JP7275152B2 - 操作された標的特異的なヌクレアーゼ - Google Patents

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Description

関連出願の相互参照
本出願は、２０１８年２月８日付けで出願された米国仮出願第６２／６２８，０１６号；２０１８年９月７日付けで出願された米国仮出願第６２／７２８，２２６号；２０１８年１１月１２日付けで出願された米国仮出願第６２／７５８，７８６号；２０１９年１月２３日付けで出願された米国仮出願第６２／７９５，９３７号；および２０１９年２月６日付けで出願された米国仮出願第６２／８０２，０９２号の利益を主張し、これらの開示は、これにより参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。
連邦政府による資金提供を受けた研究で行われた発明への権利の陳述
該当なし。
配列表
本出願は、ＡＳＣＩＩフォーマットで電子的に提出され、これにより参照によりその全体が本明細書に組み込まれる配列表を含有する。前記ＡＳＣＩＩコピーは、２０１９年２月８日に作成され、８３２５０１６９４０ＳＬ．ｔｘｔと名付けられ、５４，３０２バイトのサイズである。
技術分野
本開示は、ポリペプチドおよびゲノム工学および相同組換えの分野にある。
人工ヌクレアーゼ、例えば操作されたジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、ＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼとも称される操作されたｃｒＲＮＡ／ｔｒａｃｒＲＮＡ（「単一ガイドＲＮＡ」）を有するＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系、および／またはアルゴノート系に基づくヌクレアーゼ（例えば、「ＴｔＡｇｏ」として公知のＴ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ由来（Swarts et al (2014) Nature 507(7491):258-261）は、切断ドメインと会合するかまたはそれに作動可能に連結したＤＮＡ結合ドメイン（ヌクレオチドまたはポリペプチド）を含み、ゲノム配列の標的化された変更に使用されてきた。例えば、ヌクレアーゼは、外因性配列を挿入する、１つまたは複数の内因性遺伝子を不活性化する、遺伝子発現パターンが変更された生物（例えば、作物）および細胞系を作り出すことなどに使用されてきた。例えば、米国特許第９，２５５，２５０号；同第９，２００，２６６号；同第９，０４５，７６３号；同第９，００５，９７３号；同第８，９５６，８２８号；同第８，９４５，８６８号；同第８，７０３，４８９号；同第８，５８６，５２６号；同第６，５３４，２６１号；同第６，５９９，６９２号；同第６，５０３，７１７号；同第６，６８９，５５８号；同第７，０６７，３１７号；同第７，２６２，０５４号；同第７，８８８，１２１号；同第７，９７２，８５４号；同第７，９１４，７９６号；同第７，９５１，９２５号；同第８，１１０，３７９号；同第８，４０９，８６１号；米国特許公報第２００３０２３２４１０号；同第２００５０２０８４８９号；同第２００５００２６１５７号；同第２００５００６４４７４号；同第２００６００６３２３１号；同第２００８０１５９９９６号；同第２０１０００２１８２６４号；同第２０１２００１７２９０号；同第２０１１０２６５１９８号；同第２０１３０１３７１０４号；同第２０１３０１２２５９１号；同第２０１３０１７７９８３号および同第２０１３０１７７９６０号および同第２０１５００５６７０５号を参照されたい。例えば、ヌクレアーゼの対（例えば、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、ＴＡＬＥＮ、ｄＣａｓ－Ｆｏｋ融合体）は、ゲノム配列を切断するのに使用することができる。対の各メンバーは、一般的に、ヌクレアーゼの１つまたは複数の切断ドメイン（またはハーフドメイン）に連結された操作された（天然に存在しない）ＤＮＡ結合タンパク質を含む。ＤＮＡ結合タンパク質がその標的部位に結合すると、そのＤＮＡ結合タンパク質に連結されている切断ドメインは、二量体化とそれに続くゲノムの切断を起こすことができるように配置される。
ジンクフィンガータンパク質に関して、標的ＤＮＡ配列へのＺＦＰの特異性は、ジンクフィンガードメインと特異的なＤＮＡ塩基との配列特異的な接触に依存する。加えて、ジンクフィンガードメインは、ＤＮＡ主鎖のリン酸との非特異的なイオン対相互作用に関与するアミノ酸残基も含む。Elrod-Erickson et al（(1996) Structure 4:1171）は、ジンクフィンガータンパク質とそのコグネートＤＮＡ標的との共結晶化によって、水素結合の形成を介してＤＮＡ主鎖上のリン酸と相互作用することが可能な特異的なアミノ酸が存在することを実証した。周知のＺｉｆ２６８主鎖を用いるジンクフィンガータンパク質は、典型的には、β－シートのその第２の鎖のアミノ末端残基としてアルギニンを有し、この残基は、第２の不変システインからカルボキシル末端側に２番目の位置でもある。この位置は、各ジンクフィンガードメイン内の（－５）と称することができ、これは、この位置が、α－へリックスの開始に先行する５番目の残基であるためである。この位置のアルギニンは、その側鎖のグアニジニウム基との電荷を有する水素結合の形成によりＤＮＡ主鎖上のリン酸と相互作用することができる。Ｚｉｆ２６８主鎖中のジンクフィンガータンパク質は、第１の不変システインから４残基アミノ末端側の位置にリシンを有することも多い。この位置は、各フィンガー内の（－１４）と称することができ、これは、この位置が、亜鉛が配位しているシステイン残基間に２つの残基を有するジンクフィンガーのα－へリックスの開始に先行する１４番目の残基であるためである。リシンは、その側鎖アミノ基との、水媒介性の電荷を有する水素結合の形成によりＤＮＡ主鎖上のリン酸と相互作用することができる。リン酸基は全てＤＮＡ主鎖に沿って見出されることから、このタイプのジンクフィンガーとＤＮＡ分子との相互作用は、一般的に、非配列特異的とみなされる（J. Miller, Massachusetts Institute of Technology Ph.D. Thesis, 2002）。
オフターゲット切断事象を減少させるために、操作された絶対ヘテロ二量体（obligate heterodimer）の切断ハーフドメインが開発された。例えば、米国特許第７，９１４，７９６号；同第８，０３４，５９８号；同第８，９６１，２８１号および同第８，６２３，６１８号；米国特許公報第２００８０１３１９６２号および同第２０１２００４０３９８号を参照されたい。これらの絶対ヘテロ二量体は、異なる操作された切断ドメインがＺＦＰによって適切な標的部位に配置された場合にのみ、二量体化しその標的を切断し、それによって、単量体のオフターゲット切断を低減および／または消失させる。
最も効率的な人工ヌクレアーゼを産生するために調査され得る別のエリアは、人工ヌクレアーゼをコードする遺伝子に含まれ得る非コード配列中にある。例えば、ｍＲＮＡ分子中の３’非翻訳領域（「ＵＴＲ」）は、転写後レベルで遺伝子発現の調節において重要な役割を果たし得る。３’ＵＴＲは、ｍＲＮＡの構造的成分と、特異的なトランス作用性ＲＮＡ結合タンパク質および非コードＲＮＡとの間の組織化された相互作用によって、ｍＲＮＡの発現を制御し（Vislovukh et al (2014) World J Biol Chem 5(1):40-57）、ポリアデニル化配列も含む。一般的に使用される３’ＵＴＲの例は、ＳＶ４０ウイルスポリＡ断片、ウシ成長ホルモン（ＢＧＨ）遺伝子由来のポリＡ領域、およびウサギベータ－グロビンＵＴＲである（Ludwig, Dale (2006) BioProcess International supplement）。５’ＵＴＲは、高等真核生物において１００～２００ｂｐの長さであり、高いＧＣ含量（しばしば＞６０％）を含み得る。これらの配列は、リボソーム結合のためのコザックコンセンサス配列、およびキャップ結合のための配列などのエレメントを含んでいてもよい。高いＧＣ含量は、翻訳効率に影響を与えることができ、内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）として公知の複雑なヘアピン構造（シス作用性調節配列として公知）をもたらすことができる。５’ＵＴＲは、発現を調節するための遺伝子特異的な調節タンパク質（例えば鉄調節タンパク質）に結合するための配列を有することもでき、翻訳機構との相互作用を提供することなどの他の機能において役割を果たすこともできる（Araujo et al (2012) Comp and Funct Genom (2012) doi:10.1155/2012/475731）。一般的に使用される５’ＵＴＲ配列の例は、ベータ－グロビン５’ＵＴＲである。ＵＴＲは、しばしば３’ＵＴＲにおけるシス作用性エレメントによって媒介される転写後レベルでの遺伝子調節の空間的な制御において役割を有することもできる（Mignone et al (2002) Genome Biol 3(3):PMCID:PMC139023）。
しかしながら、強化された転写／翻訳効率を提供するため、ならびにヌクレアーゼの活性および／または特異性を増加させるための、操作されたヌクレアーゼ切断システムへの追加の方法および組成物の必要が依然としてある。
米国特許第９，２５５，２５０号明細書 米国特許第９，２００，２６６号明細書 米国特許第９，０４５，７６３号明細書 米国特許第９，００５，９７３号明細書 米国特許第８，９５６，８２８号明細書 米国特許第８，９４５，８６８号明細書 米国特許第８，７０３，４８９号明細書 米国特許第８，５８６，５２６号明細書 米国特許第６，５３４，２６１号明細書 米国特許第６，５９９，６９２号明細書 米国特許第６，５０３，７１７号明細書 米国特許第６，６８９，５５８号明細書 米国特許第７，０６７，３１７号明細書 米国特許第７，２６２，０５４号明細書 米国特許第７，８８８，１２１号明細書 米国特許第７，９７２，８５４号明細書 米国特許第７，９１４，７９６号明細書 米国特許第７，９５１，９２５号明細書 米国特許第８，１１０，３７９号明細書 米国特許第８，４０９，８６１号明細書 米国特許出願公開第２００３／０２３２４１０号明細書 米国特許出願公開第２００５／０２０８４８９号明細書 米国特許出願公開第２００５／００２６１５７号明細書 米国特許出願公開第２００５／００６４４７４号明細書 米国特許出願公開第２００６／００６３２３１号明細書 米国特許出願公開第２００８／０１５９９９６号明細書 米国特許出願公開第２０１２／００１７２９０号明細書 米国特許出願公開第２０１１／０２６５１９８号明細書 米国特許出願公開第２０１３／０１３７１０４号明細書 米国特許出願公開第２０１３／０１２２５９１号明細書 米国特許出願公開第２０１３／０１７７９８３号明細書 米国特許出願公開第２０１３／０１７７９６０号明細書 米国特許出願公開第２０１５／００５６７０５号明細書 米国特許第８，０３４，５９８号明細書 米国特許第８，９６１，２８１号明細書 米国特許第８，６２３，６１８号明細書 米国特許出願公開第２００８／０１３１９６２号明細書 米国特許出願公開第２０１２／００４０３９８号明細書
Swarts et al (2014) Nature 507(7491):258-261 Elrod-Erickson et al（(1996) Structure 4:1171） J. Miller, Massachusetts Institute of Technology Ph.D. Thesis, 2002 Vislovukh et al (2014) World J Biol Chem 5(1):40-57 Ludwig, Dale (2006) BioProcess International supplement Araujo et al (2012) Comp and Funct Genom (2012) doi:10.1155/2012/475731 Mignone et al (2002) Genome Biol 3(3):PMCID:PMC139023
本開示は、人工ヌクレアーゼの発現を増加させる、ならびにその意図した標的に対するヌクレアーゼ（例えば、ヌクレアーゼ対）の効率（活性）および／または特異性を増加させるための方法および組成物を提供する。したがって、人工ヌクレアーゼの発現を強化する５’および／または３’非翻訳配列におけるエレメントを含む操作されたプロモーターを含む、人工ヌクレアーゼ（例えば、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、ＴＡＬＥＮ、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓヌクレアーゼ）を発現させるためのポリヌクレオチド（例えば、ＤＮＡ発現ベクターまたはｍＲＮＡ）が本明細書に記載される。必要に応じて、ヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチドは、低分子ペプチド（これらに限定されないが、ペプチドタグおよび／または核局在化配列などのポリカチオン性ペプチドを含む）をコードする配列をさらに含む、ならびに／あるいはＤＮＡ結合ドメイン領域（例えば、ジンクフィンガータンパク質の主鎖またはＴＡＬＥ）における１つもしくは複数の変異、および／またはＦｏｋＩヌクレアーゼ切断ドメインもしくは切断ハーフドメインにおける１つもしくは複数に変異を含む。これらのポリヌクレオチド成分が、個々に、または任意の組合せで（例えば、任意の組合せでの、ＦＬＡＧ（例えば、３×ＦＬＡＧ）、ＮＬＳ、ＷＰＲＥおよび／またはポリＡシグナルなどのペプチド配列）使用される場合、本発明の方法および組成物は、導入遺伝子の切断および／もしくは標的化組込みの効率を増加させた、ｉｎ ｖｉｔｒｏもしくはｉｎ ｖｉｖｏでの人工ヌクレアーゼの発現（例えば、本明細書に記載される配列／改変を有さないヌクレアーゼと比較して、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０倍、またはそれよりも多い切断）、ならびに／または標的化特異性（オフターゲット効果の低減）の驚くべき、かつ予想外の増加を提供する。本開示は、目的の領域における細胞クロマチンの標的化された切断、および／または細胞中の所定の目的の領域での標的化組込みを介した導入遺伝子の組み込みのために、これらの組成物を使用する方法も提供する。
したがって、ヌクレアーゼ（例えば、ＺＦＮ、ＴＡＬＥＮ、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓヌクレアーゼなど）をコードするポリヌクレオチド（ｍＲＮＡ、プラスミド、ウイルスベクター、例えばＡＡＶ）、以下のエレメント：（ｉ）必要に応じてヌクレアーゼをコードする配列に対して５’の、ポリカチオン性配列（例えば、３×ＦＬＡＧ配列）をコードする配列；（ｉｉ）必要に応じてヌクレアーゼをコードする配列に対して５’の、５’ＵＴＲ配列（例えば、Ｘｅｎｏｐｕｓのベータ－グロビン配列、例えば配列番号１に示される）；（ｉｉｉ）ヌクレアーゼコード配列に対して３’および／もしくは５’の、ＷＰＲＥ配列；（ｉｖ）ヌクレアーゼドメイン（例えば、ＺＦＮのリン酸主鎖残基）の主鎖（非ＤＮＡ結合残基）をコードする配列への改変；（ｖ）ヌクレアーゼの切断ドメイン配列への改変（例えば、操作されたＦｏｋＩドメイン）；（ｖｉ）必要に応じてヌクレアーゼをコードする配列に作動可能に連結した、組織特異的プロモーターおよび／もしくはエンハンサー（例えば、ｈＡＡＴ、ＡｐｏＥなど）；（ｖｉｉ）ＮＬＳ配列（ヌクレアーゼをコードする配列に対して５’または３’）；ならびに／または（ｖｉｉｉ）ポリＡ配列の任意の組合せの少なくとも１、２、３、４、５、６、７または８つをさらに含むポリヌクレオチドが本明細書に記載される。ある特定の実施形態では、ポリヌクレオチドは、ｍＲＮＡである。他の実施形態では、ポリヌクレオチドは、さらに必要に応じてＩＴＲを含むＡＡＶベクター、例えば、添付の図面および／または表中の構築物のいずれかで示されるＡＡＶベクターである。単一のポリヌクレオチドが、ヌクレアーゼの一部または全部の成分、例えば、ＺＦＮの対、単一ガイドＲＮＡなどをコードしていてもよい。あるいは、別々のポリヌクレオチド（同一または異なるタイプの）が、ヌクレアーゼの成分、例えば、それぞれ１種のＺＦＮをコードする別々のヌクレオチド、またはＺＦＮのＴＡＬＥＮもしくはＴＡＬＥＮ対をコードしていてもよい。したがって、１つまたは複数のヌクレアーゼ（例えば、ＺＦＮ）をコードする１つまたは複数のポリヌクレオチド（例えば、ＡＡＶベクター）が本明細書で提供される。本明細書に記載されるポリヌクレオチドは、少なくとも１つのドナーの標的化された切断および／または組み込みのためのｉｎ ｖｉｔｒｏ、ｅｘ ｖｉｖｏおよび／またはｉｎ ｖｉｖｏの方法のために使用でき、ヌクレアーゼ活性（切断および／または組み込み）および／または特異性（オフターゲット活性と比較したオンターゲット活性）を、１～５０倍（またはそれらの間の、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０倍などを含む任意の値）増加させることができる。
一態様では、本発明は、所望の組織で人工ヌクレアーゼを発現させるための組織特異的プロモーターを含むポリヌクレオチドを記載している。一部の実施形態では、組織特異的プロモーターは、肝臓特異的プロモーターである。さらなる実施形態では、肝臓特異的プロモーターは、ヒト－α１抗トリプシンプロモーター（ｈＡＡＴ）またはトランスチレチン最小プロモーター（米国特許公報第２０１７０１１９９０６号を参照）である。一部の場合では、肝臓特異的プロモーターは、ＡｐｏＥエンハンサー配列を含む（Shachter et al. (1993) J. Lipid Res 34(10):1699-707）。一部の実施形態では、肝臓特異的プロモーターは、１つまたは複数のＡｐｏＥエンハンサー配列を含む（例えば、１、２、３および／または４つ；Okuyama et al. (1996) Hum Gen Ther 7(5):637-45を参照）。さらなる実施形態では、プロモーターは、イントロンに連結されている。好ましい実施形態では、イントロンは、ヒトβ－グロビン遺伝子の第１のイントロン由来の５’ドナー部位およびブランチ、ならびに免疫グロブリン遺伝子の重鎖可変領域のイントロン由来の３’アクセプター部位を含むＨＧＧ－ＩＧＧキメライントロンである。本明細書に記載されるポリヌクレオチドは、ｃＤＮＡ構築物（例えばＡＡＶなどのウイルスベクターに担持される）、ｍＲＮＡ、プラスミドＤＮＡ、またはゲノムへの挿入のための発現カセットの一部であり得る。
したがって、一態様では、ヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡまたはＡＡＶベクターであって、転写および翻訳効率を増加させるためのエレメントを含む、ｍＲＮＡまたはＡＡＶベクターが本明細書に記載される。一部の実施形態では、エレメントは、天然または人工の５’および／または３’ＵＴＲ配列などの非翻訳配列を含む。一部の態様では、５’ＵＴＲ配列は、発現カセット中に含まれ、一方で他の態様では、３’ＵＴＲ配列が使用される。好ましい実施形態では、人工ヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡまたはＡＡＶは、５’ＵＴＲおよび３’ＵＴＲの両方を含む。一実施形態では、５’ＵＴＲは、Ｘｅｎｏｐｕｓのβ－グロビンＵＴＲである（Falcone and Andrews (1991) Mol Cell Bio 11(5):2656-2664；Krieg and Melton (1994) Nuc Acid Res 12(18):7057を参照)。好ましい実施形態では、Ｘｅｎｏｐｕｓのβ－グロビンＵＴＲをコードするＤＮＡ配列は、５’［ＴＧ］ＣＴＴＧＴＴＣＴＴＴＴＴＧＣＡＧＡＡＧＣＴＣＡＧＡＡＴＡＡＡＣＧＣＴＣＡＡＣＴＴＴＧＧＣＡＧＡＴ（配列番号１）である（ＴＧは、必要に応じたものである）。一部の態様では、ヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡまたはＡＡＶは、３’ＷＰＲＥ配列を含む（米国特許公報第２０１６０３２６５４８号を参照）。さらなる実施形態では、ＷＰＲＥエレメントは、タンパク質Ｘの発現を防止するように「Ｘ」領域で変異している（米国特許第７，４１９，８２９号を参照）。一部の実施形態では、変異したＷＰＲＥ配列は、トランケート型のＷＰＲＥエレメントである。一部の実施形態では、変異したＷＰＲＥ配列は、Ｊ０２４４２またはＪ０４５１４ウッドチャック肝炎ウイルスのＸ領域中で変異している（Galibert et al (1982) J. Virol 41(1):51-65；Zanta-Boussif et al. (2009) Gene Ther 16(5):605-619）。本明細書に記載されるポリヌクレオチドで使用することができるＷＰＲＥ配列の非限定的な例は、以下の実施例で示される。さらなる態様では、３’ＵＴＲは、ポリＡシグナル配列を含む。これらのエレメントが組み合わせて使用される場合、ポリＡシグナルは、ＷＰＲＥ配列に対して３’または５’であり得る。好ましい実施形態では、ポリＡシグナル配列は、ウシ成長ホルモンシグナル配列である（Woychik et al (1984) Proc Natl Acad Sci 81(13):3944-8を参照）。本明細書に記載されるヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチド（ｍＲＮＡ、ＡＡＶベクター）は、ヌクレアーゼをコードする配列への改変、例えばヌクレアーゼのＺＦＰ ＤＮＡ－結合ドメインの主鎖領域への改変、および／またはヌクレアーゼ（複数可）の切断ドメイン（または切断ハーフドメイン）への改変をさらに含んでいてもよい。
別の態様では、これらの変異体が由来する親の（例えば、野生型）切断ドメインおよび／またはこれらの切断ドメインを含むポリヌクレオチド（ｍＲＮＡ）と比較して１つまたは複数の変異を含む操作されたヌクレアーゼ切断ハーフドメインが本明細書に記載される。本明細書に記載される変異としては、これらに限定されないが、切断ドメインの電荷を変化させる変異、例えば正電荷を有する残基から正電荷を有さない残基への変異（例えば、ＫおよびＲ残基の変異（例えば、Ｓへ変異している）；Ｎ残基の変異（例えば、Ｄへの）、およびＱ残基の変異（例えば、Ｅへの）；分子モデリングに基づきＤＮＡ主鎖に近いと予測され、ＦｏｋＩ相同体において変動を示す残基への変異；ならびに／または他の残基における変異（例えば、米国特許第８，６２３，６１８号およびGuo et al, (2010) J. Mol. Biol. 400(1):96-107）が挙げられる。
ある特定の実施形態では、操作された切断ハーフドメインは、ＦｏｋＩまたはＦｏｋＩ相同体由来であり、配列番号２に示される野生型全長ＦｏｋＩに対して番号付けしたアミノ酸残基４１６、４２２、４４７、４４８、および／もしくは５２５の１つもしくは複数、またはＦｏｋＩ相同体における対応する残基に変異を含む。他の実施形態では、ＦｏｋＩ由来の切断ハーフドメインは、野生型ＦｏｋＩに対して番号付けした、３８７、３９３、３９４、３９８、４００、４１６、４１８、４２２、４２７、４３４、４３９、４４１、４４２、４４４、４４６、４４８、４７２、４７３、４７６、４７８、４７９、４８０、４８１、４８７、４９５、４９７、５０６、５１６、５２３、５２５、５２７、５２９、５３４、５４２、５５９、５６９、５７０、および／もしくは５７１の１つもしくは複数を含むアミノ酸残基４１４～４２６、４４３～４５０、４６７～４８８、５０１～５０２、および／または５２１～５３１の１つまたは複数、または任意のＦｏｋＩ相同体における対応する残基に変異を含む。変異は、対応する位置におけるＦｏｋＩに相同な天然制限酵素に見出される残基への変異を含み得る。ある特定の実施形態では、変異は、置換、例えば、野生型残基の、任意の異なるアミノ酸、例えばアラニン（Ａ）、システイン（Ｃ）、アスパラギン酸（Ｄ）、グルタミン酸（Ｅ）、ヒスチジン（Ｈ）、フェニルアラニン（Ｆ）、グリシン（Ｇ）、アスパラギン（Ｎ）、セリン（Ｓ）またはスレオニン（Ｔ）での置換である。ある特定の実施形態では、ＦｏｋＩヌクレアーゼドメインは、４１６、４２２、４４７、４７９および／または５２５（野生型、配列番号２に対して番号付けした）の１つまたは複数に変異を含む。ヌクレアーゼドメインは、４１８、４３２、４４１、４４８、４７６、４８１、４８３、４８６、４８７、４９０、４９６、４９９、５２３、５２７、５３７、５３８および５５９位にも１つまたは複数の変異を含んでいてもよく、これらに限定されないが、ＥＬＤ、ＫＫＲ、ＥＬＥ、ＫＫＳが挙げられる。例えば、米国特許第８，６２３，６１８号を参照されたい。よりさらなる実施形態では、切断ドメインは、残基（例えば、４１９、４２０、４２５、４４６、４４７、４７０、４７１、４７２、４７５、４７８、４８０、４９２、５００、５０２、５２１、５２３、５２６、５３０、５３６、５４０、５４５、５７３および／または５７４）の１つまたは複数における変異を含む。ある特定の実施形態では、本明細書に記載されるバリアント切断ドメインは、ヌクレアーゼ二量体化に関与する残基への変異（二量体化ドメインの変異）、および１つまたは複数の追加の変異；例えば、リン酸接触残基への変異、例えば、二量体化ドメインの外側のアミノ酸位置での、例えばリン酸接触に参加し得るアミノ酸残基における、１、２、３、４、５、６つまたはそれよりも多くの変異と組み合わせた、二量体化変異体（例えばＥＬＤ、ＫＫＲ、ＥＬＥ、ＫＫＳなど）を含む。好ましい実施形態では、４１６、４２２、４４７、４４８および／または５２５位における変異は、荷電を有さない、または負電荷を有するアミノ酸での正電荷を有するアミノ酸の置き換えを含む。他の実施形態では、４４６、４７２および／または４７８位（必要に応じて例えば二量体化または触媒ドメインにおける追加の残基）における変異が行われる。ある特定の実施形態では、操作された切断ハーフドメインは、５４２位における変異（例えば、Ｎ５４２Ｄ）および／または４７８位における変異（例えば、Ｐ４７８Ｓ）を含む。例えば、第１の（左の）ヌクレアーゼが１つの操作された切断ドメイン（例えば、Ｎ５４２Ｄ）を含み、第２のヌクレアーゼが異なる操作された切断ドメイン（例えば、Ｐ４７８Ｓ）を含む、操作された切断ドメインのヘテロ二量体も記載される。
上述した操作された切断ハーフドメインのいずれも、例えばそれらをＤＮＡ結合ドメインと会合させることによって、人工ヌクレアーゼ（およびこれらの人工ヌクレアーゼを発現するポリヌクレオチド）に取り入れることができ、その例としては、これらに限定されないが、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、ＴＡＬＥＮ、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓヌクレアーゼなどが挙げられる。ジンクフィンガーヌクレアーゼのジンクフィンガータンパク質は、非正準亜鉛配位残基（例えば、正準Ｃ２Ｈ２立体配置ではなくＣＣＨＣ、米国特許第９，２３４，１８７号を参照）を含んでいてもよい。
別の態様では、本明細書に記載される、ＤＮＡ結合ドメイン、および操作されたＦｏｋＩまたはその相同体の切断ハーフドメインを含み、人工ヌクレアーゼを生じる融合分子が提供される。ある特定の実施形態では、融合分子のＤＮＡ結合ドメインは、ジンクフィンガー結合ドメイン（例えば、操作されたジンクフィンガー結合ドメイン）である。他の実施形態では、ＤＮＡ結合ドメインは、ＴＡＬＥ ＤＮＡ結合ドメインである。よりさらなる実施形態では、ＤＮＡ結合ドメインは、ＤＮＡ結合分子（例えばガイドＲＮＡ）および触媒的に不活性なＣａｓ９またはＣｆｐ１タンパク質（ｄＣａｓ９またはｄＣｆｐ１）を含む。一部の実施形態では、操作された融合分子は、二量体のヌクレアーゼが、二本鎖ＤＮＡ分子の１つの鎖のみを切断し、ニッカーゼを形成することのみが可能になるように、触媒的に不活性な操作された切断ハーフドメインとヌクレアーゼ複合体を形成する（米国特許第９，２００，２６６号を参照）。
本発明の方法および組成物は、ＤＮＡ主鎖上のリン酸と非特異的に相互作用することができる、標的配列のヌクレオチドを認識する残基の外側のＤＮＡ結合ドメイン内の１つまたは複数のアミノ酸への変異（例えば、「ＺＦＰ主鎖」（ＤＮＡ認識へリックス領域の外側）へのまたは「ＴＡＬＥ主鎖」（ＲＶＤの外側）への１つまたは複数の変異）も含んでいてもよい。したがって、ある特定の実施形態では、本発明は、ヌクレオチドの標的特異性に必要ではないＺＦＰ主鎖におけるカチオン性アミノ酸残基の変異を含む。一部の実施形態では、ＺＦＰ主鎖におけるこれらの変異は、カチオン性アミノ酸残基を、中性またはアニオン性アミノ酸残基に変異させることを含む。一部の実施形態では、ＺＦＰ主鎖におけるこれらの変異は、極性アミノ酸残基を中性または非極性アミノ酸残基に変異させることを含む。好ましい実施形態では、変異は、ＤＮＡ結合へリックスに対して（－５）、（－９）位および／または（－１４）位で行われる。一部の実施形態では、ジンクフィンガーは、（－５）、（－９）および／または（－１４）における１つまたは複数の変異を含んでいてもよい。さらなる実施形態では、マルチフィンガージンクフィンガータンパク質における１つまたは複数のジンクフィンガーは、（－５）、（－９）および／または（－１４）に変異を含んでいてもよい。一部の実施形態では、（－５）、（－９）および／または（－１４）におけるアミノ酸（例えばアルギニン（Ｒ）またはリシン（Ｋ））は、アラニン（Ａ）、ロイシン（Ｌ）、Ｓｅｒ（Ｓ）、Ａｓｐ（Ｎ）、Ｇｌｕ（Ｅ）、Ｔｙｒ（Ｙ）および／またはグルタミン（Ｑ）に変異している。例えば、米国公報第ＵＳ－２０１８－００８７０７２号を参照されたい。
別の態様では、本明細書に記載される操作された切断ハーフドメインまたは融合分子（人工ヌクレアーゼを含む）のいずれかをコードするポリヌクレオチドが提供される。好適なポリヌクレオチドの非限定的な例としては、ｍＲＮＡ、ｃＤＮＡ、ウイルスベクター（ＡＡＶ、Ａｄ、ＬＶ）、および／または非ウイルスベクター（プラスミドベクター）が挙げられる。
一部の態様では、本発明の方法および組成物は、真核性導入遺伝子配列に融合した外因性ペプチド配列をコードする配列の使用を含む。一部の実施形態では、外因性ペプチドは、翻訳後修飾によってタンパク質配列に融合されており、他の実施形態では、外因性ペプチドをコードする配列は、インフレーム（３’および／または５’）で人工ヌクレアーゼ（例えば、融合タンパク質）をコードする配列に連結されている。外因性ペプチドは、精製または標識付け、例えば親和性精製または免疫組織化学に有用な配列をコードしていてもよい。このようなペプチドの例は、ポリヒスチジンタグ（「Ｈｉｓタグ」、Hochuli et al (1988), Bio/Technol 6(11):1321-5）またはカチオン性ペプチドタグ、例えばＦｌａｇタグ（Hopp et al (1988) Bio/Technol 6(10):1204-10；Hernan et al. (2000) BioTechniques 28(4), 789-793）である。これらのペプチドタグ配列の１種または複数（１、２、３、４、５種またはそれよりも多く）は、任意の組合せで使用することができる。一部の実施形態では、配列Ｎ末端ＤＹＫＤＤＤＫ（配列番号３）を含む外因性Ｆｌａｇペプチドをコードする配列は、人工ヌクレアーゼをコードする配列のＣ末端またはＮ末端においてインフレームで融合されている。好ましい実施形態では、３つのＦＬＡＧ配列（３×ＦＬＡＧペプチド）をコードする配列が使用され（米国特許第６，３７９，９０３号を参照）、アミノ酸配列は、Ｎ末端（Ｍ）ＤＹＫＤＨＤＧ－ＤＹＫＤＨＤＩ－ＤＹＫＤＤＤＤＫ（配列番号４）であり、Ｎ末端メチオニン（Ｍ）は、必要に応じたものである。このようなペプチド配列（例えば、３×ＦＬＡＧなどのポリカチオン性配列）の１つまたは複数を含むことは、そのペプチド配列を有さないヌクレアーゼと比較して、ヌクレアーゼ（切断）活性を、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１倍、またはそれよりも多く増加させることができる。
一部の態様では、人工ヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡは、核局在化ペプチド配列（ＮＬＳ）を含む。一部の実施形態では、ＮＬＳは、ＳＶ４０ウイルスラージＴ遺伝子由来の配列ＰＫＫＫＲＫＶ（配列番号５）を含み（Kalderon et al (1984) Nature 311(5981):33-8を参照）、一方で他の実施形態では、ＮＬＳは、ｃ－ｍｙｃタンパク質由来の配列ＰＡＡＫＲＶＫＬＤ（配列番号６）を含む（Dang and Lee (1988) Mol Cell Biol 8(10):4048-54を参照）。一部の実施形態では、ＮＬＳは、デルタ型肝炎ウイルス由来の配列ＥＧＡＰＰＡＫＲＡＲ（配列番号７）（Alves et al (2008) Virology 370:12-21を参照）またはポリオーマＴタンパク質由来のＶＳＲＫＲＰＲＰ（配列番号８）（Richardson et al (1986) Cell 44(1):77-85）を含む。他の実施形態では、ＮＬＳは、ヌクレオプラスミンカルボキシ尾部由来の配列ＫＲＰＡＡＴＫＫＡＧＱＡＫＫＫＫＬＤ（配列番号９）を含み（Dingwall (1988) J Cell Biol 107:841-849およびRobbins et al (1991) Cell 64(3):615-23を参照）、一方で一部の実施形態では、ＮＬＳは、最初にSiomiおよびDreyfussによって記載された配列ＮＱＳＳＮＦＧＰＭＫＧＧＮＦＧＧＲＳＳＧＰＹＧＧＧＧＱＹＦＡＫＰＲＮＱＧＧＹ（配列番号１０）（Siomi and Dreyfus (1995) J Cell Biol 129(3):551-560）を含む。さらなる実施形態では、ＮＬＳは、ＨＴＬＶ－１におけるＲｅｘタンパク質由来の配列ＰＫＴＲＲＲＰＲＲＳＱＲＫＲＰＰＴ（配列番号１１）を含む（Siomi et al (1988) Cell 55(2):197-209）。本明細書に記載されるＮＬＳ配列の１種または複数を含むことは、ペプチド配列を有さないヌクレアーゼと比較して、ヌクレアーゼ（切断）活性を、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１倍、またはそれよりも多く増加させることができる。
さらに別の態様では、本明細書に記載されるヌクレアーゼ、ポリペプチド（例えば、融合分子または融合ポリペプチド）および／またはポリヌクレオチドのいずれかを含む細胞も提供される。一実施形態では、細胞は、融合ポリペプチドの対を含み、１つの融合ポリペプチドは、アミノ酸残基３９３、３９４、３９８、４１６、４２１、４２２、４４２、４４４、４４７、４４８、４７３、４８０、５３０および／または５２５における１つまたは複数の変異に加えて、ＥＬＤまたはＥＬＥ切断ハーフドメインを含み、１つの融合ポリペプチドは、残基３９３、３９４、３９８、４１６、４２１、４２２、４４２、４４４、４４６、４４７、４４８、４７２、４７３、４７８、４８０、５３０および／または５２５における１つまたは複数の変異に加えて、ＫＫＫまたはＫＫＲ切断ハーフドメインを含む（米国特許第８，９６２，２８１号を参照）。一部の実施形態では、１つの融合タンパク質は、ＦｏｋＩの残基５４２（切断ドメインの残基１５９）に変異、例えばＮ５４２Ｄを含み、１つの融合ポリペプチドは、ＦｏｋＩの残基４７８（切断ドメインの残基９５）に変異例えばＰ４７８Ｓを含む。
本明細書に記載されるこれらの融合ポリペプチドのいずれかでは、ＺＦＰパートナーは、ジンクフィンガーＤＮＡ結合ドメインにおいて、（－５）、（－９）および／または（－１４）位に変異をさらに含んでいてもよい。一部の実施形態では、－５位におけるＡｒｇ（Ｒ）は、Ｔｙｒ（Ｙ）、Ａｓｐ（Ｎ）、Ｇｌｕ（Ｅ）、Ｌｅｕ（Ｌ）、Ｇｌｎ（Ｑ）、またはＡｌａ（Ａ）に変更されている。他の実施形態では、（－９）位におけるＡｒｇ（Ｒ）は、Ｓｅｒ（Ｓ）、Ａｓｐ（Ｎ）、またはＧｌｕ（Ｅ）で置き換えられている。さらなる実施形態では、（－１４）位におけるＡｒｇ（Ｒ）は、Ｓｅｒ（Ｓ）またはＧｌｎ（Ｑ）で置き換えられている。他の実施形態では、融合ポリペプチドは、ジンクフィンガーＤＮＡ結合ドメインに変異を含んでいてもよく、（－５）、（－９）および／または（－１４）位におけるアミノ酸は、任意の組合せで、上で列挙したアミノ酸のいずれかに変更されている。
本明細書に記載される１つまたは複数の人工ヌクレアーゼを含む細胞由来の、および／またはそれから分化した細胞を含む、本発明のポリペプチドおよび／またはポリヌクレオチドによって改変された細胞も本明細書で提供される。一部の実施形態では、細胞は、ヌクレアーゼ媒介性の導入遺伝子挿入、またはヌクレアーゼ媒介性の遺伝子ノックアウトを含む。改変された細胞、および改変された細胞由来の任意の細胞は、必ずしも一過性にとどまらずに本発明のヌクレアーゼを含むとは限らないが、このようなヌクレアーゼによって媒介されるゲノム改変は依然として存在する。
さらに別の態様では、目的の領域における細胞クロマチンの標的化された切断のための方法；細胞中で相同組換えを起こさせる方法；感染を処置する方法；および／または疾患を処置する方法が提供される。これらの方法は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ、ｅｘ ｖｉｖｏもしくはｉｎ ｖｉｖｏで、またはそれらの組合せで実施してもよい。方法は、本明細書に記載される１種または複数の人工ヌクレアーゼを使用して、細胞クロマチンを、細胞中の所定の目的の領域で切断することを含む。ある特定の実施形態では、本明細書に記載される融合ポリペプチドの対（すなわち、一方または両方の融合ポリペプチドが本明細書に記載される操作された切断ハーフドメインを含む融合ポリペプチドの対）。ある特定の実施形態では、オンターゲット部位の標的化された切断は、本明細書に記載される変異を有さない切断ドメインと比較して、５０％～６０％（またはそれらの間の任意の値）、６０％～７０％（またはそれらの間の任意の値）、７０％～８０％（またはそれらの間の任意の値）、８０％～９０％（またはそれらの間の任意の値）、９０％～２００％（またはそれらの間の任意の値）を含む、少なくとも５０～２００％（またはそれらの間の任意の値）またはそれよりも多く増加する。同様に、本明細書に記載される方法および組成物を使用して、オフターゲット部位切断は、これらに限定されないが、１～５０倍（またはそれらの間の任意の値）を含む、１～１００倍またはそれよりも多い倍数まで低減される。ある特定の実施形態では、ヌクレアーゼ活性の標的化された切断は、本明細書に記載されるヌクレアーゼをコードする構築物が改変（強化）を含まない場合と比較して、５０％～６０％（またはそれらの間の任意の値）、６０％～７０％（またはそれらの間の任意の値）、７０％～８０％（またはそれらの間の任意の値）、８０％～９０％（またはそれらの間の任意の値）、９０％～２００％（またはそれらの間の任意の値）を含む、少なくとも５０～２００％（またはそれらの間の任意の値）もしくはそれよりも多く、またはこれらに限定されないが、１～５０倍（またはそれらの間の任意の値）を含む、１～１００倍もしくはそれよりも多い倍数まで増加する。
