JP7275152B2 - 操作された標的特異的なヌクレアーゼ - Google Patents
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Description
本出願は、2018年2月8日付けで出願された米国仮出願第62/628,016号;2018年9月7日付けで出願された米国仮出願第62/728,226号;2018年11月12日付けで出願された米国仮出願第62/758,786号;2019年1月23日付けで出願された米国仮出願第62/795,937号;および2019年2月6日付けで出願された米国仮出願第62/802,092号の利益を主張し、これらの開示は、これにより参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。
該当なし。
本出願は、ASCIIフォーマットで電子的に提出され、これにより参照によりその全体が本明細書に組み込まれる配列表を含有する。前記ASCIIコピーは、2019年2月8日に作成され、8325016940SL.txtと名付けられ、54,302バイトのサイズである。
本開示は、ポリペプチドおよびゲノム工学および相同組換えの分野にある。
最も効率的な人工ヌクレアーゼを産生するために調査され得る別のエリアは、人工ヌクレアーゼをコードする遺伝子に含まれ得る非コード配列中にある。例えば、mRNA分子中の3’非翻訳領域(「UTR」)は、転写後レベルで遺伝子発現の調節において重要な役割を果たし得る。3’UTRは、mRNAの構造的成分と、特異的なトランス作用性RNA結合タンパク質および非コードRNAとの間の組織化された相互作用によって、mRNAの発現を制御し(Vislovukh et al (2014) World J Biol Chem 5(1):40-57)、ポリアデニル化配列も含む。一般的に使用される3’UTRの例は、SV40ウイルスポリA断片、ウシ成長ホルモン(BGH)遺伝子由来のポリA領域、およびウサギベータ-グロビンUTRである(Ludwig, Dale (2006) BioProcess International supplement)。5’UTRは、高等真核生物において100~200bpの長さであり、高いGC含量(しばしば>60%)を含み得る。これらの配列は、リボソーム結合のためのコザックコンセンサス配列、およびキャップ結合のための配列などのエレメントを含んでいてもよい。高いGC含量は、翻訳効率に影響を与えることができ、内部リボソーム進入部位(IRES)として公知の複雑なヘアピン構造(シス作用性調節配列として公知)をもたらすことができる。5’UTRは、発現を調節するための遺伝子特異的な調節タンパク質(例えば鉄調節タンパク質)に結合するための配列を有することもでき、翻訳機構との相互作用を提供することなどの他の機能において役割を果たすこともできる(Araujo et al (2012) Comp and Funct Genom (2012) doi:10.1155/2012/475731)。一般的に使用される5’UTR配列の例は、ベータ-グロビン5’UTRである。UTRは、しばしば3’UTRにおけるシス作用性エレメントによって媒介される転写後レベルでの遺伝子調節の空間的な制御において役割を有することもできる(Mignone et al (2002) Genome Biol 3(3):PMCID:PMC139023)。
しかしながら、強化された転写/翻訳効率を提供するため、ならびにヌクレアーゼの活性および/または特異性を増加させるための、操作されたヌクレアーゼ切断システムへの追加の方法および組成物の必要が依然としてある。
総論
用語「核酸」、「ポリヌクレオチド」、および「オリゴヌクレオチド」は、同義的に使用され、直鎖状または環状のコンフォメーションの、一本鎖または二本鎖形態のいずれかの、デオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドポリマーを指す。本開示の目的のために、これらの用語は、ポリマーの長さに関する限定と解釈されないものとする。用語は、天然ヌクレオチドの公知のアナログ、ならびに塩基、糖および/またはリン酸部分において改変されたヌクレオチド(例えば、ホスホロチオエート主鎖)を包含し得る。一般的に、特定のヌクレオチドのアナログは、同じ塩基対形成の特異性を有し、すなわち、Aのアナログは、Tと塩基対を形成する。
目的の任意の遺伝子または遺伝子座における標的部位に特異的に結合するDNA結合分子/ドメインを含む組成物が本明細書に記載される。任意のDNA結合分子/ドメインを本明細書で開示される組成物および方法において使用することができ、これらに限定されないが、ジンクフィンガーDNA結合ドメイン、TALE DNA結合ドメイン、CRISPR/CasヌクレアーゼのDNA結合部分(ガイドまたはsgRNA)、またはメガヌクレアーゼ由来のDNA結合ドメインが挙げられる。
