌機能異常の減少を含み得る。内分泌機能異常は、非限定的に、甲状腺ホルモン、ＩＧＦ－１、起床時コルチゾール、副腎皮質刺激ホルモン（ＡＣＴＨ：ａｄｒｅｎｏｃｏｒｔｉｃｏｔｒｏｐｉｃ ｈｏｒｍｏｎｅ）、ＨｂＡ１Ｃおよび／またはビタミンＤのような因子（レベルおよび／または活性）の測定によって評価することができる。ＨｂＡ、ＨｂＦ、エリスロポエチン、ハプトグロビン、ヘプシジン、甲状腺ホルモン、ＩＧＦ－１、コルチゾール、ＡＣＴＨおよびビタミンＤを含むすべての上記因子の決定は、標準の臨床検査プロトコールによって測定することができる。
一部の実施形態では、本明細書で説明される治療の使用および方法は、β－サラセミア（例えば、ＴＤＴ）を有する対象におけるＲＢＣ輸血、ならびに非限定的に、血小板、静脈内免疫グロブリン（ＩＶＩＧ：ｉｎｔｒａｖｅｎｏｕｓ ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｉｎ）、血漿および顆粒球を含む他の血液製剤の輸注（の使用）についての必要性を減少させる。本発明の方法および組成物により治療される対象における、ＲＢＣおよび他の血液製剤輸注の使用における変化は、対象について使用の記録を付けることによって評価することができる。記録を使用して、年間頻度、および本明細書で開示される組成物の輸注後の濃厚赤血球（ＰＲＢＣ：ｐａｃｋｅｄ ｒｅｄ ｂｌｏｏｄ ｃｅｌｌｓ）の体積を計算することができ、治療前の対象の過去のＰＲＢＣおよび他の血液製剤利用と比較することができる。
一部の実施形態では、本明細書で説明される治療方法は、肝疾患の減少をもたらす。赤血球（ＲＢＣ）破壊の増大および髄外赤血球生成のために、肝疾患および肝腫大は、ＴＤＴの一般的な併存症である。赤血球生成速度の加速は、消化管からの食事性鉄吸収を向上し、遺伝性ヘモクロマトーシスで見られるのと類似する慢性的な鉄過剰な状態をもたらす。肝臓における鉄沈着における変化は、ＭＲＩによって評価することができ、肝細胞およびクッパー細胞における鉄沈着は、Ｒ２ベースのＦＥＲＲＩＳＣＡＮ（登録商標）（Ｒｅｓｏｎａｎｃｅ Ｈｅａｌｔｈ）技法のような標準の方法を使用して査定することができる（例えば、Ｓｔ Ｐｉｅｒｒｅら、（２０１３）Ｍａｇｎ Ｒｅａｓｏｎ Ｍｅｄ ７１（６）：２２１５～２３頁を参照）。
一部の実施形態では、本明細書で説明される治療方法は、心臓異常の減少をもたらす。心不全および致命的な不整脈を含む心臓異常は、ＴＤＴの主要な合併症および高頻度の死亡原因である。生涯の輸血療法は、心臓病理を改善するが；しかしながら、ＴＤＴ患者は、心筋鉄沈着のために心臓ヘモジデリン沈着症を頻繁に発症する（Ｈｅら、（２００８）Ｍａｇｎ Ｒｅａｓｏｎ Ｍｅｄ ６０（５）：１０８２～１０８９頁）。心筋における鉄沈着および鉄過剰は、標準の心筋Ｔ２＊（Ｔ２スター）磁気共鳴技法において見ることができるので、心臓異常における変化は、ＭＲＩによって評価することができる。
一部の実施形態では、本明細書で説明される治療方法は、ＴＤＴの一般的な合併症である骨粗鬆症および骨折の減少をもたらす（Ｖｏｇｉａｔｚｉら、（２００９）Ｊ Ｂｏｎｅ Ｍｉｎｅｒ Ｒｅｓ ２４（３）：５４３～５７頁）。本明細書で開示される方法の結果としての骨塩量、骨粗鬆症リスクおよび骨折リスクにおける変化は、標準のＤＸＡ骨密度測定スキャンを使用して評価することができる（二重エネルギーＸ線吸収測定法ＤＸＡ、例えば、ＢｌａｋｅおよびＦｏｇｅｌｍａｎ（２００７）Ｐｏｓｔｇｒａｄ Ｍｅｄ Ｊ ８３（９８２）：５０９～５１７頁を参照）。
一部の実施形態では、本明細書で説明される治療方法は、赤血球前駆細胞の形態および／型の点でベースライン赤血球生成における変化（例えば、低減または増大）をもたらす。ＴＤＴは、多くの場合奇異な形態の、高頻度の未成熟細胞および赤血球前駆体を伴う重大な赤芽球過形成を引き起こす。本発明の方法および組成物は、未成熟細胞の存在をより少なくすること、および／または非定型形態を有する細胞数を低減することを可能にする。赤血球生成における変化は、造血を特徴付けるルーチンの臨床的手技である標準の骨髄穿刺によって評価することができる。
一部の実施形態では、本明細書で説明される治療方法は、Ｆ細胞の数およびパーセントにおけるベースラインからの変化をもたらす。Ｆ細胞は、測定可能な量のＨｂＦを含有するＲＢＣである。治療方法の結果としてのＦ細胞における変化の評価は、当技術分野において公知の方法によって測定することができる（例えば、Ｗｏｏｄら、（１９７５）Ｂｌｏｏｄ ４６（５）：６７１を参照）。ある特定の実施形態では、Ｆ細胞の数および／または百分率は、未治療の対象と比較して、本明細書で説明されるように治療した対象において増大する。
内在ＢＣＬ１１Ａ配列（例えば、内在ＢＣＬ１１Ａエンハンサー配列）を切断する１つまたはそれ以上のＺＦＮをコードする１つまたはそれ以上のｍＲＮＡを含む組成物が、本明細書で開示される。ある特定の実施形態では、１つまたはそれ以上のｍＲＮＡは、ＳＢ－ｍＲＥＮＨ１ ｍＲＮＡおよび／またはＳＢ－ｍＲＥＮＨ２ ｍＲＮＡ（配列番号１５および配列番号１６で示される）を含む。また、ＳＢ－ｍＲＥＮＨ１ ｍＲＮＡおよびＳＢ－ｍＲＥＮＨ２ ｍＲＮＡを含む組成物を含む、同じまたは異なるｍＲＮＡのうちの１つまたはそれ以上を含む医薬組成物が開示される。
また、１つもしくはそれ以上のｍＲＮＡを含む単離した細胞および単離した細胞集団、ならびに／またはこれらのｍＲＮＡを含む１つもしくはそれ以上の医薬組成物が、提供される。また、遺伝子改変細胞、および非限定的に、遺伝子改変細胞の子孫を含むその系統の細胞を含む組成物が、説明される。遺伝子改変子孫細胞は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ法（遺伝子改変細胞の培養）によって得ること、および／またはｉｎ ｖｉｖｏで遺伝子改変細胞の対象への投与後に得ることが可能である。したがって、遺伝子改変子孫細胞は、遺伝子改変細胞の系統の完全にまたは部分的に分化した子孫を含んでもよい。ある特定の実施形態では、遺伝子改変細胞組成物は、ＢＣＬ１１Ａ配列が切断されており、細胞のヘモグロビン（例えば、ＨｂＦおよび／またはＨｂＡ）レベルが遺伝子改変していない細胞と比較して増大している（例えば、３～４倍またはそれ以上）遺伝子改変細胞を含む、遺伝子改変造血幹細胞（造血始原幹細胞（ＨＰＳＣ：ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ）または造血幹細胞／前駆細胞（ＨＳＣ／ＰＣ：ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ／ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ ｃｅｌｌ）とも呼ばれる）および／またはその系統もしくはそれから産生（培養）された遺伝子改変細胞を含む。本明細書に記載される細胞の細胞集団および組成物の遺伝子改変細胞の一部、もしくはすべては、１つもしくはそれ以上のｍＲＮＡおよび／またはこれらのｍＲＮＡを含む医薬組成物を含んでもよく、あるいは本明細書に記載される細胞の細胞集団および組成物の遺伝子改変細胞のいずれも、それを含まなくてもよい。したがって、細胞、これらの細胞を含む細胞集団および組成物であって、本明細書に記載されるｍＲＮＡを含む遺伝子改変細胞およびその系統の細胞を含む、細胞、細胞集団および組成物が、本明細書で説明される。細胞、細胞集団、ならびにこれらの細胞および細胞集団を含む組成物は、自家細胞および／または同種細胞を含み得る。また、本明細書に記載される遺伝子改変細胞（例えば、非改変細胞と比較してグロビン発現の増大を示すＨＰＳＣのような赤血球始原細胞（erythroid progenitor cell））を含む医薬組成物が提供される。
また、遺伝子改変細胞のヘモグロビン（例えば、ＨｂＦおよび／またはＨｂＡ）レベルが非改変細胞と比較して増大する（例えば、２倍またはそれ以上）ようにＢＣＬ１１Ａ配列（例えば、エンハンサー配列）が遺伝子改変されている遺伝子改変細胞集団を作製する方法を含む、単離した遺伝子改変細胞（または遺伝子改変細胞およびその系統の細胞を含む細胞集団もしくは組成物）を製造（作製）する方法が提供される。ある特定の実施形態では、方法は、本明細書に記載される１つまたはそれ以上のｍＲＮＡ（または１つもしくはそれ以上のｍＲＮＡを含む医薬組成物）を細胞に投与すること（例えば、トランスフェクションにより）を含む。細胞は、自家性および／または同種性であってもよく、ＨＳＰＣであってもよい。ある特定の実施形態では、方法は、遺伝子改変細胞を培養して、グロビン産生の増大を示す遺伝子改変細胞（例えば、ＨＰＳＣ細胞）および／またはその系統の遺伝子改変細胞（例えば、ＲＢＣのような他の赤血球始原細胞および／または成熟赤血球細胞）の集団を含む組成物を産生することをさらに含む。組成物は、ｍＲＮＡを含む遺伝子改変細胞および／またはｍＲＮＡをもはや含まないが遺伝子改変（ＢＣＬ１１Ａ特異的改変）を維持するそのような細胞の系統の遺伝子改変細胞を含み得る。また、遺伝子改変細胞集団および／またはその系統の細胞を含む医薬組成物が提供される。
したがって、一部の実施形態では、本明細書で開示される方法および組成物は、対象を、ｅｘ ｖｉｖｏで改変した細胞により治療することに関する。一部の実施形態では、細胞は、対象から単離され、ｅｘ ｖｉｖｏで改変され、その後、対象に戻される。他の実施形態では、細胞は、健康なドナーから単離され、ｅｘ ｖｉｖｏで改変され、その後、対象を治療するために使用される。さらなる実施形態では、健康なドナーから単離した細胞は、ｅｘ ｖｉｖｏでさらに改変して、対象による細胞の拒絶を避けるために自己マーカー（例えば、ＨＬＡ複合体）を除去する。一部の実施形態では、単離した細胞は、幹細胞である。さらなる実施形態では、幹細胞は、造血幹細胞／始原細胞（例えば、ＣＤ３４＋ＨＳＣ／ＰＣ）である。一部の実施形態では、ＣＤ３４＋ＨＳＣ／ＰＣは、１用量またはそれ以上の顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ－ＣＳＦ：ｇｒａｎｕｌｏｃｙｔｅ ｃｏｌｏｎｙ－ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ ｆａｃｔｏｒ）による処置によって各対象において動員される。一部の実施形態では、使用されるＧ－ＣＳＦの用量は、約１０μｇ／ｋｇ／日である。一部の実施形態では、１用量またはそれ以上のＧ－ＣＳＦは、１用量またはそれ以上のプレリキサフォル（ｐｌｅｒｉｘａｆｏｒ）と組み合わせられる。一部の実施形態では、使用されるプレリキサフォルの用量は、約２４０μｇ／ｋｇ／日である。さらなる実施形態では、動員された細胞は、１回またはそれ以上のアフェレーシス周期によって回収される。
動員されたヒトＣＤ３４＋ＨＳＰＣは、健康な対象またはベータ－サラセミア対象からアフェレーシスによって収集し、本明細書に記載される１つまたはそれ以上のｍＲＮＡ（または１つもしくはそれ以上のｍＲＮＡを含む医薬組成物）の投与（それによるトランスフェクション）前に精製してもよい。ある特定の実施形態では、精製したＨＳＰＣは、ＺＦＮ ｍＲＮＡ ＳＢ－ｍＲＥＮＨ１およびＳＢｍＲＥＮＨ２（配列番号１５および配列番号１６）をトランスフェクトされる。トランスフェクトした遺伝子改変ＣＤ３４＋ＨＳＰＣ（「ＳＴ－４００」）は、使用のために培養、回収および／または凍結してもよい。回収後、本明細書に記載される遺伝子改変細胞（細胞の少なくとも５０％、好ましくは少なくとも７０％またはそれ以上、さらにより好ましくは少なくとも７５～８０％またはそれ以上が、ｍＲＮＡ投与後に遺伝子改変されており、好ましくは他の遺伝子座と比較してＢＣＬ１１Ａエンハンサー配列において特異的に改変されている）（「ＳＴ－４００」）を含む組成物は、ＨＳＰＣおよびその系統の細胞、例えば、赤血球始原細胞（erythroid progenitor）（ＣＦＵ－ＥおよびＢＦＵ－Ｅ）、顆粒球／マクロファージ始原細胞（granulocyte/macrophage progenitor）（ＣＦＵ－Ｇ／Ｍ／ＧＭ）および多分化能始原細胞（multi-potential progenitor）（ＣＦＵ－ＧＥＭＭ）を含む、すべての造血系統に分化するＨＳＰＣを含み得る。ある特定の実施形態では、細胞の組成物（集団）の遺伝子改変細胞の一部もしくはすべては、ｍＲＮＡのうちの１つもしくはそれ以上を含むか、または細胞の組成物（集団）の遺伝子改変細胞のいずれも、ｍＲＮＡのうちの１つもしくはそれ以上を含まない。
本明細書に記載される方法または使用のいずれかにおいて、対象は、β－サラセミアの分子遺伝学的診断の確定；β－サラセミア（例えば、ＴＤＴ）の臨床診断の確定を有し；これらは、β０／β０もしくは非β０／β０であること、および／または以前の２年間における年率ベースで年間８回以下のＰＲＢＣ輸血事象記録を有するβベータ－サラセミア（例えば、ＴＤＴ）の臨床診断を有する１８～４０歳の年齢であることである。ある特定の実施形態では、遺伝子改変ＣＤ３４＋ＨＳＰＣは、対象から得た細胞から生成される（自家性）。ある特定の実施形態では、ＣＤ３４＋ＨＳＰＣは、Ｇ－ＣＳＦおよびプレリキサフォルによる処置を使用して各対象において動員される。動員されたＣＤ３４＋ＨＳＰＣは、アフェレーシスにより、動員の１日またはそれ以上の日数（例えば、３、４、５、６、７日またはそれ以上の日数）後、例えば、十分な細胞が収集されるまで２日またはそれ以上の連日に、各対象から収集される。ある特定の実施形態では、ＣＤ３４＋ＨＳＰＣの少なくとも約１×１０４～１×１０７（例えば、２５×１０６）個／ｋｇが収集される。必要な場合、第１の周期の１、２、３週間後またはそれ以降に、第２の動員およびアフェレーシス周期を行ってもよい。ある特定の実施形態では、収集した細胞の一部は、本明細書に記載される遺伝子改変に供され、残りは、対象のための救命処置が要される事象において維持（例えば、凍結保存）されることを示している。
一部の実施形態では、細胞は、対象から除去され（自家性）、胎児ヘモグロビン（ＨｂＦ）産生の調節に関与する遺伝子を標的化するヌクレアーゼにより処理される。一部の実施形態では、遺伝子は、ＨｂＦ産生のリプレッサーである。一部の実施形態では、遺伝子は、ＢＣＬ１１Ａ遺伝子である。一部の実施形態では、ヌクレアーゼは、ＢＣＬ１１Ａ遺伝子の赤血球特異的エンハンサー領域を標的化および切断する。一部の実施形態では、ヌクレアーゼは、ｍＲＮＡとして細胞に送達される。一部の実施形態では、赤血球特異的エンハンサー領域の切断は、赤血球転写因子ＧＡＴＡ１の結合部位（Ｖｉｅｒｓｔｒａら、（２０１５）Ｎａｔ Ｍｅｔｈｏｄｓ １２（１０）：９２７～３０頁；Ｃａｎｖｅｒら、（２０１５）Ｎａｔｕｒｅ ５２７（７５７７）：１９２～７頁を参照）が破壊されるような、細胞修復機構による切断部位のエラー・プローン（ｅｒｒｏｒ－ｐｒｏｎｅ）修復をもたらす。一部の実施形態では、ヌクレアーゼは、ＢＣＬ１１Ａ遺伝子が造血幹細胞において発現されないように、ＢＣＬ１１Ａ遺伝子の赤血球特異的エンハンサー領域を標的化する。標的化されるエンハンサー領域は、コード領域内であっても、コード領域外であってもよく、ＢＣＬ１１Ａの転写開始部位からのキロベース単位での距離により番号付けすると、非限定的に、内在ＢＣＬ１１Ａのイントロン２内の＋５８、＋５５および／または＋６２領域を含み、そのエンハンサー領域は、およそ３５０（＋５５）；５５０（＋５８）；および３５０（＋６２）ヌクレオチドの長さである。例えば、Ｂａｕｅｒら、（２０１３）Ｓｃｉｅｎｃｅ ３４３：２５３～２５７頁；米国特許第９，９６３，７１５号；同第１０，０７２，０６６号；ならびに米国特許出願公開第２０１５／０１３２２６９号および同第２０１８／０３６２９２６号を参照。一部の実施形態では、改変ＨＳＣ／ＰＣは、対象に戻す前に評価される。一部の実施形態では、改変細胞は、ＢＣＬ１１Ａエンハンサー領域におけるヌクレアーゼ誘導変異の存在および種類について評価される。一部の実施形態では、変異は、ヌクレオチドの挿入、ヌクレオチドの欠失、またはこれらの両方（「インデル」）であり得る。一部の実施形態では、細胞は、ヌクレアーゼによるオフターゲット切断について評価される。一部の実施形態では、細胞は、ヌクレアーゼ切断後の細胞染色体の分子転座および／または核型分類について評価される。一部の実施形態では、細胞は、オフターゲット転写活性について評価される。一部の実施形態では、細胞は、エンドトキシン負荷量について評価される。一部の実施形態では、細胞は、上記の特徴のうちの１つまたはそれ以上について評価してもよい。
一部の実施形態では、改変ＣＤ３４＋ＨＳＣ／ＰＣは、ＨｂＦ産生が増大し、β－サラセミアの臨床症状が減少するような用量で対象に戻される。一部の実施形態では、対象は、改変ＣＤ３４＋ＨＳＣ／ＰＣの輸注前に、１つまたはそれ以上の骨髄破壊調整剤により処置される。一部の実施形態では、骨髄破壊剤は、ブスルファンである。さらなる実施形態では、ブスルファンは、シクロホスファミドのような他の剤と共に使用される。
一部の実施形態では、細胞約３×１０６個／ｋｇ～細胞約２０×１０６個／ｋｇ（またはその間の任意の値）の用量の遺伝子改変細胞が、対象に投与される（例えば、静脈内輸注を介して）。一部の実施形態では、細胞は、ＤＭＳＯ１０％を含有する不溶解性凍結保存媒体に製剤化される。一部の実施形態では、細胞は、細胞約１×１０７個／ｍＬの濃度で、１袋当たり細胞約１．０～２．０×１０８個にて製剤化される。本明細書に記載される方法のいずれかにおいて、細胞投与量は、総細胞用量として決定しても、ＣＤ３４＋細胞用量として決定してもよく、それらは、以下のように計算することができる：ＣＤ３４＋用量＝［総細胞用量］×［ＣＤ３４＋％］。例えば、カラム２において総細胞用量、およびカラム３においてＣＤ３４＋％を示す、表Ｂを参照。一部の実施形態では、改変ＨＳＰＣを受容する対象は、改変細胞の生着について、および改変細胞集団の異型遺伝子性を評価するために輸注後にモニタリングされる。一部の実施形態では、末梢血、骨髄および／または様々な細胞集団を、ＢＣＬ１１Ａ遺伝子におけるインデルの存在について個々に査定してもよい。一部の実施形態では、治療された対象から単離した細胞のゲノムＤＮＡを単離し、ＢＣＬ１１Ａ標的配列を含む領域を増幅する。さらなる実施形態では、細胞集団内の改変細胞パーセントを決定し、投薬後経時的に再試験して、治療された対象での改変細胞集団の安定性を評価する。
一部の実施形態では、改変データを評価して、インデルプロファイルを作出する。さらなる実施形態では、インデルプロファイルを経時的にモニタリングして、集団内で異常に過増殖する任意の１つの特定の細胞種（インデルプロファイル）の可能性を決定する。
ジンクフィンガーヌクレアーゼのパートナーの各々（「対になったＺＦＮ（ｐａｉｒｅｄ ＺＦＮ）」または「左右ＺＦＮ（ｌｅｆｔ ａｎｄ ｒｉｇｈｔ ＺＦＮ）」とも呼ばれる）をコードする２つのポリヌクレオチドで処理された細胞を含む、β－サラセミアを有する対象を治療するための組成物および方法が、本明細書で開示される。場合により、ヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチドについて、小ペプチド（非限定的に、ペプチドタグおよび核局在化配列を含む）をコードする配列をさらに含み、ならびに／またはＤＮＡ結合ドメイン領域（例えば、ジンクフィンガータンパク質の骨格）のうちの１つもしくはそれ以上における変異、および／もしくはＦｏｋＩヌクレアーゼ切断ドメインもしくは切断ハーフドメインにおける１つもしくはそれ以上の変異を含む。ポリヌクレオチドは、場合により、ＡＲＣＡ ｃａｐ（米国特許第７，０７４，５９６号）を含み得る。これらのポリヌクレオチド成分が個々に、または任意の組合せで使用される場合（例えば、任意の組合せの、ＦＬＡＧ、ＮＬＳ、ＷＰＲＥ、ＡＲＣＡおよび／またはポリＡシグナルのようなペプチド配列）、本発明の方法および組成物は、人工ヌクレアーゼの発現の驚くべき予測されない増大を提供し、効率（本明細書に記載される配列／改変を伴わないヌクレアーゼと比較して、例えば、２、３、４、５、６、１０、２０倍またはそれ以上の切断）および／または標的化特異性の増大を伴う。ある特定の実施形態では、本明細書に記載されるｍＲＮＡによってＢＣＬ１１Ａ遺伝子座にて特異的に改変された遺伝子改変細胞を含む組成物が、本明細書に記載され、ここでは、細胞の１０％未満（０～１０％またはその間の任意の値）、好ましくは５％未満（０～５％またはその間の任意の値）、さらにより好ましくは１％未満（０～１％またはその間の任意の値）およびさらにより好ましくは遺伝子改変細胞の０．５％未満（０～０．５％またはその間の任意の値）が、ＢＣＬ１１Ａ遺伝子座の外側にｍＲＮＡによって作製された遺伝子改変を含む（が、ＨＬＡマーカーの不活性化のような追加の改変を含み得る）。さらなる実施形態では、ジンクフィンガーヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチドは、ｍＲＮＡ ＳＢ－ｍＲＥＮＨ１によってコードされる、ＳＢ６３０１４として公知の左ＺＦＮ（米国特許第１０，５６３，１８４号および米国特許出願公開第２０１８／００８７０７２号を参照）を含み得る。一部の実施形態では、右ＺＦＮは、ｍＲＮＡ ＳＢ－ｍＲＥＮＨ２によってコードされるＳＢ６５７２２である（米国特許第１０，５６３，１８４号および米国特許出願公開第２０１８／００８７０７２号を参照）。
また、本明細書に記載されるＺＦＮおよび／またはポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡ）を含む、単離した造血幹細胞（ＣＤ３４＋のようなＨＳＰＣ）を含む宿主細胞が、本明細書に記載される。細胞は、健康な対象から単離してもよく、またはあるいは、治療されるべき状態（例えば、ＴＤＴ）を有する対象から得、標準の技法を使用して精製した自家細胞である。ＺＦＮは、切断後に挿入および／または欠失を介して細胞を遺伝子改変する。続いて、拡張させた（培養した）細胞は、ＺＦＮ（またはこれらのＺＦＮをコードするポリヌクレオチド）をもはや含まない場合があるが、培養物において遺伝子改変（例えば、ＢＣＬ１１ａ内の挿入および／または欠失）を維持する。ある特定の実施形態では、遺伝子改変は、切断後にＮＨＥＪによって作製される挿入および／または欠失（「インデル」）である。本明細書に記載される遺伝子改変細胞は、未処理（非遺伝子改変）細胞と比較して、グロビン（α－、β－およびγ－グロビンレベル）の異なる比を示す。ある特定の実施形態では、γ－グロビンのβ－グロビンに対する比、およびγ－グロビンのα－グロビンに対する比は、未処理（トランスフェクトしていない）ＨＳＰＣと比較して、３～４倍を含む約２～５倍またはそれ以上増大している。さらに、本明細書に記載される遺伝子改変細胞は、赤血球始原細胞（ＣＦＵ－ＥおよびＢＦＵ－Ｅ）、顆粒球／マクロファージ始原細胞（ＣＦＵ－Ｇ／Ｍ／ＧＭ）および多分化能始原細胞（ＣＦＵ－ＧＥＭＭ）を含む、すべての造血系統に分化し、造血の再構成を示す正常な核型および形態を示す。
ある特定の態様では、ＴＤＴのためのｅｘ ｖｉｖｏ療法は、本明細書に記載される遺伝子改変細胞を使用して記載される。ある特定の実施形態では、遺伝子改変細胞は、治療されるべき対象から得た自家細胞であり、その細胞は、その後、本明細書に記載されるように遺伝子改変され、同じ対象に投与し戻される。対象から得られた細胞は、Ｇ－ＣＳＦおよび／またはプレリキサフォルによる処置を使用して対象において動員してもよい。図５を参照。本明細書に記載される方法のいずれかにおいて、任意の量の細胞を動員してもよく、例えば、約５×１０５個、約１０×１０５個、約１５×１０５個、約２０×１０５個、約５×１０６個、約１０×１０６個、約１５×１０６個、約２０×１０６個、約２５×１０６個／ｋｇの遺伝子改変のためのＣＤ３４＋ＨＳＰＣが、対象において動員される。自家細胞は、本明細書に記載されるように遺伝子改変し、細胞約１．０×１０８～２．０×１０８個の総細胞カウントを有する各一定分量（例えば、輸注バッグ）で標準の技法により凍結保存し（例えば、温度管理（controlled rate）冷凍庫を使用して）、それらが臨床試験センターへ輸送される準備ができるまで製造施設にて気相式液体窒素（－１５０℃未満）中で保存してもよい。
本明細書に記載される方法のいずれかにおいて、対象は、例えば、有効用量およびレジメンを使用するブスルファンの静脈内（ＩＶ：ｉｎｔｒａｖｅｎｏｕｓ）投与により、遺伝子改変細胞によるｅｘ ｖｉｖｏ療法の前に調整療法を受容してもよい。標準の手技によると、例えば、ブスルファンは、約０．５～５ｍｇ／ｋｇ（またはその間の任意の値）で投薬される。ある特定の実施形態では、対象は、ブスルファンの骨髄破壊レジメン（約３．２ｍｇ／ｋｇ／日；中心静脈カテーテルを介したＩＶ）を最長で４日間（輸注前総用量約１２．８ｍｇ／ｋｇ）、例えば、０日目の改変ＨＳＰＣの輸注の６～３日前に受容する。ＩＶブスルファンは、研究センターの実施またはガイドラインによると、１日１回（全部で４用量）または６時間毎に（全部で１６用量）投薬することができる。最初の用量後、ＩＶブスルファン用量は、薬物動態試料採取研究センターの実施に基づいて、毎日の投薬について４，０００～５，０００ｍｍｏｌ＊分の曲線下面積（ＡＵＣ：ａｒｅａ ｕｎｄｅｒ ｔｈｅ ｃｕｒｖｅ）、または６時間毎の投薬について１，０００～１，２５０ｍｍｏｌ＊分のＡＵＣを標的化するように調節され、総レジメンの標的化ＡＵＣは、１６，０００～２０，０００ｍｍｏｌ＊分である。ＩＶブスルファン薬物動態標的化は、次の対象について改変してもよい。場合により、治療薬モニタリングを行って、投薬４日後のブスルファンのクリアランスが完了していることを決定する。
ある特定の態様では、ｅｘ ｖｉｖｏ療法は、凍結した遺伝子改変ＨＳＰＣを解凍すること、および好ましくは解凍の約１５～約４５分以内に細胞を対象に輸注することを含む。投与される凍結した改変ＨＳＰＣの体積は、対象の体重によって決定される。輸注前および後に、バイタルサイン（血圧、体温、心拍、呼吸数およびパルスオキシメトリ）をモニタリングする。ある特定の実施形態では、血液検査およびＨｂＦレベル（ＨｂＦ画分のベースラインレベル（ＡおよびＦ（ｇ／ｄＬ）およびＨｂＦパーセントは、ＩＶブスルファンの第１の投与の日付またはその前の最後の査定に基づいて決定される）、内分泌機能、および／または鉄負荷量を査定するためのＭＲＩを行うことの分析を使用して、対象をモニタリングする。ある特定の実施形態では、ｅｘ ｖｉｖｏ療法は、輸注の約２～４週間以内から、ＴＤＴ対象において好中球および血小板の正常レベル内への回復をもたらす。また、対象は、ＨＳＰＣ輸注後、ＰＲＢＣ輸血を０、１回またはそれ以上受容し得る。ある特定の実施形態では、改変ＨＳＰＣの輸注後何週間も（例えば、２、３、４、５、６、７週間またはそれ以上）、対象において総ヘモグロビンレベルは安定なままであるか、または上昇し続ける。
輸注後、改変ＨＳＰＣを、患者においてモニタリングして、生着効率および／または改変異型遺伝子性を決定してもよい。これは、例えば、遺伝子改変（「インデル」）プロファイルを決定することによって行うことができる。細胞サンプルは、末梢血、骨髄穿刺液または他の組織サンプルから精製し（好ましくは、細胞約５×１０４～１×１０７個）、査定のためにゲノムＤＮＡ単離に供してもよい。骨髄穿刺液または他の組織サンプルは、約６～９カ月の時点を含む様々な時点で採取することができる。
一部の実施形態では、本明細書で開示される方法および組成物により治療していない対象と比較して、追加の治療手技を低減、遅延および／または除去する治療方法が、本明細書で提供され、例えば、有効量の改変ＨＳＣ／ＰＣは、それを必要とする対象に投与され、対象は、治療後に追加の治療手技についての必要性の低減、遅延および／または除去を有する。一部の実施形態では、追加の治療手技として、骨髄移植、ＰＲＢＣおよび／または他の血液成分輸血、ならびに鉄キレート療法に関連する治療を挙げることができるが、これらに限定されない。
一部の実施形態では、本明細書で開示される組成物および方法において有用なＺＦＮ（例えば、ＺＦＮ対（左右）ＺＦＮのメンバーが２つの別々のｍＲＮＡによって送達されるＺＦＮ）は、ＳＢ－ｍＲＥＮＨ１およびＳＢ－ｍＲＥＮＨ２と命名されたｍＲＮＡを含む。一部の実施形態では、ＢＣＬ１１Ａ特異的対のＺＦＮが、エレクトロポレーション法により送達され（例えば、ＨＳＣ／ＰＣへ）、例えば、１つのＡＡＶは、左ＺＦＮ（例えば、ＳＢ－ｍＲＥＮＨ１）を含み、別のＡＡＶは、右ＺＦＮ（例えば、ＳＢ－ｍＲＥＮＨ２）を含む。
したがって、β－サラセミア（例えば、ＴＤＴ）の治療および／または予防のためにヘモグロビン発現を変更するための方法が、本明細書に記載される。ある特定の実施形態では、第１および第２の（左右）ＺＦＮを含むＺＦＮ対、つまり、表１で示される認識ヘリックス領域を含む６３０１４と命名されたＺＦＰを含む６－フィンガーＺＦＮ（例えば、ｍＲＮＡ ＳＢ－ｍＲＥＮＨ１によってコードされる）、および表１で示される認識ヘリックス領域を含む６５７２２と命名されたＺＦＰを含む５－フィンガーＺＦＮ（例えば、ｍＲＮＡ ＳＢ－ｍＲＥＮＨ２によってコードされる）は、ＴＤＴの治療のためを含む、単離した細胞または対象の細胞においてヘモグロビンレベルを変更するために使用される。ＺＦＮ対は、ヒトゲノムのＧＲＣｈ３８／ｈｇ３８アセンブリの位置ｃｈｒ２：６０，４９５，２５０～６０，４９５，２９０におけるヒトＢＣＬ１１Ａ遺伝子の赤血球特異的エンハンサーの３３塩基対の（合計）標的部位に結合する。ある特定の実施形態では、１つのｍＲＮＡは、対の両方のＺＦＮをコードする。あるいは、別々のｍＲＮＡが使用され、その各々は対の１つのＺＦＮをコードする。ある特定の実施形態では、ｍＲＮＡ配列は、実施例１（配列番号１５および配列番号１６）で示される。
場合により、ヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチドは、小ペプチド（非限定的に、ペプチドタグおよび核局在化配列を含む）をコードする配列をさらに含み、ならびに／またはＤＮＡ結合ドメイン領域（例えば、ジンクフィンガータンパク質またはＴＡＬＥの骨格）のうちの１つもしくはそれ以上における変異、および／もしくはＦｏｋＩヌクレアーゼ切断ドメインもしくは切断ハーフドメインにおける１つもしくはそれ以上の変異を含む。これらのポリヌクレオチド成分が個々に、または任意の組合せで使用される場合（例えば、任意の組合せの、ＦＬＡＧ、ＮＬＳ、ＷＰＲＥおよび／またはポリＡシグナルのようなペプチド配列）、本発明の方法および組成物は、人工ヌクレアーゼの発現の驚くべき予測されない増大を提供し、効率（本明細書に記載される配列／改変を伴わないヌクレアーゼと比較して、例えば、２、３、４、５、６、１０、２０倍またはそれ以上の切断）および／または標的化特異性の増大を伴う。したがって、ある特定の実施形態によると、本明細書に記載される細胞（細胞の集団、ならびにこれらの細胞および細胞集団を含む組成物）は、ＢＣＬ１１Ａ遺伝子座においてｍＲＮＡによって特異的に遺伝子改変され、細胞の１０％未満（０～１０％またはその間の任意の値）、好ましくは５％未満（０～５％またはその間の任意の値）、さらにより好ましくは１％未満（０～１％またはその間の任意の値）およびさらにより好ましくは遺伝子改変細胞の０．５％未満（０～０．５％またはその間の任意の値）が、ＢＣＬ１１Ａ遺伝子座の外側にｍＲＮＡによって作製された遺伝子改変を含む（が、ＨＬＡマーカーの不活性化のような追加の改変を含み得る）遺伝子改変細胞集団（およびこれらの細胞を含む組成物）を含む。一部の実施形態では、ヌクレアーゼは、ｍＲＮＡによってコードされ、ｍＲＮＡは、場合により、転写効率および翻訳効率を増大するためのエレメントを含む。
