DE60020838T2

DE60020838T2 - Auf antibiotikum basierendes genregulationssystem

Info

Publication number: DE60020838T2
Application number: DE60020838T
Authority: DE
Inventors: J. Charles THOMPSON; E. James BAILEY
Original assignee: POLYGENE AG; POLYGENE AG RUEMLANG
Current assignee: POLYGENE AG, RUEMLANG, CH
Priority date: 1999-04-23
Filing date: 2000-04-21
Publication date: 2006-04-27
Anticipated expiration: 2020-04-22
Also published as: WO2000065080A1; AU4662000A; EP1180160A4; EP1180160B1; EP1180160A1; DE60020838D1; US6287813B1

Description

Gebiet der Erfindung
Die Erfindung betrifft ein neues Genregulationssystem in eukaryotischen Zellen und Verfahren, dieses für die Herstellung von Proteinen zu benutzen. Insbesondere stellt die Erfindung ein neues System für durch Antibiotika regulierte Genexpression in eukaryotischen Zellen bereit, die auf Sequenzen von Promotoren von Antibiotikaresistenz aus Actinomyceten basiert, ferner Polypeptide, die diese in einer von Antibiotika abhängigen Art binden, und Nukleotide, die für solche Polypeptide kodieren.
Hintergrund der Erfindung
Kontrollierte Expression von Transgenen oder von endogenen Zielgenen wird wahrscheinlich für den Erfolg von vielen Gentherapien wesentlich sein. Konstitutive Expression von Transgenen hat in Tierversuchen eine Herabregulierung von Effektorsystemen und/oder zelluläre Toxizität ergeben (Efrat et al., 1995, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92, 3576-3580). Regulierte Expression als Antwort auf stoffwechselbedingte, hormonale oder umweltbezogene Signale ist der normale Zustand für viele eukaryotische Gene. Um natürliche physiologische Expressionsmuster mit Transgenen nachzuahmen und Wechselwirkungen mit Human-Genregulationssignalen zu verringern, sind unlängst binäre Promotor/Transaktivator Konfigurationen heterologer Herkunft entwickelt worden, die auf heterologe Stimulantien reagieren. Hingegen haben sich viele exogene Stimulantien, die diese künstlichen Steuereinheiten von Säugetieren modulieren, als für die therapeutische Verwendung beim Menschen wegen Zelltoxizität oder unerwünschter Nebenwirkungen als unvereinbar erwiesen (Baim et al., 1991, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88, 5072–5076; Braselmann et al., 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90, 1657–1661; No D. et al., 1996, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93, 3346–3351; Rivera et al., 1996, Nat. Medicine 2, 1028–1032; Suhr et al., 1998, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95, 7999–8004; Wang et al., 1994, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91, 8180–8184). Das durch Tetrazyklin regulierte Expressionssystem in Säugetieren vermeidet diese Probleme, und ist in den U.S. Patenten 5,888,981; 5,866,755; 5,789,156; 5,654,168 und 5,650,298 beschrieben, um nur einige Beispiele zu nennen. Das durch Tetrazyklin regulierte System kann hingegen scheitern, unter repressiven Bedingungen Genexpression angemessen zu unterdrücken.
Ferner werden zukünftige Strategien der Gentherapie Techniken benötigen, welche eine unabhängige Kontrolle von zwei verschiedenen Transgenen oder Serien von Transgenen erlauben, die in einer Konfiguration mit Mehrfach-Genabschnitts-Expressionseinheiten (multicistronisch) gegenläufig abgelesen werden. Beispielsweise werden viele Gewebevermehrungs- und ex vivo Gentherapie-Anordnungen ein Zwei-Schritt-Verfahren benötigen, beginnend mit Expression von wachstumsfördernden Genen, um Expansion von transplantiertem Gewebe in Kultur zu ermöglichen, gefolgt von Induktion von Wachstumshemmern, um krebsartiges Verhalten von behandelten Zellen nach der Wiedereinpflanzung zu verhindern. Aufrechterhaltende Prolieferationskontrolle wird ebenfalls für Techniken benötigt, die auf Stammzellen basieren, die zur Zeit für mögliche Zell- und Gewebeersatz-Therapien geprüft werden, da Stammzellen krebsartig sind (Rossant et al., Nat. Biotechnol. 17, 23–24; Solter et al., Science 283, 1468–1470). Das zweite unabhängige Genregulierungssystem könnte in solchen Zellen für pharmakologische Kontrolle eines oder mehrerer ausgeschiedener therapeutischer Proteine, wie Insulin, verwendet werden, um die zirkulierenden Proteine in den therapeutischen Bereich einzustellen oder die Expression auf einen optimalen täglichen Dosisbereich anzupassen. Darum gibt es ein Bedürfnis für neue Säugetier-Genregulationssysteme, welche moderne, therapeutisch geprüfte Antibiotika als Kontrollagenzien verwenden und welche in Verbindung mit dem Tetrazyklin-Regulationssystem benutzt werden können, mit minimalen Wechselwirkungen zwischen Tetrazyklin-Kontrolle und der neuen Kontrollweise.
Das beim Menschen verwendete orale Antibiotikum Pristinamycin besteht, wie andere Streptogramine, aus einer Mischung von zwei strukturell ungleichen Molekülen, der Streptogramin A Komponente Pristinamycin II (PII), einem mehrfach ungesättigten Makrolakton, und der Streptogramin B Komponente Pristinamycin I (PI), einem zyklischen Hexadepsipeptid. Die wasserlösliche Form von Pristinamycin, Synercid, kürzlich in den USA und in Europa für die Verwendung gegen die meisten auf viele Medikamente resistente Grampositive Bakterien zugelassen (Barriuere et al., 1994, Expert Opin. Invest. Drugs 3, 115–131; Baquero et al., 1997, J. Antimicrob. Chemother. 39, 1–6), ist aus Dalfopristin, einem 26-Sulphonylderivat von PII, and Quinupristin, welches von PI durch synthetische Zufügung einer (5δ R)-[(3S)-Chinuclidinyl]thiomethyl-Gruppe abgeleitet ist, zusammengesetzt.
Virginiamycin ist ein anderes wichtiges Streptogramin, das als Wachstumsförderer in Viehfutter verwendet wird (Nagaraja et al., 1998, J. Anim. Sci. 76, 287–298). Entweder die Streptogramin A oder die Streptogramin B Komponente sind einzeln bakteriostatisch, aber Streptogramin A and B zusammen sind synergistisch bakterizid (bis zu 100 Mal aktiver), ein Phänomen, das das Auftreten von erworbener antibiotischer Resistenz vermindert, weil hochgradige Resistenz gegen die kombinierten Streptogramine nur wahrscheinlich ist, wenn beide Typ A und Typ B Streptogramin Resistenz-Determinanten gleichzeitig vorhanden sind (Cocito et al., 1997, 7. Antimicrob. Chemother. 39, 7–13). Kürzlich wurde eine Pristinamycin Resistenz-Determinante (ptr) von S. pristinaespiralis kloniert (Blanc et al., 1995, Mol. Microbiol. 17, 98–999; Salah-Bey et al., 1995, Mol. Microbiol. 17, 1001–1012; Salah-Bey et al., 1995, Mol. Microbiol. 17, 1109–1119). Expression aus dem ptr Promotor (enthaltend eine Erkennungssequenz mit der Bezeichnung P_PTR wird durch Pristinamycin induziert, insbesondere durch PI. Ein Pip (Pristinamycin-induziertes Protein) genanntes Protein wurde kürzlich basierend auf seiner Affinität zu P_PTR in Gelverlangsamungs-Versuchen identifiziert (Salah-Bey et al., 1995, Mol. Microbiol. 17, 1109–1119).
Das Vorkommen von gegen viele Medikamente resistenten, im Menschen pathogenen Bakterien hat kürzlich dramatisch zugenommen. Diese Zunahme korreliert mit einem Hochschnellen bakterieller Krankheiten und entsprechender Sterblichkeit. Ebenso wird die antibiotische Chemotherapie schwieriger, weil der Prozentsatz älterer und immunokompromittierter Patienten zunimmt. Die Europäische Kommission reagierte schon auf diese Situation und verbot die Verwendung gewisser Antibiotika als Wachstumförderer in Viehfutter, unter anderem das Streptogramin Virginiamycin, um die Verbreitung von Antibiotika in der Umwelt zu beschränken (als hauptsächliche treibende Kraft für die Selektion von gegen viele Medikamente resistenten pathogenen Bakterien vermutet) und um damit die Verwendung von Antibiotika bei der Therapie von Menschen zu erhalten.
Zusammenfassung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung ist auf ein neues System für durch Antibiotika regulierte Genexpression in eukaryotischen Zellen gerichtet, die auf Sequenzen von Promotoren von Antibiotikaresistenz aus Actinomyceten basiert, und auf Polypeptide, die diese in einer von Antibiotika abhängigen An binden. In einer Hinsicht ist die Erfindung auf eine isolierte Nukleinsäure SEQ ID NO:29 gerichtet, die für Polypeptide kodiert, welche an eine P_abr Sequenz in Abwesenheit des entsprechenden Antibiotikums binden. Die P_abr Sequenz ist von einem Actinomycetes Bakterium hergeleitet, und ist insbesondere eine auf ein Antibiotikum reagierende Operon-Sequenz eines Actinomycetes Bakterium. In anderer Hinsicht umfasst die Erfindung eine isolierte Nukleinsäure SEQ ID NO:29, die für ein Fusionsprotein kodiert, welches die Transkription reguliert, wobei das Fusionsprotein ein erstes Polypeptid enthält, welches an eine P_abr Sequenz in Abwesenheit des entsprechenden Antibiotikums bindet, operativ gebunden an ein zweites Polypeptid, welches die Transkription in eukaryotischen Zellen aktiviert oder unterdrückt. In einer weiteren Hinsicht ist die Erfindung auf die Proteine gerichtet, die durch solche Nukleinsäuren kodiert werden. Diese Proteine können verwendet werden, um die Transkription einer gewünschten zu transkribierenden Nukleotidsequenz, die operativ an eine P_abr Sequenz gebunden ist, zu aktivieren oder zu unterdrücken.
Die Erfindung umfasst ebenfalls Wirtszellen, die Nukleinsäuren enthalten, welche für die Proteine und Fusionsproteine der Erfindung kodieren. Solche Wirtszellen enthalten gegebenenfalls die gewünschte zu transkribierende Nukleotidsequenz operativ gebunden an eine P_abr Sequenz. Die zu transkribierende Nukleotidsequenz kann endogen oder exogen in Bezug auf die Wirtszelle sein.
In noch einer weiteren Hinsicht stellt die Erfindung eine isolierte Nukleinsäure mit einer P_abr Sequenz operativ gebunden an einen ersten eukaryotischen Promotor bereit. Der erste eukaryotische Promotor kann ebenfalls operativ an eine erste kodierende Sequenz gebunden sein. Gegebenenfalls kann die Nukleinsäure auch mindestens eine tet Operator-Sequenz operativ an einen zweiten eukaryotischen Promotor gebunden enthalten, welcher seinerseits an eine zweite kodierende Sequenz gebunden sein kann. Eine oder beide kodierenden Sequenzen können für irgend ein interessierendes Protein, für welches eine Herstellung gewünscht ist, kodieren. Weiter kann eine der kodierenden Sequenzen für ein Tumor unterdrückendes Genprodukt oder ein Genprodukt, das Zellproliferation aktiviert, kodieren. Weiter noch kann mindestens einer der Promotoren durch die Verwendung von beispielsweise einer internen ribosomalen Eintrittsstelle an mehr als eine kodierende Sequenz operativ gebunden sein. Genetisch veränderte Wirtszellen, die diese Nukleinsäuren enthalten, werden ebenfalls durch die Erfindung bereitgestellt. Unter "genetisch verändert" wird verstanden, dass die Wirtszellen mit Techniken der Molekularbiologie gehandhabt werden, einschliesslich Transformation, Transfektion und Rekombination (homologe und nicht-homologe Rekombination), um die gewünschte Nukleinsäure zu enthalten.
In anderer Hinsicht stellt die Erfindung ein Verfahren zur Regulierung der Expression eines an P_abr gebundenen Gens in einer eukaryotischen Zelle bereit. Die Methode umfasst das Einbringen eines Nukleinsäuremoleküls, das für ein PIT kodiert, in eine Zelle. Das PIT kann ein P_abr-bindendes Protein sein, oder es kann ein P_abr-bindendes Protein umfassen, das operativ an ein Polypeptid gebunden ist, das Transkription in eukaryotischen Zellen aktiviert oder unterdrückt, wobei das an P_abr gebundene Gen in die Lage versetzt wird, durch ein an das P_abr-bindende Protein in der Zelle bindendes Antibiotikum reguliert zu werden. Um die Expression des an P_abr gebundenen Gens zu regulieren, kann man dann die Menge des Antibiotikums in der Zelle modulieren.
Noch eine weitere Ausgestaltung der Erfindung ist ein Verfahren zur Herstellung eines Proteins durch Kultivieren einer eukaryotischen Zelle enthaltend ein an P_abr gebundenes Gen, das für das Protein kodiert, und eine Nukleinsäure, die für ein PIT kodiert. Das PIT kann ein P_abr-bindendes Protein sein, oder es kann ein P_abr-bindendes Protein umfassen, das operativ an ein Polypeptid gebunden ist, das Transkription in eukaryotischen Zellen aktiviert oder unterdrückt. Expression des an P_abr gebundenen Gens wird dann durch die Menge eines Antibiotikums moduliert, das an das P_abr-bindende Protein in der Zelle bindet. Gegebenenfalls umfasst das Verfahren den Schritt, das durch die Zelle produzierte Protein zu gewinnen.
Eine weitere Ausgestaltung der Erfindung ist ein Verfahren zum Screenen auf ein geeignetes Antibiotikum. Das Verfahren umfasst die Inkubation der Wirtszellen der Erfindung in Gegenwart einer Test-Verbindung, wobei die Wirtszellen ein an ein P_abr-gebundenes Reporter-Gen und eine Sequenz enthalten, die für ein P_abr-bindendes Protein kodiert, und worin eine Veränderung der Transkription des Reporter-Gens anzeigt, dass die Test-Verbindung ein geeignetes Antibiotikum ist.
Kurze Beschreibung der Figuren
1: Gel-Verlangsamungs-Test, der Pip/P_PTR Wechselwirkung anzeigt. P_PTR aus S. pristinaespiralis enthält 3 paarweise symmetrische Bindungsstellen (Spur A; P_PTR in Abwesenheit von Pip), die alle mit relativ grossen Mengen von gereinigtem Pip (0.4 pmol; Spur A) gesättigt werden, was ein einzelnes verschobenes Band ergibt. Geringere Mengen von Pip (0.02 pmol) ergaben einen Zwischenzustand, bei welchem alle möglichen Permutationen der Belegung einer Stelle in drei deutlich verlangsamten Bändern vertreten sind (Spur C). Pip (0.2 pmol Spuren D–M) wurde mit einem Bereich von 50 pmol bis 0.01 pmol PI titriert (Spuren D–H; D: 50 pmol; E: 10 pmol; F: 1 pmol; G: 0.1 pmol; H: 0.01 pmol). Unter gleichen Bedingungen wurde auch das halbsynthetische PI Derivat Quinupristin titriert (Spesen I–M; I: 50 pmol; J: 10 pmol; K: 1 pmol; L: 0.1 pmol; M: 0.01 pmol).
2: Dosis-bezogene Funktion für PI-abhängige Gen-Expression. Die Zelllinie CHO-PIT1-SEAP wurde 48 h bei verschiedenen PI Konzentrationen (ng/ml) wachsen gelassen. Die relative SEAP Produktion ist über 5 Grössenordnungen der PI Konzentration gezeigt.
3: Graphische Darstellung von pMF188, einem Vektor, der auf Tetrazyklin reagierende SEAP-(human secreted alkaline phosphatase) und auf Pristinamycin reagierende GFP-Expression in einer einzigen doppelt regulierten Expressionseinheit kombiniert: P_hCMV*-1-SEAP-pA_I-P_PIR-GFP-pA_II.
4: Graphische Darstellung von pMF201, einem Vektor, der tet-reguliertes CFP (cyan-fluoreszierendes Protein) und Pristinamycin-reguliertes YFP (gelblich-fluoreszierendes Protein) in einer einzigen Expressionseinheit enthält: P_hCMV*-1-CFP-_pA_I8-P_PIR-YFP-pA_II.
5: Graphische Darstellung von pMF196, einem Vektor, der isogen zu pMF188 und pMF201 ist, aber die folgende doppelt regulierte Expressionseinheit enthält: P_PIR-YFP-pA_I-pA_IIs28-CFP-P_hCMV*-1
6: Graphische Darstellung des Vektors pDuoRex1. pDuoRex1 enthält zwei Expressionseinheiten, welche unter Verwendung von Tetrazyklin und Pristinamycin als Regulatoren eine unabhängig anpassbare Gen-Expression in Säugetierzellen erlaubt. Die auf Tetrazyklin reagierende Expressionseinheit wird durch P_hCMV*-1, angetrieben, gefolgt von einer internen ribosomalen Eintrittsstelle (IRES) flankiert von zwei Mehrfachklonierungsstellen. Die Expressionseinheit enthält eine endständige künstliche Polyadenylisierungs-Sequenz (pA1). Das IRES-Element ermöglicht doppelte P_hCMV*-1-getriebene Genabschnitts-Expression (dicistronic). Der zweite regulierbare Genabschnitt wird durch P_PIR angetrieben, und enthält anschliessend eine Mehrfachklonierungsstelle und endständig eine zweite Polyadenylisierungs-Sequenz.
7: Graphische Darstellung des Vektors pMF195. pMF195 ist ein pDuoRex1 Abkömmling enthaltend das Tumor unterdrückende Gen p27 unter der Kontrolle des auf Tetrazyklin reagierenden Promotors P_hCMV*-1 und das Mek1 Gen unter der Kontrolle von P_PIR. Mek1 ist eine wichtige Kinase des zentralen Wachstumsfaktor-Signalweges und wurde speziell mutiert (Mek1DD), um auch in Abwesenheit eines exogenen Wachstumsfaktors konstitutiv aktiv zu sein. Mek1 ist ein Beispiel einer Klasse von Proteinen, die die Zellproliferation fördern.
8: Graphische Darstellung der Vektoren pMF189 und pMF229.
9: Graphische Darstellung von Mehrfach-Genabschnitt-Expressions-Vektoren (multicistronic). 9A illustriert die Vektoren pTRIDENT9 und pTRIDENT10, während 9B pTRIDENT11 und pTRIDENT12 illustriert. Die von pTRIDENT abgeleiteten Säugetier-Expressions-Vektoren enthalten eine dreifache Genabschnitts-Expressionseinheit (tricistronic), welche entweder vom Pristinamycin-unterdrückenden (P_pir) oder dem Pristinamycin-induzierenden (P_pirON) Promotor angetrieben werden. Während der erste Genabschnitt auf der Dreifach-Genabschnitts-Expressionseinheit in einer von cap abhängigen Art transkribiert wird, stützen sich die folgenden Gene auf cap-unabhängige Translationsauslösungbasierend auf der internen ribosomalen Eintrittsstelle (IRES) polioviralen Ursprungs oder des Encephalomyocarditis Virus. Die Mehrfach-Genabschnitts-Expressionseinheit wird durch eine Polyadenylierungsstelle (pA) des SV40 Virus abgeschlossen.
Ausführliche Beschreibung der Erfindung
Systeme zur Kontrolle der Expression fremder Gene werden wesentliche Werkzeuge für zukünftige Zell- und Gen-basierte Therapien beim Menschen sein. Die vorliegende Erfindung ist auf ein neues System für durch Antibiotika regulierte Genexpression in eukaryotischen Zellen gerichtet, die auf Sequenzen von Promotoren von Antibiotikaresistenz aus Actinomyceten basiert, und auf Polypeptide, die diese in einer von Antibiotika abhängigen Art binden.
Im Zusammenhang mit der Erfindung bedeutet eine P_abr Sequenz eine Sequenz aus einem Actinomycetes antibiotischen Resistenz-Promotor, der in vom Antibiotikum abhängender Weise an ein besonderes Polypeptid AIP bindet (hier ebenfalls als ein "Polypeptid, das an eine P_abr Sequenz in Abwesenheit des entsprechenden Antibiotikums bindet" bezeichnet). Der antibiotische Resistenz-Promotor kann von einem natürlich vorkommenden Episom abgeleitet sein, ist aber vorzugsweise ein chromosomaler Promotor. Vorzugsweise bindet AIP an die P_abr Sequenz in Abwesenheit des entsprechenden Antibiotikums, und wird von der P_abr Sequenz freigesetzt, wenn das Antibiotikum vorhanden ist, obwohl die umgekehrte Anordnung ebenfalls zum Umfang der Erfindung gehört. Entsprechend wird, in Gegenwart des AIP, die Expression des antibiotischen Resistenz- Promotors enthaltend die P_abr Sequenz durch die Gegenwart oder Abwesenheit des Antibiotikums reguliert. Folglich bedeutet im Zusammenhang mit der Erfindung der Ausdruck "entsprechendes Antibiotikum" das Antibiotikum, das, wenn an das AIP gebunden, das Protein aus seiner P_PIR Bindungsstelle freisetzt.
AIPs sind im Zusammenhang mit der Erfindung abgeleitet von oder verwandt mit AIP Proteinen, die von Actinomyceten gebildet werden. Unter "abgeleitet von" von Actinomyceten gebildeten AIP Proteinen ist in diesem Zusammenhang gemeint, dass die Aminosäuresequenz mit einem natürlich vorkommendem AIP identisch ist oder nur werterhaltende Aminosäure-Substitutionen aufweist, aber zumindest 70%, vorzugsweise 80%, and besonders bevorzugt 90% bezüglich Aminosäuren identisch ist. Unter "verwandt mit" von Actinomyceten gebildeten AIP Proteinen ist in diesem Zusammenhang gemeint, dass die Polynukleotidsequenz, die für die Aminosäuresequenz kodiert, mit einem natürlich vorkommenden von Actinomyceten gebildeten AIP zumindest unter niedrig stringenten Bedingungen hybridisiert, vorzugsweise unter mässig stringenten Bedingungen, und besonders bevorzugt unter hoch stringenten Bedingungen, und an eine P_abr Erkennungs-Sequenz bindet. Werterhaltende Substitutionen sind in der Technik bekannt und unter anderem von Dayhof, M.D., 1978, Nat. Biomed. Res. Found., Washington, D.C., Vol. 5, Sup 3, beschrieben. Genetisch kodierte Aminosäuren werden allgemein in vier Gruppen aufgeteilt: (1) sauer = Aspartat, Glutamat; (2) basisch = Lysin, Arginin, Histidin; (3) unpolar = Alanin, Valin, Leucin, Isoleucin, Prolin, Phenylalanin, Methionin, Tryptophan; und (4) ungeladen polar = Glycin, Asparagin, Glutamin, Cystein, Serin, Threonin, Tyrosin. Phenylalanin, Tryptophan und Tyrosin werden auch zusammen als aromatische Aminosäuren klassifiziert. Eine Substitution einer Aminosäure in einer besonderen Gruppe durch eine andere Aminosäure in der gleichen Gruppe wird allgemein als werterhaltende Substitution betrachtet.
Die Actinomyceten umfassen Gram-positive Bakterien aus den folgenden taxonomischen Gruppen: Actinomycineae; Corynebacterineae; Frankineae; Glycomycineae; Kineococcus group; Micrococcineae; Micromonosporineae; Propionibacterineae; Pseudonocardineae; Streptomycineae; Streptosporangineae; und nicht klassierte Actinomycetale (Stackebrandt et al., 1997, Int. J. Syst. Bacteriol. 47 (2):479–491). Zusätzliche Informationen betreffend Actinomyceten und die Mitglieder jeder Gruppe können von der taxonomischen Sammlung des Nationalen Zentrums für Biotechnologie unter http://www.ncbi.nlm.nih.gov erhalten werden. Bevorzugte Actinomyceten sind Streptomyceten, und sind folglich aus der Gruppe der Streptomycineae.
Die Erfindung wird hierunter in einer Ausführungsform dargestellt, die ein besonders bevorzugtes antibiotische System unter Verwendung von Streptograminen und der Pip/P_PTR Wechselwirkung nutzt. Im speziellen ist ein besonders bevorzugtes AIB das Pip von S. coelicolor, welches an ein bestimmtes P_abr bindet, die P_PTR Erkennungssequenz in einer auf das Antibiotikum reagierenden Art. Deshalb stellt die Erfindung in einer Hinsicht die vollständige kodierende Sequenz des Pip Proteins bereit (SEQ ID NO:29), und die davon abgeleitete Aminosäuresequenz von Pip. Die Aminosäuresequenz von Pip wurde in der Suche in Protein-Datenbanken verwendet, um zusätzliche Streptomyces und Amycolatopsis Gene innerhalb von antibiotischen biosynthetischen Gruppen zu suchen, die eine Ähnlichkeit der Sequenz zu Pip aufweisen und welche auf andere Antibiotika reagieren könnten. Insbesondere enthält Pip ein Helix-Schlaufe-Helix Motiv, das für DNS bindende Proteine charakteristisch ist. Eine Computer-Suche wurde für Proteine durchgeführt, die dieses Motiv innerhalb der biosynthetischen Gen-Gruppe enthalten, die auch für ein Resistenz-Gen für Antibiotika in einem Transmembran-Protein kodieren. Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle 1 gezeigt. Diese sowie andere, noch zu entdeckende oder zu identifizierende Actinomyceten können P_abr-Sequenzen und AIPs, die in den Zusammensetzungen und Verfahren der Erfindung gebraucht werden können, enthalten.
Tabelle 1:
Literaturstellen für Tabelle 1 sind wie folgt:

1. August et al., 1998, Biosynthesis of the ansamycin antibiotic rifamycin: deductions from the molecular analysis of the rif biosynthetic gene cluster of Amycolatopsis mediterranei 5699. Chem. Biol. 5:69–79.
2. Fernandez et al., 1991, The act cluster contains regulatory and antibiotic export genes, direct targets for translational control by the bldA tRNA gene of Streptomyces. Ce1166:769-780.
3. Guilfoile et al., 1992, Sequence and transcriptional analysis of the Streptomyces glaucescens temAR tetracenomycin C resistance and repressor gene loci. J Bacteriol 174:3651–8.
4. Offen et al., 1995, Regulation of daunorubicin production in Streptomyces peucetius by the dnrR2 locus. J. Bacteriol. 177:1216–1224.
5. Schwecke et al., 1995, The biosynthetic gene cluster for the polyketide immunosuppressant rapamycin. Proc Natl Acad Sci USA 92:7839–7843.
6. Westrich et al., 1999, Cloning and characterization of a gene cluster from Streptomyces cyanogenus 5136 probably involved in landomycin biosynthesis. FEMS Microbiol Lett 170:381–7.

Actinomycetes Antibiotika-resistente Promotoren, die P_abr Sequenzen enthalten, können auch durch Generierung von Actinomycetes Gen-Bibliotheken in einem heterologen Wirt und Vermehrung des heterologen Wirts unter Bedingungen enthaltend selektive Antibiotika identifiziert werden. Dabei gebildete resistente Klone enthaltend Antibiotika-resistente Determinanten können nach einer Sequenzanalyse durch ihre charakteristischen Protein-Bindungsabschnitte identifiziert werden.
Polynukleotidsequenzen, die für ein erstes Polypeptid kodieren, welches an eine P_abr Sequenz in Abwesenheit des entsprechenden Antibiotikums bindet, können verwendet werden, um homologe AIPs in andere Actinomyceten zu klonieren. Solche homologe AIPs können auch als das erste Polypeptid des Fusionsproteins verwendet werden, und ihre P_abr Erkennungssequenz operativ an einen interessierenden eukaryotischen Promotor gebunden werden. Folglich ist die Erfindung auch auf Nukleinsäuren gerichtet, die mit den hier beschriebenen AIPs hybridisierbar oder komplementär sind. Ein bevorzugtes AIP ist der unten vollständiger beschriebene Repressor eines Streptogramin Resistenz-Operons von S. coelicolor, Pip. Solche AIPs sind mindestens 50%, vorzugsweise 60%, mehr bevorzugt 70%, noch mehr bevorzugt 80%, immer noch mehr bevorzugt 90%, und ganz besonders bevorzugt 95% homolog bezüglich Aminosäuresequenz zu einem AIP wie hier beschrieben. Homologie kann beispielsweise unter Verwendung des BLAST Computer-Programms Version 2.0 berechnet werden, erhältich auf dem Web unter http://www.ncbi.nlm.nih.gov. Typische Parameter zur Bestimmung der Ähnlichkeit von zwei Sequenzen unter Verwendung von BLAST 2.0 sind ein Pluspunkt für eine Übereinstimmung von 1, Minuspunkt für eine fehlende Übereinstimmung von –2, Negativpunkte für offene Lücke und weitere Lücke von jeweils 5 bzw. 2, ein Ausstieg von 50, und ein Wortlänge von 11.
In einer besonderen Ausführungsform wird eine Nukleinsäure, die mit einer AIP Nukleinsäure oder einer Nukleinsäure, die für eine AIP Aminosäure kodiert, unter niedrig stringenten Bedingungen hybridisierbar ist, bereitgestellt. Verfahren, die solche Bedingungen niedriger Stringenz verwenden, sind wie folgt (siehe auch Shilo und Weinberg, 1981, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78:6789–6792): Filter enthaltend DNS werden 6 h bei 40°C in einer Lösung enthaltend 35% Formamid, 5 × SSC, 50 mM Tris-HCl (pH 7.5), 5 mM EDTA, 0.1% PVP, 0.1% Ficoll, 1% BSA und 500 μg/ml denaturierte Lachs-Spermien DNS vorbehandelt.
Hybridiserungen werden in der gleichen Lösung mit den folgenden Modifikationen ausgeführt: 0.02% PVP, 0.02% Ficoll, 0.2% BSA, 100 μg/ml Lachs-Spermien DNS, 10% (Gew./Vol.) Dextransulfat und 5–20 × 10⁶ cpm ³²P-markierte Probe wird verwendet. Filter werden in Hybridisierungs-Mischung während 18–20 h bei 40°C inkubiert, dann 1.5 h bei 55°C in einer Lösung enthaltend 2 × SSC, 25 mM Tris-HCl (pH 7.4), 5 mM EDTA und 0.1% SDS gewaschen. Die Waschlösung wird durch frische Lösung ersetzt und für weitere 1.5 h bei 60°C inkubiert. Die Filter werden trockengelegt und der Autoradiographie ausgesetzt. Falls nötig werden die Filter ein drittes Mal bei 65–68°C gewaschen und nochmals einem Film ausgesetzt. Andere Bedingungen für niedrige Stringenz, die verwendet werden können, sind in der Technik wohlbekannt (z.B. wie für Kreuz-Spezies Hybridisierung angewendet).
In einer anderen besonderen Ausführungsform wird eine Nukleinsäure, die mit einer AIP Nukleinsäure oder mit einer Nukleinsäure, die für eine AIP Aminosäure kodiert, unter mässig stringenten Bedingungen hybridisierbar ist, bereitgestellt. Verfahren unter Verwendung von solchen Bedingungen für mässige Stringenz sind wie folgt: Filter enthaltend DNS werden 6 h bei 55°C in einer Lösung enthaltend 6 × SSC, 5 × Denhart's Lösung, 0.5% SDS und 100 μg/ml denaturierte Lachs-Spermien DNS vorbehandelt.
Hybridiserungen werden in der gleichen Lösung durchgeführt, und eine 5–20 × 10⁶ cpm ³²P-markierte Probe wird verwendet. Filter werden in Hybridisierungs-Mischung während 18–20 h bei 55°C inkubiert, dann zweimal 30 Minuten bei 60°C in einer Lösung enthaltend 1 × SSC und 0.1 % SDS gewaschen. Die Filter werden trockengelegt und der Autoradiographie ausgesetzt. Andere Bedingungen für mässige Stringenz, die verwendet werden können, sind in der Technik wohlbekannt. Die Filter werden bei 37°C 1 h in einer Lösung enthaltend 2 × SSC, 0.1% SDS gewaschen.
In einer anderen besonderen Ausführungsform wird eine Nukleinsäure, die mit einer AIP Nukleinsäure oder mit einer Nukleinsäure, die für eine AIP Aminosäure kodiert, unter hoch stringenten Bedingungen hybridisierbar ist, bereitgestellt. Verfahren unter Verwendung von solchen Bedingungen für hohe Stringenz sind wie folgt: Vorhybridisierung von Filtern enthaltend DNS wird 8 h bis über Nacht bei 65°C in Puffer zusammengesetzt aus 6 × SSC, 50 mM Tris-HCl (pH 7.5), 1 mM EDTA, 0.02% PVP, 0.02% Ficoll, 0.02% BSA und 500 μg/ml denaturierte Lachs-Spermien DNS durchgeführt. Filter werden 48 h bei 65°C in Vorhybridisierungs-Mischung enthaltend 100 μg/ml denaturierte Lachs-Spermien DNS und 5–20 × 10⁶ cpm einer ³²P-markierten Probe hybridsiert. Die Filter werden bei 37°C 1 h in einer Lösung enthaltend 2 × SSC, 0.01% PVP, 0.01% Ficoll und 0.01% BSA gewaschen. Danach folgt eine Waschung in 0.1 × SSC bei 50°C für 45 min vor der Autoradiographie. Andere Bedingungen für hohe Stringenz, die verwendet werden können, sind in der Technik wohlbekannt.
Neue AIP Proteine können ebenfalls durch Bindung an P_abr Sequenzen isoliert werden. Beispielweise wird das Polynukleotid mit der P_abr Sequenz auf einer Matrix immobilisiert und eine ideale Packung in einer Kolonne gemacht. Bakterielle Extrakte werden unter Bedingungen, die eine Bindung von AIP Homologen an die immobilisierte Zielsequenz erlauben, auf die Kolonne aufgebracht. Nach geeigneten Wasch-Schritten wird das AIP Homologe bei geeigneten Bedingungen (z.B. Zugabe eines Antibiotikums) eluiert und die Sequenz des gereinigten Proteins bestimmt und das entsprechende Gen kloniert.
Die Erfindung umfasst ebenfalls isolierte oder gereinigte AIP Proteine und Polypeptide. AIP Proteine gemäss der Erfindung umfassen Polypeptide, die an P_abr Sequenzen binden, sowie Fusionsproteine enthaltend ein erstes Polypeptid, das an P_abr Sequenzen bindet, die operativ an ein zweites Polypeptid gebunden sind, das Transkription in eukaryotischen Zellen aktiviert oder unterdrückt. In diesem Zusammenhang bedeutet operativ gebunden, dass die zwei Proteine kovalent oder nicht kovalent so aneinander gebunden sind, dass sie ihre funktionelle Aktivität, an eine P_abr Sequenz zu binden (erstes Polypeptid) und Transkription zu aktivieren oder zu unterdrücken (zweites Polypeptid), beibehalten.
Wie hier gebraucht ist ein Polypeptid "im wesentlichen gereinigt", wenn das Polypeptid die Mehrheit (d.h. mindestens ungefähr 50%) bezüglich Gewicht des Materials in einer besonderen Herrichtung darstellt. Ebenso ist wie hier gebraucht ein Polypeptid "isoliert", wenn das Polypeptid mindestens ungefähr 90 Gew.% des Materials in einer besonderen Herrichtung darstellt.
Die Fusionsproteine der Erfindung enthalten sowohl das erste Polypeptid, das an eine P_abr Sequenz in Abwesenheit des entsprechenden Antibiotikums bindet, als auch ein zweites Polypeptid, das die Transkription in eukaryotischen Zellen aktiviert oder unterdrückt. Unter Transkription aktivieren ist gemeint, dass die Geschwindigkeit der Transkriptions-Auslösung der zu transkribierenden Nukleotidsequenz, die operativ an die P_abr Sequenz gebunden ist, wenn das Fusionsprotein, das die Transkription aktiviert, an die P_abr Sequenz gebunden ist, grösser ist als wenn es nicht gebunden ist. Ähnlich ist unter Transkription unterdrücken gemeint, dass die Geschwindigkeit der Transkriptions-Auslösung der zu transkribierenden Nukleotidsequenz, die operativ an die P_abr Sequenz gebunden ist, wenn das Fusionsprotein, das die Transkription aktiviert, an die P_abr Sequenz gebunden ist, geringer ist als wenn es nicht gebunden ist.
Entsprechend ist in einer Hinsicht das erste Polypeptid des Fusionsproteins, das die Transkription aktiviert, operativ an ein zweites Polypeptid gebunden, welches direkt oder indirekt Transkription in eukaryotischen Zellen aktiviert. Um das erste und zweite Polypeptid operativ zu binden, werden üblicherweise Nukleotidsequenzen, die für das erste und zweite Polypeptid kodieren, miteinander koordiniert (in-frame) verbunden, um ein chimäres Protein zu bekommen, das für das Fusionsprotein kodiert, obwohl das erste und zweite Polypeptid anderweitig operativ verbunden werden können, soweit die Funktion jedes Polypeptids erhalten bleibt (z.B. chemisch quervernetzt). Das erste und zweite Polypeptid können in irgend einer Reihenfolge sein. Das zweite Polypeptid des Transaktivators kann selber Aktivität für Transkriptions-Aktivierung besitzen (d.h. das zweite Polypeptid aktiviert direkt Transkription), oder es kann Transkription durch einen indirekten Mechanismus aktivieren, durch Bereitstellung eines Transkriptions-Aktivator-Proteins zur Interaktion mit dem Fusionsprotein. Entsprechend umfasst der Ausdruck "ein Polypeptid, das Transkription in eukaryotischen Zellen aktiviert" Polypeptide, die entweder direkt oder indirekt Transkription aktivieren.
Polypeptide, die so funktionieren können, dass sie die Transkription in eukaryotischen Zellen aktivieren, sind in der Technik wohlbekannt und sind beispielsweise in U.S. Patent Nr. 5,654,168 beschrieben. Solche Polypeptide umfassen das Herpes Simplex Virus Virion Protein 16 (VP16, dessen Aminosäuresequenz in Triezenberg, S. J. et al., 1988, Genes Dev. 2:718–729 beschrieben ist), insbesondere den 127 Aminosäuren-C-Terminus oder den 11 Aminosäuren-C-Terminus. Geeignete C-terminale Peptidabschnitte von VP16 sind in Seipel, K. et ad. beschrieben (EMBO J., 1992, 13:4961–4968).
Saure Transkriptions-Aktivierungs-Domänen, Prolin-reiche Transkrtptions-Aktivierungs-Domänen, Serin/Threonin-reiche Transkrtptions-Aktivierungs-Domänen und Glutamin-reiche Transkrtptions-Aktivierungs-Domänen können alle in den Zusammensetzungen und Verfahren der Erfindung verwendet werden. VP16 Polypeptide und Aminosäurereste 753–881 von GAL4 sind saure Aktivierungs-Domänen. Ein anderes Polypeptid, das Transkription aktiviert, ist die p65 Domäne von NF-κB (Schmitz und Baeuerle, 1991, EMBO J. 10:3805–3817). Beispiele von Prolin-reichen Aktivierungs-Domänen umfassen Aminosäurereste 399–499 von CTF/NF1 und Aminosäurereste 31–76 von AP2. Beispiele von Serin/Threonin-reichen Transkrtptions-Aktivierungs-Domänen umfassen Aminosäurereste 1–427 von ITF1 und Aminosäurereste 2–451 von ITF2. Beispiele von Glutamin-reichen Aktivierungs-Domänen umfassen Aminosäurereste 175–269 von Oct1 und Aminosäurereste 132–243 von Spl. Die Aminosäuresequenzen jeder dieser oben beschriebenen Regionen und von anderen nützlichen Transkrtptions-Aktivierungs-Domänen sind in Seipel, K. et al. (EMBO J., 1992, 13:4961–4968). Diese Literaturstelle beschreibt ebenso Verfahren der Identifizierung neuer Transkriptions-Aktivierungs-Domänen, die zum Umfang der Erfindung gehören.
In einer anderen Ausgestaltung aktiviert das zweite Polypeptid des Fusionsproteins Transkription indirekt, indem es nicht-kovalent mit einem Transkriptions-Aktivator assoziiert. Beispielsweise kann ein AIP der Erfindung mit einer Polypeptid-Domäne (z.B. einer Dimersierungs-Domäne) fusioniert werden, die eine Protein-Protein-Interaktion mit einem Transkription aktivierenden Protein vermitteln kann, wie zum Beispiel mit einem endogenen, in der Wirtszelle vorhandenen Aktivator. Nicht-kovalente Interaktionen zwischen DNS bindenden Domänen und Transaktivierungs-Domänen sind in der Technik bekannt (siehe z.B. Fields und Song, 1989, Nature 340:245–247; Chien et al., 1991, Proc. Natl. Acad Sci. USA 88:9578–9582; Gyuris et al.,1993, Cell 75:791-803; und Zervos, A. S., 1993, Cell 72:223–232). Beispiele von geeigneten Interaktions- (oder Dimerisierungs-) Domänen umfassen Leucine Zipper (Landschulz et al., 1989, Science 243:1681–1688), Helix-Schlaufe- Helix-Domänen (Murre, C. et al., 1989, Cell 58:537–544) und Zink Finger-Domänen (Frankel, A. D. et ad., 1988, Science 240:70–73).
In anderer Hinsicht kann das Polypeptid, das P_abr bindet, selbst verwendet werden, um Transkription in Abwesenheit des Antibiotikums zu unterdrücken. Auf diese Weise verhindert das Polypeptid, das P_abr bindet, Transkription, wenn es an die P_abr Sequenz gebunden ist, vermutlich indem es in die Bindung des aktivierenden Transkriptionsfaktors eingreift. Bei Abwesenheit des Antibiotikums fehlt die Transkription des mit P_abr verbundenen Promotors, oder ist sehr gering. Wenn das Antibiotikum beigefügt wird, wird hingegen das Polypeptid, das P_abr bindet, freigesetzt und erlaubt dabei, dass Transkription stattfindet.
In einer anderen Ausgestaltung kann das Fusionsprotein, das an P_abr bindet, verwendet werden, um Transkription zu unterdrücken. In einer Hinsicht ist das erste Polypeptid, wie oben beschrieben, operativ an ein zweites Polypeptid gebunden, welches direkt oder indirekt Transkription in eukaryotischen Zellen unterdrückt. Proteine und Polypeptid-Domänen innerhalb von Proteinen, die Unterdrückung der Transkription in eukaryotischen Zellen bewirken können, sind in der Technik beschrieben (für Übersichtsartikel siehe z.B. Renkawitz, R., 1990, Trends in Genetics 6:192–197; und Herschbach, B. M. and Johnson, A. D., 1993, Annu. Rev. Cell. Biol. 9:479–509). Solche Domänen können eine indirekte hemmende Wirkung auf den Transkriptions-Mechanismus haben oder Transkription indirekt unterdrücken, indem sie die Aktivität des Aktivator-Proteins hemmen. Entsprechend ist beabsichtigt, dass der Ausdruck "ein Polypeptid, das Transkription in eukaryotischen Zellen unterdrückt" wie hier verwendet Polypeptide umfasst, die entweder direkt oder indirekt Transkription unterdrücken. Wie hier verwendet ist beabsichtigt, dass "Unterdrückung" der Transkription eine Verringerung im Mass oder der Menge der Transkription eines Zielgens bedeutet, wenn mit dem Mass oder der Menge der Transkription vor der Regulierung durch das die Transaktion hemmende Protein verglichen wird. Hemmung der Transkription kann teilweise oder vollständig sein.
Eine "unterdrückende" oder "stillegende" Transkriptions-Domäne wie hier beschrieben ist eine Polypeptid-Domäne, die ihre Fähigkeit beibehält, Transkription zu unterdrücken, wenn die Domäne in ein heterologes Protein überführt wird. Proteine, von denen gezeigt worden ist, dass sie unterdrückende Domänen aufweisen, die noch funktionieren, wenn sie in ein heterologes Protein überführt werden, umfassen das v-erbA Oncogen Produkt (Baniahmad, A. et ad., 1992, EMBO J. 11:1015–1023) (z.B. ungefähr die Aminosäurereste 362–632 des natürlichen v-erbA Oncogen Produkts), der Thyroid Hormon Rezeptor (Baniahmad, supra), der Retinsäure Rezeptor (Baniahmad, supra), das Drosophila Krueppel (Kr) Protein (Licht, J. D. et al., 1990, Nature 346:76–79; Sauer, F. und Jackle, H., 1991, Nature 353:563–566; Licht, J. D. et al., 1994, Mol. Cell. Biol. 14:4057–4066) (wie beispielsweise C64KR, welches Aminosäuren 403–466 des natürlichen Proteins darstellt, oder Aminosäuren 26–110 of Kr), und die KRAB Domäne der kox1 Gen-Familie (Deuschle et al., 1995, Mol. Cell. Biol. 15:1907–1914). Andere Proteine, die Transkription unterdrückende Aktivität in eukaryotischen Zellen aufweisen, umfassen das Drosophila Homeodomain-Protein Even-skipped (eve) (Han und Manley, 1993, Genes & Dev. 7: 491–503), den S. cerevisiae Ssn6/Tupl Protein-Komplex (Herschbach und Johnson, supra), das Hefe SIRI Protein (siehe Chien et al., 1993, Ce1175:531–541), NeP1 (siehe Kohne et al., 1993, J Mol. Biol. 232:747–755), das Drosophila Dorsal Protein (siehe Kirov et al., 1994, Mol. Cell. Biol. 14:713–722; Jiang, et al., 1993, EMBO J. 12:3201–3209), TSF3 (siehe Chen, et al., 1993, Mol. Cell. Biol. 13:831–840), SF1 (siehe Targa, et al., 1992, Biochem. Biophys. Res. Comm.. 188:416–423), das Drosophila Hunchback Protein (siehe Zhang, et al., 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:7511–7515), das Drosophila Knirps Protein (siehe Gerwin, et al., 1994, Mol. Cell. Biol. 14:7899–7908), das WT1 Protein (Wilm's Tumorgen-Produkt) (siehe Anant, et al., 1994, Oncogene 9:3113–3126; Madden et al., 1993, Oncogene 8:1713–1720), Oct-2.1 (siehe Lillycrop, et al., 1994, Mol. Cell. Biol. 14:7633–7642), das Drosophila Engrailed Protein (siehe Badiani, et al., 1994, Genes Dev. 8:770–782; Han und Manley, 1993, EMBO J. 12:2723–2733), E4BP4 (siehe Cowell und Hurst, 1994, Nucleic Acids Res. 22:59–65) und ZF5 (siehe Numoto, et al., 1993, Nucleic Acids Res. 21:3767–3775).
Nicht beschränkende Beispiele von Polypeptid-Domänen, die als stillegende Domänen verwendet werden können, umfassen: Aminosäurereste 120–410 des Thyroid Hormon Rezeptors alpha (THR.alpha.), Aminosäurereste 143–403 des Retinsäure Rezeptors alpha (RAR.alpha.), Aminosäurereste 186–232 von Knirps, die N-terminale Region von WT1 (siehe Anant, supra), die N-terminale Region von Oct-2.1 (siehe Lillycrop, supra), eine 65 Aminosäure-Domäne von E4BP4 (siehe Cowell und Hurst, supra) und die N-terminale Zink Finger Domäne von ZFS (siehe Numoto, supra). Ferner werden auch kürzere oder längere Polypeptid-Fragmente umfassend diese Regionen, die immer noch volle oder teilweise unterdrückende Aktivität beibehalten, in Betracht gezogen.
Zusätzlich zu früher beschriebenen, Transkription unterdrückenden Domänen sind auch neue Transkription unterdrückende Domäne, die mit Standardverfahren identifiziert werden können (z.B. Reporter-Genkonstrukte), im Umfang der Erfindung.
Herstellung der Nukleinsäuren der Erfindung kann durch in der Technik Bewanderte mit Standard-Techniken der Molekularbiologie bewerkstelligt werden (siehe beispielsweise Maniatis et al., 1989, Molecular Cloning A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, N.Y. und Ausubel et al., 1989, Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates and Wiley Interscience, N.Y.). Typischerweise wird die Veränderung und Herstellung von Nukleinsäuren mit prokaryotischen Zellen durchgeführt, aber die Erfindung umfasst auch chemisch-synthetische Verfahren der Nukleinsäure-Herstellung und -Veränderung.
