DE602004003835T2

DE602004003835T2 - Peptid-inhibitor der proteintranslation und dessen verwendung bei der steuerung der proteintranslation

Info

Publication number: DE602004003835T2
Application number: DE602004003835T
Authority: DE
Inventors: Bertrand Cosson; Luc Paillard; Vincent Legagneux; Howard Osborne
Original assignee: Centre National de la Recherche Scientifique CNRS; Universite de Rennes 1
Current assignee: Centre National de la Recherche Scientifique CNRS; Universite de Rennes 1
Priority date: 2003-07-21
Filing date: 2004-07-20
Publication date: 2007-08-09
Anticipated expiration: 2024-07-21
Also published as: FR2857969B1; US7863413B2; CA2533479C; DE602004003835D1; ATE348841T1; EP1658309A2; WO2005010038A3; EP1658309B1; WO2005010038A2; FR2857969A1; US20070105764A1; CA2533479A1

Description

GEBIET DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung betrifft das Gebiet der Regulation der Synthese von Proteinen durch Kontrolle der post-transkriptionalen Stufen der Translation von Messenger-RNA in Proteine. Die industriellen Hauptanwendungen der Erfindung sind die Kontrolle der Produktion von Proteinen von Interesse im Bioreaktor, die Kontrolle der Produktion von Proteinen von Interesse in cellulärer Therapie (somatische Gentherapie) oder auch die Kontrolle der Produktion viraler Proteine im Rahmen antiviraler Therapien.
STAND DER TECHNIK
Im Stand der Technik gibt es ganz allgemein einen Bedarf für die Bereitstellung von Kontrollsystemen für die Produktion von Target-Proteinen von Interesse insbesondere auf dem Gebiet der Produktion von Proteinen im Bioreaktor sowie bei verschiedenen medizinischen Therapietypen.
In bestimmten Fällen sucht man eine allgemeine Inhibierung der Synthese von Proteinen, die durch bestimmte Zellen produziert werden, die man eliminieren möchte, zum Beispiel Tumorzellen.
In anderen Zellen versucht man die Produktion nur eines oder mehrerer vorbestimmter Target-Proteine zu stimulieren oder im Gegenteil zu inhibieren, wie zum Beispiel Proteine von therapeutischem Interesse, deren Expression man auf gut bestimmte Momente kontrollieren möchte, zum Beispiel in Verfahren zur Herstellung von Proteinen von Interesse durch in Bioreaktoren kultivierte Zellen oder auch durch Zellen, die in einer somatischen zellulären Gentherapie eingesetzt werden.
Im Stand der Technik kennt man Proteine, die fähig sind auf post-transkriptionalem Niveau, auf dem Niveau der Translation der Proteine durch die Zellen, zu wirken. Die post-transkriptionale biologische Aktivität von bestimmten Proteinen kann in einer Modifizierung des Metabolismus der Messenger-RNA, zum Beispiel durch Modifizierung der Stabilität und der Halbwertszeit der Messenger-RNA, durch eine Aktivierung der Translation der Messenger-RNA oder durch eine Modifizierung des Transports oder der Lokalisierung der Messenger-RNA bestehen.
So wurde gezeigt, dass Proteine, die von Hefe stammen, wie Pab1p, Pub1p, She2p, She3p; solche, die von Xenope stammen, wie Xp54 und PAP1; oder Säugerproteine wie hUPF1, hUPF2, hUPF3a, hUPF3b, RNP S1, Y14, DEK, REF2, SRm160, elF-4E, elF-4G, REV, TAP1 und NXF3 fähig waren, nach spezifischer Bindung an Messenger-RNA den Metabolismus der Messenger-RNA, an die die Proteine sich binden, zu modifizieren, zum Beispiel durch Stabilisierung dieser Messenger-RNA, durch Stimulation der Translation der Messenger-RNA, durch Stimulation der Ausschleusung Kern-Cytoplasma der Messenger-RNA oder durch Stimulation der Polyadenylierung der Messenger-RNA (COLLER et al., 2002).
Um die biologische Aktivität der verschiedenen Proteine zu testen, von denen angenommen wird, dass sie auf die verschiedenen post-transkriptionalen Stufen der Expression der Gene, das heißt auf die verschiedenen Aspekte des Metabolismus der Messenger-RNA, die oben angegeben sind, zu wirken, wurde im Stand der Technik vorgeschlagen, das Protein, dessen Funktion untersucht wird, mit einem Bindungsprotein für RNA mit bekannter Spezifität, wie das Protein MS2CP, zu fusionieren. Die Aktivität des Fusionsproteins (getestetes Protein-Bindungsprotein für RNA) wird an einem Reporter-DNA-Konstrukt getestet, das für eine Messenger-RNA codiert, umfassend (i) das Target-Nucleotid-Motiv des Bindungsproteins für RNA und (ii) ein offenes Leseraster, das für ein Reporterprotein wie Luciferase oder Beta-Globin codiert (COLLER et al., 2002, PCT-Anmeldung WO 99/60408).
Es wurde auch vorgeschlagen, ein Fusionspolypeptid zu verwenden, das ein Protein zur Fixierung an RNA fusioniert an ein Protein, das vom Faktor elF4G abgeleitet ist, umfasst, um spezifisch die Translation von Proteinen von Interesse zu aktivieren (PCT-Anmeldung WO 00/53779).
Das Protein EDEN-BP von Xenopus laevis war der erste Faktor, der „trans" wirkt, für den direkt eine essentielle Rolle bei der Spezifität der Desadenylierung der Messenger-RNA bewiesen wurde (PAILLARD et al., 1998). Schließlich wurde gezeigt, dass das Protein CUG-BP, das durch das orthologe humane Gen des Gens, das für EDEN-BP codiert, codiert wird, wahrscheinlich ein Faktor mit Desadenylierungsfunktion ist, der für die post-transkriptionalen Kontrolle der Messenger-RNA des Protooncogens c-Jun in Säugerzellen verantwortlich ist, (Pallard et al., 2002).
Im Stand der Technik gibt es einen Bedarf für Konstruktionen, die für ein Protein codieren, das fähig ist, auf Messenger-RNA zu wirken, um die Translation der Proteine im Allgemeinen zu inhibieren oder auch um die Translation von vorbestimmten Target-Proteinen zu inhibieren.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Erfindungsgemäß wird ein Peptid-Inhibitor der Translation der Proteine bereitgestellt, dadurch gekennzeichnet, dass seine Größe höchstens 250 Aminosäuren ist und dass er eine Aminosäuresequenz umfasst, die wenigstens 85% Identität mit der Aminosäuresequenz SEQ ID NO: 1 besitzt.
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung besteht aus einem Fusionspolypeptid, das fähig ist, die Translation eines Target-Polynucleotids von Interesse spezifisch zu inhibieren, dadurch gekennzeichnet, dass das genannte Polypeptid einen Peptid-Inhibitor, wie er oben definiert ist, umfasst, wobei der Peptid-Inhibitor mit einem Bindungsprotein für RNA fusioniert ist.
Die Erfindung stellt auch Nucleinsäuren bereit, die ein Polynucleotid umfassen, das für den Peptid-Inhibitor oder auch das Fusions-Polypeptid, wie es oben definiert ist, codiert.
Die Erfindung bezieht sich ebenfalls auf ein Kontrollsystem für die Translation eines Polynucleotids von Interesse, umfassend:

(a) eine erste Nucleinsäure, die aus einer Nucleinsäure besteht, die für ein Fusionspeptid, wie es oben definiert ist, codiert
(b) eine zweite Nucleinsäure, umfassend: (i) wenigstens eine Kopie einer Target-Nucleotidsequenz des Bindungsproteins für RNA, das in dem Fusionspolypeptid enthalten ist, das durch die erste Nucleinsäure, wie sie in (a) definiert ist, codiert wird; (ii) das Polynucleotid von Interesse.