また、本発明の方法および組成物は、ＤＮＡ骨格上のリン酸エステルと非特異的に相互作用し得る、標的配列のヌクレオチドを認識する残基の外側のＤＮＡ結合ドメイン内の１つまたはそれ以上のアミノ酸への変異（例えば、「ＺＦＮ骨格」（ＤＮＡ認識ヘリックス領域外）への１つまたはそれ以上の変異）を含み得る。したがって、一部の実施形態では、本明細書で開示される方法および組成物は、ヌクレオチド標的特異性に必要とされない、ＺＦＰ骨格におけるカチオン性アミノ酸残基の変異を含む。一部の実施形態では、ＺＦＰ骨格におけるこれらの変異は、カチオン性アミノ酸残基を中性またはアニオン性アミノ酸残基に変異させることを含む。一部の実施形態では、ＺＦＰ骨格におけるこれらの変異は、極性アミノ酸残基を中性または非極性アミノ酸残基に変異させることを含む。一部の実施形態では、変異は、ＤＮＡ結合ヘリックスに対して（－５）、（－９）の位置および／または（－１４）の位置で作製される。一部の実施形態では、ジンクフィンガーは、（－５）、（－９）および／または（－１４）において１つまたはそれ以上の変異を含み得る。一部の実施形態では、マルチフィンガージンクフィンガータンパク質の１つまたはそれ以上のジンクフィンガーは、（－５）、（－９）および／または（－１４）において変異を含み得る。一部の実施形態では、（－５）、（－９）および／または（－１４）のアミノ酸（例えば、アルギニン（Ｒ）またはリジン（Ｋ））を、アラニン（Ａ）、ロイシン（Ｌ）、Ｓｅｒ（Ｓ）、Ａｓｐ（Ｎ）、Ｇｌｕ（Ｅ）、Ｔｙｒ（Ｙ）および／またはグルタミン（Ｑ）に変異させる。例えば、米国特許出願公開第２０１８／００８７０７２号を参照。
一部の態様では、本発明の方法および組成物は、真核生物導入遺伝子配列に融合された外来ペプチド配列をコードする配列の使用を含む。一部の実施形態では、外来ペプチドは、翻訳後にタンパク質配列に融合され、他の実施形態では、外来ペプチドをコードする配列は、人工ヌクレアーゼをコードする配列にインフレーム（３’および／または５’）に連結される（例えば、融合タンパク質）。好ましい実施形態では、３ ＦＬＡＧ配列（３×ＦＬＡＧペプチド）をコードする配列が使用され（米国特許第６，３７９，９０３号を参照）、アミノ酸配列は、Ｎ末端ＤＹＫＤＨＤＧ－ＤＹＫＤＨＤＩ－ＤＹＫＤＤＤＤＫ（配列番号１）である。そのようなペプチド配列（例えば、３×ＦＬＡＧ）のうちの１つまたはそれ以上の包含は、ペプチド配列を伴わないヌクレアーゼと比較して、ヌクレアーゼ（切断）活性を２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１倍またはそれ以上増大し得る。
一部の態様では、人工ヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡは、核局在化ペプチド配列（ＮＬＳ：ｎｕｃｌｅａｒ ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ ｐｅｐｔｉｄｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）を含む。一部の実施形態では、ＮＬＳは、ＳＶ４０ウイルスラージＴ遺伝子からの配列ＰＫＫＫＲＫＶ（配列番号２）を含む（Ｋａｌｄｅｒｏｎら、（１９８４）Ｎａｔｕｒｅ ３１１（５９８１）：３３～８頁を参照）。本明細書に記載されるＮＬＳ配列のうちの１つまたはそれ以上の包含は、ペプチド配列を伴わないヌクレアーゼと比較して、ヌクレアーゼ（切断）活性を２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１倍またはそれ以上に増大し得る。
一部の実施形態では、本明細書で開示される方法および組成物は、例えば、末梢静脈カテーテルを介して、本発明の組成物（例えば、改変ＨＳＣ／ＰＣ）を投薬することを含む。一部の実施形態では、組成物は、対象に投与され、その後、生理食塩水（ＮＳ：ｎｏｒｍａｌ ｓａｌｉｎｅ）またはリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ：ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｂｕｆｆｅｒｅｄ ｓａｌｉｎｅ）の投与が続く。一部の実施形態では、対象は、細胞約３．０×１０６個／ｋｇ～細胞約２０×１０６個／ｋｇ（またはその間の任意の値）の総用量の改変細胞を受容する。細胞約３．０×１０６～約２０×１０６個／ｋｇの範囲内の任意の用量を使用することができる。
一部の実施形態では、対象は、細胞約３．０×１０６～約２０×１０６個／ｋｇの総用量の受容後に、例えば、追加の治療手技についての必要性の遅延、低減または除去を有する。
別の態様では、β－サラセミアを有する対象における本発明の方法および組成物による治療後に、方法および組成物による治療前の対象と比較して、サラセミア関連疾患バイオマーカーを低減、遅延または除去する方法が、本明細書で開示される。ＨｂＡ、ＨｂＦ、エリスロポエチン、ハプトグロビン、ヘプシジン、甲状腺ホルモン、ＩＧＦ－１、コルチゾール、ＡＣＴＨおよびビタミンＤを含むサラセミア関連バイオマーカーの決定は、標準の臨床検査プロトコールによって測定することができ、方法は、例えば、対象に、有効量の改変ＨＳＣ／ＰＣを投与することを含み、対象は、治療後にサラセミア関連疾患バイオマーカーの低減、遅延または除去を有する。一部の実施形態では、ＨｂＦのレベルは、本明細書で開示される方法による治療後に、約５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、１５０％、２００％、３００％、４００％またはそれ以上（またはその間の任意の値）増大する。
別の態様では、β－サラセミアを有する対象における本発明の方法および組成物による治療後に、方法および組成物により治療していない対象と比較して、ＰＲＢＣ輸血の使用、ならびに非限定的に、血小板、静脈内免疫グロブリン（ＩＶＩＧ）、血漿および顆粒球を含む他の血液製剤の輸注を低減、遅延または除去する方法が、本明細書で開示される。一部の実施形態では、ＰＲＢＣおよび／または他の血液製剤の使用は、本明細書で開示される方法により治療された対象において、治療を受容する前の対象と比較して、約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％またはその間の任意の値、減少する。一部の実施形態では、ＰＲＢＣおよび／または他の血液製剤輸注の使用は、除去される。
別の態様では、β－サラセミアを有する対象において鉄過剰に関連する症状を低減、遅延または除去する方法が、本明細書で開示される。一部の実施形態では、内分泌器官における鉄沈着の結果としての内分泌機能異常のマーカー（例えば、甲状腺マーカー、ＩＧＦ－１、起床時コルチゾール、ＨｂＡ１ＣおよびビタミンＤ）は、本発明の方法および組成物による治療後に、治療前のマーカーレベルと比較して、対象において正常化される。一部の実施形態では、肝臓および心臓における鉄過剰は、本明細書で開示される方法および組成物による治療後の対象において、治療前の対象と比較して、減少する。鉄過剰は、標準のＭＲＩ手技によって評価することができる。一部の実施形態では、ＭＲＩによって検出される肝臓および／または心臓における鉄過剰は、本明細書で開示される方法により治療された対象において、治療を受容する前の対象と比較して、約５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％またはその間の任意の値、減少する。
別の態様では、β－サラセミアを有する対象において骨粗鬆症および／または骨折に関連する症状を低減、遅延または除去する方法が、本明細書で開示される。一部の実施形態では、骨密度は、本明細書で開示される方法および組成物により治療した対象において、治療前の対象と比較して、増大する。一部の実施形態では、骨粗鬆症および骨折は、本明細書で開示される方法および組成物により治療した対象において、治療前の対象と比較して、低減または除去される。一部の実施形態では、骨粗鬆症および／または骨折は、本明細書で開示される方法により治療された対象において、治療を受容する前の対象と比較して、約５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％またはその間の任意の値、改善する。
別の態様では、本明細書で開示される方法および組成物による治療後に、治療前の対象と比較して、ＴＤＴを有する対象における赤芽球過形成、対象における骨髄内の未成熟細胞および赤血球前駆体のレベルを低減、遅延または除去する方法が、本明細書で開示される。
別の態様では、本明細書に記載される遺伝子改変自家ＨＳＣ／ＰＣを含む組成物を含む包装（例えば、袋）を含む製造物品が、本明細書で提供される。製造物品（例えば、袋）は、例えば、ＤＭＳＯ１０％を含有するＣｒｙｏＳｔｏｒ（登録商標）ＣＳ－１０凍結保存媒体（ＳｉｇｍａＡｌｄｒｉｃｈ）中での凍結保存のために製剤化してもよい。各袋は、任意の濃度の細胞を含有し得る。ある特定の実施形態では、各袋は、細胞約１×１０７個／ｍＬの濃度で、１袋当たり細胞約１．０～２．０×１０８個を含有する。
さらなる態様では、本明細書に記載される遺伝子改変細胞の集団の改変プロファイル（例えば、典型的に、切断された配列のＮＨＥＪによって、切断後に生成された挿入および／または欠失の数および／または種類）をモニタリングする方法が、本明細書に記載される。対象への投与前および／または投与後にモニタリングを行って、１種類の改変（クローン）が集団内で優勢であり、そのため、ジャックポット化により特定のクローン集団の不必要な増殖が起こり得るかどうかを決定してもよい。ある特定の実施形態では、遺伝子改変細胞の集団は、配列決定などのような標準の技法を使用して、改変の種類（挿入および／または欠失、「インデル／プロファイル」とも呼ばれる）についてモニタリングされる。ある特定の実施形態では、細胞の集団は、投与前にアッセイして改変（インデルプロファイル）のパターンのベースラインを決定し、続いて、輸注後にモニタリングして生着した細胞のインデルプロファイルが維持されており、そのため、細胞の１つのクローン集団の異常な増殖がないことを決定する。モニタリングは、輸注前および／または後に経時的に（多数回）行ってもよい。したがって、本明細書に記載される方法は、輸注前および／または後に、遺伝子改変細胞の集団をモニタリングして、インデルプロファイルが経時的に同じままであることを決定することをさらに含み得る。
本明細書の記載から、本開示が、非限定的に、以下の実施形態を含む多数の実施形態を包含することが理解される：
遺伝子改変細胞であって、ｍＲＮＡはＺＦＮ対をコードする、ＳＢ－ｍＲＥＮＨ１ ｍＲＮＡおよびＳＢ－ｍＲＥＮＨ２ ｍＲＮＡ；ならびにＺＦＮ対による切断後に作製されるゲノム改変であって、ＢＣＬ１１Ａ遺伝子が細胞において不活性化されるような内在ＢＣＬ１１Ａエンハンサー配列内に存在する改変を含む赤血球（ＲＢＣ）前駆細胞を含む前記遺伝子改変細胞。また、その系統の細胞が含まれる。
治療を必要とする対象においてベータ－サラセミア（β－サラセミア）を治療するｅｘ ｖｉｖｏ方法であって、対象における胎児ヘモグロビン（ＨｂＦ）産生が増大し、β－サラセミアの１つまたはそれ以上の臨床症状が減少、改善または除去されるように、本明細書に記載される実施形態のいずれかに記載の組成物を、対象に投与することを含む前記ｅｘ ｖｉｖｏ方法。
ベータ－サラセミアは、輸血依存性β－サラセミアである、本明細書に記載される前述の実施形態のいずれかに記載のｅｘ ｖｉｖｏ方法。
グラム／血漿ｄＬ、および／または総ヘモグロビン（Ｈｂ）中のＨｂＦパーセントにおける臨床検査ヘモグロビン画分のベースラインからの変化は、対象において達成される、本明細書に記載される前述の実施形態のいずれかに記載のｅｘ ｖｉｖｏ方法。
ヘモグロビン因子は、成人ヘモグロビン（ＨｂＡ）および／または胎児ヘモグロビン（ＨｂＦ）である、本明細書に記載される前述の実施形態のいずれかに記載のｅｘ ｖｉｖｏ方法。
対象は、β０／β０またはβ０／β＋である、本明細書に記載される前述の実施形態のいずれかに記載のｅｘ ｖｉｖｏ方法。
サラセミア関連疾患バイオマーカーのレベルは、治療後に変更される、本明細書に記載される前述の実施形態のいずれかに記載のｅｘ ｖｉｖｏ方法。
バイオマーカーは、鉄代謝における変化；ならびに／またはエリスロポエチン、ハプトグロビンおよび／もしくはヘプシジンのレベルにおける変化である、本明細書に記載される前述の実施形態のいずれかに記載のｅｘ ｖｉｖｏ方法。
鉄過剰に関連するか、またはベースライン輸血療法に関連する臨床症状は、改善または除去される、本明細書に記載される前述の実施形態のいずれかに記載のｅｘ ｖｉｖｏ方法。
対象における内分泌機能異常の減少は、甲状腺ホルモン、ＩＧＦ－１、起床時コルチゾール、副腎皮質刺激ホルモン（ＡＣＴＨ）、ＨｂＡ１Ｃおよび／またはビタミンＤレベルのレベルおよび／または活性を決定することによってアッセイされる、本明細書に記載される前述の実施形態のいずれかに記載のｅｘ ｖｉｖｏ方法。
対象におけるＲＢＣ輸血、ならびに輸注血小板輸血、静脈内免疫グロブリン（ＩＶＩＧ）輸血、血漿輸血および／または顆粒球輸血についての必要性は、低減または除去される、本明細書に記載される前述の実施形態のいずれかに記載のｅｘ ｖｉｖｏ方法。
対象において低減または除去される臨床症状は、肝疾患である、本明細書に記載される前述の実施形態のいずれかに記載のｅｘ ｖｉｖｏ方法。
対象において低減または除去される臨床症状は、心臓異常である、本明細書に記載される前述の実施形態のいずれかに記載のｅｘ ｖｉｖｏ方法。
対象において低減または除去される臨床症状は、骨粗鬆症および／または骨折である、本明細書に記載される前述の実施形態のいずれかに記載のｅｘ ｖｉｖｏ方法。
ベースライン赤血球生成は、組成物の投与後に対象において変化する、本明細書に記載される前述の実施形態のいずれかに記載のｅｘ ｖｉｖｏ方法。
過形成は、組成物の投与後に対象において低減または除去される、本明細書に記載される前述の実施形態のいずれかに記載のｅｘ ｖｉｖｏ方法。
未成熟細胞および／または非定型形態を有する細胞の数は、対象において低減される、本明細書に記載される前述の実施形態のいずれかに記載のｅｘ ｖｉｖｏ方法。
対象におけるＦ細胞の数およびパーセントは、組成物の投与後に改変される、本明細書に記載される前述の実施形態のいずれかに記載のｅｘ ｖｉｖｏ方法。
遺伝子改変細胞は、自家性または同種性である、本明細書に記載される前述の実施形態のいずれかに記載のｅｘ ｖｉｖｏ方法。
ＢＣＬ１１Ａ遺伝子改変細胞は、１つまたはそれ以上の追加の遺伝子改変をさらに含む、本明細書に記載される前述の実施形態のいずれかに記載のｅｘ ｖｉｖｏ方法。
遺伝子改変細胞は、同種細胞であり、１つまたはそれ以上の追加の遺伝子改変は、１つまたはそれ以上の自己マーカーまたは抗原の不活性化を含む、本明細書に記載される前述の実施形態のいずれかに記載のｅｘ ｖｉｖｏ方法。
遺伝子改変細胞は、対象から単離された造血幹細胞である、本明細書に記載される前述の実施形態のいずれかに記載のｅｘ ｖｉｖｏ方法。
造血幹細胞は、ＣＤ３４＋造血幹細胞または前駆細胞（ＨＳＣ／ＰＣ）であり、ＣＤ３４＋ＨＳＣ／ＰＣは、単離前に１用量もしくはそれ以上のＧ－ＣＳＦおよび／または１用量もしくはそれ以上のプレリキサフォルによる処置によって、各対象において動員される、本明細書に記載される前述の実施形態のいずれかに記載のｅｘ ｖｉｖｏ方法。
少なくとも２５×１０６個／ｋｇのＣＤ３４＋ＨＳＰＣは、対象において動員され、動員された細胞は、１回またはそれ以上のアフェレーシス周期によって回収される、本明細書に記載される前述の実施形態のいずれかに記載のｅｘ ｖｉｖｏ方法。
遺伝子改変細胞を含む組成物を対象に投与する前に、組成物の細胞をＢＣＬ１１Ａ内の挿入および／または欠失について評価することをさらに含む、本明細書に記載される前述の実施形態のいずれかに記載のｅｘ ｖｉｖｏ方法。
遺伝子改変細胞を含む組成物の投与前に、１つまたはそれ以上の骨髄破壊調整剤を１回またはそれ以上、対象に投与することをさらに含む、本明細書に記載される前述の実施形態のいずれかに記載のｅｘ ｖｉｖｏ方法。
骨髄破壊剤は、ブスルファンを含み、さらに、ブスルファンの静脈内（ＩＶ）投与は、０．５～５ｍｇ／ｋｇを１回もしくはそれ以上であるか；ブスルファンのＩＶ投与は、３．２ｍｇ／ｋｇ／日であるか；０日目の遺伝子改変細胞を含む組成物の輸注前の、輸注の６～３日前の４日間の総用量１２．８ｍｇ／ｋｇの中心静脈カテーテルを介したＩＶ；またはブスルファンのＩＶ投与は、１日１回もしくは６時間毎である、本明細書に記載される前述の実施形態のいずれかに記載のｅｘ ｖｉｖｏ方法。
対象に投与される遺伝子改変細胞の用量は、細胞３×１０６個／ｋｇ～細胞２０×１０６個／ｋｇである、本明細書に記載される前述の実施形態のいずれかに記載のｅｘ ｖｉｖｏ方法。
対象に投与される遺伝子改変細胞は、細胞約１×１０７個／ｍＬの濃度で、１袋当たり細胞約１．０～２．０×１０８個にて製剤化される、本明細書に記載される前述の記実施形態のいずれかに記載のｅｘ ｖｉｖｏ方法。
遺伝子改変細胞は、投与前に凍結保存され、解凍の約１５分以内に対象に投与される、本明細書に記載される前述の実施形態のいずれかに記載のｅｘ ｖｉｖｏ方法。
遺伝子改変細胞の投与前、投与中および／または投与後の対象のバイタルサインをモニタリングすることをさらに含む、本明細書に記載される前述の記実施形態のいずれかに記載のｅｘ ｖｉｖｏ方法。
遺伝子改変細胞の投与前に、対象におけるヘモグロビン、好中球および／または血小板レベルを査定して、対象におけるヘモグロビンのベースラインレベルを決定することをさらに含む、本明細書に記載される前述の実施形態のいずれかに記載のｅｘ ｖｉｖｏ方法。
遺伝子改変細胞の投与後の対象におけるヘモグロビン、好中球および／または血小板レベルは、ベースラインレベルと比較して、投与後何週間または何カ月間も増大するか、または安定なままである、本明細書に記載される前述の実施形態のいずれかに記載のｅｘ ｖｉｖｏ方法。
対象は、遺伝子改変細胞の投与前および／または投与後に１つまたはそれ以上の濃厚赤血球（ＰＲＢＣ）輸血を受容する、本明細書に記載される前述の実施形態のいずれかに記載のｅｘ ｖｉｖｏ方法。
対象における骨髄移植、血液成分および／または鉄キレート療法ＰＲＢＣ輸血のような追加の治療についての必要性は、低減または除去される、本明細書に記載される前述の実施形態のいずれかに記載のｅｘ ｖｉｖｏ方法。
追加の治療についての必要性は、遺伝子改変細胞の投与の１～２０日以内に低減または除去される、本明細書に記載される前述の実施形態のいずれかに記載のｅｘ ｖｉｖｏ方法。
対象を、投与後経時的にモニタリングして、輸注した細胞のインデルプロファイルと比較した、末梢血サンプル、骨髄穿刺液または他の組織源から単離した細胞のインデルプロファイルを決定して、対象における移植片の安定性をモニタリングする、本明細書に記載される前述の実施形態のいずれかに記載のｅｘ ｖｉｖｏ方法。
細胞のインデルプロファイルは、対象への投与前にモニタリングされる、本明細書に記載される前述の実施形態のいずれかに記載のｅｘ ｖｉｖｏ方法。
ＣｒｙｏＳｔｏｒ（登録商標）ＣＳ－１０凍結保存媒体中に製剤化した請求項２に記載の組成物を含む包装を含む製造物品。
各袋は、細胞約１×１０７個／ｍＬの濃度で、１袋当たり細胞約１．０～２．０×１０８個を含有する、本明細書に記載される前述の実施形態のいずれかに記載の製造物品。
これらおよび他の態様は、開示全体に照らせば、当業者に容易に明らかである。
成人ヘモグロビン変異（例えば、鎌形赤血球症またはβ－サラセミア）を有する対象への低い、上昇したおよび高い胎生ヘモグロビンレベルの影響を示す図である（出典、Ｈａｒｄｉｓｏｎ ＆ Ｂｌｏｂｅｌ（２０１３）Ｓｃｉｅｎｃｅ ３４２（６１５５）：２０６～７頁）。左端（「低胎児ヘモグロビン：」）に示されているのは、成人ヘモグロビン中に変異および野生型ＥＳＥ ＢＣＬ１１Ａを有する対象であり、この場合に対象は正常（低）レベルの胎児ヘモグロビンを有し、対象において疾患症状を生じる。中央（「上昇した胎児ヘモグロビン」）では、対象は、成人ヘモグロビン変異を有するが、ＢＣＬ１１Ａ発現は減少するが除かれず、胎児グロビンレベルの上昇をもたらすような変異も彼らのＢＣＬ１１Ａ遺伝子に有する。対象は、胎児グロビンが一部の成人グロビン機能を「置換すること」から、いくらかの疾患回復を経験する。右端（「高胎児ヘモグロビン」）では、対象は、成人グロビン変異を有するが、対象が胎児グロビンの完全な発現を示すような欠失をＢＣＬ１１Ａエンハンサーに有する。この対象は、完全なＢＣＬ１１Ａ不活性化のおかげで症状のさらに大きな改善を経験する。 健康なボランティア（ＰＢ－ＭＲ－００３およびＰＢ－ＭＲ－００４）から採取され、ＳＢ－ｍＲＥＮＨ１およびＳＢ－ｍＲＥＮＨ２によって改変されたＣＤ３４＋ＨＳＣ／ＰＣ中の胎児（ガンマグロビンまたはγグロビンとも称される）レベルを示す図である。γ－グロビン（Ａγ－グロビンとＧγ－グロビンピークとの合計）のα－グロビンに対する、ならびにγ－グロビンのβ－様グロビン（Ａγ、Ｇγ、βおよびδ－グロビンピークの合計）に対する比は、改変ＨＳＰＣの赤血球分化の２１日目のタンパク質サンプルからＵＰＬＣ分析によって決定され、表示の条件で示されている。電気穿孔法４８時間後に、細胞は採取され、凍結された。細胞は、解凍され、ｉｎ ｖｉｔｒｏ赤血球生成およびグロビン産生を研究するために使用された。示されるとおり、γ－グロビンのβ－グロビンに対する比、およびγ－グロビンのα－グロビンに対する比は、処置されたＨＳＣ／ＰＣの赤血球後代において未トランスフェクト細胞と比較しておよそ３～４倍増加していた（タンパク質データは、γ－グロビンｍＲＮＡレベルの測定によっても支持された）。各群では、左側のバーは、γ－グロビン／α－グロビンの比を示し、右側のバーはγ－グロビン／全β様グロビンの比を表している。 改変ＨＳＰＣにおける二重鎖切断の頻度および経時変化を示すグラフである。図３Ａは、トランスフェクション後７日間にわたる５３ＢＰ１フォーカス／細胞の数の経時変化を示している（「ｄｐｔ」）（平均±ＳＤ ５３ＢＰ１＋フォーカス／細胞）。 改変ＨＳＰＣにおける二重鎖切断の頻度および経時変化を示すグラフである。図３Ｂおよび図３Ｃは、トランスフェクション後１日目（図３Ｂ）および７日目（図３Ｃ）での種々の数（１～５＋）の５３ＢＰ１フォーカス／細胞を有する全細胞でのパーセントを示している。＊Ｐ＜０．０５対対照 改変ＨＳＰＣにおける二重鎖切断の頻度および経時変化を示すグラフである。３Ｂおよび図３Ｃは、トランスフェクション後１日目（図３Ｂ）および７日目（図３Ｃ）での種々の数（１～５＋）の５３ＢＰ１フォーカス／細胞を有する全細胞でのパーセントを示している。＊Ｐ＜０．０５対対照 染色体移行を検出するために使用されるプローブセットの図である。上パネルは、ＢＣＬ１１Ａエンハンサーオンターゲット部位（実線）およびオフターゲット部位（斜線）を包含する染色体セグメントを示している。下パネルは、対応する移行産生物の検出のための陽性対照試薬（ｇＢｌｏｃｋ）を記している。ＴａｑＭａｎアッセイで使用されるおよそのプライマーおよびプローブ位置も示されている。各ｇＢｌｏｃｋ内の格子縞のセグメントは、真の移行産生物から識別し、潜在的な相互汚染のモニタリングを可能にするために各対照試薬に挿入された固有の配列である。産生物１ ｇＢｌｏｃｋを、断片のＢＣＬ１１Ａ領域において探索した。産生物２ ｇＢｌｏｃｋを、断片のオフターゲット領域について探索した。 遺伝子改変ＨＳＰＣ（「ＳＴ－４００」とも称される）を使用する処置プロトコールを示す模式図である。「Ｇ－ＣＳＦ」は顆粒球コロニー刺激因子を指す；「ＨＳＰＣ」は造血幹細胞前駆細胞を指す；「ＩＶ」は静脈内を指す；「ＲＢＣ」は赤血球を指し；および「ＺＦＮ」はジンクフィンガーヌクレアーゼを指す。 本明細書に記載される改変ＨＳＰＣ（「ＳＴ－４００」）を用いて処置された患者における総ヘモグロビンおよび胎児ヘモグロビンを示すグラフである（例えば、図５を参照）。図６Ａは、表示された研究日のヘモグロビンＦレベル（ヘモグロビンの％）を示す。図６Ｂは、表示された研究日のヘモグロビンレベル（ｇ／ｄＬ）を示す。矢印は、患者がＰＲＢＣの輸血を受けた時期を示している。改変ＨＳＰＣは、０日目に投与された。データは、患者が輸注の５０日後に総ヘモグロビンのほとんど３１％まで胎児ヘモグロビンが増加したことを実証している。データは、典型的には患者はＰＲＢＣを処置前の２年間には２週間ごとに受けたが、ＳＴ－４００輸注後は１０日目～５０日目の間に患者がいかなるＰＲＢＣも必要としなかったことも実証している。 本明細書に記載される改変ＨＳＰＣ（「ＳＴ－４００」）を用いて処置された患者における総ヘモグロビンおよび胎児ヘモグロビンを示すグラフである（例えば、図５を参照）。図６Ａは、表示された研究日のヘモグロビンＦレベル（ヘモグロビンの％）を示す。図６Ｂは、表示された研究日のヘモグロビンレベル（ｇ／ｄＬ）を示す。矢印は、患者がＰＲＢＣの輸血を受けた時期を示している。改変ＨＳＰＣは、０日目に投与された。データは、患者が輸注の５０日後に総ヘモグロビンのほとんど３１％まで胎児ヘモグロビンが増加したことを実証している。データは、典型的には患者はＰＲＢＣを処置前の２年間には２週間ごとに受けたが、ＳＴ－４００輸注後は１０日目～５０日目の間に患者がいかなるＰＲＢＣも必要としなかったことも実証している。 有核血液細胞（入手可能な、骨髄吸引液、循環白血球または末梢血単核細胞）の次世代シーケンシングによって検出された１０個の最も頻度の高いインデル（挿入および／または欠失）を各時点で患者ごとに示す図である。図７Ａは患者１を示す；図７Ｂは患者２を示す；図７Ｃは患者３を示す。造血クローン性（hematopoietic clonality）について心配な顕性の出現は経時的に観察されなかった。インデル命名規則：「Ｉ」は挿入を指す；「Ｄ」は欠失を指す；最初の数字は参照塩基対からのインデルの開始を指す（「＊」は、インデルに隣接するヌクレオチドを指し、インデルのいずれかの側にアラインされる）；コロンの次の数字は挿入または欠失された塩基対の数を指す。記されるとおり、５６日目データは、患者２については入手できていない（図７Ｂ）。 有核血液細胞（入手可能な、骨髄吸引液、循環白血球または末梢血単核細胞）の次世代シーケンシングによって検出された１０個の最も頻度の高いインデル（挿入および／または欠失）を各時点で患者ごとに示す図である。図７Ａは患者１を示す；図７Ｂは患者２を示す；図７Ｃは患者３を示す。造血クローン性（hematopoietic clonality）について心配な顕性の出現は経時的に観察されなかった。インデル命名規則：「Ｉ」は挿入を指す；「Ｄ」は欠失を指す；最初の数字は参照塩基対からのインデルの開始を指す（「＊」は、インデルに隣接するヌクレオチドを指し、インデルのいずれかの側にアラインされる）；コロンの次の数字は挿入または欠失された塩基対の数を指す。記されるとおり、５６日目データは、患者２については入手できていない（図７Ｂ）。 有核血液細胞（入手可能な、骨髄吸引液、循環白血球または末梢血単核細胞）の次世代シーケンシングによって検出された１０個の最も頻度の高いインデル（挿入および／または欠失）を各時点で患者ごとに示す図である。図７Ａは患者１を示す；図７Ｂは患者２を示す；図７Ｃは患者３を示す。造血クローン性（hematopoietic clonality）について心配な顕性の出現は経時的に観察されなかった。インデル命名規則：「Ｉ」は挿入を指す；「Ｄ」は欠失を指す；最初の数字は参照塩基対からのインデルの開始を指す（「＊」は、インデルに隣接するヌクレオチドを指し、インデルのいずれかの側にアラインされる）；コロンの次の数字は挿入または欠失された塩基対の数を指す。記されるとおり、５６日目データは、患者２については入手できていない（図７Ｂ）。 ＳＴ－４００を用いた処置後の表示の時点での患者１、２および３におけるＨｂＦレベルを示す図である。各患者についてベータサラセミアの原因となる遺伝子型は、各グラフにも示されている。
ＢＣＬ１１Ａ、ガンマグロビン、およびＢＣＬ１１Ａとガンマグロビン発現との組合せのモジュレーションのためのゲノム操作のため、ならびに異常ヘモグロビン症の治療、予防、または治療および予防のための、組成物および方法が、本明細書で開示される。特に、表１の単一の行で示される認識ヘリックス領域を有するＺＦＰを含むヌクレアーゼで標的化することにより、ＢＣＬ１１Ａのエンハンサーの破壊は、ＨＳＣ／ＰＣにおいて効率的に達成され、その後の赤血球生成中の相対的ガンマグロビン発現の変化をもたらす。このＢＣＬ１１Ａおよびガンマグロビン発現のモジュレーションは、ベータグロビン発現が不十分であるか、または変異型のベータグロビンの発現がある異常ヘモグロビン症（例えば、ＴＤＴ、鎌状赤血球症のようなベータサラセミア）の治療に特に有用である。本明細書に記載される方法および組成物を使用して、異常なベータグロビンによって引き起こされる合併症および疾患関連続発症は、赤血球前駆細胞（erythrocyte precursor cell）におけるガンマグロビンの発現の変更によって克服することができる。特に、本明細書に記載される組成物および方法は、同種造血幹細胞移植（ＨＳＣＴ）に関連する問題を克服する。これらの問題は、ドナー利用可能性による制限、ならびに同種移植後の移植不全および移植片対宿主病のリスクを含む。
本明細書に記載される造血幹細胞または始原細胞におけるＢＣＬ１１Ａのイントロン性赤血球特異的エンハンサーのＧＡＴＡ結合領域の高精度の遺伝子編集は、正常な多系統造血に有害に影響を及ぼすことなく、胎児ヘモグロビン（ＨｂＦ）の持続的高発現をもたらす。そのため、遺伝子改変細胞は、ＴＤＴのような異常ヘモグロビン症のｅｘ ｖｉｖｏ治療のために使用することができる。胎児ヘモグロビン（ＨｂＦ）は、妊娠中に出生まで存在する主要なヘモグロビンである。ＨｂＦは、集合的にγ－グロビンとして公知の、２つのβ様グロビン遺伝子、Ｇγ－グロビンおよびＡγ－グロビンのうちの１つのタンパク質生成物を、α－グロビンタンパク質と四量体（α２γ２）として組み合わせることによって生成される。出生後、γ－グロビンタンパク質生成が減少するにつれて、ＨｂＦレベルは漸進的に低下し、６～１２カ月齢頃には、β－グロビンとα－グロビンタンパク質の四量体（α２β２）からなる成人ヘモグロビンによって大部分は置き換えられる。このＨｂＦレベルの低下と同時に、ＴＤＴの症状は、頻繁に、乳児において臨床的に明らかになる。ＨｂＦは通常、正常な成人生理においては小さな役割を果たすのみである。しかしながら、公開された研究により、ＨｂＦの先天性、後天性および薬物誘発性の増大は、ＴＤＴを有する患者における病的状態の低減および臨床アウトカムの改善に関連することが実証されている。例えば、大規模な不偏性の遺伝子研究は、ＴＤＴ疾患重症度と、ＨｂＦレベルの増大に関連するＢＣＬ１１Ａなどの量的形質遺伝子座との間の関連を特定しており（Ｔｈｅｉｎら、（２００９）Ｈｕｍ Ｍｏｌ Ｇｅｎｅｔ １８（Ｒ２）：Ｒ２１６～２３頁）、ＨｂＦのレベルは、多くの場合、ＴＤＴ症状の減衰の程度と比例する（Ｍｕｓａｌｌａｍら、（２０１２）Ｂｌｏｏｄ １１９（２）：３６４～７頁）。加えて、移植拒絶によるＴＤＴ患者における同種ＨＳＣＴ失敗の症例報告があり、これは思いがけず持続性の高いＨｂＦレベルをもたらし、その後、患者は、輸血非依存性になったことが報告された（Ｆｅｒｓｔｅｒら、（１９９５）Ｂｒ． Ｊ Ｈａｅｍａｔｏｌ ９０（４）：８０４～８頁；ＰａｃｉａｒｏｎｉおよびＬｕｃａｒｅｌｌｉ（２０１２）Ｂｌｏｏｄ １１９（４）：１０９１～２頁）。ＨｂＦ産生は、ヒドロキシ尿素によって増大される（Ｗａｌｋｅｒら、（２０１１）Ｂｌｏｏｄ １１８（２０）：５６６４～７０頁）。しかしながら、ヒドロキシ尿素は、β－サラセミアにおいて不定に有効であるのみであり、ＴＤＴよりも中間型β－サラセミアにおいて効能がより大きい（Ｃｈａｒａｃｈｅら、（１９９５）Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ ３３２（２０）：１３１７～２２頁；Ａｎｓａｒｉら、（２０１１）Ｊ Ｐｅｄｉａｔｒ Ｈｅｍａｔｏｌ Ｏｎｃｏｌ ３３（５）：３３９～４３頁；Ｓｉｎｇｅｒら、（２００８）Ａｍ Ｊ Ｈｅｍａｔｏｌ ８３（１１）：８４２～５頁）。さらに、ヒドロキシ尿素の効果は、対症的であり、その使用は、血球減少および他の毒性についての定期的なモニタリングを必要とする。
