JP2022553828A - ゲノム操作のための組成物および方法 - Google Patents

ゲノム操作のための組成物および方法 Download PDF

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Abstract

本開示は、ゲノム操作におけるプッシュプルドナー構築物およびそれらの使用方法を提供する。本開示は、治療用タンパク質の発現の改善を可能にするように「プッシュプル（ｐｕｓｈ－ｐｕｌｌ）」方向に構成されたドナー構築物を提供する。これらの「プッシュプル」ドナー構築物は、高い精度および効率で標的ゲノムに組み込むことができ、したがって、例えば、対象の遺伝性障害を治療する方法において有用であり、この方法は、細胞のゲノム内の標的ヌクレオチド配列を改変することを含む。

Description

関連出願の相互参照
本出願は、２０１９年１１月１日に出願された米国仮出願第６２／９２９，５２３号からの優先権および利益を主張し、その内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
配列表
本出願は、ＡＳＣＩＩフォーマットで電子的に提出された、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる配列表を含む。上述のＡＳＣＩＩコピーは、２０２０年１０月２７日に作成され、０００２２２－０００９－ＷＯ１＿ＳＬ．ｔｘｔという名称であり、サイズが３９２，１７７バイトである。
ゲノムＤＮＡの標的化切断のための様々な方法および組成物が記載されている。かかる標的化切断イベントは、例えば、標的化変異誘発を誘導し、細胞ＤＮＡ配列の標的化欠失を誘導し、所定の染色体遺伝子座における標的化組換えを促進するために使用することができる。
これらの方法は、しばしば、非相同末端結合（ＮＨＥＪ）などのエラー発生プロセスによる切断の修復、または修復テンプレート（相同組換え修復またはＨＤＲ）を使用した修復が、遺伝子のノックアウトまたは目的の配列の挿入（標的化組み込み）を引き起こすことができるように、二本鎖切断（ＤＳＢ）または標的化ＤＮＡ配列内のニックを誘導するように操作された切断システムの使用を伴う。切断は、遺伝子操作されたｃｒＲＮＡ／ｔｒａｃｒＲＮＡ（「シングルガイドＲＮＡ’」）を有するＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系を使用した、遺伝子操作されたジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）などの特異的ヌクレアーゼの使用によって行われ、特異的な切断を導くか、および／またはＡｒｇｏｎａｕｔｅ系に基づくヌクレアーゼを使用することによって行うことができる（例えば、「ＴｔＡｇｏ」として既知である、Ｔ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ由来（Ｓｗａｒｔｓ，ｅｔ ａｌ．（２０１４）Ｎａｔｕｒｅ ５０７（７４９１）：２５８－２６１）。
上述のヌクレアーゼ系の１つを使用した標的化切断を利用して、ＨＤＲまたはＮＨＥＪ媒介性プロセスのいずれかを使用して、核酸を特定の標的位置に挿入することができる。しかしながら、ＮＨＥＪを使用して特定の細胞型（例えば、心筋細胞、中棘ニューロン、初代肝細胞、胚性幹細胞、人工多能性幹細胞、および筋細胞）における標的位置に核酸を挿入するための従来の方法は、ドナー核酸が正しい方向に挿入されるという点で、組み込みイベントの半分のみが産生性であるため、効率的ではない。
したがって、より効率的な目的の細胞のゲノム操作のための組成物および方法が依然として必要である。
Ｓｗａｒｔｓ，ｅｔ ａｌ．（２０１４）Ｎａｔｕｒｅ ５０７（７４９１）：２５８－２６１
本開示は、治療用タンパク質の発現の改善を可能にするように「プッシュプル（ｐｕｓｈ－ｐｕｌｌ）」方向に構成されたドナー構築物を提供する。これらの「プッシュプル」ドナー構築物は、高い精度および効率で標的ゲノムに組み込むことができ、したがって、例えば、対象の遺伝性障害を治療する方法において有用であり、この方法は、細胞のゲノム内の標的ヌクレオチド配列を改変することを含む。したがって、本開示の第１の態様は、ポリヌクレオチド構築物であって、５’から３’への方向で、
ａ．第１の逆位末端反復（ＩＴＲ）ヌクレオチド配列と、
ｂ．第１のポリペプチドをコードする第１のヌクレオチド配列と、
ｃ．第２のポリペプチドをコードする第２のヌクレオチド配列と、
ｄ．第２のＩＴＲヌクレオチド配列と、を含み、
第１のポリペプチドをコードする第１のヌクレオチド配列が、第２のポリペプチドをコードする第２のヌクレオチド配列に対してテール－テールに配向され、第１のヌクレオチド配列および第２のヌクレオチド配列が、同じアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする、ポリヌクレオチド構築物を提供する。
いくつかの実施形態において、本開示のポリヌクレオチド構築物は、
ｅ．第１のポリペプチドをコードする第１のヌクレオチド配列に作動可能に連結された第１のスプライスアクセプター配列と、
ｆ．第２のポリペプチドをコードする第２のヌクレオチド配列に作動可能に連結された第２のスプライスアクセプター配列と、をさらに含む。
いくつかの実施形態において、上述の第１のスプライスアクセプター配列および第２のスプライスアクセプター配列のそれぞれが、独立して、第９因子スプライスアクセプター（Ｆ９ＳＡ）、ＣＦＴＲスプライスアクセプター、ＣＯＬ５Ａ２スプライスアクセプター、ＮＦ１スプライスアクセプター、ＭＬＨ１スプライスアクセプター、およびアルブミン（ＡＬＢ）スプライスアクセプターから選択される。
いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチド構築物は、
ｇ．第１のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列に作動可能に連結された第１のポリアデニル化（ポリＡ）シグナル配列と、
ｈ．第２のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列に作動可能に連結された第２のポリアデニル化（ポリＡ）シグナル配列と、をさらに含む。
いくつかの実施形態において、第１のポリＡシグナル配列は、ヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）ポリＡシグナル、ウシ成長ホルモン（ｂＧＨ）ポリＡシグナル、ＳＶ４０ポリＡシグナル、およびｒｂＧｌｏｂポリＡシグナルから選択される。いくつかの実施形態において、第２のポリＡシグナル配列は、ヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）ポリＡシグナル、ウシ成長ホルモン（ｂＧＨ）ポリＡシグナル、ＳＶ４０ポリＡシグナル、およびｒｂＧｌｏｂポリＡシグナルから選択される。
いくつかの実施形態において、第１のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列または第２のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、治療用ポリペプチドをコードする。いくつかの実施形態において、治療用ポリペプチドは、イズロン酸－２－スルファターゼ（ＩＤＳ）、アルファ－Ｌ－イズロニダーゼ（ＩＤＵＡ）、アルファ－Ｄ－マンノシダーゼ、Ｎ－アスパルチル－ベータ－グルコサミニダーゼ、リソソーム酸リパーゼ、シスチノシン（ｃｙｓｔｉｎｏｓｉｎ）、リソソーム関連膜タンパク質２、アルファ－ガラクトシダーゼＡ、酸セラミダーゼ、アルファフコシダーゼ、カテプシンＡ、酸ベータ－グルコセレブロシダーゼ、ベータガラクトシダーゼ、ベータヘキソサミニダーゼＡ、ベータヘキソサミニダーゼＢ、ベータヘキソサミニダーゼ、ＧＭ２ガングリオシド活性化因子、ＧＬｃＮＡｃ－１－ホスホトランスフェラーゼ、ベータ－ガラクトシルセラミダーゼ、アリールスルファターゼＡ、ヘパランＮ－スルファターゼ、アルファ－Ｎ－アセチルグルコサミニダーゼ、アセチルＣｏＡ：アルファ－グルコサミニドアセチルトランスフェラーゼ、Ｎ－アセチルグルコサミン－６－スルファターゼ、アリールスルファターゼＢ、ベータ－グルクロニダーゼ、ヒアルロニダーゼ、ノイラミニダーゼ、ムコリピン（ｍｕｃｏｌｉｐｉｎ）－１、ホルミルグリシン生成酵素、パルミトイル－タンパク質チオエステラーゼ１、トリペプチジルペプチダーゼ１、ＣＬＮ３タンパク質、システインストリングタンパク質アルファ、ＣＬＮ５タンパク質、ＣＬＮ６タンパク質、ＣＬＮ７タンパク質、ＣＬＮ８タンパク質、酸スフィンゴミエリナーゼ、ＮＰＣ １、ＮＰＣ ２、フェニルアラニンヒドロキシラーゼ、酸アルファ－グルコシダーゼ、カテプシンＫ、シアリン、アルファ－Ｎ－アセチルガラクトサミニダーゼ、グルコース－６－ホスファターゼ、溶質キャリアファミリー３７メンバー４、アルギニノコハク酸シンターゼ１、溶質キャリアファミリー２５メンバー１３、およびオルニチントランスカルバミラーゼからなる群から選択される。
いくつかの実施形態において、第１のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、コドン多様化されている。いくつかの実施形態において、第２のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、コドン多様化されている。いくつかの実施形態において、第１のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列および第２のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列のそれぞれが、それぞれ独立してコドン多様化されている。
いくつかの実施形態において、第１のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、配列番号１８４～１９３のうちのいずれか１つに示されるヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態において、第２のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、配列番号１８４～１９３のうちのいずれか１つに示されるヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチド構築物は、配列番号１７３～１７６のうちのいずれか１つに示されるヌクレオチド配列を含む。
本開示の第２の態様は、本開示のポリヌクレオチド構築物を含むベクターを提供する。いくつかの実施形態において、ベクターは、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターである。いくつかの実施形態において、ＡＡＶは、ＡＡＶ－ＭｅＣＰ２、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ８、ＡＡＶ８．２、ＡＡＶ９、Ｄｕａｌ ＡＡＶ９、ＡＡＶｒｈ８、ＡＡＶｒｈ１０、ＡＡＨｒｈ４３、ＡＡＶｈｕ３７、ＡＡＶ２／８、ＡＡＶ２／５、およびＡＡＶ２／６からなる群から選択される。
本開示の第３の態様は、本開示のポリヌクレオチド構築物またはベクターを含む細胞を提供する。いくつかの実施形態において、細胞は真核細胞である。いくつかの実施形態において、細胞は哺乳動物細胞である。いくつかの実施形態において、細胞は幹細胞である。いくつかの実施形態において、細胞はヒト細胞である。いくつかの実施形態において、細胞は非分裂細胞である。いくつかの実施形態において、細胞は肝細胞である。
いくつかの実施形態において、細胞は、ヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチドをさらに含む。いくつかの実施形態において、細胞は、第１のジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）をコードする第１のポリヌクレオチドと、第２のジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）をコードする第２のポリヌクレオチドと、をさらに含む。いくつかの実施形態において、細胞は、第１のジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）をコードする第１のポリヌクレオチドを含む第１のベクターと、第２のジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）をコードする第２のポリヌクレオチドを含む第２のベクターと、をさらに含む。いくつかの実施形態において、細胞は、１つ以上のジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）をコードするポリヌクレオチドをさらに含む。いくつかの実施形態において、細胞は、１つ以上のジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）をコードするポリヌクレオチドを含むベクターをさらに含む。いくつかの実施形態において、ジンクフィンガーヌクレアーゼは、ツーインワン（２－ｉｎ－１）ジンクフィンガーヌクレアーゼである。
本開示の第４の態様は、本開示のポリヌクレオチド構築物と、薬学的に許容される担体と、を含む、薬学的組成物を提供する。いくつかの実施形態において、薬学的組成物は、第１のジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）をコードする第１のポリヌクレオチドと、第２のジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）をコードする第２のポリヌクレオチドと、をさらに含む。いくつかの実施形態において、薬学的組成物は、第１のジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）をコードする第１のポリヌクレオチドを含む第１のベクターと、第２のジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）をコードする第２のポリヌクレオチドを含む第２のベクターと、を含む。いくつかの実施形態において、薬学的組成物は、１つ以上のジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）をコードするポリヌクレオチドをさらに含む。いくつかの実施形態において、薬学的組成物は、１つ以上のジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）をコードするポリヌクレオチドを含むベクターをさらに含む。いくつかの実施形態において、本開示の薬学的組成物中のジンクフィンガーヌクレアーゼは、ツーインワンジンクフィンガーヌクレアーゼである。
いくつかの実施形態において、第１のジンクフィンガーヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチド：第２のジンクフィンガーをコードするポリヌクレオチド：本開示のポリヌクレオチドの比率は、１：１：８である。いくつかの実施形態において、第１のジンクフィンガーヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチド：第２のジンクフィンガーをコードするポリヌクレオチド：本開示のポリヌクレオチドの比率は、１：１：４である。いくつかの実施形態において、第１のジンクフィンガーヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチド：第２のジンクフィンガーをコードするポリヌクレオチド：本開示のポリヌクレオチドの比率は、１：１：２である。いくつかの実施形態において、第１のジンクフィンガーヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチド：第２のジンクフィンガーをコードするポリヌクレオチド：本開示のポリヌクレオチドの比率は、３：３：４である。いくつかの実施形態において、第１のジンクフィンガーヌクレアーゼをコードする第１のポリヌクレオチドを含むベクター：第２のジンクフィンガーをコードするポリヌクレオチドを含むベクター：本開示のベクターの比率は、１：１：８である。いくつかの実施形態において、第１のジンクフィンガーヌクレアーゼをコードする第１のポリヌクレオチドを含むベクター：第２のジンクフィンガーをコードするポリヌクレオチドを含むベクター：本開示のベクターの比率は、１：１：４である。いくつかの実施形態において、第１のジンクフィンガーヌクレアーゼをコードする第１のポリヌクレオチドを含むベクター：第２のジンクフィンガーをコードするポリヌクレオチドを含むベクター：本開示のベクターの比率は、１：１：２である。いくつかの実施形態において、第１のジンクフィンガーヌクレアーゼをコードする第１のポリヌクレオチドを含むベクター：第２のジンクフィンガーをコードするポリヌクレオチドを含むベクター：本開示のベクターの比率は、３：３：４である。
いくつかの実施形態において、ツーインワンジンクフィンガーヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチド：本開示のポリヌクレオチド構築物の比率は、１：４である。いくつかの実施形態において、ツーインワンジンクフィンガーヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチド：本開示のポリヌクレオチド構築物の比率は、１：２である。いくつかの実施形態において、ツーインワンジンクフィンガーヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチド：本開示のポリヌクレオチド構築物の比率は、１：１である。いくつかの実施形態において、ツーインワンジンクフィンガーヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチド：本開示のポリヌクレオチド構築物の比率は、３：２である。いくつかの実施形態において、ツーインワンジンクフィンガーヌクレアーゼを含むベクター：本開示のベクターの比率は、１：４である。いくつかの実施形態において、ツーインワンジンクフィンガーヌクレアーゼを含むベクター：本開示のベクターの比率は、１：２である。いくつかの実施形態において、ツーインワンジンクフィンガーヌクレアーゼを含むベクター：本開示のベクターの比率は、１：１である。いくつかの実施形態において、ツーインワンジンクフィンガーヌクレアーゼを含むベクター：本開示のベクターの比率は、３：２である。
いくつかの実施形態において、組成物は、静脈内、筋肉内、皮下、または髄腔内投与用に製剤化される。
本開示の第５の態様は、細胞のゲノムを改変する方法を提供する。いくつかの実施形態において、細胞のゲノムを改変する方法は、有効量の本開示のポリヌクレオチド構築物を細胞に導入することを含む。いくつかの実施形態において、細胞のゲノムを改変する方法は、有効量の本開示のベクターを細胞に導入することを含む。いくつかの実施形態において、細胞のゲノムを改変する方法は、有効量の本開示の薬学的組成物を細胞に導入することを含む。
本開示の第６の態様は、外因性ヌクレオチド配列を細胞の標的ヌクレオチド配列に組み込む方法を提供する。いくつかの実施形態において、外因性ヌクレオチド配列を細胞の標的ヌクレオチド配列に組み込む方法は、有効量の本開示のポリヌクレオチド構築物を細胞に導入することを含む。いくつかの実施形態において、外因性ヌクレオチド配列を細胞の標的ヌクレオチド配列に組み込む方法は、有効量の本開示のベクターを細胞に導入することを含む。いくつかの実施形態において、外因性ヌクレオチド配列を細胞の標的ヌクレオチド配列に組み込む方法は、有効量の本開示の薬学的組成物を細胞に導入することを含む。
本開示の第７の態様は、細胞内の標的ヌクレオチド配列を破壊する方法を提供する。いくつかの実施形態において、細胞内の標的ヌクレオチド配列を破壊する方法は、有効量の本開示のポリヌクレオチド構築物を細胞に導入することを含む。いくつかの実施形態において、細胞内の標的ヌクレオチド配列を破壊する方法は、有効量の本開示のベクターを細胞に導入することを含む。いくつかの実施形態において、細胞内の標的ヌクレオチド配列を破壊する方法は、有効量の本開示の薬学的組成物を細胞に導入することを含む。
本開示の第８の態様は、対象の障害を治療する方法を提供する。いくつかの実施形態において、対象の障害を治療する方法は、有効量の本開示のポリヌクレオチド構築物を細胞に導入することによって、上述の対象の細胞のゲノム内の標的ヌクレオチド配列を改変することを含む。いくつかの実施形態において、対象の障害を治療する方法は、有効量の本開示のベクターを細胞に導入することによって、上述の対象の細胞のゲノム内の標的ヌクレオチド配列を改変することを含む。いくつかの実施形態において、対象の障害を治療する方法は、有効量の本開示の薬学的組成物を細胞に導入することによって、上述の対象の細胞のゲノム内の標的ヌクレオチド配列を改変することを含む。
いくつかの実施形態において、本開示の方法は、有効量の第１のジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）をコードする第１のポリヌクレオチドおよび第２のジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）をコードする第２のポリヌクレオチドを細胞に導入することをさらに含む。いくつかの実施形態において、本開示の方法は、有効量の第１のジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）をコードする第１のポリヌクレオチドを含む第１のベクターおよび第２のジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）をコードする第２のポリヌクレオチドを含む第２のベクターを細胞に導入することをさらに含む。いくつかの実施形態において、本開示の方法は、有効量の１つ以上のジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）をコードするポリヌクレオチドを細胞に導入することをさらに含む。いくつかの実施形態において、本開示の方法は、有効量の１つ以上のジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）をコードするポリヌクレオチドを含むベクターを細胞に導入することをさらに含む。いくつかの実施形態において、本開示の方法で使用されるジンクフィンガーヌクレアーゼは、ツーインワンジンクフィンガーヌクレアーゼである。
いくつかの実施形態において、本開示のポリヌクレオチド構築物を細胞のゲノムに組み込むと、第１のポリペプチドをコードする第１のヌクレオチド配列が発現される。いくつかの実施形態において、本開示のポリヌクレオチド構築物を細胞のゲノムに組み込むと、第２のポリペプチドをコードする第２のヌクレオチド配列が発現される。
いくつかの実施形態において、障害は、遺伝性障害、感染性疾患、後天性障害、およびがんからなる群から選択される。いくつかの実施形態において、遺伝性障害は、軟骨無形成症、色覚異常、酸性マルターゼ欠損症、アデノシンデアミナーゼ欠損症（ＯＭＩＭ番号１０２７００）、副腎白質ジストロフィー、アイカルディ症候群、アルファ－１アンチトリプシン欠損症、アルファ－サラセミア、アンドロゲン不応症、アペール症候群、不整脈原性右室心筋症、異形成、毛細血管拡張性運動失調症、バース症候群、ベータ－サラセミア、青色ゴムまり様母斑症候群、カナバン病、慢性肉芽腫症（ＣＧＤ）、シトルリン血症、猫鳴き症候群、嚢胞性線維症、デュカム病、外胚葉異形成症、ファブリー病、ファンコニ貧血、進行性骨化性線維異形成症、脆弱Ｘ症候群、ガラクトース血症、ゴーシェ病、汎発性ガングリオシドーシス（例えば、ＧＭ１）、ＧＳＤ（例えば、ＧＳＤ１ａ）ヘモクロマトーシス、ベータ－グロビンの６番目のコドン中のヘモグロビンＣ変異（ＨｂＣ）、血友病、ハンター症候群、ハンチントン病、ハーラー症候群、低ホスファターゼ症、クラインフェルター症候群、クラッベ病、ランガー・ギーディオン症候群、白血球接着不全症（ＬＡＤ、ＯＭＩＭ番号１１６９２０）、白質ジストロフィー、ＱＴ延長症候群、リポタンパク質リパーゼ欠損症、マルファン症候群、メビウス症候群、ムコ多糖症（ＭＰＳ）、ネイルパテラ症候群、腎性尿崩症、神経線維腫症、ニーマン・ピック病、オルニチントランスカルバミラーゼ（ＯＴＣ）欠損症、骨形成不全症、フェニルケトン尿症（ＰＫＵ）、ポンペ病、ポルフィリン症、プラダー・ウィリ症候群、早老症、プロテウス症候群、網膜芽細胞腫、レット症候群、ルビンシュタイン・テイビ症候群、サンフィリポ症候群、重症複合免疫不全症（ＳＣＩＤ）、シュワッハマン症候群、鎌状赤血球症（鎌状赤血球貧血）、スミス・マギニス症候群、スティックラー症候群、テイ・サックス病、血小板減少橈骨欠損（ＴＡＲ）症候群、トリーチャー・コリンズ症候群、トリソミー、結節性硬化症、ターナー症候群、尿素回路異常症、フォンヒッペル・リンドウ病、ワールデンブルグ症候群、ウィリアムズ症候群、ウィルソン病、ウィスコット・アルドリッチ症候群、およびＸ連鎖リンパ増殖症候群（ＸＬＰ、ＯＭＩＭ番号３０８２４０）からなる群から選択される。
いくつかの実施形態において、遺伝性障害は、リソソーム蓄積症である。いくつかの実施形態において、リソソーム蓄積症は、アルファ－マンノシドーシス、アスパルチルグルコサミン尿症、コレステリルエステル蓄積症、シスチノーシス、ダノン病、ファブリー病、ファーバー病、フコシドーシス、ガラクトシアリドーシス、Ｉ型ゴーシェ病、ＩＩ型ゴーシェ病、ＩＩＩ型ゴーシェ病、ＧＭ１ガングリオシドーシス（Ｉ、ＩＩおよびＩＩＩ型）、ＧＭ２サンドホフ病（Ｉ／Ｊ／Ａ）、ＧＭ２テイ・サックス病、ＧＭ２ガングリオシドーシスＡＢバリアント、アイセル病／ムコリピドーシスＩＩ、クラッベ病、リソソーム酸リパーゼ欠損症、異染性白質ジストロフィー、ＭＰＳ Ｉ－ハーラー症候群、ＭＰＳ Ｉ－シャイエ症候群、ＭＰＳ Ｉハーラー－シャイエ症候群、ＭＰＳ ＩＩハンター症候群、ＭＰＳ ＩＩＩＡ－サンフィリポ症候群Ａ型、ＭＰＳ ＩＩＩＢ－サンフィリポ症候群Ｂ型、ＭＰＳ ＩＩＩＣ－サンフィリポ症候群Ｃ型、ＭＰＳＩＩＩＤ－サンフィリポ症候群Ｄ型、ＭＰＳ ＩＶ－モルキオＡ型、ＭＰＳ ＩＶ－モルキオＢ型、ＭＰＳ ＶＩ－マロトー・ラミー、ＭＰＳ ＶＩＩ－スライ症候群、ＭＰＳ ＩＸ－ヒアルロニダーゼ欠損症、ムコリピドーシスＩ－シアリドーシス、ムコリピドーシスＩＩＩＣ、ムコリピドーシスＩＶ型、マルチプルスルファターゼ欠損症、神経セロイドリポフスチン症Ｔ１、神経セロイドリポフスチン症Ｔ２、神経セロイドリポフスチン症Ｔ３、神経セロイドリポフスチン症Ｔ４、神経セロイドリポフスチン症Ｔ５、神経セロイドリポフスチン症Ｔ６、神経セロイドリポフスチン症Ｔ７、神経セロイドリポフスチン症Ｔ８、ニーマン・ピック病Ａ型、ニーマン・ピック病Ｂ型、ニーマン・ピック病Ｃ型、フェニルケトン尿症、ポンペ病、ピクノディスオストーシス、シアル酸蓄積症、シンドラー病、およびウォルマン病からなる群から選択される。いくつかの実施形態において、リソソーム蓄積症は、ＭＰＳＩおよびＭＰＳＩＩから選択される。いくつかの実施形態において、リソソーム蓄積症は、ＭＰＳ Ｉ－ハーラー症候群、ＭＰＳ Ｉ－シャイエ症候群、およびＭＰＳ Ｉ－ハーラー－シャイエ症候群からなる群から選択される。いくつかの実施形態において、リソソーム蓄積症は、ＭＰＳＩＩハンター症候群である。
いくつかの実施形態において、感染性疾患は、ＨＳＶ－１およびＨＳＶ－２などの単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）、水痘帯状疱疹ウイルス（ＶＺＶ）、エプスタイン・バーウイルス（ＥＢＶ）、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、ヒトヘルペスウイルス６（ＨＨＶ－６）、ヒトヘルペスウイルス７（ＨＨＶ－７）、Ａ型肝炎ウイルス（ＨＡＶ）、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）、デルタ肝炎ウイルス（ＨＤＶ）、Ｅ型肝炎ウイルス（ＨＥＶ）、Ｇ型肝炎ウイルス（ＨＧＶ）、Ｐｉｃｏｒｎａｖｉｒｉｄａｅ、Ｃａｌｉｃｉｖｉｒｉｄａｅ、Ｔｏｇａｖｉｒｉｄａｅ、Ｆｌａｖｉｖｉｒｉｄａｅ、Ｃｏｒｏｎａｖｉｒｉｄａｅ、Ｒｅｏｖｉｒｉｄａｅ、Ｂｉｒｎａｖｉｒｉｄａｅ、Ｒｈａｂｏｄｏｖｉｒｉｄａｅ、Ｆｉｌｏｖｉｒｉｄａｅ、Ｐａｒａｍｙｘｏｖｉｒｉｄａｅ、Ｏｒｔｈｏｍｙｘｏｖｉｒｉｄａｅ、Ｂｕｎｙａｖｉｒｉｄａｅ、Ａｒｅｎａｖｉｒｉｄａｅ、Ｒｅｔｒｏｖｉｒａｄａｅ、レンチウイルス、サル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）、インフルエンザウイルスおよびダニ媒介性脳炎ウイルスからなる群から選択される。
いくつかの実施形態において、ベクターは、約１×１０９ｖｇ／ｋｇ～約１×１０１７ｖｇ／ｋｇの用量で投与される。いくつかの実施形態において、ベクターは、約５×１０１２ｖｇ／ｋｇ、約１×１０１３ｖｇ／ｋｇ、約５×１０１３ｖｇ／ｋｇ、および約１×１０１４ｖｇ／ｋｇからなる群から選択される用量で投与される。いくつかの実施形態において、１つ以上のジンクフィンガーヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチドを含むベクターは、約１×１０１２ｖｇ／ｋｇ～約１×１０１４ｖｇ／ｋｇの用量で投与される。
本開示の第９の態様は、細胞のゲノム内の疾患を引き起こす変異を修正する方法を提供する。いくつかの実施形態において、細胞のゲノム内の疾患を引き起こす変異を修正する方法は、有効量の本開示のポリヌクレオチド構築物を細胞に導入することによって、細胞のゲノム内の標的ヌクレオチド配列を改変することを含む。いくつかの実施形態において、細胞のゲノム内の疾患を引き起こす変異を修正する方法は、有効量の本開示のベクターを細胞に導入することによって、細胞のゲノム内の標的ヌクレオチド配列を改変することを含む。いくつかの実施形態において、細胞のゲノム内の疾患を引き起こす変異を修正する方法は、有効量の本開示の薬学的組成物を細胞に導入することによって、細胞のゲノム内の標的ヌクレオチド配列を改変することを含む。いくつかの実施形態において、本方法は、有効量の第１のジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）をコードする第１のポリヌクレオチドおよび第２のジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）をコードする第２のポリヌクレオチドを細胞に導入することをさらに含む。いくつかの実施形態において、本方法は、有効量の第１のジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）をコードする第１のポリヌクレオチドを含む第１のベクターおよび第２のジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）をコードする第２のポリヌクレオチドを含む第２のベクターを細胞に導入することをさらに含む。いくつかの実施形態において、本方法は、有効量の１つ以上のジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）をコードするポリヌクレオチドを細胞に導入することをさらに含む。いくつかの実施形態において、本方法は、有効量の１つ以上のジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）をコードするポリヌクレオチドを含むベクターを細胞に導入することをさらに含む。いくつかの実施形態において、本開示のポリヌクレオチド構築物を細胞のゲノムに組み込むと、第１のポリペプチドをコードする第１のヌクレオチド配列が発現される。いくつかの実施形態において、本開示のポリヌクレオチド構築物を細胞のゲノムに組み込むと、第２のポリペプチドをコードする第２のヌクレオチド配列が発現される。
いくつかの実施形態において、細胞は真核細胞である。いくつかの実施形態において、細胞は哺乳動物細胞である。いくつかの実施形態において、細胞は幹細胞である。いくつかの実施形態において、細胞はヒト細胞である。いくつかの実施形態において、細胞は非分裂細胞である。いくつかの実施形態において、細胞は肝細胞である。いくつかの実施形態において、標的ヌクレオチド配列は、内因性遺伝子座である。
本開示の第１０の態様は、疾患または障害を治療するための医薬の調製のための、本開示のポリヌクレオチド構築物の使用を提供する。
本開示の第１１の態様は、細胞のゲノムを改変するための医薬の調製のための、本開示のポリヌクレオチド構築物の使用を提供する。
本開示の第１２の態様は、導入遺伝子を細胞の標的ヌクレオチド配列に組み込むための医薬の調製のための、本開示のポリヌクレオチド構築物の使用を提供する。
本開示の第１３の態様は、細胞内の標的ヌクレオチド配列を破壊するための医薬の調製のための、本開示のポリヌクレオチド構築物の使用を提供する。
本開示の第１４の態様は、細胞のゲノム内の疾患を引き起こす変異を修正するための医薬の調製のための、本開示のポリヌクレオチド構築物の使用を提供する。
本開示の第１５の態様は、細胞のゲノム内の標的ヌクレオチド配列を改変するための医薬の調製のための、本開示のポリヌクレオチド構築物の使用を提供する。
本開示の第１６の態様は、疾患または障害を治療する際に使用するための、本開示のポリヌクレオチド構築物を提供する。
本開示の第１７の態様は、細胞のゲノムを改変する際に使用するための、本開示のポリヌクレオチド構築物を提供する。
本開示の第１８の態様は、導入遺伝子を細胞の標的ヌクレオチド配列に組み込む際に使用するための、本開示のポリヌクレオチド構築物を提供する。
本開示の第１９の態様は、細胞内の標的ヌクレオチド配列を破壊する際に使用するための、本開示のポリヌクレオチド構築物を提供する。
本開示の第２０の態様は、細胞のゲノム内の疾患を引き起こす変異を修正する際に使用するための、本開示のポリヌクレオチド構築物を提供する。
本開示の第２１の態様は、細胞のゲノム内の標的ヌクレオチド配列を改変する際に使用するための、本開示のポリヌクレオチド構築物を提供する。
標的位置に核酸を挿入する挿入する従来の非相同末端結合（ＮＨＥＪ）方法の概略図を示す。この方法は、組み込みイベントの半分のみが産生性になる（すなわち、核酸が標的部位に正しい方向に挿入される）。
例示的なプッシュプルドナー構築物の概略図を示す。パネルＡは、テール－テール方向にある２つの導入遺伝子を有するプッシュプル構築物を示す。導入遺伝子の一方または両方は、コドン多様化され得る。ＩＴＲは、逆位末端反復を指し、ポリＡは、ポリアデニル化配列を指し、ＳＡは、スプライスアクセプター配列を指す。パネルＢは、例示的な特異的プッシュプルイデュロン酸－２－スルファターゼ（ＩＤＳ）導入遺伝子構築物を示し、２つのＩＤＳ導入遺伝子のうちの１つは、コドン多様化されており、ＩＴＲは、逆位末端反復を示し、ｂＧＨは、ウシ成長ホルモンポリアデニル化シグナル配列を指し（Ｗｏｙｃｈｉｋ ｅｔ ａｌ．（１９８４）Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ８１（１３）：３９４４－８を参照されたい）、ｈＧＨは、ヒト成長ホルモンポリアデニル化シグナル配列を指し、Ｆ９ＳＡは、第９因子スプライスアクセプター配列を指す。
４つの異なるＡＡＶ（ＡＡＶ６）プッシュプルＩＤＳドナー構築物（１、２、４、および５）のジンクフィンガーヌクレアーゼ媒介性組み込みの後の、ｉＰＳ由来ヒト肝細胞におけるイデュロン酸－２－スルファターゼ（ＩＤＳ）活性を示す。パネルＡは、低用量で形質導入された肝細胞の結果を示す。３０ｖｇ／細胞の各ＡＡＶ ＺＦＮ構築物（左および右）、および２４０ｖｇ／細胞のＡＡＶドナー構築物。対照は、単一のＩＤＳ配列を含むドナー構築物を指す。パネルＢは、高用量で形質導入された肝細胞の結果を示す。３００ｖｇ／細胞の各ＡＡＶ ＺＦＮ構築物、および２４００ｖｇ／細胞のＡＡＶドナー構築物。対照は、単一のＩＤＳ配列を含むドナー構築物を指す。パネルＣは、低用量または高用量のＡＡＶ ＺＦＮおよびＡＡＶドナー構築物で形質導入された細胞における挿入および欠失の割合（インデル％）に対して正規化されたＩＤＳ活性を示す。対照は、単一のＩＤＳ配列を含むドナー構築物を指す。プッシュプルドナー構築物２および４は、対照ＩＤＳドナー構築物（単一のＩＤＳ配列を有する）よりも３倍高いレベルのＩＤＳ産生を示した。プッシュプルドナー構築物１および５は、それぞれ、対照ＩＤＳドナー構築物（単一のＩＤＳ配列を有する）よりも２倍および２．５倍高いレベルのＩＤＳ産生を示した。Ｍｏｃｋとは、ＺＦＮ／ドナーＡＡＶ治療を含まない試料を指す。
本開示は、治療用タンパク質の発現の改善を可能にするように「プッシュプル」方向に構成されたドナー構築物を使用して、対象における疾患（例えば、遺伝性障害（例えば、リソソーム蓄積症）、感染性疾患、後天性障害、およびがん）を治療するための組成物および方法を提供する。より具体的には、本開示は、治療用タンパク質の発現の改善を可能にするドナー構築物を提供する。これらの「プッシュプルドナー」構築物は、高い精度および効率で標的ゲノムに組み込むことができる。本明細書に開示される「プッシュプル」ドナー構築物は、第１のポリペプチドをコードする第１のヌクレオチド配列と、第２のポリペプチドをコードする第２のヌクレオチド配列と、を含み、第１のポリペプチドをコードする第１のヌクレオチド配列が、第２のポリペプチドをコードする第２のヌクレオチド配列に対してテール－テールに配向され、第１のヌクレオチド配列および第２のヌクレオチド配列が、同じアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする。本開示はまた、そのような構築物を含むベクター、細胞、および薬学的組成物を提供する。
本開示はまた、外因性配列を組み込むことによって、またはそのようなドナー構築物を使用して望ましくない配列を破壊もしくは欠失させることのいずれかによって、細胞のゲノムを編集または改変する方法を提供する。本明細書に開示される方法は、ヌクレアーゼ（例えば、ＺＦＮまたはＴＡＬＥＮ）によって改善された標的化および効率で組み込まれる、そのような「プッシュプル」ドナーポリヌクレオチド構築物を対象の細胞に導入することを含む。
一般論
本明細書に開示される方法、ならびに組成物の調製および使用の実践は、別段の指示がない限り、分子生物学、生化学、クロマチン構造および分析、計算化学、細胞培養、組換えＤＮＡおよび当該技術分野の技術の範囲内にある関連分野における従来の技術を使用する。これらの技術は、文献に完全に説明されている。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＣＬＯＮＩＮＧ：Ａ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ ＭＡＮＵＡＬ，Ｓｅｃｏｎｄ ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，１９８９ ａｎｄ Ｔｈｉｒｄ ｅｄｉｔｉｏｎ，２００１、Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，ＣＵＲＲＥＮＴ ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ ＩＮ ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＢＩＯＬＯＧＹ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９８７ ａｎｄ ｐｅｒｉｏｄｉｃ ｕｐｄａｔｅｓ；ｔｈｅ ｓｅｒｉｅｓ ＭＥＴＨＯＤＳ ＩＮ ＥＮＺＹＭＯＬＯＧＹ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、Ｗｏｌｆｆｅ，ＣＨＲＯＭＡＴＩＮ ＳＴＲＵＣＴＵＲＥ ＡＮＤ ＦＵＮＣＴＩＯＮ，Ｔｈｉｒｄ ｅｄｉｔｉｏｎ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，１９９８、ＭＥＴＨＯＤＳ ＩＮ ＥＮＺＹＭＯＬＯＧＹ，Ｖｏｌ．３０４，“Ｃｈｒｏｍａｔｉｎ”（Ｐ．Ｍ．Ｗａｓｓａｒｍａｎ ａｎｄ Ａ．Ｐ．Ｗｏｌｆｆｅ編集），Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，１９９９、およびＭＥＴＨＯＤＳ ＩＮ ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＢＩＯＬＯＧＹ，Ｖｏｌ．１１９，“Ｃｈｒｏｍａｔｉｎ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ”（Ｐ．Ｂ．Ｂｅｃｋｅｒ編集）Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ，Ｔｏｔｏｗａ，１９９９を参照されたい。
定義
「本明細書に」という用語は、出願全体を意味する。
本明細書で別途定義されない限り、本出願で使用される科学用語および技術用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般的に理解される意味を有するものとする。一般に、本明細書に記載される化合物、組成物、および方法と関連して使用される専門用語は、当該技術分野で周知であり、一般的に使用されているものである。
本開示の異なる態様の下に記載されるものおよび本明細書の異なる部分（実施例でのみ記載される実施形態を含む）を含む本明細書に記載される実施形態のうちのいずれかは、明示的に放棄されるか、または不適切でない限り、本発明の１つ以上の他の実施形態と組み合わせることができることが理解されるべきである。実施形態の組み合わせは、複数の従属請求項を介して特許請求されるそれらの特定の組み合わせに限定されない。
本出願において参照されるすべての刊行物、特許、および公開された特許出願は、参照により本明細書に具体的に組み込まれる。矛盾する場合には、本明細書が、その特定の定義を含み、優先される。
本明細書全体を通して、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」という語句、または「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」もしくは「含むこと（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」などの変化形は、述べられている整数（もしくは構成要素）または整数（もしくは構成要素）の群を包含することを意味するが、任意の他の整数（もしくは構成要素）または整数（もしくは構成要素）の群の除外を意味するものではないことが理解されるであろう。
本明細書全体を通して、組成物が、特定の構成要素を有するか、含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）か、または含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）（またはその変化形）と記載される場合、その組成物は、列挙された構成要素から本質的になるか、またはそれからなることもできることが企図される。同様に、方法またはプロセスが、特定の処理ステップを有する、含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）か、または含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）と記載される場合、そのプロセスもまた、列挙された処理ステップから本質的になるか、またはそれからなることもできる。さらに、本明細書に記載の組成物および方法が操作可能なままである限り、上述のステップの順序、または特定の動作を実行するための順序は、重要ではないことが理解されるべきである。さらに、２つ以上のステップまたは動作を同時に実行することができる。
「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」という用語は、本明細書で使用される場合、「含むが、これらに限定されない」を意味するために使用される。「含む」および「含むが、これらに限定されない」は、互換的に使用される。したがって、これらの用語は、述べられている整数（もしくは構成要素）または整数（もしくは構成要素）の群を包含することを意味するが、任意の他の整数（もしくは構成要素）または整数（もしくは構成要素）の群の除外を意味するものではないことが理解されるであろう。
本明細書で使用される場合、「約」または「およそ」は、当業者によって決定される特定の値に対する許容誤差範囲内であることを意味し、それは、その値がどのように測定または決定されるか、すなわち、測定システムの限界に一部依存する。
要素を説明する文脈（特に以下の特許請求の範囲の文脈）における「ａ」および「ａｎ」および「ｔｈｅ」という用語および同様の指示物の使用は、本明細書で別途指示されない限り、または文脈により明らかに矛盾しない限り、単数および複数の両方を含むと解釈されるべきである。
本明細書で使用される「または」という用語は、文脈が別途明確に示さない限り、「および／または」を意味するものと理解すべきである。
本明細書における値の範囲の列挙は、本明細書に別段の指示がない限り、その範囲内に収まる各々の別個の値を個別に指す省略法として機能することが意図されているに過ぎず、その各々の別個の値は、本明細書に個別に列挙されるかのように本明細書に組み込まれる。本明細書に記載されるすべての方法は、本明細書に別段の指示がない限り、または文脈によって明らかに矛盾しない限り、任意の好適な順序で実行することができる。本明細書で提供される任意の例およびすべての例、または例示的な言語（例えば、「など」）の使用は、単に実施形態をより良く示すことを意図しており、特に断りのない限り、特許請求の範囲の範囲に制限を与えるものではない。本明細書中のいかなる言語も、任意の請求されていない要素を必須として示すものとして解釈されるべきではない。
「核酸」、「ポリヌクレオチド」、および「オリゴヌクレオチド」という用語は、互換的に使用され、直鎖状または環状の配置で、一本鎖または二本鎖のいずれかの形態のデオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドポリマーを指す。本開示の目的のために、これらの用語は、ポリマーの長さに関して限定するものとして解釈されるべきではない。この用語は、天然ヌクレオチドの既知の類似体、ならびに塩基、糖、および／またはリン酸部分で改変されるヌクレオチド（例えば、ホスホロチオエート骨格）を包含することができる。一般に、特定のヌクレオチドの類似体は、同じ塩基対合特異性を有する。すなわち、Ａの類似体は、Ｔと塩基対合する。
「染色体」という用語は、本明細書で使用される場合、細胞のゲノムのすべてまたは一部を含むクロマチン複合体である。細胞のゲノムは、多くの場合、その核型によって特徴付けられ、これは、細胞のゲノムを含むすべての染色体の集合体である。細胞のゲノムは、１つ以上の染色体を含み得る。
「クロマチン」は、本明細書で使用される場合、細胞ゲノムを含む核タンパク質構造を指す。細胞クロマチンは、核酸、主にＤＮＡ、およびヒストンおよび非ヒストン染色体タンパク質を含むタンパク質を含む。真核細胞クロマチンの大部分は、ヌクレオソームの形態で存在し、ヌクレオソームコアは、ヒストンＨ２Ａ、Ｈ２Ｂ、Ｈ３およびＨ４のそれぞれ２つを含む八量体と会合したおよそ１５０塩基対のＤＮＡと、ヌクレオソームコア間に延びている（生物に応じて可変長の）リンカーＤＮＡと、を含む。ヒストンＨ１の分子は、一般に、リンカーＤＮＡと会合する。本開示の目的のために、「クロマチン」という用語は、真核生物および原核生物の両方のすべての種類の細胞核タンパク質を包含することを意味する。細胞クロマチンには、染色体クロマチンおよびエピソームクロマチンの両方が含まれる。
「エピソーム」は、本明細書で使用される場合、複製核酸、核タンパク質複合体、または細胞の染色体核型の一部ではない核酸を含む他の構造を指す。これは、細胞内に存在するか、または宿主細胞染色体の一部として自律的に複製することができる。エピソームの例としては、プラスミド、および特定のウイルスゲノムが挙げられる。
「切断」という用語は、本明細書で使用される場合、核酸（例えばＤＮＡ）分子またはポリペプチド（例えば、タンパク質）分子の共有結合骨格の破壊を指す。切断は、限定されないが、酵素的加水分解または化学的加水分解（例えば、核酸分子中のホスホジエステル結合の加水分解）を含む様々な方法によって開始することができる。核酸分子に関して、一本鎖切断および二本鎖切断の両方が可能であり、二本鎖切断は、２つの異なる一本鎖切断事象の結果として生じ得る。核酸切断は、鈍末端または付着末端のいずれかの生成を引き起こす場合がある。特定の実施形態において、融合ポリペプチドは、標的化二本鎖ＤＮＡ切断のために使用される。ポリペプチドに関して、切断には、アミノ酸間のペプチド結合の破壊を含む、タンパク質分解切断が含まれる。
「切断ハーフドメイン」は、本明細書で使用される場合、第２のポリペプチド（同一または異なるいずれか）と併せて、切断活性（好ましくは二本鎖切断活性）を有する複合体を形成するポリペプチド配列を指す。「第１および第２の切断ハーフドメイン」、「＋および－切断ハーフドメイン」、および「右および左の切断ハーフドメイン」という用語は、二量体化する切断ハーフドメインの対を指すために互換的に使用される。
「操作された切断ハーフドメイン」は、本明細書で使用される場合、別の切断ハーフドメイン（例えば、別の操作された切断ハーフドメイン）と偏性ヘテロ二量体を形成するように修飾されている切断ハーフドメインを指す。参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる米国特許第７，８８８，１２１号、同第７，９１４，７９６号、同第８，０３４，５９８号および同第８，８２３，６１８号を参照されたい。
「結合」という用語は、本明細書で使用される場合、巨大分子間（例えば、タンパク質と核酸との間）の配列特異的な非共有相互作用を指す。結合相互作用全体が配列特異的である限り、結合相互作用のすべての成分が配列特異的である必要はない（例えば、ＤＮＡ骨格内のリン酸残基との接触）。そのような相互作用は、一般に、１０－６Ｍ－１以下の解離定数（Ｋｄ）を特徴とする。「親和性」は、結合の強度を指す。結合親和性の増加は、より低いＫｄと相関する。「非特異的結合」とは、標的配列に依存しない、目的の任意の分子（例えば、遺伝子操作ヌクレアーゼ）と巨大分子（例えば、ＤＮＡ）との間で生じる非共有相互作用を指す。
「結合タンパク質」は、本明細書で使用される場合、別の分子に非共有結合することができるタンパク質である。結合タンパク質は、例えば、ＤＮＡ分子（ＤＮＡ結合タンパク質）、ＲＮＡ分子（ＲＮＡ結合タンパク質）、および／またはポリペプチドもしくはタンパク質分子（タンパク質結合タンパク質）に結合することができる。ポリペプチドまたはタンパク質結合タンパク質の場合、自身に結合することができ（ホモ二量体、ホモ三量体などを形成することができる）、および／または異なるタンパク質の１つ以上の分子に結合することができる。結合タンパク質は、１種類より多い結合活性を有し得る。例えば、ジンクフィンガータンパク質は、ＤＮＡ結合活性、ＲＮＡ結合活性、およびタンパク質結合活性を有する。
「ＤＮＡ結合分子」は、本明細書に使用される場合、ＤＮＡに結合することができる分子を指す。かかるＤＮＡ結合分子は、ポリペプチド、タンパク質のドメイン、より大きなタンパク質内のドメイン、またはポリヌクレオチドであり得る。いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチドはＤＮＡであり、一方、他の実施形態において、ポリヌクレオチドはＲＮＡである。いくつかの実施形態において、ＤＮＡ結合分子は、ヌクレアーゼのタンパク質ドメイン（例えば、ジンクフィンガードメイン）である。
「ＤＮＡ結合タンパク質」または「結合ドメイン」は、本明細書で使用される場合、例えば、１つ以上のジンクフィンガーを介して、またはジンクフィンガータンパク質もしくはＴＡＬＥ内の１つ以上の反復可変二残基（ＲＶＤ）との相互作用を介して、それぞれ配列特異的な方法でＤＮＡに結合するタンパク質、またはより大きなタンパク質内のドメインを指す。
「外因性」分子（例えば、核酸配列またはタンパク質）は、細胞内に通常存在しないが、１つ以上の送達方法によって細胞に導入され得る分子である。外因性分子は、治療用遺伝子、細胞に導入されたプラスミドもしくはエピソーム、ウイルスゲノム、または細胞に通常存在しない染色体を含み得る。細胞に外因性分子を導入するための方法は、当業者に既知であり、限定されないが、脂質媒介性移行（すなわち、中性脂質およびカチオン性脂質を含むリポソーム）、エレクトロポレーション、直接注射、細胞融合、粒子爆撃、リン酸カルシウム共沈殿、ＤＥＡＥ－デキストラン媒介性移行、およびウイルスベクター媒介性移行を含む。外因性分子はまた、内因性分子と同じ種類の分子であってもよいが、細胞の由来となるものとは異なる種に由来する。例えば、ヒト核酸配列は、マウスまたはハムスターに元々由来する細胞株に導入されてもよい。
本明細書で使用される場合、「外因性核酸の産物」という用語は、ポリヌクレオチドおよびポリペプチド産物、例えば、転写産物（ＲＮＡなどのポリヌクレオチド）および翻訳産物（ポリペプチド）の両方を含む。
「内因性」分子または配列は、特定の環境条件下で特定の発達段階において特定の細胞内に通常存在するものである。例えば、内因性核酸は、染色体、ミトコンドリア、葉緑体もしくは他のオルガネラのゲノム、または天然に存在するエピソーム核酸を含み得る。追加の内因性分子として、タンパク質、例えば、転写因子および酵素を挙げることができる。
「真核生物」細胞としては、限定されないが、真菌細胞（酵母など）、植物細胞、動物細胞、哺乳動物細胞、および幹細胞（多能性および複能性）を含むヒト細胞（例えば、Ｔ細胞）が挙げられる。
「融合」分子、または任意のその変化形は、２つ以上のサブユニット分子が連結され、好ましくは共有結合的に連結された分子である。サブユニット分子は、同じ化学型の分子であってもよく、異なる化学型の分子であってもよい。融合分子の例としては、限定されないが、融合タンパク質（例えば、ジンクフィンガーＤＮＡ結合ドメインと切断ドメインとの間の融合）および融合核酸（例えば、融合タンパク質をコードする核酸）が挙げられる。細胞における融合タンパク質の発現は、融合タンパク質を細胞に送達すること、または融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを細胞に送達することによってもたらされてもよく、ポリヌクレオチドは転写され、転写産物は翻訳され、融合タンパク質を生成する。トランススプライシング、ポリペプチド切断、およびポリペプチドライゲーションは、細胞におけるタンパク質の発現にも関与し得る。ポリヌクレオチドおよびポリペプチドを細胞に送達するための方法は、本開示の他箇所に提示されている。
「遺伝子」は、本明細書で使用される場合、遺伝子産物をコードするＤＮＡ領域（以下を参照）、ならびに調節配列がコード配列および／または転写配列に隣接しているか否かにかかわらず、遺伝子産物の産生を調節するすべてのＤＮＡ領域を含む。したがって、遺伝子としては、必ずしも限定されないが、プロモーター配列、ターミネーター、リボソーム結合部位および内部リボソーム侵入部位などの翻訳調節配列、エンハンサー、サイレンサー、インスレーター、境界要素、複製起点、マトリックス結合部位および遺伝子座制御領域が挙げられる。
「遺伝子発現」、または「ヌクレオチド発現」は、本明細書で使用される場合、遺伝子またはヌクレオチド配列に含まれる情報を遺伝子産物に変換することを指す。遺伝子産物は、遺伝子（例えば、ｍＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｒＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、リボザイム、構造ＲＮＡ、または任意の他の種類のＲＮＡ）またはｍＲＮＡの翻訳によって産生されるタンパク質の直接転写産物であり得る。遺伝子産物には、キャッピング、ポリアデニル化、メチル化、および編集などのプロセスによって改変されるＲＮＡ、ならびに例えば、メチル化、アセチル化、リン酸化、ユビキチン化、ＡＤＰ－リボシル化、ミリストイル化、およびグリコシル化によって改変されるタンパク質も含まれる。
「目的の領域」は、本明細書で使用される場合、例えば、外因性分子に結合することが望ましい、遺伝子または非コード配列などの細胞クロマチンの任意の領域を指す。結合は、標的化ＤＮＡ切断および／または標的化組換えの目的のためであり得る。目的の領域は、例えば、染色体、エピソーム、オルガネラゲノム（例えば、ミトコンドリア、葉緑体）、または感染ウイルスゲノムに存在することができる。目的の領域は、遺伝子のコード領域内、例えば、リーダー配列、トレーラー配列もしくはイントロンなどの転写された非コード領域内、またはコード領域の上流もしくは下流のいずれかの非転写領域内にあり得る。目的の領域は、単一のヌクレオチド対または最大２，０００ヌクレオチド対の長さ、または任意の整数値のヌクレオチド対と同じくらい小さくてもよい。
「コドン多様化された」という用語は、本明細書で使用される場合、元の多様化されていない配列（例えば、元の設計または選択されたヌクレアーゼまたは野生型または変異体ドナー）と比較して、コドン使用が変更された任意のヌクレオチド配列を指す。コドン多様化された配列は、ＧｅｎｅＧＰＳなどの任意のプログラムを使用して得られてもよく、多様化されていない配列とは異なる速度で組み換えられる配列が得られてもよく、および／または多様化されていない配列と比較して、より高いレベルのコードされたポリペプチドを発現するコード配列が得られてもよい。ＤＮＡ合成企業（例えばＡＴＵＭおよびＢｌｕｅｈｅｒｏｎ）も、コドン多様化のための内部アルゴリズムを有する。
「ＴＡＬＥ ＤＮＡ結合ドメイン」または「ＴＡＬＥ」（転写活性化因子様エフェクター）は、本明細書で使用される場合、１つ以上のＴＡＬＥ反復ドメイン／単位を含むポリペプチドを指す。反復ドメインは、ＴＡＬＥのその同族標的ＤＮＡ配列への結合に関与する。単一の「反復単位」（「反復」とも称される）は、典型的には、３３～３５アミノ酸長であり、天然に存在するＴＡＬＥタンパク質内の他のＴＡＬＥ反復配列との少なくともある程度の配列相同性を示す。例えば、米国特許第８，５８６，５２６号および同第９，４５８，２０５号を参照されたい。「ＴＡＬＥＮ」（転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ）という用語は、標的遺伝子を切断するために二量体化する１つのＴＡＬＥＮまたは一対のＴＡＬＥＮ（この対のメンバーは、「左および右」または「第１および第２」または「対」と称される）を指す。ジンクフィンガーおよびＴＡＬＥ結合ドメインは、例えば、天然に存在するジンクフィンガーまたはＴＡＬＥタンパク質の認識らせん領域の操作（１つ以上のアミノ酸を変更すること）を介して、所定のヌクレオチド配列に結合するように「操作」され得る。したがって、操作されたＤＮＡ結合タンパク質（ジンクフィンガーまたはＴＡＬＥ）は、天然に存在しないタンパク質である。ＤＮＡ結合タンパク質を操作するための方法の非限定的な例は、設計および選択である。設計されたＤＮＡ結合タンパク質は、自然界では生じないタンパク質であり、その設計／組成は、主に合理的な基準から生じる。設計の合理的な基準は、既存のＺＦＰおよび／またはＴＡＬＥ設計および結合データの情報を格納するデータベース内の情報を処理するための置換ルールおよびコンピュータ化アルゴリズムの適用を含む。例えば、米国特許第８，５６８，５２６号、同第６，１４０，０８１号、同第６，４５３，２４２号、および同第６，５３４，２６１号を参照されたい。また、国際特許公開第９８／５３０５８号、同第９８／５３０５９号、同第９８／５３０６０号、同第０２／０１６５３６号、および同第０３／０１６４９６号も参照されたい。
「組換え」は、本明細書で使用される場合、２つのポリヌクレオチド間で遺伝情報を交換するプロセスを指す。本開示の目的のために、「相同組換え（ＨＲ）」は、本明細書で使用される場合、例えば、相同組換え修復機構を介した細胞における二本鎖切断の修復中に起こる、かかる交換の特殊な形態を指す。このプロセスは、ヌクレオチド配列の相同性を必要とし、「ドナー」分子（すなわち、外因性ＤＮＡ）をテンプレートとして使用して「標的」分子（すなわち、二本鎖切断を有する分子）を修復し、それがドナーから標的分子への遺伝情報の導入をもたらすことから、「非交叉型遺伝子変換」または「ショートトラクト遺伝子変換」とも称される。特定の理論に拘束されることを望むものではないが、かかる導入は、破損した標的とドナーとの間に形成するヘテロ二本鎖ＤＮＡのミスマッチ修正、および／またはドナーが標的の一部となる遺伝情報を再合成するために使用される「合成依存的鎖アニーリング」、および／または関連するプロセスを伴い得る。かかる特殊なＨＲは、しばしば、ドナーポリヌクレオチドの配列の一部またはすべてが標的ポリヌクレオチドに組み込まれるような標的分子の配列の変化を引き起こす。
本開示の方法において、本明細書に記載の１つ以上の標的化ヌクレアーゼは、所定の部位で標的配列（例えば、細胞クロマチン）に二本鎖切断を作製し、切断領域のヌクレオチド配列と相同性を有する「ドナー」ポリヌクレオチドを細胞に導入することができる。二本鎖切断の存在は、ドナー配列の組み込みを促進することが示されている。ドナー配列は、物理的に組み込まれていてもよく、あるいは、ドナーポリヌクレオチドは、相同組換えを介した断裂の修復のためのテンプレートとして使用され、結果として、ドナー内のヌクレオチド配列のすべてまたは一部が細胞クロマチンに導入される。したがって、細胞クロマチン内の第１の標的配列を変化させることができ、特定の実施形態において、ドナーポリヌクレオチド内に存在する配列に変換することができる。したがって、「置き換える」または「置き換え」という用語の使用は、１つのヌクレオチド配列の別のヌクレオチドによる置き換え（すなわち、情報的な意味での配列の置き換え）を表すと理解することができ、必ずしも、１つのポリヌクレオチドの別のヌクレオチドによる物理的または化学的置き換えを必要としない。