本明細書に記載されるDNA結合ドメイン(例えば、ZFPまたはTALE、CRISPR/Casの成分、例えば単一ガイドRNA)および異種調節(機能性)ドメイン(またはその機能的な断片)を含む融合分子も提供される。共通のドメインとしては、例えば、転写因子ドメイン(活性化因子、リプレッサー、コアクチベーター、コリプレッサー)、サイレンサー、発癌遺伝子(例えば、myc、jun、fos、myb、max、mad、rel、ets、bcl、myb、mosファミリーメンバーなど);DNA修復酵素ならびにその関連因子および調節因子;DNA再構成酵素ならびにその関連因子および調節因子;クロマチン関連タンパク質およびその調節因子(例えばキナーゼ、アセチラーゼおよびデアセチラーゼ);ならびにDNAを改変する酵素(例えば、メチルトランスフェラーゼ、トポイソメラーゼ、ヘリカーゼ、リガーゼ、キナーゼ、ホスファターゼ、ポリメラーゼ、エンドヌクレアーゼ)ならびにその関連因子および調節因子が挙げられる。参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれるDNA結合ドメインおよびヌクレアーゼ切断ドメインの融合に関する詳細についての、米国特許公報第20050064474号;同第20060188987号および同第2007/0218528号。
ある特定の実施形態では、融合分子は、人工ヌクレアーゼを形成するためのDNA結合ドメインおよび切断(ヌクレアーゼ)ドメインを含む。そのようなものとして、遺伝子改変は、ヌクレアーゼ、例えば操作されたヌクレアーゼを使用して達成することができる。操作されたヌクレアーゼ技術は、天然に存在するDNA結合タンパク質の操作に基づく。例えば、目的に合わせたDNA結合特異性を有するホーミングエンドヌクレアーゼの操作が記載されている。Chames et al. (2005) Nucleic Acids Res 33(20):e178;Arnould et al. (2006) J. Mol. Biol. 355:443-458。加えて、ZFPの操作も記載されている。例えば、米国特許第6,534,261号;同第6,607,882号;同第6,824,978号;同第6,979,539号;同第6,933,113号;同第7,163,824号;および同第7,013,219号を参照されたい。
本明細書に記載されるタンパク質(例えば、ヌクレアーゼ)、ポリヌクレオチドならびに/またはタンパク質および/もしくはポリヌクレオチドを含む組成物は、任意の好適な手段によって、例えばタンパク質および/またはmRNA成分の注射などによって、標的細胞に送達することができる。
疾患の処置および防止における操作されたヌクレアーゼの使用は、今後数年間の最も重要な薬の開発の1つである。本明細書に記載される方法および組成物は、所望の標的部位が確実に主要な切断場所になるように、これらの新規のツールの特異性を増加させるのに役立つ。オフターゲット切断を最小化または消去することが、in vitro、in vivoおよびex vivoでの適用のためにこの技術の潜在性を十分に実現するのに必要と予想される。
ZFNの調製
本質的にUrnov et al. (2005) Nature 435(7042):646-651;Perez et al (2008) Nature Biotechnology 26(7):808-816、および米国特許第9,394,545号に記載された通りに、ヒトアルブミン遺伝子に標的化されたZFNを設計し、プラスミドベクターに取り込んだ。
アルブミン特異的なZFNの最適化
左側のZFNパートナーの結合部位(SBS47171-FLAG、表1を参照)は、ヒトの20%においてSNPを含む(図1を参照)。野生型配列において、配列は、AT塩基対(卵形により示される)を含むが、SNPを含む配列において、この位置にはGC塩基対が存在する(配列の上の長方形で示される)。野生型およびSNPアルブミン配列についてヘテロ接合型であるヒト肝細胞において、47171-FLAG/47898-FLAG対は、野生型配列に3~4倍の優先性を有する(図2を参照)。野生型アルブミン配列およびSNP含有配列を等しい活性で切断することが見出された第2の左側のパートナーが同定されたが(42875)、42875/47898対もSMCHD1オフターゲット部位においてある程度の切断活性を示した。
ポリカチオン性ペプチドタグの使用はZFN活性を増加させる
ポリカチオン性ペプチドタグを含むZFNを、切断活性について検査した。使用されたペプチドは、アミノ酸配列N末端-DYKDHDG-DYKDHDI-DYKDDDDK(配列番号71)を含む3×Flagタグ(PCT公報WO2001027293号を参照)であった。3×Flagタグをコードする配列は、ZFN融合タンパク質に、タンパク質のN末端で融合されている(表1を参照)。