Die in den Verfahren und Zusammensetzungen der Erfindung verwendeten Wirtszellen können auch irgendwelche eukaryotischen Zellen, wie Säugetierzellen, Pilzzellen, Pflanzenzellen und mikrobielle Parasiten sein. Die Erfindung wird unten durch nichtbeschränkende Beispiele unter Verwendung einer Vielfalt von Säugetierzellen verdeutlicht. Es können hingegen auch andere Arten von eukaryotischen Zellen verwendet werden. Beispielsweise wurde das durch Tetrazyklin regulierbare Promotor-System für die Verwendung in Hefe angepasst (Gari et al., 1997, Yeast 13:837–848); ähnlich können die Verfahren und Zusammensetzungen der Erfindung auch in solchen Zellen verwendet werden. Verfahren der genetischen Manipulierung von Wirtszellen, um Nukleinsäuren gemäss der Erfindung einzuführen, sind jenen in der Technik Bewanderten wohlbekannt und umfassen Transformation, Transfektion und Elektroporation. Die Nukleinsäuren können extrachromosomal sein oder sich auf dem Chromosom befinden. Die Integration kann nach Zufall, homolog oder durch Lage-spezifische Rekombination erfolgen. Unter Kultivierung einer Wirtszelle wird sowohl an vitro Kultur als auch in vivo Kultur verstanden (beispielsweise eukaryotische Zellen in Zellkultur wachsen lassen, Zellen in einem Wirtsorganismus wachsen lassen durch Implantierung in eine Körperhöhle oder Transplantation, Zellen eines bestimmten Individuums entfernen und nach genetischer Manipulation der Zellen zur Einführung von Nukleinsäuren der Erfindung diese wieder einsetzen, etc.).
Ein mit P_abr verbundenes Gen wird hier definiert als ein Promotor, der die Expression einer kodierenden Sequenz kontrolliert, wobei der Promotor und die kodierende Sequenz operativ an eine P_abr Sequenz gebunden sind. Vorzugsweise ist der Promotor ein eukaryotischer Promotor. Unter operativ gebunden wird in diesem Zusammenhang verstanden, dass die P_abr Sequenz benachbart zum Promotor steht, entweder in 5' oder in 3', oder innerhalb der Promotor-Sequenz so, dass, wenn ein Fusionsprotein, das die Transkription moduliert, an die P_abr Sequenz gebunden ist, Auslösung der Transkription am Promotor bewirkt wird. Besonders bevorzugte P_abr Sequenzen sind diejenigen P_abr Sequenzen aus S. coelicolor und S. pristinaespiralis; die Verwendung dieser Sequenzen, um mit P_abr verbundene Gene herzustellen, ist unten durch nicht-begrenzende Beispiele erläutert.
Die operativ an den Promotor gebundene kodierende Sequenz kann für irgend ein Genprodukt kodieren, für das regulierte Expression gewünscht ist, und kann exogen zur Wirtszelle oder endogen sein. Unter endogener kodierender Sequenz wird eine kodierende Sequenz verstanden, die natürlich in der Wirtszelle vorkommt und nicht durch Transformations-Techniken in die Wirtszelle eingeführt wird. Eine exogene kodierende Sequenz ist eine nicht endogene kodierende Sequenz. Kodierende Sequenzen schliessen nicht nur Sequenzen ein, die für Proteine kodieren, sondern auch andere kodierende Sequenzen, z.B. für Antisense Genprodukte, Ribozyme etc. kodierende Sequenzen. Im weiteren können kodierende Sequenzen Mehrfach-Genexpressions-Abschnitte enthalten (multicistronic, siehe beispielsweise U.S. Anmeldung Nr. 08/948,381, eingereicht 9. Oktober 1997).
Herstellung von irgendwelchen Genprodukten kann durch die Zusammensetzungen und Verfahren der vorliegenden Erfindung reguliert werden. Beispielsweise kann die Herstellung eines Marker-Genprodukts, wie grünes fluoreszierendes Protein, oder eines Modells eines sekretierten Genprodukts, wie SEAP, reguliert werden. Natürlicherweise findet die Erfindung besondere Anwendung bei der Herstellung von Produkten mit industriellem oder pharmazeutischem Interesse, wie industrielle Enzyme (z.B. Proteasen, Cellulasen, Glycosidasen oder Ligninasen), Interferone (z.B. β-INF, α-INF, γ-INF), hGH, Insulin, Erythropoietin, Gewebeplasminogen Aktivator (tPA), DNAse, monoklonale Antikörper, Faktor VIII, Faktor VII, Faktor IX, HSA, IL-2, Glucagon, EGF, GCSF, GMCSF, Thrombopoietin, gp160, HbSAg und andere virale antigene Proteine und Peptide (Rotavirus, HIV, p53ras).
Ein anderer Aspekt der Erfindung ist die Verwendung von Tumor unterdrückenden Genprodukten, um die Vermehrung von Wirtszellen der Erfindung zu regulieren. Regulierte Expression von Tumor unterdrückenden Genprodukten ist besonders nützlich für eine Reihe von Anwendungen. Beispielsweise möchte man, dass die Wirtszellen eine schnelle Vermehrungsphase durchlaufen, gefolgt von einer Produktionsphase, in welcher die Energie in der Zelle der Protein-Herstellung gewidmet ist, oder einer schnellen Vermehrungsphase in vitro gefolgt von reguliertem Wachstum in vivo (siehe beispielsweise U.S. Anmeldung Nr. 08/948,381, eingereicht am 9. Oktober 1997, deren Beschreibung als Referenz hier miteingeschlossen ist). Im Zusammenhang mit der Erfindung sind Tumor unterdrückende Genprodukte intrazelluläre Proteine, die den Zellzyklus an einer Zellzyklus-Kontrollstelle durch Wechselwirkung mit Zyklinen, Cdk's oder Zyklin-Cdk-Komplexen blockieren, oder Proteine, die dies tun, induzieren. Entsprechend hindern diese Tumor unterdrückenden Genprodukte die Zyklin-abhängige Weiterentwicklung des Zellzyklus. Besonders bevorzugte Tumor unterdrückenden Genprodukte wirken auf den G1-S Übergang des Zellzyklus. Die Erfindung ist auf die Verwendung irgend eines Tumor unterdrückenden Genprodukts gerichtet, das diese Funktion ausübt, ob bekannt oder erst noch zu entdecken. Beispiele von Tumor unterdrückenden Genen umfassen p21, p27, p53 (und besonders das p53175P mutierte Allel), p57, p15, p16, p18, p19, p73, GADD45 und APC1.
Gewünschtenfalls kann man die Verfahren und Zusammensetzungen der Erfindung verwenden, um Überlebensfaktoren in Wirtszellen zu exprimieren. Überlebensfaktoren sind intrazelluläre Proteine, die Apoptose verhindern, wie bcl-2, bcl-x_L, E1B-19K, mcl-1, crmA, abl, p35, bag-1, A20, LMP-1, Tax, Ras, Rel und NF-κB-ähnliche Faktoren. Zusätzlich sind alle bekannten Überlebensfaktoren so wie noch zu entdeckende Überlebensfaktoren nützlich in den Verfahren und Zusammensetzungen der Erfindung. In noch einer anderen Ausgestaltung werden das (die) Tumor unterdrückende(n) Gen(e) gleichzeitig mit einem Faktor, der das Tumor unterdrückende Genprodukt in der Zelle stabilisiert, exprimiert. Beispiele von stabilisierenden Faktoren sind Mitglieder der CAAT verstärkenden Bindungsprotein-Familie. Beispielsweise wird die p21 Proteinaktivität bei gleichzeitiger Expression mit C/EBPα stabilisiert. Zusätzlich induziert C/EBPα spezifisch die Transkription des endogenen p21 Gens. Infolgedessen wirkt C/EBPα sowohl als stabilisierender Faktor als auch als spezifischer Auslöser von p21.
Noch ein weiterer Aspekt der Erfindung ist die Verwendung der Nukleotide und Verfahren der Erfindung, um ein Genprodukt zu exprimieren, das die Zellproliferation aktiviert. Ein Protein, das die Zellproliferation aktiviert, ist beispielsweise Mek1, eine zentrale Proteinkinase im konservierten Säugetier Ras-MAP Signal-Übermittlungsweg, der auf wachstumsfördernde Signale wie Zytokine reagiert. Eine besonders bevorzugte Art von Mek1 ist die Mek1DD Mutante (Gruelich und Erikson, 1998, J. Biol. Chem. 273: 13280-13288), die hier unten ausgiebiger beschrieben ist. Andere genetische Determinanten, die einen positiven Einfluss auf den Säugetier-Zellzyklus ausüben, und die als ein Protein gebraucht werden können, das die Zellproliferation aktiviert, sind Zykline (z.B. Zyklin E), Ras, Raf, die MAP Kinase-Familie (z.B. MAP, Erk, Sap) E2F, Src, Jak, Jun, Fos, pRB, Mek2, EGF, TGF, PDGF, und ein Polynukleotid, das antiparallel (antisense) zu einem Tumor unterdrückenden Gen ist (z.B. ist von p27 antisense Expression gezeigt worden, dass es die Proliferation von ruhenden Fibroblasten stimuliert und Wachstum in Serum-freiem Medium ermöglicht (Rivard et al., 1996, J. Biol. Chem. 271:18337–18341)), und nedd5, das als positives wachstumskontrollierendes Gen bekannt ist (Kinoshita et al., 1997, Genes Dev. 11:1535–1547).
Ein Aspekt der vorliegenden Erfindung wird unten durch die Entwicklung eines neuen Systems für durch Antibiotika regulierte Genexpression in eukaryotischen Zellen illustriert, basierend auf dem Repressor eines Streptogramin-Resistenz Operons von S. coelicolor (einem Pip). Ein Pip Protein (PIT4) oder _Chimäre Pip Proteine (PIT und PIT2), die an einen eukaryotischen Transaktivator gebunden sind, waren in der Lage, die Expression eines synthetischen eukaryotischen Promotors (P_PIR) enthaltend die P_ptr Bindungsstelle (mit anderen Worten ein an P_abr gebundenes Gen) zu kontrollieren. Gene, die unter die Kontrolle dieses PIT/P_PIR Systems gestellt wurden, haben auf klinisch zugelassene therapeutische Verbindungen, die zur Streptogramin Gruppe (Pristinamycin, Virginiamycin und Synercid) gehören, in einer Vielzahl von Säugetier-Zelllinien (CHO-K1, BHK-21 und HeLa) reagiert. Dieses neue System zeigte bessere Induzierbarkeit und Hintergrunds-Expressions-Eigenschaften im Vergleich zum gut etablierten auf Tetrazyklin basierenden System in genetisch manipulierten CHO-Zellen, die sowohl Streptogramin- als auch Tetrazyklin-Regulierung ermöglichen. In diesen Zellen beeinflusst Streptogramin die Genexpression vom auf Tetrazyklin reagierenden Promotor nicht, und therapeutisch relevante Tetrazyklin-Konzentrationen haben nur einen geringen Einfluss auf Expression vom auf Streptogramin reagierenden PIT/P_PIR System. Deshalb können diese zwei verschiedenen Systeme zusammen in zukünftigen fortgeschrittenen Therapien, die unabhängige Regulierung von verschiedenen Transgenen benötigen, verwendet werden. Zusätzlich zeigt die Empfindlichkeit des PIT/P_PIR Systems auf alle geprüften Typ B Streptogramine, dass die Expression des Reporter-Gens von P_PIR für eine effiziente Hochdurchsatz-Methode für die Entdeckung neuer Streptogramine verwendet werden kann. Das gleiche Prinzip trifft auf andere eukaryotische, auf Antibiotika reagierende, Transkription regulierende Systeme zu, die für die Entdeckung von neuen Antibiotika an ein Reporter-Gen gebunden werden können.
Ein anderer Aspekt der Erfindung ist die Entwicklung eines doppelt regulierten Systems, das besonders vorteilhaft ist, wenn unabhängige Kontrolle von mindestens zwei verschiedenen Transgenen oder Serien von Transgenen erwünscht sind. Beispielsweise wird dieser Aspekt der Erfindung mittels eines nicht beschränkenden Beispiels verdeutlicht, bei dem die kombinierte Einrichtung von Tetrazyklin-abhängiger und Pristinamycin-abhängiger Genregulation in den gleichen Zellen verwendet wird. In den untenstehenden Beispielen wurde ein doppelt regulierter Vektor pDuoRex1 konstruiert, der sowohl Tetrazyklin-abhängige als auch Pristinamycin-abhängige Expressionseinheiten enthält. Diese Einheiten wurden beispielsweise gebraucht, um das Tumor unterdrückende Gen p27 (unter der Kontrolle eines auf Tetrazyklin reagierenden Promotors) und ein die Zellvermehrung stimulierendes Genprodukt wie Mek1 (hier unter der Kontrolle von P_PIR (pMF195) zu exprimieren. Für fortgeschrittene Gentherapie und Strategien zur genetischen Veränderung von Gewebe kann die Induktion von Mek1 (während p27 unterdrückt wird) die Proliferation von transplantierten Zellen aktivieren und Expression in Zellen erleichtern, während Induktion von p27 (während Mek1 unterdrückt wird) die Zellproliferation anhält, was eine gewünschte Eigenschaft für die Wieder-Implantierung von genetisch veränderten Zellen und Geweben ist. Es können an deren Stelle andere Tumor unterdrückende Gene und andere Gene, die die Zellproliferation stimulieren, eingesetzt werden.
Ein noch anderer Aspekt der Erfindung sind Expressionsvektoren für mehrfache Verwendung, wie auch Zellen und Verfahren, die diese verwenden, welche aus den von Antibiotika abhängigen Aktivator- und Repressor-Systemen der Erfindung einen Vorteil ziehen. Solche Vektoren können einen, zwei oder mehrfache Genexpressions-Einheiten (mono-, di- oder multicistronic) enthalten. Nicht beschränkende Beispiele solcher Vektoren werden unten mittels praktischer Ausführungsformen beschrieben.
Obwohl die hier beschriebene Erfindung für regulierte Gen-Expression ursprünglich für allgemeine Anwendungen in funktioneller Genom-Forschung, Gen-Therapie und Gewebe-Veränderung vorgesehen war, zeigt die Beobachtung, dass das unten mittels nicht beschränkendem Beispiel verdeutlichte Streptogramin-System auf alle kommerziell erhältlichen Streptogramine einschliesslich Synercid, Pyostacin und Virginiamycin reagiert, eine Verwendung als wirkungsvolles Screening-Werkzeug für die Entdeckung neuer Antibiotika auf. Entsprechend ist eine weitere Ausgestaltung der Erfindung ein Verfahren zum Screenen auf ein mögliches Antibiotikum. Das Verfahren umfasst die Inkubation der Wirtszellen der Erfindung in Gegenwart einer Test-Verbindung, wobei die Wirtszellen ein an ein P_abr-gebundenes Reporter-Gen und eine Sequenz enthalten, die für ein P_abr-bindendes Protein kodiert, und worin eine Veränderung der Transkription des Reporter-Gens anzeigt, dass die Test-Verbindung ein geeignetes Antibiotikum ist.
Als Beispiel und nicht als Beschränkung ist der Nachweis von Streptograminen auf die Zugabe von Sammlungen von Stoffwechselprodukten von Streptomyces oder aus Pilzen zu Säugetierzellen in Kultur enthaltend das auf Pristinamycin reagierende Reporter-System abgestützt. Die Gegenwart von Streptograminen wird die Expression des von P_PIR angetriebenen Reporter-Proteins, beispielsweise SEAP, verringern. Dieser Ansatz für Screening ermöglicht zwei entscheidende Vorteile gegenüber klassischer Screening-Technologie unter Verwendung von biologischen Prüfeinrichtungen mit Bakterien als Indikatoren: (i) Screening auf Antibiotika ist nicht durch die Empfindlichkeit von als Indikatoren verwendeten Bakterien auf noch nicht charakterisierte Streptogramine beschränkt (Empfindlichkeit von Bakterien auf Antibiotika variiert breit zwischen Stämmen und sogar Isolaten) und (ii) das auf Säugetierzellen abgestützte Konzept des Nachweises von Streptograminen zeigt zumindest eine Grössenordnung höhere Empfindlichkeit auf diese Antibiotika-Klasse als biologische Prüfeinrichtungen, die sich auf die bakterizide Aktivität stützen. Angesichts der vorgeschlagenen Wechselwirkung von Pip mit anderen Klassen von Antibiotika (eine Liste findet sich in Salah-Bey K, Blanc, V. und Thompson C.J, 1995; Mol. Microbiol. 17:1001–1012) kann hingegen das auf Pip/P_PIR abgestützte Regulierungssystem für Säugetier-Gene andere antibiotische Verbindungen entdecken. Ebenfalls gehört zum Umfang der Erfindung die Ausdehnung dieses Nachweis-Konzeptes der auf Antibiotika reagierenden Expression von Reporter-Genen auf andere AIP and P_abr Komponenten von anderen Actinomyceten.
Nachdem nun die Erfindung beschrieben ist, werden die folgenden Beispiele zur Verdeutlichung und nicht zur Beschränkung angeboten.
Beispiel 1: Durch Streptogramin unterdrückbares Genregulationssystem in Säuge
Nachdem gezeigt wird, dass die Gegenwart von PI die Assoziation von Pip mit P_PTR in vitro umkehrt, beschreibt dieses Beispiel die Verwendung von Pip und P_PTR bei der Gestaltung eines neuen auf Streptogramin reagierenden Genregulationssystems in Säugetieren mit ausgezeichneten Eigenschaften der Regulierung, das funktionell kompatibel mit dem gegenwärtig am meisten benutzten, auf Tetrazyklin basierenden System für die Regulierung der Transkription (TET System) ist.
VERFAHREN
Konstruktion des von Streptogramin abhängigen Transaktivators (PIT) und des durch Pristinamycin regulierbaren Promotors P_PIR
PIT, das Fusionsprotein von Pip mit der C-endständigen Transaktivierungs-Domäne von VP16 aus Herpes simplex (Triezenberg et al., 1988, Genes Dev. 2, 718–729) wurde durch Verstärkung von Pip aus S. coelicolor aus pGemT::Epip4 mit Oligonukleotiden konstruiert:
OMF63: GTACGAATTCCCACCATGAGTCGAGGAGAGGTG (SEQ ID NO:1) und
OMF64: GCGCGCGGCTGTACGCGGAGGCCTGTTCGACCATC (SEQ ID NO:2)
gefolgt von Klonieren in den Vektor pcDNA3.1N5/His-TOPO (Invitrogen) unter der Kontrolle von P_CMV (pMF150).
Diese Primer können auch zur Klonierung der gewünschten Gensequenz aus genomischer DNS von S. pristinaespiralis verwendet werden.
P_PIR Sequenz (SEQ ID NO:3):
GATCGACGTCGGAGAAATAGCGCTGTACAGCGTATGGGAATCTCTTGTACGGTGTACGAGT
ATCTTCCCGTACACCGTACAAGGAGCCTGCAGGgagtaccctcgaccgccgGAGTATAAAT
AGAGGCGCTTCGTCTACGGAGCGACAATTCAATTCAAACAAGCAAAGTGAACACGTCGCTA
AGCGAAAGCTAAGCAAATAAACAAGCGCAGCTGAACAAGCTAAACAATCTGCAGTAAAGTG
CAAGTTAAAGTGAATCAATTAAAAGTAACCAGCAACCAAGTAAATCAACTGCAACTACTGA
AATCTGCCAAGAAGTAATTATTGAATACAAGAAGAGAACTCTGAATACTTTCAACAAGTTA
CCGAGAAAGAAGAACTCACACACAGCTAGCGTTTAAACTTAAGCTTGGTACCGAGCTCGGA
TCCACTAGTCCAGTGTGGTGGAATTC.
Das SspI/BssHII Fragment von pMF 150 enthaltend Pip wurde anschliessend in die entsprechenden Stellen von pSBC2-tTA (pSAM200) (SspI/BssHII) (Fussenegger et al, 1997, Biotechnol. Prog. 13, 733–740) kloniert, wobei die TetR Domäne von tTA durch Pip ersetzt wird. Das sich ergebende Plasmid hat die folgende, für PIT kodierende Sequenz:
PIT Sequenz (SEQ ID NO:4):
ATGAGTCGAGGAGAGGTGCGCATGGCGAAGGCAGGGCGGGAGGGGCCGCGGGACAGCGTGT
GGCTGTCGGGGGAGGGGCGGCGCGGCGGTCGCCGTGGGGGGCAGCCGTCCGGGCTCGACCG
GGACCGGATCACCGGGGTCACCGTCCGGCTGCTGGACACGGAGGGCCTGACGGGGTTCTCG
ATGCGCCGCCTGGCCGCCGAGCTGAACGTCACCGCGATGTCCGTGTACTGGTACGTCGACA
CCAAGGACCAGTTGCTCGRGCTCGCCCTGGACGCCGTCTTCGGCGAGCTGCGCCACCCGGA
CCCGGACGCCGGGCTCGACTGGCGCGAGGAACTGCGGGCCCTGGCCCGGGAGAACCGGGCG
CTGCTGGTGCGCCACCCCTGGTCGTCCCGGCTGGTCGGCACCTACCTCAACATCGGCCCGC
ACTCGCTGGCCTTCTCCCGCGCGGTGCAGAACGTCGTGCGCCGCAGCGGGCTGCCCGCGCA
CCGCCTGACCGGCGCCATCTCGGCCGTCTTCCAGTTCGTCTACGGCTACGGCACCATCGAG
GGCCGCTTCCTCGCCCGGGTGGCGGACACCGGGCTGAGTCCGGAGGAGTACTTCCAGGACT
CGATGACCGCGGTGACCGAGGTGCCGGACACCGCGGGCGTCATCGAGGACGCGCAGGACAT
CATGGCGGCCCGGGGCGGCGACACCGTGGCGGAGATGCTGGACCGGGACTTCGAGTTCGCC
CTCGACCTGCTCGTCGCGGGCATCGACGCGATGGTCGAACAGGCCTCCGCGTACAGCCGCG
CGCGTACGAAAAACAATTACGGGTCTACCATCGAGGGCCTGCTCGATCTCCCGGACGACGA
CGCCCCCGAAGAGGCGGGGCTGGCGGCTCCGCGCCTGTCCTTTCTCCCCGCGGGACACACG
CGCAGACTGTCGACGGCCCCCCCGACCGATGTCAGCCTGGGGGACGAGCTCCACTTAGACG
GCGAGGACGTGGCGATGGCGCATGCCGACGCGCTAGACGATTTCGATCTGGACATGTTGGG
GGACGGGGATTCCCCGGGTCCGGGATTTACCCCCCACGACTCCGCCCCCTACGGCGCTCTG
GATATGGCCGACTTCGAGTTTGAGCAGATGTTTACCGATGCCCTTGGAATTGACGAGTACG
GTGGGTAG.
PIT2, das Fusionprotein von Pip mit der p65 Transaktivations-Domäne des menschlichen NF-κB Transkriptions-Aktivators wurde in einem Dreischritt-Verfahren kloniert: (i) Die p65 Domäne des menschlichen NF-κB Transkriptions-Aktivators wurde aus pSG424-p65 (freundlicherweise durch H. Hauser, GBF, Braunschweig, Deutschland, zur Verfügung gestellt) mit Oligonukleotiden
OMF97: GATCGCGCGCATGATGAGTTTCCCACC (SEQ ID NO:22) und
OMF98: GATCAAGCTTGGATCCTTAGGAGCTGATCTGACT (SEQ ID NO:23)
verstärkt und gleichgerichtet in pcDNA3.11V5/His-TOPO (Invitrogen) kloniert. Dies ergibt Plasmid pMF 197. (ii) pMF 197 wurde mit BssHII und HindIII, enthalten in den Oligonukleotiden (unterstrichen), geschnitten und die p65 Domäne an die entsprechenden Stellen (BssHII/HindIII) von pSBC2-tTA gebunden (Fussenegger et al., 1997), wobei die VP16 Domäne des von Tetrazyklin abhängigen Transaktivators ersetzt wird. Dabei entsteht Plasmid pMF204. (iii) Die tetR Domäne wurde aus pMF204 mit SspI/BssHII ausgeschnitten und durch Pip, ausgeschnitten aus pMF150 mit SspI/BssHII, ersetzt. Dies ergibt Plasmid pMF206. pMF206 enthält die folgende, für PIT2 kodierende Sequenz:
ATGAGTCGAGGAGAGGTGCGCATGGCGAAGGCAGGGCGGGAGGGGCCGCGGGACAGCGTGT
GGCTGTCGGGGGAGGGGCGGCGCGGCGGTCGCCGTGGGGGGCAGCCGTCCGGGCTCGACCG
GGACCGGATCACCGGGGTCACCGTCCGGCTGCTGGACACGGAGGGCCTGACGGGGTTCTCG
ATGCGCCGCCTGGCCGCCGAGCTGAACGTCACCGCGATGTCCGTGTACTGGTACGTCGACA
CCAAGGACCAGTTGCTCGAGCTCGCCCTGGACGCCGTCTTCGGCGAGCTGCGCCACCCGGA
CCCGGACGCCGGGCTCGACTGGCGCGAGGAACTGCGGGCCCTGGCCCGGGAGAACCGGGCG
CTGCTGGTGCGCCRCCCCTGGTCGTCCCGGCTGGTCGGCACCTACCTCAACATCGGCCCGC
ACTCGCTGGCCTTCTCCCGCGCGGTGCAGAACGTCGTGCGCCGCAGCGGGCTGCCCGCGCA
CCGCCTGACCGGCGCCATCTCGGCCGTCTTCCAGTTCGTCTACGGCTACGGCACCATCGAG
GGCCGCTTCCTCGCCCGGGTGGCGGACACCGGGCTGAGTCCGGAGGAGTACTTCCAGGACT
CGATGACCGCGGTGACCGAGGTGCCGGACACCGCGGGCGTCATCGAGGACGCGCAGGACAT
CATGGCGGCCCGGGGCGGCGACACCGTGGCGGAGATGCTGGACCGGGACTTCGAGTTCGCC
CTCGACCTGCTCGTCGCGGGCATCGACGCGATGGTCGAACAGGCCTCCGCGTACAGCCGCG
CGCATGATGAGTTTCCCACCATGGTGTTTCCTTCTGGGCAGATCAGCCAGGCCTCGGCCTT
GGCCCCGGCCCCTCCCCAAGTCCTGCCCCAGGCTCCAGCCCCTGCCCCTGCTCCAGCCATG
GTATCAGCTCTGGCCCAGGCCCCAGCCCCTGTCCCAGTCCTAGCCCCAGGCCCTCCTCAGG
CTGTGGCCCCACCTGCCCCCAAGCCCACCCAGGCTGGGGAAGGAACGCTGTCAGAGGCCCT
GCTGCAGCTGCAGTTTGATGATGAAGACCTGGGGGCCTTGCTTGGCAACAGCACAGACCCA
GCTGTGTTCACAGACCTGGCATCCGTCGACAACTCCGAGTTTCAGCAGCTGCTGAACCAGG
GCATACCTGTGGCCCCCCACACAACTGAGCCCATGCTGATGGAGTACCCTGAGGCTATAAC
TCGCCTAGTGACAGGGGCCCAGAGGCCCCCCGACCCAGCTCCTGCTCCACTGGGGGCCCCG
GGGCTCCCCAATGGCCTCCTTTCAGGAGATGAAGACTTCTCCTCCATTGCGGACATGGACT
TCTCAGCCCTGCTGAGTCAGATCAGCTCCTAA (SEQ ID NO:24).
Für die Konstruktion von P_PIR wurde der Minimal-Promotor des Drosophila Hitzeschock-Gens hsp70 P_hsp70min; Basenpaar –40 bis 241; (Corces et al., 1984, J. Biol. Chem. 259, 14812–14817) enthalten in pTRIDENT7 (Fussenegger et al., 1998, Biotechnol. Bioeng. 57, 1–10) mit PCR verstärkt, unter Verwendung der Oligonukleotide
OMF62: CTTGTACGGTGTACGAGTATCTTCCCGTACACCGTACAAGGAGCCTGCAGGgag
taccctcgaccgccg (SEQ ID NO:5) und
OMF57: GATCCATCGATTGATCAGGCGC (SEQ ID NO:6),
und gegenläufig gegen lacZ in den pCR2.1-TOPO Vektor (Invitrogen) kloniert. Dies ergibt Plasmid pMF153. Die vorläufige, in pMF153 enthaltene P_PIR Sequenz wurde einer zweiten Runde PCR unter Verwendung des Primers
OMF69: GATCGACGTCGGAGAAATAGCGCTGTACAGCGTATGGGAATCTcttgtacggtg
tacgagtatc (SEQ ID NO:7)
und des oben beschriebenen OMF57 unterworfen. Das sich ergebende PCR Fragment enthaltend die vollständige P_PIR Sequenz wurde in pCR2.1-TOPO in zu lacZ paralleler Orientierung kloniert und ergab pMF161. Die ergänzende Sequenz von OMF69 (Kleinbuchstaben) ist komplementär zur Verlängerung von OMF62 (Grossbuchstaben) und fügt die verbleibende Pip Bindungsstelle von P_PTR an P_PIR.
Konstruktion der auf Pristinamycin reagierenden Reporter-Plasmide pMF164 und pMF172 und der pTWIN Vektoren
Für die Konstruktion von pMF 164 wurde das P_PIR enthaltende Fragment aus pMF161 mit AatII und EcoRI ausgeschnitten und an die entsprechenden Stellen (AatII/EcoRI) des GFP Expressions-Vektors pMF104 gebunden, wobei der auf TET reagierende Promotor P_hCMV*-1 (Fussenegger et al., 1998, supra) ersetzt wird. Gleichermassen wurde durch Austausch von P_hCMV*-1 aus pMF111 (Fussenegger et al., 1997, Biotechnol. Bioeng. 55, 927–939) durch P_PIR aus pMF164 über SspI und EcoRI pMF172 für die quantitative Analyse von durch P_PIR bewirkte Expression konstruiert.
pTWIN enthält sowohl PIT als auch tTA in einer von P_SV40 getriebenen Zweifach-Genabschnitts-Expressions-Konfiguration. Für die Konstruktion von pTWIN wurde zuerst PIT aus pMF156 als ein EcoRI/HindIII Fragment zu den entsprechenden Stellen in pSBC-1 (EcoRI/HindIII; ergibt pMF167) transferiert, bevor die PIT Expressionseinheit an die tTA Expressionseinheit enthalten in pSBC2-tTA (Fussenegger et al., 1997, supra) über SspI/NotI Schnittstellen gebunden werden konnte. Auf diese Weise enthält pTWIN die Zweifach-Genabschnitt P_SV40-PIT-IRES-tTA-pA Expressions-Kassette.
Zellkultur, Transfektion, Konstruktion stabiler Zelllinien, SEAP Aktivitäts-Test und Gel-Verlangsamungs-Testanordnung
Eierstockzellen des chinesischen Hamsters (CHO-K1, ATCC: CCL61), Nierenzellen des Hamstersäuglings (BHK-21, ATCC: CRL-8544) und HeLa Zellen (ATCC: CRL-7923) sowie stabile Zelllinien CHO-PIT1, CHO-PIT2, CHO-TWIN1₉₅, CHO-TWIN1₁₀₈ und CHO-PIT1-SEAP wurden wie früher beschrieben (Fussenegger et al., 1998, Nat. Biotechnol. 16, 468–472) in Gegenwart geeigneter Antibiotika kultiviert: G418 400 μg/ml; Zeocin 100 μg/ml.
Für vorübergehende Transfektion aller Zelllinien mit hohem Wirkungsgrad wurden verbesserte CaPO₄ Versuchsvorschriften gebraucht (id). Vorübergehend transfizierte Zellen wurden routinemässig nach 48 h auf GFP oder SEAP Expression unter Verwendung von Fluoreszenz-Mikroskopie bzw. zeitliche Entwicklung der Lichtabsorption basierend auf p-Nitrophenolphosphat wie beschrieben (Fussenegger et al., 1998, Nat. Biotechnol. 16, 468-472; Berger et al., 1988, Gene 66, 1–10 b) geprüft. Für die Konstruktion stabiler CHO-PIT und CHO-TWIN Zelllinien wurde CHO-K1 entweder mit pMF156 oder pTWIN1 und pSV2neo, das das G418 Resistenzgen trägt, kotransfiziert. CHO-PIT1-SEAP wurde durch Kotransfektion von pMF172 und pZeoSV2 (Invitrogen) konstruiert. Für die Beurteilung der Dosis-abhängigen Eigenschaften von P_PIR regulierter Gen-Expression wurde CHO-PIT1-SEAP bei Zelldichten von 150'000/ml während 48 h bei verschiedenen PI Konzentrationen kultiviert. Die gemischten Zellpopulationen wurden unter Verwendung von FACS-vermittelter Einzelzell-Sortierung (FACStar^Plus; Beckton Dickinson) kloniert. Gel-Verlangsamungs-Testanordnungen wurden wie beschrieben (Salah-Bey et al., 1995, supra) unter Verwendung von Pip, gereinigt aus einem überproduzierenden Stamm von E. coli, durchgeführt. Pip (0.02 pmol) wurde mit einer Reihe von antibiotischen Konzentrationen in einem Reaktionsvolumen von 20 μl titriert. Proteinlösungen wurden bei Raumtemperatur für 15 min in Abwesenheit oder Gegenwart von PI oder dessen Abkömmling Quinupristin in einem Puffer enthaltend 10 mM Tris (pH 7.8), 10 mM MgCl₂, 300 mM NaCl, 2 mM DTT und 10% Glycerin vorinkubiert. Zu einem EcoRI-HindII P_PTR Fragment (0.02 pmol) enthaltend drei Pip Bindungsstellen wurde dATP (radiomarkiert unter Verwendung von α-³²P) zugegeben und 15 min inkubiert. Um nicht-spezifische Proteinbindung zu vermindern und die Stabilität des Proteins zu vergrössern, wurden 2 μg poly dIdC und 20 μg BSA in der Inkubationsmischung eingesetzt. Protein-DNS Komplexe wurden auf 5% Polyacrylamid/TBE Gelen getrennt und durch Autoradiographie sichtbar gemacht.
Streptogramin-Regulierung
Fünf verschiedene Quellen von Pristinamycin wurden verwendet: Die zwei therapeutischen Formen Pyostacin^TM und Synercid^TM, Pristinamycin Scheiben und die Einzelverbindungen Pristinamycin I (PI) und Pristinamycin II (PII). PyostacinTM Pillen (500 mg) wurden in einem Mörser verrieben und in DMSO oder Wasser in einer Grundkonzentration von 50 mg/ml gelöst. SynercidTM (RP 59500; Lot Nr. CB06253) wurde von Aventis in für die Injektion bereiten Ampullen enthaltend 500 mg lyophilisiertes Antibiotikum zur Verfügung gestellt, welches in 5 ml einer 5% Glukoselösung aufbereitet und bei –20°C eingefroren wurde. Pristinamycin Einzelverbindungen PI und PII (identisch mit Virginiamycin M₁ (VM₁); Sigma Ref. V2753) wurden in DMSO bei einer Konzentration von 50 mg/ml gelöst und bei –20°C aufbewahrt. Antibiotische Scheiben enthaltend 15 μg Pristinamycin oder Virginiamycin (bioMérieux, Ref. 54552; bioMérieux, Ref. 54612) wurden in 1 ml Zellkultur-Medium bei 4°C für bis zu 24 h eingeweicht. Virginiamycin besteht aus Virginiamycin S₁ (VS₁), das zu PI analog ist, und Virginiamycin M₁ welches in der Struktur mit PII identisch ist (Barriure et al., 1994, supra). 2 μg/ml Streptogramin B wurde routinemässig für Studien der Regulierung in Zellkultur gebraucht. Die Konzentration der einzelnen Streptogramin-Komponenten wurde auf Grund des festgelegten Verhältnisses 70:30 (Gew./Gew.; PII/VM₁/Dalfopristin: PINS₁/Quinupristin) berechnet. Für Kontrollexperimente wurde TET und Doxycyclin (DOX) entweder als Scheiben (30 μg/Scheibe, bioMérieux Ref. 54882 (TET) und Ref. 54172 (DOX)) oder als Pulver (Sigma Ref. T3383 und D9891) gebraucht.
ERGEBNISSE
Konstruktion und funktionelle Studien von auf Streptogramin abgestützen Genregulierungssystemen in CHO Zellen.
Gel-Verlangsamungs-Versuchsanordnungen mit gereinigtem Pip Protein und einem DNS-Fragment enthaltend P_PTR Zielsequenz zeigten eine starke Wechselwirkung in vitro zwischen beiden Bestandteilen bei Abwesenheit von Pristinamycin I. Hingegen wurde, in Gegenwart von PI, Pip völlig von P_PTR freigesetzt (1). P_PTR aus S. pristinaespiralis enthält 3 paarweise symmetrische Bindungsstellen (1, Spur A; P_PTR in Abwesenheit von Pip), die alle mit relativ grossen Mengen von gereinigtem Pip (0.4 pmol; Spur A) gesättigt werden, was ein einzelnes verschobenes Band ergibt. Geringere Mengen von Pip (0.02 pmol) ergaben einen Zwischenzustand, bei welchem alle möglichen Permutationen der Belegung einer Stelle in drei deutlich verlangsamten Bändern vertreten sind (Spur C). Pip (0.2 pmol; Spuren D-M) wurde mit einem Bereich von 50 pmol bis 0.01 pmol PI titriert (Spuren D–H; D: 50 pmol; E: 10 pmol; F: 1 pmol; G: 0.1 pmol; H: 0.01 pmol). Pip wurde durch mehr als molare Konzentrationen an PI völlig von P_PTR freigesetzt. Unter gleichen Bedingungen zeigte das halbsynthetische PI Derivat Quinupristin sogar bei höchster Konzentration nur teilweise Freisetzung von Pip aus einzelnen P_PTR Bindungsstellen (Spuren I–M; I: 50 pmol; J: 10 pmol; K: 1 pmol; L: 0.1 pmol; M: 0.01 pmol). Die verhältnismässig niedrige Freisetzungsaktivität für Pip von Quinupristin steht in Beziehung zur geringeren Wirksamkeit in der Regulierung des PIT/P_PIR Systems (siehe Tabelle 5, infra).
Um die Stärken des Pip/P_PIR Systems für die Bereitstellung eines neuen Säugetier-Genregulierungssystems zu untersuchen, passten wir diese regulatorischen Elemente aus Streptomyces für eine Verwendung im Zusammenhang mit Eukaryoten durch Konstruktion einer Folge von zwei chimären Determinanten an: der durch PI gehinderte Transaktivator (PIT, Pip an die VP16 Transaktivierungs-Domäne des Herpes simplex Virus gebunden; Triezenberg et al., 1988, supra) und der auf PI ansprechende Promotor (P_PIR) (P_PTR an den minimalen Insekten-Promotor P_hsp70min gebunden; Corces et al., 1984, supra). Nach Transfektion eines von P_PIR getriebenen GFP Expressions-Konstruktes (pMF164) in CHO Zellen konnte mit Fluoreszenz-Mikroskopie keine grüne Fluoreszenz beobachtet werden, was zeigt, dass kein endogener Wirts-Faktor das P_PIR aktiviert. Expression von GFP konnte nur entdeckt werden, wenn pMF164 mit pMF156, das für PIT kodiert, kotransfiziert wurde, was zeigt, dass das chimäre PIT Protein als ein Transaktivator für P_PIR in Säugetierzellen wirkt. Transaktivierung der Expression von GFP war streng von PIT abhängig und konnte nicht durch Kotransfektion von pMF164 mit Vektoren enthaltend andere Transaktivatoren wie den Tetrazyklin- (TET) oder Ecdyson-abhängigen Transaktivator erreicht werden (pUHD15-1 kodierend für den durch Tetrazyklin unterdrückbaren Transaktivator tTA; pUHD17-1neo kodierend für den durch Tetrazyklin induzierbaren umgekehrten tTA (rtTA); Gossen et al., 1995, supra; pVgRXR kodierend für VgEcR und RXR, welches heterodimerisiert und den von Ecdyson abhängigen Transaktivator bildet; No et al., 1996, supra). Auch PIT aktivierte keine GFP Expression aus TET- oder Ecdyson-abhängigen Promotoren (pMF 104; pIND-GFP (Invitrogen)).
Zugabe von Pristinamycin zum Kulturmedium von CHO Zellen, die gleichzeitig mit PIT (pMF156) und einem P_PIR-SEAP (human placental secreted alkaline phosphatase) Reporter-Konstrukt (pMF172) transfiziert sind, verringert die SEAP Expression im Vergleich zu einer kontransfizierten Kultur ohne Pristinamycin stark, wie in Tabelle 2 gezeigt.
Tabelle 2:
Zusätzlich wurde pMF206 (PIT2; Pip-p65) mit pMF172 (P_PIR-SEAP) kotransfiziert und der SEAP Messwert in Abwesenheit und Gegenwart von PI (2 μg/ml) direkt mit CHO-K1 Zellen, die mit pMF156 (PIT; Pip-VP16) und pMF172 (P_PIR-SEAP) kotransfiziert wurden, verglichen. Wie in der folgenden Tabelle gezeigt vermittelt PIT2 hohe Mengen an Gesamt-Expression von SEAP im Vergleich zu der pMF156/pMF172 Anordnung in Abwesenheit von Pristinamycin, aber die Grund-Expression in Gegenwart von Pristinamycin bleibt bedeutend höher.
Tabelle 3:
Dieses Beispiel zeigt, dass externes Pristinamycin in Säugetierzellen eintreten kann und dort Kontrolle über PIT/P_PIR regulierte Genexpression ausübt. Hingegen hat Pristinamycin keinen Einfluss auf die Expressions-Menge von P_SV40 oder P_CMV-angetriebenen SEAP Expressions-Konstrukten (Daten nicht gezeigt). Interessanterweise zeigt nur die Zugabe von PI, einem Streptogramin der B Gruppe, wirkungsvolle Unterdrückung von PIT/P_PIR-vermittelter SEAP Expression; PII zeigte keinerlei bedeutende unterdrückende Aktivität. Ähnliche, von PI abhängige Genexpression unter Verwendung des PIT/P_PIR Systems ist auch in BHK-21 und HeLa Zellen beobachtet worden (nicht gezeigt). Bei Konzentrationen von 2 μg/ml PI, die für die Unterdrückung des PIT/P_PIR Systems als wirkungsvoll gefunden wurden, wurden keine zerstörerischen Folgen auf die Morphologie and Wachstum von CHO Zellen beobachtet. Dies liegt in der gleichen Grössenordnung wie die Gewebekonzentrationen bei einer Antibiotika-Therapie. Nur viel höhere PI Konzentrationen (über 50 μg/ml) waren für CHO Zellen toxisch.
Stabile Expression von PIT in CHO Zellen
Zwei repräsentative Klone, CHO-PIT1 und CHO-PIT2, wurden nach Zufall aus 11 PIT exprimierenden CHO Zellklonen, die stabil mit einem konstitutiven PIT Expressions-Konstrukt (pMF 156) transfiziert waren, ausgewählt. Keine der beiden Zelllinien zeigte ungewöhnliche Zell-Morphologie, und sie zeigen ähnliches Wachstums-Verhalten verglichen mit natürlichen CHO-K1 Zellen, was anzeigt, dass andauernde konstitutive Expression von PIT keine offensichtlich zerstörerische physiologische Auswirkungen auf CHO Zellen hat.
Vorübergehende Transfektion von CHO-PIT1 und CHO-PIT2 mit einem P_PIR-SEAP Expressions-Vektor (pMF172) ergab eine hohe Menge SEAP Expression in Abwesenheit von PI und bedeutende Unterdrückung in Gegenwart von 2 μg/ml PI , wie in Tabelle 4 gezeigt.
Tabelle 4:
Die Induktionsfaktoren (das Verhältnis von SEAP Aktivität ohne PI zu SEAP Aktivität mit PI) erreichen 13 und 8 für CHO-PIT1 bzw. CHO-PIT2. Von PI abhängige SEAP Regulierung der beiden CHO-PIT Derivate ist nach wiederholten Zyklen von Zugabe und Weglassung dieses Streptogramins voll reversibel, was zeigt, dass PI-PIT Wechselwirkung in Säugetierzellen reversibel ist. Diese Eigenschaft ist nötig, um wechselnde tägliche Dosisgaben zu erreichen, die für viele therapeutische Proteine wie Insulin optimal sind.
Dosis Abhängigkeit der von PI vermittelten Genregulierung in CHO Zellen
Die Menge der von P_PIR regulierten Genexpression konnte durch Variation der Konzentrationen von PI, die für die Auslösung verwendet wurden, kontrolliert werden. Dies wurde mit einer stabilen CHO Zellline (CHO-PIT1-SEAP) bestimmt, welche P_PIR-SEAP (pMF172) exprimiert und auch einen konstitutiven PIT Expressions-Vektor (pMF156) enthält. 2 zeigt die Kurve der Dosis-Abhängigkeit für von PI abhängiger Expression von SEAP in CHO-PIT1-SEAP Kulturen über 5 Grössenordnungen der PI Konzentration. Jenseits des Konzentrations-Fensters von 10–500 ng/ml ist PIT/P_PIR entweder voll induziert (< 10 ng/ml) oder unterdrückt (> 500 ng/ml), während die Genexpression innerhalb dieses Konzentrations-Fensters auf verschiedene Mengen angepasst werden kann. Vergrösserung der Konzentration von PI über 10 ng/ml führt zu einer schrittweisen Abnahme der SEAP Expression, mit der niedrigsten Menge SEAP Expression bei Konzentrationen über 500 ng/ml PI. Neben der konstanten Anwort des PIT/P_PIR Systems bei Konzentrationen von PI unter 10 ng/ml und über 500 ng/ml zeigt dieses System ein breites Fenster zwischen diesen zwei Konzentrationen, bei welchem die Genexpression auf mittlere Mengen angepasst werden kann. Solch anpassbare Genexpressions-Eigenschaften sind besonders wichtig für klinische Anwendungen, welche die Titrierung eines zirkulierenden Proteins in einen therapeutischen Bereich benötigen.
Wirksamkeit der Regulierung durch verschiedene Streptogramine
Zugang zu anderen wirkungsvollen Streptograminen würde das Spektrum der regulierenden Verbindungen für zukünftige Verwendung in der Zell- und Gentherapie beim Menschen ausweiten. Dementsprechend wurden verschiedene kommerziell erhältliche Streptogramin-Quellen auf ihre Möglichkeit, das PIT/P_PIR System zu regulieren, geprüft, wie unten in Tabelle 5 gezeigt. Unter den erhältlichen Streptograminen erwies sich Virginiamycin als die wirkungsvollste regulierende Verbindung und zeigte einen Induktionsfaktor von 32, beinahe drei Mal höher als Regulierung basierend auf Pristinamycin.
Tabelle 5:
Virginiamycin ist Pristinamycin in der Struktur sehr ähnlich, da Virginiamycin M,, die Komponente der Gruppe A, mit PII identisch ist und Virginiamycin S₁ (VS₁), die Komponente der Gruppe B, sich von PI nur durch das Fehlen einer Dimethylamino-Gruppe unterscheidet.
Das verbesserte antibiotische Potential von Synercid liegt in seiner Wasserlöslichkeit. Obwohl von Synercid wegen seiner Wasserlöslichkeit eine bessere Kontrolle des PIT/P_PIR Systems erwartet wird, ist seine unterdrückende Aktivität beinahe vierfach niedriger im Vergleich zu Pyostacin und PI (Tabelle 5). Scheinbar erniedrigt die [(5δR)-[(3S)-Chinuclidinyl]thiomethyl Modifikation von PI die Affinität von Quinupristin zu PIT, was durch Ergebnisse des Gelverlangsamungs-Tests unterstützt wird, die zeigen, dass Quinupristin Pip aus seiner Zielsequenz P_PTR weniger wirkungsvoll freisetzt als PI (3).
Vergleich und Kompatibilitäts-Studien von auf Streptogramin und Tetrazyklin abgestützten Genregulierungssystemen in CHO Zellen
Die Regulierungs-Leistung des auf PI abgestützen Regulationssystems wurde direkt mit dem weit verbreiteten auf TET reagierenden Expressions-Konzept verglichen. pTWIN1, das sowohl für PIT als auch für den von Tetrazyklin abhängigen Transaktivator tTA in einer einzigen konstitutiven Zweifach-Genabschnitts-Expressionseinheit kodiert, wurde stabil in CHO-K1 Zellen etabliert. Zwei repräsentative Klone von 20 pTWIN1 enthaltenden Klonen, CHO-TWIN1₉₅ und CHO-TWIN1₁₀₈, wurden für weitere Untersuchungen ausgewählt. CHO-TWIN Zellen zeigen die gleiche Zell-Morphologie und ähnliches Wachstumsverhalten wie Wild-Typ CHO Zellen.
CHO-TWIN1₉₅ und CHO-TWIN1₁₀₈ wurden unter gleichen Bedingungen mit den isogenen Plasmiden enthaltend das SEAP Gen unter Kontrolle des von tTA aktivierten Promotors P_hCMV*-1 (pMF111) oder des von PIT aktivierten Promotors P_PIR (pMF 172) transfiziert. Transfizierte Zellen wurden 48 h in Gegenwart oder Abwesenheit eines der beiden Antibiotika wachsen gelassen, um die SEAP Aktivität zu bestimmen. Ergebnisse sind unten in Tabelle 6 gezeigt.
Tabelle 6:
Die maximalen SEAP Expressions-Mengen des TET Systems waren ungefähr zehnfach höher im Vergleich zur von P_PIR angetriebenen SEAP Expression. Dies wird erwartet, weil sich die verschiedenen einbezogenen chimären Promotoren in ihren Minimal-Promotor-Elementen unterscheiden. Während der TET Promotor P_hCMV*-1 durch heptamere tTA Bindungs-Elemente verbessert wurde, um 35-fach höhere Expressions-Mengen als der virale Vorläufer-Promotor CMV zu erreichen (Yin et al., 1995, Cancer Res. 55, 4922–4928), ist P_PIR in seiner unveränderten, ursprünglichen "Wild-Typ" Konfiguration noch vor solchen Verbesserungen, um voll aktivierte Transkription zu vergrössern. Um das Verhältnis der Regulierungs-Eigenschaften zu untersuchen, bestimmten wir Induktions-Faktoren (IF, Verhältnis der maximalen Expressions-Menge zu durch Antibiotika unterdrückter Expressions-Menge). Von IF's ist gezeigt worden, dass sie durch die Wahl der Minimal-Promotoren oder andere Promotor-Veränderungen, um die maximale Expressions-Menge zu vergrössern, weitgehend unbeeinflusst bleiben (No et al., 1996, supra). Während das PI- und das TET-System von CHO-TWIN1₉₅ im SEAP Reporter-Test nahezu gleiche IF's von 12 zeigen, ergibt CHO-TWIN1₁₀₈13-fache Unterdrückung von SEAP in Gegenwart von TET, aber Unterdrückung um den Faktor 45 durch die Zugabe von PI. Wenn Virginiamycin statt PI als regulierende Verbindung für mit dem P_PIR-SEAP Expressions-Vektor (pMF172) transfiziertes CHO-TWIN1₉₅ und CHO-TWIN1₁₀₈ verwendet wird, sind die IF's sogar höher (27 für CHO-TWIN1₉₅ und 83 für CHO-TWIN1₁₀₈) (Tabelle 6). Deshalb weist in CHO Zellen, die für die Regulierung beider Systeme verändert sind, das auf PIT/P_PIR abgestützte Regulierungssystem für Säugetier-Gene gegenüber dem TET-System überlegene Gen-Induzierungs-Eigenschaften auf.
Die PI und TET Systeme können für gemeinsame therapeutische Anwendungen, die verschiedene Kontrollarten für verschiedene Transgene benötigen, verwendet werden, weil sie kompatibel sind und durch verschiedene therapeutische Antibiotika reguliert werden, für die grosse Mengen von klinischen und pharmakologischen Daten erhältlich sind. Unterdrückung durch PI und TET (oder des TET Abkömmlings Doxyzyklin) auf das andere Expressions-Regulierungssystem übers Kreuz wurde für CHO-TWIN1₁₀₈, das getrennt mit P_PIR-SEAP (pMF172) und P_hCMV*-1-SEAP (pMF111) Expressions-Konstrukten transfiziert wurde, bestimmt, und die Ergebnisse sind in Tabelle 7 dargestellt.
Tabelle 7:
PI zeigt keinen Einfluss auf die Expression vom auf TET reagierenden System. Dieser Versuch zeigt, dass PI Aktivierung der SEAP Expression in Konstrukten enthaltend PIT und P_PIR durch spezifische Wechselwirkung von PI mit PIT abläuft, wie es auch zwischen PI und dem S. coelicolor Protein Pip geschieht (Tabelle 7; 5), und nicht über eine allgemeine, nicht-spezifische Wirkung von PI auf CHO Zellen.
Beide Tetrazyklin-Abkömmlinge unterdrücken das PIT/P_PIR System in von der Dosis abhängiger Weise. Hingegen ist die unterdrückenden Wirkung von TET auf das PIT/P_PIR System bei allgemein für die Regulierung des auf TET reagierenden Promotors verwendeten Konzentrationen (2 μg/ml) nur 17%. Dies ist genügend niedrig, so dass für praktische Anwendungen die TET- und Pip/P_PIR Systeme im wesentlichen unabhängig regulierbare Expression ermöglichen.
DISKUSSION
Eigenschaften eines idealen Genregulierungssystems für therapeutische Verwendung umfassen (i) niedrige Basis-Expression und hohes Induktions-Verhältnis, (ii) Kontrolle durch ein leicht bioverfügbares Medikament in Form eines kleinen Moleküls, das keine Wechselwirkung mit dem Stoffwechsel des Wirtes zeigt, (iii) hoher pharmakokinetischer Umsatz der regulierenden Verbindung in allen Geweben, um eine schnelle Rückkehr zur Anordnung im Wild-Typ zu erlauben, (iv) niedrige Wahrscheinlichkeit für immunologische Erkennung und (v) hohe Anpassungsfähigkeit der regulierenden Komponenten, um unabhängige und wirkungsvolle Optimierung als auch eine Anpassung des Systems an spezielle therapeutische Bedingungen zu ermöglichen. Das hier beschriebene auf Streptogramine abgestützte Regulierungssystem für Säugetier-Gene erfüllt diese Bedingungen in idealer Weise. In Zelllinien, die so verändert sind, dass sie Kontrolle beider Systeme ermöglichen, zeigt das auf Streptogramine gestützte System eine über 10-fach niedrigere Expressions-Grundmenge und bis zu 4-fach höhere Induktions-Verhältnisse als im auf TET reagierenden System. Noch wichtiger ist, dass Streptogramine und Tetrazykline ihre entsprechenden Transkriptionssysteme in Säugetieren im wesentlichen unabhängig regulieren, was zeigt, dass diese beiden Systeme zusammen verwendet werden können, um fortgeschrittene therapeutische Anordnungen zu erreichen, in welchen die Reihen von Transgenen getrennt reguliert werden können.
Eine ganze Reihe von Streptogramin-Antibiotika sind erhältlich, einschliesslich des kürzlich zugelassenen Synercid, und haben bestätigte, ausgezeichnete Bioverfügbarkeit, Pharmakokinetik und Verträglichkeit für den Menschen. Ebenso werden Streptogramin-Antibiotika aktiv durch menschliche Zellen aufgenommen, was zu für die Regulierung wirksamen Konzentrationen in beinahe allen Teilen des menschlichen Körpers führt (Bebear, et ad., 1997, J. Antimicrob. Chemother. 39, 59–62). Nichtsdestotrotz werden Streptogramin-Antibiotika rasch aus dem Blut und den meisten Geweben mit Halbwertszeiten, die beim Menschen üblicherweise nicht mehr als eine Stunde betragen, ausgeschieden (Bergeron et al., 1997, J. Antimicrob. Chemother. 39, 129–138), was eine leichte Umkehrbarkeit von möglichen therapeutischen Zuständen sicherstellt. Das Gehirn ist die einzige Stelle, wo nach oraler oder intravenöser Anwendung sozusagen kein Streptogramin gefunden werden konnte, weil diese Klasse Antibiotika die Blut-Hirn-Schranke nicht überqueren kann (Bergeron et al., 1997, supra). Diese natürliche gewebespezifische Selektivität könnte die einfache Expression des PIT/P_PIR Systems ausserhalb des Hirns in Gegenwart von die Regulierung bewirkenden Konzentrationen von Streptogramin in den verbleibenden Körperteilen ermöglichen, was die Planung von therapeutischen Strategien für neurodegenerative Krankheiten ermöglicht (Hardy et al., 1998, Science 282, 1075–1079).
Ein Regulierungssystem für Säugetier-Gene wie die PIT/P_PIR Anordnung, die auf eine Klasse chemisch verwandter Antibiotika reagiert, bietet noch eine andere bedeutende neue Anwendung: Das Auffinden neuer Antibiotika, welche dringend gebraucht werden, um dem zunehmenden Vorkommen von bakteriellen Pathogenen, die gegen viele Medikamente resistent sind, gewachsen zu sein. Stoffwechsel-Bibliotheken von Streptomyces oder Pilzen konnten mit kultivierten Säugetierzellen enthaltend das an ein Reporter-Gen gebundene PIT/P_PIR System geprüft werden, um neue Streptogramine aufzufinden. Diese Technik ist mindestens eine Grössenordnung empfindlicher als klassische mikrobielle Inhibitions-Tests und nicht durch antibiotische Resistenz von Indikator-Bakterien verfälscht.
Zusätzlich kann das oben beschriebene System an irgend eine Zahl verschiedener Antibiotika-Resistenz-Systeme, die in Sekundärmetaboliten/Antibiotika-Produzenten innerhalb der Actinomyceten, besonders der Streptomyces gefunden werden, angepasst werden. Beispiele solcher Systeme, die auf P_ptr reagierende Promotoren mit zugehörigen Antibiotika-bindenden Proteinen enthalten, sind die Gruppe der auf Rifamycin reagierenden Gene, die Gruppe der auf Daunorubicin reagierende Gene, die Gruppe der auf Landomycin reagierende Gene, die Gruppe der auf Rapamycin reagierende Gene und die Gruppe der auf Tetracenomycin reagierende Gene.
Beispiel 2: Das doppelte Regulierungssystem
Die meisten der heutigen Strategien für Gentherapie und Gewebeveränderung zielen auf stabile Integration von Transgenen in menschliche somatische Zellen, entweder an vivo oder ex vivo. Während erste Erfolge mit ausgeklügelter Technik des Gentransfers umfassend abgeschwächte Viren, lagespezifische Rekombination für zielgerichtete Integration und nicht-immunogene Selektionsmarker erreicht wurden, ist der Gentransfer nicht die einzige Herausforderung für zukünftige Gentherapie und Gewebeveränderung. Hingegen wird der Erfolg und die Umsetzung dieser Technik weitgehend von den Begleitkonzepten abhängen, welche ex vivo Vermehrung von verpflanztem Gewebe gefolgt von anhaltender Wachstumskontrolle und Wieder-Implantierung behandelter Zellen oder Gewebe ermöglichen. Dieses Konzept benötigt zwei aufeinander folgende Schritte gegenläufiger Proliferations-Kontrolle, welche zuerst Expression von Genen ermöglicht, die Proliferation für ex vivo Vermehrung von Gewebezellen aktivieren, gefolgt von gentherapeutischer Massnahme und Aktivierung der Proliferations-Kontrolle, um die Wieder-Implantation von genetisch verändertem Gewebe zu erlauben.
Unter Verwendung zweier für Menschen verträglicher Genregulierungssysteme, dem auf Tetrazyklin und dem auf Pristinamycin reagierenden System, begannen wir, eine doppeltes Regulierungssystem zu konstruieren, um eine vollständig von aussen kontrollierte Führung der kontrollierten Proliferation von Säugetierzellen zu erreichen.
GEGENSTÄNDE UND VERFAHREN
Um den doppelt regulierbaren Säugetier-Expressions-Vektor pDuoRexl zu konstruieren, wurde zuerst ein P_PIR-pA enthaltendes Fragment aus pMF 164 verstärkt (P_PIR-GFP Expressions-Konstrukt), und zwar mit den Oligonukleotiden
OMF87: GATCACTAGTGATATCgctagctgtgtgtgagttc (SEQ ID NO:8) und
OMF86: ATCGGATCCATCGATAATAAAATATCTTTATTTTCATTACATCTGTGTGTTGGT
TTTTTGTGTGcgtcggagaaatagcgc (SEQ ID NO:9).
OMF86 enthält an seinem 5' Ende ein künstliche Polyadenylierungsstelle (Levitt et al., 1989, Genes Dev. 3: 1019–1025), die verbessert ist, um Restriktionsschnittstellen zu beseitigen.
Ferner enthalten OMF87 und OMF86 an ihrem 5' Ende SpeI bzw. ClaI Schnittstellen (fett). Das P_PIR-pA enthaltende Fragment wurde in pcDNA3.1N5/His-TOPO (Invitrogen) in zu P_CMV gegenläufiger Ausrichtung kloniert und ergibt Plasmid pSAM224. Die P_PIR-pA enthaltende Kassette wurde durch Restriktion mit SpeI und ClaI aus pSAM224 herausgeschnitten und in die entsprechenden Stellen (SpeI/ClaI) von pTRIDENT1 kloniert, um IRESII zu ersetzen, und ergibt pDuoRexl. Wie in 6 gezeigt besteht pDuoRexl aus der folgenden, doppelt regulierten Expressionseinheit: P_hCMV*-1-MCSI-IRES-MCSII-pA_I-/-P_PIR-MCSIII-pA_II(P_hCMV*-1, von Tetrazyklin regulierter Promotor; MCS, Mehrfachklonierungs-Stelle; IRES, interne ribosomale Eintrittsstelle; pA, Polyadenylierungs-Stelle; P_PIR, auf Pristinamycin reagierender Promotor).
Doppelte Regulierung von Mek1DD, einer konstitutiv aktiven Proteinkinase des zentralen Wachstumfaktor-Signalweges im Säugetier, und des Zyklin-abhängigen Kinase-Inhibitors (CDI) p27 wurde unter Verwendung von pDuoRexl in einem 4-Schritt Klonierungsverfahren erreicht. (1) Mek1DD wurde aus pGem-Mek1DD verstärkt (Greulich und Erikson, 1998, J. Biol. Chem. 273:13280–13288), und zwar mit
OMF92: GATCGATATCACTAGTCGCCACCatgcccaagaagaagcc (SEQ ID NO:10) und
OMF93: GATCGGATCCACGCGTtcagatgctggcagcgtg (SEQ ID NO:11);
das 1.3 kb Fragment wurde in pcDNA3.1N5/His-TOPO unter Kontrolle des P_CMV Promotors kloniert und ergibt pMF 192. (2) p27 wurde aus pDD6 verstärkt (Fussenegger et al., 1998), und zwar mit
OMF94: GATCGAATTCAAGCTTgcggtcgtgcagacccgg (SEQ ID NO:12) und
OMF95: ATGCATCGATGCGGCCGCttacgtttgacgtcttctg (SEQ ID NO:13);
das 600 bp Fragment wurde in pcDNA3.1N5/His-TOPO unter Kontrolle des P_CMV kloniert und ergibt pMF 193. (3) p27 wurde mit EcoRI und NotI (enthalten in OMF94 bzw. OMF95 (fett)) aus pMF193 geschnitten und in die entsprechenden Stellen in pDuoRexl (EcoRI/NotI) kloniert, wobei das IRES enhaltende Fragment ersetzt und p27 unter Kontrolle von P_hCMV*-1 gesetzt wird. Dies ergibt Plasmid pMF194. (4) pMF192 wurde mit SpeI und BamHI (enthalten in OMF92 bzw. OMF93 (fett)) geschnitten und Mek1DD auf mit SpeI und BglII linearisiertes pMF194 übertragen, wobei Mek1DD unter Kontrolle von P_PIR gesetzt wird. Dies ergibt Plasmid pMF195. Wie in 7 gezeigt enthält pMF195 die folgende, doppelt regulierte Expressionseinheit: P_hCMV*-1-P27-pA_I-/-P_PIR-Mek1DD-pA_II.
Zusätzliche doppelt regulierte Vektoren entsprechend pMF195 (welches p27-Mek1DD enthielt) wurden noch konstruiert, in welchen die für Mek1DD kodierende Gensequenz durch andere wachstumsfördernde Gene ersetzt war. Insbesondere wurden Konstrukte enthaltend Sequenzen, die für das adenovirale grosse T Antigen, das adenovirale kleine T Antigen und das menschliche Papillomavirus E7 Protein unter Kontrolle des P_PIR Promotors kodieren, unter Verwendung wohlbekannter Techniken konstruiert.
In einem gleichzeitigen Klonierungs-Verfahren wurde pMF188 enthaltend PhCMV*-1-SEAP-IRES-pA_I-/-P_PIR-GFP-pA_II kloniert. GFP wurde aus pMF164 verstärkt, und zwar mit
OMF84: GATCGCGGCCGCAATAAAATATCTTTATTTTCATTACATCTGTGTGTTGGTTTT
TTGTGTGcgtcggagaaatagcgc (SEQ ID NO:14) und
OMF85: GTACAGATCTttatttgtagagctcatc (SEQ ID NO:15),
und in pcDNA3.1/V5/His-TOPO unter Kontrolle von P_CMV kloniert. Dies ergibt Plasmid pSAM223. Weil OMF84 an seinem Ende ein künstliches pA Element enthält, enthält pSAM223 eine pA-GFP Kassette, welche mit NotI und BglII (enthalten in OMF84 bzw. OMF85 (fett)) ausgeschnitten und in die entsprechenden Schnittstellen (NotUBglII) von pMF124 (pTRIDENT3 enthaltend SEAP in der ersten Genabschnitt-Expressionseinheit) kloniert wurde. Dies ergibt pMF188.
Eine weitere doppelt regulierte Anordnung wurde für Verwendung in transgenen Tieren kloniert, wobei zwei kompatible von GFP abgeleitete fluoreszierende Proteine, CFP (cyan-fluoreszierendes Protein) und YFP (gelblich-fluoreszierendes Protein) in einem von pDuoRexl abgeleiteten Expressions-Vektor mit einem 4-Schritt Klonierungsverfahren kombiniert wurden. (1) CFP wurde aus pECFP-C1 (Clontech) kloniert, und zwar mit den Oligonukleotiden
OMF96: GATCGAATTCCCTCAGCACCAGGTCATGCTTAAGTCGCGACATATGgatccgct
agcgctaccg (SEQ ID NO:16) und OMF89: GATCAAGCTTGCCCGGGCCACACAAAAAA
CCAACACACAGATGTAATGAAAATAAAGATATTTTATTTGATCRGGCGCGCCGCGGCCGCA
TGCttacttgtacagctcgtc (SEQ ID NO:17),
und in pcDNA3.1N5/His-TOPO unter Kontrolle von P_CMV kloniert. Dies ergibt Plasmid pSAM228. (2) YFP wurde aus pEYFP-C1 (Clontech) verstärkt und zwar mit Oligonukleotiden
OMF90: GTACGAATTCGATATCATGCATGGCGCCGTTTAAACGCGTATTTAAATgatccg
ctagcgctaccg (SEQ ID NO:18) und OMF91: GATCAAGCTTGCGGCCGCGGATCCGCC
CGGGCCACACAAAAAACCAACACACAGATGTAATGAAAATAAAGATATTTTATTATCGATA
CTAGTGCGATCGCTTAATTAATTTAAATttacttgtacagctcgtcc (SEQ ID NO:19),
und in pcDNA3.1N5/His-TOPO unter Kontrolle von PCMV kloniert. Dies ergibt Plasmid pSAM222. (3) CFP wurde mit EeoRI und NotI (enthalten in OMF96 bzw. OMF89 (fett)) aus pSAM228 geschnitten und in die entsprechenden Schnittstellen (EcoRI/NotI) von pDuoRex1 kloniert, wobei das IRES Element ersetzt wird. Dies ergibt pMF200. (4) pMF200 wurde mit EcoRV und SpeI linearisiert und an aus pSAM222 mit EcoRV und SpeI (enthalten in OMF90 bzw. OMF91 (fett)) geschnittenes YFP gebunden. Dies ergibt pMF201. Wie in 4 gezeigt enthält pMF201 die folgende, doppelt regulierte Expressionseinheit: P_hCMV*-1-CFP-pA_I-/-P_PIR-YFP-pA_II.
pMF 196 ist ein CFP/YFP enthaltendes, dem pMF201 ähnliches Konstrukt für doppelte Regulation, aber die beiden Expressionseinheiten konvergieren. Klonierung von pMF196 benötigte ein 4-Schritt Klonierungsverfahren. (1) Die YFP-pA enthaltende Kassette wurde mit EcoRI und NotI aus pSAM222 geschnitten und an die entsprechenden Schnittstellen von pMF164 (EcoRI/NotI) gebunden, wobei GFP in pMF164 ersetzt wird. Dies ergibt Plasmid pSAM226. (2) Die P_PIR-YFP-pA Kassette wurde mit SspI/NotI aus pSAM226 geschnitten und an die entsprechenden Schnittstellen in pTRIDENT 1 (SspI/NotI) gebunden, wobei
P_hCMV*-1 und IRES I von pTRIDENT1 ersetzt werden. Dies ergibt Plasmid pMF190. (3) Die CFP-pA Kassette wurde mit EcoRI und HindIII (enthalten in OMF96 und OMF89) aus pSAM228 geschnitten (OMF89 enthält an seinem Ende eine künstliche pA Stelle) und an die entsprechenden Schnittstellen (EcoRI/HindIII) von pTBC1 (Dirks et al., 1993) gebunden. Dies ergibt Plasmid pSAM227. (4) Die P_hCMV*-1-CFP-pA enthaltende Kassette wurde durch Verdauung mit XhoI und SrfI aus pSAM227 freigesetzt und an mit SalI und SrfI verdautes pMF190 gebunden. Dies ergibt Plasmid pMF196. Wie in 4 gezeigt enthält pMF196 die folgende, doppelt regulierte Expressionseinheit: P_PIR-CFP-pA_I/PA_II-YFP-P_hCMV*-1
ERGEBNISSE
Konstruktion von auf Tetrazyklin und Streptogramin reagierenden doppelten Regulations-Vektoren
Um das doppelte Regulierungs-Konzept zu veranschaulichen, wurde eine Reihe von drei Vektoren konstruiert (i) pMF 188, das die auf Tetrazyklin reagierende SEAP- (human secreted alkaline phosphatase) und auf Pristinamycin reagierende GFP-Expression in einer einzigen doppelt regulierten Expressionseinheit kombiniert: P_hCMV*-1-SEAP-pA_I-P_PIR-GFP-pA_II (3). (ii) Ähnlich wie pMF188 enthält pMF201 tet-reguliertes CFP (cyan-fluoreszierendes Protein) und Pristinamycin-reguliertes YFP (gelblich-fluoreszierendes Protein) in einer einzigen Expressionseinheit: P_hCMV*-1-CFP-pA_I8-P_PIR-YFP-pA_II( 4). (iii) pMF 196 ist isogen zu pMF 188 und pMF201, enthält aber die folgenden doppelt regulierten Expressionseinheiten: P_PIR-YFP-pA_I-pA_II-CFP-P_hCMV*-1 (5).
Wenn diese doppelt regulierenden Vektoren vorübergehend in CHO-TWIN1₁₀₈ Zellen transfiziert wurden, zeigten alle Expressionseinheiten, die in pMF188/pMF201/pMF196 enthalten sind, unabhängige verstärkende/unterdrückende Regulierung als Antwort auf die entsprechenden regulierenden Antibiotika Tetrazyklin und Pristinamycin, wie dies durch SEAP Aktivitätsmessungen und Fluoreszenz-Mikroskopie verfolgt wurde. Gestützt auf Erfahrung mit pMF188/pMF201/pMF196 entwarfen wir einen Vielzweck-Doppelregulations-Vektor pDuoRexl zur Verwendung in Gewebeveränderung und Gentherapie (6).
Für das neue Gentherapie- und Gewebeveränderungs-Konzept wurden die Gene für positive und negative Proliferations-Kontrolle sorgfältig ausgewählt. Für negative Proliferations-Kontrolle ist die Verwendung von Tumor unterdrückenden Genen wie p21, p27, p53 oder Kombinationen davon mit Differenzierungs-Faktoren wie c/ebpα und/oder Überlebens-Faktoren wie bcl-2 und bcl-x_L in einer Vielfach-Genabschnitts-Anordnung gut geprüft und verlässlich (Fussenegger et al., 1998). Die Wahl des positiven Proliferations-Kontrollgens ist wichtig, weil seine Wirkung auf veränderte Zellen genügend stark sein muss, um Wiederaufnahme des Zellzyklus in endgültig differenzierten Zellen auszulösen, aber schwach genug, um Umkehrung des Vermehrungszustands und Wieder-Implantation von behandelten Zellen im in vivo Zusammenhang zu erlauben.
Wir wählten Mek1, eine zentrale Proteinkinase im konservierten Säugetier Ras-MAP Signal-Übermittlungsweg, der auf wachstumsfördernde Signale wie Zytokine reagiert. Mek1 transferiert nicht nur, sondern verstärkt auch wachstumsfördernde Signale im Zentrum eines solchen Signal-Übermittlungsweges. Gegen den Anfang (upstream) liegende Kinasen (Erk) phosphorylieren Mek1 an zwei Stellen (Serin 218) und (Serin 222). Eine kürzlich beschriebene doppelte Mutante enthält zwei Mutationen, welche diese Aminosäuren Ser218 und Ser222 zu Aspartat verändern und Mek1DD in Abwesenheit der gegen Anfang stehenden Vermehrungssignale und in Abwesenheit einer Phosphorylierung konstitutiv aktiv werden lassen (Greulich und Erikson, 1998, J. Biol. Chem. 273:13280–13288). Frühere Resultate von Greulich und Erikson (1998) haben gezeigt, dass regulierte Überexpression von Mek1DD Vermehrung von NIH-3T3 Zellen bei niedriger Serum-Konzentration ermöglicht. Ein sich auf pDuoRex1 abstützender Expressions-Vektor, pMF 195, wurde hergestellt und enthält p27 unter Kontrolle von P_hCMV*-1 und Mek1DD unter Kontrolle von P_PIR (7).