ＢＣＬ１１Ａは、発達および造血において多くの役割を果たす転写因子である。細胞および動物モデルにおける全ゲノムでの関連および機能的フォローアップ研究により、ＢＣＬ１１Ａは、ＨｂＦ発現の重要なサイレンサーであることが示されている。精液の研究において、鎌状赤血球症（ＳＣＤ：ｓｉｃｋｌｅ ｃｅｌｌ ｄｉｓｅａｓｅ）のトランスジェニックヒト化マウスモデルにおける赤血球特異的条件付きノックアウトによるＢＣＬ１１Ａの破壊は、ヘモグロビン切り換えの失敗、高レベルのＨｂＦの維持、ならびにＳＣＤに関連する血液学的および病理学的特徴の顕著な改善をもたらす（Ｘｕら、（２０１１）Ｓｃｉｅｎｃｅ ３３４（６０５８）：９９３～６頁）。したがって、ＢＣＬ１１Ａの阻害は、ヒトにおけるＴＤＴおよびＳＣＤのようなβ－グロビン障害を治療するための潜在的に有効な方策であるように見える。しかしながら、治療的手法のためにＢＣＬ１１Ａ遺伝子を標的化することは、発達および造血におけるＢＣＬ１１Ａの決定的な役割のために、課題を提起するものである（Ｂｒｅｎｄｅｌら、（２０１６）Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ １２６（１０：３８６８～３８７８頁）。代替策は、ＢＣＬ１１Ａの第２のイントロンに位置し、かつ赤血球におけるＢＣＬ１１Ａ発現に必要とされるが、他の系統におけるＢＣＬ１１Ａ発現には必要とされない赤血球特異的エンハンサー（ＥＳＥ：ｅｒｙｔｈｒｏｉｄ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｅｎｈａｎｃｅｒ）エレメントを標的化する。エンハンサーエレメントは、より高いＨｂＦレベルに関連する共通の遺伝子変化を含有することが分かった（Ｂａｕｅｒら、（２０１３）Ｓｃｉｅｎｃｅ ３４２（６１５５）：２５３～７頁）。それゆえ、このＢＣＬ１１Ａ遺伝子の赤血球特異的エンハンサーの改変は、全体的なＢＣＬ１１Ａ機能に対する有害な効果を伴わずに赤血球における内在ＨｂＦレベルを押し上げ得ることが仮定される（ＨａｒｄｉｓｏｎおよびＢｌｏｂｅｌ（２０１３）Ｓｃｉｅｎｃｅ ３４２（６１５５）：２０６～７頁）。
改変ＨＳＰＣによる治療後の対象の安全性は、最大の関心事である。したがって、本明細書に記載される方法のいずれにおいても、輸注後に改変ＨＳＰＣをモニタリングして、改変細胞が対象において経時的に維持されるかどうか査定してもよい。加えて、ヌクレアーゼ切断後のＮＨＥＪは、インデルプロファイルとも呼ばれる、様々な異なる挿入および／または欠失を含む細胞の集団をもたらす。挿入および／または欠失（インデル）は、任意の長さ、および挿入と欠失との任意の組合せであってもよく、０～１０ｋｂヌクレオチドの欠失；０～１０ｋｂヌクレオチドの挿入；０～１０ｋｂヌクレオチドの欠失および１～１０ｋｂヌクレオチドの挿入；ならびに／または１～１０ｋｂヌクレオチドの欠失および０～１０ｋｂヌクレオチドの挿入を含むが、これらに限定されない。インデルプロファイルは、患者間で広く変動し得る。例えば、患者１、２および３について図７Ａ～図７Ｃで示される通り、最も一般的な１０個のインデルについてのインデルプロファイルが、各患者について示され、ここで、「Ｉ」は挿入を指し；「Ｄ」は欠失を指し；第１の数は参照塩基対からのインデルの開始を指し（「＊」は、インデルに隣接するヌクレオチドを指し、インデルのいずれかの側に並び得る）；コロン後の数は挿入または欠失した塩基対の数を指す。示される通り、最も一般的なインデルは、ヌクレオチド１～２８個で変動し、参照塩基対の約５０～７０（いずれかの側）で開始した。さらに、すべての患者において、「すべての他のインデル」は、評価したインデルの４０％超を構成した。加えて、示される通り、インデルプロファイルは、経時的に変化し得る。
また、遺伝子改変ＨＳＰＣをモニタリングして、それらのインデルプロファイルを決定する方法が、本明細書に記載される。ある特定の実施形態では、ｅｘ ｖｉｖｏ遺伝子改変細胞のインデルプロファイルを、輸注前に決定し、対象への投与後経時的にモニタリングする。そのようなモニタリングは、生着した細胞におけるインデルの分布パターンが維持されており、１クローン集団が残りの集団よりも速く増殖するジャックポット化としても公知の現象である、１クローン細胞集団の異常な増殖がないことを保証し（例えば、Ｈｅｄｄｌｅ（１９９９）Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ １４（３）：２５７～２６０頁を参照）、１クローン細胞集団の異常な増殖は、体内のＨＳＰＣの正常な細胞ホメオスタシスについてその改変ＨＳＰＣ由来の細胞種の不必要な増殖をもたらし得る。インデルプロファイルのモニタリングは、任意の標準の技法を使用して、例えば、配列決定または他の方法によって行うことができる。
したがって、（ｉ）ｍＲＮＡはＺＦＮ対をコードする、ＳＢ－ｍＲＥＮＨ１ ｍＲＮＡおよびＳＢ－ｍＲＥＮＨ２ ｍＲＮＡ（配列番号１５および配列番号１６で示される）；ならびに（ｉｉ）ＺＦＮ対による切断後に作製されるゲノム改変であって、ＢＣＬ１１Ａ遺伝子が細胞において不活性化されるような内在ＢＣＬ１１Ａエンハンサー配列内に存在する改変を含む遺伝子改変細胞（例えば、ＣＤ３４＋造血幹細胞または赤血球前駆細胞のような赤血球（ＲＢＣ）前駆細胞）が、本明細書で提供される。また、これらの遺伝子改変細胞を含む細胞集団；その系統の遺伝子改変細胞；遺伝子改変細胞およびその系統の細胞を含む細胞集団；ならびに遺伝子改変細胞および／またはその系統の細胞を含む組成物が、提供される。本明細書に記載される細胞、細胞集団、および組成物は、自家細胞（対象から）および／または同種細胞であり得る。さらに、遺伝子改変細胞は、１つまたはそれ以上の追加の遺伝子改変を含む場合があり、非限定的に、１つまたはそれ以上の自己マーカーまたは抗原が不活性化（ノックアウト）されている細胞を含む。
また、これらの細胞集団および／または組成物を使用するｅｘ ｖｉｖｏ細胞療法、例えば、対象（例えば、β０／β０またはβ０／β＋）における胎児ヘモグロビン（ＨｂＦ）産生が増大し、β－サラセミア（例えば、輸血依存性β－サラセミア）の１つまたはそれ以上の臨床症状が減少、改善または除去されるように、本明細書に記載される遺伝子改変細胞（および／またはその系統の細胞）を含む組成物を対象に投与することによって、ベータ－サラセミア（β－サラセミア）を有する対象を治療するｅｘ ｖｉｖｏ方法が提供される。ある特定の実施形態では、グラム／血漿ｄＬ、および／または総ヘモグロビン（Ｈｂ）中のＨｂＦパーセントにおける臨床検査ヘモグロビン画分（成人ヘモグロビンまたは胎児ヘモグロビン）のベースラインからの変化が、対象において達成される。他の実施形態では、サラセミア関連疾患バイオマーカーのレベル（例えば、鉄代謝における変化；ならびに／またはエリスロポエチン、ハプトグロビンおよび／もしくはヘプシジンのレベルにおける変化）は、治療（遺伝子改変細胞の投与）後に変更される。減少、改善または除去することができる臨床症状には、鉄過剰に関連するか、もしくはベースライン輸血療法に関連する臨床症状（例えば、甲状腺ホルモン、ＩＧＦ－１、起床時コルチゾール、副腎皮質刺激ホルモン（ＡＣＴＨ）、ＨｂＡ１Ｃおよび／またはビタミンＤレベルのレベルおよび／または活性を決定することによってアッセイされる、対象における内分泌機能異常の減少）；ＲＢＣ輸血、および輸注血小板輸血、静脈内免疫グロブリン（ＩＶＩＧ）輸血、血漿輸血および／もしくは顆粒球輸血についての必要性；肝疾患；心臓異常；骨粗鬆症；ならびに／または骨折が含まれるが、これらに限定されない。また、本明細書に記載されるｅｘ ｖｉｖｏ方法は、組成物の投与後に、非限定的に、対象における過形成の低減もしくは除去；未成熟細胞および／もしくは非定型形態を有する細胞の数の低減；ならびに／またはＦ細胞の数およびパーセントの変化（改変）を含む、対象におけるベースライン赤血球生成の変化をもたらし得る。
本明細書に記載される方法のいずれにおいても、遺伝子改変細胞は、対象から単離した造血幹細胞（例えば、ＣＤ３４＋ＨＳＣ／ＰＣ）であり、場合により、ＣＤ３４＋ＨＳＣ／ＰＣは、単離前に１用量もしくはそれ以上のＧ－ＣＳＦおよび／または１用量もしくはそれ以上のプレリキサフォルによる処置によって各対象において動員され（例えば、少なくとも２５×１０６個／ｋｇのＣＤ３４＋ＨＳＰＣ）、動員された細胞は、１回またはそれ以上のアフェレーシス周期によって回収される。さらに、遺伝子改変細胞を含む組成物は、ＢＣＬ１１Ａ（オンターゲット改変）および／または他の非ＢＣＬ１１Ａ領域（オフターゲット改変）内の挿入および／または欠失について評価してもよい。遺伝子改変細胞を含む組成物の投与前に、対象は、１つまたはそれ以上の骨髄破壊調整剤、例えば：０．５～５ｍｇ／ｋｇで１回もしくはそれ以上静脈内に（ＩＶ）；３．２ｍｇ／ｋｇ／日でＩＶ；０日目の遺伝子改変細胞を含む組成物の輸注前の、輸注の６～３日前の４日間の総用量１２．８ｍｇ／ｋｇの中心静脈カテーテルを介したＩＶ；または１日１回もしくは６時間毎のＩＶで投与されるブスルファンにより１回またはそれ以上処置（投与）してもよい。任意の用量、例えば、細胞３．０×１０６個／ｋｇ～細胞２０×１０６個／ｋｇの遺伝子改変細胞を使用することができる（例えば、細胞が、細胞約１×１０７個／ｍＬの濃度で、１袋当たり細胞約１．０～２．０×１０８個にて製剤化される場合）。遺伝子改変細胞は、投与前に凍結保存してもよく、非限定的に、解凍の約１５分～約４５分以内を含む解凍後のいつでもよい。方法は、遺伝子改変細胞の投与前、投与中および／もしくは投与後の対象のバイタルサインをモニタリングすること；ならびに／または遺伝子改変細胞の投与前に、対象におけるヘモグロビン、好中球および／もしくは血小板レベルを査定して、対象におけるヘモグロビンのベースラインレベルを決定することをさらに含み得る。ある特定の実施形態では、遺伝子改変細胞の投与後の対象におけるヘモグロビン、好中球および／または血小板レベルは、ベースラインレベルと比較して、投与後数週間または数カ月間も増大するか、または安定なままである。場合により、対象は、遺伝子改変細胞の投与前および／または投与後に１つまたはそれ以上のＰＲＢＣ輸血を受容し得る。本明細書に記載される方法のいずれにおいても、組成物の対象への投与後、対象における骨髄移植、血液成分、鉄キレート化および／または治療ＰＲＢＣ輸血のような追加の治療についての必要性は、例えば、１～２０日を含む約１～３０日以内またはそれ以上で、低減または除去される。また、細胞および対象を、投与前および／または投与後にモニタリングして、例えば、輸注した細胞のインデルプロファイルと比較した、末梢血サンプル、骨髄穿刺液または他の組織源から単離した細胞のインデルプロファイルを決定して、対象における移植片の安定性をモニタリングしてもよい。
概略
本明細書で開示される方法の実施、ならびに組成物の調製および使用は、別に示さない限り、当技術分野の技術の範囲内の分子生物学、生化学、クロマチン構造および分析、計算化学、細胞培養、組換えＤＮＡおよび関連分野の従来技法を使用する。これらの技法は、文献において完全に説明されている。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＣＬＯＮＩＮＧ： Ａ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ ＭＡＮＵＡＬ、第２版、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、１９８９および第３版、２００１年；Ａｕｓｕｂｅｌら、ＣＵＲＲＥＮＴ ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ ＩＮ ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＢＩＯＬＯＧＹ、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、１９８７年および周期更新；叢書 ＭＥＴＨＯＤＳ ＩＮ ＥＮＺＹＭＯＬＯＧＹ、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ；Ｗｏｌｆｆｅ、ＣＨＲＯＭＡＴＩＮ ＳＴＲＵＣＴＵＲＥ ＡＮＤ ＦＵＮＣＴＩＯＮ、第３版、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、１９９８年；ＭＥＴＨＯＤＳ ＩＮ ＥＮＺＹＭＯＬＯＧＹ、３０４巻、「Ｃｈｒｏｍａｔｉｎ」（Ｐ．Ｍ． ＷａｓｓａｒｍａｎおよびＡ． Ｐ． Ｗｏｌｆｆｅ編）、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、１９９９年；ならびにＭＥＴＨＯＤＳ ＩＮ ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＢＩＯＬＯＧＹ、１１９巻、「Ｃｈｒｏｍａｔｉｎ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ」（Ｐ．Ｂ． Ｂｅｃｋｅｒ編）Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ、Ｔｏｔｏｗａ、１９９９年を参照。
定義
用語「核酸」、「ポリヌクレオチド」および「オリゴヌクレオチド」は、互換的に使用され、直鎖状または環状コンフォメーションの、および一本鎖型または二本鎖型のいずれかの、デオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドポリマーを指す。本開示の目的のために、これらの用語は、ポリマーの長さについての限定として解釈されるべきではない。これらの用語は、天然ヌクレオチドの公知のアナログ、ならびに塩基、糖および／またはリン酸部分（例えば、ホスホロチオエート骨格）において改変されているヌクレオチドを包含し得る。一般に、特定のヌクレオチドのアナログは、同じ塩基対形成特異性を有する；すなわち、Ａのアナログは、Ｔと塩基対形成する。
用語「ポリペプチド」、「ペプチド」および「タンパク質」は、互換的に使用されて、アミノ酸残基のポリマーを指す。また、この用語は、１つまたはそれ以上のアミノ酸が、対応する天然に存在するアミノ酸の化学アナログまたは改変誘導体である、アミノ酸ポリマーに適用される。
「結合すること」とは、高分子間（例えば、タンパク質と核酸との間）の配列特異的、非共有相互作用を指す。相互作用が全体として配列特異的である限り、結合相互作用のすべての構成成分が、配列特異的である必要はない（例えば、ＤＮＡ骨格のリン酸残基と接触する）。そのような相互作用は、１０－６Ｍ－１またはそれ以下の解離定数（Ｋｄ）によって一般に特徴付けられる。「親和性」とは、結合の強度を指す：結合親和性の増大は、より低いＫｄと相関する。
「結合タンパク質」は、別の分子と非共有結合することができるタンパク質である。結合タンパク質は、例えば、ＤＮＡ分子（ＤＮＡ結合タンパク質）、ＲＮＡ分子（ＲＮＡ結合タンパク質）および／またはタンパク質分子（タンパク質結合タンパク質）に結合することができる。タンパク質結合タンパク質の場合、それが、それ自体に結合する（ホモ二量体、ホモ三量体などを形成する）こと、および／またはそれが、異なるタンパク質の１つもしくはそれ以上の分子に結合することが、可能である。結合タンパク質は、２つ以上の種類の結合活性を有することがある。例えば、ジンクフィンガータンパク質は、ＤＮＡ結合、ＲＮＡ結合およびタンパク質結合活性を有する。
「ジンクフィンガーＤＮＡ結合タンパク質」（または結合ドメイン）は、構造が亜鉛イオンの配位を通して安定化されている、結合ドメイン内のアミノ酸配列の領域である１つまたはそれ以上のジンクフィンガーを通して配列特異的様式でＤＮＡに結合するタンパク質、またはより大きなタンパク質内のドメインである。用語ジンクフィンガーＤＮＡ結合タンパク質は、多くの場合、ジンクフィンガータンパク質またはＺＦＰと略される。用語「ジンクフィンガーヌクレアーゼ」は、１つのＺＦＮ、および二量体化して標的遺伝子を切断する１対のＺＦＮ（対のメンバーは、「左および右」または「第１および第２」または「対」と呼ばれる）を含む。
「ＴＡＬＥ ＤＮＡ結合ドメイン」または「ＴＡＬＥ」は、１つまたはそれ以上のＴＡＬＥ反復ドメイン／ユニットを含むポリペプチドである。反復ドメインは、ＴＡＬＥの、その同族標的ＤＮＡ配列への結合に関与している。単一の「反復ユニット」（「反復」とも呼ばれる）は、典型的に３３～３５個のアミノ酸の長さであり、天然に存在するＴＡＬＥタンパク質内の他のＴＡＬＥ反復配列との少なくとも一部の配列相同性を示す。例えば、米国特許第８，５８６，５２６号および同第９，４５８，２０５号を参照。用語「ＴＡＬＥＮ」は、１つのＴＡＬＥＮ、および二量体化して標的遺伝子を切断する１対のＴＡＬＥＮ（対のメンバーは、「左および右」または「第１および第２」または「対」と呼ばれる）を含む。ジンクフィンガーおよびＴＡＬＥ結合ドメインは、例えば、天然に存在するジンクフィンガーまたはＴＡＬＥタンパク質の認識ヘリックス領域の操作（１つまたはそれ以上のアミノ酸の変更）により、所定のヌクレオチド配列に結合するように「操作」することができる。それゆえ、操作されたＤＮＡ結合タンパク質（ジンクフィンガーまたはＴＡＬＥ）は、非天然に存在するタンパク質である。ＤＮＡ結合タンパク質を操作するための方法の非限定的な例は、設計および選択である。設計したＤＮＡ結合タンパク質は、その設計／組成が主として合理的な基準から生ずる、天然には存在しないタンパク質である。設計のための合理的な基準には、置換規則、ならびに現存のＺＦＰおよび／またはＴＡＬＥ設計および結合データの情報を保存しているデータベースの情報を処理するための計算機化アルゴリズムの適用が含まれる。例えば、米国特許第８，５６８，５２６号；同第６，１４０，０８１号；同第６，４５３，２４２号；および同第６，５３４，２６１号を参照；また、国際特許公開第９８／５３０５８号；同第９８／５３０５９号；同第９８／５３０６０号；同第０２／０１６５３６号；および同第０３／０１６４９６号を参照。
「選択した」ジンクフィンガータンパク質またはＴＡＬＥは、その産生が主として例えば、ファージディスプレイ、相互作用トラップまたはハイブリッド選択のような経験的プロセスから生ずる、天然には見出されないタンパク質である。例えば、米国特許第８，５８６，５２６号；同第５，７８９，５３８号；同第５，９２５，５２３号；同第６，００７，９８８号；同第６，０１３，４５３号；同第６，２００，７５９号；および国際特許公開第９５／１９４３１号；同第９６／０６１６６号；同第９８／５３０５７号；同第９８／５４３１１号；同第００／２７８７８号；同第０１／６０９７０号；同第０１／８８１９７号および同第０２／０９９０８４号を参照。
「組換え」とは、２つのポリヌクレオチド間の遺伝子情報の交換のプロセスを指す。本開示の目的のために、「相同組換え（ＨＲ：ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ）」とは、例えば、相同組換え修復（ｈｏｍｏｌｏｇｙ－ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｒｅｐａｉｒ）機構による細胞における二本鎖切断の修復中に起こる、そのような交換の特別な形態を指す。このプロセスは、ヌクレオチド配列相同性を必要とし、「標的」分子（すなわち、二本鎖切断を受けた分子）の修復の鋳型となる「ドナー」分子を使用し、このプロセスはドナーから標的への遺伝子情報の移行をもたらすので、「非交差遺伝子変換（ｎｏｎ－ｃｒｏｓｓｏｖｅｒ ｇｅｎｅ ｃｏｎｖｅｒｓｉｏｎ）」または「ショートトラクト遺伝子変換（ｓｈｏｒｔ ｔｒａｃｔ ｇｅｎｅ ｃｏｎｖｅｒｓｉｏｎ）」としても多様に公知である。任意の特定の理論に束縛されるものではないが、そのような移行は、破壊された標的とドナーとの間で形成されるヘテロ二本鎖ＤＮＡのミスマッチ修正、および／またはドナーが遺伝子情報を再合成するために使用され、その遺伝子情報が標的の部分になる「合成依存性鎖アニーリング」、および／または関連プロセスに関与し得る。そのような特別なＨＲは、多くの場合、ドナーポリヌクレオチドの配列の部分またはすべてが標的ポリヌクレオチドに組み入れられるような、標的分子の配列の変更をもたらす。
本開示の方法において、本明細書に記載される１つまたはそれ以上の標的化したヌクレアーゼは、標的配列（例えば、細胞クロマチン）の所定の部位において二本鎖切断を作出し、切断の領域におけるヌクレオチド配列への相同性を有する「ドナー」ポリヌクレオチドが、細胞に導入される。二本鎖切断の存在は、ドナー配列の組込みを促進することが示されている。ドナー配列は、物理的に組み込まれるか、またはあるいは、ドナーポリヌクレオチドは、相同組換えによる切断の修復の鋳型として使用され、ドナーのヌクレオチド配列のすべてまたは部分の細胞クロマチンへの導入をもたらす。したがって、細胞クロマチンの第１の配列は変更され、ある特定の実施形態では、ドナーポリヌクレオチドに存在する配列に変換される。したがって、用語「置換する」または「置換」の使用は、１つのヌクレオチド配列の別のヌクレオチド配列による置換（すなわち、情報センスの配列の置換）を表すと理解することができ、１つのポリヌクレオチドの別のポリヌクレオチドによる物理的または化学的置換を必ずしも必要としない。
本明細書に記載される方法のいずれにおいても、細胞内の追加の標的部位の追加の二本鎖切断のために、ジンクフィンガーまたはＴＡＬＥＮタンパク質の追加の対を使用することができる。
細胞クロマチンの目的の領域内における配列の標的化組換えおよび／または置換および／または変更のための方法のある特定の実施形態では、染色体配列は、外来「ドナー」ヌクレオチド配列による相同組換えによって変更される。そのような相同組換えは、切断領域に相同な配列が存在する場合、細胞クロマチンにおける二本鎖切断の存在によって刺激される。
本明細書に記載される方法のいずれにおいても、第１のヌクレオチド配列（「ドナー配列」）は、目的の領域内のゲノム配列に相同であるが、同一ではない配列を含有し、それによって、相同組換えが非同一配列を目的の領域に挿入することを刺激し得る。したがって、ある特定の実施形態では、目的の領域内の配列に相同なドナー配列の部分は、置換されるゲノム配列との約８０～９９％（またはその間の任意の整数）の配列同一性を示す。他の実施形態では、例えば、１ヌクレオチドのみが、ドナーと１００個超の連続塩基対のゲノム配列との間で異なる場合、ドナーとゲノム配列との間の相同性は、９９％よりも高い。ある特定の場合、新しい配列が目的の領域に導入されるように、ドナー配列の非相同部分は、目的の領域には存在しない配列を含有し得る。これらの場合、非相同配列には、一般に、目的の領域内の配列に相同または同一の、５０～１，０００塩基対（またはその間の任意の整数値）、または１，０００個超の任意の数の塩基対の配列が両側に隣接している。他の実施形態では、ドナー配列は、第１の配列に非相同であり、非相同組換え機構によってゲノムに挿入される。
本明細書に記載される方法のいずれも、目的の遺伝子の発現を破壊するドナー配列の標的化された統合による、細胞における１つまたはそれ以上の標的配列の部分的または完全な不活性化のために使用することができる。また、部分的または完全に不活性化された遺伝子を有する細胞株が提供される。
さらに、また、本明細書に記載される標的化された統合の方法は、１つまたはそれ以上の外来配列を統合するために使用することができる。外来核酸配列は、例えば、１つもしくはそれ以上の遺伝子もしくはｃＤＮＡ分子、または任意の種類のコードもしくは非コード配列、および１つまたはそれ以上の制御エレメント（例えば、プロモーター）を含み得る。加えて、外来核酸配列は、１つまたはそれ以上のＲＮＡ分子（例えば、低分子ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ：ｓｍａｌｌ ｈａｉｒｐｉｎ ＲＮＡ）、阻害性ＲＮＡ（ＲＮＡｉ：ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ ＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ：ｍｉｃｒｏＲＮＡ）など）を産生し得る。
「切断」とは、ＤＮＡ分子の共有骨格の切断を指す。切断は、非限定的に、ホスホジエステル結合の酵素加水分解または化学加水分解を含む、様々な方法によって開始することができる。一本鎖切断および二本鎖切断の両方が可能であり、二本鎖切断は、２つの別個の一本鎖切断事象の結果として起こってもよい。ＤＮＡ切断は、平滑末端または付着末端のいずれかの産生をもたらし得る。ある特定の実施形態では、融合ポリペプチドは、標的化された二本鎖ＤＮＡ切断のために使用される。
「切断ハーフドメイン」は、第２のポリペプチド（同一または異なる）と共に、切断活性（好ましくは二本鎖切断活性）を有する複合体を形成するポリペプチド配列である。用語「第１および第２の切断ハーフドメイン」；「＋および－切断ハーフドメイン」および「右および左切断ハーフドメイン」は、互換的に使用されて、二量体化する切断ハーフドメインの対を指す。
「操作された切断ハーフドメイン」は、別の切断ハーフドメイン（例えば、別の操作された切断ハーフドメイン）と偏性ヘテロ二量体を形成するように改変されている切断ハーフドメインである。それらの全体を参照によって本明細書に組み入れる、米国特許第７，８８８，１２１号；同第７，９１４，７９６号；同第８，０３４，５９８号；および同第８，８２３，６１８号を参照。
用語「配列」は、ＤＮＡまたはＲＮＡであってもよく；直鎖状、環状または分枝鎖状であってもよく、一本鎖または二本鎖のいずれかであり得る、任意の長さのヌクレオチド配列を指す。用語「ドナー配列」は、ゲノムに挿入されるヌクレオチド配列を指す。ドナー配列は、任意の長さ、例えば、２～１０，０００ヌクレオチド（またはその間もしくはそれ以上の任意の整数値）の長さ、好ましくは約１００～１，０００ヌクレオチド（またはその間の任意の整数）の長さ、より好ましくは約２００～５００ヌクレオチドの長さの配列であってもよい。
「疾患関連遺伝子」は、一遺伝子性疾患において一部の様式で欠陥のある遺伝子である。一遺伝子性疾患の非限定的な例には、重症複合免疫不全症、嚢胞性線維症、リソソーム蓄積症（例えば、ゴーシェ病、ハーラー病、ハンター病、ファブリー病、ニーマン・ピック、テイ・サックス病など）、鎌状赤血球貧血およびサラセミアが含まれる。
「血液脳関門」は、中枢神経系において脳から循環血を分離する高選択的透過性障壁である。血液脳関門は、血液溶質の通過を制限する、ＣＮＳ脈管内のタイトジャンクションによって接続される脳内皮細胞によって形成される。血液脳関門は、高分子治療薬の取り込みを妨げ、ほとんどの低分子治療薬の取り込みを妨げると長い間考えられてきた（Ｐａｒｄｒｉｄｇｅ（２００５）ＮｅｕｒｏＲｘ ２（１）：３～１４頁）。
「クロマチン」は、細胞ゲノムを含むヌクレオプロテイン構造である。細胞クロマチンは、核酸、主としてＤＮＡ、ならびにヒストンおよび非ヒストン染色体タンパク質を含むタンパク質を含む。大部分の真核細胞クロマチンは、ヌクレオソームの形態で存在し、ヌクレオソームコアは、ヒストンＨ２Ａ、Ｈ２Ｂ、Ｈ３およびＨ４を各２つ含む八量体を伴う約１５０塩基対のＤＮＡを含み；リンカーＤＮＡ（生物によって様々な長さ）がヌクレオソームコア間に伸びている。ヒストンＨ１の分子は、一般にリンカーＤＮＡを伴う。本開示の目的のために、用語「クロマチン」は、原核細胞および真核細胞両方の、すべての種類の細胞ヌクレオプロテインを包含することを意味する。細胞クロマチンは、染色体クロマチンおよびエピソームクロマチンの両方を含む。
「染色体」は、細胞のゲノムのすべてまたは部分を含むクロマチン複合体である。細胞のゲノムは、多くの場合、細胞のゲノムを含むすべての染色体の収集物であるその核型によって特徴付けられる。細胞のゲノムは、１つまたはそれ以上の染色体を含み得る。
「エピソーム」は、細胞の染色体核型の部分ではない核酸を含む、複製核酸、ヌクレオプロテイン複合体または他の構造である。エピソームの例には、プラスミドおよびある特定のウイルスゲノムが含まれる。
「標的部位」または「標的配列」は、結合に十分な条件が存在すれば、結合分子が結合する、核酸の一部を規定する核酸配列である。
「外来」分子は、通常、細胞内に存在しないが、１つまたはそれ以上の遺伝的方法、生化学的方法または他の方法によって細胞に導入することができる分子である。「細胞内の正常な存在」は、細胞の特定の発達段階および環境条件について決定される。したがって、例えば、胚の筋肉発達中にのみ存在する分子は、成人筋肉細胞については外来分子である。同様に、ヒートショックによって誘導される分子は、ヒートショックを受けていない細胞については外来分子である。外来分子は、例えば、機能不全内在分子の機能型、または正常機能内在分子の機能不全型を含み得る。
外来分子は、他の分子の中でも、コンビナトリアルケミストリープロセスによって生成されるような低分子、またはタンパク質、核酸、炭水化物、脂質、糖タンパク質、リポタンパク質、多糖のような高分子、上記分子の任意の改変誘導体、または上記分子のうちの１つもしくはそれ以上を含む任意の複合体であり得る。核酸は、ＤＮＡおよびＲＮＡを含み、一本鎖または二本鎖であってもよく；直鎖状、分枝鎖状または環状であってもよく；任意の長さの核酸であってもよい。核酸は、二重鎖（ｄｕｐｌｅｘ）を形成することができる核酸、および三重鎖形成核酸を含む。例えば、米国特許第５，１７６，９９６号および同第５，４２２，２５１号を参照。タンパク質には、ＤＮＡ結合タンパク質、転写因子、クロマチンリモデリング因子、メチル化ＤＮＡ結合タンパク質、ポリメラーゼ、メチラーゼ、デメチラーゼ、アセチラーゼ、デアセチラーゼ、キナーゼ、ホスファターゼ、インテグラーゼ、リコンビナーゼ、リガーゼ、トポイソメラーゼ、ギラーゼおよびヘリカーゼが含まれるが、これらに限定されない。
外来分子は、内在分子と同じ種類の分子、例えば、外来タンパク質または核酸であってもよい。例えば、外来核酸は、通常、細胞内に存在しない、細胞または染色体に導入された感染性ウイルスゲノム、プラスミドまたはエピソームを含み得る。外来分子の細胞への導入のための方法は、当業者に公知であり、脂質媒介移行（すなわち、中性脂質およびカチオン性脂質を含むリポソーム）、エレクトロポレーション、直接注入、細胞融合、微粒子銃、リン酸カルシウム共沈殿、ＤＥＡＥ－デキストラン媒介移行およびウイルスベクター媒介移行を含むが、これらに限定されない。また、外来分子は、内在分子と同じ種類の分子であるが、細胞が由来する種とは異なる種に由来する分子であってもよい。例えば、ヒト核酸配列を、マウスまたはハムスターに元々由来する細胞株に導入してもよい。
対照的に、「内在」分子は、特定の環境条件下で特定の発達段階の特定の細胞において通常存在する分子である。例えば、内在核酸は、染色体、ミトコンドリア、葉緑体もしくは他の細胞小器官のゲノム、または天然に存在するエピソーム核酸を含み得る。追加の内在分子は、タンパク質、例えば、転写因子および酵素を含み得る。