WPRE調節エレメントの付加
WPREは、LNP(図5B、米国特許公開US-2018-0185516-A1号を参照)によるまたはAAV(図5C、米国特許公報第2016-0326548号を参照)による送達の後に、in vitro(図5A、米国特許公報第2016-0326548号を参照)およびin vivoの両方でZFNの活性を増加させることが見出されている。
J02442 WPREmut6:
5’UTRの付加
1994年に、KriegおよびMelton(Nucl. Acid. Res 12(18):7057)は、Xenopusのベータ-グロビン遺伝子の5’非翻訳領域を記載しており、mRNAを安定化する配列としてのその潜在性を認めた。したがって、ヌクレアーゼをコードする発現カセットの5’非翻訳領域におけるこのエレメントの配列([TG]CTTGTTCTTTTTGCAGAAGCTCAGAATAAACGCTCAACTTTGGCAGAT(配列番号1)、TGは、オプションの略記されたβglbである)を試験した。構築物を、細胞をトランスフェクションの24時間後にアッセイしたことを除き上述した通りにK562細胞で試験した。
強化の組合せ
iPSC由来ヒト肝細胞において、3×Flagタグ(「3×Flag」)、Xenopusのβ-glb(「XBG」)および/またはWPREエレメントを含むZFNを様々な組合せで試した。使用されたZFNは42877/47931であり、それをAAV6を介して送達した。形質導入の6日後に細胞を回収し、アルブミン標的に対する活性を測定した。
in vivoでの切断および標的化組込み
本明細書に記載される構築物をin vivoでも試験した。
少なくとも6~8週齢の42匹の雄野生型C57BL/6マウスを、Charles River Laboratories,Inc.、Wilmington、MAから購入した。マウスの取り扱い、注射および試料収集は、家畜学に関する標準的なプロトコールに従ってExperimur(Chicago IL)により行った。マウスを処置開始前の少なくとも1週間Experimurに隔離して保持した。
FokIドメイン1における絶対ヘテロ二量体ELD/KKR変異を含有するマウスアルブミン遺伝子座のイントロン1を標的化するヘテロ二量体ZFN。マウスのin vivoの研究のために、標準ZFN(48641および31523)または改善されたZFN(5’UTR、N末端3×FLAGおよび3’WPREmut6を有する48641および31523)を使用した。ヒトのin vitroの研究のために、標準ZFN(47171および47898)またはZFN2.0(5’UTR、N末端3×FLAGおよび3’WPREmut6を有する71557および71728)を使用した。hIDSドナー構築物は以前に記載されている(Sharma et al (2015) Blood 126, 1777-1784)。hIDSドナー構築物は、内因性IDSシグナルペプチドを欠くhIDS cDNA、hF9スプライスアクセプター配列、および合計で長さがおよそ600bpのマウスまたはヒトアルブミン標的部位への相同性を有するアームを含有する。組換えAAV2/6ベクター(AAV2 ITRおよびAAV6キャプシドで構成される)を、10チャンバーのCELLSTACK培養チャンバー(Corning)での293細胞の三つ組のトランスフェクションによって産生し、塩化セシウム密度勾配遠心分離とそれに続く透析によって精製し、以前に記載されたようにして力価測定した(Sharma、同上)。
56日目に、2L/分の流速で3分のCO2ヒュームチャンバー中でマウスを安楽死させた。肝臓試料を収集し、3つの部分に切り分け、1つの部分を10%中性緩衝ホルマリン中での組織病理学的分析用にし、残りの部分を急速冷凍し、IDS酵素活性の査定、RNA抽出、ウェスタンブロッティングおよび遺伝子改変のための処理まで-70℃で貯蔵した。
AllPrep DNA/RNA/タンパク質ミニキット(Qiagen)を製造元のプロトコールに従って使用して、マウス肝臓試料からのゲノムDNAを抽出した。QIAamp DNAマイクロキット(Qiagen)を製造元のプロトコールに従って使用して、iPS由来肝細胞のgDNAを抽出した。表10に記載されるプライマーを使用したPCRによって、ZFN標的部位を増幅した。MiSeq(Illumina)を使用してPCR産物をシーケンシングし、以前に記載されたようにして分析した(Laoharawee, K. et al. (2018) Mol. Ther. 26, 1127-1136)。