「プッシュプルドナー」構築物という用語は、第１のポリペプチドをコードする第１のヌクレオチド配列と、第２のポリペプチドをコードする第２のヌクレオチド配列と、を含み、第１のポリペプチドをコードする第１のヌクレオチド配列が、第２のポリペプチドをコードする第２のヌクレオチド配列に対してテール－テールに配向され、第１のヌクレオチド配列および第２のヌクレオチド配列が、同じアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする、ポリヌクレオチドを指す。
テール－テールの構成は、第１のポリペプチドをコードする第１のヌクレオチド配列の末端が、第２のポリペプチドをコードする第２のヌクレオチド配列の末端（開始とは反対側）により近い位置に位置する構成を指す。
「異種」という用語は、それが比較されるエンティティの残りとは遺伝子型が異なるエンティティに由来することを意味する。例えば、遺伝子操作技術によって異なる種に由来するプラスミドまたはベクターに導入されたポリヌクレオチドは、異種ポリヌクレオチドである。
「インデル％」という用語は、本明細書で使用される場合、ゲノムの標的配列におけるいくつかのヌクレオチドの挿入または欠失のパーセンテージを指す。
遺伝子発現の「調節」（またはそのバリアント）は、遺伝子の活性の変化を指す。発現の調節には、限定されないが、遺伝子活性化および遺伝子抑制が含まれ得る。ゲノム編集（例えば、切断、改変、不活性化、ランダム変異）を使用して、発現を調節することができる。遺伝子不活性化とは、本明細書に記載のＺＦＰ、ＴＡＬＥまたはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系を含まない細胞と比較した、遺伝子発現の任意の減少を指す。したがって、遺伝子不活性化は、部分的であっても完全であってもよい。
「作動性連結」および「作動可能に連結された」（または「操作可能に連結された」）という用語、またはその変化形は、本明細書で使用される場合、２つ以上の構成要素（配列要素など）の並置に関して互換的に使用され、構成要素は、両方の構成要素が正常に機能し、構成要素のうちの少なくとも１つが、他の構成要素のうちの少なくとも１つに及ぼされる機能を媒介することができる可能性を可能にするように配置される。例示として、転写調節配列が１つ以上の転写調節因子の存在または非存在に応答してコード配列の転写レベルを制御する場合、プロモーターなどの転写調節配列は、コード配列に作動可能に連結されている。転写調節配列は、一般に、コード配列とｃｉｓで作動可能に連結されているが、コード配列に直接隣接する必要はない。例えば、エンハンサーは、コード配列が連続していないにもかかわらず、コード配列に作動可能に連結された転写調節配列である。例えば、リンカー配列は、両方の配列の間に位置し得る。融合ポリペプチドに関して、「作動可能に連結された」という用語は、各構成要素が、それほど連結されていなかった場合と同じ機能を他の構成要素に連結して行うという事実を指すことができる。例えば、ＺＦＰまたはＴＡＬＥ ＤＮＡ結合ドメインが活性化ドメインに融合される融合ポリペプチドに関して、ＺＦＰまたはＴＡＬＥ ＤＮＡ結合ドメインおよび活性化ドメインは、融合ポリペプチドにおいて、ＺＦＰまたはＴＡＬＥ ＤＮＡ結合ドメイン部分がその標的部位および／またはその結合部位に結合することができる一方で、活性化ドメインが遺伝子発現を上方制御することができる場合、作動性連結である。ＺＦＰまたはＴＡＬＥ ＤＮＡ結合ドメインが切断ドメインに融合されている融合ポリペプチドにおいて、ＺＦＰまたはＴＡＬＥ ＤＮＡ結合ドメインおよび切断ドメインは、融合ポリペプチドにおいて、ＺＦＰまたはＴＡＬＥ ＤＮＡ結合ドメイン部分がその標的部位および／またはその結合部位に結合することができ、一方で、切断ドメインが標的部位の近傍でＤＮＡを切断することができる場合、作動性連結である。
「ポリペプチド」、「ペプチド」、および「タンパク質」という用語は、アミノ酸残基のポリマーを指すために互換的に使用される。この用語はまた、１つ以上のアミノ酸が対応する天然に存在するアミノ酸の化学類似体または改変誘導体であるアミノ酸ポリマーにも適用される。
「機能性」タンパク質、ポリペプチド、ポリヌクレオチドまたは核酸は、野生型タンパク質、ポリペプチド、ポリヌクレオチドまたは核酸と同じ機能を提供する任意のタンパク質、ポリペプチド、ポリヌクレオチドまたは核酸を指す。タンパク質、ポリペプチド、ポリヌクレオチドまたは核酸の「機能性断片」は、配列が全長タンパク質、ポリペプチドまたは核酸と同一ではないが、全長タンパク質、ポリペプチド、ポリヌクレオチドまたは核酸と同じ機能を保持するタンパク質、ポリペプチド、ポリヌクレオチドまたは核酸である。機能性断片は、対応する天然分子よりも多く、より少なく、または同じ数の残基を有することができ、および／または１つ以上のアミノ酸もしくはヌクレオチド置換を含有することができる。核酸の機能（例えば、コード機能、別の核酸へのハイブリダイゼーション能力）を決定する方法は、当該技術分野で周知である。同様に、タンパク質機能を決定する方法は周知である。例えば、ポリペプチドのＤＮＡ結合機能は、例えば、フィルター結合、電気泳動移動度シフト、または免疫沈降アッセイによって決定することができる。ＤＮＡ切断は、ゲル電気泳動によってアッセイすることができる。Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．（上記参照）を参照されたい。タンパク質が別のタンパク質と相互作用する能力は、例えば、遺伝的および生化学的両方の共免疫沈降、２ハイブリッドアッセイまたは相補性によって決定することができる。例えば、Ｆｉｅｌｄｓ ｅｔ ａｌ．（１９８９）Ｎａｔｕｒｅ ３４０：２４５－２４６、米国特許第５，５８５，２４５号および国際特許公開第９８／４４３５０号を参照されたい。
「セーフハーバー遺伝子座または部位」という用語は、本明細書で使用される場合、遺伝子または他の遺伝子要素が、いかなる望ましくない効果も伴わない遺伝子組換えに対して耐性であることが既知であるため、安全に挿入および発現することができる遺伝子座である。
「配列」という用語は、ＤＮＡまたはＲＮＡであり得る任意の長さのヌクレオチド配列を指し、直鎖、環状または分岐であってもよく、一本鎖または二本鎖のいずれかであり得る。「配列」という用語はまた、任意の長さのアミノ酸配列を指す。「導入遺伝子」または「ドナー遺伝子」という用語は、ゲノムに挿入されるヌクレオチド配列を指す。導入遺伝子は、任意の長さ、例えば、２～１００，０００，０００ヌクレオチド長（またはその間の任意の整数値もしくはそれより上の任意の整数値）、約１００～１００，０００ヌクレオチド長（またはその間の任意の整数値）、約２０００～２０，０００ヌクレオチド長（またはその間の任意の値）、または約５～１５ｋｂ（またはその間の任意の値）であり得る。
「特異性」（またはその変化形）という用語は、本明細書で使用される場合、特定の位置で精度をもって標的配列に結合することができるヌクレアーゼを指す。「特異性」および「精度」という用語は、互換的に使用される。
「対象」および「患者」という用語は、互換的に使用され、限定されないが、ヒト患者および非ヒト霊長類、ならびにウサギ、イヌ、ネコ、ラット、マウス、および他の動物などの実験動物を含む哺乳動物を指す。したがって、本明細書で使用される「対象」または「患者」という用語は、本発明のポリヌクレオチドおよびポリペプチドが投与され得る任意の哺乳動物患者または対象を意味する。
「疾患関連遺伝子またはタンパク質」は、遺伝的（例えば、単一遺伝子）障害、感染性疾患、後天性障害、がんなどにおいて何らかの形で欠損しているものである。
「標的ヌクレオチド配列」または「標的部位」という用語は、本明細書で使用される場合、本開示のジンクフィンガーヌクレアーゼタンパク質のジンクフィンガーヌクレオチド結合ドメインによって特異的に認識される細胞のゲノムに位置するヌクレオチド配列を指す。
「治療すること」および「治療」という用語、またはその変化形は、本明細書で使用される場合、症状の重症度および／または頻度の低下、症状および／または根本原因の排除、症状の発生および／またはそれらの根本原因の予防、症状および／または根本原因の発生を遅らせること、ならびに損傷の改善または是正を指す。治療は、疾患を治療するために必要な１つ以上の他の医薬の用量を減少させ、および／または生活の質を改善するのに役立ち得る。
「有効用量」または「有効量」は、本明細書で使用される場合、症状の発生を治療または予防するのに役立ち得る、本明細書に開示される対象に与えられる組成物の用量および／または量を指す。
ポリヌクレオチド「ベクター」または「構築物」は、遺伝子配列を標的細胞に転写することができる。典型的には、「ベクター構築物」、「発現ベクター」、「発現構築物」、「発現カセット」、および「遺伝子移入ベクター」は、目的の遺伝子の発現を指示することが可能であり、遺伝子配列を標的細胞に移入することができる任意の核酸構築物を意味する。したがって、この用語は、クローニング、および発現ビヒクル、ならびに統合ベクターを含む。
本明細書で使用される場合、「バリアント」という用語は、参照ポリヌクレオチドまたはポリペプチドに実質的に類似した配列を有するポリヌクレオチドまたはポリペプチドを指す。ポリヌクレオチドの場合、バリアントは、参照ポリヌクレオチドと比較して、５’末端、３’末端、および／または１つ以上の内部部位における１つ以上のヌクレオチドの欠失、置換、付加を有し得る。バリアントと参照ポリヌクレオチドとの間の配列の類似性および／または差異は、当該技術分野で既知である従来の技術、例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）およびハイブリダイゼーション技術を使用して検出することができる。バリアントポリヌクレオチドには、例えば、部位特異的変異誘発を使用して生成されるものなどの合成由来のポリヌクレオチドも含まれる。一般に、ＤＮＡを含むが、これらに限定されないポリヌクレオチドのバリアントは、当業者によって既知である配列アラインメントプログラムによって決定される場合、参照ポリヌクレオチドに対して、少なくとも約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約８６％、約８７％、約８８％、約８９％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、またはそれより大きい配列同一性を有し得る。ポリペプチドの場合、バリアントは、参照ポリペプチドと比較して、１つ以上のアミノ酸の欠失、置換、付加を有し得る。バリアントと参照ポリペプチドとの間の配列の類似性および／または差異は、当該技術分野で既知である従来の技術、例えば、ウエスタンブロットを使用して検出することができる。一般に、ポリペプチドのバリアントは、当業者によって既知である配列アラインメントプログラムによって決定される場合、参照ポリペプチドに対して、少なくとも約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約８６％、約８７％、約８８％、約８９％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、またはそれより大きい配列同一性を有し得る。
「ジンクフィンガーＤＮＡ結合タンパク質」または「ジンクフィンガーヌクレオチド結合ドメイン」という用語は、本明細書で使用される場合、１つ以上のジンクフィンガーを介して配列特異的な方法でＤＮＡに結合し、１つ以上の亜鉛イオンの配位を介して構造が安定化される結合ドメイン内のアミノ酸配列の領域である、タンパク質、またはより大きなタンパク質内のドメインである。ジンクフィンガーＤＮＡ結合タンパク質という用語は、ジンクフィンガータンパク質またはＺＦＰと略記される。
「ジンクフィンガーヌクレアーゼタンパク質」または「ジンクフィンガーヌクレアーゼ」という用語は、本明細書で使用される場合、ＤＮＡ切断ドメイン（例えば、Ｆｏｋ Ｉ ＤＮＡ切断ドメイン）に直接的または間接的に連結されたジンクフィンガーＤＮＡ結合ドメイン（ＺＦＰ）を含むタンパク質を指す。ジンクフィンガーヌクレアーゼタンパク質という用語は、ジンクフィンガーヌクレアーゼまたはＺＦＮと略記される。切断ドメインは、ＺＦＰに直接接続され得る。あるいは、切断ドメインは、リンカーを介してＺＦＰに接続される。リンカー領域は、約１～１５０個のアミノ酸を含む配列である。あるいは、リンカー領域は、約６～５０個のヌクレオチドを含む配列である。この用語は、標的遺伝子を切断するために二量体化する１つのＺＦＮまたは一対のＺＦＮ（この対のメンバーは、「左および右」または「第１および第２」または「対」と称される）を含む。一対のＺＦＮは、「左および右」、「第１および第２」、または「対」と称することができ、二量体化して標的遺伝子を切断することができる。
「ジンクフィンガーヌクレアーゼバリアント」という用語は、本明細書で使用される場合、ツーインワンジンクフィンガーヌクレアーゼントを指す。
本明細書で使用される場合、疾患の進行を「遅らせる」または「遅延させる」とは、疾患の発症を予防、延期、妨害、遅延、遅滞、安定化、および／または延長することを指す。この遅れは、治療される疾患および／または個体の病歴に応じて、様々な長さの時間であり得る。
「症状」は、本明細書で使用される場合、対象が経験する正常な機能、感覚、または構造から逸脱する現象または感覚を指す。例えば、ＬＳＤを有する対象は、機能能力の低下、神経学的悪化、関節硬直、車椅子依存につながる不動性、および機械的人工呼吸器の必要な使用につながる呼吸困難を含むがこれらに限定されない症状を有し得る。これらの症状は、寿命の短縮につながる可能性がある。
プッシュプルドナー構築物
本開示は、治療用タンパク質の発現の改善を可能にするドナー構築物を提供する。これらのプッシュプルドナー構築物は、高い精度および効率で標的ゲノムに組み込むことができる。
したがって、一態様において、プッシュプルドナーポリペプチド構築物であって、５’から３’への方向で、ａ）第１の逆位末端反復（ＩＴＲ）ヌクレオチド配列と、ｂ）第１のポリペプチドをコードする第１のヌクレオチド配列と、ｃ）第２のポリペプチドをコードする第２のヌクレオチド配列と、ｄ）第２のＩＴＲヌクレオチド配列と、を含み、第１のポリペプチドをコードする第１のヌクレオチド配列が、第２のポリペプチドをコードする第２のヌクレオチド配列に対してテール－テールに配向され、第１のヌクレオチド配列および第２のヌクレオチド配列が、同じアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする、ポリヌクレオチド構築物が本明細書に開示される。プッシュプルドナーポリヌクレオチド構築物が、ゲノム遺伝子座に組み込まれるとき、ポリヌクレオチドは、２つの方向に組み込むことができるが、ポリペプチドをコードする２つのヌクレオチドのうちの１つのみが発現される（すなわち、転写および／または翻訳される）。したがって、ドナーポリヌクレオチドが第１の方向に組み込まれるとき、第１のヌクレオチド配列は、ゲノム遺伝子座に組み込まれた後に発現される。ドナーポリヌクレオチドが第２の方向に組み込まれるとき、第２のヌクレオチド配列がゲノム遺伝子座に組み込まれた後に発現される。
いくつかの実施形態において、第１のポリペプチドをコードする第１のヌクレオチド配列は、コドン多様化されている。いくつかの実施形態において、第１のポリペプチドをコードする第１のヌクレオチド配列は、コドン多様化されていない。いくつかの実施形態において、第２のポリペプチドをコードする第２のヌクレオチド配列は、コドン多様化されている。いくつかの実施形態において、第２のポリペプチドをコードする第２のヌクレオチド配列は、コドン多様化されていない。いくつかの実施形態において、第１のポリペプチドをコードする第１のヌクレオチド配列および第２のポリペプチドをコードする第２のヌクレオチド配列は、それぞれ独立してコドン多様化されている。いくつかの実施形態において、第１のポリペプチドをコードする第１のヌクレオチド配列も、第２のポリペプチドをコードする第２のヌクレオチド配列も、コドン多様化されていない。
いくつかの実施形態において、プッシュプルドナーポリヌクレオチド構築物は、ａ）第１のポリペプチドをコードする第１のヌクレオチド配列に作動可能に連結された第１のスプライスアクセプター配列と、ｂ）第２のポリペプチドをコードする第２のヌクレオチド配列に作動可能に連結された第２のスプライスアクセプター配列と、をさらに含む。スプライスアクセプター部位は、イントロンの３’部位、代替的な３’スプライス部位、エクソン内の部位、またはイントロン内の部位であってもよい。
いくつかの実施形態において、第１のスプライスアクセプター配列は、第９因子スプライスアクセプター（Ｆ９ＳＡ）、ＣＦＴＲスプライスアクセプター、ＣＯＬ５Ａ２スプライスアクセプター、ＮＦ１スプライスアクセプター、ＭＬＨ１スプライスアクセプター、およびアルブミン（ＡＬＢ）スプライスアクセプターから選択される。いくつかの実施形態において、第１のスプライスアクセプター配列は、第９因子スプライスアクセプター（Ｆ９ＳＡ）である。いくつかの実施形態において、第１のスプライスアクセプター配列は、ＣＦＴＲスプライスアクセプターである。いくつかの実施形態において、第１のスプライスアクセプター配列は、ＣＯＬ５Ａ２スプライスアクセプターである。いくつかの実施形態において、第１のスプライスアクセプター配列は、ＮＦ１スプライスアクセプターである。いくつかの実施形態において、第１のスプライスアクセプター配列は、ＭＬＨ１スプライスアクセプターである。いくつかの実施形態において、第１のスプライスアクセプター配列は、アルブミン（ＡＬＢ）スプライスアクセプターである。
いくつかの実施形態において、第２のスプライスアクセプター配列は、第９因子スプライスアクセプター（Ｆ９ＳＡ）、ＣＦＴＲスプライスアクセプター、ＣＯＬ５Ａ２スプライスアクセプター、ＮＦ１スプライスアクセプター、ＭＬＨ１スプライスアクセプター、およびアルブミン（ＡＬＢ）スプライスアクセプターから選択される。いくつかの実施形態において、第２のスプライスアクセプター配列は、第９因子スプライスアクセプター（Ｆ９ＳＡ）である。いくつかの実施形態において、第２のスプライスアクセプター配列は、ＣＦＴＲスプライスアクセプターである。いくつかの実施形態において、第２のスプライスアクセプター配列は、ＣＯＬ５Ａ２スプライスアクセプターである。いくつかの実施形態において、第２のスプライスアクセプター配列は、ＮＦ１スプライスアクセプターである。いくつかの実施形態において、第２のスプライスアクセプター配列は、ＭＬＨ１スプライスアクセプターである。いくつかの実施形態において、第２のスプライスアクセプター配列は、アルブミン（ＡＬＢ）スプライスアクセプターである。
いくつかの実施形態において、第１のスプライスアクセプターおよび第２のスプライスアクセプター部位は、それぞれ独立して、第９因子スプライスアクセプター（Ｆ９ＳＡ）である。
いくつかの実施形態において、第２のスプライスアクセプター配列は、第１のスプライスアクセプター配列のヌクレオチド配列の逆相補体であるヌクレオチド配列を含む。
いくつかの実施形態において、第１のスプライスアクセプター配列は、配列番号１７８に示されるヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態において、第１のスプライスアクセプター配列は、配列番号１８２に示されるヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態において、第２のスプライスアクセプター配列は、配列番号１７８に示されるヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態において、第２のスプライスアクセプター配列は、配列番号１８２に示されるヌクレオチド配列を含む。
いくつかの実施形態において、プッシュプルドナーポリヌクレオチド構築物は、ａ）第１のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列に作動可能に連結された第１のポリアデニル化（ポリＡ）シグナル配列と、第２のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列に作動可能に連結された第２のポリアデニル化（ポリＡ）シグナル配列と、をさらに含む。いくつかの実施形態において、第１のポリＡシグナル配列および第２のポリＡシグナル配列は、同じである。いくつかの実施形態において、第１のポリＡシグナル配列および第２のポリＡシグナル配列は、異なっている。
例示的なポリＡシグナル配列としては、限定されないが、ヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）ポリＡシグナル、ウシ成長ホルモン（ｂＧＨ）ポリＡシグナル、ＳＶ４０ポリＡシグナル、およびｒｂＧｌｏｂポリＡシグナルが挙げられる。いくつかの実施形態において、第１のポリＡシグナル配列は、ヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）ポリＡシグナル、ウシ成長ホルモン（ｂＧＨ）ポリＡシグナル、ＳＶ４０ポリＡシグナル、およびｒｂＧｌｏｂポリＡシグナルから選択される。いくつかの実施形態において、第１のポリアデニル化（ポリＡ）シグナル配列は、ヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）ポリＡシグナルである。いくつかの実施形態において、第１のポリＡシグナル配列は、ウシ成長ホルモン（ｂＧＨ）ポリＡシグナルである。いくつかの実施形態において、第１のポリＡシグナル配列は、ＳＶ４０ポリＡシグナルである。いくつかの実施形態において、第１のポリＡシグナル配列は、ｒｂＧｌｏｂポリＡシグナルである。
いくつかの実施形態において、第２のポリＡシグナル配列は、ヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）ポリＡシグナル、ウシ成長ホルモン（ｂＧＨ）ポリＡシグナル、ＳＶ４０ポリＡシグナル、およびｒｂＧｌｏｂポリＡシグナルから選択される。いくつかの実施形態において、第２のポリアデニル化（ポリＡ）シグナル配列は、ヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）ポリＡシグナルである。いくつかの実施形態において、第２のポリＡシグナル配列は、ウシ成長ホルモン（ｂＧＨ）ポリＡシグナルである。いくつかの実施形態において、第２のポリＡシグナル配列は、ＳＶ４０ポリＡシグナルである。いくつかの実施形態において、第２のポリＡシグナル配列は、ｒｂＧｌｏｂポリＡシグナルである。
いくつかの実施形態において、第１の（ポリＡ）シグナル配列は、ヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）ポリＡシグナルであり、第２のポリＡシグナル配列は、ウシ成長ホルモン（ｂＧＨ）ポリＡシグナルである。いくつかの実施形態において、第１の（ポリＡ）シグナル配列は、ウシ成長ホルモン（ｂＧＨ）ポリＡシグナルであり、第２のポリＡシグナル配列は、ヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）ポリＡシグナルである。いくつかの実施形態において、第１の（ポリＡ）シグナル配列は、ヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）ポリＡシグナルであり、第２のポリＡシグナル配列は、ＳＶ４０ポリＡシグナルである。いくつかの実施形態において、第１の（ポリＡ）シグナル配列は、ＳＶ４０ポリＡシグナルであり、第２のポリＡシグナル配列は、ヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）ポリＡシグナルである。いくつかの実施形態において、第１の（ポリＡ）シグナル配列は、ヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）ポリＡシグナルであり、第２のポリＡシグナル配列は、ｒｂＧｌｏｂポリＡシグナルである。いくつかの実施形態において、第１の（ポリＡ）シグナル配列は、ｒｂＧｌｏｂポリＡシグナルであり、第２のポリＡシグナル配列は、ヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）ポリＡシグナルである。いくつかの実施形態において、第１の（ポリＡ）シグナル配列は、ウシ成長ホルモン（ｂＧＨ）ポリＡシグナルであり、第２のポリＡシグナル配列は、ＳＶ４０ポリＡシグナルである。いくつかの実施形態において、第１の（ポリＡ）シグナル配列は、ＳＶ４０ポリＡシグナルであり、第２のポリＡシグナル配列は、ウシ成長ホルモン（ｂＧＨ）ポリＡシグナルである。いくつかの実施形態において、第１の（ポリＡ）シグナル配列は、ウシ成長ホルモン（ｂＧＨ）ポリＡシグナルであり、第２のポリＡシグナル配列は、ｒｂＧｌｏｂポリＡシグナルである。いくつかの実施形態において、第１の（ポリＡ）シグナル配列は、ｒｂＧｌｏｂポリＡシグナルであり、第２のポリＡシグナル配列は、ウシ成長ホルモン（ｂＧＨ）ポリＡシグナルである。いくつかの実施形態において、第１の（ポリＡ）シグナル配列は、ＳＶ４０ポリＡシグナルであり、第２のポリＡシグナル配列は、ｒｂＧｌｏｂポリＡシグナルである。いくつかの実施形態において、第１の（ポリＡ）シグナル配列は、ｒｂＧｌｏｂポリＡシグナルであり、第２のポリＡシグナル配列は、ＳＶ４０ポリＡシグナルである。
いくつかの実施形態において、第１のポリＡシグナル配列は、配列番号１７９に示されるヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態において、第１のポリＡシグナル配列は、配列番号１８０に示されるヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態において、第２のポリＡシグナル配列は、配列番号１７９に示されるヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態において、第２のポリＡシグナル配列は、配列番号１８０に示されるヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態において、第１のポリＡシグナル配列は、配列番号１７９に示されるヌクレオチド配列を含み、第２のポリＡシグナル配列は、配列番号１８０に示されるヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態において、第１のポリＡシグナル配列は、配列番号１８０に示されるヌクレオチド配列を含み、第２のポリＡシグナル配列は、配列番号１７９に示されるヌクレオチド配列を含む。
いくつかの実施形態において、プッシュプルドナーポリヌクレオチド構築物は、第１および第２の逆位末端反復（ＩＴＲ）配列を含む。ＩＴＲは、その後にその逆相補体が続くヌクレオチド配列から構成される。逆位反復の例としては、直接反復、タンデム反復、およびパリンドロームが挙げられる。ＩＴＲは、５’ＩＴＲ、３’ＩＴＲ、またはこれらの両方であり得る。ＩＴＲは、ウイルス構築物の宿主ゲノムへの組み込み、および宿主ゲノムからのウイルス構築物のレスキューにおいて役割を果たす。
いくつかの実施形態において、第１のＩＴＲ配列は、配列番号１７７に示されるヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態において、第１のＩＴＲ配列は、配列番号１８１に示されるヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態において、第２のＩＴＲ配列は、配列番号１７７に示されるヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態において、第２のＩＴＲは、配列番号１８１に示されるヌクレオチド配列を含む。
いくつかの実施形態において、本開示のプッシュプルドナーポリヌクレオチド構築物は、５’から３’への方向に、ａ）５’ＩＴＲと、ｂ）第１のスプライスアクセプター配列と、ｃ）第１のポリペプチドをコードする第１のヌクレオチド配列と、ｄ）第１のポリアデニル化（ポリＡ）シグナル配列と、ｅ）第２のポリＡシグナル配列と、ｆ）第２のポリペプチドをコードする第２のヌクレオチド配列と、ｇ）第２のスプライスアクセプター配列と、ｈ）３’ＩＴＲと、を含む。第２のポリＡシグナル配列、第２のヌクレオチド配列、および第２のスプライスアクセプター配列は、第１のスプライスアクセプター配列、第１のヌクレオチド配列、および第１のポリＡシグナル配列に対してテール－テールに配向される。プッシュプルドナーポリヌクレオチド構築物が、ゲノム遺伝子座に組み込まれるとき、ポリヌクレオチドは、２つの方向に組み込むことができるが、ポリペプチドをコードする２つのヌクレオチドのうちの１つのみが発現される（すなわち、転写および／または翻訳される）。したがって、一方の方向において、第１のヌクレオチド配列は、ゲノム遺伝子座に組み込まれた後に発現される。別の方向において、第２のヌクレオチド配列は、ゲノム遺伝子座に組み込まれた後に発現される。
いくつかの実施形態において、第１のポリペプチドをコードする第１の配列または第２のポリペプチドをコードする第２のヌクレオチド配列は、治療用ポリペプチドをコードする。いくつかの実施形態において、治療用ポリペプチドとしては、限定されないが、イズロン酸－２－スルファターゼ（ＩＤＳ）、アルファ－Ｌ－イズロニダーゼ（ＩＤＵＡ）、アルファ－Ｄ－マンノシダーゼ、Ｎ－アスパルチル－ベータ－グルコサミニダーゼ、リソソーム酸リパーゼ、シスチノシン、リソソーム関連膜タンパク質２、アルファ－ガラクトシダーゼＡ、酸セラミダーゼ、アルファフコシダーゼ、カテプシンＡ、酸ベータ－グルコセレブロシダーゼ、ベータガラクトシダーゼ、ベータヘキソサミニダーゼＡ、ベータヘキソサミニダーゼＢ、ベータヘキソサミニダーゼ、ＧＭ２ガングリオシド活性化因子、ＧＬｃＮＡｃ－１－ホスホトランスフェラーゼ、ベータ－ガラクトシルセラミダーゼ、アリールスルファターゼＡ、ヘパランＮ－スルファターゼ、アルファ－Ｎ－アセチルグルコサミニダーゼ、アセチルＣｏＡ：アルファ－グルコサミニドアセチルトランスフェラーゼ、Ｎ－アセチルグルコサミン－６－スルファターゼ、アリールスルファターゼＢ、ベータ－グルクロニダーゼ、ヒアルロニダーゼ、ノイラミニダーゼ、ムコリピン－１、ホルミルグリシン生成酵素、パルミトイル－タンパク質チオエステラーゼ１、トリペプチジルペプチダーゼ１、ＣＬＮ３タンパク質、システインストリングタンパク質アルファ、ＣＬＮ５タンパク質、ＣＬＮ６タンパク質、ＣＬＮ７タンパク質、ＣＬＮ８タンパク質、酸スフィンゴミエリナーゼ、ＮＰＣ １、ＮＰＣ ２、フェニルアラニンヒドロキシラーゼ、酸アルファ－グルコシダーゼ、カテプシンＫ、シアリン、アルファ－Ｎ－アセチルガラクトサミニダーゼ、グルコース－６－ホスファターゼ、溶質キャリアファミリー３７メンバー４、アルギニノコハク酸シンターゼ１、溶質キャリアファミリー２５メンバー１３、およびオルニチントランスカルバミラーゼ（ＯＴＣ）が挙げられる。
いくつかの実施形態において、第１のポリペプチドをコードする第１のヌクレオチド配列および／または第２のポリペプチドをコードする第２のヌクレオチド配列としては、限定されないが、ＭＡＮ２Ｂ１、ＡＧＡ、ＬＩＰＡ、ＣＴＮＳ、ＬＡＭＰ２、ＧＬＡ、ＡＳＡＨ１、ＦＵＣＡ１、ＣＴＳＡ、ＧＢＡ、ＧＬＢ１、ＨＥＸＢ、ＨＥＸＡ、ＧＭ２Ａ、ＧＮＰＴＡＢ、ＧＡＬＣ、ＡＲＳＡ、ＩＤＵＡ、ＩＤＳ、ＳＧＳＨ、ＮＡＧＬＵ、ＧＳＮＡＴ、ＧＮＳ、ＧＡＬＮＳ、ＧＬＢ１、ＡＲＳＢ、ＧＵＳＢ、ＨＹＡＬ１、ＮＥＵ１、ＧＮＰＴＧ、ＭＣＯＬＮ１、ＳＵＭＦ１、ＰＰＴ１、ＴＰＰ１、ＣＬＮ３、ＤＮＡＪＣ５、ＣＬＮ５、ＣＬＮ６、ＣＬＮ７、ＣＬＮ８、ＳＭＰＤ１、ＳＭＰＤ１、ＮＰＣ１、ＮＰＣ２、ＰＡＨ、ＧＡＡ、ＣＴＳＫ、ＳＬＣ１７Ａ５、ＮＡＧＡ、Ｇ６ＰＣ、ＳＬＣ３７Ａ４、ＡＳＳ１、ＳＬＣ２５Ａ１３、およびＯＴＣが挙げられる。
いくつかの実施形態において、第１のポリペプチドをコードする第１のヌクレオチド配列は、配列番号１８４～１９３に示されるヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態において、第１のポリペプチドをコードする第１のヌクレオチド配列は、配列番号１８４に示されるヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態において、第１のポリペプチドをコードする第１のヌクレオチド配列は、配列番号１８５に示されるヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態において、第１のポリペプチドをコードする第１のヌクレオチド配列は、配列番号１８６に示されるヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態において、第１のポリペプチドをコードする第１のヌクレオチド配列は、配列番号１８７に示されるヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態において、第１のポリペプチドをコードする第１のヌクレオチド配列は、配列番号１８８に示されるヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態において、第１のポリペプチドをコードする第１のヌクレオチド配列は、配列番号１８９に示されるヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態において、第１のポリペプチドをコードする第１のヌクレオチド配列は、配列番号１９０に示されるヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態において、第１のポリペプチドをコードする第１のヌクレオチド配列は、配列番号１９１に示されるヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態において、第１のポリペプチドをコードする第１のヌクレオチド配列は、配列番号１９２に示されるヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態において、第１のポリペプチドをコードする第１のヌクレオチド配列は、配列番号１９３に示されるヌクレオチド配列を含む。
いくつかの実施形態において、第２のポリペプチドをコードする第２のヌクレオチド配列は、配列番号１８４～１９３に示されるヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態において、第２のポリペプチドをコードする第２のヌクレオチド配列は、配列番号１８４に示されるヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態において、第２のポリペプチドをコードする第２のヌクレオチド配列は、配列番号１８５に示されるヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態において、第２のポリペプチドをコードする第２のヌクレオチド配列は、配列番号１８６に示されるヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態において、第２のポリペプチドをコードする第２のヌクレオチド配列は、配列番号１８７に示されるヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態において、第２のポリペプチドをコードする第２のヌクレオチド配列は、配列番号１８８に示されるヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態において、第２のポリペプチドをコードする第２のヌクレオチド配列は、配列番号１８９に示されるヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態において、第２のポリペプチドをコードする第２のヌクレオチド配列は、配列番号１９０に示されるヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態において、第２のポリペプチドをコードする第２のヌクレオチド配列は、配列番号１９１に示されるヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態において、第２のポリペプチドをコードする第２のヌクレオチド配列は、配列番号１９２に示されるヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態において、第２のポリペプチドをコードする第２のヌクレオチド配列は、配列番号１９３に示されるヌクレオチド配列を含む。
いくつかの実施形態において、ドナー構築物は、配列番号１７３～１７６のうちのいずれか１つに示されるヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態において、ドナー構築物は、配列番号１７３に示されるヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態において、ドナー構築物は、配列番号１７４に示されるヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態において、ドナー構築物は、配列番号１７５に示されるヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態において、ドナー構築物は、配列番号１７６に示されるヌクレオチド配列を含む。
いくつかの実施形態において、本開示のドナー構築物のヌクレオチド配列は、当業者によって既知である配列アラインメントプログラムによって決定される場合、本明細書に開示される配列のいずれかに対して、少なくとも約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、またはそれより大きい配列同一性を含む。いくつかの実施形態において、本開示のドナー構築物のアミノ酸配列は、当業者によって既知である配列アラインメントプログラムによって決定される場合、本明細書に開示される配列のいずれかに対して、少なくとも約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、またはそれより大きい配列同一性を含む。
ベクターおよび送達系
一態様において、本開示は、本明細書に記載のプッシュプルドナーポリヌクレオチド構築物を含むベクターを提供する。本明細書に記載のプッシュプルドナーポリヌクレオチド構築物は、プラスミドベクター、ミニサークルおよび線状ＤＮＡ形態、非ウイルスベクター、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター、ポックスウイルスベクター、ヘルペスウイルスベクター、およびアデノ随伴ウイルスベクターなどを含むがこれらに限定されない、任意の好適なベクター系によってインビボまたはエクスビボで送達され得る。参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる米国特許第６，５３４，２６１号、同第６，６０７，８８２号、同第６，８２４，９７８号、同第６，９３３，１１３号、同第６，９７９，５３９号、同第７，０１３，２１９号、および同第７，１６３，８２４号も参照されたい。さらに、これらのベクターのいずれも、治療に必要な配列のうちの１つ以上を含み得ることが明らかであろう。上述のポリヌクレオチド構築物またはベクターを含有する宿主細胞もまた提供される。前述のプッシュプルドナーポリヌクレオチド構築物、ベクター、または薬学的組成物のいずれかは、本明細書に開示される方法に使用され得る。
ウイルスベクター系も使用され得る。本明細書に開示されるプッシュプルドナーポリヌクレオチド構築物、導入遺伝子、ジンクフィンガータンパク質（ＺＦＰ）およびジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）の送達のためのウイルスベースの系としては、遺伝子導入のためのレトロウイルス、レンチウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ワクシニアおよび単純ヘルペスウイルスベクターが含まれるが、これらに限定されない。宿主ゲノムへの組み込みは、レトロウイルス、レンチウイルス、およびアデノ随伴ウイルスの遺伝子導入法で可能であり、多くの場合、挿入された導入遺伝子の長期発現をもたらす。さらに、多くの異なる細胞型および標的組織において、高い形質導入効率が測定されている。
いくつかの実施形態において、アデノ随伴ウイルス（「ＡＡＶ」）ベクターもまた、本明細書に記載されるプッシュプルドナー構築物またはジンクフィンガーヌクレアーゼ構築物を用いて細胞を形質導入するために使用される。非限定的な例であるＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ８、ＡＡＶ ８．２、ＡＡＶ９およびＡＡＶ ｒｈ１０、ならびにＡＡＶ２／８、ＡＡＶ２／５、およびＡＡＶ２／６などの偽型ＡＡＶを含む、使用可能なＡＡＶ血清型も、本発明に従って使用され得る。いくつかの実施形態において、ＡＡＶは、ＡＡＶ１である。いくつかの実施形態において、ＡＡＶは、ＡＡＶ２である。いくつかの実施形態において、ＡＡＶは、ＡＡＶ３である。いくつかの実施形態において、ＡＡＶは、ＡＡＶ４である。いくつかの実施形態において、ＡＡＶは、ＡＡＶ５である。いくつかの実施形態において、ＡＡＶは、ＡＡＶ６である。いくつかの実施形態において、ＡＡＶは、ＡＡＶ８である。いくつかの実施形態において、ＡＡＶは、ＡＡＶ８．２である。いくつかの実施形態において、ＡＡＶは、ＡＡＶ９である。いくつかの実施形態において、ＡＡＶは、ＡＡＶｒｈ１０である。いくつかの実施形態において、ＡＡＶは、ＡＡＶ２／５である。いくつかの実施形態において、ＡＡＶは、ＡＡＶ２／６である。
複製欠損組換えアデノウイルスベクター（Ａｄ）は、高力価で産生され、多くの異なる細胞型に容易に感染し得る。ほとんどのアデノウイルスベクターが、導入遺伝子がＡｄ Ｅ１ａ、Ｅ１ｂ、および／またはＥ３遺伝子を置き換えるように操作され、その後、複製欠損ベクターは、欠失した遺伝子機能をトランスで供給するヒト２９３細胞において増殖される。Ａｄベクターは、肝臓、腎臓、および筋肉に見出されるものなどの非分裂の分化細胞を含む複数の種類の組織をインビボで形質導入し得る。従来のＡｄベクターは、高い運搬能力を有する。
パッケージング細胞を使用して、宿主細胞に感染することができるウイルス粒子（例えば、ＡＡＶ粒子）を形成する。かかる細胞には、アデノウイルスをパッケージングする２９３細胞、およびレトロウイルスをパッケージングするψ２細胞またはＰＡ３１７細胞が含まれる。遺伝子療法で使用されるウイルスベクターは、通常、核酸ベクターをウイルス粒子にパッケージングするプロデューサー細胞株によって生成される。ベクターは、典型的には、パッケージングおよびその後の宿主への組み込み（適用可能な場合）に必要な最小のウイルス配列を含み、他のウイルス配列は、発現されるタンパク質をコードする発現カセットによって置き換えられる。欠損しているウイルス機能は、パッケージング細胞株によってｔｒａｎｓで供給される。例えば、遺伝子療法で使用されるＡＡＶベクターは、典型的には、宿主ゲノムへのパッケージングおよび組み込みに必要なＡＡＶゲノム由来の逆位末端反復（ＩＴＲ）配列のみを有する。ウイルスＤＮＡは、他のＡＡＶ遺伝子、すなわちｒｅｐおよびｃａｐをコードするが、ＩＴＲ配列を欠くヘルパープラスミドを含む細胞株においてパッケージングされる。細胞株はまた、ヘルパーとしてのアデノウイルスに感染する。ヘルパーウイルスは、ＡＡＶベクターの複製およびヘルパープラスミド由来のＡＡＶ遺伝子の発現を促進する。ヘルパープラスミドは、ＩＴＲ配列を欠くため、かなりの量でパッケージ化されていない。アデノウイルスによる汚染は、例えば、アデノウイルスがＡＡＶよりも感受性が高い熱処理によって低減され得る。
非ウイルスベクター送達系としては、ＤＮＡプラスミド、裸の核酸、ｍＲＮＡ、およびリポソームまたはポロキサマーなどの送達ビヒクルと複合体化された核酸が挙げられる。核酸の非ウイルス送達の方法としては、電気穿孔、リポフェクション、マイクロインジェクション、バイオリスティクス、ウイロソーム、リポソーム、イムノリポソーム、ポリカチオン、または脂質：核酸コンジュゲート、裸のＤＮＡ、人工ビリオン、および薬剤強化されたＤＮＡの取り込みが挙げられる。例えば、Ｓｏｎｉｔｒｏｎ ２０００システム（Ｒｉｃｈ－Ｍａｒ）を使用したソノポレーションも、核酸の送達に使用することができる。
追加の例示的な核酸送達系には、Ａｍａｘａ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（Ｃｏｌｏｇｎｅ、Ｇｅｒｍａｎｙ）、Ｍａｘｃｙｔｅ，Ｉｎｃ．（Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、Ｍａｒｙｌａｎｄ）、ＢＴＸ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ（Ｈｏｌｌｉｓｔｏｎ、ＭＡ）、およびＣｏｐｅｒｎｉｃｕｓ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ Ｉｎｃ，（例えば、米国特許第６，００８，３３６号を参照）によって提供されるものが含まれる。リポフェクションは、例えば、米国特許第５，０４９，３８６号、同第４，９４６，７８７号、および同第４，８９７，３５５号に記載されており、リポフェクション試薬は、市販されている（例えば、Ｔｒａｎｓｆｅｃｔａｍ（商標）およびＬｉｐｏｆｅｃｔｉｎ（商標））。ポリヌクレオチドの効率的な受容体認識リポフェクションに好適なカチオン性脂質および中性脂質としては、Ｆｅｌｇｎｅｒ、国際特許公開第９１／１７４２４号および同第９１／１６０２４号のものが挙げられる。
追加の送達方法としては、ＥｎＧｅｎｅＩＣ送達ビヒクル（ＥＤＶ）に送達される核酸をパッケージングする使用が挙げられる。これらのＥＤＶは、抗体の一方のアームが標的組織に対する特異性を有し、他方がＥＤＶに対する特異性を有する二重特異性抗体を使用して、標的組織に特異的に送達される。抗体は、ＥＤＶを標的細胞表面にもたらし、次いで、ＥＤＶは、エンドサイトーシスによって細胞にもたらされる。細胞内に入ると、内容物が放出される（ＭａｃＤｉａｒｍｉｄ ｅｔ ａｌ．（２００９）Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２７（７）：６４３を参照されたい）。
遺伝子療法ベクターは、以下に記載されるように、個々の対象への投与、典型的には全身投与（例えば、静脈内、腹腔内、筋肉内、皮下、または頭蓋内注入）または局所適用によって、インビボで送達され得る。あるいは、ベクターは、個々の対象から摘出された細胞（例えば、リンパ球、骨髄穿刺液、組織生検）またはユニバーサルドナー造血幹細胞などの細胞にエクスビボで送達され、続いて、通常、ベクターを組み込んだ細胞の選択後に、細胞を対象に再移植することができる。
本明細書に開示するドナーまたはヌクレアーゼ構築物を含むベクター（例えば、レトロウイルス、アデノウイルス、リポソームなど）はまた、インビボでの細胞の形質導入のために生物に直接投与することができる。あるいは、裸のＤＮＡを投与することができる。投与は、これらに限定されないが、注射、注入、局所適用、およびエレクトロポレーションを含む、血液または組織細胞との最終的な接触に分子を導入するために通常使用される経路のうちのいずれかによるものである。そのような核酸を投与する好適な方法が利用可能であり、当業者に周知であり、１つより多い経路を使用して特定の組成物を投与することができるが、特定の経路は、多くの場合、別の経路よりも即時により効果的な反応を提供することができる。
ヌクレアーゼコード配列およびドナー構築物は、同じまたは異なる系を用いて送達され得ることが明らかであろう。例えば、ドナーポリヌクレオチドは、プラスミドによって保有され得る一方、１つ以上のヌクレアーゼは、ＡＡＶベクターによって保有され得る。特定の実施形態において、ヌクレアーゼおよびドナーは、両方ともＡＡＶベクターを使用して送達される（例えば、両方ともＡＡＶ２を使用して、両方ともＡＡＶ６を使用して、両方ともＡＡＶ２／６を使用して、ヌクレアーゼはＡＡＶ２、ＡＡＶ６、またはＡＡＶ２／６を使用して、ドナーはＡＡＶ２、ＡＡＶ６、またはＡＡＶ２／６を使用して）。さらに、異なるベクターは、同じまたは異なる経路（筋肉内注射、静脈内注射、腹腔内投与、および／または筋肉内注射）によって投与することができる。ベクターは、同時にまたは任意の順序で送達され得る。
薬学的組成物
一態様において、本開示は、本明細書に記載の核酸、タンパク質またはベクターのいずれかを含む薬学的組成物（「製剤」または「製造物品」または「薬物製品」または「薬物製品のセット」とも称される）に関する。いくつかの実施形態において、薬学的組成物は、本明細書に開示されるプッシュプルドナーポリヌクレオチド構築物を含む。いくつかの実施形態において、薬学的組成物は、本明細書に開示されるプッシュプルドナーポリヌクレオチド構築物を含み、本明細書に開示される第１のジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）をコードする第１のポリヌクレオチドと、第２のジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）をコードする第２のポリヌクレオチドと、をさらに含む。いくつかの実施形態において、薬学的組成物は、本明細書に開示されるプッシュプルドナーポリヌクレオチド構築物を含み、本明細書に開示される１つ以上のジンクフィンガーヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチドをさらに含む。特定の実施形態において、細胞のゲノムのインビボ切断および／または標的化切断に使用されるヌクレアーゼのうちの１つ以上のＤＮＡ結合ドメインは、ジンクフィンガータンパク質を含む。いくつかの実施形態において、ジンクフィンガータンパク質は、選択した標的部位に結合するように操作されている点において、天然に存在しない。例示的なジンクフィンガータンパク質は、例えば、Ｂｅｅｒｌｉ ｅｔ ａｌ．（２００２）Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０：１３５－１４１、Ｐａｂｏ ｅｔ ａｌ．（２００１）Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．７０：３１３－３４０、Ｉｓａｌａｎ ｅｔ ａｌ．（２００１）Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１９：６５６－６６０、Ｓｅｇａｌ ｅｔ ａｌ．（２００１）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１２：６３２－６３７、Ｃｈｏｏ ｅｔ ａｌ．（２０００）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．１０：４１１－４１６、米国特許第８，８４１，２６０号、同第８，７７２，４５３号、同第８，７０３，４８９号、同第８，４０９，８６１号、同第７，８８８，１２１号、同第７，３６１，６３５号、同第７，２６２，０５４号、同第７，２５３，２７３号、同第７，１５３，９４９号、同第７，０７０，９３４号、同第７，０６７，３１７号、同第７，０３０，２１５号、同第６，９０３，１８５号、同第６，７９４，１３６号、同第６，６８９，５５８号、同第６，５９９，６９２号、同第６，５３４，２６１号、同第６，５０３，７１７号、同第６，４７９，６２６号、同第６，４５３，２４２号、同第６，２００，７５９号、同第６，１４０，０８１号、同第６，０１３，４５３号、同第６，００７，９８８号、同第５，７８９，５３８号、同第５，９２５，５２３号、および米国特許出願公開第２０２０／０２４６４８６号、同第２００５／００６４４７４号、同第２００７／０２１８５２８号、ならびに同第２００５／０２６７０６１号に記載されており、すべては参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。
いくつかの実施形態において、薬学的組成物は、ツーインワンジンクフィンガーヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチドを含む。
いくつかの実施形態において、薬学的組成物は、本明細書に記載のベクターを含む。いくつかの実施形態において、薬学的組成物は、本明細書に記載のプッシュプルドナーポリヌクレオチド構築物を含むベクターを含み、本明細書に開示される第１のジンクフィンガーヌクレアーゼをコードする第１のポリヌクレオチドを含むベクターと、第２のジンクフィンガーヌクレアーゼをコードする第２のポリヌクレオチドを含むベクターと、をさらに含む。いくつかの実施形態において、薬学的組成物は、本明細書に記載のプッシュプルドナーポリヌクレオチド構築物を含むベクターを含むベクターを含み、本明細書に開示される１つ以上のジンクフィンガーヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチドを含むベクターをさらに含む。いくつかの実施形態において、薬学的組成物は、本明細書に記載のプッシュプルドナーポリヌクレオチド構築物を含むベクターを含むベクターを含み、本明細書に開示されるツーインワンジンクフィンガーヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチドを含むベクターをさらに含む。
エクスビボおよびインビボ投与の両方のための薬学的組成物は、液体または乳化液体中の懸濁液を含む。活性成分は、多くの場合、薬学的に許容され、活性成分と適合する賦形剤と混合される。好適な賦形剤には、例えば、水、生理食塩水、デキストロース、グリセロール、エタノールなど、およびそれらの組み合わせが含まれる。加えて、組成物は、薬学的組成物の有効性を高める、湿潤剤または乳化剤、ｐＨ緩衝剤、安定剤、または他の試薬などの少量の補助物質を含有し得る。
薬学的に許容される担体は、部分的に、投与される特定の組成物、ならびに組成物を投与するために使用される特定の方法によって決定される。したがって、利用可能な薬学的組成物の多種多様な好適な製剤が存在する（例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１７ｔｈ ｅｄ．，１９８９を参照されたい）。
薬学的組成物中の、ジンクフィンガーヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチドと、本明細書に開示されるプッシュプルドナー構築物との比率は、例えば、１：０．１～１：４０まで様々である。薬学的組成物中の、ジンクフィンガーヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチドと、本明細書に開示されるプッシュプルドナー構築物との比率は、例えば、３：２～１：４まで様々である。薬学的組成物中の第１のジンクフィンガーヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチド：第２のジンクフィンガーをコードするポリヌクレオチド：プッシュプルドナーポリヌクレオチド構築物の比率は、例えば、０．１：０．１：２０～１：１：４０まで様々である。薬学的組成物中の第１のジンクフィンガーヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチド：第２のジンクフィンガーをコードするポリヌクレオチド：プッシュプルドナーポリヌクレオチド構築物の比率は、３：３：４～１：１：８まで様々である。薬学的組成物中の第１のジンクフィンガーヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチド：第２のジンクフィンガーをコードするポリヌクレオチド：プッシュプルドナーポリヌクレオチド構築物の比率は、限定されないが、例えば、１：１：８、１：１：４、１：１：２、および３：３：４を含む。いくつかの実施形態において、薬学的組成物中の第１のジンクフィンガーヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチド：第２のジンクフィンガーをコードするポリヌクレオチド：プッシュプルドナーポリヌクレオチド構築物の比率は、１：１：８である。いくつかの実施形態において、薬学的組成物中の第１のジンクフィンガーヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチド：第２のジンクフィンガーをコードするポリヌクレオチド：プッシュプルドナーポリヌクレオチド構築物の比率は、１：１：４である。いくつかの実施形態において、薬学的組成物中の第１のジンクフィンガーヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチド：第２のジンクフィンガーをコードするポリヌクレオチド：プッシュプルドナーポリヌクレオチド構築物の比率は、１：１：２である。いくつかの実施形態において、薬学的組成物中の第１のジンクフィンガーヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチド：第２のジンクフィンガーをコードするポリヌクレオチド：プッシュプルドナーポリヌクレオチド構築物の比率は、３：３：４である。
薬学的組成物中の、ジンクフィンガーヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチドと、本明細書に開示されるプッシュプルドナー構築物との比率は、例えば、１：０．１～１：４０まで様々である。いくつかの実施形態において、組成物中のツーインワンジンクフィンガーヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチド：プッシュプルドナーポリヌクレオチド構築物の比率は、３：２から１：４まで様々である。いくつかの実施形態において、組成物中のツーインワンジンクフィンガーヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチド：プッシュプルドナーポリヌクレオチド構築物の比率は、限定されないが、例えば、１：４、１：２、１：１、および３：２を含む。いくつかの実施形態において、組成物中のツーインワンジンクフィンガーヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチド：プッシュプルドナーポリヌクレオチド構築物の比率は、１：４である。いくつかの実施形態において、薬学的組成物中のツーインワンジンクフィンガーヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチド：プッシュプルドナーポリヌクレオチド構築物の比率は、１：２である。いくつかの実施形態において、薬学的組成物中のツーインワンジンクフィンガーヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチド：プッシュプルドナーポリヌクレオチド構築物の比率は、１：１である。いくつかの実施形態において、薬学的組成物中のツーインワンジンクフィンガーヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチド：プッシュプルドナーポリヌクレオチド構築物の比率は、３：２である。
ジンクフィンガーヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチドを含むベクターと、本明細書に開示されるプッシュプルドナー構築物との比率は、例えば、１：０．１～１：４０まで様々である。ジンクフィンガーヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチドを含むベクターと、本明細書に開示されるプッシュプルドナー構築物を含むベクターとの比率は、例えば、３：２～１：４まで様々である。第１のジンクフィンガーヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチドを含むベクター：第２のジンクフィンガーをコードするポリヌクレオチド：プッシュプルドナーポリヌクレオチドの比率は、例えば、０．１：０．１：２０～１：１：４０まで様々である。第１のジンクフィンガーヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチドを含むベクター：第２のジンクフィンガーをコードするポリヌクレオチド：プッシュプルドナーポリヌクレオチド構築物の比率は、例えば、３：３：４～１：１：８まで様々である。第１のジンクフィンガーヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチドを含むベクター：第２のジンクフィンガーをコードするポリヌクレオチド：プッシュプルドナーポリヌクレオチド構築物の比率は、限定されないが、例えば、１：１：８、１：１：４、１：１：２、および３：３：４を含む。いくつかの実施形態において、第１のジンクフィンガーヌクレアーゼをコードする第１のポリヌクレオチドを含むベクター：第２のジンクフィンガーをコードする第２のポリヌクレオチドを含むベクター：プッシュプルドナーポリヌクレオチド構築物を含むベクターの比率は、１：１：８である。いくつかの実施形態において、第１のジンクフィンガーヌクレアーゼをコードする第１のポリヌクレオチドを含むベクター：第２のジンクフィンガーをコードする第２のポリヌクレオチドを含むベクター：プッシュプルドナーポリヌクレオチド構築物を含むベクターの比率は、１：１：４である。いくつかの実施形態において、第１のジンクフィンガーヌクレアーゼをコードする第１のポリヌクレオチドを含むベクター：第２のジンクフィンガーをコードする第２のポリヌクレオチドを含むベクター：プッシュプルドナーポリヌクレオチド構築物を含むベクターの比率は、１：１：２である。いくつかの実施形態において、第１のジンクフィンガーヌクレアーゼをコードする第１のポリヌクレオチドを含むベクター：第２のジンクフィンガーをコードする第２のポリヌクレオチドを含むベクター：プッシュプルドナーポリヌクレオチド構築物を含むベクターの比率は、３：３：４である。
ジンクフィンガーヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチドを含むベクターと、本明細書に開示されるプッシュプルドナー構築物との比率は、例えば、１：０．１～１：４０まで様々である。いくつかの実施形態において、ツーインワンジンクフィンガーヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチドを含むベクター：プッシュプルドナーポリヌクレオチド構築物の比率は、３：２から１：４まで様々である。いくつかの実施形態において、ツーインワンジンクフィンガーヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチドを含むベクター：プッシュプルドナーポリヌクレオチド構築物の比率は、限定されないが、例えば、１：４、１：２、１：１、および３：２を含む。いくつかの実施形態において、ツーインワンジンクフィンガーヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチドを含むベクター：プッシュプルドナーポリヌクレオチド構築物を含むベクターの比率は、１：４である。いくつかの実施形態において、ツーインワンジンクフィンガーヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチドを含むベクター：プッシュプルドナーポリヌクレオチド構築物を含むベクターの比率は、１：２である。いくつかの実施形態において、ツーインワンジンクフィンガーヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチドを含むベクター：プッシュプルドナーポリヌクレオチド構築物を含むベクターの比率は、１：１である。いくつかの実施形態において、ツーインワンジンクフィンガーヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチドを含むベクター：プッシュプルドナーポリヌクレオチド構築物を含むベクターの比率は、３：２である。
薬学的組成物は、任意の濃度の同じまたは異なる組成物の組み合わせを含む。例えば、薬物製品のセットを含む製造物品であって、第１のＺＦＮおよび第２のＺＦＮの対を有する精製されたＡＡＶベクターを含む第１の薬学的組成物と、疾患または障害の治療のための治療用タンパク質をコードする導入遺伝子を含むドナー配列を有する精製されたＡＡＶベクターを含む第２の薬学的組成物といった２つの別個の薬学的組成物を含む、製造物品が本明細書に提供される。薬学的組成物の一方または両方は、ＣａＣｌ２、ＭｇＣｌ２、ＮａＣｌ、スクロースおよびポロキサマー（例えば、ポロキサマーＰ１８８）を含有するリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で、または通常生理食塩水（ＮＳ）製剤で個別に製剤化され得る。いくつかの実施形態において、組成物は、およそ１．１５ｍｇ／ＭＬのリン酸ナトリウム、０．２ｍｇ／ｍＬのリン酸カリウム、８．０ｍｇ／ｍＬの塩化ナトリウム、０．２ｍｇ／ｍＬの塩化カリウム、０．１３ｍｇ／ｍＬの塩化カルシウム、および０．１ｍｇ／ｍＬの塩化マグネシウムを含む、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）を含む。ＰＢＳは、２．０５ｍｇ／ｍＬの塩化ナトリウム、１０ｍｇ／ｍＬ～１２ｍｇ／ｍＬのスクロース、および０．５～１．０ｍｇ／ｍＬのＫｏｌｌｉｐｈｏｒ（登録商標）（ポロキサマーまたはＰ１８８）でさらに改変される。さらに、製造物品は、任意の比率の使用され得る２つの薬学的組成物を含み得る。
ツーインワンジンクフィンガーヌクレアーゼ
いくつかの実施形態において、本明細書に開示される組成物および方法は、ツーインワンジンクフィンガーヌクレアーゼバリアントをコードする核酸を含む。いくつかの実施形態において、ツーインワンジンクフィンガーヌクレアーゼバリアントをコードする核酸は、ａ）第１のジンクフィンガーヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチドと、ｂ）第２のジンクフィンガーヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチドと、ｃ）２Ａ自己切断ペプチドをコードするポリヌクレオチドと、を含み、２Ａ自己切断ペプチドをコードするポリヌクレオチドが、第１のジンクフィンガーヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチドと第２のジンクフィンガーヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチドとの間に配置される。いくつかの実施形態において、第１のジンクフィンガーヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチドは、コドン多様化されている。いくつかの実施形態において、第１のジンクフィンガーヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチドは、コドン多様化されていない。いくつかの実施形態において、第２のジンクフィンガーヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチドは、コドン多様化されている。いくつかの実施形態において、第２のジンクフィンガーヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチドは、コドン多様化されていない。いくつかの実施形態において、第１のジンクフィンガーヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチドおよび第２のジンクフィンガーヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチドは、それぞれ独立して、コドン多様化されている。いくつかの実施形態において、第１のジンクフィンガーヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチドも、第２のジンクフィンガーヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチドも、コドン多様化されていない。
いくつかの実施形態において、ツーインワンジンクフィンガーヌクレアーゼバリアントをコードする核酸は、ａ）核局在化配列をコードする１つ以上のポリヌクレオチド配列、ｂ）５’ＩＴＲポリヌクレオチド配列、ｃ）エンハンサーポリヌクレオチド配列、ｄ）プロモーターポリヌクレオチド配列、ｅ）５’ＵＴＲポリヌクレオチド配列、ｆ）キメライントロンポリヌクレオチド配列、ｇ）エピトープタグをコードする１つ以上のポリヌクレオチド配列、ｈ）１つ以上の切断ドメイン、ｉ）転写後調節要素ポリヌクレオチド配列、ｊ）ポリアデニル化シグナル配列、ｋ）３’ＵＴＲポリヌクレオチド配列、およびｌ）３’ＩＴＲポリヌクレオチド配列のうちの１つ以上から選択される核酸配列をさらに含む。
いくつかの実施形態において、第１のジンクフィンガーヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチド配列は、配列番号１１６～１２９のうちのいずれか１つのヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態において、第１のジンクフィンガーヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチド配列は、配列番号１１６のヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態において、第１のジンクフィンガーヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチド配列は、配列番号１１７のヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態において、第１のジンクフィンガーヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチド配列は、配列番号１１８のヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態において、第１のジンクフィンガーヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチド配列は、配列番号１１９のヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態において、第１のジンクフィンガーヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチド配列は、配列番号１２０のヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態において、第１のジンクフィンガーヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチド配列は、配列番号１２１のヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態において、第１のジンクフィンガーヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチド配列は、配列番号１２２のヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態において、第１のジンクフィンガーヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチド配列は、配列番号１２３のヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態において、第１のジンクフィンガーヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチド配列は、配列番号１２４のヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態において、第１のジンクフィンガーヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチド配列は、配列番号１２５のヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態において、第１のジンクフィンガーヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチド配列は、配列番号１２６のヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態において、第１のジンクフィンガーヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチド配列は、配列番号１２７のヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態において、第１のジンクフィンガーヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチド配列は、配列番号１２８のヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態において、第１のジンクフィンガーヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチド配列は、配列番号１２９のヌクレオチド配列を含む。
いくつかの実施形態において、第１のジンクフィンガーヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチド配列は、配列番号１３６～１３７のうちのいずれか１つのアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態において、第１のジンクフィンガーヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチド配列は、配列番号１３６のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態において、第１のジンクフィンガーヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチド配列は、配列番号１３７のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含む。
いくつかの実施形態において、第２のジンクフィンガーヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチド配列は、配列番号１１６～１２９のうちのいずれか１つのヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態において、第２のジンクフィンガーヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチド配列は、配列番号１１６のヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態において、第２のジンクフィンガーヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチド配列は、配列番号１１７のヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態において、第２のジンクフィンガーヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチド配列は、配列番号１１８のヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態において、第２のジンクフィンガーヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチド配列は、配列番号１１９のヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態において、第２のジンクフィンガーヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチド配列は、配列番号１２０のヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態において、第２のジンクフィンガーヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチド配列は、配列番号１２１のヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態において、第２のジンクフィンガーヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチド配列は、配列番号１２２のヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態において、第２のジンクフィンガーヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチド配列は、配列番号１２３のヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態において、第２のジンクフィンガーヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチド配列は、配列番号１２４のヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態において、第２のジンクフィンガーヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチド配列は、配列番号１２５のヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態において、第２のジンクフィンガーヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチド配列は、配列番号１２６のヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態において、第２のジンクフィンガーヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチド配列は、配列番号１２７のヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態において、第２のジンクフィンガーヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチド配列は、配列番号１２８のヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態において、第２のジンクフィンガーヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチド配列は、配列番号１２９のヌクレオチド配列を含む。
いくつかの実施形態において、第２のジンクフィンガーヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチド配列は、配列番号１３６～１３７のうちのいずれか１つのアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態において、第２のジンクフィンガーヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチド配列は、配列番号１３６のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態において、第２のジンクフィンガーヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチド配列は、配列番号１３７のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含む。
いくつかの実施形態において、ツーインワンジンクフィンガーヌクレアーゼバリアントをコードする核酸は、１つ以上の切断ドメインをコードする１つ以上のポリヌクレオチド配列をさらに含む。任意の好適な切断ドメインは、ジンクフィンガーＤＮＡ結合ドメイン（例えば、ＺＦＰ）と会合され（例えば、作動可能に連結され）得る。いくつかの実施形態において、２つ以上の切断ドメインは、同じである。いくつかの実施形態において、２つ以上の切断ドメインは、同じアミノ酸配列を有する。いくつかの実施形態において、２つ以上の切断ドメインは、異なるアミノ酸配列を有する。いくつかの実施形態において、２つ以上の切断ドメインは、同じヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドによってコードされる。いくつかの実施形態において、２つ以上の切断ドメインは、異なるヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドによってコードされる。いくつかの実施形態において、切断ドメインは、二量体として活性であるＦｏｋ Ｉ切断ドメインを含む。いくつかの実施形態において、１つ以上のＦｏｋ Ｉ切断ドメインをコードするポリヌクレオチド配列は、コドン多様化されている。いくつかの実施形態において、１つ以上のＦｏｋ Ｉ切断ドメインをコードするポリヌクレオチド配列は、コドン多様化されていない。いくつかの実施形態において、第１のＦｏｋ Ｉ切断ドメインをコードするポリヌクレオチド配列は、第１のジンクフィンガーＤＮＡ結合タンパク質（ＺＦＰ）をコードするポリヌクレオチド配列に作動可能に連結されている。いくつかの実施形態において、第２のＦｏｋ Ｉ切断ドメインをコードするポリヌクレオチド配列は、第２のジンクフィンガーＤＮＡ結合タンパク質（ＺＦＰ）をコードするポリヌクレオチド配列に作動可能に連結されている。いくつかの実施形態において、第１のＦｏｋ Ｉ切断ドメインをコードするポリヌクレオチド配列は、第１のジンクフィンガーＤＮＡ結合タンパク質（ＺＦＰ）をコードするポリヌクレオチド配列に対して３’に位置している。いくつかの実施形態において、第２のＦｏｋ Ｉ切断ドメインをコードするポリヌクレオチド配列は、第２のジンクフィンガーＤＮＡ結合タンパク質（ＺＦＰ）をコードするポリヌクレオチド配列に対して３’に位置している。
いくつかの実施形態において、切断ドメインは、例えば、米国特許第８，７７２，４５３号、同第８，６２３，６１８号、同第８，４０９，８６１号、同第８，０３４，５９８号、同第７，９１４，７９６号、および同第７，８８８，１２１号に記載されているように、ホモ二量体化を最小限に抑制するか、または防止する１つ以上の操作された切断ハーフドメイン（二量体化ドメイン変異体とも称される）を含み、これらのすべての開示は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。Ｆｏｋ Ｉの４４６位、４４７位、４７９位、４８３位、４８４位、４８６位、４８７位、４９０位、４９１位、４９６位、４９８位、４９９位、５００位、５３１位、５３４位、５３７位、および５３８位のアミノ酸残基は、Ｆｏｋ Ｉ切断ハーフドメインの二量体化に影響を与えるためのすべての標的である。
偏性ヘテロ二量体を形成するＦｏｋ Ｉの例示的な操作された切断ハーフドメインとしては、第１の切断ハーフドメインがＦｏｋ Ｉの４９０位および５３８位のアミノ酸残基での変異を含み、第２の切断ハーフドメインがアミノ酸残基４８６位および４９９位での変異を含む対が挙げられる。
したがって、いくつかの実施形態において、４９０における変異は、Ｇｌｕ（Ｅ）をＬｙｓ（Ｋ）で置き換え、５３８における変異は、Ｉｓｏ（Ｉ）をＬｙｓ（Ｋ）で置き換え、４８６における変異は、Ｇｌｎ（Ｑ）をＧｌｕ（Ｅ）で置き換え、４９９位における変異は、Ｉｓｏ（Ｉ）をＬｙｓ（Ｋ）で置き換える。具体的には、本明細書に記載の操作された切断ハーフドメインは、１つの切断ハーフドメイン内の位置４９０（Ｅ→Ｋ）および５３８（Ｉ→Ｋ）を変異させて、「Ｅ４９０Ｋ：Ｉ５３８Ｋ」と表記される操作された切断ハーフドメインを生成することによって調製され、別の切断ハーフドメイン内の位置４８６（Ｑ→Ｅ）および４９９（Ｉ→Ｌ）を変異させて、「Ｑ４８６Ｅ：Ｉ４９９Ｌ」と表記される操作された切断ハーフドメインを生成することによって調製された。本明細書に記載の操作された切断ハーフドメインは、異常な切断が最小限に抑えられるか、または廃止される、偏性ヘテロ二量体変異体である。その開示は、参照によりその全体が組み込まれる、米国特許第７，９１４，７９６号および同第８，０３４，５９８号。いくつかの実施形態において、操作された切断ハーフドメインは、位置４８６、４９９、および４９６における変異（野生型Ｆｏｋ Ｉに対して番号付けされる）、例えば、位置４８６における野生型Ｇｌｎ（Ｑ）残基をＧｌｕ（Ｅ）残基で置き換える変異、位置４９９における野生型Ｉｓｏ（Ｉ）残基をＬｅｕ（Ｌ）残基で置き換える変異、ならびに位置４９６における野生型Ａｓｎ（Ｎ）残基をＡｓｐ（Ｄ）またはＧｌｕ（Ｅ）残基で置き換える変異（それぞれ、「ＥＬＤ」および「ＥＬＥ」ドメインとも称される）を含む。いくつかの実施形態において、操作された切断ハーフドメインは、位置４９０、５３８および５３７に変異（野生型Ｆｏｋ Ｉに対して番号付けされる）、例えば、位置４９０にある野生型Ｇｌｕ（Ｅ）残基をＬｙｓ（Ｋ）残基で置き換える変異、位置５３８にある野生型Ｉｓｏ（Ｉ）残基をＬｙｓ（Ｋ）残基で置き換える変異、および位置５３７にある野生型Ｈｉｓ（Ｈ）残基をＬｙｓ（Ｋ）残基またはＡｒｇ（Ｒ）残基で置き換える変異（それぞれ、「ＫＫＫ」および「ＫＫＲ」ドメインとも称される）を含む。いくつかの実施形態において、操作された切断ハーフドメインは、位置４９０および５３７に変異（野生型Ｆｏｋ Ｉに対して番号付けされる）、例えば、位置４９０にある野生型Ｇｌｕ（Ｅ）残基をＬｙｓ（Ｋ）残基で置き換える変異、ならびに位置５３７にある野生型Ｈｉｓ（Ｈ）残基をＬｙｓ（Ｋ）残基またはＡｒｇ（Ｒ）残基で置き換える変異（それぞれ、「ＫＩＫ」および「ＫＩＲ」ドメインとも称される）を含む。例えば、米国特許第８，７７２，４５３号を参照されたい。いくつかの実施形態において、操作された切断ハーフドメインは、「Ｓｈａｒｋｅｙ」および／または「Ｓｈａｒｋｅｙ変異」を含む（Ｇｕｏ ｅｔ ａｌ．（２０１０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４００（１）：９６－１０７を参照されたい）。
本明細書に記載の操作された切断ハーフドメインは、任意の好適な方法を使用して、例えば、米国特許第７，８８８，１２１号、同第７，９１４，７９６号、同第８，０３４，５９８号、および同第８，６２３，６１８号、ならびに米国特許出願公開第２０１９／０２４１８７７号および同第２０１８／００８７０７２号に記載の野生型切断ハーフドメイン（Ｆｏｋ Ｉ）の部位特異的変異誘発によって調製することができる。
いくつかの実施形態において、第１のジンクフィンガーヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチド配列は、配列番号７１～８４のうちのいずれか１つのヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態において、第１のジンクフィンガーヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチド配列は、配列番号７１のヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態において、第１のジンクフィンガーヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチド配列は、配列番号７２のヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態において、第１のジンクフィンガーヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチド配列は、配列番号７３のヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態において、第１のジンクフィンガーヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチド配列は、配列番号７４のヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態において、第１のジンクフィンガーヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチド配列は、配列番号７５のヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態において、第１のジンクフィンガーヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチド配列は、配列番号７６のヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態において、第１のジンクフィンガーヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチド配列は、配列番号７７のヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態において、第１のジンクフィンガーヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチド配列は、配列番号７８のヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態において、第１のジンクフィンガーヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチド配列は、配列番号７９のヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態において、第１のジンクフィンガーヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチド配列は、配列番号８０のヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態において、第１のジンクフィンガーヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチド配列は、配列番号８１のヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態において、第１のジンクフィンガーヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチド配列は、配列番号８２のヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態において、第１のジンクフィンガーヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチド配列は、配列番号８３のヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態において、第１のジンクフィンガーヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチド配列は、配列番号８４のヌクレオチド配列を含む。
いくつかの実施形態において、第２のジンクフィンガーヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチド配列は、配列番号７１～８４のうちのいずれか１つのヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態において、第２のジンクフィンガーヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチド配列は、配列番号７１のヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態において、第２のジンクフィンガーヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチド配列は、配列番号７２のヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態において、第２のジンクフィンガーヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチド配列は、配列番号７３のヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態において、第２のジンクフィンガーヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチド配列は、配列番号７４のヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態において、第２のジンクフィンガーヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチド配列は、配列番号７５のヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態において、第２のジンクフィンガーヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチド配列は、配列番号７６のヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態において、第２のジンクフィンガーヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチド配列は、配列番号７７のヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態において、第２のジンクフィンガーヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチド配列は、配列番号７８のヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態において、第２のジンクフィンガーヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチド配列は、配列番号７９のヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態において、第２のジンクフィンガーヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチド配列は、配列番号８０のヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態において、第２のジンクフィンガーヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチド配列は、配列番号８１のヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態において、第２のジンクフィンガーヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチド配列は、配列番号８２のヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態において、第２のジンクフィンガーヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチド配列は、配列番号８３のヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態において、第２のジンクフィンガーヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチド配列は、配列番号８４のヌクレオチド配列を含む。
いくつかの実施形態において、第１のジンクフィンガーヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチド配列は、配列番号１３０～１３１のうちのいずれか１つのアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態において、第１のジンクフィンガーヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチド配列は、配列番号１３０のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態において、第１のジンクフィンガーヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチド配列は、配列番号１３１のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含む。
いくつかの実施形態において、第２のジンクフィンガーヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチド配列は、配列番号１３０～１３１のうちのいずれか１つのアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態において、第２のジンクフィンガーヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチド配列は、配列番号１３０のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態において、第２のジンクフィンガーヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチド配列は、配列番号１３１のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含む。
いくつかの実施形態において、ツーインワンジンクフィンガーヌクレアーゼバリアントをコードする核酸は、１つ以上の核局在化配列（ＮＬＳ）をコードする１つ以上のヌクレオチド配列をさらに含む配列。いくつかの実施形態において、ツーインワンジンクフィンガーヌクレアーゼバリアントをコードする核酸は、第１の核局在化配列（ＮＬＳ）をコードするヌクレオチド配列と、第２の核局在化配列（ＮＬＳ）をコードするヌクレオチド配列と、を含み、第１の核局在化配列（ＮＬＳ）をコードするヌクレオチド配列は、第１のジンクフィンガーＤＮＡ結合タンパク質（ＺＦＰ）をコードするヌクレオチド配列に対して５’に位置しており、第２の核局在化配列（ＮＬＳ）をコードするヌクレオチド配列は、第２のジンクフィンガーＤＮＡ結合タンパク質（ＺＦＰ）をコードするヌクレオチド配列に対して５’に位置する。いくつかの実施形態において、第１のＮＬＳをコードするヌクレオチド配列は、第１のＺＦＰをコードするヌクレオチド配列に作動可能に連結され、第２のＮＬＳをコードするヌクレオチド配列は、第２のＺＦＰをコードするヌクレオチド配列に作動可能に連結されている。いくつかの実施形態において、第１のＮＬＳをコードするヌクレオチド配列は、コドン多様化されている。いくつかの実施形態において、第１のＮＬＳをコードするヌクレオチド配列は、コドン多様化されていない。いくつかの実施形態において、第２のＮＬＳをコードするヌクレオチド配列は、コドン多様化されている。いくつかの実施形態において、第２のＮＬＳをコードするヌクレオチド配列は、コドン多様化されていない。いくつかの実施形態において、２つ以上のＮＬＳのそれぞれをコードするヌクレオチド配列は、同じである。いくつかの実施形態において、２つ以上のＮＬＳのそれぞれをコードするヌクレオチド配列は、異なっている。いくつかの実施形態において、２つ以上のＮＬＳのそれぞれが、同じアミノ酸配列を有する。いくつかの実施形態において、２つ以上のＮＬＳのそれぞれが、異なるアミノ酸配列を有する。いくつかの実施形態において、第１のＮＬＳをコードするポリヌクレオチドは、配列番号５９～７０または１５５のうちのいずれか１つに示されるヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態において、第１のＮＬＳをコードするポリヌクレオチドは、配列番号５９に示されるヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態において、第１のＮＬＳをコードするポリヌクレオチドは、配列番号６０に示されるヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態において、第１のＮＬＳをコードするポリヌクレオチドは、配列番号６１に示されるヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態において、第１のＮＬＳをコードするポリヌクレオチドは、配列番号６２に示されるヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態において、第１のＮＬＳをコードするポリヌクレオチドは、配列番号６３に示されるヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態において、第１のＮＬＳをコードするポリヌクレオチドは、配列番号６４に示されるヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態において、第１のＮＬＳをコードするポリヌクレオチドは、配列番号６５に示されるヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態において、第１のＮＬＳをコードするポリヌクレオチドは、配列番号６６に示されるヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態において、第１のＮＬＳをコードするポリヌクレオチドは、配列番号６７に示されるヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態において、第１のＮＬＳをコードするポリヌクレオチドは、配列番号６８に示されるヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態において、第１のＮＬＳをコードするポリヌクレオチドは、配列番号６９に示されるヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態において、第１のＮＬＳをコードするポリヌクレオチドは、配列番号７０に示されるヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態において、第１のＮＬＳをコードするポリヌクレオチドは、配列番号１５５に示されるヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態において、第２のＮＬＳをコードするポリヌクレオチドは、配列番号５９～７０または１５５のうちのいずれか１つに示されるヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態において、第２のＮＬＳをコードするポリヌクレオチドは、配列番号５９に示されるヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態において、第２のＮＬＳをコードするポリヌクレオチドは、配列番号６０に示されるヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態において、第２のＮＬＳをコードするポリヌクレオチドは、配列番号６１に示されるヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態において、第２のＮＬＳをコードするポリヌクレオチドは、配列番号６２に示されるヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態において、第２のＮＬＳをコードするポリヌクレオチドは、配列番号６３に示されるヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態において、第２のＮＬＳをコードするポリヌクレオチドは、配列番号６４に示されるヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態において、第２のＮＬＳをコードするポリヌクレオチドは、配列番号６５に示されるヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態において、第２のＮＬＳをコードするポリヌクレオチドは、配列番号６６に示されるヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態において、第２のＮＬＳをコードするポリヌクレオチドは、配列番号６７に示されるヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態において、第２のＮＬＳをコードするポリヌクレオチドは、配列番号６８に示されるヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態において、第２のＮＬＳをコードするポリヌクレオチドは、配列番号６９に示されるヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態において、第２のＮＬＳをコードするポリヌクレオチドは、配列番号７０に示されるヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態において、第１のＮＬＳをコードするポリヌクレオチドは、配列番号１５５に示されるヌクレオチド配列を含む。
いくつかの実施形態において、第１のＮＬＳをコードするポリヌクレオチドは、配列番号３～９および１５６のうちのいずれか１つに示されるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態において、第１のＮＬＳをコードするポリヌクレオチドは、配列番号３に示されるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態において、第１のＮＬＳをコードするポリヌクレオチドは、配列番号４に示されるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態において、第１のＮＬＳをコードするポリヌクレオチドは、配列番号５に示されるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態において、第１のＮＬＳをコードするポリヌクレオチドは、配列番号６に示されるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態において、第１のＮＬＳをコードするポリヌクレオチドは、配列番号７に示されるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態において、第１のＮＬＳをコードするポリヌクレオチドは、配列番号８に示されるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態において、第１のＮＬＳをコードするポリヌクレオチドは、配列番号９に示されるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態において、第１のＮＬＳをコードするポリヌクレオチドは、配列番号１５６に示されるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態において、第２のＮＬＳをコードするポリヌクレオチドは、配列番号３～９および１５６のうちのいずれか１つに示されるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態において、第２のＮＬＳをコードするポリヌクレオチドは、配列番号３に示されるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態において、第２のＮＬＳをコードするポリヌクレオチドは、配列番号４に示されるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態において、第２のＮＬＳをコードするポリヌクレオチドは、配列番号５に示されるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態において、第２のＮＬＳをコードするポリヌクレオチドは、配列番号６に示されるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態において、第２のＮＬＳをコードするポリヌクレオチドは、配列番号７に示されるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態において、第２のＮＬＳをコードするポリヌクレオチドは、配列番号８に示されるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態において、第２のＮＬＳをコードするポリヌクレオチドは、配列番号９に示されるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態において、第２のＮＬＳをコードするポリヌクレオチドは、配列番号１５６に示されるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含む。
いくつかの実施形態において、第１のジンクフィンガーヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチド配列は、配列番号１３９～１５２のうちのいずれか１つのヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態において、第１のジンクフィンガーヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチド配列は、配列番号１３９のヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態において、第１のジンクフィンガーヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチド配列は、配列番号１４０のヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態において、第１のジンクフィンガーヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチド配列は、配列番号１４１のヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態において、第１のジンクフィンガーヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチド配列は、配列番号１４２のヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態において、第１のジンクフィンガーヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチド配列は、配列番号１４３のヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態において、第１のジンクフィンガーヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチド配列は、配列番号１４４のヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態において、第１のジンクフィンガーヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチド配列は、配列番号１４５のヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態において、第１のジンクフィンガーヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチド配列は、配列番号１４６のヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態において、第１のジンクフィンガーヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチド配列は、配列番号１４７のヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態において、第１のジンクフィンガーヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチド配列は、配列番号１４８のヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態において、第１のジンクフィンガーヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチド配列は、配列番号１４９のヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態において、第１のジンクフィンガーヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチド配列は、配列番号１５０のヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態において、第１のジンクフィンガーヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチド配列は、配列番号１５１のヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態において、第１のジンクフィンガーヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチド配列は、配列番号１５２のヌクレオチド配列を含む。
いくつかの実施形態において、第２のジンクフィンガーヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチド配列は、配列番号１３９～１５２のうちのいずれか１つのヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態において、第２のジンクフィンガーヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチド配列は、配列番号１３９のヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態において、第２のジンクフィンガーヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチド配列は、配列番号１４０のヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態において、第２のジンクフィンガーヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチド配列は、配列番号１４１のヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態において、第２のジンクフィンガーヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチド配列は、配列番号１４２のヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態において、第２のジンクフィンガーヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチド配列は、配列番号１４３のヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態において、第２のジンクフィンガーヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチド配列は、配列番号１４４のヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態において、第２のジンクフィンガーヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチド配列は、配列番号１４５のヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態において、第２のジンクフィンガーヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチド配列は、配列番号１４６のヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態において、第２のジンクフィンガーヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチド配列は、配列番号１４７のヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態において、第２のジンクフィンガーヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチド配列は、配列番号１４８のヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態において、第２のジンクフィンガーヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチド配列は、配列番号１４９のヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態において、第２のジンクフィンガーヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチド配列は、配列番号１５０のヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態において、第２のジンクフィンガーヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチド配列は、配列番号１５１のヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態において、第２のジンクフィンガーヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチド配列は、配列番号１５２のヌクレオチド配列を含む。
いくつかの実施形態において、ツーインワンジンクフィンガーヌクレアーゼバリアントをコードする核酸は、１つ以上のエピトープタグをコードする１つ以上のヌクレオチド配列をさらに含む。エピトープタグまたは発現タグは、翻訳されたタンパク質に対して５’または３’に配置されるように操作されたペプチド配列を指す。エピトープタグとしては、例えば、ＦＬＡＧ、ＨＡ、ＣＢＰ、ＧＳＴ、ＨＢＨ、ＭＢＰ、Ｍｙｃ、Ｈｉｓ、ｐｏｌｙＨｉｓ、Ｓ－タグ、ＳＵＭＯ、ＴＡＰ、ＴＡＧＰ、ＴＲＸ、Ｖ５、ＧＦＰ、ＲＦＰ、ＹＦＰなどのうちの１つ以上のコピーが挙げられる。「発現タグ」は、目的の遺伝子の発現を監視するために所望の遺伝子配列に作動可能に連結され得るレポーターをコードする配列を含む。
いくつかの実施形態において、ツーインワンジンクフィンガーヌクレアーゼバリアントをコードする核酸は、エピトープタグの１つ以上のコピーをコードする１つ以上のヌクレオチド配列をさらに含む。いくつかの実施形態において、ツーインワンジンクフィンガーヌクレアーゼバリアントをコードする核酸は、第１のエピトープタグをコードする第１のヌクレオチド配列と、第２のエピトープタグをコードする第２のヌクレオチド配列と、をさらに含む。いくつかの実施形態において、上述の第１のエピトープタグおよび第２のエピトープタグのそれぞれが同じである。いくつかの実施形態において、第１のエピトープタグをコードする第１のヌクレオチド配列は、第１のＺＦＰをコードするヌクレオチド配列に対して５’に位置し、第２のエピトープタグをコードする第２のヌクレオチド配列は、第２のＺＦＰをコードするヌクレオチド配列に対して５’に位置する。いくつかの実施形態において、第１のエピトープタグをコードする第１のヌクレオチド配列は、第１のＮＬＳをコードするヌクレオチド配列に対して５’に位置し、第２のエピトープタグをコードする第２のヌクレオチド配列は、第２のＮＬＳをコードするヌクレオチド配列に対して５’に位置する。いくつかの実施形態において、第１のエピトープタグをコードする第１のヌクレオチド配列は、第１のＺＦＰをコードするヌクレオチド配列に対して３’に位置し、第２のエピトープタグをコードする第２のヌクレオチド配列は、第２のＺＦＰをコードするヌクレオチド配列に対して３’に位置する。いくつかの実施形態において、第１のエピトープタグをコードする第１のヌクレオチド配列は、第１のＮＬＳをコードするヌクレオチド配列に対して３’に位置し、第２のエピトープタグをコードする第２のヌクレオチド配列は、第２のＮＬＳをコードするヌクレオチド配列に対して３’に位置する。いくつかの実施形態において、第１のエピトープタグをコードする第１のヌクレオチド配列は、コドン多様化されている。いくつかの実施形態において、第１のエピトープタグをコードする第１のヌクレオチド配列は、コドン多様化されていない。いくつかの実施形態において、第２のエピトープタグをコードする第２のヌクレオチド配列は、コドン多様化されている。いくつかの実施形態において、第２のエピトープタグをコードする第２のヌクレオチド配列は、コドン多様化されていない。いくつかの実施形態において、２つ以上のエピトープタグのそれぞれが、同じアミノ酸配列を有する。いくつかの実施形態において、２つ以上のエピトープタグのそれぞれが、異なるアミノ酸配列を有する。いくつかの実施形態において、２つ以上のエピトープタグのそれぞれは、同じヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドによってコードされる。いくつかの実施形態において、２つ以上のエピトープタグのそれぞれは、異なるヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドによってコードされる。