「融合」分子は、２つ以上のサブユニット分子が、結合、好ましくは共有結合している分子である。サブユニット分子は、同じ化学種の分子であってもよく、異なる化学種の分子であってもよい。融合分子の例には、融合タンパク質（例えば、タンパク質ＤＮＡ結合ドメインと切断ドメインとの間の融合）、切断ドメインと作用可能に連合するポリヌクレオチドＤＮＡ結合ドメイン（例えば、ｓｇＲＮＡ）間の融合、および融合核酸（例えば、融合タンパク質をコードする核酸）が含まれるが、これらに限定されない。
細胞における融合タンパク質の発現は、融合タンパク質の細胞への送達から、または融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドの細胞への送達（ポリヌクレオチドが転写され、転写物は翻訳されて、融合タンパク質を生成する）によって得ることができる。また、トランススプライシング、ポリペプチド切断およびポリペプチドライゲーションは、細胞におけるタンパク質の発現に関与することがある。細胞へのポリヌクレオチドおよびポリペプチド送達のための方法は、本開示の別の箇所で示されている。
本開示の目的のための「遺伝子」には、遺伝子産生物をコードするＤＮＡ領域（以下を参照）、および遺伝子産生物の産生を調節するすべてのＤＮＡ領域（そのような調節配列が、コード配列および／または転写される配列に隣接するか否かにかかわらず）が含まれる。したがって、遺伝子には、プロモーター配列、ターミネーター、リボソーム結合部位および配列内リボソーム進入部位のような翻訳調節配列、エンハンサー、サイレンサー、インシュレーター、境界エレメント、複製起点、マトリックス付着部位ならびに遺伝子座制御領域が含まれるが、必ずしもこれらに限定されない。
「遺伝子発現」とは、遺伝子に含有される情報の、遺伝子産生物への変換を指す。遺伝子産生物は、遺伝子の直接転写産生物（例えば、ｍＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｒＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、リボザイム、構造ＲＮＡまたは他の任意の種類のＲＮＡ）、またはｍＲＮＡの翻訳によって産生されるタンパク質であり得る。また、遺伝子産生物は、キャップ形成、ポリアデニル化、メチル化および編集などのプロセスによって改変されるＲＮＡ、ならびに例えば、メチル化、アセチル化、リン酸化、ユビキチン化、ＡＤＰリボシル化、ミリスチル化およびグリコシル化によって改変されるタンパク質を含む。
遺伝子発現の「モジュレーション」とは、遺伝子の活性の変化を指す。発現のモジュレーションは、遺伝子活性化および遺伝子抑制を含み得るが、これらに限定されない。ゲノム編集（例えば、切断、変更、不活性化、ランダム変異）は、発現をモジュレートするために使用することができる。遺伝子不活性化とは、本明細書に記載されるＺＦＰまたはＴＡＬＥＮを含まない細胞と比較した、遺伝子発現における任意の低減を指す。したがって、遺伝子不活性化は、部分的であっても、完全であってもよい。
「目的の領域」とは、外来分子に結合することが望ましい、例えば、遺伝子、または遺伝子内のもしくは遺伝子に隣接する非コード配列のような細胞クロマチンの任意の領域である。結合は、標的化したＤＮＡ切断および／または標的化した組換えの目的のためであり得る。目的の領域は、例えば、染色体、エピソーム、細胞内小器官ゲノム（例えば、ミトコンドリアゲノム、葉緑体ゲノム）または感染性ウイルスゲノムに存在し得る。目的の領域はコード領域の上流または下流いずれかの、遺伝子のコード領域内、例えば、リーダー配列、トレイラー配列もしくはイントロンなどの転写される非コード領域内、または非転写領域内であり得る。目的の領域は、単一のヌクレオチド対のように小さくてもよく、最大で２，０００ヌクレオチド対の長さであってもよく、または任意の整数値のヌクレオチド対であってもよい。
「真核」細胞には、真菌細胞（酵母のような）、植物細胞、動物細胞、哺乳動物細胞およびヒト細胞（例えば、幹細胞または前駆細胞）が含まれるが、これらに限定されない。用語「幹細胞」または「前駆細胞」は、非限定的に、造血始原幹細胞（ＨＰＳＣ）または造血幹細胞／前駆細胞（ＨＳＣ／ＰＣ）とも呼ばれる、造血幹細胞を含む、万能性および多能性幹細胞を指す。
「赤血球」（ＲＢＣ）または赤血球（ｅｒｙｔｈｒｏｃｙｔｅ）は、造血幹細胞に由来する高分化型細胞である。それらは、ヌクレアーゼおよびほとんどの細胞小器官を欠いている。ＲＢＣは、肺から末梢組織へ酸素を運搬するためのヘモグロビンを含有する。実際に、個々のＲＢＣの３３％は、ヘモグロビンである。また、それらは、代謝中に細胞によって産生されたＣＯ２を組織から肺へ運搬し戻し、呼息中に放出させる。ＲＢＣは、腎臓によるエリスロポエチン（ＥＰＯ：ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｉｅｔｉｎ）の放出によって媒介される血液低酸素状態に応答して骨髄において産生される。ＥＰＯは、前赤芽球の数の増大をもたらし、完全ＲＢＣ成熟に必要とされる時間を短縮する。約１２０日後、ＲＢＣは、核または他の任意の再生能力を含有しないので、細胞は、肝臓、脾臓およびリンパ節におけるマクロファージの食作用活性によって（約９０％）、または血漿中の溶血によって（約１０％）、循環から除去される。マクロファージ貪食後、ＲＢＣの化学成分は、リソソーム酵素の作用のためにマクロファージの液胞内で破壊される。
「分泌組織」は、産生物を、個々の細胞から、典型的に上皮に由来するいくつかの種類の内腔に分泌する、動物における組織である。消化管に局在化する分泌組織の例には、腸、膵臓および胆嚢を裏打ちする細胞が含まれる。他の分泌組織は、唾液腺、乳腺、前立腺、脳下垂体のような肝臓、眼および粘膜に関連する組織、ならびに内分泌系の他のメンバーを含む。加えて、分泌組織には、分泌することができる組織種の個々の細胞が含まれる。
用語「作用可能な連結」および「作用可能に連結された」（または「作動可能に連結された」）は、２つ以上の成分（配列エレメントのような）の並置について互換的に使用され、ここで、両方の成分が正常に機能し、かつ成分のうちの少なくとも１つが、他の成分のうちの少なくとも１つに対して発揮される機能を媒介し得る可能性を許容するように、成分が配置される。例示のために、転写調節配列が、１つまたはそれ以上の転写調節因子の存在または非存在に応答して、コード配列の転写レベルを制御する場合、プロモーターのような転写調節配列は、コード配列に作用可能に連結されている。転写調節配列は、一般に、コード配列とシスで作用可能に連結されているが、それに直接隣接している必要はない。例えば、エンハンサーは、たとえエンハンサーおよびコード配列が連続していなくても、コード配列に作用可能に連結された転写調節配列である。
融合ポリペプチドについて、用語「作用可能に連結された」は、成分の各々が、それが他の成分と連結していない場合に機能するのと同じ機能を、他の成分と連結して行うという事実を指し得る。例えば、ＺＦＰまたはＴＡＬＥ ＤＮＡ結合ドメインが活性化ドメインに融合されている融合ポリペプチドについて、融合ポリペプチドにおいて、ＺＦＰまたはＴＡＬＥ ＤＮＡ結合ドメイン部分がその標的部位および／またはその結合部位に結合することができ、一方で、活性化ドメインが、遺伝子発現をアップレギュレートすることができる場合、ＺＦＰまたはＴＡＬＥ ＤＮＡ結合ドメインおよび活性化ドメインは、作用可能な連結で存在している。ＺＦＰまたはＴＡＬＥ ＤＮＡ結合ドメインが切断ドメインに融合されている融合ポリペプチドの場合、融合ポリペプチドにおいて、ＺＦＰまたはＴＡＬＥ ＤＮＡ結合ドメイン部分がその標的部位および／またはその結合部位に結合することができ、一方で、切断ドメインが、標的部位の近傍のＤＮＡを切断することができる場合、ＺＦＰまたはＴＡＬＥ ＤＮＡ結合ドメインおよび切断ドメインは、作用可能な連結で存在している。
「機能的」タンパク質、ポリペプチドまたは核酸は、野生型タンパク質、ポリペプチドまたは核酸と同じ機能を提供する任意のタンパク質、ポリペプチドまたは核酸を含む。タンパク質、ポリペプチドまたは核酸の「機能的断片」は、配列が全長タンパク質、ポリペプチドまたは核酸と同一ではないが、それでも全長タンパク質、ポリペプチドまたは核酸と同じ機能を保持しているタンパク質、ポリペプチドまたは核酸である。機能的断片は、対応するネイティブ分子よりも多い、少ない、もしくは同じ数の残基を有する場合、および／または１つもしくはそれ以上のアミノ酸もしくはヌクレオチド置換を含有する場合がある。核酸の機能（例えば、コード機能、別の核酸にハイブリダイズする能力）を決定するための方法は、当技術分野において周知である。同様に、タンパク質の機能を決定するための方法は、周知である。例えば、ポリペプチドのＤＮＡ結合機能は、例えば、フィルター結合、電気泳動移動度シフトまたは免疫沈降アッセイによって決定することができる。ＤＮＡ切断は、ゲル電気泳動によってアッセイすることができる。Ａｕｓｕｂｅｌら（上記）を参照。タンパク質の、別のタンパク質と相互作用する能力は、例えば、免疫共沈降、ツーハイブリッドアッセイ、または遺伝的および生化学的両方の相補性によって決定することができる。例えば、Ｆｉｅｌｄｓら、（１９８９）Ｎａｔｕｒｅ ３４０：２４５～２４６頁；米国特許第５，５８５，２４５号および国際特許公開第９８／４４３５０号を参照。
「ベクター」は、遺伝子配列を標的細胞に移行することができる。典型的に、「ベクター構築物」、「発現ベクター」および「遺伝子移行ベクター」とは、目的の遺伝子の発現を方向付けることができ、かつ遺伝子配列を標的細胞に移行することができる任意の核酸構築物を意味する。したがって、この用語は、クローニング媒体および発現媒体、ならびに組込みベクターを含む。
「レポーター遺伝子」または「レポーター配列」とは、好ましくは、必ずしもルーチンアッセイにおいてではないが、容易に測定されるタンパク質産生物を産生する任意の配列を指す。好適なレポーター遺伝子には、抗生物質抵抗性（例えば、アンピシリン抵抗性、ネオマイシン抵抗性、Ｇ４１８抵抗性、ピューロマイシン抵抗性）を媒介するタンパク質をコードする配列、染色または蛍光または発光タンパク質（例えば、緑色蛍光タンパク質、高感度緑色蛍光タンパク質、赤色蛍光タンパク質、ルシフェラーゼ）をコードする配列、ならびに細胞増殖および／または遺伝子増幅の向上を媒介するタンパク質（例えば、ジヒドロ葉酸レダクターゼ）が含まれるが、これらに限定されない。エピトープタグは、例えば、ＦＬＡＧ、Ｈｉｓ、ｍｙｃ、Ｔａｐ、ＨＡまたは任意の検出可能なアミノ酸配列のうちの１つまたはそれ以上の複製物を含む。「発現タグ」は、目的の遺伝子の発現をモニタリングするために所望の遺伝子配列に作動可能に連結されたレポーターをコードする配列を含む。
用語「対象」および「患者」は、互換的に使用され、ヒト対象および非ヒト霊長類のような哺乳動物、ならびにウサギ、イヌ、ネコ、ラット、マウスおよび他の動物のような実験動物を指す。したがって、用語「対象」または「患者」は、本明細書で使用される場合、本発明の変更された細胞および／または本発明の変更された細胞によって産生されたタンパク質を投与することができる任意の哺乳動物対象または患者を意味する。本発明の対象は、β－サラセミア障害を有する対象を含む。
一般に、その対象または対象は、β－サラセミアの治療に適格である。本明細書の目的のために、そのような適格な対象または対象は、β－サラセミアの１つまたはそれ以上の徴候、症状または他の指標を経験しているか、経験したか、または経験しそうな対象；β－サラセミアと診断された対象（例えば、新しく診断された対象および／またはβ－サラセミアを発症するリスクにある対象のいずれも）である。β－サラセミアを患うか、またはβ－サラセミアを患うリスクにある人は、場合により、血液または血漿中の異常に低いヘモグロビンのレベルについてスクリーニングされた人として特定することができる。
本明細書で使用される場合、「治療」または「治療すること」とは、臨床結果を含む有益な結果または所望の結果を得るための手法である。本発明の目的のために、有益な臨床結果または所望の臨床結果は、以下のもののうちの１つまたはそれ以上を含むが、これらに限定されない：疾患から生ずる１つもしくはそれ以上の症状を減少させること、疾患の程度を縮小すること、疾患を安定化すること（例えば、疾患の悪化を予防または遅延すること）、疾患の進行を遅延もしくは減速すること、疾患状態を改善すること、疾患を治療するために必要な１つもしくはそれ以上の他の薬物治療の用量を減少させること、および／またはクオリティ・オブ・ライフを増大させること。
本明細書で使用される場合、β－サラセミアの進行を「遅延」または「減速」することとは、疾患の発症を予防、日延べ、妨害、減速、阻止、安定化および／または延期することを意味する。この遅延は、病歴および／または治療される個体によって、様々な時間の長さであり得る。
本明細書で使用される場合、「治療開始時」とは、本発明の組成物のようなβ－サラセミア治療組成物への第１の曝露時またはその前の期間を指す。一部の実施形態では、「治療開始時」は、β－サラセミア薬のおよそ、１年、９カ月、６カ月、３カ月、２カ月または１カ月前のいずれかである。一部の実施形態では、「治療開始時」は、β－サラセミア治療組成物への第１の曝露と同時の直前である。
本明細書で使用される場合、「に基づく」とは、（１）本明細書に記載される対象特徴を評定、決定または測定すること（および好ましくは、治療を受容するのに好適な対象を選択すること）；および（２）本明細書に記載される治療を投与することを含む。
β－サラセミアの「症状」は、対象によって経験され、β－サラセミアを示す、構造、機能または感覚における任意の現象または正常からの逸脱である。
「輸血依存性β－サラセミア」（ＴＤＴ）対象は、９～１０ｇ／ｄＬ超のヘモグロビンレベルを維持するために、ＰＲＢＣおよび他の血液製剤の定期的な輸注（輸血）を必要とする。ＴＤＴは、重度の貧血、生涯の輸血依存、避けがたい鉄過剰、重篤な併存症および一般集団と比較して短い寿命によって特徴付けられる重度の進行型β－サラセミアである。ＴＤＴを有する患者は、貧血を軽減し、生存を可能にするために、生涯の支持療法および定期的な血液輸血（典型的に、２～５週毎に与えられる）を必要とする。血液輸血についての必要性を低減または除去するレベルを含む、治療レベルは、２～１０ｇ／ｄＬ超またはそれよりも多くてもよく（２、３、５、６、７、８、９、１０ｇ／ｄＬまたはそれよりも多い量を含む）、場合により、輸血からの独立のために少なくとも約５～７ｇ／ｄＬまたはそれよりも多くてもよい。
慢性的な輸血は、避けがたい鉄過剰を引き起こし、それは、生命維持に重要な器官への顕著な損傷をもたらし得る。それゆえ、ＴＤＴを有する患者は、鉄負荷の持続的かつ厳密なモニタリングを必要とし、過剰な鉄を除去する薬物を定期的に摂取しなければならない（鉄キレート化と呼ばれるプロセス）。
用語「支持手術」は、疾患に関連し得る症状を軽減するために対象に行ってもよい手術手技を指す。
用語「免疫抑制剤」は、補助治療について本明細書で使用される場合、本明細書で治療される哺乳動物の免疫系を抑制または遮蔽するように作用する物質を指す。これは、サイトカイン産生を抑制するか、自己抗原発現をダウンレギュレートもしくは抑制するか、またはＭＨＣ抗原を遮蔽する物質を含み得る。そのような剤の例には、２－アミノ－６－アリル－５－置換ピリミジン（米国特許第４，６６５，０７７号を参照）；非ステロイド抗炎症薬（ＮＳＡＩＤＵＡ）；ガンシクロビル、タクロリムス、コルチゾールまたはアルドステロンのようなグルココルチコイド、シクロオキシゲナーゼ阻害剤のような抗炎症剤、５－リポキシゲナーゼ阻害剤またはロイコトリエン受容体アンタゴニスト；アザチオプリンまたはミコフェノール酸モフェチル（ＭＭＦ：ｍｙｃｏｐｈｅｎｏｌａｔｅ ｍｏｆｅｔｉｌ）のようなプリンアンタゴニスト；シクロホスファミドのようなアルキル化剤；ブロモクリプチン；ダナゾール；ダプソン；グルタルアルデヒド（米国特許第４，１２０，６４９号に記載されるようにＭＨＣ抗原を遮蔽する）；ＭＨＣ抗原およびＭＨＣ断片についての抗イディオタイプ抗体；シクロスポリンＡ；コルチコステロイドまたはグルココルチコステロイドまたはグルココルチコイドアナログ、例えば、プレドニゾン、メチルプレドニゾロンおよびデキサメタゾンのようなステロイド；メトトレキセート（経口または皮下）のようなジヒドロ葉酸レダクターゼ阻害剤、；ヒドロキシクロロキン；スルファサラジン；レフルノミド；サイトカインまたはサイトカイン受容体アンタゴニスト（抗インターフェロン－アルファ、－ベータ、または－ガンマ抗体、抗腫瘍壊死因子－アルファ抗体（インフリキシマブまたはアダリムマブ）、抗ＴＮＦ－アルファイムノアドヘシン（エタネルセプト）、抗腫瘍壊死因子－ベータ抗体、抗インターロイキン－２抗体および抗ＩＬ－２受容体抗体を含む）；抗ＬＦＡ－１抗体（抗ＣＤ１１ａおよび抗ＣＤ１８抗体を含む）；抗Ｌ３Ｔ４抗体；異種抗リンパ球グロブリン；汎Ｔ細胞抗体、好ましくは抗ＣＤ３または抗ＣＤ４／ＣＤ４ａ抗体；ＬＦＡ－３結合ドメインを含有する可溶性ペプチド（９０年７月２６日公開の国際特許公開第９０／０８１８７号）；ストレプトキナーゼ；ＴＧＦ－ベータ；ストレプトドルナーゼ；宿主からのＲＮＡまたはＤＮＡ；ＦＫ５０６；ＲＳ－６１４４３；デオキシスペルグアリン；ラパマイシン；Ｔ細胞受容体（Ｃｏｈｅｎら、米国特許第５，１１４，７２１号）；Ｔ細胞受容体断片（Ｏｆｆｎｅｒら、（１９９１）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５１：４３０～４３２頁；国際特許公開第９０／１１２９４号；Ｊａｎｅｗａｙ（１９８９）Ｎａｔｕｒｅ ３４１：４８２；および国際特許公開第９１／０１１３３号）；ならびにＴ１０Ｂ９のようなＴ細胞受容体抗体が含まれる。
「コルチコステロイド」とは、天然に存在するコルチコステロイドの効果を模倣または増強する、ステロイドの一般化学構造を有するいくつかの合成または天然に存在する物質のうちのいずれか１つを指す。合成コルチコステロイドの例には、プレドニゾン、プレドニゾロン（メチルプレドニゾロンを含む）、デキサメタゾン、グルココルチコイドおよびベタメタゾンが含まれる。
「鉄キレート化」は、過剰な鉄を身体から除去する種類の治療である。輸血において与えられた血液の各単位は、約２５０ミリグラムの鉄を含み、身体は、皮膚および発汗において失われる少量（約１ｍｇ）を除いては、それを排出することができない。過剰な鉄は、下垂体前葉、心臓、肝臓、膵臓および関節のような生命維持に重要な器官の組織において捕捉される。鉄が毒性レベルに達した場合、損傷は、糖尿病、硬変、変形性関節症、心発作およびホルモンの不均衡のような疾患をもたらす場合がある。甲状腺機能低下症、性腺機能低下症、不妊、インポテンスおよび生殖不能は、これらのホルモンの不均衡から生じ得る。これに対処しない場合、過剰な鉄は、完全な臓器不全および死亡をもたらし得る。鉄の低減は、デスフェリオキサミン（商標名デスフェラール（Ｄｅｓｆｅｒａｌ）またはジャドニュ（Ｊａｄｅｎｕ）（登録商標））またはデフェラシロクス、商標名エクジェイド（Ｅｘｊａｄｅ）（登録商標）のような鉄キレート剤による薬理学的な鉄の除去であるキレート療法によって達成される。
「添付文書」は、治療製品の商品包装に慣例上含まれる使用説明書を指すために使用され、それは、適応症、使用法、投与量、投与法、禁忌、包装されている製品と組み合わせる他の治療製品、および／またはそのような治療製品の使用に関する警告などについての情報を含有する。
「ラベル」は、バイアルなどの容器および添付文書を含む医薬製剤の商品包装、ならびに他の種類の包装に慣例上含まれる情報を指すために本明細書で使用される。
本明細書に記載される様々な実施形態の特性の１つ、一部またはすべてを組み合わせて、本発明の他の実施形態を形成することができることが理解されるべきである。本発明のこれらおよび他の態様は、当業者に明らかである。
ヌクレアーゼ
本明細書に記載される方法は、ＢＣＬ１１Ａ赤血球エンハンサー（erythroid enhancer）の標的化ノックアウトのために１つまたはそれ以上のヌクレアーゼを利用できる。ヌクレアーゼの非限定的例として、ＺＦＮ、ＴＡＬＥＮ、ホーミングエンドヌクレアーゼ、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓおよび／またはＴｔａｇｏガイドＲＮＡが挙げられ、導入遺伝子がゲノム中に標的化様式で組み込まれるように、導入遺伝子および細胞のゲノムの切断ためのヌクレアーゼを保有しているドナー分子のｉｎ ｖｉｖｏ切断のために有用である。例えば、米国特許第１０，４３５，６７７号；同第１０，０７２，０６６号；同第９，９５７，５０１号；同第９，９６３，７１５号；同第９，６５０，６４８号；ならびに米国特許出願公開第２０１９／０１７７７０９号；同第２０１８／０１１１９７５号および動第２０１５／０１３２２６９号を参照。ある特定の実施形態では、ヌクレアーゼのうちの１つまたはそれ以上は、天然に存在する。他の実施形態では、ヌクレアーゼのうちの１つまたはそれ以上は、天然に存在しない、すなわち、ＤＮＡ結合分子（ＤＮＡ結合ドメインとも称される）および／または切断ドメインにおいて操作されている。例えば、天然に存在するヌクレアーゼのＤＮＡ結合ドメインは、選択された標的部位（例えば、ＺＦＰ、ＴＡＬＥおよび／または選択された標的部位に結合するように操作されているＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓのｓｇＲＮＡ）に結合するように変更できる。他の実施形態では、ヌクレアーゼは、異種性ＤＮＡ結合および切断ドメイン（例えば、ジンクフィンガーヌクレアーゼ；ＴＡＬ－エフェクタードメインＤＮＡ結合タンパク質；異種性切断ドメインを有するメガヌクレアーゼＤＮＡ結合ドメイン）を含む。他の実施形態では、ヌクレアーゼは、ＴｔａｇｏシステムのＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓなどのシステムを含む。
Ａ．ＤＮＡ結合ドメイン
ある特定の実施形態では、本明細書に記載される組成物および方法は、ドナー分子への結合および／または細胞のゲノム中の目的の領域への結合のためにメガヌクレアーゼ（ホーミングエンドヌクレアーゼ）ＤＮＡ結合ドメインを用いる。天然に存在するメガヌクレアーゼは、１５～４０塩基対切断部位を認識し、一般に４つのファミリーに分類される：ＬＡＧＬＩＤＡＤＧファミリー（配列番号１７）、ＧＩＹ－ＹＩＧファミリー、Ｈｉｓ－ＣｙｓｔボックスファミリーおよびＨＮＨファミリー。例示的なホーミングエンドヌクレアーゼとして、Ｉ－ＳｃｅＩ、Ｉ－ＣｅｕＩ、ＰＩ－ＰｓｐＩ、ＰＩ－Ｓｃｅ、Ｉ－ＳｃｅＩＶ、Ｉ－ＣｓｍＩ、Ｉ－ＰａｎＩ、Ｉ－ＳｃｅＩＩ、Ｉ－ＰｐｏＩ、Ｉ－ＳｃｅＩＩＩ、Ｉ－ＣｒｅＩ、Ｉ－ＴｅｖＩ、Ｉ－ＴｅｖＩＩおよびＩ－ＴｅｖＩＩＩが挙げられる。これらの認識配列は公知である。米国特許第５，４２０，０３２号；米国特許第６，８３３，２５２号；Ｂｅｌｆｏｒｔら、（１９９７）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５：３３７９～３３８８頁；Ｄｕｊｏｎら、（１９８９）Ｇｅｎｅ ８２：１１５～１１８頁；Ｐｅｒｌｅｒら、（１９９４）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２２：１１２５～１１２７頁；Ｊａｓｉｎ（１９９６）Ｔｒｅｎｄｓ Ｇｅｎｅｔ．１２：２２４～２２８頁；Ｇｉｍｂｌｅら、（１９９６）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２６３：１６３～１８０頁；Ａｒｇａｓｔら、（１９９８）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２８０：３４５～３５３頁およびｔｈｅ Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓカタログも参照。
ある特定の実施形態では、本明細書に記載される方法および組成物は、操作された（天然に存在しない）ホーミングエンドヌクレアーゼ（メガヌクレアーゼ）を含むヌクレアーゼを利用する。Ｉ－ＳｃｅＩ、Ｉ－ＣｅｕＩ、ＰＩ－ＰｓｐＩ、ＰＩ－Ｓｃｅ、Ｉ－ＳｃｅＩＶ、Ｉ－ＣｓｍＩ、Ｉ－ＰａｎＩ、Ｉ－ＳｃｅＩＩ、Ｉ－ＰｐｏＩ、Ｉ－ＳｃｅＩＩＩ、Ｉ－ＣｒｅＩ、Ｉ－ＴｅｖＩ、Ｉ－ＴｅｖＩＩおよびＩ－ＴｅｖＩＩＩなどのホーミングエンドヌクレアーゼおよび、メガヌクレアーゼの認識配列は、公知である。米国特許第５，４２０，０３２号；米国特許第６，８３３，２５２号；Ｂｅｌｆｏｒｔら、（１９９７）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５：３３７９～３３８８頁；Ｄｕｊｏｎら、（１９８９）Ｇｅｎｅ ８２：１１５～１１８頁；Ｐｅｒｌｅｒら、（１９９４）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２２：１１２５ １１２７頁；Ｊａｓｉｎ（１９９６）Ｔｒｅｎｄｓ Ｇｅｎｅｔ．１２：２２４～２２８頁；Ｇｉｍｂｌｅら、（１９９６）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２６３：１６３～１８０頁；Ａｒｇａｓｔら、（１９９８）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２８０：３４５～３５３頁およびｔｈｅ Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓカタログも参照。加えてホーミングエンドヌクレアーゼおよびメガヌクレアーゼのＤＮＡ結合特異性は、非天然標的部位に結合するように操作することができる。例えば、Ｃｈｅｖａｌｉｅｒら、（２００２）Ｍｏｌｅｃ．Ｃｅｌｌ １０：８９５～９０５頁；Ｅｐｉｎａｔら、（２００３）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．３１：２９５２～２９６２頁；Ａｓｈｗｏｒｔｈら、（２００６）Ｎａｔｕｒｅ ４４１：６５６～６５９頁；Ｐａｑｕｅｓら、（２００７）Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ７：４９～６６頁；米国特許出願公開第２００７／０１１７１２８号を参照。ホーミングエンドヌクレアーゼおよびメガヌクレアーゼのＤＮＡ結合ドメインは、全体としてのヌクレアーゼの文脈で変更される（すなわち、ヌクレアーゼが同族切断ドメインを含むように）、または異種性切断ドメインに融合される。
他の実施形態では、本明細書に記載される方法および組成物において使用されるヌクレアーゼのうちの１つまたはそれ以上のＤＮＡ結合ドメインは、天然に存在するまたは操作された（天然に存在しない）ＴＡＬエフェクターＤＮＡ結合ドメインを含む。例えば、本明細書にその全体を参照によって組み入れる米国特許第８，５８６，５２６号を参照。ザントモナス属の植物病原性細菌は、重要な作物において多数の病気を引き起こすことが公知である。ザントモナス属の病原性は、２５個を超える異なるエフェクタータンパク質を植物細胞に注入する保存されたＩＩＩ型分泌（Ｔ３Ｓ）系に依存する。これらの内、注入されるタンパク質は、植物転写活性化因子を模倣し、植物トランスクリプトームをマニピュレートする転写活性化因子様（ＴＡＬ）エフェクターである（Ｋａｙら、（２００７）Ｓｃｉｅｎｃｅ ３１８：６４８～６５１頁を参照）。これらのタンパク質は、ＤＮＡ結合ドメインおよび転写活性化ドメインを含有する。最もよく特徴付けられたＴＡＬ－エフェクターの１つは、斑点細菌病菌由来のＡｖｒＢｓ３である（Ｂｏｎａｓら、（１９８９）Ｍｏｌ Ｇｅｎ Ｇｅｎｅｔ ２１８：１２７～１３６頁および国際特許公開第２０１０／０７９４３０号を参照）。ＴＡＬ－エフェクターは、タンデムリピートの集中したドメインを含有し、各リピートは、これらのタンパク質のＤＮＡ結合特異性のために重要であるおよそ３４アミノ酸を含有している。加えてこれらは、核局在化配列および酸性転写活性化ドメインを含有する（考察のために、Ｓｃｈｏｒｎａｃｋら、（２００６）Ｊ Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ １６３（３）：２５６～２７２頁を参照）。加えて、植物病原性細菌ラルストニア・ソラナセラムでは２つの遺伝子は、ｂｒｇ１１およびｈｐｘ１７と呼ばれ、Ｒ．ソラナセラムの次亜種１株ＧＭＩ１０００における、および次亜種４株ＲＳ１０００におけるザントモナス属のＡｖｒＢｓ３ファミリーに相同性であることが見出されている（Ｈｅｕｅｒら、（２００７）Ａｐｐｌ ａｎｄ Ｅｎｖｉｒ Ｍｉｃｒｏ ７３（１３）：４３７９～４３８４頁を参照）。これらの遺伝子は、互いにヌクレオチド配列において９８．９％同一であるが、ｈｐｘ１７のリピートドメインにおける１，５７５ｂｐの欠失によって異なる。しかしながら、両遺伝子産生物は、ザントモナス属のＡｖｒＢｓ３ファミリータンパク質に４０％未満の配列同一性を有する。例えば、本明細書にその全体を参照によって組み入れる米国特許第８，５８６，５２６号を参照。
これらのＴＡＬエフェクターの特異性は、タンデムリピートに見出される配列に依存する。リピート配列は、およそ１０２ｂｐを含み、リピートは典型的には互いに９１～１００％相同性である（Ｂｏｎａｓら、同書）。リピートの多型は、１２および１３位に通常位置し、１２および１３位の高頻度可変性二残基（ＲＶＤ）の同一性とＴＡＬエフェクターの標的配列中の近接ヌクレオチドの同一性との間に１対１対応があると考えられる（Ｍｏｓｃｏｕ ａｎｄ Ｂｏｇｄａｎｏｖｅ（２００９）Ｓｃｉｅｎｃｅ ３２６：１５０１頁およびＢｏｃｈら、（２００９）Ｓｃｉｅｎｃｅ ３２６：１５０９～１５１２頁を参照）。実験的に、これらのＴＡＬエフェクターのＤＮＡ認識のための天然のコードは、１２および１３位のＨＤ配列がシトシン（Ｃ）への結合をもたらし、ＮＧはＴに、ＮＩはＡ、Ｃ、ＧまたはＴに結合し、ＮＮはＡまたはＧに結合し、ＩＮＧはＴに結合するように決定される。これらのＤＮＡ結合リピートは、植物細胞において新規配列と相互作用し、非内在性レポーター遺伝子の発現を活性化できる人工転写因子を作るように新規の組合せおよび数のリピートを含むタンパク質にアセンブルされる（Ｂｏｃｈら、同書）。操作されたＴＡＬタンパク質は、酵母レポーターアッセイ（プラスミドベース標的）において活性を示すＴＡＬエフェクタードメインヌクレアーゼ融合物（ＴＡＬＥＮ）をもたらすようにＦｏｋＩ切断ハーフドメインに連結される。例えば、米国特許第８，５８６，５２６号；Ｃｈｒｉｓｔｉａｎら、（２０１０）Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ｅｐｕｂ １０．１５３４／ｇｅｎｅｔｉｃｓ．１１０．１２０７１７を参照。