AllPrep DNA/RNA/タンパク質ミニキット(Qiagen)を製造元のプロトコールに従って使用して、肝臓試料からの全RNAを抽出した。SuperScript(商標)III First-Strand Synthesis SuperMix(Thermo Fisher Scientific)を製造元のプロトコールに従って使用して、cDNAを生成した。TaqManユニバーサルPCRマスターミックス(Thermo Fisher Scientific)を利用して、qPCRを実行した。プライマーおよびプローブ配列について、表11を参照されたい。データをアクチンに対して正規化した。
総タンパク質抽出物を、以前に記載されたようにして、肝臓試料から調製した3。ウェスタンブロットによるIDS検出の前に、Pierceビシンコニン酸(BCA)タンパク質アッセイキット(Thermo Fisher Scientific)を使用してタンパク質濃度を決定した。使用された抗体は、IDS(AF2449;R&D Systems)およびグリセルアルデヒド3-リン酸デヒドロゲナーゼ(GAPDH)(A00191-40、GeneScript)であった。
1ugの総肝臓タンパク質抽出物またはiPS由来肝細胞条件付き培地の1:3希釈物を、以前に記載されたようにしてアッセイに使用した(Laoharawee, K. et al.、同上)。
IDUA活性は、当業界において公知の方法に従って測定される。例えば、1つの例示的なアッセイは、以下の通りである:α-L-イズロニダーゼの活性を、確立されたアッセイ条件に従って、基質として4-メチルウンベリフェリルα-L-イズロニド(Glycosynth)を使用する蛍光定量アッセイによって決定した(Whitley 1987、同上(Whitley 1986、同上)。4MU-イズロニド基質を、狭い十分に確立された最適なpH範囲の、ギ酸ナトリウム緩衝液、0.4M、pH3.5(Hopwood et al (1979), Clin Chim Acta.92:257-265, Whitley 1986、同上)を用いて、選択された基質濃度に希釈した。次いで、基質の25μLのアリコートを、25μLの生物学的試料(例えば血漿、白血球、組織ホモジネート)と混合した。混合物を37℃で30分間インキュベートし、200μLのグリシン炭酸緩衝液(pH10.4)を添加して反応をクエンチした。α-L-イズロニダーゼは、非蛍光基質(4MU-イズロニド)の蛍光生成物(4-MU)への切断を触媒した。4-メチルウンベリフェロン(4-MU、Sigma)を使用して、標準曲線を作成した。得られた蛍光を、355nmでの励起および460nmでの放射でBio-Tekプレートリーダーを使用して測定した。α-L-イズロニダーゼ酵素活性を、Pierceタンパク質アッセイキット(Fisher)を用いて決定した場合のタンパク質1mg当たりの単位(nmol、1時間当たりの生成物に変換)で表した。全ての反応を3連で行った。
特定の実施形態では、例えば以下の項目が提供される。
(項目1)
第1および第2のZFNを含むジンクフィンガーヌクレアーゼ(ZFN)であって、前記第1のZFNが、71557と名付けられたZFNを含み、前記第2のZFNが、71728と名付けられたZFNを含む、ZFN。
(項目2)
必要に応じてAAVベクターに担持される、項目1に記載の第1および第2のZFNをコードする1つまたは複数のポリヌクレオチド。
(項目3)
前記第1のZFNをコードする第1のポリヌクレオチドが、表4に示される配列を含むAAVベクターを含み、前記第2のZFNをコードする第2のポリヌクレオチドが、表5に示される配列を含むAAVベクターを含む、項目2に記載の1つまたは複数のポリヌクレオチド。
(項目4)
前記第1のZFNをコードする前記AAVベクターが、配列番号43に示される配列を含む、項目2または3に記載のAAVベクター。
(項目5)
前記第2のZFNをコードする前記AAVベクターが、配列番号56に示される配列を含む、項目2または3に記載のAAVベクター。
(項目6)
必要に応じて幹細胞もしくは前駆細胞である、項目1に記載の1つもしくは複数のZFN、項目2から3のいずれかに記載の1つもしくは複数のポリヌクレオチド、ならびに/または項目4および5に記載の1つもしくは複数のAAVベクターを含む細胞。
(項目7)
項目1に記載の1つもしくは複数のZFN、項目2から3のいずれかに記載の1つもしくは複数のポリヌクレオチド、項目4および5に記載の1つもしくは複数のAAVベクター、ならびに/または項目6に記載の1つもしくは複数の細胞を含む医薬組成物。
(項目8)
対象において内因性アルブミン遺伝子を切断するための、前記項目のいずれかに記載の、1つもしくは複数のZFN、1つもしくは複数のポリヌクレオチド、1つもしくは複数のAAVベクター、1つもしくは複数の細胞および/または1つもしくは複数の医薬組成物の使用。
(項目9)
前記対象に、必要に応じてAAVベクターに担持されるドナーを投与することをさらに含み、それにより前記ドナーが、前記対象において切断された前記アルブミン遺伝子に組み込まれる、項目8に記載の使用。