Sie bezieht sich auch auf Vektoren, in die die verschiedenen Nucleinsäuren, die im Kontrollsystem der Translation eines Polynucleotids von Interesse, das oben definiert ist, enthalten sind, insertiert sind, sowie auf Verfahren zur in vitro-Kontrolle der Translation eines Target-Polynucleotids von Interesse, wobei die genannten Verfahren das oben definierte Kontrollsystem der Translation verwenden.
Die Erfindung betrifft außerdem Kits oder Sets, die dazu bestimmt sind, die Translation eines Target-Polynucleotids von Interesse zu kontrollieren.
Die Erfindung bezieht sich außerdem auf die Verwendung eines Kontrollsystems oder eines Kits, wie es/er oben definiert ist, für die Kontrolle der Translation eines Target-Polynucleotids von Interesse.
Die Erfindung bezieht sich ebenfalls auf pharmazeutische Zusammensetzungen, die ein Fusionspolypeptid umfassen, das einen Peptid-Inhibitor der Translation der Proteine umfasst, wobei das Peptid mit einem Bindungsprotein für RNA, wie es oben beschrieben ist, fusioniert ist.
BESCHREIBUNG DER FIGUREN
1 stellt ein Wirkschema eines Fusionspolypeptids gemäß der Erfindung dar, das den Peptid-Inhibitor Pep58X fusioniert mit dem Bindungsprotein für RNA MS2CP umfasst. Das Fusionspolypeptid wird „MS2CP-Pep58X" genannt. Im unteren Teil der Figur ist eine Target-Messenger-RNA, die das Target-Nucleotid-Motiv des Bindungsproteins für RNA MS2CP umfasst, das „MS2" bezeichnet wird und das in der Figur durch eine Haarnadelstruktur dargestellt ist, und eine Expressionskassette des Target-Proteins von Interesse dargestellt. Wie in der Figur dargestellt ist, erlaubt das fusionierte Protein MS2CP die Fixierung des Fusionspolypeptids an der Target-Messenger-RNA auf der Ebene der Stelle MS2, was es dem Peptid-Inhibitor Pep58X erlaubt, seine inhibitorische biologische Aktivität spezifisch an der Target-Messenger-RNA auszuüben.
2 ist ein Schema, das die Karte des Plasmids pMS2CP-Pep58X darstellt. Auf dem Vektor bezeichnet „CMV" den Promotor des Blumenkohlmosaikvirus, der die Expression des offenen Leserasters kontrolliert, das für das Fusionspolypeptid zwischen dem Bindungsprotein für RNA MS2CP und dem Peptid-Inhibitor Pep58X codiert. In der Figur codiert das offene Leseraster für ein Fusionspolypeptid, in dem das Protein MS2CP und der Peptid-Inhibitor Pep58X durch das Peptid HA getrennt sind (Sequenz „YPYDVPDYA" [SEQ ID NO: 11], die von der Aminosäure 98 bis zur Aminosäure 106 des Hemaglutininproteins HA1 reicht), das eine Markierung zur Detektion und Reinigung des Fusionspolypeptids bildet. „T7" bezeichnet den Promotor des Phagen T7, der die in vitro-Synthese von RNA ermöglicht.
Der Vektor umfasst auch ein Resistenzgen gegen Neomycin („NEO^r"), das unter die Kontrolle des Promotors des SV40-Virus gestellt ist.
Der Vektor umfasst auch ein offenes Leseraster, das für ein Resistenzprotein gegen Ampicillin codiert.
Das 3'-Ende des offenen Leserasters, das für das Fusionspolypeptid codiert, umfasst eine Polyadenylierungssignalsequenz, die von der cDNA abgeleitet ist, die für das Rinderwachstumshormon BGH codiert (BGH für „Bovine Growth Hormone").
3 ist ein Schema des Plasmids pRLucLuc-CMVin + 3' UTRGb (MS2)n.
In der Figur kontrolliert der bidirektionale CMV-Promotor die Expression von zwei offenen Leserastern: (i) ein offenes Leseraster, das für Luciferase R („Luc R") codiert und eine 3'UTR-Region, die acht Kopien der Nucleotidstelle MS2, Erkennungsstelle des Proteins MS2CP, enthält, umfasst, und (ii) ein offenes Leseraster, das für das Protein Luciferase F („Luc F") codiert.
Der Vektor umfasst auch ein Resistenzgen gegen Ampicillin („Amp^r"), das unter die Kontrolle des Promotors des CMV-Promotors gestellt ist.
4 stellt ein Funktionsschema eines Expressionssystems I dar.
4A stellt die Synthese des Fusionspolypeptids Pep58X-Bindungsprotein für RNA dar, wenn der Promotor, der die TetP-Sequenz enthält, durch das Aktivatorprotein tTA aktiviert wird, das selbst in konstitutiver Art exprimiert wird.
4B stellt das Fehlen einer Produktion des Fusionspolypeptids Pep58X-Bindungsprotein für RNA in dem Fall dar, in dem das aktivierende Protein tTA in Gegenwart von Tetracyclin produziert wird und die Sequenz TetP des Promotors, der die Expression des Gens Pep58X-Bindungsprotein für RNA kontrolliert, nicht aktiviert.
5 stellt das Wirkprinzip des Expressionssystems II dar.
5A stellt die Unterdrückung der Expression des Fusionspolypeptids Pep58X-Bindungsprotein für RNA unter der Wirkung der Inhibierung des Promotors, der die Sequenz TetO enthält, durch das Repressorprotein Tet(r), das selbst in konstitutiver Art exprimiert wird, dar.
5B stellt die Aktivierung der Synthese des Fusionspolypeptids Pep58X-Bindungsprotein für RNA dar, wenn das Repressorprotein Tet(r) mit Tetracyclin in Kontakt gebracht wird, das dieses desaktiviert und verhindert, dass der Promotor, der die TetO-Sequenz enthält, inhibiert wird.
6 stellt die Resultate für die Inhibitor-Aktivität eines Peptid-Inhibitors der Erfindung auf die Translation des Reporterproteins CAT bei Xenope dar.
6A: Expression der CAT-B2-mRNA in Abwesenheit von Peptid oder in Gegenwart der Peptide Pep58X („58"), Pep60X („60") und Pep61X („61").
6B: Expression der CAT-B1-mRNA („B1") und CAT-B2-mRNA („B2") in Abwesenheit von Peptid oder in Gegenwart des Peptids Pep58X („B1 + 58" bzw. „B2 + 58").
Auf der Abszisse: Identität des verwendeten Peptids (6A und 6B) und Identität der verwendeten CAT-mRNA (6B).
Auf den Ordinaten: CAT-Aktivität, ausgedrückt als Prozentwerte der Aktivität ohne Peptid, wobei die Aktivität ohne Peptid willkürlich auf 100% festgelegt wurde.
7 stellt die Resultate der Translation des Markerproteins Luciferase unter Verwendung eines Kontrollsystems der Translation, das die Vektoren pMS2CP-Pep58X, pMS2CP (als Kontrolle verwendet) und das Plasmid pRLuc Luc CMVin + 3'UTRgb (MS2)₈ enthält, dar.
Auf der Abszisse: Konzentration an exprimierten Proteinen. Auf den Ordinaten: Expression von Luc F (7A) und von Luc R in Bezug auf die Expression von Luc F (7B).
DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Erfindungsgemäß wurde gezeigt, dass eine kleine Familie von Peptiden, die untereinander eine starke Strukturhomologie besitzen, die Fähigkeit hat, die Translation von Proteinen in Zellsystemen zu inhibieren.
Spezifischer ausgedrückt, die Anmelderin hat gezeigt, dass bestimmte Peptide, die aus einer spezifischen Region der Proteine EDEN-BP und CUG-BP abgeleitet sind, eine Inhibierungsaktivität für die Translation der Proteine besitzen, wenn diese Peptide gemeinsam mit Reporter-mRNA in Zellen in Kultur injiziert werden.
Erfindungsgemäß wurde so gezeigt, dass ein Peptid mit 28 Aminosäuren, das die Aminosäuresequenz besitzt, die von der Aminosäure in Position 183 bis zu der Aminosäure in Position 210 der Sequenz des Proteins EDEN-BP mit einer Länge von 498 Aminosäuren (SEQ ID NO: 9), das aus Xenopus laevis stammt, geht, allein Inhibitor-Aktivität für die Translation der gesuchten Proteine besitzt.
Dieses erste Peptid mit 28 Aminosäuren wird zu Zwecken der vorliegenden Beschreibung als „Pep58X" bezeichnet.
Erfindungsgemäß wurde auch gezeigt, dass ein Peptid, das einen sehr hohen Identitätsgrad bezüglich der Aminosäuren mit dem Peptid-Inhibitor Pep58X, der oben definiert ist, hat, wobei das Peptid Pep58H genannt wird, auch die Inhibitor-Aktivität der Translation der Proteine besitzt, die gesucht ist.
Das Peptid Pep58H besteht aus einem Peptid mit einer Länge von 28 Aminosäuren, das die Aminosäuresequenz besitzt, die von der Aminosäure in Position 183 bis zu der Aminosäure in Position 210 des humanen CUGBP-Proteins geht.
In den Beispielen wurde gezeigt, dass das Niveau der Inhibitor-Aktivität von Pep58X und Pep58H sehr ähnlich ist. Man hat auch gezeigt, dass das Niveau der Inhibitor-Aktivität von Pep58H identisch mit dem ist, das für das vollständige CUGBP-Protein beobachtet wird.
Umgekehrt wurde erfindungsgemäß auch gezeigt, dass andere Peptide mit einer Länge von 28 Aminosäuren, die von der Region mit 84 Aminosäuren, die von der Aminosäure in Position 155 bis zur Aminosäure in Position 283 des Proteins EDEN-BP mit der Sequenz SEQ ID NO: 9 geht, abgeleitet sind, keine Inhibitor-Aktivität für die Translation von Proteinen besitzen. In den Beispielen handelt es sich insbesondere um Peptide, die Pep60X bzw. Pep61X genannt werden.
FAMILIE NICHT SPEZIFISCHER PEPTID-INHIBITOREN GEMÄß DER ERFINDUNG
Erfindungsgemäß wurde gezeigt, dass das Peptid mit 28 Aminosäuren, das von dem Protein EDEN-BP von Xenopus laevis abgeleitet ist, das in der vorliegenden Beschreibung Pep58X genannt wird und das die Aminosäuresequenz SEQ ID NO: 1 besitzt, fähig ist, in nicht spezifischer Weise die Translation von Reporter-Messenger-RNA, die für das Enzym CRT (Chloramphenicolacetyltransferase) codieren, zu inhibieren.
So wurde das Peptid Pep58X zusammen mit verschiedenen Reporter-Messenger-RNA in die Embryos der Amphibie Xenope (Xenopus laevis) injiziert. Nach Expression der Reportergene wurden Proteinextrakte hergestellt und die Aktivität des Reportergens wurde bestimmt. Das Peptid Pep58X inhibiert die Translation der Reporter-Messenger-RNA, die für das Enzym CAT codieren, wobei das Reporter-Messenger-RNA-Konstrukt auch die EDEN-Nucleotidstelle der Bindung an das Protein EDEN-BP umfasst oder wobei die Reporter-Messenger-RNA keine spezifische EDEN-Nucleotidstelle der Bindung der RNA an das Protein EDEN-BP umfasst. Folglich wird erfindungsgemäß gezeigt, dass ein Peptid, das die Aminosäuresequenz SEQ ID NO: 1 umfasst, wie es für das Peptid Pep58X der Fall ist, allgemein und nichtspezifisch die Translation von zellulären Messenger-RNA inhibiert.
Die allgemeine, nichtspezifische Inhibitor-Aktivität für die Translation von Proteinen, die mit den Peptiden Pep58X der Sequenz SEQ ID NO: 1 und Pep58H der Sequenz SEQ ID NO: 2, die untereinander eine starke Identität der Aminosäuresequenzen von etwa 89,3% besitzen, bewiesen wurde, hat der Anmelderin ermöglicht, eine beschränkte Familie an Peptid-Inhibitoren für die Translation von Proteinen zu definieren, die unten beschrieben wird.
Die Größe der nichtspezifischen Peptid-Inhibitoren der Translation der Messenger-RNA in Proteine gemäß der Erfindung, die alle eine starke Identität der Sequenz der Aminosäuren mit dem Peptid Pep58X besitzen, ist höchstens 250 Aminosäuren.
Obgleich Peptide mit einer Länge von über 250 Aminosäuren auch Inhibitor-Eigenschaften der Translation der Proteine besitzen können, denkt die Anmelderin – ohne an irgendeine Theorie gebunden sein zu wollen – dass solche Peptide mit großer Größe einer verringerte Inhibitor-Aktivität besitzen können, und zwar insbesondere aufgrund der Tatsache der Bildung von Beschränkungen für die Konformation des Peptids.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist somit ein Peptid-Inhibitor der Translation der Proteine, dadurch gekennzeichnet, dass seine Größe höchstens 250 Aminosäuren ist und dass er eine Aminosäuresequenz umfasst, die wenigstens 85% Identität mit der Aminosäuresequenz SEQ ID NO: 1 von Pep58X besitzt.
Die Ausdrücke Protein, Polypeptid und Peptid, die in der vorliegenden Beschreibung verwendet werden, sind austauschbar und bezeichnen eine lineare Kette von Aminosäureresten, die durch eine Peptidbindung zwischen der Alfa-Amin-Gruppe und der Carboxygruppe von zwei fortlaufenden Aminosäureresten aneinander gebunden sind. Teil der Erfindung sind auch Polypeptide, die wenigstens eine Nicht-Peptid-Bindung, wie zum Beispiel eine retro-inverse Bindung (NHCO), eine Carba (CH₂-CH₂)- Bindung oder auch eine Ketomethylen(CO-CH₂)-Bindung, umfassen.
Ein Peptid-Inhibitor der Translation der Proteine gemäß der Erfindung umfasst eine Aminosäuresequenz, die vorzugsweise wenigstens 86%, 87%, 88%, 89%, 89,3%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% oder 99% Aminosäureidentität mit dem Peptid-Inhibitor der Sequenz SEQ ID NO: 1 besitzt.
Der Ausdruck „prozentuale Identität" bzw. „Prozentwert der Identität" zwischen zwei Aminosäuresequenzen wird im Sinne der vorliegenden Erfindung bestimmt, indem die zwei in optimaler Weise angeordneten Sequenzen durch ein Vergleichsfenster verglichen werden.
Der Teil der Aminosäuresequenz in dem Vergleichsfenster kann auch Additionen oder Deletionen (z.B. „gaps" bzw. „Lücken") bezüglich der Referenzsequenz (die diese Additionen oder diese Deletionen nicht umfasst) umfassen, sodass eine optimale Anordnung zwischen den zwei Sequenzen erhalten wird.
Der Prozentwert der Identität zwischen den zwei Aminosäuresequenzen wird berechnet, indem die Anzahl der Positionen, in denen ein identischer Aminosäurerest für die zwei nach Anordnung verglichenen Sequenzen beobachtet wird, bestimmt wird, dann die Anzahl der Positionen, in denen es eine Identität zwischen den zwei verglichenen Aminosäureresten gibt, durch die Gesamtzahl der Positionen im Vergleichsfenster dividiert wird, dann das Resultat mit 100 multipliziert wird, um den Prozentwert der Identität bzw. die prozentuale Identität zwischen den zwei Aminosäuresequenzen zu erhalten.
Die optimale Anordnung der Sequenzen für den Vergleich kann informatisch mit Hilfe bekannter Algorithmen durchgeführt werden.
In ganz bevorzugter Weise wird die prozentuale Identität der Sequenz mit Hilfe der Software CLUSTAL W (Version 1.82) durchgeführt, wobei die Parameter wie folgt festgelegt sind: (1) CPU MODE = „ClustalWmp"; (2) ALIGNMENT = „full"; (3) OUTPUT FORMAT = „aln w/numbers"; (4) OUTPUT ORDER = „aligned"; (5) COLOR ALIGNMENT = „no" (6) KTUP (WORD SIZE) = „default"; (7) WINDOW LENGTH = „default"; (8) SCORE TYPE = „percent"; (9) TOPDIAG = „default"; (10) PAIRGAP = „default"; (11) PHYLOGENETIC TREE/TREE TYPE = „none"; (12) MATRIX = „default"; (13) GAP OPEN = „default"; (14) END GAPS = „default"; (15) GAP EXTENSION = „default"; (16) GAP DISTANCES = „default" (17) TREE TYPE = „cladogram" und (18) TREE GRAP DISTANCES = „hide".
Die Peptide, die zu der Familie der erfindungsgemäßen Peptid-Inhibitoren der Translation der Proteine gehören, besitzen demnach für einige unter ihnen eine Aminosäuresequenz, die eine oder mehrere Substitutionen, Additionen oder Deletionen einer Säure, verglichen mit den Peptid-Inhibitoren, die die Sequenz SEQ ID NO: 1 umfassen, umfasst. Ein erläuterndes Beispiel solcher Peptide ist der Peptid-Inhibitor der Sequenz SEQ ID NO: 2.
Teil der Erfindung sind Peptide, deren Aminosäuresequenz eine oder mehrere Substitutionen einer Aminosäure durch eine äquivalente Aminosäure im Vergleich zu Peptid-Inhibitoren der Translation der Proteine, wie sie allgemein oben definiert sind, besitzt.
Unter Aminosäure-Äquivalenten versteht man gemäß der Erfindung Aminosäuren, die eine Inhibitoraktivität derselben Größenordnung wie die Inhibitoraktivität des Referenzpeptid-Inhibitors haben, d.h., Aminosäuren, die, wenn sie eine in der Aminosäuresequenz des Referenzpeptidinhibitors ersetzen, eine Inhibitoraktivität haben, die in derselben Größenordnung wie die des Referenzpeptidinhibitors liegt.
Zur Erläuterung, konservative Substitutionen von Aminosäuren sind Austausche einer Aminosäure durch eine andere Aminosäure, die zu derselben Klasse gehört. So sind austauschbar: die aliphatischen Aminosäuren Ala, Val, Leu und Ile; die Aminosäuren, die einen Hydroxylrest besitzen wie Ser und Thr; die sauren Aminosäuren Asp und Glu; die Aminosäuren, die eine Amidfunktion besitzen, wie Asn und Gln; die basischen Amino säuren wie Lys und Arg; und die aromatischen Aminosäuren wie Phe und Tyr.
Das Niveau der Inhibitoraktivität eines Peptidinhibitors gemäß der Erfindung kann vom Fachmann leicht bestimmt werden, z.B., indem er für jede Konzentration einer Reihe intrazellulärer wachsender Konzentrationen an Peptidinhibitor den Prozentwert der Expression eines Markerproteins, codiert durch eine Reporter-mRNA, in Bezug auf das Expressionsniveau des genannten Markerproteins in Abwesenheit des Peptid-Inhibitors errechnet, dann die Steigung der Geraden errechnet, die die verschiedenen Prozentwerte der Expression des Markerproteins verbindet, für die verschiedenen zunehmenden Werte der Konzentration des Peptid-Inhibitors errechnet, wie dies detailliert in den Beispielen beschrieben ist.
Die Berechnung der Steigung der Inhibierungsgeraden kann mit Hilfe der folgenden Formeln durchgeführt werden:

– P der Wert für die Steigung der Inhibierungsgeraden ist;
– d [Markerprotein] die Differenz der Menge an Markerprotein zwischen den zwei Konzentrationen an Peptiden a und b ist;
– d [Peptid-Inhibitor] die Differenz zwischen den zwei Konzentrationen a und b an Peptid ist.

Erfindungsgemäß besitzt ein bestimmter Peptid-Inhibitor ein Niveau der Inhibitoraktivität der Translation der Proteine der „selben Größenordnung" wie das Niveau der Inhibitoraktivität eines Referenzpeptids, wenn der Wert P des bestimmten Peptids zwischen –0,3 und –0,8, vorzugsweise zwischen –0,4 und –0,7 liegt, wobei der Wert P vorzugsweise etwa –0,6 ist.
Teil der Erfindung sind auch Peptide mit höchstens 250 Aminosäuren Länge, die wenigstens 85% Identität der Aminosäuren mit der Aminosäuresequenz, die von der Aminosäure in Position 156 bis zur Aminosäure in Position 405 der Sequenz des Proteins EDEN-BP geht, besitzen, wobei das Protein EDEN-P die Aminosäuresequenz besitzt, die in der vorliegenden Beschreibung als Sequenz SEQ ID NO: 9 bezeichnet wird. Die Aminosäuresequenz 156-405, die in der Sequenz SEQ ID NO: 9 von EDEN-BP enthalten ist, besteht aus der Aminosäuresequenz, die zwischen der zweiten und der dritten Bindungsdomäne für RNA des Proteins EDEN-BP liegt.
Teil der Erfindung sind auch Peptide mit höchstens 100 Aminosäuren Länge, die wenigstens 30 fortlaufende Aminosäuren der Sequenz mit 84 Aminosäuren umfassen, die von der Aminosäure in Position 155 bis zur Aminosäure in Position 238 der Sequenz des Proteins EDEN-BP reicht, die als Sequenz SEQ ID NO: 3 bezeichnet wird, wobei die genannten Peptide eine Aminosäuresequenz umfassen, die wenigstens 85% Identität der Aminosäuren mit der Sequenz SEQ ID NO: 1 besitzt.
Gegenstand der Erfindung sind auch Peptide mit höchstens 100 Aminosäuren Länge, die wenigstens 30 fortlaufende Aminosäuren der Aminosäuresequenz mit 88 Aminosäuren, die von der Aminosäure in Position 155 bis zur Aminosäure in Position 242 der Sequenz des Proteins CUG-8P geht, umfasst, die hier als die Sequenz SEQ ID NO: 4 gemäß der Erfindung bezeichnet wird, wobei die genannten Peptide eine Aminosäuresequenz umfassen, die wenigstens 85% Identität der Aminosäuren mit der Sequenz SEQ ID NO: 2 besitzt.
Die Anmelderin hat in der Tat gezeigt, dass die Sequenz SEQ ID NO: 3 mit 84 Aminosäuren, die von dem Protein EDEN-BP abgeleitet ist, in der Zelle mit dem Protein ePABP wechselwirkt, von dem bekannt ist, dass es in den Regulationsmechanismen auf dem Niveau der Translation der Messenger-RNA impliziert ist.
Ein Peptid-Inhibitor der Translation der Proteine, wie er oben definiert ist, hat vorteilhafter Weise eine Größe von höchstens 50 Aminosäuren Länge.
Vorzugsweise ist ein Peptid-Inhibitor der Translation der Proteine der Erfindung dadurch gekennzeichnet, dass seine Größe höchstens 30 Aminosäuren Länge ist, und ganz bevorzugt, höchstens 28 Aminosäuren Länge ist. Die Peptid-Inhibitoren kleiner Größe mit höchstens 50 Aminosäuren und besser höchstens 30 Aminosäuren sind aufgrund ihrer besseren Fähigkeit, die Zellmembranen zu durchdringen und so wirksam und schnell auf der Ebene des Cytoplasmas zur Inhibierung der Translation der Messenger-RNA zu wirken, bevorzugt.
Teil der Erfindung ist ein Peptid-Inhibitor der Translation der Proteine, der dadurch gekennzeichnet ist, dass er eine Aminosäuresequenz umfasst, die wenigstens 89%, vorzugsweise 89,3% Identität mit der Aminosäuresequenz SEQ ID NO: 1 hat.
Entsprechend der Definition eines Peptid-Inhibitors oben ist ein Peptid dadurch gekennzeichnet, dass es die Sequenz SEQ ID NO: 1 umfasst, insbesondere das Peptid der Sequenz SEQ ID NO: 1 ist.
Teil der obigen Definition eines Peptids ist ein Peptid, dadurch gekennzeichnet, dass es die Sequenz SEQ ID NO: 2 umfasst, insbesondere das Peptid der Sequenz SEQ ID NO: 2 ist.
Die Erfindung bezieht sich ebenfalls auf ein Verfahren zur Herstellung eines Peptid-Inhibitors der Translation der Proteine, wie er oben definiert wurde, wobei das Verfahren die folgenden Stufen umfasst:

(a) Insertieren einer Nucleinsäure, die für den Peptid-Inhibitor codiert, in einen geeigneten Expressionsvektor;
(b) Kultivieren einer Wirtszelle, die vorher mit dem in Stufe (a) erhaltenen rekombinanten Vektor transformiert oder transfiziert wurde, in einem geeigneten Kulturmedium;
(c) Wiedergewinnen des konditionierten Kulturmediums oder Lysieren der Wirtszelle, bspw. durch Ultraschallbehandlung oder osmotischen Schock;
(d) Abtrennen und Reinigen des Peptid-Inhibitors aus dem Kulturmedium oder auch aus Zelllysaten, die in der Stufe (c) erhalten wurden;
(e) Gegebenenfalls Charakterisieren des produzierten rekombinanten Peptid-Inhibitors.