ある特定の実施形態では、細胞のゲノムのｉｎ ｖｉｖｏ切断および／または標的化切断のために使用されるヌクレアーゼのうちの１つまたはそれ以上のＤＮＡ結合ドメインは、ジンクフィンガータンパク質を含む。好ましくは、ジンクフィンガータンパク質は、好適な標的部位に結合するように操作されているという点で天然に存在しない。例えば、すべてその全体を参照によって本明細書に組み入れる、Ｂｅｅｒｌｉら、（２００２）Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０：１３５～１４１頁；Ｐａｂｏら、（２００１）Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．７０：３１３～３４０頁；Ｉｓａｌａｎら、（２００１）Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１９：６５６～６６０頁；Ｓｅｇａｌら、（２００１）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１２：６３２～６３７頁；Ｃｈｏｏら、（２０００）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．１０：４１１～４１６頁；米国特許第６，４５３，２４２号；同第６，５３４，２６１号；同第６，５９９，６９２号；同第６，５０３，７１７号；同第６，６８９，５５８号；同第７，０３０，２１５号；同第６，７９４，１３６号；同第７，０６７，３１７号；同第７，２６２，０５４号；同第７，０７０，９３４号；同第７，３６１，６３５号；同第７，２５３，２７３号；ならびに米国特許出願公開第２００５／００６４４７４号；同第２００７／０２１８５２８号；および同第２００５／０２６７０６１号を参照。
操作されたジンクフィンガー結合ドメインは、天然に存在するジンクフィンガータンパク質と比較して新規結合特異性を有することができる。操作方法として、これだけに限らないが、合理的設計および種々の種類の選択が挙げられる。合理的設計として、例えば、各トリプレットまたはクアドルプレットヌクレオチド配列が、特定のトリプレットまたはクアドルプレット配列に結合するジンクフィンガーの１つまたはそれ以上のアミノ酸配列と会合するトリプレット（またはクアドルプレット）ヌクレオチド配列および個々のジンクフィンガーアミノ酸配列を含む、データベースを使用することが挙げられる。例えば、本明細書にその全体を参照によって組み入れる共同取得された米国特許第６，４５３，２４２号および同第６，５３４，２６１号を参照。
ファージディスプレイおよびツーハイブリッドシステムを含む例示的な選択方法は、米国特許第５，７８９，５３８号；同第５，９２５，５２３号；同第６，００７，９８８号；同第６，０１３，４５３号；同第６，４１０，２４８号；同第６，１４０，４６６号；同第６，２００，７５９号；および同第６，２４２，５６８号；ならびに国際特許公開第９８／３７１８６号；同第９８／５３０５７号；同第００／２７８７８号；および同第０１／８８１９７号に開示されている。加えて、ジンクフィンガー結合ドメインに対する結合特異性の増強は、例えば共同取得された国際特許公開第０２／０７７２２７号に記載されている。
加えて、本明細書および他の参考文献に開示されるとおり、ジンクフィンガードメインおよび／またはマルチフィンガージンクフィンガータンパク質は、例えば長さ５以上のアミノ酸のリンカーを含む任意の好適なリンカー配列を使用して一緒に連結される。例示的なリンカー配列について米国特許第８，７７２，４５３号；同第６，４７９，６２６号；同第６，９０３，１８５号；および同第７，１５３，９４９号も参照。本明細書に記載されるタンパク質は、タンパク質の個々のジンクフィンガーの間に任意の組合せの好適なリンカーを含む場合がある。
標的部位の選択；ＺＦＰならびに融合タンパク質（および同物をコードするポリヌクレオチド）の設計および構築のための方法は、当業者に公知であり、米国特許第６，１４０，０８１号；同第５，７８９，５３８号；同第６，４５３，２４２号；同第６，５３４，２６１号；同第５，９２５，５２３号；同第６，００７，９８８号；同第６，０１３，４５３号；および同第６，２００，７５９号；国際特許公開第９５／１９４３１号；同第９６／０６１６６号；同第９８／５３０５７号；同第９８／５４３１１号；同第００／２７８７８号；同第０１／６０９７０号；同第０１／８８１９７号；同第０２／０９９０８４号；同第９８／５３０５８号；同第９８／５３０５９号；同第９８／５３０６０号；同第０２／０１６５３６号；および同第０３／０１６４９６号に詳細に記載されている。
加えて、本明細書および他の参考文献に開示されるとおり、ジンクフィンガードメインおよび／またはマルチフィンガージンクフィンガータンパク質は、例えば長さ５以上のアミノ酸のリンカーを含む任意の好適なリンカー配列を使用して一緒に連結される。長さ６以上のアミノ酸である例示的なリンカー配列について米国特許第６，４７９，６２６号；同第６，９０３，１８５号；および同第７，１５３，９４９号も参照。本明細書に記載されるタンパク質は、タンパク質の個々のジンクフィンガーの間に任意の組合せの好適なリンカーを含む場合がある。
ジンクフィンガーヌクレアーゼは、ＺＦＮ対（左右ＺＦＮを含む）を含むことができ、各ＺＦＮ対は、ヌクレアーゼ（切断ドメイン）およびＢＣＬ１１Ａに標的化されたＺＦＰを含む。例えば、米国特許第９，９６３，７１５号；同第９，６５０，６４８号；米国特許出願公開第２０１５／０１３２２６９号および同第２０１８／０１１１９７５号を参照。ある特定の実施形態では、ｍＲＮＡのＺＦＮ対は、任意の他の遺伝子座（オフターゲット）と比較して、および／または他のＢＣＬ１１Ａ標的化ヌクレアーゼ（例えば、骨格に改変を有さないＺＦＮ、その改変は、米国特許第１０，５６３，１８４号に記載されている）と比較してＢＣＬ１１Ａ（例えば、＋５８エンハンサー領域）を特異的に改変する。したがって、本明細書に記載されるｍＲＮＡを使用して産生された細胞は、ＢＣＬ１１Ａ遺伝子座で特異的に改変され、細胞の１０％未満（０～１０％またはその間の任意の値）、好ましくは５％未満（０～５％またはその間の任意の値）、さらにより好ましくは１％未満（０～１％またはその間の任意の値）およびさらにより好ましくは遺伝子改変細胞の０．５％未満（０～１％またはその間の任意の値）は、ＢＣＬ１１Ａ遺伝子座の外にｍＲＮＡによって作られた遺伝的改変を含む。例えば、米国特許第１０，５６３，１８４号を参照。これらの細胞は、追加の改変、例えばＨＬＡ遺伝子の不活性化を含み得る。
ある特定の実施形態では、ヌクレアーゼのＤＮＡ結合ドメインは、例えば単一ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）を含むＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓヌクレアーゼシステムの一部である。例えば、米国特許第８，６９７，３５９号および米国特許出願公開第２０１５／００５６７０５号を参照。システムのＲＮＡ構成成分をコードするＣＲＩＳＰＲ（クラスター化した規則的な配置の短い回文配列リピート）遺伝子座およびタンパク質をコードするＣａｓ（ＣＲＩＳＰＲ関連）遺伝子座（Ｊａｎｓｅｎら、（２００２）Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．４３：１５６５～１５７５頁；Ｍａｋａｒｏｖａら、（２００２）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．３０：４８２～４９６頁；Ｍａｋａｒｏｖａら、（２００６）Ｂｉｏｌ．Ｄｉｒｅｃｔ １：７；Ｈａｆｔら、（２００５）ＰＬｏＳ Ｃｏｍｐｕｔ．Ｂｉｏｌ．１：ｅ６０）は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓヌクレアーゼシステムの遺伝子配列を構成する。微生物宿主中のＣＲＩＳＰＲ遺伝子座は、ＣＲＩＳＰＲ関連（Ｃａｓ）遺伝子およびＣＲＩＳＰＲ媒介核酸切断の特異性をプログラミングできる非コードＲＮＡエレメントの組合せを含有する。
ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲは、最もよく特徴付けられたシステムの１つであり、４つの連続した工程で標的化ＤＮＡ二重鎖切断を実行する。第１に２つの非コードＲＮＡ、プレｃｒＲＮＡアレイおよびｔｒａｃｒＲＮＡは、ＣＲＩＳＰＲ遺伝子座から転写される。第２にｔｒａｃｒＲＮＡは、プレｃｒＲＮＡのリピート領域にハイブリダイズし、個別のスペーサー配列を含有する成熟ｃｒＲＮＡへのプレｃｒＲＮＡのプロセシングを媒介する。第３に成熟ｃｒＲＮＡ：ｔｒａｃｒＲＮＡ複合体は、ｃｒＲＮＡ上のスペーサーと、標的認識のための追加の必要要素であるプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）の隣の標的ＤＮＡ上のプロトスペーサーとの間のワトソン－クリック塩基対合を介してＣａｓ９を標的ＤＮＡに方向付ける。最後に、Ｃａｓ９は、プロトスペーサー内に２本鎖切断を創出するように標的ＤＮＡの切断を媒介する。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムの活性化は、３つの工程：（ｉ）将来の攻撃を予防するためにＣＲＩＳＰＲアレイに異質のＤＮＡ配列を挿入する、「順応」と称される工程、（ｉｉ）関連タンパク質の発現、ならびにアレイの発現およびプロセシング、に続く（ｉｉｉ）異質の核酸を用いたＲＮＡ媒介干渉を含む。それにより細菌細胞において、いくつかのいわゆる「Ｃａｓ」タンパク質は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムの本来の機能に関与し、異質のＤＮＡの挿入などの機能において役割を果たす。
一部の実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃｐｆ１システムが使用される。フランシセラ菌種において同定されたＣＲＩＳＰＲ－Ｃｐｆ１システムは、ヒト細胞においてロバストなＤＮＡ干渉を媒介するクラス２ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムである。機能的に保存されているが、Ｃｐｆ１およびＣａｓ９はそれらのガイドＲＮＡおよび基質特異性を含む多数の態様において異なっている（Ｆａｇｅｒｌｕｎｄら、（２０１５）Ｇｅｎｏｍ Ｂｉｏ １６：２５１を参照）。Ｃａｓ９とＣｐｆ１タンパク質との間の主な差異は、Ｃｐｆ１がｔｒａｃｒＲＮＡを利用せず、そのためｃｒＲＮＡだけを必要とすることである。ＦｎＣｐｆ１ ｃｒＲＮＡは、４２～４ヌクレオチド長（１９ヌクレオチドリピートおよび２３～２５ヌクレオチドスペーサー）であり、二次構造を保持する配列変化を許容する単一のステムループを含有している。加えて、Ｃｐｆ１ ｃｒＲＮＡは、Ｃａｓ９によって必要とされる約１００ヌクレオチドの操作されたｓｇＲＮＡより顕著に短く、ＦｎＣｐｆｌについてのＰＡＭ必要要素は、置き換えられた鎖の５’－ＴＴＮ－３’および５’－ＣＴＡ－３’である。Ｃａｓ９およびＣｐｆ１の両方は標的ＤＮＡに二重鎖切断を作製するが、Ｃａｓ９はガイドＲＮＡのシード配列内に平滑断端切断を作製するためにそのＲｕｖＣ－およびＨＮＨ－様ドメインを使用する、一方でＣｐｆ１は、シードの外にねじれ型切断を作るためにＲｕｖＣ様ドメインを使用する。Ｃｐｆ１が重要なシード領域から離れてねじれ型切断を作ることから、ＮＨＥＪは標的部位を破壊せず、したがってＣｐｆ１が望ましいＨＤＲ組換え事象が起きるまで同じ部位を切断し続けられることを確実にする。それにより、本明細書に記載される方法および組成物では、用語「Ｃａｓ」がＣａｓ９およびＣｆｐ１タンパク質の両方を含むことは理解される。それにより、本明細書において使用される場合、「ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステム」は、両方のヌクレアーゼ、ニッカーゼおよび／または転写因子システムを含むＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓおよび／またはＣＲＩＳＰＲ／Ｃｆｐ１システムの両方を指す。
一部の実施形態では、他のＣａｓタンパク質が使用される場合がある。いくつかの例示的なＣａｓタンパク質として、Ｃａｓ９、Ｃｐｆ１（Ｃａｓ１２ａとしても公知）、Ｃ２ｃ１、Ｃ２ｃ２（Ｃａｓ１３ａとしても公知）、Ｃ２ｃ３、Ｃａｓ１、Ｃａｓ２、Ｃａｓ４、ＣａｓＸおよびＣａｓＹが挙げられ；操作されたおよびその天然のバリアント（Ｂｕｒｓｔｅｉｎら、（２０１７）Ｎａｔｕｒｅ ５４２：２３７～２４１頁）、例えばＨＦ１／ｓｐＣａｓ９（Ｋｌｅｉｎｓｔｉｖｅｒら、（２０１６）Ｎａｔｕｒｅ ５２９：４９０～４９５頁；Ｃｅｂｒｉａｎ－Ｓｅｒｒａｎｏ ａｎｄ Ｄａｖｉｅｓ（２０１７）Ｍａｍｍ Ｇｅｎｏｍｅ（２０１７）２８（７）：２４７～２６１頁）；スプリットＣａｓ９システム（Ｚｅｔｓｃｈｅら、（２０１５）Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ３３（２）：１３９～１４２頁）、インテイン－エクステインシステムに基づくトランススプライスＣａｓ９（Ｔｒｏｕｎｇら、（２０１５）Ｎｕｃｌ Ａｃｉｄ Ｒｅｓ ４３（１３）：６４５０～８頁）；ミニＳａＣａｓ９（Ｍａら、（２０１８）ＡＣＳ Ｓｙｎｔｈ Ｂｉｏｌ ７（４）：９７８～９８５頁）を含む。それにより、本明細書に記載される方法および組成物において、用語「Ｃａｓ」がすべてのＣａｓバリアントタンパク質、天然および操作されたものを含むことは理解される。
ある特定の実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、天然に存在するＣａｓタンパク質の「機能性誘導体」である場合がある。天然配列ポリペプチドの「機能性誘導体」は、天然配列ポリペプチドと共通の定性的な生物学的特性を有する化合物である。「機能性誘導体」として、これだけに限らないが、天然配列の断片ならびに天然配列ポリペプチドおよびその断片の誘導体が、それらが対応する天然配列ポリペプチドと共通の生物学的活性を有する限り、挙げられる。本明細書において検討する生物学的活性は、ＤＮＡ基質を断片に加水分解する機能性誘導体の能力である。用語「誘導体」は、ポリペプチドのアミノ酸配列バリアント、共有結合的改変の両方およびその融合物を包含する。Ｃａｓポリペプチドまたはその断片の好適な誘導体として、これだけに限らないが、Ｃａｓタンパク質またはその断片の変異体、融合物、共有結合的改変が挙げられる。Ｃａｓタンパク質またはその断片を含むＣａｓタンパク質およびＣａｓタンパク質またはその断片の誘導体は、細胞からもしくは化学的合成で、またはこれら２つの手技の組合せによって得ることができる。細胞は、天然でＣａｓタンパク質を産生する細胞あるいは、天然でＣａｓタンパク質を産生し、内在性Ｃａｓタンパク質をより高い発現レベルで産生するようにまたは内在性Ｃａｓと同じもしくは異なるＣａｓをコードする外来性に導入された核酸からＣａｓタンパク質を産生するように遺伝的に操作された細胞であり得る。一部の場合では、細胞は、Ｃａｓタンパク質を天然で産生せず、Ｃａｓタンパク質を産生するように遺伝的に操作されている。Ｃａｓタンパク質に加えておよび／または代わりに使用されるＲＮＡガイドヌクレアーゼの追加の非限定的例として、Ｃｐｆ１などのクラス２ ＣＲＩＳＰＲタンパク質が挙げられる。例えば、Ｚｅｔｓｃｈｅら、（２０１５）Ｃｅｌｌ １６３：１～１３頁を参照。
一部の実施形態では、ＤＮＡ結合ドメインはＴｔＡｇｏシステムの一部である（Ｓｗａｒｔｓら、（２０１４）Ｎａｔｕｒｅ ５０７（７４９１）：２５８～２６１頁；Ｓｗａｒｔｓら、（２０１２）ＰＬｏＳ Ｏｎｅ ７（４）：ｅ３５８８８およびＳｈｅｎｇら、（２０１４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．１１１（２）：６５２～６５７頁を参照）。真核生物では、遺伝子サイレンシングは、タンパク質のアルゴノート（Ａｇｏ）ファミリーによって媒介される。このパラダイムでは、Ａｇｏは、低分子（１９～３１ヌクレオチド）ＲＮＡに結合される。このタンパク質－ＲＮＡサイレンシング複合体は、低分子ＲＮＡと標的との間のワトソンクリック塩基対合を介して標的ＲＮＡを認識し、標的ＲＮＡをエンドヌクレアーゼ的に切断する（Ｖｏｇｅｌ（２０１４）Ｓｃｉｅｎｃｅ ３４４：９７２～９７３頁）。対照的に、原核Ａｇｏタンパク質は、低分子１本鎖ＤＮＡ断片に結合し、外来性（しばしばウイルス性）ＤＮＡを検出および除去するために機能する可能性がある（Ｙｕａｎら、（２００５）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ １９：４０５；Ｏｌｏｖｎｉｋｏｖら、（２０１３）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ ５１：５９４；Ｓｗａｒｔｓら、同書）。例示的な原核Ａｇｏタンパク質は、アクイフェックス・エオリカス、ロドバクター・スフェロイデスおよびサーマス・サーモフィラス由来のものを含む。
最もよく特徴付けられた原核Ａｇｏタンパク質の１つは、Ｔ．サーモフィラス由来のものである（ＴｔＡｇｏ；Ｓｗａｒｔｓら、同書）。ＴｔＡｇｏは、５’リン酸基を有する１５ヌクレオチドまたは１３～２５ヌクレオチド１本鎖ＤＮＡ断片のいずれかと会合する。ＴｔＡｇｏによって結合されたこの「ガイドＤＮＡ」は、タンパク質－ＤＮＡ複合体をＤＮＡの第三者分子中のワトソンクリック相補性ＤＮＡ配列に結合させるように方向付ける。これらのガイドＤＮＡ中の配列情報が標的ＤＮＡの同定を可能にすると、ＴｔＡｇｏ－ガイドＤＮＡ複合体は、標的ＤＮＡを切断する。このような機構は、その標的ＤＮＡに結合する一方で、ＴｔＡｇｏ－ガイドＤＮＡ複合体の構造によっても支持される（Ｓｈｅｎｇら、同書）。ロドバクター・スフェロイデス（ＲｓＡｇｏ）由来のＡｇｏは、同様の特性を有する（Ｏｌｏｖｎｉｋｏｖら、同書）。
無作為なＤＮＡ配列の外来性ガイドＤＮＡは、ＴｔＡｇｏタンパク質（Ｓｗａｒｔｓら、同書）にロードすることができる。ＴｔＡｇｏ切断の特異性がガイドＤＮＡによって方向付けられることから、外来性の、調査者が特定するガイドＤＮＡを用いて形成されたＴｔＡｇｏ－ＤＮＡ複合体は、したがってＴｔＡｇ標的ＤＮＡ切断を相補性の調査者が特定した標的ＤＮＡに方向付ける。このように、標的化二重鎖切断をＤＮＡ中に創出できる。ＴｔＡｇｏ－ガイドＤＮＡシステム（または、他の生物由来のオルソロガスＡｇｏ－ガイドＤＮＡシステム）の使用は、細胞内のゲノムＤＮＡの標的化切断を可能にする。そのような切断は、１本鎖または２本鎖のいずれかであり得る。哺乳動物ゲノムＤＮＡの切断のために、哺乳動物細胞における発現のために最適化されたＴｔＡｇｏコドンのバージョンを使用することは好ましい。さらに、ＴｔＡｇｏタンパク質が細胞貫通性ペプチドに融合されているｉｎ ｖｉｔｒｏで形成されたＴｔＡｇｏ－ＤＮＡ複合体を用いて細胞を処置することは好ましい場合がある。さらに、摂氏３７度での活性が改善されるような変異導入を介して変更されたＴｔＡｇｏタンパク質のバージョンを使用することは好ましい場合がある。ＴｔＡｇｏ－ＲＮＡ媒介ＤＮＡ切断は、ＤＮＡ切断の活用のために当技術分野において標準の技術を使用する遺伝子ノックアウト、標的化遺伝子付加、遺伝子修正、標的化遺伝子欠失を含む多数の結果に影響するように使用できる。
したがって、ヌクレアーゼは、それにドナー（導入遺伝子）を挿入するために望ましい任意の遺伝子中の標的部位に特異的に結合するという点でＤＮＡ結合ドメインを含む。
ある特定の実施形態では、ＤＮＡ結合ドメインはアルブミン、例えばＳＢＳ－４７１７１およびＳＢＳ－４７８９８と呼ばれるＺＦＰのＤＮＡ結合ドメインに結合する。例えば、米国特許出願公開第２０１５／０１５９１７２号を参照。
Ｂ．切断ドメイン
任意の好適な切断ドメインは、ヌクレアーゼを形成するようにＤＮＡ結合ドメインに会合（例えば、作動可能に連結）することができる。例えば、ＺＦＰ ＤＮＡ結合ドメインは、ＺＦＮ－その操作された（ＺＦＰ）ＤＮＡ結合ドメインを通じて目的の核酸標的を認識することができ、ＤＮＡがヌクレアーゼ活性を介してＺＦＰ結合部位近くで切断されるようにする機能性の実体、を創出するようにヌクレアーゼドメインに融合された。例えば、Ｋｉｍら、（１９９６）Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ９３（３）：１１５６～１１６０頁を参照。最近、ＺＦＮは、種々の生物においてゲノム改変のために使用されている。例えば、米国特許出願公開第２００３／０２３２４１０号；同第２００５／０２０８４８９号；同第２００５／００２６１５７号；同第２００５／００６４４７４号；同第２００６／０１８８９８７号；同第２００６／００６３２３１号；および国際特許公開第０７／０１４２７５号を参照。同様に、ＴＡＬＥ ＤＮＡ結合ドメインは、ＴＡＬＥＮを創出するようにヌクレアーゼドメインに融合された。例えば、米国特許第８，５８６，５２６号を参照。標的化切断を導入するようにＤＮＡに結合し、切断ドメイン（例えば、Ｃａｓドメイン）と会合する単一ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）を含むＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓヌクレアーゼシステムが、記載されている。例えば、米国特許第８，６９７，３５９号および同第８，９３２，８１４号ならびに米国特許出願公開第２０１５／００５６７０５号を参照。
上に記したとおり、切断ドメインは、ＤＮＡ結合ドメインに異種性である場合がある、例えばジンクフィンガーＤＮＡ結合ドメインおよびヌクレアーゼ由来の切断ドメインまたはＴＡＬＥＮ ＤＮＡ結合ドメインおよびヌクレアーゼ由来の切断ドメイン；ｓｇＲＮＡ ＤＮＡ結合ドメインおよびヌクレアーゼ由来の切断ドメイン（ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ）；ならびに／またはメガヌクレアーゼＤＮＡ結合ドメインおよび異なるヌクレアーゼ由来の切断ドメイン。異種性切断ドメインは、任意のエンドヌクレアーゼまたはエクソヌクレアーゼから得ることができる。切断ドメインが由来し得る例示的なエンドヌクレアーゼとして、これだけに限らないが、制限エンドヌクレアーゼおよびホーミングエンドヌクレアーゼが挙げられる。例えば、２００２～２００３カタログ、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｂｅｖｅｒｌｙ、ＭＡ；およびＢｅｌｆｏｒｔら、（１９９７）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５：３３７９～３３８８頁を参照。ＤＮＡを切断する追加の酵素は、公知である（例えば、Ｓ１ヌクレアーゼ；マングビーンヌクレアーゼ；膵臓ＤＮａｓｅＩ；小球菌ヌクレアーゼ；酵母ＨＯエンドヌクレアーゼ；Ｌｉｎｎら、（ｅｄｓ．）Ｎｕｃｌｅａｓｅｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，１９９３も参照）。これらの酵素（または、その機能性断片）のうちの１つまたはそれ以上は、切断ドメインおよび切断ハーフドメインの供給源として使用できる。
同様に、切断ハーフドメインは、任意のヌクレアーゼまたはその一部に由来する場合があり、上に記載のとおり、切断活性のために二量体化を必要とする。一般に、融合タンパク質が切断ハーフドメインを含む場合、２つの融合タンパク質が切断のために必要である。代替的に、２つの切断ハーフドメインを含む単一のタンパク質を使用することができる。２つの切断ハーフドメインは、同じエンドヌクレアーゼ（またはその機能性断片）に由来する場合がある、または各切断ハーフドメインは、異なるエンドヌクレアーゼ（またはその機能性断片）に由来する場合がある。加えて、２つの融合タンパク質のための標的部位は、２つの融合タンパク質のそれらそれぞれの標的部位への結合が、切断ハーフドメインが機能性切断ドメインを、例えば二量体化によって、形成できるような互いの空間定位に切断ハーフドメインを配置するように、互いに好ましくは配置される。それにより、ある特定の実施形態では、標的部位の近端は、５～８ヌクレオチドによって、または１５～１８ヌクレオチドによって分離される。しかしながら、任意の整数のヌクレオチドまたはヌクレオチド対は、２つの標的部位間に介在できる（例えば、２～５０ヌクレオチド対以上）。一般に、切断の部位は、標的部位の間に位置する。
制限エンドヌクレアーゼ（制限酵素）は、多数の種に存在し、ＤＮＡへの（認識部位での）配列特異的結合が可能であり、結合の部位でまたはその近くでＤＮＡを切断する。ある特定の制限酵素（例えば、ＩＩＳ型）は、認識部位から移動された部位でＤＮＡを切断し、分離可能な結合および切断ドメインを有する。例えば、ＩＩＳ型酵素ＦｏｋＩは、一方の鎖のその認識部位から９ヌクレオチド、および他方ではその認識部位から１３ヌクレオチドでＤＮＡの２本鎖切断を触媒する。例えば、米国特許第５，３５６，８０２号；同第５，４３６，１５０号および同第５，４８７，９９４号；ならびにＬｉら、（１９９２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８９：４２７５～４２７９頁；Ｌｉら、（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０：２７６４～２７６８頁；Ｋｉｍら、（１９９４ａ）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９１：８８３～８８７頁；Ｋｉｍら、（１９９４ｂ）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９：３１，９７８～３１，９８２頁を参照。したがって、一実施形態では、融合タンパク質は、操作されている場合もされていない場合もある、少なくとも１つのＩＩＳ型制限酵素由来の切断ドメイン（または切断ハーフドメイン）および１つまたはそれ以上のジンクフィンガー結合ドメインを含む。
その切断ドメインが、結合ドメインから分離可能である例示的なＩＩＳ型制限酵素は、ＦｏｋＩである。この特定の酵素は、二量体として活性である。Ｂｉｔｉｎａｉｔｅら、（１９９８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９５：１０，５７０～１０，５７５頁。したがって、本開示の目的ために、開示される融合タンパク質において使用されるＦｏｋＩ酵素の一部は、切断ハーフドメインと考えられる。それにより、ジンクフィンガー－ＦｏｋＩ融合物を使用する細胞性配列の標的化２本鎖切断および／または標的化置換のために、それぞれＦｏｋＩ切断ハーフドメインを含む２つの融合タンパク質は、触媒的に活性な切断ドメインを再構成するために使用される。代替的に、ジンクフィンガー結合ドメインを含有する単一のポリペプチド分子および２つのＦｏｋＩ切断ハーフドメインも使用される。ジンクフィンガー－ＦｏｋＩ融合物を使用する標的化切断および標的化配列変更のためのパラメーターは、本開示の他所に提供される。
切断ドメインまたは切断ハーフドメインは、切断活性を保持している、または機能性切断ドメインを形成するために多量体化（例えば、二量体化）する能力を保持しているタンパク質の任意の部分であってよい。
例示的なＩＩＳ型制限酵素は、その全体を本明細書に組み入れる米国特許第７，８８８，１２１号に記載されている。追加の制限酵素は、分離可能結合および切断ドメインも含有し、これらは本開示によって検討される。例えば、Ｒｏｂｅｒｔｓら、（２００３）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．３１：４１８～４２０頁を参照。
ある特定の実施形態では、切断ドメインは、例えば、そのすべての開示を本明細書に全体に参照によって組み入れる米国特許第８，７７２，４５３号；同第８，６２３，６１８号；同第８，４０９，８６１号；同第８，０３４，５９８号；同第７，９１４，７９６号；および同第７，８８８，１２１号に記載されるとおり、ホモ二量体化を最小化または妨げる１つまたはそれ以上の操作された切断ハーフドメイン（二量体化ドメイン変異体とも称される）を含む。ＦｏｋＩの４４６、４４７、４７９、４８３、４８４、４８６、４８７、４９０、４９１、４９６、４９８、４９９、５００、５３１、５３４、５３７および５３８位のアミノ酸残基は、すべてＦｏｋＩ切断ハーフドメインの二量体化に影響を与えるための標的である。
偏性ヘテロ二量体を形成するＦｏｋＩの例示的な操作された切断ハーフドメインは、第１の切断ハーフドメインがＦｏｋＩのアミノ酸残基４９０および５３８位に変異を含み、第２の切断ハーフドメインがアミノ酸残基４８６および４９９に変異を含む対を含む。
それにより、一実施形態では、４９０の変異はＧｌｕ（Ｅ）をＬｙｓ（Ｋ）で置き換え；５３８での変異はＩｓｏ（Ｉ）をＬｙｓ（Ｋ）で置き換え；４８６での変異はＧｌｎ（Ｑ）をＧｌｕ（Ｅ）で置き換え；４９９位での変異はＩｓｏ（Ｉ）をＬｙｓ（Ｋ）で置き換える。詳細には、本明細書に記載される操作された切断ハーフドメインは、「Ｅ４９０Ｋ：Ｉ５３８Ｋ」と呼ばれる操作された切断ハーフドメインを産生するように１つの切断ハーフドメイン中の４９０位（Ｅ→Ｋ）および５３８位（Ｉ→Ｋ）を変異させることによって、および「Ｑ４８６Ｅ：Ｉ４９９Ｌ」と呼ばれる操作された切断ハーフドメインを産生するように別の切断ハーフドメイン中の４８６位（Ｑ→Ｅ）および４９９位（Ｉ→Ｌ）を変異させることによって調製された。本明細書に記載される操作された切断ハーフドメインは、異常な切断が最小化または消失している偏性ヘテロ二量体変異体である。その開示はその全体を参照によって組み入れる米国特許第７，９１４，７９６号および同第８，０３４，５９８号。ある特定の実施形態では、操作された切断ハーフドメインは、４８６、４９９および４９６位（野生型ＦｏｋＩと比べた番号付け）に変異を、例えば、４８６位の野生型Ｇｌｎ（Ｑ）残基をＧｌｕ（Ｅ）残基で、４９９位の野生型Ｉｓｏ（Ｉ）残基をＬｅｕ（Ｌ）残基で、および４９６位の野生型Ａｓｎ（Ｎ）残基をＡｓｐ（Ｄ）またはＧｌｕ（Ｅ）残基で置き換える変異（それぞれ「ＥＬＤ」および「ＥＬＥ」ドメインとも称される）を含む。他の実施形態では、操作された切断ハーフドメインは、４９０、５３８および５３７位（野生型ＦｏｋＩと比べた番号付け）に変異、例えば、４９０位の野生型Ｇｌｕ（Ｅ）残基をＬｙｓ（Ｋ）残基で、５３８位の野生型Ｉｓｏ（Ｉ）残基をＬｙｓ（Ｋ）残基で、および５３７位の野生型Ｈｉｓ（Ｈ）残基をＬｙｓ（Ｋ）残基またはＡｒｇ（Ｒ）残基で置き換える変異（それぞれ「ＫＫＫ」および「ＫＫＲ」ドメインとも称される）を含む。他の実施形態では、操作された切断ハーフドメインは、４９０位および５３７位（野生型ＦｏｋＩと比べた番号付け）に変異、例えば、４９０位の野生型Ｇｌｕ（Ｅ）残基をＬｙｓ（Ｋ）残基で、および５３７位の野生型Ｈｉｓ（Ｈ）残基をＬｙｓ（Ｋ）残基またはＡｒｇ（Ｒ）残基で置き換える変異（それぞれ「ＫＩＫ」および「ＫＩＲ」ドメインとも称される）を含む。例えば、米国特許第８，７７２，４５３号を参照。他の実施形態では、操作された切断ハーフドメインは、「Ｓｈａｒｋｅｙ」および／または「Ｓｈａｒｋｅｙ変異」を含む（Ｇｕｏら、（２０１０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４００（１）：９６～１０７頁を参照）。
本明細書に記載される操作された切断ハーフドメインは、任意の好適な方法、例えば米国特許第７，８８８，１２１号；同第７，９１４，７９６号；同第８，０３４，５９８号；および同第８，６２３，６１８号に記載される野生型切断ハーフドメイン（ＦｏｋＩ）の部位特異的変異導入によって、調製される。
代替的に、ヌクレアーゼは、いわゆる「スプリット酵素」技術を使用して核酸標的部位でｖｉｖｏでアセンブルすることができる（例えば、米国特許出願公開第２００９／００６８１６４号を参照）。そのようなスプリット酵素の構成成分は、別々の発現構築物のいずれかで発現できる、または個々の構成成分が、例えば自己切断２ＡペプチドもしくはＩＲＥＳ配列によって分離されている１つの翻訳領域中に連結することができる。構成成分は、個々のジンクフィンガー結合ドメインまたはメガヌクレアーゼ核酸結合ドメインのドメインである場合がある。