Immunofluoreszenz-Analyse von vorübergehend mit pMF195 tranfiziertem CHO-TWIN1₁₀₈ zeigt klar unabhängige Regulierung von p27 und Mek1DD als Antwort auf die entsprechenden regulierenden Antibiotika Tetrazyklin und Pristinamycin.
Neben Mek1DD könnten andere genetische Determinanten, die eine positive Kontrolle auf den Zellzyklus von Säugetieren ausüben, wie Zykline (z.B. Zyklin E) oder E2F in Betracht gezogen werden. Beispielsweise wurden doppelt regulierte Vektoren analog pMF195 (welche p27-Mek1DD enthielten) konstruiert, in welchen die für Mek1DD kodierende Sequenz durch eine für das adenovirale grosse T Antigen, das adenovirale kleine T Antigen und das menschliche Papillomavirus E7 Protein (alle unter Kontrolle des P_PIR Promotors) kodierende Sequenz ersetzt wurden. Man kann auch eine Sequenz, die für menschliches Papillomavirus E6 Protein kodiert, verwenden. Im Prinzip kann dieses Zwei-Gen-Doppekegulierungs-Konzept auch an die Mehrfach-Genabschnitts-Expressionseinheit-Einrichtung angepasst werden, um sorgfältig die Expression von gegenläufigen Genen der Proliferations-Kontrolle fein einzustellen oder beispielsweise wachstumshemmende Gene mit Genen wie c/ebpα, die endgültige Differenzierung auslösen und aufrechterhalten, zu verbinden. Auch Konzepte mit doppelt regulierter Einfach-Genabschnitts-Expressionseinheit, welche parallele und antiparallele Expression eines einzelnen Gens verwenden, um Proliferation auszulösen oder zu verhindern (oder umgekehrt), könnten in Betracht gezogen werden. In Frage kommende Gene umfassen antiparalleles p27, von dessen Expression gezeigt worden ist, dass es Proliferation von ruhenden Fibroblasten anregt und Wachstum in serumfreiem Medium ermöglicht (Rivard et al., 1996, J. Biol. Chem. 271:18337–18341.), und nedd5, das als positives wachstumskontrollierendes Gen bekannt ist (Kinoshita et al., 1997, Genes Dev. 11: 1535–1547), aber anti-parallele Expression könnte das Wachstum verhindern und führt zu Spiegelei-ähnlichen Zellformen, bekannt für durch Überexpression von p27 angehaltenen Zellen (unsere eigenen Ergebnisse nicht gezeigt).
Beispiel 3: Veränderung des Promotors, um maximale Expression des auf Streptogramin reagierenden Systems zu verstärken.
Im Prinzip kann jeder Teil des PIT/P_PIR Systems einzeln verbessert oder durch eine stärkere Komponente ersetzt werden: (1) Die Pip Domäne von PIT kann Zufalls-Mutagenese unterworfen werden, um DNS Bindungsaffinitäten oder Spezifizität zu verändern, Affinität zu Pristinamycin oder zu anderen Streptograminen oder Antibiotika zu verbessern oder die Empfindlichkeit des PIT/P_PIR Systems auf Streptogramine umzukehren (umgekehrtes PIT/P_PIR System), beispielsweise um Induktion der Gen-Expression durch Zugabe von Pristinamycin statt auf seine Entfernung zu erlauben. (2) Die VP 16 Domäne könnte durch andere Transaktivierungs-Domänen wie die p65 Domäne des menschlichem NF-κB ausgetauscht werden (Schmitz and Baeuerle, 1991, EMBO J. 10:3805–3817), um das Regulierungssystem zu "vermenschlichen" und Immunerkennung von PIT oder der KRAB Stillegungs-Domäne des menschlichen koxI Gens zu verringern (Deuschle et al., 1995, Mol. Cell Biol. 15:1907–1914), um ein umgekehrtes PIT/P_PIR System zu konstruieren (diese Systeme werden hergestellt). (3) Austausch des minimalen Drosophila Heatshock Promotors durch andere minimale Promotoren wie dem minimalen CMV Promotor oder dem minimalen Promotor des adenoviralen E1B Gens (wird auch hergestellt).
Die natürlich vorkommende P_ptr Sequenz enthält nur drei verschiedene Pip Bindungsstellen, in denen PIT Platz finden könnte. Um die maximale Expression des auf Streptogramin reagierenden Systems zu verstärken, konstruierten wir auf PI reagierende Promotoren mit zwei (P_PIR2) und drei (P_PIR3) ptr Bindungseinheiten mit total 6 bzw. 9 Pip Bindungsstellen.
Zwei synthetische DNS Fragmente wurden hergestellt: PPIR2 (SEQ ID NO:20):
gacgtcgatatcGAAATAGCGCTGTACAGCGTATGGGAATCTCT
TGTACGGTGTACGAGTATCTTCCCGTACACCGTACGAAATAGCGCTGTRCAGCGTATGGGA
ATCTCTTGTACGGTGTACGAGTATCTTCCCGTACACCGTACcctgcagg und
PPIR3 (SEQ ID NO:21):
gacgtcgatatcGAAATAGCGCTGTACAGCGTATGGGAATCTCT
TGTACGGTGTACGAGTATCTTCCCGTACACCGTACGAAATAGCGCTGTACAGCGTATGGGA
ATCTCTTGTACGGTGTACGAGTATCTTCCCGTACACCGTACGAAATAGCGCTGTACAGCGT
ATGGGAATCTCTTGTACGGTGTACGAGTATCTTCCCGTACACCGTACCCtgcagg.
Beide DNS Fragmente wurden mit AatII und Sse8387I (entsprechende Restriktions- Schnittstellen sind fett gezeigt) verdaut und an die entsprechenden Schnittstellen in pMF 172 gebunden (P_PIR-SEAP; AatII/Sse8387I), wobei die einzelne Pip bindende Sequenz (P_ptr von S. pristinaespiralis; Salah-Bey et al., 1995; Salah-Bey und Thompson, 1995) ersetzt wird. Dies ergibt Plasmide pMF198 (P_PIR2-SEAP) und pMF199 (P_PIR3-SEAP).
Alle drei von PIT abhängigen Promotoren P_PIR, P_PIR2 and P_PIR3 wurden vor ein seap Reporter-Gen kloniert, um ihre Transkripitionsaktivität in Abwesenheit von Pristinamycin (volle Induktion) zu messen. Tabelle 8 zeigt relative Expressions-Eigenschaften von P_PIR2 (pMF198; P_PIR2-SEAP) und P_PIR3 (pMF199; P_PIR3-SEAP) im Vergleich zu "Wild-Typ" P_PIR.
Tabelle 8:
Beispiel 4: Konstruktion eines durch Pristinamycin induzierbaren Systems mit verstärkten Regulierungseigenschaften
Das klassische PIT/P_PIR System gehört zur "OFF" Familie der Regulierungs-Konzepte, weil die Genexpression bei der Entfernung des regulierenden Antibiotikums aktiviert wird. Hingegen ist in einigen Anwendungen wie der Gentherapie und Gewebeveränderung ein "ON" System eher wünschbar, das auf Zugabe von Streptogramin hin ausgelöst wird. Wir konstruierten daher ein neues, sich auf Pip abstützendes binäres PI_ON System, welches aus einem P_PIRON Promotor und einer Reihe von zwei verschiedenen Transrepressoren besteht. P_PIRON besteht aus einem PIR3 Baustein enthaltend 3 hintereinandergeschaltete Pip Bindungselemente (SEQ ID NO:21; Beispiel 3), die vor den starken viralen SV40 Promotor gelegt sind. Transrepressoren wie PIT3, welches aus einem Fusionsprotein von Pip mit der KRAB Stillegungs-Domäne des menschlichen kox-1 Gens (Deuschle et al., 1995, Mol. Cell Biol. 15:1907–1914) besteht, und PIT4, welches einfach Pip ist, exprimiert in einer eukaryotischen Konfiguration, binden an PIR3 vor P_SV40 und blockieren die Transkription dieses Promotors. Neben sterischer Transkriptionshemmung kann die Stillegungs-Domäne von PIT3 zusätzlich die P_SV40 Aktivität verringern.
GEGENSTÄNDE UND VERFAHREN
Die PIR3 Sequenz (SEQ ID NO:20) wurde mit EcoRV und SmaI aus dem Gen OpJ-PIR3 ausgeschnitten (der von pUC abgeleitete GeneOp Expressions-Vektor wird von Operon Technologies Inc. verkauft) und in die NruI Schnittstelle von pSEAP2-control (Clontech) gebunden. Dies ergibt Plasmid pMF208 enthaltend die P_SV40-PIR3-SEAP Kassette. Die Kombination von P_SV40 und PIR3 wird P_PIRON genannt.
PIT3, das Pip-KRAB Fusionsprotein, wurde in einem Dreischritt-Klonierungsverfahren konstruiert: (i) Die KRAB Domäne des menschlichen kox-1 Gens wurde aus pSCTEVga193Kox verstärkt (Moosmann et al., 1997, Biol. Chem. 378:669–677), und zwar mit den Oligonukleotiden
OMF99: GATCGCGCGCC(AGATCCAAAAAAGAAGAGAAAGGT)(AGATCCAAAAAGAAG
AGAAAGGT)(AGATCCAAAAAAGAAGAGAAAGGT)AATGGATGCTAAGTCACTA (SEQ ID NO:25) und
OMF100: GATCAAGCTTGGATCCTTACCAGAGATCATTCCTTGC (SEQ ID NO:26),
und in antiparalleler Anordnung in pcDNA3.1/V5/His-TOPO (Invitrogen) gebunden. Dies ergibt pMF203. OMF99 enthält drei aufeinander folgende nukleare Lokalisierungs-Signale (in Klammern), die vom SV40 grossen T-Antigen abgeleitet sind (Kalderon et al., 1984). (ii) Die KRAB Domäne wurde mit BssHII/HindIII aus pMF203 ausgeschnitten, in die entsprechenden Schnittstellen (BssHII/HindIII) von pSBC2-tTA gebunden (Fussenegger et al., 1997), und ersetzt dabei die VP16 Domäne von tTA. Dies ergibt pMF205. (iii) Die tetR Domäne wurde mit SspI/BssHII aus pMF205 ausgeschnitten und durch aus pMF150 mit SspI/BssHII ausgeschnittenem Pip ersetzt, dies ergibt pMF207. Das sich ergebende Plasmid hat die folgende, für PIT3 kodierende Sequenz:
ATGAGTCGAGGAGAGGTGCGCATGGCGAAGGCAGGGCGGGAGGGGCCGCGGGACAGCGTGT
GGCTGTCGGGGGAGGGGCGGCGCGGCGGTCGCCGTGGGGGGCAGCCGTCCGGGCTCGACCG
GGACCGGATCACCGGGGTCACCGTCCGGCTGCTGGACACGGAGGGCCTGACGGGGTTCTCG
ATGCGCCGCCTGGCCGCCGAGCTGAACGTCACCGCGATGTCCGTGTACTGGTACGTCGACA
CCAAGGACCAGTTGCTCGAGCTCGCCCTGGACGCCGTCTTCGGCGAGCTGCGCCACCCGGA
CCCGGACGCCGGGCTCGACTGGCGCGAGGAACTGCGGGCCCTGGCCCGGGAGAACCGGGCG
CTGCTGGTGCGCCACCCCTGGTCGTCCCGGCTGGTCGGCACCTACCTCAACATCGGCCCGC
ACTCGCTGGCCTTCTCCCGCGCGGTGCAGAACGTCGTGCGCCGCAGCGGGCTGCCCGCGCA
CCGCCTGACCGGCGCCATCTCGGCCGTCTTCCAGTTCGTCTACGGCTACGGCACCATCGAG
GGCCGCTTCCTCGCCCGGGTGGCGGACACCGGGCTGAGTCCGGAGGAGTACTTCCAGGACT
CGATGACCGCGGTGACCGAGGTGCCGGACACCGCGGGCGTCATCGAGGACGCGCAGGACAT
CATGGCGGCCCGGGGCGGCGACACCGTGGCGGAGATGCTGGACCGGGACTTCGAGTTCGCC
CTCGACCTGCTCGTCGCGGGCATCGACGCGATGGTCGAACAGGCCTCCGCGTACAGCCGCG
CGCCAGATCCAAAAAAGAAGAGAAAGGTAGATCCAAAAAAGAAGAAAGGTAGATCCAAA
AAAGAAGAGAAAGGTAATGGATGCTAAGTCACTAACTGCCTGGTCCCGGACACTGGTGACC
TTCAAGGATGTATTTGTGGACTTCACCAGGGAGGAGTGGAAGCTGCTGGACACTGCTCAGC
AGATCGTGTACAGAAATGTGATGCTGGAGAACTATAAGAACCTGGTTTCCTTGGGTTATCA
GCTTACTAAGCCAGATGTGATCCTCCGGTTGGAGAAGGGAGAAGAGCCCTGGCTGGTGGAG
AGAGAAATTCACCAAGAGACCCATCCTGATTCAGAGACTGCATTTGAAATCAAATCATCAG
TTTCCAGCAGGAGCATTTTTAAAGATAAGCAATCCTGTGACATTAAAATGGAAGGAATGGC
AAGGAATGATCTCTGGTAA (SEQ ID NO:27).
Für die Konstruktion von PIT4 wurde das Pip Protein aus Streptomyces coelicolor aus pGemT::Epip4 verstärkt, und zwar mit den Oligonukleotiden
OMF63: GTACGAATTCCCACCATGAGTCGAGGAGAGGTG (SEQ ID NO:1) und
OMF103: GATCAAGCTTTCAGGCCTGTTCGACCATC (SEQ ID NO:28),
gefolgt von Klonieren in den Vektor pcDNA3.1N5/His-TOPO (Invitrogen) unter Kontrolle von P_CMV. Das entstehende Plasmid pMF225 enthält die folgenden PIT4 Sequenzen, welche den Sequenzen des pip Gens von Streptomyces coelicolor entsprechen:
ATGAGTCGAGGAGAGGTGCGCATGGCGAAGGCAGGGCGGGAGGGGCCGCGGGACAGCGTGT
GGCTGTCGGGGGAGGGGCGGCGCGGCGGTCGCCGTGGGGGGCAGCCGTCCGGGCTCGACCG
GGACCGGATCACCGGGGTCACCGTCCGGCTGCTGGACACGGAGGGCCTGACGGGGTTCTCG
ATGCGCCGCCTGGCCGCCGAGCTGAACGTCACCGCGATGTCCGTGTACTGGTACGTCGACA
CCAAGGACCAGTTGCTCGAGCTCGCCCTGGACGCCGTCTTCGGCGAGCTGCGCCACCCGGA
CCCGGACGCCGGGCTCGACTGGCGCGAGGAACTGCGGGCCCTGGCCCGGGAGAACCGGGCG
CTGCTGGTGCGCCACCCCTGGTCGTCCCGGCTGGTCGGCACCTRCCTCAACATCGGCCCGC
ACTCGCTGGCCTTCTCCCGCGCGGTGCAGRACGTCGTGCGCCGCAGCGGGCTGCCCGCGCA
CCGCCTGACCGGCGCCATCTCGGCCGTCTTCCAGTTCGTCTACGGCTACGGCACCATCGAG
GGCCGCTTCCTCGCCCGGGTGGCGGRCACCGGGCTGAGTCCGGAGGAGTACTTCCAGGACT
CGATGACCGCGGTGACCGAGGTGCCGGACACCGCGGGCGTCATCGAGGACGCGCAGGACAT
CATGGCGGCCCGGGGCGGCGACACCGTGGCGGAGATGCTGGACCGGGACTTCGAGTTCGCC
CTCGACCTGCTCGTCGCGGGCATCGACGCGATGGTCGAACAGGCCTGA(SEQID NO:29).
pMF 150 ist beinahe mit pMF225 identisch, aber das TGA Stopp-Kodon von Pip auf pMF150 ist mutiert, um eine Verknüpfung mit verschiedenen trans-aktivierenden und trans-unterdrückenden Domänen zu erlauben. Wegen der Mutation dieses Stopp-Kodons wird dieses in pMF150 enthaltene pip Gen einige Basenpaare später beim nächsten Stopp-Kodon, das in der Vektorsequenz vorkommt, abgeschlossen. Hingegen wirken beide Pip Proteine im PipON Regulierungs-Konzept gleich.
ERGEBNISSE
Regulierungs-Eigenschaften des PipON Systems
CHO-K1 Zellen wurden mit pMF208 (P_PIRON-SEAP) und entweder dem einen Transrepressor enthaltenden Plasmid pMF207 (PIT3; Pip-KRAB) oder mit pMF225 (PIT4; Pip) kotransfiziert. Zellen wurden in Abwesenheit oder Gegenwart von PI wachsen gelassen. In Abwesenheit von PI war die Expression von P_PIRON völlig unterdrückt, und in Gegenwart von PI konnte Induktion beobachtet werden. Tabelle 9 zeigt die Regulierungseigenschaften der beiden induzierbaren Regulierungs-Konzepte.
Tabelle 9:
Während beide PipON Systeme in der Gegenwart von PI induziert werden, unterscheiden sich ihre maximale Expressionsmengen als auch die Grund-Expressionsmenge wesentlich. Während die PIT4-P_PIRON Konfiguration (pMF225-pMF208) einen zum starken konstitutiven SV40 Promotor vergleichbare Expressionsmenge erreicht und einen Induktionsfaktor von 25 zeigt, was mehr als doppelt so viel ist wie der Induktionsfaktor des klassischen PIT/P_PIR Systems, ergibt die PIT3-P_PIRON Konfiguration die deutlichste Unterdrückung und einen Induktionsfaktor von etwa 150, mehr als 15 Mal mehr im Vergleich zum PIT/P_PIR System. Hingegen ist die maximale Expressionsmenge der PIT-P_PIRON Konfiguration etwa 3-fach niedriger im Vergleich zur maximalen Expressionsmenge der PIT/P_PIR Konfiguration. Der Unterschied in ihren Regulierungseigenschaften ermöglicht die Verwendung der beiden PipON Systeme für einen weiten Bereich verschiedener Anwendungen. In Anordnungen, die eine grosse Expressionsmenge erfordern, ist die Verwendung der PIT4/P_PIRON Konfiguration vorteilhaft, während in Umständen, welche deutlichste Unterdrückung der Grund-Expression eines Transgens erfordern, das PIT3/P_PIRON Konzept das bevorzugte System ist.
Der modulare Aufbau von P_PIRON bestehend aus einem unabhängigen Operator (PIR3) und einem voll funktionsfähigen Promotor-Element ermöglicht den einfachen Austausch von PSV40 in P_PIRON durch irgend einen Typ Promotor, was beispielsweise gewebespezifisch regulierte Expression oder Anpassung dieses induzierbaren Regulierungs-Konzepts an andere Organismen wie Hefe oder Pflanze erlaubt.
Induktionsmöglichkeiten verschiedener Streptogramin Antibiotika im Pip/P_PIRON Regulierungssystem
Um die Regulierungsmöglichkeiten verschiedener Streptogramin Antibiotika zu bestimmen, wurden pMF225 oder pMF 150, die für PIT4 kodieren, mit pMF208 (P_PIRON-SEAP) in CHO-K1 Zellen kotransfiziert und die SEAP Induktion 48 h nach Transfektion gemessen (wie oben in Beispiel 1 beschrieben), und zwar nach Zugabe der folgenden Streptogramin Antibiotika: (i) PI, die Gruppe B Streptogramin Komponente von Pristinamycin; (ii) Pyostacin, das Antibiotika für orale Verwendung beim Menschen; (iii) Synercid, der erste injizierbare halbsynthetische Pristinamycin Abkömmling, der gegen die meisten der gegen viele Medikamente resistenten und im Menschen pathogenen Bakterien wirksam ist und (iv) Virginiamycin, das als Wachstumsförderer in Viehfutter verwendet wird. 2 μg/ml Gruppe B Komponente wurde für die Regulierungs-Studien verwendet (für gemischte Streptogramine wurde die Konzentration der Gruppe B Komponente mit dem festgelegten 70%:30% Verhältnis der Gruppe A zu Gruppe B Komponenten bestimmt).
Tabelle 10 zeigt die Induktionsmöglichkeiten der verschiedenen Streptogramine. Pyostacin ist gleichermassen wirkungsvoll bei der Induktion von Pip/P_PIRON wie die reine PI Komponente, Virginiamycin zeigt eine leicht niedrigere Regulierungsleistung und Synercid hat beinahe keine Induktionsfähigkeit auf das Pip/P_PIRON System. Deshalb ist wahrscheinlich die Verwendung von Synercid in antibiotischer Chemotherapie mit der Verwendung des Pip/P_PIRON Systems in Gentherapie und Gewebeveränderungs-Anwendungen verträglich.
Tabelle 10:
Beispiel 5: Konstruktion von Expressions-Vektoren für Vielfachverwendung
Um das auf Pristinamycin reagierende Genregulierungssystem in einer Vielzahl von Anwendungen zu gebrauchen, wurde eine Reihe von 6 Säugetier-Expressionsvektoren konstruiert, die mit der Verwendung aller von Pristinamycin abhängigen Transaktivatoren (PIT, PIT2) und Transrepressoren (PIT3, PIT4) verträglich sind. Die erste Reihe von Vektoren, pMF189 und pMF229, besteht aus Einfach-Genabschnitts-Expressionseinheiten enthaltend die P_PIR (pMF189) und P_PIRON (pMF229) Promotoren gefolgt von einer Mehrfach-Klonierungsstelle mit bis zu 22 eindeutigen Restriktionsschnittstellen, von denen 6 seltene Schnittstellen sind, die durch Enzyme geschnitten werden, die 8 Basenpaare erkennen (8).
Die zweite Reihe von Vektoren ist in 9 gezeigt und enthält die gleichen Promotoren P_PIR and P_PIRON, integriert in die pTRIDENT Familie von Vektoren mit Dreifach-Genabschnitts-Expressionseinheiten (Fussenegger et al. 1998, Biotechnol. Bioeng. 57, 1–10). pTRIDENT Vektoren enthalten eine einzelne Dreifach-Genabschnitts-Expressionseinheit, die entweder von P_PIR (pTRIDENT9 und pTRIDENT10) oder von P_PIRON (pTRIDENT11 und pTRIDENT12) angetrieben wird. Während der erste Genabschnitt auf der Dreifach-Genabschnitts-Expressionseinheit in der klassischen, von cap abhängigen Art translatiert wird, stützen sich die folgenden Gene auf cap-unabhängige Translationsauslösung basierend auf der internen ribosomalen Eintrittsstelle des Encephalomyocarditis Virus oder von polioviralem Ursprung (IRES). Während pTRIDENT9 (P_PIR) und pTRIDENT11 (P_PIRON) zwei IRES Elemente enthalten, enthalten pTRIDENT10 (P_PIR) und pTRIDENT 12 (P_PIRON) sowohl ein IRES als auch ein CITE Element. Beide IRES Elemente gehören zu den stärksten zur Zeit erhältlichen und zeigen hohe Translationsauslösung in einer breiten Vielzahl von Säugetier-Zellen und -Geweben (Borman et al., 1997; Fussenegger et al., 1998, Biotechnol. Bioeng. 57, 1–10, Fussenegger et al., 1998, Nat. Biotechnol. 16, 468–472). Beide IRES Elemente enthalten beidseitig grosse Mehrfachverknüpfungsstellen, welche zweckdienliche Verschiebung von Genen in pTRIDENT Abkömmlinge erlauben. pTRIDENT Vektoren haben sich als nützliche Werkzeuge für eine Vielzahl von Anwendungen herausgestellt. (Fussenegger et al., 1998, Biotechnol. Bioeng. 57, 1–10; Fussenegger et al., 1998, Nat. Biotechnol. 16, 468–472)
Konstruktion von Expressions-Vektoren für Vielfachverwendung
Der P_PIR Expressions-Vektor pMF189 wurde in einem Dreischritt-Klonierungsverfahren konstruiert: (i) das gelblich fluoreszierende Protein YFP wurde aus pEYFP-C1 (Clontech) verstärkt, und zwar mit den Oligonukleotiden
OMF90: GTACGAATTCGATATCATGCATGGCGCCGTTTAAACGCGTATTTAAATGATCCG
CTAGCGCTACCG (SEQ ID NO:30) und OMF91: GATCAAGCTTGCGGCCGCGGATCCGCC
CGGGCCACACAAAAAACCAACACACAGATGTAATGAAAATAAAGATATTTTATTATCGATA
CTAGTGCGATCGCTTAATTAATTTAAATTTACTTGTACAGCTCGTCC (SEQ ID NO:31)
und mit pcDNA3.1N5/His-TOPO verbunden. Dies ergibt pSAM222. (ii) YFP wurde mit EcoRI/NotI aus pSAM222 geschnitten, an (mit EcoRI/NotI geschnittenes) pMF164 gebunden und ersetzt dabei GFP in pMF 164 (P_PIR-GFP). Dies ergibt pSAM226 (P_PIR-YFP). (iii) YFP wurde mit SwaI aus pSAM226 entfernt und der verbleibende Vektor wieder verbunden, was Plasmid pMF 189 ergibt.
pMF229 wurde in einem Dreischritt-Klonierungsverfahren konstruiert. (i) Das PIR3 Element wurde mit XhoI/EcoRI aus pMF208 geschnitten und an pTBC1 (XhoI/EcoRI) gebunden, wobei es den auf Tetrazyklin reagierenden Promotor P_hCMV*-1 von pTBC1 ersetzt und pMF210 ergibt. (ii) pMF210 wurde mit SspI/StuI geschnitten und der mit SspI/StuI aus pSBC1 geschnittene virale SV40 Promotor vor das PIR3 Element kloniert, um P_PIRON wiederherzustellen. Dies ergibt Plasmid pMF222. (iii) Der P_PIRON Promotor wurde danach mit SspI/EcoRI aus pMF222 geschnitten und an mit SspI/EcoRI geschnittenes pMF 189 gebunden, wobei P_PIR von pMF 189 durch P_PIRON ersetzt wird. Dies ergibt pMF229.
Für die Konstruktion des Dreifach-Genabschnitt-Expressions-Vektors pTRIDENT wurde der P_PIR Promotor mit SspI/EcoRI aus pMF 164 und der P_PIRON Promotor mit SspI/EcoRI aus MF222 geschnitten.
Die P_PIR Promotor-Elemente wurden danach kloniert:

1. in SspI/EcoRI Schnittstellen von pTRIDENT1, um P_hCMV*-1 zu ersetzen; dies ergibt pTRIDENT9 (P_PIR-MCSI-IRESI-MCSII-IRESII-MCSIII-pA).
2. in SspI/EcoRI Schnittstellen von pTRIDENT3 P_hCMV*-1; dies ergibt pTRIDENT 10 (P_PIR-MCSI-IRES-MCSII-CITE-MCSIII-pA).

Die P_PIRON Promotor-Elemente wurden danach kloniert:

1. in SspI/EcoRI Schnittstellen von pTRIDENT1, um P_hCMV*-1 zu ersetzen; dies ergibt pTRIDENT11 (P_PIRON-MCSI-IRESI-MCSII-IRESII-MCSIII-pA).
2. in SspI/EcoRI Schnittstellen von pTRIDENT3, um P_hCMV*-1 zu ersetzen; dies ergibt pTRIDENT12 (P_PIRON-MCSI-IRES-MCSII-CITE-MCSIII-pA).

Konstruktion des Positiv-Rückkopplung-Regulierungssystems unter Verwendung des auf Streptogramin reagierenden Regulierungs-Konzepts.
Im Gegensatz zum klassischen PIT/P_PIR System, in welchem PIT und P_PIR auf verschiedenen Plasmiden vorhanden sind, platziert das Positiv-Rückkopplung-Regulierungs-Konzept beide Elemente in eine einzelne, meist mehrfache, Expressionseinheit. Im besonderen wird der Transaktivator PIT unter Kontrolle seines Ziel-Promotors P_PIR gesetzt.
In dieser Anordnung führen anfängliche Transkriptionen, die aus der Durchlässigkeit des P_PIR Promotors stammen, zu wenigen PIT Molekülen, die in Gegenwart von Streptograminen inaktiviert werden. Hingegen binden bei Abwesenheit dieser Antibiotika-Klasse anfänglich gebildete PIT Moleküle an P_PIR und induzieren dieses. Weil in jeder Transkriptions-Runde PIT gebildet wird, ein Prinzip, das positive Rückkopplung genannt wird, sammelt sich PIT in der Zelle an und ermöglicht eine grosse Menge Expression des interessierenden Transgens, doch bleibt das System voll regulierbar. Vorteile des Positiv-Rückkopplung-Regulierungssystems gegenüber klassisch binär regulierten Expressions-Systemen sind:

1. Bessere Unterdrückung der Genexpression, weil PIT nicht konstitutiv exprimiert wird, sondern nur von gelegentlich durchlässigen Transkriptionen herkommt. Deshalb ist in der unterdrückenden Anordnung (in Gegenwart von Pristinamycin) in der Zelle wenig PIT vorhanden, das Transkription von P_PIR auslöst, im Gegensatz zur Anordnung, in welcher PIT konstitutiv aus einem getrennten Vektor exprimiert wird.
2. Das Positiv-Rückkopplungssystem produziert in jeder Runde Transkription ein PIT Molekül, was zu höheren intrazellulären PIT Mengen führt und deshalb auch zu mehr Expression des interessierenden Transgens.
3. Das Positiv-Rückkopplung-Regulierungs-Konzept begründet regulierte Gen-Expression in einem einzelnen Schritt. Das klassisch binäre PIT/P_PIR Expressionssystem erfordert zuerst die Einrichtung von PIT und dann die Einrichtung des auf P_PIR reagierenden Gens. Zwei sich folgende Runden von Transfektion und Selektion sind nicht nur mühsam und zeitaufwändig, sondern auch unerwünscht für zukünftige fortgeschrittene Therapien wie Gewebeveränderung und Gentherapie, weil das Genom bedeutend mehr verändert wird als in einem Ein-Schritt Genveränderungsverfahren