Die Peptidinhibitioren gemäß der Erfindung können durch Fixierung an einer Immunaffinitäts-Cromatographiesäule, an der Antikörper, die gegen das Peptid gerichtet sind, vorher immobilisiert wurden, charakterisiert werden.
Nach einem anderen Aspekt kann ein Peptid-Inhibitor gemäß der Erfindung durch Passage durch eine geeignete Reihe von Chromatographiesäulen gereinigt werden, und zwar nach Verfahren, die dem Fachmann bekannt sind und von AUSUBEL et al. (1989) beschrieben wurden. Ein Peptid-Inhibitor gemäß der Erfindung kann auch durch klassische Techniken in der chemischen Synthese unterschiedslos in homogener Lösung oder in fester Phase, hergestellt werden.
Zum Beispiel kann ein Peptid-Inhibitor gemäß der Erfindung durch die Technik in homogener Lösung, die von HOUBEN WEIL (1974) beschrieben ist, oder auch durch die Technik der Synthese in fester Phase, die von MERRIFIELD beschrieben ist (1965a, 1965b), hergestellt werden.
Die vorliegende Erfindung bezieht sich auch auf eine Nucleinsäure, die ein Polynucleotid umfasst, das für einen Peptid-Inhibitor der Translation der Proteine, wie oben definiert, codiert.
Vorzugsweise ist die genannte Nucleinsäure dadurch gekennzeichnet, dass sie ein Regulator-Polynucleotid umfasst, unter dessen Kontrolle das Polynucleotid, das für den Peptid-Inhibitor der Translation der Proteine codiert, gestellt ist.
Die Erfindung betrifft auch eine Nucleinsäure, wie sie oben definiert ist, dadurch gekennzeichnet, dass sie in ei nen rekombinanten Klonierungs- oder Expressionsvektor insertiert ist.
Gegenstand der Erfindung ist auch ein rekombinanter Klonierungs- oder Expressionsvektor, der eine Nucleinsäure, wie sie oben definiert ist, umfasst.
Es kann jeder geeigneter Vektor, der bekannt oder in der vorliegenden Beschreibung definiert ist, verwendet werden.
Die Peptid-Inhibitoren, wie sie oben definiert sind, werden eingesetzt, um in nicht spezifischer Weise die Translation der Proteine, vorzugsweise in zellulären Systemen, zu inhibieren, obgleich die Peptid-Inhibitoren auch eingesetzt werden können, um die Translation der Proteine in azellulären Systemen zu inhibieren, z.B. ausgehend von einem Zelllysat, bspw. indem ein Extrakt aus zellulären Messenger-RNA in einem azellulären System, das aus einem Retikulocytenlysat von Kaninchen nach einer herkömmlichen Technik, die bei UCHIDA et al. (2002) beschrieben ist, inkubiert wird. Nach einem bevorzugten Aspekt der Erfindung verwendet man Peptid-Inhibitoren, wie sie oben definiert sind, um den Zellmetabolismus so weit zu stören, dass der Tod der Zellen, in die diese Peptid-Inhibitoren eingedrungen sind, hervorzurufen.
So können die Peptid-Inhibitoren der Translation der Proteine, wie sie oben definiert sind, verwendet werden, um bestimmte Zellkategorien, gegen die sie gerichtet sein können, wie z.B. Tumorzellen, zu eliminieren.
Beispielsweise können die Peptid-Inhibitoren gemäß der Erfindung mit einem Peptid oder einem Protein fusioniert sein oder auch an ein Polysaccharid gebunden sein, wobei das Peptid, das Protein oder das Polysaccharid, aus Liganden bestehen, die spezifisch von Rezeptoren erkannt werden, die in den Zielzellen exprimiert werden, z.B. auf der Membranoberfläche der Zielzellen, wobei die Zielzelle dann die Peptid-Inhibitoren internalisieren, die ihren Tod durch Blockierung der Translation der Zellproteine hervorrufen werden. Beispiele für Peptide oder Proteine, die mit einem Peptid-Inhibitor gemäß der Erfindung fusioniert werden können, sind insbesondere Antikörper oder Antikörperfragmente, die spezifisch Antigene erkennen, die in spezifischer Weise durch bestimmte Zellkategorien exprimiert werden, wie z.B. von Tumorzellen.
Beispielsweise kann man ein Fusionsprotein zwischen einem Peptid-Inhibitor gemäß der Erfindung und einem Antikörper oder einem Antikörperfragment, z.B. ein Fragment Fab oder auch ein Fragment F(ab')₂, die spezifisch ein Antigen erkennen, das selektiv durch die ins Auge gefassten Tumorzellen exprimiert wird, z.B. das Tumorantigen Tn, das im Stand der Technik gut bekannt ist. In vitro können so die Tumorzellen, die in einer Zellpopulation vorliegen, die einem Patienten entnommen wurden, durch Inkubation der Zellen, die vom Patienten stammen, mit geeigneten Konzentration des Fusionsproteinpeptid-Inhibitor-Antikörpers (oder Antikörperfragments), gefolgt von einer Isolierung der normalen nicht-Tumorzellen, eliminiert werden.
Es ist selbstverständlich, dass die Fusionspeptide Peptid-Inhibitor-Ligand eines Zellrezeptors auch in vivo verwendet werden können, z.B. im Rahmen von Antikrebstherapien.
Sezifische Fusionspolypeptid-Inhibitoren der Translation von Proteinen
Nach einem Aspekt bezieht sich die Erfindung auf Fusionspolypeptide, die geeignet sind, spezifisch die Translation eines Target-Polynucleotids von Interesse in das entsprechende Protein zu inhibieren, wobei ein solches Fusionspolypeptid einen Peptid-Inhibitor der Translation von Proteinen, wie er vorstehend in der Beschreibung definiert ist, umfasst, wobei der Peptid-Inhibitor mit einem Bindungsprotein für RNA fusioniert ist, das spezifisch eine Target-Nucleotidstelle für die ins Auge gefasste Messenger-RNA erkennt.
In der Tat wurde erfindungsgemäß gezeigt, dass ein Fusionspolypeptid zwischen dem Peptid Pep58X der Sequenz SEQ ID NO: 1 und dem Bindungsprotein für RNR MS2CP fähig ist, spezifisch die Translation einer Messenger-RNA zu inhibieren, die die Target-Nucleotidstelle MS2 und ein offenes Leseraster, das für das Markerprotein Luciferase codiert, unter die Kontrolle eines geeigneten Promotors gestellt, umfasst.
Wie in 1 dargestellt ist, fixiert sich das Protein MS2CP, das in dem Fusionspolypeptid enthalten ist, selektiv an seine Target-Nucleotidstelle MS2, was dem Peptid-Inhibitorpeptid Pep58X erlaubt, spezifisch die Expression der Messenger-RNA oder der Messenger-RNA, die die Target-Nucleotidstelle MS2 enthalten, zu inhibieren.
Dieselben Resultate wurden von der Anmelderin mit einem Fusionspolypeptid, das den Peptid-Inhibitor Pep58H und das Protein MS2CP zur Bindung an die RNA enthält, berichtet.
In einem Fusionspolypeptid gemäß der Erfindung ist das Bindungsprotein für RNA, das an den Peptid-Inhibitor der Translation der oben definierten Proteine fusioniert ist, vorzugsweise unter MS2CP, N, IRP und U1A, die in Tabelle 1 unten aufgelistet sind, ausgewählt.
Tabelle 1: Bevorzugte Bindungsproteine
Vorteilhafterweise ist das Bindungsprotein für RNA am NH₂-terminalen Ende des Fusionspolypeptids lokalisiert, ob gleich es auch am COOH-terminalen Ende des Fusionspolypeptids lokalisiert sein kann.
Im Fusionspolypeptid kann das Bindungsprotein für RNA direkt an den Peptid-Inhibitor fusioniert sein, d.h., in den Zellen:

– (i) wenn das Bindungsprotein für RNA am NH₂-terminalen Ende des Fusionspolypeptids lokalisiert ist, die letzte Aminosäure in der COOH-terminalen Position des Bindungsproteins für RNA chemisch, vorzugsweise über eine normale Peptidbindung, an die Aminosäure, die in NH₂-terminaler Position des Peptid-Inhibitors lokalisiert ist, gebunden ist; oder
– (ii) wenn das Bindungsprotein für RNA in COOH-terminaler Position des Fusionspolypeptids lokalisiert ist, die Aminosäure, die in der COOH-terminalen Position des Peptid-Inhibitors lokalisiert ist, direkt, vorzugsweise über eine normale Peptidbindung an die Aminosäure gebunden ist, die in NH₂-terminaler Position des Bindungsproteins für RNA gebunden ist.

Nach einer anderen Ausführungsform eines Fusionspolypeptids gemäß der Erfindung sind das Bindungsprotein für RNA und der Peptid-Inhibitor der Translation der Proteine nicht direkt aneinander gebunden, sondern sind dagegen im Fusionspolypeptid durch eine Spacer-Aminosäuresequenz, die vorzugsweise hydrophob ist, voneinander getrennt. Die Spacer-Aminosäuresequenz besitzt eine ausreichende Größe, um eine Flexibilitätsregion des Proteinmoleküls zu bilden, was eine relative Mobilität des Bindungsproteins für RNA gegenüber dem Peptid-Inhibitor ermöglicht.
Die Größe des Spacer-Peptids ist wenigstens 3 Aminosäuren lang und höchstens 50 Aminosäuren lang. Vorzugsweise ist die Größe des Spacer-Peptids zwischen 5 und 30 Aminosäuren lang und ganz bevorzugt zwischen 5 und 20 Aminosäuren lang.
Wenn die Spacer-Sequenz oder der Peptid-Spacer hydrophob ist, erleichtert die Spacer-Sequenz die Penetration des Fusionspolypeptids durch Zellmembranen hindurch. In diesem Fall enthält das genannte Spacer-Peptid hauptsächlich hydrophobe Aminosäuren wie die Aminosäuren Valin, Leucin oder auch Isoleucin. In dieser Ausführungsform umfasst das Spacer-Peptid in seiner Sequenz vorzugsweise wenigstens 50% hydrophobe Aminosäuren, vorzugsweise wenigstens 60%, und ganz bevorzugt wenigstens 80% hydrophobe Aminosäuren.
Nach einer besonderen Ausführungsform besteht das Spacer-Peptid aus einer Kette von Aminosäuren, Poly(alanin), die 3 bis 50, besser 5 bis 30, vorteilhafter Weise 5 bis 20 und in ganz bevorzugter Weise 5 bis 10 Alaninreste umfasst.
Nach einem anderen Aspekt bildet die Spacer-Aminosäuresequenz oder das Spacer-Peptid eine Markierung, die die Detektion oder auch die Reinigung des Fusionspolypeptids, das in der Probe vorliegt, ermöglicht. Beispielsweise kann das Spacer-Peptid aus dem Peptid „HA TAG", Sequenz SEQ ID NO: 11, wie in den Beispielen beschrieben, bestehen.
Spezifische und erläuternde Beispiele für spezifische Fusionspolypeptid-Inhibitoren gemäß der Erfindung bilden:

– das Fusionspolypeptid MS2CP-HA TAG-Pep58X mit der Aminosäuresequenz SEQ ID NO: 5, das durch die Nucleinsäure der Sequenz SEQ ID NO: 7 codiert wird;
– das Fusionspolypeptid MS2CP-HA TAG-Pep58H mit der Aminosäuresequenz SEQ ID NO: 6, die durch die Nucleinsäure der Sequenz SEQ ID NO: 8 codiert wird.

Die Erfindung bezieht sich auch auf eine Nucleinsäure, die ein Polynucleotid umfasst, das für ein Fusionspolypeptid codiert, wie es oben definiert ist.
Die bevorzugten Nucleinsäuren gemäß der Erfindung sind die Folgenden:

– die Nucleinsäure der Sequenz SEQ ID NO: 7, die für das Fusionspolypeptid MS2-HA TAG-Pep58H codiert;
– die Nucleinsäure der Sequenz SEQ ID NO: 8, die für das Fusionspolypeptid MS2CP-HA TAG-Pep58H codiert.