いくつかの実施形態において、ツーインワンジンクフィンガーヌクレアーゼバリアントをコードする核酸は、ＦＬＡＧタグの１つ以上のコピーをコードする１つ以上のヌクレオチド配列をさらに含む。いくつかの実施形態において、エピトープタグは、３×ＦＬＡＧである。いくつかの実施形態において、ツーインワンジンクフィンガーヌクレアーゼバリアントをコードする核酸は、第１のＦＬＡＧタグをコードする第１のヌクレオチド配列と、第２のＦＬＡＧタグをコードする第２のヌクレオチド配列と、をさらに含む。いくつかの実施形態において、上述の第１のＦＬＡＧタグおよび第２のＦＬＡＧタグのそれぞれが３×ＦＬＡＧである。いくつかの実施形態において、第１のＦＬＡＧタグをコードする第１のヌクレオチド配列は、第１のＺＦＰをコードするヌクレオチド配列に対して５’に位置し、第２のＦＬＡＧタグをコードする第２のヌクレオチド配列は、第２のＺＦＰをコードするヌクレオチド配列に対して５’に位置する。いくつかの実施形態において、第１のＦＬＡＧタグをコードする第１のヌクレオチド配列は、第１のＮＬＳをコードするヌクレオチド配列に対して５’に位置し、第２のＦＬＡＧタグをコードする第２のヌクレオチド配列は、第２のＮＬＳをコードするヌクレオチド配列に対して５’に位置する。いくつかの実施形態において、第１のＦＬＡＧタグをコードする第１のヌクレオチド配列は、第１のＺＦＰをコードするヌクレオチド配列に対して３’に位置し、第２のＦＬＡＧタグをコードする第２のヌクレオチド配列は、第２のＺＦＰをコードするヌクレオチド配列に対して３’に位置する。いくつかの実施形態において、第１のＦＬＡＧタグをコードする第１のヌクレオチド配列は、第１のＮＬＳをコードするヌクレオチド配列に対して３’に位置し、第２のＦＬＡＧタグをコードする第２のヌクレオチド配列は、第２のＮＬＳをコードするヌクレオチド配列に対して３’に位置する。いくつかの実施形態において、第１のＦＬＡＧタグをコードする第１のヌクレオチド配列は、コドン多様化されている。いくつかの実施形態において、第１のＦＬＡＧタグをコードする第１のヌクレオチド配列は、コドン多様化されていない。いくつかの実施形態において、第２のＦＬＡＧタグをコードする第２のヌクレオチド配列は、コドン多様化されている。いくつかの実施形態において、第２のＦＬＡＧタグをコードする第２のヌクレオチド配列は、コドン多様化されていない。いくつかの実施形態において、２つ以上のＦＬＡＧタグのそれぞれが、同じアミノ酸配列を有する。いくつかの実施形態において、２つ以上のＦＬＡＧタグのそれぞれが、異なるアミノ酸配列を有する。いくつかの実施形態において、２つ以上のＦＬＡＧタグのそれぞれは、同じヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドによってコードされる。いくつかの実施形態において、２つ以上のＦＬＡＧタグのそれぞれは、異なるヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドによってコードされる。
いくつかの実施形態において、第１のＦＬＡＧタグをコードするヌクレオチド配列は、配列番号１５～１６または５０～５８のうちのいずれか１つに示されるヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態において、第１のＦＬＡＧタグをコードするヌクレオチド配列は、配列番号１５に示されるヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態において、第１のＦＬＡＧタグをコードするヌクレオチド配列は、配列番号１６に示されるヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態において、第１のＦＬＡＧタグをコードするヌクレオチド配列は、配列番号５０に示されるヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態において、第１のＦＬＡＧタグをコードするヌクレオチド配列は、配列番号５１に示されるヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態において、第１のＦＬＡＧタグをコードするヌクレオチド配列は、配列番号５２に示されるヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態において、第１のＦＬＡＧタグをコードするヌクレオチド配列は、配列番号５３に示されるヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態において、第１のＦＬＡＧタグをコードするヌクレオチド配列は、配列番号５４に示されるヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態において、第１のＦＬＡＧタグをコードするヌクレオチド配列は、配列番号５５に示されるヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態において、第１のＦＬＡＧタグをコードするヌクレオチド配列は、配列番号５６に示されるヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態において、第１のＦＬＡＧタグをコードするヌクレオチド配列は、配列番号５７に示されるヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態において、第１のＦＬＡＧタグをコードするヌクレオチド配列は、配列番号５８に示されるヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態において、第２のＦＬＡＧタグをコードするヌクレオチド配列は、配列番号１５～１６または５０～５８のうちのいずれか１つに示されるヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態において、第２のＦＬＡＧタグをコードするヌクレオチド配列は、配列番号１５に示されるヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態において、第２のＦＬＡＧタグをコードするヌクレオチド配列は、配列番号１６に示されるヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態において、第２のＦＬＡＧタグをコードするヌクレオチド配列は、配列番号５０に示されるヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態において、第２のＦＬＡＧタグをコードするヌクレオチド配列は、配列番号５１に示されるヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態において、第２のＦＬＡＧタグをコードするヌクレオチド配列は、配列番号５２に示されるヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態において、第２のＦＬＡＧタグをコードするヌクレオチド配列は、配列番号５３に示されるヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態において、第２のＦＬＡＧタグをコードするヌクレオチド配列は、配列番号５４に示されるヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態において、第２のＦＬＡＧタグをコードするヌクレオチド配列は、配列番号５５に示されるヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態において、第２のＦＬＡＧタグをコードするヌクレオチド配列は、配列番号５６に示されるヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態において、第２のＦＬＡＧタグをコードするヌクレオチド配列は、配列番号５７に示されるヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態において、第２のＦＬＡＧタグをコードするヌクレオチド配列は、配列番号５８に示されるヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態において、第１のＦＬＡＧタグをコードするヌクレオチド配列は、配列番号１～２のうちのいずれか１つに示されるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態において、第１のＦＬＡＧタグをコードするヌクレオチド配列は、配列番号１に示されるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態において、第１のＦＬＡＧタグをコードするヌクレオチド配列は、配列番号２に示されるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態において、第２のＦＬＡＧタグをコードするヌクレオチド配列は、配列番号１～２のうちのいずれか１つに示されるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態において、第２のＦＬＡＧタグをコードするヌクレオチド配列は、配列番号１に示されるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態において、第２のＦＬＡＧタグをコードするヌクレオチド配列は、配列番号２に示されるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含む。
いくつかの実施形態において、第１のジンクフィンガーヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチド配列は、配列番号１７～２３および２５～３１のうちのいずれか１つのヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態において、第１のジンクフィンガーヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチド配列は、配列番号１７のヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態において、第１のジンクフィンガーヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチド配列は、配列番号１８のヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態において、第１のジンクフィンガーヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチド配列は、配列番号１９のヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態において、第１のジンクフィンガーヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチド配列は、配列番号２０のヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態において、第１のジンクフィンガーヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチド配列は、配列番号２１のヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態において、第１のジンクフィンガーヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチド配列は、配列番号２２のヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態において、第１のジンクフィンガーヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチド配列は、配列番号２３のヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態において、第１のジンクフィンガーヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチド配列は、配列番号２５のヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態において、第１のジンクフィンガーヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチド配列は、配列番号２６のヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態において、第１のジンクフィンガーヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチド配列は、配列番号２７のヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態において、第１のジンクフィンガーヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチド配列は、配列番号２８のヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態において、第１のジンクフィンガーヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチド配列は、配列番号２９のヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態において、第１のジンクフィンガーヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチド配列は、配列番号３０のヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態において、第１のジンクフィンガーヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチド配列は、配列番号３１のヌクレオチド配列を含む。
いくつかの実施形態において、第２のジンクフィンガーヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチド配列は、配列番号１７～２３および２５～３１のうちのいずれか１つのヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態において、第２のジンクフィンガーヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチド配列は、配列番号１７のヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態において、第２のジンクフィンガーヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチド配列は、配列番号１８のヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態において、第２のジンクフィンガーヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチド配列は、配列番号１９のヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態において、第２のジンクフィンガーヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチド配列は、配列番号２０のヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態において、第２のジンクフィンガーヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチド配列は、配列番号２１のヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態において、第２のジンクフィンガーヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチド配列は、配列番号２２のヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態において、第２のジンクフィンガーヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチド配列は、配列番号２３のヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態において、第２のジンクフィンガーヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチド配列は、配列番号２５のヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態において、第２のジンクフィンガーヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチド配列は、配列番号２６のヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態において、第２のジンクフィンガーヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチド配列は、配列番号２７のヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態において、第２のジンクフィンガーヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチド配列は、配列番号２８のヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態において、第２のジンクフィンガーヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチド配列は、配列番号２９のヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態において、第２のジンクフィンガーヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチド配列は、配列番号３０のヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態において、第２のジンクフィンガーヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチド配列は、配列番号３１のヌクレオチド配列を含む。
「２Ａ配列」または「２Ａ自己切断配列」は、本明細書で使用される場合、細胞における組換えタンパク質の切断を誘導することができるペプチドをコードする任意の配列を指す。いくつかの実施形態において、２Ａ自己切断配列をコードするヌクレオチド配列は、１５～２５個のアミノ酸のペプチドをコードする。いくつかの実施形態において、２Ａ自己切断配列をコードするヌクレオチド配列は、１８～２２個のアミノ酸のペプチドをコードする。２Ａ自己切断ペプチドの非限定的な例としては、Ｔ２Ａ、Ｐ２Ａ、Ｅ２Ａ、およびＦ２Ａ配列が挙げられる。例えば、Ｄｏｎｎｅｌｌｙ ｅｔ ａｌ．（２００１）Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．８２：１０１３－１０２５を参照されたい。
いくつかの実施形態において、２Ａ自己切断配列をコードするヌクレオチド配列は、配列番号２４のヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態において、ヌクレオチド配列は、配列番号１３８のアミノ酸配列を含む２Ａ自己切断配列をコードする。
いくつかの実施形態において、ツーインワンジンクフィンガーヌクレアーゼバリアントをコードする核酸は、配列番号８５～１１５のうちのいずれか１つから選択されるヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態において、ツーインワンジンクフィンガーヌクレアーゼバリアントをコードする核酸は、配列番号８５のヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態において、ツーインワンジンクフィンガーヌクレアーゼバリアントをコードする核酸は、配列番号８６のヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態において、ツーインワンジンクフィンガーヌクレアーゼバリアントをコードする核酸は、配列番号８７のヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態において、ツーインワンジンクフィンガーヌクレアーゼバリアントをコードする核酸は、配列番号８８のヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態において、ツーインワンジンクフィンガーヌクレアーゼバリアントをコードする核酸は、配列番号８９のヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態において、ツーインワンジンクフィンガーヌクレアーゼバリアントをコードする核酸は、配列番号９０のヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態において、ツーインワンジンクフィンガーヌクレアーゼバリアントをコードする核酸は、配列番号９１のヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態において、ツーインワンジンクフィンガーヌクレアーゼバリアントをコードする核酸は、配列番号９２のヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態において、ツーインワンジンクフィンガーヌクレアーゼバリアントをコードする核酸は、配列番号９３のヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態において、ツーインワンジンクフィンガーヌクレアーゼバリアントをコードする核酸は、配列番号９４のヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態において、ツーインワンジンクフィンガーヌクレアーゼバリアントをコードする核酸は、配列番号９５のヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態において、ツーインワンジンクフィンガーヌクレアーゼバリアントをコードする核酸は、配列番号９６のヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態において、ツーインワンジンクフィンガーヌクレアーゼバリアントをコードする核酸は、配列番号９７のヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態において、ツーインワンジンクフィンガーヌクレアーゼバリアントをコードする核酸は、配列番号９８のヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態において、ツーインワンジンクフィンガーヌクレアーゼバリアントをコードする核酸は、配列番号９９のヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態において、ツーインワンジンクフィンガーヌクレアーゼバリアントをコードする核酸は、配列番号１００のヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態において、ツーインワンジンクフィンガーヌクレアーゼバリアントをコードする核酸は、配列番号１０１のヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態において、ツーインワンジンクフィンガーヌクレアーゼバリアントをコードする核酸は、配列番号１０２のヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態において、ツーインワンジンクフィンガーヌクレアーゼバリアントをコードする核酸は、配列番号１０３のヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態において、ツーインワンジンクフィンガーヌクレアーゼバリアントをコードする核酸は、配列番号１０４のヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態において、ツーインワンジンクフィンガーヌクレアーゼバリアントをコードする核酸は、配列番号１０５のヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態において、ツーインワンジンクフィンガーヌクレアーゼバリアントをコードする核酸は、配列番号１０６のヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態において、ツーインワンジンクフィンガーヌクレアーゼバリアントをコードする核酸は、配列番号１０７のヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態において、ツーインワンジンクフィンガーヌクレアーゼバリアントをコードする核酸は、配列番号１０８のヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態において、ツーインワンジンクフィンガーヌクレアーゼバリアントをコードする核酸は、配列番号１０９のヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態において、ツーインワンジンクフィンガーヌクレアーゼバリアントをコードする核酸は、配列番号１１０のヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態において、ツーインワンジンクフィンガーヌクレアーゼバリアントをコードする核酸は、配列番号１１１のヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態において、ツーインワンジンクフィンガーヌクレアーゼバリアントをコードする核酸は、配列番号１１２のヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態において、ツーインワンジンクフィンガーヌクレアーゼバリアントをコードする核酸は、配列番号１１３のヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態において、ツーインワンジンクフィンガーヌクレアーゼバリアントをコードする核酸は、配列番号１１４のヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態において、ツーインワンジンクフィンガーヌクレアーゼバリアントをコードする核酸は、配列番号１１５のヌクレオチド配列を含む。
いくつかの実施形態において、ツーインワンジンクフィンガーヌクレアーゼバリアントをコードする核酸は、配列番号３５～４９のうちのいずれか１つから選択されるヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態において、ツーインワンジンクフィンガーヌクレアーゼバリアントをコードする核酸は、配列番号３５のうちのいずれか１つから選択されるヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態において、ツーインワンジンクフィンガーヌクレアーゼバリアントをコードする核酸は、配列番号３６のうちのいずれか１つから選択されるヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態において、ツーインワンジンクフィンガーヌクレアーゼバリアントをコードする核酸は、配列番号３７のうちのいずれか１つから選択されるヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態において、ツーインワンジンクフィンガーヌクレアーゼバリアントをコードする核酸は、配列番号３５～３８のうちのいずれか１つから選択されるヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態において、ツーインワンジンクフィンガーヌクレアーゼバリアントをコードする核酸は、配列番号３９のうちのいずれか１つから選択されるヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態において、ツーインワンジンクフィンガーヌクレアーゼバリアントをコードする核酸は、配列番号４０のうちのいずれか１つから選択されるヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態において、ツーインワンジンクフィンガーヌクレアーゼバリアントをコードする核酸は、配列番号４１のうちのいずれか１つから選択されるヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態において、ツーインワンジンクフィンガーヌクレアーゼバリアントをコードする核酸は、配列番号４２のうちのいずれか１つから選択されるヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態において、ツーインワンジンクフィンガーヌクレアーゼバリアントをコードする核酸は、配列番号４３のうちのいずれか１つから選択されるヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態において、ツーインワンジンクフィンガーヌクレアーゼバリアントをコードする核酸は、配列番号４４のうちのいずれか１つから選択されるヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態において、ツーインワンジンクフィンガーヌクレアーゼバリアントをコードする核酸は、配列番号４５のうちのいずれか１つから選択されるヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態において、ツーインワンジンクフィンガーヌクレアーゼバリアントをコードする核酸は、配列番号４６のうちのいずれか１つから選択されるヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態において、ツーインワンジンクフィンガーヌクレアーゼバリアントをコードする核酸は、配列番号４７のうちのいずれか１つから選択されるヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態において、ツーインワンジンクフィンガーヌクレアーゼバリアントをコードする核酸は、配列番号４８のうちのいずれか１つから選択されるヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態において、ツーインワンジンクフィンガーヌクレアーゼバリアントをコードする核酸は、配列番号４９のうちのいずれか１つから選択されるヌクレオチド配列を含む。
いくつかの実施形態において、ツーインワンジンクフィンガーヌクレアーゼバリアントをコードする核酸は、配列番号１３２～１３５のうちのいずれか１つに示されるアミノ酸配列をコードするヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態において、ツーインワンジンクフィンガーヌクレアーゼバリアントをコードする核酸は、配列番号１３２に示されるアミノ酸配列をコードするヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態において、ツーインワンジンクフィンガーヌクレアーゼバリアントをコードする核酸は、配列番号１３３に示されるアミノ酸配列をコードするヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態において、ツーインワンジンクフィンガーヌクレアーゼバリアントをコードする核酸は、配列番号１３４に示されるアミノ酸配列をコードするヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態において、ツーインワンジンクフィンガーヌクレアーゼバリアントをコードする核酸は、配列番号１３５に示されるアミノ酸配列をコードするヌクレオチドを含む。
いくつかの実施形態において、ツーインワンジンクフィンガーヌクレアーゼバリアントをコードする核酸は、１つ以上の５’ＩＴＲ、エンハンサー、プロモーター、５’ＵＴＲ、イントロン、転写後調節要素、ポリアデニル化シグナル、または３’ＩＴＲ、あるいはこれらの任意の組み合わせをさらに含む。１つ以上の５’ＩＴＲ、３’ＩＴＲ、エンハンサー、プロモーター、５’ＵＴＲ、３’ＵＴＲ、イントロン、転写後調節要素、ポリアデニル化シグナルのそれぞれは、独立して、第１および第２のＺＦＰをコードするポリヌクレオチドに作動可能に連結されている。そのような配列の例は、表４にある。
いくつかの実施形態において、ツーインワンジンクフィンガーヌクレアーゼバリアントをコードする核酸は、１つ以上の逆位末端反復（ＩＴＲ）配列をさらに含む。ＩＴＲは、その後にその逆相補体が続くヌクレオチド配列から構成される。逆位反復の例としては、直接反復、タンデム反復、およびパリンドロームが挙げられる。ＩＴＲは、５’ＩＴＲ、３’ＩＴＲ、またはこれらの両方であり得る。ＩＴＲは、ウイルス構築物の宿主ゲノムへの組み込み、および宿主ゲノムからのウイルス構築物のレスキューにおいて役割を果たす。
いくつかの実施形態において、ツーインワンジンクフィンガーヌクレアーゼバリアントをコードする核酸配列は、５’ＩＴＲをさらに含む。いくつかの実施形態において、５’ＩＴＲは、配列番号１０に示されるヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態において、ツーインワンジンクフィンガーヌクレアーゼバリアントをコードする核酸配列は、３’ＩＴＲをさらに含む。いくつかの実施形態において、３’ＩＴＲは、配列番号３４に示されるヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態において、ツーインワンジンクフィンガーヌクレアーゼバリアントをコードする核酸配列は、エンハンサーをさらに含む。いくつかの実施形態において、エンハンサーは、真核生物エンハンサーである。いくつかの実施形態において、エンハンサーは、肝臓特異的エンハンサーである。いくつかの実施形態において、エンハンサーは、原核生物エンハンサーである。いくつかの実施形態において、エンハンサーは、ウイルスエンハンサーであってもよい。例示的なエンハンサーとしては、アルファ１ミクログロブリン／ビクニンエンハンサー、ＳＶ４０、ＣＭＶ、ＨＢＶ、およびアポリポタンパク質Ｅ（ＡｐｏＥ）が挙げられる。例示的な肝臓特異的エンハンサーは、アポリポタンパク質Ｅ（ＡＰＯＥ）を含む。
いくつかの実施形態において、エンハンサーは、肝臓特異的エンハンサーを含む。いくつかの実施形態において、エンハンサーは、ＡＰＯＥエンハンサーを含む。いくつかの実施形態において、エンハンサーは、配列番号１１に示されるヌクレオチド配列を含む。
いくつかの実施形態において、ツーインワンジンクフィンガーヌクレアーゼバリアントをコードする核酸配列は、プロモーターをさらに含む。いくつかの実施形態において、プロモーターは、真核生物プロモーターである。いくつかの実施形態において、プロモーターは、原核生物プロモーターである。いくつかの実施形態において、プロモーターは、ウイルスプロモーターである。いくつかの実施形態において、プロモーターは、肝臓特異的プロモーターである。例示的なプロモーターとしては、ＣＭＶ、ＣＭＶＰ、ＥＦ１ａ、ＣＡＧ、ＰＧＫ、ＴＲＥ、Ｕ６、ＵＡＳ、ＳＶ４０、５’ＬＴＲ、多面体プロモーター（ＰＨ）、ＴＫ、ＲＳＶ、アデノウイルスＥ１Ａ、ヒトアルファ１－アンチトリプシン（ｈＡＡＴ）、マウスアルブミン（ｍＡｌｂ）、ホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼ（ｒＰＥＣＫ）、ラット肝臓脂肪酸結合タンパク質、最小トランスサイレチン（ＴＴＲ）、チロキシン結合グロブリン（ＴＢＧ）、ＥＦ１ａ、ＰＧＫ１、Ｕｂｃ、ヒトベータ－アクチン、ＣＡＧ、Ａｃ５、ＣａＭＫＩＩａ、ＧＡＬ１、ＧＡＬ１０、ＴＥＦ１、ＧＤＳ、ＡＤＨ１、ＣａＭＶ３５Ｓ、Ｕｂｉ、Ｈ１、Ｕ６、ＨＢＶなどが挙げられる。例示的なウイルスプロモーターとしては、ＣＭＶ、ＳＶ４０、５’ＬＴＲ、ＰＨ、ＴＫ、ＲＳＶ、アデノウイルスＥ１Ａ、ＣａＭＶ３５Ｓ、ＨＢＶなどが挙げられる。例示的な肝臓特異的プロモーターとしては、ヒトアルファ１－アンチトリプシン（ｈＡＡＴ）、マウスアルブミン（ｍＡｌｂ）、ホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼ（ｒＰＥＣＫ）、ラット肝臓脂肪酸結合タンパク質、最小トランスサイレチン（ＴＴＲ）、チロキシン結合グロブリン（ＴＢＧ）などが挙げられる。
いくつかの実施形態において、プロモーターは、ｈＡＡＴプロモーターを含む。いくつかの実施形態において、プロモーターは、配列番号１２に示されるヌクレオチド配列を含む。
いくつかの実施形態において、ツーインワンジンクフィンガーヌクレアーゼバリアントをコードする核酸配列は、ＵＴＲ配列をさらに含む。ＵＴＲは、５’ＵＴＲ、３’ＵＴＲ、またはこれらの両方であり得る。いくつかの実施形態において、ツーインワンジンクフィンガーヌクレアーゼバリアントをコードする核酸配列は、５’ＵＴＲを含む。いくつかの実施形態において、ツーインワンジンクフィンガーヌクレアーゼバリアントをコードする核酸配列は、３’ＵＴＲを含む。いくつかの実施形態において、ツーインワンジンクフィンガーヌクレアーゼバリアントをコードする核酸配列は、５’ＵＴＲおよび３’ＵＴＲを含む。いくつかの実施形態において、５’ＵＴＲは、配列番号１３に示されるヌクレオチド配列を含む。
いくつかの実施形態において、ツーインワンジンクフィンガーヌクレアーゼバリアントをコードする核酸配列は、キメライントロンをさらに含む。キメライントロンは、ポリヌクレオチド構築物内で操作されたイントロン調節エレメントを指す。キメライントロンは、ｍＲＮＡプロセシング（すなわち、スプライシング）を増強させ、下流のオープンリーディングフレームの発現レベルを増加させ、弱いプロモーターの発現を増加させ、インビボでの発現期間を増加させることが報告されている。例示的なキメライントロンは、ヒトβ－グロビン／ＩｇＧキメライントロンを含む。いくつかの実施形態において、キメライントロンは、ヒトβ－グロビン／ＩｇＧキメライントロンを含む。いくつかの実施形態において、キメライントロンは、配列番号１４に示されるヌクレオチド配列を含む。
いくつかの実施形態において、ツーインワンジンクフィンガーヌクレアーゼバリアントをコードする核酸配列は、転写後調節要素をさらに含む。例示的な転写後調節エレメントとしては、ウッドチャック肝炎ウイルス転写後調節要素（ＷＰＲＥ）およびＢ型肝炎転写後調節要素（ＨＰＲＥ）が挙げられる。ＷＰＲＥは、所与の順序でガンマ、アルファおよびベータ要素を含有し（Ｄｏｎｅｌｌｏ ｅｔ ａｌ．（１９９２）Ｊ Ｖｉｒｏｌ ７２：５０８５－５０９２）、ＡＡＶ系における導入遺伝子の強力な発現に寄与する（Ｌｏｅｂ ｅｔ ａｌ．（１９９９）Ｈｕｍ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ １０：２２９５－２３０５）、６００ｂｐの長い３部からなる要素である。また、イントロンを欠く導入遺伝子の発現を増強する。その天然形態において、ＷＰＲＥは、ＷＨＶ－Ｘタンパク質のための部分オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を含有する。完全に発現されたＷＨＶ－Ｘタンパク質は、ＷＨＶ（Ｗｅ２）エンハンサーなどの他のウイルス要素の文脈において、ウッドチャックおよびマウスにおける肝がんのより高いリスクと関連付けられている（Ｈｏｈｎｅ ｅｔ．ａｌ（１９９０）ＥＭＢＯ Ｊ ９（４）：１１３７－４５、Ｆｌａｊｏｌｅｔ ｅｔ．ａｌ（１９９８）Ｊ Ｖｉｒｏｌ ７２（７）：６１７５－８０）。ＷＨＶ－Ｘタンパク質は、直接的な発がん性ではないように見えるが、いくつかの研究では、特定の状況下で、ヘパドナウイルス（ヒトの場合はＢ型肝炎ウイルス、ウッドチャックの場合はウッドチャック肝炎ウイルス）による感染に関連する肝臓がんの生成のための弱い補助因子として作用し得ることが示唆されている。「野生型」ＷＰＲＥは、その３’領域にＷＨＶ Ｘタンパク質オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）の一部を含有する、５９１ｂｐ配列（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｊ０２４４２におけるヌクレオチド１０９４～１６８４）を指す。「変異した」ＷＰＲＥ配列（すなわち、ＷＰＲＥｍｕｔ６）は、潜在的に発がん性のウッドチャック肝炎ウイルス－Ｘタンパク質の断片の転写を欠くＷＰＲＥ配列を指す。この要素において、１５０２位にＷＨＶ－Ｘのための初期ＡＴＧ開始コドン、および１４８８位に配列ＧＣＴＧＡを有するプロモーター領域が存在する。Ｚａｎｔａ－Ｂｏｕｓｓｉｆ（同上）において、１４８８位のプロモーター配列をＡＴＣＡＴに改変し、１５０２位の開始コドンをＴＴＧに改変し、ＷＨＶ－Ｘの発現を効果的に阻害するｍｕｔ６ＷＰＲＥ配列が開示された。Ｊ０４５１４．１ ＷＰＲＥバリアントにおいて、ＡＴＧ ＷＨＶ Ｘ開始部位は位置１５０４であり、ｍｕｔ６型バリアントはＪ０４５１４．１株で作製することができる。別のＷＰＲＥバリアントは、ＷＨＶ Ｘ配列を欠く、野生型ＷＰＲＥ（Ｃｈｏｉ ｅｔ ａｌ．（２０１４）Ｍｏｌ Ｂｒａｉｎ ７：１７）からの最小限のガンマおよびアルファ要素のみを含む２４７ｂｐのＷＰＲＥ３バリアントである。Ｊ０２４４２．１からのＷＰＲＥ配列（例えば、ＷＲＰＥｍｕｔ６バリアント）も使用し得る。
いくつかの実施形態において、ツーインワンジンクフィンガーヌクレアーゼバリアントをコードする核酸配列は、３’ＷＰＲＥ配列を含む（例えば、米国特許出願公開第２０１６／０３２６５４８号を参照されたい）。いくつかの実施形態において、ＷＰＲＥは、野生型ＷＰＲＥである。いくつかの実施形態において、ＷＰＲＥ要素は、タンパク質Ｘの発現を防止するために「Ｘ」領域で変異したものである（米国特許第７，４１９，８２９号を参照されたい）。いくつかの実施形態において、変異したＷＰＲＥ要素は、Ｚａｎｔａ－Ｂｏｕｓｓｉｆ ｅｔ ａｌ．（２００９）Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ １６（５）：６０５－６１９に記載される変異、例えば、ＷＰＲＥｍｕｔ６配列を含む。いくつかの実施形態において、ＷＰＲＥは、ＷＰＲＥ３バリアントである（Ｃｈｏｉ ｅｔ ａｌ．（２０１４）Ｍｏｌ Ｂｒａｉｎ ７：１７）。いくつかの実施形態において、ＷＰＲＥは、ＷＰＲＥｍｕｔ６を含む。いくつかの実施形態において、ＷＰＲＥは、配列番号３２に示されるヌクレオチド配列を含む。
いくつかの実施形態において、ツーインワンジンクフィンガーヌクレアーゼバリアントをコードする核酸配列は、ポリアデニル化（ポリＡ）シグナルをさらに含む。例示的なポリアデニル化シグナルとしては、ウシ成長ホルモン（ｂＧＨ）、ヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）、ＳＶ４０、およびｒｂＧｌｏｂが挙げられる。いくつかの実施形態において、ポリＡシグナルは、ｂＧＨポリＡシグナルを含む。いくつかの実施形態において、ポリＡシグナルは、ｈＧＨポリＡシグナルを含む。いくつかの実施形態において、ポリＡシグナルは、ＳＶ４０ポリＡシグナルを含む。いくつかの実施形態において、ポリＡシグナルは、ｒｂＧｌｏｂポリＡシグナルを含む。いくつかの実施形態において、ポリＡシグナルは、配列番号３３に示されるヌクレオチド配列を含む。
いくつかの実施形態において、本開示のツーインワンジンクフィンガーヌクレアーゼバリアントの核酸配列は、当業者によって既知である配列アラインメントプログラムによって決定される場合、本明細書に開示される配列のいずれかに対して、少なくとも約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、またはそれより大きい配列同一性を含む。
したがって、対になったヌクレアーゼの構成要素をコードする配列に加えて、構築物は、任意の順序または組み合わせの追加のコード配列または非コード配列を含み得る。構築物としては、左のＺＦＮコード配列が右のＺＦＮコード配列に対して５’である構築物、および右のＺＦＮコード配列が左のＺＦＮコード配列に対して５’である構築物が挙げられる。左または右のＺＦＮコード配列の一方または両方は、任意の方法でコドン多様化され得る。「単一多様化された構築物」という用語は、１つのＺＦＮ（構築物の任意の順序で左または右のいずれか）が、多様化された配列によってコードされる構築物を指す。「二重多様化された構築物」という用語は、左および右のＺＦＮ（構築物内の任意の順序で）の両方がコドン多様化された構築物を指す。
いくつかの実施形態において、本明細書に開示される組成物および方法は、ツーインワンジンクフィンガーヌクレアーゼバリアントを含む。いくつかの実施形態において、ツーインワンジンクフィンガーヌクレアーゼバリアントは、第１のジンクフィンガーヌクレアーゼと第２のジンクフィンガーヌクレアーゼとの間に配置される２Ａ自己切断ペプチドによって分離される、第１のジンクフィンガーヌクレアーゼと、第２のジンクフィンガーヌクレアーゼと、を含む。いくつかの実施形態において、第１のジンクフィンガーヌクレアーゼは、コドン多様化されている。いくつかの実施形態において、第１のジンクフィンガーヌクレアーゼは、コドン多様化されていない。いくつかの実施形態において、第２のジンクフィンガーヌクレアーゼは、コドン多様化されている。いくつかの実施形態において、第２のジンクフィンガーヌクレアーゼは、コドン多様化されている。いくつかの実施形態において、第１のジンクフィンガーヌクレアーゼおよび第２のジンクフィンガーヌクレアーゼは、それぞれ独立して、コドン多様化されている。いくつかの実施形態において、第１のジンクフィンガーヌクレアーゼも、第２のジンクフィンガーヌクレアーゼも、コドン多様化されていない。
いくつかの実施形態において、ツーインワンジンクフィンガーヌクレアーゼバリアントは、ａ）１つ以上の核局在化配列と、ｂ）１つ以上のエピトープタグと、ｃ）１つ以上の切断ドメインと、をさらに含む。
いくつかの実施形態において、第１のジンクフィンガーヌクレアーゼは、配列番号１３６～１３７のうちのいずれか１つのアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、第１のジンクフィンガーヌクレアーゼは、配列番号１３６のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、第１のジンクフィンガーヌクレアーゼは、配列番号１３７のアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態において、第１のジンクフィンガーヌクレアーゼは、配列番号１１６～１２９のうちのいずれか１つに示されるヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドによってコードされる。いくつかの実施形態において、第１のジンクフィンガーヌクレアーゼは、配列番号１１６に示されるヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドによってコードされる。いくつかの実施形態において、第１のジンクフィンガーヌクレアーゼは、配列番号１１７に示されるヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドによってコードされる。いくつかの実施形態において、第１のジンクフィンガーヌクレアーゼは、配列番号１１８に示されるヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドによってコードされる。いくつかの実施形態において、第１のジンクフィンガーヌクレアーゼは、配列番号１１９に示されるヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドによってコードされる。いくつかの実施形態において、第１のジンクフィンガーヌクレアーゼは、配列番号１２０に示されるヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドによってコードされる。いくつかの実施形態において、第１のジンクフィンガーヌクレアーゼは、配列番号１２１に示されるヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドによってコードされる。いくつかの実施形態において、第１のジンクフィンガーヌクレアーゼは、配列番号１２２に示されるヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドによってコードされる。いくつかの実施形態において、第１のジンクフィンガーヌクレアーゼは、配列番号１２３に示されるヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドによってコードされる。いくつかの実施形態において、第１のジンクフィンガーヌクレアーゼは、配列番号１２４に示されるヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドによってコードされる。いくつかの実施形態において、第１のジンクフィンガーヌクレアーゼは、配列番号１２５に示されるヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドによってコードされる。いくつかの実施形態において、第１のジンクフィンガーヌクレアーゼは、配列番号１２６に示されるヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドによってコードされる。いくつかの実施形態において、第１のジンクフィンガーヌクレアーゼは、配列番号１２７に示されるヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドによってコードされる。いくつかの実施形態において、第１のジンクフィンガーヌクレアーゼは、配列番号１２８に示されるヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドによってコードされる。いくつかの実施形態において、第１のジンクフィンガーヌクレアーゼは、配列番号１２９に示されるヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドによってコードされる。
いくつかの実施形態において、第２のジンクフィンガーヌクレアーゼは、配列番号１３６～１３７のうちのいずれか１つのアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、第２のジンクフィンガーヌクレアーゼは、配列番号１３６のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、第２のジンクフィンガーヌクレアーゼは、配列番号１３７のアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態において、第２のジンクフィンガーヌクレアーゼは、配列番号１１６～１２９のうちのいずれか１つに示されるヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドによってコードされる。いくつかの実施形態において、第２のジンクフィンガーヌクレアーゼは、配列番号１１６に示されるヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドによってコードされる。いくつかの実施形態において、第２のジンクフィンガーヌクレアーゼは、配列番号１１７に示されるヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドによってコードされる。いくつかの実施形態において、第２のジンクフィンガーヌクレアーゼは、配列番号１１８に示されるヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドによってコードされる。いくつかの実施形態において、第２のジンクフィンガーヌクレアーゼは、配列番号１１９に示されるヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドによってコードされる。いくつかの実施形態において、第２のジンクフィンガーヌクレアーゼは、配列番号１２０に示されるヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドによってコードされる。いくつかの実施形態において、第２のジンクフィンガーヌクレアーゼは、配列番号１２１に示されるヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドによってコードされる。いくつかの実施形態において、第２のジンクフィンガーヌクレアーゼは、配列番号１２２に示されるヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドによってコードされる。いくつかの実施形態において、第２のジンクフィンガーヌクレアーゼは、配列番号１２３に示されるヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドによってコードされる。いくつかの実施形態において、第２のジンクフィンガーヌクレアーゼは、配列番号１２４に示されるヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドによってコードされる。いくつかの実施形態において、第２のジンクフィンガーヌクレアーゼは、配列番号１２５に示されるヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドによってコードされる。いくつかの実施形態において、第２のジンクフィンガーヌクレアーゼは、配列番号１２６に示されるヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドによってコードされる。いくつかの実施形態において、第２のジンクフィンガーヌクレアーゼは、配列番号１２７に示されるヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドによってコードされる。いくつかの実施形態において、第２のジンクフィンガーヌクレアーゼは、配列番号１２８に示されるヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドによってコードされる。いくつかの実施形態において、第２のジンクフィンガーヌクレアーゼは、配列番号１２９に示されるヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドによってコードされる。
いくつかの実施形態において、ツーインワンジンクフィンガーヌクレアーゼバリアントは、１つ以上の切断ドメインをさらに含む。任意の好適な切断ドメインは、ジンクフィンガーＤＮＡ結合ドメイン（例えば、ＺＦＰ）と会合され（例えば、作動可能に連結され）得る。切断ドメインのそれぞれは、同じアミノ酸配列を有し得る。あるいは、切断ドメインのそれぞれは、異なるアミノ酸配列を有し得る。いくつかの実施形態において、切断ドメインは、二量体として活性であるＦｏｋ Ｉ切断ドメインを含む。いくつかの実施形態において、１つ以上のＦｏｋ Ｉ切断ドメインをコードするヌクレオチド配列は、コドン多様化されている。いくつかの実施形態において、１つ以上のＦｏｋ Ｉ切断ドメインをコードするヌクレオチド配列は、コドン多様化されていない。いくつかの実施形態において、第１のＦｏｋ Ｉ切断ドメインは、第１のジンクフィンガーＤＮＡ結合タンパク質（ＺＦＰ）に作動可能に連結されている。いくつかの実施形態において、第２のＦｏｋ Ｉ切断ドメインは、第２のジンクフィンガーＤＮＡ結合タンパク質（ＺＦＰ）に作動可能に連結されている。いくつかの実施形態において、第１のＦｏｋ Ｉ切断ドメインは、第１のジンクフィンガーＤＮＡ結合タンパク質（ＺＦＰ）に対して３’に位置する。いくつかの実施形態において、第２のＦｏｋ Ｉ切断ドメインは、第２のジンクフィンガーＤＮＡ結合タンパク質（ＺＦＰ）に対して３’に位置する。
いくつかの実施形態において、第１のジンクフィンガーヌクレアーゼは、配列番号１３０～１３１のうちのいずれか１つのアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、第１のジンクフィンガーヌクレアーゼは、配列番号１３０のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、第１のジンクフィンガーヌクレアーゼは、配列番号１３１のアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態において、第２のジンクフィンガーヌクレアーゼは、配列番号１３０～１３１のうちのいずれか１つのアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、第２のジンクフィンガーヌクレアーゼは、配列番号１３０のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、第２のジンクフィンガーヌクレアーゼは、配列番号１３１のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含む。
いくつかの実施形態において、第１のジンクフィンガーヌクレアーゼは、配列番号７１～８４のうちのいずれか１つに示されるヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド配列によってコードされる。いくつかの実施形態において、第１のジンクフィンガーヌクレアーゼは、配列番号７１に示されるヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドによってコードされる。いくつかの実施形態において、第１のジンクフィンガーヌクレアーゼは、配列番号７２に示されるヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドによってコードされる。いくつかの実施形態において、第１のジンクフィンガーヌクレアーゼは、配列番号７３に示されるヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドによってコードされる。いくつかの実施形態において、第１のジンクフィンガーヌクレアーゼは、配列番号７４に示されるヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドによってコードされる。いくつかの実施形態において、第１のジンクフィンガーヌクレアーゼは、配列番号７５に示されるヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドによってコードされる。いくつかの実施形態において、第１のジンクフィンガーヌクレアーゼは、配列番号７６に示されるヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドによってコードされる。いくつかの実施形態において、第１のジンクフィンガーヌクレアーゼは、配列番号７７に示されるヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドによってコードされる。いくつかの実施形態において、第１のジンクフィンガーヌクレアーゼは、配列番号７８に示されるヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドによってコードされる。いくつかの実施形態において、第１のジンクフィンガーヌクレアーゼは、配列番号７９に示されるヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドによってコードされる。いくつかの実施形態において、第１のジンクフィンガーヌクレアーゼは、配列番号８０に示されるヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドによってコードされる。いくつかの実施形態において、第１のジンクフィンガーヌクレアーゼは、配列番号８１に示されるヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドによってコードされる。いくつかの実施形態において、第１のジンクフィンガーヌクレアーゼは、配列番号８２に示されるヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドによってコードされる。いくつかの実施形態において、第１のジンクフィンガーヌクレアーゼは、配列番号８３に示されるヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドによってコードされる。いくつかの実施形態において、第１のジンクフィンガーヌクレアーゼは、配列番号８４に示されるヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドによってコードされる。