ヌクレアーゼは、使用前の活性について、例えば、米国特許第８，５６３，３１４号に記載されている酵母ベースの染色体システム（yeast-based chromosomal system）においてスクリーニングされる。ヌクレアーゼの発現は、構成的プロモーターまたは誘導性プロモーター、例えば、ラフィノースおよび／またはガラクトースの存在下で活性化（抑制解除され）、グルコースの存在下で抑制されるガラクトキナーゼプロモーターの支配下であり得る。
Ｃａｓ９関連ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムは、２つのＲＮＡ非コード構成成分を含む：同一のダイレクトリピート（ＤＲ）によって間を置かれているヌクレアーゼガイド配列（スペーサー）を含有するｔｒａｃｒＲＮＡおよびプレｃｒＲＮＡアレイ。ゲノム操作を達成するようにＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムを使用するために、これらのＲＮＡの両方の機能が存在しなければならない（Ｃｏｎｇら、（２０１３）Ｓｃｉｅｎｃｅｘｐｒｅｓｓ １／１０．１１２６／ｓｃｉｅｎｃｅ １２３１１４３を参照）。一部の実施形態では、ｔｒａｃｒＲＮＡおよびプレｃｒＲＮＡは、別々の発現構築物を介して、または別々のＲＮＡとして供給される。他の実施形態では、キメラＲＮＡが構築され、操作された成熟ｃｒＲＮＡ（標的特異性を与える）がｔｒａｃｒＲＮＡ（Ｃａｓ９との相互作用を供給する）に融合されてキメラｃｒ－ＲＮＡ－ｔｒａｃｒＲＮＡハイブリッド（単一ガイドＲＮＡとも名付けられる）を創出する（Ｊｉｎｅｋら、（２０１２）Ｓｃｉｅｎｃｅ ３３７：８１６～８２１頁，Ｊｉｎｅｋら、（２０１３）ｅＬｉｆｅ ２：ｅ００４７１およびＣｏｎｇ、同書を参照）。
本明細書に記載されるヌクレアーゼは、１つまたはそれ以上の２本鎖および／または１本鎖切断を標的部位に作ることができる。ある特定の実施形態では、ヌクレアーゼは、触媒的に不活性な切断ドメイン（例えば、ＦｏｋＩおよび／またはＣａｓタンパク質）を含む。例えば、米国特許第９，２００，２６６号；同第８，７０３，４８９号およびＧｕｉｌｌｉｎｇｅｒら、（２０１４）Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ．３２（６）：５７７～５８２頁を参照。触媒的に不活性な切断ドメインは、触媒的に活性なドメインとの組合せで、１本鎖切断を作るニッカーゼとして作用できる。したがって、２つのニッカーゼを特定の領域に２本鎖切断を作るために組合せで使用することができる。追加のニッカーゼも、例えば、ＭｃＣａｆｆｅｒｙら、（２０１６）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．４４（２）：ｅ１１．ｄｏｉ：１０．１０９３／ｎａｒ／ｇｋｖ８７８．Ｅｐｕｂ ２０１５ Ｏｃｔ １９の、当技術分野において公知である。
これにより、ＤＮＡ結合ドメインおよび切断ドメインを含む任意のヌクレアーゼは、使用される。ある特定の実施形態では、ヌクレアーゼは、第１および第２から構成されるＺＦＮ（左右ＺＦＮとも称される）、例えば、ＳＢＳ－６３０１４と呼ばれるＺＦＰおよび切断ドメインを含む第１のＺＦＮ、ならびにＳＢＳ－６５７２２と呼ばれるＺＦＰおよび切断ドメインを含む第２のＺＦＮを含むＺＦＮを含む。ある特定の実施形態では、ＺＦＮの左右（第１のおよび第２の）ＺＦＮは、同じベクター上に保有され、他の実施形態では、ＺＦＮの対合する構成成分は、異なるベクター上、例えば実施例１に示される２つのｍＲＮＡベクター、１つはＳＢ－ｍＲＥＮＨ１ ｍＲＮＡと呼ばれ（６３０１４と呼ばれるＺＦＰを含むＺＦＮをコードするｍＲＮＡ）、他方はＳＢ－ｍＲＥＮＨ２ ｍＲＮＡと呼ばれる（６５７２２と呼ばれるＺＦＰを含むＺＦＮをコードするｍＲＮＡ）、に保有される。
標的部位
上に詳細に記載されるとおり、ＤＮＡドメインは、遺伝子座、例えばアルブミンまたは他のセーフハーバー遺伝子において選択した任意の配列に結合するように操作される。操作されたＤＮＡ結合ドメインは、天然に存在するＤＮＡ結合ドメインと比較して新規結合特異性を有する場合がある。操作方法として、これだけに限らないが、合理的設計および種々の種類の選択が挙げられる。合理的設計として、例えば、トリプレット（またはクアドルプレット）ヌクレオチド配列および個別の（例えば、ジンクフィンガー）アミノ酸配列を含むデータベースを使用することが挙げられ、ここで、各トリプレットまたはクアドルプレットヌクレオチド配列は、特定のトリプレットまたはクアドルプレット配列に結合するＤＮＡ結合ドメインの１つまたはそれ以上のアミノ酸配列と会合する。例えば、本明細書にその全体を参照によって組み入れる共同取得された米国特許第６，４５３，２４２号および同第６，５３４，２６１号を参照。ＴＡＬエフェクタードメインの合理的設計も実施できる。例えば、米国特許出願公開第２０１１／０３０１０７３号を参照。
ファージディスプレイおよびツーハイブリッドシステムを含むＤＮＡ結合ドメインに適用可能な例示的な選択方法は、米国特許第５，７８９，５３８号；同第５，９２５，５２３号；同第６，００７，９８８号；同第６，０１３，４５３号；同第６，４１０，２４８号；同第６，１４０，４６６号；同第６，２００，７５９号；および同第６，２４２，５６８号；ならびに国際特許公開第９８／３７１８６号；同第９８／５３０５７号；同第００／２７８７８号；および同第０１／８８１９７号ならびにＧＢ２，３３８，２３７に開示されている。
標的部位の選択；ヌクレアーゼならびに融合タンパク質（および同物をコードするポリヌクレオチド）の設計および構築のための方法は、当業者に公知であり、その全体を本明細書に参照によって組み入れる米国特許出願公開第２００５／００６４４７４号および同第２００６／０１８８９８７号に詳細に記載されている。
加えて、本明細書および他の参考文献に開示されるとおり、ＤＮＡ結合ドメイン（例えば、マルチフィンガージンクフィンガータンパク質）は、例えば５以上のアミノ酸のリンカーを含む、任意の好適なリンカー配列を使用して一緒に連結される。長さ６以上のアミノ酸の例示的なリンカー配列について米国特許第６，４７９，６２６号；同第６，９０３，１８５号；および同第７，１５３，９４９号を参照。本明細書に記載されるタンパク質は、タンパク質の個別のＤＮＡ結合ドメインの間に任意の組合せの好適なリンカーを含む場合がある。米国特許第８，５８６，５２６号も参照。
ある特定の実施形態では、ＤＮＡ結合ドメインに対する標的部位は、ＢＣＬ１１Ａ遺伝子内にある。例えば、米国特許第１０，５６３，１８４号；同第９，９６３，７１５号；同第９，６５０，６４８号；米国特許出願公開第２０１５／０１３２２６９号；同第２０１８／０１１１９７５号；および同第２０１９／０１７７７０９号を参照。
本発明の組成物／システム
ある特定の実施形態による方法を実行するために対象に送達される改変自己ＨＳＣ／ＰＣが本明細書に記載される。右左ＺＦＮパートナーをコードする２つのｍＲＮＡは、ＢＣＬ１１ａ赤血球エンハンサー配列に標的化される採取されたＨＳＣ／ＰＣに送達される。ある特定の実施形態では、ｍＲＮＡは、ＳＢ－ｍＲＥＮＨ１およびＳＢ－ｍＲＥＮＨ２を含む。本明細書に記載されるいずれの方法でも、ＣＤ３４＋ＨＳＣ／ＰＣは、単離前に対象を１もしくはそれ以上の用量のＧ－ＣＳＦおよび／または１もしくはそれ以上の用量のプレリキサフォルで処置することによる対象での動員後に採取される（例えば、アフェレーシス）ならびに動員された細胞。ある特定の実施形態では、少なくとも約２５×１０６個／ｋｇのＣＤ３４＋ＨＳＰＣが全体でまたはアフェレーシスサイクルごとに採取され、任意の長さの時間について培養することができる。得られた遺伝子改変細胞は培養され、その子孫は、特定のＢＣＬ１１Ａ遺伝的改変（例えば、１％未満の細胞がオフターゲット（非ＢＣＬ１１Ａ）改変を有する）を含むが、必ずしもｍＲＮＡを含まない。
ＢＣＬ１１Ａノックアウトを含む細胞は、次に対象に輸注される。追加の改変、例えばＨＬＡ遺伝子の不活性化は、特定のＢＣＬ１１Ａ遺伝子改変細胞において行うことができる。
細胞
同様に、遺伝子改変細胞、例えばＢＣＬ１１Ａ赤血球エンハンサーの標的化ノックアウトを含むＨＳＣ／ＰＣが本明細書で提供される。ノックアウトは、翻訳された場合に活性ＺＦＮを生じる、右左ＺＦＮパートナーをコードするｍＲＮＡを用いて採取されたＨＳＣ／ＰＣを処置することによって創出される。ＺＦＮは、二重鎖切断がＤＮＡに生じるようにＢＣＬ１１Ａ赤血球エンハンサーを切断する。細胞機構は、切断部位の周辺にヌクレオチドの挿入および欠失（インデル）を生じるエラー・プローン非相同末端結合（ＮＨＥＪ）を使用して二重鎖切断を修復する。
自己（例えば、対象由来）および同種間（健康なドナー由来）の両方のＨＳＣ／ＰＣは、方法の実施において使用することができる。
本明細書に記載される細胞は、障害を有する対象においてβ－サラセミアを処置するおよび／または予防するための細胞療法において有用である。改変幹細胞の場合は、対象への輸注後に、機能性タンパク質（挿入されたドナーから）を発現する細胞へのこれらの前駆体のｉｎ ｖｉｖｏ分化も生じる。
本明細書に記載される細胞を含む医薬組成物も提供される。加えて、細胞は、対象への投与の前に凍結保存される。
本明細書に記載される細胞集団（および組成物）は、１０％未満（０～１０％またはその間の任意の値）、好ましくは５％未満（０～５％またはその間の任意の値）、さらにより好ましくは１％未満の細胞（０～１％またはその間の任意の値）およびさらにより好ましくは０．５％未満（０～１％またはその間の任意の値）の細胞がＢＣＬ１１Ａ遺伝子座の外に遺伝的改変を含む（しかしＨＬＡマーカーの不活性化などの追加の改変を含み得る）遺伝子改変細胞集団を含む、具体的にはＢＣＬ１１Ａ遺伝子座で遺伝子改変細胞を含む。
送達
ヌクレアーゼ、これらのヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチド、ドナーポリヌクレオチド、ならびに本明細書に記載されるタンパク質および／またはポリヌクレオチドを含む組成物のｅｘ ｖｉｖｏ送達は、任意の好適な手段によって、回収したＨＳＣ／ＰＣに送達してもよい。
本明細書に記載されるヌクレアーゼを送達する方法は、例えば、米国特許第６，４５３，２４２号；同第６，５０３，７１７号；同第６，５３４，２６１号；同第６，５９９，６９２号；同第６，６０７，８８２号；同第６，６８９，５５８号；同第６，８２４，９７８号；同第６，９３３，１１３号；同第６，９７９，５３９号；同第７，０１３，２１９号；および同第７，１６３，８２４号に記載されており、すべての当特許の開示は、それらの全体を参照によって本明細書に組み入れる。
また、本明細書に記載されるヌクレアーゼおよび／またはドナー構築物は、ジンクフィンガー、ＴＡＬ－エフェクタードメインおよび／またはＣａｓタンパク質のうちの１つまたはそれ以上をコードする配列を含有するベクターを使用して送達することができる。非限定的に、プラスミドベクター、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター、ポックスウイルスベクター；ヘルペスウイルスベクターおよびアデノ随伴ウイルスベクターなどを含む、任意のベクター系を使用することができる。また、全体を参照によって本明細書に組み入れる、米国特許第６，５３４，２６１号；同第６，６０７，８８２号；同第６，８２４，９７８号；同第６，９３３，１１３号；同第６，９７９，５３９号；同第７，０１３，２１９号；および同第７，１６３，８２４号を参照。
従来型のウイルスおよび非ウイルスベースの遺伝子移行法は、ヌクレアーゼおよびドナー構築物をコードする核酸を細胞（例えば、哺乳動物細胞）および標的組織に導入するために使用することができる。非ウイルスベクター送達系は、ＤＮＡプラスミド、ネイキッド核酸、およびリポソームまたはポロキサマーなどの送達媒体と複合体化した核酸を含む。ウイルスベクター送達系は、エピソーム性または細胞への送達後に組み込まれるゲノムのいずれかを有する、ＤＮＡおよびＲＮＡウイルスを含む。遺伝子療法手技の概略については、Ａｎｄｅｒｓｏｎ（１９９２）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５６：８０８～８１３頁；ＮａｂｅｌおよびＦｅｌｇｎｅｒ（１９９３）ＴＩＢＴＥＣＨ １１：２１１～２１７頁；ＭｉｔａｎｉおよびＣａｓｋｅｙ（１９９３）ＴＩＢＴＥＣＨ １１：１６２～１６６頁；Ｄｉｌｌｏｎ（１９９３）ＴＩＢＴＥＣＨ １１：１６７～１７５頁；Ｍｉｌｌｅｒ（１９９２）Ｎａｔｕｒｅ ３５７：４５５～４６０頁；Ｖａｎ Ｂｒｕｎｔ（１９８８）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ６（１０）：１１４９～１１５４頁；Ｖｉｇｎｅ（１９９５）Ｒｅｓｔｏｒａｔｉｖｅ Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ ８：３５～３６頁；ＫｒｅｍｅｒおよびＰｅｒｒｉｃａｕｄｅｔ（１９９５）Ｂｒｉｔｉｓｈ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｂｕｌｌｅｔｉｎ ５１（１）：３１～４４頁；Ｈａｄｄａｄａら、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｔｏｐｉｃｓ ｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ＤｏｅｒｆｌｅｒおよびＢｏｈｍ（編）（１９９５）；ならびにＹｕら、（１９９４）Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ １：１３～２６頁を参照。
核酸の非ウイルス送達の方法は、エレクトロポレーション、リポフェクション、マイクロインジェクション、遺伝子銃、ビロソーム、リポソーム、イムノリポソーム、ポリカチオンまたは脂質：核酸コンジュゲート、ネイキッドＤＮＡ、人工ビリオン、および剤により向上させたＤＮＡの取り込みを含む。また、例えば、Ｓｏｎｉｔｒｏｎ ２０００システム（Ｒｉｃｈ－Ｍａｒ）を使用するソノポレーションは、核酸の送達のために使用することができる。
追加の例示的な核酸送達系には、Ａｍａｘａ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（Ｃｏｌｏｇｎｅ、Ｇｅｒｍａｎｙ）、Ｍａｘｃｙｔｅ， Ｉｎｃ．（Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、Ｍａｒｙｌａｎｄ）、ＢＴＸ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ（Ｈｏｌｌｉｓｔｏｎ、ＭＡ）およびＣｏｐｅｒｎｉｃｕｓ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ Ｉｎｃ，（例えば、米国特許第６，００８，３３６号を参照）によって提供される系が含まれる。リポフェクションは、例えば、米国特許第５，０４９，３８６号；同第４，９４６，７８７号；および同第４，８９７，３５５号に記載されており、リポフェクション試薬は、市販されている（例えば、Ｔｒａｎｓｆｅｃｔａｍ（商標）およびＬｉｐｏｆｅｃｔｉｎ（商標））。ポリヌクレオチドの効率的な受容体認識リポフェクションに好適なカチオン性脂質および中性脂質には、Ｆｅｌｇｎｅｒ、国際特許公開第９１／１７４２４号、同第９１／１６０２４号の脂質が含まれる。
イムノリピド複合体のような標的化したリポソームを含む、脂質：核酸複合体の調製は、当業者に周知である（例えば、Ｃｒｙｓｔａｌ（１９９５）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７０：４０４～４１０頁；Ｂｌａｅｓｅら、（１９９５）Ｃａｎｃｅｒ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ． ２：２９１～２９７頁；Ｂｅｈｒら、（１９９４）Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ． ５：３８２～３８９頁；Ｒｅｍｙら、（１９９４）Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ． ５：６４７～６５４頁；Ｇａｏら、（１９９５）Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ２：７１０～７２２頁；Ａｈｍａｄら、（１９９２）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． ５２：４８１７～４８２０頁；米国特許第４，１８６，１８３号；同第４，２１７，３４４号；同第４，２３５，８７１号；同第４，２６１，９７５号；同第４，４８５，０５４号；同第４，５０１，７２８号；同第４，７７４，０８５号；同第４，８３７，０２８号；および同第４，９４６，７８７号を参照）。
追加の送達方法は、ＥｎＧｅｎｅＩＣ送達媒体（ＥＤＶ：ＥｎＧｅｎｅＩＣ ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｖｅｈｉｃｌｅ）に送達される核酸のパッケージングの使用を含む。これらのＥＤＶは、抗体の１つのアームが標的組織についての特異性を有し、他方がＥＤＶについての特異性を有する二重特異性抗体を使用して、標的組織に特に送達される。抗体は、ＥＤＶを標的細胞表面にもたらし、その後、ＥＤＶは、エンドサイトーシスによって細胞内に取り込まれる。細胞に入ると、内容物が放出される（ＭａｃＤｉａｒｍｉｄら、（２００９）Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２７（７）：６４３を参照）。
操作したＺＦＰをコードする核酸の送達のためのＲＮＡまたはＤＮＡウイルスベースの系の使用は、ウイルスを体内の特定の細胞に標的化し、ウイルスペイロードを核へ輸送するための高度に発展させたプロセスを利用する。ウイルスベクターは、ｉｎ ｖｉｔｒｏで細胞を処理するために使用してもよく、改変された細胞は対象に投与される（ｅｘ ｖｉｖｏ）。ＺＦＰの送達のための従来型のウイルスベースの系には、遺伝子移行のためのレトロウイルス、レンチウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴、ワクシニアおよび単純ヘルペスウイルスベクターが含まれるが、これらに限定されない。宿主ゲノムにおける組込みは、レトロウイルス、レンチウイルスおよびアデノ随伴ウイルス遺伝子移行法により可能であり、多くの場合、挿入された導入遺伝子の長期発現をもたらす。加えて、多くの様々な細胞種および標的組織において高形質導入効率が測定されている。
組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ：ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ａｄｅｎｏ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒｕｓ）ベクターは、非病原性欠陥パルボウイルスアデノ随伴２型ウイルスに基づく有望な代替遺伝子送達系である。すべてのベクターは、導入遺伝子発現カセットの両側に隣接するＡＡＶ １４５ｂｐ末端逆位配列のみを保持するプラスミドに由来する。形質導入された細胞のゲノムへの組込みのために、効率のよい遺伝子移行および安定な導入遺伝子送達は、このベクター系にとって重要な機能である（Ｗａｇｎｅｒら、（１９９８）Ｌａｎｃｅｔ ３５１（９１１７）：１７０２～３頁；Ｋｅａｒｎｓら、（１９９６）Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ． ９：７４８～５５頁）。また、非限定的な例により、ＡＡＶ１、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ８、ＡＡＶ８．２、ＡＡＶ９およびＡＡＶｒｈ１０を含む他のＡＡＶ血清型、ならびにＡＡＶ２／８、ＡＡＶ２／５およびＡＡＶ２／６のような偽型ＡＡＶは、本発明に従って使用することができる。一部の実施形態では、血液脳関門を通過することができるＡＡＶ血清型が使用される。
複製欠損組換えアデノウイルスベクター（Ａｄ）は、高タイターで産生し、いくつかの異なる細胞種に容易に感染することができる。ほとんどのアデノウイルスベクターは、導入遺伝子がＡｄ Ｅ１ａ、Ｅ１ｂおよび／またはＥ３遺伝子を置換するように操作されており；続いて、複製欠損ベクターを、欠失した遺伝子機能をトランスで供給するヒト２９３細胞において増殖させる。Ａｄベクターは、ｉｎ ｖｉｖｏで、肝臓、腎臓および筋肉において見出される細胞などの非分裂分化細胞を含む、多種類の組織に形質導入することができる。従来型Ａｄベクターは、大きな輸送能を有する。Ａｄベクターの臨床試験における使用例は、筋内注射による抗腫瘍免疫化のためのポリヌクレオチド療法を含んだ（Ｓｔｅｒｍａｎら、（１９９８）Ｈｕｍ． Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ． ７：１０８３～９頁）。遺伝子移行のためのアデノウイルスベクターの臨床試験における追加の使用例には、Ｒｏｓｅｎｅｃｋｅｒら、（１９９６）Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ２４（１）：５～１０頁；Ｓｔｅｒｍａｎら、（１９９８）Ｈｕｍ． Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ． ９（７）：１０８３～１０８９頁；Ｗｅｌｓｈら、（１９９５）Ｈｕｍ． Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ． ２：２０５～１８頁；Ａｌｖａｒｅｚら、（１９９７）Ｈｕｍ． Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ． ５：５９７～６１３頁；Ｔｏｐｆら、（１９９８）Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ． ５：５０７～５１３頁；Ｓｔｅｒｍａｎら、（１９９８）Ｈｕｍ． Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ． ７：１０８３～１０８９頁が含まれる。
パッケージング細胞は、宿主細胞に感染することができるウイルス粒子を形成するために使用される。そのような細胞は、アデノウイルスをパッケージングする２９３細胞、およびレトロウイルスをパッケージングするψ２細胞またはＰＡ３１７細胞を含む。遺伝子療法において使用されるウイルスベクターは、通常、核酸ベクターをウイルス粒子にパッケージングする産生細胞株によって生成される。ベクターは、典型的に、パッケージングおよび次の宿主への組込み（適用可能な場合）に必要とされる最小ウイルス配列を含有し、他のウイルス配列は、発現するべきタンパク質をコードする発現カセットによって置換される。失われているウイルス機能は、パッケージング細胞株によってトランスで供給される。例えば、遺伝子療法において使用されるＡＡＶベクターは、典型的に、パッケージングおよび宿主ゲノムへの組込みに必要とされる、ＡＡＶゲノムからの末端逆位配列（ＩＴＲ：ｉｎｖｅｒｔｅｄ ｔｅｒｍｉｎａｌ ｒｅｐｅａｔ）のみを所有する。ウイルスＤＮＡは、他のＡＡＶ遺伝子、つまりｒｅｐおよびｃａｐをコードするが、ＩＴＲ配列を欠くヘルパープラスミドを含有する細胞株にパッケージングされる。また、細胞株を、ヘルパーとしてのアデノウイルスに感染させる。ヘルパーウイルスは、ＡＡＶベクターの複製、およびヘルパープラスミドからのＡＡＶ遺伝子の発現を促進する。ヘルパープラスミドは、ＩＴＲ配列の欠如のために大量にはパッケージングされない。アデノウイルスの混入は、例えば、アデノウイルスがＡＡＶよりも感受性である熱処理によって低減することができる。
本明細書に記載される遺伝子改変細胞を含む組成物は、輸注による様式を含む、任意の好適な様式で対象に送達することができる。遺伝子改変細胞を含む組成物の投与前に、対象は、１つまたはそれ以上の骨髄破壊調整剤、例えば、約０．５～５ｍｇ／ｋｇで１回もしくはそれ以上で静脈内（ＩＶ）；約３．２ｍｇ／ｋｇ／日でＩＶ；０日目の遺伝子改変細胞を含む組成物の輸注前の、輸注の６～３日前の４日間の総用量約１２．８ｍｇ／ｋｇの中心静脈カテーテルを介したＩＶ；または１日１回もしくは６時間毎のＩＶで投与されるブスルファンにより１回またはそれ以上処置（投与）してもよい。
任意の用量、例えば、細胞約３×１０６個／ｋｇ～細胞約２０×１０６個／ｋｇの遺伝子改変細胞を使用することができる（例えば、細胞が、細胞約１×１０７個／ｍＬの濃度で、１袋当たり細胞約１．０～２．０×１０８個にて製剤化される場合）。
薬学的に許容できる担体は、一部には投与される特定の組成物によって、および組成物を投与するために使用される特定の方法によって、決定される。したがって、以下に記載されるように、使用可能な医薬組成物の好適な製剤は多様にある（例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、第１７版、１９８９を参照）。
ｅｘ ｖｉｖｏおよびｉｎ ｖｉｖｏ投与の両方のための製剤は、液中懸濁液または乳液を含む。有効成分は、多くの場合、薬学的に許容でき、かつ有効成分と適合性である賦形剤と混合される。好適な賦形剤は、例えば、水、生理食塩水、デキストロース、グリセリン、エタノール、その他およびそれらの組合せを含む。加えて、組成物は、湿潤もしくは乳化剤、ｐＨ緩衝剤、安定化剤、または医薬組成物の有効性を向上させる他の試薬のような、少量の補助物質、を含有してもよい。
適用
本発明の方法は、β－サラセミアの治療および／または予防を企図する。治療は、ＢＣＬ１１Ａタンパク質の発現を遮断するための、細胞におけるＢＣＬ１１Ａエンハンサー配列のノックアウトを含み得る。ＢＣＬ１１ａタンパク質は、胎児グロビンの発現を抑制することが公知であり、そのため、ＢＣＬ１１ＡのノックアウトはＨｂＦ遺伝子の抑制の欠如をもたらす。また、本発明の方法および組成物は、造血幹細胞においてＢＣＬ１１Ａ赤血球エンハンサーをノックアウトし、これによってこれらの細胞に由来する成熟細胞（例えば、ＲＢＣ）が、治療的ノックアウトを含有するようにすることが望ましい任意の状況において使用することができる。これらの幹細胞は、ｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏで分化することができ、すべての対象に使用することができる普遍的ドナー種の細胞に由来し得る。加えて、細胞は、体内で細胞を輸送するための膜貫通タンパク質を含有し得る。また、治療は、治療用導入遺伝子を含有する対象細胞の使用を含んでもよく、ここでは、細胞をｅｘ ｖｉｖｏで発達させ、その後、対象に導入し戻す。例えば、ＢＣＬ１１Ａ赤血球エンハンサーノックアウトを含有するＨＳＣ／ＰＣは、自家骨髄移植により対象に挿入することができる。
したがって、この技術は、対象がそれらのＢ－グロビン遺伝子の変異またはその発現の欠損を有する状態における、使用の技術であり得る。ヘモグロビン鎖をコードする配列における遺伝的欠陥は、鎌状赤血球貧血およびベータサラセミアを含む異常ヘモグロビン症として公知の１群の疾患の原因であり得る。軽症型サラセミアでは、βグロビン対立遺伝子のうちの１つのみが変異を有する。個体は小球性貧血を患い、検出は通常、正常血球体積平均値よりも低いもの（＜８０ｆＬ）を含む。軽症型サラセミアを有する対象の対立遺伝子は、β＋／βまたはβ０／βである（ここで、「β＋」とは、いくらかの量のβ鎖形成が起こることを可能にする対立遺伝子を指し、「β」とは、野生型βグロビン対立遺伝子を指し、「β０」とは、ベータ－グロビン発現の完全な非存在に関連するβグロビン変異を指す）。中間型サラセミア対象は、多くの場合、通常の生活をなんとか送ることができるが、彼らの貧血の重症度によって、とりわけ病気または妊娠時に、時々の輸血を必要とし得る。これらの患者の対立遺伝子は、β＋／β＋またはβ０／β＋であり得る。重症型サラセミアは、両方の対立遺伝子がサラセミア変異（β０／β０）を有する場合に起こる。これは、重度の小球性および低色素性貧血である。治療しない場合、それは貧血、脾腫および重度の骨変形を引き起こし、進行して２０歳前に死亡する。治療は、周期的血液輸血；脾腫のための脾摘出、および輸血により引き起こされた鉄過剰のキレート化からなる。また、骨髄移植は、適切なドナーを特定することができる場合、重度のサラセミアを有する人の治療のために使用されるが、この手技は、かなりのリスクを有し得る。異常ヘモグロビン症を有する患者の大部分において、ガンマグロビンをコードする遺伝子は存在したままであるが、出産頃に起こる正常な遺伝子抑制のために発現が比較的低い。
一部の適用では、β－サラセミア（例えば、重症型β－サラセミア（ＴＤＴ）または軽症型β－サラセミア）を有するヒト対象における、本発明の方法および組成物により治療していない対象と比較した、サラセミア関連疾患バイオマーカーの改善または維持（低下の減速）の方法が、本明細書で提供される。他の適用では、β－サラセミアを有する対象において、本発明の方法および組成物による治療前の対象と比較して、ＰＲＢＣまたは他の血液製剤輸注についての必要性（用量レベルまたは頻度）を減少させる方法が、本明細書で提供される。また別の態様では、β－サラセミアを有する患者において、慢性的血液製剤輸注から起こる鉄過剰を低減する方法が、本明細書で提供される。
したがって、対象におけるＨｂＦ産生が増大し、β－サラセミアの１つまたはそれ以上の臨床症状が減少するように、ＢＣＬ１１Ａが細胞において不活性化されている遺伝子改変細胞を、対象に投与することによって（例えば、輸注によって）、治療を必要とする対象においてベータ－サラセミア（例えば、ＴＤＴ）を治療する方法が、本明細書で提供される。治療されるＴＤＴを有する対象は、以下のもののうちの１つまたはそれ以上を示し得る：（１）グラム／血漿ｄＬ、および／もしくは総Ｈｂ中のＨｂＦパーセントにおける臨床検査ヘモグロビン画分（成人ヘモグロビン、ＨｂＡ、および胎児ヘモグロビン、ＨｂＦ）のベースラインからの変化；（２）鉄代謝のバイオマーカーのような、サラセミア関連疾患バイオマーカー；および／もしくはエリスロポエチン、ハプトグロビンおよび／もしくはヘプシジンのレベルの変更（例えば、正常レベルへの、または正常レベルに近い）；（３）ベースライン輸血療法に伴う鉄過剰に関連する、対象における症状の低減もしくは除去であって、場合により、内分泌機能異常の減少が、対象における甲状腺ホルモン、ＩＧＦ－１、起床時コルチゾール、副腎皮質刺激ホルモン（ＡＣＴＨ）、ＨｂＡ１Ｃ、ビタミンＤ、ＨｂＡ、ＨｂＦ、エリスロポエチン、ハプトグロビン、ヘプシジン、甲状腺ホルモン、ＩＧＦ－１、コルチゾール、ＡＣＴＨおよび／もしくはビタミンＤのレベルおよび／もしくは活性を測定することによってアッセイされる、症状の低減もしくは除去；（４）ＰＲＢＣ輸血、血小板輸注、ＩＶＩＧ、血漿輸血および／もしくは顆粒球輸血を含む血液製剤輸注についての必要性の低減もしくは除去；（５）肝疾患の低減もしくは除去；（６）心臓異常の低減もしくは除去；（７）骨粗鬆症および／もしくは骨折の低減および／もしくは除去、および／もしくは骨塩量におけるベースラインからの変化；（８）非定型形態（例えば、過形成）および／もしくは未成熟赤血球系細胞の数の低減もしくは除去；ならびに／または（９）Ｆ細胞の数およびパーセントにおけるベースライン（治療前レベル）からの変化。