(項目10)
対象の細胞において内因性アルブミン遺伝子を切断する方法であって、前記対象に、項目1に記載の1つもしくは複数のZFN、項目2から3のいずれかに記載の1つもしくは複数のポリヌクレオチド、項目4および5に記載の1つもしくは複数のAAVベクター、項目6に記載の1つもしくは複数の細胞ならびに/または項目7に記載の1つもしくは複数の医薬組成物を投与するステップを含む方法。
(項目11)
項目1に記載の1つもしくは複数のZFN、項目2から3のいずれかに記載の1つもしくは複数のポリヌクレオチド、項目4および5に記載の1つもしくは複数のAAVベクター、項目6に記載の1つもしくは複数の細胞ならびに/または項目7に記載の1つもしくは複数の医薬組成物を含むキット。
(項目12)
(a)71557と名付けられた第1のZFNをコードする第1のポリヌクレオチドであって、必要に応じて、表4または配列番号43に示される配列を含むAAVベクターを含む、第1のポリヌクレオチド;
(b)71728と名付けられた第2のZFNをコードする第2のポリヌクレオチドであって、必要に応じて、表5または配列番号56に示される配列を含むAAVベクターを含む、第2のポリヌクレオチド;および
(c)第IX因子(FIX)配列をコードする配列を含むドナーポリヌクレオチド
を含む組成物。
(項目13)
前記ドナーポリヌクレオチドが、表6に示される配列、必要に応じて配列番号59に示される配列を含むAAVベクターである、項目12に記載の組成物。
(項目14)
前記第1の、第2の、およびドナーポリヌクレオチドが、別々のAAVベクターに担持される、項目12または13に記載の組成物。
(項目15)
それを必要とする対象においてFIX導入遺伝子を発現させるための項目12から14のいずれかに記載の組成物の使用であって、前記ZFNが前記対象において内因性アルブミン遺伝子を切断し、前記FIXの配列が切断された前記アルブミン遺伝子に組み込まれ、FIXタンパク質が前記対象において発現されるように、前記組成物が前記対象に投与される、使用。
(項目16)
前記FIXタンパク質の発現の後、前記対象において血友病が処置される、項目15に記載の使用。
(項目17)
それを必要とする対象においてFIXタンパク質を発現させる方法であって、前記FIXタンパク質が細胞中で発現されるように、前記対象に、項目12から14のいずれかに記載の1つまたは複数の組成物を投与するステップを含む方法。
(項目18)
前記対象が、血友病を有し、前記FIXタンパク質の発現が、前記疾患を処置および/または防止する、項目17に記載の方法。
(項目19)
項目12から14のいずれかに記載の1つまたは複数の組成物を含むキット。
(項目20)
(a)71557と名付けられた第1のZFNをコードする第1のポリヌクレオチドであって、必要に応じて、表4または配列番号43に示される配列を含むAAVベクターを含む、第1のポリヌクレオチド;
(b)71728と名付けられた第2のZFNをコードする第2のポリヌクレオチドであって、必要に応じて、表5または配列番号56に示される配列を含むAAVベクターを含む、第2のポリヌクレオチド;および
(c)イズロン酸-2-スルファターゼ(IDS)配列をコードする配列を含むドナーポリヌクレオチド
を含む組成物。
(項目21)
前記ドナーポリヌクレオチドが、表7に示される配列、必要に応じて配列番号65に示される配列を含むAAVベクターである、項目19に記載の組成物。
(項目22)
前記第1の、第2の、およびドナーポリヌクレオチドが、別々のAAVベクターに担持される、項目20または21に記載の組成物。
(項目23)
それを必要とする対象においてIDS導入遺伝子を発現させるための項目20から22のいずれかに記載の組成物の使用であって、前記ZFNが前記対象において内因性アルブミン遺伝子を切断し、前記IDS配列が切断された前記アルブミン遺伝子に組み込まれ、IDSタンパク質が前記対象において発現されるように、前記組成物が前記対象に投与される、使用。
(項目24)
前記IDS配列の発現の後、前記対象においてMPS IIが処置される、項目23に記載の使用。
(項目25)
それを必要とする対象においてIDSタンパク質を発現させる方法であって、前記IDSタンパク質が細胞中で発現されるように、前記対象に、項目20から22のいずれかに記載の1つまたは複数の組成物を投与するステップを含む方法。
(項目26)
前記対象が、MPS II疾患を有し、前記IDSタンパク質の発現が、前記疾患を処置および/または防止する、項目25に記載の方法。
(項目27)
項目20から22のいずれかに記載の1つまたは複数の組成物を含むキット。
(項目28)