いくつかの実施形態において、第２のジンクフィンガーヌクレアーゼは、配列番号７１～８４のうちのいずれか１つに示されるヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド配列によってコードされる。いくつかの実施形態において、第２のジンクフィンガーヌクレアーゼは、配列番号７１に示されるヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドによってコードされる。いくつかの実施形態において、第２のジンクフィンガーヌクレアーゼは、配列番号７２に示されるヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドによってコードされる。いくつかの実施形態において、第２のジンクフィンガーヌクレアーゼは、配列番号７３に示されるヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドによってコードされる。いくつかの実施形態において、第２のジンクフィンガーヌクレアーゼは、配列番号７４に示されるヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドによってコードされる。いくつかの実施形態において、第２のジンクフィンガーヌクレアーゼは、配列番号７５に示されるヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドによってコードされる。いくつかの実施形態において、第２のジンクフィンガーヌクレアーゼは、配列番号７６に示されるヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドによってコードされる。いくつかの実施形態において、第２のジンクフィンガーヌクレアーゼは、配列番号７７に示されるヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドによってコードされる。いくつかの実施形態において、第２のジンクフィンガーヌクレアーゼは、配列番号７８に示されるヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドによってコードされる。いくつかの実施形態において、第２のジンクフィンガーヌクレアーゼは、配列番号７９に示されるヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドによってコードされる。いくつかの実施形態において、第２のジンクフィンガーヌクレアーゼは、配列番号８０に示されるヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドによってコードされる。いくつかの実施形態において、第２のジンクフィンガーヌクレアーゼは、配列番号８１に示されるヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドによってコードされる。いくつかの実施形態において、第２のジンクフィンガーヌクレアーゼは、配列番号８２に示されるヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドによってコードされる。いくつかの実施形態において、第２のジンクフィンガーヌクレアーゼは、配列番号８３に示されるヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドによってコードされる。いくつかの実施形態において、第２のジンクフィンガーヌクレアーゼは、配列番号８４に示されるヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドによってコードされる。
いくつかの実施形態において、ジンクフィンガーヌクレアーゼは、１つ以上の核局在化配列（ＮＬＳ）をさらに含む。ＮＬＳのそれぞれは、同じアミノ酸配列を有し得る。あるいは、それぞれのＮＬＳドメインは、異なるアミノ酸配列を有し得る。いくつかの実施形態において、ジンクフィンガーヌクレアーゼは、第１の核局在化配列（ＮＬＳ）と、第２の核局在化配列（ＮＬＳ）と、を含み、第１の核局在化配列（ＮＬＳ）は、第１のジンクフィンガーＤＮＡ結合タンパク質（ＺＦＰ）に対してＮ末端（すなわち、上流）に位置し、第２の核局在化配列（ＮＬＳ）は、第２のジンクフィンガーＤＮＡ結合タンパク質（ＺＦＰ）に対してＮ末端（すなわち、上流）に位置する。いくつかの実施形態において、第１のＮＬＳは、第１のＺＦＰに作動可能に連結されており、第２のＮＬＳは、第２のＺＦＰに作動可能に連結されている。いくつかの実施形態において、第１のＮＬＳは、コドン多様化されている。いくつかの実施形態において、第１のＮＬＳは、コドン多様化されていない。いくつかの実施形態において、第２のＮＬＳは、コドン多様化されている。いくつかの実施形態において、第２のＮＬＳは、コドン多様化されていない。
いくつかの実施形態において、第１のＮＬＳは、配列番号３～９および１５６のうちのいずれか１つに示されるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、第１のＮＬＳは、配列番号３に示されるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態において、第１のＮＬＳは、配列番号４に示されるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、第１のＮＬＳは、配列番号５に示されるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、第１のＮＬＳは、配列番号６に示されるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、第１のＮＬＳは、配列番号７に示されるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、第１のＮＬＳは、配列番号８に示されるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、第１のＮＬＳは、配列番号９に示されるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、第１のＮＬＳは、配列番号１５６に示されるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、第２のＮＬＳは、配列番号３～９および１５６のうちのいずれか１つに示されるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、第２のＮＬＳは、配列番号３に示されるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、第２のＮＬＳは、配列番号４に示されるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、第２のＮＬＳは、配列番号５に示されるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、第２のＮＬＳは、配列番号６に示されるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、第２のＮＬＳは、配列番号７に示されるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、第２のＮＬＳは、配列番号８に示されるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、第２のＮＬＳは、配列番号９に示されるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、第２のＮＬＳは、配列番号１５６に示されるアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態において、第１のＮＬＳは、配列番号５９～７０のうちのいずれか１つに示されるヌクレオチド配列によってコードされる。いくつかの実施形態において、第１のＮＬＳは、配列番号５９に示されるヌクレオチド配列を含むヌクレオチド配列によってコードされる。いくつかの実施形態において、第１のＮＬＳは、配列番号６０に示されるヌクレオチド配列を含むヌクレオチド配列によってコードされる。いくつかの実施形態において、第１のＮＬＳは、配列番号６１に示されるヌクレオチド配列を含むヌクレオチド配列によってコードされる。いくつかの実施形態において、第１のＮＬＳは、配列番号６２に示されるヌクレオチド配列を含むヌクレオチド配列によってコードされる。いくつかの実施形態において、第１のＮＬＳは、配列番号６３に示されるヌクレオチド配列を含むヌクレオチド配列によってコードされる。いくつかの実施形態において、第１のＮＬＳは、配列番号６４に示されるヌクレオチド配列を含むヌクレオチド配列によってコードされる。いくつかの実施形態において、第１のＮＬＳは、配列番号６５に示されるヌクレオチド配列を含むヌクレオチド配列によってコードされる。いくつかの実施形態において、第１のＮＬＳは、配列番号６６に示されるヌクレオチド配列を含むヌクレオチド配列によってコードされる。いくつかの実施形態において、第１のＮＬＳは、配列番号６７に示されるヌクレオチド配列を含むヌクレオチド配列によってコードされる。いくつかの実施形態において、第１のＮＬＳは、配列番号６８に示されるヌクレオチド配列を含むヌクレオチド配列によってコードされる。いくつかの実施形態において、第１のＮＬＳは、配列番号６９に示されるヌクレオチド配列を含むヌクレオチド配列によってコードされる。いくつかの実施形態において、第１のＮＬＳは、配列番号７０に示されるヌクレオチド配列を含むヌクレオチド配列によってコードされる。
いくつかの実施形態において、第２のＮＬＳは、配列番号５９～７０のうちのいずれか１つに示されるヌクレオチド配列によってコードされる。いくつかの実施形態において、第２のＮＬＳは、配列番号５９に示されるヌクレオチド配列を含むヌクレオチド配列によってコードされる。いくつかの実施形態において、第２のＮＬＳは、配列番号６０に示されるヌクレオチド配列を含むヌクレオチド配列によってコードされる。いくつかの実施形態において、第２のＮＬＳは、配列番号６１に示されるヌクレオチド配列を含むヌクレオチド配列によってコードされる。いくつかの実施形態において、第２のＮＬＳは、配列番号６２に示されるヌクレオチド配列を含むヌクレオチド配列によってコードされる。いくつかの実施形態において、第２のＮＬＳは、配列番号６３に示されるヌクレオチド配列を含むヌクレオチド配列によってコードされる。いくつかの実施形態において、第２のＮＬＳは、配列番号６４に示されるヌクレオチド配列を含むヌクレオチド配列によってコードされる。いくつかの実施形態において、第２のＮＬＳは、配列番号６５に示されるヌクレオチド配列を含むヌクレオチド配列によってコードされる。いくつかの実施形態において、第２のＮＬＳは、配列番号６６に示されるヌクレオチド配列を含むヌクレオチド配列によってコードされる。いくつかの実施形態において、第２のＮＬＳは、配列番号６７に示されるヌクレオチド配列を含むヌクレオチド配列によってコードされる。いくつかの実施形態において、第２のＮＬＳは、配列番号６８に示されるヌクレオチド配列を含むヌクレオチド配列によってコードされる。いくつかの実施形態において、第２のＮＬＳは、配列番号６９に示されるヌクレオチド配列を含むヌクレオチド配列によってコードされる。いくつかの実施形態において、第２のＮＬＳは、配列番号７０に示されるヌクレオチド配列を含むヌクレオチド配列によってコードされる。
いくつかの実施形態において、ツーインワンジンクフィンガーヌクレアーゼバリアントは、１つ以上のエピトープタグをさらに含む。エピトープタグとしては、例えば、ＦＬＡＧ、ＨＡ、ＣＢＰ、ＧＳＴ、ＨＢＨ、ＭＢＰ、Ｍｙｃ、Ｈｉｓ、ｐｏｌｙＨｉｓ、Ｓ－タグ、ＳＵＭＯ、ＴＡＰ、ＴＡＧＰ、ＴＲＸ、Ｖ５、ＧＦＰ、ＲＦＰ、ＹＦＰなどのうちの１つ以上のコピーが挙げられる。
いくつかの実施形態において、ツーインワンジンクフィンガーヌクレアーゼバリアントは、エピトープタグの１つ以上のコピーをさらに含む。いくつかの実施形態において、ツーインワンジンクフィンガーヌクレアーゼバリアントは、第１のエピトープタグと、第２のエピトープタグと、を含む。いくつかの実施形態において、上述の第１のエピトープタグおよび第２のエピトープタグのそれぞれが同じである。いくつかの実施形態において、上述の第１のエピトープタグおよび第２のエピトープタグのそれぞれが異なっている。いくつかの実施形態において、第１のエピトープタグは、第１のＺＦＰに対してＮ末端に位置し、第２のエピトープタグは、第２のＺＦＰに対してＮ末端に位置する。いくつかの実施形態において、第１のエピトープタグは、第１のＮＬＳに対してＮ末端に位置し、第２のエピトープタグは、第２のＮＬＳに対してＮ末端に位置する。いくつかの実施形態において、第１のエピトープタグは、第１のＺＦＰに対してＣ末端に位置し、第２のエピトープタグは、第２のＺＦＰに対してＣ末端に位置する。いくつかの実施形態において、第１のエピトープタグは、第１のＮＬＳに対してＣ末端に位置し、第２のエピトープタグは、第２のＮＬＳに対してＣ末端に位置する。いくつかの実施形態において、第１のエピトープタグは、コドン多様化されている。いくつかの実施形態において、第１のエピトープタグは、コドン多様化されていない。いくつかの実施形態において、第２のエピトープタグは、コドン多様化されている。いくつかの実施形態において、第２のエピトープタグは、コドン多様化されていない。
いくつかの実施形態において、ツーインワンジンクフィンガーヌクレアーゼバリアントは、ＦＬＡＧタグの１つ以上のコピーをさらに含む。いくつかの実施形態において、エピトープタグは、３×ＦＬＡＧである。いくつかの実施形態において、ツーインワンジンクフィンガーヌクレアーゼバリアントは、第１のＦＬＡＧタグと、第２のＦＬＡＧタグと、を含む。いくつかの実施形態において、上述の第１のＦＬＡＧタグおよび第２のＦＬＡＧタグのそれぞれが３×ＦＬＡＧである。いくつかの実施形態において、第１のＦＬＡＧタグは、第１のＺＦＰに対してＮ末端に位置し、第２のＦＬＡＧタグは、第２のＺＦＰに対してＮ末端に位置する。いくつかの実施形態において、第１のＦＬＡＧタグは、第１のＮＬＳに対してＮ末端に位置し、第２のＦＬＡＧタグは、第２のＮＬＳに対してＮ末端に位置する。いくつかの実施形態において、第１のＦＬＡＧタグは、第１のＺＦＰに対してＣ末端に位置し、第２のＦＬＡＧタグは、第２のＺＦＰに対してＣ末端に位置する。いくつかの実施形態において、第１のＦＬＡＧタグは、第１のＮＬＳに対してＣ末端に位置し、第２のＦＬＡＧタグは、第２のＮＬＳに対してＣ末端に位置する。いくつかの実施形態において、第１のＦＬＡＧタグは、コドン多様化されている。いくつかの実施形態において、第１のＦＬＡＧタグは、コドン多様化されていない。いくつかの実施形態において、第２のＦＬＡＧタグは、コドン多様化されている。いくつかの実施形態において、第２のＦＬＡＧタグは、コドン多様化されていない。
いくつかの実施形態において、第１のＦＬＡＧタグは、配列番号１～２のうちのいずれか１つに示されるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、第１のＦＬＡＧタグは、配列番号１に示されるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、第１のＦＬＡＧタグは、配列番号２に示されるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、第２のＦＬＡＧタグは、配列番号１～２のうちのいずれか１つに示されるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、第２のＦＬＡＧタグは、配列番号１に示されるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、第２のＦＬＡＧタグは、配列番号２に示されるアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態において、第１のＦＬＡＧタグは、配列番号１５～１６、５０～５８、１５３または１５４のうちのいずれか１つに示されるヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドによってコードされる。いくつかの実施形態において、第１のＦＬＡＧタグは、配列番号１５のうちのいずれか１つに示されるヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドによってコードされる。いくつかの実施形態において、第１のＦＬＡＧタグは、配列番号１６のうちのいずれか１つに示されるヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドによってコードされる。いくつかの実施形態において、第１のＦＬＡＧタグは、配列番号５０のうちのいずれか１つに示されるヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドによってコードされる。いくつかの実施形態において、第１のＦＬＡＧタグは、配列番号５１のうちのいずれか１つに示されるヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドによってコードされる。いくつかの実施形態において、第１のＦＬＡＧタグは、配列番号５２のうちのいずれか１つに示されるヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドによってコードされる。いくつかの実施形態において、第１のＦＬＡＧタグは、配列番号５３のうちのいずれか１つに示されるヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドによってコードされる。いくつかの実施形態において、第１のＦＬＡＧタグは、配列番号５４のうちのいずれか１つに示されるヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドによってコードされる。いくつかの実施形態において、第１のＦＬＡＧタグは、配列番号５５のうちのいずれか１つに示されるヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドによってコードされる。いくつかの実施形態において、第１のＦＬＡＧタグは、配列番号５６のうちのいずれか１つに示されるヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドによってコードされる。いくつかの実施形態において、第１のＦＬＡＧタグは、配列番号５７のうちのいずれか１つに示されるヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドによってコードされる。いくつかの実施形態において、第１のＦＬＡＧタグは、配列番号５８のうちのいずれか１つに示されるヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドによってコードされる。いくつかの実施形態において、第２のＦＬＡＧタグは、配列番号１５３のうちのいずれか１つに示されるヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドによってコードされる。いくつかの実施形態において、第２のＦＬＡＧタグは、配列番号１５４のうちのいずれか１つに示されるヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドによってコードされる。
いくつかの実施形態において、第２のＦＬＡＧタグは、配列番号１５～１６、５０～５８、１５３または１５４のうちのいずれか１つに示されるヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドによってコードされる。いくつかの実施形態において、第２のＦＬＡＧタグは、配列番号１５のうちのいずれか１つに示されるヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドによってコードされる。いくつかの実施形態において、第２のＦＬＡＧタグは、配列番号１６のうちのいずれか１つに示されるヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドによってコードされる。いくつかの実施形態において、第２のＦＬＡＧタグは、配列番号５０のうちのいずれか１つに示されるヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドによってコードされる。いくつかの実施形態において、第２のＦＬＡＧタグは、配列番号５１のうちのいずれか１つに示されるヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドによってコードされる。いくつかの実施形態において、第２のＦＬＡＧタグは、配列番号５２のうちのいずれか１つに示されるヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドによってコードされる。いくつかの実施形態において、第２のＦＬＡＧタグは、配列番号５３のうちのいずれか１つに示されるヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドによってコードされる。いくつかの実施形態において、第２のＦＬＡＧタグは、配列番号５４のうちのいずれか１つに示されるヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドによってコードされる。いくつかの実施形態において、第２のＦＬＡＧタグは、配列番号５５のうちのいずれか１つに示されるヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドによってコードされる。いくつかの実施形態において、第２のＦＬＡＧタグは、配列番号５６のうちのいずれか１つに示されるヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドによってコードされる。いくつかの実施形態において、第２のＦＬＡＧタグは、配列番号５７のうちのいずれか１つに示されるヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドによってコードされる。いくつかの実施形態において、第２のＦＬＡＧタグは、配列番号５８のうちのいずれか１つに示されるヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドによってコードされる。いくつかの実施形態において、第２のＦＬＡＧタグは、配列番号１５３のうちのいずれか１つに示されるヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドによってコードされる。いくつかの実施形態において、第２のＦＬＡＧタグは、配列番号１５４のうちのいずれか１つに示されるヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドによってコードされる。
いくつかの実施形態において、第１のジンクフィンガーヌクレアーゼは、配列番号１７～２３および２５～３１のうちのいずれか１つのヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドによってコードされる。いくつかの実施形態において、第１のジンクフィンガーヌクレアーゼは、配列番号１７のヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドによってコードされる。いくつかの実施形態において、第１のジンクフィンガーヌクレアーゼは、配列番号１８のヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドによってコードされる。いくつかの実施形態において、第１のジンクフィンガーヌクレアーゼは、配列番号１９のヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドによってコードされる。いくつかの実施形態において、第１のジンクフィンガーヌクレアーゼは、配列番号２０のヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドによってコードされる。いくつかの実施形態において、第１のジンクフィンガーヌクレアーゼは、配列番号２１のヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドによってコードされる。いくつかの実施形態において、第１のジンクフィンガーヌクレアーゼは、配列番号２２のヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドによってコードされる。いくつかの実施形態において、第１のジンクフィンガーヌクレアーゼは、配列番号２３のヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドによってコードされる。いくつかの実施形態において、第１のジンクフィンガーヌクレアーゼは、配列番号２５のヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドによってコードされる。いくつかの実施形態において、第１のジンクフィンガーヌクレアーゼは、配列番号２６のヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドによってコードされる。いくつかの実施形態において、第１のジンクフィンガーヌクレアーゼは、配列番号２７のヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドによってコードされる。いくつかの実施形態において、第１のジンクフィンガーヌクレアーゼは、配列番号２８のヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドによってコードされる。いくつかの実施形態において、第１のジンクフィンガーヌクレアーゼは、配列番号２９のヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドによってコードされる。いくつかの実施形態において、第１のジンクフィンガーヌクレアーゼは、配列番号３０のヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドによってコードされる。いくつかの実施形態において、第１のジンクフィンガーヌクレアーゼは、配列番号３１のヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドによってコードされる。
いくつかの実施形態において、第２のジンクフィンガーヌクレアーゼは、配列番号１７～２３および２５～３１のうちのいずれか１つのヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドによってコードされる。いくつかの実施形態において、第２のジンクフィンガーヌクレアーゼは、配列番号１７のヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドによってコードされる。いくつかの実施形態において、第２のジンクフィンガーヌクレアーゼは、配列番号１８のヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドによってコードされる。いくつかの実施形態において、第２のジンクフィンガーヌクレアーゼは、配列番号１９のヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドによってコードされる。いくつかの実施形態において、第２のジンクフィンガーヌクレアーゼは、配列番号２０のヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドによってコードされる。いくつかの実施形態において、第２のジンクフィンガーヌクレアーゼは、配列番号２１のヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドによってコードされる。いくつかの実施形態において、第２のジンクフィンガーヌクレアーゼは、配列番号２２のヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドによってコードされる。いくつかの実施形態において、第２のジンクフィンガーヌクレアーゼは、配列番号２３のヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドによってコードされる。いくつかの実施形態において、第２のジンクフィンガーヌクレアーゼは、配列番号２５のヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドによってコードされる。いくつかの実施形態において、第２のジンクフィンガーヌクレアーゼは、配列番号２６のヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドによってコードされる。いくつかの実施形態において、第２のジンクフィンガーヌクレアーゼは、配列番号２７のヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドによってコードされる。いくつかの実施形態において、第２のジンクフィンガーヌクレアーゼは、配列番号２８のヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドによってコードされる。いくつかの実施形態において、第２のジンクフィンガーヌクレアーゼは、配列番号２９のヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドによってコードされる。いくつかの実施形態において、第２のジンクフィンガーヌクレアーゼは、配列番号３０のヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドによってコードされる。いくつかの実施形態において、第２のジンクフィンガーヌクレアーゼは、配列番号３１のヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドによってコードされる。
いくつかの実施形態において、２Ａ自己切断ペプチドは、１５～２５アミノ酸である。いくつかの実施形態において、２Ａ自己切断ペプチドは、１８～２２アミノ酸である。２Ａ自己切断ペプチドの非限定的な例としては、Ｔ２Ａ、Ｐ２Ａ、Ｅ２Ａ、およびＦ２Ａ配列が挙げられる。例えば、Ｄｏｎｎｅｌｌｙ ｅｔ ａｌ．（２００１）Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．８２：１０１３－１０２５を参照されたい。いくつかの実施形態において、２Ａ自己切断ペプチドは、配列番号１３８のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、２Ａ自己切断ペプチドは、配列番号２４のヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドによってコードされる。
いくつかの実施形態において、ツーインワンジンクフィンガーヌクレアーゼバリアントは、配列番号１３２～１３５のうちのいずれか１つに示されるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、ツーインワンジンクフィンガーヌクレアーゼバリアントは、配列番号１３２に示されるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、ツーインワンジンクフィンガーヌクレアーゼバリアントは、配列番号１３３に示されるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、ツーインワンジンクフィンガーヌクレアーゼバリアントは、配列番号１３４に示されるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、ツーインワンジンクフィンガーヌクレアーゼバリアントは、配列番号１３５に示されるアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態において、ツーインワンジンクフィンガーヌクレアーゼバリアントは、配列番号８５～１１５のうちのいずれか１つから選択されるヌクレオチド配列を含む核酸によってコードされる。いくつかの実施形態において、ツーインワンジンクフィンガーヌクレアーゼバリアントは、配列番号８５に示されるヌクレオチド配列を含む核酸によってコードされる。いくつかの実施形態において、ツーインワンジンクフィンガーヌクレアーゼバリアントは、配列番号８６に示されるヌクレオチド配列を含む核酸によってコードされる。いくつかの実施形態において、ツーインワンジンクフィンガーヌクレアーゼバリアントは、配列番号８７に示されるヌクレオチド配列を含む核酸によってコードされる。いくつかの実施形態において、ツーインワンジンクフィンガーヌクレアーゼバリアントは、配列番号８８に示されるヌクレオチド配列を含む核酸によってコードされる。いくつかの実施形態において、ツーインワンジンクフィンガーヌクレアーゼバリアントは、配列番号８９に示されるヌクレオチド配列を含む核酸によってコードされる。いくつかの実施形態において、ツーインワンジンクフィンガーヌクレアーゼバリアントは、配列番号９０に示されるヌクレオチド配列を含む核酸によってコードされる。いくつかの実施形態において、ツーインワンジンクフィンガーヌクレアーゼバリアントは、配列番号９１に示されるヌクレオチド配列を含む核酸によってコードされる。いくつかの実施形態において、ツーインワンジンクフィンガーヌクレアーゼバリアントは、配列番号９２に示されるヌクレオチド配列を含む核酸によってコードされる。いくつかの実施形態において、ツーインワンジンクフィンガーヌクレアーゼバリアントは、配列番号９３に示されるヌクレオチド配列を含む核酸によってコードされる。いくつかの実施形態において、ツーインワンジンクフィンガーヌクレアーゼバリアントは、配列番号９４に示されるヌクレオチド配列を含む核酸によってコードされる。いくつかの実施形態において、ツーインワンジンクフィンガーヌクレアーゼバリアントは、配列番号９５に示されるヌクレオチド配列を含む核酸によってコードされる。いくつかの実施形態において、ツーインワンジンクフィンガーヌクレアーゼバリアントは、配列番号９６に示されるヌクレオチド配列を含む核酸によってコードされる。いくつかの実施形態において、ツーインワンジンクフィンガーヌクレアーゼバリアントは、配列番号９７に示されるヌクレオチド配列を含む核酸によってコードされる。いくつかの実施形態において、ツーインワンジンクフィンガーヌクレアーゼバリアントは、配列番号９８に示されるヌクレオチド配列を含む核酸によってコードされる。いくつかの実施形態において、ツーインワンジンクフィンガーヌクレアーゼバリアントは、配列番号９９に示されるヌクレオチド配列を含む核酸によってコードされる。いくつかの実施形態において、ツーインワンジンクフィンガーヌクレアーゼバリアントは、配列番号１００に示されるヌクレオチド配列を含む核酸によってコードされる。いくつかの実施形態において、ツーインワンジンクフィンガーヌクレアーゼバリアントは、配列番号１０１に示されるヌクレオチド配列を含む核酸によってコードされる。いくつかの実施形態において、ツーインワンジンクフィンガーヌクレアーゼバリアントは、配列番号１０２に示されるヌクレオチド配列を含む核酸によってコードされる。いくつかの実施形態において、ツーインワンジンクフィンガーヌクレアーゼバリアントは、配列番号１０３に示されるヌクレオチド配列を含む核酸によってコードされる。いくつかの実施形態において、ツーインワンジンクフィンガーヌクレアーゼバリアントは、配列番号１０４に示されるヌクレオチド配列を含む核酸によってコードされる。いくつかの実施形態において、ツーインワンジンクフィンガーヌクレアーゼバリアントは、配列番号１０５に示されるヌクレオチド配列を含む核酸によってコードされる。いくつかの実施形態において、ツーインワンジンクフィンガーヌクレアーゼバリアントは、配列番号１０６に示されるヌクレオチド配列を含む核酸によってコードされる。いくつかの実施形態において、ツーインワンジンクフィンガーヌクレアーゼバリアントは、配列番号１０７に示されるヌクレオチド配列を含む核酸によってコードされる。いくつかの実施形態において、ツーインワンジンクフィンガーヌクレアーゼバリアントは、配列番号１０８に示されるヌクレオチド配列を含む核酸によってコードされる。いくつかの実施形態において、ツーインワンジンクフィンガーヌクレアーゼバリアントは、配列番号１０９に示されるヌクレオチド配列を含む核酸によってコードされる。いくつかの実施形態において、ツーインワンジンクフィンガーヌクレアーゼバリアントは、配列番号１１０に示されるヌクレオチド配列を含む核酸によってコードされる。いくつかの実施形態において、ツーインワンジンクフィンガーヌクレアーゼバリアントは、配列番号１１１に示されるヌクレオチド配列を含む核酸によってコードされる。いくつかの実施形態において、ツーインワンジンクフィンガーヌクレアーゼバリアントは、配列番号１１２に示されるヌクレオチド配列を含む核酸によってコードされる。いくつかの実施形態において、ツーインワンジンクフィンガーヌクレアーゼバリアントは、配列番号１１３に示されるヌクレオチド配列を含む核酸によってコードされる。いくつかの実施形態において、ツーインワンジンクフィンガーヌクレアーゼバリアントは、配列番号１１４に示されるヌクレオチド配列を含む核酸によってコードされる。いくつかの実施形態において、ツーインワンジンクフィンガーヌクレアーゼバリアントは、配列番号１１５に示されるヌクレオチド配列を含む核酸によってコードされる。
いくつかの実施形態において、本開示のツーインワンジンクフィンガーヌクレアーゼバリアントは、当業者によって既知である配列アラインメントプログラムによって決定される場合、本明細書に開示される配列のいずれかに対して、少なくとも約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、またはそれより大きい配列同一性を含む。
いくつかの実施形態において、ツーインワンジンクフィンガーヌクレアーゼバリアントは、配列番号１００～１１５に示されるヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドによってコードされる、第１のジンクフィンガーヌクレアーゼと第２のジンクフィンガーヌクレアーゼとの間に配置される２Ａ自己切断ペプチドによって分離される、第１のジンクフィンガーヌクレアーゼと、第２のジンクフィンガーヌクレアーゼと、を含む。
プッシュプルドナー構築物を使用する方法
本明細書に開示されるポリヌクレオチド構築物、ベクター、および薬学的組成物は、様々な方法に使用され得る。
一態様において、本開示は、細胞のゲノムを改変する方法であって、本方法が、本開示のプッシュプルドナーポリヌクレオチド構築物、本開示のベクター、または本開示の薬学的組成物を細胞に導入することを含む、方法を提供する。いくつかの実施形態において、本開示は、細胞のゲノムを改変する方法であって、本方法が、本開示のプッシュプルドナーポリヌクレオチド構築物を細胞に導入することを含む、方法を提供する。いくつかの実施形態において、本開示は、細胞のゲノムを改変する方法であって、本方法が、本開示のベクターを細胞に導入することを含む、方法を提供する。いくつかの実施形態において、本開示は、細胞のゲノムを改変する方法であって、本方法が、本開示の薬学的組成物を細胞に導入することを含む、方法を提供する。
いくつかの実施形態において、細胞のゲノムを改変する方法は、本開示のプッシュプルドナーポリヌクレオチド構築物、第１のジンクフィンガーヌクレアーゼをコードする第１のポリヌクレオチド、および第２のジンクフィンガーヌクレアーゼをコードする第２のポリヌクレオチドを細胞に導入することを含む。いくつかの実施形態において、細胞のゲノムを改変する方法は、本開示のプッシュプルドナーポリヌクレオチド構築物、および１つ以上のジンクフィンガーヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチドを細胞に導入することを含む。いくつかの実施形態において、細胞のゲノムを改変する方法は、本開示のプッシュプルドナーポリヌクレオチド構築物、およびツーインワンジンクフィンガーヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチドを細胞に導入することを含む。
いくつかの実施形態において、細胞のゲノムを改変する方法は、本開示のプッシュプルドナーポリヌクレオチド構築物を含むベクター、第１のジンクフィンガーヌクレアーゼをコードする第１のポリヌクレオチドを含むベクター、および第２のジンクフィンガーヌクレアーゼをコードする第２のポリヌクレオチドを含むベクターを細胞に導入することを含む。いくつかの実施形態において、細胞のゲノムを改変する方法は、本開示のプッシュプルドナーポリヌクレオチド構築物を含むベクター、および１つ以上のジンクフィンガーヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチドを含むベクターを細胞に導入することを含む。いくつかの実施形態において、細胞のゲノムを改変する方法は、本開示のプッシュプルドナーポリヌクレオチド構築物を含むベクター、およびツーインワンジンクフィンガーヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチドを含むベクターを細胞に導入することを含む。
いくつかの実施形態において、細胞のゲノムを改変する方法は、本開示のプッシュプルドナーポリヌクレオチド構築物と、第１のジンクフィンガーヌクレアーゼをコードする第１のポリヌクレオチドと、第２のジンクフィンガーヌクレアーゼをコードする第２のポリヌクレオチドとを含む薬学的組成物を細胞に導入することを含む。いくつかの実施形態において、細胞のゲノムを改変する方法は、本開示のプッシュプルドナーポリヌクレオチド構築物と、１つ以上のジンクフィンガーヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチドとを含む薬学的組成物を細胞に導入することを含む。いくつかの実施形態において、細胞のゲノムを改変する方法は、本開示のプッシュプルドナーポリヌクレオチド構築物と、ツーインワンジンクフィンガーヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチドとを含む薬学的組成物を細胞に導入することを含む。
別の態様において、本開示は、外因性ヌクレオチド配列または導入遺伝子を細胞の遺伝子内の標的ヌクレオチド配列に組み込む方法であって、本方法が、本開示のプッシュプルドナーポリヌクレオチド構築物、本開示のベクター、または本開示の薬学的組成物を細胞に導入することを含む、方法を提供する。いくつかの実施形態において、本開示は、外因性ヌクレオチド配列または導入遺伝子を細胞の遺伝子内の標的ヌクレオチド配列に組み込む方法であって、本方法が、本開示のプッシュプルドナーポリヌクレオチド構築物を細胞に導入することを含む、方法を提供する。いくつかの実施形態において、本開示は、外因性ヌクレオチド配列または導入遺伝子を細胞の遺伝子内の標的ヌクレオチド配列に組み込む方法であって、本方法が、本開示のベクターを細胞に導入することを含む、方法を提供する。いくつかの実施形態において、本開示は、外因性ヌクレオチド配列または導入遺伝子を細胞の遺伝子内の標的ヌクレオチド配列に組み込む方法であって、本方法が、本開示の薬学的組成物を細胞に導入することを含む、方法を提供する。
いくつかの実施形態において、外因性ヌクレオチド配列または導入遺伝子を細胞の遺伝子内の標的ヌクレオチド配列に組み込む方法は、本開示のプッシュプルドナーポリヌクレオチド構築物、第１のジンクフィンガーヌクレアーゼをコードする第１のポリヌクレオチド、および第２のジンクフィンガーヌクレアーゼをコードする第２のポリヌクレオチドを細胞に導入することを含む。いくつかの実施形態において、外因性ヌクレオチド配列または導入遺伝子を細胞の遺伝子内の標的ヌクレオチド配列に組み込む方法は、本開示のプッシュプルドナーポリヌクレオチド構築物、および１つ以上のジンクフィンガーヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチドを細胞に導入することを含む。いくつかの実施形態において、外因性ヌクレオチド配列または導入遺伝子を細胞の遺伝子内の標的ヌクレオチド配列に組み込む方法は、本開示のプッシュプルドナーポリヌクレオチド構築物、およびツーインワンジンクフィンガーヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチドを細胞に導入することを含む。
いくつかの実施形態において、外因性ヌクレオチド配列または導入遺伝子を細胞の遺伝子内の標的ヌクレオチド配列に組み込む方法は、本開示のプッシュプルドナーポリヌクレオチド構築物を含むベクター、第１のジンクフィンガーヌクレアーゼをコードする第１のポリヌクレオチドを含むベクター、および第２のジンクフィンガーヌクレアーゼをコードする第２のポリヌクレオチドを含むベクターを細胞に導入することを含む。いくつかの実施形態において、外因性ヌクレオチド配列または導入遺伝子を細胞の遺伝子内の標的ヌクレオチド配列に組み込む方法は、本開示のプッシュプルドナーポリヌクレオチド構築物を含むベクター、および１つ以上のジンクフィンガーヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチドを含むベクターを細胞に導入することを含む。いくつかの実施形態において、外因性ヌクレオチド配列または導入遺伝子を細胞の遺伝子内の標的ヌクレオチド配列に組み込む方法は、本開示のプッシュプルドナーポリヌクレオチド構築物を含むベクター、およびツーインワンジンクフィンガーヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチドを含むベクターを細胞に導入することを含む。
いくつかの実施形態において、外因性ヌクレオチド配列または導入遺伝子を細胞の遺伝子内の標的ヌクレオチド配列に組み込む方法は、本開示のプッシュプルドナーポリヌクレオチド構築物と、第１のジンクフィンガーヌクレアーゼをコードする第１のポリヌクレオチドと、第２のジンクフィンガーヌクレアーゼをコードする第２のポリヌクレオチドとを含む薬学的組成物を細胞に導入することを含む。いくつかの実施形態において、外因性ヌクレオチド配列または導入遺伝子を細胞の遺伝子内の標的ヌクレオチド配列に組み込む方法は、本開示のプッシュプルドナーポリヌクレオチド構築物と、１つ以上のジンクフィンガーヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチドとを含む薬学的組成物を細胞に導入することを含む。いくつかの実施形態において、外因性ヌクレオチド配列または導入遺伝子を細胞の遺伝子内の標的ヌクレオチド配列に組み込む方法は、本開示のプッシュプルドナーポリヌクレオチド構築物と、ツーインワンジンクフィンガーヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチドとを含む薬学的組成物を細胞に導入することを含む。
別の態様において、本開示は、細胞内の標的ヌクレオチド配列を破壊する方法であって、本方法が、本開示のプッシュプルドナーポリヌクレオチド構築物、本開示のベクター、または本開示の薬学的組成物を細胞に導入することを含む、方法を提供する。いくつかの実施形態において、本開示は、細胞内の標的ヌクレオチド配列を破壊する方法であって、本方法が、本開示のプッシュプルドナーポリヌクレオチド構築物を細胞に導入することを含む、方法を提供する。いくつかの実施形態において、本開示は、細胞内の標的ヌクレオチド配列を破壊する方法であって、本方法が、本開示のベクターを細胞に導入することを含む、方法を提供する。いくつかの実施形態において、本開示は、細胞内の標的ヌクレオチド配列を破壊する方法であって、本方法が、本開示の薬学的組成物を細胞に導入することを含む、方法を提供する。
いくつかの実施形態において、細胞内の標的ヌクレオチド配列を破壊する方法は、本開示のプッシュプルドナーポリヌクレオチド構築物、第１のジンクフィンガーヌクレアーゼをコードする第１のポリヌクレオチド、および第２のジンクフィンガーヌクレアーゼをコードする第２のポリヌクレオチドを細胞に導入することを含む。いくつかの実施形態において、細胞内の標的ヌクレオチド配列を破壊する方法は、本開示のプッシュプルドナーポリヌクレオチド構築物、および１つ以上のジンクフィンガーヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチドを細胞に導入することを含む。いくつかの実施形態において、細胞内の標的ヌクレオチド配列を破壊する方法は、本開示のプッシュプルドナーポリヌクレオチド構築物、およびツーインワンジンクフィンガーヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチドを細胞に導入することを含む。
いくつかの実施形態において、細胞内の標的ヌクレオチド配列を破壊する方法は、本開示のプッシュプルドナーポリヌクレオチド構築物を含むベクター、第１のジンクフィンガーヌクレアーゼをコードする第１のポリヌクレオチドを含むベクター、および第２のジンクフィンガーヌクレアーゼをコードする第２のポリヌクレオチドを含むベクターを細胞に導入することを含む。いくつかの実施形態において、細胞内の標的ヌクレオチド配列を破壊する方法は、本開示のプッシュプルドナーポリヌクレオチド構築物を含むベクター、および１つ以上のジンクフィンガーヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチドを含むベクターを細胞に導入することを含む。いくつかの実施形態において、細胞内の標的ヌクレオチド配列を破壊する方法は、本開示のプッシュプルドナーポリヌクレオチド構築物を含むベクター、およびツーインワンジンクフィンガーヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチドを含むベクターを細胞に導入することを含む。
いくつかの実施形態において、細胞内の標的ヌクレオチド配列を破壊する方法は、本開示のプッシュプルドナーポリヌクレオチド構築物と、第１のジンクフィンガーヌクレアーゼをコードする第１のポリヌクレオチドと、第２のジンクフィンガーヌクレアーゼをコードする第２のポリヌクレオチドとを含む薬学的組成物を細胞に導入することを含む。いくつかの実施形態において、細胞内の標的ヌクレオチド配列を破壊する方法は、本開示のプッシュプルドナーポリヌクレオチド構築物と、１つ以上のジンクフィンガーヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチドとを含む薬学的組成物を細胞に導入することを含む。いくつかの実施形態において、細胞内の標的ヌクレオチド配列を破壊する方法は、本開示のプッシュプルドナーポリヌクレオチド構築物と、ツーインワンジンクフィンガーヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチドとを含む薬学的組成物を細胞に導入することを含む。
別の態様において、本開示は、対象の障害を治療する方法であって、本方法が、本開示のプッシュプルドナーポリヌクレオチド構築物、本開示のベクター、または本開示の薬学的組成物を細胞に導入することによって、上述の対象の細胞のゲノム内の標的ヌクレオチド配列を改変することを含む、方法を提供する。いくつかの実施形態において、本開示は、対象の障害を治療する方法であって、本方法が、本開示のプッシュプルドナーポリヌクレオチド構築物を細胞に導入することによって、上述の対象の細胞のゲノム内の標的ヌクレオチド配列を改変することを含む、方法を提供する。いくつかの実施形態において、本開示は、対象の障害を治療する方法であって、本方法が、本開示のベクターを細胞に導入することによって、上述の対象の細胞のゲノム内の標的ヌクレオチド配列を改変することを含む、方法を提供する。いくつかの実施形態において、本開示は、対象の障害を治療する方法であって、本方法が、本開示の薬学的組成物を細胞細胞に導入することによって、上述の対象の細胞のゲノム内の標的ヌクレオチド配列を改変することを含む、方法を提供する。
いくつかの実施形態において、対象の障害を治療する方法は、本開示のプッシュプルドナーポリヌクレオチド構築物、第１のジンクフィンガーヌクレアーゼをコードする第１のポリヌクレオチド、および第２のジンクフィンガーヌクレアーゼをコードする第２のポリヌクレオチドを対象の細胞に導入することを含む。いくつかの実施形態において、対象の障害を治療する方法は、本開示のプッシュプルドナーポリヌクレオチド構築物、および１つ以上のジンクフィンガーヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチドを対象の細胞に導入することを含む。いくつかの実施形態において、対象の障害を治療する方法は、本開示のプッシュプルドナーポリヌクレオチド構築物、およびツーインワンジンクフィンガーヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチドを対象の細胞に導入することを含む。
いくつかの実施形態において、対象の障害を治療する方法は、本開示のプッシュプルドナーポリヌクレオチド構築物を含むベクター、第１のジンクフィンガーヌクレアーゼをコードする第１のポリヌクレオチドを含むベクター、および第２のジンクフィンガーヌクレアーゼをコードする第２のポリヌクレオチドを含むベクターを対象の細胞に導入することを含む。いくつかの実施形態において、対象の障害を治療する方法は、本開示のプッシュプルドナーポリヌクレオチド構築物を含むベクター、および１つ以上のジンクフィンガーヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチドを含むベクターを対象の細胞に導入することを含む。いくつかの実施形態において、対象の障害を治療する方法は、本開示のプッシュプルドナーポリヌクレオチド構築物を含むベクター、およびツーインワンジンクフィンガーヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチドを含むベクターを対象の細胞に導入することを含む。
いくつかの実施形態において、対象の障害を治療する方法は、本開示のプッシュプルドナーポリヌクレオチド構築物と、第１のジンクフィンガーヌクレアーゼをコードする第１のポリヌクレオチドと、第２のジンクフィンガーヌクレアーゼをコードする第２のポリヌクレオチドとを含む薬学的組成物を対象の細胞に導入することを含む。いくつかの実施形態において、対象の障害を治療する方法は、本開示のプッシュプルドナーポリヌクレオチド構築物と、１つ以上のジンクフィンガーヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチドとを含む薬学的組成物を対象の細胞に導入することを含む。いくつかの実施形態において、対象の障害を治療する方法は、本開示のプッシュプルドナーポリヌクレオチド構築物と、ツーインワンジンクフィンガーヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチドとを含む薬学的組成物を対象の細胞に導入することを含む。
別の態様において、本開示は、細胞のゲノム内の疾患を引き起こす変異を修正する方法であって、本方法が、有効量の本開示のプッシュプルドナーポリヌクレオチド構築物、本開示のベクター、または本開示の薬学的組成物を細胞に導入することによって、細胞のゲノム内の標的ヌクレオチド配列を改変することを含む、方法を提供する。いくつかの実施形態において、本開示は、細胞のゲノム内の疾患を引き起こす変異を修正する方法であって、本方法が、有効量の本開示のプッシュプルドナーポリヌクレオチド構築物を細胞に導入することによって、細胞のゲノム内の標的ヌクレオチド配列を改変することを含む、方法を提供する。いくつかの実施形態において、本開示は、細胞のゲノム内の疾患を引き起こす変異を修正する方法であって、本方法が、有効量の本開示のベクターを細胞に導入することによって、細胞のゲノム内の標的ヌクレオチド配列を改変することを含む、方法を提供する。いくつかの実施形態において、本開示は、細胞のゲノム内の疾患を引き起こす変異を修正する方法であって、本方法が、有効量の本開示の薬学的組成物を細胞に導入することによって、細胞のゲノム内の標的ヌクレオチド配列を改変することを含む、方法を提供する。
いくつかの実施形態において、細胞のゲノム内の疾患を引き起こす変異を修正する方法は、本開示のプッシュプルドナーポリヌクレオチド構築物、第１のジンクフィンガーヌクレアーゼをコードする第１のポリヌクレオチド、および第２のジンクフィンガーヌクレアーゼをコードする第２のポリヌクレオチドを対象の細胞に導入することを含む。いくつかの実施形態において、細胞のゲノム内の疾患を引き起こす変異を修正する方法は、本開示のプッシュプルドナーポリヌクレオチド構築物、および１つ以上のジンクフィンガーヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチドを対象の細胞に導入することを含む。いくつかの実施形態において、細胞のゲノム内の疾患を引き起こす変異を修正する方法は、本開示のプッシュプルドナーポリヌクレオチド構築物、およびツーインワンジンクフィンガーヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチドを対象の細胞に導入することを含む。
いくつかの実施形態において、細胞のゲノム内の疾患を引き起こす変異を修正する方法は、本開示のプッシュプルドナーポリヌクレオチド構築物を含むベクター、第１のジンクフィンガーヌクレアーゼをコードする第１のポリヌクレオチドを含むベクター、および第２のジンクフィンガーヌクレアーゼをコードする第２のポリヌクレオチドを含むベクターを対象の細胞に導入することを含む。いくつかの実施形態において、細胞のゲノム内の疾患を引き起こす変異を修正する方法は、本開示のプッシュプルドナーポリヌクレオチド構築物を含むベクター、および１つ以上のジンクフィンガーヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチドを含むベクターを対象の細胞に導入することを含む。いくつかの実施形態において、細胞のゲノム内の疾患を引き起こす変異を修正する方法は、本開示のプッシュプルドナーポリヌクレオチド構築物を含むベクター、およびツーインワンジンクフィンガーヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチドを含むベクターを対象の細胞に導入することを含む。
いくつかの実施形態において、細胞のゲノム内の疾患を引き起こす変異を修正する方法は、本開示のプッシュプルドナーポリヌクレオチド構築物と、第１のジンクフィンガーヌクレアーゼをコードする第１のポリヌクレオチドと、第２のジンクフィンガーヌクレアーゼをコードする第２のポリヌクレオチドとを含む薬学的組成物を対象の細胞に導入することを含む。いくつかの実施形態において、細胞のゲノム内の疾患を引き起こす変異を修正する方法は、本開示のプッシュプルドナーポリヌクレオチド構築物と、１つ以上のジンクフィンガーヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチドとを含む薬学的組成物を対象の細胞に導入することを含む。いくつかの実施形態において、細胞のゲノム内の疾患を引き起こす変異を修正する方法は、本開示のプッシュプルドナーポリヌクレオチド構築物と、ツーインワンジンクフィンガーヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチドとを含む薬学的組成物を対象の細胞に導入することを含む。
本明細書に開示される方法において、プッシュプルドナーポリヌクレオチド構築物配列が、ゲノム遺伝子座に組み込まれるとき、ポリヌクレオチドは、２つの方向に組み込むことができるが、ポリペプチドをコードする２つのヌクレオチドのうちの１つのみが発現される（すなわち、転写および／または翻訳される）。したがって、ドナーポリヌクレオチドが第１の方向に組み込まれるとき、第１のヌクレオチド配列は、ゲノム遺伝子座に組み込まれた後に発現される。ドナーポリヌクレオチドが第２の方向に組み込まれるとき、第２のヌクレオチド配列がゲノム遺伝子座に組み込まれた後に発現される。したがって、いくつかの実施形態において、本方法は、第１のポリペプチドをコードする第１のヌクレオチドの発現をさらに含む。他の実施形態において、本方法は、第２のポリペプチドをコードする第２のヌクレオチドの発現をさらに含む。