カルノフスキー・パフォーマンス・スケール（Ｋａｒｎｏｆｓｋｙ Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ Ｓｃａｌｅ）は、患者における機能障害を評価するための単純で広く受け入れられているツールである。各対象は、カルノフスキー・パフォーマンス・ステイタス・スケール・ディフィニションズ・レイティング・クライテリア（Ｋａｒｎｏｆｓｋｙ Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ Ｓｔａｔｕｓ Ｓｃａｌｅ Ｄｅｆｉｎｉｔｉｏｎｓ Ｒａｔｉｎｇ Ｃｒｉｔｅｒｉａ）を使用して特定の来院時に評価およびスコア付けされる。スクリーニング来院時にカルノフスキー・パフォーマンス・スケールについて６０以下のスコアを有する対象は、本研究に参加するのに適格ではない。ベースラインからの変化を評価する。
遺伝子改変細胞は、幹細胞（例えば、ＣＤ３４＋ＨＳＣ／ＰＣ、ＳＴ－４００）であってもよく、自家性または同種性（例えば、健康なドナーから単離された）であってもよく、同種細胞は、例えば、同種細胞から１つまたはそれ以上の自己抗原（例えば、ＨＬＡ複合体）を除去するように、さらに（例えば、ＢＣＬ１１Ａ不活性化に加えて）改変してもよい。例えば、米国特許第８，９４５，８６８号；同第１０，０７２，０６２号；米国特許出願公開第２０１８／０３６２９２６号を参照。自家細胞は、対象を１用量もしくはそれ以上のＧ－ＣＳＦおよび／または１用量もしくはそれ以上のプレリキサフォルにより処置することによって、ｅｘ ｖｉｖｏでの改変前に対象において動員してもよく、動員した細胞は、１回またはそれ以上のアフェレーシス周期によって回収される。場合により、少なくとも約２５×１０６個／ｋｇのＣＤ３４＋ＨＳＰＣが、対象において動員される。細胞は、１つまたはそれ以上のヌクレアーゼを使用してＢＣＬ１１Ａを不活性化するように遺伝子改変してもよく、例えば、ヌクレアーゼは、本明細書で開示されるようにｍＲＮＡ（配列番号１５および配列番号１６）として細胞に導入される。ｅｘ ｖｉｖｏでの遺伝子改変後、細胞を、ＢＣＬ１１Ａ内の挿入および／または欠失について評価してもよい。
また、治療される対象は、遺伝子改変細胞の投与前に（例えば、治療の１０～１日前に）、１つまたはそれ以上の骨髄破壊剤で事前処置してもよく、例えば、ブスルファンの静脈内（ＩＶ）投与は、約０．５～５ｍｇ／ｋｇ（またはその間の任意の値）を１回もしくはそれ以上であるか；ブスルファンのＩＶ投与は、約３．２ｍｇ／ｋｇ／日であるか；０日目の改変ＨＳＰＣの輸注前の、輸注の６～３日前の４日間の総用量約１２．８ｍｇ／ｋｇの中心静脈カテーテルを介したＩＶ；またはブスルファンのＩＶ投与は、１日１回（例えば、４用量）もしくは６時間毎（全部で１６用量）である。非限定的に、細胞約３×１０６個／ｋｇ～細胞約２０×１０６個／ｋｇを含む、任意の用量の遺伝子改変細胞を使用することができ、場合により、細胞は、ＤＭＳＯ１０％を含有する不溶解性凍結保存媒体に製剤化される。細胞は、任意の好適な容器または包装に、例えば、輸注袋に製剤化してもよい（例えば、細胞約１×１０７個／ｍＬの濃度で、１袋当たり細胞約１．０～２．０×１０８個を含む）。
本明細書で使用される場合、用語「およそ」または「約」は、目的の１つまたはそれ以上の値に適用される場合、言及される参照値と同様である値を指す。ある特定の実施形態では、この用語は、別に言及されるか、または別のように文脈から明らかでない限り、言及される参照値のいずれかの方向の（参照値より大きいか、または参照値より小さい）１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、１％以内またはそれ以下に入るある範囲の値を指す。
以下の実施例は、ヌクレアーゼがジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）またはＴＡＬＥＮを含む本開示の例示的な実施形態に関する。これは、例示の目的のためのみであり、他のヌクレアーゼまたはヌクレアーゼ系、例えば、操作したＤＮＡ結合ドメインを有するホーミングエンドヌクレアーゼ（メガヌクレアーゼ）、および／または天然に存在するもしくは操作したホーミングエンドヌクレアーゼ（メガヌクレアーゼ）ＤＮＡ結合ドメインと異種の切断ドメインとの融合物、および／または操作したシングルガイドＲＮＡを含むＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系を使用してもよいことが理解される。
ＺＦＮ設計
ＺＦＮ対は、ヒトゲノムのＧＲＣｈ３８／ｈｇ３８アセンブリ中の位置ｃｈｒ２：６０，４９５，２５０～６０，４９５，２９０でヒトＢＣＬ１１Ａ遺伝子の赤血球特異的エンハンサー中の３３塩基対（組合せ）標的部位に結合する６－フィンガーＺＦＮ（ｍＲＮＡ ＳＢ－ｍＲＥＮＨ１によってコードされる）および５－フィンガーＺＦＮ（ｍＲＮＡ ＳＢ－ｍＲＥＮＨ２によってコードされる）から構成されている。ＺＦＮおよびそれらをコードするポリヌクレオチドの調製は以下のとおり：ＳＢ－ｍＲＥＮＨ１およびＳＢ－ｍＲＥＮＨ２ ｍＲＮＡは、当技術分野において公知の方法によってｉｎ ｖｉｔｒｏで産生される。ｍＲＮＡは、ＺＦＮパートナーをコードする配列を含み、核局在化配列およびペプチドのような機能も含む。表１は、各パートナーＺＦＮと会合したヘリックスを示す（米国特許第１０，５６３，１８４号；米国特許出願公開第２０１８／００８７０７２号を参照）：
Figure 2022519949000002
ＳＢ－ｍＲＥＮＨ１ ｍＲＮＡの完全なヌクレオチド配列（１７２５ヌクレオチド）を下に示す。
５’ｇｇｇａｇａｃａａｇｃｕｕｕｇａａｕｕａｃａａｇｃｕｕｇｃｕｕｇｕｕｃｕｕｕｕｕｇｃａｇａａｇｃｕｃａｇａａｕａａａｃｇｃｕｃａａｃｕｕｕｇｇｃａｇａｕｃｇａａｕｕｃｇｃｃａｕｇｇａｃｕａｃａａａｇａｃｃａｕｇａｃｇｇｕｇａｕｕａｕａａａｇａｕｃａｕｇａｃａｕｃｇａｕｕａｃａａｇｇａｕｇａｃｇａｕｇａｃａａｇａｕｇｇｃｃｃｃｃａａｇａａｇａａｇａｇｇａａｇｇｕｃｇｇｃａｕｃｃａｃｇｇｇｇｕａｃｃｃｇｃｃｇｃｕａｕｇｇｃｕｇａｇａｇｇｃｃｃｕｕｃｃａｇｕｇｕｃｇａａｕｃｕｇｃａｕｇｃａｇａａｃｕｕｃａｇｕｇａｃｃａｇｕｃｃａａｃｃｕｇｃｇｃｇｃｃｃａｃａｕｃｃｇｃａｃｃｃａｃａｃｃｇｇｃｇａｇａａｇｃｃｕｕｕｕｇｃｃｕｇｕｇａｃａｕｕｕｇｕｇｇｇａｇｇａａａｕｕｕｇｃｃｃｇｃａａｃｕｕｃｕｃｃｃｕｇａｃｃａｕｇｃａｕａｃｃａａｇａｕａｃａｃａｃｇｇｇｃａｇｃｃａａａａｇｃｃｃｕｕｃｃａｇｕｇｕｃｇａａｕｃｕｇｃａｕｇｃａｇａａｃｕｕｃａｇｕｕｃｃａｃｃｇｇｃａａｃｃｕｇａｃｃａａｃｃａｃａｕｃｃｇｃａｃｃｃａｃａｃｃｇｇｃｇａｇａａｇｃｃｕｕｕｕｇｃｃｕｇｕｇａｃａｕｕｕｇｕｇｇｇａｇｇａａａｕｕｕｇｃｃａｃｃｕｃｃｇｇｃｕｃｃｃｕｇａｃｃｃｇｃｃａｕａｃｃａａｇａｕａｃａｃａｃｇｃａｃｃｃｇｃｇｃｇｃｃｃｃｇａｕｃｃｃｇａａｇｃｃｃｕｕｃｃａｇｕｇｕｃｇａａｕｃｕｇｃａｕｇｃａｇａａｃｕｕｃａｇｕｇａｃｃａｇｕｃｃａａｃｃｕｇｃｇｃｇｃｃｃａｃａｕｃｃｇｃａｃｃｃａｃａｃｃｇｇｃｇａｇａａｇｃｃｕｕｕｕｇｃｃｕｇｕｇａｃａｕｕｕｇｕｇｇｇａｇｇａａａｕｕｕｇｃｃｇｃｃｃａｇｕｇｕｕｇｕｃｕｇｕｕｃｃａｃｃａｕａｃｃａａｇａｕａｃａｃｃｕｇｃｇｇｇｇａｕｃｃａｕｃａｇｃａｇａｇｃｃａｇａｃｃａｃｕｇａａｃｃｃｇｃａｃｃｃｇｇａｇｃｕｇｇａｇｇａｇａａｇａａｇｕｃｃｇａｇｃｕｇｃｇｇｃａｃａａｇｃｕｇａａｇｕａｃｇｕｇｃｃｃｃａｃｇａｇｕａｃａｕｃｇａｇｃｕｇａｕｃｇａｇａｕｃｇｃｃａｇｇａａｃａｇｃａｃｃｃａｇｇａｃｃｇｃａｕｃｃｕｇｇａｇａｕｇａａｇｇｕｇａｕｇｇａｇｕｕｃｕｕｃａｕｇａａｇｇｕｇｕａｃｇｇｃｕａｃａｇｇｇｇａａａｇｃａｃｃｕｇｇｇｃｇｇａａｇｃａｇａａａｇｃｃｕｇａｃｇｇｃｇｃｃａｕｃｕａｕａｃａｇｕｇｇｇｃａｇｃｃｃｃａｕｃｇａｕｕａｃｇｇｃｇｕｇａｕｃｇｕｇｇａｃａｃａａａｇｇｃｃｕａｃａｇｃｇｇｃｇｇｃｕａｃａａｕｃｕｇｃｃｕａｕｃｇｇｃｃａｇｇｃｃｇａｃｇａｇａｕｇｇａｇａｇａｕａｃｇｕｇｇａｇｇａｇａａｃｃａｇａｃｃｃｇｇｇａｕａａｇｃａｃｃｕｃａａｃｃｃｃａａｃｇａｇｕｇｇｕｇｇａａｇｇｕｇｕａｃｃｃｕａｇｃａｇｃｇｕｇａｃｃｇａｇｕｕｃａａｇｕｕｃｃｕｇｕｕｃｇｕｇａｇｃｇｇｃｃａｃｕｕｃａａｇｇｇｃａａｃｕａｃａａｇｇｃｃｃａｇｃｕｇａｃｃａｇｇｃｕｇａａｃｃａｃａｕｃａｃｃａａｃｕｇｃａａｕｇｇｃｇｃｃｇｕｇｃｕｇａｇｃｇｕｇｇａｇｇａｇｃｕｇｃｕｇａｕｃｇｇｃｇｇｃｇａｇａｕｇａｕｃａａａｇｃｃｇｇｃａｃｃｃｕｇａｃａｃｕｇｇａｇｇａｇｇｕｇｃｇｇｃｇｃａａｇｕｕｃａａｃａａｃｇｇｃｇａｇａｕｃａａｃｕｕｃａｇａｕｃｕｕｇａｕａａｃｕｃｇａｇｕｃｕａｇａａｇｃｕｃｇｃｕｕｕｃｕｕｇｃｕｇｕｃｃａａｕｕｕｃｕａｕｕａａａｇｇｕｕｃｃｕｕｕｇｕｕｃｃｃｕａａｇｕｃｃａａｃｕａｃｕａａａｃｕｇｇｇｇｇａｕａｕｕａｕｇａａｇｇｇｃｃｕｕｇａｇｃａｕｃｕｇｇａｕｕｃｕｇｃｃｕａａｕａａａａａａｃａｕｕｕａｕｕｕｕｃａｕｕｇｃｕｇｃｇｃｕａｇａａｇｃｕｃｇｃｕｕｕｃｕｕｇｃｕｇｕｃｃａａｕｕｕｃｕａｕｕａａａｇｇｕｕｃｃｕｕｕｇｕｕｃｃｃｕａａｇｕｃｃａａｃｕａｃｕａａａｃｕｇｇｇｇｇａｕａｕｕａｕｇａａｇｇｇｃｃｕｕｇａｇｃａｕｃｕｇｇａｕｕｃｕｇｃｃｕａａｕａａａａａａｃａｕｕｕａｕｕｕｕｃａｕｕｇｃｕｇｃｇｇｇａｃａｕｕｃｕｕａａｕｕａａａａａａａａａａａａａａａａａａａａａａａａａａａａａａａａａａａａａａａａａａａａａａａａａａａａａａａａａａａａｃｕａｇ（配列番号１５）
さらに、ＳＢ－ｍＲＥＮＨ２ ｍＲＮＡについての完全なヌクレオチド配列（１６８０ヌクレオチド）を下に示す：
５’ｇｇｇａｇａｃａａｇｃｕｕｇａａｕａｃａａｇｃｕｕｇｃｕｕｇｕｕｃｕｕｕｕｕｇｃａｇａａｇｃｕｃａｇａａｕａａａｃｇｃｕｃａａｃｕｕｕｇｇｃａｇａｕｃｇａａｕｕｃｇｃｃｕａｇａｇａｕｃｕｇｇｃｇｇｃｇｇａｇａｇｇｇｃａｇａｇｇａａｇｕｃｕｕｃｕａａｃｃｕｇｃｇｇｕｇａｃｇｕｇｇａｇｇａｇａａｕｃｃｃｇｇｃｃｃｕａｇｇａｃｃａｕｇｇａｃｕａｃａａａｇａｃｃａｕｇａｃｇｇｕｇａｕｕａｕａａａｇａｕｃａｕｇａｃａｕｃｇａｕｕａｃａａｇｇａｕｇａｃｇａｕｇａｃａａｇａｕｇｇｃｃｃｃｃａａｇａａｇａａｇａｇｇａａｇｇｕｃｇｇｃａｕｕｃａｕｇｇｇｇｕａｃｃｃｇｃｃｇｃｕａｕｇｇｃｕｇａｇａｇｇｃｃｃｕｕｃｃａｇｕｇｕｃｇａａｕｃｕｇｃａｕｇｃａｇａａｇｕｕｕｇｃｃｃｇｃａａｃｇａｃｃａｃｃｇｃａｃｃａｃｃｃａｕａｃｃａａｇａｕａｃａｃａｃｇｇｇｃｇａｇａａｇｃｃｃｕｕｃｃａｇｕｇｕｃｇａａｕｃｕｇｃａｕｇｃａｇａａｃｕｕｃａｇｕｃａｇａａｇｇｃｃｃａｃｃｕｇａｕｃｃｇｃｃａｃａｕｃｃｇｃａｃｃｃａｃａｃｃｇｇｃｇａｇａａｇｃｃｕｕｕｕｇｃｃｕｇｕｇａｃａｕｕｕｇｕｇｇｇａｇｇａａａｕｕｕｇｃｃｃａｇａａｇｇｇｃａｃｃｃｕｇｇｇｃｇａｇｃａｕａｃｃａａｇａｕａｃａｃａｃｇｇｇａｕｃｕｃａｇａａｇｃｃｃｕｕｃｃａｇｕｇｕｃｇａａｕｃｕｇｃａｕｇｃａｇａａｃｕｕｃａｇｕｃｇｃｇｇｃｃｇｃｇａｃｃｕｇｕｃｃｃｇｃｃａｃａｕｃｃｇｃａｃｃｃａｃａｃｃｇｇｃｇａｇａａｇｃｃｕｕｕｕｇｃｃｕｇｕｇａｃａｕｕｕｇｕｇｇｇａｇｇａａａｕｕｕｇｃｃｃｇｃｃｇｃｇａｃａａｃｃｕｇｃａｃｕｃｃｃａｕａｃｃａａｇａｕａｃａｃｃｕｇｃｇｇｇｇａｕｃｃｃａｇｃｕｇｇｕｇａａｇａｇｃｇａｇｃｕｇｇａｇｇａｇａａｇａａｇｕｃｃｇａｇｃｕｇｃｇｇｃａｃａａｇｃｕｇａａｇｕａｃｇｕｇｃｃｃｃａｃｇａｇｕａｃａｕｃｇａｇｃｕｇａｕｃｇａｇａｕｃｇｃｃａｇｇａａｃａｇｃａｃｃｃａｇｇａｃｃｇｃａｕｃｃｕｇｇａｇａｕｇａａｇｇｕｇａｕｇｇａｇｕｕｃｕｕｃａｕｇａａｇｇｕｇｕａｃｇｇｃｕａｃａｇｇｇｇａａａｇｃａｃｃｕｇｇｇｃｇｇａａｇｃａｇａａａｇｃｃｕｇａｃｇｇｃｇｃｃａｕｃｕａｕａｃａｇｕｇｇｇｃａｇｃｃｃｃａｕｃｇａｕｕａｃｇｇｃｇｕｇａｕｃｇｕｇｇａｃａｃａａａｇｇｃｃｕａｃａｇｃｇｇｃｇｇｃｕａｃａａｕｃｕｇｃｃｕａｕｃｇｇｃｃａｇｇｃｃｇａｃｇａｇａｕｇｃａｇａｇａｕａｃｇｕｇａａｇｇａｇａａｃｃａｇａｃｃｃｇｇａａｕａａｇｃａｃａｕｃａａｃｃｃｃａａｃｇａｇｕｇｇｕｇｇａａｇｇｕｇｕａｃｃｃｕａｇｃａｇｃｇｕｇａｃｃｇａｇｕｕｃａａｇｕｕｃｃｕｇｕｕｃｇｕｇａｇｃｇｇｃｃａｃｕｕｃａｇｃｇｇｃａａｃｕａｃａａｇｇｃｃｃａｇｃｕｇａｃｃａｇｇｃｕｇａａｃｃｇｃａａａａｃｃａａｃｕｇｃａａｕｇｇｃｇｃｃｇｕｇｃｕｇａｇｃｇｕｇｇａｇｇａｇｃｕｇｃｕｇａｕｃｇｇｃｇｇｃｇａｇａｕｇａｕｃａａａｇｃｃｇｇｃａｃｃｃｕｇａｃａｃｕｇｇａｇｇａｇｇｕｇｃｇｇｃｇｃａａｇｕｕｃａａｃａａｃｇｇｃｇａｇａｕｃａａｃｕｕｃｕｇａｕａａｃｕｃｇａｇｕｃｕａｇａａｇｃｕｃｇｃｕｕｕｃｕｕｇｃｕｇｕｃｃａａｕｕｕｃｕａｕｕａａａｇｇｕｕｃｃｕｕｕｇｕｕｃｃｃｕａａｇｕｃｃａａｃｕａｃｕａａａｃｕｇｇｇｇｇａｕａｕｕａｕｇａａｇｇｇｃｃｕｕｇａｇｃａｕｃｕｇｇａｕｕｃｕｇｃｃｕａａｕａａａａａａｃａｕｕｕａｕｕｕｕｃａｕｕｇｃｕｇｃｇｃｕａｇａａｇｃｕｃｇｃｕｕｕｃｕｕｇｃｕｇｕｃｃａａｕｕｕｃｕａｕｕａａａｇｇｕｕｃｃｕｕｕｇｕｕｃｃｃｕａａｇｕｃｃａａｃｕａｃｕａａａｃｕｇｇｇｇｇａｕａｕｕａｕｇａａｇｇｇｃｃｕｕｇａｇｃａｕｃｕｇｇａｕｕｃｕｇｃｃｕａａｕａａａａａａｃａｕｕｕａｕｕｕｕｃａｕｕｇｃｕｇｃｇｇｇａｃａｕｕｃｕｕａａｕｕａａａａａａａａａａａａａａａａａａａａａａａａａａａａａａａａａａａａａａａａａａａａａａａａａａａａａａａａａａａａｃｕａｇ（配列番号１６）
細胞改変方法開発
ｉｎ ｖｉｔｒｏ研究：動員されたヒトＣＤ３４＋ＨＳＰＣを健康な対象からアフェレーシスによって回収し、精製した。精製したＨＳＰＣをＺＦＮ ｍＲＮＡ ＳＢ－ｍＲＥＮＨ１およびＳＢｍＲＥＮＨ２を用いてトランスフェクトした。同じ対象からの未トランスフェクトＣＤ３４＋ＨＳＰＣを対照とした。トランスフェクション４８時間後、トランスフェクトしたＣＤ３４＋ＨＳＰＣ（「ＳＴ－４００」）を採取し、ｉｎ ｖｉｔｒｏ研究での使用のために凍結した。
ＢＣＬ１１Ａ遺伝子のヒト赤血球特異的エンハンサーのＺＦＮ媒介遺伝子編集の効果を分析するために、上記由来の改変細胞を３ステップ液体培養物中でのプロ赤血球サイトカインとの２１日間の培養を含む「ｃＲＢＣプール分化」として公知のｉｎ ｖｉｔｒｏ赤血球生成モデルに置いた（Ｇｉａｒｒａｔａｎａら、（２０１１）Ｂｌｏｏｄ １１８（１９）：５０７１頁）。ＢＣＬ１１Ａエンハンサー遺伝子改変を、赤血球細胞の大部分の脱核に先立つ、ｉｎ ｖｉｔｒｏ分化開始のトランスフェクション２日後およびｉｎ ｖｉｔｒｏ分化の１４日目に採取したＤＮＡサンプル中でＭｉＳｅｑディープシーケンシングによってＳＴ－４００において測定した。トランスフェクトした細胞におけるＢＣＬ１１Ａエンハンサー遺伝子座の改変は、臨床材料の産生の際に予測される範囲内の約７５％インデルを含んだ。遺伝子改変レベルは、未トランスフェクト対照ＨＳＰＣにおいて≦０．２％であった。
細胞増殖（増殖（expansion））を赤血球分化の経過にわたってモニタリングした。脱核、赤血球成熟の測定を、２１日目に判定した。トランスフェクトしたＨＳＰＣの増殖は、約２５００～９０００倍の範囲であり、未トランスフェクトＨＳＰＣと比べておよそ２分の１であり、早期細胞増殖へのトランスフェクション手順の影響を反映していた。脱核された細胞のパーセントは、トランスフェクトされたおよび未トランスフェクトの細胞の間で異ならなかった（両方の場合について約５９～６２％の範囲）。
２１日目（赤血球分化のエンドポイント）で単離したタンパク質サンプルの逆相ＵＰＬＣを、トランスフェクトしたＨＳＰＣの赤血球後代においてα－、β－およびγ－グロビンレベルを測定するために使用した。
図２に示すとおり、γ－グロビンのβ－グロビンに対する比およびγ－グロビンのα－グロビンに対する比は、未トランスフェクトＨＳＰＣと比較してＳＴ－４００の赤血球後代においておよそ３から４倍増加していた。この発見は、標的化遺伝子改変が、γ－グロビンタンパク質の上昇をもたらしたことを実証し、これはＴＤＴを有する患者の赤血球細胞におけるＨｂＦレベルを上昇させるはずである。γ－グロビンレベルにおける観察された上昇は、ＢＣＬ１１Ａを標的化する他の方法について公開されたもの（Ｗｉｌｂｅｒら、（２０１１）Ｂｌｏｏｄ １１７（１０）：２８１７～２６頁）およびＢＣＬ１１Ａハプロ不全を有する患者において検出されたもの（Ｂａｓａｋら、（２０１５）Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ １２５（６）：２３６３～８頁；Ｆｕｎｎｅｌｌら、（２０１５）Ｂｌｏｏｄ １２６（１）：８９～９３頁）と同様である。
改変ＨＳＰＣの機能的潜在力のアセスメント（増殖および造血系系列への分化として評価した）のために、ＣＦＵアッセイにおいて一定数のインプット細胞によって形成されたコロニーの数および形態を使用した。同じ対象由来の未トランスフェクトＣＤ３４＋ＨＳＰＣを陰性対照として使用した。ＣＦＵアッセイを標準の手順を使用して実施した。簡潔には、それぞれ細胞１００または３００個の３回反復の培養物を６ウェルプレートに蒔き、１４日間インキュベートし、その時点で培養物をコロニー数およびコロニーの種類についてスコア化した。解凍後の生存率は、同等であった（トランスフェクトされたＨＳＰＣにおいて約７２％～８３％；未トランスフェクトＨＳＰＣにおいて約９６％）。トランスフェクトされたＨＳＰＣのプレーティング効能パーセントは、未トランスフェクトＨＳＰＣでの３７．３％～７５．０％と比較して、１５．７％～４５．７％の範囲であった。ＳＴ－４００のプレーティング効率は、遺伝子改変細胞を用いた他の研究において報告された範囲内であり（Ｄｅｖｅｒら、（２０１６）Ｎａｔｕｒｅ ５３９（７６２９）：３８４～３８９頁；Ｗｕら、（２００１）Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ ８（５）：３８４～９０頁）、未トランスフェクトＨＳＰＣと比較して低い効率は、電気穿孔法および遺伝子改変の影響によると考えられる。
表２に示すとおり、改変ＨＳＰＣは、赤血球始原細胞（ＣＦＵ－ＥおよびＢＦＵ－Ｅ）、顆粒球／マクロファージ始原細胞（ＣＦＵ－Ｇ／Ｍ／ＧＭ）および多分化能始原細胞（ＣＦＵ－ＧＥＭＭ）を含むすべての造血系系列に分化した。改変ＨＳＰＣ由来のＣＦＵ－Ｅの百分率は、未トランスフェクトＨＳＰＣのものと類似しており、ＣＦＵ－Ｇ／Ｍ／ＧＭおよびＣＦＵ－ＧＥＭＭの百分率は、ごくわずかに異なるだけであった。したがって、ＺＦＮ ｍＲＮＡ ＳＢ－ｍＲＥＮＨ１およびＳＢ－ｍＲＥＮＨ２を用いたトランスフェクションおよび遺伝的改変は、改変ＨＳＰＣの分化能にごくわずかな影響を有するまたは影響を有さない。
Figure 2022519949000003
ＳＴ－４００－トランスフェクト線維芽細胞によるソフトアガーでのコロニー形成：形質転換／腫瘍形成能のアセスメントのために、ＺＦＮ ｍＲＮＡ ＳＢ－ｍＲＥＮＨ１－およびＳＢ－ｍＲＥＮＨ２を用いてトランスフェクトしたヒトＷＩ－３８線維芽細胞の足場非依存性増殖をソフトアガー形質転換アッセイで評価した。遺伝子改変レベルを、未トランスフェクトＷＩ－３８細胞における約０．３％と比較して、遺伝子改変ＷＩ－３８細胞において約７３％インデルと測定された。トランスフェクトされたおよび未トランスフェクトＷＩ－３８細胞の足場非依存性増殖はいずれの時点でも観察されなかった。結果は、ＺＦＮ ｍＲＮＡ ＳＢ－ｍＲＥＮＨ１およびＳＢ－ｍＲＥＮＨ２を用いたトランスフェクション、およびＷＩ－３８細胞中のＢＣＬ１１Ａ遺伝子の赤血球特異的エンハンサーで生じたＺＦＮ－媒介破壊が、腫瘍形成能を促進しなかったことを示している。
改変ＣＤ３４＋ＨＳＰＣの核型分析：核型分析を改変ＨＳＰＣを用いて実行した。特定の標的遺伝子座でゲノム中にＤＳＢを誘導するようにＺＦＮを設計する。それらの作用の機構を考慮すると、ＺＦＮのオフターゲット活性が計画外の遺伝的変化を生じる可能性がある。個々の細胞からのスプレッド染色体（spread chromosome）（核型分析）の目視検査は、遺伝的完全性の全体的な見解を提供でき、他の、さらに標的化された検査によって見逃される場合があるラージスケールの構造または数的な染色体の変化を含む遺伝的な異常を検出できる。
全体的な染色体の形態学を評価するために、３名の健康な対象由来の改変ＨＳＰＣに核型分析を行った。同じ対象由来の未トランスフェクトＣＤ３４＋ＨＳＰＣを対照とした。ＭｉＳｅｑディープシーケンシングは、ＢＣＬ１１Ａ遺伝子の赤血球特異的エンハンサーでの遺伝子改変が、＜０．１％インデルと比較して、未トランスフェクトＨＳＰＣにおけるトランスフェクトＨＳＰＣにおいて７７％から７９％インデルであったことを示した。核型分析は、すべての細胞がヒト由来であり、全体的な染色体異常を有するものがないことを示した。改変ＨＳＰＣの細胞遺伝学的分析は、処置に関連する全体的な構造または数字的な染色体異常を示さなかった。
改変ＨＳＰＣにおける二重鎖切断：改変ＨＳＰＣを免疫組織化学によって７日間にわたるＺＦＮ活性の持続時間および特異性を評価するためにｐ５３－結合タンパク質１（５３ＢＰ１）アッセイで検査した。遺伝子改変レベルをトランスフェクション後１および２日目に評価した。５３ＢＰ１をＤＳＢの部位に、それらが生じた後２４時間以内にリクルートし、ＮＨＥＪ、ＺＦＮ－誘導ＤＳＢの修復のための主な経路、を介するＤＳＢ修復に関与させる。修復部位は、５３ＢＰ１に対する抗体を用いて免疫蛍光顕微鏡を使用して、固定細胞の核内で強く染色された別々のフォーカスとして可視化する。この方法を使用するＤＳＢのアセスメントは、真のＺＦＮ作用（オンおよびオフターゲットの両方）の不偏性の経時的測定を提供する。改変ＨＳＰＣにおけるＤＳＢを評価し、結果は、遺伝子改変レベルが５３ＢＰ１免疫染色レベルが減少しても高いままであったことを示し、５３ＢＰ１シグナルの低下が、トランスフェクトされた細胞の経時的な減少によらなかったことを実証している（図３Ａから図３Ｃ）。５３ＢＰ１フォーカス／細胞の最高レベルは、トランスフェクション後１～２日目に見出された。加えて、約５０％の細胞は、トランスフェクション後１日目に５３ＢＰ１フォーカス１個／細胞（ＤＳＢ １個／細胞）およびトランスフェクション後７日目に約８％の細胞（未トランスフェクト細胞を用いて見られたバックグラウンドレベルと同様）を示した。ＢＣＬ１１Ａエンハンサー標的での遺伝子改変は、トランスフェクション後１および２日目に７３．５％および７８．５％であった。
改変ＨＳＰＣでの移行アッセイ。分子移行アッセイを潜在的な移行事象を評価するために改変ＨＳＰＣを用いて実施した。オンターゲット遺伝子座（ＢＣＬ１１Ａエンハンサー）とすべての公知のオフターゲット切断部位（これまでに１９個同定された）との間に生じた移行事象の頻度を定量した。これらの内の１２個を候補オフターゲット部位の標準の、ＭｉＳｅｑベースディープシーケンシングを介して同定し、約０．０１％から約０．１％の範囲のインデルレベルを得た。残りの７部位を、ウルトラディープシーケンシングＮｅｘｔＳｅｑプラットフォームを用いるオーバーサンプリングを介してさらに小さな遺伝子座パネルのさらに集中的なアセスメントを介して同定し、約０．００１％から約０．０１％のより低い範囲のインデル率を得た。これは、高感度アプローチであり、１０５個の検索されたゲノム中に１個に近い頻度での移行事象の検出を可能にし；ＢＣＬ１１Ａ赤血球エンハンサー中の目的の切断標的と以前同定された各オフターゲット部位との間の相互移行の存在およびレベルを検索するために使用した。
それにより、ＳＴ－４００ＺＦＮ対は、ＢＣＬ１１Ａ遺伝子の赤血球特異的エンハンサーに対して高度に特異的であり、わずかな量の検出可能なオフターゲット活性しか有さない。特に、ＭｉＳｅｑディープＤＮＡシーケンシングは、０．１５％以下の非常に低いレベルのオフターゲット切断を示し、ＮｅｘｔＳｅｑ分析は、０．０１％未満の極めて低いレベルのオフターゲット切断を明らかにした。比較すると、ＢＣＬ１１Ａ遺伝子の標的化赤血球特異的エンハンサーのインデルレベルは、約７９から８６％の範囲であった。これらのゲノムワイド分析は、ＢＣＬ１１Ａオンターゲット遺伝子座でのインデルレベルが、すべての同定されたオフターゲット部位を合わせた改変のレベルの３００倍を超えていることを示している。さらに、同定されたオフターゲット遺伝子座の文献調査と併せたバイオインフォマティクス分析は、重要な造血性機能に関与する遺伝子のコード領域に改変のエビデンスがなく、オフターゲット事象がヒトにおいて造血器悪性腫瘍に関連することが公知である改変をもたらさなかったことを示した。
赤血球後代におけるＳＴ－４００ＺＦＮ対によるオフターゲット転写効果：最適化ＳＴ－４００ＺＦＮ対のオフターゲット転写活性を評価するために、ＢＣＬＡ１１Ａ遺伝子に隣接する１１個の遺伝子の発現プロファイルを、ＭｉＳｅｑディープシーケンシングを使用して分析した。ＢＣＬ１１Ａ遺伝子の赤血球特異的エンハンサーでの遺伝子改変レベルが対照と比較して＞５０％と定量された時点の１４日目にＲＮＡをトランスフェクトしたＣＤ３４＋ＨＳＰＣから回収した。トランスフェクトしたＣＤ３４＋ＨＳＰＣ中のγ－グロビンｍＲＮＡのレベルは、約２倍に増加しており（１８ＲＮＡに標準化）、ＢＣＬ１１Ａ遺伝子の赤血球特異的エンハンサーにおけるＧＡＴＡ１結合部位のオンターゲット除去から生じるＢＣＬ１１Ａ発現の減少を反映していた。対照的に、ＢＣＬ１１Ａ遺伝子に隣接する１１個の遺伝子の発現レベルは、対照細胞中の１１個の遺伝子のものと同様であった。ＧＡＴＡ１によって制御される４個の他の遺伝子（ＫＬＦ１、ＳＣＬ４Ａ１、ＺＦＰＭ１およびＡＬＡＳ２）の発現レベルも影響を受けなかった。これらの結果は、ＺＦＮ ｍＲＮＡ ＳＢ－ｍＲＥＮＨ１およびＳＢ－ｍＲＥＮＨ２の活性がＢＣＬ１１Ａ遺伝子転写の抑制およびその結果としての下流効果に限られていることを示している。
移行事象を検出するために使用した方法は、ＤＮＡ定量のための標準のＴａｑＭａｎアッセイの適用であり（Ｈｏｌｌａｎｄら、（１９９１）Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ．Ｓ．Ａ．８（１６）：７２７６～７２８０頁）、ここで、ＤＮＡへのアニーリングおよび続くＤＮＡポリメラーゼによる分解でフルオロフォアを放出するプローブと共にポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を実施する。インタクトプローブでは、フルオロフォアシグナルは、共有結合で結合したクエンチャーとの相互作用を介して抑制される。プローブは、ＰＣＲプライマーによって増幅される領域内部にアニールするように設計する。それにより検出される蛍光シグナルは、サンプル中に存在する増副産物の量に比例する。ＴａｑＭａｎプライマーは、２０塩基長であるように設計され、およそ２００塩基対（ｂｐ）に広がる増副産物を生じた。プライマーを合成し、標準の脱塩を使用して精製した。蛍光プローブを２０ｂｐに広がり６０％ＧＣ含有量を有するように設計した。プローブは、バックグラウンドシグナルをさらに低減するために５’ＨＥＸレポーターダイ、３’アイオワブラックＦＱクエンチャー、および追加の内部「ＺＥＮ」クエンチャーを含有した。プローブをＨＰＬＣ精製した。
検索した移行配列が天然ヒトゲノムにおいて見出されないことから、予測される移行ジャンクションを包含する合成ＤＮＡ断片は、標準曲線を作成し、アッセイ感度を評価するために、１９個のオフターゲット遺伝子座のそれぞれについて設計される必要があった。これらの試薬の模式的描写を、対応するプライマーおよびプローブ試薬と共に図４に提供する。混入が疑われる事象では、真の移行産生物からのシーケンシングに基づく識別を可能にするために、固有の２１ｂｐ配列を各陽性対照テンプレート内のＢＣＬ１１Ａとオフターゲット由来セグメントとの間に挿入したことに注意されたい。合成２本鎖ＤＮＡ断片を、ＤＮＡ断片の長さが２８７から４３４ｂｐの範囲であるｇＢｌｏｃｋｓとして購入した。図４では、上パネルは、ＢＣＬ１１Ａエンハンサーオンターゲット部位（緑）およびオフターゲット部位（オレンジ）を包含する染色体セグメントを示す。下パネルは、対応する移行産生物の検出のための陽性対照試薬（ｇＢｌｏｃｋｓ）の概要を示す。同様に、ＴａｑＭａｎアッセイで使用されるおよそのプライマーおよびプローブ位置を示す。各ｇＢｌｏｃｋ内のくり色のセグメントは、真の移行産生物からそれを識別し、潜在的な相互汚染のモニタリングを可能にするために各対照試薬に挿入された固有の配列である。産生物１ ｇＢｌｏｃｋｓを断片のＢＣＬ１１Ａ領域において探索した。産生物２ ｇＢｌｏｃｋｓを断片のオフターゲット領域について探索した。
それぞれの探索された移行（産生物１または産生物２、図４を参照）について、未トランスフェクト細胞由来のＣＤ３４＋ゲノムＤＮＡ（ｇＤＮＡ）の１００，０００ハプロイドゲノムの文脈において、合成ｇＢｌｏｃｋ ＤＮＡの１００００、１０００、１００、１０、３、１、０．１または０．０１コピーを含有する標準曲線を作成した。標準曲線上の最も低い２点（０．１および０．０１コピー）は、陰性シグナルを生じると予測され、対照ＤＮＡ定量およびアッセイロバストネスの追加の検証を提供するように作成した。３コピー点をより高い解像度および、このアッセイについて予測される検出限界の範囲内に追加のデータポイントを提供するように含めた。１０倍希釈物を、ＣＤ３４＋ｇＤＮＡのゲノム１００，０００個を含有するチューブに移す前に、担体としてＫ５６２細胞由来の５ｎｇ／ｕＬ、ｇＤＮＡを含有するＱＩＡＧＥＮ ＤＮｅａｓｙ Ｂｌｏｏｄ ａｎｄ Ｔｉｓｓｕｅ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）からＡＥ緩衝液（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ－Ｃｌおよび０．５ｍＭ ＥＤＴＡ ｐＨ９．０）中に作製した。
反応物をＰＣＲ緩衝液、ｄＮＴＰおよびＤＮＡポリメラーゼを含有するＢｉｏ－Ｒａｄ ｄｄＰＣＲ ２× Ｓｕｐｅｒｍｉｘ（Ｂｉｏ－Ｒａｄ；Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＣＡ）を製造者のプロトコールにしたがって使用して調製した。標準曲線（ｇＢｌｏｃｋ）のためのＤＮＡテンプレートを生成した。ＮＴＣ（テンプレートを含まない対照）サンプルは、加えられるｇＢｌｏｃｋを欠いているが、未トランスフェクトＣＤ３４＋細胞由来のｇＤＮＡ ３３０ｎｇを含む。各反応物は、０．５μＭプライマーおよび０．２５μＭプローブを含有した。ＳＴ－４００の３つのロットそれぞれからゲノムＤＮＡをＱＩＡＧＥＮ ＤＮｅａｓｙ Ｂｌｏｏｄ ａｎｄ Ｔｉｓｓｕｅ Ｋｉｔを使用して精製した。各検査サンプルについて、表示のロットからのＤＮＡの１００，０００ハプロイドゲノム（３３０ｎｇ）を標準曲線を作成するために使用した条件に合致するように各反応物に加えた。すべてのサンプルおよび標準物質を３回繰り返しで実行した。ＴａｑＭａｎアッセイを製造者の説明書にしたがってＢｉｏ－Ｒａｄ ＣＦＸ９６リアルタイムＰＣＲ検出システムで実行した。使用したＰＣＲプログラムは次のとおり：９５℃を１０分間に続けて５０サイクルの９４℃を３０秒間および５９℃を１分間。
ＴａｑＭａｎアッセイをＢＣＬ１１Ａオンターゲット部位と、ＭｉＳｅｑ分析を介して同定された１２個のオフターゲット遺伝子座との間の移行のエビデンスについてＺＦＮ処置ＣＤ３４＋細胞由来のゲノムＤＮＡを検査するために実施した。これを達成するために、動員された末梢血液由来のＣＤ３４＋細胞をＲＮＡトランスフェクションおよび発現のための臨床条件を使用してＳＴ－４００ＺＦＮを用いて処置した。２日後、ｇＤＮＡを単離し、相互移行のアセスメントのために提出した（産生物１および産生物２）。表３に要約する結果は、７個のオフターゲット部位について、１０４から１０６個のハプロイドゲノムごとに１つの移行の範囲の頻度を有する非常に低い移行シグナルを明らかにした。残りの部位は、移行のエビデンスを示さなかった。