(a)71557と名付けられた第1のZFNをコードする第1のポリヌクレオチドであって、必要に応じて、表4または配列番号43に示される配列を含むAAVベクターを含む、第1のポリヌクレオチド;
(b)71728と名付けられた第2のZFNをコードする第2のポリヌクレオチドであって、必要に応じて、表5または配列番号56に示される配列を含むAAVベクターを含む、第2のポリヌクレオチド;および
(c)アルファ-Lイズロニダーゼ(IDUA)配列をコードする配列を含むドナーポリヌクレオチド
を含む組成物。
(項目29)
前記ドナーが、表8に示される配列、必要に応じて配列番号72に示される配列を含む、項目28に記載の組成物。
(項目30)
前記第1の、第2の、およびドナーポリヌクレオチドが、別々のAAVベクターに担持される、項目28または項目29に記載の組成物。
(項目31)
それを必要とする対象においてIDUA導入遺伝子を発現させるための項目28から30のいずれかに記載の組成物の使用であって、前記ZFNが前記対象において内因性アルブミン遺伝子を切断し、前記IDUA配列が切断された前記アルブミン遺伝子に組み込まれ、IDUAタンパク質が前記対象において発現されるように、前記組成物が前記対象に投与される、使用。
(項目32)
前記IDUA配列の発現の後、前記対象においてMPS Iが処置される、項目31に記載の使用。
(項目33)
それを必要とする対象においてIDUAタンパク質を発現させる方法であって、前記IDUAタンパク質が細胞中で発現されるように、前記対象に、項目28から30のいずれかに記載の1つまたは複数の組成物を投与するステップを含む方法。
(項目34)
前記対象が、MPS I疾患を有し、前記IDUAタンパク質の発現が、前記疾患を処置および/または防止する、項目33に記載の方法。
(項目35)
項目28から30のいずれかに記載の1つまたは複数の組成物を含むキット。
Claims (35)
- 第1ZFNおよび第2のZFNのヘテロ二量体を含むジンクフィンガーヌクレアーゼ(ZFN)であって、ここで:
(a)前記第1のZFNが:
(i)F1からF5の順の5つのジンクフィンガードメインであって、ここで、F1がQSGNLAR(配列番号19)であり、F2がLKQNLCM(配列番号15)であり、F3がWQSNLQN(配列番号20)であり、F4がTSGNLTR(配列番号17)であり、そして、F5がRRSHLTS(配列番号21)である、F1からF5の順の5つのジンクフィンガードメイン、および、
(ii)第1の操作されたFokI切断ドメイン
を含み、そして、
(b)前記第2のZFNが:
(i)F1からF6の順の6つのジンクフィンガードメインであって、ここで、F1がQSSDLSR(配列番号30)であり、F2がLKHNLLT(配列番号25)であり、F3がDQSNLRA(配列番号31)であり、F4がRNFSLTM(配列番号27)であり、F5がLRHDLER(配列番号32)であり、F6がHRSNLNK(配列番号29)である、F1からF6の順の6つのジンクフィンガードメイン、および、
(ii)第2の操作されたFokI切断ドメイン
を含む、ZFN。 - 必要に応じてAAVベクターに担持される、請求項1に記載の第1および第2のZFNをコードする1つまたは複数のポリヌクレオチド。
- 前記第1のZFNをコードする第1のポリヌクレオチドが、表4に示される配列を含むAAVベクターを含み、前記第2のZFNをコードする第2のポリヌクレオチドが、表5に示される配列を含むAAVベクターを含む、請求項2に記載の1つまたは複数のポリヌクレオチド。
- 前記第1のZFNをコードする前記AAVベクターが、配列番号43に示される配列を含む、請求項2または3に記載のAAVベクター。
- 前記第2のZFNをコードする前記AAVベクターが、配列番号56に示される配列を含む、請求項2または3に記載のAAVベクター。
- 必要に応じて幹細胞もしくは前駆細胞である、請求項1に記載の1つもしくは複数のZFN、請求項2から3のいずれかに記載の1つもしくは複数のポリヌクレオチド、ならびに/または請求項4および5に記載の1つもしくは複数のAAVベクターを含む細胞。
- 請求項1に記載の1つもしくは複数のZFN、請求項2から3のいずれかに記載の1つもしくは複数のポリヌクレオチド、請求項4および5に記載の1つもしくは複数のAAVベクター、ならびに/または請求項6に記載の1つもしくは複数の細胞を含む医薬組成物。
- 対象において内因性アルブミン遺伝子を切断するための、請求項1に記載の1つもしくは複数のZFN、請求項2または3に記載の1つもしくは複数のポリヌクレオチド、請求項4または5に記載の1つもしくは複数のAAVベクター、請求項6に記載の1つもしくは複数の細胞を含む組成物、ならびに/または請求項7に記載の1つもしくは複数の医薬組成物。