Nach einem bevorzugten Aspekt ist die Nucleinsäure, die für ein Fusionspolypeptid der Erfindung codiert, dadurch ge kennzeichnet, dass sie ein Regulator-Polynucleotid umfasst, unter dessen Kontrolle das Polynucleotid, das für das Fusionspolypeptid codiert, gestellt ist.
In ganz bevorzugter Weise ist die Nucleinsäure dadurch gekennzeichnet, dass das Regulator-Polynucleotid ein induzierbares Regulator-Polynucleotid ist.
In der Praxis erfordert in der Tat die Kontrolle der Translation gewisser vorbestimmter Target-Proteine durch einen spezifischen Fusionspolypeptid-Inhibitor gemäß der Erfindung, dass zu bestimmten Zeitpunkten einer Zellkultur, z.B. im Bioreaktor, das Target-Protein oder die Target-Proteine nicht produziert werden, während dagegen zu anderen Zeitpunkten die Produktion des Target-Proteins oder der Target-Proteine gefragt ist.
Die Erfindung betrifft auch eine Nucleinsäure, die für einen spezifischen Fusionspolypeptid-Inhibitor codiert, wie er oben definiert ist, dadurch gekennzeichnet, dass sie in einen Klonierungs- oder Expressionsvektor insertiert ist.
Die Erfindung betrifft auch einen rekombinanten Klonierungs- oder Expressionsvektor, dadurch gekennzeichnet, dass er eine Nucleinsäure umfasst, die für einen spezifischen Peptid-Inhibitor, wie er oben definiert ist, codiert.
Es kann jeder Klonierungs- oder Expressions-Vektor, der bekannt ist oder in der vorliegenden Erfindung beschrieben wird, verwendet werden.
Die spezifischen Fusionspolypeptid-Inhibitoren sowie die Nucleinsäuren, die für diese Fusionspolypeptide der Erfindung codieren, haben den Anmeldern erlaubt, Kontrollsysteme der Translation eines Target-Polynucleotids oder mehrerer Target-Polynucleotide von Interesse zu realisieren, wobei die charakteristischen Techniken dieser Kontrollsysteme unten definiert sind.
Kontrollsysteme für die Translation eines oder mehrerer Target-Nucleotide von Interesse
Nach einem anderen Aspekt bezieht sich die Erfindung auf Fusionen zwischen Peptid und Oligonucleotid, die fähig sind, spezifisch die Translation eines Target-Polynucleotids von Interesse in das entsprechende Protein zu inhibieren. Ein derartiges Fusionsmolekül umfasst einen Peptid-Inhibitor der Translation der Proteine, wie er vorstehend in der Beschreibung definiert wurde, wobei der Peptid-Inhibitor mit einem Oligonucleotid fusioniert ist, das spezifisch eine Target-Nucleotidstelle einer mRNR, die ins Auge gefasst ist, erkennt. Ein Beispiel für diesen Oligonucleotidtyp ist Aptastruc, das in der PCT-Anmeldung Nr. PCT/FR 95/01036 beschrieben ist.
Die spezifischen Fusionspolypeptid-Inhibitoren der Translation der Proteine, wie sie oben definiert sind, können in verschiedene Kontrollsysteme der Translation eines Target-Polynucleotids oder mehrerer Target-Polynucleotide von Interesse eingebaut werden.
Ein erstes Kontrollsystem der Translation eines Target-Polynucleotids von Interesse oder mehrerer Target-Polynucleotide von Interesse umfasst eine Nucleinsäure, die für ein Fusionspolypeptid-Peptid-Inhibitor-Protein für die Bindung ein RNA, wie oben definiert, codiert.
Ein zweites Kontrollsystem der Erfindung besteht in einem Kontrollsystem, das ein Fusionspolypeptidpeptid-Inhibitor-Bindungsprotein für RNA, wie oben definiert, umfasst.
Wenn die Nucleinsäure, die für das Fusionspolypeptid codiert, gegebenenfalls in Form eines DNA-Inserts in einem rekombinanten Vektor verwendet wird, um die Zellen, in denen die Kontrolle der Translation gewünscht ist, zu transfizieren, wird das Fusionspolypeptid gegebenenfalls in induzierbarer Art exprimiert. Wenn das Fusionspolypeptid in den so transfizierten Zellen exprimiert wird, fixiert sich das Fusi onspolypeptid spezifisch an Target-Messenger-RNA, die die Target-Nucleotidstelle des Bindungsproteins an RNA, enthalten in dem Fusionsprotein, umfassen, dank der das Fusionspeptid die Translation der Proteine inhibiert, die durch die genannten Target-Messenger-RNA codiert werden.
Wenn außerdem der spezifische Fusionspolypeptid-Inhibitor mit den Targetzellen in Kontakt gebracht wird, wird das genannte Fusionspolypeptid in das Cytoplasma dieser Zellen internalisiert und inhibiert die Translation der Proteine, die durch die Target-Messenger-RNA codiert werden, die in ihrer Sequenz die Target-Nucleotidstelle des Bindungsproteins für RNA enthalten, welches in dem Fusionspolypeptid enthalten ist.
Gemäß einem dritten Kontrollsystem der Translation eines oder mehrerer Target-Polynucleotide von Interesse gemäß der Erfindung umfasst das genannte Kontrollsystem einerseits eine Nucleinsäure, die für den spezifischen Fusionspolypeptid-Inhibitor codiert, und andererseits eine zweite Nucleinsäure, die die Target-Nucleinsäure des Fusionspolypeptids bildet und die für das Protein von Interesse codiert, für das die Kontrolle der Translation gewünscht und gesucht ist.
Gegenstand der Erfindung ist demnach auch ein Kontrollsystem der Translation eines Target-Polynucleotids von Interesse, umfassend:

(a) eine erste Nucleinsäure, die aus einer Nucleinsäure besteht, die ein Polypeptid umfasst, das für einen spezifischen Fusionspolypeptid-Inhibitor, der in der vorliegenden Beschreibung definiert ist, codiert;
(b) eine zweite Nucleinsäure, umfassend: (i) wenigstens eine Kopie einer Target-Nucleotidsequenz des Bindungsproteins für RNA, das in dem Fusionspolypeptid enthalten ist, das durch die erste Nucleinsäure, wie sie in (a) definiert ist, codiert wird; und (ii) das Polynucleotid von Interesse, für das die Kontrolle der Translation gesucht ist.

In ganz bevorzugter Weise ist das obige dritte Kontrollsystem der Erfindung dadurch gekennzeichnet, dass die zweite Nucleinsäure, die für das Protein von Interesse codiert, für das die Kontrolle der Translation gesucht wird, ein Regulator-Polynucleotid umfasst, unter dessen Kontrolle das Polynucleotid von Interesse gestellt ist, das für das genannte Protein von Interesse codiert.
Ein viertes Kontrollsystem der Translation gemäß der Erfindung besteht in einem Kontrollsystem der Translation eines Target-Polynucleotids von Interesse, umfassend:

(a) ein Fusionspolypeptidpeptid-Inhibitor-Bindungsprotein für RNA, wie es vorher in der Beschreibung definiert wurde;
(b) eine Nucleinsäure, umfassend: (i) wenigstens eine Kopie einer Target-Nucleotidsequenz des Bindungsproteins für RNA, das in dem Fusionspolypeptid, wie es in (a) definiert ist, enthalten ist; und (ii) das Polynucleotid von Interesse, für das die Kontrolle der Translation gesucht ist.

Vorzugsweise umfasst die Nucleinsäure (b) der Kontrollsysteme der Translation der Proteine, wie sie oben definiert sind, wenigstens zwei Kopien, vorteilhafter Weise wenigstens drei oder vier Kopien der Target-Nucleotidsequenz des Bindungsproteins für RNA, das in dem Fusionspolypeptid der Erfindung enthalten ist. Vorteilhafterweise umfasst die Nucleinsäure (b) 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23 oder 24 Kopien der genannten Target-Nucleotidsequenz. In bestimmten Fällen enthält die Nucleinsäure (b) bis zu 24 Kopien der genannten Target-Nucleotidsequenz.
Die Erfindung betrifft auch ein Kontrollsystem, wie es oben definiert ist, dadurch gekennzeichnet, dass die Nucleinsäure oder die Nucleinsäuren, die darin enthalten sind, in einen rekombinanten Expressionsvektor insertiert sind.
Die Erfindung betrifft auch ein Kontrollsystem, wie es oben definiert ist, dadurch gekennzeichnet, dass die Nuc leinsäure (b) in das Genom einer prokaryotischen oder eukaryotischen Wirtszelle insertiert ist.
Das dritte und das vierte Kontrollsystem der Translation gemäß der Erfindung erlauben es, in kontrollierter Weise die Expression eines Gens, das vorher in künstlicher Weise in eine Zelle insertiert wurde, zu regulieren, wobei das Gen vorzugsweise ein Gen ist, das für ein Protein codiert, dessen Synthese kontrolliert werden soll.
Auf dem Gebiet der Produktion von Proteinen von Interesse in Bioreaktoren beispielsweise gibt es ein wiederkehrendes Problem, das auf der Toxizität des Proteins von Interesse basiert, das man gegen die Zellen in der Wachstumsphase exprimieren möchte. In dieser Anwendung erlaubt das Kontrollsystem der Translation der Proteine, wie es oben definiert ist, aufgrund des Vorliegens des Fusionspolypeptids, die Repression der Expression eines Target-Polynucleotids von Interesse während der Wachstumsphase der Zelle, dann, wenn gewünscht, die Expression des Proteins von Interesse, sobald die Ebene des Zellwachstums im Inneren des Bioreaktors erreicht ist.
Was andere existierende Kontrollsysteme angeht, die auf der Transkriptionsebene der RNA-Synthese wirken und bei denen in der Folge eine große Reaktionsträgheit beobachtet wird, wie z.B. das System TeT on/Tet off, erlaubt das erfindungsgemäße Kontrollsystem eine schnelle Repressionsantwort oder im Gegenteil Aktivierungsantwort der Synthese der Targetproteine.
Wie einzusehen ist, wird die Wirksamkeit des Kontrollsystems der Translation der Proteine gemäß der Erfindung erreicht, wenn die Expression des Fusionspolypeptid-Peptid-Inhibitor-Bindungsprotein für RNA induzierbar ist: So wird eine Unterdrückung der Synthese des Fusionspolypeptids die Translation des Target-Polynucleotids von Interesse in das entsprechende Protein erlauben, wenn eine Aktivierung der Expression des Fusionspolypeptids die Translation des Target- Polynucleotids von Interesse in das entsprechende Protein inhibieren wird.
Zur Lösung der Aufgabe der Erfindung ist es somit vorteilhaft, Nucleinsäurekonstrukte zu verwenden, in denen das Polynucleotid, das für das Fusionspolypeptid der Erfindung codiert, unter die Kontrolle eines induzierbaren Regulator-Polynucleotids gestellt wird, dessen Aktivität mit der Zeit kontrolliert werden kann.
Nach einem anderen Aspekt der Erfindung verwendet man Fusionspolypeptide im Rahmen einer angestrebten antiviralen Behandlung, indem man als Bindungsprotein für RNA ein Protein verwendet, das sich spezifisch an den Nucleotidsequenzen viraler mRNA fixiert.
Induzierbares Expressionssystem des Fusionspolypeptids, Bestandteil der Kontrollsysteme der Translation von Proteinen gemäß der Erfindung.
Die Erfindung bezieht sich auch auf eine Nucleinsäure, die ein Polynucleotid umfasst, das für ein Fusionspolypeptid Inhibitor-Bindungsprotein für RNA, wie es oben definiert ist, codiert, und die auch ein Regulator-Polynucleotid umfasst, das gegenüber der direkten oder indirekten Wirkung eines Induktionssignals empfindlich ist, das auch als induzierbares Regulator-Polynucleotid bezeichnet wird.
Induzierbare Regulationssysteme, die gemäß der Erfindung verwendbar sind, werden in den 4 und 5 dargestellt. Andere induzierbare Regulationssysteme, die auf Regulationsprinzipien basieren, die identisch sind mit denen, die in 4 und 5 dargestellt sind, können ebenfalls verwendet werden.
Man bevorzugt die induzierbaren Regulationssysteme, die in Tabelle 2 aufgelistet sind.
In ganz bevorzugter Art und Weise werden eine Nucleinsäure, die für ein Fusionspolypeptid gemäß der Erfindung co diert, sowie eine Nucleinsäure, umfassend (i) wenigstens eine Kopie einer Target-Nucleotidsequenz des Bindungsproteins für RNA, das in dem Fusionspolypeptid enthalten ist und (ii) das Polynucleotid von Interesse, für das die Kontrolle der Translation gesucht wird, in einen rekombinanten Klonierungs- oder Expressionsvektor insertiert.
Vektoren gemäß der Erfindung
Unter „Vektor" im Sinne der vorliegenden Erfindung versteht man ein kreisförmiges oder lineares DNA- oder RNA-Molekül, das beliebig in Einzelstrangform oder Doppelstrangform vorliegt.
Ein rekombinanter Vektor gemäß der Erfindung ist vorzugsweise ein Expressionsvektor.
Es kann sich insbesondere um einen Vektor bakterieller oder viraler Herkunft handeln.
In allen Fällen ist die Nucleinsäure, die für das Fusionspolypeptid Inhibitor-Bindungsprotein für RNA gemäß der Erfindung codiert, unter die Kontrolle einer oder mehrerer Sequenzen gestellt, die Regulationssignale ihrer Expression in den in Betracht gezogenen Zellen enthalten, wobei die Regulationssignale alle in der Nucleinsäure, die für das Fusionspolypeptid codiert, enthalten sein können oder eins oder mehrere von ihnen oder auch alle Regulationssignale in dem Aufnahmevektor enthalten sind, in den die Nucleinsäure, die für das Fusionspolypeptid codiert, insertiert worden ist.
Ein rekombinanter Vektor gemäß der Erfindung umfasst vorteilhafter Weise geeignete Startsequenzen und Stoppsequenzen der Transkription.
Außerdem können die rekombinanten Vektoren gemäß der Erfindung einen Replikationsursprung oder mehrere Replikationsursprünge, die in den Wirtszellen, in denen ihre Expression gewünscht ist, funktionell sind, sowie gegebenenfalls Selektionsmarkernucleotidsequenz enthalten.
Die rekombinanten Vektoren gemäß der Erfindung können so ein Regulationssignal oder mehrere Regulationssignale der Expression, wie sie oben in der Beschreibung definiert sind, enthalten, hier eingeschlossen die induzierbaren Regulator-Polynucleotide.
Die bakteriellen Vektoren, die gemäß der Erfindung bevorzugt sind, sind z.B. die Vektoren pBR322(ATCC Nr. 370170) oder auch die Vektoren wie pAA223-3 (Pharmacia, Uppsala, Schweden) und pGEM1(Promega Biotech, Madison, WI, USA). Man kann auch andere Vektoren nennen, die im Handel verfügbar sind, wie z.B. die Vektoren pQE70, gQE60, Pge9 (QUIAGEN), psiX174, pBluescript SA, pNH8A, pMH16A, pMH18A, pMH46A, pWLNEO, pSV2CAT, pOG44, pXTI und pSG (Stratagene).
Bevorzugter Weise ist ein Expressionsvektor eines spezifischen Fusionspolypeptid-Inhibitors, wie er vorstehend definiert ist, der Vektor pM52CP-PEP58X, der bei der Collection Nationale de Cultures de Microorganismes am 8. Juli 1993 unter der Eingangsnummer I-3067 hinterlegt wurde.
Ein bevorzugter Vektor, der die Nucleinsäure umfasst, die (i) wenigstens eine Kopie einer Target-Nucleotidsequenz des Bindungsproteins für RNA, das im spezifischen Fusionspolypeptid-Inhibitor enthalten ist und (ii) das Polynucleotid von Interesse, für das die Kontrolle der Translation gewünscht wird, umfasst, ist der Vektor pRLucLuc-CMVin + 3'UTRGb(MS2)n, der in den Bespielen beschrieben ist.
Die Vektoren der Eukaryotenexpression, die bevorzugt sind, sind die, die bei Makrides et al. (1999) beschrieben sind.
Transformierte Wirtszellen gemäß der Erfindung
Im Allgemeinen wird ein spezifischer Fusionspolypeptid-Inhibitor der Translation der Proteine gemäß der Erfindung verwendet, um spezifisch die Translation eines oder mehrerer Proteine von Interesse in den Zellen zu inhibieren. Für die Verwendung der Kontrollsysteme der Translation, wie sie oben definiert sind, ist es notwendig, im voraus Targetzellen mit einer Nucleinsäure oder einem rekombinanten Vektor zu transfizieren, was die Expression, gegebenenfalls induzierbar, des Fusionspolypeptids in den Targetzellen ermöglicht.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist auch eine Wirtszelle, die durch eine Nucleinsäure transformiert ist, die für einen spezifischen Fusionspolypeptid-Inhibitor gemäß der Erfindung codiert, oder die durch einen rekombinanten Vektor transformiert ist, in den eine derartige Nucleinsäure insertiert ist.
Die transformierte Wirtszelle kann von Bakterien, Pilzen oder allen anderen eukaryotischen Zellen stammen.
Jedenfalls ist die Wirtszelle in ganz bevorzugter Weise eine Säugerzelle, hier eingeschlossen eine humane Zelle.
Teile der Erfindung sind auch prokaryotische oder eukaryotische Wirtszellen, die ein Kontrollsystem der Translation der Proteine, wie sie vorstehend definiert sind, umfassen, d.h.:

– eine Nucleinsäure, die für einen spezifischen Fusionspolypeptid-Inhibitor der Translation der Proteine gemäß der Erfindung codiert;
– eine Nucleinsäure, die das Polynucleotid von Interesse umfasst, für das die Kontrolle der Translation gewünscht ist, und die auch die Targetnucleotidstelle des Bindungsproteins für RNA, die in den Fusionspolypeptid enthalten sind, umfasst.

In einigen Fällen wird man zunächst versuchen, das Target-Polynucleotid des betrachteten spezifischen Fusionspolypeptid-Inhibitors in das Genom der transformierten prokaryotischen oder eukaryotischen Wirtszelle zu integrieren, derart, dass ein stabiles Zellsystem zur Kontrolle der Translation des Target-Proteins von Interesse oder der Target-Proteine von Interesse erhalten wird.
In diesem besonderen Durchführungsmodus ist das Kontrollsystem, wie vorstehend definiert ist, dadurch gekennzeichnet, dass die Nucleinsäure (b) in das Genom der prokaryotischen oder eukaryotischen Wirtszelle insertiert wird.
Verfahren und Kits gemäß der Erfindung
Gegenstand der Erfindung ist auch ein Verfahren zur in vitro-Kontrolle der Translation eines Target-Polynucleotids von Interesse, dadurch gekennzeichnet, dass es die folgenden Stufen umfasst:

a) in eine prokaryotische oder eukaryotische Wirtszelle führt man eine Nucleinsäure ein, die umfasst: (i) wenigstens eine Kopie einer Target-Nucleotidsequenz eines Bindungsproteins für RNA; (ii) das Polynucleotid von Interesse und (iii) ein Regulator-Polynucleotid, unter dessen Kontrolle das Polynucleotid von Interesse gestellt ist;
b) man kultiviert die rekombinante Wirtszelle, die am Ende der Stufe a) erhalten wurde, in einem geeigneten Kulturmedium, wobei die rekombinante Wirtszelle das Polynucleotid von Interesse exprimiert;
c) falls gewünscht, inhibiert man die Expression des Polynucleotids von Interesse, indem man dem Zellkulturmedium einen spezifischen Fusonspolypeptid-Inhibitor, wie er in der vorliegenden Beschreibung definiert ist, zusetzt.

Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist auch ein Verfahren zur in vitro-Kontrolle der Translation eines Target-Polynucleotids von Interesse, dadurch gekennzeichnet, dass es die folgenden Stufen umfasst:

a) in eine prokaryotische oder eukaryotische Wirtszelle führt man (1) eine Nucleinsäure ein, die umfasst: (i) wenigstens eine Kopie einer Target-Nucleotidsequenz eines Bindungsproteins für RNA; (ii) das Polynucleotid von Interesse und (iii) ein Regulator-Polynucleotid, unter dessen Kontrolle das Polynucleotid von Interesse ist; und (2) eine Nucleinsäure, die ein Polynucleotid umfasst, das für einen spezifischen Fusionspolypeptid-Inhibitor gemäß der Erfindung codiert und unter die Kontrolle eines induzierbaren Regulator-Polynucleotid gestellt ist;
b) man kultiviert die eukaryotische oder prokaryotische Wirtszelle in einem geeigneten Kulturmedium;
c) wenn gewünscht, setzt man dem Kulturmedium eine geeignete Endkonzentration eines Mittels zu, das die Aktivierung oder die Unterdrückung der Expression des Polynucleotids, das für das Fusionspolypeptid codiert ermöglicht.

Unter Bezugnahme auf Tabelle zwei sowie die 4 und 5 kann das Aktivierungsmittel aus:

– Tetracyclin, wenn das induzierbare Regulator-Polynucleotid die Sequenz TetO umfasst,
– Tetracyclin, wenn das induzierbare Regulator-Polynucleotid die Sequenz Tet P umfasst, bestehen.

Gegenstand der Erfindung ist auch ein Kit oder Set für die Kontrolle der Translation eines Polynucleotids von Interesse, dadurch gekennzeichnet, dass er/es einen spezifischen Fusionspolypeptid-Inhibitor, wie er vorstehend definiert ist, umfasst.
Die Erfindung betrifft auch einen Kit oder ein Set für die Kontrolle der Translation eines Polynucleotids von Interesse, dadurch gekennzeichnet, dass er/es umfasst:

(a) einen spezifischen Fusionspolypeptid-Inhibitor, wie er vorstehend definiert ist, und
(b) einen rekombinanten Vektor, in den eine Nucleinsäure insertiert ist, die umfasst: (i) wenigstens eine Kopie einer Target-Nucleotidsequenz des Bindungsproteins für RNA, das in dem Fusionspolypeptid, wie es in (a) definiert ist, enthalten ist; (ii) das Polynucleotid von Interesse.

Die Erfindung betrifft auch einen Kit oder ein Set für die Kontrolle der Translation eines Polynucleotids von Interesse, dadurch gekennzeichnet, dass er/es einen rekombinan ten Vektor umfasst, in den eine Nucleinsäure, die ein Polynucleotid umfasst, das für einen spezifischen Fusionspolypeptid-Inhibitor codiert, vorzugsweise unter der Kontrolle eines Regulator-Polynucleotid, in ganz bevorzugter Weise unter der Kontrolle eines induzierbaren Regulator-Polynucleotids, insertiert ist.
Die Erfindung bezieht sich auch auf einen Kit oder ein Set für die Kontrolle der Translation eines Polynucleotids von Interesse, dadurch gekennzeichnet, dass er/es umfasst:

(a) einen rekombinanten Vektor, in den eine Nucleinsäure, die ein Polynucleotid umfasst, das für einen spezifischen Fusionspolypeptid-Inhibitor gemäß der Erfindung codiert, gegebenenfalls unter die Kontrolle eines Regulator-Polynucleotids gestellt, in ganz bevorzugter Weise die Kontrolle eines induzierbaren Regulator-Polynucleotids gestellt, insertiert ist; und
(b) einen rekombinanten Vektor, in den eine Nucleinsäure insertiert ist, die umfasst: (i) wenigstens eine Kopie einer Target-Nucleotidsequenz des Bindungsproteins für RNA, das in dem Fusionspolypeptid, wie es in (a) definiert ist, enthalten ist; (ii) das Polynucleotid von Interesse.

Nach einem ersten vorteilhaften Aspekt ist der Kit oder das Set, wie es oben definiert ist, dadurch gekennzeichnet, dass der rekombinante Vektor (a) der Vektor Pms2cp-PEP58X ist, der am 8. Juli 2003 unter der Eingangsnummer I-3067 bei der Collection Nationale de Microorganismes hinterlegt wurde.
Die Erfindung betrifft auch die Verwendung eines Kontrollsystems der Translation der Proteine, wie sie in der vorliegenden Erfindung definiert sind, wie auch eines Kits, wie er oben definiert ist, für die Kontrolle der Translation eines Polynucleotids von Interesse.
Nach einem ersten Aspekt ist die obige Verwendung dadurch gekennzeichnet, dass das Polynucleotid von Interesse in einem azellulären System exprimiert wird.
Nach einem zweiten vorteilhaften Aspekt ist die obige Verwendung dadurch gekennzeichnet, dass das Polynucleotid von Interesse in vitro durch Zellen, die in einem Bioreaktor kultiviert sind, exprimiert wird.
Pharmazeutische Zusammensetzungen gemäß der Erfindung
Gegenstand der Erfindung ist auch eine pharmazeutische Zusammensetzung, die einen spezifischen Fusionspolypeptid-Inhibitor der Translation der Proteine, wie er in der vorliegenden Beschreibung definiert ist, umfasst.
Die Erfindung bezieht sich auch auf eine pharmazeutische Zusammensetzung, umfassend:

(a) einen spezifischen Fusionspolypeptid-Inhibitor der Translation der Proteine, wie er in der vorliegenden Beschreibung definiert und
(b) einen rekombinanten Vektor, in den eine Nucleinsäure insertiert ist, die umfasst: (i) wenigstens eine Kopie einer Target-Nucleotidsequenz des Bindungsproteins für RNA, das in dem Fusionspolypeptid, wie es in (a) definiert ist, enthalten ist; (ii) das Polynucleotid von Interesse.