本明細書に記載される人工ヌクレアーゼ（およびそれをコードするポリヌクレオチド）は、目的の領域における細胞クロマチンの標的化された切断のための方法および／または細胞中の所定の目的の領域における相同組換えで使用することができる。細胞としては、培養細胞、細胞系、生物中の細胞、細胞および／またはその子孫が処置後に生物に戻される場合における処置のために生物から取り出された細胞、ならびに生物から取り出され、本発明の融合分子を使用して改変され、次いで処置方法（細胞療法）において生物に戻される細胞が挙げられる。細胞クロマチンにおける目的の領域は、例えば、ゲノム配列またはその一部であってもよい。組成物は、記載されたＤＮＡ結合分子（例えば、操作されたジンクフィンガーまたはＴＡＬＥ結合ドメインまたは操作されたＣＲＩＳＰＲガイドＲＮＡ）および切断ハーフドメインを含む、融合分子または融合分子をコードするポリヌクレオチドを含む。
融合分子は、例えば、細胞に融合分子をポリペプチドとして送達することによって、または細胞に融合分子をコードするポリヌクレオチドを送達することによって、細胞で発現させることができ、ポリヌクレオチドは、ＤＮＡの場合、転写され、翻訳されて、融合分子を生成する。さらに、ポリヌクレオチドが融合分子（またはその成分）をコードするｍＲＮＡである場合、細胞へのｍＲＮＡの送達の後、ｍＲＮＡは翻訳され、したがって融合分子が生成される。
本発明の他の態様では、操作されたヌクレアーゼ特異性を増加させるための方法および組成物が提供される。一態様では、オフターゲット切断活性を減少させることによって全体的なオンターゲット切断の特異性を増加させるための方法が提供される。一部の実施形態では、操作されたヌクレアーゼ複合体の成分である操作された切断ハーフドメイン含有パートナーは、細胞と接触するのに使用され、複合体の各パートナーは、１対１以外の他のパートナーに対する比率になる。一部の実施形態では、２つのパートナー（ハーフ切断ドメイン）の比率は、１：２、１：３、１：４、１：５、１：６、１：８、１：９、１：１０または１：２０の比率、またはそれらの間の任意の値になる。他の実施形態では、２つのパートナーの比率は、１：３０よりも大きい。他の実施形態では、２つのパートナーは、１：１と異なるように選択された比率で配置される。一部の態様では、各パートナーは、ｍＲＮＡとして細胞に送達されるか、またはウイルスまたは非ウイルスベクターで送達され、各パートナーをコードする異なる量のｍＲＮＡまたはベクターが送達される。さらなる実施形態では、ヌクレアーゼ複合体の各パートナーは、単一のウイルスまたは非ウイルスベクターに含まれていてもよいが、一方のパートナーが他方よりも大きいまたは小さい値で発現されるように計画的に発現され、最終的に１対１以外の切断ハーフドメインの比率で細胞に送達される。一部の実施形態では、各切断ハーフドメインは、異なる発現効率を有する異なるプロモーターを使用して発現される。他の実施形態では、２つの切断ドメインは、ウイルスまたは非ウイルスベクターを使用して細胞に送達され、両方とも、同じオープンリーディングフレームから発現されるが、２つのパートナーをコードする遺伝子は、２つのパートナーの比率が１：２、１：３、１：４、１：５、１：６、１：８、１：９、１：１０もしくは１：２０の比率、またはそれらの間の任意の値になるように３’パートナーをより低い割合で発現させる配列（例えば自己切断２Ａ配列またはＩＲＥＳ）によって分離される。他の実施形態では、２つのパートナーは、１：１と異なるように選択された比率で配置される。
したがって、別の態様では、目的の領域における細胞クロマチンを切断するための方法は、（ａ）目的の領域における第１の配列を選択するステップ；（ｂ）第１のＤＮＡ結合分子を、第１の配列に特異的に結合するように操作するステップ；（ｃ）細胞中で第１の融合分子を発現させるステップであって、第１の融合分子が、第１のＤＮＡ結合分子（例えば、ジンクフィンガー、ＴＡＬＥ、ｓｇＲＮＡ）、および切断ドメイン（またはハーフドメイン）を含む、ステップ；ならびに（ｄ）細胞中で第２の融合タンパク質を発現させるステップであって、第２の融合分子が、第２のＤＮＡ結合ドメイン、および第２の切断ドメイン（またはハーフドメイン）を含む、ステップを含んでいてもよく、融合分子の少なくとも１つが、本明細書に記載されるリンカーを含み、さらに、第１の融合分子が、第１の配列に結合し、第２の融合分子が、活性なヌクレアーゼ複合体を形成することができ、細胞クロマチンが目的の領域で切断されるように、第１の配列から２～５０ヌクレオチドの間に位置する第２の配列に結合する。ある特定の実施形態では、両方の融合分子は、ＤＮＡ結合ドメインと触媒性のヌクレアーゼドメインとの間に本明細書に記載されるリンカーを含む。
例えば標的化された変異を導入するために、細胞クロマチンの領域（例えば、内因性遺伝子）を変更する方法も提供される。ある特定の実施形態では、細胞クロマチンを変更する方法は、細胞に、１つまたは複数の標的化されたヌクレアーゼ（所定の部位で細胞クロマチン中に二本鎖切断を作り出すため）、および切断の領域における細胞クロマチンのヌクレオチド配列への相同性を有するドナーポリヌクレオチドを導入することを含む。細胞のＤＮＡ修復プロセスは、二本鎖切断の存在によって活性化され、ドナーポリヌクレオチドは、切断の修復のための鋳型として使用され、結果として細胞クロマチンへのドナーのヌクレオチド配列の全部または一部の導入が起こる。したがって、細胞クロマチン中の配列は、変更することができ、ある特定の実施形態では、ドナーポリヌクレオチド中に存在する配列に変換することができる。１つまたは複数の標的は、本明細書に記載される方法および組成物を使用して変更されてもよい。
標的化された変更としては、これらに限定されないが、点変異（すなわち、単一の塩基対の異なる塩基対への変換）、置換（すなわち、複数の塩基対の、同一な長さの異なる配列への変換）、１つまたは複数の塩基対の（or）挿入、１つまたは複数の塩基対の欠失、および上述の配列変更の任意の組合せが挙げられる。変更はまた、コードされたアミノ酸が変更されるように、コード配列の一部である塩基対の変換を含んでいてもよい。
ドナーポリヌクレオチドは、ＤＮＡまたはＲＮＡであってもよく、直鎖状または環状であってもよく、一本鎖または二本鎖であってもよい。これは、裸の核酸として、１つもしくは複数の送達剤（例えば、リポソーム、ナノ粒子、ポロキサマー）との複合体として、またはウイルス送達ビヒクル、例えば、アデノウイルス、レンチウイルスもしくはアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）などに含有されて送達されてもよい。ドナー配列は、１０～１，０００ヌクレオチドの長さの範囲（またはそれらの間のヌクレオチドの任意の整数値）またはそれよりも長くてもよい。一部の実施形態では、ドナーは、標的化された切断部位との相同性を有する領域に挟まれた全長遺伝子を含む。一部の実施形態では、ドナーは、相同な領域を欠いており、相同性と無関係のメカニズム（すなわちＮＨＥＪ）を介して標的遺伝子座に組み込まれている。他の実施形態では、ドナーは、細胞での使用のために（すなわち遺伝子修正のために）相同な領域に挟まれた核酸のより小さい一片を含む。一部の実施形態では、ドナーは、機能的または構造的な成分、例えばｓｈＲＮＡ、ＲＮＡｉ、ｍｉＲＮＡなどをコードする遺伝子を含む。他の実施形態では、ドナーは、目的の遺伝子に結合するおよび／またはその発現をモジュレートする調節エレメントをコードする配列を含む。他の実施形態では、ドナーは、目的の遺伝子に結合するおよび／またはその発現をモジュレートする目的の調節タンパク質（例えばＺＦＰ ＴＦ、ＴＡＬＥ ＴＦまたはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ ＴＦ）である。
本明細書に記載されるある特定の方法および組成物では、ヌクレアーゼおよびドナーは、１つまたは複数のｍＲＮＡおよび／またはＡＡＶベクターを使用して送達される。任意の用量のｍＲＮＡ（ｎｇ）またはＡＡＶベクター（ｖｇ／用量）を使用することができる。ｍＲＮＡがヌクレアーゼ（複数可）および／または必要に応じたドナーを送達する実施形態では、ｍＲＮＡの投薬量は、典型的には、細胞または対象あたり１０～５０００ｎｇの間の範囲である（例えば、２０００ｎｇ、６２．５ｎｇ、３１．３ｎｇ、１５．６ｎｇ）。ＡＡＶベクターがヌクレアーゼおよび／または必要に応じたドナーを運ぶのに使用される実施形態では、投薬量は、典型的には、各ヌクレアーゼ（例えば、左および右のＺＦＮ）について、対象または細胞あたり１．００Ｅ＋９～１．００Ｅ＋１３ｖｇの間の範囲であり、必要に応じたドナーは、１．００Ｅ＋１０～１．００Ｅ＋１３で与えられる。ある特定の実施形態では、対の各ヌクレアーゼは別々のＡＡＶベクターに担持され、細胞もしくは対象あたり２．００Ｅ＋１０、６．００Ｅ＋１０または２．００Ｅ＋１１ｖｇで与えられ、ドナーは、別のＡＡＶベクターに担持され、細胞もしくは対象あたり１．６０Ｅ＋１１、４．８Ｅ＋１１または１．６Ｅ＋１２ｖｇで与えられる。
上述の方法のいずれについても、細胞クロマチンは、染色体、エピソームまたは細胞小器官のゲノム中にあってもよい。細胞クロマチンは、これらに限定されないが、原核および真核細胞、真菌細胞、植物細胞、動物細胞、哺乳動物細胞、霊長類細胞およびヒト細胞を含む任意のタイプの細胞中に存在していてもよい。
一態様では、第１および第２の（左および右の、またはＺＦＮパートナーとも称される）ＺＦＮを含むジンクフィンガーヌクレアーゼであって、第１のＺＦＮが、７１５５７と名付けられたＺＦＮ（ＳＢＳ４２８７５に関して表１に示される認識へリックス領域を有するＺＦＰを含み、表３および表４に示される追加の特色（例えば、ＦｏｋＩ配列およびＺＦＰ主鎖における変異、５’ＵＴＲ配列など）を有する）を含み、第２のＺＦＮが、７１７２８と名付けられたもの（ＳＢＳ４７８７４に関して表１に示される認識へリックス領域を有するＺＦＰ、および表３および表５に示される他の特色（例えば、ＦｏｋＩ配列およびＺＦＰ主鎖における変異、５’ＵＴＲ配列など）を含む）ならびに／または左および右のＺＦＮの一方もしくは両方をコードする１つもしくは複数のポリヌクレオチドを含む、ジンクフィンガーヌクレアーゼが本明細書に記載される。ある特定の実施形態では、第１および第２の（左および右の）ＺＦＮは、別々のポリヌクレオチドによってコードされ、この別々のポリヌクレオチドは、同一または異なるタイプのものであってもよい（例えば、１つのＡＡＶが左のＺＦＮをコードする配列を含み、１つのＡＡＶが右のＺＦＮをコードする配列を含む２つのＡＡＶベクター、一方のｍＲＮＡが左のＺＦＮをコードし、他方が右のＺＦＮをコードする２つのｍＲＮＡ、自己切断ペプチド配列（例えば２Ａ）によって互いに連結された両方のＺＦＮを含む１つのＡＡＶ、および他方のＺＦＮをコードする配列を含む１つのＡＡＶと共に使用される一方のＺＦＮをコードする１つのｍＲＮＡなど）。ある特定の実施形態では、ベクターは、表４および／または表５に示されるエレメント（配列）を含むＡＡＶベクターであり、本明細書で示される「７１５５７ＡＡＶ」または「ＳＢ７１５５７ＡＡＶ」（配列番号４３）および「７１７２８ＡＡＶ」または「ＳＢ７１７２８ＡＡＶ」（配列番号５６）と名付けられた完全ＡＡＶ配列を含む。他の実施形態では、表４および５に示されるエレメントの１つまたは複数は、任意の類似の配列で置き換えられ、例えばこれらの表のＷＰＲＥ配列は、当業界において公知の、または本明細書の実施例４に記載のＷＰＲＥ配列（例えば、配列番号５３の代わりに、配列番号６８もしくは配列番号６９、または他のＷＰＲＥ配列）で置き換えられていてもよい。一部の実施形態では、ＺＦＮに多くのアミノ酸改変を行うことができる。一部の実施形態では、３、６、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０またはそれよりも多くのアミノ酸置換が行われる。一部の実施形態では、右および左側におけるフィンガーのうち６つに対して１３の組み合わされたアミノ酸置換が行われる。
したがって、第１および第２のＺＦＮを含むジンクフィンガーヌクレアーゼであって、第１のＺＦＮが、７１５５７と名付けられたＺＦＮを含み、第２のＺＦＮが、７１７２８と名付けられたＺＦＮを含む、ジンクフィンガーヌクレアーゼが本明細書に記載される。本明細書に記載される第１および第２のＺＦＮをコードする配列を含む１つまたは複数のポリヌクレオチドも提供される。ある特定の実施形態では、単一のポリヌクレオチドが、第１および第２のＺＦＮをコードし、他の実施形態では、２つの別々のポリヌクレオチドが、第１および第２のＺＦＮをコードする配列を含む。ＺＦＮをコードする１つまたは複数のポリヌクレオチドは、同一または異なるＡＡＶベクターに担持され得る。ある特定の実施形態では、第１のポリヌクレオチド（例えば、ＡＡＶベクター）が、表４に示される配列または配列番号４３に示される配列を含み、第２のポリヌクレオチド（例えば、ＡＡＶベクター）が、表５に示される配列または配列番号５６に示される配列を含む、２つのポリヌクレオチドが本明細書で提供される。一部の実施形態では、左のＺＦＮ（ＳＢ－７１５５７）を含むＡＡＶは、ＳＢ－Ａ６Ｐ－ＺＬ２と称される。一部の実施形態では、右のＺＦＮ（ＳＢ－７１７２８）を含むＡＡＶは、ＳＢ－Ａ６Ｐ－ＺＲ２と称される。
別の態様では、本明細書に記載される１つまたは複数のＺＦＮおよび／またはポリヌクレオチド（例えば、ＡＡＶベクター）を含む細胞（例えば、対象の幹細胞、前駆体細胞または肝細胞）が本明細書に記載される。これらに限定されないが、幹細胞、前駆体細胞、肝臓細胞、血液細胞などを含むあらゆる細胞または細胞系を使用することができる。細胞は、ドナーポリヌクレオチド、典型的には治療用タンパク質をコードする導入遺伝子などの外因性配列をコードするポリヌクレオチドまたはその断片をさらに含んでいてもよく、外因性配列は、内因性アルブミン遺伝子の切断後に細胞のゲノムに組み込まれる。ドナーは、ＺＦＮパートナーの一方もしくは両方と同じベクターに担持されてもよく、あるいは、別々のベクターを使用して投与されてもよく、ベクターは、ＺＦＮパートナーの一方または両方を担持するベクター（複数可）と同一または異なるタイプであってもよい。ある特定の実施形態では、細胞は、３つの別々のＡＡＶベクターを含み、第１のＡＡＶベクターは、左のＺＦＮをコードする配列を含み、第２のＡＡＶベクターは、右のＺＦＮをコードする配列を含み、第３のＡＡＶベクターは、ドナーポリヌクレオチドを含む。ＺＦＮおよびドナーポリヌクレオチドを含む細胞由来の娘細胞も記載され、この娘細胞は、ＺＦＮによって行われた遺伝子改変（例えば、組み込まれたドナーポリヌクレオチド）を含む。このような遺伝子改変は、娘細胞のゲノムＤＮＡの次世代シーケンシングを含む、当業界において公知の標準的な方法により同定することができ、このようなシーケンス結果は、ＺＦＮおよびドナーポリヌクレオチドで処置されていない野生型細胞と比較される。
別の態様では、本明細書に記載される１つもしくは複数のＺＦＮ、１つもしくは複数のポリヌクレオチド（例えば、ＡＡＶベクター）、および／または１つもしくは複数の細胞を含む医薬組成物が本明細書に記載される。ある特定の実施形態では、医薬組成物は、３つの別々のＡＡＶベクターを含み、第１のＡＡＶは、ＺＦＮ７１５５７（例えば、「７１５５７ＡＡＶ」）を含み、第２のＡＡＶは、ＺＦＮ７１７２８（例えば、「７１７２８ＡＡＶ」）を含み、第３のＡＡＶは、ドナーポリヌクレオチドを含む。
別の態様では、内因性アルブミン遺伝子を切断するための、本明細書に記載されるＺＦＮの１つもしくは複数、ポリヌクレオチド（例えば、ＡＡＶベクター）の１つもしくは複数、細胞の１つもしくは複数、および／または医薬組成物の１つもしくは複数（例えば、３つの別々のＡＡＶベクターを含む医薬組成物）を使用する方法であって、必要に応じて方法（使用）は、外因性配列が単離された細胞または対象の細胞中の切断されたアルブミン遺伝子に組み込まれるように、外因性配列（例えば、ＡＡＶベクターによって運ばれる）を含むドナーポリヌクレオチドを投与するステップをさらに含む。一部の実施形態では、このような本明細書に記載されるＺＦＮの１つもしくは複数、ポリヌクレオチドの１つもしくは複数、細胞の１つもしくは複数および／または医薬組成物の１つもしくは複数は、ヒト疾患を防止または処置するのに使用される。
本明細書に記載される１つもしくは複数のジンクフィンガーヌクレアーゼ、１つもしくは複数のポリヌクレオチド、１つもしくは複数の細胞および／または１つもしくは複数の医薬組成物、ならびに必要に応じたそれらの使用のための指示を含むキットも提供される。
さらに別の態様では、（ａ）７１５５７と名付けられた第１のＺＦＮをコードする配列を含む第１のポリヌクレオチド（例えば、ＡＡＶ）であって、必要に応じて、表４に示される配列またはＳＢ７１５５７ＡＡＶと名付けられた配列（配列番号４３）を含む、第１のポリヌクレオチド；（ｂ）７１７２８と名付けられた第２のＺＦＮをコードする配列を含む第２のポリヌクレオチド（例えば、ＡＡＶ）であって、必要に応じて、表５に示される配列またはＳＢ７１７２８ＡＡＶと名付けられた配列（配列番号５６）を含む、第２のポリヌクレオチド；および（ｃ）第ＩＸ因子（ＦＩＸ）タンパク質をコードする配列を含むドナーポリヌクレオチド（例えば、ＡＡＶ）を含む組成物（「ＦＩＸ組成物」とも称される）が本明細書に記載される。ある特定の実施形態では、ドナーは、表６に示される配列を、必要に応じて配列番号５９に示される配列を含む。本明細書に記載されるＦＩＸ組成物のいずれかでは、第１の、第２の、およびドナーポリヌクレオチドは、３つの別々のＡＡＶベクターに担持され得る。それを必要とする対象においてＦＩＸを発現させるための本明細書に記載される組成物を使用する方法も提供される。ある特定の実施形態では、ＺＦＮ（７１５５７および７１７２８）が対象において内因性アルブミン遺伝子を切断し、ＦＩＸの配列が切断されたアルブミン遺伝子に組み込まれ、ＦＩＸタンパク質が対象において発現されるように、組成物が対象に投与される。本明細書に記載される方法および組成物は、それを必要とする対象において血友病を処置および／または防止するのに使用することができる。ＦＩＸ組成物の１つまたは複数および必要に応じてその使用のための指示を含むキットも提供される。
よりさらなる態様では、（ａ）７１５５７と名付けられた第１のＺＦＮをコードする配列を含む第１のポリヌクレオチド（例えば、ＡＡＶ）であって、必要に応じて、表４に示される配列またはＳＢ７１５５７ＡＡＶと名付けられた配列（配列番号４３）を含む、第１のポリヌクレオチド；（ｂ）７１７２８と名付けられた第２のＺＦＮをコードする配列を含む第２のポリヌクレオチド（例えば、ＡＡＶ）であって、必要に応じて、表５に示される配列またはＳＢ７１７２８と名付けられた配列（配列番号５６）を含む、第２のポリヌクレオチド；および（ｃ）イズロン酸－２－スルファターゼ（ＩＤＳ）配列をコードする配列を含むドナーポリヌクレオチド（例えば、ＡＡＶ）を含む組成物（「ＭＰＳ ＩＩ組成物」または「ＩＤＳ組成物」とも称される）が本明細書に記載される。ある特定の実施形態では、ドナーは、表７に示される配列、必要に応じて配列番号６５に示される配列を含む。本明細書に記載されるＭＰＳ ＩＩ組成物のいずれかでは、第１の、第２の、およびドナーポリヌクレオチドは、３つの別々のＡＡＶベクターに担持され得る。それを必要とする対象においてＩＤＳを発現させるための本明細書に記載される組成物を使用する方法も提供される。ある特定の実施形態では、ＺＦＮ（７１５５７および７１７２８）が対象において内因性アルブミン遺伝子を切断し、ＩＤＳ配列が切断されたアルブミン遺伝子に組み込まれ、ＩＤＳタンパク質が対象において発現されるように、組成物が対象に投与される。本明細書に記載される方法および組成物は、それを必要とする対象においてＭＰＳ ＩＩを処置および／または防止するのに使用することができる。ＭＰＳ ＩＩ組成物の１つまたは複数、および必要に応じてその使用のための指示を含むキットも提供される。
よりさらなる態様では、（ａ）７１５５７と名付けられた第１のＺＦＮをコードする配列を含む第１のポリヌクレオチド（例えば、ＡＡＶ）であって、必要に応じて、表４に示される配列またはＳＢ７１５５７ＡＡＶと名付けられた配列（配列番号４３）を含む、第１のポリヌクレオチド；（ｂ）７１７２８と名付けられた第２のＺＦＮをコードする配列を含む第２のポリヌクレオチド（例えば、ＡＡＶ）であって、必要に応じて、表５に示される配列またはＳＢと名付けられた配列、配列番号５６を含む、第２のポリヌクレオチド；および（ｃ）アルファ－Ｌイズロニダーゼ（ＩＤＵＡ）配列をコードする配列を含むドナーポリヌクレオチド（例えば、ＡＡＶ）を含む組成物（「ＭＰＳ Ｉ組成物」または「ＩＤＵＡ組成物」とも称される）が本明細書に記載される。ある特定の実施形態では、ドナーは、表８に示される配列、必要に応じて配列番号７２に示される配列を含む。本明細書に記載されるＭＰＳ Ｉ組成物のいずれかでは、第１の、第２の、およびドナーポリヌクレオチドは、３つの別々のＡＡＶベクターに担持され得る。それを必要とする対象においてＩＤＵＡを発現させるための本明細書に記載される組成物を使用する方法も提供される。ある特定の実施形態では、ＺＦＮ（７１５５７および７１７２８）が対象において内因性アルブミン遺伝子を切断し、ＩＤＵＡ配列が切断されたアルブミン遺伝子に組み込まれ、ＩＤＵＡタンパク質が対象において発現されるように、組成物が対象に投与される。本明細書に記載される方法および組成物は、それを必要とする対象においてＭＰＳ Ｉを処置および／または防止するのに使用することができる。ＭＰＳ Ｉ組成物の１つまたは複数、および必要に応じてその使用のための指示を含むキットも提供される。
一部の実施形態では、本明細書で開示された組成物のいずれかは、それを必要とする対象に単回用量で投与される。他の実施形態では、組成物は、１つよりも多い用量で投与される。一部の実施形態では、組成物は、１つよりも多い用量で、用量間に期間を設けて投与される。一部の実施形態では、期間は、１、２、３、４、５、または６ヶ月を含む。一部の実施形態では、期間は、半年、１年、２年、３年、４年、５年またはそれよりも長い期間を含む。
さらに別の態様では、本明細書に記載されるポリペプチド（例えば、融合分子）および／またはポリヌクレオチドのいずれかを含む細胞も提供される。一実施形態では、細胞は、それぞれ本明細書で開示される切断ドメインを含む融合分子の対を含む。細胞としては、培養細胞、生物中の細胞、ならびに処置後に細胞および／またはその子孫が生物に戻される場合、処置のために生物から取り出された細胞が挙げられる。細胞クロマチンにおける目的の領域は、例えば、ゲノム配列またはその一部であってもよい。
別の態様では、本明細書に記載される融合タンパク質、または１つもしくは複数のジンクフィンガータンパク質、本明細書に記載される切断ドメインおよび／もしくは融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド；補助的な試薬；ならびに必要に応じて指示および好適な容器を含むキットが本明細書に記載される。キットはまた、１つもしくは複数のヌクレアーゼまたはこのようなヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチドを含んでいてもよい。
これらのおよび他の態様は、全体として開示を考慮すれば当業者に容易に明らかになる。
図１Ａおよび１Ｂは、ヒトアルブミンのゲノム配列の部分配列（配列番号４１）を描写し、例示的なＺＦＮ４７１７１－ＦＬＡＧおよび４７８９８－ＦＬＡＧの結合部位（下線または上線により示される標的部位）を示す。図１Ａは、個体のおよそ２０％で生じるＡ／ＴからＧ／Ｃへの（ボックスで囲った）一塩基多型（ＳＮＰ）も示す。図１Ｂは、左および右のＺＦＮが標的アルブミン配列と会合する方式を描写する概略図である。 同上。
図２は、示された例示的なヌクレアーゼおよび示された用量によるゲノム改変（％インデル）を示すグラフである。各条件下の左のバーは、野生型Ａ／Ｔ配列の改変を示し、右のバーは、Ｇ／Ｃ ＳＮＰの改変を示す。
図３Ａ～３Ｈは、本明細書に記載されるＺＦＮをコードするベクターを使用したゲノム改変の例示的な結果を示す。図３Ａは、本明細書に記載される改変を含まないヌクレアーゼ（「親」）と比較して、本明細書に記載される例示的な人工ヌクレアーゼ（名称で示された改変）を使用した、示された条件下でのオフターゲット部位（ＳＭＣＨＤ１）の改変と比較した、意図した標的（アルブミン）における改変の結果を示す。示した通り、本明細書に記載されるヌクレアーゼは、親ヌクレアーゼと比較して活性および特異性の増加を示す。図３Ｂは、意図した標的（「アルブミン－オンターゲット」）（２０００ｎｇ、６２．５ｎｇ、３１．３ｎｇ、１５．６ｎｇ）に対してまたはオフターゲット部位（「オフターゲット」）（２０００ｎｇ）に対して示された投薬量での、示された親または最適化されたＺＦＮを使用したディープシーケンシングによって測定された切断活性（％インデル）を示す。図に示される操作されたＦｏｋＩドメインＮ１５９Ｄは、Ｎ５４２Ｄとも称され、Ｐ９５Ｓと名付けられたＦｏｋＩドメインは、Ｐ４７８Ｓとも称される。図３Ｂは、改善されたバージョンで行われた改変を有するＺＦＮ発現カセットの概略図も示す。図３Ｃは、本明細書に記載されるＺＦＮで処置したＫ５６２およびＨｅｐＧ２細胞における示されたオンターゲット部位（アルブミン）およびオフターゲット部位（１～２６行）における活性の結果（％インデルによって示される切断活性および「捕捉事象」と名付けられた標的化組込み）を示す。「ｎｓ」は、有意ではないことを指し；「ｎｓ＊」は、ＺＦＮ切断と一致しないインデルを指し；「＾」は、ＺＦＮ切断と一致するインデルおよび有意ではないｐ値を指し；「ＮＤ」は、データがないことを指す。図３Ｄは、親４７１７１／４７８９８ＺＦＮ対（「ＺＦＮ標準」、各条件の左のバー）または最適化された７１５５７／７１７２８ＺＦＮ対（「ＺＦＮ２．０」、各条件の右のバー）を使用した、ＡＡＶベクターによって担持されるアルブミンＺＦＮおよびＩＤＳ導入遺伝子を担持するＡＡＶドナーの示された投薬量（低＝３０／２４０のＺＦＮ／ドナーＭＯＩ；中＝１００／８００のＺＦＮ／ドナーＭＯＩ；および高＝３００／２４００のＺＦＮ／ドナーＭＯＩ）における切断（％インデル）を示すグラフである。この実験で使用された７１５５７／７１７２８ＺＦＮをコードするＡＡＶ構築物は、５’β－グロビン非翻訳領域（ＵＴＲ）、３×ＦＬＡＧおよびウッドチャック肝炎ウイルス（ＷＨＶ）転写後調節エレメント変異体６（ＷＰＲＥｍｕｔ６）を含んでいた。図３Ｅ（ｉ）は、親（「ＺＦＮ標準」、各条件の左のバー）または最適化されたＺＦＮ（「ＺＦＮ２．０」、各条件の右のバー）を使用した、ＡＡＶベクターによって担持されるアルブミンＺＦＮおよびＩＤＳ導入遺伝子を担持するＡＡＶドナーの示された投薬量（低＝３０／２４０のＺＦＮ／ドナーＭＯＩ；中＝１００／８００のＺＦＮ／ドナーＭＯＩ；および高＝３００／２４００のＺＦＮ／ドナーＭＯＩ）におけるドナー導入遺伝子によってコードされたタンパク質（ＩＤＳ）の活性を示すグラフである。図３Ｅ（ｉｉ）は、示された投薬量におけるＩＤＳ活性を示すグラフである。各条件下の左から右に、（左から右に）：５日目における標準ＺＦＮ；７日目における標準ＺＦＮ；５日目におけるＺＦＮ２．０、および７日目におけるＺＦＮ２．０が示される。図３Ｆ（ｉ）および３Ｆ（ｉｉ）は、４７１７１／４７８９８対と７１５５７／４７８９８対との比較からの結果を描写する。ＺＦＮをコードするｍＲＮＡの示された量を、ＷＴ（Ａ：Ｔ）およびＳＮＰ（Ｇ：Ｃ）含有ＺＦＮ標的部位についてヘテロ接合型の初代ヒト肝細胞に３つ組でトランスフェクトした。この実験で使用された７１５５７ＺＦＮをコードするｍＲＮＡは、５’β－グロビン非翻訳領域（ＵＴＲ）およびウッドチャック肝炎ウイルス（ＷＨＶ）転写後調節エレメント（ＷＰＲＥ）を含んでいた。トランスフェクションの２４時間後に、ディープシーケンシングによってＺＦＮ活性のレベルを決定した。図３Ｆ（ｉ）は、Ａ：Ｔ ＷＴ対立遺伝子（濃い灰色）およびＧ：Ｃ ＳＮＰ対立遺伝子（薄い灰色）標的部位におけるＺＦＮ活性（％インデルとして提示される）を示す。図３Ｆ（ｉｉ）は、Ａ：Ｔ ＷＴ対立遺伝子標的部位対Ｇ：Ｃ ＳＮＰ対立遺伝子標的部位におけるＺＦＮ活性の比率を示し、１．０の値は、各対立遺伝子（薄い灰色における４７１７１／４７８９８ＺＦＮ対、濃い灰色における７１５５７／４７８９８ＺＦＮ対）における切断が等しいことを示す。図３Ｇは、４７１７１／４７８９８および７１５５７／７１７２８ＺＦＮ対の初代ヒト肝細胞における切断動態を描写するグラフであり、ＺＦＮは、ＡＡＶによって細胞に送達された。この実験で使用された７１５５７／７１７２８ＺＦＮをコードするＡＡＶ構築物は、５’β－グロビン非翻訳領域（ＵＴＲ）、３×ＦＬＡＧおよびウッドチャック肝炎ウイルス（ＷＨＶ）転写後調節エレメント変異体６（ＷＰＲＥｍｕｔ６）を含んでいた。図３Ｈは、初代ヒト肝細胞における４７１７１／４７８９８および７１５５７／７１７２８ＺＦＮ対のオンターゲットおよびオフターゲット切断データの比較を示す。この実験で使用された７１５５７／７１７２８ＺＦＮをコードするＡＡＶ構築物は、５’β－グロビン非翻訳領域（ＵＴＲ）、３×ＦＬＡＧおよびウッドチャック肝炎ウイルス（ＷＨＶ）転写後調節エレメント変異体６（ＷＰＲＥｍｕｔ６）を含んでいた。上の行は、３Ｋ～６００ＫのＭＯＩ濃度でのアルブミン遺伝子座およびＳＭＣＨＤ１遺伝子座における７１５５７／７１７２８ＺＦＮ対の活性を示す。左上のグラフには、予想される臨床用量範囲も示される。第２世代ＺＦＮをコードするＡＡＶ２／６で形質導入されたヒト初代肝細胞を、ＭｉＳｅｑディープシーケンシングによって評価した。ＮＳ－両側ｔ検定により統計学的に有意ではない、＊－両側ｔ検定によりｐ値＜０．０５。下の行は、ＳＭＣＨＤ１遺伝子座に対する別々の実験と比較した、アルブミン遺伝子座に対する第１および第２世代ＺＦＮ対の両方の１００Ｋおよび６００ＫのＭＯＩ用量の引き伸ばし図を示す。１００ＫのＭＯＩ用量において、第１世代ＺＦＮは、平均して１７％インデルのオンターゲット活性および０．１１％インデルのオフターゲット活性を示し、第２世代ＺＦＮは、平均して３５％のオンターゲット活性および０．０８％のオフターゲット活性を示した。２つのオンターゲットのオフターゲットに対する比率を比較すると、第２世代ＺＦＮは、第１世代ＺＦＮよりも約２．８倍選択的である。６００ＫのＭＯＩ用量において、第１世代ＺＦＮは、平均して２５％インデルのオンターゲット活性および０．３６％インデルのオフターゲット活性を示し；第２世代ＺＦＮは、平均して４４％のオンターゲット活性および０．３４％のオフターゲット活性を示した。２つの比率を比較すると、第２世代ＺＦＮは、第１世代ＺＦＮよりも約１．９倍選択的である。１００Ｋおよび６００ＫのＭＯＩにおいて、４７１７１／４７８９８および７１５５７／７１７２８ＺＦＮ対の％インデルは、それぞれ１７％および３５％、ならびに２５％および４４％であり、これは、７１５５７／７１７２８ＺＦＮ対が、４７１７１／４７８９８ＺＦＮ対よりも約２倍強力であることを示唆している。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。
図４Ａ～４Ｃは、ヌクレアーゼが、１つまたは複数のＦＬＡＧ配列をさらに含むポリヌクレオチドから発現される場合のヌクレアーゼ活性の増加（％インデル、次世代シーケンシングによって決定された）を示す。図４Ａは、３×ＦＬＡＧ配列を有する（ｙ軸）または有さない（ｘ軸）での人工ヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチドの導入後の活性（％インデル）を示すグラフである。対角線の右のデータポイントが、３×ＦＬＡＧ配列が有害であった場所を示すのに比べて、対角線の左のデータポイントは、３×ＦＬＡＧがヌクレアーゼ活性に対して有益であった場所を示す。図４Ｂは、ＦＬＡＧ配列を有さないポリヌクレオチドと比較して、平均で４倍を超える活性の増加を示す。図４Ｃは、示されたｍＲＮＡ量で、ＦＬＡＧペプチドを有する（「＋ペプチド」として示される薄い影を付けた丸）、または有さない（「ペプチドなし」として示される濃い影を付けた丸）アルブミン標的化ＺＦＮをコードするｍＲＮＡをトランスフェクトされたＫ５６２細胞におけるヌクレアーゼ活性（％インデル、ディープシーケンシングによって決定された）を示すグラフである。トランスフェクションの２４時間後に、細胞をＺＦＮ活性に関して査定した。薄い影を付けた丸の上の数（５’ペプチドを含むｍＲＮＡ）は、５’ペプチドを有さないｍＲＮＡと比較した増加倍率を示す。 同上。 同上。
図５Ａ～５Ｃは、ヌクレアーゼが、改変されていない３’ＵＴＲと比較して、改変された３’ＵＴＲ（例えば、ＷＰＲＥ配列）をさらに含むポリヌクレオチドから発現される場合のヌクレアーゼ活性の増加（％インデル、次世代シーケンシングによって決定された）を描写するグラフである。図５Ａは、人工ヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチド（ｍＲＮＡ）が３’ＵＴＲ中にＷＰＲＥを含んでいた場合の、単離された細胞における切断活性の増加を示す。図５Ｂは、示されたｍＲＮＡの（ＬＮＰを使用して）マウスへの投与後の、ｉｎ ｖｉｖｏ（マウス肝臓）においてＷＰＲＥを含むＺＦＮを使用した活性の増加を示した。図５Ｂは、示されたＡＡＶのマウスへの投与後の、ｉｎ ｖｉｖｏ（マウス肝臓）においてＷＰＲＥを含むＺＦＮを使用した切断活性の増加を示した。 同上。 同上。
図６は、示されたＭＯＩでポリヌクレオチド成分の示された組合せを使用した、ヌクレアーゼ活性の増加（％インデル、次世代シーケンシングによって決定された）を示すグラフである。各条件下の最も左のバー（「標準」）は、ヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチドが３×ＦＬＡＧ、ＷＰＲＥ配列およびポリＡ配列を含んでいなかった場合の結果を示す。左から２番目のバー（「３×Ｆｌａｇ、ＷＰＲＥ」）は、ヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチドが３×ＦＬＡＧペプチド配列およびＷＰＲＥ配列を含んでいた場合の結果を示す。右から２番目のバー（「５’ＸＢＧ、ＷＰＲＥ」）は、ヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチドがウシ成長ホルモン（「ＢＧ」）ポリＡ配列およびＷＰＲＥ配列を含んでいた場合の結果を示す。最も右のバー（「５ＸＢＧ、３×ＦＬＡＧ、ＷＰＲＥ」）は、ヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチドがＢＧポリＡ配列、３×ＦＬＡＧペプチド配列およびＷＰＲＥ配列を含んでいた場合の結果を示す。各条件（ＭＯＩ）の上に、観察されたヌクレアーゼ活性の増加倍率を示す。
図７Ａおよび７Ｂは、作製およびテストされた例示的な異なるバリアント構築物の図解である。図７Ａは、初期の発現構造であるＶ１を描写しており、Ｖ２～Ｖ８は、様々なバリアント構造を描写する。略語は、以下の通りである：「ＡｐｏＥ」は、アポＥエンハンサーであり；「ｈＡＡＴ」は、ヒト－α１抗トリプシンプロモーターであり；「ＨＢＢ－ＩＧＧ」は、ヒトβ－グロビン遺伝子の第１のイントロン由来の５’ドナー部位およびブランチ、ならびに免疫グロブリン遺伝子の重鎖可変領域のイントロン由来の３’アクセプター部位を含むヒトベータキメライントロンであり；「ＮＬＳ」は、核局在化配列であり；「ポリＡ」は、ポリＡ配列であり；「ＷＰＲＥ」は、ウッドチャック肝炎ウイルスの転写後調節因子エレメントであり；「３×ＦＬＡＧ」は、配列番号４および／または配列番号７１として記載されたペプチドであり；ならびに「β－ｇｌｂ」は、Ｘｅｎｏｐｕｓのベータ－グロビン遺伝子の５’非翻訳領域である。図７Ｂは、ＺＦＮ４７１７１、４７８９８、７１５５７および７１７２８をコードする配列を含むＡＡＶの概略図を示す。 同上。
図８は、示されたＭＯＩでポリヌクレオチド成分の示された組合せを使用した、ヌクレアーゼ活性（％インデル、次世代シーケンシングによって決定された）を示すグラフである。各条件下の最も左のバー（「標準（Ｖ１）」）は、バリアント１（Ｖ１）または親とも称される、ヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチドが３×ＦＬＡＧ、ＷＰＲＥ配列およびポリＡ配列を含んでいなかった場合の結果を示す。左から２番目のバー（「ＷＰＲＥ（Ｖ２）」）は、ヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチドがＷＰＲＥ配列を含んでいた場合の結果を示す。中央のバー（「３×Ｆｌａｇ、ＷＰＲＥ（Ｖ４）」）は、３×ＦＬＡＧ配列およびＷＰＲＥ配列を含んでいたバリアント（Ｖ４と名付けられた）での結果を示す。右から２番目のバー（「５’ＸＢＧ、ＷＰＲＥ（Ｖ６）」）は、ヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチド（バリアント６またはＶ６と名付けられた）がウシ成長ホルモン（「ＢＧ」）ポリＡ配列およびＷＰＲＥ配列を含んでいた場合の結果を示す。最も右のバー（「５ＸＢＧ、３×ＦＬＡＧ、ＷＰＲＥ」）は、ヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチド（バリアント８またはＶ８と名付けられた）がＢＧポリＡ配列、３×ＦＬＡＧペプチド配列およびＷＰＲＥ配列を含んでいた場合の結果を示す。
図９は、示されたｍＲＮＡ量で、５’ＵＴＲ配列（配列番号１に示されるＸｅｎｏｐｕｓのβ－グロビンＵＴＲ）を有する（「＋新規の５’ＵＴＲ」として示される薄い影を付けた丸）または有さない（「５’ＵＴＲなし」として示される濃い影を付けた丸）アルブミン標的化ＺＦＮをコードするｍＲＮＡをトランスフェクトされたＫ５６２細胞における、ヌクレアーゼ活性（％インデル、ディープシーケンシングによって決定された）を示すグラフである。トランスフェクションの２４時間後に、細胞をＺＦＮ活性に関して査定した。薄い影を付けた丸の上の数（５’ＵＴＲを含むｍＲＮＡ）は、５’ＵＴＲを有さないｍＲＮＡと比較した増加倍率を示す。