様々な疾患または障害が、本明細書に開示される方法を使用することによって治療され得る。疾患または障害の非限定的な例としては、遺伝性障害、感染性疾患、後天性障害、がんなどが挙げられる。例示的な遺伝性障害としては、軟骨無形成症、色覚異常、酸性マルターゼ欠損症、アデノシンデアミナーゼ欠損症（ＯＭＩＭ番号１０２７００）、副腎白質ジストロフィー、アイカルディ症候群、アルファ－１アンチトリプシン欠損症、アルファ－サラセミア、アンドロゲン不応症、アペール症候群、不整脈原性右室心筋症、異形成、毛細血管拡張性運動失調症、バース症候群、ベータ－サラセミア、青色ゴムまり様母斑症候群、カナバン病、慢性肉芽腫症（ＣＧＤ）、シトルリン血症、猫鳴き症候群、嚢胞性線維症、デュカム病、外胚葉異形成症、ファブリー病、ファンコニ貧血、進行性骨化性線維異形成症、脆弱Ｘ症候群、ガラクトース血症、ゴーシェ病、汎発性ガングリオシドーシス（例えば、ＧＭ１）、糖原病（例えば、ＧＳＤ１）ヘモクロマトーシス、ベータ－グロビンの６番目のコドン中のヘモグロビンＣ変異（ＨｂＣ）、血友病、ハンター症候群、ハンチントン病、ハーラー症候群、低ホスファターゼ症、クラインフェルター症候群、クラッベ病、ランガー・ギーディオン症候群、白血球接着不全症（ＬＡＤ、ＯＭＩＭ番号１１６９２０）、白質ジストロフィー、ＱＴ延長症候群、リポタンパク質リパーゼ欠損症、マルファン症候群、メビウス症候群、ムコ多糖症（ＭＰＳ）、ネイルパテラ症候群、腎性尿崩症、神経線維腫症、ニーマン・ピック病、オルニチントランスカルバミラーゼ（ＯＴＣ）欠損症、骨形成不全症、フェニルケトン尿症（ＰＫＵ）、ポンペ病、ポルフィリン症、プラダー・ウィリ症候群、早老症、プロテウス症候群、網膜芽細胞腫、レット症候群、ルビンシュタイン・テイビ症候群、サンフィリポ症候群、重症複合免疫不全症（ＳＣＩＤ）、シュワッハマン症候群、鎌状赤血球症（鎌状赤血球貧血）、スミス・マギニス症候群、スティックラー症候群、テイ・サックス病、血小板減少橈骨欠損（ＴＡＲ）症候群、トリーチャー・コリンズ症候群、トリソミー、結節性硬化症、ターナー症候群、尿素回路異常症、フォンヒッペル・リンドウ病、ワールデンブルグ症候群、ウィリアムズ症候群、ウィルソン病、ウィスコット・アルドリッチ症候群、およびＸ連鎖リンパ増殖症候群（ＸＬＰ、ＯＭＩＭ番号３０８２４０）などが挙げられる。
本掲載書に開示される方法はまた、宿主における感染（ウイルスまたは細菌）の治療を可能にする（例えば、ウイルスまたは細菌受容体の発現を遮断し、それによって宿主生物における感染および／または拡散を防止することによって）。標的化され得るウイルスまたはウイルス受容体の非限定的な例としては、ＨＳＶ－１およびＨＳＶ－２などの単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）、水痘帯状疱疹ウイルス（ＶＺＶ）、エプスタイン・バーウイルス（ＥＢＶ）およびサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、ＨＨＶ６およびＨＨＶ７が挙げられる。ウイルスの肝炎ファミリーとしては、Ａ型肝炎ウイルス（ＨＡＶ）、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）、デルタ肝炎ウイルス（ＨＤＶ）、Ｅ型肝炎ウイルス（ＨＥＶ）、およびＧ型肝炎ウイルス（ＨＧＶ）が挙げられる。限定されないが、Ｐｉｃｏｒｎａｖｉｒｉｄａｅ（例えば、ポリオウイルスなど）、Ｃａｌｉｃｉｖｉｒｉｄａｅ、Ｔｏｇａｖｉｒｉｄａｅ（例えば、風疹ウイルス、デングウイルスなど）、Ｆｌａｖｉｖｉｒｉｄａｅ、Ｃｏｒｏｎａｖｉｒｉｄａｅ、Ｒｅｏｖｉｒｉｄａｅ、Ｂｉｒｎａｖｉｒｉｄａｅ、Ｒｈａｂｏｄｏｖｉｒｉｄａｅ（例えば、狂犬病ウイルスなど）、Ｆｉｌｏｖｉｒｉｄａｅ、Ｐａｒａｍｙｘｏｖｉｒｉｄａｅ（例えば、ムンプスウイルス、麻疹ウイルス、呼吸器多核体ウイルスなど）、Ｏｒｔｈｏｍｙｘｏｖｉｒｉｄａｅ（例えば、インフルエンザウイルスＡ型、Ｂ型およびＣ型など）、Ｂｕｎｙａｖｉｒｉｄａｅ、Ａｒｅｎａｖｉｒｉｄａｅ、Ｒｅｔｒｏｖｉｒａｄａｅ、レンチウイルス（例えば、ＨＴＬＶ－Ｉ、ＨＴＬＶ－ＩＩ、ＨＩＶ－１（ＨＴＬＶ－ＩＩＩ、ＬＡＶ、ＡＲＶ、ｈＴＬＲなどとしても既知である）ＨＩＶ－ＩＩ）、サル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）、インフルエンザウイルスおよびダニ媒介性脳炎ウイルスを含む他のウイルスまたはその受容体が標的化されてもよい。例えば、これらおよび他のウイルスの説明については、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，３ｒｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｗ．Ｋ．Ｊｏｋｌｉｋ ｅｄ．１９８８）、Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，２ｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｂ．Ｎ．Ｆｉｅｌｄｓ ａｎｄ Ｄ．Ｍ．Ｋｎｉｐｅ編集、１９９１）を参照されたい。また、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ Ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅなどの他の病原性生物、またはＰｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｆａｌｃｉｐａｒｕｍなどの寄生虫による感染も含まれる。
遺伝性疾患または障害も、本明細書に開示される方法を使用して治療または予防され得る。本明細書に記載されるプッシュプルドナー構築物および方法を使用して治療され得る例示的な遺伝性疾患としては、限定されないが、軟骨無形成症、色覚異常、酸性マルターゼ欠損症、アデノシンデアミナーゼ欠損症（ＯＭＩＭ番号１０２７００）、副腎白質ジストロフィー、アイカルディ症候群、アルファ－１アンチトリプシン欠損症、アルファ－サラセミア、アンドロゲン不応症、アペール症候群、不整脈原性右室心筋症、異形成、毛細血管拡張性運動失調症、バース症候群、ベータ－サラセミア、青色ゴムまり様母斑症候群、カナバン病、慢性肉芽腫症（ＣＧＤ）、シトルリン血症、猫鳴き症候群、嚢胞性線維症、デュカム病、外胚葉異形成症、ファンコニ貧血、進行性骨化性線維異形成症、脆弱Ｘ症候群、ガラクトース血症、ゴーシェ病、汎発性ガングリオシドーシス（例えば、ＧＭ１）、糖原病（例えば、ＧＳＤ１）、ヘモクロマトーシス、ベータ－グロビンの６番目のコドン中のヘモグロビンＣ変異（ＨｂＣ）、血友病、ハンチントン病、ハーラー症候群、低ホスファターゼ症、クラインフェルター症候群、クラッベ病、ランガー・ギーディオン症候群、白血球接着不全症（ＬＡＤ、ＯＭＩＭ番号１１６９２０）、白質ジストロフィー、ＱＴ延長症候群、マルファン症候群、メビウス症候群、ムコ多糖症（ＭＰＳ）、ネイルパテラ症候群、腎性尿崩症、神経線維腫症、ニーマン・ピック病、オルニチントランスカルバミラーゼ（ＯＴＣ）欠損症、骨形成不全症、フェニルケトン尿症（ＰＫＵ）、ポルフィリン症、プラダー・ウィリ症候群、早老症、プロテウス症候群、網膜芽細胞腫、レット症候群、ルビンシュタイン・テイビ症候群、サンフィリポ症候群、重症複合免疫不全症（ＳＣＩＤ）、シュワッハマン症候群、鎌状赤血球症（鎌状赤血球貧血）、スミス・マギニス症候群、スティックラー症候群、テイ・サックス病、血小板減少橈骨欠損（ＴＡＲ）症候群、トリーチャー・コリンズ症候群、トリソミー、結節性硬化症、ターナー症候群、尿素回路異常症、フォンヒッペル・リンドウ病、ワールデンブルグ症候群、ウィリアムズ症候群、ウィルソン病、ウィスコット・アルドリッチ症候群、Ｘ連鎖リンパ増殖症候群（ＸＬＰ、ＯＭＩＭ番号３０８２４０）などが挙げられる。
いくつかの実施形態において、本開示は、対象におけるリソソーム蓄積症を治療する方法であって、本方法が、本開示のプッシュプルドナー構築物を使用して、上述の対象の細胞のゲノム内の標的配列を改変することを含む、方法を提供する。いくつかの実施形態において、本開示は、対象におけるリソソーム蓄積症を予防する方法であって、本方法が、本開示のプッシュプルドナー構築物を使用して、上述の対象の細胞のゲノム内の標的配列を改変することを含む、方法を提供する。いくつかの実施形態において、リソソーム蓄積症を治療または予防する方法は、ＬＳＤを有するヒト対象において機能能力を改善または維持する（低下を遅延させる）ことを含む。いくつかの実施形態において、リソソーム蓄積症を治療または予防する方法は、ＬＳＤを有するヒト対象において酵素補充療法（ＥＲＴ）の必要性（用量レベルまたは頻度）を減少させることを含む。いくつかの実施形態において、リソソーム蓄積症を治療または予防する方法は、ＬＳＤを有するヒト対象においてＥＲＴ開始の必要性を遅らせることを含む。いくつかの実施形態において、リソソーム蓄積症を治療または予防する方法は、ＬＳＤ（例えば、ＭＰＳ ＩＩ）を有するヒト対象において支持手術の必要性を遅らせ、低減させ、または排除することを含む。いくつかの実施形態において、リソソーム蓄積症を治療または予防する方法は、ＬＳＤを有するヒト対象において骨髄移植の必要性を遅らせ、低減させ、または予防することを含む。いくつかの実施形態において、リソソーム蓄積症を治療または予防する方法は、ＬＳＤを有するヒト対象において機能（遅らせる、低下、維持する）能力を改善することを含む。いくつかの実施形態において、リソソーム蓄積症を治療または予防する方法は、ＬＳＤを有するヒト対象において障害進行を抑制することを含む。いくつかの実施形態において、リソソーム蓄積症を治療または予防する方法は、ＬＳＤを有する対象において医療用人工呼吸器デバイスの使用の必要性を遅らせ、低減させ、または予防することを含む。いくつかの実施形態において、リソソーム蓄積症を治療または予防する方法は、ＬＳＤを有するヒト対象において、確認された障害進行の発症を遅らせること、または確認された障害進行のリスクを低減することを含む。いくつかの実施形態において、リソソーム蓄積症を治療または予防する方法は、ＬＳＤを有する対象において尿ＧＡＧを低下させ、安定化させ、または維持することを含む。いくつかの実施形態において、リソソーム蓄積症を治療または予防する方法は、ＬＳＤを有する対象において寿命を延長することを含む。
いくつかの実施形態において、本開示は、本開示のプッシュプルドナー構築物を使用して、細胞のゲノム内のリソソーム蓄積症を引き起こす変異を修正する方法を提供する。
本明細書に開示される方法によって治療および／または予防され得る様々なリソソーム蓄積症。本明細書に記載のツーインワンジンクフィンガーヌクレアーゼバリアントによって治療および／または予防され得る例示的なリソソーム蓄積症としては、限定されないが、アルファ－マンノシドーシス、アスパルチルグルコサミン尿症、コレステリルエステル蓄積症、シスチノーシス、ダノン病、ファブリー病、ファーバー病、フコシドーシス、ガラクトシアリドーシス、Ｉ型ゴーシェ病、ＩＩ型ゴーシェ病、ＩＩＩ型ゴーシェ病、ＧＭ１ガングリオシドーシス（Ｉ、ＩＩおよびＩＩＩ型）、ＧＭ２サンドホフ病（Ｉ／Ｊ／Ａ）、ＧＭ２テイ・サックス病、ＧＭ２ガングリオシドーシスＡＢバリアント、アイセル病／ムコリピドーシスＩＩ、クラッベ病、リソソーム酸リパーゼ欠損症、異染性白質ジストロフィー、ＭＰＳ Ｉ－ハーラー症候群、ＭＰＳ Ｉ－シャイエ症候群、ＭＰＳ Ｉハーラー－シャイエ症候群、ＭＰＳ ＩＩハンター症候群、ＭＰＳ ＩＩＩＡ－サンフィリポ症候群Ａ型、ＭＰＳ ＩＩＩＢ－サンフィリポ症候群Ｂ型、ＭＰＳ ＩＩＩＣ－サンフィリポ症候群Ｃ型、ＭＰＳＩＩＩＤ－サンフィリポ症候群Ｄ型、ＭＰＳ ＩＶ－モルキオＡ型、ＭＰＳ ＩＶ－モルキオＢ型、ＭＰＳ ＶＩ－マロトー・ラミー、ＭＰＳ ＶＩＩ－スライ症候群、ＭＰＳ ＩＸ－ヒアルロニダーゼ欠損症、ムコリピドーシスＩ－シアリドーシス、ムコリピドーシスＩＩＩＣ、ムコリピドーシスＩＶ型、マルチプルスルファターゼ欠損症、神経セロイドリポフスチン症Ｔ１、神経セロイドリポフスチン症Ｔ２、神経セロイドリポフスチン症Ｔ３、神経セロイドリポフスチン症Ｔ４、神経セロイドリポフスチン症Ｔ５、神経セロイドリポフスチン症Ｔ６、神経セロイドリポフスチン症Ｔ７、神経セロイドリポフスチン症Ｔ８、ニーマン・ピック病Ａ型、ニーマン・ピック病Ｂ型、ニーマン・ピック病Ｃ型、フェニルケトン尿症、ポンペ病、ピクノディスオストーシス、シアル酸蓄積症、シンドラー病、ウォルマン病などが挙げられる。
いくつかの実施形態において、ＭＰＳ ＩＩを有する対象は、弱毒化した形態のＭＰＳＩＩまたは重度のＭＰＳ ＩＩを有し得る。対象における「重度のＭＰＳ ＩＩ」は、１８ヶ月～３歳の間の発話遅延および発達遅延を特徴とする。この疾患は、重度のＭＰＳ ＩＩ対象において、器官肥大、多動性および攻撃性、神経学的悪化、関節硬直および骨格変形（異常な脊椎骨を含む）、舌の肥大を伴う粗な顔の特徴、心臓弁の肥厚、難聴およびヘルニアを特徴とする。重度のハンター症候群を有する未治療の対象の寿命は、神経学的悪化および／または心肺不全に起因する死亡を伴う１０代半ばまでである。対象における「弱毒化した形態のＭＰＳ ＩＩ」は、典型的には、重度の対象よりも遅く診断される。体細胞の臨床的特徴は、重度の対象と同様であるが、全体的な疾患重症度は軽度であり、一般に、疾患の進行が遅く、認知障害がないか、または軽度の認知障害のみである。未治療の弱毒化した形態での死亡は、多くの場合、心疾患および呼吸器疾患から２０～３０歳の間である。
様々なリソソーム蓄積症に関連するタンパク質には、表１に示されるものが含まれるが、これらに限定されない。
Figure 2022553828000001
Figure 2022553828000002
したがって、いくつかの実施形態において、本明細書に開示される方法は、修正性疾患関連タンパク質または酵素またはその一部を細胞に導入することを含む。いくつかの実施形態において、開示される方法は、修正性疾患関連タンパク質または酵素またはその一部をコードするプッシュプルドナーポリヌクレオチド構築物を細胞に導入することを含む。いくつかの実施形態において、本明細書に開示される方法は、表１に示される修正性疾患関連タンパク質または酵素またはその一部を細胞に導入することを含む。いくつかの実施形態において、本明細書に開示される方法は、表１に示される修正性疾患関連遺伝子またはその一部を細胞に導入することを含む。
いくつかの実施形態において、本明細書に開示される方法は、表１に示されるような１つ以上の修正性疾患関連遺伝子またはその一部を、必要なタンパク質（例えば、表１の酵素）の発現のために細胞中のセーフハーバー遺伝子座（例えば、アルブミン）に挿入し、血流中に放出することを含む。一旦血流中に入ると、分泌酵素は、組織中の細胞によって取り込まれてもよく、酵素は次いで、ＧＡＧが破壊されるように、リソソームによって取り込まれる。いくつかの実施形態において、疾患関連タンパク質（例えば、ＩＤＳ、ＩＤＵＡ、ＧＬＡ、ＧＡＡ、ＰＡＨなど）をコードする挿入された導入遺伝子は、コドン最適化されている。いくつかの実施形態において、導入遺伝子は、タンパク質を機能的に変化させることなく、関連するエピトープが除去されるものである。いくつかの実施形態において、本方法は、必要な酵素の発現および血流への放出のために、修正酵素（またはタンパク質）コード導入遺伝子を発現するエピソームを細胞に挿入することを含む。いくつかの実施形態において、挿入は、産物を血流に放出するための肝臓細胞などの分泌細胞への挿入である。
本発明の方法を使用して治療可能な対象には、ヒトおよび非ヒト動物の両方が含まれる。
疾患を引き起こす変異の治療または修正の方法は、インビボまたはエクスビボで行うことができる。「インビボ」とは、動物の生体内を意味する。「エクスビボ」とは、細胞または臓器が身体の外側で改変されることを意味し、そのような細胞または臓器は典型的には、生体に戻される。
いくつかの実施形態において、本明細書に開示される方法は、約１×１０９ｖｇ／ｋｇ～約１×１０１７ｖｇ／ｋｇの用量で、本明細書で開示されるプッシュプルドナーポリヌクレオチド構築物を含むベクターを投与することを含む。いくつかの実施形態において、本明細書で開示されるプッシュプルドナーポリヌクレオチド構築物を含むベクターの用量は、約１×１０９ｖｇ／ｋｇ、約５×１０９ｖｇ／ｋｇ、約１×１０１０ｖｇ／ｋｇ、約５×１０１０ｖｇ／ｋｇ、約１×１０１１ｖｇ／ｋｇ、約５×１０１１ｖｇ／ｋｇ、約１×１０２ｖｇ／ｋｇ、約５×１０１２ｖｇ／ｋｇ、約１×１０１３ｖｇ／ｋｇ、約５×１０１３ｖｇ／ｋｇ、約１×１０１４ｖｇ／ｋｇ、約５×１０１４ｖｇ／ｋｇ、約１×１０１５ｖｇ／ｋｇ、約５×１０１５ｖｇ／ｋｇ、約１×１０１６ｖｇ／ｋｇ、約５×１０１６ｖｇ／ｋｇ、約１×１０１７ｖｇ／ｋｇである。いくつかの実施形態において、本明細書で開示されるプッシュプルドナーポリヌクレオチド構築物を含むベクターの用量は、１×１０９ｖｇ／ｋｇ、５×１０９ｖｇ／ｋｇ、１×１０１０ｖｇ／ｋｇ、５×１０１０ｖｇ／ｋｇ、１×１０１１ｖｇ／ｋｇ、５×１０１１ｖｇ／ｋｇ、１×１０２ｖｇ／ｋｇ、５×１０１２ｖｇ／ｋｇ、１×１０１３ｖｇ／ｋｇ、５×１０１３ｖｇ／ｋｇ、１×１０１４ｖｇ／ｋｇ、５×１０１４ｖｇ／ｋｇ、１×１０１５ｖｇ／ｋｇ、５×１０１５ｖｇ／ｋｇ、１×１０１６ｖｇ／ｋｇ、５×１０１６ｖｇ／ｋｇ、１×１０１７ｖｇ／ｋｇである。
いくつかの実施形態において、本明細書に開示される方法は、約１×１０１２ｖｇ／ｋｇ～約１×１０１６ｖｇ／ｋｇ、約１×１０１２ｖｇ／ｋｇ～約１×１０１４ｖｇ／ｋｇの用量で、１つ以上のジンクフィンガーヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチドを含むベクターを投与することを含む。いくつかの実施形態において、１つ以上のジンクフィンガーヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチドを含むベクターの用量は、約１×１０１２ｖｇ／ｋｇ、約５×１０１２ｖｇ／ｋｇ、約１×１０１３ｖｇ／ｋｇ、約５×１０１３ｖｇ／ｋｇ、約１×１０１４ｖｇ／ｋｇ、約５×１０１４ｖｇ／ｋｇ、約１×１０１５ｖｇ／ｋｇ、約５×１０１５ｖｇ／ｋｇ、約１×１０１６ｖｇ／ｋｇ、約５×１０１６ｖｇ／ｋｇである。いくつかの実施形態において、１つ以上のジンクフィンガーヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチドを含むベクターの用量は、１×１０１２ｖｇ／ｋｇ、５×１０１２ｖｇ／ｋｇ、１×１０１３ｖｇ／ｋｇ、５×１０１３ｖｇ／ｋｇ、１×１０１４ｖｇ／ｋｇ、５×１０１４ｖｇ／ｋｇ、１×１０１５ｖｇ／ｋｇ、５×１０１５ｖｇ／ｋｇ、１×１０１６ｖｇ／ｋｇ、５×１０１６ｖｇ／ｋｇである。いくつかの実施形態において、１つ以上のジンクフィンガーヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチドを含むベクターの用量は、約１×１０１４ｖｇ／ｋｇである。いくつかの実施形態において、１つ以上のジンクフィンガーヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチドを含むベクターの用量は、１×１０１４ｖｇ／ｋｇである。
本開示のプッシュプルドナーポリヌクレオチド構築物またはジンクフィンガーヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチドを含むベクターまたは構築物の治療用投与のための方法は、当該技術分野において周知である。核酸構築物は、カチオン性脂質（Ｇｏｄｄａｒｄ，ｅｔ ａｌ，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ，４：１２３１－１２３６，１９９７、Ｇｏｒｍａｎ，ｅｔ ａｌ，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ４：９８３－９９２，１９９７、Ｃｈａｄｗｉｃｋ，ｅｔ ａｌ，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ４：９３７－９４２，１９９７、Ｇｏｋｈａｌｅ，ｅｔ ａｌ，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ４：１２８９－１２９９，１９９７、Ｇａｏ，ａｎｄ Ｈｕａｎｇ，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ２：７１０－７２２，１９９５、そのすべてが本明細書で参照により組み込まれる）で、ウイルスベクター（Ｍｏｎａｈａｎ，ｅｔ ａｌ，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ４：４０－４９，１９９７、Ｏｎｏｄｅｒａ，ｅｔ ａｌ，Ｂｌｏｏｄ ９１：３０－３６，１９９８そのすべてが本明細書で参照により組み込まれる）を使用して、「裸のＤＮＡ」の取り込みによってなどで、送達することができる。細胞のトランスフェクションに関する当該技術分野で周知の技術（上の考察を参照）は、核酸構築物のエクスビでの投与に使用することができる。正確な製剤、投与経路および投薬量は、患者の状態を考慮して個々の医師によって選択され得る。（Ｆｉｎｇｌ ｅｔ ａｌ．，１９７５，“Ｔｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ Ｂａｓｉｓ ｏｆ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ”，Ｃｈ．１ ｐｌ）
本明細書に開示されるように、本明細書に記載のプッシュプルドナー構築物および方法を、遺伝子改変、遺伝子修正、および遺伝子破壊のために使用することができる。
本明細書に記載のプッシュプルドナー構築物および方法はまた、幹細胞ベースの療法に適用することもでき、幹細胞ベースの療法としては、限定されないが、体細胞変異の修正、優性陰性対立遺伝子の破壊、病原体の細胞への侵入または産生性感染に必要な遺伝子の破壊、組織操作の増強（例えば、機能性組織の分化または形成を促進するための遺伝子活性を編集することによるもの）、および／または機能性組織の分化または形成を促進するための遺伝子活性の破壊、分化を遮断または誘導すること（例えば、特定の系統経路を分化するための幹細胞を促進するための分化を遮断する遺伝子を編集することによるもの）を引き起こす編集が挙げられる。この手順のための細胞型には、限定されないが、Ｔ細胞、Ｂ細胞、造血幹細胞、および胚性幹細胞が含まれる。さらに、患者自身の体細胞からも生成される人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）を使用してもよい。したがって、これらの幹細胞またはその誘導体（分化した細胞型または組織）は、それらの起源または組織適合性に関係なく、潜在的に任意のヒトに移植され得る。
いくつかの実施形態において、本発明の方法および組成物を使用して、これらの細胞に由来する成熟細胞（例えば、ＲＢＣ）が治療薬を含有するように、造血幹細胞において１つ以上の治療薬をコードする導入遺伝子を供給する。これらの幹細胞は、インビトロまたはインビボで分化することができ、すべての対象に使用することができるユニバーサルドナー型の細胞に由来し得る。さらに、細胞は、体内の細胞に輸送するために膜貫通タンパク質を含有してもよい。治療はまた、治療用導入遺伝子を含有する対象細胞の使用を含んでいてもよく、ここで、細胞はエクスビボで発展し、次に対象に導入して戻される。例えば、好適な導入遺伝子を含有するＨＳＣは、自己骨髄移植を介して対象に挿入され得る。あるいは、導入遺伝子を用いて編集された筋肉幹細胞またはｉＰＳＣなどの幹細胞も、筋肉組織に注射され得る。
したがって、この技術は、問題（例えば、発現レベルの問題または副機能または非機能として発現するタンパク質の問題）により、対象がいくつかのタンパク質が欠損している状態で使用することができる。
非限定的な例として、欠陥タンパク質または欠損タンパク質の産生が達成され、疾患および障害を治療するために使用される。タンパク質をコードする核酸ドナーは、セーフハーバー遺伝子座（例えば、アルブミン）に挿入され、外因性プロモーターを使用して、またはセーフハーバーに存在するプロモーターを使用して発現され得る。あるいは、ドナーは、欠陥遺伝子を系内で修正するために使用され得る。所望の導入遺伝子は、ＣＤ３４＋幹細胞に挿入され、骨髄移植の間に対象に戻され得る。最後に、核酸ドナーは、この細胞に由来する成熟赤血球が核酸ドナーによってコードされる高い生物学的濃度を有するように、ベータグロビン遺伝子座においてＣＤ３４＋幹細胞に挿入され得る。次に、生物学的に含有するＲＢＣは、膜貫通タンパク質（例えば、受容体または抗体）を介して正しい組織を標的化することができる。さらに、ＲＢＣは、エネルギー源への曝露後に破壊されやすくなるように、電気感作を介してエクスビボで感作され得る（国際特許公開第２００２／００７７５２号を参照されたい）。
治療用途に加えて、本明細書に記載されるプッシュプルドナーポリヌクレオチド構築物および方法を、細胞株操作および疾患モデルの構築に使用することができる。
一態様において、疾患または障害を治療する際に使用するための、本明細書に開示されるプッシュプルドナーポリヌクレオチド構築物が本明細書に提供される。
一態様において、疾患または障害を治療する際に使用するための、本明細書に開示されるベクターが本明細書に提供される。
一態様において、疾患または障害を治療する際に使用するための、本明細書に開示される薬学的組成物が本明細書に提供される。
一態様において、細胞のゲノムを改変する際に使用するための、本明細書に開示されるプッシュプルドナーポリヌクレオチド構築物が本明細書に提供される。
一態様において、細胞のゲノムを改変する際に使用するための、本明細書に開示されるベクターが本明細書に提供される。
一態様において、細胞のゲノムを改変する際に使用するための、本明細書に開示される薬学的組成物が本明細書に提供される。
一態様において、細胞のゲノム内の疾患を引き起こす変異を修正する際に使用するための、本明細書に開示されるプッシュプルドナーポリヌクレオチド構築物が本明細書に提供される。
一態様において、細胞のゲノム内の疾患を引き起こす変異を修正する際に使用するための、本明細書に開示されるベクターが本明細書に提供される。
一態様において、細胞のゲノム内の疾患を引き起こす変異を修正する際に使用するための、本明細書に開示される薬学的組成物が本明細書に提供される。
一態様において、外因性ヌクレオチド配列または導入遺伝子を細胞の遺伝子内の標的ヌクレオチド配列に組み込む際に使用するための、本明細書に開示されるプッシュプルドナーポリヌクレオチド構築物が本明細書に提供される。
一態様において、外因性ヌクレオチド配列または導入遺伝子を細胞の遺伝子内の標的ヌクレオチド配列に組み込む際に使用するための、本明細書に開示されるベクターが本明細書に提供される。
一態様において、外因性ヌクレオチド配列または導入遺伝子を細胞の遺伝子内の標的ヌクレオチド配列に組み込む際に使用するための、本明細書に開示される薬学的組成物が本明細書に提供される。
一態様において、細胞の遺伝子内の標的ヌクレオチド配列を破壊する際に使用するためのものであり、上述の遺伝子が、疾患または障害と関連する変異を含む、本明細書に開示されるプッシュプルドナーポリヌクレオチド構築物が本明細書に提供される。
一態様において、細胞の遺伝子内の標的ヌクレオチド配列を破壊する際に使用するためのものであり、上述の遺伝子が、疾患または障害と関連する変異を含む、本明細書に開示されるベクターが本明細書に提供される。
一態様において、細胞の遺伝子内の標的ヌクレオチド配列を破壊する際に使用するためのものであり、上述の遺伝子が、疾患または障害と関連する変異を含む、本明細書に開示される薬学的組成物が本明細書に提供される。
一態様において、細胞のゲノム内の標的ヌクレオチド配列を改変する際に使用するための、本明細書に開示されるプッシュプルドナーポリヌクレオチド構築物が本明細書に提供される。
一態様において、細胞のゲノム内の標的ヌクレオチド配列を改変する際に使用するための、本明細書に開示されるベクターが本明細書に提供される。
一態様において、細胞のゲノム内の標的ヌクレオチド配列を改変する際に使用するための、本明細書に開示される薬学的組成物が本明細書に提供される。
一態様において、疾患または障害を治療する際に使用するための、本明細書に開示されるプッシュプルドナーポリヌクレオチド構築物が本明細書に提供される。
一態様において、疾患または障害を治療する際に使用するための、本明細書に開示されるベクターが本明細書に提供される。
一態様において、疾患または障害を治療する際に使用するための、本明細書に開示される薬学的組成物が本明細書に提供される。
一態様において、細胞のゲノムを改変する際に使用するための、本明細書に開示されるプッシュプルドナーポリヌクレオチド構築物が本明細書に提供される。
一態様において、細胞のゲノムを改変する際に使用するための、本明細書に開示されるベクターが本明細書に提供される。
一態様において、細胞のゲノムを改変する際に使用するための、本明細書に開示される薬学的組成物が本明細書に提供される。
一態様において、細胞のゲノム内の疾患を引き起こす変異を修正する際に使用するための、本明細書に開示されるプッシュプルドナーポリヌクレオチド構築物が本明細書に提供される。
一態様において、細胞のゲノム内の疾患を引き起こす変異を修正する際に使用するための、本明細書に開示されるベクターが本明細書に提供される。
一態様において、細胞のゲノム内の疾患を引き起こす変異を修正する際に使用するための、本明細書に開示される薬学的組成物が本明細書に提供される。
一態様において、外因性ヌクレオチド配列または導入遺伝子を細胞の遺伝子内の標的ヌクレオチド配列に組み込む際に使用するための、本明細書に開示されるプッシュプルドナーポリヌクレオチド構築物が本明細書に提供される。
一態様において、外因性ヌクレオチド配列または導入遺伝子を細胞の遺伝子内の標的ヌクレオチド配列に組み込む際に使用するための、本明細書に開示されるベクターが本明細書に提供される。
一態様において、外因性ヌクレオチド配列または導入遺伝子を細胞の遺伝子内の標的ヌクレオチド配列に組み込む際に使用するための、本明細書に開示される薬学的組成物が本明細書に提供される。
一態様において、細胞の遺伝子内の標的ヌクレオチド配列を破壊する際に使用するためのものであり、上述の遺伝子が、疾患または障害と関連する変異を含む、本明細書に開示されるプッシュプルドナーポリヌクレオチド構築物が本明細書に提供される。
一態様において、細胞の遺伝子内の標的ヌクレオチド配列を破壊する際に使用するためのものであり、上述の遺伝子が、疾患または障害と関連する変異を含む、本明細書に開示されるベクターが本明細書に提供される。
一態様において、細胞の遺伝子内の標的ヌクレオチド配列を破壊する際に使用するためのものであり、上述の遺伝子が、疾患または障害と関連する変異を含む、本明細書に開示される薬学的組成物が本明細書に提供される。
一態様において、細胞のゲノム内の標的ヌクレオチド配列を改変する際に使用するための、本明細書に開示されるプッシュプルドナーポリヌクレオチド構築物が本明細書に提供される。
一態様において、細胞のゲノム内の標的ヌクレオチド配列を改変する際に使用するための、本明細書に開示されるベクターが本明細書に提供される。
一態様において、細胞のゲノム内の標的ヌクレオチド配列を改変する際に使用するための、本明細書に開示される薬学的組成物が本明細書に提供される。
一態様において、疾患または障害を治療する際に使用するための、本明細書に開示されるプッシュプルドナーポリヌクレオチド構築物、第１のジンクフィンガーヌクレアーゼをコードする第１のポリヌクレオチド、および第２のジンクフィンガーヌクレアーゼをコードする第２のポリヌクレオチドが本明細書に提供される。
一態様において、疾患または障害を治療する際に使用するための、本明細書に開示されるプッシュプルドナーポリヌクレオチド構築物、および１つ以上のジンクフィンガーヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチドが本明細書に提供される。
一態様において、疾患または障害を治療する際に使用するための、本明細書に開示されるプッシュプルドナーポリヌクレオチド構築物、およびツーインワンジンクフィンガーヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチドが本明細書に提供される。
一態様において、細胞のゲノムを改変する際に使用するための、本明細書に開示されるプッシュプルドナーポリヌクレオチド構築物、第１のジンクフィンガーヌクレアーゼをコードする第１のポリヌクレオチド、および第２のジンクフィンガーヌクレアーゼをコードする第２のポリヌクレオチドが本明細書に提供される。
一態様において、細胞のゲノムを改変する際に使用するための、本明細書に開示されるプッシュプルドナーポリヌクレオチド構築物、および１つ以上のジンクフィンガーヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチドが本明細書に提供される。
一態様において、細胞のゲノムを改変する際に使用するための、本明細書に開示されるプッシュプルドナーポリヌクレオチド構築物、およびツーインワンジンクフィンガーヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチドが本明細書に提供される。
一態様において、細胞のゲノム内の疾患を引き起こす変異を修正する際に使用するための、本明細書に開示されるプッシュプルドナーポリヌクレオチド構築物、第１のジンクフィンガーヌクレアーゼをコードする第１のポリヌクレオチド、および第２のジンクフィンガーヌクレアーゼをコードする第２のポリヌクレオチドが本明細書に提供される。
一態様において、細胞のゲノム内の疾患を引き起こす変異を修正する際に使用するための、本明細書に開示されるプッシュプルドナーポリヌクレオチド構築物、および１つ以上のジンクフィンガーヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチドが本明細書に提供される。
一態様において、細胞のゲノム内の疾患を引き起こす変異を修正する際に使用するための、本明細書に開示されるプッシュプルドナーポリヌクレオチド構築物、およびツーインワンジンクフィンガーヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチドが本明細書に提供される。
一態様において、外因性ヌクレオチド配列または導入遺伝子を細胞の遺伝子内の標的ヌクレオチド配列に組み込む際に使用するための、本明細書に開示されるプッシュプルドナーポリヌクレオチド構築物、第１のジンクフィンガーヌクレアーゼをコードする第１のポリヌクレオチド、および第２のジンクフィンガーヌクレアーゼをコードする第２のポリヌクレオチドが本明細書に提供される。
一態様において、外因性ヌクレオチド配列または導入遺伝子を細胞の遺伝子内の標的ヌクレオチド配列に組み込む際に使用するための、本明細書に開示されるプッシュプルドナーポリヌクレオチド構築物、および１つ以上のジンクフィンガーヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチドが本明細書に提供される。
一態様において、外因性ヌクレオチド配列または導入遺伝子を細胞の遺伝子内の標的ヌクレオチド配列に組み込む際に使用するための、本明細書に開示されるプッシュプルドナーポリヌクレオチド構築物、およびツーインワンジンクフィンガーヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチドが本明細書に提供される。
一態様において、細胞の遺伝子内の標的ヌクレオチド配列を破壊する際に使用するためのものであり、上述の遺伝子が、疾患または障害と関連する変異を含む、本明細書に開示されるプッシュプルドナーポリヌクレオチド構築物、第１のジンクフィンガーヌクレアーゼをコードする第１のポリヌクレオチド、および第２のジンクフィンガーヌクレアーゼをコードする第２のポリヌクレオチドが本明細書に提供される。
一態様において、細胞の遺伝子内の標的ヌクレオチド配列を破壊する際に使用するためのものであり、上述の遺伝子が、疾患または障害と関連する変異を含む、本明細書に開示されるプッシュプルドナーポリヌクレオチド構築物、および１つ以上のジンクフィンガーヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチドが本明細書に提供される。
一態様において、細胞の遺伝子内の標的ヌクレオチド配列を破壊する際に使用するためのものであり、上述の遺伝子が、疾患または障害と関連する変異を含む、本明細書に開示されるプッシュプルドナーポリヌクレオチド構築物、およびツーインワンジンクフィンガーヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチドが本明細書に提供される。
一態様において、細胞のゲノム内の標的ヌクレオチド配列を改変する際に使用するための、本明細書に開示されるプッシュプルドナーポリヌクレオチド構築物、第１のジンクフィンガーヌクレアーゼをコードする第１のポリヌクレオチド、および第２のジンクフィンガーヌクレアーゼをコードする第２のポリヌクレオチドが本明細書に提供される。
一態様において、細胞のゲノム内の標的ヌクレオチド配列を改変する際に使用するための、本明細書に開示されるプッシュプルドナーポリヌクレオチド構築物、および１つ以上のジンクフィンガーヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチドが本明細書に提供される。
一態様において、細胞のゲノム内の標的ヌクレオチド配列を改変する際に使用するための、本明細書に開示されるプッシュプルドナーポリヌクレオチド構築物、およびツーインワンジンクフィンガーヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチドが本明細書に提供される。
一態様において、疾患または障害を治療する際に使用するための、本明細書に開示されるプッシュプルドナーポリヌクレオチド構築物を含むベクター、第１のジンクフィンガーヌクレアーゼをコードする第１のポリヌクレオチドを含む第１のベクター、および第２のジンクフィンガーヌクレアーゼをコードする第２のジンクフィンガーヌクレアーゼをコードする第２のポリヌクレオチドチを含む第２のベクターが本明細書に提供される。
一態様において、疾患または障害を治療する際に使用するための、本明細書に開示されるプッシュプルドナーポリヌクレオチド構築物を含むベクター、および１つ以上のジンクフィンガーヌクレアーゼをコードするベクターが本明細書に提供される。
一態様において、細胞のゲノムを改変する際に使用するための、本明細書に開示されるプッシュプルドナーポリヌクレオチド構築物を含むベクター、第１のジンクフィンガーヌクレアーゼをコードする第１のポリヌクレオチドを含む第１のベクター、および第２のジンクフィンガーヌクレアーゼをコードする第２のポリヌクレオチドを含む第２のベクターが本明細書に提供される。
一態様において、細胞のゲノムを改変する際に使用するための、本明細書に開示されるプッシュプルドナーポリヌクレオチド構築物を含むベクター、および１つ以上のジンクフィンガーヌクレアーゼをコードするベクターが本明細書に提供される。
一態様において、細胞のゲノム内の疾患を引き起こす変異を修正する際に使用するための、本明細書に開示されるプッシュプルドナーポリヌクレオチド構築物を含むベクター、第１のジンクフィンガーヌクレアーゼをコードする第１のポリヌクレオチドを含む第１のベクター、および第２のポリヌクレオチドを含む第２のジンクフィンガーヌクレアーゼをコードする第２のベクターが本明細書に提供される。
一態様において、細胞のゲノム内の疾患を引き起こす変異を修正する際に使用するための、本明細書に開示されるプッシュプルドナーポリヌクレオチド構築物を含むベクター、および１つ以上のジンクフィンガーヌクレアーゼをコードするベクターが本明細書に提供される。
一態様において、外因性ヌクレオチド配列または導入遺伝子を細胞の遺伝子内の標的ヌクレオチド配列に組み込む際に使用するための、本明細書に開示されるプッシュプルドナーポリヌクレオチド構築物を含むベクター、第１のジンクフィンガーヌクレアーゼをコードする第１のポリヌクレオチドを含む第１のベクター、および第２のジンクフィンガーヌクレアーゼをコードする第２のポリヌクレオチドを含む第２のベクターが本明細書に提供される。
一態様において、外因性ヌクレオチド配列または導入遺伝子を細胞の遺伝子内の標的ヌクレオチド配列に組み込む際に使用するための、本明細書に開示されるプッシュプルドナーポリヌクレオチド構築物を含むベクター、および１つ以上のジンクフィンガーヌクレアーゼをコードするベクターが本明細書に提供される。
一態様において、細胞の遺伝子内の標的ヌクレオチド配列を破壊する際に使用するためのものであり、上述の遺伝子が、疾患または障害と関連する変異を含む、本明細書に開示されるプッシュプルドナーポリヌクレオチド構築物を含むベクター、第１のジンクフィンガーヌクレアーゼをコードする第１のポリヌクレオチドを含む第１のベクター、および第２のジンクフィンガーヌクレアーゼをコードする第２のポリヌクレオチドを含む第２のベクターが本明細書に提供される。
一態様において、細胞の遺伝子内の標的ヌクレオチド配列を破壊する際に使用するためのものであり、上述の遺伝子が、疾患または障害と関連する変異を含む、本明細書に開示されるプッシュプルドナーポリヌクレオチド構築物を含むベクター、および１つ以上のジンクフィンガーヌクレアーゼをコードするベクターが本明細書に提供される。
一態様において、細胞のゲノム内の標的ヌクレオチド配列を改変する際に使用するための、本明細書に開示されるプッシュプルドナーポリヌクレオチド構築物を含むベクター、第１のジンクフィンガーヌクレアーゼをコードする第１のポリヌクレオチドを含む第１のベクター、および第２のジンクフィンガーヌクレアーゼをコードする第２のポリヌクレオチドを含む第２のベクターが本明細書に提供される。
一態様において、細胞のゲノム内の標的ヌクレオチド配列を改変する際に使用するための、本明細書に開示されるプッシュプルドナーポリヌクレオチド構築物を含むベクター、および１つ以上のジンクフィンガーヌクレアーゼをコードするベクターが本明細書に提供される。
本明細書に開示される方法および組成物は、真核細胞または原核細胞および／または細胞株を含む任意の種類の細胞で使用することができる。細胞の例としては、限定されないが、原核細胞、真菌細胞、古細菌細胞、植物細胞、昆虫細胞、動物細胞、脊椎動物細胞、哺乳動物細胞、およびヒト細胞が挙げられる。いくつかの実施形態において、細胞は真核細胞である。いくつかの実施形態において、細胞は哺乳動物細胞である。いくつかの実施形態において、哺乳動物細胞は、幹細胞である。いくつかの実施形態において、真核細胞は、ヒト細胞である。いくつかの実施形態において、真核細胞は、植物細胞である。いくつかの実施形態において、細胞は非分裂細胞である。いくつかの実施形態において、真核細胞は、非分裂細胞である。いくつかの実施形態において、哺乳動物細胞は、非分裂細胞である。いくつかの実施形態において、幹細胞は、非分裂細胞である。いくつかの実施形態において、ヒト細胞は、非分裂細胞である。いくつかの実施形態において、細胞は肝細胞である。いくつかの実施形態において、真核細胞は、肝細胞である。いくつかの実施形態において、哺乳動物細胞は、肝細胞である。いくつかの実施形態において、幹細胞は、肝細胞である。いくつかの実施形態において、ヒト細胞は、肝細胞である。真核細胞またはかかる細胞から生成される細胞株の非限定的な例としては、Ｔ細胞、ＣＯＳ、Ｋ５６２、ＣＨＯ（例えば、ＣＨＯ－Ｓ、ＣＨＯ－Ｋ１、ＣＨＯ－ＤＧ４４、ＣＨＯ－ＤＵＸＢ１１、ＣＨＯ－ＤＵＫＸ、ＣＨＯＫ１ＳＶ）、ＶＥＲＯ、ＭＤＣＫ、ＷＩ３８、Ｖ７９、Ｂ１４ＡＦ２８－Ｇ３、ＢＨＫ、ＨａＫ、ＮＳ０、ＳＰ２／０－Ａｇ１４、ＨｅＬａ、ＨＥＫ２９３（例えば、ＨＥＫ２９３－Ｆ、ＨＥＫ２９３－Ｈ、ＨＥＫ２９３－Ｔ）、ｐｅｒＣ６、ＨｅｐＧ２、および３４８Ａ細胞、ならびに昆虫細胞、例えば、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｕｇｉｐｅｒｄａ（Ｓｆ）、または真菌細胞、例えば、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ、ＰｉｃｈｉａおよびＳｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓが挙げられる。幹細胞の例としては、限定されないが、胚性幹細胞、人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）、造血幹細胞、神経幹細胞、および間葉系幹細胞が挙げられる。
いくつかの実施形態において、プッシュプルドナーポリヌクレオチド構築物を細胞に導入するために、プッシュプルドナーポリヌクレオチド構築物の核酸配列を、プラスミド、ウイルスベクター、ミニサークル、直鎖ＤＮＡ形態、または他の送達系に組み込む。かかる送達システムは、当業者に周知である。
いくつかの実施形態において、標的ヌクレオチド配列は、内因性遺伝子座である。いくつかの実施形態において、内因性遺伝子座は、イズロニダーゼアルファ－Ｌ（ＩＤＵＡ）遺伝子（ムコ多糖症Ｉ型（ＭＰＳ Ｉ）と関連する）、イデュロン酸－２－スルファターゼ（ＩＤＳ）（ムコ多糖症ＩＩ型（ＭＰＳ ＩＩ）と関連する）、アルファ－ガラクトシダーゼ（ＧＬＡ）遺伝子（ファブリー病と関連する）、アルファ－グルコシダーゼ（ＧＡＡ）遺伝子（ポンペ病と関連する）、フェニルアラニンヒドロキシラーゼ（ＰＡＨ）遺伝子（フェニルケトン尿症（ＰＫＵ）と関連する）、およびセーフハーバー遺伝子座からなる群から選択される。いくつかの実施形態において、内因性遺伝子座は、アルファ－Ｄ－マンノシダーゼ（ＭＡＮ２Ｂ１）遺伝子（アルファ－マンノシドーシスと関連する）、Ｎ－アスパルチル－ベータ－グルコサミニダーゼ（ＡＧＡ）遺伝子（アスパルチルグルコサミン尿症と関連する）、リソソーム酸リパーゼ（ＬＩＰＡ）遺伝子（コレステリルエステル蓄積症、リソソーム酸リパーゼ欠損症、およびウォルマン病と関連する）、シスチノシン（ＣＴＮＳ）遺伝子（シスチノーシスと関連する）、リソソーム関連膜タンパク質２（ＬＡＭＰ２）遺伝子（ダノン病と関連する）、酸セラミダーゼ（ＡＳＡＨ１）遺伝子（ファーバー病と関連する）、アルファフコシダーゼ（ＦＵＣＡ１）遺伝子（フコシドーシスと関連する）、カテプシンＡ（ＣＴＳＡ）遺伝子（ガラクトシアリドーシスと関連する）、酸ベータ－グルコセレブロシダーゼ（ＧＢＡ）遺伝子（Ｉ型ゴーシェ病、ＩＩ型ゴーシェ病、ＩＩＩ型ゴーシェ病と関連する）、ベータガラクトシダーゼ（ＧＬＢ１）遺伝子（ＧＭ１ガングリオシドーシスＩ型、ＩＩ型およびＩＩＩ型、またはＭＰＳ ＩＶ－モルキオＢ型と関連する）、ベータヘキソサミニダーゼＡおよびＢ（ＨＥＸＢ）遺伝子（ＧＭ２サンドホフ病（Ｉ／Ｊ／Ａと関連する）、ベータヘキソサミニダーゼ（ＨＥＸＡ）遺伝子（ＧＭ２テイ・サックス病と関連する）、ＧＭ２ガングリオシド活性化因子（ＧＭ２Ａ）遺伝子（ＧＭ２ガングリオシドーシスＡＢバリアントと関連する）、ＧＬｃＮＡｃ－１－ホスホトランスフェラーゼ（ＧＮＰＴＡＢ）遺伝子（アイセル病／ムコリピドーシスＩＩと関連する）、ベータ－ガラクトシルセラミダーゼ（ＧＡＬＣ）遺伝子（クラッベ病と関連する）、アリールスルファターゼＡ（ＡＲＳＡ）遺伝子（異染性白質ジストロフィーと関連する）、ヘパランＮ－スルファターゼ（ＳＧＳＨ）遺伝子（ＭＰＳ ＩＩＩＡ－サンフィリポ症候群Ａ型と関連する）、アルファ－Ｎ－アセチルグルコサミニダーゼ（ＮＡＧＬＵ）遺伝子（ＭＰＳ ＩＩＩＢ－サンフィリポ症候群Ｂ型と関連する）、アセチルＣｏＡ：アルファ－グルコサミニドアセチルトランスフェラーゼ（ａｃｅｔｙｌｅ ｃｏＡ：ａｌｐｈａ－ｆｌｕｃｏｓａｍｉｎｉｄｅ ａｃｅｔｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）（ＧＳＮＡＴ）遺伝子（ＭＰＳ ＩＩＩＣ－サンフィリポ症候群Ｃ型と関連する）、Ｎ－アセチルグルコサミン－６－スルファターゼ（ＧＡＬＮＳ）遺伝子（ＭＰＳ ＩＶ－モルキオＡ型と関連する）、アリールスルファターゼＢ（ＡＲＳＢ）遺伝子（ＭＰＳ ＶＩ－マロトー・ラミーと関連する）、ベータ－グルクロニダーゼ（ＧＵＳＢ）遺伝子（ＭＰＳ ＶＩＩ－スライ症候群と関連する）、ヒアルロニダーゼ（ＨＹＡＬ１）遺伝子（ＭＰＳ ＩＸ－ヒアルロニダーゼ欠損症）、ノイラミニダーゼ（ＮＥＵ１）遺伝子（ムコリピドーシスＩ－シアリドーシスと関連する）、ＧｌｃＮＡｃ－１－ホスホトランスフェラーゼ（ＧＮＰＴＧ）遺伝子（ムコリピドーシスＩＩＩＣと関連する）、ムコリピン－１（ＭＣＯＬＮ１）遺伝子（ムコリピドーシスＩＶ型と関連する）、ホルミルグリシン生成酵素（ＳＵＭＦ１）遺伝子（マルチプルスルファターゼ欠損症と関連する）、パルミトイル－タンパク質チオエステラーゼ１（ＰＰＴ１）遺伝子（神経セロイドリポフスチン症Ｔ１と関連する）、トリペプチジルペプチダーゼ１（ＴＰＰ１）遺伝子（神経セロイドリポフスチン症Ｔ２と関連する）、ＣＬＮ３（ＣＬＮ３）遺伝子（神経セロイドリポフスチン症Ｔ３と関連する）、システインストリングタンパク質アルファ（ＤＮＡＪＣ５）遺伝子（神経セロイドリポフスチン症Ｔ４と関連する）、ＣＬＮ５（ＣＬＮ５）遺伝子（神経セロイドリポフスチン症Ｔ５と関連する）、ＣＬＮ６（ＣＬＮ６）遺伝子（神経セロイドリポフスチン症Ｔ６と関連する）、ＣＬＮ７（ＣＬＮ７）遺伝子（神経セロイドリポフスチン症Ｔ７と関連する）、ＣＬＮ８（ＣＬＮ８）遺伝子（神経セロイドリポフスチン症Ｔ８と関連する）、酸スフィンゴミエリナーゼ（ＳＭＰＤ１）遺伝子（ニーマン・ピック病Ａ型およびＢ型と関連する）、ＮＰＣ１およびＮＰＣ２（ＮＰ１およびＮＰＣ２）遺伝子（ニーマン・ピック病Ｃ型と関連する）、カテプシンＫ（ＣＴＳＫ）遺伝子（ピクノディスオストーシスと関連する）、シアリン（ＳＬＣ１７Ａ５）遺伝子（シアル酸蓄積症と関連する）、アルファ－Ｎ－アセチルガラクトサミニダーゼ（ＮＡＧＡ）遺伝子（シンドラー病と関連する）、グルコース－６－ホスファターゼ（Ｇ６ＰＣ）遺伝子（ＧＳＤ１ａと関連する）、溶質キャリアファミリー３７メンバー４（ＳＬＣ３７Ａ４）遺伝子（ＧＳＤ１ａと関連する）、アルギニノコハク酸シンターゼ１（ＡＳＳ１）遺伝子（シトルリン血症と関連する）、溶質キャリアファミリー２５メンバー１３（ＳＬＣ２５Ａ１３）遺伝子（シトルリン血症と関連する）、オルニチントランスカルバミラーゼ（ＯＴＣ）遺伝子（ＯＴＣ欠損症と関連する）、ならびにセーフハーバー遺伝子座からなる群から選択される。
いくつかの実施形態において、内因性遺伝子座は、ＦＧＦＲ３遺伝子（軟骨無形成症と関連する）、ＣＮＧＡ３／ＣＮＧＢ３／ＧＮＡＴ２／ＰＤＥ６Ｃ／ＰＤＥ６Ｈ遺伝子（色覚異常と関連する）、ＧＡＡ遺伝子（ポンペ病または酸性マルターゼ欠損症と関連する）、ＡＤＡ遺伝子（アデノシンデアミナーゼ欠損症（ＯＭＩＭ番号１０２７００）と関連する）、ＡＢＣＤ１遺伝子（Ｘ連鎖性副腎白質ジストロフィーと関連する）、Ｘ染色体（アイカルディ症候群と関連する）、ＳＥＲＰＩＮＡ１遺伝子（アルファ－１アンチトリプシン欠損症と関連する）、ＨＢＡ１およびＨＢＡ２遺伝子（アルファ－サラセミアと関連する）、ＡＲ遺伝子（アンドロゲン不応症と関連する）、ＦＧＦＲ２遺伝子（アペール症候群と関連する）、ＰＫＰ２（不整脈原性右室心筋症と関連する）、ＳＬＣ２６Ａ２（捻曲性骨異形成症と関連する）、ＡＴＭ遺伝子（毛細血管拡張性運動失調症と関連する）、ＴＡＺ遺伝子（バース症候群と関連する）、ＨＢＢ遺伝子（ベータ－サラセミア、または鎌状赤血球症（鎌状赤血球貧血）と関連する）、ＡＳＰＡ遺伝子（カナバン病と関連する）、ＣＹＢＡ／ＣＹＢＢ／ＮＣＦ１／ＮＣＦ２／ＮＣＦ４遺伝子（慢性肉芽腫症と関連する）、染色体５の短い（ｐ）アーム（猫鳴き症候群と関連する欠失）、ＣＴＦＲ遺伝子（嚢胞性線維症と関連する）、ＥＤＡ／ＥＤＡＲ／ＥＤＡＲＡＤＤ／ＷＮＴ１０Ａ遺伝子（外胚葉異形成症と関連する）、ＧＬＡ遺伝子（ファブリー病と関連する）、ＦＡＮＣＡ／ＦＡＮＣＣ／ＦＡＮＣＧ遺伝子（ファンコニ貧血と関連する）、ＡＣＶＲ１遺伝子（進行性骨化性線維異形成症と関連する）、ＦＭＲ１遺伝子（脆弱Ｘ症候群と関連する）、ＧＡＬＴ／ＧＡＬＫ１／ＧＡＬＥ遺伝子（ガラクトース血症と関連する）、ＧＢＡ遺伝子（ゴーシェ病と関連する）、ＧＬＢ１遺伝子（汎発性ガングリオシドーシス（例えば、ＧＭ１）と関連する）、ＨＦＥ遺伝子（１型ヘモクロマトーシスと関連する）、ＨＪＶおよびＨＡＭＰ遺伝子（２型ヘモクロマトーシスと関連する）、ＴＦＲ２遺伝子（３型ヘモクロマトーシスと関連する）、ＳＬＣ４０Ａ１遺伝子（４型ヘモクロマトーシスと関連する）、ＨＢＢ遺伝子（ベータ－グロビンの６番目のコドン中のヘモグロビンＣ変異（ＨｂＣ）、血友病と関連する）、ＩＤＳ遺伝子（ムコ多糖症ＩＩ型（ＭＰＳ ＩＩ）としても既知であるハンター症候群と関連する）、ＨＴＴ遺伝子（ハンチントン病と関連する）、ＩＤＵＡ遺伝子（ＭＰＳ Ｉとしても既知であるハーラー症候群と関連する）、ＡＬＰＬ遺伝子（低ホスファターゼ症と関連する）、Ｘ染色体（クラインフェルター症候群と関連する過剰染色体）、ＧＡＬＣ遺伝子（クラッベ病と関連する）、染色体８の長い（ｑ）アーム（ＴＲＰＳ ＩＩとしても既知であるランガー・ギーディオン症候群と関連する欠失）、ＩＴＧＢ２遺伝子（白血球接着不全症（ＬＡＤ、ＯＭＩＭ番号１１６９２０）と関連する）、ＡＲＳＡ遺伝子（異染性白質ジストロフィーと関連する）、ＣＡＣＮＡ１Ｃ遺伝子（ＱＴ延長症候群と関連する）、ＬＰＬ遺伝子（リポタンパク質リパーゼ欠損症と関連する）、ＦＢＮ１遺伝子（マルファン症候群と関連する）、染色体３、１０、または１３（メビウス症候群と関連する）、ＧＮＳ／ＨＧＳＮＡＴ／ＮＡＧＬＵ／ＳＧＳＨ遺伝子（ＭＰＳ ＩＩＩとしても既知であるサンフィリポ症候群と関連する）、ＧＡＬＮＳおよびＧＬＢ１（ＭＰＳ ＩＶと関連する）、ＡＲＳＢ遺伝子（ＭＰＳ ＶＩと関連する）、ＧＵＳＢ遺伝子（ＭＰＳ ＶＩＩと関連する）、ＬＭＸ１Ｂ遺伝子（ネイルパテラ症候群と関連する）、ＡＶＰＲ２およびＡＱＰ２遺伝子（腎性尿崩症と関連する）、ＮＦ１遺伝子（神経線維腫症１型と関連する）、ＮＦ２遺伝子（神経線維腫症２型と関連する）、ＳＭＰＤ１遺伝子（ニーマン・ピック病Ａ型およびＢ型と関連する）、ＮＰＣ１またはＮＰＣ２遺伝子（ニーマン・ピック病Ｃ型と関連する）、ＣＯＬ１Ａ１およびＣＯＬ１Ａ２遺伝子（骨形成不全症と関連する）、ＰＡＨ遺伝子（フェニルケトン尿症（ＰＫＵ）と関連する）、ＡＬＡＤ／ＡＬＡＳ２／ＣＰＯＸ／ＦＥＣＨ／ＨＭＢＳ／ＰＰＯＸ／ＵＲＯＤ／ＵＲＯＳ遺伝子（ポルフィリン症と関連する）、ＯＣＡ２または染色体１５（プラダー・ウィリ症候群と関連する欠失）、ＬＭＮＡ遺伝子（ハッチンソン・ギルフォード・プロジェリア症候群と関連する）、ＡＫＴ１遺伝子（プロテウス症候群と関連する）、ＲＢ１遺伝子（網膜芽細胞腫と関連する）、ＭＥＣＰ２遺伝子（レット症候群と関連する）、ＣＲＥＢＢＰ遺伝子（ルビンシュタイン・テイビ症候群と関連する）、ＩＬ２ＲＧ遺伝子（重症複合免疫不全症（ＳＣＩＤ）と関連する）、ＳＢＤＳ遺伝子（シュワッハマン症候群と関連する）、染色体１７（スミス・マギニス症候群と関連する小さな欠失）、ＣＯＬ２Ａ１およびＣＯＬ１１Ａ１遺伝子（スティックラー症候群と関連する）、ＨＥＸＡ遺伝子（テイ・サックス病と関連する）、ＲＢＭ８Ａ遺伝子（血小板減少橈骨欠損（ＴＡＲ）症候群と関連する）、ＴＣＯＦ１／ＰＯＬＲ１Ｃ／ＰＯＬＲ１Ｄ遺伝子（トリーチャー・コリンズ症候群と関連する）、染色体１３（トリソミー１３と関連する）、染色体１８（トリソミー１８と関連する）、ＴＳＣ１またはＴＳＣ２遺伝子（結節性硬化症と関連する）、Ｘ染色体（ターナー症候群と関連するモノソミー）、ＡＳＬ遺伝子（尿素回路異常症と関連する）、ＶＨＬ遺伝子（フォンヒッペル・リンドウ病と関連する）、ＥＤＮ３／ＥＤＮＲＢ／ＭＩＴＦ／ＰＡＸ３／ＳＮＡＩ２／ＳＯＸ１０遺伝子（ワールデンブルグ症候群と関連する）、染色体７：ＣＬＩＰ２／ＥＬＮ／ＧＴＦ２Ｉ／ＧＴＦ２ＩＲＤ１／ＬＩＭＫ１／ＮＣＦ１遺伝子（ウィリアムズ症候群と関連する欠失）、ＡＴＰ７Ｂ遺伝子（ウィルソン病と関連する）、ＷＡＳ遺伝子（ウィスコット・アルドリッチ症候群と関連する）、およびＳＨ２Ｄ１ＡおよびＸＩＡＰ遺伝子（Ｘ連鎖リンパ増殖症候群（ＸＬＰ、ＯＭＩＭ番号３０８２４０）と関連する）、ＰＥＸ１／１０／２６（ゼルウィガースペクトラム障害と関連する）、ならびにセーフハーバー遺伝子座から選択される。
細胞クロマチン中の目的の領域内の配列の標的化組換えおよび／または置き換えおよび／または変化のための方法のいくつかの実施形態において、染色体配列は、外因性「ドナー」ヌクレオチド配列との相同組換えによって変化する。このような相同組換えは、切断領域に相同性の配列が存在する場合、細胞クロマチン中に二本鎖切断が存在することによって刺激される。
いくつかの実施形態において、ドナー配列は、目的の領域におけるゲノム配列と相同性であるが、同一ではない配列を含有することができ、それによって、目的の領域における非同一の配列を挿入するために相同組換えを刺激する。いくつかの実施形態において、目的の領域内の配列に相同性であるドナー配列の部分は、置き換えられるゲノム配列と約８０～９９％（またはその間の任意の整数）の配列同一性を示す。いくつかの実施形態において、ドナーとゲノム配列との間の相同性は、例えば、ドナーと１００を超える連続塩基対のゲノム配列との間で、１個のヌクレオチドのみが異なる場合、９９％よりも高い。いくつかの実施形態において、ドナー配列の非相同部分は、新たな配列が目的の領域に導入されるように、目的の領域には存在しない配列を含有する。これらの場合において、非相同配列は、一般に、目的の領域内の配列と相同性または同一である５０～１，０００塩基対（またはそれらの間の任意の整数値）の配列または１，０００を超える任意の数の塩基対に隣接する。いくつかの実施形態において、ドナー配列は、第１の標的配列に非相同性であり、非相同組換え機構によってゲノムに挿入される。
いくつかの実施形態において、本開示は、細胞のゲノムのセーフハーバー遺伝子座への外因性核酸配列の組み込みを提供する。セーフハーバー遺伝子座は、典型的には、内因性遺伝子活性を乱すことなく、導入遺伝子が予測可能な方法で組み込まれ、機能することができる遺伝子座である。ヒトゲノムにおける例示的なセーフハーバー遺伝子座としては、限定されないが、Ｒｏｓａ２６遺伝子座、ＡＡＶＳ １遺伝子座、およびＳａｄｅｌａｉｎ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｃａｎｃｅｒ．２０１２；１２（１）：５１－８に列挙されているセーフハーバー遺伝子座が挙げられる。いくつかの実施形態において、セーフハーバー遺伝子座は、第１染色体に位置する。
本明細書で開示されるポリヌクレオチド構築物、ベクターおよび薬学的組成物は、単離された細胞（次いで、エクスビボでの細胞療法のために生きた対象に投与してもよい）に送達されてもよく、または生きた対象に送達されてもよい。細胞および対象への遺伝子編集分子の送達は、当該技術分野で既知である。本明細書に記載されるジンクフィンガーヌクレアーゼタンパク質を送達する方法は、例えば、米国特許第６，４５３，２４２号、同第６，５０３，７１７号、同第６，５３４，２６１号、同第６，５９９，６９２号、同第６，６０７，８８２号、同第６，６８９，５５８号、同第６，８２４，９７８号、同第６，９３３，１１３号、同第６，９７９，５３９号、同第７，０１３，２１９号、および同第７，１６３，８２４号に記載されており、これらのすべての開示は、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。
好適な細胞としては、限定されないが、真核細胞および原核細胞および／または細胞株が挙げられる。真核細胞またはかかる細胞から生成される細胞株の非限定的な例としては、Ｔ細胞、ＣＯＳ、Ｋ５６２、ＣＨＯ（例えば、ＣＨＯ－Ｓ、ＣＨＯ－Ｋ１、ＣＨＯ－ＤＧ４４、ＣＨＯ－ＤＵＸＢ１１、ＣＨＯ－ＤＵＫＸ、ＣＨＯＫ１ＳＶ）、ＶＥＲＯ、ＭＤＣＫ、ＷＩ３８、Ｖ７９、Ｂ１４ＡＦ２８－Ｇ３、ＢＨＫ、ＨａＫ、ＮＳ０、ＳＰ２／０－Ａｇ１４、ＨｅＬａ、ＨＥＫ２９３（例えば、ＨＥＫ２９３－Ｆ、ＨＥＫ２９３－Ｈ、ＨＥＫ２９３－Ｔ）、ｐｅｒＣ６、ＨｅｐＧ２、および３４８Ａ細胞、ならびに昆虫細胞、例えば、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｕｇｉｐｅｒｄａ（Ｓｆ）、または真菌細胞、例えば、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ、ＰｉｃｈｉａおよびＳｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓが挙げられる。いくつかの実施形態において、細胞は哺乳動物細胞である。いくつかの実施形態において、細胞は、幹細胞であり、例えば、一例として、胚性幹細胞、人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）、造血幹細胞、神経幹細胞、および間葉系幹細胞などの幹細胞である。
いくつかの実施形態において、プッシュプルドナーポリヌクレオチド構築物は、ベクターを介して送達され得る。本明細書に記載される１つ以上のジンクフィンガーヌクレアーゼバリアントタンパク質をコードする核酸はまた、ジンクフィンガーヌクレアーゼタンパク質の構成要素のうちの１つ以上をコードする配列を含有するベクターを使用して送達され得る。さらに、これらのベクターのいずれも、適切な場合、１つ以上のＤＮＡ結合タンパク質コード配列および／または追加の核酸を含み得ることが明らかであろう。したがって、本明細書に記載の１つ以上のジンクフィンガーヌクレアーゼタンパク質が細胞内に導入されるとき、および適切な場合には追加のＤＮＡが導入されるとき、これらは、同じベクター上または異なるベクター上に保有されていてもよい。複数のベクターが使用される場合、各ベクターは、１つまたは複数のジンクフィンガーヌクレアーゼタンパク質および所望の場合に追加の核酸をコードする配列を含み得る。従来のウイルスおよび非ウイルスベースの遺伝子導入方法を使用して、細胞（例えば、哺乳動物細胞）および標的組織内に操作されたＤＮＡ結合タンパク質をコードする核酸を導入し、所望の場合に追加のヌクレオチド配列を共導入することができる。このような方法を使用して、核酸をインビトロで細胞に投与することもできる。特定の実施形態において、核酸は、インビボまたはエクスビボでの遺伝子療法使用のために投与される。
本開示のプッシュプルドナーポリヌクレオチド構築物またはジンクフィンガーヌクレアーゼをコードする核酸を含む遺伝子療法ベクターは、以下に記載されるように、個々の患者（対象）への投与、典型的には全身投与（例えば、静脈内、腹腔内、筋肉内、皮下、または頭蓋内注入）または局所適用によって、インビボで送達され得る。あるいは、ベクターは、個々の患者から摘出された細胞（例えば、リンパ球、骨髄穿刺液、組織生検）またはユニバーサルドナー造血幹細胞などの細胞にエクスビボで送達され、続いて、通常、ベクターを組み込んだ細胞の選択後に、細胞を患者に再移植することができる。