Die Erfindung betrifft auch eine pharmazeutische Zusammensetzung, die einen rekombinanten Vektor umfasst, in den eine Nucleinsäure insertiert ist, die ein Polynucleotid, das für einen spezifischen Fusionspolypeptid-Inhibitor der Translation der Proteine gemäß der Erfindung codiert, gegebenenfalls unter der Kontrolle eines Regulator-Polynucleotids, vorzugsweise eines induzierbaren Regulator-Polynucleotids umfasst.
Die Erfindung bezieht sich auch auf eine pharmazeutische Zusammensetzung, umfassend:

(a) einen rekombinanten Vektor, in den eine Nucleinsäure insertiert ist, die für einen spezifischen Fusionspolypeptid-Inhibitor der Translation der Proteine, wie er in der vorliegenden Beschreibung definiert ist, codiert, gegebenenfalls unter die Kontrolle eines Regulator-Polynucleotids, vorzugsweise eines induzierbaren Regulator-Polynucleotids gestellt, und
(b) einen rekombinanten Vektor, in den einen Nucleinsäure insertiert ist, die umfasst: (i) wenigstens eine Kopie einer Target-Nucleotidsequenz des Bindungsproteins für RNA, das in dem Fusionspolypeptid, wie es in (a) definiert ist, enthalten ist; (ii) das Polynucleotid von Interesse.

In Zelltherapie ersetzen die Kontrollsysteme der Translation der Proteine gemäß der Erfindung vorteilhafter Weise das Regulator-Induktor-Paar, das tatsächlich in einem einzigen Molekül verwendet wird, wobei der spezifische Fusionspolypeptid-Inhibitor, wie er vorstehend definiert ist, fähig ist, direkt und sehr spezifisch die Expression eines Gens, das für ein Protein von therapeutischem Interesse codiert, zu modulieren. Mit den Kontrollsystemen gemäß der Erfindung geht die Regulierung der Expression des oder der Gene von Interesse in post-transkriptionaler Weise in Cytoplasma der Wirtszelle vor sich, was eine schnelle und reversible Wirkung des Inducers erlaubt.
Durch eine Anwendung der Kontrollsysteme gemäß der Erfindung für die direkte Korrektur von bestimmten Expressionsfehlern von zellulären Genen („regulomische" Therapie) wird der spezifische Fusionspolypeptid-Inhibitor ein Protein enthalten, das sich spezifisch an der Target-Messenger-RNA der Zelle fixiert. Eine zelluläre Spezifität dieses Behandlungstyps kann darüber hinaus erreicht werden, wenn die Target-Messenger-RNA nur in einem gegebenen Zelltyp exprimiert wird und/oder wenn der spezifische Fusionspolypeptid-Inhibitor nur die spezifischen Regulatoren dieses Zelltyps stört.
In einer antiviralen oder antiparasitären Therapie haben die derzeit verwendeten Arzneimittel oft unerwünschte Nebenwirkungen, die auf einen Mangel an Wirkspezifität basieren. Unter den Targets dieser Arzneimittel findet man zelluläre Proteine wie Polymerasen. Im Gegensatz dazu ist ein spezifischer Fusionspolypeptid-Inhibitor gemäß der Erfindung fähig, direkt und spezifisch auf die Messenger-RNA auf dem viralen Genom und nicht auf die Produkte, die durch das Genom der infizierten Zelle codiert sind. In der Tat wird das Bindungsprotein für RNA, das Bestandteil des spezifischen Fusionspolypeptid-Inhibitors der Erfindung ist, auf der Basis seiner Spezifität für die virale Messenger-RNA, die man neutralisieren möchte, ausgewählt. Diese Strategie erlaubt es, eine sehr gute Screening-Spezifität des spezifischen Fusionspolypeptid-Inhibitors der Erfindung zu erhalten. Während man darüber hinaus erwartet, dass die Expression der viralen Proteine zu einem sehr großen Teil auf dem posttranskriptionalen Niveau reguliert wird, ist ein spezifischer Fusionspolypeptid-Inhibitor gemäß der Erfindung besonders gut an die antivirale Bekämpfung angepasst.
Wie bereits oben erwähnt wurde, kann auf dem Gebiet der Produktion der Proteine von Interesse in einem Bioreaktor das rekurrente Problem der Toxizität des Proteins von Interesse, dessen Expression gewünscht wird, für die Zellen überwunden werden, in dem die Expression des Gens von Interesse dank des spezifischen Fusionspolypeptid-Inhibitors der Erfindung während der Wachstumsphase der Zelle unterdrückt wird; dann aktiviert man das Gen, das für das Protein von Interesse codiert, während der letzten Phasen, z.B. wenn die Zelle ein Plateau der Wachstumsphase erreicht hat, zu produzieren. Außerdem ist es wahrscheinlich möglich, die Expression des Gens von Interesse sehr genau während aller Stufen des Prozesses der Produktion im Bioreaktor zu kontrollieren, indem man die Konzentration des spezifischen Fusionspolypeptid-Inhibitors, der im Reaktionsmedium vorliegt, einstellt.
Die vorliegende Erfindung wird außerdem durch die folgenden Beispiele veranschaulicht, ohne sie jedoch zu beschränken.
BEISPIELE
BEISPIEL 1 – Protokoll zur Konstruktion der rekombinanten Vektoren MS2CP-Pep58X und MS2CP-Pep58H
Die Amplimere, die Pep58X und Pep58H entsprechen, die unter Verwendung des Plasmid pT7TSEDENBP (Oligonucleotide ATGCTAGCGTAAAGTTCGCAGACACTCAGAAAG [SEQ ID NO. 12] und ATGCGGCCGCTGCATTGAGCTGCTGCATTTGC) (SEQ ID NO: 13] und des Plasmids pT7TSCUGBP (Oligonucleotide ATGCTAGCGTAAAATTTGCTGATACACAGAAG (SEQ ID NO: 14] und ATGCGGCCGCTGCGCTGATTTGCTGCATCTGC (SEQ ID NO: 15]) (Paillard, 2002) als Matrize erhalten wurden, werden durch NheI und Xho I verdaut und in den Vektor pMS2CP-HA, der vorher mit NheI und XholI verdaut worden war, insertiert. Der Vektor pMS2CP-HA wurde durch Insertion des tag HA (TACCCATACGATGTTCCAGATTACGCT (SEQ ID NO: 16]) in den Vektor pcNMS2 (Lykke Andersen, Cell (103) 1121-31) erhalten.
BEISPIEL 2: Protokoll zur Konstruktion des Vektors RLucLuc-CMVin + 3' UTRGb (MS2)n
Das Plasmid pRL-Null (Promega), verdaut mit XbaI, wird an hybridisierte Oligos (et) gebunden, um das Plasmid pRLuc-XbI zu erhalten. Das Plasmid pGL3-Basic (Promega) wird mit Bam-HI/HindIII verdaut, um das Insert SV40-Luc+ freizusetzen, das in den Vektor pRL-XbI subkloniert wird, durch BamHI/HindIII verdaut wird, um das Plasmid pRLuc-Luc zu erhalten.
Ein Fragment, das den bidirektionalen CMV-Promotor und die Introns B-Globin und EF-1 (Généthon, Evry) trägt, wird in die Stellen XbaI/MIuI von pRLucLuc insertiert, um das Plasmid pRLucLucCMVin zu erhalten. Das Fragment, das das 3'-nicht-translatierte B-Globin und MS2-Wiederholungen trägt, erhalten durch NotI/ApaI-Verdauung des Plasmid pGB/SMS2) (Lykke Andersen, Cell (103) 1121-31), wird in pRLucLuc, linearisiert durch PvuII, insertiert, um das Plasmid PRLucLuc-CMVin+3'UTRgb(MS2)8 zu erhalten.
BEISPIEL 3: Charakterisierung der Aktivität eines Peptid-Inhibitors gemäß der Erfindung
A. Materialien und Verfahren
Die Inhibitor-Aktivität der Peptide Pep60X und Pep61X mit 17 und 28 Aminosäuren, die den Aminosäuren 211-227 (Pep60X) beziehungsweise 222-238 (Pep61X) der Sequenz des Proteins EDENBP entsprechen, wurde untersucht.
Die verwendeten mRNA werden ausgehend von Konstrukten hergestellt, die in Ezzedine et al., 2001, beschrieben sind. Ein Femtomol der mNRA CAT-Eg2Delta2, die keine EDEN-Sequenz in ihrem 3'-nicht-translatierten Ende trägt, wird mit 200 ng Peptid in Xenope-Embryos im Zellstadium 2 injiziert.
Nach 4,5 Stunden Inkubation werden 5 Gruppen mit 3 Embryos für jede Injektionsreihe gesammelt und es werden Proteinextrakte hergestellt, um die CAT-Aktivität zu messen.
B. Resultate
Die entsprechenden Resultate werden in 6 gezeigt. In 7A sind die durchgeführten Messungen als Mittelwert mit Standardabweichung dargestellt. Nur das Peptid Pep58X zeigt eine signifikante Inhibierungsaktivität der Expression der mRNA CAT-Eg2Delta2. Die Co-Injektion von Pep58X induziert eine analoge Translationsunterdrückung für die mRNA pEG2-Deltal und pEg2-Delta2 (6B).
BEISPIEL 4: Funktionelle Charakterisierung des spezifischen Fusionspolypeptid-Inhibitors MS2CP-Pep58X ex vivo in Säugerzellen.
A. Material und Verfahren
Die Zellen werden mit einem der Vektoren der Reihe pMS2CP und dem Plasmid co-transfiziert.
Die Niveaus der Translation der Luciferase Renilllia (R) und der Luciferase Firefly (F) werden durch Lumineszenzmessung bestimmt (Promega's Dual Luciferase^® Assay System).
Die produzierte Menge an Fusionsproteinen wird durch Westen Blot evaluiert (polyklonaler Anti-HA-Antikörper, Santa Cruz Biotechnology) und bezüglich der Menge eines ubiquitären Zellproteins, Protein PCNA (monoklonaler anti-proliferating cell nuclear antigen (PCNA)-Antikörper, Sigma Aldrich Company) normalisiert. Luc F-mRNA hat keine MS2-Stelle in seinem nicht-translatierten 3'-Teil und wird durch die Expression von MS2CP-Pep58X nicht beeinträchtigt werden. Um dies zu verifizieren wird die Expression von Luc F in Gegenwart von MS2CP-Pep58X durch die Rechnung d(Luc)F/d(Konzentration an MS2CP-Pep58X) analysiert.
Die Resultate sind in 7A dargestellt. Die Steigung der erhaltenen Gerade ist ungefähr eins (0,998), das beweist, dass das produzierte Fusionsprotein die Expression der Luciferase F nicht beeinträchtigt. Die Expression von LucF wurde dann als interner Standard verwendet, um die Wirkung des Fusionsproteins auf die Translation der LucR-mRNA zu bestimmen. Diese letzte trägt in der Tat in seinen nicht-translatierten 3'-Teil die Stellen MS2, die die Fixierung des Proteins MS2CP-Pep58X ermöglichen.
Die Resultate, die durch die Rechnung d(R/F)/d(Konzentration an MS2CP-Pep58X) (7B) analysiert. Das Experiment wurde parallel mit MS2CP durchgeführt, wobei die mit MS2CP erhaltenen Werte 100%ig der Expression der Luc R entsprechen.
B. Resultate
Die Resultate sind in 7 dargestellt, die die Resultate der Translation des Markerproteins Luciferase veranschaulicht, wobei ein Kontrollsystem der Proteintranslation verwendet wird, das die Vektoren pMS2CP-Pep58X, pMS2CP (als Vergleich verwendet) und as Plasmid pRLuc Luc CMVin + 3'UTRgb (MS2)₈ beinhaltet.
Die Expression von MS2CP-Pep58X verursacht eine Unterdrückung der Translation der Luc R-mRNA; die Steigung der entsprechenden Geraden ist ungefähr 0,6 (7B). Die Anmelderin hat gezeigt, dass das Analystensystem auch die Untersuchung von Proteinen ermöglicht, die die Translation stimulieren (Resultate nicht gezeigt).
Tabelle 2: Bevorzugte induzierbare Regulationssysteme
Tabelle 2: Bevorzugte induzierbare Regulationssysteme (Fortsetzung)
TABELLE 3
Literaturstellen:

• AUSUBEL et T. al.; (1989) Current Protocols in Molecular Biology, Green Publishing Associates and Wiley Interscience N.Y.
• COLLER J. et al., 2002, Methods, Bd.26:142-150.
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• HOUBEN WEIL (1974); In Methoden der Organischen Chemie, E. Wunsh Herausg., Band 15-I und 15-II, Thieme, Stuttgart.
• MAKRIDES, Savvas C., 1999, Protein Expr. Purif., Bd. 17(2):183-202.
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• PAILLARD L et al., 1998, The Embo Journal, Bd.17 (1) 278-287.
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Sequenzprotokoll

Claims

Peptid-Inhibitor der Translation der Proteine, dadurch gekennzeichnet, dass seine Größe höchstens 250 Aminosäuren ist und dass er eine Aminosäuresequenz umfasst, die wenigstens 85% Identität mit der Aminosäuresequenz SEQ ID NO: 1 besitzt.
Peptid nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass seine Größe höchstens 50 Aminosäuren ist.
Peptid nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass seine Größe höchstens 30 Aminosäuren, vorzugsweise höchstens 28 Aminosäuren, ist.
Peptid nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass es eine Aminosäuresequenz umfasst, die wenigstens 89% Identität mit der Aminosäuresequenz SEQ ID NO: 1 besitzt.
Peptid nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass es die Sequenz SEQ ID NO: 1 umfasst.
Peptid nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass es die Sequenz SEQ ID NO: 2 umfasst.
Fusionspolypeptid, das spezifisch die Translation eines Target-Polynucleotids von Interesse inhibiert, dadurch gekennzeichnet, dass das Polypeptid ein Peptid nach ei nem der Ansprüche 1 bis 6 umfasst, wobei das Peptid mit einem Bindungsprotein für RNA fusioniert ist.
Fusionspolypeptid nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass das Bindungsprotein für RNA unter MS2CP, N, IRP und U1A ausgewählt ist.
Nucleinsäure, die ein Polypeptid umfasst, das für ein Peptid nach einem der Ansprüche 1 bis 6 kodiert.
Nucleinsäure nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, dass sie ein Regulator-Polynucleotid umfasst, unter dessen Kontrolle das Polynucleotid, das für das Peptid kodiert, gestellt ist.
Nucleinsäure, die ein Polynucleotid umfasst, das für ein Fusionspolypeptid nach einem der Ansprüche 7 und 8 kodiert.
Nucleinsäure nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, dass sie ein Regulator-Polynucleotid umfasst, unter dessen Kontrolle das Polynucleotid, das für das Fusionspolypeptid kodiert, gestellt ist.
Nucleinsäure nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, dass das Regulator-Polynucleotid ein induzierbares Regulator-Polynucleotid ist.
Kontrollsystem für die Translation eines Target-Polynucleotids von Interesse, das ein Fusionspolypeptid nach einem der Ansprüche 7 und 8 oder eine Nucleinsäure nach einem der Ansprüche 11 bis 13 umfasst.
Kontrollsystem für die Translation eines Target-Polynucleotids von Interesse, umfassend: (a) eine erste Nucleinsäure, die aus einer Nucleinsäure nach einem der Ansprüche 11 bis 13 besteht; (b) eine zweite Nucleinsäure, umfassend: (i) wenigstens eine Kopie einer Target-Nucleotidsequenz des Bindungsproteins für RNA, das in dem Fusionspolypeptid enthalten ist, das durch die erste Nucleinsäure, wie sie in (a) definiert ist, kodiert wird; (ii) das Polynucleotid von Interesse.
Kontrollsystem für die Translation eines Target-Polynucleotids von Interesse, umfassend: (a) ein Fusionspolypeptid nach einem der Ansprüche 7 und 8; (b) eine Nucleinsäure, umfassend: (i) wenigstens eine Kopie einer Target-Nucleotidsequenz des Bindungsproteins für RNA, das im Fusionspolypeptid enthalten ist, wie es in (a) definiert ist; (ii) das Polynucleotid von Interesse.
Kontrollsystem nach einem der Ansprüche 15 und 16, dadurch gekennzeichnet, dass die zweite Nucleinsäure ein Regulator-Polynucleotid umfasst, unter dessen Kontrolle das Polynucleotid von Interesse gestellt ist.
Nucleinsäure nach einem der Ansprüche 9 und 10, dadurch gekennzeichnet, dass sie in einen rekombinanten Klonierungs- oder Expressionsvektor insertiert ist.
Rekombinanter Klonierungs- oder Expressionsvektor, der eine Nucleinsäure nach einem der Ansprüche 9 und 10 umfasst.
Nucleinsäure nach einem der Ansprüche 11 bis 13, dadurch gekennzeichnet, dass sie in einen rekombinanten Klonierungs- oder Expressionsvektor insertiert ist.
Rekombinanter Klonierungs- oder Expressionsvektor, der eine Nucleinsäure nach einem der Ansprüche 11 bis 13 umfasst.
Vektor nach Anspruch 21, dadurch gekennzeichnet, dass es sich um den Vektor pMS2CP-PEP58X handelt, der am 8. Juli 2003 bei der Collection Nationale de Cultures de Microorganismes unter der Eingangs-Nr. I-3067 hinterlegt wurde.
Kontrollsystem nach einem der Ansprüche 15 bis 17, dadurch gekennzeichnet, dass die Nucleinsäure (n), die darin enthalten ist (sind), in einen rekombinanten Expressionsvektor insertiert ist (sind).
Kontrollsystem nach einem der Ansprüche 15 bis 17, dadurch gekennzeichnet, dass die Nucleinsäure (b) in das Genom einer prokaryotischen oder eukaryotischen Wirtszelle insertiert ist.
Prokaryotische oder eukaryotische Wirtszelle, die ein Kontrollsystem nach einem der Ansprüche 15 bis 17, 23 und 24 umfasst.
Prokaryotische oder eukaryotische Wirtszelle, die eine Nucleinsäure nach einem der Ansprüche 11 bis 13 oder einen rekombinanten Vektor nach Anspruch 21 umfasst.
Verfahren zur in vitro-Kontrolle der Translation eines Target-Polynucleotids von Interesse, dadurch gekennzeichnet, dass es die folgenden Stufen umfasst: (a) in eine prokaryotische oder eukaryotische Wirtszelle führt man eine Nucleinsäure ein, die umfasst (i) wenigstens eine Kopie einer Target-Nucleotidsequenz eines Bindungsproteins für RNA; (ii) das Polynucleotid von Interesse und (iii) ein Regulator-Polynucleotid, unter dessen Kontrolle das Polynucleotid von Interesse gestellt ist; (b) man kultiviert die rekombinante Wirtszelle, die am Ende der Stufe (a) erhalten wurde, in einem geeigneten Kulturmedium, wobei die rekombinante Wirtszelle das Polynukleotid von Interesse exprimiert; (c) falls gewünscht, inhibiert man die Expression des Polynucleotids von Interesse, indem man dem Zellkulturmedium ein Fusionspolypeptid nach einem der Ansprüche 7 und 8 zusetzt.
Verfahren zur in vitro-Kontrolle der Translation eines Target-Polynucleotids von Interesse, dadurch gekennzeichnet, dass es die folgenden Stufen umfasst: (a) man führt in eine prokaryotische oder eukaryotische Wirtszelle ein: (1) eine Nucleinsäure, umfassend: (i) wenigstens eine Kopie einer Target-Nucleotidsequenz eines Bindungsproteins für RNA; (ii) das Polynucleotid von Interesse und (iii) ein Regulator-Polynucleotid, unter dessen Kontrolle das Polynucleotid von Interesse gestellt ist, (2) eine Nucleinsäure nach Anspruch 13; (b) man kultiviert die eukaryotische oder prokaryotische Wirtszelle in einem geeigneten Kulturmedium; (c) wenn gewünscht, setzt man dem Kulturmedium eine geeignete Endkonzentration eines Mittels zu, das die Aktivierung oder die Unterdrückung der Expression des Polynucleotids, das für das Fusionspolypeptid kodiert, ermöglicht.
Kit oder Set für die Kontrolle der Translation eines Polynucleotids von Interesse, dadurch gekennzeichnet, dass er/es ein Fusionspolypeptid nach einem der Ansprüche 7 und 8 umfasst.
Kit oder Set für die Kontrolle der Translation eines Polynucleotids von Interesse, dadurch gekennzeichnet, dass er/es umfasst: (a) ein Fusionspolypeptid nach einem der Ansprüche 7 und 8 und (b) einen rekombinanten Vektor, in den eine Nucleinsäure insertiert ist, die umfasst: (i) wenigstens eine Kopie einer Target-Nucleotidsequenz des Bindungsproteins für RNA, das in dem Fusionspolypeptid enthalten ist, wie es in (a) definiert ist; (ii) das Polynucleotid von Interesse.
Kit oder Set für die Kontrolle der Translation eines Polynucleotids von Interesse, dadurch gekennzeichnet, dass er/es einen rekombinanten Vektor umfasst, in den eine Nucleinsäure nach einem der Ansprüche 11 bis 13 insertiert ist.
Kit oder Set für die Kontrolle der Translation eines Polynucleotids von Interesse, dadurch gekennzeichnet, dass er/es umfasst: (a) einen rekombinanten Vektor, in den eine Nucleinsäure nach einem der Ansprüche 11 bis 13 insertiert ist, und (b) einen rekombinanten Vektor, in den eine Nucleinsäure insertiert ist, die umfasst: (i) wenigstens eine Kopie einer Target-Nucleotidsequenz des Bindungsproteins für RNA, die in dem Fusionspolypeptid enthalten ist, wie es in (a) definiert ist; (ii) das Polynucleotid von Interesse.
Kit oder Set nach Anspruch 32, dadurch gekennzeichnet, dass der rekombinante Vektor (a) der Vektor pMS2CP-PEP58X ist, der am 8. Juli 2003 bei der Collection Nationale de Cultures de Microorganismes unter der Eingangs-Nr. I-3067 hinterlegt wurde.
Verwendung eines Kontrollsystems nach einem der Ansprüche 15 bis 17, 23 und 24 oder eines Kits nach einem der Ansprüche 29 bis 33 für die in vitro-Kontrolle der Translation eines Polynucleotids von Interesse.
Verwendung nach Anspruch 34, dadurch gekennzeichnet, dass das Polynucleotid von Interesse in einem azellulären System exprimiert wird.
Verwendung nach Anspruch 34, dadurch gekennzeichnet, dass das Polynucleotid von Interesse in vitro durch Zellen exprimiert wird, die in einem Bioreaktor kultiviert werden.
Pharmazeutische Zusammensetzung, die ein Fusionspolypeptid nach einem der Ansprüche 7 und 8 umfasst.
Pharmazeutische Zusammensetzung, umfassend: (a) ein Fusionspolypeptid nach Anspruch 7 oder 8; und (b) einen rekombinanten Vektor, in den eine Nucleinsäure insertiert ist, die umfasst: (i) wenigstens eine Kopie einer Target-Nnucleotidsequenz des Bindungsproteins für RNA, das im Fusionspolypeptid enthalten ist, wie es in (a) definiert ist; (ii) das Polynucleotid von Interesse.
Pharmazeutische Zusammensetzung, die einen rekombinanten Vektor umfasst, in den eine Nucleinsäure nach einem der Ansprüche 11 bis 13 insertiert ist.
Pharmazeutische Zusammensetzung, umfassend: (a) einen rekombinanten Vektor, in den eine Nucleinsäure nach einem der Ansprüche 11 bis 13 insertiert ist; und (b) einen rekombinanten Vektor, in den eine Nucleinsäure insertiert ist, die umfasst: (i) wenigstens eine Kopie einer Target-Nucleotidsequenz des Bindungsproteins für RNA, das im Fusionspolypeptid enthalten ist, wie es in (a) definiert ist; (ii) das Polynucleotid von Interesse.