図１０Ａ～１０Ｃは、ｉｎ ｖｉｖｏまたはｉｎ ｖｉｔｒｏでの切断効率およびＺＦＮ発現を示すグラフである。図１０Ａは、示されたＺＦＮ構築物の注射から５６日後のマウス肝臓細胞における％インデルによって決定されたｉｎ ｖｉｖｏでの切断を示すグラフであり、図１０Ｂは、ＺＦＮの発現レベルを示す。野生型雄マウスに、５’ＵＴＲ、ＦＬＡＧペプチドおよびＷＰＲＥ配列を有さない（「ＺＦＮ標準」）または有する（「ＺＦＮ改善」または「ＺＦＰ２．０」）アルブミンＺＦＮをコードするＡＡＶ６構築物ならびにＩＤＳドナーを、３種の用量：２．０Ｅ＋１１ｖｇ／マウス（低用量）、６．０Ｅ＋１１ｖｇ／マウス（中用量）および／または２．０Ｅ＋１２ｖｇ／マウス（高マウス）で静脈注射した。肝臓試料を注射から５６日後に収集した。左から右へ、製剤緩衝液、低用量の改変されていない（標準）ＺＦＮをコードするベクター、低用量の本明細書に記載されるように改変されたＡＡＶ ＺＦＮをコードするベクター、改変されていない（標準）中用量、本明細書に記載されるように改変された中用量のＡＡＶ ＺＦＮをコードするベクターＺＦＮ、改変されていない（標準）高用量、および本明細書に記載されるように改変された高用量のＡＡＶ ＺＦＮをコードするベクターＺＦＮの投与後のインデルが示される。示した通り、本明細書に記載される改変（５’ＵＴＲ、５’ペプチド、ＷＰＲＥ）を含むＡＡＶベクターは、改変されていないＡＡＶベクターと比較して、切断効率において７倍の増加をもたらした。両側スチューデントｔ検定により、＊－ｐ＜０．０５、＊＊－ｐ＜０．０１。図１０Ｃは、７１５５７／７１７２８または４７１７１／４７８９８ＺＦＮ対を使用したＦＩＸドナーの発現の増加を実証する。１日目に、ＺＦＮ対を使用してＨｅｐＧ２細胞を処置し、次いで２日目に（one day 2）、ＦＩＸ導入遺伝子を使用した。９日目に、培地をＥＬＩＳＡに供して、発現されたＦＩＸタンパク質の量を決定した。データから、７１５５７／７１７２８ＺＦＮ対の使用が、４７１７１／４７８９８対と比較して、培地中においてほぼ３倍多くのＦＩＸの発現をもたらしたことが実証される。 同上。 同上。
図１１Ａ～１１Ｃは、これらの研究で使用されたドナー設計を描写する。図１１Ａは、ドナーＡＡＶに含まれるエレメントおよび導入遺伝子を示す３つのドナーの図式的な描写である。図１１Ｂは、初代ヒト肝細胞で編集するための改変の結果（左のグラフ）、および改善されたＺＦＮ（「ＺＦＮ２．０」、示された用量のもとの右のバーとして示される）と比較した、標準（「現行」、示された用量のもとの左のバーとして示される）ＺＦＮ対を使用した、ＺＦＮ駆動型の標的化組込みに供された肝細胞の上清で検出された活性の増加を示す。図１１Ｃは、図１０および実施例７に記載された通りに処置されたマウス対象のｉｎ ｖｉｖｏでの導入遺伝子発現（ＩＤＳ）を示すグラフである。野生型雄マウスに、５’ＵＴＲ、ＦＬＡＧペプチドおよびＷＰＲＥ配列を有さない（「ＺＦＮ標準」）または有する（「ＺＦＮ改善」）アルブミンＺＦＮをコードするＡＡＶ６構築物ならびにＩＤＳドナーを、３種の用量：２．０Ｅ＋１１ｖｇ／マウス（低用量）、６．０Ｅ＋１１ｖｇ／マウス（中用量）および／または２．０Ｅ＋１２ｖｇ／マウス（高マウス）で静脈注射した。肝臓試料を注射から５６日後に収集し、相対的な導入遺伝子発現を、実施例に記載された通りに測定した。左から右へ、製剤緩衝液、低用量の改変されていない（標準）ＺＦＮをコードするベクター、低用量の本明細書に記載されるように改変されたＡＡＶ ＺＦＮをコードするベクター、改変されていない（標準）中用量、本明細書に記載されるように改変された中用量のＡＡＶ ＺＦＮをコードするベクターＺＦＮ、改変されていない（標準）高用量、および本明細書に記載されるように改変された高用量のＡＡＶ ＺＦＮをコードするベクターＺＦＮの投与後の結果が示される。示した通り、本明細書に記載される改変（５’ＵＴＲ、５’ペプチド、ＷＰＲＥ）を含むＡＡＶベクターは、ドナー（ＩＤＳ）発現において、改変されていないＡＡＶベクターと比較して１８倍の増加をもたらした。 同上。 同上。
図１２は、実施例７ならびに図１０および１１に記載された通りに処置された対象の肝臓試料におけるＩＤＳ発現のウェスタンブロット解析の結果を示す。
図１３は、標的化組込みのための、改変されたおよび改変されていないＺＦＮ（低、中および用量）と共に投与されたドナーによってコードされたＩＤＳタンパク質の酵素活性を示すグラフである（実施例７を参照）。酵素活性を、実施例に記載された通りに測定した。左から右へ、製剤緩衝液、低用量の改変されていない（標準）ＺＦＮをコードするベクター、低用量の本明細書に記載されるように改変されたＡＡＶ ＺＦＮをコードするベクター、改変されていない（標準）中用量、本明細書に記載されるように改変された中用量のＡＡＶ ＺＦＮをコードするベクターＺＦＮ、改変されていない（標準）高用量、および本明細書に記載されるように改変された高用量のＡＡＶ ＺＦＮをコードするベクターＺＦＮの投与後の結果が示される。
図１４Ａおよび１４Ｂは、標準４７１７１／４７８９８ＺＦＮ対または７１５５７／７１７２８ＺＦＮ対を使用した、ＨｅｐＧ２細胞におけるＩＤＵＡドナーの挿入を描写する。図１４Ａは、ＺＦＮおよびドナーで処置したＨｅｐＧ２細胞の上清における経時的なＩＤＵＡ活性を描写する。ＺＦＮ用量は６００ＫのＭＯＩであり、ドナーは１２００ＫのＭＯＩの用量であった。図１４Ｂは、細胞中の各試験条件に対してインデルのパーセントを描写する。データから、ＺＦＮの両方の対が活性であり、ＩＤＵＡ導入遺伝子のＺＦＮ指向性の標的化組込みを引き起こすことが実証される。 同上。
操作されたヌクレアーゼの発現の効率（切断活性）を増加させるための、ならびにオンターゲットの操作されたヌクレアーゼ切断活性の特異性を増加させるための方法および組成物が本明細書で開示される。方法は、ヌクレアーゼ発現ベクター中の発現エレメントの組合せを最適化するステップ、およびＦｏｋＩ切断ドメインとＤＮＡとの間の非特異的な相互作用を減少させるステップ、およびジンクフィンガー主鎖とＤＮＡとの間の非特異的な相互作用を減少させるステップを含む。さらに、本発明の方法および組成物は、ヒトアルブミン遺伝子座を高い特異性で切断することが可能な最適化されたＺＦＮ試薬を提供し、最適化されたアルブミン試薬は、野生型アルブミン標的配列およびＳＮＰを含む同じ標的配列を切断することも可能である。本明細書に記載されるＺＦＮ試薬は、アルブミン遺伝子の効率的な高度に標的化された切断のために、例えば、タンパク質（複数可）が対象において発現され、対象における疾患または障害を低減、防止、および／または処置する（例えば、症状を軽減する）ように、１つまたは複数の治療用タンパク質をコードする配列（例えば、疾患または障害を有する対象において欠けているまたは欠乏しているタンパク質）を、切断されたアルブミン遺伝子へとヌクレアーゼの媒介により組み込むために、使用できる。
血友病Ｂは、血液凝固第ＩＸ因子（ＦＩＸ）をコードする遺伝子における変異によって引き起こされるＸ連鎖劣性遺伝の出血障害である。これはクリスマス病としても公知であり、血友病Ａまたは第ＶＩＩＩ因子欠乏症に続き血友病の２番目に一般的な形態である。これは、米国において、２５，０００人の男性のうち約１人で発生し、有病率はおよそ４，０００である。疾患の徴候は、第ＩＸ因子の凝固活性のレベルに応じて変化する。血友病Ｂを有する対象の大部分は、疾患の重度の形態（＜１％のＦＩＸ活性）を有する。彼らは通常、突発性の関節または深部筋肉の出血を起こしてから最初の２年中に診断される。中等度の疾患を有する者（１～５％のＦＩＸ活性）は、比較的軽い外傷後に、長期の、または遅延性の出血を呈し、６歳より前に診断される。比較によって、軽症血友病者（＞５～３０％のＦＩＸ活性）は、人生の後半で診断され、突発性出血を患っていないが、外科手術または抜歯後に多量出血を起こす。最終的に、女性キャリアのおよそ１０％が３０％未満のＦＩＸ活性を有し、大怪我または外科手術の後に多量出血のリスクがある。
血友病Ｂの現行処置は、ＦＩＸ濃縮物の使用からなり、１９６０年代後半、ＦＩＸ濃縮物は当初ドナー血漿由来であった。ウイルス不活性化およびドナーのスクリーニングなどのその後の改善により、さらに精製された濃縮物が得られ、１９９７年に組換えＦＩＸの導入で全盛をきわめた。ごく最近、米国において、毎週または２週に１回の投与を可能にする組換えＦＩＸ Ｆｃ融合タンパク質の販売が承認された。第ＩＸ因子のレベルを正常（すなわち約２５０ｎｇ／ｍＬ）の約５％に増加させることにより、症状の著しい改善がもたらされ、これは、突発性の生命を脅かす出血事象を防止するのに十分である。（Scriver, CR et al. The Metabolic and Molecular Bases of Inherited Disease. New York:McGraw-Hill (2001)；Lofqvist, T et al. (1997) J. Intern. Med. 241(5):395-400；Ljung, RC. (1998) Br. J. Haematol. 101(2):215-219）。これらの治療の進歩は、平均余命中央値を、血漿由来ＦＩＸの導入前の１１歳から、組換えタンパク質で６３歳に増加させた（Darby, SC et al. (2007) Blood. 110(3):815-25）。
血友病Ｂの現行処置は、精製組換え第ＩＸ因子の長期にわたる繰り返しの静脈内注入を頼るが、いくつかの欠点に悩まされている。欠点には、繰り返しの静脈内注入の必要性が挙げられ、これは、インヒビターの形成を伴い、治癒的というより予防的である。凝固因子送達への代替アプローチは、ｉｎ ｓｉｔｕ（対象の肝臓内）での治療的導入遺伝子からの合成に基づき、これらの懸念を排除する見込みを提供する。本明細書で開示される方法および組成物は、矯正的なＦＩＸ導入遺伝子を、ゲノム中、かつおよび対象自身の内因性アルブミン遺伝子座または高度に発現された外因性プロモーターの制御下に配置することにより、第ＩＸ因子の肝臓特異的な合成を生じさせる新規の戦略を介して血友病Ｂを処置することを記載している。特に、本明細書に記載される操作されたジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）は、ｉｎ ｖｉｖｏでＦＩＸ導入遺伝子を対象自身の肝細胞のゲノムに部位特異的に組み込むために用いられる。本明細書に記載されるヌクレアーゼを使用するＦＩＸ導入遺伝子の組み込みは、対象の血液への、安定な、高いレベルのＦＩＸの肝臓特異的な発現および分泌をもたらす。
ムコ多糖症Ｉ型（ＭＰＳ Ｉ）は、ハーラー／ハーラー－シャイエ／シャイエ症候群とも称され、劣性リソソーム蓄積症である。Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｎｅｕｒｏｌｏｇｉｃａｌ Ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ ａｎｄ Ｓｔｒｏｋｅ（ＮＩＮＤＳ）のＭＰＳ Ｉのファクトシートによれば、推測された発生率は、重度のＭＰＳ Ｉについて新生児約１００，０００人に１人、軽症ＭＰＳ Ｉについて新生児約５００，０００人に１人、および重度と軽症との間の疾患について新生児約１１５，０００人に１人である。
ＭＰＳ Ｉは、グリコサミノグリカン（硫酸化炭水化物ポリマー；ＧＡＧ）を分解するイズロニダーゼ（ＩＤＵＡ）酵素をコードする遺伝子における変異に関連する。ＩＤＵＡ遺伝子における変異は、ＩＤＵＡ酵素活性を減らすかまたは消失させ、尿、血漿、および体内組織中における毒性ＧＡＧの蓄積をもたらす。
ＩＤＵＡ変異の特定のタイプ（１００種よりも多くの異なる変異が記載されている）および結果得られた残留ＩＤＵＡ酵素のレベルに応じて、患者は、ハーラー症候群（ＭＰＳ Ｉ Ｈ）または軽症バリアント（ＭＰＳ Ｉ Ｈ／ＳおよびＭＰＳ Ｉ Ｓ）のいずれかを発症する。全てのＭＰＳ Ｉ患者の５０％～８０％が重度の形態を呈することが推測されるが、それは、診断が比較的容易であることに一部起因し得る（Muenzer et al. (2009) Pediatrics. 123(1):19-29）。ＭＰＳ Ｉ Ｈ患者は、生後１年の終わりまでに発達遅延の症状を、加えて２歳～４歳の間に成長の停止と進行性の精神的退化を示す。他の症状としては、臓器巨大症、角膜混濁、関節硬直および骨格奇形（異常な脊椎の骨を含む）、舌の肥大を伴う粗い顔貌、聴力の喪失ならびにヘルニアが挙げられる。これらのＭＰＳ Ｉ Ｈ患者の平均余命は、１０歳未満である。軽症型を有する患者は、これらの臨床徴候のほとんどを合わせ持つが、症状はそれほど重度ではない。加えて、ＣＮＳの関与はなく、それゆえに彼らは精神遅滞を患わない。
これらの患者の多くは、成人期まで生存できるが、罹患率は著しい。ＭＰＳ Ｉのための現行療法としては、造血幹細胞移植（ＨＳＣＴ）および酵素補充療法（ＥＲＴ）が挙げられる。重度のＭＰＳ Ｉ形態（ＭＰＳ Ｉ－Ｈ）を患っている患者が早期に（＜２．５歳）診断できる場合、ＨＳＣＴ（骨髄または臍帯幹細胞）による治療的介入が、神経認知（neurocognition）を含むほとんどの臨床的特徴を防止するかまたは好転させることができる。現在、ＭＰＳ Ｉ Ｈを有するほとんど全ての患者はＨＳＣＴを受ける。ＭＰＳ Ｉの場合、ＨＳＣＴ後の死亡率は１５％であり、生着が成功した生存率は、２００３年から使用されているチャイニーズハムスター卵巣細胞で産生された多型組換えタンパク質であるＡｌｄｕｒａｚｙｍｅ（登録商標）を用いたＥＲＴで５６％である。この酵素は、肺機能、肝脾腫大、および運動能力を改善することが示されており、改善された健康に関する生活の質をもたらす。ＥＲＴは、できるだけ早期に始めるべきである。酵素補充療法の限界としては、生涯にわたる処置の必要性、中和抗体の発生、血液脳関門を通過できないこと、継続的な心臓の、整形外科的な、眼の合併症、および煩わしい毎週の静脈内注入が挙げられる。まとめると、これらの限界により、ＭＰＳ Ｉのための幅広い根治療法を開発する緊急の必要性が強調される。
本明細書で開示される方法および組成物の使用に関する目的と根拠は、ｉｎ ｖｉｖｏでのゲノム編集によって酵素補充療法への必要性をなくすかまたは減少させることである。特に、本明細書に記載される操作されたジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）は、ｉｎ ｖｉｖｏでイズロニダーゼ酵素（ｈＩＤＵＡ）導入遺伝子の矯正的なコピーを対象自身の肝細胞のゲノムに部位特異的に組み込むために用いられる。ｈＩＤＵＡ導入遺伝子の組み込みは、アルブミン遺伝子座のイントロン１に標的化することができ、その結果、血液への、安定な、高いレベルの、イズロニダーゼの肝臓特異的な発現および分泌がもたらされる。高度に発現される内因性アルブミン遺伝子座の制御下にｈｕＩＤＵＡ導入遺伝子を配置することは、ＭＰＳ Ｉ患者の寿命にわたり永続的なイズロニダーゼの肝臓特異的な発現を提供することが予想される。
ムコ多糖症ＩＩ（ＭＰＳ ＩＩ）は、ハンター症候群とも称され、主に男性で見られるＸ連鎖、劣性遺伝の、リソソーム蓄積症である。ＭＰＳ ＩＩの発生率は、生児出生１００，０００当たり０．３～０．７１として報告されている（Burton & Giugliani (2012) Eur J Pediatr. 171(4):631-9. doi:10.1007/s00431-012-1703-y. Epub 2012 Mar 1.）。疾患の軽症型についての、２１．７歳というより保守的な平均余命中央値（疾患の重度の形態の平均余命は、１１．８歳である）（Burrow & Leslie (2008) Biologics. 2008 Jun；2(2):311-20；Young & Harper (1982) J Med Genet. 19(6):408-11）を、１年の発生率に適用すると、米国で現在生存している約６２９人のＭＰＳ ＩＩを有する個体の推定有病率が得られる。
ＭＰＳ ＩＩは、ムコ多糖類グリコサミノグリカン（ＧＡＧ）のリソソーム分解に関与する酵素をコードするイズロン酸－２－スルファターゼ（ＩＤＳ）遺伝子における変異によって引き起こされる。これは、尿、血漿および組織中におけるＧＡＧの蓄積をもたらし、多系統の進行性の疾患を引き起こす。ハンター症候群は、身体および認知への影響を伴う早期発症の重度の疾患（患者の３分の２）から、身体疾患の遅い発症、および中枢神経系（ＣＮＳ）疾患がほとんどないことによって特徴付けられる軽症ＭＰＳ ＩＩにわたる疾患スペクトルを表す。ＩＤＳ変異の特定のタイプ（＞１５０の遺伝子変異が同定されている）および結果得られた残留ＩＤＳ酵素のレベルが、疾患の重症度を決定する可能性が最も高い。軽症型における残留ＩＤＳ活性は、野生型ＩＤＳ活性の０．２～２．４％で測定されており、重度の表現型を有するものは活性がない（Sukegawa-Hayasaka et al. (2006) J Inherit Metab Dis 29(6):755-61）。ＩＤＳ遺伝子は、Ｘｑ２８にマッピングされ、２４ｋｂにわたり広がる９つのエクソンを含有する。主要な欠失および再配列は常に、疾患の重度の形態に関連する。
重度のＭＰＳ ＩＩ患者は、典型的には、１８ヶ月～３歳の間に言語遅滞および発達の遅延を有することから始まる。疾患は、重度のＭＰＳ ＩＩ患者において、臓器巨大症、活動過多および攻撃性、神経学的な劣化、関節硬直および骨格奇形（異常な脊椎の骨を含む）、舌の肥大を伴う粗い顔貌、心臓弁の肥大、聴力の喪失ならびにヘルニアにより特徴付けられる。重度のハンター症候群を有する未処置患者の平均余命は、十代の中ほどまでであり、神経学的な劣化および／または心肺機能障害により死亡する。軽症型を有する患者は、典型的には、重度の患者よりも後に診断される。身体的な臨床的特徴は重度の患者に類似しているが、全体的な疾患の重症度は、より軽度であり、一般的に疾患進行はより遅く、認知機能障害はないか、または軽度にすぎない。未処置の軽症型における死亡は、心臓および呼吸器疾患が原因で２０～３０歳の間であることが多い。
唯一の承認されたＭＰＳ ＩＩのための療法が、酵素補充療法（ＥＲＴ）である。組換えＩＤＳタンパク質（イズルスルファーゼ；Ｅｌａｐｒａｓｅ（登録商標））を用いた静脈内（ＩＶ）ＥＲＴは、２００６年から承認されている。イズルスルファーゼを使用したＥＲＴは、肝脾腫大、肺機能（ＦＶＣ）および運動能力（６分間の歩行）を改善することが示されており、改善された健康に関する生活の質をもたらす。ＥＲＴに対する応答は、処置開始時の対象の疾患の重症度に依存する。ＥＲＴの限界としては、生涯にわたる処置の必要性、中和抗体の発生、酵素が血液脳関門を通過できないこと、および煩わしい毎週の静脈内注入が挙げられる。ハーラー症候群（ＭＰＳ Ｉの重度の形態）とは対照的に、造血幹細胞移植（ＨＳＣＴ）は、ＭＰＳ ＩＩの重度の形態に推奨されない。まとめると、これらの限界により、ＭＰＳ ＩＩのための幅広い根治療法を開発する緊急の必要性が強調される。
したがって、本明細書で開示される方法および組成物は、ＭＰＳ ＩＩを有する対象におけるｉｎ ｖｉｖｏでのゲノム編集によって酵素補充療法への必要性をなくすかまたは減少させる。特に、本明細書に記載される操作されたジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）は、ｉｎ ｖｉｖｏで酵素イズロン酸－２－スルファターゼ（ｈＩＤＳ）導入遺伝子の矯正的なコピーを対象自身の肝細胞のゲノムに部位特異的に組み込むのに使用される。ｈＩＤＳ導入遺伝子の組み込みは、アルブミン遺伝子座のイントロン１に標的化され、その結果、血液への、安定な、高いレベルの、イズロン酸－２－スルファターゼの肝臓特異的な発現および分泌がもたらされる。高度に発現された内因性アルブミン遺伝子座の制御下にｈＩＤＳ導入遺伝子を配置することは、ＭＰＳ ＩＩ患者の寿命にわたり永続的なイズロン酸－２－スルファターゼの肝臓特異的な発現を提供することが予想される。
総論
方法の実施、ならびに本明細書で開示される組成物の調製および使用は、別段の指定がない限り、当業界の技術範囲内ものとして、分子生物学、生化学、クロマチン構造および分析、計算機化学、細胞培養、組換えＤＮＡならびに関連分野における従来の技術を用いる。これらの技術は、文献で十分に説明されている。例えば、Sambrook et al． MOLECULAR CLONING:A LABORATORY MANUAL, Second edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989 and Third edition, 2001；Ausubel et al., CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, John Wiley & Sons, New York, 1987および定期のアップデート；METHODS IN ENZYMOLOGYのシリーズ、Academic Press, San Diego；Wolffe, CHROMATIN STRUCTURE AND FUNCTION, Third edition, Academic Press, San Diego, 1998；METHODS IN ENZYMOLOGY, Vol. 304, "Chromatin" (P.M. Wassarman and A. P. Wolffe, eds.), Academic Press, San Diego, 1999；ならびにMETHODS IN MOLECULAR BIOLOGY, Vol. 119, "Chromatin Protocols" (P.B. Becker, ed.) Humana Press, Totowa, 1999を参照されたい。
定義
用語「核酸」、「ポリヌクレオチド」、および「オリゴヌクレオチド」は、同義的に使用され、直鎖状または環状のコンフォメーションの、一本鎖または二本鎖形態のいずれかの、デオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドポリマーを指す。本開示の目的のために、これらの用語は、ポリマーの長さに関する限定と解釈されないものとする。用語は、天然ヌクレオチドの公知のアナログ、ならびに塩基、糖および／またはリン酸部分において改変されたヌクレオチド（例えば、ホスホロチオエート主鎖）を包含し得る。一般的に、特定のヌクレオチドのアナログは、同じ塩基対形成の特異性を有し、すなわち、Ａのアナログは、Ｔと塩基対を形成する。
用語「ポリペプチド」、「ペプチド」および「タンパク質」は、同義的に使用され、アミノ酸残基のポリマーを指す。用語は、１つまたは複数のアミノ酸が、対応する天然に存在するアミノ酸の化学的アナログまたは改変された誘導体であるアミノ酸ポリマーにも適用される。
「結合」は、高分子間の（例えば、タンパク質と核酸との間の）配列特異的な非共有結合の相互作用を指す。全体としての相互作用が配列特異的である限り、必ずしも結合相互作用の全ての成分が配列特異的であること（例えば、ＤＮＡ主鎖中のリン酸残基との接触）を必要としない。このような相互作用は、一般的に１０－６Ｍ－１またはそれよりも低い解離定数（Ｋｄ）によって特徴付けられる。「親和性」は、結合の強度を指し、結合親和性の増加は、より低いＫｄと相関する。「非特異的な結合」は、オンターゲット配列に依存しない目的の任意の分子（例えば操作されたヌクレアーゼ）と高分子（例えばＤＮＡ）との間に生じる非共有結合の相互作用を指す。
「結合タンパク質」は、非共有結合によって別の分子に結合することができるタンパク質である。結合タンパク質は、例えば、ＤＮＡ分子（ＤＮＡ結合タンパク質）、ＲＮＡ分子（ＲＮＡ結合タンパク質）および／またはタンパク質分子（タンパク質結合タンパク質）に結合することができる。タンパク質結合タンパク質の場合、それは、それ自体に結合することができ（ホモ二量体、ホモ三量体などを形成する）、および／またはそれは、異なるタンパク質（単数または複数）の１つもしくは複数の分子に結合することができる。結合タンパク質は、１つよりも多くのタイプの結合活性を有していてもよい。例えば、ジンクフィンガータンパク質は、ＤＮＡ結合、ＲＮＡ結合およびタンパク質結合活性を有する。ＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼ系の場合、ＲＮＡガイドは、ヌクレアーゼの成分（Ｃａｓ９またはＣｆｐ１）にとって異種であり、両方とも操作することができる。
「ＤＮＡ結合分子」は、ＤＮＡに結合することができる分子である。このようなＤＮＡ結合分子は、ポリペプチド、タンパク質のドメイン、より大きいタンパク質またはポリヌクレオチド内のドメインであり得る。一部の実施形態では、ポリヌクレオチドは、ＤＮＡであり、一方で他の実施形態では、ポリヌクレオチドは、ＲＮＡである。一部の実施形態では、ＤＮＡ結合分子は、ヌクレアーゼのタンパク質ドメイン（例えばＦｏｋＩドメイン）であり、一方で他の実施形態では、ＤＮＡ結合分子は、ＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼのガイドＲＮＡ成分（例えばＣａｓ９またはＣｆｐ１）である。
「ＤＮＡ結合タンパク質」（または結合ドメイン）は、配列特異的な方式で、例えば１つもしくは複数のジンクフィンガーを介して、またはそれぞれジンクフィンガータンパク質もしくはＴＡＬＥにおける１つもしくは複数のＲＶＤとの相互作用を介してＤＮＡに結合する、タンパク質、またはより大きいタンパク質内のドメインである。ジンクフィンガーＤＮＡ結合タンパク質という用語は、しばしばジンクフィンガータンパク質またはＺＦＰと略記される。
「ジンクフィンガーＤＮＡ結合タンパク質」（または結合ドメイン）は、配列特異的な方式で、構造が亜鉛イオンの配位を介して安定化された結合ドメイン内のアミノ酸配列の領域である１つまたは複数のジンクフィンガーを介してＤＮＡに結合する、タンパク質、またはより大きいタンパク質内のドメインである。ジンクフィンガーＤＮＡ結合タンパク質という用語は、しばしばジンクフィンガータンパク質またはＺＦＰと略記される。人工ヌクレアーゼおよび転写因子は、ＺＦＰ ＤＮＡ結合ドメインおよび機能性ドメイン（ＺＦＮのためのヌクレアーゼドメインまたはＺＦＰ－ＴＦのための転写調節ドメイン）を含み得る。用語「ジンクフィンガーヌクレアーゼ」は、二量体化して標的遺伝子を切断する１つのＺＦＮ、ならびにＺＦＮの対（対のメンバーは、「左および右」または「第１および第２」または「対」と称される）を含む。
「ＴＡＬＥ ＤＮＡ結合ドメイン」または「ＴＡＬＥ」は、１つまたは複数のＴＡＬＥ反復ドメイン／単位を含むポリペプチドである。反復ドメインは、ＴＡＬＥのそのコグネート標的ＤＮＡ配列への結合に関与する。単一の「反復単位」（「反復」とも称される）は、典型的には３３～３５アミノ酸の長さであり、天然に存在するＴＡＬＥタンパク質内の他のＴＡＬＥ反復配列と少なくともある程度の配列相同性を示す。例えば、米国特許第８，５８６，５２６号および同第９，４５８，２０５号を参照されたい。人工ヌクレアーゼおよび転写因子は、ＴＡＬＥ ＤＮＡ結合ドメインおよび機能性ドメイン（ＴＡＬＥＮのためのヌクレアーゼドメインまたはＴＡＬＥＮ－ＴＦのための転写調節ドメイン）を含み得る。用語「ＴＡＬＥＮ」は、二量体化して標的遺伝子を切断する１つのＴＡＬＥＮ、ならびにＴＡＬＥＮの対（対のメンバーは、「左および右」または「第１および第２」または「対」と称される）を含む。
ジンクフィンガーおよびＴＡＬＥ ＤＮＡ結合ドメインは、例えば天然に存在するジンクフィンガータンパク質の認識へリックス領域を操作すること（１つまたは複数のアミノ酸を変更すること）を介して、またはＤＮＡ結合に関与するアミノ酸（「反復可変二残基」またはＲＶＤ領域）を操作することによって、所定のヌクレオチド配列に結合するように「操作」することができる。それゆえに、操作されたジンクフィンガータンパク質またはＴＡＬＥタンパク質は、天然に存在しないタンパク質である。ジンクフィンガータンパク質およびＴＡＬＥを操作するための方法の非限定的な例は、設計および選択である。設計されたタンパク質は、その設計／組成が主として合理的な基準に起因する天然に存在しないタンパク質である。設計に関する合理的な基準としては、置換ルールの適用、ならびに既存のＺＦＰまたはＴＡＬＥ設計および結合データのデータベース保存情報における情報を処理するためのコンピューター化されたアルゴリズムが挙げられる。例えば、米国特許第８，５８６，５２６号；同第６，１４０，０８１号；同第６，４５３，２４２号；および同第６，５３４，２６１号を参照されたい；また、ＷＯ９８／５３０５８；ＷＯ９８／５３０５９；ＷＯ９８／５３０６０；ＷＯ０２／０１６５３６およびＷＯ０３／０１６４９６も参照されたい。
「選択された」ジンクフィンガータンパク質、ＴＡＬＥタンパク質またはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系は、天然に見出されず、それらの産生は主として、実験的なプロセス、例えばファージディスプレイ、相互作用トラップ、合理的設計またはハイブリッド選択に起因する。例えば、ＵＳ５，７８９，５３８；ＵＳ５，９２５，５２３；ＵＳ６，００７，９８８；ＵＳ６，０１３，４５３；ＵＳ６，２００，７５９；ＷＯ９５／１９４３１；ＷＯ９６／０６１６６；ＷＯ９８／５３０５７；ＷＯ９８／５４３１１；ＷＯ００／２７８７８；ＷＯ０１／６０９７０；ＷＯ０１／８８１９７およびＷＯ０２／０９９０８４を参照されたい。
「ＴｔＡｇｏ」は、遺伝子サイレンシングに関与すると考えられる原核生物アルゴノートタンパク質である。ＴｔＡｇｏは、細菌Ｔｈｅｒｍｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ由来である。例えば、Swarts et al、同上；G. Sheng et al., (2013) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 111, 652を参照されたい。「ＴｔＡｇｏ系」は、例えばＴｔＡｇｏ酵素による切断のためのガイドＤＮＡを含む必要な全ての成分である。
「組換え」は、これらに限定されないが、非相同末端結合（ＮＨＥＪ）による捕捉および相同組換えを含む、２つのポリヌクレオチド間の遺伝情報の交換プロセスを指す。この開示の目的のために、「相同組換え（ＨＲ）」は、例えば、相同組換え修復メカニズムを介した細胞における二本鎖切断の修復中に起こる、このような交換の特殊化した形態を指す。このプロセスは、ヌクレオチド配列相同性を必要とし、「標的」分子（すなわち、二本鎖切断を経たもの）の鋳型修復に「ドナー」分子を使用し、ドナーから標的への遺伝情報の移入をもたらすことから、「非交差遺伝子変換」または「ショートトラクト遺伝子変換」として様々な形で公知である。いかなる特定の理論にも縛られることは望まないが、このような移入は、切断した標的とドナーとの間で形成されるヘテロ二重鎖ＤＮＡのミスマッチ修正、ならびに／またはドナーを使用して標的および／もしくは関連プロセスの一部になる遺伝情報を再合成する「合成依存性鎖アニーリング」を含み得る。このような特殊化したＨＲは、ドナーポリヌクレオチドの配列の一部または全部が標的ポリヌクレオチドに取り込まれるような、標的分子の配列の変更をもたらすことが多い。
本開示のある特定の方法において、本明細書に記載される１つまたは複数の標的化されたヌクレアーゼは、所定の部位（例えば、目的の遺伝子または遺伝子座）で標的配列（例えば、細胞クロマチン）に二本鎖切断（ＤＳＢ）を作り出す。ＤＳＢは、本明細書に記載される構築物（例えばドナー）の組み込みを媒介する。必要に応じて、構築物は、切断の領域中のヌクレオチド配列への相同性を有する。発現構築物は、物理的に組み込まれてもよく、あるいは、発現カセットは、相同組換えを介して、切断の修復のための鋳型として使用され、結果として、発現カセットの場合と同様にヌクレオチド配列の全部または一部の細胞クロマチンへの導入が起こる。したがって、細胞クロマチン中の第１の配列は、変更されてもよく、ある特定の実施形態では、発現カセット中に存在する配列に変換されてもよい。したがって、用語「置き換える」または「置き換え」の使用は、１つのヌクレオチド配列の別のものによる置き換え（すなわち、情報としての意味での配列の置き換え）を表すと理解することができ、必ずしも１つのポリヌクレオチドの別のものによる物理的または化学的な置き換えを必要としない。
本明細書に記載される方法のいずれかでは、追加の操作されたヌクレアーゼは、細胞内の追加の標的部位の追加の二本鎖切断に使用することができる。
細胞クロマチン中の目的の領域における配列の標的化された組換えおよび／または置き換えおよび／または変更のための方法のある特定の実施形態では、染色体配列は、外因性「ドナー」ヌクレオチド配列との相同組換えによって変更される。このような相同組換えは、切断の領域に相同な配列が存在する場合、細胞クロマチン中の二本鎖切断の存在によって刺激される。
本明細書に記載される方法のいずれかでは、第１のヌクレオチド配列（「ドナー配列」）は、目的の領域中のゲノム配列と相同だが同一ではない配列を含有していてもよく、それにより相同組換えを刺激して、目的の領域中の同一ではない配列を挿入する。したがって、ある特定の実施形態では、目的の領域中の配列に相同なドナー配列の部分は、置き換えられるゲノム配列に対して約８０～９９％の間（またはそれらの間の任意の整数）の配列同一性を示す。他の実施形態では、例えば１００個の連続する塩基対にわたりドナーとゲノム配列との間で１つのみヌクレオチドが異なる場合、ドナーとゲノム配列との相同性は９９％よりも高い。ある特定の場合では、ドナー配列の非相同部分は、新しい配列が目的の領域に導入されるように、目的の領域中に存在しない配列を含有していてもよい。これらの場合では、非相同配列は、一般的に、目的の領域中の配列に相同または同一な、５０～１，０００塩基対（またはそれらの間の任意の整数値）の配列、または１，０００個よりも大きい任意の数の塩基対に挟まれる。他の実施形態では、ドナー配列は、第１の配列に非相同であり、非相同組換えメカニズムによってゲノムに挿入される。
本明細書に記載される方法のいずれかは、ドナー配列の標的化組込みによる、または標的配列の切断とそれに続く目的の遺伝子の発現を破壊するエラープローンＮＨＥＪ媒介性修復を介する、細胞中の１つまたは複数の標的配列の、部分的または完全な不活性化のために使用することができる。部分的または完全に不活性化された遺伝子を含む細胞系も提供される。
さらに、本明細書に記載される標的化組込みの方法は、１つまたは複数の外因性配列を組み込むのにも使用できる。外因性核酸配列は、例えば、１つもしくは複数の遺伝子もしくはｃＤＮＡ分子、または任意のタイプのコードもしくは非コード配列、ならびに１つもしくは複数の制御エレメント（例えば、プロモーター）を含んでいてもよい。加えて、外因性核酸配列は、１つまたは複数のＲＮＡ分子（例えば、小ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、阻害性ＲＮＡ（ＲＮＡｉ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）など）を産生することができる。
「切断（ｃｌｅａｖａｇｅ）」は、ＤＮＡ分子の共有結合の主鎖の切断（ｂｒｅａｋａｇｅ）を指す。切断は、これらに限定されないが、リン酸ジエステル結合の酵素的または化学的な加水分解を含む様々な方法によって開始させることができる。一本鎖切断と二本鎖切断の両方が可能であり、二本鎖切断は、２つの別個の一本鎖切断事象の結果として起こり得る。ＤＮＡ切断は、平滑末端または付着末端のいずれかの生成をもたらすことができる。ある特定の実施形態では、標的とされた二本鎖ＤＮＡ切断のために、融合ポリペプチドが使用される。
「切断ハーフドメイン」は、第２のポリペプチド（同一または異なる）と共に切断活性（好ましくは二本鎖切断活性）を有する複合体を形成するポリペプチド配列である。用語「第１および第２の切断ハーフドメイン」、「＋および－切断ハーフドメイン」および「右および左の切断ハーフドメイン」は、同義的に使用されて、二量体化する切断ハーフドメインの対を指す。用語「切断ドメイン」は、用語「切断ハーフドメイン」と同義的に使用される。用語「ＦｏｋＩ切断ドメイン」は、配列番号２に示されるＦｏｋＩ配列および任意のＦｏｋＩ相同体を含む。
「操作された切断ハーフドメイン」は、別の切断ハーフドメイン（例えば、別の操作された切断ハーフドメイン）との絶対ヘテロ二量体を形成するように改変された切断ハーフドメインである。
用語「配列」は、ＤＮＡまたはＲＮＡであってもよく、直鎖状、環状または分岐状であってもよく、一本鎖または二本鎖のいずれであってもよい、任意の長さのヌクレオチド配列を指す。用語「導入遺伝子」は、ゲノムに挿入されるヌクレオチド配列を指す。導入遺伝子は、任意の長さ、例えば、２～１００，０００，０００ヌクレオチドの間の長さ（またはそれらの間の、またはそれらを超える任意の整数値）、好ましくは、約１００～１００，０００ヌクレオチドの間の長さ（またはそれらの間の任意の整数）、より好ましくは、約２０００～２０，０００ヌクレオチドの間の長さ（またはそれらの間の任意の値）、さらにより好ましくは、約５～１５ｋｂの間（またはそれらの間の任意の値）のものであってもよい。
「染色体」は、細胞のゲノムの全部または一部を含むクロマチン複合体である。細胞のゲノムは、その核型によって特徴付けられることが多く、核型は、細胞のゲノムを構成する全ての染色体の集合である。細胞のゲノムは、１つまたは複数の染色体を含んでいてもよい。
「エピソーム」は、細胞の染色体の核型の一部ではない、複製能のある核酸、核タンパク質複合体または核酸を含む他の構造である。エピソームの例としては、プラスミド、ミニサークルおよびある特定のウイルスゲノムが挙げられる。本明細書に記載される肝臓特異的な構築物は、エピソームにより維持されてもよく、あるいは、細胞に安定して組み込まれていてもよい。
「外因性」分子は、細胞中に通常存在しないが、１つまたは複数の遺伝学的、生化学的または他の方法によって細胞に導入できる分子である。「細胞中に通常存在すること」は、細胞の特定の発生段階および環境条件に関して決定される。したがって、例えば、筋肉の胚発生中にのみ存在する分子は、成体筋肉細胞にとって外因性分子である。同様に、熱ショックにより誘導された分子は、熱ショックを受けていない細胞にとって外因性分子である。外因性分子は、例えば、正常に機能しない内因性分子の機能するバージョン、または正常に機能する内因性分子の正常に機能しないバージョンを含んでいてもよい。