- 前記対象に、必要に応じてAAVベクターに担持されるドナーと組み合わせて投与されることを特徴とし、それにより前記ドナーが、前記対象において切断された前記アルブミン遺伝子に組み込まれる、請求項8に記載の組成物または医薬組成物。
- 対象の細胞において内因性アルブミン遺伝子を切断するための、請求項1に記載の1つもしくは複数のZFN、請求項2または3に記載の1つもしくは複数のポリヌクレオチド、請求項4または5に記載の1つもしくは複数のAAVベクター、請求項6に記載の1つもしくは複数の細胞を含む組成物、ならびに/または請求項7に記載の1つもしくは複数の医薬組成物。
- 請求項1に記載の1つもしくは複数のZFN、請求項2から3のいずれかに記載の1つもしくは複数のポリヌクレオチド、請求項4および5に記載の1つもしくは複数のAAVベクター、請求項6に記載の1つもしくは複数の細胞ならびに/または請求項7に記載の1つもしくは複数の医薬組成物を含むキット。
- 組成物であって、以下:
(a)第1のジンクフィンガーヌクレアーゼ(ZFN)をコードする第1のポリヌクレオチドであって、前記第1のZFNが:
(i)F1からF5の順の5つのジンクフィンガードメインであって、ここで、F1がQSGNLAR(配列番号19)であり、F2がLKQNLCM(配列番号15)であり、F3がWQSNLQN(配列番号20)であり、F4がTSGNLTR(配列番号17)であり、そして、F5がRRSHLTS(配列番号21)である、F1からF5の順の5つのジンクフィンガードメイン、および、
(ii)第1の操作されたFokI切断ドメイン
を含み、そして、必要に応じて、前記第1のポリヌクレオチドが、表4または配列番号43に示される配列を含むAAVベクターを含む、第1のポリヌクレオチド;
(b)第2のZFNをコードする第2のポリヌクレオチドであって、前記第2のZFNが:
(i)F1からF6の順の6つのジンクフィンガードメインであって、ここで、F1がQSSDLSR(配列番号30)であり、F2がLKHNLLT(配列番号25)であり、F3がDQSNLRA(配列番号31)であり、F4がRNFSLTM(配列番号27)であり、F5がLRHDLER(配列番号32)であり、F6がHRSNLNK(配列番号29)である、F1からF6の順の6つのジンクフィンガードメイン、および、
(ii)第2の操作されたFokI切断ドメイン
を含み、そして、必要に応じて、前記第2のポリヌクレオチドが、表5または配列番号56に示される配列を含むAAVベクターを含む、第2のポリヌクレオチド;ならびに、
(c)第IX因子(FIX)配列をコードする配列を含むドナーポリヌクレオチド
を含む組成物。 - 前記ドナーポリヌクレオチドが、表6に示される配列、必要に応じて配列番号59に示される配列を含むAAVベクターである、請求項12に記載の組成物。
- 前記第1の、第2の、およびドナーポリヌクレオチドが、別々のAAVベクターに担持される、請求項12または13に記載の組成物。
- それを必要とする対象においてFIX導入遺伝子を発現させるための請求項12から14のいずれかに記載の組成物であって、前記ZFNが前記対象において内因性アルブミン遺伝子を切断し、前記FIXの配列が切断された前記アルブミン遺伝子に組み込まれ、FIXタンパク質が前記対象において発現されるように、前記組成物が前記対象に投与されるものである、組成物。
- 前記FIXタンパク質の発現の後、前記対象において血友病が処置される、請求項15に記載の組成物。
- それを必要とする対象においてFIXタンパク質を発現させるための、請求項12から14のいずれかに記載の1つまたは複数の組成物。
- 前記対象が、血友病を有し、前記FIXタンパク質の発現が、前記疾患を処置および/または防止する、請求項17に記載の組成物。
- 請求項12から14のいずれかに記載の1つまたは複数の組成物を含むキット。
- 組成物であって、以下:
(a)第1のジンクフィンガーヌクレアーゼ(ZFN)をコードする第1のポリヌクレオチドであって、前記第1のZFNが:
(i)F1からF5の順の5つのジンクフィンガードメインであって、ここで、F1がQSGNLAR(配列番号19)であり、F2がLKQNLCM(配列番号15)であり、F3がWQSNLQN(配列番号20)であり、F4がTSGNLTR(配列番号17)であり、そして、F5がRRSHLTS(配列番号21)である、F1からF5の順の5つのジンクフィンガードメイン、および、
(ii)第1の操作されたFokI切断ドメイン
を含み、そして、必要に応じて、前記第1のポリヌクレオチドが、表4または配列番号43に示される配列を含むAAVベクターを含む、第1のポリヌクレオチド;
(b)第2のZFNをコードする第2のポリヌクレオチドであって、前記第2のZFNが:
(i)F1からF6の順の6つのジンクフィンガードメインであって、ここで、F1がQSSDLSR(配列番号30)であり、F2がLKHNLLT(配列番号25)であり、F3がDQSNLRA(配列番号31)であり、F4がRNFSLTM(配列番号27)であり、F5がLRHDLER(配列番号32)であり、F6がHRSNLNK(配列番号29)である、F1からF6の順の6つのジンクフィンガードメイン、および、
(ii)第2の操作されたFokI切断ドメイン
を含み、そして、必要に応じて、前記第2のポリヌクレオチドが、表5または配列番号56に示される配列を含むAAVベクターを含む、第2のポリヌクレオチド;ならびに、
(c)イズロン酸-2-スルファターゼ(IDS)配列をコードする配列を含むドナーポリヌクレオチド
を含む組成物。 - 前記ドナーポリヌクレオチドが、表7に示される配列、必要に応じて配列番号65に示される配列を含むAAVベクターである、請求項19に記載の組成物。
- 前記第1の、第2の、およびドナーポリヌクレオチドが、別々のAAVベクターに担持される、請求項20または21に記載の組成物。
- それを必要とする対象においてIDS導入遺伝子を発現させるための請求項20から22のいずれかに記載の組成物であって、前記ZFNが前記対象において内因性アルブミン遺伝子を切断し、前記IDS配列が切断された前記アルブミン遺伝子に組み込まれ、IDSタンパク質が前記対象において発現されるように、前記組成物が前記対象に投与されるものである、組成物。
- 前記IDS配列の発現の後、前記対象においてMPS IIが処置される、請求項23に記載の組成物。
- それを必要とする対象においてIDSタンパク質を発現させるための、請求項20から22のいずれかに記載の1つまたは複数の組成物。
- 前記対象が、MPS II疾患を有し、前記IDSタンパク質の発現が、前記疾患を処置および/または防止する、請求項25に記載の組成物。
- 請求項20から22のいずれかに記載の1つまたは複数の組成物を含むキット。
- 組成物であって、以下:
(a)第1のジンクフィンガーヌクレアーゼ(ZFN)をコードする第1のポリヌクレオチドであって、前記第1のZFNが:
(i)F1からF5の順の5つのジンクフィンガードメインであって、ここで、F1がQSGNLAR(配列番号19)であり、F2がLKQNLCM(配列番号15)であり、F3がWQSNLQN(配列番号20)であり、F4がTSGNLTR(配列番号17)であり、そして、F5がRRSHLTS(配列番号21)である、F1からF5の順の5つのジンクフィンガードメイン、および、
(ii)第1の操作されたFokI切断ドメイン
を含み、そして、必要に応じて、前記第1のポリヌクレオチドが、表4または配列番号43に示される配列を含むAAVベクターを含む、第1のポリヌクレオチド;
(b)第2のZFNをコードする第2のポリヌクレオチドであって、前記第2のZFNが:
(i)F1からF6の順の6つのジンクフィンガードメインであって、ここで、F1がQSSDLSR(配列番号30)であり、F2がLKHNLLT(配列番号25)であり、F3がDQSNLRA(配列番号31)であり、F4がRNFSLTM(配列番号27)であり、F5がLRHDLER(配列番号32)であり、F6がHRSNLNK(配列番号29)である、F1からF6の順の6つのジンクフィンガードメイン、および、
(ii)第2の操作されたFokI切断ドメイン
を含み、そして、必要に応じて、前記第2のポリヌクレオチドが、表5または配列番号56に示される配列を含むAAVベクターを含む、第2のポリヌクレオチド;ならびに、
(c)アルファ-Lイズロニダーゼ(IDUA)配列をコードする配列を含むドナーポリヌクレオチド
を含む組成物。 - 前記ドナーが、表8に示される配列、必要に応じて配列番号72に示される配列を含む、請求項28に記載の組成物。
- 前記第1の、第2の、およびドナーポリヌクレオチドが、別々のAAVベクターに担持される、請求項28または請求項29に記載の組成物。
- それを必要とする対象においてIDUA導入遺伝子を発現させるための請求項28から30のいずれかに記載の組成物であって、前記ZFNが前記対象において内因性アルブミン遺伝子を切断し、前記IDUA配列が切断された前記アルブミン遺伝子に組み込まれ、IDUAタンパク質が前記対象において発現されるように、前記組成物が前記対象に投与されるものである、組成物。
- 前記IDUA配列の発現の後、前記対象においてMPS Iが処置される、請求項31に記載の組成物。
- それを必要とする対象においてIDUAタンパク質を発現させるための、請求項28から30のいずれかに記載の1つまたは複数の組成物。
- 前記対象が、MPS I疾患を有し、前記IDUAタンパク質の発現が、前記疾患を処置および/または防止する、請求項33に記載の組成物。
- 請求項28から30のいずれかに記載の1つまたは複数の組成物を含むキット。
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