診断、研究、移植、または遺伝子療法のための（例えば、トランスフェクトされた細胞の宿主生物への再注入を介した）エクスビボ細胞トランスフェクションは、当業者に周知である。いくつかの実施形態において、細胞は、対象生物から単離され、プッシュプルドナーポリヌクレオチド構築物および／またはジンクフィンガーヌクレアーゼをコードする核酸でトランスフェクトされ、対象生物（例えば、患者）に再注入して戻される。エクスビボトランスフェクションに好適な様々な細胞型は、当業者に周知である（例えば、Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｌｔｕｒｅ ｏｆ Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌｓ，Ａ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｂａｓｉｃ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ（３ｒｄ ｅｄ．１９９４））および患者からの細胞をどのようにして単離し、培養するかについての考察について、そこに引用される参考文献を参照されたい）。
いくつかの実施形態において、幹細胞は、細胞トランスフェクションおよび遺伝子療法のためのエクスビボ手順に使用される。幹細胞を使用する利点は、インビトロで他の細胞型に分化させることができること、またはそれらを骨髄内に移植される哺乳類（細胞のドナーなど）に導入することができることである。ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＦＮ－γ、およびＴＮＦ－αなどのサイトカインを使用して、インビトロでＣＤ３４＋細胞を臨床的に重要な免疫細胞型に分化させるための方法は既知である（Ｉｎａｂａ，ｅｔ ａｌ．（１９９２）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７６：１６９３－１７０２）を参照されたい）。
別の態様において、本明細書には、疾患または障害を治療するための医薬の調製のための、本明細書に開示されるプッシュプルドナーポリヌクレオチド構築物のいずれかの使用が提供される。
別の態様において、疾患または障害を治療するための医薬の調製のための、本明細書に開示されるプッシュプルドナーポリヌクレオチド構築物、第１のジンクフィンガーヌクレアーゼをコードする第１のポリヌクレオチド、および第２のジンクフィンガーヌクレアーゼをコードする第２のポリヌクレオチドのいずれかの使用が本明細書に提供される。
別の態様において、疾患または障害を治療するための医薬の調製のための、本明細書に開示されるプッシュプルドナーポリヌクレオチド構築物、および１つ以上のジンクフィンガーヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチドのいずれかの使用が本明細書に提供される。
別の態様において、疾患または障害を治療するための医薬の調製のための、本明細書に開示されるプッシュプルドナーポリヌクレオチド構築物、およびツーインワンジンクフィンガーヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチドのいずれかの使用が本明細書に提供される。
別の態様において、細胞のゲノムを改変するための医薬の調製のための、本明細書に開示されるプッシュプルドナーポリヌクレオチド構築物のいずれかの使用が本明細書に提供される。
別の態様において、細胞のゲノムを改変するための医薬の調製のための、本明細書に開示されるプッシュプルドナーポリヌクレオチド構築物、第１のジンクフィンガーヌクレアーゼをコードする第１のポリヌクレオチド、および第２のジンクフィンガーヌクレアーゼをコードする第２のポリヌクレオチドのいずれかの使用が本明細書に提供される。
別の態様において、細胞のゲノムを改変するための医薬の調製のための、本明細書に開示されるプッシュプルドナーポリヌクレオチド構築物、および１つ以上のジンクフィンガーヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチドのいずれかの使用が本明細書に提供される。
別の態様において、細胞のゲノムを改変するための医薬の調製のための、本明細書に開示されるプッシュプルドナーポリヌクレオチド構築物、およびツーインワンジンクフィンガーヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチドのいずれかの使用が本明細書に提供される。
別の態様において、導入遺伝子を細胞の標的ヌクレオチド配列に組み込むための医薬の調製のための、本明細書に開示されるプッシュプルドナーポリヌクレオチド構築物のいずれかの使用が本明細書に提供される。
別の態様において、導入遺伝子を細胞の標的ヌクレオチド配列に組み込むための医薬の調製のための、本明細書に開示されるプッシュプルドナーポリヌクレオチド構築物、第１のジンクフィンガーヌクレアーゼをコードする第１のポリヌクレオチド、および第２のジンクフィンガーヌクレアーゼをコードする第２のポリヌクレオチドのいずれかの使用が本明細書に提供される。
別の態様において、導入遺伝子を細胞の標的ヌクレオチド配列に組み込むための医薬の調製のための、本明細書に開示されるプッシュプルドナーポリヌクレオチド構築物、および１つ以上のジンクフィンガーヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチドのいずれかの使用が本明細書に提供される。
別の態様において、導入遺伝子を細胞の標的ヌクレオチド配列に組み込むための医薬の調製のための、本明細書に開示されるプッシュプルドナーポリヌクレオチド構築物、およびツーインワンジンクフィンガーヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチドのいずれかの使用が本明細書に提供される。
別の態様において、細胞内の標的ヌクレオチド配列を破壊するための医薬の調製のための、本明細書に開示されるプッシュプルドナーポリヌクレオチド構築物のいずれかの使用が本明細書に提供される。
別の態様において、細胞内の標的ヌクレオチド配列を破壊するための医薬の調製のための、本明細書に開示されるプッシュプルドナーポリヌクレオチド構築物、第１のジンクフィンガーヌクレアーゼをコードする第１のポリヌクレオチド、および第２のジンクフィンガーヌクレアーゼをコードする第２のポリヌクレオチドのいずれかの使用が本明細書に提供される。
別の態様において、細胞内の標的ヌクレオチド配列を破壊するための医薬の調製のための、本明細書に開示されるプッシュプルドナーポリヌクレオチド構築物、および１つ以上のジンクフィンガーヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチドのいずれかの使用が本明細書に提供される。
別の態様において、細胞内の標的ヌクレオチド配列を破壊するための医薬の調製のための、本明細書に開示されるプッシュプルドナーポリヌクレオチド構築物、およびツーインワンジンクフィンガーヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチドのいずれかの使用が本明細書に提供される。
別の態様において、細胞のゲノム内の疾患を引き起こす変異を修正するための医薬の調製のための、本明細書に開示されるプッシュプルドナーポリヌクレオチド構築物のいずれかの使用が本明細書に提供される。
別の態様において、細胞のゲノム内の疾患を引き起こす変異を修正するための医薬の調製のための、本明細書に開示されるプッシュプルドナーポリヌクレオチド構築物、第１のジンクフィンガーヌクレアーゼをコードする第１のポリヌクレオチド、および第２のジンクフィンガーヌクレアーゼをコードする第２のポリヌクレオチドのいずれかの使用が本明細書に提供される。
別の態様において、細胞のゲノム内の疾患を引き起こす変異を修正するための医薬の調製のための、本明細書に開示されるプッシュプルドナーポリヌクレオチド構築物、および１つ以上のジンクフィンガーヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチドのいずれかの使用が本明細書に提供される。
別の態様において、細胞のゲノム内の疾患を引き起こす変異を修正するための医薬の調製のための、本明細書に開示されるプッシュプルドナーポリヌクレオチド構築物、およびツーインワンジンクフィンガーヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチドのいずれかの使用が本明細書に提供される。
別の態様において、細胞のゲノム内の標的ヌクレオチド配列を改変するための医薬の調製のための、本明細書に開示されるプッシュプルドナーポリヌクレオチド構築物のいずれかの使用が本明細書に提供される。
別の態様において、細胞のゲノム内の標的ヌクレオチド配列を改変するための医薬の調製のための、本明細書に開示されるプッシュプルドナーポリヌクレオチド構築物、第１のジンクフィンガーヌクレアーゼをコードする第１のポリヌクレオチド、および第２のジンクフィンガーヌクレアーゼをコードする第２のポリヌクレオチドのいずれかの使用が本明細書に提供される。
別の態様において、細胞のゲノム内の標的ヌクレオチド配列を改変するための医薬の調製のための、本明細書に開示されるプッシュプルドナーポリヌクレオチド構築物、および１つ以上のジンクフィンガーヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチドのいずれかの使用が本明細書に提供される。
別の態様において、細胞のゲノム内の標的ヌクレオチド配列を改変するための医薬の調製のための、本明細書に開示されるプッシュプルドナーポリヌクレオチド構築物、およびツーインワンジンクフィンガーヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチドのいずれかの使用が本明細書に提供される。
別の態様において、疾患または障害を治療するための医薬の調製のための、本明細書に開示されるベクターのいずれかの使用が本明細書に提供される。
別の態様において、疾患または障害を治療するための医薬の調製のための、本明細書に開示されるプッシュプルドナーポリヌクレオチド構築物を含むベクターのいずれかの使用が本明細書に提供される。
別の態様において、疾患または障害を治療するための医薬の調製のための、本明細書に開示されるプッシュプルドナーポリヌクレオチド構築物を含むベクター、第１のジンクフィンガーヌクレアーゼをコードする第１のポリヌクレオチドを含むベクター、および第２のジンクフィンガーヌクレアーゼをコードする第２のポリヌクレオチドを含むベクターのいずれかの使用が本明細書に提供される。
別の態様において、疾患または障害を治療するための医薬の調製のための、本明細書に開示されるプッシュプルドナーポリヌクレオチド構築物を含むベクター、および１つ以上のジンクフィンガーヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチドを含むベクターのいずれかの使用が本明細書に提供される。
別の態様において、疾患または障害を治療するための医薬の調製のための、本明細書に開示されるプッシュプルドナーポリヌクレオチド構築物を含むベクター、およびツーインワンジンクフィンガーヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチドを含むベクターのいずれかの使用が本明細書に提供される。
別の態様において、細胞のゲノムを改変するための医薬の調製のための、本明細書に開示されるベクターのいずれかの使用が本明細書に提供される。
別の態様において、細胞のゲノムを改変するための医薬の調製のための、本明細書に開示されるプッシュプルドナーポリヌクレオチド構築物を含むベクターのいずれかの使用が本明細書に提供される。
別の態様において、細胞のゲノムを改変するための医薬の調製のための、本明細書に開示されるプッシュプルドナーポリヌクレオチド構築物を含むベクター、第１のジンクフィンガーヌクレアーゼをコードする第１のポリヌクレオチドを含むベクター、および第２のジンクフィンガーヌクレアーゼをコードする第２のポリヌクレオチドを含むベクターのいずれかの使用が本明細書に提供される。
別の態様において、細胞のゲノムを改変するための医薬の調製のための、本明細書に開示されるプッシュプルドナーポリヌクレオチド構築物を含むベクター、および１つ以上のジンクフィンガーヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチドを含むベクターのいずれかの使用が本明細書に提供される。
別の態様において、細胞のゲノムを改変するための医薬の調製のための、本明細書に開示されるプッシュプルドナーポリヌクレオチド構築物を含むベクター、およびツーインワンジンクフィンガーヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチドを含むベクターのいずれかの使用が本明細書に提供される。
別の態様において、導入遺伝子を細胞の標的ヌクレオチド配列に組み込むための医薬の調製のための、本明細書に開示されるベクターのいずれかの使用が本明細書に提供される。
別の態様において、導入遺伝子を細胞の標的ヌクレオチド配列に組み込むための医薬の調製のための、本明細書に開示されるプッシュプルドナーポリヌクレオチド構築物を含むベクターのいずれかの使用が本明細書に提供される。
別の態様において、導入遺伝子を細胞の標的ヌクレオチド配列に組み込むための医薬の調製のための、本明細書に開示されるプッシュプルドナーポリヌクレオチド構築物を含むベクター、第１のジンクフィンガーヌクレアーゼをコードする第１のポリヌクレオチドを含むベクター、および第２のジンクフィンガーヌクレアーゼをコードする第２のポリヌクレオチドを含むベクターのいずれかの使用が本明細書に提供される。
別の態様において、導入遺伝子を細胞の標的ヌクレオチド配列に組み込むための医薬の調製のための、本明細書に開示されるプッシュプルドナーポリヌクレオチド構築物を含むベクター、および１つ以上のジンクフィンガーヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチドを含むベクターのいずれかの使用が本明細書に提供される。
別の態様において、導入遺伝子を細胞の標的ヌクレオチド配列に組み込むための医薬の調製のための、本明細書に開示されるプッシュプルドナーポリヌクレオチド構築物を含むベクター、およびツーインワンジンクフィンガーヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチドを含むベクターのいずれかの使用が本明細書に提供される。
別の態様において、細胞内の標的ヌクレオチド配列を破壊するための医薬の調製のための、本明細書に開示されるベクターのいずれかの使用が本明細書に提供される。
別の態様において、細胞内の標的ヌクレオチド配列を破壊するための医薬の調製のための、本明細書に開示されるプッシュプルドナーポリヌクレオチド構築物を含むベクターのいずれかの使用が本明細書に提供される。
別の態様において、細胞内の標的ヌクレオチド配列を破壊するための医薬の調製のための、本明細書に開示されるプッシュプルドナーポリヌクレオチド構築物を含むベクター、第１のジンクフィンガーヌクレアーゼをコードする第１のポリヌクレオチドを含むベクター、および第２のジンクフィンガーヌクレアーゼをコードする第２のポリヌクレオチドを含むベクターのいずれかの使用が本明細書に提供される。
別の態様において、細胞内の標的ヌクレオチド配列を破壊するための医薬の調製のための、本明細書に開示されるプッシュプルドナーポリヌクレオチド構築物を含むベクター、および１つ以上のジンクフィンガーヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチドを含むベクターのいずれかの使用が本明細書に提供される。
別の態様において、細胞内の標的ヌクレオチド配列を破壊するための医薬の調製のための、本明細書に開示されるプッシュプルドナーポリヌクレオチド構築物を含むベクター、およびツーインワンジンクフィンガーヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチドを含むベクターのいずれかの使用が本明細書に提供される。
別の態様において、細胞のゲノム内の疾患を引き起こす変異を修正するための医薬の調製のための、本明細書に開示されるベクターのいずれかの使用が本明細書に提供される。
別の態様において、細胞のゲノム内の疾患を引き起こす変異を修正するための医薬の調製のための、本明細書に開示されるプッシュプルドナーポリヌクレオチド構築物を含むベクターのいずれかの使用が本明細書に提供される。
別の態様において、細胞のゲノム内の疾患を引き起こす変異を修正するための医薬の調製のための、本明細書に開示されるプッシュプルドナーポリヌクレオチド構築物を含むベクター、第１のジンクフィンガーヌクレアーゼをコードする第１のポリヌクレオチドを含むベクター、および第２のジンクフィンガーヌクレアーゼをコードする第２のポリヌクレオチドを含むベクターのいずれかの使用が本明細書に提供される。
別の態様において、細胞のゲノム内の疾患を引き起こす変異を修正するための医薬の調製のための、本明細書に開示されるプッシュプルドナーポリヌクレオチド構築物を含むベクター、および１つ以上のジンクフィンガーヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチドを含むベクターのいずれかの使用が本明細書に提供される。
別の態様において、細胞のゲノム内の疾患を引き起こす変異を修正するための医薬の調製のための、本明細書に開示されるプッシュプルドナーポリヌクレオチド構築物を含むベクター、およびツーインワンジンクフィンガーヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチドを含むベクターのいずれかの使用が本明細書に提供される。
別の態様において、細胞のゲノム内の標的ヌクレオチド配列を改変するための医薬の調製のための、本明細書に開示されるベクターのいずれかの使用が本明細書に提供される。
別の態様において、細胞のゲノム内の標的ヌクレオチド配列を改変するための医薬の調製のための、本明細書に開示されるプッシュプルドナーポリヌクレオチド構築物を含むベクターのいずれかの使用が本明細書に提供される。
別の態様において、細胞のゲノム内の標的ヌクレオチド配列を改変するための医薬の調製のための、本明細書に開示されるプッシュプルドナーポリヌクレオチド構築物を含むベクター、第１のジンクフィンガーヌクレアーゼをコードする第１のポリヌクレオチドを含むベクター、および第２のジンクフィンガーヌクレアーゼをコードする第２のポリヌクレオチドを含むベクターのいずれかの使用が本明細書に提供される。
別の態様において、細胞のゲノム内の標的ヌクレオチド配列を改変するための医薬の調製のための、本明細書に開示されるプッシュプルドナーポリヌクレオチド構築物を含むベクター、および１つ以上のジンクフィンガーヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチドを含むベクターのいずれかの使用が本明細書に提供される。
別の態様において、細胞のゲノム内の標的ヌクレオチド配列を改変するための医薬の調製のための、本明細書に開示されるプッシュプルドナーポリヌクレオチド構築物を含むベクター、およびツーインワンジンクフィンガーヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチドを含むベクターのいずれかの使用が本明細書に提供される。
別の態様において、疾患または障害を治療する際に使用するための、本明細書に開示されるプッシュプルドナーポリヌクレオチド構築物のいずれかが本明細書に提供される。
別の態様において、疾患または障害を治療する際に使用するための、本明細書に開示されるプッシュプルドナーポリヌクレオチド構築物、第１のジンクフィンガーヌクレアーゼをコードする第１のポリヌクレオチド、および第２のジンクフィンガーヌクレアーゼをコードする第２のポリヌクレオチドのいずれかが本明細書に提供される。
別の態様において、疾患または障害を治療する際に使用するための、本明細書に開示されるプッシュプルドナーポリヌクレオチド構築物、および１つ以上のジンクフィンガーヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチドのいずれかが本明細書に提供される。
別の態様において、疾患または障害を治療する際に使用するための、本明細書に開示されるプッシュプルドナーポリヌクレオチド構築物、およびツーインワンジンクフィンガーヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチドのいずれかが本明細書に提供される。
別の態様において、細胞のゲノムを改変する際に使用するための、本明細書に開示されるプッシュプルドナーポリヌクレオチド構築物のいずれかが本明細書に提供される。
別の態様において、細胞のゲノムを改変する際に使用するための、本明細書に開示されるプッシュプルドナーポリヌクレオチド構築物、第１のジンクフィンガーヌクレアーゼをコードする第１のポリヌクレオチド、および第２のジンクフィンガーヌクレアーゼをコードする第２のポリヌクレオチドのいずれかが本明細書に提供される。
別の態様において、細胞のゲノムを改変する際に使用するための、本明細書に開示されるプッシュプルドナーポリヌクレオチド構築物、および１つ以上のジンクフィンガーヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチドのいずれかが本明細書に提供される。
別の態様において、細胞のゲノムを改変する際に使用するための、本明細書に開示されるプッシュプルドナーポリヌクレオチド構築物、およびツーインワンジンクフィンガーヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチドのいずれかが本明細書に提供される。
別の態様において、導入遺伝子を細胞の標的ヌクレオチド配列に組み込む際に使用するための、本明細書に開示されるプッシュプルドナーポリヌクレオチド構築物のいずれかが本明細書に提供される。
別の態様において、導入遺伝子を細胞の標的ヌクレオチド配列に組み込む際に使用するための、本明細書に開示されるプッシュプルドナーポリヌクレオチド構築物、第１のジンクフィンガーヌクレアーゼをコードする第１のポリヌクレオチド、および第２のジンクフィンガーヌクレアーゼをコードする第２のポリヌクレオチドのいずれかが本明細書に提供される。
別の態様において、導入遺伝子を細胞の標的ヌクレオチド配列に組み込む際に使用するための、本明細書に開示されるプッシュプルドナーポリヌクレオチド構築物、および１つ以上のジンクフィンガーヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチドのいずれかが本明細書に提供される。
別の態様において、導入遺伝子を細胞の標的ヌクレオチド配列に組み込む際に使用するための、本明細書に開示されるプッシュプルドナーポリヌクレオチド構築物、およびツーインワンジンクフィンガーヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチドのいずれかが本明細書に提供される。
別の態様において、細胞内の標的ヌクレオチド配列を破壊する際に使用するための、本明細書に開示されるプッシュプルドナーポリヌクレオチド構築物のいずれかが本明細書に提供される。
別の態様において、細胞内の標的ヌクレオチド配列を破壊する際に使用するための、本明細書に開示されるプッシュプルドナーポリヌクレオチド構築物、第１のジンクフィンガーヌクレアーゼをコードする第１のポリヌクレオチド、および第２のジンクフィンガーヌクレアーゼをコードする第２のポリヌクレオチドのいずれかが本明細書に提供される。
別の態様において、細胞内の標的ヌクレオチド配列を破壊する際に使用するための、本明細書に開示されるプッシュプルドナーポリヌクレオチド構築物、および１つ以上のジンクフィンガーヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチドのいずれかが本明細書に提供される。
別の態様において、細胞内の標的ヌクレオチド配列を破壊する際に使用するための、本明細書に開示されるプッシュプルドナーポリヌクレオチド構築物、およびツーインワンジンクフィンガーヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチドのいずれかが本明細書に提供される。
別の態様において、細胞のゲノム内の疾患を引き起こす変異を修正する際に使用するための、本明細書に開示されるプッシュプルドナーポリヌクレオチド構築物のいずれかが本明細書に提供される。
別の態様において、細胞のゲノム内の疾患を引き起こす変異を修正する際に使用するための、本明細書に開示されるプッシュプルドナーポリヌクレオチド構築物、第１のジンクフィンガーヌクレアーゼをコードする第１のポリヌクレオチド、および第２のジンクフィンガーヌクレアーゼをコードする第２のポリヌクレオチドのいずれかが本明細書に提供される。
別の態様において、細胞のゲノム内の疾患を引き起こす変異を修正する際に使用するための、本明細書に開示されるプッシュプルドナーポリヌクレオチド構築物、および１つ以上のジンクフィンガーヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチドのいずれかが本明細書に提供される。
別の態様において、細胞のゲノム内の疾患を引き起こす変異を修正する際に使用するための、本明細書に開示されるプッシュプルドナーポリヌクレオチド構築物、およびツーインワンジンクフィンガーヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチドのいずれかが本明細書に提供される。
別の態様において、細胞のゲノム内の標的ヌクレオチド配列を改変する際に使用するための、本明細書に開示されるプッシュプルドナーポリヌクレオチド構築物のいずれかが本明細書に提供される。
別の態様において、細胞のゲノム内の標的ヌクレオチド配列を改変する際に使用するための、本明細書に開示されるプッシュプルドナーポリヌクレオチド構築物、第１のジンクフィンガーヌクレアーゼをコードする第１のポリヌクレオチド、および第２のジンクフィンガーヌクレアーゼをコードする第２のポリヌクレオチドのいずれかが本明細書に提供される。
別の態様において、細胞のゲノム内の標的ヌクレオチド配列を改変する際に使用するための、本明細書に開示されるプッシュプルドナーポリヌクレオチド構築物、および１つ以上のジンクフィンガーヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチドのいずれかが本明細書に提供される。
別の態様において、細胞のゲノム内の標的ヌクレオチド配列を改変する際に使用するための、本明細書に開示されるプッシュプルドナーポリヌクレオチド構築物、およびツーインワンジンクフィンガーヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチドのいずれかが本明細書に提供される。
別の態様において、疾患または障害を治療する際に使用するための、本明細書に開示されるベクターのいずれかが本明細書に提供される。
別の態様において、疾患または障害を治療する際に使用するための、本明細書に開示されるプッシュプルドナーポリヌクレオチド構築物を含むベクターのいずれかが本明細書に提供される。
別の態様において、疾患または障害を治療する際に使用するための、本明細書に開示されるプッシュプルドナーポリヌクレオチド構築物を含むベクター、第１のジンクフィンガーヌクレアーゼをコードする第１のポリヌクレオチドを含むベクター、および第２のジンクフィンガーヌクレアーゼをコードする第２のポリヌクレオチドを含むベクターのいずれかが本明細書に提供される。
別の態様において、疾患または障害を治療する際に使用するための、本明細書に開示されるプッシュプルドナーポリヌクレオチド構築物を含むベクター、および１つ以上のジンクフィンガーヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチドを含むベクターのいずれかが本明細書に提供される。
別の態様において、疾患または障害を治療する際に使用するための、本明細書に開示されるプッシュプルドナーポリヌクレオチド構築物を含むベクター、およびツーインワンジンクフィンガーヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチドを含むベクターのいずれかが本明細書に提供される。
別の態様において、細胞のゲノムを改変する際に使用するための、本明細書に開示されるベクターのいずれかが本明細書に提供される。
別の態様において、細胞のゲノムを改変する際に使用するための、本明細書に開示されるプッシュプルドナーポリヌクレオチド構築物を含むベクターのいずれかが本明細書に提供される。
別の態様において、細胞のゲノムを改変する際に使用するための、本明細書に開示されるプッシュプルドナーポリヌクレオチド構築物を含むベクター、第１のジンクフィンガーヌクレアーゼをコードする第１のポリヌクレオチドを含むベクター、および第２のジンクフィンガーヌクレアーゼをコードする第２のポリヌクレオチドを含むベクターのいずれかが本明細書に提供される。
別の態様において、細胞のゲノムを改変する際に使用するための、本明細書に開示されるプッシュプルドナーポリヌクレオチド構築物を含むベクター、および１つ以上のジンクフィンガーヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチドを含むベクターのいずれかが本明細書に提供される。
別の態様において、細胞のゲノムを改変する際に使用するための、本明細書に開示されるプッシュプルドナーポリヌクレオチド構築物を含むベクター、およびツーインワンジンクフィンガーヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチドを含むベクターのいずれかが本明細書に提供される。
別の態様において、導入遺伝子を細胞の標的ヌクレオチド配列に組み込む際に使用するための、本明細書に開示されるベクターのいずれかが本明細書に提供される。
別の態様において、導入遺伝子を細胞の標的ヌクレオチド配列に組み込む際に使用するための、本明細書に開示されるプッシュプルドナーポリヌクレオチド構築物を含むベクターのいずれかが本明細書に提供される。
別の態様において、導入遺伝子を細胞の標的ヌクレオチド配列に組み込む際に使用するための、本明細書に開示されるプッシュプルドナーポリヌクレオチド構築物を含むベクター、第１のジンクフィンガーヌクレアーゼをコードする第１のポリヌクレオチドを含むベクター、および第２のジンクフィンガーヌクレアーゼをコードする第２のポリヌクレオチドを含むベクターのいずれかが本明細書に提供される。
別の態様において、導入遺伝子を細胞の標的ヌクレオチド配列に組み込む際に使用するための、本明細書に開示されるプッシュプルドナーポリヌクレオチド構築物を含むベクター、および１つ以上のジンクフィンガーヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチドを含むベクターのいずれかが本明細書に提供される。
別の態様において、導入遺伝子を細胞の標的ヌクレオチド配列に組み込む際に使用するための、本明細書に開示されるプッシュプルドナーポリヌクレオチド構築物を含むベクター、およびツーインワンジンクフィンガーヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチドを含むベクターのいずれかが本明細書に提供される。
別の態様において、細胞内の標的ヌクレオチド配列を破壊する際に使用するための、本明細書に開示されるベクターのいずれかが本明細書に提供される。
別の態様において、細胞内の標的ヌクレオチド配列を破壊する際に使用するための、本明細書に開示されるプッシュプルドナーポリヌクレオチド構築物を含むベクターのいずれかが本明細書に提供される。
別の態様において、細胞内の標的ヌクレオチド配列を破壊する際に使用するための、本明細書に開示されるプッシュプルドナーポリヌクレオチド構築物を含むベクター、第１のジンクフィンガーヌクレアーゼをコードする第１のポリヌクレオチドを含むベクター、および第２のジンクフィンガーヌクレアーゼをコードする第２のポリヌクレオチドを含むベクターのいずれかが本明細書に提供される。
別の態様において、細胞内の標的ヌクレオチド配列を破壊する際に使用するための、本明細書に開示されるプッシュプルドナーポリヌクレオチド構築物を含むベクター、および１つ以上のジンクフィンガーヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチドを含むベクターのいずれかが本明細書に提供される。
別の態様において、細胞内の標的ヌクレオチド配列を破壊する際に使用するための、本明細書に開示されるプッシュプルドナーポリヌクレオチド構築物を含むベクター、およびツーインワンジンクフィンガーヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチドを含むベクターのいずれかが本明細書に提供される。
別の態様において、細胞のゲノム内の疾患を引き起こす変異を修正するためにおいて使用するための、本明細書に開示されるベクターのいずれかが本明細書に提供される。
別の態様において、細胞のゲノム内の疾患を引き起こす変異を修正する際に使用、本明細書に開示されるプッシュプルドナーポリヌクレオチド構築物を含むベクターのいずれかが本明細書に提供される。
別の態様において、細胞のゲノム内の疾患を引き起こす変異を修正する際に使用するための、本明細書に開示されるプッシュプルドナーポリヌクレオチド構築物を含むベクター、第１のジンクフィンガーヌクレアーゼをコードする第１のポリヌクレオチドを含むベクター、および第２のジンクフィンガーヌクレアーゼをコードする第２のポリヌクレオチドを含むベクターのいずれかが本明細書に提供される。
別の態様において、細胞のゲノム内の疾患を引き起こす変異を修正する際に使用するための、本明細書に開示されるプッシュプルドナーポリヌクレオチド構築物を含むベクター、および１つ以上のジンクフィンガーヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチドを含むベクターのいずれかが本明細書に提供される。
別の態様において、細胞のゲノム内の疾患を引き起こす変異を修正する際に使用するための、本明細書に開示されるプッシュプルドナーポリヌクレオチド構築物を含むベクター、およびツーインワンジンクフィンガーヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチドを含むベクターのいずれかが本明細書に提供される。
別の態様において、細胞のゲノム内の標的ヌクレオチド配列を改変する際に使用するための、本明細書に開示されるベクターのいずれかが本明細書に提供される。
別の態様において、細胞のゲノム内の標的ヌクレオチド配列を改変する際に使用するための、本明細書に開示されるプッシュプルドナーポリヌクレオチド構築物を含むベクターのいずれかが本明細書に提供される。
別の態様において、細胞のゲノム内の標的ヌクレオチド配列を改変する際に使用するための、本明細書に開示されるプッシュプルドナーポリヌクレオチド構築物を含むベクター、第１のジンクフィンガーヌクレアーゼをコードする第１のポリヌクレオチドを含むベクター、および第２のジンクフィンガーヌクレアーゼをコードする第２のポリヌクレオチドを含むベクターのいずれかが本明細書に提供される。
別の態様において、細胞のゲノム内の標的ヌクレオチド配列を改変する際に使用するための、本明細書に開示されるプッシュプルドナーポリヌクレオチド構築物を含むベクター、および１つ以上のジンクフィンガーヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチドを含むベクターのいずれかが本明細書に提供される。
別の態様において、細胞のゲノム内の標的ヌクレオチド配列を改変する際に使用、本明細書に開示されるプッシュプルドナーポリヌクレオチド構築物を含むベクター、およびツーインワンジンクフィンガーヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチドを含むベクターのいずれかが本明細書に提供される。
例示的な構築物
プッシュプルドナー構築物の非限定的な例としては、表２に示されるような構築物、および任意の順序または組み合わせで表３の配列のうちの１つ以上を含む構築物が挙げられる。
Figure 2022553828000003
Figure 2022553828000004
Figure 2022553828000005
Figure 2022553828000006
Figure 2022553828000007
Figure 2022553828000008
Figure 2022553828000009
Figure 2022553828000010
Figure 2022553828000011
Figure 2022553828000012
Figure 2022553828000013
Figure 2022553828000014
Figure 2022553828000015
Figure 2022553828000016
Figure 2022553828000017
Figure 2022553828000018
Figure 2022553828000019
Figure 2022553828000020
Figure 2022553828000021
Figure 2022553828000022
Figure 2022553828000023
Figure 2022553828000024
Figure 2022553828000025
Figure 2022553828000026
ツーインワンＺＦＮ構築物の非限定的な例としては、図２に示されるような構築物、任意の順序または組み合わせで表４の配列のうちの１つ以上を含む構築物、および表５に示されるような構築物が挙げられる。
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以下の実施例は、ドナーがプッシュプルドナーポリヌクレオチドを含み、ヌクレアーゼがジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）を含む、本開示の例示的な実施形態に関する。これらの実施例は、本開示の特定の特徴および実施形態の例示の目的のためにのみ含まれ、限定することを意図するものではないことが理解されるであろう。当業者であれば、本明細書に記載の方法、核酸、タンパク質、ベクターおよび細胞と同等の多くのものを認識するか、または通常の実験のみを用いて確認することができるであろう。そのような等価物は、本開示の範囲内であるとみなされる。
付番された実施形態
本開示の特定の実施形態は、以下の番号を付けた段落に示される。
１．ポリヌクレオチド構築物であって、５’から３’への方向で、
ａ．第１の逆位末端反復（ＩＴＲ）ヌクレオチド配列と、
ｂ．第１のポリペプチドをコードする第１のヌクレオチド配列と、
ｃ．第２のポリペプチドをコードする第２のヌクレオチド配列と、
ｄ．第２のＩＴＲヌクレオチド配列と、を含み、
第１のポリペプチドをコードする第１のヌクレオチド配列が、第２のポリペプチドをコードする第２のヌクレオチド配列に対してテール－テールに配向され、第１のヌクレオチド配列および第２のヌクレオチド配列が、同じアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする、ポリヌクレオチド構築物。
２．ｅ．第１のポリペプチドをコードする第１のヌクレオチド配列に作動可能に連結された第１のスプライスアクセプター配列と、
ｆ．第２のポリペプチドをコードする第２のヌクレオチド配列に作動可能に連結された第２のスプライスアクセプター配列と、をさらに含む、段落１に記載のポリヌクレオチド構築物。
３．上述の第１のスプライスアクセプター配列および第２のスプライスアクセプター配列のそれぞれが、独立して、第９因子スプライスアクセプター（Ｆ９ＳＡ）、ＣＦＴＲスプライスアクセプター、ＣＯＬ５Ａ２スプライスアクセプター、ＮＦ１スプライスアクセプター、ＭＬＨ１スプライスアクセプター、およびアルブミン（ＡＬＢ）スプライスアクセプターから選択される、段落２に記載のポリヌクレオチド構築物。
４．ｇ．第１のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列に作動可能に連結された第１のポリアデニル化（ポリＡ）シグナル配列と、
ｈ．第２のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列に作動可能に連結された第２のポリアデニル化（ポリＡ）シグナル配列と、をさらに含む、段落１または２に記載のポリヌクレオチド構築物。
５．第１のポリＡシグナル配列が、ヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）ポリＡシグナル、ウシ成長ホルモン（ｂＧＨ）ポリＡシグナル、ＳＶ４０ポリＡシグナル、およびｒｂＧｌｏｂポリＡシグナルから選択される、段落４に記載のポリヌクレオチド構築物。
６．第２のポリＡシグナル配列が、ヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）ポリＡシグナル、ウシ成長ホルモン（ｂＧＨ）ポリＡシグナル、ＳＶ４０ポリＡシグナル、およびｒｂＧｌｏｂポリＡシグナルから選択される、段落４または５に記載のポリヌクレオチド構築物。
７．第１のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列または第２のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列が、治療用ポリペプチドをコードする、段落１～６のいずれか１つに記載のポリヌクレオチド構築物。
８．治療用ポリペプチドが、イズロン酸－２－スルファターゼ（ＩＤＳ）、アルファ－Ｌ－イズロニダーゼ（ＩＤＵＡ）、アルファ－Ｄ－マンノシダーゼ、Ｎ－アスパルチル－ベータ－グルコサミニダーゼ、リソソーム酸リパーゼ、シスチノシン、リソソーム関連膜タンパク質２、アルファ－ガラクトシダーゼＡ、酸セラミダーゼ、アルファフコシダーゼ、カテプシンＡ、酸ベータ－グルコセレブロシダーゼ、ベータガラクトシダーゼ、ベータヘキソサミニダーゼＡ、ベータヘキソサミニダーゼＢ、ベータヘキソサミニダーゼ、ＧＭ２ガングリオシド活性化因子、ＧＬｃＮＡｃ－１－ホスホトランスフェラーゼ、ベータ－ガラクトシルセラミダーゼ、アリールスルファターゼＡ、ヘパランＮ－スルファターゼ、アルファ－Ｎ－アセチルグルコサミニダーゼ、アセチルＣｏＡ：アルファ－グルコサミニドアセチルトランスフェラーゼ、Ｎ－アセチルグルコサミン－６－スルファターゼ、アリールスルファターゼＢ、ベータ－グルクロニダーゼ、ヒアルロニダーゼ、ノイラミニダーゼ、ムコリピン－１、ホルミルグリシン生成酵素、パルミトイル－タンパク質チオエステラーゼ１、トリペプチジルペプチダーゼ１、ＣＬＮ３タンパク質、システインストリングタンパク質アルファ、ＣＬＮ５タンパク質、ＣＬＮ６タンパク質、ＣＬＮ７タンパク質、ＣＬＮ８タンパク質、酸スフィンゴミエリナーゼ、ＮＰＣ １、ＮＰＣ ２、フェニルアラニンヒドロキシラーゼ、酸アルファ－グルコシダーゼ、カテプシンＫ、シアリン、アルファ－Ｎ－アセチルガラクトサミニダーゼ、グルコース－６－ホスファターゼ、溶質キャリアファミリー３７メンバー４、アルギニノコハク酸シンターゼ１、溶質キャリアファミリー２５メンバー１３、およびオルニチントランスカルバミラーゼからなる群から選択される、段落７に記載のポリヌクレオチド構築物。
９．第１のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列が、コドン多様化されている、段落１～８のいずれか１つに記載のポリヌクレオチド構築物。
１０．第２のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列が、コドン多様化されている、段落１～９のいずれか１つに記載のポリヌクレオチド構築物。
１１．第１のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列および第２のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列のそれぞれが、それぞれ独立してコドン多様化されている、段落１～１０のいずれか１つに記載のポリヌクレオチド構築物。
１２．第１のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列が、配列番号１８４～１９３のうちのいずれか１つに示されるヌクレオチド配列を含む、段落１～１１のいずれか１つに記載のポリヌクレオチド構築物。
１３．第２のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列が、配列番号１８４～１９３のうちのいずれか１つに示されるヌクレオチド配列を含む、段落１～１２のいずれか１つに記載のポリヌクレオチド構築物。
１４．上述のポリヌクレオチド構築物が、配列番号１７３～１７６のうちのいずれか１つに示されるヌクレオチド配列を含む、段落１に記載のポリヌクレオチド構築物。
１５．段落１～１４のいずれか１つに記載のポリヌクレオチド構築物を含む、ベクター。
１６．ベクターが、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターである、段落１５に記載のベクター。
１７．ＡＡＶが、ＡＡＶ－ＭｅＣＰ２、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ８、ＡＡＶ８．２、ＡＡＶ９、Ｄｕａｌ ＡＡＶ９、ＡＡＶｒｈ８、ＡＡＶｒｈ１０、ＡＡＨｒｈ４３、ＡＡＶｈｕ３７、ＡＡＶ２／８、ＡＡＶ２／５、およびＡＡＶ２／６からなる群から選択される、段落１６に記載のベクター。
１８．段落１～１４のいずれか１つに記載のポリヌクレオチド構築物、または段落１５～１７のいずれか１つに記載のベクターを含む、細胞。
１９．細胞が真核細胞である、段落１８に記載の細胞。
２０．細胞が哺乳動物細胞である、段落１９に記載の細胞。
２１．細胞が幹細胞である、段落２０に記載の細胞。
２２．細胞がヒト細胞である、段落１９に記載の細胞。
２３．細胞が非分裂細胞である、段落１８～２２のいずれか１つに記載の細胞。
２４．細胞が肝細胞である、段落１９～２３のいずれか１つに記載の細胞。
２５．細胞が、ヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチドをさらに含む、段落１８～２４のいずれか１つに記載の細胞。
２６．細胞が、第１のジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）をコードする第１のポリヌクレオチドと、第２のジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）をコードする第２のポリヌクレオチドと、をさらに含む、段落１８～２４のいずれか１つに記載の細胞。
２７．細胞が、第１のジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）をコードする第１のポリヌクレオチドを含む第１のベクターと、第２のジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）をコードする第２のポリヌクレオチドを含む第２のベクターと、をさらに含む、段落１８～２４のいずれか１つに記載の細胞。
２８．細胞が、１つ以上のジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）をコードするポリヌクレオチドをさらに含む、段落１８～２４のいずれか１つに記載の細胞。
２９．細胞が、１つ以上のジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）をコードするポリヌクレオチドを含むベクターをさらに含む、段落１８～２４のいずれか１つに記載の細胞。
３０．ジンクフィンガーヌクレアーゼが、ツーインワンジンクフィンガーヌクレアーゼである、段落２８または２９に記載の細胞。
３１．段落１～１４のいずれか１つに記載のポリヌクレオチド構築物と、薬学的に許容される担体と、を含む、薬学的組成物。
３２．組成物が、第１のジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）をコードする第１のポリヌクレオチドと、第２のジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）をコードする第２のポリヌクレオチドと、をさらに含む、段落３１に記載の薬学的組成物。
３３．組成物が、第１のジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）をコードする第１のポリヌクレオチドを含む第１のベクターと、第２のジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）をコードする第２のポリヌクレオチドを含む第２のベクターと、を含む、段落３１に記載の薬学的組成物。
３４．組成物が、１つ以上のジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）をコードするポリヌクレオチドをさらに含む、段落３１に記載の薬学的組成物。
３５．組成物が、１つ以上のジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）をコードするポリヌクレオチドを含むベクターをさらに含む、段落３２に記載の薬学的組成物。
３６．ジンクフィンガーヌクレアーゼが、ツーインワンジンクフィンガーヌクレアーゼである、段落３２、３４～３５のいずれか１つに記載の薬学的組成物。
３７．第１のジンクフィンガーヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチド：第２のジンクフィンガーをコードするポリヌクレオチド：段落１～１４のいずれか１つに記載のポリヌクレオチドの比率が、１：１：８である、段落３２に記載の薬学的組成物。
３８．第１のジンクフィンガーヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチド：第２のジンクフィンガーをコードするポリヌクレオチド：段落１～１４のいずれか１つに記載のポリヌクレオチドの比率が、１：１：４である、段落３２に記載の薬学的組成物。
３９．第１のジンクフィンガーヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチド：第２のジンクフィンガーをコードするポリヌクレオチド：段落１～１４のいずれか１つに記載のポリヌクレオチドの比率が、１：１：２である、段落３２に記載の薬学的組成物。
４０．第１のジンクフィンガーヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチド：第２のジンクフィンガーをコードするポリヌクレオチド：段落１～１４のいずれか１つに記載のポリヌクレオチドの比率が、３：３：４である、段落３２に記載の薬学的組成物。
４１．第１のジンクフィンガーヌクレアーゼをコードする第１のポリヌクレオチドを含むベクター：第２のジンクフィンガーをコードするポリヌクレオチドを含むベクター：段落１５～１７のいずれか１つに記載のベクターの比率が、１：１：８である、段落３３に記載の薬学的組成物。
４２．第１のジンクフィンガーヌクレアーゼをコードする第１のポリヌクレオチドを含むベクター：第２のジンクフィンガーをコードするポリヌクレオチドを含むベクター：段落１５～１７のいずれか１つに記載のベクターの比率が、１：１：４である、段落３３に記載の薬学的組成物。
４３．第１のジンクフィンガーヌクレアーゼをコードする第１のポリヌクレオチドを含むベクター：第２のジンクフィンガーをコードするポリヌクレオチドを含むベクター：段落１５～１７のいずれか１つに記載のベクターの比率が、１：１：２である、段落３３に記載の薬学的組成物。
４４．第１のジンクフィンガーヌクレアーゼをコードする第１のポリヌクレオチドを含むベクター：第２のジンクフィンガーをコードするポリヌクレオチドを含むベクター：段落１５～１７のいずれか１つに記載のベクターの比率が、３：３：４である、段落３３に記載の薬学的組成物。
４５．ツーインワンジンクフィンガーヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチド：段落１～１４のいずれか１つに記載のポリヌクレオチド構築物の比率が、１：４である、段落３６に記載の薬学的組成物。
４６．ツーインワンジンクフィンガーヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチド：段落１～１４のいずれか１つに記載のポリヌクレオチド構築物の比率が、１：２である、段落３６に記載の薬学的組成物。
４７．ツーインワンジンクフィンガーヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチド：段落１～１４のいずれか１つに記載のポリヌクレオチド構築物の比率が、１：１である、段落３６に記載の薬学的組成物。
４８．ツーインワンジンクフィンガーヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチド：段落１～１４のいずれか１つに記載のポリヌクレオチド構築物の比率が、３：２である、段落３６に記載の薬学的組成物。
４９．ツーインワンジンクフィンガーヌクレアーゼを含むベクター：段落１５～１７のいずれか１つに記載のベクターの比率が、１：４である、段落３３に記載の薬学的組成物。
５０．ツーインワンジンクフィンガーヌクレアーゼを含むベクター：段落１５～１７のいずれか１つに記載のベクターの比率が、１：２である、段落３３に記載の薬学的組成物。
５１．ツーインワンジンクフィンガーヌクレアーゼを含むベクター：段落１５～１７のいずれか１つに記載のベクターの比率が、１：１である、段落３３に記載の薬学的組成物。
５２．ツーインワンジンクフィンガーヌクレアーゼを含むベクター：段落１５～１７のいずれか１つに記載のベクターの比率が、３：２である、段落３３に記載の薬学的組成物。
５３．組成物が、静脈内、筋肉内、皮下、または髄腔内投与用に製剤化される、段落３１～５３のいずれか１つに記載の薬学的組成物。
５４．細胞のゲノムを改変する方法であって、本方法が、有効量の段落１～１４のいずれか１つに記載のポリヌクレオチド構築物を細胞に導入することを含む、方法。
５５．細胞のゲノムを改変する方法であって、本方法が、有効量の段落１５～１７のいずれか１つに記載のベクターを細胞に導入することを含む、方法。
５６．細胞のゲノムを改変する方法であって、本方法が、有効量の段落３１～５３のいずれか１つに記載の薬学的組成物を細胞に導入することを含む、方法。
５７．外因性ヌクレオチド配列を細胞の標的ヌクレオチド配列に組み込む方法であって、本方法が、有効量の段落１～１４のいずれか１つに記載のポリヌクレオチド構築物を細胞に導入することを含む、方法。
５８．外因性ヌクレオチド配列を細胞の標的ヌクレオチド配列に組み込む方法であって、本方法が、有効量の段落１５～１７のいずれか１つに記載のベクターを細胞に導入することを含む、方法。
５９．外因性ヌクレオチド配列を細胞の標的ヌクレオチド配列に組み込む方法であって、本方法が、有効量の段落３１～５３のいずれか１つに記載の薬学的組成物を細胞に導入することを含む、方法。
６０．細胞内の標的ヌクレオチド配列を破壊する方法であって、本方法が、有効量の段落１～１４のいずれか１つに記載のポリヌクレオチド構築物を細胞に導入することを含む、方法。
６１．細胞内の標的ヌクレオチド配列を破壊する方法であって、本方法が、有効量の段落１５～１７のいずれか１つに記載のベクターを細胞に導入することを含む、方法。
６２．細胞内の標的ヌクレオチド配列を破壊する方法であって、本方法が、有効量の段落３１～５３のいずれか１つに記載の薬学的組成物を細胞に導入することを含む、方法。
６３．対象の障害を治療する方法であって、本方法が、有効量の段落１～１４のいずれか１つに記載のポリヌクレオチド構築物を細胞に導入することによって、上述の対象の細胞のゲノム内の標的ヌクレオチド配列を改変することを含む、方法。
６４．対象の障害を治療する方法であって、本方法が、有効量の段落１５～１７のいずれか１つに記載のベクターを細胞に導入することによって、上述の対象の細胞のゲノム内の標的ヌクレオチド配列を改変することを含む、方法。
６５．対象の障害を治療する方法であって、本方法が、有効量の段落３１～５３のいずれか１つに記載の薬学的組成物を細胞に導入することによって、上述の対象の細胞のゲノム内の標的ヌクレオチド配列を改変することを含む、方法。
６６．本方法が、有効量の第１のジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）をコードする第１のポリヌクレオチドおよび第２のジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）をコードする第２のポリヌクレオチドを細胞に導入することをさらに含む、段落５４、５７、６０および６３のいずれか１つに記載の方法。
６７．本方法が、有効量の第１のジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）をコードする第１のポリヌクレオチドを含む第１のベクターおよび第２のジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）をコードする第２のポリヌクレオチドを含む第２のベクターを細胞に導入することをさらに含む、段落５５、５８、６１および６４のいずれか１つに記載の方法。
６８．本方法が、有効量の１つ以上のジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）をコードするポリヌクレオチドを細胞に導入することをさらに含む、段落５４、５７、６０および６３のいずれか１つに記載の方法。
６９．本方法が、有効量の１つ以上のジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）をコードするポリヌクレオチドを含むベクターを細胞に導入することをさらに含む、段落５５、５８、６１および６４のいずれか１つに記載の方法。
７０．ジンクフィンガーヌクレアーゼが、ツーインワンジンクフィンガーヌクレアーゼである、段落６８または６９に記載の方法。
７１．段落１～１４のいずれか１つに記載のポリヌクレオチド構築物を細胞のゲノムに組み込むと、第１のポリペプチドをコードする第１のヌクレオチド配列が発現される、段落５４～７０のいずれか１つに記載の方法。
７２．段落１～１４のいずれか１つに記載のポリヌクレオチド構築物を細胞のゲノムに組み込むと、第２のポリペプチドをコードする第２のヌクレオチド配列が発現される、段落５４～７０のいずれか１つに記載の方法。
７３．障害が、遺伝性障害、感染性疾患、後天性障害、およびがんからなる群から選択される、段落６３～７２のいずれか１つに記載の方法。
７４．遺伝性障害が、軟骨無形成症、色覚異常、酸性マルターゼ欠損症、アデノシンデアミナーゼ欠損症（ＯＭＩＭ番号１０２７００）、副腎白質ジストロフィー、アイカルディ症候群、アルファ－１アンチトリプシン欠損症、アルファ－サラセミア、アンドロゲン不応症、アペール症候群、不整脈原性右室心筋症、異形成、毛細血管拡張性運動失調症、バース症候群、ベータ－サラセミア、青色ゴムまり様母斑症候群、カナバン病、慢性肉芽腫症（ＣＧＤ）、シトルリン血症、猫鳴き症候群、嚢胞性線維症、デュカム病、外胚葉異形成症、ファブリー病、ファンコニ貧血、進行性骨化性線維異形成症、脆弱Ｘ症候群、ガラクトース血症、ゴーシェ病、汎発性ガングリオシドーシス（例えば、ＧＭ１）、ＧＳＤ（例えば、ＧＳＤ１ａ）ヘモクロマトーシス、ベータ－グロビンの６番目のコドン中のヘモグロビンＣ変異（ＨｂＣ）、血友病、ハンター症候群、ハンチントン病、ハーラー症候群、低ホスファターゼ症、クラインフェルター症候群、クラッベ病、ランガー・ギーディオン症候群、白血球接着不全症（ＬＡＤ、ＯＭＩＭ番号１１６９２０）、白質ジストロフィー、ＱＴ延長症候群、リポタンパク質リパーゼ欠損症、マルファン症候群、メビウス症候群、ムコ多糖症（ＭＰＳ）、ネイルパテラ症候群、腎性尿崩症、神経線維腫症、ニーマン・ピック病、オルニチントランスカルバミラーゼ（ＯＴＣ）欠損症、骨形成不全症、フェニルケトン尿症（ＰＫＵ）、ポンペ病、ポルフィリン症、プラダー・ウィリ症候群、早老症、プロテウス症候群、網膜芽細胞腫、レット症候群、ルビンシュタイン・テイビ症候群、サンフィリポ症候群、重症複合免疫不全症（ＳＣＩＤ）、シュワッハマン症候群、鎌状赤血球症（鎌状赤血球貧血）、スミス・マギニス症候群、スティックラー症候群、テイ・サックス病、血小板減少橈骨欠損（ＴＡＲ）症候群、トリーチャー・コリンズ症候群、トリソミー、結節性硬化症、ターナー症候群、尿素回路異常症、フォンヒッペル・リンドウ病、ワールデンブルグ症候群、ウィリアムズ症候群、ウィルソン病、ウィスコット・アルドリッチ症候群、およびＸ連鎖リンパ増殖症候群（ＸＬＰ、ＯＭＩＭ番号３０８２４０）からなる群から選択される、段落７３に記載の方法。
７５．遺伝性障害が、リソソーム蓄積症である、段落７３に記載の方法。