外因性分子は、とりわけ、コンビナトリアルケミストリープロセスによって生成されたなどの小分子、またはタンパク質、核酸、炭水化物、脂質、糖タンパク質、リポタンパク質、多糖などの高分子、上記の分子の任意の改変された誘導体、または上記の分子の１つもしくは複数を含む任意の複合体であってもよい。核酸としては、ＤＮＡおよびＲＮＡが挙げられ、これらは、一本鎖または二本鎖であってもよく、直鎖状、分岐状または環状であってもよく、任意の長さのものであってもよい。核酸としては、二重鎖を形成することが可能なもの、ならびに三重鎖形成核酸が挙げられる。例えば、米国特許第５，１７６，９９６号および同第５，４２２，２５１号を参照されたい。タンパク質としては、これらに限定されないが、ＤＮＡ結合タンパク質、転写因子、クロマチン再構築因子、メチル化ＤＮＡ結合タンパク質、ポリメラーゼ、メチラーゼ、デメチラーゼ、アセチラーゼ、デアセチラーゼ、キナーゼ、ホスファターゼ、リガーゼ、デユビキチナーゼ、インテグラーゼ、リコンビナーゼ、リガーゼ、トポイソメラーゼ、ジャイレースおよびヘリカーゼが挙げられる。
外因性分子は、内因性分子と同じタイプの分子、例えば、外因性タンパク質または核酸であってもよい。例えば、外因性核酸は、細胞中に通常存在しない、細胞または染色体に導入される感染性のウイルスゲノム、プラスミドまたはエピソームを含んでいてもよい。外因性分子の細胞への導入のための方法は、当業者に公知であり、これらに限定されないが、脂質媒介性移入（すなわち、中性およびカチオン脂質を含むリポソーム）、エレクトロポレーション、直接注射、細胞融合、粒子衝撃、リン酸カルシウム共沈、ＤＥＡＥ－デキストラン媒介性移入およびウイルスベクター媒介性移入が挙げられる。また外因性分子は、内因性分子と同じタイプの分子であってもよいが、細胞が由来するものとは異なる種に由来する。例えば、ヒト核酸配列は、元々はマウスまたはハムスター由来の細胞系に導入されてもよい。外因性分子の植物細胞への導入のための方法は、当業者に公知であり、これらに限定されないが、プロトプラスト形質転換、炭化ケイ素（例えば、ＷＨＩＳＫＥＲＳ（商標））、アグロバクテリウム媒介性形質転換、脂質媒介性移入（すなわち、中性およびカチオン脂質を含むリポソーム）、エレクトロポレーション、直接注射、細胞融合、粒子衝撃（例えば、「遺伝子銃」を使用する）、リン酸カルシウム共沈、ＤＥＡＥ－デキストラン媒介性移入およびウイルスベクター媒介性移入が挙げられる。
それに対して、「内因性」分子は、特定の細胞中に、特定の発生段階で、特定の環境条件下で通常存在するものである。例えば、内因性核酸は、染色体、ミトコンドリアのゲノム、葉緑体もしくは他の細胞器官、または天然に存在するエピソームの核酸を含み得る。追加の内因性分子としては、タンパク質、例えば、転写因子および酵素を挙げることができる。
用語「外因性核酸の生成物」は、本明細書で使用される場合、ポリヌクレオチドおよびポリペプチド生成物の両方、例えば、転写産物（ポリヌクレオチド、例えばＲＮＡ）および翻訳産物（ポリペプチド）を含む。
「融合」分子は、２つまたはそれよりも多くのサブユニット分子が好ましくは共有結合によって連結されている分子である。サブユニット分子は、同じ化学的タイプの分子であってもよく、異なる化学的タイプの分子であってもよい。融合分子の例としては、これらに限定されないが、融合タンパク質（例えば、タンパク質ＤＮＡ結合ドメインと、切断ドメイン、例えばＺＦＮまたはＴＡＬＥＮとの融合体）、切断ドメインと作用的に会合したポリヌクレオチドＤＮＡ結合ドメイン（例えば、ｓｇＲＮＡ）の融合体、および融合核酸（例えば、融合タンパク質をコードする核酸）が挙げられる。
細胞における融合分子の発現は、細胞への融合分子の成分の送達から、または細胞への融合分子の１つもしくは複数の成分をコードする１つもしくは複数のポリヌクレオチドの送達によって生じてもよく、必須のポリヌクレオチドが転写され、転写物が翻訳されて、融合分子を生成する。また、細胞におけるタンパク質の発現に、トランススプライシング、ポリペプチドの切断およびポリペプチドのライゲーションが含まれていてもよい。細胞へのポリヌクレオチドおよびポリペプチド送達のための方法は、この開示の他所で提示される。
「遺伝子」は、本開示の目的に関して、遺伝子産物をコードするＤＮＡ領域（下記を参照）、ならびに遺伝子産物の産生を調節する全てのＤＮＡ領域を含み、このような調節配列がコード配列および／または転写された配列に隣接しているかどうかは問わない。したがって、遺伝子としては、必ずしもこれらに限定されないが、プロモーター配列、ターミネーター、翻訳調節配列、例えばリボソーム結合部位および内部リボソーム進入部位、エンハンサー、サイレンサー、インシュレーター、境界エレメント、複製起点、マトリックス結合部位および遺伝子座制御領域が挙げられる。
「遺伝子発現」は、遺伝子に含有される情報の遺伝子産物への変換を指す。遺伝子産物は、遺伝子の直接的な転写産物（例えば、ｍＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｒＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、リボザイム、構造ＲＮＡまたは他の任意のタイプのＲＮＡ）、またはｍＲＮＡの翻訳によって産生されたタンパク質であり得る。遺伝子産物は、キャッピング、ポリアデニル化、メチル化、および編集などのプロセスによって改変されたＲＮＡ、ならびに例えばメチル化、アセチル化、リン酸化、ユビキチン化、ＡＤＰ－リボシル化、ミリスチル化（myristilation）、およびグリコシル化によって改変されたタンパク質も含む。
遺伝子発現の「モジュレーション」は、遺伝子の活性の変化を指す。発現のモジュレーションとしては、これらに限定されないが、遺伝子の活性化および遺伝子の抑制を挙げることができる。ゲノム編集（例えば、切断、変更、不活性化、ランダム変異）を使用して、発現をモジュレートすることができる。遺伝子の不活性化は、本明細書に記載されるＺＦＰ、ＴＡＬＥまたはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系を含まない細胞と比較した、遺伝子発現における任意の低減を指す。したがって、遺伝子の不活性化は、部分的であっても、完全であってもよい。
「目的の領域」は、外因性分子に結合することが望ましい、細胞クロマチンの任意の領域、例えば、遺伝子、または遺伝子内のもしくは遺伝子に隣接する非コード配列などである。結合は、標的化されたＤＮＡ切断および／または標的化された組換えの目的のためであり得る。目的の領域は、例えば、染色体、エピソーム、細胞小器官のゲノム（例えば、ミトコンドリア、葉緑体）、または感染性のウイルスゲノム中に存在していてもよい。目的の領域は、遺伝子のコード領域内、例えば、リーダー配列、トレーラー配列もしくはイントロンなどの転写された非コード領域内、またはコード領域の上流もしくは下流のいずれかの転写されなかった領域内であってもよい。目的の領域は、単一のヌクレオチド対ほど小さくてもよく、もしくは最長２，０００ヌクレオチド対の長さであってもよく、または任意の整数値のヌクレオチド対であってもよい。
「セーフハーバー」遺伝子座は、宿主細胞に対していかなる有害効果もなく遺伝子を挿入することができるゲノム内の遺伝子座である。最も有益なものは、挿入された遺伝子配列の発現が、隣接遺伝子からの任意のリードスルー発現によって撹乱されないセーフハーバー遺伝子座である。ヌクレアーゼ（複数可）によって標的化されるセーフハーバー遺伝子座の非限定的な例としては、ＣＣＲ５、ＨＰＲＴ、ＡＡＶＳ１、Ｒｏｓａおよびアルブミンが挙げられる。例えば、米国特許第７，９５１，９２５号；同第８，７７１，９８５号；同第８，１１０，３７９号；同第７，９５１，９２５号；米国公報第２０１００２１８２６４号；同第２０１１０２６５１９８号；同第２０１３０１３７１０４号；同第２０１３０１２２５９１号；同第２０１３０１７７９８３号；同第２０１３０１７７９６０号；同第２０１５００５６７０５号および同第２０１５０１５９１７２号を参照されたい。
「レポーター遺伝子」または「レポーター配列」は、必ずしもそうでなくてもよいが、好ましくは慣例的なアッセイで容易に測定されるタンパク質生成物を産生する任意の配列を指す。好適なレポーター遺伝子としては、これらに限定されないが、抗生物質耐性（例えば、アンピシリン耐性、ネオマイシン耐性、Ｇ４１８耐性、ピューロマイシン耐性）を媒介するタンパク質をコードする配列、有色または蛍光または発光タンパク質（例えば、緑色蛍光タンパク質、強化緑色蛍光タンパク質、赤色蛍光タンパク質、ルシフェラーゼ）、ならびに強化された細胞成長および／または遺伝子増幅（例えば、ジヒドロ葉酸レダクターゼ）を媒介するタンパク質をコードする配列が挙げられる。エピトープタグとしては、例えば、ＦＬＡＧ、Ｈｉｓ、ｍｙｃ、Ｔａｐ、ＨＡまたは任意の検出可能なアミノ酸配列の１つまたは複数のコピーが挙げられる。「発現タグ」は、目的の遺伝子の発現をモニターするために所望の遺伝子配列に作動可能に連結し得るレポーターをコードする配列を含む。
「ＷＰＲＥ」配列は、ウッドチャック肝炎ウイルス由来のウッドチャック肝炎転写後調節エレメントである。ＷＰＲＥは、６００ｂｐの長さの、所与の順番でガンマ、アルファ、およびベータエレメントを含有する三分節系エレメントであり（Donello et al (1992) J Virol 72:5085-5092）、ＡＡＶ系における導入遺伝子の強い発現に寄与する（Loeb et al (1999) Hum Gene Ther 10:2295-2305）。これは、イントロンを欠く導入遺伝子の発現も強化する。その天然形態において、ＷＰＲＥは、ＷＨＶ－Ｘタンパク質のための部分的なオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を含有する。ＷＨＶ（Ｗｅ２）エンハンサーのような他のウイルスエレメントとの関連で、完全に発現されたＷＨＶ－Ｘタンパク質は、ウッドチャックおよびマウスにおいて肝細胞癌のより高いリスクと関連していた（Hohne et. al (1990) EMBO J 9(4):1137-45；Flajolet et. al (1998) J Virol 72(7):6175-80）。ＷＨＶ－Ｘタンパク質は、直接的に腫瘍形成性ではないようであるが、一部の研究は、ある特定の状況下で、ＷＨＶ－Ｘタンパク質が、ヘパドナウイルス（人間の場合はＢ型肝炎ウイルス；ウッドチャックの場合はウッドチャック肝炎ウイルス）による感染に関連する肝臓がんの発生に関する弱い補因子として作用し得ることを示唆する。「野生型」ＷＰＲＥへの言及は、多くの場合、その３’領域にＷＨＶ Ｘタンパク質のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）の一部を含有する５９１ｂｐの配列（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｊ０２４４２のヌクレオチド１０９４～１６８４）を指す。このエレメントには、１５０２位にＷＨＶ－Ｘのための最初のＡＴＧ開始コドン、および１４８８位に配列ＧＣＴＧＡを有するプロモーター領域が存在する。Ｚａｎｔａ－Ｂｏｕｓｓｉｆ（同上）において、ｍｕｔ６ＷＰＲＥ配列が開示されたが、１４８８位におけるプロモーター配列はＡＴＣＡＴに改変され、１５０２位における開始コドンはＴＴＧに改変され、効果的にＷＨＶ－Ｘの発現を妨げている。Ｊ０４５１４．１ ＷＰＲＥバリアントにおいて、ＡＴＧ ＷＨＶ Ｘの開始部位は、１５０４位であり、ｍｕｔ６型のバリアントは、このＪ０４５１４．１株で作製することができる。別のＷＰＲＥバリアントは、野生型ＷＰＲＥ由来の最小のガンマおよびアルファエレメントのみを含む２４７ｂｐのＷＰＲＥ３バリアントであり（Choi et al (2014) Mol Brain 7:17）、これは、ＷＨＶ Ｘ配列を欠く。
「真核」細胞としては、これらに限定されないが、真菌細胞（例えば酵母）、植物細胞、動物細胞、哺乳動物細胞およびヒト細胞（例えば、Ｔ細胞）、例えば幹細胞（多能性および複能性）などが挙げられる。
用語「作用的な連結」および「作用的に（operatively）連結した」（または「作動可能に（operably）連結した」）は、両方の成分が正常に機能し、成分の少なくとも１つが、他の成分の少なくとも１つで発揮される機能を媒介し得る可能性をもたらすように成分が配列されている２つまたはそれよりも多くの成分（例えば配列エレメント）の並置に関連して、同義的に使用される。例証として、プロモーターなどの転写調節配列が、１つまたは複数の転写調節因子の存在または非存在に応答してコード配列の転写レベルを制御する場合、転写調節配列は、コード配列に作用的に連結している。転写調節配列は、一般的に、コード配列とシスで作用的に連結しているが、必ずしもそれと直接隣接していなくてもよい。例えば、エンハンサーは、それらが連続していないとしても、コード配列に作用的に連結した転写調節配列である。
タンパク質、ポリペプチドまたは核酸の「機能的な断片」は、その配列が全長のタンパク質、ポリペプチドまたは核酸と同一ではないが、全長のタンパク質、ポリペプチドまたは核酸と同じ機能を依然として保持している、タンパク質、ポリペプチドまたは核酸である。機能的な断片は、対応するネイティブの分子よりも多くの、それよりも少ない、もしくはそれと同じ数の残基を有していてもよいし、および／または１つもしくは複数のアミノ酸もしくはヌクレオチド置換を含有していてもよい。核酸またはタンパク質の機能を決定するための方法（例えば、コード化機能、別の核酸にハイブリダイズする能力、酵素活性のアッセイ）は、当業界において周知である。
ポリヌクレオチド「ベクター」または「構築物」は、遺伝子配列を標的細胞に移入させることが可能である。典型的には、「ベクター構築物」、「発現ベクター」、「発現構築物」、「発現カセット」、および「遺伝子移入ベクター」は、目的の遺伝子の発現を指示することが可能な、遺伝子配列を標的細胞に移入させることができる任意の核酸構築物を意味する。したがって、用語は、クローニング、および発現ビヒクル、ならびに組み込み型ベクターを含む。
用語「対象」および「患者」は、同義的に使用され、哺乳動物、例えばヒト患者および非ヒト霊長類、ならびに実験動物、例えばウサギ、イヌ、ネコ、ラット、マウス、および他の動物を指す。したがって、用語「対象」または「患者」は、本明細書で使用される場合、本発明の発現カセットを投与することができる任意の哺乳動物患者または対象を意味する。本発明の対象としては、障害を有する対象が挙げられる。
用語「処置すること」および「処置」は、本明細書で使用される場合、症状の重症度および／または頻度における低減、症状および／または根本的な原因の消失、症状および／またはその根本的な原因の出現の防止、ならびに損傷の改善または回復を指す。がん、単一遺伝子疾患および移植片対宿主病は、本明細書に記載される組成物および方法を使用して処置され得る状態の非限定的な例である。
「クロマチン」は、細胞ゲノムを含む核タンパク質構造である。細胞クロマチンは、核酸、主としてＤＮＡ、ならびにヒストンおよび非ヒストン染色体タンパク質を含めたタンパク質を含む。真核細胞クロマチンの大部分はヌクレオソームの形態で存在し、ヌクレオソームコアは、ヒストンＨ２Ａ、Ｈ２Ｂ、Ｈ３およびＨ４をそれぞれ２つ含む八量体と会合したおよそ１５０塩基対のＤＮＡを含み、リンカーＤＮＡ（生物に応じて様々な長さの）は、ヌクレオソームコア間に伸長する。ヒストンＨ１の分子は、一般的に、リンカーＤＮＡと会合する。本開示の目的のために、用語「クロマチン」は、原核および真核両方の全てのタイプの細胞核タンパク質を包含することが意図される。細胞クロマチンは、染色体およびエピソームのクロマチンの両方を含む。
「接近可能な領域」は、核酸中に存在する標的部位が、標的部位を認識する外因性分子が結合することができる細胞クロマチン中の部位である。いかなる特定の理論にも縛られることは望まないが、接近可能な領域は、ヌクレオソーム構造にパッケージングされていないものであると考えられる。接近可能な領域の他と異なる構造は、化学的および酵素プローブ、例えば、ヌクレアーゼに対するその感受性によって検出できることが多い。
「標的部位」または「標的配列」は、結合に十分な条件が存在するという条件で結合分子が結合する核酸の部分を定義する核酸配列である。例えば、配列５’－ＧＡＡＴＴＣ－３’は、ＥｃｏＲＩ制限エンドヌクレアーゼのための標的部位である。「意図した」または「オンターゲット」配列は、結合分子が結合することが意図される配列であり、「意図しない」または「オフターゲット」配列は、意図した標的ではない、結合分子が結合する任意の配列を含む。
ＤＮＡ結合分子／ドメイン
目的の任意の遺伝子または遺伝子座における標的部位に特異的に結合するＤＮＡ結合分子／ドメインを含む組成物が本明細書に記載される。任意のＤＮＡ結合分子／ドメインを本明細書で開示される組成物および方法において使用することができ、これらに限定されないが、ジンクフィンガーＤＮＡ結合ドメイン、ＴＡＬＥ ＤＮＡ結合ドメイン、ＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓヌクレアーゼのＤＮＡ結合部分（ガイドまたはｓｇＲＮＡ）、またはメガヌクレアーゼ由来のＤＮＡ結合ドメインが挙げられる。
ある特定の実施形態では、ＤＮＡ結合ドメインは、ジンクフィンガータンパク質を含む。好ましくは、ジンクフィンガータンパク質は、選択された標的部位に結合するように操作されているという点で、天然に存在しない。例えば、全て参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる、Beerli et al. (2002) Nature Biotechnol. 20:135-141；Pabo et al. (2001) Ann. Rev. Biochem. 70:313-340；Isalan et al. (2001) Nature Biotechnol. 19:656-660；Segal et al. (2001) Curr. Opin. Biotechnol. 12:632-637；Choo et al. (2000) Curr. Opin. Struct. Biol. 10:411-416；米国特許第６，４５３，２４２号；同第６，５３４，２６１号；同第６，５９９，６９２号；同第６，５０３，７１７号；同第６，６８９，５５８号；同第７，０３０，２１５号；同第６，７９４，１３６号；同第７，０６７，３１７号；同第７，２６２，０５４号；同第７，０７０，９３４号；同第７，３６１，６３５号；同第７，２５３，２７３号；および米国特許公報第２００５／００６４４７４号；同第２００７／０２１８５２８号；同第２００５／０２６７０６１号を参照されたい。ある特定の実施形態では、ＤＮＡ結合ドメインは、その全体が参照により本明細書に組み込まれる米国特許公開第２０１２／００６０２３０号（例えば、表１）で開示されたジンクフィンガータンパク質を含む。
操作されたジンクフィンガー結合ドメインは、天然に存在するジンクフィンガータンパク質と比較して新規の結合特異性を有していてもよい。操作方法としては、これらに限定されないが、合理的設計および様々な種類の選択が挙げられる。合理的設計としては、例えば、三つ組（または四つ組）ヌクレオチド配列および個々のジンクフィンガーアミノ酸配列を含むデータベースを使用することが挙げられ、その場合、各三つ組または四つ組ヌクレオチド配列は、特定の三つ組または四つ組配列に結合するジンクフィンガーの１つまたは複数のアミノ酸配列に関連付けられる。例えば、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる米国特許第６，４５３，２４２号および同第６，５３４，２６１号を参照されたい。
ファージディスプレイおよびツーハイブリッドシステムを含む例示的な選択方法は、米国特許第５，７８９，５３８号；同第５，９２５，５２３号；同第６，００７，９８８号；同第６，０１３，４５３号；同第６，４１０，２４８号；同第６，１４０，４６６号；同第６，２００，７５９号；および同第６，２４２，５６８号；ならびにＷＯ９８／３７１８６；ＷＯ９８／５３０５７；ＷＯ００／２７８７８；ＷＯ０１／８８１９７およびＧＢ２，３３８，２３７に開示されている。加えて、ジンクフィンガー結合ドメインに関する結合特異性の強化は、例えば、米国特許第６，７９４，１３６号に記載されている。
加えて、これらのおよび他の参考文献で開示されたように、ジンクフィンガードメインおよび／または複数のフィンガーを有するジンクフィンガータンパク質は、例えば、５つまたはそれよりも多くのアミノ酸の長さのリンカーを含む任意の好適なリンカー配列を使用して互いに連結されていてもよい。６つまたはそれよりも多くのアミノ酸の長さの例示的なリンカー配列について、米国特許第６，４７９，６２６号；同第６，９０３，１８５号；および同第７，１５３，９４９号も参照されたい。本明細書に記載されるタンパク質は、タンパク質の個々のジンクフィンガー間に、好適なリンカーの任意の組合せを含んでいてもよい。加えて、ジンクフィンガー結合ドメインの結合特異性の強化は、例えば米国特許第６，７９４，１３６号に記載されている。
標的部位の選択；融合分子（およびそれをコードするポリヌクレオチド）の設計および構築のためのＺＦＰおよび方法は、当業者に公知であり、米国特許第６，１４０，０８１号；同第５，７８９，５３８号；同第６，４５３，２４２号；同第６，５３４，２６１号；同第５，９２５，５２３号；同第６，００７，９８８号；同第６，０１３，４５３号；同第６，２００，７５９号；ＷＯ９５／１９４３１；ＷＯ９６／０６１６６；ＷＯ９８／５３０５７；ＷＯ９８／５４３１１；ＷＯ００／２７８７８；ＷＯ０１／６０９７０ ＷＯ０１／８８１９７；ＷＯ０２／０９９０８４；ＷＯ９８／５３０５８；ＷＯ９８／５３０５９；ＷＯ９８／５３０６０；ＷＯ０２／０１６５３６およびＷＯ０３／０１６４９６で詳細に記載されている。
加えて、これらのおよび他の参考文献で開示されたように、ジンクフィンガードメインおよび／または複数のフィンガーを有するジンクフィンガータンパク質は、例えば、５つまたはそれよりも多くのアミノ酸の長さのリンカーを含む任意の好適なリンカー配列を使用して互いに連結されていてもよい。６つまたはそれよりも多くのアミノ酸の長さの例示的なリンカー配列について、米国特許第６，４７９，６２６号；同第６，９０３，１８５号；および同第７，１５３，９４９号も参照されたい。本明細書に記載されるタンパク質は、タンパク質の個々のジンクフィンガー間に好適なリンカーの任意の組合せを含んでいてもよい。
通常、ＺＦＰは、少なくとも３つのフィンガーを含む。ＺＦＰのある特定のものは、４、５または６つのフィンガーを含む。３つのフィンガーを含むＺＦＰは、典型的には、９または１０ヌクレオチドを含む標的部位を認識し；４つのフィンガーを含むＺＦＰは、典型的には、１２～１４ヌクレオチドを含む標的部位を認識し；一方で６つのフィンガーを有するＺＦＰは、１８～２１ヌクレオチドを含む標的部位を認識することができる。ＺＦＰはまた、１つまたは複数の調節ドメインを含む融合タンパク質であってもよく、このドメインは、転写活性化または抑制ドメインであってもよい。
一部の実施形態では、ＤＮＡ結合ドメインは、ヌクレアーゼ由来であってもよい。例えば、ホーミングエンドヌクレアーゼおよびメガヌクレアーゼの認識配列、例えばＩ－ＳｃｅＩ、Ｉ－ＣｅｕＩ、ＰＩ－ＰｓｐＩ、ＰＩ－Ｓｃｅ、Ｉ－ＳｃｅＩＶ、Ｉ－ＣｓｍＩ、Ｉ－ＰａｎＩ、Ｉ－ＳｃｅＩＩ、Ｉ－ＰｐｏＩ、Ｉ－ＳｃｅＩＩＩ、Ｉ－ＣｒｅＩ、Ｉ－ＴｅｖＩ、Ｉ－ＴｅｖＩＩおよびＩ－ＴｅｖＩＩＩが公知である。米国特許第５，４２０，０３２号；米国特許第６，８３３，２５２号；Belfort et al. (1997) Nucleic Acids Res. 25:3379-3388；Dujon et al. (1989) Gene 82:115-118；Perler et al. (1994) Nucleic Acids Res. 22, 1125-1127；Jasin (1996) Trends Genet. 12:224-228； Gimble et al. (1996) J. Mol. Biol. 263:163-180；Argast et al. (1998) J. Mol. Biol. 280:345-353およびＮｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓのカタログも参照されたい。加えて、ホーミングエンドヌクレアーゼおよびメガヌクレアーゼのＤＮＡ結合特異性は、非天然の標的部位に結合するように操作することができる。例えば、Chevalier et al. (2002) Molec. Cell 10:895-905；Epinat et al. (2003) Nucleic Acids Res. 31:2952-2962；Ashworth et al. (2006) Nature 441:656-659；Paques et al. (2007) Current Gene Therapy 7:49-66；米国特許公開第２００７０１１７１２８号を参照されたい。
ある特定の実施形態では、本明細書に記載されるジンクフィンガータンパク質（例えば、野生型または変異切断ドメインとの融合分子で使用された）は、主鎖領域（例えば、－１～６に番号付けされる７アミノ酸の認識へリックス領域の外側の領域）に、例えば－１４、－９および／または－５位の１つまたは複数において、１つまたは複数の変異（置換、欠失、および／または挿入）を含む（例えば、図５Ａを参照）。１つまたは複数のこれらの位置における野生型残基は、欠失していても、任意のアミノ酸残基で置き換えられていても、および／または１つもしくは複数の（on or more）追加の残基を含んでいてもよい。一部の実施形態では、－５位におけるＡｒｇ（Ｒ）は、Ｔｙｒ（Ｙ）、Ａｓｐ（Ｎ）、Ｇｌｕ（Ｅ）、Ｌｅｕ（Ｌ）、Ｇｌｎ（Ｑ）、またはＡｌａ（Ａ）に変更されている。他の実施形態では、（－９）位におけるＡｒｇ（Ｒ）は、Ｓｅｒ（Ｓ）、Ａｓｐ（Ｎ）、またはＧｌｕ（Ｅ）で置き換えられている。さらなる実施形態では、（－１４）位におけるＡｒｇ（Ｒ）は、Ｓｅｒ（Ｓ）またはＧｌｎ（Ｑ）で置き換えられている。他の実施形態では、融合ポリペプチドは、ジンクフィンガーＤＮＡ結合ドメインに変異を含んでいてもよく、（－５）、（－９）および／または（－１４）位におけるアミノ酸は、任意の組合せの上で列挙したアミノ酸のいずれかに変更されている。
ある特定の実施形態では、ＺＦＮは、添付の表または図のいずれかに記載される第１および第２の（左および右の）ＺＦＮを含む。ある特定の実施形態では、第１のＺＦＮは、７１５５７と名付けられたＺＦＮを含み、第２のＺＦＮは、７１７２８と名付けられたＺＦＮを含む。ある特定の実施形態では、７１５５７と名付けられたＺＦＮは、ＡＡＶベクター、例えば表４に示される配列および／または配列番号４３に示される配列を含むＡＡＶベクターに担持される。他の実施形態では、７１７２８と名付けられたＺＦＮは、ＡＡＶベクター、例えば表５および／または配列番号５６に示される配列を含むＡＡＶベクターに担持される。
他の実施形態では、ＤＮＡ結合ドメインは、植物病原体である、Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ（Boch et al, (2009) Science 326:1509-1512およびMoscou and Bogdanove, (2009) Science 326:1501を参照）およびＲａｌｓｔｏｎｉａ（Heuer et al (2007) Applied and Environmental Microbiology 73(13):4379-4384；米国特許公報第２０１１０３０１０７３号および同第２０１１０１４５９４０号を参照）由来のものに類似した転写活性化因子様（ＴＡＬ）エフェクター（ＴＡＬＥ）由来の操作されたドメインを含む。Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ属の植物病原菌は、重要な穀物植物において多くの疾患を引き起こすことが公知である。Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓの病原性は、２５個よりも多くの異なるエフェクタータンパク質を植物細胞に注入する保存されたＩＩＩ型分泌（Ｔ３Ｓ）系に依存する。これらの注入されたタンパク質のなかでも、植物転写活性化因子を模倣し、植物トランスクリプトームをマニピュレートする転写活性化因子様エフェクター（ＴＡＬＥ）がある（Kay et al (2007) Science318:648-651を参照）。これらのタンパク質は、ＤＮＡ結合ドメインおよび転写活性化ドメインを含有する。最もよく特徴付けられたＴＡＬＥの１つは、Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ ｃａｍｐｅｓｔｇｒｉｓ ｐｖ．Ｖｅｓｉｃａｔｏｒｉａ由来のＡｖｒＢｓ３である（Bonas et al (1989) Mol Gen Genet 218:127-136およびＷＯ２０１００７９４３０を参照）。ＴＡＬＥは、タンデム反復の集中型ドメインを含有し、各反復は、これらのタンパク質のＤＮＡ結合特異性にとって重要なおよそ３４アミノ酸を含有する。加えて、それらは、核局在化配列および酸性転写活性化ドメインを含有する（総説に関して、Schornack S, et al (2006) J Plant Physiol 163(3):256-272を参照）。加えて、植物病原性細菌であるＲａｌｓｔｏｎｉａ ｓｏｌａｎａｃｅａｒｕｍにおいて、Ｒ．ｓｏｌａｎａｃｅａｒｕｍ ｂｉｏｖａｒ １株ＧＭＩ１０００およびｂｉｏｖａｒ ４株ＲＳ１０００においてＸａｎｔｈｏｍｏｎａｓのＡｖｒＢｓ３ファミリーに相同な、ｂｒｇ１１およびｈｐｘ１７と名付けられた２つの遺伝子が見出されている（Heuer et al (2007) Appl and Envir Micro 73(13):4379-4384を参照）。これらの遺伝子は、ヌクレオチド配列において互いに９８．９％同一であるが、ｈｐｘ１７の反復ドメインにおける１，５７５塩基対の欠失により異なる。しかしながら、両方の遺伝子産物は、ＸａｎｔｈｏｍｏｎａｓのＡｖｒＢｓ３ファミリータンパク質と４０％未満の配列同一性を有する。
これらのＴＡＬエフェクターの特異性は、タンデム反復に見出される配列に依存する。繰り返しの配列は、およそ１０２塩基対を含み、反復は、典型的には、互いに９１～１００％相同である（Bonas et al、同上）。反復の多型は通常、１２および１３位に位置し、ＴＡＬ－エフェクターの標的配列における連続するヌクレオチドの同一性と、１２および１３位における高度可変二残基（反復可変二残基またはＲＶＤ領域）の同一性と間に１対１の対応が存在すると考えられる（Moscou and Bogdanove, (2009) Science 326:1501およびBoch et al (2009) Science 326:1509-1512を参照）。実験的に、これらのＴＡＬ－エフェクターのＤＮＡ認識に関する天然コードは、１２および１３位におけるＨＤ配列（反復可変二残基またはＲＶＤ）により、シトシン（Ｃ）への結合が起こり、ＮＧがＴに、ＮＩがＡ、Ｃ、ＧまたはＴに結合し、ＮＮがＡまたはＧに結合し、ＩＮＧがＴに結合すると決定された。これらのＤＮＡ結合反復が、新しい組合せおよび多数の反復を有するタンパク質に組み立てられて、植物細胞において新しい配列と相互作用し、非内因性レポーター遺伝子の発現を活性化することができる人工転写因子が作製された（Boch et al、同上）。操作されたＴＡＬタンパク質をＦｏｋＩ切断ハーフドメインに連結して、非定型的なＲＶＤを有するＴＡＬＥＮを含むＴＡＬエフェクタードメインヌクレアーゼ融合体（ＴＡＬＥＮ）が得られたいる。例えば、米国特許第８，５８６，５２６号を参照されたい。
一部の実施形態では、ＴＡＬＥＮは、エンドヌクレアーゼ（例えば、ＦｏｋＩ）切断ドメインまたは切断ハーフドメインを含む。他の実施形態では、ＴＡＬＥ－ヌクレアーゼは、メガＴＡＬである。これらのメガＴＡＬヌクレアーゼは、ＴＡＬＥ ＤＮＡ結合ドメインおよびメガヌクレアーゼ切断ドメインを含む融合タンパク質である。メガヌクレアーゼ切断ドメインは、単量体として活性であり、活性のために二量体化を必要としない。（Boissel et al., (2013) Nucl Acid Res:1-13, doi:10.1093/nar/gkt1224を参照）。
よりさらなる実施形態では、ヌクレアーゼは、コンパクトＴＡＬＥＮを含む。これらは、ＴＡＬＥ ＤＮＡ結合ドメインをＴｅｖＩヌクレアーゼドメインに連結する単一鎖の融合タンパク質である。融合タンパク質は、ＴＡＬＥ ＤＮＡ結合ドメインがＴｅｖＩヌクレアーゼドメインに対してどこに位置するかに応じて、ＴＡＬＥ領域によって局在化されたニッカーゼとして作用することができるか、または二本鎖切断を作り出すことができる（Beurdeley et al (2013) Nat Comm:1-8 DOI:10.1038/ncomms2782を参照）。加えて、ヌクレアーゼドメインは、ＤＮＡ結合機能性を示すこともあり得る。任意のＴＡＬＥＮを、１つまたは複数のメガ－ＴＡＬＥを有する追加のＴＡＬＥＮ（例えば、１つまたは複数のＴＡＬＥＮ（ｃＴＡＬＥＮまたはＦｏｋＩ－ＴＡＬＥＮ）と組み合わせて使用してもよい。
加えて、これらのおよび他の参考文献で開示されたように、ジンクフィンガードメインおよび／または複数のフィンガーを有するジンクフィンガータンパク質またはＴＡＬＥは、例えば、５つまたはそれよりも多くのアミノ酸の長さのリンカーを含む任意の好適なリンカー配列を使用して互いに連結されていてもよい。６つまたはそれよりも多くのアミノ酸の長さの例示的なリンカー配列について、米国特許第６，４７９，６２６号；同第６，９０３，１８５号；および同第７，１５３，９４９号も参照されたい。本明細書に記載されるタンパク質は、タンパク質の個々のジンクフィンガー間に好適なリンカーの任意の組合せを含んでいてもよい。加えて、ジンクフィンガー結合ドメインに関する結合特異性の強化は、例えば、米国特許第６，７９４，１３６号に記載されている。ある特定の実施形態では、ＤＮＡ結合ドメインは、ＤＮＡに結合する単一ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）ＤＮＡ結合分子を含むＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓヌクレアーゼ系の一部である。例えば、米国特許第８，６９７，３５９号および米国特許公報第２０１５００５６７０５号および同第２０１５０１５９１７２号を参照されたい。系のＲＮＡ成分をコードするＣＲＩＳＰＲ（clustered regularly interspaced short palindromic repeat；クラスター化して規則的な配置の短い回文配列リピート）遺伝子座、およびタンパク質をコードするｃａｓ（ＣＲＩＳＰＲ関連）遺伝子座（Jansen et al., 2002. Mol. Microbiol. 43:1565-1575；Makarova et al., 2002. Nucleic Acids Res. 30:482-496；Makarova et al., 2006. Biol. Direct 1:7；Haft et al., 2005. PLoS Comput. Biol. 1:e60）が、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓヌクレアーゼ系の遺伝子配列を構成する。微生物宿主におけるＣＲＩＳＰＲ遺伝子座は、ＣＲＩＳＰＲ関連（Ｃａｓ）遺伝子およびＣＲＩＳＰＲ媒介性核酸切断の特異性をプログラミングすることが可能な非コードＲＮＡエレメントの組合せを含有する。
一部の実施形態では、ＤＮＡ結合ドメインは、ＴｔＡｇｏ系の一部である（Swarts et al、同上；Sheng et al、同上を参照）。真核生物において、遺伝子サイレンシングは、タンパク質のアルゴノート（Ａｇｏ）ファミリーによって媒介される。このパラダイムにおいて、Ａｇｏは、小さい（１９～３１ｎｔの）ＲＮＡに結合する。このタンパク質－ＲＮＡサイレンシング複合体は、小さいＲＮＡと標的との間でワトソン－クリック塩基対形成を介して標的ＲＮＡを認識し、エンドヌクレアーゼとして標的ＲＮＡを切断する（Vogel (2014) Science 344：972-973）。対照的に、原核生物Ａｇｏタンパク質は、小さい一本鎖ＤＮＡ断片に結合し、外来性（しばしばウイルス）ＤＮＡを検出および除去するように機能する可能性がある（Yuan et al., (2005) Mol. Cell 19, 405；Olovnikov, et al. (2013) Mol. Cell 51, 594；Swarts et al、同上）。例示的な原核生物Ａｇｏタンパク質としては、Ａｑｕｉｆｅｘ ａｅｏｌｉｃｕｓ、Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ ｓｐｈａｅｒｏｉｄｅｓ、およびＴｈｅｒｍｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ由来のものが挙げられる。
最もよく特徴付けられた原核生物Ａｇｏタンパク質の１つは、Ｔ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓに由来するもの（ＴｔＡｇｏ；Swarts et al、同上）である。ＴｔＡｇｏは、５’リン酸基を用いて１５ｎｔまたは１３～２５ｎｔの一本鎖ＤＮＡ断片のいずれかと会合する。このＴｔＡｇｏが結合した「ガイドＤＮＡ」は、タンパク質－ＤＮＡ複合体を、ＤＮＡの第三者の分子においてワトソン－クリック相補的ＤＮＡ配列に結合するように導くのに機能する。これらのガイドＤＮＡにおける配列の情報により標的ＤＮＡが確認されると、ＴｔＡｇｏ－ガイドＤＮＡ複合体は、標的ＤＮＡを切断する。このようなメカニズムは、その標的ＤＮＡに結合した状態のＴｔＡｇｏ－ガイドＤＮＡ複合体の構造によっても裏付けられる（G. Sheng et al、同上）。Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ ｓｐｈａｅｒｏｉｄｅｓ由来のＡｇｏ（ＲｓＡｇｏ）は、類似の特性を有する（Olivnikov et al、同上）。