Diese Positiv-Rückkopplung-Regulierungs-Vektoren, die konstruiert wurden, enthalten beide das grüne fluoreszierende Protein GFP und PIT in einer von P_PIR angetriebenen Anordnung mit Zweifach-Genabschnitt-Expressionseinheit. Wenn pMF170 (PPIR-GFP-IRES-PIT-pA) in CHO-K1, BHK-21 oder HeLa Zellen transfiziert wurde, konnte mit Fluoresenz-Mikroskopie in Abwesenheit von PI helle grüne Fluoreszenz beobachtet werden, wohingegen in Gegenwart von PI die Expression von GFP vollständig unterdrückt war.
Ebenfalls wurde pTRIDENT-PIT (pMF 175) konstruiert, welches den von Pristinamycin abhängigen Transaktivator in der ersten Genabschnitts-Expressionseinheit von pTRIDENT9 enthält. Genabschnitts-Expressionseinheiten 2 und 3 von pTRIDENT-PIT könnten zwei verschiedene interessierende Gene unterbringen. Deshalb ermöglichen pTRIDENT-PIT Abkömmlinge Einrichtung von auf Streptogramin reagierender Expression von bis zu zwei unabhängigen Genen in einem Schritt.
Konstruktion der Positiv-Rückkopplung-Regulierungs-Vektoren
Für die Konstruktion des selbstregulierenden Systems wurde PIT mit EcoRI/HindIII aus pMF156 ausgeschnitten und in die Mehrfach-Bindungsstellen des eukaryotischen Expressions-Vektors pSBC-2 (EcoRI/HindIII) kloniert. Als Abkömmling von pSBC-2 ist das gebildete Plasmid pMF169 mit dem pSBC-1 Abkömmling pMF164 (P_PIR-GFP) kompatibel und erlaubt Verschmelzung der beiden Expressionseinheiten über ihre SspI/NotI Schnittstellen, wobei pMF 170 gebildet wird. pMF 170 enthält eine Zweifach-Genabschnitt-, von P_PIR regulierte Expressionseinheit, die für GFP im ersten und für PIT im zweiten Genabschnitt kodiert. Von Cap unabhängige Translations-Auslösung des zweiten Genabschnitts wird durch eine picornavirale interne ribosomale Eintrittsstelle (IRES) gegen Anfang von PIT kodiert.
Für die Konstruktion von pTRIDENT-PIT wurde PIT mit EcoRI/HindIII aus pMF156 geschnitten und in mit EcoRI/HindIII geschnittenes pTRIDENT 1 kloniert. Dies ergibt Plasmid pMF 168. pMF 168 wurde dann mit SspI/EcoRI geschnitten und P_hCMV*-1 durch mit SspI/EcoRI aus pMF164 (P_PIR-GFP) geschnittenem P_PIR ersetzt. Dies ergibt pMF175, das als pTRIDENT-PIT bezeichnet wird.
Beispiel 6: Entdeckung neuer antibiotischer Aktivitäten unter Verwendung der Technik mit auf Streptogramin reagierender Expression
Streptogramine sind einmalige Antibiotika. Wegen ihrer zusammengesetzten Natur (Gruppe A und Gruppe B Streptogramine) ist es weniger wahrscheinlich, dass sie Resistenz-Mechanismen hervorrufen, und zeigen höhere bakterizide Aktivität wegen eines synergistischen Effekts der beiden Komponenten. Beispielsweise ist Synercid^® ein besonders nützliches Streptogramin, ein halbsynthetischer, injizierbarer Abkömmling von Pristinamycin, der gegen eine Vielzahl von gegen viele Medikamente resistente für Menschen pathogene Bakterien aktiv ist, einschliesslich gegen Spezies, die gegen Vancomycin resistent sind. Infektionen dieser gegen Vancomycin resistenten Spezies verursachen zunehmende Besorgnis um die Gesundheit, sowohl in den USA als auch in Europa.
Eine empfindliche Technik des Nachweises von Streptograminen wird zwei wichtige Einflüsse auf die heutigen umweltbedingten und medizinischen Bedenken haben:
(i) Nachweis von Spuren verbotener Streptogramine wie Virginiamycin in der menschlichen Nahrungskette für Kontrollzwecke und (ii) Nachweis von neuen Streptogramin-Antibiotika in Kulturüberständen von Actinomyceten und Pilzen.
ERGEBNISSE
Die Technik des Nachweises von Streptograminen beruht auf dem durch Pristinamycin auslösbaren System PipON (obwohl auch die durch Pristinamycin unterdrückbare Version verwendet werden kann), welches für Säugetierzellen (CHO-K1) eingerichtet wurde, entweder durch stabile Expression oder durch Kotransfektion von pMF150 oder pMF225 (Pip Expressions-Vektor) und pMF208 (P_PIRON-SEAP). Die Nachweismethode beruht auf der Tatsache, dass die Gegenwart von Streptograminen im Prüfmuster den P_PIRON Promotor induzieren und zu einer mengenmässigen Veränderung der SEAP Messwerte führen wird.
Unter Verwendung von 100 Mikroliter Kulturüberstand von Streptomyces pristinaespiralis (einem wichtigen Produzenten von Pristinamycin) als Standard verglichen wir das Nachweispotential des auf Pristinamycin reagierenden Systems mit dem klassischen Antibioika-Nachweis unter Verwendung einer Sammlung von auf Streptogramin empfindlichen, für Menschen pathogene Bakterien einschliesslich Staphylococcus aureus, Streptococcus pneumoniae, Streptococcus pyogenes, Listeria monocytogenes, Corynebacterium diphtheriae, Haemophilus influenzae und Neisseria gonorrhoeae, sowie des nicht-pathogenen Bacillus subtilis, das routinemässig für das Screening nach neuen Antibiotika, die gegen Gram-positive Bakterien wirksam sind, verwendet wird. Die Gegenwart von Pristinamycin konnte mit dem PipON System zuverlässig in Überständen von S. pristinaespiralis nachgewiesen werden, was etwa 20% des SEAP Messwertes ergab, der normalerweise mit 2 μg/ml reinem Pristinamycin I erreicht wird. Wurde hingegen die gleiche Menge Überstand in einem Antibiotika-Nachweis gegen Bakterien verwendet, konnte antibiotische Aktivität nur im hochempfindlichen Stamm C. diphtheriae (19 mm Hemmhof-Durchmesser) gefunden werden. Alle anderen geprüften Pathogene einschliesslich des Standard-Referenzstammes B. subtilis konnten Pristinamycin in Überständen von S. pristinaespiralis nicht nachweisen, obwohl berichtet worden ist, dass die Synergie der Streptogramine die bakterizide Aktivität um einen Faktor 100 erhöht (Cocito et al., 1997, J. Antimicrob. Chemother. 39:7–13).
In den Bemühungen, neue Streptogramin-Abkömmlinge nachzuweisen, prüften wir die Kulturüberstände von 14 neuen Streptomyces Isolaten auf antibiotische Aktivität. Bei der Messung der antibiotischen Wirkung von Überständen auf S. aureus, S. pyogenes, L. monocytogenes, C. diphteriae und N. gonorrhoeae mit 10 ml Kulturüberstand zeigten nur zwei Überstände ein antibiotisches Profil, wie es für Streptogramine typisch ist. Einer dieser Überstände ergab auch einen 3-fach erhöhten SEAP Messwert des PipON Systems unter Verwendung von 100 Mikroliter Überstand, was zeigt, dass das auf Pip abgestützte Nachweissystem für Streptogramin die klassische Antibiotika-Bestimmung um mindestens einen Faktor 100 übertrifft. Der zweite in der Antibiotika-Bestimmung positive Überstand erniedrigte die Zell-Lebensfähigkeit, wenn er auf die PipON Anordnung angewandt wurde, was anzeigt, dass das potentielle Antibiotikum gegenüber menschlichen Zellen zytotoxisch ist. Der Zusammenhang zwischen antibiotischer Aktivität und Induktion von SEAP lässt vermuten, dass eine neue Streptomyces Art isoliert wurde, die Streptogramin-ähnliche antibiotische Aktivität erzeugt.
Die Technik des Screenens mit der Strategie der auf Pristinamycin reagierenden Expression hat gegenüber der klassischen Antibiotika-Bestimmung die folgenden Vorteile:
(i) Screening auf Antibiotika ist nicht durch die Empfindlichkeit von als Indikatoren verwendeten Bakterien auf noch nicht charakterisierte Streptogramine beschränkt (Empfindlichkeit von Bakterien auf Antibiotika variiert breit zwischen Stämmen und sogar Isolaten) und (ii) das auf Säugetierzellen abgestützte Konzept des Nachweises von Streptograminen zeigt zumindest zwei Grössenordnungen höhere Empfindlichkeit auf diese Antibiotika-Klasse als antibiotische Prüfeinrichtungen, die sich auf die bakterizide Aktivität stützen, (iii) das Screening in Säugetiersystemen stellt sicher, dass nur bioverfügbare und nicht zytotoxische Antibiotika nachgewiesen werden.

Claims

Eine isolierte Nukleinsäure, die für ein Polypeptid kodiert, welches an eine auf ein Antibiotikum reagierende Operon-Sequenz eines Actinomycetes Bakterium in Abwesenheit des entsprechenden Antibiotikums bindet, wobei die Nukleinsäure unter hochstringenten Bedingungen mit einer Sequenz hybridisiert, welche für das durch SEQ ID NO:29 oder dessen Komplement kodierte Polypeptid kodiert.
Die isolierte Nukleinsäure gemäss Anspruch 1, worin die Nukleinsäure unter hochstringenten Bedingungen mit der Sequenz SEQ ID NO:29 oder dessen Komplement hybridisiert.
Die isolierte Nukleinsäure gemäss Anspruch 1, worin das Polypeptid, das an die auf ein Antibiotikum reagierende Operon-Sequenz bindet, von Actinomycetes abgeleitet ist.
Die isolierte Nukleinsäure gemäss Anspruch 1, worin das Actinomycet ein Streptomycet ist.
Eine isolierte Nukleinsäure enthaltend eine Nukleinsäure, die für ein Polypeptid kodiert, das mindestens 80% Sequenzhomologie zu einem von SEQ ID NO:29 kodierten Polypeptdid zeigt.
Die isolierte Nukleinsäure gemäss Anspruch 5 enthaltend eine Nukleinsäure, die für ein Polypeptid kodiert, das mindestens 90% Sequenzhomologie zu einem von SEQ ID NO:29 kodierten Polypeptdid zeigt.
Die isolierte Nukleinsäure gemäss Anspruch 5 enthaltend eine Nukleinsäure, die für ein von SEQ ID NO:29 kodiertes Polypeptdid kodiert.
Ein gereinigtes oder isoliertes Protein, das durch eine Nukleinsäure gemäss einem der Ansprüche 1 bis 7 kodiert wird.
Eine Wirtszelle enthaltend die Nukleinsäure gemäss einem der Ansprüche 1 bis 7.
Die Wirtszelle gemäss Anspruch 9, die weiter eine zu transkribierende Nukleotidsequenz enthält, die operativ an einen eukaryotischen Promotor und an eine auf ein Antibiotikum reagierende Operon-Sequenz eines Actinomycetes Bakterium gebunden ist.
Eine isolierte Nukleinsäure, die für ein Polypeptid kodiert, welches an eine auf ein Antibiotikum reagierende Operon-Sequenz eines Actinomycetes Bakterium in Abwesenheit des entsprechenden Antibiotikums bindet, und operativ an ein zweites Polypeptid gebunden ist, das Transkription in eukaryotischen Zellen aktiviert oder unterdrückt, wobei die Nukleinsäure unter hochstringenten Bedingungen mit einer Sequenz hybridisiert, welche für das durch SEQ ID NO:29 oder dessen Komplement kodierte Polypeptid kodiert.
Die isolierte Nukleinsäure gemäss Anspruch 11, worin das Polypeptid, das die Transkription aktiviert, aus der Gruppe bestehend aus einer VP 16 aktivierenden Domäne, einer GAL4 aktivierenden Domäne, einer CTF/NF1 aktivierenden Domäne, einer AP2 aktivierenden Domäne, einer ITF1 aktivierenden Domäne, einer ITF2 aktivierenden Domäne, einer Oct1 aktivierenden Domäne, einer Spl aktivierenden Domäne und der p65 Domäne von NF-kB ausgewählt ist.
Die isolierte Nukleinsäure gemäss Anspruch 11, worin das Polypeptid, das die Transkription unterdrückt, aus der Gruppe bestehend aus eine v-erbA Onkogen-Produkt unterdrückenden Domäne, einer Thyroid-Hormon-Rezeptor unterdrückenden Domäne, einer Retinoid-Säure-Rezeptor unterdrückenden Domäne, einer Drosophila Krueppel (Kr) Protein unterdrückenden Domäne, einer KRAB Domäne der koxl Gen-Familie, einer Even-skipped unterdrückenden Domäne, eines S. cerevisiae Ssn6/Tup1 Protein-Komplexes, eines SIRI Hefe-Proteins, NeP1, eines Drosophila Dorsal-Proteins, TSF3, SF1, eines Drosophila Hunchback-Proteins, eines Drosophila Knirps-Proteins, eines WT1 Proteins, einer Oct-2.1 unterdrückenden Domäne, eines Drosophila Engrailed Proteins, E4BP4, ZFS, einer 65 Aminosäure unterdrückenden Domäne von E4BP4 und einer N-endständigen Zink-Finger-Domäne von ZFS ausgewählt ist.
Die isolierte Nukleinsäure gemäss Anspruch 11, worin das Polypeptid, das an die auf ein Antibiotikum reagierende Operon-Sequenz bindet, von Actinomycetes abgeleitet ist.
Die isolierte Nukleinsäure gemäss Anspruch 14, worin das Actinomycet ein Streptomycet ist.
Ein gereinigtes oder isoliertes Protein, das durch die Nukleinsäure gemäss einem der Ansprüche 11 bis 15 kodiert wird.
Eine Wirtszelle enthaltend die Nukleinsäure gemäss einem der Ansprüche 11 bis 15.
Die Wirtszelle gemäss Anspruch 17, die weiter eine zu transkribierende Nukleotidsequenz enthält, die operativ an eine auf ein Antibiotikum reagierende Operon-Sequenz eines Actinomycetes Bakterium gebunden ist.
Die Wirtszelle gemäss Anspruch 18, worin die zu transkiribierende Nukleotid-Sequenz zur Wirtszelle endogen ist.
Die Wirtszelle gemäss Anspruch 18, worin die zu transkiribierende Nukleotid-Sequenz zur Wirtszelle exogen ist.
Die Wirtszelle gemäss Anspruch 18, worin die zu transkiribierende Nukleotid-Sequenz ein Reporter-Gen ist.
Die Wirtszelle gemäss Anspruch 21, worin das Reporter-Gen SEAP oder GFP ist.
Eine isolierte Nukleinsäure enthaltend eine auf ein Antibiotikum reagierende Operon-Sequenz eines Actinomycetes Bakterium, die operativ an einen ersten eukaryotischen Promotor gebunden ist, wobei die Nukleinsäure unter hochstringenten Bedingungen mit einer Sequenz hybridisiert, welche für das durch SEQ ID NO:29 oder dessen Komplement kodierte Polypeptid kodiert.
Die isolierte Nukleinsäure gemäss Anspruch 23, worin der erste eukaryotische Promotor operativ an eine erste kodierende Sequenz gebunden ist.
Die isolierte Nukleinsäure gemäss Anspruch 23, die weiter einen zweiten eukaryotischen Promotor enthält.
Die isolierte Nukleinsäure gemäss Anspruch 25, worin mindestens eine tet Operator-Sequenz operativ an den zweiten eukaryotischen Promotor gebunden ist.
Die isolierte Nukleinsäure gemäss Anspruch 25, worin der zweite eukaryotische Promotor operativ an eine zweite kodierende Sequenz gebunden ist.
Die isolierte Nukleinsäure gemäss Anspruch 24 oder 27, worin mindestens die erste oder die zweite kodierende Sequenz eine interne ribosomale Eintritts-Stelle (IRES) enthält.
Die isolierte Nukleinsäure gemäss Anspruch 28, worin mindestens die erste oder die zweite kodierende Sequenz für ein Protein kodiert, das an eine auf ein Antibiotikum reagierende Operon-Sequenz eines Actinomycetes Bakterium bindet.
Die isolierte Nukleinsäure gemäss Anspruch 27, worin entweder die erste kodierende Sequenz oder die zweite kodierende Sequenz für mindestens ein Tumor unterdrückendes Genprodukt kodiert.
Die isolierte Nukleinsäure gemäss einem der Ansprüche 25–27 und 30, worin entweder die erste kodierende Sequenz oder die zweite kodierende Sequenz für mindestens ein Gen-Produkt kodiert, das die Zell-Proliferation aktiviert.
Die isolierte Nukleinsäure gemäss Anspruch 30, die weiter eine Sequenz enthält, die für einen Überlebensfaktor kodiert.
Eine genetisch veränderte Wirtszelle, die eine Nukleinsäure gemäss einem der Ansprüche 23 bis 32 enthält.
Ein Verfahren zur Regulierung der Expression eines Gens, das an eine auf ein Antibiotikum reagierende Operon-Sequenz eines Actinomycetes Bakterium in einer eukaryotischen Zelle gebunden ist, welches die Einführung einer Nukleinsäure gemäss einem der Ansprüche 1 bis 7, 11 bis 15 und 23 bis 32 in die Zelle umfasst, wobei das Gen, das an die auf ein Antibiotikum reagierende Operon-Sequenz gebunden ist, für eine Regelung durch das Antibiotikum tauglich wird.
Das Verfahren gemäss Anspruch 34, worin das Protein, das an eine auf ein Antibiotikum reagierende Operon-Sequenz eines Actinomycetes Bakterium bindet, weiter ein operativ gebundenes zweites Polypeptid enthält, das Transkription in eukaryotischen Zellen aktiviert oder unterdrückt.
Das Verfahren gemäss Anspruch 34, das weiter die Modulierung der Menge des Antibiotikums in der Zelle umfasst.
Das Verfahren gemäss Anspruch 34, worin das Protein, das an eine auf ein Antibiotikum reagierende Operon-Sequenz eines Actinomycetes Bakterium bindet, von Amycolatopsis mediterranei, Streptomyces peucetius, Streptomyces cyanogenus, Streptomyces hygroscopicus, Streptomyces glaucescens, Streptomyces pristinaespiralis oder Streptomyces coelicolor abgeleitet ist.
Das Verfahren gemäss Anspruch 35, worin das Polypeptid, das die Transkription aktiviert, aus der Gruppe bestehend aus einer VP16 aktivierenden Domäne, einer GAL4 aktivierenden Domäne, einer CTF/NF1 aktivierenden Domäne, einer AP2 aktivierenden Domäne, einer ITF1 aktivierenden Domäne, einer ITF2 aktivierenden Domäne, einer Oct1 aktivierenden Domäne, einer Spl aktivierenden Domäne und der p65 Domäne von NF-kB ausgewählt ist.
Das Verfahren gemäss Anspruch 35, worin das Polypeptid, das die Transkription unterdrückt, aus der Gruppe bestehend aus eine v-erbA Onkogen-Produkt unterdrückenden Domäne, einer Thyroid-Hormon-Rezeptor unterdrückenden Domäne, einer Retinoid-Säure-Rezeptor unterdrückenden Domäne, einer Drosophila Krueppel (Kr) Protein unterdrückenden Domäne, einer KRAB Domäne der koxl Gen-Familie, einer Even-skipped unterdrückenden Domäne, eines S. cerevisiae Ssn6/Tup1 Protein-Komplexes, eines SIRI Hefe-Proteins, NeP1, eines Drosophila Dorsal-Proteins, TSF3, SF1, eines Drosophila Hunchback-Proteins, eines Drosophila Knirps-Proteins, eines WT1 Proteins, einer Oct-2.1 unterdrückenden Domäne, eines Drosophila Engrailed Proteins, E4BP4, ZFS, einer 65 Aminosäure unterdrückenden Domäne von E4BP4 und einer N-endständigen Zink-Finger-Domäne von ZFS ausgewählt ist.
Ein Verfahren zur Herstellung eines Proteins umfassend die Kultivierung einer eukaryotischen Zelle enthaltend: ein für das Protein kodierendes Gen, das an eine auf ein Antibiotikum reagierende Operon-Sequenz eines Actinomycetes Bakterium bindet, und eine Nukleinsäure gemäss einem der Ansprüche 1 bis 7, 11 bis 15 und 23 bis 32, und die Regulierung der Expression des Gens, das an eine auf ein Antibiotikum reagierende Operon-Sequenz bindet, durch Modulierung der Menge des Antibiotikums in der Zelle.
Das Verfahren gemäss Anspruch 40, das weiter den Schritt umfasst, das durch die Zelle produzierte Protein einzusammeln.
Das Verfahren gemäss Anspruch 40 oder 41, worin das Protein, das an eine auf ein Antibiotikum reagierende Operon-Sequenz bindet, weiter ein operativ gebundenes Polypeptid enthält, das Transkription in eukaryotischen Zellen aktiviert oder unterdrückt.
Ein Verfahren zum Screenen auf ein geeignetes Antibiotikum, worin das Verfahren die Inkubation einer Wirtszelle in der Gegenwart einer Test-Verbindung umfasst, worin die Wirtszelle ein Polypeptid, welches an eine auf ein Antibiotikum reagierende Operon-Sequenz eines Actinomycetes Bakterium in Abwesenheit des entsprechenden Antibiotikums bindet, und eine operativ an eine Nukleinsäure gemäss einem der Ansprüche 1 bis 7, 11 bis 15 und 23 bis 32 gebundene Nukleotid-Sequenz enthalt, die für ein Reporter-Gen kodiert, wobei eine Änderung in der Transkription des Reporter-Gens angibt, dass die Test-Verbindung ein geeignetes Antibiotikum ist.
Das Verfahren gemäss Anspruch 43, worin die Wirtszelle eine Säugetier-Wirtszelle ist.
Das Verfahren gemäss Anspruch 43, worin die Wirtszelle eine mikrobielle Wirtszelle ist.
Das Verfahren gemäss Anspruch 45, worin die Wirtszelle eine prokaryotische Wirtszelle ist.
Das Verfahren gemäss Anspruch 43, worin das Polypeptid, das an die auf ein Antibiotikum reagierende Operon-Sequenz bindet, von einem Actinomycetes Bakterium abgeleitet ist.
Das Verfahren gemäss Anspruch 47, worin das Actinomycet ein Streptomycet ist.
Das Verfahren gemäss Anspruch 47, worin das Polypeptid, das an die auf ein Antibiotikum reagierende Operon-Sequenz bindet, das durch Pristinamycin induzierte Protein aus Streptomyces coelicolor ist.