７６．リソソーム蓄積症が、アルファ－マンノシドーシス、アスパルチルグルコサミン尿症、コレステリルエステル蓄積症、シスチノーシス、ダノン病、ファブリー病、ファーバー病、フコシドーシス、ガラクトシアリドーシス、Ｉ型ゴーシェ病、ＩＩ型ゴーシェ病、ＩＩＩ型ゴーシェ病、ＧＭ１ガングリオシドーシス（Ｉ、ＩＩおよびＩＩＩ型）、ＧＭ２サンドホフ病（Ｉ／Ｊ／Ａ）、ＧＭ２テイ・サックス病、ＧＭ２ガングリオシドーシスＡＢバリアント、アイセル病／ムコリピドーシスＩＩ、クラッベ病、リソソーム酸リパーゼ欠損症、異染性白質ジストロフィー、ＭＰＳ Ｉ－ハーラー症候群、ＭＰＳ Ｉ－シャイエ症候群、ＭＰＳ Ｉハーラー－シャイエ症候群、ＭＰＳ ＩＩハンター症候群、ＭＰＳ ＩＩＩＡ－サンフィリポ症候群Ａ型、ＭＰＳ ＩＩＩＢ－サンフィリポ症候群Ｂ型、ＭＰＳ ＩＩＩＣ－サンフィリポ症候群Ｃ型、ＭＰＳＩＩＩＤ－サンフィリポ症候群Ｄ型、ＭＰＳ ＩＶ－モルキオＡ型、ＭＰＳ ＩＶ－モルキオＢ型、ＭＰＳ ＶＩ－マロトー・ラミー、ＭＰＳ ＶＩＩ－スライ症候群、ＭＰＳ ＩＸ－ヒアルロニダーゼ欠損症、ムコリピドーシスＩ－シアリドーシス、ムコリピドーシスＩＩＩＣ、ムコリピドーシスＩＶ型、マルチプルスルファターゼ欠損症、神経セロイドリポフスチン症Ｔ１、神経セロイドリポフスチン症Ｔ２、神経セロイドリポフスチン症Ｔ３、神経セロイドリポフスチン症Ｔ４、神経セロイドリポフスチン症Ｔ５、神経セロイドリポフスチン症Ｔ６、神経セロイドリポフスチン症Ｔ７、神経セロイドリポフスチン症Ｔ８、ニーマン・ピック病Ａ型、ニーマン・ピック病Ｂ型、ニーマン・ピック病Ｃ型、フェニルケトン尿症、ポンペ病、ピクノディスオストーシス、シアル酸蓄積症、シンドラー病、およびウォルマン病からなる群から選択される、段落７５に記載の方法。
７７．リソソーム蓄積症が、ＭＰＳＩおよびＭＰＳＩＩから選択される、段落７６に記載の方法。
７８．リソソーム蓄積症が、ＭＰＳ Ｉ－ハーラー症候群、ＭＰＳ Ｉ－シャイエ症候群、およびＭＰＳ Ｉ－ハーラー－シャイエ症候群からなる群から選択される、段落７７に記載の方法。
７９．リソソーム蓄積症が、ＭＰＳＩＩハンター症候群である、段落７７に記載の方法。
８０．感染性疾患が、ＨＳＶ－１およびＨＳＶ－２などの単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）、水痘帯状疱疹ウイルス（ＶＺＶ）、エプスタイン・バーウイルス（ＥＢＶ）、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、ヒトヘルペスウイルス６（ＨＨＶ－６）、ヒトヘルペスウイルス７（ＨＨＶ－７）、Ａ型肝炎ウイルス（ＨＡＶ）、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）、デルタ肝炎ウイルス（ＨＤＶ）、Ｅ型肝炎ウイルス（ＨＥＶ）、Ｇ型肝炎ウイルス（ＨＧＶ）、Ｐｉｃｏｒｎａｖｉｒｉｄａｅ、Ｃａｌｉｃｉｖｉｒｉｄａｅ、Ｔｏｇａｖｉｒｉｄａｅ、Ｆｌａｖｉｖｉｒｉｄａｅ、Ｃｏｒｏｎａｖｉｒｉｄａｅ、Ｒｅｏｖｉｒｉｄａｅ、Ｂｉｒｎａｖｉｒｉｄａｅ、Ｒｈａｂｏｄｏｖｉｒｉｄａｅ、Ｆｉｌｏｖｉｒｉｄａｅ、Ｐａｒａｍｙｘｏｖｉｒｉｄａｅ、Ｏｒｔｈｏｍｙｘｏｖｉｒｉｄａｅ、Ｂｕｎｙａｖｉｒｉｄａｅ、Ａｒｅｎａｖｉｒｉｄａｅ、Ｒｅｔｒｏｖｉｒａｄａｅ、レンチウイルス、サル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）、インフルエンザウイルスおよびダニ媒介性脳炎ウイルスからなる群から選択される、段落７３に記載の方法。
８１．ベクターが、約１×１０９ｖｇ／ｋｇ～約１×１０１７ｖｇ／ｋｇの用量で投与される、段落５５、５８、６１および６４のいずれか１つに記載の方法。
８２．ベクターが、約５×１０１２ｖｇ／ｋｇ、約１×１０１３ｖｇ／ｋｇ、約５×１０１３ｖｇ／ｋｇ、および約１×１０１４ｖｇ／ｋｇからなる群から選択される用量で投与される、段落８１に記載の方法。
８３．１つ以上のジンクフィンガーヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチドを含むベクターが、約１×１０１２ｖｇ／ｋｇ～約１×１０１４ｖｇ／ｋｇの用量で投与される、段落８１または８２に記載の方法。
８４．細胞のゲノム内の疾患を引き起こす変異を修正する方法であって、本方法が、有効量の段落１～１４のいずれか１つに記載のポリヌクレオチド構築物を細胞に導入することによって、細胞のゲノム内の標的ヌクレオチド配列を改変することを含む、方法。
８５．細胞のゲノム内の疾患を引き起こす変異を修正する方法であって、本方法が、有効量の段落１５～１７のいずれか１つに記載のベクターを細胞に導入することによって、細胞のゲノム内の標的ヌクレオチド配列を改変することを含む、方法。
８６．細胞のゲノム内の疾患を引き起こす変異を修正する方法であって、本方法が、有効量の段落３１～５３のいずれか１つに記載の薬学的組成物を細胞に導入することによって、細胞のゲノム内の標的ヌクレオチド配列を改変することを含む、方法。
８７．本方法が、有効量の第１のジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）をコードする第１のポリヌクレオチドおよび第２のジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）をコードする第２のポリヌクレオチドを細胞に導入することをさらに含む、段落８２に記載の方法。
８８．本方法が、有効量の第１のジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）をコードする第１のポリヌクレオチドを含む第１のベクターおよび第２のジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）をコードする第２のポリヌクレオチドを含む第２のベクターを細胞に導入することをさらに含む、段落８３に記載の方法。
８９．本方法が、有効量の１つ以上のジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）をコードするポリヌクレオチドを細胞に導入することをさらに含む、段落８３に記載の方法。
９０．本方法が、有効量の１つ以上のジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）をコードするポリヌクレオチドを含むベクターを細胞に導入することをさらに含む、段落８３に記載の方法。
９１．段落１～１４のいずれか１つに記載のポリヌクレオチド構築物を細胞のゲノムに組み込むと、第１のポリペプチドをコードする第１のヌクレオチド配列が発現される、段落８４～９０のいずれか１つに記載の方法。
９２．段落１～１４のいずれか１つに記載のポリヌクレオチド構築物を細胞のゲノムに組み込むと、第２のポリペプチドをコードする第２のヌクレオチド配列が発現される、段落８４～９０のいずれか１つに記載の方法。
９３．細胞が真核細胞である、段落５４～９２のいずれか１つに記載の方法。
９４．細胞が哺乳動物細胞である、段落９３に記載の方法。
９５．細胞が幹細胞である、段落９４に記載の方法。
９６．細胞がヒト細胞である、段落９３に記載の方法。
９７．細胞が非分裂細胞である、段落５４～９６のいずれか１つに記載の方法。
９８．細胞が肝細胞である、段落９３に記載の方法。
９９．標的ヌクレオチド配列が、内因性遺伝子座である、段落５７～９８のいずれか１つに記載の方法。
１００．疾患または障害を治療するための医薬の調製のための、段落１～１４のいずれか１つに記載のポリヌクレオチド構築物の、使用。
１０１．細胞のゲノムを改変するための医薬の調製のための、段落１～１４のいずれか１つに記載のポリヌクレオチド構築物の、使用。
１０２．導入遺伝子を細胞の標的ヌクレオチド配列に組み込むための医薬の調製のための、段落１～１４のいずれか１つに記載のポリヌクレオチド構築物の、使用。
１０３．細胞内の標的ヌクレオチド配列を破壊するための医薬の調製のための、段落１～１４のいずれか１つに記載のポリヌクレオチド構築物の、使用。
１０４．細胞のゲノム内の疾患を引き起こす変異を修正するための医薬の調製のための、段落１～１４のいずれか１つに記載のポリヌクレオチド構築物の、使用。
１０５．細胞のゲノム内の標的ヌクレオチド配列を改変するための医薬の調製のための、段落１～１４のいずれか１つに記載のポリヌクレオチド構築物の、使用。
１０６．疾患または障害を治療する際に使用するための、段落１～１４のいずれか１つに記載のポリヌクレオチド構築物。
１０７．細胞のゲノムを改変する際に使用するための、段落１～１４のいずれか１つに記載のポリヌクレオチド構築物。
１０８．導入遺伝子を細胞の標的ヌクレオチド配列に組み込む際に使用するための、段落１～１４のいずれか１つに記載のポリヌクレオチド構築物。
１０９．細胞内の標的ヌクレオチド配列を破壊する際に使用するための、段落１～１４のいずれか１つに記載のポリヌクレオチド構築物。
１１０．細胞のゲノム内の疾患を引き起こす変異を修正する際に使用するための、段落１～１４のいずれか１つに記載のポリヌクレオチド構築物。
１１１．細胞のゲノム内の標的ヌクレオチド配列を改変する際に使用するための、段落１～１４のいずれか１つに記載のポリヌクレオチド構築物。
実施例１：ｉＰＳ由来ヒト肝細胞におけるプッシュプルＩＤＳ構築物の評価
ｉＰＳ由来のヒト肝細胞を、図２に示されるように、イデュロン酸－２－スルファターゼ（ＩＤＳ）をコードする導入遺伝子を含むジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）ＡＡＶ構築物および様々なドナーＡＡＶ構築物（１、２、４、および５）で形質導入した。導入遺伝子のうちの少なくとも一方または両方が、コドン多様化された。ドナー構築物の配列を表２に列挙する。低用量の３０ｖｇ／細胞の各ＺＦＮ ＡＡＶおよび２４０ｖｇ／細胞のドナーＡＡＶ（図３、パネルＡ）、または高用量の３００ｖｇ／細胞の各ＺＦＮ ＡＡＶおよび２４００ｖｇ／細胞のドナーＡＡＶ（図３、パネルＢ）を使用して、肝細胞を形質導入した。左および右のＺＦＮをコードする別個のＡＡＶベクターを使用した。例えば、米国特許出願公開第２０１９／０２４１８７７号を参照されたい。単一のＩＤＳドナーを対照として使用した。例えば、米国特許出願第１６／５３４，２８０号を参照されたい。ＩＤＳ酵素活性は、ｎｍｏｌ／ｍＬ／時間で測定されるように、肝細胞によって産生されるＩＤＳのレベルによって測定された。ＩＤＳ活性は、挿入および欠失のパーセンテージ（インデル％）によって正規化された。ドナー構築物ＩＤＳ＿ｐｕｓｈ＿ｐｕｌｌ ２およびＩＤＳ＿ｐｕｓｈ＿ｐｕｌｌ ４のＩＤＳ活性は、対照と比較して３倍高いレベルのＩＤＳ産生をもたらした。ドナー構築物ＩＤＳ＿ｐｕｓｈ＿ｐｕｌｌ １は、対照と比較して、２．５倍増加し、一方、ドナー構築物ＩＤＳ＿ｐｕｓｈ＿ｐｕｌｌ ５は、２倍増加したＩＤＳ産生を有していた。図３のパネルＣを参照されたい。

Claims (111)

  1. ポリヌクレオチド構築物であって、５’から３’への方向で、
    ａ．第１の逆位末端反復（ＩＴＲ）ヌクレオチド配列と、
    ｂ．第１のポリペプチドをコードする第１のヌクレオチド配列と、
    ｃ．第２のポリペプチドをコードする第２のヌクレオチド配列と、
    ｄ．第２のＩＴＲヌクレオチド配列と、を含み、
    第１のポリペプチドをコードする前記第１のヌクレオチド配列が、第２のポリペプチドをコードする前記第２のヌクレオチド配列に対してテール－テール（ｔａｉｌ－ｔｏ－ｔａｉｌ）に配向され、前記第１のヌクレオチド配列および前記第２のヌクレオチド配列が、同じアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする、ポリヌクレオチド構築物。
  2. ｅ．前記第１のポリペプチドをコードする前記第１のヌクレオチド配列に作動可能に連結された第１のスプライスアクセプター配列と、
    ｆ．前記第２のポリペプチドをコードする前記第２のヌクレオチド配列に作動可能に連結された第２のスプライスアクセプター配列と、をさらに含む、請求項１に記載のポリヌクレオチド構築物。
  3. 前記第１のスプライスアクセプター配列および前記第２のスプライスアクセプター配列のそれぞれが、独立して、第９因子スプライスアクセプター（Ｆ９ＳＡ）、ＣＦＴＲスプライスアクセプター、ＣＯＬ５Ａ２スプライスアクセプター、ＮＦ１スプライスアクセプター、ＭＬＨ１スプライスアクセプター、およびアルブミン（ＡＬＢ）スプライスアクセプターから選択される、請求項２に記載のポリヌクレオチド構築物。
  4. ｇ．前記第１のポリペプチドをコードする前記ヌクレオチド配列に作動可能に連結された第１のポリアデニル化（ポリＡ）シグナル配列と、
    ｈ．前記第２のポリペプチドをコードする前記ヌクレオチド配列に作動可能に連結された第２のポリアデニル化（ポリＡ）シグナル配列と、をさらに含む、請求項１または２に記載のポリヌクレオチド構築物。
  5. 前記第１のポリＡシグナル配列が、ヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）ポリＡシグナル、ウシ成長ホルモン（ｂＧＨ）ポリＡシグナル、ＳＶ４０ポリＡシグナル、およびｒｂＧｌｏｂポリＡシグナルから選択される、請求項４に記載のポリヌクレオチド構築物。
  6. 前記第２のポリＡシグナル配列が、ヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）ポリＡシグナル、ウシ成長ホルモン（ｂＧＨ）ポリＡシグナル、ＳＶ４０ポリＡシグナル、およびｒｂＧｌｏｂポリＡシグナルから選択される、請求項４または５に記載のポリヌクレオチド構築物。
  7. 前記第１のポリペプチドをコードする前記ヌクレオチド配列または前記第２のポリペプチドをコードする前記ヌクレオチド配列が、治療用ポリペプチドをコードする、請求項１～６のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド構築物。
  8. 前記治療用ポリペプチドが、イズロン酸－２－スルファターゼ（ＩＤＳ）、アルファ－Ｌ－イズロニダーゼ（ＩＤＵＡ）、アルファ－Ｄ－マンノシダーゼ、Ｎ－アスパルチル－ベータ－グルコサミニダーゼ、リソソーム酸リパーゼ、シスチノシン（ｃｙｓｔｉｎｏｓｉｎ）、リソソーム関連膜タンパク質２、アルファ－ガラクトシダーゼＡ、酸セラミダーゼ、アルファフコシダーゼ、カテプシンＡ、酸ベータ－グルコセレブロシダーゼ、ベータガラクトシダーゼ、ベータヘキソサミニダーゼＡ、ベータヘキソサミニダーゼＢ、ベータヘキソサミニダーゼ、ＧＭ２ガングリオシド活性化因子、ＧＬｃＮＡｃ－１－ホスホトランスフェラーゼ、ベータ－ガラクトシルセラミダーゼ、アリールスルファターゼＡ、ヘパランＮ－スルファターゼ、アルファ－Ｎ－アセチルグルコサミニダーゼ、アセチルＣｏＡ：アルファ－グルコサミニドアセチルトランスフェラーゼ、Ｎ－アセチルグルコサミン－６－スルファターゼ、アリールスルファターゼＢ、ベータ－グルクロニダーゼ、ヒアルロニダーゼ、ノイラミニダーゼ、ムコリピン（ｍｕｃｏｌｉｐｉｎ）－１、ホルミルグリシン生成酵素、パルミトイル－タンパク質チオエステラーゼ１、トリペプチジルペプチダーゼ１、ＣＬＮ３タンパク質、システインストリングタンパク質アルファ、ＣＬＮ５タンパク質、ＣＬＮ６タンパク質、ＣＬＮ７タンパク質、ＣＬＮ８タンパク質、酸スフィンゴミエリナーゼ、ＮＰＣ １、ＮＰＣ ２、フェニルアラニンヒドロキシラーゼ、酸アルファ－グルコシダーゼ、カテプシンＫ、シアリン、アルファ－Ｎ－アセチルガラクトサミニダーゼ、グルコース－６－ホスファターゼ、溶質キャリアファミリー３７メンバー４、アルギニノコハク酸シンターゼ１、溶質キャリアファミリー２５メンバー１３、およびオルニチントランスカルバミラーゼからなる群から選択される、請求項７に記載のポリヌクレオチド構築物。
  9. 前記第１のポリペプチドをコードする前記ヌクレオチド配列が、コドン多様化されている、請求項１～８のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド構築物。
  10. 前記第２のポリペプチドをコードする前記ヌクレオチド配列が、コドン多様化されている、請求項１～９のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド構築物。
  11. 前記第１のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列および前記第２のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列のそれぞれが、それぞれ独立してコドン多様化されている、請求項１～１０のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド構築物。
  12. 前記第１のポリペプチドをコードする前記ヌクレオチド配列が、配列番号１８４～１９３のうちのいずれか１つに示されるヌクレオチド配列を含む、請求項１～１１のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド構築物。
  13. 前記第２のポリペプチドをコードする前記ヌクレオチド配列が、配列番号１８４～１９３のうちのいずれか１つに示されるヌクレオチド配列を含む、請求項１～１２のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド構築物。
  14. 前記ポリヌクレオチド構築物が、配列番号１７３～１７６のうちのいずれか１つに示されるヌクレオチド配列を含む、請求項１に記載のポリヌクレオチド構築物。
  15. 請求項１～１４のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド構築物を含む、ベクター。
  16. 前記ベクターが、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターである、請求項１５に記載のベクター。
  17. 前記ＡＡＶが、ＡＡＶ－ＭｅＣＰ２、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ８、ＡＡＶ８．２、ＡＡＶ９、Ｄｕａｌ ＡＡＶ９、ＡＡＶｒｈ８、ＡＡＶｒｈ１０、ＡＡＨｒｈ４３、ＡＡＶｈｕ３７、ＡＡＶ２／８、ＡＡＶ２／５、およびＡＡＶ２／６からなる群から選択される、請求項１６に記載のベクター。
  18. 請求項１～１４のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド構築物、または請求項１５～１７のいずれか一項に記載のベクターを含む、細胞。
  19. 前記細胞が真核細胞である、請求項１８に記載の細胞。
  20. 前記細胞が哺乳動物細胞である、請求項１９に記載の細胞。
  21. 前記細胞が幹細胞である、請求項２０に記載の細胞。
  22. 前記細胞がヒト細胞である、請求項１９に記載の細胞。
  23. 前記細胞が非分裂細胞である、請求項１８～２２のいずれか一項に記載の細胞。
  24. 前記細胞が肝細胞である、請求項１９～２３のいずれか一項に記載の細胞。
  25. 前記細胞が、ヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチドをさらに含む、請求項１８～２４のいずれか一項に記載の細胞。
  26. 前記細胞が、第１のジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）をコードする第１のポリヌクレオチドと、第２のジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）をコードする第２のポリヌクレオチドと、をさらに含む、請求項１８～２４のいずれか一項に記載の細胞。
  27. 前記細胞が、第１のジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）をコードする第１のポリヌクレオチドを含む第１のベクターと、第２のジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）をコードする第２のポリヌクレオチドを含む第２のベクターと、をさらに含む、請求項１８～２４のいずれか一項に記載の細胞。
  28. 前記細胞が、１つ以上のジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）をコードするポリヌクレオチドをさらに含む、請求項１８～２４のいずれか一項に記載の細胞。
  29. 前記細胞が、１つ以上のジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）をコードするポリヌクレオチドを含むベクターをさらに含む、請求項１８～２４のいずれか一項に記載の細胞。
  30. 前記ジンクフィンガーヌクレアーゼが、ツーインワン（２－ｉｎ－１）ジンクフィンガーヌクレアーゼである、請求項２８または２９に記載の細胞。
  31. 請求項１～１４のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド構築物と、薬学的に許容される担体と、を含む、薬学的組成物。
  32. 前記組成物が、第１のジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）をコードする第１のポリヌクレオチドと、第２のジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）をコードする第２のポリヌクレオチドと、をさらに含む、請求項３１に記載の薬学的組成物。
  33. 前記組成物が、第１のジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）をコードする第１のポリヌクレオチドを含む第１のベクターと、第２のジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）をコードする第２のポリヌクレオチドを含む第２のベクターと、を含む、請求項３１に記載の薬学的組成物。
  34. 前記組成物が、１つ以上のジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）をコードするポリヌクレオチドをさらに含む、請求項３１に記載の薬学的組成物。
  35. 前記組成物が、１つ以上のジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）をコードするポリヌクレオチドを含むベクターをさらに含む、請求項３２に記載の薬学的組成物。
  36. 前記ジンクフィンガーヌクレアーゼが、ツーインワンジンクフィンガーヌクレアーゼである、請求項３２、３４～３５のいずれか一項に記載の薬学的組成物。
  37. 前記第１のジンクフィンガーヌクレアーゼをコードする前記ポリヌクレオチド：前記第２のジンクフィンガーをコードする前記ポリヌクレオチド：請求項１～１４のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドの比率が、１：１：８である、請求項３２に記載の薬学的組成物。
  38. 前記第１のジンクフィンガーヌクレアーゼをコードする前記ポリヌクレオチド：前記第２のジンクフィンガーをコードする前記ポリヌクレオチド：請求項１～１４のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドの比率が、１：１：４である、請求項３２に記載の薬学的組成物。
  39. 前記第１のジンクフィンガーヌクレアーゼをコードする前記ポリヌクレオチド：前記第２のジンクフィンガーをコードする前記ポリヌクレオチド：請求項１～１４のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドの比率が、１：１：２である、請求項３２に記載の薬学的組成物。
  40. 前記第１のジンクフィンガーヌクレアーゼをコードする前記ポリヌクレオチド：前記第２のジンクフィンガーをコードする前記ポリヌクレオチド：請求項１～１４のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドの比率が、３：３：４である、請求項３２に記載の薬学的組成物。
  41. 前記第１のジンクフィンガーヌクレアーゼをコードする前記第１のポリヌクレオチドを含む前記ベクター：前記第２のジンクフィンガーをコードする前記ポリヌクレオチドを含む前記ベクター：請求項１５～１７のいずれか一項に記載のベクターの比率が、１：１：８である、請求項３３に記載の薬学的組成物。
  42. 前記第１のジンクフィンガーヌクレアーゼをコードする前記第１のポリヌクレオチドを含む前記ベクター：前記第２のジンクフィンガーをコードする前記ポリヌクレオチドを含む前記ベクター：請求項１５～１７のいずれか一項に記載のベクターの比率が、１：１：４である、請求項３３に記載の薬学的組成物。
  43. 前記第１のジンクフィンガーヌクレアーゼをコードする第１のポリヌクレオチドを含む前記ベクター：前記第２のジンクフィンガーをコードする前記ポリヌクレオチドを含む前記ベクター：請求項１５～１７のいずれか一項に記載のベクターの比率が、１：１：２である、請求項３３に記載の薬学的組成物。
  44. 前記第１のジンクフィンガーヌクレアーゼをコードする前記第１のポリヌクレオチドを含む前記ベクター：前記第２のジンクフィンガーをコードする前記ポリヌクレオチドを含む前記ベクター：請求項１５～１７のいずれか一項に記載のベクターの比率が、３：３：４である、請求項３３に記載の薬学的組成物。
  45. 前記ツーインワンジンクフィンガーヌクレアーゼをコードする前記ポリヌクレオチド：請求項１～１４のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド構築物の比率が、１：４である、請求項３６に記載の薬学的組成物。
  46. 前記ツーインワンジンクフィンガーヌクレアーゼをコードする前記ポリヌクレオチド：請求項１～１４のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド構築物の比率が、１：２である、請求項３６に記載の薬学的組成物。
  47. 前記ツーインワンジンクフィンガーヌクレアーゼをコードする前記ポリヌクレオチド：請求項１～１４のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド構築物の比率が、１：１である、請求項３６に記載の薬学的組成物。
  48. 前記ツーインワンジンクフィンガーヌクレアーゼをコードする前記ポリヌクレオチド：請求項１～１４のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド構築物の比率が、３：２である、請求項３６に記載の薬学的組成物。
  49. 前記ツーインワンジンクフィンガーヌクレアーゼを含む前記ベクター：請求項１５～１７のいずれか一項に記載のベクターの比率が、１：４である、請求項３３に記載の薬学的組成物。
  50. 前記ツーインワンジンクフィンガーヌクレアーゼを含む前記ベクター：請求項１５～１７のいずれか一項に記載のベクターの比率が、１：２である、請求項３３に記載の薬学的組成物。
  51. 前記ツーインワンジンクフィンガーヌクレアーゼを含む前記ベクター：請求項１５～１７のいずれか一項に記載のベクターの比率が、１：１である、請求項３３に記載の薬学的組成物。
  52. 前記ツーインワンジンクフィンガーヌクレアーゼを含む前記ベクター：請求項１５～１７のいずれか一項に記載のベクターの比率が、３：２である、請求項３３に記載の薬学的組成物。
  53. 前記組成物が、静脈内、筋肉内、皮下、または髄腔内投与用に製剤化される、請求項３１～５２のいずれか一項に記載の薬学的組成物。
  54. 細胞のゲノムを改変する方法であって、前記方法が、有効量の請求項１～１４のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド構築物を細胞に導入することを含む、方法。
  55. 細胞のゲノムを改変する方法であって、前記方法が、有効量の請求項１５～１７のいずれか一項に記載のベクターを細胞に導入することを含む、方法。
  56. 細胞のゲノムを改変する方法であって、前記方法が、有効量の請求項３１～５３のいずれか一項に記載の薬学的組成物を細胞に導入することを含む、方法。
  57. 外因性ヌクレオチド配列を細胞の標的ヌクレオチド配列に組み込む方法であって、前記方法が、有効量の請求項１～１４のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド構築物を細胞に導入することを含む、方法。
  58. 外因性ヌクレオチド配列を細胞の標的ヌクレオチド配列に組み込む方法であって、前記方法が、有効量の請求項１５～１７のいずれか一項に記載のベクターを細胞に導入することを含む、方法。
  59. 外因性ヌクレオチド配列を細胞の標的ヌクレオチド配列に組み込む方法であって、前記方法が、有効量の請求項３１～５３のいずれか一項に記載の薬学的組成物を細胞に導入することを含む、方法。
  60. 細胞内の標的ヌクレオチド配列を破壊する方法であって、前記方法が、有効量の請求項１～１４のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド構築物を細胞に導入することを含む、方法。
  61. 細胞内の標的ヌクレオチド配列を破壊する方法であって、前記方法が、有効量の請求項１５～１７のいずれか一項に記載のベクターを細胞に導入することを含む、方法。
  62. 細胞内の標的ヌクレオチド配列を破壊する方法であって、前記方法が、有効量の請求項３１～５３のいずれか一項に記載の薬学的組成物を細胞に導入することを含む、方法。
  63. 対象の障害を治療する方法であって、前記方法が、有効量の請求項１～１４のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド構築物を細胞に導入することによって、前記対象の前記細胞のゲノム内の標的ヌクレオチド配列を改変することを含む、方法。
  64. 対象の障害を治療する方法であって、前記方法が、有効量の請求項１５～１７のいずれか一項に記載のベクターを細胞に導入することによって、前記対象の前記細胞のゲノム内の標的ヌクレオチド配列を改変することを含む、方法。
  65. 対象の障害を治療する方法であって、前記方法が、有効量の請求項３１～５３のいずれか一項に記載の薬学的組成物を細胞に導入することによって、前記対象の前記細胞のゲノム内の標的ヌクレオチド配列を改変することを含む、方法。
  66. 前記方法が、有効量の第１のジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）をコードする第１のポリヌクレオチドおよび第２のジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）をコードする第２のポリヌクレオチドを前記細胞に導入することをさらに含む、請求項５４、５７、６０および６３のいずれか一項に記載の方法。
  67. 前記方法が、有効量の第１のジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）をコードする第１のポリヌクレオチドを含む第１のベクターおよび第２のジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）をコードする第２のポリヌクレオチドを含む第２のベクターを前記細胞に導入することをさらに含む、請求項５５、５８、６１および６４のいずれか一項に記載の方法。
  68. 前記方法が、有効量の１つ以上のジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）をコードするポリヌクレオチドを前記細胞に導入することをさらに含む、請求項５４、５７、６０および６３のいずれか一項に記載の方法。
  69. 前記方法が、有効量の１つ以上のジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）をコードするポリヌクレオチドを含むベクターを前記細胞に導入することをさらに含む、請求項５５、５８、６１および６４のいずれか一項に記載の方法。
  70. 前記ジンクフィンガーヌクレアーゼが、ツーインワンジンクフィンガーヌクレアーゼである、請求項６８または６９に記載の方法。
  71. 請求項１～１４のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド構築物を前記細胞の前記ゲノムに組み込むと、前記第１のポリペプチドをコードする前記第１のヌクレオチド配列が発現される、請求項５４～７０のいずれか一項に記載の方法。
  72. 請求項１～１４のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド構築物を前記細胞の前記ゲノムに組み込むと、前記第２のポリペプチドをコードする前記第２のヌクレオチド配列が発現される、請求項５４～７０のいずれか一項に記載の方法。
  73. 前記障害が、遺伝性障害、感染性疾患、後天性障害、およびがんからなる群から選択される、請求項６３～７２のいずれか一項に記載の方法。
  74. 前記遺伝性障害が、軟骨無形成症、色覚異常、酸性マルターゼ欠損症、アデノシンデアミナーゼ欠損症（ＯＭＩＭ番号１０２７００）、副腎白質ジストロフィー、アイカルディ症候群、アルファ－１アンチトリプシン欠損症、アルファ－サラセミア、アンドロゲン不応症、アペール症候群、不整脈原性右室心筋症、異形成、毛細血管拡張性運動失調症、バース症候群、ベータ－サラセミア、青色ゴムまり様母斑症候群、カナバン病、慢性肉芽腫症（ＣＧＤ）、シトルリン血症、猫鳴き症候群、嚢胞性線維症、デュカム病、外胚葉異形成症、ファブリー病、ファンコニ貧血、進行性骨化性線維異形成症、脆弱Ｘ症候群、ガラクトース血症、ゴーシェ病、汎発性ガングリオシドーシス（例えば、ＧＭ１）、ＧＳＤ（例えば、ＧＳＤ１ａ）ヘモクロマトーシス、ベータ－グロビンの６番目のコドン中のヘモグロビンＣ変異（ＨｂＣ）、血友病、ハンター症候群、ハンチントン病、ハーラー症候群、低ホスファターゼ症、クラインフェルター症候群、クラッベ病、ランガー・ギーディオン症候群、白血球接着不全症（ＬＡＤ、ＯＭＩＭ番号１１６９２０）、白質ジストロフィー、ＱＴ延長症候群、リポタンパク質リパーゼ欠損症、マルファン症候群、メビウス症候群、ムコ多糖症（ＭＰＳ）、ネイルパテラ症候群、腎性尿崩症、神経線維腫症、ニーマン・ピック病、オルニチントランスカルバミラーゼ（ＯＴＣ）欠損症、骨形成不全症、フェニルケトン尿症（ＰＫＵ）、ポンペ病、ポルフィリン症、プラダー・ウィリ症候群、早老症、プロテウス症候群、網膜芽細胞腫、レット症候群、ルビンシュタイン・テイビ症候群、サンフィリポ症候群、重症複合免疫不全症（ＳＣＩＤ）、シュワッハマン症候群、鎌状赤血球症（鎌状赤血球貧血）、スミス・マギニス症候群、スティックラー症候群、テイ・サックス病、血小板減少橈骨欠損（ＴＡＲ）症候群、トリーチャー・コリンズ症候群、トリソミー、結節性硬化症、ターナー症候群、尿素回路異常症、フォンヒッペル・リンドウ病、ワールデンブルグ症候群、ウィリアムズ症候群、ウィルソン病、ウィスコット・アルドリッチ症候群、およびＸ連鎖リンパ増殖症候群（ＸＬＰ、ＯＭＩＭ番号３０８２４０）からなる群から選択される、請求項７３に記載の方法。
  75. 前記遺伝性障害が、リソソーム蓄積症である、請求項７３に記載の方法。
  76. 前記リソソーム蓄積症が、アルファ－マンノシドーシス、アスパルチルグルコサミン尿症、コレステリルエステル蓄積症、シスチノーシス、ダノン病、ファブリー病、ファーバー病、フコシドーシス、ガラクトシアリドーシス、Ｉ型ゴーシェ病、ＩＩ型ゴーシェ病、ＩＩＩ型ゴーシェ病、ＧＭ１ガングリオシドーシス（Ｉ、ＩＩおよびＩＩＩ型）、ＧＭ２サンドホフ病（Ｉ／Ｊ／Ａ）、ＧＭ２テイ・サックス病、ＧＭ２ガングリオシドーシスＡＢバリアント、アイセル病／ムコリピドーシスＩＩ、クラッベ病、リソソーム酸リパーゼ欠損症、異染性白質ジストロフィー、ＭＰＳ Ｉ－ハーラー症候群、ＭＰＳ Ｉ－シャイエ症候群、ＭＰＳ Ｉハーラー－シャイエ症候群、ＭＰＳ ＩＩハンター症候群、ＭＰＳ ＩＩＩＡ－サンフィリポ症候群Ａ型、ＭＰＳ ＩＩＩＢ－サンフィリポ症候群Ｂ型、ＭＰＳ ＩＩＩＣ－サンフィリポ症候群Ｃ型、ＭＰＳＩＩＩＤ－サンフィリポ症候群Ｄ型、ＭＰＳ ＩＶ－モルキオＡ型、ＭＰＳ ＩＶ－モルキオＢ型、ＭＰＳ ＶＩ－マロトー・ラミー、ＭＰＳ ＶＩＩ－スライ症候群、ＭＰＳ ＩＸ－ヒアルロニダーゼ欠損症、ムコリピドーシスＩ－シアリドーシス、ムコリピドーシスＩＩＩＣ、ムコリピドーシスＩＶ型、マルチプルスルファターゼ欠損症、神経セロイドリポフスチン症Ｔ１、神経セロイドリポフスチン症Ｔ２、神経セロイドリポフスチン症Ｔ３、神経セロイドリポフスチン症Ｔ４、神経セロイドリポフスチン症Ｔ５、神経セロイドリポフスチン症Ｔ６、神経セロイドリポフスチン症Ｔ７、神経セロイドリポフスチン症Ｔ８、ニーマン・ピック病Ａ型、ニーマン・ピック病Ｂ型、ニーマン・ピック病Ｃ型、フェニルケトン尿症、ポンペ病、ピクノディスオストーシス、シアル酸蓄積症、シンドラー病、およびウォルマン病からなる群から選択される、請求項７５に記載の方法。
  77. 前記リソソーム蓄積症が、ＭＰＳＩおよびＭＰＳＩＩから選択される、請求項７６に記載の方法。
  78. 前記リソソーム蓄積症が、ＭＰＳ Ｉ－ハーラー症候群、ＭＰＳ Ｉ－シャイエ症候群、およびＭＰＳ Ｉ－ハーラー－シャイエ症候群からなる群から選択される、請求項７７に記載の方法。
  79. 前記リソソーム蓄積症が、ＭＰＳＩＩハンター症候群である、請求項７７に記載の方法。
  80. 前記感染性疾患が、ＨＳＶ－１およびＨＳＶ－２などの単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）、水痘帯状疱疹ウイルス（ＶＺＶ）、エプスタイン・バーウイルス（ＥＢＶ）、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、ヒトヘルペスウイルス６（ＨＨＶ－６）、ヒトヘルペスウイルス７（ＨＨＶ－７）、Ａ型肝炎ウイルス（ＨＡＶ）、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）、デルタ肝炎ウイルス（ＨＤＶ）、Ｅ型肝炎ウイルス（ＨＥＶ）、Ｇ型肝炎ウイルス（ＨＧＶ）、Ｐｉｃｏｒｎａｖｉｒｉｄａｅ、Ｃａｌｉｃｉｖｉｒｉｄａｅ、Ｔｏｇａｖｉｒｉｄａｅ、Ｆｌａｖｉｖｉｒｉｄａｅ、Ｃｏｒｏｎａｖｉｒｉｄａｅ、Ｒｅｏｖｉｒｉｄａｅ、Ｂｉｒｎａｖｉｒｉｄａｅ、Ｒｈａｂｏｄｏｖｉｒｉｄａｅ、Ｆｉｌｏｖｉｒｉｄａｅ、Ｐａｒａｍｙｘｏｖｉｒｉｄａｅ、Ｏｒｔｈｏｍｙｘｏｖｉｒｉｄａｅ、Ｂｕｎｙａｖｉｒｉｄａｅ、Ａｒｅｎａｖｉｒｉｄａｅ、Ｒｅｔｒｏｖｉｒａｄａｅ、レンチウイルス、サル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）、インフルエンザウイルスおよびダニ媒介性脳炎ウイルスからなる群から選択される、請求項７３に記載の方法。
  81. 前記ベクターが、約１×１０９ｖｇ／ｋｇ～約１×１０１７ｖｇ／ｋｇの用量で投与される、請求項５５、５８、６１および６４のいずれか一項に記載の方法。
  82. 前記ベクターが、約５×１０１２ｖｇ／ｋｇ、約１×１０１３ｖｇ／ｋｇ、約５×１０１３ｖｇ／ｋｇ、および約１×１０１４ｖｇ／ｋｇからなる群から選択される用量で投与される、請求項８１に記載の方法。
  83. １つ以上のジンクフィンガーヌクレアーゼをコードする前記ポリヌクレオチドを含む前記ベクターが、約１×１０１２ｖｇ／ｋｇ～約１×１０１４ｖｇ／ｋｇの用量で投与される、請求項８１または８２に記載の方法。
  84. 細胞のゲノム内の疾患を引き起こす変異を修正する方法であって、前記方法が、有効量の請求項１～１４のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド構築物を前記細胞に導入することによって、前記細胞の前記ゲノム内の標的ヌクレオチド配列を改変することを含む、方法。
  85. 細胞のゲノム内の疾患を引き起こす変異を修正する方法であって、前記方法が、有効量の請求項１５～１７のいずれか一項に記載のベクターを前記細胞に導入することによって、前記細胞の前記ゲノム内の標的ヌクレオチド配列を改変することを含む、方法。
  86. 細胞のゲノム内の疾患を引き起こす変異を修正する方法であって、前記方法が、有効量の請求項３１～５３のいずれか一項に記載の薬学的組成物を前記細胞に導入することによって、前記細胞の前記ゲノム内の標的ヌクレオチド配列を改変することを含む、方法。
  87. 前記方法が、有効量の第１のジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）をコードする第１のポリヌクレオチドおよび第２のジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）をコードする第２のポリヌクレオチドを前記細胞に導入することをさらに含む、請求項８２に記載の方法。
  88. 前記方法が、有効量の第１のジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）をコードする第１のポリヌクレオチドを含む第１のベクターおよび第２のジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）をコードする第２のポリヌクレオチドを含む第２のベクターを前記細胞に導入することをさらに含む、請求項８３に記載の方法。
  89. 前記方法が、有効量の１つ以上のジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）をコードするポリヌクレオチドを前記細胞に導入することをさらに含む、請求項８３に記載の方法。
  90. 前記方法が、有効量の１つ以上のジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）をコードするポリヌクレオチドを含むベクターを前記細胞に導入することをさらに含む、請求項８３に記載の方法。
  91. 請求項１～１４のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド構築物を前記細胞の前記ゲノムに組み込むと、前記第１のポリペプチドをコードする前記第１のヌクレオチド配列が発現される、請求項８４～９０のいずれか一項に記載の方法。
  92. 請求項１～１４のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド構築物を前記細胞の前記ゲノムに組み込むと、前記第２のポリペプチドをコードする前記第２のヌクレオチド配列が発現される、請求項８４～９０のいずれか一項に記載の方法。
  93. 前記細胞が真核細胞である、請求項５４～９２のいずれか一項に記載の方法。
  94. 前記細胞が哺乳動物細胞である、請求項９３に記載の方法。
  95. 前記細胞が幹細胞である、請求項９４に記載の方法。
  96. 前記細胞がヒト細胞である、請求項９３に記載の方法。
  97. 前記細胞が非分裂細胞である、請求項５４～９６のいずれか一項に記載の方法。
  98. 前記細胞が肝細胞である、請求項９３に記載の方法。
  99. 前記標的ヌクレオチド配列が、内因性遺伝子座である、請求項５７～９８のいずれか一項に記載の方法。
  100. 疾患または障害を治療するための医薬の調製のための、請求項１～１４のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド構築物の、使用。
  101. 細胞のゲノムを改変するための医薬の調製のための、請求項１～１４のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド構築物の、使用。
  102. 導入遺伝子を細胞の標的ヌクレオチド配列に組み込むための医薬の調製のための、請求項１～１４のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド構築物の、使用。
  103. 細胞内の標的ヌクレオチド配列を破壊するための医薬の調製のための、請求項１～１４のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド構築物の、使用。
  104. 細胞のゲノム内の疾患を引き起こす変異を修正するための医薬の調製のための、請求項１～１４のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド構築物の、使用。
  105. 細胞のゲノム内の標的ヌクレオチド配列を改変するための医薬の調製のための、請求項１～１４のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド構築物の、使用。
  106. 疾患または障害を治療する際に使用するための、請求項１～１４のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド構築物。
  107. 細胞のゲノムを改変する際に使用するための、請求項１～１４のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド構築物。
  108. 導入遺伝子を細胞の標的ヌクレオチド配列に組み込む際に使用するための、請求項１～１４のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド構築物。
  109. 細胞内の標的ヌクレオチド配列を破壊する際に使用するための、請求項１～１４のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド構築物。
  110. 細胞のゲノム内の疾患を引き起こす変異を修正する際に使用するための、請求項１～１４のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド構築物。
  111. 細胞のゲノム内の標的ヌクレオチド配列を改変する際に使用するための、請求項１～１４のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド構築物。
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Family Cites Families (55)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5049386A (en) 1985-01-07 1991-09-17 Syntex (U.S.A.) Inc. N-ω,(ω-1)-dialkyloxy)- and N-(ω,(ω-1)-dialkenyloxy)Alk-1-YL-N,N,N-tetrasubstituted ammonium lipids and uses therefor
US4897355A (en) 1985-01-07 1990-01-30 Syntex (U.S.A.) Inc. N[ω,(ω-1)-dialkyloxy]- and N-[ω,(ω-1)-dialkenyloxy]-alk-1-yl-N,N,N-tetrasubstituted ammonium lipids and uses therefor
US4946787A (en) 1985-01-07 1990-08-07 Syntex (U.S.A.) Inc. N-(ω,(ω-1)-dialkyloxy)- and N-(ω,(ω-1)-dialkenyloxy)-alk-1-yl-N,N,N-tetrasubstituted ammonium lipids and uses therefor
US5264618A (en) 1990-04-19 1993-11-23 Vical, Inc. Cationic lipids for intracellular delivery of biologically active molecules
WO1991017424A1 (en) 1990-05-03 1991-11-14 Vical, Inc. Intracellular delivery of biologically active substances by means of self-assembling lipid complexes
EP0752005B1 (en) 1994-03-23 2008-10-08 Ohio University Compacted nucleic acids and their delivery to cells
US5585245A (en) 1994-04-22 1996-12-17 California Institute Of Technology Ubiquitin-based split protein sensor
USRE45795E1 (en) 1994-08-20 2015-11-10 Gendaq, Ltd. Binding proteins for recognition of DNA
US5789538A (en) 1995-02-03 1998-08-04 Massachusetts Institute Of Technology Zinc finger proteins with high affinity new DNA binding specificities
US5925523A (en) 1996-08-23 1999-07-20 President & Fellows Of Harvard College Intraction trap assay, reagents and uses thereof
EP1696036B1 (en) * 1996-09-06 2010-04-21 The Trustees of The University of Pennsylvania Use of recombinant adeno-associated virus in the manufacture of a medicament for gene therapy via muscle cells
US6342345B1 (en) 1997-04-02 2002-01-29 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Detection of molecular interactions by reporter subunit complementation
GB9710809D0 (en) 1997-05-23 1997-07-23 Medical Res Council Nucleic acid binding proteins
GB9710807D0 (en) 1997-05-23 1997-07-23 Medical Res Council Nucleic acid binding proteins
AU746454B2 (en) 1998-03-02 2002-05-02 Massachusetts Institute Of Technology Poly zinc finger proteins with improved linkers
US6140081A (en) 1998-10-16 2000-10-31 The Scripps Research Institute Zinc finger binding domains for GNN
US6534261B1 (en) 1999-01-12 2003-03-18 Sangamo Biosciences, Inc. Regulation of endogenous gene expression in cells using zinc finger proteins
US6453242B1 (en) 1999-01-12 2002-09-17 Sangamo Biosciences, Inc. Selection of sites for targeting by zinc finger proteins and methods of designing zinc finger proteins to bind to preselected sites
US7013219B2 (en) 1999-01-12 2006-03-14 Sangamo Biosciences, Inc. Regulation of endogenous gene expression in cells using zinc finger proteins
US6599692B1 (en) 1999-09-14 2003-07-29 Sangamo Bioscience, Inc. Functional genomics using zinc finger proteins
US7070934B2 (en) 1999-01-12 2006-07-04 Sangamo Biosciences, Inc. Ligand-controlled regulation of endogenous gene expression
US7030215B2 (en) 1999-03-24 2006-04-18 Sangamo Biosciences, Inc. Position dependent recognition of GNN nucleotide triplets by zinc fingers
US6794136B1 (en) 2000-11-20 2004-09-21 Sangamo Biosciences, Inc. Iterative optimization in the design of binding proteins
US6379903B1 (en) 1999-10-08 2002-04-30 Sigma-Aldrich Co. Purification of recombinant proteins fused to multiple epitopes
ATE309536T1 (de) 1999-12-06 2005-11-15 Sangamo Biosciences Inc Methoden zur verwendung von randomisierten zinkfingerprotein-bibliotheken zur identifizierung von genfunktionen
WO2001059450A2 (en) 2000-02-08 2001-08-16 Sangamo Biosciences, Inc. Cells expressing zinc finger protein for drug discovery
EP1355656A2 (en) 2000-07-24 2003-10-29 Gendel Limited Red blood cell as vehicle for agent-membrane translocation sequence conjugate
JP2002060786A (ja) 2000-08-23 2002-02-26 Kao Corp 硬質表面用殺菌防汚剤
US7419829B2 (en) 2000-10-06 2008-09-02 Oxford Biomedica (Uk) Limited Vector system
US7067317B2 (en) 2000-12-07 2006-06-27 Sangamo Biosciences, Inc. Regulation of angiogenesis with zinc finger proteins
US20020155540A1 (en) * 2001-02-14 2002-10-24 Malla Padidam Method to reduce transcriptional interference between tandem genes
US7030846B2 (en) 2001-07-10 2006-04-18 Samsung Electronics Co., Ltd. Color correction liquid crystal display and method of driving same
US20040224385A1 (en) 2001-08-20 2004-11-11 Barbas Carlos F Zinc finger binding domains for cnn
US7262054B2 (en) 2002-01-22 2007-08-28 Sangamo Biosciences, Inc. Zinc finger proteins for DNA binding and gene regulation in plants
US7361635B2 (en) 2002-08-29 2008-04-22 Sangamo Biosciences, Inc. Simultaneous modulation of multiple genes
US7888121B2 (en) 2003-08-08 2011-02-15 Sangamo Biosciences, Inc. Methods and compositions for targeted cleavage and recombination
US8409861B2 (en) 2003-08-08 2013-04-02 Sangamo Biosciences, Inc. Targeted deletion of cellular DNA sequences
US7972854B2 (en) 2004-02-05 2011-07-05 Sangamo Biosciences, Inc. Methods and compositions for targeted cleavage and recombination
AU2005233550B2 (en) 2004-04-08 2010-11-18 Sangamo Therapeutics, Inc. Treatment of neuropathic pain with zinc finger proteins
CA2561714A1 (en) 2004-04-08 2005-10-27 Sangamo Biosciences, Inc. Methods and compositions for treating neuropathic and neurodegenerative conditions
WO2007139898A2 (en) 2006-05-25 2007-12-06 Sangamo Biosciences, Inc. Variant foki cleavage half-domains
DE102008025277A1 (de) 2008-05-27 2009-12-03 Merck Patent Gmbh Glaszusammensetzung
CN102159722B (zh) 2008-08-22 2014-09-03 桑格摩生物科学股份有限公司 用于靶向单链切割和靶向整合的方法和组合物
CA2788560A1 (en) 2010-02-08 2011-08-11 Sangamo Biosciences, Inc. Engineered cleavage half-domains
WO2011139349A1 (en) 2010-05-03 2011-11-10 Sangamo Biosciences, Inc. Compositions for linking zinc finger modules
EP2571512B1 (en) 2010-05-17 2017-08-23 Sangamo BioSciences, Inc. Novel dna-binding proteins and uses thereof
BR112013020734A2 (pt) * 2011-02-17 2017-06-13 Univ Pennsylvania composições e métodos para alterar a especificidade do tecido e aprimorar a transferência gênica mediada por aav9
CA2854819C (en) 2011-11-16 2022-07-19 Sangamo Biosciences, Inc. Modified dna-binding proteins and uses thereof
JP6490426B2 (ja) 2012-02-29 2019-03-27 サンガモ セラピューティクス， インコーポレイテッド ハンチントン病を治療するための方法および組成物
US20170037431A1 (en) * 2014-05-01 2017-02-09 University Of Washington In vivo Gene Engineering with Adenoviral Vectors
US10179918B2 (en) 2015-05-07 2019-01-15 Sangamo Therapeutics, Inc. Methods and compositions for increasing transgene activity
WO2017191274A2 (en) * 2016-05-04 2017-11-09 Curevac Ag Rna encoding a therapeutic protein
AU2017315414B2 (en) 2016-08-24 2024-02-15 Sangamo Therapeutics, Inc. Engineered target specific nucleases
BR112020015488A2 (pt) * 2018-02-08 2020-12-08 Sangamo Therapeutics, Inc. Nucleases alvo-específicas modificadas
EP3826664A4 (en) 2019-02-06 2022-10-26 Sangamo Therapeutics, Inc. METHOD FOR THE TREATMENT OF TYPE I MUCOPOLYSACCHARIDOSES

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