任意のＤＮＡ配列の外因性ガイドＤＮＡをＴｔＡｇｏタンパク質上にロードすることができる（Swarts et al、同上）。ＴｔＡｇｏ切断の特異性はガイドＤＮＡによって指示されるため、外因性の、研究者によって特定されたガイドＤＮＡと共に形成されたＴｔＡｇｏ－ＤＮＡ複合体は、それゆえに、相補的な、研究者によって特定された標的ＤＮＡにＴｔＡｇｏ標的ＤＮＡ切断を導く。このように、ＤＮＡ中に標的化された二本鎖切断を作り出すことができる。ＴｔＡｇｏ－ガイドＤＮＡ系（または他の生物由来のオーソロガスなＡｇｏ－ガイドＤＮＡ系）の使用は、細胞内のゲノムＤＮＡの標的化された切断を可能にする。このような切断は、一本鎖または二本鎖のいずれであってもよい。哺乳動物ゲノムＤＮＡの切断に関して、哺乳動物細胞での発現に最適化されたＴｔＡｇｏコドンのバージョンの使用が好ましい場合がある。さらに、ＴｔＡｇｏタンパク質が、細胞透過性ペプチドに融合されている場合、ｉｎ ｖｉｔｒｏで形成されたＴｔＡｇｏ－ＤＮＡ複合体で細胞を処置することが好ましい場合がある。さらに、３７℃で改善された活性を有するように変異誘発を介して変更されたＴｔＡｇｏタンパク質のバージョンを使用することが好ましい場合がある。Ａｇｏ－ＲＮＡ媒介性ＤＮＡ切断（ｃｌｅａｖａｇｅ）は、ＤＮＡ切断（ｂｒｅａｋ）の利用のために当業界において標準的な技術を使用する、遺伝子ノックアウト、標的化された遺伝子付加、遺伝子修正、標的化された遺伝子欠失を含む一連の結果に影響を与えるのに使用することができる。
したがって、任意のＤＮＡ結合分子／ドメインを使用することができる。
融合分子
本明細書に記載されるＤＮＡ結合ドメイン（例えば、ＺＦＰまたはＴＡＬＥ、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓの成分、例えば単一ガイドＲＮＡ）および異種調節（機能性）ドメイン（またはその機能的な断片）を含む融合分子も提供される。共通のドメインとしては、例えば、転写因子ドメイン（活性化因子、リプレッサー、コアクチベーター、コリプレッサー）、サイレンサー、発癌遺伝子（例えば、ｍｙｃ、ｊｕｎ、ｆｏｓ、ｍｙｂ、ｍａｘ、ｍａｄ、ｒｅｌ、ｅｔｓ、ｂｃｌ、ｍｙｂ、ｍｏｓファミリーメンバーなど）；ＤＮＡ修復酵素ならびにその関連因子および調節因子；ＤＮＡ再構成酵素ならびにその関連因子および調節因子；クロマチン関連タンパク質およびその調節因子（例えばキナーゼ、アセチラーゼおよびデアセチラーゼ）；ならびにＤＮＡを改変する酵素（例えば、メチルトランスフェラーゼ、トポイソメラーゼ、ヘリカーゼ、リガーゼ、キナーゼ、ホスファターゼ、ポリメラーゼ、エンドヌクレアーゼ）ならびにその関連因子および調節因子が挙げられる。参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれるＤＮＡ結合ドメインおよびヌクレアーゼ切断ドメインの融合に関する詳細についての、米国特許公報第２００５００６４４７４号；同第２００６０１８８９８７号および同第２００７／０２１８５２８号。
活性化を達成するための好適なドメインとしては、ＨＳＶ ＶＰ１６活性化ドメイン（例えば、Hagmann et al., J. Virol. 71, 5952-5962 (1997)を参照）、核ホルモン受容体（例えば、Torchia et al., Curr. Opin. Cell. Biol. 10:373-383 (1998)を参照）；核内因子カッパＢのｐ６５サブユニット（Bitko & Barik, J. Virol. 72:5610-5618 (1998)およびDoyle & Hunt, Neuroreport 8:2937-2942 (1997))；Liu et al., Cancer Gene Ther. 5:3-28 (1998)）、または人工キメラ機能性ドメイン、例えばＶＰ６４（Beerli et al., (1998) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95:14623-33）、およびデグロン（Molinari et al., (1999) EMBO J. 18, 6439-6447）が挙げられる。追加の例示的な活性化ドメインとしては、Ｏｃｔ１、Ｏｃｔ－２Ａ、Ｓｐ１、ＡＰ－２、およびＣＴＦ１（Seipel et al., EMBO J. 11, 4961-4968 (1992)）、ならびにｐ３００、ＣＢＰ、ＰＣＡＦ、ＳＲＣ１ ＰｖＡＬＦ、ＡｔＨＤ２ＡおよびＥＲＦ－２が挙げられる。例えば、Robyr et al. (2000) Mol. Endocrinol. 14:329-347；Collingwood et al. (1999) J. Mol. Endocrinol. 23:255-275；Leo et al. (2000) Gene 245:1-11；Manteuffel-Cymborowska (1999) Acta Biochim. Pol. 46:77-89；McKenna et al. (1999) J. Steroid Biochem. Mol. Biol. 69:3-12；Malik et al. (2000) Trends Biochem. Sci. 25:277-283；およびLemon et al. (1999) Curr. Opin. Genet. Dev. 9:499-504を参照されたい。追加の例示的な活性化ドメインとしては、これらに限定されないが、ＯｓＧＡＩ、ＨＡＬＦ－１、Ｃ１、ＡＰ１、ＡＲＦ－５，－６，－７、および－８、ＣＰＲＦ１、ＣＰＲＦ４、ＭＹＣ－ＲＰ／ＧＰ、ならびにＴＲＡＢ１が挙げられる。例えば、Ogawa et al. (2000) Gene 245:21-29；Okanami et al. (1996) Genes Cells 1:87-99；Goff et al. (1991) Genes Dev. 5:298-309；Cho et al. (1999) Plant Mol. Biol. 40:419-429；Ulmason et al. (1999) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96:5844-5849；Sprenger-Haussels et al. (2000) Plant J. 22:1-8；Gong et al. (1999) Plant Mol. Biol. 41:33-44；およびHobo et al. (1999) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96:15,348-15,353を参照されたい。
ＤＮＡ結合ドメインと機能性ドメインとの融合分子（またはそれをコードする核酸）の形成において、活性化ドメインまたは活性化ドメインと相互作用する分子のいずれかが、機能性ドメインとして好適であることは、当業者には明らかである。活性化複合体および／または活性化している活性（例えば、ヒストンのアセチル化など）を標的遺伝子に補充することが可能な本質的にあらゆる分子が、融合タンパク質の活性化しているドメインとして有用である。融合分子における機能性ドメインとしての使用に好適な、インシュレータードメイン、局在化ドメイン、ならびにクロマチン再構築タンパク質、例えばＩＳＷＩを含有するドメインおよび／またはメチル結合ドメインタンパク質は、例えば、米国特許公報第２００２／０１１５２１５号および同第２００３／００８２５５２号ならびにＷＯ０２／４４３７６に記載されている。
例示的な抑制ドメインとしては、これらに限定されないが、ＫＲＡＢ Ａ／Ｂ、ＫＯＸ、ＴＧＦ－ベータ誘導性初期遺伝子（ＴＩＥＧ）、ｖ－ｅｒｂＡ、ＳＩＤ、ＭＢＤ２、ＭＢＤ３、ＤＮＭＴファミリーのメンバー（例えば、ＤＮＭＴ１、ＤＮＭＴ３Ａ、ＤＮＭＴ３Ｂ）、Ｒｂ、およびＭｅＣＰ２が挙げられる。例えば、Bird et al. (1999) Cell 99:451-454；Tyler et al. (1999) Cell 99:443-446；Knoepfler et al. (1999) Cell 99:447-450；およびRobertson et al. (2000) Nature Genet. 25:338-342を参照されたい。追加の例示的な抑制ドメインとしては、これらに限定されないが、ＲＯＭ２およびＡｔＨＤ２Ａが挙げられる。例えば、Chem et al. (1996) Plant Cell 8:305-321；およびWu et al. (2000) Plant J. 22:19-27を参照されたい。
融合分子は、当業者に周知のクローニングおよび生化学的なコンジュゲーションの方法によって構築される。融合分子は、ＤＮＡ結合ドメインおよび機能性ドメイン（例えば、転写活性化または抑制ドメイン）を含む。融合分子は、必要に応じて、核局在化シグナル（例えば、ＳＶ４０中型Ｔ抗原由来のものなど）およびエピトープタグ（例えば、ＦＬＡＧおよびヘマグルチニンなど）も含む。融合分子（およびそれをコードする核酸）は、融合体の成分のなかでも翻訳リーディングフレームが保存されるように設計される。
一方の機能性ドメイン（またはその機能的な断片）のポリペプチド成分と、他方の非タンパク質ＤＮＡ結合ドメイン（例えば、抗生物質、インターカレーター、副溝結合剤、核酸）との融合体は、当業者に公知の生化学的なコンジュゲーションの方法によって構築される。例えば、Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃａｍｐａｎｙ（Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ）のカタログを参照されたい。副溝結合剤とポリペプチドとの融合体を作製するための方法および組成物が記載されている。Mapp et al. (2000) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97:3930-3935。さらに、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系の単一ガイドＲＮＡは、機能性ドメインと会合して、活性な転写調節因子およびヌクレアーゼを形成する。
ある特定の実施形態では、標的部位は、細胞クロマチンの接近可能な領域中に存在する。接近可能な領域は、例えば、米国特許第７，２１７，５０９号および同第７，９２３，５４２号に記載されるようにして決定することができる。細胞クロマチンの接近可能な領域中に標的部位が存在しない場合、１つまたは複数の接近可能な領域は、米国特許第７，７８５，７９２号および同第８，０７１，３７０号に記載されるようにして生成することができる。追加の実施形態では、融合分子のＤＮＡ結合ドメインは、その標的部位が接近可能な領域中にあるかないかに関係なく、細胞クロマチンに結合することが可能である。例えば、このようなＤＮＡ結合ドメインは、リンカーＤＮＡおよび／またはヌクレオソームＤＮＡに結合することが可能である。このタイプの「パイオニア」ＤＮＡ結合ドメインの例は、ある特定のステロイド受容体および肝細胞核内因子３（ＨＮＦ３）に見出される（Cordingley et al. (1987) Cell 48:261-270；Pina et al. (1990) Cell 60:719-731；およびCirillo et al. (1998) EMBO J. 17:244-254）。本明細書に記載される融合分子（例えば、人工ヌクレアーゼ）のための標的部位は、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０個、またはそれよりも多くの連続する、または連続しない塩基対の長さであってもよい。
融合分子は、当業者に公知の通りに薬学的に許容される担体と共に製剤化することができる。例えば、Remington's Pharmaceutical Sciences, 17th ed., 1985；ならびに米国特許第６，４５３，２４２号および同第６，５３４，２６１号を参照されたい。
融合分子の機能的な成分／ドメインは、融合分子がそのＤＮＡ結合ドメインを介して標的配列に結合すると遺伝子の転写に影響を与えることが可能な多種多様の成分のいずれかから選択することができる。したがって、機能的な成分としては、これらに限定されないが、様々な転写因子ドメイン、例えば活性化因子、リプレッサー、コアクチベーター、コリプレッサー、およびサイレンサーを挙げることができる。
追加の例示的な機能性ドメインは、例えば、米国特許第６，５３４，２６１号および同第６，９３３，１１３号に開示されている。
外因性の小分子またはリガンドによって調節される機能性ドメインも、選択することができる。例えば、機能性ドメインが外部のＲｈｅｏＣｈｅｍ（商標）リガンドの存在下におけるその活性なコンフォメーションのみを想定しているＲｈｅｏＳｗｉｔｃｈ（登録商標）技術を用いてもよい（例えばＵＳ２００９０１３６４６５を参照）。したがって、ＺＦＰは、調節可能な機能性ドメインに作動可能に連結することができ、その結果得られるＺＦＰ－ＴＦの活性は、外部のリガンドによって制御される。
ヌクレアーゼ
ある特定の実施形態では、融合分子は、人工ヌクレアーゼを形成するためのＤＮＡ結合ドメインおよび切断（ヌクレアーゼ）ドメインを含む。そのようなものとして、遺伝子改変は、ヌクレアーゼ、例えば操作されたヌクレアーゼを使用して達成することができる。操作されたヌクレアーゼ技術は、天然に存在するＤＮＡ結合タンパク質の操作に基づく。例えば、目的に合わせたＤＮＡ結合特異性を有するホーミングエンドヌクレアーゼの操作が記載されている。Chames et al. (2005) Nucleic Acids Res 33(20):e178；Arnould et al. (2006) J. Mol. Biol. 355:443-458。加えて、ＺＦＰの操作も記載されている。例えば、米国特許第６，５３４，２６１号；同第６，６０７，８８２号；同第６，８２４，９７８号；同第６，９７９，５３９号；同第６，９３３，１１３号；同第７，１６３，８２４号；および同第７，０１３，２１９号を参照されたい。
加えて、ＺＦＰおよび／またはＴＡＬＥをヌクレアーゼドメインに融合して、ＺＦＮおよびＴＡＬＥＮ、すなわち、その操作された（ＺＦＰまたはＴＡＬＥ）ＤＮＡ結合ドメインを介してその意図した核酸標的を認識し、ＤＮＡ結合部位の近傍でヌクレアーゼ活性によるＤＮＡの切断を引き起こすことができる機能的な実体が作り出されている。例えば、Kim et al. (1996) Proc Nat'l Acad Sci USA 93(3):1156-1160を参照されたい。ごく最近、このようなヌクレアーゼは、様々な生物におけるゲノム改変に使用されている。例えば、米国特許公報第２００３０２３２４１０号；同第２００５０２０８４８９号；同第２００５００２６１５７号；同第２００５００６４４７４号；同第２００６０１８８９８７号；同第２００６００６３２３１号；および国際公報ＷＯ０７／０１４２７５号を参照されたい。
したがって、本明細書に記載される方法および組成物は、広範囲に適用可能であり、目的の任意のヌクレアーゼを含み得る。ヌクレアーゼの非限定的な例としては、メガヌクレアーゼ、ＴＡＬＥＮおよびジンクフィンガーヌクレアーゼが挙げられる。ヌクレアーゼは、異種ＤＮＡ結合および切断ドメイン（例えば、ジンクフィンガーヌクレアーゼ；異種切断ドメインを有するメガヌクレアーゼＤＮＡ結合ドメイン）を含んでいてもよく、あるいは、天然に存在するヌクレアーゼのＤＮＡ結合ドメインは、選択された標的部位（例えば、コグネート結合部位と異なる部位に結合するように操作されたメガヌクレアーゼ）に結合するように変更されてもよい。
ある特定の実施形態では、ＺＦＮは、添付の表または図のいずれかに記載される第１および第２の（左および右の）ＺＦＮを含む。ある特定の実施形態では、第１のＺＦＮは、７１５５７と名付けられたＺＦＮを含み、第２のＺＦＮは、７１７２８と名付けられたＺＦＮを含む。ある特定の実施形態では、７１５５７と名付けられたＺＦＮは、ＡＡＶベクター、例えば表４に示される配列および／または配列番号４３に示される配列を含むＡＡＶベクターに担持される。他の実施形態では、７１７２８と名付けられたＺＦＮは、ＡＡＶベクター、例えば表５および／または配列番号５６に示される配列を含むＡＡＶベクターに担持される。
本明細書に記載されるヌクレアーゼのいずれかでは、ヌクレアーゼは、操作されたＴＡＬＥ ＤＮＡ結合ドメインおよびＴＡＬＥＮとも称されるヌクレアーゼドメイン（例えば、エンドヌクレアーゼおよび／またはメガヌクレアーゼドメイン）を含んでいてもよい。使用者が選択する標的配列とのロバストな部位特異的な相互作用のためにこれらのＴＡＬＥＮタンパク質を操作するための方法および組成物が公開されている（米国特許第８，５８６，５２６号を参照）。一部の実施形態では、ＴＡＬＥＮは、エンドヌクレアーゼ（例えば、ＦｏｋＩ）切断ドメインまたは切断ハーフドメインを含む。他の実施形態では、ＴＡＬＥ－ヌクレアーゼは、メガＴＡＬである。これらのメガＴＡＬヌクレアーゼは、ＴＡＬＥ ＤＮＡ結合ドメインおよびメガヌクレアーゼ切断ドメインを含む融合タンパク質である。メガヌクレアーゼ切断ドメインは、単量体として活性であり、活性のために二量体化を必要としない。（Boissel et al., (2013) Nucl Acid Res:1-13, doi:10.1093/nar/gkt1224を参照）。加えて、ヌクレアーゼドメインは、ＤＮＡ結合機能性を示すこともあり得る。
よりさらなる実施形態では、ヌクレアーゼは、コンパクトＴＡＬＥＮ（ｃＴＡＬＥＮ）を含む。これらは、ＴＡＬＥ ＤＮＡ結合ドメインをＴｅｖＩヌクレアーゼドメインに連結する単一鎖の融合タンパク質である。融合タンパク質は、ＴＡＬＥ ＤＮＡ結合ドメインがＴｅｖＩヌクレアーゼドメインに対してどこに位置しているかに応じて、ＴＡＬＥ領域によって局在化されたニッカーゼとして作用できるか、または二本鎖切断を作り出すことができる（Beurdeley et al (2013) Nat Comm:1-8 DOI:10.1038/ncomms2782を参照）。任意のＴＡＬＥＮを、追加のＴＡＬＥＮ（例えば、１つまたは複数のメガ－ＴＡＬを有する１つまたは複数のＴＡＬＥＮ（ｃＴＡＬＥＮまたはＦｏｋＩ－ＴＡＬＥＮ））または他のＤＮＡ切断酵素と組み合わせて使用することができる。
ある特定の実施形態では、ヌクレアーゼは、メガヌクレアーゼ（ホーミングエンドヌクレアーゼ）またはその切断活性を示す部分を含む。天然に存在するメガヌクレアーゼは、１５～４０塩基対の切断部位を認識し、一般的に４つのファミリー：ＬＡＧＬＩＤＡＤＧファミリー（配列番号７０として開示された「ＬＡＧＬＩＤＡＤＧ」）、ＧＩＹ－ＹＩＧファミリー、Ｈｉｓ－ＣｙｓｔボックスファミリーおよびＨＮＨファミリーにグループ分けされる。例示的なホーミングエンドヌクレアーゼとしては、Ｉ－ＳｃｅＩ、Ｉ－ＣｅｕＩ、ＰＩ－ＰｓｐＩ、ＰＩ－Ｓｃｅ、Ｉ－ＳｃｅＩＶ、Ｉ－ＣｓｍＩ、Ｉ－ＰａｎＩ、Ｉ－ＳｃｅＩＩ、Ｉ－ＰｐｏＩ、Ｉ－ＳｃｅＩＩＩ、Ｉ－ＣｒｅＩ、Ｉ－ＴｅｖＩ、Ｉ－ＴｅｖＩＩおよびＩ－ＴｅｖＩＩＩが挙げられる。それらの認識配列は、公知である。米国特許第５，４２０，０３２号；米国特許第６，８３３，２５２号；Belfort et al. (1997) Nucleic Acids Res. 25:3379-3388； Dujon et al. (1989) Gene 82:115-118；Perler et al. (1994) Nucleic Acids Res. 22, 1125-1127；Jasin (1996) Trends Genet. 12:224-228；Gimble et al. (1996) J. Mol. Biol. 263:163-180；Argast et al. (1998) J. Mol. Biol. 280:345-353およびＮｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓのカタログも参照されたい。
主としてＬＡＧＬＩＤＡＤＧファミリー（配列番号７０として開示された「ＬＡＧＬＩＤＡＤＧ」）由来の天然に存在するメガヌクレアーゼ由来のＤＮＡ結合ドメインが、植物、酵母、ショウジョウバエ、哺乳動物細胞およびマウスにおける部位特異的なゲノム改変を促進するのに使用されてきたが、このアプローチは、メガヌクレアーゼ認識配列を保存する相同な遺伝子（Monet et al. (1999), Biochem. Biophysics. Res. Common. 255:88-93）または認識配列が導入された前もって操作されたゲノム（Route et al. (1994), Mol. Cell. Biol. 14:8096-106；Chilton et al. (2003), Plant Physiology. 133:956-65；Puchta et al. (1996), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:5055-60；Rong et al. (2002), Genes Dev. 16:1568-81；Gouble et al. (2006), J. Gene Med. 8(5):616-622）のいずれかの改変に限定されていた。したがって、医学的に、または生物工学的に関連する部位において新規の結合特異性を示すようにメガヌクレアーゼを操作する試みが行われてきた（Porteus et al. (2005), Nat. Biotechnol. 23:967-73；Sussman et al. (2004), J. Mol. Biol. 342:31-41；Epinat et al. (2003), Nucleic Acids Res. 31:2952-62；Chevalier et al. (2002) Molec. Cell 10:895-905；Epinat et al. (2003) Nucleic Acids Res. 31:2952-2962；Ashworth et al. (2006) Nature 441:656-659；Paques et al. (2007) Current Gene Therapy 7:49-66；米国特許公報第２００７０１１７１２８号；同第２００６０２０６９４９号；同第２００６０１５３８２６号；同第２００６００７８５５２号；および同第２００４０００２０９２号）。加えて、メガヌクレアーゼ由来の、天然に存在する、または操作されたＤＮＡ結合ドメインは、異種ヌクレアーゼ由来の切断ドメイン（例えば、ＦｏｋＩ）と作動可能に連結していてもよく、および／またはメガヌクレアーゼ由来の切断ドメインは、異種ＤＮＡ結合ドメイン（例えば、ＺＦＰまたはＴＡＬＥ）と作動可能に連結していてもよい。
他の実施形態では、ヌクレアーゼは、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）またはＴＡＬＥ ＤＮＡ結合ドメイン－ヌクレアーゼ融合体（ＴＡＬＥＮ）である。ＺＦＮおよびＴＡＬＥＮは、選択された遺伝子における標的部位に結合するように操作されたＤＮＡ結合ドメイン（ジンクフィンガータンパク質またはＴＡＬＥ ＤＮＡ結合ドメイン）、および切断ドメインまたは切断ハーフドメイン（例えば、本明細書に記載される制限および／またはメガヌクレアーゼ由来）を含む。
上で詳細に記載したように、ジンクフィンガー結合ドメインおよびＴＡＬＥ ＤＮＡ結合ドメインは、選択された配列に結合するように操作することができる。例えば、Beerli et al. (2002) Nature Biotechnol. 20:135-141；Pabo et al. (2001) Ann. Rev. Biochem. 70:313-340；Isalan et al. (2001) Nature Biotechnol. 19:656-660；Segal et al. (2001) Curr. Opin. Biotechnol. 12:632-637；Choo et al. (2000) Curr. Opin. Struct. Biol. 10:411-416を参照されたい。操作されたジンクフィンガー結合ドメインまたはＴＡＬＥタンパク質は、天然に存在するタンパク質と比較して新規の結合特異性を有していてもよい。操作方法としては、これらに限定されないが、合理的設計および様々な種類の選択が挙げられる。合理的設計としては、例えば、三つ組（または四つ組）ヌクレオチド配列および個々のジンクフィンガーまたはＴＡＬＥアミノ酸配列を含むデータベースを使用することが挙げられ、その場合、各三つ組または四つ組ヌクレオチド配列は、特定の三つ組または四つ組配列に結合するジンクフィンガーまたはＴＡＬＥ反復単位の１つまたは複数のアミノ酸配列に関連付けられる。例えば、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる米国特許第６，４５３，２４２号および同第６，５３４，２６１号を参照されたい。
標的部位の選択；ならびに融合分子（およびそれをコードするポリヌクレオチド）の設計および構築のための方法は、当業者に公知であり、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる米国特許第７，８８８，１２１号および同第８，４０９，８６１号で詳細に記載されている。
加えて、これらのおよび他の参考文献で開示されたように、ジンクフィンガードメイン、ＴＡＬＥおよび／または複数のフィンガーを有するジンクフィンガータンパク質は、例えば、５つまたはそれよりも多くのアミノ酸の長さのリンカーを含む任意の好適なリンカー配列を使用して互いに連結されていてもよい。６つまたはそれよりも多くのアミノ酸の長さの例示的なリンカー配列について、例えば、米国特許第６，４７９，６２６号；６，９０３，１８５号；および同第７，１５３，９４９号を参照されたい。本明細書に記載されるタンパク質は、タンパク質の個々のジンクフィンガー間に、および／またはＤＮＡ結合ドメインとヌクレアーゼドメインとの間に、好適なリンカーの任意の組合せを含んでいてもよい。米国特許第８，７７２，４５３号および同第９，５６７，６０９号も参照されたい。
したがって、ＺＦＮ、ＴＡＬＥＮおよび／またはメガヌクレアーゼなどのヌクレアーゼは、任意のＤＮＡ結合ドメインおよび任意のヌクレアーゼ（切断）ドメイン（切断ドメイン、切断ハーフドメイン）を含んでいてもよい。上述したように、切断ドメインは、ＤＮＡ結合ドメイン、例えばジンクフィンガーまたはＴＡＬ－エフェクターＤＮＡ結合ドメイン、およびヌクレアーゼまたはメガヌクレアーゼＤＮＡ結合ドメイン由来の切断ドメイン、および異なるヌクレアーゼ由来の切断ドメインに対して異種であってもよい。異種切断ドメインは、任意のエンドヌクレアーゼまたはエキソヌクレアーゼから得ることができる。切断ドメインの由来となり得る例示的なエンドヌクレアーゼとしては、これらに限定されないが、制限エンドヌクレアーゼおよびホーミングエンドヌクレアーゼが挙げられる。例えば、２００２～２００３年カタログ、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｂｅｖｅｒｌｙ、ＭＡ；およびBelfort et al. (1997) Nucleic Acids Res. 25:3379-3388を参照されたい。ＤＮＡを切断する追加の酵素が公知である（例えば、Ｓ１ヌクレアーゼ；マングビーンヌクレアーゼ；膵臓ＤＮアーゼＩ；小球菌ヌクレアーゼ；酵母ＨＯエンドヌクレアーゼ；Linn et al. (eds.) Nucleases, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1993も参照されたい）。これらの酵素（またはその機能的な断片）の１つまたは複数は、切断ドメインおよび切断ハーフドメインの供給源として使用することができる。
同様に、切断ハーフドメインは、切断活性のために二量体化を必要とする上記したような任意のヌクレアーゼまたはその部分由来であってもよい。一般的に、融合分子が切断ハーフドメインを含む場合、２つの融合分子が切断に必要である。あるいは、２つの切断ハーフドメインを含む単一のタンパク質を使用してもよい。２つの切断ハーフドメインは、同じエンドヌクレアーゼ（またはその機能的な断片）由来であってもよく、各切断ハーフドメインは、異なるエンドヌクレアーゼ（またはその機能的な断片）由来であってもよい。加えて、２つの融合分子のための標的部位は、好ましくは、２つの融合分子のそれらそれぞれの標的部位への結合によって、切断ハーフドメインが例えば二量体化により機能的な切断ドメインを形成することが可能な空間的な配向で互いに切断ハーフドメインが配列されるように互いに配置される。したがって、ある特定の実施形態では、対を形成した標的部位の近端は、５～１０ヌクレオチドまたは１５～１８ヌクレオチド間をあけている。しかしながら、任意の整数のヌクレオチドまたはヌクレオチド対が、２つの標的部位の間に介入していてもよい（例えば、２～５０ヌクレオチド対またはそれよりも多く）。一般的に、切断部位は、標的部位間にある。
制限エンドヌクレアーゼ（制限酵素）は、多くの種に存在し、ＤＮＡに（認識部位で）配列特異的に結合し、結合部位で、またはその近傍でＤＮＡを切断することが可能である。ある特定の制限酵素（例えば、ＩＩＳ型）は、認識部位から離れた部位でＤＮＡを切断し、分離可能な結合および切断ドメインを有する。例えば、ＩＩＳ型酵素のＦｏｋＩは、一方の鎖においてその認識部位から９ヌクレオチドで、および他方の鎖においてその認識部位から１３ヌクレオチドで、ＤＮＡの二本鎖切断を触媒する。例えば、米国特許第５，３５６，８０２号；同第５，４３６，１５０号および同第５，４８７，９９４号；ならびにLi et al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:4275-4279；Li et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:2764-2768；Kim et al. (1994a) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:883-887；Kim et al. (1994b) J. Biol. Chem. 269:31,978-31,982を参照されたい。したがって、一実施形態では、融合分子は、少なくとも１つのＩＩＳ型制限酵素由来の切断ドメイン（または切断ハーフドメイン）、および操作されていてもされていなくてもよい１つまたは複数のジンクフィンガー結合ドメインを含む。
その切断ドメインが結合ドメインから分離可能である例示的なＩＩＳ型制限酵素は、ＦｏｋＩである。この特定の酵素は、二量体として活性である。Bitinaite et al. (1998) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95:10,570-10,575。したがって、本開示の目的のために、開示された融合分子において使用されたＦｏｋＩ酵素の部分は、切断ハーフドメインとみなされる。したがって、ジンクフィンガー－ＦｏｋＩ融合体を使用する標的化された二本鎖切断および／または標的化された細胞配列の置き換えのために、それぞれＦｏｋＩ切断ハーフドメインを含む２つの融合分子を使用して、触媒活性切断ドメインを再構成することができる。あるいは、ジンクフィンガー結合ドメインおよび２つのＦｏｋＩ切断ハーフドメインを含有する単一のポリペプチド分子を使用することもできる。ジンクフィンガー－ＦｏｋＩ融合体を使用する標的化された切断および標的化された配列変更のパラメーターは、この開示の他所で提供される。
切断ドメインまたは切断ハーフドメインは、切断活性を保持する、または多量体化して（例えば、二量体化して）機能的な切断ドメインを形成する能力を保持するタンパク質の任意の部分であってもよい。
例示的なＩＩＳ型制限酵素は、本明細書にその全体が組み込まれる国際公報ＷＯ０７／０１４２７５に記載されている。追加の制限酵素は、分離可能な結合および切断ドメインも含有し、これらは、本開示により企図される。例えば、Roberts et al. (2003) Nucleic Acids Res. 31:418-420を参照されたい。
ある特定の実施形態では、切断ドメインは、結晶構造１ＦＯＫ．ｐｄｂおよび２ＦＯＫ．ｐｄｂを生成するのに使用されるＦｏｋＩ切断ドメインを含む（Wah et al (1997) Nature 388:97-100を参照）。全長ＦｏｋＩの配列を以下に示す。本明細書に記載されるヌクレアーゼで使用される切断ドメインは、イタリックとアンダーラインで示され（全長タンパク質の３８４～５７９位）、ホロタンパク質配列は、後述される（配列番号２）：
Figure 0007275152000001
ＦｏｋＩ由来の切断ハーフドメインは、配列番号２に示されるアミノ酸残基の１つまたは複数における変異を含んでいてもよい。変異は、（異なる残基での野生型アミノ酸残基の）置換、（１つまたは複数のアミノ酸残基の）挿入および／または（１つまたは複数のアミノ酸残基の）欠失を含む。ある特定の実施形態では、残基４１４～４２６、４４３～４５０、４６７～４８８、５０１～５０２、および／または５２１～５３１（配列番号２に対して番号付けした）の１つまたは複数が、変異しており、これは、これらの残基が、Miller et al. (2007) Nat Biotechnol 25:778-784に記載されるその標的部位に結合したＺＦＮの分子モデルにおいてＤＮＡ主鎖の近くに位置しているためである。ＦｏｋＩ変異体の非限定的な例としては、本明細書、米国特許公開第２０１８００８７０７２号に記載される１つまたは複数の変異が挙げられ、例えば、これらに限定されないが、４１６、４２１、４２２、４２４、４７２、４７８、４８０、５２５または５４２位における１つまたは複数の残基が変異している。ある特定の実施形態では、変異は、任意の異なる残基、例えばアラニン（Ａ）残基、システイン（Ｃ）残基、アスパラギン酸（Ｄ）残基、グルタミン酸（Ｅ）残基、ヒスチジン（Ｈ）残基、フェニルアラニン（Ｆ）残基、グリシン（Ｇ）残基、アスパラギン（Ｎ）残基、セリン（Ｓ）残基またはスレオニン（Ｔ）残基での野生型残基の置換を含む。他の実施形態では、４１６、４１８、４２１、４２２、４２４、４４６、４４８、４７２、４７６、４７８、４７９、４８０、４８１、５２５および／または５４２位の１つまたは複数における野生型残基が、例えば、これらに限定されないが、Ｒ４１６Ｄ、Ｒ４１６Ｅ、Ｓ４１８Ｅ、Ｓ４１８Ｄ、Ｒ４２２Ｈ、Ｓ４４６Ｄ、Ｋ４４８Ａ、Ｎ４７６Ｄ、Ｐ４７８Ｓ、Ｉ４７９Ｑ、Ｉ４７９Ｔ、Ｇ４８０Ｄ、Ｑ４８１Ａ、Ｑ４８１Ｅ、Ｋ５２５Ｓ、Ｋ５２５Ａ、Ｎ５２７Ｄ、Ｎ５４２Ｄ、Ｒ４１６Ｅ＋Ｒ４２２Ｈ、Ｒ４１６Ｄ＋Ｒ４２２Ｈ、Ｒ４１６Ｅ＋Ｋ４４８Ａ、Ｒ４１６Ｄ＋Ｒ４２２Ｈ、Ｋ４４８Ａ＋Ｉ４７９Ｑ、Ｋ４４８Ａ＋Ｑ４８１Ａ、Ｋ４４８Ａ＋Ｋ５２５Ａ、Ｒ４１６Ｅ、Ｒ４１６Ｄ、Ｒ４１６Ｈ、Ｒ４１６Ｎ、Ｓ４１８Ｄ、Ｓ４１８Ｅ、Ｄ４２１Ｓ、Ｌ４２４Ｆ、Ｓ４４６Ｄ、Ｋ４４８Ａ、Ｓ４７２Ｄ、Ｎ４７６Ｅ、Ｎ４７６Ｇ、Ｎ４７６Ｋ、Ｐ４７８Ｄ、Ｉ４７９Ｑ、Ｉ４７９Ｔ、Ｇ４８０Ｄ、Ｑ４８１Ａ、Ｑ４８１Ｃ、Ｑ４８１Ｄ、Ｑ４８１Ｓ、Ｑ４８１Ｅ、Ｑ４８１Ｈ、Ｋ５２５Ａ、Ｋ５２５Ｃ、Ｋ５２５ＡＥ、Ｋ５２５Ｉ、Ｋ５２５Ｓ、Ｋ５２５Ｔ、Ｋ５２５Ｖ、および／またはＮ５４２Ｄを含む他の任意の残基で置き換えられている。
ある特定の実施形態では、切断ドメインは、例えば、これらの全ての開示が参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる米国特許第７，９１４，７９６号；同第８，０３４，５９８号および同第８，６２３，６１８号；ならびに米国特許公開第２０１１０２０１０５５号に記載されるような、ホモ二量体化を最小化または防止する１つまたは複数の操作された切断ハーフドメイン（二量体化ドメイン変異体とも称される）を含む。ＦｏｋＩの４４６、４４７、４７８、４７９、４８３、４８４、４８６、４８７、４９０、４９１、４９６、４９８、４９９、５００、５３１、５３４、５３７、５３８および５４２位におけるアミノ酸残基（配列番号２に対して番号付けした）は全て、ＦｏｋＩ切断ハーフドメインの二量体化に影響を与えるための標的である。変異は、ＦｏｋＩに相同な天然制限酵素に見出される残基への変異を含んでいてもよい。好ましい実施形態では、４１６、４２２、４４７、４４８、４７８、５２５および／または５４２位における変異（配列番号２に対して番号付けした）は、正電荷を有するアミノ酸の、荷電を有さない、または負電荷を有するアミノ酸での置き換えを含む。別の実施形態では、操作された切断ハーフドメインは、全て配列番号２に対して番号付けされた、１つまたは複数のアミノ酸残基４１６、４２２、４４７、４４８、または５２５における変異に加えて、アミノ酸残基４９９、４９６および４８６に変異を含む。
ある特定の実施形態では、本明細書に記載される組成物は、例えば、米国特許第７，９１４，７９６号；同第８，０３４，５９８号；同第８，９６１，２８１号および同第８，６２３，６１８号；米国特許公報第２００８０１３１９６２号および同第２０１２００４０３９８号に記載されるような、絶対ヘテロ二量体を形成するＦｏｋＩの操作された切断ハーフドメインを含む。したがって、好ましい一実施形態では、本発明は、操作された切断ハーフドメインが、４１６、４２２、４４７、４４８、または５２５位における１つまたは複数の変異に加えて、４８６位における野生型Ｇｌｎ（Ｑ）残基がＧｌｕ（Ｅ）残基で置き換えられ、４９９位における野生型Ｉｌｅ（Ｉ）残基がＬｅｕ（Ｌ）残基で置き換えられ、４９６位における野生型Ａｓｎ（Ｎ）残基がＡｓｐ（Ｄ）またはＧｌｕ（Ｅ）残基で置き換えられているポリペプチド（「ＥＬＤ」または「ＥＬＥ」）（配列番号２に対して番号付けした）を含む、融合分子を提供する。別の実施形態では、操作された切断ハーフドメインは、野生型ＦｏｋＩ切断ハーフドメイン由来であり、アミノ酸残基４１６、４２２、４４７、４４８、または５２５における１つまたは複数の変異に加えて、野生型ＦｏｋＩ（配列番号２）に対して番号付けされたアミノ酸残基４９０、５３８および５３７に変異を含む。好ましい実施形態では、本発明は、操作された切断ハーフドメインが、４１６、４２２、４４７、４４８、または５２５位における１つまたは複数の変異に加えて、４９０位における野生型Ｇｌｕ（Ｅ）残基がＬｙｓ（Ｋ）残基で置き換えられ、５３８位における野生型Ｉｌｅ（Ｉ）残基がＬｙｓ（Ｋ）残基で置き換えられ、５３７位における野生型Ｈｉｓ（Ｈ）残基がＬｙｓ（Ｋ）残基またはＡｒｇ（Ｒ）残基で置き換えられているポリペプチド（「ＫＫＫ」または「ＫＫＲ」）を含む、融合分子を提供する（参照により本明細書に組み込まれるＵ．Ｓ．８，９６２，２８１を参照）。例えば、これらの開示があらゆる目的のために参照によりその全体が組み込まれる米国特許第７，９１４，７９６号；同第８，０３４，５９８号および同第８，６２３，６１８号を参照されたい。他の実施形態では、５４２位における野生型Ａｓｎ（Ｎ）残基は、Ａｓｐ（Ｄ）残基で置き換えられているか、または４７８位における野生型Ｐｒｏ（Ｐ）残基は、Ｓｅｒ（Ｓ）残基で置き換えられている。他の実施形態では、操作された切断ハーフドメインは、「シャーキー（Ｓｈａｒｋｅｙ）」および／または「シャーキーの」変異を含む（Guo et al, (2010) J. Mol. Biol. 400(1):96-107を参照）。