Figure 2022519949000004
改変ＨＳＰＣの臨床研究
研究を、ＴＤＴを処置するために使用する改変ＨＳＰＣの安全性を検査するためにヒトにおいて実行した。加えて、改変ＨＳＰＣの効能のアセスメントを評価した。探索的目的は、改変細胞を用いた処置後のＢＣＬ１１Ａ遺伝子の赤血球特異的エンハンサーでの遺伝子改変特徴（％および永続性）を評価すること、ならびにβ－サラセミアおよびＨＳＣＴに関連する生化学、画像的、機能的および骨髄評価への改変細胞の影響のアセスメントも含んだ。
研究のための組み入れ基準は、研究のためのスクリーニング前２年以内に年換算を基に１年あたり≦８回の確認されたＰＲＢＣ輸血事象を有し、ＴＤＴの臨床診断を有する年齢１８～４０歳の間の６名の対象（β０／β０または非β０／β０）を含んだ。同様に、β－サラセミアの確認された分子遺伝学的診断が要求された。対象は、受胎調節を使用する意志がある男性および女性を含んだ。
研究における対象についての重要な除外基準は：自己または同種間ヒト幹細胞移植または固形臓器移植の病歴；酸素親和性の臨床的に重要な変化に関連するγ－グロビン対立遺伝子のバリアント（例として、これだけに限らないが、Ｈｂ Ｆ－Ｐｏｏｌｅ、Ｈｂ Ｆ－Ｍ Ｏｓａｋａ、Ｈｂ Ｆ－Ｌａ Ｇｒａｎｇｅ、Ｈｂ Ｆ－Ｃｉｎｃｉｎｎａｔｉおよびγβ－サラセミアまたはεγδβ－サラセミアなどの大きな欠失が挙げられる）；アフェレーシスへの医学的禁忌；巨大脾腫および≦１，０００／μＬの絶対好中球数（ＡＮＣ）；血清クレアチニン≧２．０ｍｇ／ｄＬによって定義される腎臓の機能障害；先行する１２カ月間またはスクリーニング時に得られた肝臓生検に基づくブリッジング線維症、肝臓肝硬変または活動性肝炎；先行する３０日間での禁止された薬物療法を用いた処置；臨床的に重要な活動性の細菌性、ウイルス性、真菌性または寄生虫感染；スクリーニング臨床検査に基づくＨＩＶの診断または活動性ＨＢＶもしくはＨＣＶ感染のエビデンス；カルノフスキー・パフォーマンス・スケール≦６０；補正ＤＬＣＯ≦５０％の予測されるまたは臨床的に重要な制限；スクリーニング肺機能検査（ＰＦＴ）に基づく肺疾患；うっ血性心不全（ＮＹＨＡクラスＩＩＩまたはＩＶ）；不安定狭心症、非管理不整脈または左心室駆出率（ＬＶＥＦ）＜４０％、スクリーニングＥＣＧに基づくＱＴｃＦ＞５００ｍｓｅｃ、スクリーニングＭＲＩに基づく心臓性Ｔ２＊ＭＲＩ＜１０ｍｓｅｃ；顕著な出血障害の病歴；非管理発作の現在の診断；過去５年間での活動性悪性腫瘍の病歴（非メラノーマ皮膚がんまたは生体内原位置の子宮頸がんは許容される）；血液悪性腫瘍の任意の病歴または、研究候補における否定的な検査結果を有さないがん素因症候群の家族歴；研究のコンプライアンスを妨げる可能性がある活動性アルコールまたは物質乱用の病歴；治療へのノンアドヒアランスの記録；調査用研究薬物を使用する別の臨床治験に現在参加していることまたは、スクリーニング来院の前９０日以内もしくは調査用産物の半減期の５倍未満でのそのような治験への参加；遺伝子治療を用いた先行する処置；ブスルファンまたは試験薬賦形剤（ヒト血清アルブミン、ＤＭＳＯおよびデキストラン４０）に対するアレルギーまたは過敏症；あるいは、研究への参加について対象を不適にする任意の他の理由、を含んだ。
研究設計
研究は、輸血依存性β－サラセミア（ＴＤＴ）を有する対象に実施した。登録で、適格な対象は、自己ＣＤ３４＋ＨＳＰＣを回収するためにアフェレーシスを受けた。試験薬を製造するためにＣＤ３４＋ＨＳＰＣをＺＦＮ ｍＲＮＡ ＳＢ－ｍＲＥＮＨ１およびＳＢ－ｍＲＥＮＨ２を用いたトランスフェクションによってｅｘ ｖｉｖｏで処置した。対象は、改変ＨＳＰＣを輸注される前に静脈内（ＩＶ）ブスルファンを用いるコンディショニング治療を受ける。ＣＤ３４＋ＨＳＰＣをＧ－ＣＳＦおよびプレリキサフォルを用いた処置を使用して各対象において動員した。動員されたＣＤ３４＋ＨＳＰＣをアフェレーシスによって動員の５および６日目に各対象から回収した（レスキュー処置を確実にするために必要な場合、＋／－７日目）。Ｇ－ＣＳＦ（動員の１～６日目）およびプレリキサフォル（動員の４、５および６日目）投与に続いてＣＤ３４＋ＨＳＰＣを各対象において動員した（図５を参照）。動員されたＣＤ３４＋ＨＳＰＣを各対象から連続する２日間（例えば、５および６日目）にアフェレーシスによって回収し、マニピュレートされていないバックアップ移植片を、合計２５×１０６個／ｋｇのＣＤ３４＋ＨＳＰＣを目標としたが、より少ない収量も許容して３日目（例えば、レスキュー処置を確実にするために７日目）に回収した。必要に応じて、２回目の動員およびアフェレーシスサイクルを≧２週間以後に実施した。
各対象の回収された細胞を２つのポーションに分け、一方のポーションは改変ＨＳＰＣ薬物製造のため、他方のポーションはレスキュー処置の必要が示される事象のために残した。
レスキュー処置ポーションは、最低限２．５×１０６個／ｋｇのＣＤ３４＋ＨＳＰＣを含む。レスキュー処置ポーションは、凍結保存未改変であり、造血性再構成の遅延または形成不全を含む移植不全の事象での有用性のために研究施設で保存した。１回目のアフェレーシスサイクルが、改変ＨＳＰＣ薬物製造のためおよびレスキュー処置のために必要な最小数のＣＤ３４＋ＨＳＰＣを動員しなかった場合、動員手順を繰り返す。２回目のアフェレーシスの時期の選択は、対象の臨床状態に基づいて調査者の判断であったが、初回アフェレーシス後２週間より早くなかった（≧２週間）。
レスキュー処置の除去および保存後、対象の動員したおよび採取した細胞の残りをＧＭＰ製造施設にクーリエ便によって送った。ＣＤ３４＋細胞選択に続いて、ＢＣＬ１１Ａ遺伝子の赤血球特異的エンハンサーを破壊するためのＺＦＮ ｍＲＮＡ ＳＢ－ｍＲＥＮＨ１およびＳＢ－ｍＲＥＮＨ２を用いたトランスフェクションを、改変ＨＳＰＣ試験薬物を生成するために実施した。改変ＨＳＰＣを凍結保存し、すべての臨床プロトコールセグメントがベースライン来院手順までおよびこれを含んで完了し、対象が輸注の準備ができるまで保存した。改変ＨＳＰＣを５０ｍＬ ＣｒｙｏＭＡＣＳ（登録商標）凍結バッグ（充填容積およそ１０～２０ｍＬ；全細胞数、細胞およそ１．０×１０８～２．０×１０８個）中で温度管理冷凍庫を使用して凍結保存した。得られた細胞が単一のバッグの最大容積を超える場合は、複数の凍結バックを使用した。輸注バッグを臨床研究センターへの輸送の準備ができるまで製造施設で気相液体窒素中に（＜－１５０℃で）保存した。
臨床使用のための改変ＨＳＰＣの遊離後、対象を専門の移植部門でＩＶブスルファンを開始するために病院に入院させた。対象は、ブスルファンの骨髄破壊レジメン（３．２ｍｇ／ｋｇ／日；中心静脈カテーテルを介するＩＶ）を、０日目の改変ＨＳＰＣの輸注の６～３日前に４日間受けた（１２．８ｍｇ／ｋｇの合計用量、自己移植のための標準治療と見なされる）。ＩＶブスルファンは、研究センターの慣例またはガイドラインにより１日１回（合計４用量）または６時間ごと（合計１６用量）で投薬される。１回目の用量後、ＩＶブスルファン用量は、薬物動態サンプリングおよび研究センターの慣例に基づいて、１日１回投薬について４，０００～５，０００ｍｍｏｌ＊分の曲線下面積（ＡＵＣ）、または６時間ごとの投薬について１，０００～１，２５０ｍｍｏｌ＊分のＡＵＣ、１６，０００～２０，０００ｍｍｏｌ＊分の総レジメン標的ＡＵＣを目標にして調整した。ＩＶブスルファン薬物動態標的化は、安全性監視委員会（ＳＭＣ）との考察後、以前の対象での経験に基づいて、続く対象について変更される。投薬４日後のブスルファンのクリアランスを決定するための治療薬モニタリングは必要なかったが、研究センターの慣例により調査者の判断で実施される（図５を参照）。
改変ＨＳＰＣ輸注：静脈内ブスルファンを用いた骨髄破壊コンディショニング後（総レジメン標的化曝露＝１６，０００～２０，０００μｍｏｌ＊分、薬物動態サンプリングに基づいて確認および／または調整）、患者は、中心静脈カテーテル輸注によって解凍ＣＤ３４＋ＨＳＰＣ（「ＳＴ－４００」）産生物を受けた（図５）。凍結改変ＨＳＰＣを、解凍および輸注の工程全体が約１５分間以内に終了するように解凍し、輸注した。凍結改変ＨＳＰＣの体積は、対象の体重によって決定した。バイタルサイン（血圧、温度、心拍数、呼吸数およびパルスオキシメトリ）を輸注の前および後にモニタリングした。
試験薬を与えたら、対象を日常的な臨床検査でモニタリングした。加えて、任意の有害事象のアセスメントも行い、血液細胞を遺伝子改変についてアッセイした。ＨｂＦレベルも評価し、内分泌機能を分析し、鉄負荷を評価するためにＭＲＩを実施する。造血性再構成の動力学および成功、コンディショニング後の入院期間、血液悪性腫瘍の発達可能性についてのスクリーニング、簡易健康状態調査（Short Form Health Status Survey）（ＳＦ－３６調査）による生活の質、カルノフスキー・パフォーマンススコアによる全体的機能、アフェレーシス手順の効率、ＳＴ－４００産生物中のインデル％と、ＳＴ－４００輸注後の骨髄および血液中で検出されるインデルとの間の差異を評価する。
ＡＥは、薬物に関連するか否かに関わる、ヒトにおける薬物の使用に関連する任意の望ましくない医学的出来事である。ＡＥは、次の事象、研究中の重症度の進展もしくは増加：研究下の状態に関連するまたは関連しないと考えられても、ベースライン状態（すなわち、スクリーニング前）と比較して性質、重症度もしくは頻度が悪化する任意の兆候、症状または身体診察所見、任意の臨床的に重要な検査の異常または薬物療法もしくは入院を必要とする検査の異常、のいずれも含み得る。異常な検査結果は、有害事象共通用語規準（ＣＴＣＡＥ）５．０規準に基づいて段階分けされ、グレード１または２の臨床検査異常は、それが調査者によって臨床的に重要であると見なされた場合だけ、ＡＥとして報告されるべきであり、ベースラインからの重症度の増加を表すグレード３および４臨床検査異常は、ＣＲＦにすでに報告された診断に関連しない場合、処置の使用と関連するすべての事象は、過剰投与、乱用、退薬現象、処置への感受性もしくは毒性、併発症、外傷または事故を含んでＡＥとして報告されるべきである。
ＳＡＥは、次の転帰のいずれかを生じる任意のＡＥである：死亡、生命を脅かす事象（すなわち、対象を死亡の直接のリスクに置く事象）；しかしながら、死亡を生じる可能性があったさらに重度の形態で生じたことがある事象、入院患者の入院または現在の入院の延長、正常な生命機能を行うための持続性のもしくは顕著な無能力または能力の実質的な破壊、曝露された対象の子孫における先天異常／先天性欠損、あるいは医学的に重要な事象は含まない。
二次および探索性事象の評価：ＨｂＦ画分（ｇ／ｄＬでのＡおよびＦ）のベースラインレベルおよびＨｂＦパーセントをＩＶブスルファンの１回目の投与の日または前の最後のアセスメントに基づいて決定する。ＨｂＦレベルおよびベースラインからの変化を研究来院ごとに要約する。
ＰＲＢＣ輸血のベースライン頻度および体積は、スクリーニング前２年間に基づく。輸血の頻度および体積は、研究期間および全体によって年換算し、ベースライン値と記述的に比較した。
輸注後の改変ＨＳＰＣ異型遺伝子性のモニタリング：輸注後、改変ＨＳＰＣをインデルプロファイルによって評価される生着効率および改変異型遺伝子性を決定するために患者においてモニタリングする。対象細胞サンプルを末梢血液、骨髄吸引液または他の組織サンプル（好ましくは細胞約５×１０４～１×１０７個）から精製し、ゲノムＤＮＡ単離に供する。次に、切断部位周辺の領域を標準条件下でＰＣＲによって増幅する。次に、反応をＭｉＳｅｑ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）を使用して分析できるようにアダプターを加えるために２回目のラウンドのＰＣＲを実施する。対象細胞からのシーケンシングデータを、インデルパーセントを決定するために標準曲線と比較する。
プロトコールは、前の患者が好中球および血小板生着を実証するまで患者２および３は化学療法コンディショニングを始めることができず；患者３の良好な生着につづいて、患者４～６は、化学療法コンディショニングを始めることができることを指示した。患者を安全性および効能についてモニタリングした。研究は、３年間の経過観察を包含し、その後、患者に長期安全性経過観察研究への参加を勧める。
安全性および認容性を有害事象（ＡＥ）および重篤なＡＥ（ＳＡＥ）の発生によって評価した。造血性再構成の成功および動態を好中球（ＡＮＣ細胞≧５００個／μＬ）および血小板（細胞≧２０，０００個／μＬ、輸血によって支持されない）生着によって評価した。オンターゲットインデルパターンを造血性クローンの出現をサーベイランスするために経時的に分子レベルで追跡した。患者を、造血性細胞中のオンターゲットインデルの存在、胎児ヘモグロビンレベルおよびＳＴ－４００輸注後の輸血必要性についてモニタリングした；移植後ヘモグロビン輸血閾値は臨床施設の標準的診療によった（患者１および２：＜８ｇ／ｄＬ；患者３：＜７ｇ／ｄＬ）。
結果
今日までに、自己ＳＴ－４００産生物を６名の患者の内５名に製造し、その３名はＳＴ－４００を受けた（表Ａ）。安全性および効能データ；これらの患者についての有害事象、胎児ヘモグロビン産生、インデルマーキングおよびＰＲＢＣ輸血要求は、経時的、潜在的に１２カ月またはさらに長期に進展する。
Figure 2022519949000005
第１／２相研究のＳＴ－４００を用いて処置した第１の患者（患者１）は、最も重度の形態の輸血依存性ベータサラセミア（β０／β０）を有する。研究の処置に先立つ２年間にわたってこの患者は、濃縮赤血球（ＰＲＢＣ）輸血を隔週で受けた。ＳＴ－４００輸注の際に、患者１は、産生物中に存在する凍結保護物質に関連すると考えられる一過性のアレルギー反応を経験した。その後、移植後臨床経過は通例であり、患者は、輸注の２および４週間以内の好中球および血小板回復をそれぞれ実証した。
患者１は、ＰＲＢＣ輸血を改変ＨＳＰＣ輸注の２週間後に受け、続く６週間にさらなるＰＲＢＣ輸注を必要としなかった。改変ＨＳＰＣを用いた輸注７週間後、総ヘモグロビンレベルは、約９ｇ／ｄＬで安定したままであり、胎児ヘモグロビンのレベルは上昇し続けている（輸注時の総ヘモグロビンのおよそ１％～３１％（図６Ａおよび図６Ｂを参照）。インデル（ＤＮＡの標的化配列に創出される挿入または欠失）は、循環白血球細胞中に検出され、ＢＣＬ１１Ａ遺伝子の良好な編集および、赤血球において内在性胎児ヘモグロビン産生を上方制御することを目的とするＢＣＬ１１Ａ赤血球特異的エンハンサーの破壊を示している。
患者１において好中球および血小板生着が実証された後、患者２および３も上に記載のとおり処置した。患者１、２および３は、すべて重度のベータサラセミア遺伝子型：β０／β０、重度のβ＋ＩＶＳ－Ｉ－５（Ｇ＞Ｃ）変異についてホモ接合性（患者１および３）または重度のＩＶＳ－ＩＩ－６５４（Ｃ＞Ｔ）変異を含むβ０／β＋遺伝子型（患者２）を有する。
患者１および患者２は、迅速な造血性再構成を経験した。患者１は、総ヘモグロビンを安定化させることに寄与する胎児ヘモグロビン（ＨｂＦ）画分が増加した。合計６週間ＰＲＢＣ輸血を免れた後、患者１は、その後、断続的な輸血を必要とした。患者２は、輸注後９０日間を通じてＨｂＦレベルの上昇が観察された。患者１および２について、オンターゲット挿入および欠失（インデル）が循環白血球細胞に存在した。患者３は、ＳＴ－４００製造を完了しただけで、ＨｂＦレベルは、輸注後に決定される。
患者１は、ＳＴ－４００輸注の際に調査者によって産生物に関連すると見なされた過敏症の重篤な有害事象（ＳＡＥ）を経験した。この事象は、処置で回復した。ＳＴ－４００に関連する他のＳＡＥは報告されなかった。クローン性造血は観察されなかった。
定期的な経過観察（造血性再構成、胎児ヘモグロビンレベル、循環白血球細胞中のインデルなどの評価）を改変幹細胞が骨髄を再配置し、造血発生を駆動することから、経時的に（例えば、１２カ月またはそれより長く）実施し、患者においてＨｂＦレベルは増加し、輸血に対する必要性は低減または除去された。
動員およびアフェレーシス転帰
毎日のアフェレーシス前の末梢血液ＣＤ３４＋数は、細胞２５～１１８個／μＬに変動した。患者１は、最初のＳＴ－４００ロットにおける低い細胞用量およびＣＦＵ強度により２サイクルの動員およびアフェレーシスを受けた。バックアップ移植片を第１のサイクルから凍結保存した。患者２、３、４および５は、それぞれ１サイクルの動員およびアフェレーシスを受け、それから彼らのＳＴ－４００ロットを製造し、バックアップ移植片を凍結保存した。
産生物特徴付けおよび造血性再構成
ＳＴ－４００産生物中のオンターゲットインデルは、下の表Ｂに示すとおり２３～８０％の範囲であった。
Figure 2022519949000006
示すとおり、最も低いインデル値は、編集効率が２つの別々の製造ロットにおいておよそ２５％であった患者１において見られた。同じ製造工程を臨床スケールで使用して、１２名の健康なドナー由来のＣＤ３４＋細胞は効率的に編集された：オンターゲットインデル中央値、７１％；範囲、５９％～８３％。ＳＴ－４００生存可能有核細胞用量は、細胞４．５～１１．４×１０６個／ｋｇであった。患者は、１４～２２日目の好中球生着および２２～３５日目の血小板生着を実証した。
安全性
クローン性造血発生の出現は、３回投薬患者におけるインデルプロファイリングによる経時的なオンターゲットインデルパターンモニタリングによって観察されなかった。図７Ａから図７Ｃを参照。
９カ月での患者１；６カ月での患者２）および５６日目での患者３における観察を通じて、任意の時点での固有のインデルの最大頻度は、検出されたすべてのインデルのそれぞれ１６％、１６％および１４％であった。
報告された深刻な有害事象（ＳＡＥ）を処置した患者について表Ｃに示す。
Figure 2022519949000007
示すとおり、ＳＴ－４００薬物産生物が原因である１回だけのＳＡＥが報告された；この過敏症のＳＡＥは、ＳＴ－４００輸注の際に生じ、輸注の終了時までに回復し、産生物凍結保護物質、ＤＭＳＯに関連すると考えられた。
他に、報告されたＡＥは、動員、アフェレーシスおよび骨髄破壊的ブスルファンコンディショニングの公知の毒性と一致した。
注入後の変化
上に記載のとおりＳＴ－４００移植に続いて、胎児ヘモグロビンレベルは、患者１および３が患者２よりも大きな誘導を示して３名の患者全員においてベースラインと比較して増加し（図８）、患者２が最も低い細胞用量およびＣＦＵ強度を有するＳＴ－４００産生物を受けたことと一致している。
患者１では、インデルは、抹消白血球において９カ月目に至って存続され、９０日目の未分画骨髄細胞は、６％インデルを示した。６週間の初期の輸血を行わない期間後に、この患者は、断続的なＰＲＢＣ輸血を再開し、生着からおよそ８カ月で、計画の年換算のＰＲＢＣ単位を３３％低減して輸血された。
患者２では、インデルは、抹消白血球において６カ月目に至って存続され、９０日目の未分画骨髄細胞は３２％インデルを示した。患者は、断続的なＰＲＢＣ輸血を受けている。
患者３では、インデルは、抹消白血球において５６日目に至って存続された。９０日目の骨髄吸引液サンプルのアセスメントは、まだ入手できていない。７週間の初期の輸血を行わない期間後に、患者は、輸注後６２日目に開始して２回のＰＲＢＣ輸血を受けた。
患者１～３の要約
患者１～３についての処置および結果を下に要約する。各患者について、ＣＤ３４＋細胞用量を次の通り算出する：ＣＤ３４＋用量＝［全細胞用量］×［ＣＤ３４＋％］。例えば、カラム２において総細胞用量およびカラム３においてＣＤ３４＋％を示す表Ｂを参照。
患者１
患者１は、β０／β０遺伝子型、最も重度の形態のＴＤＴを有し、研究への登録前に年換算で２７回の濃縮赤血球（ＰＲＢＣ）事象を有した。患者は、１回目のサイクルで達成された細胞用量および強度が低いため、２回目のサイクルの動員およびアフェレーシスを受けた。両方のＳＴ－４００ロットで、編集効率はおよそ２５％であり、研究に登録した他の患者および臨床スケールで製造された１２回の試行ロット（７１％編集効率中央値）より低かった。
輸注されたＳＴ－４００産生物でのオンターゲットインデルは、２３％であり、ＣＤ３４＋細胞用量は細胞５．４×１０６個／ｋｇであった。インデルは、９０日目で未分画骨髄細胞に存在し、抹消白血球において９カ月目に至って存続された。ＳＴ－４００輸注後、胎児ヘモグロビンレベルは５６日目でおよそ２．７ｇ／ｄＬに増加し、３９週目で、ＡＳＨデータカット時に最も近い測定値である０．９ｇ／ｄＬでベースラインと比較して上昇したままであった。６週間の初期の輸血を行わない期間後に、患者は、断続的なＰＲＢＣ輸血を再開し、生着から年換算のＰＲＢＣ単位で全体で３３％低減して輸血された。
患者２
患者２は、重度のβ＋ＩＶＳ－Ｉ－５（Ｇ＞Ｃ）変異についてホモ接合性であり、研究への登録前に年換算で１８回のＰＲＢＣ事象を有した。ＳＴ－４００産生物中のオンターゲットインデルは、細胞３．９×１０６個／ｋｇのＣＤ３４＋細胞用量で、７３％であり、最も低いものは、５名の登録患者に製造されたＳＴ－４００ロットについて見られた。インデルは、９０日目で未分画骨髄細胞に存在し、抹消白血球において６カ月目に至って存続された。ＳＴ－４００輸注後、胎児ヘモグロビンレベルは、ベースラインと比較して増加したが、２６週間に至るまで＜１ｇ／ｄＬであり、これまでに処置された３名の患者において最も低い誘導レベルが観察された。患者は、断続的なＰＲＢＣ輸血を現在受けている。
患者３
患者３は、重度のＩＶＳ－ＩＩ－６５４（Ｃ＞Ｔ）変異を含むβ０／β＋遺伝子型を有し、研究への登録前に年換算で１５回のＰＲＢＣ事象を有した。ＳＴ－４００産生物中のオンターゲットインデルは、細胞１０．３×１０６個／ｋｇのＣＤ３４＋細胞用量で、５４％であった。ＡＳＨデータカットの時に、インデルは、抹消白血球において５６日目に至って存続された。ＳＴ－４００輸注後、胎児ヘモグロビンレベルは、ベースラインと比較して増加しており、９０日目で２．８ｇ／ｄＬの最近の測定値で上昇し続けていた。７週間の初期の輸血を行わない期間後に、患者は、輸注後６２日目に開始して２回のＰＲＢＣ輸血を受けた。
これらの研究ならびに追加的患者および患者１～３のさらなる研究は、ＰＲＢＣなどの追加的治療の必要を除くことを含むＴＤＴの処置が本明細書に記載される遺伝子改変細胞（ＳＴ－４００）の投与（輸注）に続いて達成されることを実証している。
本明細書において述べるすべての特許、特許出願および特許公開は、その全体を参照によって本明細書に組み入れる。
開示は、明快な理解の目的のために例証および例としてある程度詳細に提供されているが、種々の変更および改変を本開示の精神および範囲から逸脱することなく実行することができることは当業者に明らかである。したがって、前述の記載および例は、限定として解釈されるべきでない。

Claims (41)

  1. 遺伝子改変細胞であって、
    ｍＲＮＡはＺＦＮ対をコードする、ＳＢ－ｍＲＥＮＨ１ ｍＲＮＡおよびＳＢ－ｍＲＥＮＨ２ ｍＲＮＡ；ならびに
    ＺＦＮ対による切断後に作製されるゲノム改変であって、ＢＣＬ１１Ａ遺伝子が細胞において不活性化されるような内在ＢＣＬ１１Ａエンハンサー配列内に存在する改変
    を含む赤血球（ＲＢＣ）前駆細胞を含む前記遺伝子改変細胞。
  2. 請求項１に記載の遺伝子改変細胞およびその系統の細胞を含む組成物。
  3. 治療を必要とする対象においてベータ－サラセミア（β－サラセミア）を治療するｅｘ ｖｉｖｏ方法であって、
    対象における胎児ヘモグロビン（ＨｂＦ）産生が増大し、β－サラセミアの１つまたはそれ以上の臨床症状が減少、改善または除去されるように、請求項２に記載の組成物を、対象に投与すること
    を含む前記ｅｘ ｖｉｖｏ方法。
  4. ベータ－サラセミアは、輸血依存性β－サラセミアである、請求項３に記載のｅｘ ｖｉｖｏ方法。
  5. グラム／血漿ｄＬ、および／または総ヘモグロビン（Ｈｂ）中のＨｂＦパーセントにおける臨床検査ヘモグロビン画分のベースラインからの変化は、対象において達成される、請求項３または４に記載のｅｘ ｖｉｖｏ方法。
  6. ヘモグロビン因子は、成人ヘモグロビン（ＨｂＡ）および／または胎児ヘモグロビン（ＨｂＦ）である、請求項３～５のいずれか１項に記載のｅｘ ｖｉｖｏ方法。
  7. 対象は、β０／β０またはβ０／β＋である、請求項３～６のいずれか１項に記載のｅｘ ｖｉｖｏ方法。
  8. サラセミア関連疾患バイオマーカーのレベルは、治療後に変更される、請求項３～７のいずれか１項に記載のｅｘ ｖｉｖｏ方法。
  9. バイオマーカーは、鉄代謝における変化；ならびに／またはエリスロポエチン、ハプトグロビンおよび／もしくはヘプシジンのレベルにおける変化である、請求項８に記載のｅｘ ｖｉｖｏ方法。
  10. 鉄過剰に関連するか、またはベースライン輸血療法に関連する臨床症状は、改善または除去される、請求項３～９のいずれか１項に記載のｅｘ ｖｉｖｏ方法。
  11. 対象における内分泌機能異常の減少は、甲状腺ホルモン、ＩＧＦ－１、起床時コルチゾール、副腎皮質刺激ホルモン（ＡＣＴＨ）、ＨｂＡ１Ｃおよび／またはビタミンＤレベルのレベルおよび／または活性を決定することによってアッセイされる、請求項１０に記載のｅｘ ｖｉｖｏ方法。
  12. 対象におけるＲＢＣ輸血、ならびに輸注血小板輸血、静脈内免疫グロブリン（ＩＶＩＧ）輸血、血漿輸血および／または顆粒球輸血についての必要性は、低減または除去される、請求項３～１１のいずれか１項に記載のｅｘ ｖｉｖｏ方法。
  13. 対象において低減または除去される臨床症状は、肝疾患である、請求項３～１２のいずれか１項に記載のｅｘ ｖｉｖｏ方法。
  14. 対象において低減または除去される臨床症状は、心臓異常である、請求項３～１３のいずれか１項に記載のｅｘ ｖｉｖｏ方法。
  15. 対象において低減または除去される臨床症状は、骨粗鬆症および／または骨折である、請求項３～１４のいずれか１項に記載のｅｘ ｖｉｖｏ方法。
  16. ベースライン赤血球生成は、組成物の投与後に対象において変化する、請求項３～１５のいずれか１項に記載のｅｘ ｖｉｖｏ方法。
  17. 過形成は、組成物の投与後に対象において低減または除去される、請求項１６に記載のｅｘ ｖｉｖｏ方法。
  18. 未成熟細胞および／または非定型形態を有する細胞の数は、対象において低減される、請求項１６または１７に記載のｅｘ ｖｉｖｏ方法。
  19. 対象におけるＦ細胞の数およびパーセントは、組成物の投与後に改変される、請求項３～１８のいずれか１項に記載のｅｘ ｖｉｖｏ方法。
  20. 遺伝子改変細胞は、自家性または同種性である、請求項３～１９のいずれか１項に記載のｅｘ ｖｉｖｏ方法。
  21. ＢＣＬ１１Ａ遺伝子改変細胞は、１つまたはそれ以上の追加の遺伝子改変をさらに含む、請求項３～２０のいずれか１項に記載のｅｘ ｖｉｖｏ方法。
  22. 遺伝子改変細胞は、同種細胞であり、１つまたはそれ以上の追加の遺伝子改変は、１つまたはそれ以上の自己マーカーまたは抗原の不活性化を含む、請求項２１に記載のｅｘ ｖｉｖｏ方法。
  23. 遺伝子改変細胞は、対象から単離した造血幹細胞である、請求項３～２２のいずれか１項に記載のｅｘ ｖｉｖｏ方法。
  24. 造血幹細胞は、ＣＤ３４＋造血幹細胞または前駆細胞（ＨＳＣ／ＰＣ）であり、ＣＤ３４＋ＨＳＣ／ＰＣは、単離前に１用量もしくはそれ以上のＧ－ＣＳＦおよび／または１用量もしくはそれ以上のプレリキサフォルによる処置によって、各対象において動員される、請求項２３に記載のｅｘ ｖｉｖｏ方法。
  25. 少なくとも２５×１０６個／ｋｇのＣＤ３４＋ＨＳＰＣは、対象において動員され、動員された細胞は、１回またはそれ以上のアフェレーシス周期によって回収される、請求項２４に記載のｅｘ ｖｉｖｏ方法。
  26. 遺伝子改変細胞を含む組成物を対象に投与する前に、組成物の細胞をＢＣＬ１１Ａ内の挿入および／または欠失について評価することをさらに含む、請求項３～２５のいずれか１項に記載のｅｘ ｖｉｖｏ方法。
  27. 遺伝子改変細胞を含む組成物の投与前に、１つまたはそれ以上の骨髄破壊調整剤を１回またはそれ以上、対象に投与することをさらに含む、請求項３～２６のいずれか１項に記載のｅｘ ｖｉｖｏ方法。
  28. 骨髄破壊剤は、ブスルファンを含み、さらに：
    ブスルファンの静脈内（ＩＶ）投与は、０．５～５ｍｇ／ｋｇを１回もしくはそれ以上であるか；
    ブスルファンのＩＶ投与は、３．２ｍｇ／ｋｇ／日であるか；
    ０日目の遺伝子改変細胞を含む組成物の輸注前の、輸注の６～３日前の４日間の総用量１２．８ｍｇ／ｋｇの中心静脈カテーテルを介したＩＶ；または
    ブスルファンのＩＶ投与は、１日１回もしくは６時間毎である、
    請求項２７に記載のｅｘ ｖｉｖｏ方法。
  29. 対象に投与される遺伝子改変細胞の用量は、細胞３×１０６個／ｋｇ～細胞２０×１０６個／ｋｇである、請求項３～２８のいずれか１項に記載のｅｘ ｖｉｖｏ方法。
  30. 対象に投与される遺伝子改変細胞は、細胞約１×１０７個／ｍＬの濃度で、１袋当たり細胞約１．０～２．０×１０８個にて製剤化される、請求項３～２９のいずれか１項に記載のｅｘ ｖｉｖｏ方法。
  31. 遺伝子改変細胞は、投与前に凍結保存され、解凍の１５分以内に対象に投与される、請求項３～３０のいずれか１項に記載のｅｘ ｖｉｖｏ方法。
  32. 遺伝子改変細胞の投与前、投与中および／または投与後の対象のバイタルサインをモニタリングすることをさらに含む、請求項３～３１のいずれか１項に記載のｅｘ ｖｉｖｏ方法。
  33. 遺伝子改変細胞の投与前に、対象におけるヘモグロビン、好中球および／または血小板レベルを査定して、対象におけるヘモグロビンのベースラインレベルを決定することをさらに含む、請求項３～３２のいずれか１項に記載のｅｘ ｖｉｖｏ方法。
  34. 遺伝子改変細胞の投与後の対象におけるヘモグロビン、好中球および／または血小板レベルは、ベースラインレベルと比較して、投与後何週間または何カ月間も増大するか、または安定なままである、請求項３３に記載のｅｘ ｖｉｖｏ方法。
  35. 対象は、遺伝子改変細胞の投与前および／または投与後に１つまたはそれ以上の濃厚赤血球（ＰＲＢＣ）輸血を受容する、請求項３～３４のいずれか１項に記載のｅｘ ｖｉｖｏ方法。
  36. 対象における骨髄移植、血液成分および／または鉄キレート療法ＰＲＢＣ輸血のような追加の治療についての必要性は、低減または除去される、請求項３～３５のいずれか１項に記載のｅｘ ｖｉｖｏ方法。
  37. 追加の治療についての必要性は、遺伝子改変細胞の投与の１～２０日以内に低減または除去される、請求項３６に記載のｅｘ ｖｉｖｏ方法。
  38. 対象を、投与後経時的にモニタリングして、輸注した細胞のインデルプロファイルと比較した、末梢血サンプル、骨髄穿刺液または他の組織源から単離した細胞のインデルプロファイルを決定して、対象における移植片の安定性をモニタリングする、請求項３～３７のいずれか１項に記載のｅｘ ｖｉｖｏ方法。
  39. 細胞のインデルプロファイルは、対象への投与前にモニタリングされる、請求項３８に記載のｅｘ ｖｉｖｏ方法。
  40. ＣｒｙｏＳｔｏｒ（登録商標）ＣＳ－１０凍結保存媒体中に製剤化した請求項２に記載の組成物を含む包装を含む製造物品。
  41. 各袋は、細胞約１×１０７個／ｍＬの濃度で、１袋当たり細胞約１．０～２．０×１０８個を含有する、請求項４０に記載の製造物品。
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