別の実施形態では、操作された切断ハーフドメインは、野生型ＦｏｋＩ切断ハーフドメイン由来であり、アミノ酸残基４１６、４２２、４４７、４４８、または５２５における１つまたは複数の変異に加えて、野生型ＦｏｋＩまたはＦｏｋＩ相同体に対して番号付けされたアミノ酸残基４９０、および５３８に変異を含む。好ましい実施形態では、本発明は、操作された切断ハーフドメインが、４１６、４２２、４４７、４４８、または５２５位における１つまたは複数の変異に加えて、４９０位における野生型Ｇｌｕ（Ｅ）残基がＬｙｓ（Ｋ）残基で置き換えられ、５３８位における野生型Ｉｌｅ（Ｉ）残基がＬｙｓ（Ｋ）残基で置き換えられているポリペプチド（「ＫＫ」）を含む、融合分子を提供する。好ましい実施形態では、本発明は、操作された切断ハーフドメインが、４１６、４２２、４４７、４４８、または５２５位における１つまたは複数の変異に加えて、４８６位における野生型Ｇｌｎ（Ｑ）残基がＧｌｕ（Ｅ）残基で置き換えられ、４９９位における野生型Ｉｌｅ（Ｉ）残基がＬｅｕ（Ｌ）残基で置き換えられているポリペプチド（「ＥＬ」）を含む、融合分子を提供する（参照により本明細書に組み込まれるＵ．Ｓ．８，０３４，５９８を参照）。
一態様では、本発明は、操作された切断ハーフドメインが、ＦｏｋＩ触媒ドメインにおける３８７、３９３、３９４、３９８、４００、４０２、４１６、４２２、４２７、４３４、４３９、４４１、４４７、４４８、４６９、４７８、４８７、４９５、４９７、５０６、５１６、５２５、５２９、５３４、５４２、５５９、５６９、５７０、５７１位の１つまたは複数における野生型アミノ酸残基が変異しているポリペプチドを含む、融合分子を提供する。添付の表および図のいずれかで示される１つまたは複数の変異を含むヌクレアーゼドメインが提供される。一部の実施形態では、１つまたは複数の変異は、野生型アミノ酸を、正電荷を有する残基から中性残基または負電荷を有する残基に変更する。これらの実施形態のいずれかでは、記載された変異体はまた、１つまたは複数の追加の変異を含むＦｏｋＩドメインに作製されてもよい。好ましい実施形態では、これらの追加の変異は、二量体化ドメイン中、例えば４１８、４３２、４４１、４８１、４８３、４８６、４８７、４９０、４９６、４９９、５２３、５２７、５３７、５３８および／または５５９位にあってもよい。変異の非限定的な例としては、任意の切断ドメイン（例えば、ＦｏｋＩまたはＦｏｋＩの相同体）の、３９３、３９４、３９８、４１６、４２１、４２２、４４２、４４４、４７２、４７３、４７８、４８０、５２５または５３０位における野生型残基の、任意のアミノ酸残基での変異（例えば、置換）（例えば、Ｋ３９３Ｘ、Ｋ３９４Ｘ、Ｒ３９８Ｘ、Ｒ４１６Ｓ、Ｄ４２１Ｘ、Ｒ４２２Ｘ、Ｋ４４４Ｘ、Ｓ４７２Ｘ、Ｇ４７３Ｘ、Ｓ４７２、Ｐ４７８Ｘ、Ｇ４８０Ｘ、Ｋ５２５Ｘ、Ａ５３０Ｘおよび／または、Ｎ５４２Ｘ、ここで最初の残基は、野生型を表し、Ｘは、野生型残基が置換される任意のアミノ酸を指す）が挙げられる。一部の実施形態では、Ｘは、Ｅ、Ｄ、Ｈ、Ａ、Ｋ、Ｓ、Ｔ、ＤまたはＮである。他の例示的な変異としては、Ｓ４１８Ｅ、Ｓ４１８Ｄ、Ｓ４４６Ｄ、Ｋ４４８Ａ、Ｐ４７８Ｓ、Ｉ４７９Ｑ、Ｉ４７９Ｔ、Ｑ４８１Ａ、Ｑ４８１Ｎ、Ｑ４８１Ｅ、Ａ５３０Ｅ、Ａ５３０Ｋおよび／またはＮ５４２Ｄが挙げられ、アミノ酸残基は、全長ＦｏｋＩ野生型切断ドメインおよびその相同体に対して番号付けされている。ある特定の実施形態では、組合せは、４１６および４２２、４１６位における変異、およびＫ４４８Ａ、Ｋ４４８ＡおよびＩ４７９Ｑ、Ｋ４４８ＡおよびＱ４８１Ａ、ならびに／またはＫ４４８Ａ、および５２５位における変異を含んでいてもよい。一実施形態では、４１６位における野生型残基は、Ｇｌｕ（Ｅ）残基で置き換えられていてもよく（Ｒ４１６Ｅ）、４２２位における野生型残基は、Ｈｉｓ（Ｈ）残基で置き換えられ（Ｒ４２２Ｈ）、５２５位における野生型残基は、Ａｌａ（Ａ）残基で置き換えられている。本明細書に記載される切断ドメインは、これらに限定されないが、４３２、４４１、４８３、４８６、４８７、４９０、４９６、４９９、５２７、５３７、５３８および／または５５９位におけるものを含む追加の変異、例えば二量体化ドメイン変異体（例えば、ＥＬＤ、ＫＫＲ）および／またはニッカーゼ変異体（触媒ドメインへの変異）をさらに含んでいてもよい。本明細書に記載される変異を有する切断ハーフドメインは、当業界で公知のようにヘテロ二量体を形成する。
あるいは、ヌクレアーゼは、いわゆる「スプリット酵素」技術を使用して、ｉｎ ｖｉｖｏにおいて核酸標的部位で組み立てられてもよい（例えば米国特許公開第２００９００６８１６４号を参照）。このようなスプリット酵素の成分は、別々の発現構築物で発現させてもよく、または例えば自己切断２ＡペプチドまたはＩＲＥＳ配列によって個々の成分が離れている１つのオープンリーディングフレーム中で連結させることができる。成分は、個々のジンクフィンガー結合ドメインまたはメガヌクレアーゼ核酸結合ドメインのドメインであり得る。
ヌクレアーゼ（例えば、ＺＦＮおよび／またはＴＡＬＥＮ）は、例えば米国特許第８，５６３，３１４号に記載されたような酵母ベースの染色体系で、使用前に、活性に関してスクリーニングすることができる。
ある特定の実施形態では、ヌクレアーゼは、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系を含む。系のＲＮＡ成分をコードするＣＲＩＳＰＲ（クラスター化して規則的な配置の短い回文配列リピート）遺伝子座、およびタンパク質をコードするＣａｓ（ＣＲＩＳＰＲ関連）遺伝子座（Jansen et al., 2002. Mol. Microbiol. 43:1565-1575；Makarova et al., 2002. Nucleic Acids Res. 30：482-496；Makarova et al., 2006. Biol. Direct 1:7；Haft et al., 2005. PLoS Comput. Biol. 1:e60）が、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓヌクレアーゼ系の遺伝子配列を構成する。微生物宿主におけるＣＲＩＳＰＲ遺伝子座は、ＣＲＩＳＰＲ関連（Ｃａｓ）遺伝子およびＣＲＩＳＰＲ媒介性核酸切断の特異性をプログラミングすることが可能な非コードＲＮＡエレメントの組合せを含有する。
ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲは、最もよく特徴付けられた系の１つであり、４つの逐次ステップで標的化されたＤＮＡ二本鎖切断を実行する。第１に、ＣＲＩＳＰＲ遺伝子座から、２つの非コードＲＮＡ、ｐｒｅ－ｃｒＲＮＡアレイおよびｔｒａｃｒＲＮＡが転写される。第２に、ｔｒａｃｒＲＮＡをｐｒｅ－ｃｒＲＮＡの反復領域にハイブリダイズさせ、ｐｒｅ－ｃｒＲＮＡの、個々のスペーサー配列を含有する成熟ｃｒＲＮＡへのプロセシングを媒介させる。第３に、成熟ｃｒＲＮＡ：ｔｒａｃｒＲＮＡ複合体が、Ｃａｓ９を、ｃｒＲＮＡ上のスペーサーと標的ＤＮＡ上のプロトスペーサーとの間のワトソン－クリック塩基対形成を介して標的ＤＮＡに、次に、標的認識のための追加の必要条件であるプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）に向ける。最後に、Ｃａｓ９は標的ＤＮＡの切断を媒介して、プロトスペーサー内に二本鎖切断を作り出す。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系の活性は、３つのステップ：（ｉ）「適合」と呼ばれるプロセスにおける将来的な攻撃を防止するための外来のＤＮＡ配列のＣＲＩＳＰＲアレイへの挿入、（ｉｉ）関連タンパク質の発現、ならびにアレイの発現およびプロセシング、それに続く（ｉｉｉ）外来の核酸でのＲＮＡ媒介性干渉を含む。したがって、細菌細胞において、いわゆる「Ｃａｓ」タンパク質のいくつかは、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系の天然の機能に関連し、例えば外来のＤＮＡの挿入などの機能における役割を担う。
一部の実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃｐｆ１系が使用される。ＣＲＩＳＰＲ－Ｃｐｆ１系は、Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ ｓｐｐで同定されており、ヒト細胞においてロバストなＤＮＡ干渉を媒介するクラス２ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系である。機能的に保存されているにもかかわらず、Ｃｐｆ１およびＣａｓ９は、それらのガイドＲＮＡおよび基質特異性を含む多くの態様において異なる（Fagerlund et al, (2015) Genom Bio 16:251を参照）。Ｃａｓ９とＣｐｆ１タンパク質との主要な差は、Ｃｐｆ１はｔｒａｃｒＲＮＡを利用しないことであり、したがってｃｒＲＮＡのみを必要とする。ＦｎＣｐｆ１ ｃｒＲＮＡは、４２～４４ヌクレオチドの長さ（１９ヌクレオチドの反復および２３～２５ヌクレオチドのスペーサー）であり、単一のステムループを含有し、これが２次構造を保持する配列の変化を許容する。加えて、Ｃｐｆ１ ｃｒＲＮＡは、Ｃａｓ９が必要とする約１００ヌクレオチドの操作されたｓｇＲＮＡよりも著しく短く、ＦｎＣｐｆｌのＰＡＭの必要条件は、置き換えられた鎖における５’－ＴＴＮ－３’および５’－ＣＴＡ－３’である。Ｃａｓ９およびＣｐｆ１の両方が標的ＤＮＡ中に二本鎖切断を生じるが、Ｃａｓ９は、ガイドＲＮＡのシード配列内に平滑末端化された切断を生じるのに、そのＲｕｖＣおよびＨＮＨ様ドメインを使用し、それに対してＣｐｆ１は、シードの外側に付着切断を生じるのに、ＲｕｖＣ様ドメインを使用する。Ｃｐｆ１は、重要なシード領域から離れて付着切断を生じるため、ＮＨＥＪは、標的部位を破壊せず、それゆえに、Ｃｐｆ１は、所望のＨＤＲ組換え事象が起こるまで同じ部位を確実に切り続けることができる。したがって、本明細書に記載される方法および組成物では、用語「Ｃａｓ」は、Ｃａｓ９およびＣｆｐ１タンパク質の両方を含むことが理解される。したがって、本明細書で使用される場合、「ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系」は、ヌクレアーゼおよび／または転写因子系の両方を含む、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓおよび／またはＣＲＩＳＰＲ／Ｃｆｐ１系の両方を指す。
ある特定の実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、天然に存在するＣａｓタンパク質の「機能的な誘導体」であってもよい。ネイティブ配列のポリペプチドの「機能的な誘導体」は、ネイティブ配列のポリペプチドと共通の定性的な生物学的特性を有する化合物である。「機能的な誘導体」としては、これらに限定されないが、対応するネイティブ配列のポリペプチドと共通の生物学的活性をそれらが有するという条件で、ネイティブ配列の断片、ならびにネイティブ配列のポリペプチドの誘導体およびその断片が挙げられる。本明細書において企図される生物学的活性は、ＤＮＡ基質を断片に加水分解する機能的な誘導体の能力である。用語「誘導体」は、ポリペプチドのアミノ酸配列バリアント、共有結合による改変体の両方、およびそれらの融合体、例えば誘導体Ｃａｓタンパク質を包含する。Ｃａｓポリペプチドまたはその断片の好適な誘導体としては、これらに限定されないが、Ｃａｓタンパク質またはその断片の、変異体、融合体、共有結合による改変体が挙げられる。Ｃａｓタンパク質は、Ｃａｓタンパク質またはその断片、ならびにＣａｓタンパク質またはその断片の誘導体を含み、これらは、細胞から得ることができる、または化学的に合成される、またはこれらの２つの手順の組合せによってであり得る。細胞は、天然にＣａｓタンパク質を産生する細胞、または天然にＣａｓタンパク質を産生し、内因性Ｃａｓタンパク質をより高い発現レベルで産生するように、もしくは内因性Ｃａｓと同じもしくは異なるＣａｓをコードする外因的に導入された核酸からＣａｓタンパク質を産生するように遺伝子操作された細胞であってもよい。一部の場合では、細胞は、天然にＣａｓタンパク質を産生せず、Ｃａｓタンパク質を産生するように遺伝子操作されている。一部の実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、ＡＡＶベクターを介した送達のための小さいＣａｓ９オーソログである（Ran et al (2015) Nature 510, p.186）。
ヌクレアーゼ（複数可）は、標的部位において１つまたは複数の二本鎖および／または一本鎖の切断を生じることができる。ある特定の実施形態では、ヌクレアーゼは、触媒的に不活性な切断ドメイン（例えば、ＦｏｋＩおよび／またはＣａｓタンパク質）を含む。例えば、米国特許第９，２００，２６６号；同第８，７０３，４８９号およびGuillinger et al. (2014) Nature Biotech.32(6):577-582を参照されたい。触媒的に不活性な切断ドメインは、触媒活性ドメインと組み合わせて、ニッカーゼとして作用して、一本鎖の切断を生じることができる。それゆえに、２種のニッカーゼを組み合わせて使用して、特定の領域において二本鎖の切断を生じることができる。追加のニッカーゼも当業界、例えば、McCaffery et al. (2016) Nucleic Acids Res. 44(2):e11. doi:10.1093/nar/gkv878. Epub 2015 Oct 19で公知である。
ある特定の実施形態では、ヌクレアーゼは、それぞれジンクフィンガーＤＮＡ結合ドメインおよび切断ドメイン（例えば、操作されたＦｏｋＩ）を含む第１および第２の（「左および右」および「パートナー」とも称される）ジンクフィンガーヌクレアーゼを含むジンクフィンガーヌクレアーゼである。ＺＦＮは、１つまたは複数のＡＡＶベクターによって担持され得る。ある特定の実施形態では、別々のＡＡＶベクターは、ヌクレアーゼの左および右のＺＦＮを担持する。ＡＡＶベクター（複数可）は、これらに限定されないが、５’ＩＴＲ、１つもしくは複数のエンハンサー配列（例えば、ＡｐｏＥエンハンサー）、１つもしくは複数のプロモーター配列（例えば、ｈＡＡＴプロモーター）、５’ＵＴＲ、１つもしくは複数のイントロン配列（例えば、ヒトβグロビン／ＩｇＧキメライントロン）、Ｎ末端ペプチドコード配列、ＮＬＳシグナル、１つもしくは複数のＷＰＲＥ配列（例えば、ＷＰＲＥｍｕｔ６）、ポリＡシグナルおよび／または３’ＩＴＲを含む追加のコードおよび／または非コード配列を含んでいてもよい。以下の表４および５に、例示的なヌクレアーゼＡＡＶを示す。列挙したエレメントの１つまたは複数（ＺＦＮをコードする配列は除く）は、省略され；類似の配列（例えば、異なるプロモーター配列、異なるＷＰＲＥ配列、例えば当業界において公知の、または実施例４に記載されるもの）、異なるイントロン配列など）で置き換えられている場合があり；および／または追加のエレメントが追加される場合があることが明らかである。ヌクレアーゼをコードするＡＡＶベクター（複数可）は、系において、ドナーと共に、例えば２つのＺＦＮ ＡＡＶ（例えば、表４および５で開示される左および右のＺＦＮ ＡＡＶ）を、典型的には治療用ペプチドをコードするドナーＡＡＶと組み合わせて使用することができる。ＡＡＶドナーは、以下のエレメント：任意の供給源由来の５’および／もしくは３’ＩＴＲ；任意の長さの導入遺伝子（任意のタンパク質またはその機能的な断片をコードする、任意の長さの治療用タンパク質をコードする配列）に隣接する左および／もしくは右の相同性アーム（アルブミンに対して）；スプライスアクセプター配列；ならびに／またはポリアデニル化（ポリＡ）シグナルの１つまたは複数を含んでいてもよい。ある特定の実施形態では、ＡＡＶドナーは、第ＩＸ因子、ＩＤＳまたはＩＤＵＡタンパク質、例えば以下の表６～８で示されるドナーをコードする。
送達
本明細書に記載されるタンパク質（例えば、ヌクレアーゼ）、ポリヌクレオチドならびに／またはタンパク質および／もしくはポリヌクレオチドを含む組成物は、任意の好適な手段によって、例えばタンパク質および／またはｍＲＮＡ成分の注射などによって、標的細胞に送達することができる。
好適な細胞としては、これらに限定されないが、真核および原核の細胞および／または細胞系が挙げられる。このような細胞またはこのような細胞から生成した細胞系の非限定的な例としては、Ｔ細胞、ＣＯＳ、ＣＨＯ（例えば、ＣＨＯ－Ｓ、ＣＨＯ－Ｋ１、ＣＨＯ－ＤＧ４４、ＣＨＯ－ＤＵＸＢ１１、ＣＨＯ－ＤＵＫＸ、ＣＨＯＫ１ＳＶ）、ＶＥＲＯ、ＭＤＣＫ、ＷＩ３８、Ｖ７９、Ｂ１４ＡＦ２８－Ｇ３、ＢＨＫ、ＨａＫ、ＮＳ０、ＳＰ２／０－Ａｇ１４、ＨｅＬａ、ＨＥＫ２９３（例えば、ＨＥＫ２９３－Ｆ、ＨＥＫ２９３－Ｈ、ＨＥＫ２９３－Ｔ）、およびｐｅｒＣ６細胞、ならびに昆虫細胞、例えばＳｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｕｇｉｐｅｒｄａ（Ｓｆ）、または真菌細胞、例えばＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ、ＰｉｃｈｉａおよびＳｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓが挙げられる。ある特定の実施形態では、細胞系は、ＣＨＯ－Ｋ１、ＭＤＣＫまたはＨＥＫ２９３細胞系である。好適な細胞としては、幹細胞、例えば、一例として、胚性幹細胞、人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）、造血幹細胞、神経幹細胞および間葉幹細胞も挙げられる。
本明細書に記載されるＤＮＡ結合ドメインを含むタンパク質を送達する方法は、例えば、米国特許第６，４５３，２４２号；同第６，５０３，７１７号；同第６，５３４，２６１号；同第６，５９９，６９２号；同第６，６０７，８８２号；同第６，６８９，５５８号；同第６，８２４，９７８号；同第６，９３３，１１３号；同第６，９７９，５３９号；同第７，０１３，２１９号；および同第７，１６３，８２４号に記載されており、これらの全ての開示は、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。
本明細書に記載されるＤＮＡ結合ドメインおよびこれらのＤＮＡ結合ドメインを含む融合分子もまた、ＤＮＡ結合タンパク質（複数可）の１つまたは複数をコードする配列を含有するベクターを使用して送達することができる。加えて、追加の核酸（例えば、ドナー）も、これらのベクターを介して送達することができる。これらに限定されないが、プラスミドベクター、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター、ポックスウイルスベクター；ヘルペスウイルスベクターおよびアデノ随伴ウイルスベクターなどを含む任意のベクター系を使用することができる。参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる米国特許第６，５３４，２６１号；同第６，６０７，８８２号；同第６，８２４，９７８号；同第６，９３３，１１３号；同第６，９７９，５３９号；同第７，０１３，２１９号；および同第７，１６３，８２４号も参照されたい。さらに、これらのベクターのいずれも、必要に応じて１つまたは複数のＤＮＡ結合タンパク質をコードする配列および／または追加の核酸を含んでいてもよいことが明らかである。したがって、本明細書に記載される１つまたは複数のＤＮＡ結合タンパク質および必要な場合に追加のＤＮＡが細胞に導入されるとき、それらは、同じベクターに、または異なるベクターに担持されてもよい。複数のベクターが使用される場合、各ベクターが、１つのまたは複数のＤＮＡ結合タンパク質をコードする配列および所望の場合、追加の核酸を含んでいてもよい。
従来のウイルスおよび非ウイルスベースの遺伝子移入方法を使用して、細胞（例えば、哺乳動物細胞）および標的組織中に操作されたＤＮＡ結合タンパク質をコードする核酸を導入し、所望の場合、追加のヌクレオチド配列を共導入することができる。このような方法は、ｉｎ ｖｉｔｒｏで核酸（例えば、ＤＮＡ結合タンパク質および／またはドナーをコードする）を細胞に投与することにも使用できる。ある特定の実施形態では、核酸は、ｉｎ ｖｉｖｏまたはｅｘ ｖｉｖｏでの遺伝子療法での使用のために投与される。非ウイルスベクター送達系としては、ＤＮＡプラスミド、裸の核酸、およびリポソームまたはポロキサマーなどの送達ビヒクルと複合体化した核酸が挙げられる。ウイルスベクター送達系としては、細胞への送達の後にエピソームのまたは組み込まれたゲノムのいずれかを有するＤＮＡおよびＲＮＡウイルスが挙げられる。遺伝子療法手順の総説については、Anderson, Science 256:808-813 (1992)；Nabel & Felgner, TIBTECH 11:211-217 (1993)；Mitani & Caskey, TIBTECH 11:162-166 (1993)；Dillon, TIBTECH 11:167-175 (1993)；Miller, Nature 357:455-460 (1992)；Van Brunt, Biotechnology 6(10):1149-1154 (1988)；Vigne, Restorative Neurology and Neuroscience 8:35-36 (1995)；Kremer & Perricaudet, British Medical Bulletin 51(1):31-44 (1995)；Haddada et al., in Current Topics in Microbiology and Immunology Doerfler and Boehm (eds.) (1995)；およびYu et al., Gene Therapy 1:13-26 (1994)を参照されたい。
核酸の非ウイルス送達の方法としては、エレクトロポレーション、リポフェクション、マイクロインジェクション、微粒子銃、ビロソーム、リポソーム、イムノリポソーム、ポリカチオンまたは脂質：核酸コンジュゲート、裸のＤＮＡ、ｍＲＮＡ、人工ビリオン、およびＤＮＡの作用物質増強取り込み（agent-enhanced uptake）が挙げられる。例えば、Ｓｏｎｉｔｒｏｎ ２０００システム（Ｒｉｃｈ－Ｍａｒ）を使用するソノポレーションも核酸の送達に使用することができる。好ましい実施形態では、１つまたは複数の核酸は、ｍＲＮＡとして送達される。翻訳効率および／またはｍＲＮＡ安定性を増加させるためのキャップされたｍＲＮＡの使用も好ましい。特に好ましくは、ＡＲＣＡ（ａｎｔｉ－ｒｅｖｅｒｓｅ ｃａｐ ａｎａｌｏｇ；アンチリバースキャップアナログ）キャップまたはそれらのバリアントである。参照により本明細書に組み込まれる米国特許第７，０７４，５９６号および同第８，１５３，７７３号を参照されたい。
追加の例示的な核酸送達系としては、Ａｍａｘａ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（Ｃｏｌｏｇｎｅ、Ｇｅｒｍａｎｙ）、Ｍａｘｃｙｔｅ，Ｉｎｃ．（Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、Ｍａｒｙｌａｎｄ）、ＢＴＸ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ（Ｈｏｌｌｉｓｔｏｎ、ＭＡ）およびＣｏｐｅｒｎｉｃｕｓ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ Ｉｎｃによって提供されるものが挙げられる（例えばＵＳ６００８３３６を参照）。リポフェクションは、例えば、ＵＳ５，０４９，３８６、ＵＳ４，９４６，７８７；およびＵＳ４，８９７，３５５に記載されており、リポフェクション試薬は、商業的に販売されている（例えば、Ｔｒａｎｓｆｅｃｔａｍ（商標）、Ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｎ（商標）、およびＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（商標）ＲＮＡｉＭＡＸ）。ポリヌクレオチドの効率的な受容体認識リポフェクションに好適なカチオン性および中性脂肪としては、Ｆｅｌｇｎｅｒ、ＷＯ９１／１７４２４、ＷＯ９１／１６０２４のものが挙げられる。送達は、細胞（ｅｘ ｖｉｖｏ投与）または標的組織（ｉｎ ｖｉｖｏ投与）への送達であってもよい。
標的化されたリポソームを含む脂質：核酸複合体、例えばイムノリピド（immunolipid）複合体の調製は当業者に周知である（例えば、Crystal, Science 270:404-410 (1995)；Blaese et al., Cancer Gene Ther. 2:291-297 (1995)；Behr et al., Bioconjugate Chem. 5:382-389 (1994)；Remy et al., Bioconjugate Chem. 5:647-654 (1994)；Gao et al., Gene Therapy 2:710-722 (1995)；Ahmad et al., Cancer Res. 52:4817-4820 (1992)；米国特許第４，１８６，１８３号、同第４，２１７，３４４号、同第４，２３５，８７１号、同第４，２６１，９７５号、同第４，４８５，０５４号、同第４，５０１，７２８号、同第４，７７４，０８５号、同第４，８３７，０２８号、および同第４，９４６，７８７号を参照）。
追加の送達方法としては、送達しようとする核酸のＥｎＧｅｎｅＩＣ送達ビヒクル（ＥＤＶ）へのパッケージングの使用が挙げられる。これらのＥＤＶは、二重特異性抗体を使用して標的組織に特異的に送達され、抗体の一方のアームは、標的組織に対する特異性を有し、他方のアームは、ＥＤＶに対する特異性を有する。抗体は、ＥＤＶを標的細胞表面に運び、次いでＥＤＶがエンドサイトーシスによって細胞に持ち込まれる。細胞中に入ると、内容物が放出される（MacDiarmid et al (2009) Nature Biotechnology 27(7) p. 643を参照）。
操作されたＤＮＡ結合タンパク質、および／または所望の場合、ドナー（例えばＣＡＲまたはＡＣＴＲ）をコードする核酸の送達のためのＲＮＡまたはＤＮＡウイルスベースの系の使用は、ウイルスを体内の特定の細胞に標的化する、およびウイルスペイロードを核にトラフィッキングするための高度に進化したプロセスを利用する。ウイルスベクターは、患者に直接投与してもよく（ｉｎ ｖｉｖｏ）、ウイルスベクターを使用して、ｉｎ ｖｉｔｒｏで細胞を処置してもよく、改変された細胞が患者に投与される（ｅｘ ｖｉｖｏ）。核酸の送達のための従来のウイルスベースの系としては、これらに限定されないが、遺伝子移入のための、レトロウイルス、レンチウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴、ワクシニアおよび単純疱疹ウイルスベクターが挙げられる。宿主ゲノム中での組み込みは、レトロウイルス、レンチウイルス、およびアデノ随伴ウイルス遺伝子移入方法を用いて可能であり、これは、挿入された導入遺伝子の長期にわたる発現をもたらすことが多い。加えて、高い形質導入効率が多くの様々な細胞型および標的組織で観察された。
レトロウイルスの向性は、外来性エンベロープタンパク質を取り入れ、標的細胞の潜在的な標的集団を拡張することによって変更することができる。レンチウイルスベクターは、非分裂細胞に形質導入するかまたは感染することができるレトロウイルスベクターであり、典型的には、高いウイルス力価を生じる。レトロウイルス遺伝子移入系の選択は、標的組織に依存する。レトロウイルスベクターは、最大６～１０ｋｂの外来性配列のためのパッケージング能力を有するシス作用性長末端反復で構成される。最小限のシス作用性ＬＴＲが、ベクターの複製およびパッケージングに十分であり、これは次いで、治療用遺伝子を標的細胞に組み込んで永続的な導入遺伝子発現を提供するのに使用される。広く使用されるレトロウイルスベクターとしては、マウス白血病ウイルス（ＭｕＬＶ）、テナガザル白血病ウイルス（ＧａＬＶ）、サル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）に基づくもの、およびそれらの組合せが挙げられる（例えば、Buchscher et al., J. Virol. 66:2731-2739 (1992)；Johann et al., J. Virol. 66:1635-1640 (1992)；Sommerfelt et al., Virol. 176:58-59 (1990)；Wilson et al., J. Virol. 63:2374-2378 (1989)；Miller et al., J. Virol. 65:2220-2224 (1991)；ＰＣＴ／ＵＳ９４／０５７００を参照）。
一過性発現が好ましい適用において、アデノウイルスベースの系を使用することができる。アデノウイルスベースベクターは、多くの細胞型で非常に高い形質導入効率を可能にし、細胞分裂を必要としない。このようなベクターを用いて、高い力価および高いレベルの発現が得られている。このベクターは、比較的単純な系で大量に産生することができる。アデノ随伴ウイルス（「ＡＡＶ」）ベクターは、例えば、核酸およびペプチドのｉｎ ｖｉｔｒｏの産生において、ならびにｉｎ ｖｉｖｏおよびｅｘ ｖｉｖｏでの遺伝子療法手順のために細胞を標的核酸で形質導入することにも使用される（例えば、West et al., Virology 160:38-47 (1987)；米国特許第４，７９７，３６８号；ＷＯ９３／２４６４１；Kotin, Human Gene Therapy 5:793-801 (1994)；Muzyczka, J. Clin. Invest. 94:1351 (1994)を参照。組換えＡＡＶベクターの構築は、米国特許第５，１７３，４１４号；Tratschin et al., Mol. Cell. Biol. 5:3251-3260 (1985)；Tratschin, et al., Mol. Cell. Biol. 4:2072-2081 (1984)；Hermonat & Muzyczka, PNAS USA 81:6466-6470 (1984)；およびSamulski et al., J. Virol. 63:03822-3828 (1989)を含むいくつかの出版物に記載されている。
臨床試験における遺伝子移入のために、少なくとも６つのウイルスベクターアプローチが現在利用可能であり、これらは、ヘルパー細胞系に挿入された遺伝子によって不完全なベクターを補完し、形質導入剤を生成することを含むアプローチを利用する。
ｐＬＡＳＮおよびＭＦＧ－Ｓは、臨床試験で使用されてきたレトロウイルスベクターの例である（Dunbar et al., Blood 85:3048-305 (1995)；Kohn et al., Nat. Med. 1:1017-102 (1995)；Malech et al., PNAS USA 94:22 12133-12138 (1997)）。ＰＡ３１７／ｐＬＡＳＮは、遺伝子療法試験で使用された最初の治療用ベクターであった。（Blaese et al., Science 270:475-480 (1995)）。ＭＦＧ－Ｓをパッケージングしたベクターの場合、５０％またはそれよりも大きい形質導入効率が観察されている。（Ellem et al., Immunol Immunother. 44(1) :10-20 (1997)；Dranoff et al., Hum. Gene Ther. 1:111-2 (1997)）。
組換えアデノ随伴ウイルスベクター（ｒＡＡＶ）は、不完全で非病原性のパルボウイルスアデノ随伴２型ウイルスに基づく有望な代替遺伝子送達系である。全てのベクターは、導入遺伝子発現カセットに隣接するＡＡＶの１４５ｂｐの逆位末端反復のみを保持するプラスミド由来である。形質導入される細胞のゲノムへの組み込みによる効率的な遺伝子移入および安定な導入遺伝子送達が、このベクター系の主要な特色である。（Wagner et al., Lancet 351:9117 1702-3 (1998), Kearns et al., Gene Ther. 9:748-55 (1996)）。ＡＡＶ１、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ８、ＡＡＶ８．２、ＡＡＶ９およびＡＡＶｒｈ１０ならびにシュードタイプＡＡＶ、例えばＡＡＶ２／８、ＡＡＶ２／５およびＡＡＶ２／６を含む他のＡＡＶ血清型も、本発明に従って使用することができる。
複製欠損型組換えアデノウイルスベクター（Ａｄ）を高い力価で産生し、いくつかの異なる細胞型に容易に感染させることができる。ほとんどのアデノウイルスベクターは、導入遺伝子がＡｄ Ｅ１ａ、Ｅ１ｂ、および／またはＥ３遺伝子を置き換えるように操作されており、その後、複製欠損ベクターは、欠失した遺伝子機能をトランスで供給するヒト２９３細胞中で増える。Ａｄベクターは、ｉｎ ｖｉｖｏで、非分裂性の分化細胞、例えば肝臓、腎臓および筋肉に見出されるものを含むなどの複数のタイプの組織に形質導入することができる。従来のＡｄベクターは、大きい運搬能力を有する。臨床試験におけるＡｄベクターの使用の例は、筋肉内注射での抗腫瘍免疫のためのポリヌクレオチド療法を伴うものであった（Sterman et al., Hum. Gene Ther. 7:1083-9 (1998)）。臨床試験における遺伝子移入のためのアデノウイルスベクターの使用の追加の例としては、Rosenecker et al., Infection 24:1 5-10 (1996)；Sterman et al., Hum. Gene Ther. 9:7 1083-1089 (1998)；Welsh et al., Hum. Gene Ther. 2:205-18 (1995)；Alvarez et al., Hum. Gene Ther. 5:597-613 (1997)；Topf et al., Gene Ther. 5:507-513 (1998)；Sterman et al., Hum. Gene Ther. 7:1083-1089 (1998)が挙げられる。
パッケージング細胞は、宿主細胞に感染することが可能なウイルス粒子を形成するのに使用される。このような細胞としては、アデノウイルスをパッケージングする２９３細胞、およびレトロウイルスをパッケージングするψ２細胞またはＰＡ３１７細胞が挙げられる。遺伝子療法で使用されるウイルスベクターは通常、核酸ベクターをウイルス粒子にパッケージングするプロデューサー細胞系によって生成される。ベクターは、典型的には、パッケージングおよびそれに続く宿主への組み込み（適切な場合）に必要な最小のウイルス配列を含有し、他のウイルス配列は、発現させようとするタンパク質をコードする発現カセットによって置き換えられている。失われたウイルス機能は、パッケージング細胞系によってトランスで供給される。例えば、遺伝子療法で使用されるＡＡＶベクターは、典型的には、パッケージングおよび宿主ゲノムへの組み込みに必要なＡＡＶゲノム由来の逆位末端反復（ＩＴＲ）配列のみを有する。ウイルスＤＮＡは、他のＡＡＶ遺伝子、すなわちｒｅｐおよびｃａｐをコードするがＩＴＲ配列を欠くヘルパープラスミドを含有する細胞系中にパッケージングされる。細胞系も、ヘルパーとしてのアデノウイルスで感染させる。ヘルパーウイルスは、ＡＡＶベクターの複製およびヘルパープラスミドからのＡＡＶ遺伝子の発現を促進する。ヘルパープラスミドは、ＩＴＲ配列の欠如のために相当量でパッケージングされない。アデノウイルスでの汚染は、例えば、ＡＡＶよりもアデノウイルスが感受性を示す熱処理によって低減することができる。
多くの遺伝子療法適用において、遺伝子療法用ベクターが特定の組織タイプに対して高度な特異性で送達されることが望ましい。したがって、ウイルスの外面上のウイルスコートタンパク質との融合体としてリガンドを発現することによって所与の細胞型に対して特異性を有するように、ウイルスベクターを改変してもよい。リガンドは、目的の細胞型に存在することがわかっている受容体に対して親和性を有するように選択される。例えば、Han et al., (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92:9747-9751 (1995))は、モロニーマウス白血病ウイルスは、ｇｐ７０に融合したヒトヘレグリンを発現するように改変することができ、組換えウイルスは、ヒト上皮成長因子受容体を発現するある特定のヒト乳がん細胞に感染することを報告した。この原理は、標的細胞が受容体を発現し、ウイルスが細胞表面受容体に対するリガンドを含む融合分子を発現する他のウイルス標的細胞の対に拡張することができる。例えば、線状ファージは、実質的に全ての選択された細胞受容体に対して特異的な結合親和性を有する抗体断片（例えば、ＦＡＢまたはＦｖ）を提示するように操作することができる。上の記載は主としてウイルスベクターに適用されるが、同じ原理を非ウイルスベクターに適用することができる。このようなベクターは、特定の標的細胞による取込みに有利な特定の取り込み配列を含有するように操作することができる。
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系の送達方法は、上述した方法を含んでいてもよい。例えば、動物モデルにおいて、ｉｎ ｖｉｔｒｏで転写されたＣａｓをコードするｍＲＮＡまたは組換えＣａｓタンパク質は、ゲノム編集動物の１細胞期胚に、ガラス針を使用して直接注射することができる。ｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて細胞中でＣａｓおよびガイドＲＮＡを発現するために、典型的には、それらをコードするプラスミドは、リポフェクションまたはエレクトロポレーションを介して細胞にトランスフェクトされる。また組換えＣａｓタンパク質は、ｉｎ ｖｉｔｒｏで転写されたガイドＲＮＡと複合体化することもでき、Ｃａｓ－ガイドＲＮＡリボ核タンパク質は、目的の細胞によって取り込まれる（Kim et al (2014) Genome Res 24(6):1012）。治療目的で、ＣａｓおよびガイドＲＮＡは、ウイルスおよび非ウイルス技術の組合せによって送達することができる。例えば、ＣａｓをコードするｍＲＮＡは、ナノ粒子送達を介して送達してもよく、一方でガイドＲＮＡおよび任意の所望の導入遺伝子または修復鋳型は、ＡＡＶを介して送達される（Yin et al (2016) Nat Biotechnol 34(3) p. 328）。
遺伝子療法用ベクターは、典型的には、後述するように、全身投与（例えば、静脈内、腹腔内、筋肉内、皮下、または頭蓋内注入）または局所的適用による個々の患者への投与によって、ｉｎ ｖｉｖｏで送達することができる。あるいは、ベクターは、ｅｘ ｖｉｖｏで、個々の患者からの体外培養した細胞（例えば、リンパ球、骨髄穿刺液、組織生検）またはユニバーサルドナー造血幹細胞などの細胞に送達することができ、続いて細胞は、通常ベクターを取り込んだ細胞の選択の後に、患者に再び埋め込まれる。
診断、調査、移植または遺伝子療法のためのｅｘ ｖｉｖｏでの細胞トランスフェクション（例えば、トランスフェクトされた細胞の宿主生物への再注入を介した）は、当業者に周知である。好ましい実施形態では、細胞は、対象生物から単離され、ＤＮＡ結合タンパク質核酸（遺伝子またはｃＤＮＡ）をトランスフェクトされ、再び対象生物（例えば、患者）に注入し戻される。ｅｘ ｖｉｖｏでのトランスフェクションに好適な様々な細胞型が当業者に周知である（例えば、どのように患者から細胞を単離および培養するかの考察に関して、Freshney et al., Culture of Animal Cells, A Manual of Basic Technique (3rd ed. 1994)およびそこで引用された文献を参照）。
一実施形態では、細胞トランスフェクションおよび遺伝子療法のためのｅｘ ｖｉｖｏの手順で、幹細胞が使用される。幹細胞を使用する利点は、それらがｉｎ ｖｉｔｒｏで他の細胞型に分化することができる、または哺乳動物（例えば細胞のドナー）に導入することができることであり、それらは骨髄に移植される。ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＦＮ－γおよびＴＮＦ－αなどのサイトカインを使用してｉｎ ｖｉｔｒｏでＣＤ３４＋細胞を臨床的に重要な免疫細胞型に分化させるための方法が公知である（Inaba et al., J. Exp. Med. 176:1693-1702 (1992)を参照）。
幹細胞は、公知の方法を使用して、形質導入および分化のために単離される。例えば、幹細胞は、望まれない細胞、例えばＣＤ４＋およびＣＤ８＋（Ｔ細胞）、ＣＤ４５＋（ｐａｎＢ細胞）、ＧＲ－１（顆粒細胞）、ならびにＩａｄ（分化した抗原提示細胞）に結合する抗体で骨髄細胞をパニングすることによって、骨髄細胞から単離される（Inaba et al., J. Exp. Med. 176:1693-1702 (1992)を参照）。
一部の実施形態では、改変された幹細胞も使用することができる。例えば、アポトーシスに対する耐性が付与された神経幹細胞が、治療用組成物として使用することができ、幹細胞も本発明のＺＦＰ ＴＦを含有する。アポトーシスに対する耐性は、例えば、幹細胞においてＢＡＸもしくはＢＡＫ特異的ＺＦＮを使用してＢＡＸおよび／もしくはＢＡＫをノックアウトすることによって（米国特許第８，５９７，９１２号を参照）、またはここでも例えばカスパーゼ－６特異的なＺＦＮを使用してカスパーゼにおいて破壊されているものによって、生じ得る。
治療用ＤＮＡ結合タンパク質（またはこれらのタンパク質をコードする核酸）を含有するベクター（例えば、レトロウイルス、アデノウイルス、リポソームなど）は、ｉｎ ｖｉｖｏでの細胞の形質導入のために、生物に直接投与することもできる。あるいは、裸のＤＮＡを投与してもよい。投与は、これらに限定されないが、注射、注入、局所的適用およびエレクトロポレーションを含む、最終的な血液または組織細胞との接触に分子を導くのに通常使用される経路のいずれかによる。このような核酸を投与する好適な方法は利用可能で、当業者に周知であり、特定の組成物を投与するのに１つよりも多くの経路を使用することができるが、特定の経路が、別の経路よりも即時かつ有効な反応を提供できることが多い。
造血幹細胞へのＤＮＡの導入のための方法は、例えば、米国特許第５，９２８，６３８号に開示されている。造血幹細胞、例えばＣＤ３４＋細胞に導入遺伝子を導入するのに有用なベクターとしては、アデノウイルス３５型が挙げられる。
免疫細胞（例えば、Ｔ細胞）への導入遺伝子の導入に好適なベクターとしては、非組み込み型レンチウイルスベクターが挙げられる。例えば、Ory et al. (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:11382-11388；Dull et al. (1998) J. Virol. 72:8463-8471；Zuffery et al. (1998) J. Virol. 72:9873-9880；Follenzi et al. (2000) Nature Genetics 25:217-222を参照されたい。
薬学的に許容される担体は、部分的に、投与される特定の組成物によって、ならびに組成物を投与するのに使用される特定の方法によって決定される。したがって、後述するように、利用可能な医薬組成物の多種多様の好適な製剤がある（例えば、Remington's Pharmaceutical Sciences, 17th ed., 1989を参照）。
上述したように、開示された方法および組成物は、これらに限定されないが、任意のタイプのＴ細胞および幹細胞を含む、原核細胞、真菌細胞、古細菌細胞、植物細胞、昆虫細胞、動物細胞、脊椎動物細胞、哺乳動物細胞およびヒト細胞を含む任意のタイプの細胞で使用することができる。タンパク質発現のための好適な細胞系は、当業者に公知であり、これらに限定されないが、ＣＯＳ、ＣＨＯ（例えば、ＣＨＯ－Ｓ、ＣＨＯ－Ｋ１、ＣＨＯ－ＤＧ４４、ＣＨＯ－ＤＵＸＢ１１）、ＶＥＲＯ、ＭＤＣＫ、ＷＩ３８、Ｖ７９、Ｂ１４ＡＦ２８－Ｇ３、ＢＨＫ、ＨａＫ、ＮＳ０、ＳＰ２／０－Ａｇ１４、ＨｅＬａ、ＨＥＫ２９３（例えば、ＨＥＫ２９３－Ｆ、ＨＥＫ２９３－Ｈ、ＨＥＫ２９３－Ｔ）、ｐｅｒＣ６、昆虫細胞、例えばＳｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｕｇｉｐｅｒｄａ（Ｓｆ）、ならびに真菌細胞、例えばＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ、ＰｉｃｈｉａおよびＳｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓが挙げられる。これらの細胞系の後代、変種および派生物も使用することができる。
適用
疾患の処置および防止における操作されたヌクレアーゼの使用は、今後数年間の最も重要な薬の開発の１つである。本明細書に記載される方法および組成物は、所望の標的部位が確実に主要な切断場所になるように、これらの新規のツールの特異性を増加させるのに役立つ。オフターゲット切断を最小化または消去することが、ｉｎ ｖｉｔｒｏ、ｉｎ ｖｉｖｏおよびｅｘ ｖｉｖｏでの適用のためにこの技術の潜在性を十分に実現するのに必要と予想される。
例示的な遺伝性疾患としては、これらに限定されないが、軟骨形成不全、色覚異常、酸性マルターゼ欠乏症、アデノシンデアミナーゼ欠乏症（ＯＭＩＭ番号１０２７００）、副腎白質ジストロトフィー、アイカルディ症候群、アルファ－１抗トリプシン欠乏症、アルファ－サラセミア、アンドロゲン不感性症候群、アペール症候群、不整脈原性右心室、異形成、毛細血管拡張性失調症（ataxia telangictasia）、バース症候群、ベータ－サラセミア、青色ゴムまり様母斑症候群、カナバン病、慢性肉芽腫性疾患（ＣＧＤ）、猫鳴き症候群、嚢胞性線維症、ダーカム病、外胚葉異形成、ファンコニ貧血、進行性骨化性線維形成異常（fibrodysplasia ossificans progressive）、脆弱Ｘ症候群、ガラクトース血症（galactosemis）、ゴーシェ病、全身性ガングリオシドーシス（例えば、ＧＭ１）、ヘモクロマトーシス、ベータ－グロビンの第６コドンにおけるヘモグロビンＣ変異（ＨｂＣ）、血友病、ハンチントン病、ハーラー症候群、低ホスファターゼ症、クラインフェルター症候群（Klinefleter syndrome）、クラッベ病、ランガー－ギーディオン症候群、白血球接着不全症（ＬＡＤ、ＯＭＩＭ番号１１６９２０）、白質ジストロフィー、ＱＴ延長症候群、マルファン症候群、メビウス症候群、ムコ多糖症（ＭＰＳ）、爪膝蓋骨症候群、腎性尿崩症（nephrogenic diabetes insipdius）、神経線維腫症、ニーマン－ピック病（Neimann-Pick disease）、骨形成不全症、フェニルケトン尿症（ＰＫＵ）、ポルフィリン症、プラダー－ウィリー症候群、早老症、プロテウス症候群、網膜芽細胞腫、レット症候群、ルビンシュタイン－テイビ症候群、サンフイリッポ症候群、重症複合免疫不全（ＳＣＩＤ）、シュワックマン症候群、鎌状赤血球症（鎌状赤血球貧血）、スミス－マゲニス症候群、スティックラー症候群、テイ－サックス病、血小板減少橈骨欠損（ＴＡＲ）症候群、トリーチャーコリンズ症候群、トリソミー、結節性硬化症、ターナー症候群、尿素サイクル異常症、フォンヒッペル－リンダウ病（von Hippel-Landau disease）、ワーデンブルグ症候群、ウィリアムズ症候群、ウィルソン病、ウィスコット－アルドリッチ症候群、Ｘ連鎖リンパ増殖症候群（ＸＬＰ、ＯＭＩＭ番号３０８２４０）が挙げられる。
標的化されたＤＮＡ切断および／または相同組換えによって処置することができる追加の例示的な疾患としては、後天性免疫不全症、リソソーム蓄積症（例えば、ゴーシェ病、ＧＭ１、ファブリー病およびテイ－サックス病）、ムコ多糖症（mucopolysaccahidosis）（例えばＭＰＳＩＩ（ハンター病）、ＭＰＳＩ（ハーラー病）、異常ヘモグロビン症（例えば、鎌状赤血球症、ＨｂＣ、α－サラセミア、β－サラセミア）および血友病が挙げられる。例えば、米国特許第９，８７７，９８８号および同第９，９５６，２４７号を参照されたい。特に、グルコセレブロシダーゼ（ＧＢＡ）は、ゴーシェ病で欠乏しており、アルファ－ガラクトシダーゼ（ＧＬＡ）は、ファブリー病で欠乏しており、イズロン酸－２－スルファターゼ欠乏（ＩＤＳ）は、ＭＰＳ ＩＩ（ハンター病）で欠乏しており、アルファ－Ｌイズロニダーゼ欠乏（ＩＤＵＡ）は、ＭＰＳ Ｉ（ハーラー病）で欠乏しており、スフィンゴミエリンホスホジエステラーゼ１欠乏（ＳＭＰＤ１）は、ニーマン－ピック病で欠乏している。それゆえに、これらの疾患において欠けているまたは欠乏しているタンパク質の１つまたは複数を発現するドナーを本明細書に記載されるヌクレアーゼを使用して導入して、これらの疾患の処置および／または防止を提供することができる。
このような方法は、遺伝性疾患を処置するために、宿主における（ウイルスまたは細菌）感染の処置も可能にする（例えば、ウイルスまたは細菌の受容体の発現をブロックし、それにより宿主生物における感染および／または蔓延を防止することによって）。
感染性の、または組み込まれたウイルスゲノムの標的化された切断は、宿主におけるウイルス感染を処置するのに使用することができる。加えて、ウイルスに対する受容体をコードする遺伝子の標的化された切断は、このような受容体の発現をブロックし、それにより宿主生物におけるウイルス感染および／またはウイルスの蔓延を防止するのに使用することができる。ウイルス受容体（例えば、ＨＩＶに対するＣＣＲ５およびＣＸＣＲ４受容体）をコードする遺伝子の標的化された変異誘発は、受容体をウイルスに結合することができなくし、それにより新たな感染を防止し、既存の感染の蔓延をブロックするのに使用することができる。米国特許公開第２００８／０１５９９６号を参照されたい。標的化することができるウイルスまたはウイルス受容体の非限定的な例としては、単純疱疹ウイルス（ＨＳＶ）、例えばＨＳＶ－１およびＨＳＶ－２、水痘帯状疱疹ウイルス（ＶＺＶ）、エプスタイン－バーウイルス（ＥＢＶ）ならびにサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、ＨＨＶ６およびＨＨＶ７が挙げられる。肝炎ウイルスファミリーとしては、Ａ型肝炎ウイルス（ＨＡＶ）、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）、デルタ肝炎ウイルス（ＨＤＶ）、Ｅ型肝炎ウイルス（ＨＥＶ）およびＧ型肝炎ウイルス（ＨＧＶ）が挙げられる。これらに限定されないが、Ｐｉｃｏｒｎａｖｉｒｉｄａｅ（例えば、ポリオウイルスなど）；Ｃａｌｉｃｉｖｉｒｉｄａｅ；Ｔｏｇａｖｉｒｉｄａｅ（例えば、風疹ウイルス、デング熱ウイルスなど）；Ｆｌａｖｉｖｉｒｉｄａｅ；Ｃｏｒｏｎａｖｉｒｉｄａｅ；Ｒｅｏｖｉｒｉｄａｅ；Ｂｉｒｎａｖｉｒｉｄａｅ；Ｒｈａｂｏｄｏｖｉｒｉｄａｅ（例えば、狂犬病ウイルスなど）；Ｆｉｌｏｖｉｒｉｄａｅ；Ｐａｒａｍｙｘｏｖｉｒｉｄａｅ（例えば、流行性耳下腺炎ウイルス、麻疹ウイルス、呼吸器合胞体ウイルスなど）；Ｏｒｔｈｏｍｙｘｏｖｉｒｉｄａｅ（例えば、インフルエンザウイルスＡ型、Ｂ型およびＣ型など）；Ｂｕｎｙａｖｉｒｉｄａｅ；Ａｒｅｎａｖｉｒｉｄａｅ；Ｒｅｔｒｏｖｉｒａｄａｅ；レンチウイルス（例えば、ＨＴＬＶ－Ｉ；ＨＴＬＶ－ＩＩ；ＨＩＶ－１（ＨＴＬＶ－ＩＩＩ、ＬＡＶ、ＡＲＶ、ｈＴＬＲなどとしても公知）ＨＩＶ－ＩＩ）；サル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）、インフルエンザウイルスおよびダニ媒介性脳炎ウイルスを含む他のウイルスまたはそれらの受容体を標的化することができる。これらおよび他のウイルスの記載に関して、例えば、Virology, 3rd Edition (W. K. Joklik ed. 1988)；Fundamental Virology, 2nd Edition (B. N. Fields and D. M. Knipe, eds. 1991)を参照されたい。ＨＩＶに対する受容体としては、例えば、ＣＣＲ－５およびＣＸＣＲ－４が挙げられる。
したがって、本明細書に記載されるヘテロ二量体切断ドメインバリアントは、遺伝子改変適用におけるＺＦＮ特異性を改善するための広範な有用性を提供する。これらのバリアント切断ドメインは、ｉｎ ｖｉｖｏにおける任意のＺＦＮ二量体の特異性を改善するために、部位特異的変異誘発またはサブクローニングのいずれかによって任意の既存のＺＦＮに容易に取り込むことができる。
上述したように、本明細書に記載される組成物および方法は、遺伝子改変、遺伝子修正、および遺伝子破壊に使用することができる。遺伝子改変の非限定的な例としては、相同組換え修復（ＨＤＲ）ベースの標的化た組込み；ＨＤＲベースの遺伝子修正；ＨＤＲベースの遺伝子改変；ＨＤＲベースの遺伝子破壊；ＮＨＥＪベースの遺伝子破壊ならびに／またはＨＤＲ、ＮＨＥＪ、および／もしくは一本鎖アニーリング（ＳＳＡ）の組合せが挙げられる。一本鎖アニーリング（ＳＳＡ）は、２つの相補的領域を露出させるための５’－３’エキソヌクレアーゼによるＤＳＢの切除による、同じ方向の２つの繰り返しの配列間の二本鎖切断の修復を指す。次いで２つのダイレクトリピートをコードする一本鎖が互いにアニールし、アニールした中間体は、一本鎖テール（いずれの配列にもアニールされていない一本鎖ＤＮＡの部分）が消化により除去されるようにプロセシングされ、ギャップがＤＮＡポリメラーゼによって満たされ、ＤＮＡ末端が再結合され得る。これは、ダイレクトリピート間に位置する配列の欠失をもたらす。
本明細書に記載される切断ドメイン（例えば、ＺＦＮ、ＴＡＬＥＮ、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系）を含む組成物および方法は、様々な遺伝性疾患および／または感染性疾患の処置にも使用することができる。
組成物および方法は、幹細胞ベースの療法にも適用することができ、そのような療法の例としては、これらに限定されないが、単一遺伝子の遺伝子療法（monogenic gene therapy）のための短いパッチ遺伝子の変換または標的化組込みによる体細胞変異の修正；優性阻害対立遺伝子の破壊；細胞への病原体の侵入または増殖性感染に必要な遺伝子の破壊；例えば、機能的な組織の分化または形成を促進するために遺伝子活性を改変することによる、強化された組織操作；ならびに／あるいは機能的な組織の分化または形成を促進するために遺伝子活性を破壊すること；例えば、幹細胞の具体的な系統経路への分化を促進するために分化をブロックする遺伝子を破壊すること、幹細胞分化を刺激することができる遺伝子またはｓｉＲＮＡ発現カセットの標的化された挿入、幹細胞分化をブロックでき、より優れた拡張および多能性の維持を可能にする遺伝子またはｓｉＲＮＡ発現カセットの標的化された挿入、および／または簡単なマーカーによって、幹細胞の分化状況、およびどのように培地、サイトカイン、成長条件、遺伝子の発現、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡもしくはｍｉＲＮＡ分子の発現、抗体の細胞表面マーカーへの曝露、または薬物がこの状況を変更するかをスコア付けすることを可能し得る多能性または分化状況のマーカーである内因性遺伝子を伴うフレーム内のレポーター遺伝子の標的化された挿入によって、分化をブロックまたは誘導すること；例えば、患者自身の体細胞を単離し、意図した標的遺伝子を適切な方式で改変し、細胞クローンを生成し（かつ品質を、ゲノムの安全性を確実にするように制御し）、これらの細胞から核を単離し、未受精卵に移入して、患者特異的なｈＥＳ細胞を生成することができ、ｈＥＳ細胞を患者に直接注射するか、または患者に生着させる前に分化させ、それにより、組織の拒絶を低減するかまたは消去することができる、体細胞核移入；ＭＨＣ受容体をノックアウトすることによる万能幹細胞（例えば、免疫学的アイデンティティを減らしたかまたは全体的に消滅させた細胞を生成するため）が挙げられる。この手順のための細胞型としては、これらに限定されないが、Ｔ細胞、Ｂ細胞、造血幹細胞、および胚性幹細胞が挙げられる。加えて、患者自身の体細胞から生成され得る人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）も使用することができる。それゆえに、これらの幹細胞またはそれらの誘導体（分化細胞型または組織）は、起源または組織適合性に関係なくあらゆる人へ潜在的に生着し得る。
組成物および方法は、体細胞療法にも使用することができ、それによってその生物学的な特性を強化するように改変された細胞のストックの産生を可能にする。このような細胞は、細胞のドナーの供給源およびレシピエントに対するその組織適合性と関係なく、様々な患者に注入することができる。
治療適用に加えて、本明細書に記載されるバリアントによって提供される特異性の増加は、操作されたヌクレアーゼで使用される場合、作物の操作、細胞系の操作および疾患モデルの構築に使用することができる。絶対ヘテロ二量体切断ハーフドメインは、ヌクレアーゼ特性を改善するための直接的な手段を提供する。
記載された操作された切断ハーフドメインは、介在領域を欠失させるか、または２つの特定の遺伝子座を一度に変更するかのいずれかのための、複数の標的における同時の切断を必要とする遺伝子改変プロトコールにも使用することができる。２つの標的における切断は、４種のＺＦＮまたはＴＡＬＥＮの細胞発現を必要とし得、それにより、潜在的に、１０種の異なる活性なＺＦＮまたはＴＡＬＥＮの組合せが生じ得る。このような適用の場合、野生型ヌクレアーゼドメインのためのこれらの新規のバリアントの置換は、望まれない組合せの活性を消失させ、オフターゲット切断の機会を低減し得る。ある特定の所望のＤＮＡ標的における切断がヌクレアーゼの対Ａ＋Ｂの活性を必要とし、第２の所望のＤＮＡ標的における同時の切断がヌクレアーゼの対Ｘ＋Ｙの活性を必要とする場合には、本明細書に記載される変異の使用は、ＡとＡ、ＡとＸ、ＡとＹなどの対形成を防止することができる。したがって、これらのＦｏｋＩ変異は、「変則的な」対形成の結果としての非特異的な切断活性を減少させ、ヌクレアーゼのより効率的な直交性の変異体対の生成を可能にする（共同所有の特許である米国特許公報第２００８０１３１９６２号および同第２００９０３０５３４６号を参照）。
（実施例１）
ＺＦＮの調製
本質的にUrnov et al. (2005) Nature 435(7042):646-651；Perez et al (2008) Nature Biotechnology 26(7):808-816、および米国特許第９，３９４，５４５号に記載された通りに、ヒトアルブミン遺伝子に標的化されたＺＦＮを設計し、プラスミドベクターに取り込んだ。
（実施例２）
アルブミン特異的なＺＦＮの最適化
左側のＺＦＮパートナーの結合部位（ＳＢＳ４７１７１－ＦＬＡＧ、表１を参照）は、ヒトの２０％においてＳＮＰを含む（図１を参照）。野生型配列において、配列は、ＡＴ塩基対（卵形により示される）を含むが、ＳＮＰを含む配列において、この位置にはＧＣ塩基対が存在する（配列の上の長方形で示される）。野生型およびＳＮＰアルブミン配列についてヘテロ接合型であるヒト肝細胞において、４７１７１－ＦＬＡＧ／４７８９８－ＦＬＡＧ対は、野生型配列に３～４倍の優先性を有する（図２を参照）。野生型アルブミン配列およびＳＮＰ含有配列を等しい活性で切断することが見出された第２の左側のパートナーが同定されたが（４２８７５）、４２８７５／４７８９８対もＳＭＣＨＤ１オフターゲット部位においてある程度の切断活性を示した。
したがって、ＺＦＰ主鎖内のリン酸接触アミノ酸に改変を作製した追加の候補ＺＦＮを用いて研究を実行した。以下の表１に使用されるタンパク質を示す。
Figure 0007275152000002
Figure 0007275152000003
次いで、上で列挙したＺＦＮを、それらのＺＦＰ主鎖において、ＺＦＰとＤＮＡリン酸主鎖との間のあらゆる潜在的な非特異的な接触を低減するために変更が含まれるように改変した（米国特許公開ＵＳ－２０１８－００８７０７２－Ａ１号を参照）。以下の表２Ａおよび２Ｂにおいて、例示的なＺＦＰ主鎖の変化を、各バリアントに割り当てられた新しいＳＢＳに固有の数値識別子と共に、表１からの親ＺＦＮの項目の下に示す。
Figure 0007275152000004
次いでこれらのタンパク質を、アルブミン遺伝子座（ＡＬＢ）またはＳＭＣＨＤ１オフターゲットのいずれかに対する活性に関して試験し、バリアントを、元の右側（４７８９８－ＦＬＡＧ）または左側のパートナー（４７１７１－ＦＬＡＧ）と対にした。Ｋ５６２細胞を、Ａｍａｘａエレクトロポレーションにより、製造元の指示に従って、ＺＦＮ ｍＲＮＡでエレクトロポレーションした。エレクトロポレーションの１６時間後に細胞を回収した。ＱｕｉｃｋＥｘｔｒａｃｔ（商標）ＤＮＡ抽出溶液（Ｌｕｃｉｇｅｎ）を製造元の指示に従って使用してｇＤＮＡを抽出した。アルブミンＺＦＮ切断部位またはＳＭＣＨＤ１オフターゲットを取り囲むプライマーを用いて得られたＰＣＲ産物のＭｉＳｅｑシーケンシングによってインデルのパーセンテージを測定した。全てのバリアントにおいて高い活性が見られ、特異性の増加（オフターゲット部位と比較）がほとんどのバリアントで、特にＦ１およびＦ３バリアントで観察された（図３Ａ）。
次に、ＥＬＤ／ＫＫＲ ＦｏｋＩヌクレアーゼドメインに作製されたリン酸接触アミノ酸側鎖の変異（米国特許第８，９６２，２８１号を参照）を、上述したＺＦＰ主鎖変異と対にした。これらの実験において、親ＺＦＮは、表１に示され、主鎖およびヌクレアーゼドメインの両方における変異を含み、それぞれに新しい固有の数値識別子（numeric identified）を付与したことが要約される（表３を参照）。
Figure 0007275152000005
次いでこれらのＺＦＮを含む対をＫ５６２細胞において試験して、アルブミン遺伝子座およびオフターゲット部位ＳＭＣＨＤ１におけるＺＦＮ活性を観察した。簡単に言えば、Ｋ５６２細胞に、示された通りのアルブミン標的化ＺＦＮをトランスフェクトした。細胞を、上述したようにトランスフェクションの２４時間後にディープシーケンシングによってＺＦＮ活性（％インデル）に関して査定した。
結果（図３Ａ～３Ｃに示される）は、オフターゲット活性がバックグラウンドレベルに低下する一方でアルブミン特異的な活性を大幅に改善したことを実証する。図３Ａおよび３Ｂは、オフターゲット部位ＳＭＣＨＤ１における結果を示す。不偏の捕捉アッセイも使用して、Ｋ５６２細胞およびＨｅｐＧ２細胞の両方においてこれらのＺＦＮ対に関する潜在的なオフターゲット遺伝子座を同定したところ（米国仮特許出願第６２／６７５，４３５号を参照）、示された通り（図３Ｃを参照）、改変されたＺＦＮ対は、これらの部位において検出可能な活性をほとんど有していなかった。
したがって、アルブミン遺伝子座において高いレベルのオンターゲット切断を維持し、同時にＡからＧのＳＮＰに耐容性であり、高度な特異性を有する、最適化されたヒトアルブミン特異的なＺＦＮが設計された。
また最適化されたＺＦＮも、ｉＰＳ由来ヒト肝細胞における活性（ドナーの切断および標的化組込み）に関して試験した。簡単に言えば、ｉＰＳ由来ヒト肝細胞をＣｅｌｌｕｌａｒ Ｄｙｎａｍｉｃｓ ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌから購入し、製造元のプロトコールに従ってプレーティングおよび培養した。プレーティング後の４日目に、細胞に、ヒトＺＦＮ ＡＡＶで、以下の用量：低－ ３０ＭＯＩ、中－ １００ＭＯＩおよび高－ ３００ＭＯＩで形質導入した。次の日、細胞に、ヒトドナーＡＡＶで、低－ ２４０ＭＯＩ、中－ ８００ＭＯＩおよび高－ ２４００ＭＯＩで形質導入した。ＺＦＮ ＡＡＶ形質導入後の７日目に、分析のために細胞および条件付き培地を回収した。
図３Ｄおよび３Ｅ（ｉ）で示されるように、最適化されたＺＦＮは、親ＺＦＮと比較して、最大１２倍高いレベルの切断効率、および最適化されたＺＦＮを使用して組み込まれた導入遺伝子からの１３倍高いレベルの導入遺伝子（ＩＤＳ）産生を示した。
２つのＺＦＮ対での切断後に捕捉された導入遺伝子の経時的な発現を評価するための研究を行った。簡単に言えば、ヒトｉＰＳＣ由来肝細胞に、ヒトＩＤＳ導入遺伝子ドナー（ＳＢ－ＩＤＳ）と組み合わせた、第１世代（４７１７１：４７８９８）または第２世代（７１５５７：７１７２８）ＺＦＮをコードするｒＡＡＶ２／６ベクターで、３つ組で形質導入した。形質導入後５日目および７日目におけるＩＤＳ酵素活性（細胞培養上清の１ｍＬ当たりの、時間当たりの生成物のｎｍｏｌ［ｎｍｏｌ／時間／ｍＬ］として表される）を、ＩＤＳ酵素活性アッセイによって決定した。１：１：２の左のＺＦＮ：右のＺＦＮ：ドナーの比率でＺＦＮおよびＳＢ－ＩＤＳドナーを送達した。１００：１００：２００（ＺＦＮ：ＺＦＮ：ドナーのＭＯＩ）の用量で、第２世代ＺＦＮ対での細胞の処置は、それぞれ５日目および７日目に、細胞上清中で、第１世代の対での処置よりも２倍および５倍多くのＩＤＳをもたらした。３００：３００：６００の用量で、第２世代ＺＦＮ対での細胞の処置は、それぞれ５日目および７日目に、上清中で、第１世代の対よりも７倍および２１倍多くのＩＤＳをもたらした（図３Ｅ（ｉｉ）を参照）。
次に、左のＺＦＮ結合部位内のＡからＧのＳＮＰについてヘテロ接合型の初代ヒト肝細胞に、４７１７１／４７８９８または７１５５７／４７８９８対をコードするメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）を、ＺＦＮ当たり１０または５０ｎｇのｍＲＮＡの濃度でトランスフェクトした。野生型（Ａ：Ｔ）またはＳＮＰ（Ｇ：Ｃ）オンターゲット部位における遺伝子改変のレベル（％挿入および欠失［インデル］）について、ゲノムＤＮＡをＭｉＳｅｑディープシーケンシングによって評価した。結果（図３Ｆ（ｉ）および３Ｆ（ｉｉ）を参照）から、７１５５７／４７８９８対は、ＳＮＰ含有およびＳＮＰ非含有対立遺伝子の両方において等しい活性を有していたことが実証された。
ｉｎ ｖｉｔｒｏでの細胞における遺伝子改変の速度も分析した。細胞へのＺＦＮ（１００Ｋおよび６００ＫのＭＯＩ）のＡＡＶ２／６媒介性送達後の遺伝子改変レベルを、３つの生物学的複製物で、ヒト初代肝細胞での１０日の曝露にわたり査定した。１、３、５および１０日目に細胞を回収し、ゲノムＤＮＡを単離し、ＰＣＲ増幅し、ＭｉＳｅｑディープシーケンシングを行った。７１５５７／７１７２８ＺＦＮ対は、１０日にわたり、４７１７１／４７８９８ＺＦＮ対と比較してより速い反応速度を示した（図３Ｇ）。７１５５７／７１７２８ＺＦＮ対の両方の用量レベルに対するより速い反応速度は、３日目もの早い時期に明らかであり、４７１７１／４７８９８ＺＦＮ対での２．２％および３．０％インデルと比較して、１００Ｋおよび６００Ｋ用量レベルに対してそれぞれ８．３％および１７．８％インデルを生じた。７１５５７／７１７２８ＺＦＮ対は、１０日目に４０％を超えるインデルの効果の飽和に達したようであった。７１５５７／７１７２８ＺＦＮ対での処置は、４７１７１／４７８９８ＺＦＮ対と比較して、経時的により高いレベルの遺伝子改変をもたらした。４７１７１／４７８９８ＺＦＮ対の投与は、それぞれ１００Ｋおよび６００ＫのＭＯＩ用量レベルに対して１６．９％および２５．４％インデルの遺伝子改変レベルをもたらすが、７１５５７／７１７２８ＺＦＮ対は、それぞれ３５．１％および４４．２％インデルを生じた。１０日で、７１５５７／７１７２８ＺＦＮ対の活性は、それぞれ低および高用量の群に対して４７１７１／４７８９８ＺＦＮ対の活性よりも２．１および１．７倍高かった。１０日の細胞培養実験中に完全な用量応答曲線が得られなかったことから、真のＥＣ５０値を計算および比較することができなかった。しかしながら上の結果は、第２世代ＺＦＮを用いた１０日にわたるＺＦＮ活性におけるおよそ２倍の増加の合理的な推測を提供する。
第２世代ＺＦＮ対に関する任意のオフターゲット切断事象を特徴付けるために、ヒト初代肝細胞における評価研究も行った。オフターゲット切断を、以前に開示された方法によって決定した（ＰＣＴ公報ＷＯ２０１８０３９４４０を参照）。ＱｕｉｃｋＥｘｔｒａｃｔ（商標）ＤＮＡ抽出溶液（Ｌｕｃｉｇｅｎ）を製造元の条件に従って使用してゲノムＤＮＡを抽出した。
ＳＭＣＨＤ１は、ＺＦＮの検出されたオフターゲット部位として同定されている。４７１７１／４７８９８または７１５５７／７１７２８ＺＦＮ対をコードするＡＡＶ２／６で形質導入されたヒト初代肝細胞をＭｉＳｅｑディープシーケンシングによって評価した。ヒト初代肝細胞を、以下のＭＯＩ：３Ｋ、１０Ｋ、３０Ｋ、１００Ｋ、３００Ｋ、６００Ｋで第２世代ＺＦＮ対を含むＡＡＶおよび偽（Ｍｏｃｋ）で１０日間処置した。用量応答を、オンターゲットアルブミン部位におけるＺＦＮ改変に関して観察した。１０日目におけるアルブミン遺伝子座での平均％インデルは、７１５５７／７１７２８ＺＦＮ対での処置後、０．１６、７、１５、１５、２１、３０および４４％であった（図３Ｈ、上の行を参照）。ＮＳ－両側ｔ検定により統計学的に有意ではない、＊－両側ｔ検定によりｐ値＜０．０５。１００ＫのＭＯＩ用量において、４７１７１／４７８９８ＺＦＮは、平均して１７％インデルのオンターゲット活性および０．１１％インデルのオフターゲット活性（１７／０．１１の比率＝１５４）を示し；７１５５７／７１７２８ＺＦＮは、平均して３５％のオンターゲット活性および０．０８％のオフターゲット活性（３５／０．０８の比率＝４３８）を示した。２つの比率を比較すると、第２世代ＺＦＮは、第１世代ＺＦＮよりも約２．８倍選択的である。６００ＫのＭＯＩ用量において、４７１７１／４７８９８ＺＦＮは、平均して２５％インデルのオンターゲット活性および０．３６％インデルのオフターゲット活性（２５／０．３６の比率＝６９）を示し；７１５５７／７１７２８ＺＦＮは、平均して４４％のオンターゲット活性および０．３４％のオフターゲット活性（４４／０．３４の比率＝１３０）を示した。２つの比率を比較すると、第２世代ＺＦＮは、第１世代ＺＦＮよりも約１．９倍選択的である。１００Ｋおよび６００ＫのＭＯＩにおいて、第１および第２世代ＺＦＮの％インデルは、それぞれ１７％および３５％、ならびに２５％および４４％であり、これは、第２世代ＺＦＮ（ＺＦＮ２．０）が第１世代ＺＦＮよりも約２倍強力であることを示す（図３Ｈを参照）。
第１世代の左のＺＦＮ（４７１７１）で処置した細胞において、ＳＮＰ含有対立遺伝子におけるＺＦＮ活性は、野生型対立遺伝子における活性のわずか３９～４４％の高さであった。比較において、第２世代の左のＺＦＮ（７１５５７）で処置した細胞では、ＳＮＰ含有対立遺伝子におけるＺＦＮ活性は、野生型対立遺伝子における活性の９１～１０８％の高さであった。
（実施例３）
ポリカチオン性ペプチドタグの使用はＺＦＮ活性を増加させる
ポリカチオン性ペプチドタグを含むＺＦＮを、切断活性について検査した。使用されたペプチドは、アミノ酸配列Ｎ末端－ＤＹＫＤＨＤＧ－ＤＹＫＤＨＤＩ－ＤＹＫＤＤＤＤＫ（配列番号７１）を含む３×Ｆｌａｇタグ（ＰＣＴ公報ＷＯ２００１０２７２９３号を参照）であった。３×Ｆｌａｇタグをコードする配列は、ＺＦＮ融合タンパク質に、タンパク質のＮ末端で融合されている（表１を参照）。
この研究のためのＺＦＮを、マウス、ＮＨＰおよびヒト間で保存されている７つの超保存ＤＮＡ標的に対して作製し（Bejerano et al (2004) Science 302(5675):1321-1325を参照）、試験される細胞の細胞起源を確認した。超保存ＤＮＡ標的に対して７４個のＺＦＮ対を作製し、３×Ｆｌａｇタグを有するかまたは有さないかのいずれかでＫ５６２細胞における活性について試験した。
結果（図４Ａ）から、ポリカチオン性３×Ｆｌａｇタグの存在は、ＺＦＮ切断活性にとって非常に有益であったこと（％インデルを測定するための細胞アッセイによって決定した場合）、およびこれらの３×Ｆｌａｇタグを含むＺＦＮ対において、活性が、Ｆｌａｇタグを欠くＺＦＮと比較して平均４．１倍増加したことが実証される（図４Ｂ）。図４Ｃで示されるように、３×ＦＬＡＧタグの付加は、ＺＦＮ活性における２～３倍の増加をもたらした。
（実施例４）
ＷＰＲＥ調節エレメントの付加
ＷＰＲＥは、ＬＮＰ（図５Ｂ、米国特許公開ＵＳ－２０１８－０１８５５１６－Ａ１号を参照）によるまたはＡＡＶ（図５Ｃ、米国特許公報第２０１６－０３２６５４８号を参照）による送達の後に、ｉｎ ｖｉｔｒｏ（図５Ａ、米国特許公報第２０１６－０３２６５４８号を参照）およびｉｎ ｖｉｖｏの両方でＺＦＮの活性を増加させることが見出されている。
その天然形態において、ＷＰＲＥは、ＷＨＶ－Ｘタンパク質のための部分的なオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を含有する。ＷＨＶ（Ｗｅ２）エンハンサーのような他のウイルスエレメントとの関連で、十分に発現されたＷＨＶ－Ｘタンパク質は、ウッドチャックおよびマウスにおいて肝細胞癌のより高いリスクと関連していた（Hohne et. al (1990) EMBO J 9(4):1137-45；Flajolet et. al (1998) J Virol 72(7):6175-80）。ＷＨＶ－Ｘタンパク質は、直接的に腫瘍形成性ではないようであるが、一部の研究は、ある特定の状況下で、ＷＨＶ－Ｘタンパク質が、ヘパドナウイルス（人間の場合はＢ型肝炎ウイルス；ウッドチャックの場合はウッドチャック肝炎ウイルス）による感染に関連する肝臓がんの発生に関する弱い補因子として作用し得ることを示唆する。使用されるＷＰＲＥ配列は、ＷＨＶ－Ｘタンパク質のための部分的なオープンリーディングフレームを含有するが、ＷＨＶ－Ｘタンパク質の発現を増幅すると考えられるＷｅ２エンハンサーを含有しない。さらに、ＷＰＲＥ配列は、終止コドンの３’ならびにプロモーターおよび治療的導入遺伝子を含むフレームの外側に置かれ、したがって、終止コドンのリードスルーが起こったとしても、この配列の翻訳は予想されない。
したがって、ＷＰＲＥエレメントを、典型的にはヌクレアーゼコード配列に対して３’に、本明細書に記載されるポリヌクレオチドに付加した（図７）。使用されるＷＰＲＥエレメントは、以下に示すＪ０２４４２バリアント由来のＷＰＲＥｍｕｔ６（Zanta-Boussif、同上）であり得る：
Ｊ０２４４２ ＷＰＲＥｍｕｔ６：
Figure 0007275152000006
一部の実施形態では、ＷＰＲＥエレメントは、ガンマおよびアルファエレメントのみを含むトランケート型の構築物である。ＷＰＲＥ３の配列を以下に示す：
Figure 0007275152000007
一部の実施形態では、Ｊ０４５１４．１バリアントが使用され、以下に示すようにしてｍｕｔ６バリアントが配列に付加される：
Figure 0007275152000008
Figure 0007275152000009
ＷＰＲＥバリアントの３つ全てが、ＷＨＶ Ｘ遺伝子を発現する能力を欠いており、本明細書に記載される発現構築物において交換可能に使用することができる。
（実施例５）
５’ＵＴＲの付加
１９９４年に、KriegおよびMelton（Nucl. Acid. Res 12(18):7057）は、Ｘｅｎｏｐｕｓのベータ－グロビン遺伝子の５’非翻訳領域を記載しており、ｍＲＮＡを安定化する配列としてのその潜在性を認めた。したがって、ヌクレアーゼをコードする発現カセットの５’非翻訳領域におけるこのエレメントの配列（［ＴＧ］ＣＴＴＧＴＴＣＴＴＴＴＴＧＣＡＧＡＡＧＣＴＣＡＧＡＡＴＡＡＡＣＧＣＴＣＡＡＣＴＴＴＧＧＣＡＧＡＴ（配列番号１）、ＴＧは、オプションの略記されたβｇｌｂである）を試験した。構築物を、細胞をトランスフェクションの２４時間後にアッセイしたことを除き上述した通りにＫ５６２細胞で試験した。
図９で示されるように、新規の５’ＵＴＲの付加は、ＺＦＮ活性の２～３倍の増加をもたらした。
（実施例６）
強化の組合せ
ｉＰＳＣ由来ヒト肝細胞において、３×Ｆｌａｇタグ（「３×Ｆｌａｇ」）、Ｘｅｎｏｐｕｓのβ－ｇｌｂ（「ＸＢＧ」）および／またはＷＰＲＥエレメントを含むＺＦＮを様々な組合せで試した。使用されたＺＦＮは４２８７７／４７９３１であり、それをＡＡＶ６を介して送達した。形質導入の６日後に細胞を回収し、アルブミン標的に対する活性を測定した。
結果から、初期のベクターとの比較において、３つ全てのエレメントの存在下におけるＺＦＮ活性の強化が実証された（図６を参照）。
さらに、そのようにして、ＺＦＮを含む一連の８つの発現構築物を、上述した全ての異なるエレメントの様々な組合せを含めずに、または含めて構築した（バリアントＶ１～Ｖ８を示す図７Ａを参照）。全てのバリアントをＡＡＶ６ベクターにおいて使用し、ＡｐｏＥ－ｈＡＡＴプロモーターと共に使用した（Okuyama et al (1996) Hum Gene Ther 7(5):637-45）。これらのベクターは、ヒトβ－グロビン遺伝子の第１のイントロン由来の５’－ドナー部位およびブランチ、ならびに免疫グロブリン遺伝子の重鎖可変領域のイントロン由来の３’－アクセプター部位で構成されるキメライントロンとして記載されたヒトベータ－グロビン－免疫グロブリンキメライントロン配列（Ｐｒｏｍｅｇａ）も含んでいた。これらの構築物で使用されたＮＬＳはＳＶ４０由来であった。
次いで送達されたＺＦＮ対（４２８７７／４７９３１）の切断活性についてベクターを試験し、同じバリアント構造中に両方のＺＦＮが送達された。
図８で示されるように、バリアント構造の２つ、バリアント４およびバリアント８は、両方ともＦＬＡＧ配列を含んでおり（表１）、現在使用されているベクター構造を含む他のバリアントと比較して優れた結果を提供した。これらの実験は、異なるベクターを含む３００，０００のＭＯＩのＡＡＶを使用してＨｅｐＧ２細胞で行った。
様々な強化の組合せを含むように作製された１つのアルブミン特異的なＺＦＮ対は、上述した７１５５７／７１７２８対である。図７Ｂは、これらのＺＦＮをコードするＡＡＶの概略図を描写する。対のエレメントは表に示し、配列は以下に示す。エレメントのいずれも、以下のＷＰＲＥ配列の代わりに、類似の配列、例えば当業界において公知の、または上の実施例４で示されるＷＰＲＥ配列で置換できることは明らかである。
Figure 0007275152000010
Figure 0007275152000011
Figure 0007275152000012
Figure 0007275152000013
Figure 0007275152000014
Figure 0007275152000015
Figure 0007275152000016
Figure 0007275152000017
Figure 0007275152000018
Figure 0007275152000019
Figure 0007275152000020
Figure 0007275152000021
一連の導入遺伝子ベクター（Ｆ９、ＩＤＳおよびＩＤＵＡ）を作製して、上で示したＺＦＮ対（７１５５７／７１７２８）を使用してアルブミン遺伝子に挿入した。ｈＩＤＳ挿入に関する結果を描写する図１１を参照されたい。ベクターはＡＡＶベクターであり、全てＺＦＮ切断部位に隣接する相同性の領域（左の相同性アーム：ＬＡ、および右の相同性アーム：ＲＡ）を含んでいた。ベクターは、スプライスアクセプター配列（ＳＡ）およびポリＡシグナル配列（ポリＡ）をさらに含んでいた。最終的に、全てが、５’および３’ＡＡＶ ＩＴＲ配列を含んでいた。第９因子エクソン２～９ＡＡＶ導入遺伝子ドナーのエレメントおよび配列を以下に示す。
Figure 0007275152000022
Figure 0007275152000023
Figure 0007275152000024
Figure 0007275152000025
Figure 0007275152000026
ＩＤＳ ＡＡＶ導入遺伝子ドナーのエレメントおよび配列を以下に示す：
Figure 0007275152000027
Figure 0007275152000028
Figure 0007275152000029
Figure 0007275152000030
ＩＤＵＡ ＡＡＶ導入遺伝子ドナーのエレメントおよび配列を以下に示す：
Figure 0007275152000031
Figure 0007275152000032
Figure 0007275152000033
Figure 0007275152000034
アルブミン特異的な７１５５７／７１７２８対を使用して、導入遺伝子ドナーＡＡＶ（ＡＡＶ－Ｆ．ＩＸ、ＡＡＶ－ＩＤＳ、ＡＡＶ－ＩＤＵＡ）の１つの存在下で、相同組換え標的化組込みを介して導入遺伝子がアルブミン遺伝子座に組み込まれるように、標的ヒト細胞中でアルブミン遺伝子座を切断する。組み込まれると、導入遺伝子の発現は、アルブミンプロモーターによって調節される。
標準的なプロトコールに従って、ＨｅｐＧ２細胞におけるアルブミン遺伝子座の切断およびＦＩＸ導入遺伝子の挿入に関して、７１５５７／７１７２８ＺＦＮを４７１７１／４７８９８ＺＦＮ対と比較した。簡単に言えば、ＨｅｐＧ２細胞に、５００μＬの総体積で、それぞれ１．２５×１０６ｖｇ／細胞のＭＯＩのＺＦＮのロットで形質導入した。細胞を、３７℃／５％ＣＯ２のインキュベーターで一晩（１２～２４時間）インキュベートした。次の日、ＦＩＸドナーを、５００μＬの総体積で、２．５×１０６ｖｇ／細胞のＭＯＩのＦＩＸドナーで形質導入した。９日目に、ＶｉｓｕＬｉｚｅ ＦＩＸ抗原キット（Ａｆｆｉｎｉｔｙ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ）を製造元の指示に従って使用したＥＬＩＳＡによって、培地をＦＩＸタンパク質に関して試験した。
結果（図１０Ｃを参照）から、このアッセイにおいて、７１５５７／７１７２８ＺＦＮを使用したＦＩＸドナーの挿入は、４７１７１／４７８９８対を使用した場合よりも、ほぼ３倍多くのＦＩＸ産生をもたらしたことが示される。
同様にして、標準的なプロトコールに従って、ＨｅｐＧ２細胞におけるアルブミン遺伝子座の切断およびＩＤＵＡ導入遺伝子の挿入に関して７１５５７／７１７２８ＺＦＮを４７１７１／４７８９８ＺＦＮ対と比較した。結果（図１４）から、両方の対が、ＩＤＵＡ導入遺伝子の、アルブミン遺伝子座へのＺＦＮ組換え標的化組込みを生じさせることができ、ＩＤＵＡ活性が細胞上清中に存在するように、導入遺伝子を発現させることができることが実証される。
（実施例７）
ｉｎ ｖｉｖｏでの切断および標的化組込み
本明細書に記載される構築物をｉｎ ｖｉｖｏでも試験した。
動物実験設計
少なくとも６～８週齢の４２匹の雄野生型Ｃ５７ＢＬ／６マウスを、Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．、Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ、ＭＡから購入した。マウスの取り扱い、注射および試料収集は、家畜学に関する標準的なプロトコールに従ってＥｘｐｅｒｉｍｕｒ（Ｃｈｉｃａｇｏ ＩＬ）により行った。マウスを処置開始前の少なくとも１週間Ｅｘｐｅｒｉｍｕｒに隔離して保持した。
ＡＡＶは、Ｓａｎｇａｍｏ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓによって調製され、これを受け取ったままの状態で、－７０℃で使用するまで貯蔵した。この研究に、５つの操作されたＡＡＶ２／６ベクター；標準的な構造を有する２つのＺＦＮをコードする２つのＡＡＶベクター（「ＺＦＮ標準」）；改善された構造を有する２つのＺＦＮをコードする２つのＡＡＶベクター（「ＺＦＮ改善」、例えばＺＦＮ標準＋５’ＵＴＲ、３×ＦＬＡＧおよびＷＰＲＥｍｕｔ６）；およびマウスアルブミンイントロン１相同性アームに挟まれたプロモーターを有さないｈＩＤＳ導入遺伝子ＤＮＡ鋳型（ドナー）をコードする１つのＡＡＶベクターを使用した。
ＡＡＶ２／６ベクターを製剤緩衝液（３５ｍＭのＮａＣｌおよび５％グリセロールが補充されたＰＢＳ［ｐＨ７．１］）で表１に示される用量に希釈した。６～９週齢のマウスを群１～７にランダムに割り当てた。群１のマウスには、ビヒクル、すなわち製剤緩衝液をｉ．ｖ．注射し、群２～７のマウスには、ベクターの組合せを以下の表９に示される異なる用量でｉ．ｖ．注射した。注射の総投与体積はマウス１匹当たり２００μＬであった。
Figure 0007275152000035
ＡＡＶベクター構築物およびパッケージング
ＦｏｋＩドメイン１における絶対ヘテロ二量体ＥＬＤ／ＫＫＲ変異を含有するマウスアルブミン遺伝子座のイントロン１を標的化するヘテロ二量体ＺＦＮ。マウスのｉｎ ｖｉｖｏの研究のために、標準ＺＦＮ（４８６４１および３１５２３）または改善されたＺＦＮ（５’ＵＴＲ、Ｎ末端３×ＦＬＡＧおよび３’ＷＰＲＥｍｕｔ６を有する４８６４１および３１５２３）を使用した。ヒトのｉｎ ｖｉｔｒｏの研究のために、標準ＺＦＮ（４７１７１および４７８９８）またはＺＦＮ２．０（５’ＵＴＲ、Ｎ末端３×ＦＬＡＧおよび３’ＷＰＲＥｍｕｔ６を有する７１５５７および７１７２８）を使用した。ｈＩＤＳドナー構築物は以前に記載されている（Sharma et al (2015) Blood 126, 1777-1784）。ｈＩＤＳドナー構築物は、内因性ＩＤＳシグナルペプチドを欠くｈＩＤＳ ｃＤＮＡ、ｈＦ９スプライスアクセプター配列、および合計で長さがおよそ６００ｂｐのマウスまたはヒトアルブミン標的部位への相同性を有するアームを含有する。組換えＡＡＶ２／６ベクター（ＡＡＶ２ ＩＴＲおよびＡＡＶ６キャプシドで構成される）を、１０チャンバーのＣＥＬＬＳＴＡＣＫ培養チャンバー（Ｃｏｒｎｉｎｇ）での２９３細胞の三つ組のトランスフェクションによって産生し、塩化セシウム密度勾配遠心分離とそれに続く透析によって精製し、以前に記載されたようにして力価測定した（Sharma、同上）。
組織の収集
５６日目に、２Ｌ／分の流速で３分のＣＯ２ヒュームチャンバー中でマウスを安楽死させた。肝臓試料を収集し、３つの部分に切り分け、１つの部分を１０％中性緩衝ホルマリン中での組織病理学的分析用にし、残りの部分を急速冷凍し、ＩＤＳ酵素活性の査定、ＲＮＡ抽出、ウェスタンブロッティングおよび遺伝子改変のための処理まで－７０℃で貯蔵した。
次世代シーケンシングによる肝臓におけるインデル検出
ＡｌｌＰｒｅｐ ＤＮＡ／ＲＮＡ／タンパク質ミニキット（Ｑｉａｇｅｎ）を製造元のプロトコールに従って使用して、マウス肝臓試料からのゲノムＤＮＡを抽出した。ＱＩＡａｍｐ ＤＮＡマイクロキット（Ｑｉａｇｅｎ）を製造元のプロトコールに従って使用して、ｉＰＳ由来肝細胞のｇＤＮＡを抽出した。表１０に記載されるプライマーを使用したＰＣＲによって、ＺＦＮ標的部位を増幅した。ＭｉＳｅｑ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）を使用してＰＣＲ産物をシーケンシングし、以前に記載されたようにして分析した（Laoharawee, K. et al. (2018) Mol. Ther. 26, 1127-1136）。
Figure 0007275152000036
ＲＴ－ｑＰＣＲ
ＡｌｌＰｒｅｐ ＤＮＡ／ＲＮＡ／タンパク質ミニキット（Ｑｉａｇｅｎ）を製造元のプロトコールに従って使用して、肝臓試料からの全ＲＮＡを抽出した。ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ（商標）ＩＩＩ Ｆｉｒｓｔ－Ｓｔｒａｎｄ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ＳｕｐｅｒＭｉｘ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を製造元のプロトコールに従って使用して、ｃＤＮＡを生成した。ＴａｑＭａｎユニバーサルＰＣＲマスターミックス（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を利用して、ｑＰＣＲを実行した。プライマーおよびプローブ配列について、表１１を参照されたい。データをアクチンに対して正規化した。
Figure 0007275152000037
ウェスタンブロッティング
総タンパク質抽出物を、以前に記載されたようにして、肝臓試料から調製した３。ウェスタンブロットによるＩＤＳ検出の前に、Ｐｉｅｒｃｅビシンコニン酸（ＢＣＡ）タンパク質アッセイキット（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用してタンパク質濃度を決定した。使用された抗体は、ＩＤＳ（ＡＦ２４４９；Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）およびグリセルアルデヒド３－リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）（Ａ００１９１－４０、ＧｅｎｅＳｃｒｉｐｔ）であった。
ＩＤＳアッセイ
１ｕｇの総肝臓タンパク質抽出物またはｉＰＳ由来肝細胞条件付き培地の１：３希釈物を、以前に記載されたようにしてアッセイに使用した（Laoharawee, K. et al.、同上）。
注射から５６日後に、肝臓試料を処置した動物から収集し、アルブミンの切断活性を上述したようにして測定した。加えて、肝臓ｍＲＮＡを逆転写し、生成物を、内因性マウスアルブミンエクソン１とトランスジェニックヒトＩＤＳとのジャンクションをカバーするＴａｑＭａｎプライマー－プローブ対を使用してｑＰＣＲに供することによって、導入遺伝子発現を分析した。ＩＤＳのウェスタンブロットも実行し、肝臓の総タンパク質抽出物を、ヒト特異的なＩＤＳ抗体とハイブリダイズさせた（ＧＡＰＤＨがローディング対照として役立つ）。
図１０Ａおよび１０Ｂで示されるように、本明細書に記載される改変を含むＡＡＶベクター（５’ＵＴＲ、ＦＬＡＧ、ｍｕｔ６ＷＰＲＥ）は、ｉｎ ｖｉｖｏでアルブミン遺伝子を、改変を含まないＡＡＶベクターと比較して最大７倍多く切断した。同様に、改変されたＺＦＮは、Ｆ．ＩＸドナーの組み込みの増加をもたらすことができた（図１０Ｃを参照）。
さらに、図１１～１３のドナーＩＤＳ導入遺伝子で示されるように、改変されたＺＦＮをコードするＡＡＶベクターを標的化組込みに使用した場合、ドナー導入遺伝子（ＩＤＳ）の発現は、改変されていないＺＦＮをコードするＡＡＶベクター（図１１および１２）によって媒介される組み込みと比較して、ｉｎ ｖｉｖｏで１８倍増加し、血漿における酵素活性（ＩＤＳの）も増加した。図１１Ａは、この研究で使用された３つの異なるドナー：ＳＢ－ＩＤＳ、ＳＢ－Ｆ９およびＳＢ－ＩＤＵＡの概略図を示す。改変されたＺＦＮは、図１１Ｂで示されるように、初代肝細胞においてアルブミン標的に対する活性の増加をもたらし、改善されたＺＦＮ（「ＺＦＮ２．０」）は、元のＺＦＮ対（「現行」）と比較して、中用量でのインデルパーセントにおける３４倍の増加、および高用量での活性における２２倍の増加をもたらした。これらのＺＦＮがＩＤＳドナーと対になっている場合、細胞上清において、標準ＺＦＮ（「現行」）と比較して、改善された（「ＺＦＮ２．０」）ＺＦＮの中用量で５倍、およびより高い用量で２１倍のＩＤＳ活性における増加が検出された。
ＩＤＵＡ活性アッセイ
ＩＤＵＡ活性は、当業界において公知の方法に従って測定される。例えば、１つの例示的なアッセイは、以下の通りである：α－Ｌ－イズロニダーゼの活性を、確立されたアッセイ条件に従って、基質として４－メチルウンベリフェリルα－Ｌ－イズロニド（Ｇｌｙｃｏｓｙｎｔｈ）を使用する蛍光定量アッセイによって決定した（Whitley 1987、同上(Whitley 1986、同上）。４ＭＵ－イズロニド基質を、狭い十分に確立された最適なｐＨ範囲の、ギ酸ナトリウム緩衝液、０．４Ｍ、ｐＨ３．５（Hopwood et al (1979), Clin Chim Acta.92:257-265, Whitley 1986、同上）を用いて、選択された基質濃度に希釈した。次いで、基質の２５μＬのアリコートを、２５μＬの生物学的試料（例えば血漿、白血球、組織ホモジネート）と混合した。混合物を３７℃で３０分間インキュベートし、２００μＬのグリシン炭酸緩衝液（ｐＨ１０．４）を添加して反応をクエンチした。α－Ｌ－イズロニダーゼは、非蛍光基質（４ＭＵ－イズロニド）の蛍光生成物（４－ＭＵ）への切断を触媒した。４－メチルウンベリフェロン（４－ＭＵ、Ｓｉｇｍａ）を使用して、標準曲線を作成した。得られた蛍光を、３５５ｎｍでの励起および４６０ｎｍでの放射でＢｉｏ－Ｔｅｋプレートリーダーを使用して測定した。α－Ｌ－イズロニダーゼ酵素活性を、Ｐｉｅｒｃｅタンパク質アッセイキット（Ｆｉｓｈｅｒ）を用いて決定した場合のタンパク質１ｍｇ当たりの単位（ｎｍｏｌ、１時間当たりの生成物に変換）で表した。全ての反応を３連で行った。
データから、ＡＡＶ－ＺＦＮ発現構築物の最適化は、単一遺伝子疾患の修正のためのｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏのゲノム編集構築物の両方におけるゲノム編集において、驚くべき、かつ予想外の利点をもたらす（切断における最大７倍の増加、および導入遺伝子発現における最大１８倍の増加を含む）ことが実証される。したがって、ＺＦＮ発現ベクターを構成するエレメントを最適化することによって、全体的なＺＦＮ活性および／または特異性における強化がｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏで実現される。これらの方法は、アルブミン遺伝子座への挿入のための任意の導入遺伝子ドナー（例えば、ＩＤＳ、ＩＤＵＡおよびＦ．ＩＸ）と共に使用することができる。導入遺伝子によってコードされたタンパク質の発現および分泌は、それを必要とする対象にとってｉｎ ｖｉｖｏでの産生を可能にする。
本明細書で述べられた全ての特許、特許出願および刊行物は、これにより参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
理解を明確にする目的のために図解と実施例によってある程度詳細に開示を提供したが、本開示の趣旨または範囲から逸脱することなく様々な変更や改変を実施することができることが当業者には明らかである。したがって、前述の記載および実施例は、限定として解釈されるべきではない。
特定の実施形態では、例えば以下の項目が提供される。
（項目１）
第１および第２のＺＦＮを含むジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）であって、前記第１のＺＦＮが、７１５５７と名付けられたＺＦＮを含み、前記第２のＺＦＮが、７１７２８と名付けられたＺＦＮを含む、ＺＦＮ。
（項目２）
必要に応じてＡＡＶベクターに担持される、項目１に記載の第１および第２のＺＦＮをコードする１つまたは複数のポリヌクレオチド。
（項目３）
前記第１のＺＦＮをコードする第１のポリヌクレオチドが、表４に示される配列を含むＡＡＶベクターを含み、前記第２のＺＦＮをコードする第２のポリヌクレオチドが、表５に示される配列を含むＡＡＶベクターを含む、項目２に記載の１つまたは複数のポリヌクレオチド。
（項目４）
前記第１のＺＦＮをコードする前記ＡＡＶベクターが、配列番号４３に示される配列を含む、項目２または３に記載のＡＡＶベクター。
（項目５）
前記第２のＺＦＮをコードする前記ＡＡＶベクターが、配列番号５６に示される配列を含む、項目２または３に記載のＡＡＶベクター。
（項目６）
必要に応じて幹細胞もしくは前駆細胞である、項目１に記載の１つもしくは複数のＺＦＮ、項目２から３のいずれかに記載の１つもしくは複数のポリヌクレオチド、ならびに／または項目４および５に記載の１つもしくは複数のＡＡＶベクターを含む細胞。
（項目７）
項目１に記載の１つもしくは複数のＺＦＮ、項目２から３のいずれかに記載の１つもしくは複数のポリヌクレオチド、項目４および５に記載の１つもしくは複数のＡＡＶベクター、ならびに／または項目６に記載の１つもしくは複数の細胞を含む医薬組成物。
（項目８）
対象において内因性アルブミン遺伝子を切断するための、前記項目のいずれかに記載の、１つもしくは複数のＺＦＮ、１つもしくは複数のポリヌクレオチド、１つもしくは複数のＡＡＶベクター、１つもしくは複数の細胞および／または１つもしくは複数の医薬組成物の使用。
（項目９）
前記対象に、必要に応じてＡＡＶベクターに担持されるドナーを投与することをさらに含み、それにより前記ドナーが、前記対象において切断された前記アルブミン遺伝子に組み込まれる、項目８に記載の使用。
（項目１０）
対象の細胞において内因性アルブミン遺伝子を切断する方法であって、前記対象に、項目１に記載の１つもしくは複数のＺＦＮ、項目２から３のいずれかに記載の１つもしくは複数のポリヌクレオチド、項目４および５に記載の１つもしくは複数のＡＡＶベクター、項目６に記載の１つもしくは複数の細胞ならびに／または項目７に記載の１つもしくは複数の医薬組成物を投与するステップを含む方法。
（項目１１）
項目１に記載の１つもしくは複数のＺＦＮ、項目２から３のいずれかに記載の１つもしくは複数のポリヌクレオチド、項目４および５に記載の１つもしくは複数のＡＡＶベクター、項目６に記載の１つもしくは複数の細胞ならびに／または項目７に記載の１つもしくは複数の医薬組成物を含むキット。
（項目１２）
（ａ）７１５５７と名付けられた第１のＺＦＮをコードする第１のポリヌクレオチドであって、必要に応じて、表４または配列番号４３に示される配列を含むＡＡＶベクターを含む、第１のポリヌクレオチド；
（ｂ）７１７２８と名付けられた第２のＺＦＮをコードする第２のポリヌクレオチドであって、必要に応じて、表５または配列番号５６に示される配列を含むＡＡＶベクターを含む、第２のポリヌクレオチド；および
（ｃ）第ＩＸ因子（ＦＩＸ）配列をコードする配列を含むドナーポリヌクレオチド
を含む組成物。
（項目１３）
前記ドナーポリヌクレオチドが、表６に示される配列、必要に応じて配列番号５９に示される配列を含むＡＡＶベクターである、項目１２に記載の組成物。
（項目１４）
前記第１の、第２の、およびドナーポリヌクレオチドが、別々のＡＡＶベクターに担持される、項目１２または１３に記載の組成物。
（項目１５）
それを必要とする対象においてＦＩＸ導入遺伝子を発現させるための項目１２から１４のいずれかに記載の組成物の使用であって、前記ＺＦＮが前記対象において内因性アルブミン遺伝子を切断し、前記ＦＩＸの配列が切断された前記アルブミン遺伝子に組み込まれ、ＦＩＸタンパク質が前記対象において発現されるように、前記組成物が前記対象に投与される、使用。
（項目１６）
前記ＦＩＸタンパク質の発現の後、前記対象において血友病が処置される、項目１５に記載の使用。
（項目１７）
それを必要とする対象においてＦＩＸタンパク質を発現させる方法であって、前記ＦＩＸタンパク質が細胞中で発現されるように、前記対象に、項目１２から１４のいずれかに記載の１つまたは複数の組成物を投与するステップを含む方法。
（項目１８）
前記対象が、血友病を有し、前記ＦＩＸタンパク質の発現が、前記疾患を処置および／または防止する、項目１７に記載の方法。
（項目１９）
項目１２から１４のいずれかに記載の１つまたは複数の組成物を含むキット。
（項目２０）
（ａ）７１５５７と名付けられた第１のＺＦＮをコードする第１のポリヌクレオチドであって、必要に応じて、表４または配列番号４３に示される配列を含むＡＡＶベクターを含む、第１のポリヌクレオチド；
（ｂ）７１７２８と名付けられた第２のＺＦＮをコードする第２のポリヌクレオチドであって、必要に応じて、表５または配列番号５６に示される配列を含むＡＡＶベクターを含む、第２のポリヌクレオチド；および
（ｃ）イズロン酸－２－スルファターゼ（ＩＤＳ）配列をコードする配列を含むドナーポリヌクレオチド
を含む組成物。
（項目２１）
前記ドナーポリヌクレオチドが、表７に示される配列、必要に応じて配列番号６５に示される配列を含むＡＡＶベクターである、項目１９に記載の組成物。
（項目２２）
前記第１の、第２の、およびドナーポリヌクレオチドが、別々のＡＡＶベクターに担持される、項目２０または２１に記載の組成物。
（項目２３）
それを必要とする対象においてＩＤＳ導入遺伝子を発現させるための項目２０から２２のいずれかに記載の組成物の使用であって、前記ＺＦＮが前記対象において内因性アルブミン遺伝子を切断し、前記ＩＤＳ配列が切断された前記アルブミン遺伝子に組み込まれ、ＩＤＳタンパク質が前記対象において発現されるように、前記組成物が前記対象に投与される、使用。
（項目２４）
前記ＩＤＳ配列の発現の後、前記対象においてＭＰＳ ＩＩが処置される、項目２３に記載の使用。
（項目２５）
それを必要とする対象においてＩＤＳタンパク質を発現させる方法であって、前記ＩＤＳタンパク質が細胞中で発現されるように、前記対象に、項目２０から２２のいずれかに記載の１つまたは複数の組成物を投与するステップを含む方法。
（項目２６）
前記対象が、ＭＰＳ ＩＩ疾患を有し、前記ＩＤＳタンパク質の発現が、前記疾患を処置および／または防止する、項目２５に記載の方法。
（項目２７）
項目２０から２２のいずれかに記載の１つまたは複数の組成物を含むキット。
（項目２８）
（ａ）７１５５７と名付けられた第１のＺＦＮをコードする第１のポリヌクレオチドであって、必要に応じて、表４または配列番号４３に示される配列を含むＡＡＶベクターを含む、第１のポリヌクレオチド；
（ｂ）７１７２８と名付けられた第２のＺＦＮをコードする第２のポリヌクレオチドであって、必要に応じて、表５または配列番号５６に示される配列を含むＡＡＶベクターを含む、第２のポリヌクレオチド；および
（ｃ）アルファ－Ｌイズロニダーゼ（ＩＤＵＡ）配列をコードする配列を含むドナーポリヌクレオチド
を含む組成物。
（項目２９）
前記ドナーが、表８に示される配列、必要に応じて配列番号７２に示される配列を含む、項目２８に記載の組成物。
（項目３０）
前記第１の、第２の、およびドナーポリヌクレオチドが、別々のＡＡＶベクターに担持される、項目２８または項目２９に記載の組成物。
（項目３１）
それを必要とする対象においてＩＤＵＡ導入遺伝子を発現させるための項目２８から３０のいずれかに記載の組成物の使用であって、前記ＺＦＮが前記対象において内因性アルブミン遺伝子を切断し、前記ＩＤＵＡ配列が切断された前記アルブミン遺伝子に組み込まれ、ＩＤＵＡタンパク質が前記対象において発現されるように、前記組成物が前記対象に投与される、使用。
（項目３２）
前記ＩＤＵＡ配列の発現の後、前記対象においてＭＰＳ Ｉが処置される、項目３１に記載の使用。
（項目３３）
それを必要とする対象においてＩＤＵＡタンパク質を発現させる方法であって、前記ＩＤＵＡタンパク質が細胞中で発現されるように、前記対象に、項目２８から３０のいずれかに記載の１つまたは複数の組成物を投与するステップを含む方法。
（項目３４）
前記対象が、ＭＰＳ Ｉ疾患を有し、前記ＩＤＵＡタンパク質の発現が、前記疾患を処置および／または防止する、項目３３に記載の方法。
（項目３５）
項目２８から３０のいずれかに記載の１つまたは複数の組成物を含むキット。

Claims (35)

  1. 第１ＺＦＮおよび第２のＺＦＮのヘテロ二量体を含むジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）であって、ここで：
    （ａ）前記第１のＺＦＮが：
    （ｉ）Ｆ１からＦ５の順の５つのジンクフィンガードメインであって、ここで、Ｆ１がＱＳＧＮＬＡＲ（配列番号１９）であり、Ｆ２がＬＫＱＮＬＣＭ（配列番号１５）であり、Ｆ３がＷＱＳＮＬＱＮ（配列番号２０）であり、Ｆ４がＴＳＧＮＬＴＲ（配列番号１７）であり、そして、Ｆ５がＲＲＳＨＬＴＳ（配列番号２１）である、Ｆ１からＦ５の順の５つのジンクフィンガードメイン、および、
    （ｉｉ）第１の操作されたＦｏｋＩ切断ドメイン
    を含み、そして、
    （ｂ）前記第２のＺＦＮが：
    （ｉ）Ｆ１からＦ６の順の６つのジンクフィンガードメインであって、ここで、Ｆ１がＱＳＳＤＬＳＲ（配列番号３０）であり、Ｆ２がＬＫＨＮＬＬＴ（配列番号２５）であり、Ｆ３がＤＱＳＮＬＲＡ（配列番号３１）であり、Ｆ４がＲＮＦＳＬＴＭ（配列番号２７）であり、Ｆ５がＬＲＨＤＬＥＲ（配列番号３２）であり、Ｆ６がＨＲＳＮＬＮＫ（配列番号２９）である、Ｆ１からＦ６の順の６つのジンクフィンガードメイン、および、
    （ｉｉ）第２の操作されたＦｏｋＩ切断ドメイン
    を含む、ＺＦＮ。
  2. 必要に応じてＡＡＶベクターに担持される、請求項１に記載の第１および第２のＺＦＮをコードする１つまたは複数のポリヌクレオチド。
  3. 前記第１のＺＦＮをコードする第１のポリヌクレオチドが、表４に示される配列を含むＡＡＶベクターを含み、前記第２のＺＦＮをコードする第２のポリヌクレオチドが、表５に示される配列を含むＡＡＶベクターを含む、請求項２に記載の１つまたは複数のポリヌクレオチド。
  4. 前記第１のＺＦＮをコードする前記ＡＡＶベクターが、配列番号４３に示される配列を含む、請求項２または３に記載のＡＡＶベクター。
  5. 前記第２のＺＦＮをコードする前記ＡＡＶベクターが、配列番号５６に示される配列を含む、請求項２または３に記載のＡＡＶベクター。
  6. 必要に応じて幹細胞もしくは前駆細胞である、請求項１に記載の１つもしくは複数のＺＦＮ、請求項２から３のいずれかに記載の１つもしくは複数のポリヌクレオチド、ならびに／または請求項４および５に記載の１つもしくは複数のＡＡＶベクターを含む細胞。
  7. 請求項１に記載の１つもしくは複数のＺＦＮ、請求項２から３のいずれかに記載の１つもしくは複数のポリヌクレオチド、請求項４および５に記載の１つもしくは複数のＡＡＶベクター、ならびに／または請求項６に記載の１つもしくは複数の細胞を含む医薬組成物。
  8. 対象において内因性アルブミン遺伝子を切断するための、請求項１に記載の１つもしくは複数のＺＦＮ、請求項２または３に記載の１つもしくは複数のポリヌクレオチド、請求項４または５に記載の１つもしくは複数のＡＡＶベクター、請求項６に記載の１つもしくは複数の細胞を含む組成物、ならびに／または請求項７に記載の１つもしくは複数の医薬組成物。
  9. 前記対象に、必要に応じてＡＡＶベクターに担持されるドナーと組み合わせて投与されることを特徴とし、それにより前記ドナーが、前記対象において切断された前記アルブミン遺伝子に組み込まれる、請求項８に記載の組成物または医薬組成物。
  10. 対象の細胞において内因性アルブミン遺伝子を切断するための、請求項１に記載の１つもしくは複数のＺＦＮ、請求項２または３に記載の１つもしくは複数のポリヌクレオチド、請求項４または５に記載の１つもしくは複数のＡＡＶベクター、請求項６に記載の１つもしくは複数の細胞を含む組成物、ならびに／または請求項７に記載の１つもしくは複数の医薬組成物。
  11. 請求項１に記載の１つもしくは複数のＺＦＮ、請求項２から３のいずれかに記載の１つもしくは複数のポリヌクレオチド、請求項４および５に記載の１つもしくは複数のＡＡＶベクター、請求項６に記載の１つもしくは複数の細胞ならびに／または請求項７に記載の１つもしくは複数の医薬組成物を含むキット。
  12. 組成物であって、以下：
    （ａ）第１のジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）をコードする第１のポリヌクレオチドであって、前記第１のＺＦＮが：
    （ｉ）Ｆ１からＦ５の順の５つのジンクフィンガードメインであって、ここで、Ｆ１がＱＳＧＮＬＡＲ（配列番号１９）であり、Ｆ２がＬＫＱＮＬＣＭ（配列番号１５）であり、Ｆ３がＷＱＳＮＬＱＮ（配列番号２０）であり、Ｆ４がＴＳＧＮＬＴＲ（配列番号１７）であり、そして、Ｆ５がＲＲＳＨＬＴＳ（配列番号２１）である、Ｆ１からＦ５の順の５つのジンクフィンガードメイン、および、
    （ｉｉ）第１の操作されたＦｏｋＩ切断ドメイン
    を含み、そして、必要に応じて、前記第１のポリヌクレオチドが、表４または配列番号４３に示される配列を含むＡＡＶベクターを含む、第１のポリヌクレオチド；
    （ｂ）第２のＺＦＮをコードする第２のポリヌクレオチドであって、前記第２のＺＦＮが：
    （ｉ）Ｆ１からＦ６の順の６つのジンクフィンガードメインであって、ここで、Ｆ１がＱＳＳＤＬＳＲ（配列番号３０）であり、Ｆ２がＬＫＨＮＬＬＴ（配列番号２５）であり、Ｆ３がＤＱＳＮＬＲＡ（配列番号３１）であり、Ｆ４がＲＮＦＳＬＴＭ（配列番号２７）であり、Ｆ５がＬＲＨＤＬＥＲ（配列番号３２）であり、Ｆ６がＨＲＳＮＬＮＫ（配列番号２９）である、Ｆ１からＦ６の順の６つのジンクフィンガードメイン、および、
    （ｉｉ）第２の操作されたＦｏｋＩ切断ドメイン
    を含み、そして、必要に応じて、前記第２のポリヌクレオチドが、表５または配列番号５６に示される配列を含むＡＡＶベクターを含む、第２のポリヌクレオチド；ならびに、
    （ｃ）第ＩＸ因子（ＦＩＸ）配列をコードする配列を含むドナーポリヌクレオチド
    を含む組成物。
  13. 前記ドナーポリヌクレオチドが、表６に示される配列、必要に応じて配列番号５９に示される配列を含むＡＡＶベクターである、請求項１２に記載の組成物。
  14. 前記第１の、第２の、およびドナーポリヌクレオチドが、別々のＡＡＶベクターに担持される、請求項１２または１３に記載の組成物。
  15. それを必要とする対象においてＦＩＸ導入遺伝子を発現させるための請求項１２から１４のいずれかに記載の組成物であって、前記ＺＦＮが前記対象において内因性アルブミン遺伝子を切断し、前記ＦＩＸの配列が切断された前記アルブミン遺伝子に組み込まれ、ＦＩＸタンパク質が前記対象において発現されるように、前記組成物が前記対象に投与されるものである、組成物。
  16. 前記ＦＩＸタンパク質の発現の後、前記対象において血友病が処置される、請求項１５に記載の組成物。
  17. それを必要とする対象においてＦＩＸタンパク質を発現させるための、請求項１２から１４のいずれかに記載の１つまたは複数の組成物。
  18. 前記対象が、血友病を有し、前記ＦＩＸタンパク質の発現が、前記疾患を処置および／または防止する、請求項１７に記載の組成物。
  19. 請求項１２から１４のいずれかに記載の１つまたは複数の組成物を含むキット。
  20. 組成物であって、以下：
    （ａ）第１のジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）をコードする第１のポリヌクレオチドであって、前記第１のＺＦＮが：
    （ｉ）Ｆ１からＦ５の順の５つのジンクフィンガードメインであって、ここで、Ｆ１がＱＳＧＮＬＡＲ（配列番号１９）であり、Ｆ２がＬＫＱＮＬＣＭ（配列番号１５）であり、Ｆ３がＷＱＳＮＬＱＮ（配列番号２０）であり、Ｆ４がＴＳＧＮＬＴＲ（配列番号１７）であり、そして、Ｆ５がＲＲＳＨＬＴＳ（配列番号２１）である、Ｆ１からＦ５の順の５つのジンクフィンガードメイン、および、
    （ｉｉ）第１の操作されたＦｏｋＩ切断ドメイン
    を含み、そして、必要に応じて、前記第１のポリヌクレオチドが、表４または配列番号４３に示される配列を含むＡＡＶベクターを含む、第１のポリヌクレオチド；
    （ｂ）第２のＺＦＮをコードする第２のポリヌクレオチドであって、前記第２のＺＦＮが：
    （ｉ）Ｆ１からＦ６の順の６つのジンクフィンガードメインであって、ここで、Ｆ１がＱＳＳＤＬＳＲ（配列番号３０）であり、Ｆ２がＬＫＨＮＬＬＴ（配列番号２５）であり、Ｆ３がＤＱＳＮＬＲＡ（配列番号３１）であり、Ｆ４がＲＮＦＳＬＴＭ（配列番号２７）であり、Ｆ５がＬＲＨＤＬＥＲ（配列番号３２）であり、Ｆ６がＨＲＳＮＬＮＫ（配列番号２９）である、Ｆ１からＦ６の順の６つのジンクフィンガードメイン、および、
    （ｉｉ）第２の操作されたＦｏｋＩ切断ドメイン
    を含み、そして、必要に応じて、前記第２のポリヌクレオチドが、表５または配列番号５６に示される配列を含むＡＡＶベクターを含む、第２のポリヌクレオチド；ならびに、
    （ｃ）イズロン酸－２－スルファターゼ（ＩＤＳ）配列をコードする配列を含むドナーポリヌクレオチド
    を含む組成物。
  21. 前記ドナーポリヌクレオチドが、表７に示される配列、必要に応じて配列番号６５に示される配列を含むＡＡＶベクターである、請求項１９に記載の組成物。
  22. 前記第１の、第２の、およびドナーポリヌクレオチドが、別々のＡＡＶベクターに担持される、請求項２０または２１に記載の組成物。
  23. それを必要とする対象においてＩＤＳ導入遺伝子を発現させるための請求項２０から２２のいずれかに記載の組成物であって、前記ＺＦＮが前記対象において内因性アルブミン遺伝子を切断し、前記ＩＤＳ配列が切断された前記アルブミン遺伝子に組み込まれ、ＩＤＳタンパク質が前記対象において発現されるように、前記組成物が前記対象に投与されるものである、組成物。
  24. 前記ＩＤＳ配列の発現の後、前記対象においてＭＰＳ ＩＩが処置される、請求項２３に記載の組成物。
  25. それを必要とする対象においてＩＤＳタンパク質を発現させるための、請求項２０から２２のいずれかに記載の１つまたは複数の組成物。
  26. 前記対象が、ＭＰＳ ＩＩ疾患を有し、前記ＩＤＳタンパク質の発現が、前記疾患を処置および／または防止する、請求項２５に記載の組成物。
  27. 請求項２０から２２のいずれかに記載の１つまたは複数の組成物を含むキット。
  28. 組成物であって、以下：
    （ａ）第１のジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）をコードする第１のポリヌクレオチドであって、前記第１のＺＦＮが：
    （ｉ）Ｆ１からＦ５の順の５つのジンクフィンガードメインであって、ここで、Ｆ１がＱＳＧＮＬＡＲ（配列番号１９）であり、Ｆ２がＬＫＱＮＬＣＭ（配列番号１５）であり、Ｆ３がＷＱＳＮＬＱＮ（配列番号２０）であり、Ｆ４がＴＳＧＮＬＴＲ（配列番号１７）であり、そして、Ｆ５がＲＲＳＨＬＴＳ（配列番号２１）である、Ｆ１からＦ５の順の５つのジンクフィンガードメイン、および、
    （ｉｉ）第１の操作されたＦｏｋＩ切断ドメイン
    を含み、そして、必要に応じて、前記第１のポリヌクレオチドが、表４または配列番号４３に示される配列を含むＡＡＶベクターを含む、第１のポリヌクレオチド；
    （ｂ）第２のＺＦＮをコードする第２のポリヌクレオチドであって、前記第２のＺＦＮが：
    （ｉ）Ｆ１からＦ６の順の６つのジンクフィンガードメインであって、ここで、Ｆ１がＱＳＳＤＬＳＲ（配列番号３０）であり、Ｆ２がＬＫＨＮＬＬＴ（配列番号２５）であり、Ｆ３がＤＱＳＮＬＲＡ（配列番号３１）であり、Ｆ４がＲＮＦＳＬＴＭ（配列番号２７）であり、Ｆ５がＬＲＨＤＬＥＲ（配列番号３２）であり、Ｆ６がＨＲＳＮＬＮＫ（配列番号２９）である、Ｆ１からＦ６の順の６つのジンクフィンガードメイン、および、
    （ｉｉ）第２の操作されたＦｏｋＩ切断ドメイン
    を含み、そして、必要に応じて、前記第２のポリヌクレオチドが、表５または配列番号５６に示される配列を含むＡＡＶベクターを含む、第２のポリヌクレオチド；ならびに、
    （ｃ）アルファ－Ｌイズロニダーゼ（ＩＤＵＡ）配列をコードする配列を含むドナーポリヌクレオチド
    を含む組成物。
  29. 前記ドナーが、表８に示される配列、必要に応じて配列番号７２に示される配列を含む、請求項２８に記載の組成物。
  30. 前記第１の、第２の、およびドナーポリヌクレオチドが、別々のＡＡＶベクターに担持される、請求項２８または請求項２９に記載の組成物。
  31. それを必要とする対象においてＩＤＵＡ導入遺伝子を発現させるための請求項２８から３０のいずれかに記載の組成物であって、前記ＺＦＮが前記対象において内因性アルブミン遺伝子を切断し、前記ＩＤＵＡ配列が切断された前記アルブミン遺伝子に組み込まれ、ＩＤＵＡタンパク質が前記対象において発現されるように、前記組成物が前記対象に投与されるものである、組成物。
  32. 前記ＩＤＵＡ配列の発現の後、前記対象においてＭＰＳ Ｉが処置される、請求項３１に記載の組成物。
  33. それを必要とする対象においてＩＤＵＡタンパク質を発現させるための、請求項２８から３０のいずれかに記載の１つまたは複数の組成物。
  34. 前記対象が、ＭＰＳ Ｉ疾患を有し、前記ＩＤＵＡタンパク質の発現が、前記疾患を処置および／または防止する、請求項３３に記載の組成物。
  35. 請求項２８から３０のいずれかに記載の１つまたは複数の組成物を含むキット。
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